Procédés et formulations au service de la santé 9782759809394

Ce 15e volume des Cahiers de Formulation rassemble quatorze des interventions effectuées lors des 13es Journées de Formu

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Procédés et formulations au service de la santé
 9782759809394

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PROCEDES ET FORMULATIONS AU SERVICE DE LA SANTE

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Coordonnateurs : Alain DURAND et Jean Paul CANSELIER

17, avenue du Hoggar Parc d'Activités de Courtabeuf, BP 112 91944 Les Ulis Cedex A, France

ISBN : 978-2-7598-0604-1 Tous droits de traduction, d'adaptation et de reproduction par tous procédés, réservés pour tous pays. La loi du 11 mars 1957 n'autorisant, aux termes des alinéas 2 et 3 de l'article 41, d'une part, que les « copies ou reproductions strictement réservées à l'usage privé du copiste et non destinées à une utilisation collective », et d'autre part, que les analyses et les courtes citations dans un but d'exemple et d'illustration, « toute représentation intégrale, ou partielle, faite sans le consentement de l'auteur ou de ses ayants droit ou ayants cause est illicite » (alinéa 1er de l'article 40). Cette représentation ou reproduction, par quelque procédé que ce soit, constituerait donc une contrefaçon sanctionnée par les articles 425 et suivants du code pénal.

© EDP Sciences 2011

Sommaire Préface Alain DURAND…………………………………………………………………………….3 I : Emulsions Nanoencapsulation de filtres solaires via nanoémulsions Angélica M. VILLARREAL,, Cormarie FERNANDEZ, Ana FORGIARINI, Laura MARQUEZ, Françoise NIELLOUD, Jean-Louis SALAGER …………………………5 Formulation et caractérisation d’émulsions huile dans eau stabilisées par de la b-lactoglobuline et de la gomme arabique. Eléonore BOUYER, Ghozlene MEKHLOUFI, Véronique ROSILIO, Jean-Louis. GROSSIORD, Florence AGNELY……………………………………… 19 Mécanismes d’inversion de phase catastrophique lors de l’émulsification d’huiles .visqueuses Johanna GALINDO ALVAREZ, Véronique SADTLER, Lionel CHOPLIN, Jean-Louis SALAGER………………………………………………………………….32 II : Gels et mousses Colloïdes et procédés pour l’industrie alimentaire Cécile GEHIN-DELVAL, Robert REDGWELL, Delphine CURTI………………….. 49 Gels et libération contrôlée : défis et enjeux Christophe CASTEL, Delphine MAZENS, Michèle LEONARD, Eric FAVRE …… 60 Influence de la formulation optimale et de la fraction de phase dispersée sur le comportement rhéologique des émulsions gels Emilio PARUTA, Véronique SADTLER, Philippe MARCHAL, Lionel CHOPLIN, Jean- Louis SALAGER, Shirley MARFISI..……………………………………………71 Development of bio-composite foam in supercritical environment: influence of process parameters on the distribution of pores of biomaterial Arfan SUBHANI, Selmi E. BOZBAG, Véronique SANTRAN, Jean-Stéphane CONDORET, Séverine CAMY, Alain LAMURE………………………………………81

III : Encapsulation, nanoparticules Méthodes d'encapsulation basées sur une réaction de transacylation Aude MUNIN, Maïté CALLEWAERT, Florence EDWARDS-LEVY………………. 94 Encapsulation des Protéines : Propriétés des Microsphères et Intégrité Protéique Emilie RUFFIN, Claire BORDES, Pedro MAROTE, Olivier MARCILLAT, Stéphanie BRIANCON………………………………………………………………… 104 Influence des conditions hydrodynamiques sur la microencapsulation de parfum en réacteur semi-fermé. Sophie RABEAU, Laurent FALK, Céline FROCHOT……………………………… 116 Nanoparticules biodégradables produites à partir de polysaccharides amphiphiles Cécile NOUVEL, Michèle LEONARD, Emmanuelle MARIE, Edith DELLACHERIE, Jean-Luc SIX, Alain DURAND…………………………… . 127 Formulation et fluides supercritiques Frantz DESCHAMPS, Jennifer JUNG, Fabrice LEBOEUF……………………… . 138 IV : Analyses et mesures Le nez et la langue électroniques : des outils d’aide à la formulation de médicaments Marion BONNEFILLE, Marielle BRONN…………………………………………….. 150 Dynamique d’étalement de solutions aqueuses de tensioactifs Thibault ROQUES-CARMES, Alexandra GIGANTE, Serge CORBEL…………. ..161

Index des sujets………………………………………………………………………… 175 Les Cahiers de Formulation : sommaires des volumes précédents…………….... 179

Préface Les 13es Journées de Formulation, organisées par le Groupe Formulation de la Société Chimique de France, ont eu lieu les 4 et 5 Décembre 2008 dans les locaux de l’Ecole Nationale Supérieure des Industries Chimiques de Nancy. Comme l’indique le titre de ces journées, « Procédés et formulations au service de la santé », elles étaient consacrées aux produits formulés touchant au domaine de la santé au sens large (pharmaceutique, médical, cosmétique et agroalimentaire) et ce, en allant de la conception de la formule du produit jusqu’aux procédés de fabrication. Une approche transversale a été privilégiée car c’est précisément celle qu’adopte le formulateur lorsque, pour appréhender le comportement d’un produit donné, il s’attache à le décrire par des concepts physico-chimiques indépendants de sa nature et de son application spécifique. De même, les caractéristiques physico-chimiques des produits formulés contrôlent leurs propriétés au moment de leur utilisation (propriétés d’usage) mais aussi leur comportement dans les opérations unitaires du procédé de fabrication (écoulement, agitation…). Le triangle procédé – produit – propriétés se trouve ainsi au cœur de la plupart des problématiques industrielles. Tous ces aspects ont été développés au fil des conférences et communications affichées présentées durant ces deux jours par des intervenants tant industriels qu’universitaires. Quelques concepts généraux ont ainsi été évoqués à plusieurs reprises : dispersions colloïdales, solubilité, transfert de matière… De la même façon, des opérations unitaires se sont retrouvées dans des domaines très différents : dispersion, compaction, re-dispersion… Un des objectifs était que les problématiques des hommes du métier soient confrontées à des développements issus de laboratoires universitaires. Ce volume n°15 des Cahiers de Formulation rassemble quinze textes établis sur la base de ces interventions. Les contributions ont été réparties selon quatre thématiques : « Emulsions », « Gels et mousses », « Encapsulation, nanoparticules » et « Analyses et mesures ».

Alain DURAND, Professeur Institut National Polytechnique de Lorraine

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Nanoencapsulation de filtres solaires via nanoémulsions Angélica M. VILLARREAL1, Cormarie FERNANDEZ1, Ana FORGIARINI1, Laura MARQUEZ1, Françoise NIELLOUD2, Jean-Louis SALAGER1,* __________________________________________________________ 1

Lab. FIRP, Université des Andes, Mérida Venezuela ICG MACS, UMR 5253, Faculté de Pharmacie, Université de Montpellier 1 * [email protected] 2

RESUME :

Les nanocapsules sont produites par une succession d’opérations alliant transition de phase et réaction chimique. Le système de départ est une solution micellaire inverse de surfactif dans une phase huile qui, lors de sa mise en contact avec une phase aqueuse, évolue en un cristal liquide lamellaire. Quand on ajoute une proportion d’eau supplémentaire de façon à obtenir un système diphasique, le cristal liquide stabilise la nanoémulsion H/E formée. Le pH de la phase aqueuse est alors changé pour favoriser une réaction de polymérisation à la surface des gouttes pour former les nanocapsules. Un exemple de ce procédé sol-gel, pour encapsuler un filtre solaire est présenté dans cet article.

MOTS-CLES: Formulation, microémulsion, nanoémulsion, encapsulation, filtre solaire 1. INTRODUCTION Divers véhicules peuvent être utilisés pour fixer, stabiliser, rendre compatible, structurer, protéger les matières actives ou contrôler leur relargage dans un grand nombre d’applications [1-3]. On trouve deux grandes classes de véhicules suivant le nombre de phases. La première comporte les solutions moléculaires simples et les systèmes colloïdaux. Ces derniers sont des systèmes monophasiques qui possèdent des microstructures de forme diverse suivant le mode d’autoassociation des molécules de surfactif (micelles et micelles inverses, vésicules catanioniques, liposomes, cristaux liquides divers et microémulsions). La seconde catégorie est représentée par les systèmes polyphasiques qui englobent une variété de dispersions : macroémulsions (taille > 1 mm), mini- ou nanoémulsions (taille non visible au microscope optique, typiquement 20-500 nm), aphrons et suspensions solides, en particulier nanoparticules pleines ou creuses. Ces dernières sont souvent appelées micro- ou nanocapsules et on en répertorie plusieurs types (Fig. 1) [4-8] suivant le mode de remplissage qu’on qualifie de matriciel, polynucléaire ou multiple, ou creux à coeur enrobé, ce dernier type étant le sujet du présent chapitre. On trouve des nanocapsules dans de nombreuses applications (Fig. 2) comme les toners, le papier copie sans carbone (sensible à la pression) et les adhésifs, entre autres.

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Figure 1 : Micro/nanocapsules (a) matricielle, (b) polynucléaire ou multiple, (c) creuse à coeur enrobé

On les utilise aussi pour véhiculer des matières actives comme les produits phytosanitaires, les catalyseurs, les arômes et les parfums, les enzymes, les produits pharmaceutiques et cosmétiques [9] et les filtres solaires, sujet du présent chapitre [2,10].

Figure 2 : Applications des micro/nanocapsules (a) papier copie sans carbone (b) échantillon de parfum sous couche à décoller (dans une revue par exemple)

Les nanocapsules creuses typiques ont un diamètre de 100-500 nm et contiennent une substance active dans leur cœur (dissous dans un gel ou un liquide, une huile dans cas des filtres solaires) avec une paroi plus ou moins solide de 5-10 nm d’épaisseur. Les nanocapsules sont dispersées dans une phase continue (dans le cas présent de l’eau) de façon à produire la structuration désirée, ici la dispersion de la substance active huileuse, à l’abri d’une paroi, c’est-à-dire sans contact physique avec la phase dispersante eau. Il existe de nombreuses méthodes de préparation des capsules, certaines étant applicables seulement aux petites tailles, inférieures au millimètre (microcapsules) voire au micromètre (nanocapsules) [8,11-13]. Toutes ces méthodes comportent deux étapes, souvent successives: la fragmentation de la phase de remplissage sous forme de goutte, bulle ou particule, et le recouvrement ou enrobage des fragments dispersés, c’est-à-dire l’encapsulation proprement dite.

2. FRAGMENTATION DE LA PHASE INTERNE DE LA MICRO/NANOCAPSULE. La fragmentation se fait le plus souvent encore par des méthodes mécaniques plus ou moins violentes. La première catégorie peut être qualifiée d’émulsification par “force brutale”. Elle utilise une grande variété d’appareils (voir quelques exemples sur la figure 3) qui consomment en général beaucoup d’énergie, soit grâce à des mouvements rapides (turbine, moulin à colloïdes, multicisailleur, vibreur ultrasonique) qui produisent des gradients de vitesse considérables, soit par un cisaillement élongationnel dans un mélangeur statique (orifice, homogénéisateur, diviseur de courant), soit au moyen

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d’une turbulence isotrope [14]. Ces dispositifs en général produisent des émulsions polydispersées, dont la taille descend difficilement en dessous du micromètre, et ils présentent souvent de sérieux problèmes de surchauffe qui limitent le débit traité. Les meilleures méthodes de cette catégorie sont les élongationnelles dans des dispositifs axisymétriques, qui, d’après les corrélations de Grace [15], sont particulièrement efficaces avec des fluides de viscosités différentes. L’émulsification produite par l’instabilité de Rayleigh d’un cylindre liquide, c’est-à-dire celle d’un jet de liquide dans un autre liquide immiscible (fluide dispersant), permet d’obtenir des émulsions relativement monodispersées. La rupture du jet liquide peut être spontanée ou assistée, par exemple par un couteau tournant ou un disque centrifuge. On peut aussi utiliser des membranes fixes ou tournantes pour produire de nombreux jets liquides à la fois [16]. La microfluidique est une nouvelle technique qui permet de produire des mélanges et des ségrégations à petite échelle [17-19]. Dans tous ces cas c’est la capillarité qui contribue à rompre le jet de liquide et on peut accélérer cet effet par une résonance mécanique, sonique, ou ultrasonique, ou une charge électrostatique (électrocapillarité) [20].

Figure 3 : Quelques appareils émulseurs basés sur l’application d’énergie mécanique sous forme de cisaillement Couette ou élongationnel et instabilité d’un jet liquide

La deuxième catégorie consiste en des méthodes qui utilisent une instabilité physicochimique, et qui sont souvent associées à une émulsification spontanée produite par divers phénomènes de non-équilibre comme les gradients de tension, la séparation en deux phases de systèmes sursaturés, la déstructuration d’une microémulsion ou d’un cristal liquide par un changement de formulation ou de température, ou le transfert préférentiel de substances d’une phase à l’autre.

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Pratiquement toutes ces méthodes sont mises en œuvre à partir d’un diagramme de phases qui indique les frontières entre les systèmes à comportement monophasique, diphasique ou triphasique. Ces diagrammes peuvent se représenter dans un espace tridimensionnel, en fonction d’une variable de formulation généralisée, qui inclut l’effet de la nature des composants et de la température [21-23], et de deux variables de composition, en général la concentration de surfactif et le rapport eau/huile. Dans la pratique on utilise en général des coupes bidimensionnelles de ce diagramme, qui sont les trois représentations classiques indiquées sur la figure 4: le diagramme triangulaire ou D du type de ceux de Winsor, le diagramme khi (c )entre la formulation et la relation eau/huile à concentration de surfactif constante, et le diagramme gamma (g) ou “fish” entre la formulation et la concentration de surfactif à rapport eau-huile constant [24-25]

Figure 4 : Diagramme de phases tridimensionnel formulation généralisée (inclut la température), concentration de surfactif et rapport eau-huile, et ses coupes bidimensionelles appelées diagrammes D, g, et c.

C’est le cas de la méthode dite de la température d’inversion de phases qui consiste à faire varier la température dans le domaine où l’affinité du surfactif non ionique s’inverse, de façon à produire une transition du comportement de phases décrite par Winsor comme WII ‡ WIII ou WIV ‡ WI [26-28] Le comportement triphasique de type Winsor III (WIII) correspond à un équilibre entre une microémulsion de structure bicontinue et des phases eau et huile en excès. Parfois des structures rigides de type cristaux liquides lamellaires se produisent aussi (La). Ces structures, dans lesquelles la courbure de l’interface est nulle, et qui correspondent aux comportements de phases WIII se produisent pour une formulation dite optimale, car associée à une tension interfaciale ultra-basse qui permet de récupérer un maximum de pétrole dans les méthodes dites de récupération assistée [29]. La figure 5a indique le changement du comportement de phases en fonction de la température pour un système surfactif non ionique-eau-huile et le type d’émulsion obtenue si le système est soumis à agitation. Le graphique bidimensionnel est un diagramme c où l’on a indiqué la ligne d’inversion de l’émulsion en forme d’escalier, suivant une

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phénoménologie tout à fait générale utilisée depuis plus de 20 ans [30-32]. On notera que, quand un système triphasique est refroidi sous faible agitation, la phase médiane microémulsion exsude de petites gouttes d’huile, par un phénomène de démixtion. Ce procédé a été proposé il ya une trentaine d’années [33] par Shinoda qui l’a dénommé méthode de la température d’inversion de phases (PIT en anglais) car la variable de formulation utilisée était la température pour un système non ionique. On obtient une transition similaire en changeant n’importe quelle autre variable de formulation [34]. A cette méthode est toutefois associé un problème d’instabilité cinétique des émulsions formées dans cette région proche de la formulation optimale, qui est tout-à-fait général [32, 35-38]. Il convient donc de stabiliser l’émulsion formée près de la température d’inversion par une trempe thermique, qui consiste à abaisser rapidement la température de 10 ou 20 °C dès que les nanogouttes sont formées, de façon que la formulation se déplace rapidement dans une zone de stabilité des émulsions.

Figure 5 : Exemples d’émulsification par instabilté physicochimique (a) en présence de microémulsion et (b) de cristal liquide lamellaire à la température d’inversion

10 _______________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ La figure 5b décrit une situation similaire, dans le cas où une phase cristal liquide lamellaire (La) se produit à une température voisine de la formulation optimale dans la zone de comportement de phases WIII ou WIV. La présence de cristaux liquides permet d’envelopper, par une ou plusieurs couches de la mésophase, les gouttes formées lors de la démixtion de la microémulsion et donc de stabiliser la nanoémulsion dans la zone voisine de la formulation optimale [39], grâce à une inhibition mécanique de la coalescence qui est normalement très rapide. Des travaux récents ont confirmé l’importance des cristaux liquides en ce qui concerne la stabilisation de la nanoémulsion formée près de la formulation optimale. Par exemple, l’addition d’une faible quantité d’alcool, qui dissout les cristaux liquides, suffit à éliminer la présence des minima de taille de gouttes que l’on rencontre habituellement de part et d’autre de la formulation optimale [40-41]. Dans la même catégorie on trouve les méthodes basées sur une instabilité produite par un conflit entre la physicochimie et la physique, qui sont associées à l’inversion de l’émulsion par une variation de la proportion des phases eau et huile (Fig. 6), souvent accompagnées par la formation d’émulsions multiples intermédiaires [25].

Figure 6 : Exemple d’émulsification par changement du rapport eau-huile

On peut aussi produire simultanément les deux changements antérieurs en faisant varier à la fois la formulation et la composition ; par exemple, en ajoutant de l’eau contenant un surfactif hydrophile ou simplement de l’eau froide, chemin qui correspond à la flèche sur le diagramme c de la figure 7. On constate que de très faibles variations de ce chemin produisent de grandes variations de taille des gouttes obtenues [42]. En présence de mélanges de surfactifs, une variation de la composition, par exemple une dilution à l’eau (le long des flèches sur les diagrammes c et D de la figure 8) est susceptible de produire des variations de formulation à l’interface, dues à des phénomènes de fractionnement du mélange, qui ont été étudiés en détail dans le cas de surfactifs polyéthoxylés [43].

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Figure 7 : Exemple d’émulsification par changement de rapport eau-huile (par exemple dilution) qui, par couplage, produit un changement de formulation interfaciale

Figure 8 : Diagrammes de phases présentant une distorsion produite par une variation de la formulation le long d’un chemin de dilution indiqué par une flèche (ajout d’eau : vers la droite)

Ceci se traduit par des diagrammes de phases présentant des distorsions par rapport aux diagrammes D et c classiques [25]. A cause de cette distorsion, une variation du rapport eau-huile (le long d’une flèche sur les diagrammes de la figure 8) produit une transition de phase similaire à celle induite par une variation de formulation ou de température. Cette méthode est utilisée pour former des nanoémulsions d’huile de silicone [44] et on constate que le résultat dépend du chemin suivi (point de départ, point d’arrivée et trajectoire [45-46] en particulier en ce qui concerne la traversée d’une région de cristaux liquides [41,47-49]. Ces dernières méthodes sont très complexes et c’est à peine depuis une dizaine d’années qu’on les comprend suffisamment pour commencer à les utiliser de façon systématique [24,50-51], car comme toutes les instabilités, elles ont un caractère irréversible et catastrophique. De ce fait, on ne peut pas toujours prévoir ce qui va se passer et, une fois que l’instabilité est déclenchée, on ne peut plus l’arrêter, ni d’ailleurs la contrôler Cela ne veut pas dire que l’on ne connaît pas le principe, et qu’on ne l’utilise pas depuis longtemps dans ces cas bien maîtrisés. C’est par exemple le cas de

12 _______________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ l’émulsification spontanée de l’anéthole par dilution quand on ajoute beaucoup d’eau dans du pastis. Il s’agit dans ce cas d’un processus rapide, mais il peut être lent dans d’autres cas. Les peintures émulsifiées de type polyester, polyuréthane ou époxy sont souvent produites à partir d’une résine extrêmement visqueuse à laquelle on ajoute un peu d’eau, pour former une émulsion E/H que l’on agite lentement durant longtemps et qui finalement s’inverse en une émulsion H/E qui peut se diluer à l’eau [42-53]. L’industrie pharmaceutique utilise aussi ces techniques pour produire des crèmes et des pommades. En tout état de cause ces méthodes appelées parfois émulsification par “persuasion” (en opposition à agitation par “force brutale”) sont avantageuses à plusieurs titres: elles requièrent très peu d’énergie, et donc ne présentent pas de problèmes de surchauffe ni de dégradation thermique associés à une forte agitation; l’appareillage mis en jeu est en général simple et on peut facilement l’adapter à l’échelle désirée [54]. De plus, elles permettent assez souvent de produire des émulsions monodispersées très fines, dont la taille de gouttes peut être ajustée par les variables de formulation et les conditions opérationnelles simples. C’est pour ces raisons que cette méthode dite de dilution a été choisie pour préparer une nanoémulsion avec une huile contenant des filtres solaires.

3. RECOUVREMENT OU ENCAPSULATION PROPREMENT DITE Une fois la fragmentation produite, il faut stabiliser l’émulsion par une encapsulation, qui lui conférera une bonne stabilité même quand la phase externe s’évaporera. La présence d’une couche adsorbée de surfactif n’est, en général, pas suffisante et il faut former une couche plus ou moins solide autour des gouttes. Dans la pratique on peut soit agir sur la phase externe pour former une solution de polymère de haute viscosité, voire un gel qui s’épaissira lors de l’évaporation, soit générer une fine couche solide à l’interface par transfert de solvant à la phase externe, coacervation, ou réaction de polymérisation. Dans notre cas, on a deux phases, et après avoir produit des nanogouttes d’huile de l’ordre de 100-500 nm par émulsification spontanée lors de la dilution d’une microémulsion ou d’un cristal liquide, on déclenche, par un changement de pH de la phase externe aqueuse, une séquence de réactions interfaciales qui forme une croûte plus ou moins épaisse de gel de silice. La réaction de polymérisation mise en œuvre, indiquée dans la figure 9, commence par l’hydrolyse du tétraéthyl orthosilane (TEOS), présent dans la phase huile, en silanol à pH acide. Quand le pH de la phase eau est ramené au voisinage de la neutralité au bout de quelques heures, le silanol accumulé à l’interface se polycondense en siloxane et forme des particules colloïdales qui s’agglomèrent pour générer du gel de silice à la surface des nanogouttes [11, 55-58]. A mesure que se produisent les réactions, la croûte de gel devient de plus en plus dense et compacte, et tend à limiter la diffusion de l’eau vers l’intérieur de la goutte et de l’alkoxyde vers l’extérieur. De ce fait on atteint au bout de quelques heures une couche de gel de silice d’une certaine épaisseur, typiquement 10 nm, qui est toutefois suffisamment transparente aux rayons UV pour que ceux-ci puissent pénétrer dans l’intérieur de la goutte liquide où se trouve le filtre solaire.

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Figure 9 : Réactions entre le TEOS et l’eau à l’interface des gouttes d’huile.

L’épaisseur de cette couche superficielle de la capsule doit être suffisante pour conférer les propriétés mécaniques appropriées à la capsule, c’est-à-dire ne pas se rompre lors d’un contact et ainsi éviter la coalescence entre gouttes et assurer une barrière à la diffusion. D’autre part, elle ne doit pas être trop perméable, ce qui produirait des inconvénients comme la libération des produits contenus dans les gouttes. On notera que les facteurs susceptibles d’affecter la perméabilité de la couche de polymère sont : une présence excessive de surfactif, la formation de cristaux liquides ou la proportion silanol/siloxane qui dépend des conditions de réaction (pH, température et durée). La taille des capsules (qui est essentiellement fixée par la taille des nanogouttes produites lors de l’émulsification spontanée par dilution) est aussi un facteur important, car les capsules peuvent absorber les UV et donc produire un effet protecteur par deux phénomènes différents. Le premier est un phénomène physique d’interaction de la lumière avec la matière. Suivant sa taille, la particule produit une obscuration, c’est-à-dire un blocage des rayons qui est en général efficace pour des particules de TiO2 ou de ZnO relativement grandes dans des peintures. Toutefois, si ces particules réfléchissent la lumière, le produit prend un aspect blanchâtre en séchant, qui n’est pas considéré comme esthétique dans le cas d’un filtre solaire. Si les particules sont plus petites (inférieures au micromètre) elles sont en général transparentes et produisent un effet Tyndall typique des colloïdes, qui diffusent la lumière dans toutes les directions et donc réduisent la proportion du rayonnement qui pénètre dans la peau. Il semble que le maximum de réflectance se situe pour une taille de particule aux environs du micromètre [59-60]. En conséquence, pour des nanoémulsions, la réflectance tend à diminuer à cause de ce phénomène quand la taille des nanogouttes diminue. Le deuxième effet est dû à l’absorption des radiations par les molécules de filtres solaires contenues dans la phase huile. Du point de vue du blocage des radiations, l’idéal serait de disperser ces molécules dans l’huile sous forme de solution, mais ceci implique un contact de la solution huileuse avec la peau, ce qui présente deux inconvénients ; le premier est le caractère gras de l’huile, qui n’est pas considéré comme agréable sur la peau, et le deuxième est la possibilité de pénétration de la solution, à travers le derme ou par les pores, et donc de réaction allergique ou d’irritation. Si on utilise des nanocapsules dispersées dans une phase aqueuse, on

14 _______________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ élimine ces deux problèmes, car la phase huile n’est pas en contact avec la peau, et la surface hydrophile des capsules réduit la probabilité de pénétration transdermique [1,2,61]. Toutefois, la section d’absorbance dépend de la taille des capsules. On peut en effet calculer que l’absorbance est proportionnelle à la surface spécifique de l’émulsion à proportion constante d’huile, c’est-à-dire qu’elle varie comme l’inverse de la taille des capsules. On a donc intérêt à utiliser de petites gouttes, bien que pas trop petites de façon à limiter leur pénétration transdermique. De ce fait une optimisation doit être mise en œuvre dans chaque cas [62].

4. CONCLUSION On constate que dans la plupart des alternatives de formation de micro- ou nanocapsules, et en particulier dans le cas étudié de la nanoencapsulation de filtres solaires, on retrouve la présence de problèmes de formulation dans toutes les étapes: (1) formation de la microémulsion et éventuellement d’un cristal liquide, associée à un comportement monophasique d’un mélange surfactif-eau-huile, (2) dont la dilution appropriée induit un changement de formulation, qui (3) produit spontanément une nanoémulsion (éventuellement stabilisée par un cristal liquide), dont l’encapsulation des gouttes est déclenchée par (4) un changement de formulation (par exemple de pH ou température) pour activer une réaction entre l’eau et une substance hydrolysable contenue dans l’huile.

5. REMERCIEMENTS Les auteurs remercient les organisateurs des 13èmes Journées de Formulation de la Société Chimique de France (Nancy, 4-5 décembre 2008) pour leur invitation à présenter ce travail. Ils remercient aussi le programme de coopération postgraduée franco-vénézuélien (PCP) qui a facilité les échanges de doctorants et d’enseignantschercheurs entre leurs laboratoires.

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Formulation et caractérisation d’émulsions huile-dans-eau stabilisées par de la b-lactoglobuline et de la gomme arabique Eléonore BOUYER*, Ghozlene MEKHLOUFI, Véronique ROSILIO, Jean-Louis GROSSIORD, Florence AGNELY UFR de Pharmacie – Université Paris-Sud 11, UMR CNRS 8612 « Physicochimie, Pharmacotechnie et Biopharmacie », 5 rue J.B. Clément, 92296 Châtenay-Malabry cedex. * [email protected]

RESUME :

Dans cette étude, nous avons choisi de remplacer les agents tensioactifs de synthèse servant à stabiliser des émulsions par des émulsifiants et des stabilisants « naturels » de façon à développer des émulsions pharmaceutiques et cosmétiques qui s’inscrivent dans la tendance actuelle de produits naturels et biodégradables. Dans ce but, des émulsions simples huile dans eau (H/E) stabilisées par de la b-lactoglobuline (b-lg), de la gomme arabique (GA) et des mélanges b-lg : GA ont été formulées et caractérisées. Préalablement, les dispersions aqueuses des biopolymères et de leurs mélanges ont été caractérisées par des mesures de la diffusion dynamique de la lumière, du potentiel zêta et de la viscosité. Ce travail a permis de montrer la possibilité de réaliser des émulsions stabilisées avec la GA seule, lorsque la concentration totale en biopolymère dans les dispersions est de 2,5 et 5 %. Dans le cas de la b-lg seule, la réalisation d’émulsions stables a nécessité l’utilisation d’un homogénéisateur afin d’obtenir de très faibles tailles de globules, ce qui a permis d’abaisser la concentration en b-lg à 0,5 et 1 %. Dans le but d’améliorer la stabilité des émulsions réalisées avec un mélange de b-lg et de GA, nous avons tenté d’établir des interactions électrostatiques attractives entre ces deux biopolymères en se plaçant à un pH de 4,2 auquel la protéine et le polysaccharide possèdent des charges globales opposées. L’émulsion la plus stable obtenue a été réalisée grâce à une dispersion de b-lg ensuite diluée à l’aide d’une dispersion de GA pour un ratio massique b-lg : GA de 2 : 1. Des mesures de tension interfaciale ont montré que la b-lg s’adsorbe à l’interface et que la GA s’organise probablement autour des globules huileux par des interactions électrostatiques attractives avec la b-lg. Ces résultats montrent l’intérêt de l’utilisation de la b-lg, de la GA et des complexes b-lg : GA dans la stabilisation d’émulsions.

MOTS-CLES :

émulsion, b -lactoglobuline, gomme arabique, complexes protéinepolysaccharide, tension interfaciale.

1. INTRODUCTION Les domaines où l’on rencontre des émulsions sont extrêmement nombreux et variés tels que l’agroalimentaire, la cosmétique, la pharmacie, les produits d’entretien, les revêtements routiers, etc [1]. Ces émulsions ne sont pas à l’équilibre thermodynamique et sont donc sujettes à une déstabilisation et une séparation de phases. Le formulateur peut ralentir ou inhiber les mécanismes physiques conduisant normalement à la démixtion des phases non miscibles. L’ajout d’agents tensioactifs

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permet ainsi la formation d’émulsions plus stables dans le temps. Leur rôle est d’abaisser la tension interfaciale entre les deux liquides non miscibles donnant lieu à la formation de gouttelettes de plus petite taille et formant un film protecteur autour de ces gouttelettes pour limiter ainsi leur agrégation ou leur coalescence. Ce travail vise à remplacer les tensioactifs synthétiques par des émulsifiants et stabilisants « naturels » afin de développer des émulsions qui s’inscrivent dans la tendance actuelle de produits naturels et biodégradables. Cette approche a déjà été utilisée dans l’industrie agroalimentaire qui utilise couramment les protéines et les polysaccharides comme ingrédients de contrôle de la structure, de la texture et de la stabilité des produits grâce, entre autres, à leurs propriétés de surface, d’agrégation et de gélification [2,3]. A notre connaissance, cette utilisation n’existe pas encore dans les domaines pharmaceutique et cosmétique. Deux biopolymères ont été utilisés dans cette étude : la b-lactoglobuline (b-lg) et la gomme arabique (GA). La b-lactoglobuline est une petite protéine globulaire appartenant à la famille des lipocalines. Elle constitue la protéine majeure du lactosérum puisqu’elle représente environ 50 % de la masse des protéines contenue dans celui-ci. De manière générale, elle est présente dans le lait de nombreux ruminants et d’autres espèces [4]. Elle est largement utilisée dans l’industrie alimentaire pour ses propriétés gélifiantes, moussantes et émulsifiantes. Elle est aussi utilisée comme agent nutritif dans certains produits cosmétiques. La séquence primaire de la b-lg comporte 162 acides aminés, pour une masse molaire de 18 400 g/mol, un rayon hydrodynamique qui varie entre 1,8 et 2,9 nm, et un point isoélectrique d’environ 5,1 [5]. Elle contient deux ponts disulfures et un groupement thiol libre [6]. La gomme arabique, également appelée gomme d’acacia, est un polysaccharide complexe de type arabinogalactane. Elle est produite par exsudation des arbres du genre Acacia et est principalement utilisée comme émulsifiant dans l’industrie agroalimentaire. Elle est considérée comme la meilleure gomme à utiliser dans des systèmes émulsionnés de type huile dans eau [7]. Il est également possible de faire de la microencapsulation en raison de sa haute solubilité dans l’eau et de sa faible viscosité même à forte concentration [8]. Son écoulement est considéré comme newtonien jusqu’à une concentration en gomme de 20-30 %, voire plus [9]. La gomme arabique est composée de sucres et de deux acides uroniques qui lui confèrent un caractère polyanionique [10]. Elle contient également près de 2 % de protéines liées de façon covalente à la fraction saccharidique, donnant un mélange de complexes arabinogalactane-protéine (AGP). Cet assemblage de blocs polysaccharidiques autour de la chaine peptidique est à l’origine du caractère amphiphile de la gomme. L’AGP est l’une des trois principales fractions identifiées dans la gomme arabique, les deux autres étant l’arabinogalactane (AG) et la glycoprotéine (GP) [9,11]. La fraction AGP représente moins de 15 % de la masse totale de la gomme, l’AG près de 80 à 85 % et la GP environ 1 % [12]. La teneur en protéines de la fraction AG ne représente que 0,35 % de la teneur globale de la gomme. Néanmoins, la composition protéique des fractions AG et AGP est quasiment similaire en terme d’acides aminés, les plus abondants étant l’hydroxyproline et la sérine [13]. La masse molaire totale de la gomme peut varier de 4,6 x 105 à 5,8 x 105 g/mol et le rayon hydrodynamique moyen est compris entre 12 et 20 nm [14]. Le pKa de la gomme arabique est inférieur à 3,6 [15].

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Les polysaccharides sont très utilisés dans la formulation des émulsions pour leurs propriétés stabilisantes, en modifiant la viscosité de la phase continue aqueuse, en la gélifiant ou encore en s’adsorbant à l’interface entre les deux liquides [16]. Par ailleurs, il a été montré dans la littérature que les propriétés émulsifiantes des protéines et/ou des polysaccharides se trouvent améliorées lorsque des interactions s’établissent entre ces deux biopolymères conduisant à la formation de complexes [3]. Nous nous proposons donc de développer et de caractériser des émulsions simples d’intérêt pharmaceutique ou cosmétique formulées et stabilisées avec la b-lg, la GA et les mélanges b-lg : GA. Dans un premier temps, les dispersions aqueuses de b-lg et de GA, ainsi que les mélanges b-lg : GA ont été caractérisés. Nous avons par la suite réalisé des émulsions d’huile d’amande douce dans une phase continue formée soit par la dispersion de b-lg, soit par celle de GA ou encore par le mélange b-lg : GA. Nous nous sommes intéressés à l’influence de différents paramètres sur la stabilisation des émulsions à savoir, la concentration totale en biopolymères, le pH, le ratio protéine : polysaccharide et sur la méthode de formulation. Nous avons réalisé des analyses de mobilité électrophorétique, des mesures rhéologique et interfaciale afin d’élucider le mécanisme de stabilisation des émulsions par ces deux émulsifiants.

2. MATERIELS ET METHODES 2.1 Matériels La b-lg utilisée lors de ce travail (lot n° JE 002-8-992) a été fournie par Davisco Foods International Inc. (Etats-Unis). La poudre contenait (en g/100g de poudre humide) : 89,8 % de protéines, 8,8 % d’humidité et 1,4 % de cendres. La composition minérale (en g/100g de poudre) était : Ca2+ : 0,079 ; Mg2+ : 0,013 ; K+ : 0,097 ; Na+ : 0,576 et Cl- : 0,050. La GA INSTANTGUM AA nous a été gracieusement donnée par la société CNI (Colloïdes Naturels International, Rouen, France). D’après le fournisseur, la poudre contenait jusqu’à 10 % d’humidité et 4 % de cendres. L’huile d’amande douce a été fournie par la Cooper (Melun, France). Deux lots ont été utilisés : l’huile vierge (lot n° 05120091/C) et l’huile raffinée (lot n° 06040028/A). Le raffinement de l’huile permet une meilleure conservation. Par souci de simplification, nous l’appellerons « huile » dans le reste de ce document. L’acide chlorhydrique 2 N, utilisé pour l’ajustement du pH, était de qualité analytique (Merck, lot n° 0C566024).

2.2 Préparation des dispersions de b-lactoglobuline et de gomme arabique Des dispersions de b-lg et de GA à 0,5 et 1 % (m/m) de concentrations finales en biopolymères ont été préparées à température ambiante par dispersion de poudres de b-lg et de GA dans de l’eau MilliQ (résistivité : 18,2 mΩ.cm) (Millipore Synergy 185). Durant au moins 2 h, une agitation magnétique a été maintenue de façon modérée afin d’éviter la formation de bulles d’air. Les dispersions obtenues ont alors été placées à 4 ± 1°C durant une nuit afin de permettre l’hydratation des

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biopolymères. Il est à noter que des dispersions à 2,5 et 5 % ont également été réalisées. Le pH des dispersions de b-lg a ensuite été ajusté à 4,8 (pH de solubilité minimale de la b-lg [17]) avec des solutions aqueuses de HCl 1 N et 0,1 N (pHmètre MeterLab PHM 220 LAB). Les dispersions de b-lg ont ensuite été centrifugées à 10 000 g pendant 30 min à 20 ± 1°C, afin d’éliminer les particules insolubles ainsi que les agrégats de b-lg (Centrifugeuse Sigma 3K30, Bioblock Scientific). La quantité éliminée suite à cette étape s’élève à environ 10 % (m/m) [17]. Nous avons tenu compte de cette perte de masse dans la quantité de poudre initialement dispersée afin d’obtenir la concentration finale désirée. Le pH des dispersions de b-lg a été alors réajusté à 4,2 par addition de HCl 1 N et 0,1 N. Le pH des dispersions de GA a de la même façon, été ajusté à 4,2 sans procéder à une étape de centrifugation. Le pH a été choisi afin de permettre l’établissement d’interactions électrostatiques attractives entre les deux biopolymères et former des complexes [18]. En effet, le point isoélectrique de la b-lg étant proche de 5,1, celle-ci est chargée positivement à pH 4,2. La GA, quant à elle, est alors chargée négativement. Ainsi, l’influence de la complexation sur la stabilité des émulsions formulées à l’aide de ces dispersions a pu être étudiée. 2.3 Préparation des émulsions L’huile d’amande douce a été dispersée dans une solution de b-lg, de GA ou de mélange b-lg : GA. La phase dispersée constitue 30 % (m/m). Les concentrations des solutions de b-lg et de GA utilisées pour réaliser les émulsions étaient de 0,5 et 1 %. Il est à noter que des concentrations à 2,5 et 5 % ont également été étudiées. Dans le cas où les émulsions ont été stabilisées par un seul des biopolymères, l’émulsification a été réalisée au moyen d’un agitateur à rotor-stator (Polytron PT-MR 3100, Kinematica AG, Bioblock Scientific) pendant 2 minutes à 15 000 rpm. Les émulsions ont ensuite été passées à l’homogénéisateur haute pression (APV Invensys) pendant 5 minutes et selon 2 étapes de pression successives : 500 et 50 bar. Dans le but d’obtenir des émulsions stabilisées simultanément par de la b-lg et de la GA, des dispersions des deux biopolymères ont été mélangées à des rapports massiques protéine : polysaccharide de 2 : 1 et de 1 : 2. Cette étape a été réalisée au dernier moment et uniquement pour la concentration de 0,5 %. Pour chacun de ces ratios, trois protocoles ont été mis au point pour la préparation des émulsions (Figure 1). Le protocole 1 a consisté à réaliser l’émulsion à partir d’une phase continue de b-lg et de GA. Dans le protocole 2, une émulsion a été formée à l’aide d’une dispersion de GA, qui a été ensuite diluée par ajout d’une dispersion de b-lg. Enfin, dans le protocole 3, l’émulsion a été réalisée avec une dispersion de b-lg et ensuite diluée à l’aide d’une dispersion de GA. La méthode de fabrication était identique à celle décrite ci-dessus (Ultra-Turrax et homogénéisateur) et la dilution par la dispersion de l’un ou l’autre des biopolymères a été réalisée par simple agitation manuelle (retournement) afin de minimiser la perturbation du système.

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Protocole 1

+ huile

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émulsion

a

Légende Protocole 2

+ huile a

GA

+ émulsion

b

émulsion

ß-lg a Ultraturax +homogénéisation

haute pression Protocole 3

+ huile a

b Agitation manuelle

+ émulsion

émulsion b

Figure 1 : Représentation schématique des 3 protocoles de préparation des émulsions stabilisées par le mélange b-lg : GA à 0,5 % et aux rapports 2 : 1 et 1 : 2.

2.4 Caractérisation des dispersions et des émulsions Les différentes dispersions et les émulsions, lorsqu’elles étaient stables pendant au moins 24 h, ont été caractérisées par les techniques décrites ci-dessous. Toutes les mesures ont été réalisées le premier jour de stabilité (J1) et trois fois pour chaque échantillon, à l’exception de l’analyse au Turbiscan. 2.4.1 Evaluation de la stabilité des émulsions L’évaluation de la stabilité des émulsions a été réalisée par des observations macroscopiques, en notant l’apparition d’un éventuel déphasage. Une étude plus précise a également été menée à l’aide d’un Turbiscan MA 2000. Cette technique consiste à placer 5 à 6 mL d’émulsion dans un tube et à suivre les intensités de transmission et de rétrodiffusion en fonction de la hauteur du tube, permettant ainsi de détecter le moindre déphasage. Ces analyses ont été réalisées à J1, J2, J7 et pour les émulsions les plus stables à J17 et J20. 2.4.2 Détermination de la taille des globules La taille des globules des émulsions a été étudiée grâce à deux techniques différentes : la diffraction laser et la diffusion dynamique de la lumière. a) Diffraction laser Nous avons utilisé un granulomètre laser Coulter LS 230, possédant un laser solide à l’arséniure de gallium d’une longueur d’onde de 750 nm. La cellule de mesure utilisée permet de fonctionner en module micro volume de 15 mL. De l’eau MilliQ filtrée à 0,22 μm a été utilisée pour réaliser le blanc et pour diluer les émulsions afin d’obtenir une obscuration comprise entre 8 et 13 % permettant d’éviter les phénomènes de diffusion multiple. L’appareil permet alors d’accéder à une distribution de taille des globules en volume et au diamètre moyen en volume (Dm).

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b) Diffusion dynamique de la lumière Cette caractérisation a été effectuée à l’aide d’un Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Angleterre). La mesure des fluctuations d’intensité diffusée à 90° a permis d’obtenir le rayon hydrodynamique (Rh) des globules. Avant leur analyse, les émulsions ont été diluées au 1/6ème à l’aide d’eau MilliQ filtrée à 0,22 μm afin d’éviter la diffusion multiple. 2.4.3 Mesure du potentiel zêta Les mesures de mobilité électrophorétique ont également été réalisées à l’aide du Zetasizer Nano ZS 90. La mobilité électrophorétique est déterminée en appliquant la théorie de von Smoluchowski modifiée par Henry [19]. Le potentiel zêta (z) peut ensuite être calculé par l’application de l’équation de Henry. Les mesures ont été réalisées à 25°C, sur des dispersions de b-lg, de GA et des mélanges b-lg : GA aux ratios 2 : 1 et 1 : 2 ; ainsi que sur les émulsions. Ces dernières étaient diluées au 1/6ème dans de l’eau MilliQ filtrée à 0,22 μm. 2.4.4 Etude du comportement rhéologique Le comportement rhéologique des émulsions a été étudié à t = 25,00 ± 0,01°C, en écoulement à contrainte imposée à l’aide du rhéomètre HAAKE Rhéo Stress RS600 (Thermo Electron Corporation) équipé d’une géométrie cône/plan (cône : 60 mm, 1° ; troncature : 0,052 mm). La régulation de température était assurée par un système de diodes Peltier (UTC RS 600). Le protocole établi consiste à faire varier la contrainte de cisaillement de 0 à 1 Pa pendant 180 s. Le comportement rhéologique des dispersions a été analysé à l’aide d’un rhéomètre HAAKE Roto Visco RV 1 (Thermo Electron Corporation) équipé d’une géométrie de mesure de cylindres co-axiaux Z 41 (hauteur : 55,000 mm, entrefer : 3,000 mm au fond, 1,980 mm sur les côtés), permettant ainsi l’obtention de meilleures mesures de viscosité en raison de valeurs proches de la viscosité de l’eau. Le protocole suivi est le même que pour l’analyse des émulsions au RS 600 mais en travaillant en vitesse de cisaillement imposée de 0 à 400 s-1 pendant 180 s. 2.4.5 Mesure de la tension interfaciale Des mesures de tension interfaciale ont été réalisées à 25°C, à l’aide d’un tensiomètre à goutte (Drop Shape Analyzer DSA 100, Krüss) muni d’une aiguille de diamètre 1,827 mm. Les différents systèmes étudiés étaient : eau/huile, dispersion aqueuse b-lg à 0,5 %/huile et dispersion aqueuse GA à 0,5 %/huile, à pH 4,2 pour les deux dispersions. Un tensiomètre à lame de Wilhelmy (Digital tensiometer K10ST, Krüss) a également été utilisé pour mesurer la tension interfaciale du système dispersion aqueuse b-lg : GA/huile, en fonction du temps, à la température de 23°C. La mesure du zéro a été effectuée par immersion totale de la lame de platine dans l’huile d’amande douce. 8 mL d’une dispersion de b-lg à 2,5 % (m/m) ont été placés dans un cristallisoir à bec. La lame a été happée par la surface du liquide et l’huile d’amande douce a ensuite été ajoutée délicatement au-dessus de façon à recouvrir totalement la lame (Figure 2). La tension interfaciale a été enregistrée en continu à l’aide d’un

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enregistreur (Sefram Instrument Systems 8210). Lorsque la valeur de tension interfaciale s’est stabilisée (après environ 3 h), 660 μL d’une dispersion de GA à 30 % (m/m) ont été ajoutés à la phase aqueuse sans agitation, par le biais du bec du cristallisoir, en prenant garde à ce que la lame ne se décroche pas. Les mesures de tension interfaciale ont ensuite été enregistrées pendant 18 h.

GA 30 % Huile b-lg + H2O

Figure 2 : Représentation schématique du système de tensiomètre à lame de Wilhelmy pour la mesure de la tension interfaciale du système b-lg : GA/huile d’amande douce

3. RESULTATS ET DISCUSSIONS 3.1 Caractérisation des dispersions de biopolymères Les valeurs de potentiel z obtenues pour les dispersions de b-lg, GA et les mélanges b-lg : GA aux ratios 2 : 1 et 1 : 2 sont respectivement d’environ + 20, - 25, - 16 et - 23 mV. Ces valeurs sont en accord avec le pI de la b-lg et le pKa de la GA. Le potentiel z des solutions mixtes de b-lg et de GA est négatif et proche de la valeur de la dispersion de GA seule. Ceci montre une certaine prédominance de la GA sur la b-lg qui peut s’expliquer par la taille importante de la gomme et/ou par la façon dont la complexation s’effectue entre les biopolymères, entraînant une disposition de la gomme autour de la protéine [5]. Il est également à noter que le potentiel z est plus négatif lorsque le ratio est en faveur de la GA. Les mesures rhéologiques réalisées sur ces dispersions ont montré un comportement newtonien, aussi bien pour les biopolymères seuls que pour les mélanges protéine-polysaccharide. 3.2 Caractérisation des émulsions 3.2.1 Emulsions stabilisées par de la b-lactoglobuline Les émulsions stabilisées par la b-lg seule restent stables au-delà de 24 h (Tableau I). La taille de leurs globules étant très faible, la mesure du diamètre moyen n’a pu être effectuée au granulomètre laser, en raison de la limite de résolution de cet appareil. La très faible valeur du rayon hydrodynamique déterminée par la technique de diffusion dynamique de la lumière laisse, quant à elle, planer le doute sur la nature des objets analysés (globules ou la protéine elle-même).

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Comme la taille des globules et pour la même raison technique, le potentiel zêta des émulsions n’a pu être mesuré, mais il est supposé positif car la charge globale de la b-lg au pH étudié est théoriquement positive. Les émulsions ont montré un comportement rhéologique newtonien avec une viscosité de l’ordre de 1 mPa.s comparable à celle des dispersions de b-lg (résultats non montrés). 3.2.2 Emulsions stabilisées par de la gomme arabique La GA n’a pas permis d’obtenir des émulsions stables pendant au moins 24 h (tableau I). Le déphasage observé est probablement lié à des concentrations insuffisantes de GA. En effet, des émulsions stables ont pu être obtenues, mais avec des concentrations plus élevées de GA (2,5 et 5 %) dans la phase aqueuse (résultats non montrés). L’augmentation de la concentration en GA aurait pour conséquence l’augmentation du nombre de molécules adsorbées à l’interface formant un film protecteur autour des globules [16]. 3.2.3 Emulsions stabilisées par le mélange b-lactoglobuline et gomme arabique Des dispersions de b-lg et de GA à 0,5 % et au pH 4,2 ont été utilisées pour la réalisation d’émulsions suivant les protocoles 1, 2 et 3. Les protocoles 1 et 2 n’ont pas permis d’obtenir d’émulsion stable quel que soit le ratio b-lg : GA. Il est probable que dans le cas du protocole 1, le mélange préalable des dispersions avant la formulation de l’émulsion entraîne la formation de complexes peu efficaces pour former un film interfacial. Dans le cas du protocole 2, la première émulsion est réalisée avec la GA seule puis la b-lg est ajoutée. Or, dans l’expérience décrite au 3.2.2, la GA à 0,5 % n’a pas permis de stabiliser l’émulsion. Si elle s’adsorbe, sa concentration est insuffisante pour former un film efficace. La composition chimique de la gomme laisse cependant penser qu’elle pourrait s’adsorber partiellement à l’interface et formerait une barrière vis-à-vis de la b-lg, dont l’accès à l’interface serait alors limité, voire interdit. Comme l’agitation est faible, elle ne favoriserait pas la diffusion de la protéine vers l’interface, ni la désorganisation de la barrière de GA. Il est également possible que, comme dans le protocole 1, la b-lg se complexe à la GA non adsorbée et perde de son activité de surface. Cette hypothèse pourrait être vérifiée en formulant des émulsions avec une concentration plus importante de GA puis en ajoutant la b-lg. Le protocole 3, quant à lui, n’a permis d’obtenir une émulsion stable pendant plus de 24 h qu’avec le ratio b-lg : GA 2 : 1. Le ratio 1 : 2 n’apporte sans doute pas suffisamment de b-lg lors de la formation de l’émulsion initiale pour permettre la stabilisation de l’émulsion. Apparemment, l’ajout de GA n’a pas permis de compenser l’insuffisance de b-lg à l’interface. L’émulsion stable obtenue avec le ratio 2 : 1 a été comparée à celle réalisée à l’aide de la b-lg seule (tableau 1). Le potentiel zêta de cette émulsion stabilisée par le mélange des 2 biopolymères est de - 32 mV, valeur bien plus négative que celle du mélange des dispersions dans des conditions identiques (- 16 mV). Or cette émulsion a tout d’abord été formée à l’aide de la b-lg, chargée positivement à pH 4,2. Le potentiel zêta de cette première

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émulsion (non mesurable) était donc vraisemblablement positif. La dilution de cette émulsion à l’aide de la GA a donc entraîné un changement radical du potentiel zêta vers des valeurs non seulement négatives, mais bien plus encore que celle de la dispersion de GA seule, alors que le ratio b-lg : GA, de 2 : 1 n’était pas en faveur de la GA. Cette observation inattendue montre que l’association des deux biopolymères, dans des conditions particulières, conduit à la formation d’un système nouveau, aux propriétés spécifiques. L’analyse rhéologique de cette émulsion a mis en évidence un comportement rhéologique non newtonien. Le modèle de Bingham décrit par l’équation 1 a pu être utilisé pour évaluer la contrainte de cisaillement seuil et la viscosité plastique : (1)

t = t 0 + h p g˙

où t est la contrainte de cisaillement, t 0 la contrainte de cisaillement seuil, h p la viscosité plastique et g˙ la vitesse de cisaillement. La contrainte seuil obtenue est de l’ordre de 0,7 Pa et la viscosité plastique de l’ordre de 1,8 mPa.s. Les dispersions de b-lg : GA et les émulsions stabilisées par la b-lg ayant un comportement newtonien (respectivement paragraphes 3.1 et 3.2.1), il y a probablement interaction des biopolymères avec l’interface des globules huileux entraînant une modification de la rhéologie. Tableau1I : Principaux résultats obtenus lors de la caractérisation des émulsions.

Emulsions Caractérisation

b-lg (0,5 et 1 %)

GA (0,5 et 1 %)

b-lg : GA Pr 1 et 2

b-lg : GA Pr 3 ratio 2 : 1 (0,5 %)

Stabilité

> 24 h

< 24 h

< 24 h

> 24 h

Dm (μm)

nd

~ 11 et 40 polydispersité

Rh (nm)

~4

~ 126

z (mV)

non mesurable

Rhéologie

newtonien h ~ 1 mPa.s

nd

nd

~ - 32 Bingham t 0 ~ 0,7 Pa, h p ~ 2 mPa.s

Pr : protocole nd : non déterminé t 0 : contrainte de cisaillement seuil

h p : viscosité plastique Plusieurs hypothèses peuvent être émises quant à la localisation de la GA dans l’émulsion (Figure 3) : (a) libre dans la phase continue (hypothèse 1), (b) coadsorbée à l’interface des gouttelettes en déplaçant ou non des molécules de b-lg (hypothèse 2), ou encore (c), liée par des interactions électrostatiques attractives, à la couche de b-lg elle-même adsorbée à l’interface huile/eau (hypothèse 3). Dans

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cette dernière hypothèse, la GA neutraliserait et inverserait probablement la charge de surface des globules comme cela a été observé dans le cas des émulsions stabilisées par des multicouches de polyélectrolytes [20].

-

- -

-

+

+

-

+ + +

+

-

-

+

+

+

-

+

+

+

- -

-

-

-

-

+

- -

-

+

+

-

- -

GA _ - lg

-

1 1

Globule huileux

2

-

+

- - -

-

-

-

- -+- - + - - - - - - +- +- - - --

3 Eau

Figure 3 : Représentation schématique des 3 hypothèses de localisation de la GA, lorsqu’elle est additionnée dans la phase continue d’une émulsion formée initialement par la b-lg.

L’hypothèse 1 peut être éliminée en raison des interactions électrostatiques attractives qui se produisent certainement à pH 4,2 entre les deux biopolymères. Les deux autres hypothèses restent plausibles, quoique la faible stabilité de l’émulsion préparée avec le ratio 1 : 2 par le protocole 3 et celle des émulsions préparées par le protocole 1 laissent penser que la co-adsorption de GA et de _-lg à l’interface, par adsorption successive ou sous forme de complexe déjà formé, si elle a lieu, n’est pas très efficace. De plus, il faut considérer la présence possible dans la phase continue des biopolymères libres en excès et des complexes b-lg : GA. La mesure de la tension interfaciale nous a permis d’obtenir des informations supplémentaires sur l’organisation interfaciale.

3.3 Mesures de tension interfaciale La mesure de la tension interfaciale à l’aide du tensiomètre à goutte nous a permis de mettre en évidence que la b-lg abaisse nettement la tension interfaciale huile/eau (de 21 à 12 mN/m), alors que la GA est sans effet. Cependant, Dickinson et coll. [21] ont montré que la GA est capable de s’adsorber à l’interface et que cette adsorption se fait plus particulièrement par la partie protéique de la fraction arabinogalactaneprotéine (AGP) de la gomme. Le phénomène de coalescence est alors empêché par la partie hydrophile du polymère qui forme une barrière stérique autour des globules huileux. Deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la non-concordance des résultats. La première est liée à la composition de la gomme. En effet, la GA est un produit d’origine naturelle dont la composition et les caractéristiques sont variables, car elles dépendent de la méthode d’obtention du polysaccharide, de son origine géographique, de l’espèce dont il est extrait, etc. Il serait donc intéressant de

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caractériser la GA que nous avons utilisée, pour déterminer notamment la proportion de fraction AGP puisque c’est elle qui serait responsable de l’adsorption de la GA à l’interface. La seconde hypothèse est liée à la façon dont la tension interfaciale est mesurée. Si le tensiomètre à goutte semble à priori le plus adapté à l’étude de l’interface huile/eau, les mesures réalisées immédiatement après formation des gouttes sont peut-être trop prématurées pour voir l’effet réel de la GA sur la tension interfaciale. En effet, la GA est un polymère de masse molaire élevée qui a besoin de temps pour diffuser vers l’interface et se réarranger de façon à stabiliser les émulsions. Pour caractériser son comportement interfacial, il serait préférable de réaliser des mesures sur une période plus longue. Nous avons également utilisé un tensiomètre à lame de Wilhelmy dans des conditions correspondant au protocole 3. La tension interfaciale huile/eau en présence de b-lg seule est voisine de 10 mN/m au début de l’expérience et évolue au cours du temps vers des valeurs plus faibles. La figure 4 montre que l’ajout de GA au système, après 200 min, ne modifie pas l’aspect de la courbe d’évolution de la tension. Il ne fait apparemment pas varier la tension interfaciale, ce qui signifie que la gomme ne déplace vraisemblablement pas la b-lg de l’interface pour s’y adsorber, et ce même sur un temps de mesure de plus de 16 h. Ce résultat nous permet de réfuter l’hypothèse 2 émise au paragraphe 3.2.3. Ainsi, la troisième hypothèse semble être celle qui convient le mieux pour modéliser la manière dont la GA s’organise autour des globules. Néanmoins, il serait intéressant de mesurer la tension superficielle des mélanges de biopolymères et de procéder à l’expérience inverse en ajoutant de la b-lg à la solution de GA, tout en mesurant la tension interfaciale en continu sur une longue période de temps.

Tension Interfaciale (mN/m)

12

ajout GA

10

8

6

4

2

0 0

200

400

600

800

1000

1200

Temps (min) Figure 4 : Evolution de la tension interfaciale en fonction du temps pour le système eau b-lg 2,5 %/huile avant puis après l’ajout d’une dispersion de GA en phase aqueuse.

1400

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4. CONCLUSION L’objectif de ce travail était de formuler et de caractériser des émulsions simples huile dans eau d’intérêt pharmaceutique ou cosmétique stabilisées par de la b-lactoglobuline, de la gomme arabique ou des mélanges b-lg : GA. Ce travail a permis de montrer tout d’abord qu’il n’a pas été possible d’obtenir d’émulsion stabilisée uniquement par la GA lorsque la concentration en biopolymère dans les dispersions aqueuses était de 0,5 et 1 %. Pour les concentrations de 2,5 et 5 %, les émulsions formulées n’ont pas déphasé. Dans le cas de la b-lg, l’obtention d’émulsions stables a nécessité l’utilisation d’un homogénéisateur haute pression dont le rôle est de diminuer la taille des globules. Cette démarche nous a ainsi permis de stabiliser des émulsions avec de faibles concentrations de b-lg (0,5 et 1 %). Enfin, nous avons tenté de réaliser des émulsions stabilisées par des mélanges de blg et de GA. L’objectif était d’améliorer la stabilité des émulsions par rapport à celles ne contenant qu’un seul biopolymère, en mettant à profit les interactions électrostatiques prévisibles à pH 4,2, pH auquel la protéine et le polysaccharide ont des charges globales opposées. Deux ratios massiques b-lg : GA ont été testés : 2 : 1 et 1 : 2. Trois protocoles de préparation de ces émulsions ont été évalués. L’émulsion la plus stable a été obtenue par ajout de GA à la phase continue d’une émulsion préalablement stabilisée par la b-lg selon un ratio 2 : 1 en faveur de la protéine. L’ensemble des analyses a permis de proposer un mécanisme de stabilisation de l’émulsion dans lequel seule la protéine est adsorbée à l’interface huile/eau et la GA se lie à la couche de b-lg par des interactions électrostatiques. Ces résultats ouvrent de nombreuses perspectives quant à la possibilité de stabiliser des émulsions par un système couche par couche. La stabilisation des globules s’effectuerait alors grâce à des multicouches de polyélectrolytes qui permettraient une meilleure résistance aux stress environnementaux [20]. De nombreuses hypothèses ont été émises, et il serait intéressant de réaliser certaines études complémentaires afin de les confirmer ou non. Ainsi, la stabilité d’une émulsion réalisée suivant le protocole 2 avec une concentration plus importante de GA serait à évaluer. Des mesures supplémentaires de tensions superficielle et interfaciale seraient nécessaires pour caractériser les systèmes qui n’ont pu l’être lors de cette étude et étayer notre hypothèse de localisation des biopolymères aux interfaces. Enfin, des mesures de rhéologie interfaciale seraient intéressantes pour préciser le mécanisme de stabilisation de la GA.

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Mécanismes d’inversion de phase catastrophique lors de l’émulsification d’huiles visqueuses Johanna GALINDO ALVAREZ1, Véronique SADTLER,2* Lionel CHOPLIN2, Jean-Louis SALAGER3 ————————————————————————————————————-————————— 1 Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Los Andes, Carrera 1 E. No. 19A-40, Bogotá, Colombia 2 GEMICO, Ecole Nationale Supérieure des Industries Chimiques (ENSIC), Institut National Polytechnique de Lorraine (INPL), 1 rue Grandville, BP 20451, 54001 Nancy, France. 3 Laboratorio FIRP, Ingeniería Química, Universidad de Los Andes, Avenida Don Tulio Febres, 5101 Mérida, Venezuela * [email protected]

RESUME : L’inversion de phase catastrophique correspond au changement de type d’une émulsion, d’une morphologie eau dans huile vers une morphologie huile dans eau ou vice versa. Elle résulte de la coalescence simultanée des gouttes de la phase dispersée à l’approche d’une fraction d’empilement critique. Phénomène généralement non désiré lors de procédés classiques d’émulsification, il peut être mis à profit pour des applications spécifiques telles que la mise en émulsion de produits visqueux. La formation d’émulsions multiples intermédiaires est une étape accélérant l’inversion de phase catastrophique en augmentant le volume apparent de la phase dispersée et ce, même dès le rajout de faible quantité cette phase. La mise en évidence expérimentale de cette étape est par contre délicate compte tenu de la forte instabilité de ces émulsions multiples. L’utilisation d’une phase huileuse visqueuse nous a permis d’obtenir des émulsions de différentes morphologies, suffisamment stables pour être observées en microscopie optique au travers d’un écoulement du type « squeezing flow », permettant ainsi le suivi de l’évolution de l’inversion. Nous avons pu clairement observer la formation d’émulsions multiples h/E/H, processus favorisé par la viscosité de la phase huileuse, permettant ainsi d’obtenir des inversions de phase pour des ajouts très faibles de quantités d’eau, conduisant ainsi à la formation d’émulsions H/E finales très concentrées (environ 90% de phase dispersée). L’inversion de phase résulte d’un mécanisme d’agglomérationcoalescence qui, par établissement d’un réseau au sein du milieu, induit la propagation de l’inversion dans l’ensemble du système à l’approche de la fraction d’empilement critique. Nous avons pu observer également l’aboutissement complet ou partiel du phénomène d’inversion en fonction de la distribution de tailles de gouttes avant l’inversion et à la présence d’émulsions supermultiples ou multiples complexes (émulsions multiples où les gouttelettes encapsulées contiennent, elles aussi, d’autres petites gouttelettes piégées).

MOTS-CLES : Emulsion, inversion de phase catastrophique, huile visqueuse, empilement critique, agglomération-coalescence

1. INTRODUCTION Une émulsion est une dispersion thermodynamiquement instable d’au moins deux phases immiscibles ou partiellement miscibles, classiquement l’eau (E) et l’huile (H). Les procédés mécaniques d’émulsification apportent la quantité d’énergie nécessaire pour obtenir la distribution de taille de gouttes souhaitée. Cette énergie mécanique permet de vaincre la tension interfaciale et donc de créer de l’aire interfaciale. L’utilisation de surfactifs (ou tensioactifs) facilite la mise en émulsion en diminuant la

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tension interfaciale et permet la stabilisation, dans le temps, des interfaces créées. Les émulsions peuvent être de morphologies simples, huile dans eau (H/E) si la phase dispersée est l’huile, ou eau dans huile (E/H) dans le cas contraire, mais aussi de type multiple eau dans huile dans eau (e/H/E) ou huile dans eau dans huile (h/E/H) [1,2]. 1.1 Carte formulation – composition La morphologie des émulsions obtenues par agitation de systèmes eau/huile/surfactif peut être représentée sur une carte bidimensionelle formulation-composition. En ordonnée est représentée la formulation du système (comme la valeur du HLD ou le HLB), et en abscisse le rapport de phases eau/huile (composition) (voir figure 1) [3,4]. Les régions où l’huile est la phase continue (B-, B+, A+) sont séparées des régions où la phase continue est la phase aqueuse (A-, C-, C+) par une ligne d’inversion (en gras sur la figure 1). Les signes (+) et (–) indiquent le caractère lipophile et hydrophile respectivement des émulsions. Les zones A+, A-, B+, et C- sont dites « normales » car le type d’émulsion obtenue est en accord avec la règle de Bancroft. Les zones B- et C+ sont dites « anormales », car la morphologie n’est pas le résultat de la formulation mais de la composition associée à un excès de phase interne [5,6].

Figure 1 : Carte bidimensionnelle de formulation – composition.

En pratique, au cours d’un procédé d’émulsification, les variables de composition et de formulation sont susceptibles de changer, avec comme résultat une modification de la morphologie grâce à une variation de la courbure de l’interface liquide-liquide et le déplacement du point représentatif de l’émulsion sur la carte formulationcomposition. Lorsque ce déplacement traverse la ligne d’inversion, il se produit une inversion dite dynamique, de caractère réversible ou irréversible. Si le déplacement se produit verticalement entre les régions A- et A+, l’inversion aura toujours lieu dans les mêmes conditions (au voisinage de la formulation optimale) et pour ses caractéristiques de réversibilité elle est dite transitionnelle [7]. Ce type d’inversion résulte de la modification d’une des variables de formulation, comme la température dans un système contenant un surfactif non ionique polyéthoxylé, ou la salinité dans un système avec un surfactif ionique. Quand le déplacement a lieu au travers des lignes verticales (entre les zones B- et A-, ou A+ et C+), l’inversion est dite catastrophique et est de caractère irréversible. Cette inversion se produit quand le contenu en phase interne devient supérieur à celui correspondant à la ligne

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d’inversion standard. Ce type d’inversion est très sensible au protocole de variation progressive de la composition (procédé semi-batch). Il existe des phénomènes d’hystérèse qui permettent de préserver le type d’émulsion (tout se passe comme si le système avait une mémoire) pour des plages de composition étendues, avant que l’inversion se produise [8,5,9,10]. 1.2 Inversion de phase catastrophique 1.2.1 Mécanismes d’inclusion et de fuite Le mécanisme de l’inversion de phase catastrophique n’est pas encore clairement élucidé [11]. Généralement, l’inversion résulte de la coalescence de la phase dispersée quand celle-ci atteint une certaine fraction volumique dite « critique » [1215]. Cette fraction critique peut être atteint d’autant plus rapidement s’il se forme des gouttes multiples, c'est-à-dire si au sein des gouttes de phase dispersée se retrouvent encapsulées des gouttelettes de phase continue (Figure 2). Une fraction dispersée apparente F a peut ainsi être définie comme la somme de la phase huileuse dispersée (H) et la fraction de phase continue aqueuse encapsulée (e). En effet, la présence dans le système d’un surfactif soluble dans la phase dispersée favorise l’incorporation et la stabilisation de la phase continue. A cette incorporation, s’oppose un phénomène de fuite. C’est le déséquilibre entre ces deux phénomènes qui permettra ou non l’augmentation de la fraction de phase dispersée conduisant à l’inversion [16-18].

Figure 2 : Schéma d’une goutte multiple eau dans huile dans eau (e/H/E)

La formation d’une dispersion liquide - liquide est régie par deux processus en compétition : la rupture et la coalescence des gouttes. Si le système contient un surfactif soluble dans la phase dispersée, celle-ci peut incorporer de la phase continue pour former des émulsions multiples. Ce processus d’inclusion conduit à une augmentation de la taille de gouttes et donc de la fraction volumique apparente de phase dispersée (voir figure 2). Si cette augmentation se poursuit, l’inversion de phase se produit. Au phénomène d’inclusion s’oppose un phénomène de fuite. Ainsi, l’inversion ne se produit pas pour toutes les dispersions. La fuite des gouttelettes internes (c’est-à-dire les gouttelettes encapsulées dans les gouttes multiples) résulte de la faible stabilité de l’interface entre l’émulsion multiple (ou la goutte externe) et la

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gouttelette [19]. Lors de l’agitation, la déformation des gouttes dispersées transmet une déformation de compression aux gouttelettes internes contre la surface des gouttes multiples hôtes favorisant l’échappement. Le taux de fuite est contrôlé par la taille et le volume des gouttelettes internes. Si les conditions de procédé et de formulation expliquent la formation d’émulsions multiples, le mécanisme d’inclusion de phase externe en tant que phase interne n’est pas encore bien établi, l’observation visuelle de ce phénomène étant difficile [20,21]. 1.2.2 Viscosité des phases Le rapport de viscosités Rv, entre les phases dispersée et continue (Rv = hd/hc) a une influence importante sur la fraction de phase dispersée à laquelle l’inversion se produit. Salager et Coll [22-23] ont pu mettre en évidence un effet de la viscosité de la phase huileuse sur la ligne d’inversion standard dans la zone A+/C+. Ils n’ont pas cependant observé d’effet dans la zone B-/A-, compte tenu de la viscosité relativement peu élevée (h < 0.5 Pa.s) des systèmes étudiés. Les travaux de Brooks et Richmond [17], en accord avec l’étude de Selker [24], ont permis de montrer dans la zone B-/A- une diminution de la quantité d’eau requise pour produire l’inversion lors de l’augmentation de la viscosité de l’huile, ainsi que la formation de structures e/H/E avant l’inversion. La formation des émulsions multiples serait ainsi liée au changement de régime d’écoulement induit par le changement de la viscosité des systèmes. En régime laminaire, l’augmentation du rapport de viscosités Rv, favorise la formation de gouttes ellipsoïdales et la présence de gradients de vitesse dans la cuve d’agitation [25]. Les gouttes ellipsoïdales sont à l’origine de la formation de gouttes multiples qui peuvent s’interconnecter pour former des régions d’inversion localisée. La présence de gradients de vitesse dans la cuve retarde ainsi l’atteinte de la taille de gouttes finale du système, d’où un temps d’agitation plus long de l’inversion dynamique pour aboutir à l’inversion complète du système [17]. L’émulsification dans l’eau d’huiles visqueuses, sous forme de dispersions submicroniques, est difficile et très coûteuse énergétiquement lors de l’utilisation d’un procédé classique direct. L’inversion de phase catastrophique se présente comme une alternative pour la mise en émulsion de ces huiles sous forme de petites gouttelettes avec une consommation énergétique plus faible. Au début du procédé, la dispersion de la phase aqueuse interne est favorisée d’autant plus que la phase continue huileuse est visqueuse. Il est donc conseillé de maintenir le système sous un régime d’agitation laminaire. L’addition de phase interne ou l’agitation prolongée d’une émulsion anormale (à composition fixe) permettent ainsi de déclencher l’inversion de phase [26,27]. Le but de ce travail est d’étudier le mécanisme d’inversion de phase catastrophique à l’aide d’un changement du rapport de viscosité Rv, entre la phase huileuse et la phase aqueuse. Il s’agira de suivre les mécanismes d’inversion de phase catastrophique d’émulsions eau dans huile vers des émulsions huile dans eau, par addition de phase dispersée sous agitation constante.

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2. MATERIELS ET METHODES 2.1 Formulation Le système étudié est composé d’huile de silicone. Il s’agit de polydiméthylsiloxanes linéaires (PDMS, RHODORSIL 47V, Rhodia-Silicones France), avec trois viscosités différentes : 1, 5 et 12.5 Pa.s. La phase aqueuse est de l’eau ultra pure (système Milli-Q, Millipore) contenant 1% massique de NaCl (pureté > 99.5 %, Sigma Aldrich) afin d’augmenter la conductivité de l’eau pour détecter le point d’inversion de phase pendant l’émulsification. Les tensioactifs non ioniques utilisés sont des nonylphénols polyéthoxylés (environ 10 POE) : Igepal CO – 720 (HLB = 14) et Igepal CO- 520 (HLB = 10), fournis par Sigma Aldrich, mélangés dans une proportion massique 3 :1, pour une valeur moyenne de HLB de 13. La concentration totale en tensioactifs est de 5 % massique, dans chacune des phases au début du procédé 2.1.

Procédé d’émulsification

L’émulsification est réalisée dans un rhéomètre RFSII (Rheometrics Scientifics, USA) configuré en rhéo-réacteur. Il s’agit d’un réacteur semi-fermé, composé d’une cuve tournante en aluminium et d’une géométrie cylindrique, avec un ruban hélicoïdal comme outil de macromélange (Figure 3). Dans cette configuration, la cuve tourne et le ruban est fixe et solidaire du détecteur du couple. Un bain thermostaté assure l’évolution et le maintien de la température dans la cuve [28]. La conductivité est suivie tout a long de l’expérience à l’aide d’un conductimètre CMD – 210 et d’une cellule CDC749 (Radiometer Analytical) plongée dans l’échantillon. Le suivi en temps réel du couple et de la conductivité permet de localiser le point d’inversion de phase pendant le procédé d’émulsification. En effet, la viscosité (calculée à partir de la mesure du couple) augmente progressivement pendant l’incorporation de l’eau dans l’huile jusqu'à l’observation d’une chute brutale lors de l’inversion en une émulsion huile dans eau. La conductivité, quant à elle, présente une augmentation nette au point d’inversion, résultant du passage d’une émulsion de phase externe huileuse non conductrice à une émulsion de phase externe aqueuse. Les expériences d’inversion de phase sont réalisées en procédé semi-batch : 15 gr de phase huileuse (PDMS avec 5 % p/p du mélange de tensioactifs, HLB = 13) sont placés dans la cuve du rhéo-réacteur, puis la phase aqueuse (contenant aussi 5 % p/p du mélange de tensioactifs, HLB = 13) est additionnée avec un débit constant fixé à 0,5 g/min, jusqu’à ce que le point d’inversion soit repéré par l’augmentation brutale de la conductivité au delà de 0,1 mS/cm. La cuve tourne à une vitesse d’agitation imposée constante égale à 300 tr/min. Le suivi en microscopie optique (Olympus BX 51, Olympus Europe) du mécanisme d’inversion de phase est effectué par des prélèvements ponctuels de l’émulsion. Ces prélèvements sont déposés soigneusement sur une lame porte-objet et sont ensuite recouverts avec une lamelle couvre-objet (Figure 4). Cette manipulation génère un écoulement de compression, ou « squeezing flow » entre les lames, permettant d’observer et de suivre les phénomènes d’agglomération et de coalescence au sein de l’émulsion. Dans cette expérience, compte tenu du fait que l’écoulement de compression est essentiellement généré par le poids extrêmement faible de la lamelle couvre-objet, l’écoulement entre la plaque et la lamelle peut être assimilé à

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Figure 3 : Schéma du rhéo-réacteur

un écoulement radial d’une part et, sur un intervalle de temps faible par rapport au temps total de la compression, à un écoulement pseudo-stationnaire d’autre part, où la déformation dominante est une déformation de cisaillement. En première approximation, il n’est pas irraisonnable de considérer que les sollicitations mécaniques engendrées reproduisent quelque peu ce qu’un élément de volume du système émulsionné subit sous l’effet de l’agitation (en régime laminaire) dans le rhéo-réacteur.

Figure 4 : Ecoulement de compression ou « squeezing – flow »

3. RESULTATS ET DISCUSSION L’inversion de phase catastrophique peut être déclenchée par l’addition continue de phase interne (procédé semi-batch) ou par l’agitation continue d’un système anormal (procédé batch) [9,10,17,27]. La formation de structures intermédiaires, comme les émulsions multiples, permet dans le premier cas d’aboutir à une inversion de phases à des fractions de phase dispersée plus faibles que la fraction d’empilement critique et, dans le deuxième cas, de déplacer la ligne d’inversion standard de façon à achever l’inversion sans addition de phase interne [10,27]. Dans le cas d’un procédé semi-batch, le mécanisme d’inversion est le résultat d’interactions entre les paramètres de procédé et de formulation. La réponse du système face à ces interactions est indiquée par le point d’inversion de phase. Pour

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l’inversion d’une émulsion de la zone B- vers la zone A-, le mécanisme rapporté dans la littérature est : E/H ’ h/E/H ’ H/E, à savoir la formation d’émulsions multiples comme une étape intermédiaire avant l’inversion de phase catastrophique. Néanmoins, lorsque la viscosité de la phase huileuse augmente, il est possible de trouver aussi des émulsions multiples après l’inversion suivant un mécanisme du type : E/H ’ h/E/H ’ e/H/E ’ H/E [17,29,30,31] . Les résultats observés dans notre système modèle peuvent être analysés en fonction de différents aspects : la nature physico-chimique du système, le régime d’écoulement et la viscosité de la phase huileuse. Il est important, à ce niveau, de préciser certains termes que nous utiliserons au cours de cette analyse afin d’éviter toutes confusions. Les associations de gouttes dans le système fluide seront nommées « agglomérats » : en effet, ce sont des interactions de van der Waals, à caractère réversible, qui maintiennent les objets liés les uns aux autres. Lorsque ces associations sont composées d’un nombre élevé de gouttes, nous les appellerons « amas », et si ces amas ne sont pas compacts, nous dirons qu’il s’agit d’amas de type fractal. Par rapport aux types d’émulsions que nous allons trouver tout au long du procédé, nous ferons la différence entre trois types : 1) des émulsions simples, huile dans eau (H/E) ou eau dans huile (E/H), 2) des émulsions multiples, à savoir des gouttes dispersées contenant des gouttelettes de phase continue, et 3) des émulsions multiples complexes ou supermultiples, c'est-àdire des émulsions multiples, pour lesquelles les gouttelettes internes sont elles mêmes multiples. 3.1

Influence de la nature physico-chimique du système

Le haut poids moléculaire des huiles de silicone utilisées et le caractère non siliconé des surfactifs empêchent la solubilisation de ces derniers dans la phase huileuse et la formation de micelles [32]. Si le mélange surfactif est présent à 5 % en poids dans chacune des phases, il se trouve initialement dans la phase huileuse sous forme d’une dispersion de gouttelettes. Au début du procédé, l’huile de silicone (quasiment pure) coexiste donc avec des gouttelettes de surfactifs dispersées, puis, lors de l’addition d’eau, le système présente deux types de phases dispersées dans l’huile : la phase aqueuse et le surfactif. Compte tenu de l’affinité du système surfactif pour la phase aqueuse, les gouttelettes d’eau tendent à solubiliser rapidement celui-ci lorsqu’il se trouve dans leur voisinage. Ce processus favorise une augmentation localisée de la concentration en surfactifs dans la phase aqueuse, les gouttelettes d’eau variant leur concentration massique en surfactifs de 10 à 80 % selon l’étape du procédé et la fraction à laquelle l’inversion de phase se produit. Cette condition induit une augmentation de la viscosité des films interfaciaux (les films qui recouvrent les gouttes de la phase dispersée) en ralentissant le phénomène de drainage, car le film devient plus rigide et résistant à la coalescence [33]. 3.2

Influence du régime d’écoulement

L’établissement d’un régime d’écoulement résulte des interactions entre les contraintes mécaniques liées au mouvement du fluide. Ces contraintes, qui agissent pour réduire la taille des gouttes de la phase dispersée, perçoivent l’opposition au mouvement de la part de la phase interne avec une amplitude proportionnelle à la

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viscosité induite par le gradient de vitesse [34]. Les conditions de procédé et la viscosité de la phase huileuse permettent l’établissement d’un régime d’écoulement laminaire, adéquat pour l’obtention d’un mélange homogène sans une consommation d’énergie trop importante. Le nombre de Reynolds, Re, varie entre 0,1 et 15 tout au long du procédé [35]. Au fur et à mesure de l’augmentation de la fraction de phase dispersée, le système devient viscoélastique. Dans ces conditions, les forces visqueuses exercent un champ de pression autour des gouttes en les déformant et en exerçant une pression opposée à la pression de Laplace [36-38]. Les gouttes s’étirent et s’amincissent pour acquérir une géométrie de type « filament ». Compte tenu de l’effet GibbsMarangoni, il se développe à la surface des gouttes un gradient de concentration de surfactif. Quand le diamètre des filaments devient suffisamment petit, les perturbations tendent à fractionner les pointes, là où la tension interfaciale est devenue plus faible due à la mobilité réduite des molécules de surfactif [39,40]. Dans ce mécanisme, la taille moyenne des gouttes de la dispersion diminue avec l’augmentation de la viscosité, puisque la contrainte de cisaillement (la contrainte visqueuse dans ces conditions) est proportionnelle à la viscosité de l’émulsion. De plus, le nombre de gouttelettes filles, issues de la fragmentation de la phase interne, augmente largement avec la réduction du rapport des viscosités, Rv surtout dans la plage 10-2 vers 10-3 [33,41]. 3.3

Description du mécanisme d’inversion observé

Le mécanisme d’inversion de phase catastrophique est un processus issu de la coalescence de la phase dispersée. Cette coalescence, quasi simultanée de toutes les gouttes, ne peut avoir lieu que lorsque la fraction de phase dispersée du système dépasse une valeur « critique » au-delà de laquelle le taux de coalescence est plus rapide que le taux de fragmentation de la phase dispersée. Cette valeur critique est une caractéristique du système et du type de régime d’écoulement, car la coalescence ne peut se produire que si le temps de contact entre les gouttes est supérieur au temps requis pour le drainage de la phase confinée entre les gouttes. L’état d’empilement critique peut être atteint non seulement par l’augmentation de la fraction de phase dispersée lors de l’ajout de phase interne, mais aussi par la formation d’émulsions multiples qui, en encapsulant de la phase continue, conduisent à un gonflement de la phase dispersée apparente perçue par le système (Figure 2). Dans le cas d’un procédé d’inversion de phase catastrophique en mode semi-batch, les deux phénomènes peuvent se produire simultanément ou l’un d’entre eux peut dominer selon les conditions du procédé. Au mécanisme d’encapsulation et de formation de gouttes multiples s’oppose l’échappement de la phase interne encapsulée. Ce processus a lieu lors du cisaillement de la goutte (Figure 5a), ou lors de la coalescence de la gouttelette piégée avec la phase externe de la goutte qui la contient (Figure 5b) [18,19,31,42,43].

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Figure 5 : Mécanisme d’échappement des gouttes de la phase interne, a) par cisaillement, b) par coalescence

Sur la base du suivi par microscopie optique du phénomène d’inversion de phase pour un système avec un rapport de viscosités, Rv, entre 0,001 et 0,01 avant le point d’inversion, nous proposons un mécanisme d’inclusion efficace simultané à un mécanisme d’échappement limité que nous nous proposons d’appeler « mécanisme d’agglomération – coalescence ». Au début du procédé, le surfactif forme une dispersion dans la phase huileuse et la phase aqueuse ajoutée, en se dispersant, dissout le mélange de surfactifs présent au voisinage des gouttes d’eau. Ce processus augmente la viscosité localisée du film interfaciale des gouttes dispersées, car le rapport surfactifs/eau peut être très important (égal à 8 en début du procédé). Au sein de cette émulsion très diluée, les collisions sont peu nombreuses et se produisent seulement par groupe de deux ou trois gouttes se trouvant à proximité les unes des autres A cause du caractère laminaire du régime d’agitation, ces collisions induisent une étape d’agglomération avant la coalescence (coagulation rapide de Smoluchowski). Dans ces conditions, la viscosité interfaciale s’oppose au phénomène de coalescence en rendant le drainage intergoutte plus difficile. Dans une première approche, l’augmentation des forces de collision conduit à un drainage du film plus rapide. Cependant, l’augmentation de ces forces promeut également l’aplatissement de la goutte et l’accumulation localisée de pression qui conduit à la séparation des gouttes après qu’elles soient entrées en contact [33]. Au cours de l’étape d’agglomération, les gouttes qui entrent en collision restent agglomérées les unes aux autres à cause des forces d’interaction intermoléculaire (Figure 6a) [44]. La formation de ces agglomérats soutient l’effet Marangoni, le drainage lent du film intergoutte et la coalescence a posteriori des gouttes [43]. Pendant ce processus, il y a possibilité d’encapsulation d’une faible quantité de phase continue à travers un mécanisme d’inclusion par bicollision décrit par Sajjadi et coll.[20]. Avec l’augmentation de la fraction de phase dispersée et par conséquent la viscosité de l’émulsion, augmente la probabilité de collisions entre les gouttes et la formation d’amas fractals peu compacts issus des collisions entre plusieurs agglomérats et gouttes (Figure 6b) [45]. La coalescence de ces structures donne lieu également à la formation d’émulsions multiples par un processus de collision multiple décrit par Sajjadi et coll. [18, 20] où la phase continue, piégée dans les interstices de l’amas, devient la phase encapsulée lors de la coalescence de l’agglomérat.

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a)

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b)

Figure 6 : a) Agglomération des gouttes et b) formation d’amas pendant le processus d’inversion de phase

La croissance du nombre de gouttes multiples, liée aussi à l’ajout de phase interne, induit une augmentation plus rapide de la fraction de phase dispersée apparente (Figure 7). Quand le système atteint une fraction d’empilement dite critique, l’inversion se déclenche là où la concentration de gouttes multiples est la plus importante. Sous l’effet de l’agitation, cette inversion localisée se propage à travers le milieu et la phase continue devient rapidement la phase dispersée (Figure 8).

Figure 7 : Formation des émulsions supermultiples

3.4 Cas des huiles de silicone de viscosités 5 et 12,5 Pa.s Les expériences réalisées pendant ce travail ont montré que l’utilisation des huiles de viscosités de 5 et 12,5 Pa.s, permet d’obtenir des émulsions finales H/E très concentrées, c’est-à-dire à plus de 90% en poids de phase dispersée, par inversion de phase catastrophique d’émulsions E/H diluées (environ 10% de phase aqueuse).

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De plus, l’établissement d’un régime laminaire avec les conditions d’agitation utilisées permet d’avoir un procédé de très faible consommation énergétique.

Figure 8 : Inversion de phase catastrophique et propagation du phénomène (propagation, t=70 s)

La viscosité élevée de la phase huileuse (la phase continue au début du procédé) augmente les cisaillements résultants des contraintes visqueuses et permet d’obtenir une dispersion fine de la phase dispersée (phase aqueuse ajoutée). Cette dispersion, composée au début du procédé d’un grand nombre de gouttes de surfactifs et de gouttes d’eau (ces dernières solubilisant rapidement les gouttes de surfactifs) constitue le début du processus d’inversion. Puis, compte tenu de l’augmentation du nombre de gouttes dispersées, les phénomènes de coalescence entre paires de gouttes (éventuellement multiples) peuvent apparaître. L’addition en continu de phase aqueuse augmente le nombre de gouttes dispersées et, par conséquent, la probabilité de rencontres et de collisions, pour former des agglomérats. Sous l’effet de l’agitation, ces agglomérats coalescent et encapsulent de la phase dispersée sous forme de gouttelettes. La persistance de ces agglomérats (pour lesquels le système surfactif devrait favoriser la coalescence plutôt que la floculation) peut être justifiée par l’effet d’un transfert de matière de surfactifs incomplet, comme conséquence de la viscosité de la phase huileuse. Ainsi, il semblerait que les films intergouttes doivent être soumis à un effort ou à une déformation pour se rompre, même s’ils correspondent à une formulation défavorable. Ces gouttes multiples deviennent par la suite tellement concentrées que la tension interfaciale du système ne permet plus l’obtention d’objets sphériques. Cette condition favorise la formation de corps non-sphériques de forme irrégulière, qui augmentent la probabilité de rencontre et de collision. Comme résultat, nous avons observé que la cinétique de coalescence est nettement accélérée, car toutes les collisions deviennent efficaces et le système peut donc former de gros amas de gouttes multiples (zones d’émulsion du type H/E, c’est-à-dire des zones où l’inversion s’est produite.

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Ces corps irréguliers, que nous appelons amas, construisent un réseau microscopique dans l’ensemble du système. Ce réseau est composé par des gouttes multiples sous forme d’agglomérats qui, sous l’effet d’un drainage lent des films interfaciaux, finissent par coalescer avec les agglomérats voisins. L’addition de phase aqueuse et la réduction de la circulation à l’intérieur du milieu favorisent la courbure de type H/E par l’augmentation localisée de la fraction de phase dispersée, et par conséquent, l’inversion est déclenchée à l’intérieur de ces amas pour être ensuite propagée dans l’ensemble du système à travers du réseau établi. Ce dernier point est un élément clé dans le processus de compréhension du mécanisme d’inversion car, jusqu’à présent, le phénomène a été décrit généralement comme un phénomène instantané et non comme un événement se propageant de façon graduelle. Cette observation est en accord avec d’autres travaux comme ceux de Lieu et coll. [31], qui ont mis en évidence la propagation de l’inversion dans un système composé de liquides immiscibles en l’absence de surfactif. Les clichés de la figure 9 résument l’évolution de l’émulsion au cours du processus et la figure 10 l’illustre de façon schématique.

Figure 9 : Evolution de la morphologie de l’émulsion pour une huile de 5 ou 12 Pa.s pendant le processus d’inversion de phase

Figure 10 : Représentation schématique du mécanisme d’inversion pour une huile de viscosité égale à 5 ou 12.5 Pa.s

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3.5 Cas de l’huile de silicone de viscosité 1 Pa.s L’influence de la viscosité de la phase huileuse sur le milieu peut être soulignée à travers deux facteurs : les contraintes de cisaillement en régime laminaire et la réduction de la mobilité des gouttes dans le milieu. Donc, dans un système moins visqueux, les premières différences observées seront : une taille moyenne de goutte plus grande et une distribution de taille de gouttes plus étalée, ainsi qu’une mobilité de la phase dispersée plus importante, mais tout en limitant le phénomène d’échappement. Le système, au début du procédé, est composé également d’une dispersion de surfactifs dans la phase huileuse. Cependant, l’étape de solubilisation de cette dispersion est moins favorable dans ces conditions, en raison d’un nombre moindre de gouttes (puisque plus grandes) qui ralentit le mécanisme [45]. Par conséquent, il est nécessaire d’ajouter une quantité plus importante de phase dispersée pour induire les collisions dans le milieu. Le régime d’agitation laminaire conduit à des collisions douces, moins énergétiques, avec moins de rebondissements [33]. Néanmoins, si le temps de contact entre les gouttes n’est pas suffisant pour l’établissement d’interactions, les gouttes peuvent se séparer. L’inclusion de phase interne au cours du processus de bicollision est moins importante dans ces conditions, car le drainage du film interfacial est plus rapide que celui trouvé dans le cas des huiles plus visqueuses. Il se forme, malgré tout, des gouttes multiples, présentant une distribution de taille étalée, ainsi que des gouttes multiples supermultiples, si la collision se produit entre gouttes déjà multiples. Sous l’effet de l’agitation, les gouttes multiples grossissent, mais atteignent une taille maximale, établie par le nombre capillaire critique [34], à laquelle elles sont fragmentées. Au voisinage de la fraction d’empilement critique, la probabilité de contact entre les gouttes devient si importante que les gouttes multiples sont des germes pour la propagation de l’inversion. Le système, présentant une morphologie du type e/h/E/H avant l’inversion, évolue en une émulsion multiple du type e/H/E après celle-ci. Au cours du phénomène d’inversion, le film le plus externe des gouttes participe au processus et les conditions d’agitation ne permettent pas de détruire les structures résultantes (inversion partielle). De plus, la viscosité de la phase huileuse stabilise ces émulsions du type e/H/E avec un effet plus important que celui de la formulation qui ne devrait conduire qu’à des émulsions simples H/E. La figure 11 montre l’évolution de l’émulsion pendant le procédé d’émulsification et la figure 12 schématise cette évolution.

4. CONCLUSIONS Les observations expérimentales montrent bien que l’augmentation de la viscosité de la phase huileuse améliore le processus de formation des émulsions multiples h/E/H et favorise une inversion de phase à de faibles fractions de phase aqueuse. Cette inversion est l’issue d’un mécanisme d’agglomération-coalescence qui, en établissant un réseau au sein du milieu, induit la propagation de l’inversion dans

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Figure 11 : Evolution de la morphologie de l’émulsion pour une huile de 1 Pa.s pendant le procédé d’inversion de phase

Figure 12 : Représentation schématique du mécanisme d’inversion huile de viscosité 1 Pa.s

l’ensemble du système à l’approche de la fraction d’empilement critique. Jusqu’à présent, il était admis qu’il s’agissait d’un processus d’inclusion / fuite à l’intérieur des émulsions multiples, processus conduisant à une augmentation de la fraction dephase dispersée apparente jusqu’à atteindre une fraction d’empilement critique, au dessus de laquelle l’émulsion s’inverse [7-9,18,20,26,27]. Ces mécanismes ont été proposés pour des systèmes de faible viscosité (< 0,5 Pa.s). Les résultats de ce travail ont montré deux comportements différents au fur et à mesure de l’augmentation de la viscosité de la phase continue (avant le point d’inversion) : si le rapport de viscosité Rv (avant l’inversion) n’est pas très éloigné de l’unité, c’est le mécanisme d’inclusion / fuite qui domine, mais avec l’augmentation de la viscosité de la phase continue et la réduction du rapport de viscosités, une transformation vers un mécanisme d’agglomération – coalescence se produit. Nous avons pu observer l’aboutissement complet ou partiel du phénomène d’inversion. Cette condition est liée à la distribution de tailles de gouttes avant l’inversion et à la présence d’émulsions supermultiples ou multiples complexes (émulsions multiples où les gouttelettes encapsulées contiennent, elles aussi, d’autres petites gouttelettes piégées). En effet, une distribution étalée favorise l’agglomération et la coalescence de petites et grandes gouttes (multiples ou pas), mais les plus petites ne participent pas au phénomène d’inversion car elles restent piégées dans la phase continue encapsulée lors de la coalescence des autres gouttes. L’utilisation d’huiles de haute viscosité prévient ce phénomène au travers de deux effets. D’une part, la viscosité du système permet la formation de petites gouttes ayant une distribution étroite. D’autre part, même si la viscosité de la phase continue réduit la vitesse de drainage du film interfacial, cette viscosité empêche le

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détachement des gouttes des agglomérats et prévient les phénomènes d’échappement de phase interne lors du cisaillement du système. La persistance des émulsions multiples après l’inversion dans le cas du système le moins visqueux est le résultat d’une stabilisation par la viscosité de la phase dispersée (la phase huileuse) qui consomme toute l’énergie provenant du cisaillement et qui protège les gouttelettes internes contre l’échappement.

5. REMERCIEMENTS Au Programme Alban, Programme de Bourses d'Etudes de haut niveau de l'Union Européenne pour l’Amérique Latine, bourse No. E04D027576CO.

6. LISTE DES SYMBOLES E e H h Fa Rv hd hc

Phase aqueuse Phase aqueuse contenue dans une goutte multiple Phase huileuse Phase huileuse contenue dans une goutte multiple Phase dispersée apparente Rapport de viscosités Viscosité de la phase dispersée Viscosité de la phase continue

7. REFERENCES 1

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Colloïdes et procédés pour l’industrie alimentaire Cécile GEHIN-DELVAL, Robert REDGWELL, Delphine CURTI Nestlé Research Center, Food Science and Technology Department Vers-chez-les-Blanc, CH-1000 Lausanne 26 * Cecile.Gehin-Delval@)rdls.nestle.com

RESUME :

En science alimentaire, la recherche et le développement sont les meilleurs garants de produits innovants et de qualité. De solides recherches scientifiques au sujet du produit fini sont d’autant plus nécessaires qu’il est certain qu’une alimentation saine est un des gages de bonne santé et de protection contre les maladies. La science des colloïdes, en particulier, intervient dans toutes les étapes de la fabrication d’un produit : de l’étude des matières premières et des ingrédients à l’étape finale qui est l’expérience sensorielle vécue par le consommateur du produit. Un problème précis sera détaillé afin d’illustrer « l’approche colloïdale » en science alimentaire : la texturisation d’une phase aqueuse via l’utilisation de fibres de fruit.

MOTS-CLES :

Fibres de fruits, parois cellulaires de fruits, extraction de fibres de fruits, texturisation, viscosité, modèle colloïdal

1. INTRODUCTION Le besoin des consommateurs est en constante évolution au fil du temps. Par exemple, il est connu que la proportion de personnes âgées de 60 ans et plus augmentera de 1/10 en 2005 à 1/3 en 2050. Par ailleurs, d’ici 2015, 1,5 milliard de personnes dans le monde seront obèses ou en surpoids, ce qui correspond à une augmentation de 50% par rapport à 2005. Aussi, il est aussi notable qu’aux EtatsUnis, le nombre de participants aux marathons a augmenté de 70% entre 1990 et 2004. Ce sont donc ici trois témoins de l’évolution de la population et par conséquent, de ses besoins alimentaires. L’industrie alimentaire doit alors s’adapter et prévenir les besoins et désirs de consommateurs en maintenant constamment une qualité irréprochable de ses produits, en optimisant goûts et textures des recettes et en innovant vers des produits attractifs et adaptés au mode de vie de chacun. La science des aliments, qui s’étend de la microbiologie à l’étude comportementale du consommateur permet d’optimiser le produit alimentaire. Une large part de celleci fait intervenir la physique et la chimie des colloïdes : des matières premières et ingrédients au consommateur via les procédés et les produits finis (Figure 1) et s’applique à un large panel de produits tels que les dispersions, les émulsions, les mousses, les gels et les poudres [1]. La suite de cet article illustrera, la présence de la physico-chimie des colloïdes comme outil pour la résolution d’un problème concret en science alimentaire : la texturisation de phase aqueuse.

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_____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ Matières premières et ingrédients

- Végétaux et animaux - Micro-organismes - Minéraux, vitamines - Eau - Lipides, polysacharides, protéines

Procédé

- Homogénéisation - Evaporation - Agglomération - Traitement thermique - Extrusion - Aération - Séparation

Produit

-Consistance - Apparence - Emballage

Stockage et distribution

- Stabilité - Disponibilité - Fraîcheur

Consommation

- Santé - Plaisir - Commodité

Figure 1 : La physico-chimie des colloïdes dans la conception d’un produit alimentaire : des matières premières et ingrédients au consommateur.

L’industrie alimentaire porte un intérêt grandissant à des produits qui, en plus de leurs fonctionnalités physico-chimiques, offrent au consommateur des avantages additionnels pour la croissance, le développement et la santé, en particulier au niveau des épaississants et texturisants [2]. Outre des hydrocolloïdes solubles qui donnent au produit une texturisation artificielle peu appréciée et dont la nomination est peu attrayante pour le consommateur, l’utilisation de fibres de fruits semble être une bonne alternative. Ces dernières, constituées de parois cellulaires de fruit, ont l’avantage d’enrichir avantageusement le bol alimentaire en fibres et d’améliorer ainsi le transit intestinal. D’origine naturelle, elles possèdent un rapport fibres insolubles/solubles élevé et sont, par conséquent, peu caloriques. Au niveau coût, ces matériaux sont avantageux dans la mesure où ils sont des sous-produits de l’industrie alimentaire. Le procédé d’extraction des fibres de fruit sera détaillé tout comme les méthodes d’analyse des suspensions, puis l’influence du cisaillement sur ces dispersions ainsi que celle de la force ionique du milieu seront démontrées et clarifiées.

2. TEXTURISATION DE PHASE AQUEUSE La texturisation de phase aqueuse est, à l’heure actuelle, obtenue par ajout d’épaississants polymères, d’hydrocolloïdes solubles et d’amidons qui ont un goût et une texture artificiels et apparaissent comme déplaisants pour de nombreux consommateurs. Plutôt que d’utiliser un polymère, une solution est l’utilisation de fibres de fruit. Ce matériau a pour avantage, outre les propriétés organoleptiques très attrayantes qu’elles confèrent à un produit, d’avoir des qualités nutritionnelles et sanitaires indéniables : baisse des maladies chroniques, amélioration du transit intestinal [3] Leur origine naturelle est aussi perçue très positivement par le consommateur. La suite de ce paragraphe s’attachera à présenter ces matériaux et à démontrer leurs propriétés viscosifiantes. 2.1. Matériels et méthodes Les fibres alimentaires, telles que les fibres de fruit, sont quasi-intégralement constituées de polysaccharides provenant des parois cellulaires du fruit. L’utilisation de ces matériaux comme viscosifiants ou stabilisants de systèmes dispersés est encore mineure. Plusieurs raisons à cela : le manque de matériel adapté à un prix compétitif et le fait que les fibres qui sont actuellement disponibles sur le marché ne

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possèdent pas de très bonnes fonctionnalités technologiques, en termes de capacité à la rétention d’eau, par exemple, ce dont disposent communément nombre d’hydrocolloïdes. La principale raison à cela est que les fibres sont principalement des sous-produits de produits de plus haute valeur ajoutée (comme le jus de pomme ou le lycopène extrait des tomates) dont les fonctionnalités technologiques, comme la capacité à la rétention d’eau par exemple, sont drastiquement réduites par la dernière étape de séchage non contrôlée. L’importance primordiale de la préservation de la structure in vivo des parois cellulaires pendant leur procédé d’extraction vis-à-vis de la capacité à la rétention d’eau a été en effet démontrée par Vetter et coll.[4] En particulier, il a été mis en évidence que le pré-séchage est particulièrement critique pour ne pas modifier trop la taille, la forme et la porosité des particules. Si les parois cellulaires de fruits sont séchées directement à partir de leur suspension aqueuse, des transitions d’états comme la contraction, le durcissement et le pliage des tissus compromettent sérieusement les fonctionnalités de tels matériaux après réhydratation. C’est pourquoi un intérêt tout particulier à été porté à l’extraction des fibres de pomme et de tomate. 2.1.1. Fibres de fruit : extraction et suspensions Les fibres de fruit sont, dans un premier temps, extraites des fruits directement, puis re-suspendues dans des solutions aqueuses. • Extraction des fibres de fruits Les tomates (Lycopersicon esculentum) ont été achetées chez un producteur à Lausanne (CH) et les pommes (Malus domestica) proviennent d’un supermarché. Les fruits ont été pelés et le péricarpe séparé des autres tissus. Il a ensuite été homogénéisé pendant 30 s dans un mixeur Waring après ajout d’un peu d’eau dans le cas des tomates, ou d’une solution à 0,5% massique d’acide ascorbique dans le cas des pommes pour prévenir le brunissement. Ce tissu a été ensuite chauffé à 80°C pendant 10 min pour inhiber les enzymes endogènes, puis refroidi et centrifugé à 5 000 g pendant 10 min. Le surnageant est éliminé puis le résidu re-suspendu dans de l’eau. Le lavage à l’eau est répété deux fois, puis le même procédé est effectué avec de l’acétone au lieu de l’eau. Les parois cellulaires (PC) de fruit sont ensuite suspendues à nouveau dans l’acétone puis filtrées sur un filtre en fibre de verre (GF/A). Le gâteau de PC de fruit est alors rincé avec de l’acétone sur le filtre, séché sous vide et laissé à l’air sous hotte durant 12 h. Pour comparaison, des PC de pomme ont été extraites en remplaçant le préséchage à l’acétone par un pré-séchage à l’eau. • Préparation des suspensions des PCF extraites Les fibres sont alors dispersées à 1% en masse dans l’eau désionisée, ou dans des solutions à 0,1 ; 0,02 ; 0,05 ; 0,1 et 0,5 % en masse de NaCl (Fluka) pendant 3 h à température ambiante. Un aliquot de chaque échantillon est gardé intact, l’autre est soumis à un fort cisaillement (Ultra Turrax, 1 min, 24 000 tr/min).

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2.1.2. Techniques d’analyse des suspensions Plusieurs techniques d’analyse des supensions ont été mises en œuvre : mesure de la capacité à la rétention d’eau, de la viscosité apparente, rhéologie oscillatoire, microscopie laser confocale. • Mesure de la capacité à la rétention d’eau (CRE) La capacité à la rétention d’eau a été observée visuellement 2 h après le dépôt de 50 g de la suspension sur une grille en inox (maille de 2 mm). Par ailleurs, elle a aussi été mesurée par la méthode décrite par Robertson et coll. [5] légèrement modifiée : 80 mg des PC de fruit sont suspendus dans l’eau pendant 16 h à 20°C dans des tubes pré-pesés de 30 mL. Après équilibre, les tubes sont centrifugés à 14000 g pendant 15 min. Le surnageant clair est éliminé avec une pipette Pasteur et la masse du résidu est notée. La CRE se calcule selon l’équation suivante :

CRE (g/g) =

masse résidu hydraté – masse résidu sec masse résidu sec

• Mesure de la viscosité apparente La viscosité apparente est mesurée avec un viscosimètre Brookfield (modèle DV-II+) à l’aide d’un « Helipath » (Stand Model D) et d’une barre en T (S94) à 20 et 100 rotations par minute. • Rhéologie oscillatoire Des mesures rhéologiques ont été réalisées avec un rhéomètre à cisaillement contrôlé (ARES 100FRT, Rheometric Scientific), équipé de plans rainurés (diamètre 40 mm, écartement 2mm) et d’un bain thermostaté à 25°C. Une séquence de 4 étapes pour chaque échantillon est effectuée : o un pré-cisaillement constant de 100s-1 pendant 1 minute, o un balayage dynamique en temps pendant 86.103 s à f= 0,8Hz et 0.5% d’amplitude de contrainte. o un balayage dynamique en fréquence à 0,5% d’amplitude de contrainte entre 0,01 et 10,0Hz (mode logarithmique décimal), o un balayage dynamique en amplitude de contrainte de 0,01 à 100% (mode logarithmique décimal) à 0,8Hz. Dans tous les cas, les balayages en fréquence ont été réalisés dans un régime linéaire. Les échantillons, préalablement dégazés, sont versés directement dans le système de mesure et recouvert avec un film fin d’huile silicone à basse viscosité (AP 150 Wacker) pour éviter l’évaporation durant la mesure. • Microscopie laser confocale Pour la microscopie confocale, les suspensions de PC de fruit sont colorées avec de l’acridine orange, un colorant fluorescent. Des volumes égaux de suspension de PC de fruit à 1% en masse et de solution aqueuse fraîchement préparée à 0,02% d’acridine orange sont légèrement mélangés. Le mélange est déposé entre une lame et une lamelle avant observation avec un microscope confocal Zeiss (LSM 510-

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Axioplan 2 Imaging). La pectine intercalée d’acridine orange est excitée par un rayon laser He-Ne (l=543,5nm) donnant une fluorescence verte (l =525 nm). 2.2. Résultats Diverses suspensions de fibres de pomme et de tomate, cisaillées ou non, dispersées dans l’eau désionisée ou dans une solution saline ont été étudiées en regard de leurs propriétés physico-chimiques. 2.2.1. Influence du pré-séchage L’influence de la nature du solvant de pré-séchage des PC de fruit est présentée sur la Figure 2. 12000

Viscosité apparente (mPa.s)

10000

8000

Suspension non-cisaillée

6000

Suspension cisaillée

4000

2000

0 Eau

Acétone

Figure 2 : Effet du pré-séchage du protocole d’extraction des PC de tomate sur la viscosité apparente de leur dispersion non-cisaillée (en blanc) et cisaillée (en noir).

Après extraction à l’eau, les supensions non cisaillées et cisaillées possèdent des viscosités bien plus faibles que lorsque les PC de tomate sont extraites avec un préséchage à l’acétone. Quel que soit le procédé d’extraction, il est observable que les viscosités des échantillons cisaillés sont bien supérieures aux viscosités des échantillons non-cisaillés. Dans la suite du travail, toute PC de fruit sera extraite par pré-séchage à l’acétone. 2.2.2. Capacité à la rétention d’eau La capacité à la rétention d’eau des suspensions de fibres de pomme et de tomate dispersées à 1% dans l’eau désionisée, cisaillées ou non, a été observée visuellement (Figure 3). Alors que pour la pomme, la CRE varie peu, que la suspension soit cisaillée ou non, elle est très faible pour la suspension de fibres de tomate non cisaillée et proche de 100% pour la suspension cisaillée.

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Sans cisaillement

Après cisaillement

Pomme

Tomate

Figure 3 : Photographies de dispersions de fibres de pomme (en haut) et de tomate (en bas) cisaillées (à droite) ou non (à gauche).

La CRE calculée selon la méthode modifiée de Robertson et coll. [5] est présentée sur la Figure 4 pour des dispersions de pomme et de tomate cisaillées ou non.

Capacité à la rétention d'eau (g/g)

200

150

Suspension non-cisaillée

100

Suspension cisaillée

50

0 Pomme

Tomate

Figure 4 : CRE des dispersions de PC de tomate et pomme avant (blanc) et après (noir) traitement par fort cisaillement.

Ces résultats confirment l’impression observée visuellement précédemment : la CRE de la suspension de PC de tomate cisaillée (175 g/g) est très largement supérieure à toutes les autres (50g/g).

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2.2.3. Microstructure des parois cellulaires de fruit L’effet du cisaillement sur la structure des suspensions aqueuses de PCF a été observé par microscopie confocale (Figure 5).

Sans cisaillement

Après cisaillement

Pomme

Tomate

Figure 5 : Image en microscopie confocale de suspensions de PC : pomme en haut, tomate en bas, sans cisaillement à gauche, après fort cisaillement à droite.

Sans cisaillement, les suspensions de fibres de tomate contiennent un grand nombre de cellules intactes. Le traitement d’extraction des fibres a donc été suffisant pour rompre la lamelle médiane tout en libérant des cellules intactes. Leur taille est de l’ordre de 0,5 à 1 mm. Après fort cisaillement, les cellules sont complètement détruites et réduites en fines particules de 1 mm ou moins. Les suspensions de fibres de pommes consistent en des agrégats de taille de plus de 1,5 mm de diamètre. La lamelle médiane est encore intacte. Un fort cisaillement n’a pas d’effet sur la structure des parois cellulaires ni sur les agrégats. Les mesures de rhéologie dynamique oscillatoire sont présentées sur la

Figure 6.

G’ représente le comportement solide du gel et G’’ son comportement liquide. A 1Hz, pour tous les échantillons, cisaillés ou non, G’ est supérieur à G’’. G’ augmente très faiblement aux fréquences plus élevées. Une dominante de structure « gel » est donc observable pour tous les échantillons. Pour les fibres de pomme, comme pour les fibres de tomate, G’ est plus grand après qu’avant cisaillement. G’’ montre une plus grande dépendance en fréquence avant cisaillement qu’après pour les fibres de tomate indiquant un gel plus faible avant cisaillement, ce qui n’est

56

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pas observé dans le cas des fibres de pomme. L’augmentation de G’ engendrée par le cisaillement est nettement plus élevée dans le cas des fibres de tomate que celles de pomme. 2.2.4. Rhéologie dynamique oscillatoire

Sans cisaillement

Après cisaillement

1000

1000 G'

100

G', G'' (Pa)

G', G'' (Pa)

G''

10

100

10 G'

1 1.00E-02

G'' 1.00E-01

1.00E+00

1 1.0E-02

1.00E+01

Frequency (Hz)

1.0E-01

1.0E+00

1.0E+01

Frequency (Hz)

1000

1000

G'

G', G'' (Pa)

G', G'' (Pa)

G'' 100

10

100

10 G'

1 1.0E-02

G'' 1.0E-01

1.0E+00

Frequency (Hz)

1.0E+01

1 1.0E-02

1.0E-01

1.0E+00

1.0E+01

Frequency (Hz)

Figure 6 : Balayage en fréquence des suspensions de fibres de pomme (en haut) et de tomate (en bas) avant (à gauche) et après (à droite) cisaillement.

2.2.5. Formation du gel Les propriétés viscoélastiques d’une dispersion de PC de tomate sont, contrairement à une dispersion de PC de pomme, très affectées par le degré de cisaillement qui lui a été imposé : • les particules dispersées par un léger mélange manuel à la spatule gonflent et forment une couche de sédiment sous un surnageant clair, • un léger cisaillement (Ultra Turrax, 9 000 rpm, 5 s) induit une suspension colloïdale qui ne sédimente pas, même à long terme, • un cisaillement beaucoup plus fort (Ultra Turrax, 24 000 rpm, 30 s) induit une augmentation drastique de la CRE et forme un gel qui résiste à l’écoulement. Les suspensions de PC de pomme sont très faiblement affectées par le degré de cisaillement (Figure 3). 2.2.6. Impact de la force ionique sur la viscosité des suspensions L’impact de la force ionique sur la viscosité apparente des suspensions de PC de pomme et de tomate est présenté sur la Figure 7.

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La viscosité apparente des suspensions de fibres de pomme cisaillées est toujours très inférieure à celle de fibres de tomate quelle que soit la force ionique du milieu de dispersion. La force ionique du milieu de dispersion a un impact très faible sur la viscosité des suspensions de PC de pomme alors qu’elle affecte de manière importante celles des PC de tomate. 7000

Viscosité apparente (mPa)

6000 5000

4000

Pomme Tomate

3000

2000 1000

0 0

0.02

0.05

0.1

0.5

% NaCl

Figure 7 : Viscosité apparente de suspensions de PC de pomme (en blanc) et de tomate (en noir) après cisaillement en fonction du pourcentage massique de NaCl solubilisé dans le milieu de dispersion.

Pour les suspensions cisaillées de fibres de tomate, une faible force ionique induit une forte viscosité apparente. Cette dernière décroît avec une augmentation de la force ionique du milieu. 2.3. Discussion L’influence de la nature du solvant de pré-séchage des PC de fruit est très importante pour conférer aux PC de fruit des CRE élevées (Figure 2) : l’acétone étant, en ce sens, bien meilleur que l’eau (Figure 3, Figure 4). Il a été observé (Figure 5) que la structure des PC extraites via un pré-séchage à l’acétone n’étaient pas repliées, et maintenues intègres, ce qui abonde dans le sens des observations de Vetter et coll.[4]. Le cisaillement induit, pour les fibres de tomate, une nette réduction en taille des particules en suspension, une augmentation du G’ et une plus faible dépendance en fréquence du G’’. Par contre, il n’induit pas de changements structurels dans le cas des fibres de pomme et a peu d’influence sur les propriétés viscoélastiques du gel. Ceci est tout à fait corrélé avec les CRE de ces suspensions. Shomer et coll. [6] ont décrit la double couche électrique de parois cellulaires végétales : la surface est composée de cellulose chargée (négative dans l’eau désionisée) dont la charge est compensée par des contre-ions. La double couche est très large lorsque la force ionique du milieu est faible. Elle est par contre beaucoup

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plus contractée lorsque la force ionique du milieu de dispersion est élevée. Sur la Figure 8 f représente la fraction volumique occupée par particule dans un milieu de dispersion. Plus la double couche électrique sera contractée, plus f sera faible et par conséquent plus la viscosité effective de la dispersion, proportionnelle à f, sera faible. Particule non-chargée :

Particle chargée :

Particule chargée écrantée :

Double couche diffuse (ƒÂ1)

a

a a

a

Espace occupé par particule: 4pa3 3

ƒÂ2

ƒÂ1 Espace occupé par particule: 4p(a+d1)3 3

f=

Espace occupé par les particules Volume total de la suspension

f1=

f(a+d1)3 a3

Espace occupé par particule: 4p(a+d2)3 3

f2=

f(a+d2)3 a3

Figure 8 : Représentation schématique de la fraction volumique occupée par une particule non chargée (à gauche), chargée (au milieu), chargée et fortement écrantée (à droite), dans son milieu de dispersion.

D’après la théorie DLVO [7,8], deux contributions majeures interviennent dans la force d’interaction entre deux particules : la force due à la charge des particules (répulsive, si les particules ont une charge de même signe, attractive sinon) et la force de Van der Waals (toujours attractive). Lorsque deux particules chargées de même signe se rapprochent, leurs doubles couches électriques se superposent et elles se repoussent alors. La force de l’énergie d’interaction électrique est proportionnelle au potentiel z des particules : élevé il préviendra l’agrégation ; faible, les forces de Van der Waals domineront et les particules s’aggloméreront. Quand la force ionique du milieu de dispersion augmente, il y aura un meilleur écrantage de la charge de surface des particules. Quand la surface des particules chargées augmente, l’énergie d’interaction particule/particule augmente et la viscosité aussi par conséquent (Figure 9).

Grosses particles : • Surface spécifique faible • Interaction faible • Viscosité faible

Cisaillement à réduction de la taille des particules à augmentation de la surface spécifique

Petites particles : • Surface spécifique élevée • Interaction élevée • Viscosité élevée

Figure 9 : Représentation schématique de l’effet de la taille de particules chargées sur la viscosité d’une suspension.

Les suspensions de PC de tomate et de pomme se comportent exactement selon ces modèles colloïdaux simples : - plus la force ionique du milieu est élevée, plus la viscosité de la suspension est faible (Figure 7); - plus la taille des particules est petite, plus la surface d’interaction est grande et par conséquent plus la viscosité augmente (Figures 5 et 6) d’où un effet viscosifiant

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beaucoup plus grand pour les suspensions de tomate, les particules étant fortement réduites en taille après cisaillement, que pour celles de pomme, peu modifiées par le cisaillement.

3. CONCLUSION Les parois cellulaires de fruits sont d’idéales candidates, naturelles et bénéfiques pour la santé, à l’épaississement de produits alimentaires grâce à leurs propriétés viscosifiantes et gélifiantes. Systèmes d’apparences complexes, leurs propriétés peuvent être modélisées par des comportements typiques de particules colloïdales chargées, ce qui permet, dans le but d’une application dans un produit, de limiter le nombre d’expériences et de ne sélectionner que les plus prometteuses, ainsi que d’optimiser les recettes pour une meilleure qualité de produit.

4. APPENDICE De plus amples détails sur les propriétés physiques et caractéristiques chimiques des parois cellulaires de pomme, tomate et kiwi ont été développés dans deux articles des mêmes auteurs [9,10].

5. REFERENCES 1.

Cortez Vieira M.M., Ho P., Experiments in Unit Operations and Processing of Foods, Springer, New York (2009)

2.

Redgwell R.J., Fischer M., Mol. Nutr. Food Res., 49, 421-535 (2005)

3.

Malkki, Y. Acta Aliment., 33, 39-62 (2004)

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Vetter S., Kunzec H., Eur. Food Res. Technol, 216, 129-137 (2003)

5.

Robertson J.A., De Monredon F.D., Dysseler, P. Guillon F., Amado R., Thibault, J.F. Lebensm. Wiss. Technol, 33, 72-79 (2000)

6.

Shomer I., Frenkel, H. Polinger C., Carbohydr. Polym, 16, 199-210 (1990)

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B.V.Derjaguin B.V., Landau L., Acta Physicochim URSS, 14, 633-662 (1941)

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Verwey E.J.W., Overbeek J. Th. G., Theory of stability of lyophilic colloids, Elsevier, Amsterdam, (1941)

9.

Redgwell R.J., Curti, D., Gehin-Delval C., European Food Res. Technol., 227, 607 (2008)

10.

Redgwell R.J., Curti, D., Gehin-Delval C,, European Food Res. Technol., 227, 1025 (2008)

Gels et libération contrôlée : Défis et enjeux Christophe CASTEL1*, Delphine MAZENS1, Michèle LEONARD2, Eric FAVRE3 _____________________________________________________ 1 : Gemico, 2 : Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire, 3 : Laboratoire des Sciences du Génie Chimique Nancy Université, ENSIC, 1, rue Grandville 54001 Nancy * [email protected]

RESUME :

3DUWDQW GH OD GpWHUPLQDWLRQ JOREDOH GH OD FLQpWLTXH GH OLEpUDWLRQ G¶XQ VROXWp par une matrice de type hydrogel, les différentes facettes et problématiques LQWHUYHQDQWGDQVO¶DWWHLQWHGHVSURSULpWpVILQDOHVGXSURGXLWVRQWDQDO\VpHVHW commentées. Les aspects relatifs à la maîtrise et à la prédiction des processus de transport diffusionnel des solutés ainsi que leur lien avec la VWUXFWXUHGHVK\GURJHOVHWOHVSURFpGpVG¶pODERUDWLRQVRQWpJDOHPHQWLOOXVWUpV DXWRXUG¶XQHpWXGHGHFDV

MOTS-CLES :

Gels, diffusion, libération contrôlée, modélisation, structure

1. INTRODUCTION La conception de produits formulés permeWWDQW OD OLEpUDWLRQ G¶XQ RX GH SOXVLHXUV solutés selon un profil cinétique déterminé concerne un très grand nombre G¶DSSOLFDWLRQV HW WRXFKH GLIIpUHQWV VHFWHXUV LQGXVWULHOV FRPPH OD FRVPpWLTXH OHV SURGXLWVSK\WRVDQLWDLUHVO¶DOLPHQWDWLRQOHVSURGXLWVGRPHVWLTXHVRXHQFRUHO¶LQGXVWULH pharmaceutique. Parmi les différents moyens potentiellement utilisables pour FRQWU{OHUOD FLQpWLTXHGH G¶XQ VROXWp jSDUWLU G¶XQ GLVSRVLWLI GHV PDWULFHV SRO\PqUHV sont le plus souvent employées, soit sous forme de particules jO¶LQWpULHXUGHVTXHOOHV le soluté à libérer est dissous ou dispersé (systèmes dits matriciels, Figure 1a), soit VRXVIRUPHGHV\VWqPHVVWUXFWXUpVSUpVHQWDQWXQF°XUVROLGHRXOLTXLGHFRQVWLWXpGX VROXWp SXU RX HQ VROXWLRQ  UHFRXYHUW G¶XQH SHDX GHQVH GH Solymère permettant de moduler le flux de transfert du composé (systèmes dits réservoirs, Figure 1b). Une connaissance précise des processus de transfert de matière du soluté dans le matériau polymère constituant le système, le plus souvent de nature diffusionnelle, est dans les deux cas impérative pour aborder les relations liant formulation FRPSRVpV HPSOR\pV  VWUXFWXUH HW SURSULpWpV G¶XVDJH GX SURGXLW FLQpWLTXH GH OLEpUDWLRQ /¶REMHFWLIGHFHWUDYDLOHVWGHGRQQHUXQDSHUoXGHVSRVVLELOLWpVHWOLPLWHV des outils de modélisation des processus de transfert de matière par diffusion dans une famille de matrices polymères spécifiques : les hydrogels. /HVK\GURJHOVIRQWHIIHFWLYHPHQWO¶REMHWG¶XQLQWpUrWFURLVVDQWSRXUOHVDSSOLFDWLRQVGH type libération contrôlée et offrent déjà plusieurs utilisations industrielles concrètes, en particulier dans le domaine de la santé [1-@&HFRQVWDWV¶DSSOLTXHHQSDUWLFXOLHU DX[ K\GURJHOV G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP TXL FRPELQHQW O¶DYDQWDJH GH SURYHQLU G¶XQH ressource naturellH UHQRXYHODEOH G¶RULJLQH YpJpWDOH SXLVTX¶LOV VRQW H[WUDLWV j SDUWLU GH O¶DOJXH Macrocystic pyrifera  WRXW HQ RIIUDQW GHV SRVVLELOLWpV GH PLVH HQ °XYUH dans des formulations en phase aqueuse. Par conséquent, un grand nombre G¶DSSOLFDWLRQV EDVpHV VXU O¶XWilisation de ce type de matrices, dont quelques exemples sont résumés dans le tableau 1, ont été rapportées.

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Soluté (pur ou solution)

Soluté (dissous ou dispersé)

Membrane polymère

Matrice polymère

Figure 1 5HSUpVHQWDWLRQVFKpPDWLTXHG¶XQV\VWqPHjOLEpUDWLRQGHW\SHPDWULFLHO D  et de type réservoir (b)

Tableau 1 : Exemples de différentes applications de produits formulés jEDVHG¶K\GURJHOVG¶DOJLQDWH

Domaine

Exemple

Référence

Agrochimie

Nitrate de potassium encapsulé GDQVGHVSDUWLFXOHVG¶DOJLQDWH

Mishra (2004)

Médical

Gels injectables pour libération retardée de leptine

Gu (2001)

Pharmaceutique

Libération contrôlée de virus

PCT WO 200041732

Produits domestiques

)RUPXODWLRQjEDVHG¶K\GURJHOV

US Patent 5,419,917

Cosmétique

/LSRVRPHHQFDSVXOpVGDQVXQHPDWULFHG¶DOJLQDWH Monshipouri (1995)

/¶LQWpUrWIRQGDPHQWDOG¶XQHFRPSUpKHQVLRQGHVSKpQRPqQHVGHWUDQVIHUWPLVHQMHX ORUVGHODOLEpUDWLRQGHVVROXWpVpWDQWDGPLVXQpWDWGHO¶DUWGDQVOHGRPDLQHPRQWUH TX¶XQWUqVJUDQGQRPEUHGHWUDYDX[YLVDQWjélaborer une relation quantitative entre processus, procédés et produits et faisant idéalement intervenir explicitement les rôles respectifs du soluté et de la matrice ont été déjà rapportés dans le domaine des hydrogels. Une représentation schématique du cadre général de ces études est représentée à la figure 2.a. Un modèle de transfert de matière devrait idéalement lier de manière explicite les caractéristiques intrinsèques du soluté (en particulier son rayon hydrodynamique en solution rSDLQVLTXHG¶pventuels facteurs de forme pour les solutés non sphériques) avec un paramètre représentatif de la topologie du réseau constituant le gel. Le rayon moyen des pores du réseau (noté rP) ou le rayon des fibres (noté rF) sont les dimensions caractéristiques le plus souvent employées à cet effet. Le fait de disposer G¶XQ PRGqOH GH FH W\SH TXDQWLWDWLI ULJRXUHX[ HW UHSUpVHQWDWLI RIIULUDLW XQ DWRXW GH premier plan pour établir un lien explicite entre formulation (caractéristiques des

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molécules de départ employées pour former la matrice gel), produit (structure du réseau obtenue après gélification, conduisant à une valeur de r P) et propriétés d’usage (cinétique globale de libération des solutés en fonction de leur rayon r S). Malheureusement, cet objectif se heurte encore à de nombreuses difficultés tant méthodologiques que scientifiques.

rp 1

2

3

Figure 2 : a. Représentation schématique du problème posé par le transfert diffusionnel de soluté dans une matrice de type gel. Un soluté (1) de rayon r S diffuse dans un réseau gel, constitué par un polymère (2) gonflé par un solvant (3) et de dimension caractéristique de pore r P et de fibre rF. b. Exemples de cinétiques diffusionnelles de libération d’un soluté dissous dans un système : pullulane de masse molaire comprise entre 5900 et 788 000 dans un hydrogel d’alginate de calcium de fraction volumique 0,003 [4]. La variation relative de la quantité cumulée de soluté libérée est représentée en fonction du temps. Chaque courbe représente un soluté présentant un coefficient de diffusion D donné (une diminution de D conduisant à une libération plus lente du soluté).

Cette communication vise à présenter les possibilités et les limites dans le domaine et tentera d’analyser les enjeux et défis scientifiques et technologiques relatifs à l’interprétation et à la prédiction des propriétés de libération contrôlée de solutés par un hydrogel, au travers d’une étude de cas. Une série homologue de solutés couvrant une large plage de masses molaires, encapsulés dans un hydrogel d’alginate de calcium de densité de réticulation variable a été retenue comme système modèle, afin de satisfaire un certain nombre de critères : - le soluté étant hydrophile et de type homopolymère, une conformation de type pelote statistique sphérique en solution aqueuse, nécessaire pour ne pas avoir à prendre en compte un facteur de forme, sera respectée. - les différences entre solutés seront minimes, à la différence de la plupart des études pour lesquelles des gammes de molécules pouvant présenter des interactions ou des formes en solution variables sont souvent proposées pour étudier l’incidence de la masse molaire du soluté (par exemple une série de protéines du type lysozyme, albumine, cytochrome…). - les pullulanes permettent d’explorer une très large gamme de masse molaire (de quelques milliers à plusieurs centaines de milliers). - les solutés présentent un indice de polydispersité très faible puisqu’ils sont employés pour calibrer les dispositifs de chromatographie d’exclusion stérique.

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- enfin, l¶DIILQLWp HQWUH SXOOXODQH HW DOJLQDWH SHUPHW GH PLQLPLVHU OHV HIIHWV G¶LQWHUDFWLRQV VSpFLILTXHV HQWUH OH VROXWp HW OH UpVHDX TXL SHXYHQW FRPSOLTXHU singulièrement les processus diffusionnels. Un exemple de cinétiques expérimentales de libération de solutés de type pullulane j SDUWLU GH ELOOHV G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP REWHQXHV GDQV OH FDGUH GH FH WUDYDLO HVW SUpVHQWp j WLWUH LOOOXVWUDWLI j OD ILJXUH E  /¶HIILFDFLWp GHV QRPEUHX[ PRGqOHV GH transport proposés pour prédire les coefficients de transport dans les gels sera par la suite évaluée. La problématique plus spécifique de la détermination des structures des hydrogels (taille de maille par exemple) et le rôle joué par la présence, parfois délibérée, de zones hétérogènes sur la cinétique de libération globale sera finalement présentée.

2. MATERIELS ET METHODES 2.1 Choix du système Hydrogel : /¶HQVHPEOH GHV HVVDLV D pWp UpDOLVp DYHF XQ ORW G¶DOJLQDWH GH VRGLXP H[WUDLW GH Macrocystic pyrifera 6LJPD FRQWHQDQWHQPROHG¶DFLGHPDQQXURQLTXHHW G¶DFide guluronique et de masse molaire moyenne comprise entre 240 000 et 300 000 g.mol-1'LIIpUHQWVORWVGHSDUWLFXOHVVSKpULTXHVGHJHOG¶DOJLQDWHGHFDOFLXP RQW pWp SUpSDUpV SDU LPPHUVLRQ GH JRXWWHV G¶XQH VROXWLRQ DTXHXVH G¶DOJLQDWH GDQV une solution de CaCl2. En variant la concentration en alginate dans la solution de départ, différentes fractions volumiques en polymère dans les particules de gel formées par précipitation sont réalisables. Cette variable, notée )P et qui conditionne la densité de réticulation du réseau, a pu être modulée entre 1 et 3 % dans le cadre GH FHWWH pWXGH /¶HQFDSVXODWLRQ GHV VROXWpV D pWp UpDOLVpH SDU PLVH DX FRQWDFW SHQGDQW  K VRXV DJLWDWLRQ PRGpUpH G¶XQ ORW GH SDUWLFXOHV G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP avec une solution aqueuse contenant 0,1% en masse de soluté et 3,75 g.L-1 de NaCl/CaCl2. Soluté : Une série de composés de type pullulane a été employée pour jouer le rôle de soluté test pour les essais de libération (Polymer Laboratories). La formule moléculaire, ainsi que les masses molaires et rayons hydrodynamiques correspondants des différentes molécules employées sont récapitulées dans le tableau 2. 2.2 Cinétique de libération : dispositif expérimental /HVHVVDLVGHOLEpUDWLRQRQWpWpUpDOLVpVjO¶DLGHG¶XQGLVSRVLWLIGpGLpGHW\pe cellule WKHUPRVWDWpHHWDJLWpH/¶pYROXWLRQGHODFRQFHQWUDWLRQHQSXOOXODQHGDQVOHPLOLHXGH libération est déterminée en continu par un réfractomètre différentiel inséré sur une boucle de recirculation (Figure 3a). Un comparatif avec une détermination FRORULPpWULTXH VSpFLILTXH j O¶DQWKURQH SRXU OH GRVDJH GHV SXOOXODQHV HQ VROXWLRQ DTXHXVH D pWp UpDOLVp HQ SDUDOOqOH DILQ GH FDOLEUHU OH GLVSRVLWLI 8QH VpULH G¶HVVDLV SUpOLPLQDLUHVDSHUPLVG¶LGHQWLILHUOHVFRQGLWLRQVG¶DJLWDWLRQODPDVVHWRWDOHGH

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paUWLFXOHV G¶DOJLQDWH OH YROXPH GH OLTXLGH HW OH GpELW GH OD ERXFOH GH UHFLUFXODWLRQ SHUPHWWDQWG¶REWHQLUXQVLJQDOHWXQHUHSURGXFWLELOLWpFRUUHFWV Mw (g/mol)

rs (nm)

Indice de polydispersité

5 900 22 800 47 300 112 000 404 000 788 000

1.8 3.9 5.6 8.6 18.5 28.5

1.09 1.07 1.06 1.13 1.13 1.23

Tableau 2 : Formule moléculaire, masse molaire et rayon hydrodynamique en solution aqueuse des différents solutés de type pullulane [5] utilisés pour les cinétiques de libération à partir de billes G¶DOJLQDWHGHFDOFLXP

4XDWUH ORWV GH JHOV G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP SUpVHQWDQW XQH IUDFWLRQ YROXPLTXH HQ alginate comprise entre 1 et 3% ont été préparés et comparés sur le plan des cinétiques de libération. Partant des données brutes de libération présentées à la figure 2b, la détermination du coefficient de diffusion D du soluté est effectuée selon une méthodologie détaillée au paragraphe suivant.

25° C

A

D DRI

0.04 V

Réf. OUT/IN

V3 H

F

E C

Zéro

Sample OUT/ IN

B

V2

V1

G

Figure 3 : a. Représentation du dispositif expérimental employé pour la détermination des coefficients GHGLIIXVLRQGHVROXWpVGDQVGHVSDUWLFXOHVVSKpULTXHVG¶DOJLQDWHGHFDOFLXP b. Résultats obtenus : Evolution du coefficient de diffusion (normé au coefficient de diffusion dans O¶HDX GHGLIIpUHQWVVROXWps de type pullulanes en fonction de leur masse molaire pour quatre types de JHOV G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP GH GHQVLWp GH UpWLFXODWLRQ GLIIpUHQWH H[SULPpH HQ IUDFWLRQ YROXPLTXH RFFXSpHGDQVOHJHOSDUOHVFKDvQHVG¶DOJLQDWH /HFRHIILFLHQWGHGLIIXVLRQGpFURvt avec augmentation GHODPDVVHPRODLUHGXVROXWpHWDYHFXQHDXJPHQWDWLRQGHODIUDFWLRQYROXPLTXHG¶DOJLQDWHGDQVOH gel.

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3. RESULTATS ET DISCUSSION 3.1 Aspects méthodologiques Une exploitation classique des données cinétiques de libération consiste, pour un système matriciel dans lequel le soluté est dissous (milieu supposé homogène, hypothèse admise pour le système alginate de calcium/pullulane), à utiliser la loi de Fick :

wC wt

§w 2 C· D ¨¨ 2 ¸¸ © wz ¹

(1)

En supposant le coefficient de diffusion du soluté D constant, les particules de gel (de rayon R) de sphéricité parfaite, et le milieu de libération infini (conduisant à une concentration de soluté infiniment faible du soluté dans la solution au contact du gel), la masse de soluté M libérée au temps t dans un milieu infini peut être obtenue par LQWpJUDWLRQGHO¶H[SUHVVLRQSUpFpGHQWHHWFRQGXLWj [6] : 0.5 ­ M nR ½ Dt f ° § Dt · 6 ˜ ¨ 2 ¸ ˜ ®S 0.5  2 ˜ ¦n 1 ierfc 3 2 (2) 0.5 ¾ Mf R Dt ° ©R ¹ ¿ ¯ Cette expression est très fréquemment employée pour accéder aux valeurs des coefficients de diffusion des solutés D. Elle présente en général une très bonne HIILFDFLWpG¶DMXVWHPHQW&HSHQGDQWLOHVWXWLOHDXSUpDODEOHGHV¶DVVXUHUGHODYDOLGLWp GHV QRPEUHXVHV K\SRWKqVHV VXU OHVTXHOOHV UHSRVH O¶pTXDWLRQ GH )LFN DILQ G¶pYLWHU des erreurs de détermination. Les principales hypothèses à respecter peuvent être récapitulées comme suit : le milieu est homogène, isotherme et au repos DXFXQH UpVLVWDQFH DX WUDQVIHUW GH PDWLqUH Q¶H[LVWH GDQV OD FRXFKH OLPLWH liquide du milieu de libération (le respect de cette hypothèse passe par une YLWHVVHG¶DJLWDWLRQ suffisante dans le récipient employé pour la libération) le système est binaire ou pseudo-binaire (constitué de deux composés seulement) OHPLOLHXQ¶pYROXHSDVDXFRXUVGXSURFHVVXVGHWUDQVSRUW SDVGHYDULDWLRQGH taille des particules, pas de modification structurelle) aucun phénomène convectif ne se surajoute à la diffusion du soluté (dans le cas de particules de type hydrogel en milieu aqueux, ce critère peut être mis en défaut, en particulier si un flux osmotique apparaît, conduisant à un gonflement ou à une contraction des particules de gel [7]. Une valeur totalement erronée des FRHIILFLHQWV GH GLIIXVLRQ HVW DORUV REWHQXH PDLV O¶DMXVWHPHQW GHV GRQQpHV H[SpULPHQWDOHVjO¶DLGHGHO¶pTXDWLRQ  UHVWHQpDQPRLQVWUqVDFFHSWDEOH,OV¶HQVXLW XQHGLIILFXOWpjLGHQWLILHUO¶H[LVWHQFHGHFHELDLVPpWKRGRORJLTXHPDMHXU  /D SUpVHQFH G¶XQH ERXFOH GH UHFLUFXODWLRQ QpFHVVDLUH SRXU DOLPHQWHU HQ FRQWLQX OH GLVSRVLWLI DQDO\WLTXH SRVH QpFHVVDLUHPHQW OD TXHVWLRQ GH OD YDOLGLWp GH O¶Kypothèse GH PLOLHX SDUIDLWHPHQW DJLWp /¶LQFLGHQFH G¶XQH ERXFOH LQWHUQHVXUXQ V\VWqPH DJLWp homogène peut facilement être simulée et les caractéristiques hydrodynamiques de

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O¶HQVHPEOH rWUH DLQVL SUpGLWHV /¶LQIOXHQFH GHV pFDUWV DX FDV VLPSOLILp GH PpODQJH parfait a pu être étudiée et un critère simple, faisant intervenir les volumes respectifs de la boucle et du réservoir ainsi que les temps de séjour dans la boucle et le temps GH GLIIXVLRQ GX VROXWp D pWp SURSRVp GDQV OH FDGUH GH FH WUDYDLO DILQ G¶DVVXUHr une erreur minimale sur la détermination du coefficient de diffusion [8]. Ce développement présente un intérêt majeur lorsque des dispositifs miniaturisés, LQFOXDQWXQHERXFOHG¶DQDO\VHVRQWPLVHQ°XYUHDILQGHPLQLPLVHUSDUH[HPSOHOD quantité de soluté employé. Dans ces conditions, le volume de la boucle peut avoisiner le volume du réservoir agité et une erreur considérable en découle sur la détermination du coefficient de diffusion du soluté par la méthode classique. Au final, une série de valeurs de coefficient de diffusion de pullulanes de masses molaires variables a pu être déterminée conformément au protocole expérimental décrit ci-GHVVXV HW O¶HQVHPEOH GHV YDOHXUV REWHQXHV SRXU WURLV JHOV G¶DOJLQDWH GH calcium présentant une densité de réticulation différente est représenté à la figure 3b. Les tendances classiquement rapportées : décroissance du coefficient de diffusion avec la masse molaire du soluté et avec une augmentation de la densité de réticulation du gel, sont logiquement respectées. 3.2 Modélisation des données de diffusion /H SUREOqPH SOXV DUGX GH OD SUpGLFWLRQ GHV YDOHXUV GH ' REWHQXHV j SDUWLU G¶XQ nombre minimal de paramètres explicites a été abordé en évaluant V\VWpPDWLTXHPHQW OHV SHUIRUPDQFHV G¶DMXVWHPHQW GHV GRQQpHV H[SpULPHQWDOHV présentées sur la figure 3b par les différents modèles de transport proposés à cet effet [9-15]. Un descriptif synthétique des différentes approches et des équations associées est donné au tableau 3. /HV SHUIRUPDQFHV G¶DMXVWHPHQW GHV GLIIpUHQWHV H[SUHVVLRQs se sont avérées très PpGLRFUHV SRXU OD SOXSDUW GHV PRGqOHV O¶DSSURFKH VLPSOLVVLPH GLWH GH 5HQNLQ >@ donnant les meilleurs résultats et constituant de ce fait une surprise et une exception (Figure 4a). 'HIDLW OHPRGqOHGH5HQNLQ UDSSHOp j O¶pTXDWLRn (3), fait partie des approches les SOXV DQFLHQQHV HW UHSRVH VXU XQ MHX G¶K\SRWKqVHV H[WUrPHPHQW UpGXFWHXU (Figure 4b): le gel est assimilé à un ensemble de tubes capillaires, de rayon unique, présentant une paroi dure et lisse le soluté, de forme sphérique parfaite, est indéformable (sphère dure) et monodisperse le milieu est newtonien sur le plan rhéologique

D D0

§ § rs ¨1  ¨ ¨ ¨ rp © ©

·· ¸¸ ¸¸ ¹¹

2

§ §r .¨¨1  2,1¨ s ¨r © p ©

§ · ¸  2,1¨ rs ¨r ¸ © p ¹

3

§ · ¸  0,95¨ rs ¨r ¸ © p ¹

· ¸ ¸ ¹

5

· ¸ ¸ ¹

(3)

/H SUHPLHU WHUPH GH O¶H[SUHVVLRQ WUDGXLW OH FRHIILFLHQW GH SDUWLWLRQ j O¶pTXLOLEUH GHV molécules de soluté dans le milieu [17], alors que le deuxième terme, traduisant la mobilité intrinsèque du soluté dans le tube, est obtenu à partir du facteur de friction G¶XQHVSKqUHGXUHGDQVXQWXEHOLVVH

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Tableau 3 : Récapitulatif des principaux modèles proposés dans la littérature pour prédire le FRHIILFLHQWGHGLIIXVLRQ'G¶XQVROXWpGDQVXQJHOjSDUWLUGHVRQFRHIILFLHQWGHGLIIXVLRQGDQVO¶HDXjOD même température (D0), de son rayon hydrodynamique en solution (r S) et de la fraction volumique en polymère dans le gel )P) et/ou du rayon de pore équivalent de la matrice gel (r p) et/ou du rayon des fibres constituant le réseau (rF). Les autres symboles employés dans les expressions sont des paramètres ajustables dont la définition est plus ou moins précise.

,OHVWpYLGHQWTXHO¶DSSOLFDWLRQGHFHMHXG¶K\SRWKqVHVjXQPLOLHXFRPSOH[HFRPPH FHOXL G¶XQ JHO G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP HVW GHV SOXV GLVFXWDEOHV /H IDLW G¶DVVLPLOHU XQ soluté flexible à une particule sphérique compacte constitue une simplification extrême. Les valeurs de rayons de pore équivalents obtenus par ajustement (Figure 4a) variant entre 17 et 119 nm, un mécanisme diffusionnel de type reptation, FDUDFWpULVWLTXHG¶XQHVLWXDWLRQSRXUODTXHOOHUS>> rP HWTXLQ¶HVWSDVSULVHHQFRPSWH dans O¶DSSURFKH GH 5HQNLQ HVW SUREDEOHPHQW j FRQVLGpUHU HW VH WUDGXLUDLW SDU GHV GLIILFXOWpVG¶DMXVWHPHQWSRXUOHVWUqVJURVVROXWpVGLIIXVDQWGDQVGHVJHOVFRQFHQWUpV 1pDQPRLQV OD GHVFULSWLRQ G¶HQVHPEOH HVW DFFHSWDEOH HW SHXW UpVXOWHU GHV HIIHWV GH compensation de cette expression, en particulier lorsque le milieu comporte une distribution de taille des rayons de pore, qui ont été soulignés par différents auteurs >@/¶HIILFDFLWpGHFHWWHH[SUHVVLRQSHXWGRQFrWUHLQWHUSUpWpHFRPPHODSRVVLELOLWp de décrirHO¶HQVHPEOHGXPLOLHXJHOSDUXQGHVFULSWHXUVWUXFWXUDOXQLTXH UD\RQPR\HQ des pores rP), constituant le seul paramètre ajustable du modèle. Il va sans dire que O¶pODERUDWLRQG¶XQPRGqOHSUpGLVDQWOHOLHQHQWUHODFRQFHQWUDWLRQHQDOJLQDWHGDQVOD formulation de départ et la valeur finale de rP constituerait une avancée majeure GDQVO¶pWDEOLVVHPHQWGHVUHODWLRQVIRUPXODWLRQSURGXLWSURSULpWpV

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Solution (soluté sphérique

Soluté (rayon rs)

Hydrogel (assimilé à un faisceau de

Pore (rayon rp)

Figure 4 : a. Ajustement des données expérimentales de diffusion obtenues pour quatre types de gels G¶DOJLQDWHGHFDOFLXPGLIIpUDQWVXUOHSODQGHODIUDFWLRQYROXPLTXHHQDOJLQDWHGDQVOHUpVHDX jO¶DLGHGXPRGqOHK\GURG\QDPLTXHGH5HQNLQ b. Représentation schématique du modèle hydrodynamique de Renkin.

3.3 Extension : Gels modifiés chimiquement Un système de libération de type matriciel conduit nécessairement à des profils cinétiques de libération du soluté non linéaires (évolution asymptotique, comme représenté sur la figure 2b). Dans un très grand nombre de cas, une vitesse de OLEpUDWLRQ FRQVWDQWH HVW UHFKHUFKpH FLQpWLTXH G¶RUGUH ]pUR  VH WUDGXLVDQW SDU XQH évolution linéaire de la quantité cumulée de soluté libérée dans le milieu. Une solution classique à ce problème consiste à élaborer des systèmes réservoir (Figure E  PDLV OHV GLIILFXOWpV G¶pODERUDWLRQ GH FH W\SH GH VWUXFWXUH HW OHXU FR€W DVVRFLp SHXYHQW SUpVHQWHUXQH GLIILFXOWp 8QHIRUPXODWLRQ SHUPHWWDQW G¶DVVRFLHUOD VLPSOLFLWp G¶pODERUDWLRQ G¶XQ SURGXLW KRPRJqQH j XQH SURSULpWp G¶XVage de type cinétique G¶HIIOX[ FRQVWDQWH HVW GRQF G¶XQ LQWpUrW PDMHXU 'HV WUDYDX[ UpFHQWV GH QDWXUH théorique, ont montré par simulation que cet objectif pouvait en principe être atteint pour un système matriciel hétérogène présentant des zones réservoirs, dans lesquelles le soluté présenterait une concentration plus élevée que dans la phase continue du gel, dispersées aléatoirement dans la matrice [19]. Pour un jeu de paramètres donnés (fraction volumique de la phase dispersée, taille caractéristique des réservoirs, coefficients de diffusion respectifs du soluté dans la zone réservoir et GDQV OD SKDVH FRQWLQXH  XQH FLQpWLTXH G¶HIIOX[ GX VROXWp G¶RUGUH ]pUR SHXW rWUH REWHQXH,OHVWGRQFWHQWDQWG¶DSSOLTXHUFHFRQFHSWjGHVPDWULFHVGHJHOVG¶DOJLQDWH et une solution potentielle consiste à greffer chimiquement des chaînes hydrophobes VXU OHV FKDvQHV G¶DOJLQDWH DILQ G¶LQLWLHU OD IRUPDWLRQ GH PLFURGRPDLQHV GH W\SH UpVHUYRLUV GDQV O¶HQVHPEOH GH OD PDWULFH &HWWH PRGLILFDWLRQ SUpVHQWH XQ LQWpUrW majeur pour les solutés hydrophobes (cas de nombreux principes actifs pharmaceutiques), dans la mesure où elle permet simultanément une augmentation de la solubilité du soluté dans la matrice (augmentation du taux de charge du dispositif, encore appelé pay load) tout en offrant potentiellement une cinétique G¶HIIOX[G¶RUGUH]pUR /D VWUXFWXUH G¶XQ JHO G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP KRPRJqQH HW FHOOH G¶XQ JHO PRGLILp FKLPLTXHPHQW DLQVL TX¶XQH SKRWRJUDSKLH DX PLFURVFRSH RSWLTXH SRXU FKDFXQ GHV deux cas, sont présentées sur la figure 5. La formation des microdomaines

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hydrophobes est mise en évidence par la modification de transparence du milieu dans le cas du gel modifié. Des travaux sont en cours pour étudier la possibilité G¶DWWHLQGUHXQHFLQpWLTXHWHQGDQWYHUVO¶RUGUH]pURDYHc ce type de matrices.

Figure 5 : Représentation schématique de la structure moléculaire et photographie au microscope RSWLTXH G¶XQ JHO KRPRJqQH G¶DOJLQDWH GH FDOFLXP D  HW G¶XQ JHO PRGLILp SDU JUHIIDJH FKLPLTXH GH chaînes hydrophobes (b).

4. CONCLUSION /¶REMHFWLIGHFHWWHFRPPXQLFDWLRQpWDLWG¶pWDEOLUXQpWDWGHO¶DUWGDQVOHGRPDLQHGHOD prédiction des cinétiques de diffusion de solutés dans les hydrogels, afin de satisfaire XQHSURSULpWpG¶XVDJHGHW\SHOLEpUDWLRQFRQWU{OpH3DUWDQWG¶XQV\VWqPHPRGqOHGHV SOXVVLPSOHVWRXWHQSUHQDQWVRLQG¶HPSOR\HUXQHPpWKRGRORJLHG¶DFFqVDX[YDOHXUV des coefficients de diffusion la plus rigoureuse, les limites des nombreux modèles prédictifs, supposés génériques et souvent complexes, ont été mises en évidence. /¶HIILFDFLWpGHSUpGLFWLRQGXPRGqOHWUqVVLPSOHGH5HQNLQSRXUDWWHLQGUHFHWREMHFWLI constitue de ce fait une exception et une surprise. Ce résultat laisse entrevoir la SRVVLELOLWp G¶LGHQWLILHU XQ SDUDPqWUH VWUXFWXUDO HIIHFWLI FDUDFWpULVWLTXH G¶XQ UpVHDX G¶K\GURJHOHWRXYUHGHVSHUVSHFWLYHVGDQVO¶pWDEOLVVHPHQWGHUHODWLRQVTXDQWLWDWLYHV entre formulation (composition de la solution gélifiante de départ), procédé G¶pODERUDWLRQ FRQGXLVDQWjXQJHOGHGHQVLWpGRQQpHGRQFGHYDOHXUGHU P donnée) HW SURSULpWpV G¶XVDJH FLQpWLTXH JOREDOH GH OLEpUDWLRQ JRXYHUQpH DX SUHPLHU RUGUH par le coefficient de diffusion du soluté D). Plus généralement, étant donné la simplicité du système modèle étudié dans ce travail, il va de soi que la maîtrise TXDQWLWDWLYH GHV UHODWLRQV HQWUH IRUPXODWLRQ HW SURSULpWpV G¶XVDJH GDQV OHV JHOV présente encore un défi scientifique majeur [20], particulièrement lorsque des solutés macromoléculaires sont en jeu [21].

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Influence de la formulation optimale et de la fraction de phase dispersée sur le comportement rhéologique des émulsions gels Emilio PARUTA1,2, Véronique SADTLER1*, Philippe MARCHAL1, Lionel CHOPLIN1, Jean-Louis SALAGER3, Shirley MARFISI2 1

Centre de Génie Chimique des Milieux Rhéologiquement Complexes (GEMICO), Nancy Université, 1 rue Grandville B.P. 20451 F-54001 Nancy 2 Laboratorio de Sistemas Dispersos y Ambiente (SDA), Ecole de Génie Chimique, Université d’Oriente, Puerto La Cruz, 6001 Venezuela 3 Laboratorio de Formulación, Interfase, Reología y Procesos (FIRP), Ecole de Génie Chimique, Université des Andes, Mérida, 5101 Venezuela * [email protected]

RESUME :

Dans ce travail, nous avons étudié l’influence de la formulation optimale et de la fraction de phase dispersée sur le comportement rhéologique des émulsions gels du type eau dans huile (E/H). La concentration totale en tensioactifs étant constante pour les formulations testées, le comportement rhéologique des émulsions gels peut être représenté sur une carte bidimensionnelle formulation-composition. Des émulsions eau dans dodécane ont été préparées en utilisant des mélanges de tensioactifs non ioniques pour obtenir des valeurs moyennes de HLB comprises entre 4,3 et 10. Ces émulsions ont été élaborées, par un procédé semi-batch, en faisant varier la fraction de phase dispersée de 0,90 à 0,98. Pour toutes les formulations et compositions étudiées, le module élastique diminue exponentiellement en fonction du temps pendant les quatre premiers jours après la préparation, puis il demeure constant. Dans le cas des émulsions élaborées à HLB = 10, les modules élastiques sont toujours très faibles, par rapport aux autres formulations et ce, quelle que soit la fraction de phase dispersée. Ce comportement peut être expliqué par la proximité de la formulation optimale (HLB = 10,4), et en particulier par la diminution de la tension interfaciale à l’approche de cette formulation.

MOTS-CLES :

émulsions gels, formulation optimale, module élastique, tension interfaciale.

1. INTRODUCTION Les émulsions gels sont des émulsions dont le contenu en phase interne est supérieur à 74 % en volume. Cette valeur correspond à la fraction volumique de l'empilement hexagonal compact de sphères de même taille [1,2]. Ces émulsions sont aussi dénommées émulsions concentrées, voire très concentrées, puisque le contenu en phase interne peut atteindre 99 %. Elles sont aussi appelées: "High Internal Phase Emulsions Ratio, HIPRE" [2,3], "Biliquid foams" [4], "Aphrons" [5], "Hydrocarbon Gels" [6] et "Highly Concentrated Emulsions" [7,8]. La phase continue est constituée d'un réseau de films liquides fins interconnectés à la manière d’une mousse classique. Les gouttelettes sont déformées et ont la forme géométrique de cellules polyédriques. Sans déformation ce type d'émulsion présente un comportement de liquide viscoélastique, parce qu'il est capable d’emmagasiner de

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l'énergie sous forme d’énergie élastique et de la restituer (reprise de la forme initiale), tout en dissipant une partie de cette énergie par dissipation visqueuse [9]. Les émulsions gels ont suscité de nombreuses études au cours des dernières décennies, à la fois d’un point de vue fondamental, comme la compréhension de leur structure et de leurs propriétés [1-3,6,7,10-23], mais aussi appliqué compte tenu de leurs nombreuses applications en tant que formulations pharmaceutiques [24,25], cosmétiques [21] ou alimentaires [26]. Pour relier la formulation des émulsions à leurs propriétés, et en particulier leurs caractéristiques rhéologiques, il apparait intéressant de pouvoir positionner ces systèmes eau/tensioactif/huile sur une carte bidimensionnelle formulationcomposition. En effet, ce type de carte permet de décrire différentes propriétés des émulsions (viscosité, type d’émulsion, stabilité ou taille moyenne des gouttes) [27,28] mais à notre connaissance, aucune caractérisation d’émulsions très concentrées (émulsions gels) n’a été réalisée en suivant cette approche. Cette démarche implique de travailler à une concentration totale en tensioactifs fixe, ce qui n’est généralement pas le cas dans la plupart des travaux concernant les émulsions concentrées pour lesquelles c’est le rapport tensioactif/phase continue qui est maintenu constant.

Figure 1 : a) Régions de la carte bidimensionnelle formulation-composition. b) Déplacement de la branche verticale supérieure de la ligne d’inversion

Plusieurs régions sont identifiables sur cette carte représentant la formulation en fonction de la composition [29]. Les zones B et C correspondent aux fractions élevées en huile et en eau respectivement, alors que la zone A est celle des rapports eau/huile intermédiaires (Figure 1a). Suivant la formulation, apparait une zone supérieure (+) qui correspond à des systèmes où le tensioactif présente une affinité prépondérante pour la phase huileuse. À l’inverse, la partie inférieure (-) représente des systèmes globalement hydrophiles. En se déplaçant verticalement sur la carte, les propriétés du système vont évoluer essentiellement avec la formulation. Celle-ci peut être exprimée par la notion de balance hydrophile-lipophile (H L B ), la température, ou bien, une variable de formulation généralisée comme la différence d'affinité du tensioactif (SAD) [30] ou la déviation hydrophile-lipophile (HLD) [31,32]. Ces régions sont séparées pour une ligne dite d’inversion (Figure 1a). En général, la partie horizontale de la ligne d’inversion correspond à la zone de formulation dite optimale, définie comme la formulation à laquelle les interactions du tensioactif avec l’eau et l’huile sont égales. Dans ces conditions, le système présente certaines propriétés caractéristiques comme des tensions interfaciales très fibles, une viscosité

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et une stabilité des émulsions minimales [33]. Si la ligne d’inversion est traversée horizontalement ou verticalement se produit une inversion dite respectivement transitionnelle ou catastrophique [34]. Les branches verticales peuvent être déplacées (agrandissant ou rétrécissant les zones normales et anormales de la carte) par un changement des variables comme la viscosité, la concentration en tensioactif ou l’énergie d’agitation [35]. La préparation d’émulsions gels inverses E/H consiste, par ajout progressif de la phase aqueuse dispersée dans la phase huileuse (procédé semi-batch), à déplacer la branche verticale supérieure de la ligne d’inversion vers les fractions élevées en eau (Figure 1b). Dans ce travail, il s’agit d’étudier, d’une part, l’influence de la fraction de phase dispersée sur les propriétés rhéologiques des émulsions gels et, d’autre part, l’effet de la formulation sur ces propriétés et en particulier la distance vis-à-vis de la formulation optimale. Cette distance est représentée par la valeur du paramètre HLB étudiée par rapport à la valeur HLB optimale déterminée expérimentalement.

2. PROTOCOLE EXPERIMENTAL 2.1. Matériels La phase huileuse est du dodécane (Reagent Plus®, 99 % Purum) et la phase aqueuse est de l’eau purifiée par un système Milli-Q (Millipore). Quatre tensioactifs non ioniques ont été utilisés: Span 80 (monooléate de sorbitane, HLB = 4,3), Span 20 (monolaurate de sorbitane, HLB = 8,6), Tween 85 (trioléate de sorbitane 20EO, HLB = 11), et Tween 80 (monooléate de sorbitane 20EO, HLB = 15) fournis par Sigma et Fluka. Pour déterminer la formulation optimale du système étudié, NaCl (pureté 98 %, fourni par Aldrich) a été utilisé. 2.2. Méthodes 2.2.1. Balayage de formulation Pour déterminer la ligne d’inversion standard, correspondant à la formulation optimale du système étudié, des balayages de formulation ont été réalisés en faisant varier la valeur du paramètre HLB du tensioactif ou du mélange de tensioactifs, pour trois fractions volumiques d’eau (fw = 0,50, 0,75 et 0,90). La concentration en tensioactif a été fixée à 1 % m/v par rapport au volume total de phases liquides. Pour augmenter la conductivité de la phase aqueuse et détecter le point d’inversion, du NaCl a été ajouté à 2 % m/v relativement à l’eau. Les systèmes préparés ont été laissés au repos 24 h à 27 °C. Ils ont été ensuite agités durant 30 s au moyen d’un Ultra-Turrax® (IKA T25 Basic/S25-NK-19G, Germany) tournant à 8000 tr/min. La conductivité a été mesurée à l’aide d’un conductimètre CDM210 muni d’une sonde de conductivité CDC749, à deux pôles platinés de coté 4 mm. 2.2.2. Préparation des émulsions gels 100 g d’émulsion ont été préparées en utilisant un procédé semi-batch [9,36], à des fractions massiques de phase dispersée, fw, de 0,90, 0,92, 0,94, 0,95 et 0,98. Dans cette étude, la quantité totale de tensioactif a été fixée à 1 g pour 100 g d’émulsion.

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Les différentes valeurs HLB étudiées pour le tensioactif ou mélange de tensioactifs ont été : 4,3, 5,6, 6,5, 7,7, 8,6 et 10. Le procédé semi-batch consiste à d’abord mélanger le ou les tensioactifs dans l’huile. L’agitateur est ensuite positionné au niveau de la surface de la phase continue à une vitesse d’agitation de 500 rpm avant l’incorporation de la phase aqueuse à un débit d’incorporation (Q w) de 15 g/min. Finalement, l’émulsion est homogénéisée pendant 10 min à la même vitesse d’agitation. Le mélange est assuré par un Turbo Test 33/750 P (Rayneri Groupe VMI) équipé d’un contrôleur de vitesse qui maintient constante la vitesse d’agitation, quelle que soit l’évolution de la viscosité du milieu au cours de procédé. La cuve de mélange est un bécher thermostaté de 600 ml et de 7 cm de diamètre. L’agitateur utilisé est une turbine à quatre pâles inclinées à 45° ayant un rapport entre son diamètre et le diamètre du bécher de 0,7. La température du système, égal à 27 °C, est contrôlée par circulation de fluide à l’aide d’un bain thermostaté Polystat 12HT (Bioblock Scientific). 2.2.3. Caractérisations rhéologiques Les caractérisations rhéologiques des échantillons ont été réalisées à l’aide d’un rhéomètre à contrainte imposé de type AR 2000 (TA Instruments), équipé d’une géométrie de mesure plan/plan de 40 mm de diamètre pour un entrefer de 1,5 mm et une température de 27 °C. En raison du caractère fragile des émulsions gels, les tests ont été réalisés en régime oscillatoire, dans le domaine de viscoélasticité linéaire des échantillons. Dans ces conditions, l’évolution temporelle du module élastique (G’) a été suivie à 10 rad/s pour des temps de vieillissement compris entre 1 h et 384 h après la fin de la préparation des émulsions. Les échantillons ont été stockés à l’aide d’une étuve à 27°C. 2.2.4. Tension interfaciale Les mesures de tension interfaciales ont été effectuées à l’aide d’un tensiomètre à goutte tournante Modèle 300 (Texas University) modifié pour contrôler la température. Le capillaire a été rempli avec de l’eau et une goutte de la phase continue a été incorporée (huile plus mélange de tensioactifs). Les mesures ont été réalisées pour 4 formulations (HLB = 5,6, 7,7, 8,6 et 10). L’écart-type des mesures est inférieur à 0,2 mN/m.

3. RESULTATS ET DISCUSSION 3.1. Formulation optimale Les balayages de formulation ont été réalisés à 3 fractions volumiques d’eau (fw = 0,50, 0,75 et 0,90). La formulation a été modifiée progressivement en faisant varier la valeur HLB du tensioactif ou du mélange de tensioactifs entre 10 et 11 par pas de 0,2 unités (Figure 2).

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Figure 2 : Conductivité électrolytique en fonction de la valeur HLB du tensioactif ou du mélange de tensioactifs.

Les mesures de conductivité électrolytique pour le système émulsifié eau/tensioactif non ioniques/dodécane ont permis de déterminer le passage d’une émulsion de faible conductivité (E/H) à une émulsion de haute conductivité (H/E) pour une valeur HLB du mélange de tensioactifs égale à 10,4. Cette valeur correspond à la formulation dite optimale. Par conséquent, nous avons choisi une valeur HLB = 10 comme valeur maximale pour réaliser les émulsions gels inverses E/H. 3.2. Evolution du module élastique avec le temps La figure 3 présente l’évolution du module élastique avec le temps pour les émulsions gels E/H préparées. Nous pouvons observer que pour toutes les formulations et compositions étudiées, le module élastique diminue rapidement en fonction du temps pendant les quatre premiers jours suivant la préparation, puis demeure constant. Cette diminution résulte du grossissement de la taille des gouttes lors du vieillissement de l’émulsion. Cependant, comme la diminution de G’ au-delà de 48 h devient faible, nous avons décidé de suivre l’évolution des propriétés rhéologiques des émulsions gels entre 1 h et 48 h après la préparation. Pour les émulsions préparées loin de la formulation optimale (HLB = 5,6 et 7,7), dans l’intervalle de temps étudié, le module élastique diminue de 2 à 5 fois par rapport à sa valeur initiale. Dans le cas des émulsions gels réalisées près de la formulation optimale (HLB = 10), G’ demeure essentiellement constant et ses valeurs sont plus faibles relativement à celles des émulsions formulées loin de cette formulation. 3.3. Module élastique en fonction de la formulation et de la fraction massique de phase dispersée Les différents modèles proposés dans la littérature [12,36] montrent que le module élastique est une fonction croissante de la fraction de phase dispersée et de la tension interfaciale. La figure 4 présente les variations du module élastique en fonction de la formulation et de la fraction massique de phase dispersée 1 h et 48 h

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Figure 3 : Evolution du module élastique en fonction du temps.

après la préparation. En premier lieu, le module élastique augmente nettement avec la fraction de phase dispersée pour toutes les formulations étudiées comme cela a pu être décrit par d’autres auteurs [3,7,17,20,37]. En second lieu, nous pouvons clairement observer un effet de la formulation à l’approche de la valeur optimale, où les valeurs de G’ sont les plus faibles. Ce comportement subsiste au cours de temps et reste visible aux différentes valeurs de fw étudiées. Cette influence de la formulation à une valeur H L B = 10, peut s’expliquer par les caractéristiques des systèmes à l’approche et dans la zone optimale, et en particulier par l’abaissement des tensions interfaciales [38,39]. Le tableau 1 présente les valeurs de la tension interfaciale en fonction de la formulation.

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Figure 4 : Module élastique en fonction de la formulation et de la fraction de phase dispersée pour des émulsions gels E/H.

Nous pouvons clairement constater une chute notable de la tension interfaciale eau/phase continue au voisinage de la formulation optimale. Tableau 1 : Tension interfaciale en fonction du HLB du tensioactif ou du mélange de tensioactifs.

HLB

s (mN/m)

5,6

5,7

7,7

4,8

8,6

3,6

10

1,6

Ceci peut expliquer le comportement particulier des émulsions formulées à HLB = 10, la résistance à la déformation et à l'écoulement dans de telles circonstances est beaucoup plus faible que celle des émulsions préparées à HLB = 5,6 et 7,7. Bien entendu, comme G’ est directement relié à la tension interfaciale dans les différents modèles proposés [12,36], les modules élastiques à H L B = 10 sont remarquablement plus faibles. Finalement, le module élastique des émulsions gels peut être représenté dans une carte bidimensionnelle formulation-composition sur laquelle des zones où les valeurs de G’ sont faibles ou élevées peuvent être identifiées. Ainsi, nous pouvons observer sur cette carte la région particulière où le module élastique est influencé par la formulation à la proximité de la ligne d’inversion, comme cela a été expliqué précédemment (Figure 5a). De plus, nous pouvons ajouter cette propriété rhéologique sur un troisième axe et obtenir une représentation tridimensionnelle des effets observés (Figure 5b).

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Figure 5 : Module élastique des émulsions gels E/H représenté dans une carte bidimensionnelle formulation-composition (48 h après la fin de la préparation).

4. CONCLUSIONS Le module élastique des émulsions gels diminue rapidement au cours des quatre premiers jours suivant la préparation, avec en particulier une très nette variation de G’ entre 1 h et 48 h. Les valeurs de G’ sont en premier lieu fortement influencées par la fraction de phase dispersée. Il apparait, de plus, un net effet de la formulation à l’approche de la valeur optimale avec des modules élastiques beaucoup plus faibles résultant de la diminution de la tension interfaciale. Il est ainsi possible de formuler des émulsions gels inverses E/H stables, avec des fractions de phase dispersées élevées, tout en conservant une viscosité relativement faible. Par exemple, dans les domaines pharmaceutiques ou cosmétiques, ce type de système permettrait d’incorporer d’importantes quantités de principes actifs avec une grande interface de diffusion, sous des formulations peu ou très gélifiées selon les applications visées.

5. REMERCIEMENTS Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien financier du Ministère Vénézuélien de la Science et de la Technologie et FUNDAYACUCHO pour la bourse de M. Paruta. Les auteurs voudraient remercier aussi le Programme de Coopération Universitaire PCP entre le FONACIT-Venezuela et le MRE-France.

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Development of Bio-composite Foam in Supercritical Environment: Influence of Process Parameters on the Distribution of Pores of Biomaterial Arfan Ul Haq SUBHANIa, Selmi Erim BOZBAGb, c, Véronique SANTRANd*, Jean-Stéphane CONDORETb, Séverine CAMYb, Alain LAMUREa ²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²a

Université de Toulouse, Laboratoire CIRIMAT/INP, UMR 5045; 4 allée Emile Monso, BP44362, F31432 Toulouse Cedex 4, b Université de Toulouse; INPT, UPS; Laboratoire de Génie Chimique CNRS UMR 5503; 4 allée Emile Monso, BP84234, F31432 Toulouse Cedex 4, c Dept. of Chemical & Biological Engg., Koc University, Sariyer 34450, Istanbul, Turkey d ICELLTIS, Parc Technologies Cap Delta, Delta sud, 09340 Verniolle * [email protected]

ABSTRACT:

In the literature various biodegradable scaffolds are described. Poly(D-hydroxy acids) like poly(lactic acid) (PLA), poly(glycolic acid) (PGA), and the copolymer, known as poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) are usually under investigation of tissue engineering studies [1,2]. In this work, porous structures of the biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) were prepared through the batch foaming technique (pressure quench) using supercritical CO2 as the blowing agent. The effects of process parameters upon the final porous structure, such as saturation pressure, saturation temperature, saturation time, depressurization rate and temperature drop, were investigated. Pore size of the PLGA50:50 scaffolds was observed to decrease when varying temperature from 36.5 to 45°C, where it reached a minimum value, then increased until 60°C. Low saturation times increased the heterogeneity of the pore size distribution inside the scaffold. Pore size of the scaffolds decreased with increasing depressurization rate, all other parameters being constant. A fast temperature drop resulted in faster vitrification of the polymer, which induced the pore growth to stop.

KEY WORDS:

Polylactic foams; supercritical CO 2, Taguchi design of experiments, pore distribution

1.

INTRODUCTION

Tissue engineering is proving to be a great hope for regenerating or repairing damaged tissues. Porous biodegradable scaffolds, filled with the appropriate type of cells, proteins or drugs, are used as grafts for tissue engineering. These scaffolds can be implanted into the desired tissue of the body (bone, cartilage, muscles, nerves, etc.) to provide a template for tissue regeneration, by controlled release of its content and by slowly resorbing or degrading, to ultimately leave no foreign components in the body, hence decreasing the risk of inflammation [3,4]. Different biodegradable scaffolds are described in the literature. Most of these scaffolds come from the family of polyesters. Poly(D-hydroxyacids) like poly(lactic acid) (PLA), poly(glycolic acid) (PGA), and the co-polymer, known as poly(lactic-coglycolic acid) (PLGA) are considered in many tissue engineering studies. The common use of these polymers is basically related to their degradation behavior. PLA degrades into lactic acid, and PLGA degrades into lactic and glycolic acid. Also, for PLGA, the degradability rate can be controlled by changing the co-monomer

82 _____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ composition. Furthermore, PLA and PLGA are approved by United States Food and Drug Administration for biomedical uses [5]. Foaming by supercritical carbon dioxide (scCO2) was first proposed by Mooney [3] to create porous PLGA and PLA scaffolds using the pressure quench method, which was first proposed by Goel [6,7] to manufacture microcellular PMMA foams. There has been a number of followers, which worked on foaming of biodegradable polymers to create porous scaffolds by this method [1,8,9] With the aim of creating porosity, the polymer is saturated with a gas or a supercritical fluid (usually CO2 or N2) at constant temperature and pressure. Then, the system is brought to the supersaturated state either by reducing pressure (pressure induced phase separation) or by increasing temperature (temperature induced phase separation) resulting in the nucleation and growth of pores cells inside the polymer matrix [8,10]. In amorphous polymers, usually the growth of the pores continues until the polymer vitrifies [8,11]. CO2 is used because it is relatively non-toxic, relatively inert, and non-flammable. Also, it has relatively reachable critical points (T c = 31°C, Pc = 73.8 bar) and is soluble in many polymers. The solubility of CO2 increases with pressure, which leads to work at supercritical pressures. Moreover, since the critical temperature of CO 2 is 31°C, it can be used to process thermally sensitive materials. On the other hand, it is known that sorption of CO2 into polymers depresses their glass transition temperature, which UHVXOWV LQ D SRO\PHUJDV VROXWLRQ $V VWDWHG E\ %HFNPDQ >@ ³«WKH JHQHUDWLRQ RI foamed thermoplastics using CO2 DVWKHVROHEORZLQJDJHQWLVPRVWGHILQLWHO\µJUHHQ¶ processing, as the CO2 replaces either organic or hydrofluorocarbon agents that ZRXOG RWKHUZLVH GLUHFWO\ HQWHU WKH DWPRVSKHUH«´ VXSHUFULWLFDO &22 foaming is a green process. On the other hand, in the tissue engineering field, as CO 2 replaces chemical solvents, it ensures complete absence of residual amounts of undesired substances in the scaffolds for biomedical use. In this work, the influence of the supercritical CO2 parameters upon the pore distribution of polylactic polymer is investigated. According to the literature, it appears that the main parameters controlling the scCO2 foaming are the concentration of CO2 inside of the polymer and the depressurization rate of the pressure chamber. In order to specify the influence of the process parameters on the pore size distribution obtained from this technique, we have followed a Taguchi design of experiments [13].

2.

MATERIALS AND METHODS

2.1.

Material

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA50:50) samples were purchased from Boehringer (Ingenheim, Germany). PLGA50:50 copolymers are constituted by equal ratios of D,Llactide and glycolide monomers. 2.2.

Preparation of Polymer Pellets

Firstly, approximately 0.150 g of polymer powder was molded by compression at 150 bars and 60°C for 20 min in a compression mold for making pellets. Our compression molding setup allowed 3 pellets of polymer to be prepared simultaneously. At the end, pellets have a thickness of 0.9 ~1.1 mm and a diameter around 13 mm.

_____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 83

2.3.

Manufacture of Polymer Foams

In order to create polymer foams, pellets of polymer were placed in a pressure chamber, on perforated metal stages. The foaming method typically consists of saturating polymer pellets with CO2 at the desired temperature and under high pressure, followed by a rapid depressurization causing the supersaturation. As a result of the supersaturation, the creation of the nuclei occurred, the depressurization induced desorption from the polymer matrix and the phase change of CO 2 provided the pore growth. The pressure chamber was pressurized to the desired pressure. Temperature was also controlled. Then, polymer pellets were saturated with CO 2 during a desired time. After that, the chamber was depressurized with a desired depressurization rate to provide foaming of the polymers. In this work runs were carried out in a SEPAREX SF200 pilot (Separex Company, Nancy, France)(Figure 1). Sub-cooled liquid CO2 was pumped with a volumetric membrane pump (Milton Roy, maximum 5 kg/h), then heated until the desired temperature and continuously introduced into a cylindrical mixing chamber which contained the polymer sample, with a flow-rate of 20 g/min. Pressure in the mixing chamber was adjusted by a backpressure regulator. Experiments were carried out in closed-loop configuration, i.e. after condensation, CO2 was recycled at the pump inlet, in order to provide stability. Temperatures and pressures were controlled in each unit of the pilot, pressure being limited to 300 bar and temperature around 60 oC. The temperatures of the pressure chamber and the heating fluid were recorded. Depressurization rates were controlled manually with the backpressure regulator [14] and a posteriori processing of pressure recordings allowed quantification of the depressurization rate (slope of the linear depressurization curve).

Figure 1 : Separex SF200 pilot process flow diagram

84 _____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 2.4.

Principles of Foaming

The principles of the scCO2 foaming by pressure quench method with supercritical carbon dioxide (scCO2) were described by Goel and Beckman [6,7]. This method consists of four periods as represented in Figure 2. These four periods can be explained as follows: Period I: The CO2 is compressed into a pressure vessel where a polymer sample has already been placed (Figure 2, Part I). Generally, the process is carried out until a value above the critical pressure (Pc). Pressure and temperature increase with compression until desired values called saturation pressure (Psat) and saturation temperature (Tsat). The sorption-diffusion of CO2 begins but, since the time of this period takes a maximum of 2 min, it can be neglected. Period II: The sorption-diffusion of CO2 takes place (Figure 2, Part II). The solubility (phase equilibrium) is the limiting factor of the sorption-diffusion of CO2 into the polymer since the polymer is not soluble in CO2. Moreover, under high pressure, the sorption of CO2 into the polymer brings the structural phase transition of the polymer. The polymer swells with more CO2 sorbed and a transition occurs from glassy to plasticized (rubbery) state, by lowering the glass transition temperature of the polymer. This period is called the saturation time (tsat). Period III: Period II is followed by the depressurization of the pressure chamber (Figure 2, Part III). The depressurization rate (dP/dt) can be controlled. The pressure drop in the pressure chamber generates a temperature drop (dT/dt) correlatively. The temperature drop is proportional to the pressure drop. When the pressure is reduced from the equilibrium state, the formation of nuclei occurs as a result of supersaturation. These nuclei grow by the desorption-diffusion of the gas from the polymer matrix. We can state that the pressure difference between the two sides of the pore interface is the driving force of the pore growth. One must remember that, during the depressurization, CO2 is not supercritical anymore, and its molecular volume is larger than in the supercritical state. Actually, pore growth is provided by the expansion of CO2. Period IV: The growth of the pores (swelling of the polymer) continues until vitrification (Figure 2, Part IV), when the amount of CO2 inside the polymer is not sufficient to maintain the plasticized state. In the first moments, pore growth is diffusion-controlled, then viscosity becomes more significant and finally controls the end of the foaming process. Moreover, the growing pores can coalesce and reduce global pore density. 2.5.

Design of Experiments (DOE)

Supercritical CO2 experiments have been performed using a Taguchi Design of Experiments (DOE). To optimize the process, four parameters have been chosen: the saturation pressure (Psat), the saturation temperature (Tsat), the time of saturation (tsat) and the rate of depressurization (dP/dt). The variable parameters and their levels are reported in Table 1 and examples of obtained foams are shown in Figure 3.

_____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 85

Figure 2 : Evolution with time of process parameters and the occurring phenomena. Solid and dotted lines correspond to pressure and temperature variations, respectively Table 1 : Variable parameters and their levels (Taguchi design of experiments) Tsat (°C)

Psat (bar)

tsat (min)

dP/dt (bar/s)

36.5 45 60

120 150 200

20 45 90

3 5 10

Factors Level 1 Level 2 Level 3

Figure 3 : Examples of PLGA50:50 foams after scCO2 process

3.

EXPERIMENTS

3.1.

Determination of the Molecular Mass

The molecular weight of the copolymer PLGA50-50 has been deduced from viscometric analysis. Capillary viscometry is conceptually simple: the time for a volume of polymer solution to flow through a thin capillary is compared with the time for a K /K reference solvent flow. The relative viscosity is defined by the ratio sol 'n solvent . U /U |1 For most polymer solutions at low concentrations: sol ' n solvent . Thus, to a very good approximation, the relative viscosity is a simple time ratio: Krel tsol 'n / tsolvent . (1)

86 _____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ Specific viscosity represents the fractional change in viscosity upon addition of polymer: Ksol 'n  Ksolvent (Unitless) (2) Ksp

Ksolvent

Both Krel and Ksp depend on polymer concentration, so, to extract the "intrinsic" properties of the polymer chain itself, one must extrapolate to zero concentration. Measuring at zero concentration (c = 0) would be useless, but this concept of extrapolating to c = 0 is very important in polymer characterization, and, more generally, in thermodynamics. Intrinsic viscosity, [K], corresponds to the intercept at c = 0 of two quantities: the reduced viscosity (Ksp/c) and the inherent viscosity (c-1.ln Krel). Intrinsic viscosity is given by the relations [15]:

>K @

lim

K sp

c o0 c

{ lim c 1 ln K rel

(3)

c o0

The variations of efflux time, reduced specific viscosity and inherent viscosity with polymer concentration are presented in Figures 4a and b, respectively.

400

y = 58.311x + 61.923 R2 = 0.9922

PLGA 50:50 Co-Polymer Solution Vs Efflux Time

296.53 295.23

Time (Sec)

350 300

228.74 226.65

250 200

360.54 359.98 359.03

294.12

174.56

150

130.45 129.65

100

128.12

172.78

224.56

171.64

50 0 0.0

0.5

1.5

1.0

2.0

Concentration gm/100 ml

Figure 4a : Variation of efflux time with polymer concentration PLGA 50:50&RQFHQWUDWLRQ9VȘred Șinh

Reduced & Inherent Viscosity

y = 0.1544x + 0.5953

y = -0.0403x + 0.5984

1 0.85

0.89

0.75

0.8 0.67 0.6 0.57

0.56

0.55

1.0

1.5

0.51

0.4

0.2

0 0.0

0.5

2.0

C [g/100 ml]

Figure 4b : Variation of reduced specific (i) and inherent (Π) viscosities with polymer concentration

_____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 87

The intercept of both lines at the origin gives the intrinsic viscosity [K] = 0.5969 ± 0.0015. By using the Mark-Houwink relationship >K @ KM a with K = 0.000545 and a = 0.73 [16,17], we obtain: M = 14,582 g/mol. 3.2.

Glass Transition of the Copolymer PLGA50:50

The glass transition of the copolymer has been analyzed with a DSC 204 F1 Phoenix® apparatus. Three samples have been used to determine the glass transition temperature, Tg and the step of heat capacity 'Cp (Figure 5). As shown in Table 2, these values: Tg onset = 46.5 ± 0.6°C and 'Cp = 0.45 ± 0.05J.g-1.K-1 are comparable with those given in the literature [18-20]. The more the rate of glycolic acid (GA) increases in the PLGA copolymer, the more Tg decreases.

Figure 5 : Thermograms of PLGA50:50 Table 2 : Glass transition Parameters of various polylactides Polymer

Mmonomer (g/mol)

Mw (g/mol)

PLLA

72

PLGA85:15

70

1.33 10

PLGA50 :50 PGA

65 58

1.46 10 . 5 0.35 10

3.3.

Tg onset (°C)

Tg mid (°C)

'Cp (J/g°C)

1.87 10

5

58*

60

0.336

.

5**

55

57**

0.445

5

46.5 38

48.3 40

0.45 0.012

.

.

References [18] *[19] [20] **Complementary work Present work [19]

Geometric porosity analysis

The porosity has been estimated by measuring the geometric dimensions of pellets and foams. The porosity of a given medium (scaffold and biomaterial) describes the

88 _____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ fraction of void space in the material, where the void may contain, for example, air, gas or water. It is defined by the ratio:

H

Vv VT

(4)

where Vv is the volume of void-space (foamed Volume, Vf ± unfoamed volume, Vuf) and VT the total or bulk volume of material, i.e. foamed volume, assuming there is no change in mass. The physical shapes of the scaffolds prepared by this method were almost practically circular and visually homogenous (Figure 3). In our analyses, the diameter and the thickness of polymers before and after foaming have been measured by using a vernier caliper. The volume of the polymers is given by V ʌU2h, where r and h are the radius and the thickness of pellets and foams, respectively. The porosity, H, is given by: (5) H (V f  Vuf ) / V f ¶ H 1 Vuf / V f As we know that, Vuf = m/Uuf and Vf = m/Uf, replacing these values in equation ¶ ZHREWDLQIROORZLQJUHODWLRQ

H

1

U foamed U unfoamed

(6)

where Ufoamed is the density of the foam and Uunfoamed the density of the pellet. 3.4.

Average Pore Diameter Distribution

Pore size distributions and average pore diameter have been determined by image analysis of micrographics SEM experiments. The morphologies of the cross-sections and the surfaces of the polymers were investigated using a LEO-32 SEM. All samples were frozen in liquid nitrogen, fractured for sample collection and coated with argon in a sputter coater. SEM micrographs are first pre-processed with Photoshop® CS2 in order to automatically decrease the noise by using particular filters, then average pore area was calculated by Scion Image software ® (see Figure 6 for Foam Nr 01). The pores observed by SEM for the remaining experimental conditions can be visualized in Figure 7 (Foams 02-09). The average pore diameter is calculated by assuming that the pores are perfect circles. Average cell densities are also estimated by the following equation:

Nc

U foamed 6 1 (1  ) 2 Sd Uunfoamed

(7)

where Nc is the cell density (number of pores/cm 3) and d the pore diameter. Average pore diameters deduced from SEM images are reported in Table 3 for each set of process conditions. The variation of the average pore diameter between two foams processed under the same process conditions and the corresponding geometric porosities are also

_____________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 89

reported in Table 3. As shown in Figure 8, the porosity and the diameter of pores are not correlated. Except for the last experiment, the geometric porosity is practically constant, oscillating around 80-85% while the diameter of pores is varying discontinuously.

Image Treated with Photoshop

Image of SEM

®

®

Scion Image Frequency

PLGA50:50 Pore Histogram

16

12 10 8 6 4

Pore Frequency

14

2 0 10000 12000 15000 20000 50000 75000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000

3RUH$UHD ȝP2) ®

®

Figure 6 : Example of image treated by Photoshop and Scion to determine the distribution of pores r o -1 for foam N .01 (Conditions 36.5 C, 120 bar, 20 min and 3 bar.s

Table 3 : Average Pore Diameters of Foams

r

Tsat (°C)

Psat (bar)

tsat (min)

dP/dt (bar/s)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

36.5 36.5 36.5 45 45 45 60 60 60

120 150 200 120 150 200 120 150 200

20 45 90 45 90 20 90 20 45

3 5 10 10 3 5 5 10 3

N

Avg. Pore Diameter 1 (ȝm) 549.90 9.70 4.30 18.80 19.10 10.00 127.80 113.20 14.15

Avg. Pore Diameter 2 (ȝm) 535.00 9.20 4.30 18.25 21.70 13.20 101.60 105.80 13.90

Mean Pore Diameter (ȝm) 542.5 ± 7.4 9.4 ± 0.3 4.3 ± 0.0 18.5 ± 0.3 20.4 ± 0.7 11.6 ± 1.6 114.7 ± 13.1 109.5 ± 3.7 14.03 ± 0.13

Mean Geometric Porosity (%) 93.4 ± 0.40 79.2 ± 7.01 74.0 ± 4.36 95.9 ± 0.97 86.7 ±8.16 96.1 ± 0.28 73.7 ± 16.03 91.3 ± 1.28 47.4 ± 3.32

90 __________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15___________________

r

o

-1

N 2. 36.5 C, 150 bars, 45 min and 5 bar.s

r

o

-1

N 3. 36.5 C, 200 bars, 90 min and 10 bar.s

r

o

-1

N 4. 45 C, 120 bars, 45 min and 10 bar.s

r

o

-1

N 5. 45 C, 150 bars, 90 min and 3 bar.s

r

o

-1

r

o

-1

N 6. 45 C, 200 bars, 20 min and 5 bar.s

N 7. 60 C, 120 bars, 90 min and 5 bar.s

r

o

N 8. 60 C, 150 bars, 20 min and 10 bar.s

r

o

-1

N 9. 60 C, 200 bars, 45 min and 3 bar.s

Figure 7 : SEM micrographs of PLGA50:50

-1

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________

91

Figure 8 : Geometric Porosity and Diameter of Pores under Previous Process Conditions

4.

DISCUSSION ON THE EFFECT OF PROCESS PARAMETERS

The effects of each process parameters can be deduced from the analysis of the Taguchi’s DOE. These effects are reported on the Table 4 and illustrated in Figure 9. It is important to note that all variations are non linear: an increase of Tsat, Psat, tsat or dP/dt induces first a important decrease of the diameter of pores followed by a slight positive or negative variation. These behaviors confirm observations of Krause [21]. All experimental parameters have an influence on the final pore size of the foams and allowed us to obtain pores ranging between 10 and 220 mm. Considering pore diameter, the most important parameters are the pressure and the time of saturation, but by varying the level of one parameter and blocking the other parameters, we can adjust the average diameter of pore to a given value. The maximum of pore diameter is obtained with the following process conditions: Tsat =36.5°C, Psat = 120 bars, tsat = 20 min and dP/dT=3 bar/s. 250 20

120

3

Diameter of Pores( m m)

200 35 150

100

60 10

90 50

150 200

45

5 45

0 1

(°C) 4 2Tsat 3

5

(bar/s) 6 P sat 7 (bar) 8 9 10 t sat 11(min) 12 13 dP/dt 14 15 16 Process Parameters

Figure 9 : Effects of scCO2 Process Parameters on the Pore Diameters of PLGA50:50

92 ___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________

Table 4 : Effect of the scCO2 Process Parameters on the Pore Diameters of PLGA50:50

Factors Level Tsat (°C) Psat (bar) tsat (min) dP/dt (bar/s)

36.5 45 60 120 150 200 20 45 90 3 5 10

Average Pore Diameter (mm) 185.40 16.84 79.41 225.23 46.45 9.98 221.18 14.00 46.47 192.29 45.25 44.11

Effect 91.52 -77.04 -14.48 131.34 -47.43 -83.91 127.30 -79.88 -47.42 98.41 -48.63 -49.78

For the lowest saturation parameters (temperature, pressure and time), the highest diameter of pores can be associated with a low capacity of scCO2 to penetrate into the polymer. During the sorption of scCO2, the glass transition temperature of the polymer decreases and macromolecules of PLGA50-50 become resilient, turning from glassy to rubbery state. During desorption of scCO2, the swelling of the polymer is correlated to pore growth and coalescence. But simultaneously, with desorption of scCO2 and its plasticizing effect, the glass transition temperature of the polymer increases and PLGA50:50 vitrifies. So, the longer time of desorption, obtained by decreasing the depressurization time, the longer the expansion time, and hence the larger the pore diameter.

5.

CONCLUSION

These experiments confirm the ability of the scCO2 process to control the pore size of PLGA50-50 foams and allow to manufacture scaffolds with porosity adapted to the use of tissue engineering. The pore size distribution of the polylactic foams prepared can be adapted by playing on the process conditions such as saturation pressure, saturation temperature, saturation time and depressurization rate. D u r i n g depressurization, the nuclei grow to create pores and the pores continue to grow as CO2 expands and desorbs. Pore growth continues until polymer vitrification. We strongly believe that the coalescence phenomenon occurs during depressurization which decreases pore density and increases final average pore diameter. Complementary thermodynamics studies taking into account the evolution of the polymer during the four periods are necessary to confirm this hypothesis. Moreover, further characterizations of the foams must be performed to validate the interconnectivity of the pores.

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RÉSUMÉ : Notre équipe développe une méthode originale de préparation de particules constituées de biopolymères réticulés, et évitant l'emploi d'agents réticulants bifonctionnels toxiques. La méthode utilise une réaction de transacylation impliquant les groupements aminés libres d'une protéine et les groupements ester d'un dérivé de polysaccharide, tel que l'alginate de propylène-glycol (PGA). Cette réaction, déclenchée par une simple alcalinisation, conduit à la formation de liaisons amide entre les deux biopolymères. Il en résulte un film stable constitué d'une protéine directement liée de manière covalente à un polysaccharide. Nous avons montré que cette réaction peut s'appliquer à la formation de membranes stables autour de vésicules sphériques de tailles variées. Dans une première variante, la réaction de transacylation se déroule au sein d'une émulsion et crée un réseau alginate-protéine autour des gouttelettes dispersées. Ce procédé conduit à l'obtention de microparticules stables, à partir de PGA et de protéines variées, et permet d'encapsuler divers composés. Ces microparticules sont utilisées en cosmétique. La deuxième variante est un procédé en deux étapes, conduisant à la préparation de microsphères de gel d'alginate de calcium, entourées d'une membrane alginateprotéine. La structure composite de ces microsphères à membrane, ainsi que leur stabilité et leurs propriétés de résistance à la stérilisation par autoclavage, les rendent particulièrement intéressantes pour une utilisation comme système de libération contrôlée de molécules d'intérêt thérapeutique. Enfin, la troisième variante est un procédé entièrement en milieu aqueux, produisant des sphères d'hydrogel stabilisées par une membrane alginate-protéine. Les conditions particulièrement douces requises pour l'encapsulation permettent d'utiliser ces billes à membrane stables comme des conteneurs de cellules vivantes, préservant la viabilité et la fonctionnalité cellulaires, tout en évitant la fuite des cellules dans le milieu environnant.

MOTS-CLES : Encapsulation, transacylation, membrane, alginate, protéine 1. INTRODUCTION La microencapsulation consiste à emprisonner des solides ou des liquides finement divisés au sein d'une membrane, afin de modifier les propriétés du matériau encapsulé [1,2]. Lorsque les microcapsules sont destinées aux domaines pharmaceutique, biomédical, cosmétique ou alimentaire, leur biocompatibilité est une qualité indispensable. Parmi les composés utilisables comme matériaux constitutifs des membranes, de nombreux polymères non toxiques d'origine naturelle permettent de préparer des formes particulaires utilisables chez l'homme. Les procédés de microencapsulation basés sur la réticulation de polymères, conduisant à la formation de membranes impliquant des liaisons covalentes, offrentune garantie de stabilité. Ces procédés sont très souples, et permettent de moduler les propriétés des particules par variation des divers paramètres de préparation.

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Dans l’objectif d’une biocompatibilité optimale, notre équipe a mis au point une méthode originale de préparation de particules par réticulation de biopolymères qui évite l'emploi d’agent réticulant bifonctionnel classique. Différents types de particules ont pu être préparés en utilisant une réaction de transacylation. Cette réaction conduit à la formation de liaisons amide entre une protéine et un polysaccharide, et est déclenchée par une simple alcalinisation du mélange de ces deux biopolymères. Notamment, la méthode de transacylation permet, dans des conditions ménagées, d’encapsuler des cellules vivantes dans des billes de gel à membrane particulièrement stables [3-7]. Les différentes méthodes mises au point sont détaillées dans ce chapitre, ainsi que certaines applications envisagées pour ces particules hautement biocompatibles. 2. METHODES 2.1 La réaction de transacylation entre esters polysaccharidiques et protéines : principe L’alginate de propylèneglycol (PGA) est un ester polysaccharidique hydrosoluble obtenu par estérification de l’acide alginique par l’oxyde de propylène en conditions douces [8]. Le PGA se présente sous la forme d’une poudre blanche, donnant des solutions visqueuses après dissolution dans l'eau. Il possède des propriétés tensioactives mises à profit dans le domaine alimentaire (additif E405). Contrairement aux sels de l'acide alginique (alginate de sodium, de potassium), le PGA ne précipite pas lorsqu’il est en présence d’ions calcium. De plus, il a la propriété de former des gels covalents par réaction avec des composés polyaminés. Dans la littérature, plusieurs brevets et publications décrivent en effet la formation d’un film solide et thermostable par alcalinisation d’une solution aqueuse renfermant un mélange de PGA et de protéine [9-11]. Ces gels trouvent des applications dans des domaines aussi variés que l’industrie alimentaire [12], la photographie [9], ou la purification d’antigènes [13]. Les études de structure de ces gels stables concluent à l’établissement de liaisons covalentes entre le PGA et le composé polyaminé [14-16]. Il se crée en effet des liaisons amide par une réaction de transacylation, c’est à dire une migration d’acyles en milieu alcalin, le groupement aminé provoquant une substitution nucléophile de l’ester, avec libération de propylèneglycol (PG-OH) (Figure 1). Le gel doit être ensuite neutralisé, de manière à éviter sa liquéfaction ultérieure par suite de l’hydrolyse du polysaccharide.

Figure 1 : Réaction de transacylation entre PGA et protéines

96

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2.2 Méthode d'encapsulation par transacylation en émulsion Lorsque la réaction de transacylation est déclenchée au sein de gouttelettes aqueuses, renfermant PGA et protéine et dispersées au sein d'une phase hydrophobe, on forme des microparticules constituées de l'association covalente alginate-protéine. Pour encapsuler une phase aqueuse, la méthode de préparation comporte trois étapes (Figure 2) : •Emulsification de la phase aqueuse renfermant le PGA et la protéine dans une phase hydrophobe additionnée d’un tensioactif. •Alcalinisation. Tout en maintenant la vitesse d’agitation initiale, on déclenche la réaction de transacylation dans les gouttelettes dispersées, en ajoutant à l’émulsion une solution d’un agent alcalin dans un solvant miscible à la phase aqueuse. Les ions alcalins diffusent alors jusqu’aux gouttelettes de phase aqueuse dispersée, et déclenchent la réaction de transacylation entre le PGA et la protéine, conduisant à la formation d’une microparticule. •Neutralisation. Après l’étape d’alcalinisation, la réaction est stoppée, par l’ajout à l’émulsion d’une solution d’un acide dans un liquide miscible à la phase aqueuse.

Phase aqueuse PGA + protéine

Solution alcaline

Solution acide

Phase hydrophobe + tensioactif

1 - Emulsification

2 - Alcalinisation

3 - Neutralisation

Figure 2 : Protocole de préparation de microparticules par transacylation en émulsion

Enfin, les microcapsules sont isolées du milieu organique par centrifugation et lavées. Elles pourront ensuite être conservées en suspension aqueuse. On pourra également les sécher, par exemple par lyophilisation. Ce procédé conduit à la formation de microparticules stables à partir de PGA associé à de nombreuses protéines, pures ou en mélange (sérumalbumine, hémoglobine, fibrinogène, ovalbumine, protéines végétales, protéines du lactosérum…). La méthode est exploitée en cosmétologie (Cylasphère®, BASF-BCS).

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2.3 Méthode mixte : transacylation autour de microsphères de gel La réaction de transacylation entre PGA et protéine peut également être déclenchée à la surface de microsphères de gel. Ainsi il est possible de préparer des microsphères de gel d'alginate de calcium, stabilisées par une membrane protéinealginate [17]. Le protocole, en deux étapes, est le suivant (Figure 3) : •Dans un premier temps, des microsphères de gel d'alginate de calcium contenant du PGA et une protéine, sont préparées au sein d'une émulsion. Une solution aqueuse contenant alginate de sodium, protéine et PGA est dispersée en gouttelettes au sein d'une phase hydrophobe additionnée de tensioactif et sous agitation mécanique (Figure 3, étape 1). On ajoute à l'émulsion une solution aqueuse d'un sel de calcium, qui va diffuser jusqu'à la phase aqueuse dispersée et la gélifier in situ (étape 2). Les microsphères gélifiées produites sont isolées par centrifugation. •La membrane alginate-protéine est formée dans une deuxième étape qui se déroule en suspension aqueuse. Les microsphères de gel contenant PGA et protéine sont agitées dans une solution aqueuse alcaline de protéine : la réaction de transacylation est déclenchée en périphérie des billes, et forme donc la membrane (étape 3). Après réaction, les billes à membrane sont neutralisées (étape 4) et soumises à une séquence de lavages.

Phase aqueuse Alginate Na + PGA + protéine

Solution de CaCl2

Solution aqueuse de protéine

Centrifugation

Phase hydrophobe + tensioactif

Agent alcalin

Solution tampon pH7

Lavages

Redispersion

1 - Emulsification

2 - Gélification

FORMATION DES MICROSPHERES DE GEL

3 - Transacylation

4 - Neutralisation

FORMATION DE LA MEMBRANE

Figure 3 : Protocole «mixte» de formation de microsphères de gel à membrane

Ce protocole conduit à des microparticules possédant un cœur gélifié, entouré d’une membrane stable, résistante et biocompatible (Figure 4). Cette constitution particulière les rend intéressantes pour une utilisation en tant que systèmes à libération contrôlée pour des molécules d’intérêt thérapeutique. Il a été démontré que ces particules permettaient par exemple d’assurer la libération d’un tetrapeptide bioactif, marqué par la fluorescéine, sur une période d’environ 8 jours [24].

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25 μm Figure 4 : Cliché en microscopie optique d’une coupe de microsphères de gel à membrane de PGA-sérumalbumine (d’après [17])

Des études complémentaires ont permis de préciser la nature des interactions entre le peptide et les particules [18]. En faisant varier les concentrations en peptide en présence d’une quantité fixe de microsphères, des isothermes d’adsorption ont pu être établies. Le modèle mathématique de Scatchard a été appliqué aux résultats numériques, donnant accès aux paramètres caractéristiques des interactions entre le peptide et les microsphères tels que le nombre maximal de sites de fixation et les constantes d’affinité. L’intégration des résultats obtenus sur des particules avec ou sans gel interne, de tailles différentes et de degrés de gélification différents, indiquerait une liaison de type ionique du peptide via les groupements carboxylates de l’alginate situé en périphérie de la particule, sous la membrane covalente de PGA et d’HSA. La nature de la liaison a été confirmée par des expériences de déplacement ionique (Figure 5). Ces expériences ont montré que le peptide lié aux microparticules pouvait être échangé avec des cations comme le sodium, induisant un relargage contrôlé de la molécule.

0.8

Fraction libre de peptide

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.0001

0.001

0.01

0.1

1

+

[Na ] (mol/L)

Figure 5 : Fraction libre de peptide en fonction de la concentration en ions sodium, en présence d'une quantité fixe de microsphères de gel à membrane.

De plus, il a été démontré que ces microsphères à membrane conservaient, après une étape de stérilisation par autoclavage, une morphologie et une répartition

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granulométrique identiques, ainsi que des propriétés de liaison à un traceur coloré inchangées [19]. 2.4 Méthode en milieu strictement aqueux : sphères à membrane stable pour bioencapsulation La bioencapsulation constitue un ensemble de technologies visant à immobiliser des molécules biologiques fragiles, des organites cellulaires, des cellules vivantes ou de petits amas cellulaires à l'intérieur de sphères de diamètre variable. Le but de l'encapsulation peut être par exemple de protéger les cellules encapsulées contre le système immunitaire d'un organisme hôte, rendant possible la greffe de cellules non allogéniques. La bioencapsulation est également employée dans l'industrie alimentaire pour le contrôle des fermentations (prise de mousse des boissons fermentées pétillantes, industrie laitière) [3,20]. Le procédé de gélification des alginates au moyen de cations divalents comme le calcium est largement utilisé en bioencapsulation pour immobiliser des cellules vivantes dans des sphères de gel, du fait de la disponibilité et du coût réduit de ce polymère naturel biocompatible, et des conditions particulièrement douces requises pour former ces particules [3]. Il est cependant connu que les gels d’alginate se liquéfient progressivement lorsqu’ils sont placés dans un milieu contenant des ions, comme par exemple un milieu de culture cellulaire classique. Pour éviter ce phénomène et empêcher toute fuite du matériau encapsulé dans le milieu extérieur, la surface des billes est ensuite habituellement stabilisée, par immersion dans une solution d’un polymère polycationique tel que la poly-L-lysine. Il se forme une membrane en périphérie, résultant de l’association ionique entre l’alginate et le polycation [21]. Ces membranes ont toutefois l’inconvénient d’être d’une stabilité limitée. La mise au point d’une méthode permettant de former une membrane biocompatible réticulée de façon covalente présente donc un grand intérêt. Dans le domaine de la bioencapsulation, le principal problème vient de la toxicité des agents réticulants. La réaction de transacylation s'applique ici, et permet d'entourer d'une membrane stable des billes de gel d'alginate sans utiliser de composé toxique. Le procédé mis au point au laboratoire [4], permettant d'obtenir des billes de gel de diamètre important (1-3 mm) et entourées d'une membrane, consiste à incorporer PGA et protéine à une solution d'alginate de sodium. •Cette solution est extrudée goutte à goutte dans un bain gélifiant de chlorure de calcium. Les billes gélifiées se forment instantanément (Figure 6, étape 1). •Elles sont ensuite mises en suspension dans une solution aqueuse alcaline de manière à déclencher la réaction de transacylation à la surface des billes, pour former la membrane PGA-protéine (étape 2). •L'étape suivante de neutralisation dans un tampon permet d’éviter l’hydrolyse ultérieure du polymère. •On peut éventuellement ensuite reliquéfier le gel interne, par agitation des billes à membrane dans une solution d’un agent chélatant du calcium comme le citrate de sodium (étape 3).

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Solution d’alginate de sodium + PGA + protéine

Solution alcaline puis tampon neutre

Solution de citrate de sodium

Solution de CaCl2

1 – Formation des billes (gélification)

2 – Formation de la membrane (transacylation)

3 – Liquéfaction du gel interne

Figure 6 : protocole de préparation de billes de gel à membrane PGA-protéine en milieu aqueux.

L’épaisseur de la membrane (Figure 7) est contrôlée par les paramètres de l’étape d’alcalinisation (pH de la solution alcaline, temps de réaction).

Figure 7 : Billes de gel d’alginate à membrane de PGA-sérumalbumine, préparées avec des solutions de pH croissant lors de l’étape de transacylation (diamètre moyen des billes : 3 mm).

Par cette méthode, il est possible de préparer un nouveau type d’enzyme immobilisée, en utilisant une enzyme en tant que protéine associée au PGA pour former la membrane. On a pu démontrer que l’immobilisation de phosphatase alcaline par fixation au PGA sous forme de billes à membrane permet de conserver suffisamment de sites actifs libres pour préserver une forte proportion de l’activité enzymatique de départ [4]. Des études mécaniques sur les membranes ainsi obtenues ont été entreprises [2225]. Les expériences d'écrasement des billes entre deux plaques ainsi que les expériences de gonflement osmotique des membranes ont permis d'accéder au module d'élasticité de ces membranes et de montrer l’effet de l’épaisseur de la membrane sur ses propriétés mécaniques. De plus, des expériences d'écoulement des billes dans de petits tubes ont mis en évidence la grande élasticité des membranes, capables de subir de fortes déformations dans le flux de liquide sans se rompre, démontrant par exemple leur utilisation possible en bioréacteur.

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Ce nouveau type de billes, entourées d’une membrane stable et résistante mécaniquement, est susceptible d'intéressantes applications dans le domaine de la bioencapsulation. Ainsi, la méthode a été appliquée à l’encapsulation de différents types de cellules : •Par exemple, des levures de prise de mousse de Champagne (Saccharomyces cerevisiae) ont été encapsulées dans des billes d’alginate à membrane de PGAprotéines de Soja. Des expériences préliminaires ont montré que ces levures encapsulées permettaient de conduire une fermentation jusqu’à son terme, sans fuite cellulaire dans le vin de Champagne [5]. •Après encapsulation d'hépatocytes dans des billes d’alginate à membrane de PGAsérumalbumine (diamètre : 1 mm), les cellules ont conservé leur viabilité, leur capacité de biotransformation de divers xénobiotiques, ainsi que leur propriété de synthèse de la sérumalbumine. De plus, la présence d’une membrane covalente alginate-albumine a permis d'apporter aux billes, placées en cartouche d’épuration extracorporelle, une stabilité et une résistance compatibles avec une utilisation en thérapeutique [6]. •Une lignée de cellules génétiquement modifiées, sécrétant une molécule utilisable en thérapeutique anti-VIH, a été encapsulée dans des billes d’alginate à membrane de PGA-sérumalbumine (diamètre : 2 mm) [7]. Après implantation in vivo chez la souris, les billes ont montré une excellente stabilité pendant plus d’un mois, la membrane laissant diffuser la molécule active, tout en empêchant les cellules de se répandre dans l’organisme hôte. •Ensuite, dans le but d'optimiser les paramètres de l'encapsulation, une lignée lymphocytaire T leucémique humaine (lignée JURKAT), utilisée comme modèle cellulaire, a été immobilisée au sein de billes de gel à membrane de PGAsérumalbumine humaine (diamètre : 3-4 mm). Après validation de la formulation pour ce type de lignée cellulaire, une étude visant à suivre in vitro la viabilité cellulaire intra-bille au cours du temps a été menée en pratiquant des observations microscopiques régulières et un dosage d'activité enzymatique. La méthode employée était une variante de la méthode classique au méthylthiazoletétrazolium (MTT), permettant de mesurer l’activité enzymatique (succinate déshydrogénase mitochondriale) des cellules vivantes directement au sein des billes à membrane [26]. L'étude a révélé un maintien de la prolifération des cellules sur plus d’un mois de test (Figure 8), ainsi qu'une augmentation simultanée de l'activité enzymatique intra-billes, montrant la conservation des pleines potentialités métaboliques des cellules après encapsulation [27]. Tout au long de cette étude, ces mini-containers semi-perméables ont présenté une stabilité satisfaisante, tout en permettant des échanges passifs indispensables entre le cœur des billes et le milieu nutritif environnant.

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Figure 8 : Cellules Jurkat encapsulées, photographiées à différents temps de culture après encapsulation (jours=J ;J06, J10, J22 et J37), observation à la loupe binoculaire sur fond noir, objectif x1,8.

La méthode d’encapsulation en milieu aqueux mise au point au laboratoire répond donc à un problème posé dans le domaine de la bioencapsulation : entourer d’une membrane stable et résistante des billes d’alginate gélifiées renfermant du matériel vivant.

3. CONCLUSION La réaction de transacylation entre l’alginate de propylèneglycol et une protéine a pu être utilisée pour préparer divers types de particules stables et biocompatibles, pour des applications aussi bien en cosmétologie que dans les domaines agroalimentaire, biomédical ou pharmaceutique. La gamme de tailles accessibles présente cependant une limite inférieure, du fait de la haute viscosité des polymères de départ. Afin de pouvoir diversifier les voies d'administration, le Laboratoire travaille actuellement à la préparation de sphères de plus petit diamètre.

4. REMERCIEMENTS Merci au Professeur Marie-Christine Lévy, qui, à plus d’un titre, est à l’origine de tous les travaux développés dans ce chapitre. L’entreprise Coletica-Engelhard-BASF a témoigné son intérêt pour ces travaux depuis leurs débuts. Qu'elle soit ici remerciée pour sa confiance et son soutien.

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th

Workshop

Encapsulation des Protéines : Propriétés des Microsphères et Intégrité Protéique Emilie RUFFINa*, Claire BORDESb, Pedro MAROTEb, Olivier MARCILLATc, Stéphanie BRIANÇONA a. Université de Lyon, F-69622, Lyon, France ; Université Lyon 1, Villeurbanne, LAGEP, UMR 5007, CNRS, CPE, 43 bd du 11 novembre, 69100 Villeurbanne, France b. Université de Lyon, F-69622, Lyon, France ; Université Lyon 1, Villeurbanne, Laboratoire des Sciences Analytiques, UMR 5180, CNRS, CPE, 43 bd du 11 novembre, 69100 Villeurbanne, France c. Université de Lyon, F-69622, Lyon, France ; Université Lyon 1, Villeurbanne, Institut de Chimie et de Biochimie Moléculaires, UMR 5246, Bâtiment Chevreul, CPE, 43 bd du 11 novembre, 69100 Villeurbanne, France * [email protected]

RESUME :

Le développement de médicaments à base de protéines pose de nombreuses difficultés, liées aux propriétés physico-chimiques de ces molécules. En effet, les protéines sont des molécules fragiles, très sensibles aux conditions environnementales et dont la structure complexe est directement responsable de leur efficacité biologique. /¶HQFDSVXODWLRQ GHV SURWpLQHV SHUPHW GH OHV SUpVHUYHU GHV GpQDWXUDWLRQV HW G¶DPpOLRUHU OHXU HIILFDFLWp ELRORJLTXH /H SURFpGp G¶HQFDSVXODWLRQ HW OHV FRQGLWLRQV RSpUDWRLUHV GRLYHQW FHSHQdant être DGDSWpVDILQGHUHVSHFWHUO¶LQWpJULWpGHODSURWpLQH'DQVFHWUDYDLOOD PpWKRGHG¶pPXOVLRQPXOWLSOH: 1/O/W 2 avec extraction/évaporation de VROYDQWDpWpXWLOLVpHSRXUO¶HQFDSVXODWLRQGDQVXQHPDWULFHSRO\PqUH G¶XQH SURWpLQH PRGqOH : la myoglobinH 0E  /¶LQIOXHQFH GH paramètres de formulation sur la conformation de la protéine a été pWXGLpH 'HV PHVXUHV HQ VSHFWURPpWULH 899LVLEOH HW O¶XWLOLVDWLRQ GH UDSSRUWV G¶DEVRUEDQFH GHV ORQJXHXUV G¶RQGHV VSpFLILTXHV GH OD protéine ont permis une analyse quantitative et qualitative de la Mb. Il D pWp PRQWUp TXH OH SURFpGp G¶HQFDSVXODWLRQ GDQV GHV FRQGLWLRQV optimales définies préalablement, permet de conserver la FRQIRUPDWLRQ QDWLYH GH OD SURWpLQH (Q UHYDQFKH O¶XWLOLVDWLRQ G¶XQ polymère de masse molaire plus élevée conduit à une dégradation de la protéine.

MOTS-CLES :

Microsphère, émulsion multiple, myoglobine (Mb), hème, conformation tertiaire native, spectrométrie UV/Visible

1. INTRODUCTION /¶XWLOLVDWLRQ GH SURWpLQHV HW GH SHSWLGHV SRXU OD SURGXFWLRn de médicaments permet de traiter un grand nombre de maladies (cancers, maladies auto-immunes ou LQIHFWLHXVHVGpVRUGUHVKRUPRQDX[« &HVPROpFXOHVVRQWGpVRUPDLVGLVSRQLEOHVHQ JUDQGHTXDQWLWpHWOHXUVpFXULWpHVWDPpOLRUpHJUkFHjO¶HVVRUGHVELRWHFKQROogies et GHVWHFKQLTXHVGHUHFRPELQDLVRQGHO¶$'1>-5]. &HSHQGDQWOHGpYHORSSHPHQWG¶XQ médicament à base de protéine ou de peptide pose de nombreuses difficultés,

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QRWDPPHQW HQ WHUPHV GH OLEpUDWLRQ HW GH WUDQVSRUW MXVTX¶j OD FLEOH PDLV DXVVL GH stabilité dans le sang [6]. Les protéines sont des molécules vulnérables et complexes, qui possèdent une faible perméabilité, voire une incapacité à diffuser à travers les membranes biologiques, en raison de leurs propriétés physico-chimiques (hydrophilie, poids moléculaire élevé, architectures secondaire et tertiaire complexes, voire quaternaire, maintenues grâce à des liaisons labiles) [1,5,7]. La plupart ont de courtes demi-vies et présentent une faible biodisponibilité orale et transdermique, des paramètres qui tendent à limiter leur efficacité biologique. Ainsi, elles sont le plus souvent DGPLQLVWUpHV j KDXWH GRVH HW SDU YRLH SDUHQWpUDOH DILQ G¶REWHQLU XQH HIILFDFLWp thérapeutique [5,7-11]. La microencapsulation est une technique de vectorisation de choix pour résoudre ces problèmes, en permettant la protection des protéines (contre ODGpJUDGDWLRQRXO¶DJUpJDWLRQ O¶REWHQWLRQGHIRUPHVjOLEpUDWLRQSURORQJpHHIILFDFHV HW OD SRVVLELOLWp GH WUDQVSRUWHU OHV SURWpLQHV MXVTX¶DX VLWH G¶DFWLRQ >@ /D OLWWpUDWXUH distLQJXH  WHFKQLTXHV G¶HQFDSVXODWLRQ j EDVH GH SRO\PqUHV ELRGpJUDGDEOHV  OD double émulsification avec évaporation/extraction de solvant [12,13], O¶DWRPLVDWLRQVpFKDJH RX VSUD\-drying) [14] et la séparation de phases ou coacervation simple [15]. Le procédp SULYLOpJLp HVW LQFRQWHVWDEOHPHQW OD PpWKRGH GµpPXOVLRQ PXOWLSOH (W 1/O/W 2) évaporation/extraction de solvant. Une grande variété de peptides et de protéines a été encapsulée par cette technique dans des vecteurs polymères [10, 16]. Le succès de ce type de formulation dépend de la capacité du procédé à SUpVHUYHUO¶LQWpJULWpGHODSURWpLQHHQFDSVXOpH Différents paramètres peuvent affecter la stabilité de la protéine au cours du procédé G¶HQFDSVXODWLRQ : la nature du solvant organique et du polymère, le système G¶pPXOVLILFDWLRQ PpFDQLTXH XOWUD-sons), la vitesse ou puissance et la durée G¶DJLWDWLRQODSUpVHQFHGHWDPSRQVGHVSUHVVLRQVHWRXWHPSpUDWXUHVpOHYpHVXQH FRQFHQWUDWLRQ pOHYpH HQ WHQVLRDFWLIV HW OD IRUPDWLRQ G¶LQWHUIDFHV HDXVROYDQW organique peXYHQW DOWpUHU O¶pWDW GH OD SURWpLQH >@ ,O SHXW HQ UpVXOWHU XQH élimination, une agrégation, une dégradation chimique ou encore une adsorption de ODSURWpLQHjODVXUIDFHGXSRO\PqUH/¶pYDOXDWLRQGHVFKDQJHPHQWVVWUXFWXUHOVG¶XQH protéine au cours du SURFpGp G¶HQFDSVXODWLRQ H[SRVpH j GHV FRQGLWLRQV GH GpQDWXUDWLRQ HVW HVVHQWLHOOH SRXU V¶DVVXUHU GH OD VWDELOLWp GX PDLQWLHQ GH O¶LQWpJULWp protéique et par conséquent du transport et de la libération de la protéine biologiquement active [5]. Cette étude D SRXU EXW GH GpWHUPLQHU O¶LQIOXHQFH GH FHUWDLQV SDUDPqWUHV GH formulation sur la morphologie de microsphères chargées en myoglobine (Mb, SURWpLQH PRGqOH  SURGXLWHV SDU pPXOVLRQ PXOWLSOH HW VXU O¶LQWpJULWp SURWpLTXH /D PpWKRGHG¶HQFDSVXODWLRQDpWpDGDSWée pour élaborer des microsphères à propriétés YDULDEOHV SRURVLWp GLVWULEXWLRQ GH WDLOOH HIILFDFLWp G¶HQFDSVXODWLRQ FLQpWLTXH GH OLEpUDWLRQ« HWUpGXLUHOHVFRQWUDLQWHVLPSRVpHVjODSURWpLQHjHQFDSVXOHU(QILQOH contrôle de la structure tertiaire de la protéine encapsulée et son dosage ont été réalisés au moyen de la spectrophotométrie UV/Visible et de la méthode des UDSSRUWVG¶DEVRUEDQFHVSpFLILTXHGHOD0E Cette méthode non invasive offre une grande sensibilité, permettant de travailler avec de faibles quantités (limites de détection atteignant le plus souvent 10 -4 à 10-5M MXVTX¶j -6 0  HOOH HVW pJDOHPHQW VLPSOH HW UDSLGH G¶XWLOLVDWLRQ [18]. Mais surtout, FHWWH WHFKQLTXH SHUPHW G¶HIIHFWXHU VLPXOWDQpPHQW XQH DQDO\VH TXDQWLWDWLYH HW qualitative dH OD SURWpLQH HQFDSVXOpH DYHF GpWHFWLRQ G¶pYHQWXHOV FRQWDPLQDQWV FDU

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OD PDWULFH SRO\PqUH HW OHV VWDELOLVDQWV XWLOLVpV Q¶DEVRUEHQW SDV GDQV OD JDPPH GH ORQJXHXUG¶RQGHpWXGLpH jQP  2. MATERIELS ET METHODES 2.1 Matières premières utilisées Protéine modèle : 0\RJORELQH GH F°XU GH FKHYDO ("horse heart myoglobin ", Mb, masse molaire : Mw=16 950 g.mol-1), Sigma. Polymères : - 2-Poly (H-caprolactone) (PCL) (Mw = 14 000 et 65 000 g.mol-1), Aldrich. Solvants : - Dichlorométhane (DCM), Carlo Erba, utilisé comme solvant du polymère non PLVFLEOHGDQVO¶HDX - ,VRSURSDQRO L3U2+  &DUOR (UED HPSOR\p SRXU SHUPHWWUH O¶H[WUDFWLRQ GX VROYDQW organique. Additifs : - Poly(alcool vinylique) 4±88 ou Mowiol® 4-88 (PVA) (Mw = 31 000 g.mol-1), utilisé comme stabilisant dans la phase externe, hydrolyse 86,7-88,7 mol%, Fluka. - Saccharose, utilisé comme agent équilibrant de pression osmotique, Merck. Solution tampon : Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (Fluka, 1 comprimé pour 200mL). 2.2 Préparation des microparticules Plusieurs formulations de microparticules ont été produites par émulsion multiple W1/O/W 2 avec extraction/évaporation de solvant, sous différentes conditions, à température ambiante (22-25°C) (Figure 1). Les conditions opératoires utilisées pour la référence sont celles préconisées par Al Haushey [11] pour optimiser la production de microsphères. La masse molaire, la quantité de polymère et la concentration en SURWpLQHRQWHQVXLWHpWpFKDQJpHVSRXUpYDOXHUO¶LQIOXHQFHGHFHVSDUDPqWUHVVXUOHV propriétés des microsphères (Tableau 1). 7RXW G¶DERUG OD SURWpLQH HVW GLVVRXWH GDQV OD VROXWLRQ DTXHXVH LQWHUQH : 1), soit 0,3mL de solution de PVA à 0,1%. Le PVA intervient comme stabilisant en entrant en FRPSpWLWLRQDYHFODSURWpLQHjO¶LQWHUIDFHHDXVROYDQWRUJDQLTXH + 2O/DCM), limitant ainsi le contact entre la Mb et le solvant et les risques de dénaturation et G¶DJUpJDWLRQ /D SURWpLQH HQ VROXWLRQ HVW HQVXLWH GLVSHUVpH GDQV XQH VROXWLRQ organique (O) composée de 5mL de DCM et de 2,5g de PCL. /¶pPXOVLILFDWLRQSULPDLUHV¶HIIHFWXHVRXVDJLWDWLRQUDSLGHjO¶DLGHG¶XQURWRU-stator type Ultra-turrax® (T25, Ika) à 16 000 tr/min pendant 15 s. La première émulsion (W 1/O) est transférée dans un petit volume de phase aqueuse externe (W 2), soit 50 mL de solution de PVA à 1% et 0,43 g dH VDFFKDURVH DILQ G¶pTXLOLEUHU OD SUHVVLRQ RVPRWLTXHGHVGHX[SKDVHVDTXHXVHV/¶pPXOVLRQVHFRQGDLUH: 1/O/W 2 est réalisée VRXVDJLWDWLRQWUqVUDSLGHjO¶DLGHG¶XQURWRU-stator type Ultra-turrax®, à 24 000 tr/min SHQGDQWV$ILQGHSHUPHWWUHO¶H[WUDFWLRQSXLVO¶pYDSRUDWLRQGXVROYDQWRUJDQLTXH

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et la solidification des particules par précipitation du polymère, 150 mL iPrOH/H 2O (dont 10 mL iPrOH) sont additionnés, sous agitation mécanique type hélice marine, à 300 tr/min pendant 3 h. Les microparticules VRQW UpFXSpUpHV HW ODYpHV SDU ILOWUDWLRQ VRXV YLGH j O¶DLGH GH P/ G¶HDX Gp-ionisée. Enfin, elles sont séchées par lyophilisation (lyophilisateur W\SH 8VLIURLGŠ 60+   SRXU OLPLWHU DX PD[LPXP O¶KXPLGLWp UpVLGXHOOH j O¶LQWpULHXU des particules et la flexibilité de la protéine (qui peuvent augmenter la sensibilité de ODSURWpLQHDX[FRQGLWLRQVGpOpWqUHV >@DYDQWG¶rWUHVWRFNpHVj-25°C.

Figure 1 : Encapsulation par émulsion multiple avec extraction/évaporation de solvant

 9pULILFDWLRQ GH O¶LQWpJULWp GH OD SURWpLQH PRGqOH SDU VSHFWURPpWULH UV/Visible La myoglobine (Mb) est une protéine modèle de choix. En effet, cette hémoprotéine globulaire de petite taille (16 950 g.mol-1  DEVRUEH GDQV O¶899LVLEOH HW VH GLVWLQJXH des autres protéines par sa structure compacte et spécifique, organisée en huit régions hélicoïdales (8 hélices-D) de 153 acides aminés (AA) dans lesquelles se trouve enchâssé un atome de fer. Chacune de ces régions est désignée par une lettre capitale : A à H (Figure 2a), correspondant à la partie protéique : la globine.

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/DSDUWLHPROpFXODLUHHVWDSSHOpHO¶hème (groupement prosthétique chromophorique, )LJXUH E  UHQIHUPDQW O¶DWRPH GH IHU KH[DYDOHQW GHX[ OLDLVRQV DYHF OHV D]RWHV GX cycle porphyrique et deux liaisons avec des histidines) et maintenu par des liaisons non covalentes dans une « poche » relativement hydrophobe, à l'intérieur de la protéine [20]. La conformation native repliée est une structure rigide, stabilisée de manière non-covalente, par des interactions hydrophobes, des interactions électrostatiques, des liaisons hydrogène et des liaisons de Van der Waals [5,21]. a/

b/

Figure 2 : a/ Structure tertiaire, b/: formule chimique détaillée du groupement prosthétique de la 0\RJORELQHGHF°XU de cheval

&HWWH SURWpLQH SHUPHW OH WUDQVSRUW HW OH VWRFNDJH GH O¶R[\JqQH GDQV OHV WLVVXV VTXHOHWWLTXHV HW FDUGLDTXHV HQ IL[DQW O¶DWRPH G¶R[\JqQH VXU XQH GHV GHX[ OLDLVRQV Fe-histidine. Lorsque cette liaison est rompue, par réduction, la protéine peut fixer à FHW HQGURLW G¶DXWUHV PROpFXOHV GLDWRPLTXHV HW VH SUpVHQWHU VRXV GLIIpUHQWV pWDWV G¶R[\GDWLRQ VRLW )H2+ÎFe3+ÎFe4+  >@ 6RXV FHV GLIIpUHQWV pWDWV G¶R[\GDWLRQ O¶KqPHGHODSURWpLQHSHXWrWUHGLVVRFLp F¶HVW-à-GLUHSHUWHGHO¶KqPH HWDPRUFHUXQH dénaWXUDWLRQ6XLYDQWO¶pWDWG¶R[\GDWLRQGDQVOHTXHOVHWURXYHODSURWpLQHOHVSHFWUH G¶DEVRUSWLRQHVWGLIIpUHQW La structure tertiaire de la Mb, la présence de l'hème et son interaction avec le reste GH OD SURWpLQH V¶REVHUYHQW DLVpPHQW SDU VSHFWURPpWULH 89/Visible. Les résidus G¶DFLGHV DPLQpV DURPDWLTXHV $$$  DEVRUEHQW HQWUH  HW  QP OD PDMRULWp GH O¶DEVRUSWLRQ 89 j FHW LQWHUYDOOH GH ORQJXHXU G¶RQGH SURYLHQW HVVHQWLHOOHPHQW GH OD teneur en tryptophane (Trp) à 280nm et en tyrosine (Tyr). Le groupement FKURPRSKRUH FRQVWLWXDQW O¶KqPH VH FDUDFWpULVH SDU  EDQGHV VSpFLILTXHV GDQV OH domaine du visible (400-700 nm) : deux bandes de faible absorbance à 505 et 635 nm, communément nommées bandes QD et QE, et un fort pic à 409nm. Cette dernière bande est appelée la bande de SORET et correspond au cycle porphyrique GDQVOHTXHOO¶DWRPHGHIHUUHVWHOLpGHIDoRQFRYDOHQWHjXQHPROpFXOHG¶HDX VRLWIHU KH[DYDOHQW GLW j O¶pWDW IHUULTXH )H3+). La localisation des deux bandes Q permettra GHGpWHUPLQHUO¶pWDWG¶R[\GDWLRQGHODP\RJORELQH>-24]. 2.4. Caractérisation des microparticules x Taille moyenne des particules /D GLVWULEXWLRQ GH WDLOOH GHV SDUWLFXOHV )LJXUH   D pWp PHVXUpH j O¶DLGH G¶XQ granulomètre Coulter® Counter Multisizer (Beckman Coulter® LS 250). Chaque PHVXUHHVWHIIHFWXpHjSDUWLUGHPLFURSDUWLFXOHVGLVSHUVpHVGDQVGHO¶HDXGp-ionisée sous agitation. La taille des particules est exprimée par un diamètre moyen (en μm) en volume.

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x Morphologie interne et porosité de surface Les défauts ou porosité de la surface et la morphologie interne des microparticules ont été observés par microscopie électronique à balayage (MEB) (FEG Hitachi ® S 800). Les microsphères sont déposées sur des supports métallLTXHV j O¶DLGH GH ruban adhésif double-face. Elles peuvent être examinées par MEB à 10 ou 15 kV, DSUqVPpWDOOLVDWLRQSDUSXOYpULVDWLRQG¶XQHPLQFHFRXFKHG¶RU -150 Å). x

(IILFDFLWpG¶HQFDSVXODWLRQ ((

L'efficacité d'encapsulation (EE) est déterminée après extraction de protéines à partir de microparticules décrites par Al Haushey [11] par dosage colorimétrique selon la méthode standard de Bradford. Brièvement, 100 mg de microparticules séchées sont incubés dans 1mL de DCM pendant 2 h. Ensuite, la protéine est récupérée dans 2 mL de la phase aqueuse (PBS pH7,4) après 24 h sous agitation douce. La solution protéique est centrifugée pendant 10 min à 2700 g (centrifugeuse Eppendorf, modèle &  /H VXUQDJHDQW HVW FODULILp j O¶DLGH GH ILOWUHV VHULQJXH 5& (cellulose régénérée, 0,45 Pm), puis analysé selon Bradford. La teneur en protéine dans le VXUQDJHDQW HVW GpWHUPLQpH j SDUWLU G¶XQH FRXUEH G pWDORQQDJH j  QP VXU XQ intervalle de concentrations de 0,025 à 0,3 mg.mL-1. La calibration est construite à parWLU G¶XQ DOLTXRW GH  PL de solution protéique mélangée à 3 mL de réactif de %UDGIRUG /D PpWKRGH GH %UDGIRUG UHSRVH VXU OD UpDFWLRQ G¶XQ FRORUDQW %OHX GH Coomassie G 250) avec les protéines. Ce réactif prend une coloration bleutée lors de sa liaison à GHVUpVLGXVG¶$UJLQLQH $UJ HWGH/\VLQH /\V GHODSURWpLQHHQWUDvQDQW un déplacement de l'absorption maximale du colorant de 470 nm à 595 nm. Cette méthode colorimétrique est très reproductible et rapide (environ 10 min), la coloration reste stable pendant environ 45 min, mais surtout elle permet un dosage protéique indépendamment du repliement de la protéine. /¶((HVWFDOFXOpHSDUO¶pTXDWLRQVXLYDQWH : EE (%)

Quantité de Mb encapsulée (mg) u 100 Quantité de Mb introduite dans le procédé (mg)

3. RESULTATS ET DISCUSSION 3.1. Influence des paramètres de formulation sur la taille moyenne HWO¶HIILFDFLWp G¶HQFDSVXODWLRQ (( Les distributions de taille des particules obtenues dans des conditions opératoires variables sont montrées sur la figure 3. Les tailles moyennes et les EE sont reportées GDQV OH 7DEOHDX  '¶DSUqV OD ILJXUH  OD GLPLnution de la quantité de polymère et O¶DXJPHQWDWLRQGHODPDVVHPRODLUHGX3&/ 0Z j  - ou encore la modification de la viscosité de la phase organique - sont des facteurs qui influencent de façon significative la distribution granulométriqXH /¶DXJPHQWDWLRQ GH OD TXDQWLWp de polymère et/ou de sa masse molaire conduit à une augmentation significative de la taille moyenne. A volume constant en DCM (5 mL), la solution organique de PCL de masse molaire élevée (Mw = 65 000, soit M3) est plus visqueuse que celle du PCL de masse PRODLUH SOXV IDLEOH 0Z    VRLW 0  /¶DXJPHQWDWLRQ GH YLVFRVLWp UpGXLW

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O¶HIILFDFLWp G¶DJLWDWLRQ HW OD IUpTXHQFH GHV FROOLVLRQV HQWUH SDUWLFXOHV 8QH YLVFRVLWp importante va donc favoriser la fusion des particules préformées et la production de particules plus grosses (Tableau 1, respectivement 90,4 et 14,6 μm pour M3 et M1) [7,25-27]. La viscosité augmente également avec la quantité de PCL dans la phase organique, ainsi les mêmes observations que précédemment peuvent être faites (M2 comparée à M1 ou M4 comparée à M3, indépendamment de la masse molaire) [27]. (QILQODTXDQWLWpGHSURWpLQHjHQFDSVXOHUQ¶LQIOXHQFHSDVGHPDQLqUHVLJQLILFDWLYHOD taille moyenne des particules, les distributions granulométriques des essais M1 et M5 étant comparables. $IDLEOHFRQFHQWUDWLRQHQ3&/ ZYVRLW0HW0 O¶DXJPHQWDWLRQGHODPDVVH PRODLUH DPpOLRUH O¶(( UHVSHFWLYHPHQW  FRQWUH   /D PDWULFH SRO\PqUH SOXV dense permet de piéger une plus grande quantité de protéine. L¶DXJPHQWDWLRQGHOD YLVFRVLWpDPpOLRUHOHSLpJHDJHGHODSURWpLQHjO¶LQWpULHXUGHVPLFURSDUWLFXOHV>@FH qui se retrouve en comparant les EE des formules M1 et M2. A forte concentration en 3&/  ZY VRLW 0 HW 0  OHV UpVXOWDWV VRQW LQYHUVHV O¶DXgmentation de la PDVVHPRODLUHGLPLQXHO¶(('DQVFHFDVODYLVFRVLWpGHODSKDVHRUJDQLTXHHVWWHOOH que la dispersion des gouttes huileuses est difficile, comme en témoigne O¶DXJPHQWDWLRQ VLJQLILFDWLYH GH WDLOOH FRQGXLVDQW SUREDEOHPHQW j XQH pPXOVLRQ multiple hétérogène, avec une fuite importante de la protéine vers la phase aqueuse externe. /¶DXJPHQWDWLRQGHODFRQFHQWUDWLRQHQSURWpLQH >0E@ jPJP/ -1), conduit j XQH GLPLQXWLRQ LPSRUWDQWH GH O¶(( VDQV PRGLILFDWLRQ GH OD WDLOOH GHV SDUWLFXOHs. /¶K\SRWKqVH DYDQFpH HVW TXH OH UpVHDX SRO\PqUH Q¶HVW SOXV DSSURSULp SRXU HPSULVRQQHUFHWWHTXDQWLWppOHYpHGH0ERXTXHODTXDQWLWpGHVDFFKDURVHQ¶DVVXUH SOXV O¶pTXLOLEUH GH OD SUHVVLRQ RVPRWLTXH HQWUH OHV  SKDVHV DTXHXVHV DXJPHQWDQW ainsi les risques de fuite de protéine [26,28]. Pendant la solidification des microsphères, le solvant est extrait, puis évaporé (Figure 1). Le volume des microsphères diminuant, la protéine a alors tendance à migrer de la phase interne à OD SKDVH H[WHUQH HW j V¶DGVRUEHU j OD VXUIDFH GHV SDUWLFXOHV HQ V¶DFFXPXODQW DX[ LQWHUIDFHV VROLGHOLTXLGH HW HQ HQWUDQW HQ FRPSpWLWLRQ DYHF OH SRO\PqUH G¶HQUREDJH [5]. Par conséquent, la protéine se trouve moins bien piégée à l'intérieur des microparticules. On peut également considérer que les microsphères à forte teneur en protéine ont tendance à être plus poreuses et avoir une forme plus irrégulière [28]. Ce paramètre est à prendre en compte pour prévoir les propriétés de particules désirées. 3.2. Influence des paramètres de formulation sur la morphologie interne et la porosité de surface /¶HQVHPEOH GHV IRUPXODWLRQV GH PLFURVSKqUHV SUpSDUpHV SUpVHQWH XQH ERQQH sphéricité comme le montre les Figures 4 a-d avec une surface plus ou moins poreuse selon les cas (Tableau 1). Les particules fabriquées à partir de faible quantité de polymère comme les formulations M2 et M4 possèdent une surface un peu plus poreuse (Tableau 1 et Figures 4a et d, respectivement) que celles issues des formulations M1, M3 ou M5 (Figure 4c) plus concentrée en polymère. Cela peut être dû à deux facteurs : 1°/ les

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Figure 3 : Distributions de taille des particules (formulations M1à M5) mesurées par Coulter®

gouttelettes de phase interne dans la solution de PCL faiblement concentrée ont tendance à coalescer et conduisent à la formation de gros pores et à un réseau moins tortueux, 2°/ les solutions très concentrées en polymère coagulent plus rapidement au cours de la 2e émulsion et donnent une structure plus compacte de chaînes polymères enchevêtrées [27]. Tableau 1 3URSULpWpVGHSDUWLFXOHVHWO¶LQWpJULWpSURWpLTXHGHVIRUPXODWLRQVUpDOLVpHV Le degré de porosité se traduit par faiblement (+), moyennement (++) et fortement (+++). FORMULATIONS ÉCHANTILLONS

PROPRIETES DES PARTICULES

[Mb] (mg/mL)

Mw PCL (g/mol)

m PCL (g)

Taille moyenne (µm)

EE (%)

Morphologie interne

Porosité de surface

M1

100

14.000

2,5

14,6

36

Noyau creux

Lisse (++)

M2

100

14.000

1

2,7

10

Noyau creux

Rugueuse (+)

M3

100

65.000

2,5

90,4

21

1LGG¶DEHLOOH

Rugueuse (++)

M4

100

65.000

1

11,8

17

Noyau creux

Rugueuse (+++)

M5

200

14.000

2,5

13,7

21

Noyau creux

Lisse (++)

A concentration comparable en polymère mais pour une masse molaire plus élevée, la formulation M3 (Figure 4b et Tableau 1) révèle une morphologie interne très poreuse de type alvéolé ou QLG G¶DEHLOOH contrairement aux autres formulations de type capsule ou noyau creux )LJXUH D HW 7DEOHDX   TXL SHXW V¶H[SOLTXHU SDU OD viscosité très importante de la phase organique. Par ailleurs, O¶HPSORL GX 3&/ GH PDVVH PRODLUH SOXV pOHYpH FRPPH SRXU OHV formulations M3 et M4 (Figures 4b et d, respectivement), a conduit à des PLFURSDUWLFXOHVDYHFXQHVXUIDFHSOXVSRUHXVHSRXYDQWV¶H[SOLTXHUSDUXQHSHUWHGH stabilité de la 1ère émulsion et une coagulation du polymère plus rapide (Tableau 1) [27].

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a/

c/

b/

d/

Figure 4 : Photographies des particules obtenues par MEB avec (a) structure interne en noyau creux, E VWUXFWXUHHQQLGG¶DEHLOOH F VXUIDFHOLVVH G VXUIDFHWUqVSRUHXVH

3.3. 0LVHDXSRLQWGHODPpWKRGHGHFRQWU{OHGHO¶pWDWVWUXFWXUHOHWGXGRVDJH de la protéine /H VSHFWUH G¶DEVRUEDQFH GH OD 0E HQ VROXWLRQ WDPSRQ 3%6 S+  HVW UHSUpVHQWp sur la figure 5 et se caractérise par la présence des 4 bandes spécifiques de la protéiQH /¶HPSODFHPHQW GHV EDQGHV 4D et QEà 505 et 635 nm nous informe que O¶pWDWG¶R[\GDWLRQGXIHUKpPLTXHHVWFHOXLGHODMetmyoglobine ou Met-Mb.

Figure 5 6SHFWUHG¶DEVRUEDQFHFDUDFWpULVWLTXHGHOD0EVROXWLRQGDQVGX3%6S+jƒ&

113 _________________Cahiers de formulation (2011) Vol. 15_______________

Le contrôle de la conformation tertiaire de la protéine correctement repliée a été réalisé de manière originale par spectrométrie UV/Visible en passant par le calcul GHVSULQFLSDX[UDSSRUWVG¶DEVRUEDQFH'HVHVVDLVGHGpQDWXUDWLRQGHOD0ERQWpWp réalisés, afin de vérifier O¶DWWULEXWLRQ GHV EDQGHV VSpFLILTXHV HW O¶DOWpUDWLRQ GHV GLIIpUHQWV UDSSRUWV /¶DYDQWDJH GH FHWWH PpWKRGH HVW G¶DXJPHQWHU OD VHQVLELOLWp GX contrôle (pour plus de précision) et de pouvoir pallier un mauvais rapport signal/bruit dû à des erreurs systématiqXHVSHQGDQWOHVPHVXUHV>@/HFRQWU{OHV¶HIIHFWXHVXU la protéine libérée à partir de microsphères de PCL dans du PBS à pH 7,4 maintenu jƒ&VRXVDJLWDWLRQFRQVWDQWHHWGRXFH/DYpULILFDWLRQGHO¶LQWpJULWpSURWpLTXHHVW difficilement réalisable au cours du procédé en raison de la diffusion du solvant RUJDQLTXH HW GH OD SUpVHQFH GH EXOOHV G¶DLU IRUPpHV SHQGDQW OHV pPXOVLILFDWLRQV  /HV SULQFLSDX[ UDSSRUWV G¶DEVRUEDQFH VRQW $$ $$ $$ A280/A635 et A505/A635 sur un intervalle de concentrations de 0,025 à 0,25 mg/mL  LOV VRQW UHSRUWpV GDQV OH 7DEOHDX  6HXO OH UDSSRUW $$ Q¶HVW SDV exploité, car il correspond au rapport des deux absorbances extrêmes de la Mb et se distingue par un bruit sur la mesure important. La quantification de la protéine libérée DpWpIDLWHjODORQJXHXUG¶RQGHG¶DEVRUEDQFHPD[LPDOH QP DSUqVUpDOLVDWLRQ G¶XQHGURLWHG¶pWDORQQDJHVXUXQLQWHUYDOOHGHFRQFHQWUDWLRQVFRPSULVHQWUHHW 0,25 mg/mL. 3.4. Influence des paramètres de formulation suU O¶LQWpJULWp GH OD SURWpLQH modèle Comme le montre le tableau 2, la masse molaire du polymère employé est un SDUDPqWUHTXLLQIOXHQFHVLJQLILFDWLYHPHQWO¶pWDWFRQIRUPDWLRQHOGHODSURWpLQHOLEpUpH Le maintien de la conformation tertiaire de la protéine correctement repliée a pu être confirmé uniquement dans les formulations employant le PCL de masse molaire la SOXVIDLEOH 0Z  (QHIIHWO¶DXJPHQWDWLRQGHODPDVVHPRODLUHGXSRO\PqUHD induit une augmentation de la viscosité de la phase organique, de la densité de la PDWULFH SRO\PqUH 3DU FRQVpTXHQW OD YLWHVVH G¶pOLPLQDWLRQ GX VROYDQW HVW UDOHQWLH HWRXV¶HIIHFWXHGHPDQLqUHGLVFRQWLQXHHWEUXWDOH GpIDXWVGHVXUIDFH SURORQJHDQW le contact de la protéine avec le solvant organique. La formation de réseau polymère très poreux et tortueux dans le cas de la M3, peut également être envisagée rendant difficile la diffusion de la protéine hors des microsphères et soumettant cette dernière jGHVGLVWRUVLRQVGpVWDELOLVDWULFHVFDSDEOHVG¶LQGXLUHVRQGpSOLDJH [29]. Tableau 2 &RQWU{OHGHO¶LQWpJULWpSURWpLTXHGHVIRUPXODWLRQVUpDOLVpHV /¶LQWpJULWpSURWpLTXHVHGpILQLW SDUO¶REWHQWLRQG¶XQVSHFWUHUDSSRUWVG¶DEVRUEDQFHpTXLYDOHQWVjO¶pWDWQDWLI (z) HWODSHUWHG¶LQWpJULWp SDUXQVSHFWUHG¶DEVRUEDQFHPRGLIié UDSSRUWVG¶DEVRUEDQFHQRQpTXLYDOHQWV ({) (* protéine libérée après 48 heures à 25°C dans PBS pH 7,4 sous agitation douce) FORMULATIONS ÉCHANTILLONS

A409 /A280

A280 /A505

A280 /A635

A409 /A505

A505 /A635

INTEGRITE PROTEIQUE*

2,5

4,8

3,6

10,1

17,5

2,8

z

1

4,9

3,5

10,4

17

2,9

z

65.000

2,5

0,0

49,3

12,4

1,2

0,3

{

100

65.000

1

2,7

4,8

12,2

13

2,6

{

200

14.000

2,5

4,7

3,6

9,9

17

2,8

z

4,7-5

3,2-3,6

8,5-11

15,8-17,9

2,6-3,1

[Mb] (mg/mL)

Mw PCL (g/mol)

m PCL (g)

M1

100

14.000

M2

100

14.000

M3

100

M4 M5

Mb en solution dans du PBS pH7.4 à 25°C

114 _________________Cahiers de formulation (2011) Vol. 15_______________

4. CONCLUSION &H WUDYDLO SUpVHQWH OD PLVH DX SRLQW G¶XQH PpWKRGH G¶DQDO\VH SHUPHWWDQW VLPXOWDQpPHQW GH TXDQWLILHU OD P\RJORELQH HW G¶DSSUpFLHU O¶pWDW GH VD FRQIRUPDWLRQ tertiaire. La quantification est réaliVpH j OD ORQJXHXUG¶RQGH G¶DEVRUEDQFH PD[LPDOH WDQGLVTXHODYpULILFDWLRQGHODFRQIRUPDWLRQVHEDVHVXUOHVUDSSRUWVG¶DEVRUEDQFH &HWWH PpWKRGH SUpVHQWH O¶DYDQWDJH G¶rWUH QRQ LQYDVLYH VHQVLEOH HW UDSLGH G¶XWLOLVDWLRQ/¶HPSORLGHVUDSSRUWVG¶DEVRUEDQFHSHUPHWG¶DXJPHQWHUODVHQVLELOLWpGX contrôle. Son développement a permis de mettre en évidence la préservation de la FRQIRUPDWLRQ QDWLYH GH OD SURWpLQH DX FRXUV GX SURFpGp G¶HQFDSVXODWLRQ GDQV OHV FRQGLWLRQVRSWLPDOHV(QILQO¶XWLOLVDWLRQSRO\PqUH3&/GH masse molaire élevé est le paramètre essentiel conduisant à la dénaturation de la protéine modèle.

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Influence des Conditions Hydrodynamiques sur la Microencapsulation de Parfum en Réacteur Semi-Fermé Sophie RABEAU1, Laurent FALK2, Céline FROCHOT3 ²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²²1. IRCOF, UMR 6811, Cobra LHO, 1 rue Tesnière, 76130 Mont-Saint-Aignan 2. Laboratoire Réactions et Génie des Procédés, CNRS-INPL, Nancy Université, ENSIC, 1 rue Grandville, 54001 Nancy Cedex, France 3. Département de Chimie Physique des Réactions, UMR 7630 CNRS-INPL, Nancy Université, ENSIC, 1, rue Grandville, BP 20451, 54001 Nancy Cedex, France * laurent.falk(@)ensic.inpl-nancy.fr

RESUME :

&HWWH pWXGH FKHUFKH j PHWWUH HQ pYLGHQFH O¶LQIOXHQFH GHV FRQGLWLRQV hydrodynamiques sur la structure de membrane de microcapsules obtenues par précipitation/inversion de phase. La microencapsulation a été réalisée dans un réacteur semi-fermé. Le principe actif encapsulé est un modèle multiconstituant : le parfum. L'influence des conditions hydrodynamiques sur le processus de formation de membrane a été suivie en variant la vitesse d'agiWDWLRQ DLQVL TXH OH SRLQW G¶LQMHFWLRQ /D VWUXFWXUH GHV PHPEUDQHV D pWp DQDO\VpH j O¶DLGH G¶XQ PLFURVFRSH pOHFWURQLTXH j EDOD\DJH 0(%  /D principale conséquence des variations des conditions hydrodynamiques semble être la variation de la taille des microcapsules.

MOTS-CLES :

Microencapsulation, parfum, réacteur semi-fermé

1. INTRODUCTION Depuis ces dernières années, les microcapsules ont fait leur apparition dans de QRPEUHX[ GRPDLQHV G¶DSSOLFDWLRQV DXVVL GLYHUV HW YDULpV TXH OHV FRVPpWLTXHV O¶LQGXVWULH SKDUPDFHXWLTXH O¶DJURDOLPHQWDLUH OHV HQFUHV RX ELHQ HQFRUH OHV HQJUDLV [1,2]. La microencapsulation est une technologie à laquelle a recours un grand QRPEUHG¶LQGXVWULHVLPSOLTXpHVGDQVODIDEULFDWLRQGHSURGXLWVIRUPXOpV(OOHFRQVLVWH à incorporer un ou plusieurs ingrédients dans une petite sphère creuse ou poreuse de 10 à 500 PPGHGLDPqWUH&HVLQJUpGLHQWVVRQWDORUVSURWpJpVGHO¶HQYLURQQHPHQW et peuvent être libérés hors de la microsphère dans des conditions précises de pH, GH WHPSpUDWXUH RX G¶DXWUHV VWUHVV VSpFLILTXHV /HV SURFpGpV GH IDEULFDWLRQ VRQW basés sur un grand nombre de principes physiques différents. /¶H[WUDFWLRQpYDSRUDWLRQ GH VROYDQW HVW WRXMRXUV OH SOXV ODUJHPHQW XWLOLVp Les procédés actuellement en place sur les sites de production sont des procédés FRQWLQXVRXGLVFRQWLQXVPLVHQ°XYUHGDQVGHVUpDFWHXUVGH grand volume (~5000 L). Dans ce cas, le processus de formation de la microsphère est peu ou mal contrôlé ce qui entraîne la production de lots de microsphères très hétérogènes pSDLVVHXUV HW SRURVLWpV GH OD PHPEUDQH UHQGHPHQWV G¶HQFDSVXODWLRQ GLDPqWUHV des capsules et cinétiques de libération). La plupart du temps, la microencapsulation est améliorée grâce à la formulation et DX[SDUDPqWUHVGHSURFpGpV3DUH[HPSOH/LHWFROO>@RQWPRQWUpO¶LPSRUWDQFHGHV HIIHWVGXUDSSRUWGHSKDVHVGHODYLWHVVHG¶ajout des phases, de la température, du chauffage et de la fraction volumique de solvant sur les propriétés des microsphères. De plus, Freitas et coll. [4] ont passé en revue les différentes technologies industrielles qui permettent la production de microsphères par la méthode G¶H[WUDFWLRQpYDSRUDWLRQ GH VROYDQW &HSHQGDQW PrPH VL O¶LQIOXHQFH GH TXHOTXHV

__________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________ 117

YDULDEOHV GX SURFpGp D pWp pWXGLpH O¶pWXGH GHV HIIHWV GHV FRQGLWLRQV K\GURG\QDPLTXHV Q¶HVW SDV FRPSOqWH 'H SOXV OD UHODWLRQ HQWUH OD VWUXFWXUH GH OD membrane et les variables du procédé ont été très peu étudiées LOQ¶H[LVWHSDVGH corrélation pour les microsphères, bien que ce soit un paramètre clé déterminant OHXUV SURSULpWpV G¶XVDJH 6HXOV TXHOTXHV PRGqOHV RQW pWp SURSRVpV SRXU GpFULUH OD formation de membranes polymères planes obtenues par inversion/précipitation dans des conditions statiques [5-7]. $LQVL O¶REMHFWLI GH FHWWH pWXGH HVW GH FDUDFWpULVHU O¶LQIOXHQFH GHV FRQGLWLRQV hydrodynamiques, lors de la fabrication des microcapsules, sur la structure de leur membrane et sur les propriétés de libération.

2. METHODES EXPERIMENTALES 2.1 Matériel Le tétrahydrofurane (THF, anhydre 99.9%, ROTH, 109-99-9  HW  O¶HDX GLVWLOOpH VRQW utilisés respectivement comme un solvant et un non-solvant du polymère. Le polyméthacrylate de méthyle (PMMA, masse molaire en poids (Mw) ~ 15 000 g.mol-1, Aldrich, 9011-14-7) sert à fabriquer la membrane des capsules et un parfum non PLVFLEOH j O¶HDX % 3URFWHU  *DPEOH 0DQFKHVWHU 8.  HVW XWLOLVp SRXU O¶HQFDSVXODWLRQ/¶DOFRROpolyvinylique (PVA, 87-90% hydrolysé, Mw ~ 30 000 - 70000 g.mol-1, Sigma-Aldrich, 9002-89- MRXHOHU{OHG¶DJHQWVWDELOLVDQWGHODVXVSHQVLRQ de microsphères. 2.2

Méthodes

La phase aqueuse (eau + 1.5%w PVA) est placée dans un réacteur de 0.9L maintenu à 3ƒ&HW DJLWp DYHF XQH WXUELQH 5XVKWRQ )LJXUH   $YDQW G¶DMRXWHU OD VROXWLRQ OH WX\DX G¶LQMHFWLRQ HVW UHPSOL GH SKDVH RUJDQLTXH MXVTX j OD YDQQH et un courant G¶D]RWH FLUFXOH GDQV OH WX\DX HQWUH OD YDQQH HW OH SRLQW G¶LQMHFWLRQ DILQ G¶pYLWHU OD remontée G¶HDX GDQV OH WX\DX TXL HQWUDvQHUDLW VRQ ERXFKDJH SDU FRQWDFW DYHF OH SRO\PqUH 3XLV OH WX\DX G¶LQMHFWLRQ HVW SODFp VRLW DX-dessus soit au-dessous de la surface libre.

Figure1 : Schéma du procédé de microencapsulation par précipitation/inversion de phase

118 __________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________ Ensuite, la phase organique contenant le polymère (PMMA), le parfum et un colorant HVWDMRXWpSURJUHVVLYHPHQWjODSKDVHFRQWLQXHMXVTX¶jDWWHLQGUHOHUDSSRUWGHSKDVH de 1/9 en phase organique. La suspension résultante est maintenue sous agitation pendant 1h30 pour permettre le bon déroulement du transfert du THF. Ensuite, la suspension est filtrée sur un filtre de 0,6 Pm et simplement séchée entre deux feuilles de papier filtre afin de ne pas détériorer les capsules. 2.3 Paramètres étudiés Plusieurs paramètres liés aux conditions hydrodynamiques ont été étudiés : la YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ HQWUH  HW  WUPLQ-1 ce qui, compte tenu de la faible dimension de la cuve agitée, conduit à un UpJLPHG¶DJLWDWLRQHQUpJLPHLQWHUPpGLDLUH (3.103 < Re < 104) ; lDSRVLWLRQGXWX\DXG¶LQMHFWLRQGHODSKDVHRUJDQLTXHSODFpGH manière immergée ou non ODSUpVHQFHRXO¶DEVHQFHGHFKLFDQHs et le diamètre du tuyau (0,1 et 1 mm). 2.4

Caractérisation

Les images de chutes de gouttes au-dessus de la surface libre sont prises grâce à une caméra rapide (VNR 250, SYSmat Industrie). Les sections transversales des microsphères sont observées au microscope électronique à balayage (MEB, T330A, JEOL, F). À cette fin, les microsphères sont gelées dans l'azote liquide, puis, fracturées et métallisées avec de l'or sous pression réduite. La détermination de la distribution de taille est faite par diffractométrie laser (Mastersizer S, Malvern UK). La porosité des microsphères est mesurée par un pycnomètre à hélium (Accupyc 1330, Micromeritics) et la densité apparente est ensuite calculée. &RPPH O¶XQ GHV FRQVWLWXDQWV GX SDUIXP HVW XQ IOXRURSKRUH TXLIOXRUHVFH à 410 nm ORUVTX¶LO HVW H[FLWp j  QP XQH PpWKRGH GH GRVDJH SDU VSHFWURVFRSLH GH fluorescence a été développée. Les mesures sont faites par la redissolution des capsules dans le DMF. Nous supposons ici que le fluorophore est représentatif du parfum. De pOXVOHSDUIXPHQFDSVXOpDODSURSULpWpGHIOXRUHVFHUORUVTX¶LOHVWH[FLWpj 800 nm en biphoton. Après avoir pris soin de vérifier que les autres constituants des PLFURVSKqUHVQHIOXRUHVFHQWSDVjFHWWHORQJXHXUG¶RQGHG¶H[FLWDWLRQOHPLFURVFRSH confocal a permis de localiser le parfum dans la microsphère. L'humidité résiduelle dans les microsphères a été évaluée quantitativement par l'analyse de Karl-Fischer et la cinétique de libération de parfum a été suivie par PHVXUHGHODYDULDWLRQGXSRLGVG¶pFKDQWLOORQVFRQVHUYpVjO¶pWXYHjƒ& 3. RESULTATS ET DISCUSSION 3.1 ,QIOXHQFHGXPRGHG¶LQMHFWLRQ Un des points principaux de cette microencapsulation est l'incorporation d'une phase dispersée moins dense dans une phase continue plus dense. Grâce aux images prises avec une caméra rapide (Figure 2), quand la phase dispersée a été injectée au-dessus de la surface, nous voyons que les microsphères restent au voisinage de la surface libre. Dans cette zone, les gradients de vitesse sont très faibles et non

__________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________ 119

constantVFHTXLH[SOLTXHTX¶LOHVWGLIILFLOHGHFRQWU{OHUODGLVWULEXWLRQJUDQXORPpWULTXH des microsphères.

4 cm

)LJXUH&KXWHG¶XQHJRXWWHGHSKDVHGLVSHUVpHjODVXUIDFHGHODSKDVHFRQWLQXH (1/25 s entre chaque image)

Les distributions cumulées de taille des capsules faites dans différentes conditions (Figure 3a) (au-GHVVXVGHODVXUIDFHOLEUHRXDXF°XUGHODSKDVHDTXHXVHDYHFRX VDQV FKLFDQHV  PRQWUHQW FODLUHPHQW O¶LQIOXHQFH GHV FRQGLWLRQV G¶LQMHFWLRQ /HV distributions pour les injections sous la surface libre semblent être décalées vers les SOXVSHWLWVGLDPqWUHV/DJUDQXORPpWULHPRQWUHTXHO¶LQMHFWLRQGHODSKDVHGLVSHUVpH DXF°XUGXUpDFWHXUSHUPHWGHSURGXLUHGHVFDSVXOHVSOXVSHWLWHVTXHORUVTX¶HOOHHVW injectée au-dessus du mélange, tandis que la polydispersité reste du même ordre.

Figure 3a : Distributions granulométriques de capsules faites à 400tr/min dans différentes conditions G¶LQMHFWLRQ

'¶DSUqVOHVLPDJHVGHODILJXUHELODSSDUDvWTXHODPHPEUDQHHVWPRLQVSRUHXVH quand la solution organique est injectée à l'intérieur du réacteur. (a)

(b)

Figure 3b : Images de capsules faites à 400 tr/min avec une injection de la phase dispersée audessus de la surface D HWDXF°XUGXUpDFWHXU E

120 __________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________ LH SULQFLSDO DYDQWDJH GH O¶LQMHFWLRQ VRXV OD VXUIDFH HVW OD GLPLQXWLRQ GHV SHUWHV GH PDWLqUHVXUO¶DJLWDWHXURXDXQLYHDXGHODVXUIDFHOLEUH(QHIIHWDYHFO¶LQMHFWLRQDXdessus de la surface libre, il se forme un film de polymère à la surface qui contribue à XQH SHUWH GH PDWLqUH LPSRUWDQWH SRXYDQW DWWHLQGUH  DORUV TX¶DYHF O¶LQMHFWLRQ DX F°XUGXUpDFWHXUHOOHQHGpSDVVHSDVOHV 3.3

Influence des paramètres hydrodynamiques

La figure 4 donne la distribution de taille de capsules réalisées à trois vitesses G¶DJLWDWLRQ GLIIpUHQWHV   HW  WUPLQ  DYHF LQMHFWLRQ VRXV OD VXUIDFH OLEUH Les distributions granulométriques obtenues à 400 et 800 tr/min sont quasiment superposées tandis que celle obtenue à 175 tr/min est décalée vers les plus grands diamètres. Les valeurs du diamètre médian D50 sont respectivement de 100 Pm à N= 175 tr/min, 20 Pm à 400 tr/min et 12 Pm à 800 tr/min. Le diamètre médian varie sensiblement selon une loi puissance - DYHF OD YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ TXL LOOXVWUH O¶LPSDFWLPSRUWDQWGHVFRQGLWLRQVG¶DJLWDWLRQVXUODJUDQXORPpWULHGHVFDSVXOHV

Figure 4 'LVWULEXWLRQVJUDQXORPpWULTXHVGHFDSVXOHVIDLWHVjGLIIpUHQWHVYLWHVVHVG¶DJLWDWLRQ SRXUXQHLQMHFWLRQDXF°XUGXUpDFWHXU

La figure 5 présente les distributions granulométriques cumulées en présence ou non de chicanes, pour GHX[ GLDPqWUHV GH WXEHV GµLQMHFWLRQ HW SRXU OHV WURLV YLWHVVHV G¶DJLWDWLRQ SUpFpGHQWHV 6HORQ OD ILJXUH D OHV FDSVXOHV IDLWHV j IDLEOH YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ GH  WUPLQ VRQW VHQVLEOHPHQW LGHQWLTXHV : la présence ou non de chicanes et le diamètre du tubHG¶LQMHFWLRQQ¶RQWSDVG¶LQIOXHQFH '50 = 108 - 138 Pm). 3RXU XQH YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ GH  WUPLQ ILJXUH E  HW  WUPLQ ILJXUH F  RQ retrouve les mêmes tendances que dans la figure 4 selon laquelle le diamètre est fortement influencé par la vitesVH G¶DJLWDWLRQ '50 = 20 - 83 Pm, pour 400 tr/min et D50= 13 - 51 Pm, pour 800 tr/min). On note cependant que, pour un diamètre G¶LQMHFWLRQ GH PP OD GLIIpUHQFH HQWUH OHV GLVWULEXWLRQV HVW SOXV PDUTXpH ; la présence ou non de chicanes semble avoir un impact beaucoup plus important. /¶DEVHQFHGHFKLFDQHVSHUPHWHQHIIHWGHGLPLQXHUGHPDQLqUHQRWDEOHODWDLOOHGHV FDSVXOHVJUkFHjODSUpVHQFHG¶XQYRUWH[ A l'aide des mesures réalisées au granulomètre et de celles faites au pycnomètre, il est possible de faire une première estimation de l'épaisseur de la membrane des PLFURFDSVXOHV 3RXU FHOD QRXV DYRQV VXSSRVp G¶XQH SDUW TXH OD PHPEUDQH

__________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________ 121

entièrement constituée de PMMA est non-poreuse et que toute la porosité est due à OD FDYLWp LQWHUQH HW G¶DXWUH SDUW TXH les microcapsules sont, dans un même lot, toutes identiques : même diamètre et même épaisseur de paroi membranaire. Dans ces conditions, la porosité H de l'échantillon peut être calculée selon :

(a)

(b)

(c)

Figure 5 : Distributions granulométriques de capsules faites dans différentes conditions K\GURG\QDPLTXHVSRXUXQHLQMHFWLRQDXF°XUGXUpDFWHXUHWSRXUOHVWURLVYLWHVVHVG¶DJLWDWLRQ étudiées. (a-175 tr/min, b-400 tr/min et c- 800tr/min)

122 __________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________

où, Uapparent est la masse volumique mesurée au pycnomètre (g.cm -3), UPMMA celle du PMMA et Ucavite celle du ou des produits contenus à l'intérieur des microcapsules (THF et parfum). Les capsules peuvent être dans trois états différents: i) les pores sont vides après la libération totale du THF et du parfum, ii) les pores ne contiennent pas de parfum mais sont pleins de THF, enfin, iii) les pores ne contiennent pas de THF et sont pleins de parfum. D'après la définition de la porosité et en supposant que la membrane des particulHVHVWGHQVHRQREWLHQWO¶pTXDWLRQVXLYDQWH Rint RextH 1/ 3 où, Rint est le rayon interne des microsphères et Rext leur rayon externe. /D ILJXUH  UHSUpVHQWH O¶pSDLVVHXU UHODWLYH DX GLDPqWUH HQ YROXPH GHV FDSVXOHV HQ IRQFWLRQGHODYLWHVVHG¶Dgitation. Quelles que soient les hypothèses considérées, on QRWH XQ HIIHW VHQVLEOH GH OD YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ VXU O¶pSDLVVHXU QRUPpH GHV PHPEUDQHV3OXVODYLWHVVHG¶DJLWDWLRQHVWLPSRUWDQWHSOXVODPHPEUDQHHVWILQHHW moins les autres paramètres sembleQWDYRLUG¶LQIOXHQFH

Figure 6 : Epaisseur de membrane calculée normée par la taille des microspheres (D 4,3) dans O¶K\SRthèse de capsules pleine de THF

Les images MEB (Figures 7 - 10) confirment cette idée. En effet, dans la plupart des FRQGLWLRQVOHVFDSVXOHVSUpVHQWHQWXQHPHPEUDQHGHQVHHWXQF°XUQRQSRO\PpULVp /DSRURVLWpVHPEOHDXVVLGLPLQXHUDYHFODYLWHVVHG¶DJLWDWLRQ/HVFDSVXOHVIDLWHVj 175 tr/min sont les plus poreuses.

Figure 7 : Images MEB des capsules faites à 175 (a), 400 (b) et 800 (c) tr/min dans un réacteur non-chicané avec uQGLDPqWUHG¶injection de 0,2mm

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Figure 8 : Images MEB des capsules faites à 175 (d), 400 (e) et 800 (f) tr/min dans un réacteur chicané avec uQGLDPqWUHG¶LQMHFWLRQGHPP

Figure 9 : Images MEB des capsules faites à 175 (g), 400 (h) et 800 (i) tr/min dans un réacteur non-chicané avec XQGLDPqWUHG¶LQMHFWLRQGHPP

Figure 10 : Images MEB des capsules faites à 175 (j), 400 (k) et 800 (l) tr/min dans un réacteur chicané avec XQGLDPqWUHG¶LQMHFWLRQGHPP

/D ILJXUH  SUpVHQWH OH WDX[ G¶HQFDSVXODWLRQ HQ IRQFWLRQ GH OD YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ /HV SRLQWV VRQW DVVH] GLVSHUVpV DXWRXU G¶XQH PrPH YDOHXU W[encapmoyen = 65%). La YLWHVVHG¶DJLWDWLRQDLQVLTXHODSUpVHQFHRXQRQGHFKLFDQHHWOHGLDPqWUHG¶LQMHFWLRQ Q¶RQWSDVG¶LQIOXHQFHVLJQLILFDWLYHVXUOHWDX[G¶HQFDSVXODWLRQ La figure 12 présente les cinétiques de perte de masse de deux échantillons de FDSVXOHVREWHQXHV jPrPH YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ VDQV FKLFDQHV HW GHX[ GLDPqWUHVGH WXEHVG¶LQMHFWLRQVGRQWOHVFRXUEHVJUDQXORPpWULTXHVRQWpWpSUpVHQWpHVILJXUHE On distingue que les courbes de perte de masse présentent deux régimes cinétiques WUqV GLIIpUHQWV 'DQV OHV SUHPLHUV LQVWDQWV MXVTX¶j HQYLURQ  j  KHXUHV LO \ D XQ régiPHFLQpWLTXHUDSLGHTXLFRUUHVSRQGjODSHUWHG¶HDXDGVRUEpHVXUOHVFDSVXOHV : les valeurs des pertes de masses sont en bon accord avec les valeurs mesurées de la teneur en eau par la méthode Karl-Fischer. Par ailleurs les capsules réalisées avec un tube de 1 mm de diamètre présentent une teneur en eau plus faible que les capsules obtenues avec un tube de 0,2 mm (16% contre 27%).

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Figure 11 : 9DULDWLRQVGXUHQGHPHQWG¶HQFDSVXODWLRQHQIRQFWLRQGHODYLWHVVHG¶DJLWDWLRQ pour différentes conditions hydrodynamiques 120,0

perte de masse normée (%)

100,0

80,0

60,0

40,0

20,0

1mm-400 tr/min 0,2mm-400 tr/min

0,0 0,1

1

10

100

1000

Temps (h)

Figure 12 : Cinétiques de désorption de capsules faites à 400 tr/min sans chicane DYHFGHVGLDPqWUHVG¶LQMHFWLRQGLIIpUHQWV

On obtient après un temps de 15 h un deuxième régime cinétique complètement stabilisé et plus lent. Il est identique pour les deux échantillons obtenus, ce qui est en accord avec les observations visuelles des capsules selon lesquelles les morphologies des capsules et des membranes polymères sont identiques quelles TXHVRLHQWOHVFRQGLWLRQVG¶DJLWDWLRQHWG¶LQMHFWLRQ 3.4 Localisation du parfum dans les capsules La position des entités chimiques à l'intérieur des microsphères constitue un élément clé pour identifier leur comportement au contact des diverses phases. Ainsi, les microcapsules ont été analysées au moyen d'un microscope confocal à fluorescence. Les images suivantes (Figure 13) montrent, de façon surprenante, que la majeure

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partie des constituants du parfum est localisée dans la paroi et non dans le coeur de microcapsules. Ces résultats tendent à établir la capacité des entités chimiques du SDUIXPWDQWjrWUHVWRFNpHVTX¶jrWUHWUDQVSRUWpHVjWUDYHUVODPHPEUDQHSRO\PqUH

Figure 13 : Images obtenues par microscopie confocale de microcapsules faites à 175 (a), 400 (b) et 800 (c WUPLQDYHFXQHLQMHFWLRQGHODSKDVHRUJDQLTXHDXF°XUGXUpDFWHXU

4. CONCLUSION 'XUDQW FHWWH pWXGH RQ D PLV HQ pYLGHQFH O¶LPSRUWDQFH GHV FRQGLWLRQV hydrodynamiques sur la qualité de microcapsules obtenues par extraction/évaporation du solvant. PRXUFHODRQV¶HVWSOXVSDUWLFXOLqUHPHQWLQWpUHVVp jODYLWHVVHG¶DJLWDWLRQjODSUpVHQFHRXQRQGHFKLFDQHVDXGLDPqWUHG¶LQMHFWLRQHW DXSRLQWG¶LQMHFWLRQGHODSKDVHRUJDQLTXH &HWWH pWXGH D PRQWUp TXH OD SRVLWLRQ UHODWLYH GX SRLQW G¶LQMHFWLRQ GH OD phase organique par rapport à la surface libre de la phase aqueuse dans le réacteur est de première importance dans la définition de la structure du produit final. En effet, les capsules obtenues avec une injection au-dessus de la surface libre ont un diamètre SOXVLPSRUWDQWHWVRQWSOXVSRUHXVHVTXHFHOOHVIDLWHVDYHFXQHLQMHFWLRQDXF°XUGH la phase organique. On peut donc conclure grâce à ces résultats qu'il est de haute LPSRUWDQFHG¶DMRXWHUODVROXWLRQGHSRO\PqUHjO LQWpULHXUGHODSKDVHDTXHXVHHWQon pas au-dessus de la surface de la phase continue. / DGGLWLRQGHODVROXWLRQGHSRO\PqUHDXF°XUGHODFXYHDJLWpHSHUPHWGHFRQWU{OHU les propriétés des microcapsules en faisant varier les conditions hydrodynamiques. &HSHQGDQW LO DSSDUDvW TXH VHXOH OD YLWHVVH G¶DJLWDWLRQ D XQ LPSDFW UHODWLYHPHQW signifiFDWLIVXUODWDLOOHGHVFDSVXOHV$LQVLORUVTXHODYLWHVVHG¶DJLWDWLRQSDVVHGH WUPLQ j  WUPLQ OD WDLOOH GHV FDSVXOHV DXJPHQWH G¶HQYLURQ XQ IDFWHXU  '¶DXWUH SDUW DXFXQH GHV FRQGLWLRQV K\GURG\QDPLTXHV pWXGLpHV LFL Q¶D G¶HIIHW VLJQLILFDWLI VXU OHV SURSULpWpV WDX[ G¶HQFDSVXODWLRQ VWUXFWXUH GHV FDSVXOHV«  (Q UpDOLWp O¶DQDO\VH GHVWHPSVFDUDFWpULVWLTXHVGHO¶H[WUDFWLRQGX7+) -11 m.s-1 dans le PMMA) montre que la diffusion à travers la membrane de PMMA devient le phénomène limitant par rapporW DX WUDQVIHUW GH PDWLqUH H[WHUQH j OD FDSVXOH ORUVTXH O¶pSDLVVHXU GH OD membrane atteint quelques micromètres, au bout de quelques secondes. Après ces TXHOTXHVVHFRQGHVLOQ¶HVWSOXVSRVVLEOHG¶LQIOXHQFHUODYLWHVVHG¶H[WUDFWLRQGX7+) et donc de modifier le processus de formation interne de la membrane et donc de sa PRUSKRORJLH $LQVL LO VHUDLW LQWpUHVVDQW G¶DGDSWHU OD FXYH DJLWpH j OD SUREOpPDWLTXH de la microencapsulation en utilisant des micromélangeurs, pour lesquels le temps de contact entre les deux phases est extrêmement court.

126 __________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15__________________ 5. REMERCIEMENTS Région Lorraine pour le financement de la thèse de S. Rabeau, D. Dumas, pour les images au microscope confocal à fluorescence, Plateau d'Imagerie et de Biophysique Cellulaire et Tissulaire, Faculté GH0pGHFLQH9DQG°XYUH-lès-Nancy, France.

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Nanoparticules biodégradables produites à partir de polysaccharides amphiphiles Cécile NOUVEL, Michèle LEONARD, Emmanuelle MARIE, Edith DELLACHERIE, Jean-Luc SIX, Alain DURAND* ————————————————————————————————————Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire, CNRS – Nancy-Université ENSIC, 1 rue Grandville, BP 20451, 54001 Nancy cedex 01 * [email protected]

RESUME : Les particules polymères submicroniques trouvent des applications dans le domaine de l’encapsulation de molécules actives. Le cœur des particules doit être constitué d’un polymère peu polaire, biodégradable et susceptible de contenir une quantité convenable de la substance à administrer. La surface des particules doit avoir un caractère hydrophile afin d’assurer leur dispersion dans le milieu physiologique. Cette surface doit aussi empêcher l’action du système immunitaire en réduisant au minimum l’adsorption non-spécifique de protéines à la surface des particules. Enfin, cette surface peut aussi selon les cas être à l’origine d’une reconnaissance spécifique des particules au niveau de certaines cellules. Les procédés d’élaboration de nanoparticules de type cœur-couronne sont d’abord présentés de façon générale. Puis les nanoparticules comportant des chaînes de polysaccharide (soit dans le cœur hydrophobe, soit dans la couronne hydrophile) sont examinées de façon plus détaillées. Plusieurs exemples d’études menées au Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire sont ensuite décrits. Les liens entre la structure chimique des polysaccharides (natifs ou modifiés) utilisés et les propriétés physico-chimiques des nanoparticules obtenues sont soulignés.

MOTS-CLES : nanoparticules, polysaccharide, poly(acide lactique), encapsulation.

1. INTRODUCTION Dans ce qui suit, le terme « nanoparticules » sera employé pour désigner des particules dont le diamètre moyen est inférieur à 1 mm et, dans la plupart des cas, compris entre 50 et 500 nm. Les nanoparticules polymères entrent dans la composition de formulations alimentaires, cosmétiques, biomédicales. Du fait de leur domaine de taille, le rapport surface sur volume est très élevé, ce qui fait que le comportement des suspensions aqueuses de nanoparticules est largement contrôlé par leurs propriétés de surface. Ces dernières peuvent être ajustées de différentes façons, l’une d’entre elles consistant à fixer des chaînes macromoléculaires en surface des particules soit par ancrage covalent, soit par enchevêtrement physique avec le matériau de cœur, soit encore par adsorption physique superficielle. Nous nous limiterons ici au cas des nanoparticules de type cœur – couronne (figure 1) associant un cœur dense polymère à caractère hydrophobe (dont le diamètre est de quelques centaines de nm) à une couronne hydrophile plus diffuse formées de boucles de macromolécules (avec une épaisseur de l’ordre de la dizaine de nm). Les caractéristiques principales de la couche superficielle sont : la densité et l’épaisseur du recouvrement, toutes les deux liées à la conformation des macromolécules adsorbées (en boucles, en brosse…) et à leur structure chimique (nature des unités

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de répétition, architecture, masse molaire…). Cette couche superficielle a un rôle essentiel pour plusieurs aspects : 1) le maintien de la stabilité colloïdale dans des milieux de force ionique élevée (un milieu physiologique a une force ionique proche de 0,15 mol/L), 2) la limitation de l’adsorption non-spécifique d’autres macromolécules (protéines par exemple), 3) le développement d’interactions spécifiques avec des récepteurs présents sur les organes visés. Cette dernière propriété peut induire une accumulation préférentielle des nanoparticules au voisinage immédiat de la zone à traiter, augmentant ainsi nettement l’efficacité du médicament (vectorisation).

Figure 1 : Représentation schématique d’une particule cœur-couronne.

Le matériau constituant le cœur des particules a aussi son importance sur les propriétés obtenues, tant par sa nature chimique que par sa morphologie. D’une part, la molécule encapsulée doit présenter une affinité pour ce matériau, de sorte qu’elle puisse y être incorporée en quantité suffisante. D’autre part, la molécule encapsulée doit être libérée en quantité suffisante et avec une cinétique adaptée, ce qui nécessite aux moins deux conditions. Tout d’abord, que son coefficient de partage entre le matériau du cœur et le milieu aqueux extérieur ne soit pas trop en faveur du premier (sinon la libération ne se produirait que de façon très limitée). D’autre part, il est nécessaire que les phénomènes contrôlant la cinétique de libération (diffusion au sein de la matrice solide, transfert hors du matériau de cœur, dégradation chimique progressive du matériau…) soient maîtrisés. Les polysaccharides sont des macromolécules d’origines diverses (végétale, animale, bactérienne), de structure chimique polaire et comportant des groupements fonctionnels variés (acide carboxylique, hydroxyle, amine primaire…). Ces macromolécules présentes des propriétés intéressantes pour des applications biomédicales : hydrophilie très marquée, biocompatibilité, biodégradabilité, réactivité chimique permettant une fonctionnalisation… Ce sont toutes ces caractéristiques qui ont été exploitées au Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire (LCPM, UMR 7568 CNRS – Nancy-Université) pour élaborer des nanoparticules recouvertes de polysaccharides et possédant des propriétés spécifiques. Après quelques rappels sur les procédés d’élaboration de nanoparticules polymères de type cœur-couronne (partie 2), nous détaillerons l’exemple des nanoparticules à base de polysaccharides et notamment de dextrane (polysaccharide bactérien neutre à caractère biocompatible), soit pour la couche hydrophile de surface (partie 3), soit dans le matériau du cœur (partie 4). Les travaux menés au LCPM seront particulièrement mentionnés pour illustrer les concepts présentés.

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2. PROCEDES D’ELABORATION DE NANOPARTICULES POLYMERES DE TYPE CŒUR-COURONNE Dans ce qui suit, nous séparerons les procédés « réactifs » dans lesquels la production des nanoparticules est réalisée via une ou plusieurs réactions chimiques et les procédés « physico-chimiques » dans lesquels la formation des nanoparticules se fait sans réaction chimique. Beaucoup de procédés (réactifs ou physicochimiques) font intervenir des polymères amphiphiles. Ici, pour des raisons de simplification et de cohérence avec les exemples développés dans les parties suivantes, nous nous limiterons à un type d’architecture macromoléculaire : les copolymères greffés avec une chaîne principale hydrophile et des chaînes latérales hydrophobes. Nous assimilerons aussi à cette architecture les polymères modifiés chimiquement avec une chaîne principale hydrophile et des groupements hydrocarbonés fixés aléatoirement le long de la chaîne. Cette restriction n’a pas d’influence sur le principe des procédés en eux-mêmes mais seulement sur les caractéristiques du recouvrement des particules produites. 2.1 Procédés « physico-chimiques » 2.1.1 Adsorption directe Le procédé le plus simple pour obtenir des nanoparticules recouvertes de polysaccharide est le procédé d’adsorption directe. Il consiste à partir d’une suspension de nanoparticules non recouvertes (obtenues préalablement) et à les mettre en présence de polymère amphiphile. En opérant dans des conditions de concentration, de temps de contact et de quantité de particules convenables, l’adsorption des polymères amphiphiles conduit à un recouvrement dense de la surface des particules. Ce procédé trouve sa limite en ce qu’il nécessite une étape préliminaire dans laquelle les particules (non recouvertes et contenant la molécule active) doivent être préparées et maintenues dans un milieu où elles possèdent une stabilité colloïdale suffisante (généralement une phase aqueuse à très faible force ionique). Ceci fait que le procédé d’adsorption directe n’est pas utilisé en pratique pour l’encapsulation de substances actives mais, du fait de sa simplicité, sert plutôt d’élément de comparaison pour mieux comprendre les caractéristiques des nanoparticules obtenues par des procédés faisant intervenir des phénomènes plus complexes. 2.1.2 Emulsion/évaporation de solvant Un procédé très employé est l’émulsion/évaporation de solvant. Dans ce cas, le polymère amphiphile est utilisé comme stabilisant d’une émulsion submicronique huile dans eau (seuls des polymères hydrosolubles sont adaptés). Cette émulsion est généralement produite par une étape de sonication ou bien un passage dans un homogénéiseur haute pression. La phase organique est constituée d’un solvant très volatil (dichlorométhane, acétate d’éthyle…) dans lequel sont dissous la molécule à encapsuler ainsi que le polymère destiné à former le matériau (PLA par exemple). Après l’émulsification, l’évaporation du solvant conduit à la formation du cœur solide enfermant la molécule active et à la surface duquel stabilisant polymère se trouve fixé par l’adsorption physique des séquences hydrophobes. Une contrainte majeure de ce procédé est la nécessité de trouver un solvant volatile dans lequel la molécule

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à encapsuler présente une solubilité correcte d’une part et d’autre part un coefficient de partage vis-à-vis de la phase aqueuse assez favorable. De plus l’étape d’émulsification consommatrice en énergie et au cours de laquelle une dégradation de la molécule active est toujours à craindre. 2.1.3 Nanoprécipitation Une façon de remédier au principal défaut du procédé précédent (utilisation d’opérations d’émulsification très énergiques), est d’utiliser le procédé de nanoprécipitation. Ce dernier consiste à faire précipiter le polymère formant le matériau du cœur sous la forme de particules submicroniques à la surface desquelles le polymère amphiphile vient s’adsorber. Pour cela, le polymère ainsi que la molécule à encapsuler sont dissous dans un solvant organique miscible à l’eau (tétrahydrofurane, acétone…) alors que le polymère amphiphile est dissous dans la phase aqueuse. La mise en contact des deux solutions peut se faire selon différentes procédures mais il semble que la plus courante consiste à ajouter progressivement la solution organique dans un excès de phase aqueuse, sous une faible agitation. L’inter-diffusion de l’eau et du solvant organique conduit à la précipitation du polymère sous forme de nanoparticules recouvertes par le polymère amphiphile. Ce procédé présente l’avantage indéniable de ne pas recourir à une étape consommatrice en énergie (émulsification) et de ne faire intervenir que des opérations techniquement très simples. Cependant, il peut être difficile de trouver les conditions (nature du solvant et concentration) permettant d’éviter la formation d’agrégats microniques ou macroscopiques. D’autre part les suspensions de nanoparticules formées sont généralement assez diluées. 2.2 Procédés « réactifs » 2.2.1 Polymérisation en miniémulsion Le procédé le plus employé est la polymérisation en miniémulsion. Il consiste à préparer une émulsion submicronique d’un monomère dans l’eau (encore appelée « miniémulsion »), en utilisant un polymère amphiphile comme stabilisant. Il est par ailleurs nécessaire d’ajouter une faible quantité d’huile très hydrophobe (hexadécane par exemple) dans le monomère afin d’éviter le phénomène de diffusion moléculaire (encore appelée mûrissement d’Ostwald) qui conduirait à une croissance très rapide de la taille des gouttes avant que la polymérisation puisse s’effectuer de façon significative. La molécule à encapsuler doit être initialement dissoute dans le monomère. Ensuite, la polymérisation du monomère est déclenchée par exemple par élévation de température ou bien par addition de l’amorceur. Si toutes les conditions sont réunies (stabilité suffisante de la miniémulsion, pas de nucléation homogène ni de nucléation micellaire), les nanoparticules obtenues possèdent un diamètre moyen et un recouvrement par le polymère amphiphile identiques à ceux des gouttes de départ (généralement entre 50 et 500 nm). 2.2.2 Polymérisation en émulsion Un second procédé employé est la polymérisation radicalaire en émulsion en présence de polymère amphiphile. Cette fois le monomère est dispersé sous agitation vigoureuse dans une solution aqueuse contenant le polymère amphiphile. L’amorceur est ajouté dans la phase aqueuse et y génère des radicaux qui, selon différents mécanismes non détaillés ici, vont être à l’origine de la formation de particules stabilisées par le polymère amphiphile (phase dite de nucléation).

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Lorsqu’un nombre suffisant de particules est formé (fin de l’étape de nucléation), les nouveaux radicaux générés par l’amorceur ne forment plus de nouvelles particules mais entrent dans des particules déjà existantes et contribuent à la poursuite de la polymérisation. Le monomère diffuse depuis les gouttes (dans lesquelles aucune réaction n’a lieu), à travers la phase aqueuse, dans les particules et conduit à leur croissance jusqu’à ce qu’il soit totalement consommé (phase dite de croissance des particules). Les particules obtenues ont des tailles contrôlées par les quantités d’amorceur et de polymère amphiphile introduites initialement. Ces tailles sont similaires à celles des particules obtenues par polymérisation en miniémulsion.

3. NANOPARTICULES POLYMERES RECOUVERTES DE POLYSACCHARIDE Des nanoparticules recouvertes de chaînes de polysaccharides ont été élaborées en utilisant les différents procédés mentionnés plus haut et en faisant varier les caractéristiques du recouvrement (nature chimique du polysaccharide, densité, épaisseur)[1]. Dans les exemples considérés, le matériau du cœur est du poly(acide lactique) (PLA), du poly(n-butylcyanoacrylate) (PBCA) ou bien encore du polystyrène (PS). Dans la majorité des cas, il est nécessaire de conférer au polysaccharide natif (très hydrophile) la capacité à s’adsorber à une interface eau/huile ou bien à s’autoorganiser en solution aqueuse. Ceci implique de convertir le polysaccharide en polymère amphiphile par fixation covalente de séquences hydrophobes au sein des chaînes. Deux stratégies de synthèse ont été suivies pour cela : la modification chimique et la synthèse de glycopolymères greffés. Ces polysaccharides modifiés, hydrosolubles et amphiphiles sont ensuite utilisables dans les différents procédés mentionnés plus haut. Dans ce qui suit, le taux de modification sera défini comme le rapport molaire de la quantité de groupements hydrocarbonés (ou de chaînes latérales) fixé(e)s sur une chaîne de polysaccharide, à la quantité d’unités de répétition contenues dans cette même chaîne de polysaccharide. 3.1 Synthèse et propriétés des polysaccharides amphiphiles 3.1.1 Modification chimique de polysaccharides Par modification chimique de polysaccharides natifs, des groupements hydrocarbonés aliphatiques ou aromatiques ont pu être fixés sur une fraction plus ou moins grande des unités de répétition des macromolécules. Ces réactions font intervenir le polysaccharide natif et une molécule organique comportant une fonction chimique susceptible de réagir avec certains groupements fonctionnels du polysaccharide (acide carboxylique, époxyde, halogénure d’alkyle…). La sélection du solvant de réaction approprié est souvent une question cruciale et délicate. Dans beaucoup de cas, un solvant organique polaire tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) permet de dissoudre simultanément le polysaccharide et le réactif hydrophobe. L’alginate de sodium, le dextrane et le hyaluronate de sodium sont des exemples de polysaccharides qui ont été modifiés selon cette voie [2]. Des groupements hydrocarbonés de différents types ont été fixés par des liaisons éther, ester ou encore amide. La nature de ces liaisons n’a rien d’anodin car elle a des conséquences directes sur la solubilité et la stabilité chimique des polymères formés. La stabilité chimique des polysaccharides modifiés intervient au moins à deux niveaux : lors de l’étape de préparation des nanoparticules (si des conditions particulières de pH sont nécessaires, elles ne doivent pas conduire à une

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dégradation des polysaccharides amphiphiles) et pour leur devenir dans l’organisme après injection (biodégradabilité). Selon les conditions de réaction employées, des taux de modification allant jusqu’à près de 200 % ont pu être atteints dans le cas du dextrane [3]. Des travaux plus récents ont montré qu’il était possible de synthétiser des dérivés amphiphiles du dextrane en milieu essentiellement aqueux, en évitant ainsi l’usage d’un solvant organique tel que le DMSO. Cependant, il est pour cela nécessaire d’utiliser un tensioactif cationique pour disperser le réactif hydrophobe au sein de la phase aqueuse. Par ailleurs, des réactions parallèles peuvent, en milieu aqueux, consommer le réactif hydrophobe et réduire ainsi significativement les rendements de la réaction de modification [4]. Enfin, la catalyse enzymatique a été mise à profit pour l’obtention d’esters gras de dextrane par transestérification dans le DMSO. Cette voie de synthèse permet d’obtenir des dérivés du dextrane ayant des taux de substitution variant sur un très large intervalle (plus de 100 % dans le cas d’esters de l’acide décanoïque) [5]. 3.1.2 Synthèse de glycopolymères greffés Une autre approche consiste à synthétiser des glycopolymères greffés à partir des macromolécules de polysaccharide par croissance contrôlée de chaînes latérales (stratégie dite de « grafting from »). Une polymérisation contrôlée de monomères de type vinylique (mécanisme radicalaire) ou bien lactone (mécanisme pseudoanionique) permet de contrôler la longueur des chaînes latérales et d’avoir une faible variabilité. Une étape préliminaire de protection partielle des groupements fonctionnels du polysaccharide permet de maîtriser le nombre de chaînes latérales fixées sur chaque macromolécule. Cette voie de synthèse a notamment été appliquée à l’obtention de copolymères greffés dextrane-g-poly(acide lactique), dextrane-g-poly(e-caprolactone) ou encore dextrane-g-poly(méthacrylate de méthyle) [6]. Les glycopolymères comportant des chaînes latérales polyester sont totalement biodégradables par voie enzymatique (dextranase, lipase) ou bien hydrolytique (essentiellement pour les chaînes latérales). Les copolymères comportant des chaînes latérales polyacryliques offrent beaucoup plus de possibilités de variation de la structure chimique et donc des propriétés. Toutefois, leur dégradabilité se limite à la chaîne principale de polysaccharide. 3.1.3 Propriétés physico-chimiques des polysaccharides modifiés Selon la nature et le nombre de groupements hydrocarbonés fixés, la nature, la longueur et le nombre de chaînes latérales, les macromolécules modifiées et les glycopolymères peuvent être solubles dans l’eau (plusieurs g/L) ou bien dans des solvants organiques plus ou moins polaires (chloroforme, toluène, tétrahydrofurane…). Dans tous les cas (hydrosolubles ou pas), les macromolécules modifiées de cette façon présentent un caractère amphiphile et possèdent la propriété de s’adsorber aux interfaces liquide-liquide et solide-liquide séparant un liquide, ou un solide, peu polaire d’une phase aqueuse (figure 2). Ils ont ainsi pu être utilisés comme stabilisants macromoléculaires pour la préparation d’émulsions submicroniques directes ou inverses [3]. De la même façon, leur adsorption à la surface de nanoparticules de polystyrène a été étudiée. Les isothermes d’adsorption correspondantes ont pu être décrites par l’équation de Langmuir. Les quantités maximum adsorbées sont de l’ordre de 5 à 6 mg/m2 et les épaisseurs maximales des couches hydrophiles formées sont de 6 nm [7, 8]. D’autre part, ces polysaccharides amphiphiles s’auto-associent en solution (aqueuse ou organique selon les cas) et

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forment des agrégats regroupant plusieurs macromolécules. Ceci a été démontré par différentes technique (viscosimétrie, diffusion de la lumière statique et dynamique, spectroscopie de fluorescence…) [2]. Cette capacité d’adsorption aux interfaces ou d’auto-organisation en solution a été mise à profit pour la préparation de nanoparticules à cœur hydrophobe et recouvertes de chaînes de polysaccharide [9]. Dans plusieurs procédés considérés ici, le polysaccharide amphiphile va se comporter comme un stabilisant lors de la formation des nanoparticules (nanoprécipitation et polymérisation en émulsion) ou bien lors de la préparation d’une dispersion colloïdale précurseur des nanoparticules (émulsion/évaporation de solvant et polymérisation en miniémulsion). Dans d’autres cas, c’est l’auto-organisation de ces macromolécules au contact d’un gradient de solvant qui est le moteur de la formation des nanoparticules (glycopolymères greffés solubles en milieu organique)

Figure 2 : Tension interfaciale eau/chloroforme en fonction de la concentration en polysaccharide amphiphile dans l’eau. Le polysaccharide est un dextrane modifié par des groupements phénoxy (20 % en mole des unités de répétition).

3.2 Elaboration de nanoparticules recouvertes de polysaccharides 3.2.1 Procédés physico-chimiques Des nanoparticules de PLA recouvertes de dextrane ou de hyaluronate de sodium modifiés par des groupements hydrocarbonés ont été préparées par le procédé d’émulsion/évaporation de solvant. Le solvant organique utilisé est du dichlorométhane dans les deux cas [9, 10]. Les nanoparticules recouvertes de hyaluronate de sodium sont préférentiellement capturées par les cellules du cartilage qui possèdent des groupements récepteurs (notés CD44) spécifiques de ce polysaccharide. Cette propriété permet à ces nanoparticules de présenter un ciblage spécifique au niveau de lésion du cartilage, ce ciblage permettant la vectorisation de molécules actives contribuant au traitement de ces lésions. Les nanoparticules recouvertes de dextrane ne donnent pas lieu à des phénomènes reconnaissance spécifique. Elles peuvent toutefois être fonctionnalisées en surface par fixation de groupements fonctionnels via les fonctions hydroxyle du

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polysaccharide. En modifiant la concentration du polysaccharide amphiphile dans la phase aqueuse, il est possible de faire varier le taux de recouvrement des nanoparticules entre 4 et 8 mg/m2 alors que leur diamètre moyen reste pratiquement inchangé. La présence de la couche superficielle de dextrane empêche l’adsorption non spécifique de protéines telles que l’albumine de sérum bovin (BSA). A ce sujet, plusieurs résultats indiquent que le paramètre essentiel dans la limitation de l’adsorption de la BSA est la densité superficielle des points d’ancrage du polysaccharide amphiphile avec la surface des particules (en nombre de points d’ancrage par unité de surface de particule). Ceci a été vérifié en comparant des particules de PS recouvertes par des dérivés amphiphiles du dextrane avec différentes architectures [8]. D’autre part, ces nanoparticules peuvent encapsuler des molécules hydrophobes telles que la lidocaïne. La cinétique de libération de la lidocaïne est contrôlée par la diffusion de la molécule au sein du cœur hydrophobe des nanoparticules. Enfin, les suspensions de nanoparticules recouvertes par des dextranes amphiphiles présentent une excellente stabilité colloïdale jusqu’à des forces ioniques très élevées (> 1 mol/L) et également lors d’une étape de lyophilisation. Le procédé de nanoprécipitation a également été employé pour la préparation de nanoparticules de PLA recouvertes par un dérivé amphiphile du dextrane. Le solvant organique utilisé est soit de l’acétone, soit du tétrahydrofurane (THF). La présence du polysaccharide amphiphile permet de limiter la formation de coagulat à 10 % en masse de la quantité initiale de PLA. Les suspensions obtenues possèdent une très bonne stabilité colloïdale en fonction de la force ionique. Enfin, des copolymères greffés Dex-g-PLA organosolubles ont été appliqués à la préparation de nanoparticules cœur-couronne en utilisant un procédé de nanoprécipitation qui ne fait intervenir aucun stabilisant dans la phase aqueuse. Le copolymère greffé, initialement dissous dans un solvant organique (acétone ou THF) est capable de s’auto-organiser lors de l’inter-diffusion eau-solvant organique et conduit à la formation de nanoparticules ayant des diamètres voisins de 200 nm. Les chaînes principales de dextrane s’accumulent préférentiellement à la surface des particules et leur confère une stabilité colloïdale jusqu’à des forces ioniques supérieures à 1 mol/L. Aucun tensioactif n’est nécessaire dans la phase aqueuse. Un comportement similaire a pu être obtenu avec certains dextranes modifiés hydrophobes par des groupements aliphatiques en C10 [11]. 3.2.2 Procédés chimiques La polymérisation en émulsion du styrène a permis la préparation de nanoparticules recouvertes de dextrane. Deux types de stabilisants ont été étudiés : le dextrane natif et le dextrane modifié hydrophobe par des groupements aromatiques. Dans le cas de l’utilisation du dextrane natif, il semble que des réactions d’oxydoréduction impliquant l’amorceur (persulfate de potassium) et le polysaccharide natif conduisent à la formation in situ de polysaccharides amphiphiles, ceux-ci jouant ensuite le rôle de stabilisants des nanoparticules formées lors de la polymérisation du styrène. La masse molaire du polysaccharide natif employé a un effet très important sur la taille moyenne des nanoparticules obtenues. L’utilisation de dextrane de masse molaire élevée (Mw = 500 000 g/mol) permet d’obtenir des nanoparticules de diamètre voisin de 200 nm. Avec des dextranes de masse molaires plus faibles, des tailles plus élevées sont obtenues. Ceci peut s’interpréter en termes de stabilisation stérique des particules [12].

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Il a été montré que la polymérisation en émulsion réalisée en présence de dextrane natif conduit à des nanoparticules recouvertes par une couche peu dense de polysaccharide. Les chaînes de dextrane semblent avoir assez peu de points d’ancrage avec la surface, ce qui conduit à une épaisseur de couche assez élevée (10 nm) et des taux de recouvrement faibles (moins de 2 mg/m 2). Lorsque des dextranes modifiés hydrophobes sont employés comme stabilisants pour la polymérisation en émulsion, des particules de diamètres voisins de 200 nm sont obtenues avec des quantités de polymère beaucoup plus faibles que dans le cas de l’utilisation de dextrane natif et avec des masses molaires également beaucoup plus faibles (Mw = 40 000 g/mol). Ceci tient évidemment à leur plus grande efficacité de stabilisation des particules. Les particules formées présentent un taux de recouvrement par le polysaccharide plus élevé. Il a été montré que cela permettait de diminuer davantage l’adsorption non spécifique de protéines en comparaison avec les particules obtenues en présence de dextrane natif [13]. La polymérisation en miniémulsion a également été appliquée à la préparation de nanoparticules, en utilisant des stabilisants macromoléculaires synthétisés à partir de dextrane (dextranes modifiés hydrophobes et glycopolymères greffés). Le procédé a été appliqué en miniémulsion directe et inverse. Dans tous les cas, il a été démontré que si la quantité de stabilisant est suffisante (> 2 à 3 % en masse de la phase dispersée), la taille des particules obtenues est très proche de celle des gouttes de départ (figure 3). La même corrélation a été obtenue pour le taux de recouvrement par le polymère amphiphile [14]. En miniémulsion directe, des nanoparticules de polystyrène et poly(n-butylcyanoacrylate) ont ainsi été préparées [15]. Pour ce dernier, des conditions particulières de pH de la phase aqueuse sont nécessaires afin de contrôler la vitesse de polymérisation. En miniémulsion inverse, des nanoparticules de poly(acrylamide) réticulé ont été obtenues [16].

Diamètre moyen (nm)

400

300

200

100

0

0,05

0,1

0,15

0,2

[DexP18]/[styrène] Figure 3 : Diamètre moyen des particules de polystyrène obtenues par polymérisation en miniémulsion en présence d’un polysaccharide amphiphile (le DexP18). Le diamètre moyen des gouttes initiales de monomère est donné pour comparaison [14].

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4. NANOPARTICULES A CŒUR DE POLYSACCHARIDE Pour obtenir des nanoparticules à cœur constitué de chaînes de polysaccharide, polymère très hydrophile, deux stratégies sont classiquement envisagées. La première consiste à réticuler chimiquement le polysaccharide de façon à former un réseau covalent. En général, le gonflement de ces gels chimiques en présence d’une phase aqueuse est tel que les particules atteignent une taille supérieure au micromètre. La seconde stratégie consiste à rendre le polysaccharide insoluble (ou très peu soluble) dans l’eau par une modification chimique adaptée. Ceci implique d’avoir une modification chimique assez étendue ou bien de fixer des chaînes latérales assez longues le long de la chaîne principale polysaccharide. Cette voie de préparation de nanoparticules à cœur de polysaccharide a été étudiée au LCPM. La présence de copolymère à base de polysaccharide dans le cœur des particules a plusieurs intérêts : modifier la polarité du matériau de façon à favoriser l’encapsulation de molécules polaires, augmenter le caractère hydrophile du cœur des particules de façon à contrôler la vitesse d’hydrolyse des particules, obtenir une transition vitreuse au voisinage de la température du corps etc. Sur le plan de la synthèse macromoléculaire, des dextranes modifiés organosolubles ont pu être préparés en utilisant des conditions de réaction spécifiques (voir paragraphe 3.1). Pour les dextranes modifiés hydrophobes, il est nécessaire d’effectuer la réaction dans un milieu organique dans lequel l’eau résiduelle doit être réduite au minimum, ceci afin d’atteindre des taux de modification suffisants [3]. Pour les glycopolymères greffés, la longueur des chaînes latérales doit être suffisante pour conférer une solubilité suffisante dans des solvants organiques peu polaires [17]. En utilisant le procédé d’émulsion/évaporation de solvant, des nanoparticules comportant un cœur PLA/Dex-g-PLA ont été préparées. De la même façon, des dextranes modifiés hydrophobes par des groupements hydrocarbonés aliphatiques ou aromatiques ont été employés comme matériaux de cœur de nanoparticules préparées par émulsion/évaporation de solvant et par nanoprécipitation [11]. Ces nanoparticules sont actuellement étudiées pour déterminer leurs capacités d’encapsulation et de libération ainsi que l’influence de leur composition sur ces propriétés.

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Formulation et fluides supercritiques Frantz DESCHAMPS*, Jennifer JUNG, Fabrice LEBOEUF ————————————————————————————————————SEPAREX, 5, rue Jacques Monod, BP 9, 54250 Champigneulles * [email protected] (actuellement : [email protected])

RESUME :

Les procédés de formulation de solides divisés à l’aide de fluides supercritiques sont aujourd’hui au cœur de nombreux développements et les premières applications industrielles ont été récemment décrites. Dans un premier temps, nous présentons ici les principales motivations qui sont à l’origine de ces développements, notamment pour répondre à des besoins majeurs de l’industrie pharmaceutique. Après une brève description de ces techniques, quelques applications présentes et à venir de la formulation par voie supercritique sont présentées, en s’attachant particulièrement à des considérations de transposition d’échelle et d’opération de ces procédés en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication en vigueur dans l’industrie pharmaceutique.

MOTS-CLES : fluides supercritiques, RESS, SAS, PGSS, nanoparticules, cristallinité

1. INTRODUCTION Les particularités des fluides supercritiques ont à ce jour permis de développer de nombreuses applications comme l’extraction et la purification de produits naturels, la séparation par chromatographie supercritique de principes actifs pharmaceutiques, la polymérisation de monomères fluorés, la synthèse organique en voie supercritique et plus récemment la génération de solides divisés. Dans la mesure où les procédés, les objectifs et les contraintes techniques sont souvent identiques pour la production de poudres d’un principe actif seul ou de particules composites, nous utiliserons dans la suite le terme de formulation pour décrire une opération visant à obtenir des particules composites mais aussi des poudres de principe actif pur possédant des propriétés contrôlées (taille, état solide…). Les procédés de formulation par voie supercritique sont particulièrement prometteurs pour l’industrie pharmaceutique pour laquelle la formulation de solides divisés est aujourd’hui une préoccupation de première importance. Le développement et la production de la plupart des produits finis et intermédiaires pharmaceutiques, du principe actif pur à la forme pharmaceutique finale, exigent en effet de disposer de poudres ayant une distribution de taille, des propriétés physico-chimiques, une morphologie et un état solide particuliers. Par exemple, il est aujourd’hui bien connu que la réduction de taille et le contrôle de l’état solide (polymorphisme et cristallinité) des poudres de principes actifs pharmaceutiques sont des approches de choix pour améliorer la biodisponibilité de principes actifs peu solubles dans les fluides physiologiques. La production de microparticules, ou plus récemment de nanoparticules [1], est donc souvent utilisée pour le développement de médicaments contenant des principes actifs faiblement solubles qui présentent un risque de biodisponibilité faible et variable. Considérant les particularités des formulations pharmaceutiques et de leur usage, nous utiliserons ici le terme de nanoparticules

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pour des particules de taille maximale inférieure à 1 μm et microparticules pour des poudres de taille maximale comprise entre 1 et 150 μm. Un autre intérêt de la formulation de principes actifs sous forme de micro- ou de nanoparticules est la possibilité de développer des formes d'administration alternatives, comme par exemple des poudres pour administration par inhalation. Le lieu exact de dépôt des particules dans l'appareil respiratoire est fortement dépendant du diamètre aérodynamique des particules. En conséquence, les poudres inhalables doivent être produites par des techniques adaptées [2] qui permettent à la fois d'obtenir des tailles de particules de l'ordre de 1-5 μm, une morphologie, des propriétés de surface et un état solide ad hoc. Si la possibilité de réduire la taille et de contrôler l’état solide des particules de principes actifs purs est donc cruciale pour l’industrie pharmaceutique, il existe aussi un réel besoin de préparer des formes composites comme par exemple des dispersions solides [3] ou encore des complexes d'association avec des cyclodextrines [4]. Pour des principes actifs faiblement solubles administrés par voie orale, cette approche de formulation peut permettre d’améliorer leurs performances biopharmaceutiques. Dans les dispersions solides de tels actifs, le principe actif se trouve dispersé de façon moléculaire ou non dans une matrice hydrophile. Après dissolution ou désintégration de l’excipient lors du contact avec le milieu aqueux physiologique, le principe actif peut être rapidement dissous ou libéré sous forme de particules colloïdales dans le tractus gastro-intestinal. Des particules composites peuvent également être formulées pour obtenir des formes injectables, comme par exemple des formulations polymériques ou lipidiques à libération retardée dite « dépôt » [5]. Un autre exemple est l’utilisation de nanoparticules administrées par voie intraveineuse qui permettent de cibler certaines tumeurs au sein desquelles elles peuvent s’accumuler [6] du fait de la vascularisation plus importante de ces tumeurs. Cependant, le développement de ces formulations pourtant prometteuses à l’échelle du laboratoire est souvent freiné voire interdit par certaines limitations des techniques courantes de micronisation ou de séchage. Ces techniques, telles que le séchage par atomisation, sont mises en œuvre à des températures qui peuvent induire la dégradation de composés thermosensibles tels que les protéines. D'autre part, les procédés de broyage, couramment utilisés pour réduire la taille des particules de principe actif, souffrent de nombreuses limitations parmi lesquelles un faible contrôle de la distribution de taille, de la forme et des propriétés de surface des particules produites, ainsi qu'un apport d'énergie important qui peut altérer la stabilité, le polymorphisme et le degré de cristallinité du principe actif. Par ailleurs, les techniques de cristallisation et de précipitation mettant en œuvre des solvants organiques conduisent souvent à la dénaturation de molécules biologiques fragiles, et requièrent en aval des traitements longs et couteux pour amener les résidus de solvants à des niveaux acceptables pour une utilisation in vivo. En ce qui concerne la préparation de nanoparticules de principe actif, des techniques innovantes variées ont été appliquées avec succès à plusieurs principes actifs [7]. Des procédés de nanonisation tels que le broyage à billes agitées en voie liquide ou l'homogénéisation à haute pression ont par exemple été utilisés pour produire des formulations commerciales. Ils conduisent toutefois à l'obtention de suspensions de

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nanoparticules, ce qui induit des étapes de traitement en aval en vue d'obtenir une forme finale sèche. Il convient aussi de noter que les méthodes usuelles de préparation de particules composites sont généralement complexes et donc parfois peu viables à l’échelle industrielle. Ces méthodes recourent le plus souvent à des solvants organiques comme dans le cas de la co-précipitation, de l’émulsion-extraction, de la séparation de phase ou encore du séchage par atomisation. Ces limites des procédés usuels de formulation sont à l’origine du vif intérêt suscité par l’étude du traitement de composés pharmaceutiques par des procédés utilisant les fluides supercritiques. En effet, ces procédés peuvent offrir de nouvelles opportunités pour produire des micro- ou des nanoparticules de haute pureté, chimiquement et physiquement stables, tout en contrôlant la morphologie et les propriétés des particules. Ils permettent en outre de minimiser ou même d’éliminer le recours à des solvants organiques et sont généralement opérés à des températures modérées.

2. LES TECHNIQUES DE FORMULATION PAR VOIE SUPERCRITIQUE La plupart des applications des fluides supercritiques, et notamment du CO2 à pression supercritique, sont liées à leurs propriétés modulables, en particulier leur densité et leurs propriétés de transport. Si la possibilité d’ajuster finement la solubilité de solutés dans ces fluides en jouant sur la pression et la température est aujourd’hui bien connue et à l’origine d’applications industrielles comme l’extraction de produits naturels, la faible viscosité et la diffusivité élevée de ces fluides leur confèrent par ailleurs des propriétés de transfert de masse particulièrement attrayantes. Un fluide supercritique diffuse rapidement dans les milieux poreux facilitant ainsi l'extraction, ou de manière réciproque l'imprégnation, de solutés au sein de matrices poreuses. D'autre part, la mise en contact d'une phase liquide avec un fluide supercritique conduit à une forte diminution de sa viscosité du fait de la dissolution du fluide dans cette phase, et ce même à des pressions modérées et inférieures à la pression critique [8]. Cette propriété est utilisée pour fluidifier en cours de procédé des liquides visqueux comme des polymères ou lipides fondus. En outre, la mise en contact avec du CO2 comprimé de nombreux polymères ou lipides d’intérêt pharmaceutique conduit à une diminution importante de la température de fusion ou de transition vitreuse de ces composés [9]. Une grande variété de procédés de formulation de solides divisés utilisant les fluides supercritiques a été développée. Des descriptions détaillées de ces procédés, de leurs mécanismes et forces motrices [10,11,12,13] sont disponibles dans la littérature. Nous nous bornerons donc ici à résumer les caractéristiques principales de ces techniques de formulation avant de présenter leurs applications présentes et futures et les contraintes particulières auxquelles elles doivent satisfaire pour des applications pharmaceutiques.

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Les principaux procédés de formulation par voie supercritique, dont les principes de mise en œuvre sont schématiquement présentés sur la figure 1, sont usuellement classés en trois familles selon le rôle joué par le fluide supercritique : -

Le procédé RESS (Rapid Expansion from Supercritical Solutions) [14], dans lequel les particules de principe actif précipitent à la suite d’une détente brutale d’une solution supercritique de ce principe actif, ladite détente provoquant une sursaturation élevée et extrêmement rapide.

-

Les procédés où le fluide supercritique joue le rôle d’un non-solvant comme les procédés GAS (Gas Anti-Solvent) [15] et SAS (Supercritical Anti-Solvent), dans lesquels le CO2 provoque la précipitation du soluté préalablement dissous dans un solvant organique. Il existe plusieurs variantes de ce procédé: procédé ASES (Aerosol Solvent Extraction System), procédé SEDS (Solution Enhanced Dispersion by SCF)... [10, 16].

-

Les procédés PGSS (Generation of Particles from Gas-Saturated Solutions) [17] et leurs variantes, dans lequel le CO2 comprimé est dissous dans le composé à pulvériser. La détente à travers une buse d’un tel liquide saturé en fluide comprimé conduit à la formation de particules en raison du brutal refroidissement causé par la détente du fluide.

Le produit final est généralement récupéré de manière discontinue dans l’enceinte de précipitation/pulvérisation après retour à la pression atmosphérique Avant décompression de cette enceinte, une étape de balayage au CO2 pur est en outre nécessaire pour les procédés où le fluide supercritique joue le rôle d’un non-solvant, de manière à éliminer le solvant organique. A l’échelle industrielle, pour les procédés RESS, SAS et PGSS, des modes de mise en œuvre plus élaborés peuvent permettre le soutirage en continu du solide. De nombreux autres procédés de formulation ont été proposés et pourraient permettre le développement d’applications industrielles pour l’industrie pharmaceutique, parmi lesquels nous retiendrons, sans toutefois prétendre être exhaustifs, l'imprégnation de matrices polymères avec des composés dissous dans un fluide supercritique [18] et le dépôt contrôlé de principe actifs au sein d’excipients poreux [19], l’extraction par un fluide supercritique de solvants organiques dispersés dans une phase aqueuse (procédé SFEE pour Supercritical Fluid Extraction of Emulsions) qui permet ainsi de préparer des suspensions de particules de principe actif dans la phase continue lorsqu’un soluté était initialement dissous dans la phase organique dispersée [20], le procédé de cristallisation DELOS (Depressurization of an Expanded Liquid Organic Solution) [21], ou encore l'enrobage de particules préformées par séparation de phase contrôlée d'un agent d'enrobage dissous dans le fluide supercritique [22]. D'autre part, de nouveaux procédés combinant les fluides supercritiques avec des techniques utilisées couramment dans l'industrie ont été développés récemment, tels que l'extrusion de mélanges polymères/principes actifs utilisant le CO2 sous pression comme agent plastifiant lors de l’extrusion, permettant ainsi de travailler à température plus modérée, et aussi comme agent porogène en sortie d’extrudeuse de manière à récupérer des mousses en fin de procédé [23].

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Figure 1 : Schéma de principe des principaux procédés de formulation par voie supercritique

3. FLUIDES SUPERCRITIQUES ET FORMULATION PHARMACEUTIQUE Les principales applications des techniques de formulation par voie supercritique, leurs avantages et limitations ainsi que des éléments relatifs à leur transposition d’échelle et à leur opération en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication, sont présentés dans la suite. 3.1 Applications du procédé RESS Des tailles et morphologies variées peuvent être obtenues via le procédé RESS comme illustré sur la figure 2 pour la précipitation de lovastatine par détente d’une solution de ce composé dans le CO2 supercritique. Dans le cas où le principe actif et un excipient s’avèrent être suffisamment solubles dans le fluide supercritique, ce procédé peut permettre de produire des particules composites par co-précipitation. De rares exemples de particules composites produites par RESS sont toutefois décrits dans la littérature [24,25], probablement en raison de la faible solubilité dans les fluides supercritiques de la plus grande partie des couples principe actif/excipient d’intérêt pharmaceutique.

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a) Lovastatine (Produit de départ)

b) Nano-particules de lovastatine

c) Lovastatine micronisée

d) Lovastatine micronisée

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Figure 2 : Micronisation de la lovastatine par le procédé RESS

Bien que le procédé RESS puisse en théorie offrir la possibilité de former des nanoparticules avec une distribution de taille étroite [26], il est souvent noté une agrégation des particules lors de la mise en œuvre de ce procédé, conduisant alors à la formation de formulations microparticulaires de faible uniformité. Ces poudres peuvent en outre souffrir d’une très médiocre qualité d’usage pour les opérations en aval qui sont requises pour produire la forme pharmaceutique finale comme par exemple des opérations de mélange de poudres. Une mise en œuvre du procédé RESS a toutefois été proposée pour s’affranchir de ces difficultés. Il s’agit de détendre la solution supercritique dans une phase aqueuse contenant des agents tensioactifs de manière à limiter la croissance et l’agglomération des particules [27], et ainsi récupérer une dispersion de nanoparticules. Cette approche a par exemple permis de produire à l’échelle du laboratoire des dispersions aqueuses de nanoparticules d’ibuprofène d’une taille moyenne de 80 nm [26]. Les formulations ainsi produites peuvent être comparées à celles obtenues par des techniques de broyage à billes agitées en voie liquide [1] aujourd’hui utilisées pour produire des formes orales de principes actifs peu solubles. Elles exigent donc également des opérations en aval de manière à convertir la nanodispersion en forme finale sèche (comprimés, granules…). Une autre variante permet de récupérer directement des formulations sèches en captant dans l’enceinte de détente les particules générées par RESS à la surface ou au sein de poudres d’excipients pharmaceutiques usuels [28]. De telles formulations composées de microparticules de lovastatine déposées

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sur des particules de lactose sont présentées sur la figure 3. Ces formulations sèches peuvent être manipulées sans émission de fines, avec une bonne coulabilité et une haute qualité d’usage pour la production de comprimés uniformes par des opérations pharmacotechniques conventionnelles. Si le procédé RESS a permis d’obtenir des résultats prometteurs pour la formulation de poudres dénuées de solvant résiduel, son application est fortement restreinte en raison de la faible solubilité de la plupart des principes actifs dans le CO2 supercritique. Le recours à des fluides présentant un pouvoir solubilisant plus élevé comme le diméthyléther [29,30] a d’ailleurs été récemment proposé pour le traitement d’une plus large gamme de composés. Malgré cette restriction, le procédé RESS semble aujourd’hui prometteur pour la formulation de produits de haute valeur et est par conséquent principalement étudié dans le domaine pharmaceutique : nanoparticules pour administration parentérale ou orale de principes actifs peu solubles, microparticules pour inhalation.

Figure 3 : Microparticules de lovastatine déposées sur des grains de lactose

3.2 Applications des procédés SAS et GAS Les procédés utilisant les fluides supercritiques comme non-solvant de manière à précipiter un principe actif initialement en solution sont parmi les plus étudiés en raison de leurs nombreuses caractéristiques avantageuses. Ils offrent en effet la possibilité de traiter une large gamme de principes actifs, allant des entités chimiques solubles dans les solvants organiques aux biomolécules hydrosolubles comme des protéines thérapeutiques [31,32,33]. Ils peuvent aussi permettre de contrôler finement la taille, la morphologie, la forme cristalline et la cristallinité des poudres de principe actif [34]. Ces procédés sont également évalués pour la production de particules composites par traitement de solution(s) du principe actif et d’excipient(s). Des dispersions solides de principes actifs peu solubles ont ainsi été étudiées [35,36] afin d’augmenter la vitesse de dissolution de ces actifs. Des formulations principe actif-cyclodextrines ont également été produites par ce type de procédé [37,38]. L’application à la formulation de particules de polymères biorésorbables comme les homo- ou co-polymères d’acide lactique et glycolique (PLA, PLGA) est en revanche fortement limitée [11] en raison de la diminution de la température de fusion et/ou de transition vitreuse de ces polymères en présence de CO2 supercritique, qui conduit le plus souvent à une agglomération des particules de polymères ou même à une adhésion et formation de film sur les parois du réacteur.

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Si les procédés anti-solvant par voie supercritique sont souvent regardés comme des solutions techniques d’avenir pour des produits pharmaceutiques, ils sont à notre connaissance aujourd’hui uniquement utilisés en R&D et pour la production de lots cliniques dans ce domaine. En revanche, il est intéressant de noter qu’une application à grande échelle de ces procédés pour le déshuilage de lécithine a récemment été décrite [39]. La lécithine de soja brute est un liquide contenant environ 60% de phospholipides (solides à l’état pur) et 40% de triglycérides, la fraction huileuse jouant donc le rôle de solvant des phospholipides. Le procédé de déshuilage consiste schématiquement à disperser via une buse la lécithine brute dans du CO2 supercritique qui extrait les triglycérides et provoque ainsi la précipitation des phospholipides sous forme de poudre. Ce procédé est aujourd’hui mis en œuvre sur une unité industrielle produisant environ 120 kg/h de lécithine déshuilée [40]. 3.3 Applications du procédé PGSS Reposant sur un concept de pulvérisation à basse pression d’un matériau fondu dans lequel du CO2 est dissous, le procédé PGSS est rarement applicable à la pulvérisation de principes actifs pharmaceutiques purs car ils sont souvent thermolabiles. En revanche, il est applicable à certains polymères ou composés lipidiques et a été employé avec succès pour le traitement d’ingrédients alimentaires ou nutraceutiques : lécithines, glycérides, beurre de cacao, cires, phytostérols. Dans le domaine pharmaceutique, des variantes du procédé PGSS [28] qui consistent à pulvériser une dispersion ou une solution de principe actif dans un excipient fondu saturé en CO2 sont étudiées. Ces excipients d’encapsulation peuvent être choisis parmi des glycérides ou des polymères comme les polyéthylèneglycols solides. De manière très avantageuse, ces procédés offrent l’accès en une seule étape à des dispersions solides sous forme de poudre, avec de plus un contrôle fin de la taille et de la morphologie de ces poudres selon les conditions opératoires [39]. En raison de l’effet du CO2 sur les température de fusion de ces excipients et aussi sur la viscosité de nombreux excipients fondus, ces poudres sont de surcroît produites avec des températures opératoires plus modérées que celles utilisées par les techniques « hot melt » usuellement mises en œuvre avec ces excipients d’encapsulation. Le procédé PGSS, n’utilisant pas de solvants organiques, est déjà mis en œuvre à grande échelle pour des ingrédients alimentaires. Une unité industrielle permettant de produire jusqu’à 300 kg/h de poudre a par exemple été récemment démarrée [39]. La consommation de CO2 est faible pour ce procédé, usuellement de 1 à 3 kg de CO2 par kg de produit à pulvériser. Pour une unité pouvant traiter environ 1500 kg/h, le coût de production a par conséquent été estimé à seulement 0,2 à 1 € par kg de poudre [39].

4. TRANSPOSITION D’ECHELLE ET BONNES PRATIQUES DE FABRICATION Les procédés par voie supercritique sont aujourd’hui principalement utilisés à l’échelle commerciale pour des applications d’extraction ou de purification. A l’exception de rares applications dans le domaine des ingrédients alimentaires, la formulation par voie supercritique n’est aujourd’hui mise en œuvre qu’à l’échelle du

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laboratoire ou pilote pour la production de lots cliniques. Un travail de grande ampleur reste donc à fournir pour permettre l’utilisation commerciale de ces procédés de formulation pour des applications pharmaceutiques. La transposition d’échelle des techniques de formulation par voie supercritique profiterait assurément d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes qui impliquent des sursaturations et nucléations brutales, ainsi que des phénomènes hydrodynamiques et de transfert de masse dans des milieux complexes (p. ex. introduction via une buse d’une solution organique dans un flux de fluide supercritique). Des résultats parfois discordants ont d’ailleurs été reportés quant à l’influence des paramètres opératoires sur les caractéristiques des formulations obtenues par ces procédés. Par exemple, une récente revue des travaux relatifs au procédé RESS [26] illustre bien ce besoin d’une meilleure compréhension de ces mécanismes. La plus grande partie de ces procédés comporte une étape d’atomisation ou de détente à travers une buse, ce qui exige un soin particulier lors du changement d’échelle pour garantir la conservation des caractéristiques des formulations (taille, morphologie) [41]. En outre, pour les procédés anti-solvant, la poudre générée de manière continue reste en présence d’un mélange CO2/solvant à haute pression durant la production. Elle peut donc subir des modifications dépendantes du temps de séjour dans l’enceinte de précipitation (changement de cristallinité, agglomération…). Au contraire des procédés n’utilisant qu’un fluide supercritique pur, ces techniques anti-solvant posent de plus un problème de maîtrise de la teneur en solvant organique résiduel. A l’échelle du laboratoire, la teneur en solvant résiduel peut être diminuée par une simple extraction à l’aide de CO2 supercritique frais opérée directement dans l’enceinte d’atomisation après génération de la poudre. Cette opération consomme toutefois une quantité importante de fluide [42] et peut conduire à l’obtention d’une poudre peu homogène en raison d’une percolation peu efficace dans la mesure où la poudre n’est souvent pas répartie de manière optimale après précipitation dans l’enceinte d’atomisation. Il est donc aujourd’hui généralement admis que l’étape de réduction de la teneur en solvant organique résiduelle doit être définie et opérée comme une opération séparée afin d’obtenir une efficacité acceptable. La production à l’aide de ces procédés innovants, donc non-standard, doit nécessairement répondre aux contraintes des Bonnes Pratiques de Fabrication pour qu’on puisse envisager des applications pharmaceutiques. Ces contraintes portent principalement sur la conception et l’opération de l’équipement de production et sur la validation du procédé. En ce qui concerne l’équipement, une des plus grandes difficultés reste la nécessité de réaliser un nettoyage validé, et ce malgré la difficile disponibilité de composants haute-pression compatibles avec cette contrainte (volumes morts, état de surface, matériaux). La maitrise de la contamination peut aussi être complexe notamment dans le cas d’un recyclage du fluide supercritique. Des exemples d’unités destinées à la production de lots cliniques en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication sont toutefois connus, comme par exemple une unité développée par Separex (Figure 4) qui permet de produire des lots de quelques kg de principes actifs de haute activité par formulation par voie supercritique. Le développement de cet équipement, et de son environnement, a

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demandé des solutions techniques innovantes notamment en ce qui concerne la collecte efficace des particules sans risque de contamination de la poudre ou de l’environnement de travail, le recyclage du fluide, la gestion des effluents et enfin le nettoyage de l’unité.

Figure 4 : Unité de production de lots cliniques en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication

5. CONCLUSION Dans la dernière moitié des années 1990, les procédés de formulation par voie supercritique ont souvent été présentés comme des procédés polyvalents pouvant répondre à des besoins non satisfaits de l’industrie pharmaceutique, de transposition d’échelle aisée et par conséquent rapidement disponibles pour la production commerciale de poudres pharmaceutiques. Nous pouvons aujourd’hui affirmer qu’il s’agissait alors d’une vision par trop optimiste qui négligeait des contraintes incontournables qui doivent être prises en compte afin de faire accepter un procédé innovant pour des applications pharmaceutiques : contraintes techniques et économiques bien entendu, mais aussi réglementaires ou liées aux exigences de mise sur le marché rapide d’une industrie qui de plus doit aujourd’hui se réinventer. Si des applications commerciales de ces techniques de formulation dans le domaine agro-alimentaire sont aujourd’hui connues, les temps de développement d’un produit pharmaceutique font que, à notre connaissance, aucun produit pharmaceutique obtenu par formulation par voie supercritique n’est aujourd’hui sur le marché. Toutefois, de telles formulations ont été produites en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication et sont aujourd’hui en phase d’essais cliniques. Il peut être raisonnablement avancé qu’elles atteindront le marché dans un proche avenir. Au regard des applications industrielles actuelles ou en développement, nous pouvons donc affirmer que ces procédés de formulation par voie supercritique trouveront des applications de plus en plus nombreuses et seront bientôt acceptés comme opérations unitaires dans l’arsenal des techniques de formulation pharmaceutique. Ces procédés, qui répondent à certains critères de la chimie verte, offrent en effet la possibilité de produire des formulations nouvelles et différenciées.

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st

Le nez et la langue électroniques : des outils d’aide à la formulation de médicaments Marion BONNEFILLE*, Marielle BRONN ___________________________________________ Alpha MOS, 20 avenue Didier Daurat, 31400 Toulouse * [email protected]

RESUME :

Dans de nombreuses formes orales, le goût et l’odeur générés par le principe actif peuvent être une cause d’aversion ou de rejet par le patient. Par conséquent, il est primordial pour les formulateurs de trouver les meilleures stratégies de masquage, afin d’augmenter l’acceptabilité du médicament. Si l’évaluation de l’odeur et du goût est généralement réalisée par des panels humains, ceci est interdit ou très difficile à mettre en œuvre dans l’industrie pharmaceutique, étant donné l’éventuelle toxicité des produits. C’est pourquoi l’utilisation d’instruments tels les nez et langue électroniques se révèle utile. Ces instruments mesurent respectivement les composés organiques volatils pour le nez et les composés dissous dans les liquides pour la langue. Ils fournissent une empreinte olfactive / gustative globale des produits. Grâce à leur logiciel de traitement de données, des modèles qualitatifs ou quantitatifs sont établis pour : la comparaison olfactive/gustative/chimique, le contrôle qualité ou la quantification (concentration, score sur des attributs sensoriels). Dans une première application de masquage d’odeur dans des granulés, un nez électronique à capteurs gaz a été utilisé pour évaluer le pouvoir masquant de différents enrobages et sélectionner le plus efficace. Trois applications majeures de la langue électronique dans le domaine de la formulation pharmaceutique seront développées : - mesure du niveau d’amertume de principes actifs ou de nouvelles entités chimiques, - évaluation de l’efficacité d’une stratégie de masquage de goût désagréable dû au principe actif, - optimisation du goût du placebo pour une étude clinique en double aveugle. Ainsi, les nez et langues électroniques sont des outils de décision qui aident les formulateurs à accélérer le développement de formes orales tout en évitant des problématiques de sécurité ou d’éthique liées aux tests humains.

MOTS-CLES : nez électronique, langue électronique, masquage odeur, masquage goût, masquage amertume, mesure amertume, développement de placebo, analyse sensorielle

1. INTRODUCTION Au cours de ces dix dernières années, les technologies liées aux « sens électroniques » ont connu un développement important. Ces instruments ont pour vocation de reproduire autant que possible les mécanismes sensoriels humains. Le premier des sens à avoir été reproduit à des fins industrielles est l’ouïe. Puis des « yeux électroniques » ont été créés pour des applications biométriques liées à la sécurité, telles la reconnaissance par l’iris, ou industrielles, comme le contrôle visuel de la qualité sur les lignes de production. Ce n’est que plus tardivement que l’odorat, historiquement utilisé comme moyen d’identification et de protection, a connu ses premiers « modèles électroniques ». Le terme de nez électronique est apparu en 1987 et les premiers systèmes ont été commercialisés à partir de 1993. Ces

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 151 instruments ont été conçus pour détecter et analyser les odeurs, et plus généralement les composés organiques volatils. Quant au goût, il faudra attendre le début des années 2000 pour voir apparaître les premiers instruments analyseurs de substances sapides : les langues électroniques. Les étapes du processus de détection et d’analyse du nez et de la langue électroniques présentent de fortes similarités avec celles utilisées pour l’odorat et le goût chez l’humain. Ces instruments permettent d’identifier, quantifier ou comparer les odeurs et les goûts de différents produits. Odorat et nez électronique - Goût et langue électronique La particularité des nez et langue électroniques, par rapport aux techniques analytiques séparatives (chromatographie gazeuse ou liquide, spectrométrie de masse, etc.), est d’analyser une odeur ou un goût dans leur globalité, en percevant une « empreinte» et non en la décomposant en ses différents constituants. En ce sens, les instruments s’inspirent du fonctionnement des sens humains. Très schématiquement, l’odorat et le goût mettent en oeuvre : - la perception d’une odeur / d’un goût par des récepteurs ou détecteurs, - la conversion de cette perception en un signal, - la conduction de ce signal jusqu’au cerveau, plus précisément dans le système limbique, lieu des réponses émotionnelles associées notamment à la mémoire et aux décisions indépendantes du conscient, - la transmission du signal au néocortex pour qualifier l’odeur / le goût perçus (détection, identification, appréciation, etc...)(Figure 1). Dans leur constitution, les nez et langue électroniques reprennent des éléments de l’olfaction et du goût humains : un élément « réactif » qui détecte l’odeur/le goût, un système d’acquisition et des traitements des signaux générés par le « détecteur » (Figure 1).

Figure 1 : Principe de fonctionnement schématique des instruments et des sens humains

152

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Pour le système de détection, plusieurs technologies peuvent être mises en oeuvre. Dans les nez électroniques Alpha MOS, qui mesurent les composés organiques volatils (COV) et semi-volatils (sCOV), le système de détection peut être constitué de différentes technologies : ß les capteurs à oxydes métalliques : lorsque des composés volatils sont adsorbés à la surface des semi-conducteurs, il se produit un changement de résistance électrique qui varie selon les molécules et leur concentration. Les instruments peuvent intégrer jusqu'à 18 capteurs, ainsi la gamme d'échantillons solides, liquides ou gazeux qui peut être analysée est vaste. ß La spectrométrie de masse par empreinte : l'espace de tête des échantillons est analysé sans séparation préalable des composés. Le signal représente ainsi la réponse à tous les constituants de l’odeur, sous forme d’empreinte olfactive globale. Si nécessaire, les molécules peuvent être identifiées à partir des fragments générés. ß La chromatographie gazeuse ultra rapide : des échantillons solides, liquides ou gazeux peuvent être analysés par injection de liquide ou d'espace de tête. Les C20 sont analysés en moins de 60 s. Après injection simultanée sur deux colonnes courtes de différentes polarités couplées à deux détecteurs à ionisation de flamme (FID), les deux chromatogrammes sont traités comme une empreinte globale. Une base « Kovats » est fournie, afin de rechercher des composés chimiques selon leur indice de rétention. La langue électronique ASTREE (Alpha MOS) utilise des capteurs basés sur la technologie ChemFET (Chemically modified Field Effect Transistor) pour l'analyse d'échantillons liquides. En présence de composés dissous, une différence de potentiel est mesurée entre chacun des 7 capteurs et l'électrode de référence. Chaque capteur comporte une membrane organique spécifique qui interagit différemment avec les composés chimiques ioniques et neutres présent dans l'échantillon liquide. Toute interaction à l'interface de la membrane est détectée par le capteur et convertie en signal électronique. Le système d’acquisition enregistre la réponse du système de détection (changement de résistance électrique des capteurs, pics de spectrométrie de masse ou de chromatographie, différence de potentiel). Puis un traitement mathématique de ces données permet de fournir des résultats facilement lisibles et compréhensibles, en fonction des objectifs de l’analyse. Typiquement, les résultats sont visualisés sous forme de graphiques, ou sous forme de tableaux. Les modèles de présentation des résultats se sont adaptés aux diverses applications industrielles: ß Modèles qualitatifs (Analyse en Composantes Principales, Analyse Factorielle Discriminante) pour différencier des produits selon des critères définis : qualité, origine, fournisseur, lot de production, etc. ß Cartes de contrôle qualité (modèles Statistical Quality Control et Soft Independant Modeling by Class Analogy) pour tester la conformité des produits. ß Résultats quantitatifs (modèle de régression des moindres carrés partiels) pour déterminer l'intensité d'un arôme / d'une odeur, la concentration d'un composé chimique, l'unité d'odeur ou corréler avec des notes obtenues par un panel sensoriel.

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 153 ß

Modèle de suivi de vieillissement pour étudier et comparer des profils de vieillissement, ou la stabilité de matières.

2. MESURE DE L’EFFICACITE DU MASQUAGE D’ODEUR DANS DES FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES AVEC UN NEZ ELECTRONIQUE Dans cette application, l’objectif est de masquer le plus efficacement possible une odeur désagréable due au principe actif, dans une formulation de granulés pharmaceutiques. Pour cela, un nez électronique FOX (Figure 2) a été utilisé (Tableau 1) pour comparer l’efficacité du masquage d’odeur dans plusieurs formulations de granulés. Pour ce faire, chaque formulation active va être comparée à la même formulation sans principe actif, nommée alors placebo (Tableau 2). Le placebo ne contenant pas de principe actif n’a pas d’odeur désagréable. Si la formulation et le placebo correspondant ont la même empreinte olfactive selon le nez électronique, ceci signifie que la formulation a réussi à masquer l’odeur du principe actif. L’efficacité du masquage est alors optimale. Moins il y aura de différence entre la formulation active et le placebo, meilleur sera le masquage.

1

3

2

Figure 2 : Nez électronique FOX (Alpha MOS, France) - 1 : Passeur d’échantillons espace de tête jusqu’à 96 positions – 2 : Set de capteurs à oxydes métalliques – 3 : Logiciel pour le contrôle du système et le traitement de données

Différenciation des profils olfactifs Avec un écart-type résiduel inférieur à 5%, le nez électronique présente une très grande répétabilité de mesure. En représentant les mesures instrumentales sous forme d’Analyse en Composantes Principales (ACP), toutes les formulations sont différenciées à partir de leur profil olfactif (Figure 3). Plus les produits sont proches entre eux sur l’ACP, plus leur odeur est similaire. Il apparaît bien que la formulation active avec l’enrobage 3 est très proche du placebo correspondant.

154

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ Tableau 1 : Paramètres analytiques

Paramètre

Tableau 2 : Echantillons

Valeur

Gaz vecteur Quantité d’échantillon dans le flacon Volume du flacon Génération de l’espace de tête Vitesse d’injection Volume de la seringue Température de la seringue Durée d’acquisition Temps entre 2 injections

Echantillon

Description

1

Formulation 1: PA + enrobage 1

10 mL 5mn à 50°C

2

Placebo 1 (enrobage 1 seul)

3

Formulation 2: PA + enrobage 2

2000 μL/sec 2,5 mL 60°C

4

Placebo 2 (enrobage 2 seul)

5

Formulation 3: PA + enrobage 3

6

Placebo 3 (enrobage 3 seul)

120 s 15 min

7

Formulation 4: PA + enrobage 4

8

Placebo 4 (enrobage 4 seul)

Air sec 0,2g

Indice de discrimination = 93

0,3

Formulation 4 4 PA + enrobage 0,2 PC2: 5.063%

Formulation 3 PA + enrobage 3 Placebo 3

0,1 PC2: 5.063% 0

PA + enrobage Formulation 2 2 [400] Placebo 1

PA + enrobage 1 1 Formulation -0,1

-0,2 -1,1

Placebo 4 Placebo 2 Placebo 2

PA + enrobage 2 [500]

-1

-0,9

-0,8

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

PC1: 94.709%

Figure 3 : Analyse en Composantes Principales (ACP) sur toutes les formulations

Quantification de l’efficacité du masquage d’odeur Pour évaluer l’efficacité du masquage d’odeur par les différents enrobages, la différence entre chaque formulation et l’échantillon de référence (air) est calculée (Tableau 3 et Figure 4). Cette différence est mesurée grâce à un calcul de distance euclidienne. Plus la distance entre le placebo et la formulation active est faible, meilleur est le masquage. La mesure du nez électronique FOX a mis en évidence que l’enrobage 3 masque efficacement l’odeur du principe actif, alors que les 3 autres enrobages ne sont pas efficaces.

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 155 Tableau 3 : Distances placebo-formulation active Distance

Valeur

Placebo 3 – Formulation 3 Placebo 1 – Formulation 1 Placebo 4 – Formulation 4 Placebo 2 – Formulation 2 [400] Placebo 3 – Formulation 3 [500]

0,06 0,17 0,35 1,27 1,32

3. MESURE DU NIVEAU D’AMERTUME DE GRANULES ENROBES GRACE A LA LANGUE ELECTRONIQUE ASTREE La quinine est connue pour avoir un goût amer prononcé. La langue électronique ASTREE (Figure 5) couplée à un module de prédiction d’amertume (BPM : Bitterness Prediction Module), a été utilisée pour mesurer l’intensité d’amertume de granulés contenant de la quinine pure [1], puis de la quinine masquée par différents taux d’un même enrobage (Tableaux 4 et 5). L’objectif est de vérifier le pouvoir masquant de l’enrobage afin de déterminer le masquage optimal. En parallèle, des tests de dissolution (USP XXVII) ont été menés pour quantifier la concentration en sulfate de quinine par spectrophotométrie UV.

Figure 5 : Langue électronique ASTREE (Alpha MOS, France) - 1 : Passeur d’échantillons 16 ou 48 positions – 2 : Set de 7 capteurs électrochimiques + 1 électrode de référence – 3 : Unité électronique pour l’acquisition et le contrôle du passeur Tableau 4 : Echantillons de quinine

Echantillon

Description

1 2 3 4

Granulés non enrobés Granulés avec enrobage 10% Granulés avec enrobage 20% Granulés avec enrobage 30%

Tableau 5 : Conditions analytiques Paramètre

Valeur

Volume d’échantillon Température de l’échantillon Nombre de réplicats Temps d’analyse / échantillon Durée d’acquisition pour chaque échantillon

25 mL ambiante 4 180 sec 120 sec

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Pour suivre l’évolution de l’amertume dans le temps, 5 échantillons de granules contenant l’équivalent de 100 mg de sulfate de quinine (non enrobée ou enrobée avec 10, 20 et 30% en masse) ont été dissous dans 100 mL d’eau pendant 1, 2, 3, 4 ou 5 minutes. A chaque temps, le mélange a été filtré et une mesure réalisée par la langue électronique. Le module BPM permet de déterminer le niveau d’amertume de principes actifs et nouvelles entités chimiques. Il a été développé à partir de composes amers de référence analysés à la fois par un panel sensoriel (échelle de mesure de 0 : pas d’amertume à 20 : amertume non acceptable) et par la langue électronique ASTREE équipée d’un set de capteurs spécifiques. Le modèle de corrélation qui a ainsi été établi (entre la mesure de l’instrument et les résultats in vivo), permet aujourd’hui de réaliser des quantifications d’amertume via la langue électronique sans utilisation du panel humain. Mesure de l’amertume des granulés de quinine dans le temps Les tests de dissolution montrent que, pour les granules non enrobées, 14% du sulfate de quinine sont libérés dans les 5 premières minutes. Cette quantité libérée est réduite à 9,2% - 5,9% et 2,1% pour les granules enrobées respectivement avec une quantité de 10%, 20% et 30%. D’après de précédentes études, il a été montré qu’une libération de principe actif inférieure à 9% (c’est-à-dire une concentration en sulfate de quinine inférieure à 10mg/L) conduit à une solution avec une amertume acceptable. Toutefois, les profils de dissolution issus des tests de dissolution ne permettent pas d’estimer quelles granules auront une perception de goût acceptable pour les patients lors de tests in vivo (à cause des conditions expérimentales, de la dynamique de mélange, etc.). Par conséquent, la langue électronique a été utilisée dans des conditions qui se rapprochent plus de celles dans lesquelles les médicaments sont administrés. Avec la langue électronique ASTREE, l’amertume est évaluée selon une échelle allant de 0 à 20 (Figure 6). L’écart-type résiduel observé est inférieur à 3%, ce qui révèle une très bonne répétabilité de mesure.

Figure 6 : Echelle de mesure d’amertume du module BPM

Sans enrobage, l’amertume des granules atteint un niveau inacceptable (score > 16.5) en moins d’une minute (Tableau 6). Avec un enrobage de 10%, la libération de la quinine est retardée: l’amertume atteint un score de 6 (légère amertume) et de 10 (acceptable) respectivement après 3 et 5 minutes. Avec 20% ou 30% d’enrobage, aucune amertume n’est détectée après 5 minutes (score < 4.5).

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 157 Tableau 6 : Evolution du niveau d’amertume des granulés au cours du temps Temps

Pas d’enrobage

Enrobage 10%

Enrobage 20%

Enrobage 30%

1 2 3 4 5

17 20 20 20 20

2 4 6 8 10

2 2 2 3,5 4

2 2 2 1,5 1,5

Etant donné qu’il a été montré qu’une libération retardée, même de quelques minutes, enlevait la sensation de goût désagréable, le délai de libération des granules avec 20% d’enrobage est considéré comme suffisant pour que le patient avale le médicament sans ressentir aucune gêne liée à l’amertume. 4. MESURE DE L’EFFICACITE DU MASQUAGE DE L’AMERTUME DE LA QUININE Pour accélérer le passage à la phase I - essais cliniques - une technique de formulation rapide et facile à mettre en oeuvre consiste à introduire le principe actif dans des sodas disponibles sur le marché. En effet ces boissons, du fait qu’elles contiennent des édulcorants et des sels inorganiques, ont en général un important pouvoir de masquage de l’amertume des principes actifs. Mais chaque soda a une efficacité de masquage différente. Dans cette étude, quatre types de sodas commercialisés ont été sélectionnés pour masquer l’amertume de la quinine. L’efficacité du masquage a été évaluée à l’aide d’une langue électronique. Une représentation qualitative des mesures de la langue électronique permet de visualiser et comparer rapidement les empreintes gustatives des différentes solutions (Figure 7). Coca Cola

d=

Sprite

“m

as

kDistance ing inversement proportionnelle à cal’efficacité du masquage pa bil ity ”

Dr Pepper Coca Cola + Principe Actif (PA)

Diet Sprite Sprite + PA Diet Sprite + PA Dr Pepper + PA

Figure 7 : carte de comparaison du goût des sodas seuls et avec la quinine

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Pour quantifier précisément l’efficacité du soda en terme de masquage d’amertume, la distance entre le soda seul et le soda contenant la quinine est calculée (Tableau 7). Plus la distance entre le soda seul et le soda avec quinine est petite, plus le goût des deux solutions est proche. Tableau 7 : Mesure de l’efficacité du masquage de l’amertume de la quinine par des sodas (concentration en quinine : 0,5 mg/mL) Solvant

Distance

Eau Sprite® Diet Sprite® Dr Pepper® Coca Cola®

525 310 200 251 399

Dans ce cas, le Diet Sprite® est la matrice la plus efficace pour masquer l’amertume de la quinine.

5. OPTIMISATION DU GOUT D’UN PLACEBO A L’AIDE D’UNE LANGUE ELECTRONIQUE Lors d’essais cliniques avec comparaison à un placebo, il est primordial de développer des placebos ayant un goût proche de celui du médicament afin de garantir la fiabilité des essais cliniques, en faisant en sorte que le patient ne puisse pas deviner qu’il prend le placebo et non le médicament. Pour effectuer cette évaluation, une langue électronique peut également être utilisée. Dans cet exemple, plusieurs solutions placebo (Tableau 8) contenant des concentrations différentes d’une substance amère ont été analysées avec l’instrument (Tableau 9) dans le but de déterminer la concentration optimale pour se rapprocher au mieux du goût du médicament qui sera évalué. Tableau 8 : Formulations de placebo : compositions Echantillon API BA0 BA1 BA2 BA3 BA4 BA5

Description Solution contenant le principe actif pur Solution contenant l’édulcorant seul Solution contenant l’édulcorant et la substance amère à la concentration 1 Solution contenant l’édulcorant et la substance amère à la concentration 2 Solution contenant l’édulcorant et la substance amère à la concentration 3 Solution contenant l’édulcorant et la substance amère à la concentration 4 Solution contenant l’édulcorant et la substance amère à la concentration 5

Tableau 9 : Formulations de placebo : paramètres Paramètre

Valeur

Volume d’échantillon Température de l’échantillon Temps d’analyse / échantillon Durée d’acquisition dans l’échantillon

30 mL ambiante 180 s 120 s

___________________Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15________________ 159 Plusieurs solutions ont été préparées en dissolvant des quantités variables d’une substance amère dans un volume d’eau constant (30 mL) contenant une concentration fixe d’édulcorant. En outre, deux autres solutions du même volume (30 mL) ont été analysées avec l’instrument : l’une contenant l’édulcorant seul, l’autre le principe actif seul à la concentration finale dans le médicament. Comparaison du goût des différentes solutions Afin de comparer le goût du principe actif seul et des formulations placebo, une Analyse en Composantes Principales (ACP) a été menée (Figure 8). Dans cette étude, les axes 1 et 3 sont ceux qui permettent d’obtenir la meilleure discrimination des différents échantillons. Sur ces 2 axes, les empreintes gustatives des diverses solutions sont clairement différenciées. Plus la concentration du composé amer augmente, plus le goût de la solution placebo se rapproche de celui de la solution contenant la substance active.

Figure 8 : Analyse en Composantes Principales appliquée aux différentes solutions

Sélection du placebo au goût similaire Pour déterminer quel placebo a le goût le plus proche de la formulation active, la distance entre la solution de principe actif et chaque placebo amer a été calculée. Plus cette distance est petite, plus le goût des deux solutions est proche. Dans ce cas précis, la solution de placebo BA5 contenant la concentration 5 de substance amère, présente le goût le plus proche de celui de la solution de principe actif.

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6. CONCLUSION Les caractéristiques sensorielles comme le goût et l’odeur influencent profondément la palabilité et le succès d’un médicament. Néanmoins l’évaluation de ces caractéristiques est interdite ou très difficile à mettre en œuvre dans l’industrie pharmaceutique, étant donné l’éventuelle toxicité des produits à tester. Ainsi, des instruments comme le nez et la langue électronique représentent des solutions efficaces et fiables pour cribler un grand nombre de formulations candidates et sélectionner la meilleure option, tout en éliminant les risques de santé liés aux tests humains.

7.

REFERENCES

1.

Kayumba P.C., Huyghebaert N. , Cordella C., Ntawukuliryayo J.D., Vervaet C.et Remon J.P., Quinine sulphate pellets for flexible pediatric drug dosing: formulation development and evaluation of taste masking efficiency using the electronic tongue, Eur. J. Pharmaceutics Biopharmaceutics, 66 (3), 460-465 (2007)

2.

Zheng J.Y. et Keeney M.P., Taste masking analysis in pharmaceutical formulation development using an electronic tongue, International J. Pharmaceutics, 310(1-2), 118-124 (2006)

'\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWGHVROXWLRQVDTXHXVHV de tensioactifs Thibault ROQUES-CARMES*, Alexandra GIGANTE, Serge CORBEL Département de Chimie Physique des Réactions, UMR 7630 CNRS-INPL, Nancy-Université, ENSIC, 1, rue Grandville, BP 20451, 54001 Nancy Cedex, France * [email protected]

RESUME :

/HWUDYDLOFRQFHUQHO¶pWXGHGHODG\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWVSRQWDQpHRXIRUFpH SDU DSSOLFDWLRQ G¶XQ FKDPS pOHFWULTXH GH gouttes de solutions aqueuses de tensioactifs sur des substrats solides. Dans le cas du mouillage spontané, QRXV DYRQV DLQVL PLV HQ pYLGHQFH O¶H[LVWHQFH GH SOXVLHXUV UpJLPHV G¶pFRXOHPHQW VXFFHVVLIV SHQGDQW O¶pWDOHPHQW GH PpODQJHV HDX-glycéroltensioactif sur des plaques de verre. Le nombre et la nature des régimes sont affectés par le volume de la goutte. Pour des gouttes de volume supérieur à 16,5 P/ODSUpVHQFHG¶XQWHQVLRDFWLIFRQGXLWjXQHDXJPHQWDWLRQGHODYLWHVVH G¶pWDOHPHQWHWODG\QDPLTXHHVWFRQWU{OpHSDUO¶HIIHW0DUDQJRQL/¶DSSOLFDWLRQ G¶XQ FKDPS pOHFWULTXH SDU pOHFWURPRXLOODJH PRGLILH O¶pQHUJLH GH VXUIDFH GX substrat. Cela entraîne unH IRUWH DXJPHQWDWLRQ GH OD YLWHVVH G¶pWDOHPHQW HW XQH GLPLQXWLRQ GH O¶DQJOH GH FRQWDFW GH OD VROXWLRQ DTXHXVH VXU GX WpIORQ /¶DQJOH GH FRQWDFW GLPLQXH G¶DXWDQW SOXV TXH OD WHQVLRQ VXSHUILFLHOOH OLTXLGHvapeur est faible. Ce comportement universel est indépendant de la nature et de la charge du tensioactif.

MOTS-CLES :

G\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWWHQVLRDFWLIHIIHW0DUDQJRQLpOHFWURPRXLOODJH

1. INTRODUCTION /¶pWDOHPHQW G¶XQH JRXWWH IOXLGH VXU XQ VXEVWUDW VROLGH SUpVHQWH GH QRPEUHXVHV applications dans les domaines pharmaceutiques, cosmétiques et agroalimentaires. Les études portant sur la dynamique de mouillage se sont majoritairement orientées sur le cas des liquides simples (sans tensioactif) [1,2]. (OOHVPHWWHQWHQpYLGHQFHO¶H[LVWHQFHGHSOXVLHXUVUpJLPHVG¶pFRXOHPHQWVXFFHVVLIV SHQGDQW OD GXUpH GH O¶pWDOHPHQW >@ 'DQV OH FDV GHV WUqV SHWLWHV JRXWWHV SRXU lesquelles on peut négliger les effets de la gravité, les interprétations théoriques sont principalement fondées sur deux mécanismes. Le premier fait intervenir des phénomènes moléculaires localisés à la ligne de contact (régime moléculaireFLQpWLTXH  >@ /H VHFRQG SULYLOpJLH O¶pFKHOOH PDFURVFRSLTXH VLqJH G¶pFRXOHPHQWV YLVTXHX[ GDQV O¶HQVHPEOH GX IOXLGH UpJLPH K\GURG\QDPLTXH  >@ (Q UpDOLWé, les deux mécanismes se produisent simultanément. Dans les premiers instants de O¶pWDOHPHQWODGLVVLSDWLRQGHFKDTXHF{WpGHODOLJQH PROpFXODLUH HVWGRPLQDQWHHW le régime moléculaire-cinétique est prédominant. Ensuite, la dissipation visqueuse dans le coin de la goutte domine et le modèle hydrodynamique représente bien la réalité [9]. Dans le cas de grosses gouttes, pour lesquelles on ne peut négliger les

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HIIHWV GH OD JUDYLWp O¶pWDOHPHQW VH SURGXLW JUkFH j OD VXFFHVVLRQ G¶XQ UpJLPH hydrodynamique suLYLG¶XQUpJLPHJUDYLWDLUHSRXUOHTXHOO¶pWDOHPHQWHVWJRXYHUQpSDU les forces de gravité [10,11]. Cependant les formulations industrielles sont bien plus complexes (suspensions, émulsions) et contiennent généralement des tensioactifs. En raison de la complexité GHV SKpQRPqQHV G¶DGVRUSWLRQ HW GH PRXLOODJH LO HVW GLIILFLOH G¶pWDEOLU GHV PRGqOHV SUpGLFWLIV GH OD YLWHVVH G¶pWDOHPHQW SUHQDQW HQ FRPSWH OD VWUXFWXUH GX WHQVLRDFWLI HW ses propriétés aux interfaces. Les phénomènes influençant la dynamique G¶pWDOHment sont nombreux, à savoir la rhéologie du liquide, la diffusion du tensioactif et son adsorption aux interfaces liquide-vapeur et liquide-solide, si bien que les LQWHUSUpWDWLRQV UHVWHQW TXDOLWDWLYHV &HUWDLQV DXWHXUV RQW HQYLVDJp O¶LQIOXHQFH GH OD préseQFHGHWHQVLRDFWLIVVXUODG\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWG¶XQOLTXLGHVXUXQVROLGH> @ /D SUpVHQFH G¶XQ WHQVLRDFWLI FRQGXLW JpQpUDOHPHQW j XQH DXJPHQWDWLRQ GH OD YLWHVVH G¶pWDOHPHQW >@ %LHQ TXH OH PpFDQLVPH UHVSRQVDEOH GH FHWWH augmentation de la viteVVH G¶pWDOHPHQW HQ SUpVHQFH GH WHQVLRDFWLI QH VRLW SDV FODLUHPHQWpWDEOLLOWURXYHVDQVGRXWHVRQRULJLQHGDQVO¶HIIHW0DUDQJRQL>@(Q effet, un gradient de tension superficielle induit un transport de matière des régions de faible tension superficielle vers celles de forte tension superficielle. /¶pWXGHGHODG\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWGHJRXWWHVGHVROXWLRQVDTXHXVHVGHWHQVLRDFWLI sur un substrat solide souffre G¶XQPDQTXHLQFRQWHVWDEOHGHGRQQpHVH[SpULPHQWDOHV HWG¶XQQRPEUHOLPLWpGHPRGqOHVYRLUH de leur absence en dehors des cas les plus VLPSOHV'DQVFHFRQWH[WHQRXVDYRQVVRXKDLWpHVWLPHUO¶LQIOXHQFHGHVSDUDPqWUHV PDMHXUVTXLUpJLVVHQWOHSKpQRPqQHG¶pWDOHPHQWHWTXHQRXVVRPPHVHQPHVXUHGH contrôler et de faire varier. Le travail concerne dRQF O¶pWXGH GH OD G\QDPLTXH G¶pWDOHPHQW GH JRXWWHV GH VROXWLRQV DTXHXVHV GH WHQVLRDFWLI VXU XQ VXEVWUDW VROLGH 1RXV DYRQV SOXV SDUWLFXOLqUHPHQW HQYLVDJp O¶LQIOXHQFH GH TXDWUH SDUDPqWUHV fondamentaux à savoir la nature et la concentration en tensioactifs, le volume de la goutte, la nature de la surface (verre hydrophile et polytétrafluoroéthylène, ou PTFE, K\GURSKREH  HW O¶LQIOXHQFH G¶XQ FKDPS pOHFWULTXH pOHFWURPRXLOODJH  /HV VROXWLRQV aqueuses de tensioactif mouillent parfaitement les surfaces hydrophiles comme le YHUUH HW OH WHQVLRDFWLI SHUPHW G¶DFFpOpUHU OD G\QDPLTXH GH PRXLOODJH 2Q SDUOHUD G¶pWDOHPHQWVSRQWDQp3DUFRQWUHOHVVROXWLRQVDTXHXVHVGHWHQVLRDFWLIDPpOLRUHQWOH mouillage sur des substrats hydrophobes mais le mouillage reste réduit. Nous avons GRQF HQYLVDJp G¶DSSOLTXHU XQ FKDPS pOHFWULTXH SRXU DPpOLRUHU O¶pWDOHPHQW GH OD JRXWWH 2Q SDUOHUD G¶pWDOHPHQW IRUFp /D WHFKQLTXH G¶pOHFWURPRXLOODJH UHSRVH VXU OD modification contrôlée des propriétés de mouillabilité du substrat solide par applicatioQG¶XQFKDPSpOHFWULTXH>@(OOHSHUPHWGHPRGLILHUGHIDoRQUpYHUVLEOHHW FRQWU{OpH O¶pWDOHPHQW G¶XQ OLTXLGH FRQGXFWHXU VXU XQ VROLGH K\GURSKREH SDU DSSOLFDWLRQ G¶XQ FKDPS pOHFWULTXH 'H QRPEUHXVHV DSSOLFDWLRQV GH FHWWH WHFKQLTXH sont déjà en phase induVWULHOOH GDQV OH GRPDLQH GH O¶RSWLTXH OHQWLOOH j IRFDOH variable [19]), pixels pour papier électronique [20,21], et dans le domaine de la microfluidique (déplacement de gouttes [22]).

2. ETALEMENT SPONTANE 2.1 Modèles théoriques Nous décrirons dans cette partie quelques lois générales de la dynamique G¶pWDOHPHQW HQ SDUWLFXOLHU FHOOH OLpH j O¶pWDOHPHQW VSRQWDQp 1RXV DYRQV FKRLVL GH

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SULYLOpJLHU XQH DSSURFKH HQ ORLV G¶pFKHOOH SOXW{W TXH GH QRXV OLYUHU j GH ORQJV GpYHORSSHPHQWV WKpRULTXHV /¶REMHFWLI est surtout de montrer, sur ces équations difficiles, quels sont les paramètres pertinents et comment la quantité étudiée varie en fonction de ces paramètres. Le lecteur pourra compléter ce point de vue intuitif (souvent suffisant pour attaquer un problème pratique) en se reportant aux articles ou ouvrages plus spécialisés (mais souvent plus académiques) cités en ELEOLRJUDSKLH 3RXUGHV OLTXLGHV SXUV VLPSOHV QHZWRQLHQV QRQ YRODWLOV V¶pWDODQW VXU GHV VXUIDFHV VROLGHV OLVVHV HW KRPRJqQHV OHV UpJLPHV G¶pFRulement sont bien représentés par une loi puissance, TXLGpFULWO¶pYROXWLRQWHPSRUHOOHGXUD\RQ5jOD base de la goutte dans le plan solide, soit : R(t) = K.t n&KDTXHUpJLPHG¶pFRXOHPHQW est caractérisé par un couple n et K bien défini. /¶DQJOHGHFRQWDFWDXUHSRVHVWO¶DQJOHGHFRQWDFWVWDWLTXHTE. Celui-ci est donné par OD ORL GH @ Le rayon à la base de la goutte varie comme t à la puissance 1/7 : R(t) § 92 J)/(4 ] S2))1/7 t1/7

(2)

avec ]= nkT , où ] est un coefficient de friction, n la concentration en sites K 0wO G¶DGVRUSWLRQ N OD FRQVWDQWH GH %ROW]PDQQ 7 OD WHPSpUDWXUH K0w la fréquence des sauts et O la longueuUPR\HQQHG¶XQVDXW Pour le régime hydrodynamique, la dissipation est entièrement attribuée à O¶pFRXOHPHQW )LJ E  /D GLVVLSDWLRQ YLVTXHXVH HVW GRPLQDQWH GDQV OH YROXPH SDU O¶LQWHUPpGLDLUH GH OD YLVFRVLWp >@ 'DQV FH FDV OH UD\RQ j OD EDVH GH OD goutte varie comme t à la puissance 1/10 : R(t) = 0,84 V3/10 ((Jt)/K)1/10

(3)

où V est le volume de la goutte et K la viscosité du liquide. Dans le cas des grosses gouttes, pour lesquelles le rayon des gouttes est supérieur à la longueur capillaire (N-1 J/Ug)1/2), on sera en régime de gravité. Les gouttes sont aplDWLHV HW O¶pWDOHPHQW HVW JRXYHUQp SDU OHV IRUFHV GH JUDYLWp (Q UpJLPH JUDYLWDLUH O¶pTXDWLRQ H[SULPDQW O¶pYROXWLRQ WHPSRUHOOH GX UD\RQ 5 SHXW VH PHWWUH VRXV OD forme [10,11]: R(t) = 0,77 V3/8 ((Ug)/K)1/8 t1/8

(4)

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où U est la masse volumique du liquide HWJO¶DFFpOpUDWLRQGHODSHVDQWHXU

a) Régime Moléculaire-cinétique: b) Régime hydrodynamique:

c) Régime Marangoni: gradient de J

z

U

U H

T Solide

O

Je

T R

J Flux Marangoni

x

Solide

Figure 1 'HVFULSWLRQGHVPRGqOHVXWLOLVpVSRXUFDUDFWpULVHUOHVUpJLPHVG¶pFRXOHPHQW

/HVPRGqOHVSUpFpGHQWVQHGpFULYHQWELHQODG\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWGHJRXWWHVTXH dans des cas « idéaux » à savoir un solide parfaitement lisse et une tension superficielle du liquide homogène dans toute la goutte. Il nous a donc paru LQWpUHVVDQWG¶HQYLVDJHUOHVFDVR il existe un gradient de tension superficielle dans la goutte engendré par la présence de tensioactifs dissous dans le liquide. 5DSSHORQV TXH VRXV O¶HIIHW G¶XQ JUDGLHQW VSDWLDO GH WHQVLRQ VXSHUILFLHOOH VH FUpHQW des écoulements dans la goutte des régions à faible tension superficielle vers les UpJLRQV j IRUWH WHQVLRQ VXSHUILFLHOOH )LJ F  2Q SDUOH G¶Hffet Marangoni. De nombreux auteurs estiment que ce gradient de tension superficielle résulte de la PLVH HQ FRQWDFW GH OD JRXWWH FRQWHQDQW OH WHQVLRDFWLI DYHF XQ ILOP G¶HDX FRQGHQVp SUpH[LVWDQW VXU OH VROLGH j O¶DYDQW GH OD JRXWWH ILOP QH FRQWHQDQW SDV GH tensioactif LQLWLDOHPHQW  >@ ,O V¶HQVXLW XQ IOX[ GH WHQVLRDFWLI GX FRUSV GH OD JRXWWH YHUV OD périphérie pour rééquilibrer le déficit dans le film. Dans ce cas, le rayon à la base de la goutte varie comme t à la puissance 1/4 [17,23] : R(t) = ((2 V 'J)/(SK))1/4 t1/4

(5)

2.2 Dispositif expérimental Le dispositif expérimental développé au laboratoire (Fig. 2a) permet de visualiser une JRXWWH GpSRVpH VXU XQH VXUIDFH VROLGH DX PR\HQ G¶XQH FDPpUD &&' KDXWH résolution (COHU, modèle monochrome 4913, viWHVVH G¶HQUHJLVWUHPHQW GH  images/s, avec une résolution de 572 u  SL[HOV  &HWWH FDPpUD HVW PXQLH G¶XQ téléobjectif (18- PP  HW FRXSOpH j XQ V\VWqPH G¶DFTXLVLWLRQ HW GH WUDLWHPHQW G¶LPDJHV/DJRXWWHHVWpFODLUpHGDQVO¶D[HGHODFDPpUDSDUXQHVRurce lumineuse GLIIXVHjWHQVLRQYDULDEOHFHTXLSHUPHWG¶RSWLPDOLVHUOHFRQWUDVWHHWGRQFODTXDOLWp GH O¶LPDJH /HV JRXWWHV VRQW IRUPpHV j O¶H[WUpPLWp G¶XQH VHULQJXH GRQW OH déplacement du piston est commandé par un pousse-seringue, ce qui assure un contrôle et une reproductibilité optimaux de leur volume. A la fin de chaque expérience, la plaque est pesée pour déterminer le volume de la goutte. Le système liquide-VROLGHHVWSODFpGDQVXQHFHOOXOHWKHUPRVWDWpHPXQLHG¶XQHIHQrWUHHQTXDUW] afin de limiter WRXWH GLVWRUVLRQ GH O¶LPDJH /D WKHUPRVWDWDWLRQ HVW DVVXUpH SDU XQH FLUFXODWLRQG¶DLUSUpDODEOHPHQWVpFKpGDQVXQGHVVLFFDWHXUHWGRQWODWHPSpUDWXUHHVW

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165

UpJXOpHSDUXQpFKDQJHXUGHFKDOHXU/¶DLUHVWDPHQpGDQVODFHOOXOHjO¶DLGHG¶XQH pompe à membrane. Pour limiter les perturbations extérieures pendant O¶HQUHJLVWUHPHQWGHVLPDJHVWRXVOHVpOpPHQWVGXGLVSRVLWLIVRQWSODFpVVXUXQHWDEOH anti-YLEUDWLRQ /H SURFHVVXV G¶pWDOHPHQW HVW HQUHJLVWUp HQ WHPSV UpHO j O¶DLGH GX logiciel Imastore (Fig. 2b). Le logiciel permet de décomposer le film initial en une VpULHG¶LPDJHV/HVLPDJHVVRQWWUDLWpHVDYHFOHORJLFLHO2SWLPDV&HGHUQLHUORJLFLHO SHUPHW GH UHSpUHU OH FRQWRXU GH OD JRXWWH HQ XWLOLVDQW O¶pTXDWLRQ GH %DVKIRUWK HW Adams [24]. Après traitement des imagHV VXFFHVVLYHV RQ REWLHQW O¶pYROXWLRQ temporelle des dimensions caractéristiques de la goutte (R, H et T). Le choix de mélanges eau-JO\FpURO DX[TXHOV VRQW DMRXWpHV GH IDLEOHV TXDQWLWpV G¶XQ WHQVLRDFWLI non-ionique, le Plantacare (alkyl (8-16) glucoside), permet de balayer de larges JDPPHV GH WHQVLRQ VXSHUILFLHOOH HW GH YLVFRVLWp /H JO\FpURO SHUPHW G¶DXJPHQWHU OD viscosité. Le verre est apparu comme le solide le plus approprié au regard de sa ERQQH PRXLOODELOLWp HW G¶XQH IDLEOH UXJRVLWp GH VXUIDFH &RPSWH tenu du diamètre G¶RULILFH GHV VHULQJXHV j QRWUH GLVSRVLWLRQ OH YROXPH GHV JRXWWHV YDULH GDQV XQ intervalle de 8 à 30 PL. a) Seringue

Pousse seringue motorisé

'Z Sonde de température

Platine à déplacement micrométrique

Cellule thermostatée et ventilée munie d¶une fenêtre en quartz Téléobjectif

Lampe munie d¶un filtre diffusant

Caméra CCD haute résolution

'Y 'X

Thermomètre à affichage digital

Table anti-vibration

Platines à déplacement micrométrique

Pupitre de commande

b)

Temps t (s)

Figure 2 D 'LVSRVLWLIH[SpULPHQWDOSRXUVXLYUHHQWHPSVUpHOO¶pWDOHPHQWG¶XQHJRXWWHSRVpH b) ExemSOHGHFKURQRORJLHGHO¶pWDOHPHQWG¶XQHJRXWWH

2.3 Résultats et discussion /D ILJXUH  UHJURXSH OHV FRXUEHV H[SpULPHQWDOHV G¶pWDOHPHQW GH PpODQJHV HDXglycérol-tensioactif sur des plaques de verre pour différents volumes de goutte. La

166

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concentration en tensioactif est de 1,4.10-2 M. Elle est supérieure à la concentration micellaire critique (CMC = 8.10-3 0 /DILJXUHUHSUpVHQWHOHVUpVXOWDWVG¶pYROXWLRQ temporelle du rayon de la goutte pour 3 concentrations en tensioactif. Les concentrations sont inférieures à la CMC. Le tracé des courbes R(t) en coordonnées logarithmiques met clairement en évidence des zones distinctes, pour la totalité des expériences. On observe une SUHPLqUH]RQHJpQpUDOHPHQWWUqVUHVWUHLQWHGDQVOHVSUHPLHUVLQVWDQWVGHO¶pWDOHPent HW SRXU ODTXHOOH O¶pYROXWLRQ GX UD\RQ HVW GLIILFLOHPHQW FDUDFWpULVDEOH &HWWH ]RQH FRUUHVSRQG jXQ UpJLPH WUDQVLWRLUHSUpFpGDQW OH UpJLPH G¶pWDOHPHQW SURSUHPHQW GLW 2Q D HQVXLWH GHX[ RX WURLV ]RQHV GDQV OHVTXHOOHV O¶pYROXWLRQ HVW OLQpDLUH HQ coordonnées logarithmiques et dont les pentes sont cependant distinctes. Dans ces zones, le rayon R évolue donc en fonction du temps comme une loi puissance. Le FKDQJHPHQW GH SHQWH Q  WUDGXLW GRQF XQ FKDQJHPHQW GX UpJLPH G¶pWDOHPHQW Finalement, il existe évidemment des zones de transition situées entre les zones SUpFpGHQWHV 1RXV DYRQV DLQVL SX PHWWUH HQ pYLGHQFH O¶H[LVWHQFH GH SOXVLHXUV UpJLPHV G¶pFRXOHPHQW VXFFHVVLIV SHQGDQW O¶pWDOHPHQW &KDTXH UpJLPH HVW caractérisé par un couple n et K bien défini. Les valeurs des paramètres n et K de chaque expérience sont fournies dans les tableaux 1 et 2.

Figure 3 ,QIOXHQFHGXYROXPHGHODJRXWWHVXUO¶pYROXWLRQWHPSRUHOOHGXUD\RQGHODJRXWWHHQIRQFWLRQ du temps (coordonnées logarithmiques).

Tableau 1 ,QIOXHQFHGXYROXPHGHJRXWWHVXUOHVSDUDPqWUHVG¶pWDOHPHQWGHVROXWLRQDTXHXVHGH tensioactif (J=29 mN/m et K=0,05 Pa.s). Volume (PL) 28 20 16,5 15 12 8

er

ème

1 régime n1 0,068 r 0,032 0,091 r 0,009 0,103 r 0,003 0,132 r 0,008 0,126 r 0,014 0,148 r 0,008

K -n (mm.s ) 2,336 2,355 1,708 2,493 2,215 2,145

2

ème

régime

n2 0,296 r 0,021 0,248 r 0,022 0,186 r 0,011 0,096 r 0,004 0,062 r 0,038 0,085 r 0,015

K -n (mm.s ) 1,758 2,127 1,639 2,763 2,707 2,504

3

régime

n3 0,128 r 0,008 0,116 r 0,004 0,139 r 0,010

K -n (mm.s ) 2,717 2,728 1,920

Le nombre et la nature des régimes sont fortement affectés par le volume de la goutte. Pour des gouttes de volume inférieur à 16 P/ GHX[ UpJLPHV G¶pFRXOHPHQW successifs sont observés. Bien que fluctuantes, les valeurs prises par n dans chaque

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167

zone sont proches des valeurs caractéristiques des régimes moléculaire-cinétique et hydrodynamique à savoir respectivement n1 = 1/7 puis n2 = 1/10. Ils correspondent parfaitement à ceux observés avec des liquides simples eQO¶DEVHQFHGHWHQVLRDFWLI /H WHQVLRDFWLI Q¶D DXFXQ HIIHW VXU OD FLQpWLTXH G¶pWDOHPHQW /D VROXWLRQ DTXHXVH GH tensioactif se comporte comme une solution simple (sans tensioactif). Il est pJDOHPHQW LQWpUHVVDQW GH QRWHU O¶DEVHQFH GH UpJLPH G¶pFRXOHPHQW 0DUangoni et gravitaire.

a)

b)

c)

Figure 4 ,QIOXHQFHGHODFRQFHQWUDWLRQHQWHQVLRDFWLIVXUO¶pYROXWLRQWHPSRUHOOHGXUD\RQGHODJRXWWH en fonction du temps (coordonnées logarithmiques). -3 -3 -3 a) [tensioactif] = 2.10 M, b) [tensioactif] = 4.10 M, c) [tensioactif] = 6.10 M.

Tableau 2 ,QIOXHQFHGHODFRQFHQWUDWLRQHQWHQVLRDFWLI>7$@VXUOHVSDUDPqWUHVG¶pWDOHPHQW de solutions aqueuses de tensioactif (Volume = 20 PL, K= 1,15 Pa.s). J

er

1 régime

[TA] n1

(mN/m) 55 48 35

(mol/l) -3 2.10 -3 4.10 -3 6.10

K -n (mm.s ) 0,095 r 0,006 2,456 0,104 r 0,004 2,401 0,094 r 0,006 2,154

2 n2

ème

ème

3

régime

K -n (mm.s ) 0,198 r 0,010 2,133 0,194 r 0,010 2,007 0,241 r 0,010 1,684

régime

n3

K -n (mm.s ) 0,110 r 0,009 2,827 0,129 r 0,009 2,574 0,123 r 0,004 2,448

Pour des gouttes de volume supérieur à 16 PL, ce qui donne une taille de goutte supérieure à la longueur capillaire (N-1 PP O¶pWDOHPHQWVHSURGXLWVHORQWURLV régimes successifs. La valeur de n passe successivement de 0,1 à 0,25 puis finalement 0,12. Les valeurs 0,10 et 0,12 sont très proches de celles attendues en régimes respectivement hydrodynamique et gravitaire, soit 1/10 et 1/12. La valeur obtenue pour le deuxième régime montre que la G\QDPLTXHHVWJRXYHUQpHSDUO¶HIIHW Marangoni. Ce régime est observé, quelle que soit la concentration en tensioactif et le volume de la goutte. Les interprétations pour justifier ces observations sont les VXLYDQWHV'DQVOHVSUHPLHUVLQVWDQWVO¶pWDOHPHQW suit le régime hydrodynamique et VH FRPSRUWH FRPPH XQ OLTXLGH VLPSOH /¶pWDOHPHQW GH OD JRXWWH SURYRTXH XQH DXJPHQWDWLRQ GH O¶DLUH LQWHUIDFLDOH OLTXLGH-vapeur dans le coin de la goutte. Ceci entraîne un gradient dans la distribution du tensioactif, en particulier dans le coin de la goutte. Ceci engendre un gradient de tension superficielle et donc une force de rappel qui modifie le profil des vitesses. Il se produit un flux de tensioactif du corps de la goutte vers la périphérie pour rééquilibrer le déficit dans le coin de la goutte.

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/¶pWDOHPHQW HVW GRQF OH UpVXOWDW GH OD VXSHUSRVLWLRQ G¶XQ IOX[ 0DUDQJRQL HW GX PRXLOODJHGHODJRXWWH/DG\QDPLTXHHVWGRQFJRXYHUQpHSDUO¶HIIHW0DUDQJRQLTXL DFFpOqUHO¶pWDOHPHQW/RUVTXHODTXDQWLWpGHWHQVLRDFWLIDSSRUWpH par effet Marangoni est suffisante pour équilibrer les tensions superficielles liquide-YDSHXU O¶pWDOHPHQW suit le régime gravitaire et se comporte à nouveau comme un liquide simple. Les résultats montrent que le gradient de tension superficielle ne résulte pas de la mise HQ FRQWDFW GH OD JRXWWH FRQWHQDQW OH WHQVLRDFWLI DYHF XQ ILOP G¶HDX FRQGHQVp SUpH[LVWDQW VXU OH VROLGH j O¶DYDQW GH OD JRXWWH FRPPH VRXYHQW pYRTXp GDQV OD littérature [14]. Le même type de résultats a été observé par Von Bahr et al. [25,26] ORUVGHO¶pWXGHGHO¶pWDOHPHQWGHVROXWLRQVDTXHXVHVFRQWHQDQWGXSRO\pWK\OqQHJO\FRO DON\O pWKHU VXU GHV VXUIDFHV K\GURSKLOHV ,OV REVHUYHQW OD VXFFHVVLRQ G¶XQ UpJLPH K\GURG\QDPLTXH VXLYL SDU XQ UpJLPH G¶pFRXOHPHQW 0DUDQJRQL ,O D pJDOHPHQW pWp observé TX¶XQ YROXPH GH JRXWWH PLQLPDO HVW QpFHVVDLUH SRXU HQJHQGUHU O¶HIIHW Marangoni. Lorsque le volume de goutte est trop faible [27] et/ou la diffusion du tensioactif est très lente [17], le flux Marangoni est trop rapide pour être observé.

3. ETALEMENT FORCE : ELECTROMOUILLAGE 3ULQFLSHGHO¶pOHFWURPRXLOODJH /D WHFKQLTXH G¶pOHFWURPRXLOODJH UHSRVH VXU OD PRGLILFDWLRQ FRQWU{OpH GHV SURSULpWpV GHPRXLOODELOLWpGXVXEVWUDWVROLGHSDUDSSOLFDWLRQG¶XQFKDPSpOHFWULTXH )LJ >@ Le dispositif expérimHQWDO SUpFpGHQW D pWp DGDSWp SRXU SHUPHWWUH G¶HIIHFWXHU OHV H[SpULHQFHVG¶pOHFWURPRXLOODJH/HVXEVWUDWXWLOLVpHVWXQHSODTXHGHYHUUHUHFRXYHUW G¶,72 conducteur (oxyde d'indium étain) qui sert de contre-électrode. La plaque est UHFRXYHUWHG¶XQHILQHFRXFhe de polytétrafluoroéthylène (Teflon£ AF 1600, DuPont) déposée par dip-coating (épaisseur 0,7 Pm), pour rendre le substrat électriquement LVRODQW HW K\GURSKREH >@ 8QH GHV pOHFWURGHV SORQJH GDQV O¶HDX DORUV TXH OD GHX[LqPH pOHFWURGH HVW DX FRQWDFW GH O¶,72 )LJ D  /HV pOHFWURGHV VRQW UHOLpHV j XQH VRXUFH GH WHQVLRQ FRQWLQXH /¶DSSOLFDWLRQ G¶XQ champ électrique entre les deux pOHFWURGHVSHUPHWGHIDLUHYDULHUO¶DQJOHGHFRQWDFWGHODJRXWWH )LJE  /¶DQJOH GH FRQWDFW YDULH HQ IRQFWLRQ GX SRWHQWLHO pOHFWULTXH VXLYDQW OD ORL GH Lippmann-Young (Fig. 5a) [18,29] :

cos T (V ) cos T (0V ) 

1 CV 2 2 J LG

§ J SG  J SL (0V ) · 1 H 0H r V 2 ¸¸  ¨¨ J LG ¹ 2 d J LG ©

(6)

T 9 pWDQWO¶DQJOHGHFRQWDFWHQDEVHQFHGHWHQVLRQGpILQLSDUODUHODWLRQGH@ ,O HVW GRQF QpFHVVDLUH G¶RSWLPLVHU FKDFXQ GH FHV GHX[ SDUDPqWUHV DILQ G¶rWUH GDQV OD FRQILJXUDWLRQ OD SOXV IDYRUDEOH SRXUODPDvWULVHGXSLORWDJHGHO¶pWDOHPHQWGHJRXWWHVGHOLTXLGH/DFRXFKHG¶LVRODQW

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DUHoXEHDXFRXSG¶DWWHQWLRQHWDIDLWO¶REMHWG¶XQHPLVHDXSRLQWUpFHQWH>@1RXs nous sommes donc intéressés plus particulièrement à la diminution de la tension VXSHUILFLHOOHGXOLTXLGHHQQRXVFRQFHQWUDQWSULQFLSDOHPHQWVXUO¶HIIHWGHWHQVLRDFWLIV 1RXV DYRQV FKHUFKp j FRQQDvWUH O¶LQIOXHQFH GH OD SUpVHQFH GH WHQVLRDFWLIV VXU OH phénRPqQH G¶pOHFWURPRXLOODJH /HV VROXWLRQV WHVWpHV VRQW GH O¶HDX GLVWLOOpH HQ présence de tensioactif à des concentrations variables. Les tensioactifs ont été choisis en fonction de plusieurs paramètres dont nous voulons montrer l'influence, à savoir la charge avec le SDS (anionique) ainsi que la structure chimique pour les non-ioniques en utilisant du Tween 80 (monooléate de sorbitane polyéthoxylé), Span 20 (monolaurate de sorbitane) et Plantacare (alkyl (8-16) glucoside).

Figure 5 : D 3ULQFLSHGHO¶pOHFWURPRXLOODJH/¶DSSOLFDWLRQG¶XQHGLIIpUHQFHGHSRWHQWLHOHQWUHODJRXWWH HWO¶pOHFWURGHFKDQJHO¶pQHUJLHOLEUHGHODJRXWWHHWHQWUDvQHXQHGLPLQXWLRQGHO¶DQJOHGHFRQWDFW T La forme résultante de la goutte est indiquée en trait plein. b) Evolution du profil G¶XQHJRXWWHG¶HDXjGLIIpUHQWSRWHQWLHO

3.2 Résultats Expérimentalement la goutte est soumise à une rampe de potentiels croissants MXVTX¶j XQ SRWHQWLHO GH  9, puis elle est soumise à une seconde rampe de SRWHQWLHOVGpFURLVVDQWVMXVTX¶j9'DQVWRXVOHVFDVOHVUpVXOWDWVPRQWUHQWTXHOHV FRXUEHV FRUUHVSRQGDQW DX[ GHX[ UDPSHV VRQW VXSHUSRVDEOHV HW QRXV Q¶REVHUYRQV SDV GH SKpQRPqQH G¶K\VWpUqVH >@ $ILQ GH QH pas alourdir notre propos, nous présentons une unique courbe relative à une augmentation de potentiel. /D ILJXUH  SUpVHQWH OH FRPSRUWHPHQW GH O¶DQJOH GH FRQWDFW GH OD JRXWWH VXU OD surface en fonction de la tension appliquée pour différentes concentrations de 7ZHHQ/HVSRLQWVH[SpULPHQWDX[HWODFRXUEH HQWUDLWSOHLQ LVVXHGHO¶pTXDWLRQGH Lippman-Young (équation (6)) sont tracés sur le même graphique. Les résultats

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présentés ci-dessous sont représentatifs de toutes les expériences réalisées avec les autres tensioactifs.

Figure 6 (YROXWLRQGHO¶DQJOHGHFRQWDFWHQIRQFWLRQGXSRWHQWLHODSSOLTXpSRXUGLIIpUHQWHV concentrations en Tween. Comparaison du modèle de Lippmann-Young (trait plein) et des résultats expérimentaux (points).

(QO¶DEVHQFHGHSRWHQWLHORQYRLWTXHO¶DQJOHGHFRQWDFWGLPLQXHDYHFO¶DXJPHQWDWLRQ de la concentration en tensioactif. Ce résultat est en accord parfait avec la loi de Young (équation 6) qui montre que la diminution de la tension superficielle liquideJD] GXH j O¶DGVRUSWLRQ GH WHQVLRDFWLI  GLPLQXH O¶DQJOH GH FRQWDFW /D SUpVHQFH GH tensioactif améliore les propriétés de mouillage de la solution aqueuse sur le Téflon. Cependant les angles restent élevés (T> 80°). 2QREVHUYHXQHGLPLQXWLRQGHO¶DQJOHGHFRQWDFWDYHFOHSRWHQWLHO&HWWHGLPLQXWLRQ HVW G¶DXWDQW SOXV SURQRQFpH TXH OD WHQVLRQ VXSHUILFLHOOH HVW IDLEOH 'H SOXV OHV courbes expérimentales et le modèle se superposent quasiment sur toute la plage de SRWHQWLHOHQWUHHW9/¶pTXDWLRQGH/LSSPDQQ-Young permet de représenter les points expérimentaux avec une très bonne précision sur un large intervalle de tension. La loi de Lippmann-Young est donc vérifiée en présence de tensioactif. Il existe ceSHQGDQWXQpFDUWVLJQLILFDWLIHQWUHOHPRGqOHHWO¶H[SpULHQFHSRXUOHVJUDQGV SRWHQWLHOV&HWWHGLIIpUHQFHWUDGXLWODVDWXUDWLRQGXSKpQRPqQHG¶pOHFWURPRXLOODJHDXGHOjG¶XQHFHUWDLQHWHQVLRQ/¶DQJOHGHFRQWDFWH[SpULPHQWDOQHYDULHTXDVLPHQWSOXV La tenVLRQ GH VDWXUDWLRQ HVW GH O¶RUGUH GH  9 &H SKpQRPqQH GH VDWXUDWLRQ HVW couramment observé [32]. Différentes hypothèses sont envisagées pour expliquer O¶RULJLQH GH FH SKpQRPqQH &HUWDLQV DXWHXUV pYRTXHQW O¶LRQLVDWLRQ GH O¶DLU j IRUWH tension [33]. Les charges pourraient quitter le liquide et ainsi réduire la pression latérale sur la ligne triphasique, donc réduire les forces motrices de O¶pOHFWURPRXLOODJH8QHDXWUHVXJJHVWLRQHVWOHSKpQRPqQHG¶pMHFWLRQGHJRXWWHOHWWHV

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satellites au bord de la goutte priQFLSDOHORUVGHO¶DSSOLFDWLRQG¶XQHIRUWHWHQVLRQ>@ car la ligne triple est le siège de champs électriques extrêmement forts. Les deux dernières séries ([Tween] = 4.10-4 et 4.10-3 M, JLG = 38 mN/m) sont effectuées avec des concentrations en tensioactif supérieures à la CMC (CMC=1,2.10-5 M). La tension superficielle liquide-gaz reste constante et il y a présence de micelles de tensioactif en solution. On observe que les deux courbes G¶pOHFWURPRXLOODJH sont superposées. La loi de Lippmann-Young est également YpULILpHHQSUpVHQFHGHPLFHOOHV/DYDULDWLRQGHO¶DQJOHGHFRQWDFWGHODJRXWWHVXUOD surface en fonction de la tension appliquée ne dépend que de la valeur de la tension superficielle indépendamment des espèces présentes en solution (micelles par exemple). /¶DEVHQFH GH YDULDWLRQ GH O¶DQJOH GH FRQWDFW SRXUGHV FKDPSV WUqV pOHYpV GXH j OD VDWXUDWLRQHPSrFKHO¶REWHQWLRQG¶XQPRXLOODJHWRWDO MXVTX¶j T= 0) de la surface par ODJRXWWHG¶HDX&HSKpQRPqQHHVWXWLOLVpSRXUGpSODFHUGHVJRXWWHVVXUXQHVXrface. /HGpSODFHPHQWUHSRVHVXUODFUpDWLRQG¶XQJUDGLHQWGHWHQVLRQVXSHUILFLHOOHJUkFHj une alternance de zones hydrophiles et hydrophobes. Les gouttes se déplacent préférentiellement vers les zones hydrophiles, pour diminuer leur énergie de surface. LRUVTXH OD JRXWWH UHSRVH VXU GHX[ pOHFWURGHV j OD IRLV O¶DSSOLFDWLRQ G¶XQ FKDPS électrique sur une seule des deux électrodes va entraîner un étalement de la goutte HW VRQ JOLVVHPHQW YHUV O¶pOHFWURGH DFWLYpH /HV V\VWqPHV FRPSRUWHQW GRQF XQH VXFFHVVLRQ G¶pOHFWURGHV HW OH UpVHDX G¶pOHFWURGHV VRXV FKDTXH PDWpULDX hydrophobe, est mis sous tension séquentiellement. Les principaux avantages du déplacement de goutte par électromouillage sont OD IDFLOLWp GH PLVH HQ °XYUH HW OD UDSLGLWpGHVJRXWWHV MXVTX¶jPV /¶DSSOLFDWLRQODSOXVDYDQFpHGHFHSURFpGpHVW sans doute les laboratoires sur puce (« lab on a chip ») [22]. La vitesse de GpSODFHPHQW GH OD JRXWWH HVW SURSRUWLRQQHOOH j OD GLIIpUHQFH G¶DQJOH GH FRQWDFW GH SDUWHWG¶DXWUHGHVpOHFWURGHV T(V) - T(0V)) [22,35]. 3.3 Discussion Nous allons nous intéresser à l'influence de la tension superficielle liquide-gaz sur la GLIIpUHQFHG¶DQJOHGHFRQWDFWDYHFHWVDQVFKDPSpOHFWULTXHHWSOXVSDUWLFXOLqUHPHQW la différence entre les angles de contact à 0 et à 50 V ('T= T(50V) - T(0V)). La figure  UpFDSLWXOH O¶HQVHPEOH GHV 'T REWHQXHV DYHF O¶HQVHPEOH GHV WHQVLRDFWLIV j différentes concentrations. ,OHVWSRVVLEOHGHUHSUpVHQWHUO¶HQVHPEOHGHVSRLQWVSDUXQHVHXOHHWXQLTXHFRXUEH /D YDULDWLRQ G¶DQJOe de contactaugmente avec la diminution de la tension superficielle. Il apparaît également que le SDS, tensioactif anionique, suit la même WHQGDQFH ,O Q¶\ D GRQF SDV G¶LQIOXHQFH GH OD FKDUJH GX WHQVLRDFWLI VXU OH comportement en électromouillage. On observe également que la présence de PLFHOOHVHQVROXWLRQQ¶DIIHFWHSDVO¶DOOXUHGHODFRXUEH/DYDULDWLRQG¶DQJOHGHFRQWDFW ne dépend donc que de la valeur de la tension superficielle. Pour obtenir une YDULDWLRQPD[LPDOHG¶DQJOHGHFRQWDFWDYHFHWVDQVFKDPp électrique il faut avoir une tension superficielle liquide-gaz la plus faible possible. Il est nécessaire de travailler avec une concentration en tensioactif supérieure à la CMC (tensioactif sous forme de micelles). La tension superficielle la plus basse HVW REWHQXH DYHF GX 6SDQ ,O V¶DJLW G¶XQ WHQVLRDFWLI SOXW{W K\GURSKREH +/%    'DQV FHV FRQGLWLRQV RQ DWWHLQW XQ angle de contact T(50V) de 40°.

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Figure 7 : Différence entre les angles de contact à 0 V et à 50 V ( 'T= T(50V)-T(0V)) en fonction de la tension superficielle liquide-gaz.

4. CONCLUSION /¶REMHFWLI GH FH WUDYDLO pWDLW GRQF G¶pWXGLHU OD G\QDPLTXH G¶pWDOHPHQW GH JRXWWHV GH solutions aqueuses de tensioactif sur des substrats solides. Nous nous sommes SDUWLFXOLqUHPHQW LQWpUHVVpV j O¶LQIluence de la nature et de la concentration en tensioactifs, du volume de la goutte, de la nature de la surface, verre hydrophile et 37)( 7pIORQ K\GURSKREHHWjO¶LQIOXHQFHG¶XQFKDPSpOHFWULTXH pOHFWURPRXLOODJH  Les solutions aqueuses de tensioactif mouillent parfaitement les surfaces de verre (TE ƒ  /H WHQVLRDFWLI SHUPHW G¶DFFpOpUHU OD G\QDPLTXH G¶pWDOHPHQW 2Q SDUOH G¶pWDOHPHQWVSRQWDQp3DUFRQWUHODSUpVHQFHGHWHQVLRDFWLIDPpOLRUHOHPRXLOODJHGH JRXWWHG¶HDXVXUGHVVXEVWUDWVK\GURSKREHV TE(eau) = 108° et TE(tensioactif) = 80°) mais le mouillage reste réduit. Nous avons donc appliqué un champ électrique pour DPpOLRUHUO¶pWDOHPHQWGHODJRXWWH2QSDUOHG¶pWDOHPHQWIRUFpSDUpOHFWURPRXLOODJH 'DQV OH FDV GH O¶pWDOHPHQW VSRQWDQp QRXV DYRQV PLV HQ pYLGHQFH O¶H[LVWHQFH GH SOXVLHXUV UpJLPHV G¶pFRXOHPHQW VXFFHVVLIV SHQGDQW OD GXUpH GH O¶pWDOHPHQW GH mélanges eau-glycérol-tensioactif sur des plaques de verre. Le nombre et la nature des régimes sont fortement affectés par le volume de la goutte. Pour des volumes de goutte inférieure à 16 P/ OHWHQVLRDFWLIQ¶DDXFXQHIIHWVXUODFLQpWLTXHG¶pWDOHPHQW La solution aqueuse de tensioactif se comporte comme une solution simple (sans WHQVLRDFWLI  /¶pWDOHPHQW VH SURGXLW DYHF XQH VXFFHVVLRQ G¶XQ UpJLPH PROpFXODLUHFLQpWLTXH VXLYL G¶XQ UpJLPH K\Grodynamique. Pour des volumes de goutte élevés (supérieurs à 16 P/ ODG\QDPLTXHG¶pWDOHPHQWGHYUDLWVHSURGXLUHVHORQXQUpJLPH hydrodynamique suivi par un régime gravitaire. En présence de tensioactif, on voit apparaître un régime intermédiaire de type Marangoni entre les deux régimes SUpFpGHQWVTXLFRQGXLWjXQHDXJPHQWDWLRQGHODYLWHVVHG¶pWDOHPHQW

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'DQV OH FDV GX PRXLOODJH IRUFp O¶DSSOLFDWLRQ G¶XQ FKDPS pOHFWULTXH SDU pOHFWURPRXLOODJH PRGLILH O¶pQHUJLH GH VXUIDFH GX VXEVWUDW K\GURSKREH &HOD SURGuit XQHIRUWHGLPLQXWLRQGHO¶DQJOHGHFRQWDFWGHODVROXWLRQDTXHXVHGHWHQVLRDFWLIVXUGX 7pIORQ/¶DQJOHGHFRQWDFWGLPLQXHDYHFOHSRWHQWLHODSSOLTXp$XQSRWHQWLHOGRQQp O¶DQJOHGHFRQWDFWGLPLQXHG¶DXWDQWSOXVTXHODWHQVLRQVXSHUILFLHOOHOLTXLGH-vapeur est faible. Ce comportement universel est indépendant de la nature et de la charge du tensioactif.

5. REMERCIEMENTS Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien financier de la Fédération de Recherche -DFTXHV9LOOHUPDX[SRXUODPpFDQLTXHO¶pnergie et les procédés (FR 2863, CNRS) dans le cadre du projet « Microfluidique et systèmes fluidiques multi-échelles ».

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de Gennes P.G., Brochard-Wyart F., Quéré D., Gouttes, bulles, perles et ondes, Belin, Paris, 2002

Index des sujets os

(Les n de pages renvoient uniquement aux débuts des articles)

A Acide polyglycolique, 81,138 Acide polylactique, 81,127,138 Acide polylactique-co-glycolique, 81 Adsorption, 127 Agglomération, 32 Albumine de sérum bovin (albumine bovine sérique, BSA), 127 Alcool polyvinylique, 104,116 Alginate - de calcium, 60,94 - de propylèneglycol (PGA), 94 - de sodium, 127 - protéine (association), 94 Alkylglucoside, 161 Amertume - masquage, 150 - mesure, 150 Analyse en Composantes Principales, 150 Analyse enthalpique différentielle (DSC), 81 Analyse sensorielle, 150 Angle de contact, 161 B Bingham (modèle de viscosité), 19 Biodégradabilité, 127 Bioencapsulation, 94 Biomatériau, 81 Biopolymère, 19 - réticulation, 94 Bonnes Pratiques de Fabrication, 138 BSA, 127 C Calorimétrie (DSC), 81 Capacité à la rétention d’eau, 49 Capteur à oxydes métalliques, 150 Carte formulation-composition, 32,71 Cellule Jurkat, 94

ChemFET (Chemically Modified Field- Effect Transistor), 150 Chromatographie - gazeuse ultra-rapide, 160 Cisaillement, 49 Coalescence, 32 Complexe protéine-polysaccharide, 19 Composés organiques (semi-)volatils (COV), 150 Concentration micellaire critique, 161 Conductimétrie, conductivité, 32,71 Contrôle qualité, 150 Cristal liquide lamellaire, 5 Cristallinité, 138 D Dépressurisation (vitesse), 81 Déshuilage (de la lécithine), 138 Dextrane, 127 Dichlorométhane, 127 Diffraction laser, 19 Diffusion (coefficient), 60 Diffusion de la lumière - dynamique (QELS, PCS), 19 Diméthyléther supercritique, 138 Diméthylsulfoxyde, 127 Dioxyde de carbone supercritique, 81,138 Distribution de tailles - de gouttes, 32 - de pores, 81 Dodécane, 71 Dodécylsulfate de sodium (SDS), 161 DSC (analyse enthalpique différentielle), 81 Dynamique d’étalement, 161 E Ecoulement - régime hydrodynamique, 161 - régime moléculaire-cinétique, 161

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Cahier de Formulation (2011) Vol. 15

Ecoulement de compression (“squeezing flow”), 32 Effet Marangoni, 161 Electromouillage, 161 Empilement critique, 32 Emulsification, 32,127 Emulsion, 5,94 - concentrée, 32 - gel, 71 - inversion de phases, 32 - multiple, 32,104 - polymérisation radicalaire, 127 - stabilité, 19 - submicronique, 127 Encapsulation, 32,60,94,127 - efficacité, 104 Energie superficielle, 161 Enrobage, 150 Ester polysaccharidique, 94 Esters d’acides gras, 127 Etalement (dynamique), 161 Extrapolation, 138 F Fibres de fruit - extraction, 49 - parois cellulaires, 49 Filtre solaire, 5 Fluide supercritique, 81,138 Fluorescence - microscopie confocale, 116 - spectroscopie, 116 Force ionique, 49 Formulation optimale, 71 G GAS (Gas Anti-Solvent), 138 Gel - émulsion), 71 - hydrogel), 49,60 - microsphère), 94 Glycérol, 161 Glycolide, 81 Glycopolymère greffé, 127 Gomme arabique, 19 Goût (masquage), 150 Granulométrie, 32,104,116

H Hème, 104 HLB, 32,71 Huile - d’amandes douces, 19 - de silicone, 32 - visqueuse, 32 Hyaluronate de sodium, 127 Hydrogel, 49,60 I Industrie alimentaire, 49 Inversion de phases, 5, 32 - catastrophique, 32 ITO (électrode), 161 J Jurkat (cellule), 94 L D,L-Lactide, 81 b-Lactoglobuline, 19 Langue électronique, 150 Lécithine déshuilée, 138 Libération - contrôlée, 60 Lidocaïne, 127 Lippmann-Young (équation), 161 Lovastatine, 138 M Mark-Houwink (relation), 81 Masquage - de l’amertume, 150 - du goût, 150 - de l’odeur, 150 Membrane, 94 Micelle, 5,161 Microencapsulation, 94 - conditions hydrodynamiques, 116 Microparticules, 138 Microscopie confocale à fluorescence, 116 Microscopie électronique à balayage (MEB, SEM), 81,104,116 Microscopie laser confocale, 49 Microscopie optique, 32 Microsphère, 104,116 - de gel, 94

Cahier de Formulation (2010) Vol. 15

Miniémulsion, 117 - polymérisation, 127 Module élastique, G’, 49,71 Module visqueux, G”, 49 Monolaurate de sorbitane, 71,161 Monooléate de sorbitane, 71 Monooléate de sorbitane polyéthoxylé, 71,161 Mouillage, 161 Mousse, 81 Myoglobine, 104 N Nanoémulsion, 5 Nanoencapsulation, 5 Nanoparticule, 127,138 Nanoprécipitation, 137 Newton (modèle de viscosité), 19 Nez électronique, 150 Nonylphénol polyéthoxylé, 32 O Odeur (masquage), 150 P Parfum, 116 Particule coeur-couronne, 127 PGSS (Particle Generation from Gas-Saturated Solutions), 138 Pharmacie (industrie), 138 Placebo, 150 Plan d’expériences Taguchi, 81 Poly(acide lactique), 81,127,138 2-Poly(e-caprolactone), 104 Poly(n-butylcyanoacrylate), 127 Poly(a-hydroxy)acides, 81 Polydiméthylsiloxane, 32 Polyglycolique (acide), 138 Polylactique co-glycolique (acide), 81 Polymère - amphiphile, 127 - hydrosoluble, 127 - masse molaire, 81 - vitrification, 81 Polymérisation, 5 - en miniémulsion, 127 - radicalaire en émulsion, 127 Polyméthacrylate de méthyle, 116 Polysaccharide, 94 - amphiphile, 127

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- complexe avec protéine, 19 Polystyrène, 127 Polytétrafluoroéthylène, 161 Polyvinylique (alcool), 104,116 Pomme, 49 Pores - rayon moyen, 60 - diamètre moyen, 81 - distribution de tailles, 81 Porosité, 81,116 - de surface, 104 Potentiel z, 19 Poudre pharmaceutique, 138 Procédé sol-gel, 5 Protéine, 19 - alginate (association), 94 - complexe avec polysaccharide, 19 - conformation (structure), 104 Pullulane, 60 Q Quinine, 150 R Rayon - hydrodynamique, 19,60 - moyen des pores, 60 Réacteur semi-fermé, 116 Réflectance, 5 Renkin (modèle), 60 RESS (Rapid Expansion from Supercritical Solutions), 138 Rétention d’eau (capacité), 49 Rhéologie, 19,71 - oscillatoire, 49 Rhéo-réacteur, 32 S SAS (Supercritical Anti-Solvent), 138 SDS (dodécylsulfate de sodium), 161 Silanol, 5 Silicone (huile), 32 Siloxane, 5 Span 20, 71,161 Span 80, 71 Spectrométrie de masse, 150 Spectrophotométrie UV/visible, 104 Spectroscopie de fluorescence, 116 Supercritique (fluide), 81,138

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Cahier de Formulation (2011) Vol. 15

Surfactif, 5,32 Systèmes de Winsor, 5 T Tailles - de gouttes (distribution), 32 - de pores (distribution), 81 Téflon, 161 Tensioactif, 5,32 - anionique, 161 - non ionique, 20,32,71,161 Tensiomètre - à goutte tournante, 71 Tension interfaciale, 5,19,71 Tension superficielle, 161 Tétraéthyl orthosilane, 5 Texturisation, 49 Thermogramme, 81 Tissus biologiques (ingénierie), 81 Tomate, 49 Transacylation, 94 Transition - de phase, 5 - vitreuse, 81 Transposition d’échelle, 138 Trempe en pression, 81 Trioléate de sorbitane polyéthoxylé, 71 Turbiscan, 19 Tween 80, 71,161 Tween 85, 71 V Viscoélasticité, 71 Viscosimètre à capillaire, 81 Viscosité, 32,71,81,104 - apparente, 49 - modèle newtonien, 19 - modèle de Bingham, 19 Vitesse de dépressurisation, 81 Y,Z Young (équation), 161 Zêtamétrie, 19

Les Cahiers de Formulation

Conditions d’obtention Pour les membres de la SCF et/ou du Groupe Formulation, adresser vos commandes accompagnées d’un chèque à l’ordre de la « Société Chimique de France » : Société Chimique de France (Mme Colliot) 250 rue Saint Jacques, 75 005 Paris Tél. : 01 40 46 71 60; Fax : 01 40 46 71 61 e-mail : [email protected] Pour les non-membres, adresser vos commandes à : EDP Sciences, P.A. de Courtaboeuf 17, rue du Hoggar, B.P. 112 91944 Les Ulis Cedex A Tél. : +33 (0)1 69 18 75 75 – Fax : +33 (0)1 69 28 84 91 e-mail : [email protected] Prix (TTC)

Membres de la SFC et/ou du Groupe Formulation

Non-membres

Volumes 1 à 7

15 €

23 €

Volume 8 à 14

30 €

45 €

Sommaires des Volumes Précédents Volume 1 (1990) Création d’une Option " Chimie de Formulation " dans une École d’Ingénieurs..............................1 Défloculation, stabilisation, fluidification d’une suspension de CaCO3 par un polyélectrolyte .........2 Poudres : aptitude à l’écoulement ..............................................................................................14 Formulation phytosanitaire : Réalisation de granulés dispersibles et tests d’application ".............19 Dosage d’un désherbant.............................................................................................................25 Analyse d’un produit industriel formulé : exemple de l’analyse d’une peinture..............................34 Synthèse d’une résine alkyde. Influence sur les caractéristiques de la peinture finale ................43 Peintures : relation entre CPV et brillant ; de la théorie à la pratique ...........................................53 Colles et vernis à partir d’acétate de polyvinyle............................................................................65 Exemple pratique de relation entre formulation de pesticides et action photochimique ................79 Quelques réflexions à propos d’une expérience de formation permanente liée à la formulation...92

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Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15

Volume 2 (1992) Préparation, évaluation sensorielle et optimisation d’un rouge à lèvres..........................................1 Les agents tensioactifs dans les procédés chimiques (opérations de séparation)........................12 Recherche d’un système solvant d’un adhésif polychloroprène pour coller du polystyrène expansé......................................................................................................................................35 Planification d’expériences appliquée à la formulation d’une colle époxyde pour métal...........................................................................................................................................47 La rhéologie : un outil indispensable pour la formulation actuelle ................................................55

Volume 3 (1993) La rhéologie appliquée à la formulation.........................................................................................1 Formulation de polyesterdiols obtenus à partir de déchets de PET..............................................27 Suspensions de produits minéraux en milieu aqueux et recherche d’optimisation de formulations ........................................................................................................................ 65 La mesure de la tension interfaciale ...........................................................................................84 Enseignement de la formulation ; du pragmatisme à la compréhension des phénomènes...........98 Compte-rendu du colloque « Formulation et Enseignement » du forum FORMULA III................117

Volume 4 (1994) Formulation de granulés dispersables à base d’un composé fongicide, l’oxychlorure de cuivre......1 La rhéologie appliquée à la formulation de peinture....................................................................14 Formulation d’une peinture. Étude des agents de coalescence du latex ....................................27 Effets de différents constituants dans la formulation d’une colle thermofusible ...........................34 Préparation et tests d’adhésifs thermofusibles à base de copolymères éthylène / acétate de vinyle .......................................................................................................45 Formulation de polymères « retard au feu » développant un processus d’intumescence .............54 Modélisation des propriétés des verres : Indice de réfraction d’un verre de phosphate ...............63 Construction d’un diagramme de phases à cinq constituants : SDS, BuOH, toluène, eau, NaCl .77 Formulation de microémulsions polymérisables à base d’acrylamides ..........................................91 Propriétés fonctionnelles des hydrocolloïdes. Gomme xanthane et gomme de caroube ............113 Mise au point de fluides de coupe peu polluants : Formulation et procédés d'épuration............127 Prévision de la solubilisation par l'étude des paramètres de solubilité........................................147

Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15

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Volume 5 (1996) Paramètres de Solubilité Paramètres de solubilité et propriétés physico-chimiques des solvants...............................…........1 Paramètres de solubilité et peintures………………………………………………………………………34 Paramètres de solubilité et mélanges de solvants………………………………………………………. 44 Application des paramètres de solubilité au dégraissage et au décapage des peintures………...62 Thermodynamique des paramètres de solubilité……....................................................…………..72 Paramètres de solubilité : une aide à la formulation cosmétique..................................................84 Glossaire des notions couraùmment utilisées en Formulation………………………………………….96

Volume 6 (1997) Etude de la miscibilité de mélanges polymères PVC / EVA par DSC et spectroscopie IR ..........….1 Optimisation de la formulation d'une poudre à laver ménagère...............................................….10 Synthèse de latex de polystyrène monodisperse.....................................................................… 25 Tensioactifs cationiques dans les conditionneurs pour cheveux et les adoucissants textiles .......39 Les agents superdispersants dans les ciments........................................................................…56 Les tensioactifs dans les bitumes.............................................................................…………….. 68 Agitation et mobiles d'agitation……………………………………………………………………………...88

Volume 7 (2000) Critères de Choix des Tensio-actifs Caractérisation des Agents de Surface. Mesure de leur Propriétés d' Usage.................................1 Mesure des Tensions Superficielle et Interfaciale des Liquides par Techniques Dynamiques......25 Biodégradabilité des Agents de Surface ................................................................................….44 Formulation des Emulsions et des Microémulsions .....................................................................62 Mélanges de Composés Tensioactifs. Propriétés et Intérêt en Formulation .............................…90 Agents Tensioactifs : de la Structure aux Propriétés..............................................................…105 Application des Tensioactifs dans l'Industrie Détergente ......................................................….131 Formulations agroalimentaires .................................................................................................153 Les Surfactifs en Cosmétiques ................................................................................................170 Les Adoucissants Ménagers.................................................................................................….181 Les Formulations Phytosanitaires.........................................................................................….190 Glossaire des notions couramment utilisées en Formulation...................................................... 200

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Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15

Volume 8 (2000) Formulation et Modifications de Surfaces Dures, Souples, Complexes, Revêtements, Caractérisation Physico-chimie du mouillage Énergie de surface d'un solide : physico-chimie et méthodes de mesure…….................…...…… 2 Mouillage des surfaces texturées. …….................…...………………………..……………………… 19 Modifications des surfaces dures Highlights in protecting façades with silicones…………………………………………………………….39 Verres anti-buée ou anti-pluie………………………………………………………………………………. 47 Le plasma d’azote en écoulement : principe et applications aux traitements de surfaces……… 57 Formulation des encres en fonction de leurs propriétés aux interfaces……………………………… 70 Modifications des surfaces souples La peau, physico-chimie d'une surface vivante………………………………………………………… 84 Formulation agrochimique en relation avec les surfaces végétales : séchage du dépôt d'un fongicide par microscopie environnementale………………………………………………………….…. 97 Structure fine des cheveux et soins capillaires, intérêt des céramides……………………………. 109 Modifications des propriétés de surface des fibres de laine…………………………………………. 125 Mécanismes de la détergence……………………….…………………………………………………….140 Revêtements Revêtements anticorrosion par procédé sol-gel…………………………………………………………151 Revêtements réticulables sous UV ou faisceau d'électrons………………………………………… 163 Approches globale et séquentielle pour la formulation des décapants pour peintures………… 182 Méthodes de caractérisation des surfaces Apport des microscopies (MEB et force atomique) à l'analyse des fibres textiles………………… 201 Caractérisation spectroscopique des surfaces par XPS et SIMS…………………………………… 217 Index alphabétique des mots-clés……………………………………………………………………… 229

Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15

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Volume 9 (2002) Les Mousses: Moussage et Démoussage Shampoings, Détergence, Décontamination, Bulles de Champagne, Mousses Alimentaires, Mousses Alvéolaires, Anti-mousses Morceaux choisis de la physique des mousses.................……………………………………………… 5 Foams. Colloid aspects of Formulation and Properties………………….....…………..................…. 18 Influence de la formulation sur les mousses …………………………............………………………… 58 Propriétés générales des mousses ..............................................................……………………… 92 PDMS Based Antifoams : Mechanisms and Performance …………………….............................. 116 Drainage et coalescence dans les mousses de savon…………………………............................. 125 Pouvoir moussant de mélanges de dodécylsulfate de sodium et de dodécanols polyéthoxylés en solution aqueuse ……………………………………………………………………………………….. 139 Films, bubbles, and foams of champagne wines …………………………..................................... 154 Les tensioactifs fluorés dans les mousses extinctrices …………………...................................... 170 Mousses polyuréthane rigides : contrôle de la structure cellulaire par les additifs de formulation188 Structure d’une mousse de décontamination ……………………………………………...................201 Étude du drainage d’une mousse de décontamination …………………………………................. 215 Les mousses utilisées en décontamination ………………………................................................ 236

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Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15

Volume 10 (2003) Dispersabilité Particules, Charges, Pigments, Latex Physico-chimie de la dispersion Comment améliorer la qualité des dispersions dans des milieux formulés ?…………………………..3 Choisir son désordre : quelle dispersion pour quelle propriété ? ……………………………………..17 Small particle technology……………………………………………………………………………………..27 Techniques d'analyse Visualisation, Images et Dispersion…………………………………………………………………………39 AFM Study of Rubber Compounds…………………………………………………………………………53 Application de la diffusion multiple dynamique de la lumière à l'étude de suspensions concentrées…………………………………………………………………………………………………….65 Application des techniques ultrasonores…………………………………………………………………..75 Chimie de surface et dispersabilité Surface Forces and Redispersion of Particles…… …………………………………………………….79 Dispersion of mineral particles with polyelectrolytes……………………………………………………...89 Interactions particulaires à l'origine dela prise des plâtres et ciments. Approches chimique, rhéologique et AFM …………………………………………………………………………………………..99 Modification des propriétés de surface Influence de la fonctionnalité de surface sur la dispersabilité d'une poudre dans un milieu liquide ou polymère……………………..…………………………………………………………………..117 Dispersion de silices par des silanes organofonctionnels……………………………………………..139 Dispersion aqueuse de particules minérales…………………………………………………………….155 End-chain functionalized polyoxyethylenes a dispersing agent of particles………………………..163 Stabilization of non-aqueous emulsions with poly(ter butylstyrene) - poly(ethylene oxide) block copolymers…………………………………………………………………………………………………….167 Domaines d'application industrielle Méthodes et difficultés de dispersion des poudres en formulation des aliments………………….177 Dispersion des poudres de lait…………………………………………………………………………….199 Controlling the state of dispersion and sedimentation stability of colloïdal supensions with both adsorbing and non-adsorbing polymers………………………………………………………………….207 Particules de latex stimulables pour applications biologiques………………………………………..223 Incorporation of particles in transparent Sol-Gel layers………………………………………………..239 Procédé de moulage de céramiques par coulage-coagulation………………………………………245 Stabilisation de colloïdes de rhodium à propriétés catalytiques par des ligands ou des polymères……………………………………………………………………………………………………..251 Suspensions photosensibles pour la mise en forme d'objets tridimensionnels céramiques par stéréolithographie……………………………………………………………………………………………267

Cahiers de Formulation (2011) Vol. 15

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Volume 11 (2004) Formulation des Composés Siliconés et Fluorés Silicones et composés fluorés : des produits aux propriétés d'usage….………………………………5 Les polymères fluorés…………………………………………………………………………………..…… 22 Propriétés des tensio-actifs fluorés : comparaison avec les systèmes hydrogénés………………...41 Les polymères siliciés…………………………………………………………………………………………56 Pourquoi introduire de la silice dans les huiles ou les gommes de polydiméthylsiloxanes ?………59 Emulsions silicones filmogènes……………………………………………………………………………...68 Silanes, siloxanes, silicone resins – Tailor-made for self-priming decorative coatings……………...83 Factors influencing the treatment of paper with fluorochemical surfactants for grease-proof applications……………………………………………………………………………………………………..99 Modification de charges minérales par fluoration……………………………………………………….103 Mécanismes d'adhésion et contrôle de l'adhérence pour les matériaux très déformables………110 Les mastics siliconés : formulation et performances……………………………………………………120 Une colle silicone à prise rapide, est-ce possible ?…………………………………………………….132 Rôle des composés hautement fluorés dans la formulation de substituts du sang et dans celle d’agents de contraste pour le diagnostic par échographie…………………………..141 Stabilisation of protein-containing water-in-oil emulsions..…………………………………………….152 Les silicones dans les produits de coiffage :silicones phénylées et formulation de produits de brillance…………………………………………………………………………………..

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Contrôle de la rhéologie de PDMS linéaires chargés à la silice……………………………………...184 Nanocapsules à base de cyclodextrines perfluorées : rôle potentiel pour le transport d’oxygène……………………………………………………………………………………………………..192 Photopolymérisation de revêtements silicones………………………………………………………….201 Activités dans la chimie du fluor au Laboratoire de Chimie Macromoléculaire UMR-CNRS 5076…………………………………………………………………………………………….204 Index des sujets…………………………….………………………………………………………………..207

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Volume 12 (2005) Innovations en Formulation Cosmétique Emulsions innovantes Emulsions sèches : nouveaux développements……………………………………………………………….3 Développement d’émulsions sèches par lyophilisation d’émulsions H/E déposées sur un support …11 Les émulsions de Pickering……………………………………………………………………………………...17 Procédés de préparation d’émulsions multiples en une seule étape……………………………………..31 Inversion ou déstabilisation d’émulsions à l’aide d’émulsifiants photo-stimulables……………………..41 Apport de l’IRTF et de la rhéologie à l’étude de la stabilité d’émulsions cosmétiques H/E……………49 Vectorisation des actifs Les vésicules comme modèles du transport cellulaire : rôle des pores et des tubes…………………..59 Archaeosomes: conception et application en vectorisation………………………………………………..66 Libération contrôlée des molécules de parfum à partir de précurseurs…………………………………..82 Nouveaux surfactifs végétaux, vecteurs de molécules parfumées : monoesters succiniques et azélaïques……………………………..………………………………………………………..97 Les vésicules catanioniques : paramètres de formation………………………………………………..…107 Microencapsulation d’Ibuprofène par émulsion-évaporation de solvant………………………….……117 Formulation, caractérisation et performances des produits cosmétiques Maîtrise de la texture: de la physico-chimie au procédé…………………………………………………..127 Le maquillage de l’ongle : évolution de la formulation des vernis………………………………...……..137 La polysensorialité du futur : quelles sont les grandes tendances cosmétiques qui se dessinent ?..................................................................………….............................……..........……146 Pearlized shampoo and sensory analysis : link appearance of EGDS crystal to analytical methods………………………………………………………………………………………………………….. 157 Tribologie de la surface cutanée……………………………………………………………………………. 165 Index alphabétique des mots clés……………….……………..….……………………………………….. 173

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Volume 13 (2005) Energie et Formulation Production et transport de l’énergie (combustibles fossiles) Emulsification de bruts extra-lourds : un cas typique de Génie de la Formulation ………………………5 La formulation des coulis de ciment mis en oeuvre dans la construction des puits de pétrole ….…..26 Inhibition de la formation ou de l'agglomération des hydrates de gaz par utilisation de polymères ou de tensioactifs………………………………………………………………………………………………….35 Carburants et lubrifiants Additifs de dépollution des émissions Diesel……………………………………………………………….…45 Les lubrifiants pour automobiles…………………………………………………………………………….….57 Dispersion de concentrés de fluides de coupe aqueux modèles dans de l’eau dure………………….69 Caractérisation des particules de noir de carbone dispersées en milieu aqueux et organique……… 78 Propergols et explosifs Des boosters d’Ariane 5 au gonflage des sacs airbag : évolution d’un matériau énergétique et de son process………………………………………………………………………………………………………...84 Interaction énergie-matière en formulation Ultrasons et formulation : préparation de systèmes dispersés………………………………...…………101 Energie électrique et formulation Les matériaux pour piles à combustibles…………………………………………………………………….120 Synthèse sous champ micro-onde et caractérisation de chromite de lanthane strontium dopé utilisé comme anode de pile à combustible SOFC………………………………………………………....132 Une expérience de “collaboratoire“ : la plate-forme de veille et d’animation du réseau PACo……...148 Dispersions aqueuses de particules de silice couvertes avec la fraction polaire d’une huile Minérale……………………………………………………………………………………………………………158 Index alphabétique des mots clés……………….……………..….……………………………………….. 169

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Volume 14 (2009) Formulation des Solides Divisés: des Procédés aux Propriétés d’Usage

I : Nanoparticules Procédés de génération de nanoparticules par cristallisation sphérique…………….……………..5 II : Poudres Caractérisation de la surface et morphologie des poudres………………………………………….15 Séchage par atomisation des suspensions concentrées de carbonate de calcium..…….……..33 Effet des paramètres thermodynamiques et opératoires sur la granulation humide à fort taux de cisaillement………………………………………………………..………………………..42 L’eau en poudre…………..……………………………………………….…………………………..……53 Modifications des propriétés des poudres par enrobage à sec dans un mélangeur Cyclomix…64 Formulations pour la mise en œuvre des céramique……...…………………………..………………75 Mesurer l’uniformité du mélange dans les comprimés pharmaceutiques par l’imagerie chimique en proche infrarouge………………………………………………..…………………………..83 III : Dispersions La génération de solides divisés par voie supercritique : principes de base, considérations sur l’état d’avancement des recherche………………………………………………………………………90 Caractérisation d'émulsions eau-dans-huile stabilisées avec des particules hydrophobes : comparaison avec des émulsifiants tensioactifs ……………………………………………………..106 Intérêt de la DSC pour la formulation de fluides de forage à base d’huile………….…………...116 Une nouvelle approche pour l’évaluation de l’inhibition des argiles par les fluides de forage…128 IV : Milieux granulaires Rhéologie des milieux granulaires denses vibrés………………………..………………………..…139 Index alphabétique des mots-clés……………………………………………………………………….153

Groupe Formulation Présentation de la Société Chimique de France La Société Chimique de France (SCF) est une association régie par la loi du 1er Juillet 1901, fondée en 1857 et reconnue d'utilité publique. Son objectif est la promotion de la Chimie dans ses aspects scientifiques, éducatifs et appliqués. La Société Française de Chimie, résultant de la fusion de la SCF avec la Société de Chimie Physique en 1984, a repris en 2008 le nom originel de Société Chimique de France. La SCF est organisée en Divisions, en Groupes thématiques, en Sections régionales et en Clubs de jeunes. Le Groupe Formulation constitue l'un des Groupes thématiques pluridisciplinaires.

Composition du Bureau du Groupe Formulation Présidente : Mme Cécile BONNET-GONNET, [email protected] Secrétaire : M. Alain DURAND, [email protected] Trésorier : M. Patrick CHARRIN, [email protected] Responsable des publications : M. Jean Paul CANSELIER, [email protected] Responsable des relations avec les enseignants : M. Fabbrice GOUBARD, [email protected] Responsable des relations avec la Société Française de Génie des Procédés : M. Jean Paul CANSELIER Responsable des relations avec les entreprises : Jean Claude DANIEL, [email protected] Membres : Mmes Florence AGNELY, Frédérique BELLANGER, Virginie BEREAU, Claire BORDES, Sophie DEROO, Claudine FILIATRE, Françoise LAFUMA, Véronique LAZZERI, Catherine LEHEN-FERRENBACH, Léa METLAS-KOMUNJER, Camille MICHON, Anne-Marie ORECCHIONI, Cécile PAGNOUX, Isabelle PEZRON, Martine POUX, Véronique RATAJ, Véronique SADTLER, MM. Jean-François ARGILLIER, Jean-Marie AUBRY, Daniel BERNARD, Pascal BRU, Jacques DESBRIERES, Claude DUBIEF, Serge DURAND-VIDAL, Patrick FERLIN, Pierre LANTERI, Gérard MEUNIER, Patrick PERRIN, Régis POISSON, Gilbert SCHORSCH, Stéphane UGAZIO, Frédéric VIDAL.

Renseignements et inscriptions : Société Chimique de France Tél. 01 40 46 71 60 Groupe Formulation Fax 01 40 46 71 61 250, rue Saint-Jacques Mél. [email protected] 75005 PARIS web : http:// www.societechimiquedefrance.fr /GRFORM

GROUPE FORMULATION DE LA SOCIETE CHIMIQUE DE FRANCE ___________________

La formulation, considérée auparavant comme un art, est devenue une démarche scientifique pluridisciplinaire et multi-sectorielle. Elle consiste à associer une ou plusieurs "matières actives" à une série "d'auxiliaires de formulation" pour conduire à un mélange répondant à un cahier des charges précis et susceptible de satisfaire un besoin d'un client (industriel ou consommateur final). Deux types d'industries sont plus particulièrement concernées par la formulation : les industries de spécialités chimiques, qui conçoivent les ingrédients de base des formules (tensio-actifs, pigments, composés filmogènes, parfums, huiles, stabilisants, épaississants…) et les industries de formulation, qui fabriquent des produits prêts à l'emploi possédant les propriétés d'usage requises (médicaments, cosmétiques, phytosanitaires, détergents, peintures, adhésifs…). En fait, toutes les autres industries de transformation de la matière font également appel à la formulation (produits agroalimentaires, carburants, textiles, caoutchoucs, plastiques, verres, ciments…). Le Groupe Formulation a pour ambition de contribuer au développement d'une approche raisonnée de la formulation qui éclaire la démarche empirique traditionnelle fondée sur un savoir-faire acquis "sur le terrain". Pour atteindre cet objectif, le Groupe favorise la mise en place d'enseignements dédiés à la formulation et facilite les échanges entre les acteurs industriels cités précédemment et les universitaires œuvrant dans toutes les disciplines scientifiques concernées : synthèse de produits de performance, physicochimie des interfaces et des systèmes dispersés, génie des mélanges, rhéologie des fluides complexes et des poudres, chimiométrie, déformulation, méthodes de caractérisation… Ses principales activités sont : - L'organisation annuelle des Journées de Formulation, focalisées sur des thèmes transversaux correspondant à des préoccupations communes à plusieurs industries de formulation. Les conférenciers universitaires sont chargés de faire le point sur les concepts et les méthodes et les intervenants industriels présentent des études de cas choisies dans différents domaines d'application de la formulation. - La publication des Cahiers de Formulation qui rassemblent des articles originaux rédigés par des membres du Groupe ou par les conférenciers des Journées de Formulation. - L'organisation des grands congrès internationaux "Formula" (Nice, 1987 ; Toulouse, 1990 ; La Grande-Motte, 2001 ; Londres, 2005 ; Potsdam, 2007 ; Stockholm, 2010). Ce sont des lieux de rencontre pour tous les universitaires et les industriels intéressés par la formulation au-delà de leurs domaines particuliers. - Des réunions trimestrielles du "noyau dur" du Groupe (15-20 personnes) destinées à faire le point sur les actions en cours. Site web : http://www.sfc.fr/GRFORM