Ақуыз инженериясы: оқу құралы. 9965309655, 4310020000

Table of contents :
1. АҚУЫЗДАРДЫҢ ФОЛДИНГІ
Ақуыз молекуласының бiрiншi реттiк құрылымы – полипептидтiк тiзбекте аминқышқылдарының белгiлi бiр ретпен жалғасып орналасуы, (полипептидтiк тiзбектегi аминқышқылдары қалдықтарының кезектесуi).
Ацилфермент – ферменттік реакция жүзеге асқандағы аралық қосылыс.
Бағытталған мутагенез – бір белгілі ДНҚ бөлігін мутация нәтижесінде өзгертетін процесс.
Бактериофаг – вирусты жұқтыратын бактерия.
Оқу басылымы

Citation preview

ӘЛ-ФАРАБИ атындағы ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Т.А. Карпенюк, Р.Ұ. Бейсембаева, А.В. Гончарова

АҚУЫЗ ИНЖЕНЕРИЯСЫ Оқу құралы

Алматы «Қазақ университеті» 2009 1

ББК 28.0я73 К 14 Баспаға әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті биология факультетінің Ғылыми кеңесі және Редакциялық-баспа кеңесі ұсынған

П і к і р ғжа ан зд а р : биология ғылымдарының докторы, профессор Б.Қ. Искаков; биология ғылымдарының докторы, профессор А.А. Жұбанова; биология ғылымдарының кандидаты С.И. Әбуғалиева

К 14

Карпенюк Т.А., Бейсембаева Р.Ұ., Гончарова А.В. Ақуыз инженериясы: оқу құралы. – Алматы: Қазақ университеті, 2009. – 130 б.

ISBN 9965-30-965-5 «Ақуыз инженериясы» оқу құралы авторлардың Қазақ ұлттық университеті биология факультетінде оқитын дәріс материалдарының негізінде жазылған. Ғылыми еңбек биотехнология, биология саласында маманданатын студенттерге, магистранттар ға, сондай -ақ оқытушылар мен ғылыми қызметкерлерге арналған. К

4310020000 - 040 03-09 460 (05) - 09

ISBN 9965-30-965-5

ББК 28.0я73 © Карпенюк Т.А., Бейсембаева Р.Ұ., Гончарова А.В., 2009 © Әл-Фараби атындағы ҚазҰУ, 2009

2

КІРІСПЕ Ақуыз инженериясы – гендік инженерия, құрылымдық биология және компьютерлік технологияның жетістіктерінің негізінде дамыған ғылым. Ақуыз инженериясының негізгі мақсаты: табиғи ақуыздардың құрылымына өзгерістер енгізіп өндіріске керек олардың қасиеттерін жақсарту немесе бірегей ңа жа қасиетерін беру. Ақуыз инженериясы гендік инженерияның эксперименттік әдістері мен тәсілдерін пайдаланып ақуыз молекуласының кеністік құрылымының өзгеруін іске асырады. Табиғи ақуыздарды қолданбалы пайдалану мүмкіндігі, сонын ішінде биотехнологиялық процестерде пайдалану мүмкіндігі шектелген. Себебі ақуыздар өзінің қызметтін белгілі температура аралығында және белгілі ерекше физика-химиялық жағдайында жүзеге асырады. Биохимиктер ақуыздардың қасиеттерін жақсарту үшін қөп ерекше зертеу жүргізеді. Биотехнологиялық процесттің жағдайында ақуыз өзінің құрылымы мен қасиеттерін өзгертпеу керек. Ақуыз инженерияның тәсілдерді пайдаланып, табиғи ақуыздардың құрылымы мен қасиеттерін өзгертіп биотехнологиялық процестердің талаптарына сай ақуыздар алынады. Ақуыздардың құрылымы мен қызметінің өзара байланысын талдау жүргізу үшін ақуыз инженериясы өте көп мәлімет, сонымен бірге қазіргі замаңғы алдыңғы қатарында түратын биотехнологиялық бағыт береді. Ақуыз инженериясының жетістіктері әртүрлі өніркәсіптерде және медицинада қолдананылады. Вирустармен ісіктердің дамуын қоздыратын, мутанты гендерімен байланысатын акуыздарды, мутанты гендерді зиянсыздандыратын акуыздарды, тиімділігі жо ғары екпелерді ғалымдар жасайды. Фармацевтикалық препаратардың нысанасы ретінде қызмет атқаратын клеткалық жарғакшаларының рецептор-ақуыздарын зертейді де әрілер д әсерінің механизмін анықтайды. Ақуыз инженерияны ақуыздардың сапасын өзгерту үшін қолданады, нәтижесінде азық-түліктің бұзылмай сақталуын қамтамасыз етеді, яғни ақуыз инженериясының көмегімен тағамдық азықтарды жақсартады. Ақуыз инженериясының пайдаланатын тағы бір саласы - химиялық және биологиялық шабуыл үшін пайдаланатын заттар мен микроорганизмдерді бейтараптандыратын акуыздарды құру. Мысалы, гидролаза ферменттер жүйке жүйесінің сал ауруға себеп болатын газдарды және ауыл шаруашылықта пайдаланатын пестицидтерді бейтараптандырады. Сонымен бірге ферменттерді ң өндірісі, оларды сақтау мен пайдалану айналадағы орта мен адамдардың денсаулығы үшін қауіпсіз. Ақуыз инженериясы биоремедиация үшін жаңа жолдарды ашады. Биоремедиация – бұл айналадағы ортаны ластайтын заттардан, әсіресе улы заттардан тазартуүшін, зиянды заттарды пайдалы заттарға, мысалы микроорганизмдерді пайдаланып отынға айналдырады. Қазіргі күнде бұл технологияларды кен пайдаланады. Мысалы, ауыл шаруашылык 3

қалдықтарынан, сабан, көн тағы басқа заттардан, жанғыш биогазды жасайды, ағаш ыдырағанда түзілген өнімдерден спирттің микробиоло гиялық өндірісін, микроорганизмдердің қатысуымен төгілген мүнай мен мүнай өнімдерінен ортаны, микробтардың көмегімен ағынды суды ауыр металлдардың иондарынан тазартады т.б. Аталған барлық процестер ерекше ферменттердің қатысуымен жүзеге асады. Белгілі ферменттердің каталитикалық орталықтарын ақуыз инженериясының көмегімен жақсарту нәтижесінде процестердің тиімділігі күшейеді. Ақуыз инженериясының көмегімен адам қызметінің нәтижесінде табиғатқа енген бөтен зиянды заттарды ыдырататын жаңа ферменттер құрылады. Ақуыз инженериясы жасанды ақуыздарды алуға мүмкіндік туғызады. Бұл жасанды ақуыздарды тест-жүйелерді жасағанда биосенсор ретінде пайдаланады. Биосенсордің көмегімен химиктер, медиктер, экологтар аминқышқылдарды, этил спиртті, глюкозаны, несепнәрді, аспиринді, формальдегидті, пестицидтерді және басқа заттарды әртүрлі сұйықтарда табады; моноклоналды антиденелердің негізінде жасалған биосенсорлар тұқым қуалаушылық ауруларды, СПИД-ті, адамдардың бірқатар ауруларға бейімділігін анықтайды. Ақуыз инженериясының негізгі бағыттарына: - сайт-бағытталған мутагенез әдістің көмегімен ақуыздардың құрылымдық-функционалды талдауын жүргізу; - химерлы және мультифункционалды ақуыздарды құру; - кездейсоқ мутагенезі және белгілі қасиеті бар ақуыздарды сүрыптау (молекулалық эволюция); - жасанды ақуыздарды de novo құру жатады. Ақуыз инженериясының міндеттері: 1. Ферменттердің ерекшелігі мен каталитикалық сипаттамаларын өзгерту. Соның ішінде реакцияның жылдамығын жоғарлату, Михаэлис константасын төмендету, рН оптимумын өзгерту, тежеу сайтын жою. 2. Ақуыздардың құрылымдық қасиеттерін өзгерту. Соның ішінде, ферменттің температура мен органикалы қ еріткіштерге түрақтылығын жоғарлату, физика-химиялы қ қасиеттері мен лигандларды байланыстыратын ерекшелігін және ақуыздың молекулаішілік динамикасын өзгерту. 3. Жа ңа жүйелерді құру (химерлы және мультифункционалды ақуыздарды, ерекше домендерді ақуыз молекуласына енгізу т.б.) 4. Фармакалогия мен медицинада пайдалану үшін ақуыздардың емдеу қасиетінің тиімділігін жоғарлату.

4

1. АҚУЫЗДАРДЫҢ ФОЛДИНГІ

Тірі жасушаларда ақуыз молекуласының түзілуі екі негізгі процестен: - полипептидтік тізбегінің синтезінен; - полипептидтік тізбегінің үш өлшемді нативті құрылымына бүктелуінен құрылады. Екінші процесті фолдинг деп атайды. Қазіргі күнде полипептидтік тізбектің түзілу процесі жақсы зерттелінген, ал екінші процесс, фолдинг процесс түралы біздім біліміз шамалы. Фолдинг процестің нәтижесінде полипептидтік тізбегінде алыс орналас қан аминқышқылы қалдықтары жақындайды, α және β құрылымдар түзіледі де кеністікте өзара орналасады. Ақуыз молекуласы бірнеше полипептідтік тізбегінен (суббірліктерден) құралса, онда фолдинг процеске суббірліктердің белсенді макромолекулаға жиналуы да кіреді. Ақуыз молекуласы бір ғана кеңістік құрылымына бүктелгенде белсеңді болады да бірегей биологиялық қызметті атқарады. Сондықтан генетика лық мәліметті клетка қызметінің механизміне аудару процесінде фолдинг маңызды кезең болып саналады. Фолдинг процесті зерттеп алған нәтижелері: - ақуыздың қызметі мен оның құрылымының өзара байлынысының ерекшелігін анықтау үшін қажет; - жаңа қасиеті мен жаңа биологиялық қызметті атқаратын ақуыздарды алуға мүмкіндік туғызады; - кейбір ауруларды ң, мысалы, Алцгеймер, құрқұлақ, сиырдың құтыруы, прионалық аурулар, т.б. ауруларының пайда болу механизмін түсінуге негіз жасайды. Ақуыз қасиетерін өзгерту үшін аминқышқылы қалдықтарының түрөзгерісін пайдаланады. Сондықтан ақуыз молекуласының кеңістік құрылымы құрылғанда, яғни фолдинг процесінде әр аминқышқылдың қатысатын ерекшелігін, ақуыз молекуласының құрылымына және фолдинг процесіне аминқышқылдың түрөзгерісі қандай әсер ететінін білу керек. Фолдинг процесін зерттеу 5

нәтижесінде ақуыз молекуласының аггрегациясына немесе дұрыс емес фолдингіне себеп болатын мутациялар ғары жо аталған ауруларға шалдықтыратыны анықталды. Мысалы, прионалық аурулар ерекше ақуыз моле куласының кеңістік құрылымының өзгеру нәтижесінде дамиды. Ақуыз фолдинг процесті ең бірінші рет 1920 жылы Ансон мен Мирски зертеді. Алын ған нәтижелерінің негізінде олар ақуыз молекуласының денатурациясы кері процесс деген қорытындыға келді. 1961 жылы Анфинсен рибонуклеазаның денатура циясын зерттеп мына идеяныұсынды: полипептидтік тізбегінің аминқышқылы қалдықтарының кезектесуі, яғни ақуыздың бірінші реттікқұрылымы оның үш өлшемді құрылымың белгілейді. Сондықтан денатурацияланған глобулярлы ақуыз молекуласы іn vіtro спонтандыөздігінен ұйымдасу қабілеттілі гіне ие. Басқа сөзмен айтқанда температура, еріткіш, рН т.б. әсерінен бұзылған ақуыз молекуласының кеңістік құрылымы ортаның жағдайы оптималды болғанда спонтанды нативті қалпына қайтадан келеді. Бұл қорытынды басқа ақуыздардың кеңістік құрылымының сипаттамаларын, денатурация процесін зерттеу нәтижесінде дәлелденді. Х. Динтцис, К.Кенфилд, К.Анфинсен 4 дисульфид байланысы бар А рибонуклеаза молекуласыны ң нативті белсенді конформациясының жасанды қүрылуы үшін бірнеше сағат керек екендігін, ал жасушада ақуыздың биосинтезі мен функционалды үш өлшемді құрылымының құрылуы бірнеше минуттың ғана ішінде жүзеге асатынын анықтады. Экспериментальды өлшен ген және есеп арқылы алынған ақуыз фолдинг жылдамдығының айырмашылығын Левинталь парадоксы деп атады. 100 аминқышқылдардың қалдығынан құрылған кішкентай ақуызды алып Левинталь есеп арқылы көрсетті: әр аминқышқылы қалдығының үш түрлі позицияда орналасу мүмкіндігі болғанда ақуыздың түзілетін кеңістік құрылымыны ң саңы 3100-ға (немесе 5•1017 ) тең. Ақуыз молекуласы бір құрылымынан екінші құрылымына көшу үшін 10-13 секунд керек болса, онда нативті құрылымын табу жалпы уақытты 5•1017х 10-13 с тең, яғни 1,6х1027 жыл керек. Біра қ, жасушада ақуыз секундтар немесе минуттарды ң аралығында нативті белсенді кеңістік құрылымына бүктеледі. Шынында ақуыз молекуласында әр аминқышқылы қалдығының 6

10 түрлі конформациясы болу мүмкін, ал 100 аминқышқылынан құрылған ақуыз 10100-ға жуық кеңістік құрылымына бүктеледі. Барлық мүмкіншілік 100100 құрылымдарының ішінде ақуыздың бір ғана кеңістік құрылымы функционалды белсенді келеді. Ақуыздың нативті, белсенді құрылымын 100100 кеңістік құрылымының ішінен табу үшін 10 80 жыл керек. Левинталь парадоксы мынадай: бір жағынан ақуыз нативті құрылымына, ең тұрақты құрылымына әртүрлі кинетикалық процестердің нәтижесінде жетеді. Бұл процестерге: рибосомада іске асатын биосинтез, ке ңістік құрылымына бүктелу және мембрана арқылы секреция, пробиркада жүзеге асатын ренатурация процесі жатады. Екінші жағынан ақуыз молекуласыны ң барлық кеңістік құрылымдарының ішінен нативті кеңістік құрылымы ең тұрақты құрылымы деп айтуға болмайды. Клеткада полипептидтік тізбегі ке ңістік құрылымына бүктелгенде ең тұрақты құрылымын табу үшін уақыт жоқ. Левинталь болжамы бойынша қауыздың нативті кеңістік құрылымына бүктелуі полипептидтік тізбегіні ң минималды бос энергиясы күйіне жетуге тиіс уа қытымен белгіленеді. Сонымен ақуыз полипептидтік тізбегінің нативті құрылымына бүктелу процесі молекуласының тұрақтылығымен емес, термодинамика қылы ар емес, кинетикасымен белгіленеді. Ақуыз молекуласының фолдинг процестің бірінші механизмін Филипсұсынған. Бұл гипотеза бойынша өсіп жатқан полипептидтік тізбегінің N -соңында кеңістік құрылымының ұрығы түзіледі, қалған тізбек оған оралады. Бірақ Гольдберг пен Крейтон in vitro жағдайда полипептидтік тізбегінің өздігінен құрылуына N-соңы манызды болмайды деп көрсетті Трипсин тежегіштің полипептидтік тізбегін сақина түріне айналдырды, оның өзідігінен құрылу қабілеттілігі сақталатынын анықтады, сақинаны кескенен кейін тізбектің ортасында орналасқан аминқышқылы N-соңы ретінде болса да полипептидтік тізбегінің өздігінен құрылуы нативті кеңістік құрылымына әкеледі. 1.1 Ақуыз фолдинг модельдері Ақуыз фолдингін процесінің: 1) каркас моделі; 2) гидрофобты коллапс моделі; 3) нуклеация мен конденсация кезеңдерінен құрылған өсу моделі; 4) сүрет -жұмбақ моделі бар. Ақуыз 7

фолдинг модельдерін ұсынғанда: ақуыз құрылымын теоретикалық зерттегенде алынған нәтижелер, феноменологиялық құрылуы және компьютерлік модельдеу негізге алынды. Каркас моделі. Полипептидтік тізбегінің бүктелу каркас моделін 1973 жылы Птицын ұсынды. Бұл модель бойынша ақуыз фолдингі иеархиялық процесс, бірнеше кезеңнен құрылады. Белок молекуласы бір ізбенүктеледі. б Ал дымен белоктың екінші реттікқұрылымының элементері түзіледі. Сонан соң екінші реттік құрылымының сегментері (қосылады) бірегеді де полипептидтік тізбегінің компакты құрылымы (суперекінші құрылымы) пайда болады. Ақуыздың екінші реттік құрылымының элементері үшінші реттік құрылымы түзілу үшін каркас ретінде қызмет атқарады. Сонымен ақуыз молекуласы альтернативті қүйлерінің көп санына жоламай нативті құрылымына жетеді. Ақуыздың бүктелуі бір ізді жүреді де әр кезеңінің іске асуы бүктелі процестің жалпы жылдамдығың үлғайтады. Каркас модельді ң басты идеясы – ақуыздың кеңістік құрылымының үш деңгейлері, екінші реттік құрылымы, пішінің каркасы және үшінші реттік құрылымы бір ізді құрылады. Каркас модельдің негізіне «балқыған глобула» деп аталатын ақуыз молекуласыны ң пішіні (күйі) алынған. Ақуыздың «балқыған глобула» үйі к гипотеза ретінде ұсынған ұғым, алдымен теоретикалық зерттеу арқылы шығарылды, одан кейін тәжірибе нәтижесінде табылды да зерттелінді. ХХ ғасырдың 80-жылдарында Долгих, Семисотнов, Гильманштанов т.б. (Птицын лабораторияның қызметкері) «балқыған глобуланы» «әлсіз денатурланған» ақуыздың тепе-тендік күйі деп қарастырды, кейін ақуыз молекуласының іn vіtro жағдайда бүктелу проце сінің кинетикалық аралық молекуланың түрі реттінде зерттеді. Глобулярлы қуыздардың а көбісі іn vіtro физиологиялық жағдайда өздігінен ұйымдасқанда клубоктан басталатын өзіндік құрылу жолында алғашқы аралық күйі ретінде «балқыған глобула» болады депқорытынды жасалды. Ақуыз молекуласы бүктелу барысында «балқыған глобула» милисекундты аралығында түзіледі. 100-300 аминқышқылы қалдықтарынан құрылған табиғи ақуыздың қасиеттері толық қалпына келу үшін кейбір ақуыздарға бірнеше секунда, басқаларға оң шақты минуттар 8

керек. Сонымен, полипептидтік тізбегіні ң бүктелуі каркас модель бойы жүзеге асқанда алдымен «балқыған глобула», одан кейін тығыз оралған табиғи ақуыз түзіледі. Өзіндік құрылымының жылдамдығын шектейтін ең баяу қадамы – «балқыған глобуладан» ғыз ты оралған нативті глобуланың түзілуі. Кішкентай қуыздардың а (100 -150 аминқышқылы қалдығы) фолдинг процесі іn vіtro іске қанда ас аралық қосылыстар жиналмайды, бүктелу жылдамдығы жоғары аралық қосылыстар түзетін ақуыздармен салыстырғанда бұл ақуыздардың фолдингі өте тез жүзеге асады. Бір доменді ақуыз оң шақты секунттар ішінде бүктеледі, кейбір белоктар (100 -ден аз амин қышқылы қалдықтары) фолдинг процесі бойы аралық құрылымдар жиналмайды да милисекунтты ң ішінде кеністік құрылымы толық түзіледі. Гидрофобты коллапс моделі. Гидрофобты коллапс модельде ақуыз фолдингін белгілейтін негізгі әрекеттесуі ретінде гидро фобты әрекеттесу алынады. Гидрофобты әрекеттесу – полярсыз молекулаларының, полярсыз бүйірлік топтарының жақындап өзара әрекеттесуі. Нәтижесінде полярсыз молекулаларының және полярсыз топтарының су молекулаларымен әрекеттесуі төмендейді. Гидрофобты әрекеттесуі ерекшесіз, басқа ерекшелігі жоғары әрекеттесуге қарағанда ф олдинг процесіне тезірек қатысады деген болжам бар. Конденсация мен нуклеация кезеңі барөсу моделі . Полипептидтік тізбегі таби ғи конформациясына биолог иялық маңызды уақыттың ішінде бүктелу үшін таңдап алынатын (мүмкінді) молекула құрылымдарының саны шектелген болу керек. Табиғи құрылымды іздеу жолдарын азайту молекуланың бүктелуі нуклеация кезеңі арқылы жүзеге асырылады. Нуклеация мен конденсация кезеңі бар өсу модельде полипептидтік тізбегінің бір белгілі бөлігі (8-18 аминқышқылы қалдығы) тұқым (ядро) ретінде болады, осы ядроның өсуі ақуыздың табиғи құрылымы түзілу үшін жол ашады. Ядро тұрақсыз, сондықтан денатурация процесінде өте қысқа уақыт ішінде өмір сүреді. Сүрет-жүмбақ моделі. Ақуыз молекуланың құрылымдық элементері жеке фрагменттерден сүрет-жүмбақты жинау сияқты көп жолдар арқылы жиналады. Болжам бойынша бір белгілі 9

ереже бөлшектерді жинау үшін болмайды. Осы күнде бұл теорияны қолданбайды, себебі, полипептидтік тізбегіні ң бүктелу үшін жолдары бірнеше ғана, өте көп емес. Полипептидтік тізбегі бүктелетін жолдары белгілі бір ізбен жүретін процестерімен сипатталады. 1.2 Полипептидтік тізбегінің нативті конформациясына бүктелу кезеңдері Ақуыз молекуланың кеңістік құрылымы қосымша мәліметі және энергияның ерекше көзін қажет етпейтін спонданды процестің нәтижесінде түзіледі. Бұл процесс полипептидтік тізбегінің ішкі себептерінен жүзеге асады. Ақуыз молекуласының кеңістік құрылымын бірінші реттік құрылымы, аминқышқылы қалдықтарының кезектесіп орналасуы, яғни генетикалық код белгілейді. Клеткада ақуыздың бүктелуі осылай жүзеге асады. Поли пептидтік тізбегі рибосомада N-соңғы жағынан С-соңғы жағына қарай өседі. Рибосоманың пептидилтрансферазалық орталығында орналасқан 2 аминқышқылы қалдығының бағдарлануы өзара жөнінде үнемі бір түрлі, альфа-спиральді конформациясы түрінде келеді. Өсіп жатқан пептидтің 30-40 қалдығынан құралған учаскісі рибосомамен жабылған. Болжам бойынша бұл учаскінің конформациясы мүмкін альфа -спираль түрінде болады. Пептидилтрансферазалық орталығынан 30 -40 аминқышқылы қалдығынан қашықтау орналасқан пептидтік тізбегі цитоплазмаға немесе эндоплазмалық тордың мембранасына енеді. Пептидтің С-соңы рибосомамен байланысқан, ал өсіп жатқан пептидтің N-соңғы жағы, рибосомадан шыққанан кейін әртүрлі факторлар қатысумен бүқтеледі. Фактордың түрі Ссоңына қарағанда N-соңынын қашықтау орналасуына байланысты. Сонымен, полипептидтік тізбегіні ң бүктелуі рибосома қолдайтын бастау конформациясынан басталады. Пептидті ң бүктелуі ко-трансляциялық түрінде жүзеге асады. Мысалы, бета-галактозидаза үзілгенде, т оның полипептидтік тізбегі нативті кеңістік құрылымы ко -трансляциялық бүктеледі. Бұл ферменттің молекуласы төртінші реттік құрылымы түзілгенде ғана белсенді болады. Рибосомамен байланысқан синтезі аяқтал10

маған полипептидтік тізбегі ақуыздың бос суббөліктерімен әрекеттесу қабілеттілігін көрсетеді. Рибосомамен байланысқан комплекс ферменттік белсенді болады. Бұдан басқа, мРНҚ -ның трансляциясы бітпесе өсіп де жатқан β-галактозидазаның тізбегімен байланысқан рибосома белсенді ферментке қарсы түзілген антиденелерімен әрекеттеседі. Полипептидтік тізбегі белгілі жол қылы ар бүктелу үшін рибосома мүмкіндік түғызады. Клетканың ішінде тізбегінің кеңістік құрылымының түзілуін бақылайтын жоғары үйлестірілген жүйе қызмет атқарады. Бұл жүйенің факторлары ақуыз рибосомадан бөлініп кеткенен кейін оның нативті кеңістік құрылымына тез және тиімді бүктелуіне оптималды жағдай туғызады. Толық бүктелмеген полипептидтік тізбегі мембрана арқылы транслокациядан кейін және in vitro жағдайда ренатурация процестін әтижесінде н бүктелгенде ақуыздың нативті кеңістік құрылымы түзіледі. Сонымен, ақуыз молекуласы бүктелгенде іске асатын кезеңдердің бір ізділігі манызды емес. Ақуыздың кеңістік құрылымының түзілуі - көп сатылы процесс. Полипептидтік тізбегінің әр учаскінің екінші реттік құрылымының элементерін құру қабілеттілігі (мысалы αспиральға бүктелуі) осы бөлігінің аминқышылы кезектесуіне тәуелді. Сонымен әртүрлі ақуыздардың α-спираль, β-құрылымдар және ілгектерінің саны мен полипептидтік тізбегі бойы орналасуы генетикалы қ кодпен белгіленеді. Полипептидтік тізбегінің спонтанды бірегей үш өлшемді құрылымына бүктелу потенциалды қабілеттілігін осымен түсіндіруге болады. Осы заманғы түсінік бойынша ақуыздың бүктелу процесі иерархиялық жол арқылы іске асады (1 сурет). Полипептидтік тізбегінің жазылған күйіне бос энергияның кең төбелі жоны сай. Бос энергияның түрі бұл күйінің негізгі тізбегінің конфор мациясының көп санымен іске асуын белгілейді. Полипептидтік тізбегіндегі бос энергияның деңгейі толық жазылған күйінде ең жоғары, ал нативті бүктелген күйінде ең төмен болады. Ақуыз жазылған күйінен нативті бүктелген күйіне әртүрлі жолдарымен көшу мүмкін. Ақуыздың бүктелу-жазылу процесі – кооперативті процесс, нативті белсенді үкйіне көшкенде активациялық тос қауылды (өтпелі күйін) өту қажет. Нативті және бос энергиясы минималды күйімен бірге ақуыздың жарым-жартылай бүктелген 11

аралық күйі болады. Полипептидтік тізбегінің мүмкіншілікті конформацияның саны нативті күйіне жақындағанда төмендейді, сондықтан осындай энергиялық айдыны «энергетикалық шұңқыр» деп аталады. Жазылған күйі

Өтпелі күйі Аралық күйі

Нативті күй 1- сурет. Ақуыздың нативті құрылымына бүктелу жолын белгілейтін энергия айдыны (И. М. Кузнецова мен оның әріптестері жұмысынан алынған)

Ақуыз молекуласының бүктелу жолы жалпы түрінде 2суретте көрсетілген.

2-сурет. Химотрипсин СІ2 тежегіштің бүктелу-жазылу жолының сызбасы (А.В.Финкельштейн, О.П.Птицын кітабынан алынған) 12

Қазіргі күндегі түсінік бойынша ақуыздың бүктелу процесі мынадай сатылары арқылы іске асады. 1. Екінші реттік құрылымының элементері өте тез құрылады, одан бір микросекундтың ішінде 20 -30 аминқышқылы қалды ғынан құралған пептид альфа-спираліне бүктеледі. Күрделі құрылымдар түзілу үшін екінші реттік элементері «бастапқы құрылым (затравка)» ретінде қызмет атқарады.

2. Екінші реттікқұрылымының кейбір элементері супере кінші құрылымына бірігеді. Суперекінші құрылымында бірнеше α-спиральдар, бірнеше β-тізбектер ө зара әрекеттесіп байланы сады немесе элементердің аралас ассоциаттары өте тез түзіледі.

3. «Балқыған глобула» түзіледі. Бұл кезеңінде үшінші реттік құрылымының негізгі элементері - α-спиральдар, β-құрылымдар, оларды байланыстыратын ілгектер байланысады және гидро фобты ядро құрылады. 4. Ақуыздың нативті құрылымы түзіледі. Процестің бірінші кезеңінде негізгі қүші сутек байланыстар, екінші менүшінші кезеңінде гидрофобты әрекеттесу нәтиже сінде энтропияөседі. Ақуыз глобула құрылу үшін негізгі жұмысты гидрофобтыәрекеттесу іске асыртады деп болжам айтылады. Гидрофобты әрекеттесу қатысумен «балқыған глобула» түзіледі, ал ван-дер-ваальс күштері, сутек пен иондық байланыстардың қатысумен ақуыз молекуласы қатаяды. Ван13

дер-ваальс күштері, сутек пен иондық әрекеттесуінің ерекшелігі мен атомдың құрылымына сезімталдығы гидрофобты әрекетте суімен салыстырғанда жоғары болады. Үшінші кезеңінде ақуыз молекуласының кеңістік құрылымы нативті құрылымына жақын, бірақ функционалды белсенді емес. Бұл құрылымды «балқыған глобула» деп атайды, оның тәртібі нативті құрылымының тәртібінің денгейінен төмен. Нативті және «балқыған глобула» ақуыздың құрылымдары 3-сүретте сызба түрінді көрсетілген. Осы екі құрылымды салыстырып мынадай айырмашылы ғы табылды: «балқыған глобулада» спиральді учаскілері (цилиндрлар) кішірек, гидрофобты ядроны құратын полярсыз топтарының оралған тығыздығы жеткіліксіз. 3-суретте көрсетілген сызбаларда ақуыздың гидрофобты ядроға кіретін бүйір топтары штрихтанған (сызықтап тасталған). Балқыған глобулада бүйір топтары бос қимылдайды, энтропия жағынан үтыс пайда болады, бірақ тығыз контактты энергиясын жоғалтады. Глобуланың құрамында саңылаулар пайда болады, су өтеді, бірақ балқыған глобуланы бұзбайды. Балқыған глобуланың бүйір топтары өзара ерекше әрекеттеспейді, бұл жылжымалы ілмектерінің бағытарының өзгеруіне әкеледі, молекуланың түрақсыздығы артығырақ, басқа ұқсас молекулаларымен жабысып агрегаттарды түзу қабілетті келеді. Балқыған глобула

Нативті глобула

3-сурет. Ақуыз молекуласының нативті құрылымы мен балқыған глобуланың сызба түрінде моделі (http://www.bionet.nsc.ru сайттан алынған)

14

1.3 Бүктелу процесінің реттеу механизмдері Анфинсен РНК-аза ферменттің денатурация –ренатурация процесін іn vіtro зерттеу нәтижесінде келесі қорытындыға келді: полипептидтік тізбегінің бірінші реттік құрылымы, аминқыш қылдарының кезектесуі термодинамикалық тұрақты табиғи кеңістік құрылымын белгілейді. Басқа ғалымдар ұқсас жұмыстар жүргізіп анықтады іn vіtro спонданды ренатурация процесс, яғни үш өлшемді құрылымның спонданды өзіндік бүктелуі, кішкентай белоктардағана жүзеге асады. Ал үлкен ақуыздарда денатурация процесс ж үзеге асқанда олардың полипептидтік тізбегі қосымша агрегацияланады. Полипептидтік тізбегінің рефолдингі, яғни қайтадан өзінді к бүктелу процесі, өте баяу жүреді де шығымы төмен. Сонымен бірге, егерде ортаға жасушаның кейбір бөліктерін қосса денатурланған үлкен ақуыздардың рефолдингі женілірек іске асады. Осы жүмыстардың нәтижесінде полипептидтік тізбегінің фолдинг процесіне көмекші ақуыздар қатысатындығы анықталынды. Жасушада полипептидтің тізбегінің бүктелуі және ерекше ферменттік модификациялары қосарланып жүзеге асады. Өсіп жатқан тізбегінің N-соңы рибосомадан шыққанан кейін деформилаза көмегімен соңғы метиониннің формил тобы кетіріледі. N-соңғы метионинді аминопептидаза бөліп жібереді. Жасушаның сигналдық пептидазасының әсерінен сигналдық пептид бөлінеді. Полипептидтік тізбегінің соңдары ферменттердің қатысумен ацетилденеді, гликозилденеді, тізбектің белгілі нүктелеріне липидтер байланысады, үйірлік б топтары фосфорла нады т.б. турөзгерістер іске асады. Кейбір ақуыз тізбектерінің бөліктері спонтанды бөлінеді де түзілген соңдары жабысады, яғни белок тізбегінің «сплайсингі» іске асады, басқа ақуыз тізбегінің бөліктері спонтанды түйықталады. Ақуыздың бүктелуіне қатысатын жасушаішілік басқа көмекшілері түзілген полипептидтік тізбекті қажетсіз контактарынан сақтайды. Қазіргі замаңғы ұсыныс бойынша жасушада ақуыздың кеңістік құрылымына бүктелу процесі екі механизм арқылы ретеледі: 15

- бірінші механизм «бал қыған глобуланы» нативті құры лымына айналдыру процестің жылдамдығын реттеуіне негізде лінеді; - екінші механизм жарым-жартылай бүктелген ақуызды ерекшісіз агрегациядан қорғауын қамтамасыздандырады. Ақуыз молекуланың нативті құрылымының түзілуі поли пептидтік тізбекті ң ерекше әрекеттесу нәтижесінде қайта құрылымдық құрылуын қажет етеді. Соның ішінде пролин қалдығының алдында орналасқан пептидтік байланыстың цистранс-изомерленуі. In vivo ғдайда жа бұл процесс пептидил пролил-цис-транс-изомераза ферменттік қатысумен іске асады. 1.3.1 Пептидил-пролил-цис-транс изомераза (ротамаза) Ақуыз молекуласында пептидтік байланысы екі энергетикалық ротамерлы түрінде, цис-транс-конфигурация түрінде болу мүмкін. Транс-конфигурациясының энергиясы төмен, сондықтан транс-құрылымының түзілу мүмкіндігі жоғары болады. Пептидтік байланыстың цис -конфигурациясының электрондық құрылымы және конформациясы транс-конфигурациясына қарағанда қолайлы болады. Сондықтан полипептидтік тібегінде пептидтік байланысты ң цис -конформациясы 103 рет сирек кездеседі. Егерде полипептидтік тізбегінде пептидтік байланыстан келесі пролин орналасса, онда пептидтік байланысты ң цис- мен транс- изомерлерінің бос энергиясы жақындайды, транс-конфигурация құрылу мүмкіндігі цис-конфигурациясынан 4 есеғана асады. Сондықтан ақуыздың үш өлшемді құрылы мында пептидтік байланыстар цис-түрінде, әсіресе Х-пролин бөліктерінде болуы мүмкін. Нативті (табиғи) ақуыздарда имид байланыстар цис-конфигурацияда 7%, ал басқа пептидтік байланыстардың цис-изомерлерінің мөлшері 0,05% ғана. Конформерлердің тепе-тендік қоспасында имид байланыстардың 10-30%-ы цис-изомер түрінде, ал басқа пептидтік байланыстардың 0,1 0,5%-ы ғана цис -изомері кездеседі. Сонымен қуыз а молекула сында имид байланыстар транс- және цис-конфигурация түрінде болу мүмкін, ал басқа пептидтік байланыстар, көбінесе, транс түрінде, цис-изомерлері өте сирек кездеседі. Имид байланыс тардың конфигурациясы әртүрлі конформерлердің биологиялық қасиеттері де өзгеше болады. Мысалы, протеиназаларды ң 16

көбісінің (α-химотрипсин, Р аминопептидаза, пролидаза) ерекшелігі имид байланысты ң конфигурациясына тәуелді транс конфигурациясына ғана әсер етеді. Ақуыздың полипептидтік тізбегі іn vіtro жа ғдайда бүктелгенде бір бөлігінде пепт идтік байланыстардың табиғи (нативті) дұрыс конформациясы, ал басқа бөлігінде өзгеше конформациясы құрылады. Полипептидтік тізбегінің жасанды жағдайда бүктелу жылдамдығы ақуыз молекуласындағы пролин қалдықтарының мөлшеріне тәуелді келеді, жоғары болғанда баяулайды. Табиғи жағдайда полипептидтік тізбегінің бүктелу жылдамдығы және тиімділігі пролин мөлшеріне тәуелсіз. Себебі ақуыздың үш өлшемді құрылымы түзілу процесіне ерекше ферменттер қатысады. Рибосоманың пептидил-трансфераза орталығынан шыққан полип ептидтік тізбектің барлық пептидтік байланыстары транс-конфигурацияда болады. Болжам бойынша транс-конформация түрінде құрылған пептидтік байланыстарды цис-конформацияға изомерлеу осы ферменттердің қызметі. Алғашқы рет бұл ферменттерді Е.Фишер мен оның әріптестері 1987 жылы тапты, ал Дж.Эдмен, Л.Эллисон, Р.Блэнчер бірінші рет өбліп алды. Бұл ферменттер барлық организмдерде және барлық ұлпаларда көп мөлшерде кездеседі де іn vіtro және іn vіvo жағдайларда пептидил -пролилцис-транс изомеразалық белсенділігін көрсетеді.

Алғашқы рет пептидил-пролил-цис-транс изомеразалар (КФ 5.2.1.8) жарғакшаның ішіндегі рапамициннің, FК506, А циклоспоринні ң иммуносупрессорларының рецепторы ретінде табылды. Сондықтан оларды имунофилиндер деп атады. Қазіргі күнде пептидил-пролил-цис-транс изомеразалар (РРІ)қуыздардың а 17

фолдингіне, апоптоз процеске, кейбір мембраналы қ рецептор лары мен каналдарының реттелуіне қатысатындығы анықталды. Белгілі пептидил-пролил-цис-транс изомераза (РРІ) ферменттерді 3 топқа бөледі. - FК506/рапамицин байланыстыратын белоктар; - циклофилиндер – А циклоспоринмен байланысатын а қуыздар; - парвулиндер. Үш топтың фермент молекулаларында аминқышқылының кезектесуі (бірінші реттік құрылымы) ұқсас емес, бірақ бір топқа кіретін ақуыздардың каталитикалық орталағының құрылымы жоғары кертартпалы. Ферменттерінің құрылымы ұқсас болмаса да жалпы ерекше қасиетері бар. - Барлық РРІ топтарына бірдоменді және мультидоменді ақуыздар кіреді. Бір доменді РРІ жоғары каталитикалық белсенділігін көрсетеді , кеңістік құры лымы ретсіз, бірақ құрылмаған полипептидтерге ұқсас емес. - РРІ үш топқа кіретін ферменттерді ң субстрат ерекшелігі, каталитикалық тиімділігі, катализдің механизмі әр топқа ғана тән ерекше. - FК506/рапамицин байланыстыратын ақуыздар және парвулиндер субстраттың полипептидтік тізбегінде пролин қалдығы ның алдында орналасқан аминқышқылыны ң түріне, ерекшелігіне ие. Осы орында гидрофобты амин қышқылы қалдықтары (лейцин, фенилаланин) болу қажет. Қазіргі күнде осындай ұғымы бар: имид байланыстардың цис-транс изомерленуінің ферменттік катализі әртүрлі фактор ларының қосымша қызметінің нәтижесінде жүзеге асырылады. Әр фактор цис-транс изомерлерінің арасындағы энергетикалық барьері төмендеу үшін ерекше үлес қосады. FК506/рапамицинді байланыстыратын ақуыздар үшін келесі факторлар белгілі. 1. Имид байланыстын сусыздануы, бұл процесс ферментті ң белсенді орталығыны ң гидрофобты ортасына имид байланыстың тасымалдануымен қосарланған. Пептидтік байланыстардың π-электрондарының таратпаушылығы ортаның полярлы қасиетіне тәуелді. Полярсыз еріткіштерде цис-транс изомерлерінің арасындағы энергетикалық барьері су ортасындағы энергетикалық барьерінің мөлшеріне қарағанда төмен. Ферменттің белсенді 18

орталығына гидрофобты аминқышқылдары қіреді, сондықтан имид байланыстың белсенді орталығына тасымалдануы цистранс-изомерленуінің энергетикалық барьерін төмендетеді. 2. Аралық күйіні ң тұрақтандыруы. Аралық күйін тұрақтандыруы белсенді орталығына кіретін 26 -тирозин, 36-фенилаланин, 99-фенилаланиннің қалдықтарының көмегімен жүзеге асады. Себебі, ұл б аминқышқылдарыны ң қалдықтары имид байланыстың карбонил тобымен сутек байланыстар құрайды. Көрші пептидтік байланыстың NН-топтың және пирролидин сақинасыны ң азот атомының арасында сутек байланыс түзіледі де имид байланыстың конфигурациясын тұрақтандырады. 3. Субстраттың негізгі күйіні ң тұрақсыздануы (имид байланыстың цис-транс-конфигурацияларын тұрақсыздану). Бұл процеске белсенді орталығының құрамына кіретін 37-аспарагин, 82-тирозин қатысады. Имид байланысты ң карбонил тобының және осы қалдықтарының арасындағы стерикалық және электростатикалық өзара әрекеттесуі тұрақсыздануы үшін себеп болады. Жоғары аталған катализдің механизмдері циклофилиндерге, А циклоспоринмен байланысатын белоктарға тән болады. Осы екі топтарына кіретін ақуыздарға тән катализдің механизмы келесі – имид байланыстың валентсіз түрін өзгертеді де жоғары энергетикалық аралық күйінде ферменттің орталығында тұрақтандырады. Парвулиндер катализдейтін цис-транс изомерлеуі ферментпен коваленті байланыс қан аралық қосылысты ң түзілуімен қоссарланып жүреді. 1.3.2 Ақуыз-дисульфидтік изомераза Полипептидтің тізбегінің бүктелу процесін жылдамдататың екінші фермент тиол-дисульфид изомераза алмасу реакцияны катализдейді де ұрыс д дисульфид байланыстардың түзілуін қамтамасыздандырады. Ақуыз-дисульфидтік изомераза – мультифункционалды ақуыз эукариоттарда әртүрлі жасушалалары ның эндоплазмалық тордың (ретикулумының) ішінде жоғары мөлшерде кездеседі, жасуша бөліп шығаратын дисульфидтік көпіршілері бар ақуыздардың бүктелуіне қатысады (мысалы, 19

инсулин, рибонуклеаза, иммуноглобулиндер). Ферментті ң бел сенділігі секреторлы ақуыздардың синтезінің денгейіне тәуелді болады. Ақуыз-дисульфидтік изомеразаның белсенді молекуласы екі ұксас молекулалық салмағы 57 кДа суббірліктерден түрады. Суббірліктер екі доменненқұрылған, домендері тиоредоксин деген белокқа ұқсас. Тиоредоксин – кішкентай белок, молекулалық салмағы 12 кДа, барлық тірі организмдерде, бактериялардан эукариотарға дейін кездеседі. Тиоредоксин тотығу -тотықсыздану потенциалына (редокс-потенуциалы) ие, дисульфид байланыстарының түзілуіне, изомерлеуіне және ыдырауына себепкер ретінде мүмкіндік жасайды. Ақуыз-дисульфид-изомераза изомеразалы қ белсенділігіне байланысты қуыз а молекуласының бүктелу жылдамдығын жоғарлатады. Ақуыз полипептидтік тізбегінің кеңістік құры лымы құрылғанда дұрыс емес түзілген дисульфидтік байланыстарды өте тез ыдырату мен сульфгидрил (SH) топтарын қалпына келтіруіне қатысады. Ақуыз -дисульфид-изомераза ақуыз моле куласында дұрыс дисульфидтік байланыстардың түзілу іне екі жол арқылы көмектеседі.

Белок-дисульфидтік изомераза қызметінің сызбасы

А. Ферменттің белсенді орталығына кіретін SH-тобы ақуыз молекуласының SH-тобының дұрыс тотығуына көмектеседі: 20

- алдымен ферменттің SH -тобы қауыздың SH -тобымен әрекеттеседі де арасында дисульфидтік байланыс түзіледі; сонымен қуыз а молекуласында дұрыс емес S -S байланысты ң түзілуіне кедергі жасайды;. - одан кейін дисульфидтік алмасу реакцияның нәтижесінде ақуыз молекуласының SH-тобы ақуыздың екінші SH -тобымен қажетті байланыс түзеді, ал ферментте SH-тобы босанады. Б. Ақуыз молекуласының дисульфидтік топтарының изо мерленуіне көмектеседі: - алдымен дұрыс емес түзілген дисульфидтік байланыстың ыдырауын іске асыртады да фермент пен ақуыздың SH-тобының арасында дисульфид байланыс түзіледі; - одан кейін қуыз а молекуласында жаңа қажетті дисуль фидтік байланыс түзіледі. Жасушада ақуыз -дисульфидтік изомераза басқа да қызметті атқарады. Гомодимерлы түрінде (β2) ақуыз -дисульфидтік изомераза пролил-4-гидроксилаза тетрамерлы α2β2 кешеннің құрамына кіреді. ұл Б комплекс коллаген молекуласында пролин қалдығының бүйірлік топтарының модификациясын катализдейді. Ақуыз-дисульфидтік изомераза гликозидаза және тригли церид-трансфераза ферментердің құрамына кіреді, шапероналық белсенділігін көрсетеді. Эндоплазмалық тордың құрамына ақуыз-дисульфидтік изомеразадан басқа молекуланың құрылымы тиоредоксин құрылымына ұксас дисульфидтік белсенді орталығы бар көп профилді түқымдас ферменттер кіреді. Екі фермент нативті ақуыздарымен байланысу қабіліттілігін көрсетпейді, олардың субстраттары «балқыған глобулаға» жақын жарым-жартылай жазылған құрылымына ие болады. Фермен тердің көмегімен ақуыздың бүктелу процесі жылдамдайды және дұрыс жол арқылы іске асады. Нәтижесінде аралық формалардың протеолитикалық ыдырау мен агрегациясының жүзеге асу мүмкіншілігі төмендейді. 1.3.3 Шаперондар және шаперониндер Жасушада полипептидтік тізбектің нативті кеңістік құрылымының түзілуіне ферменттерден басқа ерекше ақуыздар көмектеседі. Бұл ақуыздар молекулярлы шапе рондар деп аталады. 21

Шаперондар рибосомадан шы ққан полипептидтік тізбегімен байланысады да оның бүктелу тиімділігін жоғарлатады, дұрыс кеңістік құрылымының түзілуіне жағдай туғызады. Бірінші рет шаперон терминін Р.Ласки менәріптестері 1978 жылы нуклео сомалдарының құрастыру механизмін зерттегенде қолданды. Нуклеосома - ДНҚ мен гистондардан құрылған комплекс. Гистонның 8 молекуласы ядро құрады, ядроның айналасында қосарланған ДНҚ молекуласы орналасады. ДНҚ-гистон комплексі дұрыс түзілу үшін көмекші ақуыз нуклеоплазмин көмектесетінін Ласки мен оның әріптестері анықтады. Нуклеоплазмин ДНҚ-гистон комплексті ң құрамына кірмейді, бірінші рет шаперон деп аталды. Нуклеоплазмин гистондарды ң және ДНҚ молекулалардың дұрыс әрекеттесуіне көмектеседі. Көмекші ақуыздың қатысумен жоғары өсімдіктердің хлоропластарында түзілетін рибулозобисфосфаткарбоксилаза нативті олигомерлы холоферментке бүктеледі. Фермент молекуласы екі суббөліктен құралады. Көмекші ақуыз ферменттің үлкен суббөлігімен аралық валенттік емес комплекс түзеді, одан кейін үлкен суббөлігі екінші суббөлігімен байланысады. Бірақ, жетілген ферменттің құрамына көмекші ақуыз кірмейді. Жарғакшаларда күрделі құрылымдарының ұйымдастыруына және полипептидтік тізбегінің бүктелуіне көмектесетін ерекше ақуыздар қатысатынын Эллис тәжірибе арқылы көрсетті. Көмекші ақуыз дар әртүрлі ақуыздардың түқымдастарына кіреді. Молекулярлы шаперон деп ерекше функционалдықасиеті бар ақуыздардың бүтін бір класын атайды. Эллис бойы «Шаперондар – бұл функционалды өзара байланыспаған ақуыздардың түқымдасы. Шаперондар іn vіvo полипептидтік тізбегі кеңістік құрылымының дұрыс валенттік емес құрылуына көмектеседі, бірақ ұйымдасатын құрылымдардың құрамына кірмейді және ақуыз физиологиялық қызметтіне қатыспайды». Шаперондар жасушада мынадай қызметтер атқарады (4 сурет): - жаңа түзілген полипептидтік тізбекті танып, оның дұрыс ұйымдасу мен кеңістік құрылымының бүктелуін қамтамасыздандырады. ұБл қызметті атқару үшін шаперондар жаңа ақуыздардың дұрыс емес аггрегациясы және молекуланың 22

ішіндегі дұрыс емес әрекеттесуіне қарсы әрекет жасайды, дұрыс емес түзілген байланыстарды әлсіздендіреді; - әртүрлі факторлардың әсерінен ақуыз молекуласының құрылымы өзгергенде, яғни ақуыз денатурацияға ұшырағанда, ақуыздардың рефолдинг процесін бақылайды да көмектеседі; - жасуша ішіндегі органелаларының, митохондриялардың, эндоплазмалық тордың, хлоропластардың, лизосомалардың, жарғақшалары арқылы белоктардың тасымалдануына қатысады. Мысалы, шаперондарды ң көмегімен рефолдинг процеске ұшырамайтын денатурланған ақуыздар лизосомаларға тасымалданады. Жасушалардың органеллаларында қызмет атқаратын ақуыздардың көбісі цитоплазмада түзіледі, ал нативті кеңістік құрылымына органеланың ішінде бүктеледі. Ақуыз молекуласы мембрана арқылы жазылған түрінде ғана өтіп кетеді. Шаперон жарғақшаға жарым-жартылай жазыл ған белокты жеткізеді. Митохондрия матрикснің құрамына өзінің шаперондары кіреді. Жарғақшаны кесіп өтіп кететін полипептидтік тізбегін бұл шаперондар «іліп алады» да жарғақша арқылы «тартып» мито хондрияның ішіне енуін қамтамасыздандырады. Цитоплазмада түзілген ақуыздың эндоплазмалық тордың саңылауына өтіп кетуіне ұқсас механизм арқылы шаперондар көмектеседі. - Кейбір жасушаларда шаперондар ақуызды толық бүктел меген күйінде үстап түрады (аяқталмаған ф олдинг). Мысалы, глюкокортикоидтің рецепторы гормон болмағанда шаперонмен байланысқан күйінде қалады. Ядроның ішіне ақуыздың өтіп кетуіне қажет рецептордың ядролық таңбасы жабылған. Глюкокортикоид рецепторымен байланысқанан кейін шаперон бөлініп кетеді, фолдинг аяқталады, ядролык таңбасы рецептор молекуласының сыртына орналасады. Сондықтаң рецептор ядроның құрамына өтіп кетеді, димерлы формасы түзіледі де ДНҚ-ның бір бөлігімен байланысады. Алғашқы рет шаперон-ақуыздар туралы мәлімет жылыту шок ақуыздарды ң қызметін зерттегенде алынды. Бұл зерттеуді жылыту шок қуыздардың а үш класына кіретін ақуыздармен жүргізді - hsp60, hsp70, hsp90 (hsp – “heat shock proteіn” сөздердің бірінші әріптері, цифрлары - ақуыздардың молекулалық салмағын көрсетеді). Жылыту шок ақуыздар (hsp) табиғатта кең таралған және эукариот пен прокариоттардың жасуша 23

бөліктерінің (компартментерінің) құрамында үнемі кездеседі. Жасуша стресс жағдайына ұшырағанда жылыту шок ақуыздың мөлшері ұлғаяды.

4-сурет. Шаперондардың қызметі ( http://www.distedu.ru сайттан алынған)

Шаперондар синтезіні ң басталу себебі (инициациясы) толық бүктелмеген ақуыздардың мөлшерінің жоғарлауы. Қазіргі күнде молекулярлы шаперондардың тобына жылыту шок ақуыздардан да бас қа ақуыздарды жатқызады. Мысалы, жоғары айтылған жасушалық ядродағы нуклеоплазмин, эндоплазмалық тордың ерекше ақуызы (ТRAP немесе р28). ТRAP ақуыз Тклетка рецепторының СD3-тізбегімен валенттік емес комплексті 24

түзеді. Осы комплекс рецептордың барлық суббірліктері ұйымдасқанша өмір сүреді. Эндоплазмалық тордың басқа ақуызы (88К) жаңа түзілетін тін үйлесімділігі басты комплекстің ауыр тізбегімен аралық комплекс түзейді. Бактериофагтың құйрығы мен басы жиналғанда GroEL/GroЕS ақуыздар қатысады, бірақ белсенді фагтың құрамына кірмейді. Бұл ақуыздарды ат қаратын қызметіне байланысты екі үлкен тұқымдас топқа бөледі – шаперондар және шаперониндер. Шаперон молекулалары көбінесе, бір -екі полипептидтік тізбектен құрылады, шаперониндер қүрделі олигомерлы құрылымдар. Шаперон молекулалары полипептидтік тізбегінің бөліктерімен, байланысады да тізбекті бүктелмеген түрінде ұстап тұрады. Шаперондардың полипептидтік тізбегімен әрекеттесуі ерекшесіз, көбінесе гидрофобты топтарының қатысумен жүзеге асады. Шаперонмен байланысқан полипептидтік тізбегінің жыл жымалылығы жойылған, сондықтан нативті конформациясына бүктелу қабілеттілігі болмайды. Шаперондардың негізгі қызметі жаңа түзілетін полипептидтік тізбекті ерекшесіз аггрегациядан сақтау және басқа «көмекші ақуызға» шаперонинге тапсыру. Ал шаперониннің қызметі - ақуыздың дұрыс бүктелуіне оптималды жағдайын түгызу. Шаперондардың, Нsp70, ақуызбен әрекеттесуі полипептидтік тізбегі рибосомамен байланыс қан уақытта басталады, яғни бұл ко-трансляциялық фолдинг. Нsp70 шаперондардың өкілі – DnаК шаперон, оны ң ко шапероны DnaJ-ақуыз. Бұл шаперондардың көмегімен полипептидтік тізбегінің бүктелуі осылай жүзеге асады. DnаК шаперон рибосомадан шыққан полипептидтік тізбегі нің 7 аминқышқылы қалдығынан құрылған N-соңғы бөлігімен байланысады. Полипептидтік тізбегі 50-60 аминқышқылы қалдығына дейін ұзарғанда тізбекке DnaJ ақуыз байланысады. Бұл ақуыз DnаК-ақуыз комплексті тұрақтандырады да оның АТФ-азалық белсенділігін стимулдейді. Полипептидтік тізбегі ұзаруы бойы тізбегімен басқа DnаК және DnaJ молекулалары байланысады Үш компонентен құрылған комплекс – полипептидтік тізбегі-DnаК- DnaJ – түзілгенен кейін АТФ пен байланысады да АТФ-тың гидролизі жүзеге асырылады. АТФ гидролиздің нәтижесінде түзілген АДФ комплекспен байланысқан 25

түрінде қалады. DnаК-ның полипептидтік тізбегіне байланысатын қабілеттілігі ұлғаяды да тұрақты комплекс түзіледі. Ақуыз молекуласы ақырғы конформациясына бүктелу үшін комплекстен босану керек. Бұл процесс GroE ақуыздық реттегіш фактордың қатысумен жүзеге асады. GroE ақуыздық реттегіш факторы полипептидтік тізбек-DnаК-DnaJ-АДФ комплекстен АДФ-ты шығарады, одан кейін АТФ -тың басқа молекуласы байланысады, полипептидтік тізбегіні ң DnaК -ға ұқсастығы төмендейді де ақуыздың конформациясы өзгереді. Егерде осы конформациялық өзгерістің нәтижесінде ақуыздың нативті кеңістік құрылымы түзілсе, онда полипептидтік тізбегі комплекстен босанады, белсенді ке ңістік құрылымына бүктелмесе, циклдары қайтадан жүзеге асады. Ең жақсы зерттелінген митохондриялардың және E. coli клеткаларының hsp60 шаперониндері 14 суббірліктерінен құрылған (5 сүрет).

5-сүрет. Нsp60 шаперондардың құрылымы (http://www.distedu.ru сайттан алынған)

7 суббірліктенқұрылған бір сақиналы құрылым үстінде, екіншісі астында орналасады. Осылай құрылған цилиндрдің ортасында диаметрі 45 ангстремқуысы – каналы болады. Бұл 26

каналда шаперонинге hsp70 шапероннан көшкен полипептидтік тізбектің бүктелуі жүзеге асады. Пробирка сияқты құрылымды “Анфинсен” ячейкасы” деп атайды. Полипептидтік тізбегіүс т кенен кейін шаперонин молекуласыны ң каналы hsp10-ның 7 суббірлігіненқұрылған ақуыздық сақинамен жабылады. “Пробирка” шайқалады, кейде белсенді ашылып жабылады. Белсенді ашылуүшін АТФ жұмсалады. Ақуыз пробиркаға жабысқан түрінде болады, молекуласы толық дұрыс бүктелгенен кейін ғана босанады да пробиркадан шығады. Полипептидтік тізбегі шаперониндің орталық каналына түскенен кейін жекеленеді де бүктелу процестің баяу кезеңдерінің нәтижесінде нативті белок түзіледі. Сонымен, жасушаның ішінде шаперониндердің көмегімен ақуыздың басқа ақуыздарымен агрегациялануына шекқойылады. Ақуыздың шаперонин дерімен байланысуы ж әне кешеннің ыдырауы шаперониндің АТФ-азалық белсенділігімен реттеледі. Шапероннің олигомерлі молекуласының 14 суббірлігінің әрқайсысы бүктелінетін белокпен әрекеттесуі мүмкін. Ақуыз байланысатын орталықтарының саны ақуыз бүктелу кезеңіне тәуелді. Бүктелу процестің бас тапқы кезеңінде полипептидтік тізбегі шаперонинмен байланысатын учаскілері көп болады, ал нативті құрылымына жақын болған кезеңінде азаяды. Нsp10 шаперонин, ко-шаперонин орталық каналға кіретін есігін жабады, сонымен ұдрыс бүктелмеген және бүктелуі әлі аяқталмаған ақуыздарының шығып кетуін қақпайлайды. Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары

1. Белок инженериясы жетістіктерін пайдаланатын негізгі бағыттары. 2. Қандай процесті ақуыз фолдингі деп атайды? 3. Левинталь парадоксын түсіндіріңдер. 4. Ақуыз фолдинг модельдерін сұрыптап айтыңдар. 5. Ақуыз молекуласы құрылымының деңгейлерін бейнелеп түсіндіріңдер. 6. Полипептидтік тізбегінің бүктелу кезеңдерін сұрыптап айтыңдар. 7. Ко- және посттрансляциялық фолдинг. 8. Фолдинг процеске қатысатын ферменттер, олардың сипаттамасы мен қызметін бейнелеп түсіндіріңдер. 9. Шаперондар, олардың түрлері, құрылымы, қызметі.

27

2. АҚУЫЗ МОЛЕКУЛАСЫНЫҢ КЕҢІСТІК ҚҰРЫЛЫМЫН АНЫҚТАУ ӘДІСТЕРІ

2.1 Рентгенқұрылымдық талдау Биологиялық макромолекулалар тірі организмінде және биотехнологиялық жүйелерде атқаратын қызметінің механизмін түсіну үшін молекулаларының және олардың комплекстерінің атомдық құрылымын білу керек. Бұл білім манызды: • фундаментадық ғылым үшін – тірі табиғатта молекулалық деңгейде іске асатын процестерді түсінуге мүмкіндік береді; • медицина саласында - аурудың пайда болу және даму процестерінің молекулалық негізін түсіну үшін, аурудың диагностикасының тиімділігін жоғарлатады; • фармакалогияда – жаңа потенциалды дәрі препараттарды табуын жеңілдетеді; • өнеркәсіпте – кейбір ферменттердің өндірісінде, мысалы, жуатын ұнтақ құрамына кіретін биологиялық қоспалардың бір жылда алатын мөлшері бірнеше мың тоннаға жетеді; • ақуыздардың биологиялық әсерінің механизмін тусіну үшін және қажет бағытта олардың молекулаларының түрөзгерісін іске асыртуға жол ашады. Биологиялы қ макромолекулаларының (белоктардың, нуклеин қышқылдарының) және олардың кешендерінің атомдық деңгейінде кеңістік құрылымын анықтау үшін пайдаланатын негізгі әдіс рентгенқұрылымдық талдау болады. Рентгенқұрылымдық талдау әдістің көмегімен макромолекулалардың кеңістік құрылымын анықтау өте күрделі және қымбат процесс. Ол мынадай кезеңдерден түрады: 1. ақуызды клондау, бөліп алу және тазалау; 2. таза ақуыздың кристалдарын алу; өте күрделі сатысы және ерекше жағдайларды қажет ету мүмкін, асқын гравитациядан (ультрацентрифугаларда) салмақсыздық жағдайды ( космос станцияларда); 28

3. рентген құрылымдық тәжірибе (алынған мәліметтің көлемі үлкен, 105-107 өлшеу жүргізу керек) және биологиялық молекулалар рентгендік әулелерінің с әсерінен өмір сүретін уақыты қысқарады, сондықтан рентгендік сәулелерінің жоғары қарқындылық көзін «(синхротрон үдеткішті) пайдалану керек, ақырғы жылдарда тәжірибені криогенді (өте төмен) температурада өткізеді. 4. компьютерді қолданып ақуыз құрылымын анықтау, бұл кезеңін іске асырту үшін биохимия, молекулалық биология, нәтижелердің статистикалық өндеу әдісін, белоктың үш өлшемді құрылымын құруға мүмкіндік беретін программалардың интерфейстарын білу керек. Клеткада концентрациясы өмен т ақуыздарды (рецептор ларды, гормондарды, транскрипциялы қ факторларды) зерттегенде бір маңызды жұмыс оларды таза түрінде организмнен бөліп алу. Бұл мәселені шешу тиімді тәсіл зерттейтін ақуызды кодтайтын генді бактерия векторға енгізіп, олардың экспрессиясы қолайлы бактерия штамдарында жүзеге асыру. Вектордың құрамында енгізген генді күшті промотор бақылау керек. Ақуыздар кристалдану үшін оларды жақсы тазарту керек. Қазіргі замаңғы кристалографиялық лабораторияда бірінші кезеңінде кең пайдаланатын әдіс: ақуыздардың сұйық хроматографиясы (FPLC – fast protein liquid chromatography), (АКТА Pharmacia фирманың). Одан кейін ерекше сорбентпен толтыр ған бағана арқылы ақуызды өткізеді. Ақуызды клонданғанда оның соңына гистидин бөлігін қосады. Аффиндіқ хроматография жүзеге асыртқанда ақуызға қосылған гистидин құйрығына ерекше ұқсастығы бар сорбенті пайдаланады. Аффиндік хроматографиядан кейін гель-фильтрацияны іске асыртады. қуыз А қоспаны ұсақ саңылаулы сфералық шайылармен толтырған бағана арқылы өткізеді, ақуыздар молекулалық салмағына тәуелді бөлінеді. Келесі кезеңінде ионалмасу хроматографияны пайдаланады, ақуыздарды жалпы зарядына байланысты бөледі, Таза рекомбинанты қа уыз бар фракцияларды біріктіреді, диа лизге ұшыратады, концентрлейді, глицеринмен араластырады, кішкентай аликвоталарға бөледі де мұздатады, -80о С сақтайды. Ақуыздың тазалығы дәрежесін электрофорез көбінесе полиакриамид гель-электрофорезді немесе жарықтың шашырау әдісті 29

пайдаланып анықтайды. Ақуыз (оның фрагменті) тазарту про цесс барысында немесе протеолиздің әсерінен өзгеріске ұшыра мау керек, бұны масс-спектроскопия әдіспен зерттеп бағалайды. Өзгермеген ақуыз препаратты ғана кристалдану үшін пайдаланады.

Қалампыр шұбарлығы вирусы

Кристалда қалампыр шұбарлығы вирус бөлшектерінің орналасу моделі. Әр бөлшек 180 ұқсас ақуыз молекулаларынан құралған

6-сурет. Кейбір ферменттер мен вирустардың кристалдары (РАН-ның Кристаллография институтынан алынған, Ю.А.Владимиров мақаласының сүреті)

Келесі сатыда қуыздың а үлкен кристаллдарын алады. Қазіргі күнде кристалдану үшін қажет жабдықтарды өндіретін, ерітінділер мен құралдарды жасап шығаратын бірнеше био технологиялық компаниялар бар, соның бірі Hapmton Research. Сондықтан ақуыз кристалдарын алу қарқындады. Қазіргі замаңғы лабораториялардың көбісінде ячейкаларға бөлінген ерекше кристалдану подностарында кристаллдарды өсіреді. Ячейкаларға концентрация мен рН-ы әртүрлі тұздардың ерітін30

ділерін енгізеді. Ең қарапайым, сонымен бірге нәтижесі тиімді кристалдану әдісі аммоний сульфаты мен полиэтиленгликоль скринингі, ерітінділердің рН мен концентрациясы кең спектрін пайдаланады. Кристалдардың мысалдары 6-суретте көрсетілген. Дифракция түралы мәліметі толық алу үшін бірнеше крис талдардың жиынтығын қолданып, рентгенқұрылым талдауын жүзеге асырады. Кейбір кристалдарды ауыр металлдардың атомдарын ерекше үктелерге н енгізіп түрөзгеріске ұшыратады. Ақуыз кристалдарын өте көп уақыттың ішінде өсіреді, кейбір ақуыздардың кристалын алу үшін бірнеше жыл керек. Мысалы, гемоглобин молекуласыны ң толық кеңістік құрылымын анықтау үшін 23 жыл керек болды. Ақуыз кристалдарын зерттеу нәтижесі ақуыздардың субстраттар, тежегіштер, реттегіштер, гормондарәне ж дәрі пре параттарды тану механизмін, ферменттік катализдің жолдарын, электрондарды тасымалдау процестерін, тірі клеткаларда энергия өзгеру м еханизмін т.б. процестерін аны қтауға және түсін діруге мүмкіндік береді. Ақуыз молекуласында атомдарының орналасу ж әне белсенді орталығының қызметі туралы білім қазіргі заманғы молекулалық биология мен протеомиканың негізі, ақуыздық және гендік инженерияның зерттеулерін белгілейді. Фармацевтикалық фирмалар алынған нәтижелерінің негізінде жаңа дәрі препараттарды құрайды. Ақуыздың кристалды препараттары рентгенқұрылым талдау жүргізу үшін пайдаланады. Рентгенқұрылым әдісінің көмегімен белоктың кеңістік құрылымын анықтаудың негізгі қезеңдері 7 суретте к өрсетілген. Рентгенқұрылым әдіс ақуыз кристалы арқылы рентген сәулелерінің өткізу нәтижесінде түзілген дифракциялық суреттің тіркеуіне негізделеді (8-сурет). Кристал-дың құрылымы периодикалық түрінде, сондықтан алынған сурет ақуыздың бір ғана молекуласының суретіне ұқсас келеді. Дифракция суреттің негізінде қуыз а молекуласындағы электрондық тығызының үлестірілу картасын құруы мүмкін, ал картаның негізінде полипептидтік тізбегі қерегісінің және аминқышқылы бүйірл ік топтарының орналасу сипаттамасы анықталады. Рентгенқұрылым талдауын құрамында су молекуласы бар препараттарды зерттегенде пайдалану мүмкін. Кристалл арқылы өткенде электрондар рентгендік сәулелерінің шашырауын жүзеге асыртады. 31

Сә у л е н і ш ы ғ а р у к ө з і Рентген сәуленің қарқындылығын тіркеу Синхротрон үдеткіш (Гренобль қ.)

Рентген эксперименті Б і р і н ш і л өі кң д е у

Құрылымды анықтау

Фазалық мәселе

А лғ а ш қ ы м о д е л ь

Модельді дәлдеу

Модельді депондеу

7-сурет. Рентгенқұрылым әдістің көмегімен ақуыздың кеңістік құрылымын анықтаудың негізгі қезеңдері («Компьютеры и суперкомпьютеры в биологии» кітабынан алынған сурет)

Сондықтан көп электрондары бар үлкен атомдары арқылы өткенде кішкентай атомдарға қарағанда рентгендік сәулелерінің шашырауы күштірек болады. Көміртек (С), азот (N), оттек (О), 32

фосфор (Р) атомдары сутек атомына қарағанда сенімді анық талады. Сондықтан ақуыз молекуласындағы металл атомдары, мысалы гемоглобин молекуласында темір атомы, рентгендік сәулелерінің қарқынды шашырауын жүзеге асырады

8-сүрет. Кристалл арқылы өткенде түзілетін рентген толқындары дифракциясының типтік суреті (М.Членов жұмысынан алынған)

Экперимент нәтижесі зерттейтін үлгінің әсерінен рентген сәулелерінің шашырау қарқынын анықтауға мүмкіндік береді Әдетте бұл – оншақты мың және жүз мыңдай өлшем. Ақуыз құрылымын анықтағанда басқа шашыраңқы сәулелерінің фазалық ығысу мәнін білу керек. Эксперимент арқылы фазалық ығысуын анықтау мүмкін емес. Қазіргі күнде макромолекулалық кристалографияда төмендегідей жолдарды пайдаланып, бұл мәселені шешеді: зерттейтін қуыздардың а изоморфты түрөзгерістерін химиялық әдіспен жүзеге асыртады да қосымша рентген эксперименттерді жүргізеді, ақуыздың құрамына рентген сәуле лерінің аномалды шашырауын іске асыртатын атомдарын енгізеді немесе зерттейтін ақуызға ұқсас ақуыздың құрылымын негізіне алады. Осындай қосымша ақпарат шашыраған сәулелердің фазасының жуық мәнін, одан кейін зерттелетін заттың атомдарының координат мәнін алуға мүмкіндік береді. 33

Рентгенограммаларды молекуланың үш өлшемді құрылы мына айналдыру өте күрделі жұмыс. Тәжірибенің нәтижелері күшті компьютердің көмегімен көптеген уақыттың ішінде жөнделеді. Дифракция нәтижелерін талдау үшін көп түрлі компьютерлік программалар бар. Кристалдың бірінші дифракция суреттің талдауы ақуыздың барлық негізгі параметрлерін анықтауға мүмкіндік береді. Бұл параметрлерге: - айыру, яғни ақырғы құрылымында жеке аминқышқыл дардың орналасуын (9-сурет) немесе екінші реттікқұрылымы ның элементерін ғана көру; - элементар ұяшығында орналасқан ақуыз молекуласының саны және ұяшықтың өлшемі; - кристалда элементар ұяшығының орналасу түрі жатады.

9-сүрет. Электрондық тығыздығының жақсартылғын суреті, аминқышқылдары қалдықтарының орналасуы көрсетілген (М.Членов мақаласынан алынған)

Жұйені толық бағалау үшін дифракциялық суреттің қанша санын алу керек екендігін осы программаны ң көмегімен санайды. Алғашқы электрондық тығыздығын ерекше программаның көмегімен жақсартады. Жалпы суретте жеке аминқышқылдарын және олардың топтарын көруге болады. Ақуыздың бірінші 34

реттік құрылымын енгізеді, компьютер ерекше программаларды көмегімен автоматты бірінші кеңістік құрылымының моделін құрады. Бұл модельде таныған аминқышқылдарды электрондық тығыздығының тиісті фрагментеріне орналастырады. Электрондық тығыздығы картаның сапасына автоматты құрылған модельдің жемісті пайызына және оның айыруына тәуелді. Бұл модельді ақуыз молекуласының «дұрыс» кеңістік құрылымына жеткізу үшін керек уақытты белгілейді. Күшті компьютердің көмегімен мәселе шешіледі. Үлкен макромолекулалық комплестерді рентгенқұрылым әдіспен зертегенде қиындықтар кезде седі, ал биология мен медицина осындай құрылымдардың зерт телуіне көп назар аударады . Миоглобин құрылымын компью тердің көмегімен құрастырғанда алынған сурет төменде беріл ген (10-сурет).

10-сурет. Миоглобин құрылымының компьютерлік бейнеленуі (Ю.А.Владимиров мақаласынан алынған). 1. Атомдары әртүрлі түске боялған кішкентай сфералары түрінде - қызыл – оттек, ақ –көміртек, көк –азот, сары – күкірт. Сутек атомдары рентген толқындарын өте әлсіз шашыратады, сондықтан суретте көрсетілмеген. Ақуыз молекуласының шетінде қызыл сфералар – бұл ақуыз глобуласымен тығыз байланысқан су молекуласының оттек атомдары. 2. – полипептидтік тізбегінің жалпы бағыты. α-спиральді учаскілері қызыл түсімен белгіленген, тізбектің құрылымсыз (неструктурированные) ілгектері – ақ түсті. 3 - лента түрінде спиральді құрылымы. 4 - атомдары Ван-дер-Ваальс радиусті сфера түрінде көрсетілген. 35

2.2 Ядролық магниттік резонанс Ядролық магниттік резонанстық (ЯМР) спектроскопия кішкентай молекулалардың құрылымына талдау жүргізгенде пайдаланылады. Қазіргі күнде ЯМР кішкентай ақуыздар мен ақуыздық домендерінің кеңістік құрылымын талдау үшін қолданады. ЯМР талдауды ақуыздың шамалы концентрлы ерітіндісімен жүргізеді, алдын ала кристалды дайындау қажет емес. Ақуыздың концентрлы ерітіндісін күшті магниттік өрісінің әсеріне ұшыратады. Кейбір атом ядроларының, соның ішінде оттек атом ядро сының магниттік моменті немесе спині болады. ұл Б атомдар ішілік магниттену қабілетіне ие, ұзындық магниттің магниттену қабілетіне ұқсас. Күшті магниттік өрісінде спиндер магниттік индукция сызығы бойы сапқа тұрады, бірақ электромагниттік сәуле шығару радиожиілігі пульстың әсерінен қоздырған реттелмеген күйіне көшу мүмкін. Оттек атомының қоздырған ядросы қалыпты күйіне қайтқанда ол радиожиілігі сәулені шығарады. Бұл сәуле өлшену мүмкін және спектр түрінде көрінеді. Шығатын сәуленің түрі ядроны қоршайтын ортасына тәуелді. Бір қоздырылған ядро жақын орналасқан болса, ол басқа ядро ларының радиацияны жұту және шығаруына әсер етеді. Қосөлшемді ЯМР-дің көмегімен әртүрлі аминқышқылдарының оттек ядроларының сигналдарын айырып тануға және жақын көрші орналасқан оттек ядроларының әсерінен бұл сигналдарының шамалы өзгеруінің шамасын анықтауға мүмкіндік туды. Осын дай өзгеруінің мәні өзара әрекеттесетін оттек атомдарының арасындағы ара қашықтығын бағалау мүмкіндік береді. Сонымен, ақуыз молекуласы бөліктерінің арасындағы ара қашықтығы түралы информацияны ЯМР береді. ЯМР нәтижелері мен полипептидтік тізбегінің аминқышқылы қалдықтарының кезек тесіп орналасуы туралы білімді біріктіріп, ақуыздың үшөлшемді құрылымын есептеп шығару мүмкін. ЯМР-спектроскопия көмегімен молекулалық салма ғы 15000-20000 дальтон кішкентай ақуыздарының құрылымы анықталынады, ал 30000-40000 дальтон ақуыздарының құрылымын зертегенде ықтималдығы төмен болады. 36

Ақуыздардың түрақты құрылымдарына құрылған функционалды домендерінің көбісі кішкентай, ЯМР көмегімен талдау қолайлы. Қиын кристалданатын ақуыздардың кеңістік құрылымын зерттегенде ЯМР-спектроскопия қолайлы әдіс. Мысалы, кейбір ДНҚ-мен байланысып гендерді реттейтін ақуыздарының құрылымы ЯМР әдіспен анықталынған. ЯМР ақуыздардан басқа молекулаларды зерттеу үшін кең пайдалынады, мысалы, гликозилденген ақуыздардың күрделі құрылған көміртек бұтақтарын ЯМР көмегімен зерттейді. 2.3 Ақуыз кеңістік құрылымын компьютермен алдын ала болжау және моделдеу Ақуыз кеңістік құрылымын модельдеу үшін бірнеше әдістер белгілі, соның ішінде: - Белгілі фолдардың қорын пайдаланып ақуыздың фолдың анықтау, (фолд деген сөз – folding, бүктелу, деген агылшын сөзінен шыққан); - атомдарының өзара әрекетесу түралы білімді негізге алып ақуыз глобуласының архитектурасына алдын ала болжам жасау; - ұқсастығының негізінде модельдеу. Модельдейтін ақуыз молекуласының жақын гомологтары белгілі болмаса ке ңістік құрылымын модельдеудің бастапқы қезеңінде фолды анықтап табады. Бұл әдіспен құрылған ақуыз модельдің дәлдігі жеткіліксіз, сондықтан макромолекуланың сонымен бірге құрастырылатын молекулалық жүйенің қызметі нің механизмін зерттеу қиынға түседі. Молекула құрылымын белгілі квантовомеханикалық прин циптерінің негізіне алып, басқа қосымша әдістер мен гомологтарының құрылымы туралы білімді пайдаланбай болжам жасалады. Бұл әдістің де дәлдігі жеткіліксіз. Ақуыз молекуласының үшөлшемді құрылымын алдын ала болжам жасау, ұл б - полипептидтік тізбегінің аминқышқыл дарының кезектесіп орналасуы мен бір немесе бірнеше гомологтарының кеністік құрылымына негізделінген тиімді әдіс. Геномды зерттеу әтижесінде н бірінші реттік құрылымы белгілі ақуыздардың саны (3D) 10 6-ға жуық, ал кеңістік құрылымы (1D) белгілі қуыздардың а саны РВ D ақуыз банкте ~ 104 37

ғана жетеді. Сонымен, бірінші реттік құрылымы белгілі ақуыз дар және кеңістік құрылымы белгілі ақуыздардың ара қатынасы 100 тең, 1D/3D = 100, ғни я бірінші реттік құрылымы белгілі ақуыздардың 1%-нің ғана кеңістік құрылымы анықталған. Бұл ара қатынасы соңғы 5 жыл бір деңгейде ұсталып тұр. Қазіргі замаңғы тәжірибе әдістердің көмегімен ақуыздардың кеңістік құрылымын зерттегенде бірінші реттік құрылымы белгілі ақуыздардың санына жету мүмкіндігі жоқ. Ақуыздың кеңістік құрылымын, фолдинг процестін нәтижесін, теоретикалық тәсілдерді қолданып, компьютерлік әдіспен алдын ала болжам жасап мәселе шешілуі мүмкін. Теоретикалық тәсілдер екі топқа бөлінеді: - фолдинг «de novo», басқа ақуыздардың құрылымы туралы мәліметті пайдаланбайтін тәсіл; - салыстырмалы моделдеу немесе ақуыздардың гомология сын негізіне алып модельдеу. Фолдинг «de novo» ерекше компьютерлік программаларды қолданып жүзеге асырады, мысалы Rosetta, TASSER. Бұл программалар өте күшті компьютерлерді қажет етеді. Қазіргі күнде фолдинг «de novo» әдісті пайдаланып кішкентай (100 аминқышқылы шамасындай қалдықтарынан құралған) ақуыздарының кеңістік құрылымын алдын ала болжам ету мүмкін. Бірақ үлкен ақуыздардың үш өлшемді құрылымын «de novo» тәсілдің көмегімен алдын ала болжам жасау үшін қосымша әдістер мен басқа мәліметтер қажет. Бұл мәселені салыстырмалы моделдеу немесе ақуыздардың гомологиясы негізінде модельдеу тәсілді пайдаланып шешу мүмкін деп санайды. Қазіргі күнде әртүрлі ағзалардың геномында 5 млн астам ақуыздар табылған. Құрылымы анықталған ақуыздарды кеңістік құрылымының 1000 шамасындай типтерін құратын 3500 жуық құрылымдық тұқымдасына бөледі. Егерде екі ақуыздың аминқышқылы қалдықтарының кезек тесіп орналасуы 30%-тен астам ұқсас болса, онда бұл тұқымдас ақуыздар кеңістік құрылымдардың ұқсас болатындығы тәжірибе арқылы анықталынды. Ақуыздардың ұқсастығын олардың кеңістік құрылымын алдын ала болжам жасау үшін салыстырмалы модельдеу, гомологияға негізделінген модельдеу тәсілін негізге алады. 38

Ақуыздың үш өлшемді құрылымын алдын ала болжам ету осылай жүзеге асырылады. Кеңістік құрылымы анықталмаған ақуыздың және кеңістік құрылымы белгілі ақуыздардың полипептидтік тізбегінің құрылымдарын салыстырады да ұқсас ақуызды табады. Одан кейін белгілі кеңістік құрылымын зерттейтін полипептидтік тізбегіне тән болатындығын қарастырады. Егерде таппаса, онда зерттейтін ақуыздың бірізділігінің ерекше бөліктерінің болуын анықтайды. Одан кейін үш өлшемді құрылымының моделін құрады да оның сапасын бағалайды. Ақуыздың аминқышқылы қалдықтарының кезектесіп орналасуын негізіне алғанда оның кеңістік құрылымын алды н ала болжам ету мәселе жеңілдейді. Осыған байланысты биология лық макромолекулаларының құрылымын математикалық модельдеу әдістерімен зерттеу қарқынды дамыды. 15000 астам белоктардың кеңістік құрылымы туралы барлық мәліметті жиналған банкі құрылған. Ам инқышқылдарының кезектесіп орналасуының ұқсастығына негізделінген модельдеу үшін ұқсас ақуыздың атомдық координаттарын кеңістік матрица ретінде пайдалану мүмкін. Аминқышқылы қалдықтарының бүйірлік топтары «компьютерлік мутагенезді ң» көмегімен модельдейтін ақуыздың қалдықтарына ауыстырылады. Одан кейін модель ақуыздың орнықты құрылымы табылады. Ауыздардың кеңістік құрылымын алдын ала болжам етуүшін қажет алгоритм мен програм малардың жасалуына көп назар бөледі. Бұл молекулалық биологияның ең негізгі проблемасы деп саналады. А қуыздың үшөлшемді құрылымын аминқышқылы кезектесіп орналасу негізінде алдын ала болжам етуүмкін м емес, дәл әдістер жасалмаған. Бірақ жүздеген ақуыздардың кеңістік құрылымы туралы тәжірибе әдістерімен анықталған мәліметтер банкына жиналған. Осы мәліметтің негізінде жаңа ақуыздың кеңістік құрылымын алдын ала болжам ету мүмкін. Ұқсастығына негізделінген модельдеу процесі бірнеше сатылардан тұрады (11-сурет). Негізгі сатысықұрылымдық шаблонды іздеу және амин қышқылдары бірізділігін туралануын жүзеге асыру. Алынған модельдің сапасын белгілейтін негізгі факторы - модельдейтін ақуыз пен шаблондың аминқышқылдарының тізімінің ұқсастығының деңгейі. 39

Құрылымы анықталмаған ақуыз

(hMTRIA) модельдің бірізділігі

Бүктелу типін анықтау (шаблон табу)

Модель мен шаблонның а/к бірізділігінің туралуын жүзеге асыру Модель құру (бүйір тізбектер, ілгектер

Модельді оптимизациялау Модель сапасын бағалау

Жарғакша рецептордың құрылымының үшөлшемді моделі

Модельді пайдалану

11-сурет. Адам МТ1 мелатонин рецепторының құрылымын гомология негізінде моделдеу сызбасы (Chugunov A.O. et al мақаласынан алынған)

Құрылымдық ақуыз-шаблонды те ңестіру: кеңістік құрылымы белгілі, модельдейтін ақуызға ұқсас (аминқышқылдардың кезектесіп орналасуының ұқсастығы >30%) ақуыз -шаблонды ақуыз құрылымдардың PDB базада FASTA немесе PSI-BLAST сервердің (немесе олардың аналогтардың) көмегімен табады. Модельдейтін ақуыз және шаблон-ақуыздың аминқышқылы қалдықтарының кезектесіп орналасуының туралауы CLUSTALW сервердің (немесе оның аналогының) көмегімен жүзеге асырылады. Модельді құру – аминқышқылы қалдықтарының құрылған туралуына сәйкес модельдеу ақуыздың (МТ 1 мелатонин рецепторын) аминқышқылы тізбегін шаблондың (көздің родопсині) қанқасына керу. Modeller (оған ұқсас) программа немесе SwissModel (оған ұқсас) сервердің көмегімен модельдеуін жүзеге асырады. ModBase и Swiss-Model Repository онлайн-базаларда 40

Swiss-Prot базаның құрылымдық шаблонын тапқан барлық ақуыздарына автоматты құрылған модельдері жинақталған. Молекулаларымен жүзеге асыратын есеп эксперименттер күшті есеп қуатты керек етеді. Бұл есептерді қазіргі компьютерде бірнеше тәулік және айлар жүзеге асырады. Бұл саласында ең кең таралған молекулалық динамиканы модельдеу әдісі (молекулалық динамика әдісі|). Молекулалық динамика модельдеуі эксперименттік ж әне биомакромолекула ларының құрылымы компьютерлік модельдеу нәтижелерінің негізінде жүзеге асырады. Молекулалық динамиканың классикалық әдісінде молекулалық жүйесі Ньютон тендеуі бойы қозғалатын өзара әрекеттесетін бөлшектермен модельденеді. Ақуыз-нысананың кеңістік құрылымы белгісіз болса салыстырмалы модельдеуәдіст ің әртүрлі жолдары болады. Ақуыздың аминқышқылы кезектесіп орналасуы белгілі болса, оның үшөлшемді моделі осылай құрылады: алдымен кеңістік құрылымы белгілі гомолог ақуыздың аминқышқылы қалдықтарының координаттарына полипептидтік тізбегінің сәйкестіліг і анықта лынады, одан кейінқұрылымының кернеу мүмкіндігін жою үшін ішкі энергияны ең төмен деңгейіне жеткізеді. Келесі сатысында игілі (гибких) учаскілеріні ң орналасуын нақтылы анықтау үшін молекулалық динамика әдістерімен молекуланың жеке бөліктерінің қозғалысын модельдейді. Модельдеу ақуыздың аминқышқылы қалдықтарының кеңістікте орналасуын эксперимент арқылы кеңістік құрылымы анықталған ақуыздар дың белгілі статистикамен салыстырып алынған модельдің сапасын бағалайды. Осы тәсілмен жасалған модельд ері: мысалы, СПИД-ті емдейтін адам иммунотапшылык вирус протеазаларының жаңа тежегіштерін құру үшін, эссенциальды гипертензияны емдеу құралы ретінде ренин тежегішін және гибридті нейротроп факторларын құрастырылғанда тиімді пайланған. 2.4 Ақуыз құрылымын компьютерлік әрлендіру (дизайн) Әрлендіру – бұл жаңа, табиғатта кездеспейтін ақуыз молекулаларын құрастыру. Әрлендірудің мақсаты – ақуыз молекуласына керек кеңістік құрылымын құру үшін жарамды аминқышқылы тізімін құру. 41

Жаңа жасанды ақуыздарды құрастыру ақуыз құрылымдардың теориясына негізделінеді; олардың «құрылымдық блоктары» ретінде іштен үрақты т және тиімді жабысуына қабілеті бар α- және β-учаскілерін қодтайтын аминқышқылдардың бір ізділігі алынады. ХХ ғасырдың 70 -жылдарының аяғымен – 80-жылдардың басында жасанды гендерді әне ж ақуыз тізбектерін химиялық синтезбен алу әсілдер т дамығанан кейін ақуыз әрлендіруге байланысты зерттеулер басталды. 80-жылдардың аяғында – 90жылдардың басында қарапайым ақуыздардың молекулалары жасалды. Жасанды ақуыздардың архитектурасы табиғи белоктардан алынды, бірақ аминқышқылдардың бір ізділігі табиғи ақуыздардың бір ізділігіне ұқсас болмаса да таңдап алған архитектураны түрақтандырады. Ақуыз молекуласын de novo құрастыру – бұл ферменттік белсенділігі және ү шінші реттік құрылымы алдын ала болжам еткен белок глобула ға бүктелінетін, табиғата кездеспейтін аминқышқылының бір ізділігін алу. Макромолекула атомдарының нақты координаттары туралы мәліметті пайдаланбай ақуыз молекуласының алдын ала болжам еткен ерекше ке ңістік құрылымын алу процесті суреттеу үшін "әрлендіру de novo" терминді қолданады. Сонымен бірге белгілі ақуыздарды қайта дан құрастырып , олардың қасиеттері мен биологиялық белсенділігін ба ғыттап өзгерткенде жоғары аталған мүмкіндіктер жемісті пайдаланылады. Қайтадан әрлендіру (редизайн) процесті екі бағытта жүзеге асырады: - қысқа полипептидтік тізбектері табиғи ақуыздардың маңызды қасиеттін сақтайтын мини-ақуыздарды құрастыру; - субстраттық ерекшелігі өзгерген ферменттерді немесе экстремалды жағдайда жоғары түрақтылығына ие ферменттерді (экстремозимдерді) алу. Ақуыз әрлендіруді жемісті жүзеге асыру үшін керек: молекуласының кеңістік құрылымын функционалды күйінде тұрақтандыру, сонымен бірге дұрыс фолдингіне қарсы түратын, түзілуіне мүмкіндігі бар екінші реттік құрылымының барлық альтернативті элементтерін түрақсыздандыру. 42

Табиғата кездеспейтін жаңа ақуыздың компьютерлік әрлендіру полипептидтік тізбегінің қаңқасының координаттарын анықтау мен макромолекулада өзара әрекеттесетін күшті өрістің сызбасының құрастыруынан бастайды. Ақуыз қаңқасы екінші реттікқұрылымының белгілі элементерінің клонотека сын қолданып құрылу мүмкін. Жаңа ақуыз қаңқасының конформациясын таңдап алғанан кейін келесі сатысына керек ке ңістік құрылымына бүктелетін аминқышқылдардың бір ізділігін анықтайды. Бұл кезең кері әрлендіру деп аталады. 20 түрлі 100 аминқышқылдарынан құралған полипептидтің кездейсоқ бір ізділігінін жалпы саны 10130-ға тең. Фолдинг процеске гидрофобты және полярлы аминқышқылдардың бүйірлік топтарының әсері өте жоғары келеді, сондықтан полипептидтік тізбегі бойы алдымен оларды орналастырады. Полипептидтік тізбекке осындай қалдықтардың 5-ін ғана кіргізгенде бір ізділіктін санын 1060 рет төмендетеді, қалған варианттарының саны 1070-ға тең болады. Бұл мәселені бірнеше жолмен шешу мүмкін. Біріншіден. аминқышқылдардың әртүрлі бір ізділігі бір кеңістік құрылымына бүктелу мүмкіншілігі белгілі, сондықтан аминқышқылдардың кезектесіп түрлі орналасуының ішінен біреуін ғана қарастыруға болады. Екіншіден, аминқ ышқылдардың бірізділігін құрастырғанда 20 аминқышқылдардың барлығын пайдаланбайды. Ақуыздың кеңістік құрылымы қалыптасу үшін глобуланың ішінде орналасқан аминқышқылдардың бүйірлік топтарының арасындағы сутек байланыстар мен электростатикалық әрекеттесу ма нызды қызмет атқарады. Сондықтан ақуыз глобуланың ішіндегі әрекеттесулерінің мүмкіншілігін ерекше алгоритмларын қолданып есептеу оптималды бір ізділігін ңдап та алуына көмектеседі. Осыған байланысты мәселені оптималды шешуге мүмкіндік ашатын тиімді алгоритмларын жасау манызды болады. Аминқышқылы қалдықтарының бүйірлік топтарының төртен бірінен азыра ғы ақуыз глобуланың ішінде орналасады, еріткіштермен әрәкеттеспейді. Қалдықтарының қалған 75% -ы ақуыздың негізгі кеңістік құрылымын тұрақтандыруға көмектеседі және альтернативті күйлерін тұрақсыздандырады. Қазіргі күнде полипептидтік тізбегінің еріткіштерімен әрекеттесетін 43

учаскілерін өңдеу процесін автоматтандыруға мүмкіндік ашатын программалар жасалған. Бұл программалардың көмегімен су фазамен әрекеттесетін ақуыздың спиральді учаскілерін және көрші орналас қан аминқышқылдардың бүйірлік топтарының әрекеттесу сипаттамасын алдын ала болжам жасау ға мүмкіндік туды. Әрлендіру de novo пайдалану ақуыздың екінші реттік құрылымының элементтерін немесе олардың жеке домендерін құрастыруға тиімді келеді. Тірі организмдерде қызмет атқаратын белгілі ақуыздардың рационалды кері әрлендіруді жүзеге асыру жемісті болды. Бір тәсілде кеңістік құрылымы жақсы зерттелген ақуыз молекуласында жаңа активті орталықтарын құрады. Мыса лы, бастапқы молекула ретінде инерті қуыз а тиредоксинді алады да алдын ала компьютерлікәрлендіру жүргізіп, оның полипептидтік тізбегіне активтенген эфирлеріні ң гидролизін жүзеге асыруға қабілеттілігі бар жаңа активті орталығын енгізеді. Жалпы бос энергиясы минималды тиредоксинні ң виртуальді түрөзгерген молекулалары құрылады. Биологиялық инерті макромолекулалардың полипептидтік қаңқасының негізінде жаңа қызмет атқаратын жасанды ақуыздарды рационалды редизайн әдіспен жасау оның полипептидтік тізбегінің әртүрлі учаскілеріне бірнеше мутанты аминқышқылы қалдықтарының енгізуін қажет етеді. Полипептидтік тізбегіне бір мутацияны енгізгенде қажет нәтиже алынбайды. Жаңа ақуыз молекуласын бірнеше эксперименттік жол арқылы алады, соның ішінде полипептидтік тізбегінің химиялық синтезі. Бірақ табиғи түрөзгерген ақуыздарды немесе жаңа ақуыздарды алу үшін ең кең қолданатын тәсіл - ақуыздардың in vivo немесе in vitro биосинтезі. Бұл тәсілде алдын ала зерттейтін ақуызды кодтайтын генді құрастырады, генді экспрессияға ұшырататын вектордың құрамында клондайды, одан кейін гендің транскрипциясын және түзілген мРНҚ-ның трансляциясын жүзеге асырады. Бағытталған мутагенездің көмегімен ақуыз молекуласында аминқышқылдарын ауыстырады. Кішкентай ақуыздардың фолдингін модельдеу әдістері жасалған және тәжірибе жүзінде дәлелденген. Сонымен лабораториялық жағдайда ақуыздың бүктелу уақыты және компьютерлік модельде бұл процестін ұзақтығы бірдей болды (12-сурет). 44

12-сурет Ақуыз фолдингін компьютерлік модельдеу. Абцисс осі: in vitro фолдингтің эксперименттік уақыты, ординат осі: in silico модельдеуді жүргізгенде фолдинг уақыты. / http://www.cbio.ru/ Биотехнология : Folding@Home /

Пасаденаның (АҚШ, Калифорния) ақуызға зертеуші инженерлері ақуызды құрастырудың, ең алғашқы болмаса да бірінші болып нағыз тиімді бағдарлармаларын жасады. Олар соңғы екі оңжылдықта тұжырымдалған ақуыз құрылымының жартылай эмпирикалық ережесін анықтап, оларды бірынғай есептеу алгоритміне біріктірді. А қуыз тізб егіндегі аминқышқылдары ның бүйірлік топтарының арасындағы қосарланып әрекеттесуі, сонымен қатар олар мен полипептид қаңқасы арасындағы энергияны есептеу үшін эмпериқалық энергетикалық қызмет деген ұғым пайдаланылады. Осыдан алынған шамалар құрастырылатын ақуыздың екінші және үшінші реттік құрылымдарын оптимизациялау үшін бастапқы мәліметтер ретінде қолданы лады. Оптимизация жүйесі авторлар дәлелдеген теоремаға негізделінген және жүйенің глобалды энергетикалық минимумын іздеуге арналған. Енді жаңа ақуызды жасау үшін (әлі кішкентай ақуызды) программаны енгізіп және қажет мақсатты сұрыптап алу мүм кін. Стефан Мэйо және Бэзил Дахьят 1997 жылы бірінші рет бұл жұмысты жүзеге асырды. Олар алдына: мырыш бармағындағы 45

(мырыш ионымен байланысатын қауыз) бі р учаскінің барлық иілісін қайталайтын құрылымына бүктелетін аминқышқылы бір ізділігін табу қсатын ма қойды. Қойылған мақсат жемісті шешілді. Алдын ала «есептеу» ар қылы құрастырылған полипептид синтезбен алынды, оны ң конформациясы ядролы магниттік резонанс әдіспен көрсетілді, таңдап алынған прототипінің кеңістік құрамына ұқсас. Алынған жасанды ақуыздың артықшылығы мынадай: табиғи ақуыздың құрылымы мырыш ионнымен түрақтанады, ал оның басқа полипептидтен құрастырылған жасанды аналогы мырыш ионың қажет е тпейді. Белгілі ақуыз дардың ішінде басқа компонентерді қажет етпей бірегей үшөлшемді құрылымды өзі құрастыратын, бұл ең кішкентай ақуыз 23 аминқышқылы қалдықтарынан тұрады. Ғалымдар алгоритімін жақсартып оңы әмбебап түрінде жасады. Жақсартқан бағдарламаның көмегімен гипертермофильді, яғни жоғары температураға тұрақты, стрептококктың G белогының бір доменінің аналогын құрды. Эволюция көмегімен пробиркада осындай термофильді ақуызды алу мүмкін емес. Қазіргі күнде 100°С температурада ақуыздардың сүрыптауы н жүргізуге экс перименталды жүйелер әлі жоқ. Әлі өте кішкентай жасанды ақуыздар құрастырылған. Еске алу керек бұл ақуыздардың бірінші реттікқұрылымы бір секунданың ішінде 4 млрд операцияларды жүзеге асыратын компьютерларда есептелінген. Қазіргі күнде бір секундада триллион операцияларды үзеге ж асыратын машиналар бар. Сонды қтан үлкен жасанды ақуыз дарды құрастыру мүмкіншілігі жолға қойылды. Ақуыздың құрылымы мен қызметін аминқышқылдардың бір ізділігінің негізінде анықтау мәселені шешуге ғалымдар көп назар аударады. Егерде компьютердің көмегімен полипептидтің бүктелуін жүзеге асыру мүмкін болса, онда ағзалардың геномын мағыналы анықтау және ақуыздарды кодтайтын нуклеотидтік тексттің мағынасын түсінуге жол ашылады. Бірақ бұл мәселені шешу үшін компьютер лердің күші жеткіліксіз. Қазіргі күндегі ең күшті компьютелер бір аптаның ішінде ақуыздың бүктелу процесінің бірнеше наносекундың (10-9 сек) ғана модельдеу мүмкін, ал ақуыз бірнеше микросекунд – бірнеше секунданың аралығында бүктеледі. Сондықтан бұл мәселені шешу үшін есеп 46

күштерді жоғарлату керек. Қазіргі күнде екі түрлі проект ұсынған. Бірінші проекті 1999 жылы IBM ұсынған. Бұл компания 100 млн доллар жұмсап 5 жылдың ішінде күшті суперкомпью терді құрастырды. Бұл есеп машинаны Blue Gene деп атады, 1 млн процессорлардан құрастырылады, әр процессордың қызмет атқаратын жылдамдығы бір гигафлопқа тең болады, яғни бір секундының ішінде бір миллиард операцияларды жүзеге асырады. Blue Gene-дің жалпы жұмыс өнімділігі бір пентафлоп немесе миллион гигафлоп қа тең болады. Осындай машина қазіргі күндегі Интернеттің материаларын секундтан аз уақыттын ішінде енгізу мүмкін. Екінші проекті Стэнфорд университетінің ғалымдары (Виджея Панде жетекшісі)ұсынды, проекті folding@home деп атады. Бұл проект бойынша милли он үйдегі компьютерлерді біріктіріп ақуыздардың бүктелуін модельдеу жүзеге асыру. Панде тобының ғалымдары алгоритмді жасады. Бұл алгоритм мәселені полипептидтік тізбегінің бір энергетикалық минималды деңгейінен екінші минималды деңгейіне ауысуына байланысты жеке бөліктерге бөледі. Әр сатысындағы есептерді қамтымасыздандыру үшін көптеген компьютерлер параллельді жұмыс атқару керек. Бір компьютерде алынған нәтиже модельдеудің келесі сатысында бастапқы мәлімет ретінде қарастырылады Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары

1. Ақуыздардың кеңістік құрылым әдістердің негізгі принциптері. 2. Ақуыз молекуласының кеңістік құрылымын рентгенқұрылымдық әдіспен анықтаудың негізгі сатылары. 3. ЯМР әдісті сұрыптан айтыңдар. 4. Ақуыз молекуласының аминқышқылы қалдықтарының кезектесіп орналасуын негізіне алып кеңістік құрылымын алдын ала болжам жасау әдісті бейнелеп түсіндіріндер. 5. Ақуыз молекуласының кеңістік құрылымын молекулалық динамика әдіспен модельдеу. 6. Керек ке ңістік құрылымына бүктелетін ақуыз молекуласыны ң аминқышқылы қалдықтарының кезектесіп орналасуын de novo құрастыру.

47

3. АҚУЫЗДЫҢ ХИМИЯЛЫҚ ТҮРӨЗГЕРІСІ. АҚУЫЗ ФУНКЦИОНАЛДЫ ТОПТАРЫНЫҢ ХИМИЯЛЫҚ ТҮРӨЗГЕРІСТІҢ ТИПТІК РЕАКЦИЯЛАРЫ

Ақуыздың химиялық түрөзгерісі – бұл қасиеттері өзгерген ақуыздарды алу тәсілдің бір түрі. Сонымен бірге, химиялық түрөзгерісті: - ақуыздардың құрылымы мен қызметінің өзара байланысын зерттегенде; - ферментердің қайтымсыз тежегіштерін құрғанда; - биотехнологиялық мәселерді шешу үшін ақуыздарды, әсіресе ферменттер мен антиденелерді иммобилдегенде; - ақуыз молекуласының үстінгі сыртының топографиясы мен олардың күрделі құрылымдарда орналасуын зерттегенде пайдаланады. 1966 жылы Л. Полгар мен М.Бендер әнеж К.Ниита мен Д. Кошланд ферменттерді ң қасиеттерін химиялық әдіст ермен өзгертуді алғашқы рет іске асыртқан. К.Ниита мен Д. Кошланд субтилизин белсенді орталығының каталитикалық триадасына кіретін серинқалдығын «химиялық мутагенезді» пайдаланып цистеин қалдығына ауыстырды. Е.Кайзер 1980 жылдың екінші жартысында папаин молекуласына флавин коферментті ң байланыстырып протеиназаны оксидоредуктазаға айналдырды. Қазіргі күнде ақуыз молекулаларының қасиеттерін өзгерту үшін коваленттік және ковалентсіз химиялық түрөзгерістерді кең қолданады. Ақуыздың функционалды топтарының түрөзгерісінің типтік химиялық реакцияларын және осыған байланысты қасиеттерінің өзгеруін қарастырайық.

48

3.1 Химиялық түрөзгеріс көмегімен ферменттің белсенділігін жоғарлату Ферменттер өзінің қызметтін клетка ішіндік жағдайда атқарады, өзгерген ортаның жағдайында олардың белсенділігі төмендейді. Ақуыз инженериясы тәсілдердің көмегімен түрөзгерісті іске асыртып клетка ішіндік ортадан өзгеше жағдайда ферменттердің белсенділігін жоғарлату мүмкін. Мысалы, алкогольдегидрогеназаның лизин қалдықтарын метилпиколинимидаттың көмегімен түрөзгерісін асырады. Өзгерген ферменттің белсенділігі ортада субстраттың жоғары концентрация болғанда 19 рет ұлғайды. Сонымен бірге турөзгерген фермент катализ дейтін реакцияларының кинетикалық сипаттамалары нативті ферментке ұқсастығы анықталынды. Реакция жылдамдығын екі бағытта белгілейтін кезеңі коферменттің диссоциациясы болады, бұл анықталған эффекті түсінуге көмектеседі. Түрөзгерген ферменттің Михаэлис константасы мен тежеу константасы 1523 рет, ал реакция айналым саны нативті ферменткеқарағанда 12-30 рет есе жоғары келеді. Субстрат концентрациясы төмендегенде нативті менүрөзгерген т ферменттердің белсенділігі жақындайды. Тауық балапаны бауырының дигидрофолат-редуктазаны 11 цистеин қалдығымен әрекеттесетін реагенттің әсерімен түрөзгеріске ұшырады. Алынған түрөзгерген ферменттің физиологиялық субстраттары НАДФН пен дигидрофолатты алғанда белсенділігі 5-10 есе рет жоғарылады. Бірақ ферменттің темпе ратураға қарсы тұрақтылығы төмендеді. 3.2 Фермент молекуласының үстінгі бетінің қасиеттерін өзгерту Ақуыздың молекуланың үстіңгі беткі қасиеттерін химиялық түрөзгеріспен өзгерту мүмкін. Бұл түрөзгерістің нәтижесін ақуыздың физико-химиялық қасиеттерінің негізінде алдын ала болжауға болады. Мысалы, түрөзгеріс арқылы молекуланың үстіңгі зарядын кері зарядқа өзгерту немесе толық жою мүмкін, нәтижесінде ферменттің рКа, Км мағынасы, белсенділігі т.б. қасиеттері өзгереді. Белок молекуласының жалпы зарядын өзгерту немесе толық жою үшін келесі типтік реакцияларын пайдаланады: 49

- NH3+ янтарь қышқылының ангидриді -NHСО(CH2)2COO-NH3+ Сірке қышқылының ангидриді NHCOCH3 -COO- этилендиамин CONH(CH2)2NH3+ -COO- метиламин CONHCH3 Химотрипсин рКа-сы 7-ге тең, түрөзгеріс реакциялардың нәтижесінде жалпы заряды өзгерсе, рКа мағынасы өзгереді. Фермент молекуласының оң зарядын теріс зарядқа айналдыр ғанда рКа жоғарлайды, ал теріс зарядын оң зарядына ауысқанда рКа, төмендейді. Сукцинил тобымен байланысқан химотрипсин күрделі эфирдің гидролизін іске асыртқанда жоғарланған Ккатпен және төмендеген К м-мен сипатталады; этилендиаминмен түрөзгерген ферменттің Ккат өзгермейді, ал Км ортаның рН мағынасына тәуелді, нативті химотрипсиннің Км мағынасы ортаның рН-на тәуелсіз. Трипсинді ацетилдеу ферментті ң белсенділігін жоғарлатады. Болжам бойынша күрделі эфирлер мен амидтердің гидролизін жүзеге асырғанда ацилферменттің түзілу жылдамдығы ұлғаяды, нәтижесінде трипсин белсенділігі артады. Ақуыз молекуласының жалпы зарядын реакциялық ортаға катиондарды немесе зарядтал ған топтарын қосып өзгерту мүмкін. Мысалы, пластоцианин – хлоропластарда Р700+-дан электрондарды тасымалдайтын қуыз. а Пластоцианин ортада магний иондары болғанда ғана өзінің қызметтің атқарады, магний иондары қуыздың а карбоксил топтарының теріс зарядын экрандайды. Этилендиаминмен үрөзгерген т ақуыз белсенді келеді, өзінің қызметін тиімді атқарады, сонымен бірге тотығытотықсыздану потенциалы +40мВ-ге жоғарлайды. Термолизин молекуласында 6-7 лизинқалдықтары амино тобының әртүрлі эфирлік топтары бар ұзын тізбекті май қышқылдарымен ацетилденуі ақуыздың температураға қарсы тұрақтылығын жоғарлатады. СН3-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2СН2(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2СН2(СН2)2СН2(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2СН2(СН2)2СН2(СН2)2СН2(СН2)2СО- 50

(1) (2) (3) (4) (5)

Бесінші май қышқылының гидрофобты қасиеті ең жоғары. Бірінші май қышқылыммен түрөзгерген ақуыз қалыпты белсен ділігін (нативті ферментті ң белсенділігінің 90% -тен жоғары) және жоғарлаған жылулық түрақтылығын көрсетеді, ал 5-май қышқылдарының түындылары суда еру қабілеттілігін жоғалтады. Суда еритін полимермен байланыстырғанда ақуыз түрақта нады. Мысалы, аденозиндезаминазаны декстранмен байластырды, түзілген өнімнің белсенділігі төмендеді, нативті ферменттің белсенділігінің 13% -тін ғана көрсетті, сонымен бірге К m жоғарлады, Ккат төмендеді. Бірақ түрөзгерген ферменттің түрақтылығы ұлғаяды, нативті фермент 600-та 1 сағаттың ішінде, ал түрөзгерген фермент 2 сағаттан кейін тежеледі. 3.3 Ферменттің ерекшелігін өзгерту Протеазалар эстеразалық белсенділігін де көрсетеді. А карбоксипептидазаның екі тирозин қалдығының ацетилденуі ферменттің эстеразалық белсенділігін 6 рет үшейтеді, к ал проотеолиттік белсенділігі жойылады. Панкреатик рибонуклеазаны (РНҚаза) әртүрлі химиялық түрөзгерістерге ұшыратып өзгерген ферменттің қасиеттерін зертеді. Нативті фермент мономер, екі тізбекті РНҚ -ның гидролизін қатализдейтін белсенділігі төмен. Панкреатік РНҚ -ның екі молекуласы диметилсуберимидаттың көмегімен тігілді, димерлы формаларының екі тізбекті РНҚ-ға гидролитикалық әсері 78-440 есе жоғары болды. Ферменттің димерін ортаға оның тежегішін, индолилпропион қышқылын қосып алғанда панкреатік РНҚ-аза тағы эстеразалық белсенділігін көрсетеді. Болжам бойынша, эстеразалық бел сенділігінің пайда болу себебі ферменттің әдеттегіден тыс конформациясына тігілуіне байланысты. Тотығу реакцияларды катализдейтін ферменттер айырша жағдайларда өзгерген ерекшелігін көрсетеді. Мысалы, тиол топтарымен әрекеттесетін реагентпен өндегеннен лизинмонооксигеназа катализдейтін реакцияның түрі өзгереді, монооксигеназалық реакцияларға қатыспайды, оксидазалық реакцияларды катализдейді. Моноаминооксидаза түрөзгерістен кейін табиғи субстратқа, тираминге әсерін көрсетпейді, ал гистаминге бағыталған белсенділігі жоғарлайды, яғни ферменттің өзіндік 51

қасиеті өзгереді. Түрөзгерген флавопротеиндегидрогеназаның акцепторлық белсенділігі өзгереді, фермент тотықсыздандаратын қосылыстардың түрлері кенейеді, НАД(Ф +)+ басқа бояғыштарды, оттекті тотықсыздандарады. Бұл ферменттердің түындылары оксидаза ретіндеқызмет атқарады. Глутатионредуктаза GSSG + NADPH + H+ = 2GSH + NADP+ реакцияны катализдейді. Ферменттің лизин қалдықтарын тринитробе нзол-сульфонаттың көмегімен модификацияға ұшыратқанан кейін НАДФН-оксидазалық белсенділігі жарым-жартылай сақталады, ал глутатионредуктазалық белсенділігі толық жоғалады. 3.4 Коферменті қосу Ферменттің пайдалы түрөзгерісі полипептидтік тізбекке коферменті қосқанда жүзеге асады. Әдетте кофермент бос түрінде өмір сүреді. Бұл тұрөзгеріс тәсілді алкогольдегидрогеназа мен НАД аналогын алып зерттеді. Коньюгаттың белсенді орталығына бір кофермент байланысқан, ал оның белсенділігі фермент/еріген кофермент жүйенің белсенділігінің 20% шама сына тең. Осындай тәсілді АДФ/АТФ -, птерин- және фолаттәуелді жүйелерге қолдануға болады. 3.5 Фермент белсенділігінің жаңа түрлері Жаңа белсенділігі бар ферменті оның активті орталығын түрөзгеріске ұшыратуы мүмкін. Мысалы, флавопапаинді алайық. Папаин – каталитикалық белсенді тиол тобы бар өсімдік протеаза. Папаинді бромизоаллоксазинмен түрөзгеріске ұшрат қанда тиол-тобына (SH-тобын) редокс-топ коваленті байланысады. Түрөзгерген папаин протеолитикалық белсенділігін көрсетпейді, ал оксидазды белсенділігіне ие болады. Активті орталығына кіретін цистеин қалдығының алкилдену нәтижесінде түрөзгерген папаин дитиолдар және дигидроникотина мидтердің тотығуын катализдейтін әлсіз белсенділігін көрсетеді. Ақуыздардың әртүрлі топтарының түрөзгерстің нәтижесінде оларда жа ңа қасиеттерінің пайда болуы көрсетілген. Мысалы, миоглобин молекуласының сыртқы бетінде орналасқан гистидин үш қалдығын пентамминрутениймен байланыстырса 52

гемдің аниондарды берік байланыстыратын қабілеттілігі пайда болады. Сонымен бірге гем оттек-тәуелді аскорбат- және дигидрохинон-оксидазды белсенділігін көрсетеді. 3.6 Сусыз (органикалық) ортада қызмет атқару үшін ферменттерді оптимизациялау Биокаталитикалы қ химиялық реакциялардың ортасы ретінде органикалық еріткіштерді пайдалануы су ортада жүретін реакцияларымен салыстырса, өп к артықшылығымен сипатта лады. Соның ішінде, гидрофобты субстраттардың органикалық ортада ерігіштігі ұлғаяды да химиялық реакцияның тепе-тендігі реакцияның өнімі түзілу жағына ығысады. Ферменттердің құрылымын органикалық еріткіштерде зертеу нәтижесінде анықталынды кристалды немесе лиофильді кептірген полипептидтерөзіне ғана тән негізгі ерекшелігін сақтайтындығы анықталды. Монофункционалды реагентердің қатысумен коваленті түрөзгерістің нәтижесінде ақуыз молекуласына жаңа функционалды топты енгізеді, биохимиялы қ қасиетерін өзгертеді, мы салы, органикалық ортада ерігіштігін ұлғайтады. Ферменттер дің түрөзгерісін полиэтиленгликоль қатысуымен кең пайдаланады. Себебі, түрөзгерген ферменттің органикалық еріткіштерде түрақтылығы және биологиялық сұйықтарда өмір сүретін жарты уақыты жоғарлайды. Ферменттерді ауруларды емдегенде дәрі ретінде пайдалануүшін өте маңызды полиэтилен әсерінен макромолекуланың антигендігі әлсізденеді. Белоктардың кова ленттік түрөзгерісін амфифильді (молекуласында гидрофобты және гидрофильды топтары бар) детергентпен полиоксиэтиленлауроил эфирмен іске асыртады. Полиоксиэтиленлауроил эфир қатысумен түрөзгерген каталазаның ерігіштігі абсолютты толуол мен 1,1,1-трихлорэтанда жоғарлайды, белсенділігі 1,1,1трихлорэтанда 200 есе, ал су ортада нативті ферментпен салыстырғанда 15-20 рет жоғары артады. Өзін-өзі бақылау және білімін теқсеру сұрақтары

1. Ақуыздың химиялық түрөзгеріс деп қандай процесті атайды? Қандай мәселі шешу үшін оны пайдаланады?

53

2. Ақуыз инженерияда химиялық түрөзгерісті пайдаланудың қолданбалы бағыттарын сұрыптап айтындар. 3. Ақуыз функционалды топтарының химиялық түрөзгерісінің типтік реакцияларын сұрыптап айтындар. 4. Ақуыз молекуласының сыртқы бетінің қасиеттерін өзгерту үшін пайдаланатын реакцияларды сұрыптап айтындар. 5. Органикалық еріткіштерді ақуыз еріткішін өзгертетін әдістерді бейнелеп атандар.

54

4. АҚУЫЗДАР ЖӘНЕ ПЕПТИДТЕРДІҢ ХИМИЯЛЫҚ СИНТЕЗІ

Пептидтердiң синтезi дегеніміз – химиялық әдiстердi қолдана отырып, аминқышқылдарын бiр -бiрiмен қосып, пептидтiк тiзбекті құру. Синтездеу әдiсiмен алынған пептидтердi олардың құрылым-функциясын зерттеу үшiн кеңiнен қолданады. Биоло гиялық белсендi пептидтердiң аналогтарын және белок молекуласының құрамына кiрмейтiн аминқышқылы қалдықтары бар пептидтерді химиялы қ әдiстер арқылы алуға болады. Ақуыздардың химиялық синтез арқылы алынған пептидтік фрагменттерін олардың антигендік қасиеттерін зерттегенде, полипептидтік тізбегінің бөлек учаскілеріне қарсы ерекше антиденелерді алғанда қолданады. Антиденелерді құрылымдықфункционалды талдау үргізгенде, ж диагностикумдар мен вакциналарды жасағанда пайдаланады. Көптеген медициналық және ауылшаруашылық препараттарды пептидтік синтез әдісті пайдаланып алады, соның ішінде өнеркәсіптік деңгейінде де. Медицина мен ауылшаруашылы қта және ғылыми зерт теулерде кең пайдаланатын биологиялық белсенділігі жоғары заттарды тікелей алу ға пептидтік синтез мүмкіндік береді. Сонымен бірге табиғата кездеспейтін, басқа әдістермен, мысалы гендік инженерияәдістің көмегімен алынбайтын аналог тарын жасау м үмкін. Пептидтік синтездің негізгі қолданбалы мағынасы – көп мөлшерде биологиялық белсенді заттарды және дәрі препараттарды алу. Бұл заттардың тобына гормондар, иммуномодуляторлар, орталық жүйке жүйесіне әсер ететін заттар, диагностикалы қ жиынтықтар, мысалы, СПИД-ті анықтау үшін, кіреді. Алғашқы рет 1953 жылы химиялық синтездеу әдiсiн пайдаланып, биологиялық белсендi екi табиғи пептидтi, окситоцин мен вазопрессинді, В.Дю Виньо деген ғалым алды. Оның

55

әріптестерімен анықтаған окситоцин құрылымы 13-суретте көрсетілген.

13-сурет. Окситоцин құрылымы Дю Виньо бойынша (http://him.1september.ru/2003/06/2.htm/)

Окситоцин молекуласыны ң анықталған құрылымы химиялық синтезін іске асыруәтижесінде н 1954 жылы дәлелденді. Окситоцин - бірінші химиялық синтезі арқылы алынған табиғи пептид. Синтез барысында N-карбобензокси-S-бензилдипептид (I) гептапептидтің триамидімен (II) тетраэтилпирофосфиттың қатысумен кондесациясы іске асады. Пептидтердің амино- мен сульфгидрил топтарын қорғайтын карбобензокси - және бензил топтары кетірілгенен кейін нонапептид үзіледі. т Нонапептидті ауаның әсерімен тотықтырып окситоцин алады (14-сурет). Сонымен полипептидтік гормондың құрылымдық талдауы және химиялық синтезі бірінші рет іске асырылды. Бұл биохимия мен медицинаны ң көрнекті жетістігі. Дю Виньо

56

жұмысы негізінде ғылымда биологиялық белсенді табиғи пептидтердің химиялық синтез заманы басталды.

14-сурет. Окситоцин синтезі сызба түрінде, Дю Виньо бойынша

Он жылдан кейiн, 1963-1965 жылдары инсулин, молекулалық массасы ең төмен ақуыз, химиялық синтез арқылы алынды (Х. Цан, П. Каптсояннис, Я. Кунг). 1963 жылы Р. Швицер мен Зибер 39 аминқышқылы қалдығынан құралған кортикотропин полипептидтiк гормонды синтездедi. 1963-1969 жылдары АҚШта Р. Хиршман әріптестерімен А рибонуклеазаның S-ақуыз деп аталатын бөлiгiн синтездедi Одан кейiн 91 аминқышқылы қалдығынан құралған β-липотропин (Ч. Ли, Д. Ямашито, 1978), 124 аминқышқылы қалдығынан құралған рибонуклеаза А (Х. Яджима, 1980), 61 аминқышқылы қалдығынан құралған ортаазиялық кеңалқым жылан уының нейротоксинi II (В.Т. Иванов пен әріптестері, 1982) және басқа ақуыздар химиялық синтез арқылы алынды. Бұл жетістіктері пептидтік байланыстың құру тиімді әдістерін, амино - мен карбокситоптарыны ң қорғау әдістері мен қорғаныш топтарын және пептидтерді теңестіру әдістерін табу жұмыстарды ынталандырды. Пептидтердің синтезін іске асыртуүшін мынадай заттар қажет: аминқышқылдар, олардың туындылары, қорғаныш

57

топтарын енгізуге және жоюға қажет реагенттер және конден сация реагенттер. Пептидтiң химиялық синтезi үш негізгі сатылардан құрылады: 1) аминқышқылы немесе пептидтiң реакцияға қатыспайтын функционалды топтары ерекше тобымен қоршалады да, қорғаулы аминқышқылдары алынады; 2) бiрiншi компоненттiң (аминқышқылының немесе пептидтiң) белсендi карбоксил тобы екiншi компоненттiң амин тобымен конденсияланады да, пептидтiк байланыс түзiледi; 3) пептидтiң синтезiн жалғастыру немесе бос пептидтi алу үшiн қорғаушы топтардың таңдамалы түрде үзiлiп шығулары жүзеге асырылады. Қолданылатын әдiстемелiк жолға және синтездiң соңғы өнiмінiң сипаттамасына қарай пептидтiк синтез келесi түрлерге бөлiнедi: 1. Классикалық пептидтiк синтез ерiтiндiде өтедi. Бұл пептидтiк синтез екi түрге бөлiнедi: ұзындық пептидтiң сатылы синтезi, пептид тiзбегiне аминқышқылдары С-соңғы жағынан Nсоңына қарай бiр iзбен қосылады; ұзындық пептидтiң блокты синтезi, алдын ала синтезделген пептидтiк фрагменттерден пептид тiзбегiнiң құрылуы iске асады. 2. Полимерлi ұстауышта iске асатын пептид синтезi. Мұндай синтез кезiнде қорғалған амин тобы бар бiрiншi аминқышқылы полимерлi ұстауышпен байланысады. Осыдан кейiн пептид тiзбегiн ұлғайта түседi. Синтездiң соңында жинақталған қажетсiз топтарды бөлiп шығарады да, пептид полимерлi ұстауыштан ажырайды. Ерiмейтiн ұстауышты пайдаланғанда пептид синтезiнiң осы түрi пептидтiк қатты фазалық синтез деп аталады. Қазiргi күнде пептидтiк қатты фазалық синтез толық автоматтандырылған. Еритiн полимерлердi ұстауыш ретiнде алғанда сұйық фазалық пептидтiк синтез iске асады. 3. Бiр немесе екi түрлi аминқышқылы қалдықтарынан құрылған гомо- немесе гетерополиаминқышқылы тiзбегiнің синтезi. Аминқышқылының туындылары (N-карбоксиангидридтерi, т.б.) полимерлену немесе полимерлендiру әдiсi арқылы байланысады да, полипептидтiк тiзбек құрылады. 58

4. Ферменттiк пептидтiк синтез немесе пептидтiң синтезiнiң фермент көмегiмен iске асуы. 5. Пептидтiң жартылай синтезi. Бұл әдiсте пептид синтезi табиғи пептидтiң өзгерiске ұшырауы арқылы жүредi. Мысалы, табиғи пептидтен немесе ақуыздан кiшкентай фрагментi ажыратылып алынады да, жаңа аминқышқылы қалдықтарынан құрылған тiзбек фрагментi құрамына енгiзіледi. 6. Сақиналы пептидтердiң синтезi сызықты полипептидтi әртүрлi әдiстер қолдана отырып сақиналайды. 7. Гетеродетті пептидтердiң синтезi. Мұнда пептид амидті байланыс және басқа байланыстар (күрделi эфирлі, тиоэфирлі, дисульфид байланыстар) арқылы құрылады. 4.1 Пептидтiк синтезінде пайдаланылатын қорғаныш топтар Қорғаныш топтардың екi түрi бар: тұрақты және уақытша. Бүйiрлiк функционалды тобын қорғайтын синтездiң соңғы сатысында бөлiнiп кететін қорғаныш топты тұрақты деп атайды. Уақытша топтар пептидтiк синтезге қатысатын Nα-соңғы амин тобын және С-соңының карбоксил тобын қорғайтын қорғаныш топтар әрбiр сатының алдында үзiлiп шығарылады. Пептидтік синтезiнде қолданылатын қорғаныш топтар төмендегі шарттарға сай болу керек: - химиялық реакцияға қатыспайтын функционалды топтарды толық қоршайды; - басқа қорғаныш топтары үзiлiп шығарылғанда тұрақты; - пептидтiк байланыс түзiлгенде және қорғаныш топ енгiзілгенде немесе үзiлiп шығарылғанда қосымша реакцияларды және аминқышқылы мен пептидтiң рацемизациясын қоздырмайды; - қоршалған туындылары тұрақты және теңестірілетiн қосылыстар; - пептидтiң ерiгiштiгі өзгермейді және реакция қоспасынан пептидтi бөлiп алғанда қиындықтар болмайды. Аминқышқылы немесе пептидтің реакцияға қатыспайтын α-амин тобың реакцияның алдында қорғайды. Бұл қорғаныш 59

тобы пептидтік байланыс түзілгенен кейін пептидтің ыдырауы іске аспайтын ортаның жағдайында үзiлiп шығарылу керек. Қорғаныш топтарының түрлері мен саны көп. Бұның себебі, аминқышылы мен пептидтердің α-амино ж әне карбоксил топтарынан басқа функционалды бүйірлік топтарын да қорғау керек. Біра қ бүйірлік топтарының қорғаныш тобы синтез барысында үзіліп шығарылмайды, ал α-амино тобы пептидтік синтездің жаңа сатысының алдында босану керек. Амин тобының қорғау үшін ең бірінші бензилоксикарбонил тобы (қысқаша белгісі Z) ұсынылған. Аминқышқылы немесе пептидтің құрамына бұл топты ацилдеу реакция арқылы бензилоксикарбонилхлоридтің көмегімен енгізеді. С6Н6СН2-О-СО-Cl + NH2-CH-COOH | СН | (CH3)2 Бензилоксикарбонил- Валин хлорид

C6H6CH2-O-CO-NH-CH-COOH | СН | (CH3)2 Бензилоксикарбонилвалин

Трет-бутоксикарбонил тобын (ВОС)ң қолданады. ке Амино топты өмір к қышқылының моно -трет-бутил эфирдің ангидридімен ацилдейді, трет-бутоксикарбонил тобы қышқыл агенттердің әсерімен үзiлiп шығарылады. Қышқыл реагент ретінде үшфторсірке қышқылы н емесе органикалық ерітінде хлорлы сүтекті пайдаланады. Н3С О О СН3 CH3 O | || || | | || СН3-С – О–С – О– С – О – С – СН3 + NH2 –CH2-COOH → CH2-C-O-C-NH-CH2-COOH

9-флуоренилметилоксикарбонил топты (Fmoc-топты) жиі пайдаланады, аминқышқылы немесе пептид тиісті ангидри дімен әрекеттесу нәтижесінде бұл топ енеді. Әдетте α-карбоксил тобын метил- немесе трет-бутил эфир туындысына айналдырып қорғайды.

60

4.2 Пептидтік байланысты құру әдістері Пептидтер – бұл аминқышқылдарынан түзiлген тізбекті қосылыстар. Екi аминқышылы өзара бiр-бiрімен әрекеттескен кезде су молекуласы бөлiнiп шығады да, пептидтiк байланыс түзiледi:

Екi аминқышқылының өзара әрекеттесуін, реакцияның жоғары жылдамдығы мен шығымын қамтамасыздандыру үшiн карбоксил тобын ″активтендiру″ керек. Карбоксил тобын активтендiру – бұл карбоксил тобы көмiртек атомының электрофильдiк қабiлеттілігiн ұлғайту. Карбоксил тобының активтену дәрежесi Х тобына байланысты: О // → H2N-CH(R)-C \ OH

О // H2N-CH(R)-C \ OX

Пептидтiк синтезінде ең маңызды қосымша реакция ретінде рацемизация реакциясын санайды. Рацемизация – бұл бiр немесе бiрнеше аминқышқылы қалдығының оптикалық белсендiлiгiн толық немесе жартылай жоғалтуы. Рацемизация нәтижесiнде оптикалық бiртектi емес өнiмдер түзiледi. Түзiлген қоспаны бөлу өте қиын. Сондықтан қорғаныш топтарды және конденсация әдiсiн таңдау маңызды мақсат және қатал шек қойылады. Пептидтi синтездiң атауы аминқышқылы карбоксил тобының белсендi туындысының немесе активтендiру үшiн пайдаланылатын қосылыстың атауына байланысты. Негiзгi пептидтiк синтез әдiстерi келесi: - хлорангидрид әдiсi – бiрiншi аминқышқылының карбоксил тобы хлорангидрид туындысы түрiнде екiншi аминқышқылымен реакцияласады да, арасында пептидтiк байланыс түзiледi: 61

Бұл әдiсті сирек пайдаланады, себебi пептид рацемат түрiнде және қосымша өнiмдер түзiледi. - Азид әдiсi – бiрiншi аминқышқылының карбоксил тобының азид туындысы екiншi аминқышқылының амин тобымен әрекеттеседі де пептидтiк байланыс түзіледi:

Түзiлген пептидтiң рацемизациясы өте төмен, қосымша реакция - Курциус қайта топтасуы. - Активтендірілген эфир әдісі –

62

- Карбодиимид әдісі – ацилденген аминқышқылы карбо диимид тобымен (–N=C=N-) әрекеттеседі де О -ацилнесепнәр түзіледі. Белсенді аминқышқылы немесе пептидтің туындысы аминқышқылы амино тобымен әрекеттеседі, реакцияның нәтижесінде пептид және несепнәрдің туындысы түзіледі.

- Карбоксиангидрид әдісі – бұл әдісті пайдаланғанда пептидтің синтезі С-соңғы жағынан N-соңына қарай жүргізілді. Осы әдіспен Р. Хиршман рибонуклеазаның S -белоғының синтезін жүзеге асырды.

1963 жылы Р.Меррифилд қатты фазалық пептидтiк синтез әдiсiн ұсынды. Әдiстің принципі - полипептидтiк тiзбектің синтезi оның полимерлi ерiмейтiн ұстауышымен байланысқан кезде жүзеге асырылады (15-сурет). Бұл әдiстiң артықшылығы мынадай: аралық өнiмдер полимердi шаю және сүзу әдiсiн қолдану арқылы алынады, ерiтiндiде жүргiзiлетiн пептидтiк синтезге қарағанда аралық өнiмдердiң алынуы жеңiлiрек келеді, пептидтiң ерiмеушiлiгi 63

кедергi болмайды да, пептидтiк синтез процесiн автоматтандыруға мүмкiндiк туды. Мұндай синтез кезiнде қатты ұстауыш полистиролдық шайырдың ион алмастырушы тобымен карбоксил тобы арқылы қоршаған бос амин тобы бар бiрiншi аминқышқылы байланысады. Осыдан кейiн шайыр арқылы аминқышқылдарын ерiтiндiмен өткiзе отырып, пептид тiзбегiн ұлғайта түседi. Синтездiң соңында жинақталған қажетсiз топтарды бөлiп шығарады да, пептидтi қатты ұстауыштан ажыратады. Қатты фазалық пептидтiк синтездің қезеңдері төменде схема түрінде көрсетілген. 1. Белсенді тобы бар полимерді алу

2. Бірінші (С-соңғы) N-қоршалған аминқышқылын қосу (қоспаларды кетіру үшін жуу)

3. N-қоршау топтарын кетіру (Вос, Ddz т.б.), мысалы, CF3COOH/CH2Cl2

4. Екінші N-қоршалған аминқышқылымен конденсациясы (мысалы, DСС)

5. Тізбекті ұзарту (сатылары қайталанады)

Пептидті полимерден бөліп алу, қоршау топтарын кетіру және тазарту

15-cурет.Пептидтердің қатты фазалық синтезі (Ю. Овчинников кітабынан алынған)

Барлық химиялық реакциялар толық өтедi, себебi N-шеткi аминқышқылымен конденцияланатын агенттiң концентрациясы 64

артық. Процестiң аралық кезеңдерiнде өте жақсы тазартылған реагенттер мен ерiткiштердi қолдану керек. Меррифилд бiрiншi рет қатты фазалық синтезді қолданып брадикинин деген гормонды алды, пептидтің жалпы шығымы 70%-ке жетті. Автоматтандырылған қатты фазалық пептидтiк синтез синтезатор деп аталатын ерекше құралда жүзеге асырылды. Қатты фазалық пептидтік синтездiң бiр кемшiлiгi – полипептидтiк тiзбек ұлғая бергенде полимердiң iсiну дәрежесi өзгередi де, полипептидтiк тiзбектің соңғы NH2-топтары бүркелу мүмкiн, сондықтан бiр сатысында реакция толық өтпейдi. Нәтижесiнде пептидтiң тiзбегiнде кейбiр аминқышқылдары байланыспай түсiп қалады да, дұрыс емес пептидтер түзiледi. Синтездiң соңғы сатысында пептидтердiң қоспасының болуы өте қиынға соғады. Қатты фазалық синтез арқылы қысқа пептидтер мен кейбір қуыздарды: а соның ішінде, жеткілікті мөл шерде инсулин, бас қа пептидтік гормондарын, мысалы, балықтың кальцийтонинің (32 аминқышқылы қалдығы), эпителий өсу факторын (53 амин қышқылы қалдығы), 3 -интерлейкинді (140 аминқышқылы қалдығы), адам лейкоциттік α1- мен α2-интерферондарын және олардың аналогтарын, трипсиннің панкреатік тежегішін алады. Пептидтік тізбегі 99 қышқылдардан амин құралған адамның иммунотапшылық вирустың протеиназаның синтезі жүзеге асырылды, оны ақуыздың кеңістік құрылымын анықтау үшін пайдаланды. Сұйық фазалық пептидтiк синтезде ұстауыш ретiнде ерiгiш полимерлерді, мысалы, полистиролды пайдаланады (16-сурет). Реагенттiң артығын органикалық ерiтiндiден полимердi тұндыру арқылы кетiредi де, ерiтiндiнi сүзедi.Сұйық фазалық пептидтiк синтез арқылы шағын пептидтердi синтездеу үшiн автоматикалық синтезаторлардың кейбiр түрлерi құрылды.

65

16-сурет. Пептидтердің сұйық фазалық синтезі (Ю.Овчинников кітабынан алынған)

4.3 Ақуыздар және пептидтердiң ферменттiк синтезi Алғашқы рет 1937 жылы М.Бергман, Г.Френкель-Конрат және Дж.Фрутон протеолиттiк реакцияны керi жүргiзу арқылы пептидтiк байланыстың түзiлу мүмкiндiгiн ұсынған. Бiрақ бiрiншi ферменттiк пептидтiк синтез жақында ғана iске асырылды. Протеолиттiк ферменттер – химотрипсин, папаин, термолизин, т.б. ерекше буфер ерiтiндiлерде, көбiнесе су-органикалық қоспаларда, аминқышқылдарының арасында пептидтiк байланыстың түзiлуiн катализдеу мүмкiн екенi анықталды. Фермент катализдейтiн гидролиз-аминолиз реакциясын сызба түрiнде былай көрсетуге болады: 66

Пептид-СООН + Н2N-пептид

Аминолиз Гидролиз

СО- НN-пептид

Сулы ортада гидролиз-аминолиз реакциясының тепе-теңдiгi гидролиз жағына ығысады. Реакция жағдайын (термодинамикалық, кинетикалық параметрлерiн) белгiлi бiр мақсат үшiн өзгерткенде, реакцияның тепе-теңдiгi синтез жағына ауысуы мүмкiн. Мысал үшiн, Ас-Phe-Ala-NH2 пептидтiң синтезiне химотрипсин әсерiнiң нәтижесiн қарастырайық. Химотрипсин ароматты қышқылдардың карбоксил топтары түзетiн амидтi және күрделi эфирлi байланыстарды үзiп тастайтыны белгiлi. Реакцияның аралық сатысында ацилфермент түзiледi. Содан кейiн ацилфермент судың әсерiмен, су нуклеофил ретiнде, деацилденедi. Басқа нуклеофилдер, мысалы, аминқышқылдары, оның амидтерi және пептидтерi болса, онда гидролиздiң де, аминолиздiң де өнiмдерiн алуға болады. Гидролиз және аминолиз реакциялары жылдамдығының константаларының арақатынасы реакция бағытын белгiлейдi және нуклеофилдiң концентрациясына тәуелдi. Ортаның рН-ы 10,0, ал RNH2(Ala-NH2) концентрациясы 1 М-ға тең болғанда, пептидтiң шығу дәрежесi 95%-ға жететiнi белгiлендi. Пептидтердің ферменттік синтезі өнеркәсіпте, мысалы, 200 рет қанттан тәтті аспартам деген заттың өнеркәсібінде пайдалынады. Бензилоксикарбонил-L-аспарагин қышқылы мен Lфенилаланиннің метил эфирнің к онцентрленген ерітіндісінде металлопротеиназа, мысалы, термолизин, пептидтік байланыстың түзілуін катализдейді. Түзілген өнімдің ерігіштігі өте төмен, сондықтан тұнбаға шөгеді. Өнімдің осы төмен ерігіштігі оны реакция ортадан шы ғарыда да тепе -теңдікті синтез бағытына ығыстырады. Реакция нәтижесінде L-аспартил- L-фенилаланиннің метил эфирі түзіледі, бұл зат аспартам деп аталады Пептидтердің жарым-жартылай трансформациялары іске асырылған, мысалы, В-тізбегіндегі С-соңғы аланин қалдығын треонин қалдығына ауыстыру нәтижесінде шошқа инсулинін адам инсулиніне айналдырылған. Ферменттің қатысумен шошқа инсулиннің В-тізбегінен аланинүзіліп шығарылып, треонин 67

қосылды. Реакция ортасына карбоксил тобы қоршаған треонин мөлшері жоғары болу керек. Ферменттiк пептидтiң синтезi мынадай артықшылықтарға ие: реакцияның жылдамдығы жоғары, қорғаныш топтардың саны өте төмен, қосылыстардың реакция барысында рацемизациясы болмайды. Бiрақ гидролиз, транспептидация сияқты қосымша реакциялар нәтижесінде күрделi реакция өнiмдерiнiң қоспасы түзiлуі мүмкiн. 4.4 Ақуыздар және пептидтердiң жартылай синтезi Жартылай синтез (семисинтез)әдiсінде табиғи пептидтер, ақуыздар немесе олардың фрагменттерi мен химиялық синтезбен алынған пептидтердің не түрөзгерген табиғи заттардың арасында қосылулар жүредi. Жартылай синтез – табиғи қосылыстардың түрөзгеруіне негiзделген тәсіл. Ақуыздың құрылымдық химиясында белгiлi ферменттiк және химиялық әдiстердi қолдана отырып, пептидтiк тiзбекті ыдыратады, түзiлген фрагменттердi хроматография әдiсі арқылы бөлiп алады, нәтижесiнде гомогендi пептидтердiң блоктары алынады. Керек фрагменттiң әртүрлi әдiстерді қолданып түрөзгері сін жүзеге асырады (қысқартады, ұзартады, жаңа аминқышқылы қалдықтарын кiргiзеді, т.б.). Содан соң пептидтік блоктардан өзгерген полипептидтiк тiзбектiң жаңа түрi құрылады пептидтерге қ орғаныш топтарды енгізгенен кейін түзiлген туындылары су және су-органикалық ерітiндiлерде ерiгiштiк қабілетін сақтау керек. Даярланған пептидтiк блоктардан керектi полипептидтiк тiзбектi құрғанда көбiнесе азид және активтенген эфир әдiстерiн қолданады, сонымен бірге пептидтің рацемизациясына басты назар аударады. Жартылай синтез әдiсiн қолданып жаңа пептид немесе жаңа ақуыз алу процесiн көрсету үшiн инсулиндi мысал ретiнде келтiруге болады. Адамның және шошқаның инсулин молекула ларында бiрғана айырмашылық бар. Шошқа инсулинінiң молекуласында ғы В полипептидтiк тiзбектің 30-аминқышқылы – аланин, ал адамның инсулинiнде – треонин. Алғ аш рет 1972 жылда шош қа инсулинi адам инсулинiне айналдырылды (М.Руттенберг), шы ғымы – 10%. 68

1980-1983 жылдары шошқа инсулинін адам инсулиніне ферменттік айналдыру үшін екі тәсіл ұсынылды (К. Морихара, Дж. Маркуссен). 1983 жылы адам инсулинiн шошқа инсулинiнен алу үшiн өнеркәсiптiк әдiс жолға қойылды. Бұл тәсiлде шошқа инсулинiнiң гидролизi ү шiн иммобилденген Achromobacter lyticusдан алынған протеиназа 1 қолданылды. Содан соң түзiлген дез-Ala В-30 инсулин Thr-Obut-пептидпен конденсияланды (Т. Ока). Осы әдісті қолдана отырып цитохром с, миоглобин, рибонуклеаза, соматотропин, протеиназа тежегіші, ферредоксин, гемоглобиннің А тізбегінің және көптеген басқа ақуыздар мен биологиялық белсенді пептидтердің аналогтары алынды. Аналогтарының көмегімен ақуызда рдың құрылымы туралы, ақуыздың қызметінің жеке бөліктері мен аминқыш қылы қалдықтарымен өзара байланысы туралы манызды мәлімет алынды. Ақуыздарының жартылай синитезінің бір тәсілінде пептидтерді протеолиттік ферменттердің қатысумен тігеді. Протеолиттік реакция кері бағытта жүзеге асу үшін реакцияның жағдайын өзгертіп аралық өнім ретінде түзілетін пептидил-ферменттің комплестің аминолизі оның гидролитикалық ыдырауынан артығырақ болады. Реакция қоспасына органикалық еріткіштерді, глицерин, диметидформамид немесе ацетонитрил сия қты еріт кіштерді қосып қажетті жағдайды іске асыртады. Реакциялық қоспада екінші пептид болғанда аминолиздің нәтижесінде амидтік байланыс түзіледі де ол комплекстің пептидімен байланысады. Пептидтерді папаинмен, трипсинмен және субтилизинімен қері протеолиздің көмегімен ұштастырды. Осы тәсілді пайдаланып, ферменттерді ң қатысумен бірізділікпен олиго сахаридтер мен полипептидтерді бірге тігіп (лигирование) ерекше ақуыздардың гликозилденген туындыларын алу мүмкіндік туады, мысалы гликозилденген В рибонуклеазаны. Гендіинженериялық әдістің көмегімен протеолитік ферменттердің активті орталықтарын өзгертіп, олардың пептидтерді тігу қабі летілігі ұлғайтылды. Соның ішінде Д.Джексон әріптестерімен 1994 жылы субтилизиннің қос мутанттың алды. Бұл мутант субтилигаза деп аталды, жоғары протеинлигазалық белсенділі гін көрсетті. Ферменттің активті орталығында Ser —> Cys және Pro —> Ala орынбасуы іске асырылды. Фермент серинді 69

цистеинге ауыстырғанда С -соңы гликолат-фенилаланил-амидті тобымен этерификацияланған пептидтің әсерінен ацилдеу қабілетің көрсетеді. Пролинді аланинге ауыстыру бірінші мутацияның теріс стериялық әсерін жояды және ферментпептид аралық тиоэфирлік комплекстің аминолизін күшейтеді. Аминолиз процесс екінші пептидті ң N -соңғы амино тобы қатысумен жүзеге асады. Аминолизмен қосарланып, екі пептид пептидтік байланыс арқылы қосылады. Субтилигаза бірнеше ақуыздар мен циклдық пептидтердің синтезіне пайдалынған. Соның ішінде субтилигаза қатысуымен нативті рибонуклеазаның синтезі іске асырылды. Оффород пен К. Роуз ақуыздардың жартылай синтезі стратегиясын жетілдірді.Ғалымдар синтетиқалық және рекомби нанты пептидтерді бірге тігуүшін гидразон мен оксимдердің химиясын қолданды. Гранулоциттердің түрөзгерген колоний стимулдейтін факторын (G-CSF) жартылай синтезбен алды. Алдымен рекомбинанты фактордың Lys-Ser байланыстардың ерекше протеолизін жүзеге асырды да полипептидтік тізбегінің фрагменттерін алды. Пептидтердің N-соңын периодаттың көмегімен альдегид топтарына дейін тоты қтырды, ал С-сондарын кері протеолиздің көмегімен гидразидтерге айналдырды. Алынған туындылары өзара жеңіл әрекеттеседі де ұзындығы 174 аминқышқылы қалдықтары, биологиялық белсенді бастапқы полипептид түзіледі. Пептидтік фрагментерін химиялық синтез арқылы алынған және түрөзгерген аминқышқылы бар жасанды пептидтерге ауыстыруға болады. Гидразон мен оксимдерге негізделген әсіл т универсалды. Пептидтердің N - және Ссоңдарының түрөзгерісі табиғи ақуыздардың бүйірлік топтары қандай болса да жүзеге асырылу мүмкін және ерекше қорғауын керек қылмайды. Тәсілдің осы артықшылығы ақуыздардың химиялық синтезін женілдетеді, сондықтан қазіргі замаңғы бір топ әдістердің негізі ретінді алынды. Бұл әдістер химиялық синтезбен алынған ақуыздардың байланыстыруы (лигирование, expressed protein ligation, EPL, 1998 г.) деп аталды. EPLәдістер ақуыздар мен пептидтердің сайт-ерекше түрөзгерісін жүзеге асыруын, соның ішінде ақуыз молекуласының протеолитік немесе химиялық гидролиздің нәтижесінде алынған полипеп тидтік тізбектеріні ң фра гментерінің біріктіруіне мүмкіндік 70

жасайды. EPL өмегімен к белок молекуласының құрамына табиғи емес аминқышқылы қалдықтарын енгізіп түрөзгерген полипептидтік тізбектерін алу ға мүмкіндік береді. EPL әдіс химиялық синтез немесе рекомбинанты ДНҚ технологияны пайдаланып алынған полипептидтердің өзара ковалентік байланыстыру нәтижесіне керек түрөзгерген ақуыз өнімінің түзілуіне негізделінген. Біріктіретін полипептидтік тізбектеріні ң сондарына реакцияға қабілеті бар топтарды енгізіп, олардың су және физиологиялық рН ортада өзара әрекеттесуінің нәтижесінде ковалентік байланыстың түзілуін қамтамасыздандырады. EPL әдісті полипептидтердің толық химиялық синтез әдіспен салыстырғанда артықшылығын көруге болады. Ақуыз молекуласының бөлігінің көбісінің синтезі рибосомада жүзеге асырылады. Одан кейін полипептидтік тізбегіні ң фрагменттері химиялық синтезбен алынған пептидтермен тігіледі Полипептидтік тізбегінің қысқа бөліктерінің кез келген бағытталған өзгерістерін іске асырту мүмкін, сонымен ақуыз қызметі мен бөліктерінің құрылымының өзара байланысын анықтайды. Химиялық синтез арқылы алынған полипептидтік тізбегінің учаскілеріне әртүрлі функционалды топтарды, соның ішінде трансляция процесінде полипептидтік тізбегіне қосылмайтын аминқышқылдардың аналогтарын енгізуге болады. Сондықтан EPL әдістің көмегімен ақуыз молекуласына әртүрлі молеку лалық зондтарды, соның ішінде флуорохромдар мен түрақты изотоптарды сайт-ерекше енгізді. ұл Б күрделі ақуыздар мен макромолекулалық комплекстердің құрылымды-функционалды арақатынасын тиімді зерттеугеүмкіндік м ашты. EPL әдіс жоғары молекулалық салмағы бар ақуыздардың туындыларын алуға мүмкіндік береді. Қазіргі күнде басқа әдістерімен бұл мәселе шешілмейді. Соның ішінде EPL әдістің көмегімен Е. Coli РНК-полимеразаның 3'-суббөлігінің түрөзгерген туындысы алынды, полипептидтік тізбегі 1407 амин қышықылы қалдығы нан құралған. EPL әдістің көмегімен прокариот пен эукариото организм дердің оңшақты ақуыздары зерттелінген. Бұл ақуыздарының тізіміне: киназалар, фосфатазалар, транскрипция факторлары, РНҚ-полимеразалар, цитоплазмалық хабарды тасымалдануына 71

қатысатын ақуыздар, иондық каналдарды құратын ақуыздар, рецепторлар мен антиденелер кіреді. 4.5 Циклопептидтердiң синтезi Циклдiк пептидтердi алу үшiн амидтiк байланыстарды түзетiн әдеттегi пептидтiк синтез әдiстерiн қолданады. Алдымен, сызықты ізашары қорғалған пептид түрiнде синтезделінедi, одан кейiн С-соңындағы карбоксил тобы активтендiредi, N-соңындағы амин тобын босатады да, активтенген карбоксил тобы мен бос амин тобының арасында аминолиз реакциясы жүзеге асырылады. Қосымша молекулааралық аминолиз реакциясы өтуі мүмкiн. Бұл реакция полимерлi ө нiмдердің түзiлуiне әкеледі, оның салдарынан циклоолигомерлер түзiледi. Молекулааралық аминолиз реакциясының деңгейiн төмендету үшiн реакцияны оқшау ерiткiштерде жоғары сұйытылған жағдайда жүргізедi. Реакция нәтижесiнде циклдiк өнiмдердiң шығымы түзiлген циклдiң кернеулiгiне, бүйiрлiк топтарының тармақтылығына, термодинамикалық және конформациялық параметрлерге тәуелдi. 4.6 Гетеродет пептидтердiң синтезi Гетеродет пептидтер деп молекуласында амидтiк байланыстар мен байланыстардың басқа түрлерi болған қосылыстарды атайды. Гетеродет пептидтер тобына: депсипептидтер, құрамында гидроксиқышқылдар немесе гидроксиаминқышқылдары бар пептидтер; S-пептидтер, қалдықтары арасында тиоэфир байланысы бар пептидтер; (S-S)-пептидтер – молекуласында дисульфид байланысы бар пептидтер; гликопептидтер, N- немесе О-гликозид байланысы бар пептидтер, т.б. қосылыстар жатады (S-S)-пептидтер. Пептидтегi және ақуыздағы цистеин қалдықтары дисульфидтiк байланыстарды түзедi. Бұл дисульфидтiк байланыс бiр полипептидтің екі бөлігін немесе екi полипептидтi байланыстырады. Сызықты және циклдiк (S-S)-пептидтер түзілу мүмкін. Дисульфидтiк байланыстардың түзiлуi синтездiң ең соңғы сатысында жүзеге асырылады. Тиол тобы бар пептидтерде қолайлы тотықтырғыш әсерiмен дисульфидтiк байланыс түзiледi. 72

S-пептидтер (тиодепсипептидтер). Цистеин қалдығы бар пептидтердiң меркаптотоптары аминқышқылы туындыларымен ацилденедi, реакцияның өнiмi тиодепсипептидтер деп аталады. S-пептидтерге лантионин немесеβ -метиллантионинi бар пептидтер (антибиотик низин, субтилизин, дурамицин, циннамицин) жатады. S-пептидтерді активтенген аминқышқылдарының туындыларын қолданып алады. Депсипептидтер – гидроксиқышқылдардың қалдығы бар табиғи қосылыстар. Қышқыл қалдықтары амидтi және күрделi эфирлiк байланыс арқылы байланыстырылған. Депсипептидтер синтездеу үшiн, алдымен, күрделi эфирлiк байланыстарды түзедi, содан соң түзiлген блоктарды амидтiк байланыс арқылы байланыстырады. Депсипептидтерге валомицин, энниатиндер, антибиотиктер, т.б. аналогтар жатады. Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары

1. Ақуыз және пептидтерді химиялық синтезбен алу әдістің жалпы сызбасы, негізгі кезеңдері. 2. Пептидтердің химиялық синтездің әдістері, әр әдістің артықшылықтары мен қиыншылықтары. 3. Пептидтік синтезде пайдаланатын амино әне ж карбоксил топтары ның қорғаныс топтары. 4. Ақуыздар мен пептидтердің химиялық синтездің мысалдары. 5. Пептидтік синтезде пайдаланатын қорғаныш топта рдың алдына қоятын талаптары. 6. Пептидтік байланысты ферменттік емес әдіспен құру. 7. Ақуыз және пептидтерді қатты фазалық синтезбен алу әдістің негізгі сатылары. 8. Ақуыз және пептидтерді сұйық фазалық синтезбен алу әдісінің негізгі сатылары. 9. Протеолиттік ферменттерді пептидтік синтезде пайдалану жолдары (мүмкіндігі). 10. Ақуызды комбирленген әдіспен синтездеу, оның қолдану мүмкіншілігі. 11. Ақуыз және пептидтерді химиялық синтез арқылы алу мысалдары

73

5. БАҒЫТАЛҒАН МУТАГЕНЕЗ ЖӘНЕ АҚУЫЗДАРДЫҢ ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯСЫ

Жаңа керек қасиеті бар ақуызды алу үшін мутанты генді қолданады. Әдеттегі мутагенездің көмегімен құрылымдық геннің бір нуклеотидтің ауыстырады да геннің мутанты түрін, одан кейін өзгерген ақуызды алады. Бірақ әдеттегі мутагенезді пайдаланғанда мутанты ақуыздардың өте көп түрлері түзіледі. Сондықтан, мутагенезден кейін сұрыптау жүргізеді де мутанты ақуыздардың қоспасынан белгілі қасиеті бар ақуызды табады. Сонымен бірге бұл тәсіл өте сирек табиғи ақуыздың қасиеттін жақсартуға әкеледі. Себебі, ақуыз молекуласында аминқышқылдардың көбісін ауыстырғанда ферменттің белсенділігі төмендейді. Ерекше қасиеті бар ақуыздарды құру үшін мынадай тәсілді пайдалану тиімді болады. Ақуызды кодтайтын генді бөліп алады да клондайды, одан кейін генні ң құрам ын ерекше әдіс арқылы өзгертеді. Өзгерген геннің негізінде алғашқы ақуызда жоқ жаңа қасиетті бар ақуызды алу мүмкін. Ақуыздың қасиетін өзгерту маңызын келесі мысалдардан көруге болады. - Ферменттің бір маңызды сипаттамасы – Михаэлис-Ментен константасы (Кm). Михаэлис-Ментен константасы ферментті ң субстратпен байланысу беріктігін ж әне ерекше жағдайда суб страттын өнімге айналатын максималды жылдамдығын сипат тайды. Михаэлис-Ментен константасынөзгертіп, реакцияның жалпы каталитикалық тийімділігін ұлғайту мүмкін (Vmax/Km). - Кейбір "табиғи" ақуыздар температураның немесе рН-тың өте санаулы (тар) дипазонында белсенді келеді. Ақуызды өзгертіп, оның оптималды температура немесе рН-тың дипазонын кеңейтсе "табиғи" ақуыз тежелетін өнеркәсіптік жағдайда пайдалануға болады.

74

- Сусыз ерігіштерде қызмет атқару мүмкіндігі бар ақуызды жасаса, физиологиялық емес жағдайда каталитикалық реакцияларды жүзеге асыру мүмкін. - Кейбір ақуыздар өзінің қызметін кофактормен байланыс қанда ғана атқарады. Ақуыз өзгерткенен кейін кофакторсыз қызмет атқаратын болса, оны кейбір үздіксіз өнеркәсіпті процестерде пайдалануға болады. - Ферменттің белсенді орталығын өзгертіп, оның ерекшелігін ұлғайту, ал ұнамсыз, қосымша реакциялардын санын төмендету мүмкін. - Жасуша протеазаларының әсері не ақуыздың тұрақтылы ғын жоғарлатып таза күйінде алу процедурасын жеңілдетіп таза ақуыздың шығымын жоғарлатуға болады. - Ферменттің аллостериялық реттелуін өзгертіп, оның метаболиттердің әсерінен тежелу дәріжесін төмендетуге және өнімдің шығымын ұлғайту мүмкін. 5.1 Бағытталған мутагенез: методикасы Ақуыздардың қасиеттері молекуланың конформациясына тәуелді, ал конформациясы аминқышқылдарының қалдықтарының кезектесумен (бірінші реттік құрылымен) белгіленеді. Аминқышқылдарының құрамына өзгерістер енгізіп, жа ңа қасиеті немесе қасиеті өзгерген ақуызды алуға болады. Өзгерістерді ақуыз молекуласын құрамына немесе оны кодтайтын геннің құрамына енгізеді. Ақуыз молекуласының химиялық түрөзгерістің ерекшелігі жоғары, бірақ алынған жаңа ақуыз препараттың әрқайсысын химиялық түрөзгеріске ұшырату керек. Сондықтан ақуызды кодтайтын генді клондау және өзгерту, алынған геннің экспресиясы нәтижесінде жаңа қасиетті бар ақуызды алу, яғни екінші әдістің тиімділігі жоғары. Бұл әдісті пайдаланғанда ақуыз препараттардың барлығы өзгерген түрінде алынады. Керек қасиеттері (физикалық, кинетикалық немесе химия лық) бар ақуызды алу үшін "табиғи" ақуыз молекуласында қай аминқышқылы қалдығын немесе аминқышқылы тізбегінің қандай бөлігін өзгерту керектігі көбінесе белгілі болмайды. Полипептид тізбегіндегі қышқылы амин қалдықтарының 75

кезектесіп орналасуын негізге ала отырып компьютерді ң көме гімен ақуыздың қажетті касиеті қай аминқышқылына тәуелді болатындығын алдын ала болжауға мүмкін береді. Бұл керек қасиеті бар ақуызды құру процедураны жеңілдетеді. Қазіргі күнде клонданған гендердің құрамына жаңа генетикалық мәліметті енгізу үшін ерекше әдістерді пайдаланады. Бағытталған мутагенезбен ақуызды кодтайтын ДНҚ-ның бөлігіне, геннің құрамына ерекше мутацияны енгізеді. Мутант ты ДНҚ-ның негізінде алынған ақуыздың полипептидтік тізбегінде өзгеріс пайда болады. Одан кейін өзгерген ақуыз керек қасиетін көрсетеді ме зерттеп анықтайды. Бағытталған мутагенезді жүргізу алдында қай аминқышқылы қалдығы өзгергенде ақуызда қажет қасиеті пайда болатынын анықтау керек. Кеңістік құрылымы белгілі ақуыз молекуласының ауыстыратың аминқышқылын теңестіру жеңілірек. (Ақуыздың кеңістік құрылымын рентгенқұрылымдық талдау немесе ерекше аналитикалық әдістерді қолданып анықтайды). Бірақ ақуыздардың көбісінің кеңістік құрылымы әлі белгілі емес. Сондықтан бағытталған мутагенезбен мутанты гендердің тобын жасайды. Мутанты гендерді ң экспресиясын асыртып ақуыздарды алады да олардың қасиеттерін зерттейді. Сонымен қай аминқышқылының өзгеруі керек қасиетіне әкеледі, мысалы, қандай аминқышқылының өзгеруі ақуыздың биологиялық белсенділігін ұлғайтатынын не төмендететінін анықтайды. Клонданған гендердің бағытталған мутагенезді әртүрлі эксперименталды әдістермен жүргізеді. Бір әдісте клонданған геннің ерекше сайттың құрамына өзгеріс енгізеді, екінші әдіс арқылы клонданған генде қысқа бөлігін кездейсоқ өзгертеді де түзілген мутанты ақуыздардың ішінен биологиялық керек белсенділігі бар ақуызды таңдап алады. 5.1.1 М13 фагтың ДНҚ -ның негізінде олигонуклеотид бағытталған мутагенез Олигонуклеотид ба ғытталған (сайт -ерекше) мутагенез клонданған гендердің құрамына нүктелік мутацияларды енгізудің ең қарапайым әдісі деп саналады (17-сурет). Мутагенезді жүзеге асыру үшін: мРНҚ -кодонға сәйкес, өзгеріске ұшырайтын ДНҚ-ның бөлігінің нақты нуклеотидтік тізбегін; аминқышқылдарды ауыстыру өзгешілігін білу керек. 76

Әдетте М13 бактериофагты негізіне алып, екі тізбекті вектордың формасына нысана-генді енгізеді. Алдымен вектордың біртізбекті формасын (М13 + тізбегін) бөліп алады да жасанды олигонуклеотидпен қосып араластырады. Бұл жасанды олигонуклеотидтің бір ғана нуклеотиді өзгеше, басқалары клонданған геннің керек сегментіне комплементарлы болады. Осы жасанды олигонуклеотидтің комплементарлы емес нуклеотиді мРНҚ -ның кодонында өзгертуге ұшырайтын нуклеотидке сәйкес келеді. Олигонуклеотид бағытталған мутагенездің мысалы 17-суретте өкрсетілген. Бұл мысалда, изолейцинді кодтайтын кодоны лейцин кодонына ауыстырылған. М-13 плюс векторды жасанды олигонуклеотидпен араластырады. Жасанды олигонуклеотид клонданған геннің компле ментарлы учаскісімен будандасуүшін: 1) қосылған олигонук леотидтің мөлшері М-13 ДН Қ -ның мөлшерінен анағұрлым артады; 2) қосарланбайтын нуклеотид олигонуклеотидтің орта сында орналасады; 3) «отжиг» процесті ортаның температурасы төмен, иондық күші жоғары жағдайда жүргізеді. ДНҚ синтезі басталу үшін қосарланған олигонуклеотидтің 3' -соңы бастапқы олигонуклеотидтік негізі (затравка) ретінде, ал М13 ДН Қ -ның тізбегі матрица ретіндеқызмет атқарады. E.colі І ДНҚ -полимеразаның Кленов фрагменттің көмегімен репликация жүзеге асады, ортада өрт т түрлі дезоксирибонуклеозидүшфосфаттар болу қажет. Түзілген тізбек ақырғы нуклеотидтің затравканың 5'-соңына қосылуы Т4 фагтың ДНҚ-лигазаның көмегімен іске асады. М13 (плюс-тізбегі) фагтың нысана гені бар бір тізбекті ДНҚ-ны жасанды комплементарлы олигонуклеотидпенқосады. Бұл жасанды олигонуклеотидте бір нуклеотид алғашқы ДНҚның сайма-сай негізге комплементарлы болмайды. Олигонуклеотид ДНҚ-ның синтезі үшін бастапқы бөлігі («затравка») ретінде, ал енгізген гені бар М13-вектор матрица ретінде қызмет атқарады. Репликацияны E.colі 1 ДНҚ-полимеразаның Кленов фрагменті катализдейді. Толы қ түзілген тізбекті Т4 ДНҚ-лигаза ферментті ң көмегімен сақинаға тұйықтайды. Түзілген екі тізбекті ДНҚ молекулаларын трансформациясын E.colі-ға жүзеге асады. Фаг бөлшектерінің жартысы ДНҚ-ның жабай түріне, ал екінші жартысы мутанты ДНҚ-ға ие болады. 77

М13 ДНҚ-ның плюс-тізбігі

Қосарланбаған нуклеотид Кленов фрагменті, dNTP

Түзілген тізбек

E.coli трансформация Түйіндақтың түзілуі

М13 ДНҚ-ның плюс-тізбегі

17-cурет. Олигонуклетид бағытталған мутагенез (Пастернак пен Глик кітабынан алынған)

Бірақ ДНҚ синтезі іn vіtro жағдайда соңына дейін өте сирек жүреді. Сондықтан сахароза градиенттің пайдаланып центрифугтеу әдіс арқылы жарым -жартылай екі тізбекті молекулаларды қалыпты молекулаларынан бөледі. Комплементарлы емес нуклеотидтері бар М13 ңфагты толық екі тізбекті ДНҚ молекулаларын Е.сolі клеткаларына енгізеді де трансформациясын іске асыртады. Е.сolі клеткаларда фагтың бөлшектері түзіледі, бұл клетканың лизисіне және түйіндақтың түзілуіне әкеледі. Репликация процесі жартылай консервативті механизм қылы ар жү зеге асады, сонды қтан түзілген фаг бөлшектерінің жартысында ДНҚ-ның "жабай" түрі, ал жартысында ерекше өзгерген нуклеотидті бар мутанты ДНҚ 78

болады. Мутанты гені бар бөлшектерін ерекше жағдайда ДНҚ гибридизация әдіс пайдаланып теңестіреді. Зонд ретінде б астапқы олигонуклеотидті пайдаланады. Мутанты генді кесіп алады да экспрессияланатың E.colі -вектордың құрамына енгізеді. Мутанты ақуыздың синтезін E.colі-да іске асыртады, содан соң ақуызды бөліп алып тазартады. Мутанты ДНҚ-сы бар фаг өблшектерінің мөлше рі 50%-тен төмен, 1-5% ғана. Мутанты фагтың шығымын ұлғайту үшін олигонуклеотид бағытталған мутагенез әдісті модификация ұшыратты. Модификацияны ң бір тәсілі сызба түрінде 18-суретте к өрсетілген. М13 фаг ДНҚ-ның репликативті формасы

Клонданған ген

E.colidut ung штамдың трансформациясы

Олигонуклеотидті қосу

Екінші тізбектін синтезі

Т4 ДНҚ-лигаза. E.coli жабай түрінің трансформациясы

Мутанты формасы ыдырамайды

18-сурет. Е. сoli dut ung штамды ң трансформациясы ар қылыМ13 мутанты фагтың шығымын жоғарлату (Пастернак пен Глик кітабынан алынған)

79

М13 фаг ДНҚ -ның екі тізбекті репликативті түріне нысанагенді енгізеді, алынған молекулаларын Е. сolі dut ung штамға енгізеді. Dut мутация клеткада ғы dUTP мөлшерін ұлға йтады, нәтижесінде ДНҚ құрамына dUTP қалдықтары енеді. Ung мутация ДНҚ -ның құрамында dUTP қалдықтарының бөлмауын жүзеге асырады. Нысана-гені бар М13 фагтың екі тізбекті ДНҚ Е. Сolі жабай үт ріне енгізеді. Жабай түрінде Ung геннің өнімі (урацил-N-гликозилаза) бастап қы тізбектен урацил қалдық тарын бөліп жояды да бұл тізбек ыдырап кетеді. Мутанты тізбегінде урацил жоқ, сондықтан ол ыдырамайды. Осы тізбек ДНҚ репликация үшін үшін матрица ретінде қызмет атқарады, нәтижесінде мутанты гені бар фаг бөлшектерінің мөлшері көбейеді. Мутацияға ұшырататын гені бар М13-векторды мутанты E.colі штаммына енгізеді. E.colі-клеткаларының ДНҚ алмасуына қатысатын екі ферменті дефекті. Бір фермент – dUTP-пирофосфатазаның мутантты түрі (duf). Клеткаларда dUTP-пирофосфатаза белсенді емес, сонды қтан dUTP мөлшері жөғары, нәтижесінде репликация процесс жүзеге асырылғанда ДНҚ молекуласына бірнеше dТTP қалдықтарының орына dUTP қалдықтары енеді. Екінші фермент – дефекті урацил-Мгликозилаза (ung). Белсенді урацил-М-гликозилаза болмаған да ДНҚ-ның құрамына кездейсоқ енген dUTP-қалдықтары бөлініп кетпейді. Осындай E.colі клеткаларда түзілген М13 бір тізбекті ДНҚ-ның құрамында тимидин қалдықтарының 1% жуық уридин қалдықтарына ауысқан. Комплементарлы емес азоттық негізі бар олигонуклеотидті урацил қалдығы бар М13 ДНҚ -мен қосады да іn vіtro жағдайда екінші тізбекті құрады. Функционалды ung гені бар E.colі клеткалар ға екі тізбекті ДНҚ -ны енгізеді. E.colі клеткаларының белсенді урацил - N-гликозилазасы М13 ДНҚ -дан уридин қалдықтарын жойып жі береді (18сурет), бастапқы матрицалық М13 ыдырайды да одан ары репликацияға мутанты тізбегі ғана түседі. Мутанты тізбекте dUTP қалдықтары болмайды. Нәтижесінде мутанты гені бар фаг бөлшектерінің шығымы ұлғаяды.

80

5.1.2 Плазмидалы қ ДНҚ-ны пайдаланатын олигонуклеотид бағытталған мутагенез М13 фагты қолданатын олигонуклеотид бағытталған мута генездің негізгі кемшілігі - өте көп кезеңі. Сондықтан керек геннің мутанты түрін алғанда өте көп уақыт кетеді. Мутанты генді алуүшін плазмидалық ДНҚ -ға негізделген тәсілдер жасалған. Бұл тәсілдерде генді плазмидадан фаг ДНҚ-ға, мутагенез біткенен кейінқайта плазмидаға тасымалдау кезеңі керек емес. Әдістің бір жолында ДНҚ -ны тетрациклинге қарсы тұрақтылығын белгілейтін белсенді гені және ампициленге қарсы тұрақтылығын белгілейтін белсенді емес гені бар плазмидалық вектордың құрамына енгізеді. Ампициленге қарсы тұрақтылығын белгілейтін геннің ортасында бір нуклеотиді ауыстырылған (19-сурет). Нысана-ДНҚ-сы бар векторды E.colі клеткаларына енгізеді. Екі тізбекті плазмидалық ДНҚ-ны сілті әсерімен денатурлайды да біртізбекті сақиналы молекулаларын алады. 3 түрлі олиго нуклеотидтерді пайдаланып денатурланған ДНҚ -ның ренатурациясын (отжигін) үжргізеді. Бір олигонуклеотид клонданған нысана-ДНҚ-ның құрамына өзгеріс енгізеді, екінші олигонуклеотид ампицилинге ұрақты т геннің мутациясын жояды, ал үшінші олигонуклеотид тетрациклинге қарсы тұрақты геннің бір нуклеотидтің өзгертеді (ауыстырады), нәтижесінде геннің белсенділігі жойылады. Реакциялық ортаға 4 дезоксирибонуклеозидүшфосфаттарды, Т4 фагтын ДНҚ -полимеразасын қосады. Т4 ДНҚ-полимеразаны ң қызметі E.colі І ДНҚ-полимеразаны ң Кленов фрагментінің қызметіне ұқсас. Гибридизацияланған олигонуклеотидтер ДНҚ синтезі үшін бастапқы олигонуклеотид ретінде, ал нативті сақиналы ДНҚ молекуласы – матрица ретінде қызмет атқарады. Түзілген жаңа тізбегінде біртізбектегі үзілген жерлері Т4 ДНҚ-лигазаның көмегімен тігіледі. Реакцияның өнімін E.colі клеткаларға енгізеді. Трансформантар ампицилинге қарсы тұрақтылығына және тетрациклинге қарсы сезімшілігіне байланысты жіктеледі. Трансформантарды ң 90% -тен жуығы клонданган генді ң құрамында ерекше мутациясы болады. Қалған трансформантарда клонданған гені өзгермейді. Мутанты клонданған гені бар клеткаларды гибридизация әдіс пайдаланып теңестіреді. 81

Нысана-ген

Векторға нысана-генді енгізу Нысана-ген

Денатурация Олигонуклеотидті қосу «Мутанты» олигонуклеотид

Нысана-ген

ДНҚ синтезі Трансформация Сұрыптау Мутанты нысана-ген

19-сурет. Плазмидалық ДНҚ пайдаланып олигобағытталынған мутагенез (Пастернак пен Глик кітабынан алынған) 82

Қлонданған генді өзгерту үшін пайдаланатын олигонуклеотидтен басқа олигонуклеотидтер, плазмидалар, штамдар, фер менттер әжне буферлер е рекше жиынтықтардың құрамына кіреді,. Бұл жиынтықтарды сатып алуға болады. 5.1.3 ПЦР-амплификацияны пайдаланатын олигонуклеотид-бағытталған мутагенез Полимеразалық тізбекті реакцияларымен қосарланған сайтбағытталған мутагенезді пайдаланып мутанты гендерді көп мөлшерде аз уақыттын ішінде алу мүмкін. Бұл әдістің бір варианты 20-суретте көрсетілген. Плазмидалық векторға нысана генді енгізеді, алын ған препаратты екі пробиркаға салады. Пробирканың әрқайсысына екі ерекше праймерлерді, бірінші пробиркаға 1 және 2 праймерлерді, екінші пробирка ға 3 және 4 праймерлердіқосады. Бұл праймерлер ПЦР реакцияны жүргізу үшін қажет. 2 мен 4 праймерлер клонданған геннің бір бөлігіне немесе осы бөлігіне көрші орналасқан тізбекке толық комплементарлы. 1 мен 3 праймерлер басқа генге комплементарлы, бірақ құрамында комплементарлы емес бір нуклеотид болады және әртүрлі полинуклеотидтік тізбектерімен гибриди зациясы (будандастыруы) жүзеге асады, нәтижесінде бір белгілі жұптың екі нуклеотиді ауысады. Әртүрлі пробиркаларда түзілетін ПЦР-өнімдерінің сондары өзгеше, бұл 1 мен 2 праймерлердің және 3 мен 4 праймерлердің гибридизацияға түсетін сайттар орналасатын орындарының айырмашылығына байланысты. ПЦР біткенен кейін екі пробиркада ғы өнімдерді қосады да денатурация, одан кейін ренатурация процестерді іске асырады. Екі пробиркадағы амплификацияға ұшыраған ДНҚ молекула ларының сондарының әртүрлілігіне байланысты біртізбекті ДНҚ- лары ассоцияланады да са қиналы молекулалар түзіледі. Біртізбекті молекуланың ренатурация процесінің нә тижесінде сызықты молекулалары түзіледі. E.colі клеткаларда плазмида түрінде сақиналы молекулалары ғана сақталады. Сақиналы молекулалары ғана тұқым қуалау қабілетіне ие және барлық молекулаларында сайт-ерекше мутациясы болады. Сонымен, ПЦР-амплификацияны пайдаланып олигобағытталған мутаге нездің көмегімен клонданған геннін құрамына нүктелік мутациялар енгізіледі. 83

Бір өзгеше нуклеотиді бар праймер

Белгілер Праймер Бірізділігі Нысана Бастапқы нуклеотид

Бастапқы нуклеотид

Қосарланбаған нуклеотид

1-тізбек 4-тізбек 2-тізбек

3-тізбек

Амплифициянланған тізбекті ДНҚ Алғашқы н уклеотидтің орынын басқан нуклеотид

Денатурация, ренатурация

1-тізбек

4-тізбек 3-тізбек 3-тізбек үзіліс

үзіліс

үзіліс Бір тізбегінде үзіліс және өзгерген нуклеотидтік жұбы бар сақиналы ДНҚ

үзіліс E.coli трансформациясы

Бір тізбегінде үзіліс және өзгерген нуклеотидтік жұбы бар сақиналы ДНҚ

Мутанты плазмидалар

20-сурет. ПЦР-амплификацияны пайдаланып олигобағытталған мутагенез (Пастернак пен Глик кітабынан алынған) .

5.1.4 Аз ғынданған олигонуклеотидтік праймерлерді пайдалананатын кездейсоқ мутагенез Жаңа қасиетті бар ақуызды алу үшін клонданған геннің құрамында қандай нуклеотидті басқа нуклеотидке ауыстыру көбінесе белгілі болмайды. Сондықтан бір нуклеотидтік сайттың әртүрлі әдістерді пайдаланып өзгертеді. Мысалы, бір сайтта әртүрлі нуклеотидтері бар олигонуклеотидтік праймерлерді 84

синтездейді. Әдетте осындай «азғынданған» олигонуклеотид терді ДНҚ -ның автоматтык синтезаторына белгілі бір кезеңде, тізбекке ерекше нуклеотид қосылатын уақытта басқа үш нуклеотидтерді аз мөлшерде (бірнеше процент) қосып алады. Нәтижесінде бір сайтта айырмашылығы бар олигонуклеотид праймерлерінің жиынтығы түзіледі. Праймерлердің көмегімен ерекше сайтында бір нуклеотиді ауыстырыл ған мутанты нысанагендердің жиынтығын алады. Бұл әдістің екі артықшылығы бар: 1) ақуыз қызметті атқару үшін әр аминқышқылдарының рөлі туралы білмеуге болады; 2) кездейсо қ жаңа биологиялық манызды қасиеті бар ақуызды синтездеу мүмкін, себебі сайттың құрамын өзгерткенде әртүрлі аминқышқылдарының алмасуы жүзеге асады. Бірақ түзілген ақуыздардың біреуі де қажет қасиетіне ие болмаса, онда жүмысты басынан бастау керек, геннің басқа бөлігіне комплементарлы "азғындаған" праймерлерінің жаңа жиынтығын синтездеу керек. Нысана-геннің құрамына жарым-жартылай аз ғынданған олигонуклеотидтерді әртүрлі әдістерді пайдаланып енгізеді. Мысалы, плазмиданың екі ерекше рестрикция сайттарының ортасына генді енгізеді, одан кейін бірнеше ПЦР-дің көмегімен сол мен ңо жағында орналасқан фрагм ентердің амплификациясын жүргізеді. Сол жағындағы фрагменттің амплификациясына пайдала натын екі праймерлердің құрамына толық комплементарлы емес олигонуклеотид және әдеттегі толық комплементарлы праймер кіреді. Толық комплементарлы емес олигонуклеотид ны санагеннің ауыр тізбегімен қосарланады, ал толық комплементарлы олигонуклеотид жеңіл тізбектің бөлігімен будандасады. Сол жағындағы рестрикцияның бірегей сайты сонғы (фланкирующий) болады. Оң жағындағы фрагменттің амплификациясына пайдаланатын бір праймердің құрамына комплементарлы емес нуклеотидтер кіреді, бұл праймер нысана-геннің ауыр тізбегімен қосарланады. Екінші праймер жеңіл тізбегінің бөлігіне толық комплементарлы, екінші бірегей рестрикция сайтты ң соңын аяқтайды (фланкирует). ПЦР-амплификацияның өнімдерін таза күйінде бөліп алады, біріктіреді, денатурлайды да ренатурлайды. Н әтижесінде нысана -геннің бөлігінде ДНҚ-ның екі тізбекті молекулалары үзіледі. т ДНҚ -полимераза өкмегімен 85

қосарланған екі тізбектің түзілуін аяқтайды одан кейін ПЦРамплификацияны жүргізеді. Амплификация үшін молекуланың екі соңыңа (3' - және 5'-соңына) комплементарлы екі праймерлерді пайдаланады. Амплификацияға түскен молекулаларға екі рестрикция нуклеазалармен әсер етеді, одан кейін сәйкес плазмиданың векторының құрамына енгізеді. Осы әдіс арқылы кездейсоқ мутациялары бар өзгерген гендерді алуға болады. 5.1.5 Нуклеотидтердін аналогтарын пайдаланатын кездейсоқ мутагенез Клонданған геннің құрамына мутацияны енгізу үшін плазмидалық ДНҚ-ны пайдаланатын әдістер құрылған. Н ысанагенді плазмиданың құрамында жақын орналасқан екі рестрик ция сайттарының қасына енгізеді. Клонданған гені бар вектор ды RE1 және RE2 рестриктазалардың әсерімен бөледі, нәтиже сінде қысқарған бір 3'- және бір 5'-соңдары және бір 3'- және бір 5'- шығынқы соңдары түзіледі. Одан кейін ДНҚ-ның қысқарған 3'-соңғы жағынан ЕхоІІІ ферменттің әсерімен біріндеп нуклеотидтерді бөліп алады. Реакцияны белгілі уақыт өткенен кейін тоқтатады да полинуклеотид тізбектегі түзілген бос орынды Е.colі І ДН Қ -полимеразаның Кленов фрагменттің көмегімен толтырады. Реакция ортаға төрт түрлі дезоксирибонуклеозидұшфосфаттарды (dNTP) және шағын мөлшерде бір нуклеотидтің аналогын қосады, өнімде нуклеаза S1 көмегімен жабысқақ емес (тупой) соңы түзіледі, одан кейін Т4 ДНҚ-лигаза көмегімен қосады да Е.colі клеткаларға енгізеді. Вектордың ДНҚ-сы репликацияға түскенде комплементарлы полинуклео тидтік тізбекке аналог нуклеотиді бар сайттынаөзгеше нуклео тидттер қосылады да клонданған геннің құрамына бастапқы генде жоқ нуклеотид енеді. Кездейсоқ мутагенезді іске асырту үшін басқа әдістерді де қолданады. Мысалы, М13 фагтың ДНҚ-сын пайдаланатын олигонуклеотид-бағыталған мутагенездің бір варианттың қарастырайық. ДНҚ-ның синтезі басталу үшін бастапқы олигонуклеотид (затравка) ретінде кездейсоқ ауыстырылған нуклеотид тері бар олигонуклеотидтерді ң қоспасы болады. Нәтижесінде әртүрлі сайттарында кездейсок ауысқан нуклеотидтері бар клондардың қорын (библиотекасын) алады. Әдістің кемшілігі: 86

әр клонды зерттеп анықтау керек, қай клон қажет ақуыздың синтезін жүзеге асырады. Көбінесе осылай ғана жаңа қасиеті бар ақуызды табу мүмкін. Осы міндетті шешкенен кейін жаңа қасиеті бар ақуызды кодтайтын генні ң нуклеотидтік кезектесуін анықтайды да өзгерген сайтты теңестіреді. Сонымен, бұл тәсілдердің көмегімен бірегей жаңа ақуыздар мен ферменттерді алу және табиғи ақуыздарына жаңа қасиет терін беру мүмкін. 5.2 Сайт-ерекше мутагенезбен алынған мутанты ақуыздардың химиялық түрөзгерісі Бағытталған мутагенезбен алынған мутанты ақуыздардың бүйірлік топтарының химиялық түрөзгеріс әдісті біріктіріп, полипептидтік тізбегінің құрамына табиғи емес аминқышқылы қалдықтарын енгізу мүмкін. Полипептидтік тізбегіні ң белгілі учаскісіне бағыталған мутагенездің көмегімен жеңіл модифицияланатын бүйірлік тобы бар табиғи аминқышқылы қалдығын, мысалы, цистеин қалдығын (Cys-SН), енгізеді де химиялық әдіспен оны өзгертеді. Ақуыз молекуласының құрамындағы цистеин (Cys) қалдығын метантиосульфонатты (СН3SO2S-R) пайдаланып тиоалкиндейді. Метантиосульфонат сульфгидрил топтарымен ерекше және сандық әрекеттеседі. Табиғи ақуыз молекуласында өзінің SH-топтары болмағанда осы тәсілді қолдану тиімді, мысалы, субтилизин модификациясын іске асырт қан. Сонымен бірге ақуыз глобуласының ішінде орналасқан дисульфидтік байланыстарды құратын цистеин қалдықтары өзгермейді. Цистеин (Cys) қалдықтарын серинге (Ser) ауыстырғанда, серин активті орталығына кірмеу керек, мутацияға ұшырайтын ақуыздың ферменттік белсенділігіөзгермейді. Бағытталған мутагенез арқылы алдын ала артық цистеин қалдықтарын ауыстырғанан кейін белгілі Cys ерекше модификациясын іске асыруы м үмкін. Екі әдісті қосып асыртқан ақуыздың түрөзгерісі: ферменттің белсенді орталығының айналасында орналасқан қалдықтарын өзгертуге, ақуыз молекуласының топологиясының ерекшелігін 87

зертеуге және оны түрақтандыруына мүмкіндік береді. Осы тәсілді қолданып, субтилизінің белсенділігін, ерекшелігін және рН-оптимумын өзгертеді, ақуыздардың комбинаторлық клонотекасын құрады. Бұл клонотекаға кіретін ақуыздардың полипеп тидтік тізбегі цистеин қалдығымен мақсатылы теңестіріледі. Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары

1. Ақуыз инженерияда бағытталған мутагенез әдісті пайдалану бағыттары. 2. Бағытталған мутагенез әдістің негізгі кезеңдерін сұрыптап айтыңдар. 3. Олигонуклеотид-бағытталған мутагенез, үрлері, т артықшылықтары мен қиыншылықтары. 4. Кездейсо қ мутагенез, түрлері, артықшылықтары мен қиыншылықтары. 5. Сайт-ерекше мутагенез және химиялық түрөзгерісті бірге пайдалану әдістің артықшылықтары мен қиыншылықтары.

88

6. АҚУЫЗ ИНЖЕНЕРИЯСЫ ӘДІСТЕРІМЕН ӨЗГЕРГЕН АҚУЫЗДАРДЫ АЛУ

Қазіргі күнде ақуыз инженериясы әдісті пайдаланып алынған өзгерген ақуыздардың көптеген мысалдары белгілі, кейбіреуін қарастырайық. 6.1 Ақуыздың түрөзгерісі Қазіргі күнде ферменттер әртүрлі өнеркәсіптерде пайдалынады, мысалы, 1-кестеде көрсетілген. 1-кесте

Өнеркәсіпте пайдаланатын кейбір ферменттер түрі Фермент α-Амилаза Аминоацилаза Бромелаин Каталаза Целлюлаза Фицин Глюкоамилаза Глюкозоизомераза Глюкозооксидаза Инвертаза Лактаза Липаза Папаин Пектиназа Протеаза Ренет

Өнеркәсіпте пайдалануы Сыра қайнату, спирт өндіру L-аминқышқылдарды алу Етті жұмсарту, шырынды мөлдірлендіру Пайдалану ға дайын тағамдарда антиоксидант ретінде Спирт және глюкозаны алу Етті жұмсарту, шырынды мөлдірлендіру Сыра қайнату, спирт өндіру Фруктоза мөлшері жоғары спиртті өндіру Пайдалануға дайын тағамдарда антиоксидант ретінде Сахарозаның инверсиясы Сарысуының ыдыратуы, лактозаның гидролизі Сыра қайнату, істі зат алу Етті жұмсарту, шырынды мөлдірлендіру Шырынды мөлдірлендіру, спиртті өндіру Детегент, спиртті өндіру Сыра қайнату

Бірақ ферменттердің көбісі өнеркәсіптік жағдайда, жоғары температура мен ортаның құрамында органикалық ерітінділер болғанда тез денатурланады. Бұл қиыншылықты белок 89

инженериясы әдістермен ф ерменттердің қасиеттерін өзгертіп жеңу мүмкін. Ақуыздың қасиеттері, соның ішінде субстраттық ерекшелігі, температураға қарсы тұрақтылығы, каталитикалық белсенділігі т.б.қасиеттері полипептидтік тізбектің құрамына кіретін аминқышқылдардың түріне, олардың кезектесіп орналасуына байланысты. Клонданған геннің құрамында ерекше аминқышқылын кодтайтын кодонды өзгертеді де бір белгілі сайта қажет аминқыш қылы бар ақуыздың экспресиясын жүзеге асырады. Алдымен ақуыздың қызметі, қасиеттері үшін әр аминқышқылдың мағынасын анықтайды, одан кейін ауыстыратын аминқышқылын белгілейді. Бұл мәліметті генетикалық зерттеу немесе ақуыз молекуласының үш өлшемді құрылымын рентгенқұрылымдық талдау нәтижесінде алады. Ақуыз молекуласында бір белгілі ерекше сайтына немесе толық бір учаскісіне өзгерістер енгізіп, оның температураға қарсы тұрақтылығын жоғарылатады, субстраттық ерекшелігін, ортаның рН мағынасына сезімталығын, аллостериялық реттеуін, кофактордың қажеттілігін т.б. қасиетерін жақсартады. Полипептидтік тізбекке енгізген өзгеріс ақуыздың кеңістік құрылымы жоғары ортаның температуранын әсерінен бұзылуына себеп болмаса немесеүзілген т қосымша дисульфидтік байланыстар қалыпты қызметіне әсер етпесе белоктың тем ператураға қарсы тұрақтылығы жоғарылайды. Мысал ретінде Т4 фагтың лизоцимын қарастырайық. Т4 фагтың лизоцимінің молекуласына (жабайүрі) т екі цистеин қалдығы кіреді, дисульфидтік байланыстар жо қ. Олигонуклеотид бағыталған мутагенездің көмегімен Т4 фагтың лизоцимының 7 варианты құрылды. Лизоцим бір варианта жабайы түрінің молекуласын дағы екі цистеин қалдықтары треонин мен аланинге ауыстырылды. Осындайөзгерісті жүзеге асырғанда ферменттің белсенділігі мен температураға қарсы тұрақтылығы өзгермеді. Бұл варианты жалған жабайы түрі деп атады да стандарт ретінде алды. Басқа вариантарында 2, 4 немесе 6 ерекше аминқышқылы қалдықтары цистеин қалдықтарына ауыстырылды, молекулаларында 1, 2 немесе 3 жа ңа молекулаішілік дисульфидтік бай ланыстар түзілді. Мутанты гендерді теңестірді де E.colі клеткаларда экспрессия ға ұш ыратты, рекомбинанты қуыздардың а 90

ферменттік белсенділігі мен температураға қарсы тұрақтылығын зерттеді. Молекуласында дисульфидтік байланыстарды ң саны максималды мутанты ақуыздың тұрақтылығы ең жоғары. Бірақ температураға қарсы тұрақтылығы жоғары үш вариантың ферменттік белсенділігі толы қ тежелген. Цистеин қалдығына ауыстырылған кейбір аминқышқылдары ферменттің белсенді орталығында өзара жақын орналасады, сондықтан жаңа дисульфидтік байланыстар үзілгенде т молекуланың конформациясы қатты өзгермейді. Басқа ауыстырылған аминқышқылдары конформациясының өзгерісіне өте төзімді молекуланың бөлігінде орналасады. М үмкін дисульфидтік байланыстардың кейбір аминқышқылдарының арасында түзілуі ақуыз молекуласының конформациясының өзгеруіне себеп болады да белсенді кеңістік құрылымы бұзылады. Сонымен, жаңа дисульфидтік байланыстар түзілгенде ферменттің температураға қарсы тұрақтылығы жоғарылайды. Bacilus circulans ксиланаза ферменттің температураға қарсы тұрақты мутанттың алу зерттеу жүргізді. Ксиланаза қағаз өнеркәсібінде пайдалынады. Ферментіқосу алдында пульпаны ыстық сілтімен өндейді, сондықтан ксиланаза жоғары температура жағдайда белсенділігін жоғалтпау керек. Ксиланаза моле куласының кеңістік құрылымын компьютерлік модельдеу әдіспен құрды, қай бөлігіне дисульфидтік байланыстарды енгізгенде оның каталитикалық белсенділігі өзгермейтіні анықтады. Нативті ферментке қарағанда барлығының темпера тураға қарсы тұрақтылығы жоғары ксиланазаның 8 туындысын алды. Соның ішінде ортаның температурасы 60 0-қа тең болғанда 3 мутанттың каталитикалық белсенділігі нативті ферментінің белсенділігіне тең, N және С сондарының арасында дисульфидтік байланыс бар вариантты ң белсенділігі екі есе жоғарылады да 600-та екі сағат инкубациядан кейін белсен ділігінің 85%-ті сақталады, ал на тивті ксиланаза бұл жағдайда 30 минуттан кейін толық тежеледі. Сонымен, қосымша дисуль фидтік байланыстарды енгізу қылы ар температураға қарсы тұрақты ақуызды алу мүмкін. Аспарагин мен глутаминқалдықтарынан жоғары темпера тураның әсерінен дезаминдеу реакция нәтижесінде аммиак және аспарагин немесе глутамин қышқылы түзіледі. Аспарагин 91

қалдығының аспарагин қышқылына (глутамин - глутамин қышқылына) айналуы полипептидтік тізбегінің кеңістік құрылымының өзгеруіне әкеледі де ақуыз белсенділігін жоғалтады. Saccharomyces cerevisiae триозофосфатизомеразаны ң аспарагин қалдығын басқа аминқышқылына ауыстырып, ферменттің температураға қарсы тұрақты түрін алу мүмкіндігін анықтады. Триозофосфатизомераза екіұқсас суббірліктен тұрады. Суб бірліктер өзара жанасатын бөліктерінде аспарагин қалдықтары орналасады. Нативті ферменттің 14 - немесе 78-аспарагин қал дығын треонин немесе изолейцин қалдығына ауыстырғанда ақуыздың температураға қарсы тұрақтылығы жоғарылады, ал аспарагин қышқылына ауыстырғанда - төмендеді. Бағытталған мутагенездің көмегімен ферменттің каталитикалық белсенділігін де өзгертуге болады. Ферменттің субстраттық ерекшелігін өзгерту үшін активті орталағының кеңістік құрылымын, оның геометриясын алдын ала білу керек. В.stearothermophіlus тирозил-тРНҚ-синтетаза тирозинмен байланысатың тРНҚ-ның аминоацилдеу екі сатылы реакцияны катализдейді. Реакция бойы субстрат тирозил-тРНҚ-синтазамен байланысқан болады. (1) Tyr + ATP (2) Tyr-A + tRNATyr

Tyr-A + PPi Tyr-tRNATyr

+ AMP

Алдымен компьютерлік модельдеуәдіспен ауыстыратын аминқышқылы қалдығын белгілейді. Нативті ферменттің трео нин гидроксил тобы тирозиладенилаттың рибоза сақинасының оттек атомымен сутек байланыстықұрайды. Болжам бойынша сутек байланысүзілгенде ферменттің субстратқа ұқсастығы жоғарлайды. Олигонуклеотид бағытталған мутагенезбен 51 треонин қалдығын аланин немесе пролин қалдығына ауыстырады. Өзгерген ферментердің кинетикалық константларын анықтайды. Треонинді аланинге ауыстыр ғанда ферменттің АТФ -ты байланыстратын константасы (Км) 2-ге жуық төмендейді, катали тикалық константасы (кcat) өзгермед і, пролинге ауыстыр ғанда ферменттің каталитикалық константасы (кcat) 100-ден астам жоғарылады. Екі өзгерген тирозил-тРНҚ-синтетаза үшін аминоацилдеу реакцияның каталитикалық тиімділігі артты. 92

Ферменттердің металл кофакторлардың қажеттілігін өзгерту мүмкін. Субтилизиндерді биоыдырату детергенті ретінде өнер кәсіпте кең қолданады. Субтилизин – сериналық протеиназа, грамон бактериялар субтилизинді себінді ғаорта секреция арқылы шығарады. Субтилизиндер бір немесе бірнеше кальций атомдармен берік байланыс қан да ғана тұрақты болады. Сон дықтан тұрақты белсенді субтилизин молекуласының құрамына кальций атомдары кіреді. Біра қ субтилизин пайдаланатын өнеркәсіптік процестерге көп мөлшерде металдарды, соның ішінде кальций атомдарын байлайтың (хелаттайтын) қосылыс тар қатысады. Сондықтан өнеркәсіптік жағдайда субтилизиндер өте тез кальций атомдарын жоғалтады, сонымен бірге белсенді емес түріне айналады. Мәселені шешу үшін олигонуклеотид бағытталған мутагенезді қолданып кальций атомдарымен байланыспайтын мутантты субтилизинді алды. Сонанң со субтилизин молекуласыны ң тұрақтылығын жоғарлату үшін қандай өзгерісті енгізу керек екендігін анықтады. Bacillus amyloliquefaciens субтилизинді кодтайтын гендіңестірді, те рентгенқұрылымдық әдіспен ақуыздың кеңістік құрылымын анықтады, одан кейін субтилизинні ң мутанты генін алды. Мутанты геннің кальций атомдарын байланыстыруға жауапты аминқышқылы қалдықтарын кодтайтын нуклеотидтерді делеция арқылы кетірді. Мутанты субтилизин кальций атомдарымен байланыспайды, бірақ молекуласының к онформациясы нативті субтилизин молекуласының конформациясына ұқсас. Келесі қезеңінде мутанты субтилизиннің тұрақтылығын жоғарылату үшін жұмыс жүргізді. Болжам бойынша табиғи субтилизин молекуласында кальций байланыстыратын доменімен әрекет тесетін аминқы шқылдары мутанты ферментте манызды болмайды. Осы амин қышқылдарының ішінен 10 аминқышқылы қалдығын тандап алды. Кездейсоқ мутагенез әдісті пайдаланып 10 сайттың құрамына өзгеріс енгізді. Бұл сайттар ақуыздың 4 үтрлі бөлігінде, N -соңында, омега-илгегінде, α-спиральді аймағында және бір β-қабатында орналасқан. Мутанты субтилизин варианттарыны ң қасиеттерін зерттеді. Жұмыстың нәтижесінде мутацияларды 7 сайттына енгізгенде субтилизиннің тұрақтылығы жоғарлайтынын анықтады. Нативті ферментпен салыстырғанда мутанты субтилизиннің түрақтылығы кальций 93

болмағанда 10 есе жоғары, ал кальций болғанда түрақтылығы 50%-ке жуық жоғары. Олигонуклеотид бағытталған мутагенездің көмегімен фер менттердің қасиеттерін жақсартады және олардың ерекшелігін де өзгертуге болады. Мыс алы, ерекше емес FokІ эндонуклеазаның негізінде жаңа сайтерекше эндонуклеазалар алынды. Қазіргі күнде әртүрлі организмдерінен 2500 астам рестрикция-модификация ферменттер теңестерілген. Бұл ферменттердің көбісі бір ғана нуклеотидтік тізбегін таниды. Сондықтан 200 түрлі ғана рестриктазаларының сайттары бар, осы сайттар көбінесе 4-6 нуклеотидтердін ұбынан ж құрылады. Осындай сайттарды танитын рестрикция эндонуклеазалар ДН Қ молеку ласын көп жерде үзеді, сондықтан ДНҚ молекуласының үлкен фрагменттерін алу үшін оларды өте сирек пайдаланады. Көбінесе ДНҚ молекуласын зерттегенде 8 нуклеотидтер жұптарынан құрылған ДНҚ бөліктерін танитын рестрикция эндонуклеазаларды қолданады. Жаңа рестрикция эндонуклеазалар табу өте киын м әселе. Жаңа рестриктазаларды генно-инженериялық әдістердің көмегімен алуға болады. Бір ерекше ақуыздар белгілі. Ақуыздардың молекулаларында Zn2+ (мырыш) атомдарын байланыстыратын, мырыш бармақтары (цинковые пальцы) деп аталатын бірегей домендері бар. Бұл белоктар ДНҚ полинуклеотидтік тізбегіні ң ерекше бөлігімен байланысады, екі спиральдің үлкен сайына өзінің αспиральді учаскесімен кіреді. Мысалы, тыш қандардын Zlf268 белоктын құрамынына 3 мырыш бармақтары кіреді, әр мырыш бармағы бір белгілі ДНҚ-ның кодонымен ерекше әрекеттеседі. Болжам бойынша егерде осы домендерді бір ерекше пептидпен байланыстырса, үтзілген белок ДНҚ -ның бір ғана сайтымен байланысу мүмкін . Нәтижесінде ДНҚ -ның бір ерекше сайтты үзетін эндонуклеазаны жасауға болады. Химерлы ген жасалды. Оның негізінде ерекше емес FokІ эндонуклеазаның негізінде сайт ерекше екі жаңа эндонуклеазалар алынды. Бір эндонуклеаза λ фагтын ДНҚ -сының бір ғана белгілі сайттына әсер етеді, екінші эндонуклеазаның әсеріне бір белгілі және екі басқа сайттар түседі.

94

Ұлпа плазминаген активаторы (tРА) – сериналық протеиназа, ұйыған қанды ыдырату үшін клиникада пайдаланады.. Бірақ tРА қанайналым жүйесінен тез шығып кетеді, сондықтан tРА инфузия арқылы енгізу керек. tРА емдеу әсері тиімді болу үшін ферменттің жоғары концентрациясын қолданады. Ферменттің жоғары концентрациясын енгізгенде еріксіз ішке қан кету болу мүмкін. Сондықтан, ұйыған қанды ыдырату үшін ұзақ өмір сүретін, қантқапасындағы фибринге жоғары ұқсастығы бар, ішке қан кетуіне себеп болмайтын tРА ферментті алу қажет. Нативті tРА генніне ерекше мутациялар енгізіп айтыл ған қасиеттері бар ақуызды алуға болатыны көрсетілді. tРА молекуласында Тре-103 аспарагин қалдығына ауыстырғанда тұрақты ферментті алды. Табиғи вариантымен салыстырғанда өзгерістер енгізген ферменттің тұрақтылығы қоянның қан пл азмасында 10 есе жо ғары. Полипептидтік тізбегіндегі Лиз -Гис-Арг-Арг қалдықтарынан құрылған пептидтік бөлігі (296-299 аминқыш қылы) Ала-Ала-Ала-Ала пептидке ауыстыр ғанда ферменттің фибринге ұқсастығы жоғарылады Асн -117-і Глн-е ауыстырғанда фибринолитикалық активтілігі өзгермейді, нативті ақуыздың белсенділігіне тән болады. Белок молекуласына осы үш мутацияларды енгізгенде керекүш қасиеттері бар ферментті алды. β Интерферон (ИФβ) - маңызды дәрі ретінде пайдаланатын ақуыз. Адамның ИФβ препараттарын көп мөлшерде алу үшін генді инженериялық әдістер қолданады. Адам ИФ β-дың клонданған комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) E.colі клеткаларына енгізеді де экспрессиясын ж үзеге асырады. Нәтижесінде ИФ β көп мөлшерде алады. Бірақ нативті формасымен салыстырғанда алынған препараттың вирустарға қарсы белсенділігі 10 есе төмен. Генді-инженериялық ИФβ молекулаларының көбісі димерлер және жоғары молекулалы бесенді емес комплекстері түрінде болады. Димерлер мен олигомерлердің түзілетін себебі мүмкін бос SH топтарынан шығар. E.colі клеткаларда интерферон молкулаларында дисульфидтік байланыстар үтзіледі, ал адам клеткаларында SH топтары дисульфидтік байланыстар ға өзара байланыспайды. Болжам бойынша ИФβ молекуласында бір әлде бірнеше цистеин кодонды басқа аминқышқылдарының 95

қалдығына ауыстырса, олигомерлер түзілмейді де, белсенділігі өзгермейді. ИФβ генінде 17 цистеин кодонды серин кодонына ауыстырып генді E.colі клеткалар ға енгізді, экспрессиясын жүзеге асырды. Мутанты Сер-17 ИФβ-дың мультимерлы комплекстері түзілмейді де белсенділігі мен тұрақтылығы қалыпты ИФβ -ның сипаттамасына ұқсас болды. Инсулин В тізбегінде 10 гистинді ң орына аспарагин қыш қылын енгізгенде гормонның плазмалық жарғакшада орналасқан рецепторымен байланысатын тиімділігі нативті инсулинғе қарағанда 5 есе жоғарылады. Аминқышқылын бағытталған ауыстыру нәтижесінде инсулиннің терапевтік концентрацияда ерігіштігі мен сорылуы ұлғаятыны анықталды. Цитохром с молекуласында кертартпа фенилаланинқал дығын глицинге ауыстырса фермент өзінің белсенділігін сақтайды, бірақ пероксидазаға электрондарды тасымалдау қабілетілігі төмендейді. Трипсин молекуласыны ң субстратты байланыстыратын орталығына глицин қалдығы кіреді. Глицин қалдығын бүйірлік тобы бар аланинқалдығына ауыстырды, пептидтік субстрат тардың құрамындағы лизин ж әне аргинин қалдықтарына бағытталған ферменттің ұқсастығының айырмашылығы пайда болды. Болжам бойыншақалыпты жағдайда аргининің ұзын бүйірлік тобы субстраттық қалтаға лизинге қарағанда тереңірек енеді, ал глицин орында аланин бол ғанда аргининің бүй ірлік тобы қалтаға симайды. Bacillus stearothermophilis тирозил-тРНК-синтетазаны ң белгілі кеңістік құрылымының негізінде геніндегі нүктелік мутацияның түрі алдын ала болжам жасалды. Бұл мутацияны енгізгенен кейін ферменттің АТФ-ке ұқсастығы 100 есе жоғарылады. Ұқсас тәсілді қолданып Т4 фагтың лизоцим молекуласында қосымша дисульфидтік байланыстың түзілуін іске асырды, нәттижесінде оның термотұрақтылығы артты. B. subtilis субтилизинде аминқышқылдардың бір ізді ауыс тыруы катализ жылдамды ғы мен органикалы қ еріткіштердегі тұрақтылығының жоғарылауына әкелді, субстраттық ерекшелігі мен рН-оптимумын өзгертті, химиялық тотығу, жылулық пен сілтінің әсерінен тежелуге қарсы тұрақтылығын жоғарылатты. 96

L-лактатдегидрогеназа полипептидтік тізбегінде бір ғана аминқышқылын ауыстырып, оның субстраттық ерекшелігін өзгертті, L-лактатдегидрогеназа малатдегидрогеназаға айналды. Қазіргі күнде гендік инженерия әдістерін қолданып ферменттерді таза үкйінде және көп мөлшерде алады. Бұл био технологиялық өнеркәсібінде ферменттердің көмегімен химиялық реакцияларының ірі масштабта жүзеге асыру үшін мүмкіндік береді. Ферменттерқатысуымен іске асатын реакцияларының тиімділігі органикалық химияның әдістерімен салыстырғанда жоғары. Ферменттердің көбісі өнеркәсіптік жағдайда түрақсыз, өте тез тежеледі, түрақсыздығы олардың өнеркәсіпте пайдалануына шек қояды. Белгілі ферменттердің көзі ретінде көбінесе мезофилді организмдерді қолданады. Мезофилды организмдер ортаның қалыпты жағдайында (температура, қысымы, рН-ы, т.б параметрлары) өмір сүреді. Микроорганизмдердің бір тобы экстремалды ортаның жағдайында: температура аралығы -20150 және 600 -1100С, жоғары иондық күші (2 -5М NaCl), рН мағынасы 4-тен төмен (9) тіршілік әрекеттің жүзеге асырады. Экстремофилдердің ферменттері экстремалды жағдайда іске асатын реакцияларды катализдейді, яғни экстремалды жағдайда белсенділігін жоғалтпайды. Бұл ферменттерді экстремозимдер деп атайды. Экстремозимдердің ерекше қасиетері биотехноло гиялық өніркәсіпте оларды пайдалануға мүмкіндік береді. Сонымен бірге, таби ғи экстремозимдердің болуы көрсетеді ақуыз инженериясы әдістерді қолданып қалыпты ферменттердің түрақтылығын жоғарылатуға болады. Экстремозимдердің ферменттерін пайдалану үшін басқа тәсілдерді қолданады. Сонын ішінде, топырақтан немесе басқа көздерінен ДНҚ-ны бөліп алады да айналадағы ортаның ДНҚ клонотекасын (environmental libraries) алу үшін пайдаланады. Бұл ДНҚ клонотека жаңа гендердің сарқылмас көзі ретінде болады. Альтернативті әсіл т ақуыз инженерияның әдіс терін қолданып белгілі мезофильді ферменттерді түрөзгеріске ұшыратады, алынған модифияланған ферменттер жаңа қасиеттеріне ие болады да, экстремальды жағдайда белсенділігін жоғалтпайды. Ақуыз инженерияның нәтижелі тәсілі - экстремофилді ферменттердің бірінші және кеңістік құрылымына тән ерекшелігін 97

мезофильді аналогтарына жасанды тасымалдау, яғни ұтымды әрлендіру мен қайтадан әрлендіру әдістерді пайдалану. Соның ішінде біркелкі Bacillus stearothermophilus термофилдің термолизинге ұқсас протеиназаның по липептидтік тізбегіне бірнеше мутанты аминқышқылдарының қалдықтарын енгізгенен кейін ферменттің 1000-та түрақтылығы нативті ақуызға қарағанда 340 есе жо ғарлады. Бұл жағдайда (температура 100 0) өзгерген ферменттің өмір сүретін жарты уақыты 170 мин, меншікті белсенділігі толық сақталады. Сонымен бірге, мутанты фермент нативті протеиназаның әсеріне түрақты субстраттың гидролизін іске асыртатын болды. Болжам бойынша, мутацияларды ң нәтижесінде полипептидтік тізбегінде глутамин қышқылының қалдығы аланинге, аланин қалдығы пролинге ауыстырылса және жаңа дисульфидтік байланыстар түзілсе, ферменттің денатурланған күйінің энтропия мағынасы төмендейді де энергия жағынан денатурланған формасы нативті конформациясынан гөрі артығырақ болады. 6.2 Гибридті ақуыздарды құру Гендік инженерияның бір мақсаты гибридты ақуыздарды алу. Ақуыз инженерияда технологиялық немесе медицинаға пайдалы қасиеттеріне ие гибридты ақуыздарды ұқсас немесе әртүрлі ақуыздардың функционалды домендерінен құрады. Бұл мүмкіндік негізделінеді: 1) Табиғатта әртүрлі организмдерде физика-химиялық және биологиялық қасиетерінде айырмашылығы бар ақуыздар ұқсас биологиялық қызмет атқарады. 2) Полифункционалды ақуыздардың функционалды домен дері құрылымдық домендер түрінде орналасады да қызметі өзара байланысыз үт рде іске асырады. Домендердің алмасуы ПЦР әдістің көмегімен жүзеге асырылады. Бірінші генңің ауыстыратын доменні ң кодтайтын учаскісінің соңдарына комплементарлы праймерлерді синтездейді. Праймерлердің 5' соңында екінші генде ауыстыратын доменді кодтайтын учаскісінің соңдарына комплементарлы бөліктері болады. Бұл комплементарлы учаскілері үзілетін т дуплексін де са қталып қалады. Біртізбекті векторда екінші генді клондайды, дуплекстің 98

бір тізбегі векторбен байланысады да ауыстыратын доменді кодтайтын учаскісінде шунт үзіледі. т Вектордың негізгі бөлі гінің кепілденуін іске асыртқанда дуплекстің тізбегі праймер ретінде қызмет атқарады. Нәтижесінде вектордың комплемен тарлы тізбегі үтзіледі. Бұл тізбектін құрамына ауыстырылған доменді кодтайтын учаскісі бар екінші ген кіреді. Тұқымдас ақуыздардың функционалды домендерін ауыстыру, мысалы ретінде in vitro және in vivo рекомбинация әдіспен адам мен тышқанның α-интерферодарының гибридтерін алғанын келтіруге болады. Интерферондар организмде вирус жұқпаға қарсы клетка лардың реакцияларың реттейді. Организмнің клеткаларына вирустың еніп, көбеюіне интерферон кедергі жасайды. Интерферонді организмді вирустардың әсеріне қарсы тұратың орга низмнің қорғаныш жүйелерінің ең бірінші заты деп санайды. Интерферон – бір полипептидтік тізбегінен құрылған ақуыз, молекулалық салмағы 17500-25000 дальтон. Адам интерферондарын α-, β-, γ-интерферондар тобына бөледі. α-Интерферондар (НuІFN-α), лейкоцит клеткаларда вирустардың әсерінен түзіледі, лейкоцидтік интерферондар деп аталады. α-Интерферон молекулалары 165-166 аминқышқылы қалдықтарынан құрылады. α-Интерферондарды кодтайтын 16 жеке генетикалық локустар табылған, көпшілігінің құрылымы анықталынған. Әртүрлі α-интерферондың молекулаларының бірінші реттік құрылымының 52% шамасындайы ұқсас келеді. β- Интерферон (НuІFN-β), фибробласт клеткаларда вирустардың әсерінен түзіледі, фибробластық интерферон деп аталады. β-Интерферонды кодтайтын бір ғана гені табылған. βИнтерферон молекуласы 166 амин қышқылы қа лдықтарынан құрылған, бірінші реттік құрылымының 35%-ге жуығы αинтерферонға (НuІFN-α) ұқсас келеді. γ-Интерферондар (НuІFN-γ) иммунды интерферондар деп аталады. γ-Интерферондар митогендер, бактериялар және вирустар антигендерінің әсерінен Т-лимфоциттерде түзіледі немесе лимфоциттердің сыртқы детерминантарына қарсы антисывороткалар әсерімен, стафилоккок А белоктың әсеріне қарсы, фитогемагглютинин және А конкавалин әсерімен түзіледі. γ99

Интерферонды кодтайтын бір ғана ген табылған. γ-Интерферон молекуласы 146 аминқышқылы қалдықтарынан құрылған, бірінші реттік құрылымы α- мен β-интерферондарға ұқсас келмейді. α- мен β- интерферондардың вирустарға қарсы белсенділігі γ-интерферондарға қарағанда 10-100 есе жоғары, ал γ-интерферон 100-100000 есе жоғары иммуномодульдеу белсенделігін көрсетеді. Белгілі α-интерферондардың молекулаларының құрамына көмірсулар қалдықтары кірмейді, ал β- мен γ-интерферондардың молекулалары гликозилделінген. Лейкоциттік интерферон (αинтерферон) - ортасы гидрофобты глобулярлы белок, молекуланың 65%-ті β-қатпарларымен бөлінген α-спираль түрінде. Белгілі цитокиндердің ішінен α-интерферон ең бірінші саты латын болды. Ісіктердің көбісін және вирус ауруларды емдеу үшін α-интерферон өте тиімді дәрі болып табылды. α-Интерферон алу технологиясының негізіне клеткалар себіндісі алынды. Гибридті интерферондарды алу: Екі α-интерферондын гендерін бір рестрикция эндонуклеаза әсерімен белгілі жерлерде (орындарда) кесті де N- және С-соңғы бөліктерін бөліп алды. Бір гендің N-бөлігіне екінші геннің Ссоңғы бөлігін қосты, екінші геннің N-бөлігін бірінші геннің Ссоңғы бөлігімен байланыстырды. Алынған гибридті гендерді бактерия немесе ашытқы клеткаларына енгізді де экспрессиясын жүзеге асырды да гибридті интерферондарды алды. Гибридті интерферондардың кейбір вариантарды ң вирустарға қарсы белсенділігі алғашқы интерфердардан жоғары болды. Екі үтрлі ақуызды, γ-интерферон мен 2-интерлейкинді біріктірді. Т үзілген полипептидтік тізбегі екі белсенділігін көрсеті. Сонымен, ақуыз инженериясы (комбинирленген) әртүрлі биологиялық әсері бар ақуыздық медикалық препараттарды жасау мүмкіндігін ашады. Гибридті ақуыздардың тобына жасанды рецептор -тәуелді токсиндер, соның ішінде иммунотоксиндер жатады. Бактерия полипептидтік токсиндердің көбісі екі компоненттен құралады: белсенді А суббірлігінен және клеткалық рецепторды танитын В тізбектен. В тізбегі токсинні ң клетканың ішіне еніп кетуіне көмектеседі. В тізбекті басқа лигандға ауыстырса, токсиннің 100

жаңа ерекшелігі пайда болады. Мысалы, кұл ауру тоскиннің А тізбегін және адамдың меланоцитті стимулдейтін α гормонды біріктіргенде меланома клеткаларға уытты әсер еттетін поли пептидтік препарат түзілді. 1980 жылдардың соңында қосарланған ферменттік реакцияларды катализдейтін гибридті қауыздардың негізінде бифунк ционалды ферменттер құрды. Бір полипептидтік тізбегінде 3 галатозидаза мен галактозодегидрогеназа, галактозодегидрогеназа мен бактериялық люцифераза, малатдегидрогеназа мен цитратсинтаза қосылған гибридты ақуыздар жасалды. Гибридті ферменттердің жалпы жиынтық белсенділігі стационарлық күйінде жеке ферменттердің қосылған белсенділігінен 2-3 есе жоғары, ал жүйенің стационарлық күйіне шығудын алдындағы лаг-периоды 4-6 есе қысқарды. Процестің жалпы жылдамдығын реакцияның бірінші кезеңі лимиттейтін жағдайда, мысалы, бірінші ферментүшін ортаның рН-ы оптималды емес немесе субстраттың жетімсіздігі болғанда қосарланған жүйелерінің тиімділігі максималды жоғарылайды. Болжам бойынша гибридті бифункционалды ферменттерде олардың каталитикалық домендерінің белсенді орталықтарының тура өзара орналасуы жүйелерінің тиімділігін бірталай жоғарлатады. S1 тұқымдасының сериналық протеазалар екі ұқсас субдо мендерінен тұрады, домендерінің сыртқы беткі жағы (интер фейсі) ферментті ңбелсенді (активті) орталы ғын «қысқаш» түрінде құрады. Осы топтың ферменттерінің гидрофобты құрылымы және каталитикалық қасиетіне жауапты үш аминқышқылдары керттартпа (консервативті). Біра қ, ферменттің сыртқы беткі жағында белсенді (активті) орталығының айналасында орналасқан пептидтік ілгектерінің аминқышқылдары өзгеше. Бірінші реттік құрылымының айырмашылығы ферменттердің бірегей субстраттық ерекшелігімен және оларды реттеу өзгешілігімен арақатынасты келеді. Осы сипаттамаларын негізіне алып қан ую Xa (fXa) факторының N -соңғы субдомені мен трипсиннің Ссоңғы субдоменнің біріктіріп, гибридты fXYa протеиназа құрды. Гибридты қуыздың а кеңістік құрылымын зерттеу арқылы анықтады, белсенді орталығының айналасында керттартпа гидрофобты учаскілерінің орналасуы сақталды, бірақ ақуыз глобуласының сыртқы бетінің элементтерінің кеңістік құрылымы 101

өзгерді. Гибридты протеиназа амидолиттік белсендігіне ие, сонымен бірге субстратты қ ерекшелігі төмендеген, алғашқы ферменттерге қарағанда, Xa фактордың субстраттарын пайдаланатын жоғары қабілетілігін көрсетеді Ақуыз инженерияда клетканың ішінде және сыртында гибридты полипептидтердің орналасуын белгілі бағыта өзгерту үшін ақуыздардың адрес домендері мен сигналдық тізбектерін кең қолданады. Қазіргі күнде көптеген, соның ішінде саудалық векторлар құрылған. Бұл век торлар негізгі функционалды учаскісі адрес доменімен немесе сигналды қ тізбегімен байла нысқан гибридты ақуыздық молекулаларды алуға мүмкіндіқ береді. Осындай модификациялар гибридты молекулаларды ң әртүрлі бактериялық иесімен ерекше секрециясының қабілетілігін қамтамасыздандырады. Биосинтез процесінде адрес домендері автономды фолдингінеұшырайды да гибридты ақуыздың негізге өблігінің кеңістік құрылымына әсері әлсіз келеді. Осындай гибридты қуыздардың а қасиеті оның қызметтін белгілейді. Векторлардың осы қатарына ерекше лиганд немесе рецеп торлык қасиетері бар белоктық домендерді кодтайтын бөліктерімен клонданған гендер біріктерілген векторларды жатқызады. Қазіргі күнде адрес домендер ретінде мальтоза байланыстратын ақуызды, глютатион-Б-трансферазаны, целлюлоза немесе хитинмен әрекеттесетін домендерді, гексагистидин тізбегін тағы басқа заттарды пайдаланады. Бұл модификациялар аффинді хроматографияның көмегімен рекомбинанты ақуыздардың тазартуын жеңілдетеді. Бір саудалык векторды ң құрамында хитинд і байланыстыратын домен S. cerevisiae ашытқының интеин нуклеотидтің тізбегімен бірітірілген. Осы векторды ң көмегімен клонданған геннің экспрессиясы нәтижесінде гибридты ақуыз түзіледі. Гибридты ақуызға негізгі рекомбинанты ақуыздың С -соңында интеин мен адрес домені орналасады. Құрамында интеин бар ақуыздардың аутосплайсингі интеин қатысумен іске асады. Гибридты белоктың құрамына кіретін интеин модификациялан ған, нәтижесінде сульфгидрил топтарын тотықсыздандыратын реагентердің әсерінен активтенеді. Сондықтан иммобилденген хитинмен толтырған бағана арқылы 102

гибридты ақуыздың аффиндіқ сорбциясын іске асырғанан кейін дитиотреитол немесе 2-меркаптоэтанол ортада болғанда негізгі рекомбинанты ақуыз гибридты молекуланың құрамынан боса нып шы ғады. Бұның с ебебі интеинні ң әсерінен пептидтік байланыстың гидролизі жүзеге асады. Ақуыз инженерияның адрес домендер мен сигналдық пептидтерді пайдаланатын тағы бір қарқынды дамитын бағыты, рекомбинанты ақуыздарды бактерия клеткаларының сыртқы беткі жа ғында орналасты рып, бактериялды дисплейді, тірі вакциналарды құру және өсу процесі барысында клеткаларды иммобилдеу. Гибридты қауыздардың технологиясын полипептидтерді нуклеин қышқылдарының ерекше бөліктеріне жеткізу үшін пайдалану мүмкін. Мысалы, ДНҚ бөліктерін транскр ипция факторларымен айырып тануынақатынасатын «цинк бармақ тары» түрінде домендерін Fokl рестриктазының каталитикалық доменімен біріктіріп эндонуклеазаәсерінің ерекшелігін өзге ріске ұшыратты. Ұқсас тәсілді пайдаланып Е. coli РНҚ -полимеразаның гибридты α-суббөліктерінде транскрипция факторларының ерекшелігін өзгерту мүмкіндігі көрсетілген. Аллостериялық қасиеттері бар рекомбинанты ферменттердің негізінде жаңа биосенсорларды құру мүмкін, мысалы, осы тәсілді пайдаланып сілті фосфатазаның модификациясы іске асырылды. Сілті фосфатазаны ң полипептидтік тізбегіне ВИЧ I түрінің және С гепатит вирустың пептидтік эпитоптарын енгізді. Сонан соң рекомбинанты ферменттердің белсенділігіне эпитоптарына қарсы алынған антиденелерінің әсерін зертеді. Антиденелер сілті фосфатазаны ң жабайы түрінің негізінде алынған гибридті ферменттердің белсенділігін 20%-ке төме детеді, ал температура ға сезімтал мутантарының негізінде құрылған гибридті ферментерді стимулдейді. Зерттеу ж ұмыстарды жүргізгенде тірі клеткаларда іске асатын ақуыз биосинтезінің жылдамығын және белгілі ақуыздың мөлшерін анықтау қажет, ақуыздың клетка ішіндік орын ауысуын қадағалап байқау немесе күрделі қоспадан ақуызды таза түрінде алу. Бұл жұмыстар ақуыздар-репортердің көмегімен іске асыруы жеңілдейді. Мысалы, зерттейті ң ақуыздың С-соңына ақуыз-репортер ретінде 3-галактозидазаны байланыстырса, 103

рекомбинанты ақуызды тазартқанда 3-галактозидазаның белсенділігі немесе иммунохимиялы қ әдістердің қолданғанда, оның антигендік детерминантары таңба ретінде болады. Ақуыз-репортердің гендерімен ашық оқу рамкалары (открытые рамки считывания) бар ДН Қ фрагменттерін біріктір генде гибридті қуыздарды а таза түрінде алу үшін ақуыз репортерінің белсенділігін таңба ретінде және лаборатория жануарларды иммундау үшін пайдалану, антиденелерді ң көмегімен нативті ақуызды таза түрінде алу мүмкін. Ашық оқу рамка кодтайтын рекомбинанты полипептиді қуызды бар а тазарту үшін антиденелерді пайдаланып геннің клонданған фрагментін теңестіріледі. Сонымен ақуыз -репортерді гендердің экспрессиясын зерттегенде белсенді пайдаланады. Бүдан басқа транскрипция факторларды және сигналдардың беріліс механизмін зерттегенде, жа ңа дәрі препараттарды іздеп табу үшін, клетканың негізінде биосенсорларды құру ақуыз-репортерлер көмектеседі. Ферменттердің көбісі ақуыз-репортер ретінді пайдалану мүмкін, ферменттің түрі зертеу мақсатына байланысты. Ақуыз-репортердің: молекулалық химердың құрамында женіл теңестірілетін, түрақтылығы жоғары, айналадағы орта үшін қауіпсіз, анықтағанда сезімталдығы жоғары және фон белсенділігі төмен қасиеттері болу керек. Табиғи немесе генетикалық модифицияланған ақуыздарды ақуыз-репортер ретінде, соны ң ішінде хлорамфениколацетил трансферазаны, әртүрлі флуоресценттеуші ақуыздарды, мысалы, жарық қоңыз люциферазасын, обелин, экворин, жасыл флуоресценттеуші ақуызды және оның аналогтарын кең пайдаланады. Флуоресценттеуші ақуыздар электромагниттік сәуле шығарумен түйісу нәтижесінде сәуле шығаруға қабілетті келеді. Қазіргі күнде жеті фотопротеиндер: талассиколин (thalassicolin), экворин (aequorin), митрокомин (mitrocomin), клитин (clytin), обелин (obelin), мнемиопсин (mnemiopsin)әнеж беворин (bevorin) сипатталған. 6.3 Жасанды ақуыздар Ақуыз молекуласының құрылымының теориясын негізіне алып табиғатта табылмаған архитектурасы бар жаңа ақуыздарды 104

құру мүмкін. Бірінші жасанды ақуыз – альбебетин (21-сурет), молекуласы қайталанатын екі αββ элементтерінен құрылған, молекуласы молекулалық салмағы ұқсас табиғи глобулярлы ақуыздар сияқты тығыз, құрылымы түрақты. Альбебетин құрамына сегіз аминқышқылдарынан құралған биологиялық функ ционалды фрагмент енгізілді. Бұл пептидтік бөлігі интерферонның бласт-транформациялайтын белсенділігіне ие. Модификацияға ұшыраған альбебетин тышқандардың тимоциттердің рецепторына жоғары ұқсастығын көрсетеді және тимоциттердің бласт-трансформациялау реакциясын активтендіретін тиімділігі интерфероннан жоғары.

21-сурет. Альбебетиннің құрылған кеңістік құрылымы (.В. Финкельштейн лекций курсынан алынған)

6.4 Вакциналық препараттар Вакциналардың қарапайым вариантары - молекулярлы вакциналар, жеке иммуногендіқуыздар а (вирустарының сыртқа бетінде орналасқан ақуыздар) және гендік инженерия әдіспен синтезделген 10-15 аминқышқылы қалдықтарынан құрылған жеке эпитоптарының негізінде жасалған в акциналар. Ақуыз молекуласында антигендік белсенділігін белгілейтін үздіксіз аминқышқылы тізбегі болады. Вирус ақуыздар мен эпитоптарының көбісі синтезделінген және жануарлардың екпесі 105

ретінде зерттелінген. Мысалы, В гепатитке қарсы иммуниза цияны іске асыру үшін ерекше антигенді алуы өте қиын. В гепатит вирусы себінді жа ғдайда көбеймейді. Вирус тасымал даушысының қан сары суын жылу әсерімен өндеп оның негізінде В гепатиткеқарсы вакцинаны жасады. Одан кейін вирус тасымалдаушысы сарысуыны ң құрамына кіреті н сфералық бөлшектерін тежеп сыртқы антигендерінің негізінде вакцинаны құрды. Бұл вакциналар тиімді және қауіпсіз, бірақ вакциналарды жасауүшін өте көп сарысуы керек, қымбат жабдықтар және күрделі қорғаныш жұмыс жүргізу қажет. Сондықтан вирус геномының нуклеотидтік тізбегінің негізінде сыртқы антигендің аминқышқылы кезектесуі, ягни бірінші реттік құрылымы анықталынды. Одан кейін ЭВМ көмегімен оның құрамында антигендік детерминантарын тапты да екі циклдық пептидтерді химиялық синтезбен алды. Тышқандарға пептидтерді бір рет енгізгенен кейін, оларда антиденелерді ң синтезі жүзеге асырылды. Тірі вакциналардың штаммдарына иммуногенді ақуыздарының бөтен гендерін енгізгенде ДНҚ-вакциналарды алады. Организмге ақуыз -антигенді кодтайтын рекомбинанты плазмидаларды тері астына немесе бұлшық етке енгізгенде иммундық жауап дамиды. Экспрессия әтижесінде н аз мөлшерде ақуыз антиген үтзіледі, себебі өте аз клеткалар трансформацияға ұшырайды. Бірақ организмде күшті гуморалдык және клеткалық иммундық жауап дамиды. Грипп, В және С гепатит, құтыру, туберкулез, көк жөтел және ВИЧ-ке қарсы ДНҚ-вакциналарды жануарларда эксперименттік сынау өтті. 6.5 Рекомбинанты антиденелер Биология және медицинаның әртүрлі салаларында антиденелерді кең қолданады. Бұның себебі антиденелер табиғаты әртүрлі молекулалық салмағы жоғары және төмен лигандлармен әрекеттеседі. Антидененің лигандымен әрекетесу ерекшелігі жоғары және бірегей. Осыған байланысты антиденелерді ерекше таңба ретінде пайдалану мүмкін. Қазіргі күнде медициналық диагностикада антиденелердің қатысумен in vivо клеткаішлік аралығында және ұстауышқа бекітілген цитологиялық препараттарда макромолекулаларды ң түрін, мөлшерін анықтайды. 106

Токсиндер және радионуклеотидтермен байланысқан антиденелерді терапияда пайдаланады. Антиденелердің көмегімен зақымданған нысана-клетка немесе нысана-ұлпаға улы заттар жеткізіледі. Ақуыз инженерияның жаңа тиімді әдістері, соның ішінде әртүрлі дисплей мен кездейсоқ ақуыз тізбектерінің клонотекаларының негізінде ақуыздардың сұрыптау жүйелері, жануарлардың иммундауын жүргізбей қажет ерекшелігі бар антиденелерді тікелей фагөлшектерінің б суспензиясынан бөліп алу мүмкіндік берді. Сонымен бірге in vivo жағдайда имуногенді емес антигендергеқарсы жаңа ерекшелігі бар ақуыздарды алады. Тірі организмнің иммундық жауаптың ерекше қасиеттері антиденелерінің өндірісіне шек қояды, ақуыз инженерияның жаңа тәсілдері осы шекттерді жоюға мүмкіндік ашады. Соңғы жылдарда көп түрлі жаңа касиеті бар рекомбинанты антиденелер жасалды: молекулаларының салмағын төменд етті, антиденелерді поливаленті гибридті молекулалармен біріктіріп олардың антиденемен байланысу кабілеттін жоғарлатты. Макромолекулаларды керек жерге жеткізуін қамтамасыздандыру үшін антиденелердің фрагменттерін генді-инженериялық әдістердің көмегімен әртүрлі аминқышқылы тізбектерімен біріктірді. Осындай гибридті молекулаларының құрамына, антиденелерден басқа, генотерапияда пайдаланатын ферментердің әсерінен активтенетін цитотоксикалы қ дәрі препараттар, токсиндер, вирус бөлшектерінің ақуыздары кіреді, және химиотерапияның тиімділігін жоғарлату үшін өздері липосоманың құрамына енгізіледі. Рекомбинанты антиденелерді биосенсорларды алу үшін пайдаланады. Биосенсорларды зерттейтін молекулалардың, соның ішінде денсаулыққа қауіпті айналадағы ортаны ластайты н заттардың мониторингін жүргізгенде қолданады. Қазіргі замаңғы иммунодиагностиканың 30%-тен жуық жүйелерінде рекомби нанты антиденелердің фрагментерін қолданады. Рекомбинанты антиденелердің негізгі сипаттамасы - бір белгілі антигенге бағытталған ерекшелігі. Бұдан басқа рекомбинанты антиденелердің эффекторлық қызметті атқаратын қабі леттілігі болу керек. Рекомбинанты антиденелердің эффектор лық қызметіне олардың константы аймақтары жауапты. Адам иммуноглобулиндердің IgG класы төрт подкласына бөлінеді 107

(төрт изотипы) IgGl-IgG4. Изотиптердің айырмашылығы эффекторлық клеткаларының (макрофагтардың, табиғи киллердің) сыртында орналасқан Fc -рецепторларымен олардың әрекетте суіне және комплементті бекіту қабілетіне байланысты. Рекомбинанты антиденені ң пайдаланатын изотипының түрі шешілетін мәселеге тәуелді. Мысалы, антиденелердің көмегімен нысанаклетканы (мысалы ісік клетканы) жоюүшін иммуноглобулин дердің IgGl изотипін алады. IgGl изотипы Fc-рецептормен тиімді әрекеттеседі және комплементі бекіттіреді, сонымен киллер клеткаларды жұмылдырады. Антиденелер лигандыны рецептормен әрекеттесуінен сақтап қалу үшін қажет болғанда, онда олардың IgG4 немесе IgG2 изотиптерін алады. Осыған байланысты трансгенді тышқандардың бірнеше линиялары алынды, әр линияның тышқандарында адам антиденелерінің бір белгілі изотипы түзіледі. 6.6 Каталитикалық антиденелер Каталитикалық антиденелер - бұл биокатализатор ретінде қызмет атқаратың антиденелер, биокатализаторлардың бір түрі. Биология ғылымының саласы каталитикалық антид енелерді зерттеумен 20 жылға жуық шұғылданып келеді. Антиденелердің ферменттік белсенділігін көрсету қабілеттілігін Р.А.Лернер мен П.Г.Шультц басқаратын екі топ зерттеушілері 1986 жылы анықтады. Осы уақыттан бастап ақуыз инженерияның жаңа бағытты дамиды, иммуноглобулиндердің полипептидтік тізбектерінің негізінде жасанды ферменттерді құратын болды. Жасанды ферменттерді каталитикалы қ антиденелер немесе абзимдер деп атады. Абзимдер адам организмінде де табылды. Адамда каталитикалық антиденелердің пайда болуы кейбір кең таралған ауруларға байланысты. Қазіргі күнде каталитикалық антиденелерді биологияның бір перспективті бағытты деп санайды. Каталитикалық антиде нелерін пайдалануы фундаменталды ж әне қолданбалы жұмыстар үшін жаңа мүмкіндік ашады. Бұл биологияның саласында иммунология, энзимология, молекулярлы биология, генетикалық инженерия, органикалық химияның элементері қиылысады. 108

Ғылыми осы бағыттың теоретикалық негізі н 50 жылдан астам ертеде жүргізген зертеулерде ферменттер мен антиденелеріні ң қасиеттерін салыстырып алынған қорытындылары құрды. 1948 жылы Лайнус Полинг ферменттің және антиденелер дің, организмде әртүрлі қызмет атқараты н ақуыздардың екі тобының арасында маңызды айырмашылық: ферментті ң өзінің ерекше субстраттына комплементарлығы қатал емес , ал антиденелер өзінің гомологты антигеніне бағытталған ұқсастығы жоғары болатындығын ұсынды. Ферменттің белсенді орталығы мен реакцияны ң аралық күйінің арасында берік байланыс түзіледі. Айтқан қорытындыны энзимологияның дамуы дәлелдеді. Қазіргі күнде фе рменттердің қызметі механизмінің негіздері мен антиденелер қызметінің молекулярлы механизм і анықталған. Осы мәліметтерді негізге алып ферменттер мен антиденелердің қандай ұксастығы және қандай айырмашылығы бар айтуға болады. Осы мәселені қарастырайық. Ферменттердің және антиденелерінің жалпы қасиетіне: екі топтың ақуыздардың, ферменттер мен антиденелер молекулаларының ерекше кеңістік құрылымы және олар ерекше лигандларды (ферменттер - субстратты, антиденелер - антигенді) байлайтын қабілеті жатады Фермент құрылысының ерекше сипаттамалары: фермент молекуласының көбісі α-спираль, β-құрылым және ілгіш ілгектерден құрылады. Әр ақуыздың кеңістік құрылымы бірегей және түрақты келеді. Фермент молекуласы табиғи конформациясына үбктелгенде бірінен -бірі қашық орна ласқан жеке аминқышқылдарының бүйірлік топтары өзара жақындайды нәтижесінде активті орталығы түзіледі. Активті орталығының ерекше белсенді ңістік ке құрылымының түзілуі фермент субстрат және кофактормен немесе кофактормен әрекеттесу процесінде аяқталады. Ферменттің активті орталығының ерекше конформациясы субстратпенәрекеттесу нәтижесінде қалыпта сады, яғни субстраттың әсерінен ферменттің кеңістік құрылы мында ерекшеөзгерістер жүзеге асады да активті орталығы түзіледі. Сонымен ферменттің субстратпен әрекеттесуі «құлып пен кілт» үт рінде жүзеге аспайды. 1890 жылы Эмиль Фишер ұсынған «құлып пен кілт» моделі ферменттік катализ барысында іске асатын конформациялы қ өзгерістерді елемейді, ал 109

активті орталығының реакция бойы конформацияның өзгерісі іске асу үшін өте маңызды болады. Антидене құрылымының ерекше сипаттамаларын қарас тырайық. Организмде түзілетің антиденелер 5 класқа: ІgG, ІgA, ІgM, ІgD, ІgE бөлінеді, негізгі кластарына ІgG, ІgA, ІgM жатады. Әр кластың молекулалары (мысалы, иммуноглобулин G, ІgG) бірыңғай құрылымына ие болады. Бұл ең басты антиденелер мен ферменттердің айырмашлығы. Антиденелердің молекулалары екі ауыр (55 кДа) және екі жеңіл (25 кДа) полипептидтік тізбегінен құралады (22-сурет). Полипептидтік тізбектері дисульфид өкпіршілермен байл анысқан. ІgG молекуласының кеңістік құрылымы β-қатпарланған жапырақ және ілгектерінен құрылған; α-спиральді бөліктері болмайды. Иммундык жүйе иммуноглобулиндердің өте көп түрін синтездейді. Антидене молекулаларында же ңіл мен ауыр поли пептидтік тізбектерінде константы (тұрақты) және құбылмалы (өзгеретін) бөліктері болады. Әртүрлі антиденелердің молекулаларының айырмашылығы өзгеретін (құбылмалы, VH, VL) бөліктеріне байланысты. Иммуноглобулин молекулаларында құбылмалы бөліктері N-соңғы жағында орналасады (алғашқы 108 аминқышқылының қалдығы). Осы құбылмалы бөліктері көптеген әртүрлі гендермен кодталады. Антидене синтездейтін клеткалардың жіктелу процесі бойы құбылмалы бөліктерін кодтайтын көптеген гендердің біреуі молекуланың тұрақты (константы) бөлігін кодтайтын генімен байланысады. Осындай байланыстың комбинацияларының саны көп, әртүрлі клеткаларымен үт зілетін антиденелер түрлерінің көпшілігі осыған байланысты. Иммуноглобулин екі полипептидтік тізбегінің құбылмалы бөліктерінің (VH, VL) элементері біріккенде антигенді байлайтын орталы ғы құрылады. Антиген -антидене әрекеттесуінің ерекшелігіне L-тізбегінің үш бөліктері және Hтізбегінің үш бөліктері жауапты. Бұл бөліктерін гиперқұбылмалы бөліктері деп атайды. Молекуланың кеңістік құрылымында гиперқұбылмалы құрылымындары ілгек түрінде көрсетілген, ілгектер жоғары иілгіш және жылжымалы келеді.

110

Гиперқұбылмалы Құбылмалы домен

учаскілері

Топсалар

Ауыр Н-тізбік

Женіл L-тізбек

а

ә

Гиперқұбылмалы учаскілері

22-сурет. а) Иммуноглобин G (ІgG)-ның жалпы құрылымы; ә) VH доменнің құрылымы; б) VH менV L байланысып антигенбайлатын калтаны құру (Н. К Наградова мақаласынан алынған)

б Антидененің өзінің ерекше антигенің танып байлауы – бұл көпшілік құрылымдарының ішінен керек ғана антигенді ңе тығыз байлайтың құрылымды тандап алу. Иммундық жүйенің қабілеттілігі табиғаты әртүрлі бөтен қосылыстарды байланыстыруын қамтамасыздандыру осыған байланысты. Антиденелердің белсенді орталығы ерекше лигандымен әрекеттескенде түзіл мейді, ол алдын ала өмір сүреді. Сонымен антиденелердің активті орталығының кеңістік құрылымы лигандының құрылымына комплементарлы, яғни лиганд құрылымының негізгі күйіне 111

толық сәйкес болады да антиденелер антиген мен "құлып мен кілт" сияқты әрекеттеседі. Антиген ретінде жоғары молекулалы қосылыстар (белок, полисахаридтер т.б.) және макромолекулаларымен байланысқан төмен молекулалы заттар (гаптен деп аталатын) болуы мүмкін. Антидененің өзінің ерекше антигенімен әрекеттесуі ферменттің өзінің ерекше субстратымен әрекеттесуіне ұксас. Бірақ бұл екі ақуыздардың қызметі әртүрлі. Антиденелер антигенді байлайды да организмнен ғарып шы жібереді, ал фермент субстрат пен байланысып ңоныөзгерісін іске асыртады. Сондықтан антиденелер антигенді өте тығыз байлайды, ал фермент субстратпен әлсіз байланысады. Себебі тиімді катализ іске асу үшін ферменттің субстратпен берік байланысуы қарсы түрады. Ферменттік катализ іске асқанда, фермент пен субстрат байланысқанда, реакцияның аралық күйіне жақындағанда ең басты үші к энергияның өсуі болады. Осы субстратты байлайтың күшінің қүшеюі фермент катализдейтің реакцияның активтену энергиясының төмендеуінің себебі. Фермент лигандмен әлсіз ковалентсіз байланыстармен (сүтек байланыстар, гидрофобтыәрекеттесу, ван -дер-ваальс ж әне электростатиқалық әрекеттесу) байланысады. Фермент-субстрат комплекстің түзілуі жүйенің бос энергияның төмендеуімен қосарланып жүзеге асады. Субстраттың өнімге айналуын қамтамасыздандару үшін энергия жұмсалынады. Энергия әрекеттесетін топтарыны ң ориентациясына, тұрақсыз зарядтарының түзілуіне, байланыстардың орын алмастыруына т.б. пайдалынады. Реакцияға қатысатын қосылыстар осы энергиялық бөгетті жеңіп жоғары энергиялық денгейіне көтеріледі, яғни аралық күйіне өтеді. Субстрат молекуласы аралық күйіне өту үшін кажет энергия активтену энергиясы деп аталады. Аралық күйі – фермент пен субстратты ң қосылған күйін көрсететің геоме триялық және электрондық құрылым. Бұл күйінде реакцияласатын топтарының оптималды ориентациясы және байланыстардың үздіксіз түзілуі мен ыдырау жүзеге асады. Аралық күйінің концентрациясы менөмір сүру уақыты өте төмен, сондықтан қосылыстың аралық күйін белгілеу мен бөліп алу өте қиын. Реакцияның жылдамдығы активтену энергияның мөлшеріне тәуелді, активтену энергия неғұрлым жоғары болса, соғұрлым 112

реакцияның жылдамдығы төмен болады. Себебі, реакцияны ң жылдамдығы белсенді комплекстің концентрациясына тура пропорционалды, ал белсенді комплекстің концентрациясы активтену энергия ға кері пропорционалды. Ферменттердің катализатор ретінде қызметіні ң тиімділігі олардың реакцияның активтену энергиясынөмендету т қабілетіне байланысты. Ферменттердің әсерінен реакцияның тепе-тендігі аралық күйі жағына жылжиды, себебі ферменттер субстраттың аралық күйі құрылымын өте тығыз байлайды. Сонымен ферменттің активті орталығы субстраттың алғашқы құрылымына емес, аралық күйіне комплементарлы болады. Алғашқы рет бұл идеяны Полинг ұсынды, содан сон Д.Дженксон жалғастырды. Реакцияның аралық күйіне комплементарлы антиденелерді алу мүмкіншілігі туса, онда антиденелер аралық күйінің жетуін жылдамдатады да реакцияны катализдейді. 17 жылдан кейін бұл ұсыныстың туралығы тәжірибе арқылы сынауы жүзеге асырылды. 6.6.1 Каталитикалық антиденелерді құру үшін эксперименттік тәсілдер Каталитикалық антиденелерді құру үшін 1986 жылы нақтылы жағдайлар пайда болды. - Химиялық реакциялардың молекулалық механизмін түсіну үшін мәліметтер алынды және субстраттың аралық күйіндегі түрінің аналогтарының синтезі іске асырылды. Бұл аналогтар ретінде құрылымы тұрақты және субстраттың аралық күйінің құрылымына ұқсас қосылыстар алынды. - Құрылымы гомогенді антиденелерді алу әдістер ұсынылды. Құрылымы гомогенді антиденелер бір ғана клеткамен түзілетін антиденелер, яғни моноклоналды антиденелер. Моноклоналды антиденелер – бір ғана В -жасушаның ұрпақтарымен, бір ғана антиген детерминатына (эпитопқа) қарсы түзілген антиденелер, иммуноглобулиндердің бір класына жатады, олардың құбылмалы бөліктері, құрылымы, идиотипы, аффиндігі бірдей, бір эпитопты (детерминанттық топты) таниды. Қазіргі күнде моноклоналды антиденелерді ң түзушілері (продуценттері) ретінде гибридомалардықолданады. Монокло налды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды В-лимфоциттерді плазмоцитомаларымен қосқанда алады. Плазмоцитома 113

мен В-лимфоциттердің генетикалық қасиеттері, жіктелуқабі леттілігі ұқсас және плазмоцистоманың аппараты иммуногло булиндердің синтезіне бағытталған. Плазмоцитома мен лимфоциттерді қосып алған гибридомалар ісік жасушалары сияқты шексіз бөлінеді, лимфоциттер сияқты антиденелерді синтездейтін қа білеттілігі болады. Гибридті жасушалар іn vіtro жа ғдайда ұрпақтанады, жеке гибридті жасушаның клоны синтездейтін антиденелер моноклоналды антиденелер болып табылады. Каталитикалық антиденелер бірнеше лабораторияларда ерекше зерттеу ар қылы алынды. Зерттеулердің нәтижесінде белгілі қасиеті бар биологиялық катализаторларды жасау үшін мүмкіндік ашылды. Бұл - биологияның жаңа ғылыми бағытты. Биологиялық катализаторларды абзим деп атады. Осы күнде он шақты әртүрлі реакцияларды катализдейтін абзимдер алынды. Абзимдердің мысаларын карастырайық. Каталитикалық белсенділігі реакциялардың аралық күйін тұрақтандыруына негізделінген абзимдер. 1. Феррохелатаза – гем биосинтезі жүзеге асырылғанда ең ақырғы реакцияны катализдейтің фермент. Феррохелатаза катализдейтін реакцияны N-метилпорфирин тежейді. N-метилпорфириннің құрылымы субстраттың аралық күйінің құрылымына ұксас келеді. N-метилпорфирин гаптен ретінде алынды да Nметилпорфиринге қарсы антиденелердің синтезі жүзеге асырылды. Антиденелер каталитикалық белсенді болды. Түзілген абзимдер тиімді биокатализатор ретінде қызмет атқару қабілеттілігін көрсетті. Феррохелатазаның белсенділігімен салыстырғанда алынған абзимдердің белсенділігі 10 есе ғана төмен. Осы жұмыстың нәтижесі феррохелатаза катализдейтін реакцияда түзілетін субстраттың аралық күйінің құрылымының дұрыстығын дәлелдеді. 2. Хоризматмутаза – Клайзен орын алмастыру реакцияны катализдейтін фермент. Хоризматмутазаны ң субстраттың аралық күйінің аналогының синтезі жүзеге асырылды. Бұл қосылыс хоризматмутазаның күшті тежегіші ретінде әсер ететін зат болып шы қты , субстратқа қарағанда ферментпен 100 есе орнықты байланысады. Аралық күйінің аналогына қарсы антиденелер алынды, анденелерінің арасында абзимдер табылды. Бұл абзимдер хоризматмутаза катализдейтін реакцияның жылдамдығын 1000 есе тездетті. Бірақ табиғи ферментінің 114

әсеріне қарағанда алынған абзимдердің көмегімен іске асатын реакцияның жылдамдығы 1000 есе төмен болады. Белсенділігі нуклеофилді катализмен байланыс қан абзимдер. Субстраттың аралық күйін тұрақтандыруы ферменттік катализді ң маңызды факторы. Ферменттердің көбісінің әсерінде басқа да химиялық катализдің элементері мағынасы зор, мысалы қышқылдық -негіздік катализ, коваленттік катализ. Кейбір абзимдер химиялық катализдің элементерін пайдалана тың қабілетіне ие екені белгілі болды, мысалы, карбон қышқылының күрделі эфирлік байланыстарды гидролиздейтін антиденелер. Бұл абзимдер туралы ең бірінші мәлімет баяндалған. Теоретикалық түсінік бойы ацил тобының су молекуласына тасымалдау реакцияның мех анизмінде тетраэдрқұрылымды карбонил тобының оттегі атомында теріс заряды бар аралық күйі түзіледі. Карбонил тобындағы теріс зарядының тұрақтандыруы реакцияны үзеге ж асыру үшін өте маңызды белгісі болады. Эстеразаның активті орталығымен байланысуы аралық күйін тұрақтандыратынына болжам жасалды Фосфанат эфирлері эстераза катализдейтің реакцияларының күшті тежегіштері, сондықтан бұл қосылыстар фермент пен тығыз байланысады. Фосфат эфирлерінің құрылымының аралық күйінің құрылымына ұксастығы дәлелденген. Гаптен ретінде фосфонат эфирлерінің пайдаланып эстеразалық белсенді антиденелерді алды. Абзимдердің қасиетін зерттеп: абзимдердің тиім ділігі эстеразаның тиімділігіне жақын екендігі, катализ бағыт тында субстраттың ацил тобы абзиммен ковалентті байланыса тындығы анықталды. Осындай механизм серин протеиназаларының нуклеофилді катализінде іске асады. Қазірге күнде абзимдерді табиғи ферментермен салыстырып жетілмеген биокатализаторлар деп санайды. Абзимдердің қасиеттерін зерттеуі ферменттердің қасиеттерінің эволюция барысында жетілдіру механизмін үсіну т үшін бір тәсілі деп саналады. 6.6.2 Каталитикалы қ антиденелерді жақсарту үшін қолданатын экперименттік тәсілдер Қазіргі күнде антиденелерінің каталитиқалық қасиеттерін тәжірибелік арқылы жетілдіру үшін қолданатын жолдарын қысқаша карастырайық. 115

Абзимдердің активті орталығына ерекше функционалды топтарын енгізіп олардың қасиеттерін жақсарту мүмкін. Ерекше функционалды топтары активті орталықтарына кіреді де әртүрлі химиялық катализді жүзеге асыру үшін ферменттің қабілеті дамиды. Мысалы, "baіt and swіtch" (өзіне тарту және қосу) деген тәсіл. Бұл әдістің негізіне ерекше гаптенмен тышқандардың иммундауы алын ған. Гаптен ретінде қосымша заряды бар субстраттың аралық күйінің аналогын қолданады. Егерде қосылыстың заряды он болса, түзілген антиденелердің молекулаларында гаптенмен байланысатын өліг б інде теріс зарядталған топтары болу мүмкін. Бұл топтары (мысалы карбоксил топтары) абзимнің активті орталығында дұрыс орналасса, онда олар катализ процесіне қатысу мүм кін, сонымен абзим катализді ң тиімділігін ұлғайтады. Абзимдердің активті орталығына ерекше функционалды топтарын (кофакторларды, металл иондарын) химиялық түрөзгеріс әдістерді және әртүрлі молекулярлы биологиялық тәсілдерді қолданып енгізеді. Антиденелерді кодтайтын гендердің құрылымымен жұмыс істеу мүмкіншілігі жаңа әдістерге жол ашты, мысалы абзим дердін активті орталығына полипептидтік тізбегінің фрагмен терін енгізу мүмкіндігі пайда болды. Әртүрлі тәсілдерді қолда нып табиғи ферменттердің қасиеттері не ұқсас абзимдерді алуы қамтамасыздандырылады. 6.6.3 Абзимдерді практикада қолдану Каталитикалық антиденелер практикада пайдаланатын болашағы зор затарға жатады. Тірі организмде мыңданған реакциялары жүзеге асады. Әр реакцияны ерекше фермент катализдейді. Іn vіtro жағдайда жүзеге асатын химиялық реакциялардың түрлері одан да көп бол ады. Қазіргі күнде химиялық реакциялардың көбісін катализдейтін абзимдерді алу мүмкіншілігі ашылды. Сонымен бірге абзимдерді ң негізінде ғылым мен практикада қолданатын жаңа биокатализаторларды алу ға болады. Органикалық химияда абзимдердің көмегімен: - Химиялық катализдің ерекшелігін ұлғайту мүмкін, мысалы, на қтылы аминқышқылы қалдықтарының арасындағы пептидтік байланыстарды ерекше гидролиздеу үшін; 116

- Энантиомерлерді бөлу. Энат иомер дегеніміз – бұл ассиметриялық көміртегі атомы бар қосылыстарының стереоизомерлері. Ферменттер сияқты абзимдердің бір маңызды қасиеті – стереоерекшілігі. Абзимдер бір энантиомерді 1000 есе берік байлайтындығы анықталды. Оптикалық белсенді заттарды таза күйінде алу өте киынға түседі. Бұл мәселенің шешудің маңызы зор, себебі кейбір әрілердердің д молекулалары екі энатиомер түрінде алынады. Бірақ энантиомердің бір ғана түрі белсенді, ал екінші изомері зияндыәсерін көрсету мүмкін. Мысалы, адре налин деген дәрі L - мен D-изомерлері белгілі. D-изомері ғана фармакалогиялық белсенді, дәрі ретінде тиімді пайдалынады. Сондықтан ерекше селективті абзимдерді қолданып таза энантиомерлерді алу практиқалық манызды жолы болады. - Кейбір қосылыстардың химиялық өзгерістері өте қиындау жүреді. Егерде бір қосылыстың химиялық өзгеруі бірнеше жолдар арқылы жүзеге асады, мысалы, А субстраттан бір уақытта В, С, Дөнімдер түзіледі, яғни А субстрат үш түрлі химиялық реакция ар қылы өзгереді. Катализатор болмаса активтену энергиясы ең төмен химиялық реакция (мысалы, В өнімдің түзілуі) іске асады. А → С реакцияда үтзілетін аралық күйін берік байланыстыратын абзимді пайдаланып осы реакция арқылы А заттың өзгеруін қаматамасыздандырылады. Сонымен абзимдерді қолданып субстр аттың кинетикалық пайдалы емес жолымен өзгеруі жүзеге асырылады. Биотехнология мен медицинада абзимдерді пайдалану болашағы өте зор. Себебі, абзимдер барлық химиялық реакция ларды, соның ішінде клеткадағы табиғи ферменттер қатыспайтын реакцияларды катализдеу қабілетті. Клетка ішіне белсенді каталитикалық антиденелерді енгізу мүмкін бе? Бұл сұраққа келесі зерттеу ар қылы жауап алды. Бір құрылымдық генінде мутациясы бар ашытқының мутанты штаммды алды. Мутанты штаммда хоризматмутаза ферментті кодтайтын гені белсенді емес, сондықтан аромат қышқылдарын синтездейтін қабілетті болмайды. Генно-инженериялық әдіс пайдаланып ашытқы клеткасының генетикалық аппаратына хоризматмутазалық белсенділігі бар абзимдің геннін енгізді. Абзим геннін айқындалуы арқылы клеткада хоризматмутазаға ұқсас катализатор түзілді де клеткада ароматқышқылдарының синтезі жүзеге асырылды. 117

Жұмыстын нәтижесінде мынадай қорытынды жасады: эукариот клеткаларда әртүрлі химиялық реакцияларды катализдейтін жаңа катализаторлардың синтезін жүзеге асыру мүмкіншілігі бар. Каталитикалық антиденелерді ауруларды емдеу үшін де қолдануға болады. Организмнің иммундық жүйесі антиденелерді синтездейді. Антиденелер организмде зиянды токсиндерді, бактерияларды, вирустарды немесе рак клеткаларын байлайды да зиянды әсерін төмендетеді немесе толық жояды. Организмде зиянды затардың ыдырауын катализдейтін абзимнің синтезін жүзеге асырса иммундық жүйені жетілдіру мүмкін. Осындай каталитикалық антиденелердің каталитикалық белсенділігі төмен болу мүмкін; зиянсыз гаптеннің коньюгаттын енгізу арқылы ұзақ эффектін қамтамасыз етеді. Басқа тәсілдің негізі адам организміне абзимді енгізу. Бұл тәсілдің қолдануы меди цинада пайдалануға қолайлы моноклоналды антиденелердің алу әдістерін өндіруіне тәуелді. Адамдардың монокло налды антиденелерді алу өте күрделі, оған қол жетіңкіремейді, сондықтан тышқандарды иммундау арқылы антиденелерді алады. Иммунологиялық сәйкессіздігінің дәрежесін төмендету үшін генді-инженериялық әдістерді пайдаланады. Бұл әдістер "химерлы" немесе "гуманизмдалынған" антиденелерді алуға мүмкіншілік береді. Алынған антиденелерде тышқандардың және адамдардың антиденелерінің құрылымының элементері қосылады. Адам N-сонғы құбымалы бөліктерінен басқа антиденелердің молекуласы ауыр және жеңіл тізбектерінің элементерін сақтайды.. Осы вариабельді бөліктерінің орнына тышқан моноклоналды антиденелерінің ұқсас вариабельді бөліктерін енгізеді. Сонымен адам антиденесіқантыш антидененің антигенді байлайтын орталы ғына ие болады. Жақсатырылған "химерлы" антиденелерінің варианты ретінде келесі антидене алынған: антигенді байлайтын орталығын құратын гипервариабельді элементеріғана тышқан антиденің бөліктері болады. Осындай антиденелер вирустық ауруларды емдегенде пайдала нады, абзимдер емдеу препараттарыны ң ішінде ө те манызды препараттарға жатады Қазіргі күнде абзимдер катализдейтін 60 реакциялар белгілі. Абзимдердің каталитикалық тиімділігі табиғи ферменттерге қарағанда төмен емес, ал ерекшелігі табиги ферменттердің 118

ерекшелігінен жоғары болады. Абзимдер барлық реакцияларды катализдеу үшін жасалу және көп мөлшерде дайындалу мүмкін. Химиктер мен иммунологтар бірігіп каталитикалы қ антидене лерді жақсарту жолдарының ғылыми негізін жасау үшін ерекше зерттеу ж үргізеді. Абзимдер, жасанды биокаталитизаторлар биология, химия, өнеркәсіпте, медицинада қең пайдаланатын заттар. Мүмкін ХХІ ғасырда абзимдер биотехнологияның ен маңызды құралы ретінде пайдаға асар. Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары

1. Ақуыз инженериясы әдістерімен алынған ақуыздырдың түрлері, мысалдары. 2. Химиялық түрөзгеріс әдіспен ақуыздың қасиеттерін өзгерту мысалдары. 3. Гибридты ақуыздарды құрастыру тәсілдері, олардың мысалдары. 4. Жасанды ақуыздар, алу тәсілдің сипаттамасы, мысалдары. 5. Антиденелер, олардың құрылымы мен қасиеттері. 6. Ферменттер мен антиденелердің құрылымын және қасиеттерін салыстырып, олардың ұқсастығы мен айырмашылығын түсіндіріндер. 7. Абзим деген не, жасандыәнеж табиғи абзимдердің сипаттамасы, мысалдарын келтіріңдер. 8. Каталитикалық антиденелер, алу және қасиеттерін жақсарту әдістері, мысалдары. 9. Абзимдердің қолданбалы мағынасы

119

ӘДЕБИЕТТЕР Негізгі әдебиеттер 1. Финкельштейн А. В., Птицын О. Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями. - М.: Книжный дом «Университет», 2002.-376 с. 2. Проблема белка. Т.2. Пространственное строение белка. Ред.Т.И.Соркина. М., Наука, 1996. 3. Мюлберг А.А. Фолдинг белка. Санкт-Петербург.-2004. 156 С. 4. Бландел Т., Джонсон Л. Криеталлография белка. – М.: МИР, 1979. 5. Компьютеры и суперкомпьютеры в биологии / Под редакцией В. Д. Лахно и М. Н. Устинина. — Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2002, 528 стр. 6. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.А. Молекулярная биология. ООО «Мед.информагенство». -2003. 535 С. 7. Ю.А.Овчинников, "Биоорганическая химия" М. Просвещение, 1987 г. 8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Москва: Мир. 2002. Қосымша әдебиеттер 1. Корнелюк А.И. Белковая инженерия // Биополимеры и клетка. - 2001. Т. 17, № 6. – С. 459-466. 2. Финкельштейн А.В.. Введение в физику белка. http://phys. protres. ru /lectures/protein_physics/ 3. Наградова Н. К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков // Соросовский образовательный журнал. Биология: - 1996. № 7. – С. 10-18. 4. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Птицын О.Б., Федоров А.Н., Финкельштейн А.В. Черемис В.В. Белок de novo с заданной пространственной структурой: новые подходы к конструированию и анализу. – Молекулярная биология. – 1992. - Т. 26, № 6. - С. 1242-1250. 5. Колб В.А. Котрансляционное сворачивание белков // Молекулярная биология. -2001. –Т. 35. №4. –С. 682-690. 6. Башаров М.А. Концепция посттрансляционного сворачивания белков: насколько она реалистична? // Биохимия. -2000. –Т. 65, Вып. 10. –С. 1400-1408.

120

7. Варфоломеев С.Д., Упоров И.В., Федоров Е.В. Биоинформатика и молекулярное моделирование в химической энзимологии. Активные центры гидролаз // Биохимия. – 2002. –Т. 67. –Вып. 10. –С. 1328-1340. 8. Шайтан К.В., Терёшкина К.Б. Молекулярная динамика белков и пептидов. М.: Ойкос, 2004.-103с. 9. Владимиров Ю.А. Зачем нужна белковая кристаллография // Ж. Природа 2003 №11, / http://vivovoco.rsl.ru 10. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н., Березин И.В. Общие закономерности изменения термостабильности белков и ферментов после химической модификации их функциональных групп // Успехи химии, 1984, Т. 53, № 11. – С. 1852-1890. 11. Медведкин В.Н. Полусинтез белков и пептидов // Биоорганическая химия. – 1989, Т. 15 №5. - С. 581-614. 12. Щуров. Каталитические антитела // Молекулярная биология. – 1997. –Т.31, - №1. - С.5-14. 13. Chugunov A.O., Chavatte P., Farce A., Efremov R.G. (2006). Differences in binding sites of two melatonin receptors help to explain their selectivity to some melatonin analogs: a molecular modeling study. J. Biomol. Struct. & Dynamics 2006. №24. –С. 91-108.

121

СӨЗДЕРДІҢ ТҮСІНДІРМЕСІ (Глоссарий)

Абзим – каталитикалық белсенді антиденелер. Активтену энергия – заттың бір моль мөлшеріне кіретін барлық молекулаларының активтену күйіне көшу үшін керек химиялық энергияның мөлшері (каллория түрінде көрсетіледі). Аминқышқылы – молекуласында амин (-NH2) және карбоксил (-СООН) топтары бар гетерофункционалды органикалық қосылыс. Аминқышқылы қалдығы - полипептидтiк тiзбектiң құрамына кiретiн аминқышқылының бөлiгi. Автоматты дизайн – жасанды эволюцияның бір атауы. Ақуыз дизайн – керек кеңістік құрылымын құру үшін қажет аминқышқылы бірізділігін құрастыру. Ақуыз инженериясы - гендік инженерияәдістерді қолданып табиғи ақуыздардың қасиеттері мен қызметін өзгерту, жасанды және химерлы (гибридті) ақуыздарды алу. Ақуыз молекуласының бiрiншi реттiк құрылымы – полипептидтiк тiзбекте амин қышқылдарының белгiлi бiр ретпен жалғасып орналасуы, (полипептидтiк тiзбектегi аминқышқылдары қалдықтарының кезектесуi). Ақуыз молекуласының екiншi реттiк құрылымы – полипептидтiк тiзбекте к өршi орналасқан аминқышқылы қалдықтарының кеңiстiкте өзара орналасуы. Мысалы, ақуыз молекуласының спиральдануі немесе β-қатпарлы қабат түрiнде құрылуы. Ақуыз молекуласының конформациясы – полипептидтiк тiзбектегi атомдардың кеңiстiкте өзара орналасуы. Ақуыз молекуласының төртiншi реттiк құрылымы – белок молекуласы екi, үш, төрт немесе одан да көп полипептидтiк тiзбектен (субб өлiктерден) құрылған кезде полипептидтiк тiзбектiң әрқайсысының, өзiне ғана тән үшiншi реттiк құрылымға ие суббөлiктердiң өзара байланысып, кеңiстiкте орналасуы. Ақуыз молекуласының үшiншi реттiк құрылымы – полипептидтiк тiзбектегi алыс орналасқан аминқышқылы қалдықтарының кеңiстiкте өзара орналасуы, белок молекуласының архитектурасы, белок молекуласындағы полипептидтік тiзбектi ң табиғи жағдайдағы кеңiстiкте жинақталып, қомақталып орналасуы.

122

Альфа (α)-спираль – белоктың екінші реттік құрылымының элементі; полипептидтік тізбегінің оң жаққа бұрылған спираль, амино топтарының барлығы төртінші аминқышылы қалдығының карбонил тобымен сутек байланыстарды құрады. Анаболизм – клеткада органикалық заттардың синтезi жүзеге асатын ферменттiк реакциялардың жиынтығы. Антиген детерминанты (эпитоп) – антидененің әсері бағытталған антиген молекуласының бөлігі. Антидене - антиген ағзаға түскенде (енгенде) оған қарсы түзілетін және осы антигенмен ерекше байланысатын молекула. Антиметаболит – зат алмасу процесіні ң негізгі ферментін тежейтін зат. Антикодон – мРНҚ-ның құрамындағы кодонға (триплетке) сәйкес келетін тРНҚ молекуласындағы үш нуклеотидтен құралған бірізділік. Ақуыз рибосоималық биосинтез барысында полипептидтік тізбегіне қосылатын аминқышқылы түрін белгілейді. Антиподтар – айнада бейнелену үрiнде т өзара қатынасатын органикалық қосылыстың екi изомерлi түрi. Мысалы, L - және Dизомерлер. Апофермент – қүрделі ферменттің ақуыз бөлігі. Антиген (иммуноген) – антиденелердің синтезін қоздыратын зат. Ассимметриялық көмiртек атомы – төрт түрлi топпен байланысқан көмiртек атомы. Аутоиммунитет – ағзаның өзінің ақуыздарына қарсы иммундық жүйе реакциялары іске асады да, антиденелер түзіледі. Аутоиммунды аурулар – иммундық жүйенің реакцияларын қоздыратын аурулар, ағзаның өзінің ақуыздарына қарсы антиденелер түзіледі, мысалы, ревматоидті артрит. Ацилфермент – ферменттік реакция жүзеге асқандағы аралық қосылыс. Аффиндiк хроматография – екi заттың ұқсастығына негiзделген хроматография. Бағытталған мутагенез – бір белгілі ДН Қ бөлігін мутация нәтижесінде өзгертетін процесс. Бактериофаг – вирусты жұқтыратын бактерия. Бета (β)-құрылым (β-қабат, β-тяж) – екінші реттік құрылымының элементі, бұл құрылымында полипептидтік тізбегінің бір бөлігінің амидтік азоты екінші өлігінің б карбонил тобының оттек атомымен сутек байланысты құрады Буфер - Н+ немесе ОН- иондардың концентрациясы жоғарлағанда ортаның рН-ының өзгеруіне қарсы түратын жүйе 123

В-жасушалар (В-лимфоциттер) - антигенді байланыстыратын Gиммуноглобулинді синтездеп секреттейтін лимфоциттер. Вакцина (екпе) – жұқпалы ауруларға алдын ала арнайы иммунитет қалыптастыру үшін қолданылатын заттар. Вакцинация (егу) – жұқпалы аурулардан алдын ала сақтандыратын ерекше иммунопрофилактика. Вариабельді домендер - әртүрлі иммуноглобулиндерде аминқышқылдарының кезектесіп орналасуы өзгеше және олардың антигендік ерекшелігіне жауапты иммуноглобулиннің полипептидтік тізбектерінің N-соңында орналасатын бөліктері. Вектор – организмнің геном құрамында жоқ ДНҚ фрагменттің иесінің клеткасына енуін қамтамасыздандыратын түрөзгерген плазмида, фаг, вирус, ашытқы немесе бактерияның ДНҚ немесе РНҚ-сы. Гем – протопорфирин мен темiр атомынан құрылған хромопротеид белоктардың простетикалық тобы. Мысалы, гемоглобин, миоглобин молекуласының простетикалық тобы. Ген – ақпараттар белгiленген ДНҚ бөлiктерi. Генетикалық код – ДНҚ молекуласында 4 нуклеотид көмегiмен жазылған мәлiметтi полипептид тiзбегiндегi 20 аминқышқылының кезектесуiне көшiру ережесi. Гидрофобты әрекеттесу – сулы ортада полярсыз топтардың өзара тартылып қалыптасуы. Гендік иммундау – ақуыз-антигенді кодтайтын генді жасуша ға енгізіп, ағзаның иммундық жауабын қоздыру. Гибридома - екі түрлі, бірақ қасиеттері ұқсас, жасушаларының қосылуынан in vitro алынған гибридті жасушалық линиясы. Көбінесе лимфоциттермен ісік жасушалары (миеломды жасушалары) қосылу нәтижесінде гибридомаларды алады. Гибридті белок – бірнеше белоктардың домендерінен құрылған белок. Гидрофильный фрагмент – полярлы немесе зарядтал ған аминқышқылының бүйірлік тобы. Гидрофобты байланыс – су ортада полярсыз топтарды ң өзара әрекеттесуі. Гипер құбылмалы аймағы – иммуноглобулиндер мен Т-жасушалы қ рецепторларының V-домендерінің ұшында орналасқан ең құбылмалы бөліктері. Бұл бөліктер V-доменні ң дистальді бөлігінде бір-біріне өзара жақын орналасады және антиген байланыстыратын орталығын құрады. Денатурация – биомакромолекуланың (белоктың, ДНҚ-ның) табиғи құрылымының орта факторларының (рН, температура, детергенттер, органикалық тағы басқа агенттердiң) әсерiнен өзгеруi. 124

Дисульфидтiк байланыс (дисульфидтiк көпiршелер) – белок молекуласыны ң құрамында цистеин SH-топтары тотыққанда түз iлетiн байланыстар. Домен – өзінің үшінші реттік құрылымына бүктелген глобуллярлы белоктың бөлігі. Жылыту шок ақуыздары – стресс әсерінен клеткада түзілетін белоктар. Изоэлектрлiк нүкте – белок молекуласының жалпы заряды нөлге тең болатын кездегi ортаның рН мағынасы, ерітіндегі аминқышқылы барлық молекулалары биполярлы ион түрінде болады. Иммуноглобулин - ағзаға түскен бөтен затты танып жоюға жауапты қан сары суының ақуызы. Иммунотоксин – молекуласы иммуноглобуллин және полипеп тидтік токсинні ң бірсуббірлігінен құралған гибридті ақуыздық зат. Интерлейкиндер - иммундық жүйе жасушаларының арасында сигналды тасымалдануына қатынасатын заттардың тобы. Интерферон - жасушада вирусты ң әсерінен түзіліп, ортаға секреттелетін ақуыз. Каталитикалық антидене – каталитикалық белсенділігі бар антидене. кДНҚ –мРНҚ негізінде кері транскриптаза қатысуымен түзілетін комплементарлық ДНҚ, құрамында интрондар жоқ. Клон – бір аналы қ жасушадан шыққан, генетикалық ұқсас жасушаларының колониясы. Коваленттiк байланыс – екi атом арасында орта қ электрон жұбының түзiлуi арқылы пайда болатын химиялық байланыс. Кодон – бір амин қышқылын кодтайтын үш нуклеотидтер құрылған бірізділігі. Моноклоналды антиденелер - құрылымы, қасиеттері, антигеннің бір түрін байланыстыратын қабілетт ілігі бар иммуноглобулиндер. Бір жасушаның клоны синтездейді де секреттейді, гибридомаларды қолданып алады. Мутаген - ДНҚ негіздерін химиялық түрөзгерістің негізінде мутацияға ұшыратады. Мутант - мутация әсерінен тұқым қуалаушылық қасиеті өзгерген ағза түрі. Мутация - ұрпақта сақталатын генотиптің өзгеруі. Мутагенез – мутагендік фактормен алғашқы кездескенен бастап мутантты клон құрылғанға дейін торшада өтетін күрделі молекулалық процесс.

125

Пептидтiк байланыс – бiр аминқышқылының амин тобы мен екiншi аминқ ышқылының карбоксил тобы арасында түзiлген амидтiк коваленттiк байланыс, полипептидтiк тiзбекте амин қышқылдарының қалдықтарын бiр тiзбекке байланыстырады. Полинуклеотидтiк тiзбек – фосфордиэфирлiк байланыс арқылы байланысқан нуклеотидтердiң ұзын тiзбегi. Полипептидтiк тiзбек – пептидтiк байланыс арқылы жалғасқан аминқышқылдарының ұзын тiзбегi. Пострансляциялық модификациясы – белок молекуласының биосинтез біткеннен кейін коваленттік модификациялар ға ұшырауы. Бұл модификациялар белок молекуласының ерекше құрылымы түзілу үшін өте қажет. Прион – нейрологиялық ауруларды қоздыратын ақуыздық жұқпалы агент, мысалы, Альцгеймер, Крейцфельд-Джакоба аурулары. Протеолиз – ферменттердің қатысуымен жүзеге асатын ақуыздардың гидролизі. Рацематтардың қоспасы – екі энантиомерлердің эквимолярлы мөлшерінің қоспасы. Рецептор - жасушаның құрамына кірмейтін затпен ерекше байланысатын жасушалық жарғақшаның молекуласы. Ренатурация – денатурланған белоктың қалпына, нативті құрылымына қайтадан келу. Рибозим - каталитикалық белсенділігі бар РНҚ молекулалары. Рибосома – белоктың синтезі іске асатын клеткалық органелла. Сайт-бағытталған (сайт-ерекше) мутагенез – қажетті нүктелік мутацияның нәтижесінде геннің белгілі бір аймағын өзгертетін әдіс, полинуклеотидтік тізбегінде бір кодонды басқа кодонға ауыстыруына негізделеді. Скрининг – табиғи заттарды жинау және олардың биологиялық белсенділігін бірізділік бағалауы. Стереоизомер – молекулада бiрiздiлiкпен байланыс қан, бiр кеңiстiкте әр түрлi орналасқан атомдар. Сайт-бағытталған (сайт-ерекше) мутагенез – қажет нүктелік мутация нәтижесінде генді өзгерту техника; полинуклеотид тізбегінде бір кодонды басқа кодонға ауыстыру. Суббірлiк – белок молекуласы екi,үш, төрт немесе одан да көп полипептидтiк тiзбектен құрылған кездегі әр үшөлшемді қ ұрылымына сай келетін бiр полипептидтiк тiзбек. Транскрипция - ДНҚ молекуласының бір бөлігінің негізінде ізашар РНҚ молекуласының синтезі (ақпараттың ДНҚ -дан иРНҚ -ға көшуі). 126

Трансляция – мРНҚ-ны матрица ретінде пайдалана отырып белоктың синтезі (ақпараттың и-РНҚ-дан белоққа көшуі). Ұқсастығы (гомологичность) – аминқышқылдардың бірізділігі ұқсас ақуыздар. Ферменттi ң активті орталығы– субстратпен ерекше байланысатын және құрамында субстраттың өзгерiсiн жүзеге асыратын аминқышқылы қалдықтарының бүйiрлiк топтары бар фермент молекуласының бөлiгi. Фолдинг – полипептид тізбегіні ң үш өлшемді кеңістік құрылымына бүктелуі. Шаперон – полипептидтік тізбегінің дұрыс бүктелуін қамтама сыздандаратын күрделі жүйе. Шарнир (топса) учаскесі - иммуноглобулин молекулаларының ауыр тізбектерінің аймағы, Fc және Fab -фрагментерінің аралығында орналасады. Молекуланың иілгіштігін қамтамасыздандырады және екі антигенді байланыстыратын орталы қтарының тәуелсіз қызметі атқаруына мүмкіндік береді. Әдетте жеке экзондарымен кодталады. Штамм – генетикалық ұқсас микроорганизмдердің себіндісі. Экспрессия – геннің негізінде гендік өнімнің (ақуыз немесе РНҚ) түзілуі . Экспрессия векторы – ақуызды кодтайтын генетикалы қ мәліметті басқа клеткаға тасымалдау үшін пайдаланатын плазмида немесе бактериофаг. Электростатикалық әрекеттесу – кері зарядталған иогенді топтарының өзара әрекеттесуі, мысалы ақуыз молекуласындағы ааминқышқылы қалдықтарының бүйірлік топтарының арасында (оң зарядталған лизин қалдығының ε-аминотобы және теріс зарядталған аспарагин қышқылының карбоксилтобының арасында). Электрофорез – биополимерлердi молекулалы қ салмағына, зарядына, пiшiнiне байланысты электр тогыөрiсiнде жiктеудi жүзеге асыратын құрал. Эпитоп – антиденелерді ң антигенді байланыстыратын орталығымен немесе Т-жасушалық рецепторымен әрекеттесетін, иммундық жауапты қоздыратын антиген молекуласының бөлігі.

127

МАЗМҰНЫ КІРІСПЕ ...............................................................................................3 1. Ақуыздардың фолдингі .................................................................5 1.1 Ақуыз фолдинг модельдері ............................................................7 1.2 Полипептидтік тізбегінің нативті конформациясына бүктелу кезеңдері ..................................................................................10 1.3 Бүқтелу процесінің реттеу механизмдері ....................................15 1.3.1 Пептидил-пролил-цис-транс-изомераза (ротамаза) ..................16 1.3.2 Ақуыз-дисульфидтік изомераза..................................................19 1.3.3 Шаперондар және шаперониндер ............................................21 Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары............................27 2. Ақуыз молекуласының кеңістік құрылымын зерттеу әдістері ....................................................................................28 2.1 Рентгенқұрылымдық талдау .........................................................28 2.2 Ядролық магниттік резонанс ........................................................36 2.3 Ақуыз кеңістік құрылымын компьютермен алдын ала болжау және модельдеу .......................................................................37 2.4 Ақуыз құрылымын компьютерлік арқылы әрлендіру ................41 Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары............................47 3. Ақуыздың химиялық түрөзгерісі. Ақуыз функционалды топтарының химиялық түрөзгерістің типтік реакциялары ......48 3.1 Химиялық түрөзгеріс көмегімен ферменттің белсенділігін жоғарлату .......................................................................49 3.2 Фермент молекуласының үстіңгі бетінің қасиеттерін өзгерту ..49 3.3 Ферменттің ерекшелігін өзгерту ...................................................51 3.4 Коферменті қосу .............................................................................52 3.5 Фермент белсенділігінің жаңа түрлері..........................................52 3.6 Сусыз (органикалық) ортада қызмет атқару үшін ферменттерді оптимизициялау ............................................................53 Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары............................53 4. Ақуыздар және пептидтердің химиялық синтезі ....................55 4.1 Пептидтік синтезінде пайдаланатын қорғаныш топтар .............59 4.2 Пептидтік байланысты құру әдістері ...........................................61 4.3 Ақуыздар және пептидтердің ферменттік синтезі ......................66 4.4 Ақуыздар және пептидтердің жартылай синтезі .........................68 4.5 Циклопептидтердiң синтезi ...........................................................72 128

4.6 Гетеродет пептидтердiң синтезi ....................................................72 Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары............................73 5. Бағытталған мутагенез және ақуыздардың гендік инженериясы .......................................................................................74 5.1 Бағытталған мутагенез: методикасы .............................................75 5.1.1 М13 фагтың ДНҚ-ның негізінде олигонуклеотид-бағытталған мутагенез .............................................76 5.1.2 Плазмидалық ДНҚ-ны пайдаланатын олигонуклеотид-бағытталған мутагенез .............................................81 5.1.3 ПЦР-амплификацияны пайдаланатын олигонуклетид-бағытталған мутагенез ...............................................83 5.1.4 Азғындаған олигонуклеотидтік праймерлерді пайдаланатын кездейсоқ мутагенез ....................................................84 5.1.5 Нуклеотидтердін аналогтарын пайдаланатын кездейсоқ мутагенез .............................................................................86 5.2 Сайт-ерекше мутагенезбен алынған мутанты ақуыздардың химиялық түрөзгерісі ...........................................................................87 Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары............................88 6. Ақуыз инженериясы әдістерімен өзгерген ақуыздарды алу ..89 6.1 Ақуыздың түрөзгерісі .....................................................................89 6.2 Гибридті ақуыздарды құру ............................................................98 6.3 Жасанды ақуыздар ..........................................................................104 6.4 Вакциналық препараттар ...............................................................105 6.5 Рекомбинанты антиденелер ...........................................................106 6.6 Каталитикалық антиденелер ..........................................................108 6.6.1 Каталитикалық антиденелерді құру үшін қолданатын эксперименттік тәсілдер ......................................................................113 6.6.2 Каталитикалық антиденелерді жақсарту үшін қолданатын эксперименттік тәсілдер ......................................................................115 6.6.3 Абзимдерді практикада қолдану .............................................116 Өзін-өзі бақылау және білімін тексеру сұрақтары............................119 Әдебиеттер ...........................................................................................120 Сөздердің түсіндірмесі........................................................................122

129

Оқу басылымы

Карпенюк Татьяна Анатольевна Бейсембаева Роза Ұлтубайқызы Гончарова Алла Владимировна

АҚУЫЗ ИНЖЕНЕРИЯСЫ Оқу құралы Редакторы Самат Қалуов Компьютерде беттеген Тұраш Сапарова ИБ № 4747 Басуға 28.12.2009 жылы қол қойылды. Пішімі 60х90 1/16. Көлемі 8,125 б.т. Офсетті қағаз. RISO басылыс. Тапсырыс № 63. Таралымы 130 дана. Бағасы келісімді. Әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университетінің «Қазақ университеті» баспасы. 050040, Алматы қаласы, әл-Фараби даңғылы, 71. «Қазақ университеті» баспаханасында басылды

130

Т.А. Карпенюк Р.Ұ. Бейсембаева А.В. Гончарова

АҚ У Ы З ИНЖЕНЕРИЯСЫ Оқ у қ ұ р а л ы

131