Белковая инжинерия: учебное пособие. 9965309884, 4310020000

Citation preview

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени АЛЬ-ФАРАБИ

Т.А. Карпенюк, Р.У. Бейсембаева, А.В. Гончарова

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Учебное пособие

Алматы «Қазақ университеті» 2010 1

ББК 28. 0я73 К 12 Рекомендовано к изданию Ученым советом биологического факультета и РИСО КазНУ им. аль-Фараби

Р е ц е н з е н т ы: доктор биологических наук, профессор А.А. Жубанова; доктор биологических наук Б.К. Искаков; кандидат биологических наук С.И. Абугалиев

К 12

Карпенюк Т.А. и др. Белковая инженерия: учебное пособие/Т.А. Карпенюк, Р.У. Бейсембаева, А.В. Гончарова. – Алматы: Қазақ университеті, 2009. – 120 с. ISBN 9965-30-988-4 Учебное пособие подготовлено для студентов-биотехнологов (бакалавриат, магистратура), биологов, медико-биологов, изучающих дисциплину «Белковая инженерия».

К

4310020000 - 064 008 - 06 460(05) - 10

ББК 28. 0я73

© Карпенюк Т.А., Бейсембаева Р.У., Гончарова А.В., 2010 © КазНУ им. аль-Фараби, 2010

ISBN 9965-30-988-4

2

ВВЕДЕНИЕ Белковая инженерия – новая область молекулярной биологии и биотехнологии. Она возникла как синтетическая наука и вобрала в себя последние достижения генной инженерии, структурной биологии и компьютерных технологий. Главной задачей белковой инженерии является направленное изменение структуры существующих белков для придания им новых уникальных или изменения существующих свойств. В белковой инженерии дизайн белка осуществляется на уровне его пространственной структуры, в чем состоит ее принципиальное отличие от генной инженерии, хотя экспериментальные методы и подходы генной инженерии являются составной частью и этой науки. Биохимики давно пытаются улучшить свойства природных белков, которые, как правило, функционируют только в определенных интервалах температуры и физико-химических условий, что существенно ограничивает возможности их практического использования. Белковая инженерия позволяет адаптировать структуру белков и их свойства к условиям, необходимым для биотехнологических процессов. Белковая инженерия с одной стороны является весьма информативным методом структурно-функционального анализа белков, с другой стороны – становится одним из наиболее передовых направлений современной биотехнологии. Кроме промышленного применения, белковая инженерия нашла себе достойное место в медицинских разработках. Исследователи синтезируют белки, способные связываться с вирусами и мутантными генами, вызывающими опухоли, и обезвреживать их; создают высокоэффективные вакцины и изучают белки-рецепторы клеточной поверхности, которые часто являются мишенями для фармацевтических препаратов. Ученые, занимающиеся усовершенствованием продуктов питания, используют белковую инженерию для улучшения качеств белков, обеспечивающих сохранность продуктов растительного происхождения, а также желирующих веществ или загустителей. Еще одной областью применения белковой инженерии является создание белков, способных нейтрализовать вещества и микроорганизмы, которые могут быть использованы для химических и биологических атак. Например, ферменты гидролазы способны обезвреживать как нервнопаралитические газы, так и используемые в сельском хозяйстве пестициды. При этом производство, хранение и использование ферментов не опасно для окружающей среды и здоровья людей. Белковая инженерия может дать новый импульс биоремедиации использованию микробов для очистки окружающей среды от загрязнений, особенно токсичных, и переработки их в нечто полезное (например, в топливо). Такие технологии уже реально работают. Это получение горючего биогаза вместе с биомассой, содержащей много белка, из побочных продуктов сельского хозяйства, например навоза, соломы. Это 3

микробиологическое производство спирта из продуктов разложения древесины. Это утилизация, при участии микроорганизмов, разлитой нефти и нефтепродуктов. Это извлечение, опять же с помощью микробов, ионов тяжелых металлов из сточных вод и т. д. Все эти процессы можно интенсифицировать, усовершенствовав каталитические центры соответствующих ферментов. В более отдаленном будущем можно будет конструировать новые, не имеющие естественных аналогов ферменты, способные перерабатывать вредные для экологии и чуждые природе вещества, привнесенные в нее человеком. Еще один способ использования синтетических белков - их применение в тестовых системах в качестве биосенсоров - высокочувствительных датчиков, распознающих вещества. Химики, медики, экологи выявляют с их помощью аминокислоты, этиловый спирт, глюкозу, мочевину, аспирин, пары формальдегида, фосфорорганические пестициды и т.д.; биосенсоры на основе моноклональных антител диагностируют беременность, некоторые наследственные болезни, предрасположенность к ряду заболеваний, СПИД и др. Природа дает материал для создания самых разнообразных анализаторов. Тем не менее, видимо, существуют искусственные соединения, которые не могут быть протестированы с помощью природных биомолекул. В случае необходимости белковая инженерия сможет пополнить арсенал биосенсоров. Основными направлениями белковой инженерии в настоящее время являются: - структурно-функциональный анализ белков методами сайтнаправленного мутагенеза отдельных аминокислотных остатков; - создание химерных и мультифункциональных белков; - случайный мутагенез и селекция белков с определенной функцией (молекулярная эволюция); - создание искусственных белков de novo. Задачи белковой инженерии: 1. Изменение специфичности ферментов и их каталитических характеристик (повышение скорости реакции, уменьшение константы Михаэлиса, изменение рН-оптимума, элиминация сайта ингибирования). 2. Изменение структурных свойств белков (повышение термостабильности, повышение стабильности в органических растворителях, изменение физико-химических свойств, модификация специфичности связывания лигандов, изменение внутримолекулярной динамики белка). 3. Создание новых систем (химерные и мультифункциональные белки, введение репортерных доменов и т.д.). 4. Повышение эффективности белков как терапевтических макромолекул для применения в фармакологии и медицине. 4

1 ФОЛДИНГ БЕЛКОВ

Создание белка в живой клетке состоит из двух основных процессов: биосинтеза полипептидной цепи и ее сворачивания в нативную трехмерную структуру или фолдинга. Первый процесс достаточно хорошо изучен, в то время как относительного второго процесса известно существенно меньше. Фолдинг белка – это процесс, в котором происходит сближение соседних и удаленных друг от друга аминокислотных остатков полипептидной цепи, приводящее к формированию нативной структуры. Именно эта структура обладает уникальной биологической функцией, т.к. только свернутая полипептидная цепь проявляет функциональную активность. Поэтому фолдинг является важной стадией преобразования генетической информации в механизмы функционирования клетки. Для решения задач, стоящих перед белковой инженерией, необходимо знать особенности участия каждой аминокислоты в процессе фолдинга белка. Если для модификации свойств белка используется модификация аминокислотных остатков, то необходимо знать, как модификация влияет на структуру и фолдинг белковой молекулы и т.п., а, кроме того, исследования фолдинга белков создают базу для понимания механизмов возникновения таких заболеваний как болезнь Альцгеймера, цинга, болезнь коровьего бешенства, кистозный фиброз и т.д., ведь эти заболевания обусловлены мутациями в белках, которые приводят к агрегации или неправильному фолдингу белков. Первые исследования фолдинга белков были проведены в 1920 году Ансоном и Мирски, которые пришли к заключению, что денатурация белков обратима. В 1961 году К. Анфинсен выдвинул идею, что трехмерная структура белковой молекулы определяется последовательностью аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Глобулярный белок способен к спонтанной самоорганизации in vitro (ренатурации), если после биосинтеза он не подвергся сильной химической модификации. В этом 5

случае его архитектура, «мягко» (без разрыва цепи) разрушенная температурой, растворителем и т.д., спонтанно восстанавливается при «нормализации» среды. Это открытие, впоследствии подтвержденное на множестве других белков, а также возможность чисто химического синтеза белковой цепи, спонтанно сворачивающейся потом в активный белок (опыты Меррифилда и др.), позволяет в первом приближении отделить изучение структурообразования белка от биосинтеза белковой цепи. Х. Динтцис, К. Кенфилд и К. Анфинсен впервые обратили внимание на то, что искусственная сборка нативной конформации рибонуклеазы А с ее четырьмя дисульфидными связями продолжается несколько часов, тогда как биосинтез этого же белка и построение функционирующей трехмерной структуры занимает всего несколько минут. В настоящее время расхождение между расчетными и экспериментально измеренными скоростями фолдинга белков называют парадоксом Левинталя. Рассмотрим белок небольшого размера, включающий 100 аминокислотных остатков. Согласно расчетам, проведенным С. Левинталем, если каждый остаток может занимать три различные позиции, то общее число структур составляет 3100 (или иначе 5.1047). Если для перехода одной структуры в другую требуется 10-13 с, то общее время поиска составило бы 5.1047х10-13с, т.е. 1,6х1027 лет. Однако в действительности время сворачивания белков составляет секунды или минуты. На самом деле аминокислотный остаток имеет около 10 возможных конформаций, а цепь из 100 остатков - порядка 10100 конформаций. Так что белок должен «искать» свою пространственную структуру среди 10100 возможных. И так как время перехода из одной конформации в другую известно и оговорено выше, перебор всех 10100 структур должен был бы занять порядка 1080 лет, на фоне корорых время жизни нашей Вселенной - 1010 лет - величина бесконечно малая. Парадокс Левинталя заключается в следующем. С одной стороны, нативная пространственная структура по всем тестам ведет себя как самая стабильная из всех структур цепи: белковая цепь попадает в нее при разных кинетических процессах (и при сворачивании на рибосоме в процессе биосинтеза, и после секреции сквозь мембрану, и при ренатурации в пробирке). С другой стороны, нет никаких гарантий, что эта структура самая 6

стабильная из всех возможных – у белковой цепи просто нет времени на то, чтобы убедиться в этом. Из этого следует, что самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному «пути сворачивания», и та структура, где этот путь заканчивается, и является его нативной структурой. Иными словами, Левинталь предположил, что нативная структура белка определяется не стабильностью, не термодинамикой, а кинетикой, т.е она соответствует не глобальному, а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи. Вопрос о том, что именно – кинетика или термодинамика – определяет укладку белковой цепи, отнюдь не чисто умозаключительный. Он постоянно возникает, если речь идет о предсказании структуры белка по его аминокислотной последовательности (надо знать, что предсказывать: самую стабильную или самую быстро сворачивающуюся структуру), или о дизайне новых, не встречающихся в природе белков (надо знать, что делать: максимально усиливать стабильность желаемой структуры или пролагать максимально быстрый путь к ней). Обсуждение механизма сворачивания белков началось сразу же после расшифровки первых трехмерных структур и открытия явления самоорганизации. Первой была гипотеза Филипса, согласно которой на N-конце растущей цепи возникает зародыш структуры, и остальная цепь наматывается на него. В той или иной степени эта точка зрения присутствует в ряде работ и по сей день. Однако в работах Гольденберга и Крейтона было показано, что N-конец цепи не играет решающей роли в самоорганизации in vitro. Замкнутая в кольцо цепь небольшого белка, ингибитора трипсина, сохраняет способность к самоорганизации, и даже если разрезать это кольцо так, что N-концом окажется бывшая середина цепи – самоорганизация ведет к прежней пространственной структуре. 1.1 Модели фолдинга белков В настоящее время существует несколько моделей фолдинга белков. Предложенные модели базируются на теоретическом рассмотрении или феноменологических построениях и на компьютерном моделировании. 7

Каркасная модель Модель предложена Птицыным в 1973 году. Согласно ей фолдинг белка – процесс иерархический. Первоначально формируются элементы вторичной структуры. Флуктуирующие сегменты вторичной структуры объединяются, и полипептидная цепь становится компактной. Образующиеся элементы вторичной структуры создают каркас для формирования третичной структуры. Это означает, что белок достигает нативной структуры, избегая большого числа альтернативных состояний. Сворачивание происходит шаг за шагом и таким образом, что прохождение каждой стадии приводит к ускорению процесса. Главная идея модели состоит в том, что три уровня белковой структуры – вторичная структура, каркас свернутой формы и третичная структура – формируются последовательно. Ключевым камнем этой модели было сначала чисто гипотетическое, а теперь вошедшее в учебники состояние белковой цепи, которое ныне известно как «расплавленная глобула». Выведенная теоретически расплавленная белковая глобула была затем экспериментально обнаружена и детально исследована первоначально как равновесное состояние "слабоденатурированного" белка, а потом и как кинетический интермедиат сворачивания белка in vitro работами Долгих, Семисотновым, Гильманшиным и др. в лаборатории Птицына в 80-х годах. Расплавленная глобула оказывается в физиологических условиях ранним промежуточным состоянием на стартующем из клубка пути самоорганизации многих глобулярных белков in vitro. Для образования такого интермедиата достаточно миллисекунд, полное же восстановление свойств нативного белка из 100-300 аминокислотных остатков требует от секунд (для одних белков) до десятков минут (для других). Таким образом, самый медленный шаг самоорганизации приходится не на раннюю стадию, не на образование расплавленной глобулы, а на образование из нее плотно упакованной, нативной глобулы. Модель гидрофобного коллапса В этой модели основным типом взаимодействий, определяющих фолдинг белка, считают гидрофобные взаимодействия, в основе которых лежит сближение неполярных молекул, обеспечивающее уменьшение их контакта с водой. То обстоятельство, 8

что гидрофобные взаимодействия являются неспецифическими, делает возможным их более быстрое участие в фолдинге по сравнению с другими, более специфическими взаимодействиями. Модель роста, включающая стадии нуклеации и конденсации Чтобы полипептидная цепь приобрела нативную конформацию на протяжении биологически разумного интервала времени, перебор состояний должен быть ограничен конечным числом возможных структур. Снижение путей поиска нативной структуры обеспечивается тем, что сворачивание протекает через стадию нуклеации. В модели роста, включающей стадию нуклеации и конденсации, определенный участок полипептидной цепи (8-18 аминокислотных остатков) служит зародышем (ядром), «рост» которого ведет к образованию нативной структуры. Ядро нестабильно и поэтому существует только в течение короткого промежутка времени в ходе денатурационного процесса. Модель «картинка-загадка» Сборка структурных элементов может происходить многими путями подобно тому, как это имеет место при сборке картинкизагадки из отдельных фрагментов. Предполагается, что определенное предписание для порядка сборки отсутствует. Сейчас эта теория опровергнута, т.к. установлено, что сворачивание полипептидной цепи протекает, скорее всего, по нескольким путям, характеризующимся строго определенной последовательностью событий, чем по многим, одинаково доступным путям. 1.2 Стадии сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию В сущности, образование пространственной структуры процесс спонтанный, не требующий ни дополнительной информации, ни источника энергии. Структуру белка определяет его аминокислотная последовательность (а значит генетический код), а не работа сложных синтезирующих машин в клетке. Рассмотрим как происходит процесс сворачивания белка в клетке. Полипептидная цепь строится путем последовательного роста на рибосоме от N-конца к С-концу. В пептидилтрансферазном центре рибосомы 2 аминокислотных остатка всегда находятся в однотипной ориентации по отношению друг к другу, соответствующей альфа-спиральной конформации. 9

Участок растущего пептида длиной 30 - 40 остатков все еще оказывается закрытым рибосомой. Наиболее вероятной его конформацией при этом является α-спираль. Пептидная цепь, удаленная от пептидилтрансферазного центра далее 30 - 40 аминокислотных остатков погружается в цитоплазму или мембрану эндоплазматического ретикулума. Факторы, определяющие сворачивание N-концевой части растущего пептида будут различны в зависимости от того насколько удален рассматриваемый участок от фиксированного С-конца. Таким образом, сворачивание начинается со стартовой конформации, поддерживаемой рибосомой. Поиск путей сворачивания идет последовательно с растущего Nконцевого участка, в процессе сворачивания С-конец фиксирован. То, что сворачивание пептида происходит котрансляционно, подтверждает, например, синтез бета-галактозидазы. Ферментативная активность этого белка требует формирования четвертичной структуры. Оказалось, что растущая цепь, еще до своего завершения, будучи присоединенной к рибосоме, уже способна ассоциировать со свободными субъединицами белка, и комплекс на рибосоме проявляет ферментативную активность. Кроме того, рибосомы, несущие растущие цепи β-галактозидазы, реагируют с антителами против готового фермента еще задолго до завершения трансляции мРНК. Все это свидетельствует о том, что рибосома может способствовать определенному пути сворачивания. Благодаря существующей внутри клетки высоко координированной системе регуляции, полипептидная цепочка с самого момента своего «рождения», сходя с рибосомы, попадает под контроль факторов, которые, не изменяя специфического пути сворачивания (определяемого генетическим кодом), обеспечивают оптимальные условия для реализации быстрого и эффективного образования нативной пространственной структуры. Несмотря на «избранный» путь, определенный рибосомой, те же пространственные структуры белков получаются и после транслокации более или менее развернутой цепи через мембрану, и in vitro, при сворачивании (ренатурации) целой белковой цепи из развернутого состояния. Это значит, что детальная последовательность действий не играет решающей роли при сворачивании белка. Образование пространственной структуры белка – процесс многостадийный. Способность того или иного участка поли10

пептидной цепи образовывать элемент вторичной структуры (например, свернуться в α-спираль) зависит от характера аминокислотной последовательности данного отрезка цепи. Таким образом, число и расположение α-спиралей, β-тяжей и петель по ходу полипептидной цепи различно у разных белков и определяется генетическим кодом. Этим объясняется потенциальная способность любой полипептидной цепи к спонтанному сворачиванию в уникальную третичную структуру. Согласно современным представлениям (рис. 1), процесс сворачивания имеет иерархическую природу. Развернутому состоянию полипептидной цепи отвечает широкое холмистое плато свободной энергии, определяющее реализацию этого состояния огромным числом конформаций основной цепи. Переход от полностью развернутого состояния в нативное состояние, отвечающее глобальному минимуму свободной энергии, может осуществляться различными путями. Наряду с глобальным минимумом свободной энергии возможно существование локальных минимумов свободной энергии, отвечающее существованию частично-свернутых промежуточных состояний белка. Число возможных конформацонных состояний полипептидной цепи уменьшается по мере приближения к нативному состоянию, поэтому такую энергетическую поверхность часто называют также «энергетической воронкой».

Рис. 1. Энергетическая поверхность, определяющая пути сворачивания белка в нативное сосотояние (рисунок заимствован из работы И. М. Кузнецовой и соавторов) 11

Переход из развернутого в нативное состояние требует преодоления активационного барьера (переходное состояние), наличие которого обуславливает кооперативность процессов сворачивания-разворачивания белка. На рисунке 2 в общих чертах представлен путь сворачивания белковой молекулы.

Рис. 2. Схема пути сворачивания-разворачивания небольшого белка ингибитора химотрипсина CI2, исследованного группой Фершта (рисунок заимствован из книги А.В. Финкельштейна, О.Б. Птицына)

Согласно существующим на сегодняшний момент представлениям, этот процесс разбивается на более мелкие стадии: 1. Очень быстрое формирование элементов вторичной структуры, служащих как бы «затравками» для образования более сложных архитектурных мотивов (за десятую долю микросекунды альфа-спираль охватывает пептид из 20-30 остатков).

12

2. Специфическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры: сочетания нескольких α-спиралей, нескольких β-цепей либо смешанные ассоциаты данных элементов (тоже очень быстрая стадия). 3. Формирование «расплавленной глобулы» (создание основных элементов третичной структуры – сочетание α-спиралей, β-тяжей, соединяющих петель и образование гидрофобного ядра молекулы). 4. Формирование нативной структуры белка. На первом этапе движущей силой процесса является образование водородных связей. Основной движущей силой второй и третьей стадий является возрастание энтропии за счет гидрофобных взаимодействий. Гидрофобный эффект берет на себя, грубо говоря, три четверти работы по созданию белковой глобулы. Но он сам по себе не может создать нативный твердый белок. Он создает лишь расплавленную белковую глобулу. Отвердевает белок, как и все органические жидкости, под действием Ван-дер-вальсовых сил, а также водородных и ионных связей - взаимодействий более специфичных и более чувствительных к деталям атомной структуры, чем простая водобоязнь. Но это - окончательная огранка, а большая часть работы, вся черновая работа падает на гидрофобный эффект. На третьей стадии формирования пространственной структуры молекула приобретает пространственную структуру, близкую к структуре нативного белка. Вместе с тем она еще не обладает присущей данному белку функциональной активностью. Это состояние, состояние «расплавленная глобула», отличается от нативного меньшей степенью упорядоченности структуры. На рисунке 3 схематично показано, что размер спиральных участков (цилиндры) в расплавленной глобуле несколько меньше, неполярные группы, формирующие гидрофобное ядро молекулы, «упакованы» недостаточно плотно. 13

Рис. 3. Схематическая модель нативной и расплавленной глобулы в молекуле белка (заимствовано на сайте http://www.bionet.nsc.ru)

Входящие в гидрофобное ядро белка боковые группы заштрихованы. В расплавленной глобуле они обретают свободу движений, выигрывают энтропию, но теряют энергию плотного контакта. Так в глобуле возникают пoры, куда вода проникает, не разваливая расплавленную глобулу. Отсутствие ряда специфических взаимодействий приводит к изменению ориентации подвижных петель; в целом молекула более лабильна и склонна к «слипанию» с другими такими же молекулами с образованием агрегатов. 1.3 Механизмы регуляции процесса сворачивания Сворачивание полипептида в клетке сопровождается ферментативными модификациями цепи. Деформилаза отщепляет формильную группу концевого метионина вскоре после выхода N-конца растущей цепи из рибосомы. Аминопептидаза способна отщеплять N-концевой метионин. Мембранная сигнальная пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Несколько ферментов принимают участие в гликозилировании белка. Кроме расщепления белковой цепи, наблюдается модификация концов цепи, ацетилирование, гликозилирование, пришивание липидов в определенные точки цепи, фосфорилирование определенных боковых групп, и т.д., и т.п. Недавно был обнаружен даже 14

«сплайсинг» белковых цепей (спонтанное вырезание куска цепи и склейка образовавшихся при этом концов). Изредка наблюдается и спонтанная циклизация кусочков белковой цепи. Основная задача остальных внутриклеточных приспособлений и помощников - оберегать сворачивающийся белок от нежелательных контактов, которых было бы не избежать без строгого ока «воспитателей». Согласно современным представлениям, клетка располагает, по крайней мере, двумя типами механизмов регуляции формирования пространственной структуры белка: - первый основан на регуляции скорости превращения «расплавленной глобулы» в нативную структуру; - второй обеспечивает защиту частично свернутого белка от неспецифической агрегации. Установление «оптимального набора» специфических взаимодействий, стабилизирующих нативную конформацию, связано с необходимостью структурных перестроек, происходящих относительно медленно. К их числу относится цис-транс-изомеризация пептидной связи, предшествующей остатку пролина. In vivo она ускоряется благодаря действию специального фермента пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы. 1.3.1 Пептидилпролил-цис-транс-изомераза (ротамаза) Пептидные связи в белках реализуются в двух энергетически предпочтительных ротамерных формах, называющихся цис- и транс-конфигурациями, из которых энергия трансконфигурации на порядок меньше, что делает ее более выгодной. Транс-конфигурация пептидной связи в белках, как правило, выгоднее цис- и в электронном и в конформационном отношениях. Поэтому цис-конфигурация встречается более чем в 103 раз реже транс-конфигурации. Если же последующим остатком в аминокислотной последовательности является Pro, то величины свободной энергии двух форм пептидной связи практически выравниваются и вероятность реализации трансконфигурации превышает цис- всего лишь в четыре раза. В нативны белках до 7% имидных связей имеют цис-конфигурацию, тогда как содержание цис-изомеров других пептидных связей составляет 0,05%. В равновесной смеси конформеров 15

содержание цис-изомеров имидных связей составляет 10-30%, тогда как содержание цис-изомеров других пептидных связей – 0,1-0,5%. Конформеры, различающиеся конфигурацией имидных связей, являются биологически различимыми молекулами. Так, многие протеиназы (α-химотрипсин, аминопептидаза Р, пролидаза) обнаруживают специфичность по отношению к транс-конфигурации имидной связи. При свертывании белка в условиях in vitro неизбежно возникают ситуации, когда одна часть свертываемых цепей будет иметь пептидные связи в конфигурациях, отвечающих правильной нативной конформации, а другая – нет. В искусственных условиях белковые цепи свертываются тем медленнее, чем больше пролина входит в их состав, в естественных условиях продолжительность и эффективность свертывания белковой цепи не зависит от этого, поскольку в формировании трехмерной структуры белка в процессе его биосинтеза участвуют соответствующие ферменты. Наиболее вероятно, что их функция заключается в специфической и быстрой конформационной изомеризации транс-формы, которую имеют все пептидные связи белковой цепи при выходе из пептидилтрансферазного центра рибосомы, в цис-форму.

Впервые такие ферменты были обнаружены Г. Фишером и соавторами в 1987 году. Они присутствуют в больших количествах практически во всех тканях и организмах и проявляют пептидилпролил-цис-транс-изомеразную активность как in vitro, так и in vivo. Пептидилпролил-цис-транс-изомеразы (КФ 5.2.1.8) первоначально были идентифицированы как внутриклеточные рецепторы иммуносупрессоров циклоспорина А, FK506 и 16

рапамицина, в связи с чем их назвали иммунофилинами. В настоящее время известно, что они участвуют не только в фолдинге белков, но в регуляции некоторых мембранных рецепторов и каналов, апоптозе. Выделяют три семейства пептидилпролил-цис-транс-изомераз: FK506/рапамицинсвязывающие белки, циклофилины – циклоспорин А-связывающие белки и парвулины. В настоящее время считается, что ферментативный катализ цис-транс-изомеризации имидных связей достигается комбинацией факторов, каждый из которых вносит вклад в снижение энергетического барьера между цис- и транс-изомерами. В случае FK506/рапамицинсвязывающих белков можно выделить три таких фактора: 1. Дегидратация имидной связи, сопряженная с ее переносом в гидрофобное окружение активного центра фермента. Делокализация π-электронов в пептидных связях зависит от полярности окружения и в неполярных растворителях энергетический барьер между цис- и транс-изомерами существенно ниже, чем в воде. Поскольку в организации активного центра фермента участвую гидрофобные аминокислотные остатки, перенос имидной связи в активный центр должен сопровождаться снижением энергетического барьера цис-транс-изомеризации. 2. Стабилизация переходного состояния. В стабилизации переходного состояния принимают участие остатки Tyr-26, Phe36, Phe-99 активного центра, образующие водородные связи с карбонильной группой имидной связи. Конфигурация имидной связи стабилизируется также образованием водородной связи между азотом пирролидинового кольца и N-Н-группой соседней пептидной связи. 3. Дестабилизация основного состояния субстрата (цис- и транс-конфигураций имидной связи). Здесь принимают участие остатки Asp-37, Tyr-82 активного центра. Дестабилизация является следствием стерических и электростатических взаимодействий между этими остатками и карбонильной группой имидной связи. Описанный механизм катализа справедлив и для циклофилинов – циклоспорин А-связывающих белков. Для этих двух семейств механизм катализа заключается в невалентной деформации имидной связи и стабилизации ее в активном центре фермента в переходном высокоэнергетическом состоянии. 17

Катализ цис-транс-изомеризации, осуществляемый парвулинами, сопровождается образованием интермедиата, ковалентно связанного с ферментом. 1.3.2 Белок-дисульфидная изомераза Второй фермент, ускоряющий процесс сворачивания, катализирует образование и изомеризацию дисульфидных связей. Он локализуется в просвете эндоплазматического ретикулума и способствует сворачиванию секретируемых клетками белков, содержащих дисульфидные мостики (например, инсулин, рибонуклеаза, иммуноглобулины).

Белок-дисульфидная изомераза клеток млекопитающих проявляет активность в форме димера идентичных субъединиц молекулярной массы около 57 кДа. Они имеют два домена, каждый из которых обнаруживает близкую гомологию с тиоредоксином – небольшим белком с молекулярной массой 12 кДа, присутствующим во всех живых организмах от бактерий до высших эукариот. Тиоредоксин обладает окислительно-восстановительным потенциалом, способствующим образованию, изомеризации и разрушению дисульфидных связей. Назначение белок-дисульфидной изомеразы не сводится только к сокращению времени сборки белковой цепи путем быстрого разрушения неправильных дисульфидных связей и восстановления сульфгидрильных групп. В своей гомодимерной форме (β2) она 18

входит в тетрамерный комплекс α2β2 пролил-4-гидроксилазы, катализирующей известную модификацию боковых цепей остатков пролина в синтезируемых аминокислотных последовательностях коллагена. Белок-дисульфидная изомераза является также составной частью гликозидазы и триглицеридтрансферазы. Кроме того, в эндоплазматическом ретикулуме обнаружен ряд других белков, содержащих гомологичные тиредоксину субъединицы. Таким образом, эндоплазматический ретикулум содержит, помимо белок-дисульфидной изомеразы, целое семейство многопрофильных ферментов, в которые входят тиоредоксинподобные структуры с дитиолдисульфидными активными центрами. Характерная особенность обоих ферментов состоит в том, что они не способны связываться с нативными белками; их субстраты имеют частично развернутую структуру, близкую к состоянию «расплавленной глобулы». Ускоряя стадии, лимитирующие скорость сворачивания, ферменты способствуют удержанию белка на правильном пути приобретения нативной структуры, снижая риск протеолитической деградации и агрегации лабильных промежуточных форм. 1.3.3 Шапероны и шаперонины Кроме ферментов в формировании пространственной структуры белка участвуют специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию. Было обнаружено, что в клетке существует особая категория белков, основной функцией которых является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру. Эти белки, связываясь с развернутой или частично развернутой конформацией полипептидной цепи, не дают ей «запутаться», образовать неправильные структуры. Они удерживают частично развернутый белок, способствуют его переносу в разные субклеточные образования, а также создают условия для его эффективного сворачивания. Эти белки получили название «молекулярные шапероны», образно отражающее их функцию (chaperon - пожилая дама, сопровождающая молодую девушку на балы и пр., наставник, сопровождающий группу молодежи). К настоящему времени описано несколько классов шаперонов, различающихся по структуре и специфическим 19

функциям. Шапероны являются так называемыми «белками теплового шока», синтез которых резко увеличивается в стрессовых для клетки ситуациях. Поэтому сокращенное название этих белков - hsp (heat shock proteins). Однако и в нормальных условиях каждая клетка содержит определенный набор шаперонов, необходимых для ее жизнедеятельности. Классификация шаперонов основана на величине молекулярной массы составляющих их субъединиц, которая варьирует от 10 кДа (hsp10) до 90 кДа (hsp90) и выше. Шапероны удерживают белки в развернутом состоянии. Взаимодействие шаперонов с синтезируемым белком начинается еще до схождения полипептидной цепи с рибосомы. По характеру выполняемых этими белками функций их можно разделить на два больших семейства – шапероны и шаперонины. Связываясь с отдельными участками «опекаемой» ими полипептидной цепи, молекулы шаперона образуют прочные комплексы, удерживающие цепь в развернутом состоянии. Взаимодействие не является специфическим и в основном реализуется благодаря силам гидрофобного характера. Прочно фиксированная на шаперонах полипептидная цепь не способна к сворачиванию в нативную структуру, так как не обладает необходимой для этого подвижностью. Главная функция шаперона состоит в удержании вновь синтезируемых белков от неспецифической агрегации и в их передаче другому «белку-помощнику», шаперонину, роль которого - обеспечить оптимальные условия для эффективного сворачивания. В клетках эукариот шапероны выполняют также важную роль в транспорте белков через мембраны митохондрий (рис. 4), хлоропластов и эндоплазматического ретикулума. Такой транспорт необходим, так как многие белки клеточных органелл синтезируются в цитоплазме, а окончательно сворачиваются в месте своей постоянной локализации. Роль шаперона, «подносящего» к мембране частично развернутый белок, становится понятной, если учесть, что разворачивание - обязательное условие проникновения белковой молекулы через мембрану.

20

Рис. 4. Функции клеточных шаперонов (заимствовано на сайте http://www.distedu.ru)

Интересно, что митохондриальный матрикс содержит собственные шапероны, «подхватывающие» пересекающий мембрану белок и способствующие его «втягиванию» в митохондрию. Аналогичный механизм реализуется и при проникновении синтезированных в цитоплазме белков в просвет эндоплазматического ретикулума. Возникает вопрос: от чего же зависит прочность связывания шаперона с полипептидной цепью? Каков механизм, позволяющий развернутому белку освободиться от шаперона и перейти на шаперонин? Детальные исследования, проведенные на системах белков, выделенных из клеток 21

бактерий, показали, что главным фактором является способность шаперона связывать АТФ, в определенных условиях осуществлять его гидролиз и изменять прочность взаимодействия с полипептидной цепью в зависимости от природы связанного нуклеотида (АТФ или АДФ). С многодоменными белками в клетке работают «большие» шапероны, или шаперонины типа GroEL и GroES или TriC. В отличие от довольно просто построенных шаперонов (состоящих из одной-двух полипептидных цепей), шаперонины представляют собой сложные олигомерные структуры. Наиболее изученные hsp60 митоходрий (рис. 5), а также клеток E. coli, построены из 14 субъединиц, организованных в два семичленных кольца, лежащих одно под другим. В центре построенного таким образом цилиндра имеется полость - канал (диаметром 45 ангстрем), в котором и происходит сворачивание полипептидной цепи, перешедшей на шаперонин с шаперона hsp70. Иногда такую «пробирку» называют «ячейкой Анфинсена». После того как в канал молекулы шаперонина попадает полипептидная цепь, вход прикрывает hsp10 - белковое кольцо, построенное из 7 субъединиц.

Рис. 5. Строение шаперонина hsp60 (заимствовано на сайте http://www.distedu.ru)

Создав шаперонины, природа нашла элегантный способ обеспечить сворачивание белка в условиях, исключающих его 22

агрегацию с другими белками внутри клетки. Действительно, попадая в центральный канал молекулы шаперонина, единичная полипептидная цепь оказывается полностью изолированной и получает возможность реализовывать медленные стадии сворачивания с очень высоким выходом нативного белка. Как и в случае hsp70, связывание развернутого белка с шаперонином и его отщепление регулируются АТФ-азной активностью шаперонина. В связывании сворачивающегося белка (находящегося в состоянии «расплавленной глобулы») может принимать участие каждая из 14 субъединиц олигомерной молекулы шаперонина. Количество мест связывания зависит от стадии сворачивания: чем ближе структура к нативной, тем меньше участков, «распознаваемых» шаперонином. Роль маленького шаперонина hsp10, называемого ко-шаперонином, закрывающего вход в центральный канал, состоит в том, чтобы предотвращать «преждевременный» выход во внешнюю среду белка, не завершившего окончательное сворачивание в нативную структуру. Данная модель дает лишь самое общее представление о механизмах функционирования шаперонинов. Она основана на изучении этих белков, изолированных из митохондрий или бактериальных клеток. Между тем недавно было выяснено, что цитоплазматический шаперонин клеток эукариот весьма существенно отличается по своим свойствам: он построен из неодинаковых субъединиц и, по-видимому, не взаимодействует с ко-шаперонином. Вероятно, что общие принципы функционирования, установленные для hsp60, распространяются и на этот шаперонин, однако конкретные механизмы, вовлеченные в регуляцию эффективности сворачивания белков в разных компартментах клетки, могут существенно различаться. Контрольные вопросы 1. Основные направления применения достижений белковой инженерии. 2. Что такое фолдинг белков? 3. В чем заключается «парадокс» Левинталя? 4. Модели фолдинга белков. 5. Уровни структурной организаци белоковой молекулы. 6. Стадии сворачивания полипептидной цепи. 7. Ко- и посттрансляцилнный фолдинг. 8. Ферменты участвующие в фолдинге белков, дайте их характеритстику структуры и функции. 9. Шапероны , типы, строение, функция. 23

2 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА

2.1 Рентгеноструктурный анализ Информация об атомном строении биологических макромолекул и их комплексов является ключом к пониманию механизмов их функционирования в живом организме и биотехнологических системах. Такого рода информация исключительно важна для разных областей человеческой деятельности: • для фундаментальной науки – поскольку способствует пониманию процессов, происходящих в живой природе на молекулярном уровне; • для медицины – так как понимание молекулярных основ возникновения заболеваний делает диагностику более эффективной; • для фармакологии – это облегчает поиск новых потенциальных лекарств; • для промышленности – производство некоторых ферментов (например, биологических добавок, входящих в состав стиральных порошков достигает тысяч тонн в год); • для выяснения механизмов биологического действия белков и их целенаправленной модификации. В настоящее время рентгеноструктурный анализ (РСА) является основным методом определения пространственной структуры биологических макромолекул (белков, вирусов, нуклеиновых кислот) и их комплексов при атомном разрешении. Процедура расшифровки структуры методом РСА является сложным и дорогостоящим процессом, включающим в себя: 1) клонирование, выделение и очистку белка; 2) кристаллизацию очищенного белка (этот этап может представлять существенную сложность и требовать создания экстремальных условий: от сверхгравитации (в ультрацентрифугах) до невесомости (на космических станциях)); 24

3) рентгеноструктурный эксперимент (большой объем регистрируемой информации (105-107 измерений) и относительно короткий срок жизни биологических молекул в рентгеновском пучке требуют применения источников рентгеновских лучей высокой интенсивности (синхротронных ускорителей); тенденцией последних лет является проведение эксперимента при криогенных температурах); 4) компьютерную расшифровку структуры белка, требующую определенных навыков в биохимии, молекулярной биологии, статистической обработке данных, а также знакомства с интерфейсами программ, обеспечивающих построение конечной трехмерной структуры белка. Поскольку объектами интереса зачастую являются белки, присутствующие в клетках в незначительных концентрациях (рецепторы, транскрипционные факторы, гормоны), их прямая очистка из организмов в достаточных количествах становится весьма проблематичной. Оптимальным способом решения проблемы является клонирование генов данного вида в бактериальные вектора под контроль сильных промоторов, и их последующая экспрессия в подходящих бактериальных штаммах. Белки, используемые для кристаллизации, должны обладать высокой степенью чистоты, что требует нескольких хроматографических шагов. Одним из наиболее популярных инструментов для очистки белков в современной кристаллографической лаборатории на первом этапе является FPLC АКТА фирмы Pharmacia. Используется также аффинная хроматография, в ходе которой белок пропускается сквозь колонку с сорбентом, обладающим специфическим сродством к гистидиновому хвосту белка, добавленному при клонировании. За аффинной хроматографией обычно следует гель-фильтрация, в процессе которой белковая смесь пропускается сквозь пористые сферы определенного сорбента, что обеспечивает ее разделение по молекулярной массе. Cледующей стадией очистки обычно служит ионообменная хроматография, в которой белки разделяются по своему заряду при разных значениях pH. Фракции, содержащие чистый рекомбинантный белок, объединяют, подвергают диализу, концентрируют, смешивают с глицерином, разбивают на небольшие аликвоты, замораживают и хранят при -80ОС. 25

Эффективность очистки определяют электрофорезом. Обычно перед началом кристаллизации очищенный белок (или его фрагмент) исследуют при помощи масс-спектроскопии, чтобы убедиться в том, что он не претерпел никаких изменений в ходе очистки или протеолитического расщепления. Многие исследователи также оценивают и гомогенность своего белка при помощи нативного полиакриламидного гель-электрофореза или же метода светорассеивания.

Вирус крапчатости гвоздики

Модель укладки частиц вируса крапчатости гвоздики в кристалле. В каждой частице 180 идентичных белковых молекул.

Рис. 6. Кристаллы некоторых ферментов и вирусов, полученные в Институте кристаллографии РАН (рисунок заимствован из статьи Ю.А. Владимирова) 26

Кисталлические препараты белков используются для проведения РСА. Этот метод основан на регистрации дифракционной картины, которая получается при пропускании рентгеновских лучей через кристаллический препарат белка. Поскольку кристалл имеет периодическую структуру, то, в сущности, наблюдается та же картина, которую дала бы одна отдельно взятая молекула белка. На основании дифракционной картины можно построить карту распределения электронной плотности в молекуле белка, а, исходя из этой карты, определить характер укладки полипептидного остова и боковых групп всех аминокислот. Рентгеноструктурный анализ позволяет исследовать образцы, содержащие воду, и тем самым избежать искажений образца. По мере проникновения через образец рентгеновские лучи рассеиваются в основном электронами. Поэтому большие атомы с большим количеством электронов рассеивают рентгеновские лучи сильнее, чем небольшие атомы. Атомы углерода (С), азота (N), кислорода (О), фосфора (Р) регистрируются более надежно, чем атомы водорода (Н). По этой же причине атомы любых металлов, например, атом железа в молекуле гемоглобина, образуют интенсивный рефлекс рассеянных рентгеновских лучей. Эксперимент позволяет определить лишь интенсивности лучей, рассеянных под различными углами по отношению к исследуемому образцу. Как правило, это десятки и сотни тысяч измерений. Однако для восстановления структуры необходимо знать также и значения сдвигов фаз рассеянных лучей. Эти сдвиги фаз не могут быть зарегистрированы экспериментально. Существующие в настоящее время в макромолекулярной кристаллографии подходы к решению этой проблемы основаны либо на получении химическим путем изоморфных модификаций исследуемого белка и проведения с ними дополнительных рентгеновских экспериментов, либо на наличии в белке аномально рассеивающих атомов, либо на известной структуре белка, гомологичного исследуемому. Такая дополнительная информация позволяет получить приближенные значения фаз рассеянных лучей и затем приближенные значения координат атомов в исследуемом объекте.

27

Рис. 7. Основные этапы определения пространственной структуры методом РСА (рисунок заимствован из книги «Компьютеры и суперкомпьютеры в биологии») 28

Рис. 8. Типичная картина дифракции рентгеновских лучей, вызванная их пропусканием через кристалл белка (рисунок заимствован на сайте http://bioclass520.ru).

Процесс преобразования рентгенограммы в трехмерную структуру атомов, уложенных в молекулу, весьма сложен. Полученные данные в течение многих часов обрабатываются на мощных компьютерах. Для анализа дифракционных данных существует большое количество разных компьютерных программ. Анализ самой первой картины дифракции кристалла позволяет быстро определить все его основные параметры. К ним относятся: разрешение, от которого зависит, возможно ли будет увидеть отдельные аминокислоты на конечной структуре или же только элементы вторичной структуры; количество молекул белка в элементарной ячейке и ее размеры; тип расположения элементарных ячеек в кристалле. Эта же программа просчитывает необходимое количество дифракционных картинок, которое нужно получить для полной оценки данной системы. Существует большое количество программ, обеспечивающих улучшение первоначальной электронной плотности. После нее в общей картине уже можно рассмотреть отдельные аминокислоты и их группы.

29

Рис. 9. Улучшенная картина электронной плотности с наложенными на нее аминокислотными остатками (рисунок заимствован на сайте http:// bioclass520.ru)

После ввода первичной последовательности белка и с помощью других программ компьютер автоматически строит первую модель, в которой он помещает узнанные аминокислоты в соответствующие им фрагменты электронной плотности. Процент успешного автоматического построения модели зависит в первую очередь от качества карты электронной плотности и, конечно же, ее разрешения. Это определяет время, которое придется затратить на построение и «доводку» модели вручную. Понятно, что такая задача предъявляет серьезнейшие требования к мощности используемых компьютеров. Применение указанных выше подходов сталкивается с особенно большими сложностями при работе с большими макромолекулярными комплексами, представляющими особый интерес для биологии и медицины.

30

1

2

4

3

Рис. 10. Компьютерные изображения структуры белка миоглобина (рисунок заимствован из статьи Ю.А. Владимирова) 1 - атомы в виде небольших сфер разного цвета: красные - кислород, белые - углерод, синие - азот, желтые - сера. Атомы водорода очень слабо рассеивают рентгеновские лучи и на изображении их нет. Красные сферы по краям белковой молекулы - это кислородные атомы структурированной воды, прочно связанной с белковой глобулой; 2 - общий ход полипептидной цепи. Участки a-спирали выделены красным цветом, неструктурированные петли цепи - белым цветом; 3 - спиральные структуры в виде лент. 4 - атомы даны как сферы с радиусами Ван-дер-Ваальса.

2.2 Ядерный магнитный резонанс Ядерно-магнитно-резонансная (ЯМР) спектроскопия использовалась раньше для анализа структуры небольших молекул, а в последнее время все чаще применяется в изучении пространственной структуры небольших белков и белковых доменов. В отличие от рентгеновской кристаллографии, ЯМР не требует трудоемкого изготовления кристаллов. Для анализа достаточно небольшого объема концентрированного раствора белка, который помещают в сильное магнитное поле. 31

Некоторые атомные ядра, и в частности, ядро кислорода, обладают магнитным моментом, или спином. Это означает, что они имеют внутреннее намагничивание, каким обладает линейный магнит. Спины выстраиваются вдоль линий магнитной индукции в сильном магнитном поле, однако могут переходить в неупорядоченное возбужденное состояние в ответ на применение радиочастотных пульсов электромагнитного излучения. Когда возбужденное ядро кислорода возвращается в свое выровненное состояние, оно испускает радиочастотное излучение, которое может быть измерено и представлено в виде спектра. Природа испускаемого излучения зависит от окружения каждого ядра. Если одно ядро возбуждено, оно влияет на поглощение и испускание радиации другими ядрами, которые находятся поблизости. Посредством искусного совершенствования основной техники ЯМР, так называемого двумерного ЯМР, научились различать сигналы ядер кислорода в различных аминокислотных остатках и определять величины небольших изменений этих сигналов, которые вызваны близким соседством ядер кислорода друг к другу. Величины таких изменений позволяют оценить расстояния между взаимодействующими парами атомов кислорода. Таким образом, ЯМР может предоставить информацию о расстояниях между частями молекулы белка. Объединяя эти данные со знанием аминокислотной последовательности, в принципе возможно рассчитать трехмерную структуру белка. По техническим причинам с помощью ЯМР-спектроскопии можно определять структуры маленьких белков размером около 15000-20000 дальтон и с меньшей вероятностью можно изучать молекулы больше 30000-40000 дальтон. Многие функциональные домены белков много меньше этих размеров и могут быть выделены в стабильные структуры, доступные для анализа с помощью ЯМР. Это особенно полезно для белков, трудно поддающихся кристаллографии. Структуры некоторых белков-регуляторов генов, связывающихся для этого с ДНК, были определены именно этим методом. ЯМР широко используется и для изучения молекул, отличных от белков, например, он очень ценен как метод изучения структуры сложных ветвей у гликозилированных белков. 32

2.3 Компьютерное предсказание и моделирование пространственной структуры белка Существует несколько принципиально различающихся методов моделирования пространственной структуры белка, в частности: - Распознавание фолда (от английского слова folding – укладка, упаковка) с использованием библиотеки известных фолдов. - Предсказание архитектуры белковой глобулы на основе знаний об атомных взаимодействиях. - Моделирование по гомологии. Распознавание фолда – это начальный этап моделирования структуры. Оно применяется, если не известны близкие гомологи моделируемой молекулы. Точности построенной на базе этого метода модели недостаточно, чтобы исследовать механизмы функционирования макромолекулы и, в конечном счете, создаваемой молекулярной системы. Предсказание по известным квантовомеханическим принципам строения молекулы, осуществляемое без использования знаний о структуре гомологов или других дополнительных методов, дает примерно такую же точность, что и распознавание фолда. Наиболее успешным считается предсказание трехмерной структуры белковой молекулы по аминокислотной последовательности с использованием данных о пространственной структуре одного или нескольких гомологов. Современные геномные исследования резко увеличили число известных первичных последовательностей белков (1D) (~ 106). Число пространственных (3D) структур в белковом банке PDB ~ 104. Соотношение известных 1D/3D структур белков = 100, что означает, что пространственная структура установлена только для 1% 1D структур. Последние 5 лет это соотношение остается примерно постоянным. Таким образом, современные экспериментальные методы изучения 3D структуры белков не могут догнать методы анализа их последовательностей. Преодолеть разрыв можно с помощью компьютерного предсказания пространственной структуры белков. В прагматическом аспекте, вопрос о предсказании трехмерного строения белка сейчас ставится следующим образом: похожа ли пространственная структура рассматриваемой белковой последовательности на какую-либо из уже известных простран33

ственных белковых структур? Если да, то как рассматриваемая последовательность вписывается в эту структуру? Если нет, можем ли мы указать какие-либо характерные детали пространственной организации рассматриваемой последовательности? Предсказание пространственной структуры белков по аминокислотной последовательности, значительно упрощает и ускоряет задачу изучения пространственного строения белковой последовательности. В настоящее время существует банк данных пространственных структур белков, в котором собрана информация о более чем 15 000 пространственных структур. Атомные координаты гомологичного белка могут быть использованы как пространственная матрица для моделирования по гомологии. С помощью «компьютерного мутагенеза» боковые радикалы аминокислотных остатков заменяются на остатки моделируемого белка, структура которого затем оптимизируется. В настоящее время большое внимание уделяется разработке алгоритмов и программ для предсказания пространственной структуры белков. Данная проблема является одной из ключевых в современной молекулярной биологии. До настоящего момента не создано точных методов предсказания трехмерной структуры белка по его аминокислотной последовательности. Однако, поскольку в банках данных существует экспериментально полученная информация о трехмерной структуре сотен белков, то во многих случаях можно на ее основе предсказывать пространственную структуру неизвестного белка с достаточной точностью. Процесс моделирования по гомологии включает несколько шагов (рис. 11), главными из которых являются поиск структурного шаблона и построение аминокислотного выравнивания. Решающим фактором, определяющим качество получаемых моделей, является степень гомологии последовательностей моделируемого белка и шаблона. Идентификация структурного шаблона – белка с известной пространственной структурой, гомологичного моделируемому (идентичность последовательностей >30%) производится с помощью серверов FASTA или PSI-BLAST (или их аналогов) в базе структур белков PDB; Построение выравнивания аминокислотных последовательностей шаблона проводят с помощью сервера CLUSTALW (или его аналогов); 34

Построение модели заключается, главным образом, в «натягивании» последовательности моделируемого белка (рецептора мелатонина MT1) на «остов» шаблона (зрительного родопсина) согласно выравниванию. Моделирование проводят с помощью программы Modeller (и аналогичных ей) или сервера SwissModel (и ему подобных). В онлайн-базах ModBase и SwissModel Repository содержатся автоматически построенные модели для всех белков из базы Swiss-Prot, для которых удаётся найти структурный шаблон; Вычислительные эксперименты с молекулами требуют огромных вычислительных мощностей. Такие задачи на современных компьютерах считаются сутками и месяцами. Наиболее распространенным в этой области является моделирование молекулярной динамики (метод молекулярной динамики). Моделирование молекулярной динамики проводится на основе экспериментальных данных и данных компьютерного моделирования о строении биомакромолекул.

Рис. 11. Схема моделирования по гомологии на примере рецептора мелатонина MT1 человека (рисунок заимствован из статьи Chugunov A.O. et al.) 35

В классическом методе молекулярной динамики молекулярная система моделируется взаимодействующими частицами, движение которых подчиняется уравнениям Ньютона. Содержательные физические задачи включают явное рассмотрение от нескольких тысяч до десятков тысяч атомов. Уравнения движения решаются численно с шагом численного интегрирования ~ 10~15 сек. На каждом шаге по координатам всех частиц находятся действующие на них силы, а затем вычисляются новые координаты и скорости частиц. Полученные траектории движения частиц служат для нахождения различных усредненных характеристик молекулярной системы. Наиболее трудоемкая операция на шаге - это вычисление сил. Она требует числа операций, квадратичного по отношению к числу частиц. Существуют различные подходы к распараллеливанию вычислительных процессов в таких задачах. Наиболее перспективным на сегодня показал себя подход, основанный на разбиении молекулярной системы на домены. Так, для расчета системы, состоящей из 65536 взаимодействующих эллипсоидных частиц, на суперкомпьютере Cray-T3D (256 процессоров) удалось достичь увеличения быстродействия почти в 220 раз. В случае, когда пространственная структура белка-мишени неизвестна, имеется достаточно большое число различных подходов сравнительного моделирования. При построении трехмерной модели белка с заданной аминокислотной последовательностью эта полипептидная цепочка сначала вписывается в координаты, соответствующие остаткам гомологичного белка с расшифрованной пространственной структурой, а затем осуществляется минимизация внутренней энергии (чтобы убрать возможные напряжения в структуре). В дальнейшем методами молекулярной динамики моделируется движение отдельных частей молекулы с целью уточнения расположения гибких участков. Качество полученной модели оценивают с использованием программы, которая сравнивает пространственное расположение аминокислотных остатков моделируемого белка с известной статистикой, полученной для белков с расшифрованной экспериментально пространственной структурой. Построенные таким способом модели были успешно использованы для конструирования, например, новых ингибиторов протеазы вируса иммунодефицита человека для лечения СПИДа; ингибиторов ренина как средства 36

для лечения эссенциальной гипертензии; для белковой инженерии гибридных нейротрофных факторов и т. д. Моделирование методом молекулярной динамики дает детальное описание поведения полипептидной цепи при ее сворачивании или разворачивании. Оно дает более надежную картину в случае разворачивания, поскольку повышение температуры, используемое для денатурации белков, обеспечивает более высокую скорость протекания моделируемых событий. Эти методом моделируется состояние белка, близкое к полностью свернутому. При этом подчеркивается, что существенной стадией фолдинга является образование небольшого по размерам критического ядра сворачивания в окружении «развернутой фазы». Результаты моделирования не всегда могут быть надежно интерпретированы, поскольку процесс сворачивания должен протекать по тому же пути, что и процесс обратимого разворачивания только в том случае, когда оба процесса проводятся при одних и тех же условиях. Статистические методы (метод Монте-Карло) наиболее эффективны при компьютерном моделировании и изучении структур. 2.4 Компьютерный дизайн структуры белка Белковая инженерия обращается к дизайну, конструированию белковых молекул. Задача дизайна - обратная по отношению к задаче предсказания структуры. Если при предсказании нужно найти пространственную структуру, наиболее пригодную для рассматриваемой последовательности - то при дизайне нужно сконструировать последовательность, годную для создания желаемой пространственной структуры. Вообще говоря, расчет искусственных конструкций может быть проще, чем предсказание структуры "натуральных" белков. Конструирование новых белков опирается на теорию белковых структур; их "строительными блоками" обычно служат последовательности, кодирующие мощные, внутренне стабильные и способные к эффективному слипанию α- и β-участки. Белковый дизайн был поставлен на повестку дня в конце 70-х начале 80-х годов, когда возникла техника создания искусственных генов и техника точного химического синтеза белковых цепей. В 37

конце 80-х - начале 90-х годов при помощи прикидок, проб и ошибок были созданы простейшие белковые молекулы. Их архитектуры брались из природных белков, а их аминокислотные последовательности подбирались так, чтобы, не будучи гомологичными природным, стабилизировать эту архитектуру. Конструирование белковой молекулы с чистого листа de novo в наиболее сложной и интригующей форме предполагает получение последовательности, не встречающейся в природе, которая претерпевает фолдинг с образованием белковой глобулы с предсказанной в проекте третичной структурой и ферментативной активностью. Термин "дизайн de novo" также часто используют для описания процесса конструирования белковой молекулы с заложенными исследователем особенностями пространственной структуры ее скелета без учета данных о точных координатах атомов макромолекулы. Кроме того, все вышеупомянутые возможности успешно применяются для перестройки известных белков с целью направленного изменения их свойств и биологической активности. В этом случае в процессе редизайна пересматриваются проекты основного дизайнера белков – природы, как правило, в двух основных направлениях: для создания мини-белков, более короткие полипептидные цепи которых сохраняют важные свойства исходных природных макромолекул, а также для получения ферментов с измененной субстратной специфичностью или обладающих большей стабильностью в экстремальных условиях их использования (экстремозимов). Для успешного дизайна белка требуются не только стабилизация его пространственной структуры в функциональном состоянии, но и дестабилизация всех возможных альтернативных элементов вторичной структуры, которые иначе будут служить кинетическими и энергетическими ловушками на пути реализации правильного фолдинга. Действительно, уже в ранних экспериментах по белковому дизайну de novo было установлено, что для успешного завершения работы необходимо предвидеть и с помощью негативного дизайна нейтрализовать как можно больше альтернативных внутримолекулярных структур, обладающих низкой свободной энергией. Компьютерный дизайн совершенно новых белков начинают с определения координат скелета полипептидной цепи и 38

построения схемы силовых полей, взаимодействующих в макромолекуле. Альтернативно скелет белка может быть построен с использованием клонотеки известных элементов вторичных структур. После выбора конформации скелета создаваемого белка переходят к следующему этапу конструирования – так называемому обратному дизайну: определению последовательности аминокислотных остатков, которая может свернуться в требуемую пространственную структуру. Полный набор случайных последовательностей, который можно получить для 100-звенного полипептида из 20 разных аминокислотных остатков, представлен 10130 последовательностями. Учитывая большое влияние на фолдинг гидрофобных и полярных аминокислотных остатков, прежде всего занимаются их распределением вдоль полипептидной цепи. Введение только пяти таких остатков позволяет ограничить пространство последовательностей в 1060 раз. Но даже в этом случае число оставшихся вариантов является слишком большим (1070). Имеется несколько путей снижения остроты этой проблемы. Во-первых, известно, что большое число последовательностей может приобретать одну и ту же пространственную структуру, что дает возможность рассматривать не все возможные последовательности, а лишь одну из многих. Во-вторых, при конструировании последовательности можно использовать не все 20 аминокислот, а значительно меньшее количество. Водородные связи и электростатические взаимодействия между боковыми цепями аминокислотных остатков, погруженных в белковую глобулу, играют большую роль в формировании пространственной структуры белка. Поэтому расчет возможных взаимодействий внутри белковой глобулы с использованием специальных алгоритмов помогает осуществить выбор оптимальной последовательности из многочисленных возможных, а одной из основных задач является разработка эффективных алгоритмов, позволяющих находить оптимальные решения данной проблемы. Менее четверти боковых цепей аминокислотных остатков находится внутри белковой глобулы вне контакта с растворителем. Остальные 75% остатков помогают стабилизировать основную 39

пространственную структуру белка и дестабилизировать возможные альтернативные состояния. В настоящее время создано программное обеспечение, позволяющее автоматизировать процесс разработки участков полипептидных цепей, которые взаимодействуют с растворителем. В результате его использования удается предсказывать стабильность спиральных участков белка, контактирующих с водной фазой, и характер взаимодействия соседних групп в этих последовательностях. С помощью дизайна de novo пока удается конструировать элементы вторичной структуры белков или их отдельные домены. Гораздо более успешными оказываются попытки осуществлять рациональный редизайн известных белков, используя в качестве исходных молекул белки и ферменты, функциональность которых уже была апробирована самой природой в живых организмах. Одним из подходов в этом случае является создание новых активных центров в белках, пространственная структура которых хорошо изучена. При использовании в качестве исходной молекулы инертного белка тиоредоксина после проведения предварительного компьютерного дизайна удалось внедрить в его полипептидную цепь новый активный центр, способный осуществлять гидролиз активированных эфиров. В этом случае для решения проблемы были использованы знания, накопленные при исследовании механизмов функционирования каталитических антител (абзимов). Была создана серия виртуальных модифицированных молекул тиоредоксина с минимальной общей свободной энергией. Требуемое высокоэнергетическое состояние конкретных молекулярных участников реакции моделировали с помощью боковых цепей аминокислотных остатков, ориентированных в пространстве с целью создания условий, необходимых для осуществления катализа. Создание методами рационального редизайна искусственных белков, обладающих совершенно новыми функциями, на основе полипептидного скелета биологически инертных макромолекул, как правило, требует введения нескольких мутантных аминокислотных остатков в разные участки их полипептидных цепей, так как одиночные мутации не приводят к желаемому результату. Говоря о возможностях метода в терминах ландшафтов функциональности, можно предположить, что введение множественных мутаций позволяет пересекать 40

биологически инертные пространства последовательностей и попадать в зоны новых холмов, на их склоны. Это открывает путь для дальнейшего совершенствования функциональности нового белка, полученного методами белковой инженерии, и может приводить к изменению вида самого ландшафта. Для реализации замысла по созданию новой белковой молекулы имеется несколько экспериментальных путей, в том числе и химический синтез полипептидных цепей. Однако наиболее популярным подходом к получению совершенно новых, а также измененных природных белков, является их биосинтез in vivo или in vitro. В этом случае создают ген исследуемого белка, клонируют его в экспрессирующем векторе и далее осуществляют транскрипцию гена с последующей трансляцией образовавшихся мРНК. Замены аминокислотных остатков в исследуемом белке проводят целенаправленно, создавая мутации в определенных участках рекомбинантного гена, т.е. осуществляя процесс направленного мутагенеза. Разработаны и экспериментально подтверждены методы моделирования фолдинга на примере малых белков. При этом времена сворачивания белков в лабораторных условиях совпали с продолжительностью этого процесса на компьютерных моделях.

Рис. 12. Компьютерное моделирование фолдинга белков ( http://www.cbio.ru/Биотехнология : Folding@Home) 41

Белковые инженеры из Пасадены создали оригинальные программы автоматизированного конструирования белков - не первые, но первые по-настоящему эффективные. Они уточнили полуэмпирические правила структурной организации белков, сформулированные в течение двух последних десятилетий, а также некоторые другие, и свели их к единому вычислительному алгоритму. При вычислении энергии попарных взаимодействий между боковыми цепями аминокислот, а также между ними и каркасом полипептида, используются так называемые эмпирические энергетические функции. Полученные величины служат исходными данными для оптимизации вторичной и третичной структур конструируемого белка. Процесс оптимизации основан на теореме, доказанной авторами работы, и сводится к поиску глобального энергетического минимума системы. Теперь для создания нового белка (пока, правда, очень небольшого) достаточно запустить программу и описать желаемую цель. Впервые это сделали в 1997 году Стефан Мэйо и Бэзил Дахьят. Они задались целью найти аминокислотную последовательность, которая сама собой складывалась бы в структуру, повторяющую все изгибы одного из участков цинковых пальцев (белков, ассоциированных с ионами цинка). Задача была успешно решена. «Вычисленный » полипептид был синтезирован, и его конформация, как показала проверка с помощью ядерного магнитного резонанса, оказалась такой же, как у выбранного прототипа. В определенном смысле конструкторы даже превзошли природу. Структура естественного прототипа стабилизируется ионом цинка, а его искусственный аналог, образованный иным полипептидом, не нуждается в этой металлической скрепе. Это самый маленький из известных белков (в нем всего 23 аминокислоты), способных образовывать уникальную трехмерную структуру без подобных скреп (металлических и прочих). Уже после этой работы ученые усовершенствовали свой алгоритм, сделали его более универсальным. Применив обновленную программу, они сконструировали гипертермофильный (то есть устойчивый к высоким температурам) аналог одного из доменов белка G стрептококка. Подобный белок нельзя получить посредством эволюции в пробирке, поскольку в настоящее время не существует 42

экспериментальных систем, позволяющих проводить селекцию белков при температуре 100°С. Конечно, сконструированные белки пока очень малы по размеру. Но надо учесть, что их первичные структуры вычислялись на компьютере с быстродействием всего лишь около 4 млрд. операций в секунду. Между тем уже сейчас имеются машины, производящие триллионы операций в секунду. Так что конструирование более крупных белков не за горами. Принимая во внимание быстрый прогресс компьютерной техники, можно сделать вывод, что вычислительную белковую инженерию ждет блестящее будущее. Но специалисты по белкам не оставляют без внимания и первоначальную (прямую) задачу: установление структуры и механизмов функционирования белка по данной аминокислотной последовательности. Ведь если бы ученые умели сворачивать полипептиды in silico, то есть в компьютере, это открыло бы путь к содержательной расшифровке геномов живых организмов, к пониманию «смысла» нуклеотидных текстов, кодирующих белки. Задача ясна. Однако даже мощные компьютеры за несколько недель работы могут промоделировать лишь несколько наносекунд (10-9 сек) процесса самосборки белка, реальная продолжительность которого составляет от нескольких микросекунд до (чаще всего) нескольких секунд. Вывод: чтобы решить задачу, надо кардинально увеличить вычислительные мощности. Для достижения этой цели разработано два очень разных проекта. Первый, представленный еще в декабре 1999 г., принадлежит IBM. Эта компания намерена, затратив 100 млн. долларов, создать за пять лет мощнейший суперкомпьютер, который при нынешних темпах развития электронной индустрии появился бы только через 15 лет. Проектируемая вычислительная машина, получившая название Blue Gene, будет состоять из одного миллиона процессоров, каждый из которых будет работать со скоростью один гигафлоп (один миллиард операций с плавающей точкой в секунду). Общая производительность Blue Gene, архитектура которого включает пять иерархических уровней, составит один петафлоп, или миллион гигафлопов. Такая машина могла бы загрузить все содержимое современного Интернета менее чем за секунду. Второй проект был предложен группой Виджея Панде из Стэнфордского университета. Идея, на которой он основан, 43

заимствована из программы SETI@home. Последняя задействовала миллионы компьютеров по всему миру для анализа космических радиоволн с целью обнаружения следов внеземных цивилизаций. Панде тоже намерен объединить миллионы обычных домашних компьютеров, но уже для моделирования свертывания белков. Его группа разработала алгоритмы, которые разбивают задачу на части, соответствующие переходу полипептида от одного локального энергетического минимума к другому. Из-за многовариантности процесса вычисление каждого его этапа требует параллельной работы множества компьютеров. Результат, полученный на одном из них, служит отправным пунктом для последующего моделирования. Этот проект получил название, по аналогии со своим прототипом, folding@home. Контрольные вопросы: 1. Принципы методов определения пространственной структуры белков. 2. Этапы расшифровки пространственной структуры белка методом рентгеноструктурного анализа. 3. Суть метода ЯМР. 4. Методология предсказания пространственной структуры белка по ее ами-нокислотной последовательности. 5. Моделирование пространственной структуры белка методом молекуляр-ной динамики. 6. Конструирование de novo последовательности аминокислот, которая будет сворачиваться в заданную пространственную структуру

44

3 ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ. ТИПОВЫЕ РЕАКЦИИ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП БЕЛКА

Химическое модифицирование, т.е. проведение химических реакций, изменяющих ковалентную структуру белка, представляет собой один из приемов, используемых для получения белков с измененными свойствами. Кроме того, он широко используется для изучения структурно-функциональных отношений в белках, для создания необратимых ингибиторов ферментов, используется при иммобилизации белков, особенно ферментов и антител, для биотехнологических задач, для изучения топографии поверхности белков и их локализации в сложных структурах. Использование химических методов для направленного изменения свойств ферментов, по-видимому, началось в 1966 г. с работ Л. Полгара и М. Бендера, а также К. Ниита и Д. Кошланда, которые применили своеобразный "химический мутагенез" на уровне белковой молекулы для превращения остатка Ser в Cys в каталитической триаде активного центра субтилизина. Интерес к этому направлению исследований был стимулирован во второй половине 1980-х гг. опытами Е. Кайзера, в частности, присоединившего флавиновый кофермент к папаину, что привело к превращению протеиназы в оксидоредуктазу. Сегодня ковалентные и нековалентные химические модификации белковых молекул являются широко распространенным подходом к изменению их свойств. Типовые реакции химической модификации функциональных групп белка: 1. Модификация с целью повышения активности фермента Ферменты созданы для работы в определенной внутриклеточной среде, поэтому в условиях, заметно отличающихся от внутриклеточных, их активность можно повысить. Так, модификация в алкогольдегидрогеназе лизиновых остатков 45

метилпиколинимидатом приводит к 19-кратному повышению активности фермента при высокой концентрации субстрата. После модификации кинетические характеристики ферментативной реакции остаются такими же, как у нативного фермента, причем диссоциация кофермента является лимитирующей стадией в обоих направлениях, что является ключем для объяснения наблюдаемых эффектов. Константы Михаэлиса и ингибирования для модифицированного фермента примерно в 15-23, а число оборотов в 12-30 раз выше, чем для нативной формы. При уменьшении концентрации субстрата нативный и модифицированный ферменты по активности сближаются друг с другом. Повышение активности при модификации фермента было показано для дигидрофолат-редуктазы из печени цыпленка. Реагенты, взаимодействующие с цистеином-11, вызывают 5-10 кратное повышение активности фермента по отношению к физиологическим субстратам НАДФН и дигидрофолату. Однако, при этом фермент становится менее термостабильным. 2. Модификация, вызывающая изменение поверхностных свойств Одно из направлений химической модификации, где результат можно предсказать на основе некоторых данных о белке и физико-химических данных, заключается в изменении поверхностных свойств молекулы. Простейшим с точки зрения и реализации, и интерпретации случаем является изменение поверхностного заряда. Ниже приведены типичные реакции, используемые для удаления или обращения заряда: -NH3 ангидрид янтарной кислоты NHCO(CH2)2COO-NH3 уксусный ангидрид NHCOCH3 -COO- этилендиамин CONH(CH2)2NH3+ -COO- метиламин CONHCH3 С помощью этих реакций были смесщены значение рКа химотрипсина на ±1 от исходного значения, равного 7. Как и ожидалось, обращение положительного заряда в отрицательный увеличивает рКа, тогда как замена отрицательного заряда положительным – уменьшает. Сукцинилированный химотрипсин характеризуется также повышенным значением Ккат и 46

пониженным Км для гидролиза сложноэфирных субстратов; у фермента, модифицированного этилендиамином, не обнаруживается изменения Ккат. В последнем случае Км сильно зависит от рН, в отличие от нативного фермента, у которого такой зависимости не существует. Ацетилирование трипсина также привело к повышению активности фермента, несмотря на то, что в этом случае критическим процессом было О-ацетилирование экспонируемого остатка тирозина. Причину повышения активности трипсина авторы работы увидели в увеличении скорости образования ацилфермента при гидролизе сложных эфиров и амидов. Вместо добавления катионов в реакционную среду можно использовать присоединение заряженных групп. Пример пластоцианин. Он является переносчиком электронов с Р700+ в хлоропластах. Он работает в присутствии ионов магния, «экранирующих» отрицательные заряды карбоксильных групп пластоцианина. Тот же эффект достигается при модификации белка этилендиамином, при этом окислительно-восстановительный потенциал стал выше +40 мВ. Значительное улучшение термической устойчивости термолизина было достигнуто путем ацетилирования шести-семи аминогрупп лизиновых остатков длинноцепочечными жирными кислотами, содержащими различное число эфирных групп. СН3-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2СН2(СН2)2-О-(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2СН2(СН2)2СН2(СН2)2-О-(СН2)2СО- СН3СН2(СН2)2СН2(СН2)2СН2(СН2)2СН2(СН2)2СО- -

(1) (2) (3) (4) (5)

Гидрофобность модифицирующих групп убывает от 5 к 1. Белки, модифицированные группами 1, имеют фактически нормальную активность (>90% активности нативного фермента) и повышенную термическую стабильность; производные 5 теряют способность растворяться в воде. Другой способ стабилизации белка заключается в его связывании с водорастворимым полимером. Так, связав аденозиндеаминазу с декстраном (активированным цианбромидом), был получет продукт, активность которого (при повышенном Км и 47

снизившейся Ккат) составляла всего 13% от активности нативного фермента. Однако, при этом увеличилась в 2 раза (с 1 часа до 2-х часов) время инактивации фермента вдвое при 600С. 3. Модификация с изменением специфичности Протеазы часто обладают также эстеразной активностью. При ацетилировании в карбоксипептидазе А всего двух тирозиновых остатков наблюдается шестикратное усиление эстеразного действия, протеолитическая же активность фактически утрачивается. Панкреатические рибонуклеазы (РНКазы) подвергали многим химическим модификациям. Интересна димеризация фермента с помощью сшивающего агента диметилсуберимидата. Нативный феремент представляет собой мономер с низкой активностью по отношению к двухцепочечной РНК, однако, после сшивки гидролитическое действие фермента на двухцепочечную РНК усиливается в 78-440 раз. При сшивке этого фермента в присутствии ингибитора индолпропионовой кислоты у него появляется также эстеразная активность, что предположительно связано с осуществлением сшивки при необычной конформации фермента. Ферменты, катализирующие окислительные реакции, в соответствующих условиях также часто проявляют измененную специфичность. Например, при обработке лизинмонооксигеназы реагентами, взаимодействующими с тиоловыми группами, можно добиться перехода от монооксигеназных реакций к оксидазным. В случае моноаминооксидазы тип реакции остается тем же, но модификация приводит к потере активности по отношению к природному субстрату тирамину и повышению активности к гистамину. При модификации флавопротеиндегидрогеназ их акцепторная специфичность может меняться так, что диапазон соединений, восстанавливаемых этими ферментами, расширяется и, кроме НАД(Ф+)+, включает красители и кислород. Фактически эти ферменты из дегидрогеназ превращаются в оксидазы, как, например, в паре ксантиндегидрогеназа /оксидаза. Глутатионредуктаза катализирует реакцию GSSG + NADPH + H+ = 2GSH + NADP+. Модификация лизиновых остатков фермента тринитробензолсульфонатом приводит к частичному сохранению НАДФН-оксидазной и полной потере глутатионредуктазной активности. 48

4. Присоединение кофермента Потенциально полезная модификация фермента заключается в присоединении к полипептидной цепи кофермента, который обычно свободно диффундирует. Этот способ был опробирован на примере комбинации аналога НАД и алкогольдегидрогеназы. Коньюгат содержал приблизительно одну молекулу кофермента на активный центр, а его активность составляла около 20% активности системы фермент/растворимый кофермент. Такой подход можно распространить на АДФ/АТФ-, птерин- и фолатзависимые системы. 5. Новые типы ферментативной активности Стратегия модификации заключается в усилении слабой каталитической активности органической молекулы путем ковалентного связывания ее с белковой цепью, чтобы использовать способность последней связывать субстрат. Пример – флавопапаин. Папаин – протеаза растительного происхождения с каталитически активной тиольной группой. Обработка папаина бромоизоаллоксазинами приводит к ковалентному присоединению редокс-групп к тиолу, как показано на рис. Модифицированный таким образом фермент не проявляет протеолитической активности, но проявляет окидазную. Производное папаина, полученное алкилированием цистеинового остатка активного центра, обладает слабой способностью к окислению дитиолов и дигидроникотинамидов. Модификация активного центра - не единственный способ создания новой ферментативной активности. При мечении трех поверхностных остатков гистидина миоглобина группами пентамминрутения, у гемового центра фермента появилась способность прочно связывать анионы. Кроме того, такой гемм проявляет также выраженную кислород-зависимую аскорбат- и дурогидрохиноноксидазную активность. 6. Оптимизация ферментов для функционирования в неводных средах Использование органических растворителей в качестве среды для проведения химических реакций на основе биокатализа имеет много преимуществ перед применением водных сред для 49

осуществления аналогичных реакций. В частности, к несомненным достоинствам данной группы методов относятся повышение растворимости гидрофобных субстратов и сопутствующий этому сдвиг равновесия химической реакции в сторону образования продуктов реакции. При исследовании структуры ферментов в органических средах было установлено, что кристаллические или лиофильно высушенные полипептиды сохраняют свои основные характерные особенности. Ковалентная модификация ферментов монофункциональными реагентами используется для введения в белки новых функциональных групп, повышения их растворимости в органических средах и других изменений биохимических свойств. Особенной популярностью пользуется модификация ферментов полиэтиленгликолем (ПЭГ), которая приводит не только к стабилизации в органических растворителях, но и сопровождается повышением временем их полужизни в биологических жидкостях, а также снижением антигенности макромолекул, что важно при терапевтическом применении ферментов. Кроме того, для тех же целей используют ковалентные модификации белков амфифильным (содержащим гидрофобные и гидрофильные группы) детергентом полиоксиэтиленлауроиловым эфиром. В этом случае наблюдается повышение растворимости каталазы в абсолютном толуоле и 1,1,1-трихлорэтане, причем в последнем растворителе активность модифицированного фермента была в 200 раз выше, чем у исходного белка, а его активность в водных средах была выше в 15-20 раз. Контрольные вопросы 1. Что такое химическая модификация молекулы белка, для какой цели она используется? 2. Практические аспекты использования химической модификации белка. 3. Типовые реакции химической модификации функционалдьных групп белка. 4. Охарактеризуйте реакции, используемые для изменения поверхностных свойств молекулы белка. 5. Методы изменения растворимости белка в неводных средах. 50

4 ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Пептидный синтез – построение пептидной цепи путем соединения аминокислот с помощью химических методов. Синтетические пептиды широко используются для структурнофункциональных исследований. С помощью химических методов удается получать аналоги биологически активных пептидов, а также аналоги с остатками небелковых аминокислот. Синтетические пептидные фрагменты белков применяются для изучения их антигенных свойств и получения специфичных к отдельным участкам полипептидных цепей антител, используемых в структурно-функциональном анализе и в создании диагностикумов и вакцин. Методами пептидного синтеза получают (в том числе и в промышленном масштабе) многие практически важные препараты для медицины и сельского хозяйства. Пептидный синтез позволяет непосредственно получать вещества с высокой биологической активностью для их широкого применения в медицине, сельском хозяйстве и для научных исследований. При этом возможно создание любых аналогов, не существующих в природе, которые нельзя получить, например, методами генной инженерии. Основное практическое значение пептидного синтеза – это получение биологически активных и лекарственных веществ в довольно крупных масштабах. Спектр их применения, а это гормоны, иммуномодуляторы, вещества, действующие на центральную нервную систему, диагностические наборы, например, для СПИД, - довольно широк. Эра химического синтеза биологически активных природных пептидов началась с работ В. Дю Виньо по синтезу пептидных гормонов окситоцина и вазопрессина (1953 г.).

51

Рис. 13. Структура окситоцина, определенная Дю Виньо с сотрудниками (http://him. 1september.ru)

Структура гормона окситоцина была подтверждена его химическим синтезом в 1954 г., что являло собой впервые осуществленный полный синтез природных пептидов. Синтез включал конденсацию N-карбобензокси-S-бензилдипептида (I) с триамидом гептапептида (II) с помощью тетраэтилпирофосфита. После удаления карбобензокси- и бензильных групп, защищавших амино- и сульфгидрильные группы соответственно в обоих пептидах, образовавшийся нонапептид окисляли воздухом, в результате чего был получен окситоцин. Так были осуществлены первый структурный анализ и первый синтез полипептидного гормона – выдающееся достижение в биохимии и медицине. С работ Дю Виньо в науке началась эра химического синтеза биологически активных природных пептидов.

52

Рис. 14. Общая схема синтеза окситоцина по Дю Виньо

Через 10 лет, в 1963-1965 гг., были осуществлены полные синтезы инсулина (Х. Цан, П. Катсояннис, Я. Кунг); в 1963 году Р. Швицер и П. Зибер завершили полный синтез 39-членного гормона кортикотропина. В 1963-1969 гг. был синтезирован S-белок рибонуклеазы А, предпринятый в США под руководством Р. Хиршмана. Далее последовал синтез β-липотропина, содержащего 91 аминокислотный остаток (Ч. Ли, Д. Ямашито, 1978), рибонуклеазы А, состоящей из 124 аминокислотных остатков (Х. Яджима, 1980) и синтез неиротоксина II (61 остаток) из яда среднеазиатской кобры (В.Т. Иванов и сотр., 1982) и т.д. Эти достижения стимулировали усилия по поиску новых эффективных методов создания пептидной связи, защитных группировок, способов защиты и идентификации пептидов. Сырьё для синтеза пептидов можно разделить на следующие основные группы: аминокислоты, их производные, реактивы для введения и удаления защитных групп и конденсирующие реагенты. Современный пептидный синтез располагает богатым арсеналом методических возможностей. В общем случае синтез любого пептида состоит из трех основных стадий: блокирования (защиты) не участвующих в реакции функциональных групп 53

аминокислоты или пептида; конденсации активированной карбоксильной группы одного компонента с аминогруппой другого; селективного или полного удаления защитных групп для продолжения синтеза или получения свободного пептида. В зависимости от используемых методических приемов и характера синтезируемого конечного продукта различают следующие виды пептидго синтеза: 1. Классический пептидный синтез в растворе, подразделяемый на ступенчатый синтез линейных пептидов, осуществляемый последовательным присоединением аминокислот от С-конца к N-концу цепи, и на блочный синтез линейных пептидов, когда построение цепи ведется из предварительно синтезированных фрагментов. 2. Синтез пептидов на полимерном носителе, при этом растущая полипептидная цепь ковалентно присоединена к нерастворимому или растворимому полимеру и отделение ее от полимера осуществляется на завершающей стадии синтеза. При использовании нерастворимого носителя принято говорить о твердофазном синтезе, существующем в настоящее время и полностью автоматизированном варианте. На основе растворимых полимеров осуществляется жидкофазный синтез. 3. Синтез гомо- и гетерополиаминокислот, построенных из повторяющихся остатков одной-двух аминокислот путем полимери-зации или сополимеризации производных аминокислот (N-карбоксиангидридов и т.п.). 4. Ферментативный пептидный синтез, или синтез пептидов с помощью ферментов. 5. Полусинтез пептидов, заключающийся в использовании методов пептидного синтеза для модификации природных пептидов. Например, отщепление в молекуле природного пептида или белка небольшого франмента, а затем введение новой аминокислотной последовательности. 6. Синтез циклических пептидов, осуществляемый замыканием линейного пептида в цикл соответствующей величины различными способами. 7. Синтез гетеродетных пептидов, построенных с участием как амидных связей, так и связей другого типа – сложноэфирных, тиоэфирных, дисульфидных. 54

4.1 Защитные группы, используемые в пептидном синтезе Существует два вида защитных групп – постоянные и временные. Постоянными называют группировки, используемые для защиты боковых функциональных групп и удаляемые на заключительном этапе синтеза пептида. Временными являются защитные группы для Nα-концевой аминогруппы и С-концевого карбоксила, снимаемые соответственно перед каждой стадией удлинения цепи или конденсации фрагментов. Защитные группы, используемые в синтезе пептидов, должны удовлетворять следующим условиям: - Полностью блокировать соответствующую группировку от участия в проводимых химических реакциях; - Быть устойчивыми в ходе удаления других защитных групп; - Не вызывать побочных реакций и рацемизации при введении, удалении и при образовании пептидных связей; - Защищенные производные должны быть устойчивыми идентифицирумыми соединениями; - Не вызывать осложнений с растворимостью и выделением пептидов из реакционных смесей. α-Аминогруппу ацилирующей аминокислоты или пептида защищают так, чтобы блокирующую группировку после образования пептидной связи можно было отщепить, снять в достаточно мягких условиях, которые гарантировали бы целостность пептида. Одной из первых была предложена бензилоксикар-бонильная группа (сокращенное название Z), которую вводят ацилируя аминокислоту или пептид бензилоксикарбонил-хлоридом. С6Н6СН2-О-СО-Cl + NH2-CH-COOH | СН | (CH3)2 Бензилоксикарбонил- Валин хлорид

55

C6H6CH2-O-CO-NH-CH-COOH | СН | (CH3)2 Бензилоксикарбонилвалин

Широко применяют трет-бутоксикарбонильную (ВОС) группу. Ее вводят, ацилируя аминогруппу ангидридом монотрет-бутилового эфира угольной кислоты, отщепление же достигается мягким действием кислотных агентов – трифторуксусной кислоты или хлористого водорода в органических растворителях. Н3С О О СН3 CH3 O | || || | | || СН3-С – О–С – О– С – О – С – СН3 + NH2 –CH2-COOH → CH2-C-O-C-NH-CH2-COOH

Часто используют 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу (Fmoc-группу). Ее вводят, действуя на аминокислоту или пептид соответствующим хлорангидридом. Известно множество других защитных групп. Необходимость использования большого их набора обусловлена тем, что специфические группы требуются для защиты функциональных групп боковых цепей, причем деблокирование α-аминогрупп необходимо проводить каждый раз перед новой стадией синтеза, тогда как защита боковых групп не должна затрагиваться в этих условиях. Защита α-карбоксильной группы Для этой цели обычно используют превращение карбоксильной группы в метиловый или трет-бутиловый эфиры. 4.2 Методы создания пептидной связи Образование пептидной связи в общем сводится к отщеплению элементов воды.

Для того, чтобы сделать эту реакцию возможной и, более того, обеспечить е высокую скорость и полноту, необходимо «активировать» карбоксильную группу. Такая активация должна 56

сводиться к увеличению электрофильности карбонильного углерода. Важная роль в этом случае принадлежит группе Х’, которая в конечном счете определяет эффективность активации. Методы конденсации обычно и различаются природой группы Х’. Главной побочной реакцией в пептидном синтезе является реакция рацемизации, т.е. полной или частичной потери оптической чистоты одного или более аминокислотных остатков. Рацемизация приводит к образованию оптически неоднородных продуктов, разделение которых по мере удлинения цепи резко осложняется и превращается в практически неосуществимую задачу. Поэтому на выбор защитных групп и методов конденсации накладываются жесткие ограничения. Основные методы создания пептидной связи перечислены ниже: Хлорангидридный метод применяется редко, т.к. сопровождается рацемизацией и образованием побочных продуктов.

Метод активированных эфиров

Азидный метод - рацемизация сведена к минимуму, но есть побочная реакция – перегруппировка Курциуса.

57

Карбодиимидный метод - ацилированная аминокислота реагирует с -N=C=N- (карбодиимидной) группировкой, образуя соответствующую О-ацилмочевину. Это активированное производное вступает в реакцию с аминокомпонентом, причем образуется пептид и двузамещенная мочевина.

Карбоксиангидридный метод - этим методом построение ведется от С- к N-концу. (Р. Хиршман получил так фрагменты Sбелка рибонуклеазы).

58

Пептидный синтез в классическом варианте сопряжен со значительными затратами труда и времени. С целью создания более эффективной методологии Р. Меррифилд в 1963 году предложил твердофазный метод синтеза пептидов. Идея этого метода в закреплении растущей полипептидной цепи на полимерном нерастворимом носителе. При этом значительно упрощается операции выделения промежуточных продуктов, которые сводятся к экстракции и фильтрованию полимера, полностью снимается проблема нерастворимости пептидов и создаются предпосылки для автоматизации процесса. Определяющим фактором в твердофазном синтезе является полнота протекания всех химических реакций, которая достигается за счет применения избытка конденсирующего агента и N-защищенной аминокислоты, отделяемых экстракцией.

Рис. 15. Схема твердофазного синтеза (рисунок заимствован из книги Ю.А. Овчинникова) 59

Рис. 16. Схема жидкофазного синтеза (рисунок заимствован из книги Ю.А. Овчинникова)

Успешное проведение синтеза на твердом полимере требует применения высокоочищенных реагентов и растворителей на всех стадиях процесса. Первый твердофазный синтез гормона брадикинина был проведен Р. Меррифилдом с общим выходом 70%. Автоматический твердофазный синтез пептидов осуществляется на специальных приборах, называемых синтезаторами. Одним из недостатков твердофазного синтеза является изменение степени набухания полимера по мере роста полипептидной цепи, которое может приводить к «маскированию» концевых NH2-групп растущей полипептидной цепи. Это, в свою очередь, вызывает неполно протекание реакций конденсации на той или иной стадии, и в результате образуются «ложные пептиды», т.е. пептиды с про60

пуском отдельных аминокислотных остатков. Разделение смеси пептидов на конечном этап синтеза в этом случае оказывается затруднительным. Твердофазным синтезом получают не только короткие пептиды, но и некоторые белки, имеющие практическое значение. В частности, в значительных количествах удается получать инсулин, ряд других пептидных гормонов, например кальцитоцин рыб (32 аминокислотных остатка), фактор роста эпителия (53 остатка), росттрансформирующий фактор α (50 остатков), интерлейкин-3 (140 остатков), α1- и α2-интерфероны лейкоцитов человека и их аналоги, панкреотический ингибитор трипсина. Синтезирована и использована для определения пространственной структуры протеиназа вируса иммунодефицита человека, пептидная цепь которой содержит 99 аминокислот. Жидкофазный способ синтеза пептидов предусматривает использование в качестве носителей растворимых полимеров. В качастве растворимого полимера используется полистирол, а избыток реагентов удаляется осаждением полимера из органического раствора с последующим фильтрованием. Жидкофазный способ синтеза пептидов используется в некоторых типах автоматических синтезаторов для получения относительно небольших пептидных молекул. 4.3 Ферментативный синтез пептидов и белков Еще в 1937 году М. Бергман, Г. Френкель-Конрат и Дж. Фрутон впервые сообщили о возможности обращения протеолитической реакции в сторону образования пептидной связи, однако первые исследования по ферментативному синтезу пептидов были проведены сравнительно недавно. Установлено, что протеолитические ферменты – химотрипсин, папаин, термолизин и др. в специфических буферных растворах, чаще всего в водно-органических смесях, в принципе способны катализировать образование пептидных связей между аминокислотами и пептидами. В водной среде равновесие такой реакции сдвинуто в сторону гидролиза, однако, направленное изменение условий реакции (ее термодинамических и кинетических параметров) позволяет сместить равновесие в сторону синтеза. 61

В качестве примера рассмотрим синтез дипептида Ac-Phe-AlaNH2 под действием химотрипсина. Известно, что химотрипсин расщепляет амидные и сложноэфирные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот. Реакция протекает через промежуточную стадию образования ацилфермента, который далее деацилируется с участием воды как нуклеофила. В присутствии других нуклеофилов-аминокислот, их амидов и пептидов можно получить продукты как гидролиза, так и аминолиза. Соотношение костант скоростей гидролиза и аминолиза определяет направление реакции и зависит от концентрации нуклеофилов. Найдено, что при рН 10,0 и 1 М концентрации RNH2(Ala-NH2) выход пептида Ac-Ala-NH2 составляет 95%. Ферментный синтез пептидов используется в производстве, например для производства аспартама – соединения, превосходящего сахарозу по сладости в 200 раз: в концентрированных растворах бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина металлопротеиназы, например, термолизин, катализируют образование пептидной связи между ними, причем продукт реакции, будучи малорастворимым, выпадает в осадок. Именно эта низкая растворимость продукта, которая выводит его из сферы реакции, смещает равновесие в сторону синтеза. В результате получают метиловый эфир L-аспартил- L-фенилаланина, который и является аспартамом. Описаны катализируемые ферментами частичные трансформации пептидов, например, превращение свиного инсулина в инсулин человека, отличающийся от первого только заменой С-концевого остатка аланина в В-цепи на треонин. Это достигается путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединения вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом количестве. Преимуществами синтеза с участием ферментов является отсутствие рацемизации, возможность работы с минимальным числом защитных группировок, высокая скорость протекания реакций. Однако не исключены побочные реакции транспептидации, гидролиза, приводящие к образованию сложных реакционных смесей. 62

4.4 Полусинтез пептидов и белков Полусинтез (семисинтез, частичный синтез) – способ получения соединений, заключающийся в комбинировании природных пептидов и белков или их фрагментов с пептидами, полученными полным синтезом или модификацией природных объектов. Полусинтез можно рассматривать как методический прием, основанный на модификации природных соединений. Известные в структурной химии белка способы ферментативного и химического расщепления пептидной цепи и разделение образующихся в результате фрагментов с помощью хроматографической техники позволяют получить гомогенные пептидные блоки. С помощью различным методов можно осуществить целенаправленное изменени нужного фрагмента (укорочение, удлинение, введение новых остатков и т.п.) и затем собрать из блоков новые, видоизмененные последовательности. Защитные группы при полусинтезе выбираются таким образом, чтобы их введение сохраняло способность производных растворяться в водных и водно-органических растворах. При сборке нужной последовательности из подготовленных пептидных блоков чаще всего используются такие методы, как азидный и метод активированных эфиров. Основное внимание при этом уделяется проблеме рацемизации. Полусинтез как способ получения соединений пептиднобелковой природы можно проиллюстрировать на примере инсулина. Молекулы инсулина свиньи и человека отличаются лишь одним аминокислотным остатком: в положении В30 в инсулине свиньи находится Ala, а в инсулине человека – Thr. В 1972 году впервые было осуществлено превращение инсулина свиньи в инсулин человека (М. Руттенберг) с выходом около 10%. Позднее (1980-1983 гг.) были предложены еще два способа ферментативного превращения инсулина свиньи в инсулин человека (К. Морихара, Дж. Маркуссен). В 1983 г. разработан способ промышленного производства инсулина человека из инсулина свиньи, основанный на применении иммобилизованной протеиназы 1 из Achromobacter lyticus на стадиях гидролиза инсулина в дез-Ala B-30 инсулин и конденсации последнего с Thr-Obut (Т. Ока). Кроме инсулина с использованием данного 63

метода получены аналоги цитохрома с, миоглобина, рибонуклеазы, соматотропина, ингибиторов протеиназ, ферредоксина, А цепи гемоглобина и многих других белков и биологически активных пептидов, с помощью которых была получена уникальная информация о стороении белков и вклада в функию ее отдельных участков и аминокислотных остатков. При одном из подходов полусинтеза белков используют протеолитические ферменты для лигирования пептидов. В этом случае для обращения протеолитической реакции условия реакции изменяют таким образом, что аминолиз промежуточного пептидил-ферментного комплекса становится предпочтительнее его гидролитического расщепления. Необходимые условия создаются путем включения в реакционную смесь органических растворителей, таких как глицерин, диметилформамид или ацетонитрил. При наличии в реакционной смеси второго пептида в процессе аминолиза происходит его объединение с пептидом из комплекса посредством амидной связи. Обратный протеолиз был успешно использован для лигирования пептидов с папаином, трипсином и субтилизином. С использованием такого рода подходов путем последовательного ферментативного лигирования олигосахаридов и полипептидов удается получать специфически гликозилированные производные белков, например, гликозилированную рибонуклеазу В. Путем изменения активных центров протеолитических ферментов с помощью генно-инженерных методов удалось значительно улучшить их способность лигировать пептиды. В частности, Д. Джексон с соавт. в 1994 г. получили двойной мутант субтилизина, названный субтилигазой, обладающий высокой протеинлигазной активностью. Замена Ser→Cys в активном центре фермента придавала ему способность ацилироваться пептидами, этерифицированными по С-концу гликолат-фенилаланил-амидной группой. Вторая замена Pro→Ala в том же активном центре компенсировала негативные стерические эффекты первой мутации и усиливала аминолиз промежуточного тиоэфирного комплекса фермент-пептид Nконцевой аминогруппой второго пептида, сопровождаемый объединением этих двух пептидов с помощью пептидной связи. Субтилигаза была успешно использована для полного синтеза 64

нескольких белков и получения циклических пептидов. В частности, с ее помощью удалось осуществить синтез нативной рибонуклеазы. Дальнейшее усовершенствование стратегии полусинтеза белков было сделано Р. Оффордом и К. Роузом, которые впервые использовали химию гидразонов и оксимов для лигирования синтетических и рекомбинантных пептидов. При полусинтезе (комбинированном синтезе) модифицированного колоний-стимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF) вначале с помощью специфического протеолиза по связям LysSer рекомбинантного фактора были получены фрагменты его полипептидной цепи. С помощью периодатного окисления на Nконцах пептидов были получены альдегидные группы, а на Сконцах с использованием обратного протеолиза – гидразиды. Такие производные легко лигируются друг с другом с образованием исходного полипептида длиной в 174 а.о., обладающего биологической активностью. При этом ряд исходных пептидных фрагментов можно было заменять на искусственно полученные химическим синтезом и содержащие модифицированные аминокислотные остатки. Сила подхода, основанного на химии гидразонов и оксимов, заключается в его универсальности. Вышеупомянутые модификации N- и С-концов пептидов могут проводиться в присутствии любых боковых групп природных белков и не требуют их специальной защиты. Именно это существенно облегчило химический синтез белков и легло в основу группы современных методов, получивших название лигирования синтезированных белков - expressed protein ligation, EPL (1998 г.). ЕРL методы позволяют осуществлять сайтспецифические модификации белковых и пептидных молекул, включая объединение фрагментов полипептидных цепей, полученных протеолитическим или химическим гидролизом исходных белковых молекул. EPL позволяет вводить в белки неприродные аминокислотные остатки и получать модифицированные полипептидные цепи, которые трудно, а порой и невозможно, создать другими имеющимися методами. Метод EPL основан на ковалентном соединении друг с другом полипептидов, полученных химическим синтезом или с использованием технологий рекомбинантных ДНК, что 65

сопровождается образованием требуемого модифицированного белкового продукта. Возможность такой сборки достигается введением на соответствующие концы объединяемых полипептидов реакционноспособных групп, обеспечивающих образование ковалентных связей в водных растворах при физиологических значениях рН. Метод EPL обладает большими преимуществами перед подходами, основанными на использовании только химических методов синтеза полипептидов. При использовании лигирования синтезированных белков большая часть белковой молекулы может быть синтезирована рибосомами, и полученные фрагменты полипептидных цепей далее легко объединяются с пептидами, синтезированными химически. Это позволяет проводить почти любые направленные изменения небольших участков полипептидных цепей сложных белковых молекул и изучать их влияние на функциональность исследуемых белков. В участки полипептидных цепей, полученных химическим синтезом, можно вводить любые функциональные группы, в том числе и аналоги аминокислотных остатков, которые невозможно включить в состав полипептидных цепей с использованием аппарата трансляции. С учетом таких возможностей, метод EPL был немедленно использован для сайт-специфичес-кого введения в белки разнообразных молекулярных зондов, включая флуорохромы и стабильные изотопы, что позволило эффективно исследовать структурно-функциональные отношения в сложных белках и макромолекулярных комплексах. Метод EPL дает возможность получать производные белков чрезвычайно высокой молекулярной массы, что в настоящее время невозможно сделать никакими другими методами. В частности, с помощью этого метода были получены модифицированные производные 3'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli, длина полипептидной цепи которой составляет 1407 а.о. Методом EPL в настоящее время уже исследованы десятки белков прокариотических и эукариотических организмов. В этот список входят киназы, фосфатазы, факторы транскрипции, РНКполимеразы, белки, участвующие в цитоплазматической передаче сигналов, ионные каналы, рецепторы и антитела. 66

4.5 Синтез циклопептидов Для получния циклических пептидов используются обычные для пептидного синтеза методы создания амидной связи. Чаще всего первоначально создается линейный предшественник в виде защищенного пептида, активируется С-концевая карбоксильная группа, освобождается N-концевая аминогруппа и проводится реакция аминолиза собственной аминогруппой пептида. Для уменьшения межмолекулярных реакций аминолиза, приводящих к полимеризации и вследствии этого циклоолигомеризации, реакции циклизации проводят в условиях высокого разбавления в инертных растворителях. Выход циклических продуктов сильно зависит от стерических фактов: напряженности образующегося цикла, разветвленности боковых радикалов, термодинамических и конформационных параметров. 4.6 Синтез гетеродетных пептидов Среди соединений пептидно-белковой природы нередко встречаются такие соединения, которые наряду с обычными амидными связями содержат связи другого типа. Такие пептиды называют гетеродетными. В группу гетеродетных пептидов входят: депсипептиды, в составе которых есть гидроксикислоты или гидроксиаминокислоты; S-пептиды, содержащие тиоэфирную связь между остатками; (S-S)-пептиды, содержащие дисульфидную связь; гликопептиды, содержащие N- или О-гликозидные связи и т.п. (S-S)-пептиды. Остатки цистеина в пептидах и белках образуют дисульфидные связи, соединяющие остатки одной или отдельные пептидные цепи. (S-S)-содержащие пептиды могут быть линейными и циклическими. Создание дисульфидных связей обычно проводится на одном из последних этапов синтеза обработкой соответствующего тиольного предшественника с помощью подходящих окислителей. S-пептиды (тиодепсипептиды) – продукты ацилирования меркаптогруппы Cys-содержащих пептидов производными аминокислот. К S-пептидам относятся пептиды, содержащие остатки лантионина или β-метиллантионина (антибиотики 67

низин, субтилин, дурамицин, циннамицин). Их получают, используя различные активированные производные аминокислот. Депсипептиды – природные соединения, содержащие остатки гидроксикислот, связанных с другими остатками в цепи не только амидными, но и сложноэфирными связями. Стратегия синтеза депсипептидов предусматривает, как правило, сначала создание сложноэфирных связей, а затем соединение полученных блоков путем образования амидных связей. Депсипептидом являются антибиотики валиномицин, энниатины и множество их аналогов. Контрольные вопросы: 1. Что такое химический синтез пептидов и белков и области его применения. 2. Получения белков и пептидов методом химического синтеза, общая схема метода и основные стадии. 3. Виды химического синтеза пептидов, преимущества и недостатки каждого метода. 4. Защитные группы амино и карбоксильных групп, используемые пептидном синтезе. 5. Требования, предъявляемые к защитным группам в пептидном синтезе. 6. Неферментативные методы создания пептидной связи. 7. Основные этапы твердофазного синтеза пептидов и белков. 8. Основные этапы жидкофазного синтеза пептидов и белков. 9. Возможности применения протеолитических ферментов в пептидном синтезе. 10. Метод комбинированого синтезе белков и возможности его применения. 11. Примеры химического синтеза белков и пептидов.

68

5 НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ БЕЛКОВ

Для получения белков с заранее заданными свойствами используют мутантные формы генов. Однако число мутантных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с помощью обычного мутагенеза, чрезвычайно велико. Мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство аминокислотных замен сопровождается снижением активности фермента. Для создания белков со специфическими свойствами лучше использовать другой подход, основанный на внесении изменений в кодирующие их клонированные гены. Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов, свойствами. - Изменив константу Михаэлиса ( К м , которая характеризует прочность связывания cубстрата с ферментом, и максимальную скорость превращения субстрата в продукт при определенных условиях, можно повысить общую каталитическую эффективиость (Vmax/Kм) реакции, Vmax равна полному количеству фермента умноженную на каталическую константу. - Повысив стабильность белка в широком диапазоне температур или рН, можно использовать его в условиях, при которых исходный белок инактивируется. - Создав белки, способные функционировать в безводных растворителях, можно осуществлять каталитические реакции в нефизиологических условиях. - Изменив белок таким образом, чтобы он мог работать без кофактора, можно использовать eгo в некоторых непрерывных промышленных процессах.. - Изменив активный центр фермента, можно повысить его специфичность и уменьшить число нежелательных побочных реакций. - Повысив устойчивость белка к клеточным протеазам, 69

можно упростить процедуру его очистки и повысить выход продукта. - Изменив аллостерическую регуляцию фермента, можно уменьшить степень его ингибирования метаболитом по типу отрицательной обратной связи и увеличить выход продукта и т.д. 5.1 Направленный мутагенез: методика Получить новый белок с заранее заданными свойствами не простая задача, но вполне реально изменить свойства уже существующего белка. Изменения можно вносить в сам белок или в его ген. Однако химическая модификация белков бывает строго специфичной и ее необходимо осуществлять заново для каждого белкового препарата. Поэтому лучше вносить изменения в его клонированный ген. К сожалению, не всегда известно, какую именно аминокислоту или последовательность аминокислот нужно изменить, чтобы получить белок с нужными физическими, кинетическими или химическими свойствами. Введение новой генетической информации в клонированные гены сейчас не составляет особого труда, однако чтобы определитъ, обладает ли искомый белок нужными свойствами, необходимо проанализировать множество белковых продуктов. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. Идентификация аминокислот, замена которых даст желаемый результат, облегчается, если детально известна пространственная структура белка (ее устанавливают с помощью рентгеноструктурного анализа или аналитических методов). Однако для большинства белков такие данные отсутствуют, поэтому направленный мутагенез – это в значительной мере эмпирическая процедура, основанная на методе проб и ошибок. Каждый белок, кодируемый мутантным геном, нужно протестировать и убедиться в том, что мутация дала желаемый эффект. Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы. В одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена, в других случайным образом изменяют короткий 70

фрагмент клонированного гена и среди образующихся мутантных белков выбирают белки, обладающие необходимой активностью. 5.1.1 Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага М13 Олигонуклеотид-направленный (сайт-специфический) мутагенез – это один из наиболее простых методов внесения точковых мутаций в клонированный ген (рис. 16). Для его осуществления необходимо знать: 1) точную нуклеотидную последовательность той области ДНК, которая соответствует мРНК-кодону, подлежащему изменению; 2) характер аминокислотных замен. Обычно встраивают ген-мишень в двухцепочечную форму вектора на основе бактериофага М13. Сначала выделяют одноцепочечную форму вектора (плюс-цепь М13) и смешивают с синтетическим олигонуклеотидом, в точности комплементарным – за исключением одного нуклеотида – нужному сегменту клонированного гена. Этот отличающийся (т.е. неспаривающийся) нуклеотид соответствует тому нуклеотиду кодона мРНК, который необходимо изменить. В случае, представленном на рис. 16, триплет АТТ, соответствующий изолейциновому кодону AUU, нужно заменить на триплет СТТ, соответствующий лейциновому кодону CUU. Олигонуклеотид будет гибридизоваться с комплементарным участком клонированного гена в том случае, если: 1) он добавлен в количестве, во много раз превышающем количество ДНК М13; 2) неспаривающийся нуклеотид находится примерно посередине олигонуклеотида; 3) отжиг проводят при низкой температуре и высокой ионной силе. 3’-конец спарившегося олигонуклеотида служит затравкой для инициации синтеза ДНК, а интактная цепь ДНК М13 – матрицей. Репликация осуществляется с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli при наличии в среде четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, а присоединение последнего нуклеотида синтезированной цепи к 5'-концу затравки обеспечивает ДНК-лигаза фага T4.

71

Рис. 16. Олигонуклеотид-направленный мутагенез (рисунок заимствован из книги Глик Б., Пастернак Дж.)

Однако in vitro синтез ДНК редко идет до конца, и частично двухцепочечные молекулы приходится отделять от нормальных центрифугированием в градиенте сахарозы. Полностью двухцепочечными молекулами ДНК фага М13, содержащими, однако, некомплементарные нуклеотиды, трансформируют клетки Е.coli. B последних образуются фаговые частицы, что в конечном счете приводит к лизису клеток и образованию бляшек. Поскольку репликация идет по полуконсервативному механизму, половина популяции образующихся фаговых частиц должна содержать ДНК дикого типа, а половина – мутантную ДНК со специфической нуклеотидной заменой. Частицы, содержащие только мутантный ген, идентифицируют при помощи ДНК-гибридизации в жестких условиях, используя в качестве зонда исходный 72

олигонуклеотид. Мутантный ген вырезают и встраивают в какой-либо экспрессирующий Е.соli – вектор. Мутантный белок синтезируют в Е.соli и очищают. На самом деле число фаговых частиц, несущих мутантную ДНК, оказывается гораздо меньше ожидаемых 50%: лишь 1-5% бляшек содержат фаг с мутантным геном. Чтобы повысить выход мутантного фага, метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза модифицировали. Один из подходов состоял во введении М13-вектора, несущего ген, в который необходимо внести мутацию, в штамм Е.соli, дефектный по двум ферментам метаболизма ДНК (рис. 17).

Рис. 17. Повышение выхода мутантного фага М І З путем трансформации штамма Е.coli dut ung. (рисунок заимствован из книги Глик Б., Пастернак Дж.) 73

Один фермент – это мутантная форма dUTP-пирофосфатазы (duf). Клетки с неактивной dUTP-пирофосфатазой характеризуются повышенным содержанием dUTP, что приводит к встраиванию в ДНК при репликации нескольких остатков dUTP вместо dTTP. Второй фермент – это дефектная урацил-Мгликозилаза (ung). В отсутствие функцирнальной урацил-Мгликозилазы, остатки dUTP, случайно встроившиеся в ДНК, не могут быть удалены. В одноцепочечной ДНК М13, синтезированной в таких клетках Е.соli, примерно 1% тимидиновых остатков оказываются замененными уридиновыми. Олигонуклеотид с некомплементарным основанием отжигают с урацилсодержащей ДНК М13 и in vitro достраивают вторую цепь. Двухцепочечной ДНК трансформируют штамм Е.соlі, содержащий функциональный ген ung. Активная урацил-N-гликозилаза хозяйских клеток удаляет остатки уридина из ДНК М13, исходная матричная цепь М13 деградирует и далее реплицируется только мутантная цепь, не содержащая dUTP. B результате выход фаговых частиц, несущих мутантный ген, значительно увеличивается. 5.1.2 Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием фага М13 - большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса интересующего исследоватсля гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза – обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину; в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 18).

74

Рис. 18. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК (рисунок заимствован из книги Глик Б., Пастернак Дж.)

Клетки Е.соlі трансформируют вектором, несущим ДНКмишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют 75

щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеотидами. Один из них предназначен для внесения изменений в клонированную ДНК-мишень, второй – для устранения мутации в гене устойчивости к ампициллину, третий – для замены одного нуклеотида в гене устойчивости к тетрациклину с тем, чтобы инактивировать этот ген. В реакционную смесь добавляют 4-дезоксирибонуклеотидтрифосфат, ДНКполимеразу фага Т4, функционирующую аналогично фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I Е.соlі. Гибридизовавшиеся олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула ДНК - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНКлигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е.соlі. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизовался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клониро-ванного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу. 5.1.3 Олигонуклеотид-направленный мутагенез с спользованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, - сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 19) и помещают препарат в две пробирки.

76

Рис. 19. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР (рисунок заимствован из книги Глик Б., Пастернак Дж.)

В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР: 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому гену, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках 77

имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят дtнатурацию, а затем ренатурацию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевых молекул с двумя одноцепочечными разрывами. Эти разрывы репарируются іп vitro после трансформации Е. соlі. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е.соlі стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов Е.соlі типа dut ung и в переносе мутантного гена из М13-вектора в экспрессирующий вектор. 5.1.4 Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров К сожалению, обычно бывает неизвестно, какую нуклеотидную замену в клонированном гене нужно произвести, чтобы получить белок с нужными свойствами. Поэтому часто приходится изменять один определенный нуклеотидный сайт всеми возможными способами. Например, можно синтезировать олигонуклеотидные праймеры, в одном из сайтов которых находятся разные нуклеотиды. Такие «вырожденные» олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен просоединяться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклеотидов. В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных генов-мишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте. Этот подход имеет два преимущества: 1) не нужно в точности знать, какую роль играет тот или иной аминокислотный остаток в функционировании белка: 2) поскольку в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, могут случайно синтезироваться белки с разнообразными интересными и 78

полезными свойствами. Конечно, если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, приходится все начинать сначала, синтезировав новый набор «вырожденных» праймеров, комплементарных другой области гена. Частично вырожденные олигонуклеотиды могут быть встроены в ген-мишень разными способами. Один из подходов состоит в следующем. Ген встраивают в плазмиду между двумя уникальными сайтами рестрикции и проводят амплификацию его левого и правого перекрывающихся между собой фрагментов при помощи нескольких ПЦР. Пара праймеров, которая используется для амплификации левого фрагмента, включает неполностью комплементарный олигонуклеотид, спаривающийся с тяжелой цепью гена-мишени, и обычный, полностью комплементарный праймер, гибридизующийся с участком легкой цепи, фланкирующим левый уникальный сайт рестрикции. Один из праймеров, использующихся для амплификации правого фрагмента, содержит некомплементарные нуклеотиды и спаривается с тяжелой цепью гена-мишени, а второй праймер полностью комплементарен участку легкой цепи, фланкирующему второй (правый) уникальный сайт рестрикции. Продукты ПЦР-амплификации очищают и объединяют, а затем подвергают денатурации и ренатурации. В результате образуется некоторое количество частично двухцепочечных молекул ДНК, спаренных в области гена-мишени. Их достраивают до полностью двухцепочечных с помощью ДНК-полимеразы, а затем проводят ПЦР-амплификацию с парой праймеров, комплементарных противоположным концам молекул. Амплифицированные молекулы обрабатывают двумя эндонуклеазами рестрикции, уникальные сайты которых находятся на концах фрагмента, и встраиваются в соответствующий плазмидный вектор. Этот подход позволяет получить измененные гены со случайными мутациями. 5.1.5 Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов Помимо методов внесения мутаций в клонированный ген, основанных на использовании фага М13, были разработаны другие подходы, в которых использовались плазмидные ДНК. Ген-мишень встраивают в плазмиду поблизости от двух тесно 79

расположенных сайтов рестрикции. Эти сайты подбирают так, чтобы после расщепления двумя рестриктазами образовывались укороченные 3’- и 5’-концы, а именно, чтобы 3’-конец сайта расщепления, расположенного рядом с клонированным геном, был укорочен, а 3’-конец с другой стороны плазмиды выступал. Экзонуклеаза III (ExoIII) E. coli расщепляет молекулу ДНК только с укороченных 3’-концов, но не с выступающих 3'- или любых 5'-концов. Ее добавляют в реакционную смесь после инкубированния ДНК с двумя рестриктазами, и она отщепляет от укороченного 3'-конца цепи по одному нуклеотиду. Через определенное время реакцию останавливают и заполняют пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, используя смесь обычных четырех дезоксирибонуклеотидов с добавлением аналога одного из них. В результате получают плазмиды, содержащие генмишень, в одном или нескольких сайтах которого находится аналог соответствующего нуклеотида. Ими трансформируют клетки Е.соlі. Плазмиды реплицируются, и в клонированный ген включается нуклеотид, отличный от такового в исходном гене. Помимо описанного выше, для случайного мутагенеза используют и другие методы, например один из вариантов олигонуклеотид-направленного мутагенеза с применением ДНК фага МІЗ. В этом случае затравкой для синтеза ДНК служит смесь олигонуклеотидов, содержащих случайные замены. В результате получают библиотеки клонов, несущих множество мутаций в различных сайтах. Недостаток подходов, при которых в клонированном гене образуется большое число случайных мутаций, состоит в необходимости тестирования каждого клона для идентификации того, который детерминировал бы синтез нужного белка. Это весьма непростая задача, но зачастую только так можно выявить белки, обладающие новыми свойствами. Как только эта задача решена, определяют нуклеотидную последовательность соответствующего клонированного гена и идентифицируют измененный сайт (сайты). Таким образом, эти подходы можно использовать как для придания новых свойств уже существующим белкам, так и для создания уникальных белков и ферментов.

80

5.2 Химическая модификация мутантных белков, полученных сайт-специфическим мутагенезом Комбинированное использование методов направленного мутагенеза и химической модификации боковых цепей мутантных белков, полученных первым методом, дает возможность включать в полипептидные цепи неприродные аминокислотные остатки, что не может быть реализовано каждым из этих методов в отдельности. При таком подходе с помощью направленного мутагенеза в исследуемый участок полипептидной цепи вводят остаток природной аминокислоты, содержащий легко модифицируемую функциональную группу (например, остаток Cys), которую далее изменяют химическими методами. Остаток Cys в составе белковой молекулы можно тиоалкилировать с помощью метантиосульфоната (CH3S02S-R), который специфически и количественно реагирует с сульфгидрильными группами. Этот метод, особенно пригодный для белков, не содержащих природных SH-групп, был успешно применен для модификации субтилизина. Кроме того, остатки Cys, образовавшие дисульфидные связи и расположенные внутри белковых глобул, после таких манипуляций остаются интактными. Замена остатков Cys на Ser в том случае, если первые не входят в состав активного центра, как правило, является нейтральной по отношению к ферментативной активности мутагенизируемого белка. Это дает дополнительную возможность специфической модификации конкретных остатков Cys после предварительной замены части лишних остатков направленным мутагенезом. Обсуждаемый комбинированный подход к модификации белков может быть использован для изменения окружения активного центра ферментов, исследования топологических особенностей белковых молекул и их стабилизации. В частности, с помощью этой группы методов удается манипулировать активностью, специфичностью и рН-оптимумом субтилизина, а также конструировать комбинаторные клонотеки белков, в которых исследуемая полипептидная цепь целенаправленно сканируется остатком Cys.

81

Контрольные вопросы: 1. Применение направленого мутагенеза в белковой инженерии. 2. Метод направленного мутагенеза, опишите основные стадии метода. 3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез, типы, преимущества и недостатки. 4. Случайный мутагенез, типы, преимущества и недостатки. 5. Метод включающий сайт-специфический мутагенез и химическую модификацию мутантных белков, его преимущества и трудности.

82

6 ПРИМЕРЫ СОЗДАНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ

В настоящее время существует множество примеров создания модифицированных белков методами белковой инженерии. Рассмотрим некоторые из них: 6.1 Модификация белка В настоящее время ферменты успешно используются в промышленности. Однако, большинство ферментов быстро денатурирует при высокой температуре и в присутствии органических растворителей, а именно в этих условиях протекают многие промышленные процессы. Эти трудности можно преодолеть при помощи направленного мутагенеза и клонирования генов-мишеней. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка. Производя специфические замены в клонированных генах получают белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Выбор аминокислоты, подлежащей замене, как правило, производится с учетом ее роли в функционировании белка. Данные об этом получают в ходе генетических исследований или методом рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры белка. Изменяя специфические сайты или целые участки белковой молекулы, можно повысить термостабильность белка, изменить его чувствительность к рН, специфичность, аллостерическую регуляцию, потребность в кофакторе и т.д. Термостабильность белковых молекул можно повысить, внося в них изменения, благодаря которым они дольше не разворачиваются при повышении температуры. К значительному повышения стабильности белка может привести образование в нем дополнительных дисульфидных связей, главное, чтобы они 83

не мешали нормальному функционированию белка. Такие эксперименты были проведены для лизоцима Т4. Исходная форма белка содержит два свободных остатка цистеина, не участвующих в образовании дисульфидных связей. Результаты эксперимента показали, что термостабильность фермента повышается при образовании новых дисульфидных связей, при этом наиболее термостабильным является белок с максимальным числом таких связей, однако некоторые варианты модифицированного белка не обладали ферментативной активностью. Была предпринята попытка получения термостабильной мутантной ксиланазы Bacillus circulans – фермента, который можно использовать при производстве бумаги, поскольку обработка древесной массы ксиланазой позволяет использовать меньше отбеливающих препаратов. Однако, перед добавлением фермента пульпу обрабатывают горячей щелочью, ксиланаза должна оставаться активной при относительно высоких температурах. Для определения места введения аминокислотных остатков для образования дисульфидных связей было использовано компьютерное моделирование пространственной структуры ксиланазы. Было получено восемь производных ксиланазы, обладающих большей термостабильностью, чем нативный фермент и обладающие такой же активностью при 600С, что и нативный белок. Один вариат был в два раза более активен и сохранял свыше 85% активности после двухчасовой инкубации при 600С, в то время как нативный фермент полностью утрачивал активность в этих условиях уже через 30 минут. При высоких температурах остатки аспарагина и глутамина могут дезаминироваться с образованием аммиака и превращением этих аминокислот в аспарагиновую и глутаминову кислоты, соответственно. Это приводит к локальным изменениям конформации белка и к утрате им активности. В ходе специальных экспериментов на примере триозофосфат-изомеразы Saccharomyces cerevisiae было показано, что замена некоторых остатков аспарагина на треонин или изолейцин приводит к повышению термостабильности фермента и повышению его устойчивости к протеолитическому расщеплению, что говорит о возможности создания термостабильных форм ферментов не только введением дополнительных дисульфидных связей, но и 84

заменой несущественных для их функционирования остатков аспарагина и глутамина. С помощью направленного мутагенеза можно не только повышать стабильность ферментов, но и изменять их каталитическую активность. Возможность данного подхода иллюстрируют результаты эксперимента по изменению специфичности связывания субстрата тирозил-тРНК-синтетазой из B. stearothermophilus. Этот фермент катализирует аминоацилирование тРНК, которая специфически связывает тирозин в ходе двухступенчатой реакции: (1) Tyr + ATP→ Tyr-A + PPi (2) Tyr-A + tRNATyr →Tyr-tRNATyr + AMP В ходе обеих реакций субстраты остаются связанными с тирозил-тРНК-синтетазой. С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза остаток треонина в активном центре фермента был заменен на остаток аланина или пролина. В нативном ферменте гидроксильная группа треонина образует водородную связь с атомом кислорода рибозного кольца тирозиладенилата, и предполагалось, что разрыв этой связи увеличит сродство фермента к субстрату. В результате этих замен уменьшилась константа связывания АТФ, при этом каталитическая эффективность реакции аминоацилирования увеличилась. Можно изменить потребность ферментов в металлических кофакторах. Это показано на примере субтилизинов – сериновых протеиназ, секретируемых в культуральную среду грамположительными бактериями. Субтилизины широко используются в качестве биодеградируемых детергентов. Все они прочно связывают один или несколько атомов кальция, повышающего их стабильность. Однако при использовании субтилизинов в промышленных процессах из-за одновременного использования больших количеств хелатирующих соединений, они теряют кальций, а следовательно, и активность. Чтобы решить эту проблему, попытались сначала лишить субтилизин способности связывать кальций, а затем увеличить стабильность модифицированного фермента. Для этого был идентифицирован ген, кодирующий субтилизин Bacillus amyloliquefaciens, определена пространственная структура белка, а затем создан мутантный 85

ген с делетированными нуклеотидами, кодирующими участок связывания кальция. Белок с делецией не связывал кальций, но сохранял конформацию, сходную с конформацией нативного субтилизина. Дальше была проведена работа по стабилизации модифицированного субтилизина исходя из предположения, что аминокислотные остатки, взаимодействующие с кальцийсвязывающим доменом в нативном субтилизине не являются оптимальными в новых условиях. Были получены мутантные формы субтилизина, содержащие стабилизирующие аминокислотные замены. Фермент, полученный при их внесении в один ген, обладал кинетическими свойствами, сходными с таковыми исходного субтилизина. Мутантный субтилизин в отсутствии кальция был почти в 10 раз более стабилен, чем исходный, и, примерно на 50% более стабилен, чем исходный фермент в присутствии кальция. Олигонуклеотид-направленным мутагенезом можно не только улучшать уже существующие свойства ферментов, но и изменять ферменты таким образом, чтобы они приобретали другую специфичность. Таким образом на основе неспецифичной эндонуклеазы FokI были получены новые сайтспецифичные эндонуклеазы. Фермент – активатор тканевого плазминогена – является сериновой протеиназой, применяемой в клиниках для растворения сгустков крови. Однако, он быстро выводится из системы кровообращения и его приходится вводить путем инфузии. Чтобы добиться терапевтического эффекта используют высокие концентрации фермента, что может привести к неспецифическому внутреннему кровотечению. Поэтому было актуальным получить долго живущий фермент, обладающий высоким сродством к фибрину в тромбах и не вызывающий кровотечений. Внеся три мутации в исходный белок получили фермент, обладающий всеми тремя свойствами. В результате замены гистидина на аспартат в положении 10Вцепи инсулина образуется гормон, который связывается инсулиновым рецептором плазматической мембраны почти в пять раз более эффективно, чем нормальный инсулин. Путем направленной аминокислотной замены была повышена растворимость и всасывание инсулина при его терапевтических концентрациях. 86

Цитохром с содержит консервативный остаток фенилаланина, если его заменить на глицин, цитохром с сохраняет свою активность, но его способность к переносу электронов на цитохром-с-пероксидазу существенно снижается. Субстратсвязывающий центр трипсина содержит остаток глицина. При его замене на более объемную аминокислоту аланин происходит изменение сродства фермента к лизиновому и аргининовому остаткам в составе пептидных субстратов. Повидимому, более длинная боковая цепь аргинина в норме глубже проникает в карман, чем лизин, и лучше заполняет его пространство, а при замене глицина на аланин в кармане не хватает для него места. По известной пространственной структуре тирозил-тРНКсинтетазы Bacillus stearothermophilis была предсказана точечная мутация в ее гене, которая привела к стократному увеличению сродства фермента к АТФ. С помощью аналогичного подхода в лизоциме фага Т4 удалось образовать дисульфидную связь и тем самым увеличить его термостабильность. Последовательные замены в субтилизине B. subtilis позволили увеличить его скорость катализа и стабильность в органических растворителях, изменить субстратную специфичность и рН-оптимум, повысить устойчивость к химическому окислению, а также к термической и щелочной инактивации. C помощью замены единственного аминокислотного остатка в полипептидной цепи L-лактатдегидрогеназы можно изменить ее субстратную специфичность, превратив в малатдегидрогеназу. Современные методы генной инженерии являются основой получения любого фермента в чистом виде и, практически, в неограниченном количестве. Это позволяет использовать ферменты в биотехнологической промышленности для крупномасштабного проведения химических реакций с эффективностью, которая, как правило, недоступна методам органической химии. Существенным ограничением широкого применения ферментов в промышленности является низкая стабильность, поскольку их первичным источником чаще всего являются мезофильные организмы, т.е. организмы, существующие в условиях обычной температуры, давления и других параметров окружающей 87

среды. Тем не менее имеется обширная группа микроорганизмов, получивших название экстремофилов, обитающих в экстремальных условиях окружающей среды: температуре в пределах -2°- -15 °С и 60°-110°С, высокой ионной силе (2-5М NaCl), или значениях рН 9. Экстремофилы обладают ферментами, для которых характерна чрезвычайно высокая стабильность в экстремальных условиях проведения ферментативных реакций. Такие ферменты получили название экстремозимов. Последние весьма привлекательны для биотехнологии, так как обладают свойствами, которые ранее считались несовместимыми с биологическими объектами. Более того, сам факт наличия экстремозимов указывает на принципиальную возможность изменения обычных ферментов методами белковой инженерии для увеличения их стабильности. Для использования ферментативных ресурсов этих организмов применяют другие подходы. В частности, ДНК, выделяемую прямо из почвы или других объектов окружающей среды, используют для получения так называемых клонотек ДНК окружающей среды, которые являются неисчерпаемым источником новых генов. Альтернативно с помощью методов белковой инженерии можно модифицировать известные мезофильные ферменты для придания им новых свойств, которые бы позволили ферментам функционировать в экстремальных условиях. Плодотворным подходом в белковой инженерии этого направления является искусственный перенос особенностей первичной и пространственной структур экстремофилов к мезофильным аналогам, т.е. использование методов рационального дизайна и редизайна. В частности, введение нескольких мутантных аминокислотных остатков в полипептидную цепь термолизиноподобной протеиназы умеренного термофила Bacillus stearothermophilus позволило в 340 раз повысить стабильность фермента при 100°С по сравнению с исходным белком со временем полужизни в таких условиях – 170 мин и сохранить неизменной удельную активность фермента. Не удивительно, что этот фермент стал гидролизовать субстраты, устойчивые к действию исходной протеиназы. Как полагают, такие мутации, 88

приводящие к заменам Gly → Ala и Ala → Pro, а также образованию новой дисульфидной связи, сопровождаются понижением значений энтропии для денатурированной формы фермента, которая становится из энергетических соображений менее предпочтительной по сравнению с нативной конформацией. 6.2 Конструирование гибридных белков Получение гибридных (слитых) белков – стандартная задача генетической инженерии. В контексте белковой инженерии речь идет о создании белков, которые состоят из комбинации функциональных доменов, взятых у родственных или различных белков, и обладают полезными технологическими или медицинскими свойствами. Такая возможность основана, во-первых, на том, что в природе сходные биологические функции у разных организмов обеспечиваются белками, проявляющими самые разнообразные физико-химические и биологические свойства. Во-вторых, известно, что у многих полифункциональных белков функциональные домены действуют независимо друг от друга, так как они организованы в структурные домены. Обмен доменами удобно проводить с помощью метода ПЦР. Для этого синтезируют праймеры, комплементарные к границам переносимого домен-кодирующего участка одного гена, причем на 5’-концах предусматривают последовательности, комплементарные к концам замещаемого домен-кодирующего участка второго гена. Эти последовательности сохраняются в получающемся дуплексе. Второй ген клонируют в однонитевом векторе, что позволяет одной из нитей дуплекса связаться с ним и образовать своеобразный шунт замещаемому домен-кодирующему участку. Нить дуплекса служит праймером для клпирования основной части вектора. В результате синтезируется комплементарная нить вектора, которая содержит второй ген с замещенным домен-кодирующим участком. Пример обмена функциональными доменами, взятыми у родственных белков, служат эксперименты по получению методом рекомбинации in vitro и in vivo гибридных α-интерферонов человека и мыши. Некоторые варианты гибридных белков имели существенно большую противовирусную активность, чем 89

родительские формы. Два различных белка – человеческие γинтерферон и интерлейкин-2, объединенные в один полипептид, проявляли в нем обе активности. Этот результат позволяет ставить вопрос о создании белковых лекарственных препаратов комбинированного действия. К категории гибридных белков относятся также искусственные рецептор-опосредованные токсины, включая иммунотоксины. Многие бактериальные полипептидные токсины состоят из двух компонентов – активной субъединицы А и субъединицы В, узнающей клеточный рецептор и позволяющей токсину проникнуть в клетку. При замене субъединицы В на какой-либо другой лиганд токсин приобретает другую специфичность. Например, объединение в одном полипептиде субъединицы А дифтерийного токсина и меланоцитстимулирующего гормона α человека позволило создать препарат, токсичный для клеток меланомы. В конце 1980-х гг. с целью осуществления сопряженных ферментативных реакций была реализована потенциальная возможность создания бифункциональных ферментов на основе гибридных белков. Были получены гибридные белки, объединяющие в одной полипептидной цепи 3-галактозидазу и галактозодегидрогеназу, галактозодегидрогеназу и бактериальную люциферазу, а также малатдегидрогеназу и цитратсинтазу. Суммарная активность таких систем в стационарном состоянии была в два-три раза выше, чем активность смесей отдельных ферментов, а лаг-период перед выходом систем в стационарное состояние был в четыре-шесть раз короче. Максимальное увеличение эффективности в сопряженных системах наблюдали в условиях, когда прохождение первой стадии реакции лимитировало весь процесс, например, в неоптимальных для первого фермента значениях рН или при дефиците его субстрата. Ожидается, что в будущем точное позиционирование активных центров каталитических доменов в гибридных бифункциональных ферментах друг относительно друга должно значительно повысить эффективность таких систем. Сериновые протеиназы семейства S1 состоят из двух гомологичных субдоменов, интерфейс которых формирует активный центр типа "клешни". Гидрофобные структуры и триада каталитических остатков аминокислот консервативны у этой группы 90

ферментов. Однако пептидные петли на поверхности ферментов, окружающие активный центр, заметно варьируют по своей первичной структуре, что коррелирует с уникальными субстратными специфичностями ферментов и особенностями их регуляции. С учетом этих предпосылок была получена гибридная протеиназа fXYa с объединенными N-концевым субдоменом активированного фактора свертывания крови Ха (fXa) и Сконцевым субдоменом трипсина. Анализ трехмерной структуры гибридного белка показал, что расположение консервативных гидрофобных участков в окрестностях активного центра в основном было сохранено, однако пространственная структура элементов поверхности белковой глобулы заметно изменилась. Исследование ферментативной активности гибридного белка с помощью искусственных субстратов обнаружило наличие у него амидолитической активности. При этом гибридная протеиназа проявляла менее выраженную субстратную специфичность, чем исходные ферменты, сохраняя высокую способность использовать субстраты, характерную для фактора Ха. Адресные домены и сигнальные последовательности белков широко используются в белковой инженерии для направленного изменения внутриклеточной и внеклеточной локализации гибридных полипептидов. Разработано большое количество векторов, в том числе и коммерческих, которые позволяют с помощью простых генно-инженерных манипуляций получать гибридные белковые молекулы, у которых основной функциональный участок объединен с тем или иным адресным доменом или сигнальной последовательностью. Такие модификации могут обеспечивать гибридной молекуле способность к специфической секреции разными бактериальными хозяевами. Функциональность подобным гибридным белкам придает способность адресных доменов претерпевать автономный фолдинг в процессе биосинтеза и, следовательно, оказывать минимальное воздействие на пространственную структуру основной части гибридного белка. К той же категории относятся и векторы, в которых клонируемые гены объединяют с последовательностями, кодирующими белковые домены со свойствами специфических лигандов или рецепторов. В качестве адресных доменов в 91

настоящее время используют белок, связывающий мальтозу, глютатион-Б-трансферазу, домены, взаимодействующие с целлюлозой или хитином, гексагистидиновую последовательность и ряд других. Такие модификации значительно облегчают очистку рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии. Интересной разработкой в данной области является коммерчески доступный вектор, в котором последовательность хитин-связывающего (адресного) домена объединена с последовательностью нуклеотидов интеина дрожжей S. cerevisiae. Во время экспрессии клонированного с помощью этого вектора гена происходит образование гибридного белка, содержащего на С-конце основного рекомбинантного белка интеин и адресный домен. Интеины обеспечивают прохождение аутосплайсинга белков, их содержащих. Использованный в данной конструкции интеин был изменен таким образом, что активировался в присутствии реагентов, восстанавливающих сульфгидрильные группы. Поэтому после аффинной сорбции гибридного белка на колонке с иммобилизованным хитином происходит освобождение основного рекомбинантного белка из гибридной молекулы в присутствии дитиотриэтола или 3-меркаптоэтанола как следствие расщепления пептидной связи интеином. Еще одним интенсивно развивающимся направлением белковой инженерии, которое использует адресные домены и сигнальные последовательности, является экспонирование рекомбинантных белков на поверхности бактериальных клеток для создания бактериального дисплея, живых вакцин, а также иммобилизации самих клеток в процессе культивирования. Технологии гибридных белков могут быть использованы для доставки полипептидов к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. В частности, путем объединения доменов типа "цинковые пальцы", участвующих в распознавании последовательностей ДНК факторами транскрипции, с каталитическим доменом рестриктазы Fokl удается изменить специфичность действия этой эндонуклеазы. С помощью аналогичного подхода можно изменять специфичность и самих факторов транскрипции, что удалось продемонстрировать с помощью гибридных а-субъединиц РНК-полимеразы Е.coli. 92

Рекомбинантные ферменты, обладающие аллостерическими свойствами, могут быть использованы для создания новых биосенсоров. В частности, попытки проведения модификаций такого рода были предприняты в отношении щелочной фосфатазы. Пептидные эпитопы, специфичные для ВИЧ типа I и вируса гепатита С, были встроены в полипептидную цепь щелочной фосфатазы, после чего исследовали влияние антител к этим эпи-топам на активность рекомбинантных ферментов. Установлено, что антитела снижали на 20% активность гибридных ферментов, Полученных на основе щелочной фосфатазы дикого типа, однакостимулировали ее в два-три раза у гибридных ферментов, созданных на основе температурочувствительных мутантов. В исследовательской работе часто требуется оценивать скорость биосинтеза и содержание конкретных белковых молекул в живой клетке, следить за их перемещением во внутриклеточном пространстве или выделять труднодоступные белки в индивидуальном виде из сложной смеси. В этом случае белки-репортеры оказываются незаменимыми. Например, присоединив к С-концу анализируемого белка в качестве белкарепортера (3-галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности (3-галактозидазы или отслеживая ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединив фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, получают возможность очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Антитела далее можно применить для очистки нативного белка, в состав которого входит кодируемый ОРС, рекомбинантный полипептид, и тем самым идентифицировать клонированный фрагмент гена. Кроме активного использования в изучении экспрессии генов, белки-репортеры оказываются незаменимыми помощниками при исследовании, в частности, факторов транскрипции и механизмов передачи сигналов, при поиске новых лекарственных препаратов и конструировании биосенсоров на основе клеток. В принципе, многие ферменты могут быть использованы в качестве репортеров, и их выбор определяется конкретными 93

задачами и возможностями исследователя. Основными критериями выбора являются удобство идентификации белкарепортера в составе молекулярной химеры, его стабильность и другие важные качества. К таким свойствам можно также отнести безопасность в отношении окружающей среды, простоту использования, высокую чувствительность при обнаружении и низкую фоновую активность. В качестве белков-репортеров в настоящее время интенсивно используются природные или генетически модифицированные белки, включая хлорамфениколацетилтрансферазу, различные флуоресцирующие белки, например, люциферазу светлячков, обелин, экворин, а также зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его аналоги. Флуоресцирующие белки, т.е. белки, способные испускать свет в результате контакта с электромагнитным излучением, в последнее время получили очень широкое распространение. В настоящее время охарактеризованы, по крайней мере, семь фотопротеинов: талассиколин, экворин, митрокомин, также известный как халис-таурин, клитин, известный и под именем фиалидина, обелин, мнемиопсин и беворин. 6.3 Искусственные белки Основываясь на теории белковых структур, можно коструировать белки с новой, не обнаруженной до сих пор в природе архитектурой. Первым таким белком стал альбебетин, состоящий из двух повторяющихся αββ элементов. Его исследование показало, что практически он также компактен, как и природные глобулярные белки сходной молекулярной массы, и имеет относительно стабильную структуру. В него был введен биологически функциональный фрагмент из восьми аминокислорт, обладающий бласт-трансформирующей активностью интерферона. Модифицированный альбебетин имел высокое сродство к рецепторам тимоцитов мыши и активировал реакцию их бласт-трансформации даже эффективнее, чем интерферон.

94

Рис. 20. Конструируемая пространственная структура альбебетина (рисунок заимствован из курса лекций А. В. Финкельштейна)

6.4 Вакцинные препараты Простейшим вариантом являются молекулярные вакцины, то есть индивидуальные иммуногенные белки (поверхностные белки вирусов) и даже отдельные эпитопы, включающие всего 10-15 аминокислотных остатков, синтезированные методами генетической инженерии. В молекуле белка можно выявить непрерывные аминокислотные последовательности, определяющие его антигенную активность. Многие вирусные белки и эпитопы были синтезированы и испробованы для вакцинации животных. Например: Гепатит В – заболевание, при котором трудно получить подходящий антиген для иммунизации. Вирус гепатита В не размножается в культуре тканей. Вакцины против него получали путем тепловой обработки сыворотки бессимптомных носителей. Впоследствии была предложена вакцина на основе инактивированных сферических частичек его поверхностного антигена, присутствовавших в сыворотке носителей. Эти вакцины эффективны и безопасны, однако для их получения необходимо большое количество смешанной сыворотки, осуществление дорогостоящих защитных мер и крупные затраты на оборудование. Поэтому исходя из нуклеотидной последовательности вирусного генома была реконструирована 95

аминокислотная последовательность поверхностного антигена и с помощью ЭВМ в ней были выявлены антигенные детерминанты. Затем были синтезированы два циклических пептида, которые при одноразовом введении вызывали образование антител у мышей. Более перспективно вводить чужеродные гены иммуногенных белков в существующие живые вакцинные штаммы. Перспективными оказались ДНК-вакцины. Оказалось, что рекомбинантные плазмиды, кодирующие белок-антиген и введенные в организм внутримышечно или подкожно иммуногены. Хотя при их введении трансфицируется очень мало клеток, синтезированного белка оказывается достаточно для развития сильного гуморального и клеточного иммунного ответа. Экспериментальные испытания на животных прошли ДНК-вакцины против гриппа, гепатита В и С, бешенства, туберкулеза, коклюша, ВИЧ. 6.5 Рекомбинантные антитела Антитела, благодаря своей высокой специфичности взаимодействия с высокомолекулярными и низкомолекулярными лигандами различной природы, находят широкое применение в различных областях биологии и медицины. Уникальные свойства антител позволяют использовать их для введения специфических меток и обнаружения макромолекул как in vivo во внутриклеточном пространстве, так и на фиксированных цитологических препаратах, и делают незаменимыми в медицинской диагностике. В виде конъюгатов с токсинами и радионуклидами они находят применение в качестве средства адресной доставки этих соединений к клеткам-мишеням для их избирательной элиминации в терапевтических целях. С появлением новых эффективных методов белковой инженерии, в том числе систем отбора белков на основе разнообразных дисплеев и репрезентативных клонотек случайных белковых последовательностей появилась возможность отбирать антитела требуемой специфичности непосредственно из суспензии фаговых частиц без иммунизации лабораторных животных и при этом получать белки с совершенно новой 96

специфичностью к антигенам, которые неиммуногенны in vivo. Новые подходы дают возможность снять ограничения, накладываемые на производство антител особенностями иммунного ответа живого организма. В последние годы удалось получить большое количество рекомбинантных антител с новыми свойствами: значительно уменьшить размер их молекул, а также объединить антитела в поливалентные гибридные комплексы, сильно повысив при этом их авидность. Генно-инженерными методами удалось объединить фрагменты антител с разнообразными аминокислотными последовательностями для обеспечения адресной доставки макромолекул. Такие гибридные молекулы, кроме антител, включают ферменты для активации предшественников цитотоксичных лекарственных препаратов, токсины, белки вирусных частиц, используемые в генотерапии, и сами могут быть включены в липосомы для повышения эффективности химиотерапии. Рекомбинантные антитела применяют для получения биосенсоров, используемых при мониторинге исследуемых молекул в реальном времени, в том числе опасных для здоровья веществ, загрязняющих окружающую среду. Фрагменты рекомбинантных антител находят применение, по крайней мере, в 30% систем современной иммунодиагностики. Основной характеристикой рекомбинантных антител является их специфичность в отношении конкретных антигенов. Однако, кроме этого, они должны обладать способностью выполнять эффекторные функции, обеспечиваемые их константными областями. В классе IgG иммуноглобулинов человека имеются четыре подкласса (изотипа) IgGl-IgG4, которые различаются по способности взаимодействовать с Fc-рецепторами на поверхности эффекторных клеток (макрофагов и нормальных киллеров), а также по способности фиксировать комплемент. В зависимости от задач, которые предполагается решать с помощью рекомбинантных антител, предпочтительными оказываются антитела определенного изотипа. Так, если с помощью антител предполагается непосредственно элиминировать клетки-мишени (например, опухолевые клетки), то предпочтительными оказываются антитела изотипа IgGl, так как они эффективно взаимодействуют с Fc-рецепторами и фиксируют комплемент, что необходимо для мобилизации вышеупомянутых клеток97

киллеров. Если же антитела будут использованы только для предотвращения взаимодействия лигандов с рецепторами, то антитела должны принадлежать к изотипам IgG4 или IgG2. С учетом этих соображений было получено несколько линий трансгенных мышей, каждая из которых продуцировала антитела человека определенного изотипа. 6.6 Каталитические антитела Область биологии, связанная с исследованием каталитических антител, то есть антител, способных функционировать как биологические катализаторы, возникла сравнительно недавно. В 1986 г. двумя группами исследователей, руководимых Р.А. Лернером и П.Г. Шультцем, было показано, что молекулы антител могут обладать ферментативной активностью. С этого времени берет начало новое направление белковой инженерии по искусственному конструированию ферментов на основе полипептидных цепей иммуноглобулинов, которые получили название каталитических антител или абзимов. Более того, вскоре после этого открытия в организме человека были обнаружены абзимы, появление которых ассоциировано с некоторыми распространенными заболеваниями. Результаты данных исследований еще раз подчеркивают плодотворность рационального подхода к решению проблем белковой инженерии, который по мере углубления знаний о механизмах функционирования белковых молекул, несомненно, станет доминирующим. В настоящее время данное направление исследований развивается чрезвычайно бурно, так как представляет собой одно из наиболее перспективных направлений, сочетающее в себе элементы иммунологии, энзимологии, молекулярной биологии, органической химии и генетической инженерии. Оно связано с созданием и изучением катализаторов нового типа, использование которых открывает принципиально новые возможности для работ фундаментального и прикладного характера. Интересно, что теоретические основы этого научного направления были заложены почти полвека назад на основании чисто умозрительных соображений, возникающих при сравнении свойств 98

ферментов и антител. Лайнус Полинг в 1948 году постулировал, что важным различием между этими группами белков является то, что фермент не так строго комплементарен своему специфическому субстрату, как антитело гомологичному антигену. Наиболее прочное связывание реализуется между активным центром фермента и переходным состоянием реакции. Последующее развитие энзимологии подтвердило справедливость этих положений и позволило расшифровать структурные основы функционирования многих ферментов; не менее значительный прогресс был достигнут и в понимании молекулярных механизмов действия антител. С учетом этой информации рассмотрим, что объединяет антитела и ферменты, с одной стороны, и каковы принципиальные различия между ними, с другой. Общим свойством ферментов и антител является то, что это – белки, обладающие характерной пространственной структурой и способностью связывать специфические молекулы (лиганды) субстрат или антиген. Большая часть ферментов построена из сочетания α-cпиралей, β-складок и гибких петель, образующих уникальную трехмерную структуру, строго постоянную для данного белка. Активный центр фермента формируется из аминокислотных остатков, часто удаленных в первичной структуре, но сближенных в пространстве при сворачивании белка в нативную конформацию. Окончательное формирование активного центра происходит в процессе его взаимодействия с участниками реакции (субстратом, кофактором); можно сказать, что активный центр фермента не предсуществует, а образуется в результате специфических конформационных изменений, индуцируемых субстратом. Таким образом, взаимодействие фермента со своим субстратом не может быть уподоблено "замку и ключу", так как эта модель, предложенная в 1890 году Эмилем Фишером, не учитывает конформационных изменений, сопровождающих катализ и играющих важнейшую роль в его реализации. В отличие от ферментов антитела (главным образом иммуноглобулины G) построены по единому плану (рис. 21). Молекула антитела состоит из двух тяжелых (55 кДа) и двух легких (25 кДа) полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками. Пространственная структура иммуноглобулина 99

G представлена β-складками и петлями; α-спиральные участки отсутствуют. Громадное разнообразие антител, вырабатываемых иммунной системой, объясняется тем, что N-концевые участки обеих цепей (первые 108 аминокислот), так называемые вариабельные области (VH и VL), кодируются множеством разных генов. В процессе дифференцировки клетки, продуцирующей антитело, один из множества генов, кодирующих вариабельную область, соединяется с геном, кодирующим "константную" часть молекулы (постоянной структуры). Благодаря бесчисленному количеству возможных комбинаций возникает громадное разнообразие антител, продуцируемых разными клетками. Антигенсвязывающий центр формируется при сочетании элементов структуры, принадлежащих вариабельным участкам обеих цепей (VL и VH). При этом основной вклад в специфичность взаимодействия антиген-антитело вносят три участка L-цепи и три участка H-цепи, называемые гипервариабельными. В пространственной структуре молекулы они представлены в виде петель, обладающих большой гибкостью и подвижностью.

а б

100

в Рис. 21. (а) Общее строение одного из иммуноглобинов (IgG) (рисунок заимствован из статьи Наградовой Н. К.)

На рисунке отмечены вариабельные (V) и константные (С) домены двух легких (L: из двух доменов каждая) и двух тяжелых (H: из четырех доменов каждая) цепей, а также Сконцы всех этих цепей. Домены СН2 гликозилированы. Жирные стрелки указывают на антиген-связывающие "карманы" между доменами VL и VH. (б) Строение домена VН; почти так же выглядят домены VL, СL, СН и прочие. В показанном домене VH выделены гипервариабельные петли; гипервариабельные петли есть и в домене VL. Вместе эти два домена образуют антигенсвязывающий карман (в). Принципиально важным является то обстоятельство, что специфическое узнавание антителом своего антигена есть не что иное, как выбор из громадного разнообразия предсуществующих структур той из них, которая способна наиболее прочно связать антиген. Этим и объясняется способность иммунной системы обеспечить связывание чужеродного соединения любой природы. В отличие от активного центра фермента активный центр антитела предсуществует, а не формируется в результате взаимодействия со специфическим лигандом; он, таким образом, комплементарен, то есть оптимально структурно соответствует основному состоянию лиганда и может быть уподоблен "замку" с "ключом"-антигеном. В качестве антигена может выступать как высокомолекулярное соединение, так и молекула малого 101

размера (гаптен), если она присоединяется к носителю макромолекуле. Специфическое взаимодействие антитела со своим лигандом напоминает аналогичное взаимодействие фермента со своим субстратом. Однако, как уже указывалось, отличие функций этих белков (назначение антитела – как можно прочнее связать антиген, чтобы удалить его; назначение фермента – связать субстрат, чтобы обеспечить его дальнейшее превращение в продукт) обусловливает то обстоятельство, что очень прочное связывание субстрата невыгодно для эффективного катализа. Действительно, главной движущей силой ферментативного катализа является увеличение энергии связывания по мере приближения к переходному состоянию реакции – именно это усиление связывания субстрата и является причиной снижения энергии активации химической реакции, обеспечиваемого ферментом. Связывание фермента с лигандом, складывающееся из слабых нековалентных взаимодействий (водородные связи, электростатические взаимодействия, вандерваальсовы взаимодействия, гидрофобные связи), сопровождается уменьшением свободной энергии системы. Для того чтобы обеспечить превращение субстрата в продукт, требуется затратить энергию, необходимую для ориентации реагирующих групп, образования нестабильных зарядов, перегруппировки связей и др. Участники реакции должны преодолеть этот барьер и оказаться поднятыми на более высокий энергетический уровень, то есть оказаться в переходном состоянии. Энергия, необходимая для достижения переходного состояния, называется энергией активации. Переходное состояние – это геометрическая и электронная структура, отражающая комбинированное состояние фермента и субстрата, в котором реализуется оптимальная ориентация реагирующих групп и происходит постоянное образование и разрыв связей. Концентрация переходного состояния и его время жизни очень малы; переходное состояние трудно зафиксировать и невозможно выделить. Скорость реакции зависит от величины энергии активации: чем выше энергия активации, тем ниже скорость. Это понятно, так как скорость реакции пропорциональна концентрации 102

активированного комплекса, которая тем выше, чем ниже энергия активации. Удивительная эффективность ферментов как катализаторов объясняется их способностью снижать энергию активации и смещать равновесие в сторону образования переходного состояния. Достигается это путем очень прочного связывания структуры переходного состояния. Увеличение энергии связывания лиганда по мере перехода от субстрата к переходному состоянию – это движущая сила ферментативного катализа. Иными словами, активный центр фермента комплементарен не исходному субстрату (как предполагает концепция "ключ-замок"), а переходному состоянию. Эта идея, впервые выдвинутая Л. Полингом, была затем развита У. Дженксом, который постулировал в 1969 году, что если бы удалось выработать антитело, комплементарное структуре переходного состояния реакции, то оно должно было бы катализировать эту реакцию, ускоряя достижение переходного состояния. Так были заложены теоретические основы получения каталитических антител. Однако потребовалось еще 17 лет, чтобы оказалась возможной экспериментальная проверка справедливости этих представлений. 6.6.1 Экспериментальные подходы, используемые для выработки каталитических антител К 1986 году возникли реальные условия для получения каталитических антител. Это, во-первых, накопление информации, необходимой для понимания молекулярного механизма химических реакций и синтеза аналогов переходного состояния, то есть стабильных соединений, структура которых близка к предполагаемой структуре переходного состояния. Во-вторых, это возможность получать антитела, гомогенные по структуре, то есть являющиеся продуктом одной клетки. В результате ее деления возникает клон клеток, обладающих всеми генетическими особенностями исходной клетки и синтезирующих антитела одинаковой специфичности (моноклональные антитела). Чтобы обеспечить постоянный рост клеток в культуре, используют специальную технику, основанную на слиянии клеток, продуцирующих антитела, с клетками миеломы, способными к неконтролируемому делению. Здесь применяется 103

гибридомная технология – создание иммортализованной (бессмертной) линии клеток, продуцирующих антитела только одной специфичности. Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы – это злокачественные новообразования иммунной системы. Они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в большом количестве синтезируется один тип белков-антител. Получается, что миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. Слияние нормальных лимфоцитов и клеток миеломы дает гибриды, сначала синтезирующие смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследствии, в результате элиминации хромосом, образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Эффективно продуцировать моноклональные антитела могут любые В-клетки, необходимо лишь сделать их для этого бессмертными и пролиферирующими. Чаще всего для этой цели получают гибридные клетки – путем слияния мышиных спленоцитов с миеломными В-клетками от мышей той же линии, не секретирующими собственных антител. Возможно также получить межлинейные и межвидовые гибриды, однако они частично нестабильны. Другой метод иммортализации – это трансформация клеток, например в случае В-клеток человека путем инфицирования вирусом Эпштейна-Барр. Разработан также новый метод получения антител, основанный на использовании бактериофагов. Работы по получению каталитических антител были одновременно начаты в нескольких лабораториях; сопутствовавший им успех обеспечил интенсификацию исследований и привел к возникновению нового научного направления, связанного с созданием биологических катализаторов с заранее заданными свойствами. По аналогии с энзимами такие катализаторы получили название абзимы. К настоящему времени получены десятки абзимов, катализирующих реакции разных типов. Рассмотрим некоторые примеры. 104

Имеющиеся в настоящее время данные позволяют считать, что в большинстве случаев абзимы можно рассматривать по сравнению с естественными ферментами как катализаторы примитивного типа. Изучение их свойств – один из подходов к пониманию механизмов усовершенствования свойств ферментов в ходе эволюции, обеспечивших их эффективное функционирование в живой клетке. 6.6.2 Экспериментальные подходы к усовершенствованию каталитических свойств абзимов Работы по усовершенствованию каталитических свойств антител получили значительное развитие. Прежде всего, это подходы, направленные на введение в активный центр абзимов функциональных групп, присутствующих в активных центрах соответствующих ферментов и способных обеспечивать разные типы химического катализа. Примером может служить прием, получивший название "bait and switch" (приманить и включить) и основанный на иммунизации мыши гаптеном - аналогом переходного состояния, несущим дополнительный заряд. В том случае, если этот заряд положительный, можно ожидать, что антитела, выработанные на такой гаптен (наиболее прочно его связывающие), будут содержать в участке связывания группы, заряженные отрицательно. При удачном расположении таких групп (например, карбоксильных) в активном центре абзима они могут принимать участие в катализе, увеличивая его эффективность. Помимо описанного выше иммунологического подхода, для введения функциональных групп (а также молекул кофакторов, ионов металлов) в область активного центра абзимов могут быть использованы методы химической модификации, а также большой набор молекулярно-биологических приемов. Появившаяся в последние годы возможность оперировать со структурой генов, кодирующих антитела, позволяет включать в активные центры абзимов не только новые аминокислоты, но и отдельные фрагменты полипептидной цепи. Нет сомнений, что сочетание разных подходов может обеспечить, сообразно с замыслом исследователя, значительные изменения каталитических свойств абзимов, приближая их к свойствам естественных ферментов. 105

6.6.3 Практическое значение абзимов Очень важной, если не основной, причиной бурного развития исследований, посвященных каталитическим антителам, является исключительная перспективность их практического использования. Она прежде всего связана с уникальной особенностью абзимов, отличающей их от других биологических катализаторов: они могут быть выработаны для катализа почти всех химических реакций. Потенциальное число таких химических превращений несравненно выше, чем число реакций, происходящих в живых системах и катализируемых соответствующими ферментами. Используя абзимы, исследователь приобретает возможность создавать совершенно новые катализаторы для их применения как в научных, так и в практических целях. Трудно переоценить роль, которую может сыграть использование абзимов в органической химии. Во-первых, это увеличение специфичности катализа (например, селективное расщепление пептидной связи между конкретными аминокислотными остатками). Во-вторых, это разделение энантиомеров (молекул, содержащих три разных заместителя у углеродного атома, называемого асимметрическим; они существуют в двух изомерных формах, являющихся зеркальным отражением друг друга). Абзимы, как и ферменты, обладают стереоспецифичностью и могут связывать один энантиомер в 1000 раз прочнее, чем другой. Поскольку получение чистых право- и левовращающих популяций молекул, неотличимых по их химическим свойствам, - задача весьма трудная, если вообще разрешимая, применение соответствующих абзимов может оказаться чрезвычайно полезным в подобных случаях, например при синтезе фармакологических препаратов. В настоящее время, к сожалению, многие лекарства готовятся как смеси энантиомеров, лишь один из которых активен в медицинском отношении, а другой нередко вызывает побочные реакции. В-третьих, это катализ трудно идущих химических превращений. В том случае, если определенный субстрат (А) способен претерпевать превращения по разным путям с образованием разных продуктов: С А В, в отсутствие катализатора предпочтительной окажется реакция с наименьшей энергией активации, например А В. Однако использование абзима, прочно связывающего переходное состояние 106

реакции А С и смещающего равновесие в сторону образования данного переходного состояния, приводит к изменению баланса энергии в пользу пути превращения А С, который в отсутствие катализатора является менее кинетически выгодным. Особую роль может сыграть применение каталитических антител в биотехнологии и медицине, и это опять обусловлено их уникальной способностью катализировать любые химические реакции в дополнение к тем, для которых существуют естественные ферменты. Можно ли ввести каталитическое антитело в клетку и заставить его там функционировать? Ответ на этот вопрос был получен в работе, проведенной на штамме дрожжей, лишенных вследствие мутации в структурном гене, кодирующем хоризматмутазу, способности синтезировать ароматические аминокислоты. Используя генно-инженерные подходы, авторы включили ген абзима, обладавшего хоризматмутазной активностью, в генетический аппарат дрожжевой клетки. Ген активно экспрессировался, и проявившаяся активность абзима вполне компенсировала недостаток фермента. Таким образом была показана принципиальная возможность направить эукариотическую клетку по пути синтеза катализаторов, созданных руками человека и потенциально способных осуществлять любые химические реакции. Весьма заманчивы перспективы использования каталитических антител в терапевтических целях. Иммунная система организма могла бы быть "улучшена" за счет выработки антител, которые способны не только связывать токсины, бактерии, вирусы или раковые клетки, но и катализировать их разрушение. При этом было бы достаточно даже невысокой каталитической активности; введение безвредного коньюгата гаптена могло бы обеспечить длительный эффект. Другой подход может быть основан на введении в организм человека готового абзима. Применение такого подхода зависит от разработки техники получения моноклональных антител, пригодных для использования в медицине. В силу малой доступности моноклональных антител человека основное внимание сосредоточено на использовании антител, полученных при иммунизации мышей. Чтобы уменьшить степень иммунологической несовместимости, применяют методы генной инженерии, позволяющие конструировать "химерные" или "гуманизированные" антитела, 107

сочетающие элементы структуры мышиных и человеческих антител. В первом случае молекула антитела человека сохраняет все элементы тяжелых и легких цепей, за исключением их вариабельных N-концевых отрезков (VL и VH , см. рис. 1), на место которых вводят соответствующие отрезки моноклонального антитела мыши. Таким образом, антитело человека становится носителем антиген-связывающего центра антитела мыши. Более совершенным вариантом является "гуманизированное" антитело, в котором антителу мыши принадлежат лишь гипервариабельные элементы, формирующие антиген-связывающий центр. Такие антитела уже успешно применяются для лечения вирусных заболеваний, и есть основания ожидать, что абзимы займут достойное место среди терапевтических средств данного типа. К настоящему времени описано более 60 реакций, катализируемых абзимами. По каталитической эффективности некоторые абзимы не уступают естественным ферментам, а по специфичности даже превосходят их. Абзимы могут быть выработаны для катализа любой химической реакции и приготовлены в сколь угодно больших количествах. Разработка научной базы усовершенствования каталитических антител для их использования интенсивно ведется в ряде мощных научных центров, объединяющих химиков и иммунологов. Уже не подлежит сомнению, что эти катализаторы могут найти широкое применение в биологии, химии, промышленности и медицине. Есть все основания ожидать, что абзимы будут одним из важных инструментов биотехнологии, которая, скорее всего, станет преобладающей технологией XXI века. Контрольные вопросы: 1. Примеры белков, полученных методами белковой инженерии. 2. Изменение свойств белков методом химической модификации, примеры. 3. Подходы для получения гибридных белков, примеры гибридных белков. 4. Искусственные белки, характеристика метода получения и примеры. 5. Антитела, их строение и свойства. 6. Сравните строение и свойства ферментов и антител, в чем состоит их сходство и различие. 7. Что такое абзимы, приведите примеры искусственных и природных абзимов. 8. Методы получения и усовершенствования свойств каталитических антител. 9. Практическое значение абзимов. 108

ГЛОССАРИЙ

Абзим - антитело, обладающее каталитической активностью. Автоиммунные заболевания – заболевания, вызванные реакцией иммунной системы, при которых происходит синтез антител на собственные белки (например, ревматоидный артрит). Автоматический дизайн – альтенативное название искусственной эволюции Активный центр – область белковой глобулы, осуществляющий связывание (сорбционный подцентр) и химическую трансформацию (каталитический подцентр) субстрата. Альфа (α)-спираль – элемент вторичной структуры белка; правозакрученная спираль полипептидной цепи, в которой каждый амидный атом азота образует водородную связь с карбонильной группой четвертой аминокислоты. Аминокислоты – гетерофункциональные органические соединения, в молекуле которых амино-(NН2) и карбоксильная (СООН) функциональные группы. Аминокислотный остаток – часть молекулы аминокислоты, входящей в состав полипептида. Анаболизм – совокупность ферментативных реакций, в результате которых происходит синтез органических соединений в клетке (например, синтез жирных кислот). Антиген (иммуноген) – вещество, вызывающее синтез антител, связывающих антиген. Антигенная детерминанта (эпитоп) – часть антигена, на которое направлено действие антитела. Антикодон - последовательность из трех нуклеотидов в молекуле тРНК, комплементарная триплету мРНК (кодону), определяющая выбор аминокислоты в процессе рибосомного синтеза белка. Антиметаболит – ингибитор ключевого фермента метаболизма. Антитело – молекула иммуноглобулина, образующая прочный специфический комплекс с другой (обычно чужеродной) молекулой: называемой антигеном. Антиподы – две изомерные формы, молекулы которых относятся друг к другу как предмет к зеркальному изображению, например, L- и D-изомеры аминокислот. Апофермент – белковый компонент молекулы фермента, активная форма которого состоит из белковой части и простетической группы 109

Ассиметрический атом углерода – атом углерода, связанный с 4мя разными заместителями. Аффинная хроматография – разделение растворимых макромолекул с использованием в качестве стационарной фазы сорбента, специфически связывающего выделяемую молекулу. Ацилфермент – промежуточное соединение в ферментативной реакции. Белковая инженерия – используя методы генетической инженерии изменение свойств и функции природных белков, получение искусственных и химерных (гибридных) белков. Белок теплового шока – белок, продуцируемый некоторыми клетками как результат воздействия температуры. Бета(β)-структура (β-складка, β-тяж) – элемент вторичной структуры белка, в котором амидный атом азота одной части полипептида образует водородную связь с атомом кислорода карбонильной группы другой части полипептида. Биосенсор – биоэлектронное аналитическое устройство, преобразующее концентрационный сигнал в электрический в режиме реального времени. Буфер – система, которая стремиться воспрепятствовать изменению рН при увеличении концентрации ионов Н+ или ОН-. Вакцина – вещества, используемые для активации против инфекционного заболевания иммунной системы организма. В-клетки (В-лимфоциты) – лимфоциты, которые могут быть активированы и переведены на стадию размножения (пролиферации) и которые способны синтезировать и секретировать иммуноглобулин G, связывающий антиген. Вторичная структура белка – регулярные элементы структуры белковой молекулы, такие как α-спираль, β-листы; стерическое взаимодействие аминокислотных остатков, расположенных вблизи друг друга в линейной последовательности полипептидной цепи. Гаптен – низкомолекулярное вещество, само по себе не обладающее антигенной активностью, которое, однако, при присоединении к макромолекуле приобретает это свойство. Гем – простетическая группа хромопротеидов, включающая протопорфирин и атом железа, гем входит, например в состав гемоглобина, миоглобина. Генетический код – правила перевода с 4-х буквенного языка нуклеотидов на 20-ти буквенный язык аминокислоты. Гибридома – клетка-продуцент моноклональных антител, гибрид клеток миеломы (раковые клетки) и лимфоцитов: способна размножаться как клетки миеломы и синтезировать антитела как лимфоциты. 110

Гидрофильный фрагмент – боковая группа аминокислоты, несущая заряд или содержащая полярную группу. Гидрофобная связь – ассоциация неполярных групп в водной среде, движущей силой образования которой является неблагоприятное взаимодействие молекул воды с неполярными группами. Гомологичность – сходство структур белков по последовательности аминокислот. Гормон – эндогенный регулятор биохимических процессов, синтезирующийся в клетках эндокринной систем, затем с током крови переносящийся к клетке-мишени. Дальтон (Да) – единица массы, практически равная массе атома водорода. Килодальтон (кДа) – единица массы, равная 1000 дальтон. Денатурация – деструкция нормально структурированного структуры биополимера (белка или нуклеиновой кислоты) с потерей его функциональных свойств. Дизайн – конструирование аминокислотной последовательности, годной для создания желаемой пространственной структуры. Дисульфидная связь (дисульфидные мостики) – связи, которые образуются при окислении SН-групп в остатках цистеина, входящих в состав молекулы белка. ДНК-гираза – топоизомераза, которая удаляет положительные супервитки в молекуле ДНК внося одноцепочечные разрывы и затем заделывая фосфодиэфирные связи в остове ДНК. Домены – область глобулярного белка, имеющая собственную третичную структуру; компактная глобулярная единица белковой структуры. Изоэлектрическая точка (рI) - значение рН, при котором заряд молекулы белка равен нулю, все молекулы аминокислоты в растворе находятся в виде биполярного иона. Иммуноглобулин – один из белков крови, ответственный за «узнавание» чужеродного соединения. Ингибитор – соединение, блокирующее ферментативную активность за счет взаимодействия с активным или аллостерическим центром белка. под влиянием специфических молекул. Интерферон – белок, синтезируемый и секретируемый клеткой в ответ на вирусную инфекцию. кДНК – комплементарная ДНК; синтезированная обратной транскриптазой на матрице мРНК и поэтому не содержит интроны. Клон – колония клеток, произошедших из одной родительской и поэтому генетически идентичных. Кодон – последовательность из трех нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту. 111

Комплементарность – химическое и пространственное соответствие молекул двух соединений, например, активного центра фермента и субстрата, двух полинуклеотидных цепей в молекуле ДНК Конкурентное ингибирование – механизм ингибирования, при котором ингибитор конкурирует с субстратом за центр связывания на активном центре фермента, в результате снижеается скорость катализа реакции путем снижения доли молекул фермента, связавших субстрат. Конкурентный ингибитор – ингибитор, который взаимодействует с активным центром фермента, так как структура его молекулы подобна структуре молекулы субстрата. Константа диссоциации (рК) – значение рН, при котором кислота, наполовину диссоциирована. Константа Михаэлиса (Кm) – объединенная константа ферментативной реакции. Кm = k2 +k3/k1/ Конформация молекулы белка – расположение атомов полипептидной цепи в пространстве. Кофактор – небелковая простетическая группа в составе молекулы фермента Кофермент – косубстрат в некоторых ферментативных реакциях, в которой присутствует в ограниченном количестве in vivo и который требует регенерации за счет сопряженных реакций ( например, коэнзим А, НАД+, ФАД). Культура клетки – техника выращивания in vitro генетически однородных клеток животных или растений, обычно на комплексной богатой среде. Липосома – синтетическая везикула, образуемая дисперсией полярных липидов в водной среде. Метаболизм – совокупность химических реакций, протекающих в организме. Понятие метаболизм и обмен веществ синонимы. Моноклональное антитело – иммуноглобулины, представляющие собой полностью идентичные молекулы – продукты секреции клеток клоном, имеющим одну клетку предшественника; обычно получают, используя гибридомы. Неконкурентное ингибирование – ингибирование активности фермента, в результате связывания ингибитора со специфическим участком молекулы фермента, а не с активным центром и уменьшения числа оборотов фермента. Неконкурентный ингибитор – ингибитор, который не взаимодействует с активным центром фермента, а с другим специфическим участком молекулы фермента. Структура его молекулы отлична от структуры молекулы субстрата. 112

Нуклеотид – структурная единица ДНК и РНК, в состав ее входят азотистое гетороциклическое лоснование, дезоксирибоза (ДНК) или рибоза (РНК) и остаток фосфорной килоты. Нуклеофил – соединение или функциональная группа, способная притягивать к себе протон, ядро другого атома или положительно заряженную частицу. Окислительное фосфорилировние – процесс образования АТФ, сопряженный с транспортом электронов по цепи переносчиков от НАДН или ФАДН2 к молекуле кислорода (О2). Олигомерный белок – белок состоящий более чем из одной полипептидной цепи. Оптическая активность – способность вещества вращать плоскость поляризованного света вправо или влево. Пептидная связь – амидная ковалентная связь между аминогруппой (ΝН2-группой) одной аминокислоты и карбоксильной (СООН) группой другой, соединяющая аминокислотные остатки в цепочку. Первичная структура – последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Плазмида – саморазмножающийся внехромосомный циклический элемент наследственности; используется в качестве вектора при введении новых генов в бактерию. Полилинкер – короткий участок ДНК, содержащий несколько центров рестрикции; вводится в вектор для последующего использования при включении нужных фрагментов ДНК. Полимеразная цепная реакция – техника амплификации нужных участков ДНК с помощью ДНК-полимераз. Полипептидная цепь – последовательность аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. Праймер – олигонуклеотид, гибридующийся с матрицей ДНК в полимеразной реакции. Прион – белковый инфекционный агент, вызывающий дегенеративные нейрологические заболевания типа болезни КрейтцфельдаДжакоба. Промотор – участок ДНК, с которой связывается РНК-полимераза на первой стадии транскрипции (синтезе РНК). Простетическая группа фермента – кофермент, прочно связанный с белковой частью молекулы фермента. Протеолиз – гидролиз пептидных связей в полипептидной цепи молекулы белка под действием ферментов, например, трипсина, пепсина. Протомеры – полипептидные цепи, из которых состоит олигомерный белок. 113

Протеома – (аналогично геному) обобщенный термин, описывающий белковое содержание клетки. Проферменты ≡ зимогены – каталитически неактивные предшественники ферментов Рекомбинация – природное или синтетическое получение ДНК из полинуклеотидов более чем одного организма. Репарация ДНК – механизм восстановления многочисленных клеточных повреждений, спонтанно возникающих в ДНК. Ренатурация – восстановление исходной биологически активной нативной формы денатурированной биомолекулы (белка, нуклеиновой кислоты). Репрессор – белок регуляции транскрипции, свзывающийся с оператором и вызывающий репрессию. Рибозим – молекула РНК, обладающая каталитической активностью. Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенез – техника изменения гена с желаемой точечной мутацией; основана на замене одного кодоно в полинуклеотидной цепи на другой. Сплайсинг – процесс, в результате которого из последовательности полинуклеотида исключается интрон. Стериоизомеры – пространственные изомеры органического соединения, в молекуле которых имеется ассиметрический атом углерода. Субъединица – молекула белка, обладающая третичной структурой. Транскрипция – синтез информационной (матричной) РНК на одном участке одной из полинуклеотидных цепей ДНК как на матрице. Трансляция – биосинтез белка на иРНК как на матрице. Третичная структура белка – пространственное расположение аминокислотных остатков далеко отстоящие друг от друга в полипептидной цепи. Химерные антитела (гуманизированные антитела) – гибридные иммуноглобулины, состоящие из части антитела человека и части антитела другого организма. Холофермент – природный комплекс молекулы фермента с кофактором. Цитохромы – группа железосодержащих белков, участвующих в переносе электронов в аэробных клетках. Четвертичная структура – организация в пространстве полипептидных субъединиц при формировании многосубъединичных белков. 114

Фолдинг – укладка полипептидной цепи в нативную трехмерную структуру. Шаперон – многокомпонентная система, обеспечивающая правильное сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи в белки. Экспрессионный вектор – плазмида или бактериофаг, используемый как переносчик генетической информации в клетку, в которой синтезируются кодированные белки. Экспрессия – производство продукта гена (белка или РНК) с гена. Электростатическое взаимодействие – взаимодействие между противоположно заряженными ионогенными группами, например, в молекуле белка между боковыми радикалами аминокислотных остатков (положительно заряженной ε-аминогруппой лизина и отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка аспарагиновой кислоты). Энергия активации – количество химической энергии, (выраженное в каллориях), которое необходимо для перевода при данной температуре всех молекул одного моля вещества в активированное состояние.

115

ЛИТЕРАТУРА Основная: 1. Финкельштейн А. В., Птицын О. Б. Физика белка: Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями. – М.: Книжный дом «Университет», 2002. 376 с. 2. Проблема белка. Т.2. Пространственное строение белка. – М., Наука, 1996. 3. Мюлберг А.А. Фолдинг белка. 2004. 156 с. 4. Бландел Т., Джонсон Л. Кристаллография белка. – М.: Мир, 1979. 5. Компьютеры и суперкомпьютеры в биологии / Под редакцией В.Д. Лахно и М. Н. Устинина. – Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2002. 528 с. 6. Мушкамбалов Н.Н., Кузнецов С.А. Молекулярная биология. ООО «Мед.информагентство». 2003. 535 с. 7. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.:Просвещение, 1987. 8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - Москва: Мир. 2002. Дополнительная: 1. Корнелюк А.И. Белковая инженерия // Биополимеры и клетка. 2001. Т. 17, № 6. - С. 459-466. 2. Финкельштейн А.В. Введение в физику белка. http://phys. protres.ru /lectures/protein_physics/ 3. Наградова Н. К. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков // Соросовский образовательный журнал. Биология. 1996. N 7. 4. Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Птицын О.Б., Федоров А.Н., Финкельштейн А.В., Черемис В.В. Белок de novo с заданной пространственной структурой: новые подходы к конструированию и анализу. Молекулярная биология, 1992, т. 26, № 6. - С. 1242-1250. 5. Колб В.А. Котрансляционное сворачивание белков // Молекулярная биология. 2001. - Т. 35. №4. - С. 682-690. 6. Башаров М.А. Концепция посттрансляционного сворачивания белков: насколько она реалистична? // Биохимия. 2000. - Т. 65. Вып. 10. - С. 1400-1408. 7. Варфоломеев С.Д., Упоров И.В., Федоров Е.В. Биоинформатика и молекулярное моделирование в химической энзимологии. Активные центры гидролаз // Биохимия. 2002. - Т. 67. - Вып. 10. - С. 1328-1340. 116

8. Шайтан К.В., Терёшкина К.Б. Молекулярная динамика белков и пептидов. М.: Ойкос, 2004. 103 с. 9. Владимиров Ю.А. Зачем нужна белковая кристаллография // Ж. Природа №11, 2003. /http://vivovoco.rsl.ru/ 10. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н., Березин И.В. Общие закономерности изменения термостабильности белков и ферментов после химической модификации их функциональных групп // Успехи химии, 1984. Т. 53, № 11. - С. 1852-1890. 11. Медведкин В.Н. Полусинтез белков и пептидов // Биоорганическая химия, т. 15 №5, 1989. - С. 581-614. 12. Щуров. Каталитические антитела // Молекулярная биология. – 1997. –Т.31. - №1. - С. 5-14. 13. Chugunov A.O., Chavatte P., Farce A., Efremov R.G. Differences in binding sites of two melatonin receptors help to explain their selectivity to some melatonin analogs: a molecular modeling study // J. Biomol. Struct. & Dynamics. 2006. № 24. - С. 91–108.

117

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ..........................................................................................3 1. Фолдинг белков...............................................................................5 1.1 Модели фолдинга белков ...............................................................7 1.2 Стадии сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию ........................................................................................9 1.3 Механизмы регуляции процесса сворачивания ...........................14 1.3.1 Пептидилпролил-цис-транс-изомераза (ротамаза) ...................15 1.3.2 Белок-дисульфидная изомераза ..................................................18 1.3.3 Шапероны и шаперонины ...........................................................19 Контрольные вопросы ..........................................................................23 2. Методы определения пространственной структуры белка 2.1 Рентгеноструктурный анализ ........................................................24 2.2 Ядерный магнитный резонанс .......................................................31 2.3 Компьютерное предсказание и моделирование пространственной структуры белка ....................................................33 2. 4 Компьютерный дизайн структуры белка .....................................37 Контрольные вопросы ..........................................................................44 3. Химическая модификация. Типовые реакции химической модификации функциональных групп белка ...............................45 Контрольные вопросы ..........................................................................50 4. Химический синтез белков и пептидов ......................................51 4.1 Защитные группы, используемые в пептидном синтезе .............55 4.2 Методы создания пептидной связи ...............................................56 4.3 Ферментативный синтез пептидов и белков ................................61 4.4 Полусинтез пептидов и белков ......................................................63 4.5 Синтез циклопептидов ...................................................................67 4.6 Синтез гетеродетных пептидов .....................................................67 Контрольные вопросы ..........................................................................68 5. Направленный мутагенез и генная инженерия белков ...........69 5.1 Направленный мутагенез: методика .............................................70 5.1.1 Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага МІЗ ........................................................71 5.1.2 Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК ...................................................74 118

5.1.3 Олигонуклеотид-направленный мутагенез с спользованием ПЦР-амплификации .............................................................................76 5.1.4 Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров ...........................................................78 5.1.5 Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов...........................................................................................79 5.2 Химическая модификация мутантных белков, полученных сайт-специфическим мутагенезом ......................................................81 Контрольные вопросы ..........................................................................82 6 Примеры создания модифицированных белков методами белковой инженерии ..........................................................................83 6.1 Модификация белка .......................................................................83 6.2 Конструирование гибридных белков ............................................89 6.3 Искусственные белки .....................................................................94 6.4 Вакцинные препараты ....................................................................95 6.5 Рекомбинантные антитела .............................................................96 6.6 Каталитические антитела ...............................................................98 6.6.1 Экспериментальные подходы, используемые для выработки каталитических антител .......................................................................103 6.6.2 Экспериментальные подходы к усовершенствованию каталитических свойств абзимов ........................................................105 6.6.3 Практическое значение абзимов ................................................106 Контрольные вопросы ..........................................................................108 Глоссарий .............................................................................................109 Литература ...........................................................................................116

119

Учебное издание Карпенюк Татьяна Анатольевна Бейсембаева Роза Ултубаевна Гончарова Алла Владимировна

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Учебное пособие Выпускающий редактор З.У. Усенова Компьютерная верстка Т.Е.Сапаровой

ИБ № 4771 Подписано в печать 01.04.10. Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная. Печать RISO. Объем 7,5 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 132. Издательство «Қазақ университетi» Казахского национального университета им. аль-Фараби. 050040, г. Алматы, пр. аль-Фараби, 71. КазНУ. Отпечатано в типографии издательства «Қазақ университетi».

120