Mikroskopische Technik [15. Aufl. Reprint 2019] 9783486777031, 9783486777024

Table of contents :
Vorwort zur 15. Auflage
Vorwort zur 8. Auflage
Inhaltsverzeichnis
Allgemeiner Teil
1. KAPITEL. Das Mikroskop und seine optischen Nebenapparate
2. KAPITEL. Die Herstellung und Untersuchung frischer Präparate
3. KAPITEL. Das lebende Präparat
4. KAPITEL. Die Fixierung histologischer Präparate
5. KAPITEL. Die Nachbehandlung des fixierten Präparates
6. KAPITEL. Durchtränkung und Einbettung
7. KAPITEL. Das Mikrotom
8. KAPITEL. Das Aufkleben der Schnitte
9. KAPITEL. Die Weiterbehandlung aufgeklebter und unaufgeklebter Schnitte bis zur Färbung
10. KAPITEL. Die Färbung
11. KAPITEL. Die vitale Färbung
12. KAPITEL. Das Einschließen der Präparate
13. KAPITEL. Herstellung mikroskopischer Korrosions- und Trockenpräparate
14. KAPITEL. Rekonstruktionsmethoden
15. KAPITEL. Das Messen mikroskopischer Präparate, Methodik der Mengenbestimmung von Organen und Organteilen
Spezieller Teil
16. KAPITEL. Die Untersuchung der Zelle und ihrer Bestandteile
17. KAPITEL. Die Untersuchung von Epithelien und Endothelien
18. KAPITEL. Die Untersuchung des Blutes
19. KAPITEL. Bindegewebe
20. KAPITEL. Knorpelgewebe
21. KAPITEL. Knochengewebe
22. KAPITEL. Zahngewebe
23. KAPITEL. Muskelgewebe
24. KAPITEL. Nervengewebe
25. KAPITEL. Herz-, Blut- und Lymphgefäße
26. KAPITEL. Lymphdrüsen, Milz und Knochenmark
27. KAPITEL. Schleim- und Eiweißspeicheldrüsen (einschließlich Pankreas)
28. KAPITEL. Mundhöhle und Darm
29. KAPITEL. Leber
30. KAPITEL. Atmungsorgane
31. KAPITEL. Niere und Harnwege
32. KAPITEL. Geschlechtsorgane
33. KAPITEL. Die inkretorischen Organe
34. KAPITEL. Haut und Anhangsgebilde der Haut
35. KAPITEL. Auge
36. KAPITEL. Gehörorgan
37. KAPITEL. Geruchsorgan
38. KAPITEL. Embryologische Untersuchungstechnik
Nachtrag
Schrifttum
Autorenverzeichnis
Sachregister
Anhang

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MIKROSKOPISCHE TECHNIK von

DR. B E N N O R O M E I S o. ö. Professor der Anotomie Direktor des Instituts für Histologie und experimentelle Biologie an der Universität München 15. verbesserte Auflage

£ MÜNCHEN 1948

LEIBNIZ

VERLAG

B I S H E R R. O L D E N B O U R G

VERLAG

Prof. Benno Romeis, geboren am 3. April 1888 in München. Professor an der Universität München Copyright 1948 b y Leibniz Verlag (bisher R. Oldenbourg Verlag) München. Veröffentlicht u n t e r der Zulassungsnummer US-E-179 der Nachrichtenkontrolle der Militärregierung (Dr. Manfred Schröter u n d Dr. Rudolf Oldenbourg). Auflage 3000. D r u c k : H. Schiele, Regensburg. Buchbinder: R. Oldenbourg, Graph. Betriebe G. m. b. H., München.

Vorwort zur 15. Auflage Die vorausgehende Auflage war 1943 kurz nach ihrem Erscheinen vergriffen. Das Manuskript der neuen Auflage wurde 1944 zum Druck gegeben, fiel aber einschließlich des gesamten Satzes einem Bombenangriff zum Opfer. J a n u a r 1945 wurde mit der Drucklegung erneut begonnen. Infolge der dann eintretenden Verhältnisse konnte der Druck erst Anfang 1947 fortgesetzt und erst nach mehr als Jahresfrist beendet werden. Während dieser ungewöhnlich langen Wartezeit wurden in das Manuskript noch mehrfach Ergänzungen und Verbesserungen eingefügt. Die Notwendigkeit eines völligen Neusatzes brachte die Möglichkeit mit sich, den Wunsch vieler Benützer des Buches zu erfüllen und ein anderes Format zu wählen. Damit entfällt allerdings die bisherige Bezeichnung „Taschenbuch", die ja infolge des unvermeidlichen Anschwellens seines Umfanges schon seit längerer Zeit nicht mehr zutreffend war. Ich hoffe, daß das Buch durch das größere Format an Übersichtlichkeit gewonnen hat. Auch bei dieser Auflage war ich bemüht den Inhalt möglichst dem gegenwärtigen Stand des Wissens anzugleichen. Ich weiß, daß manche der angegebenen Methoden sich zur Zeit in Deutschland nicht durchführen lassen, da die dazu nötigen Substanzen fehlen. Es wäre aber verfehlt, das Buch diesem Elendszustand anzugleichen. Es ist doch zu hoffen, daß Unterricht und Forschung auf wissenschaftlichem Gebiet in nicht allzu ferner Zeit auch in Deutschland wieder in vollem Umfang möglich werden. Und schließlich bewiesen mir zahlreiche Anfragen aus dem Ausland, daß die Benützung des Buches nicht an Landesgrenzen gebunden ist und sein Wiedererscheinen auch dort erwartet wird. Das Schrifttum des Auslandes konnte in den letzten Jahren nicht in dem Umfang wie in früheren Zeiten ausgewertet werden, da es mir trotz aller Bemühungen nur beschränkt zugänglich war. F ü r eine Reihe von Hinweisen auf wertvolle ausländische Arbeiten bin ich Herrn Professor Dr. S. Scheidegger (Basel) zu Dank verpflichtet. München, im April 1948. Benno

Romeis.

Vorwort zur 8. Auflage Zu Beginn möchte ich vor allem in Dankbarkeit meines verehrten Lehrers Dr. Alexander Böhm gedenken, dessen Erinnerung ich diese 8. Auflage des Taschenbuches widme. Als wenige Jahre nach ihm auch seinen früheren Mitarbeiter, Professor Dr. Oppel, der Tod ereilte, wurde mir der ehrende Auftrag zuteil, eine Neuauflage des Buches zu übernehmen. Möge es mir geglückt sein, das Werk meines Lehrers in seinem Sinne fortzuführen. Die Fortschritte der mikroskopischen Technik machten eine Erweiterung des Inhalts nötig, wenn anders das Taschenbuch seiner Aufgabe, Aufschluß über die wichtigsten und gebräuchlichsten Methoden zu geben, gerecht werden sollte. Dadurch, wie durch das Bestreben, die Übersichtlichkeit des Buches zu steigern, wurde eine eingreifende Umarbeitung nötig. Das Ergebnis dieser Arbeit dürfte schon bei einem Vergleich des Inhaltsverzeichnisses der 7. und der 8. Auflage hervortreten. So wurde eine Reihe von Abschnitten wie über die Untersuchung der Piastosomen, des Golgischen Binnenapparates, der Pigmente, der innersekretorischen Organe, ferner über den Nachweis von Fermenten, von anorganischen Substanzen u. a. neu aufgenommen. Andere wie jene über das Mikroskop, die Fixierung, die Einbettungsund Schneidetechnik, die Färbung, die Untersuchung des lebenden Präparates, der Fette und Lipoide, des Blutes, des Bindegewebes usw. wurden wesentlich umgeändert und erweitert. Nur der seinerzeit von G. Born geschriebene Teil über Rekonstruktion blieb, abgesehen von der Einfügung kleinerer Ergänzungen, im wesentlichen unverändert. Der von Oppel der 7. Auflage beigefügte Abschnitt über experimentelle, entwicklungsmechanische Technik konnte leider nicht mehr aufgenommen werden, da er — auf den Stand des heutigen Wissens gebracht — den Umfang des Buches zu sehr vergrößert hätte. Den praktischen Gebrauch des Taschenbuches suchte ich durch eine beträchtliche Vergrößerung des Sachregisters zu erleichtern, wofür allerdings eine Verkleinerung der Schrifttypen in Kauf genommen werden muß. Die bereits in früheren Auflagen enthaltene Verdünnungstabelle für Alkohol und eine neuangefertigte Tabelle über die Zusammensetzung der gebräuchlichsten Fixierungsflüssigkeiten wurden gesondert beigeheftet, um allenfalls ein Herausnehmen und Anschlagen der Tabellen am Arbeitstisch zu ermöglichen. — München, im September 1919.

Benno

Romeis.

Inhaltsverzeichnis Allgemeiner

Teil

Seite

1. Kapitel. D a s M i k r o s k o p u n d s e i n e o p t i s c h e n N e b e n apparate 1—24 2. Kapitel. D i e H e r s t e l l u n g u n d U n t e r s u c h u n g f r i s c h e r Präparate 24—35 3. Kapitel. D a s l e b e n d e P r ä p a r a t 36—45 4. Kapitel. D i e F i x i e r u n g h i s t o l o g i s c h e r P r ä p a r a t e 45—78 A. Allgemeines über die Fixierung 45 B. Zusammenstellung der gebräuchlichsten Fixierungsflüssigkeiten . 54—78 Aceton S. 54. — Alkohol S. 54. — Chromsäure und Chromsalze S. 57. — Essigsäure S. 60. — Formol S. 60. — Osmiumtetroxyd S. 64. — Phosphorwolframsäure S. 68. — Pikrinsäure S. 68. — Platinchlorid S. 71. — Salpetersäure S. 71. — Sublimat S. 72. — Sulfosalizylsäure S. 75. — Trichloressigsäure S. 76. — Uranylacetat und -sulfat S. 76. — Fixierung durch Trocknen in der Kälte S. 77. 5. Kapitel. D i e N a c h b e h a n d l u n g d e s f i x i e r t e n P r ä p a r a t e s 78—87 A. Abgekürzte Verfahren 78 B. Auswaschen 80 C. Entwässern 81 6. Kapitel. D u r c h t r ä n k u n g u n d E i n b e t t u n g 87—114 A. Die Einbettung in Paraffin 89 1. Die Entfernung des Alkohols 89 2. Durchtränken des Objektes mit Paraffin 95 3. Das Einbetten 97 B. Die Einbettung in Celloidin . 99 1. Herstellung der Lösungen 100 2. Ausführung der Celloidineinbettung 102 C. Die Einbettung in Celloidin-Paraffin 106 D. b i e Einbettung in Gelatine 107 E. Die Einbettung in Celodal 111 F. Das Aufblocken des Objektes 113 7. Kapitel. D a s M i k r o t o m 114^-125 Das Gefriermikrotom 120 8. Kapitel. D a s A u f k l e b e n d e r S c h n i t t e 126—137 A. Allgemeine Bemerkungen 126 B. Das Aufkleben von Paraffinschnitten 127 1. Methoden mit Wasser 127 2. Methoden mit Eiweiß 129 3. Besondere Aufklebemethoden f ü r Paraffinschnitte 131 C. Das Aufkleben der Celloidin-Paraffinschnitte 132 D. Das Aufkleben der Celloidinschnitte 132 E. Das Aufkleben der Gefrierschnitte 136 9. Kapitel. D i e W e i t e r b e h a n d l u n g a u f g e k l e b t e r u n d u n a u f g e k l e b t e r S c h n i t t e bis zur F ä r b u n g 137—140 A. Paraflinschnitte 137 B. Celloidinschnitte 140 C. Gefrierschnitte 140

VI

Inhaltsverzeichnis Seite

10. Kapitel. D i e F ä r b u n g 141—177 A. Allgemeines 141 B. Methoden 150 1. Färbungen mit Carmin und Carminsäure 150 a) Farblösungen mit Carmin 151 b) Farblösungen mit Carminsäure 153 2. Färbungen mit Hämatoxylin 154 a) Alaun-Hämatoxyline 155 b) Eisenhämatoxyline zur Färbung von Kernen und Plasmastrukturen 159 c) Hämatoxyline mit Chromverbindungen oder mit Osmiumsäure . 162 d) Hämatoxyline mit Wolfram-, Molybdän- oder Vanadiumverbindungen 163 3. Kernfärbung mit basischen Teerfarben 164 4. Mehrfachfärbungen für Ubersichtspräparate 166 5. Färbung mit künstlichen Beizenfarbstoffen 172 11. Kapitel. D i e v i t a l e F ä r b u n g 177—186 A. Allgemeines 177 B. Vitalfärbung mit sauren Farbstoffen 180 C. Vitalfärbung mit basischen Farbstoffen 181 D. Vitalfärbung von Fett und Knochen. Verschiedenes 185 12. Kapitel. D a s E i n s c h l i e ß e n d e r P r ä p a r a t e 185—201 A. Einschlußmittel für wasserhaltige Präparate 187 B. Einschluß in Harze und öle 193 1. Die Entwässerung der Präparate 193 2. Der Einschluß in Harze oder Öle 195 C. Verschiedenes 200 13. Kapitel. H e r s t e l l u n g m i k r o s k o p i s c h e r K o r r o s i o n s und Trockenpräparate 202—204 204—212 14. Kapitel. R e k o n s t r u k t i o n s m e t h o d e n 15. Kapitel. D a s M e s s e n m i k r o s k o p i s c h e r P r ä p a r a t e . M e t h o dik der M e n g e n b e s t i m mung von O r g a n e n und O r g a n teilen 212—216 Spezieller

Teil

16. Kapitel. D i e Z e l l e u n d i h r e B e s t a n d t e i l e 217—301 A. Zellkern und Cytoplasma 217 1. Lebendbeobachtung 217 2. Herstellung, Fixierung und Färbung von Ausstrichpräparaten . 220 3. Fixierung und Färbung von Gewebsstücken und Schnittpräparaten . 224 B. Centrosom, Spindelfasern, granuläre und fibrilläre Strukturen des Cytoplasmas 227 C. Die Darstellung der Mitochondrien 230 1. Fixierungsmethoden 230 a) Fixierungsflüssigkeiten mit Osmiumsäure 231 b) Fixierungsflüssigkeiten ohne Osmiumsäure 231 2. Einbettung 232 3. Bleichung 232 4. Färbemethoden 232 a) Färbung mit Eisenhämatoxylin 233 b) Färbemethoden mit Säurefuchsin 234 c) Färbung mit Eisenalizarin-Kristallviolett 235 D. Die Darstellung der Golgi-Substanz 236 E. Nachweis von Fetten und fettähnlichen Stoffen 241

Inhaltsverzeichnis

VII Seite

1. Vorbemerkungen 241 2. Untersuchung des lebenden und frischen Präparates 242 3. Allgemeine Fettfärbemethoden 243 a) Mit Sudan und Scharlach 243 b) Nachweis von Fettsubstanzen durch Osmierung 247 4. Sog. spezifische Fettfärbemethoden 249 a) Nilblausulfat zur Trennung von Neutralfetten und anderen Fettstoffen 249 b) Fettsäure-Nachweis nach Fischler 250 c) Cholesterin und Cholesterinverbindungen 251 d) Fettähnliche Stoffe (Lezithine, Lipoide) 252 F. Nachweis von Glykogen 255 G. Die Untersuchung der Pigmente 260 1. Allgemeine Methoden für Pigmentuntersuchung 260 2. Spezielle Angaben über Pigmente und ihre Darstellung . . . . 265 H. Nachweis von Fermenten 268 1. Oxydase Reaktionen (Phenolasen) 268 a) Indophenolblau-Reaktion nach Winkler-W. H. Schultze . . 268 b) Gewebs-Nadi-Reaktion nach Gräff 269 c) Phenolreaktion nach Loele 273 2. Peroxydase-Reaktionen . 275 3. Weitere Fermentreaktionen u. dgl 276 I. Nachweis von Vitaminen 277 K. Histochemische Methoden zum Nachweis anorganischer Substanzen 279 1. Veraschungsmethoden 279 2. Nachweis von Eisen 281 3. Nachweis von Kalium 285 4. Nachweis von Calcium ' 285 5. Nachweis von Kupfer 287 6. Nachweis von Blei, Gold, Wismut 288 L. Histochemische Reaktionen auf bestimmte organische Verbindungen . 289 1. Nachweis von Thymonukleinsäure 289 2. Piasmaireaktion 292 3. Eiweißreaktionen 295 4. Xanthydrolreaktion zum Nachweis von Harnstoff 295 5. Nachweis von Histidin 296 6. Nachweis von Glutathion und Sulfhydrilgruppen 296 7. Nachweis von Phenolderivaten 297 8. Nachweis von chromotroper Substanz 297 M. Histo-Physikochemische Methoden 298 1. Methoden zur Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration in mikroskopischen Präparaten 298 2. Bestimmung des isoelektrischen Punktes 300 17. Kapitel. E p i t h e l i e n u n d E n d o t h e l i e n 302—306 18. Kapitel. B l u t 306—337 A. Die Blutentnahme 306 B. Die Untersuchung des frischen Präparates 307 1. Rote Blutkörperchen 307 2. Weiße Blutzellen 309 3. Blutplättchen 310 C. Das Ausstrichpräparat 310 1. Herstellung des Ausstriches 310 2. Fixierung des Ausstrichpräparates 312 a) Fixierung des lufttrockenen Ausstriches 312 b) Fixierung des feuchten Ausstriches 313

VIII

Inhaltsverzeichnis Seite

3. Die Färbung des Ausstrichpräparates 314 a) Allgemeine Bemerkungen zur Ausführung der Färbung . 314 b) Spezielle Methoden 316 D. Die Darstellung des Blutes im Schnittpräparat 323 E. Die Methodik der Sternalpunktion 329 F. Darstellung von Fibrin 330 G. Verschiedenes 331 H. Die Zählung der Blutelemente 333 19. Kapitel. B i n d e g e w e b e 337—366 A. Die Untersuchung des frischen Präparates 337 1. Kollagenes Bindegewebe 337 2. Elastisches Gewebe 339 B. Untersuchung des Bindegewebes mit Hilfe der Verdauungsmethoden . 340 1. Allgemeines 340 2. Verdauung mit Trypsin 341 3. Verdauung mit Pepsin 342 C. Färbemethoden 343 1. Färbung des kollagenen Bindegewebes 343 a) Färbung von Totalpräparaten 343 b) Färbung von Schnittpräparaten 344 a) Die Mallorysche Bindegewebsfärbung und Modifikationen ders. 344 ß) Die Massonsche Trichromfärbung und Modifikationen derselben 347 y) Die Pasinische Färbemethode und Modifikationen derselben 348 8) Bindegewebsfärbung mit Blauschwarz, Nigrosin, Thiazin od. dgl. 349 ¿) Färbung des Bindegewebes mit Hämatoxylin 351 2. Imprägnierung des argyrophilen und kollagenen Gewebes mit Metallsalzen . 352 a) Die Bielschowsky-Methode zur Darstellung des Bindegewebes und Modifikationen der Methode 352 a) Vorbemerkungen 352 ß) Ausführung der Methoden 353 b) Tannin-Silber-Methoden 358 3. Färbung des elastischen Gewebes 362 4. Nachweis von Amyloid 365 20. Kapitel. K n o r p e l g e w e b e 366—371 A. Hyaliner Knorpel 366 B. Elastischer Knorpel 369 C. Bindegewebsknorpel 369 D. Herstellung von Totalpräparaten 369 21. Kapitel. K n o c h e n g e w e b e 371—385 A. Beobachtung des frischen Präparates 371 B. Entkalkung 372 1. Allgemeine Bemerkungen 372 2. Entkalkungäflüssigkeiten 373 3. Färbemethoden 375 a) Herstellung von Übersichtspräparaten 375 b) Methoden zur diiferenten Darstellung von verkalktem und unverkalktem Knochengewebe 376 c) Methoden zum morphologischen Kalknaphweis 377 d) Darstellung der Knochenzellen und Knochenkanälchen . 379 e) Darstellung der fibrillären Struktur 380 f) Untersuchung des sich entwickelnden und wachsenden Knochens . 381 C. Die Herstellung und Untersuchung von Knochenschliffen 382

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IX Seite

22. Kapitel. Z a h n g e w e b e 385—387 23. Kapitel. M u s k e l g e w e b e . 388—394 A. Quergestreifte Muskulatur 388 B. Glatte Muskulatur 392 24. Kapitel. N e r v e n g e w e b e 394—467 A. Zentralnervensystem 394 1. Allgemeines 394 2. Die Untersuchung der Ganglienzellen 395 a) Isolierung 395 b) K e r n - und Tigroidsubstanz 396 a) Die Methode von Nissl 396 ß) Weitere Methoden zur Färbung der K e r n - und Tigroidsubstanz 399 c) Mitochondrien und Neurosomen 401 d) Golgi-Substanz 402 e) Darstellung der Ganglienzellen einschließlich ihrer Fortsätze . . '402 a) durch Metallimprägnation 402 aa) Die Ausführung der Golgi-Originalmethoden 402 ßß) Modifikationen der Golgi-Methoden 404 ß) durch Färbung 406 f) Die Darstellung der Neurofibrillen 407 a) Molybdänmethoden . ' 407 409 ß) Goldmethoden 7) Silbermethoden 410 410 aa) Methoden von Bielschowsky und Modifikationen derselben ßß) Methoden von Ramon y Cajal 415 yy) Natronlauge-Silbermethode von O. Schultze 417 òò) Silbermethoden von Ranson, Foley und Bodian . . . . 419 3. Die Darstellung der Markscheiden 423 a) Die Weigertsche Originalmethode 423 b) Modifikationen der Weigertschen Methode 424 c) Weitere Methoden für Markscheidenfärbung 426 d) Darstellung degenerierender, markhaltiger Nervenfasern 429 4. Die Darstellung der Neuroglia 430 a) Weigert-Methode zur Darstellung der Faserglia und Modifikationen der Methode 43^. b) Darstellung der Gliastrukturen durch Imprägnierung mit Metallsalzen 434 a) Gliamethoden von R. y Cajal 434 ß) Gliamethoden von Rio-Hortega 437 y) Modifikationen der Hortega-Methoden 440 c) Hämatöxylinmethoden 444 d) Darstellung der amöboiden Gliazellen 445 e) Darstellung der senilen Drusen 445 5. Die Darstellung des Bindegewebes im Zentralnervensystem . 446 B. Peripheres Nervensystem 447 1. Die Untersuchung im lebenden und frischen Zustand; Isolierungsmethoden 447 2. Darstellung markhaltiger Nerven im fixierten Präparat . . . . 448 3. Darstellung der Neurofibrillen (Achsenzylinder) und ihrer Endapparate 451 a) Beizenfärbung mit Ammoniummolybdat-Toluidinblau . . . . 451 b) Goldimprägnations-Methoden 452 c) Silberimprägnations-Methoden 453 d) Darstellung mittels supravitaler Methylenblaufärbung . . . . 458

X

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aa) Supravitale Methylenblaufärbung nach der älteren Methodik von Ehrlich-Dogiel 458 a) Ausführung der Färbung 459 aa) Durch Injektion in die Blutbahn 459 ßß) Durch Einspritzung in eine Körperhöhle oder in das Organbindegewebe 460 yy) Durch Färbung am herausgenommenen Organ oder Organteil 460 ß) Fixierung der supravitalen Methylenblaufärbung . . . 461 bb) Supravitale Methylenblaufärbung nach der neuen Methodik von Schabadasch 462 Kapitel. H e r z - , B l u t - u n d L y m p h g e f ä ß e 467—476 Die Darstellung des Blutgefäßnetzes 469 a) Vorbemerkung 469 b) Darstellung durch Färbung 470 c) Darstellung durch Injektion 470 470 a) Allgemeines ß) Spezielle Methoden 472 d) Darstellung der Gefäße und anderer Hohlräume durch Füllung mit Luft 475 Kapitel. L y m p h k n o t e n , M i l z u n d K n o c h e n m a r k . 476—479 Kapitel. S c h l e i m und E i w e i ß s p e i c h e l d r ü s e n (einschl. Pankreas) 479—485 A. Allgemeines 479 B. Untersuchung der Schleimdrüsenzellen 480 1. Fixierung 480 2. Färbung 481 C. Untersuchung der Eiweißdrüsen und des Pankreas . . . 484 Kapitel. M u n d h ö h l e u n d D a r m 485—492 Kapitel. L e b e r 492—496 Untersuchung der Gallenbildung und der Gallenwege 493 a) durch Injektion 494 b) durch Imprägnation mit Metallsalzen 494 c) durch Färbung 495 Kapitel. A t m u n g s o r g a n e 496—497

31. Kapitel. N i e r e u n d H a r n w e g e 32. Kapitel. G e s c h l e c h t s o r g a n e A. Weibliche Geschlechstorgane B. Männliche Geschlechtsorgane 33. Kapitel. I n k r e t o r i s c h e O r g a n e A. Epithelkörper B. Hypophyse C. Keimdrüsen D. Nebenniere und chromaffines Gewebe (Paraganglien) E. Langerhanssche Inseln des Pankreas F. Schilddrüse G. Thymus H. Zirbeldrüse 34. Kapitel. H a u t u n d A n h a n g s g e b i l d e d e r H a u t A. Epidermis B. Nagel C. Haare D. Cutis (Corium und Subcutis) E. Tierische Hautdecke

498—501 501—509 501 505 509—521 509 510 514 514 516 518 519 520 521—530 521 525 525 526 528

Inhaltsverzeichnis

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35. Kapitel. A u g e 530—538 A. Die Untersuchung des lebenden Auges 530 B. Die Untersuchung des fixierten Auges 531 1. Übersichtspräparat 531 2. Glaskörper 532 3. Hornhaut (Cornea) 533 4. Lederhaut (Sklera) 535 5. Regenbogenhaut (Iris) 535 6. Ciliarkörper. Chorioidea 535 7. Linse 535 8. Netzhaut 536 36. Kapitel. G e h ö r o r g a n 538—541 37. Kapitel. G e r u c h s o r g a n 541 38. Kapitel. E m b r y o l o g i s c h e U n t e r s u c h u n g s t e c h n i k . 542 A. Wirbellose 542 B. Wirbeltiere 544 1. Cyclostomen 544 2. Fische 545 3. Amphibien 547 4. Reptilien 550 5. Vögel 552 6. Säugetiere 554 a) Allgemeines 554 b) Aufsuchen, Beobachten und Fixieren der jüngsten Entwicklungsstadien 557 c) Behandlung älterer Entwicklungsstadien 558 Nachtrag 560 Schrifttum 563 Autorenregister 626 Sachregister 635 689 A n h a n g . Zusammenstellung der für den Anfänger zu empfehlenden Methoden Verdünnungstabelle für Alkohol 695 Tabelle der gebräuchlichsten Fixierungflüssigkeiten

A l l g e m e i n e r Teil 1. KAPITEL

Das Mikroskop und seine optischen Nebenapparate 1. Eine a u s f ü h r l i c h e B e s c h r e i b u n g des M i k r o s k o p e s u n d seiner N e b e n a p p a r a t e liegt a u ß e r h a l b des R a h m e n s dieses Buches. I m n a c h f o l g e n d e n e i n l e i t e n d e n K a pitel ist v o r a l l e m b e a b s i c h t i g t , einige p r a k t i s c h e H i n w e i s e f ü r die B e n u t z u n g des M i k r o s k o p e s u n d seiner H i l f s a p p a r a t e zu geben, die im L a u f e d e r l e t z t e n zwei J a h r z e h n t e v e r s c h i e d e n t l i c h w e i t e r a u s g e b a u t u n d v e r v o l l k o m m n e t w u r d e n . 2. Z u r E r z i e l u n g s c h w a c h e r V e r g r ö ß e r u n g e n b e d i e n t m a n sich d e r Lupe oder des einfachen Mikroskopes, i n s b e s o n d e r e w e n n a u f r e c h t e , n i c h t s e i t e n v e r k e h r t e B i l d e r e r z e u g t w e r d e n sollen, w i e es z. B. bei gleichzeitigem P r ä p a r i e r e n u. dgl. e r w ü n s c h t ist. U n t e r den L u p e n , w e l c h e teils in e i n f a c h e r F a s s u n g als H a n d l u p e n , teils, an S t a t i v e n befestigt, als S t a t i v l u p e n b e n u t z t w e r d e n , s t e h e n die a p l a n a t i s c h e n L u p e n n a c h S t e i n h e i l an e r s t e r Stelle. Sie v e r g r ö ß e r n g e w ö h n l i c h 6—lOfach bei e i n e m O b j e k t a b s t a n d von 32 bis 12 m m u n d e i n e m S e h f e l d d u r c h m e s s e r von 30—15 m m . S t ä r k e r e V e r g r ö ß e r u n g e n g e b e n die A n a s t i g m a t l u p e n ( V e r g r ö ß e r u n g 16—27fach, O b j e k t a b s t a n d 9—5 m m , S e h f e l d d u r c h m e s s e r 10—6 mm). Eine große Bedeutung besitzt das nur mit e i n e m Objektivsystem versehene e i n f a c h e Mikroskop für die Herstellung von M i k r o p h o t o g r a p h i e n bei s c h w a c h e r V e r g r ö ß e r u n g . Die dabei gebrauchten Systeme, die von den einzelnen Firmen unter verschiedenen Namen auf den Markt gebracht werden: Mikroglyptare (Busch), Mikrosummare (Leitz), Mikropolare (Reichert), Mikroluminare (Winkel), Mikroplanare, Mikrotare (Zeiss) u. a., liefern meist 60- bis lOOfache Vergrößerungen, die sich durch Schärfe und ebenes Bildfeld auszeichnen. Die durch diese Systeme auf der Mattscheibe entworfenen Bilder sind seitenverkehrt. 3. I n n e u e r e r Zeit w u r d e n a u c h L u p e n f ü r b i n o k u l a r e B e o b a c h t u n g k o n s t r u i e r t , d i e e n t s p r e c h e n d i h r e r K o n s t r u k t i o n von d e m b e t r a c h t e t e n G e g e n s t a n d ein p l a s t i s c h e s Bild g e b e n und f ü r viele Z w e c k e d e n m o n o k u l a r e n L u p e n v o r z u z i e h e n s i n d . S e h r e m p f e h l e n s w e r t ist die b i n o k u l a r e S t i r n l u p e n a c h H e ß (hergestellt von L a u t e n s c h l ä g e r , M ü n c h e n - B e r l i n ) , die mittels eines G e l e n k e s an e i n e m v e r s t e l l b a r e n S t i r n r e i f b e f e s t i g t ist, so d a ß beide H ä n d e z u m A r b e i t e n f r e i b l e i b e n . D a sie i n f o l g e i h r e r g e d r u n g e n e n F o r m (die f ü r die B e o b a c h t u n g u n n ö t i g e n L i n s e n b e z i r k e sind w e g g e s c h n i t t e n ) n u r einen k l e i n e n T e i l des G e s i c h t s f e l d e s v e r d e c k t , b r a u c h t sie bei Ü b e r g a n g von L u p e n b e o b a c h t u n g z u N o r m a l s i c h t n i c h t a b g e n o m m e n zu w e r d e n . I h r G e w i c h t ist so gering, d a ß sie s t u n d e n l a n g o h n e B e s c h w e r d e n g e t r a g e n w e r d e n k a n n . D i e Verg r ö ß e r u n g s c h w a n k t , je n a c h W a h l d e r Vorsatzlinsen, zwischen 1^2—12fach. A m e m p f e h l e n s w e r t e s t e n ist e i n e 2—3fache V e r g r ö ß e r u n g . Vorzügliche Dienste leisten ferner die binokularen L u p e n m i k r o s k o p e , über die aus § 79 Näheres zu entnehmen ist. 1

R o m e i s , Mikrosk. Technik

15. Aufl.

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 4—9.

4. F ü r Untersuchungen mit stärkeren Vergrößerungen wurde die Lupe seit Konstruktion der achromatischen Linsensysteme (D o 11 o n d 1757, erstes achromatisches Mikroskopobjektiv aber erst von B e e l d s n y d e r 1791, v a n D e y l 1807 und F r a u n h o f e r 1811) durch das „zusammengesetzte Mikroskop" völlig verdrängt. I m Gegensatz zur Lupe liefert es seitenverkehrte Bilder, so daß also die rechte Seite i m Lichtbild links, die obere dagegen unten erscheint. Am zusammengesetzten Mikroskop unterscheidet man zwischen Optik u n d Stativ. Die S t a t i v s ä u l e , die mittels einer u-förmigen, möglichst standfesten F u ß p l a t t e auf dem Mikroskopiertisch aufsteht, t r ä g t von unten nach oben gezählt den S p i e g e l , den O b j e k t t i s c h und den T u b u s . 5. Die alte primitive Form der Stativsäule hat bei den modernen Mikroskopkonstruktionen mannigfaltige Veränderungen erfahren, die alle darauf abzielen, die Standfestigkeit zu erhöhen, die empfindlichen Teile vor Beschädigung zu schützen und die Bedienung des Mikroskopes zu vereinfachen. 6. Der d r e h b a r e Spiegel ist auf der einen Seite konkav, auf der a n d e r n plan. Die B r e n n w e i t e des Hohlspiegels ist so gewählt, daß parallel auftreffende Strahlen gerade in der Objektebene konzentriert werden. Arbeitet m a n ohne Kondensor, so benutzt man meist den Hohlspiegel, insbesondere wenn Fensterkreuze, Bäume oder dgl. dem zutretenden Lichte im Wege sind. Das gleiche gilt bei Verw e n d u n g von künstlichem Licht, wobei man zweckmäßig ein fein mattiertes Glasplättchen zwischenschaltet. Wenn zwischen Spiegel und Objektiv ein Beleuchtungsapparat (Kondensor) eingeschaltet ist, so benutzt man n u r den Planspiegel. Ü b e r d i e r i c h t i g e A r t d e r B e l e u c h t u n g o r i e n t i e r t m a n sich am b e s t e n in der Weise, daß man d a s O k u l a r h e r a u s n i m m t und durch den T u b u s a u f d a s O b j e k t i v s c h a u t . Man sieht dann an dem Bild der x Lichtquelle sehr leicht, ob die Beleuchtung gleichmäßig, gerade oder schräg ist. Durch leichtes Drehen des Spiegels läßt sich ohne Schwierigkeit die Beleuchtung zweckentsprechend einstellen. Bei f e i n e r e n Untersuchungen, namentlich mit stärkeren Vergrößerungen, kommt der Beleuchtung f ü r die richtige Darstellung des Objektes größte Bedeutung zu. (Weiteres siehe § 37 ff. und 42). 7. Der Objekttisch, auf den das zu betrachtende Objekt aufgelegt wird, besitzt in der Mitte eine m e h r oder weniger große Öffnung, welche durch Blendenvorrichtungen v e r e n g e r t werden kann. Bei den neueren I n s t r u m e n t e n findet man meistens die schon von photographischen Apparaten h e r allgemein b e k a n n t e Irlsblende. Einfachere Instrumente h a b e n statt dessen häufig eine Revolverblende, eine exzentrisch zur Objektischöffnung angebrachte, d r e h b a r e Scheibe mit verschieden großen Blendenlöchern. 8. Die richtige Abbiendung ist f ü r die Güte des mikroskopischen Bildes von großer Wichtigkeit. Namentlich bei V e r w e n d u n g starker Trockensysteme ist leicht festzustellen, daß bei zu starker Ü b e r f l u t u n g des P r ä p a r a t e s mit Lichtstrahlen das Bild verschleiert erscheint. Die Apertur der das mikroskopische Objekt beleuchtenden Strahlen soll im allgemeinen nicht größer sein als die A p e r t u r des zur Beobachtung dienenden Objektivs. Besonders wichtig ist die Abbiendung bei Untersuchung u n g e f ä r b t e r oder fein s t r u k t u r i e r t e r Objekte (s. auch § 36 pankratischer Kondensor). 9. Der Objekttisch kann bei größeren Instrumenten durch zwei seitlich angebrachte Stellschrauben nach allen Richtungen verschoben und dadurch im Bedarfsfall zentriert w e r d e n (s. u.). Um das genaue Verschieben der P r ä p a r a t e zu .erleichtern, gibt es auch eigene, auf den Objekttisch aufzusetzende „Kreuztische".

§ 10—13.

Mikroskop und Nebenapparate

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Mit Hilfe ihrer Noniuseinteilungen läßt sich jede beliebige Stelle eines Präparates notieren und später wieder genau auffinden. Zu d i e s e m Z w e c k e m u ß d e r K r e u z t i s c h v o r G e b r a u c h z e n t r i e r t w e r d e n . Man stellt dazu die einzelnen Noniusteilungen auf die Zahlen ein, die auf dem jedem Kreuztisch beigegebenen Fadenkreuzobjektträger angegeben sind. Dann verschiebt man den Objekttisch an seinen seitlichen ObjekttischStellschrauben so lange, bis das Fadenkreuz des eingespannten Testobjektträgers in der Mitte des Gesichtsfeldes liegt. Die an einem derartig zentrierten Kreuztisch abgelesenen Zahlen gelten dann auch für andere mit Kreuztischen versehene Mikroskope, vorausgesetzt, daß auch diese vor Gebrauch übereinstimmend zentriert wurden. Um ein Präparat mit Hilfe des Kreuztisches systematisch zu durchmustern, beginnt man links oben und verschiebt es unter Beobachtung seiner ganzen Quere nach bis ans rechte Ende; dann schiebt man es um eine Gesichtsfeldbreite nach oben, überquert wieder die ganze Breite usw.

10. Der Tubus kann bei jedem Mikroskop neuerer Konstruktion durch ein großes zu beiden Seiten der Stativsäule angebrachtes T r i e b s c h r a u b e n p a a r gehoben und gesenkt werden (Grobbewegung). Zur feinen Einstellung dient noch eine besondere Feinbewegung an der Seite oder am oberen Ende der Stativsäule. An ihr befindet sich meist eine M e ß t r o m m e l , mit deren Hilfe sich die Schnittdicke annähernd bestimmen läßt. Bei den neuesten Mikroskopmodellen liegen Grob- und Feinbewegung zur bequemeren Bedienung zweckmäßigerweise im unteren Teil des Statives unterhalb der Objekttischebene, so daß sie von der auf dem Arbeitstisch ruhenden Hand mühelos bedient werden können.

11. Am unteren Ende des Tubus ist das Objektiv angebracht, das von dem zu betrachtenden Gegenstand in der Nähe des oberen Tubusendes ein vergrößertes und umgekehrtes Bild entwirft. Die mühelose Auswechselung verschiedener Objektive wird entweder durch eine Drehvorrichtung ( O b j e k t i v r e v o l v e r ) oder durch eine Schlittenkonstrüktion ( O b j e k t i v s c h l i t t e n ) ermöglicht. Im letzteren Falle ist es möglich, eine beliebige Zahl von Objektiven übereinstimmend zu zentrieren. Jedes Objektivsystem besteht aus einer Kombination mehrerer Linsen. Die dem Präparat zugekehrte kleinste Linse heißt F r o n t linse. Am oberen Ende des Tubus ist das Okular eingesetzt, eine kurze Röhre, in welche oben und unten Linsen eingeschraubt sind: die obere, dem Auge zugekehrte nennt man die O k u l a r l i n s e oder A u g e n l i n s e , die untere die K o l l e k t i v l i n s e . Durch das Okular wird das vom Objektiv entworfene Bild nochmals vergrößert. 12. Die Objektive werden je nach der Vollkommenheit ihrer Konstruktion verschieden benannt. Adiromate sind Objektive, deren sphärische und chromatische Aberration nicht völlig korrigiert ist. Eine Verbesserung stellen die Fluoritsysteme oder Semiapochromate dar. Die beste Korrektion ist bei den Apochromaten ererreicht. Sehr augenfällig tritt die Überlegenheit der Fluoritsysteme und Apochromate gegenüber den Achromaten auch bei Dunkelfeldbeobachtung hervor.

Als P l a n a c h r o m a t e werden neue Objektive von Zeiss bezeichnet, bei denen die Bildfeldkrümmung vollkommen beseitigt ist. Das Gesichtsfeld ist hier bis an den Rand gleichmäßig scharf abgebildet, was namentlich bei Mikrophotographie sehr vorteilhaft ist (siehe B o e g e h o l d 38). 13. Die Okulare kann man nach ihrer Verwendung in zwei Gruppen trennen. Die eine Gruppe, die H u y g e n sehen und o r t h o s k o p i s c h e n O k u l a r e , I»

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 14—16.

v e r w e n d e t m a n n u r in V e r b i n d u n g mit a c h r o m a t i s c h e n O b j e k t i v e n o d e r F l u o r i t s y s t e m e n . Die A p o c h r o m a t e e r f o r d e r n d a g e g e n den G e b r a u c h v o n K o m p e n s a t i o n s o k u l a r e n oder p e r i p l a n a t i s c h e n O k u l a r e n ; a u c h bei F l u o r i t s y s t e m e n , P l a n a c h r o m a t e n und bei s t ä r k e r e n A c h r o m a t e n (mit e i n e r n u m . Ap. ü b e r 0.65) w e r d e n m i t Vorteil die l e t z t g e n a n n t e n T y p e n b e n ü t z t . 14. Zeiß hat bei der Anpassung der Objektiv- und Okularvergrößerung an bestimmte einfache Größen die frühere Bezeichnung und Numerierung seiner Objektive und Okulare verändert. Die nachfolgende Zusammenstellung der gebräuchlichsten Trockensysteme soll den Vergleich der neuen und alten Bezeichnung (die alte ist jeweils in Klammern beigefügt) ermöglichen. A c h r o m a t e : 1—1,5 (ao), 1,5—2 (ai), 1,2—2,4

(a*), 3 (as), 6 (aa), 8 (A), 10 (AA), 20 (C), 40 (D) u n d (DD), 60 (E,)

90 (F); A p o c h r o m a t e : 20 (16 mm), 20 (8 mm), 40 (4 mm), 60 (3 mm); H u y g e n s c h e O k u l a r e : 4 X (1), 5 X (2), 7 X (3), 10 X (4), 15 X (5); O r t h o s k o p i s c h e O k u l a r e : 12,5 X (5a), 17 X (6), 28 X (7); K o m p e n s a t i o n s o k u l a r e : 3 X (2), 5 X (4), 7 X (6), 10 X (8), 15 X (12), 20 X (18). Die jetzige. Zifferbezeichnung gibt die Einzelvergrößerung des betreffenden Objektives bzw. die Lupenvergrößerung des Okulares an. Einzelvergrößerung von Objektiv X Lupenvergrößerung von Okular ergibt dann in Annäherung die Vergrößerung des ganzen Systems bei'Tubuslänge 160 mm (Beispiel: gegeben Objektiv 20, Okular 7 X; die Vergrößerung = 20 X 7 = 140fach). Auch andere Mikroskopfirmen sind zu dieser sehr zweckmäßigen Art der Bezeichnung übergegangen. Unter E i n z e l v e r g r ö ß e r u n g (oder A b b i l d u n g s m a ß s t a b ) des Objektives ist die Vergrößerung des reellen Zwischenbildes zu verstehen, das vom Objektiv allein nahe am oberen Ende des Mikroskoprohres bei richtiger Einstellung entworfen wird. 15. Die n u m e r i s c h e A p e r t u r einer Linse oder eines z u s a m m e n g e s e t z ten optischein S y s t e m s w i r d g e k e n n z e i c h n e t d u r c h die F o r m e l a = n • sin a, w o b e i a die n u m e r i s c h e A p e r t u r , n den B r e c h u n g s i n d e x des M e d i u m s zwischen D e c k g l a s u n d F r o n t l i n s e u n d o den h a l b e n Ö f f n u n g s w i n k e l des O b j e k t i v e s d a r stellt. D e r l e t z t e r e e n t s p r i c h t d e m Winkel, d e n das äußere, g e r a d e noch vom O b j e k t i v a u f g e n o m m e n e L i c h t b ü n d e l mit der O b j e k t i v a c h s e b i l d e t . F ü r T r o c k e n s y s t e m e k a n n die n u m e r i s c h e A p e r t u r h ö c h s t e n s d e n W e r t 1 e r r e i c h e n (in p r a x i 0,95), bei Uli'mmersionen den W e r t 1,45. Das A u f l ö s u n g s v e r m ö g e n eines O b j e k t i v e s ist um so größer, je h ö h e r seine n u m e r i s c h e A p e r t u r ist (siehe a u c h § 21 f.). 16. Das A u f l ö s u n g s v e r m ö g e n (D) ist a u ß e r v o n d e r A p e r t u r des O b j e k t i v s (a) a u c h v o n d e r W e l l e n l ä n g e des Lichtes (k) a b h ä n g i g ; h i e f ü r gilt die F o r m e l D = A/a (s. auch § 33). M a n w i r d also u m so f e i n e r e S t r u k t u r e n e r k e n n e n g ö n n e n , je g r ö ß e r die A p e r t u r des O b j e k t i v s u n d je k ü r z e r die W e l l e n l ä n g e d e i b e n ü t z t e n L i c h t e s ist. F ü r die E r k e n n u n g von E i n z e l h e i t e n ist das A u f l ö s u n g s v e r m ö g e n in e r s t e r L i n i e des O b j e k t i v s m a ß g e b e n d . Mit d e m O k u l a r k a n n m a n n u r solche Teilc h e n w a h r n e h m e n , die b e r e i t s in dem vom O b j e k t i v e n t w o r f e n e n B i l d e e n t h a l t e n sind. Die B e d e u t u n g des O k u l a r s b e r u h t darin, daß die f ü r den A b s t a n d d e r S e h e l e m e n t e u n s e r e r N e t z h a u t zu enge g e l e g e n e n T e i l c h e n d u r c h d a s O k u l a r soweit a u s e i n a n d e r g e z o g e n w e r d e n , d a ß sie v o m B e o b a c h t e r w a h r g e n o m m e n w e r d e n k ö n n e n . O b e r h a l b e i n e r gewissen O k u l a r v e r g r ö ß e r u n g k a n n infolgedessen eine w e i t e r e S t e i g e r u n g derselben k e i n e n e u e n E i n z e l h e i t e n m e h r zu Gesicht b r i n g e n . Die v o m O b j e k t i v u n d O k u l a r gelieferte G e s a m t v e r g r ö ß e r u n g m u ß e t w a d e m 500fachen d e r n u m . A p e r t . des b e n u t z t e n O b j e k t i v s e n t s p r e c h e n , d a m i t alle v o m Objektiv aufgelösten Bildelemente deutlich wahrgenommen werden können. M a n b e z e i c h n e t diese V e r g r ö ß e r u n g als die F ö r d e r l i c h e Vergröße-

§17—20.

Benutzung des Mikroskops

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r u n g. Ihre obere Grenze ist erreicht, wenn sie etwa das lOOOfache der num. Apert. beträgt. Eine weitere Steigerung der Vergrößerung durch Verwendung noch stärkerer Okulare vermag keine weiteren Einzelheiten aufzuzeigen. Bei einem Objektiv von n. A. 0,60 liegt demnach die förderliche Vergrößerung zwischen 300—600fach. Angenommen, das genannte Objektiv habe die Einzelvergrößerung 40, so käme als stärkstes Okular das Okular 15 X in Betracht. In besonderen Fällen, z. B. bei Messen, Zählen, kann die Verwendung noch stär ker vergrößernder Okulare angezeigt sein. 17. Die Objektive sind auf eine ganz bestimmte Tubuslänge und Deckglasdicke korrigiert, was insbesondere bei Gebrauch der starken Trockensysteme zu berücksichtigen ist. Die sog. m e c h a n i s c h e T u b u s l ä n g e beträgt für die Objektive von Reichert und Zeiss 160 mm, für jene von Busch, Leitz, Seibert und Winkel 170 mm. Sie läßt sich durch Verschieben der fernrohrartigen, mit Millimeterteilung versehenen Ausziehröhre einstellen. Die mechanische Tubuslänge ist von der Ansatzfläche des Objektivgewindes bis zum oberen Tubusrande, dem das Okular aufsitzt, gerechnet. Bei Benutzung eines Revolvers u. dgl. ist die Höhe des betreffenden eingeschalteten Zwischenstückes (hier z. B. 15 mm) in Anrechnung zu bringen. Bei Reichert- oder Zeissmikroskopen zieht man demnach bei vorgeschaltetem Revolver oder Objektivschlitten den Tubus bis zur Mark 145, bei Leitz usw. bis 155 heraus. 18. Die Deckglasdicke, für welche die Objektive korrigiert sind, beträgt meist zwischen 0,15—0,20 mm. Um die starken Trockensysteme auch bei verschiedener Deckglasdicke ohne Beeinträchtigung der Bildschärfe benutzen zu können, werden sie auch in sog. K o r r e k t i o n s f a s s u n g e n geliefert; durch Drehen des Korrektionsringes kann die Entfernung zwischen den feststehenden unteren und den verstellbaren oberen Linsenpaaren des Objektives verändert werden. Bis zu einem gewissen Grade lassen sich die Deckglasunterschiede auch durch Veränderung der Tubuslänge ausgleichen; bei zu dünnen Deckgläsern wird dieselbe etwas verlängert, bei' zu dicken dagegen verkürzt. 19. Zur exakten Feststellung der Deckglasdicke dient ein sog. Deckglastaster. Die Messung hat vor dem Auflegen des Deckglases zu erfolgen. 20. Über die Benutzung des Mikroskops. ( A n l e i t u n g f ü r d e n A n f ä n g e r . )

a) Man stellt das Mikroskop auf einen feststehenden Tisch, der durch das nahe Fenster gleichmäßiges, helles Licht erhält. Die Stativsäule ist dem Beobachter zugewendet und bleibt in dieser Stellung stehen. Ein etwa vorhandener Beleuchtungsapparat wird zunächst entfernt. b) An das untere Ende des Tubus bringt man vorerst das schwächste Objektiv und senkt den Tubus unter seitlicher Beobachtung so weit, bis die Frontlinse des Objektivs etwa 0,5 cm vom Objekttisch entfernt ist. Dann drehe man den Spiegel so lange hin und her, bis man beim Hineinsehen in den Tubus, in dem zunächst noch kein Okular steckt, ein möglichst helles, gleichmäßiges Lichtfeld erblickt. Nun wird das schwächste Okular eingesetzt. Man muß ein völlig gleichmäßig beleuchtetes, helles Gesichtsfeld vorfinden. c) Jetzt legt man den Objektträger derart auf den Objekttisch, daß das Präparat, das für den Anfang nicht allzu klein sein soll, in die Mitte des Objekttischloches zu liegen kommt ( D e c k g l a s n a c h o b e n ! ) . Dann blickt man durch das Okular und hebt gleichzeitig den Tubus durch langsames Zurückschrauben der Grobverstellung so weit, bis plötzlich ein deutliches Bild erscheint, das nunmehr mit Hilfe der F e i n v e r s t e l l u n g scharf eingestellt wird. Von jetzt ab bleibt während des Beobachtens die eine Hand stets an der Feinverstellungsschraube. Denn da das Bild stets nur5 in einer bestimmten Ebene scharf eingestellt ist, der Schnitt aber infolge seiner Dicke

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 21—22.

zahlreiche derartige Ebenen besitzt, so muß inan bald höher, bald tiefer einstellen, u m seine S t r u k t u r ganz zu durchmustern. Das geschieht dadurch, daß man w ä h r e n d des Sehens die Feinverstellung von Zeit zu Zeit u m ein geringes nach beiden Richtungen abwechselnd dreht. Die Feinverstellung l ä u f t bei längerem Gebrauch, w e n n nach einer Seite mehr als nach der anderen gedreht wird, zu Ende und m u ß d a n n wieder in eine mittlere Stellung zurückgedreht werden. d) J e d e B e o b a c h t u n g b e g i n n e m a n m i t s c h w a c h e r V e r g r ö ß e r u n g . Will man dann ein stärkeres Objektiv einstellen, so ist zu beachten, daß der Abstand der Frontlinie vom Deckglas u m so geringer ist, je stärker das Objektiv vergrößert. Auch hier dreht man wieder u n t e r s e i t l i c h e r Beobachtung den Tubus zunächst nach abwärts, bis die Frontlinse dicht ü b e r dem Deckglas steht, o h n e , d i e s e s a b e r z u b e r ü h r e n , sieht dann in das Mikroskop und dreht n u n die Schraube vorsichtig und langsam z u r ü c k . Ist etwas sichtbar geworden, so folgt die feine Einstellung mit der M i k r o m e t e r s c h r a u b e . Das E i n s t e l l e n m i t s t a r k e m O b j e k t i v e r f o r d e r t g r ö ß t e V o r s i c h t . Dreht man zu tief nach abwärts, so k a n n Deckgläschen und P r ä p a r a t , da es sich hier u m Bruchteile eines Millimeters handelt, sehr leicht zerdrückt werden. Auch eine Beschädigung der Linse ist leicht' möglich. e) Hat man das Einstellen genügend geübt, so studiere man die W i r k u n g d e r B l e n d e n v o r r i c h t u n g e n und schließlich die des B e l e u c h t u n g s a p p a r a t e s (siehe § 32). Man gewöhne sich von A n f a n g an, beim Mikroskopieren beide Augen offen zu halten. f) Bei Nichtgebrauch ist das Mikroskop sorgfältig vor Staub zu schützen. Man stellt es in den Schrank oder bedeckt es mit einer Schutzhaube aus Leichtmetall und Zellon (empfehlenswerter als ein schwerer Glassturz, der bei evtl. Anstoßen an den Objektivrevolver leicht dessen Zentrierung gefährdet). Von Zeit zu Zeit ist das Mikroskop mit einem n u r diesem Zwecke dienenden weichen Pinsel abzustauben. Auch die Optik wird durch Abstauben mit dem Pinsel gereinigt. Fester h a f tende Verunreinigungen werden durch Abwischen mit einem mit Wasser angefeuchteten weichen Leinentuch beseitigt. Zur E n t f e r n u n g von Kanadabalsam, Öl u. dgl. feuchtet m a n das Tuch mit Benzin oder Chloroform an. Niemals soll dazu Alkohol v e r w e n d e t werden. 21. Tauch- oder Immersionslinsen sind Objektive, bei deren Gebrauch zwischen P r ä p a r a t und Frontlinse des Objektivs eine Flüssigkeitsschicht eingeschaltet wird, die a n n ä h e r n d das gleiche optische Verhalten hat wie Glas. Dadurch wird die Ablenkung der Lichtstrahlen, die bei A n w e n d u n g von » T r o c k e n s y s t e m e n « durch die zwischen P r ä p a r a t und Objektiv befindliche Luftschicht eintritt, beinahe völlig ausgeschaltet und die Leistungsfähigkeit wesentlich gesteigert. F ü r gewöhnlich verwendet man die » h o m o g e n e Ölimmersion«, bei welcher eingedicktes Zedernöl als Zwischenflüssigkeit dient ( I m m e r s i o n s ö 1). Die Ölimmersion ist f ü r alle feineren Untersuchungen u n e n t b e h r lich geworden. Auch bei diesen Objektiven unterscheidet man je nach dem Grade der Korrektion zwischen A c h r o m a t e n , F l u o r i t s y s t e m e n und A p o c h r o m a t e n , welch letztere zur Zeit die besten Objektive darstellen. Die numerische A p e r t u r der homogenen Ölimmersionen liegt zwischen 1,00 und 1,40. 22. Zur Kennzeichnung der vermehrten Auflösungsfähigkeit der Immersionsobjektive gegenüber den Trockensystemen sei angeführt, daß sich mit einer homo-

§ 23—27.

Immersionsflüssigkeit

7

genen ö l i m m e r s i o n n u m . Ap. 1,40 noch zwei Teilchen optisch v o n e i n a n d e r t r e n n e n lassen, d e r e n A b s t a n d 0,19 ,, b e t r ä g t . Bei e i n e m T r o c k e n s y s t e m von n u m . Ap. 0,90 liegt die Grenze dagegen schon bei 0,31 ft . 23. A u ß e r den gewöhnlich b e n ü t z t e n I m m e r s i o n s s y s t e m e n A c h r o m a t V«", F l u o rit V12" o d e r A p o c h r o m a t 2 m m , die d u r c h s c h n i t t l i c h eine 90—lOOfache Einzelverg r ö ß e r u n g besitzen, w e r d e n von den großen F i r m e n auch noch Ö l i m m e r s i o n s systeme m i t r e l a t i v geringer E i n z e l v e r g r ö ß e r u n g (35—75fach) hergestellt, die sich bei n i e d r i g e r e m P r e i s d u r c h ein s e h r ebenes, w e i t e s . Gesichtsfeld, große L i c h t s t ä r k e u n d b e t r ä c h t l i c h e n O b j e k t a b s t a n d auszeichnen. Die Systeme sind a u s diesen G r ü n den a u c h f ü r M i k r o p r o j e k t i o n u n d M i k r o p h o t o g r a p h i e sehr geeignet. Ein Vorteil dieser I m m e r s i o n e n gegenüber T r o c k e n s y s t e m e n gleicher E i g e n v e r g r ö ß e r u n g ist auch, d a ß sie g e g e n ü b e r S c h w a n k u n g e n der Deckglasdicke u n e m p f i n d l i c h sind u n d s t ö r e n d e R e f l e x e bei ihnen v e r m i e d e n w e r d e n . F ü r U n t e r s u c h u n g e n mit s t ä r k s t e n V e r g r ö ß e r u n g e n dient die a p o c h r o m a t i s c h e ö l i m m e r s i o n m i t einer B r e n n w e i t e von 1,5 m m , die eine 120- bis 125fache Einzelv e r g r ö ß e r u n g besitzt. 24. Eine neue P l a n m o n o c h r o m a t i m m e r s i o n 90/1,25 von Zeiss zeichnet sich bei h o h e r E i n z e l v e r g r ö ß e r u n g d u r c h ein besonders planes Gesichtsfeld a u s ; sie ist als M o n o c h r o m a t f ü r die g r ü n e Quecksilberlinie \ = 0,54.6 .«, 510 f i a ) auch f ü r M i k r o p h o t o g r a p h i e lebend e r Zellen. 47. B l a u f i l t e r . Blaufilter m i t D u r c h l ä s s i g k e i t s b e r e i c h 430—485 t ufi w e r d e n v o r a l l e m in V e r b i n d u n g mit A p o c h r o m a t e n bei A u f n a h m e u n g e f ä r b t e r P r ä p a r a t e (z. B. Diatomeen) z u r E r h ö h u n g des A u f l ö s u n g s v e r m ö g e n s bei schiefer Beleuchtung und Verwendung photomechanischer Platten gebraucht. Ferner als K o n t r a s t f i l t e r bei gelben o d e r g r ü n e n F ä r b u n g e n . 48. F i l t e r z u r A b s o r p t i o n d e r W ä r m e s t r a h l e n . M a n löst 200 g p u l v e r i s i e r t e s M o h r s c h e s Salz ( A m m o n i u m f e r r o s u l f a t ) N J ^ F e (SO4) + 12 H2O k a l t in 1000 ccm dest. W a s s e r u n d setzt 5 ccm v e r d ü n n t e S c h w e f e l s ä u r e (1 Teil S c h w e f e l s ä u r e + 3 Teile Wasser) zu. H a l t b a r k e i t e t w a 3 Wochen. 49. Die U n t e r s u c h u n g m i k r o s k o p i s c h e r S t r u k t u r e n bei m o n o c h r o m a t i s c h e m ( e i n f a r b i g e m ) L i c h t von b e l i e b i g e r W e l l e n l ä n g e des s i c h t b a r e n S p e k t r u m s e r m ö g l i c h t ein M o n o c h r o m a t o r . Bei d e m » G r o ß e n l i c h t s t a r k e n M o n o c h r o m a t o r « v o n Leitz w i r d d a s v o n e i n e r N i e d e r v o l t l a m p e g e l i e f e r t e Licht d u r c h ein L i n s e n s y s t e m u n d e i n e n v e r ä n d e r l i c h e n S p a l t auf ein d r e h b a r e s Glasp r i s m a w e i t e r g e l e i t e t u n d h i e r zerlegt. S o d a n n g e l a n g t es zu e i n e m z w e i t e n v e r ä n d e r l i c h e n Spalt, d e r d u r c h ein L i n s e n s y s t e m auf d e m M i k r o s k o p s p i e g e l p r o j i z i e r t w i r d . Die jeweils n u t z b a r e W e l l e n l ä n g e ist a n e i n e m I n d e x abzulesen. Das I n s t r u m e n t leistet a u c h in d e r M i k r o p h o t o g r a p h i e a u s g e z e i c h n e t e Dienste, d a es b e i m D u r c h d r e h e n des S p e k t r u m s bei gleichzeitiger B e o b a c h t u n g u n s c h w e r gelingt, festzustellen, bei w e l c h e r W e l l e n l ä n g e die a b z u b i l d e n d e S t r u k t u r a m k o n t r a s t r e i c h s t e n h e r v o r t r i t t . A n d e r e r s e i t s lassen sich n e b e n s ä c h l i c h e S t r u k t u r e n d u r c h B e l e u c h t e n m i t d e m L i c h t i h r e r F a r b e auslöschen (s. a u c h M a a s 38).

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Mikroskop u n d N e b e n a p p a r a t e

§ 50—51.

Billiger, f ü r die in F r a g e k o m m e n d e n F ä l l e a b e r meist völlig a u s r e i c h e n d ist es, sich einen Satz m o n o c h r o m a t i s c h e r F i l t e r zu beschaffen, z. B. folgende Z u s a m m e n s t e l l u n g von L i f a - F i l t e r n : Nr. 208 Violett Nr. 372 G e l b g r ü n c < 460 ßß 5 1 0 - -550 ßß Nr. 209 Blau Nr. 373 G e l b g r ü n d 5 1 0 --570 ßß 430—485 Uß Nr. 360 Blauviolett < 485 ua Nr. 375 G e l b g r ü n Z Nr. 210 B l a u g r ü n Nr. 212 Gelb 490—540 ßß > 510 ßß Nr. 211 G e l b g r ü n 515—590 nn Nr. 213 O r a n g e > 550 ßß Nr. 370 G e l b g r ü n a Nr. 214 Rot 450—560 ßll > 600 ßß Nr. 371 G e l b g r ü n b Nr. 215 D u n k e l r o t 460—540 ßß > 650 ßß U m das f ü r d e n einzelnen Fall beste F i l t e r zu finden, schaltet m a n die in B e t r a c h t k o m m e n d e n F i l t e r w ä h r e n d der mikroskopischen B e o b a c h t u n g der Reihe n a c h vor, bis die g e w ü n s c h t e S t r u k t u r a m s c h ä r f s t e n h e r v o r t r i t t . Nachfolgend sei f ü r einige F ä r b u n g e n angegeben, welche Filter bei i h n e n die s t ä r k s t e K o n t r a s t w i r k u n g g e b e n : B i m a r k b r a u n Nr. 370, Kongorot Nr. 371, Rose bengale, P i k r o k a r m i n N r . 372, F u c h sin, Methylviolett Nr. 373, Gentianaviolett, E i s e n h ä m o t o x y l i n Nr. 375, Eosin Nr. 210, M e t h y l g r ü n Nr. 214, Methylenblau Nr. 215. 50. Eine sog. o p t i s c h e F ä r b u n g von P r ä p a r a t e n w i r d d u r c h besondere K o n d e n s o r k o n s t r u k t i o n e n von Zeiss ( » M i k r o p o l y c h r o m a r « ) u n d von R e i c h e r t (»O p t i c o l o r k o n d e n s o r « ) ermöglicht. Bei i h n e n w i r d der Beleuchtungskegel ähnlich w i e b e i m Dunkelfeldkondensor (s. § 51) in zwei Bezirke geteilt —• einen zentralen mit n i e d e r e r u n d einen p e r i p h e r e n mit hoher A p e r t u r . Vor beide S t r a h lenbezirke w e r d e n d i f f e r e n t e Farbfilter vorgeschaltet, so d a ß die z e n t r a l e n S t r a h len z. B. ein rotes, die R a n d s t r a h l e n dagegen ein r i n g f ö r m i g e s blaues F i l t e r p a s sieren m ü s s e n . Da n u n die r )ten S t r a h l e n des i n n e r e n Kegels u n g e h i n d e r t d u r c h treten, w ä h r e n d die blaugefilterten R a n d s t r a h l e n n u r d a n n in das O b j e k t i v g e l a n gen können, w e n n sie von S t r u k t u r e n des P r ä p a r a t e s abgebeugt werden, so w i r d auf diese Weise erreicht, d a ß an u n d f ü r sich u n g e f ä r b t e S t r u k t u r e n in i n t e n s i v b l a u e m F a r b t o n auf r o t e m U n t e r g r u n d a u f l e u c h t e n . Selbstverständlich k ö n n e n a n Stelle v o n Rot u n d Blau auch andere F a r b k o m b i n a t i o n e n gewählt w e r d e n . Die K o n s t r u k t i o n e n k ö n n e n u n d sollen die histologische F ä r b u n g nicht ersetzen, leisten a b e r f ü r besondere A u f g a b e n wertvolle Dienste, so vor allem dann, w e n n d a s O b j e k t e i n e r f ä r b e r i s c h e n Darstellung nicht zugänglich ist oder einer solchen n i c h t u n t e r w o r f e n w e r d e n soll u n d trotzdem k o n s t r a s t r e i c h gegen den U n t e r g r u n d a b gehoben w e r d e n soll (z. B. bei Beobachtung u n g e f ä r b t e r Zellen, bei A u s z ä h l u n g u n g e f ä r b t e r B l u t p r ä p a r a t e oder a n d e r e r Zellformen, bei B a l s a m p r ä p a r a t e n von Insekten u. dgl.). A u c h f ü r m a n c h e m i k r o p h o t o g r a p h i s c h e n A u f g a b e n m a g die Vorr i c h t u n g von Vorteil sein (s. K. J o h n 37 u. 40). 51. Die Dunkelfeldmikroskopie. B e i der D u n k e l f e l d b e o b a c h t u n g w e r d e n i m G e g e n s a t z z u r H e l l f e l d b e o b a c h t u n g alle z e n t r a l e n S t r a h l e n d e s G e s i c h t s f e l d e s v o l l k o m m e n a u s g e s c h a l t e t u n d nur d i e R a n d s t r a h l e n zur B e l e u c h t u n g d e s P r ä p a r a t e s a u s g e n ü t z t . D e r V e r l a u f dieser S t r a h l e n ist so schräg, d a ß sie an u n d f ü r sich a n d e r U n t e r f l ä c h e d e s O b j e k t t r ä g e r s total r e f l e k t i e r t w ü r d e n . Ihr V o r d r i n g e n b i s z u m P r ä p a r a t w i r d nur d a d u r c h e r m ö g l i c h t , daß z w i s c h e n der F r o n t l i n s e d e s K o n d e n s o r s u n d der U n t e r f l ä c h e d e s O b j e k t t r ä g e r s e i n e W a s s e r - oder ö l s c h i c h t e i n g e s c h a l t e t w i r d . Aber auch d a n n b l e i b e n die S t r a h l e n f ü r d e n B e o b a c h t e r n o c h v ö l l i g u n s i c h t b a r , da s i e a m D e c k g l a s total r e f l e k t i e r t w e r d e n oder a u ß e r h a l b der O b j e k t i v ö f f n u n g v o r b e i l a u f e n . B e f i n d e n sich d a g e g e n i n der F l ü s s i g k e i t s s c h i c h t z w i s c h e n O b j e k t t r ä g e r u n d D e c k g l a s k o r p u s k u l ä r e E l e m e n t e , so w e r d e n die s c h r ä g a u f t r e t e n d e n S t r a h l e n t e i l s r e f l e k t i e r t , teils a b g e b e u g t u n d d a d u r c h so v o n i h r e r R i c h t u n g abgelenkt, daß e i n E i n d r i n g e n in d a s O b j e k t i v e r m ö g l i c h t w i r d . D e r B e o b a c h t e r sieht d a n n auf t i e f d u n k l e m U n t e r g r u n d h e l l a u f l e u c h t e n d e S t r u k t u r e n , die u m so l e u c h t e n d e r h e r v o r t r e t e n , je l i c h t s t ä r k e r d i e auftrefTenden R a n d s t r a h l e n sind.

§ 52—54.

Dunkelfeldmikroskopie

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In primitiver Weise läßt sich eine Dunkelfeldbeleuchtung durch Einlegen einer sog. Z e n t r a l b l e n d e in den Blendenträger des Abbeschen Beleuchtungsapparates erzielen. Für eingehendere Untersuchungen ist dieses Dunkelfeld jedoch unzulänglich; f ü r sie ist die Verwendung eines besonderen, f ü r diese Zwecke konstruierten D u n k e l f e l d k o n d e n s o r s erforderlich, der an Stelle des vorher entfernten gewöhnlichen Kondensors eingesteckt wird. Die Dunkelfeldkondensoren werden je nach dem Zwecke, dem sie dienen sollen, von allen großen Firmen in verschiedener Ausführung geliefert. Sie sind gewöhnlich nach dem Prinzip eines Spiegelkondensors konstruiert. In Einzelheiten weichen die Konstruktionen der verschiedenen Firmen etwas voneinander ab, weshalb man, um die maximale Leistung aus dem Instrument herauszuholen, die Gebrauchsvorschriften der betreffenden Herstellerfirmen genau zu beachten hat. An dieser Stelle kann nur ein allgemeiner Überblick gegeben werden.

52. F ü r Untersuchungen mit Immersionssystemen (z. B. f ü r Kolloide, Bakterien, isolierte Zellen) dienen die eigentlichen Dunkelfeldkondensoren mit hoher numerischer Apertur. Dieselben erfordern eine gute Zentrierung zum Beobachtungssystem, Einhalten einer bestimmten Objektträgerdicke (1,0—1,2 mm) und eine möglichst dünne Objektschicht. Zwischen Frontlinse des Kondensators und Unterfläche des Objektträgers ist eine blasenfreie Verbindung mit Immersionsöl herzustellen. Als Beispiel eines derartigen Kondensors sei der Kardioidkondensor von Zeiss genannt, der sich durch große Lichtstärke, vollkommene chromatische und sehr gute sphärische Korrektion auszeichnet (num. Ap. 1,23—1,33; Schnittweite 1,3 mm). Er wird in zentrierbarer Fassung geliefert. Die optimale Objektträgerdicke beträgt 1,2 mm. Ist der Objektträger dünner, so muß der Kondensor etwas gesenkt werden, damit sich die beleuchtenden Strahlen in der Präparatebene schneiden. Dabei muß die Immersion zwischen Kondensor und Objektträger voll erhalten bleiben. Eingehende Gebrauchsvorschrift s. Zeiss Mikro 407. Der früher viel gebrauchte P a r a b o l o i d k o n d e n s o r (Zeiss) wird nicht mehr hergestellt. 53. Zur Untersuchung histologischer und cytologischer Präparate wird häufig ein sog. Wechsel- oder Hell-Dunkelfeldkondensor gebraucht, der durch einfache Verschiebung eines Hebels den unmittelbaren Übergang von Hell- zu Dunkelfeldbeobachtung und umgekehrt gestattet. Bei all diesen Kondensoren wird, wenn sie mit Immersionssystemen gebraucht werden, zur Verbindung von Kondensor und Objektträgern gewöhnlich Immersionsöl verwendet. 54. F ü r Beobachtung bei starker Vergrößerung empfiehlt sich der Gebrauch eines S ö n d e r o b j e k t i v s f ü r D u n k e l f e l d b e o b a c h t u n g , wie es von allen großen optischen Werken geliefert wird. Als Beispiele seien die achromatischen ölimmersionen 50, num. Ap. 0,90 und 90, num. Ap 1,25 oder die apochromatischen Ölimmersionen 35, num. Ap. 0,85 und 60, num. Ap. 1,0 von Zeiss genannt. Die Immersionen 90 und 60 sind mit einer an richtiger Stelle zwischen den Linsen liegenden Irisblende versehen, die bei Beobachtung im Dunkelfeld zu verengern ist. Für Untersuchungen bei schwächerer Vergrößerung verwendet man die gewöhnlichen Trockensysteme; ist ihre num. Ap. höher als 0,85, wie es z. B. bei Apochromat 40 der Fall ist, so muß das Objektiv abgeblendet werden, um scharfe, nicht verschleierte Bilder zu geben. Dies geschieht entweder mit Hilfe einer Einhängeblende oder durch Verwendung eines mit Irisblende versehenen

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 55—58.

Objektiv-Zwischenstückes (Leitz, Reichert). Bei Verwendung von Trockensystemen kann die Verbindung zwischen Kondensor und Objektträger statt durch Immersionsöl auch durch reines, staubfreies dest. Wasser erfolgen. Als Okular benützt man am besten Kompensationsokular 10 X oder 15 X oder ein entsprechendes periplanatisches Okular. Für Dunkelfelduntersuchungen mit mittelstarken Trockensystemen liefert Leitz einen sehr bequem zu handhabenden D u n k e l f e l d - T r o c k e n k o n d e n s o r (Bizentrischer Kondensor 0,50), der besonders bei großen Reihenuntersuchungen Vorteile bietet.

55. F ü r mikrurgische und präparatorische Arbeiten, Beobachtung von Gewebekulturen u. dgl., bei denen man infolge der Dicke der Objektkammer Kondensatoren mit größerer Schnittweite braucht, dient der Präparierdunkelfeldkondensor, der f ü r Hell- und Dunkelfeldbeleuchtung auch als Präparierwechselkondensor, erhältlich ist (num. Ap. 0,7—0,8; Schnittweite 11,75 mm). Kondensoren dieser Art werden o h n e Zwischenflüssigkeit verwendet. Über Einzelheiten s. P e t e r f i (26). Bei ganz schwachen Vergrößerungen (etwa lOfach und weniger) verwendet man zur gleichmäßigen Ausleuchtung des großen Gesichtsfeldes einen B r i l l e n g l a s d u n k e l f e l d k o n d e n s o r oder P l a n k t o n - D u n k e l f e l d kondensor. 56. Besonders hohe Lichtstärke besitzt der L e u c h t b i l d k o n d e n s o r , der jedoch nur für Ausstrichpräparate und Präparate, deren Einbettungsmedium einen Brechungsexponent über nn = 1,45 besitzt, verwendet werden kann. Lebende Bakterien können mit ihm daher nicht untersucht werden. Die numerische Apertur dieses Kondensors ist so hoch, daß alle Objektive bis zu einer num. Ap. von 1,30 ohne Abbiendung benützt werden können. Nähere Angaben s. Leitz Mikro D 2046.

57. Von großer Wichtigkeit ist beim Arbeiten mit Dunkelfeldkondensoren die Verwendung einer hinreichend starken Lichtquelle. Als solche sind die in § 39 und 40 angegebenen Lampen zu empfehlen, durch welche die früher erforderliche Bogenlampe (4—5 Ampere) überflüssig geworden ist. Zwischeng e s c h a l t e t e Mattscheiben müssen bei D u n k e l f e l d b e l e u c h t u n g e n t f e r n t w e r d e n . Ein etwa vorhandenes Farbfilterkölbchen wird durch ein mit reinem Wasser gefülltes Kölbchen ersetzt. 58. Kurze Anleitung für die Einstellung eines Dunkelfeldkondensors. 1. O b j e k t i v ,

Okular und Kondensor herausnehmen und Lampe und Mikroskopstativ so gegeneinander ausrichten, daß bei kleiner Öffnung der Blende der Beleuchtungslampe das Licht auf die Mitte des Spiegels fällt. 2. Ohne Objektiv. Okular oder Kondensor einzusetzen, den Spiegel so verstellen, daß auf einem auf das obere Tubusende gelegten Mattscheibchen (oder Papier) zentrisch zur Tubusöffnung eine gleichmäßig beleuchtete Kreisfläche erscheint. Der Spiegel darf nun nicht mehr verstellt werden! 3. P r ä p a r a t auflegen, ein schwaches Objektiv (3- big 8fach) und ein schwaches Okular einsetzen und auf das Präparat einstellen. 4. P r ä p a r a t zur Seite schieben, Beleuchtungsapparat etwas senken und vorsichtig (-), ohne den Spiegel zu berühren, den Dunkelfeldkondensor einsetzen. 5. Einen großen Tropfen Öl auf den Kondensor bringen und den Kondensor gesenkt halten, bis das P r ä p a r a t wieder aufgelegt ist. 6. Kondensor hochkurbeln, bis der Öltropfen den Objektträger berührt und sich flach ohne Luftblasen ausbreitet. Breitet sich die Flüssigkeitsschicht nicht gleichmäßig rund aus, so war der Öltropfen zu klein und muß größer genommen werden.

§ 59—60.

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Polarisationsmikroskop

7. Das auftretende Bild (Lichtring im Objekt mit dunklem Fleck in der Mitte oder mehr oder weniger großer Lichtfleck) durch Zentrieren des Kondensors in die Mitte des Gesichtsfeldes bringen. 8. Irisblende der Lampe (Leuchtfeldblende) eng schließen und den Kondensor in der Höhe so einstellen, daß der etwa vorhandene dunkle Fleck in der Lichterscheinung verschwindet und ein geschlossener Lichtfleck auftritt. Dieser soll möglichst klein sein und sich beim Heben und Senken des Kondensors erweitern. Durch Öffnen und Schließen der Leuchtfeldblende überzeugt man sich, daß die Größe des Lichtflecks durch die Blende begrenzt wird, dieser also ein Bild der Leuchtfeldblende darstellt. 9. Das Beobachtungsobjektiv einsetzen, Immersionsöl auf das Präparat und die Frontlinse bringen, den Tubus senken, bis das Objektiv gerade in den Tropfen eintaucht und ihn dann langsam weiter senken, während man in das Mikroskop blickt, bis das Bild erscheint. 10. Zentrierung wie in 7. wiederholen, wenn das Leuchtfeld nach Einschalten des Immersionsobjektivs nicht mehr ganz zentriert ist. 11. Das schwache Einstellokular gegen das Beobachtungsokular austauschen und die Leuchtfeldblende so weit öffnen oder schließen, daß gerade das Sehfeld ausgeleuchtet ist (nach Zeiss Mikro 407). Bei richtiger Einstellung bekommt man blendend helle Strukturen auf tiefschwarzem Untergrund. Die zur Beobachtung kommenden Präparate müssen in möglichst dünner Schicht ohne Luftblasen in Wasser oder Öl eingeschlossen sein. Eine ausführliche O e l z e (34).

Darstellung

der

Methodik

der

Dunkelfeldmikroskopie

bei

59. Das Phasenkontrasfverfahren. Von großer praktischer Bedeutung ist das von Z e r n i k e angegebene und begründete P h a s e n k o n t r a s t v e r f a h r e n , das von K ö h l e r und L o o s (41) weiter entwickelt und apparativ ausgebaut wurde. Es erlaubt ungefärbte wie lebende Präparate mit einer bisher nicht für möglich gehaltenen Deutlichkeit zu beobachten und zu photographieren. Das neue Verfahren ist, wie die Ausführungen von K ö h l e r und L o o s zeigen, in vielen Fällen dem Hell- und Dunkelfeld überlegen. Auch für einfache schnelldiagnostische Zwecke d ü r f t e es sich als sehr brauchbar erweisen. Man benötigt dazu besondere Mikroskopobjektive, die mit einem Phasenplättchen ausgerüstet sind: sie können ohne Nachteil auch f ü r die gewöhnliche Mikroskopie bei Hell- und Dunkelfeld verwendet werden. Weiter ist ein Kondensor erforderlich, in dessen unterer Brennebene Ringblenden verschiedenen Durchmessers, f ü r die verschiedenen Objektive passend, angebracht werden können. Die Blenden müssen zentrierbar und in der Höhe eingestellt sein, damit ihr Bild scharf und'deckungsfrei innerhalb des Phasenplättchens im Objektiv abgebildet werden kann. Die richtige Justierung des Blendenbildes erfolgt durch ein Hilfsmikroskop, das an Stelle des Okulars in den Mikroskoptubus eingeschoben wird, um Blendenbild und Phasenplättchen vergrößert beobachten zu können. Nach erfolgter Justierung wird das Hilfsmikroskop gegen das Okular ausgetauscht. Weiteres s. Zeiss Mikro 11—304. 60. Die Untersuchung der Doppelbrechung (Anisotropie) histologischer Objekte ermöglichen Polarisalionsapparate, die aus einem unter dem Objekttisch in den Blendenträger des Kondensors einhängbaren P o l a r i s a t o r und einem am Okular angebrachten A n a l y s a t o r bestehen. Schnitte, die mit dem Polarisationsmikroskop betrachtet werden sollen, dür2

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 61—63.

fen vorher nicht mit Phenol (z. B. Karbol-Xylol) in Berührung kommen. Außerdem hat das Entparaffinieren der Schnitte besonders sorgfältig zu geschehen, da zurückbleibende Reste des Paraffins infolge ihrer Doppelbrechung Veranlassung zu Täuschungen geben können, worauf W. J . S c h m i d t (z. B . 32) mehrmals hinwies. Namentlich in Kernen und Erythrocyten wird es festgehalten. Zum Gebrauch stellt man unter möglichster Ausschaltung von Seitenlicht zunächst beide Nicols parallel, so daß das Gesichtsfeld gleichmäßig hell beleuchtet ist. Sodann dreht man den Analysator um 90°, wodurch das Gesichtsfeld maximal verdunkelt erscheint. Doppelbrechende Elemente leuchten dagegen hell auf. Dreht man jetzt den Objekttisch im Kreise um 360°, so wiederholt sich das Aufleuchten der doppelbrechenden Strukturen viermal. Bleibt das Präparat nach jeder 90gradigen Drehung dunkel, so ist die Abwesenheit doppelbrechender Substanzen wahrscheinlich. Eine etwaige auf diese Weise schwer erkennbare Doppelbrechung läßt sich durch Einlegen von Glimmer- oder Gipsplättchen in den Polarisator verstärken (s. auch § 1039). 61. An Stelle der Kalkspatprismen werden jetzt vielfach die Polarisationsfilter nach B e r n a u e r verwendet. Das eine wird als Polarisator in den Blendenträger eingelegt, das andere als Analysator dem Okular aufgesetzt. Die einfach zu gebrauchenden Filter haben vor den Kalkspatprismen neben dem geringen Preis den Vorteil, daß durch sie die Apertur weder des beleuchtenden noch des abbildenden Systems eingeschränkt wird, WEIS namentlich für Mikrophotographie von großem Wert ist. Die Filter bestehen aus einer zwischen zwei Spiegelglasscheiben eingeschlossenen dünnen Schicht von Herapathit (Chinin-Jodverbindung), das schon in dünner Schicht, wie Kalkspat, nur Licht von bestimmter Schwingungsrichtung durchläßt. Zur Einführung in den Gebrauch des Polarisationsmikroskopes sei vor allem die »Anleitung zu polarisations-mikroskopischen Untersuchungen für Biologen« von W. J . S c h m i d t empfohlen. Eine erschöpfende zusammenfassende Darstellung der weitverstreuten einschlägigen Literatur sowie zahlreiche neue Beobachtungen gibt W. J . S c h m i d t in seinen 1924 und 1937 erschienenen Werken. 62. Didiroismus ist die Erscheinung, daß je nach der Richtung, in der das Licht beispielsweise einen Kristall durchläuft, nicht allein die Brechbarkeit, sondern auch die Absorption und damit die Färbung wechselt. Man untersucht den Dichroismus, indem man das Objekt zuerst zwischen gekreuzten Nikols auf Auslöschung stellt und dann den Analysator ausschaltet. Dabei kommt die Absorption für die Schwingungsrichtung des Objektes, die der des Polarisators parallel geht, zur Wirkung. Darauf dreht man das Objekt oder den Polarisator um 90° und prüft so die Absorption für die andere Schwingungsrichtung. Tierische wie pflanzliche Fasern lassen sich mit Gold oder Silber k ü n s t l i c h d i c h r o i t i s c h färben. Fixierung in Zenkerscher Flüssigkeit (ohne Eisessig), Paraffinschnitt, sorgfältigst entparaffinieren. Aus dest. Wasser 1;2 Stunde in 1—2°/oige Goldehlorid- oder Silbernitratlösung, dann in dest. Wasser, dem auf 100 ccm 1 Tropfen Hydrazinhydrat (Hydrazinum hydricum pro analysi E. Merck) zugesetzt wurde. Die Reduktion tritt sofort ein; gründlich auswaschen in dest. Wasser, Alkoholreihe, Xylol, Balsam. (Technische Einzelheiten bei W. J . S c h m i d t 31). 63. Auflidifmikroskopie. Für Objekte, bei welchen die Beobachtung bei durchfallendem Licht unmöglich oder unzweckmäßig ist, verwendet man zur Beleuchtung einen V e r t i k a l i l l u m i n a t o r ( O p a k i l l u m i n a t o r ) . Bei Beobachtung mit schwachen oder mittelstarken Objektiven benützt man gewöhnlich einen V.-I. nach N a c h e t mit total reflektierendem Prisma, bei starken Objektiven einen V.-I. nach B e c k mit schrägstehenden Planglas. Bei dem Instrument von Busch und Leitz ist ein Austausch von Prisma und Plättchen durch

§ 64—66.

Ultraviolettmikroskopie

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Wechselschieber möglich. Mittelstarke und s t a r k e Objektive k ö n n e n mit dem V e r t i k a l i l l u m i n a t o r n u r dann v e r w e n d e t werden, w e n n sie kurz gefaßt u n d f ü r den G e b r a u c h ohne Deckglas besonders korrigiert sind. Die in der Mineralogie u n d P e t r o g r a p h i e allgemein gebräuchliche U n t e r s u c h u n g s m e t h o d e der A u f l i c h t m i k r o s k o p i e wird in steigendem Maße auch zur U n t e r s u c h u n g tierischer S t r u k t u r e n (Kalkgerüste, Z a h n - u n d Knochengewebe, Bindegewebss t r u k t u r e n , P i g m e n t e usw.) v e r w e n d e t . Dank der technischen Verbesserungen können auch lebende Objekte damit u n t e r s u c h t werden, namentlich auch in V e r b i n d u n g mit Fluoreszenzmikroskopie (s. auch § 68 u n d 151). Präparate, die kleiner sind als das Sehfeld, beobachtet man zweckmäßig auf einem Objektträger aus poliertem schwarzen Glas (bei Leitz erhältlich). 64. E i n e wesentliche Verbesserung b e d e u t e t e f ü r die Auf lieh tmikroskopie der von Leitz hergestellte Ultropak nach H e i n e . Er gestattet u n t e r V e r w e n d u n g eines besonderen Beleuchtungsansatzes durchsichtige wie undurchsichtige Objekte bei schwächster wie stärkster V e r g r ö ß e r u n g in Dunkelfeldbeleuchtung im A u f l i c h t zu untersuchen. Das dabei g e w o n n e n e Bild zeichnet sich gegenüber den O p a k i l l u m i n a t o r e n durch seine Schleierfreiheit und Klarheit aus. W ä h r e n d beim O p a k i l l u m i n a t o r die beleuchtenden S t r a h l e n durch das Objektiv auf das P r ä p a r a t gelangen, erfolgt die Z u f u h r der L i c h t s t r a h l e n beim Ultropak und ähnlichen K o n s t r u k t i o n e n anderer F i r m e n g e t r e n n t von der Beobachtungsoptik durch r i n g f ö r m i g u m das Objektiv angeordnete Kondensoren, die nach oben und unten v e r s c h i e b b a r sind. Dadurch ist es möglich, ungestört von den oberflächlicheren Schichten, auch die tiefer gelegenen Zonen eines Objektes ohne störende Reflexe z u beobachten, was namentlich auch f ü r die U n t e r s u c h u n g lebender Objekte v o n Wichtigkeit ist. Z u m Ultropak w e r d e n Trockensysteme, Wasseru n d Ölimmersionen geliefert, die in zugehörige Ringkondensoren eingeschraubt w e r d e n (s. H e i n e 31). Auch Zeiss l i e f e r t f ü r die A u f l i c h t b e t r a c h t u n g besondere Objektive ( E p i O b j e k t i v e ) , die in V e r b i n d u n g mit E p i k o n d e n s o r e n gebraucht w e r den. Die A p p a r a t u r e n haben besondere B e d e u t u n g f ü r fluoreszenzmikroskopische U n t e r s u c h u n g e n gewonnen (s. § 68 ff.). 65. E i n e K o m b i n a t i o n der in § 63 u n d § 64 beschriebenen K o n s t r u k t i o n e n ist beim U n i v e r s a l i l l u m i n a t o r von Reichert d u r c h g e f ü h r t . E r ermöglicht I n n e n b e l e u c h t u n g d u r c h P l a n p l ä t t c h e n oder Spiegelzunge (an Stelle eines Prismas) u n d A u ß e n b e l e u c h t u n g durch r i n g f ö r m i g e Spiegelplatte u n d Ringkondensor (s. R a m s t h a l e r 37). 66. Ultraviolettmikroskopie. Ultraviolettes Licht k o m m t in der Mikroskopie mit zweifacher Zielsetzung z u r Verwendung. Beim U l t r a v i o l e t t m i k r o s k o p w i r d bezweckt, das Auflösungsvermögen der Optik gemäß der Abbeschen Theorie d u r c h V e r w e n d u n g von kurzwelligem Licht zu steigern (s. auch § 16). Da aber S t r a h l e n der h i e f ü r b e n u t z t e n Wellenlängen (gewöhnlich Wellenlänge 0,275 fi) f ü r das menschliche Auge unsichtbar sind, m u ß die S i c h t b a r m a c h u n g auf dem U m w e g e ü b e r die Mikrophotographie erfolgen. Da g e w ö h n liches Glas Ultraviolett absorbiert, müssen sämtliche optische Teile des Mikroskops aus Quarz bzw. Bergkristall sein. Das gleiche gilt f ü r O b j e k t t r ä g e r u n d Deckglas. Auch K a n a d a b a l s a m absorbiert stark, weshalb Einschluß in Glyzerin oder dgl. nötig ist. N ä h e r e s ü b e r die von A. K ö h l e r k o n s t r u i e r t e m i k r o p h o t o graphische E i n r i c h t u n g f ü r ultraviolettes Licht siehe K ö h l e r (10, 27) u n d Zeiss M i k r o 530. Das Auflösungsvermögen wird durch Verwendung von Ultraviolett etwa um das Doppelte gesteigert: Um bei subjektiver Beobachtung bei Tageslicht das gleiche 2*

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 67—72.

zu erreichen wie im Ultraviolett mit einer Immersion numer. Apert. 1,25, bedürfte man eines Objektivs von der numer. Apert. 2,5. 67. Die Untersuchung im Ultraviolettmikroskop hat in letzter Zeit erhöhte Bedeutung f ü r die Chromosomenforschung bekommen, da Nucleinsäure im Ultraviolett von 0,260 ¡j, ein ungewöhnlich hohes Absorptionsvermögen h a t (siehe C a s p e r s s o n 1936 a, b und § 919). 68. Fluoreszenzmikroskopie. Im zweiten Fall kommt ultraviolettes Licht beim F l u o r e s z e n z - oder L u m i n i s z e n z m i k r o s k o p zur Anwendung. Hier w i r d ultraviolettes Licht zur Sichtbarmachung von Fluoreszenzerscheinungen benutzt. Z u r Beleuchtung verwendet m a n eine an Ultraviolett reiche Lichtquelle, deren sichtbare Strahlen mit Ausnahme eines kleines Anteils im Rot d u r c h ein Schwarzglasfilter zurückgehalten werden, w ä h r e n d Licht von der Wellenlänge 0,300—0,400 ¡x das Filter durchdringt und durch einen Kondensor a u s Quarz o d e r U V - G l a s zum P r ä p a r a t weitergeleitet wird, wo es fluoreszenzf ä h i g e S t r u k t u r e n zum Selbstleuchten bringt. Objektträger u n d Deckglas müssen ebenfalls aus UV-Glas sein; als Einbettungsflüssigkeit w i r d Wasser, Glyzerin oder fluoreszenzfreies Paraffin, liquid, verwendet. Auch das I m m e r sionsöl m u ß fluoreszenzfrei sein. Im übrigen wird aber hier die gewöhnliche Optik verwendet. Bei den starken Systemen ist jedoch eine eingebaute Irisblende zur Verbesserung des Bildes zweckmäßig. Neuerdings w i r d von Reichert wie Zeiss als Lichtquelle auch ein sehr kleiner, leistungsfähiger Quarz-Quecksilberbrenner geliefert, der sowohl f ü r durchwie auffallendes Licht geeignet ist. Er ist etwas lichtschwächer als die Bogenlampe, hat aber sonst vor ihr große Vorzüge. 69. E i g e n f l u o r e s z e n z besitzen unter den tierischen Geweben u. a. kollagenes Bindegewebe (schwach bläulich), elastisches Gewebe (stark blau weiß), Knorpel (hellblau), die Hornschicht der Epidermis (bläulich weiß); ferner Kalk (weißlich), Lipoide (zitronengelb-ockerbraun), Porphyrine (rot). 70. Neben der p r i m ä r e n Fluoreszenz (Eigenfl.) unterscheidet man noch eine s e k u n d ä r e Fl., die dann auftritt, w e n n die Schnitte mit sehr stark v e r dünnten Lösungen bestimmter fluoreszierender Farbstoffe (sog. F l u o r o c h r o m e) behandelt werden (s. § 922 ff.). 71. E l l i n g e r und H i r t (29) brachten die Fluoreszenzmikroskopie mit sehr gutem Erfolg auch bei der Auflichtbeobachtung lebender Organe zur Anw e n d u n g (s. § 151), wobei sie eine von Zeiss gelieferte A p p a r a t u r benützten. Eingehendes über Fluoreszenzmikroskopie s. E11 i n g e r und H i r t (29, 30), H a i t i n g e r vjnd H a m p e r l (33), H a i t i n g e r (38), H i r t (34—40), ferner Zeiss-Druckschrift 507 und 549. 72. Sonderokulare. Durch Aufsetzen eines binokularen Tubusaufsalzes läßt sich an jedem gewöhnlichem Mikroskop eine binokulare Betrachtung des P r ä p a r a t e s ermöglichen. Der Gebrauch eines binokularen Tubus ist namentlich bei langd a u e r n d e m Mikroskopieren sehr angenehm, da die binokulare Beobachtung viel weniger e r m ü d e t als die monokulare. Daneben läßt sich vom P r ä p a r a t bis zu einem gewissen Grad auch ein körperliches, plastisches Bild gewinnen. Bei der kritischen Auswertung des Beobachteten ist zu beachten, daß nach S c h ü r h o f f bei Betrachtung gefärbter Präparate mittels des Stereoskopaufsatzes Täuschungen möglich sind, insofern die unserem Auge stärker gefärbt erscheinenden Körnchen höher zu liegen scheinen. S i e d e n t o p f hat einige sehr lehrreiche, einfache Versuche über farben-mikrostereoskopische Täuschungen und ihre Vermeidung beschrieben, deren Kenntnis jedem, der mit dem binokularen Tubusaufsatz arbeitet, zu empfehlen ist (s. S i e d e n t o p f 24). Die stereoskopische Bildwirkung wird bei den binokularen Tubusaufsätzen der

§ 73—78.

Sonderokulare

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einzelnen Firmen (Leitz [binokularer Tubusaufsatz und bildaufrichtender binokularer Tubus nach L i h o t z k y ] , Reichert [Stereoaufsatz nach H e i m s t ä d t ] , Zeiss [ B i t u m i , B i t u k n i mit schrägem Einblick]) in diflerenter Weise erreicht. Näheres findet man in den Arbeiten von A b b e , J e n t s c h (13, 14), H e i m s t ä d t (21, 23), L i h o t z k y • (24). Der Stereoaufsatz von Reichert kann auch ohne Mikroskop als binokulare Präparierlupe benützt werden. 73. Bei den großen Stativen neuerer B a u a r t kann der Tubus f ü r monokulare Beobachtung gewöhnlich durch eine einfache Vorrichtung gegen einen binokularen T u b u s ausgetauscht w e r d e n (Monobjektiv-binokulares Mikroskop). Diese K o n s t r u k t i o n besitzt vor dem Tubusaufsatz den Vorteil rascheren und b e q u e m e r e n Wechsels, gleichbleibender normaler Tubuslänge, größerer Stabilität und z u m Teil auch größerer Lichtstärke. Bei den neuen Konstruktionen ist der Einblick gewöhnlich um 45° geneigt, wodurch ein Kippen des Mikroskopes unnötig w i r d und der Objekttisch in horizontaler Lage bleibt. Bei einem von Reichert hergestellten Binokulartubus, der sich durch unverminderte Auflösungsfähigkeit, hohe Lichtstärke und gute Orthostereoskopie auszeichnet, erfolgt der Übergang von binokularer Beobachtung zu monokularer ohne Tubuswechsel durch Vierteldrehung eines Schaltknopfes. 74. Als Doppelokular bezeichnet m a n eine am Okularende des Mikroskopt u b u s anzubringende Vorrichtung, die die gleichzeitige Betrachtung eines P r ä parates d u r c h zwei Beobachter gestattet. Benützt man es in Verbindung mit einem Zeiger, so ermöglicht das Instrument eine rasche, mühelose Verständigung zwischen beiden Untersuchern. 75. Das Vergleichsokular wird auf zwei gleiche Mikroskope aufgesetzt, um zwei verschiedene P r ä p a r a t e unmittelbar nebeneinander in e i n e m Gesichtsfeld betrachten v und miteinander vergleichen zu können. Dem gleichen Zweck dient das V e r g l e i c h s m i k r o s k o p von Zeiss, das zwei getrennte P r ä p a r a t e in e i n e m Gesichtsfeld nebeneinander abbildet. 76. Das Spekfralokular dient zur Beobachtung der Absorptionsspektren mikroskopischer Objekte. Es wind auch in Verbindung mit einer kleinen photographischen K a m e r a (Spektralkamera 4 ly 2X6 cm von Zeiss) hergestellt (siehe A. K ö h l e r 24). Am vollkommensten d ü r f t e f ü r histologische und cytologische Zwecke z. Z. das Spektralanalysen-Mikroskop nach K ö n i g s d ö r f f e r sein (s. B o r s t u. K ö n i g s d ö r f f e r 29). 77. Das mikrophofographisdie Okular, das von den einzelnen F i r m e n in verschiedener Konstruktion und unter verschiedener Benennung hergestellt wird (Leitz: »Macca« 4"2X6 und »Makam« 9X12, Reichert: »Mikrokamera nach Cerny 9X9«, Zeiss Miflex 4''26—9X12) gestattet ohne besondere A p p a r a t u r mikrophotographische A u f n a h m e n bei gleichzeitiger Beobachtung. Mikrophotographische A u f n a h m e n mit der Leica oder Contax werden durch Einfügen besonderer Zwischenhülsen ermöglicht. 78. Leitz hat für mikrophotographische Zwecke Okulare mit besonders ebenem Gesichtsfeld konstruiert ( P e r i p l a n a t i s c h e O k u l a r e ) . In noch höherem Maße ist das Ziel bei den H o m a 1 e n (1—4) von Zeiss erreicht, die die Bildfläche bis zum Rande scharf auszeichnen. Die vorher auch für mikrophotographische Zwecke viel benützten Projektionsokulare sind damit weit überholt. (Genaueres bei B o e g e h o l d und A. K ö hl 1 e r 22 und Zeiss Mikro 390, s. auch § 12, Planachromate.) Bezüglich Mikrophotographie verweise ich auf K ö h l e r (27), E o m e i s (28), H e i m und S k e l l (31), L a u b e n h e i m e r (31), R e i n e r t (37), S t a d e und S t a u d e (39), M i c h e l (40). Ferner auf die einschlägigen Druckschriften von Zeiss (Mikro 233, 250, 264, 272, 279, 314, 322, 340—349, 373 und besonders 401).

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Mikroskop und Nebenapparate

§ 77—82.

79. Sfereoskopisdie Präpariermikroskope. Beim Arbeiten mit schwacher Vergrößerung leistet die b i n o k u l a r e P r ä p a r i e r l u p e m i t großem S e h f e l d von Leitz ausgezeichnete Dienste. Ein besonderer Vorzug des Instrumentes ist der weite Objektabstand bei großem Sehfeld, hoher Tiefenschärfe und großer Lichtstärke. So beträgt der Durchmesser des Sehfeldes bei 3,5- bis lOfacher Vergrößerung 50 bis 22 mm bei dem beträchtlichen Objektabstand von etwa 140 mm. Die Präparierlupe kann in Verbindung mit den verschiedensten Stativformen verwendet werden. Das Instrument läßt sich beim Präparieren und Untersuchen, beim Injizieren, Messen und Operieren usw. mit gleichem Vorteil verwenden. Durch eine einfache Wechselvorrichtung kann der Lupenkörper des Instrumentes gegen einen zweiten Lupenkörper für stärkere Vergrößerung ausgetauscht werden, mit dem sich je nach den verwendeten Okularen eine 10-, 20- und 30fache Vergrößerung erzielen läßt. Der Objektabstand beträgt immer noch ca. 79 mm, das Sehfeld besitzt 16, 11 bzw. 8 mm Durchmesser.

Auch Seibert und Zeiss stellen derartige Instrumente mit ähnlicher Leistung her. Ferner läßt sich auch der Stereoaufsatz von Reichert (s. § 72) als binokulare P r ä parierlupe verwenden. Vergrößerung bei letzterem 1—50fach, Objektabstand 540—100 mm, Sehfeld 105—4 mm. 80. Für Fälle, in welchen ein sehr großer Objektabstand erwünscht ist, kommt die F e r n r o h r l u p e von Zeiss in Betracht (Vergrößerungsmöglichkeit: binokular 0,75—20fach, monokular bis 29fach). Infolge der großen Brennweite (bei 6facher Vergrößerung z. B. 330 mm, bei 20facher noch 100 mm) ist z. B. die Beobachtung lebender Tiere in Aquarien, das Betrachten tiefliegender Organe bei Operationen u. dgl. ohne Schwierigkeit bei verhältnismäßig starker Vergrößerung möglich. Das Gesichtsfeld ist aber kleiner, die Lichtstärke geringer als bei der obengenannten Präparierlupe. Nach Abnahme der Vorsatzlinse ist das Prismenglas für Fernsicht benutzbar.

81. Für noch stärkere Vergrößerungen (8—336fach) dient das s t e r e o skopische Präpariermikroskop nach G r e e n o u g h . Objektabstand und Sehfeld sind bei diesem Instrument, das für viele präparatorische wie experimentelle Untersuchungen unentbehrlich ist, kleiner als bei der binokularen Präparierlupe. Zur Vornahme photographischer Aufnahmen kann der Doppeltubus gegen «ine Stereoskopkamera nach D r ü n e r ausgewechselt werden. (Näheres bei D r ü n e r 00 und 25 und Zeiss-Druckschrift Mikro 257.)

Bei einem von Reichert gebauten Greenough-Mikroskop lassen sich an Stelle der Objektivpaare für starke Vergrößerung unter Beibehaltung der aufrechten Bildlage auch Einzelobjekte einsetzen. Durch ein gleichzeitig eingesetztes Prismensystem wird das Lichtbündel in zwei symmetrische Hälften geteilt und den beiden Okularen zugeführt. Vergrößerungsmöglichkeit bei Einzelobjektiv von 190 bis 1080fach.

82. Zur Erleichterung der zeichnerischen Wiedergabe eines Präparates gibt es verschieden Zeichenapparate. Der gebräuchlichste dürfte das A b b e sehe Zeichenprisma sein. Das Bild des Präparates wird bei ihm durch zwei zu einem Würfelchen vereinigten Prismen und einen an einem seitlichen Hebelarm angebrachten Spiegel auf die Zeichenfläche geworfen. Dadurch wird es ermöglicht, die Konturen der mikroskopischen Bilder bei gleichzeitiger Beobachtung von Präparat und Bleistiftspitze mechanisch nachzufahren. Beleuchtungsunterschiede werden durch Vorschalten von Rauchgläsern ausgeglichen. Der Apparat kann auf jedes Mikroskop aufgesetzt werden. Die Zeichenfläche befindet sich am besten in Objekttischhöhe. Nicht Normalsichtige müssen beim Zeichnen ihr Augenglas benutzen. Sehr bequem ist die Benutzung eines verstellbaren Zeichentisches.

§ 83—87.

Mikrometer

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Der Abbesche Zeichenapparat ist von Z e i s s u. a. dadurch verbessert worden, daß am Prisma statt der bisherigen runden Öffnung eine schlitzförmige angebracht ist, wodurch sich das Gesichtsfeld mit Leichtigkeit bis zum Rande klar überblicken läßt. Vertauscht man das Abbesche Würfelchen mit einem entsprechenden rechtwinkligen Prisma, dann läßt sich der Abbesche Zeichenapparat in einfachster Weise in einen Projektionszeichenapparat umändern. (Eine ausführliche Anleitung zum Gebrauch der Zeichenapparate gibt die Druckschrift von Zeiss: Mikro 118, ferner K a s p e r 24.) S c h u m a c h e r (34) empfiehlt die Helligkeit von Bild- und Zeichenfläche dadurch entsprechend abzugleichen, daß man die die Zeichenfläche beleuchtende Lampe an einen Regulierwiderstand schaltet. • Man kann dann auch beliebig Bild oder Zeichnung verschwinden lassen, ohne den Zeichenapparat berühren zu müssen. Die Rauchgläser werden in diesem Falle ausgeschaltet. 83. Sehr empfehlenswert, besonders für Rekonstruktionszeichnungen, aber teuer und umfangreich ist der von E d i n g e r konstruierte Projektionszeichenapparat, der dank seiner Konstruktion gleichzeitig auch für Mikroprojektion verwendet werden kann. (Hergestellt von L e i t z , W i n k e l und Z e i s s . ) 84. Zum Messen der Größe der Objekte dienen für gewöhnlich Objekt- oder Okularmikrometer. Das erstere ist ein Objektträger, auf dem ein Millimeter in 100 Teile geteilt ist. Um die Vergrößerungen zu bestimmen, kann man sich eine Anzahl der Intervalle eines Objektmikrometers mit Hilfe eines der genannten Zeichenapparate in Objekttischhöhe abzeichnen und diese dann mit Hilfe eines gewöhnlichen Maßstabes ausmessen. Zeichnet man dann bei gleicher Linsenkombination, Tubuslänge und Tischhöhe die Umrisse eines Präparates, so lassen sich diese mit Hilfe der ermittelten Vergrößerungszahl ebenfalls leicht bestimmen. 85. Beim Okularmikrometer befindet sich das Meßplättchen im Okular. Bei Messungen mit demselben hat man für jede Vergrößerung zuerst festzustellen, wieviel Intervalle eines O b j e k t mikrometers, deren Größe ja bekannt ist, auf eine bestimmte Anzahl von Intervallen des O k u l a r m i k r o m e t e r s gehen. Daraus läßt sich dann die wirkliche Größe eines Intervalles des Okularmikrometers errechnen. Es empfiehlt sich sehr, ein Meßokular mit verstellbarer Augenlinse zu nehmen, die ein scharfes Einstellen auf die Mikrometerteilung gestattet. Weitere Anleitung zur Ausführung einer Messung s. § 900 ff. Das Meßplättchen wird so eingelegt, daß die mit der Teilung versehene Fläche nach unten sieht. (Nur bei Seibert umgekehrt.) 86. Benutzt man bei der Messung die älteren Apochromatobjektive von Z e i s s und ein als Meßokular eingerichtetes Kompensationsokular 6, so gleicht ein Intervall des Okularmikrometers bei normaler Tubuslänge (= 160 mm) ungefähr so vielen Mikra (1 Mikron = 0,001 mm) als die Brennweite des benützten Objektivs beträgt; dieselbe ist jeweils auf der Fassung des betreffenden Objektives angegeben (bei Zeiss-Apochromat 4 mm ist also ein Intervall des Okularmikrometers = 4 ß, bei Apochromat 8 mm = 8 bei Apochromat 16 mm = 16 « usw.). Wenn auf Objektiven und Okularen die jeweilige Eigenvergrößerung angegeben ist, so erhält man durch Multiplikation beider Zahlen annähernd die Vergrößerung (gewöhnlich für eine Tubuslänge von 160 mm). 87. Zeiss liefert auch ein sog. K o n t r a s t m i k r o m e t e r nach G e b h a r d t (07), bei dem die Teilung durch kleine, schwarze Quadrate gebildet wird, die mit zwei gegenüberliegenden Ecken zusammenstoßen. (Diagonale eines Quadrates = 1 /it.) Ein von L e i t z hergestelltes S t u f e n m i k r o m e t e r gestattet gleichzeitige Ausmessung nach zwei aufeinander senkrecht stehenden Richtungen. (Näheres in der von Leitz gedruckten Anleitung und bei C. M e t z 12.) Nach längerem Gebrauch dieser Teilungen bin ich wieder zur alten Strichteilung zurückgekehrt, die doch am klarsten ist.

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Herstellung frischer Präparate

§ 88—93.

88. Genauer als das einfache Okularmikrometer arbeitet das O k u l a r s c h r a u b e n m i k r o m e t e r . Auch hier muß der Betrag eines Meßtrommelintervalles für jede Vergrößerung mit Hilfe eines Objektmikrometers bestimmt werden. 89. Bei Ausmessung relativ großer, sich über mehrere Gesichtsfelder erstreckender Präparate bietet die Verwendung eines M e ß t i s c h e s Vorteile; derselbe wird an Stelle des Objekttisches aufgesetzt (Verschiebung bis zu 20 mm, ablesbar auf 0,01 mm). Das auf einer mit Gradeinteilung versehenen, drehbaren Tischplatte liegende Objekt wird mittels einer Meßschraube gegen ein im Okular befindliches Strichkreuz verschoben und der Betrag der Verschiebung an der Schraubentrommel abgelesen. . 90. Zum A u s z ä h l e n von Zellen, Kernen u. dgl. innerhalb einer,bestimmten Fläche dient das O k u l a r n e t z m i k r o m e t e r . Bei ihm ist ein quadratisches Feld von 5 oder 10 mm Seitenlänge in quadratische Felder von 1 oder 0,5 mm Seitenlänge geteilt. Um Doppelzählungen zu vermeiden, rechnet man jeden Zählpunkt, der eine Trennungslinie berührt, immer dem rechten bzw. unten gelegenen Feld zu. 3j5eim Auswerten einer sich über mehrere Sehfelder erstreckenden Präparatfläche kann es zur besseren Abgrenzung von Vorteil sein, in das Okular in der Höhe der Okularblende eine Blende mit viereckigem Ausschnitt von etwa 7—8 mm Seitenlänge einzulegen, die man sich durch Ubereinanderkleben von 4 schwarzen Papierstreifen leicht herstellen kann ( N e u w e i l e r 43). 91. Bemerkung über die Anschaffung eines Mikroskops. Man schaffe sich gegebenenfalls zunächst lieber weniger Objektive an, dafür aber ein gutes mittleres oder großes Stativ mit vollem Abbeschen Beleuchtungsapparat, das sich später durch einen Kreuztisch ergänzen läßt. Wenn das Mikroskop auch für mikrophotographische Zwecke dienen soll, so ist die Wahl eines Stativs mit w e i t e m Tubus und achromatischem Kondensor sehr zu empfehlen. Als Optik genügt für den Anfang ein schwaches und ein starkes achromatisches Objektiv (z. B. mit etwa lOfacher und 40facher Einzelvergrößerung) sowie ein schwaches und ein stärkeres Huygensches Okular (z. B. 5 X und 10 X). Als Immersion kommt für gewöhnlich die achromatische homogene Immersion 1 /ia in Betracht. Besonders empfohlen sei die nur um geringes teuerere, sehr leistungsfähige Fluoritimmersion mit 95—lOOfacher Einzel Vergrößerung; dazu Komponsationsokular oder periplanatisches Okular 7 X und 15 X. Am besten aber auch teuersten sind natürlich die Apochromate. Doch sei betont, daß heute auch die Achromate so vervollkommnet sind, daß sie den landläufigen Anforderungen vollauf genügen. 92. Eine eingehende Darstellung des Mikroskopes findet man in dem ausgezeichneten Werk von A. K o e h l e r (23, 28). Ferner bei P. M e t z n e r - A . Z i m m e r m a n n (28). Zur Einführung E h r i n g h a u s (38), v. R o h r (30), S c h e f f e r . Ältere Werke A m b r o n n , v. A p ä t h y , D i p p e l , G a r t e n , P e t r i . Uber das E l e k t r o m i k r o s k o p und die bei Untersuchungen mit demselben in Frage kommende Technik s. v. A r d e n n e (40). 2. KAPITEL

Die Herstellung und Untersuchung frischer Präparate 93. Als Unterlage für mikroskopische Präparate dienen Objektträger aus Glas von 76:26 mm Seitenlänge (sog. englisches Format). Man nehme nur solche aus reinem, weißem, schlierenfreiem und nicht zu dickem Glas. Trübe Objektträger weise man zurück. Geschliffene Ränder sind unnötig. .Objektträger, die in der Schachtel von den Kanten her betrachtet, grünlich aussehen, sind aus minderem Glas.

§ 94—97a.

Herstellung frischer Präparate

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Nach dem Vorschlage P. M a y e r s wird für den Objektträger auch die Bezeichnung „Tragglas" gebraucht. 94. Zum Bedecken der P r ä p a r a t e dienen Deckgläschen, 0,15—0,2 m m dicke Glasplättchen (bei Benützung von Immersionssystemen wähle man möglichst d ü n n e Deckgläschen!). Eine Größe von 18—22 mm Seitenlänge ist f ü r gewöhnlich hinreichend; f ü r große P r ä p a r a t e vrnd Serienschnitte sind entsprechend größere nötig. Die starken Trockensysteme sind gewöhnlich für eine Deckglasdicke von 0,17 mm korrigiert; schon Abweichungen von wenigen Vioo mm verschlechtern das Bild wesentlich, wenn keine Korrektionsfassung (s. § 18) vorhanden ist. Eine zu dicke Balsamschicht über dem Präparat wirkt wie ein zu dickes Deckglas. Bei umfangreichen Serien ist es erheblich billiger, Deckgläser aus Glimmer (Marienglas) zu verwenden, doch eignen sich derartig eingedeckte P r ä p a r a t e weniger gut zur Betrachtung mit starken Immersionssystemen. Statt Glimmer kann man zur Not zum Eindecken der Präparate auch alte photographische Filmstückchen verwenden, von welchen man durch Einlegen in heißes Wasser die Gelatineschichten entfernt hat. (N u z z i 22.) Für sehr umfangreiche Präparate, die nur mit schwachen Vergrößerungen betrachtet werden sollen, genügen auch alte gereinigte photographische Platten oder Diapositivdeckgläser. 95. L e n t z e (30) machte mit C e l l o p h a n gute E r f a h r u n g e n . Er empfiehlt es zumal zum Eindecken von Hemisphärenschnitten; Cellophan hat dabei vor Diapositivplatten den Vorzug, daß es dünn ist und die Betrachtung mit Immersion zuläßt. Man deckt mit reichlichem, dünnflüssigem Kanadabalsam ein und belastet nach Auflegen von Glas f ü r m e h r e r e Tage, damit sich die Oberfläche des Cellophans nicht wellig verzieht. Ein Nachteil des Cellophans ist die leichte Verletzlichkeit seiner Oberfläche. 96. In manchen Fällen ist es erwünscht, ein Präparat von der Ober- und der Unterseite her mit starken Vergrößerungen betrachten zu können. Man bettet dann das Präparat zwischen zwei Deckgläschen ein, die man in einen mit Fenster versehenen Aluminiumobjektträger nach H e i d e n h a i n steckt. 97. Reinigung. F ü r wertvolle P r ä p a r a t e verwendet man am besten frische ungebrauchte Objektträger aus gutem weißen Glas, die man zur Reinigung lediglich in 96°/oigen Alkohol oder in ein Gemisch von gleichen Teilen absol. Alkohol u n d Benzol legt. Z u m Gebrauch werden sie dann einfach m i t einem sauberen Leintuch abgetrocknet. Objektträger und Deckgläser, die Hüttenrauch zeigen, behandelt man nach § 97a mit Bichromat-Schwefelsäure. 97a. R e i n i g u n g m i t B i c h r o m a t - S c h w e f e l s ä u r e . Gebrauchte O b j e k t t r ä g e r u n d D e c k g l ä s e r , die mit Farbe, Kanadabalsam usw. beschmutzt sind, wie auch andere Glaswaren reinigt man mit B i c h r o m a t S c h w e f e l s ä u r e ( Z e t t n o w s e h e Flüssigkeit). Zur Herstellung derselben rührt man in konzentrierte, rohe Schwefelsäure mit einem dicken Glasstab so lange pulverisiertes Kaliumbichromat -ein, bis dasselbe im Uberschuß vorhanden ist und nicht mehr gelöst wird. Die Lösung besitzt die größte Reinigungskraft, solange sie dunkelbraun gefärbt ist. Später wird sie dunkelgrün und oxydiert dann weniger stark. Von gebrauchten Objektträgern werden zuerst die Deckgläschen nach § 99 entfernt. Hierauf werden die zu reinigenden Gläser bei Zimmertemperatur für 1—3 Tage in Bichromat-Schwefelsäure gelegt (bei Verwendung heißer Z.-Fl. genügt schon etwa 1 Stunde). Sodann werden sie e i n z e l n i n f l i e ß e n d e m W a s s e r s o r g s a m abgespült und in Wasser getaucht, dem einige Tropfen Ammoniak zugesetzt sind, um die letzten Säurespuren zu beseitigen. Dann nochmals fließendes Wasser und Abtrocknen mit einem sauberen Leintuch, wobei man

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Herstellung frischer Präparate

§ 97b—101.

die Gläser an den Kanten faßt und es vermeidet, ihre Fläche mit der Fingerbeere zu berühren. Gläser, die mit l e b e n d e m Material in Berührung kommen, werden besser nicht mit Bichromat-Schwefelsäure, sondern nach § 126 gereinigt. Zu beachten ist, daß viele Färbungen schon durch geringste zurückbleibende Säurespuren gefährdet werden. 97b. R e i n i g u n g m i t I m i oder dgl. Die Objektträger werden mit einem Messer von groben Unreinigkeiten befreit, anhaftende Deckgläser werden nach § 99 entfernt. Sodann werden sie in Wasser, dem auf 1 1 etwa 1 Kaffeelöffel eines der neueren perborathaltigen Waschmittel wie Imi oder dgl. zugesetzt ist, solange gekocht, bis alle Harz-, Fettreste usw. verseift oder gelöst sind (ca. >/4—1/a Stunde). Das schmutzige Wasser wird abgegossen und mehrmals durch reines h e i ß e s Wasser ersetzt, in dem gründlich gespült wird. Dann wird jeder Objektträger einzeln in fließendes Wasser getaucht und abgetrocknet. 98. Gelegentlich wird man die Beobachtung machen, daß Objektträger trotz gründlicher Reinigung das Wasser nicht gleichmäßig annehmen, ein Zustand, der insbesondere bei Anfertigung von Serien recht unangenehm sein kann. V a n W a l s e n (25a) vermutet die Ursache dieses Verhaltens in einer bestimmten molekularen Beschaffenheit der Glasoberfläche. Er empfiehlt in solchen Fällen einen Tropfen einer 20°/oigen Natronlauge auf den Objektträger zu setzen und diesen mit einem Wattebausch tüchtig zu verreiben. Sodann wird sorgfältig mit Wasser abgespült und mit einem Seidentuch abgetrocknet. 98a. R e i n i g u n g d e r O b j e k t t r ä g e r u n d D e c k g l ä s e r von » F e t t s p u r e n « m i t T i e r k o h l e (nach K a i s e r 41). Man bereitet aus Tierkohle und redestilliertem Wasser einen Brei, den man in einem weithalsigen gut verschließbarem Glas vor Austrocknen geschützt aufhebt. Zur Reinigung wird der Brei mit einem Tupfer auf den Objektträger aufgetragen, wobei man diesen mit Daumen und Zeigefinger der linken Hand an der einen Schmalseite hält, mit der anderen Schmalkante auf eine saubere Glasplatte aufstützt und seine Oberfläche durch kreisendes Verreiben des Kohlebreies unter ge-' wissem Druck poliert. Nach V2—1 Min. wird der Objektträger unter der Wasserleitung gut abgespült und zum Trocknen in den Trockenofen oder dgl. gestellt. — Zur Reinigung der Deckgläser wird auf eine wie oben gereinigte Glasplatte (Größe etwa 9 X 1 2 cm) Kohlebrei aufgerieben, darauf die Deckgläser aufgelegt und mit dem Kohletupfer abgerieben. Dann Abspülen usw. Den Tupfer stellt man aus einem geknöpften Glasstab her, der mit einem mehrfach gefaltenen Rehleder überzogen wird. Man entfettet ihn durch mehrtägiges Einlegen in 2—3 Benzinbäder. 99. E n t f e r n u n g d e r D e c k g l ä s c h e n . Mit Kanadabalsam aufgeklebte Deckgläschen entfernt man von alten Präparaten in der Weise, daß man den Objektträger über einer Flamme von der Unterfläche her g l e i c h m ä ß i g erhitzt, bis der Balsam schmilzt und Luftbläschen aufschießen, worauf das Deckglas mit einer Zupfnadel leicht heruntergeschoben werden kann. 100. Um aus einer größeren Menge unbrauchbarer mikroskopischer Präparate Objektträger und Deckgläser wieder zu gewinnen, empfiehlt N a g e l (30) die Verwendung eines mit Xylol beschickten Soxhletschen Extraktionsapparatea. Die Firma Wagner und Münz, München, liefert einen nach dem gleichen Prinzip aus Metall hergestellten Extraktionsapparat, der gut funktioniert. Als Lösungsmittel ziehe ich Benzol vor; das Erhitzen erfolgt am besten auf einer elekrischen Heizplatte. Das Arbeiten mit dem Apparat hat wegen der Feuersgefahr mit entsprechender Vorsicht zu geschehen. 101. A u f b e w a h r e n . Die gereinigten Objektträger hebt man entweder trocken in einer bedeckten Glasschale vor Staub geschützt auf oder man legt sie in eine mit eingeschliffenem Deckel versehene Glasdose, die mit einer Mischung aus a b s o l . A l k o h o l und B e n z o l zu gleichen Teilen gefüllt ist. Im letzteren

§ 102—107.

Herstellung frischer Präparate

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Fall trocknet man sich kurz vor Gebrauch eine entsprechende Anzahl von Objektträgern mit einem sauberen Leintuch ab.

102. Narkose. L u f t a t m e r narkotisiert man zweckmäßig mit C h l o r o f o r m oder Ä t h e r , indem man die Tiere z. B. mit einem chloroformgetränkten Wattebausch unter eine Glasglocke oder dgl. bringt und das Exzitationsstadium a b w a r t e t . Soll das Tier nicht getötet werden, dann nimmt man es gleich nach diesem S t a d i u m wieder heraus und läßt es vorsichtig Äther einatmen, indem m a n zeitweise über das Maul ein der Größe desselben entsprechendes Glasgefäß hält, auf dessen Boden ein ätherbefeuchteter Wattebausch liegt. Hunde, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse narkotisiert m a n am besten mit Äther, Katzen und Affen mit Chloroform. Bei Hunden, die gegen Chlorof o r m sehr empfindlich sind und daher n u r mit Äther b e t ä u b t w e r d e n sollen, ist es zur Erzielung einer ruhigen Narkose dringend zu empfehlen, V-2—1 Stunde vor dem Eingriff 3—5 ccm einer 2°/oigen Lösung von Morphin, hydrochloric. s u b k u t a n zu injizieren. Bei Katzen und Affen, die gegen Morphium überaus empfindlich sind, ist seine A n w e n d u n g zu vermeiden. 103. U m Wasseratmer zu betäuben, schüttelt man ca. 5 ccm Chloroform oder Ä t h e r m i t ca. 100 ccm Wasser und setzt davon einige Kubikzentimeter zu dem die Tiere bergenden Wasser. Sehr gut w i r k t auch Zusatz einer 0,5°'oigen wäßrigen Lösung von Chloreton (Azetonchloroform), die längere Zeit h a l t b a r ist. Bei vorsichtiger Dosierung und Benützung r e i n e r Substanzen lassen sich auf diese Weise auch die kleinsten Tiere ohne nachfolgende Schädigung betäuben. Nach beendeter Narkose muß m a n sie natürlich wieder in frisches sauerstoffreiches Wasser bringen. 104. Ein gutes Narkotikum für Wassertiere (kiemenatmende Amphibien), das lange dauernde Betäubung anscheinend ohne Schädigung gestattet, ist nach den Erfahrungen des Spemannschen Institutes das Narkotikum MS 22 oder TS 22 von Sandoz-Nürnberg. Es wird im Verhältnis von 1 : 3000 in der betreffenden Zuchtflüssigkeit gelöst. (Briefl. Mitt. von Herrn Doz. Dr. V. H a m b u r g e r . ) Z e i g e r (35) empfiehlt zur Narkose von Wassertieren N o v o n a 1 (I. G. Farben), das besonders bei kleinen Tieren sehr viel leichter zu dosieren ist als Urethan und bei richtiger Anwendung nicht nachweisbar schädigend auf den Kreislauf wirkt. 105. Ist die Narkose zu tief geraten, so läßt sich das Tier durch subkutane Kampfereinspritzung unter Umständen noch retten. Je nach Größe und Tierart gibt man 0,1—3 ccm einer Lösung von 1 g Kampfer in 9 ccm Olivenöl. Wassertiere bringt man (nach dem Vorschlag von G r o l l 24) in eine Schale mit frischem Wasser auf ein Stückchen Filtrierpapier, unter dem einige Kampferkristalle liegen.

106. Bei zahlreichen Versuchstieren (mit Ausnahme von Hunden, Katzen und Affen) ist auch die U r e t h a n n a r k o s e empfehlenswert. Man injiziert subk u t a n eine 100/oige wäßrige Lösung (Kaninchen etwa 8—12 ccm, Meerschweinchen 1,5—3 ccm, Ratte 2—3 ccm, Maus 0,15 ccm, Frosch 1,5 ccm). Die Wirkung kommt e r s t u n g e f ä h r 1—2 Stunden nach der Injektion voll zur Geltung. Die Tiere bleiben unter Umständen 1 bis 2 Tage lang schläfrig u n d benommen. Wassertiere bringt m a n bis zum Eintritt der Betäubung in stark verdünnte Urethanlösung. Bei Versagen der Urethannarkose wird die Injektion nicht wiederholt, sond e r n die Narkose mit Äther f o r t g e f ü h r t . 107. D u d i c h und K e s s e l y a k (38) verwenden die Urethannarkose, um Wassertiere zu betäuben und nachher in ausgestrecktem Zustand zu fixieren,. Der Zusatz von Urethan (in Kristallen oder in Lösung) soll in dem Augenblick erfolgen, in dem sich die Tiere im gewünschten Zustand befinden. Wassermenge möglichst gering, Urethankonzentration 1—8°/o.

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Herstellung frischer Präparate

§ 108—113.

Tiere mit kontraktilen Fortsätzen (Hydra, Moostierchen) werden durch Zusatz winziger Mengen von salzsaurem Kokain, solche mit Wimperapparat (Rädertiere) durch Zusatz von salzsaurem Strychnin in ausgetrecktem Zustand betäubt. 108. Bei Katzen, Hunden und Affen b e w ä h r t e sich als zuverlässiges Injektionsnarkotikum D i a l (Ciba). Man verabreicht pro kg 0,5 c c m Dial. liquidum ( = 0,05 g Substanz = Diallylbarbitursäure) intraperitoneal. Die Tiere fallen bald in tiefen Schlaf, der 24—36 Stunden andauern kann. 109. F ü r Mäuse fand ich N u m a l ( = Allylisopropylbarbitursaures Diäthylamin, Hoff mann la Roche) zur Injektionsnarkose sehr geeignet. Man verdünnt die 10°/oige Lösung des Handels im Verhältnis 1 : 99 mit physiologischer K o c h salzlösung und spritzt davon 0,07 ccm pro G r a m m Körpergewicht subkutan unter die Rückenhaut. Die Injektion hat etwa 3 Stunden vor der Operation zu erfolgen, da das Tier erst nach etwa 2 Stunden in tiefe Narkose kommt, die dann stundenlang anhält. 110. Mit C u r a r e läßt sich durch Lähmung der peripheren Nervenendigungen, j e nach der Dosierung, eine kürzer oder länger dauernde Bewegungslosigkeit erzielen. Man schwemmt dazu 0,1 g der pulverisierten Droge in 10 ccm dest. oder Glyzerinwasser (Sä) auf und läßt unter öfterem Umschütteln 24 Stunden stehen. Die über dem Ungelösten stehende bräunlich gefärbte Flüssigkeit wird zur subkutanen Injektion benutzt. (Dosis für einen Frosch ca. 0,5 ccm. Es ist zu beachten, daß das im Handel erhältliche Curare hinsichtlich seiner Güte oft sehr ungleich ist.) D a b e i L ä h m u n g m i t C u r a r e d i e S c h m e r z e m p f i n d u n g in v o l l e m M a ß e e r h a l t e n b l e i b t , w i r d m a n es n u r in F ä l l e n a n w e n d e n , in w e l c h e n es u n u m g ä n g l i c h n ö t i g ist. Wegen eingehenderer Angaben über die operative Technik des Tierexperimentes verweise ich auf H. F. O. H a b e r 1 a n d (26). 111. Zum Festhalten der Tiere verwendet man entsprechende Operationsbretter in verschiedenen Größen. F ü r kleine Tiere, z. B. Amphibienkeime, Kaulquappen, benützt man mit W a c h s a u s g e g o s s e n e G l a s s c ' h a l e n , in die dem Körper entsprechende Mulden eingedrückt werden. Zum Festhalten dienen dünne bogenförmige oder gerade Silberdrahtstücke, Glasnadeln o. dgl. (s. auch B o r n , S p e m a n n ) . 112. Das Töten der Tiere erfolgt im allgemeinen dadurch, daß man sie bis zum Aussetzen der Herz- und Atembewegungen in einem Glasgefäß oder in einem mit Blech ausgeschlagenem und mit Glasfenster versehenem Holzkasten Chloroform- oder Ätherdämpfen aussetzt. Ein schonendes Tötungsmittel ist nach K r a u s e (1) Kohlensäure, die aus der Kohlensäurebombe mittels eines Schlauches in eine Glasglocke geleitet wird. Wassertiere können in einem mit ausgekochtem Wasser vollgefüllten und oben mit einer Glasplatte bedeckten Gefäß durch Ersticken getötet werden. Ist aus besonderen Gründen die Einwirkung der obengenannten Stoffe zu vermeiden, dann tötet man kleine Tiere wie Frösche, Tauben, Mäuse u. dgl. durch rasches Abschneiden des Kopfes mit einer kräftigen Schere, wonach bei niederen Wirbeltieren noch Gehirn und Rückenmark mit einer Nadel zerstört werden müssen^ Größere Tiere (z. B. Kaninchen) werden durch starken Schlag auf den Hinterkopf getötet. 113. Zur E n t h a a r u n g von Kaninchen, Hunden usw. verwendet man ein aus Calciumsulfld (50,0), Calciumcarbonat (20,0) und Talcum (30,0) bestehendes Pulver. K a t s c h (22) empfiehlt folgende Zusammensetzung: Bariumsulfid (40,0), Zinkoxyd (80,0), Barium- und Strontiumsulfid sollen stärker wirken als Calciumsulfid. Man rührt das Pulver mit etwas Wasser zu einem dicken Brei an, feuchtet die Haare mit Wasser gut an und streicht den Brei mit einem Holzspatel auf das Fell. Nach 3—5. Minuten einfach wegstreichen. Zu lange Einwirkung greift die Haut an.

§ 114—121.

Herstellung frischer Präparate

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114. Genähte Operationswunden bestreicht man bei Säugetieren am besten mit etwas C o l l o d . e l a s t i c . oder mit M a s t i s o l und klebt ewas Watte oder Kompressentoff darüber. 115. Mit dem Tode des Tieres ist in vielen Fällen das Leben der einzelnen Zellen noch nicht erloschen. Bringt man dieselben daher in entsprechende Umgebung, so können sie noch k ü r z e r e oder längere Zeit am Leben erhalten werden. J e nach dem Lebenszustand spricht m a n dann von einem f r i s c h e n , e i n e m ü b e r l e b e n d e n P r ä p a r a t oder e i n e m l e b e n d e n P r ä parat. 116. Bei der mikroskopischen Untersuchung frischer Präparate ist eine währ e n d der Beobachtung eintretende Austrocknung peinlichst zu vermeiden. Dies geschieht durch Z u f ü g e n von sog. indifferenten Zusatzflüssigkeiten, die in der Regel den zu untersuchenden Elementen i s o t o n i s c h sind, ohne daß sie jedoch im strengen Sinne des Wortes i n d i f f e r e n t wären. 117. N a t ü r l i c h e Z u s a t z f l ü s s i g k e i t e n . Am unschädlichsten ist eine womöglich dem gleichen Tier entstammende K ö r p e r f l ü s s i g k e i t , wie A u g e n k a m m e r w a s s e r , Amnionwasser, Blutserum, B l u t p l a s m a , L y m p h e , H ä m o l y m p h e . Blutplasma wird durch Zentrifugieren von frisch und steril entnommenem Blut gewonnen. Auch filtriertes Hühnereiweiß wird verwendet. 118. K ü n s t l i c h e Z u s a t z f l ü s s i g k e i t e n . Ais-Ersatz f ü r diese in größerer Menge meist n u r schwierig zu beschaffenden Flüssigkeiten dienen häufig verschiedene einfache Salzlösungen. Am gebräuchlichsten ist die physiologische Kochsalzlösung, deren Salzgehalt je nach der Tierart etwas schwankt. F ü r Säugetier w i r d eine 0,9°/oige, f ü r Vögel eine 0,750/oige, f ü r Salamander eine 0,8°'oige, f ü r Frösche eine 0,64°/oige Lösung empfohlen. Für Seetiere wird der Salzgehalt je nach der Spezies auf 1,5—2,6°/o erhöht ( R o d i e r ) . Vielfach wird bei Geweben von Seetieren auch Meerwasser als Zusatzflüssigkeit verwendet. Während die grobe morphologische S t r u k t u r des Gewebes in dieser Lösung f ü r k ü r z e r e Zeit meist ganz gut erhalten bleibt, ist sie f ü r die F u n k t i o n d u r c h a u s nicht physiologisch, sondern g i f t i g wirkend. F ü r feinere Untersuchung wählt m a n daher besser eine der nachfolgenden Lösungen, die auf das Gewebe, zumal wenn sie mit Sauerstoff gesättigt werden, weniger schädigend wirken. 119. Als Ringerlösung wird f ü r Säugetiergewebe meist eine Flüssigkeit von folgender Zusammensetzung gebraucht: Natriumchlorid (NaCl) 9,0 g, Kaliumchlorid (KCl) 0,42 g, Calciumchlorid (CaCl 2 ) 0,25 g, dest. Wasser ad 1000,0 ccm. (Bei Amphibien statt 9,0 n u r 6,5 g NaCl.). Der Zusatz von CaCl2 darf erst nach Lösung der anderen Salze erfolgen, da es sonst als unlösliches Calciumcarbonat ausfällt. Die Lösung ist nicht lange haltbar und wird für wichtige Beobachtungen am besten frisch angesetzt. Eine weitere, bicarbonathaltige Ringerlösung hat "folgende Zusammensetzung: NaCl 8,5 g; KCl 0,25 g; NaHC0 3 0,2 g; CaCl2 0,3 g; dest. Wasser ad 1000,0 ccm. 120. Zur Aufzucht isolierter Teile von Amphibienkeimen modifizierte H o l t f r e t er (31) die Ringerlösung wie folgt: NaCl 0,35 g, KCl 0,005 g, CaCl2 0,01 g, NaHCOa 0,02 g, dest. Wasser 100 ccm. Der osmotische Druck entspricht etwa dem Gefrierpunkt A = 0,22; p H zwischen 7,8 und 8,2. 121. Die Normosallösung von S t r a u b (20) entspricht der Ringerlösung, deren Herstellung aber durch das P r ä p a r a t sehr vereinfacht wird. Das Salzgemisch wird u n t e r dem Namen N o r m o s a l (sächsische Serumwerke, Dres-

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Herstellung frischer Präparate

§ 122—126.

den) in sterilen P a c k u n g e n in den Handel gebracht. Z u m G e b r a u c h w i r d der I n h a l t einer A m p u l l e in der vorgeschriebenen Menge abgekochten, auf H a n d w ä r m e wieder a b g e k ü h l t e n dest. Wassers d u r c h Umschütteln gelöst. Die f e r t i g e Lösung darf nicht ü b e r 50° C e r w ä r m t werden. »Durch bestimmte Vorbehandlung wurde dem Calciumsalz ein Lösungsverzug erteilt, so daß es automatisch in den mit Vorsprung sich lösenden anderen Salzen des Gemisches einkommt.« Die mit der Lösung vorgenommenen Versuche ergeben die Berechtigung, das »Salzgemisch tatsächlich als ein .anorganisches Serum' zu bezeichnen und ihm alle diejenigen Eigenschaften und Funktionen zuzuschreiben, die nach Entfernung der organischen, kolloidalen Bestandteile dem Blutserum zukommen«. Straub 20. Nach den Untersuchungen von R o s t o c k (22) erhält das Normosal eingelegte Organstückchen um mehrere Stunden länger am Leben als physiologische Kochsalzlösung. 122. Locke-Lösung: NaCl 0,85 g (bei Kaltblütern 0,65 g); KCl 0,042 g; NaHC0 3 0,02 g; CaCl 2 0,024 g; dest. Wasser ad 100 ccm. — Lewis setzt dazu noch 0,5 g Glukose. Die Salze sind in der angegebenen Reihenfolge zu lösen. Die Lösung ist nicht lange haltbar und darf nicht gekocht werden, da sich in diesem Falle durch Freiwerden von C0 2 aus dem NaHCOß unlösliches Calciumcarbonat bildet. Recht einfach gestaltet sich die Herstellung der Lösung, wenn man sie durch Vereinigung einzelner Stammlösungen bereitet, die für sich gut haltbar sind. Man benötigt dazu eine 9°/oige Natriumchloridlösung, l°/oige Kaliumchloridlösung, l°/oige Lösung von ausgeglühtem Calciumchlorid, eine 10°/oige Natriumhydrocarbonatlösung, eventuell 10°/oige Glukoselösung. Unmittelbar vor Gebrauch vereinigt man 20 ccm der NaCl-, je 4 ccm der KCl- und CaCl 2 - und 5—10 der Glukoselösung und verdünnt mit dest. Wasser auf 200 ccm. Wenn nötig, sterilisiert man dann durch Erhitzen zum Sieden, Nach Abkühlen setzt man 0,4 ccm ,der NaHC0 3 zu. (B a r t a 23.) 123. Die Tyrodelösung besteht aus Natriumchlorid 8,0 g; Calciumchlorid 0,20 g; Kaliumchlorid 0,20 g; Magnesiumchlorid 0,10 g; M o n o n a t r i u m p h o s p h a t 0,05; N a t r i u m b i c a r b o n a t 1,0 g; Glukose 1,0 g; dest. Wasser ad 1000,0 ccm. Darf nicht gekocht w e r d e n ; Sterilisieren durch F i l t r i e r e n durch ein B e r k e f e l d t F i l t e r (s. auch § 125). 124. Z u r A u f r e c h t e r h a l t u n g einer k o n s t a n t e n Reaktion u n d zur B i n d u n g schädlicher A m i n o s ä u r e n empfiehlt V e t t e r die V e r w e n d u n g der Fleisdisdien Lösung, die sich auch leicht sterilisieren läßt, da die beiden Vorratslösungen v o r i h r e r Vereinigung ohne Schaden ö f t e r s gekocht w e r d e n können. L ö s u n g I: NaCl 8,0 g, KCl 0,2 g, 1/1 n N a 2 C 0 3 20,0 ccm, aqu. dest. ad 500,0. L ö s u n g I I : CaCl 2 0,2 g, MgCl 2 0,1 g, 1/1 n HCl 8,0 ccm, 1/1 n H3PO4 3,5 ccm, D e x t r o s e 1,0 g, aqu. dest. ad 500,0. Z u m G e b r a u c h w e r d e n von beiden Lösungen (nach Erkalten) gleiche Teile zusammengegossen, u n d zwar Lösung I in Lösung II. Die fertige Lösung darf nicht m e h r gekocht w e r d e n . (PH der fertigen Lösung = 7 , 5 2 . ) 125. U m eine Zusatzflüssigkeit o h n e K o c h e n z u sterilisieren, filtriert m a n sie mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe durch ein B a k t e r i e n f i l t e r (»G 5 auf 3«) der J e n a e r Glaswerke S c h o t t u. G e n . Die Filter w e r den in drei Feinheitsgraden hergestellt: G (grob f ü r Hefe), M (mittel, ausgesprochenes Bakterienfilter u n d F (fein). Die Filter können im Trockenschrank wie im Autoklaven sterilisiert werden. Sie müssen aber kalt in den kalten Sterilisator eingestellt werden und nach dem Erhitzen auf 120—150° C in diesem abkühlen. 126. Zur Reinigung des Filters gießt man etwa 80° C warme konz. Schwefelsäure auf die Füterplatte, wobei der Säure etwas Kalisalpeter oder eine Mischung von

§ 127—130.

Herstellung frischer P r ä p a r a t e

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N a N 0 3 + NaClC>4 zugesetzt wird. Man läßt über Nacht stehen, saugt ab und wäscht u n t e r Vakuum mit dest. Wasser nach, bis das F i l t r a t mit "salzsaurer Bariumchloridlösung keine T r ü b u n g mehr zeigt. Bei diesem von Schott u. Gen. empfohlenen Verfahren sind die Reaktionsprodukte der Reinigungslösung alle leicht wasserlöslich; sie w e r d e n vom Glas nicht absorbiert. Vor der Verwendung von Bichromatschwefelsäure zur Reinigung von Glasfiltern, die mit biologischem Material in B e r ü h r u n g kommen, wird dagegen gewarnt, da dabei eine Vergiftung biologischer Substanzen durch absorbierte, durch Reduktion von Chromsäure entstehende Chrom-III-Salze leicht gegeben ist.

127. Die Herstellung des frischen Präparates. Während dünne, durchsichtige,

flach ausgebeitete Gewebeteile, wie Mesenterium, Omentum mancher Tiere, Knorpelplättchen, Haare, dünne Blutgefäße oder Nerven, abgeschabte Zellen (z. B. Epithelien der Mundhöhle), Spermatozoen, gewisse Eiarten und ähnliches ohne weitere Zerkleinerung der mikroskopischen Untersuchung unterworfen werden können, müssen die meisten Organe zu dem Zweck erst zerkleinert werden. 128. Dazu zerschneidet man die betreffenden Organe mit scharfem Messer oder Schere in kleine Stückchen, die dann auf dem Objektträger in einem Tropfen einer i n d i f f e r e n t e n Flüssigkeit meist mit Hilfe von Z u p i n a d e l n weiter zerkleinert werden. Die Nadeln müssen sehr spitz sein u n d d ü r f e n an ihrer Spitze keinen Widerhaken besitzen. Von Zeit zu Zeit müssen sie auf Sandpapier oder einem Sandstein wieder zugeschliffen werden. Handelt es sich u m ein Objekt, welches in der Längsrichtung gefasert werden soll, so setzt m a n die eine Nadel an einer Stelle des Stückes auf u n d zerfasert mit der anderen, indem m a n diese senkrecht zum Faserverlauf des P r ä p a r a t e s bewegt. Man nehme beim Zupfen den Flüssigkeitstropfen nicht zu groß. Oft ist es von Vorteil, das Zerzupfen in halbtrockenem Zustand auszuführen.

129. S c h m e l z e r (34) empfiehlt zur Erleichterung des Zupfens das Präparat mittels zweier Nadelgatter zu h e c h e l n . Zur H e r s t e l l u n g d e r N a d e l h e c h e l werden in ein ca. 11 cm langes und ca. 2,5 mm breites Metallröhrchen 5—j-6 dicht aneinanderliegende feine Nähnadeln mit den Öhrenden ca. 8 mm tief eingelassen und durch Flachpressung der Hülse fest fixiert. Die Nadeln sollen ca. IV2 cm weit in gleicher Länge vorstehen. A n w e n d u n g : Ein kleines Häufchen des zu zerzupfenden Gewebes wird auf den Objektträger gebracht, die Spitzen des linken Gatters u n t e r einem Winkel von ca. 45° auf den rechten Rand der Masse gesetzt, w ä h r e n d die Spitzen des rechten durch die Lücken des linken hindurchgeschoben werden, so daß sich beide Gatter kreuzen. Dann wird die Masse am Rande gepackt u n d vom rechten Gatter in raschem Tempo bearbeitet, w ä h r e n d das linke unbeweglich am Standort bleibt. Dies wird so lange fortgesetzt, bis das ganze Material nach rechts hindurchbefördert ist. Dann Zusammenfegen des Zerzapften u n d Wiederholen, bis die Gewebsbestandteile genügend isoliert sind. Die Nadelgatter lassen sich auch zum Auseinanderziehen von Gewebe gut verwenden.

130. Energisch zerkleinernd wirkt in geeigneten Fällen das R a s p e l n des Materials mit ungebrauchtem groben Sandpapier ( S c h m e l z e r 34). Das vorher evtl. gehechelte, dann mit ein paar Tropfen Glyzerin bedeckte Material wird mit einem auf die Unterfläche eines Flaschenkorkes geklebten, groben Sandpapier durch kreisende behutsam mahlende Bewegungen auf einer Sandpapierunterlage zu einem ganz dünnen Brei zerrieben. Ein Zerquetschen des Materials wird dabei durch die hervorstehenden Kieselsplitter des Sandpapiers vermieden.

32

Herstellung frischer Präparate

§ 131—134.

131. Z u r S ä u b e r u n g v o n M e m b r a n e n u. dgl. von anliegendem Zellmaterial u. dgl. verwendet man eine Zupfnadel, deren Spitze in etwa 3 mm Länge winkelig abgebogen, abgeplattet und an einem Rand zugeschärft ist. Marderhaarpinsel, deren Haare bis auf etwa 3 mm gekürzt sind, gestatten einen festen, wirksamen und dabei doch schonenden Strich, wodurch sich eine weitgehende Reinigung erzielen läßt (N e u b e r t 40). 132. Zur Durchführung feinster präparatorischer Arbeiten empfiehlt H o c h s t e 11 e r (31) » P r ä p a r i e r f e d e r c h e n«. Er verwendet dazu die verkümmerten Schwungfedern der Waldschnepfe und der Bekassine (sog. »Schnepfengrandl«), die überaus elastisch sind und deren Biegsamkeit gegen den Kiel rasch abnimmt. Der Kiel eines solchen Federchens wird in ein mit entsprechender Bohrung versehenes Holzstäbchen eingelassen und mittels eines Tröpfchens Zellonlackes in der Bohrung festgekittet. Das Präparierfederchen kann auch zum Orientieren embryonaler Präparate beim Photographieren, Abpinseln von Niederschlägen oder Blutgerinnsel von Organoberflächen, Ausbreiten und Glattstreichen von Zelloidinschnitten u. dgl. verwendet werden.

Bei der Behandlung sehr kleiner Objekte leisten H a a r ' ö s e und H a a r s p a t e l gute Dienste. ( S c h u u r m a n n u. S t e k h o v e n 31.) Die Haaröse wird durch Einstecken eines Kopfhaares mit beiden Enden in eine zur Spitze ausgezogene Glasröhre und Befestigung in dieser Lage durch einen Tropfen Paraffin oder dgl. hergestellt. Man handhabt sie so, daß man mit ihr die Objekte aufrührt, bis sie in die Oberflächenhaut der Flüssigkeit gelangen. Dort kann man sie aus der Oberflächenhaut „herausschneiden" und innerhalb des in der Haarschlinge ausgespannten Flüssigkeitshäutchens auf Objektträger usw. überführen. Der Haarspatel wird aus einem stärkeren Haar, z. B. einem Pferdehaar hergestellt, welches n u r mit einem Ende in der spitz ausgezogenen Glasröhre befestigt wird. Es wird dann zwischen den erhitzten Schenkeln einer Flachzange ,,plattgebrannt''. 133. Ein weiteres wichtiges Werkzeug ist die S p l i t t e r p i n z e t t e , eine Pinzette normaler Größe, deren Greifarme genügend breit und kräftig sind und in sehr feine scharfe Spitzen auslaufen, die genau aufeinanderpassen ( H o c h s t e t t e r 31). Die Spitzen sind innen mit einer spitzenwärts auslaufenden Längsrinne versehen und ganz fein quergerieft (Hersteller: Firma R e i n e r , Wien IX, van Swietengasse 10.) 134. Das Schneiden mit dem Rasiermesser. Einige Gewebe sind so konsistent, daß man von ihnen mit einem Rasiermesser dünne, durchsichtige Lamellen herunterschneiden kann. Indessen wird es n u r bei großer Übung gelingen, wirklich gute Resultate zu erzielen. Beim Schneiden beachte fnan folgendes: das erste Erfordernis ist ein gutes, sehr scharfes, schartenfreies Messer. Das Stück, welches geschnitten werden soll, fasse man fest mit Daumen, Zeige- und Mittelfinger der linken Hand und stütze die Hand auf die Tischplatte fest auf. Sind die Präparate klein und schwer zu halten, so klemme man sie zwischen Holundermark oder in Alkohol gehärtete Leberstückchen; man schneide gegen sich (nicht von sich). Man schneide stets ziehend, nicht drückend, so daß bei jedem Schnitt möglichst die ganze Schneide des Messers durch das Präparat in wagrechter Richtung hindurchgezogen wird. Um ein Ankleben des Schnittes an der Messerklinge zu verhindern, schneide man feuchte Objekte etwas feucht, d. h. man benetze vor jedem Schnitt Messerklinge und Präparatoberfläche mit einer entsprechenden Flüssigkeit. Zuerst lerne man kleine, aber möglichst dünne Schnitte machen, dann erst größere. Die Schnitte

§ 135—137.

Herstellung frischer Präparate

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spült man durch Eintauchen des Messers in eine entsprechende Flüssigkeit ab. Nach dem Gebrauch wische man das Rasiermesser sorgfältig trocken, um eine Beschädigung von Schneide und Politur durch Rost zu vermeiden. Oft läßt sich an Stelle eines Rasiermessers mit Vorteil eine unbenützte Rasierklinge gebrauchen. Besonders empfehlenswert ist deren Verwendung beim Zurechtschneiden von Präparaten u. dgl., da bei der dünnen Rasierklinge die quetschende Wirkung des Messerrückens in Wegfall kommt. H o l u n d e r m a r k sammelt man am besten im Herbst von abgestorbenen Schößlingen. Aus solchen ist das Mark mühelos zu gewinnen; meist genügt ein Druck mit dem Finger, um das Mark aus seiner Umhüllung zu lösen. Das E i n k l e m m e n i n H o l u n d e r m a r ' k erfolgt in der Weise, daß man das Mark spaltet, das Objekt einlegt, wobei man für größere ev. vorher eine Rinne macht, und das Mark mit einem kleinen Gummiring von ca. 1 cm Durchmesser 2—3mal fest umschlingt. Dann wird das obere Ende des Markes keilförmig zugeschnitten. 135. Zum A b z i e h e n d e r R a s i e r m e s s e r benötigt man einen gelben und einen blaugrünen Abziehstein (bei R. J u n g , Heidelberg, erhältlich). Die Steine dürfen nur mit reinem Wasser oder mit Seifenwasser, nicht mit öl, benetzt werden. Zuerst zieht man das Messer auf dem gelben Stein ab; man führt es flach aufgelegt ohne Druck immer mit der Schneide voraus über den ganzen Stein hinweg, indem man während eines Zuges allmählich die ganze Länge der Messerschneide mit dem Stein in Berührung kommen läßt; zuerst die dem Griffe nahe Partie, dann die Spitze. Nun wendet man das Messer über den Rücken und verfährt zurück ebenso wie mit der anderen Seite usf., bis die ganze Schneide scharf und schartenfrei ist. Dann wischt man das Messer ab und setzt das Abziehen auf dem blaugrünen Stein fort, der vorher mit einem zweiten kleineren Stein (»Aufreiber«) so lange gerieben wurde, bis sich etwas Schlamm gebildet hat. Hierauf zieht man es noch einige Male auf einem Streichriemen ab, n u n m e h r a b e r n i c h t wie b e i m S t e i n m i t der S c h n e i d e , s o n d e r n m i t dem R ü c k e n v o r a n . Die Streichriemen zeigen meist 4 Abziehseiten; die Steinseite ist bei ihnen meist unbrauchbar. Die rotgefärbte Lederseite ist mit grobkörnigem Schmirgel gestrichen, die schwarze mit feinkörnigem, die vierte besteht aus feinem Leder. Man befolge beim Abziehen die genannte Reihenfolge. Von Zeit zu Zeit reinige man die geschmirgelten Lederstreifen, indem man sie mit etwas Butter abreibt und die gereinigte Lederfläche wieder mit einem erbsengroßen Stück der betr. käuflichen Schmirgelmasse, am einfachsten mit Hilfe des Bauches einer glattwandigen runden Arzneiflasche, fest einreibt. An Stelle des gelben und grünen Steines wird von manchen auch ein sog. A r k a n s a s ö l s t e i n verwendet, der nicht mit Wasser, sondern mit Glycerinalkohol ( 1 : 2 ; 90°/oig) benetzt wird. Bei plankonkaven Messern wird auf dem Stein hauptsächlich die konkave Seite abgezogen. 136. Für manche Zwecke benützt man zum Schneiden ein sog. Doppelmesser. Dasselbe besteht aus zwei parallel gestellten übereinanderliegenden Messerklingen, deren Schneiden durch eine Schraube sich mehr oder weniger genähert werden können. Geschnitten wird, indem man mit dem benetzten Doppelmesser rasch ziehend ein Organ, z. B. frische Leber, durchschneidet. Dasselbe zerfällt in zwei Teile und eine zwischen beiden Klingen befindliche Scheibe. Diese entnimmt man, indem man die Klingen durch Lösen der Schraube (ev. Aufklappen der einen Klinge) unter geeigneter Flüssigkeit voneinander entfernt. 137. In vielen Fällen wird man sich zur Herstellung frischer Präparate auch des Gefriermikrotoms bedienen. Die zu untersuchenden Organstückchen kommen unmittelbar nach der Entnahme aus dem Organismus auf den Gefriertisch. Die Schnitte werden in einer der indifferenten Flüssigkeit aufgefangen oder besser nach dem von S c h u l t z - B r a u n s (31) ausgearbeiteten Verfahren in gefro3

R o m e 1 s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Herstellung frischer Präparate

§ 138—142.

renem Zustand vom unterkühlten Messer direkt auf den Objektträger übertragen. Näheres über die Gefriertechnik siehe unter § 520 ff. Bei der Untersuchung muß man sich natürlich dessen bewußt sein, daß durch das Auftreten der Eiskristalle künstliche Zerreißungen u. dgl. entstehen können. 138. Das Eindecken des Präparafes. Das fertiggestellte Zupf- und Schnittpräparat wird möglichst rasch mit einem Deckglas bedeckt, dessen Unterfläche vorher unter Umständen mit einem Tropfen der indifferenten Beobachtungsflüssigkeit versehen wird. Die Gesamtmenge der Flüssigkeit soll so bemessen sein, daß sie den Spalt zwischen Deckglas und Objektträger gerade ausfüllt. Ist die Flüssigkeit zu reichlich, so quillt sie an den Kanten hervor und reißt dabei häufig gerade die feinsten Teilchen des Präparates mit fort; ist der Tropfen zu klein, so kommt es zur Bildung von Luftblasen, die sich im mikroskopischen Bild als schwarzumrandete Kugeln und Kreise störend bemerkbar machen. 139. Bei empfindlichen Präparaten bringt man, um eine Zerquetschung derselben durch das aufgelegte Deckglas zu vermeiden, an den vier Ecken desselben kleine Wachsfüfjchen an, indem man mit jeder Ecke leicht über etwas weiches Wachs streicht. Durch leichten Druck auf die Ecken des Deckgläschens mit einem Glasstab kann man dann am eingedeckten Präparat die Höhe der Kammer verringern und gewisse Objekte in bestimmter Lage festhalten. Man kann dazu gewöhnliches Bienenwachs benützen, besser ist sog. K l e b w a c h s . Herstellung desselben: man verrührt geschmolzenes Wachs (2 Gew.-Teile) auf dem Wasserbad mit venetianischem Terpentin (1 Gew.-Teil) und läßt die Mischung erkalten. An Stelle von Wachsfüßchen lassen sich auch dünne Glasfäden verwenden, deren Dicke man entsprechend der Dicke des Objektes wählt. 140. Unmittelbar nach dem Eindecken wird das Präparat zweckmäßig in der in § 820 näher geschilderten Weise umrandet oder nach § 815 eingedeckt. Dadurch wird einem Verdunsten der Beobachtungsflüssigkeit, durch das schädliche Konzentrationsveränderungen hervorgerufen würden, vorgebeugt. Gleichzeitig wird das Präparat dadurch gegen ein Verschieben und Drücken des Deckglases bei der Beobachtung geschützt. 141. Soll an dem frischen Präparat die Wirkung verschiedener Reagentien untersucht werden, so versieht man zunächst nur die Längskanten des Deckglases mit einem Wachsrand, während die beiden gegenüberliegenden Schmalseiten frei bleiben. Bringt man dann an die eine Kante des Deckglases mittels einer fein ausgezogenen Pipette etwas Flüssigkeit, an die gegenüberliegende Kante aber einen Streifen Filtrierpapier von der Breite des Deckglases, so saugt das Filtrierpapier die unter dem Deckglas befindliche Flüssigkeit ab, wodurch gleichzeitig die an der gegenüberliegenden Kante neu zugesetzte Flüssigkeit nachgezogen wird. Man kann auf diese Weise verschiedene Flüssigkeiten an das Präparat bringen und ihren Einfluß auf dasselbe verfolgen. 142. Ein Verdunsten der Beobachtungsflüssigkeit läßt sich auch durch Verwendung einer sog. f e u c h t e n K a m m e r vermeiden. Bei kleinen Objekten bedient man sich dazu meist eines h o h l g e s c h l i f f e n e n O b j e k t t r ä g e r s , an dessen Oberfläche in der Mitte eine mehr oder weniger tiefe Kugelkalotte eingeschliffen ist. Legt man dann über die Aushöhlung ein etwas größeres Deckglas, an dessen Unterfläche das zu untersuchende P r ä p a r a t in einem Flüssigkeitstropfen hängt, und dichtet man die Ränder des Deckglases sodann mit Vaseline, Öl, Wachs oder Paraffin ab, so sättigt sich der kleine Hohlraum alsbald so weit mit Feuchtigkeit, daß eine weitere Verdunstung vermieden wird.

§ 143—145.

Herstellung frischer Präparate

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B e i m A u f l e g e n des D e c k g l a s e s ist zu v e r m e i d e n , d a ß d e r F l ü s s i g k e i t s t r o p f e n d e n B o d e n o d e r die R ä n d e r d e r f e u c h t e n K a m m e r b e r ü h r t . 143. A u c h d u r c h A u f l e g e n eines k l e i n e n G l a s r i n g e s auf e i n e n g e w ö h n l i c h e n O b j e k t t r ä g e r , D a r ü b e r l e g e n eines Deckglases u n d e n t s p r e c h e n d e A b d i c h t u n g l ä ß t sich eine f e u c h t e K a m m e r h e r s t e l l e n . Bei g r ö ß e r e m R a u m i n h a l t ist auf d e n Boden d e r K a m m e r e t w a s F l ü s s i g k e i t zu geben, u m eine zu s t a r k e K o n z e n t r a t i o n d e r B e o b a c h t u n g s f l ü s s i g k e i t infolge V e r d u n s t u n g zu v e r m e i d e n . E i n e g r ö ß e r e f e u c h t e K a m m e r k a n n m a n sich aus j e d e r g u t s c h l i e ß e n d e n Glasdose h e r stellen, auf d e r e n B o d e n m a n a n g e f e u c h t e t e s F i l t r i e r p a p i e r o d e r g u t g e w a s c h e nen nassen Sand bringt. 144. Bei d e r U n t e r s u c h u n g von f r i s c h e m Z e l l m a t e r i a l , das z. B. d u r c h A b s t r e i f e n d e r S c h n i t t f l ä c h e eines O r g a n e s m i t d e m Messer g e w o n n e n ist, lassen sich m i t V o r t e i l a u c h die v o n A r n o l d f ü r die U n t e r s u c h u n g v o n Blutzellen e m p f o h l e n e n H o l u n d e r m a r k s c h e i b c h e n v e r w e n d e n (s. § 1301, G e w i n n u n g von H„ s. § 134). 145. U m Z u p f p r ä p a r a t e o h n e V e r l u s t zu f ä r b e n u n d in ein E i n s c h l u ß m e d i u m zu ü b e r f ü h r e n , v e r f ä h r t m a n n a c h e i n e r im P r i n z i p schon v o n O v e r t o n (90) e m p f o h l e n e n M e t h o d e . Das m i t d e m z e r z u p f t e n M a t e r i a l v e r s e h e n e T r a g g l a s (oder Deckglas) w i r d , w e n n F i x i e r u n g e r w ü n s c h t , z u n ä c h s t in e i n e r P e t r i s c h a l e J o d - , O s m i u m t e t r o x y d - oder F o r m o l d ä m p f e n ausgesetzt. Zur Entwicklung der Joddämpfe werden in einem Reagensglas einige Jodkriställchen bis zum Auftreten reichlicher Dämpfe erwärmt, die sich, dank ihrer Schwere, durch Umkehren des Röhrchens auf das Präparat gießen lassen. Die Objekte werden durch sie augenblicklich fixiert. Nach 2—3 Minuten wird der Objektträger zur Vertreibung des Jods ebensolange auf etwa 40° erwärmt. Die Fixierung durch Osmiumdämpfe erfolgt nach § 285 in 1—2 Minuten. Die Einwirkung von Formoldämpfen geschieht in der Weise, daß man ein am Boden der Schale liegendes Filtrierpapier stark mit unverdünntem Formol anfeuchtet und die Dämpfe in geschlossener Schale 1/s—1 Stunde lang einwirken läßt. N a c h d e r F i x i e r u n g legt m a n d e n O b j e k t t r ä g e r m i t d e r S c h i c h t s e i t e n a c h o b e n u n d o h n e die P r ä p a r a t e a u s t r o c k n e n zu lassen in e i n e r e t w a 2 c m h o h e n Schale auf e i n e n k l e i n e n G l a s d r e i f u ß . H i e r a u f gibt m a n auf das P r ä p a r a t mit e i n e r P i p e t t e 1—2 T r o p f e n 20°/oigen Alkohol, auf den B o d e n d e r Glasschale a b e r e i n e 2—4 m m h o h e S c h i c h t von a b s o l u t e m Alkohol, zu d e m m a n evtl. noch a u s g e g l ü h t e s K u p f e r s u l f a t setzt. Schließlich w i r d die Schale, die a n e i n e m g l e i c h m ä ß i g t e m p e r i e r t e n O r t s t e h e n soll (nicht in d e r Sonne!) m i t e i n e r gut schließenden Glasplatte bedeckt. T a g s d a r a u f h a t sich d e r A l k o h o l auf d e m P r ä p a r a t so w e i t k o n z e n t r i e r t , daß m a n es v o r s i c h t i g m i t 1—2 T r o p f e n e i n e r d ü n n f l ü s s i g e n ( e t w a l°/oigen) Celloid i n l ö s u n g b e d e c k e n k a n n , die m a n d u r c h H i n - u n d H e r n e i g e n i n d ü n n e r Schicht g l e i c h m ä ß i g ü b e r das P r ä p a r a t v e r t e i l t . S o b a l d das Celloidin n i c h t m e h r m e r k lich f l i e ß t , t a u c h t m a n d e n O b j e k t t r ä g e r m i t d e r S c h i c h t s e i t e n a c h o b e n r a s c h i n 80°/oigen Alkohol, in d e m d i e Celloidinschicht e r s t a r r t . S c h o n n a c h w e n i g e n M i n u t e n k a n n m a n d a s P r ä p a r a t in b e l i e b i g e n F a r b l ö s u n g e n w e i t e r b e h a n d e l n o h n e e i n F o r t s c h w i m m e n d e r O b j e k t e b e f ü r c h t e n zu m ü s s e n . E r f o l g t d e r E i n s c h l u ß d e r P r ä p a r a t e in B a l s a m , so m u ß e i n e A u f l ö s u n g d e r Celloidinschicht d a d u r c h v e r m i e d e n w e r d e n , d a ß m a n sie n i c h t in Ä t h y l a l k o h o l , s o n d e r n in Isop r o p y l a l k o h o l (§ 832), C a r b o l x y l o l (s. § 831) o d e r T e r p i n e o l (s. § 833) e n t w ä s s e r t .

3'

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Das lebende Präparat

§ 146—149.

3. KAPITEL

Das lebende Präparat 146. F r i s c h e P r ä p a r a t e , zu deren A n f e r t i g u n g u n d U n t e r s u c h u n g im v o r a u s g e h e n d e n K a p i t e l angeleitet w u r d e , sind sehr häufig nicht m e h r als l e b e n d zu b e t r a c h t e n . Zu dieser Bezeichnung berechtigt am isolierten P r ä p a r a t erst die Feststellung charakteristischer L e b e n s ä u ß e r u n g e n w i e Assimilation, Selbstbewegung, Selbstteilung u n d insbesondere von e c h t e m Wachstum. K l e i n e selbständige Lebewesen wie Protozoen, zahlreiche Wirbellose, zumal auf f r ü h e n E n t w i c k l u n g s s t u f e n , lassen sich o h n e Schwierigkeit in kleinen Gefäßen, M i k r o a q u a r i e n u. dgl. u n t e r das Mikroskop b r i n g e n und, soweit es i h r e D u r c h sichtigkeit gestattet, o h n e besondere A p p a r a t u r in i h r e n L e b e n s ä u ß e r u n g e n beobachten. Wesentliche Schwierigkeiten stellen sich dagegen der U n t e r s u c h u n g der lebenden Zelle u n d des lebenden Gewebes entgegen, sobald es sich u m große, undurchsichtige O r g a n e u n d u m die A n w e n d u n g s t a r k e r V e r g r ö ß e r u n g e n h a n delt. A b e r a u c h h i e r w u r d e n besonders in den letzten zwei J a h r z e h n t e n durch d e n Ausbau der Methodik b e d e u t s a m e F o r t s c h r i t t e erzielt, w e n n auch d a r ü b e r n i c h t vergessen w e r d e n darf, daß die mikroskopische U n t e r s u c h u n g lebender O r g a n e bei einzelnen, d a f ü r besonders geeigneten T i e r e n schon seit langem b e k a n n t u n d möglich ist u n d n u r durch die V o r h e r r s c h a f t der F i x i e r u n g s - u n d F ä r b e t e c h n i k zeitweise in den H i n t e r g r u n d g e d r ä n g t w u r d e . 147. Als Beispiel eines Untersuchungsobjektes, das seit langem zur Beobachtung lebender Gewebe dient, sei der Frosch genannt, bei dem sich in narkotisiertem Zustand zahlreiche Organe wie Lunge, Mesenterium, Zunge, Haut, Pigmentgewebe, Nerven usw. selbst bei starker Vergrößerung beobachten lassen. An der ausgebreiteten Harnblase können glatte Muskelzellen, Bindegewebe, Epithelien, Blutgefäße in ihren Lebensäußerungen untersucht werden. Aber auch an Säugetieren liegen schon lange einschlägige Beobachtungen vor, wie die Untersuchungen von K ü h n e und L e a (1874) an den sezernierenden Zellen des KaninchenPankreas beweisen (L a n g 1 e y 1879 Parotis). Die Untersuchungen wurden unt"" Verwertung der modernen Hilfsmittel neuerdings wiederaufgenommen H i r s c h , R i e s u. a. 148. Die Methoden zur U n t e r s u c h u n g des lebenden Gewebes lassen sich zwanglos in zwei G r u p p e n scheiden: in solche, die der U n t e r s u c h u n g des lebend e n Gewebes im u n v e r s e h r t e n V e r b ä n d e des O r g a n i s m u s dienen u n d in solche, welche die U n t e r s u c h u n g des d e m K ö r p e r e n t n o m m e n e n lebenden Gewebes zum Ziele haben. 149. Z u r e r s t e n G r u p p e gehören u n t e r a n d e r e m die Methoden zur mikroskopischen B e o b a c h t u n g des Blutkreislaufes, die in i h r e n A n f ä n g e n bis auf L e e u w e n h o e k zurückgehen. Ein eingehende, z u s a m m e n f a s s e n d e Darstell u n g der bei K a l t b l ü t e r n einzuschlagenden Technik findet m a n bei K i e m e n s i e w i c z (21). E i n e a m Menschen allgemein v e r w e n d b a r e Methodik w u r d e von L o m b a r d 1912 in der Beobachtung oberflächlicher B l u t g e f ä ß e des Nagelfalzes g e f u n d e n . M a n bedeckt dazu denselben mit einem großen T r o p f e n eingedickten Zedernholzöles oder Kanadabalsams, legt ein Deckgläschen auf u n d beobachtet bei intensiver, schräg auffallender Beleuchtung (Konzentration der S t r a h l e n d u r c h Sammellinse) bei 60—120facher V e r g r ö ß e r u n g die K a p i l l a r e n u n d kleinen H a u t g e f ä ß e (Blutstrom, Kontraktion, Verlauf der Gefäße, A r t der Schlingenbildung usw.). Eingehende A n g a b e n bei W e i ß 21. D a n k der V e r besserung der technischen Hilfsmittel (Kapillarmikroskop nach O. M ü l l e r )

§ 150—154.

Das lebende Präparat

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gelingt es die Kapillaren des Nagelfalzes, wie auch jeder anderen beliebigen Hautstelle zu beobachten und photographisch darzustellen (vgl. B e t t m a n n 26 und O. M ü 11 e r 37, 39). 150. In diese Gruppe der Untersuchungstechnik gehört auch die Augenmikroskopie mit Hilfe des Hornhautmikroskopes in Verbindung mit der Gullstrandschen Spaltlampe (s. A. V o g t und K o e p p e 21), eine Technik, die dann von V o n w i l l e r auch für die Untersuchung anderer Gewebe ausgebaut wurde. Einen weiteren Fortschritt brachte V o n w i l l e r (25) durch die Anwendung eines verbesserten Opakilluminators (s. auch § 63 ff.), der in geeigneten Fällen auch die Verwendung starker Vergrößerungen (Immersion) zur Beobachtung lebender, an Ort und Stelle belassener Gewebe gestattet. Dies ist besonders dann der Fall, wenn sich unter das zu beobachtende Gewebe künstliche Reflektoren, wie die Spitze einer chirurgischen Nadel, Silberplättchen, öltropfen od. dgl. einschieben lassen. Dadurch glückt es, z. B. an Kernen der lebenden menschlichen Haut, Beobachtungen mit stärkster Vergrößerung auszuführen ( V o n w i l l e r und V a n n o t t i 31). 151. Der Anwendungsbereich der Auf lieh tmikroskopie (s. § 63—65) zur Untersuchung lebender Organe wurde namentlich durch ihre Verbindung mit der Luminiszenzmikroskopie (s. § 68 ff.) erweitert. E l l i n g e r und H i r t (29) injizieren in diesem Sinne dem betäubten Tier in Lymphsack, Unterhautzellgewebe oder Blutbahn fluoreszierenden Farbstoff (Fluoreszein oder Trypaflavin) und legen dann die Oberfläche des zu untersuchenden Organes frei, um den in das Organ eingedrungenen Farbstoff durch auffallende ultraviolette Strahlen zum Eigenleuchten zu bringen. Zur Färbung löst man 1 g Fluoreszeinnatrium bzw. Trypaflavin in 500—1000 ccm Ringerlösung und injiziert je nach der Größe des Tieres 0,2—1 ccm (Frosch) oder 0,5—2 ccm (Ratte) der Lösung. Der Eintritt der Färbung erfolgt schon wenige Minuten nach der Injektion, bei Trypaflavin etwas später als bei Fluoreszein. Die Intensität und Dauer ist abhängig von der Menge der injizierten Farblösung und vor allem von der Blutzirkulation. Fluoreszein färbt im wesentlichen die basischen Zellelemente (Serum, Protoplasma) an, Trypaflavin dagegen die saueren (vor allem Kerne), wobei aber das Bild besonders bei der Trypaflavinfärbung durch die physiologischen Schwankungen in der Reaktion der Gewerbe beeinflußt wird. 152. Während bei all diesen Methoden das beobachtete Gewebe in ungestörter Verbindung mit dem Organismus bleibt, wird es bei der z w e i t e n G r u p p e der Methodik, bei der Explantation oder Gewebezüditung, aus dem Organismus entfernt und, außerhalb desselben und seinem Einfluß entzogen, in einem geeigneten Medium am Leben erhalten. In strengerem Sinne kann man dabei noch zwischen einem überlebenden Präparat und einer eigentlichen Gewebekultur unterscheiden, je nachdem dasselbe eine bloße Fortdauer des Lebens oder aktives Wachstum zeigt. 153. In das Gebiet der Gewebezüchtung greift zum Teil auch die Mikrurgle ein, die in dem hier in Betracht kommenden Teil besonders von S c h o u t e n C h a m b e r s und P é t e r f i durch Ausbildung einer entsprechenden Methodik und Apparatur (microdissection apparatus, Mikromanipulator) gefördert wurde (s. P é t e r f i 24a, b, 26, 28). 154. Die Technik der Gewebezüchtung geht in erster Linie auf H a r r i s o n zurück, der Gewebeteile des Frosches in s t e r i l e r F r o s c h l y m p h e züchtete. B u r r o w s entdeckte dann weiterhin als günstigstes Kulturmedium das B l u t p l a s m a . Seither wurde die Technik der Gewebszüchtung so ins ein-

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Das lebende Präparat

§ 155—157.

zelne ausgebaut, daß sie an dieser Stelle n u r in ihren Grundzügen dargestellt w e r d e n kann. Wegen eingehenderer Angaben verweise ich auf C a r r e 1 (28), L e v i (28), D e m u t h (29), A. F i s c h e r (33), P a r k e r (38), C a r r e l und L i n d b e r g (38) u n d I. F i s c h e r (42). 155. Beim Anlegen von Gewebekulturen ist in erster Linie auf peinlichste Reinlichkeit und Asepsis zu achten. Alle Instrumente, Gläser usw., die beim Anlegen der K u l t u r e n gebraucht werden, müssen keimfrei gemacht werden. Bei nachlässigem Arbeiten w i r d man n u r Mißerfolge haben. V o r A n l e g e n einerKulturdurchdenkemandasGanzebisaufdenkleinsten Handgriff. 156. Vorbereitung. Die R e i n i g u n g der Gläser (Objektträger, Deckgläser, Pipetten, Schalen usw.) erfolgt in der Weise, daß m a n sie eine halbe Stunde lang u n t e r Deckel in starker Kernseifenlösung kocht, dann mit fließendem Wasser seifenfrei spült, in 96°/oigen Alkohol bringt und zuletzt m i t sauberem Tuch abtrocknet. Verunreinigte Gläser w e r d e n vor dieser Behandlung zuerst noch f ü r 24 Stunden in Kalisalpeter-Schwefelsäure gelegt (s. § 126). Als Deckgläschen sind für Gewebekulturen Glimmerplättchen vorzuziehen, da sie gegen die Gewebe indifferenter sind als Glas, das durch Abgabe von Alkali das Wachstum beeinflussen kann (A. F i s c h e r ) . Auf jeden Fall sind Deckgläser, die schon für histologische Zwecke verwendet wurden, für Gewebekulturen unbrauchbar. Empfehlenswerte Größe 24 : 50. Die Aushöhlung des hohlgeschliffenen Objektträgers soll für gewöhnlich einen Durchmesser von 20 mm und eine Tiefe von 2—3 mm haben. Zur Übertragung von Blutplasma, Embryonalextrakt usw. benützt man mit Gummihütchen versehene Pasteurpipetten. Die S t e r i l i s i e r u n g der zur Operation der Tiere benötigten chirurgischen I n s t r u m e n t e erfolgt durch 15 Minuten langes Kochen in l°/oiger Sodalösung. M e s s e r werden nicht gekocht, sondern eine Stunde in 70- bis 90°/oigen Alkohol gelegt und vor Gebrauch mit einer sterilen Kompresse abgetrocknet. N ä h s e i d e , G u m m i h ü t c h e n , G u m m i s t o p f e n werden 15 Minuten in reinem dest. Wasser gekocht. T ü c h e r , K o m p r e s s e n u. dgl. werden eine Stunde lang i m K o c h schen Dampf topf oder V 2 Stunde im Autoklav sterilisiert. Die G l a s w a r e n und die Instrumente f ü r das Anlegen der K u l t u r e n w e r den im Heißluftsterilisator erhitzt. Dabei soll die Temperatur f ü r 30—45 Minuten auf ca. 150° gehalten werden. Dann Gas abdrehen und langsam erkalten lassen. Die Gegenstände werden vorher einzeln in dünnes Packpapier eingewickelt, Deckgläschen und hohlgeschliffene Objektträger können zweckmäßig auch einzeln in Petrischalen gelegt werden. Auch V a s e l i n e und P a r a f f i n ö l werden im Trockensterilisator keimfrei gemacht. Das zur Herstellung von Lösungen verwendete destillierte Wasser m u ß unter V e r w e n d u n g von J e n a e r Glas redestilliert werden. An Stelle des alten Wattebausches ist als keimfreier Verschluß für Reagensgläser und kleine Kulturgefäße die sog. K a p s e n b e r g k a p p e zu empfehlen. Für Steilbrustflaschen, Stehkolben u. dgl. wurde von K n ö 11 eine Verschlußkappe aus Jenaerglas angegeben. Durch beide wird der Gewichtsverlust des Gefäßinhaltes durch Verdunstung auf ein Minimum beschränkt (s. K a p s e n b e r g 40, K n ö l l 41). 157. Zur Gewinnung von Blutplasma eignen sich besonders Hühner, da sich das Blutplasma dieser Tiere bei entsprechender Methodik monatelang ungeronnen a u f b e w a h r e n läßt. Kaninchen- und Meerschweinchenplasma bleibt

§ 158—159.

Gewebekultur

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bestenfalls einige Tage brauchbar, Rattenplasma gerinnt auch bei sorgfältigster Bereitung spätestens nach einigen Stunden (s. auch § 159). Bei der Gewinnung von Blutplasma ist zu beachten, daß es bei Berührung mit nicht paraffinierten oder nicht eingeölten Gegenständen oder bei Verunreinigung mit Gewebesaft gerinnt. Die Tiere sollen am Tage der. Blutentnahme nicht gefüttert werden, da allzu großer Fettreichtum des Plasmas für die Beobachtung der Kultur störend ist. Ferner ist l a n g e dauernde Narkose bei der Gewinnung zu vermeiden, da die Kulturen im Plasma tiefnarkotisierter Tiere schlecht wachsen.

158. E i s p l a s m a m e t h o d e . 1. Man legt in Narkose unter strenger Asepsis die rechte oder linke Art. carotis com. frei und isoliert sie auf 2—3 cm Länge. — 2. Abklemmen der Carotis mit weicher Arterienklemme möglichst weit herzwärts. — 3. Unterbinden der Carotis möglichst weit kopfwärts. — 4. Anlegen einer offenen Ligaturschlinge am isolierten Gefäß. — 5. Abtupfen der Region und Einfetten der Arterie mit sterilem Paraffinöl. — 6. Schräger Einschnitt in die Gefäßwandung mit feiner Schere, Festhalten des Zipfels der Wandung mit feiner Pinzette und Einschieben einer mit sterilem Paraffinöl eingeölten Blutentnahmekanüle. Festbinden derselben mittels der vorbereiteten Ligatur. — 7. Öffnen der Klemme und Auffangen des ausfließenden Blutes (die ersten Tropfen werden verworfen) in sterilen, paraffinierten, eisgekühlten Zentrifugenröhrchen, die nach Bedecken mit Glaskappe oder sterilem Stopfen sofort 15 Minuten lang bei 3000—3500 Umdrehungen zentrifugiert werden. — 8. Abfüllen des so gewonnenen, klaren, gelblich gefärbten Blutplasmas mit steriler paraffinierter Pipette in ebensolche Röhrchen. Aufbewahren im Eisschrank. 159. H e p a r i n p l a s m a m e t h o d e nach C r a c i u n. Die Methode bedeutet eine sehr wesentliche Vereinfachung und Verbesserung der Blutplasmagewinnung. Sie beruht auf der Feststellung, daß die Gerinnung des Blutes durch Zusatz von H e p a r i n , eines aus der Leber gewonnenen Eiweißabbauproduktes, auf Woehen und Monate hinaus verhindert werden kann. Man bereitet eine 0,l°/oige Lösung in 0,85°/oiger NaCl-Lösung. Dieselbe kann im Autoklaven sterilisiert werden. Über die Gewinnung des H e p a r i n s , das jetzt im Handel erhältlich ist, s. H o w e l l und H o l t (18).

Zur A u s f ü h r u n g nimmt man mit einer eisgekühlten Lüerspritze 0,5 bis 1 ccm der Heparinlösung auf, zieht (aus der Bauchaorta oder aus dem Herzen) 15—20 ccm Blut nach und sprizt das Ganze in ein gekühltes Zentrifugengläschen, das man noch 2—3 Minuten lang im Eis stehen läßt. Eine rasche Blutentnahme und gute Durchmischung gelingt am besten mit kurzen, ziemlich starken Nadeln. — Statt dessen kann man das Blut aus der nach § 158 freigelegten Carotis auch direkt in das mit Heparinlösung beschickte, gekühlte Zentrifugenröhrchen spritzen lassen. Das gefüllte Zentrifugenröhrchen wird 15 Minuten lang bei 3000—3500 Umdrehungen zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wird in 1 ccm Glasampullen (Jenaer Glas) abpipettiert. Die zugeschmolzenen Ampullen werden an einem kühlen Ort aufbewahrt. Paraffinieren, Ölen, Einfetten von Kanüllen und Gefäßen usw. kommt bei dieser Methode völlig in Wegfall. Durch die Heparinplasmamethode sind die älteren Verfahren, bei welchen die Gerinnung des Blutes durch Zusatz von oxalsaurem Natrium hintangehalten wurde, überholt.

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Das lebende Präparat

§ 160—163.

160. G e w i n n u n g v o n F r o s c h l y m p h e . Man hängt einen narkotisierten Frosch mit dem Kopf nach unten an den ausgestreckten Hinterbeinen auf. Die Lymphe sammelt sich dann nach einiger Zeit in dem großen Rückenlymphsack an, den man oben, d. h. in Beckenhöhe durch einen winkelförmigen Hautschnitt mit der Schere eröffnet. Hebt man sodann den Hautzipfel mit einer Pinzette ab, so kann man mit Leichtigkeit, ohne anzustreifen, eine sterile paraffinierte Pipette einführen und Lymphe herausholen. 161. Zur Gewinnung von H ä m o l y m p h e v o n Schmetterlingsp u p p e n legt man dieselben kurze Zeit in 90°/oigen Alkohol und eröffnet die Leibeshöhle durch einen dorsalen Medianschnitt. ( G o l d s c h m i d t 16.) Angaben über die Gewinnung weiterer Kulturmedien für Wirbellose s. K r ö n t o w s k i 23, ferner I. F i s c h e r (42). 162. Anlegen einer Deckglaskultur. 1. Das zu züchtende, dem Spender steril und frisch entnommene Gewebe wird mit einem scharfen Starmesser (Gräfes Linearmesser) auf einer sterilen Glasunterlage in kleine Stückchen von 0,3 bis 0,4 mm Dicke und 1—2 mm Seite zerschnitten. Am besten gibt man den Stückchen mit vier Schnitten eine viereckige Form. Die Schnittflächen müssen möglichst glatt sein. Quetschen oder Zupfen ist peinlich zu vermeiden. Dann werden die Stückchen, um ein Eintrocknen zu verhüten, auf der flachen Messerklinge vorerst in einen mit steriler Locke-Lösung gefüllten hohlgeschliffenen Objektträger übertragen. — 2. Auf das zur Züchtung dienende Deckglas wird aus einer senkrecht gehaltenen, mit Gummihütchen versehenen Pasteur-Pipette ein Tropfen Plasma gesetzt und mit dem Starmesser rasch kreisförmig ausgebreitet (Durchmesser etwa 15 mm). — 3. Nun überträgt man eines der vorbereiteten Gewebsstückchen auf flacher Klinge in die Mitte des Plasmastropfens, breitet es glatt aus, setzt einen Tropfen Embryonalextrakt auf und durchmischt rasch mit der Klinge. Nach etwa Va—1 Minute tritt Gerinnung ein. — 4. Unterdessen bestreicht man einen hohlgeschliffenen Objektträger rechts und links vom Ausschliff in etwa 1 cm Entfernung von diesem mit Vaseline (mit sterilem Glasstäbchen) und preßt einen zweiten Hohlschliff ob jektträgen mit seiner nach unten gekehrten Oberfläche auf, so daß sich die Vaselineschicht dünn ausbreitet. Ein so vorbereiteter Objektträger wird dann auf das mit der Kultur versehene Deckgläschen aufgelegt. Nach Gerinnen des Plasmas wird umgedreht und das Deckglas mittels Pinsels noch mit einer geschmolzenen Mischung von Paraffin und Kanadabalsam (100:10) umrandet. Schließlich wird der Objektträger in den Brutschrank (39°) übertragen. Zur Vermeidung von Luftinfektion werden Deckgläser und Objektträger in den Zwischenzeiten stets mit Petrischalendeckeln oder dgl. überdeckt. Bei vergleichenden Untersuchungen ist es wichtig, daß Menge, Ausbreitung und Schichtdicke des Plasmatropfens möglichst übereinstimmen. Das Medium darf den Rand des Ausschliffes nicht berühren. Die Gerinnung des Plasmas darf nicht vor Einbringen des Gewebsstückchens eintreten. Der Zusatz von Embryonalextrakt ist für kürzer dauernde Gewebezüchtung nicht unbedingt notwendig, wohl aber wenn länger dauerndes Wachstum stattfinden 163. Die Lebensdauer von Deckglaskulturen ist, wenn nicht besondere Maßnahmen erfolgen, beschränkt, da sich einerseits der Sauerstoff und Nährstoffgehalt des Kulturmediums erschöpft und andererseits die Zellen des Explantates schädlich wirkende Stoffwechselprodukte abscheiden. Das Leben einer Gewebekultur läßt sich aber, wie C a r r e 1 fand, beliebig verlängern, wenn sie von Zeit zu Zeit durch Auswaschen von schädlichen Stoffwechselprodukten befreit und in frisches Nährmaterial übertragen wird.

§ 164—168.

Gewebekultur

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Der Zeitpunkt, zu dem die Übertragung in ein neues Medium nötig ist, wird in erster Linie durch die Temperatur bestimmt. Kulturen von S ä u g e t i e r g e w e b e , die bei der optimalen Temperatur von 39° C gezüchtet werden, zeigen schon am 3. Tag Degenerationserscheinungen. Sie müssen daher jeden 2. oder 3. Tag in neues Plasma übertragen werden. Bei 20° C (Zimmertemperatur) sind die Stoffwechselvorogänge dagegen so verlangsamt, daß das Überpflanzen der Kultur auch bei Säugetiergewebe erst nach 2—3 Wochen nötig ist, eine Feststellung, die f ü i die Haltung von Gewebsstämmen von größter praktischer Bedeutung ist. Nach den Untersuchungen von A. F i s c h e r verfährt man dabei am besten in der Weise, daß man die neueingesetzte Kultur für 24 Stunden bei 39° C hält und dann bei Zimmertemperatur im Dunkel aufbewahrt. Nach 2—3 Wochen wird umgesetzt, wieder für 24 Stunden in den Wärmeschrank gebracht uswl Von Zeit zu Zeit müssen einige Pcissagen bei Körpertemperatur eingeschoben werden. 164. G e w e b e k u l t u r e n v o n K a l t b l ü t e r n werden bei Zimmertemperatur gehalten. C h 1 o p i n empfiehlt für Axolotl 22—24° C, I. F i s c h e r (42) 12° C. Bei dieser Temperatur bleiben Explantate niederer Wirbeltiere 2 bis 3 Wochen und länger ohne Wechsel des Mediums am Leben (bei 12—14° C nach C h 1 o p i n bis zu 4 Monaten). 165. U m s e t z e n d e r D e c k g l a s k u l t u r . 1. Der Paraffinrand der Deckglaskultur wird umschnitten, das Deckglas mit einer Impflanzette abgehoben und mit der Kultur nach oben auf eine sterile schwarze Unterlage gelegt. — 2. Das Gewebestückchen wird innerhalb seiner neuen Wachstumszone mit einem scharfen Messer mit vier sich rechtwinklig, kreuzenden Schnitten herausgeschnitten. Die Begrenzungsschnitte sollen dabei so gelegt werden, daß sie möglichst viel von der neuen Wachstumszone einschließen, ohne daß dabei schlecht oder nicht durchwachsenes Plasma mitgenommen wird. Meist ist eine Teilung der Kultur nötig; dann zuerst Teilungsschnitte, dann Begrenzungsschnitte. — 3. Die Stückchen werden auf der Klinge für 3/4—1 Minute in sterile Locke-Lösung übertragen. — 4. Der weitere Vorgang vollzieht sich wie in § 162, 2—4. 166. Den günstigsten Nährboden bildet Blutplasma vom gleichen Tier oder der gleichen Tierart (autogenes oder homogenes Blutplasma), zumal nach Zusatz von Embryonalextrakt. Doch zeigte sich, daß die Züchtung auch in heterogenem Blutplasma gelingt. So lassen sich, wenn auch mit etwas vermindertem Wachstum, Organstückchen sämtlicher Wirbeltierklassen in verdünntem Kaninchenblutplasma züchten (C h 1 o p i n 25). Für Gewebe niederer Wirbeltiere wird dasselbe zur Beseitigung der Hypertonie mit dem gleichen Volumen sterilen dest. Wassers verdünnt. Die günstige Wirkung des Embryonalextraktes ist artunspezifisch. 167. Kulturen in unverdünntem Plasma lassen sich nur schlecht färben. Wenn eine spätere Fixierung und Färbung der Kultur beabsichtigt ist, so empfiehlt es sich daher den Nährboden mit Tyrodelösung so zu verdünnen, daß er nur 10 bis höchstens 200/o Plasma enthält (K. B a u e r ) . 168. Zur Herstellung des E m b r y o n a l e x t r a k t e s werden 8—10 Tage lang bebrütete, steril entnommene Hühnerembryonen in der Reibschale oder besser mit einem von A. F i s c h e r (25) angegebenen einfachen Apparat zerquetscht. Der Brei wird sofort in engen Röhrchen 15 Minuten zentrifugiert, der so erhaltene klare Extrakt in sterile Röhrchen abpipettiert und im Eisschrank aufgehoben. Er bleibt etwa 8 Tage lang verwendbar.

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Das lebende P r ä p a r a t

§ 169—174.

169. F ü r k u r z d a u e r n d e U n t e r s u c h u n g e n a n G e w e b e k u l t u r e n ist e i n v o n K. B a u e r (36) a n g e g e b e n e s v e r e i n f a c h t e s V e r f a h r e n g e e i g n e t , das k e i n e b e s o n d e r e A p p a r a t u r e r f o r d e r t u n d daher auch f ü r A n f ä n g e r l e i c h t a u s z u f ü h r e n ist. D a s G e w e b e s t ü c k c h e n w i r d dabei auf e i n e m D e c k g l a s i n e i n e n T r o p f e n e i n e s Mediums eingelegt, das aus gleichen Teilen Hämostix, Embryonalextrakt und T y r o d e l ö s u n g b e r e i t e t w i r d . D a s D e c k g l a s k o m m t d a n n auf e i n e n M e t a l l r i n g n a c h W. H. L e w i s , der s e i n e r s e i t s e i n e m O b j e k t t r ä g e r a u f l i e g t . D i e K u l t u r e n l a s s e n sich o h n e U m s e t z e n b i s z u 4 T a g e n a m L e b e n e r h a l t e n . Der M e t a l l z y l i n d e r besitzt eine H ö h e von 3—4 m m u n d eine lichte Weite von 20 m m ; e r ist oben u n d u n t e n plan geschliffen. Deckglas, O b j e k t t r ä g e r u n d M e tallring k ö n n e n ü b e r der F l a m m e sterilisiert werdeni Die A b d i c h t u n g zwischen den einzelnen T e i l e n s t ü c k e n erfolgt d u r c h e t w a s sterile Vaseline. H ä m o s t i x ist ein von d e r Deutschen Gesellschaft f ü r P h a r m a z i e u n d K o s m e t i k steril in A m p u l l e n geliefertes P f e r d e s e r u m . H e r s t e l l u n g des E m b r y o n a l e x t r a k t e s s. § 168. 170. A u c h künstliche Nährböden w u r d e n verschiedentlich b e n ü t z t ; sie geben j e doch, w e n i g s t e n s bis jetzt, weniger günstige R e s u l t a t e als B l u t p l a s m a oder L y m phe, insbesondere ist die L e b e n s d a u e r dieser K u l t u r e n b e s c h r ä n k t . F ü r cytologische U n t e r s u c h u n g e n bieten sie a b e r d a n k i h r e r e i n f a c h e n Herstellung, i h r e r D u r c h sichtigkeit u n d der A b w e s e n h e i t v o n F i b r i n g e r i n n s e l u n t e r U m s t ä n d e n Vorteile. C a r r e l gibt u. a. folgendes Medium a n : NaCl 0,9; CaCl 2 0,084; KCl 0,042; Glukose 0,1; A g a r 3; destilliertes Wasser 100,0. W. H. u n d M. R. L e w i s b e n ü t z e n als K u l t u r m e d i u m L o c k e sehe Lösung (s. § 122), d e r sie auf 100 ccm 15 emm H ü h n e r b o u i l l o n u n d 0,5 g Glukose zusetzen. Bei A n l e g e n einer K u l t u r m u ß bei nicht g e r i n n e n d e n , flüssigen I n t e r m e d i e n der F l ü s s i g k e i t s t r o p f e n m i t einer Glasnadel in d ü n n e r Schicht ü b e r die Mitte des Deckglases a u s g e b r e i t e t w e r d e n . A n g a b e n ü b e r v i t a m i n - u n d hormonhaltige k ü n s t l i c h e K u l t u r m e d i e n bei B a k e r (36), sowie B a k e r u n d C a r r e l (39). 171. U m e i n e n W e c h s e l d e r N ä h r f l ü s s i g k e i t u s w . o h n e eine Ü b e r t r a g u n g des E x p l a n t a t e s zu ermöglichen, w u r d e n eigene A p p a r a t e k o n s t r u i e r t ( B u r r o w s 12. R o m e i s 12). Dieselben sind ü b e r h o l t d u r c h die n e u e n G e w e b e k u l t u r - F l a s c h e n von C a r r e l , in d e n e n G e w e b e k u l t u r e n j a h r e l a n g ohne Wechsel d e r F l a s c h e a m Leben e r h a l t e n w e r d e n k ö n n e n . F ü r L e b e n d b e o b a c h t u n g u n d E i n z e l k u l t u r e n k o m m t h a u p t s ä c h l i c h d e r T y p D 3,5 in F r a g e . I m T y p H 8 lassen sich 70—100 G e w e b s f r a g m e n t e auf einmal e x p l a n t i e r e n . D i e a m Boden d e r F l a s c h e angelegte K u l t u r w i r d m i t e i n e m flüssigen M e d i u m ü b e r schichtet, das die Stoffwechselprodukte a u f n i m m t u n d in l ä n g e r e n Z e i t a b s t ä n d e n gewechselt w i r d . 172. K u l t u r e n in C a r r e l - F l a s c h e n sind n a m e n t l i c h auch f ü r U n t e r s u c h u n g e n ü b e r das A u f t r e t e n von D i f f e r e n z i e r u n g s p r o d u k t e n in G e w e b e k u l t u r e n w i e z. B. Bild u n g von B i n d e g e w e b s f a s e r n , N e r v e n f a s e r n usw. von g r o ß e m Vorteil, da dabei die bei der M e t h o d e des Umsetzens s t a t t f i n d e n d e Verletzung des w a c h s e n d e n Gewebes v e r m i e d e n w i r d . U m K u l t u r e n ohne Z e r b r e c h e n der Flasche fixieren u n d f ä r b e n zu k ö n n e n , f ü h r t m a n auf den Boden der D 3,5-Flasche e i n schmales, e t w a 4 m m b r e i t e s G l i m m e r p l ä t t c h e n ein u n d setzt d i e K u l t u r d a n n auf diesem P l ä t t c h e n an. A m E n d e des Versuches k a n n m a n d a n n dasselbe leicht a u s der F l a s c h e h e r a u s h o l e n u n d in toto mit der K u l t u r in die Fixierungsflüssigkeit ü b e r t r a g e n . 173. Ü b e r die L i n d b e r g s c h e D u r c h s t r ö m u n g s f l a s c h e siehe K. B a u e r (39). Über die Technik der O r g a n e x p l a n t a t i o n s. C a r r e l u n d L i n d b e r g h (38), 174. B e i der V i t a l f ä r b u n g v o n G e w e b e k u l t u r e n u n t e r s c h e i d e t L e v i (28) z w i s c h e n F a r b s t o f f e n , die die Z e l l e n nach k u r z e r Zeit s c h ä d i g e n ( w i e J a n u s g r ü n , J a n u s s c h w a r z , Neutralrot) u n d solchen, die u n s c h ä d l i c h sind (z. B. P y r r o l b l a u , T r y p a n b l a u , Trypanrot, L i t h i o n k a r m i n ) . B e i e r s t e r e n läßt m a n die K u l t u r z u n ä c h s t sich i n ü b l i c h e r W e i s e e n t w i c k e l n . Erst a m 2. oder 3. T a g n i m m t

§ 175—178.

Gewebekultur

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m a n das Deckglas vom Objektträger und f ä r b t einige Minuten in Janusschwarz (1:20 000 in Locke-Lösung). Dann wird in reiner, w a r m e r Locke-Lösung abgespült, wieder montiert und untersucht. Ebenso v e r f ä h r t m a n mit Neutralrot od. dgl. (M. und W. L e w i s ) . Bei der zweiten G r u p p e setzt L e v i den Farbstoff dem zur K u l t u r dienenden Plasma zu, z. B. 2—3 Tropfen einer konzentrierten Trypanblaulösung auf 2 bis 3 ccm Plasma. Die wachsenden Zellen nehmen dann den Farbstoff aus dem Plasma auf. 175. Um Gewebekulturen unter dem Mikroskop bei erhöhter T e m p e r a t u r ohne A b k ü h l u n g beobachten zu können, w u r d e n verschiedene Vorrichtungen" konstruiert. Das Prinzip der einen b e r u h t darauf, daß das ganze Mikroskop in einen mit Armlöchern versehenen Wärmekasten gestellt wird, der mittels eines Thermoregulators auf konstanter T e m p e r a t u r gehalten wird. Derartige Kästen werden v o n Z e i s s , L a u t e n s c h l ä g e r , L e i t z u. a. geliefert. Bei den anderen Konstruktionen erfolgt die E r w ä r m u n g der P r ä p a r a t e durch den mit w a r m e m Wasser oder Elektrizität geheizten Objekttisch. Ein automatisch regulierender elektrischer Heiztisch wird von E. Leitz (Wetzlar) geliefert. Beschrieben bei W. J. S c h m i d t (24). Sehr empfehlenswert ist ferner die von P e t e r f i (27) konstruierte »heizbare feuchte Kammer«, die auf den Objekttisch aufgesetzt wird. Über die Selbstherstellung eines einfachen Mikroskopheizkastens s. L a u c h e (23). 176. Zur Fixierung von Kulturen können im Prinzip alle auch sonst gebräuchlichen Flüssigkeiten v e r w e n d e t werden, doch sind alkoholische Gemische im allgemeinen weniger geeignet, da sie im Plasma meist starke Gerinnselbildungen h e r v o r r u f e n (s. auch § 167). Am einfachsten läßt man die Deckgläser mit der K u l t u r nach u n t e n auf der Fixierungsflüssigkeit schwimmen. Gute Erfolge, besonders f ü r Übersichtsbilder, gibt Fixierung nach B o u i n § 305, H e 11 y § 337 oder H e i d e n h a i n § 344 (»Susa«). Dauer 10—15 Minuten. Bei m e h r stündiger E i n w i r k u n g leidet bei H e 11 y die F ä r b b a r k e i t der Kerne. K. B a u e r empfiehlt F i x i e r u n g in der sog. »grünen Lösung« von H e l d (s. § 240), in der das P l a s m a klar und transparent bleibt. Dauer 1—24 Stunden (s. auch § 184). Die F o r m d e r Zellen wird auch sehr gut durch kurze Räucherung mit Osmiumt e t r o x y d d ä m p f e n (1—2 Min.) fixiert (vgl. auch § 285). 177. F ü r cytologische Untersuchungen ist besonders Fixierung im M a x i m o w s c h e n Gemisch zu empfehlen (Zenkerstammlösung 10 ccm, Formol 1 ccm, 2°/oige Osmiumsäure 1 ccm, ev. auch ohne Osmiumzusatz), das nach L e v i die Zellen der Gewebekulturen am lebensähnlichsten fixiert. 3—4 ccm Gemisch reichen f ü r fünf Kulturen. Ausführung: 1. Abspülen durch Schwimmenlassen des Deckgläschens (Kultur nach unten) auf warmer Locke-Lösung 1—2 Min. — 2. Fixierung in Maximow 3—6 Min. durch Schwimmenlassen in geschlossenem Gläschen. — 3. 5°/oige Kaliumbichromatlösung 10 Min. — 4. Auswaschen in fließendem Wasser 15—20 Min. 5. Lugolsche Lösung bis Sublimatniederschläge entfernt. — 6. 0,5°/oige Fixiernatronlösung 1 Min. — 7. Auswaschen in fließendem Wasser 5 Min. — 8. l°/oige Kaliumpermanganatlösung 1 Min. — 9. Abspülen in dest. Wasser. — 10. 4°/oige Oxalsäure 1 Min. — 11. Auswaschen in fließendem Wasser 10 Min. — Färbung s. § 183 ff. 178. Mit Janusschwarz oder dgl. vital gefärbte Kulturen (s. § 174) können nach W. und M. L e w i s durch Joddämpfe fixiert werden. Man erwärmt dazu ein Gläschen, auf dessen Boden ein Jodkristall liegt, über einem Mikrobrenner, bis Joddämpfe aufsteigen und bedeckt es dann für einige Sekunden mit dem die Kultur tragenden Deckgläschen. Sobald das Gewebe gelblich-braun wird, muß

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Das lebende Präparat

§ 179—185.

unterbrochen werden, da sonst die Färbung abblaßt. Ohne Auswaschen Einschluß in Gummisyrup. Die Fixierung von Gewebe und Färbung ist gut, verblaßt aber schon nach 24 Stunden. 179. D ü n n e P l a s m a k u l t u r e n oder Übersichtspräparate können in toto g e f ä r b t und eingeschlossen werden. Die dicken zentralen Stücke w e r d e n dabei, zweckmäßig meist entfernt. Dickere P l a s m a k u l t u r e n müssen dagegen g e w ö h n lich eingebettet u n d in Schnittserien zerlegt werden. Man läßt in diesem F a l l e die fixierte K u l t u r bis z u m 960/oigen Alkohol auf dem Deckglas u n d löst sie erst d a n n mit einer scharfen Rasierklinge von der Glasoberfläche ab. Dann abs. Alkohol und Einbetten in Celloidin § 450 f. oder in MethylbenzoatcelloidinP a r a f f i n nach Peterfi § 392. 180. Die Schnittpräparate können mit den meisten der sonst üblichen Methoden g e f ä r b t werden. Bei Totalpräparaten sind dagegen Methoden auszuwählen, bei denen sich das Plasma möglichst wenig mitfärbt, z. B. F ä r b u n g mit H ä m alaun, sehr v e r d ü n n t e m Delafieldschem Hämatoxylin (protrahiert) oder m i t Löfflerschem Methylenblau (s. auch § 182). 181. A. F i s c h e r (27) empfiehlt unter a n d e r e m folgende Methode: 1. F i x i r u n g in 2°/oiger Formol-Ringerlösung, 1 Stunde. — 2. Brunnenwasser, 3 S t u n den. — 3. Dest. Wasser, 5 Minuten. — 4. Deckglas m i t alkalischer Löffler-Methylenblaulösung (s. § 182) übergießen und ü b e r einer kleinen Flamme bis zum Aufsteigen von D ä m p f e n erwärmen, dann erkalten lassen; nach e t w a 15 Minuten F a r b e abgießen. — 5. Waschen mit Wasser m i t einer Pasteurpipette. — 6. 50-, 70-, 960/oiger Alkohol je 1 Minute. — 7. Aceton-Xylolmischung (5-, 30-, 70°/oiges Xylol) je 2 Minuten. — 8. Reines Xylol, Balsam. Ein Vorzug dieser F ä r b u n g ist, daß bei ihr das Plasmagerinnsel bei der Differenzierung rascher e n t f ä r b t wird als die Kerne. 182. Zur Herstellung der Löfflersdien Methylenblaulösung f ü g t m a n zu 30 ccm einer gesättigten, alkoholischen Methylenblaulösung 100 ccm einer 0,01°/oigen Kalilauge. Die Lösung m u ß 1 Monat im B r u t s c h r a n k reifen (Bildung von M e t h y lenazur). Zur Bereitung der Methylenblaulösung nimmt man 0,2 g des Farbstoffes auf 100 ccm 96°/oigen Alkohols. 183. Die nach § 177 fixierten Kulturen lassen sich als Ganz- wie Schnittpräparate sehr gut mit Heidenhainschen Eisenhämatoxylin § 672 färben (Beizung in Eisenalaun 6 Stunden, Färbung in Hämatoxylin 3—4 Stunden, dann differenzieren in Eisenalaun, wobei sich das Plasma stark entfärbt. 184. K. B a u e r (32) färbt die nach§ 240 fixierten Kulturen nach Beizung in Eisenchlorid 24 Stunden mit verdünntem Heldschen Molybdänhämatoxylin (1 : 20; s. § 1875); dann differenzieren in Ferrocyankaliumboraxlösung (§ 1822, 7) oder in l°/oiger Eisenchloridlösung. 185. Zur Darstellung der R e t i k u l u m f a s e r n imprägniert M c K i n n e y (29) (nach Fixierung in Zenker-Formol) Deckglaskulturen nach der von F o o t und M e n a r d modifizierten Bielschowskymethode. Man läßt dabei die K u l t u r auf den Lösungen schwimmen, wozu man die Oberseite des Deckgläschens mit etwas Vaseline versieht. A u s f ü h r u n g : 1. 0,25°/oige Kaliumpermanganatlösung 5 Min. — 2. Auswaschen in dest. Wasser. — 3. 50/oige Oxalsäurelösung 10 Min. — 4. Auswaschen in dest. Wasser. — 5. Silberdiaminocarbonatlösung (Herstellung nach § 1536a) 20 Min. bei 50° C. — 6. Waschen in dest. Wasser und reduzieren in 20 0/ oigem neutralem Formol 2 Min.; gut auswaschen in Brunnenwasser. — 7. 0,2°/oige Goldchloridlösung 2 Min. — 8. Auswaschen; fixieren in 5 0/ oiger Fixiernatronlösung 2 Min. — 9. Gut auswaschen in dest. Wasser, E n t f e r n u n g der Vaseline, Alkoholreihe, Xylol, Balsam.

§ 186—189.

Fixierung

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S c h'n i 11 e von Kulturen können zur gleichzeitigen Darstellung von retikulären und kollagenen Fasern zuerst nach F o o t und daran anschließend mit Azan § 1489 gefärbt werden.

186. Für elektive Darstellung der N e u r o f i b r i l l e n in Gewebekulturen empfiehlt E s a k i (29): 1. Fixieren in 950/oigem Alkohol 230 ccm, Chloralhydrat 10 g, dest. Wasser 70 ccm; auf 100 ccm dieser Flüssigkeit werden unmittelbar vor Gebrauch 2—3 Tropfen einer 2°/oigen Silbernitratlösung gesetzt. Auf ihr läßt 'man die Kulturen, nachdem man sie vorher mit der silberfreien Lösung abgespült hat, 1—2 Stunden schwimmen. — 2. Ohne Abspülen direkt in abs. Alkohol, dem auf 100 ccm 2—4 Tropfen Liqu. ammon. caust. zugefügt sind: 18—36 Stunden. — 3. 75°/oiger Alkohol 3—5 Minuten (nicht länger), dann einige Minuten auswaschen in dest. Wasser. — 4. Imprägnieren in 2°'oiger Silberniratlösung bei 39° C für 12—28 Tage. Die Dauer der Imprägnierung steht in gewisser Abhängigkeit von der Dauer der Fixierung in 1. und 2. Kürzer fixiertes Material erfordert kürzere Imprägnierung und umgekehrt.

5. Abspülen in dest. Wasser (nur einige Sekunden!) und reduzieren in Pyrogallussäure 1 g, dest. Wasser 90 ccm, Formol 10 ccm. — 6. Abpinseln des an der Oberfläche haftenden Niederschlages mit einem weichen Pinsel unter Wasser und waschen in fließendem Wasser V2 Stunde. — 75-, 95- und 100°/oiger Alkohol, Xylol, Kanadabalsam. — Ergebnis: Neurofibrillen tiefschwarz, Chromatin, Nucleoli braun, Protoplasma ungefärbt oder hell-gelblich. 4. KAPITEL

Die Fixierung histologischer Präparate A. Allgemeines über die Fixierung 187. Da sich lebendes Gewebe nach der Entnahme aus dem Organismus sehr bald stark verändert, so ist es eine Hauptaufgabe der Mikrotechnik, diese postmortalen Vorgänge hintanzuhalten und die Struktur der Gewebe in einem dem anfänglichen Zustand möglichst getreuen Abbild festzuhalten, zu fixieren. Man bedient sich dazu in den meisten Fällen der Einwirkung bestimmter Lösungen, die als Fixierungsflüssigkeifen bezeichnet werden. Dem Anfänger wird empfohlen, möglichst lebensfrisch entnommene Organteile von etwa 5 mm Seitenlänge (oder kleiner) auf einer Watte- oder Filtrierpapierunterlage für 24 Stunden in Formol (§ 264), Formol-Alkohol (§ 228) oder Bouinsche Lösung (§ 305) einzulegen und dann in der dort angegebenen Weise weiterzubehandeln. 188. Die Fixierung bewirkt oft auch eine H ä r t u n g des Gewebes, die besonders dann von Bedeutung ist, wenn uneingebettetes Material mit dem Rasiermesser geschnitten werden ¿oll. Fixierung ist jedovh nicht identisch mit Härtung. Dies geht schon daraus hervor, daß es Flüssigkeiten gibt, die das Gewebe fixieren, ohne es gleichzeitig zu härten (s. z. B . ^ 349). 189. Der scheinbar so einfache Prozeß der Fixierung stellt in Wirklichkeit einen sehr komplexen Vorgang dar, dessen Wesen bis jetzt nur zum kleinen Teil geklärt ist. Einzelne der in Betracht kommenden Faktoren seien nachfolgend etwas näher besprochen.

Eine zusammenfassende Darstellung der physikochemischen Grundlagen findet man bei Z e i g e r (38). Als methodisch wichtig seien die Arbeiten von W e r n e r (34—37) und S e k i (37) hervorgehoben.

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Fixierung

§ 190—191.

W e r n e r benützte als Testobjekt f ü r seine histologisch-technischen Untersuchungen das Innenohr des Meerschweinchens; aus seinen Arbeiten geht hervor, daß dieses Organ dazu wegen seiner mannigfaltigen Zusammensetzung ganz besonders geeignet ist. 190. Bei der B e t r a c h t u n g fixierter P r ä p a r a t e h a t m a n sich stets vor A u g e n zu halten, daß e t w a 80% der lebenden Substanz aus Wasser, 120/o aus Eiweißk ö r p e r n u n d 70/o aus F e t t e n und f e t t ä h n l i c h e n Stoffen bestehen u n d daß sich der größte Teil dieser Trockensubstanz z u r Zeit des Lebens in gelöstem Z u s t a n d vorfindet. Der Vorgang der Fixierung m u ß also auch bei bester Technik notg e d r u n g e n m i t einer m e h r oder weniger eingreifenden Z u s t a n d s ä n d e r u n g v e r k n ü p f t sein. Allerdings w e r d e n dabei nicht alle B a u e l e m e n t e des O r g a n i s m u s in gleichem Maße v e r ä n d e r t . Man k a n n in dieser Hinsicht mit Z e i g e r (38) zwischen fixations s t a b i l e n und fixations l a b i l e n S t r u k t u r e n unterscheiden. Der Unterschied sei am Beispiel der Leber etwas näher dargelegt. Bei geeigneter Fixierung wird man hier wie in anderen Organen zahlreiche Bauelemente im Schnittbild so antreffen, wie es dem intravitalen Zustand entspricht: Die Anordnung der Drüsenzellen, das Verhalten des kollagenen und retikulären Fasergewebes, die Bauart und Anordnung der Blutgefäße, der Verlauf der Gallengänge und Gallenkapillaren, die Verteilung der Nervenfasern, die Anordnung der Kupfferschen Sternzellen, ja selbst die Verteilung der Pigment- und tropfigen Fettstoffe werden in einer dem lebenden Zustand gleichenden Weise erhalten bleiben. Die Schwierigkeiten beginnen erst, sobald wir uns feineren zytologischen Strukturen zuwenden. Aber auch hier bieten noch eine Reihe von Formelementen günstige Bedingungen: so können die Mitochondrien bei Befolgen einer geeigneten Methodik ohne Frage in lebensähnlicher Form fixiert werden: gerade an ihnen läßt sich aber auch zeigen, wie sehr ihre Gestalt wie ihr Erhaltenbleiben durch ungeeignete Fixierungslösungen beeinflußt werden. Andere, im Solzustand vorhandene Zellbestandteile, werden durch den Fixierungsprozeß dagegen eingreifend verändert. So zeigt das Beispiel des Glykogens, daß eine in der Leberzelle intra vitam diffus flüssig verteilte Substanz durch die Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit in eine körnige oder fädige Erscheinungsform übergeführt wird. Trotz dieser Formveränderung lassen sich jedoch aus den fixierten Präparaten über das Verhalten des Glykogens wertvolle Aufschlüsse gewinnen, die auf anderem Wege nicht erreichbar sind. Ähnlich liegen die Verhältnisse hinsichtlich der Struktur des Zytoplasmas, der Kerne usw. Bei allen fixationslabilen S t r u k t u r e n , die im Leben aus reversiblen Gelen, Solen oder deren Zwischenstufen bestehen, h a t m a n sich dessen b e w u ß t zu sein, d a ß sie keine der bisher b e k a n n t e n Flüssigkeiten in dem Zustand zu e r h a l t e n v e r m a g , in w e l c h e m sie sich w ä h r e n d des Lebens befinden. Deshalb ist es nötig, das Fixationsbild stets d u r c h parallel gehende U n t e r s u c h u n g e n am f r i s c h e n und lebenden P r ä p a r a t zu kontrollieren. 191. Viele S t r u k t u r e n entstehen erst w ä h r e n d der Fixation intravital, s u p r a vital oder p o s t m o r t a l an O r t e n die im lebenden Z u s t a n d mikroskopisch homogen erscheinen. Dabei k a n n es sich um m a s k i e r t e S t r u k t u r e n handeln. Das sind Gebilde, die in u n g e f ä h r gleicher F o r m u n d Größe, wie sie das Fixationsbild zeigt, im Leben vorgebildet, i m gewöhnlichen Licht wegen des g e r i n g e n U n t e r schiedes i h r e r Brechungsindizes aber nicht sichtbar sind. Oft genügt eine minim a l e D e h y d r a t i o n (Entquellung), um m a s k i e r t e S t r u k t u r e n sichtbar zu machen. Mit geeigneten Mitteln lassen sich solche Gebilde auch einigermaßen f o r m getreu fixieren. Von i h n e n f ü h r e n fließende Übergänge zu den Fixationsbildern der l a t e n t e n S t r u k t u r e n . Sie sind, so wie sie im P r ä p a r a t erscheinen, d u r c h eine spezifische U l t r a s t r u k t u r des lebenden Zustandes zwar s t r e n g vorausbestimmt, aber

§ 192—194.

Allgemeines

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noch nicht endgültig vorgebildet. Als reversible Strukturen können sie auch im normalen Lebensablauf aus submikroskopischen Inhomogenitäten heraus zeitweise in Erscheinung treten oder experimentell erzeugt werden. Sie sind also Produkte der Mikrotechnik, aber keine Kunstprodukte. Endlich gibt es eine Anzahl von Mikrostrukturen, die im Gefolge der Fixation an homogenen Orten als völlige Nova auftreten. Ihre Gestalt ist zwar auch vom Zustand und der Ultrastruktur der betreffenden Substrate abhängig, aber doch nicht so streng vorausbestimmt, daß nicht die unterschiedliche Fällungswirkung bestimmter Fixationsmittel am gleichen Ort verschiedenartige Strukturen erzeugen könnte. Diese sind die A r t e f a k t e im üblichen Sinne des Wortes. Vielfach vereinigen sie sich mit Stukturen aus den vorgenannten Kategorien zu komplexen Gebilden ( Z e i g e r 38). 192. Es gibt keine Fixierungsflüssigkeit, durch die sich alle Zell- und Gewebebestandteile gleich gut erhalten ließen. Daher ist es bei eingehenden Untersuchungen immer notwendig, mit mehreren Flüssigkeiten zu arbeiten. Wenn eine Flüssigkeit eine Organart gut fixiert, so ist damit noch nicht gesagt, daß sie deshalb auch bei einer anderen den gleichen Erfolg gibt. Die Fixierbark eit kann sich je nach dem physiologischen Zustand der einzelnen Zellen sogar bei den Zellen ein und desselben Gewebes innerhalb e i n e s Tieres verschieden verhalten (vgl. auch v. A p á t h y 10). Jede Flüssigkeit gibt wieder andere Resultate. Der Wunsch nach einer Standardflüssigkeit läßt sich schon infolge der Vielheit der Fragestellungen nicht erfüllen. 193. Das D i f f u s i o n s v e r m ö g e n . Ein wichtiger Faktor ist das Diffusionsvermögen der Fixierungsflüssigkeit, das aber nicht nur von den Komponenten der Flüssigkeit, sondern auch von der strukturellen und funktionellen Beschaffenheit des zu fixierenden Organes abhängt. Bindegewebige Membranen setzen dem Eindringen der Fixierungsflüssigkeit oft beträchtlichen Widerstand entgegen; ist das Organ daher von einer dickeren bindegewebigen Kapsel bedeckt, so wird die Fixierungsflüssigkeit von den Schnittflächen aus gewöhnlich rascher eindringen als von der Organoberfläche her. Durch den Diffusionsstrom der eindringenden Fixierungsflüssigkeiten können oft- beträchtliche Verlagerungen von Strukturteilen (z. B. Kern) wie von Ausfällungen (z. B. Glykogen) veranlaßt werden. Bei langsamem Diffusionsvermögen der Fixierungsflüssigkeit dürfen die Organstücke nur geringe Dicke besitzen, da andernfalls die im Innern gelegenen Zellelemente erst spät erreicht werden und sich vor ihrer Fixierung verändern. Ist die Dicke eines Stückes, wie z. B. bei Membranen, gering, so ist Länge und Breite unwesentlich. Die Stückgröße von Organscheiben kann demnach eine beliebige sein, wenn die kleinste Seite des Stückes eine gewisse im folgenden bei den einzelnen Fixierungsgemischen vermerkte Maximalgröße nicht überschreitet. Da Druckwirkung die Zellstruktur schädigt, ist es bei sehr weichen, schwer schneidbaren Organen oft nötig, zunächst größere Stücke in die Fixierungsflüssigkeit einzulegen und sie erst nach V2—1 Stunde, wenn die Oberfläche angehärtet ist, in kleine Scheiben zu zerschneiden. 194. Die Fixierungsflüssigkeit soll möglichst von allen Seiten her in das Präparat eindringen. Man bedeckt daher den Boden der Gefäße vor dem Einlegen der Organe mit Glaswolle, Filtrierpapier oder Watte oder hängt die Organe an einem Faden oder in Porzellansieben in der oberen Flüssigkeitszone auf. Ganz kleine Fragmente legt man auf ein Stückchen Papier und läßt dieses mit dem Präparat nach unten auf der Flüssigkeit schwimmen. Die Flüssigkeit wird während der Fixierung zweckmäßig von Zeit zu Zeit umgerührt.

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Fixierung

§ 195—199.

195. W o l f (39) hat zur Beschleunigung der Durchtränkung der Objekte bei Fixierung wie Nachbehandlung eine durch Elektromotor betriebene R o t a t i o,n s t r o m m e l angegeben. 196. Das Diffusionsvermögen der in der Fixierungstechnik gebräuchlichsten Substanzen ist sehr verschieden. Platinchlorid, Osmiurfisäure, Pikrinsäure diffundieren nur sehr langsam, andere, wie Trichloressigsäure, Formol, Essigsäure dagegen verhältnismäßig schnell. So zeigt l°/oige Osmiumsäure an Leberstückchen in vier Stunden nur eine Tiefenwirkung von '/a—1 mm, konzentriertes Formol dagegen eine solche von 4—5 mm (Tellyesniczky). Bei der Anwendung von Fixierungsgemischen ist festzustellen, daß die rascher diffundierenden Komponenten den anderen vorauseilen, so daß man in den einzelnen Zonen eines Präparates auch aus diesem Grunde sehr verschiedene Fixierungsbilder erhalten kanii. So wird man z. B. an einem in Chrom-Osmium-Essigsäure fixierten Präparate im Innern hauptsächlich Essigsäurewirkung und nur in den Randzonen die Wirkung der Osmiumsäure beobachten. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Fixierungszonen machen sich vor allem an den feineren Zellstrukturen bemerkbar. Schon verschiedentlich wurde versucht, das Eindringen der Fixierungsflüssigkeiten durch Zusatz rasch diffundierender Substanzen zu beschleunigen. Neuerdings wurde besonders die Zugabe von Harnstoff empfohlen (z. B. von H a n c e 17, als Zusatz zur Flemmungschen Flüssigkeit), vgl. aber § 942. Eine wertvolle tabellarische Zusammenstellung der Diffusionsschnelligkeit verschiedener Fixierungsflüssigkeiten findet man bei T e l l y e s n i c z k y (26). 197. S e k i (37) untersuchte die D i f f u s i o n s g e s c h w i n d i g k e i t einiger n i c h t w ä ß r i g e r F l ü s s i g k e i t e n . Er fand folgende Reihe: Methylalkohol > Äthylalkohol-Eisessig, Äthylalkohol-Eisessig-Chloroform > Äthylalkohol, Azeton > Dioxan > Propylalkohol. Die Geschwindigkeit hängt von Viskosität, Dielektrizitätskonstante, Dipolmoment und evtl. auch von H-Ionenkonzentration ab. 198. Eine wichtige Rolle spielt bei der Fixierung die F ä l l u n g d e r E i w e i ß k ö r p e r , die je nach Art und Zusammensetzung des Fixierungsmittels sehr verschieden ausfällt. A. F i s c h e r (99) untersuchte als erster systematisch in vitro die »Fällungskraft« zahlreicher Fixierungsmittel an verschiedenen Eiweißkörpern. Dabei ist allerdings zu bedenken, daß Modellversuche an Eiweißkörpern nicht ohne weiteres auf lebendes oder totes Organgewebe übertragen werden können, da das kolloidchemische Verhalten der Eiweißkörper im Organismus weitgehend von ihrer Vergesellschaftung mit anderen Stoffen wie Lipoiden, Kohlehydraten und Elektrolyten abhängt ( G r o ß und L o h a u s 32 u. a.). 199. In neuerer Zeit brachten eine Reihe von Arbeiten wertvolle Aufschlüsse über die Wirkung der Fixierungsflüssigkeiten namentlich auf das Strukturbild des Kernes (s. u. a. S t r u g g e r , S c h ö n f e l d , P i s c h i n g e r ; ausführliches Schrifttum bei Z e i g e r 38). P i s c h i n g e r (37), der neben Untersuchungen an Zellkernen auch Modellversuche mit Nukleinsäure und Histonen ausführte, konnte dabei vier Gruppen von Fixantien unterscheiden. Den vitalen Charakter erhielt am besten Osmiumsäure. Alle Essigsäure enthaltenden Gemische erzeugen eine typische Gerüststruktur und Membran des Kernes. Die Nukleinsäure wird dabei entladen, dehydratisiert und unter gleichzeitiger Schrumpfung in Gerüstform ausgeflockt. Die histonreichen Komponenten werden dagegen gelöst. Die Fixierungsflüssigkeit vermag also neben einer fällenden a u c h e i n e l ö s e n d e W i r k u n g auszuüben, der die verschiedenen Gewebskomponenten wie Eiweißkörper, Fette, Lipoide, Kohlehydrate, Salze in wechselndem Ausmaß unterliegen. Das gleiche gilt für die bei der Nachbehandlung gebrauchten Flüssigkeiten.

§ 200—202.

Allgemeines

49

200. Häufig wird das Fixierungsbild nachträglich noch bei der Nachbehandlung durch die fällende Wirkung des Alkohols beeinflußt. Schon v. A p ä t h y betonte, daß keine F i x i e r u n g b e e n d e t i s t , e h e d a s O b j e k t i n 96°/o i g e n A l k o h o l g e b r a c h t w u r d e . Aber auch in den nachfolgenden Flüssigkeiten kam es noch zu Veränderungen kommen. A. F i s c h e r fand, daß Eiweißkörper, die durch Fixierungsmittel mit geringer Fällungskraft nicht gefällt wurden, bei der Nachbehandlung durch Alkohol ausgeflockt wurden. Manche Fixierungsmittel, die wie Osmiumsäure und auch Formol an sich wenig fällungsfähig sind, haben die wertvolle Eigenschaft, die Zellsubstanz so zu verändern, daß die Entstehung von mikroskopisch sichtbaren Gerinnungen, die sonst bei der Nachbehandlung mit Alkohol auftreten, ausbleibt ( M ö n c k e b e r g und B e t h e 99, O. S c h u l t z e 10b). 201. Der Vorgang der Fixierung ist gewöhnlich auch mit einer V o l u m v e r ä n d e r u n g verknüpft, die sich an den einzelnen Bauelementen wie auch an der Gesamtgröße und Geistalt des Präparates bemerkbar macht. Zumeist kommt es zu einer S c h r u m p f u n g , in anderen Fällen zu einer Q u e l l u n g . Das Ausmaß der Veränderung ist je nach Organ, dessen chemisch-physikalischem Zustand und j e nach Fixierungsflüssigkeit verschieden groß. Die Zellen können sich, wie W e r n e r am Innenohr zeigte, sogar innerhalb ein und desselben Organes verschieden verhalten, indem die einen schrumpfen, die andern quellen. Die Schrumpfung kann bei der der Fixierung folgenden Nachbehandlung noch erheblich zunehmen, so daß sie schließlich nach Paraffineinbettung zwischen 2 0 — 4 0 % der ursprünglichen Größe beträgt. Am geringsten ist die Schrumpfung (wenn auch die Nachbehandlung einschließlich Paraffineinbettung mitberücksichtigt wird) bei Verwendung von essigsaurem Formol-Alkohol 1 ) (11%), Bouinscher Flüssigkeit (18,5°/o) und Tellyesniczkyscher Flüssigkeit (19%) (festgestellt von P a t t e n und P h i l p o t t für Schweinsembryonen). Auch nach Fixierung in verdünntem Formol, die zuerst eine Quellung von 5 % bewirkt, kommt es im Laufe der Nachbehandlung zu einer Schrumpfung von 20,5 bzw. 25,5%. Genaue Messungen findet man bei K a i s e r l i n g - G e r m e r 93, T e l l y e s n i c z k y 98, 02, 26, B e r g 03, 07, 08, P a t t e n - P h i l p o t t 21, W. S c h i l l e r 30, G. H e r t w i g 31, W e r n e r 34—37. 202. I s o t o n i e und K o n z e n t r a t i o n der Fixierungsflüssigkeit. Die vorausgehenden Feststellungen über die bei der Nachbehandlung eintretende Schrumpfung lassen die von S j ö b r i n g (00), H. S t ö l t z n e r (06), H ö b e r (14) und anderen Autoren unternommenen Versuche, die Fixierungsflüssigkeit den Geweben zur Vermeidung von Schrumpfung isotonisch zu machen, vom praktischen Standpunkt aus vergeblich erscheinen, es sei denn, daß nach der Fixierung auf Alkoholbehandlung und Einbettung verzichtet wird und die Untersuchung am Gefrierschnitt od. dgl. erfolgt. B e r g , B l u m , T e l l y e s n i c z k y , ' C a r l e t o n , H i r s c h und J a c o b s (26) u. a. halten die Verwendung isotonischer Fixierungsflüssigkeiten für zwecklos. Zu beachten ist ferner, daß totes Gewebe ganz andere osmotische Verhältnisse zeigt wie lebendes (siehe S c h i l l e r 30). In Versuchen von W e r n e r besaßen isotonische Lösungen keine hinreichende Fixationskraft. Bei Durchspülung war mindestens die 2—3fache, beim einfachen Einlegen die 3—4fache Blutkonzentration nötig, um befriedigende Fixierungen zu ergeben. Aber auch unnütz hohe Konzentrationen wia *) Formol 10 ccm, 95°/oiger Alkohol 45 ccm, Eisessig 2 ccm, dest. Wasser 43 ccrri (leider fixiert diese Flüssigkeit aber nicht sehr gut). 4

H ö m e l s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Fixierung

§ 203—206.

z. B. in den Flüssigkeiten von K o l m e r (s. § 241) sind als schädlich zu v e r meiden. Das erstrebenswerte Optimum, das j e nach der Zell- oder Gewebsart u n d den Diffusionsbedingungen verschieden ist und nicht mit der Konzentration der Körpersäfte zusammenfällt, muß z. Z. noch empirisch ermittelt werden. 203. Die H-Ionenkonzentratfon der F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t . Nach Z i r k l e (28—35) bestehen zwischen Fixationsergebnis und aktueller Azidität der Fixierungsflüssigkeit enge Beziehungen. Der A u t o r unterscheidet zwischen »sauren« und »alkalischen« Fixationsbildern. Im ersteren Fall sind Chromatinnetz, Nukleolen, Chromosomen und Spindelfasern gut erhalten, Mitochondrien u n d Zytoplasma schlecht; im letzteren Fall ist es umgekehrt. Der Übergang vom einen zum andern Bild erfolgt bei einem bestimmten PH, das bei den einzelnen Flüssigkeiten verschieden liegt. Das Optimum der H-Ionenkonzentration ist jeweils durch Versuche zu ermitteln. Z i r k l e gibt (für pflanzliches Gewebe) einige derartige optimale Gemische an (Kupferbichromat PH 4,6, Ceriumbichrom a t PH 4,8), die sowohl Nukleolen, Kernsaft, Teilungschromatin, Spindelfasern, Mitochondrien und Zytoplasma gut erhalten. Zu berücksichtigen ist, daß sich das PH der Flüssigkeiten im Laufe der Fixierung sowohl durch chemische U m setzungen ihrer Komponenten wie unter dem Einfluß des P r ä p a r a t e s beträchtlich ändern kann. Versuche, die Fixierungsflüssigkeit mit Pufferlösungen auf den normalen PH-Wert der Körpersäfte (Blutserum PH 7,2) einzustellen (z. B. von G r o ß und L o h a u s [32]), sind nach W e r n e r (36) abzulehnen, da sie auf falschen Voraussetzungen beruhen; die optimalen Bilder gewinnt man vielmehr im sauren Gebiet (etwa bei PH = 4). 204. Der Temperaturfaktor. Die Frage, bei welcher T e m p e r a t u r die Fixierung am besten vorgenommen wird, findet im S c h r i f t t u m sehr verschiedene Beantwortung. Daß der F a k t o r f ü r feinere Untersuchungen nicht belanglos ist, ergibt sich aus neueren Versuchen von W e r n e r (34) am Innenohr. Bei ihnen h a t t e kalte Fixierung (1—10° C) S c h r u m p f u n g der Epithelien, Zellkerne und Deckgebilde sowie Beschädigung der Otolithen bis zum völligen Verlust zur Folge. Bei ca. 37° C sind die Epithelien dagegen wesentlich höher, die Otolithen vollständig erhalten. W e r n e r h ä l t d a h e r n u r d i e (mittels Durchspülung vorgenommene) F i x i e r u n g b e i K ö r p e r t e m p e r a t u r für einwandfrei. Auch andere Autoren schlagen vor, die Fixierung zur Beschleunigung der D i f fusion, zumal während der ersten halben Stunde, bei 37—40° C im Brutschrank vorzunehmen,. T e l l y e s n i c z k y gibt dagegen an, daß die Fixierungsflüssigkeiten bei 35° C nicht wesentlich rascher eindringen als bei 20° C. Wohl aber mazerieren die inneren Teile der bei 35° C fixierten Organe, die ja auch bei erhöhter Temperatur erst nach einiger Zeit erreicht werden, rascher als bei Zimmertemperatur. Die Fixierung bei Körpertemperatur würde also für gewöhnlich keine Vorteile bieten, sondern in ihrem Endergebnis sogar schlechter sein. Bei Durchspülung kommt der Einwand T.'s allerdings in Wegfall. 205. In besonderen Fällen kann die Fixierung in kochender Fixierungsflüssigkeit von Vorteil sein. Namentlich bei Wirbellosen ist sie nicht selten empfehlenswert. Man wirft die Objekte in die zum Kochen erhitzte Flüssigkeit und kühlt kurze Zeit darauf durch Nachschütten von bereitgestellter kalter Lösung rasch wieder ab ( S c h u b e r g 10).

206. Im Gegensatze zu obigen A u s f ü h r u n g e n steht die Fixierung bei niederer T e m p e r a t u r ( + 0 bis + 6° C) im Eisschrank, die namentlich von P o 1 i c a r d (13) empfohlen wurde. Policard fand, daß dabei die S t r u k t u r auch bei größeren •Organstücken erheblich besser erhalten bleibt als bei Fixation in w a r m e r Flüssigkeit, was zum größten Teil auf dem Stillstand autolytischer Prozesse beruht.

§ 207—212.

Allgemeines

51

Die durch die Abkühlung bewirkte Verminderung der Diffusionsgeschwindigkeit komme demgegenüber praktisch nicht in Betracht. Auch von amerikanischen Autoren wurde die Fixierung im Eisschrank empfohlen (z. B. von H a n c e 17). 207. Man fixiere womöglich immer in lebensfrischem Zustand, da sich die Organe nach dem Tode sehr rasch verändern; so haben P o l i c a r d und G a r n i e r schon 15 Minuten nach dem Tode relativ große Veränderungen an der Niere beobachtet (s. auch § 208). Die rasche Veränderlichkeit der Eingeweide ist bekannt. Über die Veränderung faulender Organe siehe F a l k (67). 208. K a n n die Fixierung aus irgendwelchen Gründen nicht unmittelbar nach dem Tode erfolgen, so verwahrt man das Material bei niederer Temperatur (am besten im Eisschrank.) Bei etwa 0° C können frisch. entnommene Organteile und Zellen längere Zeit sogar in latentem Lebenszustand erhalten werden (u. a. W e n t s c h e r 98, 03, O. H e r t w i g und P o l l 07, J o l l y 10, 12). In systematischen Untersuchungen über die postmortalen Veränderungen zeigte W e r n e r (34), daß die autolytischen Vorgänge bei 1—10° C wesentlich verzögert sind, ohne daß die Abkühlung aber belanglos ist. Sie wirkt anfangs auf die noch lebende Zelle als Reiz, auf den sie mit Kontraktur reagiert. Diese Kontraktion bleibt dann auch die Grundlage für alle späteren, nach dem Zelltode eintretenden 'Veränderungen. Dabei sind intravitale, postmortale und artifizielle Veränderungen untrennbar miteinander verflochten.

209. Die Dauer der Fixierung ändert sich j e nach der Zusammensetzung der Flüssigkeit und der Beschaffenheit des Objektes, sowie dem beabsichtigten Zweck. Jedenfalls darf man ein Organstück frühestens erst dann aus der Fixierungsflüssigkeit nehmen, wenn dieselbe das Gewebe v ö l l i g durchdrungen hat. In Zweifelsfällen durchschneidet man das Objekt zum fraglichen Zeitpunkt mit einer scharfen Rasierklinge, worauf man das Vordringen der Flüssigkeit an dem Färb- und Konsistenzunterschied leicht erkennen kann. Besonders Anfängern ist es sehr zu empfehlen, sich auf diese Weise von dem oft recht langsamen Eindringen der Flüssigkeit zu überzeugen. Andererseits darf sich die Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit für gewöhnlich auch nicht auf unbegrenzte Zeiten ausdehnen, da die Präparate in vielen Flüssigkeiten mit der Zeit brüchig und schlecht färbbar werden, mazerieren, schrumpfen oder quellen. Die manchmal vertretene Auffassung, daß die P r ä parate am besten in ihrer Fixierungsflüssigkeit aufgehoben werden, da diese nach einmal erfolgter Fixierung keine weiteren Veränderungen hervorruft, ist nicht richtig. Nur einige wenige Flüssigkeiten, wie z. B. verdünntes Formol (1:9), Bouinsche Flüssigkeit eignen sich auch zum längeren Aufheben der Präparate. 210. A u s systematischen Messungen von W e r n e r (36) geht hervor, daß einzelne Komponenten eines Organes selbst nach mehrwöchentlichem Aufenthalt in der Fixierungsflüssigkeit noch Größenveränderungen erliegen (untersucht bis zu 31 Tagen). Bei vergleichenden Messungen ist "also auch die D a u e r der Fixation konstant zu halten.

211. Das Volumen d e r F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t soll die Größe der zu fixierenden Stücke mindestens um das 50- bis lOOfache übertreffen, da sich sonst die verdünnende Wirkung des im Gewebe enthaltenen Wassers schädlich bemerkbar macht (Ausnahme: Osmiumsäure s. § 284). 212. Fixation mittels Durchspülung. N e b e n d e r F i x i e r u n g d u r c h E i n l e g e n i n d i e

Flüssigkeit ist seit langem auch die Fixierung mittels Durchspülung auf dem Gefäßweg in Gebrauch ( M a n n 94, K o l m e r 12, W e r n e r 34—37 u. a.). Das Verfahren gibt ausgezeichnete Resultate, kann aber naturgemäß in vielen Fäl4*

52

Fixierung

§ 213.

len nicht angewandt werden. Das Prinzip der Methode beruht darauf, daß die Fixierungsflüssigkeit auf dem Gefäßweg durch das zu fixierende Tier oder Organ geleitet wird. Nach der tiefen Betäubung des Tieres, die zur Vermeidung von Vasokontraktion am besten mit Leuchtgas oder durch Injektion von 10%iger Chloralhydratlösung erfolgt, müssen die Gefäße zuerst mit einer körperwarmen indifferenten Salzlösung (Ringer, Normosal od. dgl.) blutleer gespült werden. Dies hat mit einem Minimum an Flüssigkeit zu geschehen (wichtig!; ) Im nachfolgenden meist abgekürzt als »Alkohol« bezeichnet.

§ 220—223.

Fixierung (Alkohol)

55

den Zustand nur sehr wenig entspricht. Trotz dieser Nachteile bleibt die Fixierung in Alkohol aber dank der obengenannten Vorzüge für viele Spezialuntersuchungen unentbehrlich. Dazu kommt, daß die Färbbarkeit alkoholfixierter Präparate für zahlreiche Methoden vorzüglich ist. Verglichen mit anderen Fixierungsflüssigkeiten (wie Bouin, Helly, Formol u. a.) ist die bei Alkoholfixierung schon bei der Fixierung eintretende Schrumpfung sehr groß. Dafür ist aber die bei der Nachbehandlung eintretende nur mehr gering. Die schrumpfende Wirkung auf das Cytoplasma ist größer als die auf den Kern (Q. H e r t w i g 31). Über Konzentrationsbestimmung, Prüfung und Reinigung des Alkohol siehe § 376 ff. 220. Anwendungsweise: F ü r gewöhnlich kommt der Alkohol zur Fixierung wasserfrei als sog. a b s o l u t e r Alkohol (s. auch § 380) zur Anwendung. Die zu fixierenden Stücke dürfen, wenn man gute Resultate bekommen will, nicht dicker als 5 mm sein. Die Fixierung geht sehr rasch vor sich: Bei sehr dünnen Stückchen (z. B. Membranen) genügen 15—30 Min., bei 1—2 mm Dicke V2 bis 1 Stunde, bei 3—4 mm Dicke 2—4 Stunden. Wichtig ist, daß die Präparate auf dicker Watteschicht in reichlicher Menge von absolutem Alkohol liegen, damit der Alkohol durch das aus dem Präparat dringende Wasser, das bei dieser Anordnung zu Boden sinkt, nicht nennenswert verdünnt wird. Durch die Watteschicht wird auch die für eine gleichmäßige Fixierung sehr wichtige Bedingung erfüllt, daß der Alkohol von allen Seiten her in das Präparat eindringt. Die Einwirkung des absol. Alkohols soll nicht länger ausgedehnt werden, als zur völligen Durchdringung des Präparates nötig ist. Bei zu langem Einwirken leidet u. a. die spätere Schneidbarkeit der Gewebe. Bei schwer durchdringlichen Objekten (besonders bei Wirbellosen) ist es oft von Vorteil in kochendem abs. Alkohol zu fixieren (2—10 Min.). Bei großen Stücken muß die Fixierung mittels Injektion der Blutgefäße vorgenommen werden. 221. Nachbehandlung: Die fixierten Stücke werden am besten gleich im Anschluß an die Fixierung durchtränkt und eingebettet. Wenn es die beabsichtigten Färbemethoden erlauben, so bettet man alkoholfixierte Präparate zweckmäßig in Celloidin ein, da in diesem Falle die in Benzol und besonders in Paraffin eintretende starke Schrumpfung in Wegfall kommt. Ferner bleibt eine Reihe reversibel gefällter Substanzen, die in Paraffinschnitten bei Gelegenheit des Aufklebens, Färbens usw. leicht gelöst werden, im Celloidinschnitt erhalten (z. B . Glykogen). Ist eine sofortige Einbettung der fixierten Präparate nicht möglich oder nicht erwünscht, so bringt man sie in Terpineol, in dem sie ohne Beeinträchtigung von Färbbarkeit und Schneidbarkeit lange aufbewahrt werden können (Pigment entfärbt sich in ihm im Laufe der Zeit), oder man überführt sie durch 90°/oigen Alkohol in 80°/oigen. 222. Bei der Alkoholfixierung (wie auch bei vielen anderen) kann es besonders in den Randteilen des Präparates infolge der einseitigen Einwirkung zu einer Verlagerung von Zell- und Kerninhalt, ja sogar von den Kernen selbst kommen (»Flucht des Inhaltes der Zelle gegen den Mittelpunkt des Stückes« T e l l y e s n i c z k y 98, sowie S c h a f f e r 18.) 223. Die Frage, in welcher Konzentration man den Alkohol zur Fixierung am besten anwendet, wird verschieden beantwortet. K a r d a s e w i t s c h (25) u. a. findet, daß 70—90°/oiger Alkohol besser fixiert als absoluter (Objekt: Ascariseier). Z e i g e r (30a) dagegen stellte (durch Messung des Kerndurchmessers) fest, daß die geringste Schrumpfung bei Fixierung mit absolutem Alkohol eintritt. Schon

56

Fixierung

§ 224—231.

bei Fixation in 96°/oigem macht sich eine etwas stärkere Schrumpfung bemerkbar und bei Verwendung von 70°/oigem, besonders aber von 50°/oigem wird sie noch stärker. Nach S e k i (37) wird die Fixationswirkung von Alkohol, Aceton, Pyridin u. dgl. durch Zusatz einer kleinen Menge Wasser bedeutend verstärkt. Darnach wäre vielleicht zur Fixierung die Verwendung von 98°/oigem Alkohol dem wasserfreien vorzuziehen^ 224. Für Sammlungszwecke bringt man die Objekte, wenn man nicht lieber Formol verwendet, zunächst für 24—48 Stunden in 30—40°/oigen Alkohol und behandelt dann in steigendem Alkohol weiter. Für mikroskopische Untersuchungen ist diese Art der Fixierung jedoch nicht brauchbar. Für präparatorische Zwecke ist sie dagegen öfters ganz vorteilhaft, j.umal nach leichter Ansäuerung des Alkohols mit Essigsäure 0,5 :100). Alkoholgemische 225. Absoluter Alkohol mit Zusatz von Eisessig (z. B. 20 ccm auf 100 ccm Alkohol) dringt rasch ein, so daß sich darin auch etwas größere Stücke als in absolutem Alkohol in einigen Stunden durchfixieren lassen. Anwendungsweise und Resultat ähnlich wie beim absoluten Alkohol. Nach der Fixierung überträgt man noch kurz in reinen, absoluten Alkohol. Dann Einbettung. 226. Sehr gute Resultate gibt in geeigneten Fällen die Carnoysche Flüssigkeit (auch als v a n G e h u c h t e n s Gemisch bezeichnet), welche aus 60 ccm a b s o l u t e m A l k o h o l , 30 ccm C h l o r o f o r m und 10 ccm E i s e s s i g besteht. Die Lösung dringt sehr rasch ein (in 4 Stunden ca. 2,9 mm tief). Objekte von 1—2 mm sind schon in 1 Stunde, solche von 3—5 mm Dicke in 3—5 Stunden fixiert. Der Aufenthalt in der Lösung soll nicht länger ausgedehnt werden als zur völligen Durchdringung nötig ist. Bei zu langer Einwirkung verstärken sich die Schrumpfungen und außerdem werden die Präparate zu hart. Nach der Fixierung übertrage man gleich in reinen absoluten Alkohol. 227. Das rasche Eindringen der C.'schen Flüssigkeit beruht nach S e k i (37) darauf, daß die Essigsäure im wasserreichen Gewebe die H-Ionen disoziiert, wodurch sich die Kolloidalzustände der Gewebesubstanz stark ändern. Der Chloroformzusatz wirkt auf Fette und Lipoide lösend. Beide Momente erleichtern das Eindringen des Alkohols. 228. In Alkohol-Formol, 2 Teile 80%iger bis a b s o l u t e r A l k o h o l u n d I T e i l k ä u f l i c h e s F o r m o l ( S c h a f f e r 08 u. 18), wird 1—2 Tage fixiert, bei größeren Stücken länger. Sodann überträgt man in entsprechenden reinen Alkohol. Nimmt man 80°/oigen Alkohol, so bewahren bei rascher Weiterbehandlung auch sehr dotterreiche Embryonen nach meinen Erfahrungen gute Schneidefähigkeit. 229. Nach R e i m a n n und U n n a (12) soll ein Zusatz von 2 Prozent C h l o r z i n k zum 96°/oigen Alkohol (besonders f ü r Cytoplasmadarstellung) gute Resultate geben. 230. R u d n e w (07) legt frische Organe in eine dünne Alkohol-Äther-Celloidinlösung (vgl. § 443, 2°/oige Lösung) und beläßt sie darin längere Zeit (bis zu Wochen). Die Mischung fixiert, wird dabei dicker und kann gleich zum Einbetten verwendet werden (vgl. Celloidindurchtränkung). 231. P r o p y l a l k o h o l ist zur Fixierung ungeeignet, da er nur außerordentlich langsam eindringt (in 4 Stunden 0,2 mm!). S e k i (37) führt dies darauf zurück, daß er auf der Oberfläche des Organs eine Art Häutchen bildet, das dem weiteren Eindringen großen Widerstand entgegensetzt.

§ 232—237.

Fixierung (Chromsäure und Chromsalze)

57

Chromsäure und Chromsalze 232. Chromsäure für sich allein wird in der Fixierungstechnik nur mehr selten eingewandt. Sie dringt nur sehr langsam ein (in 4 Stunden 1—l 1 ^ mm); das Protoplasma sieht nach Chromsäurefixierung stark vakuölisiert aus; der K e r n inhalt w i r d in sehr starken und sehr schwachen Konzentrationen zerstört, in 0,3—l°/oiger Lösung bleibt er besser erhalten. Anwendung: Man fixiert gewöhnlich in 0,3—0,5°/oiger wäßriger Lösung kleine 1—2 mm dicke Stückchen 5—6 Stunden, größere Tage bis Wochen, wobei man die Flüssigkeit, die mindestens das 200fache an Volumen betragen soll, mehrmals erneuert. Nach der Fixierung wird in fließendem Wasser 12—24 Stunden ausgewaschen, bis die gelbe Farbe der Stücke möglichst verschwindet Die Chromsäure geht bei der Fixierung, ähnlich wie bei der Gerbung, mit Eiweiß und Leim schwerlösliche Verbindungen ein. Chromsäurehärtung wurde zum erstenmal 1840 von Adolf H a n n o v e r angewandt. Chromsäuregemische 233. Chromessigsäure fixiert dank ihres Essigsäuregehaltes etwas besser als Chromsäure allein. Zusammensetzung: Chromsäure 2,5 g, Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm. Früher auch in zahlreichen anderen Mengenverhältnissen gebraucht, kommt das Gemisch jetzt nur noch selten zur Anwendung. Über Chrom-Osmium-Essigsäuregemische (nach Flemming, Meves, Benda, Champy) s. § 289 ff. Kaliumbichromatgemische 234. Für sich allein kommt K a l i u m b i c h r o m a t (Synonyma: saures chromsaures Kali, dichromsaures Kali, doppelchromsaures Kali) als Fixierungsflüssigkeit nicht zur Anwendung, da es zumal in den Kernen stets Kunstprodukte hervorruft (Vakuolen oder Löcher und netzartige Gebilde [sog. Chromsalznetze]). Früher fixierte man hauptsächlich ansteigend in 2—5°/oiger Lösung, d. h. die Stücke kamen zuerst in 2-, dann in 3-, in 4- und schließlich in 5%ige Lösung. 235. Uberaus häufig wird das Kaliumbichromat dagegen in der Fixierungstechnik in Verbindung mit anderen Substanzen, w i e Essigsäure, Formol, Osmiumsäure, Sublimat gebraucht. Es kommt dabei insbesondere seine günstige Wirkung auf das Cytoplasma und dessen Komponenten zur Geltung, während der kernauflösende Einfluß durch die Zusatzflüssigkeiten unterdrückt wird. Präparate, die in chromhaltigen Flüssigkeiten fixiert wurden, sollen nicht wochenlang in Alkohol liegen, sondern möglichst bald eingebettet werden. Wenn sich die Alkohole bei der Durchführung durch die Alkoholreihe gelblich färben (namentlich durch extrahierte chromierte Fette), dann sind sie zu erneuern. 236. Kaliumbichromat-Essigsäure. Die von T e l l y e s n i c z k y (98) angegebene, einfach herzustellende Flüssigkeit fixiert Protoplasma, K e r n und Bindegewebe gleich gut und dringt ziemlich rasch ein (in 1 Stunde: 1 mm, in 4 Stunden: 3—4 mm). Zusammensetzung: 3%ige Kaliumbichromatlösung: 100 ccm, Essigsäure (erst unmittelbar vor Gebrauch): 5 ccm. Man fixiert 1—2 Tage, wäscht 1 T a g lang in Brunnenwasser gründlich aus und führt, mit 150/oigem Alkohol beginnend, im Dunkeln durch die Alkoholreihe. 237. Die Wirkung der Flüssigkeit ist nach T e l l y e s n i c z k y (98 u. 26) so aufzufassen, daß die schneller diffundierende Essigsäure vorauseilend die Nucleo-

58

Fixierung

§ 238—243.

Proteide fällt und die Zelle, vorerst ohne Fällung der Plasmaeiweiße, durchsäuert. In diese dringt dann das Kaliumbichromat ein, fällt die noch nicht gefällten Eiweißstoffe der ganzen Zelle aus und konserviert gleichzeitig auch Fette und fettartige Substanzen. — Eine ähnliche Rolle spielt der Essigsäurezusatz auch in anderen Fixierungsgemischen. 238. Kaliumbichromat-Formol-Essigsäure (»Kaformacet«), sehr geeignet für Ubersichtspräparate wie auch feinere Untersuchungen. Zusammensetzung: 3°/oige Kaliumbichromatlösung 85 ccm, Formol 10 ccm, Eisessig 5 ccm. (Die Vereinigung der Flüssigkeiten erfolgt erst unmittelbar vor Gebrauch; allenfalls kann man auch noch 40 ccm einer 50/oigen wäßrigen Sublimatlösung zufügen.) Man fixiert Stücke von 0,3 bis 1 cm Dicke 6—24 Stunden (kleinere kürzer) und überträgt dann unmittelbar in eine mehrmals zu wechselnde 50/oige wäßrige Lösung von Lithium- oder Natriumsulfat, um die Quellung des Bindegewebes, die bei sofortigem Auswaschen in Wasser auftreten würde, hintanzuhalten. Hierauf wird 24 Stunden in Brunnenwasser gründlich gewaschen usw. Bei vergleichenden Untersuchungen konnte ich feststellen, daß auch die Färbbarkeit der Präparate durch die Nachbehandlung mit Lithiumsulfat sehr günstig beeinflußt wird. So färbt z. B. Hämalaun, das an den in obiger Weise fixierten und mit Wasser ausgewaschenen Präparaten nur sehr langsam färbt, nach Behandlung mit Lithiumsulfat in gewöhnlicher Weise. Die in dieser Weise fixierten Präparate bettet man zweckmäßig im Laufe der nächsten 14 Tage ein, da sie bei längerem Liegen in Alkohol für eine Reihe von Farbstoffen schwer färbbar werden. 239. Das Kaliumbichromat-Formol-Essigsäuregemisch (»K a f o r m a c e t « W e r n e r 35) wurde erstmalig von W i t t m a a c k und von H e l d angegeben und seitdem in den Mengenverhältnissen vielfach variiert, so daß zur Zeit 20—30 verschiedene Vorschriften bekannt sind. Von W i t t m a a c k und seiner Schule existieren allein 6, von K o l m e r 3, von K u b o 3 usw. W e i h e r (34) hat eine größere Zahl dieser Flüssigkeiten vergleichend untersucht und dabei die verschiedenste quantitative Zusammensetzung und Konzentration (Gefrierpunktserniedrigung zwischen 0,63—5,6) festgestellt, während die H-Ionenkonzentration nur in engen Grenzen schwankt (PH 3 , 1 6 — 3 , 6 8 ; Messung 3 Tage nach Herstellung). Für die in § 238 angegebene Lösung fand W. am 3. Tag A = 4,90, p H 3,49. 240. H e l d setzt einer 3°/oigen Lösung von Kaliumbichromat 4°/o der käuflichen Formaldehydlösung und 5°/o Eisessig zu und läßt die Lösung dann einige Wochen reifen, bis sie grünlich ist ( » G r ü n e L ö s u n g « ) , W e r n e r fand am 3. Tag A = 3,29, p H 3,36; nach 25 Tagen p H 3,72—3,82. 241. K o l m e r (12) empfiehlt folgende Lösung: gesätt. wäßr. Lösung von Kaliumbichromat (enthält etwa 13°/o Kaliumbichromat) 2 oder 4 Teile, 10°/o Lösung des käuflichen Formols 2 oder 4 Teile, Eisessig 1 Teil (3. Tag A = 5,4; p H 3,26—3,36), evtl. auch noch Zusatz von gesättigter Sublimatlösung 2 Teile. 242. Sämtliche Kaformacet-Gemische ändern sich schon kurz nach ihrer Herstellung, bei der ihr ph bei 2 liegt. Die chemischen Umsetzungen bestehen im wesentlichen in einer Reduktion des Bichromats zu Chromverbindungen und in einer Oxydation des Formaldehyds zu Ameisensäure. Sie führen zu einer Verminderung der Gesamtkonzentration wie der H-Ionenkonzentration und vermutlich auch zu einer Verminderung ihres Fixationswertes. Kaformacet ist daher nur dann in bestimmter Qualität herstellbar, wenn das Rezept außer exakten Angaben über Substanzen und Darstellungsweise auch Alter und Aufbewahrungstemperatur der Lösung angibt ( W e r n e r 35). 243. Kallumbidiromat-Formol, gewöhnlich nach K o p s c h - R e g a u d : 30/oige Kaliumbichromatlösung 80 ccm, Formol 20 ccm. Ausgezeichnet für cytoplasmatische Untersuchungen (Mitochondrien), siehe auch § 976.

§ 244—251.

Fixierung (Chromsalze)

59

244. Kaliumbichromat-Natriumsultat, angegeben von Heinr. M ü l l e r (57), seitdem allbekannt als Miillersche Flüssigkeit, die früher sehr viel v e r w e n d e t wurde, jetzt aber meist nur in Verbindung mit Formol ( O r t h s . § 247) oder SublimatEisessig ( Z e n k e r s. § 336) gebraucht wird. Zusammensetzung: Kaliumbichromat 2,5 g, Natriumsulfat 1 g, dest. Wasser 100 ccm. Der Natriumsulfatzusatz ist nach T e l l y e s n i c z k y (98) und W e r n e r (35) überflüssig. p H 4,0, wie f ü r reines Kaliumbichromat. Anwendung: 0,5—1 cm dicke Stücke werden 8—14 Tage lang, größere mehrere Wochen lang im Dunkeln fixiert (menschliches Rückenmark z. B. braucht 6—8 Wochen). Anfangs wird die Flüssigkeit täglich gewechselt, später wöchentlich. Fixierungsresultat wie bei einfaeher Kaliumbichromatlösung. — Die M ü l l e r sche Flüssigkeit spielte in f r ü h e r e r Zeit auch als Härtungsmittel eine große Rolle. 245. Etwas rascher bei gleichem Ergebnis wirkt die E r 1 i c k i sehe Flüssigkeit (Kaliumbichromat 2,5 g; Kupfersulfat 0,5 g, dest. Wasser 100 ccm). Man wechselt die Flüssigkeit alle 2 Tage. Die Fixierungsdauer ist 3—4mal kürzer als bei Müllerscher Flüssigkeit. 246. Durch Erhöhung der Temperatur auf 37—40° C (durch Einstellen in den Brutschrank) läßt sich die Fixierungsdauer in Müllerscher oder Erlickischer Flüssigkeit erheblich abkürzen. (So ist z. B. menschliches Rückenmark unter diesen Verhältnissen schon in 10 bzw. 5 Tagen hinreichend fixiert.) Zur Verhütung von Verpilzung setzt man Thymol zu. Die Objekte müssen in der Flüssigkeit entweder aufgehängt oder auf Filtrierpapier oder dgl. gelegt werden, damit sie von allen Seiten her eindringen kann. 247. Orths Gemisch besteht aus 9 Teilen M ü l l e r s c h e r Flüssigkeit, zu der unmittelbar vor Gebrauch 1 Teil F o r mo 1 gesetzt wird. Fixierungsdauer 24—48 Stunden im Dunkeln. 24stündiges Auswaschen in Brunnenwasser. Die Resultate sind unvergleichlich besser als bei M ü l l e r scher Flüssigkeit allein. Besonders S c h r i d d e (10) empfiehlt diese Fixierung. 248. Nach Lithiums u. Cuprum die Zellstruktur

B u r c h a r d t (97) sind die Chromsalze des. Kaliums, Natriums, a. kernzerstörend, während die Bichromate von Calcium, Barium und Chromatinstruktur erhalten. Daher folgende Mischungen, welche die im allgemeinen gut fixieren:

a) Calc. bichr. 4°/o Kai. bichr. 5°/o Eisessig

60,0 30,0 5,0

b) Barium bichr. 4°/o Kai. bichr. 5°/o Eisessig

60,0 30,0 5,0

c) Cupr. bichr. 6°/o 60,0 Kai. bichr. 5®/o 30,0 Eisessig 5,0

Fixierungsdauer 6—24 Stunden; hierauf gründlich wässern. 249. Setzt man die Objekte während der Fixierung mit chromhaltigen Flüssigkeiten und bei der Weiterbehandlung im Alkohol der Einwirkung der Lichtstrahlen aus, so bilden sich nach H. V i r c h o w oft sehr störende künstliche Pigmente, welche unter Umständen mit natürlichen verwechselt werden können. Man stelle die Gläser daher ins Dunkle. Das Licht scheint auch die Löslichkeit der Eiweißfällungen zu beeinflussen. 250. Zur E n t f e r n u n g d e r b e i F i x i e r u n g in chromhaltigen Flüssigkeiten des öfteren a u f t r e t e n d e n N i e d e r s c h l ä g e legt L ö w e n t h a l die Präparate vor der Behandlung mit Alkohol in 0,5 o/ oige Chromsäure, in warmes Wasser oder in schwach mit Salzsäure angesäuertes Wasser. 251. Präparate, die in chromhaltigen Flüssigkeiten fixiert wurden, werden bei längerem Liegen in Alkohol grünlich und schlecht färbbar. U m sie zu bleichen u n d wieder färbbar zu machen, behandelt E d i n g e r die Schnitte für 5 Minuten mit verdünnter Salpetersäure (1:10). Dann gründliches Auswaschen.

60

Fixierung

§ 252—255.

Essigsäure 252. Essigsäure allein w i r d zur Fixierung n u r sehr selten gebraucht, da sie in dieser F o r m schlechte Ergebnisse liefert. Sehr häufig und mit großem Nutzen w i r d sie dagegen anderen Fixierungsflüssigkeiten zugesetzt. (Vgl. auch § 237). Als Eisessig bezeichnet m a n die 1000/oige Essigsäure, w ä h r e n d die sog. konzentrierte Essigsäure 40/o Wasser enthält. V e r d ü n n t e Essigsäure (z. B. l°/oig) läßt bei Zusatz zu frischen P r ä p a r a t e n die K e r n e infolge der in ihnen entstehenden Niederschläge deutlich hervortreten; das Protoplasma der Zellen wird dabei zum Teil gelöst. Siehe f e r n e r die Versuche von v a n H e r w e r d e n § 914. Formol (Formalin) 253. Das Formol hat sich, seit es durch F. B l u m (1890) in die mikroskopische Technik e i n g e f ü h r t wurde, zu einem der gebräuchlichsten Fixierungsmittel entwickelt. Bei einfacher Anwendungsweise und niedrigem Preis konserviert es Form, F a r b e u n d S t r u k t u r der Präparate gut; infolge seines guten Diffusionsvermögens und der geringen Niederschlagsbildungen durchdringt es selbst große Organe verhältnismäßig rasch, so daß in ihm auch tief gelegene Teile leidlich erhalten bleiben. Dabei verleiht es dem Gewebe einen auch zum Schneiden auf dem Gefriermikrotom sehr geeigneten Härtegrad. Ein weiterer Vorteil ist, daß sich P r ä p a r a t e in Formol selbst j a h r l a n g ohne Schädigung ihrer F ä r b b a r keit a u f b e w a h r e n lassen. Von besonderem Werte ist die Eigenschaft des F o r mols, F e t t e u n d Lipoide gut zu erhalten. D a r i n liegt auch die große Bedeutung des Formols f ü r die F i x i e r u n g des Nervensystems begründet. Die sehr verbreitete Aulfassung, daß sich in Formol alle Lipoide in unveränderter Menge erhalten, trifft, wie H a m m a r nachwies, allerdings nicht zu (s. auch § 1036 u. 1037). Die Phosphatide in Gehirn und Rückenmark werden durch Formol hydrolisiert. Galaktolipoide (Cerebroside) und Cholesterol werden dagegen nicht wesentlich verändert ( W e i l 30). Weniger geeignet ist die reine Formolfixierung f ü r verschiedene cytologische Untersuchungen z. B. f ü r Kernstrukturen, Blutbildung, Glykogen- oder Eisennachweis (s. u.), auch G u a n i n und H a r n s ä u r e werden in Formol gelöst. Nach S c h i l l e r (30) fixiert Formol die sauren E i w e i ß e unvollkommen, w e n n es rein verwendet wird, dagegen ausgezeichnet bei Zusatz von neutralen Mineralsalzen (s. auch § 268). 254. Nach den Untersuchungen von Z e i g e r (30) werden die Eiweißkolloide mikroskopischer Strukturen unter dem Einfluß des Formaldehyds saurer, also basophiler als bei reiner Alkoholflxation, während Sublimat, Bichromat, Pikrinsäure (z. B. bei Bouin), Chromsäure die Azidität herabsetzen (vgl. auch § 273). 255. B e s c h a f f e n h e i t d e r H a n d e l s w a r e : F o r m o 1 oder F o r m a l i n ist eine 30—40°'oige Lösung des gasförmigen F o r m a l d e h y d s in Wasser. Das Formol ist im Handel in verschiedener Konzentration und Güte erhältlich. Die 30o/oige, hauptsächlich f ü r Desinfektion u. dgl. gebräuchliche Lösung ist meist stark verunreinigt und f ü r mikrotechnische Zwecke nicht zu empfehlen. Das den Bestimmungen des Deutschen Arzneibuches, 6. Aufl., entsprechende Formol enthält etwas Ameisensäure und wechselnde Mengen von Methylalkohol. Es genügt den gewöhnlichen Anforderungen der Mikrotechnik,- muß aber f ü r bestimmte Methoden neutralisiert w e r d e n (s. § 257f.). F ü r histolog i s c h e Z w e c k e v e r w e n d e t m a n am b e s t e n das s ä u r e f r e i e , 40o/oige F o r m a l i n v o n S c h e r i n g - K a h l b a u m 1 ) . ') Bei der kurzen Angabe »Formol« ist im vorliegenden Buch diese Marke gemeint.

§ 256—262.

Fixierung (Formol)

61

Das Formol ist in brauner Flasche vor Licht geschützt und bei einer Temperatur von nicht \mter 4- 9° C aufzubewahren. Bei starker Abkühlung tritt in der Vorratslösung eine Trübung auf, die sich allmählich als weißer Niederschlag absetzt (Paraformaldehyd und Trioxymethylen), ebenso beim Verdunsten (z. B. am Flaschenhals). 256. Die P r ü f u n g d e s P r o z e n t g e h a l t e s ist etwas umständlich; man nimmt sie am besten nach der Vorschrift des D.A.B. 6 folgendermaßen vor: Etwa 1 g Formaldehydlösung wird in einem Meßkölbchen von 100 ccm Inhalt, das 2,5 ccm Wasser und 2,5 ccm Normalkalilauge enthält, genau gewogen; das Kölbchen wird nach dem Umschütteln mit dest. Wasser bis zur Marke gefüllt. 10 ccm dieser Lösung versetzt man mit 50 ccm einer Vio Normal-Jodlösung und fügt 20 ccm Normalkalilauge hinzu. Man läßt eine Viertelstunde lang bei Zimmertemperatur stehen und fügt dann 10 ccm verdünnte Schwefelsäure zu. Hierbei müssen für je 0,1 g Formaldehydlösung mindestens 23,3 ccm VioNormal-Jodlösung verbraucht werden, so daß zur Bindung des überschüssigen Jodes höchstens 26,7 ccm Vio Normal-Natriumthiosulfatiösung erforderlich sind, was einen Mindestgehalt von 35°/o Formaldehyd entspricht (1 ccm Vio Normal-Jodlösung = 0,001501 g Formaldehyd, Stärkelösung als Indikator).

257. N e u t r a l i s i e r u n g d e s F o r m o l s : Wie erwähnt, enthält das käufliche Formol gewöhnlich etwas Ameisensäure, die auch in anfänglich säurefreiem Formol unter der Einwirkung der Lichtstrahlen wieder auftritt. Ein geringer Säuregehalt scheint indessen für gewöhnliche Fixierungszwecke nicht schädlich zu sein. Für bestimmte Methoden, besonders Silbermethoden, ist indessen die Verwendung säurefreien Formols unerläßlich. Die N e u t r a l i s i e r u n g ist ohne Schwierigkeit sehr einfach dadurch zu erreichen, daß man das Formol in brauner Flasche ständig über einer 1—2 cm hohen Schicht von gepulvertem Calciumcarbonat stehen läßt. Anfänglich schüttelt man einige Male kräftig um. Für gewöhnlich ist die Säure schon nach 24 Stunden hinreichend abgestumpft. 258. Eine völlige Neutralisierung tritt auch nach wochenlan'gem Stehen über Calciumcarbonat nicht ein; bei Bestimmung seines P h fand ich immer einen Wert von 6,3—6,5. Wurde aber dieses in seinem Säuregehalt stark abgestumpfte Formol in üblicher Weise mit Brunnenwasser verdünnt, so ergab sich ein ph von 7,1; das im Brunnenwasser enthaltene Alkali ist also gerade hinreichend, um die letzten Säurespuren zu neutralisieren. Formol, das mit Natronlauge oder Soda genau neutralisiert ist, reagiert nach Verdünnung mit Brunnenwasser schwach alkalisch (p H 7,4—7,5). 259. Von der von M a n n empfohlenen Neutralisierung mit Magnesiumcarbonat bin ich abgekommen, da das Formol dabei schwach alkalisch (PH 7,5—7,6) wird, was besser zu vermeiden ist. 260. B u r k e (33) neutralisiert durch Zusatz von etwas Pyridin. Vorteil: Vermeidung von Calciumspuren. Pyridin reagiert nicht mit Formalhedyd, das Auftreten von Paraformaldehydniederschlägen wird vermieden (s. auch § 267).

261. D i e P r ü f u n g d e r R e a k t i o n . Bei Zusatz eines Tropfens einer ca. 0,l0/oigen Neutralrotlösung entsteht bei saurer Reaktion eine karmoisinrote, bei alkalischer eine orangegelbe Färbung. Weniger scharf, aber genügend ist die Prüfung mit Lackmuspapier. Am besten ist die Bestimmung des PH (Z. B. mit Hilfe des Folienkolorimeters von W u l f f oder dergleichen). 262. S c h ä d i g e n d e W i r k u n g d e s F o r m o l s . Formoldämpfe wirken auf die Dauer stark reizend auf die Schleimhaut der Luftwege und der Augen. An den Händen ruft Formol Gerbung der Haut und bei oftmaliger Benetzung trockene Ekzeme hervor. Ist man gezwungen, an Formolpräparaten längere Zeit

62

Fixierung

§ 263—267.

zu präparieren, so mache m a n sie vorher durch Einlegen in schwach ammoniakalisches Wasser geruchlos. 263. D i e A n g a b e d e s V e r d ü n n u n g s g r a d e s i n d e r M i k r o t e c h n i k. Die Angaben über den Formaldehydgehalt der z u r F i x i e r u n g benützten Lösung sind häufig sehr unklar, zumal wenn sie in Prozentzahlen erfolgen, da die einen Autoren die 40°/oige Stammlösung f ü r die V e r d ü n n u n g einer 100°/oigen gleichsetzen, w ä h r e n d andere von der 40°/oigen Lösung ausgehen. F ü r die ersteren enthalten dann z. B. 100 ccm einer 10°/oigen Lösung 4 ccm F o r m a l dehyd, f ü r die letzteren dagegen 25 ccm. Dazu kommt, daß es sehr vielen Autoren u n b e k a n n t ist, ob die von ihnen benutzte Stammlösung 36- oder 40°/oig war. Ich halte es daher f ü r das beste, Formol- und Wassermenge anzugeben, also z. B. Formol 1:4 (d. i. 1 Teil Formol + 4 Teile Wasser), bei wichtigen Fällen u n t e r Angabe des Prozentgeh altes der Stammlösung an Formaldehyd, z. B. Formol (40°/oig) 1:4. Zur V e r d ü n n u n g des Formols verwendet man, wenn nicht anderes angegeben ist, stets Brunnenwasser. 264. Anwendungsweise: a) in starker Lösung (nach S j ö b r i n g 00): 1 Teil des käuflichen Formols wird mit 4 Teilen Brunnenwasser v e r d ü n n t (1:4). Dauer der Fixierung: 24 Stunden oder länger. — Sollen die P r ä p a r a t e längere Zeit in Formol aufgehoben werden, so überträgt man sie nach einigen Tagen in eine schwächere Lösung (z. B. 1:9). Die N a c h b e h a n d l u n g hängt von den bei der Untersuchung verfolgten Zielen ab. Histologische Übersichtspräparate überträgt m a n unmittelbar in 90°/oigen Alkohol. — Präparate, die zu Fett- und Lipoiduntersuchungen, Silberimprägnationen, Gelatineeinbettung dienen sollen, werden dagegen aus dem Formol direkt in Brunnenwasser gebracht, in dem sie gründlich ausgewaschen werden, bis das Formol e n t f e r n t ist. 265. b) Anwendung in schwacher Lösung: Sehr häufig wird das Formol, dem Vorschlage B l u m s entsprechend, auf das Zehnfache seines Volumens v e r d ü n n t (1:9), also 1 Teil Formol mit 9 Teilen Wasser; nach der Fixierung wird gewöhnlich zuerst in Wasser (oder 50°/oigem Alkohol) ausgewaschen und d a n n mit steigendem Alkohol entwässert. 266. P o l i c a r d und andere Autoren verdünnen statt mit Wasser mit p h y siologischer Kochsalzlösung (z. B. 1 Teil Formol + 8 Teile 0,8°/oiger NaClLösung). Nach der Fixierung wird nicht in Wasser, sondern in 50%igem Alkohol ausgewaschen. Bei Silbermethoden muß d a r a n anschließend natürlich noch sorgfältig mit Brunnenwasser und schließlich mit dest. Wasser ausgewaschen werden. Ich selbst bin von der Verwendung der Formol-Kochsalzlösung wieder abgekommen, da sich die damit fixierten Präparate in sauren Farblösungen, wie z. B. Eosin schlecht färben. Außerdem scheint zumal bei längerer Einwirkung eine Reihe von Eiweißsubstanzen extrahiert zu werden. Die Präparate sehen vielfach wie ausgelaugt aus. 267. F o r m o l - P y r i d i n . B u r k e (33) empfiehlt folgende Lösung: Dest. Wasser 75 ccm, Formol 25 ccm, Pyridin rein 5 ccm. Die Menge der Fixierungsflüssigkeit soll mindestens das 20fache Volumen des P r ä p a r a t e s betragen. Dauer: 48 Stunden, periphere Nerven besser 2 Wochen. Aber auch S Monate unschädlich; kein Formolniederschlag. B u r k e findet nach dieser Fixierung alle F ä r b e - u n d Imprägnationsmethoden anwendbar; ganz besonders sei sie f ü r jene Fälle zu empfehlen, in welchen neutrales Formol vorgeschrieben ist. P«- des Formol-Pyridins um 7—7,5 (siehe auch § 260).

§ 268—273.

Fixierung (Formol)

63

268. S c h i l l e r (30) empfiehlt den Zusatz von Sulfaten oder noch mehr von Acetaten. Unter letzteren verdient das Magnesiumacetat den Vorzug, da dessen Zusatz die rascheste und damit feinste Fällung bewirkt. Gleichzeitig w i l d es der quellenden Wirkung des Formols entzogen. Als Optimum fand S c h i l l e r die Kombination einer 8°/oigen Formollösung mit 2,18% Magnesiummacetat (mit 4 Mol. Kristallwasser); also 20 ccm Formol, 40 ccm Wasser, 40 ccm einer 5,5°/oigen Lösung von kristall. Magnesiumacetat. 269. c) Anwendung in Gasform: Für manche Zwecke, z. B. zur Fixierung von Drüsengranula empfiehlt W. G r o ß die Verwendung des Formaldehyds in Gasform. Das Objekt wird dazu in Schüben zerschnitten und in einen Vakuum-Exsikkator, dessen Boden mit 40°/oiger Formaldehydlösung bedeckt ist, auf ein Gazenetz gelegt. Durch den Tubus führen zwei Glasröhren, von welchen die eine über dem Organ, die andere unter dem Organ ausmündet. Die eine Röhre steht mit einer Wasserstrahlluftpumpe, die andere mit drei Gaswaschflaschen in Verbindung, die mit 30°/oiger Formaldehydlösüng gefüllt sind und in einem auf 50° C erwärmten Wasserbad stehen. Man saugt 6—10 Stunden lang Luft bzw. Formaldehyddämpfe durch und schließt dann die Hähne. Nach 24 Stunden sind die Organe fixiert. 270. d) Anwendung für Schnelldiagnose: W a l z (20) empfiehlt dazu 1—2 mm dicke Organscheibchen 1—2 Minuten in Formol 1:4 zu kochen und dann auf dem Gefriermikrotom zu schneiden. Sudanfärbung ist möglich. 271. Die Wirkungsweise des Formols: Die fixierende Wirkung des Formols beruht nach F. B l u m auf einer Methylenierung der Eiweißkörper des Gewebes, d. h. das Formaldehyd geht mit den Gewebseiweißen unter Wasserabspaltung eine Methylenverbindung ein. J a c o b y , der über die bei Einwirkung von Formol intra vitam auftretenden Veränderungen an der Froschschwimmhaut Beobachtungen anstellte, nimmt an, daß die durch Aufnahme von einem Molekül Wasser H H I i in OH—C—OH oder H—C—OH umgewandelten Moleküle I i H OH mit ihren beiden an ein C-Atom angelagerten OH- und H-Gruppen besonders geeignet seien, die großen, in ihren Seitenketten mit substituierbaren H - und OHGruppen reichlich versehenen Eiweiß- und Kollagenmoleküle unter Wiederaustritt von Wasser wie durch Klammern miteinander zu verbinden, aber unter leichter Verkoppelung, daß die Kolloidmoleküle bei dieser Fixierung untereinander ihren ursprünglichen, im Sol-Zustand vorhandenen Abstand und damit ihr Absorptionsvermögen für Wasser und Farbstoffe nicht verändern können, sondern beibehalten, so daß infolgedessen die entstehende Masse auch nicht jenen körnigen Charakter annimmt, wie dies bei der Koagulation durch Metaliionen der Fall ist. 272. Durch zahlreiche Messungen ist festgestellt, daß die Organe bei der Fixierung in Formol ihr Volumen infolge von Quellung etwas vergrößern. Die Quellung ist um so geringer, je konzentrierter die Formollösung ist; die histologische Untersuchung zeigt aber bei den stärkeren Konzentrationen so ungünstig verzerrte Bilder der Protoplasmastruktur, daß die Anwendung von stärkeren Lösungen als 1:3 oder 1 : 4 nicht rätlich ist (S c h i 11 e r). Bei der Nachbehandlung mit Alkohol kommt es natürlich stets zu Schrumpfungen. 273. Nach den Feststellungen von S p a t z (23) bilden sich während des Aufenthaltes der Gewebestücke im Formol, auch wenn es vorher neutralisiert war, Säuren, die im Innern des Gewebsblockes auftreten. Wahrscheinlich sind es Methyleneiweißkörper, dereh Karboxylgruppen durch Veränderung ihrer Aminogruppen zur Wirkung kommen. Die Säurebildung ist mit dem Wesen der Formolfixierung verknüpft; es gelingt nicht, jene aufzuheben, ohne die Fixierung zu stören. Damit hängt zusammen, daß die Formolfixierung bei Untersuchungen auf

64

Fixierung

§ 274—280.

Eisen nicht brauchbar ist, da dasselbe dabei mehr öder weniger gelöst wird. Die Befunde werden durch die Untersuchungen von Z e i g e r (30b), der unter dem Einfluß der Formolfixation eine Steigerung der negativen Ladung der Gewebselemente nachwies, bestens gestützt. Durch Hydrolysierung von Phosphatiden scheint auch Phosphorsäure in wasserlöslicher Verbindung aufzutreten (A. W e i 1). Nach B e n d i e n und G a n s stellt sich der Säuregrad der Formollösung bei der Fixierung meist sehr bald auf ph = 4,7 ein. Sie erklären diese Erscheinung daraus, daß das Formol durch Lösung von Eiweißsubstanzen den Charakter einer Pufferlösung annimmt. 274. Entfernung von Formolniederschlägen. Sehr häufig treten in den in F o r mol fixierten Präparaten dunkelbraune, kristallinische Niederschläge auf, die durch ihre Form, Farbe und regellose Lagerung leicht erkennbaren »Formolniederschläge«, die nach B r o w i c z durch Einwirkung des Formaldehyds auf das in den Geweben vorhandene gelöste Hämoglobin entstehen. Sie geben nach B e c k e r positive Benzidinreaktion. Die E n t f e r n u n g d e r N i e d e r s c h l ä g e erfolgt am besten nach dem Vorschlag von K a r d a s e w i t s c h durch Einstellen der ungefärbten Schnitte in eine 1—5°/o Lösung von Salmiakgeist (NH4OH) in 70°/oigem Äthylalkohol. Nach 5 Minuten bis 4 Stunden sind die Niederschläge verschwunden, ohne daß Struktur oder Färbbarkeit der Gewebe beeinträchtigt wäre. — Diese Methode ist der früher meist benutzten Methode von V e r o c a c y überlegen. Der einzige Nachteil des Verfahrens von K a r d a s e w i t s c h ist, daß dabei außer dem Formolniederschlag auch Malariapigment aufgelöst wird. Die übrigen Pigmente, vor allem das braune Abnutzungspigment, melanotisches Pigment, Hämosiderin, anthrakotisches Pigment, werden dagegen durch sie nicht angegriffen (D i B i a s i). 275. Die nach Formolfixierung und nachfolgender Alkoholbehandlung im Zentralnervensystem öfters auftretenden metachromatisch färbbaren Kugeln sind Galaktolipoide; sie lassen sich durch Einstellen in heißes Wasser (60°) beseitigen (A. W e i l ) . 276. M e t h o d e v o n V e r o c a y . Die vom Niederschlag zu befreienden Schnitte kommen auf 10 Minuten in eine Mischung von 1 Teil l°/oiger wäßriger Kalilauge und 100 Teilen 80°/oigen Alkohols, dann 5 Minuten in zweimal gewechseltes Wasser, 5 Minuten in 80°/oigen Alkohol, dann Auswaschen in fließendem Wasser. 277. E n t h ä r t u n g . Wenn die Präparate infolge langen Liegens in starker Formollösung zu hart werden sollten, so kann man die Härte nach W. J. S c h m i d t (10) durch 14tägiges Einlegen in P/oige Silbernitratlösung oder 10°/oige Zitronensäure beseitigen. 278. Formolpräparate können hernach noch mit fast allen anderen Fixierungsflüssigkeiten nachfixiert werden (s. auch H a n s e n 08b); sie lassen sich mit den meisten Methoden färben und können auch mit der G o l g i s c h e n oder W e i g e r t s c h e n Methode nachbehandelt werden. 279. Formol wird häufig mit anderen Fixierungsflüssigkeiten kombiniert; der Z u s a t z erfolgt dab'ei meist u n m i t t e l b a r v o r G e b r a u c h , da sich die Flüssigkeiten, besonders wenn sie chromhaltig sind, nach Vereinigung meist rasch zersetzen. Osmiumfetroxyd 280. Osmiumtefroxyd (Synonyma: Osmiumsäure, Überosmiumsäure) wurde auf Veranlassung von F. E. S c h u l z e durch M. S c h u l t z e und R u d n e f f (65) in die Mikrotechnik eingeführt. Es ist eine schon bei Zimmertemperatur flüchtige Substanz, deren Kristalle daher in zugeschmolzenen Glasröhrchen zu

§ 281—283.

Fixierung (Osmiumtetroxyd)

65

0,1, 0,5 oder 1,0 g in den Handel kommen. Man verwendet gewöhnlich eine 1%>- oder 2°/oige wäßrige Lösung, die in einem mit gutem Schliffstopfen versehenen Kölbchen vorrätig gehalten wird. Durch Licht wird die Lösung nicht reduziert. Beim Arbeiten mit Osmiumtetroxyd ist zu beachten, daß seine Dämpfe die Schleimhäute sehr stark reizen. Ein Nachteil ist der hohe Preis (1 g ca. 9.— RM.). Die allgemein gebräuchliche Bezeichnung »Osmiumsäure« ist i m Grunde g e n o m m e n unrichtig, da ihr in Wirklichkeit die Eigenschaften einer Säure fehlen. Das Ph der Osrrnumsäurelosungen hängt w e i t g e h e n d vom Ph des zur Lösung b e nutzten Wassers ab. Bei einer älteren Lösung fanden P e t r u n k e w i t s c h u n d P i c k f o r d ca. 7,6, doch war die Alkalität durch das weiche Glas der Flasche bedingt. Bei einer frisch bereiteten in P y r e x g l a s befindlichen Lösung ergab sich ein p H v o n 6,1. Hier war die schwache Acidität durch Spuren von Kohlensäure verursacht. Ansetzen der Lösung: Zunächst wird nach Entfernung der Etikette die A u ß e n seite des Glasröhrchens sauber gereinigt. Dann w e r d e n die Kristalle durch leichtes Schütteln und Klopfen möglichst vollständig in die untere Hälfte des Röhrchens befördert und dieses selbst in der Mitte mit einer Feile sorgfältig ringsum angefeilt. Sodann faßt man f beide Hälften des Röhrchens mit einem Tuch und bricht die obere Hälfte des senkrecht gehaltenen Röhrchens ab. D i e Feilstelle m u ß s o t i e f s e i n , d a ß d i e s l e i c h t u n d o h n e Z e r s p l i t t e r'n v o r s i c h g e h t . Hierauf schüttelt man die in der unteren Hälfte angesammelten Kristalle sogleich in ein Meßkölbchen entsprechender Größe, spült die i m Röhrchen evtl. noch haftenden Substanzreste mit dem Lösungsmittel nach u n d füllt das Kölbchen bis zur Ringmarke auf. Die Auflösung der Kristalle benötigt m e h rere Stunden.

281. Da Osmiumtetroxyd durch organische Substanz (auch durch Staub u. dgl.) sehr leicht reduziert wird, so ist beim Ansetzen der Lösung mit besonderer Sorgfalt darauf zu achten, daß ganz reines dest. Wasser benutzt wird (am besten aus Glas redestilliert). Auch die Flasche (am besten aus Pyrexglas) ist sorgfältig zu reinigen. Trotz aller Vorsicht wird man aber immer wieder erleben, daß sich die Lösung nach kürzerer oder längerer Zeit durch Reduktion schwärzt und dadurch verdirbt. Ich selbst verwende daher z u r L ö s u n g d e s OsÜ4 s e i t v i e l e n J a h r e n s t a t t d e s d e s t . W a s s e r s e i n e 0,l°/o i g e C h r o m s ä u r e l ö s u n g . Lösungen dieser Art bleiben in mit Schliffstopfen verschlossenen Glaskölbchen jahrelang ohne die geringste Reduktion klar (s. auch § 291). 282. P- M a y e r empfahl zur Verhinderung der Reduktion zu je 100 ccm Lösung 10 Tropfen einer 5°/oigen Sublimatlösung = 0,4 ccm zu setzen, wodurch jedoch das Verderben der Lösung, w i e ich beobachtete, nicht immer verhindert wird.

283. Wirkungsweise: Die Osmiumsäure vermag von allen zur Zeit bekannten Fixierungsmitteln das Strukturbild der Zelle ohne Schrumpfung am lebensähnlichsten zu erhalten. Bei Abwesenheit von Säure konserviert und erhärtet sie das Gewebe, ohne mikroskopisch sichtbare Ausflockungen hervorzurulen, da die durch Aggregation sich bildenden Teilchen unterhalb der Grenze der mikroskopischen Sichtbarkeit liegen ( B e r g 27). Es besteht also in der kolloidchemischen Wirkungsweise gegenüber anderem Fixieren kein grundsätzlicher, sondern lediglich ein gradueller Unterschied in der Größenordnung der ausgeflockten Teilchen. Weiterhin ist bei der formgetreuen Erhaltung cytoplasmatischer Strukturen durch OSO4 und ihrer relativen Unempfindlichkeit bei der Nachbehandlung (s. § 200) von Bedeutung, daß OSO4 auch die Fettstoffe und Lipoide weitgehend stabilisiert ( Z e i g e r 38). Die natürlichen Farben der ver5

R o m e i s , M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u l l .

66

Fixierung

§ 284—287.

schiedenen Gewebe werden durch Oxydation in verschiedenem Grade verändert. So werden z. B. die Kerne schmutzig gelb, das Protoplasma, Muskelfasern, elastische Fasern graubraun; Fette und F6ttsubstanzen färben sich je nach ihrer Beschaffenheit gelbbraun bis schwarz (s. § 1053 ff.). Bei der ausgezeichneten fixierenden Wirkung bedeutet es einen großen Nachteil, daß das Diffusionsvermögen der Osmiumsäure nur sehr gering ist, so daß ihre günstige Wirkung nur an der Oberfläche des Präparates in einer sehr schmalen Zone zur Geltung kommt. "An den zu äußerst gelegenen Zellen kommt es leicht zu Überfixation; die Zellen werden dabei glasig und lassen keine Struktur mehr erkennen. Nach den Messungen von T e l l y e s n i c z k y dringt die 2°/oige Lösung etwas rascher ein als die 0,5.- und l°/oige (l°/'oige Lösung in 4 Stunden: SU—1 mm; 2°/oige Lösung: 1—21h mm; in 24 Stunden: 1—11 h mm bzw. 2—3 mm). Weiteres über 0 s 0 4 bei A. F i s c h e r 99, T e l l y e s n i c z k y , A. M e y e r 20, B e \ g 27, Z e i g e r 38).

284. Anwendungsweise: a) i n w ä ß r i g e r L ö s u n g . Möglichst kleine (1 bis 2 mm dicke) Stückchen kommen 1—2 Tage lang in die mindestens öfache Menge einer 1—2°/oigen Lösung von Osmiumtetroxyd. Hierauf wird 24 Stunden lang in fließendem Wasser gewaschen. Siehe auch § 684. Bei der Fixierung benützt man am besten kleine, mit eingeschliffenem Deckel versehene Wägegläschen.

285. b) in D a m p f f o r m. Bei sehr kleinen und dünnen Objekten, z. B. Blutoder Organausstrichen, Protozoen, feinen Membranen kann die Fixierung auch durch Osmiumdämpfe vorgenommen werden. Die betreffenden Zellen werden dabei außerordentlich rasch getötet und -fixiert, wodurch ihre Form sehr gut erhalten bleibt (z. B. Pseudopodien u. dgl.). Die O s m i u m r ä u c h e r u n g erfolgt in der Weise, daß man auf den Boden einer gut verschließbaren Glasdose einige Tropfen der 1—2°/oigen Osmiumsäure gibt, und das Objekt so darüber bringt, daß es mit der Flüssigkeit selbst nicht in Berührung kommt, den Dämpfen aber voll ausgesetzt ist. Einzelne Zellen, dünne Ausstriche sind nach x/2—1 Minute fixiert, dickere Ausstriche, Membranen in 1—3 Stunden. Man lasse die Dämpfe nicht länger einwirken als notwendig, um Überfixation zu vermeiden. Flemmingsche Flüssigkeit läßt sich zur Räucherung nicht verwenden, da die ihr beigemengten Essigsäuredämpfe grobe Gerinnungen hervorrufen". Sehr wertvoll ist die Osmiumräucherung auch zur Vorfixierung von Gefrierschnitten unfixierten Materials (s. § 525).

286. K o n s e r v i e r u n g d e r O s m i u m s c h w ä r z u n g . Die durch die Einwirkung der Osmiumsäure bedingte Schwärzung von Fetten und fettartigen Substanzen Wird im Kanadabalsam mit der Zeit gewöhnlich stark angegriffen. Um sie haltbarer zu machen, überträgt man die Objekte nach dem Auswaschen mit Wasser in 70°/oigen Alkohol, dem ein kleiner Kristall Natriumsulfid beigefügt ist ( H e i d e n h a i n 07); s. auch § 1057, sowie § 846 und 849 (Einschluß der osmierten Präparate). 287. F ä r b u n g n a c h O s m i u m f i x i e r u n g . Paraifinschnitte von Osmiummaterial lassen sich mit den gewöhnlichen Methoden meist nur schlecht färben. F l e m m i n g empfiehlt deshalb Stückfärbung mit Hämatoxylin oder Alaunkarmin; besonders schön werden dabei Retinapräparate. — O. S c h u l t z e überträgt die Objekte, die mit l°/oiger Osmiumsäure und dann mehrere Tage mit l°/oiger Kaliumbichromatlösung behandelt wurden, ohne Auswaschen direkt in Alauncochenille. Die Kerne färben sich dabei sehr gut. — Paraffinschnitte färbt

§ 288—291.

Fixierung (Osmiumgemische)

67

man am besten mit Safranin s. § 691 ff., nach F 1 e m m i n g s. § 961 oder nach L a n e - B e n s l e y s. § 2227. 288. D i e B l e i c h u n g d e r O s m i u m s c h w ä r z u n g erfolgt nach der Palschen Methode mit übermangansurem Kalium und Oxalsäure s. § 983 oder mit Wasserstoffsuperoxyd nach § 1013. Die Präparate gewinnen in letzterem Falle zum Teil ihre Färbbarkeit wieder (O v e r t o n 1890). Eine restlose Beseitigung des Metalls ist, wie W. J. S c h m i d t (37) am Verhalten der Doppelbrechung bei osmierten Nerven zeigte, schwierig. Sie gelingt nur mit Chlorbehandlung (nach § 1118), doch wird dabei auch die übrige Markscheidensubstanz stark angegriffen.

Osmiumgemisdie 289. Häufig wird Osmiumtetroxyd in Verbindung mit Chromsäure oder Kaliumbichromat angewandt. Dabei bestehen in der Wirkung große Unterschiede zwischen Gemischen m i t und solchen o h n e oder nur geringem Essigsäurezusatz. Zur ersten Gruppe zählen die Flemmingsche und die Hermannsche Flüssigkeit. Sie liefern für Kernstudien ausgezeichnete Resultate; das Cytoplasma und seine verschiedenen Komponenten werden dagegen infolge des hohen Essigsäuregehaltes, der ein »saures Fixationsbild« bewirkt (siehe § 203), nur schlecht erhalten. Zur zweiten Gruppe gehören die Gemische nach B e n d a , M e v e s und namentlich nach C h a m p y. Durch diese werden Cytoplasma, Mitochrondien und Netzapparat vortrefflich fixiert. a) M i t s t a r k e m

Essigsäuregehalt

290. C h r o m - O s m i u m - E s s i g s ä u r e nach F l e m m i n g (82, 95a). Für gewöhnlich kommt das sog. s t a r k e G e m i s c h zur Anwendung. Zusammensetzung: l°/oige Chromsäure 15 ccm; 2%>ige Osmiumsäure 4 ccm; Eisessig 1 ccm (a. auch § 291). H a n c e (17) setzt der Flemmingschen Flüssigkeit zur Steigerung ihres Diffusionsvermögens vor Gebrauch 0,5°/o Harnstoff zu und läßt sie auf Eis einwirken (s. auch § 942).

Anwendung: Da die Osmiumsäure nur sehr langsam in das Gewebe eindringt, dürfen in dem Gemisch nur ganz kleine Stückchen von 1—3 mm Seite fixiert werden. Anhaftendes Blut soll vorher jpit Filtrierpapier vorsichtig abgetupft werden, da dasselbe nach seiner Fixierung dem weiteren Vordringen der Flüssigkeit sehr hinderlich ist. Man läßt die Flüssigkeit, bei der das 5fache Volumen der Stückgröße ausreicht, in kleinen, mit Glasschliffstopfen versehenen Gläschen wenigstens 24 Stunden (besser einige Tage) einwirken; aber auch wochenund monatelange Einwirkung schadet nicht. Nach der Fixierung muß 24 Stunden lang in Brunnenwasser gründlich ausgewaschen werden; dann steigender Alkohol, Einbettung in Paraffin, Färbung mit Eisenhämatoxylin (s. § 672), Safr anin-Gentianaviolett-Orange (s. § 961) oder nach L a n e - B e n s l e y (§ 2227). Wirkungsweise: Die fixierende Wirkung der Flemmingschen Flüssigkeit unterscheidet sich in den einzelnen Zonen des Präparates recht erheblich, da die Komponenten des Gemisches sehr verschieden rasch eindringen. Die günstige, wertvolle Wirkung der Ösmiumsäure kommt hauptsächlich in der äußeren Zone zum Ausdruck, während sich im Innern mehr der Einfluß der Essigsäure, die der Osmium- und Chromsäure vorauseilt, geltend macht. Die Oberfläche ist häufig überfixiert. 291. Da die wäßrige Lösung von Osmiumtetroxyd leicht verdirbt, ist es nach meinen Erfahrungen sehr zu empfehlen d a s O s m i u m t e t r o x y d g l e i c h 5*

68

Fixierung

§ 292—300.

i n C h r o m s ä u r e zu l ö s e n . Diese Stammlösung ist gut verschlossen (Schliff stopfen!) jahrelang haltbar. Um die Mengenverhältnisse der Flemmingschen Flüssigkeit zu bekommen, löst man 0,5 g OsÜ4 in 120 ccm einer l°/oigen Chromsäure (aufgerundet von 118,7 ccm). Kurz vor Gebrauch setzt man zu 19 ccm dieser Stammlösung 1 ccm Eisessig. 292. Viel weniger gebraucht wird die s c h w a c h e Flemmingsche Flüssigkeit, die sich folgendermaßen zusammensetzt: l°/oige Chromsäure 25 ccm, 2°/oige Osmiumsäure 5 ccm, 1% Essigsäure 10 ccm, dest. Wasser 60 ccm. Fixierungsdauer: 24 Stunden bis Wochen. Nachbehandlung wie bei § 290. Das F o l sehe Gemisch zeigt nur unwesentliche Abänderungen. Es ist entbehrlich.

293. Die H e r m a n n s c h e F l ü s s i g k e i t besieht aus l°/oiger wässeriger Platinchloridlösung 15 ccm; 2°/oiger wässeriger Osmiumsäure 4 ccm; Eisessig 1 ccm. Bfehandlung wie mit F l e m m i n g scher Flüssigkeit ( H e r m a n n 93). Erfolg wie bei Flemmingscher Flüssigkeit. 294. Nach F l e m m i n g quellen die chromatischen Substanzen in H e r m a n n s c h e r Flüssigkeit etwas, wodurch z. B. die frühen Verdoppelungsstadien der Chromosomen an den mit ihr fixierten Objekten nicht zu sehen sind. 295. Nach der H e r m a n n sehen wie F l e m m i n g sehen Lösung und ähnlichen Osmiumgemischen kann man die Objekte auf 12—24 Stunden in rohen Holzessig legen. Dann wäscht man kurz aus und behandelt mit Alkohol. Es tritt hierbei eine eigentümliche Färbung des Objektes ein, die eine nachträgliche Färbung oft entbehrlich macht ( H e r m a n n 93).

b) M i t s c h w a c h e m o d e r f e h l e n d e m E s s i g s ä u r e g e h a l t 296. Nach B e n d a : l°/oige Chromsäure 15 ccm, 2°/oige Osmiumsäure 4 ccm, Eisessig 2—3 Tropfen (s. auch § 970); oder 19 ccm der in § 291 angegebenen Stammlösung + 2—3 Tropfen Eisessig. 297. Nach M e v e s : 0,5°/oige Chromsäure gelöst in l°/oiger NaCl-Lösung 15 ccm, 2°/oige Osmiumsäure 4 ccm, Eisessig 2—3 Tropfen (s. auch § 971). v. W i n i w a r t e r empfiehlt dieses, für zarte Objekte angegebene Gemisch auch für K e r n studien sehr. E r fügt nach dem Vorschlag von H a n c e (s. § 290), vor Gebrauch 1 /2°/o Harnstoff und fixiert auf Eis, wobei die feinen Zellstrukturen besser e r halten bleiben.

298. Nach C h a m p y : l°/oige Chromsäure 7 ccm, 3°/oiges Kaliumbichromat 7 ccm, 2°/oige Osmiumsäure 4 ccm; oder 11 ccm der § 291 angegebenen Stammlösung + 7 ccm 3°/oige Kaliumbichromatlösung. Ausgezeichnet für Mitochondrien (s. § 972) und Golgi-Substanz (s. auch § 1009 und 1015). Phosphorwolframsäure

299. R a w i t z (09) fixiert in Phosphorwolframsäure, welche »eines der mächtigsten Fällungsmittel der Eiweißstoffe« ist. Zusammensetzung: P h o s p h o r w o l f r a m s ä u r e in Lösung (K a h 1 b a u m) 40 ccm; A l k o h o l 9 5 % 50 ccm; E i s e s s i g 10 ccm. Letzterer wird erst vor Gebrauch zugesetzt. Nach 24 Stunden direkt in 7 0 % Alkohol usw. Die Alkohole sollen oft gewechselt werden und bis zu 48 Stunden einwirken. Pikrinsäure

300. Die Pikrinsäure findet in der Fixierungstechnik sehr häufige Anwendung, besonders in Verbindung mit anderen Substanzen wie Formol, Eisessig, Salpetersäure, Sublimat, während sie für sich allein nur selten gebraucht wird. Von den zahlreichen pikrinsäurehaltigen Gemischen steht das B o u i n sehe Gemisch, das sich aus Pikrinsäure, Formol und Eisessig zusammensetzt, an erster

§ 301—306.

Fixierung (Pikrinsäure)

69

Stelle. Die Färbbarkeit bleibt in allen Pikrinsäuregemischen sehr gut erhalten. Bei Untersuchung auf Kalkgehalt ist zu beachten, daß Pikrinsäure schwach entkalkend wirkt. 301. Man gebraucht die Pikrinsäure in der Fixierungstechnik gewöhnlich in Form einer gesättigten wäßrigen Lösung, der dann die anderen Flüssigkeiten vor Gebrauch zugesetzt werden. Zur Bereitung der Vorratslösung, die unbegrenzt haltbar ist, gibt man in eine 1—2-Liter-Flasche 30—50 g Pikrinsäure, füllt mit heißem dest. Wasser auf, schüttelt gut durch und läßt erkalten. Bei Zimmertemperatur lösen sich in 100 ccm Wasser etwa 1,2 g, so daß sich also in der erhalteten Lösung noch ein großer Überschuß von ungelösten Kristallen am Boden absetzt. Wenn die Lösung aufgebraucht ist, wird zum Bodensatz wieder heißes Wasser zugesetzt usw. Um stets Vorrat zu haben, arbeitet man am besten mit 2 Vorratsflaschen.

302. Das A u s w a s c h e n d e r P i k r i n s ä u r e erfolgt beinahe ausnahmslos nicht mit Wasser, sondern mit 70—80°/oigem Alkohol, da die durch Pikrinsäure hervorgerufenen Fällungen größtenteils wasserlöslich sind. Außerdem treten beim Einlegen in Wasser im Bindegewebe Quellungen auf. Der Alkohol soll beim Auswaschen einige Male gewechselt werden. Ein v ö l l i g e s A u s w a s c h e n der Pikrinsäure ist jedoch für gewöhnlich unnötig. Wenn die Entfernung der Pikrinsäure aber wie bei Celloidineinbettung erwünscht ist, dann erfolgt sie am raschesten mit Hilfe von verdünnter Salpetersäure, z. B. mit dem von B o 1 c e k angegebenen Gemisch (§ 306). 303. Die bei Arbeiten mit Pikrinsäure leicht eintretende Gelbfärbung der Finger läßt sich durch Waschen mit einem chlorhaltigen Waschmittel beseitigen. 304. Für sich allein wird die Pikrinsäure zum Fixieren nur mehr sehr selten verwendet, da sie als solche nicht sehr rasch eindringt (nach T e l l y e s n i c z k y in 0,75°/oiger Lösung in 12 Stunden nur 1—2 mm) und ziemlich starke Schrumpfungen hervorruft, besonders im Protoplasma. Man gebrauchte^ gewöhnlich die gesättigte wäßrige Lösung, in der man, je nach Größe, die Objekte 1—24 Stunden oder länger fixierte. Pikrinsäuregemische

305. Pikrinsäure-Formol-Eisessig. Dieses von Bouin angegebene Gemisch gehört zu den besten Fixierungsflüssigkeiten. Die relativ rasch eindringende Flüssigkeit ist sowohl für Übersichtspräparate wie f ü r feinere Untersuchungen sehr zu empfehlen. Auch zur Fixierung von Embryonen ist sie sehr geeignet. Die Färbbarkeit der Gewebe ist sehr gut. Die kollagenen Fasern quellen in ihr etwas auf; Fette und Lipoidsubstanzen werden weniger gut erhalten. Zur Darstellung von Mitochondrien und Netzapparat ist sie nicht brauchbar. Die schrumpfende Wirkung beträgt in der Flüssigkeit nur 21/2°/o, weshalb die Lösung auch zur Konservierung von Oberflächenbildern (Embryonen) zu empfehlen ist. Bei der nachfolgenden Alkoholbehandlung kommt es zu einer Schrumpfung von ca. 10°/o, nach Paraffineinbettung beträgt sie im ganzen ca. 20%> ( P a t t e n und P h i 1 p o 11). Zusammensetzung und Anwendungsweise: Gesättigte wäßrige Pikrinsäure 15 ccm, Formol 5 ccm, Eisessig 1 ccm. Die Vereinigung der vorrätig gehaltenen Flüssigkeiten erfolgt vor Gebrauch. Fixierungsdauer je nach Größe 2—24 Stunden, jedoch ist auch tagelange Einwirkung unschädlich. Nach der Fixierung überträgt man sogleich in 70—80°/oigen Alkohol, der 2—3mal gewechselt wird. 306. Bei C e l l o i d i n e i n b e t t u n g v o n B o u i n - f i x i e r t e m M a t e r i a l kann man häufig feststellen, daß die Präparate selbst nach langem Verweilen in

70

Fixierung

§ 307—311.

den Celloidinlösungen nur unvollständig durchtränkt sind und beim Schneiden dann bröckeln. Zur Behebung dieses Mangels bringt B o 1 c e k (30) die Präparate nach ihrer Durchführung bis zum 96°/oigen Alkohol, aus diesem für 10—48 Stunden in folgendes ölgemisch: Zedernholzöl 10 ccm, abs. Aethylalkohol 80 ccm, Origanumöl 20 ccm, Salpetersäure 10 ccm. Die Objekte werden hierauf wieder f ü r 24—48 Stunden in 96°/oigen Alkohol gelegt, der 2—3mal gewechselt wird. Weiter wie bei gewöhnlicher Celloidineinbettung. Die Präparate lassen sich nun ohne Bröckeln gut schneiden. Das Bröckeln beruht nach B. auf der Bildung von Kaliumpikrat, durch das das Eindringen des Celloidins verhindert wird. Es wird durch das 'salpetersäurehaltige ölgemisch gelöst und entfernt. Das Gesagte gilt nach meinen Erfahrungen auch für die Modifikationen der Bouinschen Flüssigkeit und die verschiedensten Arten der Celloidinbettung. M o d i f i k a t i o n e n der B o u i n s c h e n

Flüssigkeit:

307. L a n g e r o n vereinfacht die Bereitung d e r Bouinschen Flüssigkeit dadurch, daß er die P i k r i n s ä u r e in v e r d ü n n t e m F o r m o l löst (40°/oiges F o r m o l 1 Teil, dest. Wasser 3 Teile, P i k r i n s ä u r e im Überschuß). Zu 100 ccm dieser h a l t b a r e n S t a m m l ö s u n g setzt m a n dann kurz v o r G e b r a u c h 5 ccm Eisessig. 308. Eine von D u b o s c q - B r a s i l angegebene Modifikation eignet sich infolge ihres Alkoholgehaltes besonders zur Fixierung schwer durchdringlicher Objekte, z. B. von Arthropoden. H e r s t e l l u n g : 80°/oiger Alkohol 150 ccm, Pikrinsäure 1 g. Unmittelbar vor Gebrauch fügt man 60 ccm Formol (40°/oig) und 15 ccm Eisessig zu. Nach Fixierung direkt in 90°/oigen Alkohol. 309. H o l l a n d e (18) erreicht durch Zusatz v o n n e u t r a l e m essigsaurem K u p f e r eine e r h ö h t e K o n z e n t r a t i o n von P i k r i n s ä u r e . D u r c h die Lösung w e r d e n auch P e p t o n e u n d Lipoide erhalten. H e r s t e l l u n g . : Man löst in der Reibschale 2,5 g n e u t r a l e s K u p f e r a z e t a t in 100 ccm dest. Wasser u n d f ü g t d a n n l a n g s a m 4 g P i k r i n s ä u r e zu. Nach Lösung wird filtriert. Z u m F i l t r a t k o m m e n 10 ccm F o r m o l u n d 1 ccm Eisessig. Die Lösung ist h a l t b a r . F i x i e r u n g s d a u e r : 3 Tage, d a n n 24 S t u n d e n in 3mal gewechseltes dest. Wasser u n d steigenden Alkohol. 310. E. A l l e n (16) empfiehlt folgende als B-15 bezeichnete Modifikation der Bouinschen Flüssigkeit: gesättigte w ä ß r i g e P i k r i n s ä u r e 75 ccm, ehem. rein. F o r m o l (Schering) 25 ccm, Eisessig 5 ccm. Dieses Gemisch wird in geschlossenem G e f ä ß auf 38° C e r w ä r m t ; d a n n werden u n t e r Schütteln 1,5 g d u n k e l r o t e C h r o m s ä u r e k r i s t a l l e (Kahlbaum) zugesetzt u n d nach Lösung derselben 2 g krist. H a r n stoff. Die erhaltene Flüssigkeit soll dunkelbraun, aber vollkommen durchsichtig sein. Trübung oder weißliche Niederschlagsbildung deutet darauf hin, daß das verwendete Formol oder die Chromsäure verunreinigt waren. Die Reinheit der Chemikalien ist f ü r die Güte der Flüssigkeit äußerst wichtig. Die Flüssigkeit soll erst unmittelbar vor Gebrauch bereitet werden. Nach 1 Stunde wird sie grünlich; sie fixiert dann weniger gut. M a n fixiert bei 37—38° C. Das Volumen eines Stückchens soll 0,5 ccm. nicht überschreiten. D a u e r höchstens 2 Stunden. L ä n g e r e E i n w i r k u n g ist schädlich u n d m a c h t das Gewebe schlecht schneidbar. D a n n Ü b e r t r a g e n in Bouinsche Fl. oder gleich Auswaschen in 70°/oigem Alkohol. Siehe auch § 2175. B 15 ist nach M c C1 u n g eine der besten Fixierungsflüssigkeiten, namentlich für Chromosomen. Modifikation von K r a l l i n g e r s . § 943. Über den Harnstoffzusatz § 942. 311. Ein von A11 e n als PF A3 bezeichnetes Gemisch besteht aus ges. wäßr. Pikrinsäure 75 T., Formol 15 T., Eisessig 10 T., Harnstoff 1 T. In diesem können die Präparate ohne Gefahr der Überfixation längere Zeit belassen werden.

§

312—320.

Fixierung (Pikrinsäure)

71

312. Die Pikrinschwefelsöure von K l e i n e n b e r g wird folgendermaßen hergestellt: Man setzt zu 100 ccm einer gesättigten, wässerigen Pikrinsäurelösung 2 ccm konzentrierte Schwefelsäure, wobei sich ein reichlicher Niederschlag bildet. Nach 24 Stunden wird abfiltriert und das Filtrat mit dem dreifachen Volumen Wasser verdünnt. Man fixiert kleine, möglichst nicht über '/¡> cm dicke Stücke ca. 3 — 6 Stunden. Die Flüssigkeit dringt rasch ein. Auswaschen in 7 0 ° / o Alkohol. Für Organe mit reichlichem Bindegewebe ist die Flüssigkeit unbrauchbar, da die Schwefelsäure dasselbe stark quellen läßt. In kalkhaltigen Objekten entsteht leicht ein kaum entfernbarer Gipsniederschlag. 313. Den letzten Übelstand vermeidet die Pikrin-Salpetersäure von P. M a y e r : 1 0 0 ccm dest. Wasser, 5 ccm Salpetersäure (spez. Gew. 1 , 1 5 3 ) , dazu Pikrinsäure bis zur Sättigung. Nach einiger Zeit wird von dem allmählich entstehenden Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat ist ohne weitere Verdünnung zum Gebrauch fertig. Anwendung wie bei § 312. Beide Flüssigkeiten eignen sich besonders zur Fixierung von Arthropoden, da sie Chitin gut durchdringen. In den meisten anderen Fällen sind sie zweckmäßiger durch die B o u i n sehe Flüssigkeit zu ersetzen. 314. Pikrinsublimat. (R a b 1 94). 100 ccm gesättigte wässerige Pikrinsäurelösung, 100 ccm gesättigte wässerige Sublimatlösung, 200 ccm Aqu. dest.; Fixierung 12 Stunden; dann ein paar Stunden in Wasser (besser zu vermeiden, R o m e i s ) , dann in Alkohol von anfangs schwacher, jedoch rasch ansteigender Konzentration, so daß das Präparat schon nach etwa 2 4 Stunden in starkem 8 0 — 9 0 ° / o Alkohol liegt. Jodtinkturzusatz zum absoluten Alkohol. Von R a b 1 f ü r Keimscheiben und namentlich ältere Embryonen empfohlen. S c h a f f e r (96) empfiehlt diese Lösung unverdünnt (also Pikrin-Sublimatlösung 33) für Gewebe und Organe. Fixierung 1 2 — 4 8 Stunden. Dann direkt in 7 0 — 8 0 % Alkohol, dem man Jodtinktur und Lithiumcarbonat zur Entfernung des Sublimats und der Pikrinsäure zusetzt. 315. M i c h a e l i s ' Gemisch: Man fügt zu dem oben angegebenen Gemisch von R a b l noch 5 ccm Eisessig. 316. Die von O. v o m R a t h angegebenen Pikrinsäuregemische mit Osmiumsäure, Platinchlorid, Sublimat üsw. werden nur mehr wenig gebraucht. Über ihre Zusammensetzung vgl. Anat. Anz., Bd. 1 1 , S. 2 8 0 — 2 8 8 , 1 8 9 5 . Platinchlorid

317. Platinchlorid wurde von C. R a b 1 (85) in einer Lösung 1:300 zur Fixierung chromatischer wie achromatischer Figuren empfohlen. Nach den Untersuchungen von T e l l y e s n i c z k y dringt eine wäßrige Platinchloridlösung in 4 Stunden nur um Bruchteile eines Millimeters in das Gewebe ein; sie gehört also zu den am schlechtesten diffundierenden Fixierungsflüssigkeiten. 318. Besser ist die Platindilorid-Sublimafmischung ( R a b l 94). l%>ige wässerige Platinchloridlösung 10,0; gesättigte wässerige Sublimatlösung 10,0; Aqu. dest. 20,0. Anwendung wie bei Pikrinsublimat s. § 314. Große Quantitäten Fixierungsflüssigkeit! Erst unmittelbar vor Gebrauch mischen! Von C. R a b l besonders für Embryonen empfohlen. Fixierungsdauer 24 Stunden; dann Auswaschen in Wasser. 319. Platinchlorid-Chromsäure ( M e r k e l s G e m i s c h ) besteht aus Platinchlorid 1 g, Chromsäure 1 g und 800 ccm Wasser. Fixierungsdauer mehrere Tage. Auswaschen in 50—r70°/oigem Alkohol. Über Platinchlorid-Osmium-Essigsäure ( H e r m a n n s Gemisch) s. § 293. Salpetersäuse

320. Die Fixierung in reiner Salpetersäure (meist 2 ccm einer Salpetersäure s{!>ez. Gew. 1,40 mit dest. Wasser auf 100 ccm aufgefüllt; nachher Auswaschen in 70°/oigem Alkohol, nicht in Wasser) ist im allgemeinen nicht zu empfehlen

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Fixierung

§ 321—325.

und entbehrlich. Die Zellstrukturen werden nur teilweise erhalten, so daß das Cytoplasma wie ausgelaugt erscheint; Kerne und Chromatinschollen zeigen vielfach ein eigentümlich bläschenartiges Aussehen. Von Bedeutung ist die Anwendung der Salpetersäure nur in jenen Fällen, in welchen, wie z. B. bei dem Molybdänverfahren B e t h e s zur isolierten Darstellung der Neurofibrillen, eine Auslaugung des Protoplasmas beabsichtigt ist (s. § 1782).

Die Angaben über die Verdünnung der Salpetersäure sind in der Literatur vielfach ungenau, da häufig vergessen wird, das spez. Gewicht der Säure anzugeben. Die Angaben des vorliegenden Buches beziehen sich, wenn nicht anders vermerkt, auf eine chemisch reine Salpetersäure vom spez. Gewicht 1,400 mit 65,3°/o HNO;(. Die sog. offizineile Salpetersäure hat ein spez. Gewicht von 1,153 und nur 24,8°/o HNO3.

Salpetersäuregemische 321. Wesentlich besser als reine Salpetersäure fixiert Formol-Salpefersäure, die namentlich auch für Schälen von Eiern, Entfernen des oberflächlichen Eiweißes bei Keimscheiben u. dgl. zu empfehlen ist. Zweckmäßig fixiert man noch mit Formol-Sublimat nach. Herstellung: Formol (1:9) 3 Teile, Salpetersäure (10%) 1 Teil. 322. Nach P e r e n y i : 10,:'/oige Salpetersäure 40 ccm, absol. Alkohol 30 ccm, 0,5°/oige wäßrige Chromsäure 30 ccm. Fixierungsdauer für 3—4 mm dicke Stücke 3—5 Stunden. Nachbehandlung: 70°/oiger Alkohol usw. — Nach P. M a y e r und eigenen Erfahrungen wenig empfehlenswert. Über die Gemische nach G i l s o n s . § 340, nach P. M a y e r (Pikrinsalpetersäure) s. § 313, nach P e t r u n k e w i t s c h § 341.

Sublimat 323. Sublimat (Quecksilberchlorid, Hydrargyrum bichloratum) wurde durch L a n g (78) in die Fixierungstechnik eingeführt. Es gehört, zumal in Verbindung mit Chromsalzen, Essigsäure, Formol, Trichloressigsäure zu den gebräuchlichsten Fixierungsmitteln. F ü r sich allein angewendet, ruft es besonders im Protoplasma, weniger in den Kernen, starke Schrumpfungen hervor. Sublimat wirkt stark eiweißfällend und dringt anfangs gut in die Tiefe; doch wird das weitere Eindringen durch den entstehenden Gerinnungsmantel bald stark verlangsamt. Lipoide u. dgl. werden durch Sublimat nicht fixiert. Beim Arbeiten mit sublimathaltigen Flüssigkeiten hat man die Verwendung gewöhnlicher Metallinstrumente zu vermeiden, da durch sie Niederschläge hervorgerufen werden. Man gebraucht daher Instrumente aus Glas, Holz oder Horn. Metallinstrumente, die mit Sublimat benetzt wurden, müssen sofort gereinigt werden. Die Färbbarkeit der in Sublimat und Sublimatgemischen fixierten Objekte ist für die meisten Methoden gut. 324. Z u r H e r s t e l l u n g e i n e r g e s ä t t i g t e n w ä ß r i g e n L ö s u n g erhitzt man 1000 ccm dest. Wasser in einem 2-Liter-Kolben zum Kochen, stellt die Flamme ab, gibt 60 g Sublimat zu (beim Zusatz Vorsicht, da starkes Aufwallen), schwenkt von Zeit zu Zeit um und läßt erkalten. Dabei setzen sich am Boden der Flasche einige weiße Kristallnadeln ab.

Lösungen in reinem dest. Wasser sind nach P. M a y e r unbegrenzt haltbar. Der von manchem Autoren zur Erhöhung der Haltbarkeit empfohlene Kochsalzzusatz ist überflüssig.

325. Anwendungsweise: Zur Fixierung werden die Objekte, deren Dicke 3—4 mm nicht überschreiten soll, gewöhnlich in die gesättigte wäßrige Lösung

§ 326—329.

Fixierung (Sublimat)

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g e b r a c h t . N a c h H e i d e n h a i n (17) v e r d ü n n t m a n die g e s ä t t i g t e L ö s u n g aber besser z u r H ä l f t e m i t dest. Wasser, d a d a n n die bei V e r w e n d u n g g e s ä t t i g t e r L ö s u n g e n a u f t r e t e n d e n S c h r u m p f u n g e n g e r i n g e r sind. Die F i x i e r u n g s d a u e r s c h w a n k t je n a c h d e r G r ö ß e des O b j e k t e s . Bei ganz k l e i n e n O b j e k t e n (Protozoen, d ü n n e n M e m b r a n e n u. dgl.) g e n ü g e n s c h o n w e n i g e M i n u t e n ; 1 m m dicke S t ü c k c h e n w e r d e n g e w ö h n l i c h in V2—1 S t u n d e , 3 m m dicke in e t w a 3—4 S t u n d e n fixiert sein. Sobald die O b j e k t e d u r c h f i x i e r t sind (an d e r g l e i c h m ä ß i g w e i ß l i c h e n F ä r b u n g eines D u r c h s c h n i t t e s e r k e n n t l i c h ) , sollen sie a u s d e r F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t h e r a u s g e n o m m e n w e r d e n . Nachbehandlung: In S u b l i m a t fixierte O b j e k t e w e r d e n f ü r g e w ö h n l i c h nicht in W a s s e r a u s g e w a s c h e n , da die F ä l l u n g s p r o d u k t e z u m Teil wasserlöslich sind. M a n ü b e r t r ä g t d a h e r aus d e r F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t d i r e k t in 7 0 % i g e n Alkohol, in w e l c h e m S u b l i m a t a u c h l e i c h t e r löslich ist als in W a s s e r . 326. S u b l i m a t n i e d e r s c h l ä g e . G e w ö h n l i c h b i l d e n sich bei F i x i e r u n g in S u b l i m a t oder s u b l i m a t h a l t i g e n F l ü s s i g k e i t e n in d e n P r ä p a r a t e n kristallinische o d e r a m o r p h e Niederschläge, die n a c h P. M a y e r (18) teils a u s m e t t a l i s c h e m Q u e c k s i l b e r , teils aus K a 1 o m e 1 b e s t e h e n u n d u n t e r U m s t ä n d e n im m i k r o s k o p i s c h e n P r ä p a r a t r e c h t s t ö r e n d w i r k e n . Sie h a b e n a u c h schon V e r a n l a s s u n g zu m a n c h e r l e i I r r l e h r e n g e g e b e n . 327. Z u r E n t f e r n u n g d e r s o g . S u b l i m a t n i e d e r s c h l ä g e setzt m a n a m b e s t e n gleich n a c h d e r F i x i e r u n g zu d e m z u m A u s w a s c h e n d i e n e n d e n 70—80°/oigen Alkohol einige T r o p f e n e i n e r alkoholischen J o d j o d k a l i l ö s u n g (J2 : 2 g; K J : 3 g; 90°/oiger Alkohol 100 ccm), bis der A l k o h o l k o g n a k b r a u n gef ä r b t ist (P. M a y e r 87). A u c h alkoholische J o d t i n k t u r (10 g J o d auf 100 ccm 96°/oigen Alkohol) k a n n v e r w e n d e t w e r d e n , doch w i r d im l e t z t e r e n F a l l e e t w a e n t s t e h e n d e s r o t e s Q u e c k s i l b e r j o d i d , das in J o d k a l i löslich ist, n i c h t gelöst (P. M a y e r 18a). D i e E n t f e r n u n g d e r S u b l i m a t n i e d e r s c h l ä g e k a n n a u c h e r s t auf d e n S c h n i t t p r ä p a r a t e n erfolgen, doch r ä t S p u 1 e r (09), sie b e r e i t s n a c h d e r F i x i e r u n g am Stück vorzunehmen. Meist ist es n o t w e n d i g , a u c h die S c h n i t t e n o c h m a l s k u r z m i t J o d a l k o h o l zu b e h a n d e l n , da die S t ü c k j o d i e r u n g g e w ö h n l i c h nicht h i n r e i c h t u m alle S u b l i m a t n i e d e r s c h l ä g e zu beseitigen. Zu beachten ist, daß Jod, Jodkalium und Jodjodkalium auch einen Teil der Sublimatfällungen lösen können. Die Jodbehandlung soll also nicht länger ausgedehnt werden als zur Beseitigung der Niederschläge nötig ist. 328. Entjodung. Da J o d f ü r die m e i s t e n F ä r b u n g e n , i n s b e s o n d e r e f ü r Anilinf a r b e n , s e h r schädlich ist, so m u ß a u c h dieses w i e d e r völlig e n t f e r n t w e r d e n . H e i d e n h a i n (08a) empfiehlt, die S c h n i t t e von j o d i e r t e m M a t e r i a l dazu einige M i n u t e n i n e i n e r 0,25°/oigen N a t r i u m t h i o s u l f a t l ö s u n g zu bleichen, die m a n sich d u r c h V e r d ü n n e n aus e i n e r 2,5%>igen S t a m m l ö s u n g h e r s t e l l t . (Verd ü n n t e L ö s u n g ö f t e r s w i e d e r e r n e u e r n ! ) S p u 1 e r (10) n i m m t a u c h die E n t j o d u n g s c h o n a m S t ü c k vor. S t a r k e L ö s u n g e n v o n N a t r i u m t h i o s u l f a t (über l°/o) k ö n n e n f e i n e Z e l l s t r u k t u r e n (z. B. C h r o m o s o m e n ) leicht z u m Quellen b r i n g e n (B 6 1 a f 28). 329. Von manchen Autoren wird zur Herstellung der gesättigten Sublimatlösung an Stelle des dest. Wassers p h y s i o l o g i s c h e K o c h s a l z l ö s u n g verwendet. S t ö 1 tz n e r empfiehlt eine mit Sublimat gesättigte •t'/ä'Voige R o h r z u c k e r l ö s u n g als eine für Warmblüter isotonische Fixierungsflüssigkeit, in der das Volumen der Organe so gut wie unverändert bleibt. Dies gilt jedoch nur, solange die Organe in der Fixierungsflüssigkeit verweilen. Bei der Nachbehandlung mit

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Fixierung

§ 330—337.

Alkohol usw. kommt es zu den gleichen Volumveränderungen wie bei anderen Fixierungsflüssigkeiten (siehe auch § 202). Sub limatgemische 330. M i t Alkohol (nach v. A p ä t h y ) . Herstellung: Sublimat 3—4 g, Kochsalz 0,5 g, 50°/oiger Alkohol 100 ccm. Fixierungsdauer: 12—24 Stunden. Nachbehandlung: 70%>iger Alkohol usw. S c h a u d i n n v e r d ü n n t 2 Teile konzentrierter wäßriger Sublimatlösung mit 1 Teil absoluten Alkohols und fixiert heiß (60—70°). 331. M i t Eisessig (nach L a n g ) . Herstellung: gesättigte wäßrige Sublimatlösung 100 ccm, Eisessig 5—10 ccm. Fixierungsdauer: Vs—6 Stunden; bei größeren Stücken wird Nachfixierung mit reiner Sublimatlösung angeraten. Nachbehandlung: 70°/oiger Alkohol usw. Sublimat-Eisessig leistet besonders f ü r Kernstudien, f ü r embryonales Gewebe und f ü r bindegewebsarme Organe (z. B. Hoden, Drüsen) Gutes. 332. M i t Formol (nach H e i d e n h a i n ) . Herstellung: Sublimat 4,5 g, Kochsalz 0,5 g, dest. Wasser 80 ccm, Formol 20 ccm oder, wenn man von einer gesättigten wäßrigen Lösung ausgeht: von dieser 40 ccm, dest. Wasser 40 ccm, Formol 20 ccm. Fixierungsdauer 2—24 Stunden. Nachbehandlung: 70°/oiffer Alkohol usw. — Sublimat-Formol eignet sich auch sehr gut zur Fixierung bindegewebsreicher Organe. Das Protoplasma wird in ihm besser erhalten als in reinem Sublimat. 333. M i t Formol und Eisessig (naph S t i e v e ) : Gesättigte wäßrige Sublimatlösung 76 ccm, Formol 20 ccm, Eisessig 4 ccm. Das Gemisch fixiert sehr gut. Es gehört nach meinen E r f a h r u n g e n zu den am raschesten eindringenden Gemischen, so daß durch dasselbe auch größere P r ä p a r a t e (z. B. ganze menschliche Ovarien, Uterusstücke) gut fixiert werden. Nachbehandlung: Übertragen in 90°/oigen Alkohol. 334. Nach W o r c e s t e r : Formol (10 :90) gesättigt mit Sublimat 9 Teile, Eisessig 1 Teil. 335. S u p i f o r m e i s (nach P f u h l 32): Sublimat ges. 40 ccm, Pikrinsäure ges. 40 ccm, Formol (40°/o) 20 ccm, Eisessig 5 ccm. Dauer ca. 12 Stunden. 336. M i t Kaliumbichromat, besonders gebräuchlich in Form der Z e n k e r s c h e n F l ü s s i g k e i t . Herstellung: Müllersche Flüssigkeit 100 ccm, Sublim a t 5 g; dazu u n m i t t e l b a r vor Gebrauch 5 ccm Eisessig. Die Müllersche Flüssigkeit besteht aus Kaliumbichromat 2,5 g, Natriumsulfat 1 g, dest. Wasser 100 ccm. Statt Müllerscher Flüssigkeit kann man mit dem gleichen Erfolg auch reine 2,5—3°/oige Kaliumbichromatlösung verwenden. Ebenso in § 337 u. 338. Fixierungsdauer: je nach Größe 1—24 Stunden. (Die Größe der Stücke soll eine Dicke von 5 m m nach Möglichkeit nicht überschreiten.) Nachbehandlung: Gründliches Auswaschen in Brunnenwasser, bis dasselbe farblos bleibt (ca. 24 Stunden), steigender Alkohol mit Jodzusatz (s. § 327) usw. — Die Zenkersche Flüssigkeit dringt ziemlich rasch ein und fixiert sehr gut. Sie ist ebenso wie die nachfolgende Modifikation von H e 11 y auch f ü r Übersichtspräparate sehr zu empfehlen. Das Färbungsvermögen ist nach beiden Fixierungen f ü r die meisten Methoden sehr gut (s. auch M e r c i e r 94 u n d S p u 1 e r 10). 337. H e l l y s c h e F l ü s s i g k e i t . H e l l y setzt zur Zenkerschen S t a m m lösung u n m i t t e l b a r vor Gebrauch statt Eisessig 5 ccm Formol. Fixierungsdauer: 1—6 Stunden. Besonders bei hämatologischen Untersuchungen soll diese Zeit-

§ 338—342.

Fixierung (Sulfosalicylsäure)

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dauer nicht überschritten werden. Man nehme daher die Stückchen nicht zu groß (2—4 mm dick). Nach längerer Einwirkung (1—2 Tage) gelingt auch die Darstellung der Mitochondrien. Die Blutzellen und ihre Granulationen bleiben in der H e 11 y sehen wie in der nachfolgend angegebenen M a x i m o w sehen Flüssigkeit noch besser erhalten als in der Zenkerschen Flüssigkeit. 338. M a x i m o w (09) setzt zu 100 ccm der Zenkerschen Stammlösung 10 ccm F o r m o 1 (also: Kaliumbichromat 2,5 g, Natriumsulfat 1 g, Sublimat 5 g, Wasser 100 ccm, Formol 10 ccm). Fixierungsdauer"1—6 Std. In vielen Fällen empfiehlt es sich nach M a x i m o w , zu der genannten Z e n k e r - F o r m o l l ö s u n g noch 10 ccm einer 2°/oigen O s m i u m s ä u r e l ö s u n g zuzufügen. Die Fixierungsdauer k a n n dann auf 24 Stunden und m e h r verlängert werden. Die Schnitte f ä r b e n sich gut. Das Fett w i r d osmiert. Nach F i x i e r u n g in beiden Fällen gründliches Auswaschen in" B r u n n e n w a s s e r (24 Stunden). 339. Der Vorteil der Fixierung nach § 337 oder 338 kommt erst dann voll zur Geltung, wenn die Präparate nachher in Celloidin oder Celloidin-Paraffin (s. § 464 oder 466) eingebettet werden. Bei Einbettung in Paraffin sind die Schrumpfungen oft erheblich. 340. M i t Salpetersäure. Nach G i 1 s o n : Sublimat 20 g, 60°/oiger Alkohol 100 ccm, dest. Wasser 880 ccm, Salpetersäure (spez. Gew. 1,456) 15 ccm, Eisessig 4 ccm Fixierungsdauer: je nach- Größe Va—6 Stunden. Nachbehandlung: 70°/o iger Alkohol usw. Das Gemisch dringt sehr rasch ein. Es wird besonders bei vVirbellosen (Arthropoden) angewendet. 341. Nach P e t r u n k e w i t s c h : dest. Wasser 300 ccm, absoluter Alkohol 200 ccm, Eisessig 90 ccm, Salpetersäure 10 ccm, Sublimat bis zur Sättigung (ca. 20 g). Anwendung wie bei § 340. S u b l i m a t g e m i s c h e m i t T r i c h l o r e s s i g s ä u r e s. § 344ff. Sulfosalicylsäure 342. S u l f o s a l i c y l s ä u r e w i r d zu Fixierungszwecken von S a n n o m i y a (26) empfohlen, entweder in 5°/oiger wäßriger Lösung oder besser in Verbindung mit Alkohol und Eisessig: abs. Alkohol 100 ccm, Sulfosalicylsäure 3 g, Eisessig 5 ccm. Das alkoholische Gemisch ist unmittelbar vor Gebrauch zu bereiten. 2—3 mm dicke Stückchen sind in letzterem in etwa 3 S t u n d e n durchfixiert. Sie werden dann direkt in abs. Alkohol übertragen. Als Vorzug der Sulfosalicylsäure rühmt S. ihre starke eiweißfällende Wirkung, ferner die Wasserunlöslichkeit der Eiweißfällungen, die konservierende Wirkung auf Glykogen und Lipoide, welch letztere bei Fixierungen in wäßrigen Lösungen ähnlich wie in Formol oder Kaliumbichromat schwer löslich werden. Das Diffusionsvermögen einer 5°/oigen wäßrigen Lösung steht zwischen dem einer 5°/oigen Sublimat- und 5°/oigen Trichloressigsäurelösung. Die schrumpfende Wirkung der Alkoholkomponente des Fixierungsgemisches wird durch den Sulf.-sal.-Zusatz aufgehoben (nicht aber die bei Nachbehandlung eintretende Schrumpfung!). Die Ränder von Darmstückchen u. dgl. rollen in ihr sich nach auswärts. Die Konsistenz der Präparate ist wie bei Formolfixierung. Die auf Schrumpfungsvorgänge zurückgeführten Spalträume bei Ganglienzellen treten nicht auf. Flimmerhaare, Becherzellen, Zymogenkörnchen in Drüsenzellen, Myofibrillen usw. werden sehr gut fixiert. Die Färbbarkeit der in Sulfosalicylsäure fixierten Präparate ist gut. Als Nachteil der Sulfosalicylsäure hebt S c h i l l e r hervor, daß sie die sauren Eiweiße (Nucleine) zerstört. Die mit ihr fixierten Gewebe nehmen daher mit • Methylgrün-Pyronin keine grüiie Kernfärbung mehr an. Strukturen im Bereich der basischen Eiweiße werden dagegen sehr gut fixiert.

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Fixierung

§ 343—348.

Trichloressigsäure

343. Tridtloressigsäure wurde von H o l m g r e n und H e i d e n h a i n (05b) in die Fixierungstechnik eingeführt. Sie komrht in 5—10°/oiger wäßriger Lösung zur Anwendung. Fixierungsdauer bei Stückchen von 1 mm Dicke V-2—1 Stunde, 3 mm Dicke 4 Stunden, 6 mm Dicke 12—24 Stunden. Nachbehandlung: direktes Übertragen in 96°/oigen Alkohol, der zur Entfernung der Säure mehrmals e r neuert werden muß, und mindestens 24 Stunden lang einwirken soll. Wasser und schwächerer Alkohol müssen vermieden werden, da in ihnen das Bindegewebe sehr stark quillt. Die Fixierungsflüssigkeit dringt rasch ein und fixiert gut. Von besonderem Vorteil ist in gegebenen Fällen ihre stark entkalkende Wirkung.Vgl. auch § 1619. Die Trichloressigsäurekristalle müssen in gut verschlossener Glasschliff-Flasche aufgehoben werden, da sie an der Luft zerfließen.

Trichloressigsäuregemisch 344. Nach H e i d e n h a i n (16): Sublimat 4,5 g, Kochsalz 0,5 g, dest. Wasser 80 ccm, Trichloressigsäure 2 g ( Eisessig 4 ccm, Formol 20 ccm. Fixierungsdauer je nach Größe 1—24 Stunden. Nach der Fixierung wird sogleich in 90°/oigen Alkohol übertragen, der mehrmals zu wechseln ist. Das mit dem Namen „Susa" bezeichnete, rasch eindringende Gemisch gibt ausgezeichnete Resultate. Die Färbbarkeit des Gewebes ist sehr gut. 345. Ein älteres von H e i d e n h a i n unter der Bezeichnung „Subtrie" angegebenes Gemisch besteht aus gesättigter wäßriger Sublimatlösung 100 ccm, Trichloressigsäure 2 g, Eisessig 1 ccm. Anwendung w i e in § 344.

346. R o m e i s (18) fixiert in einer Mischung von gesättigter wässeriger Su b l i m a t l ö s u n g 25 ccm; 5°/o T r i c h l o r e s s i g s ä u r e 20 ccm; F o r m o 1 5 ccm. Kleine Stücke werden nach 1—2 Stunden, größere nach 3—24 Stunden in 80—90% Alkohol übertragen, der mehrmals gewechselt wird. Die Flüssigkeit dringt rasch ein und fixiert gut. Auch stark wasserhaltige Gewebe wie z. B. Froschlarven werden in ihrer Form sehr gut erhalten. Nach den Untersuchungen von P f u h l (31) eignet sich sowohl das vorliegende wie das in § 344 angegebene Gemisch ganz besonders auch zur Fixierung von Vitalfärbungen mit Trypanblau. 347. Ein von S t i e v e angegebenes, als »T r i p i f o r m« bezeichnetes Gemisch setzt sich zusammen aus: gesättigter, wäßriger Pikrinsäure 140 ccm, 5°/oige wäßrige Trichloressigsäure 10 ccm, Formol 10 ccm. Anwendung wie in § 344. Uranylacefat und -sulfal

348. Uranylacetat und Uranylsulfat sind i n s t a r k e r V e r d ü n n u n g angewandt, nach den Untersuchungen von S c h i l l e r (30) sehr brauchbare F i xierungsmittel. Die von T e l l y e s n i c z k y hervorgehobene schlechte Diffusionsfähigkeit des Uranylacetats erklärt sich aus der Verwendung zu konzentrierter Lösungen, die zudem auch stark schrumpfend wirken. Diese Mängel, die auch den von F r i e d e n t h a l und P o l l angegebenen Gemischen anhaften, kommen bei entsprechender Verdünnung und Kombination in Wegfall. Von den zahlreichen von S c h i l l e r zusammengestellten und geprüften Fixierungsgemischen seien folgende vom Autor besonders empfohlene Lösungen angeführt: L ö s u n g 131: Gesättigte wäßrige Lösung von Uranylacetat 1 ccm, gesät-

§ 349—351a.

F i x i e r u n g (durch Kälte)

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tigte wäßrige Lösung von Sublimat 1 ccm, Stammlösung 25 ccm, destilliertes Wasser ad 100 ccm. Die »Stammlösung« b e s t e h t Wasser ad 100 ccm.

aus

K a l i u m b i c h r o m a t 8 g, M a g n e s i u m a c e t a t 4 g,

L ö s u n g 172: Gleiche Zusammensetzung mit dem Unterschied, daß an Stelle der Uranylacetatlösung eine mit physiologischer Kochsalzlösung bereitete 4°/oige Uranylsulfatlösung verwendet wird, die nach S c h i l l e r noch besser fixiert als das Acetat. Die einzelnen K o m p o n e n t e n der Gemische, die f ü r sich h a l t b a r sind, sollen erst u n m i t t e l b a r vor G e b r a u c h vereinigt w e r d e n , da die f e r t i g e n Gemische bald v e r d e r b e n . — F i x i e r u n g s d a u e r 12—24 S t u n d e n ; d a n n 2—3 S t u n d e n A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m Wasser u n d E n t w ä s s e r n in steigendem Alkohol. 349. F ü r a n a t o m i s c h - p r ä p a r a t o r i s c h e Z w e c k e h a b e n U r a n y l a c e t a t - oder S u l f a t lösungen o h n e Zusatz den Vorteil, d a ß sie w o h l fixieren, a b e r nicht h ä r t e n . Die Gewebe b l e i b e n d a h e r weich u n d b e w a h r e n i h r e n a t ü r l i c h e Konsistenz, wie w e n n sie frisch w ä r e n . D e r a r t i g e P r ä p a r a t e d ü r f e n aber, d a sie noch quellen können, n i c h t zu l a n g e g e w ä s s e r t w e r d e n . Die H ä r t u n g b e g i n n t m a n zweckmäßig in s t a r k v e r d ü n n t e m Alkohol, dessen K o n z e n t r a t i o n m a n s c h r i t t w e i s e steigert. Fixierung durch Trocknen in der Kälte 350. A 11 m a n n (94) empfiehlt, kleine O r g a n s t ü c k c h e n bei einer T e m p e r a t u r von e t w a — 25° C im V a k u u m ü b e r S c h w e f e l s ä u r e vollständig zu t r o c k n e n u n d a n schließend im V a k u u m gleich mit P a r a f f i n zu d u r c h t r ä n k e n . Nach A. bleibt dabei n e b e n a u s g e z e i c h n e t e r E r h a l t u n g der S t r u k t u r auch die R e a k t i o n s f ä h i g k e i t der Gewebe in i h r e m n a t ü r l i c h e n Z u s t a n d erhalten. Das Schwierigste ist dabei, w ä h r e n d des m e h r e r e T a g e d a u e r n d e n Trockenprozesses ein Ansteigen der T e m p e r a t u r auf ü b e r — 15° zu v e r h ü t e n , da sonst S c h r u m p f u n g e n eintreten. 351. Die Methode w u r d e neuerdings d u r c h G e r s h (32) wesentlich verbessert. G e r s h b r i n g t d a s O r g a n s t ü c k u n m i t t e l b a r n a c h d e r E n t n a h m e in flüssige L u f t , a u s der es n a c h r a s c h e m D u r c h f r i e r e n in eine auf — 20° C g e k ü h l t e T r o c k e n k a m m e r ü b e r t r a g e n wird, die d u r c h ö l p u m p e u n d Q u e c k s i l b e r d a m p f p u m p e rasch auf 0,0001 m m Hg (nach V e r d a m p f e n des Wassers auf 0,0001 mm) e v a k u i e r t wird. U n t e r diesen B e d i n g u n g e n ist das P r ä p a r a t n a c h 12 S t u n d e n vollständig trocken. Es kann d a n n im V a k u u m in 5—10 M i n u t e n in P a r a f f i n eingebettet w e r d e n . Auch gewöhnliche E i n b e t t u n g in P a r a f f i n oder Celloidin ist möglich. Wegen Einzelheiten m u ß auf die eingehende D a r s t e l l u n g v o n G e r s h verwiesen w e r d e n . Die A p p a r a t u r v o n G e r s h w u r d e von S c o t t u n d W i l l i a m s (36) verbessert. Der ganz in Metall a u s g e f ü h r t e A p p a r a t ist w e s e n t l i c h e i n f a c h e r zu bedienen s. auch H o e r r 36). 351a. V e r e i n f a c h t e s V e r f a h r e n von H a c k m a n n (42). E t w a 10X15 X 5 m m große G e w e b s s t ü c k c h e n w e r d e n sofort n a c h T ö t u n g ' d e s Tieres in eine Porzellanschale m i t A e t h e r gebracht. D a n n gibt m a n in kleinen P o r t i o n e n solange f e s t e K o h l e n s ä u r e zu, bis die a n f a n g s s e h r h e f t i g e Gasbildung a u f h ö r t und ein Bodensatz von K o h l e n s ä u r e b e s t e h e n bleibt. Die O r g a n s t ü c k c h e n sind in k u r z e r Zeit s t e i n h a r t g e f r o r e n u n d w e r d e n in diesem Z u s t a n d mit e i n e r Pinzette r a s c h auf einige L a g e n Mull in einen m i t S c h w e f e l s ä u r e oder P h o s p h o r s ä u r e a n h y d r i d beschickten, dicht schließenden E x s i k k a t o r gebracht, der scharf evak u i e r t w i r d . Die V e r d u n s t u n g s k ä l t e v e r h i n d e r t bei a u s r e i c h e n d e m V a k u u m ein A u f t a u e n des- Gewebes. Bei h ö h e r e r R a u m t e m p e r a t u r w i r d der E x s i k k a t o r zweckmäßig k ü h l gestellt. Die T r o c k n u n g d a u e r t je n a c h Größe der S t ü c k c h e n m e h r e r e S t u n d e n . Bei richtiger T r o c k n u n g b e h a l t e n sie F o r m , Größe u n d oft auch F a r b e u n v e r ä n d e r t bei. T r i t t S c h r u m p f u n g ein, so ist vorzeitiges A u f t a u e n erfolgt, das vom G e f r i e r e n bis z u m Ende der T r o c k n u n g u n b e d i n g t zu v e r m e i d e n ist. Ges c h r u m p f t e s M a t e r i a l ist u n b r a u c h b a r . D e r E x s i k k a t o r darf erst geöffnet werden,

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Nachbehandlung der Präparate

§ 352—354.

wenn er Zimmertemperatur angenommen hat, da sich die Stückchen sonst mit Feuchtigkeit beschlagen. Die. Stückchen kommen nun sofort für 2—4 Stunden in Benzol (lmal wechseln). Dann Benzol-Paraffin, weiches, hartes Paraffin, Einbetten. Die Schnitte müssen, wenn wasserlösliche Substanzen untersucht werden, trocken nach § 544 aufgeklebt werden. 352. Für mikrochemische Untersuchungen ist zu beachten, daß die Verteilung der löslichen Salze anscheinend auch bei dieser Methode infolge der Wirkung der Eisbildung auf das Protoplasma und seine Komponenten nicht unbeeinflußt bleibt (s. C h a m b e r s und H a i e , S c o t t ) . 5. KAPITEL

Die Nachbehandlung des fixierten Präparates A. Abgekürzte Verfahren 353. Dioxanmethode. Das von G r a u p n e r und W e i ß b e r g e r (31) in die mikroskopische Technik eingeführte Dioxan gestattet es, das Präparat schon d i r e k t aus der F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t in D i o x a n und aus d i e s e m in D i o x a n - P a r a f f i n und in P a r a f f i n zu ü b e r t r a g e n , wodurch die ganze Reihe der Alkohole und Intermedien erspart wird. Die Methode gibt gute Resultate und ist bei entsprechender Vorsicht (s. § 354) wegen ihrer einfachen und zeitsparenden Arbeitsweise empfehlenswert. Man führt das Präparat durch 3—4 Portionen Dioxan: der Boden der einzelnen Gefäße wird dabei mit einer Schicht von gebranntem Kalk (CaO) bedeckt, der das aus dem Präparat ins Dioxan übergehende Wasser (bzw. Alkohol) wieder aufnimmt. Die Präparate werden auf einem Zinknetz oder in einem fein durchlöcherten Porzellansieb liegend in die obere Zone der Flüssigkeit gehängt. Nach völliger Durchtränkung mit Dioxan werden die Objekte in Dioxan-Par affin übertragen, das durch Vereinigung von gleichen Teilen g e s c h m o l z e n e n Paraffins (Schmp. 56—58° C) und Dioxan bereitet wird. Man läßt das Gemisch in einer gut verschlossenen (!) Glasschlifflasche im Wärmeschrank bei 58° stehen, da es bei Zimmertemperatur erstarrt. Die Präparate bleiben hierin 1 bis 2 Stunden und kommen dann in reines Paraffin. Weitere Behandlung wie in § 419. Als Glasgefäß empfehle ich die in Abb. 2 § 367 dargestellte Art von Kappenflaschen. 354. Beim Arbeiten mit Dioxan ist zu beachten, daß D i o x a n s e h r f e u e r g e f ä h r l i c h ist und daß D i o x a n d ä m p f e sehr g e s u n d h e i t s s c h ä d l i c h sind. Alle Dioxan enthaltenden Gefäße müssen daher mit guten GlasschlifTstopfen verschlossen sein. Dioxan ist ein starkes Leber- und Nierengift. Die Erkrankung beginnt mit Rückenschmerzen und Erbrechen und führt in schweren Fällen innerhalb 5 bis 8 Tagen unter Harnsperre zum Tod. Dioxan wird nicht nur durch die Atemluft, sondern auch durch die vollständig unverletzte Haut in den Körper aufgenommen. P. H u b e r (42), der eindringlich auf die Gefährlichkeit des Dioxans hingewiesen hat, gibt folgende sehr zu beachtende Vorschriften: 1. In Wohnräumen darf mit Dioxan nicht gearbeitet werden. — 2. Der Arbeitsraum muß sich gut lüften lassen. — 3. Dioxan darf nur in Glasgefäßen mit vollkommen dichtem Schliff verwendet werden! Flüssigkeitswechsel darf nur bei geöffnetem Fenster oder unter dem Abzug erfolgen. Einatmen der Dämpfe ist zu vermeiden! Keine Flüssigkeit verschütten! Achtung auf Finger und Hände! Pinzetten und Spatel

§ 355—358.

Dioxan

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verwenden! Mit Dioxan nicht Gefrier schneiden! — 4. Der Paraffinschrank soll luftdicht abschließen oder durch ein weites Rohr mit einem gut ziehenden Kamin oder Entlüftungsrohr in Verbindung stehen. Ist dies nicht möglich, so sind die Schälchen mit Dioxan-Paraffin und die ersten Stufen mit Reinparaffin in ein passendes größeres Glasgefäß mit vollkommen dichtem Schliff zu stellen. 355. Dioxan (oder Diaethylendioxyd) ist eine klare farblose Flüssigkeit mit einem Siedepunkt von 101° C (spez. Gew. 1,040). Es mischt sich in jedem V e r hältnis mit Wasser, Methyl-, Ä t h y l - und Propylalkohol sowie mit geschmolzenem Paraffin. Fette, öle, Harze, Gummi, Eisenchlorid, Jod, Pikrinsäure, Sublimat, Hämatoxylin sowie die Fettfarbstoffe werden in Dioxan gelöst. Die meisten Teerfarbstoffe sind in wasserfreiem Dioxan unlöslich, lösen sich aber bei A n wesenheit von Wasser, z. B. Anilinblauj Eosin, Lichtgrün, Methylenblau, Safranin, Säurefuchsin. Dioxan wird jetzt von Schering in gereinigtem und in reinstem Zustande geliefert. Das erstere ist um zwei Drittel billiger und für mikrotechnische Zwecke genügend. Zur Beseitigung etwaiger Wasserspuren gibt man auf den Boden der Vorratsflasche zweckmäßig eine Schicht gebrannten Kalk (CaO). 356. Die Präparate können aus Wasser, Formol und beliebigen Alkoholkonzentrationen sowie aus einer Reihe von Fixierungsflüssigkeiten direkt in Dioxan übertragen werden. So ist z. B. eine unmittelbare Übertragung aus Formol, FormolAlkohol, Sublimat-Formol, ferner aus den Flüssigkeiten nach Carnoy, Bouin, Heidenhain (Susa), Stieve möglich. Nach Fixierung in sublimathaltigen Flüssigkeiten kann dem Dioxan zur Entfernung des Sublimats Jod zugesetzt werden. Im allgemeinen empfiehlt es sich die Präparate nach Fixierung in wasserhaltigen Fixierungsflüssigkeiten zuerst noch in 70—80°/oigen Alkohol zu bringen und dann erst in Dioxan zu übertragen. Nach Fixierung in stark alkoholischen Flüssigkeiten wird man dagegen gleich in Dioxan überführen. Nach Fixierung in chromhaltigen Flüssigkeiten ist ein Auswaschen in Wasser unerläßlich, da Chromsalze in Dioxan unlöslich sind. Die D a u e r des Aufenthaltes im Dioxan richtet sich nach der Größe des Objektes. Im allgemeinen genügen 24 Stunden. Kleine Stückchen von 1—2 mm Dicke sind aber auch schon nach 3—6 Stunden entwässert und durchtränkt. Der Erhaltungszustand der Präparate ist bei sorgfältiger Dioxanbehandlung sehr gut. Die Schrumpfung fand ich bei unmittelbarer Übertragung aus Bouin in Dioxan nur um geringes stärker als bei Einbettung über Methylbenzoat-Celloidin (siehe § 392), bei Zwischenschalten- von 80°/oigem Alkohol sogar etwas geringer. Die Farbbarkeit wird durch Dioxan nicht beeinträchtigt. Im allgemeinen ziehe ich die Einbettung über Methylbenzoat-Celloidin vor, namentlich bei bindegewebsreichen Organen. Auch konnte ich beobachten, daß sich die Schnitte bei letzterer Einbettungsweise besser und leichter strecken als nach direkter Dioxanbehandlung. 357. In geeigneten Fällen kann das Dioxan schon der Fixierungsflüssigkeit zugesetzt werden. Ein w a s s e r h a l t i g e s Gemisch setzt sich z. B. zusammen aus: gesätt. wäßr. Pikrinsäure 5 Teile, Eisessig 1 Teil, Dioxan 4 Teile. W a s s e r f r e i e Gemische sind: Gesätt. Lösung von Pikrinsäure in Dioxan 4 Teile, Eisessig 1 Teil, abs. Alkohol 4 Teile; oder Dioxan 6 Teile, Chloroform 2 Teile, Eisessig 1 Teil. Dauer bei ca. 3 mm großen Stückchen 1—2 Stunden, dann direkt in Dioxan usw. ( M c C 1 u n g 37). Die rasch arbeitenden Methoden, die ziemlich starke Schrumpfungen hervorrufen, kommen mehr für Schnelldiagnose in Betracht. 358. Auch durch Verwendung von Butyl- oder Isobutylalkohol ist eine Abkürzung der Nachbehandlung möglich. Die Präparate werden in diesem Falle nach dem Auswaschen aus 50°/oigem oder höher °/oigem Äthylalkohol (nicht aus

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Nachbehandlung des Präparates

§ 359—361.

Wasser!) in B u t y l a l k o h o l oder g e s t u f t e M i s c h u n g e n b e i d e r A l k o h o l e (jede S t u f e 1—2 S t u n d e n ) . Nach 2 4 s t ü n d i g e m V e r w e i l e n in a b s o l u t e m alkohol k o m m e n sie in kaltgesättigte, d a n n in w a r m g e s ä t t i g t e L ö s u n g r a f f i n in B u t y l a l k o h o l u n d schließlich in r e i n e s P a r a f f i n , in d e m sie 24 v e r b l e i b e n (M c C 1 u n g 37).

gebracht Buthylvon PaStunden

359. S e h e n w i r von d e n oben a n g e g e b e n e n V e r f a h r e n ab, so m u ß das fixierte P r ä p a r a t bei d e r N a c h b e h a n d l u n g e i n e R e i h e v o n F l ü s s i g k e i t e n d u r c h l a u f e n , e h e es z u r E i n b e t t u n g in P a r a f f i n o d e r Celloidin geeignet ist. M a n k a n n bei diesem P r o z e ß d e r N a c h b e h a n d l u n g z w i s c h e n A u s w a s c h e n , E n t w ä s s e r n u n d D u r c h t r ä n k e n u n t e r s c h e i d e n . In m a n c h e n F ä l l e n g e h t d e m A u s w a s c h e n n o c h e i n e D u r c h t r ä n k u n g m i t einem N e u t r a l s a l z z u r U n t e r d r ü c k u n g v o n Q u e l l u n g e n (s. z. B. § 238) o d e r e i n e I m p r ä g n i e r u n g m i t i r g e n d w e l c h e n M e t a l l s a l z e n z u r B e e i n f l u ß u n g d e r F ä r b b a r k e i t (Beizung s. z. B. § 1780) voraus. B e i all diesen P r o z e s s e n k a n n es zu S u b s t a n z v e r l u s t e n k o m m e n .

B. Auswaschen 360. Das A u s w a s c h e n erfolgt, j e n a c h d e r A r t d e r F i x i e r u n g , m i t Wasser o d e r m i t A l k o h o l w e c h s e l n d e r K o n z e n t r a t i o n . N a c h F i x i e r u n g in c h r o m - oder o s m i u m h a l t i g e n F l ü s s i g k e i t e n k o m m t g e w ö h n l i c h Wasser, n a c h p i k r i n s ä u r e h a l tigen G e m i s c h e n m e i s t 70—80°/oiger Alkohol, n a c h c h r o m f r e i e n S u b l i m a t - oder T r i c h l o r e s s i g s ä u r e g e m i s c h e n 90—96°/oiger A l k o h o l z u r V e r w e n d u n g . Die gen a u e n A n g a b e n ü b e r die jeweilige A r t d e r N a c h b e h a n d l u n g findet m a n schon i m v o r a u s g e h e n d e n A b s c h n i t t bei d e n e i n z e l n e n F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t e n v e r merkt. 361. D a s A u s w a s c h e n i n B r u n n e n w a s s e r e r f o l g t a m e i n f a c h s t e n in den von F a i r c h i l d (96) a n g e g e b e n e n P o r z e l l a n sieben, die m i t e i n e m g r o ß e n K o r k s t o p f e n v e r s c h l o s s e n u n d d a d u r c h s c h w i m m e n d e r h a l t e n w e r d e n (s. A b b . 1). Es empfiehlt sich m e h r e r e P o r z e l l a n s i e b e v e r s c h i e d e n e r Größe u n d m i t v e r s c h i e d e n e r P o r e n w e i t e v o r r ä t i g zu halten. Nach Einlegen d e r P r ä p a r a t e l ä ß t m a n d i e P o r z e l l a n siebe in einem u n t e r f l i e ß e n d e m W a s s e r s t e h e n d e n G e f ä ß s c h w i m m e n . U m ein g l e i c h m ä ß i g e s A u s w ä s s e r n zu geAbb l wasserun s währleisten, ist es r a t s a m , n i c h t zuviel P r ä p a r a t e in ein siebe nach F a i r c h i l d Porzellansieb zu g e b e n u n d die S t ü c k c h e n v o n Zeit zu Zeit e t w a s u m z u s c h ü t t e i n . Das Ubertragen kleiner Objekte aus einer Flüssigkeit in eine andere erfolgt am schonendsten mit Hilfe einer mit weiter Öffnung und mit Gummihütchen versehenen Pipette. Die Verwendung von fließendem Wasser ist nicht unbedingt erforderlich; man kann die Siebdosen auch in stehendem Wasser schwimmen lassen. In diesem Fall wird das Wasser im Laufe von 24 Stunden etwa 10—12mal erneuert. Im Bedarfsfalle läßt man die Siebe statt in Brunnenwasser in dest. Wasser, in Neutralsalzlösungen u. dgl. schwimmen. Das Auswaschen mit Hilfe der F a i r c h i l d sehen Porzellansiebe scheint mir, nachdem ich im Laufe der Zeit die verschiedensten Vorrichtungen durchgeprüft habe, am einfachsten und zweckmäßigsten zu sein. Vor den Drahtkörbchen (Schaffer u. a.) haben sie die Indifferenz und Stabilität des Materials voraus; vor den

§ 362—367.

Auswaschen. Entwässern

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mit Gaze zu verschließenden Glastuben die Einfachheit der Handhabung; vor beiden, daß man sich nicht um ein Aufhängen zu kümmern braucht, da sie ja durch den Kork schwimmend erhalten werden. Gegenüber den mit Heber arbeitenden Vorrichtungen ist das Fehlen irgendwelcher Abflußstörungen von Vorteil. Ein weiterer Vorzug ist, daß sich zahlreiche Präparate gleichzeitig behandeln lassen, ohne daß (bei Kennzeichnung der einzelnen Siebe durch Einlegen von Zetteln oder dgl.) die Gefahr einer Verwechslung besteht. Anderen Apparaten wieder sind die F.-sehen Porzellansiebe durch ihre geringen Anschaffungskosten überlegen.

362. Objekte, die so klein sind, daß man auch bei Verwendung feinporiger Porzellansiebe ein Fortschwimmen befürchten muß, wässert man am besten auf dicker Watteschicht liegend in einem größeren Gefäß in stehendem, mehrmals zu erneuerndem Wasser aus. Auch die Jenaer Glasfilterplatten lassen sich dazu verwenden. 363. Um das Spritzen des Wasserhahnes und das, besonders nervösen Leuten, lästige Geräusch des fließenden Wassers zu vermeiden, empfiehlt S c h u b e r g (10) in .den Wasserhahn einen weit durchbohrten Kork zu stecken, durch dessen Bohrung ein Bindfaden bis auf den Wasserspiegel herunterhängt.

Über die Behandlung eingetrockneter Präparate s. § 214. C. Entwässern

364. Nach dem Auswaschen der Fixierungsflüssigkeit müssen Präparate, die in Paraffin oder Celloidin eingebettet werden sollen, zunächst e n t w ä s s e r t werden, ein Vorgang, der durch Übertragen in wasserfreiem Alkohol erfolgt. Um dabei starke Zerreißungen und Schrumpfungen zu vermeiden, erfolgt die Entwässerung stufenweise, indem man allmählich von schwachprozentigem Alkohol zu stärkerprozentigem ansteigt. Für gewöhnlich ist es hinreichend, die Präparate nach Auswaschen mit Wasser durch 50-, 60-, 70-, 80- und 96°/oigen Alkohol durchzuführen, bevor sie in absolutem Alkohol ihres letzten Wassergehaltes beraubt werden. Erfolgte das Auswaschen mit Alkohol, so beginnt man die Entwässerung natürlich mit der nächst höher gelegenen Stufe (bei Auswaschen mit 70%>igem Alkohl z. B. mit 80°/oigem usw.). 365. Bei feinen zytologischen Untersuchungen ist es vorzuziehen, die Konzentration des Alkohols von 10 zu 10 Prozent zu steigern. Man füllt die Alkohole in eine fortlaufende Reihe von Gläsern und hängt die in einem Porzellansieb (s. § 61 und Abb. 1) liegenden Präparate so in die obere Schicht des Alkohols, daß die wasserhaltige Flüssigkeit bodenwärts herausdiffundieren kann. Der beim Auswaschen mit Wasser aufgesetzte Kork muß bei der Alkoholbehandlung entfernt werden. Über den Ersatz des reinen Äthylalkohols durch vergällten Äthylalkohol Isopropyalkohol s. § 386.

oder

366. Findet die Fixierung in einer stark alkoholischen Flüssigkeit statt, z. B. in Carnoyscher Flüssigkeit, so setzt die Entwässerung schon mit der Fixierung ein. Die Nachbehandlung im absoluten Alkohol kann dann entsprechend abgekürzt werden.

367. Um dem Alkohol von allen Seiten her Zutritt zu gewähren, werden die Objekte beim Entwässern auf Watte, Glaswolle oder Filtrierpapier gelegt oder noch besser in der oberen Flüssigkeitszone aufgehängt. Man kann dann deutlich sehen, wie der wasserhaltige Alkohol aus dem Präparate zu Boden sinkt. 6

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Nachbehandlung des Präparates

§ 368—370.

Bei dem aus Abb. 2 ersichtlichen, von mir angegebenen Entwässerungsgefäß liegen die Objekte in einem Porzellansieb, mit dem sie einfacher Weise von einer Alkoholstufe in die nächste übertragen werden. (Erhältlich bei Wagner und Münz, München.)

Die Dauer des Aufenthaltes in den einzelnen Alkoholen wird von der Größe und der Beschaffenheit der Objekte bestimmt; für gewöhnlich genügen für die niedrigen Konzentrationen (10—60°yoig) je 2—4 Stunden, für die höheren je 12 bis 24 Stunden. Sehr kleine Objekte (unter 1 mm Dicke) können rascher durchgeführt werden; bei ihnen ist es hinreichend, wenn jede Alkoholstufe 1—2, bzw. 2—4 Stunden lang einwirkt.

368. Die einzelnen Alkohole sollen nicht zu sehr ausgenützt, sondern des öfteren erneuert werden, da sie durch die WgefäßU"BS" den Geweben entzogenen Fette u. dgl. rasch verunreinigt werden. Sehr deutlich tritt dies bei der Nachbehandlung von Präparaten zutage, die in einer chromhaltigen Flüssigkeit fixiert wurden. Hier kommt es stets zu einer Verfärbung der einzelnen Alkohole durch extrahierte, chromhaltige Fettsubstanzen, eine Erscheinung, die sich auch durch noch so langes Auswaschen in Wasser nicht vermeiden läßt. Abb. 2.

369. Die Entwässerung der Präparate mit absolutem Alkohol ist besonders dann mit Sorgfalt durchzuführen, wenn d i e O b j e k t e d a r a n a n s c h l i e ß e n d i n B e n z o l u. d g l . ü b e r t r a g e n w e r d e n s o l l e n . Man lasse in diesem Falle die Präparate lieber ein paar Stunden zu lange in absolutem Alkohol wie zu kurz. Andererseits ist auch ein allzu langes Liegenlassen der Präparate in absolutem Alkohol zu vermeiden, da dadurch verschiedene Gewebsbestandteile sehr hart und schwer schneidbar werden. Die Behandlung mit absolutem Alkohol soll daher auch in dem genannten Falle nicht über 24 Stunden ausgedehnt werden. Im ü b r i g e n ist diese g a n z e F r a g e der Entwässerung durch die E i n f ü h r u n g von Z w i s c h e n f 1 ü s s i g k e i t e n , die n e b e n A l k o h o l auch g e r i n g e M e n g e n von W a s s e r a u f z u n e h m e n v e r m ö g e n , s e h r v e r e i n f a c h t . Ich empfehle als Zwischenflüssigkeit besonders Methylbenzoat (weiteres s. § 392). Es spielt in diesem Falle gar keine Rolle, ob der entwässernde Alkohol wasserfrei oder nur 99- oder 98°/oig ist; im Bedarfsfall lassen sich die Präparate selbst aus dem 96°/oigen Alkohol in Methylbenzoat überführen, das dann 3—4mal zu erneuern ist. Ein weiterer Vorzug der Methode ist, daß durch die Zwischenschaltung des Methylbenzoats auch etwaige bei Paraffineinbettung sehr schädliche Reste von Alkohol beseitigt werden, ferner daß man den Aufenthalt der Präparate im absoluten Alkohol ohne Schaden auf 12 Stunden beschränken kann. Noch größeren Spielraum in der Verwendung wasserhaltiger Alkohole gewährt das Dioxan, das in jedem Verhältnis mit Wasser mischbar ist und sogar die gänzliche Auschaltung des Alkohols gestattet (s. § 353 ff.). 370. Der absolute Alkohol läßt sich in der Paraffintechnik auch dadurch ausschalten, daß man nach dem Vorschlag von K i s s e r (29) die Präparate aus dem 96°/oigen Alkohol durch mehrere Alkohol-Benzolgemjsche führt; also: 1. 96°/oiger Alkohol. — 2. 3 Teile 96°/o A. + 1 Teil Benzol. — 3. 2 Teile 96°/o A. + 2 Teile B. — 4. 1 Teil 96°/o A. + 3 Teile B. — 5. 7 ccm 96°/o A. + 100 ccm Benzol. — 6. Heines Benzol. Auch Alkohol-Carbolsäuregemische (B a r t a) oder Alkohol-Carbolsäure-

§ 371—377.

Entwässern

83

Chloroformgemische (B a c s i c h) lassen sich zu diesem Zweck verwenden. Sie alle sind durch die Methylbenzoatmethode (s. § 392) und die Dioxanmethode (siehe § 353) überholt. 371. E- A l l e n empfiehlt die höherprozentigen Alkohole zu vermeiden und die Entwässerung mit Anilinöl vorzunehmen. Dasselbe wird tropfenweise dem 50°/oigen Alkohol, in dem die Präparate liegen, zugefügt, bis der Alkohol schließlich völlig durch Anilinöl ersetzt ist. Genauere Angaben s. § 2175. 372. D i e N a c h b e h a n d l u n g d e r P r ä p a r a t e in s t e i g e n d e m A l k o h o l h a t in allen F ä l l e n e i n e S c h r u m p f u n g d e r P r ä p a r a t e z u r Folge, die meist 5—10°/o der u r s p r ü n g l i c h e n G r ö ß e b e t r ä g t . Sie ist a u c h d a n n n i c h t zu v e r m e i d e n , w e n n die K o n z e n t r a t i o n s e r h ö h u n g des A l k o h o l s t r o p f e n w e i s e e r f o l g t . I m a l l g e m e i n e n ist es a u c h f ü r f e i n e U n t e r s u c h u n g e n a u s r e i c h e n d , die K o n z e n t r a t i o n des A l k o h o l s in d e r in § 365 a n g e g e b e n e n Weise v o n 10 zu 10°/o zu e r h ö h e n . 373. Manche empfehlen die Konzentration des Alkohols nur ganz langsam zu steigern. Das Prinzip der hiefür von E. A l l e n (16) angegebenen Apparatur, die von K r a l l i n g e r (28) wesentlich vereinfacht wurde, beruht darauf, daß das neue Medium tropfenweise zugeführt wird, während ein ständig durchperlender getrockneter Luftstrom f ü r eine fortwährende Durchmischung der Flüssigkeiten sorgt und gleichzeitig auch die Präparate in Bewegung hält. 374. Kleine, zarte Objekte (z. B. Algen) können in schonendster Weise nach dem Verfahren von O v e r t o n (s. § 145) entwässert werden, das auch I d e - R o z a s empfiehlt. Die Objekte werden nach 24—48 Stunden in feinen absol. Alkohol übertragen. 375. Mehrfach wurden auch Apparate konstruiert, die selbsttätig das Weiterf ü h r e n der Präparate vom Wasser bis zum Einbettungsmedium besorgen (z. B. von R a n k e 28). Sie kommen mehr f ü r pathologische Institute zur Erledigung des täglichen Einlaufmaterials als f ü r feine Untersuchungen in Betracht. 376. D i e F e s t s t e l l u n g d e r K o n z e n t r a t i o n d e s Alkohols e r f o l g t a m e i n f a c h s t e n m i t H i l f e eines A r ä o m e t e r s . W i c h t i g ist, d a ß die A b l e s u n g b e i d e r auf d e m A l k o h o l o m e t e r a n g e g e g e b e n e n T e m p e r a t u r (meist 15° C) e r f o l g t , d a die d u r c h die T e m p e r a t u r b e d i n g t e n A b w e i c h u n g e n n i c h t u n b e t r ä c h t l i c h sind. Bei h ö h e r e n T e m p e r a t u r e n zeigt die S k a l a zu hohe, bei n i e d r i gen zu g e r i n g e W e r t e . F ü r mikrotechnische Zwecke ist das nach P l a t e s Angaben hergestellte, bei Z e i s s erhältliche Alkoholometerbesteck zu empfehlen, da es auch das Arbeiten mit kleinen Flüssigkeitsmengen gestattet. 377. Ü b e r d i e V e r d ü n n u n g d e s A l k o h o l s (und a n d e r e r F l ü s s i g keiten). Z u r H e r s t e l l u n g e i n e r b e s t i m m t e n K o n z e n t r a t i o n v e r f ä h r t m a n a m e i n f a c h s t e n in f o l g e n d e r , a u c h z u r V e r d ü n n u n g a n d e r e r L ö s u n g e n g e e i g n e t e r Weise: G e g e b e n ist eine L ö s u n g v o n a°/o; g e w ü n s c h t e i n e L ö s u n g v o n b°/o. M a n n i m m t b Teile d e r a°/oigen L ö s u n g u n d f ü g t (a—b) T e i l e des L ö s u n g s m i t t e l s zu. E r g e b n i s : a Teile d e r g e w ü n s c h t e n b°/oigen Lösung. B e i s p i e l : Aus 96°/oigem Alkohol soll 70°/oiger hergestellt werden. Man nimmt 70 Teile des 96°/oigen Alkohols, fügt 96—70 = 26 Teile dest. Wassers hinzu und erhält 96 Teile 70°/oigen Alkohols. Soll a u s e i n e r L ö s u n g 1 : a e i n e solche v o n 1 : b h e r g e s t e l l t w e r d e n , d a n n n i m m t m a n a Teile d e r L ö s u n g 1 : a, f ü g t (b—a) Teile des L ö s u n g s m i t t e l s zu u n d e r h ä l t b Teile d e r V e r d ü n n u n g 1 : b. B e i s p i e l : Formol 1 :3 soll auf 1 :20 verdünnt werden. Man verdünnt 3 Teile (1:3) mit 20—3 = 17 Teilen Wasser, das gibt 20 Teile Formol 1:20 ( R i e c k e n berg). 6«

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Nachbehandlung des Präparates

§ 378—381.

Will män bei der Verdünnung eine ganz bestimmte Menge erhalten, dann füllt man c • — ccm des vorhandenen Alkohols mit destilliertem Wasser auf ii •c ccm auf. (a = gegebene Konzentration, b = gewünschte Konzentration, c = gewünschte Menge). Bei den angegebenen Formeln bleibt die bei Vornahme der Verdünnung eintretende Zusammenziehung des Alkohols unberücksichtigt. Die Unterschiede sind jedoch so gering, daß sie f ü r die Praxis der Mikrotechnik gewöhnlich vernachlässigt werden können. 378. Genaue Werte bekommt man mit der im Anhang beigegebenen Verdünnungstabelle (s. Anhang), bei deren Berechnung die Zusammenziehung des Alkohols berücksichtigt ist. Die Tabelle gibt an, wieviel Kubikzentimeter destillierten Wassers man zu 100 ccm Alkohol einer bestimmten Konzentration hinzufügen muß, um den gewünschten schwächerprozentigen Alkohol zu erhalten. Wenn man dabei exakt vorgehen will, darf man wegen der Volumveränderung des Alkohols das Wasser nicht nachfüllen, sondern muß Wasser- und Alkoholmenge in getrennten Meßzylindern abmessen und in ein drittes Gefäß zusammengießen. 379. Für gewöhnlich wird man sich außer absolutem und 96°/oigem Alkohol noch 80-, 70-, 60- und 50°/oigen Alkohol vorrätig halten. Zur Herstellung von je 1000 ccm 80°/tigen Alkohols braucht m a n bei Verwendung von 96°/o Alkohol als Ausgangsflüssigkeit: 836 ccm Alkohol + 164 ccm dest. Wasser; für 70"laigen: 730 ccm Alkohol + 270 ccm Wasser, für 60*l»igen: 630 ccm Alkohol + 370 ccm Wasser; für 50°/oigen: 530 ccm Alkohol + 480 ccm Wasser. Man bringt diese Zahlen am besten gleich auf den Etiketten der einzelnen Flaschen an. 380. Absoluter Alkohol. Der absolute Alkohol des Handels enthält stets etwa 1—2°/o Wasser. Wenn der Wassergehalt nicht größer ist, so kann der Alkohol f ü r mikrotechnische Zwecke praktisch als absolut erachtet werden. Ein geringer Wassergehalt kann insbesondere dann vernachlässigt werden, wenn die Objekte aus dem absoluten Alkohol nicht direkt in Benzol, sondern in Methylbenzoat gebracht werden, das neben dem Alkohol auch diese Wasserspuren aufnimmt (vgl. auch § 397). J B I . D i e H e r s t e l l u n g v o n a b s o l u t e m A l k o h o l a u s 96°/oigem A l k o h o l erfolgt am einfachsten und besten mit Hilfe von Ätzkalk. Man füllt eine große Flasche mit Stücken von gebranntem Kalk (CaO), schüttet den zu entwässernden Alkohol zu, so daß die Kalkstücke ihn noch überragen und destilliert nach 2—3 Tagen ab. — Will man den Alkohol schnell entwässern, dann kocht man den Alkohol mit dem Ätzkalk 1—2 Stunden auf dem Wasser- oder Wachsbad unter Rückflußkühlung, kehrt den Kühler dann um und destilliert ab (E r 1 e n m a y e r). — Enthält der zu entwässernde Alkohol mehr als 5°/o Wasser, so ist der Vorgang 2—3mal zu wiederholen. Dabei darf beim erstenmal der Raum, den der Alkohol einnimmt, n u r zur Hälfte mit Kalkstücken gefüllt werden, da sonst das Gefäß'durch allzu rasche Hydratbildung zersprengt werden kann. Bei größeren Alkoholmengen verwendet man mit Rücksicht auf die Feuergefährlichkeit an Stelle eines Glaskolbens besser eine Kupferblase, die man in einem mit Wasser gefüllten Topf erhitzt. (Abbildung eines derartigen Apparates bei H o e p k e 30.)

Will man aus dem käuflichen absoluten Alkohol auch die letzten Wasserreste entfernen, so entwässert man mit C a l c i u m ( W i n k l e r ) . Man gibt in einen

§ 382—385.

Entwässern

85

Destillierkolben 1000 ccm des zu entwässernden Alkohols, 10—20 g geraspeltes metallisches Calcium (bei M e r c k auch in kleinen Packungen gebrauchsfertig erhältlich) und einige Siedesteinchen (kleine, unglasierte Tonscherben). Nach Vorsetzen eines Kühlers und einer mit Chlorcalciumröhre versehenen Auffangflasche, wird der in einem Wasserbad oder besser auf einer elektrischen Heizplatte stehende Kolben vorsichtig nur so weit erwärmt, daß lebhafte Wasserstoffentwicklung eintritt, der Alkohol jedoch kaum überdestilliert. (Vorsicht! da bei zu starker Erwärmung die Reaktion sehr heftig ist.) Wenn nach mehrstündigem Erwärmen die Gasentwicklung aufgehört hat, dann wird die Temperatur erhöht und der Alkohol abdestilliert. Das Destillat ist ca. 99,9°/oig. Soll auch der letzte Rest entfernt werden, so wird der Vorgang mit 3—5 g Calcium nochmals wiederholt. 382. Von M i k r o t e c h n i k e r n w i r d häufig mit K u p f e r s u l f a t e n t w ä s s e r t , eine Methode, die a u c h n a c h m e h r t ä t i g e r E i n w i r k u n g keinen v o l l k o m m e n absoluten Alkohol gibt. Z u d e m e n t h ä l t d e r so b e h a n d e l t e Alkohol o f t S ä u r e s p u r e n . —• Bei A u s f ü h r u n g der Methode gibt m a n in den zu e n t w ä s s e r n d e n Alkohol pulverisiertes w a s serfreies K u p f e r s u l f a t , schüttelt m e h r m a l s d u r c h u n d läßt absetzen. Das weißliche P u l v e r f ä r b t sich u n t e r W a s s e r a u f n a h m e allmählich w i e d e r g r ü n u n d blau und m u ß d a n n d u r c h w a s s e r f r e i e s ersetzt w e r d e n . Das g e b r a u c h t e K u p f e r s u l f a t k a n n d u r c h e r n e u t e s Rösten w i e d e r seines Wassergehaltes b e r a u b t w e r d e n , indem m a n es auf d e m S a n d b a d (zweckmäßig u n t e r d e m Abzug) so l a n g e röstet, bis es wieder weiß ist. U m dabei die Bildung f r e i e r S ä u r e zu v e r h i n d e r n , setzt E 1 s c h n i g v o r h e r e t w a s geschabte K r e i d e zu. 383. D i e Prüfung des absoluten Alkohols auf Wassergehalt e r f o l g t am e i n f a c h -

sten durch Einwerfen einiger Körnchen Calciumcarbid. Bei Anwesenheit von Wasser entwickelt sich das durch seinen Geruch leicht erkennbare Acetylengas und eine Trübung durch Bildung von Calciumhydrat. T r i t t bei Z u f ü g e n einiger T r o p f e n des Alkohols zu 4—5 ccm Benzol oder Xylol T r ü b u n g auf, so b e t r ä g t der W a s s e r g e h a l t des Alkohols m i n d e s t e n s 3°/o. — U m S p u r e n von Wasser nachzuweisen, setzt m a n zu d e m zu u n t e r s u c h e n d e n Alkohol e t w a 1 m g A n t r a c h i n o n u n d e t w a s N a t r i u m a m a l g a n . W e n n wasserhaltig, Hotfärbung, wenn wasserfrei, Grünfärbung ( N e u b e r g ) . 384. Reinigung von gebrauchtem Alkohol. U m g e b r a u c h t e n A l k o h o l

wieder

verwendbar zu machen, destilliert man ihn aus einem mit Femelkühler od. dgl. versehenen Kupferkessel ab. Wenn man im Glaskolben destilliert, vergesse man nicht, in denselben einige Siedestückchen einzulegen, da sonst die Flüssigkeit stark stößt. Das farblose Destillat mißt meist 80—90 Volumprozent. Bei Destillation von altem Präparatenspiritus destillieren oft auch flüchtige Substanzen über, die dem Destillat einen üblen Geruch verleihen und schwer zu entfernen sind. Ein derartiges Destillat ist für Färbe- und Lösungszwecke nicht verwendbar. A u s d e m gleichen G r u n d v e r m e i d e t m a n beim S a m m e l n v o n g e b r a u c h t e m Alkohol d e n Zusatz von Alkohol; d e r mit Benzol, Toluol oder dgl. v e r u n r e i n i g t ist. — S e h r o f t ist der Alkohol von der F i x i e r u n g h e r d u r c h Q u e c k s i l b e r v e r u n r e i n i g t . Z u dessen Beseitigung legt m a n in d a s S a m m e l g e f ä ß einige Spiralen aus d ü n n e m K u p f e r b l e c h . J o d l ä ß t sich d a d u r c h beseitigen, d a ß m a n in den g e b r a u c h t e n Alkohol b e i m Destillieren einige Gummischlauchschnitzel gibt. 385. Prüfung auf Reinheit. Nach A b d a m p f e n von r e i n e m Alkohol soll n u r ä u ß e r s t w e n i g R ü c k s t a n d bleiben. Zwischen den H ä n d e n v e r r i e b e n , soll er keinen s t a r k e n G e r u c h hinterlassen. Bei Zusatz von S i l b e r n i t r a t darf k e i n e T r ü b u n g a u f t r e t e n . L a k m u s p a p i e r soll w e d e r gebläut noch gerötet w e r d e n . Gibt m a n zu 10 ccm des zu p r ü f e n d e n Alkohols 1 — 2 T r o p f e n einer Lösung von 1 g H ä m a t e i n u n d 1 g

86

Nachbehandlung des Präparates

§ 386—387.

Chloraluminium in 100 ccm Alkohol, so darf nach 24 Stunden noch keine Fällung aufgetreten sein (P. M a y e r 91). 386. Die h o h e B e s t e u e r u n g des reinen Äthylalkohols legt in gesteigertem Maße die F r a g e nahe, w i e weit sich derselbe in der Mikrotechnik d u r c h v e r g ä l l t e n A l k o h o 1 ersetzen läßt u n d welche A r t der Vergällung am zweckmäßigsten g e w ä h l t w i r d . Eingehende systematische U n t e r s u c h u n g e n sind d a r ü b e r mit A u s n a h m e einer ä l t e r e n Arbeit von K i t t s t e i n e r nicht veröffentlicht. Soweit ich es auf G r u n d meiner eigenen E r f a h r u n g e n beurteilen kann, läßt sich folgendes feststellen: a) Von den verschiedenen Vergällungsmitteln scheint mir P e t r o l b e n z i n am unschädlichsten zu sein. Mit Petrolbenzin v e r g ä l l t e r Äthylalkohol läßt sich sowohl zur N a c h b e h a n d l u n g u n d E n t w ä s s e r u n g der in P a r a f f i n oder Celloidin einzubettenden P r ä p a r a t e w i e zur B e h a n d l u n g der Schnitte vor u n d n a c h der F ä r b u n g benützen. Auch z u r Herstellung von Celloidinlösungen wie der meisten Farblösungen ist e r o h n e weiteres v e r w e n d b a r . E r h a t n u r den Nachteil, daß er sich bei s t a r k e r V e r d ü n n u n g mit Wasser infolge seines Gehaltes an P e trolbenzin s t a r k , t r ü b t . (Die T r ü b u n g beginnt e t w a bei V e r d ü n n u n g auf 50 bis 55°/o Alkoholgehalt.) Läßt man den stark verdünnten Alkohol einige Tage verschlossen stehen, so sammelt sich das Petrolbenzin auf der Oberfläche und der Alkohol wird, selbst bei Verdünnung auf 20—30°/o klar. Am besten nimmt man die Verdünnung in einem mit Stopfen versehenen Scheidetrichter vor. b) Der mit H o l z g e i s t ( = v e r u n r e i n i g t e m Methylalkohol) vergälllte Äthylalkohol läßt sich sowohl zur D u r c h f ü h r u n g und E n t w ä s s e r u n g vor der P a r a f f i n e i n b e t t u n g wie zur S c h n i t t b e h a n d l u n g vor u n d nach d e r F ä r b u n g v e r w e n d e n . Doch ist dabei zu berücksichtigen, daß der Alkohol infolge seines Gehaltes an Methylalkohol m a n c h e F ä r b u n g e n m i t Teerfarbstoffen (z. B. Toluidinblau) stärk e r angreift als reiner Äthylalkohol. In m a n c h e n F ä l l e n (z. B. Differenzierung der Nißlfärbung) k a n n a b e r diese Eigenschaft sogar von Vorteil sein. Im Gegensatz zu dem mit P e t r o l b e n z i n vergällten Alkohol t r i t t auch bei s t a r k e r V e r d ü n n u n g mit Wasser k e i n e T r ü b u n g ein. Für Präparate, die in Celloidin eingebettet werden sollen, scheint der mit Holzgeist vergällte Alkohol weniger geeignet zu sein, da Methylalkoholspuren Löslichkeit und Konsistenz des Celloidins beeinflussen können. Aus dem gleichen Grunde ist es auch nicht ratsam, Celloidinblöcke oder -Schnitte in mit Holzgeist oder Methylalkohol vergällten Alkohol aufzubewahren. c) Mit M e t h y l a l k o h o l und P y r i d i n b a s e n v e r g ä l l t e r 90°/oiger Alkohol (sog. d e n a t u r i e r t e r Spiritus) r u f t nach K i t t s t e i n e r (09) als Fixierungsflüssigkeit an d e n K e r n e n s t ä r k e r e S c h r u m p f u n g e n h e r v o r als reiner Äthylalkohol. Z u r N a c h b e h a n d l u n g nach F i x i e r u n g e n usw., dagegen läßt sich der Alkohol bei P a r a f f i n p r ä p a r a t e n nach Kittsteiner o h n e nachteilige W i r k u n g verwenden. Uber die Verwendbarkeit von vergälltem Alkohol zur Feuchtkonservierung naturkundlicher Objekte s. W. A r n d t (37). 387. I s o p r o p y l a l k o h o l (Hartosoll) ist sowohl zur E n t w ä s s e r u n g der P r ä p a r a t e vor der P a r a f f i n e i n b e t t u n g wie zur B e h a n d l u n g d e r S c h n i t t p r ä p a r a t e v o r und nach der F ä r b u n g zu gebrauchen. Ich k o n n t e hiebei gegenüber r e i n e m Äthylalkohol in Bestätigung d e r E r f a h r u n g e n D i e t r i c h s (30) keinen schädlichen Unterschied feststellen. Nach empfindlichen F ä r b u n g e n (z. B. Giemsaf ä r b u n g ) ist seine n e u t r a l e Reaktion sehr schätzenswert. Die Differenzierung

§ 388—389.

Durchtränkung und Einbettung

87

v e r l ä u f t i n i h m n a c h verschiedenen F ä r b u n g e n o f t l a n g s a m e r als in Äthylalkohol. Mit Wasser ist er in jedem V e r h ä l t n i s k l a r mischbar. Der »absolute« Isopropylalkohol des Handels (I. G. Farben) ist hinreichend w a s s e r f r e i ; er läßt sich selbst mit d e m gegen Wasser so empfindlichen Xylol ohne T r ü b u n g in j e d e m V e r h ä l t n i s vermischen. Nur der „absolute" Isopropylalkohol ist brauchbar. Da er mit viel geringerer Energie Wasser aus der Luft anzieht wie absol. Aethylalkohol ist er gut verkorkt jahrelang wasserfrei zu halten. Daher geht aber auch das Entwässern der Präparate in ihm langsamer vor sich. So müssen z. B. mittelgroße Objekte aus 92bis 95°/o°igem Alkohol für 3X24 Stunden in 3 Partien Isopropylalkohol gebracht werden. Dann in I. + Benzol 1 : 1 oder I. + Chloroform 1 : 1, hierauf Benzol oder Chloroform, Paraffin. F ü r C e l l o i d i n - E i n b e t t u n g ist der Isopropylalkohol dagegen u n b r a u c h b a r , da Celloidin in i h m praktisch unlöslich ist. Selbst ein Gemisch von Isopropylalkohol u n d Ä t h e r löst Celloidin n u r sehr langsam und in geringen Mengen. F ü r das E n t w ä s s e r n con Celloidinblöcken und Celloidinschnitten läßt sich diese Eigenschaft des Isopropylalkohols dagegen m i t Vorteil v e r w e n den. B u t y l a l k o h o l löst gequollenes Celloidin, nicht a b e r trockenes.

6. KAPITEL

Durchtränkung und Einbettung 388. F i x i e r t e O b j e k t e besitzen nicht i m m e r die z u m Schneiden nötige Beschaffenheit; so sind m a n c h e so weich, daß sie dem schneidenden Messer nicht genügend Widerstand bieten, andere e n t h a l t e n große H o h l r ä u m e u n d w ü r d e n b e i m Schneiden auf das s t ä r k s t e deformiert, wieder a n d e r e sind zu klein und zu zart, als daß m a n sie ü b e r h a u p t mit den F i n g e r n anfassen k ö n n t e usw. All dem k a n n m a n d a d u r c h abhelfen, daß m a n das O b j e k t m i t e i n e m M e d i u m durchtränkt, d a s n a c h h e r z u e i n e r f e s t e n , g u t s c h n e i d b a r e n M a s s e e r s t a r r t . D a n n schneidet sich das Ganze wie die Einbett u n g s m a s s e allein, vorausgesetzt, daß das O b j e k t nicht h ä r t e r als letztere ist. J e nach d e r zur D u r c h t r ä n k u n g b e n ü t z t e n Substanz w e r d e n dabei verschiedene Wege eingeschlagen. Die gebräuchlichsten E i n b e t t u n g s m i t t e l sind Paraffin, Celloidin u n d Gelatine.

Dazu kommt für besondere Zwecke die Einbettung in C e l a d a l (s. § 480 f.). 389. R i c h t l i n i e n f ü r d i e A n w e n d u n g d e r e i n z e l n e n E i n b e t t u n g s m a s s e n . F ü r die Mehrzahl d e r bei histologischer u n d embryologischer U n t e r s u c h u n g verfolgten Zwecke ist Paraffin (zuerst K 1 e b s 1869) das geeignetste Einbettungsmittel. Es ist unentbehrlich, w e n n es sich d a r u m h a n delt, sehr d ü n n e Schnitte (1—5 ju) zu machen. Serien lassen sich schneller und leichter v o n P a r a f f i n m a t e r i a l wie von Celloidinmaterial anfertigen. E i n weiterer Vorzug ist, daß die E i n b e t t u n g in P a r a f f i n rascher u n d einfacher v o r sich geht u n d die in P a r a f f i n eingebetteten O b j e k t e beliebig lange a u f g e h o b e n w e r d e n können, o h n e daß eine V e r ä n d e r u n g zu b e f ü r c h t e n w ä r e . A m besten v e r f ä h r t m a n daoei nach der in § 392 angegebenen Methode, bei d e r die P r ä p a r a t e mit Methylbenzoat oder Methylbenzoat-Celloidin v o r b e h a n d e l t werden. Ein Nachteil j e d e r P a r a f f i n e i n b e t t u n g ist, daß es w ä h r e n d der D u r c h t r ä n k u n g mit P a raffin zu einer S c h r u m p f u n g von 8—20°/o k o m m t .

88

Durchtränkung und Einbettung

§ 389

Das Durchtränken mit Celloidin (zuerst D u v a 1 1879, S c h i e f f e r d e c k e r 1882) ist dagegen besonders bei Geweben, die durch die bei Paraffineinbettung nicljt vermeidbare Erhitzung leicht zu hart werden, wie z. B. Haut, entkalkter Knochen, dicke Schichten glatter Muskulatur u. a. von Vorteil. Sehr wertvoll ist der Wegfall der obenerwähnten, bei Paraflineinbettung eintretenden Schrumpfungserscheinungen. Von Nachteil ist, daß der Einbettungsprozeß längere Zeit beansprucht, daß sich die Celloidinblöcke nur angefeuchtet und in der Regel nicht so dünn und so gleichmäßig wie Paraffinpräparate schneiden lassen. Auch das Anfertigen lückenloser Serien ist bei Celloidinmaterial schwieriger als bei Paraffineinbettung, das Aufkleben der Präparate auf den Objektträger umständlicher. TABELLE 1 N«me

Aceton Äthyläther Äthylalkohol (abs.) Anilin Benzin (Rohbenzin) Benzol Benzylalkohol . . Benzylbenzoat . . Bergamottöl Cedernholzöl Chloroform Dekalin . . . . . Dioxan Glycerin Isobutylalkohol . . Isopropylalkohol . Kreosot . . . . ' . Methylalkohol Methylbenzoat Nelkenöl Origanumöl

. . . . . . . .

Celloidin

Paraffin

a b s . Alkohol

Wasser

+ + +

+

+ + +

12 : 1

— — — — — — —

. . . . . . . .

. . . . . . . .

Paraffinöl Petroläther Schwefelkohlenstoff . . Terpineol Terpentinöl Tetrachlorkohlenstoff Tetralin Toluol Trichloräthylen . . . . Xylol

— —

+

—

—

+ + + +

+ (bei 56°)

+ + +

+ (bei 56°) + (bei 56°) —

—

+

—

—

—

+ + + —

—

— — — — — — — —

+ i. d. Wärme —

80°/o A l k .

+ +

78» 182"

—

150°

90°/o A l k .

—

206"

90°/o A l k .

—

80»/o A l k .

—

183°

95»/o A l k .

—

237°

+ + + +

50°/o Alk.

61°

—r-

188°

+ +

+

+

+

70°/o A l k .

—

—

+

90°/o A l k .

+ + + + + +

34»

+

80,5°

—

—

56°

—

80°/o A l k .

+ + +

+

—

—

etwas i. d. Wärme

Siedepunkt

101° 290» 108» 82,8» 205220» 67» 199» 247»

90°/o A l k .

—

>

-

+ +

46»

90°lo A l k .

+ + + + + +

300»

30—50° 210» 156» 78° 206» 111» —

88» 140»

+ = mischbar; — = nicht mischbar. (Es wurde dabei nur die für die Praxis in Betracht kommende Mischbarkeit berücksichtigt.) In der Rubrik für Alkohol ist auch vermerkt, bis zu welchem Wassergehalt herab Äthylalkohol mit der betreffenden Flüssigkeit gut vermischbar bleibt.

§ 390—392.

A. Paraffineinbettung

89

Vorzüge beider Methoden sind in der Celloidin-Paraffinmethode vereinigt, bei der die zuerst in Celloidin eingebetteten P r ä p a r a t e nachträglich noch mit P a raffin d u r c h t r ä n k t werden. Auch bei dieser Methode ist jedoch das Herstellen von Serien zeitraubender als beim einfachen Paraffinverfahren. Auch die sehr zu empfehlende Methode von P e t e r f i (s. § 392) geht von einer kombinierten Durchtränkung mit Celloidin und Paraffin aus, doch ist bei dieser der Celloidinzusatz nur sehr gering. Das Verfahren kann daher auch nicht als eigentliche Celloidin-Paraffinmethode bezeichnet werden, wie es gelegentlich geschieht. Die Gelatineeinbeffung kommt hauptsächlich dann in Betracht, w e n n es sich d a r u m handelt, von locker gebauten, leicht zerfallenden Gewebsstückchen dünne, zusammenhängende G e f r i e r s c h n i t t e zu gewinnen. Die Gelatineeinbettung eignet sich also f ü r alle Fälle, in welchen das Schneiden mit dem Gefriermikrotom erwünscht ist, wie bei F e t t - und Lipoiddarstellung usw. Da die bei Gelatineeinbettung auftretende S c h r u m p f u n g im Gegensatz zur Paraffinund Celloidinmethode n u r äußerst gering ist, so ist sie auch f ü r feine U n t e r suchungen, die die Intercellularsubstanz, das Bindegewebe usw. betreffen, von großem Werte. Bei der von G a s k e l l - G r ä f f angegebenen Methode (siehe § 469) läßt sich die Gelatinemasse aus dem Schnitt nicht mehr entfernen, w ä h rend das von H e r i n g a und t e n B e r g e angegebene Verfahren (s. § 471) eine nachträgliche E n t f e r n u n g der Gelatine aus dem aufgeklebten Schnitt ohne Schwierigkeit gestattet 390. Verhalten verschiedener Zwischenflüssigkeiten zu Celloidin, Paraffin, Alkohol und Wasser. A. Die Einbettung in Paraffin 1. Die Entfernung des Alkohols

391. Schon im vorausgehenden Abschnitt w u r d e betont, wie wichtig die sorgfältige Entwässerung der ztir Einbettung in Paraffin bestimmten P r ä p a r a t e ist. V o n n i c h t g e r i n g e r e r B e d e u t u n g i s t nach Beendigung der Entwässerung d i e E n t f e r n u n g d e s a b s o l u t e n A l k o h o l s . Ein tadelloses Einbetten ist, wie besonders v. A p ä t h y (12) in seiner f ü r die Einbettungs- und Schneidetechnik so wertvollen Arbeit betont hat, n u r dann möglich, w e n n das Objekt vollkommen frei von Wasser u n d Alkohol ist. »Das Schrumpfen und Hartwerden, die schlechte Schneidbarkeit des Objektes in Paraffin k o m m t meist daher, daß es noch Wasser oder Alkohol, oft beides enthält.« 392. Der D u r c h t r ä n k u n g mit Paraffin m u ß also unter allen Umständen noch eine E n t f e r n u n g d e s A l k o h o l s , ein E n t s p r i t e n , vorausgehen. Von den zahlreichen diesem Zwecke dienenden Methoden empfehle ich auf Grund l a n g j ä h r i g e r E r f a h r u n g an erster Stelle die Verwendung von Methylbenzoat, sei es von M e t h y l b e n z o a t - C e l l o i d i n nach der Methode von P e t e r f i oder von reinem M e t h y l b e n z o a t . In beiden Fällen müssen die P r ä p a r a t e anschließend noch m i t Benzol behandelt werden. Das Wesentliche ist bei dieser Methode, daß durch die Zwischenschaltung des Methylbenzoats aus den Präparaten neben den Wasserresten auch der Alkohol vollkommen beseitigt wird. Der Celloidinzusatz spielt dabei keine ausschlaggebende Rolle, man kann daher mit r e i n e m Methylbenzoat so ziemlich den gleichen Erfolg erzielen. Wichtig ist, daß das Methylbenzoat nicht zu sehr ausgenützt, sondern öfters erneuert wird.

90

Durchtränkung und Einbettung

§ 393—395.

Methylbenzoat (benzoesaures Methyl) ist eine farblose, nicht unangenehm riechende, stark lichtbrechende Flüssigkeit (Brechungszahl 1,517), die an der Luft langsam und ohne Rückstand verdunstet.

A u s f ü h r u n g : Die Präparate werden aus absolutem Alkohol in Methylbenzoat-Celloidin (siehe § 393) oder in reines Methylbenzoat übertragen. Sie schwimmen zunächst an der Oberfläche und sinken in 1—4 Stunden, je mehr die Flüssigkeit den Alkohol verdrängt, zu Boden. Man überträgt sie dann in eine frische Lösung, in der sich das gleiche wiederholt und schließlich in eine dritte. Nach 24 Stunden kommen die durchscheinenden Objekte für 30 Minuten in einmal gewechseltes Benzol, worauf sie zur Durchtränkung mit Paraffin bereit sind. Man bringt sie dazu für 30—60 Minuten in eine gesättigte Lösung von Paraffin in Benzol, die auf der Oberfläche des Thermostaten steht (ca. 30° C) und sodann in den Thermostaten in reines Paraffin (s. § 418 ff.).

Die obigen Zeitangaben gelten für Stückchen von 3—5 mm Seitenlange. Angaben für andere Stückgrößen s. Anhang, Tabelle D. Bei sehr zarten Objekten unterschichtet man den abs. Alkohol mit Methylbenzoat, ähnlich wie in § 407.

393. Herstellung der Methylbenzoat-Celloidinlösung: Man löst 10 g getrocknetes Celloidin (s. § 443) in 1000 ccm Methylbenzoat. Man läßt die Würfelchen einzeln in die mit Methylbenzoat gefüllte Flasche fallen und schüttelt dann gut durch. Die Gesamtmenge der Flüssigkeit ist, wenn möglich, so zu berechnen, daß sie die Flasche gerade ausfüllt. Diese wird dann gut verkorkt und nach 12 Stunden auf den Kopf gestellt, worauf das aufgequollene Celloidin gegen den Flaschenhals sinkt. Nach weiteren 12 Stunden wird sie wieder auf den Boden gestellt, usf., bis das Celloidin gelöst ist, was meist 1—2 Wochen in Anspruch nimmt. Die fertige Lösung ist leicht gelblich gefärbt. Die Lösung des Celloidins läßt sich durch Erhitzen auf dem Wasserbad beschleunigen. Zur Herstellung von 1 Liter Lösung erwärmt man zunächst 400 ccm Methylbenzoat auf dem kochenden Wasserbad in einem Erlenmeyerkolben, dem man zum Schutz gegen Wasserdämpfe und zur Kondensierung verdunstenden Methylbenzoats einen gut schließenden, mit Siederohr versehenen Stopfen aufsetzt. In die auf etwa 100° erhitzte Flüssigkeit läßt man dann die Celloidinwürfelchen (10 g) fallen. Von Zeit zu Zeit nimmt man den Kolben vom Wasserbad und rührt das in Lösung gehende, quellende Celloidin mit einem dicken Glasstab gut um. Wenn nach 4—8 Stunden das Celloidin ziemlich gelöst ist, setzt man noch die restlichen 600 ccm zu und läßt erkalten. Eine Erhitzung des Methylbenzoats auf über 100° ist zu vermeiden, da es bei höherer Temperatur leicht zu einer Zersetzung des Celloidins und Bildung schädlicher Säure kommt. 394. Die Bereitung der Lösung durch Vereinigung von 1 Teil einer 2°/oigen ätheralkoholischen Celloidinlösung mit 1 Teil Methylbenzoat (P e t e r f i) ist nach meinen Erfahrungen nicht empfehlenswert, da die dabei in die Lösung eingebrachten Äther- oder Alkoholspuren bei der Parafüindurchtränkung überaus schädlich sind.

395. Sehr einfach ist die Herstellung der Lösung, wenn man statt Celloidin C e d u k o l (s. § 445) verwendet, das sich viel rascher löst. Man breitet dazu etwa 14 g Cedukol auf Filtrierpapier aus und läßt sie zur Beseitigung des Alkohols einige Stunden an staubfreiem Ort trocknen (Vorsicht!). Dann wiegt man 10 g davon ab, übergießt sie mit 1000 ccm Methylbenzoat und schüttelt gut durch. Alle paar Stunden wird die Flasche abwechselnd auf den Kopf gestellt. Nach 24 Stunden ist meist alles gelöst. Noch rascher geht es bei Verwendung einer Schüttelmaschine.

§ 396—399.

A. Paraiíineinbettung

91

396. Bemerkungen. Präparate, die in Formol, P i k r i n s ä u r e - oder Alkoholgemischen fixiert sind, werden im Methylbenzoat völlig durchscheinend, w ä h r e n d P r ä p a rate, die in chrom-, osmium- oder sublimathaltigen Flüssigkeiten waren, ziemlich undurchsichtig bleiben. Man darf das nicht verwechseln mit Trübungen, die auf schlechter Entwässerung beruhen. In letzterem Falle müssen die Objekte nochmals in abs. Alkohol zurück. Die Methylbenzoat-Celloidinlösung läßt sich mehrmals verwenden; dann ersetzt m a n die erste, a m stärksten mit Alkohol verunreinigte Portion durch die zweite, diese durch die dritte usw. Die Dauer des Aufenthaltes in der Lösung soll so bemessen sein, daß das P r ä p a rat von ihr völlig durchdrungen ist; die Zeitdauer hängt also von der Größe des P r ä p a r a t e s ab. Man braucht dabei jedoch nicht ängstlich zu sein, da auch ein mehrtägiges Liegen im Methylbenzoat den P r ä p a r a t e n nicht schadet. I m allgemeinen sind 24—48 Stunden ausreichend, f ü r sehr kleine Objekte genügen schon einige Stunden. Bindegewebsreiche oder schwer schneidbare Organe läßt m a n besser 3—6 Tage in der Lösung. Im Benzol sollen die P r ä p a r a t e nur so lange v e r weilen, bis die Hauptmenge an Methylbenzoat ausgewaschen ist; V2—2 Stunden werden dazu je nach der Größe der P r ä p a r a t e genügen. Übermäßig langes Liegen in Benzol und Benzolparaffin verschlechtert die Schneidbarkeit der P r ä p a r a t e . Verwendet man Methylbenzoatcelloidinlösung, so ist es gut, die Methylbeñzoatcelloidinlösung von den P r ä p a r a t e n vor dem Einlegen ins Benzol ordentlich abtropfen zu lassen, da sich sonst an der Oberfläche kleine, schwer schneidbare Celloidintröpfchen niederschlagen. Am besten legt m a n die d u r c h t r ä n k t e n P r ä parate zu diesem Zweck f ü r einige Minuten auf Filtrierpapier. 397. Die unmittelbare Übertragung aus Methylbenzoat-Celloidin in Paraffin über reines Methylbenzoat u n d paraffinhaltiges Methylbenzoat, wie sie R e i c h a r d t u n d W e t z e 1 (28) empfehlen, gibt nach meinen E r f a h r u n g e n schlechtere Resultate. 398. K r ü g e r (40, 41) v e r w e n d e t als I n t e r m e d i u m Kreosot und Benzylbenzoat. D i e in absol. A l k o h o l e n t w ä s s e r t e n Objekte k o m m e n zuerst in Kreosot, dann in Benzylbenzoat, Benzylbenzoat-Paraffin (12—14 Stunden bei 56° C) und aus d i e s e m in reines Paraffin (3mal wechseln). Kreosot (s. auch § 390) ist gegen wasserhaltigen Alkohol wenig empfindlich, es mischt sich sogar noch mit 70°/oigem Alkohol. Da es andererseits große Affinität zu organischen Kolloiden hat, ist es nach K r ü g e r von allen Intermedien am besten geeignet, kolloidal gebundene Spuren von Wasser und Alkohol zu vertreiben. Benzylbenzoat (benzoesaures Benzyl) ist eine klare, farblose Flüssigkeit, die sich mit Alkohol, Benzol, Chloroform, Xylol usw. mischt. Die P r ä p a r a t e können im Bedarfsfall schon aus 90°/oigem Alkohol ü b e r t r a g e n werden, da B. gegen Wasserreste unempfindlich ist. Trockenes Celloidin löst sich in B. nicht, wohl aber gequollenes. B. mischt sich mit Kollodium, mit Methylbenzoatcelloidin, ebenso mit geschmolzenem Paraffin. Da das handelsübliche P r ä p a r a t oft etwas wasserhaltig ist, empfiehlt es sich ihm zur E n t f e r n u n g von Wasser und Alkohol wasserfreies Chlorcalcium zuzusetzen. Färbungen u n d Osmierungen werden in B. nicht angegriffen. I m Gegensatz zu Methylbenzoat ist B. fast geruchlos, doch w i r d dieser Vorteil bei Kombination mit Kreosot durch den penetrantem Geruch des letzteren m e h r als ausgeglichen. 399. S e k i (37b) empfiehlt als bestes I n t e r m e d i u m z w i s c h e n Ä t h y l a l k o h o l u n d Paraffin Dekalin; er r ü h m t dessen g e r i n g e s c h r u m p f e n d e Wirkung u n d die vorzügliche S c h n i t t f ä h i g k e i t der damit b e h a n d e l t e n Präparate. D e k a l i n (Dekahydronaphthalin) verhält sich anderen Stoffen gegenüber sehr indifferent. Es mischt sich m i t Methylbenzoat, Benzol, X y l o l ; die japanische Marke auch mit Ä t h y l a l k o h o l in j e d e m Verhältnis, die deutsche d a g e g e n nicht. S e k i schaltet daher zur B e s e i t i g u n g v o n Alkohol und Wasserresten z w i s c h e n Ä t h y l a l k o h o l

92

§ 400—403.

Durchtränkung und Einbettung

und Dekalin eine Mischung von Dekalin-Methylbenzoat (8 :2) ein. Dekalin dringt etwas langsamer ein als Benzol. Die Zeiten sind nachfolgender Tabelle 2 zu entnehmen. TABELLE 2 Z e i t d a u e r bei Dekalin-Paraffineinbettung i n

Stunden

Seitenlange des Objek es 2-3 mm 3—5 mm 5—8 mm abs. Äthylalkohol . . . Dekalin-Methylbenzoat . Dekalin Dekalin-Paraffin 1:1 . . Paraffin

3—6 1—2 1—2 7*—7>

6-12 2-4 2—4 72—1

12—24 4—8 4-8 1—2

1-2

2-4

4-8

1 mal wechseln 1 mal wechseln 1 mal wechseln 1 mal wechseln; im Wärmeofen 1 mal wechseln; im Wärmeofen

400. Wenn m a n aus irgendwelchen G r ü n d e n die D u r c h t r ä n k u n g mit Methylbenzoat-Benzol (nach § 392) oder Dioxan (nach § 353) nicht anwenden kann, so empfiehlt sich als Zwischenflüssigkeit zwischen Alkohol und Paraffin vor allem Benzol, in welchem die Objekte viel weniger h a r t w e r d e n als in Toluol oder Xylol. Man ü b e r t r ä g t die Objekte dann aus absolutem Alkohol direkt in Benzol, das 2—3mal zu wechseln ist. Da Benzol nur sehr wenig Wasser aufzun e h m e n vermag, so m u ß in diesem Falle die vorhergehende E n t w ä s s e r u n g im absoluten Alkohol sehr sorgfältig erfolgt sein. Über das Vermeiden von absolutem oder höher prozentigem Alkohol s. § 370 f. und' 358, von Alkohol überhaupt § 353 f. 401. Die in Benzol gebrachten Objekte werden nach einiger Zeit d u r c h scheinend; t r i t t beim Übertragen der P r ä p a r a t e in das Benzol eine T r ü b u n g auf, oder bleiben in ihrem Innern auch nach mehrstündigem Verweilen milchige Stellen bestehen, so ist das ein Zeichen ungenügender Entwässerung. Man bringt die Objekte in diesem Falle wieder in absoluten Alkohol zurück. Doch ist zu beachten, daß Präparate, die in chrom-, osmium- oder sublimathaltigen Flüssigkeiten fixiert sind, nicht so durchscheinend werden, wie z. B. nach F o r mol- oder Alkoholfixierung. Die Zeitdauer der D u r c h t r ä n k u n g richtet sich nach der Größe des Objektes und der A r t der Zwischenflüssigkeit. Sie soll nicht länger ausgedehnt werden, als unbedingt nötig ist, da die P r ä p a r a t e sonst h a r t werden. Einige Anhaltspunkte gibt Tabelle D des Anhangs. Um sicher zu sein, daß der Alkohol vollständig entfernt ist, f ü h r t man die P r ä p a r a t e zweckmäßig durch drei P a r t i e n Benzol. 402. Es ist wichtig, darauf zu achten, daß das Benzol farblos, wasser- und alkoholfrei ist ( B e n z o l u m c r i s t a l l i s a t u m ) . Technisches Benzol ist meist m i t Toluol, Xylol, höher siedenden Kohlenwasserstoffen oder Thiophen verunreinigt. Reines Benzol zeigt einen Siedepunkt von 80,5°. Thiophenhaltiges Benzol n i m m t nach Zusatz von etwas konzentrierter Schwefelsäure und etwas Isatin eine tiefblaue F a r b e an. Benzoldämpfe wirken in größerer Menge eingeatmet giftig. 403. Verunreinigtes Benzol kocht man einige Stunden unter Rückflußkühlung mit Tierkohle und destilliert ab. Das Destillat bleibt einen Tag über metallischem Natrium stehen und wird dann davon bei 81° abdestilliert. Kochen und Destil-

§ 404r—409.

A. Paraffineinbettung

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lieren erfolgt in der Weise, daß man den das Benzol enthaltenden Kolben in ein auf ca. 105° erwärmtes Wachsbad stellt. B e i a l l e n M a ß n a h m e n i s t d i e g r o ß e F e u e r g e f ä h r 1 i'c h!k e i t d e s B e n z o l s w o h l z u b e a c h t e n . Am besten verwendet man eine elektrische Heizplatte. 404. Manche Autoren empfehlen zarte, leicht zerreißliche Objekte nicht direkt in Benzol, sondern zuerst in Mischungen von Alkohol und Benzol (1 :1 oder 2 :1, 1 :1 und 1 :2) zu übertragen. Von anderen wird der Wert dieser Maßnahme bestritten. Über D i o x a n als Zwischenflüssigkeit s. § 353 ff. 405. Außer Benzol seien von den zahlreichen Flüssigkeiten, die infolge ihrer Mischbarkeit mit Alkohol und Paraffin als Zwischenflüssigkeiten zur Verwendung kommen, noch C h l o r o f o r m , S c h w e f e l k o h l e n s t,o f f , T e t r a c h l o r k o h l e n s t o f f , T e t r a l i n , T o l u o l und X y 1 o 1 genannt, ferner verschiedene ö l e , wie B e r g a m o t t ö l , T e r p e n t i n ö l , Z e d e r n holzöl. Eingehendes über die in der Mikrotechnik gebräuchlichen flüchtigen öle und ihren Ersatz findet man bei P. M a y e r (19). Über die Verwendung von Butylalkohol s. § 358. 406. Chloroform wird vielfach als bestes, schonendstes Intermedium betrachtet; abgesehen davon, daß es vor der Methylbenzoatmethode keine besonderen Vorzüge besitzt, ist die V e r w e n d u n g v o n C h l o r o f o r m n u r d a n n zu e m p f e h l e n , w e n n es v ö l l i g w a s s e r f r e i und a l k o h o l f r e i i s t , was bei dem im Handel erhältlichen häufig nicht der Fall ist. Aber auch ganz reines Chloroform zersetzt sich leicht und wird dadurch wasserhaltig. Aus diesen Gründen ist im allgemeinen das Arbeiten mit Methylbenzoat und Benzol vorzuziehen. 407. Das hohe spezifische Gewicht des Chloroforms benützt man zweckmäßig zur allmählichen Durchtränkung des Präparates in der Weise, daß man in einem Glastubus eine Chloroformsäule mit absolutem Alkohol überschichtet und das anfangs an der Grenzfläche beider Flüssigkeiten schwimmende Präparat sich langsam im Chloroform zu Boden senken läßt. (Senkverfahren). Hierauf überträgt man es noch 1-—2mal in reines Chloroform. Manche Objekte sinken auch bei tagelangem Aufenthalt im reinen Ckloroform nicht zu Boden, wohl aber nach Zusatz von etwas Paraffin. Bei dotterreichem Material ist die Einbettung durch w a s s e r f r e i e s (!!) Chloroform oft recht vorteilhaft. Aus dem Chloroform überträgt man in eine gesättigte Mischung von Chloroform-Paraffin (Schmelzpunkt 40°), in der man die Objekte auf dem ParafSinschrank bis zu 24 Stunden stehen läßt. Dann nur kurze Zeit reines Paraffin zwischen Schmelzpunkt 50—58°. 408. Um Chloroform alkohol- und wasserfrei zu machen, empfiehlt K e m p f (10) es längere Zeit über Calciumchlorid stehen zu lassen, das entwässernd wirkt und zugleich den Alkohol "bindet. Wegen seiner Zersetzlichkeit hebt man derartig gereinigtes Chloroform nach Filtrieren lichtgeschützt in kleinen, bis an den Hals gefüllten, braunen Glasflaschen auf. 409. Schwefelkohlenstoff ( H e i d e n h a i n 01) gibt sehr gute Resultate. Er durchdringt die Präparate sehr rasch, läßt sich aus ihnen ebenso leicht wieder verdrängen und macht die Präparate nicht hart. Um die in ihm unter Umständen eintretende Schwärzung der Objekte zu vermeiden, überträgt H e u d o r f e r nach dem Entwässern für je 24 Stunden in Tetrachlorkohlenstoff, dann in Schwefelkohlenstoff und schließlich in Schwefelkohlenstoff, gesättigt mit Paraffin vom Schmelzpunkt 48°. S e i n e r a l l gemeinen A n w e n d u n g steht aber die hohe F e u e r g e f ä h r l i c h k e i t (Entzündung schon bei 150° C) u n d g r o ß e G i f t i g k e i t e n t -

94

Durchtränkung und Einbettung

§ 410—417.

g e g e n . Der üble Geruch macht sich, w e n n man die Gläser g u t verschlossen ruhig stehen läßt, nicht sehr bemerkbar. Luftgemische mit 4°/o Schwefelkohlenstoff können schon bei 0° durch einen F u n ken zur Explosion gebracht werden. Schwefelkohlenstoffdämpfe sind sehr giftig. Bei Einatmen können sie u. a. Schwindel, Bewußtseins- und Sehstörungen bewirken. 410. Tetrachlorkohlenstoff hat den Vorzug, daß er osmiertes Fett nich löst (P 1 e c n i k); er ist weniger feuergefährlich, löst sehr viel Paraffin, läßt sich aber aus diesem infolge seiner geringen Flüchtigkeit schwer entfernen; seine Verwendung erscheint daher n u r in besonderen Fällen angezeigt. 411. Tetralin (Tetrahydronaphthalin) wird von C o r o n i n i , D r a h n , V o ß u. a. als Zwischenflüssigkeit empfohlen, in der selbst Sehnengewebe leicht schneidbar bleiben soll. Nach meinen Erfahrungen ist das Tetralin dem reinen Benzol gegenüber unterlegen. Zudem verunreinigt es das heiße Paraffin, aus dem es sich infolge seiner geringen Flüchtigkeit schwer entfernen läßt. Ich schließe mich daher dem ungünstigen Urteil P. M a y e r s (23) vollkommen an. — Völlig- unbrauchbar ist das technische Tetralin. F ü r mikrotechnische Zwecke kann nur das gereinigte Tetralin der Firma Riedel A.G., Berlin, verwendet werden (auch durch Hollborn, Leipzig, beziehbar). 412. Trichloräthylen ist f ü r Einbettungszwecke nicht empfehlenswert (s. B r u c h 20).

413. Toluol und Xylol machen die Präparate hart und sind w e g e n ihres höheren Siedepunktes (111° C bzw. 140° C) schwerer aus den Präparaten und Paraffinen zu entfernen w i e das erheblich flüchtigere Benzol. S:e sind daher in der Einbettungstechnik besser durch Benzol zu ersetzen. 414. Von den Ö l e n k o m m e n als Zwischenflüssigkeit vor allem A n i l i n , B e r g a m o t t ö l , T e r p e n t i n ö l und Z e d e r n h o l z ö l in Betracht. 415. Anilin wird, von E. A l l e n zur Entwässerung und Durchtränkung in der Weise verwendet, daß es den bis zum 50°/oigen Alkohol durchgeführten Präparaten tropfenweise zugesetzt wird. Schließlich k o m m e n sie in reines Anilin, in dem sie v o l l k o m m e n durchscheinend werden. Aus diesem w e r d e n sie zur Entfernung des Anilins in Bergamottöl übertragen und dann nach f ü n f m a l i g e m Wechseln desselben in reines Paraffin. A l l e n zieht dabei synthetisches Bergamottöl dem natürlichen vor. Genaueres s. § 2175. 416. In Terpentinöl oder Zedernholzöl k o m m e n die Präparate aus absolutem Alkohol. Die Objekte s c h w i m m e n zunächst einige Zeit an der Oberfläche; dabei müssen sie, u m ein Vertrocknen der Oberfläche zu vermeiden, mit e t w a s ölgetränkter Watte bedeckt werden. Allmählich sinken sie dann zu Boden. Nach völliger Durchtränkung überträgt man die durchscheinenden Objekte aus dem Öl direkt in heißes geschmolzenes Paraffin. Vorbedingung für gute Erfolge ist aber, daß das zuletzt gebrauchte Öl völlig wasser- und alkoholfrei ist. T e r p e n t i n ö l und Z e d e r n h o l z ö l brauchen also bei der Durchtränkung mit Paraffin nicht so sorgfältig entfernt zu werden, wie verschiedene andere Zwischenflüssigkeiten, da sie mit reinem Paraffin ein gut schneidbares Gemisch bilden (P. P o s o [10] und v. A p ä t h y [12]). Nach meinen Erfahrungen ist die Durchtränkung mit Zedernholzöl der Methylbenzoat-Benzol-Methode unterlegen. 417. P r a n t e r überträgt aus absolutem Alkohol f ü r 24 Stunden in Zedernholzöl, dann 12 Stunden in Ligroin, ebensolange in Ligroin-Paraffin, dann nach '/->stündigem Aufenthalt im Thermostat für 3—6 Stunden in reines Paraffin. Große Stücke muskulöser Organe (z. B. Uterus, Herz) bringt man durch abs. Alkohol und Zedernholzöl in 2—3mal gewechseltes reines Zedernholzöl (6—10 Tage bei 37°) und von hier in mehrmals erneuertes reines Paraffin (Schmelzp. 56°; 2—8 Tage je nach Größe). Das ö l kann man mit Chlorcalcium wieder entspriten.

§ 418—420.

A. Paraffineinbettung

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2. Durchtränken des Objektes mit Paraffin 418. Durditränkung mit Benzol-Paraffin. I s t d a s O b j e k t n a c h d e r i n § 392 f. o d e r

§ 400 f. angegebenen Methode mit Benzol durchtränkt, dann überträgt man es in eine mit Paraffin gesättigte Benzollösung; zur Bereitung derselben gibt man so viel Paraffin in reines Benzol, bis ein kleiner Überschuß ungelöst zurückbleibt. Am besten steht eine derartige paraffingesättigte Lösung in einem gut verschlossenen Gefäß zur ständigen Benützung in dem auf der Oberfläche des Wärmeofens gewöhnlich angebrachten Vorwärmer (35—40° C) dauernd bereit. Für das Benzol-Paraflingemisch benützt man zweckmäßig ein Glas mit weitem Hals, Schliffstopfen und aufgeschliffener Kappe (s. Abb. 3).

Die D a u e r d e s A u f e n t h a l t e s i m B e n z o l - P a r a f f i n wechselt je nach der Größe und der Dichte des Präparates. Stücke von 2—3 mm Seitenlänge bleiben 20—30 Min., solche von 3—5 mm 30—60 Min., von 5—10 mm 1—2 Stunden, größere noch länger in dem Gemisch. Das Gewebe soll vollständig von dem Gemisch durchsetzt sein, damit später beim Entweichen des Benzols im heißen Paraffin keine nicht durchtränkten Partien zurückbleiben. Ein allzulanges Verweilen im Benzol-Paraffin ist jedoch zu vermeiden, da die Präparate dadurch hart und schwer schneidbar werden. Wurde statt Benzol als Durchtränkungsflüssigkeit Chloroform, Schwefelkohlenstoff oder dgl. genommen, so verwendet man statt Benzol-Paraffin eine paraffingesättigte Lösung dieser Intermedien. Über Dioxan siehe § 353 f. 419. Durditränkung mit Paraffin. N a c h h i n r e i c h e n d e r

Durch-

A b b . 3. G e f ä ß m i t aufgeschliifener K a p p e u. S c h l i f f stopfen (für Benzol-Paraffin)

tränkung mit Benzol-Paraffin wird das Präparat mit einem angewärmten Spatel in r e i n e s g e s c h m o l z e n e s P a r a f f i n in den Wärmeofen übertragen. Da das erste Paraffin durch das im Präparat noch enthaltene Benzol verunreinigt wird, muß das Objekt nach einiger Zeit noch in eine zweite evtl. auch dritte Paraffinschale übertragen werden. Die Z e i t d a u e r d e r D u r c h t r ä n k u n g mit heißem Paraffin wird durch G r ö ß e und D i c h t i g k e i t des Objektes bestimmt. Kleine Objekte unter 1 mm Seite benötigen mindestens V2—1 Stunde; mittlere Objekte von 2—5 mm Seite 2—5 Stunden, große von 5—10 mm Seite 5—24 Stunden. Größere Präparate müssen ein bis mehrere Tage im Paraffin bleiben. Locker gebautes Gewebe wird rascher durchdrungen als dichter gebautes (s. auch die Übersichtstabelle im Anhang). Man lasse die Objekte lieber länger als zu kurz im geschmolzenen Paraffin. Wenn das Objekt gut entwässert und vor allem auch der Alkohol vollkommen entfernt ist, dann schaden, wie v. A p á t h y (12) feststellte und ich auf Grund eigener Messungen bestätigen kann, auch Tage und Wochen nichts. Bei unvollständig entwässerten und entspriteten Präparaten allerdings wird das Resultat um so schlechter, je länger das Verweilen in reinem geschmolzenen Paraffin dauert. 420. Die schlechte Schneidbarkeit von verhornter Haut, Bindegewebe, Knochen u. dgl., über die viele klagen, beruht bei Paraffinpräparaten meist darauf, daß die Durchtränkung mit Paraffin ungenügend war. Läßt man derartige schwer durchdringliche Präparate nach mehrtägiger Behandlung mit Methylbenzoat einige Tage in heißem Paraffin, dann schneiden sie sich gewöhnlich ausgezeichnet. Eine Ausnahme bilden vielleicht dotterreiche Keime, deren Sprödigkeit mit der Dauer des Aufenthaltes im heißen Paraffin zuzunehmen scheint.

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Durchtränkung und Einbettung

§ 421—427.

K r ü g e r (41) f ü h r t das Hartwerden bei Paraffineinbettung auf eine T r o c k n u n g der Objekte im Paraffin zurück. Eine solche erfolgt, w e n n zurückgebliebene Wasser- und Alkoholspuren im Wärmeschrank zur Verdunstung gebracht werden. Auch nach Durchtränkung mit flüchtigen Intermedien mit einem Siedepunkt unter 150° C ist die Gefahr einer Trocknung gegeben, wenn das Intermedium im Wärmeofen rascher aus dem Präparat austritt als das Paraffin an seine Stelle eindringt (s. auch § 398). 421. Als Gefäße verwendet man bei der Paraffindurchtränkung Kristallisierschalen mit flachem Boden aus Jenaer Geräteglas oder Porzellanschalen. S p u 1 e r gab Porzellantöpfchen mit Einsatz aus Drahtnetz a n (erhältlich bei Wagner und Münz, München, Karlsto. 43). Nach meinen Beobachtungen färbt sich dabei das Paraffin mit der Zeit durch Kupferspuren grün; vermutlich sind Netze aus Nickel oder Silber geeigneter. 422. Von manchen Autoren wird empfohlen, die Objekte aus einer kaltgesättigten Lösung von Paraffin und Intermedium zunächst in weiches Paraffin vom Schmelzpunkt 35° und nach einigen Stunden erst in Paraffin von hohem Schmelzpunkt zu bringen. v. A p á t h y (12) dagegen hält das Durchtränken mit einer Mischung von Intermedium und Paraffin oder mit Paraffin von niedrigem Schmelzpunkt f ü r zwecklos und überträgt aus dem Intermedium gleich in das definitive Paraffin. 423. Paraffinsorlen. Je nach der Temperatur, bei welcher man zu schneiden beabsichtigt, und je nach der gewünschten Schnittdicke v e r w e n d e t man Paraffin v o n verschiedenen Schmelzpunkten, bei niederer Temperatur ein solches von 45—50° C, bei höherer zu 58—60° C. Für gewöhnlich ist ein Paraffin v o n 56—58° C zu empfehlen. 424. Durch entsprechendes Mischen von weichem (Schmelzpunkt 45—54°) und hartem (Schmelzpunkt 58—60°) Paraffin kann man den Härtegrad beliebig einstellen. Nach v. A p á t h y ist das gewöhnliche Paraffin des Handels für exaktes Arbeiten meist unbrauchbar, da es häufig noch gasförmige Bestandteile enthält, wodurch der Block beim Einbetten blasig, bröckelig und schlecht schneidbar wird. Man halte es sich daher im Vorrat und lasse es f ü r längere Zeit in flachen Schalen bei 70° C stehen, ö f t e r e s Filtrieren und Erkaltenlassen bessert seine Beschaffenheit. Sehr gutes, ohne weitere Vorbereitung verwendbares Paraffin beziehe ich seit J a h r e n von der Firma Dr. Grübler & Co., Leipzig C 1, Liebigstr. 1 B. 425. Die B e s t i m m u n g d e s S c h m e l z p u n k t e s erfolgt in der Weise, daß man eine kleine Menge des geschmolzenen Paraffins in eine dünne Glaskapillare saugt und hier erstarren läßt. Nach Säuberung der Oberfläche befestigt man das kurze Kapillarröhrchen mit einem Tropfen Wasser neben dem Quecksilber eines Thermometers, taucht das Ganze in ein mit Wasser gefülltes Becherglas und erw ä r m t langsam unter genauer Beobachtung und stetem Rühren mit einem gebogenem Glasstab, bis das Paraffin schmilzt. Gleichzeitig liest man die Temperatur ab. Eingehenderes darüber bei K i s s e r 27. 426. Graf S p e e (85) empfiehlt namentlich f ü r B ä n d e r s c h n e i d e n überh i t z t e s P a r a f f i n . Herstellung: Paraffin von Schmelzpunkt 50° C wird in geschmolzenem Zustand längere Zeit erhitzt, bis es unter Entwicklung weißlicher, unangenehm riechender Dämpfe eine braungelbe Farbe angenommen hat. (Auch von H o l l b o r n beziehbar.) 427. Sehr empfehlenswert ist es, dem Paraffin etwas Bienenwachs zuzusetzen, da dadurch seine Schneidbarkeit und Geschmeidigkeit gesteigert wird. V a n W a l s e m (94) nimmt auf 100 g Paraffin (Schm. 56°) 5 g gelbes Bienenwachs. K a b s c h (12) fügt außerdem tropfenweis unter Rühren noch l°/o Mastix (in etwas Alkohol gelöst) zu. Andere empfehlen den Zusatz von etwas RizinusölF ü r sehr dicke Schnitte (über 25 w ) ist das von A 1 1 m a n n angegebene Gemisch empfehlenswert: Paraffin (60°), 425 g, Stearin 50 g, Wachs 25 g.

§ 428—433.

A. Paraffineinbettung

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428. M c C 1 u n g (37) empfiehlt als bestes Paraffin K a u t s c h u k p a r a f f i n . Herstellung: Roher indischer Kautschuk (India rubber) kleingeschnitten 1 Teil, Paraffin, geschmolzen und mit Asphalt bernsteinbraun gefärbt 99 Teile. Das Gemisch wird f ü r 24—48 Stunden auf 100° C erhitzt. Die überstehende Flüssigkeit wird abgeschöpft und das Paraffin abgekühlt. 429. Durch Zusatz von 1—10°/o »Lorbeerwachs« soll Paraffin vom Schmelzpunkt 40—42° an Härte so zunehmen, daß es einem Paraffin von etwa 56° C vergleichbar ist ( B u r k e t in M c C l u n g 37). Auch Zusatz von technischer Stearinsäure macht Paraffin von Schmelzp. 52° C härter und setzt gleichzeitig den Schmelzpunkt herab ( W a t e r m a n 29). 430. O r t o n und P o s t (32) verwenden G l y k o l s t e a r a t zur Einbettung, das wachsartige Konsistenz besitzt, bei 48,5° C schmilzt und leicht Wasser aufnimmt. Die Objekte können daher aus Wasser in das geschmolzene Einbettungsmittel g e bracht werden, in dem sie etwa 48 Stunden verbleiben. Die Schnitte werden mit Eiweißglyzerin aufgeklebt und durch Chloroform vom Einbettungsmittel befreit.

431. Die D u r c h t r ä n k u n g m i t P a r a f f i n wird in einem Wärmeofen (Thermostaten) vorgenommen. Dazu dient ein doppelwandiger mit einer Tür versehener Kasten, der durch Gas oder Elektrizität geheizt wird. Der Raum zwischen den doppelten Wänden wird mit Wasser oder Glyzerin gefüllt. Die Konstanterhaltung der Temperatur erfolgt durch einen Thermoregulator. Die älteren Modelle sind durch den neuen r u n d e n B r u t s c h r a n k der Firma Heraeus, Hanau, überholt, dessen Temperaturausgleich nicht durch Wassermantel, sondern durch starkwandiges Aluminiumblech erfolgt. Er zeichnet sich durch kurze Anheizzeit (ca. 1 Stunde), rasche mühelose Einstellung verschiedener Temperaturen, äußerst geringen Stromverbrauch infolge ausgezeichneter Isolierung, bequeme Anschlußmöglichkeit durch geringe Stromaufnahme und hohe Regelgenauigkeit bis auf ± V40 C f ü r den gesamten Temperaturbereich von 30—110° C aus. 3. Das Einbetten

432. Erst wenn das P r ä p a r a t völlig mit Paraffin durchtränkt ist, wird es durch Erstarrenlassen desselben e i n g e b e t t e t . Als Form benützt man f ü r mittlere Objekte zweckmäßig zwei Doppelwinkel (»Einbettungsrähmchen«) aus glattem Metall _l ~ , welche auf eine glattpolierte Metallplatte von etwa 10 X 15 cm Fläche (am besten aus Messing oder Kupfer) aufgesetzt werden. Durch gegenseitiges Verschieben der Winkel läßt sich die Größe der Form vaiieren. Die Einbettungsrähmchen sollen nicht zu niedrig sein. Die von mir benützten Einbettungsrähmchen (Länge der schmalen Seite 3 cm, der langen Seite 8 cm) haben eine Höhe von 17 mm. Man kann als Unterlage auch eine Glasplatte benützen. Sie hat aber den Nachteil, daß sie jedesmal mit etwas Glyzerin eingerieben werden muß, damit sich der Paraffinblock leicht ablöst. Das ist bei einer Metallplatte unnötig.

433. Beim Einbetten verfährt man folgendermaßen: Nachdem man die Einbettungsrähmchen auf der sauber geputzten Grundplatte hergerichtet hat, erwärmt man das Einbettungsparaffin auf etwa 60° C und gießt davon sorgfältig, ohne Luftblasen mitzureißen, bis zum oberen Rand in die Form. Dann überträgt man mit einem über der Flamme erwärmten Metallspatel das einzubettende Präparat. Hierauf wird das Objekt o r i e n t i e r t , d. h. mit einer erwärmten Zupfnadel in die Lage gebracht, in der es hernach geschnitten werden soll. Dabei ist es im allgemeinen zweckmäßig, die Bodenfläche als spätere Schnittebene anzunehmen. 7

R o m e i s , M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u f l .

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Durchtränkung und Einbettung

§ 434—438.

Das Einhalten einer gleichmäßigen Orientierungsweise der Objekte ist sehr empfehlenswert, da man später, wenn das Paraffin erstarrt und undurchsichtig ist, häufig nicht mehr feststellen kann, wie das Präparat liegt. Nun setzt man die paraffingefüllte Form in eine flache Schale (z. B. eine photographische Entwicklungsschale von 18 X 24 cm) auf zwei Glas- oder Metallstreifen auf, so daß die Bodenfläche hohl liegt. Dann gießt man aus einem Krug vorsichtig und ohne zu spritzen Brunnenwasser zu, bis dieses, an den oberen Rand des Einbettungsrähmchens reicht, und überläßt das Paraffin der langsamen Erstarrung. D i e O b e r f l ä c h e d e s P a r a f f i n s w i r d also nicht vom Wasser überflutet. Bei diesem Vorgehen zieht sich die Oberfläche des erstarrenden Blockes nabelartig ein, während das Innere des Paraffinblockes eine sehr gleichmäßige Beschaffenheit von ausgezeichneter Schnittfähigkeit annimmt. Wichtig ist, daß das O b j e k t von r e i n e m P a r a f f i n v ö l l i g d u r c h d r u n g e n ist u n d d a ß d a s E i n b e t t u n g s p a r a f f i n g u t u n d r e i n ist. 434. In früheren Auflagen habe ich ebenso wie andere Autoren empfohlen, die Form, wenn die Oberfläche des Paraffins zu einem Häutchen erstarrt ist, unterzutauchei), so daß der ganze Block von Wasser überflutet ist. Auch C a r a z z i hielt das Erstarren unter Weisser für notwendig, da das an der Luft erstarrende Paraffin nicht so homogen werde und sich nicht so gut schneide. Später machte ich jedoch immer wieder die Erfahrung, daß beim Erstarren unter Wasser die Innenteile des Paraffinblockes inhomogen, bröckelig und mit Vakuolen durchsetzt sind, Erscheinungen, die sich beim Verfahren nach § 433 niemals zeigen. Ich bin daher vom Erstarrenlassen u n t e r Wasser völlig abgekommen. Unbedingt schädlich für die Schnittfähigkeit ist langsames Erstarrenlassen an der Luft ohne Kühlung durch Wasser von unten her. Gute Paraffinblöcke geben beim Auffallenlassen auf den Tisch einen hellen Klang und sind auf der Schnittfläche weder milchig noch bröckelig. 435. Die nabelartige Einziehung der Blockoberfläche, die bei dem Verfahren nach § 433 eintritt, ist, wenn man, wie oben empfohlen, hohe Einbettungsrähmchen nimmt und die größeren Objekte an den Händern der Form anordnet, unschädlich. Soll sie vermieden werden, so muß man dem erstarrenden Paraffin mit dem erwärmten Spatel von oben her immer neues zutropfen und so die Oberfläche offen halten, bis es von unten her allmählich erstarrt ist. 436. Die Temperatur des zur Abkühlung verwendeten Wassers beträgt am besten zwischen 10—18° C, bei kälterem Wasser bekommt der Block auch seitlich und unten Einziehungen, unter Umständen sogar Sprünge. 437. An Stelle des Einbettungsrähmchens kann man auch Papier- oder Stanniolkästchen verwenden. Für sehr kleine Objekte bedient man sich mit Vorteil eines Uhrschälchens als Form. (Siehe auch § 441.) Recht praktisch sind für kleine und kleinste Objekte die kleinen 20X15X10 mm messenden, von Aquarellfarben her bekannten viereckigen Porzellannäpfchen, die sich gegen den Boden zu leicht verengen (F r y 27). Die vorher beim Entwässern mit Eosin angefärbten Objekte heben sich gegen den weißen Boden gut ab, so daß sie unter einer binokularen Lupe leicht orientiert werden können. Nach dem Erstarren des Paraffins in kaltem Wasser treibt man in eine oder in zwei Ecken des Schälchens eine kräftige stumpfe Nadel und hebelt den Paraffinblock heraus. Einreiben mit Glyzerin ist unnötig. 438. K e n n z e i c h n u n g k l e i n e r O b j e k t e . Um kleine Objekte, die nach ihrer Einbettung in Paraffin oft schwer sichtbar sind, leicht auffindbar zu machen, ritzt man während der Einbettung bei noch flüssigem Paraffin nach der Orientierung mit der erwärmten Zupfnadel um das Objekt in die erstar-

§ 439—442.

B. Celloidineinbettung

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r e n d e B o d e n s c h i c h t e i n e n Kreis, d e r d a n n a u c h im f e r t i g e n Block von der B o d e n f l ä c h e h e r d e u t l i c h s i c h t b a r ist. I n gleicher Weise lassen sich a u c h Richt u n g s m a r k e n f ü r die S c h n i t t r i c h t u n g a n b r i n g e n . E i n a n d e r e s V e r f a h r e n ist, die O b j e k t e b e i d e r E n t w ä s s e r u n g i m steigenden A l k o h o l d u r c h Zusatz v o n e t w a s Eosin r o t a n z u f ä r b e n . 439. O r i e n t i e r u n g k l e i n e r O b j e k t e . Z u r E r l e i c h t e r u n g der O r i e n t i e r u n g k a n n m a n auf d e n B o d e n d e r G u ß f o r m kleine, p a r a f f i n d u r c h t r ä n k t e , d ü n n e P a p i e r s t ü c k c h e n ( Z i g a r e t t e n p a p i e r ) legen, auf d e n e n ein ger a d e r T u s c h e s t r i c h a n g e b r a c h t ist. M a n r i c h t e t d a n n das P r ä p a r a t b e i m Einb e t t e n so n a c h d e m S t r i c h aus, daß die s p ä t e r e S c h n i t t e b e n e p a r a l l e l demselben zu liegen k o m m t . Das P a p i e r b l ä t t c h e n w i r d m i t e i n g e b e t t e t . E s k a n n d a n n spät e r n a c h d e m E i n s p a n n e n des Blockes v o r B e g i n n des S c h n e i d e n s evt. e n t f e r n t werden. 440. Auch nach einer von P e t e r f i (21b) angegebenen Methode lassen sich kleine Objekte genau nach einer bestimmten Schnittrichtung orientieren. Man benötigt dazu kleine Plättchen aus Celloidin, die man in der Weise gewinnt, daß man in einer mit Paraffin ausgegossenen Glasschale eine etwa 5 mm hohe Schicht einer 4°/oigen Celloidinlösung in Chloroformdämpfen erstarren läßt. Die so erhaltene Platte schneidet man in kleinere, möglichst regelmäßige Täfelchen, die man mit Terpineol durchtränkt und in demselben aufhebt. Die zur Einbettung bestimmten Objekte kommen dann über die Alkoholreihe in eine l°/oige Methylbenzoat-Celloidinlösung und werden nach Durchtränkung auf einem Celloidinplättchen unter entsprechender Vergrößerung so ausgerichtet, daß die später gewünschte Schnittrichtung einem bestimmten Rande des Plättchens entspricht. Dann läßt man das ganze durch 15—30 Minuten lange Einwirkung von Chloroformdämpfen erstarren und bettet über Benzol in Paraffin ein. In ähnlicher Weise lassen sich auch Schnitte auf Celloidinplättchen orientieren und nochmals in einer beliebig gewünschten Schnittrichtung zerlegen. P. M a y e r verwendet kleine Gelatineplättchen, auf die die Objekte vor der Paraffindurchtränkung mit einer Lösung von Celloidin in Methylbenzoat festgeklebt werden (16b). 441. Kleine Objekte, die nicht orientiert werden brauchen, überträgt man nach P. M a y e r aus dem obs'oluten Alkohol in kleine in der Apotheke erhältliche Gelatinekapseln, die man in ausgestanzte Korkstücke steckt, und behandelt die Objekte weiter, wie wenn sie in Glastuben wären. Schließlich ersetzt man nach völliger Durchtränkung das Paraffin mit Hilfe einer angewärmten Pipette durch reines Einbettungsparaffin und bringt die Kapsel in kaltes Wasser, in dem das Paraffin erstarrt und die Gelatine sich leicht ablöst (16a). — Eine weitere von B e l a f f ü r kleinste Objekte angegebene Methode s. § 2388. Ü b e r die W e i t e r b e h a n d l u n g des e i n g e b e t t e t e n P a r a f f i n m a t e r i a l s siehe § 482 u n d 533 ff. B. Die Einbettung in Celloidin 442. V o r a u s s e t z u n g f ü r ein o p t i m a l e s Gelingen, d e r C e l l o i d i n e i n b e t t u n g ist, d a ß die O b j e k t e a u f s s o r g f ä l t i g s t e e n t w ä s s e r t u n d die Celloidinlösungen mit wasserfreiem Äther und Alkohol bereitet werden. Nach A p ä t h y haben n u r w a s s e r f r e i e L ö s u n g e n die nötige E i n d r i n g u n g s f ä h i g k e i t u n d n u r w a s s e r f r e i e s Celloidin k a n n o h n e vorzeitiges E r s t a r r e n bis zu e i n e r 16°/oigen K o n z e n t r a t i o n eingedickt w e r d e n , w i e es z u r G e w i n n u n g 5—10M dicker S c h n i t t e n ö t i g ist. N i m m t m a n die E n t w ä s s e r u n g w e n i g e r g e n a u , so g e l i n g e n m e i s t n u r 15—20/< dicke S c h n i t t e u n d a u c h diese häufig n i c h t in r e g e l m ä ß i g e r Folge.

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Durchtränkung und Einbettung

§ 443—445.

1. Herstellung der Lösungen

443. Das in Tafeln käufliche Celloidin (von S c h e r i n g ) muß zuerst zu kleine Würfelchen (3—5 cmm) zerschnitten werden, die, auf einer Lage Filtrierpapier ausgebreitet, staubfrei bei Zimmertemperatur getrocknet werden. Die gelblichen, hornartigen Würfelchen können dann in einer gut verschlossenen Flasche vorrätig aufbewahrt werden. Weniger mühsam und zugleich besser ist es, die Celloidintafeln nach dem Vorschlag von K i s s e r (34) auf jenem Universalgerät der Küche, das zum Schneiden von Kraut, Gurken und Rüben und zum Reiben von Meerrettich dient und f ü r letzteren Zweck auf der einen Seite kleine vorspringende Zähnchen besitzt, genau so wie Meerrettich zu zerreiben. Man erhält so eine überaus feine faserige Masse, die sehr rasch trocknet und sich infolge ihrer Feinheit sehr leicht löst. Celloidin ist Kollodiumwolle (im wesentlichen sog. Dinitrocellulose), die in wenig Äther-Alkohol gelöst ist und in gallertartigem Zustand in Platten in den Handel gebracht wird. I n t r o c k e n e m n i c h t a n g e f e u c h t e t e m Z u s t a n d ist Celloidin sehr f e u e r - und e x p l o s i o n s g e f ä h r l i c h . Zur Einbettung bedarf man einer 2°/o-, 4%- und 8°/oigen Lösung, die man sich in Kappenflaschen mit gut eingeschliffenem Glasstöpsel herstellt. Zur Herstellung von 1000 ccm einer 2%>igen Lösung übergießt man 20 g der getrockneten Celloidinwürfelchen in der Kappenflasche zunächst mit 500 ccm w a s s e r f r e i e m Alkohol und läßt die gut verschlossene Flasche unter öfterem Umschütteln 24 Stunden stehen. Während dieser Zeit quillt das Celloidin stark auf, ohne sich nennenswert zu lösen. Nach 24 Stunden schüttelt man nochmals gut durch und fügt dann 500 ccm w a s s e r f r e i e n Äthers 1 ) zu, worauf sich das gequollene Celloidin, namentlich wenn man die Flasche in mehrstündigen Zwischenräumen abwechselnd auf den Kopf stellt, verhältnismäßig rasch löst. Ähnlich verfährt man bei der Herstellung der 4- und 8°/oigen Lösung. Der Kappenschliff der Glasflaschen muß durch Vaseline oder Hahnenfett abgedichtet werden. Läßt man das Celloidin in dieser Weise zuerst in Alkohol vorquellen, dann geht Lösung hernach viel rascher vor sich als bei sofortigem Zusatz von Äther-Alkohol. Von Äther allein wird trockenes Celloidin nicht gelöst. 444. Unter der Bezeichnung »Celloidin für histologische Zwecke, wasserfrei« liefert Schering Celloidintafeln, die aus Kollodiumwolle und absolutem Alkohol bestehen. Sie brauchen daher nicht erst getrocknet zu werden, sondern können nach Zerschneiden in dünne Späne sofort mit Alkohol-Äther versetzt werden, in dem sie sich natürlich erheblich rascher lösen als getrocknetes Celloidin. Vor Ansetzen einer Lösung muß die Tafel gewogen werden. Da jede Tafel 40 g Kollodiumwolle enthält, so erfährt man aus dem Gewicht nach Abzug von 40 g die Menge des in ihr enthaltenen Alkohols. B e i s p i e l : Es sollen 1000 ccm einer 4°/oigen Lösung bereitet werden. Gewicht der Tafel: 200 g = 40 g Kollodiumwolle + 160 g absoluter Alkohol; man braucht also noch 320 g absoluten Alkohol + 480 g Äther.

445. Einfach und rasch ist die Herstellung der Celloidinlösung bei Verwendung von C e d u k o 1, das von der I. G. Farbenindustrie in den Handel gebracht wird. Cedukol ist ein leicht lösliches Zellstoffpräparat; die feinen weißen Flocken sind schwach mit 50°/oigem Alkohol befeuchtet, der während des ') Mit der abgekürzten Bezeichnung »Äther« ist im vorliegenden Buch stets Äthylx y 1 i n verwenden, ohne daß diese Stoffe wesentliche Vorteile bieten.

§ 446—449.

B. Celloidineinbettung

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L a g e r n s v o r V e r d u n s t e n z u s c h ü t z e n ist. Die P a c k u n g ist d a h e r k ü h l u n d vor direktem Sonnenlicht geschützt aufzubewahren. Z u r . B e r e i t u n g der d i c k f l ü s s i g e n S t a m m l ö s u n g übergießt man l a u t G e b r a u c h s a n w e i s u n g den I n h a l t e i n e r P a c k u n g m i t 500 ccm eines Gemisches von gleichen V o l u m t e i l e n Ä t h e r u n d a b s o l u t e m Alkohol. Die L ö s u n g geht, n a m e n t l i c h w e n n m a n die F l a s c h e i n s t ü n d l i c h e m Wechsel auf Kopf u n d B o d e n stellt, in w e n i g e n S t u n d e n v o r sich. F ü r w a s s e r f r e i e L ö s u n g e n ist es nötig die C e d u k o l f l o c k e n z u e r s t auf F i l t r i e r p a p i e r a u s g e b r e i t e t zu t r o c k n e n . C e d u k o l löst sich a u c h in g e t r o c k n e t e m Z u s t a n d viel l e i c h t e r w i e g e w ö h n l i c h e s Celloidin. D e r I n h a l t e i n e r P a c k u n g w i e g t f e u c h t 75 g, g e t r o c k n e t 40 g. Die obige S t a m m l ö s u n g e n t s p r i c h t also e i n e r 8°/oigen Celloidinlösung. H e r s t e l l u n g der 4%>igen L ö s u n g : 1 Teil S t a m m l ö s u n g + 1 Teil Ä t h e r - A l k o h o l . 2°/oige L ö s u n g : 1 Teil S t a m m l ö s u n g + 3 Teile Ä t h e r - A l k o h o l . 446. In gleicher Weise wie Celloidin kann man auch P h o t o x y l i n oder C o 11 o x y 1 i n verwenden, ohne daß diese Stoffe wesentliche Vorteile bieten. 447. Z u r H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g e n v e r w e n d e t m a n a m b e s t e n wasserfreien Äthyläther 0,713 D.A.B. 6 in O r i g i n a l p a c k u n g . D e r g e w ö h n l i c h e A t h y l ä t h e r m u ß v o r seiner V e r w e n d u n g m e i s t erst g e r e i n i g t u n d e n t w ä s s e r t w e r d e n . 448. R e i n i g u n g d e s Ä t h y l ä t h e r s (Schwefeläthers). Der gewöhnliche, käufliche Äther ist mit Wasser, Wasserstoffsuperoxyd, Alkohol und anderen Substanzen verunreinigt, von welchen vor Bereitung der Celloidinlösung vor allem der Wassergehalt entfernt werden soll. Besser als das Stehenlassen über geröstetem Kupfersulfat ist folgendes, von Chemikern häufig geübte Verfahren: zunächst empfiehlt es sich, die Hauptmenge des Wassers durch Schütteln mit 50°/oiger Schwefelsäure zu entfernen. Man bereitet sich dazu in einem Erlenmeyerkölbchen (vorsichtig!) ein Gemisch von 50 ccm konz. Schwefelsäure und 50 ccm dest. Wassers, kühlt dasselbe ab (!!) und gibt es nach Erkalten in einen Scheidetrichter zu 500 ccm des zu reinigenden Äthers, worauf kräftig durchgeschüttelt wird. Hierauf trennt man die im Schütteltrichter unten angesammelte Schwefelsäure ab, der darüber befindliche ausgeschüttelte Äther kommt in eine sauber gereinigte, trockene, braune Kappenflasche und wird zur Entfernung der noch vorhandenen Wasser-, Säure- und Alkoholreste mit 3—5 g metallischem Natrium versetzt, das man in dünnen Spänen oder noch besser in Spiralfäden oder kleinen Kügelchen zugibt. Einfacher, f ü r die vorliegenden Zwecke aber völlig zureichend, ist folgendes Verfahren: Zuerst läßt man den Äther f ü r 2—3 Tage über gekörntem Calciumchlorid stehen (eine Hand voll pro Liter). Dann abfiltrieren unter Bedecken des Trichters mit einer Glasscheibe (Vorsicht wegen Feuergefahr; im Raum darf kein offenes Feuer oder Licht sein, die Dämpfe können sich auch an einer entfernt vom Arbeitstisch liegenden Feuerstelle entzünden. Nicht Rauchen!). Dann Einlegen von Natriumstückchen (s. o.) und Verschließen der Flasche mit einem Stopfen mit aufgesetztem Chlorcalciumrohr, damit der entwickelte Wasserstoff entweichen kann. Nach zwei Tagen Aufsetzen des eigentlichen Stopfens. Das metallische Natrium kommt in verlöteten Blechbüchsen in den Handel. Nach Aufschneiden der Büchse überträgt man die Natriumstangen, die sich an der Luft rasch mit einem weißlichen Überzug bedecken, sofort in ein mit reinem Petroläther oder Benzol gefülltes gut verschließbares Glasgefäß, so daß sie vollkommen von Flüssigkeit bedeckt sind. In dieser Weise lassen sie sich lange Zeit im Vorrat aufheben. Verbrauchtes Natrium wird in einer Schale durch Übergießen mit Alkohol (nicht Wasser!) vernichtet. Beim Arbeiten mit Natrium setze man eine Schutzbrille auf. 449. P r ü f u n g d e s Ä t h e r s a u f W a s s e r . Man schüttelt 2—3 ccm des Äthers im Reagensglas mit der gleichen Menge Schwefelkohlenstoff: bei Wassergehalt

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Durchtränkung und Einbettung

§ 450.

tritt Trübung ein. — Auf A l k o h o l : man fügt zu einer Probe etwas Anilinviolett; alkoholfreier Äther bleibt ungefärbt. — Auf S ä u r e g e h a l t : Lakmuspapier oder ein zugesetzter Tropfen Lakmustinktur wird rot gefärbt. 2. Ausführung der Celloidineinbeffung 450. A l k o h o l - C e l l o i d i n m e t h o d e (nach v. A p ä t h y ) . 1. Die in absolutem Alkohol sorgfältig entwässerten Präparate werden zunächst in wasserfreien Äther-Alkohol übertragen, der durch Vermischen gleicher Raumteile von Äther und Alkohol bereitet wird. 2. Nach 4—6 Stunden wird das Gemisch abgegossen und durch eine 2°/oige Celloidinlösung ersetzt. Nach 2 Tagen kommen die Präparate in eine 4°/oige, nach weiteren 2 Tagen in eine 8°/oige Lösung, in der sie 4—8 Tage verbleiben. Diese Zeiten gelten f ü r 3—4 mm dicke, leicht durchdringliche Objekte. Größere Präparate und solche mit sehr dichter Struktur (z. B. Sehnen, Knochen) müssen in der 2- und 4°/oigen Lösung mehrere Tage bis Wochen verweilen. Die Gläschen für die zu durchtränkenden Präparate sollen in ihrer Größe so bemessen sein, daß sie von der benötigten Lösungsmenge möglichst ausgefüllt werden. Sie müssen mit gutsitzenden Korken verschlossen sein. Zweckmäßig stellt man sie dann in einen mit Calciumchlorid gefüllten Exsikkator. 3. Nach hinreichender Durchtränkung gießt man die Präparate mit der 8°/oigen Celloidinlösung in ein Einbettungsgefäß. Nach Orientieren der Präparate wird das Schälchen in einen mit Schwefelsäure versehenen Exsikkator gestellt, in dem dann die Celloidinlösung auf die Hälfte ihres Volumens, also auf die Konzentration einer 16%>igen Lösung, eingedickt wird ( „ E i n d i c k u n g"). Für die Güte des späteren Celloidinblockes ist von größter Wichtigkeit, daß dieser Prozeß der Eindickung gleichmäßig vor sich geht, da anderenfalls die Bodenschicht des Blockes zu weich bleibt. Die Eindickung soll daher nicht zu rasch erfolgen, was dadurch erreicht wird, daß man auf das Einbettungsgefäß von Zeit zu Zeit für eine halbe Stunde die Deckelscheibe auflegt. Wesentlich ist das Verhältnis von Celloidinmenge einerseits, Luftraum im Exsikkator und Oberflächengröße der Schwefelsäure andererseits. Je größer die beiden letzten Faktoren sind, desto rascher verläuft der Prozeß und desto schwieriger wird ein gleichmäßiges Eindicken. Es ist daher zweckmäßig, das Schwefelsäuregefäß nicht zu groß zu nehmen und je nach der Zahl der Präparate einen kleineren oder größeren Exsikkator zu verwenden. Die Menge der 8°/oigen Celloidinlösung muß so reichlich bemessen werden, daß sich auch nach Eindicken auf die Hälfte noch eine 2—3 mm hohe Schicht über den Präparaten befindet. Liegen die Objekte zu nahe der Oberfläche, so werden sie durch den entstehenden Schrumpfungsdruck oft stark deformiert. Nachträgliches Nachgießen von Celloidinlösung ist unzweakmäßig. Um den Grad der Eindickung exakt feststellen zu können, klebt man an die Außenseite des Einbettungsgefäßes ein Streifchen Millimeterpapier, an dem man die Anfangshöhe und die daraus berechnete Endhöhe des Flüssigkeitsspiegels anzeichnet. Bildet sich beim Einengen schon nach kürzerer Zeit an der Oberfläche des Celloidins ein festes Häutchen, so ist das Celloidin nicht wasserfrei. In diesem Fall wird es meist nicht möglich sein, die optimale Schnittfähigkeit zu erreichen. Um ein weiteres Eindicken auch der tieferen Teile zu ermöglichen und die Bildung von Hohlräumen zu vermeiden, muß das Häutchen dann mit einem Messerchen vom Rand des Einbettungsgefäßes losgelöst werden. Wenn im letzten Stadium des Eindickens störende Luftblasen auftreten, so läßt sich die Situation dadurch retten, daß man etwas wasserfreien Äther-Alkohol (8ä)

§ 451—454.

B. Celloidineinbettung

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zusetzt und das Einbettungsgefäß für etwa eine Stunde abdeckt. Die Luftblasen steigen dann nach Lösen des Celloidins entweder von selbst auf oder lassen- sich leicht mit einer Zupfnadel entfernen. Die Celloidinlösung nimmt wieder gleichmäßige Beschaffenheit an, worauf die Eindickung auf das ursprünglich angezeichnete Volumen fortgesetzt wird. 4. Ist die Celloidinlösung auf die Hälfte eingedickt, so stellt man das Einbettungsgefäß in eine mit Deckel versehene Glasschale, deren Boden mit einer 0,5—1 cm hohen Schicht von 70°/oigem Alkohol bedeckt ist, und wartet ab, bis sich unter der Einwirkung der wasserhaltigen, Alkoholdämpfe an der Oberfläche des Celloidins im Laufe einiger Stunden ein Häutchen gebildet hat ( V o r h ä r t u n g ) . Dabei kommt es auch zu einer weiteren Volumverminderung des Celloidins, die nach Bedarf verschieden weit getrieben wird. Schließlich füllt man auch das Einbettungsgefäß selbst mit 70°/oigem Alkohol, der unter Aufnahme des noch im Celloidin befindlichen absoluten Alkohols eine weitere Entquellung und dadurch H ä r t u n g des Celloidins bewirkt. Nach 24 Stunden ist es dann so fest, daß das Präparat umschnitten und vorsichtig aus der Schale gehoben werden kann. Der so erhaltene Block wird dann zur weiteren Härtung noch einige Tage in die mehrfache Menge 70°/oigen Alkohols gelegt, in dem er auch aufbewahrt wird. Noch stärker härtet ein Gemisch aus einem Teil Glyzerin und zwei Teilen 70°/oigen Alkohol. Die bei der V o r h ä r t u n g eintretende weitere Volumverminderung unterbleibt, wenn man das eingedickte Celloidin nicht Alkohol-, sondern C h l o r o f o r m dämpfen aussetzt. Zu diesem Zweck wird das Einbettungsgefäß in eine Deckelschale gestellt, deren Boden 3—5 mm hoch mit Chloroform bedeckt ist. Nach 24 Stunden ist das Celloidin unter der Einwirkung der Dämpfe gleichmäßig erstarrt. Der Block wird dann herausgeschnitten und noch 2—3 Tage lang in 70°/oigem Alkohol oder in Alkohol-Glyzerin nachgehärtet. Über Aufblocken s. § 484 ff., über Schneiden § 510. 451. Das Eindringungsvermögen der Celloidinlösungen ist recht gering; es kann daher leicht vorkommen, daß die Präparate nicht hinreichend mit Celloidin durchdrungen sind. In diesem Fall ist die Schnittfläche des eingebetteten Präparates nicht glatt, sondern rauh. Besonders schlecht dringt Celloidin in pikrinsäurehaltige Präparate ein (Abhilfe s. § 306). 452. Um die Durchtränkung mit Celloidin zu beschleunigen, stellen S c h a f f e r , W o l f u. a. die in kleinen mit Kork gut verschlossenen Gläschen befindlichen Objekte in eine Rotationstrommel (nach § 195, oder Wasserrad nach T h o m a). 453. D e r G r a d d e r E i n d i c k u n g i n § 450, 3 u n d d e r V o r h ä r t u n g in 4 i s t e n t s c h e i d e n d f ü r d i e H ä r t e u n d S c h n i t t f ä h i g k e i t d e s s p ä t e r e n B l o c k e s . Ist die Eindickung wegen zu frühzeitiger Unterbrechung des Prozesses oder wegen Wassergehaltes der Celloidinlösung zu gering, so hilft auch alles nachträgliche Härten des Blockes nichts mehr. Bei Gebrauch wasserfreier Lösungen hält man sich wie oben an die Vorschrift A p ä t h y s , daß die 8°/oige Lösung auf die Hälfte ihres Volumens eingedickt werden soll. Dieses 16°/oige Celloidin-Sol ist bei richtige Einhaltung der Vorschriften noch von zähflüssiger Beschaffenheit. Ist es zittrig-sulzig, so zeigt dies fehlerhafte wasserhaltige Beschaffenheit an. Bei derartigen wenige;- sorgfältig bereiteten wasserhaltigen Lösungen muß man das Eindicken so lange fortsetzen, bis das Celloidin etwa die Konsistenz eines weichen Radiergummis besitzt. Dann Härtung in Alkohol oder Glyzerin-Alkohol. Der f e r t i g e Block soll die Konsistenz eines Hartgummis besitzen. 454. S e k i (37c) läßt über die Oberfläche des eingedickten Celloidins aus einem Erlenmeyerkölbchen durch ein gebogenes Glasröhrchen für 15—30 Sekunden Wasserdämpfe streichen, wodurch es sofort zur Bildung eines dünnen Häutchens kommt. Dann überschichtet er zur Härtung mit 70°/oigem Alkohol-Chloroform

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Durchtränkung und Einbettung

§ 455—458

(10 :3). N a c h 24 S t u n d e n müssen die Blöcke noch f ü r einige Tage in 70°/oigem Alkohol n a c h g e h ä r t e t w e r d e n . 455. Als E i n b e t t u n g s g e f ä ß e v e r w e n d e t m a n Glasschälchen mit s e n k r e c h t e r W a n d u n g u n d f l a c h e m Boden, von d e n e n m a n sich eine Anzahl v o n v e r s c h i e d e n e r G r ö ß e v o r r ä t i g hält. A p ä t h y e m p f i e h l t Glasringe mit a u f g e s c h l i f f e n e r B o d e n u n d Deckelscheibe. Bei Alkohol-Celloidin w i r d der Ring mit G u m m i s i r u p , bei C h l o r o f o r m h ä r t u n g des Celloidins m i t P a r a f f i n , bei G e l a t i n e e i n b e t t u n g m i t N e l kenöl-Celloidin aufgeklebt. Als E x s i k k a t o r v e r w e n d e t A p ä t h y eine Glasglocke, die auf e i n e m a t t i e r t e Spiegelglasscheibe aufgeschliffen ist. 456. Z a c h (38) b r i n g t die in 8o/°iger Celloidinlösung liegenden O b j e k t e in einen mit C a l c i u m c h l o r i d beschickten E x s i k k a t o r . Alle 12 S t u n d e n w i r d dieser geöffnet, E i n b e t t u n g s g e f ä ß u n d T r o c k e n m i t t e l h e r a u s g e n o m m e n u n d die Ä t h e r dämpfe verjagt. Hernach wird Einbettungsgefäß und alkoholfeuchtes Calciumchlorid w i e d e r z u r ü c k g e b r a c h t u n d der E x s i k k a t o r verschlossen. N a c h 2—3 Tagen b e g i n n t d a s Celloidin infolge des Ä t h e r v e r l u s t e s in F o r m e i n e r w e i c h e n Sülze a u s z u f a l l e n . Das an d e r O b e r f l ä c h e sich bildende H ä u t c h e n m u ß v o n der W a n d u n g mit e i n e m Messerchen abgelöst w e r d e n . M e r k t m a n beim L ü f t e n n u r m e h r g e r i n g e n Ä t h e r g e r u c h , d a n n geht m a n a n die B e f r e i u n g des Celloidins v o m absol u t e n Alkohol. Sie erfolgt d a d u r c h , daß m a n n u n alle 12 S t u n d e n das d u r c h die A l k o h o l d ä m p f e g e t r ä n k t e Chlorcalcium a u s d e m T r o c k e n r a u m n i m m t , es a n z ü n d e t u n d n a c h V e r b r e n n e n des Alkohols in d e n E x s i k k a t o r z u r ü c k b r i n g t . Dies w i r d sol a n g e fortgesetzt, bis das Celloidin eine »gewisse, weiche Festigkeit« a n g e n o m m e n hat. Ü b e r die w e i t e r e B e h a n d l u n g s. § 461. Daß Z a c h n a c h der von A p ä t h y (s. § 450) a u s g e a r b e i t e t e n M e t h o d e keine g u t e n R e s u l t a t e erhielt, b e r u h t w o h l d a r a u f , d a ß er anscheinend nicht m i t w a s s e r f r e i e n L ö s u n g e n arbeitete.

457. M e t h a n o l - C e l l o i d i n nach S e k i (37). In vergleichenden Versuchen stellt S e k i fest, daß eine methylalkoholische Lösung von Celloidin besser und rascher in das Gewebe eindringt, als die gewöhnliche Lösung in Äthylalkohol. Als weiteren Vorteil fand er verminderte Schrumpfung. Zur Anwendung kommen 2-, 4- und 8°/oige Lösungen von Celloidin oder Cedukol in wasserfreiem Methanol. A u s f ü h r u n g : 1. Überführen der fixierten und wie üblich durch die Alkoholreihe geführten Präparate aus 95°/oigem Äthylalkohol in wasserfreies Methanol 24 Stunden. — 2. 2°/oiges Methanol-Celloidin 1 Tag. — 3. 4°/oiges Methanol-Celloidin 2 Tage. — 4. 8°/oiges Methanol-Celloidin 4 Tage. — 5. Übertragen in das Einbettungsgefäß mit 8°/oiger Lösung und Bildung eines Oberflächenhäutchens durch Aufstrahlen von Wasserdampf nach § 454. — 6. Überschichten mit einem Gemisch von 3 Teilen Chloroform und 10 Teilen 70°/oigem Äthylalkohol 1 Tag, bei drüsigem Gewebe bis zu 6 Tagen. Die Härtungsflüssigkeit soll mindestens das doppelte Volumen der Blockmasse betragen; sie ist einmal zu erneuern. —• 7. Zurechtschneiden des Blockes, der die Konsistenz eines weichen Radiergummis besitzt und mehrtägiges Nachhärten in 60—70%>igem Äthylalkohol. — Schnitte nicht dünner als 8 u möglich. G e n u ß von M e t h a n o l ( = Methylalkohol), a u c h ä u ß e r l i c h e r G e b r a u c h oder E i n a t m u n g g r ö ß e r e r Mengen, ist sehr gesundheitsschädlich; e r f ü h r t häufig zu S e h störungen und Erblindung.

458. Glyzerin-Celloidinmethode. W o l f (39) empfiehlt die P r ä p a r a t e nicht in

Alkohol, sondern in Glyzerin zu entwässern und dann direkt mit Celloidin zu durchtränken. W o l f hebt die Schnelligkeit und Einfachheit der Methode wie die Vollkommenheit der Celloidindurchtränkung hervor, die ich bestätigen kann. Ausführung: 1. Das Objekt kommt nach dem Auswaschen der Fixierungsflüssigkeit zuerst auf 6 Stunden in gewöhnliches Glyzerin (1,23 = 27—28° Be). Objekte mit größeren Hohlräumen f ü h r t man, um Schrumpfungen zu

§ 459—461.

B. Celloidineinbettung

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vermeiden, durch abgestufte Wasser-Glyzeringemische. — 2. Übertragen in wasserfreies Glyzerin (1,26 = 31° Be), das gut zu verschließen ist. 6 Stunden. — 3. Sorgfältiges Abtrocknen des Präparates mit einem weichen, gut ausgewaschenen Tuch. Die Oberfläche des Präparates soll dadurch möglichst vom Glyzerinüberschuß befreit werden. — 4. Einhängen des Präparates in 8°/oige Celloidinlösung, so daß das Glyzerin zu Boden sinken kann: 2 Tage. Dabei ist wichtig, daß nicht zuviel Objekte in einem Gefäß sind; f ü r ein Präparat von 3 X 6 X 6 mm sind 10—20 ccm der 8°/oigen Lösung zu rechnen. — 5. Einbetten wie in § 450, 3 u. 4. Die Zeiten gelten für ein Objekt der angegebenen Größe. Für größere und sehr dichte Präparate sind sie entsprechend zu verlängern.

459. Pyridin-Celloidinmefhode. K. B a u e r (41) überträgt das in Formol fixierte Objekt nach dem Wässern sogleich in ein Gemisch von gleichen Teilen Pyridin (puriss. Merck) und Celloidin (4%ige Lösung in wasserfreiem ÄtherAlkohol), das nach 24 Stunden erneuert wird. Nach weiteren 24 Stunden werden die Stücke f ü r 24 Stunden in reine 8°/oige Celloidinlösung übertragen. Dann Celloidineinbettung wie gewöhnlich. Härten in Chloroformdämpfen. Das Pyridin bewirkt eine wesentliche Beschleunigung des Eindringens des Celloidins. Die schrumpfende Wirkung des Pyridins wird nach den Angaben B a u e r s durch das Celloidin ausgeglichen. In ähnlicher Weise kürzt B a u e r auch die Einbettung in Paraffin ab. Die Objekte werden dabei aus Wasser für je 12 Stunden in Pyridin-Wasser (Sä) und in reines Pyridin übertragen; dann ebensolange in Pyridin-Paraffin (ää); Paraffin mit niedrigem Schmp. und weiter hartes Paraffin wie gewöhnlich. Bei diesem Verfahren kommt es allerdings zu stärkeren Schrumpfungen.

460. Öl-Celloidinmethode. Die in Alkohol-Gelloidin eingebetteten Objekte müssen in Alkohol aufgehoben und unter ständiger Alkoholbenetzung geschnitten werden. Um die damit verbundenen Nachteile zu vermeiden, ersetzte man verschiedentlich den Alkohol durch nicht trocknende Öle. Unter den verschiedenen Methoden steht das von A p ä t h y ausgearbeitete Verfahren an erster Stelle. Die Einbettung geht zunächst wie beim Alkohol-Celloidin vor sich (§ 450, 1—4). Dann wird der in 70°/oigem Alkohol gehärtete Bloch in 90°/oigen Alkohol gelegt. Nach 24 Stunden wird der Block in folgendem unbegrenzt haltbarem Ö l g e m i s c h (braune Flasche!) entwässert: 4 Gewichtsteile Chloroform, 2 Gwt. Origanumöl, 4 Gwt. Zedernholzöl, 1 Gwt. absoluter Alkohol, 1 Gwt. Carbolkristalle. Alle Bestandteile müssen wasserfrei sein. Ist der Block vollkommen durchsichtig (ohne Trübung) geworden, dann wird das Ölgemisch nach je 24 Stunden noch zweimal gewechselt. Wasserhaltig gewordenes Ölgemisch kann durch Zusetzen von geglühtem Natriumsulfat wieder entwässert werden. Hierauf kommen die Blöcke in wasserfreies Terpineol (von S c h i m m e l & Co.), das zur Entfernung des Ölgemisches 1—2mal gewechselt wird. Die damit durchtränkten Blöcke werden in Terpineol oder trocken in Glastuben verschlossen aufbewahrt. Da das Celloidin durch das Öl ganz aufgehellt wird, ist es oft gut, es etwas anzufärben. Zu dem Zweck setzt man dem 70°/ooder 90% Alkohol etwas alkoholische Safraninlösung zu. (Über das Aufkleben und Schneiden der Blöcke siehe §§ 486, 504, 511, 558 und 567.) Arbeitet man bei Durchtränkung und Einbettung mit wasserfreien Lösungen, so tritt an der Luft keine Schrumpfung der Blöcke ein; wasserhaltige oder nicht genügend eingedickte Blöcke bröckeln oder schieben sich beim Schneiden und sind wenig brauchbar. 461. In etwas vereinfachter Form bringt Z a c h (38) die nach § 457 behandelten Objekte zunächst für 24 Stunden in 1—2mal zu wechselnden 90°/oigen Alkohol,

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Durchtränkung und Einbettung

§ 462—464.

dann ebensolange in Alkohol (90°/oig)-Terpineol 3:1, Alkohol-Terpineol 1 :1 und schließlich für einige Tage in reines Terpineol, das zur Beseitigung des Alkohols mehrmals gewechselt wird. 462. ö l c e l l o i d i n m e t h o d e von J o r d a n . Die wie gewöhnlich mit wasserfreiem Alkohol und mit Alkohol-Äther vorbehandelten Stücke werden wie in § 450 mit Celloidin durchtränkt; nur setzt man der 2- und 4°/oigen Celloidinlösung auf je 4 Teile einen Teil Zedernholzöl zu (beim 8°/oigen auf 5 Teile). Dann bringt man das in der dicken Lösung liegende Objekt in eine Papierform, härtet kurze Zeit in Chloroformdämpfen, bis sich eine Haut gebildet hat, und überträgt in die aus 5 Teilen wasserfreiem Chloroform und 1 Teil Zedernöl bestehende Härtungsflüssigkeit, die mehrmals gewechselt wird. Nach einigen Tagen ist der Block genügend gehärtet. Nach dem Aufblocken und Nelkenölcelloidin (§ 486) wird der Block zum Härten in das Chloroform-Zedernholzölgemisch zurückgebracht. C. Die Einbettung in Celloidin-Paraffin 463. Ausgezeichnete Dienste leistet in vielen Fällen die Celloidin-Paraffinmethode, welche die Vorteile der P a r a f f i n e i n b e t t u n g mit solchen des Celloidinv e r f a h r e n s vereinigt. F ü r zarte, bei P a r a f f i n e i n b e t t u n g leicht s c h r u m p f e n d e O b j e k t e (z. B. Mesenchymgewebe, B l u t b i l d u n g s h e r d e u. dgl.) ist das V e r f a h r e n ganz besonders zu empfehlen. J e nach d e r Eindickungsstärke des Celloidins u n d d e m Schmelzpunkt des Paraffins läßt sich die H ä r t e des Blockes verschieden einstellen. F ü r 10—15 ¡i dicke Schnitte darf die Eindickung des Celloidins nicht so weit getrieben w e r d e n wie f ü r Alkohol-Celloidin. Zweckmäßig w ä h l t m a n in diesem Falle auch ein weicheres P a r a f f i n z. B. mit S c h m e l z p u n k t 50 bis 52° C. S t a r k e s Eindicken u n d hartes P a r a f f i n dagegen ermöglichen es, selbst 1 ¡1 dicke Schnitte ohne Deformation zu gewinnen. Von den im S c h r i f t t u m vorliegenden V e r f a h r e n seien nachfolgende a n g e f ü h r t . A m e x a k t e s t e n ist die Methode von A p ä t h y , die auch w e i t g e h e n d s t e Anpassung an die Schnittdicke gestattet. In vielen F ä l l e n genügen aber auch schon e i n f a c h e r e V e r f a h ren, wie z. B. das von P f u h l . 464. C e l l o i d i n - P a r a f f i n m e t h o d e n a c h v. A p ä t h y. Die Objekte k o m m e n zunächst wie in § 450, 1—2 d u r c h Äther-Alkohol f ü r entsprechende Zeit in 2-,4- u n d 8°/oige Celloidinlösung. Sind Schnitte von 1—5fa erwünscht, so w i r d diese wie in § 450, 3 noch w e i t e r auf 16°/o eingedickt, f ü r dickere Schnitte stellt m a n das Einbettungsgefäß schon mit der 8°/oigen (unter U m s t ä n d e n sogar schon m i t der 4°/oigen) Lösung in eine gut verschlossene Schale, deren Boden einige Millimeter hoch mit Chloroform bedeckt ist (also keine Alkoholhärtung). D u r c h die C h l o r o f o r m d ä m p f e w i r d das Celloidin in wenigen S t u n d e n so gehärtet, daß m a n es in einzelne Blöcke zurechtschneiden kann, welche d a n n noch auf 24 S t u n d e n in Chloroform gebracht werden. Von hier k o m m e n sie auf 24 S t u n d e n zur E n t f e r n u n g jeglicher Wasserspur in das in § 460 angegebene Ö l g e m i s c h , worauf w i e d e r u m dieses u n d der noch enth a l t e n e Alkohol d u r c h m e h r f a c h gewechseltes Benzol e n t f e r n t w i r d . Sodann legt m a n den Block auf mindestens 24 S t u n d e n in das heiße P a r a f f i n . Schließlich n i m m t m a n den Block aus dem Paraffin, legt ihn zwischen zwei O b j e k t t r ä g e r u n d t a u c h t ihn in kaltes Wasser oder m a n bettet i h n in gewöhnlicher Weise in P a r a f f i n ein. Die Ölcelloidin- wie die Celloidinparaffinmethode nach A p ä t h y leistet auch bei schwer s c h n e i d b a r e n O b j e k t e n (wie z. B. Insekten) sehr gute Dienste. (Vgl. S i k o r a 16).

§ 465—467.

C. Celloidin-Paraffin — D. Gelatineeinbettung

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Ölcelloidinblöcke (nach A p ä t h y) können leicht in Paraffincelloidinblöcke umgewandelt werden, indem man vor der Paraffineinbettung durch Benzol das Terpineol entfernt. Die Blöcke müssen vorher aber mit dem ölgemisch entwässert sein. 465. W a s s e r m a n n benutzt die Celloidin-Paraffinmethode- zur Einbettung ganz kleiner Objekte. Er verwendet dazu kleine Glasrohrstutzen von 7 mm Länge und 4 mm Durchmesser, die am einen Ende plangeschliffen sind und hier mit Paraffin auf ein Glasplättchen aufgeklebt werden. Die im Äther-Alkohol befindlichen Objekte werden mit einer weiten Pipette in die Kammer übertragen, die Flüssigkeit mit einer Kapillarpipette bis auf einen geringen Rest abgesaugt und durch 3°/oige Celloidinlösung ersetzt, die man in bedeckter Schale im Laufe einiger Tage auf die Hälfte eindicken läßt. Dann Härten in Chloroform, Ablösen des Stutzens und Herausdrücken des erstarrten Celloidinblockes mit einem entsprechenden Holzdorn; nach weiteren 12stündigem Liegen in reinem Chloroform Zuschneiden und über Chloroform-Paraffin Einbetten in Paraffin. 466. P f u h l (40) bringt die Objekte wie gewöhnlich über Äther-Alkohol in 2- und 4°/oiges Celloidin. Aus diesem kommen sie nach mehrtätigem Verweilen direkt in Chloroform bis sie untersinken, dann zur Entfernung der letzten Wasserspuren in frisches Carbolxylol, weiter in Benzol (2mal wechseln), Benzol-Paraffin, weiches Paraffin (2mal, das zweite stets frisch) und hartes Paraffin. In eigenen Versuchen erhielt ich mit diesem einfachen Verfahren gute Resultate. Zu empfehlen ist, das Celloidin vor dem Einlegen der Präparate in Chloroform gut abtropfen zu lassen. Zu beachten ist ferner, daß nach verschiedenen Fixierungen die Präparate im Chloroform auch nach völliger Durchtränkung nicht untersinken. An Stelle von Carbolxylol verwende ich Carbolbenzol (10 : 100). Das Einlegen in weiches Paraffin ist oft entbehrlich. 466a. K o m b i n i e r t e C e l l o i d i n - P a r a f f i n e i n b e t t u n g nach S e k i (37). 1. Übertragen der Präparate aus 95°/oigem Äthylalkohol in wasserfreies Methanol 24 Stunden. — 2. Methanol-Äthyläther (55) 12 Stunden. — 3. l°/oige Celloidinlösung in Methanol-Äthyläther (55) 12 Stunden bis 4 Tage je nach Größe. — 4. Übertragen in das Einbettungsgefäß und Eindicken der Celloidinlösung auf etwa 2 h ihres Volumens im Exsikkator. — 5. Härtung in Chloroformdämpfen 24 Stunden. — 6. Ausschneiden des Celloidinblockes und Entwässern in wasserfreiem Iso-Buthylalkohol 12—24 Stunden (2—3mal erneuern). — 7. Übertragen in Benzol 3—5 Stunden (1—2mal wechseln). — 8. Benzol-Paraffin bei 35—45° C V2—1 Stunde. — 9. Paraffin. S e k i empfiehlt die dünne Celloidinlösung, da das Objekt in konzentrierteren Lösungen nach der Paraffineinbettung leicht zu hart wird und sich dann schwer schneidet und schlecht ausbreitet. D. Die Einbettung in Gelatine 467. Die Methoden der Gelatineeinbettung lassen sich in zwei nach Technik und Anwendungsbereich gänzlich verschiedene Gruppen trennen: das von v. A p ä t h y angegebene Verfahren und die von G a s k e 11 eingeführte Methode, die dann durch G r ä f f (16 u. 18), H e r i n g a und t e n B e r g e (23), A d r i o n (22) u. a. weiter vervollkommnet wurde. Als Gelatine empfehle ich besonders die von der Lijm- en Gelatinefabrik »Delft« (Holland) hergestellte pulverisierte Gelatine (»Einbettungsgelatine« und »Aufklebegelatine«). Bezugsquelle für Deutschland: Dr. K. Hollborn, Leipzig. Für die Wahl der Methode beachte man folgendes: Bei der v. A p ä t h y s c h e n M e t h o d e kommen die Objekte bis zum absoluten Alkohol und wer-

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Durchtränkung und Einbettung

§ 468.

d e n T e m p e r a t u r e n b i s z u 60° C ausgesetzt. S i e e i g n e t s i c h also n i c h t f ü r U n t e r s u c h u n g e n auf F e t t - u n d L i p o i d s u b s t a n z e n . N a c h v. A p ä t h y g e l i n g t es j e doch, die s t r u k t u r l o s e , i n t e r s t i t i e l l e G r u n d g a l l e r t e v o l l k o m m e n u n g e s c h r u m p f t z u erhalten. A u c h f ü r R e k o n s t r u k t i o n e n ist s i e w e g e n d e s F e h l e n s v o n F o r m veränderungen empfehlenswert. D i e Objekte dürfen jedoch höchstens 6 m m d i c k sein. F ü r die a l l g e m e i n e A n w e n d u n g ist die M e t h o d e aber e t w a s u m s t ä n d lich. U m e i n e n a c h h e r i g e F ä r b u n g z u u m g e h e n , a r b e i t e t m a n a m b e s t e n m i t Stückfärbung. B e i der M e t h o d e n a c h G a s k e l l w i r d d i e E i n w i r k u n g v o n A l k o h o l u n d a n d e r e n f e t t l ö s e n d e n S u b s t a n z e n s o w i e e i n e E r w ä r m u n g ü b e r 38° C v o l l k o m m e n v e r m i e d e n . D i e e i n g e b e t t e t e n O b j e k t e w e r d e n a m b e s t e n auf d e m G e f r i e r m i k r o t o m g e s c h n i t t e n . Bei r i c h t i g e r T e c h n i k g e l i n g t es o h n e S c h w i e r i g k e i t , auch v o n g a n z l o c k e r g e b a u t e n G e w e b e n , w i e z. B. H o d e n , 7—10 u d i c k e f e h l e r f r e i e S c h n i t t e n z u erhalten. V o n d e n M o d i f i k a t i o n e n der G a s k e l l s c h e n M e t h o d e sind b e s o n d e r s die v o n G r ä f f (16, 18) u n d d i e v o n H e r i n g a u n d t e n B e r g e (23) s e h r z u e m p f e h l e n . B e i der e r s t g e n a n n t e n w i r d die G e l a t i n e i n W a s s e r unlöslich, so daß sie aus d e m S c h n i t t e n u r d u r c h L a u g e (B ö h m i g 28) e n t f e r n t w e r d e n k a n n , w a s m a n c h e N a c h t e i l e hat. D i e z w e i t e g e s t a t t e t d a g e g e n die G e l a t i n e n a c h A u f k l e b e n des S c h n i t t e s s c h o n allein d u r c h w a r m e s W a s s e r b i s auf m i n i m a l e R e s t e w i e d e r z u e n t f e r n e n . 468. Methode von Apäthy: a) H e r s t e l l u n g d e r Einbettungsmasse: 50 g Gelatine von der feinsten k ä u f l i c h e n Sorte in t r o c k e n e n B l ä t t e r n w e r d e n in 175 g destillierten Wassers u n d 25 g Glyzerin w a r m gelöst, im T h e r m o s t a t e n filt r i e r t u n d eben d o r t ü b e r Chlorcalcium bis z u m v o l l k o m m e n e n V e r d u n s t e n des Wassers eingedickt. N a c h E r k a l t e n der Masse, die w a r m eben noch in F a d e n zu ziehen ist, w i r d sie in k l e i n e W ü r f c h e n zerschnitten, die in diesem Z u s t a n d in gut verschlossener Flasche u n b e g r e n z t a u f b e w a h r t w e r d e n k ö n n e n , b) D u r c h t r ä n k u n g u n d E i n b e t t u n g d e s O b j e k t e s : Die zuerst bis z u m 96°/o-Alkohol d u r c h g e f ü h r t e n O b j e k t e m ü s s e n z u n ä c h s t vom Alkohol b e f r e i t u n d allmählich in Glyzerinwasser (4 Volumteile Glyzerin, 5 Volumteile Wasser) ü b e r g e f ü h r t w e r d e n . U m S c h r u m p f u n g e n zu v e r m e i d e n , k a n n m a n das Glyzerinw a s s e r m i t destilliertem Wasser, 35°/o-, 70°/o- u n d 90°/o-Alkohol überschichten u n d das O b j e k t sich a l l m ä h l i c h h e r a b s e n k e n lassen. (Kann einige Tage dauern.) Schließlich w i r d das Glyzerinwasser zur E n t f e r n u n g jeglicher Alkoholspur m e h r m a l s gewechselt; d a n n setzt m a n zu i h m das gleiche Volumen e i n e r G e l a t i n e lösung, die d u r c h Lösen von 3 Teilen der oben b e s c h r i e b e n e n Gelatinemasse in 7 Teilen w a r m e n Wassers hergestellt wird. D a r i n bleibt das O b j e k t im z u g e k o r k t e n T u b u s m i n d e s t e n s 24 S t u n d e n bei 40° C. H i e r a u f gießt m a n sie in das E i n bettungsgefäß, stellt .es in eine große, gut v e r s c h l i e ß b a r e Glasschale, auf d e r e n Boden Chlorcalcium liegt u n d -bringt das Ganze w i e d e r in den T h e r m o s t a t e n bei 55—60°. N u n w i r d so l a n g e eingedickt, bis die u r s p r ü n g l i c h e Lösung auf die H ä l f t e k o n z e n t r i e r t ist. D a n n n i m m t m a n das G e f ä ß aus d e m W ä r m e s c h r a n k u n d läßt die Lösung e r s t a r r e n . M a n b e k o m m t so eine Masse, w e l c h e e t w a 1 Teil Gelatine, 3 Teile Glyzerin u n d 1 Teil Wasser e n t h ä l t . F ü r die S c h n i t t f ä h i g k e i t ist dieses V e r h ä l t n i s a m günstigsten. Ist zuviel W a s s e r in d e r Masse, d a n n k o m m t es s p ä t e r i m Alkohol zu S c h r u m p f u n g e n , ist zu w e n i g darin, d a n n w i r d die S u b stanz zu h a r t . Die e r s t a r r t e n Blöcke schneidet m a n auf einer mit P a r a f f i n , liquid, bestrichenen Glasplatte zurecht, i n d e m m a n das mit Öl oder P a r a f f i n , liquid, b e n e t z t e Messer h i n d u r c h d r ü c k t , n i c h t zieht. Block zweckmäßig n i c h t dicker als 5—6 m m . D e r selbe w i r d d a n n mit einer Stecknadel auf der U n t e r s e i t e eines K o r k e s befestigt u n d dieser auf einen e t w a 50 ccm absoluten Alkohol e n t h a l t e n d e n T u b u s gesetzt, so daß Glyzerin u n d Wasser allmählich d u r c h Alkohol e n t f e r n t w e r d e n . N a c h

§ 469—470.

D. G e l a t i n e e i n b e t t u n g

109

24 S t u n d e n w i r d das P r ä p a r a t in gleicher Weise in neuen, w a s s e r f r e i e n absoluten Alkohol gebracht. So w i r d es m e h r e r e Tage g e h ä r t e t (für j e d e n Millimeter 1 Tag). D a n n w i r d der K o r k m i t Block u n d Nadel auf e i n e n mit Terpineol gefüllten T u b u s gesetzt. Der Alkohol ist in ebensovielen T a g e n d u r c h das ö l ersetzt u n d der Block s c h n i t t f ä h i g . (Über A u f k l e b e n u n d S c h n e i d e n siehe § 487 u n d 511.) Bei d e r a r t i g e i n g e b e t t e t e m M a t e r i a l läßt sich b e i m Schneiden a u c h bei einer S c h n i t t d i c k e von 1—2 a jegliche Deformation v e r m e i d e n , w e s h a l b diese Methode b e s o n d e r s f ü r R e k o n s t r u k t i o n e n Vorteile besitzt. 469. Methode von Gaskell-Gräff: a) H e r s t e l l u n g der Einbettungsm a s s e . M a n b e n ö t i g t eine d ü n n e (12,5°/oige) u n d eine d i c k e (25°/oige) G e latinelösung. Z u r B e r e i t u n g d e r letzteren schmilzt m a n auf d e m W a s s e r b a d (bei 37° C) 25 g feinster, in S t ü c k c h e n zerschnittener Gelatine in 75 ccm l°/oigen K a r bolwassers (in geschlossenem Gefäß, u m V e r d u n s t u n g zu vermeiden). Die d ü n n e Lösung e r h ä l t m a n d u r c h V e r d ü n n u n g von 1 Teil der dicken Lösung mit 1 Teil K a r b o l w a s s e r . M a n f ü l l t die in g r ö ß e r e r Menge hergestellten Lösungen in kleinere, f ü r je e i n e E i n b e t t u n g h i n r e i c h e n d e Teile in Reagenzgläser oder dgl. ab. Die Masse soll n ä m l i c h i m m e r n u r einmal v e r w e n d e t w e r d e n , da die Gelatine u m so schlechter gerinnt, je ö f t e r sie geschmolzen wird. b) D u r c h t r ä n k u n g und Einbettung. Die n i c h t ü b e r 3 m m dicken Organscheiben m ü s s e n z u n ä c h s t d u r c h 24stündiges W ä s s e r n in f l i e ß e n d e m Wasser g r ü n d l i c h von d e r F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t b e f r e i t w e r d e n . E r s t d a n n legt m a n sie, da sonst wegen G e r i n n u n g der Gelatine keine g u t e D u r c h t r ä n k u n g erfolgt, auf 6—24 S t u n d e n in die d ü n n e u n d mindestens e b e n s o l a n g e in die dicke G e l a t i n e lösung bei 37° C ein. Hierauf b r i n g t m a n sie in das E i n b e t t u n g s g e f ä ß (Papierk ä s t c h e n oder dgl) in dicke Gelatinelösung u n d läßt möglichst r a s c h (wenn m ö g lich im Eisschrank) e r s t a r r e n . N a c h etwa 30 M i n u t e n schneidet m a n den Block zu, t r o c k n e t an d e r L u f t weiter, bis er die Konsistenz eines m i t t e l h a r t e n R a d i e r g u m m i s h a t u n d legt ihn zur H ä r t u n g f ü r 1—2 Tage in reichlicher F o r m a l i n lösung 1 : 4. F ü r l ä n g e r e s A u f b e w a h r e n k o m m t er d a n n in eine Formalinlösung 1 : 10. W i r d der Gelatineblock zu f r ü h in F o r m a l i n g e h ä r t e t , so f ü h l t er sich glitschig o d e r bröckelig an. Z u m Schneiden w i r d d e r Block n a c h 1 k— 1 /->stündigem W ä s s e r n auf dem G e f r i e r m i k r o t o m t i s c h l a n g s a m a n g e f r o r e n , indem m a n in g r ö ß e r e n A b s t ä n d e n K o h l e n s ä u r e a u s t r e t e n läßt, bis das O b j e k t h a r t g e w o r d e n ist. Gibt m a n zu viel oder zu rasch K o h l e n s ä u r e zu, so ü b e r f r i e r t das P r ä p a r a t u n d l ä ß t sich nicht schneiden. Das A b b r e c h e n des Blockes l ä ß t sich d a d u r c h v e r m e i d e n , daß m a n zwischen O b j e k t t i s c h u n d Block e t w a s flüssige Gelatinelösung o d e r ein S t ü c k c h e n a n g e f e u c h t e t e s F i l t r i e r p a p i e r gibt. Gelatine f r i e r t e t w a s l a n g s a m e r als gewöhnliche G e w e b e s t ü c k c h e n . O f t schneidet sich der Block besser, w e n n m a n ihn n a c h d e m ersten D u r c h f r i e r e n w i e d e r a u f t a u e n läßt u n d d a n n e r n e u t g e f r i e r t (A d r i o n). Bei richtiger T e c h n i k müssen sich mindestens 10 /< dicke Schnitte g e w i n n e n lassen. Die S c h n i t t e w e r d e n in 30°/oigem Alkohol o d e r in Wasser a u f g e f a n g e n . In Formollösung 1 : 10—20 lassen sich die Schnitte l a n g e a u f b e w a h r e n . Will m a n ohne G e f r i e r e n auf d e m S c h l i t t e n m i k r o t o m schneiden, so k i t t e t m a n d e n f e r t i g e n Block m i t dicker Gelatinelösung auf ein Holzblöckchen, h ä r t e t 12—24 S t u n d e n in F o r m a l i n 1 : 4 u n d schneidet u n t e r B e n e t z u n g des Messers m i t 30°/oigem Alkohol. 470. Bei allen m i t F o r m o l h ä r t u n g a r b e i t e n d e n M e t h o d e n w i r d die Gelatine w a s serunlöslich. U m sie t r o t z d e m a u s den P r ä p a r a t e n zu e n t f e r n e n , legt B ö h m i g (28) die S c h n i t t e in eine 10°/oige N a t r o n - oder Kalilauge, in d e r sich die Gelatine i m L a u f e von e t w a 30 M i n u t e n (auf d e m P a r a f f i n o f e n schon in 10—20 Minuten) löst (Betrachten gegen s c h w a r z e n U n t e r g r u n d ) . D a n n 1—2stündiges A u s w a s c h e n in m e h r f a c h g e w e c h s e l t e m Wasser. Die F ä r b b a r k e i t w i r d n a c h Bö h m i g d u r c h die B e h a n d l u n g n i c h t b e e i n t r ä c h t i g t . Ein N a c h t e i l der Methode ist, d a ß a u f geklebte P r ä p a r a t e , w i e m a n sie auch a u f k l e b e n mag, in d e r L a u g e a b s c h w i m m e n .

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Durchtränkung und Einbettung

§ 471—473.

471. M e t n o d e n a c h H e r i n g a u n d t e n B e r g e . Ein b e s o n d e r e r V o r teil d e r v o n H e r i n g a u n d t e n B e r g e a n g e g e b e n e n M e t h o d e ist, d a ß sich bei i h r die G e l a t i n e aus d e n f e r t i g e n P r ä p a r a t e n o h n e S c h w i e r i g k e i t w i e d e r e n t f e r n e n läßt. A u s f ü h r u n g : 1. A u s w a s c h e n d e r in F o r m o l f i x i e r t e n P r ä p a r a t e 2—6 S t u n d e n in f l i e ß e n d e m Wasser. 2. E i n l e g e n in 10°/oige G e l a t i n e 2—5 S t u n d e n bei 37° C. D a n n Ü b e r t r a g e n in 15—20°/oige Gelatine. 3. W e n n die I m p r ä g n i e r u n g d a m i t vollzogen ist (2—5 Stunden), w i r d in 15—20°/oige G e l a t i n e e i n gebettet, w o b e i das E i n b e t t u n g s g e f ä ß v o n k a l t e m W a s s e r u m s t r ö m t w i r d . N a c h E r s t a r r e n (ev. schon n a c h 15—30 Min.) k a n n d e r Block o h n e w e i t e r e s T r o c k n e n s o f o r t z u g e r i c h t e t u n d auf d e m G e f r i e r m i k r o t o m g e s c h n i t t e n w e r d e n . D i e S c h n i t t e w e r d e n in T h y m o l w a s s e r (s. § 472) a u f g e f a n g e n . 4. Ü b e r t r a g e n der S c h n i t t e m i t G l a s s t a b in r e i n e s Wasser, w o b e i sich die S c h n i t t e s t r e c k e n . G e l i n g t d a s S t r e c k e n n i c h t gut, so m u ß das W a s s e r e r n e u e r t w e r d e n , da sich auf s e i n e r O b e r f l ä c h e a l l m ä h l i c h eine d ü n n e Schicht T h y m o l a n s a m m e l t . 5. A u f f a n g e n d e r g e s t r e c k t e n S c h n i t t e auf ein Tragglas, das v o r h e r m i t einer d ü n n e n S c h i c h t e i n e r 3°/oigen A u f k l e b e g e l a t i n e ü b e r z o g e n w u r d e (s. § 473). 6. A u f l e g e n einiger leicht a n g e f e u c h t e t e r F i l t r i e r p a p i e r s t r e i f e n v o n O b j e k t t r ä g e r g r ö ß e . M a n legt m e h r e r e solche T r a g g l ä s e r ü b e r e i n a n d e r , b e s c h w e r t sie leicht m i t 2—3 k l e i n e n B l e i g e w i c h t e n u n d stellt sie f ü r 10 M i n u t e n in e i n e n B r u t s c h r a n k bei 37°. 7. Das T r a g g l a s , auf dem die P a p i e r s t r e i f c h e n liegen, w i r d s e n k r e c h t in W a s s e r v o n 37—40° C g e h a l t e n . D i e P a p i e r s t r e i f c h e n g l e i t e n ab, die G e l a t i n e löst sich, w i e m a n b e i m B e t r a c h t e n des S c h n i t t e s g e g e n das L i c h t leicht k o n t r o l l i e r e n k a n n , a u s d e m S c h n i t t (s. § 474). 8. F ä r b e n d e r S c h n i t t e in v e r d ü n n ten, w ä s s e r i g e n F a r b l ö s u n g e n . S o d a n n w i r d d e r a u s g e w a s c h e n e u n d v o m W a s s e r möglichst b e f r e i t e S c h n i t t i n G e l a t i n e b a l s a m (s. § 475) eingelegt, w o r a u f m a n d a s P r ä p a r a t n o c h f ü r 10 M i n u t e n i n den B r u t s c h r a n k (37° C) legt. 472. H e r s t e l l u n g d e r G e l a t i n e l ö s u n g : D i e B e n u t z u n g d e r r i c h t i g e n G e l a t i n e ist f ü r den E r f o l g v o n g r o ß e r B e d e u t u n g . H e r i n g a u n d t e n B e r g e b e n ü t z t e n G e l a t i n e p u l v e r der L i j m - en G e l a t i n e f a b r i e k »Delft« t e D e l f t , Holland, s. a u c h § 467. Als L ö s u n g s m i t t e l d i e n t T h y m o l w a s s e r . Die G e l a t i n e w i r d n a c h 20 M i n u t e n l a n g e m Quellen in T h y m o l w a s s e r auf d e m W a s s e r b a d bei 37° C gelöst u n d d u r c h einen W a r m w a s s e r t r i c h t e r filtriert ( P a p i e r Nr. 520a v o n S c h l e i c h e r u n d Schüll). M a n b e r e i t e t sich in dieser Weise e i n e 10°/oige u n d eine 20°/oige L ö s u n g . Nach meinen Erfahrungen nimmt man züm Ansetzen der Gelatinelösung statt Thymol- besser ltyoiges Karbolwasser, da auf der Thymolgelatine das Wachstum von Mikroorganismen nicht immer verhindert wird. H e r s t e l l u n g d e s T h y m o l w a s s e r s : E t w a s T h y m o l w i r d in W a s ser bei e t w a 50° C gelöst. N a c h E r k a l t e n w i r d filtriert. Die L ö s u n g desinfiziert u n d setzt die O b e r f l ä c h e n s p a n n u n g h e r a b . 473. H e r r i c h t e n d e s T r a g g l a s e s : Auf die O b e r f l ä c h e des T r a g glases w i r d m i t e i n e m P i n s e l eine d ü n n e Schicht e i n e r 3°/oigen G e l a t i n e l ö s u n g ( A u f k l e b e g e l a t i n e ) a u f g e s t r i c h e n . N a c h T r o c k n e n an d e r L u f t w e r d e n die so v o r b e r e i t e t e n G l ä s e r f ü r 2 S t u n d e n in eine 5°/oige Na2SO,j-Lösung g e t a u c h t , w o d u r c h die G e l a t i n e w e n i g e r löslich w i r d . Hierauf w i r d m i t L e i t u n g s - u n d dest. W a s s e r g u t a b g e s p ü l t u n d an d e r L u f t g e t r o c k n e t , w o r a u f m a n die T r a g gläser ohne Schaden beliebig lange aufheben kann. Ich habe gefunden, daß die Schnitte auch auf Eiweißobjektträgern, die in der in § 546, 1 oder 3 beschriebenen Weise hergerichtet sind, sehr gut haften. Auflangen usw. wie in § 471, 5—7 beschrieben.

§ 474—480.

E. Einbettung in Celodal

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474. E n t g e l a t i n i e r e n d e s S c h n i t t e s : Wird der Schnitt zu laiige in das w a r m e Wasser eingetaucht, so schwimmt er ab. Das gleiche geschieht, wenn die Filtrierpapierstreifchen vorher zu feucht w a r e n oder der Aufenthalt im Thermostaten zu kurz war. 475. H e r s t e l l u n g d e s G e l a t i n e b a l s a m s : 26 g kristallisierte Lävulose werden in 15 ccm dest. Wasser auf dem Wasserbad bei 55° C gelöst. Nach Abkühlen setzt man 1,125 g Gelatine zu, läßt quellen, löst bei 50° C, setzt 0,075 g Kalialaun zu und filtriert. (Kann vorrätig gehalten werden.) Zum Gebrauch w e r d e n ca. 1,25 ccm des erstarrten Gelees bei 37° verflüssigt und mit 2 Tropfen u n v e r d ü n n t e n Formalins versetzt. Nach Formolzusatz darf der »Gelatinebalsam« nicht zu weit abkühlen,, denn einmal geronnen, verflüssigt er schwer und n u r bei höherer Temperatur. Am besten fertigt m a n sich die Lösung in einem spitzen Zentrifugenglas an und b e w a h r t sie, mit Kork verschlossen, im Brutschrank auf. Brechungsindex: bei 15° 1,464. Bei den in Gelatinebalsam eingelegten Präparaten kann es im Laufe der Zeit zu Auskristallisierungen kommen. Der Vorgang läßt sich durch Umrandung der frisch eingedeckten Präparate vermeiden. Zur Beseitigung der Kristalle legt man die Präparate bei 37° in eine mit feuchtem Filtrierpapier beschickte Petrischale ( H e r i n g a 31). 476. A u f b e w a h r u n g d e r G e l a t i n e b l ö c k e : In gut verschlossenen Gläsern können die Gelatineblöcke einige Zeit a u f b e w a h r t werden. Doch kommt es nicht selten, insbesondere bei V e r w e n d u n g von Thymol-Gelatine, zu Verflüssigung. Es ist daher sicherer, die aufzuhebenden Blöcke u n t e r Verzicht auf die Löslichkeit der Gelatine in Formol (1:10) zu bringen. Nach H e r i n g a (28) können angeschnittene Gelatineblöcke unter Paraffin liquid, aufgehoben werden, wenn man reichlich Thymolkristalle zufügt. 477. Auch A d r i o n (22) vermeidet die Formolhärtung des Gelatineblockes. Er verwendet eine 12,5- und 25°/oige Gelatinelösung; er löst die Gelatine durch 1- bis 2stündiges Einlegen der Schnitte in angesäuertes Wasser (3—4 Tropfen Eisessig auf 20 ccm H 2 0) bei 37° C. 478. Zur Färbung verwendet man am besten verdünnte Farblösungen (dafür längere Färbedauer), insbesondere bei alkoholischen Lösungen, die, um Schrumpfungen der Gelatine zu vermeiden, mit Wasser verdünnt werden. Alkoholgehalt bis zu 70°/o ist jedoch unschädlich. Sehr gut gelingen Färbungen in saurem Hämatoxylin nach E h r l i c h § 666 sowie in Sudan III oder Scharlach R. Ferner nach § 702 mit Kresylviolett. Wenn sich bei Anwendung von Hämalaun die Gelatine stark mitfärbt, so differenziere man nachher in 5°/oiger Alaunlösung. Gute Resultate gibt- auch Gallocyanin, s. § 734 f. Die Einbettung der Schnitte erfolgt in Glyzerin oder Glyzeringelatine. Ganz besonders eignet sich auch das W e i g e r t sehe Eisenhämatoxylin zur Färbung von Gelatineschnitten, da es die Gelatine fast ungefärbt läßt, evtl. Entfärben mit Salzsäure-Alkohol. 479. Man kann die Schnitte nach S c h m o r 1 (21) auch in Balsam bringen, indem man sie aus 90°/oigem Alkohol über Karbolxylol in Xylol überführt. Die im starken Alkohol auftretende Kräuselung gleicht sich i m Karbolxylol wieder aus, siehe ferner die empfehlenswerte Technik von C h r i s t e l l e r in § 519. E. Einbettung in Celodal 480. Das zur Konservierung makroskopischer P r ä p a r a t e ausgearbeitete Verf a h r e n der Einbettung in Celodal läßt sich auch f ü r mikroskopische Zwecke verwenden (H o e p k e 39). Als Vorteile des Celodals nennt H o e p k e die Durchsichtigkeit, die eine genaue Orientierung ermöglicht, die außerordent-

Durchtränkung und Einbettung

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§ 481.

liehe geringe Schrumpfung sowie die Möglichkeit sehr dünne Schnitte anzufertigen. Als Nachteile erwähnt H. die saure Beschaffenheit des Einbettungsmediums; ferner war es bis jetzt nicht möglich, Serien zu schneiden.

Celodal ist ein Harnstoff-Formol-Kondensationsprodukt der I. G. Farbenindustrie. Die helle, klare, zähflüssige Masse reagiert annähernd neutral und ist in kaltem, leichter in warmem Wasser löslich. Brechungsind. 1,53. Nach Zusatz von Säuren wird sie in kurzer Zeit fest. Zusatz von Alkalien verhindert das Erstarren oder führt Erweichung herbei. Bei der Einbettung ist jedes Zusammentreffen mit Wasser zu vermeiden.

481. Einbettungsverfahren. 1. Die beliebig fixierten Präparate werden in 70°/oigen Alkohol übertragen. — 2. Aus diesem kommen sie für mindestens 12 Stunden in: Celodal 50,0; 70%iger Alkohol 50,0; Formol 5,0; 25°/oige Ammoniumchloridlösung 1,0. Das Gemisch ist beim Bereiten mit Glasstab kräftig umzurühren und dann gut verschlossen zu halten. Mit der Zeit dickt es ein und ist dann zu erneuern. — 3. Zur Einbettung werden die Präparate mit einem Spatel in eine Petrischale übertragen (Schnittfläche nach oben) und mit der vorher entlüfteten Einbettungsmasse (s. u.) Übergossen. Sodann läßt man die Masse bei Zimmertemperatur allmählich erstarren. Da die Stücke im Celodal langsam an die Oberfläche steigen und dann über die Masse vorstehen, füllt man das Einbettungsgefäß (man kann dazu auch leere Deckglasschächtelchen u. dgl. nehmen) bis an den Rand mit Celodal und legt eine Glasplatte auf, durch die die Stücke verhindert werden, den Flüssigkeitsspiegel zu überragen.

Die mit einem scharfen Messer zurechtgeschnittenen Blöcke kann man beliebig lange trocken liegenlassen. Sind sie nicht hart genug, so legt man sie noch einige Zeit in den Brutofen bei 30° C. — Zum Aufblocken gießt man etwas Celodal in ein Uhrschälchen, fügt einige Tropfen Ammoniumchlorid (oder wenn es sehr schnell erstarren soll, Salzsäure) zu, bringt die rasch verrührte Masse auf ein Holzblöckchen und drückt das Präparat in sie ein. Geschnitten wird mit längsgestelltem Celloidin-Messer. Block und Messer werden dabei mit 70°/oigem Alkohol befeuchtet. Der Block kann aber auch trocken auf dem Gefriermikrotom geschnitten werden. Die Schnitte werden in beiden Fällen in 70°/oigem Alkohol, dem l°/o Ammoniak zugesetzt ist, aufgefangen. Die gewöhnlichen Färbungen wie Hämalaun-Eosin, Azan, Sudan gelingen gut. Einschluß in Kanadabalsam oder Caedax. Empfindliche Präparate wie Embryonen u. dgl. werden aus dem 70°/oigen Alkohol durch folgende vier abgestufte Gemische in die Einbettungsmasse gebracht (Tabelle 3): TABELLE 3

Celodal 70°/oiger Alkohol Formol 25°/oige Ammoniumchloridlösung . .

l

2

3

100 100

100 100

100 50

100 40

4 1

4 1

5 1

( 5 0 % iE)

4 1

4

Herstellung und Entlüftung der Einbettungsmasse. In eine 1-Liter-Flasche gießt man 100 g Celodal, fügt 5 g Formol und 1 g einer 25°/oigen Ammoniumchloridlösung zu und mischt gründlich durch kräftiges Umrühren mit dem Glasstab. Zutritt von Wasser ist peinlich zu vermeiden. Dann schließt man das

§ 482—486.

F. Aufblocken des Objektes

113

Gefäß an die Wasserstrahlpumpe und evakuiert, bis die sprudelnde Masse nicht mehr ansteigt, was nach 3—5 Min. der Fall ist. Hierauf läßt man Luft zutreten. Noch vorhandene kleinste Bläschen verschwinden binnen kurzem von selbst, bei größeren Blasen muß das Evakuieren wiederholt werden. Alle Gefäße und Instrumente sind nach Gebrauch sofort mit Wasser zu reinigen, da die einmal erstarrte Masse unlöslich ist.

F. Aufblocken des Objektes 482. Das in Paraffin eingebettete Objekt wird mit einem Messer zu einem Würfel zugeschnitten, wobei man von 5 Seiten des rechteckigen Stückes möglichst viel überflüssiges Paraffin wegschneidet. Mit der 6. Seite wird das Stück auf ein in die Klammer des Objekthalters passendes Holz- oder Stabilitblöckchen aufgeschmolzen. (A p ä t h y empfiehlt dazu 2—3 cm lange Zylinderstücke aus weißem Lindenholz, die man sich aus einem Stab von IV2 cm Durchmesser herstellt.) Das Aufblocken geschieht in der Weise, daß man mit einem heißen Metallspatel etwas heißes Paraffin auf das Holzblöckchen auftropft, und sodann den Paraffinblock, dessen Unterfläche mit dem heißen Spatel bestrichen wurde, rasch aufdrückt. Hierauf werden die Seitenwände mit dem heißen Spatel noch etwas angeschmolzen und das ganze in kaltes Wasser getaucht. Ebenso werden Paraffincelloidinblöcke aufgeblockt. 483. Will man aus umfangreichen, in Paraffin eingebetteten Organen bestimmte Teile herausschneiden, so geschieht dies am besten mit einer heißen Laubsäge ( S t i e v e ) . 484. A u f b l o c k e n von Alkohol-Celloidin. Zunächst stellt man ein sauberes Holzblöckchen für ein paar Minuten in Äther-Alkohol. Dann nimmt man den gehärteten, zurecht geschnittenen Celloidinblock aus dem Alkohol, trocknet ihn gut ab und rauht die möglichst ebene Unterfläche des Blockes mit einer Zupfnadel etwas an. Hierauf gibt man auf die Hirnholzseite des Holzblöckchens 1—2 Tropfen der 8°/oigen Celloidinlösung und drückt den Celloidinblock 2 bis 3 Minuten lang mäßig stark an, wobei man das seitlich vorquellende Celloidin abwischt. Hierauf wird das Ganze mit dem Celloidinblock nach unten für einige Stunden in 70%>igen Alkohol gestellt. Ist das Holzblöckchen sehr glatt, so ist es zweckmäßig die Oberfläche vor dem Aufblocken mit einer Feile etwas anzurauhen.

485. Sehr gut haften die Celloidinblöckchen auf S t a b i l i t ( J e l i n e k ) . Die Verwendung von roten Stabilitklötzchen hat außerdem noch den Vorteil, daß man die Objekte jahrelang in auf geblocktem Zustand in Alkohol aufheben kann, da Stabilit in Alkohol unlöslich ist. Holz- oder Korkblöckchen geben dagegen im Laufe der Zeit Extraktivstoffe ab, die die Färbbarkeit des Objektes beeinträchtigen. Die Stabilitblöckchen lassen sich auch sehr gut beschriften. Das Aufkleben erfolgt wie in § 484. Die Stabilitklötzchen können von einschlägigen Firmen, wie Jung, Reichert usw., bezogen werden. 486. tflcelloidinblöcke klebt man am besten mit N e l k e n ö l c e l l o i d i n auf (hergestellt aus 3 Teilen einer 16°/o-Celloidinlösung in Äther-Alkohol und I Teil Nelkenöl oder Methylbenzoat). »Der Block wird etwas abgetrocknet, die Aufklebefläche mit Filtrierpapier etwas abgerieben, Block und Holzblock werden mit etwas Nelkenölcelloidin bestrichen, aneinandergerückt und etwas aneinander gerieben, um die Klebemasse gleichmäßig auszubreiten.« (v. Apäthy 12.) Der aufgeklebte Block bleibt etwa i f* Stunde an der Luft stehen und kommt 8

H o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. A u f l .

114

Das Mikrotom

§ 487—493.

dann auf einige Stunden in Terpineol. Auch Alkoholcelloidinblöcke können in dieser Weise aufgeklebt werden. Sie kommen nach einigen Minuten dann auf 1—2 Stunden in 70%igen Alkohol. 487. Gelafineblöcke werden mit Gelatine, Ölgelatineblöcke mit Nelkenölcelloidin aufgeklebt. 7. KAPITEL

Das Mikrotom 488. Da das Schneiden mit dem Rasiermesser beträchtliche manuelle Geschicklichkeit erfordert und auch dann noch keine exakte Vorherbestimmung der Schnittdicke zuläßt, suchte man diesen Mängeln durch Konstruktion von Schneidemaschinen, den sog. Mikrotomen, zu begegnen, welche die ziemlich mühelose Herstellung aufeinanderfolgender Schnitte von genau bestimmbarer Dicke gestatten. Dieses Ziel wird bei den einzelnen Konstruktionen auf verschiedenem Wege erreicht, und zwar lassen sich hauptsächlich drei Konstruktionsprinzipien unterscheiden. Bei dem einen wird das Objekt durch Vorschieben auf einer ansteigenden Schlittenbahn gehoben und durch ein auf einer horizontalen Bahn laufendes Messer abgeschnitten; bei der zweiten Konstruktionsart erfolgt die Hebung des Objektes gleich direkt in vertikaler Richtung durch eine Schraubenspindel; beim dritten Typus wird das Objekt an der feststehenden Messerschneide vorbeigezogen und bei jedem Schnitt um einen bestimmten Betrag vorgeschoben. Am gebräuchlichsten sind die nach den beiden erstgenannten Prinzipien gebauten Schlittenmikrotome, während das nach dem dritten Typ konstruierte M i n o t m i k r o t o m hauptsächlich nur f ü r Paraffinserien von Embryonen in Betracht kommt. Gute, empfehlenswerte Mikrotome werden u. a. von Jung, Leitz, Reichert, Sartorius hergestellt. 489. Einen besonderen Typ stellt das von der Firma Jung (Heidelberg) hergestellte K r e i s s c h n i t t m i k r o t o m nach V o n w i l l e r und L o w dar, welches das Schneiden von Zylindermänteln, Kegelmänteln und Kugelschalen gestattet (siehe V o n w i l l e r - L ö w 26). 490. Für sehr harte Substanzen (z. B. Horn, Holz u. dgl.) liefert Reichert ein H a r t s c h n e i d e m i k r o t o m . Zur Herstellung von (allerdings nur fragmentarischen) Schnitten von unentkalktem Knochen- oder Zahngewebe dient das Mikrotom K von Jung (s. V o n w i l l e r , L o w und S c h i l l i n g 30). 491. Mit Hilfe des K e i l s c h n i t t m i k r o t o m e s und der K e i l s c h n i t t m e t h o d e lassen sich für elektronenmikroskopische Zwecke Schnitte gewinnen, deren Stärke unter 10~ 3 mm liegt (im günstigsten Fall 0,2 ß). Weiteres s. v. A r d e n n e (39).

492. Zur Einführung f ü r den Anfänger seien kurz die Bestandteile eines Schlittenmikrotoms beschrieben, das bei relativ einfacher Bauart doch Vorzügliches leistet. Mikrotome dieser A r t werden von verschiedenen Firmen wie Jung (Heidelberg), Leitz (Wetzlar), Reichert (Wien) u. a. geliefert 493. Bei einem J u n g s c h e n Schlittenmikrotom trägt eine senkrecht stehende Metallplatte, welche auf einer horizontalen Fußplatte aufgeschraubt ist, zwei Schlittenbahnen, eine u n t e r e , langsam a n s t e i g e n d e , und eine o b e r e , h o r i z o n t a l verlaufende. Auf der oberen sitzt der das Messer tragende Messerschlitten, auf der unteren der das Objekt haltende Objektschliften, der durch die M i k r o m e t e r s c h r a u b e des Mikrometerschlittens

§ 494—498.

Das Mikrotom

115

verschoben werden kann. Messer- und Objektschlitten laufen, um die Reibung zu vermindern, mit Metall- oder Elfenbeinplättchen auf drei plangeschliffenen Schienen. 494. Auf dem Messerschliften wird durch eine Flügelschraube ein Messerhalter befestigt, der das horizontal liegende Mikrotommesser trägt. Durch diese Vorrichtung kann die Messerschneide quer oder schräg zum Objekt eingestellt werden (vgl. § 505 f.). Um auch ein Verstellen der S c h n e i d e f a c e t t e n des Messers zu gestatten (vgl. § 498), was f ü r feinere Arbeiten häufig nötig wird, ist die Benützung eines sog. »neigbaren« Messerhalters zu empfehlen. 495. Der Objekfschliffen trägt den Objekthalfer, im einfachsten Falle eine höher oder tiefer stellbare Klammer, in die das Objekt durch eine Schraube »eingespannt« wird. Statt der einfachen Klammer werden auch Vorrichtungen konstruiert, welche ein Verstellen und Neigen des Objektes nach allen Seiten ermöglichen. F ü r feinere, speziell embryologische Untersuchungen, bei welchen das Objekt genau in eine bestimmte Schnittebene eingestellt werden muß, ist ein derartiger Orientierungsapparat unentbehrlich. Bei dem sehr empfehlenswerten Mikrotom Modeil Hn von J u n g (Heidelberg) wie anderen ähnlichen Konstruktionen (z. B. beim Tetrander nach P. M a y e r ) wird der Objekthalter durch Schraubenspindel direkt senkrecht gehoben, w a s gegenüber der Verschiebung auf schiefer Ebene manche Vorteile bietet.

496. Die Bewegung des Objektschlittens erfolgt durch eine Mikrometerschraube, welche an einem eigenen Schlitten, dem Mikrometerschlitten, eingelassen ist. Derselbe wird durch eine seitliche Klemmschraube an der Schlittenbahn festgeschraubt. Die Achse der Mikrometerschraube trägt eine mit Gradeinteilung versehene Trommel, durch die der Betrag einer Umdrehung bestimmt werden kann. Beim J u n g s c h e n Schlittenmikrotom ist die Trommel in 15 Intervalle eingeteilt; jedes Intervall entspricht einer Schnittdicke von 1/1000 mm = 1 ¡u; eine volle Umdrehung der Schraube ist demnach = 15 /,ige Lösung v o n Celloidin in Äther-Alkohol. Sodann läßt man die L ö s u n g abtropfen und bringt die Präparate, bevor die Ä t h e r l ö s u n g völlig v e r d u n s t e t (Vorsicht!), in 70°/oigen Alkohol, in d e m die äußerst dünne, die Präparate überziehende Celloidinschicht gehärtet wird; dann Wasser, Färbung usw. Auf diese Weise läßt sich auch das A b s c h w i m m e n schlecht getrockneter Schnitte (s. § 536) verhüten. Über d i e V e r e i n i g u n g mehrerer Paraffinschnitte durch Celloidinüberguß ( M e t h o d e v o n O b r e g i a ) s . § 563. 549. Schnitte, die sehr angreifenden Prozeduren ausgesetzt werden (z. B. starken Säurep, Alkalien, Verdäuungsflüssigkeiten u. dgl.), empfiehlt 0 1 1 mit Gelatine aufzukleben. Man löst dazu 10 g feinster Gelatine in 100 ccm destilliertem Wasser auf dem Wasserbad, setzt zur Klärung der Lösung das Eiweiß eines Hühnereies zu und kocht 10 Minuten unter Umrühren. Zum Filtrat der heißfiltrierten Lösung fügt m a n 10 ccm einer 5°/oigen Carbolsäurelösung. Zum Aufkleben löst m a n etwa 10 g dieser beim Abkühlen erstarrenden Masse u n t e r leichtem E r w ä r m e n in 100 ccm destilliertem Wasser und verwendet diese wie in § 533 oder § 546 an Stelle des dest. Wassers oder des Eiwe ; ßglyzer in wassers zum Aufkleben, wobei man zum Glätten der Schnitte auch e r w ä r m e n kann. Sodann saugt man den Uberschuß an Flüssigkeit mit Filtrierpapier ab und bringt die Schnitte f ü r 1 Stunde in eine gut verschlossene Glasdose oder in einen Exsikkator, auf dessen Boden ein Schälchen mit etwas 40°/oigem Formol steht. Nach der Einwirkung der Formalindämpfe k o m m e n die Objektträger noch einige Minuten in 10°/oige wässerige F o r mollösung. Sodann werden sie mit Filtrierpapier abgetrocknet und im T h e r m o staten getrocknet. Durch die Formalindämpfe wird die dünne Eiweißgelatineschicht so gehärtet, daß sich der Schnitt selbst bei Einwirken von Alkalien nicht mehr loslöst. Nachteilig ist, daß sich die Gelatine bei manchen Färbungen m i t färbt. Weitere Verwendung dieser Methode siehe § 561. 550. S z o m b a t h y (17) empfiehlt: 1. Man löst 1 Teil Gelatine in 100 Teilen destillierten Wassers bei 40° u n d fügt 1 Teil einer 2°/oigen Karbollösung zu. Nach A b kühlen w i r d filtriert und 15 Teile Glyzerin zugesetzt. Damit klebt man auf w i e mit Eiweißwasser. Dann 1 Stunde in Dose mit Formol dämpfen. Oder: 2. Man v e r reibt etwas von obiger Gelatinelösung auf dem Objektträger. Dann f ü g t m a n 1 Tropfen einer 2°/oigen Formaldehydlösung zu, breitet ihn aus, haucht an u n d klebt auf. Trocknen im Thermostaten. Oder: 3. Aufkleben mit 50 Teilen e i n e r l°/oigen Gelatinelösung und 50 Teilen einer 2°/oigen Formaldehydlösung. Im Thermostaten trocknen. Die Schnitte sollen sich auch in Alkalien nicht loslösen. Die Gelatine f ä r b t sich nicht mit. s«

132

Aufkleben der Celloidin-Paraffinschnitte

§ 551—555.

551. Sehr große oder viel Bindegewebe enthaltende Schnitte streckt M i c h a e l i s zunächst auf Wasser von 35—40° C, fängt sie mit dem Objektträger auf und drückt sie mit glattem Schreibpapier fest an denselben an. Dann zieht er das Papier mit dem anklebenden Schnitt ab, schneidet dasselbe dicht um denselben ab und klebt den Schnitt samt Papier unter festem Andrücken auf einen zweiten mit Eiweiß nach § 544 bestrichenen Objektträger. Sodann Koagulieren des Eiweißes durch Erhitzen usw. Beim Weiterbehandeln fällt das Papier ab. 552. Will m a n eine größere Zahl von Paraffinschnitten etwa f ü r Kurszwecke gleichmäßig und gleichzeitig behandeln, so klebt m a n sie auf d ü n n e Glimmerplatten entsprechender Größe (z. B. 9X12 cm) auf. Man legt dazu die Glimmerfolie auf eine Glasplatte, fischt damit die in w a r m e m Eiweißwasser schwimmenden, getrockneten Paraffinschnitte reihenweis geordnet h e r a u s und stellt sie in den Trockenschrank. Nach dem Trocknen w e r d e n die Platten wie gewöhnliche auf O b j e k t t r ä g e r geklebte P r ä p a r a t e entparaffiniert, g e f ä r b t und durch die Alkoholreihe in Xylol gebracht. Erst dann werden die P r ä p a r a t e einzeln abgeschnitten und eingedeckt. — Taucht man die fertig gefärbten bis zum Xylol g e f ü h r t e n P l a t t e n kurz in heißes Paraffin, so lassen sich die P r ä p a r a t e in g e f ä r b t e m Zustand in Briefumschlägen beliebig lange ohne Eindecken aufheben (z. B. f ü r Kurszwecke). 552a. P e t r y (42) verwendet an Stelle des teuren Glimmers das folgende Lackverfahren. 1. Serienmäßiges Auflegen der Paraffinschnitte auf große Objektträger, F ä r b e n usw. wie gewöhnlich u n d D u r c h f ü h r e n bis zum absol. Alkohol. — 2. Die Objektträger werden einzeln aus dem absoluten Alkohol genommen; Verdunsten des Alkohols bis die Schnitte gerade ein mattes Aussehen bekommen. — 3. A u f t r o p f e n des dünnflüssigen »Sprimoloidlackes f ü r histologische Zwecke« (Lackfabrik Springer und Möller, Leipzig-Lentzsch), bis die ganze O b j e k t t r ä g e r f l ä c h e gleichmäßig bedeckt ist. Trocknenlassen zu einem d ü n n e n Film (ca. 10 Stunden). — 4. Abheben des Films an einer Seite und Einlegen in dest. Wasser, in dem sich der Film einschließlich der g e f ä r b t e n P r ä p a r a t e nach 1—2 Stunden meist von selbst abhebt. — 5. Trocknen zwischen Filtrierpapier u n t e r Beschweren. — 6. Zur A u f b e w a h r u n g Paraffinieren; Aufheben zwischen zwei Objektträgern. C. Aufkleben der Celloidin-Paraffinschnitte 553. Das A u f k l e b e n der Celloidin-Paraffinschnitte bereitet nach den gewöhnlichen Methoden oft etwas Schwierigkeiten, die sich jedoch auf folgende Weise me ; st beheben lassen. 1. Auf der Oberfläche des Objektträgers wird ein Tropfen Eiweißglyzerin verrieben. — 2. Aufbringen einiger Tropfen der d e R u y t e r schen Flüssigkeit (s. § 547). — 3. Auflegen der Schnitte und Strecken derselben durch E r w ä r m e n . — 4. Ablaufenlassen des Flüssigkeitsüberschusses, Auflegen einiger glatter Filtrierpapierstreifchen und Anpressen der Schnitte durch k r ä f tiges Darüberstreichen mit einem Finger. — 5. Einstellen in den Trockenschrank. —• 6. Koagulation der Eiweißschicht durch E r w ä r m e n . 554. P f u h l (40) vermeidet ein Strecken der Schnitte durch Erwärmen; er breitet die Schnitte mit Pinsel und Zupfnadel auf dem mit Eiweiß und Wasser beschickten Objektträger aus und walzt sie mit einem saüberen Tintenlöscher fest. Hierauf müssen die Schnitte in der Wärme nachgetrocknet werden. D. Aufkleben der Celloidinschnitte 555. C e l l o i d i n s c h n i t t e können u n a u f g e k l e b t oder a u f g e k l e b t weiterbehandelt werden. Im ersteren Falle w e r d e n sie in 70°/o- oder

§ 556—559.

Aufkleben der Celloidinschnitte

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80°/oigem Alkohol a u f g e f a n g e n u n d wie u n a u f g e k l e b t e G e f r i e r s c h n i t t e mit Hilfe von Spatel u n d Nadel aus einer Flüssigkeit in die a n d e r e ü b e r t r a g e n . (Weiteres s. § 584). Sollen die Schnitte dagegen a u f g e k l e b t werden, d a n n empfiehlt sich f ü r nicht zu dicke Schnitte die A n w e n d u n g der in § 557 angegebenen r u s s i s c h e n M e t h o d e , die auch eine völlige E n t f e r n u n g des Celloidins erlaubt, ein U m stand, der bei einer Reihe von F ä r b e m e t h o d e n , die das Celloidin s t a r k m i t f ä r ben, von großer B e d e u t u n g ist. K a n n das Celloidin dagegen e r h a l t e n bleiben, so ist bei A n f e r t i g u n g von Serienschnitten das V e r f a h r e n von O b r e g i a empfehlenswert, bei welchem Celloidinschnitte in beliebiger Zahl zu einer einzigen Celloidinplatte vereinigt w e r d e n können, die d a n n nach A r t eines u n a u f g e k l e b t e n Celloidinschnittes w e i t e r b e h a n d e l t wird. Serienschnitte von großen Objekten, z. B. Gehirn, w e r d e n beim Schneiden mit s c h w a r z e r Tusche n u m e r i e r t . Sie k ö n n e n d a n n ohne G e f a h r der Verwechslung gemeinsam g e f ä r b t w e r d e n . 556. Um bei Serien von größeren Alkohol-Celloidinsehnitten das Numerieren der einzelnen Schnitte zu ersparen, fädelt S c h a r r e r (33) die einzelnen Schnitte wie sie vom Messer kommen locker hintereinander mit einer Nähnadel auf einen Faden auf, dessen Ende mit einem kleinen Metallstück beschwert, in einer Schale mit 70°/oigem Alkohol liegt. So werden Bündel von etwa 50 Schnitten gebildet und mit fortlaufender Nummer versehen. Die Bündel werden dann durch Farbe usw. gebracht, wobei man darauf achtet, daß die Schnitte, nicht zu dicht aufeinander liegen. Schließlich werden sie durch Propylalkohol in Xylol gebracht. Hier werden die Schnitte vom Faden genommen und in der richtigen Reihenfolge eingedeckt. 557. Methode von R u b a s c h k i n (07), D a n t s c h a k o f f (08), ( r u s s i s c h e M e t h o d e ) . Nach der von M a x i n o w (09) angegebenen Modifikation entfaltet m a n die in 70°/oigem Alkohol geschnittenen Schnitte auf dem Messer u n d ü b e r t r ä g t sie mit Hilfe eines Spatels mit möglichst wenig Alkohol auf einen O b j e k t t r ä g e r , auf dessen Oberfläche v o r h e r ein kleiner T r o p f e n Eiweißglyzerin (2 :1) v e r r i e b e n w u r d e , p r e ß t sie hier nach völligem Glätten m i t m e h r f a c h gef a l t e t e m glatten F i l t r i e r p a p i e r an u n d ü b e r g i e ß t sie m i t r e i n e m englischen Nelkenöl. Sind die Schnitte ganz aufgehellt (ca. 5—20 Minuten), so w i r d das ö l abgegossen u n d der O b j e k t t r ä g e r in 95°/oigen oder absoluten Alkohol gestellt; n a c h 5—10 M i n u t e n folgt ein 2. u n d 3. Glas mit absolutem Alkohol, d a n n z u r völligen Lösung des Celloidinä noch eines mit Ätheralkohol oder Methylalkohol. D a n n 70°/oiger Alkohol usw. 558. 5 bis 12 i< dicke Schnitte lassen sich auf diese Weise mit Sicherheit aufkleben, dickere Schnitte (15 ß und mehr) schwimmen dagegen leicht ab. Die Methode ist auch für dünne 'Ölcelloidinschnitte verwendbar. Man bringt die trocken oder unter ö l geschnittenen Schnitte zunächst in 99°/oigen Alkohol, ordnet sie auf den Objektträger, preßt mit Filtrierpapier an usw. Statt Nelkenöl kann man auch Methylbenzoat nehmen. Nach L e h n e r (24) soll man die Schnitte nicht zu lange im Nelkenöl lassen, da sonst Schrumpfungen eintreten. A n i t s c h k o w (10a) bringt die Schnitte nach der Nelkenölbehandlung statt in Alkohol in Aceton, dann in 70°/oigen Alkohol, Wasser usw. 559. J o r d a n verreibt auf der Oberfläche eines Objektträgers etwas Eiweißglyzerin, schichtet reichlich Chloroform-Zedernholzöl (8 :1) auf, legt die ölcelloidinschnitte auf, die sich zumal bei leichtem Erwärmen gut strecken, und läßt sie im Trockenschrank antrocknen. Dann kommen sie in absol. Alkohol, Alkoholäther usw.

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Aufkleben der Celloidinschnitte

§ 560—563.

560. Nach der i t a l i e n i s c h e n Methode (Ca r a z z i ) bringt man die Serienschnitte zunächst vom Messer auf alkoholbefeuchtete (70°/o) Klosettpapierstreifen, wo man sie ordnet. Dann legt man den Papierstreifen, der nicht zu feucht sein darf, auf den Eiweißobjektträger und preßt die Schnitte fest auf. Dann vorsichtiges Abheben des Papiers, 96°/'oigen Alkohol, Nelkenöl, absoluten Alkohol üsw. 561. Die O l t s c h e M e t h o d e (s. § 549) führt man bei Celloidinschnitten folgendermaßen aus: Man verreibt auf dem Objektträger mit dem Finger ein kleines Stückchen der Eiweißgelatine, legt auf die so präparierte Oberfläche den in 60°/oigen Alkohol aufgefangenen geglätteten Celloidinschnitt, wobei man möglichst wenig Flüssigkeit mit überträgt, drückt den Schnitt mit glattem Fließpapier gut an und setzt den Objektträger wie in § 549 Formoldämpfen aus. Dann in Wasser usw. oder, wenn das Celloidin gelöst werden soll, durch 80°/oigen Alkohol in Ätheralkohol usw.

562. All diese Methoden arbeiten bei d i c k e n Celloidinschnitten unsicher. Zum Aufkleben dicker Schnitte wurde von v. F i e a n d t (31) ein Verfahren ausgearbeitet, das darauf beruht, daß Chromgelatine unter der Einwirkung von Licht eine unlösliche Verbindung bildet. Leider ist die Methode etwas umständlich, so daß wegen Einzelheiten auf das Original verwiesen werden muß. 563. Das Prinzip der Methode von O b r e g i a besteht darin, daß man eine Glasplatte mit einer Zuckerschicht bedeckt, auf dieser die Celloidinschnitte auflegt, mit einer dünnen Celloidinschicht überdeckt und dann die Zuckerschicht durch Einlegen in Wasser zur Lösung bringt, worauf sich die durch ein dünnes Celloidinhäutchen zu einem Blatt vereinigten Schnitte ablösen. Die Methode ist auch zur vereinfachten, gleichzeitigen Behandlung von Kurspräparaten u. dgl. zu empfehlen. 1. V o r b e r e i t u n g d e r G l a s p l a t t e . Man gießt auf eine sauber gereinigte Glasplatte einige Kubikzentimeter der unten angegebenen Zuckerlösung, breitet dieselbe durch Hin- und Herneigen der Glasplatte über die ganze Oberfläche gleichmäßig in dünner Schicht aus, läßt den Überschuß in die Flasche zurückfließen und trocknet einige Stunden im Wärmeschrank bei ca. 40° C. Die Oberfläche der Zuckerschicht soll nach dem Trocknen spiegelglatt sein, was n u r nach vollständiger Lösung des Zuckers und nachheriger Filtration erreicht wird. (Herstellung im Vorrat möglich). 2. A u f l e g e n d e r S c h n i t t e . Die Schnitte werden mit Streifen aus ungeleimten Papier (z. B. einseitig satiniertes Klosettpapier) in der gewünschten Reihenfolge aufgefangen, indem man den mit 70°/oigem Alkohol befeuchteten Papierstreifen mit der glatten Seite auf die auf dem Messer ausgebreiteten Schnitte auflegt. Sie bleiben am Papier haften und können behutsam mit dem Papier vom Messer abgehoben werden. Man legt die Papierstreifen, bis eine hinreichende Anzahl von Schnittreihen vorhanden ist, zur Verhütung des Austrocknens auf eine mit 70°/oigem Alkohol befeuchtete Lage von Fließpapier. Schließlich werden die Papierstreifen mit den Schnitten nach unten, auf die präparierte Glasplatte aufgelegt und, wenn alle Streifen aufgelegt sind, durch ein darüber gelegtes Stück Filtrierpapier, fest angedrückt. Hierauf zieht man die Papierstreifen vorsichtig, wie bei einem Abziehbild, von einer Seite her ab. Sodann übergießt man die fest an der Zuckerschicht haftenden Schnitte mit einer dünnen Celloidinlösung (s. u.), läßt diese nach Abgießen des Überschusses unter gleichmäßigem Hin- und Herneigen der Glasplatte erstarren, schneidet die Celloidinhaut an drei Seiten der Platte etwa 0,5 ccm vom Rande entfernt ein und überträgt dann das Ganze in Wasser. Nach Auflösen der Zuckerschicht löst sich das die Schnitte vereinigende Celloidinhäutchen leicht vom Glas ab,

§ 564—567.

Aufkleben der Celloidinschnitte

135

wobei es zunächst an der 4. nicht eingeschnittenen Seite noch an der Glasplatte haftet, so daß man die Präparate, w e n n man diese Seite der Platte'immer zuerst aus der Flüssigkeit hebt, bequem in ausgebreitetem Zustand aus einer Lösung in die andere übertragen kann. Nach der Färbung w e r d e n sie schließlich aus 96°/oigem Alkohol in Carbolxylol oder besser in wasserfreien Isopropylalkohol oder in Terpineol übertragen und hier oder im Xylol mit der Schere allenfalls in kleinere Stücke zerteilt. H e r s t e l l u n g d e r Z u c k e r l ö s u n g . Man löst 150 g pulverisierten Kandiszucker in 150 ccm kochenden dest. Wassers (Lösung a), ferner 50 g gelbes Dextrin in 50 ccm kochendem dest. Wasser (Lösung b). Nach Erkalten gibt man zu Lösung a 200 ccm 80°/nigen Alkohols und dann Lösung b. Von etwaigen Verunreinigungen wird dekantiert. H e r s t e l l u n g d e r C e l l o i d i n l ö s u n g . Man läßt 10 g getrocknetes Celloidin oder P h o t o x y l i n über Nacht in 100 ccm abs. Alkohols quellen und löst durch nachfolgenden Zusatz von 100 ccm Äther. 564. Die Methode läßt sich unter kleinen Abänderungen auch sehr gut zur V e r e i n i g u n g v o n P a r a f f i n s c h n i t t e n verwenden. Man verfährt dann folgendermaßen: 1. Man bedeckt eine Glasplatte mit der oben angegebenen Zuckerlösung, die man zweckmäßig mit der gleichen Menge dest. Wassers verdünnt ( N e u m a y e r ) , legt die Paraffinschnitte auf und streckt sie wie gewöhnlich durch leichtes Erwärmen. — 2. Trocknen im Trockenschrank bei ca. 40° C. — 3. Einlegen der Glasplatte in Xylol (man verwendet dazu am besten Glasschalen, wie sie zu photographischen Zwecken benutzt werden): 10 Minuten. — 4. Einlegen in 2 Portionen absoluten Alkohols: 5—10 Minuten. — 5. Abtropfen des Alkohols und Aufgießen der Celloidinlösung, wie oben. — 6. Nach Erstarren des Celloidinübergusses Einlegen in 70°/oigen Alkohol und, nach Einritzen, in Wasser; dann Weiterbehandlung wie in § 563. 565. Die Methode O b r e g i a s hat sich aus dem Verfahren von W e i g e r t entwickelt, bei welchem die Glasplatte statt mit Zucker mit einer Kollodiumschicht Übergossen wird, so daß die Schnitte schließlich zwischen zwei Kollodiumblätter eingeschlossen sind. Das Weigertsche Verfahren wird, falls man es der eben beschriebenen Methode vorzieht, am besten in der von O. F i s c h e r (25) angegebenen Weise ausgeführt. 566. G. L e v i (37) empfiehlt folgende Methode: 1. Ordnen der Alkohol-Celloidinschnitte auf dem Objektträger unter Feuchthalten mit 96"/oigem Alkohol. Dabei sollen sich die Ränder der Schnitte berühren. — 2. Auflegen von glatten Filtrierpapierstreifen und rasches Andrücken der Schnitte ans Glas. —• 3. Schnelles Einlegen des Objektträgers mit den noch feuchten Schnitten in Alkoholäther (1:4) 10—20 Sek., Schnitte unter 5 mm Durchmesser nur 5 Sek. Taucht man zu lange ein, so lösen sie sich leicht ab. — 4. Übertragen in 70°/oigen Alkohol, in dem das Cejloidin wieder erhärtet. Die Schnitte haften jetzt fest am Glas und sind auch untereinander fest verbunden. — 5. Dest. Wasser usw. 567. v. A p ä t h y bringt die unter Terpineol geschnittenen Olparaffin-, ölcelloidinoder ölgelatineschnitte zunächst auf ein glattes, mit Terpineol befeuchtetes, signiertes Zigarettenpapier (Grundblatt); darüber kommt dann ein zweites, geöltes Deckblatt. Die Schnitte können so zunächst unaufgeklebt aufbewahrt werden. Zum Aufkleben legt man das Ganze mit dem Deckblatt nach unten auf eine Glasplatte, legt ein trockenes. Zigarettenpapier auf und streift mit gelindem Druck darüber. Wenn sehr feucht, wiederholt man diesen Vorgang mit neuem Papier nochmals. Dann faßt man das über den Schnitten liegende Papier an einer Ecke und rollt es sorgfältig ab, wobei die Schnitte auf dem früheren Deckblatt haften bleiben. (Bleiben sie am abzunehmenden Blatt kleben, so ist es ein Zeichen, daß das Papier zu trocken war, man feuchte es dann vorher mit Terpineol etwas an.)

136

Aufkleben der Gefrierschnitte

§ 568—569a.

Nunmehr wird das Papier mit den Schnitten nach unten auf einen mit Eiweiß bestrichenen Objektträger (nach § 546, 1 oder 3) gelegt und hier abgeklatscht. Dann legt man ein trockenes Zigarettenpapier auf, darüber einen Objektträger und bringt das Ganze auf eine auf mindestens 65° C erwärmte Metallplatte, drückt mit dem Finger etwas auf den oberen Objektträger und wartet, bis auch dieser die genannte Temperatur angenommen hat, was rasch geschieht. Zur Not kann das Erwärmen auch über einer Flamme vorgenommen werden (das Papier darf aber nicht Feuer fangen). Dann stellt man die Objektträger, ohne sie zu verschieben, noch warm, schief in Chloroformalkohol (Sä) in der Weise, daß der die Schnitte tragende Objektträger der untere ist. Nach ein paar Minuten kann man die Objektträger auseinandernehmen, wobei sich das Papier von selbst ablöst. Falls nötig, kann man dann das Celloidin durch absoluten Alkohol noch lösen usw. Will man Alkoholcelloidinschnitte nach dieser Methode aufkleben, so muß man in 90°/oigem Alkohol schneiden (geht höchstens 1 Stunde lang, dann wieder härten in 70°/oigem Alkohol), in Bergamotöl strecken, von hier auf Zigarettenpapier auffangen, mit Terpineol befeuchtetem Deckblatt bedecken usw. (Weitere Einzelheiten siehe in der Originalärbeit.) Die Schnitte müssen also bei Anwendung der A p a t h y s c h e n Aufklebemethode entwässert werden, da sonst beim Erhitzen sehr starke Schrumpfungen eintreten.

E. Aufkleben der Gefrierschnitte 568. I w a n o f f (36) k l e b t G e f r i e r s c h n i t t e in V e r b e s s e r u n g d e r v o n A n i t s c h k o w (10b) a n g e g e b e n e n M e t h o d e f o l g e n d e r m a ß e n a u f : 1. M a n b e s t r e i c h t D e c k g l ä s c h e n oder O b j e k t t r ä g e r e t w a s d i c k e r als g e w ö h n l i c h m i t E i w e i ß g l y z e r i n (2 :1) u n d t r o c k n e t 24 S t u n d e n i m P a r a f f i n o f e n . Will m a n das T r o c k n e n u m gehen, so b e s t r e i c h t m a n m i t einer M i s c h u n g v o n g l e i c h e n Teilen E i w e i ß u n d 5°/oigem F o r m o l . — 2. A u f f a n g e n d e r G e f r i e r s c h n i t t e aus dest. W a s s e r auf d e n v o r b e r e i t e t e n O b j e k t t r ä g e r . — 3. A u f l e g e n v o n 2 S t r e i f e n g l a t t e n F i l t r i e r p a p i e r s und einem sauberen Objektträger, der sanft angedrückt und dann sofort wieder a b g e n o m m e n w i r d . — 4. A u f t r o p f e n v o n 1—2 T r o p f e n abs. A l k o h o l oder (bei F e t t f ä r b u n g ) 40°/oigen F o r m o l s auf die d e m S c h n i t t e n t s p r e c h e n d e Stelle des Filtrierpapiers zur Koagulation der Eiweißschicht und nochmaliges Auflegen des O b j e k t t r ä g e r s , d e r e t w a Vz M i n u t e l a n g s a n f t a n g e d r ü c k t w i r d . — 5. V o r sichtiges A b n e h m e n des O b j e k t t r ä g e r s , Auf t r o p f e n v o n 1—2 T r o p f e n Wasser, dann Abnahme der Filtrierpapierstreifen und Weiterbehandeln. 569a. v. S z ü t s (41) legt auf einen Objektträger einen angefeuchteten Cellophanstreifen entsprechender Größe (Cellophanlamelle, wie sie in der Chirurgie f ü r Verbände gebraucht wird), so daß er mit einer Kante den Objektträger überragt. Dann fischt er damit den aufzuklebenden Schnitt in ausgebreitetem Zustand aus der Lösung, saugt das überschüssige Wasser mit Filtrierpapier sorgfältig ab, hebt den Cellophanstreifen von der vorstehenden Kante aus mit der Pinzette ab und klatscht ihn mit der Schichtseite auf einen vorbereiteten Objektträger ab. Dieser wird vorher mit Eiweißglyzerin bestrichen und 2—3mal über die Flamme gezogen, bis er sich w a r m anfühlt. Die Eiweißschicht muß dabei noch feucht bleiben. Auf diese Schicht wird der Cellophanstreifen mit einem Filtrierpapier aufgedrückt; dann wird der Objektträger vorsichtig bis zur Koagulation der Eiweißschicht erhitzt (leichtes Dampfen). Der noch aufliegende Cellophanstreifen löst sich beim Einstellen in Wasser leicht ab. Die aufgeklebten Schnitte können nach v. Szüts in 70°/oigem Allkohol oder nach Abtrocknen mit Filtrierpapier auch trocken a u f bewahrt werden. — Nach der Färbung trocknet v. Szüts mit Filtrierpapier ab, entwässert rasch mit Aceton und bringt durch Benzol in Balsam. — v. Szüts empfiehlt die Methode namentlich f ü r Silberimprägnationspräparate.

§ 569—572.

Die Weiterbehandlung der Schnitte

137

569. Bei Anwendung der O l t s c h e n Gelatinemethode bringt man die Gefrierschnitte zunächst in die § 549 angegebene Lösung von 10 g Eiweißkarbolgelatine in 100 ccm Wasser und fängt sie auf dem Objektträger auf. Dann saugt man den Überschuß an Flüssigkeit ab und härtet in Formoldämpfen. Über das Aufkleben von Gelatine-Gefrierschnitten siehe § 471 f., Methode H e r i n g a. Uber das Aufkleben der bei Messertiefkühlung nach S c h u l t z - B r a u n s gewonnenen Schnitte siehe § 524.

9. KAPITEL

Die Weiterbehandlung aufgeklebter und unaufgeklebter Schnitte bis zur Färbung A. Paraffinschnitte 570. Nach völligem Trocknen (und nach Koagulation der Eiweißschicht) kommen die aufgeklebten Paraffinschnitte zur Paraffinbefreiung auf kurze Zeit (2—5 Minuten) in Xylol. Nach Lösung des Paraffins ü b e r t r ä g t m a n das P r ä p a r a t in absoluten Alkohol (2—5 Min.), sodann in 96-, 80- und 60°/oigen Alkohol (je 1—2 Min.) und endlich in Wasser. Die angegebenen Zeiten stellen M i n d e s t z e i t e n dar, die ohne Schaden auch u m das Vielfache überschritten w e r d e n können. Für Kurszwecke ist es genügend, die Präparate durch Xylol, absol. Alkohol und 80°/oigen Alkohol in Wasser zu bringen. 571. Ist der Paraffinschnitt infolge S t ü c k f ä r b u n g schon g e f ä r b t und nach § 535 n u r mit Wasser aufgeklebt, was in diesem Fall völlig genügend ist, so k a n n er nach dem Entparaffinieren gleich in Kanadabalsam eingeschlossen w e r den. Mit Eiweißglyzerin aufgeklebte Paraffinschnitte dürfen dagegen nach dem Lösen des Paraffins in Xylol nicht direkt in Balsam eingeschlossen werden, sondern müssen vorher stets noch in absoluten Alkohol kommen, um das Glyzerin zu entfernen, da andernfalls T r ü b u n g e n entstehen können. 572. J o d i e r e n und E n t j o d e n. Schnitte v o n Präparaten, die in sublimathaltigen Flüssigkeiten fixiert wurden, müssen bei der D u r c h f ü h r u n g durch die Alkoholreihe in jodhaltigen Alkohol kommen. Die Schnittjodierung soll auch dann vorgenommen werden, wenn bereits eine Stückjodierung (s. § 327 f.) vorausging. Man setzt dazu dem 80°/o-igen Alkohol einige Tropfen einer J o d t i n k t u r oder besser Lugolschen Lösung zu und läßt die Schnitte in ihm so lange stehen, bis sie bei mikroskopischer Kontrolle f r e i von Sublimatniederschlag sind. Natürlich darf m a n im P r ä p a r a t enthaltene Pigmente nicht mit Sublimatniederschlägen verwechseln. Nach der Jodierung müssen die Schnitte entjodet werden, da zurückbleibendes Jod f ü r eine Reihe von T e e r f a r b e n wie auch f ü r Hämatox y l i n f ä r b u n g e n schädlich ist. Man b r i n g t sie dazu in eine 0,25°/oige Natriumthiosulfatlösung (Fixiernatron), die m a n durch approximative V e r d ü n n u n g einer 2,5°/oigen Vorratslösuiig bereitet u n d von Zeit zu Zeit erneuert (s. auch § 328). Die vom Jodalkohol her meist noch leicht gelblich g e f ä r b t e n Schnitte w e r d e n in ihr in kürzester Zeit rein weiß. Hierauf wird mit Wasser gründlich gewaschen. F ü r sublimathaltige P r ä p a r a t e lautet die Reihenfolge also: Xylol — absoluter Alkohol — 96°/oiger Alkohol — 80°/oiger Alkohol — jodhaltiger 80°/oiger

138

Die Weiterbehandlung der Schnitte

§ 573—579.

Alkohol — 60°/oiger Alkohol — dest. Wasser — 0,25°/oige Fixiernatronlösung — Wasser. Man nehme die Jodierung usw. gründlich vor, sonst können in den Präparaten unter Umständen noch 1—2 Jahre nach dem Eindecken allmählich schwarze Quecksilberkugeln auftreten. 573. An Stelle von Xylol kann man auch eines der anderen in § 405 angegebenen Lösungsmittel verwenden, wie z. B. Toluol oder Benzol; für feine Färbungen scheint aber Xylol am besten zu sein. Chloroform ist nicht empfehlenswert. 574. Das von S a p h i e r angegebene Trichloräthylen ist nach B r u c h auch f ü r sonst resistenten F ä r b u n g e n (wie z. B. Hämalaun), wenn die Einwirkung eine b e stimmte, schwer bestimmbare Dauer überschreitet, schädlich. Das von D r a h n empfohlene Tetralin bietet gegenüber Xylol n u r Nachteile (geringe Flüchtigkeit, unangenehmer Geruch u. dgl.). 575. Z u r Reinigung von gebrauchtem Xylol oder Toluol versetzt man es u n t e r K ü h lung zur H ä l f t e mit Schwefelsäure u n d schüttelt im Schütteltrichter gut durch. Der abgetrennten Flüssigkeit werden zur Entfernung von Säure- u n d Wasserresten auf 1 Liter 20 g wasserfreies Natriumcarbonat zugesetzt. Nach 2—3 Tagen filtriert m a n ab, versetzt mit 20 g Tierkohle, kocht 1—2 Stunden auf dem Sandbad u n t e r R ü c k f l u ß k ü h l u n g und destilliert dann bei 140 bzw. 110° ab. (Vorsicht, Feuergefahr!)

576. Beim Übertragen des Objektträgers von einer Flüssigkeit in die andere lasse man die Flüssigkeiten gut abtropfen, um die nächstfolgende möglichst w e n i g mit der v o r a u s g e h e n d e n zu verunreinigen. Dabei dürfen aber die Präparate unter keinen Umständen austrocknen, w a s besonders, w e n n sie aus l e i c h t f l ü c h t i -

gen Medien, wie Benzol, Äther u. dgl. genommen werden, leicht eintritt. Man erkennt das Austrocknen am Weißlichwerden des Schnittes. 577. U n a u f g e k l e b t e P a r a f f i n s c h n i t t e werden in prinzipiell gleicher Weise wie aufgeklebte durch Xylol und die Alkoholreihe in Wasser übertragen. Die Übertragung erfolgt in ausgebreitetem Zustand mit Hilfe eines Spatels oder Objektträgers und einer Nadel. 578. In bestimmten Fällen ist es empfehlenswert, die Paraffinschnitte vom Mikrotom direkt in die Farblösung oder dgl. zu bringen und das Paraffin erst am Schluß vor dem Eindecken der Präparate aufzulösen. Man bringt die Schnitte vom Mikrotom auf die schwach erwärmte( (30—35° C) Farblösung u n d läßt sie hier schwimmen. Sie legen sich bald glatt u n d färben sich sehr gut, wenn auch etwas langsamer. Nach vollendeter F ä r b u n g w e r d e n sie gut gewaschen und mit Wasser oder Eiweißglyzerin aufgeklebt, wobei m a n einen Überschuß an Wasser mit Filtrierpapier absaugt. Nach dem Trocknen Weiterbehandlung wie in § 571. Diese wichtige Beobachtung, daß Paraffinschnitte schon ohne Lösung des Paraffins f ü r wässerige Lösungen permeabel sind, k a n n mit kleinen Modifikationen in v e r schiedenen Fällen nutzbar gemacht werden, so beim F ä r b e n von Material, das sich beim Aufkleben n u r schwer glatt legt, wie z. B. Ossifikationen, Gefäße; oder bei Behandlung mit Verdauungsflüssigkeiten, mit Silbernitrat usw. 579. Glasgefäfye für Zwischenflüssigkeiten und Farblösungen. Für a u f g e k l e b t e

Präparate benutzt man gewöhnlich die in Abb. 11 wiedergegebenen zylindrischen Glasgefäße von 8,5 cm Höhe und etwa 3,5 cm innerem Durchmesser, die mit lose aufsitzenden Überfalldeckeln bedeckt werden. Um das Umfallen zu

§ 580—582..

Abb. 11. F ä r b e g l a s

Die Weiterbehandlung der Schnitte

Abb. 12. Schutzglas m i t a u f geschliffener Glaskappe

139

Abb. 13. D u r c h s c h n i t t d u r c h ein Färbeglas, in das 6 O b j e k t t r ä g e r e i n gestellt sind

v e r h i n d e r n , stellt m a n sie in e i n e n e n t s p r e c h e n d a u s g e b o h r t e n Holzblock. Abb. 13 zeigt i m Q u e r s c h n i t t , w i e m a n 6 O b j e k t t r ä g e r (je 2 m i t der f r e i e n F l ä c h e a n e i n a n d e r g e l e h n t ) in e i n e m solchen Glase u n t e r b r i n g e n k a n n , o h n e daß sich die a u f g e k l e b t e n S c h n i t t e b e r ü h r e n . Noch e m p f e h l e n s w e r t e r sind die in Abb. 14 w i e d e r g e g e b e n e n m i t S c h l i f f s t o p f e n v e r s e h e n e n Gläser. F ü r u n a u f g e k l e b t e S c h n i t t e v e r w e n d e t m a n am b e s t e n n i c h t zu t i e f e Glasdosen m i t a u f g e s c h l i f f e n e m K a p p e n - oder R i l l e n deckel. 580. Um eine größere Anzahl von Objektträgern auch verschiedener Größe gleichzeitig behandeln zu können, nimmt S t u d n i c k a (38) eine Kristallisierschale von etwa 18 cm Durchmesser und mindestens 76 mm hoher senkrechter Wandung und stellt in sie eine zweite ebensolche mit 15 cm Durchmesser, die mit Wasser gefüllt wird. In den Zwischenraum dagegen kommen Farblösung und Präparate.

Abb. 14.

Färbeglas mit 581. A r b e i t e t m a n in f e u c h t e r L u f t , so e m p f i e h l t es sich, die eingeschliffem i t X y l o l u n d a b s o l u t e m A l k o h o l g e f ü l l t e n G l ä s e r in S c h u t z n e m Deckel gläser m i t a u f g e s c h l i f f e n e r K a p p e zu stellen (s. Abb. 12), d e r e n B o d e n m a n m i t e n t s p r e c h e n d e n T r o c k e n m i t t e l n , z. B. P h o s p h o r p e n t o x y d , Chlorcalcium od. dgl. b e d e c k t (Gläser bei W a g n e r & Münz, M ü n c h e n 2, T ü r k e n s t r . 17, erhältlich). W e i d e n r e i c h (26) v e r s e n k t in das f ü r a b s o l u t e n A l k o h o l u n d f ü r X y l o l b e s t i m m t e F ä r b e g l a s eine kleine, m i t e i n e m e n t s p r e c h e n d e n E n t w ä s s e r u n g s m i t t e l g e f ü l l t e Glasdose. D e r Deckel d e r Dose b e s t e h t aus e i n e r J e n a e r Glasfilterplatte, w o d u r c h eine gegenseitige B e e i n f l u s s u n g der R e a g e n z i e n e r m ö g l i c h t ist.

582. Viel im Gebrauch sind auch die meist 10—20 Objektträger fassenden Glas- oder Porzellantröge m i t R i l l e n . Die gleichzeitige Behandlung von 36 Objektträgern ermöglicht ein von H a u s e r angegebenes Metallgestell, das in entsprechende Glaströge gestellt wird (siehe Abb. 15; erhältlich bei W a g n e r u. M ü n z , München 2, Türkenstr. 17). N e u m a y e r gibt eine reifartige Vorrichtung an, die die gleichzeitige Behandlung von 100 bis 200 Objekt-

Abb

15

Glastrog und

Färbegestell

nach Hauser

140

Die Weiterbehandlung der Schnitte

§ 583—589.

trägem in großen rund Glasschalen gestattet. In einer von M a t h i s (33) beschriebenen Färbewanne können gleichzeitig 106 Präparate gefärbt werden.

583. Die P r ä p a r a t e w e r d e n nach der D u r c h f ü h r u n g durch die Alkoholreihe vor der F ä r b u n g gewöhnlich noch kurze Zeit in Brunnenwasser ausgewaschen. Man klemmt sie dazu zweckmäßig mit der Schmalseite des Objektträgers in eine kleine Korkklammer, wie sie zum Wässern von Lichtbildern in Gebrauch sind, und läßt sie in einem Wasserglas schwimmen. Vor manchen F ä r b u n g e n müssen die P r ä p a r a t e auch noch mit dest. Waser ausgewaschen werden. B. Celloidinschnifte 584. Alkoholcelloidinschnitte werden meist unaufgeklebt weiterbehandelt, da das Celloidin häufig nicht entfernt zu werden braucht und den Schnitt vor Beschädigung schützt. Die Schnitte, welche vom Schneiden h e r mit 70°/o Alkohol benetzt sind, w e r d e n zunächst in 70°/oigem Alkohol gesammelt und durch 50°/oigen Alkohol in Wasser übertragen. Sublimatfixierte P r ä p a r a t e müssen nach § 572 jodiert und entjodet werden. 585. Unaufgeklebte Schnitte von Qlcelloidin bringt man, wenn das Celloidin erhalten werden soll, vom Messer weg auf kurze Zeit in 96°/oigen Alkohol oder in Propylalkohol, der das Celloidin nicht löst, dann in 80°/oigen Alkohol usw. 586. W e i t e r b e h a n d l u n g a u f g e k l e b t e r C e l l o i d i n s c h n i t t e . Bei einer Reihe von F ä r b u n g e n f ä r b t sich das Celloidin so stark mit, daß es entf e r n t werden muß. In diesen Fällen klebt man die Celloidinschnitte nach einer der in § 555 bis § 561 angegebenen Methoden auf u n d k a n n n u n ohne Nachteil das Celloidin durch Einstellen der Objektträger in Äther-Alkohol ää), Aceton oder Methylalkohol entfernen; hierauf wird das Lösungsmittel durch reinen 96°/oigen Alkohol beseitigt u n d der Schnitt wie ein aufgeklebter paraffinbefreiter Paraffinschnitt weiterbehandelt. 587. Auch Nelkenöl oder Methylbenzoat lösen Celloidin, aber langsamer wie Aceton, Methylalkohol oder Äther-Alkohol. An Stelle des unangenehm riechenden teuren Nelkenöls, das auch für viele Färbungen schädlich ist, empfiehlt P. M a y e r (166) M e t h y l b e n z o a t , das sich schon mit 90°/oigem Alkohol, mit Xylol usw. und mit Kanadabalsam mischt. Es löst Celloidin, aber nicht Paraffin; mit Glyzerin mischt es sich nicht, no = 1,57.

588. Aufgeklebte Celloidin-Paraffinsdinifte bringt m a n zunächst in Xylol, absoluten Alkohol, Methylalkohol oder Äther-Alkohol, 96°/oigen Alkohol usw. wie § 270 f. C. Gefrierschnitfe 589. Die Gefrierschnitte, die sich unaufgeklebt oder aufgeklebt meist schon in dest. Wasser befinden, erfordern gewöhnlich keine besondere Vorbehandlung, sondern werden direkt in die Farblösung übertragen. Ist dieselbe alkoholisch, so w i r d zweckmäßig noch ein schwachprozentiger Alkohol dazwischen geschaltet. Über Auflösung der Gelatine s. § 470. Uber die Weiterbehandlung der. bei Messertiefkühlung nach S c h u l t z B r a u n s gewonnenen Schnitte s. § 525.

§ 590—593.

Die Färbung

141

10. K A P I T E L

Die Färbung A. Allgemeines 590. Die Erkenntnis, daß bestimmte Bestandteile der Zellen und der Gewebe gewisse Farben mit größerer Intensität aufnehmen und festhalten wie andere, war für die Histologie von weittragendster Bedeutung. Denn erst dadurch gelang es, zahlreiche Strukturen, die infolge ihres Lichtbrechungsvermögens in ungefärbtem Zustand nicht oder nur undeutlich sichtbar und unterscheidbar waren, scharf hervorzuheben und mühelos voneinander zu trennen. 591. Die Anwendung der Farbstoffe ruht in der histologischen Technik zum größten Teil auch jetzt noch auf rein empirischer Grundlage, da es trotz zahlreicher Untersuchungen noch nicht geglückt ist, das Wesen und die Bedingungen des histologischen Färbungsprozesses klarzustellen. Selbstverständlich haben bei diesen Fragen die rein chemischen Reaktionen, die wie z. B. die Berlinerblau-Reaktion mit dem Auftreten gefärbter Verbindungen einhergehen, auszuscheiden. Auf diese wird in einem eigenen Abschnitt einzugehen sein. Es handelt sich hier vielmehr um die Ergründung der Faktoren, die die Färbung des Gewebes bei der Einwirkung natürlicher oder künstlicher Farbstoffe bedingen. Während sich vor einiger Zeit die chemische Theorie, die die Färbung auf Salzbildung oder das Zustandekommen chemischer Additionsverbindungen zurückführte, großer Anhängerschaft erfreute, treten gegenwärtig vor allem physiko-chemische Erklärungsversuche in den Vordergrund. 592. Unter den physikalischen Faktoren spielen D i f f u s i o n s g e s c h w i n d i g k e i t und K o n z e n t r a t i o n der Farblösung sowie die S t r u k t u r d i c h t e (Porengröße) des Objektes für die histologische Färbung zweifellos eine große Rolle. Ihre Bedeutung wurde schon 1899 von A. F i s c h e r in grundlegenden Modellversuchen dargetan. Später wurde die Diffusionsgeschwindigkeit der Farblösungen namentlich von v. M ö l l e n d o r f f und seiner Schule (1923—1925) als Ursache der FarbstofTverteilung im histologischen Präparat in Betracht gezogen. Dabei bestimmt die Dichte der Gewebe die Reihefolge der Färbung der einzelnen Strukturen, die Dispersität des Farbstoffes die Geschwindigkeit des Färbevorganges. Die Farbstoffe sind darnach Reagentien auf Dichteverhältnisse, nicht aber auf chemische Eigenschaften. 593. Auf Grund des physikalisch-chemischen Verhaltens von Farbstoff und Gewebe unterscheidet v. M ö l l e n d o r f f (24) zwischen einer D u r c h t r ä n k u n g s f ä r b u n g und einer N i e d e r s c h l a g s f ä r b u n g . Bei der D u r c h t r ä n k u n g , der alle Strukturen zugänglich sind, kommt es zu einer völligen Durchdringung der Strukturen mit dem gelösten Farbstoff. Saure Farbstoffe geben nur Durchtränkungsfärbungen, die basischen Farbstoffe können außer diesen zum Teil auch noch Niederschlagsfärbung geben. Bei sauren Farbstoffen (im wesentlichen auch bei basischen) nimmt aus äquimolekularen Lösungen die colorimetrisch gemessene Färbungsstärkö mit fallender Dispersität zu. Die N i e d e r s c h l a g s f ä r b u n g ist ein Oberflächenphänomen, das nur an bestimmten Gewebsstrukturen auftritt. Sie beruht auf einer Ausflockung der basischen Farbstoffe, die an der Oberfläche dieser Strukturen in Gegenwart von kolloiden Säuren zustande kommt. Die Niederschlagsfärbung nimmt mit steigender Konzentration dauernd zu, die Durchtränkungsfärbung erreicht dagegen bei einer Reihe von Farbstoffen (z. B. bei Methylenblau, Neutralrot) ein Färbungsoptimum (im angegebenen Fall etwa bei 1 : 1 0 OOOmal), von dem aus die Intensität der Ge-

142

Die Färbung

§ 594—597.

samtfärbung nach der fallenden wie nach der steigenden Konzentration hin abnimmt. Beispiele von Niederschlagsfärbungen sind nach v. M ö l l e n d o r f f Färbungen der Kerne, der Mastzellkörner, des Knorpels, des Schleimes. Auch die Beizenfarbstoffe liefern nach v. M ö l l e n d o r f f Niederschlagsfärbungen. 594. I m G e g e n s a t z dazu b e z w e i f e l t P i s c h i n g e r , d a ß der D i s p e r s i t ä t u n d D i f f u s i o n j e n e u m f a s s e n d e B e d e u t u n g z u k o m m t , die i h n e n v. M ö l l e n d o r f f beilegt. A u c h e i n e u r s ä c h l i c h e U n t e r s c h e i d u n g z w i s c h e n D u r c h t r ä n k u n g s - u n d N i e d e r s c h l a g s f ä r b u n g im S i n n e v. M ö l l e n d o r f f s l e h n t P i s c h i n g e r ab, da sich in s e i n e n V e r s u c h e n f ü r e i n e o b e r f l ä c h l i c h e F a r b l o k a l i s a t i o n in F o r m v o n F a r b f l o c k e n k e i n e A n h a l t s p u n k t e finden ließen. Die V e r s u c h e w i e s e n v i e l m e h r d a r a u f hin, d a ß a u c h bei d e r » N i e d e r s c h l a g s f ä r b u n g « e i n e F a r b a d s o r p tion in den S t r u k t u r e n vor sich geht. Z u d e m gleichen E r g e b n i s k o m m t J ä g e r (38). 595. E i n e f ü h r e n d e Rolle spielen o h n e F r a g e auch die elektrischen F a k t o r e n d e r F a r b s t o f f e wie der S u b s t r a t e . Schon 1905 e r b r a c h t e B e t h e den Nachweis, d a ß d e r S ä u r e - u n d A l k a l i g e h a l t der F a r b l ö s u n g v o n w e s e n t lichem E i n f l u ß auf das F ä r b e e r g e b n i s ist. Die G e w e b s e l e m e n t e v e r h a l t e n sich d a b e i v e r s c h i e d e n , so daß es gelingt, b e s t i m m t e S t r u k t u r e n bei e i n e r f ü r sie c h a r a k t e r i s t i s c h e n H - I o n e n k o n z e n t r a t i o n m e h r oder w e n i g e r e l e k t i v d a r z u s t e l len. Die V e r s u c h e b i l d e n die G r u n d l a g e f ü r e i n e e l e k t r o s t a t i s c h e A u f f a s s u n g des Wesens d e r histologischen F ä r b u n g , die jetzt v o r a l l e m v o n K e l l e r , G i c k l h o r n , N a y l o r , P u l c h e r , P i s c h i n g e r , Z e i g e r u. a. v e r t r e t e n w i r d . Die F ä r b u n g e n fixierter histologischer P r ä p a r a t e stellen s o w o h l bei V e r w e n d u n g eines basischen w i e eines s a u r e n F a r b s t o f f e s A d s o r p t i o n s prozesse dar, die w i e d e r in e n g e r B e z i e h u n g z u r e l e k t r i s c h e n L a d u n g d e r G e w e b e s t e h e n . D e m e n t s p r e c h e n d sind auch die B e z e i c h n u n g e n »saures u n d b a sisches Gewebe«, w e l c h e m e h r c h e m i s c h e n C h a r a k t e r t r a g e n , besser d u r c h »negativ« o d e r »positiv« g e l a d e n zu ersetzen, wobei diese b e i d e n B e g r i f f e n i c h t absolut g e n o m m e n w e r d e n d ü r f e n , d a es von d e r e i n w i r k e n d e n H - I o n e n k o n z e n t r a t i o n a b h ä n g t , ab ein G e w e b e b e i g e g e b e n e n B e d i n g u n g e n acidophil oder b a s o p h i l a u f t r i t t (s. a u c h § 1264). 596. Als e x t r e m e r V e r f e c h t e r einer c h e m i s c h e n F ä r b e t h e o r i e sei U n n a g e nannt. Nach U n n a (28) sind alle Färbungen in ihrem Anfang rein physikalische Vorgänge, bei denen der in Lösung befindliche Farbkörper in die gröberen und feineren Poren des Gewebes eindringt und sich hier nach physikalischen Gesetzen (Kapillarität, Oberflächenanziehung) verteilt und anhäuft. Auf diese schon in wenigen Minuten erreichte erste Phase folgt eine zweite, die eigentliche Färbung, die einen rein chemischen Vorgang darstellt. Die chemisch verschiedenen Strukturelemente überwinden dabei das dem Färbeakt entgegenarbeitende Lösungsbestreben des flüssigen Mediums, in dem die Farbe gelöst war. Im dritten Stadium der Färbung, dem der Entfärbung, kann dann durch stärkere Lösungsmittel die zuerst getroffene chemische Auslese modifiziert und beschränkt werden. Das fertige Präparat stellt ein neues chemisches Individuum dar, in dem bestimmte Affinitäten einzelner Strukturelemente sich chemisch verbunden haben. 597. S c h o n diese k u r z e n A u s f ü h r u n g e n lassen e r k e n n e n , daß sich die T h e o r i e n ü b e r das W e s e n d e r F ä r b u n g bis in die j ü n g s t e Zeit n o c h v i e l f a c h u n v e r einbar gegenüberstehen. Aus dem Widerstreit der beigebrachten Befunde ergibt sich i m m e r m e h r , d r " ' e r V o r g a n g der histologischen F ä r b u n g so k o m p l e x e r N a t u r ist, d a ß sich f ü r ihn w o h l ü b e r h a u p t k e i n e allgemein gültige, sein ganzes Wesen u m f a s s e n d e T h e o r i e a u f s t e l l e n läßt. W e g e n w e i t e r e r E i n z e l h e i t e n sei auf die z u s a m m e n f a s s e n d e D a r s t e l l u n g von Z e i g e r (38) v e r w i e s e n , in der m a n

§ 598—599.

Allgemeines

143

auch das einschlägige Schrifttum vorfindet. Wichtige Beobachtungen finden sich ferner in den Arbeiten von S e k i. 598. Ungeachtet der noch schwebenden Streitfragen haben die Methoden den Wert von Farbreaktionen, die in Verbindung mit dem morphologischen Verhalten der durch sie dargestellten Strukturen die Identifizierung bestimmter Gewebsteile erlauben. Wenn es z. B. gelingt, durch die Einwirkung eines Farbstoffes bei den dem Untersucher bekannten Objekte gewisse Kernbestandteile oder Zellgranula, elastische Fasern oder Schleimtröpfchen usw. charakteristisch zu färben, so läßt sich mit großer Wahrscheinlichkeit darauf schließen, daß man es, wenn die Färbung auch bei der Untersuchung neuer Objekte auftritt, gleichfalls wieder mit einem ähnlichen Gewebsteil oder Stoff zu tun hat, namentlich wenn auch Übereinstimmungen im Verhalten gegen Lösungsmittel, Verdauungsflüssigkeiten u. dgl. bestehen. Man muß sich aber stets dessen bewußt bleiben, daß sich aus derartigen Färbungsergebnissen keine Schlüsse auf die chemische Beschaffenheit der Strukturen ziehen lassen. Wohl zu beachten ist ferner, daß sehr oft ganz verschiedene Gewebsteile gleiches Verhalten gegen Farbstoffe zeigen können, und daß auch die Vorbehandlung des Präparates (Fixierung usw.) eine Änderung der Reaktionen bewirken kann. Es würde daher zu falschen Resultaten führen, wollte man sich gleich färbende Dinge stets f ü r gleich halten. Solche Schlüsse dürfen nur mit besonderer Vorsicht und auf Grund großer Erfahrung gezogen werden. Dagegen kann man mit geringerem Bedenken annehmen, daß Strukturen, die sich bei gleicher Behandlung und unter gleichen Bedingungen verschieden färben, auch in Wirklichkeit verschieden sind. Ebenso wie bei der Fixierung hat man auch bei der Färbung mit der Möglichkeit des A u f t r e t e n s v o n K u n s t p r o d u k t e n zu rechnen, weshalb auch hier der Vergleich mit ungefärbten, wie besonders mit frischen, unfixierten Präparaten von großer Wichtigkeit ist. 599. D i e Unterscheidung von sauren und basischen Farbstoffen d a r f n i c h t in d e m

Sinne aufgefaßt werden, als ob dadurch das Verhalten der Farbstoffe z. B. gegenüber Lackmus zum Ausdruck kommt. Die Bezeichnung »basisch« ist hier nicht gleichbedeutend mit »alkalisch«. E i n b a s i s c h e r F a r b s t o f f i s t e n t w e d e r eine F a r b b a s e oder ein Salz e i n e r s o l c h e n , ein saurer Farbstoff d e m e n t s p r e c h e n d eine F a r b s ä u r e oder ein Salz einer solchen. Ein gefärbter Körper aus der aromatischen Reihe, der keine salzbildende Gruppe enthält, vermag selbst nicht zu färben. Er wird als C h r o m o g e n bezeichnet. Erst durch Hinzutreten einer oder mehrerer salzbildender Gruppen (Chromophore) erhält er färbende Eigenschaft. Als b a s e n b i l d e n d e Gruppen kommen besonders die Aminogruppe (NH2), die Mono- und Dimethylaminogruppe (NH.CH 3 bzw. N.(CH 3 ) 2 ) und die Imidogruppe (NH) in Betracht. S ä u r e b i l d e n d e Gruppen sind die Hydroxylgruppe (OH), die Carboxylgruppe (COOH), die Nitrogruppe (N0 2 ) und die Sulfosäuregruppe (SO2OH). Chromogen + basenbildende Gruppe gibt einen basischen, Chromogen + säurebildende Gruppe einen sauren Farbstoff. J e mehr salzbildende Gruppen ein Farbstoff enthält, desto intensiver ist gewöhnlich seine Färbkraft. Man bezeichnet derartige, hinzutretende salzbildende Gruppen als a u x o c h r o m e Gruppen. Ein Chromogen kann sowohl säurewie basenbildende Gruppen enthalten. Seine Natur wird dann durch das Überwiegen der einen oder anderen Gruppe bestimmt. Farbstoffe, bei welchen sich beide das Gleichgewicht halten, bezeichnet M i c h a e l i s als amphoter.

144

Die Färbung

§ 600—602.

Bei Vereinigung der wässerigen Lösungen eines sauren und eines basischen Farbstoffes fällt häufig ein neuer, durch Vereinigung der F a r b s ä u r e und F a r b base gebildeter, sog. neutraler Farbstoff aus. Ein neutraler Farbstoff ist also das Salz aus einer Farbbase und einer Farbsäure. Nicht zu verwechseln damit ist ein sog. neutrales Farbgemisch, das, wie M i c h a e l i s zeigt, weder in chemischer Beziehung noch in seiner färberischen Wirksamkeit mit neutralen Farbstollen identisch ist. Das Wesentliche eines neutralen Farbgemisches ist die gleichzeitige Anwesenheit von basischen und saurem Farbstoff. Das Chromogen k a n n statt durch eine säure- oder basenbildende Gruppe auch durch eine indifferente Gruppe (wie z. B. —OCH 3 , —OC2H5 oder n u r —O) f ä r b e n d e Eigenschaften bekommen. Derartige Farbstoffe bezeichnet M i c h a e 1 i s als indifferente Farbstoffe. Weiteres siehe M i c h a e l i s , Einführung in die Farbstoffchemie für Histologen. 600. B e i s p i e l e v o n s a u r e n F a r b s t o f f e n sind Aurantia, Benzoazurin, Bordeaux, Congorot, Eosin, Erythrosin, Indulin, Lichtgrün S. F., Nigrosin, Orange, Pikrinsäure, Säurefuchsin usw. Sie dienen hauptsächlich zur Färbung des »Plasmas« und der Differenzierungsprodukte. Sie sind in Wasser meist löslicher als in Alkohol. B a s i s c h e Farbstoffe sind z. B. Bismarckbraun, Fuchsin, Gentianaviolett, Methylenblau, Methylgrün, Methylviolett, Thionin, Toluidinblau u. a. Sie dienen vor allem zur Färbung des Chrorjiatins der Kerne, färben unter bestimmten Bedingungen aber auch andere Strukturen wie gewisse Granula, Schleim, Nervenelemente usw. Sie sind in Alkohol häufig löslicher als in Wasser. Als Beispiel eines n e u t r a l e n Farbstoffes sei das eosinsaure Methylenblau erwähnt. Ein neutrales Farbgemisch stellt das Triacid-Gemisch (Methylgrün— Säurefuchsin—Orange) dar. Zu den i n d i f f e r e n t e n Farbstoffen gehören die für die Färbung von Fettsubstanzen so wichtigen Farbstoffe Sudan III und Scharlach R. Die Färbung mit diesen Farbstoffen ist ein typisches Beispiel für einen auf rein physikalischen Vorgängen beruhenden Färbeprozeß. 601. Will man feststellen, ob irgendein Farbstoff sauer oder basisch ist, dann fügt man nach M i c h a e l i s die wäßrige Lösung des Farbstoffes zu einer gesättigten wäßrigen Lösung von Pikrinsäure. Entsteht dabei ein Niederschlag, so handelt es sich um einen basischen Farbstoff, andernfalls um einen sauren. 602. Entsprechend der Trennung in s a u r e , b a s i s c h e und n e u t r a l e Farbstoffe f ü h r t e E h r l i c h auch die Unterscheidung zwischen a c i d o p h i l e n , b a s o p h i l e n und n e u t r o p h i l e n Gewebsbestandteilen ein. E h r l i c h nimmt dabei an, daß die basischen Farbstoffe von sauren Gewebsbestandteilen, die sauren Farbstoffe von basischen Substraten bevorzugt werden. Die Bezeichnungen haben, auch vom Standpunkt der chemischen Färbetheorie aus betrachtet, n u r beschränkte Gültigkeit, da die meiste f ä r b b a r e Eiweißsubstanz a m p h o p h i l ist, d. h. sich bei Anwendung homogener basischer oder saurer Farbgemische sowohl mit der einen, wie mit der anderen Komponente f ä r b t ( P a p p e n h e i m). Die Bezeichnung azido- bzw. basophil bedeutet also nur, daß im amphoteren Molekül entweder die sauren Carboxyl- oder die basischen Aminogruppen an Zahl oder chemischer Affinität überwiegen, so daß bei A n w e n d u n g eines heterogenen, neutralen Gemisches saurer und basischer F a r b Farbstoffe die einen Substrate n u r den basischen, die andern n u r den sauren Farbstoff aufnehmen, die andere Farbgemischkomponente aber zurückweisen. Im Falle der Neutrophilie halten sie sich wohl die Wagschale. Basophilie und Oxyphilie versteht sich also n u r in Rücksicht auf die bei Anwendung n e u t r a l e r Gemische zutage tretende prävalierende Chromophilie (s. auch § 595 u. 1264).

§ 603—604.

Allgemeines

145

603. M i t Mefachromasie bezeichnet m a n die Erscheinung, daß gewisse G e websbestandteile in b e s t i m m t e n F a r b l ö s u n g e n einen F a r b t o n annehmen, der von dem der F a r b l ö s u n g m e h r od6r w e n i g e r stark abweicht. Die betreffenden Gewejpsbestandteile w e r d e n als c h r o m o t r o p bezeichnet. So f ä r b t z. B . T h i o nen, dessen wässerige Lösung einen violetten F a r b t o n hat, S c h l e i m und M a s t zellengranula rot. Die Erscheinungen der Metachromasie wurden in sehr verschiedener Weise gedeutet. F ü r manche unreine Farbstoffe mag die alte Erklärung von F i s c h e r , daß die Metachromasie auf Verunreinigung der Farbstoffe durch anders f ä r bende Begleitstoffe bedingt sei, auch heute noch zutreffen. Es handelt sich dann um die besser als A l l o c h r o m a s i e ( L e h n e r ) zu bezeichnende Erscheinung. F ü r chemisch reine, einheitliche Farbstoffe mit typischer Metachromasie wie Thionin, Toluidinblau, Neutralrot, Pyronin, Neublau R, Rhodamin O ist diese E r klärung jedoch hinfällig. H a n s e n erklärte die Metachromasie durch die A n nahme einer hydrolytischen Spaltung: die Metachromasie beruhe darauf, daß gewisse Gewebsbestandteile, wie Schleim, Amyloid, Knorpelgrundsubstanz, die in wässerigen Farblösungen vorhandenen, hydrolytisch gebildeten freien Moleküle der Farbbase in besonderem Grad aufspeichern und sich daher in deren Ton besonders stark mitfärben, v. M ö l l e n d o r f f betrachtet die Metachromasie lediglich als eine Niederschlagsfärbung, die sich von anderen Niederschlagsfärbungen nur dadurch unterscheidet, daß die Niederschlagsbildung der betreffenden Farbstoffe einen anderen Farbton aufweist als der gelöste Farbstoff. Nach P i s c h i n g e r soll bei Metachromasie mit dem Entstehen von Adsorptionsverbindungen zwischen Farbstoff und Gewebe ein neuer spezifisch gefärbter Körper auftreten.

E i n e neue Wendung e r f u h r die F r a g e der M e t a c h r o m a s i e durch die w i c h t i gen U n t e r s u c h u n g e n von L i s o n (35). Nach diesen ist die F ä h i g k e i t eines basischen Farbstoffes zu M e t a c h r o m a s i e n u r dann gegeben, wenn wenigstens e i n e Aminogruppe nicht vollständig substituiert ist und die Möglichkeit zur Bildung einer Iminobase vorliegt. D e r m e t a c h r o m a t i s c h e F a r b u m s c h l a g dieser basischen F a r b s t o f f e stellt nach Lison eine echte histochemische R e a k t i o n dar, die ganz ausschließlich an das Vorhandensein von S c h w e f e l e s t e r höheren M o l e k u l a r gewichts vom T y p R — OSO3 und ihre Salze gebunden ist. 604. Die Arten der histologischen Färbung. L ä ß t m a n den S c h n i t t n u r so lange in der F a r b e , bis er genügend gefärbt ist, so spricht man von progressiver F ä r bung; als regressive Färbung bezeichnet m a n es dagegen, wenn der S c h n i t t in der F a r b l ö s u n g zunächst ü b e r f ä r b t und der Überschuß der F a r b e durch A u s waschen (Differenzieren) mit einer geeigneten Flüssigkeit wieder e n t f e r n t wird. D i e zur D i f f e r e n z i e r u n g benützte F l ü s s i g k e i t muß nach Abschluß des V e r f a h r e n s sorgfältig entfernt, ausgewaschen werden, da sie sonst über den gewünschten G r a d hinaus w e i t e r w i r k t und die F ä r b u n g unter Umständen z e r stört. S o w o h l bei progressiver wie regressiver F ä r b u n g mit T e e r f a r b e n empfiehlt es sich, die F a r b l ö s u n g e n nicht allzu k o n z e n t r i e r t zu nehmen. E i n e 24stündige progressive F ä r b u n g in stark v e r d ü n n t e r Erythrosinlösung gibt z. B . r e i n e r e S t r u k t u r b i l d e r als eine k u r z dauernde F ä r b u n g in einer hochprozentigen L ö sung. A u c h bei regressiver F ä r b u n g ist die Anwendung verdünnter Lösungen empfehlenswert, da das F ä r b e e r g e b n i s nach Ü b e r f ä r b u n g in stark k o n z e n t r i e r t e r Lösung und nachfolgender E x t r a k t i o n oft ungleichmäßig und fleckig ausfällt. A u ß e r d e m k a n n die F ä r b e k r a f t v e r d ü n n t e r Lösungen unter U m s t ä n d e n größer sein, als die hochprozentiger Lösungen (vgl. auch § 593). Ebenso geht die Differenzierung schöner und gleichmäßiger vor sich, wenn die dazu benützten 10

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

146

Die F ä r b u n g

§ 605—607

Lösungen in verdünntem Zustand gebraucht werden. Dicke Schnitte eignen sich für regressive Färbemethoden im allgemeinen weniger als dünne. Auch große umfangreiche Schnitte geben meist ungleichmäßige Resultate. Sehr wichtig ist, zumal bei Vergleichsschnitten, eine gleichmäßige, übereinstimmende Schnittdicke. Wegen all dieser U m s t ä n d e bedarf es einiger Übung, u m m i t regressiven M e t h o den gute, sichere Ergebnisse zu erzielen. D e r A n f ä n g e r w i r d d a h e r m i t leichter a u s z u f ü h r e n d e n , progressiven F ä r b e m e t h o d e n beginnen, z. B. mit H ä m a l a u n f ä r b u n g u. dgl. 605. M a n u n t e r s c h e i d e t f e r n e r z w i s c h e n substantiver (direkter) u n d adjektiver

(indirekter) Färbung. Tingieren sich die Objekte aus einer Farblösung unmittelbar, so färben sie sich substantiv. Wenn sie sich aber erst nach Vorbehandlung mit einem anderen Stoff in der gewünschten Weise färben, dann spricht man von einer adjektiven Färbung. 606. Letztere A r t d e r F ä r b u n g w i r d von der technischen F ä r b e r e i her a u c h als Beizenfärbung, die b e t r e f f e n d e n F a r b e n als Beizenfarbstoffe bezeichnet. Die N a t u r der B e i z e n f ä r b u n g f a n d s e h r verschiedene E r k l ä r u n g . W ä h r e n d B e c h e r (21) sie h a u p t s ä c h l i c h von c h e m i s c h e n Gesichtspunkten a u s b e t r a c h t e t , glauben v. M ö l l e n d o r f f u n d T o m i t a (25), daß der F ä r b u n g s a u s f a l l d u r c h physikochemische K o n s t a n t e n der Lacklösung bedingt wird. N a c h Z e i g e r (38) dagegen h a b e n auch die v e r w i c k e l t e n Vorgänge der B e i z e n f ä r b u n g d u r c h den Nachweis i h r e r e l e k t r i schen Bedingtheit eine h i n r e i c h e n d e K l ä r u n g g e f u n d e n . Z e i g e r legt dies auf G r u n d des einschlägigen S c h r i f t t u m s f ü r Carmin, H ä m a t e i n , k ü n s t l i c h e Beizenfarbstoffe, Orcein u n d Resorcinfuchsin im einzelnen dar.

607. Läßt man bestimmte Farben in Mischung (simultan) oder nacheinander (succedan) auf denselben Schnitt einwirken, so färben sich nicht etwa alle Gewebeteile des Schnittes in der Farbe der Mischung, sondern bestimmte Gewebeteile halten nur die eine, andere dagegen die zweite Farbe fest. Je nach der Zahl der kombinierten Farben spricht man dann von Doppel-, Dreifach- oder kurz von Mehrfachfärbungen. Wenn ein Gemisch von zwei Farben einen Schnitt in gleichmäßiger Mischfarbe tingiert, so ist das keine Doppelfärbung in unserem Sinne. Nur ganz bestimmte Farbenzusammenstellungen geben Mehrfachfärbungen, die für die histologische Untersuchung von Wert sind. Eine echte M e h r f a c h f ä r b u n g liegt z. B. vor, w e n n die K e r n e d u r c h C a r m i n oder K e r n e c h t r o t r o t u n d gleichzeitig die elastischen F a s e r n d u r c h Resorcinfuchsin dunkelviolett g e f ä r b t w e r d e n . Häufig k o m m t der Effekt einer M e h r f a c h f ä r b u n g d a d u r c h zustande, d a ß der eine Farbstoff diffus das ganze P r ä p a r a t f ä r b t , a n b e s t i m m t e n Stellen a b e r d u r c h einen zweiten ü b e r l a g e r t wird. Wenn z. B. ein H ä m a l a u n - E o s i n p r ä n a r a t blau u n d rot g e f ä r b t erscheint, so b e r u h t das n i c h t d a r a u f , d a ß die K e r n e n u r d u r c h H ä m a l a u n , nicht a b e r d u r c h Eosin g e f ä r b t w e r d e n ; d e n n in Wirklichkeit w e r d e n a u c h die K e r n e d u r c h Eosin a n g e f ä r b t . I h r e R o t f ä r b u n g w i r d a b e r im f e r t i g e n P r ä p a r a t d u r c h i h r e B l a u f ä r b u n g mit H ä m a l a u n überdeckt. Der E i n f l u ß des Eosins l ä ß t sich a u c h a m Rotstichigwerden des Blau deutlich e r kennen.

In allen gebräuchlichen Mischungen verschiedener saurer Farbstoffe besitzen die einzelnen Komponenten des Farbgemisches verschiedene Diffusionsgeschwindigkeit; so ist bei der van Gieson-Färbung Fuchsin S schwächer und Pikrinsäure stärker diffusibel. Der differente Färbeeffekt beruht dann darauf, daß die leichter diffundierende Farbe in die dichter gebauten Gewebsstrukturen eindringt, während der weniger diffusionsfähige die weitporigen bevorzugt.

§ 608—614.

Allgemeines

147

608. Wird das Objekt noch v o r dem Schneiden als ganzes Stück durchgefärbt, so spricht man von Stückfärbung, während die Schnittfärbung nach dem Schneiden an einzelnen Schnitten ausgeführt wird. 609. Die erstere gestattet rascheres Arbeiten, bei der letzteren kann dagegen die Färbung unter dem Mikroskop stets kontrolliert werden; ferner können bei Schnittfärbung an e i n e m Objekt die verschiedensten Färbemethoden versucht werden; dann kann man sich bei ihr vieler Farben bedienen, welche zur Stückfärbung nicht angewendet werden können, vor allem gehört hierher die Mehrzahl der Mehrfachfärbungen. In gewissen Fällen lassen sich beide Methoden verbinden, so daß man dasselbe Objekt zuerst im Stück und dann im Schnitt färben kann.

610. Einfluß der Fixierung. Eine Reihe von Färbungen (insbesondere auch mit Teerfarben) läßt sich nur dann mit vollem Erfolg ausführen, wenn das Präparat nach einer bestimmten Fixierungsmethode yorbehandelt wurde. S e h r v i e l e M i ß e r f o l g e in d e r M i k r o t e c h n i k e r k l ä r e n s i c h aus dem U m s t a n d , daß diese G r u n d r e g e l n i c h t g e n ü g e n d b e a c h t e t wird.

So kann man z. B. nach Fixierung in F l e m m i n g s c h e r Flüssigkeit nur schwer mit Hämalaun tingieren, während die Färbung mit Safranin oder Eisenhämatoxylin am gleichen Material ausgezeichnet gelingt. Nach Formolfixierung hingegen färbt sich der Schnitt sehr gut mit Hämalaun, schlecht mit Safranin usw. Aber nicht nur die Fixierung, auch die übrige Vorbehandlung ist von Bedeutung. So vermindert z. B. langes Liegen in Alkohol die Färbbarkeit, insbesondere wenn durch den Flaschenkork Spuren von Gerbsäure in den Alkohol gelangen. Ebenso wirkt langes Chromieren, lang dauerndes Entkalken u. dgl.

611. F i x i e r u n g u n d V o r b e h a n d l u n g s i n d n i c h t n u r f ü r den A u s f a l l , s o n d e r n auch für die H a l t b a r k e i t der F ä r b u n g v o n g r o ß e r B e d e u t u n g . So können durch Säurespüren, die infolge ungenügenden Auswaschens im Präparat zurückgeblieben sind, Färbungen mit säureempfindlichen Farbstoffen schon in kürzester Zeit zerstört werden. Zurückgebliebene Jodspuren können nicht nur Färbungen mit Teerfarben, sondern auch solchen mit Hämatoxylin gefährlich werden (s. § 572). Sehr schädlich sind auch Säurespuren, die z. B. bei gebrauchten Objektträgern vom Reinigungsprozeß her zurückbleiben können (s. § 97). 612. D i e H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g . Die Farbstoffe werden meist in wässeriger oder alkoholischer Lösung benützt. Besondere Einzelheiten sind später aus den bei den verschiedenen Farbstoffen angeführten Vorschriften zu entnehmen. Zur Herstellung w ä s s e r i g e r Farblösungen darf nur reines, neutral reagierendes destilliertes Wasser verwendet werden. Um Schimmelbildung zu vermeiden, setzt man wässerigen Farblösungen etwas Thymol, Campher, Formol od. dgl. zu. Trotzdem wird man des öfteren die Erfahrung machen, daß rein wässerige Farblösungen nach einiger Zeit verderben.

Thymolzusatz soll bei einigen Teerfarbstofflösungen (z. B. Kristallviolett) für deren Färbekraft schädlich sein. 613. Nach v a n W a l s e m (32) läßt sich die Haltbarkeit vieler Farblösungen dadurch verbessern, daß man der Lösung etwas feingepulvertes Silber zusetzt (oligodynamische Wirkung).

614. M i c h a e l i s empfiehlt Lösungen von Toluidinblau, Methylenblau u. dgl. in der Weise herzustellen, daß man zuerst eine in destilliertem Wasser gesättigte Lösung bereitet, der man nach 1—2 Tagen das gleiche Volumen 90°/oigen Alkohols zusetzt, worauf man gut durchmischt. Diese Stammlösungen sind sehr haltbar und besitzen eine große Färbekraft. Zur Färbung verdünnt man 10*

148

Die Färbung

§ 615—621.

einige Kubikzentimeter der Stammlösung mit der 20—50fachen Menge dest. Wassers. Zur Bereitung a l k o h o l i s c h e r Farblösungen nimmt man gewöhnlich 90—96°/oigen Alkohol. 615. Ein Ubelstand ist, daß in zahlreichen Original-Färbevorschriften nur sehr ungenaue Mengenbezeichnungen gegeben werden, wie z. B. die Angabe von 'Tropfenzahl statt von cmm, oder die Angabe »große oder kleine Messerspitze« u. dgl. igen Alkohols (H e i d e n'h a i n 26). 677. Eisenhämatoxylin von W e i g e r t zur Kernfärbung. Lösung a: 1 g Hämatoxylin in 100 ccm 96%>-Alkohol. Lösung b: 4 ccm Liquor ferri sesquichlorati, 1 ccm offizineile Salzsäure, 95 ccm dest. Wasser (oder 1,16 g Eisenchlorid, 98 ccm dest. Wasser und 1 ccm officin. Salzsäure). Unmittelbar vor Gebrauch mischt man gleiche Teile von a und b. Die getrennten Lösungen sind jahrelang haltbar, während die Mischung im Laufe von etwa 8 Tagen verdirbt. Man mischt daher

% 678—681.

Eisenhämatoxyline

161

immer nur kleine Mengen (5—10 ccm), die man am besten in einem Tropfgläschen (s. § 623) aufhebt. Zur Färbung bedeckt man das horizontal liegende Präparat, das sich vorher in dest. Wasser beiand, mit einigen Tropfen der Farblösung. Nach 1—2 Minuten auswaschen in fließendem Wasser. Bei richtiger Färbedauer ist ein Differenzieren unnötig; bei Uberfärbung differenzieren in 0,l°/oiger Salzsäure. Dann sehr sorgfältig auswaschen.

Das Weigertsche E.-H. leistet für viele Zwecke ausgezeichnete Dienste. Nicht nur, daß die Färbung der Kerne einfach, rasch und dauerhaft gelingt, es gibt auch in Fällen, in welchen andere Hämatoxyline versagen, noch vortreffliche Resultate. So fand ich, daß sich Schnitte von entkalktem Material, die sich in Hämalaun nur schlecht oder gar nicht mehr färben, mit dem W.E.H. noch ausgezeichnet tingierten. Ein weiterer Vorzug ist, daß Celloidin fast ungefärbt bleibt oder sich durch kurzes Einlegen in 0,l°/oige Salzsäure völlig entfärben läßt. Auch bei Gelatine-Gefrierschnitten ist es mit Vorteil zu verwenden, da es die Gelatine ungefärbt läßt. Uber Nachfärbung mit Pikrinsäuregemischen s. § 707; ferner § 710. Das Eisenhämatoxylin nach J a n s s e n (s. L i l l i e und E a r 1 e 39) bietet m. E. keine Vorteile. 678. Der L i q u . f e r r . s e s q u i c h l o r . ist eine 29%ige wässerige Lösung von Eisenchlorid. 679. Zur Herstellung der o f f i c i n e l l e n S a l z s ä u r e fügt man zu 100 ccm einer Salzsäure vom spez. Gew. 1,19 ( = 23° Bé, ca. 37°/o) 50 ccm dest. Wasser. Sie hat ein spez. Gew. = 1,124 und enthält 25% HCl. 680. n - S a l z s ä u r e ist 3,6°/oig. Zu ihrer Bereitung füllt man 10 ccm einer Salzsäure vom spez. Gew. 1,19 mit dest. Wasser auf 100 ccm auf.

681. Eisenfrioxyhämafein nach H a n s e n liefert eine gute haltbare Kernfärbung unter mäßiger Anfärbung plasmatischer Strukturen. Dadurch ist die Lösung der einfachen E. H.-F. in gewissen Fällen überlegen; so bleiben z. B. Muskel- und Bindegewebe bei Färbung nach § 672 nach Fixierung in Formol oft fleckig gefärbt, während sie sich nach Färbung mit Eisentrioxyhämatein unter Erhaltung der Kernfärbung völlig entfärben. — H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g : Lösung a: 10 g violette Eisenalaunkristalle und 1,40 g Ammoniumsulfat werden unter leichtem Erwärmen in 150 ccm dest. Wasser gelöst. — Lösung b: 1,6 g Hämatoxylin werden in 75 ccm dest. Wasser unter Erwärmung gelöst. — Nach vollständigem Erkalten der beiden Lösungen wird Lösung a unter stetem Umrühren in die in einer Porzellanschale befindliche Lösung b gegossen (nicht umgekehrt!), worauf die vereinigte Lösung erst braun, dann blau, dann dunkelviolett wird. Nun erhitzt man langsam zum Kochen, läßt 30—60 Sekunden (höchstens!) sieden, wobei man nur wenig umrührt, um die Luftoxydation nicht zu sehr zu steigernd Sodann wird rasch abgekühlt, indem man die Schale auf kaltem Wasser schwimmen läßt. — Die fertige Lösung soll eine dunkelbraune Farbe haben. Ein grünlicher Ton zeigt an, daß zu stark oxydiert wurde. Die Lösung färbt dann schlechter. Die Lösung kommt ohne Filtration in eine Flasche aus Jenaer Glas, die mit Gummistopfen gut verschlossèn wird. Die Größe der Flasche ist so zu wählen, daß über der Flüssigkeit nicht viel Luft steht. Nach der Färbung wird die Lösung immer wieder zurückgegossen.

Zur Färbung kommen Paraffin- oder Celloidinschni^te aus dest. Wasser für 1—2—5—10 Minuten in die filtrierte Farblösung, bis der gewünschte Grad der Färbung erreicht ist. Sodann wird mit dest. Wasser abgespült und mit Brunnenwasser 15—30 Minuten lang gewaschen. Dann abspülen in dest. Wasser, 11

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

162

Färbemethoden

§ 682—684.

Alkoholreihe, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Die P r ä p a r a t e zeigen eine b r a u n schwarze, scharfe K e r n f ä r b u n g . J e nach Färbedauer und Differenzierung (in 2—3%iger Schwefelsäure oder 0,5—l°/oiger Essigsäure) können aber auch die verschiedensten Zellstrukturen (Granulationen, Kittleisten, Zilien, F a s e r s t r u k t u r e n usw.) dargestellt werden. Wenn die Mitfärbung des Plasmas u n t e r d r ü c k t w e r d e n soll u n d reine K e r n f ä r b u n g gewünscht ist, so f ü g t man zu 8 ccm der Farblösung 2—4 ccm einer l°/oigen Schwefelsäure. Uber N a c h f ä r b u n g mit P i k r o f u c h s i n nach H a n s e n s . § 709. 682. E i s e n c h l o r i d h ä m a t o x y l i n nach H ä g g q u i s t . A. Progressive Methode. 1. Einstellen der Schnitte aus dest. Wasser in eine 3—5%>ige Eisenchloridlösung 5 Min. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. F ä r b e n in l°/oiger Hämatoxylinlösung bis die gewünschten S t r u k t u r e n gefärbt sind (meist schon nach 3—5 Min. der Fall). — 4. Gründliches Auswaschen in fließendem Wasser usw. — B. Regressive Methode: 1. Einstellen in 5°/oige Eisenchloridlösung 1 Stunde. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. F ä r b e n in l°/oiger Hämatoxylinlösung 1 Stunde. — 4. Abspülen in dest. Wasser. —• 5. Differenzierungen in l°/oiger Eisenchloridlösung. — 6. Auswaschen usw. Die Methode gibt keine vorwiegende Kernfärbung wie z. B. § 677, sondern färbt auch zahlreiche andere Strukturen mit. H ä g g q u i s t empfiehlt sie besonders nach Fixierung in Sublimat, Formol, Susa u. dgl., ferner nach Carnoy, Trichloressigsäure. Reine Formolfixierung ist weniger geeignet. Frisch bereitete Hämatoxylinlösung färbt in blauem, ältere in braunschwarzem Ton. c) H ä m a t o x y l i n m i t C h r o m v e r b i n d u n g e n mit Osmiumsäure

oder

683. Die R. H e i d e n h a i n s c h e H ä m a t o x y l i n f ä r b u n g ist eine S t ü c k f ä r b u n g . Man bereitet eine il3aloige wässerige Lösung von Hämatoxylin. Dieselbe kann frisch verwendet, im Lichte aber nicht lange aufbewahrt werden. Färbung: .Die in Alkohol oder gesättigter Pikrinsäurelösung fixierten Objekte kommen für 24 Stunden in die Farbe, dann ebensolange in eine 0,5°/oige wässerige Lösung von einfach chromsaurem Kalium (Kalium chromicum flavum). Dieses wird durch die auftretenden Farbwolken rasch gefärbt und muß daher mehrmals gewechselt werden. Dann Auswaschen in Wasser und Weiterbehandlung in steigendem Alkohol usw., Einbetten in Celloidin oder Paraffin. Die Schnitte dürfen höchstens 5 u dick sein. Neben der Kernfärbung erhält man ausgezeichnete Cytoplasmafärbung. 684. F ü r S t ü c k f ä r b u n g empfiehlt O. S c h u l t z e (10) eine OsmiumHämafoxylinmethode. Sehr kleine Organstückchen w e r d e n nach § 384 in 1 bis 2°/oiger Osmiumsäure fixiert; nach 24—48 Stunden wird die Osmiumsäure abgegossen und durch destilliertes Wasser ersetzt. Nach einigen Minuten (spätestens in 24 Stunden) k o m m e n die Objekte in eine 0,5°/oige Hämatoxylinlösung in 70°/oigem Alkohol, die m a n vorher zur Reifung 2—3 Tage lang in offener Flasche bei 35—40° C stehen läßt. Die Farblösung schwärzt sich zunächst und w i r d 1—2mal gewechselt, bis sie ihre b r a u n e F a r b e behält. Nach 2tätigem Stehen bei Z i m m e r t e m p e r a t u r wird in 70°/oigen Alkohol übertragen und dieser so oft erneuert, bis er sich n u r noch wenig b r ä u n t . Nach 24 Stunden Übertragen in 96°/oigen Alkohol, absoluten Alkohol, Zedernöl, P a r a f f i n (1 Stunde oder k ü r zer). Die Schnitte sollen nicht über 2/j, dick sein. R e s u l t a t : Darstellung der Zellgrenzen, der Interzellularsubstanzen und Kittleisten, Epithelfasern, Granula, Mitochondrien, S t r u k t u r der quergestreiften Muskulatur usw.

§ 685—688.

Wolfram- und Molybdänhämatoxyline

163

d) H ä m a t o x y l i n e m i t W o l f r a m - , M o l y b d ä n - o d e r Vanadiumverbindungen 685. Phosphorwolframhämatoxylin nach M a 11 o r y (0,1). 0,1 g Hämatoxylin wird in 80 ccm dest. Wassers unter Erwärmen gelöst; dazu kommen nach Abkühlen 20 ccm einer 10%igen Lösung von Phosphorwolframsäure ( M e r c k ) und nach Lösung 0,2 ccm Wasserstoffsuperoxyd zur Beschleunigung der Oxydation. Nach 12bis 24stünd. Färben rasch waschen in Wasser, dann 95°/o-Alkohol, Origanumöl, Xylol, Kanadabalsam. Resultat: Kerne, Neurogliafasern u. a. blau, Nervenfasern rosa, Bindegewebe tief rosa. Voraussetzung für dieses Färbeergebnis ist, daß die Präparate in der von Mallory angegebenen Weise fixiert und vorbehandelt werden (s. § 1874). Nach anderen Fixierungsmethoden färbt sich das Bindegewebe meist blau. U a s s o n fixiert nach Bouin oder Helly und beizt die Paraffinschnitte 3—24 Stunden lang in Lugolscher Lösung. Dann bleichen in 5°/oiger Natriumthiosulfatlösung, auswaschen in Wasser und färben wie oben. An Stelle von Kanadabalsam empfiehlt er eingedicktes Zedernöl. Ergebnis wie oben. Das ältere Mallorysche Hämatoxylin (91) verdankte seine Färbekraft einer unbekannten Verunreinigung der Phosphorwolframsäure. P h o s p h o r w o l f r a m h ä m a t o x y l i n nach S c h u e n i n o f f siehe § 1514. 686. M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n nach H e l d . H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g : Man löst 1 g Hämatoxylin in 100 ccm 70°/oigem Alkohol und gibt Acidum molybdänicum p u r u m im Überschuß zu (etwa 2,5 g). Dann läßt man die Lösung unter öfterem Umschütteln 4—5 Wochen reifen. Sie wird zuerst blau, später allmählich schwarz. Erst dann ist sie brauchbar. Am besten sind 1 bis 2 J a h r e alte Lösungen. F ä r b u n g : Man v e r d ü n n t 2—3 Tropfen der F a r b lösung' mit 50 ccm dest. Wasser und f ä r b t in der vorher filtrierten Lösung 24 Stunden bei Zimmertemperatur. Dann Abspülen in 2—3mal gewechseltem dest. Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Kerne, quergestreifte Muskelfasern, Knochengewebe in Abstufungen tiefblau, Erythrocyten schwarzblau. Hyaliner Knorpel n u r schwach gefärbt. Kollagenes Bindegewebe graublau, mitunter rotstichig; elastische Fasern rotviolett; muköser Schleim ungefärbt, mukoides Sekret rotviolett. Auch Epithelfasern, Balsamembranen, Flimmerhaare, oxyphile Sekretkörnchen, Gitterfasern w e r d e n scharf und deutlich gefärbt. — Die F ä r b u n g gelingt nach den meisten Fixierungen. Über die Anwendung zur Gliafärbung s. § 1875. Durch Nachbehandlung mit einer 3—5%igen wäßrigen Eisenalaunlösung läßt sich das Bindegewebe entfärben und dann mit Eosin oder dgl. nachfärben. Differenziert man die gefärbten Schnitte in einer 3—5%igen wäßrigen Lösung von Phosphorwolfram- oder Phosphormolybdänsäure, so nehmen Bindegewebe und Knochen einen weinroten Ton an. Dann Auswaschen in dest. Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. B a e c k e r (43). 687. Molybdathämafein nach H a n s e n . Man vereinigt 10 ccm einer l°/oigen Ammoniummolybdatlösung und 10 ccm einer 0,25°/oigen wässerigen Hämatoxylinlösung und setzt 3 ccm einer 2°/ooigen Kaliumpermangänatlösung zu. Nach kurzer Zeit ist die Lösung dunkel geworden u n d f ä r b t sehr kräftig. F ä r b e d a u e r 3—10 Minuten. Falls die F ä r b u n g zu intensiv ist, wird in Borax 0,5 g, F e r r i c y a n kalium 0,5 g, Wasser 100 ccm unter Kontrolle differenziert. Dann abspülen in dest. Wasser und gründlich auswaschen in Leitungswasser. E r g e b n i s : N e r venzellen, Nervenfasern, Gliafasern tiefblau. 688. M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n nach C l a r a (33). Eine l°/oige wässerige Lösung von Hämatoxylin wird mit der gleichen Menge einer 10°/oigen Ii*

164

Färbemethoden

§ 689—692.

wässerigen Lösung von molybdänsaurem Ammonium versetzt; zu diesem Gemisch gibt m a n Acid. molybdaenic. pur. im Uberschuß (es löst sich n u r wenig, das übrige bleibt als Bodensatz; öfters umschütteln). Die zuerst blauviolette Lösung w i r d nach einiger Zeit dunkelrot; erst jetzt gibt sie gute Färberesultate. — Zur F ä r b u n g w i r d die Stammlösung wie bei der Heldschen Methode (siehe § 1875) mit dest. Wasser stark verdünnt (etwa 0,1 ccm auf 100 ccm). Die Schnitte k o m m e n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r ohne vorherige B.eizung f ü r 10—24 Stunden oder länger in die v e r d ü n n t e Lösung und werden dann mit dest. Wasser ausgewaschen. — E r g e b n i s : Das Bindegewebe zeigt eine fast isolierte weinrote bis b r a u n r o t e Färbung, w ä h r e n d die übrigen Gewebsbestandteile nicht oder n u r blaß g e f ä r b t sind. Bei Uberfärbung kann man ohne Schädigung der Färbung des Bindegewebes mit Pikrinsäure differenzieren; dann sofort mit 80—90%igem Alkohol abspülen usw. Werden die Schnitte nicht mit dest. Wasser, sondern mit Brunnenwasser ausgewaschen, dem evtl. S p u r e n (!) von Lithiumcarbonat zugesetzt sind, so entfärbt sich das Bindegewebe, während die Kerne eine reine, blaue Farbe annehmen. Nachfärbung mit Eosin od. dgl. möglich. Weitere Molybdänhämatoxyline siehe § 1513 (nach M a 11 o r y), § 1514 (nach R i b b e r t). Uber ein V a n a d i u m - H ä m a t o x y l i n , das in Herstellung und Anwendung manche Schwierigkeiten bereitet, s. M. H e i d e n h a i n (03 u. 08b). 3. Kernfärbung mit basischen Teerfarfeen

689. Die nachfolgend angegebenen basischen Teerfarbstoffe dienen zur Erzielung guter, kontrastreicher Kernfärbungen. Der Färbeprozeß vollzieht sich dabei, je nach der Zusammensetzung der Farblösung, teils progressiv, teils regressiv. An Brillanz und Lebhaftigkeit der Farbtöne sind die T e e r f a r b e n den Hämatoxylin- und Carminfärbungen nicht selten überlegen, an Haltbarkeit stehen sie letzteren aber häufig beträchtlich nach (s. auch § 625 ff.). 690. An und für sich ist die Zahl der in der Mikrotechnik verwendbaren basischen Teerfarbstoffe sehr groß; man kommt jedoch mit einer verhältnismäßig geringen Zahl aus, da die Mehrzahl der Farbstoffe, abgesehen von geringen Unterschieden in den Farbnuancen, sich in ihren für mikrotechnische Zwecke ausnutzbaren Eigenschaften ziemlich ähnlich sind. Das gleiche gilt auch für die sauren Teerfarbstoffe, die meist zur Gegenfärbung (Plasmafärbung) in Anwendung kommen. (Siehe Mehrfachfärbung § 706 ff.) 691. Salranin ist ein wertvolles Kernfärbemittel, vor allem f ü r Präparate, die i n chrom- oder osmiumhaltigen Flüssigkeiten fixiert wurden. Ausschlaggebend f ü r das Gelingen der F ä r b u n g ist die Verwendung eines guten Safranins. Das alte von F l e m m i n g benutzte ist nicht mehr erhältlich, v. W i n i w a r t e r (23) empfiehlt das Safranin rein (von Grübler) und das S a f r a n i n G e x t r a (Ciba, Basel). Ich habe mit dem letztgenannten Farbstoff ebenfalls ausgezeichnete Resultate erhalten. 692. Man löst 10 g S a f r a n i n G extra (Ciba) in 155 ccm 95°/oigen Alkohols und 145 ccm dest. Wassers. Diese Stammlösung ist lange Zeit haltbar. Nach v. W i n i w a r t e r wird sie mit der Zeit durch Reifen sogar besser. Zur F ä r b u n g verd ü n n t man 20 ccm der Stammlösung mit 80 ccm 50°/oigen Alkohols. Die Schnitte werden hierin 24 Stunden gefärbt, mit dest. Wasser kurz abgewaschen und in abs. Alkohol differenziert. Hierauf Xylol und Balsam. Resultat: Chromatin intensiv rot, besonders bei Objekten, die mit osmiumsäurehaltigen Lösungen fixiert wurden (Basichromatin, H e i d e n h a i n).

§ 693—699.

K e r n f ä r b u n g mit basischen Teerfarben

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Mit schwach angesäuertem abs. Alkohol (l°/oo Salzsäure) geht die Differenzierung rascher vor sich. Die Säure m u ß durch reinen abs. Alkohol sorgfältig ausgewaschen werden. P o d w y s s o s z k i (87) nimmt statt Salzsäure pikrinsäurehaltigen absoluten Alkohol (s. auch § 952). Von zahlreichen anderen Safraninlösungen f ü h r e ich noch folgende an: 693. Alkoholische Lösung von F l e m m i n g : Man löst 1 g Safranin in 100 ccm abs. Alkohol und v e r d ü n n t nach Lösung mit 50 ccm dest. Wasser. 694. AnMinwassersafranin nach B a b e s. Man löst 2—3 g S a f r a n i n in 100 ccm Anilinwasser bei E r w ä r m u n g auf 60° C und filtriert heiß durch ein wasserbenetztes Filter (Lösung nur einige Monate haltbar). Die Lösung gibt auch nach SublimatEisessigfixierung noch a n n e h m b a r e Resultate. Herstellung von Anilinwasser siehe § 617. 695. S c h u b e r g empfiehlt eine Mischung der in § 693 und 694 angegebenen Safraninlösungen zu gleichen Teilen. 696. Liegt Osmium- oder Chrommaterial schon lange in Alkohol, so läßt sich seine F ä r b b a r k e i t f ü r S a f r a n i n dadurch wieder herstellen, daß man die Schnitte 5 bis 10 Min. mit v e r d ü n n t e r F l e m m i n g s c h e r Lösung beizt; 10—15 Tr. auf 5 ccm Wasser ( S s o b o l e w 99).

697. Thionin w i e Toluidinblau (P. M a y e r 98) geben vorzügliche Kernfärbun-

gen in prachtvoll blauem Farbton. Man (färbt 12—24 Stunden in einer l°/oigen wässerigen oder nach § 614 hergestellten Lösung und differenziert in 96°/oigem Alkohol. Vielfach genügt es auch schon, 10—20 Minuten zu färben. Fixierung in Sublimat, Sublimatgemischen, Bouinscher oder Flemmingscher Lösung, auch absolutem Alkohol ( A l t m a n n , M e t z n e r u. a.). Schleim, Knorpelgrundsubstanz und Maitzellengranula färben sich metachromatisch. Die Thioninfärbungen sind gegen Alkohol äußerst empfindlich. Auch im Kanadabalsam blassen sie leicht ab. Die Färbungen mit Toluidinblau sind haltbarer. 698. U m die F ä r b u n g beständiger zu machen, empfiehlt M e t z n e r (07 u. 15), die aufgeklebten u n d paraffinbefreiten Schnitte zunächst etwa 45 Min. in 3—5°/oiger wäßriger Eisenalaunlösung zu beizen. Nach Abspülen mit Wasser f ä r b t m a n 10 bis 20 Min. in einer d ü n n e n Lösung von Toluidinblau und differenziert in 50%igem Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen. Wenn sich die Schnitte ablösen sollten, so beizt m a n etwa 40 Stunden in einer alkoholischen Eisenalaunlösung und f ä r b t mit alkoholischer Farblösung. Die Färbungen können auch mit 5°/oigem molybdänsaurem Ammonium (5—10 Min.) fixiert werden (s. auch § 626).

699. Mefhylgrün färbt nach P a p p e n h e i m (08) von allen substantiv färbbaren oxyphilen und basophilen Substraten nichts als das Chromatin (Metazoen). Herstellung: 1 g Methylgrün wird in 100 ccm dest. Wassers gelöst und 25 ccm abs. Alkohol zugegeben. Färbung: 10 Minuten. Bei längerer Dauer wird mit 20%>igem Alkohol auf das Doppelte oder mehr verdünnt. Nach der Färbung abspülen in Wasser, differenzieren in 70°/oigem Alkohol (ca. 1—2 Min.), abs. Alkohol (1 Min.), Xylol, Kanadabalsam oder Zedernöl. Leider ist die Haltbarkeit der Färbung nur gering. Wichtige Farbgemische mit Methylgrün s. § 721 f. D a Methylgrün gegen Alkali äußerst empfindlich ist, muß die R e a k t i o n a l l e r mit dem g e f ä r b t e n P r ä p a r a t in B e r ü h r u n g k o m m e n d e n F l ü s s i g k e i t e n v ö l l i g n e u t r a l (oder s c h w a c h sauer) sein. Methylgrün ist oft mit Methylviolett verunreinigt. schüttelt m a n mit Chloroform aus.

Zur Entfernung

desselben

166

Färbemethoden

§ 700—707.

700. Bismarckbraun nach W e i g e r t (78). Kerne, Knorpel und Schleim werden intensiv gefärbt. Zur Herstellung der Farblösung löst man 0,5 g des Farbstoffes in 100 ccm 30%>igen Alkohols. Die Lösung bleibt jahrelang klar. Farbton unschön braun. 701. Fuchsin (Magenta, Rubin; basischer Farbstoff, nicht zu verwechseln mit S ä u r e fuchsin u n d Rubin S). A n w e n d u n g wie Safranin. Nach S e r e n i besitzt es metachromatische Eigenschaften ( S c h l e i m wird z. B. violett gefärbt). 702. Gentianavioleft dient zur K e r n f ä r b u n g z. B. in l°/oiger wässeriger Lösung. Differenziert wird in 96°/oigem Alkohol. Ebenso Methylenblau oder Kresylvioletf R exfra. Haltbarer sind konzentrierte wässerige Lösungen der betreffenden Farbstoffe, zu denen man nach 1—2 Tagen das gleiche Volumen 96°/o-Alkohols setzt. Zur F ä r b u n g gibt man 5—10 ccm auf 10 ccm destilliertes Wasser. Bei sehr s t a r k e r U b e r f ä r b u n g differenziert m a n in schwach essigsaurem Wasser. Dann absoluter Alkohol. 703. Zur Herstellung der Grantschen Gentianavioletflösung (etwa 10 Tage haltbar) setzt m a n zu 100 ccm Anilinwasser (s. § 617) 11 ccm einer gesättigten Lösung von Gentianaviolett in 96°/oigem Alkohol. F ä r b e d a u e r 3—5 Min., abspülen mit Wasser, abtrocknen mit Filtrierpapier, aufgießen von Lugolscher J o d j o d kaliumlösung 2—3 Min., abgießen der Jodlösung, abtrocknen, differenzieren in absolutem Alkohol oder Anilin; Xylol, Balsam. Die Methode dient auch zur Darstellung der gram-positiven Bakterien, die durch sie intensiv violettschwarz gefärbt werden. 704. Haltbarer als diese Lösung ist Carbolwasser-Gentianavioleft: Krist. Carbolsäure 2,5 g; dest. Wasser 100 ccm. Dazu 10 ccm einer gesättigten Lösung von Gentianaviolett in 96°/oigem Alkohol. 705. Herstellung der L u g o l s c h e n L ö s u n g : Man löst 2 g Jodkalium in e t w a 5 ccm dest. Wasser, gibt 1 g J o d zu, das sich auf diese Weise in wenigen Minuten löst, und füllt mit dest. Wasser auf 300 ccm auf. 4. Mehrfachfärbungen für Übersichtspräparate

706. Nachfolgend findet sich eine Zusammenstellung von Methoden, die neben speziellen Zwecken auch der F ä r b u n g von Übersichtspräparaten dienen. Über die M e h r f a c h f ä r b u n g mit Hämalaun-Eosin usw. ist § 659 ff. nachzusehen. 707. Sehr beliebt ist f ü r Übersichtspräparate neben der gewöhnlichen Hämalaun-Eosinfärbung die zuerst von v a n G i e s o n angegebene Dreifachfärbung m i t Hämafoxylin-Pikrinsäure-Säurefudisin, durch die die K e r n e schwarzbraun, das Bindegewebe leuchtend rot, Muskulatur intensiv gelb g e f ä r b t werden, während Amyloid, Kolloid, Hyalin, Mucin u. dgl. verschiedene Tonabstufungen annehmen. Nachteilig ist es, daß die Haltbarkeit der F ä r b u n g n u r beschränkt ist. Da die Mengenangaben in der Originalvorschrift von v a n Gieson ungenau sind, e r f u h r die Methode bald zahlreiche Modifikationen. Von diesen möchte ich besonders die Methode von H a n s e n empfehlen, die bei genauer Einhaltung der Vorschriften sehr sicher arbeitet und sehr klare, reine F ä r b u n g e n liefert. An und f ü r sich läßt sich dieselbe an jede Hämatoxylinf ä r b u n g anschließen; am besten wendet m a n sie aber in Verbindung mit der E i s e n t r i o x y h ä m a t e i n f ä r b u n g nach H a n s e n (s. § 681) oder der Eisenhämatoxylinfärbung nach W e i g e r t (s. § 677) an, da die damit erzielten K e r n f ä r b u n g e n widerstandsfähiger sind, als K e r n f ä r b u n g e n mit A l a u n h ä m a teingemischen. Bei Anwendung der letzteren ist in Anbetracht der ausziehen-

§ 708—709.

Mehrfachfärbung

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den Wirkung der Pikrinsäure eine starke Ü b e r f ä r b u n g zu empfehlen. F ü r Übersichtszwecke genügt auch die einfachere in § 708 angegebene Methode. Die P i k r o f u c h s i n f ä r b u n g nach H a n s e n läßt sich auch mit einer K e r n f ä r bung durch Chromalaun-Carmin nach F y g (s. § 637) oder durch NaphthazarinAluminumchlorid (s. § 738) verbinden, was den Vorteil hat, daß diese K e r n f ä r b u n g e n durch Pikrinsäure nicht angegriffen werden. Um die Haltbarkeit der F ä r b u n g e n zu steigern, w u r d e verschiedentlich v e r sucht, teils die Pikrinsäure, teils das Säurefuchsin durch andere beständigere Farbstoffe zu ersetzen. Unter diesen Abänderungen steht das von D o m a g k a n g e g e b e n e P i k r i n s ä u r e - T h i a z i n r o t - G e m i s c h (s. § 710) a n e r s t e r S t e l l e . . E s erreicht an L e u c h t k r a f t des Farbbildes die van GiesonMethode, ü b e r t r i f f t diese aber so sehr a n Beständigkeit, daß es im allgemeinen d e r Originalmethode vorzuziehen ist. 708. V a n G i e s o n - M e t h o d e . 1. K e r n f ä r b u n g mit Weigertschen Eisenhämatoxylin nach § 677 2 Minuten. 2. Gründlich auswaschen in fließendem Wasser 10 Minuten. 3. Abtrocknen mit glattem Filtrierpapier und a u f t r o p f e n von Pikrofuchsin (100 ccm gesätt. wäßr. Pikrinsäure + 5—10 ccm einer l°/oigen wäßr. Säurefuchsinlösung) eine Minute. 4. Abschleudern der Farblösung u n d abtrocknen mit glattem Filtrierpapier. 5. 96°/oiger Alkohol, absoluter Alkohol, Xylol, Balsam. 708a. C u r t i s ersetzt das Säurefuchsin durch P o n c e a u - S (Grübler), das im Gegensatz zu Säurefuchsin nicht ausbleichen soll. Von Nachteil ist, daß es das junge kollagene Bindegewebe nicht so spezifisch färbt ( C a r l e t o n 26).-Herstellung der Lösung: l°/oige wäßrige Lösung von Ponceau S 10 ccm, gesätt. wäßr. Pikrinsäure 90 ccm, 2°/oige Essigsäure 1—2 ccm. Färbedauer 3—5 Min. Sonst wie § 708. 709. Eisenhämafoxylin-Pikrofuchsinfärbung nach H a n s e n . Ausführung d e r F ä r b u n g : 1. K e r n f ä r b u n g in Eisentrioxyhämatein (s. § 681): 3 Minuten. — 2. Abspülen in dest. Wasser, auswaschen in Leitungswasser: 10 Minuten, dest. Wasser. — 3. Einstellen in angesäuertes Pikrofuchsin (auf 60 ccm der S t a m m lösung (s. u.) = Inhalt eines Färbeglases werden 7 Tropfen = 0,2—0,3 ccm einer 2°/oigen Essigsäure zugesetzt): 5 Minuten. — 4. Eintauchen (2—4 Sekunden, nicht länger!!) in 60 ccm dest. Wasser, dem vorher 2,5 ccm der angesäuerten Pikrofuchsinlösung zugesetzt wurden. (Cave! reines dest. Wasser!) — 5. Schnell abtrocknen mit einer Lage von 4—5 glatten Filtrierpapierstreifen und einstellen in 96°/oigen Alkohol, wobei der O b j e k t t r ä g e r einige Male hin- u n d h e r bewegt wird. Nach 1 Minute ü b e r t r a g e n in ein zweites Glas mit 96%igem Alkohol: 1—2 Minuten. — 6. Absoluter Alkohol (mindestens 2 Gläser): 3—5 Minuten, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Die K e r n e sind scharf schwarzbraun gefärbt, das kollagene Bindegewebe leuchtend rot, glatte und quergestreifte Musk u l a t u r intensiv gelb. —• Das Auswaschen der überschüssigen Pikrinsäure in 96%>igem und absolutem Alkohol muß sehr sorgfältig erfolgen, da sonst die F ä r b u n g schon nach sehr k u r z e r Zeit verblaßt. Sehr schädlich ist die E i n w i r k u n g von Alkalien, durch die Säurefuchsin rasch zerstört wird. Auch das Alkali von schlechtem Glas (Objektträger, Deckglas) k a n n schädlich sein. H e r s t e l l u n g d e r P i k r o f u c h s i n l ö s u n g . 1000 ccm kalt gesättigt e r wässeriger Pikrinsäurelösung w e r d e n mit 50 ccm einer 2%igen wässerigen Säurefuchsinlösung versetzt. Diese Stammlösung ist unbegrenzt haltbar. Soll der rote F a r b t o n besonders k r ä f t i g werden, d a n n erhöht m a n den Säurefuchsinzusatz von 50 auf 75 ccm.

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Färbemethoden

§ 710—713.

710. Pikrinsäure-Thiazinrot nach D o m a g k (s. auch § 707 und § 1509). Ausführung der Färbung: 1. Kernfärbung mit Weigertschem Eisenhämatoxylin 2 Min. — 2. Gründliches Auswaschen in fließendem Wasser 10 Min. — 3. Färbung in Pikrinsäure-Thiazinrot 3—5 Min. — 4. Abspülen in dest. Wasser. — 5. Zweimal 96°/oiger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Kerne dunkelbraun, Bindegewebe leuchtend rot, Muskelgewebe gelb. Herstellung der Farblösung: Man setzt zu 100 ccm gesätt. wäßr. Pikrinsäure 7,5 ccm einer l°/oigen wäßr. Lösung von Thiazinrot (stand. »Bayer-MeisterLucius«). Für die Haltbarkeit und Klarheit der Präparate ist es wichtig, daß der "Überschuß der Pikrinsäure im 96%igen Alkohol gut ausgewaschen wird. Die Methode kann auch mit einer Kernfärbung mit Chromalaun-Carmin (s. § 637) verbunden werden.

711. H ä m a l a u n - E r y t h r o s i n - S a f r a n f ä r b u n g nach P. M a s s o n. — 1. Kernfärbung mit Hämalaun. (Das kollagene Bindegewebe muß ungefärbt bleiben, ev. muß mit schwachem Salzsäurealkohol oder 0,5°/oiger Alaunlösung differenziert werden.) — 2. Auswaschen in Leitungswasser. — 3. Färbung in einer l°/oigen wässerigen Erythrosinlösung, der auf 100 ccm 2 Tropfen Formol zugesetzt sind: 5 Minuten. — 4. Abspülen mit Wasser. — 5. Differenzieren in 70°/oigem Alkohol: einige Sekunden. —• 6. Waschen in Wasser. — 7. Färben in der Safranlösung (s. u.): 5 Minuten. — 7. Rasch eintauchen in dest. Wasser, abtrocknen. — 8. Rasches Entwässern durch Auftropfen von absolutem Alkohol. (Safran ist in absolutem Alkohol fast unlöslich, in wasserhaltigem dagegen leicht löslich.) Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Kerne dunkelblau, Cytoplasma usw. rötlich, Muskel-, Nerven- und elastische Fasern lebhaft rot, kollagenes Bindegewebe, Knorpel, Knochen leuchtend goldgelb. H e r s t e l l u n g d e r S a f r a n l ö s u n g : Man kocht 2 g Safran 1 Stunde lang auf dem Wasserbad in 100 ccm Leitungswasser, filtriert nach Erkalten und setzt 1 ccm einer 5%igen wässerigen Tanninlösung und 1 ccm Formol zu.

712. H ä m a t o x y l i n - S ä u r e f u c h s i n - T u c h e c h t g e l b - M e t h o d e von W a 11 a r t und H o u e 11 e (37 und briefliche Mitteilung). Die Methode gibt schöne Übersichtspräparate, in denen sich das rot gefärbte Muskelgewebe gegen das leuchtend gelb gefärbte Bindegewebe abhebt. Ausführung: 1. Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin nach W e i g e r t (5 /¿-Schnitte 5 Min., 7 /i 3 Minuten). — 2. Kurz abspülen in Wasser und differenzieren in l°/oiger Essigsäure, bis das Bindegewebe völlig entfärbt ist. — 3. Gründlich auswaschen in fließendem Wasser 10 Minuten. — 4. Färben in Säurefuchsin-Tuchechtgelb (durch Einstellen in die Lösung oder durch Auf tropfen) 5 Min. —• 5. Kurz abspülen in dest. Wasser, dann einstellen in l°/'oige Essigsäure 5 Min. — 6. Abwischen von Unterfläche und freier Oberfläche des Objektträgers mit Filtrierpapier oder Tuch. — 7. Abs. Alkohol, Xylol, Balsam. H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g : 1. Säurefuchsin 1 g dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm. — 2. Tuchechtgelb G oder GG (Ciba) 3 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm. — 3. l°/oige Phosphormolybdänsäure. Von diesen Lösungen bereitet man ein Gemisch zu gleichen Teilen (lange haltbar). Die Fixierung spielt nach W. u. H. fast keine Rolle, die Färbung gelingt u. a. nach Formol, Orth, Zenker, Helly, Bouin, Susa.

713. Nach Kernfärbung mit Carmin wurde f r ü h e r häufig Pikrinsäure als Kontrastfarbe benutzt, meist als gesättigte wässerige Lösung (in manchen Fällen auch in alkoholischer Lösung), die f ü r die Färbung im Verhältnis 1 : 3 mit Wasser verdünnt wird. Bei Schnitten genügt eine Nachfärbung von 2—5 Minuten. Dann auswaschen mit Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. Zu beachten ist, daß

§ 714—722.

Mehrfachfärbung

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Pikrinsäure in fließendem Wasser sehr rasch ausgezogen wird. Auch durch Alkohol und Xylol wird sie noch extrahiert. Die N a c h f ä r b u n g m i t P i k r i n s ä u r e k a n n auch im S t ü c k geschehen; D a u e r je nach der Größe des O b j e k t e s 2—24 S t u n d e n . Dabei w i r k t die P i k r i n s ä u r e auf P r ä p a r a t e , w e l c h e mit B o r a x k a r m i n d u r c h g e f ä r b t sind, differenzierend, so d a ß also die S t ü c k e aus B o r a x k a r m i n s t a t t in s a l z s a u r e m Alkohol d i r e k t in P i k r i n s ä u r e ü b e r t r a g e n w e r d e n können. M a n n i m m t d a n n eine gesättigte Lösung in 70°/oigem Alkohol.

714. Indigocarmin, ein Teerfarbstoff, der mit Carmin nichts zu tun hat, kann

nach P. M a y e r (96) in einfacher Weise angewandt werden, indem man eine Lösung von 0,1 g Indigocarmin in 50 ccm Wasser (oder 5°/o-Alaunlösung) mit dem 4—20fachen Volumen von Carmalaun oder Hämalaun vermischt. 715. C a l l e j a (97) b r i n g t n a c h C a r m i n f ä r b u n g 5—10 M i n u t e n in eine Lösung von 0,25 g Indigocarmin in 100 ccm e i n e r gesättigten w ä s s e r i g e n P i k r i n s ä u r e , fixiert k u r z in l°/oiger Essigsäure u n d w ä s c h t d a n n in Wasser die Essigsäure, in abs. Alkohol die überschüssige P i k r i n s ä u r e aus. 716. R a m ó n y C a j a l (97) f ä r b t zuerst in gesättigter w ä s s e r i g e r Magentalösung, w ä s c h t in Wasser, bis die F a r b e nicht m e h r abgeht, u n d f ä r b t d a n n 5 Min. in gesättigter wässeriger Pikrinsäurelösung, in d e r auf 100 ccm 0,4 g Indigocarmin gelöst w u r d e . Waschen in Wasser, zu d e m eine S p u r Essigsäure zugesetzt w u r d e ; r a s c h e E n t w ä s s e r u n g m i t Alkohol; Xylol, K a n a d a b a l s a m . R e s u l t a t : Azidophile S u b s t a n z feuerrot, basophile g r a u bis h i m m e l b l a u . M a g e n t a oder M a g e n t a r o t sind s y n o n y m e Bezeichnungen f ü r Fuchsin. 717. P o l l (08) f ä r b t 5 Min. in einer Mischung von ges. wässeriger Pikrinsäure 100 ccm u n d Indigocarmin 0,4 g, d a n n o h n e oder n a c h k u r z e m A b s p ü l e n in Wasser in konz. wässer. Magentarot (5 Min.) u n d differenziert in abs. Alkohol.

718. Pikroindigocarmin. R. K r a u s e (11) färbt nach Carmalaun, Paracarmin oder Safranin 5—10 Min. mit 1 g Indigocarmin in 300 ccm konz. wässer. Pikrinsäure; auswaschen in 70°/oigem Alkohol usw. Kerne rot, Bindegewebe leuchtend blau, Cytoplasma und Muskelgewebe grasgrün. 719. Carmin — Bleu de Lyon ( B a u m g a r t e n ) .

B l e u d e L y o n ist l ö s l i c h in

in Alkohol, unlöslich in Wasser. R ö s e löst die Farbe in absolutem Alkohol und verdünnt dann einige Tropfen der Lösung so stark mit absolutem Alkohol, daß die Flüssigkeit kaum mehr blau erscheint. Darin werden die im Stück oder Schnitt mit Carmin vorgefärbten Präparate 24 Stunden nachgefärbt. 720. Bleu de Lyon f ä r b t n a c h T o n k o f f viel r a s c h e r u n d intensiver, w e n n m a n zur F a r b e J o d t i n k t u r zusetzt (1 Tr. auf 30 ccm Farblösung) oder die S c h n i t t e vor der F ä r b u n g mit s e h r v e r d ü n n t e r J o d t i n k t u r l ö s u n g b e h a n d e l t . Wie ich beobachten k o n n t e , bleichen die P r ä p a r a t e bei J o d z u s a t z s p ä t e r r a s c h e r aus.

721. Mßthylgrün-Säurefuchsin-Orange ist ein neutrales Gemisch, das gewöhn-

lich unter dem Namen Triazid bekannt ist. Die ursprüngliche E h r l i c h - B i o n d i s c h e Lösung ist: von den gesättigten wässerigen Lösungen werden gemischt 10 ccm Orange G, 1 ccm Säurefuchsin, 3 ccm Methylgrün. 722. Die b e s t e V o r s c h r i f t g i b t K r a u s e (11). Man verreibt 3,4 g Methylgrün, 4,2 g Säurefuchsin und 3,0 g Orange (standard. Farbstoffe, von Hollborn, Leipzig, zu beziehen) in einer Porzellanreibschale auf das sorgfältigste zu einem ganz gleichmäßigen Pulver, das in einem Erlenmeyerkölbchen aus bestem Jenenser Glas mit 100 ccm dest. Wassers Übergossen wird. Durch gewöhnliches Glas wird die Farbe rasch verdorben. (Alkali! evtl. Paraffinieren nach § 720.) Auch Objektträger und Deckglas müssen aus gutem Glas sein. M a n läßt die Lösung gut v e r k o r k t u n t e r ö f t e r e m U m s c h ü t t e l n 2—-3 T a g e bei ca. 35° C stehen. Nach völliger Lösung r e s u l t i e r t d a n n eine d u n k e l b r a u n e Flüssigkeit m i t einem Stich ins Rötliche. Diese l a n g h a l t b a r e S t ä m m l ö s u n g w i r d z u r F ä r b u n g in folgender Weise v e r d ü n n t u n d a n g e s ä u e r t : In eine S c h ü t t e l m e n s u r von 100 ccm

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Färbemethoden

§ 723—725.

Inhalt gibt man 1 ccm Essigsäure, füllt mit destilliertem Wasser auf 100 ccm auf, schüttelt gut durch und gießt den Inhalt aus. Die an der Wand haftenden Säurespuren genügen zur Ansäuerung. Dann mißt man in einem zweiten kleinen Meßzylinder 5 ccm der Stammlösung ab, spült sie mit destilliertem Wasser vollständig in den angesäuerten Zylinder und füllt auf 100 ccm auf. (Lösung einige Tage haltbar.) Die Färbedauer ist meist von geringem Einfluß, es genügen schon 10 Min., man kann aber auch 24 Stunden färben. Nach kurzem Abspülen in 0,5%iger Essigsäure überträgt man in 70°/oigen Alkohol, wo starke Farbwolken abgehen. Man soll den Aufenthalt in ihm nicht zu lange ausdehnen, sondern den Schnitt, sobald er rot geworden ist, durch absoluten Alkohol in Xylol übertragen. Was das zu verwendende Material anlangt, so muß man zwischen Gefrier- und Paraffinschnitten unterscheiden. Von ersteren geben beinahe alle Fixationen vorzügliche Resultate, von Paraffinschnitten nur in Sublimat, Sublimatgemischen oder nach Carnoy fixiertes Material. Paraffinschnitte von in Osmiumsäure, Chromsäure und Chromaten fixierten Objekten sind nicht brauchbar. Bei Celloidinmaterial ist vor der Färbung das Celloidin zu entfernen. Resultat: Chromatin blaugrün, ebenso Knorpel und Schleim; Mastzellengranula blauviolett; Nukleolen, Kernsaft, Zentriolen, Sphären, Spindeln, Cytoplasma, kollagenes und elastisches Gewebe, oxyphile Granulationen, Knochen, Zahnbein rot in verschiedenen Abstufungen. Rote Blutkörperchen orange. Leider blaßt die Färbung häufig bald ab. 723. Melhylgriin-Pyronin. Zusammensetzung nach U n n a 13 (die ursprüngliche Vorschrift von P a p p e n h e i m ist ungenau): Methylgrün 00 Cryst. gelblich 0,15 g; Pyronin 0,25 g; 96°/o-Alkohol 2,5 ccm; Glyzerin 20,0 ccm; 0,5°/oige wässerige Karbolsäure ad 100 ccm. Färbedauer 20 Minuten, dann schnell abspülen in Wasser, schnell differenzieren und entwässern in absol. Alkohol; Bergamottöl oder Xylol; Balsam. — Ergebnis: Chromatin (Nucleoproteide) grün, alles übrige in verschieden abgestuftem Rot. Voraussetzung für den typischen Färbeeffekt ist vorausgehende Fixierung in absolutem Alkohol oder Carnoy und baldige Einbettung in Paraffin oder Celloidin. Nach U n n a sind auch Gefrierschnitte von unfixiertem Material geeignet. Ferner sollen in den von S c h i l l e r angegebenen uranylsalzhaltigen Flüssigkeiten (s. § 348) die für den Färbeeffekt wichtigen sauren Eiweiße erhalten bleiben. Nach der Mehrzahl der üblichen Fixierungsflüssigkeiten kommt das Methylgrün dagegen nur schwach oder gar nicht zur Geltung, da durch sie die sauren Eiweiße zerstört werden. Nach den Flüssigkeiten von Helly, Orth oder Regaud kann die Färbung gelingen. 724. P a p p e n h e i m (08) unterscheidet mit Hilfe der Methylgrün-Pyroninfärbung zwischen Chromatin (grün) und Plastin der Zelle (rot, und zwar karyogenes wie plasmatisches Basi- und Oxyplastin). Mittels der Methylgrün-Pyronin-Orangefärbung (s. § 725) trennt er zwischen Chromatin (grün), Basiplastin (rot) und Oyxplastin (orange). Die Methylenblau-Eosinfärbung (s. § 1352) läßt dagegen nur ganz allgemein zwischen basophiler und oxyphiler Substanz trennen, unterscheidet aber innerhalb der basophilen nicht das Basiplastin vom Oxyplastin. Nach den Untersuchungen v. M ö l l e n d o r f f s (23), s. auch § 1264, ist diesen Unterscheidungen gegenüber eine gewisse Vorsicht am Platz. Denn wir sind »vorerst nur berechtigt, von einer Basophilie gewisser Gewebsorte zu sprechen, wobei wir dieselbe aber nicht den rein chemischen, sondern den kolloidchemischen Phänomenen zuzurechnen haben. Für eine Oxyphilie dagegen ergibt sich aus der Färbung keinerlei Anhaltspunkt.« 725. Methylgrün-Pyronin-Orange-Neutralgemisch nach G r o s s o (02). Man mischt von gesättigten wässerigen Farblösungen von Methylgrün 3,2 ccm, Pyronin 6,0 ccm, und Orange G 1 gern mit 75 ccm destillierten Wassers in der genannten Reihenfolge. Nach 24 Stunden wird die Lösung, die sehr haltbar ist, zum Gebrauch

§ 726—728.

Mehrfachfärbung

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filtriert. Die von alkohol- oder formolfixiertem Material stammenden Schnitte kommen auf 5—10 Min. in die Farbe, sodann abspülen in destilliertem Wasser, abtrocknen mit Filtrierpapier, differenzieren in absolutem Alkohol, bis fast keine Farbe mehr ausgezogen wird, Xylol, Kanadabalsam. 726. F ü r Übersichtsbilder wie f ü r spezielle Zwecke (vgl. § 1411) empfiehlt sich sehr die von D o m i n i c i angegebene Orange-Eosin-Toluidinblaufärbung. Leider ist die Haltbarkeit der F ä r b u n g beschränkt. Fixierung: Sublimat-, P i k r i n s ä u r e - oder Formolgemische (wie z. B. Bouin § 305, Orth § 247, Zenker § 336, Helly § 337, Maximow § 338, Heidenhain § 344, Romeis § 346) oder in abs. Alkohol (auch Carnoy). F ä r b u n g : Die Schnitte kommen zuerst f ü r 20—30 Min. in eine Orange-Eosinlösung (0,5 g Eosin w. g. + 0,6 g Orange G in 100 ccm dest. Wasser). Sodann werden sie in 60°/oigem Alkohol k u r z abgespült und auf V2 bis 2 Min. in Toluidinblau gebracht. (0,5 g Toluidinblau auf 100 ccm dest. Wasser.) Dann differenzieren in 96°/oigem Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen, abs. Alkohol, 2—3 Portionen reinstes Xylol, Balsam. Nach meiner Erfahrung wird der Kontrast der Färbung durch Ansäuern der Orange-Eosinlösung mit 1 Tropfen Eisessig (auf 100 ccm, nicht mehr!) noch gesteigert. 727. T i s c h u t k i n gebraucht u n t e r sonst gleichen Bedingungen statt obiger Orange-Eosinlösung eine Mischung von 10 ccm einer zur H ä l f t e mit Wasser verdünnten, filtrierten, konz. wässer. Lösung von O r a n g e G und 2 ccm einer konz. Lösung von E r y t h r o s i n in absolutem Alkohol. Die F ä r b u n g wird d a r i n noch kontrastreicher. 728. Die Mefhylblau-Eosinfärbung nach M a n n ist sowohl f ü r Übersichtspräp a r a t e wie auch f ü r die Darstellung feinerer Zellstrukturen (Chromatin, Nucleolus, Sekretkörnchen, Cytoplasma u. dgl.) sehr zu empfehlen. Zur H e r s t e l l u n g d,e r F a r b l ö s u n g vereinigt man 35 ccm einer l°/oigen wässerigen Lösung von Methylblau (nicht Methylenblau!), 45 ccm einer l°/oigen wässerigen Lösung von Eosin (w. g.) u n d 100 ccm dest. Wassers. Die fertige Farblösung, die eine grünlich fluorescierende rotviolette F ä r b u n g zeigt, ist längere Zeit haltbar. A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g : 1. Einstellen der aufgeklebten Schnitte aus dest. Wasser in die Farblösung: 24 Stunden. — 2. Abspülen in dest. Wasser (20 bis 30 Sekunden) und entwässern in absolutem Alkohol. Die Schnitte sehen jetzt blau aus. — 3. Differenzieren in alkalischem Alkohol (Herstellung s. u.), bis die Schnitte makroskopisch betrachtet rot geworden sind, w a s unter U m ständen 5—10 Minuten und länger dauern kann. — 4. Auswaschen in absolutem Alkohol, bis die Natronlauge völlig e n t f e r n t ist. — 5. Übertragen in gewöhnliches, schwach angesäuertes Wasser; (auf 60 ccm Wasser 4—5 Tropfen Eisessig): 2—3 Minuten. In den Schnitten kommt jetzt bei mikroskopischer Bet r a c h t u n g die blaue K e r n f ä r b u n g wieder z u m Vorschein. — 6. Entwässern in absolutem Alkohol, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Das Chromatin der K e r n e ist tiefblau gefärbt. Nucleolus rot, Cytoplasma violett, Sekretkörnchen in rotem und blauem Farbton. Acido- und basophile Granulationen treten sehr scharf hervor, ebenso Kolloid (meist violett). Erythrocyten l e b h a f t rot, Muskulatur u n d Bindegewebe zart rosa. Zur H e r s t e l l u n g d e s a l k a l i s c h e n a b s o l u t e n A l k o h o l s (unter Nr. 3) gibt man zu 10 ccm absoluten Alkohol 0,3 (genauer 0,33) ccm einer 30°/oigen wässerigen Natronlauge. Von dieser Stammlösung gibt man 10 Tropfen auf 60 ccm reinen absoluten Alkohol. Wenn es sehr lange dauert, bis die Präparate in dieser Lösung rot werden, dann erhöht man den NaOH-Gehalt auf das Doppelte oder Dreifache.

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Färbemethoden

§ 729—732.

Das zur Herstellung der Farblösung verwendete Methylblau muß in absolutem Alkohol völlig unlöslich sein. — Wird das Präparat i m essigsauren Wasser (Nr. 5) zu stark blau, so bringt man es nochmals in den alkalischen Alkohol (Nr. 3) zurück und differenziert weiter. Wenn der rote Farbton im fertigen Präparat nicht genügend zum Vorschein kommt, sondern vom Blau überdeckt ist, so wurde gewöhnlich nicht lange genug im alkalischen Alkohol (Nr. 3) differenziert. Eine genaue Zeitdauer hiefür kann jedoch nicht angegeben werden, da sie je nach Objekt und Fixierung verschieden ist. Auch ungeeignete Fixierung kann daran schuld sein. Am besten gelingt die Färbung nach Fixierung in Sublimat-, Pikrinsäure- oder Alkoholgemischen.

729. M o d i f i k a t i o n nach D o b e 11. 1. Färbung der Schnitte in der Mannschen Methylblau-Eosinlösung: 12—24 Stunden. — 2. Differenzieren in einer sehr verdünnten Lösung von Orange G in 70°/oigem Alkohol. — 3. Rasches E n t wässern in absolutem Alkohol; Xylol. Balsam. 730. Auch die Färbung mit A z u r - E o s i n nach N o c h t - M a x i m o w oder G i e m s a , die p a n o p t i s c h e Färbung und die P a n c h r o m f ä r b u n g nach P a p p e n h e i m geben bei Übersichtspräparaten gute Resultate, wenn sie auch in erster Linie hämatologischen Zwecken dienen. Näheres siehe § 1396 ff. Ausgezeichnetes leisten f ü r Übersichtspräparate auch verschiedene Bindegewebsfärbungen wie die Azan- (s. § 1489) und die Trichromfärbung (§ 1496) und ihre Modifikationen. 5. Färbung mit künstlichen Beizenfarbstoffen

731. In systematisch ausgebauten Versuchen gelang es S. B e c h e r , eine Reihe reduktionsechter Färbemethoden mit synthetischen Teerfarbstoffen zu finden, die an Schärfe und Haltbarkeit wie an Einfachheit der Anwendung den wegen ihrer Dauerhaftigkeit bekannten Carmin- und Hämatoxylinfärbungen gleichkommen. Eine besondere Bedeutung kommt Derivaten des Anthrachinons und Naphthochinons zu, die sowohl gegen Oxydation wie Reduktion sehr widerstandsfähig sind. Aus der Fülle der im ersten Teile des B e c h e r sehen Werkes niedergelegten Methoden, die aber, wie B e c h e r selbst betont, nicht alle von praktischer Bedeutung sind, möchte ich auf Grund ei'gener Nachprüfung einige der wichtigsten und praktisch wertvollsten wiedergeben und angelegentlich empfehlen. 732. Die in § 732—752 angeführten Methoden sind durchgehends f ü r P a r a f f i n s c h n i t t e geeignet. Zur Färbung von C e l l o i d i n s c h n i t t e n ist die Mehrzahl der Methoden dagegen weniger zu empfehlen, da sich das Celloidin in einer Reihe von Farblösungen, wie z. B. in Gallocyanin, Gallaminblau, Coelestinblau, Naphthazarin u. a. stark mitfärbt. Eine Ausnahme macht die A n t h r a c e n b l a u - A l u m i n u m s u l f a t l ö s u n g (s. § 741), in der das Celloidin so gut wie ungefärbt bleibt und die sich daher auch für Celloidinmaterial sehr gut eignet. Zur Färbung von G e f r i e r s c h n i t t e n ist nach K r a u s p e vor allem das G a l l o c y a n i n zu empfehlen (s. § 734). D o m a g k verwendet f ü r Gefrierschnitte N a p h t h a z a r i n (s. § 738) sowie N a p h t h a z a r i n - A z o p h l o x i n (s. § 740). Die übrigen Methoden mit künstlichen Beizenfarbstoffen können bei Gefrierschnitten mit den Hämatoxylinfärbungen an Schärfe, Klarheit und Tonreichtum bis jetzt leider nicht konkurrieren, was wegen der schlechten Haltbarkeit der Hämatoxylinfärbungen in Glyzerin, Laevulose usw. zu bedauern ist.

§ 733—736.

Künstliche Beizenfarbstoffe

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Für S t ü c k f ä r b u n g kommt in erster Linie eine Lösung von G a l l a m i n b l a u (s. § 736) in A l u m i n i u m c h l o r i d (0,1 g Farbstoff in 100 ccm einer 5%>igen Lösung) in Betracht, die man zu diesem Zwecke mit einer 5°/oigen wässerigen Alumiumchloridlösung aufs Doppelte verdünnt. Färbedauer 1—2 Tage. 733. Wie bei allen Färbemethoden ist natürlich auch bei diesen die Art der Fixierung f ü r die Güte, die Tönung und die Schnelligkeit der Färbung von Bedeutung. Nach den allgemein üblichen Fixierungsmethoden gelingen sie ohne Schwierigkeit, selbst nach der Fixierung in Flemmingscher Flüssigkeit, bei der Hämalaun u. dgl. häufig versagt. Die Färbedauer muß hierbei etwas verlängert werden. Die nachfolgend angegebenen Methoden gaben mir stets gute Resultate (vgl. E o m e i s , 23). Ich betone das deshalb, weil manche Autoren (z. B. P. M a y e r 22) auch über Mißerfolge berichteten. Dieselben erklären sich daraus, daß die im Handel befindlichen Farbstoffe trotz gleicher Bezeichnung verschiedener Herkunft sind und in ihren Eigenschaften differieren. Bei den nachfolgenden Methoden wurden Farbstoffe verwendet, die von der Firma Dr. K. H o l l b o r n u. S ö h n e , L e i p z i g , bezogen waren. 734. Eine ausgezeichnete Kernfärbung gibt der Chromlack des Gallocyanins. Bei richtiger Anwendung ist nur das Chromatin tiefblau bis schwarz gefärbt, während alles übrige ungefärbt bleibt. Bei überaus einfacher Anwendung gehört diese Färbung zu den schönsten, reinsten und haltbarsten Chromatinfärbungen, da die Farbe weder durch Wasser noch durch Alkohol ausgezogen wird und sehr reduktionsecht ist. Siehe auch § 1749! H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g : 0,15 g Gallocyanin wird in 100 ccm einer 5°/oigen Chromalaunlösung unter öfterem Umschütteln f ü r 3 Min. aufgekocht, wobei sich der in der Kälte schwer lösliche Farbstoff in tiefblauem Farbton löst. Nach Erkalten wird die Lösung filtriert und mit dest. Wasser auf 100 ccm aufgefüllt. F ä r b u n g : Die Schnitte kommen aus destilliertem Wasser füi» 24—48 Stunden in die Farblösung. Sodann auswaschen in Wasser zur Entfernung des Chromalauns. Alkoholreihe, Xylol, Balsam. Am besten färben frisch hergestellte Farblösungen, während Lösungen, die über einen Monat alt sind, nach meinen Erfahrungen schwächer und mehr graublau färben. 735. Gallocyanin eignet sich nach K r a u s p e auch sehr zur Kernfärbung von Gelatinegefrierschnitten, da es das Einbettungsmaterial nicht mitfärbt. Man färbt die mit Gelatine aufgeklebten Gefrierschnitte 12—24 Stunden bei 37° in der vorausgehend angegebenen Gallocyaninlösung.

736. Eine sehr reine, prächtig blaue Kernfärbung, die die Schönheit einer Toluidinblaufärbung erreicht, ist mit Gallaminblau zu erzielen. Man löst 0,1 g des Farbstoffes unter Kochen in 100 ccm einer 5°/oigen wässerigen Natriumoder Kaliumalaunlösung, läßt erkalten und filtriert die tiefblaue Farblösung Die Schnitte werden aus destilliertem Wasser f ü r 6—24 Stunden in die Farblösung gestellt. Dann auswaschen in Wasser, Alkohol usw. Außer den Kernen färbt sich noch die Knorpelgrundsubstanz, und zwar metachromatisch rötlich bis rötlich-violett. Bei längerer Einwirkung alter Lösungen nimmt auch das Cytoplasma und das übrige Gewebe einen schwach bläulichen Ton an. Im Gegensatz zum Gallocyaninchromlack bewahrt die Gallaminalaunlösung lange Zeit unvermindert ihre F ä r b e k r a f t (nach eigenen Beobachtungen 2 bis 3 J a h r e lang), doch wird der Farbton schließlich statt rein blau mehr graublau.

174

Färbemethoden

§ 737—740.

Wenn es darauf a n k o m m t , alles außer d e m C h r o m a t i n u n g e f ä r b t zu erhalten, d a n n steht der Gallocyanin-Chromlack a n erster Stelle; sonst ist aus den angef ü h r t e n G r ü n d e n die Gallaminblau-Alaunlösung vorzuziehen. 737. Die Lösung von Gallaminblau in Borax-Borsäure, die K i s s e r (23) für Färbung von Pflanzen-Zellkernen so sehr lobt, kann ich für tierische Objekte nicht empfehlen, da sie auf die Struktur des Präparates mazerierend wirkt, und zudem die Güte der Färbung von der Lösung in Natriumalaun übertroffen wird. 738. Sehr r e i n e u n d scharfe K e r n f ä r b u n g e n l i e f e r n die A l u m i n i u m l a c k e der Oxanthrachinone. Bei k u r z d a u e r n d e r F ä r b u n g ist n u r das C h r o m a t i n g e f ä r b t ; bei länger d a u e r n d e r f ä r b t sich auch das ü b r i g e Gewebe schwach an. Sehr e m p f e h l e n s w e r t ist das Alizarincyanin RR, Alizarincyanin G oder Naphthazarin f ü r b l a u e F a r b t ö n e , Rufigallol f ü r b r a u n e . H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g : 0,25 g des b e t r e f f e n d e n Farbstoffes u n d 5 g chemisch reines Aluminiumchlorid w e r d e n in 100 ccm dest. Wasser 5 bis 10 Minuten lang gekocht. Die abgekühlte Lösung w i r d nach einigen S t u n d e n filtriert. Sie k a n n d a n n gebraucht werden. Nach 8 Tagen m u ß sie nochmals filt r i e r t w e r d e n . U m ein Verpilzen der Lösung zu v e r h ü t e n , setzt m a n e t w a s T h y mol oder Formol zu. Die Lösung ist h a l t b a r , f ä r b t aber nach meinen E r f a h r u n gen nach einiger Zeit (V4—V2 Jahr) langsamer. Eine Uberoxydation wie bei Hämatoxylinlösungen t r i t t nicht ein. F ä r b u n g : Die Schnitte k o m m e n aus dest. Wasser in die filtrierte F a r b lösung. Die F ä r b e d a u e r schwankt j e nach Objekt, F i x i e r u n g u n d je nach d e m Alter der F a r b l ö s u n g zwischen 30 M i n u t e n u n d 24 Stunden. Man kontrolliert den Schnitt nach einigen Minuten und k a n n d a n n bei einiger Ü b u n g o h n e Schwierigkeit die u n g e f ä h r e F ä r b e d a u e r abschätzen. Da Ü b e r f ä r b u n g n u r bei sehr langer E i n w i r k u n g eintritt, schadet es auch nichts, w e n n das P r ä p a r a t einige S t u n d e n l ä n g e r in d e r Farblösung bleibt. Eine eigentliche Ü b e r f ä r b u n g t r i t t auch nach s t u n d e n l a n g e m Überschreiten d e r optimalen F ä r b e d a u e r nicht ein. Die F a r b s t o f f e gleichen in dieser Beziehung dem A l a u n k a r m i n . Die bei l a n g d a u e r n d e r F ä r b u n g eintretende T ö n u n g des Plasmas u n d der M u s k u l a t u r (der K n o r p e l bleibt meist u n g e f ä r b t ) k a n n insbesondere bei Metachromasie des K o n t r a s t e s h a l b e r sogar erwünscht sein. Nach der F ä r b u n g läßt m a n die P r ä p a r a t e zur E n t f e r n u n g des Aluminiumchlorids k u r z e Zeit in destilliertem Wasser stehen und b r i n g t sie d a n n durch die Alkoholreihe in Xylol u n d Balsam. Ein Ausziehen der F a r b e d u r c h Wasser oder Alkohol ist nicht zu b e f ü r c h t e n . Entkalktes Material wird durch Naphthazarin schlecht gefärbt. — Bei zu starker Plasma-Mitfärbung infolge zu langer Färbung läßt sich durch Einwirkung einer konzentrierten Lösung von Aluminiumchlorid in 95°/oigem Alkohol eine Abschwächung erzielen. 739. Mit anderen Metallsalzen der Anthrachinone (Chromlack, Eisenlack u. dgl.) ist die ausgezeichnete Wirkung des Alumiumlackes nicht in gleicher Güte zu erreichen. 740. Die N a p h t h a z a r i n f ä r b u n g k a n n auch mit einer N a c h f ä r b u n g mit E o s i n kombiniert w e r d e n . E m p f e h l e n s w e r t ist f e r n e r die sehr lichtechte, einfach auszuführende* D o p p e l f ä r b u n g mit N a p h t h a z a r i n - A z o p h l o x i n (Dorn a g k). Man h ä l t dazu außer der nach § 738 bereiteten Naphthazarinlösung (A) noch eine 0,l°/oige wi'ßrige Azophloxinlösung (B) vorrätig. Vor G e b r a u c h setzt m a n zu 3 Teilen der Lösung A 1 Teil der Lösung B u n d filtriert. Die Mischung w i r d am besten i m m e r k u r z vor der F ä r b u n g in der benötigten Menge b e r e i t e t G e f r i e r s c h n i t t e w e r d e n in ihr 10—15 Min., P a r a f f i n s c h n i t t e 20—30 Min. lan

§ 741—745.

Künstliche Beizenfarbstoffe

175

gefärbt, dann in dest. Wasser abgespült und über Alkohol und Xylol in Balsam gebracht. Das Ergebnis ähnelt dem einer Hämalaun-Eosinfärbung. Man kann die Färbedauer leicht so einstellen, daß eine Differenzierung unnötig ist. Dann lassen sich bei gleicher Fixierung, Schnittdicke und Färbedauer stets vergleichbare Resultate erhalten. 741. Sehr gute Resultate gibt das Anthracenblau bei Lösung in Aluminiumsulfat. Da sich die Kerne intensiv blauviolett, das umgebende Gewebe aber schwach rotviolett färbt, so ist die sehr einfach auszuführende Methode auch für den allgemeinen Gebrauch und für. Übersichtspräparate sehr zu empfehlen. Die Färbung erreicht häufig schon nach V2 bis 2 Stunden hinreichende Stärke; eine Überfärbung ist nicht zu befürchten; sie tritt nur sehr langsam ein. Die Farblösung besitzt selbst nach 2 Jahren noch gute Färbekraft. Nach dem Färben wird in dest. Wasser gewaschen und durch die Alkoholreihe in Xylol und Balsam gebracht. Ein Ausziehen der Farbe tritt nicht ein. Zur H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g verrührt man 0,5 g Anthrazenblau (in Teigform) mit 100 ccm einer 5%>igen wässerigen Aluminiumsulfatlösung, erhitzt zum Kochen, läßt erkalten und filtriert nach einigen Stunden. Bei Lösung in 5°/oiger wässeriger Chromalaunlösung tritt die Metachromasie nicht ein. 742. Der Chromlack des Coelestinblaus (0,1 g in 100 ccm 5°/oiger wässeriger Chromalaunlösung gekocht) gibt neben einer blauen K e r n f ä r b u n g eine schwach rotviolette F ä r b u n g des Bindegewebes, w ä h r e n d Knorpel u n d Schleimzellen stark rotviolett hervortreten. (Färbedauer 24 Stunden.) Die Muskulatur bleibt dagegen fast ungefärbt. Die Lösungen des Coelestinblaues haben aber die unangenehme Eigenschaft, nach einigen Tagen zu einer Gallerte zu erstarren. Auch mehrmaliges Verdünnen ändert daran nicht viel.

743. Für r o t e K e r n f ä r b u n g ist vor allem das Kernechtrot zu empfehlen, das ausgezeichnete, an Carminfärbungen erinnernde Resultate gibt, das Carmin aber in der Einfachheit und Sicherheit der Anwendungen übertrifft. Zur Herstellung der Farblösung wird 0,1 g Kernechtrot in 100 ccm 5°/oiger wäßriger Aluminiumsulfatlösung heiß gelöst. Nach dem Erkalten wird die Lösung filtriert. Zur Färbung kommen die Schnitte für 5—10 Min. oder länger in die Farblösung; dann Abspülen in dest. Wasser, Alkoholreihe, Xylol, Balsam. Nach der K e r n f ä r b u n g sind die verschiedensten Gegenfärbungen möglich, so mit Anilinblau, Anilinblau-Orange, Lichtgrün, Alizarinviridin u. dgl. Auch Resorcinfuchsin, Eisenreaktion und Silberimprägnationen lassen sich mit Kernechtrotfärb u n g gut kombinieren. B e c h e r hat f ü r rote Töne das P u r p u r i n und N a p h t h o p u r p u r i n sowie das A l i z a r i n b o r d e a u x empfohlen. Nach eingehender P r ü f u n g vermag ich mich dem lobenden Urteil Bechers nicht anzuschließen, da der Farbton bei diesen F a r b stoffen an Intensität und L e u c h t k r a f t doch erheblich hinter einer guten Carma l a u n f ä r b u n g zurückbleibt. Eine sehr kräftige rote K e r n f ä r b u n g gibt dagegen Säurealizarinblau bei Nachbehandlung mit Phosphorwolframsäure. Siehe § 748. 744. Die K e r n e c h t r o t f ä r b u n g läßt sich auch mit der G r a m f ä r b u n g kombinieren. Man f ä r b t in diesem Falle zuerst 5—10 Min. nach § 743, spült mit dest. Wasser ab u n d f ä r b t nach § 703. 745. I n r e i n w ä s s e r i g e r Lösung f ä r b t Kernechtrot das B i n d e g e w e b e in rotem Ton. D o m a g k f ä r b t zuerst 2—10 Min. mit Eisenhämatoxylin und a n schließend 5—10 Min. in gesätt. wässer. Pikrinsäure 100 ccm, heiß gesätt., wässer. Kernechtrotlösung 7,5 ccm. Abspülen in dest. Wasser, 2mal 96°/oiger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Balsam.

176

Färbemethoden

§ 746—748.

746. B e c h e r empfiehlt als Plasmagegenfärbung u. a. A l i z a r i n r o t S, das man nach blau färbenden Kernfarbstoffen, wie z.- B. nach Naphthazarin-Aluminiumchlorid an Stelle von Eosin benützt. Man verwendet dazu eine 0,05°/oige wässerige Lösung, die in wenigen Minuten in rötlichem Tone färbt. Nach Naphthopurpurin empfiehlt B e c h e r Gegenfärbung mit einer 0,06°'/oigen wässerigen Lösung von A l i z a r i n v i r i d i n oder von N a p h t h o l g r ü n B, das man in angesäuertem Wasser löst. Nach der Färbung werden die Präparate wie gewöhnlich in Wasser abgespült und durch steigenden Alkohol in Xylol gebracht. 747. Außerdem können Kernfärbungen mit künstlichen Beizenfarbstoffen auch mit einer Reihe anderer Färbemethoden kombiniert werden. So läßt sich z. B. die Kernfärbung mit A l i z a r i n c y a n i n R R sehr gut mit einer N a c h f ä r b u n g m i t S ä u r e f u c h s i n - P i k r i n s ä u r e vereinigen. Man verwendet dabei am besten die von H a n s e n angegebene Pikrofuchsinlösung (s. § 709). Die Färbung vollzieht sich dann folgendermaßen: 1. Kernfärbung mit Alizarincyanin RR durchschnittlich 2—3 Stunden oder länger. — 2. Auswaschen in dest. Wasser: 5 Minuten. — 3. Einstellen in angesäuertes Pikrofuchsin (siehe § 709): 5 Minuten. — 4. Eintauchen in die verdünnte Pikrofuchsinlösung: 2 bis 4 Sekunden. — 5. Schnell abtrocknen und einstellen in 96°/oigen Alkohol: 1 bis 2 Minuten. — 6. Absoluter Alkohol, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s (nach Zenkerfixierung): Kerne braunschwarz, Schleim und Knorpel blau, Bindegewebe leuchtend rot, Muskulatur gelb. Das Ergebnis der Färbemethode stimmt bei Vorfärbung mit Alizarincyanin nicht ganz mit dem überein, das man bei Vorfärbung mit Hämatoxylin erhält, da sich die Alizarinfärbung auf Chromatin, Knorpel und Schleim beschränkt, während sich bei Hämatoxylinfärbung auch eine Reihe anderer plasmatischer Substanzen schwach mitfärbt. Die letztere enthält daher mehr braune Halbtöne.

748. Eine sehr schöne und rasche Färbung der Kerne und Muskelfasern gelingt mit Säurealizarinblau bei nachfolgender Differenzierung mit Phosphorwolframsäure oder Phosphormölybdänsäure. Im ersteren Falle erhält man rote, im letzteren blaue Farbtöne ( P e t e r s e n 26). Die Haltbarkeit der Färbung ist nach meinen Erfahrungen sehr gut. Die Färbung ist auch f ü r Celloidinschnitte geeignet, da das Celloidin vollständig entfärbt wird." Zur H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g versetzt man 10 g ehem. reines Aluminiumsulfat und 0,5 g Säurealizarinblau mit 100 ccm dest. Wassers und bringt zum Kochen, wobei der Farbstoff leicht in Lösung geht. Nach 5—10 Minuten langem Kochen läßt man die dunkelblaue Farblösung erkalten, füllt mit dest. Wasser auf 100 ccm auf und filtriert. Die erkaltete Lösung ist rotviolett gefärbt. Zur A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g bringt man die Schnitte 1. aus dest. Wasser f ü r 5 Minuten in die Farblösung, in der sich das Gewebe diffus violett färbt. — 2. Abspülen in dest. Wasser und einstellen in eine 5°/oige Phosphorwolframsäure: 30 Minuten. Der Farbton schlägt hier rasch nach Rot um. Im Laufe der Differenzierung gibt das kollagene Bindegewebe den Farbstoff völlig ab, während die Kerne ihn festhalten. Auch glattes und quergestreiftes Muskelgewebe bleibt ziemlich stark gefärbt. — 3. Auswaschen in mehrfach gewechseltem dest. Wasser, in welchem die Färbung, wenn die Einwirkung nicht allzulange dauert, nicht angegriffen wird. — 4. Übertragen in 96%>igen Alkohol: 1 Minute, absoluter Alkohol 3—5 Minuten; Xylol; Balsam. E r g e b n i s : Kerne leuchtend rot, Cytoplasma blaßrot, Muskelgewebe rot, Bindegewebe ungefärbt, aber ganz gut sichtbar.

§ 749—754.

Vitale Färbung

177

Die Färbedauer und das Färberesultat werden nach meinen Erfahrungen durch die Fixierung ziemlich stark beeinflußt. So ist nach Zenker- und Formolfixierung ein Uberschreiten der angegebenen Färbedauer zu vermeiden, da sonst die Färbung der Kerne und des Muskelgewebes so dicht wird, daß stundenlanges Differenzieren nötig ist. Nach Fixierung in Sublimat-Trichloressigsäuregemischen hält das Bindegewebe den Farbton auch bei sehr langem Differenzieren in Phosphorwolframsäure fest, weshalb die Färbung nach dieser Fixierung weniger zu empfehlen ist. Nach Fixierung in Bouinscher Flüssigkeit treten die Erythrocyten nach der Differenzierung in leuchtendem Rotorange hervor, während das Muskelgewebe den Farbstoff leicht abgibt. Bei der Nachbehandlung der gefärbten Präparate ist die Einwirkung von schwachprozentigem Alkohol als schädlich zu vermeiden; durch hochprozentigen wird die Farbe dagegen nicht angegriffen. 749. Die Färbung entspricht (nach Formol- und Zenkerfixierung) in ihrem Effekt einer Azocarminfärbung. P e t e r s e n kombiniert sie daher auch mit einer Nachfärbung mit Anilinblau-Orange (s. § 1491). 750. Wünscht man eine Gegenfärbung in grünen Farbtönen, so empfiehlt sich eine Nachfärbung in einer 0,05°/oigen wässerigen Lösung von Alizarinviridin, durch die das Bindegewebe g r ü n gefärbt wird (Färbedauer 2—5 Minuten, dann abspülen in dest. Wasser). 751. Differenziert man das in S ä u r e a l i z a r i n b l a u - A l u m i n i u m c h l o r i d gefärbte P r ä p a r a t in 2—5°/oiger P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e , so erhält m a n nach Formol- und Zenkerfixierung violette und dunkelblaue Farbtöne: Kerne blau, glattes und quergestreiftes Muskelgewebe scharf blau, Erythrocyten schwarzblau, Bindegewebe (durch Phosphormolybdänsäure) schwach gelblich. 752. Vorwiegend diffus, aber in verschiedenen A b s t u f u n g e n von tief violettrötlichviolett f ä r b t der Eisendiloridalizarinlack ( O m n i c h r o m ) nach O k a j i m a (35). Herstellung: 2°/oige wässerige Lösung von Eisenchlorid 10 ccm, gesätt. wässer. Lösung von alizarinsulfosaurem Natrium 60 ccm. Vor Gebrauch wird die Mischung mit der 2fachen Menge dest. Wasser v e r d ü n n t . Färbung: Paraffin-, Celloidin- und andere Schnitte kommen f ü r Vs—2 Minuten in die Farblösung. Dann auswaschen in Brunnenwasser. Alkoholreihe (70°/oiger Alkohol zieht bei längerer Einwirkung der F a r b e aus), Xylol, Balsam. Erythrocyten, Nucleoli, verhornte Substanz, Linsenfasern färben sich orangerot. 753. Uber die Anwendbarkeit der künstlichen Beizenfarbstoffe in der Histopathologie des Nervensystems vgl. K i h n und vor allem E i n a r s o n (s. § 1749 ff.).

11. KAPITEL

Die vitale Färbung A. Allgemeines 754. Als V i t a l f ä r b u n g im allgemeinen bezeichnet m a n Färbungsmethoden, welche am lebenden Tier (oder an lebenden Zellen) mit Erfolg vorgenommen und von diesen ohne sichtlichen Schaden längere Zeit ertragen werden ( F i s c h e l 10). Im übrigen stößt eine einwandfreie Definition des Begriffes auch heute noch auf größte Schwierigkeiten (s. B e c k e r 36, Z e i g e r 38). Von e l e k t i v e r V i t a l f ä r b u n g spricht man, w e n n es gelingt, bei einem lebenden beliebig weit differenzierten Organismus mit gelösten F a r b 12

B o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

178

Vitale Färbung

§ 755—757.

Stoffen von bestimmten chemischen und physikalischen Eigenschaften oder u n t e r bestimmten Bedingungen der F ä r b u n g fallweise n u r ein einziges Organ oder eines der verschiedenen Gewebe inmitten der ü b r i g e n u n g e f ä r b t bleibenden Teile auffallend sichtbar zu machen. ( G i c k l h o r n 31b). Bei der elektiven Vitalfärbung, die bisher vor allem bei Wirbellosen'zur Anwendung gelangte (s. auch § 785 ff.), ist das Hauptgewicht der Auswertung weniger auf das Endstadium, das Bild der maximalen Färbung, zu legen, als auf die Beobachtung des Verlaufes der Färbung, wobei man zwischen Farbstoffaufnahme, -Verteilung und -speicherung zu unterscheiden hat. Die Betonung des Dynamischen gegenüber dem Statischen hat sich aber auch bei der gewöhnlichen Vitalfärbung schon als sehr fruchtbar erwiesen (vgl. H i r s c h 31, 32). Über e l e k t r o h i s t o l o g i s c h e F ä r b u n g s r e a k t i o n e n siehe K e l l e r (30) und K e l l e r und G i c k l h o r n (28). Eine grundlegende Darstellung der Vitalfärbung geben K i y o n o , S u g i y a m a und A m a n o (37 und 38). Zur Theorie der Vitalfärbung vgl. Z e i g e r (38) und R i e s (38). 755. Die f ü r morphologische Untersuchungen wichtige Frage, ob die durch V i t a l f ä r b u n g dargestellten S t r u k t u r e n p r ä f o r m i e r t sind, m u ß von Fall zu Fall entschieden werden. Im allgemeinen läßt sich annehmen, daß sich die b a s i s c h e n Farbstoffe häufig an schon vorher in den Zellen sichtbare, meist g r a n u l ä r e Bildungen anlagern. Bei der F ä r b u n g mit s a u e r e n Farbstoffen treten dagegen im Cytoplasma bestimmter Zellen g e f ä r b t e Körnchen' auf, die meist erst u n t e r dem Einfluß der Farbstoffe entstehen, und zwar im allgemeinen an Stellen, die vorher von sichtb a r e n S t r u k t u r e l e m e n t e n nicht eingenommen w u r d e n , (v. M ö l l e n d o r f f (15 u. 18), S c h ü l e r n a n n (17) u. a.). Doch k a n n es auch bei sauren Farbstoffen in gewissen Fällen (z. B. in Darmepithelien) zu einer A n f ä r b u n g p r ä f o r m i e r t e r S t r u k t u r e n kommen. 756. Eine allgemein gültige Theorie der V i t a l f ä r b u n g läßt sich zur Zeit ebensowenig aufstellen wie f ü r die histologische F ä r b u n g . J e d e Vitalfärbung stellt das Resultat des Zusammenwirkens zahlreicher F a k t o r e n dar, deren Analyse bis jetzt vielfach erst angebahnt ist. Als Faktoren, die bei der Charakterisierung der Farbstofflösungen zu berücksichtigen sind, kommen u. a. in Betracht: konstitutionschemische Merkmale des Moleküls, Löslichkeit, Ladungssinn, Ladungsgröße, Dispersitätsgrad bzw. Teilchengröße, Oberflächenspannung, Viskosität, Dielektrizitätskonstante, Konzentration, Temperatur, osmotische Zustandsgrößen, Dichte, Oxydations- und Reduktionsfähigkeit, Elektrolytempfindlichkeit, Verhalten gegen S ä u r e und Alkali, aktuelle Reaktion usw. Die überwiegende Bedeutung physikalisch-chemischer Faktoren bei der Vitalfärbung gegenüber rein chemischen Vorgängen wurde schon von S c h u l e m a n n (16) nachgewiesen. So sind von den sauren Farbstoffen die halbkolloiden Farbstoffe für Vitalfärbung am geeignetsten, da sie einerseits noch gut diffundieren, andererseits nur langsam ausgeschieden werden, während die hochdispersen Farbstoffe zwar rasch in die Gewebe eindringen, aber auch ebenso schnell wieder ausgeschieden werden. Bei schlecht diffundierenden Farbstoffen hinwiederum' beschränkt sich die Färbung auf die nächste Umgebung der Injektionsstelle. Auch die Beobachtung, daß alte kolloide Farbstofflösungen schlechter färben als frische, erklärt sich physiko-chemisch aus einer Verminderung ihrer Dispersität. 757. Nicht minder wichtig als die in der Farblösung u n d in äußeren Bedingungen gelegenen F a k t o r e n sind die physikalischen u n d chemischen Eigenschaften des zu f ä r b e n d e n Organismus, deren Erfassung zudem durch dessen Lebenstätigkeit erschwert wird. Als Beispiele seien die reduzierende Wirkung

§ 758—760.

Allgemeines

179

des Cytoplasmas auf den Farbstoff (v. M ö l l e n d o r f f , W a n k e i l ) , sowie die je nach Funktion wechselnde Permeabilität der Zelle ( H i r s c h 31c) genannt. Gerade in dieser vielseitigen Verknüpfung liegt aber auch die Bedeutung der Vitalfärbung als Methode für die Bearbeitung zahlreicher histophysiologischer Fragestellungen. Von besonderem Interesse ist die Übereinstimmung, die sich zwischen der Verteilung von Farbstoffen und jener von Arzneimitteln feststellen läßt (z. B. die Ablagerung eines dem Gichtmittel Atophan nahestehenden Farbstoffes, der Thienyl-Chinolin-Carbonsäure, in Knorpel, Sehnen und elastischem Gewebe ( R o m a n ) oder die Ablagerung des Kollargols im reticuloendothelialen Apparat). Der Kreis der Anwendungsmöglichkeit wird sich noch wesentlich erweitern lassen, wenn man die Untersuchung nicht, wie es meist der Fall ist, auf die Beobachtung im Hellfeldmikroskop beschränkt, sondern auch auf eine Untersuchung (bzw. Photographie) im polarisierten, ultravioletten und infraroten Licht (P 1 o t n i k o w) ausdehnt. Eine ausgezeichnete Darstellung der Möglichkeiten und Ziele der Vitalfärbung findet man bei G i c k l h o r n 30b und c. 758. Schädigung und Absterben der Zellen hat eine Veränderung der Färbung zur Folge. Der Farbstoff wird nicht mehr vakuolär gespeichert, sondern geht auch auf andere, während des Lebens für gewöhnlich ungefärbte Bestandteile, wie z. B. den Kern, über (s. aber auch § 920). Auch färben sich bei Schädigung oft Zellen, die normalerweise ungefärbt bleiben. Dieser Wechsel ist u. a. für die Beurteilung der Färbung ( i n t r a - , s u p r a - und p o s t v i t a l ) von Wichtigkeit. In neuerer Zeit hat man erkannt, daß nicht nur den G r a n u l a f ä r b u n g e n , sondern auch den D i f f u s f ä r b u n g e n , die früher meist als Fehlresultat betrachtet wurden, Bedeutung zukommt. Die vitale Diffusfärbung, die nicht mit der starken diffusen Farbstoffdurchtränkung toter Zellen verwechselt werden darf, ist besonders durch ihren hellen Farbton charakterisiert. 759. Die E i n v e r l e i b u n g d e s F a r b s t o f f e s erfolgt in den meisten Fällen durch Einspritzung (intravenös, subkutan, pleuroperitoneal, intradural), seltener durch Verfütterung (oral oder enteral) oder Einreibung in die Haut (gewisse Arzneistoffe, Tätowierung). Wassertiere werden zur Färbung meist längere Zeit lebend in der Farblösung gehalten. Die Anwendung der Vitalfarbstoffe beschränkt sich aber nicht auf den lebenden Gesamtorganismus, auch Organe und Organfragmente können, wenn sie durch entsprechende Maßnahmen lebend erhalten werden, mit ihnen vital gefärbt werden. Einlegen in Farblösungen, Einspritzung derselben durch die Blutgefäße, Durchrieselung unter Sauerstoffzufuhr usw.). Um einzelne Zellen unter dem Mikroskop zu färben, kann man auch etwas Farblösung auf dem Deckglas antrocknen lassen und dieses dann auf das flüssigkeitsbedeckte Präparat legen. (Letztere Methode bei C e s a r i s D e m e l 09.) 760. Die U n t e r s u c h u n g d e s v i t a l g e f ä r b t e n O b j e k t e s soll, wenn möglich, in lebendem Zustand, zumindest aber im frischen, unfixierten Zupfpräparat erfolgen. Im letzteren Falle breitet man das entnommene Gewebsstückchen mit einem Paar Zupfnadeln auf dem Objektträger rasch aus, bedeckt mit dem Deckglas, umrandet und untersucht, evtl. auf einem heizbaren Objekttisch. Am besten ist die Untersuchung in Körperflüssigkeit; reicht diese nicht aus, dann gibt man Serum oder eine der in § 117 ff. genannten indifferenten Beobachtungsflüssigkeiten zu. F ü r die Lebendbeobachtung bei erhaltenem Kreislauf wurden Methoden u. a. von K l e m e n s i e w i c z , W e n t z l a f f (Froschlunge), G a r m u s (Nickhaut des F r o -

12»

180

Vitale Färbung

§ 761—761.

sches), C h i r o n (Mäuseniere), V o n w i l l e r (Cornea), H i r s c h (Pankreas) angegeben.

Erst in zweiter Linie kommt die Untersuchung des fixierten Präparates. 761. E i n t e i l u n g d e r V i t a l f a r b s t o f f e . Als s a u r e V i t a l f a r b s t o f f e • sind besonders Trypanblau, Pyrrolblau und Lithiumcarmin in Gebrauch. Ihre Anwendung ist vor allem bei Untersuchungen über Aufnahme, Verteilung, Speicherung und Ausscheidung von Stoffen im Organismus zu empfehlen. Als b a s i s c h e V i t a l f a r b s t o f f e finden hauptsächlich Neutralrot, Nilblausulfat, Bismarkbraun, Naphtholblau und Methylenblau Verwendung. Die Vitalfärbung mit diesen Farbstoffen dient vor allem der Anfärbung primär vorhandener granulärer Zelleinschlüsse, die durch die Reizwirkung des Farbstoffes unter Umständen noch vermehrt werden können. Janusgrün wird speziell zur Anfärbung von Mitochondrien gebraucht. Einen Sonderfall bildet die Verwendung von Krapp oder Alizarin zur F ä r bung von wachsendem Knochengewebe und die Verwendung von fettlöslichen indifferenten Farbstoffen wie Sudan III oder Scharlach zur Färbung von Fettsubstanzen. B. Vitalfärbung mit sauren Farbstoffen

762. Trypanblau (eingeführt von E. G o 1 d m a n n 09, 12). Zur Herstellung der Farblösung löst man 0,5 g des Farbstoffes in 100 ccm dest. Wassers. Vor Gebrauch wird filtriert und (zur Sterilisierung) aufgekocht. Die Lösung soll nicht älter als 4 Wochen sein, da ältere Lösungen des öfteren giftig wirken (v. M ö l lendorff). Die Verabreichung erfolgt gewöhnlich durch Injektion; ob subkutan, intraperitoneal oder intravenös ist f ü r das Endergebnis gleichgültig. Bei intravenöser Einspritzung ist die Dosierung zur Vermeidung einer Giftwirkung erheblich niedriger zu halten als bei subkutaner Verabreichung. Bei Mäusen rechnet man auf 20 g Körpergewicht subkutan 0,5—1 ccm der obigen Lösung, bei Kaninchen auf 1000 g subkutan 10—15 ccm, intravenös 3—4 ccm, bei Fröschen auf 20 g subkutan 1 ccm. Nach subkutaner Injektion muß der Farbstoff zur Beschleunigung der Resorption durch leichtes Massieren verteilt werden. Ist eine allgemeine Vitalfärbung des Tieres beabsichtigt, so muß die Farbstoffinjektion in 4—5tägigen Zwischenräumen so lange wiederholt werden, bis die Haut des Tieres stark blau gefärbt ist. (Bei erwachsenen Mäusen z. B. 7—lOmal 0,5 ccm.) Bei Untersuchungen über die Tätigkeit der Excretionsorgane ist dagegen nach v. M ö l l e n d o r f f die einmalige Injektion die einzige Methode, die ein klares Bild gibt. 763. Nach P f u h l (40) unterscheiden sich die Trypanblaumarken des Handels in ihrer Wirkung auf den lebenden Organismus ganz wesentlich; P f u h l selbst empfiehlt das Trypanblau pro injektione der Firma M e r c k (Darmstadt). Er verabreicht beim Meerschweinchen von 300—400 g Gewicht 3 ccm einer l°/oigen Lösung subkutan. 764. Die rascheste Verteilung des Farbstoffes wird natürlich durch die intravenöse Injektion erreicht, bei der der Farbstoff zuerst vom Reticuloendothel aufgenommen wird. Bei subkutaner Injektion kommt es zuerst zu einer Lokalfärbung des die Injektionsstelle umgebenden Bindegewebes; bei intraperitonealer tritt der Farbstoff zuerst in den Endothelzellen und in den Milchflecken des Netzes auf, ehe es zu einer Algemeinfärbung kommt.

§ 765—772.

Saure Vitalfarbstoffe

181

765. Zur Vitalfärbung von Kaulquappen wird das Trypanblau dem Wasser des Aquariums zugesetzt. Bei einer Konzentration von 1 :5000—1 :10 000 bleiben sie monatelang am Leben. Werden die Tiere dauernd im Dunkeln gehalten, so läßt sich die Konzentration der Farblösung noch erheblich steigern, ohne daß die Tiere eine Schädigung zeigen. Bei Säugetieren kommt es bei Verfütterung des Farbstoffes durch Zusatz desselben zu einem aus Milch, Zucker und Mehl bereiteten Breies selbst nach Wochen zu keiner granulösen Farbstoffablagerung im Körpergewebe (abgesehein vom Dünndarmepithel) v. M ö l l e n d o r f f (24, 25). 766. Die F i x i e r u n g der T r y p a n b l a u s p e i c h e r u n g erfolgt am besten i m Sublimat - F o r m o l - T r i c h l o r e s s i g s ä u r e - Gemisch nach Heidenhain (§ 344) oder Romeis (§ 346), nach Bouin (§ 305) oder Stieve (§ 333). Wie P f u h l (31) in eingehenden Untersuchungen feststellte, sind diese Gemische dem zumeist empfohlenen F o r m o l wesentlich überlegen; mit ihnen können auch die feinsten Trypanblaukörnchen zuverlässig fixiert werden. Nach P f u h l muß bei allen Arbeiten, bei welchem die Trypanblauspeicherung mit Formol fixiert wurde, damit gerechnet werden, »daß zarte Speichergranula entfärbt waren und daß andererseits der Farbstoff verlagert und in andere Strukturen eingedrungen war.« 767. Bei kalkhaltigem Gewebe dehnt m a n den Aufenthalt im Trichloressigsäuregemisch so lange aus, bis das kalkhaltige Gewebe schneidbar geworden ist. Zweckmäßig erhöht man den Trichloressigsäuregehalt der Flüssigkeit nach der F i x i e r u n g durch Zugabe von Kristallen auf 5 Prozent (ähnlich B 1 o t e v o g e 1 24). 768. Zur Nachfärbung der mit Trypanblau gefärbten Schnitte verwendet man Carmalaun od. dgl. Nach v. M ö l l e n d o r f f gibt eine Nachfärbung mit Bismarckblau oder nach P a p p e n h e i m - K a r d o s (s. § 1407) besonders scharfe Kontraste. P f u h l (40) färbt 6—12 Stunden lang mit Kernechtrot (s. § 743), wodurch außer den Kernen auch das übrige Gewebe etwas angefärbt wird. 769. Das von E. G o l d m a n n benutzte P y r r o l b l a u (Isaminblau) ist durch Trypanblau verdrängt. 770. Vitale Carminspeicherung (zuerst R i b b e r t). 2,5 g bester Carmin (Hollborn) werden in 100 ccm einer kaltgesättigten, wässerigen Lösung von Lithiumcarbonat gelöst und 10—15 Minuten auf dem Wasserbad gekocht. Unmittelbar vor Gebrauch wird filtriert. Man injiziert 5 — 8 Tage hindurch täglich einmal, und zwar bei Mäusen je 0,3 ccm, bei Ratten 2,5—3 c c m (subkutan), bei Kaninchen 10 c c m (intravenös). F i x i e r u n g in Alkohol, F o r m o l oder Sublimat. Paraffineinbettung. Kernfärbung mit Hämalaun. (Vgl. K i y o n o (14), B o r e 11 (19).) Zur Bereitung der Lithiumcarbonatlösung versetzt man 1 g Lithiumcarbonat mit 100 ccm dest. Wasser. 771. U n t e r s c h i e d z w i s c h e n T r y p a n b l a u u n d C a r m i n . F ü r intravenöse Verabreichung ist Carmin, für subkutane Trypanblau vorzuziehen; im übrigen sind die Resultate gleich. Carmin ist etwas giftiger, hat aber den Vorzug, daß die Farbstoffablagerungen bei Fixierung und Nachbehandlung widerstandsfähiger sind. C . Vitalfärbung mit basischen Farbstoffen 772. Neutralrot (von E h r l i c h in die Technik eingeführt) kann per os, subkutan oder intravenös verabreicht werden. W a s s e r t i e r e (z. B. Kaulquappen) bringt man zur F ä r b u n g auf einige Tage in eine wässerige Lösung von 1 : 200 000; in stärkeren Lösungen (1 : 1 0 000 bis 50 000) sind sie schon nach wenigen Stunden kräftig gefärbt, aber auch

182

Vitale Färbung

§ 773—780.

sehr matt. Nach Eintritt der Färbung untersucht man kleine Stücke der Epidermis, der Vorniere u. dgl. in physiologischer Kochsalzlösung oder Ringerlösung. Die gefärbten Tiere können für einige Zeit ohne Verlust der Färbung in reines Wasser übertragen werden. N i l b l a u s u l f a t ( 1 : 3 0 000 bis 300 000) färbt schon in einigen Stunden, ebenso B i s m a r c k b r a u n ( 1 : 1 0 000 bis 60 000). Bei M ä u s e n (Pankreas) spritzt H i r s c h (31c) 2X0,5 ccm einer 0,l°/oigen Neutralrotlösung in physiol. Kochsalzlösung im Abstand von 15 Minuten intraperitoneal ein. Nach 30 Min. Untersuchung des vorgelagerten Organes. 773. A r n o l d (11) verfüttert Neutralrot und fixiert Magen- und Darmstücke in Formoldämpfen nach der von G r o ß für Fixierung von Pyrrolblaufärbung angegebenen Methode. Weiteres darüber s. § 269. — In anderen Fällen bringt Arnold den Farbstoff in Substanz direkt auf das zu färbende Gewebe. Auch Injektion oder Benetzung mit l°/oiger Lösung führt zum Ziel. 774. Zur S u p r a v i t a l f ä r b u n g v o n Z u p f p r ä p a r a t e n wird Neutralrot in starker Verdünnung der indifferenten Beobachtungsflüssigkeit zugesetzt. (Verdünnung etwa 1 : 10 000—50 000, Färbedauer 5—10 Minuten.) Über den Farbstoff s. auch § 1006. 775. Da die rote Farbe des Neutralrotes bei alkalischer Reaktion bekanntlich in Gelb umschlägt, so wurde bei vitalgefärbten Objekten dieser Farbumschlag des öfteren zu Rückschlüssen auf die Reaktion eines gefärbten Bestandteiles verwendet. v. Möllendorff (26) ist dagegen der Ansicht, daß man nicht berechtigt ist, aus solchen Farbdifferenzen auf das Bestehen von Anoden und Kathoden (wie R. K e 1 1 e r 19—25), oder auf Unterschiede in der H-Konzentration zu schließen. Nach ihm ist Gelbrot die Farbe im geflockten, Blaurot in gelöstem Zustand. Die basische Granulafärbung fällt unter die Regeln der gegenseitigen Beeinflussung entgegengesetzt geladener Kolloide. Danach flocken sich geeignete Kombinationen am Neutralpunkt aus, während der Überschuß einer der Komponenten, im stärkeren Maße der höher Kolloidalen, das Flockungsprodukt löst. 776. Die Dotterplättchen von Hühnerkeimscheiben ( G r ä p e r 11) und Amphibien (v. M ö 11 e n d o r f f 18) färben sich mit Neutralrot und Nilblausulfat auf ganz jungen Stadien homogen; auf älteren lagert sich die färbbare Substanz den zerfallenen Dotterkörnchen oft kappenförmig auf. — Phagocytierte Zelleinschlüsse färben sich häufig intensiv rot. 777. Bei allen Neutralrotfärbungen ist zu beachten, daß der Farbstoff auch in sehr starker Verdünnung noch giftig wirken kann. So ruft Neutralrot nach P o l i t z e r bei Salamanderlarven schon nach 2stündigem Aufenthalt in einer Verdünnung von 1 :150 000 am Hornhautepithel eine Wachstumsschädigung, Hemmung des Zellteilungsrhythmus und der Zellteilung hervor. 778. Ähnlich wie Neutralrot lassen sich auch andere basische Farbstoffe zu Vitalfärbung verwenden. Häufig gebraucht sind insbesondere Nilblausulfat und Bismarckbraun. In Meerwasser lösen sich Neutralrot, Methylenblau med., Bismarckbraun, Janusgrün und Lithiumcarmin ( H o l l b o r n 37). 779. Chinin, Strychnin, Atropin, Novokain, Coffein und Pilocarpin verdrängen nach B o r n s t e i n und R ü t e r Neutralrot, Nilblausulfat u. dgl. aus den vitalgefärbten Geweben; sie benützen diese Entfärbung, um auf diese Weise das Eindringen der Alkaloide in die Zellen unter dem Mikroskop zu verfolgen. 780. Eine besondere Stellung unter den basischen Vitalfarbstoffen nimmt Janusgrün ( D i a z i n g r ü n ) ein, das hauptsächlich zur V i t a l f ä r b u n g d e r M i t o c h o n d r i e n verwendet wird. (Zuerst M i c h a e l i s 00.) Man verwen-

§ 781—785.

Basische Vitalfarbstoffe

183

det stark verdünnte Lösungen des Farbstoffes in physiol. Kochsalzlösung oder dgl. (10 000—50 OOOfach). Die Farblösung wird in dünner Schicht auf das Präparat gegeben, das dann u n b e d e c k t für 10—20 Minuten in eine feuchte Kammer gelegt und von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop kontrolliert wird. Erst wenn die Färbung genügend stark ist, darf ein Deckglas aufgelegt werden. H i r s c h träufelt am freigelegten lebenden Mäusepankreas eine 0,05°/oige Janusgrünlösung auf und saugt 2—3mal mit Filtrierpapier ab. 781. Ausschlaggebend für den Erfolg ist die Verwendung der richtigen Farbstoifmarke. M i c h a e l i s gebrauchte s. Z. Janusgrün B der Höchster Farbwerke. Am besten ist das D i a z i n e G r e e n der National Anilin and Chemical Co., New York, oder das J a n u s g r ü n B von Coleman and Bell Co., Norwood, USA. Nach C o w d r y (18) beruht das mitochondrienfärbende Vermögen auf dem Vorhandensein von 2 (C 2 H 5 )-Gruppen; die von C. gebrauchte Marke ist Diaethylsafranin. 782. Bei sofortigem Auflegen des Deckglases wird der Farbstoff von den Mitochondrien anscheinend zur Leukobase reduziert. Ähnlich wie bei Methylenblau ist auch bei Janusgrün zum Zustandekommen der Färbung der Zutritt von Luftsauerstoif notwendig. In diesem Sinne sprechen auch die Angaben von A. F is c h e r (27), daß sich die Mitochondrien in Deckglaskulturen in einem sauren, Janusgrün enthaltenden Medium (PH 4, 4) oder bei Zusatz von Pyrogallussäure (PH 6, 4) oder von Kaliumcyanid (P'H 8,6) nicht färben. Wird jedoch das Medium durch eine frische Locke-Lewis-Lösung, die keine Farbe enthält, ersetzt, so zeigen die Mitochondrien plötzlich Farbe. Nach W. H. and M. R. L e w i s (15) ist Janusgrün selbst in Verdünnung 1 :200 000 f ü r die Zellen noch giftig, so daß sie in wenigen Stunden absterben. 783. Zur gleichzeitigen Färbung von Mitochondrien und Sekretkörnchen in dünnen Gewebshäutchen, Kulturen usw. mit Neutralrot-Janusgrün wurden verschiedene Vorschriften angegeben. S e e m a n n (30) verwendet dazu eine l°/oige Neutralrotlösung (Stammlös. I) und eine l°/oige Janusgrünlösung (Stammlös. II), beide in Ringer-Lewislösung (NaCl. 9,0; CaCl2 0,25; KCl 0,42; dest. Wasser 1000,0). Unmittelbar vor Gebrauch setzt man zu 15—20 ccm Ringer-Lewis 10—15 Tropfen I und 1—2 Tropfen II. Färbedauer 5—10 Minuten bei Luftzutritt. Dann Abspülen in Ringer-Lewis, Aufziehen auf Objektträger, Umranden. 784. Methylenblau (zuerst E h r l i c h 85) findet hauptsächlich Verwendung zur vitalen bzw. supravitalen Nervenfärbung. Weiteres hierüber s. § 1928 ff. 785. V i t a l f ä r b u n g mit H y p o s u l f i t w e i ß nach R o s k i n und M a s i o w a (35). Herstellung: Zu 100 ccm einer 0,01°/oigen Lösung von Methylenblau (oder Azur I, Thionin, Toluidinblau oder Brillant-Kresylblau) werden 1 bis 2,5 ccm einer Vio-n-Natriumthiosulfatlösung und 1 bis 4 ccm einer Vio-n-Salzsäure zugesetzt. Das Gemisch wird mit einem Glasstab sorgfältig durchgerührt und bei Zimmertemperatur im Dunkeln stehen gelassen. Je nach Farbstoff und Konzentration der Reagenzien entsteht in 2—3 Stunden oder später die farblose Leukobase ( = Hyposulfitweiß = HW), die wegen ihrer starken Lichtempfindlichkeit im Dunkeln aufbewahrt werden muß. Anwendung: Zur Färbung fügt man dem frisch entnommenen Objekt, das auch in physiol. Kochsalzlösung liegen kann, 1—2 Tropfen HW zu. Nach 5—15 Minuten kommt es zu einer homogenen Färbung der Kerne, teilweise auch des Plasmas, die ein bis mehrere •Stunden bestehen bleiben kann. Die Färbung ist nach R. und M. an die Vitalität der Objekte gebunden, an toten Geweben gibt die Methode abweichende Resultate. Vio-n-Thiosulfatlösung: 24,82 g Natriumthiosulfat (krist.) aufgefüllt mit dest. Wasser auf 1000 ccm.

184

Vitale Färbung

§ 786—791.

786. Über Doppelfärbungen mit sauren und basischen Vitalfarbstoffen vgl. H e r z f e l d 17, S t e c k e l m a c h e r 18 und v. M ö l l e n d o r f f 20, S n o o k 39. 787. Die F i x i e r u n g b a s i s c h e r V i t a l f ä r b u n g e n ist bis jetzt n u r in sehr beschränktem Maße möglich. Die von P r z e s m i k y , Golowin, C o l o m b o , V o n w i l l e r (15, 18) und S k r a u p empfohlene F i x i e r u n g in Sublimat ist unzuverlässig. Auch die von M i t a m u r a (23) angegebenen Lösungen liefern keine einwandfreien Resultate und arbeiten bei basischen F a r b stoffen nicht sicher genug. A r n o l d empfiehlt zur Fixierung von Neutralrotf ä r b u n g e n F o r m o l d ä m p f e (s. § 773 u n d 269). 788. E l e k t i v e V i t a l f ä r b u n g b e i W i r b e l l o s e n . Als erster beobachtete A. F i s c h e l (08"a), daß sich bei Cladoceren durch Zusatz von Alizarin, sicc. zum Zuchtwasser eine vitale und gleichzeitig spezifische F ä r b u n g des Nervensystems erzielen läßt. Die F ä r b u n g t r i t t bei einigen Tieren schon nach S t u n d e n ein. 789. W e s t b l a d gibt auf ca. 20 ccm kochender physiol. Kochsalzlösung 1 Messerspitze Alizarin (Kahlbaum), kocht nochmals, filtriert nach Abkühlen und verdünnt mit 2- bis 4facher Menge physiologischer Kochsalzlösung. Man bringt die zu färbenden Tiere für 1 Stunde in die Farblösung (im Dunkeln), untersucht dann unter dem Deckglas in physiologischer NaCl, tötet durch Durchsaugen von neutralem Formol, ersetzt durch dest. Wasser und bringt für einige Stunden zur Fixierung der Färbung in Kalkwasser. Kurz abwaschen in dest. Wasser; rasch durchführen durch Alkohol. Aufheben in Zedernöl. Nach G i c k l h o r n (31a) läßt sich die Löslichkeit des Alizarins durch Zusatz von Urotropin steigern. Man erhält dadurch nach Lösen in der Hitze konzentrierte Lösungen, die lange Zeit beständig sind und auch leicht angesäuert und alkalisiert werden können. Einen sehr wichtigen Ausbau erfuhr die Methodik der elektiven Vitalfärbung von Wirbellosen durch die Arbeiten von K e l l e r , G i c k l h o r n und ihrer Schule (Excretionsorgane von Cyclops, Frontalorgane, Schalendrüse, Kiemensäckchen, Nervensystem von Daphnia usw.) siehe G i c k l h o r n 31b. 790. Ö r t l i c h e V i t a l f ä r b u n g m i t A g a r - F a r b m a r k e n nach V o g t (25). Man zerschneidet dünne Agar-Agarblätter in kleine Stückchen und läßt diese m e h r e r e Tage bis Wochen in einer l°/oigen Neutralrot-, Nilblausulfatoder Bismarckbraunlösung quellen. Das g e f ä r b t e Material nimmt m a n aus der Farblösung u n d zerkleinert die großen Stückchen in Wasser, bis eine A u f schwemmung kleinster Agarstückchen entsteht. Diese läßt man in einem P e t r i schälchen auftrocknen, wobei die g e f ä r b t e n Agarstückchen am Boden der Schale festkleben und in dieser Weise beliebig lange a u f b e w a h r t w e r d e n können. Zur A n b r i n g u n g der F a r b m a r k e läßt man einen derartigen F a r b s t o f f t r ä g e r k u r z e Zeit in Wasser quellen, schneidet ihn zurecht und bringt ihn, unter Abdichtung der U m g e b u n g mit Wachs, Stanniol od. dgl. an das zu f ä r b e n d e Material. Im übrigen sei auf die eingehende Darstellung der Methodik durch V o g t (25) verwiesen. 791. F a r b m a r k e n nach V o g t können f ü r Beobachtung in einem Gemisch von 3°/oiger Kaliumbichromatlösung 50 ccm, 5% Ammoniummolybdatlösung 50 ccm und Eisessig 3—5 ccm bei tadelloser F o r m e r h a l t u n g des Keimes gut fixiert werden; bei der D u r c h f ü h r u n g durch Alkohol und Einbettung in Paraffin versagt jedoch diese Flüssigkeit. Zur histologischen Fixierung von Nilblausulfat-Farbmarken eignen sich die Methoden von" L e h m a n n , A d a m s und F y g - B a l t z e r .

§ 792—795.

Basische Vitalfarbstoffe

185

792. Methode von F. E. L e h m a n n (nach L e h m a n n und d e R o c h e [34]). A. Fixierung: 1. Einlegen in Zenker (lOccm + 0,5 ccm Eisessig) 2—3 Std. — 2. Fließendes Brunnenwasser 2—3 Std. — 3. Einlegen in 2°/oige Phosphorwolframsäure 2—12 Std. zur Fixierung des Nilblausulfates. — 4. Fließendes Brunnenwasser 2—8 Stunden. — 5. Direktes Ü b e r t r a g e n in Dioxan I-III (mit Calciumchlorid am Boden, siehe § 353 ff.) je 1 Stunde. — 6. Benzol 15 Min. — 7. Paraffin 15 Min. — B. Färbung der Schnitte: 1. Entparaffinieren in Xylol 5 Min., dann Benzol 1 Min. — 2. Z u r S u b l i m a t e n t f e r n u n g in Jodbenzol I, II je 10 Min. — 3. Entjoden in Benzol I, II je 10 Min. — 4. Benzol-Dioxan (1 : 1) 5 Min., Dioxan 5 Min., dest. Wasser 30 Min. — 5. K e r n f ä r b u n g in Säurealizarinblau (hergestellt nach § 748) 3—4 Min. (während der F ä r b u n g kontrollieren!!). — 6. Auswaschen in dest. Wasser I, II je 15 Min. — 7. Eosin 0,l°/oig, Va Min. — 8. Blauschwarz B (Lösung wie in § 1505, aber ohne Pikrinsäure) V* Min. — 9. Dioxan I 5 Min., II und III je 1 Min. — 10. Benzol, Balsam. 793. A. E. A d a m s (28) fixiert 12 Stunden in Zenker-Formol (85:15), dann 12—24 Stunden in Zenker ohne Zusatz. Dann 1 Stunde in 2mal gewechseltes reines wasserfreies Azeton, Benzol 20 Minuten, Paraffin (52°) 20 Minuten. — Die Schnitte kommen in Xylol (10 Sekuhden), Azeton (10 Sekunden), Wasser (5 Sekunden), Harris Hämatoxylin ohne Eisessig (s. § 2045) oder 0,05°/oiges Methylenblau (5 Sekunden), Wasser (5 Sekunden), Azeton (10 Sekunden), Xylol (10 Sekunden), Balsam. 794. Methode von F y g - B a l t z e r (nach H a d o r n). 1. Fixierung in Zenker ohne Eisessig, unter Zugabe von Sublimatkristallen im Überschuß. 2 Stunden. — 2. Fließendes Brunnenwasser 2 Stunden. — 3. Entwässern in konzentrierten Lösungen von Sublimat in 35-, 70-, 96- und 100°/oigem Alkohol (letzterer 2mal) je 10 Minuten. — 4. Benzol 3mal je 10 Minuten. — 5. Benzol-Paraffin. — 6. P a raffin. — Zur K e r n f ä r b u n g kommen die Schnitte über Benzol und die konzentrierte Sublimat-Alkoholreihe in dest. Wasser (je 5 Min.). Dann progressive F ä r b u n g in Säurealizarinblau-Chromalaun (s. unten) bis 20 Minuten. — Auswaschen in fließendem Wasser; das Plasma bleibt ungefärbt. — Aufsteigende Sublimat-Alkoholreihe (je 5 Minuten), Benzol (10 Minuten), Jodbenzol (20 Minuten, l m a l wechseln), Einschluß in neutralen Benzol-Kanadabalsam. Es ist wichtig, daß sämtliche Sublimat-Alkohole stets ungelöstes Sublimat enthalten. Uneingebettete P r ä p a r a t e lassen sich in konz. Sublimatlösung aufbewahren. Zur Bereitung der Farblösung erhitzt H a d o r n 100 ccm dest. Wasser + 5 g Chromalaun, bis die Flüssigkeit grünblau ist, gibt 0,5 g Säurealizarinblau zu, läßt 15 Min. bei kleiner Flamme kochen und filtriert. Verwendet man statt Chromalaun Aluminiumsulfat, dann erhält man statt ultraminblauer Kernfarbe mehr violettrote Töne (briefl. Mitt.). D. Vitalfärbung von Fett und Knochen. Verschiedenes 795. Zur V i t a l f ä r b u n g d e s F e t t e s v e r f ü t t e r t man stark fetthaltiges, mit Sudan III oder Scharlach vermischtes Futter, worauf allmählich eine A n f ä r b u n g des im K ö r p e r vorhandenen Fettes zustandekommt. Fixierung in F o r mol. Gefrierschnitte. Ebenso wirkt Injektion von Sudan oder Scharlach. Für eine Maus genügen z. B. 0,4 ccm der gewöhnlichen alkoholischen Sudanlösung (J a c o b s t a 1 09). Verfütterung von 0,1 g mit Sudan III gesättigten Fettes bewirkt bei der Maus schon nach 6 Stunden eine leuchtende Rotfärbung des g e s a m t e n F e t t e s . Eine Trennung zwischen neu resorbiertem und vorhandenem Fett ist durch Verfütterung von Sudan also nicht möglich ( J o e l und S c h ö n h e i m e r ; ferner M. B. S c h m i d t 24).

186

Das Einschließen der Präparate

§ 796—800.

796. V i t a l f ä r b u n g w a c h s e n d e r K n o c h e n s u b s t a n z . Seit langem bekannt ist die Eigenschaft des K r a p p s (Wurzeln von Rubia tinctorum), bei Verfütterung an junge, wachsende Tiere die sich neubildende Knochensubstanz zu färben (s. § 1601). Ebenso wirkt das aus dem Krapp gewonnene oder das synthetisch hergestellte A l i z a r i n . G o t t l i e b (14), P r ö 11 (26) u. a. färben durch Injektion von a l i z a r i n s u l f o s a u r e m N a t r i u m (l°/oige Lösung in physiologischer Kochsalz- oder Ringerlösung, intravenös, intraperitoneal oder intramuskulär). Am besten reagieren junge Hunde oder Hühner. Gefärbt werden die noch freien Kalksalze des sich neubildenden Knochens, di6 Zellen bleiben ungefärbt, desgleichen voll ausgebildetes, fertiges Knochengewebe. 797. A m y l o i d kann durch Congorot und durch Tryp anblau vital gefärbt werden (s. § 1575). Trypanblau färbt auch grobes elastisches Gewebe vital (H e r z e n b e r g). 798. I n d i r e k t e V i t a l f ä r b u n g m i t S u l f o s ä u r e f a r b s t o f f e n (z. B. Fuchsin S, Wasserblau, Lichtgrün) nach K a r c z a g und P a u n z. Die Farbstoffe werden im Laufe des Tages in 2,5°/oiger Lösung (in physiologischer Kochsalzlösung) subkutan infundiert. Ein Kaninchen verträgt pro Kilo 5 g Fuchsin S, 4 g Wasserblau oder 3 g Lichtgrün. Die Organe werden auf dem Gefriermikrotom geschnitten oder in Formalin-Essigsäure fixiert und innerhalb 2—3 Tagen durch Alkohol und Chloroform in Paraffin eingebettet. Die Schnitte sind zunächst ungefärbt oder nur schwach gefärbt, da die Farbstofimoleküle innerhalb des Tierkörpers eine Umwandlung in die tautomere und farblose Carbinolform erfahren haben. Durch mehrstündiges Einlegen der Schnitte in 0,le/oige Salzsäure tritt eine Regeneration der Carbinole zu den gefärbten Verbindungen ein. Die Carbinole besitzen im Gegensatz zu den unveränderten Farbstoffen eine elektive Histotropie. K a r c z a g und P a u n z bezeichnen die Methode als i n d i r e k t e V i t a l f ä r b u n g . 799. V i t a l f ä r b u n g m i t T h i e n y l - C h i n o l i n - C a r b o n s ä u r e ( R o m a n 18). Man gibt subkutan oder per os 1 g pro Kilogramm Körpergewicht des, Natriumsalzes der Thienyl-Chinolin-Carbonsäure, das sich in H 2 0 bei neutraler Reaktion löst. Intravenös oder intraperitoneal ist die Dosis geringer (0,4 g). Die Injektion kann mehrmals wiederholt werden. Als Tiermaterial verwendet man am besten Kaninchen. Schon kurze Zeit danach färbt sich besonders das elastische Gewebe tief violett. Weniger intensiv ist die Färbung des kollagenen Bindegewebes, des Knorpels und Knochens. Literatur über Methodik der Vitalfärbung s. v. M ö 11 e n d o r f f 20, 21b, 26; V o n w i l l e r 21, 28; K e l l e r 30; G i c k l h o r n 31; S e k i 33, 34; B e c k e r 36; K i y o n o , S u g i y a m a und A m a n o 37, 38.

12. KAPITEL

Das Einschließen der Präparate 800. Zur Untersuchung und Konservierung werden die nach den vorausgehenden Methoden behandelten Präparate gewöhnlich noch in ein besonderes Einsdiluljmedium gebracht, wenn sie auch an und für sich in jeder der vorausgehenden Flüssigkeiten untersucht werden können. Von dem Einschlußmedium ist zu fordern, daß es die Präparate durchsichtig erhält, ohne zum mindesten für die Dauer der Untersuchung ihre Struktur und Farbe zu schädigen. Die Einschlußmedien kann man im großen ganzen in zwei Gruppen trennen, je nachdem sie mit Wasser mischbar oder unmischbar sind. Beim Einschließen in ein Me-

§ 801—803.

Einschluß in Glyzerin

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dium der ersten Gruppe, zu welcher die Methoden mit G l y z e r i n , G u m m i s i r u p , L ä v u l o s e und G e l a t i n e zu rechnen sind, ist eine vorherige Entf e r n u n g des Wassers aus den P r ä p a r a t e n unnötig. Bei A n w e n d u n g einer Methode d e r zweiten G r u p p e dagegen m u ß das P r ä p a r a t vor dem Einschluß auf das sorgfältigste entwässert werden; hieher zählen die Einschlußmethoden mit H a r z e n u n d Ö l e n . Dazu kommen noch Methoden, die den Einschluß in Harze oder harzähnliche Medien u n t e r mehr oder weniger weitgehender Vermeidung von Alkoholen gestatten. Die Wahl der Methode wird durch die Zwecke, die m a n bei der Herstellung des P r ä p a r a t e s verfolgt, bestimmt. Bei jedem dieser Einschlußverfahren m u ß das Einschließen von L u f t b l ä s chen vermieden werden. Eine Beseitigung der Bläschen durch Druck auf das Deckglas m i t der Zupfnadel od. dgl. ist f ü r das P r ä p a r a t gewöhnlich schädlich. Sehr leicht und schonend können die Luftbläschen auch bei Einschluß in zähflüssige Intermedien dadurch e n t f e r n t werden, daß m a n das P r ä p a r a t u n m i t t e l b a r nach dem Eindecken in schräger Lage in einen Exsikkator stellt, einige Min u t e n mit der Wasserstrahlpumpe evakuiert und dann wieder L u f t zutreten läßt. 801. B e s t i m m u n g d e s B r e c h u n g s i n d e x u n t e r d e m M i k r o s k o p . Bei Einschluß farbloser oder durchsichtiger Objekte ist es wichtig, ein Einschlußmedium zu wählen, dessen Brechungsexponent von dem des Objekts möglichst verschieden ist. Dazu ist es notwendig zuerst den Brechungsindex des durchsichtigen Körpers unter dem Mikroskop zu bestimmen. Eine sehr gute, einfache Methode dazu b e r u h t auf der Totalreflexion. Man bringt dazu das einzuschließende Objekt in verschiedene Flüssigkeiten von b e k a n n t e m Brechungsindex (s. u.) u n d beobachtet bei etwa 500facher Vergrößerung, nach welcher Seite sich die Lichtlinie, die parallel einer K a n t e des Objekts a u f t r i t t ( = Beckesche Linie), beim Bewegen des Tubus verschiebt. Beim Heben des T u b u s w a n dert sie gegen das s t ä r k e r brechende Medium. Bei g l e i c h e n Brechungsindices verschwindet die Linie. (H. T h a l e r 30/31). Z u r Bestimmung verwendet m a n Flüssigkeiten, die u n t e r dem N a m e n „Flüssigkeiten zur Bestimmung des Brechungsindex" bei Schering-Kahlbaum oder E. Merck erhältlich sind. Chloroform n = 1,443 Monobrombenzol n = 1,559 Lavendelöl n = 1,464 Bromoform n = 1,558 Ricinusöl n = 1,478 Zimtöl n = 1,602 Cedernöl n = 1,503 Monochlornaphthalin n = 1,635 Monochlorbenzol n = 1,523 Monobromnaphthalin n = 1,655 Nelkenöl n = 1,541 A. Einschlufpnittel für wasserhaltige Präparate 802. Der Einschluß in Glyzerin k o m m t hauptsächlich dann in Betracht, wenn die Schnitte vor dem Einschluß nicht m e h r mit Alkohol, Xylol od. dgl. in Ber ü h r u n g kommen sollen, also z. B. bei Gefrierschnitten, welche auf F e t t e oder Lipoide u n t e r s u c h t w e r d e n sollen, bei alkohollöslichen F ä r b u n g e n u. dgl. F ü r gewisse Untersuchungen (z. B. bei Beobachtung ungefärbter Präparate) ist auch die geringere Lichtbrechung des Glyzerins (n = 1,456) von Wert. Nachteilig ist„ daß sich sehr viele F ä r b u n g e n , auch die Hämatoxylinfärbungen, in ihm nur schlecht halten. 803. Zum Einschluß breitet man das im Wasser liegende Präparat auf einem schräggehaltenen Objektträger unter Wasser sorgfältig aus, zieht den Objektträger

188

Das Einschließen der Präparate

§ 804—807.

langsam aus dem Wasser, wobei man das Präparat mit einer Zupfnadel festhält, saugt das überschüssige Wasser mit Filtrierpapier ab, ohne das Präparat selbst zu berühren, bringt einen Tropfen Glyzerin darauf und legt unter Vermeidung von Luftblasen ein Deckglas auf. Soll das Präparat aufgehoben werden, so muß es umrandet werden (s. § 81411.). Zu beachten ist, daß Glyzerin aus der Luft Wasser anzieht.

804. Bei unmittelbarem Übertragen der Präparate aus Wasser wirkt Glyzerin schrumpfend. Empfindliche Präparate bringt man daher zunächst in abgestufte Mischungen von Wasser und Glyzerin (z. B. 5 :1; 3 :1, 1:1). In geeigneten Fällen überträgt man in eine Mischung von Glyzerin und 80°/oigem Alkohol ( 1 : 1 oder noch schwächer, z. B. 1 : 3), stellt diese in einen mit Chlorcalcium beschickten Exsikkator und läßt den Alkohol l a n g s a m verdunsten, bis das P r ä p a r a t in reinem Glyzerin liegt. 805. Durch Sättigung von wasserfreiem G l y z e r i n mit C a d m i u m c h l o r i d i n der Wärme erhält man nach Auskristallisieren des Salzüberschusses eine sirupartige, schwach gelblich gefärbte Flüssigkeit, deren Lichtbrechungsvermögen etwa 1,540 beträgt. H a m m a r (24) empfiehlt dieses Einschlußmittel f ü r Sudan- oder Scharlachpräparate, die zum Zwecke des Zeichnens u. dgl. bei durchfallendem Licht projiziert werden sollen. (Bei Einschluß in gewöhnlichem Glyzerin kommt dabei die orangerote Färbung nicht zur Geltung.) Die Färbung bleibt in ihm gut erhalten. Auch durch Sättigung mit Chloralhydrat oder Zinkjodid kann die Brechungszahl des Glyzerins erhöht werden (Glyzerin-Chloralhydrat n = 1,51; Glyzerin-Zinkjodid n = 1,56). Durch Zusatz von Wasser wird sie vermindert (Glyzerin-dest. Wasser [1:1] n = 1,39).

806. Glyzeringelatine ( K a i s e r 80). Herstellung: Man weicht 7 g feinste Ge-

latine 2 Stunden lang in 42 ccm Aqua dest. ein, setzt 50 g Glyzerin und 0,5 g Karbolsäurekristalle zu, erwärmt 10—15 Minuten unter Umrühren auf dem Wasserbad, filtriert heiß durch angefeuchtete Glaswolle oder im Heißwassertrichter und läßt erkalten, (n = 1,474.) K i s s e r (34) zieht eine wasserärmere Glyzeringelatine vor (50 g Gelatine, 175 ccm dest. Wasser, 150 ccm Glyzerin). Zum Einschließen bringt man von der erstarrten Masse ein kleines Stückchen auf einem Deckglas durch vorsichtiges Erwärmen zum Schmelzen, dreht rasch u m und legt den hängenden Tropfen auf das Präparat, wo sich die Masse rasch ausbreitet und erstarrt. Man kann auch das Röhrchen mit Glyzeringelatine in warmes Wasser stellen, einen Tropfen der verflüssigten Masse mit einem Glasstäbchen auf das Präparat bringen und rasch ein Deckglas auflegen. Man kann die Präparate direkt aus Wasser in Glyzeringelatine einlegen. Besser ist es, den aus dem Wasser auf den Objektträger gezogenen Schnitt zunächst mit einem Tropfen Glyzerin zu bedecken, dieses dann vorsichtig ohne den Schnitt zu berühren mit Filtrierpapier abzusaugen und dann erst in Glyzeringelatine einzulegen.

807. Ein großer Nachteil der Karbolglyzeringelatine ist, daß die Kernfärbung mit Hämatoxylin in ihr sehr bald zerstört wird. Um diesen, auf dem Säuregehalt des Einbettungsmittels beruhenden Nachteil zu vermeiden, empfiehlt W. G r o ß (30) eine von L o h a u s mit B o r a t p u f f e r zusatz bereitete Glyzeringelatine. Gemeinsam mit J. W ü s t habe ich die in etwas gedrängter Form angegebene Vorschrift von G r o ß folgendermaßen präzisiert, wobei wir, da der Borsäuregehalt nach unseren Erfahrungen nicht hinreichte um ein Verpilzen der Gelatine zu verhüten, der Boratlösung eine geringe Menge Sublimat zufügten: 7,0 g feinste Gelatine werden kalt mit 42 ccm einer m/5 Boratlösung (s. u.) ver-

§ 808—813.

Einschluß wasserhaltiger Präparate

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setzt u n d n a c h Q u e l l e n auf d e m W a s s e r b a d i n Lösung g e b r a c h t . Z u r w a r m e n G e l a t i n e l ö s u n g w e r d e n 42 ccm G l y z e r i n (doppelt dest.; 1,26) z u g e f ü g t , w o r a u f m a n die F l ü s s i g k e i t n o c h so l a n g e auf d e m W a s s e r b a d b e l ä ß t , bis eine h o m o g e n e d ü n n f l ü s s i g e L ö s u n g e n t s t a n d e n ist. Zu dieser w a r m e n L ö s u n g f ü g t m a n a l s I n d i k a t o r 10 T r o p f e n einer B r o m t h y m o l b l a u l ö s u n g (s. u.), w o d u r c h sie e i n e g e l b e F a r b e a n n i m m t . N u n v e r s e t z t m a n so l a n g e t r o p f e n w e i s e m i t n - N a O H , b i s die g e l b e F a r b e d e u t l i c h n a c h b l a u u m g e s c h l a g e n h a t . Auf diese Weise e r g i b t sich PH d e r L ö s u n g gleich ca. 7,7. Die f e r t i g e L ö s u n g w i r d w a r m m i t H i l f e eines H e i ß w a s s e r t r i c h t e r s d u r c h F i l t r i e r p a p i e r filtriert. L e i d e r b l e i b t die K e r n f ä r b u n g m i t H ä m a t o x y l i n auf die D a u e r a u c h in g e p u f f e r t e r Glyzeringelatine' n i c h t e r h a l t e n (R.). Herstellung der m/5 B o r a t l ö s u n g : 1,24 g krist. Borsäure werden in 10 ccm ti-NaOH gelöst und mit dest. Wasser auf 100 ccm aufgefüllt. Dazu 0,1 ccm einer konz. wäßrigen Sublimatlösung (s. o.). Herstellung der 1/n NaOH s. § 1159. Herstellung der Bromthymolblaulösung: 0,1 g Bromthymolblau werden in 3,2 ccm n/20 NaOH gelöst; dann Auffüllen mit dest. Wasser auf 250 ccm. 808. S t a t t G l y z e r i n w i r d a u c h e i n e g e s ä t t i g t e w ä s s e r i g e L ö s u n g v o n Kalium aceticum g e b r a u c h t , w e l c h e die T e e r f a r b s t o f f e m e i s t w e n i g e r a n g r e i f t w i e G l y zerin. O. S c h u l t z e (07) e m p f i e h l t eine M i s c h u n g v o n K a l i u m aceticum, M e t h y l a l k o h o l u n d Wasser zu g l e i c h e n Teilen (n = 1,370). 809. Eine o f t s e h r n ü t z l i c h e E i n s c h l u ß f l ü s s i g k e i t ist d a s Lacfophenoi ( A m a n n 96). M a n v e r m i s c h t zu seiner B e r e i t u n g 20 g chem.-reine, k r i s t . K a r b o l s ä u r e , 20 g M i l c h s ä u r e (spez. Gew. 1,21), 10 g G l y z e r i n (spez. G e w . 1,25) u n d 20 g dest. Wasser. Die M i s c h u n g ist in b r a u n e r F l a s c h e a u f z u b e w a h r e n , n = 1,44. T o t a l p r ä p a r a t e (wie z. B. Insekten, W ü r m c h e n u. dgl.) k ö n n e n d i r e k t in das Gemisch e i n g e l e g t w e r d e n , S c h n i t t p r ä p a r a t e w e r d e n a u s W a s s e r ü b e r t r a g e n , u n t e r allm ä h l i c h e r K o n z e n t r a t i o n s s t e i g e r u n g w i e in § 804. N a c h H ä m a t o x y l i n f ä r b u n g ist L a c t o p h e n o l n i c h t angezeigt. 810. Als E i n s c h l u ß f l ü s s i g k e i t f ü r c h l o r o p h y l h a l t i g e s M a t e r i a l empfiehlt A m a n n 0,2 g krist. Kupferchlorid und 0,2 g krist. Kupferacetat (CuCjHßOj) in 95 ccm dest. Wasser und 5 g Lactophenol zu lösen. Die grüne Farbe bleibt darin gut erhalten. 811. Für spezielle Zwecke, z. B. Amyloidfärbung, wird aus Wasser in Lävulose eingeschlossen. Man rührt 30 g Fruchtzucker mit 20 ccm Wasser an und läßt ihn zum Eindicken 24 Stunden bei 37° C stehen. Die Lösung muß schließlich ganz dick sein. Der Sirup, der allmählich ganz fest wird, greift Anilin- und Carminfärbungen nicht an. Hämatoxylin-Färbungen werden dagegen nach einiger Zeit zerstört. Ähnlich ist der von H e r i n g a angegebene, sehr brauchbare G e l a t i n e b a l s a m (s. § 475). n = 1,464. 812. S e h r e m p f e h l e n s w e r t ist d e r G u m m i s i r u p n a c h v. A p ä t h y (92). Z u r H e r s t e l l u n g löst m a n 50 g G u m m i a r a b i c u m in s o r g f ä l t i g a u s g e s u c h t e n ganz r e i n e n f a r b l o s e n S t ü c k e n u n d 50 g g e w ö h n l i c h e n , n i c h t k a n d i e r t e n R o h r z u c k e r auf d e m W a s s e r b a d in 50 ccm dest. Wasser. D a n n Zusatz v o n 0,5 g T h y m o l oder 1 ccm F o r m o l . In d e r rasch e r h ä r t e n d e n E i n s c h l u ß m a s s e b l e i b e n M e t h y l e n b l a u p r ä p a r a t e u n d z a h l r e i c h e a n d e r e F ä r b u n g e n mit T e e r f a r b s t o f f e n s e h r g u t erh a l t e n . A u c h S u d a n - H ä m a l a u n p r ä p a r a t e h a b e n sich n a c h m e i n e n B e o b a c h t u n g e n in i h m b e s s e r g e h a l t e n als in G l y z e r i n o d e r G l y z e r i n g e l a t i n e , n = 1,524. 813. Einschlußmittel von F a r r a n t. Zur Herstellung werden 30 g feinster Gummi arabicum kalt in 30 ccm dest. Wasser gelöst. Dazu kommen 30 ccm Glyzerin, in dem 0,1 g arsenige Säure gelöst ist. Schließlich Zusatz von etwas Kampfer.

190

Das Einschließen der Präparate

§ 814—815.

814. Umrandung. P r ä p a r a t e , die in ein flüssiges, nicht erhärtendes Medium eingeschlossen wurden, müssen u m r a n d e t werden. Vorbedingung d a f ü r ist, daß die Einschlußflüssigkeit nicht über den Rand des Deckglases vordringt, da sich die Umrandungsmasse an befeuchteten Stellen mit der Glasoberfläche nicht verbinden kann. Ist dies dennoch geschehen, d a n n m u ß die Verunreinigung vorher mit Filtrierpapier und einem geeigneten Lösungsmittel vorsichtig e n t f e r n t werden. (Absaugen mit Filtrierpapier, d a n n vorsichtiges Abwischen mit einem feinen Läppchen, das mit einem geeigneten Lösungsmittel g e t r ä n k t ist, bei Glyzerin z. B. mit absolutem Alkohol). N e u m a n n und H u b e r beseitigen das an den Deckglasrändern vordringende Glyzerin in der Weise, daß sie es mit feingepulvertem Traganth (Tragacantha) bestreuen, der sich nach kurzer Zeit mit dem Glyzerin zu einer kittartigen, halbweichen Masse verbindet. Nach 2—3 Tagen wird diese mit einem scharfen Messer abgeschnitten und beseitigt. Das Verfahren mit Traganth ist der älteren Methode, bei der die verunreinigten Stellen mit Bleioxyd bestreut wurden, überlegen. 814a. Ein guter Deckglasverschluß an einem D a u e r p r ä p a r a t m i t wässerigen Einschlußmedien soll folgende Eigenschaften besitzen: Gute Ko- u n d Adhäsion, geringes A u f r a g e n ü b e r das Deckglasniveau, Resistenz gegen Zedernöl und Benzin sowie gegen Sommerwärme, Resistenz gegen Feuchtigkeit, keine n a c h t r ä g liche Absonderung von Säuren, kein nachteiliges Altern, rasches Trocknen, einfache saubere Handhabung, geringe Materialkosten. ( K a m p t n e r 36). Diese Bedingungen w e r d e n am besten von den in § 815, 816 und 816a angegebenen Methoden erfüllt. 815. U m r a n d u n g m i t K a n a d a b a l s a m ( C a e d a x od. dgl.) nach Z e 11 e r (42). Das elegante V e r f a h r e n h a t sich mir f ü r glyzerin- wie wasserhaltige Beobachtungsflüssigkeiten sehr bewährt, sodaß ich es an erster Stelle empfehlen möchte. Vorbedingung f ü r guten Erfolg ist sauberes Arbeiten u n d eine gewisse manuelle Geschicklichkeit. A u s f ü h r u n g : 1. Aufziehen des einzuschließenden P r ä p a r a t e s auf ein kleines Deckglas (z.B. 9X18 oder 18X18 Millimeter) und Bedecken mit dem Einschlußmittel (Glyzerin, Glyzerinwasser od. dgl.). — 2. Rasches U m d r e h e n des mit einer Deckglaspinzette gefaßten Deckglases, sodaß der Schnitt mit Einschlußmedium nach unten sieht. Auflegen des Ganzen auf ein zweites Deckglas von größerem F o r m a t (z. B. 24X26 oder 24X35 Millimeter), sodaß das kleinere Deckglas ringsum vom größeren gut ü b e r r a g t wird. Wichtig ist, die Menge des Einschlußmediums so zu bemessen, daß d e r Spaltraum zwischen kleinem und großen Deckglas gerade ausgefüllt wird, w o durch der Schnitt fest zwischen beide Deckgläser gepreßt wird. Quillt das Medium am Rande vor, so m u ß es durch ein senkrecht gehaltenes Filtrierpapierstreifchen sauber abgesaugt werden. — 3. A u f t r o p f e n von 2—3 T r o p f e n K a n a d a balsam auf einen sauberen Objektträger und gleichmäßiges Ausstreichen d e r Tropfen in einer Ausdehnung, die etwas geringer ist als die des großen Deckglases. — 4. A u f h e b e n des Deckglaspaares mit der Pinzette und umdrehen, sodaß das kleine Deckglas nach unten schaut. — 5. Wagrechtes Auflegen d e r beiden durch die K a p i l l a r k r a f t des Intermediums fest aneinander h a f t e n d e n Deckgläser auf die Balsamschicht, derart, daß der Kanadabalsam mit seiner ganzen Fläche gleichzeitig mit der ganzen Deckglasfläche in B e r ü h r u n g kommt. Auf diese Weise wird das Einschlußmedium hermetisch unter dem kleinen Deckglas eingeschlossen und von einfer breiten Balsamzone umgeben. Die f e r t i gen P r ä p a r a t e können sehr gut auch mit Immersion betrachtet werden, da d a s

§ 816—819.

Umrandung

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Wegwischen des Immersionsöles mit Xylol öder Balsam nach E r h ä r t e n des Balsams leicht und ohne Schädigung des P r ä p a r a t e s möglich ist. 816. U m r a n d u n g m i t E m a i l l a c k nach K a m p t n e r (36). Der Emaillack wird mit einem Aquarellpinsel in der Weise auf das eingedeckte P r ä p a r a t aufgetragen, daß der Anstrich 1—2 Millimeter über den Rand des Deckglases auf dieses übergreift. Selbstverständlich m u ß die Glasoberfläche sauber u n d trocken sein. Nach einigen Tagen läßt man zweckmäßig einen zweiten Anstrich folgen. Der Pinsel w i r d gleich nach Gebrauch auf Papier ausgestrichen und in Chloroform gereinigt. K a m p t n e r empfiehlt den rasch trocknenden weißen „ S u p e r o l E m a i l l a c k " der Firma O. Fritze, Wien I, Hoher Markt 11. Nach meinen Erfahrungen kann man auch jeden andern guten Emaillack verwenden z. B. Flamuco-Emaillack u. a. 816a. Eine sehr gute, h a r t e Umrandungsmasse erhält m a n nach K a m p t n e r auch, w e n n man dem gewöhnlichen f a r b l o s e n B e r n s t e i n l a c k (K o p a l - ö l l a c k ) k u r z vor Gebrauch eine gewisse Menge Z i n k w e i ß beimischt. Da das Festwerden des Gemisches sehr rasch vor sich geht, muß die Masse immer frisch bereitet werden. Man b r i n g t dazu auf ein Stück P e r g a m e n t papier soviel vom Lack, als man gerade braucht, und daneben Zinkweiß. Dann v e r r ü h r t man (etwa mit einem Streichholz) soviel Zinkweiß mit dem Lack, daß sich eine gelblich-weiße, undurchsichtige homogene Masse ergibt, die eben noch gute Strichkonsistenz besitzt. Alles übrige wie in § 816. Mit beiden Vorschriften erhielt ich ausgezeichnete Resultate. 817. U m r a n d u n g m i t C e l l u l o i d . M c C l u n g empfiehlt eine Lösung von Celluloid in Aceton. Die Masse, die nicht zu dickflüssig sein darf, wird wie in § 812 mit dem Pinsel aufgetragen (Auswaschen in Aceton). Sie wird rasch hart, haftet aber nur, wenn die Glasoberfläche ganz trocken war. Aber auch dann kann es leicht vorkommen, daß sich der Rahmen nach einiger Zeit ablöst. Als weiteren Nachteil fand ich, daß eine Reihe von Farbstoffen durch das Lösungsmittel des Rahmens so stark angezogen werden, so daß schließlich der Rahmen gefärbt, das Präparat aber mehr oder weniger entfärbt ist. 818. R u i j t e r (34) benützt die Eigenschaft der K a l i u m b i c h r o m a t G e l a t i n e unter Lichteinwirkung unlöslich zu werden, um eine gut abschliessende widerstandsfähige U m r a h m u n g zu erzielen. Man verflüssigt 20 g Gelatine in 100 ccm gesätt. Thymolwasser auf dem Wasserbad oder im B r u t s c h r a n k (38°), f ü g t 10 ccm einer 5°/oigen Kaliumbichromatlösung zu und mischt gut durch. Die Lösung wird zum Gel erstarrt i m D u n k e l n (!) aufgehoben. Vor Gebrauch wird die benötigte Menge bei 37° C verflüssigt. Das U m r a n d e n erfolgt mit einem P i n sel. Hierauf läßt m a n am Licht bei Z i m m e r t e m p e r a t u r trocknen. Einmal getrocknet widersteht die U m r a n d u n g anstandslos einer Reinigung des Deckglases mit Chloroform u. dgl. 819. Die ä l t e r e n Umrandungsmassen, die meist aus Gemischen von Wachs u n d Harzen bestehen, haben den Nachteil, daß sie heiß aufgetragen werden müssen, meist dicke plumpe R a h m e n geben, mit der Zeit oft undicht w e r d e n u n d gegen öl, Benzin usw. "empfindlich sind. Auch müssen sie gewöhnlich noch gefirnißt werden (siehe § 821). Von ihnen sei als beste Masse das L a n o l i n K o l o p h o n i u m g e m i s c h von d u N o y e r (18) angeführt, das gut abschließt, widerstandsfähig ist und nicht spröde wird. Die gut h a l t b a r e Harzmasse wird in der Weise bereitet, daß 20 Teile wasserfreien Lanolins zunächst f ü r 15—30 Minuten zur Vertreibung etwaiger Wasserreste in einer Porzellan-

192

Das Einschließen der Präparate

§ 820—822.

abdampfschale mäßig erhitzt werden. Sodann werden stückweise 80 T e i l e K o l o phonium zugesetzt und das Ganze zu einer homogenen, klaren, g e l b b r a u n gef ä r b t e n Masse v e r r ü h r t (Vorsicht, feuergefährlich), die m a n zum A u f b e w a h r e n i n kleine B l e c h s c h a c h t e l n (z. B . alte Zigarettenschachteln) gießt und e r s t a r r e n läßt. Z u r U m r a n d u n g erhitzt man einen Glasstab, einen r e c h t w i n k l i g gebogenen M e t a l l d r a h t oder einen dreieckigen Umrandungsspatel, schmilzt damit etwas von der Masse ab und b r i n g t zunächst an zwei E c k e n des Deckglases kleine T r o p f e n an, durch die das Deckglas in seiner L a g e fixiert wird. E r s t dann v e r sieht man die einzelnen K a n t e n des Deckglases mit einem lückenlosen, gut ü b e r greifenden R a h m e n , wobei man den S p a t e l am besten in der R i c h t u n g vom D e c k g l a s zum O b j e k t t r ä g e r führt. Der Umrandungsspatel usw. soll kräftig erhitzt werden. Doch darf die Hitze desselben nicht allzu groß sein, da sonst die Harzmasse bei Berührung mit der Beobachtungsflüssigkeit verspritzt, wobei die Deckglasoberfläche mit Harztröpfchen übersät werden kann. Nach wenigen Versuchen wird die richtige Erhitzung ohne Schwierigkeit gelingen. Beseitigt man vorher das Glyzerin nach § 814 mit Traganth, so kommt es fast niemals zu einem Verspritzen. 820. Für Präparate, die sofort beobachtet werden und nur einige Tage erhalten bleiben sollen, kann man auch dünne Wachskerzchen zum Umranden benützen. Man zündet ein solches an, löscht es gleich wieder aus, fixiert das Deckglas an zwei gegenüberliegenden Ecken mit zwei kleinen Wachströpfchen und streicht nun mit dem Docht, an dem das geschmolzene Wachs herunterläuft, rasch an den Kanten des Deckglases entlang, indem man diese und die anschließenden Objektträgerteile mit einem etwa 0,5 cm breiten Streifen bedeckt. Soll das Präparat längere Zeit erhalten bleiben, so muß der Wachsrahmen noch gefirnißt werden (siehe § 821).

821. Zum F i r n i s s e n der Wachsumrandungen werden verschiedene L a c k e empfohlen: B e r n s t e i n l a c k , A s p h a l t - oder M a s k e n l a c k . Auch eine sirupdicke Lösung von K a n a d a b a l s a m in Terpentinöl ist b r a u c h b a r . A m besten ist e c h t e r Bernsteinlack. 822. Einschluß in Gelatine. U m die Deckgläser und den K a n a d a b a l s a m durch e t w a s B i l l i g e r e s zu ersetzen, bringt E d i n g e r (13) die einzudeckenden S c h n i t t e aus Wasser f ü r 1 S t u n d e in eine 10°/o-Lösung von feinster photographischer G e l a t i n e (Deutsche G e l a t i n e f a b r i k Höchst), der 2%> Glyzerin zugesetzt sind. S o dann k o m m e n sie auf den O b j e k t t r ä g e r , auf dem ein Ü b e r g u ß mit der gleichen G e l a t i n e v o r h e r etwas e r s t a r r t ist; h i e r w e r d e n sie nochmals mit G e l a t i n e Übergossen. Alle diese Prozeduren werden auf einem T e l l e r w ä r m e r bei etwa 40° C vorgenommen. D i e fertigen, zunächst noch undurchsichtigen S c h n i t t e läßt man abkühlen, taucht sie dann f ü r eine h a l b e S t u n d e in 1 0 % i g e Formollösung, wodurch der L e i m in Wasser unlöslich wird, und läßt sie trocknen, wobei die S c h n i t t e genau so durchsichtig wie in K a n a d a b a l s a m werden. Die D e c k s c h i c h t ist steinh a r t und so dünn, daß auch Anwendung von Ölimmersionen möglich ist. Das V e r f a h r e n eignet sich für Markscheidenfärbung ( M a r c h i - P r ä p a r a t e ) , S i l b e r fibrillen, Carmin-, H ä m a t o x y l i n - und S u d a n f ä r b u n g e n , dagegen ist es f ü r alle wasserlöslichen Anilinfärbungen u n b r a u c h b a r . Die Gelatinelösung (nicht über 45° C erhitzen!) m u ß jedesmal neu b e r e i t e t werden, weil m e h r m a l s erhitzte in eine andere Modifikation übergeht, die zum S p r i n g e n neigt (n = 1,542). Ü b e r die V e r w e n d u n g von C e l l o p h a n zum Eindecken großer P r ä p a r a t e s. § 95. Ü b e r den E i n s c h l u ß in G e l a t i n e b a l s a m nach H e r i n g a und t e n B e r g e siehe § 475.

§ 823—828.

Einschluß in Harze und ö l e

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B. Einschluß in Harze und ö l e 1. Die Entwässerung der Präparate

823. Uberaus häufig erfolgt der Einschluß in Harze, die zunächst in gelöster Form auf den Schnitt gebracht werden und durch Verdunsten des Lösungsmittels erhärten. V o r b e d i n g u n g f ü r d i e s e n E i n s c h l u ß i s t v o l l k o m m e n e E n t w ä s s e r u n g d e s P r ä p a r a t e s . Dieselbe erfolgt nach alkoholischer Färbung gewöhnlich in der Weise, daß die Präparate durch allmählich steigenden Alkohol hindurchgeführt werden (Alkoholreihe), also z. B. durch 60-, 80-, 96°/oigen Alkohol je 1—2 Minuten. Zuletzt werden sie f ü r 3 bis 5 Minuten in 2—3 Portionen absoluten Alkohol übertragen, in dem sie die letzten Wasserspuren abgeben. Hierauf kommen sie zur Entfernung des Alkohols in 2—3 Portionen reines Xylol oder Toluol und sind dann zum Einschluß in eines der Harze bereit (s. § 837 ff.). 824. Wenn die Entwässerung nicht sorgfältig genug vorgenommen wird, so tritt beim Ubertragen des Objektträgers ins Xylol eine weißliche Trübung auf. Die Präparate müssen in diesem Falle wieder in den absoluten Alkohol zurückgebracht werden, der allenfalls zu erneuern ist. Man hat natürlich darauf zu achten, daß auch die oberen, gewöhnlich aus den Flüssigkeiten herausragenden Kanten des Objektträgers vor dem Übertragen in Xylol von Wasserresten befreit sind. Die Objektträger müssen immer einzeln in die verschiedenen Flüssigkeiten übertragen werden. Das besonders von Anfängern oft geübte Verfahren zwei Rücken an Rücken klebende Objektträger von einer Schale in die andere zu übertragen, ist unbedingt zu vermeiden, da in diesem Falle die zwischen den beiden Objektträgern befindliche Flüssigkeit nicht genügend verdrängt werden kann. 825. Alkohole und Xylol müssen frei von schädlichen Verunreinigungen sein. Vergällung mit Petrolbenzin (s. § 386, a) ist unschädlich. Die Alkohole sind des öfteren zu erneuern. Die gebrauchten Flüssigkeiten können gesammelt und nach § 384 wieder gereinigt werden. Dabei empfiehlt es sich, sie nicht mit den bei der Entwässerung und Einbettung fixierter Präparate benützten, stark fetthaltigen Flüssigkeiten zu vereinigen, sondern sie getrennt zu behandeln. 826. D r a h n empfiehlt als Ersatz für Toluol oder Xylol das T e t r a 1 i n. Ich kann mich dem lobenden Urteil D r a h n s nicht anschließen. Die geringe Flüchtigkeit des übelriechenden Tetralins macht sich auch bei dieser Verwendung (vgl. auch § 411) sehr unangenehm bemerkbar.

827. I n g e w i s s e n F ä l l e n i s t e s n o t w e n d i g , v o n d e r i n § 823 geschilderten Art und Weise der E n t w ä s s e r u n g abzuw e i c h e n . Es kommen dann f ü r den einzuschlagenden Weg zur Hauptsache folgende Möglichkeiten in Betracht: a) die Färbung wird durch schwachprozentigen Alkohol angegriffen; man verfährt nach § 828f. b) Die Färbung wird durch Starkprozentigen Alkohol angegriffen; Verfahren nach § 831 ff. Ebenso, wenn die Einwirkung von abs. Alkohol auf das Einbettungsmittel des Schnittes (Celloidin, Gelatine) zu vermeiden ist. c) Die Färbung wird durch jeglichen Alkohol angegriffen: man entwässert nach § 834 ff. d) Es soll sowohl hochprozentiger Alkohol wie Xylol u. dgl. vermieden werden: man verfährt nach § 836 oder 850 f. 828. V e r m e i d u n g v o n s c h w a c h p r o z e n t i g e m A l k o h o l . Man nimmt in diesem Falle den Objektträger aus dem Wasser, legt ihn mit dem Präparat nach oben auf Filtrierpapier, bedeckt ihn mit 5—6 Filtrierpapierstreifen und trocknet unter leichtem, sanftdrückendem Darüberstreichen mit dem Finger ab. Dann hebt man die Streifen sorgfältig ab und bringt das abgetrocknete, 13

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Das Einschließen der Präparate

§ 829—832.

noch etwas feuchte Präparat in 96°/oigen oder absoluten Alkohol. (In dieser Weise wird z. B. bei der Pikrofuchsinfärbung verfahren, s. § 709.) 829. Die Filtrierpapierstreifen sollen aus glattem, nicht faserndem, sog. schwedischen Filtrierpapier sein. Punktiertes oder gestreiftes Filtrierpapier ist unbrauchbar. Für gewöhnliche Objektträger ist eine Streifengröße von 4X9 cm zu empfehlen. Sehr geeignet ist das Filtrierpapier Nr. 660 von Schleicher u. Schüll.

830. E i n d e c k e n n i c h t a u f g e k l e b t e r S c h n i t t e . Nicht aufgeklebte Schnitte (Gefrierschnitte, Celloidinschnitte) werden beim Einlegen in hochprozentigen Alkohol u. dgl. leicht wellig, faltig oder brüchig. Um dies zu vermeiden v e r f ä h r t man folgendermaßen: 1. Die Präparate werden nach Färbung mit Glasstäbchen aus Wasser in Schälchen mit 70- und 80°/oigem Alkohol übertragen und dabei flach ausgebreitet. — 2. Aufziehen auf einen Objektträger, auflegen einiger Streifchen Filtrierpapier und abtrocknen unter leichtem Druck; dann sofort auftropfen von 96°/oigem Alkohol, sodaß die ganze Objektträgerfläche damit bedeckt ist. 3 Min. — 3. Abgießen des Alkohols. Abtrocknen. Auftropfen von Carbolxylol (s. § 831) oder Benzylbenzoat-Carbolxylol (s. § 1858), das nach Ablaufenlassen lmal erneuert wird. 3—5 Min. — 4. Abgießen und auftropfen von reinem Xylol (lmal erneuern) 5 Min. — 5. Abgießen; abtrocknen mit Filtrierpapier und sofort auftropfen von Balsam. Deckglas. Die einzelnen Flüssigkeiten hält man am besten in Tropfgläschen bereit (s. Abb. 16, § 623). Um ein Herabfließen der Flüssigkeit zu vermeiden, legt man den Objektträger auf ein deckelloses Färbeglas (Abb. 11, S. 139). Durch Drehen desselben läßt sich die Objektträgerfläche leicht annähernd horizontal einstellen. Wenn die Präparate Neigung haben abzuschwimmen, dann verreibt man auf dem Objektträger vor dem Aufziehen der Präparate (in No. 2) 1—2 Tropfen Eiweißglyzerin.

831. Die V e r m e i d u n g v o n a b s o l u t e m A l k o h o l kann in verschiedener Weise erfolgen. Sehr gebräuchlich ist die Verwendung von C a r b o l x y l o l , in das die Präparate aus dem 90°/oigen oder 95%>igen Alkohol übertragen werden können, da die Carbolsäure die Wasserreste aufzunehmen und die Schnitte dadurch zu entwässern vermag. Nach völliger Durchtränkung und vor dem Einschluß in Balsam kommen die Präparate zur Entfernung der Carbolsäure zweckmäßig noch in reines Xylol. Zur Herstellung des Carbolxylols verwendet man Carbolsäure ( = Phenol) D.A.B. 6 in losen Kristallen. Die Konzentration der Lösung wird meist sehr hoch angegeben (z. B. 10 g Phenol auf 30 ccm Xylol). Ich selbst ziehe zur Schonung von Präparaten und Fingern eine schwächere Konzentration vor (10 g Phenol auf 100 ccm Xylol) und erneuere die Lösung dafür öfters. Über BenzylbenzoatCarbolxylol s. § 1858. Das Carbolxylol wird außer für Celloidinschnitte auch noch f ü r unaufgeklebte, in Balsam einzulegende Gelatine-Gefrierschnitte gebraucht, da diese bei Entwässerung in absolutem Alkohol stark schrumpfen und sehr brüchig werden. An Stelle des Carbolxylols lassen sich auch Gemische von 96°/oigem Alkohol und Benzol verwenden (s. § 370). Mit Carbolxylol behandelte Präparate sind für die Beobachtung im polarisierten Licht unbrauchbar. Wenn das glatte Ausbreiten eines Celloidinschnittes Schwierigkeiten macht, dann kann es übrigens von Vorteil sein, den auf den Objektträger gezogenen Schnitt für kurze Zeit mit absolutem Alkohol zu bedecken und dadurch das Celloidin zu erweichen.

832. Celloidinschnitte, deren Celloidin ungelöst bleiben soll, werden in wasserfreiem P r o p y l a l k o h o l (oder Isopropylalkohol) entwässert. Aus diesem werden sie wie gewöhnlich in Xylol übertragen. Ebenso läßt sich B u t y 1 oder I s o b u t y l a l k o h o l verwenden.

§ 833—837.

Einschluß in Harze und ö l e

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833. F ü r u n a u f g e k l e b t e S c h n i t t e , n a m e n t l i c h a u c h f ü r G e f r i e r s c h n i t t e , ist ganz b e s o n d e r s die V e r w e n d u n g von T e r p i n e o l z u e m p f e h l e n . Die Schnitte werden vorher in 90%>igem Alkohol, in dem sie sich schön ausbreiten und nicht schrumpfen, vorentwässert und dann in Terpineol gebracht; wenn nötig, können sie zur Not sogar aus 80o/oigen Alkohol übertragen werden (s. auch § 834). Die wasserhelle, angenehm riechende Flüssigkeit greift auch zarte, empfindliche Färbungen nicht an (P. M a y e r 10). In die Flüssigkeit gebrachte Schnitte schwimmen zuerst auf der Oberfläche und sinken dann allmählich unter. Celloidin wird in Terpineol nicht gelöst. Die Präparate können nach 5—10 Minuten in reines Xylol übertragen werden. Auch direktes Eindecken in Terpineol, das etwas weniger lichtbrechend ist als Kanadabalsam, ist möglich (n = 1,483). Das fertige Präparat wird in diesem Falle nach § 815 f., 818 oder 819 umrandet. Man verwendet das w a s s e r f r e i e , ehem. reine Terpineol von Schimmel & Co. 834. Trocknet man die Präparate wie in § 828 mit Filtrierpapier ab, so lassen sie sich sogar direkt aus Wasser in Terpineol übertragen (v. V o l k t a a n n 32). Schon nach wenigen Minuten werden sie durchsichtig und können dann direkt in Xylol übertragen werden. Zur Beschleunigung der Entwässerung sind sie im Terpineol öfters zu bewegen. Dann läßt man das Terpineol gut ablaufen (Einstellen des Objektträgers in ein leeres Färbeglas) und bringt in 2—3 Portionen Xylol.

835. Eine v ö l l i g e V e r m e i d u n g v o n A l k o h o l ist möglich durch Verwendung von A c e t o n . Man bringt die Präparate (wenn möglich nach Abtrocknen) zuerst kurz in reines Aceton, dann in Aceton-Xylol 3:1, 1:1, 1:3 und endlich in reines Xylol. Die Mischungen mit Xylol wendet man an, um den Aufenthalt in reinem Aceton möglichst abzukürzen, da auch dieses häufig die Farbe auszieht. Das zur Verwendung kommende Aceton muß vollkommen rein und säurefrei sein (vgl. § 217). 836. Auch D i o x a n gestattet eine Ausschaltung von Alkohol, da es sich mit Wasser wie Xylol in jedem Verhältnis mischt. Man kann die Präparate daher unmittelbar aus Wasser in Dioxan und aus diesem in Xylol bringen. Dabei ist zu beachten, daß die meisten der in der Mikrotechnik gebräuchlichen Teerfarbstoffe in wasserfreiem Dioxan unlöslich, schon nach geringem Wasserzusatz aber leicht löslich sind. Wenn daher bei der Behandlung ein F a r b verlust möglichst vermieden werden soll, so sind die aus dem Wasser genommenen Präparate vor dem Einbringen in Dioxan wie in § 828 abzutrocknen und aus dem ersten Dioxan bald ins zweite zu bringen. Da Dioxan auch Kanadabalsam löst, besteht die Möglichkeit im Bedarfsfall außer dem Alkohol auch Xylol auszuschalten und die Präparate direkt aus Wasser über Dioxan in Balsam zu bringen. 2. Der Einschluß in Harze oder ö l e

837. Zum Einschließen der entwässerten Präparate verwendet man am besten Caedax, ein synthetisch hergestelltes, vollkommen neutrales, klar durchsichtiges Produkt vom Brechungsindex 1,55. Durch seine neutrale Reaktion eignet sich Caedax namentlich nach Färbung mit säureempfindlichen Teerfarbstoffen wesentlich besser als Kanadabalsam, der stets Säure enthält und auch nach Neutralisieren noch nachsäuert (D o m a g k 33). Der Balsam soll die Konsistenz von frischem Honig haben. Zu dickflüssiges Caedax läßt sich durch Zusatz von etwas Xylol leicht wieder auf die richtige Konsistenz bringen. 13*

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D a s Einschließen d e r P r ä p a r a t e

§ 838—840.

Beim Eindecken wird der Objektträger mit dem Schnitt aus dem reinen Xylol oder Toluol genommen und nach kurzem Ablaufenlassen der Flüssigkeit waagerecht auf eine geeignete Unterlage (Filtrierpapierstreifen, Schachteldeckel oder dgl.) gelegt. Sodann wird das Präparat rasch mit einem Tropfen Caedax bedeckt und unter Vermeiden von Luftblasen ein vorher sauber gereinigtes Deckglas aufgelegt. Ein Anhauchen des Präparates ist dabei zu vermeiden, da das sich hierbei niederschlagende Wasser störende Trübungen erzeugen kann. Die Menge des Balsams ist so zu bemessen, daß der Zwischenraum zwischen Deckglas und Objektträger gerade ausgefüllt wird. Im Laufe der Zeit verdunstet das Lösungsmittel des Balsams, wodurch das Deckglas fest auf den Objektträger angekittet wird. Sollte dabei der Balsam den Raum unter dem Deckglas nach einigen Wochen nicht mehr völlig ausfüllen, so setzt man an den betreifenden Rand des Deckglases einen neuen Tropfen Caedax, der dann in die Lücke eindringt. Allenfalls hilft man dabei durch leichtes Erwärmen nach. Um etwaige Unebenheiten des Schnittes auszugleichen und um die Balsamschicht möglichst dünn zu verteilen, was f ü r die Erhaltung der Farben oft zweckmäßig ist, belastet man das Deckglas nach dem Eindecken f ü r 1—2 Tage mit einem kleinen Bleigewicht. Zur Beschleunigung der Erhärtung kann man die eingedeckten beschwerten Präparate auch f ü r einige Tage in den Trockenschrank legen (bei ca. 37° C). G r ö ß e r e Celloidinschnitte, d i e sich leicht e t w a s wellen, k a n n m a n n a c h d e m E i n d e c k e n a u c h m i t H i l f e v o n W ä s c h e k l a m m e r n g l a t t p r e s s e n ( P e t e r s e n 29). Die in C a e d a x e i n g e d e c k t e n P r ä p a r a t e m ü s s e n vollkommen k l a r u n d d u r c h s i c h t i g sein. D a s A u f t r e t e n v o n weißlichen, m i l c h i g e n F l e c k e n o d e r o p a k e r T r ü b u n g d e u t e t auf V e r u n r e i n i g u n g m i t w a s s e r h a l t i g e n S u b s t a n z e n hin. In d i e s e m F a l l e m ü s sen Deckglas u n d K a n a d a b a l s a m d u r c h E i n s t e l l e n i n Xylol w i e d e r abgelöst u n d das P r ä p a r a t zur n o c h m a l i g e n E n t w ä s s e r u n g in a b s o l u t e n Alkohol z u r ü c k g e b r a c h t w e r d e n . 838. G r o a t (39) e m p f i e h l t ein als N e v i l l i t e V b e z e i c h n e t e s K u n s t h a r z als a b s o l u t n e u t r a l e s E i n b e t t u n g s m e d i u m (n -= 1,544; S c h m e l z p . 145—155°, d a h e r s e h r g e e i g n e t f ü r P r o j e k t i o n s p r ä p a rate!). E s w i r d a m b e s t e n in 60°/oiger L ö s u n g i n Toluol a n g e w a n d t .

A b b . 17.

Balsamflasche

839. Als B a l s a m f l a s c h e n b e n ü t z t m a n w e i t h a l s i g e F l a schen m i t ü b e r g r e i f e n d e r a u f g e s c h l i f f e n e r K a p p e (s. A b b . 17), d e r e n Schliff m i t e t w a s G l y z e r i n e i n g e r i e b e n w i r d . I m I n n e r n s t e h t e i n d ü n n e s G l a s s t ä b c h e n , m i t d e m der B a l s a m in T r o p f e n e n t n o m m e n w i r d . (Erhältlich bei W a g n e r u. M ü n z , M ü n c h e n 2, T ü r k e n s t r a ß e 17.)

840. Der natürliche Kanadabalsam (n = 1,541 bis 1,547) ist im Handel in Sirupform oder in Stücken erhältlich. Im letzteren Falle setzt man zu einigen Stücken des trockenen Harzes so viel reinstes Xylol, daß man eine Flüssigkeit von der Konsistenz eines dünnflüssigen Honigs bekommt. Die Lösung geht ziemlich langsam vor sich und läßt sich durch das Einstellen des gut verschlossenen Glases in den Wärmeschrank beschleunigen. Eine nach dem Zusetzen des Xylols manchmal auftretende Trübung verschwindet bei völliger Lösung wieder. Der g e w ö h n l i c h e Kanadabälsam ist wegen seiner sauren Reaktion f ü r viele Färbungen schädlich. Man verwendet am besten den »neutralen« Kanadabalsam von Grübler und Hollborn oder den »zur Glashärte getrockneten reinsten Kanadabalsam« von Merck (Darmstadt).

§ 841—846.

Einschluß in Harze und öle

197

841. Der Kanadabalsam wird in Form eines flüssigen Harzes gewonnen, das sauer reagiert. Zür N e u t r a l i s i e r u n g wird dieser natürliche Kanadabalsam durch Erwärmen dünnflüssig gemacht, mit etwas Kaliumcarbonat in Substanz versetzt und unter Umrühren auf dem Sandbad so lange erhitzt, bis ein auf einen Objektträger gesetzter Tropfen beim Erkalten zu einer glasharten Masse erstarrt. (Verfahren nach C o l u c c i . ) M c C l u o g bringt zur Neutralisierung von Säuren auch in das Balsamglas etwas Natriumcarbonat. 842. Verschiedentlich wird das Ablassen empfindlicher Präparate nach Eindecken in Xylol-Kanadabalsam auf zurückbleibende Xylolreste zurückgeführt. Zur Vermeidung dieses Umstandes werden andere Lösungsmittel vorgeschlagen. R. K r a u s e (26) empfiehlt als bestes Lösungsmittel Terpineol. ( T e r p i n e o l - K a n a d a b a 1 s a m.) Die Lösung des getrockneten neutralen Kanadabalsams in Terpineol erfolgt am einfachsten durch Einstellen des gut verschlossenen Glases in den Paraffinofen; sie benötigt mehrere Tage. 843. L a n g e r o n (25) empfiehlt die E i n b e t t u n g "in t r o c k e n e n K a n a d a b a l s a m nach P. M a s s o n. Bei Anwendung dieser Methode sollen die Färbungen ausgezeichnet erhalten bleiben. Man verfährt dabei folgendermaßen: 1. Die gefärbten, entwässerten und mit Xylol durchtränkten Präparate kommen zunächst für 1—2 Minuten in eine verdünnte Lösung von Kanadabalsam, die durch Auflösung von 1 Teil des natürlichen Kanadabalsams in 5—6 Teilen Xylol bereitet wird. Bei Färbungen mit Säurefuchsin u. dgl. muß diese Lösung mit Salizylsäure gesättigt sein. — 2. Die Präparate werden herausgenommen, abgetropft, horizontal gelegt und unter Staubabschluß bei Zimmertemperatur oder im Trockenschrank getrocknet, bis die die Präparate überziehende dünne Balsamschicht so hart geworden ist, daß sie sich mit dem Fingernagel nicht mehr einritzen läßt, dann gibt man auf ein Deckglas einen Tropfen des natürlichen, sirupdicken, weder mit Xylol noch Toluol verdünnten Kanadabalsam und legt dasselbe auf das Präparat. Schließlich werden die Präparate zur Verteilung des dickflüssigen Balsams in den Wärmeschrank oder auf ein Wärmetischchen gelegt, wobei sie mit 20 Gramm-Gewichten od. dgl. beschwert werden. 844. S a l i c y l s ä u r e - B a l s a m ist Kanadabalsam, dem auf 10 ccm eine »tüchtige Messerspitze« Salicylsäure zugesetzt ist. ( M a s s o n ) . 845. Ebenso wie Kanadabalsam ist auch Dammarharz durch Caedax überholt. Zur Herstellung eines reinen brauchbaren Dammarlackes muß das käufliche Dammarharz (auch das sog. I a gereinigte) gereinigt werden, (n = 1,540.) Ich verfahre dabei unter Verwertung der Angaben von P e t e r s e n (29) folgendermaßen: 100 g gutes Dammarharz werden in einem 2-1-Kolben mit 1 1 reinsten Xylols übergössen und nach Beifügen einiger Siedesteinchen bei 140° eine Stunde lang unter Rückflußkühlung auf dem Sandbad gekocht. Nach Erkalten fügt man 3—4 g gepulverte Tierkohle zu und schüttelt kräftig durch. Hierauf wird die schwarz gefärbte Flüssigkeit auf einige xylolbefeuchtete Faltenfilter (Schleicher-Schüll Nr. 588) verteilt. Die ziemlich rasch durchlaufenden Filtrate werden vereinigt und nochmals durch ein Filter gegeben. Die nun völlig klare, gelblich gefärbte Lösung wird unter entsprechender Vorsicht durch Abdestillieren des überschüssigen Xylols auf etwa 200 ccm eingeengt und nochmals filtriert (Erhitzen auf dem Sandbad unter Vorlegen eines Kühlers, Einstellen von einigen Glaskapillaren in die Lösung zur Vermeidung von Siedeverzug. Das Xylol destilliert bei 132° über; der Vorlaut, der verschiedene Verunreinigungen enthält, wird verworfen). Falls weitere Einengung des Dammarlackes erwünscht ist, stellt man die Lösung noch einige Zeit in einen mit Paraffinschnitzeln beschickten evakuierten Exsikkator. 846. Ein Einschlußmittel mit gutem Brechungsvermögen, bei dem sich Xylol als Lösungsmittel -vermeiden läßt, ist eingedicktes Zedernöl (n = 1,515), wie es

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Das Einschließen der Präparate

§ 847—852.

im Immersionsöl zur Verfügung steht. Es ist darauf zu achten, daß die ölschicht möglichst dünn ist. Sie dickt dann ziemlich bald soweit ein, daß das Deckgläschen vollkommen festhaftet. In Zedernöl halten sich manche empfindliche F ä r bungen wie z. B. Giemsapräparate sehr gut. Auch Osmierungen bleiben in ihm gut erhalten. 847. Das sogen, e i n g e d i c k t e Z e d e r n ö l in Gestalt des allgemein gebräuchlichen Immersionsöles, darf nicht mit dem viel dünnflüssigeren, gewöhnlichen Zedernholzöl verwechselt werden, das man beim Einbettungsvorgang oder bei der ölcelloidintechnik zum Durchtränken der Präparate gebraucht. Man kann beide Ölsorten sehr leicht dadurch unterscheiden, daß man im Reagenzglas ein paar Tropfen des Öles mit der gleichen Menge absoluten Alkohols mischt: Das eingedickte Öl gibt sofort eine flockig-milchige Trübung, während sich das gewöhnliche ö l vollkommen klar mischt.

848. Auch Terpineol ist empfehlenswert. Es greift mit wenigen Ausnahmen auch zarte Färbungen nicht an und ist etwas weniger lichtbrechend als Kanadabalsam (n = 1,483). Auch Benzylalkohol (n = 1,541) läßt sich verwenden. Für silberimprägnierte Präparate ist Terpineol als Einschlußmittel nicht angezeigt, da sie in ihm nach meinen Erfahrungen schon nach wenigen Wochen abblassen können.

Bei den letztgenannten Einschlußmitteln ist eine Umrandung nach § 815, 816 f. oder 818 zweckmäßig. 849. F ü r osmierte Präparate, deren Schwärzung erhalten bleiben soll, eignet sich besonders Paraffinum liquidum (n = 1,482), in das die Präparate aus Xylol, Toluol oder Terpineol übertragen werden. Hierauf Umrandung nach § 815 ff. oder 818. Auch Färbungen mit Azur-Eosin, Thionin, Toluidinblau und ähnlichen Farbstoffen halten sich in Paraffinum liquidum gut. 850. Präparate, bei deren Einschluß sowohl hochprozentiger Alkohol wie Xylol u. dgl. vermieden werden sollen, können aus 80%>igem Alkohol in Euparal übertragen werden, ein in seiner genauen Zusammensetzung unbekanntes Gemisch von Paraldehyd, Eucalyptol, Camsal und Sandarak (bei H o l l b o r n erhältlich). n flüssig = 1,483, nach Erhärten 1,535 (P. M a y e r ) . In Euparal sollen sich auch empfindliche Färbungen (z. B. Giemsapräparate) gut halten. 851. Ähnlich ist ein S a n d a r a k - D i o x a n g e m i s c h ( M c C l u n g 38), in das die Präparate aus Alkohol oder Dioxan ohne weiteres Zwischenmittel eingeschlossen werden. Es trocknet rasch und ist klar und durchsichtig, n etwas niedriger als Kanadabalsam. Zur Bereitung des Gemisches werden ausgesucht reine Stücke von Sandarak in Dioxan gelöst, die Lösung filtriert und konzentriert. Hierauf wird zu 9 Teilen des Konzentrates 1 Teil C a m s a l zugesetzt, filtriert und eingedickt. — Camsal ist eine Mischung von Kampfer und Salol (= Salicylsäurephenylester) in einem Verhältnis, daß etwas Kampfer ungelöst bleibt.

852. A u f h e l l u n g u n d E i n s c h l u ß s e h r d i c k e r S c h n i t t e . Für sehr dicke Schnitte (z. B. 100 bis 500^ und mehr, evtl. bis zu 5 mm) empfiehlt A u r e 11 (42) Kolophoniumgemische mit Alcarin (n = 1,677), einem von Grübler, Leipzig, zu beziehenden synthetischen Harz. Zumeist kommt man mit folgenden 2 Gemischen aus: 1. E i n s c h l u ß m i t t e l m i t n = 1,559: helles, bestes Kolophonium 90 g, Alcarin 10 g. Lösen in Monobrombenzol (Merck). Das Gemisch eignet sich vor allem f ü r die »Epithelgruppe«, die Leber, Niere, Lunge, Hoden, Nebenhoden, Milz, aber auch glatte und quergestreifte Muskulatur umfaßt und deren Brechzahl zwischen 1,556—1,560 liegt. Auch Gehirn (n = 1,555) kann damit eingeschlossen werden. — 2. E i n s c h l u ß m i t t e l n = 1,552: Kolophonium

§ 853—853a.

Einschluß in Harze und öle

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95,4 g, Alcarin 4,6 g. Lösen in Nitrobenzol (Merck). Das Gemisch eignet sich für die »Bindegewebsgruppe« (Coriumbindegewebe, Sehne, Lig. nuchae, auch Myometrium des Uterus). Die einzelnen Harzsorten werden abgewogen, gemischt und dann im betreffenden Lösungsmittel (evtl. bei 37—40° C) zu dicker Sirupkonsistenz gelöst. Der Einschluß erfolgt in der Weise, daß das Präparat mit Rasiermesser oder Gefriermikrotom in Schnitte der gewünschten Dicke zerlegt wird, die dem verfolgten Zweck entsprechend gefärbt werden (z. B. 1 Stunde in Hämatoxylin nach Ehrlich, differenzieren in salzsaurem Alkohol bis das Bindegewebe entfärbt ist, dann einlegen für 1 Stunde in ammoniakalischen 95°/oigen Alkohol; oder Färbung in Carmalaun und differenzieren in Alkohol). Nach der Färbung Entwässerung in steigendem Alkohol, Benzol, abtrocknen mit Filtrierpapier und einlegen in das jeweilige Lösungsmittel des Harzgemisches. Über 1 mm dicke Schnitte werden vor dem Eindecken noch für 1—3 Tage in das betreffende Harzgemisch eingelegt. Schließlich wird eingedeckt und mit Bleigewichten beschwert für einige Tage ii\ den Wärmeschrank gelegt, wobei das verdunstete Lösungsmittel vom Rande her durch Harzgemisch zu ersetzen ist. Manche Organe wie Leber, Milz müssen nach der Fixierung sorgfältig mit H 2 O 2 gebleicht werden. Auch vorherige Entfernung von Glykogen und Gallenpigment kann nötig sein. Nach A u r e 11 (42) werden bei diesem Verfahren verschiedene Mängel, die einer von ihm früher (38) veröffentlichten Methode anhaften, vermieden, z. B. das Nachdunkeln. 853. Aufbewahren mikroskopischer Präparate. Die fertigen Präparate müssen vor Licht und Staub geschützt aufbewahrt werden. A m zweckmäßigsten haben sich mir hiefür die bekannten mit gezähnten Holzleisten versehenen Präparatenschachteln erwiesen, in die jeweils 100 Objektträger senkrecht eingestellt werden können. Die Schachteln sind leicht zu ordnen und staubsicherer als die mit horizontal liegenden Mappen versehenen Kästen, die auch weniger zugänglich sind und mehr Raum beanspruchen. A m unökonomischsten sind Präparatenschränke mit ausziehbaren Schubfächern. Beachtenswert ist der Vorschlag von S e i f r i e d (39) auf die Unterbringung histologischer Schnitte das Maha-Hängeregistraturverfahren sinngemäß anzuwenden. In eine sog. Hängesteckkarte von 36X10 cm können durch entsprechende Kartoneinlage und Abheftung 10 Objektträger senkrecht eingesteckt werden. Die Karten werden in ausziehbare Metallschienen eingehängt und können leicht geordnet werdeH (verschiedene Kartonfarbe, Klemmreiter usw.). In einen Schrank von 55X33X64 cm Größe können etwa 6000 Schnitte untergebracht werden. S e i f r i e d rühmt als Vorzüge dieses Systems u. a. Übersichtlichkeit, bestmögliche Ordnung, Griffbereitschaft, unbegrenzte Erweitungsmöglichkeit ohne Störung der Ordnung, geringe Raumbeanspruchung. Uber eine einfache und zweckmäßige „Präparatekartei", die sich jeder leicht selber herstellen kann, s. J a k o b 43. 853a. Um histologische S c h n i t t p r ä p a r a t e v o n zerbrochenen O b j e k t t r ä g e r n a u f n e u e z u ü b e r t r a g e n verfährt P e t r y (42) folgendermaßen: 1. Entfernen des Deckglases und Kanadabalsams durch Einlegen in Xylol, nachdem der zerbrochene Objektträger durch Überstreichen seiner Rückseite mit »Geiseltalsprimoidlack hell P-1540« (Lackfabrik Springer und Möller, Leipzig-Leutsch) verfestigt wurde. — 2. Absoluter Alkohol. — 3. Herausnehmen und Verdunstenlassen des Alkohols bis die Schnitte ein mattes Aussehen bekommen (aber nicht austrocknen lassen!). —• 4. Auftropfen des dünn-

Das Einschließen der P r ä p a r a t e

200

§ 854—858.

flüssigen »Sprimoidlackes für histologische Zwecke« (gleiche Firma). Trocknenl a s s e n b i s e i n f e s t e r F i l m e n t s t a n d e n ist (ca. 10 S t u n d e n ) . — 5. E i n l e g e n d e s O b j e k t t r ä g e r s i n dest. Wasser, n a c h d e m m a n d e n F i l m a n e i n e r S e i t e e i n w e n i g v o n d e r U n t e r l a g e g e l ö s t hat. N a c h 1—2 S t u n d e n l ä ß t s i c h d e r F i l m d a n n m i t d e n g e s a m t e n S c h n i t t e n r e s t l o s abziehen. — 6. T r o c k n e n des F i l m s z w i s c h e n F i l t r i e r papier. X y l o l . N e u e i n d e c k e n i n B a l s a m .

C . Verschiedenes 854. M e t h o d e v o n S p a 11 e h o 1 z (11, 22) z u m A u f h e l l e n größerer P r ä p a r a t e . Die b e t r e f f e n d e n O b j e k t e w e r d e n in F o r m o l od. dgl. fixiert, s o d a n n gut a u s g e w a s c h e n , mit H 2 0 2 gebleicht, in s t e i g e n d e m Alkohol völlig e n t w ä s s e r t u n d in Benzol ü b e r t r a g e n . N a c h 2—3maligem Wechseln k o m m e n sie in die A u f h e l l u n g s flüssigkeit, die in i h r e r Z u s a m m e n s e t z u n g je n a c h d e m O b j e k t e t w a s wechselt. F ü r e r w a c h s e n e menschliche K n o c h e n n i m m t m a n 5 Gew.-Teile W i n t e r g r ü n ö l u n d 3 B e n z y l b e n z o a t oder 3 W i n t e r g r ü n ö l u n d 1 Isosafrol; f ü r größere m e n s c h l i c h e E m b r y o n e n 2 W : 1 B bzw. 10 W : 5 I; f ü r j ü n g e r e 3 W : 1 B bzw. 27 W : 5 I; f ü r j ü n g s t e 5 W : 1 B bzw. 9 Wi: 1 I. — Das V e r f a h r e n bietet a u c h f ü r s e h r dicke Schnitte, z. B. injizierte P r ä p a r a t e , Vorteile. N a c h d e m die P r ä p a r a t e in d i e Endflüssigkeit, in der sie a u c h eingeschlossen w e r d e n , ü b e r t r a g e n sind, müssen, u n t e r der L u f t p u m p e die in i h n e n e n t h a l t e n e n Benzol- u n d L u f t r e s t e sorgfältig e v a k u i e r t w e r d e n . — B l u t g e f ä ß e w e r d e n häufig v o r h e r m i t g e f ä r b t e n Massen injiziert (s. auch § 1948 ff.). Z u m S t u d i u m d e r Ossifikationsvorgänge e m p f i e h l t sich eine V e r b i n d u n g der L u n d vallschen F ä r b e m e t h o d e (vgl. § 1596 ff.) u n d der Spalteholz-Methode (S. S t o e c k l i 22).

855. Als E n d f l ü s s i g k e i t k a n n m a n s t a t t Wintergrünöl, Isosafrol u n d Benzylbenzoat nach D r a h n a u c h eine Mischung v o n T e t r a 1 i n u n d N a p h t h a l i n v e r w e n den. M a n löst dazu 32 g N a p h t h a l i n in 100 ccm T e t r a l i n u n t e r E r w ä r m e n u n d läßt d a n n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r stehen. Ein Teil des N a p h t h a l i n s fällt a u s ; die d a r ü b e r stehende Flüssigkeit (n = 1,561) e n t h ä l t ca. 25°/o N a p h t h a l i n . D u r c h weiteres V e r d ü n n e n m i t T e t r a l i n g e w i n n t m a n d a n n eine Flüssigkeit von e n t s p r e c h e n d e r B r e chungszahl (5°.'oig: n = 1,549; 10°/oig: n = 1,554; 20°/oig: n = 1,558). 856. L j e t n i k v e r w e n d e t Xylol m i t Zusatz von N a p h t h a l i n . B r e c h u n g s i n d e x mit 10°/o N a p h t h a l i n : n = l,5095,jnnit 20°/o: n = 1,5225, mit 30°/o: n = 1,531, gesättigt n : = 1,5391; im letzten w i r d menschliche H a u t a m b e s t e n aufgehellt. 857. Z u m V e r s c h l u ß d e r S a m m l u n g s g e f ä ß e e m p f i e h l t D r a h n ü b e r die G l a s ö f f n u n g eine K a p p e von s t a r k e m P a p i e r zu stülpen, d e r e n seitlich ü b e r f a l l e n d e R ä n d e r m i t S y n d e t i k o n an d e n G l a s w ä n d e n festgeklebt w e r d e n . D a r ü b e r k o m m t eine z u m oberen G e f ä ß r a n d passende Glasscheibe, die d u r c h einen u m gelegten L e u k o p l a s t s t r e i f e n befestigt wird. D u r c h Uberziehen d e s letzteren mit einem geeigneten L a c k k a n n der Verschluß noch weiter abgedichtet w e r d e n . 858. Z u r Konservierung anatomischer Präparate i n ihrer E i g e n f a r b e sind besonders die Gemische v o n Kaiserling oder Jores zu empfehlen. A m vorteilh a f t e s t e n ist zur Zeit die A n w e n d u n g der J o r e s s c h e n F l ü s s i g k e i t i n V e r b i n d u n g m i t e i n e r v o r h e r i g e n S ä t t i g u n g mit L e u c h t g a s n a c h A . S c h u l t z (s. § 861). M e t h o d e von Kaiserling: F i x a t i o n in F o r m a l i n 200 ccm; Wasser 1000 ccm; K a l i u m nitric. 15 g; Kai. acetic. 30 g. Nach 1 bis m e h r e r e n Tagen b e h a n d e l t , m a n ohne A u s w a s c h e n in 80°/oigem Alkohol, bis die B l u t f a r b e w i e d e r h e r g e s t e l l t ist. D a n n ü b e r t r ä g t m a n in ein Gemisch von destilliertem Wasser 2000 ccm; K a l i u m acetic. 200 g; Glyzerin 400 ccm. Ein Z u s a t z von 2 ccm Acid. carbol. l i q u e f a c t - auf 1 1 v e r h i n d e r t d a s A u f t r e t e n von Schimmelpilzen. E i n e n z u s a m m e n f a s s e n d e n Rückblick ü b e r die Ergebnisse der M e t h o d e findet m a n bei K a i s e r l i n g (22).

§ 859—865.

Einschluß makroskopischer Präparate

201

859. Ein Teil des Kalium aceticums der definitiven Lösung läßt sich nach E. H o m a n n (25) durch das billigere Natr. sulfur. crudum ersetzen (dest. Wasser 1000 ccm, Kai. acetic. 35 g, Natr. sulf. crud. 65 g, Glyzerin 1000 ccm). 860. Jores (13) fixiert mehrere Tage bis Wochen in: künstlichem Karlsbadersalz 50 g, Formol 50 ccm; wässer. Chloralhydratlösung (1:1 D i e t r i c h ) 50 ccm; Wasser 1000 ccm. (Im Sommer am besten im Eisschrank.) Nach 6—24stündigem Auswaschen kommen die Stücke in Kalium acetic. 300 g, Glyzerin 600 ccm, dest. Wasser 1000 ccm. — Ein Vorteil dieser Flüssigkeit ist, daß sie infolge des Fehlens von Alkohol auch nach Jahren noch die Vornahme von Fettfärbungen gestattet ( D i e t r i c h ) . 861. A. S c h u l t z (28, 31) führt das Hämoglobin der Präparate durch Einwirkung von Kohlenoxyd in das sehr beständige CO-Hämoglobin über und erreicht damit, daß die Blutfarbe der Präparate noch besser erhalten bleibt als bei den bisherigen Verfahren. Eine nachträgliche Alkoholbehandlung erübrigt sich. Zur Ausführung der Methode sättigt man die zur Fixierung benutzte Kaiserlingsche oder besser Joressche Flüssigkeit vor dem Einlegen der Präparate mit Kohlenoxyd. Die Präparate bleiben je nach Größe Tage bis Wochen in der ersten Flüssigkeit, werden dann einige Stufiden in fließendem Wasser gewässert und schließlich in die Aufbewahrungsflüssigkeit übertragen (Glyzerin 600 ccm, Natr. acetic. 300 ccm, Wasser 1000 ccm). Da sich die durch Kohlenoxyd bewirkte schöne Farberhaltung naturgemäß nur auf die oberflächlichen Gewebsschichten erstreckt, müssen die Präparate schon vor der Konservierung so zugeschnitten werden, wie man sie dauernd aufzubewahren wünscht. Die Sättigung der Flüssigkeit mit CO erfolgt am einfachsten in der Weise, daß man eine mit durchbohrtem Stopfen und Zuleitungsrohr versehene Flasche zur Hälfte mit der Flüssigkeit füllt, mit einem Gummischlauch an die Leuchtgasleitung anschließt, den Hahn öffnet und die Flüssigkeit unter Gasdruck 5 Minuten lang kräftig durchschüttelt. Die von S c h u l t z angegebenen Vergasungsapparate sind bequem, aber, zumal bei kleineren Mengen, entbehrlich. 662. Löst man in der erwärmten Konservierungsflüssigkeit 4°/o Gelatine, so kann man das Medium nach Einlegen des Präparates durch Abkühlen zum Erstarren bringen (Methode der Plattenpräparate, T a l a j e w , E. H o m a n n , V e r n e s , C. K r a u s e 30). Über Konservierung in Zucker siehe T a n d 1 e r (26). 863. Zur M o n t a g e d e r k o n s e r v i e r t e n P r ä p a r a t e eignen sich vor allem Celluloidplatten, die durchsichtig, weiß und schwarz erhältlich sind (Stärke meist 1 mm, nur für umfangreiche Präparate 2 mm). Celluloid ist in der Mehrzahl der gebräuchlichen Aufbewahrungsflüssigkeiten, wie Kaiserling, Jores, Formol, Glyzerin, Tetralin unlöslich. In Alkohol, Benzol oder Wintergrünöl liegende Präparate müssen dagegen auf Glas montiert werden. Celluloid läßt sich leicht schneiden, und über ein erhitztes Stahlrohr beliebig biegen. Celluloidteile können durch einen Tropfen Essigäther leicht und rasch verklebt werden (weiteres bei S p a n n e r 26). 864. K i t t z u m V e r s c h l u ß d e r S a m m l u n g s g l ä s e r : Wachs + Kolophonium 8ä, dazu einige Tropfen Glyzerin. Man bestreicht den trockenen Rand des Gefäßes 2—3-mm dick mit dem durch Erwärmen flüssig gemachten Kitt und legt die gleichfalls erwärmte Glasplatte auf, die dann einige Tage mit Gewichten beschwert wird. Zuletzt evtl. noch Lacküberzug. —• Auch P i c e i n läßt sich gut als Kitt verwenden. 865. C. K r a u s e (30) empfiehlt als widerstandsfähigen Kitt für Glas auf Glas, Glas mit Holz oder Metall eine steife Paste aus Zinkoxyd und Bernsteinlack. Die Konsistenz läßt sich durch größeren oder kleineren Zusatz von Bernsteinlack dem jeweiligen Zweck aufs beste anpassen. Auftragen mit dem Finger.

202

Korrosions- und Trockenpräparate

§ 866—867.

13. K A P I T E L

Herstellung mikroskopischer Korrosions- und Trockenpräparate 866. Zur Darstellung von Hohlräumen innerhalb irgendwelcher Organe, wie z. B. von Nierenbecken, Lungenalveolen, Drüsengängen, Gefäßen, läßt sich neben der in § 854 angegebenen Spalteholzmethode häufig mit besonderem Erfolg auch das Korrosionsverfahren benutzen, das in neuerer Zeit durch das von S c h u m m e r (35) in die Technik eingeführte » P 1 a s t o i d « ganz wesentlich verbessert wurde. Durch dieses neue Mittel dürften alle älteren Verfahren überholt sein. Ein besonderer Vorteil des Plastoids liegt in seiner hohen Geschmeidigkeit und Gleitfähigkeit, dank welcher sich die feinsten Hohlräume füllen lassen, in seiner geringen Schrumpfung und in seiner Resistenz im erhärteten Zustand. Plastoid ist eine polymerisierbare Vinylverbindung, die in monomerem Zustand eine mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit von spez. Gew. 0,946 darstellt. Sie kann durch Erwärmen in Gegenwart von Katalysatoren über dickflüssigen Zustand in festen Zustand (spez. Gew. 1,18) übergeführt werden. In fester Form ist es gegen Laugen wie Säuren jeder Konzentration völlig widerstandsfähig. Bei etwa 100° C wird das verfestigte Material plastisch, so daß es beliebig geformt werden kann. Das Plastoid wird in verschiedenen Farben von der chemischen Fabrik R ö h m und H a a s , Darmstadt, geliefert. Anwendung: Zunächst ist es nötig, dem dünnflüssigen monomeren Plastoid die für das betreffende Objekt nötige Konsistenz zu geben. Man versetzt dazu eine bestimmte Menge mit der in der Gebrauchsanweisung angegebenen Menge eines Katalysators und gibt die Flüssigkeit in einen nicht zu kleine^ Rundkolben (300 ccm z. B. in 1-1-Kolben). Nach Aufsetzen eines Rückflußkühlers' wird der Kolben in einem Ölbad langsam erhitzt und bei 130—140° C unter steter Beobachtung gekocht, bis die Flüssigkeit zur gewünschten Konsistenz (meist honigartig) eingedickt ist. Dann muß, um weiteres Eindicken zu vermeiden, rasch abgekühlt werden. Die fertige Masse, die monatelang unverändert bleibt, muß in braunem Glas und kühl aufbewahrt werden. Sie kann auch mit frischem Plastoid wieder verdünnt werden. Die Masse wird in kältem Zustand in die kalten oder lebenswarmen Organe injiziert, am besten mit einer nicht über 20 ccm fassenden Rekordspritze, in die die Masse nicht eingesaugt, sondern nach Herausnahme des Kolbens von oben her eingeschüttet wird. Nach der Injektion wird das Organ in ein mit warmem Wasser (35° C) gefülltes, gut verschließbares Glasgefäß gebracht, wobei die Temperatur nach einigen Stunden auf 40—45° C erhöht wird. Um Schrumpfung zu vermeiden, wird dem Wasser etwas Kalilauge zugesetzt. Nach 12—24 Stunden besitzt die Masse celluloidartige Festigkeit. Hierauf werden Weichteile in 25°/oige Kalilauge, Knochensubstanz in konz. oder verdünnter Salzsäure korrodiert. Zuletzt Abspülen der korrodierten Teile und gründliches Wässern. Die so gewonnenen Präparate sind mechanischen und thermischen Einflüssen gegenüber wenig empfindlich und können ohne weitere Nachbehandlung aufbewahrt werden. Störende weißliche Flecken lassen sich durch Bepinseln mit unverdünntem Plastoid leicht beseitigen. Mpntage mit in Aceton gelöstem Celluloid. Das Instrumentarium kann mit Benzol, Aceton, Chloroform u. dgl., worin Plastoid leicht löslich ist, gereinigt werden. Um die Durchsichtigkeit des Plastoids zu beseitigen fügt S p a n n e r (37) der Masse eine geringe Menge Deckweiß zu. 867. Herstellung von Trockenpräparaten zur Betrachtung der Oberflächengestaltung mit dem Binokularmikroskop. S c h m e l z e r (33) übertrug das alte

§ 868—869a.

Korrosions- und Trockenpräparate

203

S e m p e r s c h e Verfahren auf mikroskopische Präparate. Die in § 867 und 868 angegebenen Verfahren können für eine Reihe von Fragestellungen und namentlich auch für Unterrichtszwecke mit Vorteil verwertet werden und oft mühsame Rekonstruktionen ersparen. Die Methode sei am Beispiel der Dünndarmschleimhaut kurz dargelegt.

Ausführung: Ein Darmstück von 3—4 cm Länge wird aufgeschnitten, in physiolog. Lösung sorgfältig abgespült, auf Korkplatte gespannt, in Formol fixiert, nach 6 bis 12 Stunden für ebensolange Zeit in 95°/oigen Alkohol übertragen und unter ständiger Benetzung mit Alkohol in kleinere Stücke (1—3 cm) zerschnitten. Abziehen von Muskularis und Abtragen der Submucosa. Hierauf gründlichst entwässern, 1—2 Tage Karbolxylol, dann Xylol-Terpentin (2:1) und reines Terpentin. Aufstecken auf Korkplatte (Schleimhaut nach oben). Nun werden drei ca. 5 cm lange Nadeln in die Schichtseite der Korkplatte gesteckt, diese wie ein Dreifuß auf ein Asbestdrahtnetz gestellt und so die Scheibchen bei mäßiger Hitze über kleiner Flamme in ca. V» Stunde getrocknet. D i e T r o c k n u n g m u ß g a n z a l l m ä h l i c h u n d a l l s e i t i g g l e i c h m ä ß i g erfolgen. Die nun kreideweiß aussehenden, eine mürbledrig-bröckelige Konsistenz besitzenden Scheibchen werden vorsichtig - abgenommen und auf schwarz glänzender Unterlage (schwarzes Glas, Ebonit od. dgl.) mit etwas Leim montiert. Dann Aufkleben eines entsprechenden Schutzrahmens aus Pappe und Darüberkleben eines Deckglases. Betrachtung mit Binokular bei 50—70facher Vergrößerung zeigt die Zotten »wie aus weißem Marmor gemeißelt in den verschiedensten Stellungen«. Von Natur gefärbte Gebilde sind auf weißer Unterlage zu montieren.

868. Zur Erzielung einer P l a s t i k m i t d u r c h s c h e i n e n d e r O b e r f l ä c h e (z. B. für Darstellung der Magengrübchen) wird das Präparat zunächst wie in § 867 behandelt und dann ganz vorsichtig mit dünnem Balsam befeuchtet, wodurch sich das Bild in überraschender Weise ändert. 869. Herstellung von Oberflächenpräparafen mit Hilfe der Adhäsionsmethode nach J . W o l f (39a—c). 1. Die Oberfläche des zu untersuchenden Gegenstandes wird (am besten mit der Fingerbeere) mit einer Lösung von Celluloid oder Celloidin in Aceton rasch und in nicht zu dicker Schicht bestrichen. W. verwendet eine Celluloidlösung »Rellon« (erhältlich bei A. K a s p a r , Prag VII, Sternberkova 8). — 2. Trocknenlassen, was 1/2—1 Min. dauert (nicht anblasen, damit das Häutchen nicht weißlich wird!). — 3. Abheben der getrockneten Celloidinschicht mittels eines mit einer klebenden Oberfläche aus Kautschuk und Harz versehenen Cellophanstreifens (»Durex«, von Durex Abrasives Corporation, New York, 82 Beaver St., USA.). — 4. Auflegen des Cellophanstreifens auf einen Objektträger. Beim Auflegen des Cellophanstreifens in 3. und 4. muß dieser, um das Auftreten von Luftblasen zu vermeiden, von einem zum anderen Ende fortschreitend angedrückt werden. — Die Untersuchung erfolgt im durchfallenden Licht bei starker Abbiendung oder unter seitlicher Verschiebung des Beleuchtungsapparates. Die Methode liefert das reine Celloidinreliefbild der Oberfläche trockener oder auch feuchter Objekte. In besonderen Fällen (z. B. Epidermis) können durch das Celloidinhäutchen auch die oberste Zellschicht oder einzelne Zellen abgehoben und evtl. auf einen Objektträger abgeklatscht und gefärbt werden. 869a. Zur M a z e r a t i o n v o n S k e l e t t e i l e n dient folgendes Verfahren: 1. Wegschneiden der gröberen Weichteile. — 2. Einlegen in Antiformin (5 Teile auf 100 Teile Wasser) bei 60° C je nach der Größe 2—12 Stunden (für Skelette kleiner Tiere wie Maus, Ratte genügen schon 2—4 Stunden, für einen menschlichen Schädel 10—12 Stunden). — 3. Entfernen der mazerierten Weich-

204

Rekonstruktionsmethoden

§ 870—871.

teile in heißem Wasser durch Abspritzen, vorsichtiges Abbürsten usw. — 4. Auswaschen in fließendem Wasser 24 Stunden. — 5. Entleimen in 2°/oiger Sodalösung 6—12 Stunden (bei kleinen Knochen unnötig). — 6. Auswaschen in fließendem Wasser 24 Stunden. — 7. Bleichen in 2°/oigem Wasserstoffsuperoxyd 12—24 Stunden. — 8. Auswaschen in Wasser und Trocknen. — 9. E n t f e t t e n in Xylol bei 60° C 24 Stunden oder besser in einem Extraktionsapparat, z. B. Soxleth m i t Benzol. — 10. Trocknen. Zu langes Behandeln mit Antiformin ist zu vermeiden, da sich sonst die Nähte lösen und die Knochensubstanz brüchig wird. Antiformin ist eine im Handel erhältliche alkalische Natriumhypochloritlösung, die 7,5°/o freies Ätznatron und 5,3% gebundenes Chlor enthält. Für Mazerationszwecke genügt Rohantiformin. Eingehenderes über Mazeration bei S c h m o r 1 (28) und K a e w e l (31). 14. KAPITEL

Rekonstruktionsmethoden 870. Eine k ö r p e r l i c h e A n s c h a u u n g d e r z e l l i g e n E l e m e n t a r t e i l e läßt sich meist leicht aus e i n und d e m s e l b e n S c h n i t t e durch sukzessives Einstellen der aufeinanderfolgenden optischen Durchschnittsebenen gewinnen; wo dies wegen der Ungewöhnlichen F o r m oder Ausdehnung der Elementarteile Schwierigkeiten macht (z. B. Purkinjesche Zellen der Kleinhirnrinde), da h i l f t die Kombination von Bildern, die m e h r e r e n , verschied e n o r i e n t i e r t e n Schnitten entnommen sind. Schwieriger wird das Gewinnen k ö r p e r l i c h e r (dreidimensionaler) A n schauungen mitunter schon bei den sich zunächst aus Zellen a u f b a u e n d e n O r g a n u 1 i s ; — w u r d e n doch die Endteile vieler Drüsen nach den einzelnen Schnittbildern lange Zeit fälschlich als »azinös« (beerenförmig) bezeichnet, w ä h rend es in Wirklichkeit längere, mannigfach hin- und hergebogene und ausgebauchte Schläuche sind. In vielen solchen Fällen bringt die Benutzung stark aufgehellter Dickschnitte namentlich nach der von A u r e 11 ausgearbeiteten Methode (s. § 852) Klarheit. Auch die bei der älteren Histologenschule vielgebrauchten Mazerationsmittel (Holzessig, Salzsäure, starke Alkalien u. dgl. mehr) können mit Vorteil zur Ermittlung der Form benutzt werden. Ebenso die in § 866—>-868 angegebenen Verfahren. Es bleibt aber noch eine große Anzahl von anatomischen und namentlich von embryologischen Objekten übrig, die einerseits zu klein und von zu komplizierter F o r m sind, als daß sich von ihnen durch P r ä p a r a t i o n und direkte Bet r a c h t u n g mit der Lupe oder mit schwachen Mikroskopvergrößerungen eine ausreichende körperliche (plastische) Vorstellung e r w e r b e n ließe, die aber andererseits viel zu groß und wieder zu kompliziert sind, als daß aus einzelnen Schnitten oder aus Mazerationspräparaten ihre F o r m (namentlich auch die der Binnenräume) richtig erschlossen w e r d e n könnte. In diesen Fällen ist man gezwungen, eine R e k o n s t r u k t i o n solcher Gebilde aus den Bildern, die die aufeinanderfolgenden Schnitte einer Serie gewähren, auszuführen. 871. Die Rekonstruktion kann' entweder eine f l ä c h e n h a f t e (rein zeichnerische) sein, bei der die Tiefendimension n u r durch V e r k ü r z u n g u n d Schattier u n g in der Fläche einigermaßen dargestellt wird, oder sie ist eine k ö r p e r l i c h e — plastische. In beiden Fällen wird die Rekonstruktion wohl immer

§ 872—873.

Graphisch? Rekonstruktion

205

mit einer mehr oder weniger erheblichen V e r g r ö ß e r u n g verbunden sein. Wie leicht verständlich, erscheint die zeichnerische Rekonstruktion häufig n u r als ein provisorisches Hilfsmittel, das auf leichtere Fälle beschränkt werden muß. Alle Rekonstruktionsmethoden sind mühsam und zeitraubend; man vermeide sie also, w e n n m a n mit anderen Hilfsmitteln, m i t Präparation, Mazeration, Injektion, Korrosion usw. auskommt; anderseits k ^ n n nicht genug davor gewarnt werden, sich auf die vielfach beliebte »Rekonstruktion im Kopfe« (aus den Schnittbildern) bei irgendwelchen schwierigen Objekten zu verlassen. Außerd e m liefern namentlich die plastischen Rekonstruktionen vergrößerte und d a r um leichter d e m o n s t r a b l e Präparate. 872. D i e V o r a u s s e t z u n g j e d e r R e k o n s t r u k t i o n ist die Herstellung einer lückenlosen Serie von p a r a l l e l e n S c h n i t t e n durch das Objekt, — eine Forderung, die mit allen modernen Mikrotomen verhältnismäßig leicht zu erfüllen ist. Meist w i r d die Serie gleichmäßig dick sein; — doch k a n n es sich in besonderen Fällen empfehlen, zwischen dickere Schnitte in bestimmten Abständen einen halb so dicken einzuschalten. U n t e r allen Umständen m u ß die S c h n i t t d i c k e jedes einzelnen.Schnittes b e s t i m m t und b e k a n n t sein; man wähle je nach der Größe und Schneidbarkeit des Objekts .Schnittdicken von 6, 8, 10, 12, 15 oder 20 /.i. Die S c h n i t t r i c h t u n g ist zwar theoretisch beliebig, in praxi aber ist meist eine zu der Hauptachse des Objekts parallele oder senkrechte Richtung zu bevorzugen. Paraffineinbettung ist der Celloidineinbettung durchaus vorzuziehen. Als ideale Methode f ü r Rekonstruktionsserien bezeichnet v. A p ä t h y die Einbettung in ö l g e l a t i n e (nach § 468). U n t e r allen Umständen müssen die Schnitte in richtiger Aufeinanderfolge ganz g l a t t — ohne irgendwelche Verschiebung (auch von ringsum isolierten Teilen!), ohne Verzerrung und Faltenbildung auf den O b j e k t t r ä g e r aufgelegt und aufgeklebt werden. Die h i e r f ü r gebräuchlichen und empfehlenswerten V e r f a h r e n siehe § 535, 546, 557 und 563. Die Zuverlässigkeit und Schönheit jeder Rekonstruktion hängt durchaus von der Vollkommenheit der Schnittserie ab; m a n v e r s c h w e n d e keine Mühe und Zeit mit R e k o n s t r u k t i o n s v e r s u c h e n aus lückenhaften, ungleichen und schlecht aufgelegten Serien! 873. M e t h o d e n der graphischen Rekonstruktion: 1. D i e H e r s t e l l u n g e i n e s B i l d e s , d e s s e n F l ä c h e senkr e c h t z u r S c h i t t e b e n e der S e r i e l i e g t ( p r o j e k t i v e R e k o n s t r u k t i o n n a c h H i s , das älteste und auch jetzt noch vielfach und mit Erfolg benützte Verfahren). A u f g a b e : Es sei das Bild der Organe eines kleinen menschlichen Embryos im M e d i a r i s c h n i t t e nach einer gleichmäßigen Querschnittserie von 20 a Dicke in 50facher Vergrößerung herzustellen. — Lösung: Von dem in Zedernholzöl od. dgl. liegenden, aufgehellten, im Stück gefärbten Embryo werden möglichst vielseitige Zeichnungen oder Lichtbilder bei geeigneter (z. B. 5- oder lOfacher) Vergrößerung abgenommen; für unser Beispiel ist eine genaue P r o f i l z e i c h n u n g notwendig. (Die Zeichnungen sind womöglich, während der Embryo im flüssigen Paraffin liegt, zu wiederholen.) Jeder Schnitt der 20 ß dicken Querschnittserie ist bèi 50facher Vergrößerung zu zeichnen, um diesen Zeichnungen die nötigen Maße direkt entnehmen zu können. Arbeitet man a) ohne Richtebene (siehe § 874), so muß die Schnittrichtung genau bekannt sein, — oder dieselbe muß durch Vergleich der Lage bestimmter Punkte

206

Rekonstruktionsmethoden

§ 874—875.

in den Schnitten und im Profilbilde aufgesucht und in dieses eingetragen werden. Arbeitet man b) mit Richtebene, so ist die genaue Fixierung der Schnittrichtung entbehrlich. Ad. a) Eine Pause der auf 50mal gebrachten Profilzeichnung wird so auf »Millimeterpapier« geklebt, daß die Querlinien des Papiers der bekannten oder nachträglich bestimmten Schnittrichtung genau parallel laufen; nun numeriert man die Querlinien vom Kopfende an, entsprechend den Schnittnummern und trägt auf jeder Linie die Abstände, die die Organe auf der 50fach vergrößerten Zeichnung des zugehörigen Schnittes in der Medianlinie vom Umriß der Profilzeichnung und voneinander zeigen, ab. Die Verbindung der entsprechenden Punkte gibt dann den Umriß der betreffenden Organe im Medianschnitte. Ad. b). Die Medianlinie jedes 50mal vergrößerten Schnittbildes wird so weit verlängert, bis sie die mitgezeichnete Richtlinie schneidet. Die Medianschnittpunkte der Richtlinien werden in der Reihenfolge der Schnitte auf einer Senkrechten des Millimeterpapiers markiert und numeriert. Die Abstände, welche die Umrißlinien und die Organe in der Medianlinie auf den 50mal vergrößerten Zeichnungen von diesen Punkten zeigen, werden an den zugehörigen Horizontalen des Millimeterpapiers abgetragen und die entsprechenden Punkte der aufeinanderfolgenden Linien miteinander verbunden. Bei diesem Verfahren entsteht der Umriß des ganzen Embryos erst nachträglich, zugleich mit den Umrissen der Organe bei der Konstruktion des Medianschnittes. Es ist klar, daß sich nach dieser Methode auch laterale Teile, auf die Medianebene projiziert, darstellen lassen, so daß man z. B. nicht nur den Umriß, sondern auch annähernd das abschattierte Tiefenbild der median durchschnittenen Organe herstellen kann. In gleicher Weise lassen sich auch Lateralansichten, Frontalschnitte, Frontalaufsichten usw. aus einer Querschnittserie gewinnen. Nach einer solchen zeichnerischen »Durcharbeitung« einer Serie in den verschiedensten Schnitten und Aufsichten ging H i s daran, das betreffende Objekt (oder bestimmte Organe desselben), unter stetiger Berücksichtigung der den Schnittbildern entnommenen Maße, »frei« zu modellieren — ein Verfahren, das trotz ausgezeichneter Resultate in den Händen seines Autors wegen der hohen Anforderungen, die es bei mannigfachen subjektiven Fehlerquellen an das künstlerischtechnische Geschick des Arbeiters stellt, kaum Nachahmung gefunden hat. 874. 2. Die „graphische Isolierung" nach K a s t s c h e n k o (86, 87, 88). Vorausgesetzt ist, daß das Objekt im Paraffin von ihm dicht anliegenden, sich winklig schneidenden und zur Schnittebene senkrechten „Definierflädien" umgeben ist, oder daß sich neben demselben eine »Richtfläche, mit Richtleisten« (siehe § 879) befindet. Nicht selten läßt sich die Richtlinie durch in ihrer Lage gut charakterisierte Gebilde des Präparates wie Nerven, Gefäße od. dgl. ersetzen. Ausführliches über die Technik der graphischen Rekonstruktion ohne Richtlinie bei L e b e d k i n (26). Die vergrößerten Schnittbilder der »graphisch zu isolierenden Organe« werden der Reihenfolge nach übereinander auf Karton gezeichnet, wobei aber dafür gesorgt wird, daß sich jedesmal die Durchschnittslinie der Definierflächen, resp. die gezackten Richtlinien, genau decken. Man beginnt dabei das Organ von der dem Zeichner zugekehrten Seite aus zu zeichnen. Die Konturen, die von schon gezeichneten überdeckt werden, zieht man nicht aus. So entsteht ein richtig orientiertes System um- und nebeneinander gelagerter Umrißlinien, nach denen sich die A u f s i c h t a u f d a s O r g a n s e n k r e c h t z u r S c h n i t t e b e n e leicht entsprechend schattiert herstellen läßt. 875. P e t e r hat eine Methode ausgearbeitet, mit deren Hilfe die graphische Rekonstruktion ohne Schwierigkeit auch in einer beliebigen Schrägansicht gelingt. Ausführliches siehe bei P e t e r 22, 27.

§ 876—879.

Plattenmodelliermethoden

207

876. Auch L e b e d k i n (26, 28) gibt eingehende Anleitung zur Technik der Projektionsrekonstruktion unter beliebigem Winkel zur Schnittfläche. Nach dem von ihm angegebenen Verfahren gelingt auf graphischem Wege auch die Herstellung von Bildpaaren zu stereoskopischer Betrachtung (stereoskopische Rekonstruktion). Vgl. auch die Kritik von T h o m e e . Ein sehr vielseitiges Verfahren zur perspektivischen, graphischen Rekonstruktion, das Bilder in fast jeder beliebigen Blickrichtung und in jedem beliebigen Winkel zur Schnittebene der Serie gestattet, wurde von L i s o n (36) entwickelt. 877. In manchen Fällen, z. B. zur Rekonstruktion des Verlaufes von Nervenfasern ist es von Vorteil, ein durchsichtiges Modell herzustellen ( P l a t t e n d i a g r a m m ) ; man zeichnet in diesem Fall die einzelnen Schnitte auf Glas-, Celluloid- oder Gelatineplatten, die in entsprechender Reihenfolge hintereinandergereiht werden (historische Darstellung der Methodik bei T h o m e e (28), der auch die Glasrekonstruktion und den durch den Brechungsindex bedingten Fehler bespricht). Auch d ü n n e Cellophanfolien, die m a n nach dem Zeichnen auf Glas aufzieht, sind sehr brauchbar. Die Methode w u r d e von R o i s h o v e n (37) f ü r die stark vergrößerte Wiedergabe kleinster Gewebsbezirke ( » h i s t o l o g i s c h e G e w e b s r e k o n s t r u k t i o n«) sehr zweckmäßig weiterentwickelt (»C e l l o p h a n - S c h i e b e m o d e l l e«). 878. F ü r plastische Rekonstruktionen wird allgemein die Plattenmodelliermethode ( B o r n ) benutzt. Ihr hoher Wert f ü r embryologische Untersuchungen, die meist n u r eine 30bis lOOfache Vergrößerung erfordern, ist unbestritten. Die Methode arbeitet aber auch bei stärkeren Vergrößerungen, wie sie f ü r histologische Untersuchung oft notwendig sind, entgegen den Angaben mancher Autoren einwandfrei, wenn gewisse Vorbedingungen beachtet werden. Das Wichtigste ist dabei das vorherige, oft sehr zeitraubende, genaue Durcharbeiten der Serie unter Anlegen fortlaufender Skizzen oder Lichtbilder. Genaueres hierüber bei P e t e r (42). Das Prinzip der Plattenmodelliermethode ist folgendes: Aus jedem Schnitt einer gleichmäßigen Serie werden die Teile, die m a n plastisch rekonstruieren will, in einer bestimmten Vergrößerung auf Wachsplatten aufgezeichnet, deren Dicke dem P r o d u k t Schnittdicke X Vergrößerung entspricht, Die interessierenden Teile w e r d e n dann aus den P l a t t e n herausgeschnitten und die Ausschnitte der Reihenfolge nach aufeinander geklebt. Geschieht dies in der richtigen Weise — ohne seitliche Verschiebungen, — so muß, nachdem die Stufen zwischen den R ä n d e r n der Platten geglättet sind, ein i n a l l e n drei Dimensionen richtig vergrößertes plastisches Abb i l d des durch die Schnittserie zerlegten Objekts herauskommen. Nehmen wir zur Erläuterung ein ähnliches Beispiel wie oben: — Aus der gleichmäßig 20 ti dicken Querschnittserie durch einen kleinen menschlichen Embryo sei der Darmkanal 50mal vergrößert plastisch zu rekonstruieren. — Man hat dazu die Durchschnittsfigur des Darmkanals aus jedem Schnitte in 50facher Vergrößerung auf 50X20 u, d. h. 1 mm dicke Platten, aufzuzeichnen. Die richtig übereinander geklebten Ausschnitte der Durchschnittszeichnungen des Darmes aus diesen Platten ergeben die 50mal vergrößerte, plastische Rekonstruktion des Organs. 879. R i c h t f l ä c h e m i t R i c h t l e i s t e n . Wenn man nicht nach einer fertigen Serie modellieren muß, ist es empfehlenswert, am Paraffinblock dicht neben dem Objekt eine zur Schnittebene senkrechte R i c h t e b e n e mit ebenso senkrechten R i c h t l e i s t e n anzubringen, die später mit einem entsprechenden Lacküberzug versehen werden. "Man erhält dadurch auf jedem Schnitt eine neben dem P r ä p a r a t liegende g e z a c k t e R i c h t l i n i e , die zum Ausrich-

208

Rekonstruktionsmethoden

§ 880.

ten der einzelnen Schnittbilder dient (s. unten). Die Herstellung von Richtebene und Richtlinien erfolgt entweder bei der Einbettung nach dem Verfahren von B o r n (98) und P e t e r (99), oder durch nachträgliches Beschneiden und Ritzen des Blockes. 880. H e r s t e l l u n g d e r R i c h t l i n i e n n a c h B o r n - P e t e r , a) Bei Paraffineinbettung. Man verwendet dazu zweckmäßig die von Z e i s s hergestellte Richtplatte nach B o r n - P e t e r , die aus zwei Glaswinkeln und einer Glasrundplatte besteht. Die letztere ist auf der, der Einbettungskammer zugekehrten Seite mit feinen, parallel verlaufenden Furchen versehen, die später am Paraffinblock entsprechende Leisten erzeugen. Vor Gebrauch werden Grundplatte und Glaswinkel zunächst sehr sorgfältig mit Alkohol und dann mit Chloroform gereinigt und mit einer Spur AlkoholGlyzerin eingerieben. Dann stellt man den zusammengesetzten Apparat V2 bis 1 Stunde vor dem Einbetten zur Erwärmung in den Paraffinofen. Unmittelbar vor der Einbettung füllt man die Kammer mit Paraffin, das auf 68—70° C erhitzt ist, überträgt das einzubettende Objekt und orientiert es in entsprechender Weise nach den am Boden der Grundplatte sichtbaren, sich rechtwinklig überkreuzenden schwarzen Linien. Dabei hat man zu berücksichtigen, daß das Objekt später so aufgeblockt wird, daß die gegenwärtige Grundfläche zu einer Seitenfläche wird, während die dem Einbettenden zugekehrte Seitenfläche zur Fußfläche wird. Nach beendeter Orientierung wird die Rammer mit kaltem Wasser umgeben, so daß das Paraffin vom Boden her langsam zu erstarren beginnt. Die Oberfläche des Paraffins muß dagegen mit dem heißen Spatel unter Zugabe von etwas Paraffin 10—15 Minuten lang flüssig gehalten werden. Man verhütet dadurch, daß das beim Erstarren zusammenschrumpfende Paraffin die untere mit den Richtlinien versehene Fläche des Blockes einzieht. Nach längerem Liegen in kaltem Wasser lösen sich Winkel und Grundplatte glatt ab; man erhält einen rechtwinkligen Paraffinblock, der auf einer Seite mit feinen parallel verlaufenden Linien versehen ist (Richtfläche). L a c k i e r e n . Die Richtfläche muß nun zunächst mit einem Überzug vort schwarzem Lack versehen werden. P e t e r empfahl hiefür einen Schuhlack amerikanischer Herkunft »Nubian Waterp'roof Blacking« (bei Hollborn, Leipzig, erhältlich) oder Ruß. In letzterem Falle verbrennt man ein Stückchen Kampfer, fängt den Ruß in einem Porzellannäpfchen auf, verreibt ihn mit etwas Zaponlack und überstreicht damit die Richtlinien. Der Überzug soll ganz dünn sein. Nach völligem Trocknen wird der Block mit einem dünnen Paraffinmantel versehen, indem man ihn ganz kurz in ein auf 75° C erwärmtes Paraffin eintaucht. Nach Erkalten wird das Eintauchen so oft wiederholt, bis die Richtfläche einen etwa 1 mm dicken Paraffinüberzug trägt. Dabei darf die als Basis dienende Fläche des Blockes natürlich nicht benetzt werden. An Stelle des Nubian Waterproof Blacking, der inkonstante Ergebnisse liefert, verwenden M a i n 1 a n d und S t o v e r die bei der Korrektur von Schreibmaschinen-Wachsbogen benutzte blaue Korrektionsflüssigkeit (»Corrections fluid« A. B. Dick Company Chicago, III.). Die mit ihr hergestellten Richtlinien sind gegen Benzol, Chloroform, Xylol und Wasser sehr widerstandsfähig, von Äther werden sie leicht gelöst.

Auf blocken. Hierzu bedeckt man den Objekttisch des Mikrotoms zunächst mit einem 2—3 mm dicken Paraffinüberzug, dessen Oberfläche man mit dem queren, definitiv festgestellten Mikrotommesser glatt abhobelt. Auf diese horizontale Fläche setzt man den zurechtgeschnittenen Paraffinblock mit seiner unverletz-

§ 881—885.

Plattenmodelliermethoden

209

ten Grundfläche so auf, daß die Richtfläche senkrecht zur Messerschneide steht und schmilzt ihn mit einem heißen Spatel und Paraffin den K a n t e n seiner Basis entlang an. Auf diese Weise erreicht man, daß Richtlinien und Richtfläche gen a u senkrecht zur Schnittebene verlaufen. 881. b) H e r s t e l l u n g d e r R i c h t l i n i e n b e i C e l l o i d i n e i n b e t t u n g. Bei Celloidineinbettung befestigt P e t e r (06) die Winkel auf der Grundplatte, indem er in die Spalten einen T r o p f e n Schellackfixativ einfließen läßt, das die Flächen rasch aneinander kittet. Das Eindicken des Celloidins nehme m a n recht langsam vor. Beim Einsetzen des Apparates in 80°/oigen Alkohol löst sich das Fixativ auf, Winkel und Grundplatte fallen ab. »Man erhält einen Celloidinwürfel mit Richtfläche und Richtleisten, der ganz dem P a r a f f i n w ü r f e l gleicht.« 882. H e r s t e l l u n g d e r R i c h t l i n i e m i t d e m Beschneide-, r i t z e r. Um an jedem beliebigen Paraffinblock senkrechte Flächen und parallel verlaufende Richtlinien herstellen zu können, w u r d e n verschiedene Apparate konstruiert. Der beste und einfachste Apparat ist der Beschneideritzer nach O k a j i m a (22), der von den Sartorius-Werken, Göttingen, geliefert wird. Der nachherige Lack- und Paraffinüberzug erfolgt wie in § 880. 883. Wenn nun nach diesen Vorbereitungen das Quermesser beim Schneiden der Serie nicht mehr v e r r ü c k t wird, wird das Objekt in Schnitte zerlegt, die senkrecht zur Längsachse desselben stehen und welche g l e i c h z e i t i g d i e geschwärzte R i c h t f l ä c h e mit den Richtleisten senkrecht t r e f f e n . Dicht neben jedem Schnitte liegt d a n n eine feine, gezackte, schwarze » R i c h t l i n i e « (mit vom Schnitte abgewendeten Zacken!). — Würde man sämtliche Schnitte der Reihenfolge nach so aufeinander legen können, daß alle gezackten Richtlinien sich wieder zu einer senkrechten Richtfläche mit senkrechten Richtleisten zusammenfügten, so w ü r d e n auch alle Organdurchschnitte richtig, d.h. ohne seitliche Verschiebung auf einanderf allen:— In der hier angedeuteten Weise — n u r daß nicht die Schnitte, sondern deren vergrößerte Bilder aufeinandergelegt werden — w e r d e n die Richtlinien bei graphischen Rekonstruktionen (§ 873f.) wie bei der Plattenmodelliermethode benutzt. Man w i r d sich aber immer dessen bewußt sein müssen, daß beim Schneiden usw. auch die Richtlinien eine Verschiebung e r f a h r e n können, also keine absolut u n v e r r ü c k b a r e Marke darstellen. Einen neuen Weg schlägt H e a r d ein, der vor jedem Schnitt die stark beleuchtete Oberfläche des Paraffinblockes auf Kinofilm photographiert und dadurch eine Reihenfolge nicht deformierter Umrisse des Objektes erhält, die dann durch Projektion beliebig vergrößert werden können. 884. Die Sdinlttserie. Die sorgfältig hergestellten Serienschnitte klebe man nach einer der in § 533 ff. a n g e f ü h r t e n Methoden auf, wobei man auf völlige Streckung der Schnitte und gleichmäßige Ordnung derselben achte. Sehr empfehlenswert ist die in § 546,3 angegebene Methode von v. A p ä t h y. Nach dem Trocknen taucht m a n P a r a f f i n p r ä p a r a t e nach P e t e r (06) zuerst in abs. Alkohol, da sich sonst die Lacklinie im Xylol kräuselt. Dann folgt Xylol, und wenn die P r ä p a r a t e nicht im Stück d u r c h g e f ä r b t sind, Nachfärbung. Bei S t ü c k f ä r b u n g § 571. 885. Das Zeichnen. Man zeichne mit Benutzung des Abbeschen Zeichenapparates oder am besten u n t e r Zuhilfenahme eines Projektionsapparates (s. § 83^, da dieser selbst bei s t a r k e n Vergrößerungen (100—150mal), ein großes, ebenes, gleichmäßig erhelltes Gesichtsfeld gewährt. Walzt m a n die Platten selbst aus, so zeichne m a n mit Kopierstiften (um Kopien abnehmen zu können) auf ein 1*

R o m e i s , Mikrosk. Technik

15. Aufl.

210

Rekonstruktionsmethoden

§ 886—890.

möglichst ungeleimtes Druckpapier (Zeitungspapier); auf fertige Platten wird mit einem weichen Bleistift gezeichnet. Man mache es sich zur Regel, eher etwas zu viel als zu wenig zu zeichnen. 886. H e r s t e l l u n g d e r W a c h s p l a t t e n . Wachspapierplatten sind in den gebräuchlichen Dicken im Handel erhältlich (z. B. bei Hollborn, Leipzig). Bei häufigerem Bedarf empfiehlt es sich dieselben selbst herzustellen. Die einfachste, von S t r a ß e r angegebene Apparatur besteht aus einem Lithographenstein, dem 2 Metallschienen von entsprechender Dicke aufgelegt werden, einer Metallwalze und einer Heizvorrichtung zum Erwärmen derselben. Der Stein w i r d mit der auf ungeleimtem Papier (Zeitungspapier) hergestellten Zeichnung bedeckt und diese mit einem mit Terpentin befeuchtetem Pinsel fest angedrückt. Dann w i r d die geschmolzene Wachsmasse mit einem Schöpflöffel aufgegossen, die Oberfläche der erstarrenden Wachsshicht mit dünnem Florpapier bedeckt und mit der erwärmten Walze auf eine bestimmte Plattendicke ausgewalzt. Nach Erstarren w i r d die Wachsplatte abgehoben und zwischen Filtrierpapier, mit einer Glasplatte leicht beschwert, einige Tage getrocknet. Eine alle Einzelheiten berücksichtigende' Beschreibung der Herstellung findet man bei P e t e r (08, 26). 887. Ausgezeichnet, wenn auch teuer, ist der von B e r n e r (10) beschriebene Apparat zum Walzen von Wachsplatten (hergestellt von Jung, Heidelberg). 8 8 8 . * P e t e r benutzt reines gelbes Bienenwachs. Billiger ist folgende Mischung: Gelbes Bienenwachs 2 Gew.-Teile, Paraffin (Schmelzp. 40—45°) 1 Gew.-Teil, Paraffin (Schmelzp. 50—52°) 1 Gew.-Teil. F e d o r o w empfiehlt Ceresin (Ceresin. flav. U. O.) oder Mischung desselben mit Wachs. Ebenso K a p p e r s (15) Ceresin (Schmelzp. 55—58°) 2 Teile; Wachs 1 Teil. 889. Das Ausschneiden u n d das Aufeinanderpassen der Ausschnitte. Zum Ausschneiden der Zeichnungen werden am besten die Beschneidefedern benutzt, w i e sie zum Beschneiden von Photographien gebräuchlich sind. Man beginne mit den Hohlräumen und lasse zwischen allen, gar nicht oder nur schmal zusammenhängenden Teilen provisorische Verbindungsstreifen (»Brücken«) stehen, die später — wenn die vorher getrennten Teile sich beim Aufeinanderpassen vereinigt haben — entfernt werden; bleiben Modellstücke dauernd isoliert, so werden die »Brücken« zuletzt durch Drahtstifte u. dgl. ersetzt. A n der » R i e h t 1 i n i e « bleibt ein fingerbreiter Wachsstreifen stehen, aus dem die Richtzacken herausstehen; natürlich wird auch die Richtlinie mit den Schnitten durch »Brücken« verbunden. Einzelne Zellen und Zellgruppen können beim Zusammensetzen des Modells durch Einlegen von Schrotkörnern markiert werden, deren Verteilung im Modell schließlich durch Röntgenphotographie (am besten durch Stereoröntgenphotographie) zur Darstellung gebracht wird. In gleicher Weise können Binnenräume oder Organe dargestellt werden, wenn man sie mit Kontrastmitteln bestreicht. P o l i t z e r nimmt dazu Bariumsulfatvaseline, P r a t j e eine wässerige Aufschwemmung von Roebaryt, die nachher wieder leicht entfernt werden kann ( P o l i t z e r 28, P r a t j e 30). 890. In vielen Fällen braucht man auch bei Arbeiten ohne Richtlinien keine allzugroßen Fehler zu befürchten: »Die Profilkontur, durchgehende gestreckte Gebilde, wie Chorda, Blutgefäße usw., schützen meist vor falschen seitlichen Verschiebungen bei dem Aufeinanderpassen der Ausschnitte; außerdem besitzen die Schnitte durch ein einigermaßen kompliziertes Gebilde so viele Merkmale zweiter und dritter Ordnung, die immer nur e i n e bestimmte Art der Aufeinanderpassung möglich oder wahrscheinlich machen, daß ein Abirren nicht leicht vorkommen kann.«

§ 891—895.

Plattenftiodelliermethoden

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891. Das Anlegen, Zeichnen u n d Rekonstruieren von gezackten Richtlinien wird überflüssig, w e n n m a n nach dem Vorschlage T r i e p e 1 s (20) die Lage der Schnitt bilder durch eine Ebene u n d eine Gerade bzw. zwei danach gezogene, sich r e c h t winkelig kreuzende Senkrechte bestimmt. M a n benötigt bei dem Triepelschen V e r f a h r e n auch keine Bornschen Einbettungsrähmchen. Näheres bei T r i e p e 1 (20). Auch L e b e d k i n (14, besonders 30), gibt beachtenswerte Ratschläge f ü r die H e r stellung von Rekonstruktionen ohne Richtlinien. Eine Vorrichtung, u m Rekonstruktionen zarter Gebilde w ä h r e n d der Arbeit Halt zu geben, beschreiben A l e x a n d e r s o n u n d C l a u s e n (33). 892. Die Vollendung des Modells. Man l e g e zuerst e t w a 5 Ausschnitte richtig übereinander und b e f e s t i g e dieselben provisorisch, i n d e m m a n ihre breiteren Teile mit e i n e m stark erhitzten, schmalen Modellierspatel durchsticht; dann glättet man die S t u f e n und verschmilzt die Ränder mit e i n e m heißen, breiten Spatel. Darauf w e r d e n w i e d e r 5—6 A u s s c h n i t t e aufgelegt usw. Im Interesse des Einblicks in Hohlräume usf. w i r d man das Modell häufig nicht in einem zusammenhängenden Stücke fertigstellen, sondern dasselbe lieber nach provisorischer Vereinigung und oberflächlicher Glättung in bestimmten Ebenen wieder in getrennte Stücke zerlegen. S c h a p e r (04) benutzt zum Zerschneiden großer Modelle einen durch elektrischen Strom glühend gemachten Draht. In a n deren Fällen schneidet m a n »Fenster« ein, setzt »Stütz- u n d Verbindungsdrähte« an und was dgl. m e h r ist. Über die r e c h t z e i t i g e E n t f e r n u n g der Brücken siehe § 889. Zuletzt glättet m a n das stufenartig a u f g e b a u t e Modell m i t d e m h e i ß e n Spatel, mit einem breiten, in Terpentin getauchten Pinsel, mit der Fingerbeere usf., so w e i t w i e möglich: e i n g l a t t e s M o d e l l , a n d e m d i e S t u f e n u n d d i e zufälligen Unebenheiten e n t f e r n t sind, läßt die charakteristischen Formen viel besser e r k e n n e n als ein rauhes. 893. Z u m Glätten und Modellieren des Wachsmodells w u r d e v o n v. W a c h e n f e l d t (25) ein praktischer elektrischer Modellierspatel angegeben; desgleichen v o n H a n n und S a u b e r e r (34). 894. L. N e u m a y e r (07) trägt auf die Oberfläche des zuerst mit Alkohol abgewaschenen u n d dann mit einer dünnen Schellacklösung bestrichenen Wachsmodells zur Konsolidierung e r w ä r m t e n Knochenleim auf und bemalt es d a n n mit Ölfarben. Emaillack an Stelle des Leims mehrmals aufgetragen, macht wasserbeständig. — B o e n i g (27) mischt Temperafarben mit dem sog. »Malmittel« ohne Zusatz von Wasser, worauf die F a r b e n am Wachsmodell sehr gut haften. — L a m m (30) e r zielt eine d a u e r h a f t e F ä r b u n g des Wachsmodells dadurch, daß er beim Glätten des Modells mit dem heißen Spatel kleine Stückchen von sog. Fettstiften (»Dermatographen«) zum Schmelzen bringt und aufstreicht. Die F a r b e n mischen sich d a n n mit dem durch den heißen Spatel beim Glätten zum Schmelzen gebrachten oberflächlichen Wachsschichten sehr innig. 895. Sehr z w e c k m ä ß i g ist es, zumal bei zarten Modellen und bei w a r m e r Temperatur, die Wachsmodelle nach dem v o n T a n d 1 e r angegebenen V e r f a h ren galvanisch zu verkupfern. Man überstreicht dazu das fertige Wachsmodell mit einer l ü c k e n l o s e n Graphitschicht und h ä n g t es dann an Leitungsdrähten in eine 20°/oige Kupfersulfatlösung, der einige Tropfen Salpetersäure zugesetzt sind. D a s Bad w i r d v o n e i n e m S t r o m v o n 1,5 V durchflössen. V e i t (32) läßt nach dem Wachsmodell durch einen geschickten Gipsformer eine Leimform und darnach einen Gipsabguß herstellen, der dann nach dem Metallspritzverfahren der Metallisator Berlin A.-G. (Berlin-Neukölln, Lahnstr. 30) mit einem ca. , /i mm dicken Metallüberzug versehen wird. 14*

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Das Messen mikroskopischer Präparate

§ 896—899.

896. Statt Wachsplatten wurden verschiedentlich auch andere Materialien wie Pappe, Blech usw. benutzt. T r i e p e 1 (18) klebt die Zeichnung auf dünne Elfenbeinkartons (0,4 mm) auf und schneidet diese dann aus. Um die entsprechende .Schnittdicke zu bekommen, klebt man dann noch kleine Pappstückchen dazwischen. Zuletzt gießt man die Spalten mit Wachs aus. 897. L a p i n e (27) verwendet Gelatineplatten, deren Ausschnitte er verschieden anfärbt und dann wieder einsetzt, S e n i o r (29) Gelatine- oder Celluloidplatten („Transparent Kodaloid No. 1"), M i l l e r (31) Löschpapier, das zuletzt mit Wachs durchtränkt wird. E n b o m (38) empfiehlt Platten aus gelblichem Plastelin. 898. Oft ist es einfacher, die N e g a t i v f o r m z u r e k o n s t r u i e r e n und das Positiv durch Ausgießen der Hohlräume zu gewinnen. S e 1 e n k a baut die Gußform aus Pappe und gießt mit Woodschem Metall aus, worauf die Pappe durch Aufweichen entfernt wird. W i l s o n rekonstruiert die Form aus Wachsplatten, gießt mit Gips aus und entfernt die Form durch Abschmelzen. Das Gipsmodell wird mit Sandpapier abgeschliffen und mit Paraffin durchtränkt. Beide Methoden lassen sich nur bei wenig komplizierten, gut zusammenhängenden Gebilden anwenden. Leistungsfähiger w u r d e das Negativverfahren dadurch, daß D a n k m e i j e r (39) als Negativmasse das P o 11 e r sehe N e g o c o l l empfahl, das dazu in Platten gegossen wird. Das Positiv wird durch Ausgießen mit verflüssigtem H o m i n i t gewonnen, w a s bei komplizierten Formen schrittweise vorgenommen w e r d e n kann, da die einzelnen Güsse g u t miteinander verschmelzen. Zuletzt wird das umhüllende Negocoll entfernt, das bei stetem Feuchthalten i m m e r wieder v e r w e n d e t w e r d e n kann. 898a. Ein neues Gußverfahren, das sich f ü r sehr komplizierte Rekonstruktionen eignet, die auf andere Weise nicht oder nicht ebenso haltbar und n a t u r g e t r e u gewonnen werden können, w u r d e von B o e h m (46) entwickelt. Die Guß-» f o r m wird dabei aus Wachsplatten aufgebaut. In alle Höhlräume, Kanäle usw. k o m m e n achsiale Eisendrähte. Diese werden mit Hilfe der elektrischen P u n k t schweißung zu einem starren Gerippe verbunden. Als Gußmasse dient leicht fließender Portland-Zement (Mischung: 100 g g e w ö h n l i c h e r schweizerischer Portland-Zement, 30 g feinkörniger Quarzsand und 50 ccm Wasser). Beim Einfüllen läßt m a n die Form, um Gußlücken zu vermeiden, auf einer einfachen maschinellen Vorrichtung vibrieren. Nach dem E r h ä r t e n wird der Gußkern mit Skalpellen freigelegt. Eine eingehende Darstellung der älteren Rekonstruktionsverfahren bei P e t e r (06, 22 und 27). 15. KAPITEL

Das Messen mikroskopischer Präparate, Methodik der Mengenbestimmung von Organen und Organteilen 899. G r ö ß e n b e s t i m m u n g d u r c h S c h ä t z u n g . Grobe Anhaltsp u n k t e f ü r die Größe mikroskopischer S t r u k t u r e n lassen sich schätzungsweise durch einen Vergleich mit häufig vorkommenden Strukturbestandteilen bek a n n t e r Größe (z. B. mit roten Blutkörperchen) gewinnen. Bei umfangreicheren mikroskopischen S t r u k t u r e n empfiehlt sich f ü r annähernde Schätzungen ein Vergleich mit der Größe des Gesichtsfelddurchmessers. Den letzteren ermittelt man dadurch, daß man an Stelle des P r ä p a r a t e s bei gleichbleibender Optik und

§ 900—901.

Das Messen mikroskopischer Präparate

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Tubuslänge ein Objektmikrometer einstellt (für schwache Vergrößerungen n i m m t man ein Objektmikrometer von 1 cm, davon 1 mm. in Zehntel geteilt, f ü r starke ein solches von 1 mm, das in 100 Teile geteilt ist). Zweckmäßig fertigt m a n sich f ü r die meist gebrauchten Objektiv-Okularkombinationen eine kleine Tabelle an. 900. G r ö ß e n b e s t i m m u n g d u r c h M e s s u n g . Eine genaue Größene r m i t t l u n g muß durch Messung mit einem Okularmikrometer erfolgen. B e i spiel: A u f g a b e : Eine Gewebsschicht mißt bei Betrachtung mit Objektiv 20 und Komp. Okular 7 X bei Tubuslänge 169 auf dem eingelegten O k u l a r m i k r o m e t e r 36 Skalenteile. Wieviel ¡x mißt sie demnach? L ö s u n g : Ehe die Aufgabe gelöst w e r d e n kann, m u ß der sich bei jeder Vergrößerung ändernde » M i k r o m e t e r w e r t « des Okularmikrometers ermittelt werden, d. h. es m u ß festgestellt werden, welchen wirklichen Wert ein Skalenteil ( = Intervall) der Okularmikrometerteilung besitzt. Man bringt dazu b e i g l e i c h b l e i b e n d e r O p t i k u n d Tubusl ä n g e an Stelle des P r ä p a r a t e s ein Objektmikrometer, bei dem 1 mm in 100 Teile geteilt ist, so daß ein Skalenteil des Objektmikrometers also 0,01 m m — 10 li entspricht. Dann stellt m a n die Teilungen von Objekt- und Okularmikrometer parallel übereinander scharf ein und liest ab, wieviel Teile des Objektmikrometers mit einer größeren Anzahl von Teilen des Okularmikrometers ger a d e übereinstimmen. Werden z. B. 30 Teile des Objektmikrometers von 43 Teilen des Okularmikrometers gedeckt, so sind diese letzteren gleich 30X10 ¡x = 300 ¡u, da ja ein Teil des Objektmikrometers 10 fj, entspricht (s. o.). Daraus ergibt 30X10 sich aber, daß ein Teil des Okularmikrometers gleich — - ju = 6,98 a ist. Der Mikrometerwört beträgt also im vorliegenden Fall abgerundet 7 u. Da n u n die zu messende Gewebsschicht 36 Skalenteile des Okularmikrometers deckt, so b e t r ä g t ihre wirkliche Länge 36X7 f j , = 252 ¡x. 901. Allgemein gefaßt findet man also den Mikrometerwert m nach der F o r aXc mel m = ^ ' , wenn a die abgelesene Anzahl der Skalenteile des Objektmikrometers, b die entsprechende Anzahl von Skalenteilen des Okularmikrometers und c der bekannte Wert eines Skalenteiles des Obiektmikrometers ist. Bei den meisten Messungen wird man einen in 0,01 mm geteilten Objektmikrometer verwenden. Für die Messung bei ganz schwachen Vergrößerungen ist dagegen ein Objektmikrometer vorzuziehen, bei dem 1 cm in 0,1 mm geteilt ist. Im letzteren Falle entspricht dann ein Skalenteil des Objektmikrometers 100 ft. Bei A u s f ü h r u n g einer Messung beachte m a n noch folgendes: Zu genauen Messungen benütze man n u r die Mitte des Sehfeldes. Vor Ablesen der Teilung bewege m a n das Auge senkrecht zur Richtung der Teilstriche ein wenig hin und her. Bei dieser Bewegung d ü r f e n die Teilstriche des Okularmikrometers und die K o n t u r e n des Objektes — oder die Teilstriche des Objektmikrometers — keine scheinbare Verschiebung (Parallaxe) gegeneinander zeigen, sonst m u ß die Einstellung des Mikroskops geändert werden, bis die Parallaxe verschwindet. (Besonders wichtig beim Messen mit schwachen Vergrößerungen.) Erscheinen die Teilstriche — bei starker Vergrößerung — ziemlich breit, so benütze m a n beim Messen stets die Mitte oder den nach der rechten Seite gelegenen Rand der Striche.

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Das Messen mikroskopischer P r ä p a r a t e

§ 902—904.

Die Verschiebung der verschiebbaren Augenlinse des Mikrometerokulars beim Einstellen ändert die Größe des Mikrometerwertes nicht. Systeme mit Korrektionsfassung müssen bei Bestimmung des Mikrometerwertes und bei der Messung mittels des Korrektionsringes stets auf dieselbe Deckglasdicke eingestellt sein. (Unter Benützung der Zeiss-Druckschrift Mikro 273). 902. Über die bei Gebrauch eines Okularschraubenmikrometers zu beachtenden Regeln s. Q u a s t l e r (32). Bei Messung größerer Präparate, die sich über zwei oder mehrere Gesichtsfelder erstrecken, bietet die Verwendung eines M e ß t i s c h e s Vorteile (s. auch § 89). Ausführliches über Messung, Fehlergröße usw. siehe K a i s e r l i n g 26.

903. D u r c h n e u e r e U n t e r s u c h u n g e n ist die B e d e u t u n g genauer Mengen-

besfimmungen an Stelle der meist geübten, einfachen Abschätzung nach einem oder mehreren histologischen Schnittbildern dargetan. Im einfachsten Fall, wenn z. B. die Größe zweier kleiner nicht wägbarer Organe verglichen werden soll, werden zunächst die Umrisse der in Serienschnitte von bekannter Dicke zerlegten Organe gezeichnet (am besten mit Projektionszeichenapparat). Sodann wird entweder durch Planimetrieren (s. § 906) oder durch sorgfältiges Ausschneiden und Wägen die Größe der gezeichneten Flächen ermittelt. Im letzteren Fall muß zur Interpolation noch vom gleichen Papier das Gewicht einer Fläche von bekannter Größe bestimmt werden. Um die wirklichen Werte zu erhalten, müssen die ermittelten Flächenwerte durch das Quadrat der Linearvergrößerung der Zeichnung (V2) dividiert werden. Durch Multiplikation mit der Schnittdicke können die Werte dann weiterhin noch in Volumina umgerechnet werden. 904. Als Beispiel f ü r den Weg, den man bei der numerischen Analyse verschiedener Organanteile einzuschlagen hat, sei in Kürze die Methode angeführt, die H a m m a r (14, 26) zur Berechnung des Thymus angegeben hat. Das frische, von Fett und Bindegewebe f r e i p r ä p a r i e r t e Organ wird unzerstückelt gewogen u n d in Formalin 1:10 oder in einer andern gut eindringenden Flüssigkeit fixiert. Hierauf w e r d e n aus dem Organ vier Querscheiben von 5—10 m m Dicke herausgeschnitten (davon zwei aus der Mittelpartie) u n d in P a r a f f i n (Schmelzp. 47°) eingebettet. Von jeder Scheibe wird ein ganzer unbeschädigter Querschnitt von genau bekannter Dicke (zwischen 10—20 «) in Hämalaun-Eosin od. dgl. gefärbt und in Balsam montiert. Von jedem der vier Schnitte w e r d e n bei derselben geeigneten Vergrößerung — z. B. 17fach — die Umrisse des ganzen Schnittes auf gleichmäßig dickes Papier abgezeichnet u n d die Grenzen von Rinde, Mark und Zwischengewebe eingetragen. Die Flächenbestimmung erfolgt mittels Planimeters oder mittels Wägung. Im letzteren Fall wird die Umrißzeichnung ausgeschnitten u n d gewogen. Das gleiche erfolgt d a n n getrennt mit Rinde. Mark und Interstitium. F e r n e r w e r d e n vom gleichen Papier noch zwei Quadrate von je 20 mm Seite = 400 q m m ausgeschnitten u n d gewogen. Daraus läßt sich d a n n der Flächeninhalt der gezeichneten u n d ausgeschnittenen Gewebsteile berechnen. Die Ermittlung der Gesamtmenge erfolgt dann nach folgenden Gleichungen: , R • s • j • 100 „ r°/0-Gk D. 0/ Rinde: r u r . 7s r i T , 7 , . T : G ' 100 IR+Mh •h' m"/o • Gk M-s • / • 1 0 0 M a r k : m% = —— r ; G, (R+M)-s 100 i«/o • Gk J-Sf h • loo Interstitialgewebe: t°/o = , D , . tti ~r',Gi {R+M)-s-.f+J-s,-f1' 100 Gr, Gm, Gi = Totalgewicht von Rinde, Mark, Interstitialgewebe; R, M, J •= Fläche der gezeichneten Rinde, Mark, Interstitialgewebe; Gk = Frischgewicht des T h y -

§ 905—906.

Planimetrie

215

muskörpers; s = spezifisches Gewicht des Thymusparenchyms = 1,075; si = spezifisches Gewicht des Interstitialgewebes = 1,1 (wenn bindegewebig) oder 0,95 (wenn fettgewebig); f = Koeffizient der beim Einbetten eingetretenen Schrumpfung des Parenchyms ( = 1,087); fi = desgleichen für Interstitialgewebe = 1,190. Zur Berechnung von Größe und Zahl der Hassallschen Körperchen werden dieselben bei lOOfacher Vergrößerung herausgezeichnet und der Durchmesser jedes Körperchens festgestellt. Die Resultate werden in acht verschiedenen Größengruppen eingeteilt. Sodann erfolgt nach einer im Original nachzusehenden Tabelle eine Größenkorrektion. An diese schließt sich, da die meisten Hassallschen Körnerchen in mehr als einem Schnitt getroffen sind, noch eine Reduktion der Anzahl. Weitere Einzelheiten in der Originalarbeit. 905. Diese Methode, die je nach Organ und Fragestellung verschiedene Abänderungen erfährt, wurde von H a m m a r wie anderen Autoren bereits zu zahlreichen quantitativen Organanalysen verwendet. Angaben für die jeweils empfehlenswerte Technik finden sich u. a. bei H a m m a r (32) für Fettgewebe, Muskelgewebe, Lymphdrüsen, Gaumentonsillen, Milz, lymphoides Gewebe des Darmes, Thymus, Schilddrüse, Epithelkörper, Hypophyse, Nebenniere, Ovar, Hoden, Leber, Niere; bei H a m m a r (24), B e n g t s s o n (39), C a r 1 s o n u. Mitarb. für Nebenniere; bei H a m m a r und H e l l m a n n (20) für Pankreas; S t i e v e (19), R o m e i s (21), L u n d g r e n (25) für Hoden; bei R a s m u s s e n u. H e r r i c h (22) für Hypophyse; bei H o 11 a t z (22), S c h m e e r (40) für Niere; bei D a h l b e r g (24) für graue und weiße Substanz des Großhirns. Uber den Schrägschnittfehler bei Arealbestimmungen histologischer Oberflächen s. C h r i s t o f f e r s e n (33).

906. F l ä c h e n b e s t i m m u n g durch P l a n i m e t r i e . Gewöhnlich ist es nicht nur einfacher, sondern auch genauer, die Flächenbestimmung nicht durch Ausschneiden und Wägen, sondern durch Planimetrieren vorzunehmen. Ich selbst verwende dazu das Polarplanimeter (Kompensationsplanimeter) von Ott. Die Meßgenauigkeit beträgt Vioo bis V5oo der vermessenen Fläche. Ein Polarplanimeter (s. Abb. 18) besteht im Prinzip aus dem mit Fahrspitze versehenen Fahrarm F, der mit Meßtrommel ausgestatteten Laufrolle L und dem Polararm P. Der letztere ist am einen Ende gelenkig mit dem Fahrarm verbunden, am anderen mit dem Polgewicht PG, das durch eine Nadelspitze unverschieblich auf der Zeichenfläche fixiert werden kann. Ausführung einer Messung: 1. Aufstecken der Zeichnung auf eine ebene Unterlage von hinreichender Größe (z.B.Zeichenbrett). FixieAbb. 18. Schematische Darstellung ren des Polgewichtes außerhalb der zu meseines Polarplanimeters senden Figur, so daß man letztere bequem umfahren kann. — 2. Einstellen des Fahrstiftes über einen beliebigen Punkt der Randlinie, der durch Bleistiftstrich oder Punktieren mit dem Fahrstift markiert wird. Notieren der Ausgangsstellung der Meßtrommel. — 3. Nun fährt man die Fahrstiftspitze in geschlossenem Zug so genau als möglich der Randlinie entlang bis zur Rückkehr zum Ausgangspunkt. Es ist wichtig, daß dabei die Laufrolle immer auf der glatten Papierfläche, niemals über Unebenheiten (z. B. Papierrand) läuft. — 4. Ablesen der Endstellung der Meßtrommel. Die kleinere Zahl wird von der größeren abgezogen. Die erhaltene Zahl entspricht, mit 0,1 multipliziert, bei richtiger Einstellung des Fahrarmes dem Flächeninhalt der umfahrenen Figur in Quadratzentimetern.

216

Das Messen mikroskopischer Präparate

§ 907—909.

Über die Reduktion auf die wirklichen Werte s. § 903, 2. Absatz. Wichtige Messungen soll man zur Ausschaltung von Fehlern 2mal vornehmen. — Um mehrere nebeneinanderliegende Figuren in einem Zuge zu vermessen, verbindet man sie durch Brücken, die dann zur Aufhebung 2mal befahren werden müssen (einmal hin, einmal her). — Bei zahlreichen feinen Zacken fährt man die Durchschnittslinie. Eingehenderes über Planimeter und Planimetrie bei G e o r g i (18). 907. Zur M e s s u n g v o n k o m p l i z i e r t g e f o r m t e h Gewebet e i l e n , v e r s t r e u t e n Ze11en oder v o n Z e 1 1 e n e i n s c h 1 ü s s e n (z. B. Mitochondrien, Golgiapparat) eignet sich vor allem eine von O k k e 1 s ausgearbeitete quantitative histologische Meßmethode auf photometris c h e r Grundlage. O k k e 1 s stellt zunächst von charakteristischen Stellen der zu messenden P r ä p a r a t e Mikrophotographien her. Von jeder P l a t t e macht m a n drei Abzüge; auf dem einen werden die zu messenden Gebilde (wie Zellen, Körnchen, Binnennetze od. dgl.) sehr sorgfältig mit nicht abwaschbarer Tusche (Marke G ü n t h e r Wagner) überzeichnet. Nach dem Trocknen w e r d e n alle anderen Bildteile mit J o d und Fixiernatron entfernt, so daß auf dem Abzug ausschließlich die zu messenden S t r u k t u r e n tief schwarz dargestellt sind. Ein zweiter Abzug w i r d n u r mit Jod usw. behandelt und als weißes Papier f ü r die Blindwertbestimmung benützt. Nun wird die Zeichnung auf einer drehbaren Scheibe befestigt und bei gleichmäßiger Beleuchtung durch Elektromotor rotiert. Gleichzeitig wird das von der Tuschezeichnung reflektierte Licht mit einem Elektrophotometer (Elektro-Bewi-Superinstrument von Will, München-Pasing) bestimmt (Wert a). In gleicher Weise wird bei gleichbleibender Beleuchtung f ü r den zweiten leeren Abzug der Wert A ermittelt. Hierauf w e r d e n auf diesen nach und nach q u a d r a t zentimetergroße tuschegeschwärzte Stückchen aufgeklebt bis der Lichtwert a erreicht ist. Die Anzahl der aufgeklebten Quadratzentimeter entspricht d a n n der Differenz A—a und der Gesamtfläche der gezeichneten S t r u k t u r e n . — Weit e r e Einzelheiten und Fehlerquellen siehe Originalarbeit. 908. F ü r eine Reihe zellphysiologischer Fragestellungen (z. B. K e r n p l a s m a relation, Teilkörpertheorie, Amitosefrage, pathologisches Wachstum u. a.) ist B e r e c h n u n g d e r z w e i k e r n i g e n Z e l l e n von Wichtigkeit (s. Jacobi 42). Durch eine Auszählung im mikroskopischen Schnitt läßt sich jedoch ihre Zahl, wie P f u h l zeigte, n u r ungenau ermitteln. Sie erfolgt durch Berechnung aus der Zahl, die durch Auszählung im Schnitt gefunden wurde, aus K e r n durchmesser + Kernabstand und der Schnittdicke. Weitere methodischkritische A u s f ü h r u n g e n s. bei P f u h l (30). 909. Die Bestimmung von Krümmungen, Längenmessung von Bogen, Ablesung von Winkeln ist mit Hilfe eines Abbeschen Zeichenapparates und einer als Diapositiv hergestellten entsprechenden Kreisbogenskala möglich. Näheres darüber bei K ü h l (25). Über Messungen kurzschenkliger Winkel an biologischen Objekten s. P. W e i ß (30). Winkelmessungen an histologischen Präparaten lassen sich mit Hilfe eines G o n i o m e t e r o k u l a r s (Zeiss, Leitz) ausführen.

Spezieller Teil 16. KAPITEL

Die Untersuchung der Zelle und ihrer Bestandteile A. Zellkern und Cytoplasma 910. Für die Cytologie ist die Untersuchung der lebenden und überlebenden Zelle stets von besonderer Bedeutung gewesen. Wenn sie trotzdem einige J a h r zehnte des öfteren über Gebühr vernachlässigt wurde, so lag das sicher nicht allein am Aufschwung der Fixierungs- und Färbetechnik, der die Sichtbarmachung der verschiedensten Strukturen in viel sinnfälligerer und oft auch müheloserer Weise gestattete als die Lebendbeobachtung, sondern auch daran, daß sich mit den älteren Hilfsmitteln der Untersuchungstechnik am ungefärbten Präparat nicht mehr viel weiter vordringen ließ. In neuerer Zeit schufen Fortschritte auf experimentellem Gebiet (Gewebezucht, Mikrurgie) wie Verbesserungen technischer Hilfsmittel (Ultraviolett- und Lumineszenzmikroskopie, Phasenkontrastverfahren, Elektronenmikroskop) die Möglichkeit die Klärung alter Probleme erneut in Angriff zu nehmen. Eine weitere Befruchtung ergab sich aus der Verbindung mit physikalisch-chemischer Forschung und Methodik. Auch der Ausbau polarisations-mikroskopischer Untersuchungstechnik f ü h r t e zu neuen wertvollen Ergebnissen. 911. Viele der in den letzten J a h r e n ausgeführten Untersuchungen brachten Einblicke, die sich mit den älteren Fixierungs- und Färbemethoden nie hätten erreichen lassen. Darüber darf aber nicht vergessen werden, daß gerade die neueren Untersuchungen an der lebenden Zelle — ich nenne als Beispiel n u r die auf mikroskopischem Wege gewonnenen Feststellungen über die Struktur der Chromosomen, über die Spindelfasern usw. — die Bestätigung f ü r die reale Existenz von Strukturen erbrachten, die noch vor gar nicht langer Zeit verschiedentlich als Kunstprodukte der Fixierungsmethoden hingestellt wurden. Selbstverständlich entbindet diese Feststellung nicht von der Forderung, daß die in fixierten und gefärbten Präparaten beobachteten Zellstrukturen auch weiterhin einer eingehenden kritischen Analyse und eines sorgfältigen Vergleiches mit dem lebenden Objekte zu unterziehen sind, ehe ihr intravitales Vorhandensein angenommen werden darf. 1. Lebendbeobachtung 912. Als M a t e r i a l f ü r d i e L e b e n d b e o b a c h t u n g d e s K e r n e s u n d d e s C y t o p l a s m a s eignen sich besonders somatische und generative Zellen von Pflanzen, Wirbellosen und niedrigen Wirbeltieren, zumal bei ihnen die bei der Lebendbeobachtung von Säugetiermaterial erforderliche Temperaturerhöhung in Wegfall kommt. Von ersteren sind die Staubfadenhaare und PoJlenmutterzellen von Tradescantia virginica beliebte, günstige Objekte; aus

218

Die Untersuchung der Zelle

§ 913—915.

dem Bereich der Wirbellosen seien die Zeilen der Speicheldrüsen von Limnaea stagnalis oder von Chironomuslarven, die Spinndrüsenzellen von Raupen und vor allem die Spermatocyten aus den Hoden von Schmetterlingen, Blattwanzen, Heuschrecken und Schnecken hervorgehoben, an welchen sich auch die Teilungsvorgänge oft gut verfolgen lassen. Unter den Wirbeltieren liefern die Larven von Amphibien (Axolotl, Trit. alpestr., Salamandra atra und maculosa) gutes Beobachtungsmaterial. Aber auch die lebenden Zellen von Gewebekult u r e n lassen sich zu cytologischen Untersuchungen mit Vorteil heranziehen. Sehr geeignet sind die intakten, in situ befindlichen Epithelzellen der Schwanzflossen von Tritos alpestris. Man beobachtet in frischem Brunnenwasser evtl. mit Hilfe eines D u r c h s t r ö m u n g s k o m p r e s s o r i u m s nach H. E. Z i e g 1 e r (Hersteller H. Elbs, Freiburg/Br.). Eingehende Angaben hierüber bei Z e i g e r (35). Eine sehr gute Übersicht über empfehlenswerte Objekte für die Untersuchung der einzelnen Zellbestandteile in lebendem und fixiertem Zustand findet man bei B e l a r (28). 913. F ü r feinere Untersuchung des Kernes (wie auch anderer Zellstrukturen) ist es nicht n u r unerläßlich, daß das Material frisch ist, sondern dasselbe muß auch von v ö l l i g g e s u n d e n , u n t e r n o r m a l e n Lebensbeding u n g e n s t e h e n d e n T i e r e n stammen. (Über den Einfluß ungünstiger äußerer Lebensbedingungen, Gefangenschaft u. dgl. auf die K e r n s t r u k t u r der Eizellen vgl. S t i e v e 13, 18.). 914. Die Beobachtung der lebenden Zelle e r f o r d e r t ein beträchtliches Maß von E r f a h r u n g u n d Kritik, da die Möglichkeit einer Täuschung durch v i t a l e A r t e f a k t e groß ist. Solche können durch Quellung, Entquellung, Entmischung usw. infolge von Asphyxie, mechanischem Druck, Konzentrationsänderung der Beobachtungsflüssigkeit, Wärmestrahlen, Ansäuerung (auch durch Säuredämpfe), V i t a l f ä r b u n g u. dgl. verursacht werden. Erreichen sie n u r geringe Grade, so sind sie ohne Schädigung des Lebens reversibel. Durch Versuche v a n H e r w e r d e n s (25) ist bekannt, daß in den lebenden Zellkernen des Schwanzepithels von Froschlarven nach Einbringen der Tiere in eine 0,05—0,075°/oige Essigsäure Körner und lichtbrechende Schollen sichtbar werden, und daß diese Strukturen für unser Auge wieder verschwinden, wenn die Larve nach nicht zu langer Säureeinwirkung in Brunnenwasser ausgewaschen wird. Dieser ohne Absterben der Zelle mehrmals wiederholbare Prozeß ist als reversible Gelbildung aufzufassen, die eine Etappe auf dem Wege zur irreversiblen Fixierung darstellt. Z e i g e r (35) vermochte in ähnlichen Versuchen bemerkenswerterweise auch eine gewisse Ortsbeständigkeit solcher Strukturen im Kernraum nachzuweisen. Bei Paramaecium Aurelia konnte v a n H e r w e r d e n durch Einbringung in eine 0,01—0,l°/oige Formollösung eine Erstarrung hervorrufen, die bei rechtzeitigem Auswaschen der Tiere in Brunnenwasser wieder beseitigt wird. Bei der Erstarrung wird der zuvor optisch leere Macronucleolus vollkommen undurchscheinend, die Biegsamkeit des Körpers verschwindet, während sich das Tier noch langsam fortbewegt. Bei Actinophys hört bei Zusatz von 0,01°/o Formol die bei jungen Tierer» im Cytoplasma sichtbare Brownsche Molekularbewegung auf, um nach Auswaschen wiederzukehren. 915. Die Untersuchung lebender Zellpräparate erfolgt f ü r gewöhnlich am besten in der Körperflüssigkeit des betreffenden Tieres. Das P r ä p a r a t muß, um eine Konzentrationsveränderung des Beobachtungsmediums zu verhindern, sofort mit einem Deckglas bedeckt und mit Vaseline oder Wachs u m r a n d e t werden. G e i 11 e r untersucht Mitosen in Pflanzenhaaren u. dgl., um ein Austrocknen zu vermeiden, in Paraffinum liquidum, das völlig indifferent ist.

§ 916—920.

Zellkern und Cytoplasma

219

916. Der Anfänger versäume nicht zu Beginn seiner Untersuchungen an lebenden Zellen die Wirkung von mechanischem Druck, f e r n e r von Ansäuerung mit v e r d ü n n t e r Essigsäure steigender Konzentration bis zum A u f t r e t e n i r r e versibler S t r u k t u r e n zu verfolgen. 917. Der Einfluß, den die Dämpfe verschiedener, auch in der Fixierungstechnik viel gebrauchter Substanzen auf Chromosomen und Plasma lebender Zellen (von Tradescantia) ausüben, wurde von W a d a eingehend beschrieben (so von Essigsäure, Chloroform, Äther, Butylalkohol u. a.). 918. F ü r die Untersuchung lebender Zellen und Gewebe verspricht das neue P h a s e n k o n t r a s t v e r f a h r e n großen Nutzen, da bei ihm die Kontraste in der Lichtbrechung einzelner S t r u k t u r e n in einem f ü r direkte Beobachtung bis jetzt unerreichten Grade gesteigert sind (siehe auch § 59). 919. Sehr wertvoll f ü r die Untersuchung lebender wie fixierter K e r n e ist die M i k r o p h o t o g r a p h i e im u l t r a v i o l e t t e n Licht mit der K ö h l e r sehen A p p a r a t u r (s. § 66). Mit ihrer Hilfe w u r d e von C a s p e r s s o n u . a. erwiesen, daß das optisch leere Aussehen lebender Kerne bei gewöhnlichem Licht in den untersuchten Fällen n u r durch gleiche Lichtbrechung von S t r u k t u r und Umgebung vorgetäuscht war. D a r ü b e r h i n a u s benützt C a s p e r s s o n die A u f n a h m e im UV-Licht, um mit Hilfe eines selbstregistrierenden Mikrophotometers mit Thermoelement und eines M o l l sehen Mikrogalvanometers die Absorption der Nukleinsäuren quantitativ zu messen. Das V e r f a h r e n gründet sich auf die äußerst intensive Ultraviolettabsorption, welche die in den Nukleinsäuren enthaltenen P u r i n - und P y rimidinbasen besitzen. Die ausgesprochene Dominanz der Absorption der Nukleinsäuren im UV über die anderen Zellbestandteile ermöglicht es ihre Verteilung u n d Konzentration in den Z e l l k e r n s t r u k t u r e n zu untersuchen. Es zeigte sich, daß die Absorption schon von Teilchen, deren Durchmesser viermal die Wellenlänge des verwendeten Lichtes beträgt, mit zureichender Genauigkeit bestimmbar ist. Es können also Mengen von Substanzen bestimmt werden, die eine Größenordnung von etwa 10—9 mg h a b e n (untere Grenze sogar 10~ 11 mg = 1 ju,3 einer l°/o Lösung; demgegenüber liegt die Erfassungsgrenze durch chemische Methoden bei etwa 10—1 mg!). Die Absorptionsuntersuchung f ü r Nukleinsäurelokalisation wird vorteilhaft durch Digestion mit bestimmten Trypsinpräparaten. ergänzt, in denen Nukleinsäuren unlöslich sind, während Eiweiß in Lösung geht. Die Digestion wird unter dem Mikroskop in einer besonderen Digestionskammer aus Quarz, die von der Enzymlösung durchströmt wird, u n t e r Kontrolle im sichtbaren und UV-Licht durchgeführt. Wegen Einzelheiten bezüglich A u f n a h m e wie Absorptionsmessung muß auf die wichtigen Originalarbeiten C a s p e r s s o n s (36a, b) verwiesen werden. Die absorptionsspektrographische Methode C a s p e r s s o n s ist der Nuklealfärbung an Empfindlichkeit überlegen; sie kann in Fällen, in welchen letztere versagt, noch positives Resultat geben. 920. Eine V i t a l f ä r b u n g des Kernes gelingt bei tierischem Material n u r in Ausnahmefällen u n d unter besonderen Bedingungen, so vor allem bei Sauerstoffmangel. Nach Z e i g e r (38) hat eine vitale Färbung des Ruhekernes tierischer Zellen das Vorhandensein eines ganz bestimmten Kolloidzustandes im Kernraum zur Voraussetzung. Dieser ist bei vereinzelten Zelltypen schon normalerweise vorhanden, bei anderen kann er durch eine verschiedenartige Reizung der gesäumten Zelle experimentell erzeugt werden. R i e s führt die vitale Unfärbbarkeit des Kernes

220

Die Untersuchung der Zelle

§ 921—925.

auf die starke Hydratation der Kerneiweiße zurück. Dehydratation hat bei optisch, leeren wie bei normalerweise in ihren Einzelheiten sichtbaren Kernen eine Vitalfärbbarkeit zur Folge. Die reversible Vitalfärbung der Kerne ist nach I. F i s c h e r nur vorübergehend während eines besonderen physiologischen Zustandes der Zelle möglich; sie tritt als ein charakteristisches Übergangsstadium zwischen der typischen Vitalfärbung und der postvitalen histologischen Färbung auf. Vitalfärbungen tierischer Kerne gelangen u n t e r Beachtung des Gesagten z. B. in 0,001—0,l°/oiger Neutralrotlösung. Als dehydratisierende Mittel dienen Alkohol, Anilin, Aceton, Äther, Chloroform in 0,1—l°/oiger Lösung, als entquellende Magnesiumsulfat oder Calciumchlorid in 2—20°/oiger Lösung, als Säuren 0,005—0,l°/oige Essigsäure oder 0,003—0,3°/oige Salzsäure. Sie kommen e n t w e d e r vorher durch Zusatz zur Tyrodelösung oder w ä h r e n d der F ä r b u n g durch Zusatz zur Farblösung zur Einwirkung. 921. Bei Pflanzenzellen konnte K ü s t e r (26) mit Eosin eine Färbung des lebenden Cytoplasmas und Kernes erzielen. A1 b a c h erhielt mit Dahliaviolett und Methylviolett (0,05—0,l°/o), ferner mit Malachitgrün (0,001—0,l°/oig) intensive vitale Kernfärbung. In den Epidermiszellen sehr junger Tradescantiablätter gelingt es mit Eosin (0,05—0,l%ig) selbst die Chromosomen vital zu färben ( G i c k l h o r n 30). Ubersichten. über vitale Kernfärbung und die bisher benutzten Farbstoffe bei A l e x a n d r o w (33) und B e c k e r (36). 922. Neue Möglichkeiten ergeben sich f ü r die V i t a l f ä r b u n g von K e r n und Cytoplasma aus der Anwendung der F l u o r o c h r o m e mit nachfolgender U n t e r s u c h u n g im Fluoreszenzmikroskop. Ein besonderer Vorzug dieser F a r b stoffe ist, daß sie in sehr starker V e r d ü n n u n g zur Anwendung kommen u n d schon in wenigen Minuten genügend färben. Nach gründlichem Spülen in viel Wasser wird entweder sofort in Wasser untersucht oder durch die Alkoholreihe in fluoreszenzfreies Paraffinöl übertragen. 923. F ü r Vitalfärbung des Kernes kommt namentlich A c r i d i n o r a n g e N O in schwach alkalischer Lösung (1 :10 000; Phosphatpufferlösung PH = 7,7 bis 8,0) in Betracht. Einwirkung 3—4 Min. Weiteres bei B u k a t ' s c h und H a i t i n g e r (40) und S t r u g g e r (40). Nach S t r u g g e r (42) läßt sich durch Anfärben der Zellen mit Acridinorange bei Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie innerhalb weniger Minuten feststellen, ob eine Zelle noch lebt oder ob sie bereits abgestorben ist. Im ersteren Fall tritt grünes, im letzteren kupferrotes Aufleuchten auf (bisher an Bakterien, Amöben, Hefe- und Pilzzellen erprobt). 924. Zur Vitalfärbung des lebenden Cytoplasmas (pflanzl. Material) empfiehlt S t r u g g e r (38) als unschädlichen Farbstoff R h o d a m i n B (Merck) (1 : 1000 in Leitungswasser 3—4 Min., dann 15 Min. auswaschen in Leitungswasser). Das Cytoplasma w i r d diffus gefärbt, lediglich die Mitochondrien speichern den F a r b stoff elektiv stärker, sodaß sie im Fluoreszenzmikroskop leuchtend goldgelb h e r v o r t r e t e n . M o n n e (38) erhielt mit R h o d a m i n B auch an tierischem Material positive Resultate. 2. Herstellung, Fixierung und Färbung von Ausstridipräparaten (Tofalpräparaten) 925. Mitosenuntersuchungen werden in neuerer Zeit häufig an Ausstrichpräp a r a t e n vorgenommen. Die Vorteile des Verfahrens bestehen in tadelloser Fixierung, Beobachtung unverletzter, ganzer Zellen bzw. K e r n e und sehr großer Zeitersparnis. Die Methode ist namentlich auch f ü r Orientierungszwecke sehr zweckmäßig. Die Organausstriche (z. B. von Hoden, Knochenmark, Milz u. dgl.)

§ 926—928.

Zellkern und Cytoplasma

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w e r d e n gewöhnlich in der Weise hergestellt, daß man das mit der Pinzette gef a ß t e Gewebsstück rasch ü b e r die Deckglas- oder Objektträgeroberflache h i n wegstreicht oder mehrmals auf den Objektträger a u f t u p f t . In anderen Fällen w i r d das Organ oder Orgahstück mit Zupfnadeln oder feinen Pinzetten zerrissen und der ausgetretene Inhalt rasch verschmiert. U n m i t t e l b a r d a r a u f m u ß der noch f e u c h t e A u s s t r i c h in e i n e g e e i g n e t e F i x i e T u n g s f l ü s s i g k e i t ü b e r t r a g e n w e r d e n . Schnellstes Arbeiten ist von ausschlaggebender Wichtigkeit. Liegengebliebene größere Stückchen werd e n erst nach der Fixierung entfernt. In Wurzelspitzen u. dgl. findet man die meisten Kernteilungen in den frühen Morgenstunden. In Präparaten, die untertags fixiert sind, sind sie viel spärlicher. 926. Die Fixierung durch T r o c k n e n kommt nur in besonderen Fällen zur Anwendung, so vor allem bei Blutausstrichen. Auch bei Hodenausstrichen ist sie bei manchen Tierarten möglich, so bei Hemipteren, nicht bei Orthopteren. 927. Sehr gebräuchlich ist zur Fixierung und F ä r b u n g derartiger Ausstrichp r ä p a r a t e namentlich bei Mitosestudien seit B e 11 i n g u n d H e i t z die C a r m i n e s s i g s ä u r e m e t h o d e . Bei ihr kommt der nach § 925 hergestellte Ausstrich unmittelbar nach der Herstellung zunächst zur Fixierung in AlkoholEssigsäure (abs. Alkohol 3 Raumteile + Eisessig 1 Raumteil). Die A.-E. muß bei der Fixierung möglichst unvermittelt und u n v e r d ü n n t in die Objekte eindringen (wichtig). Nach 2—5 Minuten wird das^ P r ä p a r a t zur F ä r b u n g in Carminessigsäure (s. § 640f.) übertragen, in der es u n t e r leichtem Bewegen und evtl. schwachem E r w ä r m e n 2—3 Min. oder etwas länger g e f ä r b t wird. Hierauf wird es aus der F a r b e genommen, ohne Abspülen in der Farblösung eingedeckt und untersucht. Soll das P r ä p a r a t einige Zeit aufgehoben werden, so wird es, nachdem Deckglasrand und R a n d f u g e trocken geworden, mit Krönigschem Deckglask i t t umrandet. Stellt man die Ausstriche auf Deckgläschen her, so benützt man bei Fixierung und Färbung zweckmäßig sog. Blockschälchen. Material, das nach Fixierung in A.-E. nicht sofort verarbeitet wird, kann einige Tage darin aufbewahrt werden. Für längere Aufbewahrung bringt man es aus A.-E. unmittelbar in 96%igen Alkohol, wobei man 1—2mal wechselt, um die Essigsäure zu entfernen. In ihm hält es sich unbegrenzt. Vor der Untersuchung überträgt man es wieder in A.-E., bis es durchtränkt ist, wozu einige Minuten genügen (G e i 11 e r). Die Methode gibt auf einfachste, rascheste Weise sehr gute, klare Bilder der einzelnen Teilungsstadien, die sich auch f ü r Chromosomenzählungen sehr eignen. Die Chromosomen sind etwas gequollen, was aber f ü r die Beobachtung o f t von Vorteil ist. Da Carminessigsäure n u r das Chromatin intensiv färbt, w ä h r e n d die echten Nukleolen u n g e f ä r b t bleiben, erscheinen die Ruhekerne häufig fast ungefärbt. Der Typus des chromatinarmen Ruhekernes läßt sich dah e r mit dieser Methode sehr leicht von einem Chromonema-Chromomeren-Kern unterscheiden. Die gute F i x i e r u n g s w i r k u n g von Alkohol-Eisessig kommt n u r in Verbindung mit der Carminessigsäurebehandlung zur Geltung, bei Paraffineinb e t t u n g und Schneiden auf dem Mikrotom liefert die Fixierung in A.-E. meist u n b r a u c h b a r e Ergebnisse, da A.-E. keine stabilen F ä l l u n g s s t r u k t u r e n liefert. ( G e i t l e r 42). 928. Bei pflanzlichen Geweben, deren Zellen sich nicht ausstreichen lassen, wendet man die H e i t z s e h e K o c h m e t h o d e an. Die möglichst kleinen Stückchen werden zunächst f ü r einige Minuten in Alkohol-Eisessig fixiert, dann direkt in Carminessigsäure übertragen und in ihr in einem Proberöhrchen zwei

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Die Untersuchung der Zelle

§ 929—932.

M i n u t e n l a n g gekocht. H i e r a u f k o m m e n die O b j e k t e auf e i n e n O b j e k t t r ä g e r u n d w e r d e n m i t 2 Z u p f n a d e l n f e i n z e r z u p f t . D a n n w i r d ein D e c k g l ä s c h e n aufgelegt, C a r m i n e s s i g s ä u r e z u g e s e t z t u n d ü b e r k l e i n e r F l a m m e a u f g e k o c h t , so oft, bis die z e r d r ü c k t e Zellmasse i n t e n s i v rot g e f ä r b t ist. Die v e r d u n s t e n d e F l ü s s i g k e i t w i r d n a c h B e d a r f ersetzt. Bei s e h r kleinen C h r o m o s o m e n m u ß ö f t e r s a u f g e k o c h t w e r den, u m die I n t e n s i t ä t auf das Nötige zu steigern. D u r c h leichten, v o r s i c h t i g e n , mit der Nadel s e n k r e c h t auf das D e c k g l a s g e f ü h r t e n D r u c k k a n n das P r ä p a r a t n a c h d e m K o c h e n auf n a h e z u S c h n i t t d i c k e g e b r a c h t w e r d e n , so d a ß die K e r n t e i l u n g s f i g u r e n in e i n e r E b e n e liegen. Auf d i e s e n k r e c h t e D r u c k r i c h t u n g ist die g r ö ß t e S o r g f a l t zu legen, u m V e r z e r r u n g e n d e r C h r o m o s o m e n u n d u n e r w ü n s c h t e V e r s c h i e b u n g e n u n t e r e i n a n d e r zu v e r m e i d e n . Auf k e i n e n F a l l d a r f das D e c k g l a s i r g e n d w i e v e r s c h o b e n w e r d e n . N a c h d e m K o c h e n setzt m a n n e u e C a r m i n l ö s u n g z u u n d l ä ß t a b k ü h l e n . Das P r ä p a r a t ist d a m i t z u r U n t e r s u c h u n g f e r t i g . Als Material eignen sich Antheren, Fruchtknoten, sprossende Pflanzenteile, Wurzelspitzen. Handgefertigte Querschnitte durch Wurzelspitzen, die in obiger Weise behandelt werden, geben schöne Polansichten von Mitosen. Eine eingehende Darstellung der Carminessigsäuremethodik wie auch der Überf ü h r u n g in Dauerpräparate, deren Einschluß in venetianischem Terpentin oder in Euparal erfolgt, s. bei G e i 11 e r (42). 929. P a i n t e r bringt die zu untersuchenden, rasch zerkleinerten Organstückchen f ü r 20 Min. bis mehrere Stunden in Carnoy und färbt dann ca. 30 Minuten in Carminessigsäure. Sehr kleine Stückchen davon werden unter dem Deckglas vorsichtig zerquetscht. Um Dauerpräparate zu gewinnen, stellt m a n diese Präparate einige Stunden in Alkoholdampf, dann in 96%igen Alkohol, wobei sich das Deckglas loslöst. Hierauf Einschluß in Euparal. 930. Die S p i r a l s t r u k t u r der Chromosomen läßt sich u. a. durch 5—10 Min. 7 lange Vorbehandlung mit oder 2 8 mol KCN und nachfolgender Färbung mit Carminessigsäure sichtbar machen. K u w a d a u. Mitarb. geben hierfür auch noch eine Reihe weiterer Chemikalien an (z. B. NH : r Dämpfe, KOH Vsoomol, NaOH'/.ioomol, N a H C 0 3 2—8mol u. a. S t r a u b (43) empfiehlt dazu besonders Pollenmutterzellen von Tradescantia. Richtiges Stadium (Metaphase der ersten Reifeteilung), wenn Staubbeutel gerade leicht gelblich, nicht mehr grünlich und noch nicht kräftig gelb gefärbt ist. Man quetscht den Inhalt der Anthere mit einer Lanzettnadel auf den Objektträger aus, sodaß die Pollenmutterzellen frei auf das Glas zu liegen kommen und bedeckt sofort mit einem Tropfen 20°/oigen Alkohols, dem auf 100 ccm 1 Tropfen konz. Ammoniaklösung zugesetzt wurde. Nach 30—60 Sekunden rasch absaugen mit Filtrierpapier, sofort bedecken mit Carminessigsäure, Deckglas. 931. Die Sichtbarkeit der mit Carminessigsäure rot gefärbten Strukturen läßt sich durch Verwendung eines dichten Grünfilters bei entsprechend starker Beleuchtung wesentlich steigern. Sie treten dadurch in tiefschwarzem Ton hervor. 932. Seit l a n g e m ist z u r F i x i e r u n g v o n Ausstrichpräparaten O s m i u m t e t r o x y d ( O s m i u m s ä u r e ) in G e b r a u c h , sei es in D a m p f f o r m o d e r als Z u s a t z zu v e r s c h i e d e n e n Flüssigkeiten. Von B e d e u t u n g ist, daß O s m i u m s ä u r e , die, w i e schon L e w i t z k y , L e w i s (15), A. M e y e r (20) u. a. f e s t stellten, a m l e b e n s ä h n l i c h s t e n fixiert, n e b e n den K e r n s t r u k t u r e n a u c h die v e r s c h i e d e n e n K o m p o n e n t e n des Zelleibes s e h r gut e r h ä l t , w ä h r e n d diese bei F i x i e r u n g in A l k o h o l - E s s i g s ä u r e größtenteils z e r s t ö r t w e r d e n . W i c h t i g ist a u c h die V e r b i n d u n g m i t d e m A u s s t r i c h v e r f a h r e n ; d e n n n a c h G e i t l e r (40) lassen sich m i t S t ü c k f i x i e r u n g u n d Mikro'tomtechnik n i e m a l s a u c h n u r a n n ä h e r n d so g u t e E r g e b n i s s e erzielen w i e m i t dem O s m i u m t e t r o x y d v e r f a h r e n a m A u s s t r i c h .

§ 933—936.

Zellkern und Cytoplasma

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Ausführung : 1. H e r s t e l l u n g d e s A u s s t r i c h e s . Sie erfolgt wie in § 925, aus Gründen der Sparsamkeit am besten auf einem Deckglas (etwa 2 0 X 2 0 mm). 2. R ä u c h e r n d e s n o c h f e u c h t e n (!) Ausstriches über 2°/oiger Osmiumsäure 10—20 Sek. (nach G e i t l e r 2—5 Min.). 3. F i x i e r u n g des noch immer feuchten Ausstriches in ChromosmiumEssigsäure nach B e n d a (s. § 296) 10 Min. B e m e r k u n g e n : ad. 2. Zur Räucherung soll der Ausstrich möglichst nahe über die Osmiumsäure gelegt werden. Man baut sich dazu zweckmäßig folgende kleine Apparatur auf: ein kleines Glasnäpfchen von ca. 18 mm Durchmesser und 5 mm Höhe wird mit einem Tropfen Paraffin auf einer kleinen Glasplatte befestigt. Nach Einfüllen von ca. 1 ccm 2°/oiger Osmiumsäure wird das Näpfchen zunächst mit einem leeren Deckglas bedeckt. Über das Ganze stülpt man ein etwas größeres Glasgefäß mit abgeschliffenem Rand als Glocke. Zur Feuchthaltung der Kammer wird die Wandung der Glocke mit feuchtem Filtrierpapier ausgelegt. — Zur Räucherung wird die Glocke aufgehoben, das Deckglas abgenommen, an seine Stelle mit Schichtseite nach unten der Ausstrich gelegt und die Kammer wieder geschlossen. Durch das Räuchern werden die isolierten Teile des Ausstriches anfixiert und durch einen dünnen gelatinierten Eiweißfilm wie durch einen dünnen Celloidinüberzug in ihrer Lage befestigt, so. daß man bei der Weiterbehandlung kein Abschwimmen usw. zu befürchten hat. Die zum Räuchern verwandte Osmiumsäure darf keine Essigsäure enthalten, da deren Dämpfe auf das Präparat schädlich wirken. Der in § 281 angegebene Zusatz von Chromsäure ist natürlich unschädlich. Nach Gebrauch wird die Flüssigkeit in ein kleines mit Schliff stopfen versehenes Gläschen gegossen; sie kann mehrmals verwendet werden. Die Räucherung in Osmiumsäure ist nicht unbedingt notwendig. Die Ausstriche können auch direkt in 3. kommen. Ad. 3. Bei dickeren Ausstrichen sowie bei Untersuchungen am Cytoplasma ist die Fixierungsdauer auf 30—60 Min. zu verlängern. Im allgemeinen soll nicht länger fixiert werden als nötig, da sonst die Färbbarkeit leidet. 933. G e 1 e i (24) empfiehlt zur Fixierung von Ausstrichen das Sublimat-Osmiumgemisch nach v. A p ä t h y (6%ige Sublimatlösung und l°/oige Osmiumsäure ää. dazu Spuren von NaJ0 3 ). Dauer 30 Sek. bis einige Min. 934. F ä r b e m e t h o d e n f ü r o s m i e r t e A u s s t r i c h e . V o r b e h a n d l u n g n a c h G e i t l e r (40). Die nach § 932 fixierten Ausstriche werden zunächst in Brunnenwasser gut abgespült und für 2 X 5 — 1 0 Min. in dest. Wässer gelegt (Blockschälchen, Schicht nach unten). Anschließend kommen sie V2 bis mehrere Stunden in 70°/oigen Alkohol, da sich die Präparate dann besser färben. Weiteres Einlegen in 3°/oiges Wasserstoffsuperoxyd (10 Min.) beseitigt, wenn gewünscht, die durch die Osmierung hervorgerufene Schwärzung oder Bräunung. 935. Die osmiumfixierten Ausstriche lassen sich nur mit bestimmten Methoden mit Erfolg färben. Neben dem Heidenhainschen Eisenhämatoxylin kommt vor allem Safranin-Lichtgrün, Gentianaviolett nach Gram und Azur-Eosin nach Giemsa in Betracht. 936. S a f r a n i n - L i c h t g r ü n (nach G e i t l e r ) . Die nach § 932 fixierten und dann nach § 934 vorbehandelten Ausstriche kommen für 10 Minuten in Safranin, werden kurz in dest. Wasser abgespült, kurz in 96%>igen Alkohol getaucht und schließlich in Lichtgrün differenziert (V4—1 Minute). Dann abspülen in 96°/oigem Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Ergebnis: Chromatin und Nukleolen rot, Plasma, Spindel, Centrosom usw. grün.

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Die Untersuchung der Zelle

§ 937—941.

Herstellung der Farblösung: Nach G e i t l e r verwendet man am besten „Safranin wasserlöslich" von Grübler; man bereitet eine gesätt. Lösung in Anilinwasser. Nimmt man „Safranin alkohollöslich", so mischt man eine gesätt. Lösung in 96°/oigem Alkohol vor Gebrauch mit der gleichen Menge Anilinwasser. Lichtgrün wird in 96%igem Alkohol gelöst, in einer Konzentration, „daß die Lösung in einer etwa 3 cm dicken Schicht dunkelgrün erscheint".

937. G e n t i a n a v i o l e t t leistet nach G e i t l e r im wesentlichen das gleiche wie Safranin, färbt aber manchmal, namentlich nach Räucherung, etwas distinkter. Auch fällt jede Differenzierung weg, die Färbung erfolgt zwangsläufig und kann »blind« durchgeführt werden. 1. Färben in einer gesättigten Lösung von Gentianaviolett in Anilinwasser (oder nach § 703 bereitet): 10 Min. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. Einlegen in Jodjodkaliumlösung (s. § 705) einige Minuten. — 4. Abspülen in 96°/oigem Alkohol, dann in frischem Alkohol, bis keine Farbe mehr abgeht (meist 1 bis 2 Min.). — 5. Absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Chromatin intensiv, Nukleolen oft ziemlich blaß gefärbt, Plasma nicht Qder kaum gefärbt. Bei zu blasser Färbung sind die Zeiten in 1) und 3) zu verlängern. Um Plasmafärbung zu erzielen, taucht man das Präparat nach dem absol. Alkohol in eine deutlich orangegelb gefärbte Lösung von Orange G in absol. Alkohol. Präparate, die sich schlecht färben, empfiehlt B i z z o z e r o nach der Färbung in Gentianaviolett etwa 5 Sek. in absol. Alkohol abzuspülen und für 10 Min. in Jodjodkali zu stellen. Dann absol. Alkohol 20 Sek., l°/oige Chromsäure */* Min., absol. Alkohol 15 Sek., l°/oige Chromsäure V» Min., dann Auswaschen in absol. Alkohol, Xylol, Balsam.

938. N u k l e a l q u e t s c h m e t h o d e nach H e i t z. Die Methode, die von H e i t z namentlich für junges pflanzliches Material angegeben wurde, verbindet die lebensähnliche Fixierung durch Osmiumsäure mit der mazerierenden Wirkung heißer Salzsäure, dank welcher sich die gefärbten Zellen am Schlüsse der Färbung durch Druck auf das Deckglas in dünner Schicht ausbreiten lassen. Ausführung: 1. Fixierung kleinster Stückchen in Chromosmium-Essigsäure nach Benda (s. § 296) 20—30 Min. — 2. Direktes Übertragen in auf 60° C erwärmte n/1 HCl 10—30 Min. — 3. Ausschütten der Objekte in eine Schale mit Wasser. — 4. Übertragen in ein gut verschließbares Glas mit fuchsinschwefliger Säure für 30 Min. — 5. Untersuchung in einem Tropfen 45°/oiger Essigsäure, wobei man die Zellen durch vorsichtigen Druck auf das Deckglas in dünner Schicht ausbreitet. 939. V e r h a l t e n d e r K e r n e g e g e n ü b e r Verdauungsflüssigk e i t e n . In leicht angesäuerter Pepsinlösung wird das Nuklein der frischen oder in Alkohol fixierten Kerne nicht angegriffen. Durch Trypsin werden die Kerne dagegen aufgelöst.

940. Um das fertige Ausstrichpräparat von zwei Seiten her beobachten zu können, schließt man es zwischen zwei Deckgläser ein, die man in einen gefensterten Aluminiumobjektträger nach Heidenhain legt. 3. Fixierung und Färbung von Gewebsstiicken und Schnittpräparaten 941. Bei cytologischen Untersuchungen ist es sehr wichtig, daß die Fixierung sofort nach der Entnahme aus dem Tier (innerhalb 30 Sekunden) erfolgt (P a i n t e r , M i n o u c h i , K r a l l i n g e r ) ; denn »die autolytischen Vorgänge in den Zellen beginnen mit dem Aufhören der gleichmäßigen Durchblutung der Gewebe und haben zunächst eine Verklumpung der Mitosechromosomen zur Folge«. Die Stückchen sollen nicht mehr als 3 mm im Durchmesser haben, doch

§ 942—945.

Zellkern und Cytoplasma

225

ist langes Z u r i c h t e n mit d e m Messer als schädlich zu vermeiden. Z u r Fixier u n g der Keimzellen des Hodens ist es besser, einzelne Jtanälchen aus der S c h n i t t f l ä c h e h e r v o r z u z u p f e n u n d in toto zu fixieren. 942. Zu den b r a u c h b a r s t e n F i x i e r u n g s m i t t e l n f ü r K e r n - u n d P l a s m a s t r u k t u r e n zählt die Flemmingsche Flüssigkeit, namentlich in i h r e n Modifikationen nach B e n d a (s. § 296) und C h a m p y (s. § 298). F i x i e r u n g s d a u e r 24 S t u n d e n ; d a n n ebenso langes Auswaschen in fließendem Wasser oder in Alkohol nach § 943. Wichtig ist geringe Stückgröße (höchstens 3 m m Dicke), andernfalls sind die S t r u k t u r e n im I n n e r n n u r unzureichend erhalten. Der H a r n s t o f f zusatz, den H a n c e (s. § 290) und A l l e n (s. § 310) empfehlen, ist bei Chromosomenuntersuchungen besser zu vermeiden, da Harnstoff einen verklumpenden Einfluß auf die Chromosomen ausübt ( M i n o u c h i , K r a l l i n g e r ) . 943. A u c h durch die Bouinsche Flüssigkeit w e r d e n K e r n s t r u k t u r e n sehr gut fixiert, besonders in der von K r a l l i n g e r (31) angegebenen Modifikation (gesättigte w ä ß r i g e P i k r i n s ä u r e 75 ccm, F o r m o l 25 ccm, Eisessig 1—3 ccm, krist. C h r o m s ä u r e 1 g). Man b r i n g t die Stückchen in die auf K ö r p e r t e m p e r a t u r erw ä r m t e Flüssigkeit u n d läßt langsam abkühlen. Nach e t w a 18 S t u n d e n wäscht K r a l l i n g e r 24 S t u n d e n in fließendem Wasser oder besser in 10°/oigem Alkohol, der e t w a zehnmal zu wechseln ist. 944. In Fällen, in welchen eine möglichst klare, scharfe Niederschlagsbildung e r w ü n s c h t ist, w i r d m a n auch Sublimatgemische mit Vorteil a n w e n d e n (z. B. die von Z e n k e r § 336, H e 11 y § 337, S t i e v e § 333 angegebenen Gemische). Gelobt w i r d auch die Flüssigkeit nach S a n f e l i c e (l°/oige C h r o m s ä u r e 160 ccm, Formol 80 ccm, Eisessig 10 ccm; D a u e r : 24 S t u n d e n ; d a n n 48 S t u n d e n in m e h r fach gewechseltes Wasser; G u t h e r z 22). Besonders bei Wirbellosen w e r d e n auch die Gemische nach P e t r u n k e w i t s c h (§ 341) u n d C a r n o y (§ 226) häufig a n g e w a n d t . Für m i k r o c h e m i s c h e , f a r b a n a l y t i s c h e u n d ä h n l i c h e U n t e r s u c h u n g e n k o m m t vor allem die F i x i e r u n g in absolutem Alkohol, evtl. auch noch i n dem Gemisch von Carnoy in Betracht; f e r n e r K ä l t e t r o c k n u n g nach § 350 f. 945. Zu Demonstrationszwecken eignen sich für M i t o s e n Ganzpräparate von Hornhautepithel und Kiemenplättchen junger Molch- oder Salamanderlarven. Um reichliche Kernteilungen anzutreffen, läßt man die frisch gefangenen Tiere in einem kleinen Aquarium einige Tage hungern und füttert sie dann reichlich. Nach 3 Tagen fixieren in Helly. Hinaufführen in 70°/oigen Alkohol, dem Lugol zugesetzt wird bis keine Entfärbung mehr eintritt. Abtrennen des Kopfes, zurückführen in Wasser. 0,25°/oige Fixiernatronlösung. Auswaschen in Wasser, dann dest. Wasser. Die C o r n e a wird am Übergang in die Sklera mit spitzer Schere umschnitten und dann mit der Pinzette abgezogen. Die K i e m e n p l ä t t c h e n werden zuerst mit der Kiemenleiste herauspräpariert und dann erst von dieser abgetrennt. Färbung mit Hämalaun, Delafield oder Carmin. Hochführen durch Alkohol usw. Caedax. (Cornea: gewölbte Seite dem Deckglas zukehren!). S p e i c h e l d r ü s e n k e r n e von Chironomuslarven. Zur Isolierung der Speicheldrüsen wird der Larvenkörper mit scharfer Klinge hinter dem zweiten Körperring durchschnitten. Die Drüsen dringen dann als zwei wasserhelle Bläschen heraus und werden mit Zupfnadeln ganz hervorgezogen (ev. Lebenduntersuchung in P a raffinöl, s. § 915). In dieser Weise köpft man einige Larven auf einem Deckglas, präpariert die Speicheldrüsen und läßt das Deckglas mit der Schichtseite nach unten auf Carnoy- oder Sanfelice-Gemisch einige Stunden schwimmen. Nach Auswaschen Nuklealreaktion (s. § 1233 ff.): n-Salzsäure 60° C 25 Min. (Sanfelice) oder 7—10 Min. (Carnoy). — Fuchsinschweflige Säure 15 Min. — S0 2 -Wasser 3X5 Min., dann H 2 Q, 30-, 60-, 80-, 96°/oiger Alkohol je V2 Stunde, Xylol '/-> Stunde, Caedax. 15

R o m e i s , M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u f l .

226

Die Untersuchung der Zelle

§ 946—949.

Zur Gewinnung von W u r z e l s p i t z e n werden Samen von Erbsen über Nacht eingeweicht, sodann in Petrischalen auf 4fach gefaltetes, feuchtes Filtrierpapier ausgelegt, mit 2fach gefaltetem feuchtem Filtrierpapier bedeckt und mit dem Deckel verschlossen. Die Keimung erfolgt in wenigen Tagen. Bei Hyacinthen und Küchenzwiebeln schneidet man vom Zwiebelkuchen mit scharfem Messer eine Scheibe weg und setzt die Zwiebel auf ein Glas mit Wasser, sodaß das Wasser den Zwiebelboden eben berührt. Küchenzwiebeln haben dann in 1—2 Tagen bereits Wurzelspitzen von 5—8 mm Länge getrieben. Die Wurzelspitzen werden etwa 5 mm lang abgeschnitten. Um möglichst viele Kernteilungen anzutreffen, werden die Versuchspflanzen nachts über kühl gestellt und am andern Morgen an die Wärme gebracht. Verarbeitung der Wurzelspitzen nach 2—3 Stunden (H u b e r 42). 946. Besondere Sorgfalt ist bei cytologischen Untersuchungen der E n t w ä s s e r u n g und E i n b e t t u n g zuzuwenden. Man v e r f ä h r t bei ersterer zweckmäßig nach dem in § 365 Gesagten. Die Einbettung in Paraffin erfolgt ü b e r Methylbenzoat-Celloidin nach § 392. Die Methode leistet das gleiche wie das viel umständlichere V e r f a h r e n nach E. A l l e n (s. § 2175). T e m p e r a t u r im Thermostaten nicht über 58—60° C. Noch besser ist Einbettung in CelloidinParaffin nach § 463, 464 oder 466. 947. F ä r b e m e t h o d e n f ü r S c h n i t t p r ä p a r a t e . Außerordentlich klare Bilder gibt das Heidenhainsche Eisenhämotoxylin (§ 672), das im Gegensatz zu vielen anderen Farblösungen auch nach Fixierung in osmiumhaltigen Lösungen gut f ä r b t . Bei der Beurteilung der Bilder ist, da das E. H. nicht n u r Chromatin färbt, natürlich Kritik nötig. Auf eine Gegenfärbung k a n n man oft verzichten, da die S t r u k t u r e n ohne sie häufig klarer sind. K r a l l i n g e r wendet das E. H. zur Chromosomenfärbung in der Weise an, daß er die Färbung wiederholt: 5°/oige Eisenalaunlös. 24 Stunden; wässern, frische Hämatoxylinlös. 24 Stunden; völliges Ausziehen der Farbe in 0,5°/oiger Eisenalaunlös.; wässern; nochmals 24 Stunden färben und hierauf differenzieren in 0,5°/oiger Eisenalaunlös.; 2stündig'es Wässern. Viel gebraucht sind auch die progressiv färbenden Hämatoxylinlösungen, wie Hämalaun, Delafieldsches H. Besonders das letztere liefert bei progressiver F ä r b u n g in stark v e r d ü n n t e r Lösung, evtl. v e r b u n d e n mit nachfolgender Differenzierung in ganz schwacher (z. B. 0,l°/oiger) Alaunlösung (s. § 657), sehr klare Bilder. 948. G u t e Resultate gibt auch die B r a s i l i n f ä r b u n g nach H i c k s o n (01), die, zumal nach Fixierung in chromhaltigen Flüssigkeiten, neben den K e r n s t r u k t u r e n auch das Cytoplasma gut sichtbar macht. 1. Beizen der Schnitte in einer l°/oigen Lösung von Eisenalaun in 70°/oigem Alkohol 1—3 Stunden. (Man löst 1 g Eisenalaun in 23 ccm dest. Wassers und gibt dann 77 ccm 90°/oigen Alkohols zu. Nur einige Tage haltbar.) — 2. Kurz abwaschen in 70°/oigem Alkohol. — 3. F ä r b e n in einer 0,5°/oigen Lösung von Brasilin in 70°/oigem Alkohol 3—16 Stunden. — 4. Auswaschen in 70%>igem Alkohol. Entwässern, Xylol, Balsam. G u t h e r z (22) r ü h m t an der Brasilinfärbung die einer Eisenhämatoxylinf ä r b u n g gleichkommende Schärfe in Verbindung mit einer sich nicht n u r auf das Cytoplasma, sondern auch auf die Kernbestandteile erstreckenden Abstuf u n g des braunschwarzen-braunvioletten Farbtones, die besonders nach Fixier u n g nach S a n f e l i c e ( s . § 944) schön hervortritt. 949. Sehr reine und klare Chromatinfärbungen geben verschiedene künstliche Beizenfarbstoffe von B e c h e r ; so vor allem G a l l o c y a n i n - C h r o m a l a u n (s. § 734), G a l l a m i n b l a u - N a t r i u m a l a u n (s. § 736) und

§ 950—957.

Centrosom, Spindelfasern, Cytoplasma

227

Naphthazarin-Aluminiumchlorid (s. § 737); ferner C h r o m a l a u n - C a r m i n nach F y g (s. § 638) in blauschwarzem Ton. 950. O b s t schließt an Sublimatfixation eine 16—17stündige Stückfärbung mit Boraxcarmin. Sodann Schnittfärbung mit stark verdünnter wässeriger Lichtgrünfärbung. Ergebnis: Chromatin rot, Nukleolen grün. 951. Eine ausgezeichnete, eindeutige Färbung des Chromatins läßt sich mit der N u k l e a l f ä r b u f i g (s. § 1234) erzielen, auch nach Champy- oder Flemmingfixierung, wonach gewöhnliche Färbemethoden oft mißlingen. Ein Vorzug der Nuklealmethode ist, daß sie im Gegensatz zu vielen anderen Färbungen die echten Nukleolen, die frei von Thymonukleinsäure sind, stets ungefärbt läßt. 952. Für osmiumfixierte Präparate wird des öfteren auch eine Kernfärbung mit S a f r a n i n (s. § 961) empfohlen. Zur Gegenfärbung differenziert B e n d a die 24 Stunden lang in Safranin gefärbten Schnitte nach Abspülen in Wasser in einer l°/oigen Lösung von L i c h t g r ü n in 96°/oigem Alkohol. Dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam (s. auch § 936). Uber SafraninrGentianaviolettfärbung s. § 961. 953. Auch die Giemsafärbung gibt an osmiumfixierteñ Präparaten oft gute Resultate, wenn auch in etwas verändertem Farbton. Auch das Cytoplasma wird gut dargestellt. 954. Die Nukleolen erscheinen je nach Fixierung und Färbung basophil, oxyphil oder neutrophil. Die Färbung der Nukleolen kann daher keineswegs als Ausdruck einer bestimmten stofflichen Zusammensetzung oder einer spez. Reaktion gewertet werden (G e r s c h 40). So kommt es, wie seit langem bekannt ist, bei der Färbung osmiumfixierter Präparate, mit Teerfarbstoffen oft zu einer Farbumkehrung, so daß z. B durch Methylgrün-Pyronin das Chromatin rot, die Nukleolen aber grün gefärbt sind. 955. F ü r Untersuchungen im Fluoreszenzmikroskop ist zur Färbung der Kerne im f i x i e r t e n Präparat besonders C o r i p h o s p h i n O zu empfehlen (1: 10 000, einige Min.). Bringt man die Schnitte anschließend für eine wenige Sekunden in R o s a n i l i n h y d r o c h l o r i d (Fuchsin, 1: 10 000), so läßt sich Doppelfärbung erzielen (Chromatin leuchtend grünlichgelb, Nukleolen orange, Protoplasma tief rot. B u k a t s c h und H a i t i n g e r 40). Bei der Fixierung von Präparaten, die im Fluereszenzmikroskop beobachtet werden sollen, sind schwermetallsalzhaltige Flüssigkeiten (Sublimat!) zu vermeiden, da diese die Fluoreszenz vernichten. 956. Nach Vorbehandlung mit Alkohol läßt sich in geeigneten Fällen an Chromosomen Doppelbrechung nachweisen. Näheres über das an sich einfache Verfahren bei S c h m i d t (39a). Uber die Doppelbrechung von Karyoplasma, Cytoplasma und Metaplasma siehe S c h m i d t (37, 39b, 41), Doppelbrechung der Kernmembran S c h m i d t (39c), der Kernspindel S c h m i d t (40a). Sammelreferat über polarisationsmikroskopische Arbeiten bei Sc h m i d t (38 u. 40b). Über submikroskopische Morphologie des Protoplasmas siehe ferner F r e y - W y ß l i n g (38), R i e s (40). B. Centrosom, Spindelfasern, granuläre und fibrilläre Strukturen des Cytoplasmas 957. F ü r die L e b e n d b e o b a c h t u n g d e r a c h r o m a t i s c h e n Z e l l b e s t a n d t e i l e eignen sich Spermatocyten von Schmetterlingshoden (besonders Lymantria-Arten), Eier von Piscicola (in Fischzuchtanstalten erhältlich), von freilebenden Nematoden, z. B. Rhabditisarten (vgl. B é l a f 24) u. dgl. F ü r Untersuchungen am fixierten Objekte sind außerdem auch Eier von Ascaris megalocephala, von marinen Strudelwürmern (Thysanazoon), von Rynchelmis u. dgl. zu empfehlen. 15*

228

Die Untersuchung der Zelle

§ 958—961.

958. Zur Fixierung kommt vor allem die Flemmingsche Flüssigkeit, d a n n Sublimatgemische, wie Sublimat-Salpetersäure nach Petrunkewitsch, Z e n k e r Formol u. dgl. in Betracht. 959. Die F ä r b u n g d e s C e n t r o s o m s gelingt besonders nach Fixierung in einer sublimathaltigen Flüssigkeit a m leichtesten mit der Eisenhämatoxylinmethode (s. § 672), zumal w e n n man die Schnitte nach dem Vorschlag von M. H e i d e n h a i n vorher mit einer 0,l°/oigen wässerigen Lösung von Bordeaux R v o r f ä r b t . Protoplasma und Chromatin entfärben sich dann später bei der Differenzierung rascher als das Centrosom. Das Fortschreiten der Differenzierung, die zuletzt zweckmäßig mit stark v e r d ü n n t e r Eisenalaunlösung erfolgt, m u ß u n t e r dem Mikroskop (am besten mit einer Wasserimmersion) verfolgt werden. 960. Mit Hilfe der Eisenhämatoxylinmethode lassen sich auch die Spindelf a s e r n u n d andere granuläre und fibrilläre S t r u k t u r e n des Cytoplasmas sichtbar machen. Zur Gegenfärbung ist, wenn ü b e r h a u p t nötig, neben Bordeaux R auch Orange G oder Lichtgrün gut geeignet. 961. Vortrefflich werden Centrosom, Spindelfäden, Lininfäden, Polstrahlen u. dgl. dargestellt durch die von F l e m m i n g (91 und 95) angegebene F ä r b u n g mit S a f r a n i n - G e n t i a n a v i o l e t t - O r a n g e . Bei der A u s f ü h r u n g der Methode v e r f ä h r t m a n am besten nach den Angaben von v. W i n i w a r t e r (08, 23), die auch den nachfolgenden Vorschriften zugrunde liegen. V o r b e h a n d l u n g : Am besten gelingt die Methode nach F i x i e r u n g in Flemmingscher Flüssigkeit mit oder ohne Zusatz von Harnstoff (s. § 290). Die Oberfläche der Gewebstückchen soll beim Fixieren möglichst wenig mit Blut bedeckt sein. Monate-, selbst jahrelanges Liegen in Flemmingscher Flüssigkeit ist unschädlich. Dagegen verschlechtert' sich das Färberesultat nach v. W i n i w a r t e r bei Präparaten, die schon lange Zeit in Paraffin eingebettet liegen. Nach der Fixierung m u ß 24 Stunden sorgfältig in fließendem Wasser ausgewaschen werden. Die P r ä p a r a t e sollen nicht lange im Alkohol liegen, sondern bald in Paraffin eingebettet werden, nach v. W i n i w a r t e r am besten über Zedernholzöl (s. § 416). Werden die Schnitte erst nach mehreren Jahren angefertigt, so müssen sie zur Wiederherstellung ihrer Färbbarkeit nach dem Aufkleben für 24 Stunden in Flemmingsche Flüssigkeit eingelegt werden. Auch aufgeklebte Paraffinschnitte von anders fixiertem Material werden leidlich brauchbar, wenn man sie für 24 Stunden in Flemmingsche Flüssigkeit stellt und dann 20 Minuten in fließendem Wasser auswäscht. (Nach F i x i e r u n g in Sublimat-Eisessig und Verwendung von AnilinwasserSafranin (s. § 694) findet S t i e v e (20) die Osmiumbeizung unnötig). H e r s t e l l u n g ' d e r F a r b l ö s u n g e n : a) Safraninlösung. Ausschlaggebend f ü r das Gelingen der F ä r b u n g ist die Verwendung eines guten Safranins. Mit dem von v. W i n i w a r t e r (23) empfohlenen S a f r a n i n G extra der F a r b w e r k e Ciba, Basel, erhielt ich ausgezeichnete Resultate. Man löst 10 g dieses S a f r a n i n s in 155 ccm 96°/oigen Alkohols und 145 ccm destill. Wassers. Diese Stammlösung ist lange haltbar; sie wird nach v. W i n i w a r t e r mit der Zeit sogar besser. Zur F ä r b u n g verdünnt man 20 ccm der Stammlösung mit 80 ccm 50°/oigen Alkohols. b) Gentianaviolettlösung. Man löst 1 g Gentianaviolett in 110 ccm destill. Wassers. c) Orange-G-Lösung. Man bereitet eine Stammlösung durch Auflösen von 1 g Orange G in 200 ccm dest. Wassers. Zur F ä r b u n g v e r d ü n n t m a n 10 ccm der Stammlösung mit 100 ccm dest. W>ssers.

§ 962.

Centrosom, Spindelfasern, Cytoplasma

229

A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g : 1. Die Schnitte kommen aus destill. Wasser für 24 Stunden in die oben angegebene verdünnte Safraninlösung. Sie sollen darin ein lebhaftes, intensives aber durchsichtiges Rot annehmen. Werden sie schwarzrot oder braunrot, so muß die Lösung eventuell noch etwas mit 50°/oigem Alkohol verdünnt werden. Es kann aber auch ein Zeichen einer ungeeigneten Safraninmarke sein. 2. Abspülen in dest. Wasser ca. Va Minute. 3. Einstellen in die Gentianaviolettlösung: 24 Stunden. Die Präparate sollen hier dunkelviolett werden; erscheinen sie fast schwarz gefärbt, so muß die Farblösung verdünnt werden. 4. Abspülen in 2—3mal gewechseltem dest. Wasser. 5. Eintauchen in die verdünnte Lösung von Orange G: 30 Sekunden (s. u.). 6. Eintauchen in angesäuerten abs. Alkohol (auf 100 ccm abs. Alkohols 6 Tropfen einer Mischung von gleichen Teilen abs. Alkohols und Salzsäure): höchstens 2—3 Sekunde]} (nicht länger!, sehr wichtig!). Beim ersten Auftreten einer violetten Farbwolke heraus und sofort 7. in reinen absoluten Alkohol, um Säure- und Farbüberschuß zu entfeinen; ca. V2—1 Minute. 8. Langsames Differenzieren in Nelkenöl, dem auf 50 ccm 5 ccm absoluter Alkohol zugesetzt sind. Durch Erhöhung oder Erniedrigung des Alkoholzusatzes läßt sich der Verlauf der Differenzierung beliebig beschleunigen oder verlangsamen. Man differenziert, bis die Schnitte in den kernreichen Teilen makroskopisch blau, in den kernarmen orangegelb aussehen. 9. Entfernung des Alkohols in reinem Nelkenöl. 10. Aufstellen des Objektträgers in einem leeren, bedeckten Färbeglas, um das Öl ablaufen zu lassen. 11. Auswaschen des Nelkenöls in mehrfach gewechseltem Xylol. Kanadabalsam. E r g e b n i s : Cytoplasma und Cytoplasmastrukturen gelblich-bräunlich, in verschiedenen Tonabstufungen. Chromatin der ruhenden Kerne dunkelblau, Chromosomen in Teilungsfiguren dunkelrot. Chromatin degenerierender Kerne in Ruhe oder in Teilung: alle Abstufungen zwischen schmutzigem Braunrot und Violett. Nukleolus hellrot. Erythrocyten rot. Fett nach Osmiumfixierung schwarz. 962. Sehr wesentlich für das Zustandekommen des typischen Färbeeffektes ist die richtige Konzentration der Orangelösung. Da die einzelnen Farbmarken verschieden sind, muß man das Optimum der Konzentration durch Versuch feststellen. Am besten versucht man zunächst die oben angegebene Konzentration, die einer Verdünnung von 1:2000 entspricht, bei einer Einwirkungsdauer von genau 30 Sekunden. Ist der gelbliche Farbton im f e r t i g e n Präparat zu schwach, dann erhöht man die Konzentration (z. B. 1:1500 oder 1:1000), andernfalls verdünnt man noch stärker (bis 1:5000). Embryonales Material erfordert oft stärkere Konzentration. Die einmal richtig eingestellte Lösung kann dann lange Zeit benutzt werden. Blaufärbung durch Gentana violettspuren beeinträchtigt ihre Wirksamkeit nicht. Das beste Zeichen für eine gute Safraninfärbung ist, wenn die Erythrocyten im fertigen Präparat leuchtend rot hervortreten. — Außer dem oben genannten Safranin empfiehlt v. W i n i w a r t e r auch das »Safranin, Grübler, rein«; er löst 1 g in 100 ccm 50°/oigen Alkohols. Wenn im fertigen Präparat die Blaufärbung der Kerne zu schwach ist, dann liegt der Fehler meist in einer zu langen Einwirkung des salzsauren Alkohols in 6. Statt Nelkenöl benutzte ich eine Zeit lang Terpineol, bin aber jetzt für die vorliegenden Zwecke wieder zu Nelkenöl zurückgekehrt.

230

Die Untersuchung der Zelle

§ 963—969.

Man wird mit dieser ausgezeichneten Färbemethode nur dann gute Resultate haben, wenn man die Vorschriften genau befolgt. Die zahlreichen Modifikationen sind entbehrlich. 963. Bei formol-fixierten Präparaten gelingt die Darstellung des Centrosoms mit der von R i o H o r t e g a (16b) modifizierten Achücarro-Methode (s. § 1547). 964. Zur Darstellung des i n t e r g r a n u l ä r e n N e t z w e r k e s in der Zelle legt A11 m a n n (92) frische Gewebestückchen für 24 Stunden in molybdänsaures Ammonium 2,5 g; Chromsäure 0,25—1,0 g; dest. Wasser 100 ccm. Nach 24 Stunden überträgt man direkt in Alkohol usw. Färbung wie gewöhnlich, in Hämatoxylin, Gentiana od. dgl. 965. U n n a (28) unterscheidet am Protoplasma zwischen »Granoplasma« und »Spongioplasma«. Zur Färbung des ersteren verwendet er das blaue Polychrom (s. § 1415), zur Darstellung des Spongioplasmas beseitigt er das Granoplasma durch Einlegen der Schnitte in 2°/oige Kochsalzlösung und färbt dann drei Minuten in einer 0,5°/oigen wässerigen Bordeauxlösung; hierauf Abspülen in Wasser, Hämalaun usw. C. Darstellung der Mitochondrien (Chondriosomen, Piastosomen) 966. Zur L e b e n d b e o b a c h t u n g von Mitochondrien eignen sich ganz besonders Pflanzenzellen. Namentlich die Epidermen des Perigons der Tulpe und der Schwertlilie sind dazu sehr günstig ( G u i l i i e r m o n d 19). Ferner die Achselschuppen junger Elodeablättchen. Man beobachtet in 7,5—10°/oiger Rohrzuckerlösung. 967. Sehr schön lassen sie sich auch in Gewebekulturen, in den Zellen dünner Knorpelplättchen von Amphibienlarven u. dgl. beobachten. T e r n i empfiehlt die Geschlechtszellen von Geotriton fuscus. Vitalfärbung gelingt am besten mit Janusgrün (allenfalls auch mit Dahlia oder Methylviolett). (Weiteres s. § 780 f.) Ein zur Vitalfärbung der Mitochondrien sehr geeigneter Farbstoff scheint R h o d a m i n B z u sein. Er ist nach S t r u g g e r (38) für sie völlig unschädlich, erfordert aber Beobachtung im Fluoreszenzmikroskop (s. § 924). 968. Die Form der Mitochondrien ist von den osmotischen Verhältnissen des umgebenden Mediums abhängig. Bei Isotonie überwiegen schlanke, grazile Fäden, bei Hypertonie findet man eckige Schollen, bei Hypotonie tritt Quellung und Umwandlung zu Tropfen ein. Bei entsprechender Veränderung der NaClKonzentration kann man in ein- und derselben Zellart alle möglichen Mitochondrienformen hervorrufen. Durch ihre tropfige Umwandlung kann eine Vakuolenbildung im Zellplasma vorgetäuscht werden ( B a n g und S j ö v a 11, A n i t s c h k o w , H i r s c h und J a c o b s ) . Auch durch Temperaturunterschiede werden die Mitochondrien leicht beeinflußt. Schon einmaliges Gefrieren mit C0 2 verändert die Mitochondrien der Leber ( D o y o n und P o l i c a r d 12). Ebenso wird ihre Form durch Erwärmen rasch verändert. Bei Einwirkung von 47° C auf nicht fixierte Pränarate verschwinden die Mitochondrien in 20—30 Min.; nach Fixierung in Regaud halten sie dagegen Erhitzen auf 200° C aus (M e o 1 a 34). 1. Fixierungsmethoden

969. Vorbedingung ist , Verwendung l e b e n s f r i s c h e n Materials und F i x i e r u n g m ö g l i c h s t k l e i n e r O r g a n s t ü ck ch e n. Dabei ist jede Beschädigung durch Pinzettendruck, jedes Quetschen sorgfältig zu vermeiden.

§ 970—976.

Mitochondrien (Fixierung)

231

In den u n m i t t e l b a r an der Schnittfläche gelegenen Zellen sind die Mitochondrien oft zerstört. Auch bei unzweckmäßiger Fixierung kommt es sehr leicht zu artifiziellen Veränderungen, wie Zerfall in Körner, Reduktion d e r Zahl, Übergang der Körner in Bläschen. Aus der großen Zahl der als b r a u c h b a r angegebenen Fixierungsflüssigkeiten seien die nachfolgenden als erprobt und sicher arbeitend empfohlen. A m häufigsten kommen die Flüssigkeiten nach C h a m p y (§ 972) und R e g a u d (§ 976) zur Anwendung; in beiden Werden die Mitochondrien ausgezeichnet erhalten. Welcher Methode der Vorzug zu geben ist, hängt vom Material ab. a) F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t e n

mit

Osmiumsäure.

970. M e t h o d e v o n B e n d a ( 0 1 und 03): 1. Fixieren in l°/oiger wässeriger Chromsäure 15 ccm; 2°/oige Osmiumsäure 4 ccm; Eisessig 2—3 Tropfen, 8 Tage. 2. Waschen ca. 1 Stunde in dest. Wasser, d a n n ü b e r t r a g e n in Acetum pyrolignosum rectificat. (Holzessig) + l°/oige wässerige Chromsäure ää. Nach 24 Stunden Abspülen mit dest. Wasser, und 3. in 2°/oige wässerige Kaliumbichromatlösung, 1—3 Tage. 4. 24stündiges Auswaschen, Entwässern in steigendem Alkohol, Paraffineinbettung. F ä r b u n g nach Benda (§ 996), Heidenhain (§ 986) oder K u l i (§ 994). 971. F ü r .zartes embryonales Material (z. B. Hühnerkeimscheibe) ist die von M e v e s angegebene Flüssigkeit zu empfehlen: 0,5°/oige Chromsäure in l°/oiger NaCl-Lösung: 15 ccm, 2°/oige Osmiumsäure: 4 ccm, Eisessig: 3 Tropfen. Dauer 1—8 Tage. 972. Modifikation von C h a m p y : 3°/oige Kaliumbichromatlösung 7 ccm, l°/oige Chromsäurelösung 7 ccm, 2°/oige Osmiumsäurelösung 4 ccm. Dauer 24—48 Stunden; dann Nachchromjerung nach Benda (§ 970) oder Regaud (§ 976). N a c h K u l i (13) f i x i e r t d i e s e M e t h o d e v o n a l l e n a m b e s t e n . 973. B e n s l e y ( C o w d r y 13) fixiert in Kaliumbichromatlösung 2,5°/oig 16 ccm; Osmiumsäurelösung 2°/oig 4 ccm; Essigsäure 1—2 Tropfen. Dauer 2—i Stunden; Auswaschen 1 Stunde in dest. Wasser, dann 50-, 70-, 96°/oiger und abs. Alkohol je 24 Stunden und durch Bergamottöl in Paraffin. 974. S e h r gut fixiert ferner die A l t m a n n s c h e Flüssigkeit: 2%>ige Osm i u m s ä u r e + 5%ige wässerige Kaliumbichromatlösung zu gleichen Teilen. Dauer: 24 Stunden, dann Auswaschen in fließendem Wasser, Alkohol usw. 975. Ferner s. Fixierung und Färbung nach S c h u l t z e § 684. b) F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t e n

ohne

Osmiumsäure.

976. R e g a u d fixiert in seiner gebräuchlichsten Methode in einem frisch bereiteten Gemisch von 3°/oiger Kaliumbichromatlösung 80 ccm, Formol 20 ccm. Dauer 4 Tage, jeden Tag frische Flüssigkeit; dann 8tägige Nachchromierung in 3°/oiger Kaliumbichromatlösung oder nach B e n d a (siehe § 970). Hierauf 24stündiges Auswaschen in Wasser usw. Oft genügt schon ein 3tägiges Chromieren in der 3°/oigen Kaliumbichromatlösung. Die Methode gibt in Verbindung mit den In §§ 986—990 angegebenen Färbemethoden mit großer Sicherheit ausgezeichnete Resultate. Das von Regaud verwendete Fixierungsgemisch entspricht im übrigen ziemlich genau einer ursprünglich von K o p s c h angegebenen Flüssigkeit (3,5°/oige Kaliumbichromatlösung statt 3°/oige). Uber weitere Methoden von R e g a u d siehe Originalarbeit. Bei all diesen in § 976—979 angegebenen Flüssigkeiten darf der Formolzusatz erst unmittelbar vor Gebrauch erfolgen. Am besten nimmt man über CaC03j, neutralisiertes Formol (s. § 257).

232

Die Untersuchung der Zelle

§ 977—984.

977. K o l s t e r fixiert in Kaliumbichromatlösung 5°/oig 40,0; Chromalaunlösung 2°/oig 40,0; Formol 20,0. Dauer 24 Stunden; dann für 3 Tage in die gleiche Lösung ohne Formolzusatz, Dann 24stündiges Wässern usw. 978. D u b r e u i l empfiehlt Sublimat 5 g; Kaliumbichromat 3 g; Wasser 90 ccm + Formol 10 ccm. Fixierung 3—4 Tage, dann 10—15 Tage in 3°/oigem Kaliumbichromat. 979. K i y o n o (14) fixiert in Formol oder nach Helly (24 Stunden), wäscht einige Stunden aus und chromiert 2 Tage bei 37° C in Kaliumbichromat 5 g; Chromalaun 2 g; Wasser 100 ccm. 24 Stunden wässern usw. Nach dieser Fixierung, die auch an etwas größeren Stückchen gelingen soll, ist auch die Altmannsche Färbung möglich. 980. Die Chromierung ist zur Darstellung der Mitochondrien sehr zu empfehlen, aber nicht unbedingt nötig; R o m e i s (12) und besonders B a n g und S j ö v a 11 wiesen nach, daß die Mitochondrien auch nach Formolfixierung (unverdünntes, 40°/oiges Formol oder 1: 1—4 Teile Wasser) durch Eisenhämatoxylin f ä r b b a r sind. 2. Einbettung

981. Die Einbettung erfolgt, schon in Anbetracht der wünschenswerten, geringen Schnittdicke (2—4, höchstens 5 ju), am besten in Paraffin, zweckmäßig ü b e r Methylbenzoat-Celloidin-Benzol nach § 392. Die D u r c h f ü h r u n g der P r ä p a r a t e d u r c h die Alkoholreihe und durch Benzol soll möglichst beschleunigt w e r d e n (Benzol etwa 2X5—10 Min.), da sich die Mitochondrien nach längerem Verweilen in diesen Flüssigkeiten infolge von Lipoidverlust schlechter färben. 982. Manche Autoren (z. B. W a t a n a b e) empfehlen aus diesem Grunde eine Durchführung durch stark fettlösende Zwischenflüssigkeiten wie Benzol, Xylol u. dgl. überhaupt zu vermeiden . W a t a n a b e führt die Präparate, ähr.Hch wie O. S c h u l t z e (§ 684), aus absolutem Alkohol durch Cedernöl. Ich selbst konnte zwischen Präparaten, die nach dieser Methode und solchen, die über Methylbenzoat-Celloidin eingebettet waren, keinen Unterschied bemerken. 3. Bleichung

983. Häufig gelingt die Färbung der Mitochondrien nach Fixierung in osmiumsäurehaltigen Flüssigkeiten leichter und schärfer, w e n n m a n die paraffinb e f r e i t e n Schnitte vor der Färbung nach L u s t g a r t e n - P a l bleicht. Man bringt sie dazu aus dem Wasser f ü r 4 Minuten in eine 0,25°/oige Lösung von Kaliumpermanganat, sodann gleichlang in l°/oige Oxalsäure + l°/oige Lösung von Kaliumsulfit ää, worauf in fließendem oder öfters gewechseltem Wasser ausgewaschen wird ( R u b a s c h k i n 10, M e v e s 14). C o w d r y (14) stellt 30 Sekunden in l°/oige Lösung von Kai. hypermangan. und sodann 30 Sekunden in 5°/oige Oxalsäure. Auch nach Regaudfixierung u. dgl. kann die Bleichung von Vorteil sein. Es wird dadurch die Chromierung vermindert oder beseitigt. 4. Färbemethoden

984. Am leichtesten und zugleich haltbarsten ist die F ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin. Man kann dabei nach einer der in § 986—990 angegebenen Methoden v e r f a h r e n . Bei der Deutung der g e f ä r b t e n S t r u k t u r e n ist zu beachten, daß sich mit Eisenhämatoxylin außer den Mitochondrien auch noch andere Bestandteile des P r ä p a r a t e s in gleichem Farbton f ä r b e n können. — Die Methoden von A 1 1 m a n n (§ 991), K u 11 (§ 994) und C o w d r y (§ 995) verwenden z u r Darstellung

§ 985—990.

Mitochondrien (Färbung)

233

der Mitochondrien Säurefuchsin. Die Methoden geben klare, farbprächtige Bilder, die aber leider den Nachteil geringerer Haltbarkeit besitzen. Ein Vorzug der Kullschen Methode ist, daß sie die Mitochondrien gegenüber den Sekretg r a n u l a gut abhebt u n d auch die K e r n e different f ä r b t . — Nur noch selten wird die zwar schönste, aber auch technisch schwierigste Methode, die Kristallviol e t t f ä r b u n g nach B e n d a (§ 996) ausgeführt. Sie gelingt befriedigend n u r bei genauer Einhaltung der Bendaschen Fixierungsvorschrift (§ 970). 985. F ü r das Gelingen aller Methoden ist wichtig, daß die Schnitte möglichst d ü n n sind (2 bis höchstens 5 ¡x). Natürlich lassen sich auch dickere Schnitte f ä r ben; meist ist in diesem Falle aber die Überlagerung der S t r u k t u r e n so stark, daß die P r ä p a r a t e auch bei richtiger Differenzierung zu dunkel gefärbt und u n k l a r erscheinen. a) F ä r b u n g

mit

Eisenhämatoxylin

986. Die F ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin ist nach allen in § 970—979 angef ü h r t e n Fixierungen möglich. Sie wird in der gewöhnlichen, in § 672 angegebenen Weise d u r c h g e f ü h r t . Die Mitochondrien treten bei gelungener F ä r b u n g scharf schwarz gefärbt hervor. S e k i (38) empfiehlt der Heidenhainschen Hämatoxylinlösung 3—5°/o Karbolsäure zuzusetzen. Die Farblösung ist sofort gebrauchsfertig, wird aber bald überreif und färbt schon nach 2 Wochen etwas schlechter. 987. Die Eisenalaunlösung soll aus violetten, nicht verwitterten Kristallen bereitet werden. Eine Beschleunigung der Lösung darf nicht durch Erwärmen, sondern nur durch Verreiben in der Reibschale erfolgen. 988. R e g a u d (10) beizt die aufgeklebten, evtl. mit Kollodium überstrichenen Schnitte 8—10 Tage bei Z i m m e r t e m p e r a t u r (oder 1—4 Tage bei 35° C) in 5—15°/oiger Eisenalaunlösung, wäscht einige Minuten in dest. (!) Wasser und f ä r b t 24 Stunden mit Hämatoxylin (1 g H. gelöst in 10 ccm abs. Alkohol; nach Lösung wird zugefügt Glyzerin 10 ccm; dest. Wasser 80 ccm). Differenzieren in 5°/oiger Eisenalaunlösung. Resultat wie in § 986. Meist ist es schon hinreichend, die Schnitte 24 Stunden bei 35° C in der Eisenalaunlösung zu beizen. 989. Abgekürztes V e r f a h r e n von H i r s c h und B r e t s c h n e i d e r (38). Die paraffinbefreiten Schnitte w e r d e n Vz—1 Stunde im Wärmeschrank (56° C) in einer (jedesmal frisch zu bereitenden) 3°/oigen Eisenalaunlösung gebeizt, dann ganz k u r z in dest. Wasser abgespült und wieder im Wärmeschrank 10—20 Min. in einer vorgewärmten ausgereiften Heidenhainschen Hämatoxylinlösung gef ä r b t . Dann spült man in kaltem Leitungswasser ab und differenziert das n u r ganz leicht angefärbte Plasma in stark v e r d ü n n t e r Eisenalaunlösung zurück. Mitochondrien tiefblauschwarz auf hellem Grund. 990. C o w d r y (13) bekommt die Mitochondrien nach folgender Methode scharf dunkelblau auf hellem Grunde (fix. nach Bensley § 973 oder Altmann § 974): 1. Die Schnitte kommen aus Wasser für 5 Minuten in gesättigte wässerige Lösung von Kupferazetat; 2. Auswaschen in mehrfach erneuertem dest. Wasser 1 Minute; 3. 0,5°/oige wässerige Lösung von Hämatoxylin 1 Minute (wird hergestellt durch Verdünnung einer 10°/'oigen, gut ausgereiften alkoholischen Stammlösung); 4. Abspülen in dest. Wasser; 5. 5°/oige wässerige Lösung von neutralem Kaliumchromat 1 Minute. (Die Schnitte sollen hierin dunkelblau werden. Sind sie nur hellblau geworden, so spüle man sie in dest. Wasser ab und beginne von vorne, bis kein Dunklerwerden der Farbe mehr eintritt). 6. Auswaschen in dest. Wasser und Zurück-

234

Die Untersuchung der Zelle

§ 991—995.

bringen in das Kupferazetat für wenige Sekunden, um allen Farbstoff in Kupferlack umzuwandeln. 7. Auswaschen in dest. Wasser mehrere Minuten. 8. Differenzieren unter dem Mikroskop in: Borax 4 g; rotes Blutlaugensalz (Ferricyankali) 5 g; dest. Wasser 600 ccm. 9. 6—8stündiges Auswaschen in Brunnenwasser. 10. Entwässern, Xylol, Balsam. b) F ä r b e m e t h o d e n

mit

Säurefuchsin

991. F ä r b u n g n a c h A l t m a n n (nach Meves 11). Die höchstens 5 ¡j, dicken, mit Eiweißwasser aufgeklebten Schnitte werden nach Entfernung des Paraffins in hoher Schicht mit Säurefuchsin-Anilinwasserlösung (s. § 992) übergössen und über kleiner Flamme erwärmt, bis Dämpfe aufsteigen; sodann Abkühlen. Dies wiederholt man 1—2mal und läßt dann nach vollständigem E r kalten die überschüssige Farblösung ablaufen. (Statt dessen kann man die Schnitte auch für 30 Minuten in die auf 60° erwärmte, im Brutschrank stehende Farblösung bringen.) Zur Differenzierung dient Pikrinsäure am besten in den von M e t z n e r empfohlenen Konzentrationen. L ö s u n g I : Pikrinsäure, in abs. Alkohol gesättigt 10 ccm, 20°/oiger Alkohol 40 ccm. L ö s u n g I I ; Pikrinsäure in abs. Alkohol gesättigt 10 ccm, 20°/oiger Alkohol 70 ccm. Mit der ersten Lösung werden 2 Gläser gefüllt: eines, um die überschüssige Farblösung abzuspülen (ca. 15 Sekunden); in dem zweiten wird dann differenziert. Nach Abschluß der Differenzierung (ca. 1—3 Minuten), die man zuletzt in einem dritten, mit der Lösung II gefüllten Glas vornimmt, muß sehr gründlich in 95°/oigem Alkohol gewaschen werden. Abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Die Mitochondrien sind scharf rot auf gelblichem Untergrund. Die Methode empfiehlt sich besonders nach Altmannscher Fixierung (§ 974), gelingt aber auch bei Fixierung nach § 970—973. Am schwierigsten ist die Differenzierung in der Pikrinsäure. Wird sie zu früh unterbrochen, so sind Mitochondrien und Protoplasma noch gleichmäßig rot gefärbt, zu spät unterbrochen heben sich die Mitochondrien vom entfärbten Protoplasma nicht mehr genügend ab. 992. Herstellung der Farblösung: In 100 ccm Anilinwasser (s. § 617) werden 20 g (nach D u e s b e r g 10 g) Säurefuchsin gelöst. Da die Haltbarkeit der Lösung sehr beschränkt ist (etwa 24 Stunden), setzt man besser nur 10 ccm an. 993. S e k i löst 5 g Säurefuchsin statt in Anilinwasser in 100 ccm 3—5%>iger Karbolsäurelösung. Diese Lösung soll viel besser färben als die Originallösung. S e k i empfiehlt sie auch für die Kullsche Methode. 994. M e t h o d e v o n K u l i (13). 1. Färben unter Erhitzen bis zur Dampfbildung mit dem Altmannschen Säurefuchsin (vgl. § 992). 2. Abkühlen 6 Min.; dann rasch Abspülen des Farbüberschusses mit dest. Wasser. 3. Färben in einer 0,5°/oigen wässerigen (Thionin- oder) Toluidinblaulösung (1—2 Minuten). 4. Abspülen mit dest. Wasser. 5. Differenzierung in einer 0,5°/oigen Lösung von Aurantia in 70°/oigem Alkohol (20—40 Sekunden). Kontrolle mit dem Mikroskop. 6. 96°/oiger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Mitochondrien bläulich rot, Chromatin blau. Cytoplasma gelbbraun, Dotterkörnchen blaurot. Eine Modifikation dieser Methode siehe in § 1016. 995. Methode von C o w d r y (18). F i x i e r u n g nach Regaud (§ 976). Paraffin. Bleichung mit Permanganat-Oxalsäure je 30 Sek. nach § 983 (s. auch unten), dest. Wasser 1 Min. F ä r b u n g : Abtrocknen des Präparates bis auf eine kleine Zone um das Präparat, auftropfen der Farblösung (Anilinwasser 10 ccm, Säurefuchsin 1 g; nur 24 Std. haltbar), erhitzen über der Flamme bis Dämpfe auf-

§ 996—997.

235

Mitochondrien (Färbung)

steigen, abkühlen, nach 6 Min. abschleudern der F a r b e und abtrocknen u m den Schnitt, so daß n u r auf diesem noch F a r b e zurückbleibt. Wenn zuviel Farbe zurückbleibt, gibt es im Methylgrün Niederschlag; wenn die Farbe zu sehr entfernt wird, fällt die Färbung der Mitochondrien zu schwach aus. Zusetzen von l°/oiger wässeriger Methylgrünlösung mit einer Pipette, so daß die F a r b e den Schnitt überflutet, wobei man diesen, um den Färbeprozeß verfolgen zu können, über ein weißes Papier hält. Dauer etwa 5 Sekunden. Abschleudern, 1—2 Sek. 95°/oiger, dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Mitochondrien rot, andere Zellbestandteile grün bis b r a u n . Der springende Punkt der Methode ist die Behandlung mit Methylgrün. Wenn dieses auch bei kurzer Einwirkung alles Säurefuchsin auszieht, so war die Chromierung der Mitochondrien zu schwach. Man läßt dann die Bleichung weg oder stellt den Schnitt unmittelbar vor der Färbung einige Sekunden in 2°/oige Kaliumbichromatlösung. Färbt das Fuchsin so stark, daß es durch Methylgrün nur ungenügend entfernt wird, so ist das Präparat zu stark gebeizt. Man verlängert dann die Bleichung. Wird das Methylgrün nach guter Differenzierung zu stark ausgezogen, dann bringt man das Präparat statt in 96°/oigen gleich in absoluten Alkohol. Methylgrün gibt besseren Kontrast wie die Pikrinsäure bei der Altmannschen Färbemethode und außerdem sind die Präparate besser haltbar. c) F ä r b u n g

mit

Eisenalizarin-Kristallviolett

u. a.

996. Eisenalizarin-Kristallviolettfärbung von B e n d a (Ol, 03, nach M e v e s u n d D u e s b e r g 08). 1. Die ca. 5 ¡A dicken Schnitte kommen aus dest. Wasser auf 24 Stunden in eine 4%ige Eisenalaunlösung (aus violetten Kristallen). — 2. Nach Abspülen in dest. Wasser, Einstellen in sulfalizarinsaures Natron 24 Std. (Herstellung: Man v e r d ü n n t vor Gebrauch 1 ccm einer gesätt. wässer. Lösung desselben mit 80—100 ccm dest. Wasser.) — 3. Nach Abspülen in dest. Wasser w i r d jedes Deckgläschen bzw. Objektträger in einem Kristallviolettlösung e n t haltenden Schälchen (Uhrglas bzw. Porzellanschälchen) erwärmt, bis Dämpfe aufsteigen und noch 3—5 Min. darin belassen. (Herstellung: Eine 3°/oige Lösung von Kristallviolett in 96n/oigem Alkohol wird vor Gebrauch mit der gleichen Menge Anilinwasser verdünnt.) — 4. Kurz Abspülen in dest. Wasser und Differenzieren in 30°/oiger Essigsäure 1—2 Min. (evtl. auch kürzer oder länger). — 5. Gründliches Auswaschen in fließendem Wasser (mindestens 5—10 Min.), u m jede Spur von der Säure zu entfernen. Dabei t r i t t der durch die Alizarinfärbung b e w i r k t e rötliche Farbton wieder hervor. — 6. Abtrocknen mit glattem Filtrierpapier, momentanes Eintauchen in abs. Alkohol, Bergamottöl (oder Terpineol), Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Mitochondrien intensiv rötlich violett. Auch manche Sekretgranula, Basalmembranen, Kernkörperchen, eosinophile Leukocytengranula können, besonders wenn die Vorbehandlung nicht ganz der Vorschrift entsprach, violett gefärbt sein, doch wird man diese Dinge bei einiger Kritik niemals mit Mitochondrien verwechseln. 997. Der für die Färbung gefährlichste Augenblick ist das Entwässern in Alkohol, da hierin das Kristallviolett sehr leicht zu stark ausgezogen wird. Die Färbung muß dann von 3. ab wiederholt werden. B e n d a (26) empfahl später den abs. Alkohol in 6. ganz zu vermeiden und die Präparate nach dem Abtrocknen mit Filtrierpapier durch reines neutrales Aceton in Cedernöl zu bringen. Auch durch Terpineol läßt sich der Alkohol vermeiden (s. § 834). Ist man bei der Differenzierung zu hastig gewesen, sodaß auch andere Zellbestandteile noch violett gefärbt sind, so differenziert man nach Entfernung des Balsams durch Xylol in einer Mischung von Kreosot und Xylol nach.

236

Die Untersuchung der Zelle

§ 998—1003.

998. Nach S e k i (38) gelingt die Bendasche Methode leichter, wenn man statt Kristallviolett Fuchsin verwendet, das gegenüber Alkohol weniger empfindlich ist ( E i s e n a l i z a r i n - A n i l i n - F u c h s i n - Methode). Fixierung nach Benda, Regaud, Champy oder dgl. Nach Osmium Bleichung. 1. Einstellen der Schnitte in 4%ige Eisen-alaunlösung 2 Stunden oder länger. — 2. Kurz Abspülen in dest. Wasser, Einstellen in sulfalizarinsaures Natron wie § 996 2 Stunden oder länger. — 3. Abspülen in Wasser und Färben in Anilinwasser-Fuchsin w i e in § 996, 3, bis Dämpfe aufsteigen (Herstellung wie Kristallviolettlösung in § 996, 3 nur daß man Fuchsin nimmt). — 4. Abkühlen, kurz Abspülen in Wasser, Differenzieren in 30°/oiger Essigsäure (gewöhnlich 2—5 Min.). — 5. Auswaschen in fließendem Wasser, kurz Eintauchen in 96°/oigen Alkohol, dann 1 Min. in abs. Alkohol, Xylol, Balsam. 999. Die Darstellung der Mitochondrien gelingt ferner auch mit Hilfe der in § 1547 angegebenen Methode von R i o H o r t e g a (1. Modifikation). Bisweilen werden sie auch durch die für die Golgi-Substanz üblichen Methoden sichtbar gemacht.

1000. Als Ergastoplasma werden besonders strukturierte und färbbare Plasmazonen in Ei- und Drüsenzellen bezeichnet, die zumeist erst nach Fixierung mit starken Eiweißfällern in Erscheinung treten, nicht dagegen nach sehr schonender Fixierung mit Mitteln, die Lipoideiweißkomplexe stabilisieren ( R i e s 40). Ergastoplasma und Mitochondrien sind zwei voneinander verschiedene Komponenten des Cytoplasmas. Gute Ergastoplamafixierer sind Alkohol, Carnoysche und Bouinsche Flüssigkeit (Beispiel: Pankreaszelle); Färbung besonders mit Eisenhämatoxylin nach § 672; schwache Gegenfärbung mit Orange G (§ 665). Zur Vitalfärbung ergastoplasmatischer Strukturen bringt M o n n e (38) Speicheldrüsenzellen von Helix 15—30 Min. in l,15°/oige Natriumbikarbonatlösung, dann für 10—15 Min. in eine zweite, die etwas Dahlia enthält. Ergastoplasma blau.

1001. Durch Behandlung mit bestimmten P«-Stufen gelingt es im Grundplasma von Pankreaszellen auch polarisationsoptisch dem Ergastoplasma entsprechende fibrilläre Strukturen nachzuweisen. (Näheres bei R i e s 40.) D. Die Darstellung der Golgi-Substanz1] 1002. Die i n t r a v i t a l e B e o b a c h t u n g d e r G o l g i - S u b s t a n z gelingt an den männlichen Geschlechtszellen von Helix pomatia (P1 a t n e r 85, K a r p o v a 25). Man bringt dazu ein kleines Stückchen der Zwitterdrüse in einen Tropfen Körperflüssigkeit, setzt eine mikroskopische Quantität einer geeigneten, stark verdünnten Farblösung (z. B. Dahlia oder Kresylechtviolett) zu, bedeckt mit einem Deckglas und umrandet. 1003. M o n n e (38) konnte die Golgi-Substanz 1 ) in somatischen Zellen (Helix, Speicheldrüsenzellen u. a.) durch Vitalfärbung darstellen. Die Zellen kommen dazu für 1 Stunde in 0,73°/oige Ammoniumchloridlösung, werden 15 Min. in einer 0,8°/oigen Kochsalzlösung gewaschen und auf 10—15 Min. in eine l,15°/oige Natriumbicarbonatlösung gebracht, die Dahlia und Chrysoidin (Sä) in »in ziemlich starker Menge« enthält. Die Golgi-Substanz kommt grünlich gefärbt in Gestalt von ziemlich großen Plättchen zum Vorschein. ') Als G o l g i - S u b s t a n z wird hier die im Zelleib gelegene, sich bei entsprechender Technik mit Osmiumtetroxyd oder Silbersalzen schwärzende Masse bezeichnet. Eine Zusammenstellung der überaus verwirrten Nomenklatur bei H i r s c h (39).

§ 1004—1010.

Golgi-Substanz

237

1004. Bei Zusatz von etwas Neutralrotlösung färben sich rötliche Granula, die von P a r a t und P a i n l e v e und anderen Autoren als »vacuome« bezeichneten Substanzen entsprechen. Sie sind entgegen der Ansicht von P. und P. mit dem durch Metallimprägnation nachweisbaren Binnenapparat n i c h t identisch. 1005. B e a m s (30a u. b, 31) injiziert zur Darstellung des V a c u o m s in Pankreas und Spinalganglienzellen der Ratte intraperitoneal oder subkutan eine l°/oige Neutralrotlösung in Ringerlösung (2—3mal je 4 ccm in 2stündigen Zwischenräumen). 6—8 Stunden nach Beginn Tötung und Untersuchung dünner Gewebsstückchen in Ringerlös.; Vaselineumrandung. Soll gleichzeitig auch der Binnenapparat dargestellt werden, dann anschließend 14—18 Stunden in l°/oige Osmiumsäure 1 Teil, Sublimatlösung, gesättigt in 0,75°/oiger Kochsalzlösung 1 Teil; 'j-i—3 Stunden Waschen in dest. Wasser, dann 3—6—8 Tage in 2°/oige Osmiumsäure bei 35—37°. 1006. Die besten Resultate gibt nach B o w e n (28) das von der Firma Krall unter der Bezeichnung »Microcolore« gelieferte Neutralrot (erhältlich bei Cogit, Boulevard St. Michel 36, Paris). Bereitet man eine l°/oige Lösung in Ringer od. dgl., so soll diese dauernd bei 38° aufgehoben werden, da andernfalls der Farbstoff nach einigen Tagen wieder ausfällt. Lösungen in dest. Wasser sind bei Zimmertemperatur haltbar. 1007. Zur D a r s t e l l u n g d e r G o l g i - S u b s t a n z i m f i x i e r t e n P r ä p a r a t stehen vor allem zwei Methoden zur Verfügung, die beide mehrere Modifikationen erfahren haben: die S c h w ä r z u n g m i t O s m i u m s ä u r e und die I m p r ä g n i e r u n g m i t S i l b e r s a l z e n . Die Erfahrungen der letzten Jahre haben gezeigt, daß die Osmiummethode den Vorzug verdient, da bei ihr auch die übrigen Teile der Zelle gut fixiert sind. Mit großer Sicherheit und in kurzer Zeit gelingt die Cadmium-Silbermethode von A o y a m a (§ 1023), doch ist die Zellfixierung nicht so gut. Gegen Essigsäure ist die Golgi-Substanz sehr empfindlich. Während der Imprägnation sind die Präparate i m Dunkeln zu halten. Ein ausschlaggebender Faktor ist auch die Temperatur! 1008. Als besondere Vorzüge der O s m i u m m e t h o d e führt K o p s c h (26) an, daß sie fast immer und in jedem Lebensalter gelingt, bei Protozoen wie Metazoen, beim Menschen unter Umständen auch noch mehrere Stunden nach dem Tode; sehr wesentlich ist ferner, daß sie auch eine nachträgliche Darstellung der Drüsengranula, Mitochondrien und anderer Zellbestandsteile mit spezifischen Methoden erlaubt, während die Färbbarkeit und nicht selten auch der Erhaltungszustand der Silberpräparate schlecht ist. 1009. A m besten ist zurzeit wohl die Osmiummethode von K o p s c h in der Modifikation von K o l a t s c h e w : 1. Fixierung im Gemisch von C h a m p y (3°/oige Kaliumbichromatlösung 7 ccm, l°/oige Chromsäurelösung 7 ccm, 2°/oige Osmiumsäure 4 ccm; ( N a s s o n o w [23] mischt 2:2:1). Dauer: 24 Stunden bei Zimmertemperatur. — 2. Auswaschen in fließendem Wasser oder oft erneuertem dest. Wasser 6—24 Stunden. — 3. Osmierung in l°/oiger Osmiumsäure bei 33—35° C. Wenn sich die Flüssigkeit vor Ablauf von 4 Tagen schwärzt, muß sie erneuert werden. Dauer:-3—9 Tage (s. u.). — 4. Sorgfältiges Waschen wie unter 2. Dauer: 1 h—1 Stunde. — 5. Beschleunigtes Durchführen durch die Alkoholreihe. Einbettung in Paraffin. Schnittdicke je nach dem Objekt 2—5 ¡x. — E r g e b n i s : Golgi-Substanz schwarz auf gelblichem bis grauem Untergrund. Zur Nachfärbung der Kerne eignet sich Safranin oder die Nuklealfärbung nach § 1234 f., zur Anfärbung des Protoplasmas Orange G. 1010. B e m e r k u n g e n : ad 1. Die Menge der Fixierungsflüssigkeit soll nicht zu gering sein: Für 4 Stückchen von zusammen 120—200 cmm benötigt man 10 ccm Flüssigkeit. Die Stückchen dürfen nicht mehr als 1—3 mm Seitenlänge haben. Die Fixierungsdauer kann ohne Schaden bis zu 8 Tagen verlängert werden. Der von

238

Die Untersuchung der Zelle

§ 1011—1015.

N a s s o n o w (23) anfänglich empfohlene Zusatz von 0,l°/oiger Pyrogallussäure (auf 10 ccm Champysche Flüssigkeit 2—3 Tropfen) ist unnötig ( N a s s o n o w 24, K o p s c h 26). — An Stelle des Gemisches von Champy kann auch jenes von Altmann, Flemming (ohne Eisessig), Hermann, Meves, oder auch Regaud u. dgl. verwendet werden. Nach H i r s c h l e r (43) ist die Fixierung dem Wassergehalt der Zellen anzupassen: je wasserreicher sie sind, desto osmiumreichere Gemische sind anzuwenden und umgekehrt. Er fixiert daher reihenmäßig in Champygemischen, in denen das Mengenverhältnis der Osmiumsäure zu den beiden anderen Bestandteilen 1:3,5, 1:2 und 1:1 beträgt. ad 3. N a s s o n o w bringt für 8 Stunden in 2°/oige Osmiumsäure bei 40° C und beläßt dann in der gleichen Lösung f ü r 3—9 Tage bei 35°. Im übrigen ist die Zeitdauer des Osmierung f ü r den Erfolg ausschlaggebend. Um den Vorgang im richtigen Zeitpunkt zu unterbrechen, verfährt N a s s o n o w folgendermaßen: Wenn sich die in Osmiumsäure eingelegten Stücke geschwärzt haben (also gewöhnlich vom 3. Tag ab), löst man von einem Stück mit der Zupfnadel ein ganz kleines Fragment ab, verreibt es unter einem Deckglas mit etwas Glyzerin und untersucht bei starker Vergrößerung. Dies wird täglich wiederholt. Bei genügender Imprägnation wird unterbrochen. — Man kann statt dessen auch von jedem Organ mehrere Stückchen einlegen und etwa am 4., 5., 6., 7. und 9. Tage je eines entnehmen und weiterbehandeln. — Zur Osmierung von 4 Stückchen von zusammen. 120 bis 200 cmm benötigt man 3 ccm einer l°/oigen Osmiumsäurelösung. Nach H i r s c h l e r (43) liefert die Osmierung bei 23—25° C reinere und naturgetreuere Bilder als bei 35° C. Die Zeitdauer ist in diesem Fall auf 18—20 Tage zu verlängern. Die O s m i e r u n g m u ß in r e i n w ä s s e r i g e r O s m i u m s ä u r e l ö s u n g e r f o l g e n ; die in § 281 angegebene Lösung in 0,l°/oiger Chromsäure läßt sich zu diesem Zweck nicht verwenden. 1011. Bei vergleichenden U n t e r s u c h u n g e n h a t m a n stets die gleiche Methode, die gleiche Größe der Organstückchen, die gleichen T e m p e r a t u r e n u n d die gleiche Z e i t d a u e r einzuhalten. 1012. Empfehlenswerte Objekte, an denen die Darstellung leicht gelingt, sind Prostata, Trachealdrüsen, Tränendrüsen, Spinalganglien, Niere, Pankreas. 1013. B l e i c h u n g . Bei lang d a u e r n d e r Osmierung w i r d außer der GolgiSubstanz u n d den Mitochondrien (grau) auch das Cytoplasma der Zellen s t a r k geschwärzt, w o d u r c h der Unterschied zwischen Golgi-Substanz u n d Cytoplasma m e h r oder w e n i g e r verschwindet. Z u r B l e i c h u n g der S c h w ä r z u n g b r i n g t K o p s c h (26) die Schnitte in v e r d ü n n t e Wasserstoffsuperoxydlösung; m a n n i m m t 2 T r o p f e n der 3°/oigen Wasserstoffsuperoxydlösung auf 50 ccm dest. Wasser. Meist genügt schon eine E i n w i r k u n g von 10—60 S e k u n d e n . D a n n sofort Auswaschen in Wasser. Bei längerer D a u e r der Bleichung (ca. 5 Minuten) wird auch die Golgi-Substanz e n t f ä r b t . 1014. B ' o w e n zieht dagegen die L u s t g a r t e n s c h e Bleichmethode (§ 983) vor. Die Schnitte w e r d e n u n t e r sorgfältigster mikroskopischer Kontrolle in einer 0.1°/oigen Lösung von ü b e r m a n g a n s a u r e m Kali gebleicht; k u r z bevor die GolgiSubstanz angegriffen wird, einmal abspülen in dest. Wasser u n d sofort in 0,1 "/tilge O x a l s ä u r e 1—2 Minuten. Dann f ü r 10—15 Minuten in fließendes Wasser, Die Lösungen sollen i m m e r frisch b e r e i t e t werden. 1015. Z u r vergleichenden U n t e r s u c h u n g von Mitochondrien, Golgi-Substanz u n d S e k r e t k ö r n c h e n empfiehlt N a s s o n o w (24) folgende Kombinationen: 1. Sekretorische G r a n u l a allein: F i x i e r u n g nach C h a m p y . U n t e r s u c h u n g ohne jegliche F ä r b u n g : Sekretgranula gelblich, Mitochondrien und Golgi-Substanz unsichtbar.

§ 1016—1020.

Golgi-Substanz

239

2. Golgi-Substanz u n d sekretorische G r a n u l a : Osmierung ohne d a r a u f f o l g e n d e F ä r b u n g ; Golgi-Substanz schwarz. Sekretgranula gelblich. 3. Golgi-Substanz u n d T r o p f e n von flüssigem S e k r e t : L ä n g e r d a u e r n d e O s m i e r u n g ohne nachfolgende F ä r b u n g ; Golgi-Substanz schwarz, Tropfen weiß auf grauem Protoplasma. 4. Golgi-Substanz + S e k r e t . + Mitochondrien: Osmierung; d a n n F ä r b u n g mit S ä u r e f u c h s i n - K r i s t a l l v i o l e t t - A u r a n t i a . GolgiSubstanz schwarz, Sekret rot, Mitochondrien violett. 5. Mitochondrien + Sekretionsgranula: F i x i e r u n g n a c h C h a m p y , F ä r b u n g wie Nr. 4. Mitochondrien violett, Sekretgranula rot, Golgi-Substanz ungefärbt. 6. K o n t r o l l p r ä p a r a t e z u m allgemeinen S t u d i u m der Zelle, des K e r n e s u n d des Sekretes: irgendeine Technik, die die Mitochondrien nicht e r h ä l t (z. B. F i x i e r u n g nach Z e n k e r , C a r n o y ) , F ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin. 1016. Die F ä r b u n g m i t S ä u r e f u c h s i n — K r i s t a l l v i o l e t t — A u r a n t i a entspricht ungefähr der Kullschen Methode. 1. Färbung in Säurefuchsin nach Altmann bis zur Dampfbildung. 2. Abspülen in viel dest. Wasser. 3. Färbung in gesättigter Lösung von Kristallviolett in 70°/oigem Alkohol 3—10 Min. (die Dauer wechselt je nach Objekt). 4. Abspülen in dest. Wasser. 5. Schnelle Differenzierung in einer 0,5°/oigen Lösung von Aurantia in 70°/oigem Alkohol einige Sekunden bis eine Minute. 6. 96°/oiger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Balsam. 1017. Ursprünglich brachte K o p s c h (02) die frischen Gewebsstückchen ohne Vorfixierung in 2°/oige Osmiumsäure. Diese Methode der »primären« Osmierung, die 5—8 Tage währte, wurde zugunsten der oben geschilderten »sekundären« Osmierung ziemlich verlassen. 1018. S j ö v a l l (06) fixiert 8 Stunden in Formol 1 Teil + 3 Teile dest. Wassers bei 5—7° C im Dunkeln, wäscht 1 Stunde mit Wasser aus und imprägniert 2 Tage bei 35° C im Dunkeln, wäscht 1 Stunde mit Wasser aus und imprägniert 2 Tage bei 45° C mit 2°/oiger Osmiumsäure. (Das Formol muß säurefrei sein!) 1019. U n t e r den S i l b e r m e t h o d e n ist die U r a n n i t r a t m e t h o d e von R a m ó n y C a j a l und vor allem ihre Modifikation von D a F a n o (20) u n d die C a d m i u m - S i l b e r m e t h o d e von A o y a m a (29) zu empfehlen, w ä h r e n d die Methode Golgis mit arseniger S ä u r e wegen i h r e r i n k o n s t a n t e n Resultate n u r w e n i g géübt w i r d . Zur beachten ist, daß sich in m a n c h e n Fällen neben der Golgi-Substanz auch Mitochondrien i m p r ä g n i e r e n können. 1020. U r a n n i t r a t m e t h o d e von R a m ó n y C a j a l (15): 1. F i x i e r e n ganz frisch e n t n o m m e n e r Stückchen in: U r a n y l n i t r a t 1 g, dest. Wasser 85 ccm, neutrales F o r m o l 15 ccm; D a u e r : 10—24 S t u n d e n . Ab u n d zu leicht umschütteln. Bei Nervenzellen fixiert m a n besser in: F o r m o l 15—20 ccm; dest. Walser 80 ccm; abs. Ä t h y l a l k o h o l 30 ccm; U r a n y l n i t r a t , 1 g. 2. Nach raschem A b s p ü l e n der Stücke in dest. Wasser (einige Sekunden) k o m m e n sie in eine 1—l,5°/oige Lösung von Argent. nitric., w o r i n sie bei Zimm e r t e m p e r a t u r j e nach Größe 36—48 S t u n d e n bleiben. 3. Nach raschem Abspülen in dest. Wasser k o m m e n die Stücke f ü r 8 bis 24 S t u n d e n zur Reduktion in Hydrochinon 1—2 g; n e u t r a l e s F o r m o l 15 ccm; Wasser 100 ccm; Natriumsulfit (wasserfrei!) 0,1—0,5 g (d. h. eine Menge N a t r i u m sulfit, die h i n r e i c h e n d ist, u m in dem Bade sofort eine gelbliche F ä r b u n g zu e r zeugen). Die Lösung ist erst u n m i t t e l b a r vor G e b r a u c h zu bereiten.

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Die Untersuchung der Zelle

§ 1021—1026.

4. Nach Abspülen in gewöhnlichem Wasser H ä r t u n g in Alkohol u n d Einbett u n g in P a r a f f i n oder Celloidin. — Ist die I m p r ä g n a t i o n gut gelungen, d a n n tritt die Golgi-Substanz schwarz auf hellgelbem G r u n d e scharf hervor. A m leichtesten glückt sie an e m b r y o n a l e m und jugendlichem Säugetiermaterial. •3021. V o n b e s o n d e r e r W i c h t i g k e i t f ü r das Gelingen der Methode ist die N e u t r a l i s i e r u n g des f ü r die Fixierungsflüssigkeit wie des f ü r die Reduktionsflüssigkeit v e r w e n d e t e n Formols ü b e r Calciumcarbonat (s. § 257). 1022. K o b a l t n i t r a t m e t h o d e v o n D a F a n o (20). 1. F i x i e r u n g 3 m m dicker Stückchen in K o b a l t n i t r a t 1 g, dest. Wasser 100 ccm, F o r m o l 15 ccm. 6—8 S t u n d e n bei jungem, 12—24 S t u n d e n bei e r w a c h s e n e m Gewebe. Z i m m e r t e m p e r a t u r . — 2. Schnell abspülen, u n d einlegen in l,5°/oige Silbernitratlösung im D u n k e l n u n d bei Z i m m e r t e m p e r a t u r D a u e r 24—48 Stunden, je n a c h Größe. — 3. Schnell abspülen, zerschneiden auf 2 m m Dicke u n d r e d u z i e r e n nach § 1020,3 8—24 Stunden. 4. K u r z auswaschen in Wasser. E i n b e t t u n g in P a r a f f i n oder Celloidin. 1023. C a d m i u m - S i l b e r m e t h o d e von F. A o y a m a (29). 1. Fixieren kleiner S t ü c k c h e n f ü r 3—4 Stunden in Cadmiumchlorid 1 g, n e u t r . Formol 15 ccm, dest. Wasser 85 ccm. — 2. Zweimaliges rasches A b w a s c h e n in dest. Wasser u n d einlegen in eine l,5°/oige Silbernitratlösung 10—15 S t u n d e n bei 22° C. — 3. Zweimaliges rasches A b w a s c h e n in dest. Wasser u n d reduzieren nach § 1020,3 5—10 Stunden. — 4. Gründliches Auswaschen in B r u n n e n w a s s e r . E i n b e t t e n in P a r a f f i n . Die angegebenen Konzentrationen und Zeiten stellen für die meisten Warmblütergewebe das Optimum dar. Bei Kaltblütern müssen die Zeiten in 1 und 2 verlängert werden. — Die Flüssigkeiten werden zum Lichtschutz unter Papphülsen gestellt, das Wechseln erfolgt bei gedämpftem Licht. Cadmiumchlorid hat nach A. den Vorteil, daß es leichter eindringt als Urannitrat und haltbarer ist als hygroskopische Kobaltnitrat. 1024. Bei § 1020 wie bei § 1022 und 1023 tritt eine vollständige Imprägnierung der Golgi-Substanz meist nur in einer schmalen Zone des Präparates ein. Von Wichtigkeit ist die Zeitdauer der Fixierung, die durch Probieren für jedes Objekt festgestellt werden muß. Häufig trifft man schon nach 3 Stunden die beste Imprägnierung, die dann bei längerer Dauer wieder zurückgeht. 1025. Z u r Darstellung der Golgi-Substanz in Einzelschnitten nach Celloidinu n d P a r a f f i n e i n b e t t u n g w u r d e von v. F i e a n d t und S a x e e n (36) eine modifizierte Bielschowsky-Methode angegeben. Näheres s. Original. 1026. Als L i p o c h o n d r i e n bezeichnet R i e s k ö r n c h e n a r t i g e Substanzen, die d u r c h Lipoidreaktionen, vitale F ä r b b a r k e i t mit basischen Vitalfarbstoffen u n d d u r c h Teilungsfähigkeit gekennzeichnet sind. Zu i h r e m Nachweis dient V i t a l f ä r b u n g mit Neutralrot, f e r n e r Einlegen des frischen Zellmaterials in 1%>ige Osmiumsäure, wobei sich die Lipochondrien bei Z i m m e r t e m p e r a t u r binnen 1 S t u n d e b r ä u n e n . Im fixierten P r ä p a r a t sind sie elektiv durch S a f r a n i n - L i c h t g r ü n darzustellen. H i r s c h (39) rechnet die Lipochondrien den P r ä s u b s t a n z e n der Golgisysteme zu. J ä r v i (40) konnte w e d e r ihre Teilnahme an der Sekretbild u n g noch eine Beziehung zur Golgi-Substanz bestätigen; er h ä l t sie f ü r eine V o r s t u f e von Lipofuscin. Zusammenfassende Literatur über die Golgi-Substanz: C o w d r y , D a F a n o (25), K o p s c h (26), J a c o b s (27) und insbesondere H i r s c h (39). Eine sehr eingehende Darstellung der Technik bei B o w e n (28).

§ 1027—1031.

Fette und fettähnliche Stoffe

241

E. Nachweis von Fetten und fettähnlichen Stoffen 1. Vorbemerkungen 1027. Bei allen histologischen Fettfärbemethoden ist zu beachten, daß sich auch im günstigsten Falle nur das morphologisch sichtbare Fett darstellen läßt, während sich das in fein disperser Phase befindliche sog. »unsichtbare« Fett, das meist in ansehnlicher Menge vorhanden ist, dem histologischen Nachweis entzieht. Schon das »unsichtbare« Fett vereitelt sowohl eine quantitative wie qualitative histologische Fettanalyse. 1028. Werden Gefrierschnitte von unfixiertem, fetthaltigem Gewebe mit Aceton extrahiert, so verlieren sie ihre Färbbarkeit mit den gebräuchlichen Fettfarbstoffen, trotzdem sie, wie eine nachfolgende Extraktion mit Äther und Alkohol ergibt, noch reichliche Mengen von Fettsubstanzen enthalten ( K u t s c h e r a A i c h b e r g e n). Zu diesem unfärbbaren Fett kommen noch die an Eiweiß gebundenen Fettstoffe, die durch Lösungsmittel nicht extrahierbar, aber durch Behandlung mit Pepsin, Trypsin, ( B i e d e r m a n n 24), Laugen oder Phenolen sichtbar zu machen sind. Das Auftreten von Fetteinschlüssen infolge Befreiung aus Eiweißverbindungen, wie es z. B. bei Zelldegerationen vorkommt, wird als »L i p o p h a n e r o s e « bezeichnet. Diese ist abzugrenzen von der Aufspeicherung von Fett durch » f e t t i g e I n f i l t r a t i o n « .

1029. Eine quantitative Analyse des Fettgewebes auf histologischem Wege scheitert auch daran, daß das Sichtbarwerden von Fett nicht nur von der Menge des vorhandenen Fettes, sondern vor allem auch von den sehr wechselnden physikalisch-chemischen Bedingungen, so z. B. von seinem Lösungszustand abhängig ist. Die morphologisch sichtbare Fettmenge kann infolgedessen bei gleichem Fettgehalt überaus wechselnd sein. In den Zellen der Rattenleber treten nach R o s e n t h a l sichtbare Fettropfen erst auf, wenn der Neutralfettgehalt 1,5 mg °/o übersteigt. Bei einem Fettgehalt unter 2 mg °/o besteht nach H e r i n g a (39) eine bemerkenswerte Ungleichförmigkeif der Sudanfärbung.

1030. Die sog. Fettfarbstoffe färben neben den F e t t e n im engeren Sinne in wechselndem Ausmaß auch die L i p o i d e , worunter man Wachse, Phosphatide, Cerebroside, Sterine und Carotinoide zusammenfaßt. Die im tierischen Gewebe morphologisch nachweisbaren Fette und Lipoide (zusammenfassend als » F e t t s u b s t a n z e n « bezeichnet) sind niemals rein, sondern stellen stets Gemische verschiedenartiger Stoffe dar, durch welche Lösungsverhältnisse wie Färbbarkeit stark beeinflußt werden, so daß es bis jetzt nicht möglich ist, bestimmte Gruppen mit Sicherheit histochemisch zu erfassen. Im günstigsten Falle mag es gelingen, auf mikroskopischem Wege zu einer Aussage über die Hauptkomponente des Gemisches zu gelangen, während sich die Begleitsubstanzen wohl immer einer genaueren Feststellung entziehen. Ältere Angaben über die Spezifität der histologischen Fettfärbemethoden lassen sich nur in sehr eingeschränktem Maße aufrechterhalten. Diese Einschränkung ist auch bei der nachfolgenden Zusammenstellung der Methoden zu Gruppenreaktionen stets im Auge zu behalten. Weitere Angaben über die Leistungsfähigkeit werden bei der Beschreibung der einzelnen Färbemethoden erfolgen. Siehe auch § 1088. 1031. Zur Feststellung der Spezifität der Fettfärbemethoden untersuchten seit A11 m a n n zahlreiche Forscher auch Reinsubstanzen und deren Gemische, die, auf Papierstreifen aufgetragen, fixiert und gefärbt wurden. (Z. B. A s c h o f f , K a w a m u r a , M a y e r , S c h a e f f e r und R a t h e r y , E s c h e r , C h a l a t o w u. a.) Aus neuerer Zeit seien besonders die Untersuchungen von K a u f it

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

242

Die Untersuchung der Zelle

§ 1032—1038.

m a n n und L e h m a n n (26, 27, 28) hervorgehoben, die einige der wichtigsten Fettfärbemethoden (Sudan, Nilblausulfat, Methode nach Fischler, Smith-Dietrich, Schulz, Ciaccio) an über 100 verschiedenen Fettsubstanzen und Fettgemischen auf ihre Spezifität prüften; sie benützten dabei als Substrat an Stelle der bisher üblichen Papierstreifen, die sich als wenig brauchbar erwiesen, entfettetes Hollundermark. Die Versuche ergaben eine weitgehende Einschränkung der Spezifität der genannten Methoden.

1032. Aus dem Gesagten ergibt sich ferner, daß der negative Ausfall einer histologischen Fettfärbemethode niemals berechtigt, das Fehlen dieser oder jener Fettsubstanz anzunehmen. Wenn irgend möglich, soll die histologische Untersuchung durch parallellaufende, chemische Analysen, die sich nicht nur auf eine, sondern möglichst zahlreiche Fettsubstanzen zu erstrecken haben, ergänzt werden. 2. Untersuchung des lebenden und des frischen Präparates

1033. Für die V i t a l f ä r b u n g der Fettsubstanzen dürfte die Färbung mit R h o d a m i n B, das stark lipoidlöslich und dabei unschädlich ist, Bedeutung gewinnen. Seine Verteilung in der lebenden Zelle deckt sich nach S t r u g g e r vollständig mit der Verteilung der lipoiden Komponenten. Erforderlich ist allerdings Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop (s. auch § 924). 1034. Das Auftreten und die allmähliche Vergrößerung von Fettröpfchen läßt sich am schönsten an den lebenden Zellen von Deckglaskulturen beobachten. Vitalfärbung durch Zufügen von etwas Sudan III oder Scharlach R ist möglich. 1035. Eine zusammenfassende Darstellung über intravitale Fettfärbung auf enteralem und parenteralem Weg bei H a d j i o f f (38b, c); s. ferner § 795.

1036. Die Untersuchung des Präparates in f r i s c h e m u n f i x i e r t e m Z u s t a n d ist sehr zu empfehlen, da sie vorhandene Fettsubstanzen oft besser erkennen läßt, als das fixierte Präparat. Außerdem ist bekannt, daß die Fettsubstanzen durch die Fixierung, auch bei Vermeidung von fettlösenden Flüssigkeiten, häufig nicht unwesentlich beeinflußt werden. Auch das so viel gebrauchte Formol ist nicht indifferent, da es auf die Fettsubstanzen nicht nur lösend, sondern auch verändernd wirkt (s. § 1037 und § 253). 1037. So verlieren z. B. Gefrierschnitte von frischem Gehirn nach Acetonextraktion ihre Färbbarkeit mit Sudan usw., während sich Gefrierschnitte von formolfixiertem Gehirn auch nach Acetonextraktion noch nachfärben. Nebennierenschnitte bleiben dagegen nach Acetonextraktion in unfixiertem wie fixiertem Zustand ungefärbt ( K a u f m a n n ; L e h m a n n und B a n i e c k i). Längere Einwirkungen von Formol ist auch auf die Doppelbrechung von nachteiligem Einfluß. Ferner ist festgestellt, daß dadurch die Art der Farbreaktion z. B. mit Nilblausulfat verändert wird (B o e m i n g h a u s). Die Abnahme der Färbbarkeit bei älterem Formolmaterial findet ihre Erklärung u. a. in der Feststellung von H a m m a r , daß durch Formol eine beträchtliche Menge an Fettstoffen extrahiert wird.

Jede eingehende U n t e r s u c h u n g sollte daher auch das f r i s c h e G e w e b e b e r ü c k s i c h t i g e n . Z u m m i n d e s t e n ist zu f o r d e r n , daß bei speziellen F e t t u n t e r s u c h u n g e n das Mat e r i a l n i c h t l ä n g e r als h ö c h s t e n s e i n i g e T a g e in F o r m o l l i e g t (s. auch V e r s e 25). 1038. Die Untersuchung des frischen Gewebes erfolgt an Zupfpräparaten oder an Gefrierschnitten, die in üblicher Weise in physiologische Kochsalzlösung, Glyzerin od. dgl. allenfalls unter Zusatz von Farbstoffen eingeschlossen

§ 1039—1041.

Fette und fettähnliche Stoffe

243

und u m r a n d e t werden. Die Fettsubstanzen treten bei schwacher Vergrößerung und s t a r k e r Abbiendung als dunkle, stark lichtbrechende Körnchen hervor. 1039. Z u r Feststellung der D o p p e l b r e c h u n g untersucht man das frische, in Kochsalzlösung oder Glyzerin liegende P r ä p a r a t im Polarisationsmikroskop. F e t t e verhalten sich meist einfachbrechend (isotrop), Lipoide häufig doppelbrechend (anisotrop). Doppelbrechende Lipoide können in Tropfen- oder in Kristallform vorkommen. Sind sie im ersteren Fall in amorpher F o r m vorhanden, so k a n n auch eine bestehende Doppelbrechung infolge unregelmäßiger Lagerung der Achsen der einzelnen Lipoidteilchen zueinander undeutlich oder nicht e r k e n n b a r sein. Sind die Tropfen dagegen als Sphärokristalle vorhanden, dann zeigen sie im polarisierten Licht ein dunkles Achsenkreuz mit vier hellaufleuchtenden Quadranten. In Kristallform erscheinen sie bei Drehen des Objekttisches um 360° viermal hell und viermal dunkel. Nach Einschalten eines Gipsplättchens Rot I. Ordnung heben sich die doppelbrechenden Substanzen in lebhaften I n t e r f e r e n z f a r b e n vom roten U n t e r g r u n d ab, außerdem ist von Vorteil, daß dabei die Verdunkelung des Gesichtsfeldes, die sonst bei Kreuzung beider Nicols eintritt, ausbleibt, so daß die verschiedenen S t r u k t u r e n ständig sichtb a r bleiben und gut lokalisiert werden können. Weiteres s. § 1074 ff. Eingehende Angaben über das Verhalten der Fettsubstanzen im polarisierten Fett findet man bei W. J. S c h m i d t (24, 37, 38, 40b). Hier auch reiche Literaturangaben. 3. Allgemeine Fettfärbemethoden

a) M i t S u d a n u n d

Scharlach

1040. Die gebräuchlichste Fettfärbemethode ist zweifellos die F ä r b u n g mit Sudan oder Scharlach, durch die beinahe alle im Körper vorkommenden Fettarten g e f ä r b t werden. Bei ihrer Anwendung ist daher zu berücksichtigen, daß weder die Sudan- noch die Scharlachfärbung ein Urteil über die Gruppenzugehörigkeit der durch sie gefärbten Fettsubstanzen gestattet (s. auch § 1030 f). Differenzen im F a r b t o n beruhen nicht auf chemischen, sondern auf Konzentrationsunterschieden infolge verschieden s t a r k e r Anreicherung des Farbstoffes. Vorbedingung f ü r die Anwendung der Fettfarbstoffe ist, daß die P r ä p a r a t e weder vor noch nach der F ä r b u n g mit fettlösenden Flüssigkeiten (z. B. höherprozentigem Alkohol, Xylol u. dgl.) in B e r ü h r u n g kommen. Man verwendet dah e r vor allem Gefrierschnitte, die entweder von unfixierten oder von geeignet fixierten P r ä p a r a t e n angefertigt werden. Als Fixierungsflüssigkeit ist h a u p t sächlich Formol, Helly oder Regaud zu empfehlen (s. auch § 1063). Nach der F i xierung w i r d in Wasser ausgewaschen. Leicht zerfallende Organe werden in Gelatine eingebettet. Die F ä r b u n g des Fettes durch Sudan usw. b e r u h t darauf, daß der Farbstoff aus dem schlechteren Lösungsmittel, dem Alkohol, durch das bessere, das Fett, gewissermaßen ausgeschüttelt wird ( M i c h a e l i s ) . Der Färbevorgang ist also ein Beispiel eines rein physikalischen Färbeprozesses. Unter Sudanlösungen gleicher Alkoholkonzentration ist die F ä r b e k r a f t einer Lösung u m so größer, je mehr i h r Farbstoffgehalt jenen einer bei Z i m m e r t e m p e r a t u r im Lösungsgleichgewicht befindlichen überschreitet. Die kolloidale Beschaffenheit spielt dabei m e h r die Rolle einer Begleiterscheinung als die einer Ursache (R o m e i s 29). 1041. D e r im Handel erhältliche Farbstoff S u d a n I I I stellte lange J a h r e ein inkonstantes Gemisch mehrerer Farbstoffe dar. R o m e i s (29) konnte aus IS*

244

Die Untersuchung der Zelle

§ 1042—1044.

ihm drei in ihren Eigenschaften sehr verschiedene Farbstoffe isolieren, die zur Unterscheidung als Sudan-Rot, Sudan-Orange und Sudan-Gelb bezeichnet wurden. Sudan-Rot (Schmelzpunkt 179,6°) löst sich in konz. Schwefelsäure in dunkelgrüner, Sudan-Orange (Schm.-p. 201,5°) dagegen in roter Farbe. SudanOrange ist in absolutem wie in wasserhaltigem Alkohol viel leichter löslich als Sudan-Rot. Sudan-Gelb ist eine dem Handelsprodukt anhaftende Begleitsubstanz, die als Fettfarbstoff belanglos, bei der Herstellung kolloidaler Lösungen aber offensichtlich von wesentlicher Bedeutung ist. Das Mengenverhältnis von Sudan-Rot und Sudan-Orange ist in den einzelnen Handelsmarken von Sud a n III verschieden. Das jetzt bei Hollborn erhältliche standarisierte S u d a n besteht aus SudanRot. In geringer Menge enthält es auch den als Sudan-Gelb bezeichneten Begleitstoff. Der Farbstoff entspricht dem Sudan-Rot B der I. G. Farben. 1042. Bei allen in § 1045—1052 angegebenen Methoden muß die Färbung in gut verschlossenen Färbeschalen vorgenommen werden (Glasschliff), da es bei Verdunsten des Lösungsmittels sehr leicht zu Farbstoffniederschlägen im Präparat kommt. Stammlösungen in 80- oder 96°/oigem Alkohol sind jahrelang haltbar, die schwächerprozentigen Färbelösungen sollen dagegen öfters erneuert werden, da sie mit zunehmendem Alter O/2—1 Jahr) schlechter färben. Meist läßt man der Fettfärbung noch eine Blaufärbung der Kerne folgen, zumal durch den Farbgegensatz auch die Farbtöne der dargestellten Fettsubstanzen verstärkt werden. Zu empfehlen ist dazu besonders das Ehrlichsche Hämatoxylin (§ 666) oder das saure Hämalaun (§ 651). M i c h a e l i s verwendet eine verdünnte wässerige Lösung von Methylenblau. 1043. Der E i n s c h l u ß d e r g e f ä r b t e n P r ä p a r a t e erfolgt in Glyzerin, Glyzeringelatine, Gelatinebalsam oder Lävulosesirup (s. § 811). Den letzteren empfiehlt besonders M i c h a e l i s , da er schneller eindringt und stärker aufhellt. Bei Einschluß in Lävulose färbt man die Kerne mit Methylenblau, da die Hämatoxylinfärbung in ihr rasch zerstört wird. 1044. Für die Färbung g r o ß t r o p f i g e n Fettes genügen alle nachfolgend angegebenen Lösungen, unter welchen die alkoholische Sudanlösung nach D a d d i (§ 1045) am häufigsten gebraucht wird. Ähnliche Ergebnisse gibt die Scharlach- oder Sudan-Diacetinlösung nach G r o ß - D o m a g k (§ 1047). Am raschesten f ä r b t die Scharlach-Acetonlösung nach H e r x h e i m e r (§ 1046). Die feinen i n t r a z e l l u l ä r e n F e t t - u n d L i p o i d t r ö p f c h e n , die durch die vorausgehend angeführten Lösungen nur unvollständig oder auch gar nicht angefärbt werden, werden erst durch die kolloidale Sudanlösung nach R o m e i s (§ 1048) klar und vollständig zur Darstellung gebracht. Bei dieser Lösung kommt auch die schrumpfende Wirkung der Aceton- oder KOH-haltigen Lösungen, wie die fettlösende Wirkung der mit höherprozentigem Alkohol angesetzten Lösungen in Wegfall. Daß die letztere bei exakten Untersuchungen nicht vernachlässigt werden darf, haben die Untersuchungen von K a u f m a n n und L e h m a n n (26, 29) deutlich gezeigt, dann sie stellten fest, daß die zumeist gebrauchte 70%ige alkoholische Lösung aus fettgetränkten Papierstreifen wie auch aus dem Gewebe große Fettmengen entzieht, während eine 40°/oige alkoholische Lösung eine kaum nennenswerte extrahierende Wirkung besitzt. — Ebenso vollständig gelingt die Färbung der feinsten Fett- und Lipoidtröpfchen mit Sudan-Schwarz (§ 1050).

§ 1045—1048.

Fette und fettähnliche Stoffe

245

1045. Färbung mit a l k o h o l i s c h e r S u d a n l ö s u n g nach D a d d i . 1. Die in dest. Wasser aufgefangenen Gefrierschnitte werden für wenige Minuten in 50°/oigen Alkohol übertragen. 2. Färben in alkoholischer Sudanlösung (s. u.) 15—30 Minuten. 3. Kurz abspülen in 50°/oigem Alkohol (nach B. F i s c h e r unnötig und schädlich), 4. Auswaschen in dest. Wasser. Kernfärbung mit Hämalaun od. dgl. Auswaschen. Einlegen in Glyzerin od. dgl. (s. o.). E r g e b n i s : Fettsubstanzen intensiv orangegelb, Kerne blau. H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g : Man übergießt 0,2—0,3 g Sudan mit 100 ccm heißen 70°/oigen Alkohols und stellt unter mehrmaligem Umschütteln verschlossen in den Paraffinofen. Nach einigen Stunden läßt man erkalten und filtriert. Die Färbekraft dieser Lösung läßt sich dadurch verstärken, daß man zu 20 ccm der Lösung kurz vor der Färbung 2—3 ccm dest. Wasser setzt. Sobald sich die Lösung leicht trübt, was nach kurzer Zeit der Fall ist, wird in ihr 20 Minuten gefärbt ( F r o b o e s e und S p r ö h n l e 28). 1046. F ä r b u n g m i t S c h a r l a c h R. (Zuerst M i c h a e l i s . ) 1. Einlegen der Gefrierschnitte in 50°/'oigen Alkohol. 2—5 Minuten. — 2. Färben in der Aceton-Scharlachlösung nach H e r x h e i m e r (s. u.): 2—3 Minuten. — 3. Kurz abspülen in 70%igem Alkohol. — 4. Auswaschen in Wasser. Kernfärbung mit saurem Hämalaun. Auswaschen. Glyzerin. — E r g e b n i s : Fettsubstanzen orangerot, Kerne blau. H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g : Aceton 50 ccm, 70°/oiger Alkohol 50 ccm, Scharlach R 0,2—0,3 g. Vor Gebrauch filtrieren. Gut verschließen. Allenfalls gibt man zu der filtrierten Farblösung, um das leicht eintretende Ausfallen von Farbkristallen (z. B. bei Temperaturschwankungen im Laboratorium) zu verhüten, einige ccm einer reinen Aceton-Alkoholmischung. Das Abspülen in 70°/oigem Alkohol ist notwendig, um die Mitfärbung des Bindegewebes zu beseitigen und ein späteres Auftreten von Farbkristallen zu vermeiden. — Die obige Färbedauer soll nicht viel überschritten werden. Allzu intensiv gefärbte Fettröpfchen treten im Präparat weniger gut hervor als leuchtend orangerot gefärbte. 1047. D i a z e t i n - S c h a r l a c h l ö s u n g nach W. G r o ß (30). Man verdünnt zuerst 50 ccm Diazetin mit 50 ccm dest. Wasser, fügt 0,6 g Scharlach zu, löst bei 60° C, läßt abkühlen und filtriert. Zur Färbung bringt man die Schnitte aus Wasser in die Farblösung, stellt etwa 10 Minuten in den Paraffinofen, läßt abkühlen und überträgt die Schnitte in Wasser, in dem sie zur Vermeidung von Niederschlägen unter Bewegung gründlich abgespült werden müssen. G r o ß hebt als Vorzug der Methode hervor, daß Diazetin kein Fett löst. D o m a g k (33) empfiehlt die gleiche Methode unter Verwendung von Sudanrot. 1048. F ä r b u n g m i t k o l l o i d a l e r S u d a n l ö s u n g nach R o m e i s (29, 36). V o r b e m e r k u n g : Meine 1929 veröffentlichte Färbevorschrift war für die damals erhältlichen Farbstoffmarken ausgearbeitet, die ein Gemisch von drei verschiedenen Farbstoffen darstellten (s. § 1041). Das bei Hollborn jetzt erhältliche standardisierte Sudan weist in der Zusammensetzung diesen älteren Marken gegenüber Unterschiede auf; es besteht vorwiegend aus Sudanrot. Bei Verwendung dieser Farbstoffmarke verfahre ich nun nach der folgenden, 1936 veröffentlichten Vorschrift. 1. Herstellung der Stammlösung: J e 1 g Sudan werden in einem Erlenmeyerkolben mit je 100 ccm 80°/oigen Alkohol Übergossen. Nach Aufsetzen eines Siederohres (Glasrohr von etwa 1,2—1,5 m Länge und 6—8 pim lichter Weite in durchbohrtem Korkstopfen) wird die Flüssigkeit in einem kochenden Wasserbad bis zum Sieden erhitzt. Hierauf läßt, man den mit Gummistopfen verschlossenen

246

Die Untersuchung der Zelle

§ 1049.

Kolben bei Zimmertemperatur abkühlen und stellt ihn noch für V2—1 Stunde in fließendes Wasser; die am folgenden Tag vom Ungelösten abfiltrierte Lösung wird als Stammlösung in einem Kolben aus Jenaer Glas gut verschlossen aufbewahrt. Sie ist jahrelang haltbar. Längeres Kochen der Farblösung ist nicht von Vorteil. Man nimmt die Lösung vielmehr kurz nach Beginn des Siedens aus dem Wasserbad. 2. Bereitung der kolloidalen Färbelösung von 40°/o Alkoholgehalt. a) L a n g s a m e M e t h o d e . Eine bestimmte Menge (z. B. 20 ccm) der Stammlösung w i r d abfiltriert und in einem reinen Schüttelzylinder mit der gleichen Menge dest. Wasser versetzt. Der Zusatz erfolgt in Portionen von 5 ccm; nach jedem Zusatz wird der Schüttelzylinder lOmal hin und her gekippt. Die sehr stark kolloidale Lösung muß zunächst 24 Stunden gut verschlossen stehenbleiben. Erst dann kann sie nach Filtrieren zum Färben verwendet werden. b) R a s c h e M e t h o d e . Eine abfiltrierte Menge der Stammlösung w i r d w i e in a) mit der gleichen Menge dest. Wasser versetzt, anschließend auf Zentrifugengläser verteilt und V2 Stunde lang zentrifugiert. Hierauf wird vorsichtig von dem evtl. vorhandenen geringen Sediment abgegossen und filtriert. Das Filtrat kann, wenn nötig, sofort zum Färben verwendet werden. Andernfalls w i r d es gut verschlossen aufbewahrt. Das Zentrifugieren der Färbelösung erfolgt auf einer einfachen Laboratoriumszentrifuge mit 1000—3000 Umdrehungen. Zum Filtrieren verwendet man ein gewöhnliches Schleicher-Schüllfilter Nr. 595. Nach beiden Methoden muß die Färbelösung ein zinnoberrotes, lackfarbenes Aussehen besitzen. Sie muß so stark kolloidal sein, daß sie selbst in 3 mm dicker Schicht noch völlig undurchsichtig ist. Setzt sich der Farbstoff beim Zentrifugieren oder nachher im Laufe der ersten 24 Stunden in Flocken ab, so wurde bei der Herstellung der Lösung ein Fehler begangen oder die verwendete Farbmarke ist ungeeignet. Gute kolloidale Lösungen sind, wenn sie gut verschlossen aufbewahrt werden, 2—3 Wochen brauchbar, müssen aber vor jedem Gebrauch filtriert werden. 3. Ausführung der Färbung. Ein mit eingeschlifienem Glasdeckel versehenes Wägegläschen od. dgl. w i r d zu zwei Drittel mit der nach 2a) oder 2b) bereiteten Färbelösung gefüllt. Die Schnitte werden mit einem gebogenen Glasstäbchen aus dest. Wasser in die Lösung übertragen. Die Färbedauer ist vor allem von der Temperatur abhängig. Bei 28° C genügen in der Regel 4—5 Stunden, bei 19 bis 20° C dauert es 12—16 Stunden bis der gleiche Färbegrad erreicht ist. Nach der Färbung müssen die Schnitte in dest. Wasser unter kräftigem Hin- und Herbewegen abgespült werden. Hierauf Kernfärbung in Ehrlichschem Hämatoxylin (§ 666), kurz dest. Wasser und gründliches Auswaschen in Brunnenwasser (15—30 Min.), Eindecken in Glyzerin oder in Gummisirup. 4. Ergebnis. Die Fettsubstanzen sind bis zur Grenze der mikroskopischen Sichtbarkeit herab außerordentlich scharf gefärbt. Neben den intra- und interzellulär gelegenen Fettröpfchen ist auch das in diffuser Form vorhandene Fett durch mehr oder weniger starke diffuse Anfärbung in orangerotem Ton sichtbar. Auch die Markscheiden werden stark gefärbt. 1049. H y d r o t r o p e L ö s u n g e n nach H a d j i o l o f f . Durch Zusatz hydrotroper Substanzen (z. B. Seifen, Saponin, Coffeinum benzoicum, Trichloressigsäure) gelingt es, wasserunlösliche Fettfarbstoffe in Wasser zu lösen. H a d j i o l o f f verwertet diese Erscheinung zur Herstellung wäßriger Sudanlösungen. Man bereitet zuerst eine Lösung der hydrotropen Substanz (z. B- eine 30°/oige Trichloressigsäurelösung), gibt dann den Farbstoff zu (Sudan oder Scharlach) und läßt die Lösung

§ 1050—1053.

Fette und fettähnliche Stoffe

247

einige Tage im Wärmeschrank bei 56° C stehen. Dann abkühlen und filtrieren. Das Filtrat muß völlig klar sein. Zur Färbung werden Gefrierschnitte von frischem oder fixiertem .Material für 20 Min. bis 24 Std. (je nach Konzentration oder Natur der hydrotropen Substanz) in die Farblösung gebracht. Dann sehr sorgfältig Auswaschen in Wasser, evtl. Kernfärbung mit Hämatoxylin, Glycerin. Die hydrotropen Lösungen haben oft einen anderen Farbton als der Farbstoff (Sudan löst sich z. B. in Trichloressigsäure blau), die Fettsubstanzen färben sich aber im Ton des Farbstoffes. Uberfärbung ist zu vermeiden; bei ihr nehmen namentlich die kleinsten Fettröpfchen einen schwarzroten Farbton an, der sich gegen die blaugefärbten Kerne schlechter abhebt als der orange- bis granatrote bei richtiger Färbedauer. Außerdem setzen sich bei allzulanger Dauer der Färbung auf dem Schnitt leicht Farbkristalle ab. 30° C sollen bei der Färbung nicht überschritten werden. 1050. Färbung mit S u d a n s c h w a r z B ( L i s o n 34). Zur Herstellung der Lösung übergießt man 0,1 g Sudanschwarz (standard., Hollborn) mit 100 ccm 70°/oigem Alkohol und erhitzt zum Kochen. Nach Abkühlen wird filtriert. Die Schnitte kommen aus dest. Wasser oder 40°/oigem Alkohol für Va—3 Stunden in die Farblösung. Großtropfiges Fett ist schon in 5—10 Minuten stark gefärbt. Dann Abspülen in dest. Wasser, Kernfärbung in Kernechtrot, Carmalaun oder Safranin. Auswaschen in Wasser. Einlegen in Glyzerin od. dgl. — Ergebnis: Die Fettröpfchen sind sehr scharf und vollständig in dunkelblauem bis schwarzem Ton gefärbt. Auch die Markscheiden treten gut hervor. Unter pathologischen oder experimentellen Bedingungen auftretende Kohlenwasserstoffe (Vaselin, Paraffin, liquidum) färben sich im Gegensatz zu den normalen Fettkörpern violett ( G é r a r d 35). 1051. Auch das von L i s o n empfohlene B l e u BZL (Ciba) färbt die Fette gut. Infolge des hellblauen Farbtones treten die feinen Fettröpfchen jedoch weniger scharf hervor als bei Färbung mit Sudanschwarz. Man verwendet eine heißgesättigte Lösung in 50%igem Alkohol. Die Schnitte kommen aus Wasser für 15 Min. bis 24 Stunden in die filtrierte Farblösung, dann abspülen in dest. Wasser. Weiteres wie in § 1050. 1052. F e t t f ä r b u n g m i t C h l o r o p h y l l . (Zuerst E i s e n b e r g.) Man verwendet dazu eine gesättigte Lösung von Chlorophyll in Aceton und 70°/oigem Alkohol zu gleichen Teilen (gut v verschließen!). Die Gefrierschnitte werden kurz in 70°/oigen Alkohol getaucht, 3 Minuten gefärbt, in 70°/oigem Alkohol abgespült und in dest. Wasser gut ausgewaschen. Zur Kernfärbung eignet sich Carmalaun, Kernechtrot oder dgl. E r g e b n i s : Fettsubstanzen grün. Die Chlorophyllmethode kommt besonders dann in Betracht, wenn bei Vornahme kombinierter Färbungen eine grüne Kontrastfärbung des Fettes erwünscht ist. A r n d t kombiniert sie z. B. mit Glykogenfärbung nach B e s t , mit Eosin, mit van Giesonscher Färbung, Tuberkelfärbung, Amyloidfärbung, mit Darstellung eisenhaltiger Pigmente durch Turnbullblau u. dgl. b) N a c h w e i s v o n F e t t s u b s t a n z e n d u r c h O s m i e r u n g . 1053. Vor Einführung der Fettfärbung mit Sudan usw. erfolgte der Nachweis der Fettsubstanzen vor allem durch Einwirkung von O s m i u m s ä u r e , eine Methode, die auch jetzt noch in geeigneten Fällen empfehlenswert ist. Die Verwendung der Osmiumsäure beruht auf der Beobachtung, daß sich ein Teil der Fettsubstanzen eines Gewebsstückchens durch Reduktion des auf sie einwirkenden Osmiumtetroxyds zu Osmiumdioxyd schwärzt ( p r i m ä r e Schwärzung). Ein anderer Teil derselben wird unter der Einwirkung der Osmiumsäure zunächst nur gebräunt. Werden die Präparate aber nachträglich mit schwach

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Die Untersuchung der Zelle

§ 1054—1060.

prozentigem (60—70°/oigem) Alkohol nachbehandelt, so tritt auch bei ihnen Schwärzung ein ( s e k u n d ä r e Schwärzung). Erfolgt die Nachbehandlung gleich mit hochprozentigem Alkohol, so kommt es infolge teilweiser Lösung zu unvollständiger Schwärzung, wodurch sog. Ringkörper u. dgl. entstehen. 1054. S t a r k e und andere Autoren nahmen an, daß die primäre Schwärzung durch ungesättigte, eine Doppelbindung (—C=C—) enthaltende Verbinduig veranlaßt ist. Bei den primär geschwärzten Tröpfchen sollte es sich um Glyceride, bei den gebräunten um Lipoide handeln. Diese Schlußfolgerungen lassen sich nach E s c h e r (19), K a u f m a n n , L i s o n und anderen Autoren nicht mehr aufrechterhalten. 1055. Von den von E s c h e r auf Papierblättchen geprüften chemisch reinen Fettstoffen reduzierten von den Glycerinestern: Triolein und Leinöl, von den Fettsäuren: Ölsäure (schwach) und Linolensäure, von den Cholerinestern: Cholesterinoleat; von den Lezithinen: Hirn- und Eigelb-Lezithin (schwach). 1056. Im Gewebe w i r d die stärkste p r i m ä r e Schwärzung im allgemeinen durch Ölsäure und Oleingemische veranlaßt; diese Tatsache gestattet es aber nicht, die Komponenten von Fettsubstanzgemischen befriedigend zu u n t e r scheiden ( L i s o n , H o e r r). Zu beachten ist auch, daß nicht einmal alle F e t t säuren, wie das negative Verhalten von Stearin- und Palmitinsäure zeigt, die Reaktion geben, andererseits aber auch Substanzen nicht fettiger N a t u r (z. B. Eleidin, Gerbsäure) auf Osmiumsäure reduzierend wirken. Schließlich k a n n das Reaktionsprodukt nach H o e r r auch w a n d e r n und an geeigneten Oberflächen (z. B. K e r n m e m b r a n ) adsorbiert werden. Aus diesen G r ü n d e n kommt der Osmiumreaktion, so b r a u c h b a r sie oft f ü r morphologische F r a g e n ist, nicht jene histochemische Bedeutung zu, die man ihr unsprünglich zuschrieb. Primäre wie sekundäre Schwärzung können auch durch die Vorbehandlung stark beeinflußt werden. So bleibt bei Lecithin die sekundäre Schwärzung im Alkohol nach Vorbehandlung mit Kaliumbichromat aus. Bei vergleichenden Untersuchungen ist also auch übereinstimmende Vorbehandlung erforderlich. 1057. L ö s l i c h k e i t d e r O s m i u m s c h w ä r z u n g . Das mit Osmiumsäure geschwärzte F e t t ist ziemlich unlöslich in absolutem Alkohol, mehr oder weniger leicht löslich in Xylol, Toluol, Benzol, Äther, Kreosot, Terpentin, T h y men u. a. Schwerer geht es in Chloroform, Nelkenöl, Bergamottöl oder Terpineol in Lösung; am besten bleibt es in Zedernholzöl, P a r a f f i n u m liquidum und in Glyzerin erhalten. Die Einbettung in Paraffin erfolgt daher, wenn eine möglichst vollständige E r h a l t u n g der Schwärzung erwünscht ist, am besten ü b e r Zedernholzöl (vgl. § 416 ff.). 1058. Der Schutz des oxydierten Lipoids gegen Lösung, den die Osmiumbehandlung bis zu einem gewissen Grade gewährt, dürfte nach S c h m i d t dadurch zustande kommen, daß die Lipoidteilchen in kolloidalen Raumverhältnissen von Osmium umhüllt sind. Eine wirkliche Verbindung von Metall und Lipoid ist dagegen unwahrscheinlich. 1059. Die osmierten Substanzen der Nebenniere (H. R a b l 91), des Thymus, der Winterschlafdrüse ( S c h a f f e r 96), der Epithelkörperchen, der Keimdrüsen u. a. lösen sich auch in Bergamottöl und Chloroform leicht. Wenn eine Lösung von osmierter Substanz mit Sicherheit vermieden werden soll, dann schneidet man auf dem Gefriermikrotom und schließt in Glyzerin ein. Uber das Schwerlöslichmachen der Osmiumschwärzung durch Natriumsulfid siehe § 286. Über das Bleichen osmierter Präparate § 288, 983 und § 1013. 1060. A u s f ü h r u n g d e r O s m i e r u n g . Kleinste, frisch entnommene Gewebsstückchen w e r d e n in 0,5—l°/oige Osmiumtetroxydlösung gelegt. Nach 24 Stunden w e r d e n sie ebensolange in Wasser gewaschen und, falls Feststellung

§ 1061—1064.

Fette und fettähnliche Stoffe

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der p r i m ä r e n Schwärzung erwünscht, auf dem Gefriermikrotom geschnitten. Einlegen in Glyzerin. Falls s e k u n d ä r e Schwärzung beabsichtigt ist, legt m a n entweder das ganze Stück oder die Schnitte noch 1—2 Tage in 70°/oigen Alkohol. 1061. Bei eigenen Versuchen fand ich, daß die nach § 281 mit 0,l°/oiger Chromsäure bereitete Osmiumsäure gleichmäßigere, bessere Resultate gibt als reine Osmiumsäure. Auch in § 1062 ist sie vorteilhafter. 1062. Da die Osmiumsäure n u r sehr wenig in die Tiefe dringt, ist es meist vorzuziehen, die P r ä p a r a t e zuerst mit Helly, Regaud oder Formol (s. § 1082) vorzufixieren und die Osmierung erst an Gefrierschnitten des fixierten Materials vorzunehmen. Der Vorgang gestaltet sich d a n n folgendermaßen: 1. Fixieren wie angegeben; 24 Stunden. 2. Auswaschen. 3. Schneiden auf dem Gefriermikrotom, Auffangen der Schnitte in dest. Wasser. 4. Osmieren der Schnitte in l°/oiger Osmiumsäure, 24 Stunden. 5. Gründliches Auswaschen. 6. Untersuchen in Glyzerin, Kali aceticum, Gelatinebalsam od. dgl. — Ist sekundäre Schwärzung erwünscht, so kommen die Schnitte nach 5. f ü r 24 Stunden in 70°/oigen Alkohol. Dann Auswaschen in dest. Wasser, Glyzerin usw. Zur Darstellung der Kerne ist Nachfärbung mit Kernechtrot, Paracarmin oder Safranin-Lichtgrün möglich. Soll statt in Glycerin in Paraffinum liquidum eingeschlossen werden, so führt man die Schnitte zur Entwässerung durch abs. Alkohol und Zedernholzöl. 1063. Nach H o e r r ist zur Vorfixierung jede säurehaltige Flüssigkeit ungeeignet, da die Säure die Phosphorlipoide hydrolisiert und F e t t s ä u r e n in Freiheit setzt. So gibt z. B, Bouinsche Flüssigkeit schlechte Resultate. Die größte Zahl an geschwärzten Fettsubstanztröpfchen erhielt H o e r r nach Fixierung in Hellyscher oder Regaudscher Flüssigkeit (4 Stunden), gefolgt von 2tägiger Beizung in 3°/oigem Kaliumbichromat und 3—6tägiger E i n w i r k u n g von 2°/oiger Osmiumsäure. Dann Einbettung in Paraffin. Auch Gefrierschnitte zeigen nach H. m e h r geschwärzte Fettröpfchen, wenn sie vor der Osmierung f ü r 1—24 Stunden in 3°/oigem Kaliumbichromat vorgebeizt werden. Sowohl die Dauer der Chromierung wie die der Osmierung ist auf das Ergebnis von Einfluß. So n i m m t nach zu langer Chromierung die Zahl der geschwärzten Tröpfchen wieder ab. 4. Sog. spezifische FetHärbemethoden1)

a) N i l b l a u s u l f a t z u r T r e n n u n g v o n N e u t r a l f e t t e n und anderen Fettstoffen 1064. L o r r a i n S m i t h (08) n a h m an, daß die von ihm angegebene F ä r b u n g mit N i l b l a u l u l f a t eine T r e n n u n g in Neutralfette (rosa) und Fettsäuren (blau) gestatte. Zur Zeit läßt sich n u r folgern, daß eine Rosafärbung durch Nilblausulfat die Gegenwart eines nicht gesättigten Glyzerides (Triolein) bedeutet. Die ursprüngliche Annahme, daß die B l a u f ä r b u n g spezifisch f ü r F e t t s ä u r e n sei, läßt sich dagegen nicht aufrechterhalten (s. § 1065). Da die tierischen Fettsubstanzen meist Mischungen verschiedener Stoffe darstellen, finden sich neben den e x t r e m e n Farbtönen rosa und blau auch alle möglichen violetten A b s t u f u n gen. Vorzüge der Methode sind neben den differenten Farbtönen das Erhaltenbleiben der Doppelbrechung, die gleichzeitige F ä r b u n g der K e r n e und die völlige Vermeidung von Alkohol. ') Anmerkung: Siehe die einschränkenden Bemerkungen in § 1030 und 1031.

250

Die Untersuchung der Zelle

§ 1065—1070.

1065. Nach K a u f m a n n und L e h m a n n (26) überwiegt bei allen Fettmischungen, in welchen zugleich eine ungesättigte Fettsäure und ein ungesättigtes Triglyzerid vorhanden ist, die Blaufärbung der Fettsäure; dadurch wird die Rosafärbung des ungesättigten Triglyzerids gewissermaßen verdeckt. Ferner werden die Färbeergebnisse durch Zusätze von Cholesterin, Lecithin, Kerasin und Glyzerin, also von Stoffen, die im Organismus regelmäßig vorkommen, wesentlich beeinflußt. So geben z. B. Cholesterin und Triolein oder Lecithin und Triolein oder Glyzerin und Triolein positive Blaufärbung. Bei dieser Sachlage kann also nur die Rosafärbung, nicht aber die Blaufärbung als verläßlich anerkannt werden. — Sehr ablehnend urteilt E s c h e r (19) über die Färbemethode. 1066. Die Nilblausulfatfärbung soll möglichst am frischen oder frisch in Formol fixierten Präparat ausgeführt werden, da sich das Verhalten der Fettsubstanzen, wie B o e m i n g h a u s nachwies, bei mehrwöchentlichem Liegen in Formol verändert. 1067. A u s f ü h r u n g d e r N i l b l a u s u l f a t f ä r b u n g (in der Modifikation von K l e e b e r g 23). 1. Fixierung in Formol. Gefrierschnitte. Auffangen in dest. Wasser (oder Herstellung eines frischen Zupfpräparates). — 2. Färben in einer gesättigten wässerigen Lösung von Nilblausulfat: 20 Minuten. — 3. Abspülen in Wasser. — 4. Differenzieren in l°/oiger Essigsäure 10 bis 20 Minuten (bis die Farbtöne rein sind, was unter Umständen auch schon nach 1—2 Minuten der Fall sein kann). — 5. Gründliches Wässern in mehrfach gewechseltem Wasser 1—2 Stunden. — 6. Aufziehen auf den Objektträger; absaugen des Wasserüberschusses; Einschluß in Glyzerin oder lauwarme (nicht heiße!) Glyzeringelatine. — E r g e b n i s : nichtgesättigte Glyzeride, Triolein (L i s o n) rosa; Fettsäuren und zahlreiche andere Fettsubstanzen und Fettgemische blau bis violett. Kerne, elastisches Gewebe dunkelblau. b) F e t t s ä u r e - N a c h w e i s

nach

Fischler

1068. Die Methode von F i s c h l e r beruht auf einer Kupfersalzbildung zwischen Kupferacetat und Fettsäure, die weiter eine Farblackbildung mit Hämatoxylin zur Folge hat. Die Reaktion wurde anfänglich als ziemlich spezifisch erachtet, spätere Untersuchungen lassen jedoch an ihrer Spezifität zweifeln. L i s o n (36) spricht der Methode jede h i s t o c h e m i s c h e Bedeutung ab. 1069. K a u f m a n n und L e h m a n n stellten an Fettgemischen fest, daß die Farblackbildung auch bei zahlreichen Gemischen auftrat, in welchen keine Spur von freier Fettsäure vorhanden war, z. B. bei Cholesterin-Triolein, SphingomyelinCholesterin oder Lezithin, Glyzerin-Triolein und anderen mehr. Andererseits blieb die Reaktion in 5 Fällen trotz Anwesenheit freier Fettsäure aus. 1070. A u s f ü h r u n g d e r M e t h o d e : 1. Fixierung in Formol (1:10); 2. Einlegen der Gefrierschnitte auf 24 Stunden in eine konz. Lösung von Cupr. acetic. bei 35—37° C. 3. Sorgfältig Auswaschen in mehrmals erneuertem dest. Wasser. . 4. Färben (mindestens 20 Minuten) in folgendem, von Weigert angegebenen Hämatoxylin: Lösung a: Hämatoxylin 1,0; abs. Alkohol 10,0. Lösung b: konz. wässrige Lösung von Lithiumcarbonat 1,0; dest. Wasser 90,0. Zur Färbung werden Lösung a und b einige Tage vor Gebrauch vereinigt. 5. Die darin überfärbten Schnitte werden in stark verdünnter Boraxferricyankalium-Lösung (rotes Blutlaugensalz 2,5 kg; Borax 2,0 g; dest. Wasser 100,0) solange differenziert, bis die roten Blutkörperchen entfärbt sind. 6. Gründliches Auswaschen in dest. Wasser. 7. Eindecken in Glyzerin oder Glyzeringelatine. (Will man in Kanadabalsam einlegen, dann löse man diesen statt in Xylol in Benzin. Aber auch dann ist eine Lösung von Fettsäuren nicht ausgeschlossen.) Resultat: Fettsäuren tiefschwarz gefärbt. Außerdem können sich noch Eisen, Hämoglobin, Kalk und die Granulationen von eosinophilen

§ 1071—1079.

Fette und fettähnliche Stoffe

251

Leukozyten und von Mastzellen färben. Man kann gleichzeitig auch noch durch Nachfärbung mit Scharlach R die übrigen Fette sichtbar machen. Als erster benutzte B e n d a (00) eine Metallsalzbeize als histochemisches Reagens auf Fettsäuren. Seine Beobachtungen wurden von E s c h e r (19) voll bestätigt. 1071. Zur U n t e r s c h e i d u n g d e r F e t t s ä u r e n v o n K a l k bringt man die Schnitte nach dem Kupfern in l°/oige wässerige Salzsäure, worin sich der Kalk löst. E i s e n kann man durch l°/oige Oxalsäure lösen. 1072. Um die K a l i u m - und N a t r i u m s a l z e d e r F e t t s ä u r e n , welche durch Formol gelöst werden, zu färben, fixiert man in 10°/oiger Formalinlösung, der bis zur Sättigung Calcium salicylicum zugesetzt ist, wodurch die genannten Seifen in wasserunlösliches fettsaures Calcium umgewandelt werden, das dann nach § 1070 (Fischler) gefärbt werden kann. 1073. Zur U n t e r s c h e i d u n g z w i s c h e n F e t t s ä u r e n u n d S e i f e n bringt man die Schnitte nach dem Kupfern in Ätheralkohol, wodurch die Fettsäuren gelöst werden. c) C h o l e s t e r i n

und

Cholesterinverbindungen

1074. F ü r den Nachweis von Cholesterin u n d Cholesterinverbindungen ist die U n t e r s u c h u n g i m polarisierten Licht von besonderer Bedeutung. I m frischen P r ä p a r a t t r e t e n die Cholesterinverbindungen, insbesondere Cholesterinester oder Gemenge von solchen mit Triglyzeriden, als doppelbrechende Tropfen mit d u n k l e m Achsenkreuz auf. Bei Formolfixierung n e h m e n die T r o p f e n häufig K r i s t a l l f o r m an. U m in diesem Falle entscheiden zu können, ob es sich um C h o l e s t e r i n v e r b i n d u n g e n oder a n d e r e F e t t s u b s t a n z e n handelt, e r w ä r m t m a n das P r ä p a r t d u r c h 15 Minuten langes Einlegen in den W ä r m e s c h r a n k (58 bis 60° C): C h o l e s t e r i n v e r b i n d u n g e n verlieren d a n n ihre Doppelbrechung, u m beim A b k ü h l e n auf Z i m m e r t e m p e r a t u r als doppelbrechende Sphärokristalle mit typischem s c h w a r z e n Achsenkreuz u n d hellen Q u a d r a n t e n w i e d e r a u f z u t r e t e n . 1075. Z u b e a c h t e n ist, daß auch Neutralfette, F e t t s ä u r e n u n d ebenso ihre Gemische i m P r ä p a r a t in kristallisierter F o r m a u f t r e t e n k ö n n e n u n d in diesem Zustand d a n n doppelbrechend sind. I m Gegensatz z u m Cholesterin usw. bleibt bei ihnen aber die Doppelbrechung b e i m E r w ä r m e n erhalten. F e r n e r bilden sie nie S p h ä r o k r i s t a l l e mit Achsenkreuz. 1076. Osmierung, F ä r b u n g mit S u d a n oder Scharlach, E i n w i r k u n g von K a r bolsäure h e b t die Doppelbrechung auf. Bei Einlegen der Schnitte in Lävuloses i r u p (seltener in Glyzerin) k o m m t es häufig z u m Auskristallisieren der Choles t e r i n v e r b i n d u n g e n : bei S u d a n g e f ä r b t e n P r ä p a r a t e n t r i t t in diesem Falle die D o p p e l b r e c h u n g w i e d e r auf. 1077. Genaue Aussagen über den quantitativen Gehalt an Cholesterin sind auf Grund des histologischen Befundes nicht möglich (vgl. T h a y s e n , F e x ) ; auch werden die Cholesterinverbindungen erst von einer gewissen Menge an sichtbar. 1078. Mit Sudan färben sich die Cholesterinverbindungen orangegelb, lassen sich also mit Hilfe dieser Färbung von anderen Fettsubstanzen nicht unterscheiden. 1079. C h o l e s t e r i n n a c h w e i s n a c h A. S c h u l t z e. Der Methode liegt die A n w e n d u n g der L i e b e r m a n n - B u r c h a r d s c h e n Cholesterinreaktion auf den Gewebsschnitt zugrunde. A u s f ü h r u n g : 1. G e f r i e r s c h n i t t e von Formolm a t e r i a l (möglichst n a c h Gelatineeinbettung) w e r d e n in v e r d ü n n t e m Formalin m i n d e s t e n s 4 Tage (besser länger) intensivem Tages- bzw. Sonnenlicht ausgesetzt. — 2. Auffangen der Schnitte aus Wasser auf den O b j e k t t r ä g e r u n d sorgfältiges A b t r o c k n e n mit glattem F i l t r i e r p a p i e r (wichtig!). — 3. Beschicken des

252

Die Untersuchung der Zelle

§ 1080—1082.

Schnittes mit einigen T r o p f e n eines Gemisches aus gleichen Raumteilen Eisessig und konz. Schwefelsäure (spez. Gew. 1,84). Bei Herstellung des einige Wochen haltbaren Gemisches setzt man die Schwefelsäure vorsichtig tropfenweise dem Eisessig zu. — 4. Auflegen des Deckglases. — Nach wenigen Minuten ist die Reaktion voll ausgebildet. Die cholesterinhaltigen Lipoide treten in tiefblauem F a r b t o n hervor. Die P r ä p a r a t e sind n u r einige Stunden haltbar. Die Probe fällt nur dann positiv aus, wenn das Cholesterin in Oxycholesterin verwandelt wird, entweder wie oben durch mehrtägige intensive Belichtung mit Tageslicht, oder mit Höhensonne (mindestens 6 Stunden) oder durch Beizung mit 2'/2°/oiger Eisenalaunlösung (violette Kristalle; 12—24 Stunden bei 37°). Die Einwände von K i m m e l s t i e l (25) erscheinen durch A. S c h u l t z e und L o h r (25) und F. L a u x (26) widerlegt. Die Methode leistet ungefähr dasselbe wie die Untersuchung im polarisierten Licht. Ein negativer Ausfall ist nicht beweisend für die Abwesenheit von Cholesterin. K a u f m a n n und L e h m a n n fanden die Reaktion bei Prüfung an cholesterinfreien F e t t e n und Fettgemischen niemals positiv; dagegen war sie bei einer Reihe von Fällen trotz Anwesenheit von Cholesterin negativ (besonders bei Mischungen, in denen Glyzerin, Phrenosin oder Kerasin vorhanden waren). 1080. M i k r o c h e m i s c h e r N a c h w e i s v o n C h o l e s t e r i n mit Hilfe der Windausschen Digitoninreaktion. Man läßt einen Tropfen einer 0,5%igen Lösung von D i g i t o n i n in 85°/oigem Alkohol u n t e r dem Deckglas auf den zu untersuchenden Schnitt einwirken. Bei Anwesenheit von Cholesterin e r folgt eine momentane Umsetzung in Digitonincholesterid, das in spitzen Nadeln u n d Nadelbüschen aufschießt. Das Digitonincholesterid läßt sich durch seine Löslichkeitsverhältnisse identifizieren, es ist unlöslich in Wasser, Aceton, Äther, praktisch unlöslich in kaltem 85—96°/oigem Alkohol, leichter in kochendem abs. Alkohol und in Methylalkohol, gut löslich in Eisessig und besonders gut löslich in Pyridin. In Chloralhydrat verschwinden die Kristalle sofort. Von den ü b lichen Fettfarbstoffen w e r d e n sie nicht gefärbt. Deckgläser und O b j e k t t r ä g e r müssen absolut rein sein; schon eine einzige Fingerspur genügt wegen des Cholesteringehaltes des menschlichen Schweißes f ü r einen positiven Ausfall der Reaktion ( B r u n sw i k 22). 1081. G o l o d e t z bringt zum Cholesterinnachweis auf einen Gefrierschnitt ein Deckglas, dessen Unterfläche einen Tropfen Formol-Schwefelsäure-Gemisch (Formol 30°/o 2 Teile, Schwefelsäure 5 Teile) trägt. Das cholesterinhaltige Gewebe färbt sich nach 1—2 Minuten stark braunrot. Reines Cholesterin schwärzt sich nicht mit Osmiumlösung. Dies kann zur Unterscheidung gegenüber Olein und anderen Fetten benutzt werden, die ebenfalls die Braunfärbung auf Formolschwefelsäure zeigen können. In abs. Alkohol, Aceton, Äther, Benzol usw. ist Cholesterin löslich. Diese Reaktion ist nach B r u n s w i k nicht ganz eindeutig, da bei Gegenwart von Formol auch viele Phenole, Fette und öle eine schwarzbraune Färbung geben können. d) F e t t ä h n l i c h e S t o f f e ( L e z i t h i n e ,

Lipoide)

1082. D a r s t e l l u n g d e r » L i p o i d e « n a c h C i a c c i o (10). 1. Man fixiert kleine Stückchen 2 Tage in 5°/oigem wässerigen Kai. bichrom. 80,0; 40°/oigem Formol 20,0; Ameisensäure 4—5 Tropfen oder besser Eisessig 5 ccm. 2. Nachchromieren in 3°/oigem wässerigem Kai. bichrom.; Zeitdauer wechselnd, s. § 1085. 3. Auswaschen 24 Stunden in fließendem Wasser. 4. Steigender Alkohol 24 Stunden. Abs. Alkohol 1—2 Stunden. Einbetten in Paraffin nach Durchf ü h r e n durch Schwefelkohlenstoff (oder Benzol). Die aufgeklebten entparaffinierten Schnitte kommen aus 70°/oigem Alkohol am besten in folgende S u d a n -

§ 1083—1086.

Fette, und fettähnliche Stoffe

253

III-Lösung: Äthylalkohol 80%>ig 95 ccm; Aceton 5 ccm; Sudan bis zur Sättigung d e r auf ca. 50° e r w ä r m t e n Flüssigkeit. Nach Erkalten wird filtriert. Die Schnitte werden in dieser Lösung Vä—1 S t u n d e bei 30° C gefärbt, wenige Sekunden in 50°/oigem Alkohol abgespült und in dest. Wasser gut ausgewaschen. Evtl. Nachf ä r b u n g mit Hämalaun. Einschluß i n Gummisirup nach v. A p ä t h y oder in Glyzerin. Auch F ä r b u n g mit Nilblausulfat ist möglich. Die Lipoide färben sich orangegelb bzw. violett oder blauviolett. 1083. Zur D i f f e r e n z i e r u n g d e r L i p o i d e v o n d e n N e u t r a l f e t t e n schließt C i a c c i o an die oben beschriebene Fixierung und Chromierung eine mehrtägige Behandlung mit der Marchischen Mischung (vgl. § 1839). Weiterbehandlung dann wie oben. Nach Ciaccio's Auffassung sollen sich nun die, Lipoide mit Sudan oder Nilblau färben, während die Fette durch Reduktion der Osmiumsäure dagegen schwarz erscheinen, s. aber § 1086. 1084. K a s a r i n o f f empfiehlt zur Einbettung: Gummi arabic. 50,0 g, Rohrzucker 20 g; Wasser 50 ccm; Thymol 0,05 g. Nach Lösen bei 55° Filtrieren. 1085. Nach C i a c c i o werden bei dem in § 1082 angegebenen V e r f a h r e n die ungesättigten Phosphatide (Eilecithin, Cephalin, Myelin, Cuorin und Sahidin) schon nach einfacher Fixierung oder 1—2tägiger Chromierung unlöslich. Mischungen von ungesättigten Phosphatiden und Cholesterin, Cholesterinester und gesättigten Phosphatiden bleiben nach 2—4tägiger, gesättigte Phosphatide nach ötägiger Chromierung f ä r b b a r . Gesättigte und ungesättigte F e t t s ä u r e n sowie Glyzerin- und Cholesterinester sollen dagegen selbst nach 6—7tägiger Chromierung bei der Nachbehandlung in Lösung gehen. Die Methode der »elektiven Darstellung der sog. Ciaccio-Lipoide« stützt sich also auf die Annahme, daß die in Alkohol an und f ü r sich leicht löslichen Lipoide durch Chromierung im Gegensatz zu den obengenannten Fettsäuren usw. mehr oder weniger unlöslich werden, so daß sie dann auch nach Einbettung m i t S u d a n f ä r b b a r bleiben. Die Schlußfolgerungen Ciaccios lassen sich, wie K a u f m a n n und L e h m a n n (28) überzeugend nachgewiesen, nicht aufrechterhalten. So ergab sich, daß sämtliche Fettstoffe mit Ausnahme der gesättigten Trigylzeride nach der Methode Ciaccios färbbar sind. Positiver Ausfall spricht nur für das Vorhandensein ungesättigter Fettstoffe mit dem Rest einer ungesättigten Fettsäure. Eine Scheidung von sogenannten Lipoiden und ungesättigten Neutralfetten ist mit Hilfe der CiaccioMethode nicht möglich. Auch zeigte sich, daß dem Gewebe bei der Nachbehandlung trotz der Chromierung ein ganz beträchtlicher Teil der Lipoide entzogen wird, während anderseits ein großer Prozentsatz der nicht zu den eigentlichen Lipoiden zählenden Fettstoffe im Gewebe zurückbleibt. Sie geben dann, soweit sie ungesättigten Charakter haben, positive Farbreaktion. Die Ciaccio-Reaktion kann somit nicht als spezifischer Lipoidnachweis betrachtet werden. 1086. Methode von S m i t h - D i e t r i c h : 1. Fixierung in Formol. Gefrierschnitte. 2. Chromierung der Schnitte 24—48 Std. in 5°/oigem Kaliumbichromat bei 37°. 3. Abspülen in einmal erneuertem dest. Wasser. 4. F ä r b e n in essigs a u r e m Hämatoxylin nach Kultschitzky (10°/oige, mindestens ein halbes J a h r alte Lösung von Hämatoxylin in abs. Alkohol: 10,0 + 2°/oige Essigsäure 90,0) 4 bis 5 S t u n d e n bei 37°. 5. Abspülen in Wasser. 6. Differenzieren in Boraxferrizyankaliumlösung nach Weigert (vgl. § 1822,7) über Nacht. 7. Gründliches Auswaschen in Wasser. 8. Einschluß in Lävulose. Die lipoiden Substanzen sind blauschwarz gefärbt. Die Methode von S m i t h - D i e t r i c h soll Phosphatide, Cerebroside, Cholesterinfettsäuregemische, F e t t s ä u r e n und Seifen färben. Doch können sich in gleicher Weise auch Eisen, Hämoglobin und hämatogene P i g m e n t e färben.

254

Die Untersuchung der Zelle

§ 1087—1088.

1087. Nach K a u f m a n n und L e h m a n n darf nur eine tiefschwarze Färbung als positiv aufgefaßt werden, die blaugraue Färbung ist völlig uncharakteristisch, da sie bei den verschiedensten Mischungen auftritt. »Der Ausfall der Färbung ist in hohem Maße von der bei der Färbung innegehaltenen Temperatur abhängig.« Bei 60° färbten sich Lezithin und Sphingomyelin (Phosphatide), Phrenosin und K e rasin (Cerebroside) schwarz. Die schönsten Färbungen ergaben Mischungen der genannten Stoffe mit' Fettsäuren und Triglyzeriden. Bei Zusatz von Eiweiß odes Glyzerin war die Reaktion trotz Anwesenheit eines Phosphatids sehr häufig negativ. Auch Cholesterinestergemische färbten sich, nicht aber Cholesterinfettsäure, -gemische. Bei sämtlichen Fettsäuren war die Färbung negativ.

1088. Trotz der Skepsis, die den histochemischen Deutungen der Fettnachweismethoden gegenüber oft angebracht ist, besteht doch die Möglichkeit einer, wenn auch beschränkten histochemischen Analyse, wenn die Untersuchung nach einem von L i s o n ausgearbeiteten Plan durchgeführt wird. Ich gebe den Untersuchungsgang in gedrängter Form nachfolgend wieder. Vorbedingung ist, daß die Untersuchung in der vorgeschriebenen Reihenfolge durchgeführt wird, da einzelne der Reaktionen nur dann einen Wert haben, wenn vorher die Anwesenheit anderer Substanzen ausgeschlossen werden konnte. Gang

einer

histochemischen Analyse der F e t t s u b s t a n z (gekürzt zusammengestellt nach L i s o n 36)

I. Gefrierschnitt, ungefärbt in Lävulosesirup: Die Fettsubstanzen zeigen Eigenfarbe, gewöhnlich gelb, orange oder braun. 1. Mit Jodjodkali (s. § 1142) behandelt schwarzgrünliche—dunkelviolette F ä r bung; bei Einwirkung von Chromsäure Entfärbung: C a r o t i n o i d e . 2. Die genannten Reaktionen sind negativ. Bei Zusatz von Schwefelsäure Rotfärbung (s. § 1137): A b n u t z u n g s p i g m e n t e (Chromolipoide). II. Gefrierschnitt, ungefärbt: Die Fettsubstanzen zeigen keine Eigenfarbe. 1. Reaktion von Liebermann-Schultze (s. § 1079) positiv: Farbe blau, p u r p u r oder violett, später in Grün umschlagend: a) Digitoninreaktion (s. § 1080) positiv, Kristalle doppelbrechend, u n f ä r b bar mit histologischen Färbemethoden: f r e i e s C h o l e s t e r i n . b) Reaktion gibt keinen kristallinen Niederschlag: C h o l e s t e r i n e s t e r . 2. Reaktion von Liebermann-Schultze wiederholt negativ: a) In Lävulosesyrup zwischen gekreuzten Nicols aufleuchtend, mit Achsenkreuz: L i p o i d e . b) In Lävulosesyrup zwischen gekreuzten Nicols kein Aufleuchten oder Aufleuchten, aber ohne Achsenkreuz. a. Methode von Smith-Dietrich (s. § 1086) gibt intensive Schwarzfärbung: L i p o i d e . ß. Methode von Smith-Dietrich gibt graue oder keine Färbung. aa. Nilblausulfat (s. § 1067) gibt Rosafärbung: u n g e s ä t t i g t e Glyceride. ßß. Nilblausulfat gibt Blaufärbung oder keine Färbung: g e s ä t t i g t e oder u n g e s ä t t i g t e G l y c e r i d e , F e t t s ä u r e n oder L i p o i d e . Uber den Nachweis von A c e t a l p h o s p h a t i d e n s. § 1241 ff. Zusammenfassende Darstellungen über den Nachweis von Fettsubstanzen bei L i s o n (36), N a g e o 11 e (37), R i e s (38).

§ 1089—1093.

Glykogen.

255

F. Nachweis von Glykogen 1089. In der lebenden Zelle ist das Glykogen teils diffus im Cytoplasma verteilt, teils an Granulationen gebunden (z. B. in eosinophilen Leucocyten). Bei E i n w i r k u n g geeigneter Fixierungsflüssigkeiten wird es in Form von Körnern und Schollen niedergeschlagen. Im ausgeschnittenen Organ oder nach dem Tode beginnt der postmortale Glykogenschwund sehr bald; je höher die einwirkende T e m p e r a t u r ist, desto rascher schreitet er fort. Durch Einwirkung von Wasser wird die Lösung des Glykogens stark beschleunigt. Ebenso wirkt 5°/oige Kalilauge oder Pepsinsalzsäure stark lösend ( N o l l 23). Die zur Untersuchung auf Glykogen bestimmten P r ä p a r a t e müssen l e b e n s f r i s c h fixiert werden. B e r ü h r u n g mit Wasser, physiologischer Kochsalzlösung u. dgl. ist vor und nach der Fixierung zu vermeiden. 1090. Fixierung. Da Glykogen in höherprozentigem Alkohol unlöslich ist, werden zu seiner Fixierung zumeist alkoholische Lösungen verwendet. Sehr gebräuchlich ist absoluter Alkohol oder Carnoysche Flüssigkeit. Auch FormolAlkohol (1 T. Formol 4- 3 T. 80°/oiger Alkohol) wird öfters gebraucht. Die beiden letztgenannten Flüssigkeiten sind dem absol. Alkohol vorzuziehen, da in ihnen die Gewebestruktur besser erhalten bleibt. Allen ist gemeinsam, daß es in der Außenzone des Präparates, namentlich in protoplasmareicheren Zellen, zu einer charakteristischen Verlagerung des körnig oder schollig niedergeschlagenen Glykogens kommt, die als »Alkoholflucht des Glykogens« bekannt ist. S. auch § 1092 und 1093. 1091. N e u k i r c h (09) fixiert in dextrosegesättigten Flüssigkeiten, eine Methode, die auch A r n d t (25) und M ü n z e r (28) sehr empfehlen. Für Gefrierschnitte fixiert man in unverdünntem oder verdünntem (1:4) Formol, das mit Dextrose (Traubenzucker) gesättigt ist. Nach 6—24 Stunden überträgt man in gesätt. Dextroselösung und schneidet auf dem Gefriermikrotom. Die Schnitte werden in der Dextroselösung oder in 96°/oigem Alkohol aufgefangen und nach B e s t gefärbt. Alle mit dem Präparat vor der Färbung in Berührung kommenden wässerigen Flüssigkeiten müssen völlig (wichtig!) mit Dextrose gesättigt sein. Auch Celloidineinbettung ist möglich. Als Nachteil der Methode wird angegeben, daß die Präparate bei Einbettung schwer schneidbar werden. 1092. In neuerer Zeit werden zur Fixierung des Glykogens verschiedene pikrinsäurehaltige Flüssigkeiten empfohlen. H. B a u e r (33) verwendet vor allem das Gemisch nach Bouin-Allen (s. § 310). Auch P a s t e e i s und L é o n a r d (35) erhielten damit namentlich bei erwachsenem Gewebe gute Resultate. Außerdem empfehlen sie (besonders f ü r embryonales Gewebe) ein D i o x a n - P i k r i n s ä u r e g e m i s c h (Dioxan, gesättigt mit Pikrinsäure, 8,5 Teile, Formol 1 T., Eisessig 0,5 T.; Pikrinsäure löst sich zu 35°/o in Dioxan!). Fixierungsdauer 1 Std., d a n n Dioxan und Einbettung nach § 353. 1093. G e n d r e (37) erhielt mit der Fixierung nach Bouin-Allen inkonstante, ja sogar negative Resultate. Nach seinen Beobachtungen wird das Glykogen am besten durch folgendes Gemisch fixiert: 90°/oiger Alkohol, gesätt. mit Pikrinsäure 8 T., Formol 1,5 T., Eisessig 0,5 T. (Vereinigung der Flüssigkeiten erst unmittelbar vor Gebrauch!). Fixierungsdauer je nach Stückgröße 1—4 Stunden, dann 90°/oiger Alkohol usw. Ich kann die ausgezeichnete Erhaltung des Glykogens durch diese Flüssigkeit bestätigen. Die »Alkoholflucht des Glykogens« ist allerdings auch bei ihr festzustellen, ebenso bei den in § 1092 angeführten Flüssigkeiten.

256

Die Untersuchung der Zelle

§ 1094—1096.

1094. S c h a b a d a s c h (39) fixiert das Glykogen durch Injektion eines Gemische von 96%>igem Alkohol 55 g, Calciumpikrat 35 g, Monochloressigsäure 5 g, Formol 4°/oig 5 g. Die Flüssigkeit soll sich dadurch auszeichnen, daß sie die glykolytischen Systeme vernichtet, das Glykogen gut niederschlägt und rasch eindringt. 1095. E i n b e t t u n g u n d N a c h b e h a n d l u n g . Sehr wichtig f ü r die E r h a l t u n g des Glykogens ist neben der Fixierung auch die A r t der Einbettung u n d der anschließenden Nachbehandlung. Gewöhnlich w i r d in erster Linie die E i n b e t t u n g in Celloidin empfohlen, da in ihm das Glykogen seine Wasserlöslichkeit einbüßt. F ü r vergleichende quantitative Untersuchungen ist dabei jedoch von Nachteil, daß es schwer ist, von Celloidinblöcken mit Sicherheit Schnitte g l e i c h e r Dicke herzustellen. In dieser Hinsicht ist die Paraffineinb e t t u n g ohne F r a g e überlegen. Der Nachteil, daß das Glykogen aus Paraffinschnitten durch wäßrige Flüssigkeiten mehr oder weniger stark gelöst wird, läßt sich dadurch vermeiden, daß man die Schnitte nach dem Aufkleben und Enlparaffinieren „celloidiniert", d. h. mit einem dünnen Celloidinüberzug versieht (s. u.), durch den das Glykogen wasserunlöslich wird. Die Celloidineinbettung wird nach § 450 vorgenommen, wobei die Stücke einige Wochen lang durchtränkt werden müssen. Auch Pyridin-Celloidin nach § 459 ist bei Verlängerung der Zeiten möglich. Durch Metanol-Celloidin wird das Glykogen dagegen vollständig gelöst. Die abgekürzten Celloidin-Paraffin-Verfahren (§ 466 f.) schützen das Glykogen nur in einer schmalen Randzone gegen Lösung. Das gleiche gilt entgegen der Annahme von H. B a u e r , W a l l r a f f u. a. auch für die Methylbenzoat-Celloidin-Paraffinmethode. Die Berücksichtigung dieser Verhältnisse ist namentlich bei Anwendung der Polysaccharidreaktion (§ 1104) von Wichtigkeit ( R o m e i s 44). Auch beim Aufkleben der Paraffinschnitte kann Glykogen verloren gehen. Am sichersten wird dies bei der trockenen Aufklebemethode mit Eiweiß nach § 544 vermieden. Zum Feuchtaufkleben muß hochprozentiger Alkohol verwendet werden. Man stellt dazu eine mit 80—90%igem Alkohol gefüllte, mit einer Glasplatte bedeckte Schale in den Trockenschrank bei 45° und läßt die Schnitte auf der Oberfläche schwimmen. Nach Strecken werden sie auf Eiweißobjektträger aufgefangen und im Trockenschrank getrocknet. Bei Aufkleben mit Wasser, 30—50°/oigem Alkohol oder Ruyterschem Gemisch wird Glykogen mehr oder weniger stark gelöst ( E o m e i s , unveröff. Versuche) Das C e l l o i d i n i e r e n erfolgt in der Weise, daß man die aufgeklebten Schnitte nach Xylol und absol. Alkohol f ü r 1—2 Minuten in Ätheralkohol (53) u n d dann in eine 2°/oige Lösung von Celloidin in Äther-Alkohol stellt. Nach 2—3 Minuten läßt man die Celloidinlösung vom Objektträger gut ablaufen, hält ihn dann waagrecht und wischt die Unterseite mit einem Tuch ab. Sobald der Celloidinüberzug der Schichtseite zu e r s t a r r e n beginnt, stellt man den Objektt r ä g e r zur E r h ä r t u n g des Celloidins f ü r einige Minuten in 80°/oigen Alkohol. Die celloidinierten P r ä p a r a t e kann m a n unbesorgt ins Wasser bringen ohne einen Glykogenverlust b e f ü r c h t e n zu müssen. Der Celloidinüberzug kann später vor dem Eindecken wieder dadurch beseitigt werden, daß man den Objektträger für 3—5 Min. aus absol. Alkohol in AetherAlkohol stellt. Dann absol. Alkohol, Xylol, Balsam. 1096. Zur F ä r b u n g d e s G l y k o g e n s kommen vor allem die von C l a u d e B e r n a r d entdeckte, auch jetzt noch wichtige Jodprobe (§ 1097 ff.), die Carminmethode nach B e s t (§ 1102) und die Kohlehydratreaktion mit f u c h sinschwefliger Säure nach H. B a u e r (§ 1104) in Betracht.

§ 1097—1102.

Glykogen.

257

N i e l s e n , O k k e l s und S t o c h h o l m landen bei vergleichenden mikro- und histochemischen Untersuchungen, daß sich mit Hilfe der Jodreaktion (nach § 1101) und der Best'schen Methode quantitativ im histologischen Bild nur drei Stufen unterscheiden lassen: ein Glykogengehalt unter l°/o, zwischen 1—4°/o und über 4°/o. 1097. Die älteste Methode des Glykogennachweises ist die sog. J o d r e a k t i o n . Sie beruht auf der Feststellung, daß sich Glykogen bei Einwirkung von Jod stark bräunt. Benetzt man die Präparate v o r - der Jodbehandlung mit Speichel, so bleibt die-Jodreaktion infolge der Überführung des Glykogens in Zucker aus. Erfolgt der Speichelzusatz n a c h der Jodeinwirkung, dann wird das durch Jod gebräunte Glykogen gelöst, während andere Substanzen, wie Amyloid, Lecithin oder Chitin, die durch Jod ebenfalls gebräunt werden, unverändert bleiben ( S p e i c h e l r e a k t i o n ) . 1098. Die Jodreaktion kann an Zupfpräparaten von frischem wie fixiertem Gewebe, an Schnittpräparaten von uneingebettetem und eingebettetem Material und an Ausstrichen vorgenommen werden, vorausgesetzt, daß die Präparate vorher nicht mit wässerigen, Glykogen lösenden Flüssigkeiten in Berührung kommen. Von den verschiedenen Methoden seien folgende empfohlen: 1099. J o d r e a k t i o n nach L a n g h a n s . 1. Einlegen der Präparate in Lugolsche Lösung (5—10 Minuten). — 2. Entwässern in absolutem Alkohol, dem auf 4 Teile 1 Teil einer 10°/oigen Jodtinktur zugesetzt ist. — 3. Aufhellen und Einschließen in Origanumöl. Umrahmen nach § 815 oder § 819. E r g e b n i s : Glykogen braun. A m deutlichsten hebt sich das Glykogen 2—3 Tage nach Herstellung des Präparates von der Umgebung ab. Die Präparate sincl höchstens einige Monate lang haltbar. C a r l e t o n empfiehlt das Origanumöl mit Xylol auszuwaschen; dann Einschluß in Balsam. Zur Darstellung der Kerne ist vor 1. eine Vorfärbung mit Paracarmin (§ 643) oder Delafieldschem Hämatoxylin (§ 668) möglich. 1100. G e n d r e (37) verwendet zur Gegenfärbung Anilinblau, da sich dadurch das gebräunte Glykogen gegenüber dem grünlichen Untergrund und den blaugefärbten Kernen kontrastreicher anhebt. Der entparaffinierte Schnitt kommt dazu für einige Minuten in dest. Wasser, dem auf 60 ccm 25 Tropfen einer gesätt. wässerigen, mit Eisessig angesäuerten Anilinblaulösung zugesetzt sind. Dann in Lugolsche Lösung. Differenzieren in Jodalkohol. Einschluß in Paraffinöl. 1101. J o d p r o b e nach N i e l s e n , O k k e l s und S t o c h h o l m (32). Fixierung in absolutem Alkohol,, Einbettung in Paraffin. Die trocken oder mit 90°/oigem Alkohol (unter Erwärmen auf 45°) aufgeklebten Schnitte werden ohne Entfernung des Paraffins in ein gut verschlossenes Glas gestellt, dessen Boden mit einigen Tropfen einer 59/oigen Jodtinktur bedeckt ist. Durch die jodgesättigte Luft werden dann die Glykogenablagerungen in charakteristischer Weise gebräunt. Nach 24 Stunden wird entparaffiniert und in eine möglichst kleine Menge jodierten Balsams eingedeckt. Diese einfache Methode gibt sehr gute Resultate, die mit jenen der Best'schen Methode übereinstimmen und deren Ergebnisse wertvoll bestätigen. 1102. C a r m i n f ä r b u n g nach B e s t . Die Methode liefert prächtige, klare Bilder, in denen auch die geringsten Spuren des morphologisch nachweisbaren Glykogens durch ihre leuchtend rote Färbung hervortreten. Der Einwand, daß sich bei der Färbung außer Glykogen auch andere Substanzen, wie Schleim, Fibrin, Granula der Mastzellen und Magendrüsen, Knochengewebe rot färben können, beeinträchtigt den Wert der Methode nicht. Bei sorgfältiger Untersuchung wird man diese Substanzen niemals mit Glykogen verwechseln. Im Zweifelsfall führt man an einem der Präparate v o r der Best^ärbung die Probe 17

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. A u f l .

258

Die Untersuchung der Zelle

§ 1103—110 t.

auf Löslichkeit in Speichel aus (s. § 1097.) Das Glykogen wird durch Speichel selbst aus Celloidinschnitten meist schon in einer Stunde völlig gelöst, während es durch Wasser aus Celloidinschnitten sogar nach 20tägiger Einwirkung bei 38° nur zum geringen Teil ausgezogen wird. (P a t z e 11 28.) 1103. A u s f ü h r u n g d e r C a r m i n f ä r b u n g n a c h B e s t : 1. Intensive K e r n f ä r b u n g in saurem H ä m a l a u n oder Ehrlichschem H ä m a t o xylin. 2. Gründliches Auswaschen. 3. F ä r b e n f ü r 5—20 M i n u t e n in folgender F a r b l ö s u n g : Bestsche Carminstammlösung 20,0 (filtrieren!) + Ammoniak. 30,0 + Methylalkohol 30,0. 4. Direktes Ü b e r t r a g e n (kein Wasser!) zur Differenzier u n g in: Methylalkohol 40 ccm + abs. Alkohol 80 ccm + dest. Wasser 100 ccm w e n i g e S e k u n d e n bis Minuten, bis keine F a r b w o l k e n m e h r abgehen (2 Portionen Flüssigkeit). 5. A b s p ü l e n in 80°/oigem Alkohol, entwässern, Xylol, Balsam. E r gebnis: Glykogen intensiv rot, Kerne blau. Herstellung der Bestschen Carminstammlösung: Man kocht bei kleiner F l a m m e 2 g Carmin (opt. r u b r . Grübler), 1 g K a l i u m c a r b o n a t u n d 5 g Kaliumchlorid einige Minuten mit 60 ccm dest. Wasser (Vorsicht, s c h ä u m t stark!) Der F a r b t o n schlägt dabei in D u n k e l r o t um. Nach E r k a l t e n setzt m a n 20 ccm A m m o n i a k zu. Die Lösung ist sofort g e b r a u c h s f e r t i g u n d h ä l t sich g u t verschlossen u n d k ü h l a u f b e w a h r t im Sommer 1, im Winter e t w a 2 Monate (dunkle Flasche). Vor dem V e r d ü n n e n m u ß filtriert w e r d e n . Die verd ü n n t e Lösung h ä l t sich n u r wenige Tage. 1104. P o 1 y s a c c h a r i d r e a k t i o n mit f u c h s i n s c h w e f l i g e r S ä u r e nach H. B a u e r (33). Die Reaktion b e r u h t darauf, daß F i x i e r u n g mit c h r o m säurehaltigen, nicht r e d u z i e r t e n Gemischen oder nachträgliche B e h a n d l u n g mit C h r o m s ä u r e an verschiedenen Polysacchariden (Glykogen, Galaktogen, Stärke, Tunicin u n d Zellulose, nicht an Inulin) eine chemische V e r ä n d e r u n g bewirkt, durch die die g e n a n n t e n Körper, soweit sie v o r h e r löslich waren, wasserunlöslich w e r d e n . Gleichzeitig t r e t e n an ihnen A l d e h y d g r u p p e n auf, die mit f u c h s i n schwefliger S ä u r e die Schiffsche Reaktion geben. Die Methode h a t die Bedeutung einer histochemischen Reaktion u n d ist zur Zeit das beste V e r f a h r e n zur morphologischen Darstellung des Glykogens. Ä h n lich wie die Best'sche Methode bringt sie auch die kleinsten Glykogenteilchen in l e u c h t e n d e m Rot z u r Darstellung. I h r e einfache Technik, die geringen H e r stellungskosten u n d lange Haltbarkeit des Reagens, der Wegfall jeder s u b j e k tiven Differenzierung infolge des automatischen A b l a u f e s der Reaktion, die S c h ä r f e u n d ausgezeichnete Sichtbarkeit der F ä r b u n g geben ihr sogar eine gewisse Überlegenheit ü b e r die Best'sche F ä r b u n g . Ein schwacher P u n k t der Methode ist, daß das Glykogen aus Schnitten, die nicht in Alkohol-Celloidin eingebettet w u r d e n , zu Beginn der Chromierung, also noch vor seiner E r f a s s u n g durch die Reaktion, gelöst w e r d e n kann. Dies läßt sich jedoch d u r c h vorheriges Celloidinieren der e n t p a r a f f i n i e r t e n Schnitte mit Sicherheit v e r h ü t e n . Es ergibt sich d a r a u s die F ö r d e r u n g , d a ß d i e S c h n i t t e in a l l e n F ä l l e n , in w e l c h e n k e i n e w o c h e n 1a n g e Durchtränkung mit Alkohol-Celloidin vorgenommen wurde, mit einer dünnen Celloidinschicht versehen werd e n m ü s s e n ( R o m e i s 44; s. dazu auch § 1095). Die Angabe von W a 11 r a f f und B e d n a r a - S c h ö b e r (43), daß die Bauer' sehe Reaktion der Best'schen Färbung in der mengenmäßigen Erfassung des Glykogens unterlegen ist, trifft nicht zu; sie erklärt sich daraus, daß das Glykogen bei der von den Autoren angewandten Technik vorzeitig in Lösung ging (Rom e i s 44).

§ 1105—1106.

Glykogen.

259

Ausführung der Reaktion: Fixierung in absol. Alkohol, Carnoy, Bouin-Allen, Zenker oder nach § 1092—1094. Über die Einbettung s. § 1095. 1. Entparaffinieren in Xylol, absol. Alkohol, Celloidinieren (s. § 1095), ÄtherAlkohol 1—2 Min., 2°/oige Celloidinlösung 2—3 Min., 80°/oiger Alkohol 3—5 Min., dest. Wasser (einmal wechseln). 2. Einstellen in frisch bereitete 4%>ige Chromsäurelösung 1 Stunde (dunkel stellen). Die Zeitdauer der Chromierung wie die Konzentration der Chromsäurelösung sind auf die Stärke der Reaktion von ausschlaggebendem Einfluß. Zu starke Konzentration wie zu lange Einwirkung führt zum Verschwinden der Reaktion ( B a u e r ) . Bei vergleichenden Untersuchungen sind daher die oben angegebenen optimalen Daten genau einzuhalten. 3. Auswaschen in fließendem Wasser 5 Min. 4. Einstellen in fuchsinschweflige Säure (Herstellung s. § 1235) 10—15 Min. 5. Auswaschen in schwefeldioxydhaltigem Wasser (3 Portionen, in jeder 5 Min., um sicher alle fuchsinschweflige Säure zu entfernen; Herstellung siehe § 1235). 6. Auswaschen in fließendem Wasser 10 Min. (nach G e n d r e 2 Stunden). 7. Kräftige Gegenfärbung der Kerne mit Hämalaun, auswaschen in Brunnenwasser (10 Minuten), 80—96°/oiger und absol. Alkohol, entcelloidinieren in Äther-Alkohol, absol. Alkohol, Xylol, Balsam. Zur Färbung der Kerne eignet sich Hämalaun besser wie Ehrlich'sches Hämatoxylin, da in diesem das leuchtend rot gefärbte Glykogen stark blaustichig und stumpi wird (R o m e i s) E r g e b n i s : Glykogen intensiv rotviolett, Kerne blau. Uber die Unterscheidung von Glykogen, Galaktogen, Zellulose, Tunicin und Chitin, die alle positive Reaktion geben, 3. L i s o n (36). 1105. Die Annahme B a u e r s , daß die Reaktion nur von Polysacchariden gegeben wird, bedarf einer Einschränkung. Wie W a l l r a f f und B e c k e r t (40) feststellten, werden durch sie auch andere Anteile des Gewebes wie die schleimbildenden Zellen in Speicheldrüsen und Magendarmkanal, die Zona pellucida, die hyaline Substanz in atretischem Eifollikeln und in Hassallschen Körperchen, das Kolloid in Schilddrüse und Hypophyse, sowie das Fibrinoid der Placenta gefärbt. Im allgemeinen wird kein Anlaß zu Verwechslungen bestehen. Im Zweifelsfall ist die Frage durch Ausführung der Speichelreaktion (§ 1097) ohne Schwierigkeit zu klären. Dieselbe ist aber am entparaffinierten Schnitt v o r der Chromierung und Färbung auszuführen. Während sich Glykogen dabei auflöst, bleiben die obengenannten Gewebsteile in ihrer Färbbarkeit unbeeinflußt. N a c h Ausführen der Kohlehydratreaktion führt die Speichelreaktion zu keiner Auflösung des gefärbten Glykogens mehr (im Gegensatz zum Verhalten nach Best-Färbung). Es ist daraus zu schließen, daß das Glykogen durch die Einwirkung von Chromsäure und der fuchsinschwefligen Säure in eine unverdauliche Farbverbindung übergeht. Der Wert der Reaktion wird durch diese Einschränkung m. E. nicht vermindert. 1106. Zur gleichzeitigen F i x i e r u n g v o n G l y k o g e n u n d F e t t verdünnt G e 1 e i (13) eine 1—2°/oige Osmiumsäurelösung mit gleichen Teilen abs. Alkohols. Um eine Reduktion der Osmiumsäure durch den Alkohol zu verzögern, setzt man etwas Natriumjodat zu und fixiert bei 0° im Eisschrank. Das Glykogen läßt sich hierauf nach der Bestschen Methode bei 5—lOmal längerer Färbedauer sehr elektiv darstellen. Ferner empfiehlt G e 1 e i Fixierung in Osmiumsäure l°/oig (1 T.), Kaliumbichromat 4°/oig (2 T.), abs. Alkohol (3 T.). Auch hiermit wird bei 0° fixiert. Nach der Fixierung (24 Stunden) wird bei beiden Flüssigkeiten mit eisgekühltem 55%>igen Alkohol ausgewaschen. Fixiert man 17*

260

Die Untersuchung der Zelle

§ 1107—1112.

mit der letztgenannten Flüssigkeit, dann kann man zur Färbung der Mitochondrien gleich noch die Schultzesche Osmiumhämatoxylinfärbung im Stück anschließen. 1107. A r n d t (25) gibt für die g l e i c h z e i t i g e F ä r b u n g v o n G l y k o g e n u n d F e t t folgende Methode an: 1. Fixierung in Dextrose-Formol

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264

Untersuchung der Zelle

§ 1127—1131.

in 80°/oigem Alkohol differenziert (V4—1—2 Stunden). Dann durch 96°/o und absol. Alkohol in Xylol. Chromierte Präparate bringt man evtl. direkt aus 80°/oigem Alkohol über Terpineol in Xylol. — Ergebnis: Abnutzungspigment tiefviolett, Vorstufen je nach Reifegrad und Massivität heller oder dunkler. In schwierigen Fällen färbt v. V o l k m a n n zuerst in Hämalaun, hierauf in Neutralrot, dann nach Abspülen 2—5 Mjn. in Gentianaviolett; schließlich Differenzieren in 80°/oigen Alkohol. Pigment sehr scharf schwarzviolett. 1127. Eine sehr klare Färbung des Abnutzungspigments ist nach R o m e i s (40) mit polychromem Methylenblau (s. § 1412) zu erzielen. 1128. Die Färbung mit F e t t f a r b s t o f f e n erfolgt mit Sudan nach § 1045, mit Scharlach nach § 1046, mit Sudanschwarz nach § 1050. Über die Färbung nach Fischler s. § 1068, nach Smith-Dietrich § 1086, nach Weigert § 1424. Die Osmierung wird nach § 1060 oder 1062 vorgenommen. 1129. Bei der Prüfung des Verhaltens gegenüber S i l b e r l ö s u n g e n hat man scharf zwischen A r g e n t a f f i n i t ä t und A r g y r o p h i l i e ( = A r g e n t o p h i l i e ) zu unterscheiden. Als A r g e n t a f f i n i t ä t bezeichnet man die Erscheinung, daß gewisse Strukturelemente des Gewebes die Fähigkeit haben, ammoniakalische Silberlösung von sich aus ohne Anwendung eines Weiteren Reduktionsmittels zu reduzieren. Die Reaktion wird von Polyphenolen, Aminophenolen und Polyaminen in Ortho- und Parastellung gegeben ( L i s o n 36). Die Prüfung auf Argentaffinität erfolgt am besten nach der Massonschen Methode mit der Fontanaschen Lösung. Über Argyrophilie s. § 1131. Die Reaktion kann an frischem Gewebe oder an Schnitten von fixiertem (z. B. Bouin, Formol, Carnoy u. dgl.) und eingebettetem Gewebe ausgeführt werden. Die entparaffinierten Schnitte müssen aber vor der Reaktion 2—3 Stunden lang sorgfältig mit dest. Wasser ausgewaschen werden. Ausführung: 1. Einstellen der Schnitte in Fontanasche Lösung (s. u.) für 24 Stunden im Dunkeln. Das Färbeglas muß gut verschlossen sein. — 2. Abspülen in reichlichem dest. Wasser. — 3. Natriumthiosulfat 5°/oig 3—5 Min. — 4. Auswaschen in fließendem Wasser 15 Min. Kernfärbung mit Carmalaun, Kernechtrot od. dgl. Alkoholreihe. Xylol. Balsam. — Ergebnis: Argentaffine Substanzen schwarz (evtl. in Abstufungen), Kerne rot. Zur Bereitung der F o n t a n a sehen Lösung fügt man zu einer 5°/oigen Silbernitratlösung unter Umschütteln tropfenweise Ammoniak, bis der sich bildende Niederschlag gerade wieder gelöst ist. Dann setzt man vorsichtig Tropfen für Tropfen einer 5°/oigen Silbernitratlösung zu, bis eine auftretende Trübung bestehen bleibt. Die fertige Flüssigkeit soll nicht mehr nach Ammoniak riechen. Vor Gebrauch wird dekantiert. Die obige Methode M a s s o n s ist nach den Angaben von H a m p e r 1 (25) dargestellt. Die ursprüngliche Originalmethode weicht dádurch ab, daß Masson nach Punkt 2 für 5—10 Min. in 0,l°/oige Goldchloridlösung stellt. Daneben existieren noch eine Reihe weiterer Vorschriften (z. B. von H a s e g a w a , T ö r ö , O g a t a u. a.), die in der Technik wie auch in den Resultaten mehr oder weniger stark abweichen (vgl. dazu H a m p e r 1 32). Bei diesbezüglichen Untersuchungen ist daher die jeweils befolgte Technik genau anzugeben. Die für Stückimprägnation angegebenen Methoden arbeiten ungleichmäßig. 1130. H u e c k , L i g n a c u. a. bringen die Präparate aus dest. Wasser für 24 Stunden in eine l°/oige Silbernitratlösung. Auch hier handelt es sich um Argentaffinität, da die Reaktion ohne Mitwirken eines äußeren Reduktionsmittels erfolgt. 1131. Als A r g y r o p h i l i e bezeichnet man die Erscheinung, daß sich zahlreiche Substanzen verschiedenster Natur bei den üblichen Silberimprägnationsmethoden von Bielschowsky, Hortega, Achucarro, Ranson usw. n a c h t r ä g l i c h durch die Einwirkung eines R e d u k t i o n s m i t t e l s (Formol, Hydrochinon, Tannin od.

§ 1132—1138.

Pigmente. — Spezielle Methoden

265

dgl.) schwärzen. Auch bei der -Fontanaschen M e t h o d e , bei der das Gewebe zuerst in Tannin und dann in Fontanasche Lösung kommt, handelt es sich bei Schwärzung um Argyrophilie. Dieser kommt im Gegensatz zur Argentaffinität keine histochemische Bedeutung zu. 1132. Bei der Untersuchung von Pigment arbeite man nicht nur mit durchfallendem Licht, sondern auch mit auffallendem, ferner mit polarisiertem Licht und mit Dunkelfeldbeleuchtung. Sehr wichtig sind Kontrolluntersuchungen am lebenden oder überlebenden Objekt. Auch dabei kann man sich mit Vorteil der Auflichtbeleuchtung bedienen (s. § 63 f.). 1133. Als Beispiel einer Untersuchung zur allgemeinen Orientierung ü b e r die A r t vorhandener Pigmente diene der von L i g n a c (21) empfohlene U n t e r suchungsgang. Das in absolutem Alkohol oder Formol-Alkohol fixierte P r ä p a r a t wird allmählich in dest. Wasser übertragen und auf dem Gefriermikrotom geschnitten. Die Schnitte kommen aus dest. Wasser f ü r 24 Stunden in eine l°/oige Silbernitratlösung (im Dunkeln). Nach Auswaschen in dest. Wasser wird ein Deckglas aufgelegt und untersucht. Vorhandenes Hautpigment (Melanin) h a t sich geschwärzt. Diese Schwärzung läßt sich durch Zusatz von Lugolscher Lösung (1—2 Stunden), d a n n dest. Wasser und 10°/oige Lösung von Fixiernatron wieder aufheben, so daß die Eigenfarbe wieder zum Vorschein kommt. Zur weiteren Charakterisierung wäscht m a n w i e d e r u m mit dest. Wasser aus und setzt 3°/oiges Wasserstoffsuperoxyd zu (mehrmals wiederholen). Nach 24—36 Stunden ist Abnutzungspigment, Malariapigment und Hautpigment völlig gebleicht. Hämatoidin und Hämosiderin aber unverändert. Letzteres läßt sich durch die positive Eisenreaktion erkennen. Uber das mit Formolfixierung des öfteren entstehende »Formolpigment« s. § 274. 2. S p e z i e l l e A n g a b e n ü b e r P i g m e n t e u n d i h r e D a r s t e l l u n g . 1134. H ä m o g l o b i n . Über seine färberische Darstellung s. § 1436ff. 1135. H ä m o s i d e r i n . Fundstelle z. B. Stauungslunge, Milz; liegt meist intracellulär. Eisenreaktion stets positiv. Unlöslich in Alkalien, löslich in Säuren, nicht bleichbar, nicht argentaffin, f e t t f r e i . 1136. H ä m a t o i d i n . Fundstelle: Thromben, Extravasate, apoplektische Herde, Gewebe ikterischer Neugeborener. Bei Zusatz von konz. Schwefelsäure w e r d e n die Kristalle feuerrot, dann violett — blau — grün (G m e 1 i n sehe Reaktion). — Lage vorwiegend im Zwischengewebe. Eisenreaktion immer negativ. Unlöslich in v e r d ü n n t e n Säuren, Wasser, Alkohol, Äther. Löslich in Alkalien. 1137. A b n u t z u n g s p i g m e n t ( = Alterspigment, braunes P., Chromolipoide, Hämofuscin, Lipofuscin, Lipomelanin). Fundstelle: artrophischer Herzmuskel, alternde Organe. Die Alterspigmente sind Fettkörper oder Derivate von solchen. Sie besitzen Eigenfarbe, die mit fortschreitender Oxydation dunkler wird. Gleichzeitig v e r m i n d e r t sich ihre Löslichkeit in Fettlösungsmitteln bis zur Unlöslichkeit. Unlöslich in Wasser, Säuren und Alkalien. Konz.- Schwefelsäure f ä r b t sie zum Unterschied von Carotinoiden niemals blau, dagegen häufig rotbraun. F ä r b b a r mit Fettfarbstoffen (besonders deutlich sichtbar nach Bleichen in H2O2), selbst nach Paraffineinbettung. Bleichung erfordert längere Einwirk u n g von H 2 0 2 als bei Melanin. Nicht argentaffin. Eisenreaktion manchmal positiv. 1138. M e 1 a n i n. F u n d o r t vor allem im E k t o d e r m und in Geweben ektodermaler H e r k u n f t . Unlöslich in Wasser, Säuren, Fettlösungsmitteln. Mehr oder weniger löslich in konz. Kali- oder Natronlauge. Leicht bleichbar durch Oxy-

266

Untersuchung der Zelle

§ 1139—1145.

dantien. Typisch argentaffin (auch die Vorstufen). Weder mit Fettfarbstoffen noch mit Nilblau, Gentianaviolett u. dgl. f ä r b b a r . 1139. Die Vorstufe des Melanins läßt sich nach B l o c h durch die von ihm angegebene Dioxyphenylalinreaktion (Dopa, s. a. § 1178) sichtbar machen. 1140. Im polarisierten Licht sind die Melaninkörnchen einfach brechend, bei Dunkelfeldbeleuchtung leuchten sie hell, weißlich auf. 1141. Zur U n t e r s u c h u n g a m l e b e n d e n P r ä p a r a t eignen sich besonders die Flossensäume von Frosch-, Tritonen- und Salamanderlarven. Z u m S t u d i u m der intrazellulären Pigmentkörnchenströmung sei besonders auf das von B a l l o w i t z (14a) angegebene Objekt, die dorsale H i r n h a u t von Gobius minutus, verwiesen. Die gleichen Objekte, ferner Fischschuppen, eignen sich auch z u r Herstellung von D a u e r t o t a l p r ä p a r a t e n . Da das Melanin sehr widerstandsfähig ist, bietet die F i x i e r u n g keine Schwierigkeit. S c h m i d t empfiehlt besonders Formol-Alkohol und F ä r b u n g mit Delafieldschem Hämatoxylin. 1142. C a r o t i n o i d e (Lipochrome) sind sehr labile, ungesättigte, stickstofff r e i e Kohlenwasserstoffe, die sich im K ö r p e r gewöhnlich in F e t t e n gelöst vorfinden. F a r b e gelb bis rot. Vorkommen im menschlichen Organismus selten (z. B. in jugendlichen Luteinzellen), bei niederen Tieren dagegen häufig. Unlöslich in Wasser, Glyzerin, v e r d ü n n t e n wässerigen Säuren und Alkalien. Langsam löslich in kaltem Alkohol, besser in Aceton, Äther, Chloroform, Petroläther und Toluol, leicht löslich in Schwefelkohlenstoff. Sehr leicht bleichbar durch l % i g e Chromsäure, selbst schon durch Luftsauerstoff und Tageslicht. Sehr charakteristisch ist die bei Zusatz von konz. Schwefelsäure a u f t r e t e n d e Blaufärbung, f e r n e r die Jodprobe mit Jodjodkalilösung (1 g J, 7 g KJ, 100 ccm H a O): dunkelviolette F ä r b u n g mit metallischem Glanz. Dadurch sind Carotinoide leicht von A b n u t zungspigmenten zu unterscheiden. 1143. Die Carotinoide kommen bei Tieren in Fetten gelöst als kleine gefärbte Tröpfchen oder als winzige Körnchen und stäbchenförmige Kristalle (bzw. Kristallite) vor, die im polarisierten Licht doppelbrechend sind. Die mit gelbem Farbstoff versehenen Zellen werden als Xanthophoren, die mit rotem als Erythrophoren, die Gesamtgruppe als Lipophoren bezeichnet. 1144. Als U n t e r s u c h u n g s o b j e k t in überlebendem Zustand eignet sich besonders der Hinterrand der dachziegelig sich deckenden Bauchschilder unserer Eidechsen ( S c h m i d t 17). Man biegt das Tier so, daß die Bauchseite vorgewölbt ist und die Schuppen sich voneinander spreizen. Dann schneidet man mit einer gekrümmten Schere den 0,5—1,0 mm breiten feinen Hinterrand der Schuppe ab, bringt sie — die Außenseite dem Deckglas zugekehrt — in phys. NaCl-Lösung und umrandet mit Wachs. Auch Gefrierschnitte von u n f i x i e r t e m Material (Haut vom Frosch, Salamander, Mundschleimhaut junger Vögel) sind geeignet. Die Schwefelsäurereaktion ist an dünnen Hautstücken oder Gefrierschnitten auszuführen, wobei die Säure konzentriert oder reichlich zugesetzt werden muß. Störende Guanophoren können ohne Schädigung der Lipophoren durch NaOH oder KOH gelöst werden. 1145. Die Herstellung von D a u e r p r ä p a r a t e n wird durch die Löslichk e i t des Farbstoffes sehr erschwert. Am besten ist noch das Einlegen des frischen Objektes in Glyzerin. N u r bei einigen Lipophoren, z. B. Epidermis von erwachsenem Feuersalamander, in der Cutis von Triton-, Salamander- und Froschlarven ist der körnig-kristallinische Farbstoff so widerstandsfähig, daß man kleine Stückchen in abs. Alkohol rasch entwässern und durch Zedernholzöl rasch in Immersionsöl ü b e r f ü h r e n kann.

§ 1146—1153.

Pigmente. — Spezielle Methoden

267

1146. Als C a r o t i n a l b u m i n e werden Pigmente verschiedenster Färbung bezeichnet, die eine Verbindung zwischen einem Carotinoid und einem Eiweißkörper darstellen. Merkmale: in Wasser kolloidal löslich, in allen organischen Lösungsmitteln unlöslich. Durch Kochen oder Eiweißfixierer wird das Albumin niedergeschlagen und das Carotinoid in Freiheit gesetzt (z. B. Hummerpanzer). L i s o n (36).

1147. A l l o p h o r e n sind Pigmentzellen, die einen alkoholunlösl i c h e n gelben bis roten Farbstoff enthalten. Im polarisierten Licht sind sie einfach brechend. Bei Dunkelfeldbeleuchtung entstehen oft sehr f a r b e n p r ä c h tige Bilder. Fundort: In der Haut von Knochenfischen (vgl. B a l l o w i t z 13a und b), von Reptilien (Chamäleon, Eidechsen, Schlangen) und Amphibien (z. B. Rana fusca). 1148. Zu ihrer F i x i e r u n g dient besonders Alkohol und Sublimat. Stark saure Fixierungsflüssigkeiten können den Farbstoff angreifen. Durch Zerstörung gleichzeitig vorhandener Guanophoren mit Hilfe von Alkalien lassen sich die Allophoren stärker hervorheben. Ist das nicht möglich, so untersuche man g u a n i n a r m e und - f r e i e Stellen. 1149. Neben Balsamtotalpräparaten kann man auch Schnittpräparate untersuchen (am besten ungefärbt, da die Allophorengranula künstliche Farbstoffe stark speichern können, wodurch die natürliche Farbe verdeckt wird). Ist man, wie bei Hautverknöcherungen, gezwungen zu entkalken, so gehen die Allophorenfarbstoile meist zugrunde. 1150. G u a n o p h o r e n ( = Interferenzzellen, Iridozyten, Leukophoren) sind Pigmentzellen, deren Zelleib feinkörnige oder deutlich kristallinische Guanineinschlüsse enthält. F ü r die Auffindung kleiner Mengen ist wertvoll, daß Guaninkristalle doppelbrechend sind, wobei ein Teil der Kristalle natürlich infolge Zusammenfallens der optischen Achsen dunkel bleiben kann. Beim Einschalten des Gipsplättchens Rot 1. Ordnung treten lebhafte Interferenzfarben auf. F ü r die Beobachtung bei Dunkelfeldbeleuchtung empfiehlt sich Einschluß in Caedax. 1151. F i x i e r u n g . Durch starke Säuren oder Alkalien wird das Guanin gelöst. M a n fixiere also in Alkohol, Alkohol-Formol oder Sublimatgemischen. Das Formol muß sorgfältig neutralisiert werden. Man lasse die P r ä p a r a t e aber nicht länger als einige Tage in Formol, da sonst Verluste möglich sind. In Pikrinsäure bildet sich leicht Guaninpikrat, weshalb ihre Anwendung zu vermeiden ist. Essigsäure soll in der in der Fixierungstechnik gebräuchlichen Verdünnung nach M i 11 o t unschädlich sein. 1152. F ä r b u n g . Alaunhaltige Flüssigkeiten w i r k e n lösend. So läßt sich z. B. das Guanin, was bei Untersuchung von K e r n und Protoplasma der Guanophoren v o n Nutzen sein kann, durch Einstellen der Schnitte in 5°/oige Eisenalaunlösung entfernen. Da die gebräuchlichen Hämatoxylinlösungen meist alaunhaltig sind, so können durch sie die Guaninkristalle angegriffen werden. Man verwendet sie daher stark v e r d ü n n t und f ä r b t so kurz als möglich ( B a l l o w i t z 14a). S c h m i d t nimmt verdünntes Delafieldsches Hamatoxyhn. 1153. Nicht alle F ä r b u n g e n von Haut und Hautorganen der Wirbeltiere ber u h e n auf Pigmenten; zum großen Teil spielen auch S t r u k t u r f a r b e n — allein und wie bei der grünen H a u t f a r b e des Frosches in Verbindung mit Pigm e n t e n — eine Rolle. Die S t r u k t u r f a r b e n sind an meist sehr feine S t r u k t u r e n geknüpft, die durch Interferenz des auffallenden Lichtes oder durch Herstellung eines t r ü b e n Mediums Farbenerscheinungen veranlassen. Diese verschwinden daher, wenn die optischen Unterschiede z. B. durch den ausgleichenden Einfluß d e r Einbettungsmittel beseitigt werden (z. B. D u r c h t r ä n k u n g blauer Vogelfedern mit Balsam).

268

Untersuchung der Zelle

§ 1154—1155.

Weiteres über die bei Untersuchung von Strukturfarben anzuwendende Technik s. B i e d e r m a n n . Schrifttum über Pigmentuntersuchung B i e d e r m a n n , H u e c k (12, 21), L i s o n (36), O b e r n d o r f e r (21), W. J. S c h m i d t (17, 18), S c h m i d t m a n n (28), V e r n e (26). H. Nachweis von Fermenten 1. Oxydase-Reaktionen (Phenolasen) 1154. W i n k l e r (07) stellte im Cytoplasma von Leukocyten durch Einwirkung von a-Naphthol und Nachbehandlung mit Dimethylparaphenylendiamin blaugefärbte Granulationen dar. Die Reaktion (Indophenolblausynthese) ist durch oxydierende Fermente ( O x y d a s e n 1 ) ) der betreffenden Zellen bedingt. W. H. S c h u l t z e wies dann mit Hilfe dieser Methode, die von ihm noch weiter ausgearbeitet wurde, auch in zahlreichen anderen Zellen Oxydasen nach. B e merkenswert ist, daß die Reaktion niemals innerhalb des Kernes, sondern n u r im Cytoplasma auftritt. Die Methode von W i n k l e r - S c h u l t z e , die zweckmäßig als I n d o p h e n o l b l a u - R e a k t i o n bezeichnet wird, erfuhr im Laufe der Zeit eine Reihe von oft nur kleinen Abänderungen, durch die aber das Ergebnis oft wesentlich verändert wird. Es ist daher unumgänglich notwendig, sich bei der Ausführung dieser Reaktionen genau nach den einzelnen Vorschriften zu richten. Zweifellos ist das ganze Gebiet zur Zeit noch wenig geklärt. Von manchen Autoren (z. B. H o 11 a n d e) wird die Fermentnatur der gefärbten Substanzen überhaupt bestritten (vgl. dazu L i s o n 36). a) I n d o p h e n o l b l a u - R e a k t i o n n a c h W i n k l e r - W . H. S c h u l t z e . Synonyme Bezeichnungen: Modifikation A der Oxydasereaktion (W.H. Schultze), a-Naphthol-Methode A (L o e 1 e), Myelo-Oxydase-Reaktion oder M-Nadi-OxydaseReaktion (G r a e f f), Reaktion auf stabile Oxydasen (v. G i e r c k e). 1155. V o r b e r e i t u n g d e s M a t e r i a l s : Fixierung in Formol oder Orthscher Flüssigkeit (möglichst bald nach dem Tode). Auswaschen in Wasser. Schneiden auf dem Gefriermikrotom, 7—10//. Die Färbung wird am besten gleich nach der Anfertigung der Schnitte vorgenommen. Blutausstriche werden vor der Färbung 2 Stunden lang in Formol-Alkohol (1 Teil Formol + 4 Teile 80—96%iger Alkohol) fixiert. S t r a s s m a n n fixiert in der sog. »Bonner-Lösung«: Karlsbader Salz 50 g, dest. Wasser 1000 ccm, 40°/oiges Formol 125 ccm. Nach der Fixierung auswaschen in Wasser. Nach dieser Vorbehandlung ist auch Einbettung in Paraffin möglich. Die —1 mm dicken Organstückchen müssen aber rasch durch steigenden Alkohol geführt und in einer Stunde durch Benzol in Paraffin gebracht werden. H e r s t e l l u n g der L ö s u n g e n : a) 1 g a-Naphthol wird in einem Erlenmeyerkölbchen in 100 ccm dest. Wassers erhitzt, bis das Wasser zu kochen beginnt und die am Boden des Gefäßes liegende Substanz geschmolzen ist. Sodann wird unter leichtem Umschwenken des Kölbchens tropfenweise so viel einer 25°/oigen ehem. reinen Kalilauge zugesetzt, bis das geschmolzene a-Naphthol vollständig gelöst ist. Beim Erkalten fällt unter Umständen wieder etwas Substanz in Kristallen aus. Die überstehende, leicht gelblich gefärbte Flüssigkeit wird verwendet (etwa 4 Wochen lang haltbar; im Dunkeln aufbewahren). ') Nach L i s o n (36) handelt es sich bei den »Oxydasen« der Histologen in Wirklichkeit um Phenolasen, die nur einen Teil der Oxydasen im weiteren Sinn darstellen.

§ 1156—1157.

269

Fermente

b) 0,5 g D i m e t h y l - p - P h e n y l e n d i a m i n b a s e (von M e r c k in Glasröhrchen eingeschmolzen z u beziehen, da die Substanz an der L u f t rasch verdirbt) w e r d e n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r in 50 ccm dest. Wasser gelöst. Die Lösung b e k o m m t i h r e volle F ä r b e k r a f t erst nach 1—2 Tagen; sie ist in braune 1 " Flasche gut verschlossen a u f b e w a h r t , 2—3 Wochen h a l t b a r . K a t s u n u m a und andere Autoren ziehen schwächere Lösungen vor; Katsunuma löst z. B. 0,1 g Dimethyl-p-phenylendiaminbase in 50 ccm dest. Wassers, das durch vorhergehendes Auskochen sauerstoffrei gemacht ist. Nur 24 Stunden lang brauchbar. Bei Verwendung der starken Lösung kann es nach Katsunuma leicht zu diffusen Färbungen und Farbstofiniede'rschlägen kommen, die mit der Zellreaktion nichts zu tun haben. Statt der Dimethyl-p-Phenylendiaminbase kann man auch das Chlorhydrat verwenden, das haltbarer ist; Herstellung der Lösung wie oben. A u s f ü h r u n g der F ä r b u n g : 1. Man mißt gleiche Mengen von a) u n d b) in ein Schälchen, filtriert u n d f ä r b t g u t ausgebreitete (!) G e f r i e r s c h n i t t e von f o r m o l f i x i e r t e m Mat e r i a l unter* o f t m a l i g e m S c h w e n k e n des Schälchens. Meist t r i t t schon nach w e n i g e n Minuten (2—5 Min.) eine B l a u f ä r b u n g d e r Oxydase h a l t e n d e n Zellen ein. Das Farbgemisch ist nur f ü r wenige Schnitte brauchbar und muß dann erneuert werden. Man kann die Färbung ev. schon hier unterbrechen, das Präparat in Wasser abspülen und in Glycerin einlegen. 2. U m die F ä r b u n g h a l t b a r zu machen, spült m a n die g e f ä r b t e n Schnitte in •dest. Wasser k u r z ab u n d legt sie f ü r 2—3 Minuten in v e r d ü n n t e Lugolsche Lös u n g (1:2 Teilen dest. Wasser). Die Granula färben sich darin braun. 3. Ü b e r t r a g e n in dest. Wasser, dem auf 10 ccm 1—2 T r o p f e n einer 0,5°/oigen w ä s s e r i g e n L i t h i u m c a r b o n a t l ö s u n g zugesetzt sind. 10 Minuten bis 24 Stunden, bis die Granula gebläut sind. 4. G e g e n f ä r b u n g in C a r m a l a u n , Kernechtrot, H ä m a l a u n - E o s i n od. dgl. Abs p ü l e n in Wasser. Einlegen in Glyzerin oder Glyzeringelatine, (v. G i e r c k e empfiehlt als Einschlußmittel Wasserglas.) R e s u l t a t : Die O x y d a s e g r a n u l a sind d u n k e l b l a u g e f ä r b t . Die P r ä p a r a t e s i n d m e h r e r e Monate lang h a l t b a r . Intensiv blau gefärbt sind u. a. die Granula der neutrophilen, eosinophilen, pseudoeosinophilen und amphooxyphilen Leucocyten. Ebenso die der basophilen Mastleucocyten des Blutes und Knochenmarkes, ferner die Granula der Speichelund Tränendrüse und der syncytialen Auskleidung der Placenta. Lymphocyten und Plasmazellen sind dagegen ungefärbt. Diesem Umstand verdankt die Reaktion ihre Anwendung zur Trennung myeloider und lymphoider Zellen. 1156. S c h m o r 1 (18) benützt zur Fixierung der Färbung statt Lugolscher Lösung eine konzentrierte wässerige Lösung von Ammonium molybdaenicum, da dieses die Schnitte ungefärbt läßt. b) G e w e b s - N a d i - R e a k t i o n

nach G r ä f f

Synonyme Bezeichnungen: G-Nadi-Reaktion, Gewebs-Oxydasereaktion, labile Oxydase-Reaktion. 1157. A l l g e m e i n e s . In G e f r i e r s c h n i t t e n von f r i s c h e m unfixiertem Gew e b e treten, wie v. G i e r c k e fand, bei E i n w i r k u n g von alkalifreier a-Naphthollösung u n d l°/oiger D i m e t h y l - p - P h e n y l e n d i a m i n l ö s u n g b l a u e K ö r n c h e n auf, die sich mit alkalihaltiger F a r b l ö s u n g u n d nach Formolfixierung nicht mehr n a c h w e i s e n lassen. V o n G i e r c k e stellte diese Substanzen als » l a b i l e O x y -

270

Untersuchung der Zelle

§ 1158—1159.

d a s e n« den durch Formolfixierung nicht beeinflußten » s t a b i l e n«, nach § 1155 darstellbaren Oxydasen gegenüber. G r ä f f bezeichnete diese am unfixierten P r ä p a r a t ausgeführte Reaktion als G e w e b s - N a d i - R e a k t i o n und stellte fest, daß ihr Ausfall in hohem Maße von der Wasserstoffionenkonzentration des Gewebes und des Reaktionsgemisches abhängig ist. Die letztere l ä ß t sich durch Zusatz von Pufferlösungen beliebig einstellen. Im Ergebnis der Reaktion unterscheidet G r ä f f zwischen einem »Ma«-Effekt, womit er eine schon makroskopisch sichtbare Bläuung des Schnittes bezeichnet und einem »Mi«Effekt, der im A u f t r e t e n blauer, n u r mikroskopisch sichtbarer Körnchen b e steht. 1158. Die unter optimalen Bedingungen ausgeführte G-Nadi-Reaktion gestattet den Nachweis von Gewebsoxydasen auch in Zellen, die bei der Indophenolblaureaktion ungefärbt bleiben. Die Nadi-Reaktion ist nach Gräff daher unter den sog. Oxydase-Reaktionen die einzige, »welche mit so gut wie allen Zellen des tierischen Gewebes positiv reagiert, d. h. den Nachweis eines oxydationsbeschleunigenden Agens (,Oxydasel, Katalysator) in jenen Zellen gestattet«. Durch sie werden auch in Lymphocyten Granula gefärbt. Nach G r ä f f berechtigt nur die unter optimalen Bedingungen angestellte Nadi-Reaktion zu Schlüssen über den Oxydasegehalt einer Zelle. Einlegen frischer Gewebsschnitte in 0,1—l°/oige Cyankalilösung löscht die GOxydasereaktion in wenigen Minuten völlig aus (G-Nadi optimal ph 8,1). Bei Einwirkung auf das Tier ist die Wirkung je nach Art der Verabreichung des KCN" verschieden. Am stärksten ist Abschwächung bei intravenöser oder intrakardialer Injektion. Die Indophenolblaureaktion wird durch KCN nicht beeinflußt (H a 11 h e i m e r 25). 1159. H e r s t e l l u n g d e r z u r G - N a d i - R e a k t i o n benötigten Lösungen. a) H e r s t e l l u n g d e r a - N a p h t h o l l ö s u n g (1:1000). Man gibt 1,0 g a Naphthol in einen Maßkolben und füllt mit 90°/oigem Alkohol auf 10 ccm auf, wobei sich das a-Naphthol leicht löst. Diese alkoholische Stammlösung wird bei Bedarf lOOfach mit dest. Wasser verdünnt, in dem man z. B. 1 ccm der Stammlösung abpipettiert, die Pipette mehrfach mit Alkohol nachspült, beides mit einigen ccm Alkohol in eine braune Flasche gibt und mit dest. Wasser auf 100 ccm zur völlig klaren, gebrauchsfertigen Lösung auffüllt. b) H e r s t e l l u n g d e r D i m e t h y 1 - p - p h e n y 1 e n d i a m i n ch 1 o r h y d r a t l ö s u n g (1,2:1000). 0,6 g der Substanz werden in dunkler Flasche unter Vermeidung von Schütteln in 500,0 ccm dest. Wasser gelöst. Die Lösung soll möglichst farblos oder nur leicht rötlich gefärbt sein. Die Stammlösungen sind gut verschlossen zu halten, am besten mit paraffinierten Stöpseln. Durch Autooxydation stärker gefärbte Lösungen sind ungeeignet. c) H e r s t e l l u n g d e r S t a m m l ö s u n g e n f ü r d i e P u f f e r g e m i s c h e . Für das h-Bereich der Puffer von 10~ 3 bis 10 10 braucht man folgende gut verschlossen zu haltende Stammlösungen: n - N a t r o n l a u g e : 40,01 g Natr. hydric. pur. in bacill. werden im Maßkolben mit dest. Wasser auf 1000,0 ccm aufgefüllt. S o d a kristallisiert, nicht verwittert (Na 2 C0 3 + 6 H 2 0, Molekulargewicht 286): 14,3 g im Maßkolben mit dest. Wasser auf 100,0 ccm aufgefüllt. G 1 y k o k o 11 : 7,5 g auf 100,0 ccm wie Soda. S e k u n d ä r e s N a t r i u m p h o s p h a t (Marke Kahlbaum zu Enzymstudien »nach Sörensen«) 1.5 molar : 11,9 g in warmem dest. Wasser gelöst und auf 1000,0 im Maßkolben aufgefüllt. P r i m ä r e s N a t r i u m p h o s p h a t (»nach Sörensen« von Kahlbaum) 1,5 molar : 9,1 g auf 1000,0 wie vorausgehend.

§ 1159.

271

Fermente

N a t r i u m a z e t a t (CH3COONA + 3 H 2 0 , Molekulargewicht 136) 13,6 g auf 100 ccm wie Soda. n - E s s i g s ä u r e : 60,03 g krist. .Eisessig mit dest. Wasser auf 1000,0 ccm aufgefüllt. Von diesen Stammlösungen werden zum Ansetzen der Puffer mit Ausnahme der Phosphate jeweils 1/io Verdünnungen gebraucht; man pipettiert zur Bereitung derselben vor Gebrauch 10,0 ccm der Stammlösung in einen Erlenmeyerkolben ab und gibt 90,0 ccm dest. Wasser zu; die Phosphate sind in Form der Stammlösung gebrauchsfertig. d) H e r s t e l l u n g d e s N a d i - P u f f e r g e m i s c h e s : Zu gleichen Teilen der Lösungen a) und b) werden unmittelbar vor Gebrauch bestimmte Mengen der Lösungen von c) zugesetzt. Der P'H hängt bei gleichbleibender Konzentration der Lösungen a) und b) von der Art und der Menge der zugesetzten Pufferlösungen ab. Die nachfolgende Tabelle 5 gibt die Puflerwerte bei 50,0 ccm Nadi-Gemisch und 10 ccm Pufferlösung: (annähernd 0,5°/oo Nadigemisch); Tabelle 6 gibt die Werte bei 5 ccm Nadi-Gemisch und 20 ccm Pufferlösung: (annähernd 0,l°'oo Nadigemisch). Zur Abmessung der Lösungen a) und b) nimmt man am besten eine 25 ccmBürette; die Pufferlösungen werden abpipettiert; die in der Tabelle angegebenen Zahlen bedeuten ccm. W e r n i c h t m i t Ph - R e i h e n , s o n d e r n n u r u n t e r o p t i m a l e n ph Bedingungen arbeiten will, verwendet für physiologischc h e m i s c h e o d e r m i k r o s k o p i s c h e U n t e r s u c h u n g e n am T i e r u s w . a m b e s t e n N a d i p u f f e r g e m i s c h Ph = 8,2 o d e r 7,8 ( T a b e l l e 5) o d e r p H = 8,1 ( T a b e l l e 6); a n d e r P f l a n z e p H = 3,4—5,9 ( T a b e l l e 5) o d e r p H = 3,6—5,8 ( T a b e l l e 6). TABELLE 5

PH

über

12,0 11,6 11,0 10,8 9,5 9,2 9,0 8,5 7,8 7,4

7,0 6,5 6,5 5,9 5,4 4,5 4,0 3,4

Natron

10,0 6,5 8,0 5,0 2,5 5,0 1,5 4,0 3,0

Soda

Glykokoll

-

sek. Phosphat

Azetat

prim. Phosphat

Puffer 10,0 Essigsäure

Indikator

—

3,5 5,0 7,5 8,5

2,0

2,0 1,0

Alizaringelb GG

2,0

Phenolphthalein

5,0

»»

>j m-Nitrophenol

6,0 7,®

8,0 10,0 5,0

Nadi ohne Puffer

„ >»

5,0

8,0 9,0 10,0 5,0 3,0 1,0

unter

3,0 3,0

Nadigemisch 50,(

p-Nitrophenol

,, ,,

>>

5,0 7,0 9,0 10,0

y-Dinitrophenol a-Dinitrophenol

,,

Untersuchung der Zelle

272

§

1160—1161.

TABELLE 6 Nadigemiscti 5,0 — Puffer 20,0 PH

über 12,0 11.5 10,7 10.6 9.1

Natron

2,0 1,0 10,0 4,0

Soda

18,0 19,0 20,0

Glykokoll

sek. Pnosphat

prim. Phosphat

Azetat

Essigsäure

Indikator

Alizaringelb GG 10,0 16,0

Phenolphthalein m-Nitrophenol >>

20,0

8,1

16,0

4,0

7.2 6,8 6,4 5,8 4,6 4,0 3,6

10,0

10,0

10,0 Nadi 5 0 + 20,0 dest. W asser ohiìe Puffei

p-Nitrophenol 20,0 10,0 4,0

>1

10,0 10,0 10,0

••-Dinitrophenol a-Dinitrophenol

Über die Feststellung des Ph von Nadigemischen mittels der Indikatorenmethode vgl. man die Originalarbeit von G r ä f f. Ferner M i c h a e l i s , Deutsche med. Wochenschr. 1921, Nr. 17 und 24. Außerdem M i c h a e l i s , Praktikum der physikalischen Chemie. Berlin, Springer 1922, S. 32 ff. 1160. A u s f ü h r u n g d e r Gewebs-Nadi-Reaktion: a) V o r b e h a n d l u n g d e s P r ä p a r a t e s : D i e R e a k t i o n m u ß an u n fixiertem G e w e b e a u s g e f ü h r t w e r d e n , d a die sog. »labilen« O x y d a s e n gegen chemische, t h e r m i s c h e u n d sonstige E i n f l ü s s e s e h r e m p f i n d l i c h sind. D i e U n t e r s u c h u n g h a t d a h e r a u c h möglichst b a l d n a c h d e m T o d e zu e r f o l g e n . ( E v e n t u e l l a u f b e w a h r e n auf Eis.) S p ä t e r h a t G r ä f f eine M e t h o d e a n g e g e b e n , die auch d i e V o r n a h m e e i n e r F i x i e r u n g g e s t a t t e t (s. § 1161). b) A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n . 1. F r i s c h e B e r e i t u n g des N a d i p u f f e r g e m i s c h e s . 2. E i n b r i n g e n d e r S c h n i t t - , Z u p f - o d e r Q u e t s c h p r ä p a r a t e des f r i s c h e n t n o m m e n e n u n f i x i e r t e n G e w e b e s in einige ccm des Gemisches, d a s h i n - u n d h e r bewegt wird. 3. W e n n die u n t e r U m s t ä n d e n schon m a k r o s k o p i s c h , in a n d e r e n F ä l l e n n u r m i k r o s k o p i s c h s i c h t b a r e B l a u f ä r b u n g e i n g e t r e t e n ist, w i r d das P r ä p a r a t auf d e n O b j e k t t r ä g e r g e b r a c h t , d e r Rest d e r F l ü s s i g k e i t m i t F i l t r i e r p a p i e r a b g e s a u g t u n d m i t p h y s i o l o g i s c h e r Kochsalzlösung k u r z a u g e w a s c h e n . 4. E i n d e c k e n in K a l i u m aceticum. E r g e b n i s : Die O x y d a s e g r a n u l a sind d u n k e l b l a u g e f ä r b t . E t w a v o r h a n d e n e s F e t t f ä r b t sich bei positiver R e a k t i o n i n f o l g e d e r Löslichkeit des e n t s t e l l e n d e n I n d o p h e n o l b l a u e s in F e t t violett. 1161. N a d i r e a k t i o n nach F o r m o l f i x i e r u n g . Um die Nadireaktion auch am formolfixierten Präparat ausführen zu können, fixiert G r ä . f f in einer mit Phosphat gepufferten Formollösung. Durch die Pufferung soll der postmortal eintretenden Säuerung entgegengetreten werden. Man stellt dazu unter Erwärmen folgende zwei Stammlösungen her: a) primäres Kaliumphosphat 9,1 g, dest. Wasser auf 1000,0 ccm, b) sekundäres Natriumphosphat 11,8 g, dest. Wasser auf 1000,0 ccm.

§ 1162—1165.

Fermente

273

Bei der Bereitung der 4—10°/oigen Formollösung nimmt man dann zum Verdünnen des Formols statt Wasser 1 Teil a und 4 Teile b (Ph um 7,3). Sind die Gewebe schon stark sauer, dann nimmt man zu Anfang besser 1 Teil a und 9 Teile b (PH um 7,6). Die Fixierungsflüssigkeit muß in reichlicher Menge genommen, öfters umgeschüttelt und erneuert werden. Nach der Fixierung Auswaschen in Wasser und Schneiden auf dem Gefriermikrotom. Die Schnitte kommen in frisch bereitete Nadilösung, die für —1 Stunde im Brutschrank auf 37—50° C erwärmt wird. Dann Abspülen in warmem Wasser, Fixieren der Färbung mit Lugolscher Lösung und Lithiumcarbonat (s. § 1154, 2). Einschluß in Glyzerin od. dgl. Zur Bereitung des Nadigemisches verwendet man die in § 1159 unter a—c angegebenen Lösungen, und zwar 10 ccm Lösung a, 10 ccm Lösung b und 4 ccm sekundäres Natriumphosphat (Ph um 7,0). c) P h e n o l r e a k t i o n n a c h Loele (Synonyme Bezeichnung: Naphtholreaktion) 1162. Die Reaktion geht aus von der Beobachtung, daß gewisse Zellgranulationen bei Einwirkung alkalischer a-Naphthollösung eine violette bis pechschwarze Farbe annehmen. Läßt man weiterhin entweder gleichzeitig ( s i m u l t a n ) oder nachfolgend ( s u k z e s s i v ) einen basischen Teerfarbstoff einwirken, so nehmen die durch a-Naphthol gefärbten Granulationen den Farbstoff auf und halten ihn so fest, daß die Durchführung durch Alkohol und X y l o l und Einbettung in Canadabalsam möglich ist. Die auf dieser Grundlage beruhenden Methoden bezeichnet L o e l e als p r i m ä r e P h e n o l r e a k t i o n e n . 1143. Der positive Ausfall der Reaktion zeigt nach L o e l e nur, »daß eine Oxydationsbeschleunigung vorliegt und gleichzeitig eine Bindung des Farbstoffes erfolgt, die nicht auf einfacher Oxyphilie beruht, sondern mit chemischen Umsetzungsvorgängen verbunden ist, so daß sich aus der Reaktion allein über den eigentlichen Hergang und über die Eigenschaften der Oxydase selbst nichts Bestimmtes aussagen läßt«. a.) Primäre Phenolreaktion nach Loele 1164. Zur Herstellung der Farblösung tropft man in ein Reagenzglas zu einer Messerspitze a-Naphthol so viel 10°/oige Kalilauge, bis der Farbstoff unter stetem Schütteln gelöst ist; sodann w i r d mit 200 ccm dest. Wassers verdünnt. Die Lösung soll erst dann benützt werden, wenn sie anfängt leicht gelblich auszusehen, was meist 24 Stunden nach der Herstellung der Fall ist. Sie ist dann etwa 3 Wochen lang haltbar. Zur Ausführung der Reaktion kommen Gefrierschnitte von Formolmaterial für einige Minuten in die Farblösung, zum Abspülen in dest. Wasser. Einlegen in Glycerin od. dgl. E r g e b n i s : Die die Oxydation beschleunigenden Substanzen sind hellbis dunkelviolett bis schwarz gefärbt. ß) Phenol-Gentianaviolett-Methode nach Loele 1165. S i m u l t a n e Färbemethode zur Herstellung von Dauerpräparaten. Zur Herstellung der Farblösung w i r d zu einer Messerspitze a-Naphthol so viel einer 10°/oigen Kalilauge zugetropft, bis sich der Farbstoff unter Schütteln gelöst hat; sodann wird die gleiche Menge Glycerin oder Glykol als Schutzkolloid zugesetzt, um die Ausfällung des Farbstoffes zu verzögern; hiezu kommt 18

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

274

Untersuchung der Zelle

§ 1166—1170.

die lOfache Menge Leitungswasser und einige Tropfen einer gesättigten alkoholischen oder wässerigen Lösung von Gentianaviolett, Methylviolett od. dgl. Vor Gebrauch wird die Lösung filtriert. Zur A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n kommen Gefrierschnitte von Formolmaterial f ü r 6—24 Stunden in die angegebene Farblösung; hierauf steigender Alkohol, Xylol, Canadabalsam. E r g e b n i s : Die Phenole bindenden Granula der Myelocyten und anderer Zellen sind blauviolett gefärbt. Die Präparate sind jahrelang haltbar. Wenn die Färbung mißlingt, sind Änderungen im Mengenverhältnis der einzelnen Komponenten der Lösung nötig oder man versuche folgende Modifikation. 1166. S u k z e s s i v e F ä r b e m e t h o d e . 1. Einlegen von Gefrierschnitten von Formolmaterial in die in § 1164 angegebene Naphthollösung bis die Granula gefärbt sind. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. Kurze Färbung in gesättigter wässeriger Gentianaviolettlösung. — 4. Differenzieren in Lugolscher Lösung. — 5. Alkohol, Xylol, Balsam. Ergebnis wie in § 1165. y) Sekundäre Phenolreaktion nach Loele (Aldaminreaktion) 1167. Die sekundäre Naphtholreaktion beruht auf der Beobachtung Loeles, daß gewisse Zellstrukturen nach Vorbehandlung mit einem Formolextrakt bestimmter Schneckenarten die Fähigkeit gewinnen, a-Naphthol in Form eines schwarzen Farbstoffes zu binden. Die phenolbindenden Substanzen bezeichnet L o e l e als Aldamine (Aldehyde-Aminobasen), da in ihnen eine Aldehydgruppe f ü r das Zustandekommen der Reaktion von besonderer Wichtigkeit sein soll. Nach der Wirksamkeit der Extrakte lassen sich nach L o e l e unterscheiden: 1. Sekundäre Phenolreaktion 1. Grades, die nur einzelnen Zellstrukturen, besonders primär naphtholnegativen Granula die Fähigkeit gibt, Naphthol zu binden und 2. Sekundäre Phenolreaktion 2. Grades, die anscheinend bei allen Kernkör perchen und verschiedenen Kern- und Protoplasmastrukturen positiv auftritt. Den Extrakt, der die Phenolreaktion 1. Grades auslöst, bezeichnet L o e l e als Extrakt I, den 2. als Extrakt II. 1168. H e r s t e l l u n g d e r E x t r a k t e : Mehrere Exemplare von Limax cinereus oder Arion rufus werden in einer 10°/oigen Formollösung getötet und nach erfolgter Fixierung in Stücke zerschnitten. Die Wirksamkeit des Extraktes II tritt nach mehreren Tagen ein und bleibt nur für einige Tage erhalten. Die Wirksamkeit des Extraktes I, der sich erst allmählich durch Zersetzung des Extraktes II bildet, hält dagegen mehrere Wochen an. Zur Prüfung des Extraktes I eignen sich die großen Granulocyten im Leibe von Limnaea stagnalis oder einer Limaxart. Zur Prüfung des Extraktes II eignen sieh Gefrierschnitte von menschlichem Gehirn oder Niere; die Kernkörperchen der Nervenzellen und Nierenepithelien müssen eine deutliche Schwarzfärbung zeigen.

1169. Zur A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n werden Gefrierschnitte des zu untersuchenden frischen oder kurz in Formol fixierten Gewebes bis f ü r 24 Stunden in Extrakt I oder II gelegt und dann in die Naphthollösung (nach § 1165) übertragen, bis die Reaktion eintritt. Hierauf abspülen in dest. Wasser und einlegen in Glycerin. 1170. Statt der Herstellung von Formolauszügen, die weniger haltbar sind, kann man nach L o e l e auch so vorgehen, daß man die Schnecken im ganzen in Formol fixiert und ohne Zerschneiden in ihm aufhebt. Limax ist nach 2—3, Arion nach 8 Wochen brauchbar. Zur Ausführung der Reaktion schneidet man dann von die-

§ 1171—1174.

Fermente

275

sem Vorratsmaterial auf dem Gefriermikrotom eine Anzahl von Schnitten herunter, fängt sie in einem, mit etwas dest. Wasser gefüllten Schälchen auf und setzt dann Gefrierschnitte des zu untersuchenden Organes zu. Nach einigen Stunden sind die phenolbindenden SuDstanzen gelöst und von den Kernkörperchen usw. absorbiert. Dann Ubertragen in die Naphthollösung: 2. Peroxydase-Reaktionen 1171. B e n z i d i n p e r o x y d a s e - R e a k t i o n . Die von K r e i b i c h und F i s c h e 1 angegebene Reaktion soll den Nachweis intracellulärer Peroxydasen ermöglichen. Von den verschiedenen Modifikationen führe ich die Vorschrift von L o e 1 e an, die mit einer wässerigen Benzidinlösung arbeitet; die ebenfalls gebrauchten alkoholischen Lösungen sind weniger haltbar. Zur Herstellung des Reagens wird 1 g Benzidinbase in 200 ccm dest. Wassers in einer Flasche kräftig geschüttelt. Vor Gebrauch wird filtriert und auf 50 ccm Flüssigkeit 1 ccm einer l°/oigen Wasserstoffsuperoxydlösung zugesetzt. Die letztere wird durch Verdünnen von 1 Teil Perhydrol »M e r c k« mit 29 Teilen dest. Wassers bereitet. Zur A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n werden Gefrierschnitte von F o r molmaterial für 3—5 Minuten in die Benzidinlösung gelegt. Dann ev. Nachfärbung in wässeriger Methylenblaulösung zur Darstellung der Kerne; Alkoholreihe, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Einzelne Granulationen färben sich sofort gelb bis braun. Andere nehmen zunächst eine himmelblaue bis grünliche Farbe an, die dann in Braun übergeht. (Nach L o e 1 e sind die letzteren farbchemisch als saure, erstere als basische Substanzen zu betrachten.) Die Kerne bleiben; wenn keine Nachfärbung vorgenommen wird, ungefärbt. Die Erythrocyten sollen ungefärbt bleiben; wenn sie sich mitfärben, so ist der Wasserstoffsuperoxydzusatz zu vermindern. Benötigt die Reaktion mehr als 5 Minuten oder sind die Granulationen unscharf gefärbt, dann fügt man dem Reagens 1—2 Tropfen einer 20°/oigen Kalilauge zu. 1172. N a p h t h o l p e r o x y d a s e - R e a k t i o n n a c h L . o e l e . — Zur H e r s t e l l u n g d e s R e a g e n s schüttelt man einen gehäuften Teelöffel a-Naphthol einige Zeit in 1000 ccm 0,85°/oiger Kochsalzlösung. Vor Gebrauch werden 50 ccm abfiltriert und mit 1 ccm einer l°/oigen Wasserstoffsuperoxydlösung (aus Perhydrol) zugesetzt. Zur Ausführung der Reaktion werden Gefrierschnitte von Formolmaterial kurz in die Lösung gebracht, mit Wasser abgespült und in Glycerin eingeschlossen. — E r g e b n i s : Ähnlich wie Oxydasereaktion; doch gibt es nach L o e 1 e Fälle, in welchen die Oxydasereaktion schneller und intensiver ausfällt, als die Peroxydasereaktion, oder in welchen die Peroxydasereaktion positiv ist, während die Oxydasereaktion negativ verläüft. Die mit dieser Reaktion nachgewiesenen Substanzen nennt L o e 1 e Naphtholperoxydasen. 1173. Zur Darstellung der N a p h t h o l p e r o x y d a s e n i m D a u e r p r ä p a r a t färbt L o e 1 e in der in § 1172 angegebenen Lösung bis die oxydierenden Substanzen violett gefärbt sind, dann abspülen in dest. Wasser und Auftropfen von Naphtholgentianaviolettlösung (s. § 1174). Nach einigen Minuten differenzieren in 50°/oigem Alkohol, bis nur noch die naphtholpositiven Substanzen gefärbt sind. Einschluß in Glycerin. 1174. Zur H e r s t e l l u n g d e r Naphtholgentianaviolettlösung gibt man in 1000 ccm 0,85°/oiger Kochsalzlösung einen gehäuften Teelöffel a-Naphthol, schüttelt einige Zeit und filtriert. Sodann tropft man von einer gesättigten alkoholischen Gentianaviolettlösung so viel zu, bis die Mischung anfängt trübe zu werden. Hierauf verdünnt man mit 70°/'oigem Alkohol bis die Lösung wieder 18'

276

Untersuchung der Zelle

§ 1175—1179.

durchsichtig erscheint. Die richtig eingestellte Lösung ist sehr lange gebrauchsfähig. 1175. Zur F ä r b u n g v o n B l u t p r ä p a r a t e n fixiert L o e l e den lufttrockenen Ausstrich in 80°/oigem Alkohol und färbt dann mit der in § 1174 angegebenen Naphtholgentianaviolettlösung, bis der ganze Ausstrich blau gefärbt ist. Nach Abspülen in Wasser tropft man die H 2 0 2 -haltige Naphthollösung (§ 1172) auf und läßt einige Minuten einwirken. Nach Abspülen mit Alkohol dürfen nur die Granula des myeloischen Systems blau gefärbt sein. Nimmt man zu viel H 2 0 2 , dann färben sich die Erythrocyten blau, während die Granula der weißen Blutzellen vielfach keine Peroxydasereaktion mehr zeigen. 1176. P e r o x y d a s e r e a k t i o n nach L i s o n (36). Bei ihr wird ein mit Zinkstaub und Essigsäure reduziertes stabiles Leuko-Säurefuchsin verwendet, das sehr klare, haltbare Präparate gibt. Zur Bereitung der Lösung wird ein Gemisch von 1,5 g Säurefuchsin oder Säureviolett, 10 g Zinkstaub, 2 ccm Eisessig und 100 ccm dest. Wasser erwärmt bis seine Farbe nach gelblich-bräunlich umschlägt. Nach Abkühlen werden nochmals 2 ccm Eisessig zugesetzt. Dieses »Zink-Leuko« ist einige Tage haltbar; wenn es sich anfärbt, wird es von neuem gekocht. Vor Gebrauch filtriert man 10 ccm ab und setzt 1 ccm des gewöhnlichen Wasserstoffsuperoxyds (mit 12 Volumprozent) zu. Die eingelegten Schnitte werden von 5—10 Min. kontrolliert. Dann Auswaschen, Färben mit irgendeiner histol. Färbemethode und Einlegen in Balsam wie gewöhnlich. Für hämatologische Präparate wird das Reagens 5—lOmal verdünnt. 1177. F a u t r e z bereitet die Lösung mit Patentblau. Die grünlich-graue Lösung, die bis zu einem Jahr haltbar ist, färbt die Peroxydasen sehr scharf grünlichblau. Anwendung wie in § 1176. 3. Weitere Fermentreaktionen und dergl 1178. D o p a - R e a k t i o n . Nach B l o c h (17) läßt sich durch Behandlung von Gewebstückchen oder Schnitten mit 3 • 4 Dioxyphenylalanin (abgekürzt »Dopa«) ein spezifisches intrazelluläres Oxydationsferment nachweisen, durch das das Dioxyphenylalanin in einen schwarz gefärbten Körper, das Dopamelanin, übergeführt werden soll. Der positive Ausfall der Dopareaktion »zeigt nach B l o c h die Fähigkeit einer Zelle an, aus einem normalerweise im Blut kreisenden Dioxyphenylalanin-ähnlichen Stoff Haut- und Haarpigment zu bilden.« Bloch betrachtet das »Dopaferment« als das »Pigmentbildungsferment«. Technik: Man legt lebensfrische Hautstücke in lauwarme Agarlösung, läßt die Substanz durch Erkalten zu einer festen Gallerte erstarren und schneidet mit dem Gefriermikrotom. Die möglichst dünnen Schnitte kommen bei Zimmertemperatur auf 24 Stunden vor Verdunsten geschützt in eine 1 bis 2 pro miliige wässerige Lösung von Dioxyphenylalanin. Erfolgt die Reaktion zu schwach, dann färbt man im Brutschrank bei 37" C. Sodann wird in dest. Wasser sorgfältig abgespült und in Glycerin eingebettet oder in steigendem Alkohol entwässert und durch Xylol in Balsam eingebettet. Nachfärbung z. B. mit Methylgrün-Pyronin zulässig. Resultat: Das Plasma der Zellen der Epidermis färbt sich diffus oder granulär gelbbraun bis schwarz. In der Cutis färben sich polynukleäre Leukozyten durch die Phenolase. 1179. Um die Dopa-Reaktion von Zufälligkeiten unabhängig zu machen, hat L a i d l a v (32) folgendes Verfahren ausgearbeitet: 1. Herstellung der Stammlösung: Man löst 0,3 g Dopa-Pulver (»für Bloch-Reaktion« Hoffmann la Roche) in 300 ccm dest. Wasser. Gut verkorkt im Eisschrank mehrere Wochen haltbar. Brauchbar solange farblos oder nur schwach gefärbt. 2. Pufferlösungen: a) 11 g Na 2 HP0 4 + 2 HoO in 1000 ccm Wasser. — b) 9 g K 2 HP0 4 in 1000 ccm Wasser.

§ 1180—1183.

Vitamine

277

3. Färbelösung: U n m i t t e l b a r vor der F ä r b u n g gibt m a n zu 25 ccm S t a m m l ö s u n g 2 ccm Lös. b) u n d 6 ccm Lös. a) (p'n 7,4). F i l t r i e r e n d u r c h feinporiges Filter. Die S t a m m l ö s u n g ist sofort w i e d e r in den E i s s c h r a n k zu stellen. — Eine S p u r Säure v e r h i n d e r t die Reaktion, eine S p u r Alkali beschleunigt die Reaktion. D a h e r m ü s sen a l l e Glasgefäße peinlich s a u b e r sein. 4. Ausführung: Das möglichst bald n a c h d e m Tod e n t n o m m e n e G e w e b e k o m m t f ü r 2—3 S t u n d e n in F o r m o l 1:8. Bei dieser K o n z e n t r a t i o n u n d Z e i t d a u e r k o m m t es zu k e i n e r Schädigung. G e f r i e r s c h n i t t e d a v o n w e r d e n 5 Sek. (nicht länger!) in dest. W a s s e r abgespült u n d dan,n sofort in das gepufferte R e a g e n s gebracht, gew ö h n l i c h bei 30—37° C. N a c h einer h a l b e n S t u n d e w i r d das Reagens erneuert. Das F o r t s c h r e i t e n der Reaktion w i r d mikroskopisch kontrolliert. Bei richtigem V e r l a u f w i r d die Flüssigkeit n a c h 2 S t u n d e n rötlich, n a c h 3—4 Std. s e p i a b r a u n . I m P r ä p a r a t müssen Melanoblasten u n d Leukocyten g r a u oder s c h w a r z h e r v o r t r e t e n ; das Melanin b e h ä l t seine n a t ü r l i c h e Farbe, alles ü b r i g e ist u n g e f ä r b t . 3. N a c h B e e n d i g u n g d e r R e a k t i o n A u s w a s c h e n evtl. G e g e n f ä r b u n g m i t Cresylviolett, Differenzieren mit Alkohol, d a n n w i e gewöhnlich in Balsam. 1180. Die S c h l u ß f o l g e r u n g e n B l o c h s w e r d e n von a n d e r e n A u t o r e n in ihrer R i c h t i g k e i t bestritten. K r e i b i c h (18) erhielt ähnliche F ä r b e e r g e b n i s s e mit Dirnen t h y l p h e n y l e n d i a m i n . N a c h H e u d o r f e r (21) h a n d e l t es sich bei der D o p a r e a k t i o n w e d e r u m einen spezifisch f e r m e n t a t i v e n noch ü b e r h a u p t u m einen f e r m e n t a t i v e n Vorgang. Die positive Dopareaktion b e r u h t auf einer Oxydation des D i o x y p h e n y l a l a n i n s infolge d e r p r i m ä r r e d u z i e r e n d e n E i g e n s c h a f t e n des P i g m e n t e s u n d seiner Vorstufen. Ebenso L e m m e 1 (21). Dagegen w e n d e t sich B l o c h (21). A b e r auch K a t s u n u m a (24) k o m m t zu dem Ergebnis, daß die Blochsche Dopareaktion w e d e r mit f e r m e n t a t i v e n noch sonstigen biologischen Vorgängen e t w a s zu t u n hat. L i s o n (36) ist dagegen der Ansicht, daß die R e a k t i o n ein i n t r a c e l l u l ä r e s F e r m e n t sichtb a r m a c h t , h ä l t es a b e r f ü r möglich, d a ß dieses eher einer Tyrosinase w i e einer D o p a o x y d a s e entspricht. 1181. T y r o s i n a s e - R e a k t i o n . Z u m N a c h w e i s der Tyrosinase l e g t m a n die darauf z u p r ü f e n d e n G e w e b e i n f r i s c h e m , u n f i x i e r t e m Z u s t a n d in e i n e k a l t g e s ä t t i g t e w ä s s e r i g e L ö s u n g v o n Tyrosin. A n d e n b e t r e f f e n d e n S t e l l e n tritt i m L a u f e v o n 1—24 S t u n d e n ein v i o l e t t e r bis s c h w a r z e r N i e d e r s c h l a g a u f . W e i t e r e s s i e h e b e i H a s e b r o e k (21). E i n g e h e n d e r e s ü b e r F e r m e n t n a c h w e i s s. bei L o e 1 e (20, 26), P r e n a n t (24), R i e s (37, 38). I. Nachweis v o n Vitaminen 1182. V i t a m i n A. J o y e t - L a v e r g n e (37) v e r w e n d e t z u m N a c h w e i s v o n V i t a m i n A e i n e g e s ä t t i g t e L ö s u n g v o n A n t i m o n t r i c h l o r i d i n Chloroform. D a s G e w e b e w i r d in F o r m o l - R i n g e r (15 : 85) fixiert u n d ü b e r A l k o h o l in P a r a f f i n e i n g e b e t t e t . D i e S c h n i t t e k o m m e n f ü r e i n i g e M i n u t e n b i s 3 S t u n d e n in o b i g e L ö s u n g . In a n d e r e n F ä l l e n l ä ß t er die L ö s u n g auf T r o c k e n p r ä p a r a t e e i n w i r k e n . D a s V i t a m i n A soll s i c h a l s B e s t a n d t e i l der N u k l e o l e n u n d d e r M i t o c h o n d r i e n vorfinden. — D i e M e t h o d e ist n o c h nicht gesichert. 1183. V i t a m i n C. D e r h i s t o c h e m i s c h e N a c h w e i s v o n V i t a m i n C g r ü n d e t s i c h auf d i e v o n v. S z e n t - G y ö r g y i e n t d e c k t e Tatsache, daß das i m G e w e b e b e f i n d l i c h e V i t a m i n C auf S i l b e r n i t r a t l ö s u n g , a u c h w e n n die R e a k t i o n i m D u n k e l n e r f o l g t , stark r e d u z i e r e n d w i r k t . Z u r U n t e r s c h e i d u n g v o n a n d e r e n m i t S i l b e r n i t r a t r e a g i e r e n d e n , r e d u z i e r e n d e n S u b s t a n z e n der Z e l l e n ist die A n s ä u e r u n g m i t E i s e s s i g w i e die V o r n a h m e der R e a k t i o n i m D u n k e l n v o n B e d e u t u n g . F ü r d i e M e t h o d i k ist w i c h t i g , daß V i t a m i n C i n W a s s e r w i e A l k o h o l s e h r

278

Untersuchung der Zelle

§ 1184—1187.

leicht löslich ist und durch oxydierende Fixierungsflüssigkeiten rasch zerstört wird. Weiterhin ist zu , beachten, daß Vitamin C im Gewebe in reduzierter und in reversibel oxydierter Form vorkommt, von welch beiden nur die erstere mit Silbernitrat reagiert. Die Methode ist für den Nachweis von reduzierter 1-Ascorbinsäure unter normalen Verhältnissen weitgehend, aber keineswegs absolut spezifisch, da auch o-D.ioxybenzolverbindungen, wie sie z. B. in den Melaninen und in den spez. Granula der basalgekörnten Zellen vorkommen, unter bestimmten Bedingungen eine positive Reaktion geben können; andererseits scheint zumindest ein Teil der an Eiweißkörper gebundenen reduzierten Ascorbinsäure durch die Silbernitratreaktion nicht erfaßt zu werden ( C l a r a (43). Die geschwärzten Granula bestehen nicht aus Vitamin C, sondern aus reduziertem Silber; sie zeigen nur an, daß in diesen Zellbezirken Silbernitrat durch Vitamin C reduziert wurde Cf f u h 1 42). 1184. Nach der Originalmethode von G i r o u d und L e b i o n d (34) werden die zu untersuchenden Organe unmittelbar .nach dem Tode kurz mit isotonischer Lävuloselösung durchspült, um etwa vorhandenes Kochsalz aus der Blutbahn zu entfernen. Anschließend werden die Gefäße mit einer 10°/oigen Silbernitratlösung gefüllt, der auf 100 ccm 1 ccm Eisessig zugesetzt ist. Nach 15 Min. wird mit dest. Wasser durchgespült. Um ein Nachdunkeln der Gewebe durch überschüssige Silbernitratreste zu verhüten, kann noch mit 3°/oiger Natriumthiosulfatlösung nachgespült werden. Nach 15 Min. Auswaschen mit dest. Wasser und Paraffineinbettung wie gewöhnlich. 11 BS. Im allgemeinen wird man vorziehen, an Stelle dieser etwas umständlichen Injektionsmethode, die zur Sicherung der Methodik für Zweifelsfälle notwendig sein kann, die Durchtränkungsmethode an kleinen Stückchen vorzunehmen. 1. Einlegen 2—3 mm großer Organstückchen in 10°/oige Silbernitratlösung, die auf 100 ccm mit 1 ccm Eisessig versetzt wird (PH = 3—4) 10 Min. — 2. Auswaschen in 3—4mal erneuertem dest. Wasser 15—20 Min. — 3. 5%>ige Fixiernatronlösung 10 Min. — 4. Auswaschen in mehrmals erneuertem dest. Wasser 15—20 Min. — 5. 96°/oiger Alkohol und Paraffineinbettung wie gewöhnlich (Zeiten nach R o m e i s 40). D i e g a n z e R e a k t i o n v o n 1. b i s 5. m u ß i m D u n k e l n V o r g e n o m m e n w e r d e n . Die Präparation erfolgt bei Rotlicht in der Dunkelkammer. Die Paraffinschnitte werden nach Entfernung des Paraffins nochmals einige Minuten in Fixiernatron gestellt, ausgewaschen und dann mit Methylenblau, Hämalaun oder Kernechtrot nachgefärbt. Das Vitamin C tritt, soweit es sich in reduzierter F o r m vorfindet, als schwarzer Niederschlag hervor. 1186. Eine zweite von G i r o u d und L e b i o n d angegebene Lösung besteht aus einer l°/oigen Silbernitratlösung, der auf 100 ccm 0,5 ccm Eisessig zugesetzt ist. B o u r n e (36) bevorzugt eine 5°/oige Silbernitratlösung mit 5°/o Eisessigzusatz. B o u r n e gibt auch eine Methode an, um das reversibel oxydierte Vitamin C zu erfassen, bemerkt aber selbst, daß die darnach hergestellten Präparate nicht viel mehr zeigen als bei gewöhnlicher Methode. 1187. T o n u t t i und P l a t e (38) gebrauchen (für Placenta und Knochengewebe) an Stelle der Silbernitratlösung auch eine l°/oige Goldchloridlösung, der auf 1 ccm 2 Tropfen Eisessig zugesetzt werden. Die Gewebsstückchen werden bei künstlichem Licht entnommen und für Va Stunde im Dunkeln in die Lösung gelegt. Dann 15 Min. langes Auswaschen in dest. Wasser und Einbetten in Paraffin (alles bis zur Paraffineinbettung im Dunkeln; es sind immer frische Lösungen zu verwenden, auch das Paraffin soll frisch sein.

§ 1188—1190.

Histochemische Methoden (anorganisch)

279

1188. Bei der Beurteilung der Resultate ist außer dem in § 1183 Gesagten zu berücksichtigen, daß alle diese Methoden, u m positiv auszufallen, eine beträchtliche Menge von Vitamin benötigen und daß sie trotz Anwesenheit von Vitamin C negativ ausfallen können, weil das Reduktionsvermögen durch die hemmende Wirkung anderer im Gewebe vorhandene Substanzen, wie Glutathion, maskiert sein kann. 1188a. Über den morphologischen Nachweis verschiedener Vitamine (A, B^, B2, C) in lebenden Organen oder in Gefrierschnitten formolfixierter Organe (Fixierung nicht länger als 24 Stunden) mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes siehe H i r t (38) und W i m m e r (39). Zusammenfassende Darstellungen: Vitamin A: J o y e t - L a v e r g n e (38). Vitamin C: B o u r n e (36), G i r o u d (38), T o n u t t i (38, 40). K. Histochemische Methoden zum Nachweis anorganischer Substanzen 1189. Beim Nachweis anorganischer Substanzen h a t m a n mit besonderer Sorgfalt darauf zu achten, daß die nachzuweisenden Stoffe durch die vorbereitenden Eingriffe so wenig als möglich beeinflußt werden. Man w i r d daher versuchen, die Reaktionen tunlichst an Schnitten des frischen, nicht fixierten Objektes auszuführen, eine Forderung, deren E r f ü l l u n g durch die von S c h u l t z B r a u n s ausgearbeitete Gefrierschnittmethode mit u n t e r k ü h l t e m Messer sehr erleichtert wird (s. § 520 ff.). Soweit die betreffende^ Stoffe unlöslich in absol u t e m Alkohol und Benzol sind, k a n n auch F i x i e r u n g in abs. Alkohol und Einb e t t u n g in Paraffin in Betracht gezogen werden. Dabei h a t man aber zu berücksichtigen, daß die Löslichkeitsverhältnisse auch der anorganischen Substanzen durch die Anwesenheit von Lipoiden in schwer abschätzbarer Weise beeinflußt werden können. Bei mikrochemischen Reaktionen unterscheidet man zwischen E r f a s s u n g s g r e n z e und E m p f i n d l i c h k e i t s g r e n z e . Erstere gibt die geringste Gesamtmenge nachweisbarer Substanz an, letztere sagt aus, in wieviel Teilen Lösungsmittel ein Teil der Substanz eben noch nachweisbar ist. Wie T i m m (32) zeigte, lassen sich die Erfahrungen der Mikrochemie nicht ohne weiteres auf histochemische Verhältnisse übertragen. Nach T i m m sind die Einheiten der Mikrochemie (7 und cmm) für die Histochemie millionenfach zu groß. Er schlägt vor, in der Histochemie, der histologischen Längeneinheit von 1 « entsprechend, eine Gewichtseinheit von 1 Digamma f = 10"6y = 10-12g zu gebrauchen (bei Granulationen von 1 p Durchmesser würde es sich beispielsweise um Körperchen dieser Größenordnung handeln). Nach R i e s übertreffen die histochemischen Nachweismethoden auch die spektralanalytischen, deren Grenze zwischen 0,1 bis 0,01 Y liegen, um das 50 OOOfache. Weiteres s. R i e s (38). 1. Veraschungsmethoden 1190. Die Gesamtmenge der anorganischen Substanz eines Gewebes läßt sich am.besten durch V e , r a s c h e n eines Schnittes auf dem O b j e k t t r ä g e r zur Darstellung bringen (zuerst R a s p a i 1 1833, dann L i e s e g a n g 10, besonders ausgebaut durch P o 1 i c a r d 23). Die Methode der S c h n i t t v e r a s c h u n g erstrebt eine restlose Zerstörung der im Gewebe vorhandenen organischen Substanz bei gleichzeitiger E r h a l t u n g der Lage u n d der Menge aller anorganischen Bestandteile. Im S p o d o g r a m m werden außerdem auch einfachere, leichter zu durchschauende Bedingungen f ü r die Analyse der mineralischen Bausteine geschaffen. So wird eine Reihe von Stoffen, die sich mit dem Reagens umsetzen und dadurch zu Täuschungen Veranlassung geben können, zerstört. Ferner

280

Untersuchung der Zelle

§ 1191—1196.

werden die Fehlermöglichkeiten, die beim frischen Präparat durch den möglichen Einfluß der Kolloide auf den Ablauf der Reaktion vorhanden sind, ausgeschaltet. Durch die Kolloide des frischen Präparates kann sowohl eine Verminderung wie Vermehrung der nachzuweisenden Substanz vorgetäuscht werden, im ersteren Fall dadurch, daß sie die chemischen Umsetzungen durch Schutzwirkung mehr oder weniger verhindern, im letzteren dadurch, daß sie durch Adsorption chemische Vorgänge vortäuschen. Dazu kommt die Unsicherheit der Reaktion gegenüber komplexen, »maskierten« Verbindungen.

Nachteilig ist, daß »durch Zerstörung aller organischen Verbindungen und die Uberführung aller Elemente in ihre Oxyde oder hitzebeständigen Neutralsalze jedes Urteil unmöglich wird, wie diese Elemente im Körper miteinander verbunden waren. Es geht somit jede Möglichkeit verloren, Bau- und Betriebsstoffe voneinander zu trennen« ( S c h u l t z - B r a u n s 29). 1191. Die Veraschung wird an frischen wie an fixierten Präparaten vorgenommen. Im ersteren Falle (»Nativpräparat«) verwendet man am besten Gefrierschnitte, die nach § 520 ff. von frisch entnommenen unfixierten Organen mit tiefgekühltem Messer hergestellt sind, Schnittdicke 10 bis höchstens 15,a, da dickere Schnitte schwerer veraschen und ihre Asche leichter verlagert wird. Für die Beurteilung von Mengenverhältnissen ist die Einhaltung gleicher Schnittdicke Voraussetzung. Ferner ist wichtig, daß die Schnitte ohne Falten und Blasen auf dem Objektträger liegen. Ein besonderes Klebemittel ist bei diesen Nativpräparaten unnötig. Auch die Asche haftet bei ihnen so fest am Öbjektträger, daß sie bei einigermaßen vorsichtiger Behandlung nicht n u r nicht abfällt, sondern sogar beim Eintauchen in Wasser in ihren unlöslichen Bestandteilen nicht abgespült wird ( S c h u l t z - B r a u n s ) . 1192. Bei Berücksichtigung nachfolgender Vorbedingungen kann die Veraschung auch an Schnitten von fixiertem und in Paraffin eingebetteten Material vorgenommen werden. Die Verwendung von Paraffinschnitten kann namentlich bei cytologischen Untersuchungen sogar notwendig werden, da für diese die Gefrierschnitte oft zu dick sind. 1193. Als Fixierungsflüssigkeiten kommen absoluter Alkohol, Formol-abs. Alkohol (1 : 9) und Formol (1 :4) in Betracht. Die Befürchtung, daß es namentlich bei Formol zu starken Substanzverlusten komme, scheint nicht zuzutreffen (P o 1 i c a r d und O k k e l s 32, U o t i l a und J ä ä s k e l a i n e n 37). Die Einbettung erfolgt über abs. Alkohol und Benzol in Paraffin. Schnittdicke 3—5 ju. Beim Aufziehen der Paraffinschnitte ist Eiweißglyzerin wegen seines Aschengehaltes zu vermeiden, ebenso dest. Wasser u. dgl., da dadurch Verluste an anorganischer Substanz eintreten können. O k k e l s verwendet daher zum Strekken der Schnitte leicht angewärmtes Paraffinöl, dessen Überschuß nach erfolgter Streckung vom Objektträger abgesaugt wird. Das Paraffin der Schnitte wird vor der Veraschung nicht beseitigt. 1194. Gefrierschnitte von fixiertem Material werden in Petroleum aufgefangen und aus diesem auf den Objektträger gezogen ( H a c k m a n n 33). 1195. Schnitte, namentlich Nativpräparate von lipoidreichen Organen (Gehirn, Nebenniere) sollen vor der Veraschung 3—5 Stunden in wasserfreiem Äther extrahiert werden ( S c h e i d 30), doch kommt es dabei leicht zu Substanzverlust. A11 a r a (37) hält die Extraktion bei genauer Beachtung der richtigen Temperaturhöhe und Veraschungsdauer für entbehrlich. 1196. Die V e r a s c h u n g wird in einem elektrisch geheizten Quarzröhrenofen vorgenommen, dessen Temperatur durch ein mit Galvanometer verbundenes Thermoelement registriert und durch einen Gleitwiderstand geregelt wird (Appa-

§ 1197—1200.

Histochemische Methoden (anorganisch)

281

ratur erhältlich bei der Firma C. Gerhard, Bonn). Die Verkohlung erfolgt im Stickstoffstrom, in dem mehr Asche bleibt, als in dem von T s c h o p p - empfohlenen Sauerstoffstrom. Die Steigerung der Temperatur soll langsam erfolgen, weil es bei zu rascher Erhitzung zu stärkerer Bildung von teerartigen Tropfen kommt, die aus dem Gewebe hervorquellen und zu Verlagerung von anorganischen Substanzen führen können. Bei Erreichung der Veraschungstemperatur von 500—530° wird die Stickstoffzufuhr abgestellt und der Ofen etwas geöffnet; es erfolgt dann die Oxydation der Kohle durch den Sauerstoff der hindurchströmenden Luft in wenigen Minuten. Höhere Temperaturen als die angegebenen sind für gewöhnlich zu vermeiden, da dabei durch Verdampfen eine erhebliche Verminderung der Aschenmenge eintreten kann. Richtig veraschte Präparate dürfen keine Kohleteilchen mehr enthalten. 1197. Die B e t r a c h t u n g und Au s w e r t u n g der Aschenbilder soll sofort nach der Herstellung erfolgen, weil dieselben schnell an Schärfe und Klarheit verlieren, da ein Teil der Aschenbestandtile sehr hygroskopisch ist. »Lediglich die Aufbewahrung im Exsikkator oder besser noch im Trockenschrank bei 60—80° ermöglicht ein Aufbewahren der Präparate.« ( S c h u l t z - B r a u n s . ) Für spätere Untersuchung werden die Präparate nur mit einem Deckglas bedeckt und mit Paraffin umrandet. Dabei wird durch eine dünne Paraffinschicht zwischen Deckglasrand und Objektträger vermieden, daß das Deckglas auf die Asche drückt. Einschluß in irgendein Medium hat sich als unzweckmäßig erwiesen. 1198. Die Untersuchung der Aschenpräparate erfolgt vorwiegend im Dunkelfeld oder im Auflicht (Ultropack od. dgl.) auf schwarzem Untergrund. Für genaue quantitative Untersuchungen konstruierte S c h u l t z - B r a u n s eine besondere Beleuchtungsvorrichtung, die auch eine quatitativ-photographische Darstellung der Aschenbilder gestattet. Neuerdings werden hiefür auch photoelektrische Meßinstrumente gebraucht (z. B. von S c o t t 33). 1199. Bei der Veraschung bleiben von den in den Geweben vorhandenen Salzen als solche zurück: NaCl, KCl, Ca 2 (P0 4 ) 3 , Mg 3 (P0 4 ) 2 und Fe 2 0 3 . Die sauren Carbonate des .Natriums und Calciums werden in neutrale Carbonate übergeführt, aus welchen bei höherer Temperatur CO2 abgespalten wird, so daß aus den so entstandenen und den schon früher vorhandenen neutralen Carbonaten nur Na 2 0, CaO und MgO zurückbleiben. Während die neutralen Phosphate des Calciums und Magnesiums (Ca 3 [P0 4 ] 2 , Mg 3 [P0 4 ] 2 ) weitgehend hitzebeständig sind, wird aus dem sekundären Kaliumphosphat (K 2 HP0 4 ) Kaliumpyrophosphat K 4 P 2 0 7 . Schließlich können noch aus der Verbrennung organischer Substanzen S 0 2 und Pyrophosphate und aus dem Hämoglobin Eisenoxyd (F 2 0 3 ) entstehen (H e n c k e 1). Eingehende Angaben über Herstellung und Untersuchung von Aschenpräparaten bei P o 1 i c a r d (29), T s c h o p p (29), S c h u l t z - B r a u n s (31), P o 1 i c a r d und O k k e l s (32), S c o t t (34) und namentlich bei H i n t z s c h e (38). 2. Nachweis von Eisen 1200. Die üblichen in § 1204—1207 angegebenen Methoden bringen nur das ionisierte oder leicht ionisierbare Eisen zur Darstellung, während sie das oft noch reichlicher vorhandene, gebundene Eisen ungefärbt lassen. Die Versuche, auch dieses »maskierte« oder »okkulte« Eisen durch Demaskierung (§ 1208 bis 1212) dem Nachweis zugänglich zu machen, hatten bis jetzt nur teilweisen Erfolg. Die einzige Methode, die mit Sicherheit das Gesamteisen des Schnittes zur Darstellung bringt, ist nach L i s o n (36) die Schnittveraschung, bei der die eisenhaltigen Aschenteile durch ihre rötliche bis gelbliche Färbung charakterisiert sind. Die Methode ist streng spezifisch, da unter den Aschen des Gewebes das Eisenoxyd die einzige gefärbte Substanz ist. Erfassungsgrenze nach P o l i c a r d 3,75X10~7y.

282

Untersuchung der Zelle

§ 1201—1205.

1 2 0 1 . Bei Ausführung der Reaktionen ist zu beachten, daß sämtliche mit den Präparaten in Berührung kommenden Flüssigkeiten eisenfrei sein müssen, insbesondere auch das zum Auswaschen benützte dest. Wasser. Die Gläser sind durch sorgfältiges Putzen mit warmer Salzsäure, Wasser und Alkohol von Eisenspuren zu reinigen. Metallspatel, Eisennadeln u. dgl. sind durch gläserne zu ersetzen. Sehr beachtenswert ist die Feststellung, daß Gewebebestandteile die Fähigkeit besitzen, geringste in den einwirkenden Lösungen vorhandene Eisenspuren an sich zu reißen und zu konzentrieren ( R i c h t e r 22). In strittigen Fällen ist daran zu denken, daß auch durch das Mikrotom- oder Rasiermesser (namentlich nach frischem Abziehen) Eisenspuren in das Gewebe gelangen können.

1202. F i x i e r u n g . Die Präparate sollen möglichst lebensfrisch fixiert werden, da bei Autolyse eisenhaltige Verbindungen in Lösung gehen und andere Teile durchtränken können. Zur Fixierung wird meist absoluter Alkohol empfohlen. Nach den Feststellungen von N i s h i m u r a , H u e c k u. a. ist aber auch neutrales Formol zulässig; doch wird man die Einwirkung mit Rücksicht auf die Beobachtungen von S p a t z (23) auf 1—2 Tage beschränken und das Material rasch verarbeiten. L i s ó n (36) vollends fand, daß das- Eisen histologisch wie histochemisch am besten durch die Flüssigkeiten von Bouin oder Bouin-Hollande (§ 309) fixiert wird. Nach G r y n f e l t t und C r i s t o 1 sind im Gegensatz zu älteren Angaben sogar die Flüssigkeiten von Regaud oder Helly anwendbar, wenn die Schnitte mit einer Lösung von Bleinitrat behandelt werden. 1203. Die Präparate können auf dem Gefriermikrotom geschnitten werden (unfixiert nach § 520 ff.) oder in Paraffin oder Celloidin eingebettet werden. Im letzteren Fall ist zu berücksichtigen, daß Äther manche eisenhaltige Verbindungen lösen und im Gewebe verschleppen kann. 1204. D i e g e b r ä u c h l i c h s t e m i k r o c h e m i s c h e Reaktion auf E i s e n ist die T u r n b ü l l b l a u m e t h o d e n a c h T i r m a n n und . S c h m e l z e r . Durch sie wird das gesamte ionisierté Eisen zur Darstellung gebracht. Die Methode ist sehr empfindlich, sehr sicher, völlig spezifisch und gibt haltbare Präparate. A u s f ü h r u n g : Die Schnitte kommen aus dest. Wasser für 1—24 .Stunden in eine 10°/oige Ammoniumsulfidlösung (»gelb« Kahlbaum). Dann sorgfältiges Abspülen in dest. Wasser und übertragen in eine frischbereitete Mischung von 20°/oiger Ferricyankaliumlösung und l°/oiger Salzsäure zu gleichen Teilen für 10—20 Minuten. Dann sorgfältiges Abspülen in dest. Wasser, Kernfärbung mit Paracarmin (§ 643) oder Kernechtrot (§ 743). Ergebnis: Eisen leuchtend blau, Kerne rot. Die Schwefelammoniumlösung soll rein gelb gefärbt sein. Sie darf also nicht älter als drei Wochen sein und nicht offen an der Luft gestanden haben, wobei sie bräunlich-gelb und unwirksam wird. Durch das Ammoniumsulfid werden die Verbindungen mit dreiwertigem Eisen, die mit Ferricyankalium nicht reagieren würden, in Schwefeleisen übergeführt, das dann in Turnbullblau übergeht. Ohne die Vorbehandlung würden nur die spärlich vorhandenen Verbindungen mit zweiwertigem Eisen reagieren.

1205. Die B e r l i n e r b l a u r e a k t i o n wird am besten nach den Angaben von W i c k l e i n - F a l k e n b e r g ausgeführt. Darnach kommen die Schnitte aus dest. Wasser für 30—60 Min. in eine frisch bereitete Mischung von 25 ccm l°/oiger Salzsäure und 8—10 Tropfen einer frisch angesetzten 2°/oigen Ferrocyankaliumlösung. Hierauf sehr sorgfältig Auswaschen mit dest. Wasser und Kernfärbung mit Kernechtrot und Paracarmin (nicht Lithioncarmin) usw.

§ 1206—1210.

Histochemische Methoden (anorganisch)

283

Die Methode ist insofern unsicherer als die in § 1204 angegebene, als durch zu konzentrierte oder zu lange einwirkende Salzsäure aus dem Blutlaugensalz allein schon die sog. Eisenblausäure und daraus unter dem Einfluß des Luftsauerstoffes Berlinerblau entstehen kann. Letzteres kann sich dann in Form feiner Flocken im Präparat niederschlagen und zu Täuschungen Veranlassung geben. 1206. Da die Beschaffung von eisenfreier Salzsäure schwierig ist und außerdem das Gewebseisen bei Einwirkung der Säurelösung in lösliche Form übergehen kann, wodurch eine Diffusion in die Umgebung möglich wird, so empfiehlt L i e s e g a n g (23) die Säure nur in Dampfform einwirken zu lassen. Man stellt den Schnitt "zuerst 20—30 Min. in eine frisch bereitete 2°/oige Ferrocyankaliumlösung und legt ihn dann über ein Becherglas, dessen Boden mit Salzsäure bedeckt ist, deren Eisengehalt nun gleichgültig ist. Das Ganze wird mit einer Glasglocke überdeckt. Im Laufe einiger Stunden färbt sich das Eisen blau, allenfalls vorhandenes Kupfer braun. 1207. E i s e n n a c h w e i s i m S ' t ü c k nach T a r t a k o w s k y . Kleine Gewebsstücke werden in einem Gemisch von 95 Teilen 70°/oigen Alkohol und 5 Teilen Schwefelammonium 24 Stunden fixiert und ebenso lang in absol. Alkohol, dem einige Tropfen Ammoniumsulfid zugesetzt sind, übertragen. Nach oberflächlichem Abspülen mit dest. Wasser Einlegen in eine l,5°/oige Ferrocyankaliümlösung 30Min. und für 10 Min. in eine 0,45°/oige Salzsäurelösung. Zuletzt gründlich wässern in dest. Wasser und Einbetten in Paraffin. Die Methode wird von H i r s c h und B r e t s c h n e i d e r (38) sehr empfohlen. 1208. N a c h w e i s v o n o k k u l t e m E i s e n . Zur D e m a s k i e r t f n g von gebundenem Eisen wurden namentlich von M a c a l l u n i und von K o c k e l Methoden angegeben; sie sollen dasselbe mehr oder weniger vollständig in die ionisierte Form überführen und damit den Nachweis zugänglich machen. Der Wert der Methoden wurde stark bestritten (vgl. Z a c h a r i a s 09, H u e c k 12, W i e n e r 16, s. aber auch L i s o n 36). 1209. D e m a s k i e r u n g nach M a c a l l u m (12). a) Die Schnitte oder Zupfpräparate werden für 2—14 Tage bei 50—60° C in saures Ammoniumsulfid + Glyzerin eingelegt; oder b) die Präparate kommen für V2 bis mehrere Stunden in ein Gemisch von 96 Teilen 90°/oigem Alkohol und 4 Teilen konz. Schwefelsäure. Nach Abspülen w i r d einer der oben angegebenen Eisennachweise ausgeführt. Zur Herstellung des sauren Ammoniumsulfids leitet man in eine Ammoniaklösung (Dichte 0,96) so lange Schwefelwasserstoff, bis der Ammoniakgeruch verschwunden ist und H2S-Geruch auftritt (stets frisch herzustellen). Man gibt 1 Tropfen davon zu 1 Tropfen Glyzerin + dest. Wasser (53). Nach L i s o n (36) vermögen die Methoden von Macallum das okkulte Eisen einzelner Verbindungen, wie z. B. in den eisenhaltigen Pigmenten blutbildender Organe zu demaskieren; in der Mehrzahl der Fälle z. B. beim Hämoglobin versagen sie vollständig. Da der positive Ausfall der Reaktion oft darauf zurückzuführen ist, daß die Reagenzien mit Eisenspuren verunreinigt sind, müssen die erhaltenen Ergebnisse mit größter Kritik gedeutet werden. 1210. D e m a s k i e r u n g und E i s e n n a c h w e i s nach K o c k e l (30). Fixierung in Alkohol oder Formol. Gefrier- oder Paraffinschnitte kommen zuerst in absol. Alkohol und dann zur Demaskierung für 20 Min. in Tetrachlorkohlenstoff, der mit gasförmigem Chlor gesättigt ist. Hierauf werden die Schnitte mit Glasstäbchen und Objektträger herausgefischt und das völlige Verdampfen von Tetrachlorkohlenstoff und Chlor abgewartet. Auch diese Methode vermag das gebundene Eisen nur teilweise zu demaskieren, so versagt sie z. B. bei Erythrocyten (L i s o n). Zum . E i s e n n a c h w e i s wird dann unmittelbar darauf das den Schnitt

284

Untersuchung der Zelle

§ 1211—1213.

tragende Deckglas oder Tragglas mit der Schichtseite nach unten auf ein Blockschälchen gelegt, auf dessen Boden sich ca. 0,5 g Rhodankalium befindet. Hierauf w i r d mit einer Pipette vorsichtig 0,5 ccm Salzsäure zugesetzt, und das Ganze mit einer Glasglocke überdeckt. Durch den sich rasch entwickelnden Rhodanwasserstoff werden schon nach kurzer Zeit die eisenhaltigen Stellen unter Bildung von Rhodaneisen stark rot gefärbt. — Sofortiger Einschluß in Glyzerin und sofortige Untersuchung, da die Färbung schon nach einigen M i nuten abzublassen beginnt. Da R h o d a n w a ss e r s t o f f g a s sehr g i f t i g ist, muß die R e a k t i o n u n t e r e i n e m g u t e n A b z u g oder im F r e i e n vorgenommen werden. Der Vorteil der Rhodanprobe ist eine wesentliche Steigerung der Empfindlichkeit der Reaktion. Wenn man, um Dauerpräparate zu bekommen, auf diesen Vorteil verzichten will, kann man nach der Demaskierung auch nach § 1204 oder 1205 'verfahren. 1211. R h o d a n p r o b e nach S c h m e l z e r . Der zu prüfende Celloidinschnitt wird durch absol. Alkohol und Xylol in Paraffinöl gebracht, auf einen kleinen Glimmerstreifen gezogen und mit Filtrierpapier angedrückt. Als Reaktionsraum dient ein starkwandiges Probierröhrchen von 7 cm Länge und 1,5 cm Weite, das mit einem gut sitzenden Kork verschlossen wird. Der Glimmerstreifen wird in einen Einschnitt des Korkes festgeklemmt. Auf den Boden des Röhrchens kommt 0,5 g feinverteiltes Rhodankalium und mit Pipette 0,5 ccm Schwefelsäure, worauf sofort ohne Neigen der Kork aufgesetzt wird und das Röhrchen in eine mit feuchter Watte ausgelegte Blechdose gestellt wird. Nach 20 Min. wird der Glimmerstreifen unter Vorsicht herausgenommen, Schichtseite nach oben in ein Glasschälchen gelegt, sofort mit ein paar Tropfen Paraffinöl bedeckt und das Schälchen verschlossen. Nach einigen Minuten wird das objekttragende Ende des Glimmerstreifens abgeschnitten und in Paraffinöl eingedeckt. Schmelzer gibt als Vorzug streng lokalisierte Reaktion und mehrwöchige Dauerhaftigkeit des Präparates an. 1212. O k a m o t o (37) demaskiert in einem Gemisch aus naszierendem Sauerstoff und Chlor. Fixierung in abs. Alkohol. Paraffinschnitte davon kommen in X y l o l und abs. Alkohol und werden dann in der L u f t getrocknet. Zur Entwicklung des Gases löst man 30—40 g Ammoniumpersulfat (Merck) in 100 ccm 5°/oiger Kochsalzlösung und setzt eine kleine Menge Schwefelsäure zu. Die stets frisch zu bereitende Lösung wird im Wärmeschrank bei 30° C gehalten. Zur Demaskierung werden 60—70 ccm der Flüssigkeit in einen gewöhnlichen Färbetrog gegossen und der Objektträger mit der Schichtseite nach unten horizontal dicht über den Flüssigkeitsspiegel gelegt; dann wird die Schale mit einer Glasplatte bedeckt und für 12—24 Stunden im Wärmeschrank belassen, bis ein auf den Objektträger gelegtes blaues Lackmusstreifchen gerötet oder entfärbt ist. Daran anschließend Eisenreaktion nach § 1204 oder 1205, evtl. noch Gegenfärbung mit Eosin. Nach O. läßt sich auf diese Weise auch das im K e r n enthaltene Eisen deutlich darstellen. Positiven Ausfall erhielt O. u. a. in den Kernen von Blutzellen, ferner von Milz, Leber, Knochenmark, Herzmuskel, Lunge, Nebenniere. Bei den Kernen anderer Gewebe (glatte Muskelzellen, reife Spermien, Eizellen, geschichtetes Plattenepithel, Nervenzellen) fiel die Reaktion dagegen negativ aus. 1213. Der Eisennachweis im S p o d o g r a m erfolgt nach § 1204 in der Weise, daß man ein Deckglas auflegt und die Reagenzien vom Rand her zutreten läßt. Die maximale Blaufärbung tritt erst nach etwa 12—15 Stunden nach dem Salzsäurezusatz ein ( M e i t z e r 36).

§ 1214—1216.

Histochemische Methoden (anorganisch)

285

3. Nachweis von Kalium

1214. M a c a l l u m benützt dazu die Eigenschaft des Kobaltnitrifs, mit Kalium einen orangegelben Niederschlag zu geben. Herstellung des Reagens: 20 g Kobaltnitrit und 35 g chemisch reines Natriumnitrit werden in 75 ccm verdünnter Essigsäure (10 ccm Eisessig auf 65 ccm dest. Wasser) gelöst. Nach einigen Stunden wird filtriert und auf 100 ccm aufgefüllt. Aufbewahren im Eisschrank. N a c h w e i s : Die mit unterkühltem Messer nach § 521 f. hergestellten Gefrierschnitte frischer Organe werden n o c h i n g e f r o r e n e m Z u s t a n d (um eine Verlagerung des Kaliums durch Diffusion zu verhindern) in das Reagens gebracht. Nach '/a bis mehreren Stunden wird das Reagens abgesaugt und durch eisgekühltes Wasser ersetzt, das nach etwa 3 Minuten erneuert wird. Dies wird in 20 Min. 5—6mal wiederholt. Dann breitet man den Schnitt auf dem Objektträger flach aus. Da die orangerote Färbung in geringen Mengen schwer sichtbar ist, führt man sie in eine schwarze über. Man bedeckt dazu mit einem Tropfen GlyzerinAmmoniumsulfid (s. § 1209). Spermatozoen oder einzelne Zellen rührt man 30 Min. mit dem dreifachen Volumen des Reagens an, dann mehrmaliges Auswaschen mit eisgekühltem Wasser (mit Hilfe der Zentrifuge oder auf Filtern mit Saugpumpe), Glyzerin-Ammoniumsulfid usw. B o z 1 e r (25) verwendet an Stelle des unbeständigen Kobaltnitrits das beständigere Kobaltnitrat. Auch gegen diese Reaktion Macallums wurden Bedenken vorgebracht (s. L i e s e g a n g 14, L i s o n , C a r e r e - C o m e s ) . Eine Fixierung der Organe in absol. Alkohol ist nicht möglich, da dieser erhebliche Mengen von Kalium (34—36°/o, S c h e i d ) zu lösen vermag. Die gleiche Reaktion wie Kalium geben im Tierkörper Ammonium und Kreatin (Trennung durch Vergleichsreaktion am Aschenbild, bei dem nur Kalium übrigbleibt).

1215. K a l i u m n a c h w e i s mit S i e n a - O r a n g e lösung. CarereC o m e s (38) benutzt die Eigenschaft des Natriumparadipicrylamins in Gegenw a r t von Kalium einen feinen kristallinischen orangeroten Niederschlag zu geben. Die Reaktion ist spezifisch f ü r Kalium, selbst bei Anwesenheit der Elemente der 4. und 5. Gruppe, mit Ausnahme von Rubidium und Caesium. Ammonium gibt eine positive Reaktion nur, wenn es in großer Menge vorhanden ist. Die wässerige Lösung des Reagens ist als »Siena-Orangelösung« bei flollborn erhältlich. Ausführung der Reaktion: 1. Fixierung in neutralem Formol. Paraffineinbettung, Entparaffinieren der Schnitte, Alkoholreihe, dest. Wasser. — 2. Überschichten mit Siena-Orangelösung 2 Min. — 3. 10°/oige Lösung von konz. Salzsäure (spez. Gew. 1,19) 3 Min. — 4. Auswaschen in 2mal gewechseltem dest. Wasser 10 Min. — 5. Abtrocknen mit Filtrierpapier. Einschluß in eingedicktem Cedernöl. — Ergebnis: Kalireiches Gewebe, orange, alles übrige ungefärbt oder blaßgelb. — Die Spezifität der Reaktion wird bestritten. Die Reaktion läßt sich auch zur elektiven Färbung von Gewebebestandteile verwenden, die wie Erythrocyten, Muskelfasern, epidermoidale Gebilde besonders kaliumreich sind. Näheres s. § 1417 und § 1731. 4. Nachweis von Calcium

1216. Calcium kann im Organismus gelöst als Chlorid, Sulfat oder Laktat, ferner ungelöst, aber ionisiert oder ionisierbar als Carbonat oder Phosphat auftreten. Dazu kommt noch das sog. maskierte Calcium. Für alle diese Erscheinungsformen wurden histochemische Nachweismethoden angegeben, die jedoch, wie die ausgezeichnete Darstellung von L i s o n (36) zeigt, nur zum klei-

286

Untersuchung der Zelle

§ 1217—1220.

nen Teil der K r i t i k standhalten. Nachfolgend seien die gebräuchlichsten dieser Methoden a n g e f ü h r t . 1217. F ä l l u n g d e s g e l ö s t e n C a l c i u m s a l s O x a l a t . Zum Nachweis einer Anreicherung von g e l ö s t e m Kalk im ossifizierendem Gewebe fixiert R a b 1 (23) die betreffenden Gewebsstücke in einem Gemisch aus gleichen Teilen einer 4°/oigen Ammoniumoxalatlösung und neutralisiertem Formol (1 :4) oder besser nur in einer kalt gesättigten Ammoniumoxalatlösung mit etwas Toluolzusatz (gegen Fäulnis). Die mit gelöstem Kalk durchtränkten Stellen sind dann am Auftreten charakteristischer monokliner Calciumoxalatkristalle erkenntlich. Der abgelagerte phosphor- und kohlensaure Kalk bleibt nach R a b 1 vom Reagens unberührt; um ihn zu entfernen und dadurch das Gewebe schneidbar zu machen, entkalkt R a b 1 die, mit dem Reagens behandelten Stücke nach gründlichem Auswaschen des überschüssigen Ammoniumoxalats mit Essig- oder Phosphorsäure unter Zusatz von etwas Formol. F r e u d e n b e r g (26) hält es für unmöglich, mit Hilfe dieser Methode in Gewebsstücken den gelösten Kalk vom niedergeschlagenen zu trennen, da durch längere Einwirkung einer gesättigten neutralen Oxalatlösung auch eine Umsetzung von bereits niedergeschlagenem Kalk in Calciumoxalat bewirkt wird (s. dazu auch' R a b 1 26). Auch L i s o n bezweifelt den histochemischen Wert der Methode. 1218. N a c h w e i s v o n i o n i s i e r t e m o d e r i o n i s i e r b a r e m C a l c i u m . Sehr sicher ist der histochemische Nachweis von Calcium in F o r m v o n G i p s k r i s t a l l e n (Calciumsulfat). Man bedeckt dazu den auf d e m O b j e k t t r ä g e r in 40°/oigem Alkohol liegenden Schnitt mit einem T r o p f e n einer 3°/oigen Schwefelsäure. Bei A n w e s e n h e i t von Calcium t r e t e n kurz darauf die typischen Gipskristalle auf. D e r Nachteil der Methode ist, daß sich durch sie wohl das Vorhandensein, nicht aber die Lokalisation des Calciums e r k e n n e n läßt. 1219. Ein lokalisierter Nachweis des Calciums gelingt durch L a c k b i l d u n g mit A l i z a r i n u n d seinen Derivaten, wie in der P u r p u r i n m e t h o d e von G r a n d i s u n d M a i n i n i (00). 1. G e f r i e r - oder P a r a f f i n schnitte von f r i s c h e m oder alkoholfixiertem M a t e r i a l k o m m e n in eine gesätt. wässerige P u r p u r i n l ö s u n g , bis sie stark rot g e f ä r b t sind (5—10 Min.). — 2. Ü b e r t r a g e n in 0,75°/oige Kochsalzlösung 3 Min. — 3. Auswaschen in 70%igem A l kohol, bis keine F a r b e m e h r abgeht. — 4. Absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Calciumhaltiges Gewebe p u r p u r r o t . Die Reaktion f ä l l t n u r bei Anwesenheit von reichlichem Calcium positiv aus, ist in diesem F a l l e aber als einfach u n d sicher sehr zu empfehlen. F ü r den Nachweis von Calcium im Zellprotoplasma ist sie dagegen zu unempfindlich. Z u beachten ist, daß auch Erdalkalien, Eisen u n d a n d e r e Schwermetalle m i t Alizarinen Lacke bilden können. I h r Vorhandensein ist also im Zweifelsfall auszuschließen. 1220. Methode von C r é t i n (24) mit G a l l u s s ä u r e - F o r m o l . Herstellung des Reagens: 2 Teile Gallussäure u n d 1 Teil T r i o x y m e t h y l e n w e r d e n i m Mörser fein verrieben. U n m i t t e l b a r vor G e b r a u c h übergießt m a n 0,25 g des Gemisches mit 5 ccm k o c h e n d e m dest. Wasser u n d f ü g t zur Lösung t r o p f e n weise 0,5 ccm A m m o n i a k von 18° Bé (Vorsicht, spritzt stark!)- Dann b e w e g t m a n das Gläschen h i n u n d her, bis die zuerst rote Flüssigkeit strohgelb u n d damit g e b r a u c h s f e r t i g g e w o r d e n ist. Die Lösung ist n u r k u r z e Zeit h a l t b a r . B r a u n e oder rötliche Lösungen sind u n b r a u c h b a r . Ausführung der Reaktion: M a n t r o p f t eine kleine Menge des noch l a u w a r m e n Reagens auf den in Xylol e n t p a r a f f i n i e r t e n u n d mit Chloroform gewaschenen Schnitt, schleudert nach 10—15 S e k u n d e n den Überschuß ab u n d l ä ß t das P r ä p a r a t an der L u f t liegen, bis sich die k a l k h a l t i g e n Teile in c h a r a k -

§ 1221—1224.

Histochemische Methoden (anorganisch)

287

teristischer Weise gebläut haben. Hierauf wird das P r ä p a r a t mit gesätt. wässeriger Losung von Calciumsulfat gewaschen und dann zur Gegenfärbung in eine Eosinlösung gebracht, der auf 100 ccm 5 ccm Ammoniak zugesetzt sind. Dann rasch Abwaschen in Formol 10 :100; absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Calcium blau, alles übrige rot. Die Reaktion ist sehr empfindlich und nach L i s o n eine der besten histochemischen Calciumreaktionen. C r é t i n konnte mit ihr sogar das in den K e r n e n vorhandene Calcium nachweisen. Die blaue F a r b e ist spezifisch f ü r Calcium. B a r y u m u n d S t r o n t i u m geben grüne, Silicium gelbe, Eisen b r a u n violette, Magnesium rosa Farblacke. Die Empfindlichkeit der Reaktion ist aber bei letzteren Metallen viel geringer. Als nachteilig hebt L i s o n hervor, daß die Reaktion o f t erst nach einigem Probieren gelingt und daß zarte Schnitte durch die stark alkalische Reaktion des Reagens beschädigt oder abgelöst w e r den können. 1221. Die Methode von M a c a l l u m (Calciumnachweis durch Behandlung mit Schwefelsäure und Bleiacetat) ist nach L i s o n ohne histochemischen Wert. 1222. Die f ü r den Nachweis von C a l c i u m p h o s p h a t angegebenen Methoden von K o s s a , G ö m ö r i , R o e h l , S t o e l t z n e r u. a. stellen keine spezifischen histochemischen Reaktionen dar. Sie werden, da sie in erster Linie f ü r morphologische Untersuchungen von Bedeutung sind, später bei den Methoden zur Untersuchung des Knochengewebes dargestellt (s. § 1636 ff.). 1223. Das m a s k i e r t e C a l c i u m k a n n bis jetzt n u r zusammen mit den übrigen Ca durch Veraschen als CaO sichtbar gemacht werden. Nach S c h u l t z - B r a u n s läßt sich die Calciumasche von der übrigen Asche dadurch abtrennen, daß man zunächst das CaO durch Anhauchen in wasserunlösliches CaCC>3 überführt, dann das Aschenpräparat 2—3 Min. lang vorsichtig mit warmem Wasser (50° C) extrahiert und dann trocknet. Leider bestehen auch bei diesem Verfahren, wie S c o t t (33) darlegte, eine Reihe von Fehlerquellen. 5. Nachweis von Kupfer 1224. Kupfernachweis nach O k a m o t o und U t a m u r a (38). Fixierung möglichst frisch am besten in abs. Alkohol (auch neutrales Formol ist b r a u c h bar). Paraffin-, Celloidin- oder Gefrierschnitte kommen f ü r 12—24 Stunden bei 36° C in das gut verschlossene Reagens (s. u.). Dann Abspülen mit dest. Wasser, K e r n f ä r b u n g mit Carmalaun, Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Kupferhaltige Verbindungen' grünlich, schwarze Granula. Als Reagens dient R u b e a n w a s s e r s t o f f s ä u r e (von Schuchardt, Chem. Fabrik, Görlitz). Man bereitet eine haltbare Stammlösung durch Lösen von 0,1 g R. in 100 ccm abs. Alkohol. Unmittelbar vor Gebrauch mischt man 2—5 ccm der Stammlösung mit 100 ccm einer 10°/oigen wässerigen Natriumacetatlösung. — Erfassungsgrenze 0,0006 7 Cu. Mit Ag und Hg gibt das Reagens schwarzen, mit Ni blauvioletten, mit Co gelbbraunen Niederschlag. Bei einer 2. Methodé w i r d das Reagens p - D i m e t h y l a m i n o b e n z y l i d e n r h o d a n i n verwendet. Zur Reaktion v e r d ü n n t man 3 ccm der h a l t b a r e n gesätt. alkoholischen Lösung mit 100 ccm dest. Wasser. A u s f ü h r u n g der Reaktion wie bei der 1. Methode, Gegenfärbung aber mit Hämalaun oder Wasserblau. — Ergebnis: K u p f e r rotviolett-rotbraun. Bei dieser 2. Methode ist das Vorliegen von Pd, Pr, Au, Ag, Hg durch ein Parallelpräparat, bei dem das Reagens mit 1—4 c c m n-Salpetersäure und 25 ccm einer 3°/oigen H20.2-lösung versetzt wird, auszuschließen. In dieser sauren Lösung reagieren die Kupferverbindüngen nicht.

288

Untersuchung der Zelle

§ 1225—1231.

6. Nachweis von Blei, Gold, Wismut 1225. Nachweis von B l e i nach F r a n k e n b e r g e r (21) u n d C r é t i n (29). Fixierung in Kaliumbichromat-Formol nach Regaud. Dabei werden Bleisalze als unlösliches gelbes Bleichi'omat niedergeschlagen, das sehr leicht erkennbar ist. Die Methode verbindet nach L i s o n gute Spezifität mit tadelloser Fixierung. 1226. Nachweis von G o l d nach B o r c h a r d t - M i c h a e l i s (30). Fixierung in abs. Alkohol oder Formol. Die Schnitte werden f ü r 15 Min. auf d e m kochenden Wasserbad oder f ü r 12—24 Stunden bei 40° C in eine 5°/oige Silbernitratlösung gebracht. Hierauf k o m m e n sie zur Beseitigung des Silberniederschlages in 20°/oige Salpetersäure. Das Gold bleibt in F o r m von schwarzen Körnchen erhalten. P r ü f u n g auf Löslichkeit in KCN! 1227. Nachweis von G o l d nach O k a m o t o , A k a g i und M i k a m i (38). Fixierung in abs. Alkohol oder neutralem Formol. Paraffin-, Celloidin- oder G e f r i e r schnitte kommen f ü r 24 Stunden bei 36° C in folgendes Reagens: p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin, gesätt. Lösung in abs. Alkohol 10—20 ccm, n - H N 0 3 1—3 ccm, H 2 0 2 30/oig 5—10 ccm, dest. Wasser 100 ccm. Dann Abspülen in dest. Wasser, evtl. Gegenfärbung in Hämalaun. Alkohol, Xylol, Balsam. Goldverbindungen als violett- bis braunrote Granula sichtbar. Über A b t r e n n u n g gegen Ag, Hg, P t und Pd s. Original. Zu beachten ist, daß sich auf diese Weise nur ionisiertes Gold nachweisen läßt. 1228. Nachweis von Q u e c k s i l b e r nach B r a n d i n o (27). Fixierung in F o r mol oder Alkohol. Die Schnitte kommen in eine l°/oige Lösung von Diphenylcarbazid. Das Quecksilber bildet einen violetten Niederschlag. 1229. U r a n s a l z e f ä r b e n sich nach G é r a r d u n d C o r d i e r (32) bei A u s f ü h r u n g der Berlinerblaureaktion (§ 1205) braun. 1230. Nachweis von W i s m u t nach C h r i s t e l l e r (26) u n d K o m a j a (25). 1. Fixierung in Formol. — 2. Gefrierschnitte davon kommen f ü r 1 Minute in das Reagens von K o m a j a. (a. 1 g Chininsulfat in 50 ccm dest. Wasser; tropfenweiser Zusatz von officin. Salpetersäure, bis gelöst [ca. 10 Tropfen nötig]. — b. 2 g J o d kali in 50 ccm dest. Wasser. — Vor Gebrauch vereinigt m a n je 5 ccm a und b, f ü g t 2 Tropfen officin. Salpetersäure zu u n d filtriert.) — 3. Ganz kurz abspülen in dest. Wasser 10 ccm, officin. Salpetersäure 2 Tropfen. — 4. Aufziehen auf Objektträger, Abtrocknen u n d vorsichtig erwärmen. Carbolxylol-Alkohol (5 :5 :2), Carbolxylol-Balsam. Ergebnis: Wismut tiefgelb-braun. — Vorfärbung mit Gentianaviolettlösung möglich. 1231. Bei eindeutigen Verhältnissen leistet f ü r den Nachweis von Metallen eine von T i m m (32, 36) angegebene Methode gute Dienste. Fixierung in abs. Alkohol, Einbettung in Paraffin wie gewöhnlich. Die Schnitte werden mit Xylol entparaffiniert u n d dann in Brombenzol (D = 1,56) gebracht und in Brombenzol-Kanadabalsam eingedeckt. Dadurch wird erreicht, daß das Gewebe bei nachfolgender Betrachtung im Dunkelfeld unsichtbar ist, w ä h r e n d die abgelagerten Metallteilchen als hellaufleuchtende Körnchen hervortreten (Nachweis im sog. optisch leeren Schnitt). Auf diese Weise lassen sich z. B. nach Sublimatvergiftung die in den Zellen usw. abgelagerten Hg-Teilchen sichtbar machen. Um die Orientierung zu erleichtern, k a n n m a n die Schnitte mit Hämalaun färben, wodurch die Kerne im Dunkelfeld rötlich hervortreten. F ü r den B l e i n a c h w e i s im Knochen fixiert T i m m dünne Knochenscheiben in mit H 2 S gesättigtem Alkohol (oder Formol, S i e b e r 36). Der sehr leicht eindringende H 2 S soll bewirken, daß sich die schwer löslichen Sulfide wirklich am natürlichen Ort des Metallvorkommens bilden. Hierauf wird in mit H 2 S gesätt. 30°/oiger Natriumsulfatlösung und mit H 2 S gesätt. dest. Wasser säurefrei gewaschen u n d auf d e m Gefriermikrotom geschnitten. Die Schnitte w e r d e n wie oben eingedeckt u n d untersucht. Die Methode ist s e h r empfindlich, sie gestattet nach T i m m noch den Nachweis von 0,4—4 F Blei (1 Digamma = 10"12 g). Sie ist aber andererseits nicht spezifisch,

§ 1232—1234.

Histochemische Methoden (organisch)

289

da mit H 2 S natürlich auch eine Reihe anderer Metalle reagieren kann. Beim Knochen sind vor allem Fe, Cu und St auszuschließen. Fe-Sulfid wird durch die Ameisensäure beim Entkalken ausgelöst, Cu-Sulfid kann in Kaliumcyanidlösung, St-sulfid in gelbem Schwefelammonium gelöst und entfernt werden, während das Pb-sulfld dabei ungelöst zurückbleibt. So muß die Methode den jeweiligen Erfordernissen entsprechend ergänzt werden. 1232. Eine ausführliche, kritische Darstellung der histochemischen Methoden findet man bei L i s o n (36). Uber Metallnachweis mit Hilfe der Histospektrographie s. W. u. W. G e r 1 a c h (32, 33) und P o 1 i c a r d (33). L. Histochemische Reaktionen auf bestimmte organische Verbindungen 1. Nachweis von Thymonukleinsäure 1233. Die N u k l e a l f ä r b u n g von F e u l g e n h a t zur Voraussetzung, d a ß das P r ä p a r a t zuerst einer milden sauren Hydrolyse u n t e r w o r f e n wird, wodurch aus dem Verband der Thymonukleinsäure die P u r i n k ö r p e r Guanin und Adenin abgespalten werden. Der verbleibende Rest (Thyminsäure) bekommt dadurch freie Aldehydgruppen und bleibt, an Eiweiß als Substrat gebunden, im Zellkern zurück. Bringt man das so »aufgeschlossene« P r ä p a r a t n u n in f u c h sinschweflige S ä u r e ( S c h i f f s c h e s R e a g e n s ) , so verbinden sich die Aldeh y d g r u p p e n mit dem Reagens zu einem intensiv rotvioletten Farbstoff. Die Reaktion findet n u r an d e n Stellen statt, wo T h y m i n s ä u r e sitzt bzw. Thymonukleinsäure gesessen hat. Da sich diese aber n u r im K e r n vorfindet, so kommt gleichzeitig eine elektive »Kernfärbung« zustande. Die Nuklealfärbung ist daher nicht n u r eine sehr spezifische histochemische Reaktion auf Thymonukleinsäure, sondern auch eine ausgezeichnete morphologische K e r n f ä r b e methode. Als K e r n f ä r b e methode h a t die N u k e a l f ä r b u n g den Vorzug, daß die F ä r bung automatisch ohne irgendwelche Differenzierung vor sich geht, daß sie sich n u r auf das nukleinsäurehaltige »Chromatin« beschränkt, w ä h r e n d echte Nukleolen und plasmatische S t r u k t u r e n stets u n g e f ä r b t bleiben, daß es niemals zu Ü b e r f ä r b u n g kommt und keine K u n s t p r o d u k t e auftreten. Die Hydrolyse bringt bei geeigneter Fixierung keine sichtbaren S t r u k t u r v e r ä n d e r u n g e n mit sich. 1234. D i e A u s f ü h r u n g d e r N u k l e a l f ä r b u n g . Nachfolgend gebe ich die Ausführung der Methode nach der Originalvorschrift von F e u l g e n wieder. Aus den beigefügten Bemerkungen sind die Vereinfachungen zu entnehmen, die sich im Laufe der Zeit als möglich erwiesen haben, a) F i x i e r u n g . Die Nuklealfärbung k a n n an Ausstrichen, Gefrier- und Paraffinschnitten vorgenommen werden. Ausstriche fixiert m a n mittels Durchziehen durch die Flamme. F ü r Stücke f o r d e r t e F e u l g e n ursprünglich eine Fixierung in Sublimat-Eisessig (6°/oige Sublimatlösung 100 ccm, Eisessig 2 ccm) u n t e r Vermeidung einer nachfolgenden Jodierung. S p ä t e r e r g a b s i c h , d a ß b e s s e r i n C h r o m o s m i u m-, C h r o m f o r m o l - o d e r K a l i u m b i c h r o m a t f o r m o l g e m i s c h e n f i x i e r t w i r d (s. § 1238). Ausstriche und Gefrierschnitte müssen vor Anstellen der Reaktion zur Beseitigung des störenden Piasmals (s. § 1241) f ü r 24 Stunden in 96°/oigen Alkohol gestellt werden. Bei Paraffinschnitten ist dies unnötig, da bei ihnen das Plasmal schon beim Entwässerungs- und Einbettungsprozeß extrahiert wird. Im allgemeinen w i r d man die Reaktion besser an Paraffin- als an Gefrierschnitten vornehmen. .19

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

290

Untersuchung der Zelle

§ 1234.

Ursprünglich fügte F e u 1 g e n der Alkoholreihe zur Bindung etwa v o r h a n d e n e r Aldehyde l°/o Dimethylcyclohexadion zu. Der Zusatz erwies sich als überflüssig. Die nach Sublimatfixierung übliche Jodierung ist unschädlich (V o ß , H. B a u e r ) . Einbettung über Methylbenzoat-Celloidin-Paraffin ist zulässig, b) A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n . 1. D i e m i t E i w e i ß - G l y z e r i n a u f g e k l e b t e n 10u d i c k e n S c h n i t t e k o m m e n n a c h E n t p a r a f f i n i e r e n a u s dest. W a s s e r z u r H y d r o l y s e in w a r m e S a l z s ä u r e ; Z e i t d a u e r b e i S u b l i m a t f i x i e r u n g g e n a u 4 Minuten. Die Hydrolyse w i r d in einem auf einem Drahtnetz stehenden Becherglas von 150 bis 200 ccm Fassungsraum vorgenommen. Dasselbe wird mit '/i-n-Salzsäure gefüllt, die durch einen Mikrobrenner konstant auf 60° gehalten wird. In das Becherglas taucht, durch eine Klemme festgehalten, ein Thermometer, an das man d e n Objektträger anlehnt. Der Stand der Salzsäure wird an der Außenseite des Becherglases durch einen Strich m i t dem Fettstift od. dgl. angegeben, so daß das v e r dampfende Wasser ohne Schwierigkeit von Zeit zu Zeit wieder nachgefüllt w e r den kann. Die T e m p e r a t u r läßt sich leichter konstant halten, wenn man das Gefäß in ein Wasserbad stellt. Temperaturschwankungen zwischen 59 u n d 61° sind unschädlich. Viel e i n f a c h e r i s t e^, d i e H y d r o l y s e in g u t v e r s c h l o s s e n e m G e f ä ß i n e i n e m a u f 60° C e i n g e s t e l l t e n W ä r m e s c h r a n k v o r zunehmen. Die optimale Dauer der Hydrolyse ist je nach Fixierungsflüssigkeit verschieden. Wird die Hydrolyse ü b e r ein gewisses Optimum hinaus fortgesetzt, so n i m m t die Stärke der Reaktion ab, bis sie überhaupt ausbleibt. Bei Sublimatfixierung ist das nach 10—15 Min. der Fall. Weiteres s. § 1238. 2. U n t e r b r e c h e n d e r H y d r o l y s e d u r c h E i n t a u c h e n d e s O b j e k t t r ä g e r s i n W a s ser und kurzes Auswaschen der Salzsäure. 3. E i n s t e l l e n d e r P r ä p a r a t e in f u c h s i n s c h w e f l i g e S ä u r e 1—IV2 S t u n d e n (pflanzliche Objekte besser 3 Stunden). Als Behälter verwendet m a n f ü r die fuchsinschweflige Säure einen mit Rillen versehenen gläsernen Färbetrog, der mit einer aufgeschliffenen Glasplatte bedeckt ist. Sobald die Lösung rötlich wird, m u ß sie e r n e u e r t werden. 4. A u s w a s c h e n i n S 0 2 - h a l t i g e m W a s s e r : 3 m a l 2 M i n u t e n . Die S 0 2 - h a l t i g e Spülflüssigkeit füllt m a n in drei mit I, II und III bezeichnete Bechergläser, die mit Uhrgläsern bedeckt werden. Die P r ä p a r a t e werden i m m e r in der gleichen Reihenfolge durchgeführt, so d a ß das erste Glas am meisten, das letzte aber keine fuchsinschweflige Säure mehr a u f n i m m t . Die Spülflüssigkeit ist täglich mindestens einmal zu erneuern. Das Auswaschen in SOo-Wasser hat bei allen exakten Untersuchungen sehr sorgfältig zu erfolgen. N u r bei Fällen von gewöhnlicher K e r n f ä r b u n g mag man sich damit begnügen, die Farblösung rasch unter dem Strahl der Wasserleitung abzuspülen. 5. A u s w a s c h e n i n B r u n n e n w a s s e r 5—10 M i n u t e n . S t e i g e n d e r A l k o h o l . X y l o l , Balsam. Längeres Wässern gibt erheblich sattere Färbung. Nach dem Wässern evtl. ganz schwache N a c h f ä r b u n g mit Lichtgrün (l°/oig, 2 Min.) oder Orange G (0,l°/oig, 5 Minuten). E r g e b n i s : D i e t h y m o n u k l e i n s ä u r e h a l t i g e n S u b s t a n z e n des P r ä p a r a t e s sind intensiv rot-violett gefärbt. Da dieselben im Chromatin der K e r n e lokalis i e r t sind, so g l e i c h t d a s E r g e b n i s d e m ' e i n e r e l e k t i v e n K e r n f ä r b u n g . Z u b e a c h t e n ist, d a ß die H y d r o l y s e e i n e n w e s e n t l i c h e n T e i l d e r N u k l e a l f ä r b u n g d a r s t e l l t . O h n e H y d r o l y s e k o m m t es zu g a n z a n d e r e n R e a k t i o n e n , d i e als P l a s m a l - , ( s . § 1241) u n d als K o h l e h y d r a t r e a k t i o n (s. § 1104) b e k a n n t sind.

§ 1235—1238.

Histochemische Methoden (organisch)

291

1235. H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g e n , : n - S a l z s ä u r e : 100 ccm konz. Salzsäure vom spez. Gewicht 1,19 mit dest. Wasser auf 1000 ccm a u f g e f ü l l t . F u c h s i n s c h w e f l i g e S ä u r e : 1 g zerriebenes Fuchsin (Parafuchsin) w i r d in einem E r l e n m e y e r k o l b e n mit 200 ccm siedendem Wasser Übergossen u n d z u r Lösung etwa 5 Minuten lang ö f t e r s umgeschüttelt. Nach A b k ü h l u n g auf ca. 50° C filtriert m a n in eine mit Schliffstopfen versehene Flasche, versetzt m i t 20 ccm n-Salzsäure, k ü h l t d u r c h Berieseln mit Wasser auf ca. 25° C ab und löst in der Flüssigkeit 1,0 g w a s s e r f r e i e s Natriumbisulfit (NaHSC>3, siccum pro analysi) auf. Man läßt mindestens 24 S t u n d e n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r stehen, w ä h r e n d dessen sich die Lösung e n t f ä r b t . (Im D u n k e l n u n d g u t verschlossen l ä n g e r e Zeit haltbar). Die f e r t i g e fuchsinschweflige S ä u r e ist schwach gelblich g e f ä r b t ; sie m u ß stets einen gewissen Überschuß an schwefliger S ä u r e enthalten, u m v o r Zersetzung b e w a h r t zu werden, die am Rötlichwerden der Lösung e r k e n n b a r ist. Die Lösung darf nicht e r w ä r m t w e r d e n ( S c h i f f s c h e s Reagens). Wichtig ist, einwandfreies, reines basisches Fuchsin (Pararosanilin) zu verwenden, da man nur dann farblose Lösungen bekommt. Statt Natriumbisulfit empfiehlt d e T o m a s e (36) die gleiche Menge des besser haltbaren Kaliummetabisulfit (K 2 S 2 0 5 ). S C > 2 h a l t i g e S p ü l f l ü s s i g k e i t : 200 ccm Leitungswasser w e r d e n mit 10 ccm einer 10°/oigen Lösung des käuflichen w a s s e r f r e i e n Natriumbisulfit u n d 10 ccm n - S a l z s ä u r e vermischt. Das Gemisch w i r d jeweils frisch hergestellt. Es soll s t a r k nach SO2 riechen (»Schwefeldioxydwasser«). Die Bisulfitlösung kann, gut verschlossen, v o r r ä t i g gehalten werden. 1236. B e m e r k u n g e n : Z u r sicheren Beurteilung einer F ä r b u n g als Nukl e a l f ä r b u n g dient ein Kontrollversuch, bei dem ein P r ä p a r a t o h n e Hydrolyse nach k u r z e m E i n t a u c h e n in k a l t e H C L der W i r k u n g der fuchsinschwefligen S ä u r e ausgesetzt wird. Die K e r n e d ü r f e n dabei d a n n keinerlei A n f ä r b u n g zeigen. Beim Kontrollversuch soll die fuchsinschweflige Säure nicht länger als eine halbe Stunde einwirken, da sonst Hydrolyse eintritt und die Reaktion positiv wird. 1237. Nach W e r m e l (27) liegt die wichtigste Fehlerquelle in der Eigenschaft der fuchsinschwefligen Säure sich sehr leicht zu zersetzen unter Freiwerden von Fuchsin, das dann vom Gewebe absorbiert wird. Wenn daher die fuchsinschweflige Säure aus dem Präparat nicht vollständig entfernt wird, kann bei nachfolgender Zersetzung sehr leicht eine zu irrigen Deutungen veranlassende Färbung auftreten. Um diese Fehlerquelle zu verringern, verwendet W e r m e l an Stelle der fuchsinschwefligen Säure das Monoäldehydprodukt derselben; zur Herstellung bereitet man zunächst die fuchsinschweflige Säure nach den Angaben von F e u 1 g e n. 2 Stunden nach dem Zusatz des Natriumbisulfits gibt man 0,2 ccm Azetaldehyd zu, wobei die Lösung eine dunkelviolette Farbe annimmt. Nach 30—60 Minuten erfolgt ein Zusatz von 20 ccm n-Salzsäure und 1 g Natriumsulfit (Na 2 S0 3 + 7 aq.). Die Entfärbung der Lösung beginnt zum zweiten Male und dauert bei Zimmertemperatur 1—2 Tage. Filtrieren der Lösung ist zu vermeiden, da es dabei leicht zu einer Zersetzung der Lösung kommt. 1238. D i e A r t d e r F i x i e r u n g i s t f ü r d a s F ä r b e r e s u l t a t v o n w e s e n t l i c h e r B e d e u t u n g . H. B a u e r fand bei der Prüfung der gebräuchlichsten Fixierungsgemische, daß sich nach den meisten bei bestimmter Verlängerung der Hydrolysedauer maximale Nuklealfärbung erzielen läßt. Gleichzeitig ergab sich aber auch, daß der Grad der Strukturschädigung durch die Hydrolyse von der Fixierungsart abhängig ist. Nach der von Feulgen selbst angegebenen 1»*

292

Untersuchung der Zelle

§ 1239—1241.

Sublimatfixierung (4—5—8) kommt es, wie schon B e r g sah, zu einer starken Quellung und Vakuolisierung des Chromatins. Chromosmium- und Chromformolgemische fixieren die Chromatinstrukturen dagegen derart, daß selbst nach lange dauernder Hydrolyse keine Veränderungen sichtbar werden. Die besten Resultate erhielt B a u e r nach Fixierung in Champy (16—25—40) oder Flemming-Heitz (= Fl. ohne Eisessig; 16—25—40), ferner nach Regaud (6—14—60), Zenker (4—5—12), Helly (4—8—16), Sanfelice (3—£—60), Bouin-Allen (19—22—40). Bei den drei letztgenannten Flüssigkeiten steht dem Vorteil besseren Eindringens der Nachteil einer geringen Quellung der Chromosomen . gegenüber. Die eingeklammerten Zahlen geben die Optimaldauer der Hydrolyse in Minuten an; in der fettgedruckten Zeit wird die stärkste Reaktion erreicht. Ein Vergleich der einzelnen Zeiten zeigt, daß Anstieg, Dauer des Maximums und Beginn des Abfalls bei den einzelnen Flüssigkeiten sehr verschieden liegen. Fixierung in Petrunkewitsch (3—6), Carnoy (4—8) oder Bouin ist nicht zu empfehlen, da die Strukturen sich hiernach bei der Hydrolyse schlecht erhalten; ferner kommt es nach ihnen auch bei Verlängerung der Hydrolysedauer zu .keiner maximalen Nuklealfärbung (H. B a u e r ) . 1239. Bei negativem Ausfall der Nuklealreaktion ist stets die Möglichkeit ins Auge zu fassen, daß die Konzentration etwa vorhandener Nuklealstoffe so gering ist, daß die Reaktion unter der Schwelle der Empfindlichkeit liegt. F e u 1 g e n nennt als Beispiel hiefür die Kerne reifer, nicht befruchteter Eier, in deren angeschwollenem Kern die Nuklealstoffe so sehr verteilt sind, daß es zu keiner Anfärbung kommt. K o c h und H. B a u e r beobachteten die Erscheinungen bei mehreren Tierarten am Chromatin wachsender Eizellen. Sie erklären sie mit einer chemischen Veränderung der Chromosomensubstanz. 1240. Die Nuklealfärbung gelingt nach V o ß (26) auch als Stückfärbung, wenn die Einwirkungsdauer der einzelnen Lösungen entsprechend verlängert wird. V o ß gibt für die Durchführung eines größeren Mäuseembryos folgende Zeiten an: 1. Uberführung des Objektes aus der Aufbewahrungsflüssigkeit in dest. Wasser. — 2. Hydrolyse in n-Salzsäure bei Zimmertemperatur l'A Stunden. — 3. Hydrolyse in n-Salzsäure bei 55° C im Thermostaten 1*1* Stunden. — 4. Einlegen in S 0 2 haltiges Wasser 15—20 Minuten. — 5. Fuchsinschweflige Säure 4'/2 Stunden. — 6. Auswaschen in SOa-haltigem Wasser 16—18 Stunden. — 7. Alkoholreihe, Einbetten in Paraffin. 2. Piasmaireaktion

1241. F e u 1 g e n und V o i t beobachteten, daß bei E i n w i r k u n g von fuchsinschwefliger S ä u r e auf G e f r i e r s c h n i t t e die Nuklealfärbung häufig durch eine im Cytoplasma a u f t r e t e n d e starke R o t f ä r b u n g überdeckt wird. Diese Reaktion ist durch die Anwesenheit eines bis dahin unbekannten, weit verbreiteten lipoiden Aldehyds bedingt, den F. u. V. als P 1 a s m a 1 bezeichneten. Das Fehlen der Substanz in P a r a f f i n schnitten erklärt sich aus ihrer leichten Löslichkeit in Alkohol, dank welcher sie bei dem der Einbettung vorausgehenden E n t w ä s s e r u n g s v e r f a h r e n durch Alkohol extrahiert wird. Im weiteren Verlauf der Untersuchungen von F e u 1 g e n und seinen Mitarbeitern ergab sich, daß das Plasmal in der Zelle niemals f r e i vorkommt, sondern stets an eine Komponente gekoppelt ist, die ebenfalls lipoider Natur und alkohollöslich ist. Der Gesamtkomplex stellt das P l a s m a l o g e n dar, das nach den bisherigen Ergebnissen einem Gemisch von A c e t a l p h o s p h a t i d e n entspricht, w ä h r e n d Plasmal ein Gemisch von Aldehyden der Palmitinund Stearinsäure ist. Im Gegensatz zum Plasmal reagiert das Plasmalogen nicht mit dem Schiffschen Reagens. Es ist jedoch sehr empfindlich gegen S ä u r e n und gegen Sublimat. Schon die Azidität des Reagenzes genügt, um innerhalb von etwa 15 Min. Plasmal abzuspalten. Noch rascher wirkt Behandlung mit Sublimat.

§ 1242—1242a.

Histochemische Methoden (organisch)

293

D e r h i s t o c h e m i s c h e N a c h w e i s v o n P i a s m a l b a u t sich also d a r a u f auf, daß d u r c h e i n e B e h a n d l u n g m i t S u b l i m a t gleichzeitig d a s G e w e b e fixiert u n d die A l d e h y d e d e r h ö h e r e n F e t t s ä u r e n (Plasmale) aus d e m G e s a m t k o m p l e x ( P l a s m a logen) a b g e s p a l t e n w e r d e n , w o r a u f diese A l d e h y d e d u r c h A n l a g e r u n g a n die weingelb gefärbte fuchsinschweflige Säure eine R o t f ä r b u n g ergeben. N u k l e a l f ä r b u n g (§ 1233), P i a s m a l r e a k t i o n (§ 1241) u n d K o h l e h y d r a t r e a k t i o n (§ 1104), die alle d r e i auf d e r A n w e n d u n g v o n f u c h s i n s c h w e f l i g e r S ä u r e b e r u h e n , u n t e r s c h e i d e n sich d e m n a c h n u r d u r c h die A r t der V o r b e h a n d l u n g , b r i n g e n a b e r d a n k dieser g a n z v e r s c h i e d e n e S u b s t a n z e n z u r D a r s t e l l u n g . Die e r s t g e n a n n t e R e a k t i o n e r f o l g t n a c h A l k o h o l e x t r a k t i o n u n d s a u r e r H y d r o l y s e , die z w e i t e u n t e r V e r m e i d e n von A l k o h o l n a c h E i n w i r k e n v o n S u b l i m a t o d e r P l a t i n chlorid, die d r i t t e n a c h V o r b e h a n d l u n g m i t C h r o m s ä u r e . 1242. A u s f ü h r u n g d e r Piasmaireaktion. Vorbemerkung. Da die P l a s m a l e in A l k o h o l leicht löslich sind, m u ß die Rea k t i o n a n A u s s t r i c h e n oder G e f r i e r s c h n i t t e n v o r g e n o m m e n w e r d e n . Eine v o r h e r i g e E i n b e t t u n g in P a r a f f i n oder Celloidin ist n i c h t möglich. A m sichersten u n d v o l l s t ä n d i g s t e n ist d e r A u s f a l l d e r Reaktion, w e n n diese an u n f i x i e r t e n Gefrierschnitten oder Z u p f p r ä p a r a t e n nach der Technik von Pischinger (§ 1244) erfolgt, die z u d e m d e n Vorteil hat, d a ß bei i h r p r a k t i s c h k e i n e Sublim a t n i e d e r s c h l ä g e a u f t r e t e n . Das ist i n s o f e r n w e r t v o l l , als eine E n t f e r n u n g der Sublimatkristalle durch Jodierung wegen Beeinflussung der Plasmale vermieden werden muß. Reine Sublimatfixierung im Stück erzeugt neben störenden Niederschlägen auch tropfige Entmischungen, Zusammenballungen und Umlagerungen der Plasmalogene. Das Gleiche gilt auch für Sublimatgemische. Als unbrauchbar haben sich auch Fixierungsmittel erwiesen, die neben Sublimat noch Formaldehyd enthalten, da durch diesen die Plasmalogene, entgegen der Annahme von G é r a r d , L i s o n , B e c h e r u. a. so verändert werden, daß sie nicht mehr erfaßt werden können. Dabei ist es gleichgültig, welchen PH das Fixierungsmittel besitzt. Sublimat- und cadmiumsulfathaltige Gemische wie z. B. das Becher'sche, erzeugen besonders starke und auffällige Verklumpungen der Plasmale ( P i s c h i n g e r 42). Chrom- und osmiumhaltige Flüssigkeiten sind infolge ihrer oxydierenden Wirkung zur Fixierung der Plasmale unbrauchbar. D e r E i n s c h l u ß d e r P r ä p a r a t e e r f o l g t a m b e s t e n in S 0 2 - W a s s e r . A u c h G l y c e r i n w a s s e r oder G u m m i s i r u p k ö n n e n v e r w e n d e t w e r d e n . Die H a l t b a r k e i t d e r P i a s m a l p r ä p a r a t e ist jedoch, w e l c h e E i n s c h l u ß m e t h o d e m a n a u c h v e r w e n det, s e h r schlecht. In j e d e m F a l l e sind die P r ä p a r a t e w e g e n i h r e r L i c h t e m p f i n d lichkeit d u n k e l a u f z u b e w a h r e n . Bei dieser S a c h l a g e ist m a n g e z w u n g e n , die U n t e r s u c h u n g s o f o r t n a c h H e r s t e l l u n g der P r ä p a r a t e v o r z u n e h m e n u n d den B e f u n d d u r c h F a r b s k i z z e o d e r Lichtbild, am b e s t e n auf F a r b f i l m , f e s t z u h a l t e n . 1242a. Von verschiedenen Autoren (z. B. W a 11 r a f f) wurde empfohlen die Untersuchungen am Gefrierschnitt noch durch die Vornahme von Stückfärbung mit anschließender Paraffineinbettung zu ergänzen (§ 1246). Wie P i s c h i n g e r (42) jedoch zeigte, werden durch die Paraffineinbettung, gleichgültig wann und wie sie erfolgt, Kunstprodukte erzeugt, weshalb sie gerade bei feineren Piasmaluntersuchungen vermieden werden muß. Eine Ausnahme im Verhalten gegen Alkohol bildet das elastische Gewebe, welches das Plasmalogen und Plasmal so hartnäckig festhält, daß es durch Alkohol nicht oder nur unvollständig extrahiert wird. Darauf beruht nach F e u 1 g e n die Mitfärbung des elastischen Gewebes bei der Nuklealfärbung. — Einige weitere Ausnahmen beschreibt V o ß (27). Die Herstellung der fuchsinschwefligen Säure und des S0 2 -Wassers erfolgt nach § 1235.

294

Untersuchung der Zelle

§ 1243—1246.

1243. O r i g i n a l m e t h o d e v o n F e u l g e n . M a t e r i a l : A u s s t r i c h e o d e r G e f r i e r s c h n i t t e v o n f r i s c h e m u n f i x i e r t e m G e w e b e . Von zwei ü b e r e i n s t i m m e n d h e r g e s t e l l t e n P r ä p a r a t e n k o m m t das eine f ü r 3 Min. in l°/oige S u b l i m a t l ö s u n g , W ä h r e n d das a n d e r e u n t e r d e s s e n im W a s s e r v e r b l e i b t . N a c h s o r g f ä l t i g e m A b s p ü l e n des S u b l i m a t s m i t W a s s e r k o m m e n b e i d e P r ä p a r a t e g l e i c h z e i t i g f ü r 10—15 M i n u t e n in die f u c h s i n s c h w e f l i g e S ä u r e . D a n n S p ü l e n in SC>2-Wasser, B e t r a c h t e n in S p ü l f l ü s s i g k e i t . In dem mit Sublimat vorbehandelten Präparat reagiert das dadurch frei gewordene Plasmal sofort unter violetter Farbstoffbildung, während es bei dem nicht vorbehandelten erst nach längerer Zeit unter dem Einfluß der fuchsinschwefligen Säure zu einer Aufspaltung des Plasmalogens und damit zu einer Farbreaktion kommt. Auf diese zeitliche Verschiebung ist beim Nachweis des Plasmalogens der größte Wert zu legen. I m h ä u s e r fixiert in 0,3 n^HCl m i t 1%> S u b l i m a t z u s a t z u n d läßt 1—2 S t u n d e n i m Reagens. V o ß fixiert in Sublimateisessig, ebenso W a l l r a f f . N a c h l e t z t e r e m ist auch N a c h f i x i e r u n g in gesätt. w ä ß r . S u b l i m a t l ö s u n g sowie l ä n g e r e s V e r w e i l e n in d e r F i x i e r u n g s - F l ü s s i g k e i t o h n e B e e i n t r ä c h t i g u n g d e r R e a k t i o n möglich. 1244. A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n n a c h P i s c h i j i g e r (41, 42). D a b e i ist die gleichzeitige E i n w i r k u n g von S u b l i m a t u n d f u c h s i n s c h w e f l i g e r S ä u r e w e s e n t l i c h . 1. H e r s t e l l u n g 10—20// d i c k e r G e f r i e r s c h n i t t e v o n u n f i x i e r t e n O r g a n e n bei M e s s e r t i e f k ü h l u n g n a c h § 520, wobei d a s Rollen d e r S c h n i t t e m i t e i n e m P i n s e l v e r h i n d e r t w i r d . A u f f a n g e n d e r S c h n i t t e auf d e n O b j e k t t r ä g e r . — 2. E i n s t e l l e n in e i n e u n m i t t e l b a r v o r h e r b e r e i t e t e M i s c h u n g v o n 1 Teil g e s ä t t . S u b l i m a t l ö s u n g u n d 3 T e i l e n Schiffschem Reagens, 10 Min. D e r e r s t e F a r b t o n t r i t t schon n a c h 20—25-Sek. auf. Die Lösung, die sich n a c h einiger Zeit t r ü b t , k a n n n u r l m a l v e r w e n d e t w e r d e n . — 3. S p ü l e n in m e h r m a l s g e w e c h s e l t e m S 0 2 - W a s s e r . — 4. E i n s c h l i e ß e n in SOg-Wasser oder G l y c e r i n . U m r a n d e n m i t Krönigschem Deckglaskitt. K l e i n e o d e r s e h r d ü n n e O r g a n e oder O r g a n s t ü c k c h e n b r i n g t P i s c h i n g e r (42) n a c h 1 - h ö c h s t e n s 2 M i n u t e n l a n g e m V e r w e i l e n in S 0 2 - W a s s e r f ü r Va bis 1 S t u n d e d i r e k t in die S u b l i m a t - R e a g e n s m i s c h u n g . D a n n ü b e r t r a g e n in SO2Wasser, in d e m sie auf d e m O b j e k t t r ä g e r z e r z u p f t , e i n g e d e c k t u n d gleich u n t e r s u c h t w e r d e n . A u c h G e f r i e r s c h n i t t e k ö n n e n v o n so v o r b e r e i t e t e n O r g a n e n gemacht werden. 1244a. I m a l l g e m e i n e n g u t e R e s u l t a t e gibt n a c h P i s c h i n g e r (42) a u c h e i n e F i x i e r u n g d e r O r g a n e in k o c h e n d e r R i n g e r l ö s u n g . D a s V e r f a h r e n h a t den Vorteil, d a ß sich d a r n a c h leicht G e f r i e r s c h n i t t e h e r s t e l l e n lassen, die n a c h k u r zer S u b l i m a t b e h a n d l u n g e i n e ausgezeichnete P i a s m a i r e a k t i o n geben. In einzelnen F ä l l e n b e o b a c h t e t e P. bei diesem V o r g e h e n a b e r e i g e n a r t i g e , noch u n e r k l ä r b a r e F ä r b u n g s u m k e h r u n g e n , w e s h a l b gewisse V o r s i c h t nötig ist. 1245. V e r n e (29) fixiert 3—4 mm dicke Stückchen in gesätt. wässer. Lösung von Sublimat 30 ccm, physiol. Kochsalzlösung 70 ccm; oder in Sublimat 50 ccm, l°/«ige Lösung von Urannitrat oder Cadmiumchlorid 50 ccm; oder in l°/oiger wäßriger Lösung von Platinchlorid. Letztere hat den Vorteil, daß die Präparate niederschlagsfrei sind. Nach der Fixierung Auswaschen in fließendem Wasser 10—12 Stunden ünd Schneiden auf dem Gefriermikrotom und Piasmaireaktion wie oben. Zuletzt Einschluß in Sirup von Apathy. Material, das nach 24 Stunden nicht geschnitten wird, wird in stark verdünnter Fixierungsflüssigkeit aufgehoben. 1246. P l a s m a l s t ü c k f ä r b u n g . Voß empfiehlt sie für Untersuchungen an Eiern und Embryonen. Nach W a 11 r a f f kann sie bei jedem tierischen Gewebe mit Erfolg angewendet werden. Ausführung: 1. Fixierung in Sublimat. — 2. Ein-

§ 1247—1252.

Histochemische Methoden (organisch)

295

legen etwa 2 mm dicker Organscheiben in S0 2 -Wasser 2 Stunden. — 3. Einlegen in fuchsinschweflige Säure 2 Stunden. — 4. Auswaschen in mehrfach erneuertem SCte-Wasser mindestens 15 Stunden. — 5. 70-, 96- und 100°/oiger Alkohol je eine Stunde, Methylbenzoat-Celloidin, Benzol, Paraffin. Siehe dazu § 1242a. 3. Eiweifyreaktionen

1247. X a n t h o p r o t e i n r e a k t i o n . Der Schnitt wird für einige Minuten in kalte rauchende Salpetersäure gebracht, in der sich die Eiweißkörper gelb färben. Setzt man dann den Schnitt nach Auswaschen in Wasser Ammomiakdämpfen aus, so schlägt der Farbton nach Orange um. Die Reaktion fällt auch bei Phenolen, Indolderivaten und Alkaloiden positiv aus. 1248. M i l l o n s c h e R e a k t i o n . Für histochemische Zwecke ist das Reagens in der von B e n s 1 e y und G e r s h (33) angegebenen Zusammensetzung zu empfehlen. 400 ccm konz. Salpetersäure (spez. Gew. 1,42) werden mit dest. Wasser auf 1 Liter verdünnt. Nach 48stündigem Stehen wird weiter 1 Teil dieser Lösung mit 9 Teilen dest. Wasser verdünnt. Die so erhaltene 4°/oige Salpetersäure wird mit einem reichlichen Überschuß von Quecksilbernitratkristallen versetzt und mehrere Tage unter öfterem Schütteln der völligen Sättigung überlassen. Zu 400 ccm des Filtrats fügt man 3 ccm der 40°/oigen Ausgangslösung und 1,4 g Natriumnitrit. — In diese Lösung werden die Schnitte eingelegt. Gewöhnlich genügen 3 Stunden, um die Eiweißkörper genügend rosa oder rot zu färben. Dann kurz Eintauchen in l°/oige Salpetersäure, und rasch durch abs. Alkohol in Xylol und Balsam. Die Reaktion ist auch bei verschiedenen eiweißfreien Phenolen positiv. 1249. Die N i n h y d r i n r e a k t i o n dient zum Nachweis niederer Eiweißkörper bzw. ihrer Abbauprodukte. B e r g fixiert dazu Gewebestückchen von 2 bis 4 mm Kantenlänge in 10°/oiger Formollösung (unfixiertes oder nicht entsprechend fixiertes Gewebe ist für die Reaktion unbrauchbar). Durch die Formoleinwirkung büßen höhere Eiweißkörper ihre Reaktionsfähigkeit mit Ninhydrin ein, während sie die niederen Eiweißkörper bewahren (B e r g). Nach der Fixierung wird V2—1 Stunde ausgewaschen und auf dem Gefriermikrotom geschnitten. Die 10—15/t dicken Schnitte werden in kleinen gläsernen Abdampfschalen in 2,5 ccm einer 0,02°/oigen Ninhydrinlösung einheitlich eine Minute lang gekocht, in Wasser abgespült und in Glyzerin oder Glyzeringelatine eingelegt. — E r g e b n i s : Eiweißabbauprodukte und niedere Eiweißkörper sind blau gefärbt. 1250. Der bei der Ninhydrinreaktion entstandene Farbstoff kann auch beliebige andere Strukturen färben, wenn er hinreichend konzentriert ist und genügend lange Zeit einwirken kann. Er verhält sich dann wie ein histologisch saurer Farbstoff. Bei der Beurteilung der Färbeeffekte muß man daher zwischen der eigentlichen Reaktion in situ und dieser sekundären Färbung sorgfältig unterscheiden ( B e r g). 1251. Zur g l e i c h z e i t i g e n D a r s t e l l u n g v o n E i w e i ß a b b a u s t o f f e n u n d F e t t färben B e r g und F a l k Isolationspräparate von formolfixiertem Material nach l^-l'/^stündigem Auswaschen zunächst V2 Stunde in alkoholischer Scharlachlösung (konz. in 70°/oigem Alkohol) mit vor- und nachheriger Behandlung in 50°/oigem Alkohol. Dann Ninhydrinreaktion wie oben. 4. Xanfhydrolreaktion zum Nachweis von Harnstoff

1252. Durch die von S t ü b e l (21) an Nierenstückchen angewandte Reaktion wird der Harnstoff im Gewebe in Gestalt der charakteristischen Kristallaggregate des Dixanthylharnstoffs nachgewiesen.

296

Untersuchung der Zelle

§ 1253—1255a.

Man bringt dazu die frisch entnommenen Gewebsstückchen von höchstens (das Reagens dringt nur langsam in das Gewebe ein) 2 mm Kantenlänge auf 6 bis 12 Stunden in eine 6°/oige Lösung von Xanthydrol in Eisessig. Nach 48stündigem Auswaschen mit absolutem Alkohol wird durch Xylol (höchstens 1 Std.) in Paraffin eingebettet. Die mit Hämalaun gefärbten Schnitte zeigen die oben genannten Kristalle. Die Xanthydrollösung ist immer frisch zu bereiten. Auch die Substanz oxydiert an der Luft ziemlich rasch zu Xanthol, ist daher frisch zu beziehen und gut verschlossen aufzubewahren. Die Dixanthylharnstoffkristalle haben die Form von feinen Nadeln. Sie bilden fast immer Drusen verschiedener Größe und gelblich grüner Farbe. In Wasser, Alkohol, Äther, Xylol sind sie unlöslich. In Carbolxylol werden sie zerstört. Sie sind doppelbrcchend. Der histochemischen Auswertung ist dadurch eine Grenze gezogen, daß sie Orte der Kristallbildung häufig nicht mit der Lage des Harnstoffes intravitam übereinstimmen. Eine Lokalisation bis in die Einzelzelle oder in bestimmte Zellorte hinein ist daher nicht möglich (s. auch G i c k l h o r n 36). Über die färberische Darstellung von Harnsäure und Uraten s. § 2134 ff. 5. Hisfidinnachweis nach Brunswik (23)

1253. Frische oder fixierte Schnitte werden vorsichtig mit 33°/oiger Salpetersäure erwärmt, u m durch die Xanthoproteinreaktion die Tyrosinkomponente reaktionsunfähig zu machen, ohne dem Histidin die Kuppelungsfähigkeit mit der Diazobenzosulfosäure zu rauben. Hierauf werden die Schnitte mit Wasser abgespült und in konzentrierte Sodalösung übertragen, bis die Eiweißbestandteile eine orangegelbe Farbe angenommen haben; dann wird von dem in konzentrierter Sodalösung gelösten Diazoreagens unter dem Deckglas ein Tropfen zugesetzt. E r g e b n i s : Die histidinhaltigen Eiweißbestandteile nehmen eine ziegelrote Färbung an. — Die Eiweißnatur der fraglichen Strukturen ist vorher sicher zu stellen. 1254. Blutausstriche werden mit Methylalkohol oder mit Formoldämpfen 5—10 Minuten lang vorbehandelt (B e r g). Die Erythrocyten nehmen bei Ausführung der Reaktion eine stark ziegelrote Farbe an, die weißen Blutzellen bleiben fast ungefärbt. Führt man die Reaktion an nicht nitrierten (d. h. nicht mit Salpetersäure behandelten) Präparaten aus, dann färben sich auch die weißen Blutzellen ziegelrot (Probe auf Histidin + Tyrosin). Die Kerne bleiben dagegen auch in diesem Falle ungefärbt ( B e r g 23). 6. Nachweis von Glutathion und Sulfhydrilgruppen

1255. Zum histochemischen Nachweis des in sehr vielen Zellen vorkommenden Glutathions bringt J o y e t - L a v e r g n e (28) Gefrierschnitte von frischem Gewebe in 20°/oiger Nitroprussidnatriumlösung auf den Objektträger, setzt ein Tropfen n-Sodalösung zu und bedeckt mit Deckglas. Glutathion violett. Die Präparate müssen sofort untersucht werden, da die Färbung n u r kurze Zeit haltbar ist. G i r o u d und B u l l i a r d (31, 30) bringen Gefrierschnitte zum Nachweis von Verbindungen der Sulfhydrylgruppe f ü r einige Sekunden in 5°/oige wässerige Zinkacetatlösung. Dann rasch Abspülen in dest. Wasser und Einlegen in 10°/oige Nitroprussidnatriumlösung, der etwa 2% Ammoniak zugesetzt sind. Dann Alkohol, Xylol, Balsam. SH-haltige Substanzen rot. Präparate kühl und dunkel aufbewahren. 1255a. N a c h w e i s v o n S u l f h y d r i l g r u p p e n nach C h è v r e m o n t und F r é d é r i c (43). Die Reaktion kann an frischen oder fixierten Ausstrichen wie Schnitten ausgeführt werden. Die Fixierung erfolgt am besten in

§ 1256—1257.

Histochemische Methoden (organisch)

297

Formol-Kochsalz (s. § 266 oder Formol-Ringer. Auch Bouin ist möglich. Dauer am besten nur einige Stunden bis 1 Tag, keinesfalls länger als 2 Tage. Herstellung möglichst dünner Gefrierschnitte oder auch Paraffinschnitte. (Der Aufenthalt im Alkohol, Zwischenmedium und Paraffin soll möglichst kurz bemessen sein; einige Stunden im ganzen, daher dünne Stückchen nehmen!). — A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n : 1. Schnitte von fixiertem Material müssen zur Entfernung des Formols sorgfältig in dest. Wasser ausgewaschen werden. — 2. Einstellen in 3 Portionen des unmittelbar vor Gebrauch bereiteten und filtrierten Reagens, das aus 1 Teil einer frischen 0,l°/oigen Lösung von Kaliumferricyanid (pro analysi) und 3 Teilen einer l°/oigen Lösung von Ferrisulfat (Fe2 (SC>4)3, pro analysi) zusammengesetzt wird, P'H 2,4; das Gemisch ist im Licht etwa 2 Stunden haltbar. Es darf nicht mit Metallinstrumenten in Berührung kommen. Gesamtdauer der Einwirkung: bei Gefrierschnitten 1 0 — 2 0 Min., bei Paraffinschnitten und Blutausstrichen 2 0 — 2 5 Min., Hefe 1 Stunde. — 3. Langes Auswaschen im Wasser. — 4. Eventuell Gegenfärbung, z. B. mit Azocarmin. — 5. Einschluß in Balsam oder Lävulosesirup. — E r g e b n i s : Die Anwesenheit von Sulfhydrilgruppen wird durch blaue Granula oder einen sehr feinen kolloidalen Niederschlag, der einer diffusen blauen Färbung gleicht, angezeigt Untergrund gelblich. — Die Präparate sind längere Zeit haltbar. 7. Nachweis von Phenolderivaten

1256. Die Methodik des Nachweises der Ortho- und Paraphenole mittels Diazokupplungsreaktion wurde zuerst von L i s o n (31) ausgearbeitet; sehr bequem ist der Gebrauch der von C l a r a (34) empfohlenen stabilisierten Diazoverbindung E c h t r o t s a l z B (I. G. Farben; erhältlich bei Hollborn), die in Pulverform gut haltbar ist. Zum Gebrauch wird eine kleine Menge der Substanz in eisgekühltem dest. Wasser (Zusatz von Eisstückchen und äußere Eiskühlung; Temperatur nicht über 5° C) gelöst; hierauf wird durch Zugabe von Lithiumcarbonat die Lösung alkalisch gemacht, was am Auftreten einer immer stärker werdenden Gelbfärbung erkennbar ist. In die so bereitete Lösung werden die Schnitte auf höchstens 30 Sekunden eingelegt und dann sofort in Wasser ausgewaschen. Alkoholreihe, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Die Phenolderivate enthaltenden Strukturen sind leuchtend braunrot gefärbt, die übrigen Teile nur zart diffus gelb.

Die fertige Lösung hat auch bei sorgfältigster Kühlung schon nach etwa 10 Min. ihre Brauchbarkeit verloren.'Man stellt daher nur eine geringe Menge von Lösung her, die sofort benutzt wird. — Zur Einübung der Methode eignen sich nach C l a r a am besten die basalgekörnten Zellen des Darmepithels (bei Säugern besonders zahlreich im kranialen Abschnitt des Duodenum). 8. Nachweis der diromotropen Substanz

1257. Als chromotrope Substanz werden Substanzen bezeichnet, die durch ihren Gehalt an hochmolekularen Esterschwefelsäuren (wie Chondroitinschwefelsäure, Mucoitinschwefelsäure) gekennzeichnet sind. Sie besitzen namentlich in den Geweben des Embryos große Verbreitung, kommen aber auch beim Erwachsenen vor, z. B. in der Cornea, im Knorpel und in Gefäßwandungen. Zum Nachweis der chromotropen Substanz fixiert H o l m g r e n 12—24 Stunden in 4°/oigem basischen Bleiacetat (Kahlbaum); dann Abspülen in Wasser, Alkoholreihe, Einbettung in Paraffin. Zur Färbung kommen 5u dicke Schnitte für 15 bis 30 Min. in l°/oige wässerige Toluidinblaulösung und werden dann so rasch

298

Untersuchung der Zelle

§ 1258—1259.

wie möglich durch 96%>igen und absol. Alkohol in Xylol gebracht. Balsam. — Ergebnis: Chromotrope Substanz metachromatisch rotviolett, Kerne blau. Die Bleiacetatlösung muß stets frisch bereitet und gut verschlossen werden. Man kann dabei vom basischen Bleiacetat in Substanz oder von Kahlbaums Liqu. Plumbi subacetici pro analysi ausgehen. Im Präparat auftretende Kristallniederschläge können nur 'unter Schädi'gung der chromotropen Substanz beseitigt werden. Bei Fixierung in Formol, Formol-Sublimat oder nach Bouin nimmt die Färbbarkeit der chromotropen Substanz schon nach 24 Stunden ab, nach 96 ist sie völlig verschwunden. M. Histo-Physikodiemische Methoden 1. Methoden zur Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration in mikroskopischen Präparaten

1258. Verchiedentlich wurde versucht, die zur Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration üblichen Methoden den Anforderungen der mikroskopischen Untersuchung so weit anzupassen, daß die Messung am lebenden oder irischen Gewebe und in der einzelnen Zelle möglich wird. Das Ziel wurde bis jetzt nur teilweise erreicht: Eine besondere Schwierigkeit besteht darin, daß beim Absterben von Zellen, aber auch schon bei Verletzungen, Druck oder anderen schädlichen Einwirkungen in der Zelle Entmischungserscheinungen der vielfach sehr labilen Biokolloide auftreten, die fast stets mit Reaktionsveränderungen verbunden sind ( R i e s 38). Daher liefern auch Messungen an Gewebeschnitten PH-Werte, die von jenen der lebenden Systeme beträchtlich abweichen. Dazu kommen noch eine Reihe von Fehlerquellen, die durch den Eiweiß-, -Salzund Lipoidfehler, den metachromatischen Fehler (Lison 35), durch verschiedene Farbstoffkonzentration, die schlechte Permeabilität der Indikatorfarbstoffe u. dgl. bedingt sind. 1259. Von den zur k o l o r i m e t r i s c h e n Bestimmung angegebenen Methoden haben sich am besten die von S c h m i d t m a n n und von C h a m b e r s ausgearbeiteten bewährt. Das Prinzip der Schmidtmannschen Methode besteht darin, daß mit Hilfe eines Mikromanipulators ein Körnchen Indikatorsubstanz in die zu messende Zelle eingeführt, der Farbstoffumschlag beobachtet und mit entsprechenden Testpräparaten verglichen wird. A u s f ü h r u n g : Man stellt die Nadelspitze im Mikromanipulator in gewöhnlicher Weise ein, bringt aber dann auf die Feuchtkammer zunächst ein Deckglas, dessen Unterfläche mit einem schmalen Streifen Lecithin bestrichen und daneben mit feinsten Körnchen der Indikatorsubstanz bestäubt ist. Sodann schiebt man die Nadel bei mikroskopischer Beabachtung erst in das Lecithin, um hierauf mit ihr ein Farbstoffkorn von geeigneter Größe aufzunehmen. Hierauf wird das Farbstoffdeckglas mit einem zweiten Deckglas vertauscht, welches das Untersuchungsobjekt in hängenden Tropfen trägt. Die mit der Indika,torsubstanz behaftete Nadel wird von unten her in die Zelle eingeführt und alsbald rasch zurückgezogen. Man kann nun beobachten, wie sich das Körnchen im Protoplasma der Zelle löst und dabei dasselbe je nach Art und Reaktionsweise des Indikators färbt. Hat man zunächst durch Prüfen verschiedener Indikatoren festgestellt, in welchem Gebiet ungefähr das Ph einer Zelle 'liegt, so wird der genauere Wert in folgender Weise ermittelt: Man gibt auf ein Deckglas nebeneinander kleinste Tropfen von Pufferlösungen, deren Ph etwa dem nach den Vorversuchen zu erwartenden p'h der Zelle entsprechen. Führt man nun in die Pufferlösungen auf dieselbe Weise wie in die Zelle je ein Farbkorn ein, so erhält man eine Vergleichsskala für die Farbennuance der untersuchten Zelle.

§

299

Histo-Physikochemische Methoden

1260—1262.

B e i s p i e l (nach S c h m i d t m a n n ) . Präparat von quergestreifter Muskulatur der Maus. Bromthymolblau löst sich in gelber Farbe, Neutralrot ausgesprochen rot, p-Nitrophenol gelb. Das Umschlagsgebiet des Bromthymolblau liegt zwischen 6 und 7,6. Der Vergleich mit Pufferlösungen ließ eine Übereinstimmung der Farbnuance bei Ph = 6,6 erkennen. Für p-Nitrophenol liegt das Umschlagsgebiet zwischen 5 und 7; hier ergab der Vergleich mit den Puffergemischen eine Übereinstimmung bei p"h = 6,7. TABELLE 7 Liste besonders empfehlenswerter pa-Indikatoren (nach R i e s 38). Eignung Farbstoff

Bromphenolblau Bromkresolgrün Methylrot Chlorophenolrot B r o m k r e so 1 p u r p u r Bromphenolrot Alizarin-Na Bromthylmolblau Phenolrot Neutralrot o-Kresolrot m-Kresolrot N i1 b1 auc h 1 orhyd rat Thymolblau Nilblausulfat

Umschlagsbereich

. . . .

. . . . . .

3 — 4,6 3,8— 5,4 4 , 4 — 6.2 4 , 8 — 6,4 5 , 2 - 6,8 5 , 4 - 7,0 5 , 5 - 6,8 6 , 0 — 7,6 6 , 8 - 8,4 6 , 8 - 8,0 7 , 0 - 8,8 7 , 6 — 9,2 7 , 2 - 7,7 (8,6) 8 , 0 — 9,6 10,2—13,0

zu direkter Vitalfärbung

— .

-i-

(+) (+) —

(-r) —

(B

+++

+

++ + — •

+++

ZU Mikroinj.

+ + + + + + + +

—

+ + + •—*

C h a m b e r s n i m m t mit Hilfe des Mikromanipulators Mikroinjektionen von Indikatorlösungen in die Zelle vor, wobei saure Indikatorsubstanzen durch N a t r o n l a u g e neutralisiert werden, um einer Ansäuerung im Protoplasma entgegenzuwirken. 1260. R i e s (38) benützt direkte A n f ä r b u n g mit Neutralrot, Nilblauchlorh y d r a t und Nilblausulfat, empfiehlt aber gleichzeitige Kontrolle durch Verw e n d u n g d e r Indikatoren von C l a r k und L u b s , von denen sich Methylrot, Kresolrot u n d Phenolrot als besonders geeignet erwiesen haben, zumal sie bei einigen Objekten zu direkter Vitalfärbung benützt werden können. Der F a r b ton d e r G r a n u l a f ä r b u n g mit basischen Vitalfarbstoffen dagegen darf zur PHB e s t i m m u n g in der Zelle nicht herangezogen w e r d e n ( R i e s 38). Tabelle 7 gibt eine Zusammenstellung besonders zu empfehlender Pk-Indikatoren. Leider dringen die Clarkschen Indikatoren bei einer Reihe von Objekten n u r sehr schlecht ein, wodurch eine genauere E r m i t t l u n g der PH-Werte sehr erschwert wird. 1261. A r n o l d (38) erzielt bei V i t a l f ä r b u n g am Säugetierei mit den Indikatoren Brillantkresylviolett, Kresylechtviolett, Brillantvitalrot. Neutralrot und P r u n e p u r e gute Resultate. Sie w e r d e n dem Beobachtungsmedium (Ringer oder Blutserum) in S p u r e n zugesetzt. 1262. Bei geeigneten Objekten (z. B. Furchungszellen) läßt sich zur Bestimm u n g der Wasserstoffionenkonzentration auch die e l e k t r o m e t r i s c h e Methode anwenden, besonders mit Hilfe der von B u y t e n d i j k ausgearbei-

300

Untersuchung der Zelle

§ 1263—1264.

teten potentiometrischen Methode, die auf der Eigenschaft des Antimons beruht, bei Berührung mit einer Flüssigkeit einen Potentialunterschied zu zeigen, der n u r von der Wasserstoffionenkonzentration der Flüssigkeit abhängt. B u y t e n d i j k und W o e r d e m a n n konnten mit Hilfe der Antimonelektrode unter Verwendung des Mikromanipulators Bestimmungen mit einer Sicherheit eines Ph von 0,05 ausführen. Ein Nachteil ist, daß der Durchmesser der Elektrodenspitze bis jetzt nicht feiner als 0,05 mm genommen werden konnte. 1263. Über die Bestimmung des O x y d a t i o n s - R e d u k t i o n s p o t e n t i a l s ( R e d o x p o t e n t i a l s = i"h) in der Zelle s. R i e s (38). An der gleichen Stelle findet man auch eine Übersicht der bisherigen Befunde über das PH und rn der verschiedenen Gewebe. 2. Bestimmung des isoelektrischen Punktes

1264. Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes in Geweben beruht nach P i s e h i n g e r 1 ) auf folgendem Prinzip: Nach Alkoholfixierung und Paraffineinbettung bleiben im histologischen Schnitt die in organischen Flüssigkeiten nicht löslichen Stoffe, das sind hauptsächlich Eiweißkörper, zurück. Diese gewinnen in wäßriges Medium zurückgebracht wiederum ihre f ü r Ampholyte eigentümlichen elektrostatischen Ladungen, die vom Dissoziationsverhältnis der basischen NH2- und sauren COOHGruppen bestimmt werden. Da sich dieses Verhältnis mit der Wasserstoffionenkonzentration der Umgebung ändert, variiert damit auch der Wert der elektrostatischen Ladungen des Eiweißsubstrates. Mit zunehmender Ch ( = abnehmenden PH) wird durch Zurückdrängung der COOH-Dissoziation die negative Ladung verringert, die positive steigt gleichzeitig durch fortschreitende NH^-Dissoziation. Bei einem bestimmten PH wird die Dissoziation beider Gruppen gleich sein. Dieses PH heißt der isoelektrische Punkt. In diesem Bereich erfolgt ein Umschlag der elektrostatischen Ladung, womit sich naturgemäß auch die elektrostatische Adsorption ändert: nach der sauren Seite geht das Bindungsvermögen der Eiweißstoffe f ü r basische (positive) Farbstoffe rasch verloren, nimmt dagegen f ü r saure (negative) zu. Durch Färbung mit nicht umladbaren Farbstoffen bei variierter Wasserstoffionenkonzentration kann man daher den Isoelektrischen Punkt histologischer Elemente durch Ermittlung des raschen Färbeabfalles annähernd bestimmen. Für verschiedene Eiweißkörper liegen die Umladungsbereiche nicht bei gleichem PH. Azidophilie' und Basophilie sind nach dem Gesagten relative Begriffe. Unerläßliche Voraussetzung für die Bestimmung des isoelektrischen P u n k tes in Gewebsschnitten ist genaues Arbeiten mit chemisch reinen Büretten, Pipetten, Meßkolben, guten Waagen und chemisch reinen Reagenzien. A u s f ü h r u n g : 1. Fixierung in reinem absoluten Alkohol. — 2. Einbettung über Benzol in Paraffin. — 3. Anfertigen einer entsprechenden Zahl gleich dicker Schnitte (5—6u), die durch reine Adhäsion mit dest. Wasser aufgeklebt werden (in Salpetersäure, Bichromatschwefelsäure oder Seifenwasser gereinigte und in dest. Wasser aufbewahrte Objektträger). — 4.Entparaffinieren und färben der Schnittreihe mit gepufferten Methylenblau- bzw. Kristallponceaulösungen von verschiedenen PH: 10 Min. — 5. Abspülen mit Pufferlösungen von gleichem ') Ursprünglich verwandte Pischinger (26. Toluidinblau und Cyanol. Auf meine Bitte hatte Herr Professor Pischinger die Liebenswürdigkeit 1 seine jetzt befolgte Technik in der in § 1264 wiedergegebenen I?orm darzustellen.

§ 1265—1266.

Histo-Physikochemische Methoden

301

Ph: ca. 1 Min. — 6. Bei Methylenblau fixieren der Färbung mit 5°/oigem Ammoniummolybdat nach B e t h e : 4 Min. — 7. Rasches Entwässern. Xylol. Caedax. Bemerkungen: ad 1. Andere Fixierung gibt geänderte Werte; so kommt es z. B. nach Formol infolge Methylenierung der NH2-Gruppen zu einer Verschiebung der IEP nach der sauren Seite (s. Z e i g e r 30). — ad. 4. Statt Kristallponceau kann man als sauren Farbstoff auch Cyanol verwenden,- das jedoch schwieriger zu behandeln ist. Ist der Regel kommt man mit Methylenblaufärbungen allein aus. H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g e n : a) Pufferlösungen: Es können verschiedenartige Puffer verwendet werden, z. B. m/50-Phosphat- oder m/50-Acetatgemische (siehe M i c h a e l i s und R o n a (»Praktikum der physikalischen Chemie«). Als besonders vorteilhaft haben sich die Acetat-Veronal-Puffergemische nach M i c h e a l i s (31) erwiesen, die einen Bereich von Ph 2,62—9,64 umfassen. Weiteres darüber siehe § 1265. b) m/250-Farbstoffstammlösungen: 0,13 g reinstes Methylenblau bzw. 0,18 g Kristallponceau rein auf je 100 ccm dest. Wasser. Zum Färben mischt man gleiche Teile Puffer- und Farbstofflösungen, zum Spülen gleiche Teile Puffer und dest. Wasser. Die Methode gibt Äquivalentwerte für die eingehaltenen physikalisch-chemischen und technischen Bedingungen; daher muß die Technik konstant gehalten werden, um vergleichbare Werte zu erzielen bzw. Verschiebungen der normalen Werte feststellen zu können ( P i s c h i n g e r ) . 1265. Zur Bereitung des Acetat-Veronal-Puffers nach M i c h a e l i s (31) werden 9,714 g Natriumacetat ( N a C 2 H 3 0 2 + 3 H 2 0 ) und 14,714 g VeronalNatrium in CC>2-freiem Wasser zu einem Volumen von 500 ccm gelöst. Von dieser Stammlösung werden j e 5 ccm mit 2 ccm einer 8,5°/oigen NaCl-Lösung, a ccm n/10 HCl und (18—a) ccm H a O versetzt.- Durch den NaCl-Zusatz wird die Ionenstärke des Puffers stets gleich einer für Blut isotonischen Salzlösung gehalten. Die Intervalle in der Tabelle sind entsprechend dem Wechsel in der Neigung der Kurve so gewählt, daß zwischen den angegebenen Intervallen eine lineare Interpolation erlaubt ist.

TABELLE 8

a

PH

0 0,25 0,5 0,75 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5

9,64 9,16 8,90 8,68 8,55 8,18 7,90 7,66 7,42 7,25 6,99 6,75

a

PH

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

6,12 5,32 4,93 4,66 4,33 4,13 3,88 3,62 3,20 2,62

1266. Z e i g e r (35) zieht der Alkoholfixierung die Fixierung in saurem Formol ( 1 : 4 ) vor, da bei ihr die Naturtreue der Strukturfixierung erheblich besser ist als bei Alkoholfixation u. andererseits bei gleichzeitiger Verschiebung der Umladungsbereiche nach der sauren Seite das gegenseitige Verhältnis der Ladung der einzelnen Gewebselemente nicht berührt wird. Dazu bietet die Formolfixierung bei Anwendung der Gefrierschnittmethode noch den Vorteil einer weitgehenden Stabilisierung der Fette und Lipoide. Z e i g e r verweist dabei auch auf die Feststellungen von Y a s u z u m i (33), nach welchen auch die Fixierung in reinem Alkohol den Wert der Umladungsbereiche von lebenden Gewebselementen nicht unangetastet läßt.

302

Untersuchung von Epithelien und Endothelien

§ 1267—1271.

17. KAPITEL

Die Untersuchung von Epithelien und Endothelien 1267. Zur f r i s c h e n U n t e r s u c h u n g w e r d e n die Epithelien d u r c h leichtes Abschaben einer epithelbekleideten Oberfläche mittels eines s c h a r f e n Messers gewönnen. Z u r E n t n a h m e von Pflasterepithelien eignet sich u. a. die Zungenoberfläche. Z u r Beobachtung der F l i m m e r e p i t h e l i e n dienen als k l a s sische Objekte die G a u m e n s c h l e i m h a u t der Frösche oder die K i e m e n p l ä t t c h e n d e r Muscheln, f e r n e r die Lebergangzellen der Schnecken. Auch viele in der Harnblase u n d K l o a k e des Frosches anzutreffende P a r a s i t e n h a b e n f l i m m e r n d e Oberfläche. 1268. Als U n t e r s u c h u n g s f l ü s s i g k e i t frischer Objekte dient K ö r p e r f l ü s s i g k e i t oder eine der in § 118—124 genannten Beobachtungsflüssigkeiten. D u r c h Zusatz schwacher S ä u r e n u n d Alkalien läßt sich der E i n f l u ß auf die F l i m m e r u n g studieren (Kalilauge [1 : 1000 Wasser] w i r k t z. B. e r regend). Will m a n die F l i m m e r b e w e g u n g zur besseren B e o b a c h t u n g v e r l a n g samen, d a n n setzt m a n zur Beobachtungsflüssigkeit etwas Gummilösung. In Z u n g e n - oder M u n d h ö h l e n a b s t r i c h e n findet m a n neben Plattenepithelien u n d zahllosen B a k t e r i e n auch Speichelkörperchen, in deren P r o t o p l a s m a häufig zahlreiche in B r o w n s c h e r Molekularbewegung befindliche K ö r n c h e n eingelagert sind. 1269. Um ü b e r die F o r m von Epithelzellen ins k l a r e zu kommen, ist es o f t nötig, die einzelnen Epithelzellen zu isolieren. Dies geschieht d u r c h Einlegen von lebensfrischen, nichtfixierten Epithelfetzen oder von Stücken epithelial ausgekleideter Organe (z. "B. Darm, Trachea) in I s o l i e r u n g s - ( M a z e r a t i o n s - ) F l ü s s i g k e i t e n . Dabei soll die Flüssigkeitsmenge e t w a dem gleichen oder höchstens d r e i f a c h e n Volumen des zu m a z e r i e r e n d e n O r g a n s entsprechen, da bei reichlicher Flüssigkeit die fixierende W i r k u n g o f t überwiegt. D u r c h E i n w i r k u n g bei e r h ö h t e r T e m p e r a t u r (37° C) läßt sich der Prozeß beschleunigen. Nach einer gewissen Zeit k ö n n e n die Zellen d a n n durch einfaches Schütteln, K l o p f e n oder Z u p f e n isoliert werden. Man u n t e r s u c h t in der Isolierungsflüssigkeit, in Wasser oder in Glyzerin, dem m a n u n t e r U m s t ä n d e n auch etwas F a r b stoff wie Eosin oder P i k r o k a r m i n zusetzen kann. 1270. Zu den besten I s o l a t i o n s m i t t e l n f ü r Epithelien g e h ö r t der sog. D r i t t e l a l k o h o l nach R a n v i e r (74): 30 ccm 90°/oiger Alkohol + 60 ccm Wasser. Nicht allzu große Stückchen eines frischen Epithels w e r d e n 12 bis 24 S t u n d e n in w e n i g Flüssigkeit eingelegt. F ü r gewöhnlich gelingt die Isolierung dann schon durch einfaches Schütteln, d u r c h leichtes Beklopfen der auf einen O b j e k t t r ä g e r gelegten Stückchen mit einer Z u p f n a d e l oder d u r c h Abstreifen mit einem s e n k r e c h t aufgesetzten Messer. 1271. Zur Darstellung von Flimmerepithelien eignet sich besonders das Epithel der Trachea (Hund, Katze, Mensch). Nach P o s k a - T e i ß (36) läßt sich die Schleimhaut schon 20—45 Min. nach dem Einlegen in Drittelalkohol abheben. Zur Färbung der isolierten Zellen streicht man einen Tropfen des Mazerates mit horizontal gehaltener Zupfnadel in dünner Schicht auf Glimmer oder einen Objektträger aus und stellt den noch feuchten Ausstrich für 20—30 Min. in Bouinsche Flüssigkeit. Dann 50%iger Alkohol, Wasser, Färbung mit Hämalaun-Eosin oder dgl., Alkoholreihe, Xylol, Balsam. In anderen Fällen kann es zweckmäßig sein, die noch unversehrten Gewebsstücke nach der Mazeration in toto mit Hämalaun oder Carmalaun zu färben, auszuwaschen und erst dann die Isolation der Zellen vorzunehmen.

§ 1272—1280.

Isolationsmittel für Epithelien

303

1272. E w a l d (97) fixiert n a c h der Isolierung mit Drittelalkohol noch mit ©,5%iger Osmiumsäure und wäscht einige Male aus. W e i t e r e I s o l a t i o n s m i t t e l f ü r E p i t h e l i e n sind: 1273. O s m i u m s ä u r e 1 : 1000. Man mazeriert kleine Stückchen 24 S t u n den und länger, wäscht mit Wasser und zerzupft in Wasser oder in Glycerin. 1274. J o d s e r ü m nach M. S c h u l t z e (64): Amniosflüssigkeit wird bis zur Sättigung mit Jod versetzt (0,1 g Jod löst sich in etwa 700 ccm Amniosflüssigkeit). Einwirkung: 24 Stunden oder länger. 1275. W ä s s e r i g e C h r o m s ä u r e l ö s u n g 1:1000. Dauer der Einwirkung. 24 Stunden bis Wochen. Thymol- oder Kampferzusatz. Ebenso wirkt 0,5—l°/oige K a l i u m - oder A m m o n i u m b i c h r o m a t l ö s u n g oder verdünnte M ü 1 l e r s c h e F l ü s s i g k e i t (10: 1000). 1276. In wenigen Stunden mazeriert 1—2°/oige N a t r i u m f l u o r i d l ö s u n g . Für Epidermis, Linsenfasern, glatte Muskelzellen u. a. geeignet ( L e v i 04). 1277. Das A u s w a s c h e n m a z e r i e r t e r G e w e b s f r a g m e n t e e r folgt am besten und einfachsten mit einer Z e n t r i f u g e , m i t deren Hilfe sich der ganze Vorgang des Auswaschens, Färbens, Entwässern usw. ohne Materialverlust rasch und exakt d u r c h f ü h r e n läßt. Natürlich muß m a n nach jedem Flüssigkeitswechsel den Bodensatz wieder gut aufschütteln. 1278. Am zweckmäßigsten ist eine einfache Handzentrifuge oder eine kleine Wasserturbinenzentrifuge mit 2000 Umdrehungen pro Minute, da einerseits diese Geschwindigkeit zur Ausschleuderung des Sediments völlig hinreicht und andererseits bei diesen Modellen das zeitraubende, genaue Austarieren der Zentrifugengläser, das bei Benützung großer elektrischer Zentrifugen nötig ist, in Wegfall kommt. 1279. In Ermangelung einer Z e n t r i f u g e arbeitet man mit dem S e d i m e n t i e r v e r f a h r e n . Man läßt dazu die mazerierten Gewebsfragmente in einem Spitzglas absetzen und hebert d a n n die über dem Bodensatz stehende Flüssigkeit mit einem Heber nach M a y s ab. (Bei demselben ist der in die Flüssigkeit versenkte k ü r z e r e Heberschenkel am u n t e r e n Ende nochmals nach oben u m gebogen und dann kurz über der Biegung abgeschnitten, so daß die Ö f f n u n g des Rohres nach oben gerichtet ist.) Mit einem derartigen Heber kann, zumal w e n n man das Rohrlumen ziemlich eng nimmt, die Flüssigkeit fast bis zum letzten T r o p f e n abgehebert werden, ohne etwas vom Bodensatz mitzureißen. Hierauf erfolgt Zusatz der Waschflüssigkeit, erneutes Absetzenlassen usw. 1280. Bei Beobachtung frischer Epithelien oder Endothelien von der Fläche her sind die Zellgrenzen gar nicht oder n u r sehr undeutlich sichtbar. Um diese hervortreten zu lassen, bedient m a n sich der sog. Versilberungsmethode (R a n v i e r 68 und 89). Bei Einwirkung der Silberlösung auf frisches unfixiertes Gewebe spricht man von V o r v e r s i l b e r u n g , bei Einwirkung auf fixiertes von N a c h v e r s i l b e rung. Man spült dazu frische Membranen, Mesenterien, Perikardstücke, aufgeschnittene d ü n n e Gefäße, aufgeblasene Lungenalveolen usw. kurze Zeit mit dest. Wasser ab, u m etwa a n h a f t e n d e Blut- u n d Eiweißflüssigkeit fortzuschwemmen, ü b e r t r ä g t in eine 0,5%>ige wässerige Silbernitratlösung und läßt die Stücke so lange darin, bis sie anfangen, weißlich opak und undurchsichtig zu werden, was meist nach etwa 5 Minuten der Fall ist. Sodann w e r d e n die Stücke in viel dest. Wasser übertragen und an einem von der Sonne beschienenen Orte so lange stehen gelassen, bis sich die Stücke zu b r ä u n e n beginnen. Daraufhin.werden sie noch einige Male mit dest. Wasser tüchtig abgespült und entweder in Glyzerin oder dgl. untersucht oder allmählich in abs. Alkohol übertragen, ,wobei

304

Untersuchung von Epithelien und Endothelien

§ 1281—1288.

für eine geeignete Spannung der Membranen (z. B. Aufspannen mit Nadeln auf einem Kork) Sorge zu tragen ist. Xylol, Canadabalsam. An solchen Stückchen erscheinen, wenn die Versilberung gelungen ist, die Zellgrenzen resp. die Kontaktflächen der Zellen schwarz, während Zelleib und -Kerne gar nicht oder nur wenig imprägniert sind. Eine nachträgliche Färbung der Kerne, etwa mit Carmalaun, Hämalaun od. dgl. ist zulässig. Sie wird am besten nach dem Behandeln mit Alkohol eingeschoben. 1281. Beim Auftreten der Silberlinien sind nach A c h a r d und A y n a u d sowie nach J a 1 o w y und C h r z a n o w s k i (39) ausschließlich die Chloride von ursächlicher Bedeutung. 1282. Die Zellgrenzen wurden an der Epidermis mit Silbernitrat 1844 zum ersten Male von C. K r a u s e dargestellt, und in einer Dissertation, die 1854 unter C o c c i u s erschienen ist, hat F 1 i n s e r darauf aufmerksam gemacht, daß nach der Ätzung des Hornhautepithels mit einem Höllensteinstift Niederschläge zwischen den Zellen entstehen. Eine ausführliche historische Darlegung bei F. S t a d t m ü l l e r (21). 1283. Als Lösungsmittel für Silbernitrat kann statt des Wassers auch eine 0,5°/oige O s m i u m s ä u r e (R. und O. H e r t w i g) oder eine 2—3°/oige S a l p e t e r s ä u r e genommen werden, wodurch gleichzeitig auch eine fixierende Wirkung ausgeübt wird. Man lasse die Flüssigkeit etwa eine Viertelstunde einwirken, wasche etwa eine halbe Stunde mit dest. Wasser ab, übertrage in 70°/oigem Alkohol, färbe evtl. nach (Hämalaun oder Carmin) und überführe in Canadabalsam nach bekannten Regeln. 1284. O. S c h u l t z e (07) läßt eine 2°/oige Silbernitratlösung mit 0,1% Osmiumsäuregehalt während 30 Minuten einwirken. Dann spült er kurz mit dest. Wasser ab und reduziert in vollem Sonnenlicht mit l°/oiger Hydrochinon- oder Pyrogallussäurelösung. Man kann auch erst für 24 Stunden eine 0,5°/oige Osmiumsäure und dann ebensolange eine 2°/oige Silbernitratlösung einwirken lassen. Dann abspülen und reduzieren wie oben. 1285. B e i a l l e n V e r s i l b e r u n g s m e t h o d e n i s t d e r K o n t a k t von gewöh n 1ichen B 1echspate 1n , eisernen Nade1n, Pinz e t t e n usw. mit S i l b e r l ö s u n g e n auf das s o r g f ä l t i g s t e zu v e r m e i d e n . Man kann sich leicht mit improvisierten Instrumenten helfen, die man sich aus Holz, Horn, Borsten, Stacheln usw. zuammenfügt. Statt Nadeln benützt man Igelstacheln; zwei geeignet zugeschnittene Stückchen Horn oder Holz in der Verlängerung einer gewöhnlichen Pinzette festgebunden, ein Holzspatel oder Hornlöffel u. dgl. werden im allgemeinen genügen. 1286. Das S c h l u ß l e i s t e n n e t z stelle man nach § 672 oder 684 dar. 1287. Zur Darstellung der Interzellularbrücken spült K o l o s s o w (98) die Blutgefäße der zu untersuchenden Organe mit 0,6°/oiger Kochsalzlösung aus und injiziert dann folgende Lösung: 0,5°/oige wässerige Osmiumsäure 100 ccm; 0,5—1 ccm einer 30°/oigen Salpetersäure; 1 ccm Eisessig; Kalcium nitricum 10 bis 12 g. Die nach kurzer Zeit (Vi—V2 Std.) in kleine Stücke zerschnittenen Organe kommen dann auf 16—24 Stunden in 0,5°/oige Osmiumsäure und ebensolange in 10°/oige Tanninlösung, die so lange zu wechseln ist, bis die Schwärzung verschwindet. Wasser, 70%-, 85°/o-, ößVoiger und abs. Alkohol usw. Einbetten in Paraffin. Färbung nicht nötig. 1288. W o r o n i n (98) beizt Schnitte 10 Minuten oder länger in l°/oiger O s m i u m s ä u r e , behandelt sie ebensolange mit gesättigter T a n n i n lösung, überträgt sie nochmals auf etwa 20 Minuten in l°/oige Osmiumsäure und wäscht längere Zeit mit abs. Alkohol.

§ 1289—1291.

Färbemethoden

305

1289. Sicherer und schöner gelingt die Färbung der fibrillären Strukturen mit dem von L a n e - B e n s l e y für andere Zwecke empfohlenen Gentianaviolett-Orange-Farbstoff. C h a r i p p e r (28) empfiehlt' Material von Wirbellosen dazu 12—24 Stunden zu fixieren in: Zenker ohne Eisessig mit 5°/oigem Ameisensäurezusatz 4 Teile, 2°/oige Osmiumsäure 1 Teil. Für Wirbeltiermaterial: Zenker ohne Eisessig 95 ccm, Ameisensäure (85°/oig) 2,5 ccm, Osmiumsäure (2°/oig) 2,5 ccm. Paraffineinbettung. Herstellung und Anwendung der Farblösung wie in § 2227 f. Ergebnis: Kerne, Fibrillen, Granulationen purpurviolett, Protoplasma gelb. 1290. Zur Darstellung von Zellgrenzen, Flimmerhaaren mit basalen Knötchensäumen und insbesondere auch von Protoplasmafasern der sog. Stachelzellen (Faserzellen) eignet sich sehr gut die Unnasche W a s s e r b l a u - O r c e i n - E o s i n - F ä r b u ng.

F i x i e r u n g am besten in H e 11 y ; aber auch Orth, Bouin, Formol-Alkohol oder Formol möglich.

H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g e n : 1. Safraninlösung: Man erwärmt 1 g Safranin 0 (Hollborn) + 30 ccm 95°/oigen Alkohol in einem Kolben im Wasserbad, setzt nach Lösung 70 ccm dest. Waser zu und filtriert. Safranin 0 ist ein Gemisch von Tolusafranin und Phenosafranin. 2. Wasserblau-Orcein-Eosinlösung: Dieselbe wird durch Vereinigung von zwei getrennt anzusetzenden Lösungen A und B erhalten. L ö s u n g A: Man löst 1 g Wasserblau in 100 ccm dest. Wassers und 1 g Orcein in 50 ccm 96°/oigen Alkohols, vereinigt beides nach völliger Lösung und gibt 20 ccm Glyzerin und 5 ccm Eisessig zu. L ö s u n g B : 1 g Eosin (alkohollöslich) in 80 ccm absol. Alkohols. Zur Färbung mischt man 10 Teile der Lösung A mit 3 Teilen der Lösung B.

Nach der ursprünglichen Vorschrift von U n n a werden der letztgenannten Mischung noch 3 Teile einer l°/oigen Hydrochinonlösung beigegeben. Nach M a r t i n o 11 i (24) ist dieser Zusatz jedoch überflüssig. — Nach der letzten Vorschrift (29) mischt U n n a 6 Tropfen der Lösung A mit 54 Tropfen einer Lösung von 1 g Eosin (alkohollösl.) in 100 ccm abs. Alkohol.

A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g : 1. Einstellen der höchstens 5 u dicken, mit Eiweiß aufgeklebten Paraffinschnitte in die fertige Wasserblau-OrceinEosinlösung: 10 Minuten. — 2. Kurzes Abspülen in dest. Wasser. — 3. Färben in der l°/oigen Safraninlösung: 10 Minuten. — 4. Abspülen in dest. Wasser. — 5. Einstellen in eine 0,5°/oige Lösung von Kaliumbichromat: 10—15 Sekunden (s. u.). — 6. Abspülen in dest. Wasser, Differenzieren und Entwässern in absolutem Alkohol. Xylol, Canadabalsam. — E r g e b n i s : Chromatin rötlich violett', Nucleolus rot, Epithelfibrillen rötlich, Cytoplasma bläulich-violett, Bindegewebe blau, elastisches Gewebe braunrot. — Makroskopisch soll das Präparat violett aussehen. Der Farbton der Epithelfasern fällt je nach der Dauer des Verweilens im Kaliumbichromat (Nr. 5) verschieden aus; bei kurzer Dauer werden die Fasern hellviolett, bei längerer dunkelviolett und schließlich blauviolett gefärbt.

1291. D e l R i o H o r t e g a (26) empfiehlt zur Darstellung der Epithelfibrillen folgende nach Formolfixation vom 15. Tag an ziemlich sicher gelingende Methode: 1. Möglichst dünne Gefrierschnitte kommen in 10 ccm Silbercarbonatlösung (Herstellung s. § 1551), der 10—12 Tropfen Pyridin zugesetzt sind. Man erwärmt in verschlossenem Gefäß auf 50—55°'C, bis die Schnitte kräftig gefärbt sind. — 2. Auswaschen in reichlicher Menge dest. Wassers. — 3. Reduzieren in Formol 1 : 100. — 4. Fixieren in 5°/oigem Nathriumthiosulfat. Auswaschen. Steigender Alkohol. Xylol. Balsam. 20

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

306

Untersuchung des Blutes

§ 1292—1296.

1292. In O r g a n e n m i t g e m i s c h t e m E p i t h e l ( P f l a s t e r - u n d F l i m m e r - oder Z y l i n d e r e p i t h e l ) k a n n m a n die V e r t e i l u n g d e s E p i t h e l s v o n d e r O b e r fläche aus mit der Lupe nach folgender Methode von Z i l l i a c u s beurteilen: M a n s c h n e i d e t ' d i e O r g a n e , w i e K e h l k o p f , U t e r u s usw., auf, fixiert sie n a c h s o r g f ä l t i g e m R e i n i g e n i n physiologischer K o c h s a l z l ö s u n g in n a t ü r l i c h e r L a g e 24 S t u n d e n i n : g e s ä t t i g t e r P i k r i n s ä u r e l ö s u n g 1 Vol., g e s ä t t i g t e r S u b l i m a t l ö s u n g 1 Vol. u n d dest. W a s s e r 2 Vol.; aus d i e s e m G e m i s c h g e n o m m e n , w e r d e n die S t ü c k e 1 S t u n d e i n f l i e ß e n d e m Wasser g e w a s c h e n u n d auf 2—3 T a g e in e i n e gesättigte wässerige Pikrinsäurelösung übertragen. Nach Abspülen des P r ä p a r a t e s in g e w ö h n l i c h e m W a s s e r w i r d es 2—4 M i n u t e n in H ä m a l a u n u n t e r K o n t r o l l e g e f ä r b t . Z u m S c h l u ß s p ü l e man, w e n n nötig, m i t l°'/oiger Sodalösung, d a n n a u s w a s c h e n i n f l i e ß e n d e m Wasser usw. Das P l a t t e n e p i t h e l e r s c h e i n t gelb, d a s zylindrische g r ü n s c h w a r z . W e i t e r e s ü b e r die U n t e r s u c h u n g von e p i t h e l i a l e m G e w e b e in K a p i t e l 34.

18. KAPITEL

Die Untersuchung des Blutes A. Die Blutentnahme 1293. Z u r B l u t e n t n a h m e b e n ü t z t m a n eine m i t Ä t h e r g e r e i n i g t e l a n z e t t f ö r m i g e N a d e l (sog. B l u t l a n z e t t e , evtl. I m p f l a n z e t t e ) oder a m b e s t e n d e n F r a n k e schen S c h n e p p e r . M a n m a c h t d a m i t in die f e s t g e h a l t e n e F i n g e r k u p p e (oder i n das O h r l ä p p c h e n ) e i n e n r a s c h e n , 2—3 m m t i e f e n Einstich. S e h r wichtig ist es, die b e t r e f f e n d e H a u t s t e l l e v o r h e r d u r c h W a s c h e n m i t S e i f e u n d A b r e i b e n mit A l k o h o l g r ü n d l i c h zu e n t f e t t e n . Der e r s t e h e r a u s q u e l l e n d e B l u t s t r o p f e n w i r d abgewischt. F ü r j e d e s P r ä p a r a t m u ß w i e d e r ein f r i s c h h e r a u s t r e t e n d e r B l u t t r o p f e n v e r w e n d e t w e r d e n , w ä h r e n d d e r Ü b e r r e s t des v o r h e r g e h e n d e n T r o p fens abgeputzt wird. 1294. N ä g e l i empfiehlt vor der Blutentnahme zur Erzielung einer aktiven Hyperämie ein warmes Handbad zu verabreichen und die Finger hierauf trocken zu reiben. Der Einstich muß so groß sein, daß das Blut von selbst hervorquillt. Jegliches Drücken oder Quetschen der Stichwunde und ihrer Umgebung muß vermieden werden, da in diesem Falle durch Zutritt von Gewebsflüssigkeit die Zusammensetzung des Bluttropfens in unkontrollierbarer Weise verändert werden kann. Bei vergleichenden, feineren Untersuchungen nimmt man die Entnahme am besten am Morgen in nüchternem Zustand vor. 1295. O b j e k t t r ä g e r w i e D e c k g l ä s e r m ü s s e n p e i n l i c h f e t t f r e i g e m a c h t w e r d e n (vgl. § 97 ff.). M a n r e i b t sie z u l e t z t noch m i t Ä t h e r a l k o h o l ab u n d zieht sie einige Äiale d u r c h die F l a m m e . 1296. Bei h ö h e r e n W i r b e l t i e r e n (Kaninchen, M e e r s c h w e i n c h e n usw.) g e w i n n t m a n das B l u t n a c h R a s i e r e n u n d R e i n i g u n g d e r O h r m u s c h e l d u r c h A n s t e c h e n e i n e r O h r v e n e ; w e n n die G e f ä ß e nicht g e n ü g e n d h e r v o r t r e t e n , so r e i b t m a n die H a u t d e r O h r m u s c h e l k u r z e Zeit mit e i n e m m i t Toluol b e f e u c h t e t e n W a t t e bausch, w o r a u f sie sich r a s c h e r w e i t e r n . Bei k l e i n e n T i e r e n , E m b r y o n e n , A m p h i b i e n l a r v e n u s w . p u n k t i e r t m a n das H e r z m i t e i n e r f e i n e n G l a s k a p i l l a r e , o d e r m a n n i m m t das H e r z h e r a u s , wobei m a n m i t e i n e r P i n z e t t e die Herzbasis a b k l e m m t , s c h n e i d e t die H e r z s p i t z e ab u n d v e r w e n d e t das a u s t r e t e n d e B l u t z u m Ausstrich. Bei M ä u s e n u n d R a t t e n g e w i n n t m a n das B l u t d u r c h A b s c h n e i d e n eines S c h w a n z s t ü c k e s oder A n s t e c h e n e i n e r g r o ß e n E x t r e m i t ä t e n v e n e , bei F i -

§ 1297—1301.

Blutentnahme. — Frisches Präparat

307

sehen durch Abschneiden von Flossen, bei Vögeln durch Anstechen des K a m mes, einer Hals- oder Flügelvene. 1297. Über die Fehlermöglichkeiten bei der Blutentnahme bei Laboratoriumstieren, die namentlich bei kleinen Tieren, wie Maus und Ratte, recht groß sind, vgl. K l i e n e b e r g e r und C a r l (10 und 27), M a r l o f f (19), K ü h l (19), F r i t s c h (20), F l a u m (31) und H a a m (31). B. Untersuchung des irischen Präparates 1. Rote Blutkörperchen 1298. Die roten Blutkörperchen können ohne weiteren Zusatz untersucht werden. Man tupft mit einem Deckgläschen die Kuppe eines Bluttropfens ab, legt es rasch auf einen Objektträger und umrandet mit einem in geschmolzenes Paraffin oder Wachs getauchten Pinsel, um einem Verdunsten der Blutflüssigkeit vorzubeugen. Verfährt man dabei nicht rasch genug, so treten mehr oder weniger starke Veränderungen ein ( S t e c h a p f e l - o d e r M o r g e n s t e r n f o r m , K e u l e n f o r m ) . AucH die dem Objektträger beim Putzen zuerteilte elektrische Ladung kann nach B r i n c k m a n n und v a n D a m auf die Blutkörperchen verändernd wirken (Umwandlung der bikonkaven Form in Kugelform). 1299. Vermischt man den Bluttropfen mit etwas dest. Wasser, so blähen sich die Erythrozyten zunächst auf und geben dann ihren Farbstoff (Hämoglobin) ab. Sie werden dadurch immer blasser und entziehen sich mehr und mehr der Beobachtung ( S c h a t t e n ) . Setzt man dann eine 5°'/oige Lösung von Kaliumchlorat zu, so schrumpfen sie stark zusammen und nehmen wieder Hämoglobin auf. Man vergesse nicht, auch Galle desselben Tieres zuzusetzen, namentlich weil man dabei eine direkte Lösung der Blutkörperchen beobachten kann: sie blähen sich auf und explodieren förmlich. Ähnlich wirkt eine hypotonische L ö sung von Natriumchlorid oder Natriumsulfat. Bei Zusatz verdünnter (z. B. 5°/oiger) Essigsäure blähen sie sich im Augenblick der Berührung stark auf, werden zunächst etwas dunkler, um dann rasch den Farbstoff abzugeben. Man benützt diese Wirkung bei Zählungen der weißen Blutzellen, da die roten Blutkörperchen dabei unsichtbar werden, während die weißen um so deutlicher hervortreten. 1300. Die Oberflächenschicht der Erythrozyten ist für Kochsalzlösung nicht durchgängig (daher Schrumpfung), wohl aber für Harnstoff. Die Erythrozyten sind weiter impermeabel für Natrium-, Kalium-, Baryum-, Strontium- etc. -Salze, ferner für Dextrose und Inosit. Permeabel sind sie für Ammoniumchlorid, Ammoniumazetat, Ammoniumoxalat, Methyl- und Äthylalkohol, Glyzerin, Azetamid, Biuret, Pyridin ( C o h n s t e i n 96). 1301. Bei einer von A r n o l d angegebenen Methode werden die Blutkörperchen sehr gut gegen Austrocknung und mechanische Verletzung geschützt. Man sterilisiert dazu ganz dünne, mit dem Mikrotom geschnittene Scheibchen von getrocknetem H o l u n d e r m a r k durch Kochen in dest. Wasser und trocknet sie. Zur Untersuchung legt man ein derartiges Plättchen auf ein steriles Deckglas, beschickt es mit einem Bluttropfen und legt das Ganze mit dem Tropfen nach unten auf einen mit Vaseline umrandeten, hohlgeschliffenen Objektträger. W i l l man den Einfluß von Salzlösungen, Farbstoffen u. dgl. verfolgen, so befeuchtet man das Holunderblättchen vorher mit der betreffenden Flüssigkeit. Man kann schließlich auch das Ganze fixieren, einbetten usw. (Gewinnung von Holundermark s. § 134). 20*

308

Untersuchung des Blutes

§ 1302—130(5.

1302. Als i n d i f f e r e n t e B e o b a c h t u n g s f l ü s s i g k e i t z u m V e r d ü n n e n des B l u t e s ist a m b e s t e n B l u t s e r u m des gleichen Tieres. W e n i g e r i n d i f f e r e n t sind die in § 118—124 g e n a n n t e n F l ü s i g k e i t e n . Die H a y e m s c h e F l ü s s i g k e i t ( S u b l i m a t 0,5 g + N a t r i u m c h l o r i d 1,0 g + N a t r i u m s u l f a t 5 g + Wasser 200 ccm) w i r k t n a t ü r l i c h fixierend. 1303. S u p r a v i t a l f ä r b u n g d u r c h die Trockenfarbschichtm e t h o d e . Z u r F ä r b u n g des f r i s c h e n B l u t t r o p f e n s beschickt P a p p e n h e i m die O b e r f l ä c h e eines g u t g e r e i n i g t e n O b j e k t t r ä g e r s mit H i l f e eines G l a s s t a b e s o d e r d e r geschliffenen K a n t e eines z w e i t e n O b j e k t t r ä g e r s m i t e i n e r d ü n n e n S c h i c h t d e r zu v e r w e n d e n d e n w ä s s e r i g e n F a r b l ö s u n g w i e z. B. B r i l l a n t k r e s y l b l a u , M e t h y l e n b l a u , M e t h y l e n a z u r , Dahlia, N e u t r a l r o t od. dgl. u n d l ä ß t d i e selbe vollkommen antrocknen. . M c C 1 u n g e m p f i e h l t die z u r H e r s t e l l u n g des T r o c k e n f i l m s v e r w e n d e t e n F a r b s t o f f e in absol. A l k o h o l zu lösen, die O b j e k t t r ä g e r o b e r f l a c h e d a m i t zu ü b e r s c h i c h t e n u n d den A l k o h o l v e r d u n s t e n zu lassen. D a b e i ist wichtig, d a ß die g e r i n g s t e A c i d i t ä t des Alkohols die F ä r b u n g l e b e n d e r Zellen v e r e i t e l n k a n n . D e r A l k o h o l soll d a h e r v o r h e r ü b e r K a l k destilliert w e r d e n . 1304. Supravitalfärbung mit Neutralrot-Janusgrün nach S e e m a n n (30). Man bereitet zwei Stammlösungen: a) 0,2 g Neutralrot, 100 ccm (reiner!) 96°'oiger Alkohol. b) 0,2 g Janusgrün, 100 ccm 96°/oiger Alkohol. Zur Färbung mischt man 2 ccm 96°/oigen Alkohol, 1 ccm a), 0,2 ccm b). Ein Tropfen des Gemisches wird mittels dünner Pipette auf den leicht erwärmten Objektträger gesetzt und mit einem zweiten (geschliffenen) wie ein Bluttropfen ausgestrichen. Dann trocknen. Je nach der Größe des Tropfens läßt sich der Farbüberzug dünner oder dicker gestalten. Auf den so vorbereiteten Objektträger legt man dann in der in § 1298 beschriebenen Weise das mit einem frischen Bluttropfen versehene Deckglas auf und umrandet. 1305. F ä r b u n g d e r R e t i c u l o c y t e n n a c h S e y f a r t h (27). Z u n ä c h s t w i r d die O b e r f l ä c h e eines s o r g f ä l t i g s t g e r e i n i g t e n O b j e k t t r ä g e r s w i e in § 1303 m i t e i n e r Schicht e i n e r l°'/oigen Lösung von B r i l l a n t k r e s y l b l a u in a b s o l u t e m A l k o h o l b e d e c k t . F a l l s die s c h w a c h g r a u v i o l e t t e F a r b s c h i c h t n a c h d e m A n t r o c k n e n n i c h t g l e i c h m ä ß i g d ü n n a u s g e b r e i t e t ist, k a n n sie a n g e h a u c h t u n d mit e i n e m f e i n e n T u c h zu e i n e r d ü n n e n Schicht v e r r i e b e n w e r d e n . Auf d e n so v o r b e r e i t e t e n O b j e k t t r ä g e r w i r d d a n n ein richtig b e m e s s e n e r B l u t t r o p f e n a u f g e s e t z t u n d m i t H i l f e eines D e c k g l ä s c h e n s wie bei e i n e m g e w ö h n l i c h e n B l u t a u s s t r i c h gleichm ä ß i g a u s g e s t r i c h e n . Der n o c h n a s s e (!) A u s s t r i c h w i r d so r a s c h w i e m ö g lich in eine m i t f e u c h t e m F i l t r i e r p a p i e r ausgelegte, g u t s c h l i e ß e n d e P e t r i s c h a l e ü b e r t r a g e n , n a c h e t w a 5 (besser 12—15) M i n u t e n h e r a u s g e n o m m e n u n d an der L u f t getrocknet. Anschließend kann sofort untersucht werden. — Ergebnis: S u b s t a n t i a g r a n u l o - f i l a m e n t o s a scharf b l a u v i o l e t t . Nach 12—24stündigem Trocknen an der Luft können die gefärbten Ausstriche auch 3—5 Min. lang in Methylalkohol fixiert und dann mit Giemsalösung (1 Tropfen auf 1 ccm Wasser) für 20—30 Min. nachgefärbt werden. 1306. H o l b o l l v e r f ä h r t f o l g e n d e r m a ß e n : 1. P a r a f f i n s c h ä l c h e n h e r s t e l l e n a u s p a r a f f i n i e r t e m U h r g l a s oder w e i c h e r K e r z e n m a s s e , die m a n m i t der F i n g e r k u p p e eindellt. — 2. In L e u k o c y t e n p i p e t t e B l u t bis Teilstrich 0,2 a u f z i e h e n u n d in d a s P a r a f f i n s c h ä l c h e n ausblasen. — 3. Mit gleicher P i p e t t e v o n e i n e r l°/oigen B r i l l a n t k r e s y l b l a u l ö s u n g , h e r g e s t e l l t mit physiol. Kochsalzlösung, bis M a r k e 0,8 a u f z i e h e n u n d e b e n f a l l s in das P a r a f f i n s c h ä l c h e n ausblasen. — 4. Mit d ü n n e n G l a s s t a b u m r ü h r e n u n d s o f o r t in eine m i t f e u c h t e m F i l t r i e r p a p i e r ausgelegte P e t r i s c h a l e stellen. 30 Min. — 5. W i e d e r u m v o r s i c h t i g u m r ü h r e n u n d auf O b j e k t t r ä g e r ü b l i c h e n A u s s t r i c h a n f e r t i g e n . — 6. L u f t t r o c k n e n u n d auszählen.

§ 1306a—1313.

Frisches B l u t p r ä p a r a t

309

W i r d die P'oige B r i l l a n t k r e s y l b l a u l ö s u n g m i t einer 3,8°/oigen N a t r i u m c i t r a t l ö s u n g bereitet, so e r ü b r i g t sich das P a r a f f i n s c h ä l c h e n . 1306a. Darstellung der Reticulocyten im T r o c k e n p r ä p a r a t nach H i r s c h Ausstriches in f e l d - U n d r i t z (37). 1. F ä r b e n des l u f t t r o c k e n e n , unfixierten Löfflers M e t h y l e n b l a u (s. § 182) 5 Min. (vorsichtig u n d schnell aufgießen). — 2. A b s p ü l e n in dest. Wasser (lange mit s c h w a c h e m Strahl). — 3. Einstellen in Carbolgentianaviolett (s. § 704) 5—30 Min. — 4. G u t abspülen in f l i e ß e n d e m Wasser, l u f t t r o c k n e n , eindecken in B a l s a m oder Cedernöl. U n d r i t z schlägt vor »polychromatische Erythrocyten, basophil p u n k t i e r t e E., Granulofilocyten, Reticulocyten, Vitalgranulierte« einheitlich als »jugendliche E r y t h r o c y t h e n « oder »Proerythrocyten« zu bezeichnen.

1307. Zur Färbung der Fettröpfchen verwendet man in analoger Weise eine alkoholische Lösung von Sudan III. Auch die in § 1301 genannten Hollundermarkplättchen können mit den Farbstoffen durchtränkt oder bestäubt werden. Bezüglich der Färbung der Lipoide vgl. auch § 1381. 1308. U m den R a n d f a d e n v o n A m p h i b i e n e r y t h r o z y t e n ( S a l a m a n d r a a t r a oder maculosa) zu zeigen, setzt m a n zu e i n e m f r i s c h e n B l u t t r o p f e n e t w a s G e n t i a n a - oder Methylviolett-Kochsalzlösung (0,25 g Farbstoff gelöst in 100 ccm einer 6,6°/oigen NaCl-Lösung) (M e v e s). Z u r F i x i e r u n g der s u p r a v i t a l g e f ä r b t e n P r ä p a r a t e h e b t m a n n a c h B e e n d i g u n g der F ä r b u n g vorsichtig das Deckglas ab u n d setzt es f ü r 30—60 S e k u n d e n der E i n w i r k u n g von O s m i u m t e t r o x y d d ä m p f e n aus. 2. Weifte Blutzellen

1309. Die oben gegebenen Methoden gelten auch für w e i ß e Blutzellen. Will man an ihnen Lebensäußerungen, wie a m ö b o i d e B e w e g u n g e n usw. beobachten, so bedarf man bei Warmblütern eines heizbaren Objekttisches oder Mikroskopschrankes (s. § 175). Kaltblüterblut kann man dagegen bei Zimmertemperatur untersuchen. Man benützt dabei Objektträger und Deckgläser aus Quarz oder man überzieht nach D e e t j e n die Objektträgerfläche mit einer dünnen Schicht einer Agarlösung (s. § 1310), worauf man den Bluttropfen und ein Deckglas aufsetzt und mit Wachs umrandet. 1310. Zur Herstellung der A g a r l ö s u n g löst man 1 g pulv. Agar durch Kochen in 100 ccm Wasser, filtriert heiß und setzt zu 100 ccm Filtrat 0,6—0,9 g NaCl. Füllt man die Lösung in sterile, mit Wattebausch versehene Reagensröhrchen ab, so läßt sie sich 3—4 Wochen lang aufbewahren. Zum Gebrauch verflüssigt man das Agar durch Einstellen in kochendes Wasser. 1311. Um weiße Blutzellen zu gewinnen, bringt man sterile Holunderblättchen (siehe § 1301) in den Rückenlymphsack eines Frosches und vernäht die Wunde. Nach wenigen Stunden findet man sie voll von Leukozyten. Weitere Technik wie § 1301. 1312. H a b e r l a n d t (18, 19) spritzt in d e n R ü c k e n l y m p h s a c k von R a n a f u s c a 0,5 ccm einer »mäßig dichten« Suspension von sterilem K o h l e p u l v e r in R i n g e r lösung. Die nach 1—2 T a g e n e n t n o m m e n e , noch k l a r e L y m p h e e n t h ä l t reichlich Leukozyten. Als k ü n s t l i c h e r N ä h r b o d e n w i r d eine 10°/oige m i t Ringerlösung b e r e i t e t e Gelatinelösung v e r w e n d e t . Zusatz v o n Agar u n d P e p t o n w i r k t schädlich, d e r von F r o s c h b l u t s e r u m dagegen günstig. V i t a l f ä r b u n g m i t f r i s c h b e r e i t e t e r N e u t r a l r o t l ö s u n g 1 : 1 0 000 (in physiologischer Kochsalzlösung). — Eine einfache M e t h o d e s. f e r n e r bei v a n H e r w e r d e n (19).

1313. Um die feinsten Protoplasmaausläufer zu sehen, arbeite man mit Dunkelfeldbeleuchtung (ein besonders günstiges Untersuchungsobjekt sind die Hämolymphzellen des Flußkrebses).

310

Untersuchung des Blutes

§ 1314—1317.

3. Blutplättchen

1314. Die Blutplättchen verändern sich außerordentlich leicht; u m sie zu untersuchen, b r i n g t m a n einen Tropfen einer l°/'oigen Osmiumsäure auf die vorher gut gereinigte H a u t und sticht d a n n unter dem Tropfen ein, so daß sich das Blut mit der Flüssigkeit mischt ohne vorher mit der L u f t in B e r ü h r u n g zu kommen. Dann A b n e h m e n des Tropfens mit dem Deckglas usw. . 1315. An Stelle von Osmiumsäure k a n n m a n auch 0,6—0,9%ige Kochsalzlösung mit geringem Methylviolettzusatz (500 :0,1), die Hayemsche Flüssigkeit (s. § 1298) oder 149/oige Magnesiumsulfatlösung verwenden. U m B l u t p l ä t t c h e n i n M e n g e z u g e w i n n e n , läßt m a n nach B ü r k e r einen großen Bluttropfen auf einen in Paraffin getauchten und hierauf wieder erkalteten Objektträger fallen u n d stellt ihn in einer mit angefeuchtetem Filtrierpapier ausgelegten Petrischale f ü r 20—30 Minuten in den B r u t schrank. Der T r o p f e n gerinnt dabei nicht, die Blutkörperchen sinken zu Boden, w ä h r e n d die spezifisch leichteren Blutplättchen sich oben sammeln und bei Betupfen der T r o p f e n k u p p e mit einem Deckgläschen an diesem massenhaft kleben bleiben. 1316. M e t h o d e v o n D e g k w i t z (20): Auf einen mit Paraffin ü b e r zogenen O b j e k t t r ä g e r bringt man 2 T r o p f e n Blutplättchenfixativ (s. u.), einen weiteren auf die gereinigte Fingerbeere. Dann erfolgt Einstich durch den Tropfen, in der Weise, daß die Wunde erst auf leichtesten Druck hin n u r einen kleinen B l u t t r o p f e n austreten läßt, der durch eine Bewegung des Fingers sogleich mit dem Fixativ vermischt wird. Nach sofortiger Ü b e r t r a g u n g eines Tropfens auf den Objektträger wird durch Stoßen an dessen Rand f ü r rasche Mischung gesorgt. Von dem Gemisch w i r d mit einer Nadel ein kleinster Tropfen auf einen fettfreien O b j e k t t r ä g e r gebracht und mit Deckglas bedeckt (Schwimmpräparat). Bei U n t e r s u c h u n g mit Immersion sieht m a n die grünlich schimmernden P l ä t t chen als dünne, scharf konturierte Scheiben. Das B l u t p l ä t t c h e n f i x a t i v besteht aus: H 2 0 100 ccm; Na P 0 3 (Natriummonophosphat) 0,4 g; Na C1 0,4 g; Formol 40°/o 3 ccm; es wird in einem braunen Tropfglas aufbewahrt. Zur F ä r b u n g verfährt man zunächst w i e oben und setzt dann zu 3 Tropfen der Blutmischung 3 Tropfen einer Lösung zu, die in 100 ccm H 2 0 1 g Na Cl, 0,3 g Na 3 PO4 (Natriumtriphosphat) und 3 ccm Formol enthält. In den 6 Tropfen verrührt m a n einige Körnchen Brillantkresylblau bis zu deutlicher Blaufärbung. Nun entnimmt man von dem Gemisch ein Tröpfchen mit einer Nadel, bedeckt mit Deckglas und betrachtet mit Immersion. Die Plättchen zeigen in einer homogenen, schwach grünblau gefärbten Grundsubstanz feine, blaugefärbte Granula. Ein Innenkörper oder Kern ist nicht zu sehen. Größe: (Mensch) 2—3 .«, seltener bis zu 5 u (über Zählung der Blutplättchen s. § 1450).

C. Das Ausstrichpräparat 1. Herstellung des Ausstriches

1317. V o r b e d i g u n g f ü r g u t e B l u t a u s s t r i c h e ist die Verwend u n g sorgfältig gereinigter, fettfreier Objektträger, die man in Äther-Alkohol od. dgl. vorrätig hält und vor Gebrauch mit einem sauberen Leinenläppchen abtrocknet (s. auch § 97 f.). Eine B e r ü h r u n g der Ausstrichfläche mit dem Finger ist sorgfältig zu vermeiden.

§ 1318—1322.

Herstellung des Blutausstriches

311

1318. Zur Herstellung eines Deckglaspräparates verwendet man quadratische Deckgläschen von 20 oder 22 mm Kantenlänge. Man nimmt mit der Mitte des Deckglases einen kleinstecknadelkopfgroßen Bluttropfen ab und läßt ein zweites über Eck (s. Abb. 19) darauffallen, so daß sich' die Blutkörperchen durch Kapillarität gleichmäßig zwischen beiden Deckgläschen ausbreiten. Kurz darauf zieht man sie unter Vermeidung jeglichen Druckes mit einem einzigen sanften Zug wieder auseinander. Man faßt sie dabei mit je zwei Fingerspitzen an den in Abb. 19 schwarz gezeichneten Ecken.

1319. Bei Herstellung eines Objekffrägerausstridies tupft man einen linsengroßen Bluttropfen an der in Abb. 20 schraffierten Stelle ab. Der Objektträger A darf dabei nur die Kuppe des Bluttropfens berühren und nicht etwa an die Haut angedrückt werden. Sofort nach der Abnahme schiebt man von der Mitte des Objektträgers A her einen zweiten schräg gehaltenen Objektträger B an den Tropfen heran, läßt diesen sich entlang der Kante ausbreiten und schiebt dann den Objektträger B in schräger Stellung in der Richtung des Pfeiles (nicht umgekehrt!) über den Objektträger A hinweg. Dadurch wird der Bluttropfen in gleichmäßig dünner Schicht über den Objektträger ausgebreitet. Je spitzer der Winkel a ist, dest dünner wird der Ausstrich. (Der zum Ausziehen des Tropfens benützte Objektträger B besitzt am besten geschliffene Kanten; unbedingt nötig ist es jedoch nicht.) Nach dem Ausstreichen läßt man das Präparat, evtl. unter Hin- und Herbewegen, möglichst rasch l u f t t r o c k e n werden. 1320. Um zu vermeiden, daß der Rand des Blutausstriches mit dem Rand des Objektträgers zusammenfällt, verschmälert man zweckmäßig den Objektträger B durch Abschneiden einer Ecke oder verwendet an seiner Stelle ein großes Deckglas von 20—22 mm Breite. 1321. Das Ausziehen des Bluttropfens darf weder zu rasch noch zu langsam erfolgen. Arbeitet man zu langsam, so nehmen die Erythrocyten infolge Wasserverdunstung Stechapfelform an. Arbeitet man zu hastig, dann wird der Ausstrich ungleichmäßig. Das gleiche ist der Fall, wenn man den ausstreichenden Objektträger zu flach hält, sodaß der Winkel a der Abb. 20 zu spitz wird. Die optimale Geschwindigkeit läßt sich aus ein paar Probeversuchen sehr bald erkennen. 1322. Bei einem guten Ausstrichpräparat müssen die Blutkörperchen schließlich in g a n z d ü n n e r S c h i c h t und eines m ö g l i c h s t i s o l i e r t vom andern über die Glasfläche ausgebreitet sein. Übereinanderliegen und gegenseitiges Verkleben der Blutkörperchen ist meist darauf zurückzuführen, daß der Bluttropfen zu groß gewählt wurde. Zerquetschte und deformierte Blutkörperchen weisen auf eine falsche Bewegung des ausstreichenden Objektträgers hin, Stechapfelformen u. a. treten bei zu langsamem Trocknen auf. Eine ungleichmäßige Verteilung der Blutkörperchen kann auch mit Verunreinigung

312

§ 1323—1329.

Untersuchung des Blutes

des Objektträgers durch Fettspuren oder mit elektrischer Ladung (infolge Reibens beim Reinigen!) zusammenhängen. Zur Vermeidung ziehe m a n den Obj e k t t r ä g e r nach d e m Putzen mehrmals durch eine Flamme und lasse abkühlen. 1323. F ü r gewisse Zwecke (z. B. Nachweis von Parasiten schwacher I n f e k tion) dienen sog. » d i c k e T r o p f e n p r ä p a r a t e « nach R o ß . Man stellt sie am besten in d e r Weise her, daß m a n einen größeren Bluttropfen auf einen reinen O b j e k t t r ä g e r setzt und ihn durch Schräghalten des Objektträgers eine kurze Strecke weit herabrollen läßt oder ihn mit einer Glasnadel auf Pfenniggröße ausbreitet. Wichtig ist ein rasches Trocknen des Präparates, das man am besten durch 1—2stündiges Einlegen in den Brutschrank erreicht. (Vgl. auch S c h i 11 i n g 20, 33 und § 1365.) 1324. H a r v a r t h vermischt den Bluttropfen sofort mit einem Tropfen 2°/oiger Natriumcitratlösung und breitet ihn mit Glasstab auf etwa Zehnpfennigstückgröße aus. Dadurch wird besseres Haften und bessere Durchsichtigkeit erzielt. 2. Fixierung des Ausstrichpräparates

a) F i x i e r u n g

des l u f t t r o c k e n e n

Ausstriches.

1325. Am besten ( b e s o n d e r s f ü r G i e m s a f ä r b u n g ) stellt man die lufttrockenen Ausstriche f ü r 5—10 Minuten in reinen, wasserfreien M e t h y l a l k o h o l , n i m m t sie mit der Pinzette h e r a u s und stellt sie zum Trocknen einzeln schräg auf Filtrier^» apier auf. Man verwendet f ü r den Methylalkohol am besten ein mit Schliffstopfen versehenes Färbeglas (s. Abb. 1"4, § 579). A n dernfalls w i r d der Methylalkohol nach Gebrauch sofort wieder in eine Flasche mit Schliffstopfen zurückgegossen. Bei M a y - G r ü n w a l d p r ä p a r a t e n ist eine Fixierung unnötig, da diese durch den in der F a r b e enthaltenen Methylalkohal besorgt wird. 1326. Der Methylalkohol (Methanol) muß wasserfrei und frei von Verunreinigungen, besonders Aceton, sein. Am besten verwendet man »Methanol zur Analyse« von Kahlbaum oder Merck. Um Methylalkohol unbekannter Güte auf Aceton zu prüfen, verdünnt man stark mit Wasser und setzt einige Tropfen einer frisch hergestellten Lösung von Nitroprussidnatrium zu: Bei Anwesenheit von Aceton erfolgt Rotfärbung, die sich bei Eisessigzusatz verstärkt. Um wasserhaltigen Methylalkohol zu entwässern, läßt man ihn über CaO (nicht Kupfersulfat!) stehen und destilliert dann ab. 1327. Statt in Methylalkohol kann man, allerdings weniger sicher, auch in absolutem Alkohol oder in einem Giemisch von gleichen Teilen absol. Alkohol und Äther (30 Min. oder länger) fixieren. Die letztere Methode soll nach N i k i f o r o w auch die Hitzefixation ersetzen. Aceton (5 Minuten) ist weniger zu empfehlen. Auch nach diesen Fixierungen läßt man die Ausstriche wieder lufttrocken werden. 1328. F ü r manche F ä r b u n g e n (besonders Triazidfärbung) w i r d der Ausstrich durch H i t z e fixiert ( E h r l i c h ) . Man erhitzt dazu eine K u p f e r p l a t t e durch eine d a r u n t e r gestellte Bunsenflamme so stark, daß ein a u f g e t r o p f t e r Wassertropfen das Leidenfrostsche P h ä n o m e n zeigt. (Hin- und Herrollen in Kugelform.) An diese Stelle legt man das lufttrockene Deckglas f ü r 5—30 Sek u n d e n (meist genügen 7—10 Sekunden) mit der Schichtseite nach unten auf. Die Dauer der Einwirkung ist von großem Einfluß auf die Güte der ^Färbung (es handelt sich dabei oft nur um Sekunden). Bei zu langer Einwirkung der Hitze bekommen die .Granula zackige Form. 1329. F ü r die Fixierung der Blutzellen niederer Wirbeltiere empfiehlt W e r z b e r g folgende Methode:

§ 1330—1335.

Fixierung des Blutausstriches

313

Die l u f t t r o c k e n e n Ausstriche werden am folgenden Tag 1—2 Minuten durch die Dämpfe von folgendem Gemisch fixiert: 3 ccm Jodtinktur + 1 ccm Formalin + 10 Tropfen einer 2°'/oigen Osmiumsäurelösung und Eisessig §5. Nach einem weiteren Tag wird gefärbt. F ä r b t man zu früh, so treten F a r b inversionen auf. Zur Darstellung sehr zarter Elemente, z. B. von Spindelzellen, fixiert man die Ausstriche, solange sie noch feucht sind. b) F i x i e r u n g

des

feuchten

Ausstriches.

Bei den nachfolgenden Methoden werden die Ausstriche in noch feuchtem Zustand, also vor dem Lufttrockenwerden, fixiert. 1330. Gute Ergebnisse liefert die O s m i u m r ä u c h e r u n g n a c h W e i d e n r e i c h , durch die besonders auch die Blutplättchen gut fixiert werden. Die gereinigten Objektträger werden für 1—2 Minuten über eine Glasschale gelegt, in die man 5 ccm einer l°'/oigen Osmiumsäure und 8—10 Tropfen Eisessig gegeben hat. Das Ganze überdeckt man mit einer Glasglocke. . Dann streicht man einen frischen Bluttropfen auf der geräucherten Glasseite des Objektträgers aus und setzt die noch feuchte Blutschicht nochmals höchstens 1 Minute den Dämpfen aus. (Längere Einwirkung beeinträchtigt die Färbbarkeit.) Hierauf zieht j n a n ihn 5mal durch eine Flamme. Vor der Färbung stellt man ihn 1 Minute in eine hellrote Lösung von übermangansaurem Kali, wäscht ab und färbt (besonders mit Giemsalösung s. § 1357).

1331. Die Räucherung kann man auch in einem mit eingeschliffenem Glasstopfen versehenen Glastubus vornehmen, an dessen Boden man etwas mit der Flüssigkeit befeuchtete Glaswolle geschoben hat.

1332. Statt mit Osmiumdämpfen kann man auch mit Formoldämpfen fixieren, was besonders für Amphibienblut vorzuziehen ist (W e i d e n r e i c h ) .

1333. U m d i e F o r m d e r w e i ß e n B l u t z e l l e n , die bei gewöhnlichen Ausstrichen sehr oft beschädigt wird, g u t z u e r h a l t e n , empfiehlt sich folgende Methode W e i d e n r e i c h s : Zunächst gießt man eine nach § 1310 bereitete und durch Einstellen in kochendes Wasser verflüssigte Agarlösung in nicht zu dünner Schicht auf einer reinen horizontal stehenden Glasplatte aus. Nach Erstarren (nicht Trocknen!) schneidet man vierseitige Plättchen aus, die kleiner als das später zu benützende Deckglas sind. Mehrere derselben bringt man dann in Abständen auf eine Glasplatte. Dann tupft man mit einem sorgfältig gereinigten, durch die Flamme gezogenen Deckglas einen nicht zu großen Bluttropfen ab und legt ihn ohne Druck und Schub auf das Agarplättchen auf. Nach 5—10 Minuten, während welcher man, falls man Bewegungsstudien machen will, die Glasplatte in den Brutofen stellt (37° C), gibt man, ohne das Deckglas zu berühren, einige Tropfen einer l°/oigen Osmiumsäure von der Seite her unter das Deckglas, so daß der freigebliebene Rand zwischen Glas und Agar völlig ausgefüllt wird. Nach etwa 5 Minuten hebt man das Deckgläschen vom Agar ab, spült mit Wasser ab und färbt die an ihm haftengebliebene Blutschicht (am besten nach Giemsa).

1334. Bei der Färbung der fixierten feuchten Ausstriche fallen die Farbtöne häufig etwas anders aus, als bei typisch vorbehandelten lufttrockenen Ausstrichen. 1335. Zur Herstellung von Organausstrichen streicht man mit der K a n t e eines Objektträgers über die Schnittfläche des betreffenden Organs und stellt mit dem dadurch gewonnenen Organsaft nach § 1319 ein Ausstrichpräparat her. Oder man tupft die frische Schnittfläche des Organes mehrmals nebeneinander auf den Objektträger. Das n o c h f e u c h t e Präparat kommt sofort für kurze Zeit (ca. 10 Minuten) in Hellysche oder Maximowsche Fixierungsflüssigkeit (Zenker: 100 ccm + Formol 5 bzw. 10 ccm). Dann wird in fließendem Wasser

Untersuchung des Blutes

314

§ 1336—1340.

gut ausgewaschen (ca. 1 Stunde), auf je 10 Minuten in 70°/oigen u n d 90°/'oigen Alkohol gestellt, durch 70°/oigen Alkohol zurück in dest. Wasser gebracht und ohne vorheriges Trocknen gefärbt. (Allenfalls auch Sublimat- und J o d e n t f e r nung nach § 327 und 328.) 3. Die Färbung des Ausstrichpräparates

P r a k t i s c h am w i c h t i g s t e n ist von den n a c h f o l g e n d e n M e t h o d e n die F ä r b u n g nach M a y - G r ü n w a l d (oder Jenner), G i e m s a u n d b e s o n d e r s d i e K o m b i n a t i o n b e i d e r F ä r bungen nach Pappenheim. a)

Allgemeine

B e m e r k u n g e n zur Ausführung der Färbung. 1336. F ü r das tadellose Gelingen der nachfolgenden Färbungen, insbesondere der Azur-Färbungen, ist peinlich sauberes Arbeiten unerläßliche Vorbedingung. Alle zur V e r w e n d u n g gelangenden Glasinstrumente müssen sorgfältig gereinigt und frei von Säure- und Alkalispuren sein. Man v e r w e n d e n u r gutes Glas, kein gewöhnliches Alkaliglas. 1337. V o n ü b e r r a g e n d e r B e d e u t u n g f ü r d a s Gelingen der B 1 u t f ä r b em e t h o d e n ist d i e R e a k t i o n des z u r V e r d ü n n u n g der F a r b l ö s u n g e n und zum Auswaschen verw e n d e t e n d e s t . W a s s e r s . Sie soll, wie schon G i e m s a betonte, am N e u t r a l p u n k t liegen. Die Erfüllung dieser Forderung ist besonders bei allen mit Azur arbeitenden Methoden von Wichtigkeit. 1338. Häufig b e r u h t das Fehlschlagen der Azurfärbungen, wenn Verunreinigungen durch unsaubere Gläser, Pipetten usw. ausgeschlossen w e r d e n können, auf einem zu hohen Kohlensäuregehalt des dest. Wassers ( G i e m s a ) . In diesem Falle hilft auch mehrmaliges Destillieren nichts, da die Kohlensäure in das Destillat übergeht. U m sie zu beseitigen, läßt m a n das benötigte Tagesquant u m an dest. Wasser in einem unbedeckten Stehkolben aus J e n a e r Glas auf einem Drahtnetz 5—10 Minuten lang l e b h a f t sieden. Nach Abkühlen verschließt man mit einem gut sitzenden Gummistopfen. 1339. Z u r P r ü f u n g d e s d e s t . W a s s e r s gibt G i e m s a in eine Probe von ca. 10 ccm 3—4 Tropfen einer Hämatoxylinlösung, die durch Auflösen einiger Körnchen Hämatoxylin in absol. Alkohol j e w e i l s f r i s c h b e r e i t e t wird. Das Wasser soll nach wenigen Minuten eine immer intensiver w e r d e n d e R o t f ä r b u n g zeigen. Bleibt es farblos, so setzt man dem Wasservorrat t r o p f e n weise ,so viel einer 1-promilligen Natriumkarbonatlöung zu, bis die H ä m a t o x y linprobe in einer neuen Wasserprobe innerhalb 1—3 Min. (aber nicht früher!) positiv ausfällt. Die P r ü f u n g des Wassers kann auch durch Feststellung seiner Wasserstoffionenkonzentration mit Hilfe von Indikatoren oder, mit Annäherung, mittels des Wulffschen Folienkolorimeters erfolgen. Das Optimum liegt f ü r h ä m atologische Zwecke bei PH 6,8. 1340. Eine Reihe von Autoren hat empfohlen, die Wasserstoffionenkonzentration des bei der F ä r b u n g benutzten Wassers durch Zusatz von Puffergemischen in geeigneter Höhe zu stabilisieren und dadurch den »Wasserfehler« auszuschalten. Die Angaben über die optimale Wasserstoffionenkonzentrion und den geeigneten Pufferungsgrad weichen voneinander allerdings nicht unbeträchtlich ab. Das b e r u h t zum Teil darauf, daß das Optimum nicht f ü r alle Objekte gleich liegt. Bekanntlich wird die Giemsafärbung nicht n u r f ü r h ä m a t o -

§ 1341—1347.

Färbung des Blutausstriches

315

logische Zwecke, sondern auch zur F ä r b u n g von Blut- und Gewebeprotozoen gebraucht. M c C 1 u n g empfiehlt f ü r die ganze Bluttechnik an Stelle von dest. Wasser das in § 1341 angegebene Puffergemisch von H a d e n auch zum Verd ü n n e n der Farblösungen. F ü r Protozoenfärbung h a t sich nach G i e m s a (34) die Pufferung nach W e i s e (s. § 1344) gut bewährt. 1341. Nach H a d e n ( 2 3 ) soll das dest. Wasser schwach sauer sein ( P H < = 6 , 0 bis 6,6). Die von ihm empfohlene Pufferlösung enthält einbasisches Kaliumphosphat nach Sörensen 6,63 g, sekundäres Natriumphosphat nach Sörensen 2 , 5 6 g, dest. Wasser auf 1 0 0 0 , 0 ccm. P H = 6 , 4 . 1342. C o l l i e r bereitet ein m/5 Phosphatgemisch durch Mischen von 1 m = 3 n Phosphorsäure (Merck) 20,0 ccm, n - Natronlauge 33,6 ccm, dest Wasser 46,4 ccm. Diese Pufferlösung ist haltbar und wird vor Gebrauch mit dest. Wasser auf das lOfache verdünnt. Ph des fertigen Wassers = 7,1,. 1343. B ä 1 i n t verwendet zur P u f f e r u n g des dest. Wassers die Sörensenschen m/15-Lösungen von p r i m ä r e m Kaliumphosphat und sekundärem Natriumphosphat. Man mischt 4 Teile der primären mit 6 Teilen der sekundären Phosphatlösung und verdünnt mit der 10—20fachen Menge dest. Wassers. PH des fertigen Wassers = 6,98. Zur Herstellung der m/15 primären Kaliumphosphatlösung gibt man genau 9,078 g des Salzes (KH2PO4nach S ö r e n s e n , Kahlbaum) in einen 1000 ccm Maßkolben und füllt bei der auf dem Kolben angegebenen Aichtemperatur (meist 18 oder 20° C) mit dest. Wasser auf 1000,0 auf. Für die m'15 sekundäre Natriumphosphatlösung löst man in gleicher Weise 11,876 g sekundäres Natriumphosphat (Na2HP04 + 2 H 2 0 nach S ö r e n s e n , Kahlbaum). 1344. W e i s e (33) füllt 0,49 g Kaliumphosphat nach S ö r e n s e n und 1,14 g Natriumphosphat nach S ö r e n s e n mit abgekochtem dest. Wasser auf 1000 ccm auf. Das gepufferte Wasser w i r d in einer Flasche mit doppelt durchbohrtem Stopfen a u f b e w a h r t ; die eine Bohrung trägt ein N a t r o n k a l k r o h r zum Schutz gegen die Kohlensäure der Luft, durch die andere f ü h r t ein Heberohr mit Quetschhahn. Das Wasser bleibt so m e h r e r e Wochen brauchbar. PH = 7,2. Das Salzgemisch wird von Hollborn als W e i s e s P u f f e r s a l z g e m i s c h für 1 und 5 1 reichend gebrauchsfertig geliefert. 1345. M o m m s e n puffert das destillierte Wasser f ü r spezielle Zwecke (s. § 1 3 6 2 ) , indem er 6 , 7 ccm 1 m = 3 n-Phosphorsäure und 1 0 , 0 n-Natronlauge mit destilliertem Wasser auf 1 0 0 0 , 0 ccm auffüllt. P H = 5 , 4 . Die Trockensubstanz ist unter der Bezeichnung M o m m s e n s PufferG e m i s c h bei Hollborn in Gelatinekapseln erhältlich; der Inhalt einer Kapsel wird in 100 ccm dest. Wasser gelöst. Haltbarkeit der Lösung 2—3 Monate. 1346. Die B l u t f ä r b u n g e n w e r d e n b e i O b j e k t t r ä g e r a u s s t r i c h e n in der Regel so vorgenommen, daß der horizontal in einer Petrischale auf zwei Glasstäben liegende Objektträger mit der, Farblösung in 1—2 m m hoher Schicht überschichtet wird, wobei man sorgfältig ein Herabfließen der Flüssigkeit über die Ränder des Objektträgers vermeidet. Auf einen Objektträger rechnet man m a x i m a l 30—40 Tropfen Flüssigkeit, auf ein Deckglas (22 mm) 8—10 Tropfen. Bei zu wenig Flüssigkeit gibt es leicht Niederschläge. Das Einschließen in eine Petrischale usw. ist nötig, u m ein Verdunsten u n d eine dadurch eintretende Farbstoffausfällung zu vermeiden. Recht zweckmäßig sind auch die f ü r Einzelobjektträger berechneten »Färbewännchen nach Giemsa« (erhältlich bei Zeiss, Hollborn und anderen Firmen). 1347. Für gleichzeitige Färbung einer größeren Anzahl von Präparaten ist der Färbetrog nach M. M a y e r (s. Lautenschläger Katalog 100, Nr. 5882) empfehlenswert.

316

Untersuchung des Blutes

§ 1348—1352.

1348. Bei Farbflüssigkeiten, die zu Niederschlagsbildung neigen, kann es zweckmäßig sein, die Ausstriche mit der Schicht nach unten zu färben. D e c k g l a s präparate läßt man dazu einfach auf der Flüssigkeit schwimmen oder man legt sie mit der Schichtseite nach abwärts in ein Uhrgläschen oder Blockschälchen und unterschichtet mit Farblösung, bis die Flüssigkeit die Unterfläche des Deckgläschens benetzt. Bei O b j e k t t r ä g e r ausstrichen verfährt man in der Weise, daß man auf den sauberen Boden einer Petrischale die beiden Hälften eines zerbrochenen Objektträgers und auf diese dann mit der Schichtseite nach unten das Ausstrichpräparat legt. Dann w i r d der zwischen den beiden Glasböcken befindliche Spaltraum von der Seite her mittels einer Pipette mit Farblösung gefüllt. 1349. Z u m A b m e s s e n d e r M e n g e n beim Verdünnen der Farblösungen verwendet man am besten graduierte Pipetten von 1 ccm Inhalt, geteilt in 1/100. Da sich die Tropfengröße je nach der Ausflußöffnung ändert, hält man sich zweckmäßig statt an Tropfenzahl an genaue Maßzahlen, wobei man zehn Tropfen gleich 0,30 ccm rechnet. Absolut iu v e r w e r f e n ist das zwar häufig geübte, aber sehr ungenaue und unsaubere direkte Heraustropfen der Lösung aus der Flasche. Der Gebrauch von Stiftgläschen (s. § 623) ist für Giemsalösung u. dgl. weniger empfehlenswert, da es im Tropfröhrchen infolge der Flüchtigkeit des Lösungsmittels leicht zu Farbstoffniederschlag kommt. 1350. Die Pipetten müssen nach Gebrauch gleich wieder mit dest. Wasser, 96°/'oigem Alkohol und dest. Wasser mehrmals ausgespritzt werden. Dann stellt man sie zum Trocknen mit der Spitze nach oben in ein mit Watte belegtes Zylinderglas. Mißt man die Farblösung im Meßzylinder ab, so stellt man die Verdünnung nicht durch Nachgießen von dest. Wasser in den gleichen Zylinder her, sondern schüttet die in getrennten Zylindern abgemessenen Mengen in ein gesondertes Gefäß zusammen. Dazu benützt man am besten ein mit Schnabel versehenes Becherglas von ca. 50 ccm Inhalt oder ein Färbeglas von 2,5—3 cm Durchmesser (auf keinen Fall aber enge Reagensröhrchen!). Die Lösung wird rasch in das dest. Wasser geträufelt und das Mischglas schnell 5—8mal herumgeschwenkt, bis beide Flüssigkeiten homogen durchmischt sind, nicht länger, da sonst der Farbstoff leicht ausgefällt wirdi

1351. N a c h d e r F ä r b u n g wird der Ausstrich kurz in dest. oder gepuffertem Wasser abgespült (am besten mit der Spritzflasche mit kräftigem Strahl) und mit Filtrierpapier abgetrocknet. Schon nach einigen Minuten kann der lufttrockene Ausstrich direkt mit einem Tropfen Immersionsöl bedeckt und untersucht werden. Nach Beendigung der Untersuchung wird das ö l mit einem weichen mit Chloroform befeuchteten Leinenläppchen weggewischt. Falls Einschluß unter Deckglas erwünscht ist, so wird der lufttrockene Ausstrich am besten direkt in Immersionsöl oder in Paraffinum liquidum eingedeckt. A n Stelle von Canadabalsam verwendet man besser Caedax; zum mindestens muß der Canadabalsam neutralisiert sein, da andernfalls die Färbungen rasch ablassen. Im allgemeinen halten sich die Blutausstriche uneingedeckt besser. b) S p e z i e l l e

Methoden

1352. F ä r b u n g n a c h May-Griinwald oder nach Jenner mit eosinsaurem Methylenblau: 1. Auftropfen der unverdünnten Farblösung auf die frisch hergestellten lufttrockenen Ausstrichpräparate zur Fixierung derselben. 3—5 Minuten (nicht länger!!). — 2. Verdünnen der aufgetropften Farblösung durch

§ 1353—1357.

Färbung des Blutausstriches

317

Zusatz der gleichen Menge dest. Wassers. 5—10 Minuten. Erst in dieser Lösung findet die eigentliche Färbung statt; das Präparat muß darin einen rötlichen Ton annehmen. — 3. Abgießen der Lösung, ganz kurzes Eintauchen in dest. Wasser Trocknen zwischen Filtrierpapier. R e s u l t a t : Kerne blau, eosinophile (a-) Granula leuchtend ziegelrot, basophile (y-) Granula tiefblau, neutrophile (e-) Granula: feine hellrote bis purpurrote Körnchen. Blutplättchen: blaßblau; Erythrozyten: hellrot. Die Färbung gelingt am besten mit ganz frisch hergestellten Ausstrichen. Ältere fixiert man etwa Va Stunde mit Methylalkohol oder einige Stunden mit Äther-Alkohol. Es ist wichtig, n e u t r a l e s dest. Wasser zu verwenden. Die Menge der auf die Ausstriche geträufelten Farblösung soll nicht zu gering bemessen werden, da sonst der in der Lösung enthaltene Methylalkohol zu rasch verdunstet, wodurch es beim Zusatz von dest. Wasser zu Farbniederschlägen kommt. Die Einwirkung der konzentrierten Farblösung in 1. darf 3—5- Min. nicht überschreiten, da sonst die Färbbarkeit unter der zu langen Einwirkung des konzentrierten Methylalkohols leidet. Die Methode bringt die Granula der Granulocyten vortrefflich zur Darstellung, Kerne und Cytoplasma werden dagegen nur unvollkommen gefärbt. 1353. H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g : 1 g Eosin und 1 g Methylenblau medicínale werden in 1000 ccm dest. Wassers gelöst. Bei Vereinigung beider Lösungen entsteht ein dunkelgefärbter Niederschlag, den man einige Tage absetzen läßt. Schließlich saugt man auf der Nutsche ab, wäscht den Niederschlag mit kaltem dest. Wasser so lange aus, bis das Filtrat ungefärbt bleibt, und trocknet. Zur Färbung bereitet man eine gesättigte Lösung des Farbstoffes in reinstem Methylalkohol. 1354. Einfacher ist es, den Farbstoff entweder als Lösung oder als Trockensubstanz fertig zu beziehen. Von letzterer löst man 0,25 g in 100 g reinstem Methylalkohol unter leichtem Erwärmen im Wasserbad (60°). Nach dem Erkalten wird durch ein trockenes Filter filtriert und gut verschlossen aufbewahrt. Der Farbstoff ist bei Hollborn auch in Kapselform erhältlich. (Inhalt einer Kapsel 0,25 g, Herstellung der Lösung wie oben.) 1355. Die Farbstoffe von M a y - G r ü n w a l d , J e n n e r , L e i s h m a n n unterscheiden sich etwas in der A r t und Weise der Gewinnung des eosinsauren Methylenblau; im Färbeeffekt sind sie ziemlich gleich. 1356. A ß m a n n modifiziert die Färbung wie folgt: 1. Auftropfen von 40 Tropfen = 1 ccm der Farblösung auf den frisch hergestellten, unfixierten, in einer Petrischale liegenden Objektträgerausstrich 3 Minuten. 2. Übergießen mit 20 ccm dest. Wassers, dem unter Schütteln 5 Tropfen einer Kaliumcarbonatlösung (Pottasche) 1 : 1000 zugesetzt wurden und Bewegen der Schale, bis die Farblösung gleichmäßig gemischt ist. Färbung 5 Minuten. 3. Abtrocknen mit Filtrierpapier ohne abzuspülen.

1357. Färbung nach Giemsa ( R o m a n o w s k y ) : 1. Fixieren des frischen, lufttrockenen Präparates in Methylalkohol 5—10 Min. oder in abs. Alkohol oder Äther-Alkohol 30 Min. oder länger (s. § 1325 ff.). — 2. Abtrocknen und Bereitlegen der Objektträger (Schichtseite nach oben) waagerecht auf parallelen Glasstäben in Petrischale (s. § 1346). — 3. Verdünnen der Farblösung (s. § 1358) und s o f o r t i g e s Aufgießen derselben auf den Ausstrich: 30—45 Min. — 4. Abschleudern der Farblösung, kräftiges Abspritzen mit abgekochtem oder gepuffertem dest. Wasser, abtrocknen und lufttrocken werden lassen (nicht durch Erwärmen trocknen, da dadurch die Azurgranula zerstört werden). — 5. Evtl. Einschluß in Zedernöl, Paraffin, liquid, oder Caedax (s. § 1351). — Ergebnis: Kerne rotviolett; eosinophile Granula rötlich-rotbraun, selten so schön leuchtend w i e bei May-Grünwald; basophile Granula blau; neutrophile Granula rotviolett; Protoplasma der Lymphocyten blau, evtl. mit feinen purpur-

318

Untersuchung des Blutes

§ 1358—1360.

roten Azurkörnchen. Erythrocyten blaßrötlich. Blutplättchen blau mit violettrotem Innenkörper. Kerne von Blutparasiten und Protozoen leuchtend rot. Ein etwaiges Differenzieren der Färbung ist nach 3. durch kürzeres oder längeres Einlegen der Präparate in n i c h t abgekochtes, d. h. kohlensäurehaltiges dest. Wasser möglich. Dadurch nehmen die meist etwas überfärbten eosinophilen Zellen eine schöne reinrote Farbe an. 1358. D i e V e r d ü n n u n g d e r F a r b l ö s u n g erfolgt in der Weise, daß man in ein mit Schnabel versehenes Becherglas von ca. 50 ccm Inhalt 10 ccm abgekochtes oder gepuffertes dest. Wasser abmißt, aus einer graduierten Pipette (s. § 1349) 0,3 ccm Giemsastammlösung zuträufelt und kurz umschwenkt (nicht schütteln! s. § 1 3 5 0 ) . Fällt der Farbstoff kurz nach der Herstellung der Verdünnung aus, so ist die verdünnte Lösung unbrauchbar, da sie infolge der Ausfällung ihre Färbekraft einbüßt. Die Ursache kann in ungeeignetem dest. Wasser, unsauberen Glasgefäßen oder in zu alter, verdorbener Stammlösung zu suchen sein. Nach 45 Min. ist das Maximum der Färbung erreicht, das Azur-Eosin hat sich dann aus der hiermit stark übersättigten Lösung größtenteils abgeschieden und die Färbung wird auch durch längeres Einwirken des Gemisches nicht mehr verstärkt. Will man besonders intensiv färben, so läßt man nach G i e m s a das Gemisch nach 45 Min. durch Neigen des Objektträgers abfließen, ersetzt es (ohne abzutrocknen oder mit Wasser zu spülen) sofort durch ein frisch bereitetes neues Gemisch und läßt dieses weitere 30—45 Min. einwirken. Über die Färbung protozoischer Blutparasiten in a l t e n -Trockenausstrichen s. G i e m s a (35). 1359. Die Giemsalösung enthält Methylenazur, Methylenviolett, Methylenblau und Eosin. Man bezieht sie am besten gebrauchsfertig von Dr. K. Hollborn, Leipzig (Bezeichnung: Original-Giemsa-Lösung für die Romanowskyfärbung). Das Farbstoffgemisch ist auch trocken in Kapseln erhältlich. Zur Lösung schüttet man den Inhalt einer Kapsel (für 100 g Stammlösung) in einen reinen Glaskolben aus Jenaer Glas, der 50 g (!) Methylalkohol (puriss. Merck; acetonfrei!) und 50 g (!) Glycerin (puriss. Merck) enthält und erwärmt den Kolben unter öfterem Umschwenken im Wasserbad (oder Thermostat) auf 60° C. Nach dem Erkalten wird durch ein trockenes Filter in einen reinen trockenen Rundkolben aus Jenaer Glas filtriert und mit Gummistopfen fest verschlossen. Es gibt auch Kapseln für 50 bzw. 25 g Stammlösung. Sie werden in entsprechend verminderter Flüssigkeitsmenge gelöst. Das Glycerin soll ein spezifisches Gewicht von 1,26 mit einem Wassergehalt von nur l,5°/o besitzen. Die Stammlösung muß sehr gut verschlossen werden, da sowohl Verdunsten des Methylalkohols wie Wasseraufnahme des Glycerins eine Ausfällung des Farbstoffes zur Folge hat. Luftdicht verschlossen ist sie unbegrenzt haltbar. 1360. Bei richtig ausgeführter Färbung soll das Chromatin der Kerne rotviolett gefärbt sein. Der richtige Färbeeffekt tritt bei P H = 6 , 8 — 7 , 0 ein. A n wesenheit von freier Säure hat nach G i e m s a (24) eine Veränderung der Färbung zum Nachteil der azurophilen Elemente zur Folge. Die Kerne zeigen einen schwachen, mehr oder weniger bläulichen Farbton, während die Erythrozyten, die sich normalerweise nur schwach rötlich färben, stark rot gefärbt sind. Makroskopisch sieht ein derartig gefärbter Blutausstrich stark rotstichig aus, während er bei richtiger Färbung nur einen zarten, rötlichvioletten Hauch zeigen soll. Enthält das Farbgemisch dagegen freies oder kohlensaures Alkali, so verschiebt sich die Färbung zum Nachteil der eosinophilen Elemente. Die Erythrozyten nehmen dann einen bläulichen Farbton an; makroskopisch sieht der Ausstrich blauviolett aus (vgl. auch das in § 1341 ff. Gesagte).

§ 1361—1365.

Färbung des Blutausstriches

319

1361. Der Ausfall der Giemsafärbung zeigt bei verschiedener Wasserstoffionenkonzentration große Unterschiede. Nach den Feststellungen M o m m s e n s färben sich bei Ph = 4,5, nur die eosinophilen Granula leuchtend rot; von Ph = 6,5 ab bekommen sie zunehmend einen Stich ins Violette. Die neutrophilen Granula sind beim Gesunden bei Ph = 5,4 nicht mehr erkennbar; in stark sauren Gebieten sind sie rot gefärbt und unterscheiden sich von eosinophilen nur durch die Form. Bei Ph = 6,0—7,0 erscheinen sie als dunkelviolette Körner; ab Ph = 7,5 werden sie undeutlicher. Die Kernfärbung beginnt ab Ph = 5,0; ab Ph = 7,5 treten an den Kernen der Lymphocyten neben überfärbten Stellen wolkige Aufhellungen auf, die sich bei Ph = 8,0 noch verstärken und auch auf die Neutrophilen übergreifen. 1362. Unter pathologischen Verhältnissen z. B. bei Infektionskrankheiten lassen sich nun im Cytoplasma einer Anzahl von Neutrophilen bei P'H = 5,4 noch feine oder etwas gröbere blauschwarze Pünktchen beobachten (sogen, toxische oder pathologische Granulierung). M o m m s e n hält diese Granulaveränderungen für den feinsten Indikator für die Diagnose einer krankhaft veränderten Zelle. Zur objektiven Feststellung und Auszählung dieser »pathologischen Granulation« dient die Giemsafärbung mit Mommsens Pufferlösung von P'H = 5,4. A u s f ü h r u n g : 1. Fixierung des dünnen lufttrockenen Ausstriches 4 Minuten in Methylalkohol. — 2. Färbung in 3 Tropfen Giemsalösung + 1 ccm Pufferlösung nach § 1345, 1h—1 Stunde. — 3. Scharfes Abspülen mit der Pufferlösung. Abtrocknen. ölimmersion. 1363. S c h n e l l f ä r b e m e t h o d e n a c h G i e m s a (14). Bei ihr erfolgt die Fixierung durch die etwas modifizierte Farblösung, die kurz vor Gebrauch in kleiner Menge durch Vermischen von gleichen Teilen der Original-Giemsalösung (s. § 1359) und reinstem Methylalkohol in einem Tropffläschchen bereitet wird. (Das Gemisch ist auch als »Original-Giemsa-Farbfixierlösung« bei Dr. K. Hollborn erhältlich.) Ausführung: 1. Man legt den lufttrockenen, s e h r d ü n n e n Objektträger ausstrich mit der Schichtseite nach oben waagerecht in ein trockenes »Färbewännchen nach Giemsa« (s. § 1346), und zwar so, daß er die Seitenwände nicht berührt. 2. Auftropfen der Farblösung, bis die Schichtseite völlig bedeckt ist (10—12 Tropfen), wobei ein Überlaufen über den Objektträgerrand zu vermeiden ist. Dauer: V2—1 Min. 3. Zugießen, von 10—12 ccm abgekochtes, dest. Wasser, so daß der ganze Objektträger in die Flüssigkeit eintaucht. Hin- und Herschwenken, bis die beiden Flüssigkeiten gut durchmischt sind. Dauer: 10 Min. oder länger. 4. Farblösung abgießen, abspülen, trocknen. 1364. N e r i (30) mischt 1 Teil Giemsalösung mit 4 Teilen Methanol. Die Methode hat den Vorteil, daß man weniger Farbstoff und keine Färbewännchen braucht. Man legt die n i c h t fixierten Austriebe auf zwei parallele Glasstäbe und träufelt das Farbgemisch und nach einer Minute ca. 10 Tropfen abgekochtes dest. Wasser auf. Nach 5 Min. abspülen und trocknen. 1365. » D i c k e T r o p f e n p r ä p a r a t e « nach § 1323 werden o h n e vorherige Fixierung nach Trocknen für 45 Min. mit der nach § 1358 verdünnten Farblösung gefärbt, und nach Abschleudern der Farblösung vorsichtig in ein Glas mit entsprechendem dest. Wasser getaucht (nicht Abspritzen, da dadurch die Schicht leicht abgeschwemmt wird!). Dann Aufstellen des Objektträgers auf Filtrierpapierunterlage und Trocknen an der Luft ohne weitere Berührung der Schicht. Untersuchung unter Zedernöl. In gut gelungenen Präparaten sind die normalen Erythrocyten infolge Hämolyse fast farblos, so daß sich die ganze Tiefe des Präparates überblicken läßt. Parasiten, kernhaltige polychrome Erythrocyten, eosinophile Zellen u. a. m. sind dagegen gut gefärbt und mit Hilfe dieser Methode schon in geringer Menge nachzuweisen.

320

Untersuchung des Blutes

§ 1366—1370.

1366. Uber Färbungen mit Azur-Eosin siehe § 1396. Eine Darstellung der geschichtlichen Entwicklung der Romanowsky - Giemsafärbung bei G i e m s a (34).

1367. A u s g e z e i c h n e t e heim empfohlene (Panoptische Färbung):

Resultate

gibt

die

von

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Kombination der May-Griinwald- und Giemsa-Methode

1. Fixieren des frischen lufttrockenen Ausstriches durch darüber geschichtete May-Grünwald-Lösung (20—30 Tropfen) 3 Minuten. 2. Zufügen der gleichen Menge dest. Wassers 1 Minute. 3. Abgießen, nicht Abspülen der verdünnten Farblösung und Zufügen der verdünnten Giemsa-Lösung (10 Tr. = 0,26 ccm auf 10 ccm dest. Wassers). Färbung 15—20 Minuten. 4. Kräftiges Abspülen in dest. Wasser, Trocknen zwischen Piltrierpapier. 5. Evtl. Einlegen in Zedernöl, Paraff. liquid, oder Caedax. R e s u l t a t : Kerne rötlich violett, Plasma der lymphoiden Zellen lichtblau; lymphoide Azurkörnung leuchtend purpurrot; myeloische Azurkörnung violett mit einem Stich ins Violettbräunliche; Neutralkörnung: bräunlich bis bläulichrosa; eosinophile: bräunlichorange bis ziegelrot; Mastkörnung: ultramarin mit Stich ins Violette. Erythrozyten rosa; polychrome Formen der Erythrozyten überwiegend bläulich; basophile Punktierung der Erythrozyten: kräftig kobaltblau. Jollykörperchen: rötlich-violett. 1368. B á l i n t fixiert die lufttrockenen Ausstriche in Jennerlösung (5 Minuten), verdünnt mit der gleichen Menge seiner Pufferlösung (s. § 1343). Nach 10 Minuten abwaschen in Pufferlösung und färben in Giemsalösung (1 Tropfen der Originallösung auf 1 ccm Pufferlösung) 25 Minuten. Dann abwaschen in Pufferlösung und abtrocknen mit Filtrierpapier. M o m m s e n fixiert (3 Minuten) und färbt vor (4 Minuten) mit May-Grünwaldlösung in der üblichen Weise (s. § 1352), dann abtropfen und Nachfärben mit Giemsalösung (1 Tropfen der Originallösung auf 1 ccm Pufferlösung) (s. § 1345) 5—10 Minuten). Abspülen in dest. Wasser. Abtrocknen mit Filtrierpapier.

1369. Ähnlich wie die in § 1367 angegebene Färbung erfolgt eine weitere von P a p p e n h e i m (11) empfohlene und als P a n c h r o m f ä r b u n g bezeichnete Methode. Der einzige Unterschied besteht darin, daß man bei Nr. 3 statt mit verdünnter Giemsalösung 15 Minuten mit verdünnter Panchromlösung (15 Tropfen = 0,3 ccm der Stammlösung auf 10 ccm dest. Wasser) färbt. Über Schnittfärbung mit panoptischem Gemisch und Panchrom s. § 1405 ff. Über die Zusammensetzung der Panchromlösung s. § 1406. Die Panchromlösung nach Pappenheim ist von Dr. Hollborn, Leipzig zu beziehen.

1370. Sehr gute Resultate gibt auch die Färbung nach K a r d o s - P a p p e n h e i m . Nr. 1 u. 2. wie in § 1367, dann 3. Abgießen der Farblösung und Färben mit Kardosgemisch (Herstellung s. § 1371) 15 Minuten. Kurzes Abspülen in Wasser, Trocknen, Einbetten. R e s u l t a t : Die Färbung gibt ausgezeichnete Differenzierung zwischen Mastzellen, Eosinophilen, Lymphozyten, Bindegewebszellen und Bindegewebe. Die Kerne sind violettrot. Azurkörnung der lymphoiden Zellen: purpurrot; neutrophile Körnung bräunlichviolett, und zwar kräftiger und distinkter als sonst bei Giemsa; das Paraplasma der fertig differenzierten polynuklearen Neutropenien diffus rosa. Paraplasma der Lymphozyten, Monozyten und Leukoblasten hellblau, Spongioplasma scharfblau strukturiert. Mitunter entsteht A z u r p r ä z i p i t a t i o n durch Farbstoffniederschlag, die mit echter Azurgranulation verwechselt werden könnte. Taucht man die v ö l l i g t r o c k e n e n Präparate vor dem Eindecken erst noch kurz in abs. Alkohol, so löst sich die Azurpräzipitation.

§ 1371—1376.

Färbung des Blutausstriches

321

1371. Zur H e r s t e l l u n g des K a r d o s - G e m i s c h e s vereinigt man, am besten unmittelbar vor Gebrauch, 10 T r o p f e n Panchromlösung + 5 Tropfen Methylgrün-Orangelösung + 15 ccm dest. Wasser. Nach der Mischung muß die Lösung kräftig umgeschüttelt und vom malvefarbigen Schaum abgegossen werden. Die M e t h y l g r ü n - O r a n g e l ö s u n g wird so hergestellt, daß der Niederschlag, der bei Vereinigung einer 2°/oigen wässerigen Orange-G-Lösung mit konz. wässeriger Methylgrünlösung entsteht, auf dem Filter gesammelt, getrocknet und in Methylalkohol aufgenommen wird (als Methylgrün-Orangelösung nach KardosPappenheim bei Hollborn erhältlich). Außer diesen vielseitigen, allgemein orientierend e n M e t h o d e n s e i e n z u r D a r s t e 11 u n g s p e z i e 11 e r S t r u k turen noch folgende angeführt: 1372. Zur Trennung von a- und /^-Granulationen (in eosinophilen und pseudoeosinophilen Leukozyten), welch letztere besonders in Blutzellen von Kaninchen und Meerschweinchen vorkommen (vgl. u. a. F u r n o 11, B e n a c c h i o 11), f ä r b t man die hitzefixierten Ausstriche mit dem E h r l i e h sehen T r i g l y z e r i n g e m i s c h : Eosin 2 g, Indulin 2 g, Aurantia 2 g, Glyzerin 30 ccm. Dasselbe wird vor der F ä r b u n g auf ßO^C e r w ä r m t , dann wird 24 Stuhden bei 37° C gefärbt, mit Wasser abgespült und getrocknet. Resultat: K e r n e schwarz, eosinophile (a-) Granula gelb, Spezial-(/?-) Granula dunkelrot, basophile Granula dunkelgrauschwarz. 1373. Die /-Granulationen der Mastzellen des strömenden Blutes lösen sich leicht in Wasser, nicht in starkem Alkohol. Man f ä r b t sie nach E h r l i c h mit einer gesättigten Lösung von Dahlia in: Eisessig 12,5 + abs. Alkohol 50,0 + dest. Wasser 100,0. Über die Färbung der Mastzellen in Schnitten sowie ihre Unterscheidung von Plasmazellen s. § 1408 ff. 1374. Zur Darstellung der ¿-Granulationen (sehr feine basophile Granulationen in Monozyten) f ä r b t man 10—20 Minuten in gesättigter wässeriger Methylenblaulösung. Abspülen in Wasser. Trocknen. 1375. Die ¿-Granulationen (neutrophile Leukozyten) lassen sich a m schönsten mit dem T r i a z i d g e m i s c h von Ehrlich-Biondi darstellen. Man fixiert am besten in der Hitze (§ 1328) und f ä r b t mit der von Hollborn zu beziehenden oder nach § 722 hergestellten Farblösung, indem man sie mit einer Pipette auf den Ausstrich schichtet. Nach 5—10 Minuten Abspülen mit dest. Wasser, bis keine Farbwolken m e h r abgehen. Trocknen zwischen Filtrierpapier. R e s u l t a t : K e r n e grün (meist unscharf), eosinophile G r a n u l a : leuchtend k u p f e r r o t ; neutrophile: violettrot; basophile ungefärbt, ebenso Cytoplasma der Lymphozyten. Erythrozyten orange. Ein von P a,p p e n h e i m angegebenes T r i a z i d (02) enthält noch Methylenblau zur besseren Kernfärbung. Anwendung wie vorausgehend. 1376. Zur Darstellung p o l y c h r o m a t o p h i l e r und b a s o p h i 1 p u n k t i e r t e r E r y t h r o c y t e n (z. B. bei Bleivergiftung) h a t sich nach D o r n a r u s (29) als zuverlässigste Methode die M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g n a c h M a n s o n - S c h w a r z bewährt. H e r s t e l l u n g der Lösungen: I. 2 g Borsäure und 1 g Methylenblau werden in einem Kölbchen aus Jenaer Glas in 100 ccm dest. Wasser gelöst (bei Zimmertemperatur längere Zeit haltbar). — Lösung II: 0,28 g NaOH werden in 100 ccm dest Wasser gelöst. — Vor Gebrauch gibt man in einen Meßzylinder 6 Tropfen der Lösung I und 8 Tropfen der Lösung II, schüttelt gut durch und füllt mit dest Wasser auf 10 ccm auf. — F ä r b u n g : 1. Fixierung in Methylalkohol 3—5 Min. 21

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

322

Untersuchung des Blutes

§ 1377—1381.

— 2. Lufttrocknen. — 3. 5 Sekunden färben. — 4. Vorsichtig abspülen in dest. Wasser. Abtrocknen. — Ergebnis: Erythrozyen hellgrünlichblau, evtl. mit blauer Punktierung, basophile Granula blauschwarz. Größere Malariaplasmodien g r ü n blau. Das f ü r Lösung wie Färbung verwendete dest. Wasser ist durchgehends nach § 1338 C 0 2 frei zu machen. 1377. Für die a - N a p h t h o l - O x y d a s e - R e a k t i o n werden die B l u t abstriche vor der Färbung für 2 Stunden in Formol-Alkohol gestellt (Formol 1 Teil + 96°'/oiger Alkohol 4 Teile). Die a-Naphthol-Oxydase-Reaktion wird in der Hämatologie sehr häufig zur Trennung myeloischer und lymphoider Zellen angewandt. In diesem Falle verfährt man bei der Färbung nach' der in § 1155 angegebenen Färbevorschrift, bei welcher die Granula der eosinophilen, pseudoeosinophilen, neutrophilen und amphooxyphilen Leukocyten des Blutes und des Knochenmarkes gefärbt werden. Lymphocyten, Lymphoblasten und Plasmazellen bleiben dagegen fast stets ungefärbt. 1378. P e r o x y d a s e r e a k t i o n f ü r B l u t z e l l e n nach G r a h a m . 1. Fixieren des frischen Blutausstriches in Formol (40%) 1 Teil + Alkohol (96°/o) 9 Teile w e n i g e Sekunden. — 2. Kurz abspülen in Wasser. — 3. Färben in Benzidinlösung (s. u.) 5 Min. — 4. Grünlich auswaschen in Brunnenwasser. — 5. Gegenfärbung mit Anilinwasserthionin V2—1 Min. — 6. Kurz abspülen in dest. Wasser. Lufttrockren. — Ergebnis: Oxydasegranula braun. Herstellung der Benzidinlösung: Man setzt zu einigen Kristallen Benzidin 0,02 ccm 3°/oiger H 2 0 2 - L ö s u n g (mit Sahli-Pipette), dann 10 ccm 40°/oiger Alkohol. 10 ccm gesätt. Lösung von Thionin in 75°/oigem Herstellung der Thioninlösung: Alkohol + 40 ccm Anilinwasser. 1379. Bei der Beurteilung der Färbeergebnisse hat man zu berücksichtigen, daß die verschiedenen Modifikationen der Winkler-Schultzeschen Methode zum Teil ganz verschiedene Resultate geben. Von besonderer Bedeutung ist dabei vor allem auch die Wasserstoffionenkonzentration. So werden bei der unter optimalen Bedingungen ausgeführten G-Nadireaktion nach G r ä f f (s. § 1158) auch in den Lymphocyten Granula sichtbar. Weiteres siehe G r ä f f. Ältere Angaben bei P a p p e n h e i m und N a k a n o (13). Auch mit der »Dopa«-Reaktion (s. § 1178) färben sich die Granula des myeloischen Systems, jedoch häufig nicht vollständig. 1380. O x y d a s e - S c h n e l l r e a k t i o n nach H i r s e h f e l d (37). 1. Man bringt in ein Blockschälchen 10—20 Tropfen einer 40°/oigen Formaldehydlösung, befestigt den u n f i x i e r t e n Deckglasausstrich mit seiner nicht beschickten Seite durch einen kleinen Wassertropfen a m Deckel des Schälchens, legt den Deckel auf das Schälchen und läßt die Dämpfe 3 Min. lang einwirken. Objektträgerausstriche legt man in eine Petrischale, während man die Unterfläche des Deckels mit einem formolbefeuchteten Filtrierpapierstreifen belegt. — 2. Eintauchen des Ausstriches in verdünnte Lugolsche Lösung (1 Teil Lugol nach § 705 : 3 Teilen dest. Wasser) 10 Sekunden, dann kräftig abspulen mit Wasser. — 3. F ä r ben in Löftiers Methylenblau (s. § 182) 3 Min. — 4. Krätig abspülen mit Wasser, trocknen, eindecken in Balsam oder Cedernöl. — Ergebnis: Kerne blau, neutrophile, gröbere eosinophile und ganz zarte Monocytengranula kräftig braun, wie bei Oxydase- oder Peroxydasereaktion. 1381. Zur Darstellung der L i p o i d e in den Blutzellen wurden von S a v i n i , S e h r t , G o l d m a n n u. a. Methoden angegeben. A m sichersten und einfachsten ist die Methode v o n G o l d m a n n (29). Ausführung: 1. Die B l u t ausstriche, die nicht älter als 24—48 Std. sein dürfen, werden für 3 Minuten in Formol (40°/o) 1 Teil, Alkohol (96%) 4 Teile fixiert. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. 30—40%iger Alkohol einige Minuten. — 4. Sudanlösung (s. u.) 15 Min.

§ 1382—1388.

Färbung des Blutausstriches

323

— 5. Abspülen mit dest. Wasser. — 6. Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin nach Weigert (s. § 677) 1—3 Min. (oder Hämalaun 1 Min.). — 7. Auswaschen in Brunnenwasser, Einlegen in Glyzerin, Glyzeringelatine od. dgl. Ergebnis: Eosinophile, Neutrophile, Monocyten und junge Mastzellen zeigen sudanophile Körnchen. Herstellung der Farblösung: 70°/odger Alkohol 100 ccm, Wasser 20 ccm, Sudan im Überschuß, a-Naphthol 1,2 g. Das Gemisch wird 5 Min. lang gekocht. Nach dem Erkalten wird 0,3 ccm einer 3°/oigen Wasserstoffsuperoxydlösung zugesetzt. 1382. Schon G o l d m a n n wies darauf hin, daß die in den Blutzellen auftretenden Lipoidgranula nach Größe, Form und Verteilung vollkommen mit der Oxydasegranulation übereinstimmen. Nach d e B r u y n (38) beruht die Zuverlässigkeit der Methoden von G o 1 d m a n n und S e h r t auf einer besonderen granulabildenden Wirkung des in der Farblösung enthaltenen Naphthols, eine Wirkung, die der ganzen chemischen Familie der Phenole zukommt. Die von einer Naphthollösung hervorgerufenen Granula sind der Färbung nicht nur durch Sudan, sondern durch die verschiedensten histologischen Farbstoffe wie Janusgrün, Safranin, Neutralrot, Methylenblau, Fluoreszin zugänglich. Sie bestehen wahrscheinlich aus einem Gemisch von Fett und Eiweiß. 1383. U m die M i t o c h o n d r i e n ( P i a s t o s o m e n ) in Ausstrichpräparaten darzustellen, fixiert S c h r i d d e dünne, f e u c h t e Ausstriche in Orthschem Gemisch (1—2 Stunden), spült mit dest. Wasser ab und legt 30 Minuten in 0,5%>ige Osmiumsäure. Dann kurz abspülen, färben und differenzieren nach Altmann, s. § 991. Noch besser gelingen die Methoden nach Benda, Meves, Regaud oder Kiyono auf feuchte Ausstriche angewandt. 1384. Zur Unterscheidung von Spongioplasma und Paraplasma, ferner von Lymphozyten und Spindelzellen niederer Tiere wendet P a p p e n h e i m (10) eine Kombination der Farblösungen von U n n a und Z i e h 1 an (s. auch W e r z b e r g 11). Fixation: Hitze (7—10 Sekunden) oder Dampfgemisch nach § 1329, sodann abs. Alkohol + Methylalkohol ää (ca. 15 Minuten)'. Zur Färbung gibt man auf 10 ccm dest. Wasser 8—10 Tropfen (= 0,4—0,5 ccm) polychromes MethylenblauUnna (s. § 1413) und 8 Tropfen (= 0,2 ccm) Karbolfuchsin. Färbedauer 5—8 Min. Häufiges Abspülen in dest. Wasser. Trocknen. Einbetten. R e s u l t a t : Kerne blau, alle Plasmas, auch Spindelzellen, rot, nur Lymphozyten und Großlymphozyten infolge ihres hohen Spongioplasmagehaltes blau. 1385. Herstellung von K a r b o l f u c h s i n : Fuchsin 1 g, abs. Alkohol 10 ccm, 5°/oiges Karbolwasser 100 ccm. 1386. Aus einer Mischung von Pikrinsäure und einem anderen sauren Farbstoff färben sich die Erythrozyten besonders mit Pikrinsäure. Zur Sichtbarmachung des Hämoglobins in blutbildenden Zellen dient Eosin, siehe ferner § 1417 und 1436 f. 1387. In nachfolgender Tabelle 9 (s. S. 324) sind die häufigsten hämatologischen Methoden übersichtlich zusammengestellt. Die bei Anwendung derselben besonders deutlich hervortretenden Zellbestandteile sind durch Fettdruck hervorgehoben. D. Die Darstellung des Blutes im Sdiniftpräparat 1388. Zur F i x i e r u n g von Organen und Embryonen eignet sich bei h ä m a t o l o g i s c h e n U n t e r s u c h u n g e n besonders das nach M a x i m o w modifizierte H e 11 y sehe Gemisch. ( = Zenkersche Flüssigkeit, der man unmittelbar vor Gebrauch auf 100 ccm statt Eisessig 10 ccm Formalin zusetzt.) Man fixiert darin 2—4 m m dicke Organstückchen 6—24 Stunden bei Zimmertemperatur. Nach 24stündigem Auswaschen in Brunnenwasser überträgt man in steigenden Alkohol (im 80°'/oigen Alkohol Jodbehandlung zur Entfernung des Sublimats nach § 327), dann Einbettung in Paraffin oder besser in Celloidin oder Celloidin-Paraffin (s. § 339). 21*

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§ 1389—1395.

Färbung von Schnittpräparaten

325

1389. M a x i m o w (09) empfiehlt zur Fixierung von Warmblütergewebe die Fixierungsflüssigkeit auf 37° C zu erwärmen, dann Formol zuzugeben und die frischen, lebenswarmen Objekte rasch in .die Lösung zu bringen. Nach einer halben Stunde läßt man die Lösung wieder erkalten. Dünne Keimscheiben präpariert M a x i m o w zuerst in körperwarmer Ringerlösung mit Schere und Pinsel vorsichtig ab, schiebt sie auf die Konvexität eines Uhrglases und bringt sie durch Aufträufeln von etwas Fixierungsflüssigkeit während ein paar Sekunden in aufgespannter, faltenloser Lage zur Erstarrung. Dann werden sie in der Fixierungsflüssigkeit durch leichtes Schwenken des Glases von demselben losgelöst. Bei Embryonen über 1,5 cm Länge muß die Hautdecke geöffnet werden. Dauer der Fixierung bei Keimscheiben u. dgl. 10—15 Minuten, Embryonen bis zu 3 mm 1 Stunde, größere bis zu 6 Stunden. Auswaschen und Weiterbehandlung wie § 1388-

1390. Sehf gute Resultate gibt auch eine weitere von M a x i m o w angegebene Flüssigkeit (Zenkersche Flüssigkeit ohne Eisessig 100 ccm, Formol 10 ccm, 2°/oige wässerige Osmiumsäure 10 ccm; vgl. § 338). D i e O r t h s c h e F l ü s s i g k e i t s o w i e F o r m a l i n a l l e i n e r h a l t e n die G r a n u l a t i o n e n m e i s t n u r s c h l e c h t (s. E i l e r m a n n 19). 1391. Empfehlenswert ist ferner'nach L e h n e r (24) der Formol-Alkohol nach S c h a f f e r (1 Teil Formol und 2 Teile 80°/oiger Alkohol), der die Granula der Leukocyten wie auch die Körner der Mastzellen vollständig erhält. Zur Fixierung der letzteren s. auch § 1408. 1392. Nach R e g e n d a n z und R e i c h e n o w (33) gelingt die Färbung von Gewebs- und Blutparasiten mit Giemsalösung auch nach Fixierung in Carnoyschem Gemisch ausgezeichnet.

1393. Das H ä m o g l o b i n wird durch die in § 1388 ff. angeführten Flüssigkeiten in den Blutzellen gut fixiert. Auch Sublimat-Kochsalzlösung (nicht Sublimatwasser) wird dazu empfohlen. Durch Zusatz vpn Eisessig oder Triehloressigsäure wird es dagegen angegriffen. Über die Färbung des Hämoglobins s. § J436. Beim Gefrierenlassen frischer Präparate kommt es zu einem Hämoglobinaustritt aus den Erythrocyten. 1394. Zur F ä r b u n g d e r S c h n i t t p r ä p a r a t e eignen sich besonders die auch für Ausstrichpräparate gebrauchten Methoden mit eosinsaurem Methylenblau und Azur-Eosin, die bei Schnittpräparaten zum Teil etwas modifiziert zur Anwendung kommen (s. § 1395 ff.). Auch hier sind aber die in § 1336 ff. angegebenen allgemeinen Vorschriften wohl zu beachten. 1395. Zur F ä r b u n g m i t e o s i n s a u r e m M e t y l e n b l a u ist für Schnitte die Methode von E i l e r m a n n (19) empfehlenswert. Fixierung nach Maximow (s. § 1388), Einbettung in Paraffin. Nicht über 5ju dicke Schnitte kommen durch Xylol, Alkohol in dest. Wasser (Wasser und Gefäße müssen frei von Alkalien und Säuren sein!). Nach Abtrocknen mit Filtrierpapier Vorfärbung in Formol-Eosin (l°'/oige wässerige Lösung von Eosin [bläulich, Kahlbaum] 50 ccm + n e u t r a l e s Formol 2,5 ccm. Das Formol neutralisiert man in der in § 257 geschilderten Weise durch Stehenlassen über Calciumcarbonat.) Nach 15 Minuten wäscht man 2—4 Minuten lang in warmem (ca. 45° C) dest. Wasser aus. Dann Färbung in einer 0,5°'/oigen Lösung von eosinsaurem Methylenblau in Methylalkohol, die vor Gebrauch mit gleichen Teilen dest. Wasser verdünnt .wird (färbt am besten, wenn Stammlösung einige Monate alt). Nach 30 Minuten wäscht man 5—10 Minuten in dest. Wasser aus, trocknet mit Filtrierpapier ab und differenziert in w a s s e r f r e i e m Alkohol, bis der Schnitt rötlich ist (2—5 Minuten; 99°'/oiger Alkohol gibt andere Resultate; der Alkohol muß über CaO oder mit metall. Ca nach § 381 völlig entwässert sein). Dann Xylol (mehrmals wechseln), Balsam.

326

Untersuchung des Blutes

§ 1396—1401.

R e s u l t a t : Kerne: kräftig blau; Bindegewebe und Reticulum: schwach blau; neutrophile Granula: rotbraun; eosinophile Granula: leuchtend rot; basophile Granula: schwarzblau; Erythrozyten: bläulich-rötliches Cytoplasma; Plasmazellen: graublaues Cytoplasma mit hellem, oft rötlichem Hof am Kern. 1396. F ä r b u n g m i t A z u r - E o s i n nach N o c h t - M a x i m o w . Sie gelingt am besten bei Fixierung nach Maximow (s. § 1388), gibt aber auch nach Helly, Zenker, Formol-Alkohol oder abs. Alkohol noch brauchbare Resultate. Man bereitet zwei Stammlösungen, die in Kolben aus Jenaer Glas, gut verschlossen, einige Monate lang haltbar sind. L ö s u n g A: 0,1 g Eosin w. g. (Hollborn), 100 ccm dest. Wasser. L ö s u n g : B: 0,1g Azur II (Hollborn), 100 ccm dest. Wasser. — Unmittelbar vor Gebrauch werden 10 ccm der Lösung A in einem Becherglas mit 100 ccm abgekochtem dest. Wasser (s. § 1338) verdünnt; sodann fügt man unter 4—ömaligem ruhigen Umschwenken die in einem kleinen Meßzylinder abgemessenen 10 ccm der Lösung B zu. Die gebrauchsfertige Lösung ist dunkelviolett gefärbt. F ä r b u n g : 1. Einstellen der Schnitte aus abgekochtem dest. Wasser f ü r 6—12—24 Stunden in die Farblösung. Während dieser ganzen Zeit darf kein grobflockiger Niederschlag auftreten. Ein zartes metallisches Häutchen auf der Oberfläche der Lösung ist dagegen unschädlich. — 2. Differenzieren der stark überfärbten Schnitte in 96°/oigem Alkohol, bis das Rot der Erythrocyten und des Bindegewebes hervortritt. — 3. Entwässern in abs. Alkohol V2—1 Minute. — 4. Drei Portionen reinsten Xylols, neutraler Balsam oder Zedernöl. — E r g e b n i s : Cytoplasma blau in verschiedenen Tonabstufungen, Basichromatin dunkelblau, Oxychromatin rosa, Hämoglobin leuchtend rot, acidophile Granulationen hellrot, Bindegewebe zart rosa. 1397. Tritt das Eosin im fertigen Präparat zu wenig hervor, so liegt es oft daran, daß die Differenzierung des Präparates im 96°/oigen Alkohol zu bald unterbrochen wurde, so daß das Rot noch von Blau überlagert ist. In anderen Fällen, z. B. bei Amphibienlarven, muß der Eosinzusatz gesteigert werden (Lösung A: 16 ccm, Wasser: 80 ccm, Lösung B : 8 ccm). Nicht zu korrigieren ist der Fehler, wenn ihn ungeeignete Fixierung veranlaßt. 1398. Wenn gleich nach Mischung der Lösungen ein grobflockiger Farbniederschlag auftritt, so ist die Lösung unbrauchbar. Meist ist daran das zur Herstellung verwendete destillierte Wasser schuld (s. § 1338 ff.). Auch Verunreinigung der benutzten Glaswaren kann die Ursache sein.

1399. Von großer Bedeutung für den Ausfall der Färbung ist die Reaktion des dest. Wassers (s. auch § 1338 ff.). Ähnlich wie bei der F ä r b u n g der Ausstrichpräparate ist daher auch hier die Pufferung des Wassers zu empfehlen, in dem man 10 ccm der Stammlösung A mit 100 ccm des nach § 1343 gepufferten, verdünnten Wassers verdünnt und dann 10 ccm der Lösung B zusetzt.

1400. C o l l i e r bereitet die Farblösung in folgender Weise: Lösung A: 0,08 g Eosin B A extra, dest. Wasser 100 ccm. Lösung B: 0,08 g Azur II, dest. Wasser 100 ccm. Zur Färbung gibt man zu 20,8 ccm der Lösung B 4 ccm der Lösung A und füllt mit der in § 1342 angegebenen, verdünnten Pufferlösung auf 100 ccm auf. Färbedauer 1—3 Stunden.

1401. F ä r b u n g d e r S c h n i t t e n a c h G i e m s a . Fixierung wie in § 1388 ff. Färbung: 1. Einstellen der Schnitte in ausgekochtes oder gepuffertes dest. Wasser, das einmal gewechselt wird. — 2. Färben in frisch verdünnt e r Giemsalösung (1 ccm, bei längerer Färbedauer 0,5 ccm der Originallösung auf 50 ccm dest. Wasser oder Pufferlösung, s. § 1343): 2—12 Stunden. — 3. Abspülen der stark überfärbten blauvioletten Schnitte in gekochtem oder gepuff e r t e m dest. Wasser. — 4. Differenzieren und Entwässern in: a) Aceton 95 ccm

§ 1402—1408.

Färbung von Schnittpräparaten

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+ Xylol 5 ccm; b) A c e t o n 70 ccm + Xylol 30 ccm; c) A c e t o n 30 ccm + Xylol 70 ccm. — 5. R e i n e s Xylol. Z e d e r n h o l z ö l o d e r C a e d a x . — E r g e b n i s : w i e § 1357. Das zur Entwässerung verwendete Aceton muß völlig rein, methylalkohol- und säurefrei sein. 1402. Neuerlich verwendet G i e m s a zur Färbung histologischer Schnitte, die in Sublimat-Alkohol nach S c h a u d i n n (gesätt. wässer. Sublimatlösung 2 Teile, absol. Alkohol 1 Teil) oder nach Carnoy fixiert sind, die nach § 1358 verdünnte Farblösung, die nach 45 Min. erneuert wird. Die Färbedauer wird in Anbetracht der höheren Konzentration kürzer genommen als in § 1396. Zum Puffern gebraucht G. das Puffergemisch von W e i s e (s. § 1344). 1403. P a n o p t i s c h e F ä r b u n g n a c h P a p p e n h e i m (12). F i x i e r u n g n a c h M a x i m o w o d e r H e 11 y. F ä r b u n g : 1. V o r f ä r b u n g in w ä s s e r i g v e r d ü n n t e r M a y - G r ü n w a l d - oder J e n n e r l ö s u n g (1 Teil d e r in § 1352 a n g e g e b e n e n S t a m m l ö s u n g auf 8 Teile dest. Wasser): 20 M i n u t e n bei 35° C. — 2. A b l a u f e n lassen d e r F a r b l ö s u n g u n d N a c h f ä r b e n m i t v e r d ü n n t e r G i e m s a l ö s u n g : 0,2 ccm d e r S t a m m l ö s u n g (s. § 1358) auf 15 ccm dest. W a s s e r (oder P u f f e r l ö s u n g siehe § 1343) 40 M i n u t e n b e i 35° C. — 3. K u r z e s D i f f e r e n z i e r e n i n v e r d ü n n t e r Essigs ä u r e (0,15 ccm Eisessig auf 100 ccm dest. Wasser). — 4. A u s w a s c h e n in dest. Wasser. — 5. A b t r o c k n e n m i t F i l t r i e r p a p i e r , E n t w ä s s e r n in A c e t o n + abs. Alkohol zu g l e i c h e n Teilen. — 6. Xylol, Z e d e r n ö l oder C a e d a x . E r g e b n i s : w i e in § 1367; d a s B i n d e g e w e b e w i r d bei dieser M e t h o d e s t ä r k e r g e f ä r b t als bei e i n f a c h e r A z u r - E o s i n - oder G i e m s a f ä r b u n g . Die M e t h o d e e i g n e t sich w e g e n i h r e r s c h a r f e n D i f f e r e n z i e r u n g u n d r e i c h e n T o n a b s t u f u n g n i c h t n u r f ü r h ä m a t o l o g i s c h e Zwecke, s o n d e r n a u c h i ü r Ü b e r sichtspräparate. 1404. Die Verdünnung der Farblösungen hat unmittelbar vor Gebrauch zu erfolgen. Während der Färbung sind die Färbeschalen — am besten benutzt man Petrischalen oder die Färbewännchen nach Giemsa — gut zu bedecken. 1405. P a n c h r o m f ä r b u n g n a c h P a p p e n h e i m . F i x i e r u n g n a c h M a x i m o w o d e r Helly. F ä r b u n g : 1. V o r f ä r b e n m i t v e r d ü n n t e r M a y - G r ü n w a l d l ö s u n g (1 Teil d e r S t a m m l ö s u n g auf 8 Teile dest. Wasser): 10 M i n u t e n . — 2. N a c h f ä r b e n i n P a n c h r o m l ö s u n g (10 T r o p f e n = 0,15 ccm d e r S t a m m l ö s u n g (s. u.) auf 10 ccm dest. Wasser): 20 M i n u t e n . — 3. D i f f e r e n z i e r e n in 0,l°/oiger, w ä s s e r i g e r P i k r i n s ä u r e , bis d e r S c h n i t t rötlich aussieht. — 4. A u s w a s c h e n in dest. W a s s e r (ca. 5 Minuten). — 5. A b t r o c k n e n m i t F i l t r i e r p a p i e r . A c e t o n x y l o l (3 : 7). F i l t r i e r p a p i e r . A c e t o n x y l o l . Xylol. C a e d a x . E r g e b n i s : wie in § 1367. 1406. Das Panchromgemisch besteht aus: Methylenblau 1,0; Toluidinblau 0,5; Azur I 1,0; Methylenviolett 0,5; Eosin 0,75; Methylalkohol 250,0; Glyzerin 200,0; Aceton 50,0. Es wird am besten gebrauchsfertig von Dr. K. Hollborn bezogen. 1407. S e h r e m p f e h l e n s w e r t ist f e r n e r die F ä r b u n g n a c h K a r d o s - P a p p e n h e i m , die a u c h eine s c h a r f e T r e n n u n g z w i s c h e n A z u r k ö r n u n g ( p u r p u r rot) u n d n e u t r o p h i l e n G r a n u l a t i o n e n ( b r ä u n l i c h v i o l e t t ) g e s t a t t e t . F i x i e r u n g nach M a x i m o w o d e r Helly. D e r p a r a f f i n b e f r e i t e S c h n i t t k o m m t aus dest. Wasser in ein F ä r b e w ä n n c h e n , w i r d m i t d e m K a r d o s g e m i s c h (s. § 1371) ü b e r s c h i c h t e t u n d 1—2 S t u n d e n b e i 37® C g e f ä r b t (zudecken!). D a n n A b s p ü l e n m i t dest. Wasser, a b t r o c k n e n m i t F i l t r i e r p a p i e r , k u r z abs. Alkohol, Xylol, n e u t r a l e r Balsam. E r g e b n i s : w i e in § 1370. 1408. Die M a s t z e l l e n des G e w e b e s u n d i h r e G r a n u l a b l e i b e n n a c h den U n t e r s u c h u n g e n v o n H o l m g r e n (37,38) a m b e s t e n bei F i x i e r u n g in basis c h e m B l e i a c e t a t e r h a l t e n . M a n v e r w e n d e t e i n e 4°/oige Lösung, die d u r c h V e r d ü n n e n der Sol. P l u m b i subacetici ( K a h l b a u m : G e h a l t 19°/o) o d e r d u r c h Lösen d e r S u b s t a n z f r i s c h v o r G e b r a u c h b e r e i t e t w i r d . K l e i n e S t ü c k c h e n des zu u n t e r -

328

Untersuchung des Blutes

§ 1409—1415.

suchenden Gewebes werden 24 Stunden lang fixiert, dann in dest. Wasser abgespült und in der üblichen Weise in Paraffin eingebettet. Die Schnitte werden 1 Stunde in einer l°/oigen Lösung von Toluidinblau gefärbt, das teils in dest. Wasser, teils in 60°'/oigem Alkohol gelöst wird. In der wässerigen Lösung färbt sich neben den Mastzellen auch das übrige Gewebe, in der alkoholischen dagegen nur die Mastzellen. 1409. Die Granula der Mastzellen sind häufig wasserlöslich, doch bestehen zwischen den einzelnen Tierarten beträchtliche Unterschiede. Sehr empfindlich sind die Mastzellenkörner des Kaninchens und Hundes, besonders widerstandsfähig dagegen die der Ratte. Die letzteren bleiben daher in zahlreichen Fixierungsflüssigkeiten gut erhalten, so daß das subkutane Bindegewebe der Ratte (z. B. Querschnitt durch die Schnauze) als günstiges Untersuchungsobjekt zu empfehlen ist. Bei der Katze können nach V a r i c a k (38) wasserresistente (Subcutis) und wasserempfindliche (Omentum) Mastzellengranula) festgestellt werden. 1410. Durch Einwirkung von Bleiacetat wird die metachromatische Substanz der Mastzellengranula, die nach H o l m g r e n aus Polyesterschwefelsäure besteht und mit H e p a r i n identisch ist, ausgefällt und wasserunlöslich. H o l m g r e n erblickt in den Mastzellen daher Bildungs- und Sekretionsstätte eines antikoagulierenden Stoffes. 1411. Ältere Methoden für Gewebsmastzellen: Fixierung in Formol-Alkohol (s. § 1391) oder in absol. Alkohol. Färbung nach Dominici (s. § 726): Mastzellen tief , dunkelblau. — Mit saurer Toluidinblaulösung (70°/oiger Alkohol 100 ccm, Salzsäure 0,5 ccm, Toluidinblau 0,25 g; nach 24 Stunden nochmals 0,5 ccm Salzsäure) färben sich nur die Körnchen der Mastzellen und die Knorpelgrundsubstanz ( S c h a f f e r 07; Ausnahmen bei L e h n e r 24, S. 91). •— L e h n e r empfiehlt Färbung mit Kresylechtviolett (1 mg auf 1000 ccm Wasser). Die Granula färben sich metachromatisch, und zwar satter und beständiger als mit Thionin. 1412. Eine d i f f e r e n t e D a r s t e l l u n g v o n M a s t z e l l e n und P l a s m a z e l l e n gestattet nachfolgende Methode von U n n a . Fixierung wie § 1411. Einbettung in Celloidin oder Paraffin. 1. Färbung in polychromem Methylenblau 10 Minuten. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. Differenzieren in Glycerinäthermischung nach Unna, die mit 4—10 Teilen dest. Wassers verdünnt wird V2—1 Minute (Vorsicht! nicht zu lang!). Wenn der Schnitt kornblumenblau ist, dann 4. gründliches Auswaschen in Wasser 2—5 Minuten, abtrocknen mit Filtrierpapier, kurz abs. Alkohol, Xylol, Canadabalsam. Ergebnis: Kerne blau, Granula der Mastzellen rot, die der Plasmazellen blau. 1413. Zur H e r s t e 11 u n g d e s p o l y c h r o m e n M e t h y l e n b l a u s wird eine Lösung von 1 g Methylenblau in 100 ccm dest. Wasser und 20 ccm 96°/oiger Alkohol mit 1 g Kaliumkarbonat versetzt und auf dem Wasserbad langsam auf 100 ccm eingedampft, wobei (neben Methylenblau) noch Methylenazur und Methylenviolett entsteht. 1414. Zur H e r s t e l l u n g d e s G l y z e r i n ä t h e r s gibt man 50 ccm reines Glyzerin und 10 g trockenes Calciumchlorid in einen Destillierkolben und sammelt die bei 120—220° C übergehenden Fraktionen. Die erhaltene braune Flüssigkeit wird mit Tierkohle vermischt und nochmals destilliert. Man bekommt nun ein bereits bei etwa 100° C übergehendes hellgelbliches Destillat. Eine etwa noch vorhandene geringe Trübung kann durch Zusatz einer Spur abs. Alkohols beseitigt werden. Die in § 1412 genannte G l y z e r i n ä t h e r m i s c h u n g stellt eine 5—lOfache Verdünnung des Glyzerinäthers mit dest. Wasser dar. Gebrauchsfertig erhältlich bei Hollborn. 1415. Eine von U n n a (28) als B l a u e s P o l y c h r o m bezeichnete Farblösung gibt noch farbkräftigere Bilder. Zur Herstellung löst man je 0,5 g Methylenblau und Toluidinblau in wenig 75°/oigem Alkohol, gießt beide Lösungen zusammen in 100 ccm einer l°/oigen Kaliumcarbonatlösung und kocht das Gemisch 2 Minuten

§ 1416—1422.

Sternalpunktion

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lang unter ständigem Rühren. Nach Erkalten wird filtriert. — Man färbt damit Paraffin-, Celloidin- oder Gefrierschnitte 1—2 Minuten und verfährt dann weiter wie in § 1412. — U n n a verwendet die Farblösung auch zur Darstellung des Granoplasmas der Zellen. 1416. Die P l a s m a z e l l e n treten am schönsten bei Anwendung der Methylgrün-Pyroninfärbung nach P a p p e n h e i m - U n n a hervor (s. § 728). Der rundliche Cytoplasmaleib wird dabei tief rot gefärbt, der Kern (»Radspeichenform«) grün. 1417. Die elektive Darstellung der E r y t h r o c y t e n und ihrer Vorstufen gelingt sehr schön mit dem von C a r e r e - C o m e s (38) angegebenen S i e n a O r a n g e - R e a g e n s . Ausführung: 1. Fixierung in neutralem Formol; Paraffineinbettung. Xylol, Alkoholreihe, dest. Wasser. — 2. Überschichten mit Siena-Orange-Reagens 1 Min. — 3. 10%ige Salzsäurelösung 3 Min. — 4. Dest. Wasser (2mal wechseln) 10 Min. — 5. Sorgfältige Differenzierung in Aceton (mit der gleichen Menge dest. Wasser verdünnt) 5—10 Min. — 6. Dest. Wasser (2mal wechseln) 10 Min. — 7. Gegenfärbung mit Gentianaviolett (10 Tropfen einer alkohol. gesätt. Lösung auf 20 ccm dest. Wasser) 2 Min. — 8. Abspülen mit dest. Wasser, abtrocknen mit Filtrierpapier. — 9. Sorgfältige Differenzierung in abs. Alkohol, bis die orangegelb gefärbten Erythrocyten usw. scharf hervortreten. — 10. Xylol, Caedax. 1418. Sehr deutlich treten die Erythrocyten nach Fixierung in chromhaltigen Flüssigkeiten (z. B. H e 11 y oder M a x i m o w) auch bei Färbung mit Brasilin (§ 948) hervor. 1419. Zur Darstellung der B l u t p l ä t t c h e n im Schnittpräparat fixiert man nach A s c h o f f (92) kleine lebensfrische Organstückchen in 1 Teil 1%>iger Osmiumtetroxydlösung und 2 Teilen 0,75%iger NaCl-Lösung. Die Schnitte färbt man ganz kurz (V2—1 Minute) in Methylviolett (0,1 g in 500 ccm phys. Na Cl-Lösung). Blutplättchen blaß bläulich. E. Die Methodik der Sternalpunktion 1420. Zur E n t n a h m e v o n K n o c h e n m a r k punktiert man gewöhnlich das Sternum, und zwar in der Mittellinie in der Höhe des 2. oder 3. Intercostalraums. Die Dicke der Lamina compacta anter. beträgt hier beim Menschen 0,5—1 mm. Beim Kind unter 2 Jahren wird besser die Tibia punktiert, und zwar im oberen Drittel an der medialen Fläche. 1421. Als Instrument dient eine mit genau sitzendem Mandrin versehene Sternalpunktionsnadel von etwa 5 cm Länge und 1—2 mm Lichtung (Hersteller: A. Bott, Zürich, Mythenstr. 15)'. Sie soll eine verstellbare Schutzplatte haben, die ein Durchstoßen der hinteren Corticalis verhindert und eine Orientierung über die Tiefe des Einstiches erlaubt. Die Nadelspitze soll kurz geschliffen und gut geschärft sein. Mehrere im Schrifttum beschriebenen Todesfälle beweisen, daß sich das Herz an der Nadelspitze nach Durchstoßen der hinteren Corticalis infolge Weglassens der Schutzplatte aufschlitzen kann. 1422. P u n k t i o n s t e c h n i k (nach R o h r 40). Nach gründlicher Desinfektion der Haut erfolgt zunächst sorgfältige Anästhesierung von Haut, Subcutis und vor allem Periost mit 1—3 ccm eines üblichen Anästhetikums. Nach einigen Minuten wird die mit Mandrin versehene Nadel senkrecht eingestochen, bis die Spitze auf dem Knochen aufsitzt. Dann wird die Arretierung etwa 5 bis 8 mm über der Hautoberfläche festgeschraubt und die Corticalis unter gleichmäßiger kräftiger Drehbewegung durchstoßen. Meist spürt man schon nach geringer Drehbewegung am Nachlassen des Widerstandes, daß sich die

330

Untersuchung des Blutes

§ 1423—1425.

Nadelspitze i m M a r k r a u m befindet. D e r W i d e r s t a n d des K n o c h e n s ist individuell s e h r v e r s c h i e d e n . N o r m a l e r w e i s e b e d a r f es eines k r ä f t i g e n D r u c k e s . B e i m E i n b r e c h e n in den. M a r k r a u m h ö r t oder f ü h l t m a n o f t ein leises K r a c h e n . N u n w i r d n a c h E n t f e r n u n g des M a n d r i n s eine g e n a u sitzende P r a v a t z s p r i t z e v o n 20 ccm a n g e s e t z t u n d a s p i r i e r t . Es ist wichtig, d a ß k e i n e k l e i n e r e S p r i t z e b e n u t z t w i r d , weil diese n i c h t d e n s e l b e n k r ä f t i g e n A s p i r a t i o n s z u g e r l a u b t , d e r in vielen F ä l l e n g e r a d e erst z u m positiven R e s u l t a t f ü h r t . Die A s p i r a t i o n selbst ist o f t m i t e i n e m k u r z d a u e r n d e n , aber r e c h t l e b h a f t e n S c h m e r z im B r u s t b e i n v e r b u n d e n . D u r c h l a n g s a m e Aspiration k a n n diese u n a n g e n e h m e Sensation v e r m i n d e r t w e r d e n , doch g e l i n g t es oft n i c h t o h n e k r ä f t i g e r e n Z u g M a r k g e w e b e zu b e k o m m e n . W e n n M a r k t e i l c h e n oder K o a g u l a die K a n ü l e verlegen, so lassen sich diese d u r c h I n j e k t i o n von e t w a s s t e r i l e r physiol. Kochsalzlösung b e seitigen. G e w ö h n l i c h e n t h a l t e n die ersten T r o p f e n a m m e i s t e n M a r k g e w e b e , bei w e i t e r a n d a u e r n d e r A s p i r a t i o n k o m m t n a m e n t l i c h Blut. J e n a c h d e m , ob n u r A u s s t r i c h e oder a u c h histologische V e r a r b e i t u n g e r f o l g e n sollen, w i r d m a n m e h r o d e r w e n i g e r M a r k ansaugen. Der S p r i t z e n i n h a l t w i r d möglichst rasch auf einen O b j e k t t r ä g e r o d e r in ein B l o c k s c h ä l c h e n ausgespritzt, wobei die klein e n M a r k b r ö c k e l als g r a u g e l b l i c h e o d e r r ö t l i c h e F e t z c h e n vom u m g e b e n d e n B l u t leicht z u u n t e r s c h e i d e n sind. M a n s a u g t d a n n z u n ä c h s t das B l u t m i t F i l t r i e r p a p i e r o d e r T u p f e r ab, s u c h t die M a r k s t ü c k c h e n s o r g f ä l t i g h e r a u s u n d b e n ü t z t sie in ü b l i c h e r W e i s e z u r H e r s t e l l u n g v o n O b j e k t t r ä g e r a u s s t r i c h e n oder Tupfpräparaten. F ä r b u n g e n w i e bei g e w ö h n l i c h e n A u s s t r i c h e n n a c h § 1367 oder n a c h m e i n e n E r f a h r u n g e n b e s s e r n a c h § 1403, 1405 oder 1407. F ü r R e t i c u l o c y t e n n a c h § 1305; O x y d a s e r e a k t i o n n a c h § 1377; P e r o x y d a s e r e a k t i o n n a c h § 1378. 1423. F ü r histologische S c h n i t t p r ä p a r a t e w e r d e n M a r k b r ö c k e l oder das k o a g u l i e r t e P u n k t i o n s m a t e r i a l am b e s t e n n a c h M a x i m o w (§ 1388) fixiert. E i n b e t t u n g w i e g e w ö h n l i c h in P a r a f f i n oder C e l l o i d i n - P a r a f f i n (nach § 464 oder 466, s. a u c h § 339). F. Darstellung von Fibrin 1424. F i b r i n f ä r b u n g nach W e i g e r t . F i x i e r u n g beliebig. P a r a f f i n - , Celloidin- o d e r G e f r i e r s c h n i t t e . Nach F i x i e r u n g in c h r o m h a l t i g e n F l ü s s i g k e i t e n m ü s s e n die S c h n i t t e v o r d e r F ä r b u n g f ü r 10 Min. i n e i n e 0,3°/o K a l i u m p e r m a n g a n a t l ö s u n g u n d d a n n n a c h A b s p ü l e n f ü r 2—3 S t u n d e n i n 5 % i g e O x a l s ä u r e gestellt w e r d e n . D a n n g r ü n d l i c h A u s w a s c h e n . — F ä r b u n g : 1. K e r n f ä r b u n g m i t C a r m a l a u n , K e r n e c h t r o t od. dgl. A u s w a s c h e n , d a n n dest. Wasser. — 2. A b t r o c k n e n m i t F i l t r i e r p a p i e r . A u f t r o p f e n v o n A n i l i n w a s s e r - G e n t i a n a v i o l e t t (s. § 703) oder b e s s e r M e t h y l v i o l e t t l ö s u n g (s. § 1426) 15 Sek. A b t r o c k n e n . — 3. A u f t r o p f e n v o n J o d j o d k a l i l ö s u n g (s. § 705) 15—20 Sek. A b s c h ü t t e n u n d A b t r o c k nen. — D i f f e r e n z i e r e n in e i n e r A n i l i n ö l - X y l o l m i s c h u n g (1 : 1) solange bis das F i b r i n d i s t i n k t v i o l e t t e r s c h e i n t , w ä h r e n d das ü b r i g e G e w e b e sich m e h r oder w e n i g e r e n t f ä r b t h a t . H i e r a u f m u ß das A n i l i n ö l d u r c h X y l o l s o r g f ä l t i g e n t f e r n t w e r d e n , da sonst die F ä r b u n g nach k u r z e r Zeit v e r d i r b t . D a n n E i n s c h l u ß in Canadabalsam. 1425. Zu beachten ist, daß es sich bei dieser Methode um keine spezifische, chemische Farbreaktion handelt, sondern daß außer Fibrin auch andere Bestandteile des Präparates gefärbt bleiben können. Man hat also bei der Diagnose Fibrin nicht nur die Farbreaktion, sondern auch die morphologische Struktur des Gefärbten zu beachten. Andererseits kann in gewissen Fällen ein Teil der Fibrinfäden auch ungefärbt bleiben.

§ 1426—1433.

Fibrin — Verschiedenes

331

1426. W e i g e r t e m p f a h l an Stelle der rasch verderbenden Anilinwasser-Gentianaviolettlösung auch eine Methylviolettlösung, die unmittelbar vor Gebrauch aus zwei jahrelang haltbaren Stammlösungen bereitet wird. Lösung A: abs. Alkohol 33 ccm, Anilinöl 9 ccm, Methyl violett im Überschuß. Lösung B: gesättigte wässerige Methyjviolettlösung. — Zum Gebrauch mischt m a n 3 ccm der Lösung A mit 27 ccm der Lösung B. 1427. Gefrier- u n d Celloidinschnitte müssen zur Vermeidung starker Schrumpfungen, wie sie bei nicht aufgeklebten Schnitten besonders im Anilinöl auftreten, vor dem Auftropfen der Farblösung auf einen Objektträger aufgezogen und mit Filtrierpapier angedrückt werden. In gleicher Weise werden dann auch die übrigen Flüssigkeiten aufgetropft. 1428. Zur Differenzierung sehr dicker Schnitte wird der Anilinölgehalt der Xylolmischung erhöht, u n t e r Umständen bis zu reinem Anilinöl. Bei dünnen, zarten Schnitten n i m m t m a n dagegen Anilinöl-Xylol-Mischungen im Verhältnis 2 : 3 oder 1:3. Bei Verwendung der letztgenannten Lösungen leistet die Methode auch ausgezeichnetes f ü r die Darstellung aller möglichen F a s e r s t r u k t u r e n wie z. B. Bindegewebsfasern, Knochenfibrillen, Sharpeysche Fasern (s. § 1649), Epithelfasern im Plattenepithel, Interzellularbrücken, Gallenkapillaren u. a. (B e n e k e 93). Man muß die Differenzierung unter dem Mikroskop verfolgen und, wenn der richtige Entfärbungsgrad erreicht ist, sofort unterbrechen und mit Xylol gut auswaschen. 1429. Fibrinfärbung nach K o c k e l (99). 1. Einstellen der entparaffinierten Schnitte aus dest. Wasser in l°/oige wässerige Chromsäurelösung 5—10 Minuten. — 2. Kurz Auswaschen in Wasser (höchstens 5—10 Sekunden). Die Schnitte dürfen ihre gelbe F a r b e nicht verlieren. — 3. F ä r b e n i n Lithiumhämatoxylin nach Weigert (s. § 1824) 15—20 Min. — 4. Abspülen in Wasser, einstellen in eine 10°/oige wässerige Alaunlösung, bis die Schnitte dunkelblau sind (ca. 1 Minute). — 5. Auswaschen in Wasser u n d Übertragen in Weigertsche Borax-Ferricyankaliumlösung (s. § 1822, 7), die mit der dreifachen Menge Wasser v e r d ü n n t wird. Differenzieren bis Untergrund im Mikroskop hellbräunlich. 3—6 Minuten. — 6. Auswaschen in Wasser, E n t f ä r b e n des Untergrundes in 10°/oiger Alaunlösung. Auswaschen, evtl. K e r n f ä r b u n g mit C a r m a l a u n usw. — Die Kockelsche Methode f ä r b t neben Fibrin auch Muskeln (Fibrillen!), Blutkörperchen, Gallenkapillaren usw. 1430. S c h u e n i n o f f f ä r b t Fibrin mit dem § 1513 angegebenen Malloryschen Hämatoxylin 15—20 Minuten, spült mit Wasser ab und behandelt die Schnitte 20 Minuten bis 20 S t u n d e n weiter mit 5—10"/oiger Phosphorwolframsäure, wäscht mit Wasser gut aus, d a n n Alkohol usw. 1431. Bei A n w e n d u n g der Azanfärbung oder Malloryfärbung färben sich die Fibrinfäden häufig distinkt rot. 1432. Um F i b r i n auf dem Objektträger darzustellen, lasse man einen Bluttropfen ein paar Stunden in einer feuchten K a m m e r r u h i g liegen, bedecke das Ganze mit einem Deckglas und wasche mit Wasser aus, indem man an der einen Seite des Deckglases Wasser zusetzt und auf der gegenüberliegenden Seite mit Fließpapier absaugt. Sind die meisten Blutkörperchen weggeschwemmt, so setzt man Jod-Jodkaliumlösung hinzu, wodurch sich die Fibrinfäden u n d -netze intensiv gelb bis braun färben. Uber Fixierung, Einbettung u n d F ä r b u n g des B l u t p l a s m a - G e l s s. B u c h e r (36).

G. Verschiedenes 1433. Darstellung von H ä m i n k r i s t a l l e n (T e i c h m a n n sehe Kristalle). Man bringt einen Tropfen Blut auf einen Objektträger und vermischt ihn sorgfältig mit einem kleinen Tropfen einer 0,9°/oigen Kochsalzlösung. Dann erwärmt man bis die Flüssigkeit verdunstet ist und ein rotbrauner Rückstand zurückbleibt. Nach Auflegen eines Deckglases läßt man Eisessig zufließen, bis der Spalt zwischen Deckglas und Objektträger gefüllt ist. Nun erwärmt man

332

Untersuchung des Blutes

§ 1434—1437.

das Präparat bis zum völligen Verdunsten des Eisessigs. Zuletzt wird das nun trockene Präparat mit Xylol ausgewaschen und in Balsam eingelegt. — Die Häminkristalle ( = salzsaures Hämatin) treten als rhombische Täfeichen hervor. 1434. Hämatoidinkristalle findet man als rotgelbe, aus fuchsroten, rhombischen, eisenfreien Kristallen bestehende Massen in apoplektischen Herden, in Corpora lutea des Ovars u. dgl. 1435. Zum raschen N a c h w e i s v o n H ä m o s i d e r i n (z. B. zur Schnelldiagnose von progressiver Paralyse) legt man nach S p a t z (23b) kleine Stückchen des betreffenden unfixierten Gewebes nach Abspülen des anhaftenden Blutes mit H2O für mindestens 15 Minuten (besser länger) in konzentrierte Schwefelammoniumlösung, wobei die eisenhaltigen Blutpigmentteilchen sich dunkel färben. Derartige Teilchen zerzupft man in phys. NaCl-LöSung weiter, bringt sie in Glyzerin und stellt durch Aufdrücken eines Deckgläschens ein Quetschpräparat her. 1436. H ä m ö g l o b i n f ä r b u n g nach L e p e h n e (20). Fixierung: Formol (Material, das zu lange in Formol liegt, ist unbrauchbar). Bei Fixierung in Chromsäure und deren S,alzen ist die Färbung oft schwächer. Fixierung in Alkohol oder Aceton ist ungeeignet.' Gefrier- oder unaufgeklebte Paraffinschnitte kommen aus Wasser 1. in Benzidin-Perhydrollösung. Eine kleine Messerspitze Benzidin wird in 2 ccm 96°/oigem Alkohol im Reagenzglas gelöst und ein Gemisch von 0,5 ccm Perhydrol und 4,5 ccm 70°/oigen Alkohol zugesetzt (am besten frisch bereitet). Man färbt 1—3 Minuten im Uhrschälchen, Paraffinschnitte etwas länger. Die Schnitte dürfen sich nicht falten und nicht an der Oberfläche schwimmen. 2. Übertragen in 50°/oigem Alkohol. — 3. Wasser. — 4. Nachfärben in Hämalaun 5—10 Minuten. — 5. Wasser; durch Alkohol und Xylol in Balsam. — Ergebnis: Erythrozyten und freies Hämoglobin dunkelbraun. Um in unklaren Fällen Verwechslung mit H ä m o s i d e r i n zu vermeiden, bringt man die Schnitte nach Nr. 3 auf 1/a—1 Stunde in 2°/oige Ferrocyankaliumlösung und l°/oige Salzsäure 5ä. Dann Auswaschen und evtl. Karminfärbung. Ergebnis: Hämoglobin: braun; Hämosiderin: blau. Bei der Färbung von A u s s t r i c h e n nimmt man zur Verdünnung des Perhydrols statt 70°/oigen 96°/oigen Alkohol. Färbedauer des unfixierten Präparates 10 Minuten; dann wässern usw. Die Färbung ist nicht sehr lange haltbar. 1437. Um die Haltbarkeit der Färbung zu erhöhen, versuchen S l o n i m s k i und L a p i n s k i (32) das Hämoglobin bei der Fixierung möglichst rasch in Methämoglobin umzuwandeln. Sie fixieren zu diesem Zwecke Objekte beliebiger Größe für 15—24 Stunden in: Ferricyankalium 2,5—4 g, Formol 10 bis 20 ccm, dest. Wasser 100 ccm. Dann 24stündiges Auswaschen in fließendem Wasser, Einbettung in Paraffin. Die mit Eiweißglyzerin aufgeklebten Schnitte werden wie gewöhnlich entparaffiniert, aus dest. Wasser flach in eine Petrischale gelegt und mit dem Benzidinreagens (s. u.) Übergossen. Nach 2—5 Min., während welcher man die Schale zur Verfolgung der Färbung über eine weiße Unterlage hält, wird das Präparat in 70°'/oigem Alkohol gut abgespült. Anschließend Kernfärbung mit einem roten oder grünen Farbstoff wie Neutralrot oder Methylgrün (besser Kernechtrot R.). Dann Alkohol, Xylol, Balsam. Ergebnis: Erythrocyten und freies Methämoglobin sind anfangs blau gefärbt, später geht der Farbton in dunkelbraun oder bräunlichgold über. Herstellung der Benzidinlösung: 0,1—0,2 g Benzidin. puriss. (Merck) wird unter Schütteln in 2—3 ccm 96°/oigem Alkohol gelöst und in 10 ccm 70°/oigen Alkohol gegossen. Hierauf Zusatz von 2 ccm 10°/oigem Perhydrol und 1 ccm Wu's B e n z i d i n r e a g e n s ( = konzentrierte Lösung von Benzidin in Eisessig).

§ 1438—1442.

Zählen der Blutkörperchen

333

1438. Uber die Verwendung dieser und ähnlicher Methoden zur Darstellung der B l u t k a p i l l a r e n s. § 1966 ff. 1439. Der B l u t k r e i s l a u f läßt sich am einfachsten an den im Sommer so leicht zu beschaffenden K a u l q u a p p e n von Fröschen oder Kröten untersuchen. Man bedeckt dazu den Rumpf einer auf den Objektträger gelegten Larve mit etwas feuchter Watte. Das Tier schlägt zuerst ziemlich lebhaft, beruhigt sich aber bald, worauf man die Blutgefäße des Flossensaumes mit mittlerer Vergrößerung ohne Mühe einstellen und beobachten kann. 1440. Beim e r w a c h s e n e n F r o s c h nimmt man die Untersuchung in Urethannarkose vor (s. § 106). Man injiziert dem Tier dazu subkutan oder in den Rückenlymphsack 1,5 ccm einer 10°/oigen Lösung und wartet die volle Wirkung ab, die erst nach 1—2 Stunden eintritt Als gute Beobachtungsstelle ist die S c h w i m m h a u t zu empfehlen. Man zieht dazu zwei Zehen auseinander und befestigt sie mit dünnen Insektennadeln auf einer Korkplatte, die mit einem Locheisen durchlocht ist. Die Platte ist so groß zu wählen, daß der ganze Frosch darauf Platz hat. Das Loch der Korkplatte wird dann über die Öffnung des Mikroskoptisches gebracht, so daß die Schwimmhaut und ihre Gefäße bei durchfallendem Licht beobachtet werden können. Weitere Beobachtungsstellen bietet die F r o s c h z u n g e , die vorgezogen und in ähnlicher Weise mit Nadeln auf die durchlochte Korkplatte aufgespannt wird. Ferner das M e s e n t e r i u m , das durch einen in der Axillarlinie gemachten Einschnitt an einer Darmschlinge aus der Bauchhöhle vorgezogen wird (s. C o h n h e i m 67b). Für die L u n g e verfahre man nach F. H o l m g r e n (74). Während längerer Beobachtung müssen die Objekte, um Austrocknung zu vermeiden, mit physiologischer Kochsalzlösung berieselt werden. Weitere Objekte: Tritonlunge ( E w a l d 97), Harnblase ( H ä l l s t e n 86), ferner äußere Kiemen von Tritonen und besonders von Salamanderlarven; Flossenteile kleiner Fische. Vogelkeimscheiben vom 2.—3. Bebrütungstag usw. 1441. Man achte bei diesen Untersuchungen auf das Vorhandensein des axialen und Wandstromes, auf das Pulsieren in den Arterien usw. Man sieht unter günstigen Umständen die Umkehr des Stromes in den Kapillaren. An den Bifurkationsstellen der Kapillaren bleiben oft die Blutkörperchen hängen und werden ganz enorm (auf das zwei- bis dreifache ihrer ursprünglichen Länge) gedehnt. Wird ein Blutkörperchen wieder frei, so nimmt es wieder die ursprünglichen Dimensionen an (Elastizität). An Mesenterien, aber auch in der Lunge, treten alsbald infolge der Vertrocknung, Temperaturschwankungen usw. Zustände auf, die als Anfänge der Entzündung aufgefaßt werden; u. a. sieht man das Auswandern der weißen Blutkörperchen durch, die Gefäßwände. Eine sehr eingehende Darstellung der Verfahren und Einrichtungen zur Beobachtung des Blutstromes an Kaltblütern findet man bei K l e m e n s i e w i c z (21). Uber die Beobachtung der oberflächlichen Blutgefäße am lebenden Menschen siehe E. W e i ß (21). H. Die Zählung der Blufelemenfe 1442. Zum Z ä h l e n d e r B l u t k ö r p e r c h e n dient der Zählapparat von T h o m a - . Z e i s s , der aus zwei M i s c h p i p e t t e n und einer Z ä h l k a m m e r besteht. Die Mischpipetten sind Kapillarröhrchen mit einer ovoiden Erweiterung, in der eine freibewegliche Glasperle liegt. Unterhalb der Erweiterung befinden sich auf jedem Röhrchen zwei mit 0,5 und 1 bezeichnete Marken; die letztere soll nahe an der Erweiterung liegen. Oberhalb der Erweiterung sind die Marken 101 bzw. 11 angebracht. Die Mischpipette mit Marke 101 dient zur Zählung der r o t e n , die mit Marke 11 zur Zählung der w e i ß e n Blutkörperchen.

334

Untersuchung des Blutes

§ 1443—1444.

Das Aufsaugen des Bluttropfens (über die Entnahme desselben s. § 1293 f ) geschieht mittels eines Gummischläuchchens, das mit einem gläsernen Mundstück versehen ist. In letzteres steckt man, um das exakte Ansaugen zu erleichtern, ein ca. 1 cm langes Watteröllchen. Dadurch lassen sich alle zum Teil kostspieligen und unhandlichen sog. Präzisionssauger ersetzen. Die Z ä h l k a m m e r ist genau 0,1 mm tief. Ihr Boden ist in kleine Quadrate eingeteilt, wobei je 16 kleine Quadrate ein größeres »Gruppenquadrat« bilden, das durch besondere Liniensysteme abgegrenzt ist. Die Seitenlänge eines kleinen Quadrates mißt V20 mm, seine Fläche demnach V20XV20 = 'A00 mm 2 . Da die Höhe der Kammer aber V10 mm beträgt, so entspricht das Volumen über einem kleinen Quadrat V4ooXVio = V4000 mm 3 . Die ä l t e r e n Zählkam'mern sind aufgekittet; bei ihrer Reinigung ist daher Xylol, Äther u. dgl. zu vermeiden. Die n e u e r e n Kammern sind kittlos aus e i n e m Stück gearbeitet. Ihr Mittelstück ist durch Rinnen in drei Leisten geteilt, von denen die beiden äußeren zum Auflegen des Deckglases dienen, während die mittlere um V10 mm niedriger ist und eine oder mehrere Netzteilungen trägt. Die neueren Kammern sind leichter zu beschicken und leichter zu reinigen. Die Netzteilung wird in verschiedener Ausführung geliefert. Von den zahlreichen Modifikationen der ursprünglichen T h o m a sehen Netzteilung seien als gebräuchlichste die von B ü r k e r , N e u b a u e r und T ü r c k genannt. Sehr zweckmäßig ist auch die Netzteilung nach B r a n d t (Zeiss), bei fler doppelte und dreifache Linien vermieden sind und trotzdem eine klare Begrenzung der Zählflächen erreicht ist. 1443. R e i n i g u n g d e r I n s t r u m e n t e . Zählkammer wie Pipetten sind peinlich sauber zu halten und nach jeder Benützung sofort zu reinigen. Die Zählkammer wird mit dest. Wasser und Seidenpapier gesäubert. Durch die Mischpipette saugt man — am besten mit einer Wasserstrahlpumpe — zuerst l°/oige t Natronlauge, dann reichlich Wasser und zuletzt etwas Alkohol und Äther, worauf man durch Durchsaugen von Luft trocknet. Haben sich Blutgerinnsel festgesetzt» so füllt man die Pipette mit 40°/oiger Natronlauge und läßt sie einen halben Tag liegen. Die Gerinnsel lösen sich dann beim Durchsaugen von Wasser leicht los. Auch Verdauung mit salzsaurer Pepsinlösung führt zum Ziel. 1444. A u s f ü h r u n g e i n e r Z ä h l u n g d e r r o t e n B l u t k ö r p e r c h e n . a) Füllung der Mischpipette. Man saugt einen frischen Bluttropfen mit der dazu bestimmten Pipette sorgfältig bis zur Marke 0,5 auf, wischt die Spitze der Pipette außen vorsichtig ab und saugt unter Vermeiden von Luftbläschen genau bis zur Marke 101 Verdünnungsflüssigkeit (s. u.) nach (ein geringer Überschuß kann durch vorsichtiges Abwischen der Pipettenspitze entfernt werden). Dann faßt man die Pipette nach Abnahme des Gummischläuchchens zwischen Daumen und Mittelfinger und mischt den Pipetteninhalt 1 Min. lang durch vorsichtiges Schütteln unter Vermeidung von Schaumbildung. Die Erweiterung der Pipette enthält nun eine Blutverdünnung von 1: 200. Bei starker Anämie saugt man das Blut bis zur Marke 1,0. Die schließliche Verdünnung ist in diesem Fall 1:100. Als Verdünnungsflüssigkeit dient meist H a y e m sehe Flüssigkeit (s. § 1302). b) Beschickung der Zählkammer. Nach der Mischung des Blutes bläst man, ohne zu warten, die ersten 2—3 Tropfen aus der Pipette, den nachfolgenden Tropfen verwendet man zur Zählung. Bei der ä l t e r e n aufgekitteten Zählkammer setzt man den Tropfen in die Mitte der Kammer und schiebt dann sofort ein geschliffenes Deckglas unter Vermeiden von Luftblasen vom Rand /her so fest darüber, daß an den Rändern N e w t o n sehe Farbringe erscheinen. Bei der n e u e r e n kittlosen Kammer wird zuerst das Deckglas unter Beachtung des Farbphänomens fest aufgelegt, was durch ganz geringe Anfeuchtiung der seitlichen Kammerleisten erleichtert wird. Dann wird auf die mittlere Leiste seitlich am

§ 1445—1446.

Zählen der Blutkörperchen

335

D e c k g l a s r a n d d e r B l u t t r o p f e n aufgesetzt, der d u r c h kapillare A n s a u g u n g von selbst die K a m m e r f ü l l t . c) Zählung. N a c h Beschickung l ä ß t m a n die Zellen bei horizontaler Lage der K a m m e r f ü r 3—5 Min. absetzen. D a n n stellt m a n bei m i t t l e r e r V e r g r ö ß e r u n g (etwa A c h r o m a t 40X, Okular 8X) u n d s t a r k e r A b b i e n d u n g auf die Striche der Netzteilung u n d d a m i t auf die zu z ä h l e n d e n B l u t k ö r p e r c h e n ein. Man b r i n g t ein G r u p p e n q u a d r a t ins Gesichtsfeld u n d z ä h l t d a n n die in j e d e m d e r 16 kleinen Q u a d r a t e liegenden E r y t h r o c y t e n aus. U m Doppelzählungen zu v e r m e i d e n , w e r d e n dabei von d e n auf d e n Grenzlinien eines kleinen Q u a d r a t e s liegenden F o r m e l e m e n t e n n u r diejenigen gezählt, die auf d e r r e c h t e n oder auf der u n t e r e n G r e n z linie liegen. In dieser Weise zählt m a n die E r y t h r o c y t e n von m i n d e s t e n s 80 klein e n Q u a d r a t e n ( = 5 G r u p p e n q u a d r a t e n ) aus. T • 4000 • v d) Berechnung. Die B e r e c h n u n g erfolgt n a c h der F o r m e l , wobei r die igen wässerigen Lösung von Ferridammonium tartaricum f ü r 1—24 Stunden, dann kurz in Wasser und 3—24 Stunden in eine 0,5°/oige wässerige (gereifte) Hämatoxylinlösung. Dann Wässern usw. Sind nach Abspülen des Farbstoffes die Bälkchen des Reticulums noch nicht tiefschwarz, so kommt das Präparat noch auf 20—30 Minuten in die stets frisch zu bereitende Eisensalzlösung zurück. 1480. S c h n i t t v e r d a u u n g v o r A u f l ö s u n g d e s P a r a f f i n s b z w . C e l l o i d i n s . Bei s e h r z a r t e n S c h n i t t e n läßt man die Verdauungsflüssigkeit nach dem Vorgange C. M. J a c k s o n s vor Entfernung des Paraffins einwirken, indem man die 6—8¡x dicken Schnitte entweder aufgeklebt in die Lösung stellt oder besser sie auf ihr schwimmen läßt. Man muß die Trypsinlösung jedoch länger als sonst einwirken lassen (1—4 Tage). Die verdauten Schnitte werden ausgewaschen und vor Lösung des Paraffins noch mit Eisenhämatoxylin gefärbt (1 Tag Eisenalaun, 1 Tag Hämatoxylin, Differenzieren unnötig). Dann kann man nach Auswaschen, Aufkleben und Trocknen der Schnitte'das Paraffin durch Xylol lösen und in Balsam einschließen. 3. Verdauung mit Pepsin

1481. H e r s t e l l u n g d e r V e r d a u u n g s f l ü s s i g k e i t . 0,1—0,5 g Pepsinum siccum (Merck) werden in 100 ccm einer 0,2°/oigen Salzsäure gelöst. Zusatz von 2—3 ccm Toluol. 1482. Die E i n w i r k u n g erfolgt am besten bei 37—40° C. Bei Schnittverdauung wird von Zeit zu Zeit das Fortschreiten der Auflösung im Mikroskop kontrolliert. Sobald der gewünschte Gewebsteil hinreichend isoliert ist, wird

§ 1483—1485.

Färbemethoden (Kollagen)

343

die Verdauung durch Auswaschen in dest. Wasser unterbrochen. Wie bei der Trypsinverdauung läßt sich der Vorgang auch hier am Stück oder am Schnitt ausführen. In manchen Fällen läßt man der Vorverdauung mit Pepsin noch eine Nachverdauung mit Trypsin folgen, das dann auch Gewebe angreift, die sonst der Verdauung längere Z'eit widerstehen. C. Färbemethoden 1. Färbung des kollagenen Gewebes a) F ä r b u n g v o n

Totalpräparaten

1483. Zur färberischen Darstellung der F i b r o c y t e n und H i s t i o c y t e n u n d i h r e r p r o t o p l a s m a t i s c h e n A u s l ä u f e r breitet man kleine Stückchen des subkutanten Bindegewebes in der in § 1454 geschilderten Weise rasch auf Objektträgern aus und fixiert sie noch vor dem Trockenwerden durch Einstellen in Hellysche oder Maximowsche Flüssigkeit (Formol ist dafür wenig geeignet). Nach 1—2 Stunden ebenso langes Auswaschen in Wasser, steigender Alkohol bis zum 96°/oigen, dann zurück in dest. Wasser und panoptische Färbung nach Pappenheim (s. § 1403 ff.). („H ä u t c h e n p r ä p a r a t"). S t i e v e (29) empfiehlt zur Färbung derartiger Häutchenpräparate an Stelle der von W. und M. M ö l l e n d o r f f (26) angegebenen Eisenhämatoxylinlackmethode als besser und zuverlässiger die Molybdänhämatoxylinfärbung von Held |(siehe § 1875), die bei richtigem Alter der Farblösung stets ganz vorzüglich klare Bilder liefert. S t i e v e weist mit Hecht auch auf die Wichtigkeit der Untersuchung von Flachschnitten hin. 1484. J a ß w o i n (32) bringt das zu untersuchende Bindegewebe zuerst möglichst rasch in Formol (12: 88 Brunnenwasser). Das Formol wird kurz vor Verdünnung zur Neutralisierung mit Magnesiumkarbonat (5 g auf 100 ccm) geschüttelt und filtriert. 1 Stunde nach Einlegen kann man schon mit einer scharfen Schere einen kleinen Streifen aus der Oberfläche des glasartig durchsichtigen Bindegewebes herausschneiden. Er wird auf eineu Eiweißobjektträger gezogen und solange dem Trocknen ausgesetzt, bis er sich ohne zu gleiten mit Nadeln zu einem dünnen Häutchen ausbreiten läßt. Dieses wird sofort in 96°/oigen Alkohol und dann durch absteigenden Alkohol in dest Wasser gebracht. Bei richtiger Herstellung haftet das Präparat sehr gut. Zur Färbung löst man 1 g Hämatoxylin in 100 ccm dest. Wasser durch Kochen bei kleiner Flamme und läßt reifen bis Lösung dunkelrot. Ca. 5 Tropfen davon werden zu 12 Tropfen einer ö^oigen Eisenalaunlösung gefügt. (Verhältnis wechselt je nach Reife der H.-Lösung; man muß die maximale Menge zufügen, welche noch keinen Niederschlag erzeugt). Die blauviolette Farblösung wird für 15—30 Sek. auf das Präparat gegossen, dann Übertragen in Brunnenwasser, evtl. Nachfärbung, dann Alkoholreihe, Karbolxylol, Xylol, Balsam. 1485. A u f b l ä t t e r n b i n d e g e w e b i g e r M e m b r a n e n (z. B. von Organkapseln). N i e ß i n g (35) bringt dazu die Häutchen durch die Alkoholreihe in abs. Alkohol und drückt sie dann auf einen gut entfetteten Objektträger platt an. Dann wartet man, bis sie etwas trockener geworden sind und gießt, vor sie anfangen sich abzuheben, eine Lösung von Zelluloid in Amylacetat (2,0—5,0: 100) darauf, läßt trocknen und wiederholt den Vorgang 1—2mal. Nach Trocknen lassen sich dann vom Präparat, das fest auf dem Objektträger haftet, vom Rand her etwa von einem kleinen Einschnitt aus mit einer gut greifenden Pinzette leicht Häutchen der verschiedensten Dicke abziehen. Das auf dem Objektträger verbleibende Stück gewährt durch seine im Auflicht deutlich hervortretende Reliefbildung einen Einblick in seine innere Struktur.

344

Untersuchung des Bindegewebes

b) F ä r b u n g v o n

§ 1486—1489.

Schnittpräparaten

aj Die Mallorysche Bindegewebsfärbung und Modifikationen derselben. 1486. Die von M a l l o r y 1900 zur Färbung des kollagenen Bindegewebes angegebene Methode ist heute nur noch wenig in Gebrauch, da sie durch eine Reihe von Modifikationen überholt ist. Die Originalvorschrift von M a l l o r y lautet: 1. Färben in einer 0,l°/oigen wässerigen Säurefuchsinlösung 3 Minuten. 2. Kurzes Auswaschen in Wasser und Fixieren der Färbung durch Einstellung in l°/oige Phosphormolybdänsäure 3—5 Minuten. 3. Auswaschen in Wasser und 2 Minuten Färben in einer Lösung von Anilinblau 0,5 g; Orange G 2 g; Oxalsäure 2 g; dest. Wasser 100 ccm (die längere Zeit haltbare Lösung wird gekocht, abgekühlt und filtriert). 4. Auswaschen in Wasser, Differenzieren in 96°/oigem Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Canadabalsam. R e s u l t a t : Kollagenes und retikuläres Bindegewebe scharf dunkelblau, Schleim blau, Erythrozyten rotorange, Muskelgewebe leuchtend orange, Neuroglia, Ganglienzellen rotviolett, Chromatin rot bis gelblich bräunlich. S ä u r e f u c h s i n wird von Alkohol gar nicht, stark aber von Wasser angegriffen (daher Fixierung in Phosphormolybdänsäure); A n i l i n b l a u verhält sich umgekehrt. 1487. Am schönsten gelingt die Mallorysche Originalmethode nach Fixierung in Sublimat oder Zenker'scher Flüssigkeit, doch können auch in Formol, Alkohol, Bouin'scher oder Flemming'scher Flüssigkeit fixierte Objekte noch leidlich gefärbt werden, wenn man die Schnitte vor der Färbung 20 Min. bis mehrere Stunden in Zenker'sche Flüssigkeit oder in 3°/oige Kaliumbichromatlösung einstellt, kurz abwäscht und färbt (M c G i l l . 09).

1488. Die Methode M a l l o r y s e r f u h r im Laufe der J a h r e zahlreiche Abänderungen, durch die ihre Mängel behoben werden sollten. Von den Modifikationen seien nachfolgend die Methoden von H e i d e n h a i n , Petersen, D o m a g k und C r o s s m o n näher angeführt. 1489. Azanfärbung nach H e i d e n h a i n (15). Die Methode ist der Malloryschen Bindegewebsfärbung an Haltbarkeit, Schärfe der Färbung und Sicherheit des Gelingens weit überlegen. Sie hat sich f ü r die konstrastreiche Darstellung des kollagenen Bindegewebes wie f ü r die Färbung verschiedenster Drüsengewebe außerordentlich bewährt, so daß sie zu den besten und gebräuchlichsten Färbemethoden zählt. V o r b e h a n d l u n g : Am besten gelingt die Methode nach Fixierung in sublimathaltigen Flüssigkeiten, wie Sublimat-Eisessig, Sublimat-Trichloressigsäuregemischen, Zenkerscher Flüssigkeit und deren Modifikationen nach Helly, Maximow, Held usw., ferner nach Bouinscher oder Carnoyscher Flüssigkeit u. a. mehr. Selbst nach einfacher Formolfixierung bekommt man mit der Azanfärbung noch gute Resultate, während die Mallorysche Originalmethode hiernach unbefriedigend ausfällt. Nur Präparate, die nach Fixierung in chromhaltigen Flüssigkeiten schlecht ausgewaschen oder zu lange chromiert wurden, färben sich unschön und fleckig. Die besten Resultate erhält man bei einer Schnittdicke von 5—7, höchstens 10//. A u s f ü h r u n g der F ä r b u n g : 1. Einstellen der paraffinbefreiten Schnitte aus dest. Wasser in Azocarmin (Herstellung s. u.; oft empfiehlt sich auch Vorbehandlung der Schnitte mit Anilinalkohol; vgl. § 1490). Man färbt in gut verschlossenem Glas 45—60 Minuten im Thermostaten bei 56° bis 60° C und läßt dann für 5—10 Minuten bei Zimmertemperatur abkühlen. Bei Vorwärmen der Farblösung läßt sich die Färbezeit im Thermostaten gewöhnlich auf 10—15 Minuten abkürzen.

§ 1490—1491.

Färbemethoden (Kollagen)

345

2. Abspülen in dest. Wasser. 3. Differenzieren in einer alkoholischen Anilinlösung (1 ccm Anilinöl auf 1000 ccm 90°/oigen Alkohols). Man differenziert bis die Kerne durch Entfärbung des übrigen Gewebes gut hervortreten. Allenfalls läßt sich der Vorgang durch Zusatz von etwas dest. Wasser zur Anilinlösung beschleunigen. 4. Kurzes Auswaschen des Anilins in essigsaurem Alkohol (1 ccm Eisessig auf 100 ccm 96°/oigen Alkohol) V2—1 Minute. Die Differenzierung wird dadurch unterbrochen. Wenn das Gewebe noch zu stark rot gefärbt ist, dann kommt das Präparat wieder zurück in den Anilinalkohol. 5. Beizung dös Bindegewebes in einer 5°/oigen wässerigen Phosphorwolframsäure, 1—3 Stunden. Das Bindegewebe wird dabei noch weiter entfärbt. Die Phosphorwolframsäure soll ehem. rein und unzersetzt sein. 6. Kurzes Abspülen in dest. Wasser. 7. F ä r b e n in Anilinblau-Orange-Essigsäure (s. u.) 1—3 Stunden. 8. Kurzes Auswaschen in Wasser, differenzieren in 96%>igem Alkohol, dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Bei sehr empfindlichen feinsten Fasern unterläßt man das Abspülen in Wasser und taucht gleich kurz in 96°/oigen Alkohol. E r g e b n i s : Das kollagene und reticuläre Bindegewebe ist außerordentlich scharf blau gefärbt, Chromatin rot, Muskelgewebe je nach Fixierung rötlich bis orange. Erythrocyten: rot, Gliafasern rot, Schleim blau. Die Granulationen der Zellen f ä r b e n sich je nach ihrer Beschaffenheit gelb, rot oder blau. — Die Haltbarkeit der P r ä p a r a t e ist bei sorgfältiger Herstellung sehr gut. Herstellung der F ar b 1ös u n g en : A z o c a r m i n l ö s u n g : 0,1g Azocarmin G (Hollborn) w i r d in 100 ccm dest. Wasser aufgeschwemmt, k u r z aufgekocht und nach Abkühlen auf Zimm e r t e m p e r a t u r durch ein nicht gehärtetes Filter abfiltriert. Dabei geht ein Teil der sehr feinen Farbkriställchen ungelöst durchs Filter, und zwar gerade so viel, als sich beim späteren E r w ä r m e n im Wärmeschrank löst. Schließlich w e r den 100 ccm der filtrierten Lösung mit 1 ccm Eisessig versetzt. . Weniger empfehlenswert ist nach H e i d e n h a i n das wasserlösliche A z o c a r m i n B, das in 0,25—l°/oiger Lösung angewandt wird. Auch hier wird auf 100 ccm Lösung 1 ccm Eisessig zugesetzt. Anilinblau-Orange-Gemisch. Man löst 0,5 g wasserlösliches Anilinblau und 2 g Gold-Orange G in 100 ccm dest. Wasser, gibt 8 ccm Eisessig zu, kocht auf und fitriert nach Erkalten. Zur F ä r b u n g v e r d ü n n t m a n diese Stammlösung mit der 1—3fachen Menge dest. Wassers. H e i d e n h a i n ersetzt demnach die Oxalsäure des Mallory'schen Originalgemisches durch Eisessig, da dieser die Azocarminfärbung nicht angreift. Das Farbgemisch ist sehr gut haltbar. 1490. In der ursprünglichen Vorschrift stellte Heidenhain die Schnitte vor der Azocarminfärbung in alkoholische Anilinlösung. Neuerdings läßt Heidenhain diese Vorbehandlung als unnötig weg. Bei vergleichenden Färbeversuchen konnte ich aber feststellen, daß die Kernfärbung nach Vorbehandlung mit Anilin meist doch noch leuchtender ausfällt. Es ergab sich folgende Reihenfolge: am intensivsten: bei Vorbehandlung mit Anilin und Färbung bei 56°; schwächer: Färbung bei 56° ohne Vorbeize; noch schwächer: Anilin und Färbung bei 19°; am schwächsten: Färbung bei 19°. ohne Vorbeize. 1491. Statt Azocarmin verwendet P e t e r s e n (24) mit ähnlichem Ergebnis S ä u r e a l i z a r i n b l a u (s. § 748), wodurch sich die Färbezeit abkürzen und eine E r w ä r m u n g der Farblösung entbehren läßt. Nach Fixierung in Formol,

346

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1492—1494.

Zenker, Helly u n d dgl. f a n d ich das Ergebnis bei beiden F ä r b u n g e n ü b e r e i n stimmend. Nach F i x i e r u n g in P i k r i n s ä u r e - u n d Sublimattrichloressigsäuregemischen ist die Heidenhainsche Azocarminmethode vorzuziehen. A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g : 1. F ä r b u n g in S ä u r e a l i z a r i n b l a u - A l u m i n i u m s u l f a t : 5 M i n u t e n (über Einzelheiten s. § 748). — 2. A b s p ü l e n in dest. Wasser, differenzieren u n d beizen in 5°/oiger Phosphorwolf r a m s ä u r e : einige M i n u t e n bis eine Stunde. — 3. Abspülen in dest. Wasser. — 4. F ä r b e n in der u n v e r d ü n n t e n Anilinblau-Orange-Oxalsäurelösung (s. § 1486) 2 M i n u t e n (oder in der 2—3fach v e r d ü n n t e n 1—2 Stunden). — 5. K u r z spülen in Wasser, 96°/oiger Alkohol. Abs. Alkohol. Xylol. Balsam. 1492. K e r n e c h t r o t - A n i l i n b l a u - O r a n g e nach D o m a g k (33). Die Methode a r b e i t e t rasch u n d einfach, leistet jedoch in der D a r s t e l l u n g der f e i n e n Bindegewebsfasern wie in der Differenzierung der verschiedenen D r ü senzellen bei w e i t e m nicht das gleiche wie die Azanmethode. A u s f ü h r u n g : 1. K e r n f ä r b u n g mit K e r n e c h t r o t - A l u m i n i u m s u l f a t (siehe § 743) 5 Min. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3 . Einstellen in l°/oige wässerige P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e 5 Min. — 4. K u r z abspülen in dest. Wasser. — 5. F ä r b e n in A n i l i n b l a u - O r a n g e - O x a l s ä u r e (s. § 1486) 2 Min. — 6. Abspülen in dest. Wasser. — 7. Differenzieren in 96°/oigem Alkohol; absol. Alkohol, Xylol, Balsam. 1493. Noch weiter bleibt eine von R e i s i n g e r angegebene Modifikation, bei der eine heißgesättigte Lösung von Kernechtrot in Liqu. Alumin. acet. zur Anwendung kommt, in ihrem Ergebnis hinter der Azanmethode zurück. 1494. Hämatoxylin-Säurefuchsin-Orange-Lichtgrünf ä r b u n g nach C r o s s m o n (37). Die F ä r b u n g gibt nach den meisten F i x i e r u n gen g u t e Resultate. E i n b e t t u n g in Paraffin, Entparaffinieren, E n t f e r n u n g des S u b l i m a t s usw. w i e gewöhnlich. — Färbung: 1. Ü b e r f ä r b e n der K e r n e mit saur e m H ä m a l a u n oder Weigertschem H ä m a t o x y l i n . — 2. Auswaschen in B r u n n e n w a s s e r 10 Min. — 3. F ä r b e n in S ä u r e f u c h s i n - O r a n g e - G e m i s c h (s. u.) 1 Min. — 4. G u t abspülen in dest. Wasser. — 5. Differenzieren in l°/oiger P h o s p h o r w o l f r a m - oder P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e , bis das kollagene Bindegewebe v o l l s t ä n d i g e n t f ä r b t ist (sehr wichtig!). Man kontrolliert den Vorgang zweckm ä ß i g an der Adventitia der Gefäße. — 6. K u r z abspülen in dest. Wasser. — 7. G e g e n f ä r b u n g in L i c h t g r ü n (s. u.) oder Anilinblau (s. u.) 5 Min. — 8. K u r z abspülen in dest. Wasser. — 9. Differenzieren in l°/oiger Essigsäure, bis der Überschuß von L i c h t g r ü n bzw. Anilinblau von allen S t r u k t u r e n nicht bindegewebiger N a t u r e n t f e r n t ist u n d die roten F a r b t ö n e rein h e r v o r t r e t e n . Zeitd a u e r gewöhnlich 1—5 Min. — 10. K u r z abspülen in dest. Wasser. — 11. Direktes U b e r t r a g e n in absol. Alkohol (3 Portionen), Xylol, Balsam. Ergebnis: K e r n e s c h w a r z b r a u n . Cytoplasma, Muskelgewebe rot, E r y t h r o c y t e n orange, Bindegewebe g r ü n bzw. blau. Die O r a n g e f ä r b u n g d e r E r y t h r o c y t e n t r i t t am schöns t e n nach Z e n k e r - oder Hellyfixierung hervor. Herstellung

der

Farblösungen:

a) Säurefuchsin 1 g, Orange G 0,4 g, dest. Wasser 300 ccm, Eisessig 3 ccm, Thymolkristalle 0,2 g. b) Lichtgrün 1 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm. c) Anilinblau 2 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm. Bemerkungen: ad 3. Wenn sich die Präparate in 1 Minute schon sehr stark überfärben, so daß sich die nachfolgende Differenzierung in PW ungewöhnlich lange hinzieht, so empfiehlt es sich, das Farbgemisch mit dest. Wasser zu verdünnen. — ad 5. Die Differenzierung ist für den Erfolg von größter Wichtigkeit; wird sie zu frühzeitig unterbrochen, so kommt es nachher bei der Bindegewebsfärbung zu unschöner Farbstoflüberlagerung. Die entfärbende Wirkung der Lösung erschöpft

§ 1495—1497.

Färbemethoden (Kollagen)

347

sich ziemlich bald. Die Lösung muß daher nach einigen Präparatreihen wieder erneuert werden. — ad 7. Lichtgrün färbt durchsichtiger als Anilinblau, man kann mit ihm daher auch dickere Schnitte noch sehr gut färben. — ad 9. Für die Differenzierung in Essigsäure gilt das gleiche wie in 5. Mißerfolge beruhen meist auf Nichtbeachtung dieser beiden Punkte. — ad 11. Bei der Entwässerung in abs. Alkohol kommt es wahrscheinlich dank der Vorbehandlung mit Essigsäure selbst bei längerer Einwirkung zu keinem Farbstoffverlust mehr.

ß ) D i e Massonsche T r i c h r o m f ä r b u n g u n d M o d i f i k a t i o n e n d e r s e l b e n 1495. Die n a m e n t l i c h in F r a n k r e i c h viel g e b r a u c h t e M a s s o n s c h e T r i c h r o m f ä r b u n g gibt s e h r g u t e R e s u l t a t e . Die f e i n s t e n B i n d e g e w e b s f ä s e r c h e n w e r d e n d u r c h sie z w a r e t w a s w e n i g e r scharf d a r g e s t e l l t als d u r c h d i e A z a n f ä r b u n g . D a f ü r ist das C y t o p l a s m a bei d e r Massonschen M e t h o d e i n f o l g e seiner s c h a r f e n R o t f ä r b u n g u n d i n f o l g e des G e g e n s a t z e s z u r s c h w a r z e n K e r n f ä r b u n g besser s i c h t b a r . Beide M e t h o d e n e r g ä n z e n sich also s e h r gut. A u c h die von W a 11 a r t u n d v o n G o 1 d n e r a u s g e a r b e i t e t e n Modifikationen d e r O r i g i n a l m e t h o d e , die d e n F ä r b e p r o z e ß v e r e i n f a c h e n , sind s e h r e m p f e h l e n s w e r t . Die H a l t b a r k e i t d e r P r ä p a r a t e ist ausgezeichnet. 1496. O r i g i n a l m e t h o d e v o n M a s s o n. F i x i e r u n g n a c h Bouin, Z e n k e r , Helly, M a x i m o w , Stieve, C a r n o y od. dgl., E i n b e t t u n g in P a r a f f i n . — Färbung: 1. Beiz u n g d e r S c h n i t t e in 5°/oiger E i s e n a l a u n l ö s u n g 24 S t u n d e n (oder 30 Min. bei 50 D C). — 2. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r . — 3. F ä r b e n in R e g a u d s c h e m H ä m a t o x y lin (s. § 988) 24 S t u n d e n (oder 30 Min. b e i 50° C). — 4. A b s p ü l e n in dest. Wasser, g u t a b t r o p f e n lassen. — 5. D i f f e r e n z i e r e n in 2,5%igem E i s e n a l a u n oder besser in p i k r i n s a u r e m A l k o h o l (2 Teile gesät*, a l k o h . L ö s u n g v o n P i k r i n s ä u r e , 1 Teil 96°/oiger Alkohol), bis n u r m e h r die K e r n e g e f ä r b t sind. — 6. A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r 10 Min. — 7. F ä r b e n in S ä u r e f u c h s i n 1 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm 5 Min. — 8. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r . — 9. B e d e c k e n d e s h o r i z o n t a l g e l e g t e n O b j e k t t r ä g e r s m i t l°/oiger P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e (ehem. r e i n , unzersetzt!). 5 Min. Das B i n d e g e w e b e w i r d h i e r i n e n t f ä r b t , w ä h r e n d das C y t o p l a s m a r o t g e f ä r b t bleibt. — 10. A b g i e ß e n u n d o h n e A b w a s c h e n auf t r o p f e n e i n e r gesätt. w ä s s e r i g e n L ö s u n g v o n A n i l i n b l a u , der auf 100 ccm 2,5 ccm Eisessig zugesetzt sind. H i n - u n d h e r n e i g e n des O b j e k t t r ä g e r s , u m die P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e r e s t e m i t d e m A n i l i n b l a u zu v e r m i s c h e n . 2—5 Min. — 11. A b s p ü l e n m i t dest. Wasser. — 12. D i f f e r e n z i e r e n in l°/oiger Essigsäure, u m d e n Ü b e r s c h u ß v o n A n i l i n b l a u u n d P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e zu e n t f e r n e n . Z e i t d a u e r s c h w a n k t z w i s c h e n 1—30 Min. — 13. E i n t a u c h e n in a n g e s ä u e r t e n absol. A l k o h o l (0,1 ccm Eisessig auf 100 ccm). — 14. Absol. Alkohol, Xylol, Bals a m m i t S a l i c y l s ä u r e z u s a t z (s. § 844). — Ergebnis: K e r n e , gewisse S e k r e t g r a n u l a , C e n t r o s o m s c h w a r z , C y t o p l a s m a ziegelrot, Gliafasei;n rot, kollagenes Bindegewebe intensiv blau. Bemerkungen: ad 1. An Stelle der zeitraubenden Eisenhämatoxylinfärbung genügt häufig eine einfache Kernfärbung mit Weigertschem Eisenhämatoxylin (s. § 677) 2—3 Min. Da sich bei kurzer Färbedauer nur die Kerne färben, hat dies auch den Vorteil, daß die Präparate oft noch klarer werden. — ad'3. Statt in Säurefuchsin kann man auch in einer l°/oigen Lösung von Ponceau de Xylidine, der auf 100 ccm 1 ccm Eisessig zugesetzt ist, färben. Noch mehr empfiehlt M a s s o n P o n c e a u S ä u r e f u c h s i n , eine Mischung von 3 Teilen der Ponceaulösung und 1 Teil der Säurefuchsinlösung. — ad 13. Das Eintauchen in essigsauren Alkohol ist meist entbehrlich. — ad 14. Bei Verwendung von Caedax ist Salicylsäurezusatz unnötig. 1497. T r i c h r o m f ä r b u n g n a c h W a 11 a r t u n d H o u e 11 e (30). A. T r i c h r o m f ä r b u n g mit Anilinblau. A u f g e k l e b t e 5/n dicke P a r a f f i n -

348

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1498—1499

s c h n i t t e w e r d e n e n t p a r a f f i n i e r t und in f l i e ß e n d e m , d a n n i n dest. W a s s e r gew a s c h e n . D a n n t r o p f t m a n 1—3 T r o p f e n W e i g e r t s c h e s E i s e n h ä m a t o x y l i n (siehe § 677) a u f , f ü g t gleich 5—10 T r o p f e n F a r b g e m i s c h A (s. u.) zu u n d n e i g t den O b j e k t t r ä g e r m e h r m a l s h i n u n d her. N a c h 5 Min. a b s p ü l e n m i t dest. W a s s e r u n d e i n s t e l l e n in l°/oige Essigsäure. N a c h w e i t e r e n 5 Min. w i r d d e r S c h n i t t d i r e k t m i t absol. A l k o h o l e n t w ä s s e r t , i n d e m m a n diesen t r o p f e n w e i s e auf d e n s c h r ä g g e h a l t e n e n O b j e k t t r ä g e r a u f g i e ß t . D a n n Xylol, S a l i c y l b a l s a m o d e r Caedax. Das Farbgemisch A setzt sich zusammen aus: Ponceau-Fuchsin 20 ccm, Phosphormolybdänsäure l°/oig 10 ccm, Anilinblau (Verwendung von Marke Krall wichtig!) gesätt. in 2,5° oiger Essigsäure 1,5 ccm. Herstellung der Ponceau-Säurefuchsinlösung s. § 1496, Bemerkung ad 3. B. T r i c h r o m f ä r b u n g m i t L i c h t g r ü n . 1. K e r n f ä r b u n g m i t W e i g e r t s c h e m E i s e n h ä m a t o x y l i n 2—4 Min. — 2. A u s w a s c h e n i n f l i e ß e n d e m W a s ser. — 3. A u f t r o p f e n v o n F a r b g e m i s c h B (s. u.) 5 Min. — 4. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r . — 5. Einstellen in l°'/oige E s s i g s ä u r e 5 Min. — 6. E n t w ä s s e r n u s w . w i e oben. Das Farbgemisch B setzt sich zusammen aus: Säurefuchsin 0,5°/oig (erhalten durch Verdünnen einer l°/oigcn Lösung mit der gleichen Menge einer l°/oigen Essigsäure) 20 ccm, Phosphormolybdänsäure l°/oig 10 ccm, Lichtgrün l°/oig 10 ccm. 1498. M o d i f i k a t i o n d e r M a s s o n s c h e n Trichromfärbung n a c h G o l d n e r (38). 1. K e r n f ä r b u n g m i t W e i g e r t s c h e m E i s e n h ä m a t o x y l i n (s. § 677) 1—2 Min. N i c h t ü b e r f ä r b e n ! — 2. A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r 10 Min. — 3. F ä r b e n i n S ä u r e f u c h s i n - P o n c e a u , A z o p h l o x i n oder P o n c e a u - F u c h s i n - A z o p h l o x i n (s. u.) 5 Min. o d e r evtl. l ä n g e r . — 4. A b s p ü l e n in l°/oiger Essigs ä u r e . — 5. D i f f e r e n z i e r e n in P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e - O r a n g e (s. u.) 15 Sek. bis 30 Min.; es ist w i c h t i g , d a ß dabei d a s B i n d e g e w e b e v o l l s t ä n d i g e n t f ä r b t w i r d , w a s sich a m V e r h a l t e n d e r G e f ä ß a d v e n t i t i a leicht v e r f o l g e n l ä ß t . G e w ö h n l i c h g e n ü g e n d a z u einige M i n u t e n . — 6. K u r z a b s p ü l e n in l°/oiger Essigs ä u r e . — 7. G e g e n f ä r b u n g m i t L i c h t g r ü n (s. u.) 5 Min. — 8. A u s w a s c h e n in l°'/oi g e r E s s i g s ä u r e 5 Min. — 9. Absol. A l k o h o l (3 P o r t i o n e n ) , Xylol, B a l s a m . — Ergebnis: Kerne bräunlich-schwarz, C y t o p l a s m a ziegelrot, Erythrocyten o r a n g e g e l b , B i n d e g e w e b e u n d Schleim g r ü n . Die Färbung gelingt besonders gut nach Fixierung in Bouin; nach Carnoy ist sie nicht zu empfehlen (R.). Herstellung der Farblösungen: a) Ponceau de Xylidine (Krall oder Hollborn) 0,2 g, Säurefuchsin 0,1 g, dest. Wasser 300 ccm, Eisessig 0,6 ccm. b) Azophloxin 0,5 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 0,2 ccm. c) Ponceau-Säurefuchsin-Azophloxin besteht aus 5—10 ccm der Massonschen Ponceau-Säurefuchsinlösung (s. § 1496, Bemerkung ad 3), 2 ccm der obigen Azophloxinlösung und 88 ccm 0,2°/oiger Essigsäure. d) Phosphormolybdänsäure (oder Phosphorwolframsäure) 3—5 g, dest. Wasser 100 ccm, Orange G 2 g. e) Lichtgrün 0,1—0,2 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 0,2 ccm. y) Die P a s i n i s c h e F ä r b e m e t h o d e u n d M o d i f i k a t i o n e n

derselben

1499. O r i g i n a l m e t h o d e v o n P a s i n i . Die M e t h o d e gibt s c h a r f e F a r b g e g e n sätze z w i s c h e n B i n d e g e w e b e u n d den ü b r i g e n G e w e b e b e s t a n d t e i l e n . Sie leistet ebenso w i e die U n n a s c h e W a s s e r b l a u - O r c e i n - M e t h o d e (s. § 1290) i n s b e s o n d e r e auch zur Trennung von epithelialem und mesenchymatischem Reticulum gute Dienste. F i x i e r u n g in Alkohol, Formol,. S u b l i m a t , n a c h Z e n k e r , Helly, M a x i m o w , S t i e v e u. a. E i n b e t t u n g in P a r a f f i n oder Celloidin. Färbung: 1. Ü b e r t r a -

§ 1500—1505.

Färbemethoden (Kollagen)

349

gen der Schnitte aus Wasser in eine 2°/oige Lösung von Phosphorwolframsäure f ü r 10 Minuteri. 2. Kurz abspülen in dest. Wasser. 3. F ä r b e n 15—20 Minuten in folgender Mischung: W a s s e r b l a u - O r c e i n (siehe § 1500): 10 Tropfen + 2°/oige E o s i n - B.-A.-Lösung in 50°/oigem Alkohol: 12 Tropfen + gesättigte wässerige S ä u r e f u c h s i n l ö s u n g : 1 Tropfen + neutrales G l y z e r i n 5 Tropfen. 4. Wässern in dest. Wasser. 5. Differenzieren in abs. Alkohol. 6. Eintauchen in 2°/oige P h o l p h o r w o l f r a m s ä u r e (einige Sekunden). 7. Abs. Alkohol. Xylol, Balsam. — Ergebnis: Kollagenes Bindegewebe scharf blau, Cytoplasma hellblau, Kerne, Epithelfasern, Keratohyalin rot, Keratin gelbrot. Ich habe das V o l u m e n der Tropfen bestimmt und dabei für die oben angegebenen Mengen folgende Zahlen gefunden: Wasserblau-Orcein = 0,3 ccm; Eosin = 0,3 ccm; Säurefuchsin = 0,04 ccm; Glyzerin = 0,25 ccm. Zur Herstellung des Gemisches vereinige ich die lOOfache Menge, also 30, 30, 4 und 25 ccm. 1500. Zur H e r s t e l l u n g d e r U n n a s c h e n Wasserblau-Orcein1 ö s u n g löst man a) 1 g Wasserblau in 100 ccm dest. Wasser und b) 1 g Orcein in 50 ccm abs. Alkohol, setzt hierzu 5 ccm Eisessig und 20 ccm Glyzerin und vereinigt Lösung a) und b). 1501. Es gibt noch eine zweite e o s i n h a l t i g e Wässerblau-Orcein-Lösung von U n n a (s. § 1290), die jedoch für die Pasini-Methode nicht zu brauchen ist. 1502. M o d i f i k a t i o n der P a s i n i - Methode nach W a l t e r (29). Die Methode gestattet eine sehr scharfe T r e n n u n g zwischen kollagenem Bindegewebe und Cytoplasma. Gegenüber der Massonschen Methode hat sie den Nachteil, daß der Gegensatz zwischen Kern und Cytoplasma gering ist, da sie beide rot gefärbt sind. — Fixierung am besten in sublimathaltigen Flüssigkeiten (z. B. nach Zenker, Helly, Maximow, Stieve, Heidenhain) oder nach Carnoy. Einbettung in Paraffin. Schnittdicke a m besten nicht über 5/u. Färbung: 1. Die in üblicher Weise von Paraffin befreiten Schnitte kommen aus dest. Wasser in 2,5(V/o Eisenalaunlösung; 2—4 M dicke Schnitte f ü r 24 Stunden, f ü r dickere genügen 1—2 Stunden. — 2. Abspülen in 2mal gewechseltem dest. Wasser. — 3. Einstellen in das Pasini-Farbgemisch, 2—4m dicke Schnitte f ü r 24 Stunden, dickere f ü r 5 Minuten bis 1 Stunde. — 4. Abspülen in Brunnenwasser. 96°/oiger Alkohol, bis keine F a r b w o l k e n m e h r abgehen und genügend differenziert ist. Abs. Alkohol. Xylol. Balsam. — Ergebnis: Kollagene Fasern intensiv blau, Cytoplasma bis in die feinsten Ausläufer intensiv karmoisinrot. Sekretkörnchen je nach ihrer Natur blau, violett, rot, gelb oder grün. Schleim lebhaft azurblau. Herstellung des Pasini-Farbgemisches s. oben § 1499. 1503. In einer zweiten Modifikation mischt W a l t e r (30) 2 Teile des Farbgemisches mit 1 Teil 2,5°/oiger Eisenalaunlösung. Das Gemisch wird nach 24 Stunden filtriert. Die Schnitte kommen aus dest. Wasser ohne Vorbeizung direkt in die Farblösung, 5—7 ß dicke für 5—10 Minuten, dünnere (bis zu 24 Stunden. Nach meinen Erfahrungen ist die getrennte Anwendung nach § 1502 vorzuziehen. 1504. A z o c a r m i n - P a s i n i . K o h a s h i (37) kombiniert bei Celloidinschnitten Azocarminfärbung mit Pasinifärbung, was gegenüber der Azanfärbung den Vorteil hat, daß sich das Celloidin dabei entfärben läßt. 1. bis 4. erfolgt wie in § 1489, 1—4. — 5. 5°/oige Phosphorwolframsäure Va—1 Stunde. — 6. Abspülen in dest. Wasser. — 7. Färben in Pasinischer Lösung, Zeitdauer je nach Präparat verschieden. — 8. Differenzieren in 95°/oigem Alkohol. — 9. Carbolxylol 30 Sekunden, Xylol, Balsam. (5) Bindegewebsfärbungen mit Blauschwarz, Nigrosin, Thiazin u. dgl. 1505. Gute und sehr h a l t b a r e P r ä p a r a t e gibt die F ä r b u n g mit P i k r o b , l a u s c h w a r z ( H e i d e n h a i n 08b), durch die sich, besonders nach Fixierung in

350

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1506—1500.

Sublimat, Subtrie, Alkohol, Orthcher oder Hellyscher Lösung auch Reticulumfasern, Basalmembranen, intrazellulär gelegene, entstehende Fibrillen sehr scharf darstellen lassen. Auch die Zellgrenzen werden, besonders auch bei embryonalem Material, sehr deutlich sichtbar. Man f ä r b t zuerst in Carmalaun, Kernechtrot od. dgl. und dann unter Kontrolle mit dem Mikroskop progressiv in: Blauschwarz B i g , konz. wässerige Pikrinsäure 400 ccfn; Methylalkohol 80 ccm, dest. Wasser 320 ccm. Die Farblösung ist unbegrenzt haltbar; zur F ä r bung ist es zweckmäßig, sie mit dem gleichen Volumen Wasser zu verdünnen. Resultat: Bindegewebe scharf schwarz gefärbt, Knorpel graublau, Muskel gelblich, Dotter gelb, ebenso Erythrocyten, Kerne rot. 1506. Ähnlich wirkt die von F r e e b o r n angegebene Färbung mit P i k r o N i g r o s i n , welche S c h a f f e r (99) zur Wahrnehmung dünnster Häutchen von der Fläche empfiehlt. Die mit Wasser aufgeklebten Schnitte werden 30 Minuten oder länger in einem Gemisch von 90 ccm gesättigter, wässeriger Pikrinsäureund 10 ccm lVoiger wässeriger Nigrosinlösung gefärbt; sodann ausgewaschen, Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Bindegewebe blauschwärzlich, Muskelfasern graugrün (Verdichtungsknoten leuchtend gelb). 1507. Nach H ä m a t o x y l i n k e r n f ä r b u n g eignet sich zur Darstellung von Bindegewebsfasern besser als Eosin eine konzentrierte Lösung von C h r o m o t r o p 2 R in 96°yoigem Alkohol (ev. ansäuern mit 1 Tropfen Eisessig auf 100 ccm Farblösung). Wenn F ä r b u n g genügend, dann abspülen in absol. Alkohol, Xylol, Balsam (in H e i d e n h a i n 05 d und 08 a). Der Farbstoff f ä r b t sehr rein und echt. Eisenhämatoxylinfärbung ist nach H e i d e n h a i n Benzolichtbordeaux (s. § 676) empfehlenswerter. 1508. S c h i e f f e r d e c k e r (21) benützt zur Bindegewebsfärbung als besonders elektiv die Methode von C a 11 e j a (s. § 715). Er unterscheidet mit ihr zwischen einem »färbbaren« (chromophilen) Bindegewebe und einem »nicht färbbaren« (chromophoben) Bindegewebe. Das zweite entspricht dem argentophilen, das bei Silbermethoden scharf schwarz hervortritt, während das erstere dabei bräunlich erscheint. 1509. F ä r b u n g mit T h i a z i n r o t - P i k r i n s ä u r e nach H e i d e n h a i n (N e u b e r t 22). F ü r d i c k e Schnitte (20/* und mehr) ist die A z a n f ä r b u n g u n geeignet, da diese zu dicht f ä r b t . F ü r sie empfiehlt sich die nachfolgende Methode, bei der auch dicke Schnitte noch vollkommen durchsichtig bleiben; aber auch dünnere Schnitte werden durch sie schön g e f ä r b t (s. auch § 710). Gegenüber der viel geübten v a n G i e s o n sehen Methode und ihren Modifikationen (s. § 707 ff.) h a b e n die Thiazinrotmethoden den Vorzug viel besserer Haltbarkeit. In der Darstellung feinster Fäserchen ist die Azanmethode überlegen. Fixierung in Susa, Formol, nach Bouin, Helly, Stieve, Carnoy od. dgl. 1. K r ä f tige K e r n f ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin, Delafielschem oder Weigertschem Hämatoxylin. — 2. Gründlich abwaschen in fließendem Wasser. — 3. F ä r b e n in Thiazinrot-Pikrinsäure (s. u.), bis das kollagene Gewebe k r ä f t i g g e f ä r b t ist. — 4. K u r z abspülen in dest. Wasser. — 5. Sorgfältiges Auswaschen des P i k r i n säureüberschusses in 96°'/oigem Alkohol (wichtig wegen Haltbarkeit!). — 6. Absol. Alkohol. Xylol. Balsam. Nach der Übertragung in Xylol werden die Schnitte dadurch alkalisch gemacht, daß man sie kurze Zeit in ein Gefäß hält, dessen Boden mit einigen Tropfen Salmiakgeist befeuchtet ist. T h i a z i n r o t - P i k r i n s ä u r e - G e m i s c h : Dest. Wasser 200 ccm, 0,5%ige wässer. Lösung von Thiazinrot 90 ccm, gesätt. wässer. Lösung von Pikrinsäure 10 ccm, 96°/oiger Alkohol 30 ccm.

$ 1510—1516.

Färbemethoden (Kollagen)

351

1510. Eine sehr schöne leuchtende Gelbfärbung des kollagenen Bindegewebes gelingt mit T u c h e c h t g e l b (siehe Methode von W a l l a r t § 712). 1511. Um B i n d e g e w e b s f i b r i l l e n u n d M i t o c h o n d r i e n gleichzeitig darzustellen,, fixiert F r e d e r i k s e (17) nach Altmann oder Benda, färbt dann mit Anilinwasser-Säurefuchsin und differenziert mit alkoh. Pikrinsäure (vgl. § 991). Hierauf färbt man mit einer Mischung von 9 Teilen gesättigter alkoh. Pikrinsäurelösung und 1 Teil einer Lösung von Naphtholschwarz B (1 g auf 80 ccm Wasser und 20 ccm Glyzerin). Ergebnis: Mitochondrien rot, Bindegewebsfibrillen blau. 1512. Sehr schwierig ist meist die Bearbeitung von S e h n e n g e w e b e . M. H e i d e n h a i n (13) trocknet für Kurszwecke die Sehnen, fertigt Rasiermesserschnitte an und färbt die in Wasser gebrachten, wieder aufquellenden Schnitte mit Rutheniumrot. e) Färbung des Bindegewebes mit Hämatoxylin 1513. M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n methode nach M a 11 o r y. Fixierung nach Zenker oder Helly. Paraffinschnitte kommen für 12—24 Stunden in Molybdänhämatoxylin (bei 54er C genügen schon 2—3 Stunden). Abspülen in dest. Wasser und differenzieren in 96°'/oigem Alkohol. Dann absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Bindegewebsfasern tiefblau, aber nicht so scharf wie bei Bielschowsky. Farblösung: Hämatoxylin 1 g, Phosphormolybdänsäure 2 g, dest. Wasser 100 ccm. Die Lösung muß einige Wochen reifen. Bei Zusatz von 5 ccm einer l°/oigen Kaliumpermanganatlösung ist sie sofort gebrauchsfertig. 1514. Methode von R i b b e r t (nach der Modifikation von H u e t e r 11). Schnitte beliebig fixierter Präparate kommen (ev. nach Carminvorfärbung) 15 bis 30 Sekunden in 10°/oige Phosphorwolf ramsäure, werden tüchtig in Wasser gespült und in P h o s p h o r w o l f r a m h ä m a t o x y l i n (s. u.) gefärbt. Hierauf werden die Schnitte 10—20 Miiiuten in öfters gewechseltem 50°/oigem Alkohol gebläut, dann durch abs. Alkohol (10—15 Minuten) in Xylol und Balsam gebracht. Ergebnis: Bindegewebsfasern leuchtend blau bis schwarzblau. Herstellung des Phosphorwolframhämatoxylins (von S c h u e n i n o f f ) : Hämatox. 1,75 g; ^Acid. carbol. crist. 5 g, 10°/oige wässerige Phosphorwolframsäure (Kahlbaum) 10 ccm, dest. Wasser 200 ccm. Die Lösung muß mehrere Monate im Sonnenlicht reifen. R i b b e r t nimmt statt Phosphorwolframsäure die gleiche Menge Phosphormolybdänsäure. 1515. Methode von V e r o c a y : Aufgeklebte Schnitte beliebig fixierter Objekte werden (bei Paraffirieinbettung nach Entfernung des Paraffins) gründlich gewässert und etwa 10—24 Stunden bei 46° C in l9'/oiger wässeriger Chromsäurelösung gebeizt. Die Dauer der Beizung ist je nach Organ und Fixierung verschieden. Hierauf wird nach zweimaligem Abspülen in Wasser 1/-2—2 Stunden in unverdünntem Delafieldschen Hämatoxylin gefärbt. Nach kurzem Auswaschen in Wasser ev. Kontrastfärbung mit Eosin, Aurantia, Orange od. dgl. Alkohol, Xylol, Balsam. Resultat: Bindegewebsfasern blauschwarz. Mißerfolge kommen nach Verocay ha/uptsächlich dadurch zustande, daß man vor der Chromierung nicht genügend gewässert hat; bei Celloidinschnitten auch dadurch, daß man die Objekte auf Material aufgeblockt hat, aus dem durch den Alkohol schädliche Stoffe ausgezogen werden (z. B. bei Holzblöckchen). 1516. Über die Bindegewebsfärbung mit Molybdänhämatoxylin nach C l a r a siehe § 687.

352

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1517—1521.

2. Imprägnierung des argyrophilen und kollagenen Gewebes mit Metallsalzen 1517. Die nachfolgenden Methoden sind zur Darstellung bestimmter Anteile des Bindegewebes (argyrophile oder reticuläre Fasern, Gitterfasern) unentbehrlich. Die genannten Fasern werden durch sie in tief schwarzem oder braunschwarzem Ton außerordentlich scharf und klar sichtbar gemacht. Außer den argyrophilen Fasern können aber auch die gewöhnlichen kollagenen Bindegewebsfasern bis zu den feinsten Fäserchen herab überaus deutlich imprägniert werden; häufig gelingt es argyrophiles und kollagenes Bindegewebe in differentem Tone darzustellen. 1518. Die Verfahren nehmen ihren Ausgang von einer von B i e l s c h o w s k y 1904 veröffentlichten Methode, die er zur Darstellung der Neurofibrillen des Zentralnervensystems empfahl. Kurz darauf verwandte M a r e s c h (05) die Bielschowskysche Methode ohne sie zu ändern auch zur Imprägnation der »Gitterfasern und der feinsten Bindegewebsflbrillen«. Auch Bielschowsky hatte diese Mitimprägnation des Bindegewebes schon beobachtet und deshalb 1905 für periphere Nervenfasern eine kleine Modifikation empfohlen, durch die sich ein Unterschied im Farbton von Bindegewebe und Achsenzylinder erzielen läßt. Seitdem wurde die Bielschowskymethode eine der wichtigsten Verfahren für die Darstellung des argentophilen Bindegewebes wie der Neurofibrillen. Dabei erfuhr sie für das eine wie das andere Ziel eine große Zahl.von Modifikationen, die teils eine Steigerung der Leistungsfähigkeit und Sicherheit der Methode, teils eine Vereinfachung der Technik zum Ziele haben. Viel später erst begann man mit einer Klärung und experimentellen Ergründung der theoretischen Grundlagen der Methodik, die auch jetzt noch nicht abgeschlossen ist.

a) D i e B i e l s c h o w s k y - M e t h o d e z u r D a r s t e l l u n g des B i n d e g e w e b e s und M o d i f i k a t i o n e n der Methode a) Vorbemerkungen 1519. V o r b e d i n g u n g für gute E r f o l g e ist peinlichste S a u b e r k e i t u n d s t r e n g e B e a c h t u n g d e r V o r s c h r i f t e n . Schon geringe Abweichungen können zu andersartigen Resultaten oder auch zu Mißerfolgen führen. Die für die Imprägnierungsmethoden benützten Glasgefäße und Pipetten sollen nur für diese Zwecke und immer nur für die gleichen L ö sungen benutzt werden. Sie müssen vollkommen rein sein. Man stellt sie zur Reinigung in Kaliumbichromat-Schwefelsäure (s. § 97), wäscht gründlich mit fließendem Wasser und schließlich mit dest. Wasser. Nach Gebrauch sind die Gefäße sofort zu reinigen und mit dest. Wasser nachzuspülen. Unaufgeklebte Schnitte dürfen nur mit Glasstäbchen von der einen in die andere Lösung übertragen werden. 1520. Niederschlagsbildungen kommen häufig auch daher, daß z. B. beim Übertragen eines Schnittes aus einer Lösung a in Wasser b und von hier in eine Lösung c durch den Glasstab Flüssigkeits-Spuren von a in c übertragen werden, da an eine Reinigung des Glasstabes oft nicht gedacht wird. Es ist daher gut, nach Überführen des Schnittes aus a in b den Glasstab zu wechseln und mit einem neuen den Schnitt aus b in c zu bringen. Die benützten Glasstäbe werden in ein Glas mit öfters zu wechselndem destilliertem Wasser gestellt und vor Gebrauch abgetrocknet. 1521. Sehr wichtig ist auch mit ganz reinen Chemikalien zu arbeiten. Man verwendet am besten Analysenpräparate von Merck oder Kahlbaum (Bezeichnungen s. § 1527). Daß das zur Verwendung kommende destillierte Wasser nicht

§ 1522—1525.

Impragnationsmethoden

353

verunreinigt sein darf, ist selbstverständlich. Man prüfe es vorher durch Zusatz einiger Tropfen einer 5—10°/oigen Silbernitratlösung. Bei Mißerfolgen trotz strenger Beachtung der Vorschriften empfiehlt es sich das zur Verwendung kommende dest. Wasser nach Zusatz von ein paar Tropfen einer Kaliumpermanganatlösung aus Glas zu redestillieren. Dazu ist ein von R i c h a r d s angegebener Destillationsapparat sehr empfehlenswert, da bei ihm jeder Stöpselverschluß wegfällt, wodurch er auch sehr leicht zu bedienen ist. Das Prinzip ist aus Abbildung 21 zu entnehmen. Die Verbindung zwischen Kolben und Kühlrohr schließt sich, sobald A b b . 21. V e r b i n d u n g von Destillationskolben sich das Wasser im Kolben erhitzt, automatisch durch und K ü h l r o h r Kondenswasser. Zweckmäßig nimmt man das Kühlrohr nach R i c h a r d s aus Quarzglas. 1522. Besondere Sorgfalt ist der Bereitung der ammoniakalischen Silberlösung zuzuwenden (s. § 1527 und 1535). Die Lösung muß vollkommen klar sein. Trübe Lösungen, die unweigerlich zu Niederschlägen im Präparat führen, sind zu verwerfen. Abb. 21. Verbindung von pestillationskolben und Kühlrohr nach R i c h a r d s . Die zur Herstellung verwendete Natronlauge bewahrt man in einer mit Gummistopfen versehenen Flasche. Die Lauge wird nicht herausgeschüttet, sondern mit einer Pipette entnommen. Den Ammoniak tropft man aus einem kleinen Stiftgläschen (s. § 623) zu, das man aus der Vorratsflasche füllt. 1523. Die E i n w i r k u n g der ammoniakalischen Silberlösung kann durch Einstellen des Präparates in ein mit der Lösung gefülltes Färbeglas erfolgen. Bei kürzerer Einwirkung (etwa bis zu einer 1/-.—1 Stunde) ist es vorzuziehen, die Lösung mit einer Pipette oder aus einem Stiftgläschen auf den Objektträger aufzuträufeln (ca. 1 ccm). Man legt ihn dazu waagrecht in eine Petrischale auf zwei rechtwinklig abgebogene, parallele Glasstäbe und bedeckt sofort mit dem Deckel. Das Auftropfen hat außer geringerem Verbrauch noch den Vorteil, daß für jeden Schnitt eine nt>ch unbenützte Lösung verwendet wird. 1524. Die Anwendungsmöglichkkeit und Sicherheit der Bielschowsky-Methode hat sich wesentlich erweitert, seit P e r d r a u (21) erstmals eine Vorbehandlung der Präparate mit Kaliumpermanganat-Oxalsäure empfahl. Dadurch lassen sich nicht nur nach Formolfixierung, sondern auch nach zahlreichen anderen, allgemein üblichen Fixierungsmethoden mit Sicherheit gute Resultate erzielen. Ein weiterer Vorzug dieser Vorbehandlung ist, daß die Bielschowsky-Methode dann an aufgeklebten, entparaffinierten Paraffinschnitten mindestens ebensogut, wenn nicht besser gelingt als an Gefrierschnitten. Die Paraffinmethode ist aber nicht nur bei unzusammenhängenden und leicht auseinanderfallenden Geweben von Vorteil, sondern bietet auch den Vorzug einer geringeren und gleichmäßigen Schnittdicke sowie der ebeneren Streckung der Schnitte. Auch Celloidinschnitte sind nach der angegebenen Vorbehandlung der Silberimprägnation zugänglich.

ß ) Die Ausführung der Methoden 1525. S i l b e r i m p r ä g n a t i o n n a c h B i e l s c h o w s k y a n a u f g e klebten Paraffinschnitten. A . V o r b e r e i t u n g : 5—lO^a dicke Paraffinschnitte werden auf völlig fettfreie Objektträger mit dünner Eiweißlösung aufgeklebt und nach Trocknen durch X y l o l und Alkoholreihe in dest. Wasser gebracht. B. V o r b e h a n d l u n g : 1. Einstellen der Schnitte in 0,25®/«ige Kaliumpermanganatlösung 3 Minuten. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. l % i g e Oxal23

Romeis,

Mikrosk. Technik. 15. A u f l .

354

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1526.

s ä u r e 5 Minuten. — 4. 1—2stündiges Auswaschen in 5—8mal gewechseltem dest. Wasser. Nach dieser Vorbehandlung gelingt die Methode nach der Mehrzahl der üblichen Fixierungsmethoden, wie z. B. Alkohol-Formol, Bouin, Carnoy, Heidenhain, Held, Helly, Maximow, Stieve, Zenker u. a. — Für die Einwirkung von übermangansaurem Kali und Oxalsäure werden von den einzelnen Autoren verschiedene Zeiten empfohlen; es geht daraus hervor, daß sich 'die Zeitdauer ohne Schaden variieren läßt. Ich selbst verwende nun an Stelle der Oxalsäure wie in § 1533 eine l°/oige Lösung von Kaliummetabisulfit (1 Min.), was den Vorteil hat, daß es nachher genügt einige Minuten in Brunnenwasser und dann in 2 Portionen dest. Wasser auszuwaschen. C. S i l b e r i m p r ä g n a t i o n . 1. Einstellen der Schnitte in 2°/oige Silbernitratlösung 24 Stunden. Man kann auch länger imprägnieren, doch nimmt dann sehr leicht auch Kern und Cytoplasma bei der weiteren Behandlung eine stark braune Tönung an. 2. K u r z eintauchen in zwei Gläser mit dest. Wasser (im ganzen 3—5 S e k u n den), wobei m a n d e n O b j e k t t r ä g e r h i n - und h e r b e w e g t . Bleibt der Schnitt zu lange im destillierten Wasser, so erhält man keine Imprägnierung der Fasern mehr, 3. Ammoniakalische Silberlösung 5—10 Minuten. Die Lösung ist jeweils nach § 1527 frisch zu bereiten. Die Einwirkung erfolgt in der in § 1523 angegebenen Weise durch Auftropfen auf den Objektträger. 4. A b t r o p f e n d e r Silberlösung und kurz eintauchen in 2 Gläser mit dest. Wasser (im ganzen 5—10 Sekunden). W i c h t i g ! B e i zu l a n g e m A u s w a s c h e n w i r d d i e I m p r ä g n a t i o n unvollständig. 5. Einstellen in F o r m o l (1 Teil 4001/oiges n e u t r a l e s Formol + 9 Teile B r u n n e n wasser) 5 Min. (die Schnitte f ä r b e n sich sehr rasch schiefergrau-schwärzlich). 7. Auswaschen in B r u n n e n w a s s e r : 15 Minuten; d a n n d u r c h dest. Wasser. 7. In v e r d ü n n t e Goldchloridlösung (5 T r o p f e n einer l°/oigen wässerigen Goldchloridlösung auf 10 ccm dest. Wasser u n d 2 T r o p f e n Eisessig) 5—15 Minuten. Die Präparate werden in der Goldlösung klarer, da die braune Tönung der Zellen in ihr zurückgeht, während der Farbton der imprägnierten Fasern von Dunkelbraun in tiefes Schwarz übergeht. 8. F i x i e r e n in einer 5%>igen Natriumthiosulfatlösung (Fixiernatron), der auf 100 ccm 10 T r o p f e n einer konz. Lösung von s a u r e m schwefligsaurem N a t r i u m (saure Sulfitlauge) zugesetzt sind. Va Minute. Bei zu langer Einwirkung verliert die Imprägnation der feinen Fasern an Schärfe. 9. Sehr sorgfältiges Auswaschen in fließendem oder oft gewechseltem B r u n nenwasser. Va—2 S t u n d e n . Entwässern in steigendem Alkohol. Xylol. Balsam. Ergebnis: Die G i t t e r f a s e r n heben sich tiefschwarz außerordentlich scharf ab. Die kollagenen Bindegewebsfasern sind e n t w e d e r b r ä u n l i c h oder grauschwarz i m p r ä g n i e r t . Breite Bindegewebsbündel sind meist in einem m e h r braunvioletten Ton g e f ä r b t . Kerne u n d Cytoplasmagranulationen sind oft in b r ä u n l i c h e m oder s c h w a r z e m Ton sichtbar. Ohne Vergolden und Fixieren sind die Präparate nur kurz haltbar, da das Silber in einer in Alkohol, Xylol und Harzen löslichen Form niedergeschlagen ist. 1526. Bei I m p r ä g n a t i o n v o n G e f r i e r s c h n i t t e n v e r f ä h r t m a n wie in § 1525, n u r mit dem Unterschied, daß m a n das Auswaschen der Schnitte in destilliertem Wasser in Nr. 2 und Nr. 4 auf 2—3 S e k u n d e n abkürzt. Die F l ü s sigkeiten k o m m e n in kleinen mit Überfalldeckel versehenen Glasschälchen zur A n w e n d u n g . Die Schnitte w e r d e n mit Hilfe von gebogenen Glasstäbchen ü b e r tragen, die n a c h jeder Flüssigkeit gewechselt w e r d e n .

§ 1527—1532.

Imprägnationsmethoden

355

1527. H e r s t e l l u n g d e r a m m o n i a k a l i s c h e n Silberlösung: Die richtige Bereitung der ammoniakalischen Silberlösung ist für das Gelingen der Methode von großer Bedeutung. Man benötigt dazu 1. eine 10°'/oige Silbernitratlösung (bereitet aus Argent. nitric. puriss. crist. pro analysi Merck), 2. eine 40°/oige Natronlauge (aus Natrium hydric. puriss. e Natro pro analysi Merck) und 3. Ammoniak (spez. Gew. 0,875—0,910 pro analysi) (s. auch § 1522). Man mißt in eine 20—25 ccm haltende, mit Glasstopfen versehene Schüttelmensur, die man n u r zur Bereitung der Silberlösung verwendet, 10-ccm der 10°/oigen Silbernitratlösung und setzt 5 Tropfen der 40c'/oigen Natronlauge zu, wobei sich ein braunschwarzer Niederschlag von Silberoxyd bildet. Hierauf wird unter stetem Umschütteln der Silberlösung tropfenweise so lange Ammoniak zugesetzt, bis der Niederschlag bis auf ein paar Körnchen gelöst ist. Zu Beginn kann man 3—5 Tropfen auf einmal zusetzen. Sobald sich die Niederschlagswolke aber auflockert, wird man vorsichtiger und setzt nur mehr Tropfen für Tropfen zu. Dabei wartet man nach jedem Tropfen unter Umschütteln erst 10—20 Sekunden lang die Wirkung ab, ehe man den nächsten zusetzt. Ein Überschuß an Ammoniak ist peinlich zu vermeiden. Zuletzt füllt man mit dest. Wasser auf 20 ccm auf. Die Lösung enthält ammoniakalisches Silberoxyd und -nitrat. Die Lösung wid am besten unmittelbar vor ihrem Gebrauch hergestellt, da sie, zumal wenn sie nicht gut verschlossen ist, bald unbrauchbar wird. 1528. Von verschiedenen Autoren (z. B. S c h l e m m e r , D e i k u n u. a.) wird empfohlen, den bei der Herstellung der ammoniakalischen Silberlösung bei Zusatz der Natronlauge entstehenden Niederschlag vor dem Auflösen in Ammoniak auszuwaschen, am einfachsten in der Weise, daß man die überstehende Flüssigkeit abgießt, dest. Wasser zusetzt und den Niederschlag durchschüttelt. Nach Absetzen des Niederschlages wird die Waschflüssigkeit abgegossen und dieser Vorgang einigemale wiederholt. Zuletzt wird dann der Niederschlag wie in § 1527 durch Ammoniakzusatz gelöst. Eine so bereitete Lösung unterscheidet sich chemisch natürlich wesentlich von einer ohne Auswaschen hergestellten. Für die Imprägnation der G i t t e r f a s e r n sah ich jedoch (vorausgesetzt, daß von vornherein reine Substanzen verwendet wurden) von einem derartigen Auswaschen keine Vorteile, hatte sogar verschiedentlich den Eindruck als sei die Imprägnation ohne Auswaschen vollständiger. 1529. W i l d e r (35) behandelt die Präparate mit 10°/oiger Phosphormolybdänsäure, F o o t (32) mit Pyridin-Glyzerin vor. Nach G ö m ö r i geben beide Verfahren schlechtere Resultate wie Kaliumpermanganat. 1530. Die B i e l s c h o w s k y - Methode kann auch als S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g vorgenommen werden. In Verbindung mit Pyridin ist sie jedoch für die D a r s t e l l u n g d e r G i t t e r f a s e r n nicht sehr geeignet, da durch den Pyridinzusatz der Imprägnierung des Bindegewebes zugunsten der Neurofibrillen entgegengewirkt werden soll. 1531. Die Bielschowsky-Methode für Bindegewebe wurde im Laufe der Jahre vielfach modifiziert, wobei am wichtigsten die schon in § 1525 angeführte, von P e r d r a u vorgeschlagene Vorbehandlung mit Kaliumpermanganat-Oxalsäure war. Aus neuerer Zeit seien die Modifikationen von F o o t (23—32), F o o t und M e n a r d (27), K u b i e und D a v i d s o n (28), L a i d 1 a v (29), W i l d e r (35) und G ö m ö r i (37) erwähnt. Von diesen Modifikationen möchte ich besonders die von G ö m ö r i empfehlen, die ausgezeichnete Resultate gibt, sehr sicher arbeitet und dabei sehr wenig Zeit beansprucht. 1532. Die sog. »Methode« von P a p (30) besteht lediglich darin, daß die Präparate nach der Vorbehandlung mit Kaliumpermanganat (5—8 Minuten) und Oxalsäure (5°/oig 8—10 Minuten) nur kurz mit dest. Wasser abgespült und dann gleich in 2°/oige Silbernitratlösung gebracht werden. Sonst wie in § 1525. Ich erhielt durch diese kleine Variation keine besseren Resultate. 23*

356

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1533—1535.

1533. M o d i f i k a t i o n v o n G ö m ö r i (37). A. F i x i e r u n g . Gömöri •erprobte die Methode an Formol fixierten Präparaten. Einbettung in Paraffin. B. V o r b e h a n d l u n g . 1. Einstellen der entparaffinierten Schnitte in 0,5 {bis l)ff/oige Lösung von Kaliumpermanganat 1—2 Min. — 2. Auswaschen in Brunnenwasser 5 Min. — 3. Entfärben in 1—3°/oiger Kaliummetabisulfitlösung 1 Min. — 4. Auswaschen in Brunnenwasser 5—10 Min. C. I m p r ä g n a t i o n . 1. Sensibilisieren in einer 2cl/oigen Eisenammoniumsulfatlösung ( = Eisenalaun, aus violetten Kristallen jeweils frisch bereitet) 1 Minute. Eine Verlängerung der Einwirkung hat keine Verstärkung des Effektes zur Folge. 2. Auswaschen in Brunnenwasser 3—5 Min.; dann durch 2 Portionen dest. "Wassers je 2 Min. 3. Imprägnieren in ammoniakalischer Silberlösung (Herstellung s. § 1535) I Minute. 4. Rasch abspülen in dest. Wasser 5—10 Sekunden. Zeitdauer für den Erfolg sehr wichtig! Bei zu kurzem Abspülen wird die Imprägnation zu dicht, bei zu langem unvollständig. 5. Reduzieren in Formol 1 : 9 (Brunnenwasser) 5 Min. 6. Auswaschen in Brunnenwasser 5 Min. 7. Tonen in 0,1—0,2°yoiger Goldchloridlösung, mindestens 10 Min. Abspülen in dest. Wasser. 8. Reduzieren in 1—3"'/oiger Kaliummetabisulfitlösung 1 Min. 9. Fixieren in l°/oiger Fixiernatronlösung 1 Min. (nicht länger, da sonst die feinsten Fasern leiden). 10. Gründlich auswaschen in Brunnenwasser. Alkoholreihe. Xylol. Balsam. 1534. B e m e r k u n g e n : ad A. Die Methode gab mir auch nach den anderep üblichen Fixerierungen gute Resultate. Ganz besonders klar und vollständig imprägnieren sich die Fasern nach meinen Erfahrungen nach C a r n o y - Fixierung, ad B. Falls die Schnitte abschwimmen, empfiehlt Gömöri sie statt mit Eiweißwasser mit Glyzeringelatine aufzukleben, die mit Wasser so weit verdünnt wird, daß sie bei 19° C flüssig ist. Die Schnitte werden dann 10 Stunden im Brutschrank in Formoldämpfen getrocknet (man stellt dazu in den Brutschrank ein Schälchen mit einigen Tropfen Formol am Boden). Anschließend müssen sie zur Beseitigung des Formols für einige Stunden Ammoniakdämpfen ausgesetzt werden. ad C 1. Nach Gömöri gibt die Sensibilisierung mit Metallsalzen bessere Erfolge als mit Tannin. Von 17 verschiedenen Metallen gaben Silber, Gold, Cadmium, Eisen, Blei, Zinn und Uransalze die besten Resultate. Am vollständigsten werden die Gitterfasern nach Eisensensibilisierung dargestellt. Nach ihr tritt beim Vergolden auch die schönste Metachromasie auf. — Verwendet man Silber, so gibt die 2 Minuten lange Einwirkung einer 10°/oigen Silbernitratlösung den gleichen Effekt wie die 24stündige einer 2°/oigen bei Bielschowsky. Zur Vermeidung von Niederschlag sind die Präparate in diesem Fall nach B 4 noch mit 2 Portionen dest. Wasser auszuwaschen. ad C 2. Im Gegensatz zu Bielschowsky empfiehlt Gömöri die Schnitte nach der Sensibilisierung gründlich in Brunnenwasser und dest. Wasser auszuwaschen. Die Bilder werden dadurch klarer und niederschlagsfreier. Wird mit ßilbernitrat sensibilisiert, so wird nicht in Brunnenwasser, sondern in mehreren Portionen dest. Wasser ausgewaschen. ad C 5. Die Konzentration des Formols kann ohne Einfluß auf die Wirkung innerhalb weiter Grenzen schwanken. Auch die Reaktion des Formols fand Gömöri im Gegensatz zu F o o t unwichtig. Gewöhnliches wie neutrales, alkalisiertes wie angesäuertes Formol gab die gleichen Resultate. 1535. H e r s t e l l u n g d e r S i l b e r l ö s u n g n a c h G ö m ö r i . Zu 10 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung setzt man in einer Schüttelmensur 2 ccm einer

§ 1536—1537

Imprägnationsmethoden

357

10°/oigen Kaliumhydroxydlösung. Anschließend fügt man tropfenweise starken Ammoniak zu, wobei nach jedem Tropfen geschüttelt wird. Wenn auf diese Weise der Niederschlag völlig gelöst ist, setzt man sehr sorgfältig Tropfen für Tropfen einer 10°7oigen Silbernitratlösung zu, bis der dabei auftretende Niederschlag beim Schütteln nur mehr schwer verschwindet. Dann füllt man mit dest. Wasser auf das Doppelte des Volumens auf. Die Lösung ist in brauner, gut verschlossener Flasche 2 Tage haltbar. G ö m ö r i verwendet also bei der Bereitung der Lösung das schon von F o n t a n a und anderen benützte Prinzip des Zurücktitrierens mit Silbernitrat, bei dem sich der optimale Ammoniakgehalt leichter treffen läßt als bei direktem Zusatz wie in § 1527. Die richtige Bereitung der Silberlösung ist f ü r den Erfolg der Methode ausschlaggebend. Enthält die Lösung zuviel Ammoniak, dann ist die Imprägnation der Fasern unvollständig, enthält sie zu wenig, so wird der Untergrund fleckig und zu dunkel. 1536. Modifikation von W i l d e r (35). V o r b e h a n d l u n g : Einlegen der P r ä parate in 0,25°/oige Kaliumpermanganatlösung oder 10°/oige Phosphormolybdänsäure 1 Min. — Abspülen in dest. Wasser. — Bromwasserstoffsäure (Mercks konz. 34°/oige Lösung 1 Teil, dest. Wasser 3 Teile) 1 Min. (kann nach PM unterbleiben). — Auswaschen in Brunnenwasser, dann in dest. Wasser. — S e n s i b i l i s i e r u n g : Eintauchen in l°/oige Urannitratlösung (Na-frei!) 5 Sek. oder kürzer. — I m p r ä g n a t i o n : Waschen in dest. Wasser 10—20 Sek., dann Silberdiaminohydroxyd (s. u.) 1 Min. — R e d u k t i o n : rasch eintauchen in 95°/oigen Alkohol, dann reduzieren in einem Gemisch von dest. Wasser 50 ccm, 40°/oiges Formol (neutral. mit Magnesiumkarbonat) 0,5 ccm, Urannitrat l°/oig 1,5 ccm 1 Min. — T o n e n : Waschen in dest. Wasser, vergolden in Goldchlorid 1 : 500 1 Min., dest. Wasser, Fixiernatron 5°/oig 1 Min. — Waschen in Brunnenwasser usw. Herstellung der S i l b e r d i a m i n o h y d r o x y d l ö s u n g : zu 5 ccm einer 10,2°/oigen Silbernitratlösung wird tropfenweise starker Ammoniak gegeben, bis der entstandene Niederschlag wieder gelöst ist. Dann werden 5 ccm einer 3,l°/oigen Natronlauge zugesetzt und der neuerdings entstandene Niederschlag wieder durch Zutropfen von Ammoniak eben gelöst. Dann auffüllen mit dest. Wasser auf 50 ccm (ursprünglich angegeben von K u b i e und D a v i d s o n 29). 1536a. Zur Bereitung der S i l b e r d i a m i n o c a r b o n a t l ö s u n g von K u b i e und D a v i d s o n setzt "man zu 10 ccm einer 10,2°/oigen Silbernitratlösung tropfenweis Ammoniak bis der Niederschlag wieder gelöst ist und fügt dann 10 ccm einer 3,l°/oigen Natriumcarbonatlösung zu, wobei kein weiterer Niederschlag mehr a u f tritt. Dann auffüllen mit dest. Wasser auf 100 ccm.

1537. H e r i n g a (33), J a l o w y (38) u. a. verwenden die S i l b e r m e t h o d e von L a g u e s s e , die rasch arbeitet und bei Gelingen sehr schöne Präparate gibt. Fixierung in neutralem Formol 2—20 Tage. Auch andere Fixierungen sind möglich. Einbettung in Paraffin. Ausführung: 1. Auswaschen der entparaffinierten Schnitte in 2 Portionen dest. Wasser. — 2. Einstellen in ammoniakalische Silberlösung, die vorher im Brutschrank auf ca. 37" C angewärmt ist, 5—30 Min. Die Schnitte färben sich darin braun. — 3. Abspülen in dest. Wasser. — 4. Eintauchen in dest. Wasser, dem auf 100 ccm 10—15 Tropfen Ammoniak (spez. Gew. 0,875—0,910; pro anal., Merck) zugesetzt sind: 1—3 Sek. Die Behandlung in dieser Flüssigkeit ist für das Resultat entscheidend: Zu kurze gibt zu starke Imprägnierung (Mitimprägnierung von Kern und Cytoplasma,. dunkle Färbung des Kollagens, Niederschläge usw.), zu lange gibt unvollständige Imprägnierung. — 5". Sobald der braune Farbton des Schnittes nur etwas ins Gelbliche übergeht, sofort übertragen in neutrales Formol (1 :4 dest. Wasser) und darin hin und her bewegen, 3 Min. — 6. Auswaschen in Brunnenwasser. — 7. Vergolden in Goldchlorid 1 :500 15 Min. — 8. Abspülen in dest. Wasser. — 9. Fixiernatron l°/oig

Untersuchung des Bindegewebes

358

§ 1538—1543.

10 Sek. — 10. G r ü n d l i c h e s A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m Wasser. Alkohol. Xylol. Balsam. Manchmal ist es vorteilhaft die Vergoldung zu unterlassen und die Präparate schon nach 6 auszuwaschen und einzudecken. 1538. Bereitung der Silberlösuhg: Zu 25 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung wird unter Schütteln tropfenweise 40°/oige Natronlauge zugesetzt (etwa 18 Tropfen), bis alles Silber niedergeschlagen ist. Der Niederschlag wird im Dunkeln 8—lOmal mit dest. Wasser ausgewaschen, dann durch tropfenweises Zusetzen von Ammoniak gelöst. Immer nach Zusatz von 5 Tropfen wird etwa eine 1/a Minute lang energisch geschüttelt. An der Wand haftende Silberteilchen müssen jedesmal mit dem folgenden Tropfen abgespült werden. Wenn die Prozedur einige Male wiederholt ist, wird die Wand des Gefäßes mit etwas dest. Wasser aus einer Spritzflasche abgespült; dann läßt man den Niederschlag absetzen. Die darüberstehende Flüssigkeit wird abgegossen und gesondert aufgehoben. Der Rückstand wird in gleicher Weise wie vorher mit Ammoniak gelöst und abgegossen. Die Flüssigkeiten werden schließlich vereinigt. Dann wird so lange 10°/oige Silbernitratlösung zugetropft, bis der sich bildende Niederschlag sich auch beim Schütteln nicht m e h r löst. Schließlich wird zentrifugiert und die klare Flüssigkeit mit dest. Wasser auf 115 ccm verdünnt. Die Silberlösung bleibt in dunkler, gut verschlossener Flasche einige Monate brauchbar. Einen mit der Zeit evtl. auftretenden Niederschlag läßt man absetzen. 1539. D i f f e r e n z i e r u n g d e r S i l b e r i m p r ä g n a t i o n . Mißlung e n e I m p r ä g n a t i o n e n , bei d e n e n n i c h t n u r die F i b r i l l e n , s o n d e r n a u c h die ü b r i g e n S t r u k t u r e n s t a r k d u n k e l g e f ä r b t sind, k a n n m a n n a c h B e r g (21) d a d u r c h r e t t e n , d a ß m a n die ü b e r f ä r b t e n S c h n i t t e f ü r 2—10 S e k u n d e n v o r s i c h t i g m i t e i n e r 0,5—l°/ooigen C y a n k a l i l ö s u n g b e h a n d e l t . Ein ä h n l i c h e s R e s u l t a t gibt a u c h e i n e k u r z e E i n w i r k u n g e i n e r f r i s c h e n 1—2,5°/ooigen Lösung v o n K a l i u m p e r m a n g a n a t . D e r U n t e r g r u n d w i r d in b e i d e n F ä l l e n hell, w o d u r c h die, F i b r i l l e n d e u t lich h e r v o r t r e t e n . Die D i f f e r e n z i e r u n g m u ß s e h r v o r s i c h t i g v o r g e n o m m e n w e r den, d a d a b e i s e h r leicht a u c h die I m p r ä g n a t i o n d e r F i b r i l l e n v e r l o r e n g e h t . 1540. B i e l s c h o w s k y benützt zum Abschwächen folgendes Gemisch: l°/oige Ferricyankaliumlösung 10 ccm, l°/oige Urannitratlösung 10 ccm, dest. Wasser 100 ccm. Man wendet die Lösung erst nach der Behandlung der Schnitte mit Fixiernatron an; eine vorausgehende Vergoldung ist dabei unnötig. Nach dem Abschwächen muß sorgfältig ausgewaschen werden. 1541. O s t e r t a g (25) schwächt den dunklen Untergrund dadurch ab, daß er dem Fixiernatron einige Tropfen einer 20°/oigen Ferricyankaliumlösung zusetzt. 1542. E i n e v o l l s t ä n d i g e B e s e i t i g u n g d e r g a n z e n S i l b e r i m p r ä g n a t i o n (z. B. a u c h bei S c h n i t t e n von S t ü c k i m p r ä g n a t i o n ) e r f o l g t a m e i n f a c h s t e n d u r c h K a l i u m p e r m a n g a n a t - K a l i u m m e t a b i s u l f i t n a c h § 1533, B, w o b e i die Zeiten evtl. e t w a s zu v e r l ä n g e r n sind. A u c h 1—12stündiges E i n l e g e n in l°/oige C y a n k a l i l ö s u n g f ü h r t z u m Ziel (s. auch § 1819). Die S c h n i t t e m ü s s e n g a n z w e i ß w e r d e n . M a n k a n n d a n n n a c h g r ü n d l i c h e m A u s w a s c h e n die I m p r ä g n a t i o n w i e d e r h o l e n o d e r eine b e l i e b i g e a n d e r e F ä r b u n g v e r s u c h e n , doch ist die F ä r b b a r k e i t gewöhnlich herabgesetzt. b)

Tannin-Silber-Methoden

1543. F ü r d e n E r f o l g d e r n a c h f o l g e n d e n T a n n i n - S i l b e r - M e t h o d e n von A c h ü c a r r o s o w i e von Rio H o r t e g a ist die V e r w e n d u n g eines g u t e n T a n n i n s v o n auss c h l a g g e b e n d e r B e d e u t u n g . A m meisten e m p f i e h l t sich das v o n M e r c k g e l i e f e r t e r e i n s t e T a n n i n (Acid. t a n n i c . leviss. puriss. Merck), das sich zu 100% in W a s s e r löst. D a s s c h w e r e r lösliche T a n n i n D. A. IV. ist u n b r a u c h b a r . A u c h l a n g e s L a g e r n d e r S u b s t a n z scheint u n g ü n s t i g zu w i r k e n .

§ 1544—1546.

Imprägnationsmethoden

359

1544. T a n n i n - S i l b e r - M e t h o d e v o n Achücarro. 1. Fixierung in Formollösung 1 : 9 (nicht über 1 Jahr). Gefrierschnitte von 10 bis 20¡j,. Kurzes Auswaschen in dest. Wasser. Man kann auch Paraffin- oder Celloidinschnitte von anders fixiertem Material verwenden; unbrauchbar sind jedoch Fixierungsflüssigkeiten, die Metallsalze (besonders Chromate) enthalten. 2. E r w ä r m e n der Schnitte in kalt gesättigter wässeriger Tanninlösung, 15 Minuten oder länger bei 50° C. 3. Nach dem Erkalten auswaschen j e d e s e i n z e l n e n Schnittes in dest. Wasser, bis er durch A b g a b e des freien Tannins wieder undurchsichtig geworden ist, und überführen in 20 ccm dest. Wasser, dem 8—12 T r o p f e n der ammoniakalischen Silberlösung nach Bielschowsky (s. § 1527) zugefügt sind. Hier wird der Schnitt mit einer Glasnadel so lange hin- und herbewegt, bis er gebräunt ist. Der Grad der notwendigen Bräunung ist für die verschiedenen Organe verschieden. 4. Direktes Übertragen in Formol 1 : 9 (nach Ranke; Achücarro wäscht vorher kurz in dest. Wasser aus). 5. Auswaschen, evtl. K e r n - oder Cytoplasmafärbung, besonders mit Eosin, Methylenazur; steigender Alkohol, X y l o l , Balsam. Ergebnis: Bei richtiger Technik sind auch die feinsten Fasern scharf schwarzbraun gefärbt. 1545. Modifikation von K l a r f e l d . 1. Einlegen der 10—15« dicken Celloidinschnitte in Formol (1 : 9 Brunnenwasser) 24 Stunden. — 2. Abspülen in Wasser, einlegen in kaltgesättigte Tanninlösung (Merck, s. § 1543!) 2—3 Stunden im Wärmeschrank bei 50°'C in bedeckter Schale. — 3. Erkaltenlassen, waschen der Schnitte in dest. Wasser, bis sie undurchsichtig sind. — 4. Einlegen in ammoniakalische Silberlösung (s. u.), in der sie mit einem Glasstäbchen hin- und herbewegt werden, bis sie bräunlichgelb sind. A m besten nimmt man dazu zwei Schalen, um die Schnitte, sobald die erste Lösung sich bräunt, in die zweite zu bringen. — 5. Direktes Übertragen in Formol (1 :9 B r u n n e n w a s s e r ! ) 5 Min., worin die Schnitte dunkelbraun bis schwarz werden. — 6. Auswaschen in fließendem, dann in dest. Wasser. — 7. Differenzieren in: 0,5%ige wässer. Ferrocyankaliumlösung 100 ccm + 96°/oiger Alkohol 50 ccm. — 8. Auswaschen in dest. Wasser 30 Min. — 9. Alkohol. Xylol. Balsam. H e r s t e l l u n g d e r S i l b e r l ö s u n g : Zu 5 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung wird tropfenweise Ammoniak zugesetzt, bis der gebildete Niederschlag wieder gelöst ist. Hierauf wird noch ein Überschuß von 5—10 Tropfen Ammoniak zugegeben (wichtig!) und mit dest. Wasser auf 20 ccm aufgefüllt. Von dieser Lösung werden 15 Tropfen mit 20 ccm dest. Wasser verdünnt. M o d i f i k a t i o n e n der nach Del

Methode von Rio-Hortega

Achücarro

1546. D e l R i o - H o r t e g a hat eine Reihe von wichtigen Modifikationen der Methode A c h ü c a r r o s angegeben, durch welche die Tannin-Silber-Methode so sehr an Sicherheit gewonnen hat, daß sie für die Darstellung des Bindegewebes der Methode von B i e l s c h o w s k y an Bedeutung gleichkommt. Geringe Modifikationen gestatten die Darstellung nicht nur der Gitter- und Bindegewebsfasern, sondern auch zahlreicher anderer Gewebe- und Zellstrukturen. Auch die monatelange Haltbarkeit der von Rio Hortega angegebenen ammoniakalischen Silberlösung bedeutet eine Vereinfachung in der Ausführung der Methode. Die Methoden gelingen an Formolpräparaten w i e auch nach zahlreichen anderen Fixierungen (z. B. Formolalkohol, Sublimat-Eisessig, Pikrinsäuregemi-

360

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1547—1548.

sehen u. a.). Sie können an Gefrierschnitten wie an unaufgeklebten Celloidinschnitten a u s g e f ü h r t werden. Teilweise glücken sie auch an aufgeklebten P a raffinschnitten (s. § 1549, V o 11 e r r a). Sehr wesentlich f ü r das Gelingen ist, daß die Tanninlösung die vorgeschriebene T e m p e r a t u r von 50° C besitzt. K ä l t e r e Lösungen geben oft nur unvollständige Imprägnationen ( P l e n k 27). 1547. 1. Modifikation nach Rio-Hortega (16a). Dargestellt werden: Kern, Centrosom, Mitochondrien, Zellgranula, Epithelfibrillen, Myofibrillen, Zelleinschlüsse, Gliafasern, Fibrin, elastische Fasern. Ungefärbt bleiben: Kollagenes Bindegewebe u n d Gitterfasern. A u s f ü h r u n g : 1. Fixierung in Formol 10 :100 (beliebig lange, aber mindestens 10 Tage). 2. Schneiden mit dem Gefriermikrotom. Einlegen der Schnitte aus dest. Wasser auf 5 Minuten in eine 3°/oige w ä s s e r i g e Lösung von T a n n i n (50—55° C). 3. Übertragen in ein mit 20 ccm dest. Wasser gefülltes Glasschälchen, das am besten auf dunkler Unterlage steht; dem Wasser sind 4 ccm A m moniak zugesetzt. Man bewegt die in der Flüssigkeit liegenden Schnitte leicht mit einem Glasstäbchen, bis sie ihre Biegsamkeit und Transparenz wieder erlangt haben; das letztere ist auf dem dunklen U n t e r g r u n d leicht zu erkennen. Sobald das eingetreten ist, 4. übertragen in drei Glasschälchen, deren jedes mit je 10 ccm dest. Wasser + 1 ccm ammoniakalischer Silberlösung (Herstellung s. § 1551) gefüllt ist.. Sobald sich der ständig leicht zu bewegende Schnitt im ersten Schälchen zu f ä r b e n beginnt, ü b e r t r ä g t man ihn ins zweite; w e n n er hier gelb wird, in das dritte, in dem sich der Ton noch verstärkt. 5. Auswaschen in reichlichem dest. Wasser. 6. Vergolden in einer 0,2°/oigen Lösung von Goldchlorid 20—30 Minuten bei 40—4501 C. Die P r ä p a r a t e tönen sich hier m a u l b e e r farbig. 7. Auswaschen in dest. Wasser. 8. Fixierung in einer 5°/oigen F i x i e r natronlösung 1 Minute. 9. Gründliches Auswaschen, entwässern, Xylol, Balsam. Soll das C e n t r o s o m besonders hervorgehoben werden, so erwärmt man sub 2 die Tanninlösung etwa 5 Minuten lang auf 65—70° C. Im übrigen verfährt man wie vorausgehend beschrieben. ( R i o - H o r t e g a 16b.) 1548. 2. Modifikation nach Rio-Hortega (16a). Dargestellt werden in erster Linie die Gitterfasern in tiefschwarzem Ton, w ä h r e n d sich das kollagene Bindegewebe n u r schwach bräunlich färbt. — D a s T a n n i n w i r d i n 96% i g e m Alkohol gelöst. A u s f ü h r u n g : 1. Fixierung in Formol 10 :100 oder längere Zeit in Alkohol. Schneiden auf dem Gefriermikrotom 10—15¡x dick. Auch Celloidin-schnitte können imprägniert werden (am besten löst man das Celloidin vor der I m p r ä g n i e r u n g in Äther-Alkohol auf). 2. Einlegen der Schnitte in die l°/oige a l k o h o l i s c h e Tanninlösung bei 50—55°'C auf 5 Minuten. 3. Noch vor Abkühlen der Schnitte kurz auswaschen in dest. Wasser, nicht länger als bis sie mit Wasser d u r c h t r ä n k t sind. 4. D u r c h f ü h r e n durch drei Schälchen, die mit je 10 ccm dest. Wasser + 1 ccm einer ammoniakalischen Silbernitratlösung gefüllt sind, wie bei Modifikation 1. Wenn der Schnitt blaßgelb g e f ä r b t ist, b r i n g t man ihn 5. in dest. Wasser, in welchem man i h n o h n e i h n z u b e w e g e n , am Boden liegen läßt, bis er gleichmäßig d u n k l e r geworden ist. 6. K u r z Abwaschen in dest. Wasser (Vorsicht; bei sich schlecht imprägnierenden P r ä p a r a t e n oft n u r wenige Sekunden!). 7. Einlegen in eine säurefreie Formollösung 20 :100 f ü r 30 Sekunden (das Formol wird durch Stehen über Kreidepulver entsäuert). Durch kürzeres oder längeres Reduzieren und durch stärkeres oder schwächeres vorhergehendes Auswaschen läßt sich die Intensität der Imprägnation abstufen. 8. Gründliches Auswaschen in Wasser usw.

§ 1549—1555.

Imprägnationsmethoden

361

1549. V o l t e r a (23) bringt aufgeklebte Paraffinschnitte von Formol, Alkohol oder Carnoy fixiertem Material nach Entparaffinieren über die absteigende Alkoholreihe für 7—8 (!) Minuten in die l°/oige alkoholische Tanninlösung bei 52 bis 55° C im Brutschrank (Zeiten und Temperatur für das Gelingen ausschlaggebend!). Dann weiter wie oben. In der ammoniakalischen Silberlösung bleiben die Schnitte, bis sie eine fleckig-gelbliche Tönung zeigen. 1550. 3. Modifikation nach Rio-Hortega (16a). Dargestellt wird das kollagene Bindegewebe in dunkelviolettem oder rotviolettem Ton. A u s f ü h r u n g : 1. Fixierung in Formol oder besser längere Zeit in Alkohol. 2. Gefrierschnitte kommen aus Wasser in l°/oige alkoholische Tanninlösung bei 5 0 — C auf 5 Minuten. 3. Kurzes Abwaschen in dest. Wasser (2—3 Sek.). 4. I m p r ä g n i e r u n g in drei aufeinanderfolgenden Schälchen, wie bei Modifikation Nr. 1, bis' der Schnitt braungelb ist. 5. Auswaschen in reichlichem Wasser. 6. Vergolden in einer 0,2°yoigen wässerigen Lösung von Goldchlorid, 15—20 Min. bei 40—45° C, bis die Schnitte maulbeerfarbig sind. 7. Fixierung in 5°/oigem Fixiernatron. 8. Gründliches Auswaschen in Wasser usw. 1551. Herstellung der ammoniakalischen Silberlösung: Zu 30 ccm einer 10%>igen Silbernitratlösung w e r d e n 40 Tropfen einer 40°'/oigen Natronlauge gesetzt. Der erhaltene Niederschlag wird 10—12mal mit dest. Wasser gewaschen, im ganzen mit etwa 1—IV2 Liter. Den gewaschenen Niederschlag suspendiert man in 50 ccm dest. Wasser und setzt u n t e r leichtem Bewegen der Flüssigkeit vorsichtig Ammoniak zu, bis er eben gelöst ist. Die Lösung wird auf 150 ccm aufgefüllt und in b r a u n e r Flasche im Dunkeln beliebig lange a u f b e w a h r t . 1552. 4. Über eine 4. M o d i f i k a t i o n , die hauptsächlich zur Darstellung der Neuroglia dient, siehe § 1859. 1553. 5. Schnellfärbemethode mit ammoniakalischem Silbercarbonat nach Rio-Hortega (19a). Dargestellt wird das Gewebe des P r ä p a r a t e s im allgemeinen. 1. Fixierung in Formol 10 : 100. Stücke nicht dicker als 4—5 mm, benötigen bei Z i m m e r t e m p e r a t u r 1—2 Tage, bei 35" 10—15 Stunden, bei 60—70° 5—10 Minuten, in kochendem Formol 1 Minute. 2. Schneiden auf dem Gefriermikrotom. Die Schnitte kommen aus dest. Wasser in Silbercarbonatlösung (Herstellung s. § 1554) bei 45—50° C f ü r 1—2 Minuten, in der sie jedoch höchstens schwach gelblich w e r d e n dürfen. 3. Ohne Auswaschen übertragen in Formol 1 :100, in dem sie leicht bewegt werden, bis sie sich gelb färben. Nehmen sie n u r eine graugelbliche F a r b e an, so müssen sie nochmals in die Silbercarbonatlösung zurück. 4. Vergolden in 0,20'/oiger Goldchloridlösung ca. 30 Sekunden. 5. Kurz Eintauchen in 5°'/oige Fixiernatronlösung. 6. Auswaschen, evtl. Gegenfärbung mit Pikrofuchsin od. dgl., dann entwässern, 95°/oiger Alkohol, aufhellen in einem Gemisch aus 1 Teil Karbolsäure, 1 Teil Buchenholzkreosot, 8 Teilen Xylol. Reines Xylol. Balsam. 1554. Herstellung der Silbercarbonatlösung. Zu 50 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung setzt m a n 150 ccm einer 5%>igen Natriumcarbonatlösung und dazu u n t e r stetem Schütteln langsam und vorsichtig Ammoniak, bis der Niederschlag eben gelöst ist. Dann dest. Wässer 550 ccm. Die Lösung ist in b r a u n e r Flasche im D u n k e l n a u f b e w a h r t , längere Zeit haltbar. Weitere Methoden Rio-Hortegas zur Darstellung von Nerven- und Gliaelementen siehe § 1857. 1555. O 1 i v e i r a (36) kombiniert die Hortega- und Wildersche Methode, um an Paraffinschnitten die feinsten argyrophillen u n d kollagenen Fasern in schwarzem bzw. rot-violettem F a r b t o n different darzustellen. Fixierung in n e u t r a l e m Formol, absol. Alkohol oder Zenker.

362

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1556—1557.

Ausführung: 1. Die Schnitte kommen nach Entparañinieren aus dest. Wasser in lOVoige Phosphormolybdänsäure 1 Min. — 2. Abspülen in dest. Wasser 10—20 Sek. — 3. li/oige Uranylnitratlösung 5 Sek. — 4. Abspülen in dest. Wasser 5 Sek. — 5. Übertragen in F o o t s c h e Lösung 1 Min. (immer frisch zubereiten!) — 6. K r ä f tiges Abspülen in reichlich 95°/oigem Alkohol, der sich dabei leicht trübt 5 Sek. — 7. Reduktion in: neutrales 40°/oiges Formol' 3 ccm, l°/oige Uranylnitratlösung 1 ccm, dest. Wasser 100 ccm 1 Min. Die Schnitte nehmen eine hellbraune Farbe an. — 8. Waschen in dest. Wasser 3—5 Min. — 9. Imprägnieren in ammoniakalischer Silberchromatlösung im Wärmeschrank bei 56° C 15—20 Min. Die Schnitte werden hierbei rötlich-braun. (Die Lösung ist jedesmal frisch zu bereiten und vor Gebrauch anzuwärmen.) —• 10. Waschen in dest. Wasser 3—5 Min. — 11. Reduktion in: neutrales 40°/oiges Formol 30 ccm, Hydrochinon 0,3 g, dest. Wasser 70 ccm 1 Min. Die Schnitte werden dunkelbraun. — 12. Auswaschen in Brunnenwasser 3—5 Min. — 13. Vergolden in einer 0,2°/oigen gelben Goldchloridlösung bei 56° C 5—10 Min. (vor Gebrauch anwärmen). — 14. Fixierung in 5°/oiger Fixiernatronlösung 6—10 Min. — 15. Gründlich auswaschen in Brunnenwasser. Alkohol. Xylol. Balsam. Die Schnitte sind in den Lösungen häufig zu bewegen und beim Wechseln der Lösungen langsam herauszuziehen, damit diese soweit als möglich ablaufen. Die Lösungen in 1., 3., 7., und 13. sind in brauner Flasche gut haltbar. Bereitung der Silberlösungen: A. F o o t s c h e Lösung: Zu 5 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung wird tropfenweise Ammoniak zugesetzt, bis der sich bildende Niederschlag sich wieder vollkommen auflöst. Dann fügt man 5 ccm einer 3°/oigen Natronlauge zu und löst den dadurch gebildeten Niederschlag durch tropfenweisen Zusatz von Ammoniak wieder auf. Zuletzt füllt man mit dest. Wasser auf 50 ccm auf. B. S i l b e r c h r o m a t l ö s u n g : Zu 5 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung werden 10 ccm einer 5°/oigen Kaliumbichromatlösung zugesetzt. Der Niederschlag wird in der Schüttelmensur mit dest. Wasser gewaschen, bis sich das Waschwasser nicht mehr färbt. Dann gibt man 40 ccm dest. Wasser zum Niederschlag und setzt unter dauerndem Schütteln tropfenweise Ammoniak, bis der Niederschlag bis auf eine deutlich erhaltene Trübung gelöst ist. Dann füllt man mit dest. Wasser auf 85 ccm auf. 3. Färbung des elastischen Gewebes 1556. O r c e i n m e t h o d e nach (T a e n z g r -) U n n a (94). Die Methode bringt die elastischen Fasern bis in die feinsten Verzweigungen sehr scharf und vollständig zur Darstellung. D i e Färbung gelingt nach den meisten Fixierungen u n d läßt sich ohne Schwierigkeit mit verschiedenen Kernfärbungen kombinieren. — Ausführung der Färbung: 1. Einstellen der Schnitte aus dest. Wasser in die Farblösung: 30—60 Minuten. — 2. Kurz abspülen in dest. Wasser und 96°/oigem Alkohol. — 3. Differenzieren in abs. Alkohol, bis der Untergrund fast farblos ist und die elastischen Fasern isoliert hervortreten. — 4. Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Die elastischen Fasern sind überaus scharf braunrot gefärbt, w ä h r e n d alles übrige mit Ausnahme der Knorpelsubstanz mehr oder weniger entfärbt ist. Nach manchen Fixierungen, z. B. Bouin, bleiben auch die Kerne schön violett gefärbt. Bei Überfärbung läßt sich der Überschuß an Farbe durch längeres Differenzieren mit hochprozentigem Äthylalkohol unschwer wieder ausziehen. Noch stärker extrahiert Methylalkohol. Herstellung der Farblösung: Man löst l g Orcein'in 100 ccm 70°/oigen Alkohols, dem 1 ccm officin. Salzsäure zugesetzt wurde. Die Lösung ist sofort gebrauchsfertig. 1557. Wichtig ist die Verwendung eines guten, unverfälschten Farbstoffes. Orcein wird aus ost- und westindischen Flechtenarten gewonnen. Es ist unlöslich in

§ 1558—1561.

F ä r b e m e t h o d e n (Elastin)

363

Äther, Benzol, Chloroform, Toluol, Xylol, wenig löslich in dest. Wasser, Leitungsw a s s e r u n d l°/oiger Essigsäure, leicht löslich in l°/oiger N a t r o n l a u g e , Aceton, Eisessig, abs. Äthylalkohol u n d Methylalkohol. Bei alkalischer R e a k t i o n schlägt der b r a u n r o t e Ton des F a r b s t o f f e s in d u n k e l b l a u v i o l e t t um. 1558. P f a n t e r setzt die Orceinlösung f o l g e n d e r m a ß e n z u s a m m e n : Orcein D (Grübler) 0,1 g; offiz. S a l p e t e r s ä u r e 2 ccm; 70°/oiger Alkohol 100 ccm; Färbezeit 8—24 S t u n d e n . Oder Orcein- 1 g; offiz. S a l p e t e r s ä u r e 5 ccm; 70°/oiger Alkohol 100 ccm; F ä r b e z e i t '/-—1 Stunde.

1559. Zur V e r b i n d u n g m i t e i n e r K e r n f ä r b u n g spült man die Schnitte nach der Orceinfärbung mit dest. Wasser ab und färbt in der üblichen Weise mit Hämalaun od. dgl. Nach der Färbung wird in dest. Wasser und dann in Leitungswasser gewaschen und durch 96%>igen Alkohol in absoluten übertragen, in dem das Präparat so lange bleibt, bis der Überschuß an Orcein ausgezogen ist. — Statt mit Hämatoxylin können die Kerne auch mit wasserlöslichen basischen Teerfarbstoffen gefärbt werden, z. B. mit Tolu'idinblau, Methylenblau, polychromem Methylenblau u. a.; wenn die Kernfärbung durch das nachfolgende Differenzieren der Orceinfärbung in abs. Alkohol angegriffen wird, so nimmt man die Differenzierung vor der Kernfärbung vor. 1560. R e s o r c i n f u c h s i n nach W e i g e r t (98). Auch diese ausgezeichnete Methode bringt die elastischen Fasern bis in ihre feinsten Verzweigungen scharf und vollständig zur Darstellung. Ausführung: 1. Einstellen der Präparate aus 80°/oigem Alkohol in die Farblösung 10—30 Min. — 2. Auswaschen in fließendem Wasser 1 Min. Abtropfenlassen. — 3. Differenzieren in 96°/oigem Alkohol, bis der Untergrund entfärbt ist und die elastischen Fasern schwarzblau hervortreten. — 4. Absol. Alkohol. Xylol (nicht Karbolxylol!), Balsam. Meist ist es zweckmäßig, auch eine Kernfärbung vorzunehmen. Man bringt die Präparate dazu nach 2. für 5 Min. in Kernechtrot-Aluminiumsulfat (s. § 743). Dann abspülen in dest. Wasser und differenzieren in 96°'/oigem Alkohol wie oben. Auch Carmalaun, Paracarmin oder fuchsinschweflige Säure sind zur Gegenfärbung der Kerne sehr geeignet. In diesem Falle muß die Kernfärbung aber v o r der Resorcinfärbung erfolgen. 1561. Herstellung der Farblösung: Sie erfolgt im P r i n z i p n a c h d e n A n g a b e n We'igerts, w u r d e a b e r von m i r e t w a s modifiziert (R o m e i s 40), u m den Arbeitsgang zu v e r e i n f a c h e n u n d die F e u e r s g e f a h r zu v e r m i n d e r n , da die zweite, alkoholische Lösung, w e n n sie n a c h Weigerts Vorschrift in offener Porzellanschale erhitzt wird, s e h r l e i c h t F e u e r f ä n g t , was, w i e m i r b e k a n n t w u r d e , schon zu schweren U n glücksfällen führte. A n Stelle des von W e i g e r t angegebenen Liqu. f e r r . sesquichlor, v e r w e n d e ich eine e n t s p r e c h e n d e Menge von Eisenchlorid, da der L i q u o r je n a c h seinem Alter v e r s c h i e d e n w i r k e n d e F a r b l ö s u n g e n gibt. M a n b e r e i t e t zwei L ö s u n g e n : L ö s u n g A: 0,5 g F u c h s i n (nicht S ä u r e f u c h s i n ! ) u n d 1 g Resorcin (ehem. r e i n p r o analys. »Kahlbaum«) w e r d e n in e i n e m E r l e n m e y e r k ö l b c h e n von e t w a 200 ccm I n h a l t u n t e r E r w ä r m e n in 50 ccm dest. Wasser gelöst. L ö s u n g B: 2 g Eisenchlorid (kryst. pro analys. »Kahlbaum«) w e r d e n in einem Kölbc h e n i n 10 ccm dest. Wasser gelöst. D a n n e r h i t z t m a n Lösung A bis z u m Kochen, gibt Lösung B zu u n d läßt bei kleiner F l a m m e u n t e r m e h r m a l i g e m U m s c h w e n k e n noch 5 Min. kochen. N a c h E r k a l t e n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r s a m m e l t m a n den Niederschlag auf e i n e m kleinen Filter, b r i n g t i h n mit diesem in das E r l e n m e y e r k ö l b c h e n zurück, ü b e r g i e ß t ihn mit 70 bis 100 ccm 96°/oigen Alkohol u n d erhitzt vorsichtig a u f d e m W a s s e r b a d oder auf einer e l e k t r i s c h e n H e i z p l a t t e bis z u m Kochen, wobei d e r Niederschlag in Lösung geht. N a c h d e m E r k a l t e n w i r d m i t 0,7 ccm konz. S a l z s ä u r e (spez. Gew. 1,19) oder m i t 1 ccm officineller Salzsäure versetzt u n d filtriert. — Die Lösung ist f ü r Eia-

364

Untersuchung des Bindegewebes

§ 1562—1566.

stinfärbung einige Monate haltbar, doch ist es zweckmäßig, keine großen Vorratsmengen zu bereiten. Herstellung der officinellen Salzsäure s. § 679. 1562. Als K r e s o f u c h s i n wird eine von S p i e g e l (07) analog der W e i g e r t schen Vorschrift bereitete Farblösung bezeichnet, bei der das Resorcin durch Bikresol oder Diphenol ersetzt ist. Nach meinen Erfahrungen ist das Weigertsche Resorcinfuchsin vorzuziehen.

1563. Die Resorcinfuchsinfärbung läßt sich mit den verschiedensten F ä r b u n gen kombinieren. H o r n o w s k y verband sie mit der v a n G i e s o n - Methode zur gleichzeitigen F ä r b u n g von elastischem (schwarz), kollagenem (rot) und muskulärem Gewebe (gelb). Die Haltbarkeit der Färbung ist aber leider n u r gering. An ihrer Stelle empfehle ich eine Verbindung mit P i k r i n s ä u r e T h i a z i n r o t , die den gleichen Färbeeffekt gibt und wesentlich haltbarer ist. Ausführung: 1. Einstellen der Präparate aus SOVoigem Alkohol in Resorcinfuchsin 15 Min. — 2. Abspülen in Brunnen- und dest. Wasser. — 3. Kernfärbung mit Weigertschem Eisenhämatoxylin (s. § 677) 2—3 Min. — 4. Kurz abspülen in dest. Wasser, dann auswaschen in fließendem Wasser 10 Min. — 5. Pikrinsäure-Thiazinrot (Herstellung s. § 710) 5 Min. — 6. Kurz abspülen in dest. Wasser. — 7. Differenzieren der Elastinfärbung und gleichzeitiges Auswaschen der überschüssigen Pikrinsäure in 2 Portionen 96°/oigem Alkohol. — 8. Absol. Alkohol. Xylol. Balsam. 1564. Noch differenter gefärbte und gleichzeitig sehr haltbare Präparte erhalte ich durch Kombination von Resorcinfuchsin mit der in § 1498 angegebenen Bindegewebsfärbung. Ausführung: 1. Einstellen der Präparate aus 80"/oigem Alkoholen Resorcinfuchsin 15 Min. — 2. Abspülen in Brunnen- und dest. Wasser. — 3. Kernfärbung mit Weigertschem Eisenhämatoxylin (s. § 677) 2—3 Min. — 4. Abspülen in dest. Wasser, dann auswaschen in fließendem Wasser 10 Min. — 5. Färben in Azophloxin. 5 Min. — 6. Abspülen in lol/oiger Essigsäure. — 7. Differenzieren in Phosphormolybdänsäure-Orange, bis das kollagene Bindegewebe v o l l s t ä n d i g entfärbt ist. — 8. Kurz abspülen in l°'/oiger Essigsäure. — 9. Gegenfärbung mit Lichtgrün 5 Min. — 10. Auswaschen in l°'/oiger Essigsäure 5 Min. — 11. Absol. Alkohol (3 Portionen), Xylol, Balsam. — Ergebnis: Kerne schwarz, Cytoplasma rot, kollagenes Bindegewebe grün, elastisches schwarz, Muskelgewebe rot. Herstellung der Lösungen wie in § 1498. An Stelle von Azophloxin kann wie in § 1498 auch Säurefuchsin-Ponceau verwandt werden. 1565. v. V o l k m a n n ung S t r a u ß (34) färben 1—12 Stunden in Resorcin-Gentianaviolett (s. § unten) und nach Abspülen in 70o/'°igem Alkohol und Wasser 15 bis 30 Min. bei Zimmertemperatur in Azokarmin G (s. § 1489). Nach kurzer Differenzierung (nicht zu stark!) in Anilinalkohol kommen die Präparate bis zur v ö l l i g e n Entfärbung des Kollagens in 5°/oige Phosphorwolframsäure. Nach Abspülen in Wasser Gegenfärbung in Naphtholgrün B (1 g in 100 ccm dest. Wasser + 1—2 ccm Eisessig) 15 Min. oder länger. Dann Wasser, 96°/o und absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Kerne und Muskulatur rot, Kollagen grün, Elastin schwarz. Die Herstellung der Resorcin-Gentianaviolettlösung kann wie in § 1561 erfolgen mit dem Unterschied, daß man statt Fuchsin Gentianaviolett B (Merck) nimmt und den Salzsäurezusatz wegläßt. Die Lösung setzt in den ersten Tagen stark ab und muß daher mehrmals filtriert werden (immer durch das gleiche Filter). 1566. Z u r g l e i c h z e i t i g e n D a r s t e l l u n g v o n e l a s t i s c h e n Fas e r n u n d F e t t färbt B. F i s c h e r formolfixierte Gefrierschnitte mit folgender Lösung: Weigerts Resorzin-Fuchsin-Lösung 74 ccm + dest. Wasser 26 ccm. Darin löst man unter Kochen Scharlach R im Überschuß, läßt abkühlen und filtriert.

§ 1567—1572.

Färbemethoden (Elastin-Amyloid)

365

Man färbt eine Stunde in gut gedeckter Schale, differenziert 15 Minuten in einer heiß gesättigten Lösung von Scharlach R in 70°/oigem Alkohol (zudecken), spült mit 70°/oigem Alkohol ab und bettet in Glyzerin ein. 1567. » E l a s t i n H«, ein von Hollborn in den Handel gebrachtes Farbgemisch, färbt die elastischen Fasern im Farbton des Orceins, das übrige Gewebe, namentlich das Kollagen blaßblau. Die Färbung gelingt nach allen Fixierungen, auch an frischem Material und an Gefrierschnitten ( E w a l d 22). Man löst 0,5 g Elastin H in 50 ccm 70°/oigem Alkohol + 1 ccm Acid. nitr. pur. unter gelindem Erwärmen auf dem Wasserbad. Die Lösung ist nach Filtrieren gebrauchsfertig. Färbedauer mindestens 6—10 Stunden, dann abspülen in 96°/oigem Alkohol, absol. Alkohol, Xylol, Balsam. 1568. K o n g o r o t - M e t h o d e nach M a t s u u r a (25). Fixierung beliebig, am besten Formol (auch Alkohol oder Müllersche Flüssigkeit). 1. Färbung der Schnitte in Kongorot 12—24 Stunden (1 g K. wird in 100 ccm 90°/oigem Alkohol öfters kräftig geschüttelt. Nach 24 Stunden wird abfiltriert). — 2. Kurz abspülen in abs. Alkohol. — 3. Einlegen in alkohol. Phosphormolybdänsäurelösung (1 g Phosphormolybdänsäure (Merck) wird kurz vor Gebrauch in 100 ccm abs. Alkohol gelöst): 5 Minuten (bis das Präparat blau ist). — 4. Differenzieren in abs. Alkohol 1—2 Minuten. — 5. Aufhellen in Origanumöl. — 6. Canadabalsam (neutral). E r g e b n i s : Elast. Fasern rötlich-violett; kollagenes Bindegewebe grün, Muskel, Drüsenzellen, Epithelien braunrot; Kerne rot, Erythrocyten feuerrot; weiße Blutzellen violettrot. •—• Nimmt man statt Phosphormolybdänsäure Phosphorwolframsäure, dann wird das kollagene Bindegewebe blau. 1569. Zur D a r s t e l l u n g d e r S c h w a l b e s c h e n S c h e i d e n d e r e l a s t i s c h e n F a s e r n fixiert E w a l d (19) in Alkohol oder 10°/oiger Formollösung. Rasiermesserschnitte von dem in Alkohol liegenden Material kommen für 24 Stunden in eine sehr stark verdünnte wässerige Gentianaviolettlösung. (E. taucht eine Nadel in eine konz. alkohol. Lösung und überträgt die anhaftende Farbe in 10 ccm dest. Wasser.) Es ist zweckmäßig, 2—3 Farbschälchen mit etwas verschiedener Konzentration zu verwenden. Die Schnitte dürfen nicht aufeinanderliegen. Nach der Färbung werden die Schnitte ohne Auswaschen f ü r 2 Minuten in eine 1 l°/oige wässerige Lösung von Phosphormolybdänsäure gebracht, dann 96°/oiger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol (je 1 Minute), Xylolbalsam. An Paraffinschnitten ist die Färbung nicht möglich. 1570. Zur Darstellung des E 1 a c i n s, womit U n n a eine im Alter auftretende Degenerationsform des Elastins bezeichnet, fixiert U n n a in Alkohol, bettet in Paraffin ein und färbt Schnitte davon 5 Minuten mit blauem Polychrom (siehe § 1415), dann abspülen mit Wasser, einstellen in konz. Tanninlösung 5 Minuten, Wasser, Alkohol, ö l , Balsam. E r g e b n i s : E l a c i n dunkelblau, Kollagen ungefärbt. Setzt man der Tanninlösung einige Tropfen einer l°/oigen Orangelösung zu, so färbt sich das Kollagen gleichzeitig gelb. 1571. Zur gleichzeitigen Färbung von E l a s t i n (orceinrot), E l a c i n (dunkelblau) und K o l l a g e n (bräunlich) färbt U n n a über Nacht in saurer Orceinlösung (nach § 1576), dann Differenzierung in 2°/oiger wäss. Salzsäurelösung. Fortsetzung des Prozesses durch direkte Uberführung iii abs. Alkohol; hierauf auswaschen in Wasser, färben in blauem Polychrom 5 Minuten, gründlich auswaschen in Wasser bis keine blauen Farbwolken mehr abgehen, einstellen in konzentrierte Tanninlösung, 30 Minuten, gründlich auswaschen in Wasser, Alkohol, ö l , Balsam. Nachweis von

Amyloid

1572. Die Amyloidreaktionen werden durch Vorbehandlung mit fettlösenden Flüssigkeiten wie Alkohol, Äther, Chloroform, Xylol, Benzol u. dgl. nicht be-

366

Untersuchung des Knorpelgewebes

§ 1573—1576.

e i n f l u ß t . Selbst m e h r j ä h r i g e s Liegen in A l k o h o l ist u n s c h ä d l i c h . V o n d e n S ä u r e n s t ö r e n die R e a k t i o n e n n u r Essig- u n d P h o s p h o r s ä u r e , n a c h d e r e n E i n w i r k u n g die J o d r e a k t i o n v e r s c h w i n d e t . D u r c h O x y d a t i o n s - oder R e d u k t i o n s m i t t e l w i r d die M e t a c h r o m a s i e des A m y l o i d s n i c h t g e ä n d e r t . A l k a l i e n wie N a t r o n - o d e r K a l i l a u g e , A m m o n i a k , B a r y t w a s s e r b r i n g e n d a g e g e n die M e t h y l v i o l e t t r e a k t i o n z u m V e r s c h w i n d e n . D a b e i b l e i b t ein h y a l i n e r K ö r p e r z u r ü c k , d e r k e i n e R e a k t i o n e n m e h r gibt. Auf G r u n d dieses V e r h a l t e n s b e z e i c h n e t L e u p o l d (18, 25) die F i x i e r u n g in A l k o h o l als die b e s t e f ü r Amyloid. W e n i g e r g u t ist F o r m o l . 1573. J o d r e a k t i o n . F i x i e r u n g in abs. A l k o h o l (oder F o r m o l ) . P a r a f f i n o d e r G e f r i e r s c h n i t t e k o m m e n aus W a s s e r in s t a r k v e r d ü n n t e L u g o l s c h e Lösung, bis sie s t r o h g e l b sind. A b s p ü l e n in Wasser. E i n s c h l u ß i n Glyzerin. Ergebnis: Amyloid: mahagonibraun. 1574. F ä r b u n g m i t M e t h y l v i o l e t t (oder G e n t i a n a v i o l e t t ) n a c h P. M a y e r . F i x i e r u n g w i e in § 1573. E i n b e t t u n g in P a r a f f i n . 1. F ä r b u n g in 0,5%>iger L ö s u n g von M e t h y l v i o l e t t 5 B 5—10 Min. D i e P a r a f f i n s c h n i t t e w e r d e n d a z u a m b e s t e n n i c h t a u f g e k l e b t , s o n d e r n d i r e k t v o m Messer w e g auf die auf e t w a 40° C e r w ä r m t e F a r b l ö s u n g ü b e r t r a g e n und auf i h r g e s t r e c k t . — 2. A b s p ü l e n in W a s s e r u n d d i f f e r e n z i e r e n in l°/oiger Essigsäure 10—15 M i n u t e n . — 3. S o r g f ä l t i g e s A u s w a s c h e n d e r E s s i g s ä u r e m i t Wasser. — 4. Ü b e r t r a g e n in 7°/oige K a l i a l a u n l ö s u n g . — 5. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r u n d a u f z i e h e n d e r S c h n i t t e auf O b j e k t t r ä g e r . T r o c k n e n im W ä r m e s c h r a n k . — 6. L ö s e n des P a r a f f i n s i n Xylol, B a l s a m . — Er-, gebnis: A m y l o i d rotviolett, G e w e b e b l a u . Gefrierschnitte werden nur einige Minuten gefärbt und nach 2. und 3. in Glyzerin oder Lävulose eingelegt. 1575. F ä r b u n g m i t K o n g o r o t n a c h B e n n h o l d (22). 1. F ä r b u n g der e n t p a r a f f i n i e r t e n S c h n i t t e in l°/oiger w ä s s e r i g e r K o n g o r o t l ö s u n g 15—20 M i n u t e n ( G e f r i e r s c h n i t t e b e n ö t i g e n n u r 20 S e k u n d e n ) . — 2. E i n t a u c h e n in g e s ä t t . w ä s s e r . L i t h i u m c a r b o n a t l ö s u n g 15 S e k u n d e n . — 3. E n t f ä r b e n in 80°'/oigem Alkohol, bis K o n g o r o t s c h l i e r e n a m O b j e k t t r ä g e r h e r a b l a u f e n . D a n n sogleich in Wasser a b s p ü l e n . Ist d e r S c h n i t t n i c h t gleichmäßig e n t f ä r b t , d a n n 2 u n d 3 w i e d e r h o l e n . — 4. A u s w a s c h e n in Wasser 15 Minuten, evtl. N a c h f ä r b e n m i t H ä m a l a u n . A l k o hol. Xylol. B a l s a m . Ergebnis: Amyloid rot. H y a l i n oder Kolloid b l e i b e n u n g e färbt. Wie B e n n h o l d fand, läßt sich das Amyloid auch intravital durch intravenöse Injektion von Kongorot darstellen. Bei Mäusen injiziert man dazu intravenös, 1 ccm einer 0,01 bis 0,l°/oigen Kongorot- oder Trypanblaulösung. 20. KAPITEL

Knorpelgewebe A . Hyaliner Knorpel 1576. Z u r H e r s t e l l u n g v o n f r i s c h e n P r ä p a r a t e n eignet sich b e s o n d e r s d e r k n o r p e l i g e Teil des E p i - oder H y p o s t e r n u m s o d e r d e r Scapula des Frosches, f e r n e r d e r proc. x i p h o i d e u s kleiner S ä u g e r w i e Maus, Ratte, M e e r s c h w e i n c h e n . A n h a f t e n d e Weichteile werden durch Abreiben mit einem Leinenläppchen oder Abschaben mit dem Skalpell entfernt. Man untersucht am besten im Gewebss a f t o d e r e i n e r a n d e r e n K ö r p e r f l ü s s i g k e i t . Z u r V e r m e i d u n g von V e r d u n s t u n g m u ß d a b e i s o f o r t m i t D e c k g l a s b e d e c k t u n d u m r a n d e t w e r d e n . Bei V e r w e n d u n g e i n e r u n g e e i g n e t e n B e o b a c h t u n g s f l ü s s i g k e i t k o m m t es s e h r rasch zu einer R e -

§ 1577—1585.

Hyaliner Knorpel

367

traktion der Knorpelzellen (vgl. auch B r o d e r s e n 14, 15). Bei größeren Knorpelstücken lassen sich mit dem Rasiermesser oder nach Einspannen in das Mikrotom auch mit diesem leicht dünne Schnitte gewinnen, z.B. vom Oberschenkelkopf des Frosches. R a n v i e r empfiehlt deren Betrachtung in 0,5%iger Alaunlösung. 1577. Zur F i x i e r u n g d e r K n o r p e l z e l l e n leistet, auf kleine Stückchen angewandt, die Flemmingsche Flüssigkeit (s. § 290) sehr Gutes. Größere Stückchen fixiert man nach Helly, Maximow od. dgl. Zur Fixierung der Mitochondrien, des Netzapparates, von Glykogen und Fettsubstanzen verwendet man die einschlägigen Methoden. Desgleichen zu ihrer färberischen Darstellung. 1578. V e r z w e i g t e K n o r p e l z e l l e n findet man in Flachschnitten durch die oberflächlichen Schichten vieler Gelenkknorpel z. B. des Talus-Gelenkknorpels vom Kalb ( H a n s e n 05). Sehr gut ausgebildet sind sie im Kopfknorpel der Cephalopoden.

1579. Das glatte Aufkleben knorpelhaltiger Paraffinschnitte macht wegen der leicht auftretenden Falten oft Schwierigkeiten, die sich am besten mit der in § 547 angegebenen Aufklebemethode von R u y t e r überwinden lassen. Gelingt es auch damit nicht, so f ä r b t man die Schnitte nach Entfernung des Paraffins in unaufgeklebtem Zustand und entwässert sie zuletzt nach § 831 oder 833. 1580. D a r s t e l l u n g d e r K n o r p e l g r u n d s u b s t a n z . Die Art der F i x i e r u n g und V o r b e h a n d l u n g ist f ü r ihre spätere Färbbarkeit von wesentlicher Bedeutung. Fixierung und langes Liegen in chromhaltigen oder in stark wasserhaltigen Flüssigkeiten, wie verdünntem Formol oder schwachem Alkohol setzt die Färbbarkeit der Knorpelgrundsubstanz stark herab ( S c h a f f e r 26). Am besten bleibt die Basophilie, die durch die im Chondromucoid enthaltene Chondroitinschwefelsäure bedingt ist, bei Fixierung in abs. Alkohol erhalten, ferner in dem die Zellen besser fixierenden Formol-Alkoholgemisch (1 Teil F + 2 Teile 80"/'oiger Alkohol). Auch Fixierung nach Stieve (Formol-Sublimat-Eisessig), Bouin oder Zenker geben gute Resultate. 1581. Knorpel von älteren Individuen, namentlich Rippenknorpel, Larynx- und Trachealknorpel zeigen Kalkeinlagerungen und müssen daher nach der Fixierung z. T. entkalkt werden. Mit dem Gefriermikrotom läßt sich zwar auch ziemlich stark kalkhaltiger Knorpel noch ganz gut schneiden. Bei Färbung mit Hämalaun od. dgl. färben sich die kalkhaltigen Stellen tief dunkelblau. Langdauernde Einwirkung von chromsauren Salzen beraubt die unverkalkte Knorpelgrundsubstanz nach P o m m e r (85) ihrer Färbbarkeit mit Hämatoxylin, die verkalkte behält sie.

1582. F ü r Übersichtspräparate ist ganz besonders die Färbung mit verdünntem Delafieldschem Hämatoxylin (s. § 668) zu empfehlen, durch die die Knorpelgrundsubstanz prachtvoll in tiefblauem Farbton zur Darstellung kommt, während sie durch Hämalaun gewöhnlich n u r blaßblau gefärbt wird. 1583. G a l l a m i n b l a u - N a t r i u m a l a u n l ö s u n g (vgl. § 736) färbt den Knorpel nach etwa 24stündiger Einwirkung bei gleichzeitiger tiefblauer Kernfärbung rosa. In C o e l e s t i n b l a u - C h r o m a l a u n oder C o e l e s t i n b l a u - A l u m i n i u m s u l f a t färbt sich der Knorpel intensiv violettrot (s. § 742). 1584. Sehr intensiv und scharf wird die Knorpelgrundsubstanz durch Toluidinblau gefärbt, z. B. bei der Methode von D o m i n i c i (s. § 726). 1585. Sehr scharfe Kontraste zwischen K n o r p e l g r u n d s u b s t a n z und B i n d e g e w e b e gibt folgende Methode (R o m e i s 11). Fixierung am besten nach Helly. 1. Kernfärbung mit Carmalaun oder Kernechtrot. Abspülen in dest. Wasser. 2. Färben in stark verdünnter angesäuerter M e t h y l e n b l a u -

368

Untersuchung des Knorpelgewebes

§ 1586—1591.

l ö s u n g (s. u.): 12—24 Stunden. 3. Abspülen in dest. Wasser und fixieren in ö'Voiger Ammoniummolybdatlösung (2—3 Stunden). 4. Einige Minuten auswaschen in fließendem Wasser. Abtropfen. 5. 1—3 Minuten in C h r o m o t r o p 2 R (gesättigte Lösung in 95"/oigem Alkohol). 6. Kurz abs. Alkohol. Xylol. Ergebnis: Knorpel leuchtend blau, K e r n e violett bis rot, kollagenes Gewebe, Muskel usw. hellrot, Fibrillenbündel und osteogenes Gewebe leuchtend rot. Zur Bereitung der Methylenblaulösung gibt man unmittelbar vor der Färbung 1—3 Tropfen einer konz. wässerigen Lösung auf 100 ccm dest. Wassers und säuert mit 20 Tropfen einer 0,5°/oigen Salzsäurelösung an. 4586. Schöne Farbkontraste gibt auch folgende Färbung ( R o m e i s 11): 1. Färben in einer hellblauen Lösung von B l e u d e L y o n in abs. Alkohol (auf 100 ccm 1 bis 2 Tropfen Jodtinktur) 24 Stunden. 2. Durch 70°/oigen Alkohol rasch in M u c i c a r m i n (s. § 2025), das man zur Färbung mit 3 Teilen 70°/oigen Alkohols verdünnt; 24 Stunden. Dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. Ergebnis: Knorpel karmoisinrot, Knochen, Bindegewebe blau. Man kann auch noch mit Carmalaun oder Weigertschem Eisenhämatoxylin die Kerne vorfärben. 1587. Zur Darstellung der K n o r p e l k a p s e l empfiehlt S c h a f f e r (26) u. a. progressive V o r f ä r b u n g mit Orange G und Nachfärbung mit tiefveilchenb l a u e m Delafieldschen Hämatotylin. Ergebnis: Kapsel fast schwarzblau, Zellhof leuchtend gelb. 1588. A. E w a l d legt dazu frische dünne Knorpelplatten von Rana oder Triton in Methylenblau (1 g: 2000 ccm 0,5°/oiger NaCl) für 4—5 Minuten; hierauf abspülen in 0,5°/oiger Kochsalzlösung, dann 15 Minuten in 10°/oiger Lösung von molybdänsaurem Ammonium, auswaschen in dest. Wasser. Alkohol, Xylol, Balsam. 1589. I n n e r e r und ä u ß e r e r Z e l l h o f lassen sich durch F ä r b u n g mit stark v e r d ü n n t e r Pikrofuchsinlösung trennen (S c h a f f e r 26): der innere f ä r b t sich dabei einschließlich der Knorpelkapsel intensiv rot, der äußere einschließlich d e r interterritorialen Substanz gelb. Fixierung in Pikrin-Sublimat. K n o r p e l k a p s e l n , i n n e r e Z e l l h ö f e und c h o n d r o m u c o i d e S u b s t a n z f ä r b t S c h a f f e r (26) mit sehr stark v e r d ü n n t e m Thionin (1 bis 3 Tropfen einer konz. alkoholischen Lösung auf 10 ccm dest. Wasser). D a r a n anschließend Fixierung in 5°'/oigem Ammoniummolybdat. Die I n t e r t e r r i t o r i a l s u b s t a n z bleibt dabei u n g e f ä r b t (Fixierung Formol-Alkohol). 1590. Zur Darstellung der i n t e r t e r r i t o r i a l e n S u b s t a n z f ä r b t S c h a f f e r (26) Schnitte vom Rippenknorpel Erwachsener 36—48 Stunden in stark v e r d ü n n t e m Molybdän-Hämatoxylin nach H e l d . Sollen gleichzeitig auch die Zellhöfe g e f ä r b t werden, so wird ebensolange in sehr stark v e r d ü n n t e r Resorcinfuchsinlösung nach P. M a y e r (s. § 1597) vorgefärbt, dann gründlich auswaschen in dest. Wasser. Alkohol, Xylol, Balsam. 1591. Die f i b r i l l ä r e S t r u k t u r des Knorpels läßt sich am einfachsten durch Untersuchung im polarisierten Licht erkennen (vgl. W. J. S c h m i d t 24). Zu beachten ist, daß die Schnitte in diesem Fall aber nicht mit Karbol-Xylol in Ber ü h r u n g kommen dürfen. Zur färberischen Darstellung müssen die kollagenen Fibrillen zuerst durch Auflösen des sie umhüllenden Chondromucoids demaskiert werden. H a n s e n (05) fixiert zunächst gut und lange in Formol-Alkohol, behandelt die u n a u f g e k l e b t e n Schnitte d a n n 1—3 S t u n d e n lang m i t 0,5°/oiger Kalilauge, bringt nochmals einige Stunden in Formol-Alkohol, wäscht gut aus und f ä r b t mit Pikrofuchsin nach H a n s e n (s. § 709). Die Fibrillen w e r d e n dann intensiv rot gefärbt. Statt dessen kann man auch in Carnoy fixieren, die Schnitte in Trypsin verdauen und mit Azan färben. Auch die Bielschowsky-Methode liefert nach derartiger Vorbehandlung oft sehr lehrreiche Präparate.

§ 1592—1596.

Elastischer Knorpel. — Bindegewebsknorpel

369

1592. T i l l m a n n s läßt von Weichteilen gesäuberte hyaline Knorpelscheiben, z. B. aus der Patella oder den Kondylen, 3—7 Tage in einer mittelstarken Lösung von Kalium hypermanganicum oder in einer 10°/oigen Kochsalzlösung mazerieren. Die erstere wechsle man 4—6mal täglich. Die hyaline Grundsubstanz zerfällt dann in sehr feine Fibrillen, welche den Bindegewebsfibrillen gleichen. 1593. Sogenannter F e t t k n o r p e l findet sich in der Ohrmuschel von Mäusen und Ratten. Man zieht auf beiden Seiten die Haut ab und f ä r b t frisch oder nach Formolfixierung in Sudan III und Hämalaun. Einlegen in Glyzerin od. dgl. B. Elastischer Knorpel 1594. Elastischen Knorpel findet man in der Epiglottis, im Arytänoidknorpel und in der Ohrmuschel. F ü r Untersuchung im frischen Zustand sind wegen der Undurchsichtigkeit des Objektes sehr dünne Schnitte nötig, die sich am besten noch mit Hilfe des Gefriermikrotoms gewinnen lassen. In stark v e r d ü n n t e r Jodlösung f ä r b e n sich die elastischen Netze nebst etwa vorhandenen Glykogen braun. Fixierungsmethoden wie beim hyalinen Knorpel. Zur F ä r b u n g dienen die f ü r elastisches Gewebe angegebenen Methoden (s. § 1556 ff.). An gewöhnlichen Hämalaun-Eosinpräparaten sieht m a n von den F a sern n u r wenig. Molybdänhämatoxylin f ä r b t sie dagegen stark mit ( P a t z e l t 23). Nicht selten f ä r b t sich neben den Fasern auch die Knorpelgrundsubstanz m e h r oder weniger intensiv mit, wodurch die Fasern etwas verdeckt werden. Um dies zu vermeiden, empfiehlt S c h a f f e r (26) die mit s a u r e m Orcein gef ä r b t e n Schnitte (s. § 1556) f ü r k u r z e Zeit in stark alkalisch gemachten Alkohol zu bringen (5 Tropfen einer 5°/oigen Kalilauge auf 5 ccm 96%igen Alkohol); die Knorpelgrundsubstanz w i r d dadurch rasch entfärbt, so daß die Fasern und Körnchen n u n sehr scharf hervortreten. C. Bindegewebsknorpel 1595. Bindegewebsknorpel findet man in den Zwischenwirbelscheiben, in der Schambeinsymphyse, f e r n e r im Lig. teres. Man fixiert nach Bouin, Helly, Stieve, Zenker, in Formol, Formol-Alkohol od. dgl. F ä r b u n g mit Azan, Pikroblauschwarz oder einer anderen der BindegewebsfärDungen. D. Herstellung von Totalpräparaten 1596. Zur Herstellung von Übersichtspräparaten (Totalpräparaten) embryonaler Skelette oder auch ganzer Embryonen v e r f ä h r t man nach den von L u n d v a 11 (04, 06, 12 und 27) u n d S p a l t e h o l z angegebenen Methoden. V o r b e r e i t u n g : F i x i e r u n g in n e u t r a l e m Formol 1:4. Auswaschen in Wasser. Dann bei pigmentreichen Objekten Bleichen in Perhydrol (Merck) 3 ccm, Formalin 10 ccm, Wasser 90 ccm. Die Bleichung, die m a n am besten bei ca. 40° C vornimmt, dauert bei mehrmaligem Wechseln der Flüssigkeit ein bis m e h r e r e Tage. Sorgfältiges Auswaschen in Wasser und E n t f e r n e n der Luftbläschen durch ausgekochtes Wasser, evtl. u n t e r der Wasserstrahlpumpe. In seiner letzten Veröffentlichung empfiehlt L u n d v a l l (27) zur Fixierung von Knorpel- wie Knochenpräparaten folgendes Gemisch: Formol 10 ccm, 30°/oige Lösung von Oxalsäure in 95°'/oigem Alkohol 10—20 ccm, 96°/oiger Alkohol 70—80 ccm. Das Gemisch dringt gut ein und w i r k t gleichzeitig bleichend. Wenn 24

R 0 m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

370

Untersuchung des Knorpelgewebes

§ 1597.

es sich trübt, muß es e r n e u e r t werden. Man läßt die Objekte so lange im Gemisch, bis sie weiß sind. Knorpelpräparate werden direkt in 96°/oigen Alkohol übertragen. K n o c h e n p r ä p a r a t e kommen zunächst in lG/oige Ammoniaklösung (1 bis m e h r e r e Tage), d a n n ebenso lange in Formol 1 :10; hierauf gründlich auswaschen und steigender Alkohol. Sehr pigmentreiches Material wird in der Fixierungsflüssigkeit nicht vollkommen entfärbt, sondern m u ß durch Zusatz von Wasserstoffsuperoxyd zur Ammoniaklösung nachträglich noch gebleicht w e r den. F ä r b u n g : a) R e i n e K n o r p e l f ä r b u n g . 1. Einlegen in Toluidinblau-Salzsäurelösung (0,25 g Toluidinblau werden in 100 ccm 70°'/orgen Alkohols + 1 ccm Salzsäure gelöst und nach 24 Stunden filtriert). Man f ä r b t einige Tage bei 40° C. 2. Mehrtägiges E n t f ä r b e n bei 40® C in Salzsäurespiritus (0,25 ccm HCl in 100 ccm 70°/oigem Alkohol), der öfters zu wechseln ist, bis n u r m e h r der Knorpel tiefblau g e f ä r b t ist. 3. Entsäuren in mehrfach gewechseltem 96°/oigem Alkohol. 4. Abs. Alkohol. 5. Abs. Alkohol + Benzol. 6. Benzol. 7. Benzol + Benzylbenzoat (bei jungen Embryonen w i e 1 :1, bei älteren wie 2 :3, bei erwachsenem Gewebe wie 1 : 2). Neuerdings ü b e r t r ä g t L u n d v a l l die P r ä p a r a t e aus dem Benzol in eine gesättigte Lösung von Naphthalin in Benzol. Der Brechungsexponent dieser Lösung muß dann dem Gewebe entsprechend eingestellt w e r d e n u n d zwar durch Zusatz von Benzol (Senkung) oder von einer gesättigten Lösung von Naphthalin in Anisöl (Erhöhung). Statt in Toluidinblau kann man auch in Methylgrün 1 g, 70°/oiger Alkohol 1000 ccm, Eisessig 5 ccm färben. Die Differenzierung erfolgt dann in reinem 96°/oigem Alkohol. Überfärbung tritt nicht ein. Die Färbung mit Methylgrün ist nach L u n d v a l l (27) für Material vom Erwachsenen besser als die Toluidinblaumethode. R e s u l t a t : Alle knorpelhaltigen Teile sind tiefblau oder dunkelgrün gefärbt. b) F ä r b u n g v o n K n o r p e l u n d K n o c h e n . Vorbereitung wie oben. Zur F ä r b u n g bereitet man dagegen folgende h a l t b a r e Stammlösungen: A. Toluidinblau 0,1 g; 95°/oiger Alkohol 100 ccm. B. Gesättigte Lösung von Alizarinum cristallisatum (Grübler) in 95°/oigem Alkohol 10 ccm, l % i g e Essigsäure in 70°/oigem Alkohol 90 ccm. Vor Gebrauch mischt m a n Stammlösung A: 1 Teil, Stammlösung B: 4 Teile, dazu l°/oige Essigsäure in 70°'/oigem Alkohol 5 Teile. Man f ä r b t einige Tage bei 40° C, differenziert abwechselnd in s c h w a c h e s s i g s a u r e m Wasser und 70°/oigem Spiritus, bis keine Farbe m e h r abgeht. R e s u l t a t : Knochen und kalkhaltiges Gewebe rot; Knorpel blau. c) R e i n e K n o c h e n f ä r b u n g . Die am besten in oxalsaurem Formol (s. o.) fixierten und entsprechend nachbehandelten P r ä p a r a t e kommen in neutralen Alizarinalkohol (90 ccm 95°/oiger Alkohol + 5 ccm einer gesättigten Lösung von Alizarin cristall. in 95%igem Alkohol). Nach 24—48 Stunden differenzieren in reinem (oder ev. schwach essigsaurem) 95°'/oigem Alkohol, bis die Weichteile e n t f ä r b t sind; dann Weiterbehandlung wie oben. E r g e b n i s : Knochen und kalkhaltiges Gewebe rot. 1597. P- M a y e r (16) färbt zur Darstellung des Knorpels in Totalpräparaten mit einem modifizierten Resorcinfuchsin. Man erhält dieses dadurch, daß man den nach § 1561 gewonnenen. Niederschlag von Resorcinfuchsin vor dem Auflösen in Alkohol auf dem Filter sorgfältig mit dest. Wasser auswäscht und dadurch vom Überschuß an Eisenchlorid befreit. Dadurch verliert der Farbstoff die Fähigkeit das elastische Gewebe zu färben, während die Knorpelgrundsubstanz stark gefärbt wird. Nach dem Auswaschen wird der Niederschlag in salzsaurem Alkohol gelöst. Man färbt

§ 1598—1603.

Knochengewebe. — Frisches Präparat

371

bis zu mehreren Tagen und wäscht dann in 70°/oigem Alkohol aus, bis nur mehr der Knorpel gefärbt ist. 1598. K r o h n (30) erhielt an Köpfen von Tritonen nach Formolfixierung wie nach Fixierung nach Lundvall schlechte Resultate, insofern weder die Knorpel- noch die Knochenfärbung zufriedenstellend ausfiel. Sie empfiehlt statt dessen 7tägige Fixierung in 80°/oigem Alkohol, dem auf 100 ccm 4—5 ccm neutrales Formol zugesetzt ist. Anschließend bleichen in 1 Teil Perhydrol + 2 T. Wasser (neutralisiert mit Ammoniak) 3—4 Stunden oder länger. Auswaschen in Brunnen- und dest. Wasser je 1 Stunde. Dann je 24 Stunden in 70-, 80-, 88-, 96- und 100°/oigem Alkohol, Lösung AA und BB nach Spalteholz (14). 3—4 Stunden 100°/oiger Alkohol, reinstes Benzol (zur Aufbewahrung). Zur Beobachtung bringt man den Kopf in eine Mischung von 5 Teilen Wintergrünöl und 1 T. Isosafrol. Literatur zu Kap. 18: F l e s c h 80; H a n s e n 05; besonders S c h a f f e r 26 in Enzyklopädie und Handbuch. 21. KAPITEL

Knochengewebe A. Beobachtung des frischen Präparates 1599. Man v e r w e n d e t dazu feine Knochenplättchen aus dem Siebbeinlabyrinth der Maus, die Schädelknochen von jungen Tritonen. Bälkchen aus der Spongiosa u. dgl., von denen man sorgfältig die a n h a f t e n d e n Weichteile abschabt. Die Beobachtung erfolgt in indifferenter Flüssigkeit, z. B. Ringerlösung, der u n t e r Umständen etwas Methylviolett, Thionin oder Neutralrot zugesetzt wird. Knochenkanälchen wie Knochenkörperchen lassen sich auf diese Weise recht g u t untersuchen. An diesen P r ä p a r a t e n lassen sich auch sehr gut verschiedene histochemische Reaktionen wie Nachweis von Calcium, von Phosphaten, Kalium u. dgl. a u s f ü h r e n (s. W. S c h u l z e 25). Uber die Mikrotortiie des unentkalkten Knochengewebes s. V o n w i l l e r , L o w und S c h i l l i n g und § 490. 1600. Um kompakte Knochen in frischem Zustand zu beobachten, w e r d e n d ü n n e Sägeschnitte frischer Knochen auf einer rotierenden Schmirgelscheibe u n t e r stetem Zusatz von physiologischer Kochsalzlösung geschliffen. F ä r b t m a n dann* 24 Stunden in stark v e r d ü n n t e r wässeriger Chinoleinblaulösung (Zachariades), so lassen sich die rötlich gefärbten Knochenzellen mit ihren A u s l ä u f e r n ganz gut beobachten. 1601. V i t a l f ä r b u n g . Über die V i t a l f ä r b u n g des wachsenden Knochens durch V e r f ü t t e r u n g von Krapp, Alizarin od. dgl. s. § 796. Zur Untersuchung w e r d e n dünne Sägeschnitte hergestellt, die mit der Feile oder auf dem Stein zugeschliffen w e r d e n und dann entweder frisch eingeschlossen und untersucht oder rasch entwässert und in trockenen Canad'abalsam eingedeckt werden (siehe § 1666). 1602. Die Fütterung mit Alizarin ist der Krappfütterung nicht ganz gleichwertig, da im Krapp neben Alizarin auch Purpurincarboxylsäure wirksam ist, die viel stärker färbt als Alizarin ( R i c h t e r 37). 1603. Trypanblau f ä r b t bei jungen Mäusen vital Osteoblasten, Odontoblasten u n d inneren Schmelzzellen. Knochen, Dentin u n d Schmelz w e r d e n n u r in ihren unverkalkten Teilen diffus blau. ( B l o t e v o g e l 24.) Über Fixierung der Trypanblaupräparate s. § 766 u. 767. 24*

372

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1604—1608.

B. Entkalkung 1. Aligemeine Bemerkungen 1604. Um Knochengewebe schnittfähig zu machen, ist die E n t f e r n u n g der in •seine Grundsubstanz eingelagerten Kalksalze nötig; man bezeichnet diesen Proz e ß als »Entkalken«. Das betreffende Gewebe w i r d dazu mit Säuren behandelt, die die S ä u r e n der Knochensalze in Freiheit setzen. Dabei entstehen an Stelle d e r zuerst wasserunlöslichen Verbindungen alkohol- oder wasserlösliche Verbindungen, die dann durch Auswaschen leicht e n t f e r n t werden können. 1605. D e r E n t k a l k u n g h a t e i n e g u t e g r ü n d l i c h e Fixierung v o r a u s z u g e h e n . F ü r Übersichtspräparate und Fibrillendarstellung eignet sich dazu besonders Formol, f ü r zytologische Untersuchung die Flüssigkeit nach H e l l y , H e i d e n h a i n § 344 oder S t i e v e § 333. Die V e r w e n d u n g formolhaltiger Flüssigkeiten ist besonders empfehlenswert, da dann die Quellung des kollagenen Bindegewebes bei der nachfolgenden E n t k a l k u n g geringer ist. F ü r f e i n e r e Untersuchung fixiert man natürlich keine ganzen Knochen, sondern kleine herausgesägte Knochenscheiben. Zweckmäßig spannt man den Knochen z u m Sägen zwischen zwei Korkstücke in einen Schraubstock. Kleinste Stückchen können f ü r zelluläre Untersuchungen auch in Flemmingscher Flüssigkeit fixiert werden. D e l a u n a y (36) fixiert ca. 1 cm dicke Knochenscheiben für 48 Stunden im V a k u u m , wobei er bei essigsäurehaltigen Flüssigkeiten statt Essigsäure die gleiche Menge einer 5°/oigen Trichloressigsäure zusetzt. 1606. Nach der Fixierung muß die Fixierungsflüssigkeit durch Auswaschen m i t Wasser (bzw. Alkohol) gut e n t f e r n t werden, da andernfalls bei der nachfolgenden Säurebehandlung schwer lösliche Niederschläge entstehen können. Nach dem Auswaschen bringt man die P r ä p a r a t e zunächst d u r c h d i e A l k o h o l r e i h e b i s z u m 96°/o i g e n A l k o h o l und hierauf wieder zurück in Wasser. E r s t j e t z t s c h r e i t e t m a n z u r E n t k a i k u n g. Von dieser Regel weicht man n u r bei Verwendung von Fixierungsflüssigkeiten ab, die wie z. B. die Pikrinsäure oder Trichloressigsäure, gleichzeitig fixieren und entkalken. 1607. Die Entkalkung nimmt man in reichlichen Flüssigkeitsmengen vor, die täglich e r n e u e r t werden. Dabei hängt man das zu entkalkende Objekt an einem F a d e n oder in einem Porzellansieb in der oberen Flüssigkeitsschicht auf, so daß die gelösten Salze zu Boden sinken können. Die Zeitdauer der E n t k a l k u n g variiert je nach Material wie Flüssigkeit erheblich. Der richtige Grad der Entk a l k u n g ist erreicht, wenn die Objekte ganz weich geworden sind, so daß sie sich mit dem Messer ohne Knirschen und ohne starken Widerstand schneiden lassen. Das sehr beliebte P r ü f e n der Entkalkung durch Biegen oder Quetschen ist zu vermeiden, da es f ü r die feineren S t r u k t u r e n der P r ä p a r a t e schädlich ist. D u r c h häufiges U m r ü h r e n der Entkalkungsflüssigkeit, evtl. Gebrauch des Thomaschen Wasserrades, läßt sich die Zeitdauer der E n t k a l k u n g stark abkürzen. D e l a u n a y (36) nimmt die Entkalkung (in täglich zu erneuernder l°/oiger Trichloressigsäure) im V a k u u m vor. 1608. Die Beendigung der Entkalkung läßt sich auch durch P r ü f u n g d e s C a l c i u m g e h a l t e s der Entkalkungsflüssigkeit ermitteln (S h i p 1 e y). Man hängt dazu das zu prüfende Objekt in 50 ccm frische 5°/oige Salpetersäure (mit dest. Wasser zu bereiten!). Nach 12 Stunden entnimmt man ihr 5 ccm (vorher umschüt-

§ 1609—1613.

Entkalkung

373

teln!), gibt 2 Tropfen einer Methylrotlösung zu und tropft dann solange Ammoniak zu, bis die Indikatorfarbe dauernd in Gelb umschlägt. Dann setzt man noch 2 ccm einer gesätt. Ammoniumoxalatlösung zu, schüttelt um und läßt 1 Stunde stehen. Ist dann ein Niederschlag von Calciumoxalat nachzuweisen, so ist die Entkalkung noch nicht hinreichend und das Objekt muß nochmals in die Entkalkungsflüssigkeit zurück. — Die Methode ist namentlich bei der Entkalkung von in Celloidin eingebetteten Objekten von Bedeutung (s. § 1611). G o l d h a m m e r (29) empfiehlt das Fortschreiten der Entkalkung röntgenologisch zu prüfen. 1609. N a c h d e r E n t k a l k u n g m u ß d i e - S ä u r e sorgfältig a u s g e w a s c h e n w e r d e n . Dies erfolgt bei verschiedenen Entkalkungsflüssigkeiten, wie Trichloressigsäure, Pikrinsäure durch 80—90°/oigen Alkohol, bei den anorganischen Säuren durch Wasser. I n l e t z t e r e m F a l l m ü s s e n a b e r die O b j e k t e , um Q u e l l u n g e n des B i n d e g w e b e s zu v e r h i n d e r n , v o r d e m A u s w a s c h e n a u f 24 S t u n d e n i n q u e l l u n g s h i n d e r n d e F l ü s s i g k e i t e n , wie z. B. in eine 5°/oige Natriumoder Lithiumsulfatlösung e i n g e l e g t w e r d e n . 1610. Zur Einbettung ist, vor allem bei großen Stücken, in erster Linie die Celloidinmethode zu empfehlen. Doch läßt sich, zumal bei kleineren Objekten, w e n n richtig und vollständig entkalkt wurde, auch die Paraffinmethode verwenden. Zum Schneiden empfiehlt W e i d e n r e i c h (23) die keilförmigen Messer von J u n g , Nr. C, H ä r t e 2. Die Knochenschnitte werden beim Schneiden häufig stark elektrisch, eine Erscheinung, die man durch kräftiges Anhauchen der Schnittfläche b e k ä m p f e n kann. Im übrigen ist bei Knochengewebe der Geb r a u c h des Gefriermikrotoms ganz besonders anzuraten, zumal sich die Objekte auf ihm schon vor völliger E n t k a l k u n g gut schneiden lassen. 1611. Wenn durch die E n t f e r n u n g des Kalks eine Verlagerung der organischen Bestandteile zu b e f ü r c h t e n ist, so empfiehlt es sich, die Objekte vor der Entkalkung in Celloidin einzubetten, den in 80°/oigem Alkohol gehärteten Celloidinblock zur V e r d r ä n g u n g des Alkohols in Wasser zu legen und dann nach § 1613 zu entkalken ( S c h a f f e r 02). 1612. Bei der Wahl der Entkalkungksflüssigkeit hat man folgendes zu b e achten: An erster Stelle steht die E n t k a l k u n g mit S a l p e t e r s ä u r e oder s c h w e f l i g e r S ä u r e mit nachfolgender Behandlung in Natrium- oder Lithiumsulfat (§ 1613 u. 1615). Sie w i r d f ü r die meisten Fälle ausreichen. Zells t r u k t u r e n und F ä r b b a r k e i t bleiben bei richtiger A n w e n d u n g sehr gut erhalten. Auch zur Darstellung von Knochenfibrillen und Primitivröhrchen ist sie geeignet. Doch ist f ü r letztere Zwecke die klassische Methode die Entkalkung mit Kochsalz-Salzsäure nach v. E b n e r (§ 1617). Ausgezeichnete Resultate gibt auch Trichloressigsäure, die namentlich bei Formolzusatz sehr schonend entkalkt (§ 1619). J u n g e s embryonales Material wird auch in Eisessig- oder Chromsäurehaltigen Flüssigkeiten häufig hinreichend entkalkt (z. B. in Flemmingscher Flüssigkeit). 2. Entkalkungsflüssigkeiten

1613. Salpetersäure ist nach S c h a f f e r (02) in wässeriger V e r d ü n n u n g die rascheste und schonendste Entkalkungsflüssigkeit. Man wendet sie a m besten' in 5—7,5°/oiger wässeriger Lösung an. Zur Bereitung derselben füllt man 5 bis 7,5 ccm der chem- reinen konz. Salpetersäure (Acid, nitric. conc. von 1,40 spez. Gew.) in der Schüttelmensur mit dest. Wasser auf 100 ccm auf. Bei reichlicher Flüssigkeit und häufigem Umschütteln sind 0,4 g dichtesten Knochens schon in

374

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1614—1619.

10 Stunden entkalkt. Nach der Entkalkung müssen die Stücke 24 Stunden in 5°/oige Natrium- oder Lithiumsulfatlösung gehängt werden, um die Quellung des Bindegewebes zu verhindern. Dann erst wäscht man 24—48 Stunden in fließendem Wasser aus. Die Verwendung niedriger- wie höher-prozentiger Lösungen ist zu widerraten. In ersterem Fall tritt Quellung, in letzterem Schädigung der Zellstruktur ein, ohne daß die entkalkende Wirkung durch den höheren Säuregehalt wesentlich gesteigert würde. 1614. Die von verschiedenen Autoren empfohlene Alkohol- oder Phloroglucinzusätze zur Salpetersäure sind unvorteilhaft, da sie die Entkalkung vielfach nur verzögern. H a u g : Phloroglucin 1 g; Salpetersäure: 10 ccm (Vorsicht beim Lösen!), dest. Wasser 50 ccm. T h o m a : Salpetersäure 100 ccm, 96°/oiger Alkohol: 500 ccm. Formolzusalz ist unschädlich (z. B. A l e x a n d e r : Salpetersäure 70 ccm, Formol 50 ccm, dest. Wasser 1000 ccm). 1615. Schweflige Säure (gesättigte, wässerige Lösung von 5% Säuregehalt) wird zur Entkalkung ohne weitere Verdünnung benützt (vorausgehende Fixierung am besten in Formol, nicht in sublimathaltigen Lösungen). Nach der Entkalkung wird 1—2 Tage in fließendem Wasser ausgewaschen. Die schweflige Säure entkalkt rasch und gleichmäßig. Die Dauer der Entkalkung beträgt z. B. für den Humerus eines ausgewaschenen Meerschweinchens 1 bis 2 Tage, Tritonenextremitäten benötigen nur 2—4 Stunden, größere menschliche Knochen 8 Tage. Kleinere, passend fixierte und nicht länger wie 2—5 Stunden entkalkte Knochen zeigen in ihren Weichteilen die feinsten Zellstrukturen noch gut erhalten. Auch die Färbbarkeit ist wenig beeinträchtigt. 1616. Die Wirkung der von P. Z i e g l e r (99) eingeführten schwefligen Säure beruht darauf, daß das wasserunlösliche Tricalciumphosphat, das neben dem kohlensaurem Kalk die Hauptmasse der anorganischen Bestandteile des Knochens darstellt, unter dem Einfluß der schwefligen Säure in das in Wasser leicht lösliche Monocalciumphosphat umgewandelt wird. 1617. Salzsäure. Zur Darstellung der fibrillären und lamellären Struktur des Knochengewebes sowie der Primitivröhrchen eignet sich besonders die K o c h s a l z - S a l z s ä u r e l ö s u n g nach E b n e r (75). Zellstrukturen und Färbbarkeit der Kerne leiden in ihr jedoch sehr. Bei der Entkalkung verfährt man folgendermaßen: 100 ccm einer kaltgesättigten Kochsalzlösung werden mit 100 ccm Wasser verdünnt und 4 ccm offizin. Salzsäure zugesetzt (für Zähne bis zu 10 und 20 ccm). Während die zu entkalkenden Knochen in dieser Flüssigkeit verweilen, werden täglich 1—2 ccm Salzsäure zugefügt, bis die Knochen weich und leicht schneidbar sind. Sodann werden sie einige Tage mit kaltgesättigter wässeriger Kochsalzlösung ausgewaschen. Diese nimmt bald saure Reaktion an, welche durch allmähliches spurweises Zusetzen von verdünnter Ammoniaklösung wieder neutralisiert wird, und zwar so lange, bis aus dem Knochen keine Säure mehr abgeht (Prüfung mit Lakmuspapier). Die Flüssigkeit entkalkt sehr langsam, liefert aber gute Resultate. Die Färbung der in NaCl-Salzsäure entkalkten Schnitte erfolgt nach sorgfältigem Auswaschen am besten mit Gentianaviolett (s. § 1649), Karbolthionin-Pikrinsäure (s. § 1643), Anthracenblau (s. § 741) oder Gallein (s. § 1626). 1618. Salzsäure allein (offizinelle) ist zur Entkalkung für gewöhnlich nicht zu empfehlen. 1619. Tridiloressigsäure entkalkt in 5°/oiger wässeriger Lösung ziemlich rasch und fixiert gleichzeitig. Zweckmäßig setzt man 10—20°/o Formol zu. Die Entkalkung ist bei kleinen Stücken nach 1—4 Tagen gewöhnlich genügend. Ausgewaschen wird in 90—96%>igem Alkohol, auf k e i n e m F a l l i n W a s s e r , da in diesem das Bindegewebe nach dieser Vorbehandlung sehr stark quillt.

§ 1620—1625.

Färbung

375

Die Entkalkung in Trichloressig ist auch nach vorausgegangener Fixierung in Formol,. Bouinscher Flüssigkeit oder dgl. empfehlenswert. Die Färbbarkeit bleibt gut erhalten. D e l a u n a y (36) nimmt die Entkalkung in täglich zu erneuernder l°/oiger Trichlot-essigsäure im V a k u u m vor. 1620. Pikrinsäure (in konzentrierter, wässeriger Lösung) entkalkt nur sehr langsam, ist also meist nur bei embryonalen Objekten oder Knochen kleiner Tiere zu verwenden. Sie erhält Zellstrukturen wie Färbbarkeit sehr gut. Nach der Entkalkung, die einen bis mehrere Monate dauert, wird mit 70—80°/oigem Alkohol ausgewaschen (nicht mit Wasser!). Rascher wirkt P i k r i n s a l p e t e r s ä u r e (s. § 313).

1621. Auch Ameisensäure wird zur Entkalkung verwandt, da sie die Färbbarkeit n u r wenig beeinträchtigt (M u r a y a m a 37). Man verdünnt konz. Ameisensäure mit der gleichen Menge 70°/oigen Alkohols. Die Präparate müssen vorher in Formol gut durchfixiert sein. Erfolgt das Auswaschen nachher mit 70°/oigem Alkohol oder mit verdünntem Formol (1:9), so ist die Quellung des Bindegewebes nur gering. Ameisensäure wird namentlich zur Entkalkung von Zähnen empfohlen. 1622. Sehr schonend, aber auch sehr langsam ist die Entkalkung in M ü l l e r scher F l ü s s i g k e i t . Man fixiert den in Stücke zerteilten Knochen zunächst 3 Tage in Formol 1 :4 und legt ihn dann in Müllersche Flüssigkeit. Dieselbe soll alle 2 Wochen lmal (nicht öfter) erneuert werden. Der Femur einer Ratte braucht 22—30 Tage, menschliche Knochen benötigen Monate bis Jahre. Bei 37° C verläuft der Prozeß etwas rascher. Die Methode ist namentlich f ü r die Unterscheidung von verkalktem und unverkalktem Knochengewebe wertvoll, da sich ersteres mit Hämalaun-Eosin blau, letzteres rot färbt. Man verfertigt nach Auswaschen meist Gefrierschnitte oder Rasiermesserschnitte (s. insbesondere P o m m e r ) oder bettet in Celloidin ein. 3. Färbe-Methoden

a) H e r s t e l l u n g

von

Übersichtspräparaten

1623. Beim Strecken und Aufkleben knochengewebehaltiger Paraffinschnitte verfährt man nach § 547. Gefrierschnitte werden mit Hilfe eines Objektträgers in ausgebreitetem Zustand aus dem Wasser gefischt und mit einem weichen Pinsel sorgfältig von störenden Gewebefetzen befreit; dann bringt man den Objektträger wieder unter Wasser, dreht den Schnitt um und reinigt in gleicher Weise auch die andere Seite. — Empfehlenswert ist auch eine Untersuchung der ungefärbten Schnitte in 10°/oiger Kochsalzlösung oder in Glyzerin. Anschließend Umrandung nach § 815. 1624. Unaufgeklebte Knochenschnitte werden in Xylol leicht spröde und wellig, so daß sie sich beim Eindecken schlecht glätten lassen. Um das zu vermeiden, bringt man die Schnitte aus 90%igem Alkohol in Terpineol, auf dessen Oberfläche sie sich schön ausbreiten und in dem sie geschmeidig bleiben. Man kann dann nach einmaligem Wechsel entweder gleich in Terpineol oder Caedax eindecken. Auch Euparal ermöglicht das Umgehen von abs. Alkohol und Xylol (s. § 850). 16Ì5. Zur Färbung von Übersichtspräparaten ist die Anwendung von verdünntem Delafieldschem Hämatoxylin sehr zu empfehlen, in dem sich die Knochenkörperchen, Kittlinien usw. meist sehr deutlich anfärben.

376

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1626—1632.

An Präparaten, die sich infolge langdauernder Entkalkung in Salpetersäure bei gewöhnlicher Färbemethodik nicht mehr färben, ist oft noch sehr schöne Kernfärbung dadurch zu erzielen, daß man die Schnitte f ü r 5—6 Stunden oder länger bei 38—40" C in Hämalaun stehen läßt. Dann auswaschen, Eosin usw. wie gewöhnlich. 1626. Schöne Übersichtspräparate gelingen auch mit der von B e c h e r eingeführten G a 11 e i n - A 1 u m i n i u m c h 1 o r i d 1 ö s u-n g ( P e t e r s e n 26). Herstellung der Farblösung: 0,1 g Gallein wird in 100 ccm einer kochenden 5°/oigen Aluminiumchloridlösung eingetragen und 15 Minuten lang gekocht. Nach Erkalten wird auf 100 ccm aufgefüllt, filtriert und auf 1 : 5—1 :10 verdünnt. Färbedauer 12—24 Stunden. Ergebnis: Kittlinien, Knochenzellen, Kerne, elastische Fasern usw. treten deutlich hervor. 1627. In wässeriger Lösung färbt Gallein den Knochen in 24 Stunden metachromatisch bräunlichrot, während das übrige Gewebe grauviolett wird. Mit frisch hergestellter Lösung in 2°/oiger Boraxlösung (die Lösung ist nicht haltbar) werden auch die Kerne gut hervorgehoben. Die letztere Methode hat Bedeutung für die Darstellung kalkspiculahaltiger Gewebe, wenn es auf vollständige Erhaltung der Kalknadeln ankommt. 1628. In Coerulein A (in 2°/oiger Boraxlösung) färbt sich Knochengewebe intensiv grün, während alles übrige ungefärbt bleibt (Färbedauer 24 Stunden). 1629. Anthracengelb C gibt in wässeriger Lösung eine intensive Gelbfärbung des Knochengewebes (Färbedauer 24 Stunden). B e c h e r 21.

von

b) M e t h o d e n z u r d i f f e r e n t e n D a r s t e l l u n g v e r k a l k t e m und u n v e r k a l k t e m Knochengewebe

1630. Die hier einschlägigen Methoden sind in zwei Gruppen zu teilen; bei der einen geht der Untersuchung eine vollständige Entkalkung voraus (§ 1631 ff.), bei der anderen werden die Kalksalze nicht oder nur unvollständig entfernt (§ 1635). 1631. Sehr empfehlenswert ist die Färbung mit Hämalaun-Eosin nach B o c k (24). 1. Vorbedingung ist, daß die Präparate je nach ihrer Größe 8—30 Tage in Müller-Formol (1000 ccm 5°/oige Formollösung + 250 ccm Müllersche Flüssigkeit) gelegen haben. 2. Entkalkung nach v. E b n e r (s. § 1617) oder in 5°/oiger Salpetersäur (s. § 1613). 3. Entsäuerung in halbgesättigter Kochsalzlösung (3 bis 6 Tage) oder 5°/oiger Kalialaunlösung (24 Stunden). 4. Auswässern in fließendem Wasser 24—48 Stunden. 5. Entwässern und 10—14 Tage in 2°/oiges, 4—6 Tage in 4°/o Celloidin, dann einbetten. 6. 5—10« dicke Schnitte werden 12 bis 18 Stunden in Hansenscher Hämatoxylinlösung gefärbt (jedesmal frisch zubereiten: a) Hämatoxylin 1 g in 10 ccm absoluten Alkohol; b) Kalialaun 20 g in 200 ccm dest. Wasser; c) Übermangansaures Kali 1 g in 16 ccm destilliertem Wasser. Nr. a) und b) werden vereinigt, 3 ccm von Lösung c) zugesetzt und das Ganze 1 Minute gekocht. Nach Erkalten filtrieren). 7. Differenzieren der stark überfärbten Schhitte in Glyzerin, pur. + Eisessig zu gleichen Teilen 5 bis 20 Minuten oder länger. 8. Auswaschen 1 Stunde in fließendem Wasser. 9. Gegenfärbung in Eosin-Alkohol 4 :1000; 5 Minuten. Dann 96°/oiger Alkohol, abs. Alkohol, Kreosot, Canadabalsam (oder besser 96°/oiger Alkohol, Terpineol, Xylol, Caedax. R.) oder zurück in Wasser und allmähliche Glyzerineinbettung. E r g e b n i s : Die ursprünglich kalkhaltigen und unvollständig verkalkten Teile sind blau, die kalklosen rot gefärbt. 1632. Mit gewöhnlichem Alaunhämatoxylin nach B ö h m e r färbt sich an Celloidinschnitten durch rachitischen Knochen, der in Müllerscher Flüssigkeit unvoll-

§ 1633—1637.

377

Kalknachweis

ständig entkalkt ist, das verkalkte Gewebe elektiv blau. Das unverkalkte färbt sich dagegen in Böhmerschem Alaunhämatoxylin mit Zusatz von 10°/o Natriumazetat ( S t o e l t z n e r 19). Zur Herstellung des nur mehr selten gebrauchten A l a u n - H ä m a t o x y l i n s nach B ö h m e r löst man (nach S c h m o r 1) 1 g Hämatoxylin in 10 ccm 96°/oigen Alkohols und fügt dies zu 200 ccm einer 10°/oigen Kalialaunlösung. Dann läßt man 10 bis 14 Tage reifen. Die Originalangaben Böhmers sind sehr ungenau.

1633. P o m m e r fixiert zum Nachweis ehemals verkalkter Stellen in entkalkten Präparaten in Müllerscher Flüssigkeit und entkalkt nach § 1617. Gefrierschnitte davon kommen aus Wasser 12—18 Stunden in eine 0,02%>oige wässerige Methylviolettlösung (oder eine 0,04°/ooige wässerige Dahlia- oder 0,16°/ooige wässerige Safraninlösung). Man untersucht in der Farblösung oder in Glyzerin mit geringem Zusatz derselben Farbe. c) M e t h o d e n

zum

morphologischen

Kalknachweis1).

1634. E r ö s (28) bringt entparaffinierte Schnitte von beliebig entkalktem Material aus Wasser für 10—15 Minuten in eine mit Kalialaun kalt gesättigte l°/oige Lösung von Säurefuchsin. Dann nur kurz abspülen in Wasser, abtrocknen mit Filtrierpapier und differenzieren in Salzsäure-Alkohol (abs. Alkohol 97 ccm, Salzsäure [spez. Gew. 1,126] 3 ccm); Dauer 1—12 Stunden unter Kontrolle. Zuletzt auswaschen in abs. Alkohol, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Kalkhaltiges Gewebe (auch nach Entkalkung) lebhaft rot, Kerne rot, Bindegewebe und Muskelgewebe blaßrot. — Die Methode ist auch zum färberischen (nicht histochemischen) Nachweis von Kalkablagerungen in anderen Organen, z. B. in Gefäßen, Zirbeldrüse usw. geeignet. Zur differenten Darstellung von phosphorsaurem Kalk (schwarz) und kohlensaurem Kalk (rot) behandelt E r ö s die Präparate zuerst nach der Methode von K o s s a (s. § 1637) und dann nach obiger Methode.

1635. Bei der zweiten Gruppe von Methoden, die auf den Nachweis der Kalkablagerungen i m u n e n t k a l k t e n Präparat abzielen, ist zu beachten, daß alle Fixierungsflüssigkeiten mit Ausnahme des Alkohols entkalkend wirken. Auch Formol löst schon bei mehrtägiger Einwirkung infolge der sich bildenden Säure Kalksalze. Ja sogar dest.- Wasser wirkt auf Schnitte nach längerer Zeit kalklösend (vgl. auch S c h u s c i k 20). Für gewöhnlich wird man die hier einschlägigen Methoden wegen der geringen Schneidbarkeit normal entwickelten Knochens an dünnen Knochensplitterchen, z. B. Labyrinthknochen, Spongiosabälkchen u. dgl. ausführen. 1636. Phosphorsaurer Kalk löst sich bei Zusatz verdünnter Säure (z. B. 2°/oiger Salzsäure) ohne Bildung von Gasblasen auf; bei kohlensaurem Kalk treten C02-Bläschen (auf. 1637. M e t h o d e nach K o s s a (01). Fixieren in Alkohol. Gefrier- oder Paraffinschnitte von unentkalktem oder nicht ganz entkalktem Material kommen aus dest. Wasser auf 10—60 Min. bei starker Belichtung in 5°/oige Silbernitratlösung. Nach Auswaschen in dest. Wasser werden sie für einige Minuten in l°/oige Pyrogallussäurelösung übertragen. Dann abspülen in dest. Wasser und fixieren in 5°/oiger Fixiernatronlösung 3—5 Min. Sorgfältiges Auswaschen in Brunnenwasser, evtl. Nachfärben mit Carmalaun, Kernechtrot, Safranin od. dgl., Alkoholreihe, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Kalkhaltige Stellen tiefschwarz. Die Methode soll vor allem den phosphorsauren Kalk zur Darstellung bringen (siehe auch § 1638 und 1634). ])

Über den histochemischen Nachweis von Calcium s. § 1216 ff.

378

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1638—1641.

Zu beachten ist, daß auch Fettsäuren sowie Chloride, Phosphate, Sulfate und Carbonate anderer Basen mit Silber reagieren können. Ähnlich dem Silber haben auch fast alle anderen Metalle Affinität zu verkalktem Gewebe. Weiteres darüber bei S t o e l t z n e r (05). 1638. Nach Z i l l (24) ist es möglich, mittels der Kossaschen Methode zwischen kohlensaurem und zhosphorsaurem Kalk zu trennen. Bei Vorhandensein von phosphorsaurem Kalk tritt nach Aufbringen, von Silbernitrat ein leuchtend gelber Niederschlag auf, der erst allmählich durch die anwesenden Eiweißkörper reduziert und geschwärzt wird. Er läßt sich am besten unter dem Mikroskop bei auffallendem Licht beobachten. 1639. D a r s t e l l u n g u n l ö s l i c h e r K a l k s a l z e i n d e n Geweb e n n a c h G ö m ö r i (32). D i e M e t h o d e g e h t d a v o n aus, d a ß bei E i n w i r k u n g e i n e r S i l b e r s a l z l ö s u n g auf k a l k h a l t i g e s G e w e b e z w i s c h e n K a l k - u n d S i l b e r s a l z e n e i n e R e a k t i o n e i n t r i t t , in d e r e n Verlauf sich a n S t e l l e d e r Kalksalze, w e n i g s t e n s des P h o s p h a t s , die e n t s p r e c h e n d e S i l b e r v e r b i n d u n g e i n l a g e r t . Das S i l b e r salz w i r d a n s c h l i e ß e n d z u m e t a l l i s c h e m S i l b e r r e d u z i e r t u n d die Kalksalze, die an.der Reaktion nicht teilgenommen haben, durch Entkalkung entfernt. 1. Fixierung höchstens 1—2 mm dicker Stückchen in 80—96°/oigem Alkohol 2 bis 3 Tage. — 2. Auswaschen in mehrmals gewechseltem dest. Wasser 4—5 Stunden. — 3. Versilbern in l,5°/oiger Silbernitratlösung 6—10 Tage. Die. Lösung ist mehrmals zu erneuern. Das Gewebe soll höchstens ein helles Bräunlichgelb annehmen. — 4. Auswaschen 3—4 Tage lang in täglich 4—5mal gewechseltem dest. Wasser, bis das zuletzt abgegossene Waschwasser mit Salzsäure keine Trübung mehr gibt. — 5. Reduktion in einer frisch bereiteten 5°/oigen Natriumhypophosphitlösung. Vor Gebrauch werden zu 100 ccm 4—5 Tropfen einer n/10-Natronlauge zugesetzt. Dauer -4—6 Tage. Sobald sich die Lösung bräunt, ist sie zu ersetzen. Niemals darf Trübung eintreten; sie zeigt schlechtes Auswaschen in 4. an. — 6. Auswaschen in fließendem Wasser 3—4 Stunden. — 7. Fixierung in mehrmals gewechselter 3- bis 5°/oiger Fixiernatronlösung 2 Tage, — 8. Auswaschen in fließendem Wasser. Entwässern, einbetten wie gewöhnlich. Nr. 3 bis 7 m u ß u n t e r L i c h t a b s c h l u ß e r f o l g e n ! — Ergebnis: Kalk tiefschwarz. Ein Nachteil der Methode ist das geringe Eindringungsvermögen der Silberlösung, so daß oft nur die Randzone gut dargestellt ist. 1640. Z u m N a c h w e i s v o n C a l c i u m p h o s p h a t e n t a u c h t R o e h l G e f r i e r s c h n i t t e f ü r e i n i g e S e k u n d e n in eine l°/oige s a l p e t e r s a u r e L ö s u n g v o n m o l y b d ä n s a u r e m A m m o n i u m , w o b e i sich m o l y b d ä n s a u r e A m m o n i u m p h o s p h a t e b i l d e n . H i e r a u f w e r d e n die S c h n i t t e in s a l p e t e r s a u r e m W a s s e r a u s g e w a s c h e n u n d in Z i n n c h l o r ü r r e d u z i e r t , w o d u r c h die v o r h e r c a l c i u m p h o s p h a t h a l t i g e n Stellen durch Bildung von Molybdänoxyd eine intensiv blaue F a r b e annehmen. D a s ü b r i g e G e w e b e darf bei r i c h t i g e r A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n n u r b l a ß b l a u g e f ä r b t sein. 1641. D e m N a c h w e i s g e b a l l t e n P h o s p h a t s i m G e w e b e d i e n t eine v o n H e i d e r m a n n s u n d W u r m b a c h (34) a u s g e a r b e i t e t e Methode, die auf d e r E i g e n t ü m l i c h k e i t d e r U r a n y l s a l z e b e r u h t , m i t P O 4 " N i e d e r s c h l ä g e zu b i l d e n , die in E s s i g s ä u r e unlöslich, in v e r d ü n n t e n M i n e r a l s ä u r e n d a g e g e n löslich s i n d . F o r m o l f i x i e r u n g . E i n b e t t u n g in P a r a f f i n . 1. S c h n i t t e aus dest. Wasser i n l°/oiges U r a n y l s u l f a t IV2—2 S t u n d e n . — 2. A b s p ü l e n in dest. Wasser. — 3. K u r zes E i n t a u c h e n in l°/oige S a l p e t e r s ä u r e z u r E n t f e r n u n g des locker a d s o r b i e r t e n U r a n y l s . — 4. A b s p ü l e n in dest. Wasser. — 5. Ü b e r t r a g e n in 5°'/oige K a l i u m f e r r o c y a n i d l ö s u n g 20 M i n u t e n ; dabei soll n o c h k e i n e o d e r n u r g a n z s c h w a c h e R e a k t i o n einsetzen, a n d e r n f a l l s w a r die E i n w i r k u n g d e r S s l p e t e r s ä u r e zu s t a r k . — 6. A b s p ü l e n in W a s s e r . , — 7. Einstellen in 5"/oige S a l p e t e r s ä u r e 2—5 M i n u t e n , w o r i n es f a s t a u g e n b l i c k l i c h zu einer d u n k e l b r a u n e n F ä r b u n g d e r V e r k n ö c h e -

§ 1642—1645.

Knochenzellen, Knochenkanälchen

379

r u n g s z o n e n kommt. — 8. Mehrmaliges A b s p ü l e n in Wasser. — 9. G e g e n f ä r b u n g m i t Thionin 10 Min. — 10. Alkoholreihe, Xylol, Balsam. — Ergebnis: P h o s p h a t tief d u n k e l b r a u n , K n o r p e l g e w e b e p u r p u r r o t , E r y t h r o c y t e n grün, Bindegewebe blau. d) D a r s t e l l u n g der Knochenzellen Knochenkanälchen

und

1642. S e h r häufig w e r d e n die K n o c h e n k ö r p e r c h e n schon d u r c h eine k r ä f t i g e U b e r f ä r b u n g mit Delafleldschem H ä m a t o x y l i n g u t sichtbar gemacht, zumal w e n n das Material in Hellyscher Flüssigkeit fixiert w u r d e . Besonders deutlich w e r d e n sie aber d u r c h die nachfolgenden Methoden hervorgehoben. , 1643. T h i o n i n - P i k r i n s ä u r e m e t h o d e v o n S c h m o ' r l . Fixier u n g am besten in M ü l l e r - F o r m o l oder n u r Formol; S u b l i m a t ist zu vermeiden. E n t k a l k u n g in Müllerscher Lösung mit 3°/oigem Salpetersäurezusatz, in 5°/oiger S a l p e t e r s ä u r e oder nach v. E b n e r . G e f r i e r - oder Celloidinschnitte k o m m e n zunächst 10 M i n u t e n in Wasser u n d w e r d e n d a n n e n t w e d e r in K a r b o l t h i o n i n nach Nicolle (Karbolwasser 100 ccm + 10 cmm einer gesätt. Thioninlösung i n 50°/oigem Alkohol) oder in T h i o n i n l ö s u n g (1 Teil gesätt. Thioninlösung in 50°/oigem Alkohol + 10 Teile dest. Wasser) 10 Min. l a n g g e f ä r b t . D a n n Abspülen in Wasser u n d Ü b e r t r a g e n in gesättigte wässerige P i k r i n s ä u r e l ö s u n g f ü r V2—1 Minute; nach n e u e r l i c h e m Abspülen differenziert m a n in 70°/oigem Alkohol, b i s keine F a r b w o l k e n m e h r abgehen (etwa 5—10 Minuten). 96°/oiger Alkohol, Karbolxylol, Xylol, Balsam. Wenn die F ä r b u n g nicht r e c h t gelingen will, setzt m a n z u m Thionin 1—2 T r o p f e n A m m o n i a k . Ergebnis: Knochenhöhlen d u n k e l b r a u n auf h e l l b r a u n e m G r u n d e . Zellen rot. 1644. T h i o n i n - P h o s p h o r w o l f r a m - M e t h o d e v o n S c h m o r l (»panoptische K n o c h e n f ä r b u n g « ) . Man fixiert d ü n n e Knochenscheiben in F o r mol, h ä r t e t 5—8 Wochen in Müllerscher Flüssigkeit u n d e n t k a l k t in dieser, in S a l p e t e r s ä u r e oder nach E b n e r . G e f r i e r - oder Celloidinschnitte (nicht ü b e r 10ju Dicke) f ä r b t man' in der in § 1643 angegebenen Thioninlösung mit Zusatz von A m m o n i a k 3 Minuten. Nach Abspülen mit Wasser ü b e r t r ä g t m a n f ü r 1—2 Min. in 70°/oigen Alkohol, spült k u r z in dest. Wasser ab u n d differenziert k u r z e Zeit m i t gesätt. P h o s p h o r m o l y b d ä n - oder besser P h o s p h o r w o l f r a m s ä u r e (da die Säur e n Metall angreifen, a r b e i t e m a n n u r m i t Glasinstrumenten). Sodann wäscht m a n aus, bis die Schnitte hellblau w e r d e n (etwa 5—10 Minuten), fixiert in einer z u r H ä l f t e mit Wasser v e r d ü n n t e n Formollösung 1—2 S t u n d e n oder i n einer v e r d ü n n t e n A m m o n i a k l ö s u n g (1 :10) 5 M i n u t e n u n d ü b e r t r ä g t direkt in 90%>igen Alkohol, d e n m a n einmal wechselt. Karbolxylol, Xylol, Balsam. Ist die G r u n d s u b s t a n z zu d u n k e l geraten, so schiebt m a n nach dem 90°/oigen Alkohol l°/oigen salzsauren Spiritus ein u n d w ä s c h t d a n n gründlich mit Wasser aus. Ergebnis: K n o c h e n h ö h l e n u n d deren A u s l ä u f e r intensiv blauschwarz, Protop l a s m a u n d K e r n e diffus blau, G r u n d s u b s t a n z hellblau bis rötlich u n d p u r p u r r o t (bei M ü l l e r - P r ä p a r a t e n ) . Die Lamellengrenzen u n d Kittlinien sind deutlich zu erkennen. 1645. S e h r e m p f e h l e n s w e r t ist die D a r s t e l l u n g d e r K n o c h e n z e l l e n im Schliff nach der M e t h o d e von R u p p r i c h t (13, 31). M a n legt dazu das f r i s c h entnommene, d ü n n e K n o c h e n s t ü c k c h e n (Splitter, f e i n e Sägeschnitte) in g u t verschlossenen Schälchen in gesättigte Lösungen von Fuchsin (nicht Säurefuchsin!). R u p p r i c h t b e g i n n t mit einer gesättigten Lösung des Farbstoffes in öC/oigem Alkohol u n d f ü h r t ü b e r solche i n 60-, 70-, 80-, 90- u n d 96°/oigem Alkohol bis z u m absoluten Alkohol (Dauer der E i n w i r k u n g j e 1 Tag.) K r o m -

380

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1646—1649.

p e c h e r (37) v e r w e n d e t m i t gleichem E r f o l g n u r 3 g e s ä t t i g t e Lösungen, n ä m lich in 50-, 96°/oigem u n d a b s o l u t e m A l k o h o l ( D a u e r je 2—3 Tage). A u s d e r F a r b l ö s u n g in a b s o l u t e m A l k o h o l w e r d e n die S t ü c k c h e n d i r e k t in Xylol ü b e r t r a g e n , w o r i n sie d a n n o h n e S c h ä d i g u n g l ä n g e r e Zeit v e r w e i l e n k ö n n e n . N a c h d i e s e r V o r b e h a n d l u n g w e r d e n die S t ü c k c h e n u n t e r s t e t e r B e n e t z u n g mit X y l o l auf S c h l e i f s t e i n e n o d e r M a t t s c h e i b e n v e r s c h i e d e n e r K ö r n i g k e i t u n t e r Zusatz v o n f e i n s t p u l v e r i s i e r t e m Bimsstein (s. a u c h § 1658) zu d ü n n e n L a m e l l e n zugeschliffen. B e i m S c h l e i f e n w i e b e i d e r mikroskopischen K o n t r o l l e i s t p e i n l i c h s t d a r a u f z u a c h t e n , d a ß..d e r S c h l i f f n i e m a l s a u s t r o c k n e t . Der f e r t i g e Schliff w i r d schließlich in m e h r m a l s g e w e c h s e l t e m Xylol s o r g f ä l t i g abgespült, ev. m i t e i n e m P r ä p a r i e r f e d e r c h e n (s. § 132) a b g e p i n s e l t u n d in C a e d a x eingedeckt. E r g e b n i s : D i e K n o c h e n zellen t r e t e n o h n e e r k e n n b a r e S c h r u m p f u n g m i t all i h r e n F o r t s ä t z e n l e u c h t e n d r o t auf u n g e f ä r b t e m U n t e r g r u n d h e r v o r . K e r n e s c h w a r z r o t . Die M e t h o d e gibt ausgezeichnete R e s u l t a t e . U m e i n e v o l l s t ä n d i g e D u r c h f ä r b u n g z u e r r e i c h e n ist es wichtig, d a ß die K n o c h e n s t ü c k c h e n n i c h t zu dick sind. D a s P e r i o s t ist v o r d e m Einlegen in die F a r b l ö s u n g a b z u s c h a b e n . W i c h t i g ist, d a ß das P r ä p a r a t h i n r e i c h e n d d ü n n z u g e s c h l i f f e n w i r d , da in d i c k e n S c h l i f f e n die F o r t s ä t z e d e r K n o c h e n z e l l e n i n f o l g e Ü b e r l a g e r u n g n u r u n d e u t l i c h zu e r k e n n e n sind. Zur Herstellung der gesättigten Farblösung benötigt man für 100 ccm 50°/oigen Alkohol 7—8 g Fuchsin, für 100 ccm 96°/oigen Alkohol etwa 2 g, für den absoluten Alkohol etwa 1,5 g. Die zur Färbung benötigte Menge der Farblösung wird dekantiert. Sie kann nach Gebrauch wieder in die Vorratsflasche zurückgegossen werden. Die Methode läßt sich auch für andere Hartsubstanzen, wie Zahngewebe oder Geweih, verwenden. Für formolflxiertes Knochengewebe empfiehlt B ü s i n g (39) gesättigte Fuchsinlösungen in Methanol. Im allgemeinen ist jedoch die Verwendung von frischem unfixiertem Gewebe vorzuziehen. 1646. Die G r e n z s c h e i d e n t r e t e n a n S c h n i t t e n d u r c h f o r m o l f i x i e r t e u n d i n S a l p e t e r s ä u r e e n t k a l k t e n K n o c h e n n a c h 2 4 s t ü n d i g e r F ä r b u n g in v e r d ü n n t e m Delafieldschem Hämatoxylin recht deutlich hervor. 1647. Z u r I s o l i e r u n g d e r G r e n z s c h e i d e n u n d K n o c h e n k ö r p e r c h e n b e d e c k t m a n ein d ü i i n e s K n o c h e n s t ü c k c h e n m i t e i n e m T r o p f e n S a l p e t e r s ä u r e u n d G l y z e r i n u n d legt ein D e c k g l a s auf. Nach 24 S t u n d e n lassen sie sich d a n n d u r c h D r u c k auf d a s D e c k g l a s leicht isolieren. e) D a r s t e l l u n g

der

fibrillären

Struktur

1648. Die fibrilläre S t r u k t u r des K n o c h e n s l ä ß t sich a n G e f r i e r s c h n i t t e n v o n M a t e r i a l , das i n S a l p e t e r s ä u r e oder in S a l z s ä u r e e n t k a l k t ist, schon in u n g e f ä r b t e m Z u s t a n d s e h r schön b e o b a c h t e n . Z w e c k m ä ß i g schließt m a n die S c h n i t t e d a z u in ein s c h w a c h l i c h t b r e c h e n d e s M e d i u m ein (z. B. i n g e s ä t t i g t e w ä s s e r i g e L ö s u n g v o n K a l i u m a c e t a t (nD = 1,370), 10°/oige Kochsalzlösung, 5°/oige C h l o r a l h y d r a t l ö s u n g o d e r dgl.). V o n b e s o n d e r e r B e d e u t u n g f ü r den Einblick in d e n fibrillären A u f b a u ist die U n t e r s u c h u n g i m p o l a r i s i e r t e n Licht. Schnitte, die i n p o l a r i s i e r t e m L i c h t u n t e r s u c h t w e r d e n sollen, d ü r f e n n i c h t in K a r b o l x y l o l e n t wässert werden. 1649. Z u r f ä r b e r i s c h e n D a r s t e l l u n g d e r l a m e l l ö s e n w i e f i b r i l l ä r e n S t r u k t u r e n d e s K n o c h e n s e m p f i e h l t W e i d e n r e i c h (23) als b e s t e M e t h o d e die W e i g e r t s c h e F i b r i n f ä r b u n g m i t A n i l i n w a s s e r - G e n t i a n a v i o l e t t , d i e bis z u r D i f f e r e n z i e r u n g in d e r in § 1424 g e s c h i l d e r t e n Weise a u s g e f ü h r t w i r d ,

§ 1650—1654.

Fibrillare Struktur — Knochenentwicklung

381

also 1. Färben in Anilinwasser-Gentianaviolett, 5—10 Minuten. — 2. Abtropfen •der Farblösung, Abtrocknen mit Filtrierpapier. — 3. Jodjodkalilösung, 5 bis 10 Minuten. — 4. Abtrocknen. — 5. Differenzieren in Anilinöl-Xyiol. Dieser Vorgang erheischt bei den Fibrillenpräparaten ganz besondere Sorgfalt. Man differenziert zunächst in Anilinöl: Xylol = 1 :3. Geht die Differenzierung zu langsam, dann nimmt man eine Mischung von 1 : 2 oder 1 : 1 ; bei dicken Schnitten muß man schließlich unter Umständen sogar in reinem Anilinöl differenzieren. Man zieht die Farbe unter mikroskopischer Kontrolle so lange aus, bis keine Farbwolken mehr abgehen und die Fibrillen auf der möglichst farblosen Grundsubstanz scharf hervortreten. Hierauf sorgfältiges Auswaschen des Anilinöles mit Xylol. Balsam. Darstellung der Kerne durch Vorfärben mit Carmalaun. Sehr güt gelingt die Darstellung der Fibrillen an sehr dünnen formolfixierten, entkalkten Schnitten auch mit Hilfe der Bielschowskyschen Silbermethode und ihrer Modifikationen (s. § 1525 ff.). Die zur Färbung des kollagenen Bindegewebes angegebenen Methoden sind gleichfalls mit Vorteil zu verwenden. Auch die S h a r p e y s c h e n F a s e r n treten bei all diesen Methoden sehr deutlich hervor. 1650. Eine I s o l i e r u n g d e r L a m e l l e n gelingt bei entkalkten Knochen durch Kochen mit Wasser. Die Lamellen lassen sich dann leicht abschälen. f) U n t e r s u c h u n g des sich e n t w i c k e l n d e n wachsenden Knochens

und

1651. Zum Studium der O s s i f i k a t i o n fixiere man vor allem Röhrenknochen embryonaler Säugetiere (z. B. von Kaninchen) in Helly- oder Bouinscher Flüssigkeit, Trichloressigsäure-Gemischen oder dgl. Man entkalkt in Salpetersäure, schwefliger Säure oder Trichloressigsäure. Für cytologische Untersuchungen fixiere man kleine Stückchen in Flemmingscher Flüssigkeit. Neben Längsschnitten untersuche man auch Querschnitte. Übersichtspräparate färbt man mit Hämalaun-Eosin, Azan u. dgl. Zur gleichzeitigen differenten Darstellung unverkalkter und verkalkter Stellen verfährt man nach § 1631. Schöne Kontraste zwischen Knorpel und neugebildetem Knochen geben die in § 1585 und 1586 angegebenen Färbungen. Uber die Färbung des wachsenden Knochens mit Krapp usw. s. § 1601. 1652. Sehr empfehlenswert ist ferner die von S c h a f f e r (26) angegebene Doppelfärbung mit Hämatoxylin-Kongorot. Fixierung in Müller, Müller-Formol oder nach Helly. Entkalkung in Salpetersäure. Vorfärbung mit Delafieldschem Hämatoxylin. Auswaschen. Nachfärbung mit wässeriger Kongorotlösung (1:300), direktes Übertragen in 95%>igen Alkohol. Ergebnis: neugebildeter Knochen ziegelrot, verkalkter blaßrot, Knorpel und Kerne blau. 1653. v. K o r f f färbt Schnitte von jungen Knochen (und Zähnen) nach Fixierung in chromhaltigen Flüssigkeiten (z. B. Zenker) in Rubin S 2 g, Orange G 1 g; Glyzerin 7 ccm; dest. Wasser ad 100. Färbung V2 Minute. Differenzieren in 95°/oigem Alkohol. Resultat: Osteoblasten, Knochenzellen (und Odontoblasten) orange, ebenso ihre Ausläufer; Fibrillen der unverkalkten Grundsubstanz rot, verkalkt gewesene Stellen orange oder gelb. 1654. v. V o l k m a n n (29) färbt Ossifikationspräparate mit Eisenhämatoxylin nach Heidenhain (Beize und Färbung je 4—6 Stunden) und differenziert statt in Eisenalaunlösung in einer 5°/oigen wäßrigen Lösung von Phosphorwolframsäure, in der Knorpelgrundsubstanz und kollagenes Gewebe eine rote Färbung

382

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1655—1660.

annehmen, w ä h r e n d die K e r n e schwarz bleiben. Nach hinreichender Differenzierung (und zwar schon v o r Erreichen der gewünschten Intensität) wird nicht in Wasser, das das Rot zerstört, sondern direkt in abs. Alkohol übertragen, d e r mehrmals z u wechseln ist. Xylol. Balsam. 1655. T o t a l p r ä p a r a t e z u r U n t e r s u c h u n g d e r Knochene n t w i c k l u n g werden am besten nach den in § 1596—1598 angegebenen Methoden hergestellt. 1656. P. M a y e r (16) löst zur Färbung der Knochen in Totalpräparaten 1 g Borax in 100 ccm 35°/oigen Alkohols und setzt dazu so viel einer 3°/oigen Lösung von Carminsäure in 90°/oigem Alkohol, daß die Flüssigkeit sehr hellviolett wird. Darin färbt man formolfixierte, mit Wasserstoffsuperoxyd gebleichte Objekte. 1657. Bei einer älteren, von O. S c h u l t z e (96) angegebenen Methode werden die Embryonen mindestens 8 Tage in Alkohol fixiert (Säuregemische sind zu vermeiden) und dann solange in 3—5°/oige Kalilauge gelegt, bis sie durchsichtig sind. Bei größeren Embryonen müssen Gehirn, Brust- und Baucheingeweide entfernt werden. Nach dem Durchsichtigwerden überträgt man die Präparate zur Konservierung in ein Gemisch aus 100 ccm dest. Wasser, 30 ccm Glyzerin und 2 ccm Formol. C. Die Herstellung und Untersuchung von Knochenschliffen 1658. Zur Herstellung von K n o c h e n s c h l i f f e n w ä h l e man gut mazerierte, völlig entfettete Knochen, da bei diesen durch Fäulnis wie Austrocknung die organische Substanz aus den Hohlräumen e n t f e r n t und durch L u f t ersetzt ist. Dadurch werden dann auch die feinsten Kanälchen (Primitivröhrchen) gut sichtbar. Zur Vorbereitung läßt m a n frische, nicht getrocknete Knochen nach Ablösung der Weichteile einige Wochen bis Monate in Wasser an einem w a r m e n Ort faulen, b ü r s t e t sie m e h r m a l s kräftig ab und läßt sie an der L u f t trocknen. Hierauf werden sie noch m e h r e r e Tage zur völligen E n t f e t t u n g in Benzin oder Trichoräthylen extrahiert. Nach Trocknen der schließlich weiß aussehenden Knochen stellt man sich mit einer feinen Metallaubsäge (sog. Uhrmachersäge) d ü n n e Sägeschnitte her, wobei man das Knochenstück a m besten in einen Schraubstock einspannt. Derartige Schnitte schleift W e i d e n r e i c h (23) auf einer mattierten Glasscheibe mit fein pulverisiertem Bimsstein, der f ü r das grobe Schleifen mit wenig, f ü r das nachfolgende feine mit viel Wasser a n g e r ü h r t wird. Der Schliff wird dabei mit einem breiten, ebenen Kork festgehalten. Die genügend feinen Schliffe w e r den dann mit reichlichem Wasser auf einer leicht m a t t i e r t e n Glasscheibe ohne Bimsstein weiterbehandelt u n d zuletzt auf einem guten Abziehstein poliert. Schließlich spült m a n den Schliff unter Zuhilfenahme eines Borstenpinsels gut in dest. Wasser vom Schleifstaub u. dgl. ab, entwässert in abs. Alkohol, b r i n g t in Benzol und läßt das dünne Knochenplättchen an der L u f t trocknen. Die Hauptschwierigkeit beim Schleifen besteht darin, das Zerbrechen des Knochenplättchens, das natürlich um so leichter erfolgt, je dünner und schöner der Schliff wird, zu vermeiden. 1659. W e n i g e r l e i c h t s p l i t t e r n n i c h t m a z e r i e r t e , i n F o r m o l f i x i e r t e K n o c h e n s t ü c k c h e n , die man nach Abspülen in Wasser wie oben in dünne Scheiben zersägt und unaufgeklebt schleift. Nach dem Schleifen wäscht man gut aus u n d behandelt dann wie bei einem Schnittpräpar a t ohne Austrocknenlassen weiter. 1660. Bei sehr locker gebautem Material ist es oft zweckmäßig, das Knochenscheibchen u n t e r Vermeiden von Luftblasen mit etwas festem, durch Erhitzen

§ 1661—1666.

Knochenschliffe

383

geschmolzenen Canadabalsam auf ein ebenes Hartholzklötzchen oder • einen Glasblock zu kitten. Wenn die eine Seite ganz glatt geschliffen ist, löst man die Verkittung mit Benzol, kittet dann die geschliffene Seite auf und schleift vorsichtig weiter, bis der Schliff ganz dünn geworden ist. Dann löst m a n wieder ab und poliert beide Flächen unter stetem Ändern der Schleifrichtung auf einem feinkörnigen Schleifstein (Arkansastein) oder einer mattierten Glasplatte, wobei man ab und zu unter dem Mikroskop die Brauchbarkeit kontrolliert. Ist das Knochenstück nicht genügend fest aufgekittet, was man bei Verwendung eines Glasklotzes an den glänzenden Luftblasen zwischen Schliff und Unterlage erkennt, so pflegt der Schliff, gerade wenn er anfängt brauchbar zu werden, zu zerbrechen. Derartig aufgeklebte Schliffe müssen zuletzt natürlich ganz besonders sorgfältig mit Benzol behandelt werden, um den in die Knochenröhrchen eingedrungenen Canadabalsam wieder zu lösen. 1661. Recht empfehlenswert ist es, die auf gekitteten Knochensch eibchen zuerst mit groben und feinen Feilen dünn zu feilen und erst zuletzt glatt zu schleifen. Man k a n n dadurch Zeit und Mühe sparen. Rascher als auf dem Schleifstein usw. geht das Schleifen bei Benützung einer horizontalstehenden, durch Elektromotor getriebenen Schleifscheibe aus verschieden fein gekörntem Karborund. Während des Schleifens muß aber ständig Wasser aufgeträufelt werden, um einer zu starken Erhitzung des Schliffes, den man mit einem Kork anpreßt, vorzubeugen. 1662. Von verschiedenen Firmen werden eigene Schneide- und Schleifapparate geliefert, mit deren Hilfe die Herstellung von Schliffen natürlich sehr erleichtert wird. Eine Maschine, die sich auch zur Anfertigung von Serienschliffen eignet, findet man bei B ö d e c k e r (22) beschrieben. 1663. Betrachtet man den Schliff in Wasser, so sieht m a n in der ersten Zeit sehr deutliche, schwarzgefärbte, mit L u f t gefüllte K n o c h e n k ö r p e r c h e n und P r i m i t i v r ö h r c h e n . Erst allmählich dringt Wasser an Stelle der austretenden L u f t ein. Auf dieser Tatsache b e r u h t die einfachste Darstellung der Primitivröhrchen und Knochenkörperchen durch Einschluß des lufthaltigen Schliffes. 1664. Sowohl bei der Untersuchung von Knochen wie von Zahnschliffen kann die Betrachtung mit dem O p a k i l l u m i n a t o r von Vorteil sein, zumal es dabei genügt, n u r e i n e Seite des zu untersuchenden Objektes anzuschleifen u n d sorgfältig zu polieren. Das ist insbesondere bei sehr brüchigen wie auch bei wertvollen Objekten oft von Bedeutung. Über die Technik der Untersuchung vgl. W. J. S c h m i d t (21), f ü r Zähne F r i e d e b e r g (22). 1665. Ganz besondere Bedeutung kommt der Untersuchung im polarisierten Lichte zu, die über die Verlaufsrichtung der Fibrillenbündel und Lamellensysteme sehr wertvolle Aufschlüsse gibt (vgl. S c h a f f e r 22, S. 100 ff. und S. 103 ff.; f e r n e r das Lehrbuch von W. J . S c h m i d t 24). 1666. E i n s c h l u ß d e s l u f t h a l t i g e n S c h l i f f e s . Man e r w ä r m t dazu ein Stückchen festen, auf dem Objektträger liegenden Canadabalsams vorsichtig über eine Flamme, bis es flüssig wird; entstehende Luftblasen n i m m t m a n mit eirrer heißen Nadel weg. Nun legt m a n den vorher lufttrocken gemachten, weißgewordenen Schliff auf den flüssigen Canadabalsam und bedeckt rasch mit einem e r w ä r m t e n Deckgläschen. Dabei h a t man darauf zu achten, daß besonders auch der R a u m zwischen Schliff u n d Deckgläschen mit Canadabalsam gefüllt wird, was man eventuell durch Drücken mit der Nadel auf das Deck-

384

Untersuchung des Knochengewebes

§ 1667—1671.

glas oder Nachwärmen erreichen kann. Der Canadabalsam erstarrt in der kürzesten Zeit, und es bleibt die Luft in den Knochenräumen gefangen. Die Prozedur gelingt nur, wenn man rasch arbeitet. Das Ergebnis ist eine Darstellung der Knochenkörperchenhöhlen und der sie verbindenden Prynitivröhrchen. Auch an S c h n i t t e n durch entkalkte Knochen gewinnt man durch E i n t r o c k n e n , wenn auch nur im Bereich kleiner Bezirke, mit Luft gefüllte Primitivröhrchen und Knochenkörperchen, die man auf dieselbe Weise dauernd einschließen kann. F1 e m m i n g (86).

1667. Zur H e r s t e l l u n g k o l l a g e n f r e i e r S c h l i f f e empfiehlt S c h m i d t (32) gewöhnliche dünne Knochenschliffe 3—5 Min. lang in Glyzerinkalilauge (90 mg Kaliumhydroxyd auf 3—4 ccm Glyzerin) zu kochen. Dabei setzt auf der Oberfläche des Schliffes ein heftiges Sieden ein, gleichzeitig wird er gelblich, dann rein weiß. Anschließend wird er zur Entfernung der Glyzerinkalilauge in dest. Wasser ausgekocht. Hierauf Entwässern, Xylol, Trocknen an der Luft, Einschluß in Balsam nach § 1666. Die ehemals von den kollagenen Fasern eingenommenen Räume sind mit Luft gefüllt. Die kollagenfreien Schliffe zeigen den entgegengesetzten optischen Charakter wie kollagenhaltige. 1668. Sehr schöne Präparate gewinnt man dadurch, daß man die Knochenkörperchen mit Primitivröhrchen an mazerierten, getrockneten Schliffen oder Schnitten mit einem Farbstoff füllt. R a n v i e r (75) brachte dazu die Schliffe in alkoholische Anilinblaulösung und dampfte diese langsam ein. Empfehlenswerter ist es, die Schliffe in ein kleines etwa 5 ccm fassendes Kristallisierschälchen zu legen, das mit 20°/oiger wässeriger Säurefuchsinlösung gefüllt ist, und dieses in einen mit der Wasserstrahlpumpe verbundenen Exsikkator zu stellen. Dann wird eine Stunde lang evakuiert und der Exsikkator geschlossen. Wenn die Lösung dann nach 24 Stunden eingetrocknet ist, werden die Präparate herausgenommen und der aufliegende Farbniederschlag auf einem feinen Karborundstein abgeschliffen. Sodann werden sie auf einem feinen Schleifstein poliert, in absol. Alkohol entwässert und durch Xylol wie gewöhnliche Schnitte in flüssigem Balsam eingedeckt. 1669. Zur gleichzeitigen Darstellung von F i b r i l l e n (braun), P r i m i t i v r ö h r c h e n und L a k u n e n (schwarz) empfiehlt S c h a f f e r (26) die Sublimat-Schwefelammonium-Methode von C o l q u h o u n und F u r r e r. Dünne Sägeschnitte von mazerierten Knochen kommen f ü r einige Tage in gesättigte wäßrige Sublimatlösung, zuerst im Brutofen, dann unter der Luftpumpe im Vakuum. Dann übertragen direkt in frisch bereitetes Schwefelammonium, wo sie im Laufe einiger Tage tief schwarz werden müssen. Zuletzt werden die Plättchen so dünn als möglich geschliffen, getrocknet und in erwärmten Balsam eingeschlossen. 1670. D a r s t e l l u n g d e r K n o c h e n k a n ä l c h e n d u r c h K o r r o s i o n . T e h v e r (36) füllt die Knochenkanälchen gut mazerierter Knochen mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe mit 10—15°/oiger Celluloidlösung in Aceton. Nach Trocknen wird zuerst die Kalksubstanz mit Ebnerscher Flüssigkeit und schließlich mit konz. Salzsäure die ganze Knochensubstanz entfernt. Einzelheiten s. Original. Uber Darstellung von Knochen durch Mazeration s. § 869a. 1671. Will man die Hart- und Weichteile im Zusammenhange untersuchen, ohne die Entkalkung vorher vorzunehmen, so bediene man sich der von v. K o c h (78) mit großem Erfolge bei seinen Korallenuntersuchungen angewandten Versteinerungsmethode. Diese wurde von W e i l für die Herstellung der Zahnschliffe mit Erhaltung der Weichteile angewandt. Zähne oder Knochen werden, nachdem durch geeignetes Absprengen der Zugang zu den Weichteilen gesichert ist, fixiert und nach den allgemeinen Regeln bis zur eventuellen Stückfärbung inkl. behandelt.

§ 1672—1674.

Zahngewebe

385

Dann werden sie durch absoluten Alkohol und Terpentinöl, resp. Chloroform, in eine Mischung von Canadabalsam und Terpentinöl, bzw. Chloroform, übertragen. Durch allmähliches Verdunsten des Chloroforms, bzw. Eindicken des Terpentinöls, zumal bei einer hohen Temperatur, was unter Umständen mehrere Wochen in Anspruch nimmt, wird der den Zahn imprägnierende Canadabalsam, steinhart. R ö s e (92) empfiehlt, die Präparate im Wärmeofen bei 50° C trocknen zu lassen, wozu etwa 3—4 Monate nötig sind. Man kann, ohne Schrumpfung befürchten zu müssen, am Schlüsse etwas rascher eindampfen, nur muß man bei Beginn des Eindampfens möglichst geringe Temperaturgrade wählen. Dann kann das Ganze nach denselben Regeln geschliffen werden wie die Hartgebilde allein. 1672. Über die Trennung tierischer Skelettsubstanzen ( K e r a t i n , S c i n t i l l i n , Z e l l u l o s e , T u n i c i n , S p o n g i o 1 i n , Ch i t i n , Co n ch i o I i n , C o r n e i n) vgl. P. S c h u l z e und G. K u n i k e (23). Schrifttum: Eine ausgezeichnete, eingehende Darstellung der Untersuchungsmethoden für Knochen und Zähne bei S c h a f f e r (26). Angaben über die Untersuchung des Knochengewebes der Fische bei T r e t j a k o f f u. C h i n k u s (27).

22. KAPITEL

Zahngewebe 1673. Die Untersuchung der Zähne findet ähnlich wie beim Knochen im allgemeinen an entkalkten Schnittpräparaten oder an nicht entkalkten Schliffen statt. Für die Herstellung der Präparate gelten daher die gleichen Regeln, die im vorhergehenden Kapitel über Knochenpräparate gegeben wurden; auch hier ist es oft vorteilhaft, das Schleifen nicht an mazeriertem, getrocknetem, sondern an formolfixiertem, feuchtem Material vorzunehmen. Bei Anfertigung von Schnittpräparaten hat man bei feineren Untersuchungen auf Verwendung frisch fixierten Materials zu achten. Zähne von Sektionsleichen, die erst 1—2 Tage nach dem Tode fixiert werden, sind dafür unbrauchbar. Von den Tieren ist als Untersuchungsobjekt besonders der Hund zu empfehlen. Man fixiert für Gefrierschnitte in Formol 1 :4, möglichst unter Eröffnung der Pulpahöhle. (Anschleifen des Zahnes von der Seite her bis die Pulpahöhle durchscheint oder Anbohren von der Krone her.) Für feinere Untersuchungen ist das Sublimatgemisch von Stieve (§ 333) zu empfehlen, das sehr gut eindringt. Am vollkommensten erfolgt die Fixierung durch Injektion von der art. carot. commun. aus. 1674. Die Entkalkung der Zähne darf, wenn man von der spärlichen organischen Grundsubstanz des Schmelzes noch etwas vorfinden will, erst n a c h Einbettung in Celloidin vorgenommen werden. Dentin und Zement bleiben auch bei Entkalkung uneingebetteter Stücke hinreichend erhalten. B u r k e t bettet dazu die nicht entkalkten ¡Zähne in üblicher Weise in 8°/oiges Celloidin ein, härtet in Chloroform, schneidet das Celloidin bis auf eine schmale Zone weg und legt für 24 Stunden in wasserfreien Isopropylalkohol, der Celloidin nicht löst. Dann über 95°/o Isopropyl- und 80- und 60°/oigen Äthylalkohol für 24 Stunden in Brunnenwasser. Erst jetzt wird der Block in 7,5°/oige Salpetersäure gehängt. Das Fortschreiten der Entkalkung wird nach § 1608 geprüft. Die entkalkten Blöcke kommen für 24 Stunden in 5°/oige Natriumsulfatlösung, hierauf ebensolange in fließendes Wasser. Dann zurückführen über 60- und 80°/oigen Alkohol in 95- und 100°/oigen Isopropylalkohol. Die entwässerten Blöcke kommen dann in kleine Schälchen, die mit 6°/oigem Celloidin gefüllt sind, um die vom aufgelösten Schmelz entstandenen Lücken auszufüllen. Dann Härten in Chloroform 25

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

386

Zahngewebe

§ 1675—1684.

wie gewöhnlich. Zur Einbettung in Paraffin werden sie schließlich für 24 Stunden in 4mal gewechseltes Benzol gebracht, bis sie durchscheinend sind. Dann für 24 Stunden in Paraffin von 40—42° C. Dann in gleiches Paraffin mit Zusatz von Lorbeerwachs (s. § 429). Die eingebetteten Blöcke werden im Eisschrank aufbewahrt. 1675. Um die Feinheiten der Schmelzüberreste zu erhalten, entkalkt B u r k e t die Celloidinblöcke in 7°/oiger Essigsäure. Auch Ameisensäure (s. § 1621) wird zur Entkalkung der Zähne empfohlen. 1676. Das Durchsägen des Zahnes zur Herstellung von Schliffen erfolgt am besten mit einer elektrisch betriebenen Stahlkreissäge. Mit der Handsäge ist es eine sehr mühselige Arbeit. 1677. U n t e r s u c h u n g d e s Schmelzes. Die Untersuchung der Schmelzprismen erfolgt am besten an Längs- und Querschliffen..Die R e t z i u s s c h e n S t r e i f e n , treten besonders bei Verwendung gut getrockneter Zähne hervor. Zur Isolierung von Schmelzprismen legt man einen Zahn in 5—10°/oige Salzsäure. Wenn der Schmelz weich wird, entnimmt man ein kleines Stück davon und zerzupft es mit Nadeln. Eindecken in physiol. Kochsalzlösung. 1678. Zur Darstellung der S c h r e g e r s c h e n S t r e i f e n bringt man Längsschliffe für wenige Sekunden in 5°/oige Salpetersäure, tupft mit Filtrierpapier ab und wäscht gründlich mit Wasser aus (v. E b n e r ) . 1679. Die K i t t s u b s t a n z d e s S c h m e l z e s k a n n man an Schliffen durch E i n w i r k u n g von v e r d ü n n t e r Salzsäure sichtbar machen, da durch dieselbe die Schmelzprismen rascher gelöst werden. Auch Pikrinsäure w i r k t lösend. Zur F ä r b u n g behandelt m a n d ü n n e Schliffe nach § 1669. 1680. G o t t l i e b (15) färbt zur Darstellung der organischen Substanz dünne Schliffe in einer gesättigten Lösung von alizarinsulfosaurem Natrium, der vorher zur Neutralisierung solange verdünnte Na OH zugesetzt wird, bis die Lösung auch beim Umschütteln violettstichig bleibt. Die Schliffe werden für einige Stunden in die Lösung gelegt, mehrmals aufgekocht und dann an den Oberflächen auf einem Arkansastein in 95°/oigem Alkohol glatt poliert. Schließlich durch abs. Alkohol und Xylol in Balsam. 1681. An jungen Zähnen, die nach § 1674 entkalkt sind, f ä r b t sich die K i t t substanz besonders schön mit K o n g o r o t ( S c h a f f e r ) . In chromhaltigen Fixierungsflüssigkeiten f ä r b t sich der Schmelz junger Zähne braun, in Osmiumsäure schwarz. 1682. Dentin. Z u r Darstellung der Dentinröhrchen an Schliffen v e r f ä h r t m a n nach § 1666—1669. E n t k a l k t e Schnitte f ä r b t man mit v e r d ü n n t e m Delafieldschen Hämatoxylin-Eosin oder nach S e h m o r i (§ 16431). Bei ersterer Methode t r e ten die N e u m a n n s c h e n Z a h n s c h e i d e n auf Querschnitten sehr deutlich als dunkelblaue Ringe hervor (besonders nach Fixierung in Formol und Nachbehandlung in Müllerscher Flüssigkeit). Auch die A z a n f ä r b u n g ist dazu sehr zu empfehlen. Die Verbindung der Odontoblaisten mit dem Dentin soll am besten bei E n t k a l k u n g mit Ameisensäure (s. § 1621) erhalten bleiben. 1683. Die f i b r i l l ä r e G r u n d s u b s t a n z des Dentins (und Zements) läßt sich an Gefrierschnitten entkalkter Zähne sehr gut nach der Bielschowskyschen Methode darstellen. Ausgezeichnete Resultate gab mir die Azanfärbung an Material, das in Susa (mittels Durchspülung) fixiert und in Salpetersäure entkalkt war. Die Methode eignet sich sowohl zur F ä r b u n g der Fibrillen wie zur Darstellung der Odontoblasten. 1684. W e i d e n r e i c h (25, 26) empfiehlt die F ä r b u n g mit AnilinwasserGentianaviolett (s. § 1649) nach Fixierung in Zenker-Formol (100 : 10 nach Maximow) und nachträglicher Entkalkung in 5°/oiger Salpetersäure. Fixierung in Formol ist ungeeignet. Außerdem verwendet er die F ä r b u n g nach Mallory,

§ 1685—1689.

Zahngewebe

387

die er in der Weise modifiziert, daß er die Vorfärbung mit Säurefuchsin wegläßt und das Orange der zweiten Farblösung durch Säurefuchsin ersetzt (Anilinblau 0,5 g, Säurefuchsin 0,5 g, Oxalsäure 2,0 g, dest. Wasser 100 ccm). E r erzielt dadurch eine intensive Kontrastwirkung zwischen Rot und Blau. 1685. Das Zement wird nach den beim Knochen gegebenen Vorschriften an Schnitten und Schliffen untersucht. 1686. Die Pulpa wird am besten erhalten, wenn die Fixierung mittels Durchspülung vorgenommen wird. Ist diese Art der Fixierung nicht möglich, so fixiert man den frisch gezogenen Zahn, nachdem man ihn durch Einklemmen in einen Schraubstock zersplittert hat, in Formol oder Zenkerscher Flüssigkeit und isoliert nach der Fixierung den Pulpastrang aus den Zahnfragmenten. Einbettung in Celloidin oder Paraffin. Färbung in Hämalaun-Eosin, Azan, u. dgl. Die O d o n t o b l a s t e n trifft man natürlich in jungen Zähnen am besten entwickelt. 1687. Über die Form der O d o n t o b l a s t e n orientiert man sich am besten an einem Zupfpräparat. Man legt dazu eine frisch isolierte Pulpa für 8 Tage in Müllersche Flüssigkeit. Kleine Stückchen davon werden in Wasser fein zerzupft. Man kann an diesen Präparaten oft ziemlich lange Odontoblastenfortsätze beobachten.

1688. Zum Studium der verschiedenen Entwicklungsstadien der Zahnbildung fixiere man Unterkiefer von Schaf- oder Schweinsembryonen in Susa, Bouinscher oder Zenkerscher Flüsigkeit. Nach Fixierung in Susa oder Bouinscher Flüssigkeit entkalkt man in Trichloressigsäure, sonst in Salpetersäure oder schwefliger Säure. Einbettung in Celloidin. 1689. Zur D a r s t e l l u n g d e r N e r v e n versuche man die Modifikation der Cajalschen Silberimprägnation, die von d e C a s t r o (26) für jene Fälle angegeben wurde, in welchen die Nerven von Knochengewebe umgeben sind. 1. Fixierung in einer der nachfolgend angegebenen Flüssigkeiten: a) Chloralhydrat 2,5 g, dest. Wasser 50 ccm, abs. Alkohol 50 ccm, Salpetersäure 3,4 ccm; oder b) Äthylurethan 1—2 g, dest. Wasser 40 ccm, abs. Alkohol 60 ccm, Salpetersäure 3,4 ccm; oder c) Somniphen (20°/oig) 2—4 ccm, abs. Alkohol 60 ccm, dest. Wasser 40 ccm, Salpetersäure 3,4 ccm. Einwirkungsdauer je nach Größe 1 bis 3 Tage bis zur völligen Entkalkung. Zu große Stücke werden nach 12—24 Stunden in 4—5 mm dicke Scheiben zerlegt. Die unwichtigen Teile werden abgetrennt. Die Flüssigkeit ist 2—3mal zu wechseln. 2. Auswaschen in dest. Wasser 24—36 Stunden. 3. Einlegen in 50 ccm 96°/oigen Alkohol, dem 4—5 Tropfen Ammoniak zugesetzt sind (ausreichend für 3—4 Stücke von 5 mm Kantenlänge). 4. Auswaschen in dest. Wasser 10—30 Minuten, dann Imprägnieren in einer 1,5—2°/oigen Silbernitratlösung bei 37—40° C, 5—7 Tage, bis die Stücke braun oder grau sind. 5. Schnelles Abspülen in dest. Wasser und Reduktion in chemisch reiner P y rogallussäure 1 g, Formol 10 ccm, dest. Wasser 90 ccm, 24 Stunden. 6. Auswaschen in Wasser, Alkoholreihe, Einbettung in Celloidin oder P a raffin. Eventuell Nachvergolden der Schnitte nach Bielschowsky. Weiteres über Nervendarstellung s. Kapitel 24. B. Ausführliches zu Kapitel 22 besonders bei S c h a f f e r 26 und v. E b n e r 08. Über Untersuchung im polarisierten Licht s. W. J. S c h m i d t 24.

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388

Muskelgewebe

§ 1690—1694.

23. KAPITEL

Muskelgewebe A. Quergestreifte Muskulatur 1690. Zur Herstellung eines f r i s c h e n P r ä p a r a t e s zerzupft man ein kleines, frisch entnommenes Stückchen eines Skelettmuskels, legt schnell ein Deckglas auf und umrandet. Am besten ist es, wenn man mit der Gewebsflüssigkeit auskommt, andernfalls fügt man einen Tropfen einer Körperflüssigkeit oder einer sog. indifferenten Beobachtungsflüssigkeit zu. Sehr gute Isolationspräparate, insbesondere auch Querschnittbilder bekommt man, wenn man ein Stückchen Skelettmuskel auf einen Objektträger legt, an einem Ende mit der Pinzette festhält und vom anderen mit einem scharfen Rasiermesser kleine Stückchen herunterhackt. An solchen Präparaten ist die Q u e r s t r e i f u n g der Muskelfasern (entdeckt von E. B r ü c k e 1857) sehr deutlich zu erkennen (mittleres oder starkes Trockensystem, enge Blende!). Nach längerem Liegen in physiologischer Kochsalzlösung (1 bis mehrere Stunden) wird der Nachweis der Querstreifung immer schwieriger. Zur Konservierung kann man die Zupfpräparate ca. 5 Minuten in Osmiumtetroxyddämpfen räuchern. Die Muskelfasern werden dadurch leicht bräunlich gefärbt, wodurch die Strukturen noch besser hervortreten. 1691. Die M y o f i b r i l l e n lassen sich am leichtesten durch Zerzupfen frischer Flügelmuskeln von Fleischfliegen, Bremsen, Wespen, Heuhupfern od. dgl. in 0,5°/oiger Na Cl-Lösung isolieren (v. E b n e r 18). 1692. Beim Zerzupfen sarkoplasmareicher Muskelfasern, insbesondere aber bei Herzmuskelpräparaten und Muskeln von Insekten, sind neben einzelnen stark lichtbrechenden Fettröpfchen zahlreiche, schwächer lichtbrechende Körperchen von etwa 0,5 M. Durchmesser sog. »Sarkosomen« zu beobachten. In P r ä paraten von älteren Herzmuskeln finden sich außerdem noch bräunliche 'Pigmentkörnchen. Nach P i s c h i n g e r und B o e r n e r (29, ferner P. 31) sind die Sarkosomen Kunstprodukte. Sie sind im lebenden oder unbehandelten Muskel normalerweise nicht vorhanden. Die Körner entstehen vielmehr infolge der überaus großen Empfindlichkeit der Muskelbaustoffe im nativen Zustand durch tropfige Entmischung erst dann, wenn man verschiedene Lösungen wie z. B. Ringer- oder phys. Kochsalzlösung auf den Muskel einwirken läßt. In gleicher Weise wirken die gebräuchlichsten Fixierungsmittel. Auch durch Druckwirkung können sie hervorgerufen werden. Zur Färbung der nach Fixierung in Alkohol-Formol oder Sublimat auftretenden „ S a r c o s o m e n " empfahl v. E b n e r (20) besonders das Molybdänhämatoxylin von Held (s. § 1875). 1693. Die K e r n e der Muskelfasern treten bei frischen Zupfpräparaten auf Zusatz von verdünnter Essigsäure (1—5°/o) deutlich hervor. Die Querstreifung der Muskelfasern wird dabei meist undeutlicher, dagegen ist die Längsfibrillierung besser zu beobachten. Über das Verhalten der Muskelfasern und ihrer Fibrillen gegenüber verschiedenen Reagenzien vgl. A. M e y e r (21, S. 692 ff.), Z e i g e r und S c h r e i b e r (27), B o e r n e r und P i s c h i n g e r (27, 28), B o e r n e r (29). 1694. Das S a r c o l e m m läßt sich an frischen Zupfpräparaten am deutlichsten an künstlichen Rißstellen der Muskelfasern beobachten. An gekochten Fasern ist es als faltiges Häutchen leicht zu erkennen. Bei Zusatz von kalt ge-

§ 1695—1701.

Quergestreifte Muskulatur

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sättigter wässeriger Lösung von Ammoniumcarbonat hebt es sich nach S o l g e r unter Bildung mehr oder weniger starker Vorwölbungen von der Muskelfaser ab. 1695. Zur S u p r a v i t a l f ä r b u n g frischer Muskelpräparate gibt R. K r a u s e auf ein frisch zerhacktes Muskelpräparat (s. § 1690) 1—2 Tropfen einer 0,l°/oigen Lösung von Kresylechtviolett R B in dest. Wasser (vorher filtrieren!). Nach einigen Minuten, wenn die Muskelfasern makroskopisch rötlich erscheinen, legt man das Deckglas auf und umrandet. E r g e b n i s : Kerne metachromatisch rot, interstitielle Körner dunkelblau, Sarcoplasma hellviolett, Bindegewebe ungefärbt. 1696. M a z e r a t i o n s p r ä p a r a t e quergestreifter Muskelf a s e r n gewinnt man zweckmäßig durch Einlegen kleiner Stückchen in schweflige Säure (gesättigte wässerige Lösung mit 5°/o Säuregehalt). S a n d m a n n läßt diese in einem gut verschlossenen Gläschen 1—8 Tage lang einwirken, wäscht dann mit dest. Wasser gut aus und kocht 3—4mal in dest. Wasser, wobei man dazwischen jedesmal abkühlen läßt. Schließlich lassen sich die Fasern durch Schütteln leicht isolieren. Zur Vergoldung übergießt man sie in einem Zentrifugengläschen mit verdünnter Goldchloridlösung (1—3 Tropfen einer l°/o Goldchloridlösung auf 10 ccm dest. Wasser, schüttelt auf und setzt sie kräftigem Tageslicht aus. Nach wenigen Minuten, wenn die Fasfern gelblich geworden sind, wäscht man mit dest. Wasser gründlich aus (am besten mit Hilfe der Zentrifuge) und erwärmt nach Zusatz eines Tropfens Essigsäure bis der gelbliche Ton in Purpurviolett umschlägt. Einlegen in Glyzerin, das zur Hälfte mit Wasser verdünnt ist oder durch Alkoholreihe und Xylol in Balsam. 1697. Zusatz von Alkohol, von stark verdünnten Lösungen von Chromsäure oder chromsauren Salzen (unter 0,l°/o) begünstigt den f i b r i l l ä r e n Z e r f a l l d e r M u s k e l f a s e r n beim Zupfen. Nach 1—2 Wochen langem Liegen in 5°/oiger Trichloressigsäure lassen sich die Muskelfasern durch Schütteln in 96°/oigem Alkohol isolieren. 1698. P é t e r f i legt kleine Muskelstückchen zur Isolierung der Fasern 2 bis 4 Wochen in 2,5°/oigen salizylsauren Alkohol, wäscht 24 Stunden in Leitungswasser, kocht 1—2 Stunden in Wasser, legt in 10°/oigen Alkohol ein und bringt durch steigenden Alkohol in Xylol, in dem dann isoliert wird. 1699. Der Zerfall quergestreifter Muskelfasern in B o w m a n n s c h e S c h e i b e n (= Querscheiben = Q) läßt sich am besten an den Muskeln gewisser Käfer (z. B. Hydrophilus piceus) zeigen. Man bringt die Tiere dazu lebend in 93°/oigen Alkohol und untersucht 24—48 Stunden später entnommene, zerzupfte Muskelstückchen in verdünntem Glyzerin ( R o l l e t 85). 1700. Behandelt man Säugetiermuskeln nach Überschreitung des Maximums der Totenstarre mit 0,l°/oiger Salzsäure (oder 0,5—l°/oiger Essigsäure), so erzielt man häufig einen Zerfall der Fasern in Scheiben, die den Z - S c h e i b e n entsprechen, während die Q-Scheiben sich nach starker Quellung auflösen ( K r a u s e ) . Bei H e r z m u s k e l f a s e r n tritt dieser Zerfall nicht ein (v. E b n e r 20). 1701. Zur V e r g o l d u n g legt man frische Muskelstückchen auf 20 bis 25 Minuten in 0,5°/oige Goldchloridlösung und reduziert dann 8—12 Stunden in l°/oiger Ameisensäure ( R e t z i u s , R o l l e t ) . Die auf diese Weise rot bis violett gefärbten Längsstreifen entsprechen, insbesondere wenn sie perlenschnurartig aussehen, häufig dem Sarkoplasma und Sarkosomen, während die gequollenen Fibrillen farblos sind. In anderen Fällen, besonders bei Verwendung abgestorbener, vorher tage- oder wochenlang mit Alkohol behandelter Muskelstückchen, färben sich die Fibrillen. Positive, d. i. Sarkoplasmafärbung und negative, d. i. Fibrillenfärbung, lassen sich oft nur mit Schwierigkeit auseinanderhalten (siehe auch v. E b n e r 20).

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Muskelgewebe

§ 1702—1707.

1702. Die gegenseitige V e r t e i l u n g v o n t r ü b e n u n d h e l l e n M u s k e l f a s e r n u n t e r s u c h t m a n nach S c h a f f e r an in leicht g e s p a n n t e m Zustand g e t r o c k n e t e n Muskeln, von denen m a n mit dem Messer Schabequerschnitte anfertigt, die m a n in 0,75%>iger Kochsalzlösung zum A u f q u e l l e n b r i n g t . 1703. Beim Menschen enthalten die ä u ß e r e n Augenmuskeln, Zwerchfell, Masseter hauptsächlich sog. t r ü b e Fasern. Biceps, Temporaiis, Rectus abdominis besitzen v o r w i e g e n d helle Fasern. Bei Tieren bestehen m a n c h e Muskeln ganz aus d e r einen oder der a n d e r n Art. Besonders reich an S a r k o p l a s m a (im V e r gleich z u r Fibrillenmenge) sind die B r u s t m u s k e l n d e r F l e d e r m a u s (ferner die die Rückenflosse des Seepferdchens b e w e g e n d e n Muskeln). Das differente Aussehen der trüben und hellen Muskelfasern hängt, wie aus den Untersuchungen P i s c h i n g e r s hervorgeht, damit zusammen, daß das Sarkoplasma, was Entmischbarkeit betrifft, nicht gleich empfindlich ist. Die trüben Muskelfasern verdanken darnach ihr Aussehen dem Umstand, daß das Sarkoplasma dieser Muskeln sehr leicht entmischbar ist, so daß in ihnen bei Zusatz von Beobachtungsflüssigkeit u. dgl. zahlreiche Sarkosomen auftreten. 1704. F i x i e r u n g . Beim H e r a u s p r ä p a r i e r e n des Muskels h a t m a n sorgfältig jedes Quetschen des Gewebes zu vermeiden. H e i d e n h a i n (18) e m p fiehlt, den Muskel nicht gleich nach dem Tode in die Fixierungsflüssigkeit zu bringen, d a in diesem F a l l e sehr leicht K u n s t p r o d u k t e (Zerreißungen usw.) entstehen. E r u m w i c k e l t daher f r i s c h e n t n o m m e n e Muskelstückchen m i t einem in physiolog. Kochsalzlösung eben angefeuchteten Gazestreifen u n d läßt sie in einer verschlossenen Schale einige S t u n d e n liegen. Starkes Benetzen ist zu v e r m e i d e n , weil es leicht zu Quellungen f ü h r t . Dann spannt m a n die Muskels t ü c k c h e n in n a t ü r l i c h e r Länge mit Igelstacheln auf K o r k auf u n d fixiert in 5°/'oiger Trichloressigsäure. Nach 24 S t u n d e n ü b e r t r ä g t m a n in ö f t e r zu wechselnden 97°7oigen Alkohol usw. S e h r g u t eignen sich auch die in § 344—346 angegebenen Trichloressigsäuregemische, f e r n e r Formolalkohol. Nach R. K r a u s e (26) wird die S t r u k t u r der q u e r g e s t r e i f t e n Muskelfasern am besten durch 10°/oiges Formol oder d u r c h l°/oiges Platinchlorid (in letzterem F a l l kleinste Stückchen) erhalten. F i x i e r u n g i n chromsalz- oder pikrinsäurehaltigen Flüssigkeiten b e w i r k t eine V e r q u e l l u n g des S a r k o p l a s m a s . 1705. Um Skelettmuskeln in k o n t r a h i e r t e m Zustand zu untersuchen, bringt sie H ü r t h 1 e (31) sofort nach Entnahme in eine Lösung von fester Kohlensäure in Aether (Temperatur etwa —70° C). Für Bilder des e r s c h l a f f t e n Zustandes läßt man den Muskel vorher eine Stunde lang an der Luft liegen, wodurch er seine Erregbarkeit gegenüber dem Kältereiz verliert. Anschließend werden die Muskeln in gefrorenem Zustand im Vakuum getrocknet. Zur Herstellung der Präparate werden einzelne Fasern abgesplittert und in Glyzerin od. dgl. untersucht. Auch Einbettung in Paraffin wurde von H. angewandt, wobei sich die Präparate aber zum Teil schlecht schnitten. Vermutlich ließe sich die Untersuchungstechnik durch Anwendung des in § 351 erwähnten Verfahrens verbessern. 1706. F ä r b u n g . F ü r Über sich tsbilder genügt eine einfache H ä m a l a u n E o s i n f ä r b u n g . Besser t r i t t insbesondere die Q u e r s t r e i f u n g bei 24stündiger F ä r b u n g in s t a r k v e r d ü n n t e m Delafieldschen H ä m a t o x y l i n h e r v o r (keine Gegenf ä r b u n g m i t Eosin u. dgl.). Sehr deutliche F ä r b u n g läßt sich mit E i s e n h ä m a t o xylin, mit V a n a d i u m h ä m a t o x y l i n (§ 688), f e r n e r mit Hilfe der V e r s i l b e r u n g m e t h o d e n (§ 1525 ff.) erzielen. 1707. E i n e intensive, reine B l a u f ä r b u n g der M u s k e l f a s e r n ist d u r c h G a l l a m i n b l a u ( B e c h e r ) zu erzielen. M a n löst von dem in Teigform erhältlichen Farbstoff e t w a 0,1 g in dest. Wasser d u r c h Kochen, l ä ß t a b k ü h l e n u n d filtriert.

§ 1708—1715.

Quergestreifte Muskulatur

391

Wenn man nicht zu lange färbt, beschränkt sich die Färbung fast nur auf die Muskelfasern. Auch durch die Färbung mit Säurealizarinblau (s. § 748) wird die Muskulatur sehr gut hervorgehoben (bei Differenzierung mit Phosphorwolframsäure rot, mit Phosphormolybdänsäure blau). 1708. Eine sehr scharfe Färbung der Myofibrillen gelingt nach F y g mit Kupferalauncarmin. Man löst dazu 6 g reinen Kupferalaun heiß in 100 ccm dest. Wasser, setzt 0,5 g Carmin zu und kocht 15 Minuten lang. Nach Erkalten filtrieren. Man färbt progressiv 1—12 Stunden und wäscht 30 Minuten in mehrfach gewechseltem dest. Wasser. Wie üblich in Balsam.

1709. H e i d e n h a i n (03b) färbt nach Fixierung in Trichloressigsäure (siehe § 343) die Schnitte in 0,5°/oiger bis l°7oiger T h i a z i n r o t l ö s u n g , bis sie kräftig gefärbt, aber doch noch durchsichtig sind, und dann 1 bis 12 Stunden mit einer basischen Farbe, z. B. T h i o n i n oder Methylenblau in l°/oiger wäss. Lösung, differenziert mit Alkohol oder, wenn dieser die Farbe nicht energisch genug auszieht, mit Methylalkohol. Auf diese Weise erhält man eine sehr scharfe Färbung von Z, M, I und h; Q bleibt ungefärbt. Auch die Schaltstücke in der Herzmuskulatur färben sich sehr schön (M. H e i d e n h a i n 03b.) 1710. Färbung mit E i s e n h ä m a t o x y l i n - T h i a z i n r o t nach M: H e i d e n h a i n ( P e t e r f i 13). Zuerst typische Färbung mit Eisenhämatoxylin nach § 672. Dann Nachfärbung mit 0,5%iger wässeriger Thiazinrotlösung, Abspülen in dest. Wasser, 96°/oiger und abs. Alkohol, Xylol. Myofibrillen dunkelblau, Bindegewebe und Sarkolemm lebhaft rot, Q-Streifen und Chromatin schwarz. 1711. Auch die Azanfärbung, die Massonsche Trichromfärbung, die Pasinische Färbung und die Modifikationen dieser Methode, ferner die in § 712 angegebene Methode von W a 11 a r t und H o u e 11 e sind zur Darstellung von quergestreiften Muskelfasern sehr geeignet. Einzelne, versprengte Muskelfasern lassen sich besonders schön durch die Methode von G o l d n e r (§ 1498) hervorheben. 1712. Um Schnitte von fixiertem Material zu v e r g o l d e n bringt man sie, wie in § 1701 auf 20—30 Minuten in 0,5°/oige Goldchloridlösung und dann in l°/oige Ameisensäure. Ist die Färbung nicht intensiv genug, so läßt sie sich nach M a r c u s (21) dadurch verstärken, daß man das Präparat nach der Reaktion in Ameisensäure zunächst in starken Alkohol taucht. Dann läßt sich die Vergoldung beliebig oft wiederholen, bis die Färbung intensiv genug ist.

1713. Die Darstellung der M u s k e l s p i n d e l n erfolgt mit Hämatoxylin nach S i h l e r - G a d . 1. Muskelbündel von der Dicke eines Gänsefederkieles kommen auf 18 Stunden in ein Gemisch von 1 Teil Essigsäure, 1 Teil Glyzerin wnd 6 Teilen l°/oige Chlorhydratlösung. —• 2. Ubertragen in reines Glyzerin und zerzupfen. — 3. Färben in einem Gemisch von 1 Teil Ehrlichschem Hämatoxylin, 1 Teil Glyzerin und 6 Teilen l°/oige Chlorhydratlösung 3—10 Tage, evtl. auch mehrere Wochen. — 4. Differenzieren in Essigsäure-Glyzerin bis nur mehr die Nerven und ihre Endigungen am Muskel gefärbt sind. — 5. Einlegen in reines Glyzerin. Noch besser gelingt die Darstellung des nervösen Anteiles der Muskelspindeln durch vitale Methylenblaufärbung (s. V i h v e 1 i n 32) oder durch Silberimprägnation nach Bielschowsky od. dgl.

1714. Die Faserstrukturen der S a r k o l e m m s werden am schönsten durch die Silbermethoden von G ö m ö r i (s. § 1533) oder L a g u e s s e (s. § 1537) dargestellt. Neben dem aus feinsten argyrophilen Fasern bestehenden Anteil ist dabei noch eine hyaline, strukturlose Membran zu unterscheiden, die sich z. B. mit Nigrosin anfärben läßt. Siehe auch P 1 e n k (27, S. 367 ff.). 1715. Zur gleichzeitigen differenten Darstellung g y r o p h i l e n (schwarz) und k o l l a g e n e n (35) folgende von S c h ä f f l e r ausgearbeitete Alkohol. — 2. Imprägnation der Gitterfasern

von M y p f i b r i l l e n (gelb), a r (rot) Fasern verwendet S c h ü 1 e Methode: 1. Fixierung in Formolnach § 1548 (etwas abgeändert):

392

Muskelgewebe

§ 1716—1721.

a) Einlegen der Schnitte in eine 5°/oige Tanninlösung in 95°/oigem Alkohol bei 55° C, iO—15 Min. — b) Kurzes Auswaschen in Alkohol. — c) Kurzes Auswaschen in Wasser. — d) Einbringen der Schnitte in drei Schälchen mit ammoniakalischer Silberlösung, auswaschen in Wasser und reduzieren in Formol wie in § 1548. — Wasser. — 3. Vorsichtiges Differenzieren des Silbers in 0,02°/oiger wässeriger Pikrinsäure. — Gutes Auswaschen in Wasser. — 4. Ersetzen des Silbers durch Platin durch Einlegen in 0,l°/oige essigsaure, wässerige Platinchloridlösung. — Wasser. — 5. Nachfärben mit einem Gemisch von gesätt., wässer. Pikrinsäure 9 Teile + 1 Teil 5°/oiger Säurefuchsinlösung. Auswaschen in Wasser, dem einige Tropfen des Farbgemisches beigesetzt sind. — 6. Aufziehen der Schnitte, Alkohol usw. Das Schwierigste in der Färbung liegt in der Imprägnation der Gitterfasern und in der Differenzierung und Zusammenstellung des Säurefuchsingemisches in Punkt 5, die je nach. Präparat und Tierart wechselt. Läßt man die Schnitte nach Punkt 3 für 3 Wochen in Wasser liegen, so kann man sich das Überführen in Platin ersparen. Das Silber verändert sich dann derart, daß es durch die Pikrinsäure in 5 nicht mehr angegriffen wird. 1716. Um den Ü b e r g a n g d e r M y o f i b r i l l e n i n e l a s t i s c h e F a s e r n nachzuweisen, färbt L o g i n o w (13) die'mit Chromhämatoxylin vorgefärbte Membrana retrolingualis des Frosches 3—6 Stunden in Orcein (Orcein 0,5 g; 70°/oiger Alkohol 70 ccm) nach, differenziert mit salpetersaurem Alkohol und schließt in Balsam ein. Resultat: Muskelfasern violett, elastische Fasern braun. 1717. Bei der Untersuchung der Beziehungen von M u s k e l f a s e r und S e h n e sind auch die in § 1715 angeführten Methoden mit Vorteil zu verwenden. Schrifttum zur Frage des Überganges von Muskel-Sehne O. S c h u 11 z e (11), P e t e r f i (13), V. S c h m i d t (27), C l a r a (31), S c h ü l e (35). 1718. Erheblich schwieriger als beim Skelettmuskel ist die Anfertigung frischer Zupfpräparate beim H e r z m u s k e l , da sich das Fasernetz beim Zupfen ständig kontrahiert und sich nur schwer in dünner Lage ausbreiten läßt. Die Herzmuskelfasern besitzen nach v. E b n e r (20) kein Sarkolemm. Im übrigen erfolgt die Untersuchung des Herzmuskelgewebes wie beim Skelettmuskel. 1719. Die Muskelzellen der P u r k i n j e s c h e n F ä d e n (Reizleitungssystem) werden in toto in der Weise dargestellt, daß man V2 mm dicke Lamellen mit dem Endokard in wenig Ranvierschen Drittelalkohol auf 24 Stunden einlegt. Auch eine 5°/oige Lösung von Ammoniummonochromat in Wasser leistet Vorzügliches ( R a n v i e r , 89). Das Endokard kann dann glatt abgezogen werden. Die nun sichtbaren P u r k i n j e s c h e n Fäden werden abgehoben und d : e Zellen mit Nadeln isoliert. Dieselben können dann mit Pikrocarmin nachgefärbt und in Glyzerin eingeschlossen werden. Sehr geeigneteObjekte liefern die Herzen der Schafe, Ziegen und Pferde, nicht des Menschen. 1720. Zur F ä r b u n g d e r P u r k i n j e s c h e n F ä d e n in Schnittpräparaten ist an Stelle der van Giesonschen Färbung die Pikrinsäure-ThiazinrotMethode (s. § 710) zu verwenden. Sehr schöne und haltbare Präparate gibt auch die Färbung nach Pasini (§ 1499). B. Glatte Muskulatur 1721. Zur Beobachtung der g l a t t e n M u s k e l z e l l e n i m f r i s c h e n P r ä p a r a t eignet sich besonders die Harnblase des Frosches oder das Mesenterium des Salamanderenddarmes. Verzweigte glatte Muskelzellen lassen sich nach B e n i n g h o f f (26) an Häutchenpräparaten untersuchen, die man durch Abziehen kleiner, fixierter Endokardstückchen gewinnt und nach Stieve mit Molybdänhämatoxylin (siehe § 1513) färbt.

§ 1722—1729.

Glatte Muskulatur

393

1722. Zur I s o l i e r u n g g l a t t e r M u s k e l z e l l e n füllt man eine Froschharnblase mit D r i t t e l a l k o h o l und legt sie dann in solchen ein. Nach 24 Stunden schneidet man auf, pinselt das Epithel ab, färbt mit Delafieldschem Hämatoxylin und mit Congorot (M. H e i d e n h a i n ) . 1723. Sehr schön gelingt die Isolierung lang gestreckter glatter Muskelzellen mit S a l i z y l s ä u r e mit einer von F r o r i e p f ü r Skelettmuskulatur angegebenen Methode. Man fixiert Stücke eines Katzendarmes in 80—90°/oigen Alkohol mit einem Zusatz von 2,5% Salizylsäure. Nach einigen Tagen kocht man sie 1—2 Stunden lang in einer 0,25°/'oigpn wässerigen Salizylsäurelösung, läßt erkalten und läßt sie darin einige Wochen liegen. Dann überträgt m a n sie in 10°/oigen Alkohol, in welchem man sie jahrelang aufbewahren kann. Kleine Stückchen der Muskularis lassen sich in Wasser oder 50°/oigen Alkohol ohne Schwierigkeit zerschütteln. Die isolierten Zellen wäscht man mit Hilfe der Zentrifuge gründlich mit dest. Wasser aus und f ä r b t mit Congocorinth G (M. H e i d e n h a i n , zum Teil nach brieflicher Mitteilung). 1724. Sehr rasch erfolgt die I s o l i e r u n g i n K a l i l a u g e . Man legt kleine Stückchen in 33°/oige Kalilauge (spez. Gewicht 1,33) und zerteilt sie nach 1—l'/zStunden ohne Wechsel der Flüssigkeit mit 2 Zupfnadeln in kleine Fragmente, die bei gelungener Mazeration nach Auflegen des Deckglases schon unter dem Drucke desselben in einzelne Spindelzellen zerfallen. 1725. Ebenso isoliert man die verzweigten quergestreiften Muskelzellen aus der Zunge des Frosches. Auch Alkoholpräparate lassen sich so mazerieren ( M o l e s c h o t t 59 und 63). Will man die Mazeration unterbrechen, so setze man der Kalilauge-etwa 60% Kali aceticum zu; will m a n färben, so wasche man mit Alaunlösung aus. 1726. L e v i isoliert einige Stunden mit einer 1—2%igen Natriumfluoridlösung, die.überhaupt »Kittsubstanzen« lösen soll. Die Färbbarkeit der isolierten Elemente ist schlecht. 1727. An kleinen Gefäßen, z. B. im Mesenterium kleiner Tiere, lassen sich die Z e l l g r e n z e n d e r g l a t t e n M u s k e l f a s e r n durch Versilbern sehr schön darstellen. Technik wie in § 1280. 1728. Zur U n t e r s u c h u n g i m S c h n i t t p r ä p a r a t eignen sich vor allem die Muskelzellen des graviden Uterus. Besonders schöne Präparate bekommt man bei Flachschnitten, gleichsinnig zur Oberfläche der Gebärmutter (S t i e v e 29). Sehr günstig ist ferner die Darmmuskulatur der Katze, besonders wenn man die Fixierung nach § 212 durch Injektion vom Herzen aus vornimmt (mit Kaformacet § 238). An derartigen Präparaten lassen sich die Myofibrillen und deren Kontraktionsknoten sehr gut beobachten (Färbung z. B. mit Azan oder nach Pasini). Auch das feine intermuskuläre Bindegewebsnetz (siehe auch S c h a f f e r 99) tritt bei Färbung mit Azan oder nach Pasini-Walter schön hervor. Noch schärfer läßt es sich mit der Silbermethode von Gömöri (§ 1533), Laguesse (§ 1537) oder Rio Hortega (§ 1548) darstellen. Fixierung in Formol, Formol-Alkohol oder nach Stieve. 1729. Zur differenten Darstellung von glatter Muskulatur und Bindegewebe leistet die in § 1498 angegebene Methode von Goldner, namentlich nach Fixierung in Bouinscher Flüssigkeit Ausgezeichnetes. Bei ihr treten auch die kleinsten Muskelzüge noch überaus klar hervor. Soll gleichzeitig auch das elastische Gewebe dargestellt werden, so v e r f ä h r t man nach § 1564. Auch die Färbung mit Gallaminblau (1707) oder mit Säurealizarinblau (§ 748 und 1730) läßt die Muskelzellen sehr deutlich hervortreten. An Stelle der viel gebrauchten v a n

394

Nervengewebe

§ 1730—1734.

G i e s o n s c h e n Färbung wählt man besser die Färbung mit PikrinsäureThiazinrot nach § 710. 1730. Sehr klar tritt das glatte Muskelgewebe in blauem Farbton bei einer von N e u b e r t (40) angegebenen Methode hervor. 1. Färbung in einer je nach der Dicke der Präparate mehr oder weniger mit dest. Wasser verdünnten L ö sung von Säurealizarinblau in Aluminiumsulfat (s. § 748) 5—30 Min. — 2. D i f ferenzieren und beizen in 5°/oiger Phosphorwolframsäure. — 3. Abspülen in dest. Wasser. — 4. Einstellen in eine wässerige Lösung von Kupferacetat, je nach Konzentration der Salzlösung und Dicke des Objekts 5—30 Min. — 5. Auswaschen in Brunnenwasser 5—15 Min. — 6. Alkohol, Xylol, Balsam. 1731. Infolge seines hohen Kaliumgehaltes wird das glatte Muskelgewebe auch durch die von C a r e r e - C o m e s zum Kaliumnachweis eingeführte S i e n a - O r a n g e - L ö s u n g intensiv gefärbt. Man verfährt dabei in Punkt 1 bis 4 w i e in § 1215; anschließend werden die Präparate 5. unter mikroskopischer Kontrolle f ü r 5—15 Min. in einem Gemisch von Aceton + dest. Wasser 33 differenziert. Dann 6. dest. Wasser (2mal wechseln) 10 Min. — 7. Gegenfärbung in einer 0,01°/oigen wässerigen Lösung von Anilinblau (aus einer l°/oigen Stammlösung frisch herzustellen), bis die intensiv orangegölb gefärbten Muskelfasern gegenüber dem blaugrünlichen Bindegewebe deutlich hervortreten, 10—15 Min. — 8. Abspülen in dest. Wasser. Abtrocknen mit Filtrierpapier, absol. Alkohol (kurz), Xylol, Balsam. 1732. Über den Form- und Größenunterschied der glatten Muskelzellen in kontrahierten und gefüllten Organen und auf verschiedene Anordnung der kontraktilen Elemente in beiden Zuständen s. A. M ü l l e r . 1 Bei der Umordnung der Elemente ist das intermuskuläre Bindegewebe tätig. 1733. Bei der Fixierung lebensfrisch entnommener Organe kommt es unter der Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit gewöhnlich zu einer maximalen K o n traktion der glatten Muskulatur, die zu starken Zerreißungen des umgebenden Gewebes führen kann. Diese Fixierungsreaktion läßt sich durch vorausgehende Durchspülung mit einem Kava-Kava-Extrakt oder durch Einlegen in einen solchen weitgehend ausschalten oder abschwächen. Es gelingt so die glatte Muskulatur in nicht kontrahiertem Zustand zu fixieren ( W o l f - H e i d e g g e r 39). Weiteres s. § 2065. 24. K A P I T E L

Nervengewebe A.

Zentralnervensystem 1. Allgemeines

1734. Beim Herausnehmen v o n G e h i r n u n d R ü c k e n m a r k entferne man zuerst möglichst vollständig die darüber gelegene Haut- und Muskelschicht. Dann wird der Rückenmarkskanal mit einer Knochenzange eröffnet; die Schädelhöhle öffnet man bei kleinen Tieren, z. B. Fischen, Fröschen u. dgl. mit einem Messer, bei jungen Meerschweinchen oder Kaninchen mit einer alten Schere. Bei größeren Tieren benötigt man Säge und Knochenzange. Ist das Gehirn bzw. Rückenmark freigelegt, so müssen zunächst noch die Nerven der Hirnbasis durchschnitten werden. In die Fixierungsflüssigkeit werden die Stücke auf Glaswolle oder Wattebäusche eingelegt oder an einem Faden eingehängt. Gehirn und Rückenmark größerer Säugetiere verschafft man sich aus dem Schlachthof. Die Objekte sollen möglichst lebensfrisch in die Fixierungs-

§ 1735—1739.

Zentralnervensystem (Allgemeines)

395

flüssigkeit kommen. Mehrere Stunden nach dem Tode lassen sich meist nur mehr Orientierungsbilder gewinnen. Als Fixierflüssigkeiten kommen beim Nervensystem hauptsächlich A l k o h o l , F o r m o l , K a l i u m b i c h r o m a t und M ü l l e r s c h e F l ü s s i g k e i t in Betracht. Formol wird zur Fixierung des Zentralnervensystems meist in der Verdünnung 1 :9 gebraucht (im Schrifttum meist als 10°/oiges Formol bezeichnet, s. dazu auch § 263). Bei Formolfixierung kommt es nach W e i l zu einer monatelang andauernden Hydrolyse der Phosphatide (s. auch § 253). Die in formolfixierten und mit Alkohol nachbehandelten Präparaten häufig auftretenden metachromatischen Kugeln sind nach W e i l Galaktolipoide. Sie lassen sich durch Einstellen der Schnitte in heißes Wasser entfernen. 1735. Kann die Fixierung, wie es gerade bei menschlichem Material meist der Fall ist, erst 24—48 Stunden nach dem Tode erfolgen, so kann man versuchen, dadurch eine leidliche Konservierung zu erzielen, daß man mit einer nicht zu dünnen mit Dorn versehenen Kanüle von der Nasenhöhle aus das Siebbein durchstößt und so in die Schädelhöhle gelangt; man läßt möglichst viel Liquor ablaufen und injiziert dann eine 10°/oige Formollösung. Auch durch Lumbalpunktion kann eine Fixierung versucht werden. Noch günstiger ist eine Durchspülung von der Art. carotis aus.

1736. Eine große Zahl der Methoden läßt sich am besten an Gefrierschnitten vornehmen. Bei cytologischen Untersuchungen kommt häufig Paraffineinbettung in Frage, während bei faseranatomischen und cytoarchitektonischen Untersuchungen fast ausschließlich das Celloidinverfahren angewandt wird. Man verf ä h r t dabei in der in § 450 ff. angegebenen Weise. Bei großen Gehirnscheiben erfordert die Celloidineinbettung mehrere Monate; im 2°/oigen Celloidin müssen sie mindestens 6—8 Wochen, im 4°/oigen 2—4 Wochen verweilen. Zur Anfertigung großer Gehirnschnitte bedient man sich am besten eines Tauchmikrotoms. Einzelheiten über die Herstellung großer Gehirnschnitte bei S t u r m a n n (15).

1737. S p i n a l g a n g l i e n und s y m p a t h i s c h e G a n g l i e n werden in derselben Weise fixiert. Letztere trifft man öfters als Nebenbefunde bei Untersuchung größerer Arterien. 1738. Eine V i t a l f ä r b u n g d e s Z e n t r a l n e r v e n s y s t e m s ist bei Säugetieren nur in beschränktem Maße möglich. S p a t z spritzt den Farbstoff (Trypanblaulösung) in geringen Dosen, aber öfters wiederholt subarachnoidal 'mittels Suboccipitalstich ein. B e h n s e n (27) verabreicht Mäusen subkutan 3mal 1 Spritze in eintägigen Zwischenräumen und zwar jedesmal 0,5 ccm einer lVoigen Lösung auf 20 g Körpergewicht. 5 Tage nach der letzten Einspritzung wird das Tier getötet, das Gehirn 12—24 Stunden in Formol 1 :4 (besser wäre vermutlich in Trichloressigsäure-Sublimat s. § 766) fixiert, innerhalb 12 Stunden in Celloidin I gebracht, am folgenden Tage über Celloidin II und III in Celloidin-Paraffin eingebettet. Über elektive Vitalfärbung des Nervensystems bei Wirbellosen s. § 788 f. Über die supravitale Färbung mit Methylenblau s. 1928 ff. 2. Untersuchung der Ganglienzellen

a)

Isolierung

1739. Zur I s o l i e r u n g v o n G a n g l i e n z e l l e n schneidet man mit der Schere aus den Vorderhörnern eines frischen Rückenmarkes 1—2 cm lange Stückchen heraus und legt sie f ü r 3—8 Tage in stark verdünnte wässerige Chromsäurelösung (z. B. 5 ccm einer 0,05°/oigen Chromsäurelösung auf 45 ccm dest. Wasser).

396

Zentralnervensystem

§ 1740—1742.

Von anderen Isolierungsflüssigkeiten seien noch genannt: Drittel-Alkohol ( R a n v i e r , 1—2 Wochen, s. § 1270), Jodserum (M. S c h u 11 z e , 24 Stunden s. § 1274), Kaliumbichromat 0,l°/oig, 2 Wochen oder länger, Osmiumsäure 0,l°/oig, 24 Stunden oder länger. Sehr'große Ganglienzellen findet man im Rückenmark von Rind, Pferd, Katze. Sind die Fasermassen durch die Einwirkung der Isolierungsflüssigkeit genügend erweicht, dann lassen sich die Ganglienzellen durch S c h ü t t e l n , Z u p f e n , H e c h e l n (§ 129) oder R a s p e l n (§ 130) ziemlich leicht isolieren. Die Präparate werden dann in Wasser oder Glyzerin untersucht; durch Zusatz von etwas Eosin, Säurefuchsin od. dgl. lassen sich die Zellen leicht etwas anfärben. Die Ganglienzellen sind der Fäulnis gegenüber sehr resistent. Man kann graue Substanz in Wasser oder sehr verdünnter Chromsäure geradezu faulen lassen und dann die Ganglienzellen mit langen Fortsätzen durch Tupfen isolieren. 1740. M e n n e r (35) färbt die nach § 1739 in verdünnter Chromsäure mazerierte weiche Masse der grauen Substanz für 24 Stunden in Azosäure (s. u.). Nach der Färbung wird kurz in dest. Wasser abgespült und dann für je 24 Stunden in Glyzerin-Wasser 1 : 3 , 1 : 1 und schließlich in reines Glyzerin übertragen. Sodann werden kleine Fragmente davon unter dem Deckglas breitgedrückt. Die Ganglienzellen erscheinen zunächst purpurrot, die Fortsätze blaurot; nach einigen Wochen heben sie sich leuchtend blau auf farblosem Grund ab. Herstellung der Farblösung: 2 g Azosäure »B« (Hoechst), 1 g Brechweinstein und 4 g Oxalsäure werden in 20 ccm dest. Wasser aufgekocht und nach 24 Stunden filtriert. Von dieser haltbaren Stammlösung verdünnt man zur Färbung 4 ccm mit 96 ccm dest. Wasser. b) K e r n -

und

Tigroidsubstanz

1741. Die Wahl der Methodik zur Untersuchung der Zellen dés Zentralnervensystems wird von den dabei verfolgten Zwecken bestimmt. Bei c y t o a r c h i t e k t o n i s c h e n und h i s t o p a t h o l o g i s c h e n Untersuchungen, die das von N i s s l aufgestellte Nervenzelläquivalentbild zur Grundlage haben, kommen nur die in § 1742—1745 angegebenen Methoden in Frage. Es ist aber möglich, daß die Methode mit der Zeit durch die einfachere und sichere F ä r bung mit gepufferter Farblösung nach P i s c h i n g e r (s. § 1748) ersetzt wird. Bei rein cytologischen Untersuchungen sind die auch sonst bei zellulären Studien üblichen Fixierungsmethoden anzuwenden. a) Die Methode von Nissl 1742. Die N i s s i s c h e M e t h y l e n b l a u - F ä r b u n g , die N i s s l zur Grundlage seines N e r v e n z e l l ä q u i v a l e n t b i l d e s machte, beruht auf einer Überfärbung des alkoholfixierten Schnittes mit einer basischen Anilinfarbe und einer nachfolgenden Auswaschung des Farbüberschusses in Alkohol, wobei die zelligen Bestandteile den Farbstoff stärker festhalten als die Fasermassen, die sich racher entfärben. Dadurch wird erreicht, daß sich schließlich das gesamte Zellmaterial intensiv gefärbt vom farblosen Untergrund scharf abhebt. An der Färbung der Zellen beteiligen sich Bestandteile des Kernes wie besondere in das Cytoplasma der Nervenzellen eingelagerte Substanzen, die T i g r o i d s c h o l l e n , N i s s l - S c h o l l e n oder N i s s l - S u b s t a n z . Unter Nervenzelläquivalentbild versteht N i s s l »das mikroskopische Strukturbilci der im Gewebe vorhandenen Nervenzellen des in einer bestimmten Weise getöteten Tieres, das bei einer bestimmten mikroskopisch-technischen Behandlung des Nervengewebes unter bestimmten Voraussetzungen erfahrungsgemäß mit einer gesetzmäßigen Gleichheit zur Darstellung gebracht werden kann.«

§ 1743.

Ganglienzellen (Nißl-Methode)

397

Die N i s s 1 - Methode hat übrigens im Laufe der Zeit eine Reihe von Vereinfachungen erfahren. Selbst die Grundforderung N i s s 1 s , daß die Präparate in Alkohol fixiert werden müssen, wird nur mehr teilweise befolgt, insofern die Methode sehr häufig auch an formolfixiertem Material ausgeführt wird (siehe § 1745). Wenn dies auch bis zu einem gewissen Grade möglich ist, so wird es sich in wichtigen Fällen doch empfehlen, die Färbung an Material vorzunehmen, das nach Vorschrift in Alkohol fixiert wurde. Die auf das Schneiden und Färben bezüglichen Vorschriften N i s s 1 s können dagegen wohl ohne Beeinträchtigung des Erfolges durch die übliche Alkohol-Celloidinmethode und die kontrastreichere Färbung mit Toluidinblau oder Thionin ersetzt werden. Zunächst sei nun die Originalmethode N i s s 1 s angegeben; daran anschließend die üblichen Abweichungen. 1743. N i s s l - M e t h o d e : a) Fixierung. Die mit einer scharfen Schere aus dem Gehirn in Würfelform herausgeschnittenen Stücke werden sofort, ohne daß sie mit Wasser in Berührung kommen, in reichliche Menge 96°/oigen Alkohols gebracht. Die Stücke sollen nicht zu groß und nicht zu klein sein (nicht unter 1 cm Seitenlänge). Man fixiert möglichst bald nach dem Tode; man braucht aber nicht allzu ängstlich sein, da die Methode nach den Untersuchungen N i s s 1 s auch 12 bis 18 Stunden nach dem Tode noch gelingt. Wichtig ist, daß der Gewebesblock allseitig von Alkohol umspült ist (Auflegen auf Watte), und daß derselbe am ersten Tag mindestens einmal, später jeden zweiten Tag erneuert wird. Eine Probe des gebrauchten Alkohols soll beim Vermischen mit Wasser keine milchige Trübung mehr geben. b) Schneiden. Nach 5 Tagen hat der Block meist die günstigste Konsistenz erreicht. Die zum Aufkleben bestimmte Seite wird mit einem scharfen Rasiermesser glatt abgeschnitten, so daß die Dicke nicht mehr als 6—8 mm mißt, während die Größe der Schnittfläche beliebig sein kann. Die ebene Aufklebefläche eines Holzblockes wird dann mit einer honigdicken wässerigen Lösung von Gummi arabicum bestrichen, die des Hirnblockes mit Filtrierpapier abgetupft und dann mit leichtem Druck auf die Gummilösung gepreßt, so daß er überall gut anliegt. Dann bringt man ihn zurück in 96°/oigen Alkohol, worin der Gummi unter Weißlichwerden rasch erhärtet. Nach einigen Minuten kann der Block dann eingespannt und geschnitten werden. Man schneidet mit schrägstehendem, mit Alkohol benetztem Messer, wobei man mit einem mit Alkohol befeuchteten Pinsel nach Möglichkeit danach trachtet, daß sich die 10—15^ dicken Schnitte schon beim Schneiden völlig ausbreiten. Die Schnitte werden in einer Schale mit 96°/oigem Alkohol gesammelt. Sie sollen hierin aber nicht lange aufgehoben, sondern sogleich der Färbung zugeführt werden. Der Block läßt sich dagegen beliebig lang in Alkohol aufheben; er muß aber dazu abgeblockt werden. c) Färbung. Die Schnitte läßt man in einem Uhrschälchen auf folgender Farblösung schwimmen: Methylenblau B-Patent (C. Buchner & Sohn, München) 3,75 g; geschabte venezianische Seife 1,75 g, dest. Wasser 1000 ccm. Man erwärmt die Farblösung vorsichtig, bis Dämpfe aufsteigen.' Dann bringt man die a u s g e b r e i t e t e n Schnitte zur Differenzierung in eine frisch bereitete Mischung von w a s s e r h e l l e m Anilinöl (Höchster Farbwerke) 10 ccm + 96°/oigen Alkohol 90 ccm, bis keine gröberen Farbwolken mehr abgehen. Der auf den Objektträger gebrachte Schnitt wird mit glattem Fließpapier abgetrocknet und rasch mit Cajeputöl bedeckt, dann wieder abgetrocknet, mit Benzin Übergossen ( n i c h t a u s t r o c k n e n l a s s e n ! ) und mit Kolophonium-Xylol bedeckt. (Gesättigte Lösung von Kolophonium in Xylol.) Nim wird der Objektträger vorsichtig erwärmt, bis das Xylol verdunstet ist, worauf man auf die noch heiße Kolophoniumschicht ein heiß gemachtes Deckglas auflegt. Die Farblösung, die vor Gebrauch geschüttelt und filtriert wird, muß vor der Verwendung mindestens 1 Vierteljahr »reifen«.

398

Zentralnervensystem

§ 1744—1747.

N i s s 1 hat in einer eingehenden Darstellung seiner Methode die Bedeutung der einzelnen M a ß n a h m e n sowie die verschiedenen Fehlerquellen ausführlich d a r gelegt. (Enzykl. d. mikr. Technik. Artikel: Nervensystem.) 1744. V e r e i n f a c h t e N i s s l - M e t h o d e. Vorbereitung: Das in Alk o h o l n a c h § 1743 a) fixierte M a t e r i a l w i r d in A l k o h o l - C e l l o i d i n e i n g e b e t t e t . D i e S c h n i t t e w e r d e n i n 70°/oigem A l k o h o l a u f g e f a n g e n u n d k ö n n e n h i e r i n a u c h l ä n g e r e Zeit a u f g e h o b e n w e r d e n . — Färbung: 1. D i e S c h n i t t e k o m m e n in a u s g e b r e i t e t e m Z u s t a n d i n e i n e l°/ooige w ä ß r i g e L ö s u n g v o n T o l u i d i n b l a u o d e r T h i o n i n , die s o d a n n 2 m a l b i s z u r D a m p f b i l d u n g e r h i t z t w i r d . — 2. N a c h E r k a l t e n a b s p ü l e n in dest. W a s s e r u n d 70°/oigem A l k o h o l . — 3. D i f f e r e n z i e r e n in 9 6 % i g e m A l k o h o l . — 4. D u r c h z i e h e n d u r c h abs. A l k o h o l . X y l o l . B a l s a m . O d e r : 1. F ä r b e n w i e oben. — 2. D i f f e r e n z i e r e n i n A n i l i n ö l - A l k o h o l n a c h § 1743 c). — 3. A u f z i e h e n auf d e n O b j e k t t r ä g e r , a b t r o c k n e n m i t F i l t r i e r p a p i e r ; a u f h e l l e n i n C a j e p u t ö l . — 4. A b g i e ß e n d e s Öles; a b t r o c k n e n ; X y l o l . B a l s a m . — Ergebnis: T i g r o i d s c h o l l e n i n t e n s i v b l a u o d e r v i o l e t t , e b e n s o K e r n m e m b r a n u n d Kernkörperchen, Cytoplasma der Ganglien- und Gliazellen blaßblau, faserige nervöse Substanz ungefärbt. Als Kriterium f ü r das Gelingen der Methode hat nach S p i e l m e y e r zu gelten, »daß unter normalen Bedingungen zwischen den intensiv blau gefärbten Zellleibsbestandteilen u n g e f ä r b t e Züge (Fibrillenbahnen) sichtbar sein müssen«. B e m e r k u n g e n : Die Einbettung in Celloidin hat vor dem UneingebettetSchneiden u. a. den Vorteil, daß in den Schnitten auch die Pia erhalten bleibt. — Bei Präparaten, die sich schwerer färben, z. B. älteres Material, Formolmaterial, muß die Farblösung evtl. längere Zeit (30—60 Minuten) e r w ä r m t werden. Derartig gefärbte P r ä p a r a t e sollen auch haltbarer sein. —• Die Differenzierung in Anilin-Alkohol geht rascher vor sich als die in Alkohol. Mit Methylalkohol vergällter Alkohol differenziert rascher als reiner Alkohol. —• Sowohl Anilin wie Cajeputöl müssen sehr sorgfältig entfernt werden, .da zurückgelassene Spuren die Haltbarkeit sehr ungünstig beeinflussen. — Nach dem Eindecken soll der Canadabalsam möglichst rasch erhärten. S p i e l m e y e r empfiehlt zu diesem Zwecke die P r ä p a r a t e m e h r m a l s durch die F l a m m e zu ziehen u n d d a n n das Deckglas anzudrücken. 1745. U m F o r m o 1 m a t e r i a l f ü r die F ä r b u n g e i n i g e r m a ß e n b r a u c h b a r z u m a c h e n , m ü s s e n d i e B l ö c k e z u e r s t 1—2 T a g e g e w ä s s e r t u n d d a n n w o c h e n od'er b e s s e r m o n a t e l a n g i n m e h r m a l s g e w e c h s e l t e n 70- u n d 96°/oigen A l k o h o l gelegt werden. Hierauf Celloidineinbettung. S p i e l m e y e r (30) e m p f i e h l t a u c h die C e l l o i d i n s c h n i t t e n o c h f ü r 24 S t u n d e n i n d e n B r u t o f e n i n 70°/oigen A l k o h o l zu stellen, d a n n m i t T h i o n i n zu f ä r b e n u n d m i t A n i l i n - A l k o h o l zu d i f ferenzieren. Gefrierschnitte von Formolmaterial kommen f ü r 2 Tage im Brutofen in 70°/oigen Alkohol. Dann F ä r b u n g mit Kresylviolett (l°/o). Differenzieren mit Alkohol (S p i e 1 m e y e r). 1746. C h r o m i e r t e s M a t e r i a l macht T s i m i n a k i s dadurch verwendbar, daß er die Schnitte zuerst entchromt (Kaliumpermanganat Vs0/oig 5 Minuten. — Dest. Wasser. — l°/oige Oxalsäure + l°/oige Natriumsulfitlös. Sä 10—15 Minuten. —• Auswaschen in fließendem und in dest. Wasser 1 Stunde. Das Ganze 2mal wiederholen). — D a n n F ä r b u n g in 0,5°/oiger Toluidinblaulösung 4 Minuten. — Auswaschen 10 Minuten. — Differenzieren in Anilinöl 30 + 96°/oiger Alkohol 70 Teile (oft wechseln) 1—2 Stunden. — Terpineol. Xylol. Balsam. 1747. S t u r m a n n (15) fixiert statt in Alkohol in der Carnoyschen Flüssigkeit u n d bekommt dabei besonders bei embryonalem Material, das anders leicht schrumpft, bedeutend bessere Resultate. Ferner bettet er in P a r a f f i n ein. Färbung mit Toluidinblau oder nach Nissl. Nach der F ä r b u n g hellt St. in Bergamottöl auf, übergießt mit d ü n n e m Xylol-Canadabalsam u n d läßt soviel als möglich ab-

§ 1748—1750.

Ganglienzellen (Kern- und Tigroidsubstanz)1

399

tropfen. Dann läßt man 24 Stunden in horizontaler Lage vor Staub gesichert bei Zimmertemperatur und hierauf noch 6 Stunden bei 58° trocknen, ohne ein Deckglas aufzulegen (trocknet man gleich in der Wärme, so bilden sich Schlieren). Später wird das Präparat noch mit einer 10°/oigen filtrierten Gelatinelösung Übergossen, die man wieder abtropfen läßt. Nach 1—2 Tagen ist die Schicht trocken. Nach Sturmann bleichen derartig eingedeckte Präparate nicht aus. ß) Weitere Methoden zur Färbung der K e r n - und Tigroidsubstanz 1748. Durch die Untersuchungen von P i s c h i n g e r wurde erwiesen, welche Bedeutung dem PH der Farblösung für die Darstellung der Kerne w i e der T i groidschollen der Ganglienzellen zukommt. Mit der nachstehenden, von P i s c h i n g e r angegebenen gepufferten Farblösung gelingt es in einfacher Weise sämtliche auch nur in Spuren vorhandenen Nissl-Schollen ganz gleichmäßig zur Darstellung zu bringen. Außerdem sind Basichromantin und Kernkörperchen gefärbt. Fixierung in 96%igem Alkohol. Paraffineinbettung. Die entparaffinierten Schnitte kommen für 10 Minuten aus dest. Wasser in folgende Farblösung: 1,0 ccm n-Es^igsäure, 1,0 ccm n-Natriumacetat, 0,064 g Methylenblau pur., dest. Wasser auf 100 ccm (PH der Farblösung 4,65). Nach der Färbung wird in der gleichen Pufferlösung ohne Farbstoff abgespült; dann fixieren in 4°/oiger A m m o niummolybdatlösung. Dest. Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. Nach P i s c h i n g e r ist die Methode gleichmäßiger und sicherer als die OriginalNissl-Methode, da das Abtrocknen der Schnitte wie jede andere nicht genau bestimmte Handlung wie z. B. das Differenzieren wegfällt. Weiterhin entspricht sie noch vollkommener den Forderungen einer Äquivalentmethode, da sie genauestens reproduzierbar und physikalisch-chemisch bestimmt ist. — Das Ph von 4,65 der Farblösung kann auch nach § 1265 mit Acetat-Veronalpuffern hergestellt werden. 1749. Eine sehr schöne und reine Färbung der Tigroidsubstanz (und des Chromatins) ist an Paraffinschnitten mit Gallocyanin-Chromalaun zu erzielen (E i n a r s o n 32). Die Herstellung der Farblösung erfolgt nach § 734. PH der Farblösung etwa 2,09. Färbedauer 2 4 — 4 8 Stunden. Die Färbung gelingt nach der Mehrzahl der üblichen -Fixierungsgemische, sofern diese die Tigroidsubstanz erhalten, z. B. Alkohol, Alkohol-Formol, Formol, SublimatFormol-Alkohol, Zenker u. a. Von besonderem Vorteil ist neben der Elektivität der Färbung ihre leichte Ausführung, ferner die große Haltbarkeit der Präparate, das gänzliche Ungefärbtbleiben der Faserstrukturen und der progressive Verlauf der Färbung. Auch die pathologischen Veränderungen w i e Tigrolyse, Vakuolisation, Verklumpung usw. kommen klar zur Darstellung (E i n a r s o n). Erhöht man das Ph der Farblösung auf 2,09—4,46, so kommt es zu einer zunehmenden Mitfärbung sowohl von Gliazellen und Faserstrukturen als auch von Cytoplasma und Fortsätzen. Bei einem p'h von 2,60 erhielten E i n a r s o n und B e n t s e n (39) an Tiermaterial ein Zellbild von hoher Qualität. Zur Bereitung der Lösung versetzen die Autoren die 5 Min. lang gekochte Gallocyaninlösung mit der gleichen Menge der nachfolgenden Soda-Boraxlösung. Färbedauer 48 Stunden. Herstellung der Soda-Borax-Lösung: Lösung A : 5,30 g NaaCOis auf 1 Liter dest. Wasser. — Lösung B: 19,10 g Na 2 B 4 0 7 + 10 H 2 0 auf 1 Liter dest. Wasser. — 97,3 ccm A und 2,7 ccm B geben die gewünschte alkalische Pufferlösung von pH 11. 1750. Zur Färbung von Celloidinschnitten (aber auch Paraffinschnitten) empfehlen E i n a r s o n und B e n t s e n (39) eine Anthracenblau-Alum i n i u m s u l f a t - C h r o m a l a u n l ö s u n g . Herstellung: 5 g Aluminiumsulfat und 5 g Chromalaun werden in 100 ccm dest. Wasser gelöst, dann 0,5 g Anthracenblau zugesetzt und das Ganze 10—15 Minuten gekocht. Nach Erkalten

400

Zentralnervensystem

§

1751—1755.

wird filtriert. P H 1 , 9 5 . Man färbt progressiv 2 4 — 4 8 Stunden. Dann auswaschen in dest. Wasser, Alkoholreihe, Karbolxylol, Xylol, Balsam.

J e nach Zusatz von n-HCl oder der in § 1749 angegebenen alkalischen Pufferlösung läßt sich das Färbeergebnis verschieden einstellen. Ferner zeigte sich, daß das Optimum für die einzelnen Hirnregionen verschieden ist. Für Großhirn ist ein P H von 1 , 9 5 — 2 , 5 9 , für Mittelhirn, Oblongata, Kleinhirn ein solches von 2 , 6 8 bis 2 , 7 3 , für Rückenmark von 2 , 7 3 — 3 , 2 5 empfehlenswert. Nähere Mengenangaben im Original.

1751. Um an Paraffin- und Celloidinschnitten von chromiertem Material gute Kernfärbungen für cytoarchitektonische Studien zu erhalten, verwendet K r y s p i n - E x n e r (41) folgende Lösung: 5 g Eisenalaun (violette Kristalle) und 5 g Chromalaun werden nacheinander in 200 ccm dest. Wasser gelöst; dann wird 0,5 g Anthracenblau mit wenig dest. Wasser zu einem Brei verrieben und der Alaunlösung unter Umschwenken zugesetzt. Die Mischung wird 15 Min. lang gekocht. Nach Erkalten wird mit dest. Wasser auf 200 ccm aufgefüllt und 1 ccm konz. Salzsäure zugesetzt. Nach einigen Tagen wird filtriert und das Filtrat mit der gleichen Menge dest. Wasser verdünnt. Thymolzusatz. 2—3 Monate brauchbar. — Die nach Pal-Lustgarten (s. § 983) gebleichten, in dest. Wasser gewaschenen Schnitte kommen für 48 Stunden in die Farblösung, dann auswaschen in dest. Wasser, Alkohol usw. 1752. P- M a y e r (18) streckt Paraffinschnitte zuerst auf warmem Wasser und läßt sie dann ohne Lösung des Paraffins 24 Stunden auf einer der beiden nachfolgenden Lösungen schwimmen: T h i o n i n 2g, W e i n s t e i n s ä u r e l g , dest. Wasser 1000 ccm, oder P y r o n i n G 2 g, W e i n s t e i n s ä u r e 2 g, dest. Wasser 1000 ccm. (Um Schimmelbildung zu vermeiden, setzt man noch 2—3 ccm Formol zu.) Nach der Färbung fängt man den Schnitt mit dem Objektträger auf und läßt trocknen. Hierauf Xylol und Balsam od. dgl. Die Tigroidsubstanz färbt sich nach dieser Methode sehr scharf, auch nach Formolfixierung.

1753. H e l d fixiert 24 Stunden mit Pikrinschwefelsäure (vgl. auch § 312, auch Carnoysche Flüssigkeit gibt nach C o w d r y sehr gute Resultate), führt von 20°/oigem Alkohol allmählich bis zum abs. Alkohol, bettet in Paraffin ein und färbt unter leichtem Erwärmen die mit 30°/oigem Alkohol aufgeklebten dünnen Schnitte 2 Minuten i n E r y t h r o s i n l g ; Eisessig 2 Tropfen, dest. Wasser 150 ccm. Nach Auswaschen in Wasser kommen die Schnitte in ein Gemisch von 5°'/oigem Aceton in Wasser und der Nissischen M e t h y l e n b l a u l ö s u n g (ää), das man bei der Färbung bis zum Verschwinden des Acetongeruches erwärmt. Nach Erkalten differenziert man in 0,l°/oiger Alaunlösung, bis der Schnett wieder rötlich wird. Auswaschen in Wasser, abs. Alkohol, Xylol, Balsam. R e s u l t a t : Tigroidschollen und Nukleolus scharf dunkelblau, Protoplasma und Kern rötlich. 1754. Die Erscheinungsform der Nisslschollen wird durch die Art der Fixierungsflüssigkeit stark beeinflußt. Bei Anwendung von Zenkerscher Flüssigkeit ohne Eisessigzusatz treten sie als eine diffus im Protoplasma verbreitete granuläre Substanz hervor; bei Eisessigzusatz bilden sie gut abgegrenzte Schollen, die um so größer sind, je höher der Säurezusatz ist. Formol-Alkoholgemische stellen sie schärfer dar als Formol oder Alkohol allein (A. E. H o p k i n s 24). Bei Nuklealreaktion bleiben Nissl-Schollen wie Nukleolus des Kernes ungefärbt. Beide enthalten aber beträchtliche Mengen von Nukleinsäuren, die auch die charakteristische Basophilie bedingen. Diese Nukleinsäuren unterscheiden sich aber von den in den Chromosomen vorhandenen dadurch, daß sie als Kohlehydrat an Stelle von d-2-Ribodesose d-Ribose enthalten ( L a n d s t r ö m , C a s p e r s s o n und W o h l f a h r t 41).

1755. Zur differenten Darstellung von N i s s l - S c h o l l e n und g e l b e m

§ 1756—1759.

Ganglienzellen (Mitochondrien, Neurosomen)

401

P i g m e n t der Ganglienzellen wurde von B e t h e und F 1 u c k (38) eine exakte Methode ausgearbeitet, deren Einzelheiten im Original nachzusehen sind. Das Prinzip der Methode beruht darauf, daß zuerst die Nissl-Schollen mit gepufferter Farblösung dargestellt werden. Nach ihrer Untersuchung wird die Färbung in verdünnter Salzsäure wieder ausgewaschen und das Präparat mit 0,5°/oiger Sodalösung behandelt. Dadurch wird die Nissl-Substanz im alten PH-Bereich unfärbbar, während das Pigment seine Färbbarkeit behält. Die Färbung des Pigments tritt nur in einem ziemlich engen PH-Bereich ein und muß, da sie in Alkohol löslich ist, mit Ammoniummolybdat fixiert werden. Auf diese Weise lassen sich auch die kleinsten Pigmentkörnchen einschließlich ihrer Grundsubstanz erfassen. Es wird so an ein und derselben Zelle nacheinander das Nisslund das Pigmentbild erhalten. Das gelbe Pigment (= Abnutzungspigment) besteht nach den Untersuchungen von B e t h e und F 1 u c k aus einer wahrscheinlich eiweißartigen Grundsubstanz, einer in gewissen organischen Lösungsmitteln löslichen, mit Fettfarbstoffen färbbaren Substanz und einem gelben Farbstoff, welcher der Grundsubstanz anhaftet. Die Grundsubstanz färbt sich mit basischen Farbstoffen primär. Diese Färbung ist im Gegensatz zur primären Färbung der Nissl-Schollen nicht alkoholbestän-: dig. Die Grundsubstanz des Pigments und ihre Färbbarkeit sind alkalibeständig, während die primäre Färbbarkeit der Nissl-Schollen in alkalischen Bädern verschwindet. Der P/y-Bereich, in welchem sich elektiv die Nissl-Schollen und elektiv die Pigmentgranula färben, ist deutlich verschieden. Am weitesten im Sauren liegt der isoelektrische Punkt der Nissl-Substanz, dann kommt jener der Pigmentgrundsubstanz und nahe am Neutralpunkt der der Ganglienzellengrundsubstanz und der Fibrillen. c)

Mitochondrien

und

Neurosomen

1756. Zur Darstellung der Mitochondrien der Nervenzellen eignen sich die in § 969—999 angegebenen Methoden. 1757. Bei der in § 995 angeführten Methode färben sich die Mitochondrien hellrot, die N i s s l - S u b s t a n z grün oder blau, die N e u r o f i b r i l l e n hellbraun. Auch das K a n a l s y s t e m kann hervortreten. 1758. Ähnlich ist die Methode A l z h e i m e r s , der 24 Stunden in 10%>igem Alkohol fixiert und 8 Tage mit Flemmingscher Flüssigkeit (Eisessig nur 1 bis 2 Tropfen!) nachbehandelt. Die paraffinbefreiten Schnitte werden 1 Stunde bei 58° in gesättigter wässeriger S ä u r e f u c h s i n l ö s u n g gefärbt, kurz in dest. Wasser abgespült, bis keine Farbwolke mehr abgeht, für 10—20 Sekunden in eine Mischung von 30 ccm einer gesättigten alkoh. P i k r i n s ä u r e l ö s u n g und 60 ccm dest. Wasser eingetaucht, wieder mit Wasser abgespült und 20 bis 50 Minuten in einer gesättigten wässerigen Lösung von L i c h t g r ü n , die zur Hälfte mit dest. Wasser verdünnt ist, nachgefärbt. Dann kurz abspülen mit Wasser, mit Fließpapier abtrocknen und durch abs. Alkohol rasch in Xylol und Balsam. R e s u l t a t : Mitochondrien und Neurosomen leuchtend rot, NisslSubstanz grün; Zelleib der amöboiden Gliazellen grünlich, Glia- und Bindegewebsfasern rot. 1759. Die von H e l d mit Erythrosin-Methylenblau (§ 1753) dargestellten Neurosomen entsprechen zum großen Teil Mitochondrien. Bei Anwendung einer für die Erhaltung der Mitochondrien ungeeigneten Fixierungsflüssigkeit (z. B. Carnoyscher Flüssigkeit) bekommt man dieselben in veränderter, scholliger Form, während gut fixierte Mitochondrien der Nervenzellen scharf konturierte Körnchen- und Stäbchenform besitzen. Ein anderer Teil der Neurosomen entspricht nach C o w d r y Körperchen unbekannter Natur. Möglicherwelse entstehen diese durch Umwandlung von Mitochondrien. 26

R o m e i s , M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u f l .

§ 1760—1764.

Zentralnervensystem

402 d)

Golgi-Substanz

1760. Z u r D a r s t e l l u n g d e r G o l g i - S u b s t a n z ( A p p a r a t o r e t i c o l a r e i n t e r n o , P h o r m i e n , C e n t r o p h o r m i e n ) i n den G a n g l i e n z e l l e n v e r g l e i c h e m a n § 1007—1025. 1761. Außer diesen auch allgemein anwendbaren Methoden wird öfters noch eine ältere Methode Ramön y C a j a 1 s (07 u. 08) gebraucht, die jedoch nicht so sicher ist wie die in § 1009 oder 1020 und 1022 angegebenen Methoden. e) D i e

Darstellung

der Ganglienzellen ihrer Fortsätze

einschließlich

a) D a r s t e l l u n g d u r c h M e t a l l i m p r ä g n a t i o n 1762. U n t e r d e n einschlägigen M e t h o d e n s t e h e n an e r s t e r Stelle die S i l b e r i m p r ä g n a t i o n s m e t h o d e n v o n G o 1 g i , die auf d e r B i l d u n g v o n Silb e r v e r b i n d u n g e n b e r u h e n , die sich i n einzelnen G a n g l i e n z e l l e n u n d d e r e n F o r t s ä t z e n (häufig a b e r a u c h in Gliazellen, G e f ä ß e n u n d a n d e r e n Gebilden) n i e d e r schlagen. V o n d e n v e r s c h i e d e n e n , v o n G o 1 g i a n g e g e b e n e n M e t h o d e n ist v o r a l l e m die s o g e n a n n t e » r a s c h e M e t h o d e « g e b r ä u c h l i c h , die z u d e m s i c h e r e r a r b e i t e t als die »langsame Methode«. In vielen F ä l l e n k a n n sie ü b r i g e n s d u r c h die e i n f a c h e r e u n d leichter g e l i n g e n d e S i l b e r m e t h o d e von O. S c h u l t z e (siehe § 1808) e r s e t z t w e r d e n . Ein N a c h t e i l e u n d gleichzeitig a u c h w i e d e r ein V o r z u g d e r G o l g i - M e t h o d e ist, d a ß sich die I m p r ä g n i e r u n g n i e m a l s auf alle, s o n d e r n i m m e r n u r auf einzelne Zellen e r s t r e c k t . D a d u r c h ist das Bild z w a r u n v o l l s t ä n dig, gleichzeitig a b e r auch k l a r e r , als es bei d e r D a r s t e l l u n g a l l e r Zellen sein würde. 1763. Die G o l g i - M e t h o d e n h a b e n n i c h t n u r f ü r die I m p r ä g n i e r u n g d e r N e r v e n z e l l e n g r o ß e B e d e u t u n g erlangt, sie k o m m e n auch zur D a r s t e l l u n g v o n N e r v e n e n d i g u n g e n , S e k r e t k a p i l l a r e n , D r ü s e n g ä n g e n , Z e l l g r e n z e n u. dgl. h ä u f i g z u r A n w e n d u n g . Zweifellos leisten die Methoden, auch w e n n sie g e w i s s e r m a ß e n n u r S c h a t t e n b i l d e r l i e f e r n , in dazu g e e i g n e t e n F ä l l e n z u r S i c h t b a r m a c h u n g der v e r s c h i e d e n s t e n G e w e b e s e l e m e n t e Vorzügliches. N a t ü r l i c h m u ß m a n sich b e i i h r e r A n w e n d u n g stets dessen b e w u ß t bleiben, daß die D a r s t e l l u n g auf e i n e r N i e d e r s c h l a g s b i l d u n g b e r u h t , die u n t e r U m s t ä n d e n D i n g e v o r t ä u s c h e n k a n n , die i n W i r k l i c h k e i t n i c h t v o r h a n d e n sind. A u c h h a t m a n i m m e r zu b e a c h t e n , d a ß d i e d a r g e s t e l l t e Zelle o d e r S t r u k t u r m ö g l i c h e r w e i s e n u r u n v o l l s t ä n d i g i m p r ä g n i e r t ist. D a z u k o m m t , d a ß m a n bis z u e i n e m gewissen G r a d auf den Z u f a l l a n g e w i e s e n ist, w e l c h e G e b i l d e i m p r ä g n i e r t w e r d e n , d a die B e d i n g u n g e n , u n t e r w e l c h e n e i n e N i e d e r s c h l a g s b i l d u n g erfolgt, l e i d e r noch n i c h t h i n r e i c h e n d b e k a n n t sind. Diese U m s t ä n d e b r i n g e n es m i t sich, daß die D e u t u n g d e r GolgiP r ä p a r a t e ein gewisses M a ß von V o r k e n n t n i s u n d E r f a h r u n g e r f o r d e r t , u m I r r t ü m e r zu v e r m e i d e n . V o n d e n n a c h f o l g e n d a n g e g e b e n e n V o r s c h r i f t e n e m p f e h l e ich b e s o n d e r s die von B u b e n a i t e (§ 1773), m i t der ich b e i j u n g e n w i e alten, b e i k u r z w i e l a n g fixierten G e h i r n e n m i t S i c h e r h e i t g u t e R e s u l t a t e erhielt. Über die Theorie des Golgi-Verfahrens s. Z e i g e r (38). ad) Die A u s f ü h r u n g d e r G o l g i - O r i g i n a l - M e t h o d e 1764. R a s c h e M e t h o d e v o n G o l g i . 1. E i n l e g e n e i n e r A n z a h l von m ö g l i c h s t f r i s c h e n G e w e b e s t ü c k c h e n in ein G e m i s c h v o n 40 ccm einer 2,5 (bis 3,5°/oigen [C a j a l ] ) K a l i u m b i c h r o m a t l ö s u n g u n d 10 ccm e i n e r l°/oigen O s m i u m s ä u r e bei 20—25° C (Glasstopfen!). Die Stückchen sollen nicht zu groß und nicht zu klein sein; am besten 2—3 mm dick und 5—10 mm2 Fläche. Man legt sie in brauner Flasche auf etwas Glaswolle,

§ 1765—1766.

Ganglienzellen

(Golgimethoden)

403

damit die Flüssigkeit von allen Seiten eindringen kann. Die oben angegebene Flüssigkeitsmenge genügt f ü r 5—6 Stückchen. Die Zeitdauer der Einwirkung läßt sich im voraus nicht angeben, da sie bei jedem Objekt verschieden ist. Man legt daher i m m e r eine größere Zahl von Stückchen ein und nimmt vom 2.—7. Tag in Abständen von e t w a 12 Stunden einige davon aus der Lösung.

2. Abtupfen mit Filtrierpapier und Eintauchen in eine geringe evtl. mehrmals zu erneuernde Menge einer 0,75°'/oigen Silbernitratlösung, bis kein Niederschlag mehr erscheint; dann Einlegen in 100 ccm einer 0,75°/oigen Silbernitratlösung für 1—2 Tage (nach Cajal 1—6 Tage) bei Zimmertemperatur oder 35" C (nicht höher) am besten im Dunkeln. 3. Auswaschen in 40°/oigem Alkohol, der mehrmals zu erneuern ist (1 bis 2 Stunden). 4. Übertragen in 80°/o und 96°/oigen Alkohol. 5. Einklemmen in gehärtete Leber (s. § 134) oder Aufkleben mit Gummi arabicum (s. § 1743, b) und Schneiden unter Alkoholbefeuchtung mit dem Rasiermesser oder Mikrotom (Schnittdicke 20—100/igen Alkohol über Karbolxylol in Balsam gebracht. ß) Darstellung durch Färbung 1778. Zur färberischen Hervorhebung g r o b e r G a n g l i e n z e l l f o r t s ä t z e und größerer Faserzüge ist die alte Methode von G e r l a c h (71, 72) noch immer empfehlenswert. W i c h t i g f ' ü r i h r G e l i n g e n i s t , d a ß die P r ä p a r a t e v o r i h r e r F ä r b u n g in C a r m i n n i c h t mit A l k o h o l i n B e r ü h r u n g k o m m e n . — Ausführung: 1. Fixierung in Müllerscher Flüssigkeit oder 3—5°/oiger Kaliumbichromatlösung.

Die Fixierungsdauer ist sehr verschieden. Vogel- und Froschhirn brauchen einige Wochen. Menschenhirn und Rückenmark Monate, ja Jahre. Die Härtungszeit ist nicht proportional der Größe des Gehirns.

2. Herstellung von Gefrierschnitten, mehrstündiges Auswaschen derselben in Wasser.

3. F ä r b e n in v e r d ü n n t e r ammoniakalischer Carminlösung. 2 4 — 4 8 Stunden. Die richtige Bereitung der Lösung ist von großer Wichtigkeit. Man verreibt 1 g Carmin, gibt 100 ccm dest. Wasser zu und tropft so viel Salmiakgeist zu, bis sich der Farbstoff völlig gelöst hat. Die Lösung muß dann in einem offenen Glas so lange reifen, bis der Ammoniakgeruch fast verschwunden ist. Nur lange gestandene Lösungen sind brauchbar. Die Stammlösung wird zum Gebrauch mit dest. Wasser so stark verdünnt, daß die Schnitte 24—48 Stunden zur Färbung benötigen. Die Carminlösung kann wiederholt gebraucht werden; sie wird mit der Zeit eher besser.

4. Differenzieren der Schnitte in schwach essigsaurem Wasser: 1—2 Stunden. 5. Auswaschen, steigender Alkohol, Xylol, Balsam.

§ 1779—1781.

Neurofibrillen (Molybdänmethode)

407

Ergebnis: Die Ganglienzellen sind einschließlich i h r e r Fortsätze intensiv rot g e f ä r b t . Ebenso die Achsenzylinder der N e r v e n f a s e r n u n d die Zellkerne. Das Gliafasergewebe ist rosa gefärbt, die Markscheiden bleiben u n g e f ä r b t . F ä r b t m a n mit H ä m a t o x y l i n vor, d a n n b e k o m m t m a n die K e r n e different in blauem Tone g e f ä r b t (s. ü b e r die Methode auch F o r e 1 (77) u n d S c h w a l b e (01). 1779. Die D a r s t e l l u n g d e r G a n g l i e n z e l l e n im Z e n t r a l n e r v e n system gelingt auch mit Hilfe der v i t a l e n M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g (s. auch § 1929ff.). Beim Frosch spritzt man a m besten nach K r a u s e (23) nach Ö f f n u n g des T h o r a x vom pulsierenden B u l b u s cordis aus eine 2°/oige Lösung von Methylenblau in physiologischer Kochsalzlösung (Methylenblau rectif. n. Ehrlich zu I n j e k t i o n e n in vitales Gewebe, Dr. Hollborn, Leipzig) ein, bis das Tier tiefblau ist. »Man k a n n des G u t e n gar nicht zu viel tun.« Nach 30—70 Min u t e n n i m m t m a n G e h i r n - und R ü c k e n m a r k h e r a u s u n d h ä n g t sie in einer f e u c h t e n K a m m e r auf. 1—2 S t u n d e n später ist das M a x i m u m der F ä r b u n g erreicht. Man fixiert die F ä r b u n g durch Einlegen der Organe in toto in 5—8°/oige Lösung von m o l y b d ä n s a u r e m A m m o n i u m (12—24 Stunden), wäscht in dest. Wasser aus u n d b r i n g t d u r c h Alkohol usw. rasch in P a r a f f i n . Bei K a n i n c h e n ( K r a u s e 21) k a n n der Farbstoff e n t w e d e r intravenös, subk u t a n oder i n t r a k a r d i a l v e r a b r e i c h t werden. Im ersten Falle injiziert m a n dem m i t C h l o r a l h y d r a t b e t ä u b t e n T i e r alle 5 M i n u t e n in die vena femoralis einer l°/oigen Methylenblaulösung, die mit gleichen Teilen einer p h y siologischen Kochsalzlösung v e r d ü n n t und auf K ö r p e r w ä r m e gebracht ist. Nach einer S t u n d e spritzt m a n die u n v e r d ü n n t e Lösung ein u n d f ä h r t damit fort, bis das Tier u n t e r K r ä m p f e n stirbt. Die F ä r b u n g w i r d u m so besser, j e länger die Einspritzungen v e r t r a g e n werden. Bei s u b k u t a n e r A n w e n d u n g injiziert m a n in h a l b s t ü n d i g e n Zwischenräumen 10 ccm einer 5°/oigen Methylenblaulösung u n t e r die R ü c k e n h a u t . T r i t t nach der 4. oder 5. Injektion, wie es gewöhnlich der F a l l ist, der Tod ein, so spritzt m a n nach Eröffnen der B r u s t h ö h l e vom Herzen aus in die Aorta noch weitere 50 ccm einer l°/oigen Lösung ein. Nach einstündigem Liegen wird Gehirn und R ü c k e n m a r k h e r a u s g e n o m m e n u n d in toto in m o l y b d ä n s a u r e m A m m o n i u m fixiert usw. f) D a r s t e l l u n g

der

Neurofibrillen

a) Molybdänmethode 1780. Die M o l y b d ä n v e r f a h r e n v o n D o n a g g i o (96, 99, 04) und B e t h e (00,03) b e r u h e n darauf, daß die Neurofibrillen aus einer Lösung von A m m o n i u m m o l y b d a t große Mengen des Salzes speichern u n d daß bei der darauffolgenden E i n w i r k u n g eines basischen Farbstoffes zwischen molybdänsalzreichen S t r u k t u r e n u n d dem Farbstoff eine schwer lösliche V e r b i n d u n g zustande k o m m t . 1781. D a r s t e l l u n g d e s e n d o z e 11 u 1 ä r e n N e u r o f i b r i l l e n n e t z e s n a c h D o n a g g i o (06). F ü r Groß- u n d K l e i n h i r n empfiehlt D o n a g g i o von den verschiedenen, von i h m angegebenen Methoden besonders ein als Methode IV bezeichnetes V e r f a h r e n , das auch bei anderen nervösen Z e n t r e n und bei Ganglien g u t e Erfolge gibt. Vorbehandlung: 1. F i x i e r u n g ca. 5 m m dicker Stückchen in r e i n e m P y r i d i n f ü r 7 Tage. Nach 5—6 Stunden wird gewechselt, dann nochmals nach 2 Tagen. Auf 1 ccm Gewebe ist nicht unter 20 ccm Pyridin zu rechnen. Die Fixierungsdauer läßt sich auf 3 Tage abkürzen, wenn man die ersten 24 Stunden in Pyridin-Salpetersäure

408

Zentralnervensystem

§ 1782.

fixiert (Pyridin 72 ccm -+- 50°/oige Salpetersäure 28 ccm). Das Gemisch ist nach 5 Stunden zu erneuern; dann 48 Stunden in reines Pyridin. 2. Sorgfältiges Auswaschen in dest. Wasser 24 Stunden. Das letzte Waschwasser darf nicht m e h r nach Pyridin riechen. 3. Einlegen in frisch bereitete 4°/oige Ammoniummolybdatlösung, der m a n auf 100 ccm 4 Tropfen Salzsäure zusetzt, 24 Stunden. Der beim Zusatz der Salzsäure entstehende Niederschlag geht beim Umschütteln gleich wieder in Lösung. Die Lage der Stückchen ist nach einigen Stunden zu wechseln. 4. Abspülen der Stückchen in 1—2 Portionen dest. Wasser. 95°/oiger Alkohol (6 Stunden), 2 Portionen absol. Alkohol (12 Stunden). Benzol. Paraffineinbettung (nicht über 52° C). b) Färbung: Die ersten Schnitte des Blockes w e r d e n verworfen, die folgenden mit dest. Wasser oder trocken m i t dem Pinsel aufgeklebt (Schnittdicke 3 bis 7¡u). Sie kommen durch Xylol und Alkohol f ü r 15—30 Sek. (auf keinen Fall länger als 1 Min.!) in dest. Wasser, dann in frisch bereitete wässerige Thioninlösung 1 :40 000 (Thionin von Merk! wichtig). Die Schnitte werden in einer ersten Portion der Farblösung etwa 1 Min. lang bewegt, dann in eine zweite übertragen, bis der richtige Färbegrad erreicht ist, was manchmal 30 Min. oder länger dauern kann. Die Färbung vollzieht sich in drei Phasen. In der ersten kommt es zu einer blassen diffusen Blaufärbung von weißer wie grauer Substanz. In der zweiten nimmt die graue Substanz eine lebhafte violette Farbe an. Die Zellkerne erscheinen blau. In der dritten wird die graue Substanz rötlich-violett, während die weiße abbleicht und nur einen bläulichen Ton bewahrt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Neurofibrillen am besten gefärbt, während die Zellkerne nun völlig entfärbt sind. Nach der F ä r b u n g kommen die Schnitte einige Sekunden in dest. Wasser, d a n n in SS'/oigen Alkohol, in dem sie wenige Sek. bis Min. differenziert werden. Dann zurück in dest. Wasser, das 2—3mal erneuert wird, bis es frei von Alkohol ist, und zur Fixierung f ü r 15—30 Min. in 4°'/oige Ammoniummolybdatlösung. Schließlich auswaschen in 3—4 Portionen dest. Wasser (15—20 Min.), 95°'/oiger und absol. Alkohol, Xylol, abtrocknen mit Filtrierpapier, Balsam (s. u.). — Ergebnis: Neurofibrillen violettrot, auf blaßrosa g e f ä r b t e m Untergrund. D o n a g g i o empfiehlt zum Einschluß einen Dammarbalsam, der rasch erhärtet und die Färbung gut erhält. Man löst dazu 12 g Dammarharz in 100 ccm Xylol und fügt nach vollständiger Lösung unter Schütteln 10 ccm Petroläther zu. Nicht filtrieren, sondern absetzen lassen. 1782. N e u r o f i b r i l l e n d a r s t e l l u n g n a c h B e t h e . a) Vorbehandlung: 1. 4—10 m m dicke Stückchen aus dem Zentralnervensystem werden f ü r 24 Stunden in 3—7°/oiger Salpetersäure (spez. Gew. 1,40) fixiert. F ü r Fibrillenf ä r b u n g nimmt man die schwächere, f ü r Golgi-Netze die stärkere Konzentration. 2. Ohne Spülen ü b e r t r a g e n in 95°'/oigen Alkohol f ü r 24 Stunden. 3. Einlegen in eine Mischung von Ammoniak (spez. Gew. 0,95) 1 Teil, dest. Wasser 3 Teile, 96°/oiger Alkohol 8 Teile. 24 Stunden. 4. 96% Alkohol 3—6 Stunden. 5. Auf 24 Stunden in eine Mischung von Salzsäure (spez. Gew. 1,18) 1 Teil, dest. Wasser 3 Teile, 96°/oiger Alkohol 8—12 Teile. 6. 96%iger Alkohol 3 bis 6 Stunden. 7. Dest. Wasser 2—6 Stunden. 8. 24 Stunden in eine 4°'/oige wässerige Lösung von Ammon. molybdaenic. (weißes Präparat). Bei all diesen Prozeduren soll die T e m p e r a t u r 20° C nicht übersteigen. 9. 96%iger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, Paraffin. Trockenes Aufkleben der 5 — d i c k e n Schnitte m i t Eiweiß, nicht mit Wasser, da sonst das Molybdän herausgelöst wird. b) Färbung: Die durch Alkohol in Wasser gebrachten aufgeklebten Schnitte Werden gut (nach G a r i a e f f n u r wenig) mit dest. Wasser abgespült; sodann

§ 1783—1784.

Neurofibrillen (Goldmethoden)

409

w i r d der O b j e k t t r ä g e r u n t e n abgetrocknet, auf die Schnitte 1—2 ccm Wasser geschichtet u n d so f ü r 2—10 M i n u t e n (Ausprobieren!) z u r Differenzierung i n d e n T h e r m o s t a t (58—60°) gelegt. D a n n Abgießen des Wassers, k u r z e s Spülen, A u f s c h i c h t e n einer Toluidinblaulösung (1 :3000), 10 M i n u t e n F ä r b e n im T h e r mostaten, A b s p ü l e n m i t Wasser, bis keine F a r b w o l k e n m e h r abgehen, abs. A l kohol, Xylol, C a n a d a b a l s a m . ( H a l t b a r k e i t der P r ä p a r a t e , w e n n Xylol u n d Can a d a b a l s a m ganz w a s s e r f r e i , 1 /i—4 Jahre.) Ergebnis: Bei r i c h t i g e r F ä r b u n g sind die Neurofibrillen sehr scharf violett gefärbt. Der Ausfall der Färbung hängt davon ab, daß die Differenzierung mit warmem Wasser zum richtigen Zeitpunkt unterbrochen wird. Die Schnelligkeit des Vorgangs wird von der Wassermenge, der Molybdänmenge im Gewebe und der Dauer der Wärmeeinwirkung bestimmt. Um das Optimum abzuschätzen, differenziert man drei gleiche Präparate 2, 5 und 8 Minuten lang. Bei richtiger Färbung sind nur Neurofibrillen und Kerne gefärbt. Niederschlag auf der Oberfläche spricht für zu kurze, blasse Fibrillenfärbung für zu lange Differenzierung. Tritt die Entfärbung schon vor 2 Minuten ein, so differenziert man statt mit Wasser mit Molybdänlösung (1 :2500—5000) oder färbt mit stärkerer Toluidinblaulösung (1 :1000); ist sie nach 10 Minuten noch nicht genügend, so erhöht man die Wassermenge. Am leichtesten gelingt die Fibrillenfärbung bei Vorderhornzellen von Mensch, Hund, Kaninchen, die Darstellung der Golgihetze an den Zellen des Nucleus dentatus und der Olivenkerne. In peripheren Nerven gelingt die Darstellung der Neurofibrillen mit Hilfe dieser Methode nicht (s. auch § 1902).

ß ) G o l d m e t h o d e n z u r Neurofibrillendarstellung 1783. H a u p t s ä c h l i c h bei Wirbellosen ist z u r D a r s t e l l u n g der l e i t e n d e n E l e m e n t e des N e r v e n s y s t e m s die G o l d - M e t h o d e von v. A p ä t h y (97a) häufig in Gebrauch, die m a n e n t w e d e r auf f r i s c h e oder auf v o r h e r fixierte O b j e k t e a n w e n d e t . I m e r s t e r e n F a l l e spricht m a n von Vorvergoldung, i m l e t z t e r e n von Nachvergoldung. Die M e t h o d e ist, wie L o n d o n , ein Schüler Apäthys, sagt, s e h r leicht a u s z u f ü h r e n , gibt aber häufig u n b e f r i e d i g e n d e Resultate, sogar in d e n e r f a h r e n s t e n H ä n d e n ; jedoch sind v o n 100 P r ä p a r a t e n i m m e r einige t a u g lich, u n d diese sind d a n n so schön, daß sie d e n V e r l u s t an Zeit u n d M ü h e v e r gelten. A m leichtesten gelingt sie an Wirbellosen (Hirudineen), w e s h a l b m a n sie zweckmäßig h i e r a n einübt. Im allgemeinen ist die Methode d u r c h die sicherer arbeitenden Silberimprägnationsmethoden überholt. 1784. a) v. A p ä t h y s M e t h o d e der Vor Vergoldung. Kleine Objekte, n a m e n t l i c h d ü n n e M e m b r a n e n , k o m m e n auf m i n d e s t e n s 2 S t u n d e n im D u n k e l n in eine l®/oige L ö s u n g von A u r u m chlorat. flav., d a n n o h n e A u s w a s c h e n in e i n e l°/oige Lösung von A m e i s e n s ä u r e (spez. Gew. 1,223), worauf sie sofort d e r a r t d e m Lichte f ü r 6—8 S t u n d e n ausgesetzt w e r d e n , d a ß sie von allen Seiten v o n L i c h t s t r a h l e n d u r c h d r u n g e n w e r b e n . Die A m e i s e n s ä u r e ist allenfalls zu er-, n e u e r n . Einschluß a m b e s t e n in G u m m i s i r u p oder konz. Glyzerin. b) v. A p ä t h y s M e t h o d e d e r Nachvergoldung. M a n fixiere bei W i r b e l t i e r e n in S u b l i m a t - O s m i u m (1 Vol. gesättigte S u b l i m a t l ö s u n g in 1 /2°/oige Kochsalzlösung + 1 Vol. l°/oige Osmiumsäurelösung) 24 S t u n d e n , w a s c h e n in oft e r n e u e r t e m dest. Wasser, alsdann in wäss. J o d j o d k a l i u m l ö s u n g (1 g K J u n d V2 g J auf 100 ccm dest. Wasser) 12 Std. Weiter wie nach e i n f a c h e r S u b l i m a t f i x i e r u n g . Schließlich w i r d d u r c h C h l o r o f o r m mit P a r a f f i n d u r c h t r ä n k t , geschnitten u n d mit Wasser a u f g e k l e b t . Bis z u m D u r c h t r ä n k e n m i t P a r a f f i n w i r d i m D u n k e l n gearbeitet. Die Schnitte k o m m e n d u r c h C h l o r o f o r m u n d Alkohol f ü r

410

Zentralnervensystem

§ 1785—1786.

m i n d e s t e n s 6 S t u n d e n in dest. Wasser, oder m a n s p ü l t sie in W a s s e r ab, b r i n g t sie 1 Min. in l°/oige A m e i s e n s ä u r e , s p ü l t a b e r m a l s in W a s s e r ab u n d k a n n sie d a n n w e i t e r b e h a n d e l n , z u n ä c h s t f ü r 24 S t u n d e n in l°/oiger L ö s u n g von Goldc h l o r i d i m D u n k e l n . Sie w e r d e n d a n n k u r z in W a s s e r a b g e s p ü l t , in l°/oige A m e i s e n s ä u r e l ö s u n g g e b r a c h t u n d d e m L i c h t e ausgesetzt. M a n stellt d a z u d e n O b j e k t t r ä g e r m i t d e r Schichtseite n a c h u n t e n s c h r ä g in d e n F ä r b e z y l i n d e r , d e r auf e i n e r w e i ß e n U n t e r l a g e steht. U n e r l ä ß l i c h e B e d i n g u n g f ü r das G e l i n g e n des V e r f a h r e n s ist allseitige B e l i c h t u n g d e r S c h n i t t e »bei m ö g l i c h s t i n t e n s i v e m L i c h t e u n d m ö g l i c h s t g e r i n g e r T e m p e r a t u r « . W e n n die S t r u k t u r e n in h i n r e i c h e n d e r D e u t l i c h k e i t h e r v o r t r e t e n , s p ü l t m a n in dest. W a s s e r ab; d a n n e n t w ä s s e r n i n A l k o h o l ; Xylol, B a l s a m . O f t ist es z w e c k m ä ß i g , aus dest. Wasser d i r e k t in G l y z e r i n oder G u m m i s i r u p einzulegen. — D ü n n e M e m b r a n e n w e r d e n auf R ä h m c h e n v o n L i n d e n h o l z a u s g e s p a n n t u n d w i e a u f g e k l e b t e S c h n i t t e b e h a n d e l t . S i n d die P r ä p a r a t e g u t gelungen, so e r s c h e i n e n die N e u r o f i b r i l l e n d u n k e l v i o l e t t bis s c h w a r z . y) S i l b e r m e t h o d e n z u r N e u r o f i b r i l l e n d a r s t e l l u n g 1785. E i n e viel a u s g e d e h n t e r e V e r w e n d u n g als die M o l y b d ä n - u n d Goldm e t h o d e n h a b e n z u r D a r s t e l l u n g d e r N e u r o f i b r i l l e n u n d A c h s e n z y l i n d e r die s e h r w i c h t i g e n , v o n B i e l s c h o w s k y , C a j a l , O. S c h u l t z e , R a n s o n , D a v e n p o r t u n d B o d i a n in die T e c h n i k e i n g e f ü h r t e n S i l b e r m e t h o d e n e r l a n g t . Sie l i e f e r n k o n s t a n t e r e und leichter zu e r z i e l e n d e E r g e b n i s s e w i e die G o l d m e t h o d e n , w e s h a l b sie a u c h in d e r T e c h n i k d e r H i s t o p a t h o l o g i e viel g r ö ß e ren Eingang fanden. aa) M e t h o d e n v o n Bielschowsky u n d M o d i f i k a t i o n e n d e r s e l b e n 1786. V o r b e d i n g u n g f ü r d a s G e l i n g e n d e r N e u r o f i b r i l l e n d a r s t e l l u n g n a c h B i e l s c h o w s k y i s t F i x i e r u n g in F o r m o l , das z w e c k m ä ß i g v o r h e r n a c h § 257 n e u t r a l i s i e r t w i r d . Das O p t i m u m d e r D a r s t e l l b a r k e i t b e g i n n t e t w a 3 W o c h e n n a c h d e m Einlegen u n d b l e i b t e t w a 6 W o c h e n l a n g b e s t e h e n ; d o c h gibt a u c h j a h r e a l t e s F o r m o l m a t e r i a l n a m e n t l i c h b e i A n w e n d u n g des P y r i n d i n v e r f a h r e n s (s. § 1788) noch b r a u c h b a r e R e s u l t a t e . Die M e t h o d e w i r d e n t w e d e r a m G e f r i e r s c h n i t t ( S c h n i t t i m p r ä g n i e r u n g ) o d e r am S t ü c k ( S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g ) v o r g e n o m m e n . U n e r l ä ß l i c h f ü r das G e l i n g e n ist p e i n l i c h s a u b e r e s A r b e i t e n ( m a n b e a c h t e § 1519 ff.), g e n a u e B e f o l g u n g d e r V o r schriften (nur Glasinstrumente!) und Verwendung reiner Chemikalien. Ausführung der Bielsc.howsky-Methode am Schnitt, a) V o r b e r e i t u n g : 1. F i x i e r u n g in F o r m o l 1 : 9, möglichst b a l d n a c h d e m T o d f ü r m i n d e s t e n s 14 Tage. M a x i m a l e D i c k e d e r S c h e i b e n 1 cm. — 2. A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r 2—3 S t u n d e n , d a n n 1—2 T a g e in dest. W a s s e r . — 3. S c h n e i d e n auf d e m G e f r i e r m i k r o t o m (5—10¡u). A u f f a n g e n d e r S c h n i t t e i n dest. Wasser. D i e g u t e n S c h n i t t e w e r d e n h e r a u s g e f i s c h t u n d n o c h 1—2 S t u n d e n i n 3—4mal g e w e c h s e l t e m dest. Wasser a u s g e w a s c h e n . b) I m p r ä g n i e r u n g : 1. Einlegen d e r S c h n i t t e in e i n e 2°/oige S i l b e r n i t r a t l ö s u n g 24 S t u n d e n . 2. R a s c h d u r c h z i e h e n d u r c h dest. W a s s e r (2—3 S e k u n d e n ! Glasstabwechsel). Bleibt der Schnitt zu lange in dest. Wasser, so erhält man keine Imprägnierung der Achsenzylinder mehr. 3. E i n l e g e n in e i n e f r i s c h b e r e i t e t e a m m o n i a k a l i s c h e S i l b e r n i t r a t l ö s u n g ( H e r s t e l l u n g n a c h § 1527) 10—20 M i n u t e n . D e r S c h n i t t soll h i e r e i n e gelbliche T ö nung annehmen.

§ 1787—1790.

Neurofibrillen (Bielschowsky)

411

4. Rasch Durchziehen durch 2—3 Schalen mit dest. Wasser. 5. Reduzieren in s ä u r e f r e i e m Formol ( 1 : 4 Teile Brunnenwasser) 10 Minuten. Die Schnitte färben sich hier rasch schiefergrau-schwärzlich (s. auch § 1787). 6. Auswaschen in Brunnenwasser: 15 Minuten. 7. Vergolden in einer verdünnten Goldchloridlösung (3—5 Tropfen einer 1%igen Lösung von gelbem Goldchlorid auf 10 ccm dest. Wasser), bis der braune Ton des Präparates in einen grauen oder grauvioletten umgeschlagen hat. 8. Fixieren in einer 5°'/oigen Natriumthiosulfatlösung 1—2 Minuten. 9. Sorgfältiges Auswaschen in Brunnenwasser (1—2 Stunden); Alkoholreihe, Carbolxylol, Xylol (nicht länger als nötig), Balsam. An gut gelungenen Präparaten sind die Neurofibrillen schwarz auf hellem Grunde zu sehen, ebenso die perizellulären Netzstrukturen der Ganglienzellen. Auch die dünnsten Achsenzylinder treten klar hervor. 1787. S e k i (40b) empfiehlt der reduzierenden Formollösung in § 1786,5 1%> Natriumzitrat zuzusetzen. Die Silberbilder fallen dadurch sehr gleichmäßig und kontrastreich aus.

1788. P y r i d i n - S i l b e r - M e t h o d e . B i e l s c h o w s k y (11) hat für Material, bei dem es mehr auf die Darstellung der Achsenzylinder als auf die der endozellulären Neurofibrillen ankommt, eine Vorbehandlung mit Pyridin empfohlen, da dadurch die Mitfärbung von Glia- und Bindegewebe stark zurückgedrängt wird. Fixierung und Vorbehandlung wie in § 1786. Die Gefrierschnitte werden 1—2 Stunden in dest. Wasser gewaschen und auf 24—48 Stunden in unverdünntes Pyridin (Merck) übertragen. Nachher müssen sie sorgfältig von Pyridin befreit werden, indem man sie so lange in oft erneuertem dest. Wasser auswäscht, bis der sehr durchdringende Pyridingeruch verschwunden ist. Dann Übertragen in 2°'/oige Silbernitratlösung (24 Stunden) und Weiterbehandlung wie in § 1786. 1789. S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g . Sehr häufig kommt auch die Imprägnierung ganzer Stücke zur Anwendung. Dieselbe kann ohne oder mit Pyridinvorbehandlung erfolgen. Im ersteren Fall bringt B i e l s c h o w s k y die in Formol fixierten, nicht über 1 ccm großen Gewebsblöcke ohne Auswaschen je nach ihrer Größe f ü r 1 bis 8 Tage in 2°/oige Silbernitratlösung, überträgt f ü r V2—6 Stunden in die ammoniakalische Silberlösung und von hier nach raschem Durchziehen durch dest. Wasser in die 20°/oige Formollösung, in der sie 12—24 Stunden verweilen. Hierauf möglichst rasche Einbettung in Paraffin. Diese »einfache Stückimprägnierung« ist durch die mit größerer Sicherheit gelingende, nachfolgend beschriebene »Pyridin-Stückimprägnierung« verdrängt. 1790. P y r i d i n m e t h o d e z u r S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g nach B i e 1s c h o w s k y (11): 1. Aus den mindestens 1 Woche lang in neutralem Formol (1:4 bis 1 :9) fixierten Organen werden nicht über 0,5 cm dicke Scheiben herausgeschnitten und f ü r 3—4 Tage bei Zimmertemperatur in reines unverdünntes Pyridin (Merck) gelegt. — 2. Auswaschen in fließendem Wasser 12—24 Stunden, dann ebensolange in häufig erneuertem dest. Wasser. — 3. Durchtränken in 3%iger Silbernitratlösung 3—5 Tage lang bei 36° C. — 4. Rasch abspülen in dest. Wasser. — 5. Einlegen in ammoniakalische Silberlösung: 24 Stunden; die Lösung wird nach § 1527 bereitet, aber mit dest. Wasser statt auf 20 ccm auf 100 ccm aufgefüllt. — 6. Auswaschen in häufig gewechseltem dest. Wasser: Zeitdauer nach Bielschowsky je nach Dicke der Blöcke bis zu 1 Stunde, nach Boeke 2 Stun-

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Zentralnervensystem

§ 1791—1792-

den. — 7. Reduktion in n e u t r a l e m Formol (1:9); 10—12 Stunden (s. auch § 1787). — 8. Abspülen in dest. Wasser. Beschleunigtes D u r c h f ü h r e n durch die Alkoholreihe. E i n b e t t u n g in Paraffin. Die Vergoldung und Fixierung wird am Schnitt vorgenommen. Bei Anwendung der Pyridinmethode ist auch jahrelang in Formol gelegenes Material noch brauchbar. Glia und Bindegewebe treten gewöhnlich stark zurück oder heben sich durch ihren andersartigen Farbton ab. Die flbrilläre Struktur der Ganglienzellen kommt bei dieser Modifikation nicht so klar zur Darstellung wje bei der Originalmethode. Die motorischen und sensiblen Endformationen der Nerven treten dagegen gut hervor. Häufig kommt aber die Imprägnation nicht im ganzen Stück, sondern nur in bestimmten Zonen gut zustande. Günstiger liegen die Verhältnisse bei embryonalem Gewebe, das leichter durchdrungen wird. 1791. Neuerdings empfiehlt B i e l s c h o w s k y zur Reduktion des Silbers in § 1790, 7 nicht Formol zu verwenden, sondern ein Traubenzuckergemisch, das aus 75 ccm einer 30°/oigen Traubenzuckerlösung, 75 ccm einer 10°/oigen Seignettesalzlösung, 20 ccm einer 10°/oigen Kaliumcarbonatlösung und 5 ccm reines Formol besteht. In dieses Gemisch werden die imprägnierten Blöcke f ü r 24 S t u n den bei 50° C eingelegt; dann Auswaschen in dest. Wasser, Entwässern und E ' n betten wie gewöhnlich.' Das Gemisch kann auch zur Reduktion von imprägnierten Schnitten verwendet werden. Man bringt in diesem Falle die Schnitte nach der ammoniakalischen Silberlösung nach kurzem Abspülen für 1—2 Minuten in die auf 50° erwärmte Lösung. Dann Auswaschen, Vergolden usw. wie gewöhnlich. Besonders vorteilhaft ist das Reduktionsgemisch nach B i e l s c h o w s k y (27) für die Darstellung der pericellulären Endformationen im Zentralnervensystem. 1792. Bei der Bielschowskyschen Stückimprägnierung kommt es stets z u r Ausbildung einer oberflächlichen, mit reduzierten Silbersalzen durchsetzten Kruste, deren äußerer Bereich f ü r die Untersuchung u n b r a u c h b a r ist. Ein weiterer Nachteil ist die Beschränkung der Nervenimprägnation auf begrenzte Bezirke. A g d u h r (17) gelang es in systematischen Untersuchungen diese Mängel einzuschränken, so daß es in günstigen Fällen gelingt, z. B. bei E m b r y o n e n eine mehr oder weniger vollständige Imprägnation des zentralen und peripheren Nervensystems zu erhalten. Nach der letzten Veröffentlichung (30) v e r f ä h r t A g d u h r n u n folgendermaßen: 1. Fixierung in n e u t r a l e m Formol (1 :1), 7 Tage oder länger. Bei zartem Gewebe (z. B. bei Embryonen beginnt A g d u h r mit stärker verdünnter Formollösung (1 :7) und steigert dann allmählich auf obige Konzentration. Knochenhaltiges Gewebe wird nachher mit Salpetersäure entkalkt, 2 Tage in 5°/oige Natriumsulfatlösung gelegt, 1 Tag in fließendem Wasser ausgewaschen und dann für einige Tage wieder in Formol gebracht. 2. Nachfixierung in Pyridin 5—10 Tage. Schwer imprägnierbares Gewebe z. B. Muskelgewebe erwachsener Frösche behandelt Agduhr 2 Tage oder länger mit alkalischer Pyridinlösung (dest. Wasser 40 T., Pyridin 4 T„ 40°/oige NaOH 1 T.). Sofort abbrechen, wenn Gewebe deutlich anzuschwellen beginnt. 3. Sorgfältiges Auswaschen in täglich l m a l zu wechselndem dest. Wasser zur E n t f e r n u n g des Formols und anderer reduzierender Substanzen 6—20 Tage. Die Dauer des Auswässerns ist für die einzelnen Gewebe verschieden. Schwer permeable Gewebe erfordern längere Zeit als locker gebaute. Bei menschlichen Embryonen meist 7 Tage am besten. Allzu langes Wässern ist schädlich, da dann die Imprägnation mißlingt. 4. 10—25tägige Imprägnation in 3%>iger Silbernitratlösung im Dunkeln, bei Z i m m e r t e m p e r a t u r (18—20°).

•S 1793.

Neurofibrillen (Gros-Schultze)

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Die Flüssigkeitsmenge soll mindestens das 15—20fache Volumen des Objektes besitzen (wichtig!). Sie kann im Bedarfsfall 1—2mal erneuert werden. Embryonen bleiben 6—12 Wochen in der Lösung, die in diesem Falle nicht erneuert werden soll. 5. Nach Abspülen in dest. Wasser 1—3tägige Imprägnation in ammoniakalischer Silbernitratlösung. Die Lösung muß täglich erneuert werden und mindestens das 20fache Volumen des Objektes besitzen. Dauer der Einwirkung bei Muskeln und Embryonen 24 Stunden. H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g : Man setzt zu 10 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung 20 Tropfen einer 40°/oigen NaOH-Lösung, dazu 400 ccm dest. Wasser und tropft unter stetem Umschütteln vorsichtig Ammoniak zu, bis der Niederschlag bis auf einen geringen Rest gelöst ist. 6. Behandlung der Stücke mit schwach essigsaurem Wasser (0,2 ccm Eisessig auf 1000 ccm dest. Wasser) 24 Stunden (unterbleibt bei Muskel und Embryonen). 7. Reduktion in neutraler Formollösung (1 F. + 4 T. Brunnenwasser) 4 bis 6 Tage lang. Evtl. E r n e u e r n des Formols, bis keine T r ü b u n g durch Silbernitrat m e h r eintritt. 8. Einbettung in Paraffin. 9. Die 5—7—10p, dicken, mit Eiweiß-Glycerin aufgeklebten Schnitte werden d u r c h Xylol, Alkohol und dest. Wasser in stark verdünnte, schwach angesäuerte Goldchloridlösung (sie soll n u r schwach gelb gefärbt sein) gebracht u n d hier u n t e r mikroskopischer Kontrolle solange belassen, bis das Bindegewebe fast farblos ist. (Bei Embryonen meist entbehrlich.) 10. 0,5®/oige Fixiernatronlösung wenige Sekunden. 11. Auswaschen in Brunnenwasser 5—10 Stunden. 12. Alkoholreihe, Xylol, Balsam. 1793. M e t h o d e v o n G r o s - S c h u l t z e (18). < Die f ü r Gefrierschnitte sehr empfehlenswerte Methode h a t den großen Vorzug, daß m a n den Verlauf d e r Imprägnation unter dem Mikroskop überwachen kann. 1. Fixierung der lebensfrischen Gewebsstückchen in n e u t r a l e m Formol 1 :4—9 (mindestens zehn Tage, dann monatelang brauchbar). S. auch § 1915. — 2. Auswaschen der 2 bis 3 m m dicken Gewebsstückchen in fließendem Wasser IV2—2V2 Stunden, dann in 2mal e r n e u e r t e m dest. Wasser 14—17 Stunden. — 3. A u f f a n g e n der 20—30^ dicken Gefrierschnitte in dest. Wasser. Nach P i e p e r (41) müssen die Schnitte je nach der Dichte des Gewebes nur 1 bis 2 Stunden in 1—2mal erneuertem dest. Wasser ausgewaschen werden . Die Zeitdauer des Auswaschens in Punkt 2 und 3 ist nach P. für den Erfolg von großer Wichtigkeit. Zu kurzes wie zu langes Auswaschen ist ungünstig. 4. Imprägnierung der Schnitte in 20°'/oiger Silbernitratlösung mindestens 1 Stunde (dunkel stellen!). Bei zarten Präparaten ruft die 20°/oige Silbernitratlösung leider starke Schrumpfungen hervor. 5. Übertragen in Formol (1 T. Formol + 4 T. Brunnenwasser) (s. auch § 1795). Die Schnitte werden einzeln übertragen und im Formolschälchen in steter Bewegung gehalten. Sobald weiße Wolken auftreten, wird der Schnitt in ein zweites Schälchen gebracht usw., bis keine Wolken mehr abgehen. Man benötigt evtl. 4 bis 6 Schälchen. (Wichtig, um Niederschläge zu vermeiden!) Dauer 4—7 Min. 6. Übertragen in ammoniakalische Silberlösung. Herstellung: zu 5—10 ccm einer 20°/oigen Silbernitratlösung wird tropfenweise unter stetem Schütteln Ammoniak (Merck; 25°/oig; spez. Gew. 0,910) zugesetzt, bis der braune Niederschlag eben wieder verschwunden ist.

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Zentralnervensystem

§ 1794—1796.

Zur Reaktion gibt m a n 4—5 ccm der Lösung in ein Uhrglas und setzt auf je 1 ccm 1 T r o p f e n A m m o n i a k zu. Man beobachtet dann den aus d e m Formol i n das S c h ä l c h e n übertragenen Schnitt bei s c h w a c h e r Vergrößerung. Erfolgt noch B i n d e g e w e b s - und Kernfärbung, so ist e i n neuer Schnitt in ammoniakalische Silberlösung mit e t w a s mehr Ammoniak (z. B. 3 Tropfen auf 2 ccm) zu übertragen, bis m a n erreicht, daß ausschließlich die Achsenzylinder in f e i n s t e n F i brillen t i e f s c h w a r z auf farblosem Grund erscheinen. B e i zarten Präparaten m u ß der A m m o n i a k z u s a t z unter Umständen vermindert werden, z. B. auf 2 oder 1 T r o p f e n auf 5 ccm Lösung. 7. S o f o r t i g e s Übertragen in dest. Wasser 8 ccm + A m m o n i a k 7 c c m f ü r 1 Minute. 8. K u r z a u s w a s c h e n in dest. Wasser, vergolden, fixieren usw. P i e p e r überträgt aus 6 sofort in ein Schälchen mit dest. Wasser, das durch Zusatz einiger Tropfen einer l°/oigen Goldchloridlösung schwach gelb gefärbt ist. Hierin bleiben die Schnitte bis sie rötlich-violett sind ('/a—3U Stunden). Dann 2 S t u n d e n auswaschen in mehrfach erneuertem dest. Wasser usw. Die M e t h o d e g i b t a u c h f ü r d i e m u l t i p o l a r e n N e r v e n z e l l e n d e s S y m p a t h i k u s , die Spinalganglienzellen, peripheren Nervenfasern usw. ausgezeichnete Result a t e (s. a u c h § 1808). Bei d e r Gelatinegefriermethode (nach § 471) müssen die Schnitte, nachdem die Gelatine in dest. Wasser von 37° C e n t f e r n t worden ist, in formolhaltiges Wasser gebracht werden, ehe sie in die 20°/oige Silbernitratlösung kommen ( A k k e r i n g a 30). 1794. S z a t m a r i (36) legt Gefrier- oder Paraffinschnitte von Formolmaterial zuerst f ü r 24 Stunden in unverdünntes Pyridin Merck. Dann auswaschen in dest. Wasser, bis der Pyridingeruch völlig verschwunden ist. Anschließend wird dann die Gros-Schultze-Methode nach § 1793 ab P u n k t 4 durchgeführt. Durch die Pyridinvorbehandlung wird erreicht, daß die Reaktion des Bindegewebes in weiteren Grenzen unterdrückt wird. Dadurch wird die in § 1793, 6 angegebene ge naue Abstimmung des Ammoniakgehaltes der Silberlösung im Uhrglas unnötig. — Die Methode gelingt in diesem Falle auch an Paraffinschnitten. 1795. F ü r den Ausfall der Methode ist auch das Ph des Wassers, das in § 1793, 5 zur V e r d ü n n u n g des Formols verwendet wird, von großer Bedeutung. Nach S e k i (40b) gibt die Formollösung f ü r elektive Darstellung der Axone und Axonäste bei einem Ph von 6,6—6,8 die besten Resultate; bei niedrigerem ph k o m m t es zu schwacher Schwärzung, bei höherem schwärzen sich auch Cytoplasma u n d Zellkerne. F ü r gewöhnlich wird die optimale Bedingung erreicht, w e n n man über CaCO s neutralisiertes Formol (s. § 257) mit dest. Wasser verdünnt. Die größte und beste P u i f e r w i r k u n g beobachtete S e k i bei Verwendung eines Grundwassers mit einem Ph von 7,3, mit dem nicht neutralisiertes Formol v e r d ü n n t w u r d e (Ph der v e r d ü n n t e n Formollösung: 6,6). 1796. Modifikation der Methode nach L a n d a u f ü r Paraffinschnitte ( M o r a n d i 40). Fixierung in Formol (am besten einige Monate). Einbetten in Paraffin. 1. Die aufgeklebten, entparaffinierten Schnitte kommen zur Nachfixierung aus dest. Wasser f ü r 24 Stunden in Formol 1 : 9 . — 2. Rasch abspülen in dest. Wasser. —• 3. Einlegen in eine Petrischale, a u f t r o p f e n von 20°/oiger Silbernitratlösung; 1 Stunde bei 35—40° C. — 4. Rasch abspülen in dest. Wasser. •— 5. A u f t r o p f e n von ammoniakalischer Silberlösung (Herstellung s. unten) einige Min. — 6. Rasch abspülen in dest. Wasser. — 7. Reduzieren in 1—4°/oigem Formol einige Min. — 8. Alkoholreihe, Carbolxylol, Xylol, Balsam. Wenn die Imprägnation zu stark ist, dann abschwächen mit 10°/oiger Kaliumjodidlösung, wenn zu schwach, dann nach 7. erneut a u f t r o p f e n von ammoniakalischer Silberlösung.

§ 1796a—1798.

Neurofibrillen (Ramón y Ca jal)

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Herstellung der ammoniak. Silberlösung: Man gibt in ein braunes Gläschen 1 ccm einer 20°/oigen Silbernitratlösung und fügt tropfenweise Ammoniak zu, bis der anfängliche Niederschlag gerade wieder gelöst ist. 1796a. Modifikation der Bielschowsky-Methode nach R e u m o n t - L h e r m i t t e . 1. Fixierung 2— 3cm dicker Blöcke möglichst bald ¡nach dem Tode in neutralem Formol (ca. 40°/oiges Formol 1 Teil, Wasser 4 Teile für 14—20 Tage, bei längerer Dauer dann übertragen in Formol 1 : 10). Gefrierschnitte 15—30 u. Auswaschen in dest. Wasser. — 2. Übertragen in 95°/oigen Alkohol, dem auf 100 ccm 5 Tropfen Nikotin zugesetzt sind. — 3. Einlegen in dest. Wasser Stunde, dann vorsichtig Wasser abgießen. — 4 .Zugießen von 20°/oiger Silbernitratlösung, Dauer der Einwirkung bei 50° C je nach Hirnteil verschieden: Rückenmark 50 Min., Med. oblong. 1 Std., Rinde 1 Std. und länger, Kleinhirn l'/a Std. Die Schnitte sollen schließlich tabakbraun sein. — 5. Rasches Auswaschen mit dest. Wasser. — 6. Ammoniakalisches Silbernitratlösung (Herstellung wie § 1793, 6) 5—10 Min. — 7. Rasches Auswaschen in dest. Wasser. — 8. Reduktion in Formol 1:4, 15 Min. — 9. Auswaschen in dest. Wasser 10—20 Min. Die Schnitte sollen braunschwarz sein. — 10. Vergolden in l°/oiger Goldchloridlösung bis grau-leichtviolett, 5—10 Min. Auswaschen. — 11. Fixieren in 3°/oiger Fixiernatronlösung 5 Min. — 12. Auswaschen, Entwässern, Carbolkreosotxylol (s. § 1858). Xylol. Balsam. ßß) M e t h o d e n v o n R a m ó n y C a j a l 1797. Die von R a m ó n y C a j a l z u r D a r s t e l l u n g der N e u r o f i b r i l l e n a n g e g e b e n e n I m p r ä g n a t i o n s v e r f a h r e n w e r d e n v o r w i e g e n d in G e s t a l t einer S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g v o r g e n o m m e n . D a s P r i n z i p d e r M e t h o d e b e r u h t d a r a u f , daß d i e frisch entnommenen Gewebsstückchen entweder unmittelbar oder nach Fixier u n g in A l k o h o l m i t S i l b e r n i t r a t l ö s u n g d u r c h t r ä n k t u n d die d a b e i a u f t r e t e n d e n Silberverbindungen durch nachfolgende Behandlung mit Pyrogallussäure oder H y d r o c h i n o n r e d u z i e r t w e r d e n . D i e M e t h o d e n b r i n g e n die N e u r o f i b r i l l e n in g e l u n g e n e n F ä l l e n schön z u r D a r s t e l l u n g . Von N a c h t e i l ist, d a ß m e i s t n u r e i n e m i t t l e r e Zone des i m p r ä g n i e r t e n S t ü c k e s b r a u c h b a r ist, d a die S i l b e r l ö s u n g i n die t i e f e r e n S c h i c h t e n n i c h t e i n d r i n g t , w ä h r e n d die A u ß e n z o n e infolge z u s t a r k e r S c h w ä r z u n g ausscheidet. A u ß e r d e m k o m m t es o f t zu s t a r k e n S c h r u m p f u n g e n , so daß d e r a l l g e m e i n e E r h a l t u n g s z u s t a n d d e r P r ä p a r a t e h ä u f i g n i c h t s e h r gut ist. Bei n e u e r e n Modifikationen, bei w e l c h e n die F i x i e r u n g in F o r m o l u n d die I m p r ä g n i e r u n g an S c h n i t t e n v o r g e n o m m e n w i r d , sind diese N a c h t e i l e vermieden. Die E i n w i r k u n g der Silberlösungen muß d u r c h g e h e n d s u n t e r L i c h t a b s c h l u ß e r f o l g e n ( b r a u n e G l a s f l a s c h e m i t Schliffstopf e n , H ü l l e aus P a p p e od. dgl.). D i e G e w e b s s t ü c k c h e n s o l l e n n i c h t ü b e r 3 mm d i c k s e i n . 1798. M e t h o d e I. Geeignet f ü r G e h i r n v o n k l e i n e n T i e r e n , f e r n e r v o n E m b r y o n e n u n d N e u g e b o r e n e n g r o ß e r Tiere. D a r g e s t e l l t w e r d e n P y r a m i d e n zellen i m G r o ß h i r n , K ö r n e r z e l l e n im K l e i n h i r n . Ausführung: 1. Die f r i s c h e n t n o m m e n e n S t ü c k e k o m m e n f ü r 3—5 T a g e bei 35° C d i r e k t in e i n e 0,75—3°/oige S i l b e r n i t r a t l ö s u n g . M a n i m p r ä g n i e r t , bis die S t ü c k c h e n t a b a k b r a u n sind. — 2. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r 1 Min. — 3. R e d u z i e r e n in: P y r o g a l l u s s ä u r e o d e r H y d r o c h i n o n 1—2 g, n e u t r a l . F o r m o l 5 ccm, dest. W a s s e r 100 ccm 24 S t u n d e n . — 4. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r 5 Min. — 5. E i n b e t t e n in Celloidin oder P a r a f f i n . Die E n t w ä s s e r u n g soll möglichst r a s c h e r f o l g e n , e t w a in 5—6 S t u n d e n . Für Embryonen und Neugeborene nimmt man eine 0,75°/oige Silbernitratlösung, für ausgewachsene Säugetiere eine 3°/oige, für Wirbellose eine 6°/oige Lösung. Für 2—3 Stückchen rechnet man 80—100 ccm Lösung.

416

Zentralnervensystem

§ 1799—1806.

1799. M e t h o d e II. Geeignet f ü r marklose u n d markhaltige Nervenfasern, perizelluläre Verästelungen, große und mittlere Nervenzellen namentlich in Großhirn, Kleinhirn, Rückenmark. F e r n e r motorische und sensorische Nervenendigungen (Vater-Pacini, Meißner, Krause usw.), Regenerationsstadien. Ausführung: 1. Fixieren in 96°/oigem oder absol. Alkohol 24 Stunden. — 2. Zerschneiden in 2,5—3 mm dicke Stückchen. Imprägnieren derselben in 1—l,5°/oiger Silbernitratlösung 5—7 Tage bei 30—35° C. — 3. Abspülen in dest. Wasser 1 Min. — 4. Reduzieren in Pyrogallussäure oder Hydrochinon 1—2 g, neutrales F o r m o l 5 ccm, dest. Wasser 100 ccm 24 Stunden. — 5. Abspülen in dest. Wasser 5 Min. — 6. Einbetten in Paraffin oder Celloidin, wobei die Entwässerung möglichst rasch (etwa in 5—6 Stunden) erfolgen soll. 1800. Ist die Imprägnation zu hell ausgefallen, so behandelt man die Schnitte 5 bis 10 Min., mit einem Gemisch von sulfocyansaurem Ammonium 3 g, unterschwefligsaurem Natrium 3 g, dest. Wasser 100 ccm, l°/oige Goldchloridlösung einige Tropfen. 1801. Setzt m a n dem in § 1799, 1 zur Fixierung benutzten Alkohol auf 50 ccm 1 g Veronal, Chloralhydrat od. dgl. zu, so erfordert die Imprägnierung in Silb e r n i t r a t n u r 5 Tage. Außerdem gewinnt die Methode an Sicherheit. F e r n e r w i r d sie dadurch an Material anwendbar, das lange in Alkohol lag. • 1802. M e t h o d e I I I . Geeignet namentlich f ü r Neurofibrillen in Rückenm a r k , sensiblen und sympathischen Ganglien, von Mensch, Katze, Hund, Kaninchen. Ausführung: 1. 24stündige Fixierung in 96°/oigem oder absol. Alkohol 50 ccm, Ammoniak (spez. Gew. 0,910) 1—12 Tropfen. Großhirn 1—3 Tropfen, Kleinhirn 4, Rückenmark und Medulla 8—12, periphere Endigungen 2—3. Wenn zuviel Ammoniak zugesetzt wird, dann fällt die Imprägnierung zu blaß aus. — Die Schrumpfung kann dadurch vermindert werden, daß man zuerst für 6 Stunden in 70°/oigen Alkohol, dann für 2—4 Stunden in 85°/oigen Alkohol einlegt und erst dann in den ammoniakalischen Alkohol überträgt. 2. Abtrocknen mit Filtrierpapier. — 3. Imprägnieren usw. wie in § 1799, 2—6. 1803. M e t h o d e IV. Geeignet f ü r marklose Fasern des Zentralnervensystems, perizelluläre Verästelungen, Moosfasern des Kleinhirns. — Ausführung: 1. Fixieren in Formol 15 ccm + Wasser 85 ccm. — 2. Waschen in fließendem Wasser 6—12 Stunden. — 3. Einlegen in 96°/oigen Alkohol 50 ccm + Ammoniak 5 T r o p f e n 24 Stunden. — 4. Abtrocknen mit Filtrierpapier. — 5. Weiter e s wie in § 1799, 2—6. 1804. M e t h o d e V. Sehr geeignet f ü r Embryonen. Bei Erwachsenen vor allem f ü r Neurofibrillen, Nervenendigungen, Nervenregeneration (mit Ausnahme d e r ersten Stadien). Ausführung: 1. Fixieren in 70%>igem P y r i d i n oder in einem Gemisch von 40 T. Pyridin und 30 T. 95%igem Alkohol 24 Stunden. — 2. Auswaschen in fließendem Wasser, bis geruchlos; 12—24 Stunden. — 3. Qö'Voiger Alkohol 6—12 Stunden. 4. Weiteres wie in § 1799, 2—6. 1805. M e t h o d e V I . Geeignet f ü r motorische Endplatten, perizelluläre Verästelungen, Kleinhirn. 1. Fixieren in Chloralhydrat 5 g, absol. Alkohol 25 ccm, dest. Wasser 75 ccm 24 Stunden. — 2. Abspülen in dest. Wasser 1 Min. — 3. Einlegen in absol. Alkohol 50 ccm, Ammoniak 4 Tropfen 24 Stunden. — 4. Waschen i n fließendem 12—24 Stunden und in mehrmals gewechseltem dest. Wasser 2 bis 5 Stunden. — 5. Weiteres wie in § 1799, 2—6. 1806. Eine Imprägnation von G e f r i e r s c h n i t t e n gelingt nach folgend e r Methode C a j a 1 s (26) (geeignet f ü r Großhirn, Kleinhirn, motorische Endplatten, Sinnesepithelien usw.). 1. Fixierung in Formol 1 : 4, 3 Tage oder länger. — 2. Gefrierschnitte 30—40ju. A u f f a n g e n in Formol. — 3. Nach schnellem Auswaschen in dest. Wasser (einige Minuten) Einlegen in 2°/oige Silbernitrat-

§ 1807—1808.

Neurofibrillen (O. Schultze)

417

lösung 12 ccm, P y r i d i n 7—10 Tropfen, 97°/oiger Alkohol 5—6 ccm. Die Schnitte sollen hierin in 4—6 Stunden hellbraun werden; ist das nicht der Fall, dann erw ä r m t man einige Minuten über der Flamme. — 4. Eintauchen der einzelnen Schnitte in abs. Alkohol: 2—4 Sekunden. — 5. Reduktion 1—3 Minuten in: Hydrochinon 0,3 g, dest. Wasser 70 ccm, Formol- 20 ccm, Aceton 15 ccm. — 6. G r ü n d liches Auswaschen in Wasser, Vergolden und Fixieren wie gewöhnlich. — 7. Auswaschen. Aufziehen auf Objektträger, Abtrocknen mit Filtrierpapier. Absol. Alkohol, Nelkenöl, Xylol, Dammar. Wenn die Methode bei markhaltigen Fasern der weißen Substanz versagt, dann behandelt man die Gefrierschnitte vor dem Silberbad in 3. für 2 Stunden in abs. Alkohol 10 ccm, dest. Wasser 10 ccm, Ammoniak 8—10 Tropfen. Dann Auswaschen, Silbernitrat-Pyridinbad usw. 1807. C o w d r y fixiert 2—6 Stunden in Carnoy, wäscht 24 Stunden in dest. Wasser und legt 3 Tage lang in l,5°/oiges Silbernitrat bei 39° (einmal wechseln), Abspülen in dest. Wasser und Reduzieren in: Pyrogallussäure 1 g, Formol 5 ccm, dest. Wasser 100 ccm im Dunkeln während 24 Stunden. Auswaschen in dest. Wasser, 1 Stunde 96°/oiger Alkohol, 2 Stunden abs. Alkohol, 2 Stunden Zedernholzöl, 3 Stunden Paraffin (60°); Einbettung; Schnittdicke 3«. Die entparaffinierten Schnitte kommen aus dest. Wasser 2 Stunden in eine 0,l°/oige Goldchloridlösung, die mit Lithiumcarbonat neutralisiert wurde, dann 5 Minuten in 5°/oige Fixiernatronlösung und 6 Stunden in fließendes Wasser. Nun färbt man gegebenenfalls in l°/oiger wässeriger Lösung von Toluidinblau od. dgl.' die NisslSubstanz, dann Entwässern, Xylol, Balsam. yy) Natronlauge-Silbermethode von O. Schultze 1808. Die Methode leistet f ü r die Darstellung d e r Ganglienzellen, Achsenzylinder, Neurofibrillen und Endigungen sowohl im zentralen wie peripheren Nervensystem Ausgezeichnetes. Die Einfachheit u n d Schnelligkeit der Methode, die Vermeidung von Niederschlägen und die Möglichkeit, sie gegebenenfalls auch an sehr dicken Schnitten (50/4 a u s f ü h r e n zu können, bedeuten große Vorzüge gegenüber änderen Verfahren. Ein weiterer, sehr wesentlicher Vorteil ist, daß sich der Verlauf der Reduktion u n t e r dem Mikroskop überwachen und durch Ä n d e r u n g verschieden starker Lösungen genau abstimmen läßt. Die Methode b e r u h t auf der Feststellung O. S c h u l t z e s , daß formolfixierte P r ä p a r a t e eine viel bessere Imprägnierung mit Silberverbindungen gestatten, w e n n sie vorher mit Wasser, Säuren oder Alkalien extrahiert (»entschlackt«) werden. Bei der weiteren Ausarbeitung der Methode durch S t ö h r jr. ergab sich dann, daß m a n auf die saure und neutrale Entschlackung verzichten kann, da eine den Objekten angepaßte Behandlung mit Natronlauge und Siiberlösung f ü r alle Zwecke hinreichend ist. Ausschläggebend ist bei der Methode die richtige Wahl der Konzentration der einzelnen Flüssigkeiten, die f ü r Großhirn, Kleinhirn, Rückenmark, periphere Nerven usw. verschieden ist, u n d allenfalls durch ein p a a r Probeversuche ermittelt werden muß. Herstellung der Lösungen 1. n - N a t r o n l a u g e : Man gibt 4 g (genau 4,01 g) Natrium hydricum puriss. e natro (pro analysi, Merck) in einen Maßkolben und füllt mit dest. Wasser auf 100 ccm auf. Von dieser Normallösung w e r d e n unmittelbar vor Gebrauch entsprechende Verdünnungen bereitet, indem man eine gewisse Menge der Lösung, z. B. 6 ccm, mit jeweils 50 ccm Wasser v e r d ü n n t (in der nachfolgenden Tabelle in diesem Falle "bezeichnet mit 6 :50). 27

R o m e l s , M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u f l .

418

Zentralnervensystem

§ 1809.

2. 10°/oige S i l b e r n i t r a t l ö s u n g . Dieselbe wird vor Gebrauch dem Objekte entsprechend verdünnt. Gebrauchte Lösungen dürfen nicht mehr zurückgeschüttet werden. 3. H y d r o c h i n o n l ö s u n g . Man löst 2,5 g Hydrochinon in 100 ccm dest. V/assers und fügt 5 ccm des käuflichen Formols zu (bezeichnet als Stammlösung). Von ihr stellt man sich eine 5fach und eine 20fach verdünnte Lösung im Vorrat her. Unter Umständen benötigt man noch stärkere Verdünnungen. Die Lösungen sind etwa 3 Monate lang haltbar. Vor Gebrauch müssen sie gut durchgeschüttelt werden. Ausführung der Methode 1. F i x i e r u n g . Man fixiert in gewöhnlichem oder neutralem Formol, das i m Verhältnis von 1 : 4—10 mit dest. Wasser verdünnt ist. Länger als 6 Monate soll man jedoch nach S t ö h r (22) die Objekte nicht in Formol liegen lassen, da später die Resultate unsicher werden. 2. E n t s c h l a c k u n g . 30—40^ dicke Gefrierschnitte werden aus dest. Wasser in verdünnte n-Natronlauge übertragen. Der Grad der Verdünnung ist f ü r die einzelnen Objekte verschieden; er ist aus der beifolgenden Tabelle zu entnehmen. Zeitdauer der Einwirkung meist 24 Stunden bei Zimmertemperatur. Die stärkere Konzentration nimmt man, wenn nur Achsenzylinder und Fibrillen dargestellt werden sollen; bei den schwächeren färben sich auch Kerne und Gliazellen sowie deren Produkte.

3. A u s w a s c h e n . Die Schnitte werden nun mit reichlichem dest. Wasser, das innerhalb 2 Stunden mindestens 4mal erneuert wird, sorgfältig ausgewaschen. Nach S t Ö h r ist dieser Punkt f ü r die Niederschlagsfreiheit von großer Wichtigkeit (evtl. P r ü f u n g des Waschwassers mit Phenolphtalein, siehe § 1811, 4). Beim Eintragen der Schnitte in die nachfolgende Silbernitratlösung darf keine weißliche Trübung entstehen. 4. V e r s i l b e r n . Die Schnitte kommen für 12—24 Stunden in eine 0,5 - bis 10%>ige Silbernitratlösung, in der sie sich leicht bräunen. Die Stärke der Silberlösung ändert sich je nach dem Objekt. J e stärker die Konzentration der Lösung ist, desto mehr wird meist die Mitfärbung des Bindegewebes unterdrückt. Weitere Angaben siehe Tabelle 10. 5. R e d u k t i o n . Der leicht gebräunte Schnitt kommt direkt in die Hydrochinon-Formollösung, in der die Reduktion nach wenigen Sekunden einsetzt. Man beobachtet den f ü r das Gelingen der Methode entscheidenden Vorgang am besten bei schwacher Vergrößerung unter dem Mikroskop, indem man den Schnitt in einem Uhrschälchen schwimmen läßt. Sobald die Achsenzylinder schwarz, die Ganglienzellen dunkelbraun bis schwarz erscheinen, muß die Reduktion unterbrochen werden. Eine starke Bräunung des umgebenden Gewebes muß vermieden werden. Dauer: wenige Sekunden bis einige Minuten. Am besten reduziert man den ersten Schnitt mit der 20fach verdünnten Lösung, den zweiten mit der 5fach verdünnten. Allenfalls muß man noch stärker verdünnen (bis 80- oder 120fach). Wenn sich die Reduktion bei genauer Prüfung als zu schwach erweist, dann bringt man den Schnitt wieder in die Hydrochinonlösung zurück.

6. Abspülen in dest. Wasser (2mal wechseln), dann direkt in 96°/oigen Alkohol, Carbolxylol, Xylol, Balsam. 1809. S t ö h r d.'J. (21—22) hat die Methode an den verschiedensten Abschnitten des zentralen und peripheren Nervensystems angewandt und dabei nähere Angaben über die optimalen Zeiten und Verdünnungen gegeben, die ich in nach-

419

Neurofibrillen

§ 1809. M I •S? C.S 22 M ^ s >• 55

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cu /oigen NaOH zugesetzt sind, 1—5 Minuten. 4. Durchziehen durch dest. Wasser (2—3 Sekunden) u n d imprägnieren in ammoniakalischer Silbernitratlösung, h ö c h s t e n s 1 5 Sekunden. Herstellung: 1 ccm einer 20°/oigen Silbernitratlösung wird mit 1 Tropfen einer 15°/oigen Ammoniaklösung versetzt. Der zuerst grau-weißliche Niederschlag ballt sich bei langsamem Schwenken des Gefäßes unter Reduktion zu größeren braunen Schollen zusammen, worauf mit dest. Wasser auf 15 ccm aufgefüllt und filtriert wird. Das Filtrat muß völlig klar sein. 5. Ohne Auswaschen sofort in 0,5—lVoiges säurefreies Formol, dem auf 20 ccm 1 Tropfen einer 20°/oigen Silbernitratlösung zugesetzt wurde. Bewegen des Uhrglases bis das P r ä p a r a t grünlich-gelb ist. 6. Gründliches Auswaschen in dest. Wasser (stündlich 3—4mal wechseln), evtl. vergolden und fixieren in üblicher Weise. Aufziehen auf Objektträger, abtrocknen, absol. Alkohol, Origanumöl, Balsam. 1871. Weitere Modifikationen wurden u. a. von C a j a l (25, s. § 1855), H e r r e r a (32), P e r e z (32), R y d b e r g (32) angegeben. Eine von S t e r n (32) mitgeteilte Modifikation gestattet die Darstellung am Celloidinschnitt. 1872. Nach S e k i (40a) w i r d bei den Gliamethoden Rio-Hortegas AgBr in die Gefügelücken der Gliazellen geschafft, auf dessen Grundlage sich das bei. der Reduktion der Silberlösung naszierende Silber hauptsächlich niederschlägt. D u r c h die Behandlung der Schnitte mit Ammoniakwasser w i r d die Wegsamkeit d e r Gefügelücken der dichteren Gewebsbestandteile durch Füllung mit h y d r o philem Kolloid verringert. S e k i glaubt, daß f ü r die elektive Silberschwärzung der Gliazellen ihre passende S t r u k t u r d i c h t e und evtl. ihre A r m u t an Schutzkolloid besonders wichtig ist. Ein Reduktionspotential der Gliazellen oder eine vorherige Bildung von Silberkeimen in ihnen ist d a f ü r nicht notwendig, wohl aber können in ihnen gebildete Silbersalzniederschläge (wie z. B. solche von AgBr) Grundlage f ü r Ablagerung von naszierendem Silber sein. S e k i fand auf G r u n d zahlreicher Versuche, daß die in Tabelle 11 zusammengestellten Lösungen und Zeiten f ü r die Darstellung der Oligodendro- wie Mikroglia die besten Resultate liefern. Eine starke Schwärzung von Nervenzelleib und kleinen Gliakernen ohne Hervortreten von Hortegazellen v e r r ä t meistens eine zu kurze Ammoniakwasserbehandlung oder zu viel Carbonat bzw. Ammoniak in der Silberlösung. 1873. B r o m a l i n - S i l b e r m e t h o d e v o n B i e l s c h o w s k y (31) zur Darstellung der gesamten Neuroglia. 1. Das möglichst frisch entnommene Material wird in 0,5—1 cm dicken Scheiben fixiert in: Bromalin 20—30 g, dest. Wasser ad 200 ccm; dazu 20 ccm säurefreies Formol.

§ 1873.

443

Neuroglia (Bromalin-Silber)

Bromalin ist ein von E. Merck, Darmstadt, geliefertes Bromsalzpräparat (Hexamethylentetraminbromäthylat). Will man die Hortegazellen und die Oligodendroglia möglichst elektiv herausholen, so empfiehlt es sich die Fixierung nicht über 36—48 Stunden auszudehnen. Ein vollständigeres Bild der Gliaelemente bekommt man aber bei längerer Einwirkung. Bei allzulanger Fixierung (über 3—4 Wochen) macht sich dagegen die Imprägnation der nervösen Elemente störend bemerkbar. TABELLE 11

1.

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Fixieren in Brom-Formol 1 ) . . . . Auffangen der Gefrierschnitte . . . Auswaschen Ammoniakwasser 2 ) Ammoniakalische Silberlösung . . . Auswaschen Reduktion in Formol 0,2°/oige Goldchloridlösung Auswaschen 0,5°/oige Fixiernatronlösung

. . . . . . . .

vorwiegend Oligodendroglia

vorwiegend Mikroglia

1—2 Tage in Brom-Formol 10—30 Sek. 30 Minuten 5-5-Silbercarbonat 3 ) 7 Min. unterbleibt 8 : 92; ¡2 Min. einige Min. 5 Min. 2 Min.

2—4 Tage in Brom-Formol 10—30 Sek. 10 Minuten 5-10-Silbercarbonat 4 ) 15 Min. 3—5 Sek. 12 :88; 2 Min. einige Min. 10 Min. 2 Min.

2. Schneiden der direkt aus der Fixierungsflüssigkeit genommenen Blöcke auf dem Gefriermikrotom, Auffangen der 10—20ju dicken Schnitte in der Fixierungsflüssigkeit. Erst vor dem Färben werden sie ganz. kurz in 2mal zu wechselndem dest. Wasser ausgewaschen. 3. Übertragen in die Imprägnationsflüssigkeit, die man so lange einwirken läßt, bis die Schnitte einen leicht gelblichen Ton angenommen haben. H e r s t e l l u n g d e r F l ü s s i g k e i t : 10 ccm einer 10°/oigen Silbernitratlösung werden mit 5 ccm einer 20°/oigen Kalium- (oder Natrium-)carbonatlösung versetzt (es ist k r i s t a l l i s i e r t e P o t t a s c h e oder S o d a zu verwenden!), worauf sich ein gelblich weißer Niederschlag bildet. Dann werden 2—3 Tropfen einer frischen reinen 10°/oigen Natriumperoxydlösung (Na 2 0 2 ) oder 2 Tropfen einer 20°/oigen Natronlauge zugefügt, wobei ein bräunlich schwarzer Niederschlag entsteht. Die Silbercarbonat- und Silberoxydniederschläge werden durch kräftiges Schütteln im Meßzylinder durchmischt. Dann erfolgt die teilweise Auflösung der Niederschläge durch Zusatz von 12—14 Tropfen eines möglichst hoch konzentrierten Ammoniaks (etwa 35°/oig, spez. Gew. 0,880, bei Merck erhältlich). Die Auflösung des Niederschlags ist bei der genannten Ammoniakmenge keine vollständige. Es bleibt ein schmutzig brauner Rest, von dem abfiltriert wird. Das wasserhelle Filtrat wird mit dest. Wasser auf das Doppelte aufgefüllt. 4. Rasches Durchziehen der Schnitte durch dest. Wasser und Reduktion in Formol 1 :9 oder in dem nachfolgend angegebenen Reduktionsgemisch. Herstellung des Reduktionsgemisches: gleiche Teile einer 10°/oigen Seignettsalzlösung und einer 10°/oigen Traubenzuckerlösung werden vereinigt und auf je 2 ccm des Gemisches 1 Tropfen von reinem Formalin (Schering) zugesetzt. — Durch Erwärmen kann die Reduktionskraft gesteigert werden. J

) Ammoniumbromid 2 g + Formol 18 ccm + dest. Wasser 82 ccm. ) Dest. Wasser 50 ccm + 30°/oiger Ammoniak 2 Tropfen. 3 ) 10°/o AgN0 3 5 ccm + 5°/o Na 2 C0 3 (wasserfrei) 5 ccm + Ammoniak (bis Niederschlag gelöst) + dest. Wasser 30 ccm: 4 ) 10°/o AgN0 3 5 ccm + 5°/o Na2C0 3 (wasserfrei) 10 ccm + Ammoniak (bis Niederschlag gelöst) + dest. Wasser 25 ccm. 2

444

Zentralnervensystem

§ 1874—1876.

5. K u r z e s A u s w a s c h e n , d a n n v e r g o l d e n in einer v e r d ü n n t e n G o l d c h l o r i d l ö s u n g u n d F i x i e r u n g in e i n e r 5°/oigen F i x i e r n a t r o n l ö s u n g . A u s w a s c h e n , A l k o h o l r e i h e , s c h w a c h e s K a r b o l x y l o l , Xylol, B a l s a m . Die Methode bietet noch den Vorteil, daß das Material nach Auswaschen der Fixierungsflüssigkeit auch für alle möglichen anderen Färbungen (Kerne, Fett, Markscheiden, Neurofibrillen) verwendet werden kann. Bei einer zweiten Methode B. wird in Bromsalzlösungen fixiert. Bei ihr muß das Material schon am 3.—6. Tag nach dem Einlegen verarbeitet werden. Doch sind die Verfahren von G l o b u s und K a n z l e r anwendbar. c) D a r s t e l l u n g

der

Gliastrukturen durch Hämatoxylinmethoden 1874. M e t h o d e v o n M a l l o r y (Ol). Dieselbe g e l i n g t n u r bei g e n a u e r Befolgung der Fixierungsvorschrift. Nach neuen Angaben von M a l l o r y und P a r k e r (37) fixiert m a n a m besten 2—4 m m dicke S t ü c k e 24 S t u n d e n in Z e n k e r s c h e r F l ü s s i g k e i t . N a c h 24stündigem A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r w i r d w i e g e w ö h n l i c h in P a r a f f i n eingebettet. Die S c h n i t t e k o m m e n n a c h E n t p a r a f f i n i e r e n f ü r 5—10 Min. in 0,25°/oige K a l i u m p e r m a n g a n a t l ö s u n g u n d n a c h A b w a s c h e n in dest. W a s s e r f ü r 10—20 Min. in 5°/oige O x a l s ä u r e . N a c h s o r g f ä l t i g e m W a s c h e n in dest. W a s s e r w e r d e n sie 12—24 S t u n d e n in P h o s p h o r w o l f r a m h ä m a t o x y l i n (s. § 685) g e f ä r b t . — Ergebnis: N e u r o g l i a f a s e r n blau. B i n d e g e w e b e b r ä u n l i c h rot. 1875. D a r s t e l l u n g d e r m a r g i n a l e n G l i a n a c h H e l d (09). 1. F i x i e r u n g d ü n n e r G e w e b s s t ü c k e möglichst f r i s c h in f o l g e n d e r F l ü s s i g k e i t : M ü l l e r s c h e F l ü s s i g k e i t 100 ccm, S u b l i m a t 3 g; dazu u n m i t t e l b a r v o r G e b r a u c h Eisessig 3 ccm, F o r m a l i n 0,5 ccm. D a u e r 1—6 T a g e bei 37° C (am b e s t e n ist es, d i e F l ü s s i g k e i t d u r c h die G e f ä ß e zu injizieren). C e l l o i d i n e i n b e t t u n g . 2. D i e C e l l o i d i n s c h n i t t e k o m m e n auf 5 M i n u t e n in e i n e L ö s u n g v o n 1 g N a t r i u m h y d r o x y d in 100 ccm 80°/oigem Alkohol. ( A u f l ö s u n g des Celloidins.) 3. A u s w a s c h e n in dest. Wasser. 4. E i n i g e M i n u t e n l a n g e s Beizen in 5°/oiger E i s e n a l a u n l ö s u n g . 5. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r und f ä r b e n in M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n n a c h H e l d ( H e r s t e l l u n g s. § 686). Z u r F ä r b u n g m i s c h t m a n einige T r o p f e n d a v o n m i t dest. W a s s e r bis m a n eine e b e n noch d u r c h s i c h t i g e d u n k e l v i o l e t t e F a r b f l ü s s i g k e i t b e k o m m t . H i e r i n f ä r b t m a n bei 50° C 12—24 S t u n d e n . 6. D i f f e r e n z i e r u n g in 5%>iger E i s e n a l a u n l ö s u n g , bis das k o l l a g e n e B i n d e g e w e b e e n t f ä r b t ist, w a s u. U. einige S t u n d e n d a u e r t , g u t a u s w a s c h e n in Wasser. 7. G e g e n f ä r b u n g in P i k r i n s ä u r e - S ä u r e f u c h s i n (van Gieson) 15 Sek. (besser T h i a z i n r o t - P i k r i n s ä u r e). 8. 96%>iger Alkohol, abs. Alkohol, Xylol, B a l s a m . Ergebnis: G l i a f a s e r n s c h w a r z , k o l l a g e n e s B i n d e g e w e b e rot. 1876. B a u e r (41) fixiert in Formol oder besser in Zenker und bettet in Paraffin oder nach § 459 in Pyridin-Celloidin ein. 1. Vorbeizen der Schnitte für 20 Min. bei 40° C in 5%igem Eisenalaun. — 2. Kurz abspülen in dest. Wasser. — 3. Färben in Heldschem Molybdänhämatoxylin (1 ccm Farblösung auf 10 ccm Wasser) mindestens 12 Stunden bei Zimmertemperatur oder bei 40° C. — 4. Kurz auswaschen. — 5. Differenzieren wenige Minuten oder Sekunden in Ferricyankaliboraxlösung s. § 1822, 7) oder in Eisenalaun, was sich über Stunden hinziehen kann. — 6. Auswaschen längere Zeit in Brunnenwasser oder besser nachbeizen für mehrere Stunden in 5°/oigem Natriumphosphat, (Na 2 PH0 4 ), wodurch die feinsten Protoplasmanetze einen besseren blauen Farbton erhalten. Celloidinschnitte kommen zur Entfernung des Celloidins vor 1) kurz in Laugenalkohol (100 ccm 96%>iger Alkohol + 30 Tropfen n/10 NaOH).

§ 1877—1880.

Neuroglia (Amöboide Gliazellen, Senile Drusen)

d) D a r s t e l l u n g

der amöboiden

445

Gliazellen

1877. D a r s t e l l u n g d e r a m ö b o i d e n G l i a z e l l e n u n d i h r e r E i n s c h l ü s s e n a c h A l z h e i m e r . Man fixiert dünne Gewebsblöcke in d e r Weigertschen Gliabeize mit Formolzusatz (s..§ 1845, 2; Kleindr.) und wäscht8—12 Stunden in fließendem Wasser aus. lOwdicke Gefrierschnitte werden 2 Stunden in eine gesättigte wässerige Lösung von Phosphormolybdänsäure gebracht, in zweimal erneuertem dest. Wasser ausgewaschen und 1 Stunde in der Mannschen Methylblau-Eosinlösung gefärbt (l°/o wässerige Methylblaulösung : 35 ccm + l°/oige wässerige Eosinlösung : 45 ccm + dest. Wasser 100 ccm). Man spült rasch in dest. Wasser, differenziert kurz in 96°/oigen Alkohol und bringt durch abs. Alkohol und Xylol in Balsam. Resultat: Gliafasern dunkelblau, amöboide Gliazellen blau, ebenso Achsenzylinder; Markscheiden und Erythrozyten rot, Bindegewebsfasern blau. 1878. Wenn man die Präparate längere Zeit (am besten Monate) in der Weigertschen Gliabeize fixiert, so erhält man auch sehr gute Darstellung der Kernstrukturen. Besonders treten dabei die Nukleolen scharf rot hervor. Das ist nicht der Fall, wenn die Fixierung in der Gliabeize nur kurz oder nachträglich nach vorheriger Formolfixierung vorgenommen wird ( S p a t z , 18). Dünne Gefrierschnitte schrumpfen beim Übertragen in die Phosphormolybdänsäure sehr. Um dies zu vermeiden, bringt man sie vorher ganz kurz in stark verdünnte Phosphormolybdänsäure ( S p a t z , persönliche Mitteilung). 1879. Bei einer z w e i t e n M e t h o d e A l z h e i m e r s kommen Gefrierschnitte von ebenso vorbehandeltem Material f ü r 2 Minuten in angesäuertes dest. Wasser (auf 100 ccm 10 Tropfen Eisessig) und von hier unmittelbar f ü r 2 Minuten in altes Mallorysches Hämatoxylin (s. § 685), von dem man zur F ä r b u n g so viel in dest. Wasser tropft, bis die in einem Schälchen befindliche F a r b flüssigkeit gerade undurchsichtig wird. Nach der F ä r b u n g kurz auswaschen in dest. Wasser, entwässern, Xylol, Balsam. Die f ü r die D a r s t e l l u n g d e r a m ö b o i d e n G l i a z e l l e n i n P a raffinschnitten sehr zu empfehlende Säurefuchsin-Lichtg r ü n m e t h o d e Alzheimers siehe in § 1758. e) D a r s t e l l u n g d e r s e n i l e n

Drusen

1880. Zur Darstellung der senilen Drusen w u r d e von v. B r a u n m ü h l (29) eine rasch und sicher arbeitende Methode angegeben, die sich auch zur Imprägnierung von r e t i k u l ä r e m Gewebe verwenden läßt. 1. Fixierung in Formol, mindestens 8 Tage. Blöcke 5 Minuten wässern. — 2. 10—20// dicke G e f r i e r schnitte. — 3. A u f f a n g e n in dest. Wasser, l m a l wechseln, 5 Min. — 4. 20°/oige Silbernitratlösung bei 50—60° C f ü r 30 Minuten (Schnitte ganz untertauchen!). — 5. Kurz einlegen in dest. Wasser 80 ccm, Ammoniak 16 Tropfen. (Schale bedecken! Wenn Trübung, Lösung erneuern!) Die Zeitdauer ist je nach Material verschieden; meist genügen 3—7 Sekunden. — 6. S c h n e l l durchziehen durch dest. Wasser. — 7. Neutrales Formol 20 ccm, Brunnenwasser 80 ccm; 1—3 Sekunden. — 8. Zurück in 5., 1—3 Sekunden, dann wieder ins Formol, 5 Minuten (ev. Wiederholung!). — 9. Dest. Wasser 5 Minuten, dann l 0 /oige Goldchloridlösung 6 Tropfen, dest. Wasser 25 ccm. Dauer je nach Schnittdicke verschieden. — 10. 5%>ige Fixiernatronlösung 15—30 Sekunden. — Auswaschen usw. Der springende Punkt ist, den rechten Zeitpunkt für die Herausnahme des Schnittes aus 5. zu treffen. Wird der Schnitt in 6. nur gelb oder hellbraun, so war er zu lange in 5. — Um fleckige Präparate zu vermeiden muß man darauf bedacht sein, die Schnitte möglichst faltenlos durch die Lösungen zu führen.

446

Zentralnervensystem

§ 1881—1883.

5. Darstellung des Bindegewebes im Zentralnervensystem 1881. Zur F ä r b u n g des die Gefäße begleitenden Bindegewebes läßt sich an und f ü r sich jede der gebräuchlichen Bindegewebsmethoden verwenden. Sehr schöne u n d k l a r e Resultate gibt f e r n e r eine von B i o n d i angegebene Goldmethode, die an Gefrierschnitten von Formolmaterial ausgeführt wird. Vorzügliche Resultate erhält man mit der altbekannten B i e l s c h o w s k y - M e t h o d e f ü r Bindegewebe (s. § 1525) oder der f ü r Zentralnervensystem besonders geeigneten Modifikation von P e r d r a u (s. § 1883). 1882. G o l d - I m p r ä g n a t i o n d e s B i n d e g e w e b e s nach B i o n d L 1. Fixierung in Formol 1 :10. 2. 25—30a dicke Gefrierschnitte w e r d e n in einer filtrierten, gesättigten Lösung von Kaliumpermanganat aufgefangen. Bei Zimmertemperatur lösen sich 8—9 g in 100 ccm dest. Wassers. Die Schnitte werden in der Kaliumpermanganatlösung so spröde, daß die gewöhnliche Ubertragung mit Glasstäbchen nicht möglich ist.. Man fängt daher den Gefrierschnitt im Wasser auf einem Filtrierpapierstreifchen auf, überträgt ihn mit diesem in die Permanganatlösung und in gleicher Weise nach 10 Minuten wieder ins dest. Wasser, wo die Schnitte rasch ihre gewöhnliche Konsistenz wieder erlangen. 3. Ganz kurz in dest. Wasser. 4. Einlegen der Schnitte in ein Gemisch von Kaliumsulfit-Oxalsäure bis die Schnitte e n t f ä r b t sind. B i o n d i mischt zur Bereitung des Gemisches unmittelbar vor Gebrauch unter Schütteln gleiche Teile einer gesättigten wässerigen Kaliumsulfitlösung und einer gesättigten wässerigen Oxalsäurelösung. Dabei kommt es natürlich zu einer teilweisen Aussalzung von Oxalsäure (sog. Niederschlag!), die dann erst wieder durch Filtrieren beseitigt werden muß, weshalb die Verwendung von gesättigten Lösungen überflüssig erscheint. Nimmt man statt dessen l°/oige Lösungen, so bleibt das Gemisch klar. — Vori Oxalsäure lösen sich in 100 ccm dest. Wasser bei 20° C 13,9 g. 5. Kurzes Auswaschen in 2 Schalen mit dest. Wasser. 6. Vergolden in: l°/oiger Goldchloridlösung 2 ccm, 5°/oige Sublimatlösung 2 ccm, dest. Wasser 10 ccm. Dauer der Einwirkung: 20 Stunden im Dunkeln. Die Lösungen werden erst kurz vor Gebrauch zusammengegossen. Die angegebene Menge genügt für höchstens 4 Schnitte. 7. Gründliches Auswaschen in m e h r f a c h gewechseltem dest. Wasser und (um ein Nachdunkeln zu vermeiden) fixieren in 2°/oiger Fixiernatronlösung 1 Min. 8. Gründliches Auswaschen in m e h r m a l s gewechseltem dest. Wasser, Alkoholreihe, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Die Bindegewebsfasern sind sehr scharf in tiefschwarzem Ton auf violettem U n t e r g r u n d imprägniert. 1883. Modifikation d e r Bielschowsky-Bindegewebsmethode nach Perd r a u . 1. Fixierung in Formol. Vor dem Gefrierschneiden 12—24 Stunden auswaschen in fließendem Wasser. Celloidin- oder Paraffinschnitte ü b e r Nacht in dest. Wasser. 2. Einstellen der 15—20u dicken Schnitte in 0,25°/oige Kaliumpermanganatlösung 20—30 Min. — 3. Nach Abspülen in dest. Wasser in Oxals ä u r e 1 g, Natriumsulfit 1 g, dest. Wasser 100 ccm, bis die Schnitte weiß sind. — 4. Auswaschen in dest. Wasser (mehrmals wechseln) 3—4 Stunden. — 5. 2°/oige Silbernitratlösung über Nacht. — 6. Kurz abspülen in d.est. Wasser. — 7. A m moniakalische Silbern'.tratlösung (s. u.) 40—60 Min. — 8. K u r z abspülen in dest. Wasser (gewöhnlich 5—10—20 Sek.). — 9. Reduzieren in Formol (1 :4 B r u n n e n wasser) 10 Min. — 10. Auswaschen, vergolden, fixieren, auswaschen und weiterbehandeln wie § 1525.

§ 1884—1885.

Peripheres Nervensystem (frisches Präparat)

447

Die H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g erfolgt, abgesehen von einigen Mengenunterschieden, im Prinzip wie in § 1527. Da diese Unterschiede aber, wie aus neueren Untersuchungen hervorgeht, für den Erfolg von Bedeutung sein können, sei die Vorschrift in Kürze angeführt: 5 ccm einer 20°/oigen Silbernitratlösung werden mit 2 Tropfen einer 40°/oigen Natronlauge versetzt, dann tropfenweise Zusatz von Ammoniak, bis der Niederschlag gerade gelöst ist; hierauf auffüllen mit dest, Wasser auf 25 oder 50 ccm. B. Peripheres Nervensystem 1. Die Untersuchung im lebenden und frischen Zustand; Isolierungsmethoden 1884. Die L e b e n d b e o b a c h t u n g m a r k l o s e r Nervenfasern gelingt, wie H i r t (39) zeigte, sehr schön mit Hilfe der Luminiszenzmikroskopie. Dem lebenden Tier (Frosch, Maus, Ratte) wird dazu intraperitoneal ein SpezialTrypaflavin (Verdünnung 1 :100—5000) eingespritzt. Nach 15—30 Min. wird das zu untersuchende Organ in Urethannarkose freigelegt und nach Abspülen des noch nicht resorbierten Farbstoffes mit Ringerlösung (beim Warmblüter e r wärmt) auf einem besonderen Objekttisch befestigt. Dann Beobachtung mit dem Zeißschen Luminiszenzmikroskop für Lebendbeobachtung unter Verwendung von Wasserimmersion, die mit Ringer bespült wird. — Ergebnis: Die Zellkerne leuchten grün, die Mastzellengranula meist rot, die Schwannschen Kerne überwiegend hellgelb, die marklosen Nervenfasern rot. Letztere erscheinen teils homogen, teils zeigen sie rotleuchtende Tröpfchen. Im Gegensatz zu den marklosen Nervenfasern fand H i r t bei den Achsenzylindern der markhaltigen keine Rotfluoreszenz. Sie erscheinen dunkel oder schwach grün, während die Markscheiden hellgrün fluoreszieren. Im Plasma der Schwannschen Zellen oft feinste rote Körnchen. 1885. Um m a r k h a l t i g e N e r v e n i n f r i s c h e m Z u s t a n d zu beobachten, entnimmt man einem frisch getöteten Tier unter sorgfältiger V e r meidung einer Quetschung oder Zerrung ein kleines Stückchen eines peripheren Nerven (z. B. vom n. ichiadicus einer Maus), überträgt dasselbe rasch auf einen trockenen Objektträger und, breitet es hier ohne weiteren Flüssigkeitszusatz in wenigen Sekunden mit Hilfe zweier Zupfnadeln zu einem feinen, weißlichen Häutchen aus. Ein Kunstgriff dabei ist, die entnommene Nervenfaser mit der einen Nadel am einen Ende festzuhalten, während man mit der Spitze der anderen den Nerven entlang streift und dadurch die bindegewebigen Hüllen durchreißt. Dadurch wird das flächenhafte Ausbreiten des Nerven wesentlich erleichtert. Hierauf gibt man auf das Präparat 1—2 Tropfen einer 0,5%igen Osmiumsäure und legt das Deckglas auf. In dieser Weise bleibt die myelinhaltige Hülle ohne Schrumpfung glatt konturiert erhalten, während bei dem häufig geübten Zusatz von physiologischer Kochsalzlösung sofort starke Forinveränderungen auftreten. Es ist daher auch ein vorhergehendes Einlegen des Nerven in physiologische Kochsalzlösung zu vermeiden, zumal dadurch auch das leichte, mühelose Zerzupfen des Nerven vereitelt wird. Will man das Präparat konservieren, so nimmt man nach 15—20 Minuten das Deckglas ab, wäscht die Osmiumsäure durch mehrmaliges Aufträufeln von dest. Wasser aus und schließt in Glyzeringelatine ein. Bei Zusatz von dest. Wasser zum frischen unfixierten Präparat verändern sich die Markscheiden rasch in eigentümlicher Weise. Die Ranvierschen Einschnürungen verschwinden, ebenso die Lantermannschen Segmente und innerhalb der Markscheiden treten eigenartige Gerinnungen auf. An den freien Enden fließt das Mark aus und gerinnt zu typisch aussehenden Myelintropfen,

4-48

Peripheres Nervensystem

§ 1886—1892.

Letztere trifft man auch massenhaft in Z u p f p r ä p a r a t e n der weißen Substanz des Zentralnervensystems. 1886. Die gleiche Technik läßt sich auch zur Untersuchung von m a r k l o s e n N e r v e n und pathologisch veränderten Nerven gebrauchen. Als Untersuchungsobjekt f ü r marklose Nerven sind die Milznerven großer Säuger, der Halssympathicus oder der Vagus eines Kaninchens zu empfehlen. Meist findet m a n zwischen den marklosen Fasern auch einzelne markhaltige vor. 1887. Die Entscheidung darüber, ob eine frische Nervenfaser schon m a r k haltig ist oder nicht, trifft m a n am einfachsten und zugleich sichersten durch Untersuchung im polarisierten Licht (A m b r o n n und H e 1 d 96, K i ß und M i h a 1 i k 30). Wird die frisch zerzupfte, in physiologischer Kochsalzlösung liegende Nervenfaser bei gekreuzten Nicols so eingestellt, daß ihre Achse der längeren Achse der Elastizitätsellipse des Gipsplättchens parallel steht, so erscheint die Faser bei vollkommen entwickelter Myelinscheide gelblich weiß, bei noch nicht vollkommen reifer Myelinscheide rötlich-orange, also in der Subtraktionsfarbe, w ä h r e n d marklose Fasern die Additionsfarbe (violett, indigo) e r k e n n e n lassen. 1888. Zur Beobachtung der groben E n d v e r z w e i g u n g e n eines N e r v e n i m f r i s p h e n P r ä p a r a t fasert man kleine Stückchen von kurzen Muskeln (z. B. Augenmuskeln, Interossei) auf dem Objektträger mit Zupfnadeln d e r Länge nach vorsichtig auf, setzt dann l°/oige Essigsäure zu, bedeckt mit einem Deckglas und u m r a n d e t mit Wachs. Nach einigen Stunden treten die Nervenfasern deutlich hervor. Das P r ä p a r a t ist einige Zeit haltbar. 1889. Zur I s o l i e r u n g d e s A c h s e n z y l i n d e r s markhaltiger Nervenfasern legt man frische dünne Nerven f ü r 5—8 Tage in 0,l°/oige Chromsäure, in 0,2°/oige Kaliumbichromatlösung oder in Holzessig (evtl. mit nachfolgender Safraninfärbung). Beim Zupfen gelingt es dann häufig die geronnene Markscheide streckenweise abzustreifen und den Achsenzylinder bloßzulegen. 2. Darstellung markhaltiger Nerven im fixierten Präparat

1890. Bei der H e r a u s n a h m e u n d F i x i e r u n g eines peripheren Nerv e n h a t m a n jede Z e r r u n g und Quetschung zu vermeiden. Man legt ihn zu diesem Zwecke, ohne ihn selbst zu berühren, sorgfältig frei, schiebt ein Filtrierpapierstückchen entsprechender Größe unter, schneidet den Nerven oben und u n t e n ab und läßt das Papierstreifchen mit dem Nerven nach unten auf der Fixierungsflüssigkeit schwimmen. Größere Nerven werden nach ihrer Freilegung an ein Holz- pder Glasstäbchen, eine steife Borste od. dgl. angebunden u n d dann in die Fixierungsflüssigkeit gebracht. 1891. D a r s t e l l u n g d e r M y e l i n s c h e i d e n d u r c h O s m i e r u n g . M a n bindet dazu einen dünnen Nerven, z. B. den n. ischiadicus eines Frosches, in situ mit Zwirn auf ein untergelegtes Zündholz auf, schneidet ihn dann h e r a u s und legt ihn 24 Stunden in 0,5°/oige Osmiumsäure. Hierauf wäscht m a n ca. Va Stunde mit dest. Wasser, ü b e r t r ä g t f ü r je 2 Stunden Glyzerinwasser und Glyzerin und zerfasert n u n auf dem Objektträger. Es ist dazu n u r das zwischen den beiden Ligaturen gelegene nicht gequetschte Stück zu gebrauchen. Zuletzt Einschluß in Glyzerin oder Gelatinebalsam. Ergebnis: Myelin schwarz, Achsenzylinder hellgelblich; K e r n e gut sichtbar, ebenso das Neurilemm ( = Schwannsche Scheide). Auch die R a n v i e r s c h e n Einschnürungen treten gut hervor. 1892. Um Anordnung und Verteilung markhaltiger Nerven z. B. im Skelettmuskel sichtbar zu machen, spült Z ö b i s c h (34) beim Frosch zunächst das Gefäßsystem

1893—1896.

Markscheiden

449

mit physiol. Kochsalzlösung vom Herzen aus blutfrei. Dann werden von der Bauchaorta aus 10—20 ccm einer 2°/oigen Essigsäurelösung eingespritzt und nach 2 bis 3 Minuten 5—7 cCm einer 0,5°/oigen Osmiumsäurelösung. Man wartet bis die Nerven tiefschwarz gefärbt sind, präpariert die einzelnen Muskeln heraus und legt sie nochmals in 0,5°/oige Osmiumsäure, bis sie leicht hellbraun sind. Dann überträgt man für 10 Min. in l°/oige Essigsäure; anschließend in Glyzerin, dem zur Steigerung der Lichtbrechung bis zur Sättigung Chloralhydrat zugesetzt ist. Die aufgehellten Stückchen werden unter leichter Pressung mit Kompressorium unter dem binokularen Mikroskop untersucht. 1893. D a r s t e l l u n g d e r R a n v i e r s c h e n K r e u z e . Nicht zu dicke markhaltige periphere Nerven werden wie in § 1891 aufgespannt, für 24 Stunden in l°/oige Silbernitratlösung gelegt, kurze Zeit mit dest. Wasser gewaschen und in Alkohol übertragen. Dann Herstellung von Zupfpräparaten oder Einbettung in Paraffin und Herstellung von Längsschnitten. Frische nach § 1885 hergestellte Zupfpräparate werden direkt in Silbernitratlösung gestellt. Die Silberreaktion, die zur Ausbildung der R.-K. führt, verläuft folgendermaßen: das im Gewebe vorhandene Chlorid verbindet sich mit dem eindringenden Silbernitrat zu Silberchlorid, aus dem durch die Einwirkung des Lichtes Photochloridkeime entstehen; an diesen schlägt sich metallisches Silber nieder, das von dem unter der Lichtwirkung bei Berührung mit organischer Substanz sich zersetzenden Silbernitrat geliefert wird ( C o r r e n s 39). Die im Achsenzylinder in Nachbarschaft der R.-K. auftretenden F r o m a n n s c h e n L i n i e n sind als Artefakte im Sinne der L i e s e g a n g s c h e n R i n g e zu betrachten. 1894. Um Dauerpräparate zu gewinnen, in welchen die S c h m i d t - L a n t e r m a n n s c h e n E i n k e r b u n g e n ihre eigentliche Form behalten, fixiert S a n n o m y i a (27) Nervenstücke für 24—36 Stunden in einem Gemisch von 20°/oiger Formollösung und l°/oiger Osmiumsäure zu gleichen Teilen. Die E i n k e r b u n g e n sind nach B i t o (26) in vivo vorhandene Struktureigentümlichkeiten der markhaltigen, peripheren Nervenfasern, die der Ernährung der Nervenfaser dienen. Sie sind nicht mit Lipoid, sondern mit Eiweiß ausgefüllt, das stark oxydierend wirkt. Die die Einkerbungen ausfüllende Substanz wird durch Einwirkung von 0,4—9°/oiger Formollösung in steigendem Grade zur Quellung gebracht. Diese Wirkung kann durch Zusatz von l,l°/o Kochsalz selbst bei der maximal wirkenden 9°/oigen Lösung völlig gehemmt werden. In stärkeren Formollösungen nimmt die Quellung wieder ab, um endlich in einer 20°/oigen Lösung ganz zu verschwinden. Die in den Einkerbungen befindliche Substanz wird durch nachfolgende Reagenzien in ansteigendem Maße zur Quellung gebracht: Natronlauge, Kalilauge, Salzsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Ameisensäure (maximale Wirkung). Die Trichter- oder Fischflossengestalt der Einkerbungen an eingebetteten Präparaten ist eine nachträgliche Wirkung des Alkohols. 1895. N e u r o k e r a t i n . E w a l d und K ü h n e bezeichneten damit ein feinmaschiges Gerüst, das in der Markscheide nach Fixierung in absolutem Alkohol u. dgl. aufzutreten pflegt. Zur Darstellung desselben fixiert man einen nach § 1891 aufgespannten Nerven in Carnoyscher Flüssigkeit und färbt gut orientierte Längsschnitte mit Eisenhämatoxylin. S t ö h r (28) betrachtet das Neurokeratin als »ein kunstvolles Resultat großer Verständnislosigkeit der lebenden Materie gegenüber«. 1896. Die F ä r b u n g d e r M a r k s c h e i d e n p e r i p h e r e r Nerven erfolgt nach den gleichen Methoden wie im Zentralnervensystem (s. § 1820 bis 1843). Am häufigsten kommt die Methode von Benda-Spielmeyer (s. § 1832) zur Anwendung. Nach Anwendung verschiedener Fixierungsmittel wie Sublimat, Kaliumbichromat tritt an Querschnitten von Nervenfasern eine deutlich erkennbare feine radiäre 2»

Someit,

Mikrosk. T e c h n i k . 15. Aufl.

450

Peripheres Nervensystem

§ 1897—1898.

Streifung der Markscheide hervor, die die ganze Dicke der Markscheide durchzieht. Sie ist als Kunstprodukt zu deuten ( S t ö h r 28). 1897. Eine sehr scharfe Darstellung der Markscheiden peripherer Nerven gelingt mit Hilfe der Piasmaireaktion, durch die sie intensiv violett g e f ä r b t w e r den, w ä h r e n d das Bindegewebe dabei völlig u n g e f ä r b t bleibt. Die Reaktion erfolgt in üblicher Weise nach 8—24stündiger Fixierung in Sublimat-Eisessig an 10—30n dicken Gefrierschnitten. Außer den Markscheiden sind auch die Achsenzylinder plasmalhaltig; ihr Plasmalgehalt ist jedoch im allgemeinen geringer. Das Plasmal ist in den Fasern der Rückenmarksnerven gleichmäßig und schollenförmig, in den Fasern der Kopfnerven und autonomen Nerven nur gleichmäßig verteilt. Sympathische Ganglienzellen sind ebenfalls plasmalhaltig ( W a l l r a f f 42). 1898. M e t a c h r o m a t i s c h e M a r k s c h e i d e n f ä r b u n g nach F e y r t e r (35, 42). 1. Fixieren in Formol (1 :9) 24 Stunden oder länger, oder in Orth'schem Gemisch. Die Methode hat Fixation in Formol oder formolhaltigen Gemischen zur Voraussetzung. An unfixiertem Gewebe tritt die typische Farbreaktion nicht in Erscheinung. Die Chromotropie von Schleim, Knorpelgrundsubstanz oder Mastzellenkörnchen kommt dagegen auch nach Fixation an Sublimat, Müller'scher Flüssigkeit oder dgl. zustande. 2. Auswaschen in dest. Wasser. Schneiden auf dem Gefriermikrotom 10 bis 15/^, auffangen in dest. Wasser. Brunnenwasser muß vermieden werden, da es zu Niederschlägen führt. Gelatineeinbettung ist nur wenn unbedingt nötig anzuwenden. 3. Aufziehen der Schnitte auf den Objektträger. Der Objektträger darf nicht mit Eiweißglyzerin bestrichen werden. Aufkleben durch Antrocknenlassen ist unstatthaft. 4. A u f t r o p f e n der Thioninlösung. H e r s t e l l u n g : Thionin Ehrlich (Lauths-Violett) der Firma Riedel de Haen (Berlin) 1 g, Weinsteinsäure (ehem. rein!) 0,5 g, dest. Wasser 100 ccm. Die frisch bereitete Lösung muß vor Gebrauch einige Tage stehen, damit sich die Niederschläge absetzen, da ein Filtrieren der Lösung nicht angängig ist. Thionine anderer Herkunft sind meist unbrauchbar. 5. Nach 5 Minuten langer Einwirkung der Farblösung auflegen des Deckgläschens auf die Schnitte unter Vermeidung von Luftblasen u n d Falten; Absaugen der Flüssigkeit vom Rande her, soweit n u r möglich. Neben der Formolfixierung ist die Vornahme der Färbung unter dem Deckglas eine unerläßliche Voraussetzung für ihr Zustandekommen. 6. U m r a h m e n des Deckgläschens mit Lanolin-Kolophonium nach § 819. 7. Betrachten der Schnitte u n t e r Verwendung einer sog. Tageslichtlampe als Lichtquelle. — E r g e b n i s : Markscheiden metachromatisch leuchtend rot K e r n e blau. — D i e P r ä p a r a t e s i n d n u r b e s c h r ä n k t e Z e i t h a l t bar. Das richtige Färbeergebnis tritt erst nach Einschluß des Präparates und zwa gewöhnlich erst nach Stunden in Erscheinung, um oft erst nach einem Tag seinei Höhepunkt zu erreichen. — Gefrierschnitte von Gehirn und Rückenmark färbei sich oft fleckig. Der Übelstand läßt sich vermeiden, wenn man die Gefrierschnitt vor Punkt 3 für 10 Minuten in 3p°/oigen Alkohol legt. Für Dauerpräparate empfiehlt F. das Präparat nach Punkt 4 nicht zu umrahmer sondern das Deckglas nur an den 4 Ecken mit etwas Kittmasse zu fixieren un dann den Schnitt für 48 Stunden in die Farblösung einzulegen. Dann entferne der Kittropfen mit dem Messer und ablösen des Schnittes vom Objektträger i einer Thionin-Weinsteinsäure-Lösung, die bis zur Durchsichtigkeit verdünnt is Ubertragen des Schnittes für einige Min. in dest. Wasser, fixieren in 5°/oiger An

§ 1899—1902.

Einschlußfärbung nach Feyrter

451

moniummolybdatlösung 10 Min., dann dest. Wasser, Alkoholreihe, Xylol, Balsam. F e y r t e r ist der Auffassung, daß die „Einschlußfärbung" nicht nur f ü r die Darstellung der Markscheiden, sondern m e h r noch f ü r den Nachweis besonderer Lipoide von Bedeutung ist, die in den Geweben des tierischen u n d menschlichen Körpers weit verbreitet sein sollen. Er bezeichnet diese sich rosa bis rot f ä r b e n den lipoiden Substanzen als „ c h r o m o t r o p e L i p o i d e o d e r L i p o p r o t e i d e". Diese A n n a h m e n treffen jedoch nach den Untersuchungen von P i s c h i n g e r (43) nicht zu. Die Metachromasie ist vielmehr lediglich durch den im Gewebe anläßlich der Fixierung festgehaltenen Formaldehyd bedingt („F o r m o l m e t a c h r o m a s i e"). Unter dem Einfluß des Formaldehyds erfolgt je nach den gegebenen Mengenverhältnissen eine Veränderung der F a r b e des Thionins nach Rot u n d Blau bis Blaugrün. Steht einer geringen Menge Thionin viel Formaldehyd gegenüber, d a n n tritt rasch u n d anscheinend unmittelbar der blaugrüne, im umgekehrten Fall der rote Körper auf. Der letztere wird bei Weiterlaufen der Reaktion ebenfalls in das blaugrüne Produkt umgewandelt. Das gegenseitige Massenverhältnis im P r ä p a r a t hängt ab von der Konzentration der angebotenen Farblösung bzw. der Farbstoffanreicherung durch das Gewebe, ferner vom Ausmaß und der Geschwindigkeit, mit welcher der festgehaltene Formaldehyd von den verschiedenen Strukturkolloiden freigegeben wird. P i s c h i n g e r bezeichnet die Einschlußfärbung als eine wertvolle morphologische Methode, insofern sie bei erhaltenen Lipoiden eine Differenzierung von S t r u k t u r e n ermöglicht Wenn die Bedeutung der besonderen Formaldehydverbindungen in den Geweben aufgeklärt ist, k a n n sie vielleicht auch histochemisch ausgewertet werden. 1899. D a r s t e l l u n g d e r ¡ t - G r a n u l a ( R e i c h 07). Markhaltige periphere N e r v e n w e r d e n vorsichtig auf Holzstückchen gespannt u n d einige Zeit in 10°/oiger Formollösung, Orthschem Gemisch oder Müllerscher Flüssigkeit fixiert. Gefrierschnitte davon (Längsschnitte) k o m m e n f ü r 5—10 M i n u t e n in eine gesättigte w ä s s e r i g e Lösung v o n Thionin, w e r d e n dann kurz i n dest. Wasser g e w a s c h e n und durch 80- und 95%>igen Alkohol in abs. A l k o h o l gebracht, w o sie einige Minuten verweilen, bis keine F a r b w o l k e n m e h r abgehen. D a n n durch X y l o l in Balsam. In gut g e l u n g e n e n Präparaten erscheinen die Jt-Granula karmoisinrot, die K e r n e blau, die Markscheiden blaßblau gefärbt. Die ^ - G r a n u l a sind gegen Alkalien und anorganische S ä u r e n sehr widerstandsfähig. Von Fettlösungsmitteln werden sie in der Wärme sehr rasch gelöst (daher Paraffineinbettung nicht möglich), ebenso tritt bei künstlicher Verdauung Lösung ein. Durch Nilblausulfat werden sie tiefblau, nach S m i t h - D i e t r i c h schwarz gefärbt; die übrigen Fettfärbungsmehoden versagen dagegen. Bei Mensch, Hund, Ziege sind sie stets nachzuweisen, bei Kaninchen, Meerrschweinchen, Hühnern, Fischen hat sie U k a i (23) vermißt 1900. F ü r die Z ä h l u n g v o n m a r k h a l t i g e n und m a r k l o s e n F a s e r n in peripheren Nerven ist ein von J o n e s (36) ausgearbeitetes Verfahren zu empfehlen, dessen Einzelheiten im Original nachzusehen sind. 3. Darstellung der Neurofibrillen (Achsenzylinder) und ihrer Endapparale 1901. Zur Darstellung der A c h s e n z y l i n d e r peripherer N e r v e n w i e der peripheren N e r v e n e n d i g u n g e n stehen vier Gruppen v o n Methoden zu Gebote: B e i z e n f ä r b u n g mit A m m o n i u m m o l y b d a t - T o l u i d i n b l a u , Vergoldung, Silberimprägnation u n d Supravitalfärbung mit Methylenblau. A m häufigsten k o m m e n die b e i d e n letztgenannten Gruppen, die auch die größte Aussicht auf Erfolg bieten, zur A n w e n d u n g . a) B e i z e n f ä r b u n g

mit

Ammoniummolybdat-Toluidinblau.

1902. D a r s t e l l u n g d e r N e u r o f i b r i l l e n nach M ö n c k e b e r g B e t h e . 1. F i x i e r u n g des aufgespannten, nicht zu dicken N e r v e n 24 Std. in iE»

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Peripheres Nervensystem

§ 1903—1907.

0,25%>iger Osmiumsäure. 2. Auswässern 4—6 Std. 3. Direktes Einlegen in 90°/«igen Alkohol 10 Std. u n d länger. 4. Zurück in Wasser auf 4 Std. 5. Einlegen in eine 2°/oige Lösung von Natriumbisulfit, zu welcher auf je l O c c m 2—3 Tropf e n Salzsäure zugesetzt werden, 6—12 Stunden. 6. Wasser 1—2 Stunden. 7. Durch Alkohol und Benzol in Paraffin. 8. Die 2—3/x dicken, mit sehr v e r d ü n n t e m Eiweiß aufgeklebten Schnitte kommen durch Xylol, Alkohol u n d Wasser auf 5—10 Minuten in 1—4°/oige Ammoniummolybdatlösung bei 25° C. 9. A b spülen in m e h r f a c h gewechseltem dest. Wasser, überschichten mit 0,05—0,1%iger Toluidinblaulösung und färben 5 Minuten bei 50—60°. 10. Abspülen in Wasser, dann durch Alkohol und Xylol in Canadabalsam. Nach B e t h e (04) sind die Neurofibrillen basophil und behalten die Basophilie nach Fixierung m i t Alkohol. Mit Toluidinblau w e r d e n sie rötlich-violett. Falls sich auch die Markscheiden etwas mitfärben, behandelt m a n die g e f ä r b ten P r ä p a r a t e längere Zeit mit Toluol, worin sich die Markscheiden entfärben, w ä h r e n d die Fibrillen i h r e F ä r b u n g beibehalten. 1903. Uber die Färbung'der M u s k e l s p i n d e l n nach S i h l e r - G a d mit Hämatoxylin s. § 1713. b)

Goldimprägnations-Methoden

1904. Von den h i e r f ü r angegebenen Methoden seien als die relativ sichersten die von L ö w i t - F i s c h e r , R a n v i e r u n d M i l l e r hervorgehoben. I m übrigen gilt das in § 1783 Gesagte auch hier. Am leichtesten gelingen Vergoldungen bei Reptilien (besonders bei Pseudopus Pallasii, Chamäleon und Gecko), d a n n bei Säugern. Ungünstig sind im allgemeinen Vögel, Amphibien und Fische. 1905. Die L ö w i t s c h e M e t h o d e . ( L ö w i t 75, F i s c h e r 76, B r e m e r 82). Kleine Muskelstückchen (1 mm) w e r d e n in v e r d ü n n t e Ameisensäure (Ameisensäure 1 Teil, dest. Wasser 2 Teile) gelegt, bis sie durchsichtig werden (10—20 Minuten). Von hier werden sie f ü r 15—60 Minuten in eine kleine Menge einer l°/oigen Goldchloridlösung übertragen, worin sie gelb w e r d e n ( G r a b o w e r 02 u. a. n e h m e n eine 0,25°/oige Lösung). Sodann kommen die Stücke in die oben genannte Ameisensäure zurück und verbleiben darin 24 Stunden in Dunkelheit. Man k a n n dann noch f ü r ebensolange in konz. Ameisensäure übertragen (im Dunkeln). Zuletzt werden die Stücke mit dest. Wasser gewaschen u n d auf dem O b j e k t t r ä g e r gezupft. Der zentrale Teil der Stücke ist gewöhnlich violett, der periphere schmutzigbraun. Zwischen beiden Schichten findet man die am besten imprägnierten Nervenfasern und Endapparate. 1906. R a n v i e r b r i n g t kleine Stückchen zunächst in Z i t r o n e n s a f t , bis sie durchscheinend werden (ca. 5—15 Minuten). Der frisch ausgepreßte Zitronensaft w i r d durch Flanell filtriert; n u r der S a f t frisch gereifter Zitronen ist brauchbar. Nach k u r z e m Abspülen in dest. Wasser ü b e r t r ä g t man auf 20 bis 60 Minuten in l % i g e G o l d c h l o r i d l ö s u n g , spült wiederum kurz mit dest. Wasser ab und bringt in schwach angesäuertes Wasser (1 Tropfen Eisessig auf 30 ccm Wasser oder l°/oiger Essigsäure). Hierin bleiben sie 24 bis 48 Stunden, am besten auf weißer Unterlage in hellem Sonnenlicht. Da bei so behandelten Präparaten die Reduktion des Goldes keine vollständige ist, dunkeln sie meist nach. Dies ist nicht der Fall, wenn man statt der verdünnten Essigsäure verdünnte Ameisensäure (A. 1 Teil + dest. Wasser 2 Teile) 24 Stunden im Dunkeln einwirken läßt. 1907. M i l l e r (23) legt dünne Streifchen von Intercostalmuskeln (Kaninchen) 20—30 Minuten in eine 4°/oige wässerige Lösung chemisch reiner Zitronensäure (im Dunkeln). Dann kurz abspülen in dest. Wasser und übertragen in

§ 190&—1909.

Neurofibrillen (Goldmethoden, Silbermethoden)

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l°/oige Goldchloridlösung f ü r 20—30 Minuten (im Dunkeln). Von hier kommen die P r ä p a r a t e 48 Stunden lang in chemisch reine Ameisensäure 33 ccm + dest. WaSser 67 ccm (ebenfalls i m Dunkeln). Dann auswaschen in dest. Wasser und einlegen in Glyzerin. c)

Silberimprägnations-Methoden

1908. Unter den Silbermethoden, die der Darstellung der peripheren Nervenfasern und ihrer Endigungen dienen, steht an erster Stelle die BielschowskyMethode einschließlich ihrer Modifikationen (§ 1909 ff.). Namentlich das Verf a h r e n von G r o s - S c h u l t z e (§ 1914) liefert, wie die zahlreichen Veröffentlichungen von S t ö h r und seinen Schülern zeigen, ausgezeichnete Resultate. F ü r die Darstellung des T e r m i n a l r e t i c u l u m s ist sie unentbehrlich. Leider ist die Methode, da sie am Gefrierschnitt erfolgen muß, bei unzusammenhängenden oder locker gebauten Organen nur mit Schwierigkeiten anzu^ wenden. Sehr häufig findet auch S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g nach B i e l s c h o w s k y oder C a j a 1 Anwendung, bei der aber häufig n u r eine mittlere Zone des Blockes b r a u c h b a r ist. In letzter Zeit w u r d e auch die I m p r ä g n i e r u n g a m a u f g e k l e b t e n P a r a f f i n s c h n i t t (§ 1922 ff.) wesentlich weiterentwickelt ( D a v e n p o r t , B o d i a n u. a.). Die Vorteile, die letztere Methodik bietet, liegen auf der Hand; leider werden aber auf diesem Wege die feinsten Verzweigungen der Nervenfasern oft n u r unvollkommen imprägniert. Die Darstellung der Achsenzylinder u n d gröberen Endapparate gelingt dagegen sehr gut. Bei der Deutung der imprägnierten Strukturen als Nervenfasern ist sorgfältigste Kritik und Beachtung der morphologischen Merkmale von Nöten. Dies gilt auch hinsichtlich Aussagen über degenerative Veränderungen. »Wenn man in einem Präparat keine Nerven findet oder solche Nerven für degeneriert hält, die in Wirklichkeit schlecht fixiert oder ungenügend imprägniert sind, so suche man zuerst die Wirkung seiner Silberimprägnierung aufs peinlichste zu überprüfen, ehe man an marklosen Elementen die Diagnose einer Nervenfaserdegeneration stellt« (S t ö h r 32). 1909. M e t h o d e v o n B i e l s c h o w s k y f ü r p e r i p h e r e N e r v e n . A. S c h n i t t i m p r ä g n i e r u n g . F ü r die A u s f ü h r u n g der Methode gilt im allgemeinen das in § 1786 ff. Gesagte. Bei der Imprägnierung der peripheren Nerven ist n u r insoferne eine kleine Modifikation notwendig, als man die Schnitte nach dem Einwirken der ammoniakalischen Silberlösung f ü r kurze Zeit in v e r d ü n n t e Essigsäure bringt, u m die Mitfärbung des Bindegewebes abzuschwächen. Sehr wichtig ist die Vergoldung der Schnitte, da erst durch sie die feinsten nervösen Elemente sichtbar gemacht werden. Außerdem werden dadurch die P r ä p a r a t e kontrastreicher und dauerhafter. 1. Fixierung nicht über 1 cm dicker Stücke möglichst bald nach dem Tode in säurefreiem Formol 1 : 9 (mindestens 24 Stunden, besser 1—2 Wochen). Auswaschen m e h r e r e Stunden in fließendem Wasser, schneiden auf dem Gefriermikrotom 10//. A u f f a n g e n und auswaschen der Schnitte in dest. Wasser (1 bis 3 Stunden oder länger). Sehr empfehlenswert ist es, die Schnitte nach dem Schneiden für 2 Tage in Pyridin zu legen und dann solange in oft gewechseltem dest. Wasser auszuwaschen, bis der Pyridingeruch verschwunden ist. 2. Einlegen in 2—3°/oige Silbernitratlösung 24 Stunden. 3. Rasch durchziehen durch dest. Wasser (2—3 Sekunden!) und einlegen in die ammoniakalische Silbernitratlösung (Herstellung s. § 1527) bis die Schnitte

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Peripheres Nervensystem

§ 1910—1913.

eine dunkelbraune Farbe angenommen haben, was meist nach 10—20 Minuten der Fall ist. 4. Ü b e r t r a g e n d e r S c h n i t t e i n v e r d ü n n t e Essigsäure (5 Tropfen Eisessig auf 20 ccm Wasser), bis der braune Farbton in einen gelben umschlägt (1—5 Minuten). Sobald dieser deutlich hervortritt. 5. Reduktion in neutralem Formol 1 : 10. 10 Minuten. Hier bleiben die Schnitte mindestens solange, als sich aus ihnen noch weißliche Wolken entfernen.

6. Kurzes Abwaschen und Vergolden der ganz blassen Schnitte i n n e u t r a 1 e m Goldbad (5 Tropfen einer l°/oigen Lösung von braunem Goldchlorid auf 10 ccm dest. Wasser), bis der Grundton rötlich-violett ist (im Durchschnitt etwa eine Stunde). 7. Fixieren in 5°/oigem Fixiernatron 30 Sekunden. 8. Gut auswaschen, entwässern usw. Ergebnis: Die Achsenzylinder sollen tiefschwarz, das Bindegewebe bräunlich-violett sein. 1910. Wenn die Imprägnierung zu schwach ausgefallen ist, dann empfiehlt es sich, die Präparate nach der Reduktion in Formol (Nr. 5) gründlich in dest. Wasser auszuwaschen und nochmals in die ammoniakalische Silbernitratlösung (Nr. 3) zurückzubringen, um den Vorgang von da ab zu wiederholen. Die Imprägnation der Achsenzylinder kann auch an- Paraffinschnitten vorgenommen werden, wenn die Zeiten entsprechend verlängert werden.

1911. B. S t ü c k i m p r ä g n i e r u n g nach B i e l s c h o w s k y . Sehr häufig kommt besonders zur Darstellung der N e r v e n e n d i g u n g e n die Methode der Stückimprägnierung zur Anwendung, die, allerdings meist nur in beschränktem Bezirk, sehr klare und scharfe Bilder gibt. Man behandelt dazu die Gewebsstücke entweder nach § 1790 oder § 1912. 1912. B o e k e (16, 17) führt die Bielschowskysche Stückimprägnierung fast übereinstimmend mit den Angaben in § 1790 folgendermaßen aus: 1. Fixierung in 12%>igem, neutralem Formol (12 ccm Formol, 88 ccm dest. Wasser). 2. 3tägige Behandlung mit Pyridin. 3. 8stündiges Auswaschen in dest. Wasser. 4. Imprägnierung in 3°/oiger Silberlösung bei 30—35° C, 5—6 Tage. 5. Verdünnte ammoniakalische Silberlösung wie in § 1790 24 Stunden. 6. 2 Stunden langes Auswaschen in dest. Wasser (Bielschowsky nimmt verdünnte Essigsäure). 7. Reduzieren in neutraler Formollösung (20 ccm, Formol, 80 ccm dest. Wasser 12—24 Stunden. 8. Auswaschen, möglichst rasche Einbettung in Paraffin. Vergolden im Schnitte. Auch die in § 1796a angegebene Modifikation von R e u m o n t - L h e r m i t t e gibt gute Resultate. Verfahren wie in § 1796a, nur bei 1) ev. Nachfixierung der Gefrierschnitte für einige Stunden in Formol 1 :4. Bei 4) Einlegen der Schnitte in die 20°/oige Silbernitratlösung für 24 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur. Bei 6) verlängern der Zeitdauer auf 1—6 Stunden.

1913. I m p r ä g n a t i o n d e r N e r v e n i n f e t t - u n d l i p o i d r e i c h e n O r g a n e n . Da bei diesen die Bielschowsky-Methode nicht selten mißlingt, hat W a l l a r t (35) für diese Fälle folgende Modifikation ausgearbeitet: 1. Fixierung in neutr. Formol 1 Teil: dest. Wasser 4—9 Teile für mindestens 14 Tage. — 2. Einlegen 3—5 mm dicker Scheiben in ein Gemisch von Pyridin, Äther und absol. Alkohol zu gleichen Teilen; auf je 5 ccm des Gemisches wird ein Tropfen einer 4°/oigen Natronlauge zugesetzt. Dauer 4 Tage. — 3. Auswaschen in fließendem Wasser 12 Stunden und ebensolange in dest. Wasser, das alle 2 Stunden zu erneuern ist. — 4. Imprägnation in einer 1,5%>—3°/oigen Silbernitratlösi\ng, 5 Tage bei 37°'C. — 5. Abspülen einige Sekunden in dest. Wasser. — 6. Einlegen

§ 1914—1919.

Neurofibrillen (Silbermethoden)

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in ammoniakalische Silberlösung 24—26 Stunden bei Zimmertemperatur (Herstellung: zu 10 ccm einer 10°/oigen AgNOg-Lösung 5 Tropfen einer 40°'/oigen NaOH, dann Ammoniak wie § 1527, zuletzt auffüllen mit dest. Wasser auf 100 ccm). — 7. Auswaschen in dest. Wasser 2 Stunden (alle V2 Stunden erneuern). — 8. Reduktion in neutralem Formol 1 : 9, 12—18 Stunden. — 9. Rasches Entwässern. Benzol, Paraffin, innerhalb von 10—12 Stunden. Die 10/^t dicken aufgeklebten Schnitte werden wie üblich vergoldet. 1914; Die ausgezeichnete Methode von G r o s - S c h u l t z e wird auch bei peripheren Nerven und Ganglien in der in § 1793 ff. angegebenen Weise ausgeführt. Zur Darstellung der » n e u r o g e n e n N e b e n z e l l e n«, zu denen chromaffine und nichtchromaffine Zellen, Kapselzellen, vielleicht auch unreife Ganglienzellen und interstitielle Zellen gehören, kombiniert S t ö h r (39) die Methode nach G r o s - S c h u l t z e mit Plasmafärbungen wie Eosin, Eosin-Lichtgrün, Anilinblau-Orange-Essigsäure, Dominici, Ehrlich-Biondi, Azan oder polychromes Methylenblau. 1915. L a w r e n t j e w (29, 30) fixiert die Gewebsstückchen für die genannte Methode zunächst in einem Gemisch von gleichen Teilen gesätt. arseniger Säure, neutralem Formol und 96°/oigem Alkohol (A.-F.-A.-Gemisch). Nach einer Stunde überträgt man sie für beliebige Zeit in neutrales Formol (1 : 4). Gefrierschnitte dieses Materials werden dann nach G r o s - S c h u l t z e weiterbehandelt, mit dem einzigen Unterschied, daß sie gewöhnlich nur 10 Minuten in der 20°'/oigen Silbernitratlösung bleiben, da sie nach der A.F.A.-Fixierung das Silber energischer aufnehmen. P i e p e r (41) fixiert für intraepitheliale Nerven- in neutralem Formol 1 Teil, Alkohol (96%) 1 Teil, dest. Wasser 2 Teile.

1916. Auch die Natronlauge-Silbermethode nach O. Schultze (§ 1808) läßt sich für die Darstellung der Achsenzylinder wie Endigungen mit großem Vorteil verwenden. 1917. Der E i n s c h l u ß d e r f e r t i g e n Imprägnationspräpar a t e erfolgt besonders bei Verwendung von Gefrierschnitten häufig besser in Gelatinebalsam nach H e r i n g a (s. § 475) als in Canadabalsam, da hiebei die Schrumpfung geringer ist. 1918. Von den C a j a l s c h e n M e t h o d e n kommt für motorische und sensible Endigungen Methode II (§ 1799), für sensible und sympathische Ganglienzellen Methode III (§ 1802), für Neurofibrillen, Nervenendigungen und Regenerationsstadien Methode V (§ 1804) in Betracht. Die in § 1806 angegebene Methode Cajals dient der Darstellung von motorischen Endplatten und von Sinnesepithelien im Gefrierschnitt. Die Imprägnierung peripherer Nerven und Nervenendigungen, die in K n o r p e l - , K n o c h e n - oder Z a h n g e w e b e gelegen sind, gelingt mit der in § 1869 angegebenen Methode von d e C a s t r o , die auch für nicht knochenhaltiges Gewebe empfohlen wird. Weiterhin kommt für Blockimprägnation die Methode von R a n s o n (§ 1812) und von F o l e y (§ 1813) in Betracht. Weitere Modifikationen des Cajalschen Verfahrens in § 1919 und 1920. 1919. Modifikation von F a w o r s k y (30). 1. Einlegen der Gewebsstücke in eine 0,5—5°/oige Lösung von Essigsäure (Acid. acet. officin.) in 50—80°/oigen Alkohol für 24 Stunden. — 2. Auswaschen in 50°/oigem Alkohol einige Stunden. — 3. 96°/oiger Alkohol 100 ccm + Ammoniak 1 ccm, 2 Tage. — 4. Auswaschen in mehrmals gewechseltem dest. Wasser, bis die Stücke untersinken. — 5. Pyri-

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Peripheres Nervensystem

§ 1920—1922.

din 1—2 Tage. — 6. Auswaschen 12—24 Stunden in fließendem Wasser, 2 bis 3 Stunden in gewechseltem dest. Wasser. — 7. Imprägnieren in 2ft/oiger Silbernitratlösung bei 37° C 4—10 Tage je nach Größe und Dichte des Objektes. — 8. Kurz abspülen in dest. Wasser (kleine Objekte nur abtupfen mit Filtrierpapier). — 9. Reduktion in Formol (neutral, über Magnes. carbonic.) 10 ccm, Pyrogallussäure 1—2 g, dest. Wasser 100 ccm 12 Stunden. — 10. Entwässern (im 70°'/oigen Alkohol nicht über IV2 Stunden lassen, stärkerer schadet nicht); einbetten in Paraffin oder Celloidin.

F a w o r s k y hebt als Vorzug seines Verfahrens die gleichmäßige Imprägnation und relativ geringe Schrumpfung hervor. Bei derbem Gewebe ist schwächere Konzentratioh des Alkohols (50°/o) und höherer Essigsäuregehalt (3—5°/o) notwendig, bei zartem umgekehrt. Dargestellt werden intracelluläre Neurofibrillen, Achsenzylinder, Nervenendigungen in Muskel, Bindegewebe und Epithel. 1920. Modifikation von P e r e z (32). Fixierung 4—6 mm großer Gewebsstückchen in 12°/oiger Chloralhydratlösung (2mal wechseln), 48 Stunden. — 2. Kurz abspülen in dest. Wasser. — 3. Einlegen in absol. Alkohol, dem auf 60 ccm 4 Tropfen Ammoniak (Merck, 24° Be; wichtig!) zugesetzt sind, 24 Stunden. — 4. Abspülen in dest. Wasser. — 5. Imprägnieren in l,5°/oiger Silbernitratlösung bei 38° C 8 Tage. — 6. Reduktion in l,5°/oiger Pyrogallussäure 90 ccm + Formol 10 ccm 12 Stunden. — Einbettung in Paraffin.

1921. Zur D a r s t e l l u n g d e r L a n t e r m a n n s c h e n E i n k e r b u n gen, S e g a l l s c h e n R i n g e und der A p p a r a t e von Golgi-Rez-z o n i c o benützt man die folgende Methode von C a j a l (P. R o j a s 17). 1. Fixierung in Formol 6 ccm, Pyridin 10 ccm, Mangannitrat 0,5 g, dest. Wasser 40 ccm. 24 Stunden. 2. 24stündiges Auswaschen in fließendem Wasser zur Entfernung des Pyridins, da sonst Niederschläge auftreten. 3. Einlegen in l,5°/oige Silbernitratlösung für 48 Stunden. 4. Reduktion in Hydrochinon 1 g, Formol 5 ccm, dest. Wasser 80 ccm, wasserfreies Natriumsulfat 0,25 g. 24 Stunden. Hierauf Zerzupfen und Einlegen in Glyzerin. 1922. D a r s t e l l u n g d e r N e r v e n i n a u f g e k l e b t e n P a r a f f i n s c h n i t t e n . Methode von D a v e n p o r t (30). 1. Fixierung in neutral. Formol 10 ccm, dest. Wasser 90 ccm, Eisessig 5 ccm; 24—36 Stunden. — 2. Auswaschen in fließendem Wasser 24 Stunden. — 3. Auswaschen in mehrmals erneuertem dest. Wasser 24 Stunden. — 4. Einbetten in Paraffin, evtl. über Dioxan. — 5. Aufkleben der Schnitte auf Objektträger, lösen des Paraffins in Benzol. — 6. Einstellen der Schnitte in Äther-Alkohol §ä V2 Min. — 7. Einlegen des Objektträgers in eine 3—5°/oige Celloidinlösung, die die Schnitte ganz bedecken soll. Nach 3 Min. wird der Objektträger aus der Lösung genommen, seine Rückseite abgewischt und die über den Schnitten befindliche Celloidinschicht bei horizontaler Lage durch Hinzuträufeln von Celloidinlösung noch etwas verdickt. Dann warten, bis die Celloidinschicht eine gallertige Konsistenz annimmt und vor sie eintrocknet, 8. übertragen in 80°/oigen Alkohol, in dem die Celloidinschicht erhärtet. — 9. Einstellen in alkoholische Silbernitratlösung für 12 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur. Vor der Weiterbehandlung wird das Gefäß noch für —1 Stunde in den Wärmeschrank (37°) gestellt. Herstellung: 10 g Silbernitrat (pro analys. Schering oder Merck) werden in 10 ccm dest. Wasser gelöst, dann mit 96°/oigem Alkohol auf 100 ccm verdünnt und mit 10—14 Tropfen einer n - H N 0 3 versetzt.

10. Kurz abspülen in 96°/oigem Alkohol. — 11. Reduktion in: 96°/oiger Alkohol 100 ccm, Pyrogallussäure 5 g, neutr. Formol 5 ccm.

§ 1923—1926.

Neurofibrillen (Silbermethoden)

457

Nur einmal benützbar. Das Fortschreiten der Reduktion kann unter dem Mikroskop verfolgt und im geeigneten Augenblick unterbrochen werden (etwas vorher, da das Präparat im Alkohol noch nachdunkelt). Zuerst erscheinen die Achsenzylinder der markhaltigen, dann die der marklosen Fasern. 12. A b s p ü l e n in 96%>igem u n d absol. Alkohol, Lösen der Celloidinschicht in Äther-Alkohol. — 13. Nochmals 96°/oiger u n d absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Achsenzylinder schwarz auf gelblichem Grund. 1923. P o d h r a s k y (33) tropft nach dem 96°/oigen Alkohol in Punkt 13 1. einige Tropfen einer Lösung von 1 g Goldchlorid in 100 ccm 96°/oigem Alkohol auf den Objektträger, worauf die Schnitte nach einigen Sekunden grau bis weißlich werden. —• 2. Absaugen der Goldchloridlösung mit Filtrierpapier, mehrmals auftropfen von 96°/oigem Alkohol. — 3. Reduktion in 96°/oigem Alkohol, in dem auf 100 ccm 3—5 g Pyrogallol gelöst sind, 3 Min. Die fahlen Schnitte werden nun bläulichviolett. — 4. Mehrmals auftropfen von 96°/oigem Alkohol, dann abs. Alkohol, Xylol, Balsam. 1924. Schnitte von Bouin-Präparaten behandelt F o l e y (38), um sie f ü r die Methode brauchbar zu machen, folgendermaßen vor: 1. Pyridin 1 Stunde. — 2. 80°/oiger Alkohol 99 ccm + Ammoniak 1 ccm 24 Stunden. — 3. 40°/oige wässerige Silbernitratlösung 6 Stunden; dann wie in § 1922 Punkt 9 in alkoholisch angesäuerte Silbernitratlösung usw. 1925. Bei Anwendung der Davenportschen Methode für e m b r y o n a l e s Material empfiehlt v. M i h a l i k (40) einige Abänderungen, ad 1 von § 1922: Die Fixierung erfolgt für ganz junge Neuroblasten am besten in Formol 1 : 9 o h n e E i s e s s i g z u s a t z , wonach auch die neuroflbrillären Strukturen am deutlichsten erhalten bleiben. Für etwas ältere Stadien setzt man 2—3°/o, für alte 5°/o Eisessig zu. Ad 9: v. Mihalik fügt zu 100 ccm der alkoholischen Silberlösung 2 ccm einer 1/10-n-Salpetersäure und imprägniert 2—10 Stunden bei 37° C (wichtig!).— Ad 10: Die embryonalen Nervenelemente kommen nur dann zur Darstellung, wenn das Auswaschen in Alkohol unterbleibt. 1926. M e t h o d e von R o g e r s (31). 1. F i x i e r u n g in Formol 1 : 4 oder 1 :9 (neutral oder sauer) oder in Bouin 7 Tage oder länger. — 2. Auswaschen, und zwar nach F o r m o l in fließendem Wasser, nach Bouin in 70°/oigem Alkohol, bis der Überschuß an P i k r i n s ä u r e beseitigt ist. — 3. E n t w ä s s e r n je 24 S t u n d e n in 80- u n d 90%>igem Alkohol, welchen auf je 30 ccm 1 ccm A m m o n i a k z u g e f ü g t wird. D a n n 2—4 S t u n d e n in einmal gewechselten abs. Alkohol. — 4. Einbetten ü b e r C h l o r o f o r m oder Zedernöl in P a r a f f i n . — 5. Die 2—40// dicken, mit Eiweiß a u f g e k l e b t e n Schnitte k o m m e n durch Xylol u n d abs. Alkohol f ü r 12 Stunden in 96°/oigen Alkohol, dem auf 100 ccm 2 ccm A m m o n i a k zugesetzt sind. — 6. A b spülen in 80%>igem Alkohol. — 7. 40%ige Silbernitratlösung f ü r 20 Minuten (im D u n k e l n schaden auch einige Tage nichts). — 8. Rasch abspülen in dest. Wasser. — 9. A u f t r o p f e n von F o r m o l (1 :4) 2—5 Minuten. — 10. A b t r o p f e n des Formols, aber nicht abspülen (wichtig!). — 11. Bedecken mit ammoniakalischer Silbernitratlösung (Herstellung s. unten). M a n beobachtet u n t e r dem Mikroskop, bis sich die N e r v e n f a s e r n g e f ä r b t haben. — 12. Waschen in dest. Wasser e t w a 1 Minute. Ist die I m p r ä g n i e r u n g zu stark, d a n n läßt sie sich d u r c h Differenzier e n in 4%>iger Essigsäure abschwächen. — 13. Vergolden in Goldchlorid 1 : 300, d e m auf je 50 ccm 10 T r o p f e n Eisessig zugesetzt sind. 10.—15 Min. — 14. Waschen in dest. Wasser; w e n n die Schnitte zu hell sind, d a n n Einstellen in 4°'/oige Oxalsäure. — 15. F i x i e r e n in 5°/oiger Fixiernatronlösung. 5 Minuten. — 16. Sorgfältiges A u s w a s c h e n in fließendem Wasser usw. E r g e b n i s : Achsenzylinder u n d N e r v e n e n d i g u n g e n sind schwarz g e f ä r b t . R o g e r s hat außer dieser Vorschrift noch drei weitere angegeben, bemerkt aber, daß die oben mitgeteilte Vorschrift bei Amphibien wie Säugetieren die zufriedenstellendsten Resultate gibt.

458

§ 1927—1929.

Nervengewebe

H e r s t e l l u n g d e r a m m o n i a k a l i s c h e n S i l b e r l ö s u n g : 'Zu 4 ccm einer 20°/oigen Silbernitratlösung werden einige Tropfen Ammoniak zugesetzt. Der dabei entstandene Niederschlag wird dann u n t e r s t ä n d i g e m S c h ü t t e l n durch weiteren vorsichtigen tropfenweisen Zusatz von Ammoniak eben gelöst. Sodann wird auf je 2 ccm der ursprünglichen 20°/oigen Silbernitratlösung 1 Tropfen Ammoniak zugefügt. Schließlich gibt man noch 4 ccm dest. Wasser zu. Die Lösung ist einige Tage haltbar. 1927. Ü b e r , die a u c h f ü r p e r i p h e r e N e r v e n s e h r zu e m p f e h l e n d e M e t h o d e v o n B o d i a n s. § 1816 f. Ü b e r die O s m i u m j o d i d m e t h o d e von C h a m p y z u r D a r s t e l l u n g s y m p a t h i s c h e r N e r v e n i n D r ü s e n s. § 2046. d) D a r s t e l l u n g

mittels supravitaler blaufärbung

Methylen-

1928. D i e v o n P. E h r l i c h (85) e i n g e f ü h r t e s u p r a v i t a l e M e t h y l e n b l a u f ä r f ä r b u n g b r i n g t N e r v e n u n d N e r v e n e n d i g u n g e n i m F a l l e eines p o s i t i v e n E r f o l g e s i n t e n s i v b l a u g e f ä r b t auf m e h r oder w e n i g e r f a r b l o s e n U n t e r g r u n d z u r D a r s t e l l u n g . V o r b e d i n g u n g f ü r die A n w e n d u n g d e r M e t h o d e ist allerdings, d a ß die F ä r b u n g u n m i t t e l b a r n a c h d e m Tode o d e r d e r E n t n a h m e aus d e m O r g a n i s m u s ausgeführt wird. Eine sehr bedeutsame Vervollkommnung e r f u h r die Technik d e r s u p r a v i t a l e n M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g d u r c h die A r b e i t e n von W o r o b i e w u n d s e i n e r Schule. F ü r m i k r o s k o p i s c h - a n a t o m i s c h e U n t e r s u c h u n g e n sind d a v o n v o r a l l e m die V e r ö f f e n t l i c h u n g e n v o n S c h a b a d a s c h von W i c h t i g k e i t . N a c h f o l g e n d soll n u n z u n ä c h s t die ä l t e r e M e t h o d i k d e r s u p r a v i t a l e n M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g d a r g e s t e l l t w e r d e n , die ja a u c h j e t z t noch viel g e b r a u c h t w i r d ; die n e u e M o d i f i k a t i o n k o m m t in d e n §§ 1941—1946 z u r D a r s t e l l u n g . aa)

Supravitale Methylenblaufärbung nach M e t h o d i k von E h r 1i ch - D o g i e1

der

älteren

1929. D i e F ä r b u n g k a n n auf v e r s c h i e d e n e Weise v o r g e n o m m e n w e r d e n , n ä m lich a) d u r c h I n j e k t i o n d e r F a r b l ö s u n g in die B l u t b a h n , b) d u r c h E i n s p r i t z u n g in e i n e K ö r p e r h ö h l e (z. B. B r u s t - o d e r Bauchhöhle), c) d u r c h E i n s p r i t z u n g in d a s B i n d e g e w e b e des zu u n t e r s u c h e n d e n O r g a n e s oder d) d u r c h u n m i t t e l b a r e s E i n l e g e n v o n O r g a n e n b z w . O r g a n t e i l e n in die F a r b l ö s u n g . A m m e i s t e n ist die e r s t e u n d l e t z t g e n a n n t e A n w e n d u n g s w e i s e in G e b r a u c h . U n m i t t e l b a r an die A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g schließt sich d e r e n F i x i e r u n g , o h n e w e l c h e die erzielte F ä r b u n g schon in k u r z e r Zeit w i e d e r v e r blassen würde. S e h r w e s e n t l i c h f ü r das G e l i n g e n d e r F ä r b u n g ist die V e r w e n d u n g eines u n v e r f ä l s c h t e n , r e i n e n Farbstoffes. K r a u s e e m p f i e h l t das c h e m i s c h reine, k r i s t a l l i s i e r t e M e t h y l e n b l a u d e r H ö c h s t e r F a r b w e r k e , das ein C h l o r z i n k d o p p e l salz d a r s t e l l t , oder das chemisch r e i n e M e t h y l e n b l a u m e d i c i n a l e d e r F i r m a M e r c k , d a s f r e i v o n Chlorzink ist. F ü r g e w ö h n l i c h b e r e i t e t m a n e i n e l°/oige S t a m m l ö s u n g in 0,6—0,9°'/oiger N a t r i u m c h l o r i d l ö s u n g ( A m p h i b i e n 0,6%>ige, S ä u g e r 0,9°/oige). M a n v e r w e n d e nicht g e w ö h n l i c h e s Kochsalz, s o n d e r n c h e m i s c h r e i n e s N a t r i u m c h l o r i d . D e r G e b r a u c h v o n R i n g e r l ö s u n g , N o r m o s a l u. dgl. ist in d i e s e m F a l l e n i c h t zu e m p f e h l e n , d a es d a b e i zu F a r b s t o f f n i e d e r s c h l ä g e n im Gewebe kommen kann. Aus der l°/oigen Stammlösung lassen sich durch Zusatz von physiologischer, Kochsalzlösung leicht die jeweils notwendigen Verdünnungen bereiten. Am besten verfährt man dabei in der Weise, daß man zunächst 1 Teil Stammlösung mit 1 Teil der Salzlösung verdünnt ( =1 /2°/oig), dann 1 Teil dieser Verdünnung wieder mit

§ 1930—1931.

Supravitale

Methylenblaufärbung

459

1 T e i l S a l z l ö s u n g ( = 1/4°/oig) usw. A u f diese Weise b e k o m m t m a n eine 1/s, Vi, 1 /a u n d 1/ie°/oige L ö s u n g , die einschließlich einer V«0/oigen m e i s t f ü r alle F ä l l e g e n ü g e n . D i e K o n z e n t r a t i o n ist f ü r d i e einzelnen O b j e k t e v e r s c h i e d e n ; z w e c k m ä ß i g f ü h r t m a n den ersten V e r s u c h m i t drei v e r s c h i e d e n e n K o n z e n t r a t i o n e n , z. B. einer V4-, l / - und 1 /s°/oigen L ö s u n g a u s ; a m b e s t e n ist j e n e L ö s u n g , die bei intensiver Fär6 b u n g der N e r v e n die geringste M i t f ä r b u n g des B i n d e g e w e b e s gibt. D a s n a c h t r ä g liche A n f e u c h t e n der P r ä p a r a t e e r f o l g t m e i s t m i t einer stark v e r d ü n n t e n L ö s u n g (i/10»/oig), u m eine zu s t a r k e A n r e i c h e r u n g v o n F a r b s t o f f , die eine k r ä f t i g e B i n d e g e w e b s f ä r b u n g zur F o l g e hätte, zu v e r m e i d e n .

Die Färbung der Nerven erreicht nach einer bei den einzelnen Objekten verschiedenen, von vornherein nicht zu bestimmenden Zeit ihr Maximum, um dann, wenn sie nicht fixiert wird, an Güte wieder abzunehmen. Bei Warmblütern erfolgt die Färbung bei Körpertemperatur (ca. 37° C) bei Kaltblütern bei Zimmertemperatur (ca. 18°'C). Die Tötung des Tieres soll (nach Betäubung mit Chloroform od. dgl.) durch möglichst vollständiges Entbluten erfolgen. Nimmt man die Färbung durch intravital beginnende Einspritzung in die Blutbahn vor, so muß das Tier mit Chloralhydrat betäubt werden. a) Ausführung der Färbung aa) Durch Injektion in die Blutbahn

1930. Dieselbe erfolgt in den meisten Fällen nach vorausgehender Tötung des Tieres (über die intravitale Injektion s. § 1931). Vor der Einverleibung des Farbstoffes müssen die Blutgefäße blutleer gespült werden. Man führt dazu durch einen kleinen Einschnitt der linken Herzkammer eine Kanüle in die Aorta, bindet sie fest und durchspült in gewohnter Weise mit körperwarmer physiologischer Kochsalzlösung. Bei großen Tieren können statt dessen auch einzelne herausgeschnittene Organe durchspült werden. Hierauf wird die auf 37° C erwärmte V4—V»0/»ige Methylenblaulösung injiziert, bis die Oberfläche der zu untersuchenden Organe makroskopisch blau gefärbt erscheint. Nach 30 Minuten werden ganze Organe oder, wenn sie größer sind, 1—2 bis 3 cm große Stücke derselben herausgeschnitten und auf Glaswolle, welche mit V«—Vi6°/oiger Methylenblaulösung gut angefeuchtet ist, in eine flache Schale übertragen; diese schließt man mit einem n i c h t f e s t schließenden Deckel und stellt sie in einen auf 36° C erwärmten Thermostaten. Nach 10—30 Minuten oder, bei größeren Stücken, nach 1, IV2, 2 Stunden werden die Präparate aus dem Thermostaten herausgenommen und fixiert. Sind die Organe konsistent, so fertigt man von ihnen 15 Minuten nach der Methylenblau-Injektion zweckmäßig Rasiermesserschnitte an, die man in ähnlicher Weise wie oben mit Vie0/o Methylenblaulösung befeuchtet und in einer feuchten Kammer in den Thermostaten bringt. Alle 5—15 Minuten untersucht man bei schwacher Vergrößerung das Fortschreiten der Nervenfärbung, um sie im gegebenen Augenblick unterbrechen zu können. Bei Kaltblütern wird die ganze Prozedur bei Zimmertemperatur ausgeführt: man injiziert eine V4—VsVoige Lösung; nach V2—1—2 Stunden wird das zu untersuchende Organ f r e i g e l e g t , so daß die Luft gut zutreten kann; nach 20—30 Minuten wird es herausgeschnitten und fixiert. 1931. Soll die Verabreichung des Farbstoffes noch i n t r a v i t a l erfolgen, so injiziert man dem mit Chloralhydrat betäubten Tier nach K r a u s e alle 5 Minuten in die Vena femoralis 1 ccm der körperwarmen Farblösung, deren Konzentration man in diesem Falle langsam von 0,25°/o auf l°/o steigert. Das

460

Nervengewebe

§ 1932—1934.

Tier muß dabei durch Einhüllen mit Tüchern vor Abkühlung geschützt werden. Das Ergebnis ist um so besser, j e mehr Farbstoff einverleibt werden kann. Diese Abart der Methode kommt vor allem für Gehirn und Rückenmark in B e tracht. S. auch § 1779. ßß) Durch Einspritzung in eine Körperhöhle oder in das Organbindegewebe 1932. Man verfährt dabei in analoger Weise wie in § 1930. Bei Injektion in die Brusthöhle wird die ganze den Thorax umgebende Haut- und Muskeldecke abpräpariert, bei Einspritzung in die Bauchhöhle entfernt man Haut und oberflächliche Muskelschichten. yy) Durch .Färbung am herausgenommenen Organ oder Organteil. 1933. In diesem Falle legt man die zu untersuchenden Organe bzw .0,5 bis 2 cm dicke Organscheiben auf den mit etwas Glaswolle bedeckten Boden einer Glasschale. Sodann durchfeuchtet man die Glaswolle mit einer stark verdünnten (z. B. Vi6°/oigen Methylenblaulösung), während man auf die Organe selbst Vi—1/8ff/oige Farblösung auftropft, so daß ihre Oberfläche in dünner Schicht mit Methylenblaulösung bedeckt ist: Hierauf wird die Schale mit einer lose aufliegenden Glasplatte bedeckt und (bei Warmblütermaterial) in einen auf 36 bis 37° C erwärmten Thermostaten gestellt. Um ein Austrocknen des Präparates zu verhindern, muß ab und zu V8—Vi6°'/oige Farblösung nachgetropft werden. Von Zeit zu Zeit beobachtet man bei schwacher Vergrößerung das Fortschreiten der Färbung, die im Falle ihres Gelingens meist nach 1—2 Stunden ihren Höhepunkt erreicht. — Bei Kaltblütern erfolgt die Färbung bei Zimmertemperatur. Zu beachten ist, daß sich die Färbung meist nur auf die oberflächlichen Schichten der Präparate erstreckt, während die tieferen Schichten ungefärbt bleiben. Es empfiehlt sich daher die Präparate möglichst dünn anzufertigen und alle ungefärbten Teile vor oder nach der Fixierung mit einem scharfen Rasiermesser zu entfernen. In den meisten Fällen wird man auf diese Weise die Herstellung von Totalpräparaten versuchen. Von derben Organen, wie z. B. der Wachshaut des Schnabels oder dem harten Gaumen von Wasservögeln, werden Rasiermesserschnitte hergestellt, die auf einem Objektträger mit Ve—1/8°7oiger Methylenblaulösung benetzt und in einer feuchten Kammer wie oben gefärbt werden; die Schnitte dürfen in der F a r b lösung nicht schwimmen, müssen aber durch Befeuchten vor Verdunstung geschützt werden. Die Färbung geht hierbei sehr rasch, in 10—15—20 Minuten, vor sich; dann wird fixiert. Bei all diesen Methoden sind kleine Modifikationen, welche dem Charakter des ganzen Verfahrens nicht zuwider sind, selbstverständlich zulässig. E r g e b n i s : Die Nervenendigungen und Achsenzylinder der Nervenfasern sind intensiv blau gefärbt, während das übrige Gewebe ungefärbt oder nur schwach getönt erscheint. Mitfärbung des Bindegewebes ist meist ein Zeichen dafür, daß die verwendete Farblösung zu konzentriert war. 1934. Als ein zur Untersuchung der Nervenendigungen besonders geeignetes Objekt empfiehlt K r a u s e (23) die Bauchmuskeln eines Frosches. Man injiziert dazu 5 ccm einer 0,5°'oigen Methylenblaulösung in den Bulbus cordis. Nach einer halben Stunde wird die Bauchhaut entfernt, der Muse, rectus abdom. herausgeschnitten und auf einer gefensterten Wachsplatte kräftig ausgespannt. Gewöhnlich tritt die Färbung an dem in feuchter Kammer unter Luftzutritt liegendem Objekt schon bald ein. Man fixiert (s. § 1935 ff.), wäscht und entwässert in gespanntem Zustand.

§ 1935—1938.

Supravitale Methylenblaufärbung

461

ß ) Fixierung der supravitalen Methylenblaufärbung 1935. Wie schon vorausgehend e r w ä h n t wurde, m u ß die F ä r b u n g der Nerven mit Methylenblau, sobald sie ihren Höhepunkt erreicht hat, fixiert werden. Man gebraucht dazu entweder p i k r i n s a u r e s oder m o l y b d ä n s a u r e s A m m o n i u m oder beide Salze nacheinander. Mir persönlich gab die Fixierung m i t molybdänsaurem Ammonium nach B e t h e - D o g i e l (s. § 1936) bei T o t a l p r ä p a r a t e n stets ausgezeichnete Resultate. Sollen die P r ä p a r a t e nach d e r F ä r b u n g in Paraffin eingebettet werden, so ist die d o p p e l t e Fixier u n g nach § 1940 zu empfehlen. 1936. F i x i e r u n g m i t m o l y b d ä n s a u r e m A m m o n i u m nach B e t h e - D o g i e l . Man gebraucht dazu eine frisch bereitete 5—8°/oige wässerige Lösung von molybdänsaurem Ammonium. Falls die Lösung nicht klar ist, m u ß sie vor Gebrauch filtriert werden. Oft ist es empfehlenswert, der Lösung etwas Osmiumsäure zuzusetzen (auf 100 ccm etwa 4—6 Tropfen einer l°/oigen Lösung), da dann die übrigen Gewebselemente besser erhalten werden. Die mit Methylenblau gefärbten P r ä p a r a t e werden unmittelbar in die 50- bis' lOOfache Menge der Fixierungsflüssigkeit eingelegt. D ü n n e Präparate, wie z. B. Membranen od. dgl., w e r d e n vorher auf eine gefensterte Wachsplatte, ein mit Filtrierpapier belegtes Kartonstreifchen od. dgl. mit Igelstacheln oder Holzstiftchen (Metallinstrumente sind zu vermeiden) aufgespannt. Die Dauer der Fixierung, die bei Z i m m e r t e m p e r a t u r erfolgt, hängt von der Größe der P r ä p a r a t e ab; d ü n n e Membranen sind schon nach '/ 2 —1 Stunde fixiert, größere benötigen bis zu 24 Stunden. Langer Aufenthalt in der Flüssigkeit schadet nicht. Nach beendeter Fixierung w e r d e n die P r ä p a r a t e in mehrmals gewechseltem Wasser gründlich ausgewaschen (je nach Größe 1—6 Stunden). Hierauf ü b e r t r ä g t man sie (in aufgespanntem Zustand) in absoluten Alkohol, in welchem sie n u r so lange (höchstens 5 Stunden) verweilen sollen, als zu ihrer Entwässerung nötig ist, da der Alkohol mit der Zeit die F ä r b u n g angreift. U m die schädliche Wirkung des Alkohols auf ein Minimum zu reduzieren, h a t es sich mir als zweckmäßig erwiesen, n u r die H a u p t m e n g e des Wassers mit 96®/oigem Alkohol und die letzten Reste durch Einlegen in einmal gewechseltes Terpineol zu entfernen, in welchem die Objekte ohne Schaden mehrere Stund e n bis zum völligen Durchsichtigwerden verweilen können. In diesem Falle genügt es d ü n n e P r ä p a r a t e f ü r 5—10 Minuten in 1—2mal gewechseltem, größere 1—2 Stunden in 2—3mal gewechseltem 96°/oigem Alkohol zu belassend Nach der Terpineolbehandlung werden die Objekte durch Xylol in Canadabalsam eingebettet. Derartig fixierte und eingebettete P r ä p a r a t e halten sich vor Licht geschützt jahrelang in u n v e r ä n d e r t e r Frische. 1937. Will man Schnittpräparate herstellen, so ü b e r t r ä g t man die nicht zu großen Stücke aus abs. Alkohol auf einige Stunden in eine 4°/oige Celloidinlösung, klebt sie auf einen Holzblock und h ä r t e t das Ganze in 70°/oigem Spiritus. Der Block soll möglichst bald geschnitten werden, da der Alkohol die F ä r b u n g angreift. Ist dies nicht möglich, so b r i n g t man ihn in Wasser, worin er ohne Schaden noch 2—3 Tage aufgehoben werden k a n n (M a r k o v i t i n ) . Um in Paraffin zu schneiden, fixiere m a n nach B e t h e - D o g i e l , § 1936. Die P a raffineinbettung greift aber die F a r b e unter Umständen doch sehr an. Statt dessen k a n n man auch versuchen, die P r ä p a r a t e nach dem Auswaschen ohne sie in Alkohol zu bringen, in Gelatine einzubetten (s. § 469 oder 471) und auf dem Gefriermikrotom zu schneiden. ,1938. A m m o n i u m m o 1 y b d a t - W a s s e r s t o f f s u p e r o x y d nach B e t h e (95). Die gefärbten Präparate kommen in ein Gemisch aus: molybdänsaures Am-

462

Nervengewebe

§ 1939—1941

monium 10 g, dest. Wasser 100 ccm, Wasserstoffsuperoxyd (3°'oig) 10 g, officin. Salzsäure 10 Tropfen. Je nach Größe bleiben die Stücke im Eisschrank (bei + 2° C) 2—5 Stunden in der Flüssigkeit, hernach noch einige Zeit bei Zimmertemperatur; dann auswaschen in dest. Wasser (1—2 Stunden) und Weiterbehandlung wie oben (ev. Paraffin- oder Celloidineinbettung; man verwendet dabei eisgekühlten Alkohol). Nachfärbung mit Carmalaun oder Teerfarben zulässig. Setzt man nach einiger Zeit der Fixierungsflüssigkeit Osmiumsäure zu, so wird die Methylenblaufärbung dunkler und alkoholbeständiger. 1939. F i x i e r u n g i n p i k r i n s a u r e m A m m o n i u m n a c h D o g i e l . Man überträgt die P r ä p a r a t e , wenn die N e r v e n f ä r b u n g ihren Höhepunkt erreicht hat, in eine reichliche Menge einer gesättigten wässerigen Lösung von pikrinsaurem A m m o n i u m (ca. 1 g auf 100 ccm dest. Wasser). Die Dauer der Einwirkung beträgt je nach der Größe der P r ä p a r a t e 2—24 Stunden, auf keinen Fall länger als 48 Stunden. Sodann wird in ein Gemisch aus Fixierungsflüssigkeit und Glyzerin zu gleichen Teilen eingeschlossen, nachdem alle überflüssigen und störenden Gewebsteile entfernt sind. — F ü g t man zu 100 ccm Fixierungsflüssigkeit 1—2 ccm einer 2%>igen Osmiumsäure, so kann m a n die P r ä p a r a t e nachträglich mit Pikrocarmin färben. Einschluß wie vorher. 1940. D o p p e l t e F i x i e r u n g n a c h D o g i e l - B e t h e . Dieselbe ist besonders dann zu empfehlen, wenn man, wie z. B. bei Paraffineinbettung, eine Zerstörung der Methylenblaufärbung zu b e f ü r c h t e n hat. Bei der Methode kommt sowohl pikrinsaures Ammonium wie molybdänsaures Ammonium zur Anwendung. Der F a r b t o n der P r ä p a r a t e schlägt dabei von Blau in Violett um. A u s f ü h r u n g : 1. Einlegen der P r ä p a r a t e unmittelbar nach der F ä r b u n g in eine gesättigte wässerige Lösung von pikrinsaurem Ammonium (ca. 1 g auf 100 ccm dest. Wasser; Vorsicht, das trockene Salz explodiert bei Erhitzen!): 30—60 Minuten. 2. Ohne Auswaschen übertragen in 5°/oige wässerige Lösung von molybdänsaurem Ammonium, der auf 100 ccm 10—20 ccm einer 0,5°/oigen Osmiumsäure zugesetzt werden: 12—24 Stunden. 3. Sorgfältiges Auswaschen in oft gewechseltem dest. Wasser: 4—6 Stunden. 4. Rasches D u r c h f ü h r e n durch 70°'/oigen und 96°/oigen Alkohol (am besten im Eisschrank und in 1—2 Stunden). Sorgfältiges Entwässern und Durchtränken in mehrmals gewechseltem Terpineol. Dann rasch durch Benzol in Paraffin. Bei der Nachbehandlung der Paraffinschnitte ist darauf zu achten, daß auch diese möglichst wenig mit Alkohol in Berührung kommen. Weitere Angaben bei M i c h a i 1 o w (10) und D o g i e l (10, 27). bb) S u p r a v i t a l e M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g n a c h Methodik von Schabadasch

der

1941. Seit E h r l i c h , D o g i e l , M. H e i d e n h a i n u. a. galten Lebendzustand, Sauerstoffsättigung und Alkalinität der Gewebssäfte und des Milieus als Grundbedingungen einer guten Methylenblaufärbung des Nervensystems. Diese Auffassung k o n n t e von S c h a b a d a s c h durch eine Reihe ausgezeichneter Untersuchungen (25—36) widerlegt werden. Aus der Feststellung, d a ß Methylenblau auf den Organismus in der f ü r die F ä r b u n g nötigen Dosierung toxisch wirkt, ergab sich, daß nicht das Leben im eigentlichen Sinne, sondern der frische Zustand der Gewebe, das Erhaltensein eines gewissen Teils der morphologisch-physiologischen Stoff Wechselmechanismen erforderlich ist. Weiterhin konnte bewiesen werden, daß es weder auf eine Sauerstoffaktivierung in den Geweben, noch auf eine Sauerstoffsättigung der Zellen und Fasern ankommt,

Supravitale Methylenblaufärbung (Schabadasch)

§ 1941.

463

sondern auf die Mobilisierung der Wasserstoffatome. In Gegenwart von Methylenblau, das ein energischer Wasserstoffakzeptor ist, kommt es zu einem Vorherrschen von Dehydrierungsprozessen, in deren Gefolge typisch anaerobiotische I n t e r m e d i ä r p r o d u k t e auftreten. Die Wasserstoffakzeption seitens des Farbstoffes f ü h r t zu weitgehenden intrazellulären Umstellungen, die die Voraussetzung f ü r die finale Reaktion zwischen Methylenblau und den kolloidalen Gewebesstrukturen geben. Die Funktion des Methylenblaus als Wasserstoffakzeptor konnte durch Zusatz von ergänzenden organischen Wasserstoffakzeptoren, wie Pyrocatechin, Resorcin, Chinon usw. gesteigert werden. Was endlich die Forderung einer Alkalinität des Färbungsmilieus betrifft, so konnte S c h a b a d a s c h zeigen, daß im Gegensatz zu dieser A n n a h m e namentlich f ü r die Darstellung der Geflechte des vegetativen Systems das Optimum bei einem PH < 7,0, also auf der sauren Seite liegt. Weiterhin h ä n g t nach S c h a b a d a s c h der Erfolg der Methylenblaufärbung von Kohlehydratstoffwechsel ab. Es ergab sich, daß Zusatz von T r a u b e n zucker und einiger seiner Umwandlungsprodukte (namentlich von brenzt r a u b e n s a u r e m Natrium) bei PH + 7,0-Werten der Methylenblaufärbung sehr förderlich ist, so daß dann eine Reihe sonst schwer f ä r b b a r e r nervöser Elemente sehr elektiv dargestellt wird. Die starke Wirksamkeit des Traubenzuckers auf den Färbungsvorgang erklärt S c h a b a d a s c h aus einer weitgehenden Veränderung des Zuckers durch das Nervengewebe und aus dem A u f t r e t e n von hochaktiven I n t e r m e d i ä r p r o d u k t e n im Gewebe. Er bezeichnet die Glykolyse des Nervengewebes geradezu als diejenige seiner Eigenschaften, die die Elektivität der F ä r b u n g bestimmt. Auch Substanzen, die die A t m u n g hemmen, also die Glykolyse fördern, wie Urethan, Thymol, Hedonal u. a. haben in Verbindung mit Glukose sehr günstige Wirkung; ebenso Magnesiumsalze, die gleichfalls die Glykolyse stimulieren. All diese F a k t o r e n bewirken gleichzeitig auch eine starke Beschleunigung des Färbeprozesses. Auf Grund dieser Erkenntnisse arbeitete S c h a b a d a s c h eine Reihe von Vorschriften aus, die in einer die f r ü h e r e n Ergebnisse der Methylenblaufärbung weit übertreffenden Vollständigkeit je nach Zusammensetzung marklose und markhaltige Fasern, Endapparate und andere Verzweigungen des zerebrospinalen wie vegetativen Nervensystems darzustellen gestatten. TABELLE 12 (nach S c h a b a d a s c h 30) Auf 1000 c c m F a r b l ö s u n g in g Organ

Tierart

Katze Hund Kalb Meerschweinchen . . . Macacus rhesus

. . . .

Blindschleiche

. . . .

* Paraamidophenol

Magen Darm Magen Darm Herz Dünndarm

NaCl

Methylenblau

Resorcin

7,2 7,2 8,5 8,5 8,0 7,2

0,15 0,15 0,2 0,2 0,075 0,25

0,05 0,12 0,2 0,3 0,75* 0,3

0,33 0,7 0,05

0,33—0,5 0,7 4,0

Dünndarm 8,5—9,0 Dickdarm 8,5—9,0 Niere 6,5-7,0

Benötigte Menge in c c m

Maximum der Färbung nach Min.

2400 1200 3200 3200

10 5

30

7—12

464

Nervengewebe

§ 1942—1944.

Die Methodik von S c h a b a d a s c h läßt sich, wie die Untersuchungen von H i 11 a r p (46) zeigen, auch zur Darstellung feinster nervöser Strukturen verwenden. Die Resultate sind bei Einhaltung konstanter optimaler Bedingungen reproduzierbar. Die Methode ist stark elektiv für Neurofibrillen und gibt ein getreues Bild der vitalen Morphologie. 1942. Die supravitale Methylenblaufärbung nach S c h a b a d a s c j i muß durch Injektion der Farblösung in die Blutbahn erfolgen, am besten im leben, den Zustand oder unmittelbar nach dem Tode des Tieres. A u s f ü h r u n g d e r I n j e k t i o n . Das Tier wird dazu tief narkotisiert. Das Organ, dessen Nerven gefärbt werden sollen, wird durch den nächsten großen Arterienstamm injiziert. Gleichzeitig wird zu Beginn der Injektion die zugehörige Vene geöffnet, um den Abfluß des Blutes und der injizierten Flüssigkeit zu ermöglichen. Die Höhle, in der das Organ liegt, bleibt während des ganzen Verlaufes der Injektion uneröffnet. Zur Verkleinerung des Gefäßgebietes werden die großen Gefäße der für die Untersuchung nicht in Betracht kommenden Körperteile abgebunden. Also: Bei Färbung der Organe der Bauch- und Beckenhöhle Injektion durch Aorta thorac. und abbinden der Vasa femor.; bei Färbung der Organe der Brusthöhle Injektion durch Aorta abdomin. und abbinden der Vasa axill. aa. Carotid., vv. jugul. usw. Nach Verbrauch von 4/s der ganzen Injektionsflüssigkeit wird die Abflußvene unterbunden und mit dem Rest die Blutbahn der betreffenden Organe unter erhöhtem Druck strotzend gefüllt. Unmittelbar nach Beendigung der Injektion wird das Organ freigelegt, vorsichtig ohne Quetschen herausgenommen und in die Injektionsflüssigkeit, aber ohne Methylenblauzusatz, übertragen (bei Hohlorganen auch damit angefüllt); dann wird der Eintritt des Maximums der Färbung abgewartet. Da der ganze Vorgang von der Injektion bis zur maximalen Färbung in verhältnismäßig kurzer Frist verläuft (gewöhnlich in 7 bis 20 Min.), hat man die ganze Aufmerksamkeit auf das zu untersuchende Organ zu konzentrieren, um das Optimum der Färbung nicht zu verpassen. Über die Fixierung der Färbung s. § 1945. 1943. A p p a r a t u r z u r I n j e k t i o n . Die Injektion der Farblösung muß unter einem Druck erfolgen, der dem mittleren Blutdruck des Tieres entspricht. Bei größeren Tieren verwendet man als Behälter für die Farblösung eine Wulffsche Flasche mit drei Hälsen; der erste Hals dient für ein zuführendes, mit Gummigebläse und Dreiweghahn versehenes Rohr, der zweite für einen Scheidetrichter, durch den während der Injektion Lösungen zugesetzt werden können, der dritte für ein abführendes mit dem Injektionsschlauch verbundenes Rohr und ein Thermometer. Auch ein Manometer zur Druckmessung kann mit der Flasche noch verbunden werden. Für kleine Tiere benützt man eine an einem Stativ befestigte graduierte Bürette, in der die Flüssigkeit mittels kommunizierender Röhre ständig auf dem gleichen Niveau gehalten wird. Alle Behälter müssen aus Glas sein und eine gut sichtbare Graduierung besitzen; ihr Rauminhalt soll die zur Injektion erforderliche Flüssigkeitsmenge nicht wesentlich übersteigen. 1944. H e r s t e l l u n g d e r F a r b l ö s u n g , a) F a r b s t o f f . Schab a d a s c h verwendet ausschließlich das Methylenblau medicinale ehem. rein und chlorzinkfrei, H o e c h s t . Die optimale Konzentration des Methylenblaus ist für die einzelnen Tierarten verschieden. Sie schwankt zwischen 0,0037 bis 0,5 g pro Mille. Stärkere Konzentrationen verschlechtern das Ergebnis. b) W a s s e r . Alle Lösungen werden mit doppelt destilliertem Wasser bereitet. Die Reinheit des Wassers ist für das Ergebnis von größter Bedeutung, da die Methylenblaufärbung eine höchst empfindliche biologische Reaktion dar-

Supravitale Methylenblaufärbung (Schabadasch)

§ 1944.

465

stellt, deren Ablauf schon durch minimale Mengen von Reagenzien gestört werden kann. Es darf daher grundsätzlich nur doppelt dest. Wasser verwendet werden. Das Destillationsgerät für die zweite Destillation muß aus Jenaer Glas sein (am besten mit Quarzrohr wie bei der in § 1521 und in Abb. 21 dargestellten Apparatur). Dem zu destillierenden Wasser wird etwas Permanganat und einige Tropfen NaOH zugesetzt. TABELLE 13 (nach S c h a b a d a s c h 30 und 36) Tierart

Organ

Optimal* F ä r b u n g beipH

Hund Blindschleiche . .

extraorgane Nerven Magenfundus intramural Magenpylorus „ Duodenum, Jejunum subserös Ileum, Dickdarm subserös Harnblase, sub- und intraepethelial Uterus, intramural Vagina, „ Harnleiter „ Samenleiter „ Blutgefäße Duodenum, subserös, intramural Jejunum intramural Heum, Colon intramural Gallenblase intramural Niere1

7,2 6,98 6,0—6,24 6,98 5,9 5,4-5,6 5,9-5,6 5,9 5,6 5,9 4,6—5,1 6,9 6,24 5,7—5,9 6,2 5,1

Katze

Affe

c) I s o t o n i e . Als Grundlösung für alle Vorgänge (Injektion, Durchspülung, Differenzierung) verwendet man eine aus ehem. reinem Natriumchlorid bereitete Salzlösung. Der Salzgehalt wird je nach Tierart verschieden eingestellt (s. Tab. 12). Die Temperatur der Lösungen soll der Körpertemperatur des Versuchstieres entsprechen; sie ist während der ganzen Dauer des Versuches auf gleicher Höhe zu halten. d) W a s s e r s t o f f i o n e n k o n z e n t r a t i o n der Farblösung. Die H Konzentration ist für den Erfolg der Färbung von großer Wichtigkeit. Nach S c h a b a d a s c h gibt es für jedes Organ eine ganz bestimmte H"-Konzentration, bei der die Färbung des Nervensystems die größte Vollständigkeit und Elektivität erreicht. Unter Umständen können sogar am gleichen Organ verschiedene Zonen vorhanden sein (vgl. z. B. Magenfundus und Pylorus in Tab. 13). Das Optimum ist erst für eine beschränkte Zahl von Objekten ermittelt (siehe Tab. 13) und muß für neue durch Versuchsreihen ermittelt werden. Zur Pufferung der Kochsalzlösung empfiehlt S c h a b a d a s c h besonders die Phosphatgemische von Soerensen. Die Vorratslösungen des ein-, zwei- und dreibasischen Natriumphosphats werden in Molarkonzentrationen aus chemisch reinen Reagenzien hergestellt. Die gewünschte H--Konzentration wird durch Vermischung in Proportionen der Soerensenschen Skala erhalten und zunächst elektrometrisch, später — vor jedem Versuch — kolorimetrisch nach Clark oder Michaelis nachgeprüft. Die Menge der Phosphate beträgt auf 1 1 Flüssigkeit 10 ccm des Gemisches der Molarlösungen. (Einzelheiten über die Herstellung der Pufferlösungen bei Michaelis.) e) Z u s ä t z e z u r F a r b l ö s u n g . 30

Romeis

M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u f l .

466

Nervengewebe

§ 1945.

a) O x y - oder A m i n o p h e n o l e (meist Resorcin). Ihre Menge hängt von der Tierart ab; sie steigt gemäß folgender Reihe: Katze, Hund, Kalb, Kaltblüter, Affe, Mensch. Einen gewissen Anhaltspunkt gibt die Tabelle 12. Die Lösung des Resorcins usw. wird gesondert bereitet, in den Scheidetrichter des Injektionsgefäßes gefüllt und zur Methylenblaulösung erst dann zugefügt, wenn der größte Teil des Blutes aus den Gefäßen gespült ist und aus den Venen entfärbte Methylenblaulösung abfließt. ß) T r a u b e n z u c k e r . In späteren Untersuchungen empfiehlt S c h a b a d a s c h (36) den Zusatz von Traubenzucker, namentlich in Verbindung mit b r e n z t r a u b e n s a u r e m N a t r i u m , das eine natürliche, nicht toxische, leicht diffundierende Verbindung darstellt. Ihr Zusatz gibt dem Untersucher ein sehr vielseitiges, fein abstimmbares Verfahren in die Hand, um das Nervensystem in den verschiedensten Abschnitten und bei den verschiedensten Tierarten nach Belieben zu färben. Beispiel einer Lösung für vegetative Geflechte: Dest. Wasser 1000,0 + Natriumchlorid 8,0 + Glukose (puriss. pro analysi) 2,0 g + brenztraubensaures Natrium 0,32 g + Methylenblau 0,35 g. Gepuffert w i r d mit m/1 einbasischem Phosphat bis PH 5,4—5,6 (10 ccm Phosphat auf 1 Liter Flüssigkeit). Injektionsmenge (für Katze) 1500 ccm. Optimale Färbung nach 7—10 Minuten.

y) M a g n e s i u m s a l z e . Weitere Möglichkeiten ergeben sich durch den Zusatz von Magnesiumbromid oder -chlorid. Die Mg-Ionen stimulieren die glykolytischen Ferment- und Cofermentsysteme des Nervengewebes. Durch stufenweise Dosierung der Mg-Salze ist man imstande, den Verlauf der Färbung aufs feinste zu regeln. Beispiel einer Lösung für vegetative Geflechte: Dest. Wasser 1000,0 + Natriumchlorid 7,5 g + Glukose 2,0 g + brenztraubensaures Natrium 0,35 g + Methylenblau 0,2 g + Magnesiumbromid (Kahlbaum, M g Br 2 + 6 H 2 0 ) 0,3 g. Für markhaltige Nervenfasern und sensible Endapparate, daneben auch vegetative Geflechte: Dest. Wasser 1000,0 + Natriumchlorid 8,0 g + Glukose 2,0 g + brenztraubens. Natrium 0,32 g + Magnesiumbromid 1,25 g. Pufferung auf PH 6,0; Injektionsmenge 1500 ccm. M g Br 2 ist zur Vermeidung von Niederschlägen in kleinen Portionen unter Rühren zuzusetzen.

1945. F i x i e r u n g . Wie schon hervorgehoben, erreicht die Färbung der Nerven nach einer je nach Organ und Tierart verschiedenen Zeitdauer ihr Optimum, um dann mehr oder weniger rasch wieder abzublassen. Es ist daher notwendig, die Färbung auf ihrem Höhepunkt zu fixieren. Während die in § 1935 ff. angegebenen Methoden für kleine Gewebsstückchen genügen, versagen sie, wenn es sich wie bei der Methode S c h a b a d a s c h s um die Erhaltung der Nervenfärbung in größeren Komplexen handelt, vollständig, da das Eindringungsvermögen der genannten Lösungen zu gering ist. Eine geeignete Fixierungsflüssigkeit fand S c h a b a d a s c h dagegen in einem Gemisch aus Ammoniumpikrat und Ammoniumjodid oder Ammoniumrhodanid, das sehr rasch eindringt und schon nach etwa 5—7 Minuten die Färbung der nervösen Elemente auch in den tief gelegenen Teilen gut fixiert. H e r s t e l l u n g d e r L ö s u n g : Man bereitet eine 2,ll°/oige wässrige Lösung von Ammoniumjodid (NH4J) oder eine l,12°/oige Lösung von Ammoniumrhodanid (NH4CNS). Darauf sättigt man eine dieser auf 60° C erwärmten Lösungen durch Zugabe von Ammoniumpikrat im Überschuß und läßt sie bei Zimmertemperatur einige Tage stehen. Das zur Verwendung kommende Ammoniumpikrat soll aus großen nadeiförmigen, orangefarbigen Kristallen bestehen, das eine Beimengung von Ammonium picraminicum enthält (»pikrinsaures Ammonium angefeuchtet« von Leitz). Das aus feinen kanariengelben Kristallen bestehende ist nicht brauchbar.

§ 1946—1950.

Herz, Blut- und Lymphgefäße

467

A n w e n d u n g : Zur Fixierung erwärmt man eine entsprechende Menge des Gemisches auf dem Wasserbad ( n i c h t ü b er d e r F l a m m e ! !) auf 35° C und legt das gefärbte Präparat auf 3—6 Stunden ein. Das Nervengewebe ist nach dem Fixieren intensiv dunkelviolett mit einem bräunlichen Ton gefärbt. E i n s c h l u ß : Als Einschlußmedium empfiehlt S c h a b a d a s c h eine Glycerin-Pikrat-Gelatine, in der sich die Präparate jahrelang unverändert halten. Zur Herstellung derselben bereitet man folgende Lösungen: a) Chem. reines fettsäurefreies Glycerin wird im Verlauf von 6 Tagen bei 25° C in gut verschlossenem Gefäß mit Kristallen von Ammoniumpikrat gesättigt, b) Man läßt 10 g bester Gelatine in 50 ccm heißen dest. Wasser quellen, setzt dann 50 ccm kochendes dest. Wasser zu und löst auf dem Wasserbad. Filtrieren durch 4faches Leinen. Gleiche Teile von a und b werden vereinigt und ohne Zusatz von Carbolsäure oder Thymol in Jenaerglas aufgehoben. Die Präparate kommen unmittelbar aus der Fixierungsflüssigkeit oder (bei dickeren Schichten) nach Aufhellen in gesätt. Ammoniumpikratglycerin in das Einschlußmedium. Über die Verwendung der Technik von Schabadasch zur Darstellung der perizellulären Apparate von Ganglienzellen (Synapsen) sowie des peripheren Innervationsapparates finden sich eingehende Angaben bei H i 11 a r p (46). 1946. Will man die Präparate in Canadabalsam bringen, so muß man nach obiger Fixierung noch mit Ammoniummolybdat-Osmiumsäure nachfixieren. S p a n n e r (29) gibt auf 10 ccm einer 10°/oigen Ammoniummolybdatlösung 10 Tropfen einer l°/oigen Osmiumsäure und beläßt die Präparate mindestens 6 Stunden lang in der Lösung; dann wenige Minuten wässern, Gefrierschneiden, 96°/oiger Alkohol (kurz!), abs. Alkohol (beliebig lang), Xylol, Balsam.

25. K A P I T E L

Herz-, Blut- und Lymphgefäße 1947. U b e r s i c h t s p r ä p a r a t e v o m H e r z e n lassen sich mehr oder weniger nach allen gebräuchlichen Fixierungs- und Färbemethoden gewinnen. Beabsichtigt man eine Fixierung in extremer D i a s t o l e , so vergiftet man nach K r a u s e das Tier mit Chlocalhydrat (2—3 g pro kg Körpergewicht) und unterbindet vor der Herausnahme des Herzens und Einlegen in die Fixierungsflüssigkeit sämtliche zu- und abführende Gefäße. Zur Herbeiführung einer extremen S y s t o l e injiziert man dem Tier bis zum Tode von einer Vene aus eine l°/oige Bariumchloridlösung. 1948. Große, umfangreiche Herzstücke bettet man zweckmäßig in Celloidin ein. — Die intrakardialen Blutgerinnsel sind vor der Einbettung nach Möglichkeit zu entfernen, da sie meist sehr hart und schwer schneidbar werden. — Kalkhaltiges Klappengewebe muß natürlich entkalkt werden.

1949. Zur D a r s t e l l u n g d e s M u s k e l g e w e b e s sei Fixierung in Formol-Alkohol und Imprägnierung nach Bielschowsky oder Färbung mit Säurealizarinblau-Phosphormolybdänsäure (§ 1491) empfohlen. Sehr schöne Präparate gibt ferner nach Fixierung in Susa (§ 344), Subtrie (§ 345 oder nach § 333) die Färbung mit Eisen- oder Vanadiumhämatoxylin (s. § 688). 1950. Zur Färbung von M u s k e l - und B i n d e g e w e b e eignet sich sehr gut die Azanfärbung (s. § 1489) oder die Methode von Masson (§ 1496) oder Pasini (§ 1499) sowie deren Modifikationen. Überaus klar wird das Bindegewebe durch die in § 1517—1554 angegebenen Silbermethoden dargestellt. 30*

468

Herz, Blut- und Lymphgefäße

§ 1951—1951.

1951. Die P u r k i n j e sehen F ä d e n lassen sich infolge ihres Glykogenreichtums durch F ä r b u n g nach Best (§ 1103) oder Bauer (§ 1104) deutlich h e r vorheben (Fixierung nach Carnoy). Weiteres über ihre Darstellung s. § 1719. 1952. E n d o - und P e r i k a r d können nach § 1280 ff. versilbert, mit der Pinzette abgezogen und in Glyzerin oder Canadabalsam eingeschlossen werden. 1953. Das i n t r a k a r d i a l e N e r v e n s y s t e m läßt sich durch s u p r a vitale Methylenblaufärbung wie durch Silbermethoden (bes. nach G r o s S c h u l t z e , § 1793) zur Darstellung bringen (s. M i c h a i l o w , Wolh y n s k y , L a w r e n t j e w u. a.). 1954. Die B l u t g e f ä ß e fixiert m a n in Formol, Formol-Alkohol, Susa, nach Helly, Stieve od. dgl. Bei großen, an elastischem Material sehr reichen Gefäßen wendet m a n häufig Celloidineinbettung an. 1955. Paraffinschnitte, die sehr viel elastisches Material enthalten (z. B. Aorta), färbt man am besten vor dem Aufkleben und vor der Paraffinbefreiung, indem man sie nach § 1752 auf den Farblösungen (z. B. Orcein) schwimmen läßt und erst zuletzt auf dem Objektträger auffängt. Man vermeidet auf diese Weise die sonst leicht auftretenden Faltenbildungen. 1956. Behandelt man die Media unfixierter Blutgefäße einige S t u n d e n mit K a l i - oder Natronlauge, Drittel-Alkohol (24 Stunden oder länger) oder l°/oiger Weinsäure, so lassen sich stellenweise elastische Membranen, Netze und Fasern d u r c h sorgfältiges Spalten u n d Zupfen isolieren. 1957. Die Darstellung der einzelnen Gewebskomponenten der Gefäße erfolgt nach den in den diesbezüglichen Kapiteln angegebenen Methoden. Besonders e m p f e h l e n s w e r t sind f ü r glattes Muskelgewebe § 1729—1731, f ü r kollagenes Bindegewebe § 1489, f ü r argyrophiles Bindegewebe § 1525, 1533, 1537, 1548, f ü r elastisches Bindegewebe § 1556 oder 1560, ferner kombinierte F ä r b u n g e n nach § 1564, 1565; f ü r Nervengeflechte § 1793 und 1808. 1958. Die sog. E p i t h e l o i d e n Z e l l e n (»Q u e l l z e l l e n«) d e r a r t e r i o v e n ö s e n A n a s t o m o s e n treten sehr schön an A z a n p r ä p a r a t e n hervor, namentlich nach Fixierung in Susa, Sublimat-Formol-Eisessig u. dgl. 1959. Z u m Studium k l e i n e r G e f ä ß e und P r ä k a p i l l a r e n eignen sich ganz besonders Stückchen der Pia m a t e r eines in Formol oder Alkoholformol fixierten Gehirnes, die man der Fläche nach auf dem O b j e k t t r ä g e r ausbreitet, und gleich Gefriersöhnitten mit Hämalaun-Eosin, nach Hornowsky od. dgl. f ä r b t . Auch Schnittpräparate der Pia lassen den A u f b a u der kleinen Gef ä ß e sehr schön erkennen. F ü r eingehendere Untersuchungen hat man zu berücksichtigen, daß der Bau der Gefäßwandungen in den Einzelheiten je nach d e r H e r k u n f t und Topographie o f t sehr beträchtliche Unterschiede aufweist; s. auch B e n n i n g h o f f (27). 1960. Z u m Studium der K a p i l l a r e n sind Zunge und Harnblase vom Frosch sehr geeignet. Man fixiert in ausgespanntem Zustand nach Helly, Zenker, in Susa, Formol-Sublimat-Alkohol od. dgl. und bettet in P a r a f f i n ein. Zur F ä r b u n g empfiehlt V i m t r u p (22, 23) besonders die Methode.von Calleja (siehe § 715), wobei auch die Rougetschen Zellen gut hervortreten. B e n n i n g h o f f (26) f ä r b t sie nach § 1489. Über die Beobachtung der Hautkapillaren in lebendem Zustand vgl. § 149, E. W e i ß (21) und O. M ü l l e r (36, 38). 1961. K. W. Z i m m e r m a n n (23), der die Rougetschen Zellen als Pericyten bezeichnet, stellt sie mit Hilfe einer Modifikation der Golgi-Methode dar, die auch P 1 e n k (27) sehr empfiehlt. Die am besten 1 ccm großen Gewebsstückchen werden dabei in dem Kopschschen Kaliumbichromat-Formolgemisch (§ 243) fixiert, einige Tage mit reiner Kalium-

§ 1962—1965.

Gefäß-Injektionsmethoden

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bichromatlösung nachbehandelt und dann auf 5—6—8 Tage in eine 8°/oige Silbernitratlösung übertragen. Hierauf durch 50-, 80-, 96°/oigen absoluten Alkohol und Benzol in Paraffin ( P l e n k behandelt je Vä Stunde in- 50-, 96°/oigem, absol. Alkohol, Äther-Alkohol, dünnem und dickem Celloidin, legt die Stücke auf Stabilitblöcke, härtet xh Stunde in Chloroformdämpfen und dann in 80°/oigem Alkohol). Die 25—30/t dicken Schnitte werden entparaffiniert und in eine frisch bereitete Mischung von 20 ccm einer in 50°/oigem Alkohol gesättigten Sodalösung und 10 ccm Formol übertragen, in der sie einen bis mehrere Tage verbleiben (einmal wechseln, Schnitte öfters bewegen). Hierauf werden die Schnitte in 50°/oigem Alkohol ausgewaschen, dem zur Beseitigung der Braunfärbung der Schnitte so viel einer 5°/oigen Eisenalaunlösung zugesetzt wird, bis der Alkohol leicht gelblich gefärbt ist. Wenn der Untergrund genügend entfärbt ist, wird sofort mit Brunnenwasser gründlich ausgewaschen. Hierauf ev. Nachfärbung mit Hämalaun, Auswaschen, Entwässern, Xylol, Canadabalsam. Ähnlich wie die Golgi-Methode gelingt auch diese Modifikation nicht in jedem Falle. — Nach P l e n k (29) läßt sich statt einer 8°/oigen ebensogut eine l°/oige Silbernitratlösung verwenden. 1962. L y m p h g e f ä ß e untersucht man am besten an Schnitten durch die Umgebung des Hilus großer Lymphdrüsen des Mesenteriums, der Inguinalgegend od. dgl. 1963. Die Z e l l g r e n z e n d e s E n d o t h e l s der Kapillaren und kleiner Gefäße werden durch Versilberung dargestellt. Solche Präparate zeigen häufig auch die Grenzen der glatten Muskelzellen. Man verfährt dabei entweder nach § 1280 ff. oder man spült ein betäubtes, durch Abschneiden der Herzspitze verblutetes Tier mit einer 3,3°/oigen isotonischen Natriumsulfatlösung blutfrei und injiziert eine 1—5°/oige Silbernitratlösung oder Silbergelatine (s. u.), bis das ganze Gefäßsystem gefüllt ist (bei einem Frosch z. B. 10—15 ccm). Hierauf werden Stücke des Mesenteriums, der Lunge, Harnblase und dgl. entnommen, ausgebreitet, abgespült, mit Alkohol fixiert und eingeschlossen. Allenfalls auch Nachfärbung mit Hämalaun od. dgl. Zur Herstellung der Silbergelatine läßt man reinste Gelatineblätter in 2—3mal erneuertem dest. Wasser quellen, drückt sie aus, schmilzt und setzt 0,1—1 Silbernitrat zu. 1964. Behandelt man Blutgefäße nach der in § 1822 angegebenen Methode, so färben sich in der Media starre, gradlinig verlaufende, » t e l e g r a p h e n d r a h t ä h n l i c h e « - Fasern, die auch im Bindegewebe zerstreut auftreten (D ü r c k). Die Darstellung des Blufgefäf|netzes a) V o r b e m e r k u n g 1965. Nicht injizierte Kapillaren kollabieren häufig so sehr, daß man sie in Schnitten oft nur schwer feststellen kann. Über die Menge und den Verlauf der Kapillaren eines Organes läßt sich daher aus mikroskopischen Schnitten meist nur dann eine richtige Vorstellung gewinnen, wenn das Lumen der Kapillaren entweder durch eine Anstauung der roten Blutkörperchen oder durch Injektion von Farbmassen angefüllt wird. Im ersteren Fall lassen sich durch intensive Färbung der roten Blutkörperchen Präparate gewinnen, die schönen Injektionspräparaten gleichen. Von den verschiedenen dafür angegebenen Methoden seien die Verfahren von S 1 o n i m s k i (§ 1966) und P i c k w o r t h (§ 1967) empfohlen. Beide gelingen natürlich nur, wenn die Blutgefäße gut und gleichmäßig mit Erythrozyten gefüllt sind. Es ist daher bei der Fixierung durch entsprechende Lagerung, Unterbindung u. dgl. dafür zu sorgen, daß die zu untere suchenden Gefäßbezirke stark gefüllt sind und sich auch während der Fixierung nicht entleeren können. Bei den Injektionsmethoden soll dagegen das Gefäßnetz möglichst blutleer sein. Häufig schickt man daher der Injektion der Farbmasse eine Durchspülung

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Herz, Blut- und Lymphgefäße

§ 1966—19C8.

m i t physiol. K o c h s a l z l ö s u n g od. dgl. voraus. D a b e i ist a b e r eine a l l z u l a n g e D u r c h s p ü l u n g u n t e r a l l e n U m s t ä n d e n zu v e r m e i d e n , d a sie leicht zu u n a n g e n e h m e n E x t r a v a s a t e n f ü h r t N i c h t selten k a n n m a n ü b e r h a u p t d a r a u f v e r z i c h t e n u n d das B l u t gleich m i t d e r I n j e k t i o n s f l ü s s i g k e i t h e r a u s s p ü l e n . U n t e r den I n j e k t i o n s m e t h o d e n sei f ü r m i s k r o s k o p i s c h e Z w e c k e b e s o n d e r s die T u s c h e i n j e k t i o n (§ 1977) h e r v o r g e h o b e n , die den ä l t e r e n C a r m i n g e l a t i n e m e t h o d e n n a m e n t l i c h f ü r die D a r s t e l l u n g f e i n s t e r K a p i l l a r e n ü b e r l e g e n ist. F ü r K o r r o s i o n s p r ä p a r a t e leistet die I n j e k t i o n m i t d e m S c h u m m e r sehen P l a s t o i d ( s . § 1985) ausgezeichnetes. F ü r A u f h e l l u n g s p r ä p a r a t e von g r ö ß e r e n G e f ä ß e n , G ä n g e n u n d v o n H o h l r ä u m e n ist die K l e i s t e r i n j e k t i o n n a c h P a n s c h - S p a n n e r w e r t v o l l (s. § 1988). b) D a r s t e l l u n g d u r c h Färbung 1966. M e t h o d e v o n S l o n i m s k i u n d C u n g e. 1. F i x i e r u n g in F o r m o l (40°/o) 25,0, N a t r i u m c h l o r i d 10,0, F e r r i c y a n k a l i u m 4,0, dest. W a s s e r 250,0. Die F l ü s s i g k e i t w i r d a m b e s t e n erst k u r z vor G e b r a u c h bereitet. F i x i e r u n g s d a u e r 24—48 S t u n d e n . — 2. A u s w a s c h e n 2 S t u n d e n . — 3. G e f r i e r s c h n i t t e 120/ige Natriumsulfatlösung oder konz. wässerige Lösung von oxalsaurem Ammonium, der zur Lähmung der Gefäßmuskulatur auf 100 ccm 5 Tropfen A m y l n i t r i t zugesetzt sind. Die Durchspülung soll, um das Auftreten von Ödemen zu vermeiden, n u r kurze Zeit dauern. Siehe auch § 1965 1974. Die Injektion muß vor dem Auftreten intravaskulärer Gerinnungen vorgenommen werden. Das Tier tötet man am besten durch Narkose. Bei W a r m b l ü t e r n injiziert man warm (ca. 38—40°), bei K a l t b l ü t e r n b e i Z i m m e r t e m p e r a t u r , da bei umgekehrtem Vorgehen die Gefäße leicht zu reflektorischer Kontraktion veranlaßt werden. 1975. T o t a l i n j e k t i o n e n werden bei größeren Tieren häufig unvollständig, weshalb man sich zweckmäßig nur auf das in Betracht kommende Organ beschränkt und alle abzweigenden, unwichtigen Gefäße unterbindet.

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Herz, Blut- und Lymphgefäße

§ 1976—1980.

1976. Man injiziere langsam und zunächst mit ganz schwachem Druck, den man erst allmählich etwas steigert. Die Höhe des Druckes, Menge der Injektionsmasse und Dauer der Injektion hängt vom Objekt ab und muß im Einzelfall durch Versuch ermittelt werden. Zu starker Druck ist wegen der Bildung von Extravasaten zu vermeiden. Nach Beendigung der Injektion unterbindet man sogleich das Zuflußgefäß. Bei Verwendung von Gelatinemassen kühlt man das Organ nach der Injektion am besten im Eisschrank ab, um die Masse möglichst rasch zur Erstarrung zu bringen. Nach 1—2 Stunden wird in Formol oder Alkohol fixiert. ß) Spezielle Methoden 1977. Tuscheinjektion. F ü r die Darstellung kapillarer Blutgefäße hat sich ganz besonders die Injektion verdünnter T u s c h e l ö s u n g bewährt. Als besondere Vorzüge dieses Verfahrens sind hervorzuheben die mühelose Füllung auch der feinsten Gefäße, der Wegfall von Diffusion der Injektionsflüssigkeit in die Umgebung der Gefäße und die Klarheit des mikroskopischen Bildes. Sehr angenehm ist ferner, daß man bei Abkühlung keine Verstopfung der Kanüle zu befürchten hat und daß die Injektion in vielen Fällen auch mit der nicht erwärmten Flüssigkeit vorgenommen werden kann. Zur Injektion verdünnt man die käufliche P e r l t u s c h e von Günther Wagner je nach der Weite der Gefäße mit der 2—3fachen Menge physiologischer Kochsalz- oder Ringerlösung. Wichtig ist, daß die Flüssigkeit vor der Injektion mehrmals filtriert wird. S p a n n e r (31) schreibt vor, die mit Ringer verdünnte Lösung 6mal in der Wärme zu filtrieren und dann noch 2mal 15 Min. zu zentrifugieren. Nach dieser Vorbehandlung dringt die Flüssigkeit auch in die feinsten Kapillarsprossen. Eine vorausgehende Durchspülung ist bei Tuscheinjektion meist unnötig, man spült das Blut gleich mit der Injektionsflüssigkeit aus den Gefäßen und klemmt dann ab. Das Fortschreiten der Injektion läßt sich an der zunehmenden Schwärzung der Haut, bzw. des betreffenden Organes, leicht erkennen. Nach Beendigung der Injektion werden auch die zuführenden Gefäße sorgfältig unterbunden und das Ganze f ü r einige Tage in Formol oder Formol-Alkohol fixiert. 1978. Die Injektion mit Tuscheverreibungen wurde erstmals von T a g u c h i (88) empfohlen. G r o s s e r (00) verrieb chinesische Tusche mit Hühnereiweiß. H a m b u r g e r (08) schließlich verwandte die käufliche Perl tusche von Günther Wagner, die er mit Hühnereiweiß (1 :1) oder mit Pferdeserum (2 : 3) verdünnte. 1978a. L ü d i c k e (41) empfiehlt die Injektion von unverdünntem S k r i p t o l , einer ebenfalls von Günther Wagner hergestellten tiefschwarzen Tuschelösung.

1979. Gelafineinjektion. Die Injektion mit gelatinehaltigen Massen muß zumeist in der Wärme vorgenommen werden. Organe von Warmblütern müssen, falls sie erkaltet sind, vor der Injektion in körperwarmer Ringer-Lösung vorgewärmt werden. F ü r gewöhnliche Schnittpräparate benötigt man eine transparente Injektionsmasse wie Carmingelatine (§ 1980) oder Berlinerblaugelatine (§ 1982); f ü r Aufhellungspräparate verfährt man nach § 1984. 1980. C a r m i n - G e l a t i n e . Man löst 1 g Carmin in 1—2 ccm Ammoniak und 6—8 ccm Wasser und erhitzt in einer Kolbenflasche auf dem Sandbad solange, bis sich das überschüssige Ammoniak verflüchtigt hat (die dunkelrote Farbe nimmt dabei eine mehr hellrote Nuance an). Nach Erkalten wird filtriert. Ferner läßt man 50 g beste Gelatine 24 Stunden in dest. Wasser quellen, preßt das überschüssige Wasser mit den Händen aus und löst durch Erwärmen auf dem Wasserbad (auf 60° C, nicht höher); dann fügt man von obiger Farblösung

§ 1981—1984.

Gefäß-Injektionsmethoden

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unter ständigem Umrühren soviel zu, als zur Erziehung eines intensiven Farbtones nötig ist und digeriert, bis der Farbton hellrot wird. Dann setzt man 5 bis 10 Volumprozent Glyzerin und 2—3 Gewichtsprozent Chloralhydrat zu (in konz. Lösung), filtriert im Heißwassertrichter durch Flanell und hebt die Masse in offener Schale unter einer Glasglocke auf. Zur Injektion bringt man die Masse durch Einstellen in warmes Wasser (ca. 40° C) zum Schmelzen. Die größte Schwierigkeit bei der Bereitung einer guten Carmin-Gelatine besteht darin, den richtigen Neutralisationspunkt zu treffen. Ist zuviel Ammoniak vorhanden, dann diffundiert der Farbstoff durch die Gefäßwand in die Umgebung; bei saurer Reaktion dagegen fällt das Carmin mehr oder weniger grobkörnig aus, wodurch die kleineren Gefäße verstopft und infolgedessen inur unvollkommen injiziert werden. Bei einer guten Masse muß das Carmin in kolloidaler Lösung bleiben. 1981. K r a u s e (09) läßt 100 g Gelatineblätter 2 Stunden lang in dest. Wasser quellen. Dann läßt er sie für l h Stunde in einem Sieb abtropfen und färbt sie 2—3 Tage lang in Boraxcarmin (100 g Borax werden in 2 Liter heißem dest. Wasser gelöst, 15 g Carmin zugesetzt und gekocht. Nach Abkühlen filtrieren.) Nach Abtropfen der Farblösung wird in Brunnenwasser gut abgewaschen. Dann taucht man die Blätter einzeln in 5—10 Liter 2%>ige Salzsäure, bis das Carmoisinrot in Kirschrot umschlägt (nicht länger!) und wäscht 1 Stunde in fließendem Wasser aus. Schließlich werden die gefärbten Gelatineblätter nach Abtropfen auf dem Wasserbad unter Zusatz von etwas Kampfer geschmolzen. 1982. B l a u e I n j e k t i ' o n s m a s s e . Man bereitet sich dazu eine konzentrierte wässerige Lösung des käuflichen wasserlöslichen Berlinerblau und eine Gelatinelösung wie in § 1980. Dann bringt man beide Lösungen im Wasserbad auf gleiche Temperatur (60° C) und setzt die Berlinerblaulösung unter ständigem Rühren allmählich zur Gelatine. Man rührt so lange, bis die Masse völlig gleichmäßig ist und am Glasstab keine Farbkörncherj mehr erkennen läßt. Hierauf werden 5—10 Volumprozent Glyzerin und mindestens 2 Gewichtsprozent Choralhydratkristalle zugesetzt und das Ganze im Heißwassertrichter durch Flanell filtriert. Die mit Berlinerblau injizierten Stücke können hierauf auch mit chromsalzhaltigen Flüssigkeiten fixiert werden. Abgeblaßte Stücke oder Schnitte erlangen in Nelkenöl ihre blaue Farbe wieder. Setzt man dem zum Entwässern der Präparate dienenden Alkohol etwas Eisenchlorid zu, so läßt sich das Abblassen der Farbmasse von vornherein vermeiden. — Durch Einlegen der Präparate in P a l l a d i u m c h l o r ü r l ö s u n g geht die blaue Farbe in eine tiefbraune über, die unverändert bleibt. (K u p f f e r.) Bearbeitet man mit Gelatine injizierte Präparate (kleine Stücke) mit Osmiumsäure, so quellen sie nicht mehr in kaltem und lösen sich nicht mehr in heißem Wasser (Ran v i er 85). 1983. E i n e b e i 17° C n o c h f l ü s s i g e G e l a t i n e m a s s e erhält man nach T a n d 1 e r folgendermaßen: Man löst 5 g Gelatine in 100 g Wasser unter leichtem Erwärmen, fügt dann je nach Bedarf (ob heller oder dunkler gefärbt) Berlinerblaulösung zu und setzt zuletzt langsam unter stetem Umrühren 5 g Jodkalium zu. Durch noch höheren Zusatz kann man die Masse bei noch tieferen Temperaturen flüssig erhalten. 1984. G e l a t i n e m a s s e f ü r A u f h e l l u n g s p r ä p a r a t e . Für feinste Gefäße löst S p a n n e r (25, 37) 2 Blatt der käuflichen Speisegelatine in 100 ccm warmem Waser und fügt der mit etwas Thymol versetzten Lösung langsam unter stetem Rühren reichlich den feinst gepulverten Farbstoff (Deckweiß,

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Herz, Blut- und Lymphgefäße

§ 1985—1938.

Zinnober, oder Kobaltblau) zu. Erfolgt dies mit der nötigen Sorgfalt, so ist ein nachträgliches Filtrieren durch Flanell, das einen beträchtlichen Farbstoffverlust bedeutet, unnötig. Nach der Injektion wird in Formol fixiert, evtl. in 15°/oigem Wasserstoffsuperoxyd gebleicht, über Nacht gewässert und durch steigenden Alkohol 'in Benzol gebracht. Schließlich kommen die Präparate in Wintergrünöl + chlorfreies Benzylbenzoat (2 :1). Zum Eindecken derartiger Präparate empfiehlt S p a n n e r einen Balsam, der durch Lösen von 55 g allerfeinstem hellem Geigenkolophonium in 8 ccm einer Mischung von Benzylbenzoat und Wintergrünöl (1 :1) in der Wärme bereitet wird. Die Präparate werden am besten in die noch warme Masse eingelegt. Die Injektion mit Zinnober- oder Deckweißgelatine hat auch noch den Vorteil, daß sich von den damit injizierten Gefäßen gute Röntgenbilder gewinnen lassen. Für Doppelinjektionen, z. B. zum Nachweis arteriovenöser Anastomosen verwendet S p a n n e r Deckweißgelatine und Tusche, die von Arterie und Vene zu gleicher Zeit unter möglichst gleichem Druck injiziert werden. In manchen Fällen ist es erwünscht, eine Füllung der feinsten Kapillaren zu vermeiden. Dann verwendet man eine dickere Gelatinelösung. Man läßt dazu die Gelatineblätter einige Stunden in Wasser quellen, drückt dann das überschüssige Wasser aus, schmilzt auf dem Wasserbad und rührt reichlich Zinnober zu. Dann engt man so lange ein, bis ein mit einem Glasstab auf eine senkrecht stehende Glasplatte gesetzter Tropfen nicht mehr herabläuft, sondern sofort in seiner Tropfenform erstarrt.

1985. Für Korrosionspräparate von Gefäßen ist vor allem eine von S c h u m m e r (35) angegebene, als P 1 a s t o i d bezeichnete Injektionsmasse zu empfehlen, über deren Anwendung schon in § 866 nähere Angaben gemacht wurden. Die Durchsichtigkeit des Plastoids beseitigt S p a n n e r durch Zusatz von etwas Deckweiß. S p a n n e r bezeichnet die Einführung des Plastoids durch S c h u m m e r als eines der größten Verdienste um den Ausbau der Forschungsmethoden der Korrosionsanatomie seit H y r 11.

1986. Aufhellungs- und Korrosionspräparate werden am besten bei auffallendem Licht in Binokularmikroskop auf schwarzer Unterlage betrachtet. Sehr vorteilhaft ist der Schräglichtkondensor von Busch, namentlich f ü r die Unterscheidung schwieriger Uberkreuzungen von Gefäßen. Um empfindliche Präparate ohne Schädigung ausgiebig drehen zu können, verwendet man den Kugelgelenkobjekttisch von Leitz oder eine mit Schrot gefüllte Messingkugel von 3 cm Durchmesser, die auf einem passend eingeschliffenem 3,5 cm hohen Messingrohr lose aufliegt ( S p a n n e r ) . 1987. Kaulsdiukinjektion. Für präparatorische Zwecke ist die Verwendung kautschukhaltiger Injektionsmassen zu empfehlen ( » R e v e r t e x « der Kautschukgesellschaft, F r a n k f u r t a. M., Bockenheimeranlage 45, oder » J ä t e x« von Klentze & Co., Hamburg 1, Schopenstehl 1). Die elastische, gummibandartige Beschaffenheit der erstarrten Injektionsmasse bietet gegenüber den brüchigen älteren Harz- oder Wachsmassen besondere Vorteile. Die injizierten Präparate können nach Erhärtung auch in'' roher Salzsäure, der V« des Volumens Wasser zugesetzt iät, mazeriert werden. Näheres über die Injektionstechnik bei N e u m a y e r (32). 1988. Kleisterinjektion. Die Füllung von größeren Gefäßen, Drüsengängen, Gelenk- oder Körperhöhlen gelingt sehr gut mit einer ursprünglich von P a n s c h (77) angegebenen Kleistermasse, die neuerdings von S p a n n e r verbessert wurde. Von Vorteil ist, daß die Masse bei der Härtung der Präparate infolge der Quellung des Mehles nicht schrumpft. Weitere Angaben über diese

§ 1989—1991.

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Gefäß-Injektionsmethoden

m e h r m a k r o s k o p i s c h e Methode, die in V e r b i n d u n g m i t A u f h e l l u n g s v e r f a h r e n s e h r schöne R e s u l t a t e gibt, b e i S p a n n e r (38). 1989. Die Injektion von Lymphgefäßen e r f o l g t m i t e i n e r S p r i t z e v o n e t w a 2 ccm I n h a l t . (Am b e s t e n ist die von B a r t e l s modifizierte »Rekordspritze«.) Als K a n ü l e n b e n ü t z t m a n f e i n ausgezogene G l a s k a n ü l e n , die m a n m i t H a n d s c h u h l e d e r s t r e i f chen in den S p r i t z e n a n s a t z e i n d r e h t . Als I n j e k t i o n s m a s s e n dienen a m b e s t e n die von G e r o t a a n g e g e b e n e n . H e r s t e l l u n g e i n e r b l a u e n M a s s e n a c h G e r o t a - B a r t e l s : Man verreibt 5 Minuten lang 2 g Preußisch-Blau (Ölfarbe in Tube) oder Berlinerblau in einer Porzellanreibschale mit 3 g reinem Terpentinöl, setzt einige Tropfen Äther zu und filtriert durch ein terpentinölgetränktes, reines Putzleder. Z u r I n j e k t i o n stößt m a n die K a n ü l e ganz f l a c h u n t e r die O b e r f l ä c h e ein, zieht e t w a s z u r ü c k u n d i n j i z i e r t m i t l a n g s a m e m , r u h i g e m D r u c k . N a c h der Injektion, die m a n möglichst b a l d n a c h d e m Tod v o r n i m m t , s p ü l t m a n a u s g e t r e t e n e F a r b r e s t e u n t e r d e r W a s s e r l e i t u n g s o r g f ä l t i g ab u n d r e i b t die l e t z t e n S p u r e n m i t e i n e m t e r p e n t i n g e t r ä n k t e n W a t t e b ä u s c h c h e n ab, w o m i t m a n gleichzeitig e i n e l e i c h t e Massage v e r b i n d e t . D a n n l ä ß t m a n das P r ä p a r a t einige S t u n d e n r u h i g liegen u n d fixiert l ä n g e r e Zeit i n F o r m a l i n 1 : 10. Z u r m i k r o s k o p i s c h e n U n t e r s u c h u n g b r i n g t m a n 50«, dicke S c h n i t t e d u r c h A l k o h o l in Xylol u n d B a l s a m ; w e i t e r e A n g a b e n bei B a r t e l s (09) u n d H o y e r (26). S. auch § 1990 u. 1992. d) D a r s t e l l u n g d e r G e f ä ß e u n d a n d e r e r durch Füllung mit Luft

Hohlräume

1990. P e r h y d r o l m e t h o d e v o n M a g n u s (22). D u r c h A u f t r o p f e n v o n e t w a s a n g e w ä r m t e r 3°/oiger W ä s s e r s t o f f s u p e r o x y d l ö s u n g auf die O b e r f l ä c h e l e b e n s w a r m e r O r g a n e • (oder d u r c h I n j e k t i o n ins O r g a n i n n e r e ) d r i n g t S a u e r s t o f f , d£r d u r c h B e r ü h r u n g des H2O2 m i t d e r in d e n L y m p h g e f ä ß e n v o r h a n d e n e n K a t a l a s e f r e i w i r d , in L y m p h b a h n e n , G e f ä ß e u n d G e w e b s s p a l t e n ein. D i e l u f t g e f ü l l t e n G e b i l d e e r s c h e i n e n bei A u f l i c h t b e l e u c h t u n g i n f o l g e d e r s t a r k e n L i c h t r e f l e x i o n silberhell auf d u n k l e m G r u n d . Bei F i x i e r u n g in 5%>igem F o r m o l b l e i b e n sie einige Zeit s i c h t b a r . Mit H 2 0 2 hergestellte Frischpräparate können nach K r a u ß (35) in einer Mischung von 5 Teilen 96°/oigem Alkohol und 1 Teil Perhydrol dauerhaft fixiert werden, ohne daß die Gefäße kollabieren. Zuletzt überträgt man in absol. Alkohol und in Äther. Durch rasches Verdunsten des Äthers erhält man dann einwandfreie Trockenpräparate. 1991. L u f t f ü l l u n g d u r c h G e w e b s t r o c k n u n g n a c h B e c h e r (31) u n d F i s c h e r (33a). O r g a n s t ü c k c h e n w e r d e n n a c h F i x i e r u n g in F o r m o l , C a r n o y o d e r A l k o h o l in S c h e i b e n v o n 2—3 m m Dicke zerlegt, in a u f s t e i g e n d e m A l k o h o l e n t w ä s s e r t , mit A c e t o n d u r c h t r ä n k t u n d d a n n an d e r L u f t g e t r o c k n e t . Dies g e s c h i e h t z w i s c h e n zwei L a g e n F i l t r i e r p a p i e r , das, u m ein E i n r o l l e n d e r S c h n i t t e zu v e r h i n d e r n , leicht b e s c h w e r t w i r d . Die T r o c k n u n g soll (evtl. u n t e r Z u h i l f e n a h m e eines F ö n oder m i t E v a k u i e r e n ) in V2—1 S t u n d e b e e n d e t sein; d e n n j e r a s c h e r sie v o r sich geht, desto g e r i n g e r ist die d a b e i a u f t r e t e n d e S c h r u m p f u n g . Die g e t r o c k n e t e n P r ä p a r a t e w e r d e n in d ü n n e r , f l a c h e r Schicht m i t t e l s G l a s s t a b m i t B a l s a m (s. u.) b e s t r i c h e n u n d m i t i h r e r U n t e r s e i t e m i t d i c k f l ü s s i g e m B a l s a m auf e i n e m O b j e k t t r ä g e r b e f e s t i g t . D a s a u f g e h e l l t e u n d evtl. a m 2. T a g n o c h m a l s m i t B a l s a m b e s t r i c h e n e O b j e k t soll z u n ä c h s t einige T a g e a n e i n e m k ü h l e n l u f t i g e n O r t a n t r o c k n e n ; d a n n w i r d es m i t e t w a s dickf l ü s s i g e m B a l s a m b e d e c k t u n d ein D e c k g l a s a u f g e l e g t .

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Lymphdrüsen, Milz und Knochenmark

§ 1992—1994.

Die Konsistenz des zum Aufhellen benützten Balsams ist von großer Wichtigkeit. Vor allem darf er nicht zu dünnflüssig sein, da es darauf ankommt, daß die Luft in den Kanälchen eingeschlossen bleibt und nicht durch den eindringenden Balsam verdrängt wird. Aus dem gleichen Grund müssen die Präparate bis zur vollkommenen Trocknung o f f e n aufbewahrt werden, andernfalls können die luftgefüllten Räume noch nach Wochen vom eindringenden Balsam' ausgefüllt werden. In diesem Fall kann man durch Einlegen in Xylol den Balsam entfernen und Trocknung und Luftfüllung nach vorausgegangener Alkohol- und Acetonbehandlung wiederholen. K r a u ß (35) empfiehlt als Einbettungsmittel ein Präparat von Hollborn „ D a m m a r h a r z m i t Z e d e r n ö l v e r d i c k t", dem er noch eine Schmelze von xylolfreiem Dammarharz zugibt. Die Substanz wird erwärmt, auf das Präparat gegossen und unter leichtem Druck mit einem Deckglas bedeckt. Die Methode läßt sich verwenden, um Blut- und Lymphgefäße, Drüsenkanälchen, Interzellularlücken, Bindegewebsstränge, Fettzellen in normalem wie pathologisch veränderten Organen zur Darstellung zu bringen (E. F i s c h e r ) . Bei der Deutung der dargestellten Strukturen ist natürlich sorgfältige Kritik nötig. Fertige, ganz ausgetrocknete. Präparate sind jahrelang unverändert haltbar. 1992. M e t h o d e d e r p a r e n c h y m a t ö s e n L u f t i n j e k t i o n , namentlich zur Darstellung der Lymphgefäße, nach E. F i s c h e r (33b). Man benötigt dazu nur eine 2—5 ccm fassende Spritze und eine feinere Kanüle. Die Kanüle wird an verschiedenen Stellen des Aüsbreitungsbezirkes der Lymphbahnen auf das Geratewohl flach eingestochen. Dann wird während des Vorschiebens oder Zurückziehens der Nadel unter leichtem Druck Luft injiziert. Man hat dabei Sorge zu tragen, daß die zartwandigen Gebilde nicht eintrocknen, und nimmt daher die Injektion unter Wasser vor oder hält das Organ durch gelegentliches Übergießen mit physiol. Kochsalzlösung feucht. Nach der Luftfüllung kommen die Präparate in kalte physiol. Kochsalzlösung, zur Aufbewahrung in schwaches Formolwasser, Glyzerinwasser (Sä) oder 70% Alkohol. Die Präparate sind einige Zeit haltbar. 1993. M e t h o d e d e r s e l b s t t ä t i g e n L u f t f ü l l u n g (E. F i s c h e r 33c). Die zur Untersuchung bestimmten Organe werden nach der Entnahme aus dem frisch getöteten Tier in Formol (1 :9) fixiert, gewässert und in 70—90°/oigen Alkohol überführt. Alsdann erfolgt ein mehrmaliges Wechselbad zwischen Wasser und 96°/oigem Alkohol, wobei das Präparat in jedem Bad mehrere Minuten bis Stunden belassen wird. Im Verlauf dieses Wechselbades füllen sich die Lymphgefäße zunehmend bis in die Kapillaren mit einem aus Alkoholdämpfen und Luft bestehendem Gasgemisch. Die Aufbewahrung erfolgt in Alkohol, die Beobachtung im Auflicht. Im Bedarfsfall ist es möglich, vor Anwendung der Methode eine Versilberung der Zellgrenzen und Färbung der Zellkerne vorzunehmen. Die Methode kann auch benützt werden, um die Gefäße in nach § 1990 oder 1992 hergestellten Präparaten wieder neu mit Luft zu füllen. 26. KAPITEL

Lymphdrüsen, Milz und Knochenmark 1994. Lymphdrüsen. Zu Übersichtsbildern eignen sich besonders die im Mesenterium (z. B. bei der Katze, Kaninchen, Hund, Mensch usw.) anzutreffenden Knoten, die man nach H e 11 y oder M a x i m o w fixiert, besonders wenn man später die für die Blutuntersuchung gebräuchlichen Färbemethoden anwenden will. Zur Untersuchung des Fasergerüstes und des Retikulumgewebes fixiert man nach Heidenhain (»Susa«) (§ 344) oder Stieve (§ 333).

§ 1995—2004.

Lymphdrüsen, Milz und Knochenmark

477

Über Mengenbestimmung des lymphoiden Gewebes siehe H e l l m a n n (22). 1995. Hämolymphdrüsen findet m a n besonders beim Schaf gut ausgebildet (hier im retroperitonealen Bindegewebe von den Nieren abwärts neben den großen Gefäßen). Man erkennt sie an ihrer d u n k l e r e n rötlichen Farbe. Bei der Ratte liegt eine relativ große Blutlymphdrüse hinter dem Pankreas. Vgl. W e i d e n r e i c h , v. S c h u m a c h e r . 1996. F ü r Übersichtsbilder f ä r b t man mit Hämalaun-Eosin oder nach Dominici (§ 726), f ü r fyämatologische Zwecke leistet die panoptische F ä r b u n g nach P a p p e n h e i m (§ 1403) sehr Gutes. 1997. Zur Darstellung des E n d o t h e l b e l a g e s der Trabekel injiziert m a n von einem vas afferens aus oder durch Einstich in den Knoten selbst schwache (z. B. 0,l°/oige) Silbernitratlösung. Nach einer halben Stunde fixiert m a n in Alkohol. Schnitte nicht u n t e r 15/.i. 1998. Zur i s o l i e r t e n D a r s t e l l u n g d e s r e t i k u l ä r e n G e w e b e s schneidet man unfixierte, frische L y m p h k n o t e n 20—30¡j, dick auf dem Gefriermikrotom, breitet die Schnitte auf einem Objektträger gut aus und b e t u p f t sie vorsichtig mit einem feinen, feuchten Marderhaarpinsel. Die freien Zellen bleiben dann am Pinsel hängen, w ä h r e n d das Retikulum zurückbleibt ( P i n s e l m e t h o d e , H i s , 61). 1999. Schnitte von vorher fixierten P r ä p a r a t e n schüttelt man nach H i s in einem zur H ä l f t e mit Wasser gefüllten Reagenzröhrchen (Schüttelm e t h o d e ) . Bei Zusatz von Froschgalle erzielt man nach B ö h m und O p p e 1 in k ü r z e r e r Zeit bessere Resultate (Lösung der in den Maschen gelegenen Elemente?). 2000. Bei längerer Bestrahlung lebender Tiere mit R ö n t g e n s t r a h l e n schwindet das lymphoide Gewebe fast ganz, während das Retikulumgewebe erhalten bleibt (H. H e i n e c k e , E r i c h M e y e r u. a.). Ebenso wirken R a d i u m s t r a h l e n (Thies). 2001. Das Netzwerk der Gitterfasern kann durch Verdauen der Schnitte mit T r y p s i n isoliert werden (vgl. § 1475 ff.). 2002. F 1 i n t nimmt die Verdauung an Stücken vor, die, nicht über 3 mm dick, vorher in Alkohol oder Carnoyscher Flüssigkeit fixiert werden. Formalin, Chromsäure und deren Salze, Osmiumsäure dürfen nicht zur Fixierung benützt werden. Man verfährt nach § 1477. 2003. Z u r F ä r b u n g der Gitterfasern eignen sich besonders die in § 1517 ff. dargestellten Imprägnationsmethoden. Sehr schön treten Kerne, protoplasmatisches Retikulum und Gitterfasern bei A z a n f ä r b u n g nach Fixierung in »Susa« h e r v o r ( s . ' H e u d o r f e r 21). 2004. Milz. Zur Untersuchung des f r i s c h e n Milzgewebes verfertigt man Ausstrichpräparate, 'die m a n durch Abschaben einer Schnittfläche des möglichst lebensfrischen Organes gewinnt. Der so erhaltene Organsaft wird in d ü n n e r Schicht auf Objektträger ausgestrichen. Oft ist es zweckmäßig, ein Tröpfchen des Breies vorher mit physiol. Kochsalzlösung oder Ringerlösung zu verdünnen und die v e r d ü n n t e Flüssigkeit ähnlich einem Bluttropfen auf den O b j e k t t r ä g e r auszustreichen (s. § 1335). Oder man t u p f t das frisch durchschnittene Organstückchen mehrmals auf den O b j e k t t r ä g e r auf. Die Fixierung er^ folgt bei lufttrockenen Ausstrichen nach § 1325 und 1329, bei feuchten nach § 1330—1335. Zur Darstellung der myeloiden Pulpazellen haben die Oxydasemethoden (§ 1154 ff.) besondere Wichtigkeit erlangt.

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Lymphdrüsen, Milz und Knochenmark

§ 2005—2009.

Die Färbung der Blutzellen erfolgt nach den in Kap. 18 angegebenen Methoden. 2005. F i x i e r u n g . Für Übersichtspräparate wählt man rasch einringende Flüssigkeiten wie die Trichloressigsäure-Sublimatgemische (§ 344 f.), Hellysche oder Stievesche Flüssigkeit u. dgl., wonach auch die Darstellung der Gitterfasern nach § 1525 f. gut gelingt. Für h ä m a i o l o g i s c h e Untersuchungen fixiert man nach Helly oder Maximow (s. § 337 und 338). Man verarbeitet dazu k l e i n e Stückchen und dehnt die Einwirkung der Fixierungsflüssigkeit nicht länger aus, als nötig ist. 2006. F ä r b u n g . Für Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e verwendet man Hämalaun-Eosin oder Dominicifärbung. Die Darstellung der F a s e r s t r u k t u r e n gelingt sehr schön mit der Azanfärbung, die G i t t e r f a s e r n werden am besten mit der Silbermethode von Bielschowsky (§ 1525) oder den Tanninsilbermethoden von Achücarro (§ 1544) oder Rio-Hortega (§ 1548) dargestellt. Für h ä m a t o l o g i s c h e Untersuchungen benützt man die in Kap. 18 angegebenen Methoden. Für Hämoglobinfärbung kommen besonders die in § 1436 f. und § 1417 angegebenen Methoden in Betracht. 2007. Zur Darstellung der von M o 11 i e r (11) beschriebenen G i t t e r - und F a s e r s t r u k t u r e n d e r M i l z k a p i l l a r e n ist es notwendig, die Milz in toto auszuspülen und zu dehnen. Die Ausspülung und Dehnung der Milz nimmt man nach W o r o n i n (98) in der Weise vor, daß man das dem eben getöteten Tier in toto entnommene Organ von der art. lienalis aus mit auf 37° C erwärmter Ringerlösung (15—20 Liter) unter dem gleichmäßigen Druck einer Wassersäule von IV2 m Höhe (oder 10 cm Hg) blutleer spült. N e u b e r t (22) empfiehlt dabei zur Beschleunigung der Ausspülung der freien Zellen die vena lienalis abwechselnd abzuklemmen und wieder freizugeben, wobei man das Organ aber höchstens auf das Doppelte des Anfangsvolumens anschwellen lassen darf. Nach 2—3 Stunden ist das Organ vollkommen weiß gespült. Dann setzt man der Spülflüssigkeit Formol (oder Susaflüssigkeit, N e u b e r t) zu, bindet die ableitenden Venen, wenn die Fixierungsflüssigkeit konzentriert abläuft, schließlich ab und läßt, ev. unter E r höhung des Druckes, das Organ auf das 2—3fache Volumen anschwellen. Dann Abbinden aller Gefäße und Einlegen in die betreffende Fixierungsflüssigkeit. N e u b e r t spült nach 24 Stunden nochmals mit 6—7 Liter 96°/oigem Alkohol durch. Die nach 2—3 Tagen in kleinere Stücke zerlegten Organe werden wie gewöhnlich in Paraffin eingebettet. Als Färbemethoden der ausgespülten und gedehnten Milz empfiehlt sich die Azanfärbung, ferner die Thiazinrot-Eisenhämatoxylinfärbung (s. § 1509). Mit beiden Methoden läßt sich sowohl protoplasmatisches wie faseriges Retikulum schön darstellen. 2008. Der Nachweis von Eisen erfolgt nach § 1200 ff. Spezialliteratiir über Milz siehe S c h m i n c k e (16) und (22) und A. H a r t m a n h (28). 2009. .Knochenmark behandelt man nach den gleichen Methoden wie Milz und Lymphdrüsen. Man entnimmt es am besten einem langen Röhrenknochen, von dem man ein Stück der Diaphyse heraussägt und den Knochenmantel dann mit Hilfe eines Meißels aufsprengt. Das derart freigelegte Markgewebe wird dann äußerst behutsam — um Quetschungen zu vermeiden — in die Fixierungsflüssigkeit — am besten nach Helly, Orth oder Maximow — übertragen. Zu Ausstrichpräparaten ist rotes Knochenmark zu nehmen. Um aus spongiösem Knochen das Mark zu gewinnen, spannt man ihn in einen Schraubstock und quetscht

§ 2010—2016.

Schleim- und Eiweißspeicheldrüsen

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ihn aus. Nach s t a r k e r Bestrahlung mit Röntgenstrahlen gehen die blutbildenden Zellen des Knochenmarks in einer bestimmten Reihenfolge zugrunde. 2010. Über die Untersuchung des Knochenmarks beim Lebenden durch Sternalpunktion s. § 1420 ff. 27. KAPITEL

Schleim- und Eiweißspeicheldrüsen (einschließlich Pankreas) A. Allgemeines 2011. Das mikroskopische Bild der Drüsenzelle wird in hohem Maße von dem jeweiligen Zustand ihrer Tätigkeit bestimmt. Eine eingehende Untersuchung darf sich daher nicht auf ein einziges Tätigkeitsstadium beschränken, sondern m u ß bestrebt sein, die ganze Sekretionsphase bzw. den ganzen Arbeitsrhythmus einer Drüsenzelle zu erfassen. 2012. In günstig gelegenen Fällen lassen sich die durch die sekretorische Tätigkeit bedingten S t r u k t u r v e r ä n d e r u n g e n der Drüsenzelle kontinuierlich a m l e b e n d e n G e w e b e verfolgen. Empfehlenswerte Objekte sind h i e r f ü r die Drüsen der Nickhaut des Frosches (Untersuchungstechnik bei D r a s c h 89), die Schleimdrüsentubuli am Rande der Froschzunge (Technik bei B i e d e r m a n n 82, 86), die Pankreasläppchen im Mesenterium der Maus (Technik bei H i r s c h 32, a—d), s. auch § 146, 147 und 151. 2013. Die genannten Objekte lassen sich auch sehr gut zur s u p r a v i t a l e n B e o b a c h t u n g verwenden. Man schneidet dazu kleinste Stückchen heraus, bringt sie rasch auf einen Objektträger, legt das Deckglas auf und umrandet. Am besten ist dabei Untersuchung im eigenen Gewebssaft. Zusatz von künstlichen, indifferenten Beobachtungsflüssigkeiten kann, namentlich an den reifen Sekretkörnern, leicht Veränderungen h e r v o r r u f e n . — Ein sehr empfehlenswertes Objekt f ü r supravitale Beobachtung liefern Randstücke der Bauchspeicheldrüse eines Frosches oder Salamanders. Durch Zusatz von geeigneten Farbstoffen, z. B. J a n u s g r ü n (§ 780 ff.), Neutralrot (§ 772), läßt sich auch eine F ä r b u n g einzelner Bestandteile erzielen 2014. S o l g e r empfiehlt Gefrierschnitte frischer Drüsen ohne Zusatzflüssigkeit zu untersuchen; Austrocknung ist durch Umrandung zu verhüten. Die dabei sichtbaren Sekretgranula der Eiweißdrüsenzellen lassen sich durch mehrtägige Formolfixierung, durch Sublimat oder Altmannsche Flüssigkeit konservieren. 2015. Bei supravitaler Beobachtung wie auch bei Untersuchung am fixierten Objekt wird man versuchen, eine Reihenfolge der einzelnen Sekretionsstadien dadurch zu erhalten, daß man die Drüsen vor der Entnahme in entsprechender Weise beeinflußt, die Tiere also z. B. h u n g e r n läßt, dann f ü t t e r t und in b e stimmten Zeitabständen tötet. Auch d u r c h mechanische oder elektrische Reizung der sekretorischen Nerven lassen sich differente Tätigkeitszustände gewinnen. G. C. H i r s c h (32) hat als Hilfsmittel f ü r die Analyse des Arbeitsr h y t h m u s eine statistische S t u f e n z ä h l m e t h o d e ausgearbeitet, bei der willkürlich gewählte Zellstadien unterschieden w e r d e n und durch Auszählen zu verschiedenen Zeiten nach Auslösung eines Reizes die Aufeinanderfolge dieser Stadien erschlossen und kurvenmäßig dargestellt wird. 2016. Sehr wertvoll k a n n f ü r die Analyse des Arbeitsrythmus von Drüsenzellen die Einspritzung von P i l o c a r p i n und A t r o p i n sein. Pilocarpin wirkt auf die Nervenendigungen der Drüsenzellen erregend, r u f t also schon kurze Zeit nach der Injektion eine gewaltige Steigerung der Sekretion hervor,

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Schleim- und Eiweißspeicheldrüsen

§ 2017—2021.

d i e bald von einer Erschöpfung der entleerten, ihre Sekrets b e r a u b t e n Drüsenzellen gefolgt ist. (Eine Ausnahme, bilden Niere und Milchdrüse, auf die P. k e i n e Wirkung ausübt.) Dadurch, daß die Injektion von Pilocarpin eine extreme u n d anomal rasche Sekretausschüttung erzwingt, w e r d e n auch asynchron oder hemisynchron ( H i r s c h ) arbeitende Drüsenzellen auf entsprechende Stadien gleichgerichtet und so zu gemeinsamem Arbeitsrhythmus gezwungen, der leicht e r analysierbar ist. Atropin h a t auf die Nervenendigungen einen lähmenden Einfluß; histologisch findet man daher prall mit Sekret' gefüllte Drüsenzellen. A n w e n d u n g s w e i s e : P i l o c a r p i n als Pilocarpinum hydrochlori•cum. Man verabreicht s u b k u t a n 1—3 ccm einer 0,l°/oigen Lösung. — A t r o p i n kommt als Atropinum s u l f u r i c u m zur Anwendung. Die einzelnen Tiera r t e n sind gegen Atropin verschieden empfindlich. Beim Kaninchen gibt m a n s u b k u t a n 1 ccm einer 0,5°/oigen Lösung pro kg Körpergewicht. (Tödliche Dosis f ü r den Menschen: 0,1 g!) 2017. Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e . Zur Gewinnung von Übersichtspräpar a t e n ist Fixierung nach Bouin oder Stieve, in Susa od. dgl. zu empfehlen. Die F ä r b u n g erfolgt zweckmäßig mit der Azanmethode (§ 1489), die dank der scharfen, klaren A n f ä r b u n g der Basalmembran den A u f b a u der Drüse sehr schön h e r v o r t r e t e n läßt. Bei Untersuchung der feineren zytologischen S t r u k t u r e n w i r d die Zahl der Fixierungs- und Färbemethode durch die A r t der Drüse bestimmt. B. Untersuchung der Sdileimdriisenzellen 1. Fixierung 2018. Am schwierigsten sind die reifen Sekrettröpfchen der Schleimdrüsen zu fixieren, die sich oft am besten nach § 2013 am frischen P r ä p a r a t beobachten lassen, w ä h r e n d es beim Fixieren und noch mehr beim nachfolgenden Auswaschen sehr leicht zu einer Quellung und Lösung kommt. Sublimat und sublimathaltige Flüssigkeiten (auch Hellysche Flüssigkeit) sind nach M e t z n e r u n d nach A r i m a (18) zur Fixierung der reifen Schleim- (und Eiweißgranula) ungeeignet. 2019. Nach L a n g l e y (89) äußert sich die stark quellende Wirkung von Alkohol auf frische S c h l e i m g r a n u l a bis zur Konzentration von 70°/o; stärkerer Alkohol läßt die Granula zu unregelmäßigen Formen schrumpfen. Dieselbe Wirkung besitzt 0,5—2%ige Osmiumsäure. Auch Xylol soll nicht indifferent sein. 2020. M e t z n e r bringt zur Vermeidung der Quellung kleinste Stückchen f ü r 24 Stunden i n . 3 ccm einer 5%>igen O s m i u m s ä u r e lösung (bereitet mit einer 2—3°/oigen Kochsalzlösung) + 1 ccm einer kalt gesättigten wässerigen K a l i u m b i C h r o m a t lösung. Nach 24 Stunden wäscht m a n 2—4 Stunden in 2°/oiger Natriumchloridlösung aus (Wasser w ü r d e Quellung der Schleimgranula veranlassen). Dann Übertragen in 70°/oigen Alkohol, der innerhalb von 3—4 Stunden so oft gewechselt wird, bis in einer Probe auf Zusatz von Silbern i t r a t kein Niederschlag m e h r auftritt. Sodann 1 Stunde absoluter Alkohol, hierauf über Benzol in Paraffin. Die ganze Alkoholbehandlung soll höchstens 5 Stunden dauern, da sonst die Stücke zu h a r t werden. 2021. Bei einer zweiten Methode fixiert M e t z n e r in: 7 ccm 5°/oiger O s m i u > m s ä u r e (mit l,5°/oiger Kochsalzlösung bereitet) + 1 ccm kalt gesättigte -wässerige K a l i u m b i c h r o m a t l ö s u n g . Zu 8 ccm der Mischung setzt m a n 3—4 Tropfen rauchender S a l p e t e r s ä u r e . Nach 15—20 Minuten b r i n g t m a n die Stückchen noch f ü r 24 Stunden in die gleiche Lösung ohne

§ 2022—2027.

Schleimdrüsenzellen

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S ä u r e z u s a t z . D a n n w ä s s e r n in f l i e ß e n d e m Wasser, dest. Wasser, d a n n Alkohol u s w . Bei b e i d e n v o n M e t z n e r a n g e g e b e n e n M e t h o d e n bleiben die S t r u k t u r e n d e r D r ü s e n z e l l e n g u t e r h a l t e n . I m u m g e b e n d e n G e w e b e k o m m t es dagegen m e i s t zu s t a r k e n S c h r u m p f u n g e n . Die F ä r b u n g der n a c h § 2020 oder 2021 fixierten S c h l e i m z e l l e n g r a n u l a erf o l g t a m b e s t e n m i t d e r von M e t z n e r a n g e g e b e n e n E i s e n a l a u n - T o l u i d i n b l a u m e t h o d e (s. §' 698). 2022. Viel g e b r a u c h t ist z u r F i x i e r u n g v o n S c h l e i m d r ü s e n ein von S c h a f f e r d a f ü r a n g e g e b e n e s Gemisch von 1 Teil F o r m o l u n d 2 Teilen absol. Alkohol, d a s n a m e n t l i c h die P r ä m u c i n g r a n u l a g u t e r h ä l t . 2. Färbung 2023. Färbung der mukösen Schleimdriisenxellen.

S c h a f f e r

unterscheidet

nach dem färberischen Verhalten zwischen m u k ö s e n und mukoiden Schleimzellen. Die m u k ö s e n f ä r b e n sich i m a l l g e m e i n e n m i t M u c i c a r m i n , M u c h ä m a t e i n , Delafieldschem H ä m a t o x y l i n , S a f r a n i n , Thionin, T o l u i d i n b l a u ; sie f ä r b e n sich n i c h t o d e r n u r s c h w a c h m i t A n i l i n b l a u oder B e s t s c h e m K a r m i n . Die m u k o i d e n D r ü s e n z e l l e n d a g e g e n f ä r b e n sich mit d e r e r s t g e n a n n t e n G r u p p e v o n F a r b s t o f f e n nicht, m i t d e r z w e i t e n d a g e g e n gut. A u ß e r d e m n e h m e n die m u k o i d e n D r ü s e n m i t M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n einen c h a r a k t e r i s t i s c h e n r o t v i o l e t t e n F a r b t o n an (L e h n e r 23), w ä h r e n d sich m u k ö s e Zellen b l a u f ä r b e n . E i n w e i t e r e r U n t e r s c h i e d b e s t e h t d a r i n , d a ß in d e n m u k o i d e n D r ü s e n z e l l e n A t r a k t o s o m e n r e g e l m ä ß i g f e h l e n ( C l a r a 37). Die f ä r b e r i s c h e n V e r s c h i e d e n h e i t e n sind jedoch k e i n e s w e g s als absolut zu w e r t e n ; als w i r k l i c h spezifisch k a n n k e i n e der S c h l e i m f ä r b u n g e n b e z e i c h n e t w e r d e n ( C l a r a 40). 2024. Nach S e e 1 i g e r (37) muß sich ein muköser Schleim kräftig mit Mucicarmin bzw. Muchämatein färben; er kann sich auch mit Bestschem Carmin färben, darf sich aber nicht mit Molybdänhämatoxylin färben. Ein mukoider Schleim muß sich kräftig mit Bestschem Carmin und Molybdänhämatoxylin färben, kann aber auch eine mehr oder weniger kräftige Färbung mit Mucicarmin oder Muchämatein annehmen. 2025. S c h l e i m f ä r b u n g m i t M u c i c a r m i n (P. M a y e r 96). Herstellung der Farblösung: 1 g C a r m i n , 0,5 g A l u m i n i u m c h l o r i d (weiß, trocken) u n d 2 ccm dest. W a s s e r w e r d e n in e i n e r k l e i n e n P o r z e l l a n s c h a l e ü b e r k l e i n e r F l a m m e v o r s i c h tig u n t e r s t ä n d i g e m R ü h r e n m i t e i n e m G l a s s t a b erhitzt, bis das z u e r s t h e l l r o t e G e m i s c h g a n z d u n k e l r o t g e w o r d e n ist (ca. 2 Min.). D a n n setzt m a n zu d e r n o c h w a r m e n Masse n a c h u n d n a c h u n t e r R ü h r e n 100 ccm 50°/oigen Alkohol. N a c h 24 S t u n d e n w i r d filtriert. — Färbung: M a n v e r d ü n n t 1 Teil d e r S t a m m l ö s u n g m i t 10 T e i l e n dest. W a s s e r (die v e r d ü n n t e L ö s u n g ist i m Gegensatz z u r S t a m m l ö u n g n u r k u r z e Zeit h a l t b a r ) u n d f ä r b t die S c h n i t t e d a r i n 5—10 Min., w o b e i sich n u r d e r S c h l e i m r o t f ä r b e n d a r f ; d a n n a b s p ü l e n in Wasser, A l k o h o l u s w . Die K e r n e f ä r b t m a n v o r h e r o d e r n a c h h e r m i t H ä m a l a u n . Sind auch die Kerne rot gefärbt, so enthält die Farbe freie Säure und man neutralisiert vorsichtig durch tropfenweisen Zusatz einer l0/oigen Lösung von doppelkohlensaurem Natron NaHC0 3 ). 2026. Bei wasserempfindlichen Schleimgranula ist auch bei der Färbung jede Berührung mit Wasser zu vermeiden. Zu diesem Zwecke wird die Stammlösung statt mit Wasser mit 70°/oigem Alkohol verdünnt (sog. »alkoholische Mucicarminlösung«). Auch das Auswaschen erfolgt mit Alkohol. 2027. M a s s o n (10) färbt nach Fixierung in Bouin 1. die Kerne in Hämalaun. — 2. Nach Auswaschen in Wasser färben des Gewebes mit Metanilgelb (5 g in 100 ccm verdünnter Essigsäure 1 :500). — 3. Auswaschen in dest. Wasser. — 31

R o m e i s , M i k r o s k . T e c h n i k . 15. A u f l .

482

Schleim- und Eiweißspeicheldrüsen

§ 2028—2033.

4. Schleimfärbung in verdünntem Mucicarmin 2 Stunden. — 5. Abspülen in dest. Wasser, absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Schleim intensiv rot auf gelbem Grund. Kerne schwarz.

2028. M u c h ä m a t e i n (P. M a y e r ) . W ä s s e r i g e L ö s u n g : Man verreibt 0,2 g Hämatein mit einigen Tropfen Glyzerin und setzt dann 0,1 g Aluminiumchlorid, 40 ccm Glyzerin und 60 ccm dest. Wasser zu. A l k o h o l i s c h e L ö s u n g : Hämatein 0,2 g; Aluminiumchlorid 0,1 g; 70°/oiger Alkohol 100 ccm; Salpetersäure 1—2 Tropfen. In diesen Lösungen darf sich nur der Schleim blau färben. Anwendung wie Mucicarmin. Zur Darstellung der Kerne färbt man mit Paracarmin.

vorher

2029. Auch D e l a f i e l d sches H ä m a t o x y l i n gibt bei progressiver Färbung in verdünnter Lösung schöne Schleimfärbung. Zu beachten ist, daß die schleimfärbende Eigenschaft desselben erlischt, wenn es einen bestimmten Grad der Reife überschritten hat, offenbar infolge einer Änderung der elektrischen Ladungsverhältnisse ( C l a r a 40). Nachfärbung mit Erythrosin oder Eosin ist der Schleimfärbung oft abträglich. 2030. Häufig läßt sich der Schleim auch durch die für die Darstellung des elastischen Gewebes gebräuchlichen Farbstoffe wie Resorcinfuchsin oder Orcein zur Darstellung bringen.

2031. Die seit S t Öhr (87) bekannte Erscheinung, daß bei Anwendung der sog. spezifischen Schleimfärbungen neben intensiv gefärbten Schleimzellen nahezu immer auch wenig oder gar nicht gefärbte Schleimzellen anzutreffen sind, beruht nicht aüf einem Fehlen oder einer Unreife der mukösen Stoffe in diesen Zellen, sondern auf einer abweichenden physikochemischen Verfassung dieser Substanzen. Die intensiv gefärbten Zellen enthalten muköse Stoffe, die eine relativ hohe negative Ladung zeigen, während die nicht oder nur schwach gefärbten Schleimstoffe infolge von Salzbildungen oder Mucoitinschwefelsäure eine Abschwächung ihrer sauren Reaktion erfahren haben und daher eine Verschiebung ihrer elektrischen Ladung nach der neutralen Seite aufweisen. Die Färbbarkeit der Schleimsubstanzen durch die oben angeführten Schleimfarbstoffe beruht darauf, daß diese Farblösungen positiv geladen sind und daher nur stark negativ geladene Gewebsbestandteile wie Schleim und Knorpelgrundsubstanz färben, die beide durch ihren Gehalt an Schwefelsäurestern eine relativ stark saure Reaktion zeigen ( C l a r a 40). 2032. Die bei Anwendung der »spezifischen« Schleimfärbungen ungefärbt bleibenden Schleimstoffe der mukösen Drüsen werden in geradezu elektiver Weise durch das Bestsche Carmin gefärbt. Dieses Färbeergebnis beruht auf der Umladbarkeit des Carmins, das nach S e k i bei saurer Reaktion positiv, bei alkalischer Reaktion aber negativ geladen ist (s. § 633). Das stark alkalische Bestsche Carmin färbt daher nur solche Schleimsubstanzen, die eine relativ positive Ladung haben. In gleicher Weise läßt sich die mit dem Bestschen Carmin übereinstimmende Färbung durch das Anilinblau der Malloryschen Methode erklären ( C l a r a 40). Der Unterschied tritt im übrigen nur dann hervor, wenn die Färbezeit mit dem Bestschen Carmin nicht mehr als 20 Min. beträgt. Bei Verlängerung der Färbezeit auf 40 Min. werden alle Schleimzellen durch das Carmin gefärbt (C1 a r a).

2033. Häufig kommt auch die m e t a c h r o m a t i s c h e F ä r b u n g des Schleimes durch basische Teerfarbstoffe wie Safranin, Thionin, Toluidinblau zur Anwendung. G u i z z e t t i (27) fixiert dazu 1 bis mehrere Tage in Formol 1 :9 und färbt Gefrierschnitte davon in einer gesättigten Lösung von Thionin in 2%>iger Carbolsäure. Dann kurz abspülen in schwach mit Essigsäure ange-

§ 2034—2038.

Schleimdrüsenzellen

483

säuertem Wasser und untersuchen in Wasser. Ergebnis: Schleim intensiv rotviolett, K e r n e blau. — Die F ä r b u n g bleibt in Gummisirup einige Zeit erhalten. — L e h n e r fixiert in Formol-Alkohol und f ä r b t progressiv in v e r d ü n n t e r wässeriger Thioninlösung. 2034. Auch die Färbung nach F e y r t e r (s. § 1898) liefert eine intensive metachromatische Rotfärbung des Schleimes, die je nach Zellart verschieden lange erhalten bleibt. 2035. Zur Schleimfärbung mit C o e l e s t i n b l a u färbt man 24 Stunden in einer frisch bereiteten wässerigen Lösung des Farbstoffes und differenziert dann in Wasser oder verdünntem Alkohol, bis nur noch Schleimzellen (und Knorpel) gefärbt sind. Eine Lösung des Farbstoffes in 5°/oiger Aluminiumsulfat- oder Chromalaunlösung färbt auch das Bindegewebe metachromatisch rot, die Kerne blau. Weiteres s. § 742. 2036. F ü r die Darstellung der mukoiden Substanzen spielt die zuerst von L e h n e r (23) beobachtete m e t a c h r o m a t i s c h e r o t v i o l e t t e Färbung d u r c h M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n eine besondere Rolle. Fixierung in Formol-Alkohol. Paraffin- oder Celloidinschnitte kommen f ü r 24 Stunden oder länger o h n e vorherige Beizung (wichtig!) in Molybdänhämatoxylin nach Held (§ 1875, 5) oder Clara (§ 687), das mit dest. Wasser so stark v e r d ü n n t wird, daß die Lösung n u r m e h r schwach rosa gefärbt ist. Nach entsprechender F ä r b u n g wird in dest. (!) Wasser ausgewaschen, wobei die Schnitte von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop kontrolliert werden, ob die gewünschte Differenzierung erreicht ist. Wird der A u f e n t h a l t im Wasser zu lange (mehrere Stunden) ausgedehnt, dann geht die Intensität und Prägnanz der F ä r b u n g verloren. Bei gelungener F ä r b u n g erscheint der mucoide Schleim leuchtend weinrot, das kollagene Bindegewebe rötlich, der muköse Schleim und das übrige Gewebe blau bis blauschwarz gefärbt. Einschluß ü b e r Anisol-Nelkenöl (ää) u n d Xylol in Caedax. Die metachromatische R o t f ä r b u n g der mukoiden Substanzen beruht nach C l a r a wahrscheinlich darauf, daß deren Reaktion infolge von Salzbildungen der Mukoitinschwefelsäure nach der neutralen Seite verschoben ist. 2037. Eine gleichzeitige Darstellung a l l e r Schleimstoffe, der mukösen wie der mukoiden, gelingt mittels der P o l y s a c c h a r i d e a k t i o n von H. B a u e r (s. § 1104), wobei sich aber der muköse Schleim durchwegs stärker f ä r b t als der mukoide. Im Gegensatz zu dem in § 2031 Gesagten erstreckt sich die F ä r b u n g bei dieser Reaktion auf a l l e Schleimzellen. Die F ä r b u n g beruht auf dem chemischen Nachweis einer in allen Schleimzellen enthaltenen Substanz vom Charakter der Polysaccharide. Daß es sich dabei nicht u m Glykogen handelt, geht daraus hervor, daß die Reaktion auch nach A u s f ü h r u n g der Speichelprobe positiv ausfällt ( C l a r a 40). 2038. Zur Fixierung der erstmals von S c h a f f e r (17) in Schleimzellen der Glandulae bulbo-urethrales beschriebenen A t r a k t o s o m e n eignet sich besonders Hellysche Flüssigkeit (§ 337); auch durch Formol, Formol-Alkohol, Bouin u n d Susa w e r d e n sie gut erhalten. Zur F ä r b u n g empfiehlt C l a r a (37) besonders folgende Methodik: 1. Beizung der Schnitte in 2,5°/oiger Eisenalaunlösung 2 Tage oder länger. — 2. Eisenhämatoxylin nach Heidenhain 24 Stunden, dann k r ä f t i g e Differenzierung in 2,5°/oigem Eisenalaun. — 3. Auswaschen in Brunnenwasser 1—2 Stunden. — 4. Angesäuerte 0,l°/oige Säurefuchsinlösung 5 Min., differenzieren in Brunnenwasser (unter dem Mikroskop kontrollieren; wenn E n t f ä r b u n g zu stark, zurück in Säurefuchsin). — 5. 5°/oige Phosphormolybdänsäure 24 Stunden. — 6. Auswaschen in Brunnenwasser 3—5 Min. — 7. F ä r b e n in Anilinblau-Orange-Oxalsäure (nach § 1486) 3—5 Min. — 8. G r ü n d lich differenzieren in 95°/oigem Alkohol usw. Einschluß. Celloidinschnitte bringt 31*

484

Schleim- und Eiweißspeicheldrüsen

§ 2039—2046.

Clara aus 95°/oigem Alkohol, um sie geschmeidig zu erhalten, über Anisol in Xylol. — Ergebnis: Atraktosomen intensiv blau gefärbt. Siehe auch § 2187. C. Untersuchung der Eiweifydrüsen, Pankreas 2039. Für die Beobachtung der lebenden und frischen Drüsen gilt das in § 2015 ff. Gesagte. Die Fixierung der Sekretgranula' erfolgt am besten mit den zur Darstellung der Mitochondrien üblichen Methoden. Besonders geeignet ist die Fixierung nach Regaud (§ 977) evtl. unter Zusatz von 2—3 Tropfen Eisessig auf 100 ccm Flüssigkeit. Zur Untersuchung der Sekretgranula des Pankreas eignet Pankreas von Amphibien, da sie hier besonders groß sind.

sich besonders

das

2040. Zur D a r s t e l l u n g d e r S e k r e t k ö r n c h e n färbt L a u n o y in Zenkerscher Flüssigkeit fixierte Präparate 15—20 Minuten in H ä m a l a u n wäscht aus, differenziert in Salzsäure-Alkohol, bis n u r mehr das Chromatin gef ä r b t ist, und wäscht wieder gut aus. Dann färbt man 24 Stunden in M a g e n t a r o t ( = Fuchsin; konz. Lösung in 5°/oigem Carbolwasser), wäscht in Wasser, färbt ganz kurz in einer 0,l°/oigen alkoholischen (70°/o) L i c h t g r ü n l ö s u n g , differenziert in Salzsäure-Alkohol (1 Tr. auf 100 ccm abs. Alkohol) und bringt durch abs. Alkohol und Xylol in Balsam. Resultat: Chromatin blau. Prozymogen-Körnchen grün. Zymogen-Körnchen rot. Basalfilamente blau, Nukleolen blau mit rotem Zentrum. 2041. Auch mittels der Eisenhämatoxylinmethode, ferner der P a s i n i s c h e n Färbung (§ 1499), den Metznerschen Methoden (§ 2020 f.), der Methode von L a n e (§ 2227) u. a. m. lassen sich die Zymogengranula sehr schön darstellen.

2042. Zur Darstellung der M i t o c h o n d r i e n benützt man die in § 969 bis 999 angegebenen Methoden. M i s l a w s k y (13) empfiehlt dafür besonders Fixierung in 3°/oiger Kaliumbichromatlösung 80 ccm + Formol 20 ccm + l°/oige Osmiumsäurelösung 5 ccm. Nach 48 Stunden f ü r 7—8 Tage in 3°/oiges Kaliumbichromat, wässern usw. Zur Bleichung behandelt M. die Schnitte vor der Färbung mit 10°/oiger Perhydrollösung. 2043. Die als E r g a s t o p l a s m a oder B a s a l f i l a m e n t e bezeichneten Strukturen bekommt man u. a. nach Fixierung nach Bouin oder Carnoy und Färbung nach Dominici (§ 726) dargestellt. 2044. Sekretkapillaren sowie Ausführungswege lassen sich in größeren Zusammenhängen durch die rasche Golgimethode gut sichtbar machen. Für feinere Einzelheiten ist die Untersuchung von Eisenhämatoxylinpräparaten zu empfehlen. Die letztere Methode ist auch für B a s a l z e l l e n (Korbzellen) zu empfehlen. 2045. Für die plastische Darstellung der Ausführungswege leistet Injektion mit Plastoid mit nachfolgender Korrosion gute Dienste (s. § 866). Über die Untersuchung der Lagerhansschen Zellinseln des Pankreas s. § 2224 ff.

2046. Zur D a r s t e l l u n g d e r s y m p a t h i s c h e n Innervation d e r D r ü s e n verwenden C h a m p y und Mitarbeiter (1946) die von C h a m p y 1913 angegebene Osmiumjodidmethode, die nach C o u j a r d (43) eine histochemische Grundlage zu haben scheint, insofern sie die Diphenole schwärzt. Sie scheint das sympathische Terminalnetz zu färben, da es mit Adrenalin imprägniert ist. Die Endigungen der cholinergischen Nerven bleiben dagegen ungefärbt. Zur F i x i e r u n g setzt man unmittelbar vor Gebrauch zu 1 Teil einer 2°/oigen Osmiumsäure 3 Teile einer 3°/oigen Natriumjodidlösung. Die hellgelb gefärbte Lösung zeigt größere Diffusibilität als Osmiumsäure allein. Die Gewebsstückchen dürfen nicht zu klein sein, da sie sonst nur Osmiumwirkung zeigen

§ 2047—2053.

Mundhöhle und Darm

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(Größe am besten 5—6 m m Seite). Dauer mindestens 24 Stunden; das Gemisch m u ß in reichlicher Menge angewendet werden, damit es in den 24 Stunden nicht vollständig reduziert wird. Nach Fixierung Auswaschen in fließendem Wasser. Alkoholreihe, Benzol, Paraffin. 28. K A P I T E L

Mundhöhle und Darm 2047. Zur Fixierung der Mundhöhlensdileimhaut lassen sich alle f ü r Gewinn u n g von Übersichtsbildern gebräuchlichen Methoden verwenden (also z. B. Formol, Formol-Alkohol, Susa, nach Bouin u. dgl.). Man f ä r b e mit HämalaunEosin, nach Dominici, mit der Azanmethode, nach Masson und nach § 1564. Für spezielle Zwecke, wie Drüsenuntersuchung od. dgl. hat m a n natürlich die entsprechenden cytologischen Methoden anzuwenden. 2048. P a p i l l a e f i l i f o r m e s trifft m a n besonders in der Mitte des Zungenrückens, P. f u n g i f o r m e s ati der Zungenspitze, P. c i r c u m v a l l a t a e an der Zungenwurzel, wo auch die Zungenbälge gelegen sind. P. f o l i a t a findet man besonders schön an den Seitenrändern der Kaninchenzunge. Zur Färb u n g seien neben den gewöhnlichen Methoden die A z a n f ä r b u n g sowie die Methode von Masson und von Pasini sowie deren Modifikationen empfohlen. 2049. G e s c h m a c k s k n o s p e n , die sich aus den Stütz- und Sinneszellen zusammensetzen, trifft m a n besonders in den Pap. circumvall., beim Kaninchen auch in den Pap. fol. Man fixiert kleine, ganz frische Epithelstückchen der betreffenden Gegend am besten in Flemmingscher Lösung und f ä r b t die längs oder quer durch die Papille gelegten dünnen Schnitte mit Eisenhämatoxylin oder S a f r a n i n — Gentianaviolett. (Sehr genaue Orientierung der Schnittrichtung erforderlich!) Zur Darstellung der Geschmacksnerven v e r f ä h r t m a n nach § 1909. 2050. F ü r Tonsillenpräparate eignen sich besonders die Tonsillen von Kaninchen und Katzen. Fixierung nach Helly (§ 337) oder Maximow (§ 338). Das epitheliale Retikulum t r i t t bei Anwendung der Pasinischen Methode (§ 1499) schön hervor (M o 11 i e r 13). 2051. F ü r Übersichtsbilder von O e s o p h a g u s wähle man kleinere Tiere, da sich bei diesen der A u f b a u der einzelnen Schichten leichter überblicken läßt. U m von der M a g e n - und D a r m s c h l e i m h a u t gute P r ä p a r a t e zu erhalten, ist es nötig, die P r ä p a r a t e möglichst lebensfrisch zu fixieren, da das Ephitel durch die sehr bald einsetzende Selbstverdauung stark geschädigt wird. Das namentlich bei Pathologen beliebte Abspülen der Schleimhaut mit Brunnenwasser und Abstreifen der Oberfläche mit dem Messer m u ß bei Stücken, die einer mikroskopischen Untersuchung unterzogen w e r d e n sollen, unbedingt vermieden werden. 2052. Um ein Einrollen der Stücke zu verhindern, ist es oft angezeigt, die Darmstückchen zur Fixierung auf Korkrähmchen aufzuspannen. (Epithel nach oben!) Größere Stücke fixiert man, indem man das D a r m r o h r nach Zubinden des einen Endes mit Fixierflüssigkeit mäßig füllt und d a n n abbindet. Hierauf legt man die ganze Darmschlinge noch in die Fixierflüssigkeit. Beim Auswässern werden die beiden u n t e r b u n d e n e n Enden abgeschnitten. 2053. Zur Fixierung des Magen- und Darmepithels eignet sich besonders die Carnoysche Flüssigkeit oder Susa. Man ü b e r t r ä g t nach der Fixierung (bei menschlichem D a r m ca. 12 Stunden) direkt in 96°/'oigen Alkohol. Den der

486

Mundhöhle und Darm

§ 2054—2060.

Schleimhaut allenfalls noch anhaftenden Darminhalt beseitigt man unter Flüssigkeit durch sorgfältiges Aufspritzen von Alkohol mit einer mit Gummihütchen versehenen Pipette. 2054. Das Schneiden der Muscularis bereitet nach Paraffineinbettung oft Schwierigkeit. Das ist besonders dann der Fall, wenn mit Toluol oder Xylol durchtränkt wurde. Bei Verwendung von Benzol oder Schwefelkohlenstoff lassen sich die Präparate dagegen meist gut schneiden, zumal wenn man vorher nach § 392 mit Methylbenzoat-Celloidin durchtränkt. Sehr leicht schneiden sich die Objekte nach Celloidineinbettung. 2055. Magen. In der Magenschleimhaut lassen sich Oberflächenzellen, Nebenzellen, Hauptzellen und Belegzellen unterscheiden. Dazu kommen noch Kardiaund Pylorusdrüsenzellen. Die Oberflächenzellen, Nebenzellen, Pylorus- und Kardiadrüsenzellen werden auf Grund ihres färberischen Verhaltens den m u k o i d e n Drüsen zugerechnet. Sie färben sich zwar wie muköse Zellen mit Mucicarmin und Muchämatin, zeigen aber gegenüber typischen mukösen Drüsenzellen, wie z. B. den Belegzellen des Darmes oder den Schleimdrüsenzellen der Speicheldrüsen, eine Reihe von Unterschieden. So bleiben sie in Delafieldschem Hämatoxylin, das muköse Zellen intensiv blau färbt, meist ungefärbt. Auch die typischen Schleimfarbstoffe wie Thionin lassen die mukoiden Zellen der Magenschleimhaut ungefärbt. Heldsches Molybdänhämatoxylin färbt sie »metachromatisch« rotviolett, den Schleim dagegen blau (L e h n e r 23). Andererseits werden Oberflächenepithelzellen, Nebenzellen, Kardia- und Pylorusdrüsenzellen mit Bestschem Carmin, das muköse Zellen ungefärbt läßt, intensiv rot gefärbt. Auch die Belegzellen des Magens werden durch letzteres stark gefärbt. Die Färbung ist nicht durch Glykogen bedingt, da sie auch nach Speichelreaktion eintritt. ( P a t z e l t 29). 2056. Es ist empfehlenswert, die verschiedenen Magendrüsenzellen auch in frischem Zustand in isotonischer Lösung zu untersuchen. Zur Herstellung von Isolationspräparaten eignet sich besonders l°/oo Osmiumsäure. 2057. Die O b e r f l ä c h e n e p i t h e l z e l l e n zeigen schon sehr bald nach dem Tode Veränderungen. Bei lebensfrischer Fixierung in Alkohol-Formol (s. § 2022) oder nach Carnoy sind die 'Zellen wie im frischen Zustand von zahlreichen Körnchen erfüllt. Kurz nach dem Tod fixiert erscheinen sämtliche Zellen in helle becherartige Gebilde umgewandelt, deren Inhalt sich mit Azan blau f ä r b t ( S c h a f f e r 27). 2058. D i f f e r e n t e D a r s t e l l u n g d e r D r ü s e n z e l l e n d e r M a g e n s c h l e i m h a u t nach K. W. Z i m m e r m a n n (25). 1. Starke Färbung in Hämalaun. — 2. Differenzieren in salzsäurehaltigem Alkohol, bis das Bindegewebe entfärbt ist. — 3. Färben in einer frischen Lösung von Mucicarmin (verdünnt 1 :10 mit 50°/oigem Alkohol) bis 24 Stunden. — 4. Kräftig färben in Aurantia (gesätt. in 50°/oigem Alkohol). — 5. Differenzieren in 50%igem Alkohol (nicht zu stark, da beim Entwässern noch Farbverlust eintritt. — 6. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: Oberflächenepithelzellen rot, Nebenzellen rot, Hauptzellen graublau, Belegzellen gelb. 2059. P a t z e 11 (29) empfiehlt die Kombination Delafieldsches Hämatoxylin — Bestsches Carmin — Aurantia, ohne jedoch genauere technische Angaben zu machen.

2060. Zur Darstellung der sehr labilen Granula der H a u p t z e l l e n fixiert H a m p e r 1 (26) lebensfrisch entnommene Schleimhautstückchen 24 Stunden in Formol 33 ccm, Alkohol 80°/o) 66 ccm, Kalium aceticum (wichtig!) 3—6 g.

§ 2061—2064.

Magen

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Dann übertragen in 95%>igen Alkohol, absol. Alkohol usw. Einbettung in Paraffin. Zur Färbung kommen die entparaffinierten Schnitte nach Vorfärbung der Kerne mit Carmin für 12 Stunden in eine stark verdünnte, blaßviolette wässerige Lösung von Methylviolett. Dann abspülen in dest. Wasser, differenzieren in absol. Alkohol (meist etwa 1 Min.). Xylol. Balsam. Ergebnis: Körnchen der Hauptzellen dunkelviolett, Kerne rot. 2061. Zur Darstellung der B e l e g z e l l e n färbt man. Schnitte der Fundusschleimhaut nach Fixierung in Carnoyscher Flüssigkeit oder in Sublimatgemischen in Hämalaun, wäscht gut aus in fließendem Wasser und färbt dann für 2—5 Minuten oder länger in einer verdünnten wässerigen Lösung von C o n g o r o t (3 ccm einer, l°/oigen wässerigen Lösung auf 100 ccm. dest. Wasser). Hierauf differenziert man in Wasser oder 50°/oigem Alkohol, bis das zunächst überfärbte Präparat genügend ausgezogen erscheint. Abs. Alkohol zieht den Farbstoff nur sehr langsam aus. Entwässern, Xylol, Balsam. Ergebnis: Hauptzellen bläulich, Belegzellen braunrot. Auch die Granula eosinophiler Zellen färben sich mit Congorot ( S t i n t z i n g , 99). Die mit Congorot gefärbten Präparate dürfen mit keiner Säure in Berührung kommen, da sonst der rotbraune Farbton in Blau umschlägt. 2062. Auch durch Eosin, Erythrosin und andere saure Teerfarbstoffe lassen sich die Belegzellen, namentlich nach Fixierung in sublimathaltigen Flüssigkeiten leicht färben. Durch Osmiumsäure werden die Granula der Belegzellen gebräunt. Bei Injektion von Vitalfarbstoffen (Neutralrot) kommt es nach G l a e ß n e r , W i t t g e n s t e i n und H a m p e r 1 (25) zu einer vitalen Farbstoffspeicherung, und zwar ausschließlich in den Belegzellen. 2063. Die korbförmigen intracellulär gelegenen S e k r e t k a p i l l a r e n d e r B e l e g z e l l e n werden am besten mit Hilfe der G o l g i s c h e n Methode dargestellt (E. M ü 11 e r , 92). Z i m m e r m a n n (98) bringt die nach der GolgiMethode (s. 1764) hergestellten Schnitte in eine Mischung von 100 ccm physiolog. Kochsalzlösung und 200 ccm 96°/oigen Alkohols für 10—15 Min. (häufig umrühren) und läßt sie einen halben Tag in hellem Licht in 75—96%igem Alkohol stehen, wobei das in Chlorsilber umgewandelte Chromsilber reduziert wird. Nachfärbung mit Thionin oder Safranin. Ersteres färbt besonders schön, wenn* der Fixierungsflüssigkeit (s. § 1764) anstatt Osmiumsäure Formalin zugesetzt wurde. — Auch die in § 1772 angegebene Modifikation der Golgi-Methode gibt gute Resultate. 2064. Zum N a c h w e i s v o n i o n i s i e r t e m C h l o r in der Magenschleimhaut hat L i s o n (36) folgende auch bei anderen Organen anwendbare Methode entwickelt: 1. Fixierung: Durchspülen der Gefäße des narkotisierten Tieres mit isotonischer Glukoselösung, der l°/oo Natriumnitrit zugesetzt ist. Unmittelbar anschließend durchspülen mit einer Lösung von 2 g Silbernitrat, 3 ccm Salpetersäure und 100 ccm dest. Wasser. Zur besseren Fixierung können noch 10 ccm Formol zugesetzt werden. — 2. Herausnahme des Magens und einlegen in die gleiche Lösung für 2—4 Stunden. — 3. Auswaschen in 3°/oiger Silbernitratlösung 12 bis 24 Stunden, evtl. mit Zusatz von 10°/o Formol; alle 2 Stunden erneuern. — 4. Einbetten in Paraffin. Auswaschen der 5—10« dicken Schnitte in 3°/oigen Salpeter, säure, die öfters gewechselt wird. Zuletzt in dest. Wasser. — Nr. 1—4 bei gedämpftem Licht. — 5. Einstellen bei vollem Tageslicht in einen Entwickler, der unmittelbar vor Gebrauch durch Vereinigung gleicher Teile der folgenden Stammlösungen bereitet wird: Lösung A: Metol 4 g, Hydrochinon 8 g, Natriumsulfit 50 g, Bromkali 1 g, dest. Wasser 1000 ccm. — Lösung B: Kaliumcarbonat 150 g, dest. Wasser 1000 ccm. Dauer 5 Min. — 6. Auswaschen in dest. Wasser. — Beliebige Gegenfärbung (Carmalaun; Hämalaun-Eosin od. dgl.) usw. Die Untersuchungen ergaben reichliche Anwesenheit von ionisiertem Chlor an der

488

Mundhöhle und Darm

§ 2065—2069.

Schleimhautoberfläche, bis zum Grund der Drüsenlichtungen, in den intracellulären Sekretkapillaren, in den Oberflächenzellen, im Bindegewebe, aber n i c h t i n d e n B e l e g z e l l e n , in denen während der Sekretionsphase ionisiertes Chlor nicht nachweisbar ist; trotzdem könnte aber nicht-ionisiertes Chlor in gebundenem Zustand vorhanden sein.

2065. Dünndarm. Die naturgetreue Fixierung des Dünndarms bietet oft beträchtliche Schwierigkeiten, da es auch bei lebensfrisch entnommenem Material gewöhnlich zu einer Kontraktion des glatten Muskelgewebes in den Zotten wie in der Wandung des Darmes kommt, die zu einer Ablösung des Epithels ( G r ü n h a g e n sehe Räume, L i e b e r k ü h n sehe Spitzenlöcher) und zu mehr oder weniger starken Zerreißungen in der Submukosa führt. Um diese überaus leicht auftretenden Kunstprodukte zu vermeiden, empfiehlt W o l f - H e i d e g g e r (39) bei der Fixierung des Dünndarms (wie auch anderer Hohlorgane) die Anwendung von Kava-Kava-Extraktion, durch die die Reaktionsfähigkeit der glatten Muskulatur gegenüber dem Fixierungsreiz mehr oder weniger aufgehoben wird. Man durchspült dazu das Gefäßsystem des tief narkotisierten Tieres von der Aorta aus mit körperwarmem Kava-Extrakt (bei Katzen z. B. mit 400—500 ccm). Unmittelbar darauf werden die Darmstücke entnommen, gegenüber dem Mesenteriasansatz vorsichtig aufgeschnitten und entweder sogleich in Susa fixiert oder in Kava-Extrakt von Zimmertemperatur gelegt und für 5—15 Minuten bei •—Io in den Eisschrank gestellt, um sodann in eisgekühlter Susalösung fixiert zu werden.

Herstellung des Kava-Extraktes: 250 ccm Ringerlösung werden auf 80° C erwärmt, dann 15 g Kava-Kava-Pulver (Radix Kava-Kava subtilis Merck) unter ständigem Umrühren zugesetzt. Dann wird eine Messerspitze Diastase (Merck) in einigen ccm Ringerlösung gelöst und der auf 37° C abgekühlten Kava-Aufschwemmung zugesetzt. Nach 2 1 /2stündigem Stehen bei 37° wird die überstehende gelbbraune klare Flüssigkeit, die das wirksame Prinzip enthält, vom Bodensatz abfiltriert. Das nicht sehr lange haltbare Filtrat soll in möglichst frischem Zustand verwandt werden. 2066. Will man an aufgeschnittenen Darmstücken die Ablösung vermeiden, dann lasse man sie, vor Austrocknung geschützt (z. B. auf einer mit physiol. Kochsalzlösung befeuchteten Filtrierpapierlage in einer Petrischale) etwa 30 Minuten lang liegen. Für cytologische Untersuchungen sind die Präparate dann allerdings meist nicht mehr geeignet.

2067. Im Dünndarm ist zwischen den mit Cuticularsaum versehenen S a u m z e l l e n , den B e c h e r z e l l e n , den P a n e t h s c h e n (oder o x y p h i l e n ) Z e l l e n und den b a s a l g e k ö r n t e n ( g e l b e n oder e n t e r o c h r o m a f f i n e n ) Z e l l e n zu unterscheiden. Dazu kommen noch die B r u n n e r schen Drüsen des Duodenums. 2068. Die Untersuchung von Mitochondrien, Golgi-Substanz, Glykogen und Fett erfolgt nach den dafür in früheren Kapiteln angegebenen Methoden. Der C u t i c u l a r saum wird durch For.mol sowie durch Kaliumbichromat-Formolgemische gut fixiert. Zur Färbung seiner stäbchenartigen Struktur eignet sich Eisenhämatoxylin, Azan und nach P a t z e 11 (28) besonders Bestsches Carmin. Durch Behandlung des frischen Präparates mit Wasser oder Essigsäure kann der Cuticularsaum als eine sich über mehrere Zellen erstreckende Membran abgehoben werden. 2069. B e c h e r z e l l e n . Im lebensfrischen Präparat besteht der die Theka der Becherzellen mehr oder weniger füllende Schleim aus mäßig stark lichtbrechenden, mattglänzenden Körnchen. Bei Quellung derselben nimmt er ein mehr homogenes Aussehen an. Die feinere Struktur der Becherzellen untérliegt sehr rasch postmortalen Veränderungen. Die meisten wässerigen, namentlich

§ 2070—2073.

Dünndarm

489

aber saure und alkalische Reagenzien führen zu Quellungen, wodurch die Zellen im Schnittbild sehr verschiedenes Aussehen zeigen. In Alkohol-Formol, Kaliumbichromat-Formol, gesätt. wässer. Pikrinsäure sowie nach den von M e t z n e r angegebenen Methoden (s. § 2020 f.) werden auch die reifen Schleimkörnchen gut fixiert. Die Färbung e r f o l g t mit Delafieldschem Hämatoxylin, Mucicarmin, Muchämatin. Durch Safranin, Thionin, Toluidinblau werden sie metachromatisch gefärbt. Näheres siehe § 2033. Mit Bestschem Carmin färbt sich der Schleim der Becherzellen nach P a t z e 11 (28) nicht oder nur schwach. 2070. Die P a n e t h s c h e n Z e l l e n kommen besonders im Bereich des Dünndarms vor. Im Coecum und Appendix sind sie seltener, im Colon und Rectum sind sie höchstens vereinzelt aufzufinden. Sowohl hinsichtlich Verteilung wie Aussehen der Zellen bestehen zwischen den einzelnen Tierarten Unterschiede (vgl. B a e c k e r 34, P a t z e l t 36). Bei Hund und Katze fehlen sie. Die oxyphilen Granula bleiben bei Fixierung in Formol gut erhalten. Noch besser fixieren die Kaliumbichromat-Formolgemische von Kopsch, Regaud, Orth. Nach all diesen Fixierungen lassen sich die Granula mit sauren Farbstoffen w i e Eosin, Orange, Säurefuchsin gut färben. Sehr gut werden sie auch durch Fixierung und Färbung nach Altmann (§ 974 und 991) dargestellt. Die Panethschen Zellen sind als besondere sekretoische Zellart aufzufassen, die den Schleimzellen näher stehen als den albumoiden Drüsenzellen (P a t z e 11 36, hier auch eingehende zusammenfassende Darstellung). 2071. D i e b a s a l g e k ö r n t e n Z e l l e n . In frischem Zustand untersucht zeigen die Körnchen dieser Zellen oft, aber nicht immer, eine gelbliche Eigenfarbe. Im Fluoreszenzmikroskop zeichnen sie sich durch lebhafte goldgelbe Eigenfluoreszenz aus (E r o e s 32). Besonders zahlreich findet man die basalgekörnten Zellen im kranialen Teil des Duodenums des Meerschweinchens. 2072. Die F i x i e r u n g muß in lebensfrischem Zustand erfolgen, da die Körnchen gegenüber autolytischen Vorgängen überaus empfindlich sind. Als Fixierungsmittel kommen Formol oder die Kaliumbichromat-Formolgemische von Kopsch, Regaud oder Orth in Betracht. Vor allem aber ist Bleiacetat-Formol nach L i s o n (31) zu empfehlen, durch das die spezifische Substanz der Körnchen stabilisiert und eine nachträgliche Lösung verhindert w i r d (siehe § 2073). Pikrinsäure, Essigsäure, Trichloressigsäure, starker Alkohol, Sublimat sowie Gemische, die diese Substanzen in größerer Menge enthalten, sind für die Fixierung ungeeignet. Bei Behandlung mit chromhaltigen Lösungen zeigen die Körnchen die von J. E. S c h m i d t (5) entdeckte »Chromreaktion«, die aber nicht auf einer spezifischen Verbindung mit Chrom, sondern auf teilweiser Oxydation der in den Körnchen enthaltenen phenolartigen Substanz und Bildung einer gelbgefärbten Chinonverbindung durch Kupplung mit dem noch nicht oxydierten Teil beruht ( H a m p e r l 25). Die Gelbfärbung tritt auch nach Einwirkung von 2°/oiger Natriumjodatoder Kaliumpermanganatlösung ein. 2073. B l e i a c e t a t - F o r m o l n a c h L i s o n (31). Zusammensetzung: Bleiacetat 3—5 g, Formol (40%) 10 ccm, dest. Wasser 100 ccm. L i s o n empfiehlt die Flüssigkeit namentlich für histochemische Untersuchungen. Sie fixiert besser als Formol, erlaubt alle histochemischen Reaktionen, die mit wässeriger Fixierung vereinbar sind. Außerdem bleibt sein Ph durch Pufferwirkung sehr konstant, was wertvoll ist, wenn eine Flüssigkeit gewünscht ist, deren PH nahe am Neutralpunkt liegt.

4Ö0

Mundhöhle und Darm

§ 2074—2079.

Die leichte Trübung der Lösung ist unschädlich. Man kann die Lösung auch mit 2—3°/o Eisessig ansäuern, worauf sie sich klärt. 2074. In den Körnchen der basalgekörnten Zellen liegt ein ortho-Dioxybenzolderivat vor, das in para-Stellung einen nicht näher bestimmten Rest trägt. Diese Seitenkette bedingt die Löslichkeit der Körnchen in starkem Alkohol und in starken Säuren sowie ihre Konservierbarkeit durch Formol ( C l a r a 33). 2075. F ä r b u n g der basalgekörnten Zellen. Nach Fixierung in den gen a n n t e n Kaliumbichromat-Gemischen erscheinen die Körnchen nach H ä m alaun-Eosin oder Dominici-Färbung in A b s t u f u n g e n gelb-orange, nach Fixier u n g in chromfreien Lösungen sattrot. 2076. C l a r a (32) empfiehlt ganz besonders die F ä r b u n g mit dem Heldschen Molybdänhämatoxylin, durch das die Körnchen der basalgekörnten Zellen in einem braunschwärzlichen Ton gefärbt werden, der sich von allen übrigen F a r b n u a n c e n des Schnittes deutlich unterscheidet. Ausführung: Fixierung in neutralem Formol 1 :9 oder nach § 2073, Celloidin- oder Paraffinschnitte kommen aus dest. Wasser o h n e vorherige Beizung, (wichtig!) in Heldsches Molybdänhämatoxylin (s. § 1875, 5), das mit dest. Wasser so stark v e r d ü n n t ist, daß die Lösung n u r ganz zart rosa erscheint. Wenn die F ä r b u n g nach 24 Stunden noch nicht intensiv genug ist, setzt m a n einen neuen T r o p f e n der Stammlösung zu. Aus der Farblösung kommen die Schnitte f ü r einige Minuten in dest. Wasser, dann in Brunnenwasser. Bei Ü b e r f ä r b u n g können die Schnitte durch entsprechend langes Verweilen in Brunnenwasser differenziert werden. Alkoholreihe, Xylol, Balsam. — Ergebnis: K e r n e blau, Körnchen in den basalgekörnten Zellen braunschwarz bis grünlichschwarz. Bei der Analyse des'Färbevorganges lassen sich zwei Phasen unterscheiden: eine sehr schnell eintretende Gelbfärbung der Körnchen und dann eine erst allmählich auftretende braunschwärzliche Färbung. Erstere beruht auf einer Komplexverbindung des in den Körnchen enthaltenen ortho-Dioxybenzolderivates mit dem Molybdän, letztere wahrscheinlich auf einer chemischen Bindung des Derivates mit dem Molybdänsäure-Hämatoxylinlack. C l a r a mißt dem Färbeeffekt den Wert einer mikrochemischen Reaktion bei. Sehr gut gelingt die isolierte F ä r b u n g der basalgekörnten Zellen auch mit Gallocyanin oder Gallaminblau (0,1 g auf 100 ccm dest. Wasser). F ä r b e d a u e r 24 Stunden, dann Auswaschen in dest. Wasser, Alkoholreihe usw. Körnchen fast schwarz ( C l a r a 35). 2077. Besondere Bedeutung hat f ü r die Darstellung der basalgekörnten Zellen ihre von M a s s o n (14) entdeckte Fähigkeit mit ammoniakalischer Silberlösung zu reagieren. Die »S i 1 b e r r e a k t i o n« w i r d nach der in § 1129 angegebenen Methode ausgeführt. Die Reaktion gelingt nach Fixierung in Formol wie in den Gemischen von Regaud, Kopsch, Orth oder Lison. Auch bei dieser Reaktion entsteht zunächst durch Oxydation des Dioxybenzolderivates eine gelbgefärbte Chinonverbindung; erst sekundär kommt es zur Ausfällung von reduziertem Silber ( G é r a r d , C o r d i e r und L i s o n 30). 2078. Die " B r u n n e r s c h e n D r ü s e n . Die Sekretkörnchen derselben w e r d e n in lebensfrischem Zustand durch Sublimat-Kochsalz, Formol oder Formol-Alkohol gut fixiert. Nach dieser Vorbehandlung werden sie am besten mit dem Bestschen Carmin gefärbt ( P a t z e l t 28). Mucicarmin, Muchämatin oder Delafieldsches Hämatoxylin färbt sie nach Fixierung in Formol-Alkohol n u r schwach. Mit Molybdänhämatoxylin f ä r b e n sie sich im Gegensatz zu den blaugrau gefärbten Becherzellen rotviolett. Eine metachromatische F ä r b u n g mit Thionin oder S a f r a n i n tritt nicht ein. 2079. Z u r Untersuchung der L y m p h f o U i k e l eignen sich besonders die

§ 2080—2085.

Dünndarm

491

P e y e r sehen Plaques, welche makroskopisch gesucht, ausgeschnitten u n d z. B. n a c h Helly oder Maximow fixiert werden. F ä r b u n g mit den in Kap. 18, 4 angegebenen hämatologischen Methoden. Ebenso v e r f ä h r t m a n bei Untersuchung des diffusen lymphoiden Gewebes der Darmschleimhaut. 2080. Zur F l ä c h e n d a r s t e l l u n g d e s l y m p h o i d e n Gewebes des menschlichen D a r m s legt H e 11 m a n n (22) den herausgenommenen u n d a m Mesenterialansatz aufgeschnittenen D a r m f ü r einige Tage in fließendes Wasser. Hierauf wird er in 15—20 cm lange Stücke zerschnitten und auf Fließpapier ausgebreitet, 2—5 Tage lang in "2—3°/oige Essigsäure gelegt, bis er ganz durchsichtig ist. Nun werden die Stücke f ü r 2—3 Stunden in fließendem Wasser aufgehängt u n d 12—60 Stunden lang in Harrisschem Hämatoxylin gefärbt, das m i t dest. Wasser auf 1 :100 v e r d ü n n t ist. (Auch andere gute Hämatoxylinlösungen sind verwendbar.) Nach k r ä f t i g e r D u r c h f ä r b u n g werden sie in 2—3°/oiger Essigsäure differenziert, bis sich die Solitärfollikel scharf gegen die fast ungef ä r b t e Umgebung abheben (12—24 Stunden). Hierauf wässern und abziehen von Serosa und Muskularis, worauf das lymphoide Gewebe sehr schön hervortritt. Z u r Konservierung kommen die Stücke in die von Kaiserling oder Jores angegebene definitive Aufbewahrungsflüssigkeit (s. § 858 bzw. 860). 2081. H e r s t e l l u n g d e r H ä m a t o x y l i n l ö s u n g n a c h H a r r i s : 1 g Hämatoxylin wird in 10 ccm abs. Alkohol gelöst; ferner 20 g Kalialaun unter Erwärmen in 200 ccm dest. Wasser. Nach 24 Stunden werden beide Lösungen vereinigt und 0,5 g rotes oder gelbes Quecksilberoxyd zugesetzt. Hierauf wird bis zum Sieden erhitzt, dann schnell abgekühlt und nach 24 Stunden filtriert. Die dunkelrote Flüssigkeit ist sogleich gebrauchsfertig. 2082. H. V o ß (24) bringt die fertiggestellten Präparate durch die Alkoholreihe in Tetralin oder füllt die nicht aufgeschnittenen, gefärbten und differenzierten Darmstücke nach dem Wässern mit Talg, worauf das Präparat in der Luft freischwebend aufgehängt wird. Nach 1-—2 Wochen wird der Talg im Thermostaten vorsichtig herausgeschmolzen und das getrocknete Darmstück in siedendem Benzin entfettet. Unmittelbar darauf wird es mit Leinöl-Xylol Sä bepinselt und getrocknet. 2083. Die Darmschleimhaut junger Tiere ist reicher an lymphoidem Gewebe wie die der alten; i m Alter nimmt es fortschreitend ab. Seine Menge ist bei den verschiedenen Tierarten verschieden: am reichsten an lymphoidem Gewebe sind Schwein, Mensch u n d Affe, spärlicher ist es bei Einhufern, Wiederkäuern und Fleischfressern. E l l e n b e r g e r , 06. 2084. Über die leukozytären Elemente der Darmschleimhaut der Säugetiere siehe P. W e i 11 (19). Tötung der Tiere 2—4 Stunden nach reichlicher Fütterung, Fixierung 2 S t u n d e n bei 37° C in Hellyscher Flüssigkeit (§ 337), F ä r b u n g nach § 659, 726, 1403, 1407. Zur F ä r b u n g mit Methylgrün-Pyronin vereinigt Weill vor Gebrauch 35 ccm einer l°/oigen Pyronin- und 15 ccm einer l°/oigen Methylgrünlösung, f ä r b t 3 Minuten, spült rasch ab in Wasser u n d entwässert in Aceton. Der Nachweis feiner glatter Muskelzellen in Mucosa und Submucosa erfolgt am besten m i t den in § 1498 oder 1730 angegebenen Methoden. 2085. Die e x t r a m u r a l e n N e r v e n u n d die i n t r a m u r a l e n N e r v e n g e f l e c h t e des Magens und Darmes (Auerbachscher Plexus, Meißnerscher Plexus usw.) w e r d e n in ihrer Gesamtheit am besten mit Hilfe der s u p r a vitalen M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g nach Schabadasch dargestellt (vgl. § 1941 ff. und die Arbeiten von S c h a b a d a s c h 30—36). F ü r die Darstellung der feineren Innervationsverhältnisse ist in erster Linie die Bielschowsky-Methode in der Modifikation von Gros-Schultze (s. § 1793) zu empfehlen, die, wie vor allem S t ö h r (30) zeigte, ausgezeichnete Bilder gibt.

492

Leber

§ 2086—2091.

Bei der Katze werden mit dieser Methode im Auerbachschen Plexus fast immer nur die Ganglienzellen vom Typus II gut imprägniert, beim Kaninchen dagegen vor allem die vom Typus I (S t ö h r 30). Eine erschöpfende Darstellung des Schrifttums über Magen bei P1 e n c k (32), über Darm bei P a t z e 11 (36). 29. KAPITEL

Leber 2086. F ü r Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e , die den Läppchenaufbau der L e b e r zeigen sollen, wählt man am besten eine Schweineleber, deren Läppchen durch reichlich entwickeltes interlobuläres Bindegewebe voneinander gut getrennt sind. Beim Menschen wie den meisten anderen Tieren sind die einzelnen Läppchen dagegen mehr oder weniger weitgehend verschmolzen und das interlobuläre Bindegewebe dementsprechend nur spärlich entwickelt.

Zur Embryonalzeit ist die Leber durch Blutbildungsherde ausgezeichnet. Beim Menschen fällt der Höhepunkt der blutbildenden Tätigkeit in den 5. Schwangerschaftsmonat (M o 11 i e r 09). Beim Hühnchen findet H a f f (14) zwei Perioden, die erste vom 7. bis 9. Bebrütungstag, die zweite vom 11. bis gegen Ende der embryonalen Epoche (Höhepunkt 14. Tag).

2087. L e b e r z e l l e n und L e b e r z e l l b a l k e n isoliert man nach H e i d e n h a i n 03), indem man die frische Schnittfläche einer nicht verfetteten Leber eines am besten durch Verbluten getöteten Tieres mit einem Skalpell abstreift, das Geschabte zum Teil frisch untersucht, zum Teil für 24 Stunden nach § 1277 f. weiterbehandelt. Besonders große Leberzellen findet man beim Kaninchen (mittlerer Zelldurchmesser 25,7/i; siehe auch Tab. 6 bei P f u h l 32). Die feinere Zellstruktur der Leberdrüsenzellen kann je nach der Fütterung außerordentlich verschiedenes Aussehen aufweisen. Eine eingehende zusammenfassende Darstellung der Strukturbeeinflussung durch Ernährung, Hunger, und experimentelle Bedingungen bei P f u h l (32).

2088. Die Wahl der F i x i e r u n g s m e t h o d e richtet sich nach dem bei der Untersuchung verfolgten Zweck. F ü r Ü b e r s i c h t s b i l d e r eignen sich beinahe alle für allgemeine Zwecke gebräuchlichen Fixierungsflüssigkeiten, wie Formol-Sublimat-Eisessig, Hellysche oder Bouinsche Flüssigkeit u. dgl. F ü r Fettnachweis fixiere man in Formol und verfahre nach § 1040 ff., Mitochondrien stelle man nach § 969—998, das Glykogen nach § 1090—1107 dar. Zur histologischen Darstellung der Tropfen des gespeicherten Eiweißes empfiehlt B e r g (27), die Methylgrün-Pyronin-Methode (§ 723). Fixierung nach Helly.

2089. Zur Darstellung der d u n k l e n L e b e r z e l l e n färben F i s c h l e r und R o e c k l (38) Gefrierschnitte von fixiertem Material im verdünnten Ehrlichschen Hämatoxylin (1 :10) mehrere Stunden bis 2 Tage, bis die Schnitte schwarz sind. Nach Auswaschen in Brunnenwasser differenzieren in Boraxferricyankalium nach § 1822, 7 (1 :10 mit dest. Wasser verdünnt) oder in Ferricyankalium 2,5 g, NaHC0 3 2,0, dest. Wasser ad 1000,0 bis die Schnitte dunkelgrau und etwas durchsichtig geworden sind. Dann gut auswaschen in Brunnenwasser, Alkohol, Xylol, Balsam. Ergebnis: Dunkle Zellen dunkelblaugrau bis bräunlichviolett.

2090. Die Darstellung der G i t t e r f a s e r n erfolgt nach den in Kap. 19, -/ (S. 508) angegebenen Imprägnationsmethoden. 2091. Die Sichtbarmachung der K u p f f e r sehen S t e r n z e l l e n (Reticuloendothelin, Endocyten n. Z i m m e r m a n n ) gelingt am leichtesten durch Vitalfärbung mit T r y p a n b l a u (§ 762) oder L i t h i u m c a r m i n (§ 770).

§ 2092—2095.

Leber

493

An Stelle von Farbstoffen können auch feine Suspensionen von Tusche, Kollargol, Zinnober u. dgl. verwendet werden. v. K u p f f e r (99) verreibt dazu etwa 0,5 g schwarze T u s c h e in 10 ccm physiologischer Kochsalzlösung und spritzt die Suspension einem Kaninchen intravenös ein (vena jugularis oder einfacher Ohrvene). Nach 24—36 Stunden tötet man das Tier und fixiert die Leber beliebig. An Schnittpräparaten findet man dann die Sternzellen stark mit Tuschekörnchen gefüllt. Den gleichen Erfolg erzielt man durch subkutane oder intraperitoneale Injektion von käuflicher Tuschelösung (z. B. Pelikantusche von Günther Wagner). Versuchstiere: Maus, Ratte, Frosch od. dgl.

T s c h a s c h i n (13) injiziert Kaninchen in zweitägigen Zwischenräumen 4—5mal 4—5 ccm einer l°/oigen K o l l a r g o l l ö s u n g (intravenös). Fixierung in 10°/oigem Formol, Gefrierschnitte oder Paraffineinbettung. 2092. Die venösen Blutgefäße der Leber werden am besten von der Pfortader aus injiziert, wobei man nach kurzer Durchspülung die Vena cava inferior unterbindet. Andernfalls bekommt man die Gefäße nur unvollkommen gefüllt. Die arteriellen Gefäße lassen sich gleichzeitig durch andersfarbige Injektion darstellen. 2093. Zur Darstellung der N e r v e n spült man nach R i e g e l e (28) die Leber eines frisch getöteten Tieres von der A. hepatica und der Pfortader aus unter gleichzeitiger Öffnung der V. cava inf. mit 0,75°/oiger Kochsalzlösung gründlich blutleer. Darauf wird die Leber auf gleichem Wege mit Formol 1 : 4 injiziert und in kleine Stückchen zerschnitten, die sofort in Formol 1 :10 eingelegt werden. Die Formmollösung darf nach 2—3maligem Wechsel keine Trübung oder Gelbfärbung mehr aufweisen. Die Darstellung der Nerven erfolgt dann nach der Methode von Gros-Schultze (s. § 1793).

Die U n t e r s u c h u n g der G a l l e n b i l d u n g und der

Gallenwege.

2094. Die intravitale Beobachtung der Gallenkapillaren gelingt mit Hilfe der von H i r t und E l l i n g e r (29a) angegebenen Technik (Einspritzung von Fluorescin und Beobachtung mit Opakilluminator bei ultraviolettem Licht; Objekt: Froschleber, s. auch § 68 ff. u. 151). .2095. B a r i u m c h l o r i d m e t h o d e nach F o r s g r e n (28) z u m m i k r o s k o p i s c h e n ' N a c h w e i s d e r G a l l e n b i l d u n g . Bei gewöhnlicher Fixierung werden die Gallenbestandteile nicht ausgefällt, sondern ausgewaschen. Um sie zu erhalten, legt F o r s g r e n 3—4 mm dicke Leberscheiben f ü r 6—12 Stunden in 3°/oige Bariumchloridlösung (im Überschuß, z. B. 5 Stückchen auf 100 ccm Lösung). Dann Nachfixierung f ü r 12—18 Stunden in Formol 1 : 9. Hierauf kurz auswaschen in Alkohol und Einbettung in Paraffin. Schnittdicke 5JLI. Zur Färbung kommen die Schnitte 1. f ü r 1—3 Min. in 0,l°/oige wässerige Säurefuchsinlösung (Marke Grübler, wichtig!); dann abspülen in dest. Wasser. — 2. l°/oige Phosphormolybdänsäure Va—1 Min.; sorgfältig abspülen in dest. Wasser. — 3. Anilinblau-Orange-Oxalsäure nach § 1486 3—5 Min. Abspülen in dest. Wasser usw. wie in § 1486. Ergebnis: Inhalt der Gallenkapillaren und ein Teil der Körner in den Leberzellen intensiv rot. Kerne blau oder orange. Kupffersche Sternzellen blau, Gallengangsepithel blau, ebenso Bindegewebe. Erythrocyten orange. Die äußerste Zone des Blockes wird jweckmäßig weggeschnitten, weil die Färbbarkeit dort schlecht zu sein pflegt. Bei Säurefuchsin von Merck löst F o r s g r e n 0,1 g in 100 ccm n/100 HCl. Färbung 1—3 Min.; abspülen in dest. Wasser. — 2. Färbung in einer Lösung von 2 g

494

Leber

§ 2096—2102.

Orange G und 0,5 g Anilinblau in 100 ccm n/100 HCl 3—5 Min. — 3. Abspülen in dest. Wasser. Alkohol. Xylol. Balsam. 2096. Gallenbildung wie Glykogenbildung erfolgt nach F o r s g r e n (28, 29) in einem regelmäßigen, autonomen 24-Stundenrhythmus, der wahrscheinlich unabhängig von der Fütterung ist. Beim Kaninchen Glykogenmaximum um 9—10 h, Minimum um 14—16 h. Der Aufbau der Gallengranula verhält sich gerade umgekehrt. Bei der weißen Maus Glykogenmaximum im März zwischen 20—2 h, Minimum zwischen 12—17 h, im Februar Maximum zwischen 3—8 h. H o l m g r e n (33) konnte auch für Fett einen gewissen 24-Stundenrhythmus feststellen. a) D a r s t e l l u n g d e r G a l l e n k a p i l l a r e n durch Injektion 2097. B e r l i n e r b l a u i n j e k t i o n . Man injiziert dazu am besten eine konz. Lösung von wasserlöslichem Berlinerblau vom Ductus hepaticus oder Ductus choledochus aus. Im letzteren Fall füllt sich zuerst die Gallenblase mit Farbmasse und erst dann durch den Duct. hepat. die Gallengänge. Bei dieser Art der Darstellung hat man oft mit Extravasaten zu kämpfen; zudem gelingt sie meist nur an beschränkten, gewöhnlich peripher gelegenen Bezirken der Leberläppchen. Bei kleineren Tieren injiziert R a n v i e r die Gallenkapillaren von der Gallenblase aus. Die Injektion gelingt nach K r a u s e (22) besonders leicht bei der Taube, und zwar vom linken Ductus hepaticus aus, den man nach Aufheben des rechten Leberlappens und Auseinanderdrängens der beiden Schenkel der Duodenalschlinge leicht findet. Verschiedene Tiere (z. B. Pferd) besitzen keine Gallenblase. 2098. M e t h o d e n d e r p h y s i o l o g i s c h e n S e l b s t i n j e k t i o n ( C h r z o n s z c z e w s k y , 64 und 66). Man injiziert in die Vena jugularis ext. eine gesättigte wässerige Lösung von Indigocarmin (Hund auf einmal je 50 ccm, Katze 30 ccm, ausgewachsenes Kaninchen 20 ccm) dreimal im Laufe von l'/z Stunden. Nach Ablauf dieser Zeit tötet man das Tier und fixiert kleinere Leberstücke mit abs. Alkohol. Man kann auch nachträglich die Gefäße mit Carmingelatine injizieren und mit Alkohol härten; man bekommt dann mit Indigocarmin natürlich injizierte Gallenkapillaren und mit Carmingelatine injizierte Blutgefäße nebeneinander. Schneidet man die so fixierte Leber, so findet man die Gallenkapillaren, falls die Zeit des Abtötens gut getroffen wurde, gefüllt mit Indigocarmin, das aus den Blut- und Lymphbahnen durch die Leberzellen in diese ausgeschieden worden ist. 2099. Beim Frosch läßt sich das Ganze noch einfacher machen: Man injiziert in den Lymphsack des Frosches etwa 2 ccm einer wässerigen Indigocarminlösung; nach ein paar Stunden wird das Tier getötet, die Leber in absolutem Alkohol fixiert und weiter behandelt. 2100. Bei a b g e b l a ß t e n I n j e k t i o n s p r ä p a r a t e n läßt sich durch Einwirkung von N e l k e n ö l die Farbe wieder auffrischen. 2101. K. O p p e n h e i m e r (23) beobachtete, daß sich die Gallenkapillaren und mittleren Gallengänge nach Verfütterung von Scharlachrot (in Olivenöl gelöst) orangerot färben. Noch intensiver ist die Färbung, wenn der Farblösung noch Cholesterin beigemengt wird. Fixierung in Formol. Gefrierschnitte. b) D a r s t e l l u n g

durch

Imprägnation

2102. Darstellung der G a l l e n k a p i l l a r e n mit d i c h r o m s a u r e m S i l b e r . ( B ö h m A., siehe K u p f f e r , 89.) Frische, nicht über 1 ccm große Leberstücke, werden auf dreimal 24 Stunden in folgende von R a m ó n y C a j a 1 für andere Zwecke angegebene Flüssigkeit übertragen: 3%>ige Lösung von Kaliumbichromat 4 Teile, l°/oige Osmiumsäure-Lösung 1 Teil. Hieraus auf 24 bis 48 Stunden in eine 3/4°/oige wässerige Silbernitratlösung. Die Stücke wer-

§ 2103—2106.

495

Gallenkapillaren

den alsdann mit dest. Wasser abgespült, in Alkohol kurz nachgehärtet und geschnitten. Die G a l l e n k a p i l l a r e n sind schwarzbraun imprägniert. 2103. B r a u s (96) imprägniert die Gallenkapillaren mit A r g e n t u m nitricum nach Fixierung in einer Mischung von 3 Teilen V3°/oiger Chromsäurelösung oder Müllerscher Flüssigkeit und 1 Teil Formol. Oft k a n n ein Erfolg durch wiederholtes Ü b e r f ü h r e n der Stückchen von Chromlösung in Silber noch nach Wochen erzielt werden. Auch die Methode von Kopsch (§ 1772) ist gut. c) D a r s t e l l u n g

durch

Färbung

2104. H o 1 m e r (27) fixiert möglichst frisch in Formol (1 Teil auf 4—10 Teile 0,9°/oige Kochsalzlösung) und bettet in gewöhnlicher Weise in P a r a f f i n (oder Celloidin) ein. Entparaffinierte Schnitte kommen aus dest. Wasser 1. f ü r 3 bis 5 (besser 30—45) Minuten) in Liqu. f e r r i sesquichlorati. — 2. Abspülen in dest. Wasser bis zur E n t f ä r b u n g der Schnitte (nicht zu lange!). — 3. F ä r b u n g in ger e i f t e r 0,5°/oiger Hämatoxylinlösung 5—10 (besser 20—30) Minuten (Herstellung: 1 g Hämatoxylin wird in 100 ccm heißem dest. Wasser gelöst. Nach Reifen w i r d vor Gebrauch mit gleicher Menge dest. Wasser verdünnt). — 4. K u r z abspülen in dest. Wasser. — 5. Differenzieren in stark v e r d ü n n t e r Liqu. ferr. sesqu. (Zitronenfarbe) unter Hin- und Herbewegen. Normales Lebergewebe w i r d dabei grau. — 6. K u r z abspülen in Wasser. — 7. Eintauchen in ges. wäss. Lithiumcarbonatlösung bis stahlblau, einige Sekunden. — 8. Einige Minuten auswaschen in Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Die Gallenkapillaren sind als scharf konturierte Röhrchen sichtbar. Nach C l a r a (34) gelingt die Methode nach' Fixierung in Formol-Alkohol (§ 2022) oder Formol — absol. Alkohol — Eisessig (20 :80 :1) noch besser. 2105. O t a m i (26) beizt Paraffinschnitte von beliebig, jedoch nicht in Alkohol oder Kaiserling fixiertem Material 1—2 Stunden in gesättigter K a l i u m bichromatlösung (bei 37°), spült 5—10 Sekunden in dest. Wasser ab u n d f ä r b t 5—60 Minuten bei 37° in Hämatoxylin nach Kultschitzky (§ 1825). Hierauf differenzieren in der Boraxlösung nach Weigert (§ 1822, 7). Auswaschen, Alkoholreihe, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Gallenkapillaren dunkelblau, Leberzellen graubraun. 2106. Ähnlich ist die Vorschrift von C l a r a (33, 34). Fixierung nach §2104. Celloidineinbettung. 1. Beizung der Schnitte 24 Stunden bei 40—50° C in folgendem Gemisch: A. Kaliumbichromat 2 g, Chromalaun 1 g, dest. Wasser 30 ccm. B. Ammoniummolybdat 2,5 g, Chromsäure 0,25 g, dest. Wasser 100 ccm. Vor Gebrauch werden gleiche Teile A und B gemischt. — 2. K u r z auswaschen in dest. Wasser. — 3. F ä r b u n g in Hämatoxylin nach Kultschitzky (§ 1825) 24 Stunden bei 37° C. — 4. Auswaschen in Brunnenwasser. — 5. Differenzieren in Boraxferricyankalium (§ 1822, 7). — 6. Gründlich auswaschen in B r u n n e n wasser. — 7. Entwässern, Xylol, Balsam. — Ergebnis: K e r n e blauschwarz, Cytoplasma zart graublau, Zellmembranen gelbbraun, Gallenkapillaren sehr scharf d u n k e l b r a u n — blauschwarz. Gefrierschnitte werden bei Zimmertemperatur gebeizt und ebenso in 3 gefärbt und zwar mit einer 0,5°/oigen gereiften Hämatoxylinlösung. Die Methode hat vor der in § 2104 angegebenen den Vorteil, daß bei ihr Mitochondrien und Cytoplasmaeinlagerungen schwächer gefärbt werden, wodurch die Gallenkapillaren noch klarer hervortreten. Im übrigen hängt das Gelingen der Färbung der Gallenkapillaren mehr vom Funktionszustand der Leber als von der Anwendung einer bestimmten Methode ab: sie gelingt in einer bestimmten Leber entweder mit allen Methoden oder gar nicht.

496

Atmungsorgane

§ 2107—2113.

2107. F i x i e r u n g d e r G a l l e n b l a s e . Das Epithel der Gallenblase verändert sich unter dem Einfluß der aufgespeicherten Galle nach dem Tode ungemein rasch. Will man die Gallenblase in uneröffnetem Zustande fixieren, dann muß die Galle sofort mit Hilfe einer Spritze abgesaugt und durch physiologische Kochsalzlösung und Fixierungsflüssigkeit ersetzt werden. Besser ist es, die Gallenblase aufzuschneiden und mit der Schleimhaut nach oben aufzuspannen. Als Fixierungsflüssigkeit ist die Carnoysche Flüssigkeit sehr zu empfehlen. Für spezielle Zwecke (Mitochondrien usw.) verwendet man die einschlägigen Methoden. 30. KAPITEL

Atmungsorgane 2108. Rachen, Kehlkopf

u n d Trachea k l e i n e r e r ,

nicht zu alter Tiere

werden

nach Bouin, Heidenhain (Susa), Zenker od. dgl. fixiert, wobei man darauf achtet, daß die Flüssigkeit auch in die Luftwege voll eindringt und nicht durch zurückgebliebene Luftblasen abgehalten wird. 2109. Bei älteren Tieren sind die Knorpelteile häufig verkalkt und daher ohne Entkalkung schwer zu schneiden. Bei solchen präpariere man die Schleimhaut nach der Fixierung sorgfältig ab, durchtränke und schneide sie allein. Oder man entkalke sorgfältig in Salpetersäure oder Trichloressigsäure. Für Ubersichtspräparate vom Kehlkopf größerer Tiere ist Einbettung in Celloidin zu empfehlen.

2110. Schnitte der nach § 2108 fixierten Präparate färbe man mit Azan, Hämalaun, Eosin, Mucicarmin usw. Beobachtung des Epithels von der Fläche nach § 1292 gibt Aufschluß über die Verteilung des Flimmer- und Pflasterepithels. Frische Präparate und Isolationspräparate des Epithels der Respirationswege w e r den nach den in § 1267 ff. angeführten Methoden dargestellt. Als Mazerationsflüssigkeit ist Drittelalkohol sehr zu empfehlen. Für die Darstellung der D r ü s e n gilt das in § 2018 ff. Gesagte.

2111. Die F i x i e r u n g der Lunge erfolgt am besten d u r c h I n j e k t i o n auf dem

Gefäßweg, da man n u r an Präparaten mit gut entfaltetem Kapillarnetz eine richtige' Vorstellung über die Lage der die Innenfläche der Alveolen auskleidenden Zellen gewinnen kann ( C l a r a 36). Um ein Kollabieren der Alveolen zu vermeiden, kann es zweckmäßig sein, vorher die Trachea abzubinden oder sie mit einem Korkpfropfen zu verschließen. Als Fixierungsflüssigkeit eignet sich besonders Susa oder Sublimat-Formol-Eisessig. Schnitte f ü r Übersichtspräparate, die den Zusammenhang der einzelnen Abschnitte zeigen sollen, orientiert man am besten senkrecht zur Organoberfläche. 2112. Weniger empfehlenswert ist es, die Lunge von einer in die Luftröhre eingebundenen Kanüle aus mit Fixierungsflüssigkeit zu füllen. Der Eingriff wird in diesem Falle am besten v o r Eröffnung der Brusthühle vorgenommen. Die Fixierungsflüssigkeit muß dabei, um die Luft zu vertreiben, mehrmals mit der Spritze aspiriert werden. Nach genügender Füllung wird das Organ in toto herausgenommen und noch für 24 Stunden in die gleiche Flüssigkeit gehängt. Fixiert man die Lunge in kleinen Stückchen, so müssen diese, da sie auf der Flüssigkeit schwimmen, mit einer Watteschicht bedeckt werden; andernfalls bleibt die Oberfläche der Stückchen unfixiert.

2113. Zur F ä r b u n g der epithelialen Auskleidung der Gänge und der Alveolen eignet sich die Azanfärbung wie die Färbung nach Masson (§ 1496). C l a r a empfiehlt auch die mit Eisenhämatoxylin vorgefärbten Präparate mit

§ 2114—2118.

Atmungsorgane

497

der Malloryschen Originalmethode (§ 1486) nachzufärben. Die D e c k z e l l e n oder „ E p i c y t e n " heben sich dann in rötlichem Farbton von dem intensiv dunkelblau gefärbten Grundhäutchen der Kapillaren sehr scharf ab. Argyrophile Fasern werden durch Silberimprägnation nach § 1525 ff., elastische nach § 1556 oder 1560 dargestellt. 2114. Nach neueren Autoren wie P o l i c a r d , C h i o d i , S e e m a n n , C l a r a u. a. ist in den eigentlich respiratorisch funktionierenden Anteilen der Lunge (Ductuli alveolares und Alveolen) keine geschlossene Epithelauskleidung nachweisbar. Die Deckzellen (Epicyten) bedecken vielmehr die Innenfläche der Alveolen in nicht zusammenhängender Schicht. An den dazwischen gelegenen Stellen grenzt das G r u n d h ä u t c h e n der Kapillaren unmittelbar u n d nackt an den Alveolarraum. Die Deckzellen sind nach C l a r a Abkömmlinge des ursprünglich vorhandenen Epithels. In Erfüllung wichtiger, der Reinigung, Verdauung und Abwehr dienender Aufgaben können sie sich auch von der Unterlage loslösen und zu freien, selbständigen Elementen („A I v e o l a r p h a g o c y t e n") werden. 2115. Die älteren Autoren (wie F. E. S c h u l z e , K o e l l i k e r u. a.) kamen auf Grund von Präparaten, die sie durch Einwirkung von Silbernitratlösungen erhielten, zur Auffassung, daß die Alveolen von einem kontinuierlichen Belag aus kernhaltigen und kernlosen Platten ausgekleidet sind. Nach C l a r a fehlt f ü r die Deutung der bei Anwendung dieser Technik (s. § 2115) a u f t r e t e n d e n Silberlinien als Zellgrenzen und f ü r die daraus abgeleitete Vorstellung von kernlosen Platten jeder Beweis. 2116. J e k e r (33) nimmt die von E b e r t h (62) eingeführte Silbernitratmethode zur Darstellung des Alveolarepithels und der kernlosen P l a t t e n folgendermaßen vor: Bei kleinen Tieren werden die Thoraxorgane in tot herausgenommen und die Lungen von der Trachea aus mit Hilfe einer Glasspritze mit frisch bereiteter 0,5°/oiger AgNOa-Lösung, die auf 37° C e r w ä r m t ist, gefüllt. Um die L u f t aus den Alveolen möglichst vollständig durch die Silbernitratlösung zu verdrängen, ist es notwendig, die eingespritzte Flüssigkeit wiederholt zu aspirieren und wieder vorzutreiben. Bei großen Tieren wird mit einzelnen Lungenlappen so verfahren. Sind die Lungen prall und haben sie an der Oberfläche eine grauweiße F a r b e angenommen, so wird die Trachea abgebunden u n d das P r ä p a r a t f ü r 6 S t u n d e n bei 37° C im Dunkeln in 0,5°/oige Silbernitratlösung gehängt. Dann wird das Material durch frontale Schnitte in kleinere Stücke zerlegt, die weitere 6—12 Stunden in der Flüssigkeit bleiben. Nach kurzem Abspülen in dest. Wasser werden Gefrierschnitte von 60 /( der Sonne oder starkem Licht ausgesetzt, wodurch die Reduktion erfolgt. Dem Wasser kann zur Förderung der Reaktion 0,2% Hydrochinon und 0,5% Formol zugesetzt werden. Wenn die Schnitte b r a u n geworden sind, werden sie mit oder ohne Vergoldung durch die Alkoholreihe in Xylol und Balsam gebracht. Man k a n n das Material vor der Reduktion auch in Paraffin einbetten. 20—30 ;< dicke, mit dest. .Wasser aufgeklebte Schnitte werden vor oder nach Entfernung des P a r a f f i n s in Wasser der Sonne ausgesetzt u n d dann wie bei der Bielschowskymethode (§ 1525, t, 7) vergoldet. Zur nachträglichen K e r n f ä r b u n g empfiehlt J e k e r A z o c a r m i n G (§ 1489, 1). Durch sorgfältige Differenzierung in Anilinalkohol und Phosphorwolframsäure gelingt es eine reine K e r n f ä r b u n g zu erhalten. Mit Orcein lassen sich neben den Silberlinien auch die elastischen Fasern darstellen. 2117. Eine gleichzeitige Darstellung der Gefäße gelingt am besten durch Stauung. Diese läßt sich erreichen, w e n n in tiefer Narkose des Tieres, solange das Herz noch schlägt, der linke Vorhof und etwas später auch die Lungenarterie abgek l e m m t wird. Dann weiter nach § 2116. Die gefüllten Gefäße lassen sich dann später nach § 1417 färben.

211S. D i e D a r s t e l l u n g d e r B l u t g e f ä ß e d e r L u n g e durch Injektion erfolgt nach den in § 1965—1986 angegebenen Methoden. Bei Amphibien sind die mit Blüt gefüllten Blutgefäße auch leicht in vivo zu beobachten. 32

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aull.

498

Niere und Harnwege

§ 2119—2125.

31. KAPITEL

Niere und Harnwege 2119. Die L e b e n d b e o b a c h t u n g der Glomeruli, K a n ä l c h e n u n d Gefäße der Niere gelingt m i t Hilfe der von E l l i n g e r u n d H i r t (30, 31) ausgearbeiteten Technik (vgl. § 151). Die dabei benötigte T r y p a f l a v i n l ö s u n g w i r d k u r z v o r G e b r a u c h in der Weise bereitet, daß m a n 0,1 g T r y p a f l a v i n m i t 3 T r o p f e n konz. Salzsäure in 100 ccm Ringerflüssigkeit löst. W i n t e r f r ö s c h e eignen sich besser als Sommerfrösche. 5—15 Minuten nach Einspritzung in den Schenkellymphsack erscheint der Farbstoff in den Kapseln der arbeitenden Glomeruli, k u r z h e r n a c h in den L u m i n a der 2. Abschnitte, d a n n k o n z e n t r i e r t e r in j e n e n der 4. 2120. Über die L e i c h e n v e r ä n d e r u n g e n in der Nierensubs t a n z der R a t t e h a b e n P o l i c a r d u n d G a r n i e r wertvolle Beobachtungen veröffentlicht. Die M a l p i g h i sehen K ö r p e r c h e n v e r ä n d e r n sich erst n a c h 2—4 S t u n d e n nach d e m Tode, indem die Epithelien des G l o m e r u l u s u n d der A m p u l l e t r ü b werden. Schon nach 20—30 M i n u t e n w e r d e n die H e i d e n h a i n sehen Basalstäbchen grobgranuliert, das Cytoplasma d e r Zellen der gew u n d e n e n K a n ä l c h e n w i r d basophil u n d ihr K e r n acidophil. Der Bürstenbesatz ist, entgegen der B e h a u p t u n g vieler Autoren, n u r wenig empfindlich, er schwindet sehr spät, u n d 4 S t u n d e n n a c h dem Tode ist er deutlicher als zuvor zu sehen. Nach Ablauf der ersten Viertelstunde erscheinen im L u m e n der Kanälchen h y a l i n e Kugeln, zuerst in den g e w u n d e n e n Kanälchen, später distal. H e n l e sche Schleifen v e r ä n d e r n sich weniger rasch usw. Die g e w u n d e n e n K a n ä l e sind d e m n a c h am empfindlichsten. Man k a n n sie nach den g e n a n n t e n A u t o r e n n u r mit O s m i u m s ä u r e d ä m p f e n tadellos fixieren. 2121. Z u r Isolierung der H a r n k a n ä l c h e n legt m a n 1—1,5 m m dicke Scheibchen einer Niere f ü r 1 S t u n d e in r e i n e Salzsäure (spez. Gew. 1,19). Hierauf w ä s c h t m a n in dest. Wasser aus, f ä r b t 1—2 Tage in Hämalaun, ü b e r t r ä g t zus a m m e n h ä n g e n d e Stückchen auf den O b j e k t t r ä g e r u n d schält, am besten u n t e r der b i n o k u l a r e n Lupe, z u s a m m e n h ä n g e n d e Abschnitte vorsichtig heraus. Einschluß in v e r d ü n n t e s Glyzerin oder in Glyzeringelatine. D e r Glyzerinzusatz m u ß sehr vorsichtig erfolgen, damit die isolierten K a n ä l c h e n d u r c h S t r ö m u n g nicht verwickelt oder zerrissen werden. Natürlich ist ü b e r Alkohol u n d T e r pineol auch Einschluß in Balsam möglich. 2122. Ein besonders günstiges Objekt für die Isolierung ist die Niere der Schildkröte wie die der Maus, bei denen häufig die Isolierung sehr langer Abschnitte gelingt. Die menschliche Niere ist für die Herstellung von Isolationspräparaten dagegen recht ungünstig. 2123. Auch Salpetersäure läßt sich zur Isolierung verwenden. Doch ist Salzsäure vorzuziehen, da man bei ihr längere Stücke von Kanälchen erhält. Auch ist die Färbbarkeit besser. Außerdem stören bei ihrer Verwendung die roten Blutkörperchen nicht, da diese in Salzsäure unsichtbar werden. 2124. Zur Isolierung der Harnkanälchen v i t a l g e f ä r b t e r Nieren mazeriert v. M ö l l e n d o r f f (15) halbierte Mäusenieren 2—21 /a Stunden in Salzsäure (spez. Gew. 1,24), wäscht in dest. Wasser aus und zerzupft. Die Färbung mit Trypanblau, durch die besonders die Hauptstücke gut hervorgehoben werden (subkutane Injektion von 1 ccm einer 0,5%>igen Lösung in eine Maus 48 Stunden vor der Tötung), wird dabei nicht angegriffen. 2125. Z u r I s o l i e r u n g d e r E p i t h e l i e n mazeriert m a n kleine Stücke in Drittel-Alkohol oder nach R. H e i d e n h a i n (80) in $%>iger Lösung von

§ 2126—2135.

Niere und Harnwege

499

neutralem chromsaurem Ammonium, in welcher besonders die Stäbchenstrukt u r e n der Zellen bestimmter Abschnitte der Harnkanälchen klar zum Vorschein kommen sollen. 2126. Zur Herstellung von Übersichtsbildern eignen sich alle gebräuchlichen Fixierungsmittel, wie Formol, Formolalkohol, Susa, die Flüssigkeiten nach Helly, Stieve usw. Die Bouinsche Flüssigkeit ist nach C a r l e t o n zur Fixier u n g von Nierengewebe nicht empfehlenswert. 2127. K. W. Z i m m e r m a n n (33) durchspült auf dem Gefäßweg zuerst mit Ringerlösung, der auf 1000 ccm 12 ccm einer l°/oigen Atropinlösung zugesetzt sind und läßt dann zur Fixierung folgende Losung einlaufen: Kaliumbichromat 2,4 g, Eisessig 4,0 ccm, dest. Weisser 77,6 ccm, dazu kurz vor Gebrauch Formol 16,0 ccm. Nach genügend langer Durchrieselung werden die Nieren in Scheiben zerschnitten und noch für mehrere Tage in die Fixierungsflüssigkeit gelegt (beim Wechseln ohne Formolzusatz). Dann Auswaschen in Brunnenwasser usw. 2128. 'Die D e c k z e l l e n ( E p i c y t e n ) d e s Nierenglomerulus werden am besten durch Kombination der Heidenhainschen Eisenhämatoxylin mit nachfolgender Malloryfärbung (diese nach § 1486) dargestellt. Zu beachten ist dabei lediglich, daß die Hämatoxylinfärbüng genügend stark differenziert w i r d ( C l a r a 36). Das Ausläufernetzwerk der Epicyten, das die Kapillarschlingen krallenartig umfaßt, h e b t sich gegen das bläulich gefärbte, Grundhäutchen der Kapillaren in rotem Ton ab. 2129. Die Z e l l g r e n z e n der Zellen der Harnkanälchen lassen sich nach B ö h m und D a v i d o f f (95) sehr gut mittels der Silbermethode von Golgi (§ 1764) oder von Cox (§ 1774) darstellen. Die sog. » S t r i c h e l u n g der E p i t h e 1 i e n« t r i t t am besten und lebensähnlichsten bei Anwendung der Mitochondrienmethoden (s. § 969—998) hervor, w ä h r e n d bei der f r ü h e r üblichen Fixierungsweise in sauren Flüssigkeiten, wie z. B. in Carnoyscher Flüssigkeit, n u r Rudimente der eigentlichen S t r u k t u r erhalten bleiben. 2130. D a s B i n d e g e w e b e der Niere stellt man am besten durch Azanfärbung (§ 1489) dar, die Gitterfasern nach Bielschowsky (§ 1525) oder Rio Hortega (§ 1548). 2131. Nach L a u d a und R e z e k (28) lassen sich mit Hilfe der Silbermethode von d a F a n o (s. § 1022) bestimmte Kanälchenabschnitte der Niere isoliert zur Darstellung bringen, insofern sich bei Anwendung dieser Methode das Cytoplasma der dicken Anteile der Henleschen Schleife, der Zwischenstücke und der Schaltstücke mit Silber imprägniert, während die Hauptstücke und die dünnen Anteile der Henleschen Schleife ungefärbt bleiben. Technik wie in § 1022. Gegenfärbung mit Hämatoxylin-Eosin, Lithioncarmin oder Thionin gelingt, wenn man den entparaflinierten Schnitt vorher mit Goldchlorid und Fixiernatron behandelt. 2132. Über das Verhalten der Nierenzellen gegenüber vital injizierten Farbstoffen vgl. insbesondere die Arbeiten S u z u k i s , v. M ö l l e n d o r f f s und S c h u l e manns. 2133. Instruktive Bilder gibt die Injektion von Berlinerblau in die Harnkanälchen vom Harnleiter aus. K r a u s e (22) empfiehlt dazu besonders die Niere der Taube. Nach der Injektion Fixierung in Formol 1 : 4 + 5% Eisessig. Gefrierschnitte davon deckt man in Laevulose-Syrup ein. 2134. F ü r die Darstellung der H a r n s ä u r e und der U r a t e im Schnittp r ä p a r a t w u r d e n von A. S c h u l t z und W. S c h m i d t (31) folgende Methoden ausgearbeitet: 2135. F ä r b u n g d e r k r i s t a l l i n i s c h e n H a r n s ä u r e u n d d e s H a r n s ä u r e i n f a r k t e s : Fixierung in abs. Alkohol. Übertragen d ü n n e r Scheibchen auf 4—5 Stunden in dreimal gewechseltes Aceton. Paraffineinbettung. — Entparaffinieren, zweimaliges Abspülen in abs. Alkohol und K e r n f ä r b u n g in (gut ausgereiftem) Alaunhämatoxylin (s. u.) Farblösung auf den 32*

500

Niere und Harnwege

§ 2136—2138.

Schnitt gießen und unter ständigem Bewegen —1 Minute färben. — Zweimal eintauchen in abs. Alkohol mit 0,5°/oigem Salzsäurezusatz. — Übertragen in abs. Alkohol, dem auf 50 ccm 5 Tropfen Ammoniak zugesetzt sind, bis Schnitt blau ist. — Dreimal gewechselter abs. Alkohol. Carminfärbung. Aufgießen der Carminlösung (s. u.) auf den in einer Petrischale liegenden Schnitt und 5 Minuten unter leichtem Bewegen färben. — Abspülen in abs. Alkohol. Xylol. Balsam. E r g e b n i s : Kerne blau. Harnsäurekristalle sowie kolloidale Tropfen und Sphärolithe bei Harnsäureinfarkt stark rot gefärbt. Mononatriumurat ungefärbt. Auch Glykogen bleibt bei genauer Einhaltung der Färbedauer ungefärbt.

Herstellung der Hämatoxylinlösung: a) 10 g krist. Hämatoxylin, gelöst in 100 ccm 96°/oigem Alkohol; b) 20 g Ammoniakalaun in 200 ccm dest. Wasser; a) und b) werden vereinigt und auf 1000 ccm mit dest. Wasser aufgefüllt. Die Lösung muß einige Wochen reifen. Vor Gebrauch filtrieren. Herstellung der Carminlösung: Carmin 1 g, Ammoniumchlorid 2 g, Lithiumcarbonat 0,5 g, dest. Wasser 50 ccm. Aufkochen; nach Erkalten Zusatz von 20 ccm Ammoniak (0,960). Zur Färbung setzt man zu 3 ccm dieser begrenzt haltbaren Stammlösung nach Filtrieren 1,5 ccm Ammoniak (0,960) und 2,5 ccm Methylalkohol.

2136. F ä r b u n g d e s H a r n s ä u r e i n f a r k t e s : Fixierung, Einbettung und Kernfärbung wie § 2135. Nach gründlichem Abspülen in abs. Alkohol kommen die Schnitte für 5 Minuten in: Methylalkohol 8 Teile, Ammoniak 2 Teile. Kurz abspülen in abs. Alkohol, Aufgießen einer konz. alkoh. (96%) Methylenblaulösung, die zur Hälfte mit abs. Alkohol verdünnt ist, und unter Bewegen etwa '/a Minute färben. Abspülen mit abs. Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen. — Färben mit in abs. Alkohol gesätt. Pikrinsäurelösung, der auf 30 ccm 10 Tropfen einer konz. Lösung von Säurefuchsin in 96°/oigen Alkohol zugesetzt sind (aufgießen und bewegen!) 15 Sekunden. — Mehrmals mit abs. Alkohol abspülen. Xylol. Balsam. E r g e b n i s : Kerne blauschwarz, Bindegewebe rot, kolloidale Harnsäure und Sphärolithe leuchtend grün. 2137. F ä r b u n g d e s M o n o n a t r i u m u r a t s : Fixierung und Einbett u n g wie in § 2135. Dann Carminfärbung nach § 2135. — Dann abspülen in mehrfach gewechseltem abs. Alkohol. Färbung mit Methylenblau wie in § 2138 Minute. — Abspülen in abs. Alkohol. Färben etwa 15 Sekunden mit folgendem filtrierten Gemisch: konz. wässerige Pikrinsäurelösung 9 ccm, heiß gesätt. wässeriger Natriumsulfatlösung 1 ccm (auf den Objektträger gießen und bewegen). — Abspülen in mehrfach gewechseltem abs. Alkohol. Xylol. Canadabalsam. — E r g e b n i s : Kerne graublau, Mononatriumurat leuchtend grün, kristallinische Harnsäure tief blaugrün. 2138. Für den N a c h w e i s e x p e r i m e n t e l l z u g e f ü h r t e r H a r n s ä u r e sind die angegebenen Methoden nicht geeignet. A. S c h u l t z arbeitete mit W. S c h m i d t d a f ü r folgendes Verfahren aus: Fixierung in gesättigter Lösung von Pikrinsäure in abs. Alkohol. Paraffineinbettung. Nach Entparaffinierung und Abspülen in abs. Alkohol setzt man den noch feuchten Schnitt 3 bis 5 Sekunden lang Ammoniakdämpfen aus (über die geöffnete Flasche halten!). — Abspülen mit abs. Alkohol. — Färben in gut ausgereifter Weigertscher Hämatoxylinlösung (s. § 677) 5—10 Minuten. Wenn hierbei auch keine sichtbare Färbung auftritt, so hat sich diese Vorbehandlung doch als unbedingt notwendig erwiesen. — Abspülen in abs. Alkohol und nochmals wie oben Ammoniakdämpfen aussetzen. — Abspülen in abs. Alkohol und Färben in Methylenblau (konz. Lösung in abs. Alkohol, zur Hälfte verdünnt mit abs. Alkohol). V2 bis 1 Minute. — Abs. Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen. Xylol. Balsam.

§ 2139—2143.

Geschlechtsorgane

501

— E r g e b n i s : Alle H a r n s ä u r e a b s c h ei d ü n g e n l e u c h t e n d g r ü n , die ü b r i g e n Gewebsteile blaßblau. 2139. Z u m N a c h w e i s des N a t r i u m c h l o r i d s legt L e s c h k e (14) d ü n n e S c h n i t t e e i n e r f r i s c h e n t n o m m e n e n N i e r e in eine s a l p e t e r s a u r e S i l b e r n i t r a t l ö s u n g u n d r e d u z i e r t den S i l b e r c h l o r i d n i e d e r s c h l a g m i t H y d r o c h i n o n . H a r n s t o f f f ä l l t m a n m i t e i n e r s a l p e t e r s a u r e n L ö s u n g von Q u e c k s i l b e r o x y d n i t r a t , b e t t e t in P a r a f f i n ein u n d f ü h r t den N i e d e r s c h l a g d u r c h S c h w e f e l w a s s e r s t o f f w a s s e r in Q ü e c k s i l b e r s u l f i d ( b r a u n s c h w a r z ) ü b e r . Die H a r n s ä u r e u n d die P u r i n k ö r p e r w e r d e n d u r c h a m m o n i a k a l i s c h e S i l b e r n i t r a t l ö s u n g gefällt u n d n a c h A u s w a s c h e n d e r S i l b e r l ö s u n g m i t dest. W a s s e r d u r c h H y d r o c h i n o n r e d u z i e r t . D i e C h l o r i d e u n d P h o s p h a t e b l e i b e n in L ö s u n g . Z u r D a r s t e l l u n g der P h o s p h a t e legt L e s c h k e d ü n n e O r g a n s c h e i b e n in v e r d ü n n t e U r a n n i t r a t l ö s u n g u n d f ü h r t d e n w e i ß g e l b e n N i e d e r s c h l a g von U r a n p h o s p h a t d u r c h B e h a n d l u n g d e r P a r a f f i n s c h n i t t e m i t e i n e r s a l z s a u r e n L ö s u n g von F e r r o c y a n n a t r i u m in r o t b r a u n e s U r a n i f e r r o c y a n n a t r i u m ü b e r . Die m i t diesen R e a k t i o n e n g e w o n n e n e n E r g e b n i s s e s i n d m i t g r o ß e r K r i t i k zu b e u r t e i l e n . 2140. Viel e m p f i n d l i c h e r als d e r v o r a u s g e h e n d a n g e g e b e n e H a r n s t o f f n a c h w e i s v o n L e s c h k e , m i t d e m sich z. B. physiologische M e n g e n n i c h t m e h r n a c h w e i s e n lassen, ist die v o n F o s s e e i n g e f ü h r t e Xanthydrolreaktion, die m a n m e i s t in der v o n S t ü b e 1 a n g e g e b e n e n Weise a u s f ü h r t (s. § 1252). H o 1 m a n n injiziert die Xanthydrollösung, um rasches Durchdringen des Organes mit dem Reagens zu erreichen, durch die Nierenarterie, bindet Gefäße und Ureter dann ab und legt das Organ in die Lösung. Bei Vereinigung einer Xanthydrollösung mit Wasser scheiden sich Xanthydrolkristalle ab. Dies geschieht bir zu einem gewissen Grade auch im Gewebe. Einer Verwechslung mit Dixanthyl-Harnstofi wird jedoch dadurch vorgebeugt, daß die Xanthydrolkristalle infolge ihrer Löslichkeit in Alkohol beim Entwässern usw. der Präparate verschwinden (O e s t r e i c h e r 26). 2141. Die F i x a t i o n u n d F ä r b u n g des Ureters u n d d e r Harnblase e r f o l g t m i t d e n a l l g e m e i n ü b l i c h e n M e t h o d e n . Die H a r n b l a s e b e t t e t m a n w e g e n d e r s c h w e r s c h n e i d b a r e n M u s k u l a t u r a m b e s t e n in Celloidin ein. U m die V e r ä n d e r u n g e n zu s t u d i e r e n , die das A u s s e h e n des Ü b e r g a n g s e p i t h e l s bei D e h n u n g d e r O r g a n e erleidet, i n j i z i e r t m a n U r e t e r bzw. H a r n b l a s e m i t d e r F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t bis zu p r a l l e r S p a n n u n g u n d b i n d e t d a n n ab. Das E p i t h e l p l a t t e t sich d a b e i s e h r s t a r k a b ( L o n d o n 81). 32. KAPITEL

Geschlechtsorgane 2142. F ü r das S t u d i u m d e r K e i m d r ü s e n h a t m a n s o w o h l das A l t e r w i e d e n j e w e i l i g e n F u n k t i o n s z u s t a n d g e n a u zu b e r ü c k s i c h t i g e n . S e h r w i c h t i g ist es f e r n e r f ü r f e i n e r e U n t e r s u c h u n g e n , n u r M a t e r i a l von g e s u n d e n u n d w o m ö g l i c h f r i s c h g e f a n g e n e n T i e r e n zu v e r w e n d e n , da g e r a d e die Geschlechtszellen d u r c h u n g ü n s t i g e u n d a n o m a l e ä u ß e r e B e d i n g u n g e n a ü ß e r o r d e n t l i c h leicht b e e i n f l u ß t werden. A. Weibliche Geschlechtsorgane 2143. G ü n s t i g e O b j e k t e f ü r die U n t e r s u c h u n g a m Irisdien Präparat l i e f e r n z a h l r e i c h e Wirbellose, w i e b e s o n d e r s S e e i g e l (Echinus m i c r o t u b u l a t u s ) u n d S e e s t e r n e (Asterias glacialis oder A. r u b e n s , e r s t e r e r i m M i t t e l m e e r , l e t z t e r e r in d e r Nordsee). F ü r die U n t e r s u c h u n g l ä ß t m a n sich, da sich m e i s t n i c h t

502

Geschlechtsorgane

§ 2144—2148.

alle Tiere im geeigneten Zustande befinden, eine größere Anzahl von der nächstliegenden zoologischen Meeresstation schicken.

Näheres über die Art der Präparation bei P. B u c h n e r (15), H a e c k e r und B e l a r (28), wo man auch zahlreiche andere Angaben über die Untersuchung von Geschlechtszellen der Wirbellosen findet. 2144. A u c h die unreifen Eier niederer Wirbeltiere, w i e von F i s c h e n , A m p h i b i e n ,

Reptilien und Vögeln kann man zur Herstellung frischer Präparate benutzen. Man schneide sich dazu die unreifen, hell ausschauenden (gewöhnlich dorsal liegenden) Teile des Eierstockes mit einer Schere heraus, breite sie in einer indifferenten Flüssigkeit auf einem Objektträger aus und untersuche mit schwacher Vergrößerung. Für die Beobachtung mit stärkerer Vergrößerung muß man die kleineren Eier isolieren und durch ein mit Schutzleisten oder Wachsfüßchen versehenes Deckglas vor Druck schützen. 2145. Um die viel kleineren Eier der Säugetiere i m u n r e i f e n . Z u s t a n d zu isolieren, führt man mit einem scharfen Rasiermesser einen Schnitt durch ein frisch entnommenes Ovar eines nicht zu alten Tieres (z. B. einer Ziege oder einer Sau). Hierauf benetzt man die Schnittfläche etwas mit einer indifferenten Flüssigkeit (vgl. § 116 ff.) und schabt sie sorgfältig mit einem Skalpell oder mit der Rasiermesserklinge selbst ab. Durch den sanften Druck lösen sich aus vielen Follikeln die Eizellen heraus in die Flüssigkeit, die man tropfenweise auf den Objektträger bringt und zunächst bei mittlerer Vergrößerung untersucht. Bei Untersuchung mit starker Vergrößerung verfährt man wie in § 2144. 2146. Die isolierten Eizellen kann man vorsichtig in Flemmingscher Flüssigkeit, Sublimat-Eisessig od. dgl. fixieren. Überführt man sie hierauf in bekannter Weise in Glycerin oder Canadabalsam, so muß man bei Übertragen in die verschiedenen Flüssigkeiten, zur Vermeidung von Schrumpfungen, mit ganz schwachen Konzentrationen beginnen. Um reife Eier von Säugetieren zu bekommen, untersucht man die Ovarien ausgewachsener Tiere unmittelbar vor oder während der Brunstzeit. Man sucht sich dazu am unverletzten Ovar die oberflächlich gelegenen, durchscheinenden, bläschenförmigen, reifen Follikel aus, sticht diese mit einer spitzen Nadel an und fängt die herausspritzende Follikelflüssigkeit in einem Uhrschälchen auf. Durch die starke Druckentlastung wird dabei gewöhnlich das Ei mit der Corona radiata losgelöst und herausgeschleudert. (O. S c h u l t z e 97). Man untersucht die Flüssigkeit mit der Lupe, überträgt das Ei mit einer Pipette auf einen Objektträger usw. wie in § 139 f.

Wendet man dabei keine Wachsfüßchen an, so drückt das Deckgläschen auf die immerhin ziemlich voluminösen Gebilde: die Zona pellucida zeigt dann alsbald einen in der Sehebene liegenden, strichförmigen Riß (künstliche Mikropyle), der durch den Druck bedingt ist.

2147. Die r e i f e n E i e r u n s e r e r e i n h e i m i s c h e n F i s c h e , A m p h i b i e n u n d R e p t i l i e n sind wegen ihrer Größe und ihres Dottergehaltes zu undurchsichtig, als daß sie eine Untersuchung bei durchfallendem Licht gestatten würden. Hier läßt sich nur durch Anfertigung von Schnittpräparaten nähere Einsicht gewinnen. Bei auffallendem Licht sind jedoch unter der Lupe oder dem binokularen Mikroskop einzelne Details, wie Polkörperchen, Eihülle u. dgl. ganz gut zu erkennen. Untersuchung des fixierten Präparates 2148.

Z u r G e w i n n u n g von Ubersichtsbildern w i e Darstellung der Keimzellen

(Chromatin) fixiere man nach Helly (§ 337), Bouin (§ 305), Carnoy (§ 226), Heidenhain (§ 344) oder Stieve (§ 333). Bei kleinen Ovarien (z. B. Maus, Ratte,

§ 2149—2155.

Weibliche Geschlechtsorgane

503

Fledermaus) wird m a n auch mit Flemmingscher Flüssigkeit (§ 290) gute Erfolge haben. Ganz besonders empfehlenswert ist i h r e A n w e n d u n g bei Material von Wirbellosen. Bei größeren Objekten dagegen, z. B. bei Eierstöcken von Hunden, Ziegen u. dgl. gibt Flemmingsche Flüssigkeit wegen ihrer geringen Tief e n w i r k u n g n u r dann gute Resultate, wenn man, was nicht i m m e r möglich ist, durch Injektion oder in d ü n n e n Scheiben fixiert. S t i e v e (20, 21)' empfiehlt für Amphibien (Grottenolm) besonders Sublimat-Eisessig und Carnoy; mit Flemmingscher Flüssigkeit erhielt er bei diesem Objekt nur schlechte Resultate. F ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin (§ 672), Safranin-Lichtgrün (§ 952), SafraninGentianaviolett-Orange (§ 961) mit fuchsinschwefliger Säure (§ 1234) od. dgl., f ü r Bindegewebe: mit Azan (§ 1489) usw. 2149. L e v i (13) empfiehlt feine etwas modifizierte Maximowsche Flüssigkeit (zu 10 ccm der 2,5°/o Kaliumbichroxnat und 5°/o Sublimat enthaltenden wässerigen Lösung setze man unmittelbar vor Gebrauch 2 ccm Formol und 2 ccm einer 2°/oigen Osmiumsäurelösung. Fixierungsdauer 2—3 Tage, hierauf 1 Stunde in fließendes Wasser usw.). 2150. Zur O r i e n t i e r u n g benützt m a n am zweckmäßigsten Ovarien kleiner Tiere, wie Mäuse, Ratten, Fledermäuse, Meerschweinchen usw., da sich dieselben leichter fixieren lassen u n d ohne Schwierigkeiten zu bekommen sind. Von größeren Tieren eignen sich besonders Katzen, Kaninchen, Schweine, Ziegen u. dgl. 2151. Das Keimepithel, das auf dem Schnitt gut sichtbar ist, kann auch von der Fläche durch Versilberung dargestellt werden (siehe § 1280f.): Hierauf wird mit Alkohol nachbehandelt und tangential zur Oberfläche geschnitten. Ganz kleine Ovarien junger Mäuse, Fledermäuse usw. lassen sich nach der Versilberung im ganzen einschließen und die Silberlinien des Keimepithels bei passender Einstellung beobachten. 2152. Dotterkeme findet m a n u n t e r Säugetieren besonders bei Ziegen und Katzen gut ausgebildet'. Nach Fixierung in Zenkerscher Flüssigkeit od. dgl. t r e t e n sie bei A z a n f ä r b u n g leuchtend rot hervor. Von Wirbellosen eignen sich nach H a e c k e r besonders Spinnen (Tegenaria) f ü r Dotterkernstudien. Man fixiere die Ovarien dazu womöglich i m F r ü h j a h r . 2153. Zur Darstellung der M i t o c h o n d r i e n , der G o l g i s u b s t a n z , des G l y k o g e n s und der F e t t s u b s t a n z e n in Ei-, Follikel-, Lutein- und interstitiellen Zellen des Eierstockes wähle m a n die in den einschlägigen Kapiteln a n g e f ü h r t e n Methoden. Die tyntersuchung der Fettsubstanzen bietet im Eierstock insofern keine großen Schwierigkeiten, als sich bei ihm infolge seiner dichten Bauart sehr leicht Gefrierschnitte herstellen lassen. 2154. Die Trennung zwischen Granulosa und Theca-interna-Elementen soll sich nach K r o n f e l d - G u i l e r a (21) nach der Technik von Rio Hortega leicht erzielen lassen (vgl. § 1547). Im Cytoplasma der Granulosazellen werden dabei reichliche, imprägnierte Zellgranula sichtbar, die den Thecazellen fehlen. Behandelt man imprägnierte Schnitte vom Ovar eines 25 ccm langen menschlichen Embryos mit NH3, so verschwindet die Imprägnierung des zelligen Bindegewebes (auch in Thecazellen), während sie in Ei- und Follikelzellen erhalten bleibt. Über Mengenbestimmung s. H a m m a r und H e l l m a n n (20). 2155. S a l a z a r (23a) h a t zur Darstellung „ t a n n o p h i l e r Substanz e n " des Eierstockes eine T a n n i n e i s e n m e t h o d e angegeben, die folgendermaßen ausgeführt wird: 1. Fixierung in Bouinscher Flüssigkeit. Einbettung in Paraffin. — 2. Entparaffinieren der aufgeklebten Schnitte, Alkoholreihe, Auswaschen in Wasser, bis die Pikrinsäure e n t f e r n t und die Schnitte weiß sind. — 3. Einstellen in essigsaure Tanninlösung (Herstellung: Man l ö s t ' i n einer

504

Geschlechtsorgane

§ 2156—2162.

Mischung von 2 Teilen dest. Wasser und 1 Teil Eisessig so viel Tannin, bis die Lösung eine bernsteinbraune Farbe zeigt. Um Verpilzung zu vermeiden, fügt man etwas Thymol zu.) Die Dauer der Einwirkung ist von Fall zu Fall verschieden. Oft genügen 1—2 Minuten. — 4. Abspülen in dest. Wasser. — 5. Einstellen in eine 3—4°/oige Eisenalaunlösung. Das Fortschreiten der Färbung wird unter dem Mikroskop verfolgt. Sobald die tannophilen Substanzen genügend gefärbt sind 6. auswaschen in Wasser, entwässern, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : Die tannophilen Substanzen, z. B. körnige Einlagerungen in interstitiellen Zellen, Bindegewebsfasern u. dgl. sind schwarz gefärbt. Die Kerne bleiben ungefärbt; sie können durch Vorfärbung mit AnilinwasserSafranin zur Darstellung gebracht werden (S a 1 a z a r 24b). Die Methode gelingt nicht immer. Auch kommt es vor, daß Teile des Präparates, besonders die zentral gelegenen, eine diffuse, graue Färbung annehmen. — In einer älteren, nunmehr verlassenen Methode.beizte S. mit einer wässerigen Tanninlösung.

2156. Tuben werden wie Darm behandelt. Wenn es auf genaue Querschnitte ankommt, so muß die Tube vor dem Fixieren gestreckt werden, indem man zuvor die peritoneale Duplikatur möglichst nahe der Anheftungsstelle der Tube mit einer krummen Schere durchtrennt. 2157. Der schlauchförmige Uterus kleiner Tiere, z. B. von Mäusen, Ratten, Meerschweinchen usw. kann in Bouinscher, Stievescher Flüssigkeit od. dgl. ohne Schwierigkeit im ganzen fixiert werden. Bei größeren Tieren legt man entweder Teilstücke ein oder füllt das Uteruslumen mit Fixierungsflüssigkeit. Vgl. ferner § 2159. 2158. M o l l (10) fixiert Uteri in Alkohol abs. 100 ccm, Formol 25 ccm, Eisessig 6 Tropfen. 2159. Zur F i x i e r u n g d e s m e n s c h l i c h e n U t e r u s empfiehlt S t i e v e (26, 27a) neben dem Zenkerschem Gemisch in der Modifikation von S p u 1 e r (Müllersche Flüssigkeit 700 ccm + konz. Sublimatlösung 300 ccm + Eisessig 10—30 ccm. besonders Sublimat-Formol-Eisessig (s. § 333) oder Formol 18 ccm + 96°/oiger Alkohol 80 ccm + Eisessig 2 ccm. Die Fixierung soll nach Möglichkeit ganz frisch nach der Entnahme erfolgen. Die Gebärmutter wird zunächst im ganzen in die Fixierungsflüssigkeit gelegt. Nach 3 Stunden wird die nicht schwangere Gebärmutter in Stücke zerschnitten. Man teilt sie zunächst durch einen Querschnitt senkrecht zur Längsachse etwas oberhalb des inneren Muttermundes. Der Cervicalteil kommt dann im ganzen in die Fixierungsflüssigkeit zurück, der Körper wird durch weitere Querschnitte in 1 cm dicke Scheiben zerlegt, die noch 12—16 Stunden in der Fixierungsflüssigkeit bleiben. Schwangere Gebärmütter bringt S t i e v e sofort in Hellysche Flüssigkeit. Das Fruchtwasser wird mittels Rekordspritze (schiefer Einstich!) abgesaugt und durch ebensoviel Formol (1 : 4) ersetzt. Nach 8—12 Stunden wird ein kleines Fenster von etwa 2 cm Länge eingeschnitten; nach Ablaufen der Flüssigkeit kommt das Organ für weitere 8—12 Stunden in reichliche Hellysche Flüssigkeit zurück. — Einbettung in Paraffin nach der Methylbenzoatmethode von P e t e r f i oder in Celloidin. 2160. Zur F ä r b u n g d e s B i n d e g e w e b e s verwendet man vor allem die Azanfärbung, bei der auch die glatte Muskulatur gut hervortritt, ferner Pikrinsäure-Thiazinrot (§ 710) oder Eisenhämatoxylin-Chromotrop 2 R. (§ 672, 665). 2162. Über die H e r s t e l l u n g v o n S c h e i d e n a u s s t r i c h'e n zur Feststellung des Brunstzyklus siehe § 2448 ff.

§ 2163—2168.

Männliche Geschlechtsorgane

505

B. Männliche Geschlechtsorgane 2163. Um Spermien von niederen Wirbeltieren in l e b e n d e m Z u s t a n d zu beobachten, zerschneidet man den Hoden eines geschlechtsreifen Tieres kurz vor oder zu Beginn der Brunstzeit in einem mit etwas physiologischer Kochsalzlösung gefüllten Schälchen in kleine Stückchen. Einen Tropfen der trüb aussehenden Flüssigkeit untersucht man dann unter dem Deckglas bei schwacher Vergrößerung. Man blendet dabei am besten ziemlich stark ab. Auch bei Dunkelfeldbeleuchtung lassen sich derartige Präparate mit Vorteil untersuchen. 2164. S p e r m i e n v o n S a l a m a n d e r n , F r ö s c h e n u n d K r ö t e n lassen alle bis jetzt beschriebenen Bestandteile {Spitzenstück, Kopf, Mittelstück, Schwanz, ev. undulierende Membran, Randfaden usw.) gut erkennen. Setzt man dem Präparat dest. Wasser zu, so hört die Bewegung bald auf. Schwache alkalische Lösungen wirken dagegen ähnlich wie auf die Flimmerbewegung anreizend. 2165. B e i h ö h e r e n W i r b e l t i e r e n durchschneidet man, um reife Spermien zu gewinnen, am besten den Nebenhoden und vermischt die aus den angeschnittenen Kanälchen hervordringende, milchige Flüssigkeit mit etwas physiologischer Kochsalzlösung od. dgl. Untersucht man den Gewebssaft einer Hodenschnittfläche, so findet man neben reifen Spermien auch zahlreiche unreife Formen. Die Spermien schwimmen immer gegen den Strom; wenn man Sperma unter das Deckglas bringt und durch ein Stückchen Fließpapier, das man an eine Kante des Deckglases auflegt, eine Strömung erzeugt, so läßt sich das Phänomen (Rheotaxis) leicht beobachten.

2166. Als B e l e b u n g s f l ü s s i g k e i t f ü r menschliche Spermien empfehlen P o l l a k und J o e l (39) ein Gemisch von 8 Teilen einer 5,42°/oigen Dextroselösung und 2 Teilen einer n/8-Magnesiumchlorid- (-sulfat- oder -hydroxyd-) Lösung. Zur S u p r a v i t a l f ä r b u n g verwendet P o l l a k eine l°/oige wässerige Lösung von Brillantkr.esylblau, die die Motilität der Spermien n u r wenig beeinträchtigt. 2167. Sehr schöne Ausstrichpräparate lassen sich mit Hilfe einer von Z e i g e r (28) abgegebenen Methode gewinnen, die, ähnlich wie das B u r r i s c h e Tuscheverfahren bei Spirochaeten, helle Negativbilder auf dunkelblauem Untergrund gibt und Einzelheiten in der Form sehr gut erkennen läßt. Man bringt dazu mit einer feinen Glaskapillare ein möglichst kleines Tröpfchen Spermaflüssigkeit, die man am besten dem Nebenhoden entnimmt, auf einen sauber geputzten Objektträger, setzt daneben mit einem Glasstab einen etwas größeren Tropfen unverdünnter Opalblaulösung (s. u.), vermischt beide Tropfen innig miteinander und streicht rasch und gleichmäßig mit der Kante eines geschliffenen Objektträgers wie bei einem Blutpräparat aus. Nach Lufttrockenwerden deckt man das Präparat mit Canadabalsam ein. Die Opalblaulösung ist, nach der Vorschrift von B r e ß 1 a u bereitet, bei Dr. H o l l b o r n , L e i p z i g , erhältlich. Vor Gebrauch kocht man einige ccm davon -zur Lösung allenfalls ausgeflockter Teilchen im Reagenzglas kurz auf. B r e ß 1 a u (21) benutzt die Lösung in ähnlicher Weise zur Darstellung von Infusorien. Für das Gelingen der Methode ist von Wichtigkeit, daß die Dicke des Ausstriches den Größenverhältnissen der betreifenden Spermien angepaßt ist. Ferner ist wichtig, daß der Austrocknungsprozeß weder Zu rasch noch zu langsam verläuft. Beide Faktoren sind je nach dem Objekt verschieden, sind aber leicht auszuprobieren.

2168. Die f i b r i l l ä r e S t r u k t u r d e s R a n d - u n d A c h s e n f a d e n s läßt sich häufig durch M a z e r a t i o n deutlich machen. Man versetzt dazu et-

506

Geschlechtsorgane

§ 2169—2173.

w a s Spermaflüssigkeit mit 0,6—3°/oiger wässeriger Kochsalzlösung, b r i n g t einen T r o p f e n davon auf einen Objektträger u n t e r ein Deckglas und u m r a n d e t sogleich mit Wachs, sodaß kein Verdunsten eintreten kann. Nach 1—2 Tagen läßt sich dann der fibrilläre Zerfall mit starke.r Vergrößerung beobachten. Auch durch F ä u l n i s k a n n dieses Resultat oft erzielt werden. 2169. Um die i s o l i e r t e n A c h s e n f ä d e n z u f ä r b e n , entfernt man nach der Mazeration den Wachsrand, bringt an eine Kante des Deckglases eine 0,5°/oige wässerige Gentianaviolettlösung und leitet die Farblösung so lange vorsichtig unter dem Deckglas durch, bis eine hinreichende Färbung erzielt ist. Hierauf saugt man von beiden gegenüberliegenden Kanten her den Überschuß an Flüssigkeit ab, drückt das Deckglas etwas an, umrandet und untersucht. Ausführliche Angaben über die Mazeration von Spermien findet man in den Untersuchungen von B a l l o w i t z über die Spermien verschiedener Tierarten. 2170. Zur F i x i e r u n g d e r S p e r m i e n eignet sich vor allem O s m i u m s ä u r e . Man bringt 2—3 ccm einer l°/oigen Lösung auf den Boden einer gut schließenden Schale und läßt 5—10 Minuten die D ä m p f e auf die in hängenden Tropfen befindlichen Spermien einwirken. Hierauf verfertigt m a n in der in § 1317—1322 geschilderten Weise Ausstrichpräparate, die man lufttrocknen läßt. Nicht so gut ist es, der spermienhaltigen Flüssigkeit einige Tropfen der Osmiumsäurelösung zuzusetzen. Die mit obiger Methode hergestellten, l u f t trockenen Ausstriche können dann mit Safranin, Gentianaviolett, Eisenhämatoxylin u. dgl. gefärbt werden. Zweckmäßig zieht m a n sie vorher einige Male d u r c h eine Flamme, auch die Bleichung nach § 1013 ist oft empfehlenswert. Zum Unterschied von Blutausstrichen verfertigt man also hier die Ausstriche nicht von unfixiertem, sondern von fixiertem Material. B e i A u s s t r i c h e n von u n f i x i e r t e m werden die f e i n e r e n Strukturen leicht zerstört. 2171. Gute Erfolge gibt auch die Fixierung nach § 932 mit nachfolgender F ä r b u n g nach § 934—937 oder 939. 2172. Um von einem E j a k u l a t S c h n i t t p r ä p a r a t e zu gewinnen, zentrifugiert J o e l (39), die Samenflüssigkeit 20 Min. lang, gießt die überstehende Flüssigkeit ab und übergießt das Sediment mit Formol 1 :9. Nach 24 Stunden wird der Vorgang wiederholt. Nach weiteren 24 Stunden wird das Formol durch 50°/oigen Alkohol ersetzt. Dann wird alle 24 Stunden die Konzentration um je 5°,'o bis zum absoluten Alkohol gesteigert. Das gelatinös erstarrte Material bringt J o e l schließlich für je 10 Min. durch eine Alkohol-Xylolreihe (9:1, 8 : 2 , 7 : 3 usw.) in reines Xylol, aus dem es in Xylol-Paraffin (30 Min.), weiches und hartes Paraffin (je 3 Stunden) kommt. Dann einbetten. 2173. F ü r Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e v o n H o d e n fixiert m a n zweckmäßig die Hoden kleiner Tiere (z. B. Maus, Ratte) in Susa (§ 344), nach Bouin oder Stieve (§ 333). Nach Fixierung in »S u s a« hängt man den Hoden in toto f ü r einige Tage in 96°/oigen Alkohol, den man mehrmals erneuert. Dann abs. Alkohol, Methylbenzoat-Celloidin nach Peterfi, Benzol, Paraffin. Auf diese Weise lassen sich die sehr leicht entstehenden Schrumpfungsspalten zwischen Hodenkanälchen und i n t e r t u b u l ä r e m Zwischengewebe, die weniger bei der Fixierung, als vielmehr bei der Nachbehandlung auftreten, fast völlig vermeiden. Sehr gute Resultate erhielt ich auch bei Einbettung ü b e r Dioxan (s. § 353). Das naturgetreueste Bild der Verteilung des • Zwischengewebes erhält man durch Schneiden des unfixierten Hodens auf dem Gefriermikrotom bei Messert i e f k ü h l u n g (s. § 520). Formolfixierte Hoden bringt man nicht unmittelbar in 90°/oigen Alkohol, da in diesem Falle die Samenkanälchen stark zusammenschrumpfen; m a n ü b e r t r ä g t sie vielmehr entweder f ü r 1—3 Tage in 3°/oige Kaliumbichromatlösung

§ 2174—2175.

Männliche Geschlechtsorgane

507

u n d w ä s c h t dann mit Wasser aus oder in 50°/oigen Alkohol, der 2—3mal ern e u e r t wird. U m die Hoden großer Tiere gleichmäßig zu fixieren, ist es am besten, die F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t V o n der art. spermat. int. aus einzuspritzen. Ist das nicht möglich, so h ä n g t m a n d e n H o d e n zunächst f ü r Vs—1 S t u n d e i n toto in die F l ü s sigkeit u n d schneidet ihn dann in Scheiben. F ü r f e i n e cytologische Unters u c h u n g e n ist es natürlich nötig, kleine Teilstücke zu fixieren. 2174. S t i e v e (23) fixiert Mäusehoden nach § 333. Die Flüssigkeit wird vor dem Gebrauch auf K ö r p e r w ä r m e gebracht; die Hoden verbleiben in ihr 3 Stunden bei 37° C. Dann 24 Stunden in 70°/oigem Alkohol mit Jodzusatz u n d nun langsam über von 5°/o zu 5°/o steigenden Alkohol in abs. Alkohol, dann ü b e r Chloroform und Chloroform-Paraffin im Paraffin. (Schmp. 52°). Alles bis zum Paraffin dauernd bei 37° C. 2175. E. A l l e n (19) v e r f ä h r t in folgender, auch für andere empfindliche Objekte g e e i g n e t e n Weise: 1. F i x i e r u n g mit der i n § 310 angegebenen Flüssigkeit, der statt 5 ccm 10 c c m Eisessig zugesetzt werden. Zur A u s f ü h r u n g der Fixierung wird das Tier (Ratte) zuerst mit Ringer- oder Locke-Lösung von der Brustaorta aus durchspült u n d d a n n mit der auf 38° C erw ä r m t e n Fixierungsflüssigkeit injiziert, bis die Hoden h a r t geworden sind. Dann w e r d e n die Hoden noch f ü r 30 Minuten in frische, w a r m e Fixierungsflüssigkeit gehängt und schließlich mit einer Giletteklinge in ca. 4 m m dicke Scheiben zerschnitten. 2. Sehr wichtig f ü r das Endergebnis ist das n u n f o l g e n d e A u s w a s c h e n und Entwässern, das durch t r o p f e n w e i s e Konzentrationssteigerung unter gleichzeitiger B e w e g u n g der Flüssigkeit durch D u r c h l e i t e n eines L u f t s t r o m e s erfolgt. Die P r ä p a r a t e werden zunächst f ü r 45 Minuten direkt aus der Fixierungsflüssigkeit in 5°/oigen Alkohol übertragen. Dann Eintropfen von 10°/oigem Alkohol, dem zur E n t f e r n u n g der Pikrinsäure etwa 1% einer gesättigten Lithiumcarbonatlösung zugesetzt ist. Wenn eine Alkoholkonzentration von 10°/o erreicht ist, läßt m a n die Mischung etwas langsamer weitertropfen (1 Tropfen in 10 Sekunden). Nach 2 Stunden überträgt man in frischen 10°/oigen Alkohol u n d t r o p f t 50%igen Alkohol zu (mit Lithiumcarbonatzusatz), etwa 1 Tropfen pro Sekunde, bis eine Konzentration von 30°/o erreicht ist, worin m a n die Stücke f ü r 1 Stunde läßt. Hierauf t r o p f t m a n zum 30°/oigen Alkohol in Abständen von 5 Sekunden kleine Tropfen einer Mischung von 50°/oigem Alkohol u n d reinem, hellem Anilinöl zu gleichen Teilen. (Tritt Niederschlag auf, so enthält das P r ä p a r a t noch zu viel Pikrinsäure u n d muß nochmals in 30°/oigen Alkohol zurück.) Wenn die Konzentration der zugetropften Mischung erreicht ist, t r o p f t m a n eine Mischung von 70°/oigem Alkohol u n d Anilinöl zu gleichen Teilen zu; schließlich t r o p f t man reines Anilinöl (1 Tropfen in 10 Sekunden) zu, bis der Alkohol völlig v e r d r ä n g t ist (12—14 Stunden). — Bei dieser D u r c h f ü h r u n g werden die einzelnen Flüssigkeiten, w e n n die Endkonzentration einer Stufe erreicht ist, zweckmäßig immer durch reine Flüssigkeiten der gleichen Konzentration ersetzt. 4. N a c h völliger D u r c h t r ä n k u n g mit Anilinöl s i n d die Präparate bernsteingelb u n d völlig durchscheinend. N u n m u ß das Anilinöl durch ein geeignetes Intermedium, w i e Bergamottöl oder Zedernholzöl, verdrängt werden, w a s ebenfalls w i e d e r durch langsames Eintropfen erfolgt. Schließlich w e r d e n die in r e i n e m Bergamottöl l i e g e n d e n Präparate s t u f e n w e i s e mit Paraffin durchtränkt. Man b e g i n n t m i t einer Mischung v o n 10 T e i l e n Paraffin (Schmp. 52—55°) und 90 T e i l e n B e r g a m o t t ö l und steigert dann den Paraffingehalt v o n 10 zu 10%, w o bei j e w e i l s nur so viel e r w ä r m t wird, als z u m F l ü s s i g h a l t e n des' Gemisches nötig ist. (Dauer der D u r c h f ü h r u n g durch die ganze Reihe m i n d e s t e n s 2 Stun-

508

Geschlechtsorgane

§ 2176—2182.

den.) Zuletzt w e r d e n die O b j e k t e noch f ü r 2—3 S t u n d e n in 4—5mal g e w e c h seltes, reines P a r a f f i n g e b r a c h t u n d e i n g e b e t t e t . Der gleiche Erfolg läßt sich auch mit Hilfe des von K r a 11 i n g er (28) angegebenen, vereinfachten Apparates erzielen. 2176. K o m m t es, w i e h ä u f i g bei d e r U n t e r s u c h u n g d e r L e y d i g s c h e n Z e l l e n ( Z w i s c h e n z e l l e n ) auf die E r h a l t u n g der F e t t s u b s t a n z e n an, so fixiert m a n in F o r m o l oder K a l i u m b i c h r o m a t - F o r m o l (§ 243), w ä s c h t in W a s s e r g r ü n d lich aus u n d b e t t e t in G e l a t i n e ein. S c h n e i d e n auf d e m G e f r i e r m i k r o t o m . B e i V e r w e n d u n g des M e s s e r t i e f k ü h l e r s (s. § 520) lassen sich die H o d e n auch in u n fixiertem Z u s t a n d auf d e m G e f r i e r m i k r o t o m schneiden. Die F ä r b u n g e r f o l g t n a c h den e i n s c h l ä g i g e n M e t h o d e n des K a p i t e l s 16, E. 2177. F ü r s p e r m i o g e n e t i s c h e U n t e r s u c h u n g e n fixiere m a n k l e i n e S t ü c k c h e n in Sublimat-Eisessig, n a c h Carnoy, Z e n k e r oder A l l e n (§ 310 u. § 2175). A u c h die I f l e m m i n g s c h e o d e r die H e r m a n n s c h e F l ü s s i g k e i t (§ 293) gibt g u t e R e s u l t a t e , n a m e n t l i c h b e i M a t e r i a l v o n W i r b e l l o s e n (z. B. I n s e k t e n ) . Bei S a l a m a n d e r h o d e n n i m m t m a n bei l e t z t e r e r n u r die H ä l f t e d e r in § 293 a n g e g e b e n e n O s m i u m t e t r o x y d m e n g e . M a n lasse die F l ü s s i g k e i t auf möglichst k l e i n e S t ü c k e 24 S t u n d e n o d e r b e s s e r l ä n g e r e i n w i r k e n , w a s c h e 24 S t u n d e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r u n d b r i n g e d u r c h Alkohol i n P a r a f f i n . 2178. Z u r F ä r b u n g d e r K e r n s t r u k t u r e n v e r w e n d e t m a n die in § 925—955 a n gegebenen Methoden. 2179. N a c h F i x i e r u n g in F l e m m i n g s c h e r oder H e r m a n n s c h e r F l ü s s i g k e i t g i b t a u c h die von H e r m a n n a n g e g e b e n e F ä r b u n g m i t Safranin-Gent i a n a v i o l e t t g u t e Resultate. Bei i h r w e r d e n d ü n n e S c h n i t t e auf 24 bis 48 S t u n d e n in A n i l i n w a s s e r - S a f r a n i n (1 g S a f r a n i n , 10 ccm abs. Alkohol, 90 ccm A n i l i n w a s s e r , vgl. § 617) g e b r a c h t , m i t W a s s e r abgespült, i m s a l z s a u r e n A l k o h o l d i f f e r e n z i e r t (nicht zu stark!) u n d m i t abs. A l k o h o l g e w a s c h e n . D a n n f ä r b t m a n 3—5 M i n u t e n in G e n t i a n a v i o l e t t (11 ccm e i n e r konz. alkoholischen Lösung auf 100 ccm A n i l i n w a s s e r ) u n d b r i n g t sie f ü r 1—3 M i n u t e n in J o d j o d k a l i u m l ö s u n g ( 1 : 2 : 300), in d e r die S c h n i t t e v o l l k o m m e n s c h w a r z w e r d e n . N u n w e r d e n sie in 96%>igem A l k o h o l d i f f e r e n z i e r t , bis sie violett m i t e i n e m Stich ins B r ä u n l i c h e w e r d e n . R e s u l t a t : C h r o m a t i n n e t z e der r u h e n d e n K e r n e , sowie a u c h im Spirem- u n d Dyspiremstadium blauviolett, echte Nukleolen rot; im Asteru n d D y a s t e r s t a d i u m f ä r b t sich das C h r o m a t i n d a g e g e n rot. Die C y t o p l a s m a s t r u k t u r e n sind e b e n f a l l s s e h r deutlich s i c h t b a r u n d g e l b b r a u n g e f ä r b t . Die Köpfe, Mittelstücke, S c h w ä n z e , S p i r a l f ä d e n usw. e r s c h e i n e n d e u t l i c h u n d in v e r s c h i e d e n e n F a r b e n : r o t b l a u , v i o l e t t b l a u usw. 2180. Die K o p f k a p p e n d e r S p e r m i e n und ihre Anlage in den Spermatiden (Idiozom) lassen sich nach Fixierung in Hellyscher Flüssigkeit und Färbung mit Eisenhämatoxylin sehr schön durch Nachfärbung mit Benzolichtbordeaux in alkoholischer Lösung darstellen (Objekt: Meerschweinchen). H e i d e n h a i n 26. 2181. Die M i t o c h o n d r i e n d e r u n r e i f e n S a m e n z e l l e n u n d d e r Z w i s c h e n zellen stellt m a n n a c h d e n in § 969—998 a n g e g e b e n e n M e t h o d e n d a r . A u c h die O s m i u m - H ä m a t o x y l i n - M e t h o d e (§ 284—684) gibt g u t e R e s u l t a t e . 2182. Z u r D a r s t e l l u n g d e r M i t o c h o n d r i e n d e r S p e r m i e n fixiert R e g a u d 24 S t u n d e n bis 4 T a g e in f o l g e n d e r L ö s u n g : 3°/oige K a l i u m b i c h r o m a t l ö s u n g 100 ccm, Eisessig 5 ccm, F o r m o l 20 ccm (2—3mal wechseln), c h r o m i e r t o h n e A u s w a s c h e n 8 T a g e in 3°/oiger K a l i u m b i c h r o m a t l ö s u n g , w ä s c h t 24 S t u n d e n in W a s s e r u n d b e t t e t in P a r a f f i n ein. Die S c h n i t t e w e r d e n 10 T a g e in 5- bis 10°/oiger E i s e n a l a u n l ö s u n g gebeizt u n d m i t d e m in § 988 a n g e g e b e n e n H ä m a t o x y l i n in d e r d o r t a n g e g e b e n e n Weise g e f ä r b t . Bei d i e s e r B e h a n d l u n g bleiben die

§ 2183—2190.

Inkretorische Organe

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M i t o c h o n d r i e n d e s S y n c y t i u r a s u n d d e r A u x o c y t e n ungef ä r b t oder sehr blaß. Fixiert man dagegen nach der in § 976 angegebenen Vorschrift, so treten die Mitochondrien der letztgenannten Zellen scharf hervor, w ä h r e n d die der Spermien beinahe farblos bleiben. 2183. Zur L e b e n d b e o b a c h t u n g der Mitochondrien der Geschlechtszellen ist vor allem Material von Geotriton fuscus (vgl. T e r n i) geeignet, ferner von Drohnenhoden (vgl. bei B u c h n e r , S. 231). 2184. Material für Spermatogenese. Von W i r b e l l o s e n sei besonders Paludina vivipara empfohlen (vgl. M e v e s 03), bei der man den ganzen Sommer über geeignete Stadien antrifft. Von n i e d e r e n W i r b e l t i e r e n eignet sich besonders Salamandra maculosa. Man fixiere dieselben im Sept. und Okt., da zu dieser Zeit die Spermatogenese in vollem Gange ist. Bei R a n a e s c u l e n t a findet man entsprechende Stadien im August, bei V ö g e l n zu Ende der Winterperiod.e und Anfang des Frühjahrs. K a n i n c h e n , R a t t e n , M ä u s e und M e e r s c h w e i n c h e n bieten während des ganzen Jahres geeignetes Untersuchungsmaterial.

2185. Die i n t r a z e l l u l ä r e n E i w e i ß k r i s t a l l e in Leydigschen Zellen, Spermatogonien uhd Sertolischen Zellen werden am sichersten in Alkohol oder Formol-Alkohol fixiert; man findet sie aber häufig auch nach einfacher Formolfixierung erhalten. Sie f ä r b e n sich gut mit Eisenhämatoxylin, Gentianaviolett u. dgl. 218t. Zur F i x i e r u n g u n d F ä r b u n g d e r A u s f ü h r u n g s w e g e und der a n h ä n g e n d e n D r ü s e n bedarf es keiner speziellen Methoden. 2187. Zur Fixierung der Glandula bulbo-urethralis (und vestibularis maior) empfiehlt S c h a f f e r (17) das Formol-Alkoholgemisch (s. § 2022). Mit Eisenhämatoxylin nach Heidenhain f ä r b e n sich im Cytoplasmanetz der Drüsenzellen feinste Körnchen. Zur Darstellung der Atraktosomen (s. § 2038) beizt S c h a f f e r die Schnitte 24 Stunden bei 37° C in Erlickischer Flüssigkeit (s. § 245) und f ä r b t nach kurzem Abwaschen in Wasser mit Azan (§ 1489). C l a r a (37) empfiehlt die in § 2038 angegebene Methodik. 33. KAPITEL

Die inkretorischen Organe 2188. Zur Gewinnung von Ü b e r s i c h t s b i l d e r n lassen sich mehr oder weniger alle gebräuchlichen Fixierungs- und Färbungsmethoden verwenden. Über die bei der Untersuchung inkretorischer Organe oft sehr wichtigen Methoden der Mengenbestimmung s. § 903 ff. F ü r spezielle Zwecke seien noch folgende Methoden angeführt. Epithelkörper (Glandula parathyreoidea) 2189. Zur F i x i e r u n g der Epithelkörper kommen, je nach dem verfolgten Ziele verschiedene Flüssigkeiten in Betracht. F ü r Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e fixiert man nach Helly, Zenker, Bouin, Heidenhain od. dgl., zur Darstellung der F e t t s u b s t a n z e n in Formol, f ü r G l y k o g e n nach Carnoy oder Gendre (§ 1093). Die feinen, im Cytoplasma der Zellen vorkommenden G r a n u l a t i o n e n werden ebenso wie die Mitochondrien am besten bei Fixierung nach Regaud, Champy oder Altmann erhalten. 2190. Die Epithelkörper sind nicht immer leicht zu finden. Anfänger legen a m besten Kehlkopf, Schilddrüse und das anliegende Stück von L u f t r ö h r e und Speiseröhre einer Ratte, einer Maus oder eines Meerschweinchens in die Fi-

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Inkretorische Organe

§ 2191—2197.

xierungsflüssigkeit und schneiden das Ganze in Serie. Sie bekommen dann das dem Schilddrüsengewebe dicht anliegende E.-K. mit Sicherheit. Beim Menschen verfolgt man, um die E.-K. zu finden, von der Rückseite der im ganzen herausgenommenen Halsorgane her die Verzweigungen der Art. thyreoidea c'aud. — Makroskopisch sind die E.-K. leicht mit Lymphdrüsen zu verwechseln. 2191. Die F ä r b u n g erfolgt mit den in Kap. 16 zum Nachweis von Fettsubstanzen, Glykogen, Mitochondrien usw. angegebenen Methoden. Das Bindegewebe wird am besten mit der Azan- oder Bielschowskymethode zur Darstellung gebracht. 2192. Die oxyphilen Zellen treten bei Gegenfärbung mit Eosin, Säurefuchsin, Lichtgrün od. dgl. deutlich hervor. B. Hypophyse 2193. Die F i x i e r u n g erfolgt f ü r gewöhnlich in Susa, nach Bouin, Stieve od. dgl., bei großen Tieren und beim Menschen am besten durch Injektion von den Carotiden aus. Ist f ü r spezielle Färbemethoden besondere Fixierung vorgeschrieben, so muß diese, u m den gewünschten Erfolg zu erzielen, genau eingehalten werden. 2194. Für Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e ist nach den in § 2193 genannten Fixierungen besonders die Azanfärbung zu empfehlen; die eosinophilen Zellen werden durch sie rot, die basophilen blau, die chromophoben blaßviolett gefärbt. Außerdem tritt bei ihr noch ein besonderer, von R o m e i s (41) al e-Zelle bezeichneter Zelltyp in orangegelber Färbung hervor. Kolloid blau und rot. Bindegewebe scharf blau. Eosinophile und basophile Zellen werden auch durch die Methylblau-Eosinfärbung (§ 728) sehr schön hervorgehoben. Auch die Methode von Masson (§ 1496) und ihre Modifikationen von Wallart (§ 1497) geben sehr gute Resultate. Für spezielle Untersuchungen an den Parenchymzellen des Drüsenteiles w u r den besondere Methoden .ausgearbeitet, von denen nachfolgend die gebräuchlichsten angeführt seien. 2195. F ä r b u n g d e r e o s i n o p h i l e n (a-) Z e l l e n nach K r a u s (12). Fixierung in Formol. Paraffineinbettung. 1. Beizung 5ju dicker Schnitte in 5°/oiger Kaliumbichromatlösung über Nacht bei 37° C. — 2. Gut abspülen in dest. Wasser. — 3. Färben in reifem Hämatoxylin nach Kultschitzky (§ 1825) bei Zimmertemperatur 24 Stunden. — 4. Abspülen in Wasser. — 5. Differenzieren in einfach verdünnter Boraxferricyankalilösung (§ 1822), bis basophile Zellen hellbräunlich. — 6. Gründliches Auswaschen, evtl. nachfärben mit Pikrofuchsin, Alkohol, Xylol, Balsam. Ergebnis: eosinophile Zellen schwarz. 2196. F ä r b u n g d e rx b a s o p h i l e n (/?-) Z e l l e n nach E r d h e i m und S t u m m e (09). Fixierung mit Formol, Formol-Alkohol oder nach § 2193. Die 5¡u dicken Schnitte werden nach kräftiger "Vorfärbung mit Carmalaun 6 bis 24 Stunden in einer frisch bereiteten (!) Eesorcinfuchsinlösung gefärbt. Differenzieren in 96%igem Alkohol; absol. Alkohol, Xylol. Ergebnis: Kerne rot, basophile Zellen dunkelblau-schwarz. — Statt Vorfärbung mit Carmin ist auch Nachfärbung mit Kernechtrot möglich. 2197. M e t h o d e v o n B e r b l i n g e r und B u r g d o r f (35). Vorbehandlung: Fixierung in Formol oder Formol-Alkohol. Einbettung in Paraffin. Färbung: 1. Färben der cntparaffinierten Schnitte 2—48 Stunden in alkoholischer Kresofuchsinlösung (Grübler oder Hollborn). Abspülen in 96°/oigem Alkohol und kontrollieren unter dem Mikroskop. — 2. Dest. Wasser einige Minuten. —• 3. Kernfärbung in Alauncarmin 3 Stunden. — 4. Abspülen in dest. Wasser. —•

§ 2198—2199.

Hypophyse

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5. F ä r b e n f ü r 5 Min. in folgender Lösung: Orange G 2 g, Phosphormolybdänsäure 1 g, dest. Wasser 100 ccm. — 6. Kurzes Abspülen in dest. Wasser. — 7. A b trocknen der Schnitte mit Filtrierpapier. — 8. F ä r b e n in Anilinblaulösung (s. u.) 10—20 Min. — 9. Abspülen mit Wasser. — 10. Differenzieren in 75°/oigem Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen. — 11. Entwässern in 96°/o u n d absol. Alkohol. Xylol. Balsam. Ergebnis: K e r n e rot. G r a n u l a der eosinophilen Zellen orangegelb, Granula der basophilen Zellen rotblau, andere dunkelblau. Hauptzellen schwach blau oder grau. Bindegewebe blau. Herstellung der Anilinblaulösung: 0,5 g wasserlösliches Anüinblau auf 100 ccm dest. Wasser + 8 ccm Eisessig. Das Gemisch wird aufgekocht und nach Erkalten filtriert. Die haltbare Stammlösung wird zur Färbung mit 2 Teilen dest. Wasser verdünnt. 2198. K r e s a z a n f ä r b u n g n a c h R o m e i s (40). Vorbehandlung: Fixierung in Susa, Sublimat-Formol-Eisessig oder Formol. Einbettung ü b e r Methylbenzoat-Celloidin in Paraffin oder über Äther-Alkohol in Celloidin-Paraffin. Schnittdicke höchstens 5m. Celloidin-Paraffinschnitte müssen nach Lösung des Paraffins in üblicher Weise mit Äther-Alkohol vom Celloidin b e f r e i t werden. Schnitte von Sublimatmaterial w e r d e n zur E n t f e r n u n g der Sublimatniederschläge wie gewöhnlich mit Jod-Alkohol behandelt. Färbung: 1. Die Schnitte kommen aus dest. Wasser ü b e r 80°/oigen Alkohol in Resorcinfuchsin, bis die /^-Zellen intensiv schwarzblau oder schwarzbraun gefärbt sind. Die Förbedauer wechselt nach Fixierung der Präparate und Alter der Farblösung. Im günstigsten Fall ist sie schon nach 1 Stunde hinreichend, in anderen muß sie auf mehrere Stunden oder über Nacht verlängert werden. Zur Prüfung der Färbung wird der Schnitt in 96°/oigem Alkohol abgespült und unter dem Mikroskop betrachtet. Eine zu lange Färbung muß vermieden werden, da sonst auch die übrigen Zellen einen grauen Farbton annehmen und die nachfolgenden Färbungen unrein ausfallen. Das gleiche tritt bei ungeeigneter Fixierung ein. Die Resorcinfuchsinlösung wird genau nach § 1561 bereitet. Sie soll möglichst frisch sein und für vorliegende Zwecke nicht länger als 2—3 Wochen benutzt werden. 2. Differenzieren in 3 Portionen 96°/oigen Alkohol, bis sich der U n t e r g r u n d e n t f ä r b t h a t und die /3-Zellen klar hervortreten. Im letzten reinen Alkohol bleiben die Schnitte 15 Min. stehen. — 3. Einstellen in Anilin-Alkohol (0,1 ccm Anilinöl auf 100 ccm 90°/oigen Alkohol) 15 Min. — 4. Azocarmin G s/4—1 S t u n d e bei 58° in geschlossenem Glas; dann l h S t u n d e abkühlen lassen (Herstellung nach § 1489). — 5. Differenzieren in Anilin-Alkohol, bis die a-Zellen k l a r h e r vortreten und das Bindegewebe e n t f ä r b t ist. — 6. Kurzes Auswaschen des Anilins in essigsaurem Alkohol (1 ccm Eisessig auf 100 ccm 96°/oigen Alkohol) Va Min. — 7. Abspülen in dest. Wasser. — 8. 5°/oige Phosphormolybdänsäure 4 Min. — 9. Abtrocknen mit Filtrierpapier. — 10. Anilinblaulösung nach § 2197 40 Min. — 11. Kurz abspülen in dest. Wasser. — 12. Differenzieren in 96°/oigem Alkohol, bis keine groben Farbwolken, m e h r abgehen. — 13. Absol. Alkohol, Xylol, Balsam. — Ergebnis: a-Zellen leuchtend rot, /^-Zeilen intensiv b r a u n v i o l e t t — blauviolett, -/-Zellen hellviolett, ¿-Zellen kobaltblau. Bindegewebe blau. Kolloid blau und rot. Für manche Zwecke ist noch das Hinzufügen einer Orangefärbung erwünscht; in diesem Falle kommen die Präparate nach Punkt 7 für 5 Min. in folgende Lösung: Orange G 2 g, Phosphormolybdänsäure 1 g, dest. Wasser 100 ccm; dann kurz abspülen in dest. Wasser und weiter wie oben Punkt 8 usw. 2199. T a n n i n e i s e n - T o l u i d i n b l a u f ä r b u n g nach Wallraff (39). T a v a r e s d e S o u s a (38) fand, daß sich die Granula der basophilen

512

Inkretorische Organe

§ 2200.

Zellen mit d e r T a n n i n e i s e n m e t h o d e von S a l a z a r (§ 2155) intensiv s c h w a r z f ä r b e n . W a 11 r a f f b e n ü t z t e die B e o b a c h t u n g , d a ß die t a n n o p h i l e n G r a n u l a d e r b a s o p h i l e n Zellen bei N a c h f ä r b e n m i t T o l u i d i n b l a u diesen F a r b s t o f f s e h r s t a r k f e s t h a l t e n , u m die Methode z u r D a r s t e l l u n g der B a s o p h i l e n w e i t e r zu v e r b e s s e r n . Ausführung: 1. F i x i e r u n g in B o u i n s c h e r Flüssigkeit. E i n b e t t u n g in P a r a f f i n . — 2. 5/¿-Schnitte k o m m e n n a c h E n t p a r a f f i n i e r e n u n d A u s w a s c h e n d e r P i k r i n s ä u r e in dest. W a s s e r f ü r 2—3 Min. in die T a n n i n l ö s u n g n a c h S a l a z a r (§ 2155). — 3. A b s p ü l e n in dest. Wasser. — 4. E i n s t e l l e n in eine 3—4°/oige E i s e n a l a u n l ö s u n g V2 Min. — 5. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r . — 6. D i f f e r e n z i e r e n in S a l z s ä u r e - A l k o h o l (0,5 ccm officin. S a l z s ä u r e + 100 ccm 70%iger Alkohol). — 7. A u s w a s c h e n in 70°/oigem Alkohol. — 8. F ä r b u n g in A z o c a r m i n B Va bis 3 /4 S t u n d e n in T h e r m o s t a t . B e h a n d l u n g m i t A n i l i n a l k o h o l u n d e s s i g s a u r e m A l kohol wie b e i A z a n f ä r b u n g (s.'§ 1489). — 9. 96°/oiger u n d 70°/oiger Alkohol, dest. Wasser. — 10. F ä r b e n in e i n e r 0,2—l°/oigen w ä ß r i g e n T o l u i d i n b l a u l ö s u n g 1 bis 3 Min. — 11. D i f f e r e n z i e r e n in 96%>igem A l k o h o l 24 S t u n d e n . — 12. Absol. A l kohol, Xylol, B a l s a m . — Ergebnis: B a s o p h i l e Z e l l g r a n u l a d u n k e l b a u , desgl. Kolloid. D i e ü b r i g e n Zellen grau u n d o h n e e r k e n n b a r e G r a n u l i e r u n g . K e r n e l e u c h t e n d rot. B i n d e g e w e b e b l a u s c h w a r z . Wird die Färbezeit in Toluidinblau und entsprechend die Dauer der Differenzierung in 96°/oigem Alkohol gekürzt, so bleiben auch die Granula der eosinophile.! Zellen gefärbt. 2200. M e t h o d e v o n S e v e r i n g h a u s (32). A. Vorbehandlung: 1. F i x i e r u n g k l e i n e r S t ü c k c h e n i n : 2°/oige O s m i u m s ä u r e 1 Teil, 3°/oiges K a l i u m b i c h r o m a t 2 Teile, l°'/oige C h r o m s ä u r e 1 Teil, 24 S t u n d e n . — 2. A u s w a s c h e n in m e h r f a c h g e w e c h s e l t e m dest. Wasser Vz S t u n d e . — 3. B e i z u n g in Holzessig 1 Teil, l°/oige C h r o m s ä u r e 2 Teile, 18—24 S t u n d e n . — 4. A u s w a s c h e n i n m e h r f a c h g e w e c h s e l t e m W a s s e r V2 S t u n d e . — 5. Beizung in 3°'/oigem K a l i u m b i c h r o m a t 3—6 Tage. — 6. A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r 24 S t u n d e n . — 7. D u r c h f ü h r e n d u r c h s t e i g e n d e n A l k o h o l bis z u m 96°/oigen im L a u f e von 6 S t u n d e n . — 8. Absol. A l kohol 1 S t ü n d e ; absol. Alkohol + Z e d e r n ö l (ää) 12—24 S t u n d e n ; Z e d e r n ö l 24 S t u n d e n ; Z e d e r n ö l - X y l o l (ää) l S t u n d e ; Xylol 1 S t u n d e ; X y l o l - P a r a f f i n 6 S t u n d e n ; w e i c h e s P a r a f f i n (45°) 48 S t u n d e n . — 9. E i n b e t t e n d u r c h 4—5 P o r tionen P a r a f f i n vor* 60—621*, in j e d e r 20 Min. B. Färbung: 1. S e r i e n s c h n i t t e v o n 3m u n t e r K ü h l u n g des P a r a f f i n s . — 2 . D u r c h f ü h r e n d e r e n t p a r a f f i n i e r t e n Schnitte bis z u m dest. Wasser; b e d e c k e n m i t 20°/eiger S ä u r e f u c h s i n l ö s u n g in Anilinwasser, 2—3mal e r h i t z e n bis z u m A u f s t e i g e n von D ä m p f e n . — 3. A b s p ü l e n mit dest. W a s s e r u n d a u f t r o p f e n v o n v e r d ü n n t e r P i k r i n s ä u r e (1 Teil g e s ä t t i g t e Lösung v o n P i k r i n s ä u r e in absol. A l k o h o l -+• 7 Teile 20°/oiger Alkohol); d i f f e r e n z i e r e n u n t e r m i k r o s k o p i s c h e r K o n t r o l l e 1 U—1 Min. — 4. A b s p ü l e n in dest. W a s s e r u n d einstellen in l°/oige P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e 1 Min. — 5. G r ü n d l i c h a b s p ü l e n u n d f ä r b e n in e i n e m G e m i s c h aus l°/oiger M e t h y l g r ü n l ö s u n g 7 Teile, l°/oiger S ä u r e v i o l e t t l ö s u n g 5 Teile, 50%>iger A l k o h o l 5 Teile, V2—1 Min. A b s p ü l e n in dest. Wasser, a b t r o c k n e n . — 6. 95°/oiger A l k o h o l 5 S e k u n d e n ; d i f f e r e n z i e r e n in: absol. Alkohol 1 Teil + Nelkenöl 3 Teile. A b t r o c k n e n , rasch d u r c h absol. Alkohol in Xylol, B a l s a m . — Ergebnis: eosinophile G r a n u l a rot, b a s o p h i l e b l a u , M i t o c h o n d r i e n l e u c h t e n d f u c h sinrot, Nucleoli rot, B l u t k ö r p e r c h e n o r a n g e g e l b . Ist die Darstellung des Golgiapparates erwünscht, dann wird das Material nach der Fixierung in A 1 für 24 Stunden in fließendem Wasser ausgewaschen, in dest. Wasser abgespült und für 8—10 Stunden bei 40° C, für weitere 4—6 Tage bei 35'' C in 2°/oige Osmiumsäure gebracht. Dann auswaschen in fließendem Wasser und weiter wie in A 7. Vor der Färbung (B 2)' kommen die Schnitte für 1 Min. in

§ 2201—2206.

Hypophyse

513

0,l0/'oiges Kaliumpermanganat und nach Abwaschen ebensolange in l°/oige Oxalsäure. Auswaschen. 2201. M e t h o d e von C l e v e l a n d , R u c k e r u n d W o l f e (32). Vorbehandlung: 1. F i x i e r u n g in R e g a u d s c h e r F l ü s s i g k e i t 5 T a g e (täglich e r n e u e r n ) . —• 2. C h r o m i e r e n in 3°'/oiger K a l i u m b i c h r o m a t l ö s u n g 8 T a g e (alle 2 T a g e w e c h seln). — 3. A u s w a s c h e n in f l i e ß e n d e m W a s s e r 24 S t u n d e n . — 4. Möglichst r a s c h d u r c h A l k o h o l r e i h e in Zedernöl, i n d e m die S t ü c k e einige T a g e b l e i b e n (bei zu l a n g e r E i n w i r k u n g w i r d das M a t e r i a l zu spröde). — 5. 1—2 S t u n d e n X y l o l u n d e i n b e t t e n in P a r a f f i n (60°). — Färbung: 1. Die 2—3¡u d i c k e n S c h n i t t e w e r d e n e n t p a r a f f i n i e r t , d u r c h A l k o h o l in W a s s e r g e b r a c h t u n d d a n n f ü r 3 Min. in E h r l i c h s c h e m H ä m a t o x y l i n (§ 666) g e f ä r b t . — 2. A b s p ü l e n in dest. Wasser, b l ä u e n i n L i t h i u m c a r b o n a t l ö s u n g . — 3. Beizen in 5°/oiger K a l i u m b i c h r o m a t l ö s u n g (täglich wechseln) 3 T a g e im D u n k e l n . — 4. R a s c h a b s p ü l e n in dest. Wasser u n d f ä r b e n in e i n e r 0,5°/oigen w ä ß r i g e n L ö s u n g v o n E r y t h r o s i n . — 5. A b s p ü l e n in 2 P o r t i o n e n dest. Wasser. — 6. F ä r b e n in: O r a n g e G 2 g, P h o s p h o r m o l y b d ä n s ä u r e 1 g, dest. W a s s e r 100 ccm; g e w ö h n l i c h g e n ü g e n 2—3 Min. — 7. A b s p ü l e n in dest. Wasser. — 8. F ä r b e n in l°/mger w ä ß r i g e r L ö s u n g von A n i l i n b l a u 30 bis 60 S e k u n d e n . — 9. Rasch a b s p ü l e n in dest. Wasser, 95°/oiger Alkohol, absol. A l kohol, absol. A l k o h o l - X y l o l (ä§) Xylol, B a l s a m . — Ergebnis: Die V e r f a s s e r u n t e r s c h e i d e n 4 T y p e n von Z e l l e n - u n g r a n u l i e r t e Zellen mit u n g e f ä r b t e m oder b l a ß b l a u e m C y t o p l a s m a , Zellen m i t b l a u e m C y t o p l a s m a u n d p u r p u r r o t e n G r a n u l a , Zellen m i t o r a n g e r o t e n G r a n u l a u n d Z e l l e n m i t gelben G r a n u l a . K e r n e b l a u , B i n d e g e w e b e blau. Im V o r k o m m e n d e r Zellen b e s t e h e n z w i s c h e n d e n e i n zelnen T i e r a r t e n U n t e r s c h i e d e . 2202. Das K o l l o i d wird sehr gut durch eine von K r a u s auch für das Kolloid der Schilddrüse angegebene Methode (s. § 2237) dargestellt. Zu beachten ist, daß in der Säurefuchsin-Tanninlösung unter mikroskopischer Kontrolle so lange zu differenzieren ist, bis die basophilen Zellen fast rötlich erscheinen, während die eosinophilen die blaue Farbe beibehalten sollen. 2203. S ä u r e v i o l e t t - S ä u r e f u c h s i n f ä r b u n g n a c h M a u r e r und L e w i s (22) zur Darstellung der Zellen des tierischen Z w i s c h e n l a p p e n s . Fixierung in Zenker ohne Eisessig 24 Stunden bei 38° C. Paraffineinbettung. — Färbung: Die Schnitte kommen nach Sublimateinbettung (nach § 572) für 20 bis 30 Sekunden in ein Gemisch aus 70 ccm einer l,7°/oigen Säurefuchsinlösung und 30 ccm einer gesätt. Säureviolettlösung. Hierauf rasch abtrocknen, entwässern in wasserfreiem Aceton und übertragen in Xylol. Sodann differenzieren in Nelkenöl, absol. Alkohol (wie 3 : 1) abtrocknen, Xylol (mehrmals wechseln), Balsam. —• Ergebnis: In den Zellen des Zwischenlappens sind feine blaue Granula sichtbar, die sich durch ihre hellere Farbe und geringere Größe von jenen der basophilen Vorderlappenzellen deutlich unterscheiden. Eosinophile Zellen rot. Bindegewebs blau. 2204. Die D a r s t e l l u n g d e s a r g y r o p h i l e n B i n d e g e w e b e s gelingt sehr schön mit der Silbermethode von G ö m ö r i (§ 1533), am besten nach CarnoyFixierung (Ro m e i s 40). 2205. D i e N e r v e n f a s e r n des H i r n t e i l s d e r H y p o p h y s , e w e r d e n n a c h F i x i e r u n g in n e u t r a l e m F o r m o l a n G e f r i e r s c h n i t t e n s e h r gut d u r c h die N a t r o n l a u g e - S i l b e r m e t h o d e v o n O. S c h u l t z e (§ 1808) d a r g e s t e l l t . D i e M e t h o d e h a t n u r d e n Nachteil, daß sich leicht a u c h Teile d e r P i t u i c y t e n f a s e r n m i t i m p r ä g n i e r e n (R o m e i s 40). Die besten, v o l l s t ä n d i g s t e n u n d k l a r s t e n I m p r ä g n a t i o n e n e r h i e l t R o m e i s m i t d e r M e t h o d e v o n B o d i a n (§ 1816 u. 1818) a n P a raffinschnitten. 2206. F ü r die D a r s t e l l u n g d e r P i t u i c y t e n u n d P i t u i c y t e n f a s e r n k o m m t v o r allem die S i l b e r c a r b o n a t m e t h o d e f ü r Oligodendroglia v o n 33

R o m e i s , Mikrosk. T e c h n i k . 15. A u f l .

514

Inkretorische Organe

§ 2207—2210.

Rio Hortega (s. § 1861) in Betracht. K a n n das Material — was vorzuziehen ist — in den ersten Tagen nach dem Einlegen verarbeitet werden, so v e r f ä h r t m a n am besten nach der Originalmethode; später ist die Anwendung der Modifikation von Penfield (s. § 1868) vorzuziehen. Argyrophile und kollagene Bindegewebesfasern sollen in gelungenen P r ä p a r a t e n u n g e f ä r b t oder n u r blaß getönt sein. Vorbedingung f ü r gute Resultate ist, daß die Fixierung möglichst bald nach dem Tode erfolgt, da sich die Pituicyten rasch postmortal v e r ä n d e r n (R o m e i s 40). Zu einer befriedigenden Imprägnation der Pituicyten kommt es nach R o m e i s nur dann, wenn das zur Reduktion verwandte Formol (s. § 1861, 7) mit Brunnenwasser verdünnt wird. Die Schale mit dem Formol ist während der Reduktion zu bewegen. Zu beachten ist ferner, daß die Strukturen oft erst durch die Vergoldung klar hervorgehoben werden (Stammlösung: braunes Goldchlorid 1 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 3 Tropfen; zur Vergoldung verdünnt man 1 ccm mit 4 ccm dest Wasser; Dauer ca. 30 Min. bei Zimmertemperatur. 2207. Zur T r e n n u n g v o n P i t u i c y t e n f a s e r n u n d Bindeg e w e b e behandelt R o m e i s (40) Paraffinschnitte von Carnoy- oder Bouinmaterial wie folgt: 1. Vorbehandlung mit Kaliumpermanganat und Oxalsäure nach § 1525, B, 1—3. — 2. Silberimprägnation und Vergoldung nach Bielschowsky nach § 1525, C, 1—8. — 3. Auswaschen in fließendem Wasser Va Std. — 4. F ä r b e n in Säurefuchsin 2 g, dest. Wasser 100 ccm, Eisessig 1 ccm 5 Min. — 5. Abspülen in dest. Wasser. — 6. Einstellen in l°/oige Phosphormolybdänsäure 5 Min. — 7. Abspülen in dest. Wasser. — 8. Eintauchen in l°/oige Essigsäure. — 9. Abtrocknen. — 10. Absol. Alkohol. — 11. Xylol. — 12. Caedax. — Ergebnis: Gitterfasern schwarz, Pituicytenfasern intensiv rot. 2208. Z u r T r e n n u n g v o n P i t u i c y t e n f a s e r n u n d N e r v e n f a s e r n w e r d e n an Stelle des Bindegewebes zuerst die Nervenfasern nach Bodian (§ 1816) imprägniert und dann die P. nach § 2207 mit Säurefuchsin nachgefärbt. — Zur gleichzeitigen Darstellung von Nervenfasern (schwarz), Pituicytenfasern (violett) und Bindegewebe (blau) schließt R o m e i s (40) an die N e r v e n f ä r b u n g nach Bodian (s. § 2205) die A z a n f ä r b u n g an. 2209. Das P i g m e n t des Hinterlappens wird in frischen Präparaten besonders schön durch Neutralrot gefärbt (K o h n 10). Man legt dazu frische, zerzupfte Stückchen in eine schwache Lösung von Neutralrot in 0,9°/oiger Kochsalzlösung. Nach 15—30 Min. sind die Pigmentkörperchen leuchtend rot. In fixierten Präparaten wird das Pigment u. a. durch Eisenhämatoxylin schwarz, durch wässerige Lösungen von Toluidinblau, Thionin oder Methylenblau blaugrün-grün gefärbt. Eine sehr scharfe Färbung gibt auch polychromes Methylenblau, z. B. bei Färbung nach § 2237. In frischem wie fixiertem Zustand zeigt es zum größten Teil sehr ausgesprochene Argentaffinität (s. § 1129). (Rom e i s 40). Weitere Angaben über die Untersuchungstechnik der Hypophyse bei B e n o i t (35) und R o m e i s (40). Siehe Kapitel 32.

C. Keimdrüsen

D. Nebennieren und diromaffines Gewebe (Paraganglien) 2210. Die F i x i e r u n g der Nebenniere h a t in Anbetracht des raschen Eintrittes postmortaler Veränderungen, namentlich in der Marksubstanz, möglichst bald nach dem Tode zu erfolgen. F e r n e r ist zu berücksichtigen, daß das Gewebe gegen Druck (beim Durchschneiden des Organes u. dgl.) sehr empfindlich ist. Dies gilt besonders f ü r die Zellen der Marksubstanz, die sich namentlich bei größeren Tieren meist n u r durch Fixierung auf dem Gefäßwege in befriedigen-

§

2211—2217.

Nebennieren

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der Weise e r h a l t e n lassen. Die Nebennieren kleiner Tiere, w i e Maus oder Ratte, k ö n n e n jedoch auch d u r c h Einlegen in toto gut fixiert werden. Die Wahl der Fixierungsflüssigkeit w i r d durch den bei d e r U n t e r s u c h u n g verfolgten Zweck bestimmt. F ü r Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e ist F i x i e r u n g in Susa oder S u b l i m a t - F o r mol-Eisessig sehr zu empfehlen. 2211. D i e c h r o m a f f i n e R e a k t i o n d e r M a r k z e l l e n . Seit H e n l e (1865) ist b e k a n n t , daß sich die Markzellen der N e b e n n i e r e bei F i x i e r u n g in k a l i u m b i c h r o m a t h a l t i g e n Flüssigkeiten, z. B. in Müllerscher Flüssigkeit, lebh a f t b r ä u n e n . Diese Reaktion ist in der N e b e n n i e r e d u r c h A d r e n a l i n bedingt. In gleicher Weise v e r h a l t e n sich auch die chromaffinen Zellen der P a r a g a n g l i e n , f ü r die die nachfolgenden A u s f ü h r u n g e n d a h e r ebenfalls gelten. 2212. D a s W e s e n d e r R e a k t i o n , das von B o r b e r g , O g a t a und anderen Autoren auf die Bildung von Chromoxyden zurückgeführt wurde, beruht in Wirklichkeit auf der Bildung von Chinhydronen ( G é r a r d , C o r d i e r und L i s o n 30). Die Braunfärbung hat mit einer Farbwirkung der Chromsalze nichts zu tun, sondern ist durch ein Oxydationsprodukt der reagierenden Substanz selbst bedingt. Sie läßt sich daher auch durch Einwirkung chromfreier, oxydierender Substanzen, z. B. durch Kaliumjodat, erzielen. Die Reaktion wird ausschließlich von Di- und Polyphenolen, Aminophenolen oder Polyaminen in Ortho- oder Parastellung gegeben. Ein positiver Ausfall zeigt also die Anwesenheit einer dieser Verbindungen an. 2213. A u s f ü h r u n g d e r R e a k t i o n . B o r b e r g (12) f a n d bei systematischen U n t e r s u c h u n g e n die stärkste B r ä u n u n g bei folgender F i x i e r u n g : Einlegen in Müllersche Flüssigkeit 1 bis m e h r e r e Tage, hierauf 1 Tag in MüllerFormol (9 :1), d a n n 1 bis m e h r e r e Tage w i e d e r in Müllersche Flüssigkeit. Die G e s a m t d a u e r soll mindestens 3 Tage betragen, wonach das M a x i m u m der B r ä u n u n g erreicht ist. Auswaschen in fließendem Wasser 24 S t u n d e n usw. Die Angabe von K u t s c h e r a - A i c h b e r g e n , daß die Bräunung nach 6stündigem Fixieren in Müllerscher Flüssigkeit ebenso stark ist wie nach 6 Wochen, konnte ich nicht bestätigen. 2214. Leider ist bei F i x i e r u n g nach § 2213 der E r h a l t u n g s z u s t a n d der Zellen sehr schlecht. Ich ziehe es d a h e r vor, die P r ä p a r a t e nach d e m Vorgehen von P f e i f f e r u n d J a r i s c h (19) sofort in K a l i u m b i c h r o m a t (3,5°/oig) 9 Te'.le, Formol 1 Teil zu fixieren u n d nach 24 S t u n d e n f ü r 3 T a g e in reine 3;5%>ige K a liumbichromatlösung zu ü b e r t r a g e n . D a n n 24stündiges Auswaschen in fließendem Wasser usw. Die Bräunung ist bei diesem Vorgehen etwas gelblicher und daher heller, der Erhaltungszustand aber unvergleichlich besser. 2215. Sublimathaltige Flüssigkeiten geben ungleichmäßige, chromsäure- oder alkoholhaltige sogar negative Resultate. Auch Eisessigzusatz (über 0 , 5 ° / o ) oder stärkerer Formolzusatz (über 1 0 ° / o ) ist schädlich. Dies ist namentlich bei vergleichenden experimentellen Untersuchungen zu beachten. 2216. Die B r ä u n u n g d e r chromaffinen Zellen t r i t t am stärksten an u n g e f ä r b ten oder mit C a r m a l a u n gefärbten, in Glycerin eingelegten Schnitten h e r v o r , ist aber auch an Celloidin- oder P a r a f f i n s c h n i t t e n sehr g u t sichtbar. F ü r v e r gleichende U n t e r s u c h u n g e n h a t die P a r a f f i n t e c h n i k w e g e n gleichmäßigerer Schnittdicke Vorteile. N e b e n F ä r b u n g der Schnitte mit Carmalaun, K e r n e c h t rot, H ä m a l a u n ist auch die A n w e n d u n g der A z a n m e t h o d e wie der Massonschen T r i c h r o m m e t h o d e (§ 1495 ff.) sehr zu empfehlen. 2217. F ä r b u n g n a c h W i e s e l . F i x i e r u n g nach § 2214. Färbung: 1. l°/oige wäßrige Toluidinblaulösung 20 Min. — 2. Auswaschen in B r u n n e n w a s s e r 5 Min. — 3. l % i g e w ä ß r i g e S a f r a n i n l ö s u n g 20 Min. — 4. Differenzieren in 96°/oigem 53»

516

Inkretorische Organe

§ 2218—2224.

A l k o h o l , bis die b l a u e F a r b e w i e d e r h e r v o r t r i t t . — 5. Carbolxylol, Xylol, B a l s a m . — Ergebnis: c h r o m a f f i n e Zellen g r ü n , K e r n e rot, C y t o p l a s m a d e r ü b r i g e n Zellen b l a u . 2218. D e r N a c h w e i s d e r a r g e n t a f f i n e n S u b s t a n z e r f o l g t n a c h M a s s o n - H a m p e r l (s. § 1129). 2219. T. u n d A. O g a t a e m p f e h l e n dazu f o l g e n d e s V e r f a h r e n : 1. Möglichst d ü n n e f r i s c h e S c h e i b e n des D r ü s e n g e w e b e s k o m m e n o h n e v o r h e r i g e F i x i e r u n g f ü r 2 S t u n d e n in eine l°/oige A m m o n i a k l ö s u n g . — 2. Ü b e r t r a g e n in die a m m o n i a k a l i s c h e S i l b e r l ö s u n g v o n Bielschowsky (s. § 1587), die m i t dest. W a s s e r auf die H ä l f t e v e r d ü n n t w u r d e , 3—5 S t u n d e n . — 3. E i n l e g e n i n eine m e h r f a c h e r n e u e r t e l°/oige A m m o n i a k l ö s u n g , 30 M i n u t e n . — 4. F i x i e r e n in e i n e r 3®/oigen F i x i e r n a t r o n l ö s u n g , 1 S t u n d e . — 5. A u s w a s c h e n in Wasser, 1 S t u n d e . — 6. F i x i e r e n in F o r m o l (1 : 10), S c h n e i d e n auf d e m G e f r i e r m i k r o t o m . — E r g e b n i s : I n d e n c h r o m a f i n e n Zellen (ebenso in d e n B l u t g e f ä ß e n ) sind z a h l r e i c h e g e schwärzte Körnchen nachweisbar. Nr. 1—Nr. 4 soll möglichst unter Ausschluß von Tageslicht erfolgen. 2220. Die F e t t - u n d L i p o i d s u b s t a n z e n d e r R i n d e u n t e r s u c h t m a n n a c h d e n in K a p i t e l 16, E a n g e g e b e n e n M e t h o d e n . D a b e i ist zu b e a c h t e n , d a ß sich die in d e r R i n d e v o r h a n d e n e n , mit O s m i u m s ä u r e s c h w ä r z e n d e n L i p o i d s u b s t a n z e n b e i m E i n b e t t u n g s p r o z e ß in Toluol, Benzol, C h l o r o f o r m , B e r g a m o t t öl, a u c h in T e r p i n e o l bei l ä n g e r e r E i n w i r k u n g sehr leicht lösen (vgl. § 1057 f.). S e l b s t in P a r a f f i n u m l i q u i d u m , in d a s m a n die S c h n i t t e d u r c h A l k o h o l u n d T e r p i n e o l b r i n g t , lösen sie sich in e i n i g e r Zeit z u m g r ö ß t e n Teil. A m b e s t e n n i m m t m a n die O s m i e r u n g an G e f r i e r s c h n i t t e n vor u n d legt diese in G l y z e r i n ein. 2221. Die d o p p e l t b r e c h e n d e n L i p o i d e der R i n d e u n t e r s u c h t m a n a n f r i s c h e n oder f o r m o l f i x i e r t e n S c h n i t t e n im P o l a r i s a t i o n s m i k r o s k o p (s. § 1039, 1074 f.). W e l t m a n n (13) f ä r b t formolfixierte, auf 80°' C e r w ä r m t e S c h n i t t e m i t N i l b l a u s u l f a t u n d b e o b a c h t e t im p o l a r i s i e r t e n Licht. 2222. In der Nebenniere des Frosches findet man außer chromaffinen und Rindenzellen noch eine dritte Zellart (sog. Sommerzellen), die in ihrem Cytoplasma bei Hämalaun-Eosin- oder Triacidfärbung rote Granulationen zeigt (acidophile Zellen von P a t z e 11 und K u b i k 12). Die Granula färben sich auch bei Anwendung der Wieseischen Methode (s. § 2217) rot ( W a l t e r ) . 2223. Das B i n d e g e w e b e in R i n d e u n d M a r k w i r d a m v o l l s t ä n d i g s t e n d u r c h S i l b e r i m p r ä g n a t i o n n a c h Bielschowsky u s w . (§ 1525 ff.) d a r g e s t e l l t . F ü r das N e r v e n g e w e b e seien die M e t h o d e n v o n B i e l s c h o w s k y (§ 1909 ff.), G r o s - S c h u l t z e (§ 1793) o d e r O. Schultze (§ 1808) e m p f o h l e n . E. Langerhanssche Inseln des Pankreas 2224. V i t a l f ä r b u n g d e r L a n g e r h a n s sehen I n s e l n z u r F e s t s t e l l u n g i h r e r Z a h l u n d Größe. B e n s 1 e y (12) d u r c h s p ü l t dazu d a s d u r c h V e r b l u t e n g e t ö t e t e T i e r v o n d e r A o r t a aus m i t 4—5 L i t e r k ö r p e r w a r m e r R i n g e r lösung, d e r N e u t r a l r o t oder J a n u s g r ü n zugesetzt ist (1 : 15 000, C l a r k n i m m t 1 : 50 000 b z w . 1 :30 000). Die nicht zur Region g e h ö r i g e n G e f ä ß e w e r d e n zu B e g i n n d e r I n j e k t i o n gleich a b g e b u n d e n . Schon bald nach Beginn färbt sich das Pankreas bei Verwendung von Neutralrot rot. Wenn die Färbung genügend ist, bringt man ein Stück der Drüse unter das Mikroskop, wobei sich die intensiv gelbrot gefärbten Inseln von dem rötlich gefärbten exokrinen Gewebe deutlich abheben. Kurz darauf entfärbt sich das exokrine Gewebe durch Reduktion der Farbe, während die Inseln noch gefärbt blei-

§ 2225—2228.

Langerhanssche Inseln des Pankreas

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ben. Bei Überfärbung genügt kurzes Bedecken mit einem Deckglas, um die Entfärbung herbeizuführen. In gleicher Weise wird bei Verwendung von Janusgrün verfahren. Man durchspült, bis die ganze Drüse tief blaugrün ist. Dann bedeckt man die Drüse mit einem Stück Mesenterium od. dgl., worauf sich der exokrine Anteil der Drüse unter Reduktion des Farbstoffes rötet, während die Inseln grün gefärbt bleiben. Im geeigneten Augenblick, meist nach 15—20 Minuten, muß dann die Reduktion dadurch, daß man das Organ der Luft aussetzt oder 5°/oige Ammoniummolybdatlösung einfließen läßt, unterbrochen werden, da Site sonst auch auf die Inseln übergreift (Fehlerquelle!). Wichtig ist die Verwendung eines geeigneten Farbstoffes. Der von B e n s 1 e y benützte stammte von der Firma L. A. M e t z u. Co., N e w Y o r k . Der Grüblersche war unbrauchbar. 2225. F i x i e r u n g . F ü r Ü b e r s i c h t s b i l d e r eignet sich so ziemlich j e d e der g e b r ä u c h l i c h e n F i x i e r u n g s f l ü s s i g k e i t e n . F ü r cytologische U n t e r s u c h u n g e n (Mitochondrien) ist die F i x i e r u n g n a c h C h a m p y oder n a c h R e g a u d , f ü r die D a r s t e l l u n g v e r s c h i e d e n e r Z e l l t y p e n das V e r f a h r e n n a c h § 2230 a n z u w e n d e n . E i n e r b e s o n d e r e n F i x i e r u n g b e d a r f es bei der F ä r b e m e t h o d e n a c h L a n e (§ 2227). 2226. F ä r b u n g . Die H e r v o r h e b u n g d e r L. I. g e g e n ü b e r d e m e x o k r i n e n D r ü s e n g e w e b e g e l i n g t bei V e r m e i d u n g e i n e r U b e r f ä r b u n g meist schon m i t H i l f e d e r g e w ö h n l i c h e n H ä m a l a u n - E o s i n f ä r b u n g s e h r g u t . — K o c h (13) sowie J a f f e u n d L ö w e n f e l d (12, 14) e m p f e h l e n die M e t h y l g r ü n - P y r o n i n - M e t h o d e von P a p p e n h e i m - U n n a (s. § 723). Die l e t z t e r e n f i x i e r e n dazu in e i n e m G e misch aus 2 T e i l e n M ü l l e r s c h e Flüssigkeit u n d 1 Teil 10%iges F o r m o l . — A u c h die p a n o p t i s c h e F ä r b u n g n a c h P a p p e n h e i m (§ 1403) gibt s e h r k l a r e Bilder. Die b i n d e g e w e b i g e H ü l l e d e r Inseln t r i t t a m s c h ä r f s t e n b e i A z a n f ä r b u n g oder Silb e r i m p r ä g n a t i o n (§ 1525 ff.) h e r v o r . 2227. L a n e (07) u n t e r s c h e i d e t in den L. I. zwei v e r s c h i e d e n e , als T y p u s A und Typus B bezeichnete Zellarten. Zur F ä r b u n g verwendet m a n f ü r beide T y p e n die gleiche F a r b l ö s u n g , n ä m l i c h G e n t i a n a v i o l e t t - O r a n g e n a c h B e n s 1 e y. V e r s c h i e d e n d a g e g e n ist die A r t der F i x i e r u n g . F i x i e r u n g f ü r T y p u s A: kleine Drüsenstückchen kommen für 2—4 Stunden in ein Gemisch von gleichen Teilen einer in 96°/oigem Alkohol gesättigten Sublimatlösung und einer 2,5°/oigen Kaliumbichromatlösung. Auswaschen in 50°/oigem Alkohol. Einbettung in Paraffin. F i x i e r u n g f ü r T y p u s B: kleine Stückchen kommen f ü r 24 Stunden in Kaliumbichromat 2,5 g, Sublimat 5 g, dest. Wasser 100 ccm (= Zenker ohne Natriumsulfat und Eisessig). Auswaschen in Wasser. Entwässern. Paraffineinbettung. F ä r b u n g (nach L a n e - B e n s l e y ) : 1. Die S c h n i t t e k o m m e n aus dest. W a s s e r f ü r 24 S t u n d e n in n e u t r a l e G e n t i a n a v i o l e t t l ö s u n g (s. § 2228). — 2. A b t r o c k n e n m i t F i l t r i e r p a p i e r . — 3. E n t w ä s s e r n in Aceton. — 4. Ü b e r t r a g e n in Xylol. — 5. D i f f e r e n z i e r e n in abs. Alkohol 1 Teil + N e l k e n ö l 3 Teile. — 6. Xylol, C a n a d a b a l s a m . — M a n d i f f e r e n z i e r t , bis sich die Z y m o g e n - G r a n u l a in d e n e x o k r i n e n Zellen p u r p u r v i o l e t t gegen den b r ä u n l i c h e n U n t e r g r u n d a b h e b e n . E r g e b n i s : Bei F i x i e r u n g f ü r A : in d e n »A«-Zellen sind f e i n e i n t e n s i v violette G r a n u l a s i c h t b a r . D i e »B«-Zellen sind n u r b l a ß o r a n g e g e f ä r b t . Bei F i x i e r u n g f ü r B e n t h a l t e n die »B«-Zellen f e i n e v i o l e t t e G r a n u l a , w ä h r e n d die »A«-Zellen o r a n g e g e f ä r b t sind. Schließlich u n t e r s c h e i d e t B e n s 1 e y n o c h g r a n u l a f r e i e »C«-Zellen. (Im S c h r i f t t u m a u c h als a-, ß-, y-Zellen bezeichnet.) 2228. G e n t i a n a v i o l e t t - O r a n g e l ö s u n g n a c h B e n s l e y . Zu ihrer Herstellung werden 50 ccm einer gesättigten wässerigen Lösung von Gentianaviolett (oder Kristallviolett) mit der äquivalenten Menge einer gesättigten wässerigen Lösung von Orange G vereinigt urjd leicht geschüttelt. Wird die richtige Menge von Orange G zugesetzt, so kommt es zu einer praktisch vollkommenen

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Inkretorische Organe

§ 2229—2234.

Ausfällung eines Neutralfarbstoffes, der bei Überschuß von Orange G leicht wieder in Lösung geht. In diesem Fall muß dann wieder Gentianaviolett zugesetzt werden, bis die Ausfällung vollständig ist. Der so erhaltene Farbniederschlag ist praktisch unlöslich in Wasser, leicht löslich in Alkohol oder Aceton. E r wird auf dem Filter gesammelt, mit dest. Wasser gewaschen, getrocknet und in 50 ccm absol. Alkohol gelöst (»Stammlösung«). Zur Färbung tropft man davon soviel in 20°/oigen Alkohol, bis die Lösung die Farbe eines guten Hämalauns hat. Diese verdünnte Lösung wird als »neutrale Gentianaviolettlösung« bezeichnet. 2229. Zur gleichzeitigen Darstellung der A- und B-Zellen fixiert B e n s 1 e y (12) wie oben in B. Die Schnitte kommen 1. in neutrale Gentianaviolettlösung 24 Stunden. — 2. Abtrocknen. — 3. Aceton. 4. Wasser. — 5. Fixieren in 5°/oiger Ammoniummolybdatlösung 5 Minuten. — 6. Wasser. — 7r Anilinwasser-Säurefuchsin nach Altmann (§ 992) 5 Minuten bei 60° C. — 8. Differenzieren in einer alkoholischen (30%) Pikrinsäurelösung. — 9. Abs. Alkohol, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Granula der A-Zellen rot, der B-Zellen violett.

2230. Besser als mit den vorausgehend angegebenen Methoden, die nicht sehr gut fixieren, gelingt die Darstellung verschiedener Zelltypen in den Langerhansschen Inseln nach der von B l o o m (31) angegebenen Weise: Fixierung möglichst frisch in Zenker-Stammlösung 9 Teile + neutrales Formol 1 Teil, Dauer 6—8 Stunden. Dann Celloidineinbettung. Aufkleben und Entcelloidinieren der Schnitte nach Rubaschkin-Maximow (s. § 557) und Färben mit Azan nach § 1489. E r g e b n i s : Die »A«-Zellen treten als vereinzelte, mit leuchtend roten Granula versehene Zellen hervor, Während die »B«-Zellen gelblich-orange gefärbt sind und feine grau-orange gefärbte Körnchen enthalten. Einzelne mit blau gefärbtem Protoplasma versehene Zellen bezeichnet B l o o m als »D«Zellen. 2231. Mit Hilfe der Silbermethode von Gros-Schultze (§ 1793) können nach Fixierung in Formol oder Formol-Alkohol in den L.-I. schwarzgekörnte, argentophile Zellen dargestellt werden (»Silberzellen«), die nach F e r n e r (38) als unreife, noch nicht insulinbildende Elemente anzusehen und den a-Zellen gleichzusetzen sind. »Die Methode ist besonders geeignet, alle im Pankreas zu einem bestimmten Zeitpunkt der Entwicklung und Funktion vorhandenen ,ruhenden', d. h. noch nicht oder nicht mehr funktionierenden Inselzellen in sicherer Weise darzustellen.« F. Schilddrüse

2232. Die L e b e n d b e o b a c h t u n g der Schilddrüsenfollikel gelingt bei kleinen Tieren, z. B. bei der Maus, mit Hilfe der Auflichtfluoreszenzmikroskopie nach § 71 und 151 (s. H a r t o c h 32). 2233. Zur I s o l i e r u n g von Schilddrüsenfollikeln legt R i e n h o f f (29) Drüsenstücke für 3 Wochen in ein Gemisch von Eisessig 5 ccm, Glyzerin 12 ccm, Chloralhydrat 1 g, Formol (1 :9) 100 ccm und mazeriert dann 1 Stunde in 5°/oiger Salzsäure bei 60° C.

2234. Die A r t d e r F i x i e r u n g hängt von den bei der Untersuchung verfolgten Zielen ab. Für Übersichtspräparate lassen sich alle auch sonst gebräuchlichen Methoden verwenden. Kommt es darauf an, das Kolloid möglichst ungeschrumpft zu erhalten, so ist die Fixierung in Formol, in Kaliumbichromat— Formol oder bei kleinsten Stückchen auch in Flemmingscher Flüssigkeit zu empfehlen, während sublimat- und pikrinsäurehaltige Flüssigkeiten weniger geeignet sind. Sehr häufig ist die Herstellung von Gefrierschnitten von Vorteil, da die Schrumpfungserscheinungen oft erst beim Entwässern und Einbetten auftreten, zum minäesten aber dabei leicht verstärkt werden. Die Einbettung hat dementsprechend sorgfältig zu erfolgen. Bei Celloidineinbettung ist die

§ 2235—2240.

Schilddrüse. — Thymus

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S c h r u m p f u n g geringer als bei Paraffin. F ü r cytologische Untersuchungen an den Drüsenzellen kommen die in Kapitel 16 besprochenen einschlägigen Methoden in Betracht. 2235. B u c h e r (38) untersuchte das Verhalten des Schilddrüsenkolloids nach Fixierung in absol. Alkohol, Formol, Sublimat, Pikrinsäure und Osmiumsäure. Dabei zeigte sich, daß jeder dieser "Flüssigkeiten eine m e h r oder weniger charakteristische S c h r u m p f u n g s f o r m entspricht. Die S c h r u m p f u n g ist bei Fixierung in Osmiumsäure und in Formol am geringsten, stärker in Sublimat, nach Alkoholfixation b e t r ä g t sie bis zu 50"/o; am stärksten ist sie bei Pikrinsäure. Der isoelektrische P u n k t liegt bei Fixierung in Formol in einem PH-Bereich um 3,5, bei Alkohol um 4,0, bei Sublimat u m 4,5, bei Pikrinsäure u m 5,5. 2236. F ü r die F ä r b u n g von Übersichtspräparaten wie auch f ü r feinere Untersuchungen, z. B. ü b e r Sekretionsvorgänge, ist die A z a n f ä r b u n g sehr zu empfehlen, durch die auch das Bindegewebe sehr scharf dargestellt wird. Das dünnflüssige Kolloid w i r d durch sie blau, das eingedickte rot gefärbt. Bei Anwendung der T a n n i n - E i s e n m e t h o d e von S a l a z a r (s. § 2155) erweist sich das durch Azan blaugefärbte Kolloid als tannophil, das rotgefärbte als tannophob. Bei Färbung nach W a l l r a f f (s. § 2199) färbt sich ersteres blau, letzteres rot. Auch die Kolloidzellen sind tannophil. Die Granula aktiver Hauptzellen sind schwach tannophil ( H r u b y 41). 2237. F ü r die D a r s t e l l u n g d e s K o l l o i d s wird auch eine von K r a u s (14) angegebene Methode viel gebraucht. Die Fixierung muß möglichst frisch in Formol 1 : 9 erfolgen (wichtig!), am besten bei 37® C. Sorgfältige Paraffineinbettung. Schnittdicke 3—5ju. Färbung: 1. Einstellen der Schnitte in polychromes Methylenblau (s. § 1413) 6 Min. — 2. Abspülen in dest. Wasser. — 3. Differenzieren in einer 25°'/oigen Tanninlösung, bis keine gröberen Farbwolken m e h r abgehen. — 4. F ä r b e n in Säurefuchsin-Tanninlösung (s. § 2238), bis die Zellk e r n e scharf blau, das Bindegewebe rot erscheint. — 5. Gut auswaschen in dest. Wasser. — 6. N a c h f ä r b e n in einer 2°/oigen wäßrigen Säurefuchsinlösung 1 Min. — 7. Kurz abspülen in Wasser. — 8. Einstellen in eine l % i g e Phosphormolybdänsäure Va Min. — 9. Auswaschen in Wasser, abtrocknen, rasch durch absol. Alkohol in Xylol u n d Balsam. — Ergebnis: gerbsäurefestes Kolloid blaß rötlichviolett-tiefveilchenblau; fuchsinophiles Kolloid rötlich-gelb-gelbrot; f u c h sinophobes Kolloid lichtblau. Die feine Granulierung des gerbsäurefesten Kolloids ist ein durch die Formolfixierung bedingtes Kunstprodukt. An den Berührungsflächen der verschiedenen Kolloide können Mischfarben, z. B. grünlich-blau u. dgl., auftreten. 2238. Die S ä u r e f u c h s i n - T a n n i n l ö s u n g nach F r ä n k e 1 besteht aus einem Gemisch einer 0,5°/oigen wässer. Säurefuchsinlösung, einer 33°/oigen Tanninlösung und Glycerinäthermischung zu gleichen Teilen. 2239. Nach W a i 1 (22) und A b r i k o s o f f (24) sind die bei der Methode von Kraus zutage tretenden Farbunterschiede nicht durch chemische Unterschiede in der Art des Kolloids, sondern durch unspezifische physikalisch-chemische Einflüsse bedingt (s. auch § 2236, ferner B a r g m a n n 39). G . Thymus 2240. Zur G e w i n n u n g von Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e n fixiert man das möglichst schonend ohne Quetschung oder Z e r r u n g h e r a u s p r ä p a r i e r t e Organ in dem Sublimat-Gemisch von Stieve (s. § 333), das auch große Organstücke sehr gut durchdringt. Nicht sehr umfangreiche Organe werden am besten unzerstückelt fixiert, große Organe werden vorsichtig in ihre beiden Lappen getrennt und quer zur Längsachse eingeschnitten. Zur F ä r b u n g der Übersichtspräparate

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Inkretorische Organe

§ 2241—2247.

k o m m e n die allgemein üblichen Methoden wie Hämalaun-Eosin, Dominici usw. in Betracht, durch die der Gegensatz zwischen Rinde u n d M a r k gut h e r v o r gehoben wird. 2241. F ü r f e i n e r e c y t o l o g i s c h e U n t e r s u c h u n g e n ist die F i x i e r u n g in Hellyscher oder Maximowscher Flüssigkeit zu e m p f e h l e n (s. § 1388). Z u r F ä r b u n g dieser P r ä p a r a t e eignen sich besonders die f ü r hämatologische S t u d i e n g e b r ä u c h l i c h e n Methoden nach Maximow (§ 1396), Dominici (§ 726), Giemsa (§ 1401), P a p p e n h e i m (§ 1403); R e t i k u l u m u n d Hassallsche K ö r p e r c h e n w e r d e n auch d u r c h die Methode von Pasini (§ 1499) gut dargestellt. 2242. Z u r i s o l i e r t e n D a r s t e l l u n g d e s R e t i k u l u m s legt m a n kleine S t ü c k e einer f r i s c h e n T h y m u s 2—3 Tage in Drittelalkohol, ü b e r t r ä g t in Wasser u n d schneidet auf dem G e f r i e r m i k r o t o m . Die 30—40¡j, dicken Schnitte w e r d e n zunächst k r ä f t i g mit H ä m a l a u n g e f ä r b t u n d d a n n durch S c h ü t t e l n oder Auspinseln von den Lymphocyten b e f r e i t . 2243. Eine V e r ö d u n g der T h y m u s an Lymphocyten k a n n d u r c h H u n g e r ( H a m m a r 10 u. a.) oder durch R ö n t g e n b e s t r a h l u n g (R u d b e r g 07 u. a.) e r zielt w e r d e n (accidentelle Involution). 2244. Bei allen eingehenderen U n t e r s u c h u n g e n der T h y m u s ist zu beachten, d a ß das histologische Bild der T h y m u s d u r c h Alter wie durch L e b e n s b e d i n g u n gen stark b e e i n f l u ß t wird. Das gleiche gilt f ü r die Größe des Organes. Eine eingehende Analyse der T h y m u s ist d a h e r erst d a n n erreicht, w e n n neben den S t r u k t u r v e r h ä l t n i s s e n auch die Mengenverhältnisse der einzelnen Organanteile festgestellt ist. Die dabei a n z u w e n d e n d e Untersuchungstechnik w u r d e in v o r bildlicher Weise von H a m m a r (14, 24, 26a und b) entwickelt, auf dessen g r u n d legende A r b e i t e n eindrücklich verwiesen sei (vgl. auch § 904). Die H a m m a r s c h e U n t e r s u c h u n g s t e c h n i k ist in erster Linie der T h y m u s des Menschen angepaßt. F ü r das K a n i n c h e n w u r d e die U n t e r s u c h u n g s m e t h o d i k durch H a m m a r s Schüler S a n d e g r e n (17), G e d d a (21), B l o m u n d A d e r m a n (23) ausgearbeitet. H. Zirbeldrüse (Epiphysis) 2245. F ü r Übersichtsbilder genügt die F i x i e r u n g in einer der gebräuchlichsten Fixierungsflüssigkeiten wie Formol, Susa, Sublimat-Formol-Eisessig, Bouin u. dgl. mit nachfolgender H ä m a l a u n - E o s i n f ä r b u n g oder A z a n f ä r b u n g . Z i r b e l d r ü s e n älterer T i e r e b e d ü r f e n wegen der o f t sehr reichlichen K a l k e i n l a g e r u n g e n einer E n t k a l k u n g , die jedoch rasch vor sich geht. 2246. Die Darstellung der einzelnen Gewebskomponenten der Zirbel erfolgt n a c h den d a f ü r in den verschiedenen Abschnitten angegebenen Methoden. Die Astrocyten w e r d e n mit der Goldsublimatmethode von C a j a l (§ 1849) i m p r ä g niert. Die Gliafasern t r e t e n nach Susafixierung bei A z a n f ä r b u n g gut in rotem F a r b t o n h e r v o r . Auch dur'ch Eisenhämatoxylin lassen sie sich gut f ä r b e n . 2247. Die P i n e a l z e l l e n und ihre eigentümlichen Fortsätze w e r d e n am besten d u r c h die von R i o - H o r t e g a (23) d a f ü r angegebene Methode dargestellt. 1. F i x i e r u n g in F o r m o l 1 :10 (mindestens 2 Tage lang). — 2. Schneiden auf dem G e f r i e r m i k r o t o m . Schnitte in m e h r m a l s gewechseltem Wasser sorgfältig auswaschen. — 3. Einlegen in eine 2°/oige Silbernitratlösung, der auf 10 ccm 3 T r o p f e n reines P y r i d i n zugesetzt w e r d e n . Man e r w ä r m t die Schnitte in dieser Lösung f ü r 5—10 Min. auf 50° C u n d l ä ß t sie- d a n n einige S t u n d e n im B r u t s c h r a n k stehen; oder m a n beläßt sie s.tatt dessen, w a s u n t e r U m s t ä n d e n besser ist, 24 S t u n d e n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r in der Lösung. Die Schnitte sollen eine d u n k e l o c k e r b r a u n e T ö n u n g annehmen. — 4. Auswaschen in dest. Wasser, d e m

§ 2248—2252.

Zirbeldrüse. — Haut und Anhangsorgane

521

auf 10 ccm 2 Tropfen Pyridin zugesetzt sind. — 5. Übertragen in die in § 1862 angegebene Silbercarbonatlösung, der auf 10 ccm 3 T r o p f e n Pyridin zugesetzt werden. Man e r w ä r m t auf etwa 50°' C, bis die Schnitte sepiabraun sind. — 6. Auswaschen in gewöhnlichem oder dest. Wasser. — 7. Reduktion in Formol 1 : 10. — 8. Vergoldung in einer 0,2°/oigen Goldchloridlösung unter leichter E r w ä r m u n g , u m die F ä r b u n g zu verstärken und violette Töne zu bekommen. —• 9. Fixierung in 5°'/oiger Fixiernatronlösung. Auswaschen usw. 2248. F ü r die Darstellung von Zellstrukturen und Zelleinschlüssen, von kollagenem und argyrophilem Bindegewebe verwendet R i o - H o r t e g a f e r n e r noch die in § 1547—1550 angegebenen Tanninsilbermethoden.

34. KAPITEL

Haut und Anhangsgebilde der Haut A. Menschliche Epidermis 2249. Frisches geeignetes Material verschafft man sich am besten aus einer chirurgischen Klinik (z. B. von f r i s c h e n Amputationen nach Unglücksfällen, von plastischen Operationen od. dgl.). F ü r gewöhnliche Übersichtspräpar a t e genügt auch Leichenmaterial. Bei V e r w e n d u n g des Messertiefkühlers (s. § 520) lassen sich mit dem Gef r i e r m i k r o t o m auch von frischem, unfixiertem Material einschließlich des subk u t a n e n Fettgewebes schöne Schnitte gewinnen. 2250. Wie sonst ist auch bei der Haut die A r t der Fixierung f ü r das Gelingen einer Reihe von Färbemethoden von großer Bedeutung. M a r t i n o t t i (24) empfiehlt vor allem neutrales Formol ( S c h e r i n g ) ; zur Fixierung von verhornter Haut v e r d ü n n t er 8 ccm 40°/oiges Formol mit 92 ccm dest. Wasser (Dauer 5—8 Tage). Bei pathologisch v e r ä n d e r t e r Haut verwendet e r eine höhere Konzentration (1 Teil Formol + 4 Teile dest. Wasser). Bei Paraffineinbettung w i r d aus dem Formol direkt in 80®/oigen Alkohol übertragen. — F ü r eine Reihe von F ä r b u n g e n ist Fixierung in absol. Alkohol notwendig (siehe später). — F ü r Übersichtspräparate lassen sich die meisten der üblichen Fixierungsmethoden verwenden. 2251. Um ein Einrollen der Haut bei der Fixierung zu verhüten, ist es häufig notwendig, das zu fixierende Hautstück, unter Umständen schon vor der Entnahme, mit Nadeln auf eine mit Filtrierpapier belegte Kortyplatte oder Paraffinplatte aufzustecken. Bei behaarter Haut sind die Haare noch vor dem Herausschneiden der Hautstücke möglichst kurz abzuschneiden (mit einer Schere, nicht mit dem Rasiermesser). S c h a r p f f (26) empfiehlt kleine, mit Nickelnadeln versehene Hartgummiblöcke; die Nadeln derselben werden in die Haut eingedrückt; erst dann wird das Hautstück in Blockgröße umschnitten, von der Unterlage ab präpariert und mit dem Block in die Fixierungsflüssigkeit gebracht. Es bleibt dann bis zum abs. Alkohol auf dem Block aufgespannt. 2252. W i c h t i g i s t , d a ß d i e H a u t s t ü c k e n i c h t w o c h e n l a n g i m s t a r k p r o z e n t i g e n A l k o h o l (über 80tt/oig) l i e g e n , da sie in ihm mit der Zeit sehr h a r t werden. Will m a n Material uneingebettet a u f b e w a h r e n , so b r i n g t man es in einigen Tagen durch die Alkoholreihe in ein geeignetes ö l , wie Methylbenzoat, Zedernholzöl, Terpineol od. dgl., oder man läßt die P r ä p a r a t e in Formol 1 : 10 liegen.

522

Haut und Anhangsorgane

§ 2253—2259.

2253. In vielen Fällen, so z. B. bei den nachfolgend angegebenen Methoden von M a r t i n o t t i w e r d e n die in Formol fixierten P r ä p a r a t e nicht eingebettet, sondern auf dem Gefriermikrotom geschnitten. M a r t i n o t t i vermeidet dabei vor dem Schneiden ein Auswaschen in Wasser und f ä n g t auch die Schnitte in v e r d ü n n t e m Formol (1 : 10) auf. 2254. Große, umfangreiche, f ü r Übersichtszwecke dienende Hautstücke bettet man zweckmäßig in Celloidin ein. — Bei den speziellen Färbemethoden sind dagegen meist sehr d ü n n e Schnitte erforderlich; deshalb und wegen der oft s t a r k e n M i t f ä r b u n g des Celloidins in Teerfarbstoffen bettet man in diesen F ä l len besser in Paraffin ein, am besten nach dem Peterfi'schen V e r f a h r e n über Methylbenzoat-Celloidin u n d Benzol. Wichtig ist, daß die P r ä p a r a t e völlig entwässert sind, was sich bei Anwendung der Methylbenzoatmethode am Durehscheinendwerden leicht p r ü f e n läßt. Zu beachten ist, daß verhornte Haut langsamer entwässert wird als zahlreiche andere Organe. Auch die D u r c h t r ä n k u n g mit Paraffin erfordert längere Zeit. Schlecht d u r c h t r ä n k t e P r ä p a r a t e schneiden sich ebenso schlecht wie unvollständig entwässerte. Ich lasse Hautstücke, die 3—4 Tage mit Methylbenzoat-Celloidin vorbehandelt sind, 1—2 Stunden in Benzol (1—2mal wechseln) 2—3 Stunden in Benzol-Paraffin und hierauf 24 bis 48 Stunden in Paraffin bei 54® C. Selbst stark v e r h o r n t e Fußsohlenhaut schneidet sich dann ausgezeichnet. Von manchen Autoren wird empfohlen, die Hauptstücke aus schwachprozentigem Alkohol durch Aceton in Paraffin überzuführen, um dadurch den hochprozentigen Alkohol zu vermeiden. Für ffeinere Untersuchungen ist dieses Verfahren nicht ratsam. 2255. Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e f ä r b e m a n mit Hämalaun-Eosin oder Hämalaun-Congorot. S e h r farbenprächtige Bilder liefern die Azanfärbung, f e r n e r die Methode von Masson (§ 1496) und von Pasini (§ 1499) sowie deren Modifikationen. 2256. Zur I s o l i e r u n g v o n Z e l l e n d e r E p i d e r m i s , namentlich des S t r a t u m Malpighii behandelt S c h i e f f e r d e c k e r (86) kleine unfixierte Hautstückchen bei 40" C mit einer wässerigen, bei Z i m m e r t e m p e r a t u r gesättigten Lösung von P a n c r e a t i n u m siccum ( W i t t e ) . Nach 3—4 Stunden lassen sich dann die Zellen der Epidermis ohne Schwierigkeit abschaben u n d isolieren. Z u r A u f b e w a h r u n g ü b e r t r ä g t man in ein Gemisch von Wasser, Glycerin u n d 96°'/oigen Alkohol zu gleichen Teilen. 2257. Zur F ä r b u n g der Z e l l v e r b i n d u n g e n f ä r b t S c h u b e r g Schnittp r ä p a r a t e einige \Minuten in einem Gemisch von 0,3—1 g Dahlia, 12—20 ccm Eisessig und 80—85 ccm dest. Wasser. Hierauf auswaschen in Wasser, Fixieren der F ä r b u n g in 10°7oiger Tanninlösung 5 Minuten, auswaschen in Wasser, Nachb e h a n d l u n g mit l°/oiger Brechweinsteinlösung 5 Minuten auswaschen, Alkohol, Xylol, Balsam. Über die ebenfalls geeigneten Methoden von K o l o s s o w und W o r o n i n s . § 1287 und 1288. 2258. Die I n t e r c e l l u l a r l ü c k e n und S a f t b a h n e n lassen sich nach P a t z e l't (25) an formolfixierten Gefrierschnitten mit Hilfe der Thionin-Pikrinsäuremethode von Schmorl (s. § 1643) darstellen. 2259. Zur D a r s t e l l u n g der Epithelfasern eignet sich besonders das gewucherte Epithel an den Rändern von Kankroiden oder das Epithel von spitzen Kondylomen. Man k a n n sie aber auch an normaler Haut, z. B. von der F u ß sohle, Hohlhand usw. sehr schön darstellen. Die Verlaufsrichtung der Fasern tritt' am schönsten bei Untersuchung von Gefrierschnitten im polarisierten

§ 2260—2267.

Epidermis

523

L i c h t h e r v o r . H e i d e n h a i n (11) e m p f i e h l t e m b r y o n a l e H u f a n l a g e n , die e r in S u b l i m a t - E i s e s s i g oder in S u s a fixiert u n d m i t E i s e n h ä m a t o x y l i n f ä r b t . 2260. Z u r F ä r b u n g d e r E p i t h e l f a s e r n ist in e r s t e r L i n i e die W a s s e r b l a u - O r c e i n - E o s i n m e t h o d e von U n n a zu e m p f e h l e n . Sie gelingt n i c h t n u r n a c h F i x i e r u n g i n Alkohol, s o n d e r n a u c h n a c h F i x i e r u n g in F o r m o l alkohol, F o r m o l , O r t h , Helly, Susa. D i e A u s f ü h r u n g d e r F ä r b u n g e r f o l g t n a c h § 1290. — Ä h n l i c h e R e s u l t a t e g i b t a u c h die M e t h o d e v o n P a s i n i (§ 1499) u n d P a s i n i - W a l t e r (§ 1502). 2261. Bei einer zweiten Vorschrift zur Färbung der Epithelfasern färbt U n n a (28) 10 Minuten in der in § 1290 angegebenen Wasserblau-Orcein-Eosinmischung, "wäscht in Wasser ab und färbt 5 Minuten in Carbolfuchsin (1 g Fuchsin, 10 ccm abs. Alkohol, 2,5°/'oige Carbolsäure ad 100 ccm) oder 10 Minuten in Carbolgentianaviolett (1 g Gentianaviolett, 10 ccm abs. Alkohol, 2,5°/oige Carbolsäure ad 100 ccm). Dann Wasser, Alkohol, öl, Balsam. 2262. P a t z e 11 (25) empfiehlt zur Färbung der Epithelfasern das Heldsche Molybdänhämatoxylin (s. § 1875); man verdünnt 1 Tropfen der mindestens einige Wochen alten Farblösung mit 10—20 ccm dest. Wasser und färbt progressiv 6 bis 24 Stunden. Dann kurz auswaschen mit dest. Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. Die Epithelfasern treten metachromatisch in blaugrauem, stellenweise auch rötlichein Tone in ihrer Gesamtheit scharf hervor. 2263. G u t e R e s u l t a t e gibt a u c h die T a n n i n - S i l b e r m e t h o d e v o n R i o - H o r t e g a (17), d u r c h die sowohl E p i t h e l f a s e r n w i e auch die V e r b i n d u n g s f a s e r n z w i s c h e n E p i t h e l u n d B i n d e g e w e b e g u t d a r g e s t e l l t w e r d e n (s. § 1547). 2264. D u r c h diese M e t h o d e n sind die ä l t e r e n F ä r b u n g e n n a c h K. H e r x h e i m e r , K r o m a y e r u. a. m e h r oder w e n i g e r e n t b e h r l i c h g e w o r d e n . V o r b e d i n g u n g f ü r die A n w e n d u n g d e r l e t z t e r e n ist, daß das M a t e r i a l in A l k o h o l fixiert w u r d e . S c h n i t t d i c k e n i c h t ü b e r 5/j,. K. H e r x h e i m e r färbt 10 Minuten in Anilinwasser-Gentianaviolett (s. § 703), behandelt 1—2 Minuten in Jodjodkalilösung und differenziert in Anilinöl-Xylol (1:2). K r o m a y e r färbt 15 Minuten in Anilinwasser-Methylviolett 6 B und behandelt nur 1 Sekunde mit Jodjodkali. S. auch § 1426 ff. 2265. D a s Keratohyalin des S t r a t u m g r a n u l o s u m t r i t t m e i s t s c h o n bei g e w ö h n l i c h e r H ä m a l a u n f ä r b u n g i n t e n s i v b l a u g e f ä r b t h e r v o r . Noch s c h ä r f e r ist die F ä r b u n g d e r K ö r n e r , w e n n m a n z u e r s t m i t H ä m a l a u n od. dgl. k r ä f t i g ü b e r f ä r b t u n d d a n n f ü r 10 S e k u n d e n i n e i n e 0,05°/oige w ä s s e r i g e L ö s u n g v o n K a l i u m p e r m a n g a n a t e i n t a u c h t (U n n a). D i e K e r a t o h y a l i n k ö r p e r sind d a n n scharf b l a u s c h w a r z g e f ä r b t . N a c h d e r M e t h o d e v o n P a s i n i f ä r b t sich das K e r a t o h y a l i n r o t . K e r a t o h y a l i n gibt k e i n e N u x l e a l r e a k t i o n ( N ü r n b e r g e r , 28). 2266. K o n z e n t r i e r t e w ä s s e r i g e K r e s y l e c h t v i o l e t t l ö s u n g (Leonh a r d t & Co., M ü h l h e i m a. M.) f ä r b t die K e r a t o h y a l i n k ö r p e r n a c h F i x i e r u n g i n Z e n k e r s c h e r F l ü s s i g k e i t m e t a c h r o m a t i s c h r o t (F i c k ) . M a n f ä r b t 3—4 M i n u t e n , w ä s c h t m i t W a s s e r aus, zieht die F ä r b e m i t 90°/oigem A l k o h o l aus, bis das B i n d e g e w e b e e n t f ä r b t ist u n d b r i n g t r a s c h d u r c h abs. A l k o h o l in X y l o l u n d B a l s a m . Die H o r n s u b s t a n z f ä r b t sich d a b e i violett. 2267. N a c h W a l d e y e r (82) q u e l l e n die K e r a t o h y a l i n k ö r n e r in 1—5°/oiger K a l i l a u g e in d e r K ä l t e auf u n d w e r d e n d a b e i hell. I n d e r W ä r m e lösen sie sich gleichzeitig m i t d e n Zellen, i n d e n e n sie eingeschlossen sind ( P f e r d e h u f ) . D u r c h A m m o n i a k w e r d e n die K ö r n e r n i c h t v e r ä n d e r t , u n d m a n k a n n dieses R e a g e n s z u m N a c h w e i s des K e r a t o h y a l i n s m i t V o r t e i l g e b r a u c h e n , d a die m e i s t e n G e w e b e in A m m o n i a k d u r c h s i c h t i g w e r d e n . S a l p e t e r - u n d S a l z s ä u r e w i r k e n ä h n lich w i e A l k a l i e n . In E s s i g s ä u r e u n d Eisessig b l e i b e n die K e r a t o h y a l i n k ö r p e r l ä n g e r e Zeit u n v e r ä n d e r t ; d a die E s s i g s ä u r e die E p i t h e l i e n r a s c h z u m Q u e l l e n

524

Haut und Anhangsorgane

§ 2268—2272.

bringt und aufhellt, so k a n n man diese ähnlich wie Ammoniak vorteilhaft zum Nachweis des Keratohyalins benutzen. Eine l°/i>ige Natriumcarbonatlösung macht die größeren Schollen durchsichtiger und läßt sie aufquellen. Die größer e n Körner sind weniger widerstandsfähig wie die kleinen. In Alkohol, Chlorof o r m u n d Äther bleiben die Körner unverändert. In Glycerin-Pepsin-Extrakt u n d Trypsin lösen sie sich auf. 2268. Eleidin, das nach L o r b e r b a u m und U n n a (25) aus einem Gemisch v o n Cholesterin und Histon besteht, trifft man am reichlichsten in der Epidermis der Fußsohle oder Handfläche. Ein vollständiges richtiges Bild des Eleidins läßt sich nach U n n a (28) n u r aus unfixierten, frischen Gefrierschnitten gewinnen. Z u r Fixierung eignet sich nach M a r t i n o t t i Formol (Schering), Orthsche oder Bouinsche Flüssigkeit .während sublimathaltige Flüssigkeiten wie Zenker, Helly u. dgl. weniger empfehlenswert sind. Eleidin löst sich in Wasser, Glycerin und Ammoniak, im Überschuß von Salzsäure und Essigsäure sowie in konzentrierten Lösungen von Kupfersulfat, Zinksulfat und Ferrocyankalium. Es ist unlöslich in Kochsalz-, Magnesiumsulfat- und Ammonsulfatlösung, in Salpetersäure, Schwefelsäure, Oxalsäure, Pikrinsäure, Trichloressigsäure, Phosphorwolframsäure, Chromsäure, Ameisensäure und Formol ( H o e p k e 30). 2269. Zur F ä r b u n g des E l e i d i n s empfiehlt U n n a F ä r b u n g mit P i k r o Nigrosin. A u s f ü h r u n g : 1. konz. wässerige P i k r i n s ä u r e 5 Minuten. — 2. Nach A b spülen in Wasser l°/oige wässerige Nigrosinlösung 1 Minute. — 3. Abspülen in Wasser, Alkohol, öl, Balsam. — Ergebnis: Eleidin blauschwarz, Hornsubstanz leuchtend gelb. 2270. M a r t i n o t t i f ä r b t formolfixierte G e f r i e r s c h n i t t e (!) mit Hämalaun und differenziert zur Erzielung einer reiner K e r n f ä r b u n g kurz mit Kalialaun. Nach Auswaschen Nachfärbung in einer frisch bereiteten l°/oigen wässerigen Lösung von Azofuchsin, Chromazonrot, Tolanrot oder Rhodamin. Dann Abspülen in Wasser, differenzieren in abs. Alkohol, Xylol, Balsam. — E r g e b n i s : Eleidin rot, Kerne blau. 2271. Zur F ä r b u n g des Keratins empfiehlt M a r t i n o t t i u. a. folgende Methode: 1. Fixierung in Formol (s. § 2253), S c h n e i d e n a u f d e m G e f r i e r m i k r o t om. — 2. Auswaschen in dest. Wasser. — 3. F ä r b u n g mit Orange GMethyleosin-Wasserblau 5—10 Minuten (s. u.). — 4. Abspülen in Wasser. — 5. Entwässern in abs. Alkohol, Xylol, Balsam. E r g e b n i s : K e r a t i n blau, Eleidin goldgelb, Übergangssubstanz rot, Keratohyalin violett. H e r s t e l l u n g d e s F a r b g e m i s c h e s : Man bereitet getrennt folgende drei gut haltbare Farblösungen: I. Orange G 5 g dest. Wasser 100 ccm

II. Methyleosin 1 g III. Wasserblau 1 g dest. Wasser 80 ccm dest. Wasser 80 ccm 95°/oiger Alk. 10 ccm 95°/oiger Alk. 10 ccm Glycerin 10 ccm Glycerin 10 ccm Man löst die Farben zuerst unter Erwärmen in der angegebenen Wassermenge, läßt erkalten und setzt erst dann das Alkohol-Glyceringemisch zu. Zur Färbung mischt man 2 ccm Lösung I, 3 ccm Lösung II und 4 ccm Lösung III. In braunem Glas gut verschlossen lange haltbar. 2272. Zur distinkten Hervorhebung des Keratins ist auch C o r i g o r o t zu empfehlen. Man f ä r b t nach V o r f ä r b u n g der K e r n e mit Hämalaun nach Auswaschen 5—10 Minuten in einer konz. wässerigen Congorotlösung, spült mit Wasser gut ab und differenziert u n d entwässert in abs. Alkohol. Dann Xylol, Balsam. E r g e b n i s : K e r n e und Keratohyalin blau, Keratin dunkelrot. Weitere Färbemethoden bei M a r t i n o t t i (24).

§ 2273—2282.

Nagel — Haare

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B. Nagel 2273. Zur Gewinnung von Schnittpräparaten fixiert man die Endphalanx eines Fingers oder einer Zehe in Formol und entkalkt nach Alkoholbehandlung in Salpetersäure nach § 1613. Am besten schneidet man dann auf dem Gefriermikrotom. Will man einbetten, so kommt vor allem die Einbettung in Celloidin in Frage. 2274. Wenn die Einwirkung von Säure vermieden werden soll, so schneide man Material von Föten oder Neugeborenen. Sehr dicke, harte Nägel lassen sich durch Einlegen in Diaphanol schneidbar machen (s. § 2300 ff.). 2275. D i e E l e m e n t e d e s N a g e l s i s o l i e r t man in konz. Kalilauge, welche man bis zum Kochen erwärmt und abkühlt. Fetzen des weich gewordenen Nagels lassen sich dann auf dem Objektträger durch Andrücken des Deckglases isolieren. 2276. Zur Färbung verwendet man die im vorausgehenden Abschnitt angegebenen Methoden. C. Haare 2277. 'Zur H e r s t e l l u n g v o n S c h n i t t p r ä p a r a t e n fixiere man kleine Stücke von behaarter Haut, z. B. einer frischen Kopfhaut in Formol, Formolalkohol od. dgl. Am einfachsten schneidet man dann auf dem Gefriermikrotom, ev. nach Gelatineeinbettung, die besonders dann wünschenswert ist, wenn das die Haarzwiebeln bergende Bindegewebe locker gebaut ist. Beim Schneiden orientiert man den Block so, daß zuerst der Bulbus und zuletzt das fertige Haar vom Messer getroffen wird. Im frischen unfixierten Zustand läßt sich behaarte Haut bei Anwendung des Messertiefkühlers schneiden. — Die Einbettung erfolgt entweder in Celloidin oder über Methylbenzoat in Paraffin nach den in § 2254 angegebenen Zeiten. Oft nicht leicht ist die Orientierung der Schnittfläche, da man, um gute Präparate zu erhalten, das Haar entweder rein längs oder rein quer treffen soll. Bei Querschnitten darf man daher nicht parallel der Hautoberfläche schneiden, da das Haar die Haut in schräger Richtung durchdringt. 2278. Für H a a r e n t w i c k l u n g empfiehlt S t ö h r Teile der Stirnhaut eines 5—6monatigen Fptus in aufgespanntem Zustand (Korkplatte) zu fixieren; für Haarwechsel Längsschnitte des Nasenrückens 7V2monatiger Föten. 2279. T a s t h a a r e findet man in besonders schöner Ausbildung in der Oberlippe des Pferdes, der Katze und des Schweines. 2280. Zur Färbung der Haarschnitte lassen sich die gleichen Methoden verwenden wie bei der Untersuchung der Epidermis. Empfehlenswert ist ferner die Färbung mit Carmalaun-Pikro-Indigocarmin (s. § 718).

2281. Nach S c h a f f e r (14) färbt sich das Haaroberhäutchen (Epidermicula) nach Fixierung in Kochsalz-Sublimat und langem Liegen in Alkohol in Delafieldschem Hämatoxylin scharf blau. Fixiert man in Müllerscher Flüssigkeit und färbt mit Hämalaun, so färbt sich dagegen die innere Wurzelscheide blau.

2282. Die T r i c h o h y a l i n t r o p f e n in den Zellen der Huxleyschen und Henleschen Zellschicht werden im Gegensatz zum Keratohyalin in Hämalaun nicht gefärbt. Zu ihrer Darstellung empfiehlt sich folgende Methode von U n n a : 1. lVoige wässerige Bordeauxlösung 30 Sekunden; Abspülen in Wasser. — 2. Kernfärbung in Hämalaun 15 Sekunden; Wasser. — 3. Abs. Alkohol + 3 Tropfen 3°/oiger Ammoniaklösung 30 Sekunden. — 4. Alkohol, öl, Balsam. —• E r g e b n i s : Trichohyalin weinrot, Kerne blau.

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Haut und Anhangsorgane

§ 2283—2288.

Besonders schön wird das Trichohyalin nach meinen E r f a h r u n g e n auch durch die in § 664 angegebene Azophloxinlösung dargestellt. 2283. Zur gleichzeitigen Darstellung von W u r z e l s c h e i d e und T r i c h o h y a l i n f ä r b t U n n a (28): 1. 5 Minuten in l°/oiger wässeriger Nilblaulösung, Wasser. — 2. l°/oige Bordeauxlösung 1 Minute, Wasser. — 3. Alkalischer Alkohol, öl, Balsam. — E r g e b n i s : Wurzelscheide blau, Trichohyalin weinrot. Weitere Methoden bei U n n a (28). 2284. Isolierte Haare von Menschen u n d Tieren werden zunächst u n v e r ä n d e r t n a c h ' F o r m , F a r b e und etwaigen Verunreinigungen untersucht. D a n n wird das Haar in Seifenwasser gereinigt und in Äther entfettet. Hierauf Betrachtung m i t freiem Auge, Dickenmessung mit Okularmikrometer, mikroskopische Untersuchung in Wasser oder Glycerin; dabei tritt der M a r k s t r a n g und die in ihm enthaltene charakteristische Luftverteilung deutlich hervor. Störendes Pigment k a n n durch Bleichung mit 5—10°/oigem Perhydrol beseitigt werden. Auch A u f hellen durch 24stündiges Einlegen des trockenen Haares in Terpentinöl ist e m p fehlenswert. Bei hellen Haaren k a n n das Öl mit Indophenol g e f ä r b t werden. Zur Beobachtung der Doppelbrechung bringt m a n das Haar durch abs. Alkohol und Xylol in Balsam und untersucht dann in polarisiertem Licht. Die Zeichn u n g des Haaroberhäutchens (Epidermicula, fälschlich Cuticula) läßt sich a n Mikrophotographien von Gelatineabdrucken untersuchen. Näheres darüber bei L o c h t e (38). 2285. Zur Isolierung von Haaroberhäutchen und Rindenschicht mazeriert man das Haar in einem Uhrschälchen in heißer 17°/oiger Kalilauge. Bei Tieren zerfällt dabei der Markstrang in einzelne Scheiben. Auch vorsichtiges Erwärmen in konz. Schwefelsäure führt zum Ziel. Untersuchung in Wasser. 2286. Um die die Hohlräume jedes Haares erfüllende Luft zu entfernen, bringt F. W e r n e k e (16) die Haare auf dem Objektträger in etwas Glyzerin, bedeckt mit einem Deckglas und kocht vorsichtig über einer Spiritusflamme. Nach dem Kochen, das nicht zu lange fortgesetzt werden darf, da sonst Trübungen auftreten, wird umrandet. Eine eingehende Darstellung der Untersuchungstechnik des menschlichen und tierischen Haares bei L o c h t e (38). D. Cutis (Corium und Subcutjs) 2287. Zur Darstellung des Oberflächenreliefs der Cutis behandelt man frische Hautstücke einen bis m e h r e r e Tage mit 10°/oiger Kochsalzlösung, worauf sich die Epidermis unschwer abziehen läßt. 2288. F ü r große Übersichtspräparate aus gemischtem Gewebe ist die W e i c h c e l l o i d i n m e t h o d e von P e t e r s e n (29) sehr zu empfehlen, vor allem, wenn, wie z. B. bei Fingerlängsschnitten, auch schwer schneidbare Teile wie Nagel, entkalkter Knochen, Gelenke, Sehnen, Muskelbündel darin vorkommen. Benützt man Material, das durch Durchspülung fixiert ist, dann bleiben auch die lockeren Zwischenschichten gut erhalten. Die P r ä p a r a t e w e r d e n dazu zuerst wie bei gewöhnlicher Celloidineinbettung bis in 8%iges Celloidin gebracht und in diesem im Einbettungsgefäß geordnet. D a n n w i r d durch Einstreuen trockner Celloidinschnitzel weiter eingedickt und in Chloroformdämpfen geh ä r t e t . Dann aufgießen von 70°/oigem Alkohol u n d abwarten, bis die Masse d u r c h h ä r t e t ist, herausschneiden u n d a u f b e w a h r e n in 70°/oigem Alkohol. Vor dem Schneiden auf dem Gefriermikrotom wird der Block 24 S t u n d e n in fließendem Wasser gewässert. Schnittdicke f ü r Übersichtspräparate 40—80«.

§ 2289—2296.

Corium, Subcutis

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2289. Die Untersuchung des kollagenen und elastischen Bindegewebes der Cutis erfolgt mit Hilfe der in Kap. 19 angegebenen Methoden. J e nach den v e r folgten Zielen wird m a n dabei an. Z u p f p r ä p a r a t e n , unfixierten und fixierten Gefrier-, Celloidin- oder Paraffinschnitten arbeiten. Zur gleichzeitigen D a r stellung von K o l l a g e n , E l a s t i n und E 1 a c i n f ä r b t U n n a (28) Paraffinoder Celloidinschnitte von alkoholfixiertem Material in folgender Weise: 1. F ä r b u n g über Nacht in saurer Orceinlösung (Herstellung nach § 1556). — 2. G r ü n d liche E n t f ä r b u n g in 2°7oiger wässeriger Salzsäurelösung, hierauf direkt in abs. Alkohol zur weiteren Entfärbung. Wasser. — 3. Blaues Polychrom (Herstellung nach § 1415) 5 Minuten. — 4. In Wasser gründlich abspülen, bis keine blauen F a r b w o l k e n mehr abgehen. — 5. Konzentrierte Tanninlösung 30 Minuten. — 6. Gründliche Spülung in Wasser. — 7. Alkohol, Öl, Balsam. — E r g e b n i s : Kollagen bräunlich, Elastin orceinrot, Elacin blau. 2290. Gleichzeitige Färbung von K o l l a g e n und E l a c i n nach U n n a : 1. Blaues Polychrom 5 Minuten. — 2. Abspülen in Wasser. — 3. Konzentrierte Tanninlösung, der einige Tropfen einer l°/oigen Orangelösung zugesetzt sind: 5 Minuten. — 4. Abwaschen in Wasser, abs. Alkohol, öl, Balsam. — E r g e b n i s : Elacin blau, Kollagen gelb. 2291. Z u r Darstellung m e m b r a n a r t i g e r B i l d u n g e n a n B i n d e g e w e b s f a s e r n und zur S i c h t b a r m a c h u n g f e i n s t e r Fäserc h e n an Schweißdrüsen, Talgdrüsen usw. empfiehlt H e r x h e i m e r (15) f o l gende Methode: Fixierung in Formolalkohol. Möglichst dünne Schnitte werden 36 bis 48 Stunden bei 37°' C in Giemsalösung (2—3 T r o p f e n auf 1 ccm dest. Wasser) gefärbt. Auswaschen in dest. Wasser 1—2 Stunden. Differenzieren in einer 0,25°/oigen Tanninlösung (30 Minuten oder länger). Abtrocknen, Xylol, Balsam (zwischen dem Abtrocknen und dem Xylol schalte ich zur Entwässerung noch Terpineol ein). Man findet an jeder rotgefärbten Bindegewebsfaser noch a z u r blaue Konturen, die einen membranartigen Eindruck erwecken. 2292. Die Untersuchung des subkutanen F e t t g e w e b e s erfolgt nach den in Kap. 16, E dargestellten Methoden, die auch zur Darstellung des Sekretes d e r T a l g d r ü s e n heranzuziehen sind. Über die Untersuchung der H a u t p i g m e n t e s. Kap. 16, G. 2293. Die Gestalt der H a u t d r ü s e n (ekkrine und apokrine Schweißdrüsen, Talgdrüsen, Milchdrüse usw.) läßt sich sehr schön an dicken, mit Carmin d u r c h f ä r b t e n und nach Aurell (s. § 852 und 909a) aufgehellten Schnitten, wie auch an Mazerationspräparaten beobachten. Sehr oft lassen sich dadurch auch zeitraubende Rekonstruktionen ersparen. S. auch D a b e 1 o w (34 und 41). 2294. Zur Gewinnung von M a z e r a t i o n s p r ä p a r a t e n (z. B. von apok r i n e n Schweißdrüsen = a-Drüsen oder Achselstoffdrüsen) legt P e t e r (35) Hautstücke von etwa 2 cm 2 Fläche in konz. Salzsäure von 1,124—1,126 spez. Gew. und ü b e r t r ä g t nach 5—7 Stunden in dest. Wasser. Am folgenden T a g liegen nach Abschneiden des weißen Fettes die Knäuel der Drüsen im s u b k u tanen Gewebe leicht isolierbar vor. 2295. Bei der Untersuchung von Schnittpräparaten der Hautdrüsenorgane ist vor allem die Anwendung der Azanfärbung zu empfehlen. Eingehendes über die Haütdrüsenorgane in dem grundlegenden Werk von S c h a f f e r (40). 2296. Zur Darstellung der s e n s i b l e n wie der v e g e t a t i v e n N e r v e n der Haut und, der Hautorgane eignet bis besonders die Imprägnationsmethode von Gros-Schultze (s. § 1793), mit der z. B. J o h n (40) die Gefäß- und Schweißdrüsennerven der menschlichen Haut sehr schön darstellen konnte. Auch die Bielschowsky-Methoden, die Natronlauge-Silbermethode von Schultze (siehe*

528

Haut und Anhangsorgane

§ 2297—2300.

§ 1808) u n d a n d e r e in K a p . 24, B 3c a n g e f ü h r t e M e t h o d e n g e b e n g u t e R e s u l t a t e . Die g r ö ß e r e n E n d a p p a r a t e , w i e V a t e r - P a c i n i s c h e K ö r p e r c h e n , M e i ß n e r s c h e K ö r p e r c h e n usw., s i e h t m a n schon an g e w ö h n l i c h e n H ä m a l a u n - E o s i n p r ä p a r a t e n ; ü b e r i h r e f e i n e r e S t r u k t u r u n d i h r e B e z i e h u n g e n zu d e n N e r v e n f a s e r n e r h ä l t m a n a b e r n u r bei A n w e n d u n g einer der g e n a n n t e n M e t h o d e n A u f s c h l u ß . Für die Darstellung intraepithelialer Nerven ist das Epithel von Kalbsschnauze, Rinderschnauze oder Kalbsklauen zu empfehlen ( P i e p e r 41). 2297. F u n d s t e l l e n f ü r M e i ß n e r sehe K ö r p e r c h e n : die B i n d e g e w e b s p a p i l l e n d e r F i n g e r b e e r e ; f ü r H e r b s t sehe u n d G r a n d r y s c h e K ö r p e r c h e n : W a c h s h a u t u n d G a u m e n l e i s t e n des E n t e n s c h n a b e l s , e r s t e r e ü b e r a u s z a h l r e i c h a u c h in d e r Z u n g e des S p e c h t e s ( L u d w i g F e r d i n a n d v o n B a y e r n ) ; f ü r V a t e r - P a c i n i s c h e K ö r p e r c h e n : S u b c u t i s der H o h l h a n d , P a n k r e a s u n d Mesocolon d e r Katze, in l e t z t e r e m o f t schon m i t f r e i e m A u g e e r k e n n b a r ; f ü r T a s t s c h e i b e n , K r a u s e sehe E n d k o l b e n : Rüssel v o m S c h w e i n . Siehe a u c h S t ö h r (28). E. Tierische Hautdecke 2298. Z u r F i x i e r u n g d e r diitinhaltigen A u ß e n h ü l l e v o n W i r b e l l o s e n e i g n e n sich a m m e i s t e n G e m i s c h e v o n h o c h p r o z e n t i g e m A l k o h o l u n d Eisessig. So fixiert S c h e u r i n g (13) in e i n e m Gemisch v o n abs. A l k o h o l 48 ccm, F o r m o l 48 ccm u n d Eisessig 4 ccm. G u t e R e s u l t a t e gibt f e r n e r die in § 340 a n g e g e b e n e F l ü s s i g k e i t von G i 1 s o n u n d die C a r n o y ' s c h e F l ü s s i g k e i t . Die G e m i s c h e sind i m m e r e r s t u n m i t t e l b a r v o r G e b r a u c h h e r z u s t e l l e n . W e n n möglich, v e r w e n d e t m a n f r i s c h g e h ä u t e t e Tiere, d a bei i h n e n das S c h n e i d e n des noch n i c h t e r h ä r t e t e n C h i t i n s a m l e i c h t e s t e n gelingt. Bei h a r t e r C h i t i n h ü l l e N a c h b e h a n d l u n g n a c h § 2300 ff. Bei Herstellung von Totalpräparaten kleiner ehitinumkleideter Objekte, z. B. Insekten, empfiehlt es sich dieselben aus 80- oder 90°/oigem Alkohol in Terpineol zu übertragen, in dem etwa vorhandene Luftbläschen in Kürze verschwinden. Aus Terpineol (lmal wechseln) können sie dann direkt in Kanadabalsam eingelegt werden. Die Methode ist auch präparatorisch von Vorteil, da sich dadurch das Sprödwerden und Abbrechen der Extremitäten u. dergl., das bei Xylolbehandlung leicht eintritt, vermeiden läßt. 2299. Die E i n b e t t u n g e r f o l g t möglichst s o r g f ä l t i g in Celloidin o d e r ü b e r M e t h y l b e n z o a t - C e l l o i d i n u n d Benzol in P a r a f f i n . D a b e i ist zu b e a c h t e n , daß das C h i t i n v o m P a r a f f i n n u r l a n g s a m d u r c h d r u n g e n w i r d u n d d a ß sich u n v o l l s t ä n dig d u r c h d r u n g e n e s C h i t i n schlecht schneidet; eine S t u n d e zu w e n i g s c h a d e t h i e r m e h r w i e ein T a g zu viel. Ich lasse die O b j e k t e o f t 1—3 T a g e l a n g i m h e i ßen P a r a f f i n . 2300. Die E r w e i c h u n g v o n C h i t i n u n d a n d e r e n t i e r i s c h e n H a r t s u b stanzen, w i e K e r a t i n , T u n i c i n u. dgl. (z. B. v o n Igelstacheln, H u f h o r n , N a g e l s u b s t a n z ) gelingt m i t d e m v o n P. S c h u l z e (22) zu d i e s e m Z w e c k e i n g e f ü h r t e n Diaphanol ( = Chlordioxydessigsäure). S. a u c h § 2301. Anwendung Die O b j e k t e w e r d e n n a c h i h r e r F i x i e r u n g z u n ä c h s t bis z u m 96°/oigen A l k o h o l u n d d a n n w i e d e r z u r ü c k bis z u m 65°/oigen A l k o h o l g e b r a c h t . V o n h i e r k o m m e n sie in Diaphanol, das m a n i m D u n k e l n bei Z i m m e r t e m p e r a t u r in e i n e m m i t e i n g e f e t t e t e n S c h l i f f s t o p f e n v e r s e h e n e n G l a s e i n w i r k e n läßt. D u r c h e n t s p r e c h e n d e s A n s c h n e i d e n d e r O b j e k t e ist d a f ü r zu sorgen, d a ß die bei E i n w i r k u n g des D i a p h a n o l s e n t s t e h e n d e n G a s b l ä s c h e n e n t w e i c h e n k ö n n e n . Bei E n t f ä r b u n g des in w i r k s a m e n Z u s t a n d goldgelben D i a p h a n o l s m u ß dieses w i e d e r e r n e u e r t w e r d e n . W e n n die H a r t s u b s t a n z v o l l s t ä n d i g e r w e i c h t ist, w i r d

§ 2301—2303.

Tierische Hautdecke

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direkt in 65°/oigem Alkohol ausgewaschen und darin durch die Alkoholreihe über Methylenbenzoat-Celloidin u n d Benzol in Paraffin übertragen. Über die Herstellung des Diaphanols findet man bei D r a h n (26) genaue Angaben. Über die Anwendung des Diaphanols zur Bleichung von Pigmenten und von Osmiumschwärzung s. § 1120. 2301. Besser und schonender als Diaphanol w i r k e n C h l o r d i o x y d s a l p e t e r s ä u r e oder C h l o r d i o x y d s c h w e f e l s ä u r e , da sie im Gegensatz zur C102-Essigsäure ohne Quellungserscheinungen u n d u n t e r voller Erhaltung der Gewebestruktur arbeiten ( D r a h n 26). Z u r Bereitung dieser Flüssigkeiten mischt man vor Gebrauch 10 Teile wäßriger Chlordioxydlösung (Herstellung siehe § 2303 oder § 2303a) mit 1 Teil einer officinellen Salpetersäure ( = 25°/oig, spz. Gew. 1,145—1,148 = ca. 18,501 Be) bzw. mit 1 Teil konz. Schwefelsäure (spz. Gew. 1,84). — M o 11 e r (33) empfiehlt vor allem die Chlordioxydsalpetersäure. Anwendung: Die in Formol fixierten P r ä p a r a t e werden nach Alkoholbehandlung (wie § 2300) in die C102-Salpetersäure eingelegt, bis sie hinreichend erweicht sind und sich mit einer Nadel leicht durchstechen lassen (kann ev. Wochen dauern). Sobald die Flüssigkeit e n t f ä r b t ist, muß sie erneuert werden, da die Zersetzungsprodukte f ü r das Gewebe schädlich sind. Sodann überträgt man f ü r 12—24 Stunden in ein mehrmals zu wechselndes Gemisch von gleichen Teilen einer 2,5°/oigen wässerigen Natriumthiosulfatlösung und einer 5 a /oigen wässerigen Natriumnitratlösung. Hierauf Auswaschen in fließendem Wasser, Alkoholreihe usw. 2302. Zarte Objekte, bei denen es durch Erweichung der Hartsubstanz zu einer Verlagerung oder Deformierung kommt, bettet man zunächst in Celloidin ein und nimmt das Erweichen erst am Celloidinblock vor (M o l l e r ) . Im einzelnen v e r f ä h r t m a n folgendermaßen: 1. Fixieren. — 2. Einbetten in Celloidin. Härten beliebig in Chloroform oder Alkohol. — 3. Alkoholreihe bis zum 60°/oigen. Hierbei wird das Celloidin auf allen Seiten möglichst weit entfernt, so daß das Objekt nur noch von einem dünnen, etwa millimeterstarken Mantel umschlossen ist. — 4. Einlegen des Blockes in Chlordioxydsalpetersäure, bis genügende Erweichung eingetreten ist. — 5. Neutralisieren in 2,5°/oiger Natriumthiosulfatlösung + 5°/giger Natriumnitratlösung 8ä, 24 Stunden. Bei Trübung ist die Lösung zu erneuern. — 6. Auswaschen in fließendem Wasser 24 Stunden. — 7. Alkoholreihe bis zum 96°/oigen. — 8. Einlegen in Apäthys ölgemisch (s. § 460), bis die untergetauchten Blöcke völlig durchsichtig geworden sind (3—i Tage). Bei Trübung nochmals zurück in 96°/oigen Alkohol. 9. Benzol (2—6 Stunden). — 10. Benzolparaffin, Paraffin. — Mit Hilfe dieser Methode war es M o 11 e r möglich, von stark verhornten Vogelzungen lückenlose Serien von 3—6« herzustellen. 2303. Zur H e r s t e l l u n g der C h l o r d i o x y d l ö s u n g empfiehlt M o l l e r folgendes Verfahren, das sich durch seine Einfachheit auszeichnet: An Glasgefäßen benötigt man n u r ein Präparatenglas von ca. 1000 ccm und ein Becherglas von ca. 100 ccm Inhalt. In ersteres kommen 220 ccm dest. Wasser. In das Becherglas werden zu 12 ccm dest. Wasser allmählich u n d u n t e r U m r ü h r e n 44 ccm konz. Schwefelsäure zugesetzt. Erst nach völligem Erkalten dieser Lösung kommen dazu 12 g Kaliumchlorat (KCIO3, nicht zerreiben oder zerstoßen, explosiv!). Jetzt wird das Becherglas offen in das große Gefäß gesetzt und dieses gut verschlossen (Deckel mit Vaseline abdichten!). Die ganze Anordnung m u ß wegen Explosionsgefahr vor Sonnenlicht geschützt werden. A m besten stülpt m a n als Lichtschutz ü b e r das Präparatenglas einen Pappkarton. Nach 24 bis 34

E o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Auge

§ 2303a—2307.

36 Stunden hat das im Becherglas sich entwickelnde CIO2 genügend auf das umgebende Wasser eingewirkt. Das Becherglas wird herausgenommen und die tief goldgelb gefärbte Chlordioxydlösung aus dem Präparatenglas in eine braune Flasche mit vaselingedichtetem Schliffstopfen abgefüllt. Sie ist kühl und dunkel aufbewahrt längere Zeit haltbar. Die ganze Prozedur wird wegen der giftigen Dämpfe unter einem guten Abzug oder in einem unbenützten Raum vorgenommen. 2303a. Noch einfacher ist das Verfahren von T o t z e : Man mischt in einem Erlenmeyerkolben 150 g pulverisierte Oxalsäure vorsichtig mit 40 g chlorsaurem Kalium (nicht zerreiben oder schütteln, explosiv!), fügt 30 ccm dest. Wasser zu und erhitzt im Wasserbad auf 60° C. Das sich entwickelnde gasförmige Chlordioxyd wird in eine eisgekühlte Vorlage eingeleitet, die mit 500 ccm dest. Wasser (für Diaphanol mit 50 ccm 50°/oiger Essigsäure) gefüllt ist. Es bildet sich tiefgoldgelbe Chlordioxydlösung, die sofort in eine dunkle Vorratsflasche mit eingefettetem Schliffstopfen abgefüllt wird. Weiteres wie § 2301. 2304. Bei der Untersuchung der H a u t d e c k e d e r W i r b e l t i e r e kommen im allgemeinen die gleichen Methoden zur Anwendung wie bei der Untersuchung der menschlichen Haut. In einzelnen Fällen machen es aber besondere Hartgebilde wie H a u t k n o c h e n u. dgl. notwendig, die Präparate nach der Fixierung und Alkoholbehandlung durch Einlegen in Salpetersäure in einen schneidbaren Zustand zu bringen. So erfordert die Haut der Knochenfische und mancher Reptilien eine Entkalkung in Salpetersäure nach § 1613. Bei sehr hartem Hautpanzer kommt auch die Herstellung von Schliffpräparaten in Frage. Die den Hautknochenplättchen von Reptilien oft aufgelagerte Guanophorenschicht läßt sich im Bedarfsfall durch Einlegen in Kalilauge lösen. Eingehende Angaben über die Untersuchung der Reptilienhaut findet man bei W. J. S c h m i d t (10—14). Bei stark ausgebildeter H o r n s u b s t a n z verfährt man nach § 2301—2303. 35. KAPITEL

Auge A. Die Untersuchung des lebenden Auges 2305. Die Untersuchungsmethodik des Auges hat durch die Anwendung des Hornhautmikroskopes in Verbindung mit 'der Gullstrandschen Spaltlampe eine wesentliche Erweiterung erfahren. Die Darstellung der Technik der Spaltlampenmikroskopie fällt jedoch außerhalb des Rahmens dieses Buches; eine ausführliche Behandlung findet man bei A. V o g t (21) und L. K o e p p e (21). 2306. Bei Augen kleiner Tiere (insbesondere bei Insekten) läßt sich nach dem Vorgehen von H o m a n n mit Erfolg der Vertikalilluminator (s. § 63) zur mikroskopischen Beobachtung benutzen. Die Tiere werden dazu mit Äther betäubt, die Oberfläche des Auges zur Beseitigung störender Reflexe mit Anilin benetzt und mit einem schrägliegenden Deckglas bedeckt. Die besten Bilder erzielte H o m a n n bei Verwendung des Objektives 2 (Winkel) in Verbindung mit starken Okularen (Vergrößerung bis 200fach). Vermutlich läßt sich diese Untersuchungsmethode mit Hilfe des Leitzschen Ultropaks (s. § 64) wesentlich verbessern.

2307. Zur Vitalfärbung der verschiedensten Gewebsbestandteile des Auges machen K n ü s e 1 und V o n w i l l e r (23) folgende Angaben: Neutralrot färbt, in den Konjunktivvalsack gebracht, intra vitam perinucleär gelegene Körnchen der Zellen des Hornhautepithels; Brillantkresylblau durchdringt das Epithel, ohne es dauernd zu färben. Dagegen färbt es sämtliche Zellen des Binde-

§ 2308—2312.

Übersichtspräparat

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gewebes u n d die L y m p h g e f ä ß e ; Methylenblau tingiert die sich abschuppenden Epithelzellen u n d die N e r v e n s a m t i h r e r E n d a p p a r a t e (V o n w i 11 e r , 23). Z u r Technik g i b t K n ü s e 1 an, daß m a n am besten mit einer 1—2 J a h r e alten w ä s serigen 0,1—l°/oigen Methylenblaulösung f ä r b t (Methylenblau med. puriss.). F r i s c h e Lösungen sind ungeeignet, da sie s t a r k reizen. M a n instilliert entw e d e r n u r 1 T r o p f e n einer l°/oigen Lösung u n d läßt das A u g e 15—20 Minuten lang u n t e r einem O k k l u s i v v e r b a n d geschlossen h a l t e n oder m a n instilliert in k u r z e n Z w i s c h e n r ä u m e n eine l°/ooige Lösung. B e t r a c h t u n g mit H o r n h a u t mikroskop bei Beleuchtung m i t der Gullstrandschen Spaltlampe. B. Untersuchung des fixierten Auges 1. Übersichtspräparat

2308. D i e F i x i e r u n g d e s A u g a p f e l s i m g a n z e n gelingt am besten d u r c h I n j e k t i o n der Fixierungsflüssigkeit in die Blutbahn. M a n spült dazu erst die G e f ä ß e von den aa. carot. commun. aus mit Ringerlösung od. dergl. b l u t leer u n d l ä ß t d a n n die Fixierungsflüssigkeit nachfließen (s. § 212). Dabei w e r den die a u c h sonst üblichen Fixierungsgemische von Bouin, Heidenhain (»Susa«), Stieve, Helly, Carnoy od. dgl. v e r w e n d e t . Bei g e l u n g e n e r I n j e k t i o n l ä ß t sich das F o r t s c h r e i t e n der F i x i e r u n g an der H o r n h a u t sehr g u t verfolgen. Z u letzt legt m a n den Kopf in toto noch f ü r einige Zeit in die Fixierungsflüssigkeit. Nach Beendigung der F i x i e r u n g w i r d der B u l b u s sorgfältig freigelegt, exstirp i e r t und w e i t e r b e h a n d e l t . 2309. W e n n eine F i x i e r u n g d u r c h I n j e k t i o n nicht möglich ist, d a n n exstirp i e r t m a n bei größeren T i e r e n den Bulbus u n t e r sorgfältiger V e r m e i d u n g von Anstechen u n d Drücken, b e f r e i t ihn von Muskeln u n d B i n d e g e w e b e u n d legt ihn auf einer dicken Watteschicht in eine der oben g e n a n n t e n F i x i e r u n g s f l ü s sigkeiten. Das beliebte A u f h ä n g e n am F. opticus ist zu vermeiden, da es dabei leicht zu artifiziellen V e r ä n d e r u n g e n kommt. Bei kleineren Tieren fixiert m a n den Kopf o f t besser im ganzen u n d e n t f e r n t das Auge erst nach der F i x i e r u n g . Soii der Bulbus später in einer ganz bestimmten Richtung geschnitten werden, dann müssen beim Herauslösen desselben Orientierungsmarken angebracht werden, am einfachsten, indem man mit einer gekrümmten Nadel am dorsalen Pol einen einfachen, am lateralen Pol einen doppelten Faden anbringt und knotet. 2310. B ü c k l e r s fixiert den Bulbus f ü r 24 S t u n d e n in Susa (s. § 344). W e n n der G l a s k ö r p e r selbst nicht e r h a l t e n bleiben muß, so ist es ratsam, a u ß e r d e m noch mit S o r g f a l t soviel Fixierungsflüssigkeit in den B u l b u s einzuspritzen, bis seine W a n d u n g p r a l l gespannt ist. Die Nadel soll fein u n d scharf sein und die Sklera an unwichtiger Stelle in langsam b o h r e n d e r B e w e g u n g s c h r ä g d u r c h d r i n g e n . Ist die Einspritzung nicht möglich, d a n n E r ö f f n u n g der V o r d e r k a m m e r d u r c h Abschneiden einer großen K a l o t t e mit Hilfe eines äußerst s c h a r f e n Rasiermessers. 2311. V e r h o e f f empfiehlt als Fixierungsflüssigkeit für ganze Bulbi ein Gemisch von: Formol 10 ccm, 95°/oiger Alkohol 48 ccm, Pikrinsäure 1 g, Wasser 36 ccm. Das Auge bleibt 48 Stunden oder länger in der Flüssigkeit und wird dann, ohne zu wässern, direkt in 70°/oigen Alkohol gebracht. Celloidineinbettung. Die Form des Bulbus soll bei dieser Methode ohne Ablösung der Retina sehr gut erhalten bleiben. 2312. Die Müllersche Flüssigkeit, die für die Fixierung des Augapfels früher sehr beliebt war, wird jetzt nur noch für ganz spezielle Zwecke angewandt, da sie sehr langsam eindringt (ein menschliches Auge benötigt z. B. 3 Wochen) und viele Teile schlecht fixiert. Besser ist das Resultat bei Zusatz von 5—10°/o Formol 34*

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Auge

§ 2313—2317.

= Orthsche Flüssigkeit, welche ein menschliches Auge in 4 bis 5 Tagen durchfixiert. 2313. Die N a c h b e h a n d l u n g richtet sich nach der angewandten Fixierungsmethode; sie ist bei den betreffenden Methoden nachzusehen. Sie hat, w e n n man Ablösungen der einzelnen Schichten vermeiden will, besonders sorgfältig und schrittweise zu erfolgen. 2314. Die E i n b e t t u n g erfolgt, wenn Schnitte durch das ganze Auge beabsichtigt sind, am besten in Celloidin. Vor dem Einlegen in die Celloidinlösung m u ß der Bulbus an 2—3 Stellen durch A b t r a g e n kleiner Kappen geö f f n e t werden. F ü r gewisse Fälle ist auch Gelatineeinbettung (nach § 469) zu •empfehlen (s. G r ä f f 18). Auch hiebei muß der Bulbus geöffnet werden, da a n d e r n f a l l s die Gelatine nicht eindringen kann. — Bei Paraffineinbettung v e r f ä h r t man nach § 392 (Schmelzpunkt des Paraffins am besten 55—56° C). 2315. Die F ä r b u n g der Übersichtspräparate erfolgt nach einer der allgemein üblichen Färbemethoden, wie z. B. Hämalaun-Eosin, van Gieson-Hansen, C a r m a l a u n mit Gegenfärbung durch Lichtgrün, Bleu de Lyon oder Pikroblauschwarz, alles Methoden, bei welchen das Celloidin m e h r oder weniger ungef ä r b t bleibt. 2. Glaskörper

2316. Zur U n t e r s u c h u n.g d e s G l a s k ö r p e r s i n f r i s c h e m Z u s t a n d entnimmt S t u d n i c k a (33) mittels einer Schere ein höchstens 5 m m breites Stückchen u n d legt es auf einige Minuten in 3—lOmal verdünnte, gelöste chinesische Tusche feinster Art. Dann kurz abspülen in Wasser und b e decken mit Deckglas (evtl. Deckglasfüßchen, u m Druck zu vermeiden). Die S t r u k t u r e n t r e t e n an günstigen Stellen grau g e f ä r b t hervor. Nach St. stellt der Glaskörper ein im Prinzip zellfreies Gewebe dar, das ein persistierendes, primäres Mesostroma vorstellt. 2317. Zur F i x i e r u n g d e s G l a s k ö r p e r s eignet sich besonders folgende von S z e n t - G y ö r g y i (14) angegebene Flüssigkeit, die auch f ü r Übersichtspräparate a n w e n d b a r ist: 4°/oige wässerige Sublimatlösung 100 ccm, Aceton 125 ccm, Eisessig 5 ccm, Formol 40 ccm. Die Vereinigung der Komponenten darf erst unmittelbar vor Gebrauch erfolgen. Kleine Augen läßt m a n 2—3 Tage, größere 6—7 Tage in dem Gemisch, wonach man auf je 100 ccm weitere 50 ccm Aceton hinzufügt, und das Objekt noch 1—2 Tage bzw. 3—4 Tage in der Lösung beläßt. Nach der F i x i e r u n g hängt man das Objekt direkt in reinem konz. Aceton f ü r 3—4 Tage auf, wobei man dasselbe am 2. Tag e r n e u e r t und auf den Boden des Gefäßes zur Entwässerung wasserfreies Calciumchlorid gibt. Hierauf Ä t h e r Alkohol und Celloidin (2-, 4-, 6°/oig, je 3 Tage). Vor der Übertragung in das Celloidin schneidet m a n vom Auge mit einer scharfen Rasierklinge ein bis zwei seitliche K u p p e n ab. Bei großen Augen (z. B. Mensch) d u r c h t r ä n k t man, um S c h r u m p f u n g e n zu vermeiden, nur mit 1,2- und 3°/oiger Lösung. Nach genügender D u r c h t r ä n k u n g stellt m a n die zur Einbettung dienende, mit Celloidin gef ü l l t e Papierschachtel zur E r h ä r t u n g bis nahe an den Rand direkt in Chloroform. F ü r die Untersuchung des Glaskörpers benutzt man am besten 150—200//, dicke Schnitte. Mußte m a n in 3°/oigem Celloidin einbetten, so ist die Konsistenz noch zu gering. Man n i m m t daher den erstarrten Block aus der Schachtel, löst ringsherum die das Auge umgebende Celloidinschicht ab, schneidet die Hornh a u t mit einer Rasierklinge weg und entfernt d u r c h einen Einschnitt in die Iris auch sorgfältig die Linse. Dann spült man in Äther-Alkohol ab, bringt in

§ 2318—2324.

Glaskörper. — Hornhaut

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8°yoiges Celloidin und bettet hier ein (Härtung durch Chloroform). In diesem festen Rahmen läßt sich das Auge dann gut schneiden. Man kann auch versuchen, den in 3°/oiges Celloidin eingebetteten Block ohne Umbetten auf dem Gefriermikrotom zu schneiden (nach der Weichcelloidinmethode Petersens). 2318. Z u r F ä r b u n g d e r F i b r i l l e n d e s G l a s k ö r p e r s eignet sich nach Szent-Györgyi besonders das M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n von Held (s. § 1875), das das Celloidin nicht mitfärbt. Man v e r d ü n n t die mindestens zwei Wochen alte Lösung mit der lOfachen Menge dest. Wassers, f ä r b t 24 Stunden u n d wäscht mehrere Stunden in dest. Wasser, Alkohol, Xylol, Balsam. Auch F ä r b u n g in Bleu de Lyon (s. § 719) liefert gute Resultate, w ä h r e n d sich bei anderen Anilinfarben das Celloidin stark mitfärbt. Weniger f ä r b t sich Photoxylin, bei dem sich das V e r f a h r e n in der gleichen Weise wie bei der Celloidineinbettung gestaltet. 2319. Sehr gute Resultate gibt nach Sz.-G. auch die, Versilberung der Fibrillen nach einer von L e n h o s s e k angegebenen Methode. Das frische Auge k o m m t dazu in ein Gemisch von Formalin 20 ccm, dest. Wasser 80 ccm, Argent. nitric. 1,5 g (täglich frisch erneuern). Kleine Augen (Schlange, Eidechse) w e r den darin 7 Tage, größere (Frosch, Meerschweinchen) 9 Tage behandelt. Hierauf w i r d in Pyrogallol-Merck 1,5 g; Formalin 0,5 ccm; dest. Wasser 100 ccm reduziert (24 Stunden, viel Flüssigkeit, mehrmals erneuern) u n d nach g r ü n d lichem Waschen (24—48 Stunden) rasch in Celloidin oder besser in Gelatine eingebettet. Sz.-G. gibt f ü r letzteren Fall eine eigene Methode an. Doch scheint mir auch die in § 471 angegebene gangbar. F ü r große Augen ist die Silbermethode nicht geeignet. 3. Hornhaut (Cornea) 2320. Die H o r n h a u t kleinerer Tiere kann, frisch ausgeschnitten, in einer indifferenten Flüssigkeit oder in Kammerwasser, das man durch Einstich einer fein ausgezogenen Kapillarröhre in die vordere Augenkammer gewinnt, u n t e r sucht werden. 2321. Das v o r d e r e H o r n h a u t e p i t h e l wird am besten durch Einlegen des ganzen Augenapfels in die Fixierungsflüssigkeit (z. B. Susa, Bouin, Helly) fixiert. Erst nach Fixierung und Auswaschen schneidet man mit einem scharfen Rasiermesser die H o r n h a u t vom Bulbus ab. F ü r Mazerationspräparate v e r w e n d e man Drittel-Alkohol (s. § 1270) oder stark v e r d ü n n t e Osmiumsäure (s. § 1273). 2322. Das h i n t e r e ( D e s c e m e t sehe) H o r n h a u t e p i t h e l k a n n m a n durch Versilberung und nachträgliche K e r n f ä r b u n g mit Carmin darstellen. 2323. U m das D e s c e m e t sehe E p i t h e l z u i s o l i e r e n , umschneidet m a n bei einem frisch getöteten Tier den H o r n h a u t r a n d , krempelt die h e r a u s genommene Cornea u m und taucht sie auf 5 bis höchstens 10 Minuten in S u blimat-Eisessig oder Flemmingsche Lösung. Das fixierte Epithel läßt sich d a n n mit einem Pinsel leicht in größeren oder kleineren Stücken ablösen. Weitere Behandlung mit Alkohol. F ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin.- Im Cytoplasma der Epithelzellen sieht man häufig Netzapparate, Phormien ( B a l l o w i t z 00), die d e m Golgischen Binnenapparat entsprechen. Besonders günstiges Objekt: Katze. 2324. Die G r u n d s u b s t a n z d e r H o r n h a u t läßt sich nach Mazeration in Kalkwasser, ü b e r m a n g a n s a u r e m Kalium u. dgl. in Lamellen u n d F i brillen zerlegen ( R o 11 e 1 1 , 72). In Wasser quellen die Fasern der H o r n h a u t grundsubstanz auf.

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Auge

§ 2325—2335.

2325. Z u r F ä r b u n g d e r H o r n h a u t l a m e l l e n benutzt m a n die f ü r kollagenes Bindegewebe üblichen Methoden. Elastische F a s e r n w e r d e n mit O r cein oder Resorcinfuchsin dargestellt. 2326. Die D a r s t e l l u n g d e r f i x e n H o r n h a u t z e l l e n ( H o r n h a u t körperchen) k a n n durch Quellungsversuche am frischen P r ä p a r a t , d u r c h Metalli m p r ä g n a t i o n e n wie d u r c h F ä r b u n g erfolgen. 2327. Im e r s t e r e n F a l l b r i n g t m a n die frisch e n t n o m m e n e H o r n h a u t eines Frosches in einen T r o p f e n K a m m e r w a s s e r (Descemetsche Epithel auf die Deckglasseite), legt das Deckglas auf einen ausgeschliffenen O b j e k t t r ä g e r u n d u m r a n d e t . Nach einiger Zeit quellen die H o r n h a u t f a s e r n auf, w o d u r c h eine Änder u n g im Lichtbrechungsvermögen zustande k o m m t u n d die Hornhautzellen s a m t i h r e n protoplasmatischen A u s l ä u f e r n gut sichtbar w e r d e n . 2328. Z u r V e r s i l b e r u n g der H o r n h a u t k ö r p e r ätzt m a n die vom vorder e n Epithel b e f r e i t e H o r n h a u t am b e t ä u b t e n Tier (Frosch) mit d e m Lapisstift. Schneidet m a n d a n n die H o r n h a u t aus u n d ü b e r t r ä g t sie in Wasser, so erschein e n alsbald die H o r n h a u t k ö r p e r c h e n einschließlich i h r e r A u s l ä u f e r hell auf d u n k l e m G r u n d e : n e g a t i v e V e r s i l b e r u n g ( R a n v i e r 81). 2329. Läßt .man die Präparate einige Tage in Wasser liegen, so entfärbt sich die Grundsubstanz, während die Körperchen dunkel werden: p o s i t i v e V e r s i l b e r u n g ( R a n v i e r 81). 2330. Bei größeren Tieren kann die Hornhaut (in Narkose!) ebenso behandelt werden. Wegen der Dicke der Hornhaut fertigt man aber bei ihnen nach der Ätzung und Tötung des Tieres mit dem Rasiermesser Flachschnitte an. 2331. Z u r V e r g o l d u n g der Hornhautzellen, wobei häufig auch die N e r v e n dargestellt werden, legt man die H o r n h a u t eines Frosches f ü r 5 M i n u t e n in Z i t r o n e n s a f t (s. § 1906) u n d ü b e r t r ä g t d a n n f ü r 15 Minuten in eine l°'/oige Lösung von Goldchloridkalium. Hierauf r e d u z i e r t m a n 1—2 Tage i m Tageslicht in a n g e s ä u e r t e m Wasser (2 T r o p f e n Eisessig auf 30 ccm dest. Wasser) ( R a n v i e r 89). 2332. Die H o r n h a u t von großen Säugetieren (z. B. Katze) vergoldet m a n nach L ö w i t (s. § 1905), ü b e r t r ä g t sie nach d e m Waschen in 70°/oigen Alkohol u n d spaltet sie nach einigen Minuten mit zwei Pinzetten d u r c h Anfassen a m Rande u n d Auseinanderziehen in möglichst d ü n n e Lamellen, die m a n d u r c h die Alkoholreihe u n d Xylol in Canadabalsam ü b e r t r ä g t . 2333. D a r s t e l l u n g d u r c h T u r n b u l l b l a u ( L e b e r ) . Der Bulbus (oder Kopf) eines Frosches wird in eine l°/oige Lösung von Ferrosulfat eingelegt; nach 15 Minuten wird kurz in dest. Wasser getaucht und nach Abschaben des Hornhautepithels in eine l°/oige Lösung von Ferrizyankalium übertragen. Nach einigen Minuten treten die Hornhautkörperchen weiß auf blauem Untergrund hervor. Einlegen in Glyceringelatine. 2334. Z u r D a r s t e l l u n g d u r c h F ä r b u n g fixiert R. K r a u s e einen Froschkopf in toto in Bouinscher Flüssigkeit, schneidet die H o r n h a u t mit dem Rasiermesser ab, wässert eine Stunde u n d beizt und f ä r b t wie bei einem gewöhnlichen Schnitt in Eisenhämatoxylin. A m nächsten T a g w i r d differenziert, bis das P r ä p a r a t durchsichtig zu w e r d e n beginnt, ausgewaschen, entwässert u n d in Xylol ü b e r t r a g e n . Hier wird zunächst das v o r d e r e Epithel weggekrazt. die G r u n d s u b s t a n z in Lamellen zerlegt u n d eingebettet. E r g e b n i s : Hornh a u t z e l l e n einschließlich i h r e r A u s l ä u f e r g r a u bis schwarz auf hellem U n t e r grund. 2335. Die N e r v e n d e r H o r n h a u t werden am besten nach Bielschowsky (s. § 1912; B o e k e 25) oder Gros-Schultze (s. § 1793; R e i s e r 35) dargestellt. Mit Spaltlampe und Hornhautmikroskop sind sie auch am Lebenden sichtbar ( V o g t

§ 2336—2344.

Sklera, Iris, Ciliarkörper, Linse

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30). Auch bei vitaler Methylenblaufärbung lassen sie sich gut beobachten (siehe K n ü s e l 23). a) L e d e r h a u t ( S k l e r a ) 2336. Die S k l e r a wird nach den f ü r Bindegewebe gebräuchlichen Methoden behandelt. Bei Tieren mit Knocheneinlagerungen (z. B. beim Vogel) m u ß e n t k a l k t werden. b) R e g e n b o g e n h a u t

(Iris)

2337. Um die Iris auf dem jeweiligen vitalen Kontraktionszustand zu fixieren, empfiehlt H e e r f o r d t die Injektion von Formol in die vordere Kammer. 2338. Bei pigmentierten Augen m u ß vor der A u s f ü h r u n g feinerer Untersuchungen das Pigment e n t f e r n t werden. Man v e r f ä h r t dazu nach der in § 1119 angegebenen Methode von Kopsch. Auch naszierendes Chlor (s. § 1118) oder Diaphanol (s. § 1120 ff.) k a n n zur E n t f ä r b u n g des o f t recht widerstandsfähigen Pigmentes benutzt werden. Die Bleichung nach Lustgarten-Pal (s. § 983) ist dagegen weniger empfehlenswert; sie muß nicht selten mehrmals wiederholt w e r den und greift dann die S t r u k t u r des P r ä p a r a t s an. 2339. Am bequemsten ist es, die Untersuchung an den Augen albinotischer Tiere vorzunehmen (z. B. weiße Maus oder weißes Kaninchen). Man unterlasse nicht, die Iris auch an gut orientierten Flachschnitten zu untersuchen. Zur elektiven Hervorhebung der Muskelbündel ist die Säurealizarinblau-Phosphorwolframsäuremethode nach Neubert sehr geeignet (s. § 1730). c) C i l i a r k ö r p e r .

Chorioidea

2340. Auch h i e f ü r verwendet man mit Vorteil Augen albinotischer Tiere. Der A u f b a u der Chorioidea bleibt am besten bei Fixierung durch Injektion (s. § 212 und 2308) erhalten. E n t f e r n u n g des Pigmentes wie in § 2338. 2341. Die B 1 u t g e f ä ß e d e r A d e r h a u t können durch Gelatine- oder Tuscheinjektionen (s. § 1968 ff.), wie auch durch L u f t h ü l l u n g (s. § 1991 ff.) zur Darstellung gebracht werden. Ausgezeichnete Bilder bei P a s s e r a (96, 97). 2342. Die Fasern der Z o n u l a Z i n i i (Fixierung: Susa oder Sublimat-Formol-Eisessig; Einbettung: Celloidin-Paraffin) w e r d e n sehr gut mit Orcein oder R e s o r z i n f u c h s i n gefärbt, f e r n e r durch Molybdänhämatoxylin nach Held (s. § 1875) oder mit der Weigertschen Neurogliafärbung (§ 1845). d)

Linse

2343. Zur Fixierung der Linse ist besonders das von C. R a b 1 (94, 00) h i e f ü r angegebene Platinchlorid-Sublimat (s. § 318) zu empfehlen. Erst vor Gebrauch mischen; Fixierungsdauer 24 Stunden. Nach 12 Stunden Kalotten. Auch Fixier u n g in Susa (§ 344) gibt gute Resultate. 2344. Die Linse ausgewachsener Tiere läßt sich am besten nach Celloidineinbettung schneiden; bei Einbettung in Paraffin (Schmp. 50—52°'C) v e r f ä h r t man nach der Methode von Péterfì (s. § 392). Wenn die Schnitte sehr stark splittern, dann überstreicht m a n die Schnittfläche des Paraffinblockes nach jedem Schnitt mittels eines weichen Pinsels mit heißem Paraffin. Es wird auch empfohlen, die Schnittfläche des Paraffinblockes 1—2 Min. lang mit dest. Wasser zu bedecken, wonach sich 2—3 dünne Schnitte abziehen lassen. Bei Linsen älterer Tiere ist es oft nötig, den sog. Kern der Linsen auszubohren (C. R a b 1). Nicht selten lassen sich von schwer schneidbaren Linsen mit dem Gefriermikrotom noch b r a u c h b a r e Schnitte herstellen.

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Auge

§ 2345—2351.

2345. Zur F ä r b u n g der Linsenschnitte ist neben den andern gebräuchlichen Methoden besonders die Azanmethode zu empfehlen, die sehr schöne, klare Bilder gibt. 2346. Zur I s o l i e r u n g d e r L i n s e n f a s e r n v e r w e n d e t L e v i (04) eine 1—2°yoige Natriumfluoridlösung. Sehr gut gelingt sie auch mit dem Ranvierschen Drittel-Alkohol. Man legt dazu die frisch entnommene Linse in ca. 50 ccm Drittel-Alkohol, eröffnet nach 2 Stunden durch Anstechen die Linsenkapsel, zieht diese ab und läßt die Linse noch weitere 24 Stunden im Drittel-Alkohol liegen. Hierauf wird auf dem Objektträger in Glyzerin zerzupft, in etwas Carmalaun gefärbt und in Glyceringelatine eingeschlossen. Man studiere die verschiedenen Formen der Linsenfasern, vor allem beim Fisch und Säugetier. e) N e t z h a u t ' (Retina) 2347. F ü r Ü b e r s i c h t s p r ä p a r a t e der Netzhaut wie auch f ü r P r ä p a r a t e zur Untersuchung ihres feineren A u f b a u e s ist zumal bei größeren Tieren in erster Linie die Fixierung durch Injektion in die Blutbahn zu empfehlen, da bei den auf gewöhnliche Weise in toto fixierten Bulbi infolge des Widerstandes, den die derbe Sklera dem Eindringen der Fixierungsflüssigkeit entgegensetzt, der Erhaltungszustand der Retina meist n u r mangelhaft ist. Sind kleinere Stücke hinreichend, so halbiert man den frischen Bulbus durch einen ä.uatorialen Schnitt, e n t f e r n t den Glaskörper und legt in die betreffende Fixierungsflüssigkeit ein. 2348. Als Fixierungsflüssigkeit kommen je nach den beabsichtigten Methoden Formol, Trichloressigsäure- oder Sublimatgemische, Bouinsche Flüssigkeit, Osmiumsäuregemische usw. in Betracht. K o 1 m e r (09) empfiehlt ein frisch bereitetes Gemisch aus gesättigter wässeriger Kaliumbichromatlösung 40 ccm, 10°'/oiges Formol 40 ccm, Eisessig 10 ccm. Bei Säugetieren können noch je 10 ccm einer 500'/oigen Trichloressigsäurelösung und einer gesättigten wässerigen Uranylacetatlösung zugesetzt werden. Nach 12—24 Stunden wechseln und ebensolange einlegen in die gleiche Lösung ohne Trichloressigsäure und U r a n ylacetat. Dann auswaschen in fließendem Wasser, Alkoholreihe, Celloidin- oder Paraffineinbettung. 2349. Beim Studium der Retina begnüge man sich nie mit Querschnitten, sondern fertige auch gut orientierte F l a c h s c h n i t t e an. Mit Recht b e m e r k t W. K r a u s e , daß man, ohne Flachschnitte untersucht zu haben, schwerlich zu einer richtigen Vorstellung z. B. über den Bau der Zwischenkörnerschichc gelangen kann. 2350. Einen sehr guten Überblick über die Anordnung und S t r u k t u r der S t ä b c h e n - und Z a p f e n s c h i c h t gewinnt m a n bei S c h n i t t f ä r b u n g mit Azan (Fixierung in »Susa«), Empfehlenswert ist auch die F i x i e r u n g nach Kolm e r (s. § 2348) mit nachfolgender F ä r b u n g mit Eisenhämatoxylin, wobei sich die Sekretkörnchen gut darstellen lassen. 2351. Um den Einfluß des Lichtes auf die Verteilung der Pigmentkörnchen des Pigmentepithels zu beobachten, fixiere man vergleichsweise Augen von Tieren, die bei hellem Tageslicht, und solchen, die einige Stunden im Dunkeln gehalten wurden. Im ersteren Fall findet m a n zwischen Stäbchen und Zapfen reichlich Pigmeptkörnchen, im letzteren Fall ist das Pigment auf eine schmale Schicht zurückgezogen. Sehr geeignet ist f ü r derartige Untersuchungen das Froschauge. Auch die Länge der Innenglieder der Zapfen ändert sich: sie ist beim belichteten Auge kürzer ( E n g e l m a n n , 85).

§ 2352—2355.

Netzhaut

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2352. Zur Darstellung des S e h p u r p u r s w i r d ein Frosch 2 Stunden im Dunkel gehalten (maximale P u r p u r b i l d u n g nach K ü h n e ) , bei rotem Licht dekapitiert, die vordere Bulbushälfte samt Linse bei den in situ gelasenen Augen weggeschnitten u n d der die hinteren Bulbushälften umschließende Teil des Kopfes in eine 2,5°'/oige Platinchloridlösung eingelegt. Nach 12—24 Stunden p r ä p a r i e r t m a n die Bulbi heraus, b r i n g t durch die Alkoholreihe und Benzol in Paraffin. In den 10—20p, dicken Schnitten findet m a n die Außenglieder der Stäbchen intensiv orangegefärbt. Die Methode gelingt auch bei Kaninchen und Katzen ( S t e r n ) . 2353. Die Darstellung der Ö l k u g e l n gelingt am besten an einer frischen Vogelretina (z. B. Taube). Man legt dieselbe mit ihrer Innenseite auf einen Obj e k t t r ä g e r und beobachtet sie nach E n t f e r n u n g von Chorioidea und Pigmentepithel von oben her. Durch Salpetersäure werden die Kugeln in i h r e r n a t ü r lichen F a r b e konserviert; in Alkohol w i r d der Farbstoff gelöst. Zur Herstellung von D a u e r p r ä p a r a t e n bringt man Gefrierschnitte von Formolmaterial in Gelatinebalsam (s. § 475). 2354. F ü r die Darstellung der n e r v ö s e n und g l i ö s e n Elemente d e r N e t z h a u t kommen im Prinzip die gleichen Methoden in Betracht, die beim Zentralnervensystem verwendet werden; doch w u r d e n bei einer Reihe von Methoden kleine Modifikationen vorgeschlagen. So empfiehlt C a j a 1 (94a) die Golgimethode (s. § 1764 f.) in folgender Weise vorzunehmen: 1. Einlegen der hinteren Bulbushälfte nach E n t f e r n u n g des Glaskörpers in 3°/oiges Kaliumbichromat 20 ccm + l°/oige Osmiumsäure 5—6 ccm. Dauer 1—2 Tage. — 2. Vorsichtiges Abtrocknen mit Filtrierpapier, ü b e r t r a g e n in 0,75°'/oige Silbernitratlösung: 24 Stunden. — 3. Ohne Abwaschen ü b e r t r a g e n in 3°/oiges Kaliumbichromat 20 ccm + l°'/oige Osmiumsäure 2—3 ccm. 24—36 Stunden. — 4. Einlegen in 0,75°/oige Silbernitratlösung mindestens 24 Stunden. Weiterbehandlung nach § 1764. Wenn abgelöste Netzhautstückchen behandelt werden, so rollt man diese, um die Niederschlagsbildung an der Oberfläche zu vermindern, vor der Imprägnierung zu kleinen Rollen auf, die man, um ein Wiederaufrollen zu verhüten, kurz in dünne Celloidinlösung taucht; hierauf läßt man die Celloidinhülle einige Sekunden an der Luft erstarren, s. auch § 1767. 2355. Die N e u r o f i b r i l l e n d e r N e t z h a u t w e r d e n häufig mit Hilfe der Silbermethoden von R. y C a j a 1 (04) imprägniert. U y a m a (26) bringt eine derselben in folgender Weise zur A n w e n d u n g : Man löst die Netzhaut möglichst schnell, aber sehr sorgfältig aus dem in tief chloroformiertem Zustand enukleierten Augapfel und bringt sie sogleich f ü r 3—5 Tage in eine vorher auf 37° C e r w ä r m t e 2—5°/oige Silbernitratlösung; daran anschließend w i r d das Objekt 12—36 Stunden lang in einem Gemisch von Pyrogallussäure (0,7 g), F o r mol (5 ccm) und Wasser (50 ccm) reduziert u n d dann in üblicher Weise in P a raffin eingebettet. Die Darstellung der einzelnen Zelltypen gelingt bei den einzelnen Tierarten verschieden; Typen, deren Darstellung bei der einen Tierart sehr leicht gerät, lassen sich bei anderen nur schwer oder gar nicht darstellen. Die H o r i z o n t a l z e l l e n sind sehr leicht darstellbar bei Kaninchen, Meerschweinchen, Katzen, Hunden; die B i p o l a r z e l l e n (Ganglion retinae) bei Meerschweinchen; die a m a k r i n e n und die h o r i z o n t a l e n a m a k r i n e n Z e l l e n bei Hühnern, Kaninchen; die G a n g l i e n z e l l e n des Ganglion opticum bei Kaninchen, Katzen, Meerschweinchen, Hunden, Hühnern, Fröschen; die a m a k r i n e n Z e l l e n in der G a n g l i e n z e l l e n s c h i c h t bei Kaninchen.

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Gehörorgan

§ 2356—2361.

2356. Sehr schön lassen sich die nervösen Elemente der Netzhaut auch mit Hilfe der vitalen Methylenblaufärbung darstellen. D o g i e 1 verfährt dabei folgendermaßen: »Ein eben enukleiertes Auge eines Warmblüters wird durchschnitten, die Retina in Fetzen mit Pigmentschicht und Glaskörperresten vorsichtig aufgehoben, mit der äußeren Fläche nach oben, auf breite Objektträger gebracht und deren Oberfläche oder aber der Objektträger am Rande des Präparats mit einigen Tropfen einer Ve—V8°/oigen Methylenblaulösung benetzt. Nach 5 Minuten wird jedes Stück auf ein reines Objektglas, doch dieses Mal mit der Nervenfaserschicht nach oben, übertragen, der Glaskörper teilweise vorsichtig mit einer Schere entfernt und dasselbe oder der Objektträger am Rande des Präparats mit 2—3 Tropfen der Methylenblaulösung angefeuchtet. Die Objektgläser werden alsdann in einer flachen Schale, die gut schließt, geordnet und in derselben in einem Thermostaten aufgestellt; von Zeit zu Zeit muß die Färbung der Nervenelemente unter dem Mikroskop kontrolliert werden; nach 30—40 Minuten hat die Färbung gewöhnlich den Höhepunkt erreicht, worauf die Präparate entweder direkt auf dem Objektglas fixiert oder aber von letzterem abgehoben und in die Fixierungsflüssigkeit gebracht werden. Bei kleinen Warmblütern nimmt man am besten die ganze Netzhaut auf einmal heraus, ebenso wie bei kleinen Kaltblütern (Frosch), bei denen jedoch die Färbung bei Zimmertemperatur vor sich geht.« 2357. Die Untersuchung des S e h n e r v e n erfolgt nach den in Kap. 24 f ü r das Nervensystem angegebenen Methoden. 2358. Für Übersichtsbilder der O r b i t a l d r ü s e n (Tränendrüse, H ä r d e r sehe D r ü s e ) ist besonders Fixierung mit Susa und Färbung mit Azan zu empfehlen. Spezialabhandlungen über die Untersuchung des Auges: G r e e f (98), S e l i g m a n n (99), H e r z o g (26). Weitere Angaben bei K o l m e r - L a u b e r (36).

36. KAPITEL

Gehörorgan 2359. Bei der Behandlung der s c h a l l p e r z i p i e r e n d e n Organe macht dem Anfänger in der Regel die r i c h t i g e O r i e n t i e r u n g des das Gehörorgan enthaltenden Felsenbeines Schwierigkeiten. Am leichtesten gelingt die Orientierung bei Nagern, da bei ihnen die Cochlea scharf gezeichnete Vorsprünge am Tegmen tympani hervorruft. 2360. Man o r i e n t i e r t nach dem Vorgange K o 1 m e r s (09) f ü r Schnitte durch das Labyrinth am besten so, daß die Schnecke parallel zum M o d i o l u s getroffen wird. Hat man dann alle mittleren, die ganze Modiolusachse enthaltenden Schnitte aufgefangen, dann bettet man das Objekt um und schneidet von der Spitze beginnend senkrecht auf den Modiolus, wobei das C o r t i s c h e O r g a n so orientiert wird, daß das Messer möglichst parallel zu seiner Oberfläche geführt wird. 2361. Um bei Material von größeren Tieren den Umfang der Schnittfläche durch Entfernung der unwichtigen Teile des Schäfenbeines tunlichst zu verringern, verfährt man am besten nach folgender von P a n s e angegebenen Methode: Das Schläfenbein wird zwischen sulcus sigmoideus und Warzenfortsatz festgeklemmt und zuerst die Schleppe in einer dem Tegmen tympani gleichlaufenden Ebene abgesägt. Ein zweiter Sägeschnitt geht, nachdem die Dura

§ 2362—2364.

Gehörorgan

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u n d N e r v e n des i n n e r e n Gehörorganes nach hinten g e d r ü c k t sind, d u r c h dessen Mitte s e n k r e c h t z u r oberen Felsenbeinkante. Ein d r i t t e r Sägeschnitt l ä u f t diesem parallel h i n t e r d e m Sulcus endolymphaticus. N u n w i r d das P r ä p a r a t m i t diesen beiden festen Sägeflächen an die A r m e des Schraubstockes gelegt u n d festgeschraubt. Nachdem die v o r d e r e untere W a n d des äußeren Gehörganges bis n a h e z u m T r o m m e l f e l l mit der Knochenschere abgezwickt ist, t r e n n t ein v i e r t e r Sägeschnitt das D a c h des äußeren Gehörganges u n d die S c h u p p e n w u r z e l ab, parallel dem Trommelfell. Ein f ü n f t e r Sägeschnitt k a n n z u r V e r k l e i n e r u n g des P r ä p a r a t e s parallel dem Tegmen T y m p a n i u n t e r dem Trommelfell, P a u k e n b o d e n u n d B u l b u s ven. jugul. g e f ü h r t w e r d e n . Z u m Schluß wird der obere Bogengang m i t einigen Meißelschlägen eröffnet u n d an der v o r d e r e n oberen K a n t e des P r ä p a r a t e s am inneren Gehörgang ein Dreieck zur E r ö f f n u n g der Schnecke eingekerbt. 2362. Die F i x i e r u n g d e s G e h ö r o r g a n e s soll f ü r feine histologische U n t e r s u c h u n g e n , w e n n irgendmöglich, in lebensfrischem Zustand mittels D u r c h s p ü l u n g erfolgen, und zwar möglichst bei K ö r p e r t e m p e r a t u r . W e r n e r (36) v e r w e n d e t dazu von den von W i t t m a a c k angegebenen Gemischen ein als »W i t t m a a c k s L a b o r « bezeichnetes Gemisch, das u n m i t t e l b a r vor Geb r a u c h f o l g e n d e r m a ß e n hergestellt w i r d : 85 Teile einer 5°/oigen Stammlösung von K a l i u m b i c h r o m a t , 10 Teile Formol u n d 5 Teile Eisessig w e r d e n vereinigt u n d mit 100 Teilen dest. Wasser v e r d ü n n t . E i n w i r k u n g s d a u e r 1 T a g im B r u t schrank, 2 Tage bei Z i m m e r t e m p e r a t u r . D a n n einlegen in 4"/oige L i t h i u m s u l f a t lösung u n d auswaschen in fließendem Wasser, j e 24 S t u n d e n . Alkoholreihe E i n b e t t u n g in Celloidin. Die E n t k a l k u n g in Salpetersäure wird, u m Schädig u n g e n zu vermeiden, erst n a c h der E i n b e t t u n g a m Block v o r g e n o m m e n . Das vielgebrauchte Kaliumbichromatgemisch von Kolmer (s. § 241) und ähnliche sind nach W e r n e r (36) viel zu sauer und unnötig hoch konzentriert. 2363. Die F i x a t i o n s t e m p e r a t u r beeinflußt das mikroskopische Bild der Lab y r i n t h g e w e b e erheblich (s. dazu § 204), ebenso die F i x a t i o n s d a u e r (s. § 210). Z u s a m m e n f a s s e n d w i r d n a c h den wichtigen u n d sehr l e s e n s w e r t e n U n t e r suchungen von W e r n e r (26—37) das mikroskopische Schnittbild des Innenohres, insbesondere die Höhe der Epithelien (Macula, Stria vascularis, Sulcus internus), das V o l u m e n der Sensularien (Cupulae, M e m b r a n a tectoria) u n d die Beschaffenheit der Otolithen d u r c h folgende v a r i a b l e F a k t o r e n der histologischen V e r a r b e i t u n g b e e i n f l u ß t : A r t der F i x i e r u n g (Durchspülung oder Einlegen), V e r k l e i n e r n u n d E r ö f f n e n des P r ä p a r a t e s , Diffusionsgeschwindigkeit der fixierenden Substanzen, Zeit zwischen T ö t u n g und Fixierung, T e m p e r a t u r der Fixationslösung, Gesamtkonzentration ( G e f r i e r p u n k t s e r n i e d r i g u n g ) der F i x a tionslösung, u n d z w a r d u r c h verschiedene F i x a t i o n s k r a f t u n d osmotischen Druck, vielleicht auch durch agonale Reizung, f e r n e r die a k t u e l l e Acidität (HIonenkonzentration) und Titrationsacidität bzw. relative Menge der einzelnen Substanzen, Dauer der Fixierung, Z e i t p u n k t der E n t k a l k u n g (vor oder nach der Einbettung). 2364. Bei menschlichem Material w i r d es häufig nicht möglich sein, diese Bedingungen (namentlich F i x i e r u n g mittels D u r c h s p ü l u n g oder wenigstens sofortiges Einlegen nach d e m Tod) zu erfüllen. U m trotzdem die Zellen des Mittel- u n d Innenohres leidlich zu erhalten, k a n n m a n versuchen, gleich nach d e m Tode durch Nasenhöhle u n d T u b a Eustachii einen d ü n n e n T u b e n k a t h e t e r einz u f ü h r e n u n d 0,5"/oige O s m i u m s ä u r e (oder F o r m o l 1 : 4 ) in die P a u k e n h ö h l e einzuspritzen. Der K a t h e t e r m u ß so d ü n n sein, daß die L u f t neben i h m ent-

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Gehörorgan

§ 2365—2369.

weichen kann. Nach 24—48 Stunden wird das Schläfenbein herausgenommen und f ü r einige Tage in Pikrin-Sublimat-Essigsäure gelegt (R. K r a u s e , 26). K o 1 m e r injiziert, u m beim Menschen möglichst gut erhaltene Epithelien des Labyrinthes zu bekommen, mit einer Pravazspritze einen Tropfen einer in Ringerlösung gesättigten Osmiumsäure einerseits durch die Steigbügelplatte, anderseits durch den Meatus acusticus internus. 2365. W i t t m a a c k v e r f ä h r t bei der Fixierung des menschlichen Gehörorganes folgendermaßen: 1. Einlegen des Schläfenbeins nach Umschneiden des Meatus acusticus int. und Abziehen der Dura in: Kaliumbichromat 5 g, dest. Wasser 85 ccm, Formol 10 ccm, Eisessig 3 ccm. Man läßt die Flüssigkeit 6 bis 8 Wochen lang bei 37° C ohne Wechseln und ohne Eröffnung des Bogenganges oder der Schnecke einwirken. — 2. Auswaschen in fließendem Wasser 24 S t u n den. — 3. Verkleinern nach Panse (s. § 2361). — 4. Einlegen in Formol 10 ccm, Eisessig 3—5 ccm, dest. Wasser ad 100 ccm, 3—4 Wochen. — 5. Entkalken i n täglich zu e r n e u e r n d e r 10°/oiger wässeriger Salpetersäure (500 ccm) 10 bis 14 Tage. — 6. Auswaschen in fließendem Wasser 2 Tage. — 7. 70°/oiger Alkohol. Erst jetzt w e r d e n Bogengang und Schneckenkapsel eröffnet. Einbetten in Celloidin. Für feine Untersuchungen empfiehlt Wittmaack, die Stücke nach der Behandlung in Formol-Eisessig noch 8 Tage bei 37° C in Kaliumbichrom. 2,5 g, Osmiumsäure 0,5 g, Eisessig 3 ccm, dest. Wasser 100 ccm einzulegen und dann 48 Stunden lang in Formalin 10 ccm, Salpetersäure 3 ccm, dest. Wasser 100 ccm einer Vorentkalkung zu unterziehen. Dann bettet man nach gründlichem Auswaschen in Celloidin ein und entkalkt nachträglich den Celloidinblock in Salpetersäure (vgl. § 1611). 2366. Gute Resultate gibt auch die Fixierung in den § 344—347 angegebenen Trichloressigsäuregemischen (am besten mit Durchspülung); nach 24—48stündiger Fixierung entkalkt m a n in 5°/oiger Trichloressigsäure, bis der Knochen weich ist, und wäscht d a n n in 90°/oigem Alkohol säurefrei. 2367. Zur I s o l i e r u n g der Zellelemente des Cortischen Organes v e r f ä h r t m a n nach § 2376. 2368. Zur F ä r b u n g dienen f ü r Übersichtsbilder die gebräuchlichen Methoden, wie Hämalaun-Eosin. F ü r feinere S t r u k t u r e n wird man mit Vorteil d i e Eisenhämatoxylinfärbung nach Heidenhain oder Weigert mit G e g e n f ä r b u n g durch Rubin S, Lichtgrün od. dgl. verwenden. Zur Darstellung der F a s e r s t r u k t u r e n kommt neben den gebräuchlichen Färbemethoden wie Azanfärbung u. dgl., die wegen der vorausgehenden Entkalkung aber o f t ungleichmäßig a u s fallen, besonders die Methode von Bielschowsky (s. § 1525) in Betracht. M a n f i x i e r t in d i e s e m F a l l e a b e r b e s s e r in F o r m o l , s t a t t in c h r o m h a l t i g e n F l ü s s i g k e i t e n . Das gleiche gilt bei A n w e n d u n g d e r Bielschowsky-Methode zur Darstellung der nervösen Elemente (Fixierung in 20°/oiger Formollösung, Entkalken in 5°/oiger Salpetersäure, 24stündiges E i n legen in 4°/oiges Lithiumsulfat, gründliches Auswaschen in fließendem Wasser, nochmals einige Tage in Formol, dann 1 Stunde in Wasser und Schneiden auf dem Gefriermikrotom). (Siehe auch K o l m e r [27], B i e l s c h o w s k y u n d u n d B r ü h l [07]). S a x é n (37) empfiehlt die Anwendung der Natronlauge-Silbermethode von Schultze oder der Bielschowsky-Methode in besonderen Modifikationen. Näheres siehe Originalarbeit. 2369. F ü r die Darstellung der O t o l i t h e n m u ß die A n w e n d u n g von stark sauren Fixierungsgemischen und von Entkalkungsflüssigkeiten vermieden w e r den; auch in eisessighaltigen Gemischen w e r d e n sie zum größten Teil gelöst;

§ 2370—2376.

Geruchsorgan

in K a l i u m b i c h r o m a t - F o r m o l bleiben sie in n o r m a l e r Größe erhalten 11 e r 34) (s. auch § 204).

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(W e r -

37. K A P I T E L

Geruchsorgan 2370. Bei F i x i e r u n g der Nasenschleimhauf h a t m a n d a f ü r zu sorgen, daß die Fixierungsflüssigkeit g u t z u t r e t e n k a n n u n d nicht e t w a d u r c h zurückgehaltene L u f t b l a s e n am E i n d r i n g e n g e h i n d e r t wird. A m besten w i r d m a n daher die Nasenhöhle von irgendeiner Seite h e r eröffnen, w e n n m a n nicht vorzieht, die F i x i e r u n g auf d e m Wege der I n j e k t i o n in die B l u t b a h n v o r z u n e h m e n . Um Einblick in den A u f b a u der S c h l e i m h a u t zu bekommen, m u ß m a n sowohl Schnitte a u s d e r Regio olfacforia w i e a u s d e r Regio respiratoria u n t e r s u c h e n .

2371. Riechepithel findet m a n beim F r o s c h im C a v u m principale u n d Recessus medialis des C a v u m inferius, bei R e p t i l i e n im dorsalen Teil der Nasenhöhle, bei V ö g e l n von d e r h i n t e r e n H ä l f t e der Dorsalfläche der mittl e r e n Muschel ü b e r das Nasenhöhlendach bis zur Mitte des Septums, bei S ä u g e t i e r e n auf den im oberen h i n t e r e n Teil der Nasenhöhle gelegenen Riechmuscheln, b e i m M e n s c h e n auf d e m m i t t l e r e n Teil d e r oberen Muschel u n d d e m gegenüberliegenden Abschnitt des Nasenseptums. 2372. Als Fixierungsflüssigkeit ist das in § 238 a n g e f ü h r t e K a l i u m b i c h r o m a t gemisch, das Hellysche oder Bouinsche Fixierungsgemisch, Susa, u. dgl. zu empfehlen. Wenn die k n ö c h e r n e n Teile d e r Nasenhöhle mitgeschnitten w e r d e n sollen, so m u ß n a t ü r l i c h e n t k a l k t w e r d e n . Bei feineren U n t e r s u c h u n g e n a m Rieche p i t h e l ist es besser, eine E n t k a l k u n g zu vermeiden u n d die b e t r e f f e n d e n Teile d e r Schleimhaut n a c h der F i x i e r u n g mit einem s c h a r f e n Messer von der knöc h e r n e n U n t e r l a g e abzuschneiden. 2373. Z u r F ä r b u n g des Riechepithels ist neben den f ü r Übersichtspräparate ü b l i c h e n Methoden besonders die Eisenhämatoxylinmethode zu empfehlen. Die Schleimdrüsen, Becherzellen u n d anderen Teile d e r Nasenhöhle w e r d e n mit d e n auch sonst gebräuchlichen Methoden g e f ä r b t . 2374. Die D a r s t e l l u n g der Sinneszellen erfolgt e n t w e d e r d u r c h Silberimprägn a t i o n nach Bielschowsky (§ 1909 ff.), Gros-Schultze (§ 1793) oder C a j a l (siehe § 1918ff.) oder d u r c h vitale M e t h y l e n b l a u f ä r b u n g . R. K r a u s e durchspült d a z u den Kopf eines frisch geschlachteten Schafes, das sich h i e f ü r besonders eignet, von der Carotis aus mit k ö r p e r w a r m e r Ringerlösung u n d gibt d a n n 200 bis 500 ccm einer l°/oigen Methylenblaulösung nach. Eine h a l b e S t u n d e später w i r d die Nasenhöhle d u r c h einen etwas n e b e n d e m S e p t u m v e r l a u f e n d e n sagittalen Sägeschnitt freigelegt u n d die obere Muschel usw. in A m m o n i u m m o l y b d a t fixiert. Im abs. Alkohol w i r d das Epithel d a n n heruntergeschnitten. Paraffineinbettung. 2375. Die Stützfibrillen der Stützzellen stellt K o 1 m e r (27) nach Fixierung n a c h § 241 d u r c h U b e r f ä r b u n g m i t M o l y b d ä n h ä m a t o x y l i n n a c h Held u n d vorsichtiges Differenzieren mit m o l y b d ä n s a u r e m A m m o n i u m dar. 2376. Sehr gut läßt sich die F o r m der Sinneszellen an M a z e r a t i o n s p r ä p a r a t e n e r k e n n e n . Sehr e m p f e h l e n s w e r t ist h i e f ü r eine von R a n v i e r angegebene Methode, bei der die F o r m der Zellen trotz i h r e r Länge sehr g u t e r h a l t e n bleibt. M a n legt dazu die Epithelstückchen f ü r 1—3 S t u n d e n in Drittel-Alkohol, ü b e r t r ä g t sie d a n n f ü r 5—15 M i n u t e n in l°/oige O s m i u m s ä u r e u n d z e r z u p f t sie in e i n e m T r o p f e n Wasser. Auch 24stündige Mazeration in 0,l°/oiger Osmiumsäure gibt g u t e Resultate.

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Embryologische Untersuchungstechnik

§ 2377—2380.

38. KAPITEL

Embryologische Untersuchungstechnik A. Wirbellose 2377. Im Frühjahr und Sommer hat man häufig Gelegenheit, Eier, Konkons und Larven verschiedener wirbelloser Tiere, namentlich von Schnecken, in stehenden oder langsam fließenden Gewässern zu sammeln. Während sich die älteren Entwicklungsstadien hauptsächlich nur für spezielle Untersuchungen eignen, geben die frühen Stadien allgemein interessantes Beobachtungsmaterial ab. So läßt sich z. B. an frisch abgelegten Eiern der Tellerschnecke sehr schön das A u s t r e t e n d e r R i c h t u n g s k ö r p e r beobachten. Eingehende technische Angaben bei H a e c k e r , R ö t h i g , B u c h n e r , B ß l a r (28); über die Entwicklung der Evertebraten bei K o r s c h e i t und H e i d e r. Zahlreiche praktische Angaben, namentlich hinsichtlich Beschaffung und Pflege des Tiermaterials, findet man bei G e y e r (29), K l i n g e l h ö f f e r (31), Rachow.

2378. Ein sehr wertvolles Objekt für das eingehende Studium der B e f r u c h t u n g wie der T e i l u n g s v o r g ä n g e b e i d e r F u r c h u n g liefert der im Darm der Pferde (namentlich im Winter) vorkommende Spulwurm, Ascaris megalocephala. Man trifft zwei Varietäten: die eine hat vier, die andere, seltener vorkommende, nur zwei Chromosomen (B o v e r i). Beim Transport der Würmer aus dem Schlachthof in das Institut hat man nach Möglichkeit eine Abkühlung der Tiere zu vermeiden, da dadurch leicht pathologische Erscheinungen (anormale Teilungsfiguren u. dgl.) hervorgerufen werden können. Man bindet dazu am besten eine die Würmer enthaltende Darmschlinge durch doppelte Ligatur ab oder verpackt sie in warmen Pferdemist. Reinlicher ist es, die abgebundene Darmschlinge in einer weiten, zuerst durch heißes Wasser angewärmten Thermosflasche zu transportieren, wenn man die Fixation nicht gleich am Schlachtort selbst vornehmen kann. 2379. Zur Fixierung der Sexualschläuche steckt man das Tier in einer Wachsschale auf und spaltet den Hautmuskelschlauch vorsichtig von cranial nach caudal. Die in der Leibeshöhle der Tiere vorhandene Flüssigkeit enthält ein flüchtiges Gift, das bei vielen Untersuchern Kopfschmerzen, Entzündung der Schleimhäute, Übelkeit u. dgl. hervorruft. Ist man dafür empfindlich, so arbeite man unter dem Abzug. 2380. Die Fixierung ist. gerade bei Ascaris oft sehr launisch. Man bekommt das eine Mal mit der gleichen Fixierungsflüssigkeit ausgezeichnete Bilder, das andere Mal ganz schlechte. Es ist daher ratsam, immer gleich die Geschlechtsröhren mehrerer Tiere zu fixieren. Bald nach dem Eindringen des Spermiums verdickt sich die Eihülle erheblich und setzt dann dem Vordringen der Fixierungsflüssigkeit oft sehr großen Widerstand entgegen. In 30—60°/oigem Alkohol, in Kaliumbichromat, Müllerscher Flüssigkeit bleiben die Embryonen wochenlang am Leben. Man kann diese Eigenschaft benutzen, um sich alle möglichen Entwicklungsstadien zu verschaffen. Man bindet dazu das untere Ende des Vaginalteiles ab und legt die Eiröhren bei 37° C in eine feuchte Kammer (z. B. eine Petrischale, auf deren Boden sich eine mit physiolog. Kochsalzlösung leicht benetzte Filtrierpapierlage befindet). Die Eier entwickeln sich dann sehr gut weiter. Zu vermeiden ist, daß Wasser auf die Eischläuche tropft, da sie sonst platzen. Man kann die Eischläuche auch in 40- bis 50°/oigen Alkohol oder 2°/oige Kaliumbichromatlösung legen und bei etwa 20° der Weiterentwicklung

§ 2381—2385.

Wirbellose

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überlassen. Die fortgeschrittensten Stadien finden sich natürlich am weitesten gegen die Geschlechtsöffnung zu. Die lebenden Eier untersucht man am besten in einem Tropfen der Leibeshöhlenflüssigkeit der Tiere. 2381. F ü r K e r n s t u d i e n fixiert m a n das Ascarismaterial zweckmäßig in dem Gemisch von Carnoy (§ 226), von Petrunkewitsch (§ 341) oder nach B o v e r i (97): Konz, wässerige P i k r i n s ä u r e 33 ccm, dest. Wasser 66 ccm, Eisessig 1 ccm. Nach 24stündiger Fixierung wäscht m a n bei letzterer Methode mit 70°/oigem Alkohol (sehr sorgfältig!), f ä r b t 24 Stunden in Grenachers alkoholischem Boraxcarmin, differenziert 24 Stunden in 70°/oigem Alkohol mit l°'/o Salzsäurezusatz und entsäuert in reinem 70°/oigem Alkohol. Bringt man dann die Eiröhren in eine Mischung von 1 Teil Glycerin u n d 3 Teilen abs. Alkohol und läßt diese so lange stehen, bis der Alkohol verdunstet ist, so erhält man die Eier ohne alle Schrumpfung. 2382. Nach Fixierung in Carnoyscher Flüssigkeit f ä r b t m a n vorteilhaft mit Eisenhämatoxylin, Methylgrün-Pyronin oder nach Ehrlich-Biondi. 2383. K o s t a n e c k i - S i e d l e c k i fixieren in Sublimat (heiß gesättigt in physiologischer Kochsalzlösung und dann abgekühlt) + 3°/oige Salpetersäure zu gleichen Teilen oder in einer Mischung von gleichen Teilen ges. Sublimatlösung, 3°/oiger Salpetersäure (oder Eisessig) und abs. Alkohol. Nach 24 Stunden Übertragen in 30bis 70°/oigen Alkohol, dem man etwas Jodtinktur zusetzt, dann je 24 Stunden in Alkohol von 50, 70, 90, 95 und 100°/o. Die Einbettung erfolgt nach § 2385. 2384. Abgelegte oder den in Kochsalzlösung belassenen Uteri entnommene Eier von Ascaris schneidet A r t o m (08), um ein Eindringen der Konservierungsflüssigkeit (z. B. Flemmingsche Lösung) durch die resistente Schale (Perivitellinhülle) zu ermöglichen, mit dem Gefriermikrotom in etwa 30.« dicke Schichten, so daß die äußersten (widerstandsfähigsten) Schichten der Schalen angeschnitten werden, und fixiert dann. 2385. An den befruchteten Eiern von Ascaris läßt sich in außerordentlich klarer Weise die A u s s a a t d e r M i t o c h o n d r i e n d e s S p e r m i u m s i n s E i p r o t o p l a s m a zeigen. Man zerzupft dazu nach M e v e s (11) kleine, der Länge nach aufgeschnittene Uterusstückchen, welche geeignete Stadien enthalten, in Altmannscher Flüssigkeit (s. § 974). Nach 24 Stunden fischt m a n mit einer Pinzette die Fetzen der Schlauchwandung zwischen den Eiern heraus und gießt die Eier mit der Fixierungsflüssigkeit in Zentrifugengläser, läßt sie in diesen sedimentieren und ersetzt die Fixierungsflüssigkeit durch dest. Wasser, das m a n in den nächsten 24 S t u n d e n mehrmals wechselt. Hierauf w e r d e n die Eier durch steigenden Alkohol (in jedem Konzentrationsgrad je 24 Stunden) in P a r a f f i n gebracht. Dazu ü b e r f ü h r t m a n sie aus dem abs. Alkohol ganz allmählich (im Laufe von 24 Stunden) in eine Mischung von 3 Volumen Chlorof o r m und 1 Volumen Äther. Dann w e r d e n sie mit einem Teil der ChloroformÄthermischung in Porzellanschälchen ausgeschüttet, die in Glasdosen eingeschlossen werden. Hierzu f ü g t man nach und nach kleine Paraffinstückchen, bis nach einigen Tagen eine konzentrierte Lösung entstanden ist. Hierauf w e r den die Schälchen aus den Glasdosen herausgenommen und auf die obere Fläche des Thermostaten gestellt, wo der Zusatz von Paraffin bis zum Eintritt der S ä t tigung wiederholt wird. Dann kommen die Schälchen im ganzen auf IV2 S t u n den in einen auf 40—50° C und in einen zweiten auf 58® C erhitzten W ä r m e schrank, w ä h r e n d welcher Zeit die Mischung von Chloroform-Äther-Paraffin allmählich durch reines P a r a f f i n vom Schmelzpunkt 56° C ersetzt wird. Dann w i r d ein Teil des Paraffins abgegossen und der Rest mit den Eiern in Gelatinekapseln gefüllt (von etwa 30 m m Länge, 11 m m Durchmesser), die m a n noch-

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Embryologische Untersuchungstechnik

§ 2386—2392.

mal in den Thermostaten bringt, bis sich die Eier am Boden gesammelt haben. Zuletzt bringt man die Kapseln in kaltes Wasser und läßt erstarren. 2386. Für die Untersuchung späterer Stadien schneidet M e v e s (14) die Uteri wie A r t o m (§ 2384) auf dem Gefriermikrotom (Schnittdicke 60/,) und bringt die Schnitte in gefrorenem Zustand in .die Altmannsche Flüssigkeit. Weiterbehandlung wie oben.

2387. Ein sehr günstiges Objekt für die Beobachtung der Befruchtungsvorgänge bietet sich nach B él a f (23, 24, 28) in den Eizellen der freilebenden Nematoden (Rhabditisarten), bei denen sich die Vorgänge auch intra vitam gut verfolgen lassen. Das Material ist auch insofern interessant, als bei der Entwicklung der Weibcheneier physiologische Parthenogenese vorliegt. Das in das Ei eingedrungene Spermium regt nur die Entwicklung an, gibt an das Ei sein Centrosom ab und degeneriert, ohne einen männlichen Vorkern zu bilden. Zur Fixierung eignet sich sehr das Petrunkewitsch-Gemisch (s. § 341). 2388. Zur Einbettung der isolierten Eier empfiehlt B e l a r ein Verfahren, das sich auch für andere kleinste Objekte gut geeignet. Das fixierte Material wird durch Zentrifugieren oder Absetzenlassen in einer möglichst geringen Wassermenge gesammelt; hierauf überträgt man auf einen Objektträger und setzt ein Tröpfchen f r i s c h e s Hühnereiweiß zu. Seine Menge soll so bemessen sein, daß die Objekte völlig darin eingebettet sind, ohne daß um sie herum eine große Eiweißschicht liegt. Nach guter Durchmischung nimmt man das entstandene Klümpchen mit einem Skalpell ab und streicht es an den Rand eines glatt abgeschnittenen Papierstreifens, der die nötigen Notizen trägt, ab. Dieser wird, mit dem Eiweißklümpchen nach unten, zur Koagulation vorsichtig in Sublimat-Alkohol nach Schaudinn oder Formol 1 :8 getaucht; dann wird wie gewöhnlich weiterbehandelt. Nach der Durchtränkung in Paraffin löst man das Klümpchen mit einem warmen Skalpell vorsichtig ab und bettet ein.

B. Wirbeltiere 1. Cydostomen

2389. Bei N e u n a u g e n , P e t r o m y z o n f l u v i a t i l i s und P 1 a n e r i gelingt leicht k ü n s t l i c h e B e f r u c h t u n g ; man preßt dazu bei einem laichreifen Weibchen durch vorsichtiges Streichen die Eier durch den Porus abdominalis heraus in eine trockene Emailleschale. In eine zweite streicht man in gleicher Weise aus geschlechtsreifen Männchen Spermaflüssigkeit, die man dann mittels der Fahne einer Feder auf die in kleine Häufchen verteilten Eier streicht. Dann erst setzt man Wasser zu ( H e r f o r t ) . 2390. An eben befruchteten Petromyzoneiern lassen sich die Befruchtungsvorgänge, die sehr rasch, in wenigen Minuten, ablaufen, deutlich beobachten. Die Eier stellen sich von selbst mit dem animalen Pol in die Sehebene ein. Das Eindringen des Spermiums sieht man von Seiten der Eier mit verschiedenen Protoplasmabewegungen begleitet. (K u p f f e r und B e n e c k e). 2391. Zur Fixierung sind die Flüssigkeiten von Bouin (§ 305), Gilson (§ 340) oder Petrunkewitsch (§ 341) zu empfehlen. Man bringe die Keime bald ins Paraffin und überziehe die aufgeklebten Paraffinschnitte, um das sehr leicht eintretende Abschwimmen der Präparate zu verhüten, nach § 548 mit einer dünnen Celloidinschicht. 2392. Neunaugen laichen im Herbst, resp. Frühjahr und sind aus Fischhandlungen in Memel, Danzig, Elbing, Stettin, Kiel und Bremen zu beziehen (K o p s c h). Im Frühjahr findet man solche bei Bamberg, Troisdorf, Niederlahnstein, Harburg, Wittenberge, Magdeburg, Rathenow, Crossen und Schwedt a. O., Bromberg. L u -

§ 2393—2397.

Wirbeltiere (Fische)

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b o s c h hat sein Material aus Jennowitz im Riesengebirge, Mergentheim in Württemberg, Haynau in Schlesien, Tharand, Tauberbischofsheim, bei Königsbronn und Itzelheim in Württemberg und Lockwitz, bei Dresden, P e t r o m y z o n P i a n e r i kommt in M ü h l e n g r a b e n vor (aus L u b o s c h). 2. Fische

2393. Fischeier sind das ganze J a h r hindurch zu bekommen. Bei den meisten kann man das Oberflächenbild des Keimes bei günstiger Beleuchtung in f r i schem Zustand sehen und studieren. 2394. L a i c h z e i t der verbreitesten Süßwasserfische: Äsche: März, April; Amaul: April, Mai; Barbe: Mai, Juni; Barsch: März, April, Mai; Bartgrundel (Schmerle): März, April; Elritze: Mai, Juni; Felchen: November, Dezember; Forelle: Oktober, November, Dezember; Gareisl (Karausche): Juni; Gründling: Mai, Juni; Hecht: April, Mai; Huchen: April; Karpfen: Mai, Juni; Kaulbarsch: April, Mai; Lachs: September, Oktober, November; (Fluß-) Neunauge: April; Quappe: Januar; Renke: November, Dezember; Rotauge: April, Mai; Saibling: Juni, Oktober, November; Schleie: Mai, Juni; Waller (Wels): Juni, Juli.

2395. Zur Vornahme der k ü n s t l i c h e n B e f r u c h t u n g , die bei Fischen leicht gelingt hält man das Weibchen mit einem Tuch am Kopf fest und streicht den nach abwärts hängenden Leib von den Brustflossen gegen die Analöffnung zu mehrmals ohne Druck ab, wodurch die Eier, falls das Tier geschlechtsreif ist, ohne Schwierigkeit entleert werden. Man darf dieses Verfahren nur so lange fortsetzen, bis eine Spur Blut aus der Analöffnung herauskommt. Das gleiche wiederholt man bei einem geschlechtsreifen Männchen. Eier wie Samen werden getrennt in reinen Glasschalen aufgefangen. Hierauf verteilt man das Sperma mit der Fahne einer Gänsefeder ohne weiteren Flüssigkeitszusatz gleichmäßig über die Oberfläche der Eier (trockene, sogenannte russische Methode). Nun erst wird vom Rande der Schale aus soviel reines Brunnenwasser zugesetzt, daß die Eier reichlich damit bedeckt sind. Nach etwa 10 Minuten gießt man das mit Sperma getrübte Wasser ab und ersetzt es so oft durch frisches, bis keine Trübung mehr wahrzunehmen ist. Die Besamung ist nun vollzogen und man kann die Eier in reinem, fließendem Wasser zur Weiterentwicklung bringen. Am zweckmäßigsten verwendet man dazu eigene Fischbruttröge. 2396. Zur Lebendbeobachtung der Befruchtungs- und Furchungsvorgänge sind wegen ihrer Durchsichtigkeit besonders die Eier des Stichlings oder Barsches zu empfehlen (von Seefischen: Belone). 2397. Zur Darstellung und zum Studium des Vorganges der B e f r u c h t u n g und der dabei stattfindenden Veränderungen, wie Bildung der Richtungskörper, des Eikernes, des Furchungskernes, der Protoplasmastrahlungen usw. am fixierten Objekt eignen sich nach B ö h m (81) ganz besonders künstlich befruchtete F o r e l l e n e i e r , die leicht zu beschaffen sind und klare Bilder geben. Man fixiert gleich nach der Besamung beginnend, etwa alle 5 Minuten einige Eier in Sublimat-Eisessig (100 : 20). Noch besser ist folgende Methode: Die Eier kommen zunächst in die oben angegebene Sublimat-Eisessiglösung, in der sich der Keim schon nach weniger als einer halben Minute trübt — also abgetötet ist. Alsdann überträgt man die Eier in eine Sublimatlösung mit geringerem Eisessigzusatz (5%), die man sich natürlich auch durch Zugießen reiner Sublimatlösung herstellen kann. In beiden Fällen kommen die Eier schon nach 30—45 Minuten in 70°/oigen Alkohol, dem etwas Jodtinktur zugesetzt ist. Nach etwa 45 Minuten schneidet 35

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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Embryologische Untersuchungstechnik

§ 2398—2401.

m a n mit einem scharf geschliffenen Rasiermesser die die Keimscheibe e n t h a l tende K u p p e des Eies ab, wobei m a n das Ei vorsichtig mit der l i n k e n H a n d f e s t hält. Sollen die Keimscheiben in Alkohol a u f b e w a h r t werden, so b r i n g e m a n sie in keinen h ö h e r prozentigen als 80°/oigen. Besser ist es, die Keimscheiben möglichst rasch in P a r a f f i n einzubetten, da der Dotter durch den Alkohol ü b e r aus schwer schneidbar wird. Als I n t e r m e d i u m n i m m t m a n Chloroform, oder u n t e r V e r m e i d u n g des abs. Alkohols B e r g a m o t t - oder Zedernöl. Die damit d u r c h t r ä n k t e n P r ä p a r a t e bringt m a n zunächst einige S t u n d e n in weiches P a raffin (Schmp. 35—40°) u n d dann n u r k u r z e Zeit (15—60 Minuten) in h a r t e s (Schmp. 56°). — Ebenso g u t ist die E i n b e t t u n g ü b e r Methylbenzoatcelloidin nach § 392. Man k a n n mit Vorteil auch E i n b e t t u n g ü b e r Dioxan versuchen, wobei sich die E i n w i r k u n g von Alkohol völlig v e r m e i d e n läßt (s. § 353 u n d 2414). 2398. Um den Dotter zu entfernen, empfehlen V i r c h o w - K o p s c h zuerst die ganzen Forelleneier mit Chromsäure 2 g, dest. Wasser 900 ccm, Eisessig 100 ccm etwa 10 Minuten vorzubehandeln; für Embryonen mit kleiner werdendem Dotterloch genügen schon 5 Minuten. Dann werden die Eier für l1/-' Stunden in 0,2"/oige Chromsäurelösung gebracht und möglichst sofort weiterbearbeitet. Dazu überträgt man die einzelnen Eier in physiologische Kochsalzlösung, eröffnet sie schonend, entfernt die Eihaut und bläst den nicht geronnenen Dotter mit einem mit der erwähnten Kochsalzlösung gefüllten, fein ausgezogenen Röhrchen von der Keimscheibe weg. So vom Dotter gereinigte Keimscheiben fixiert man nun vollends, z. B. mit Sublimat (2 Std.), Flemmingschem Gemisch (sorgfältiges Auswaschen!) usw. Derart behandelte Keimscheiben bieten gute Oberflächenansichten und lassen sich gut in Paraffin schneiden. 2399. B o e k e J. (03) fixiert kurze Zeit mit Sublimat-Eisessig oder mit Zenkerscher Flüssigkeit und härtet in 10°/oiger Formollösung nach; nach einigen Stünden überträgt er die Eier in 30°/oigen Alkohol, um sie weiter mit 40, 50°/o usw. zu behandeln. Der Dotter der Salmoniden wird sehr hart, der des Gobius capito läßt sich dagegen in Päraffin gut schneiden. 2400. B a u K i e n - T s i n g (22) b r i n g t die noch lebenden Knochenfischeier auf 3—5 Minuten in eine 0,7%ige NaCl-Lösung, der auf 100 ccm 3—5 ccm Essigs ä u r e zugesetzt w e r d e n . (Je älter das Entwicklungsstadium, desto weniger Essigsäure.) Die Schale w i r d auf diese Weise vollkommen durchsichtig, die Emb r y o n a l a n l a g e h e b t sich rein weiß vom gelb g e f ä r b t e n Dotter ab. Soll das Ei d a n n als T o t a l p r ä p a r a t erhalten bleiben, so konserviert m a n e n t w e d e r in einer 10°/oigen Lösung von Formalin m i t Zusatz von 2—5% Essigsäure oder mit Zusatz von 2—5°7« Wasserstoffsuperoxyd. Die letztere Lösung ist f ü r j u n g e unc alte E m b r y o n e n geeignet, die essigsäurehaltige dagegen m e h r f ü r alte Stadien In beiden Lösungen k ö n n e n die Eier unbegrenzt lange verweilen. — Soll da: Ei dagegen geschnitten werden, so ü b e r t r ä g t m a n aus der Essigsäure-Kochsalz lösung in reine 0,7°/oige NaCl-Lösung, eröffnet mit Schere u n d Pinzette dii Schale u n d bläst mit der Pipette von der h e r a u s g e s c h w e m m t e n E m b r y o n a l anlage den Dotter ab. Hierauf F i x i e r u n g der letzteren in Bouinscher Flüssig keit. 2401. A l s a l l g e m e i n e R e g e l m u ß g e l t e n , dotterhaltige F i s c h m a t e r i a l s o r a s c h w i e m ö g l i c h e i n z u b e t t e n , da di Dottersubstanz auch in schwachem Alkohol mit der Zeit h a r t u n d brüchig wirf Liegen die Eier einmal ein paar J a h r e in Spiritus, so k a n n m a n höchstens noc versuchen, die K e i m e u n d E m b r y o n e n mit S t a r n a d e l n u n d Skalpellspitzen at zusprengen und isoliert weiterzuschneiden, wobei m a n aber außer bei groß« Ü b u n g mit ziemlichem Materialverlust zu rechnen hat.

§ 2402—2405.

Wirbeltiere (Amphibiei^)

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Ist die sofortige Einbettung nicht möglich, so bewahre man die Keimscheiben in Terpineol oder Zedernöl auf. 2402. Zum Studium der frühen Stadien der B l u t b i l d u n g empfiehlt es sich, die Keimscheiben nach dem Vorgehen von M a x i m o w (23) f ü r 30 bis 40 Minuten in Zenker-Formol (s. § 338) zu fixieren und dann in toto weiter zu behandeln. Sie kommen nach 12—24stündigem Auswaschen in dest. Wasser durch die Alkoholreihe für kurze Zeit in absoluten Alkohol und dann f ü r mehrere Tage in Äther-Alkohol, da erst dann eine gute Färbung gelingt. Nach der Entfettung werden die Objekte über abs., 96-, 75- und 50°'/oigen Alkohol wieder in Wasser gebracht und nach Dominici, mit Azur-Eosin oder Eisenhämatoxylin gefärbt. Die gleiche Methode ist auch f ü r Reptilien und Vögel empfehlenswert. 3. Amphibien

2403. Ende März bis Mitte April findet man in Teichen, Pfützen und Bächen Frosch- und Krötenlaich. Die Frösche laichen in Klumpen, die Kröten in Schnüren. Solche Eier kann man schon frisch der Untersuchung unterwerfen und bei auffallendem Licht beispielsweise die Furchung studieren. Die P a a r u n g s z e i t ist bei uns: T r i t o n alpestris März bis Mai; T. cristatus April bis Juni; T. taeniatus Mai; R a n a esculenta Ende April und Mai; R. temporaria März; P e l o b a t e s fuscus Anfang April; B o m b i n a t o r igneus Mai und Juni; A l y t e s obstetricans zweimal im Jahre (Frühjahr und Herbst); B u f o vulgaris und variabilis April; B. calamita im Frühjahr, zuletzt unter den Kröten (vgl. darüber auch A. F r a n k e 81).- S a l a m a n d r a maculosa Frühling bis Sommer. Axolotl lassen sich in jeder Jahreszeit zum Laichen bringen.

2404. Bei R a n a und B uf o vollziehen sich die l e t z t e n R e i f u n g s v o r g ä n g e unmittelbar vor der Laichabgabe. Nach O. H e r t w i g und B o r n (94) schimmert das Keimbläschen bei den Endstadien der Eireifung am dunkelpigmentierten animalen Pol als heller Fleck durch. Der Durchtritt der Eier durch den Eileiter dauert bei Rana nach R ö t h i g 12 Stunden. Bei Bufo erfolgt der Durchtritt ohne Aufenthalt. Bei Bufo cal., Aly tes, Bombinator und den Urodelen vollzieht sich die Eireifung nach C a r n o y - L e b r u n während der Laichzeit. Bei Triton erfolgt dieselbe nach B o r n (94) schubweise. Warme Witterung scheint die Endreifung des Ovarialeies zu begünstigen. Man muß die Weibchen noch am Tage des Fanges töten, da die Endstadien bei gefangenen Tieren schon nach 24 Stunden verschwinden (Brunstzeit von April—Juni). 2405. Die k ü n s t l i c h e B e f r u c h t u n g gelingt am besten bei Fröschen oder Kröten, die in copula gefangen wurden. Will man längere Zeit Material zur Verfügung haben, so trennt man die Pärchen und hält sie an einem kühlen Ort in mit feuchtem Moos gefüllten Körben. Am Tage vor der stattfindenden Befruchtung bringt man Männchen und Weibchen wieder zusammen in ein Gefäß mit etwas Wasser. Zur Vornahme der Befruchtung dekapitiert man zuerst ein Männchen. Bei r. tempor. findet man bei brünstigen Männchen die Samenblasen meist stark gefüllt. Man nimmt sie vorsichtig mit einer Pinzette heraus und entleert den Inhalt in ein mit etwas Wasser gefülltes Schälchen. Bei r. esculenta muß man die Hoden in etwas Wasser bringen und fein zerschneiden und zerzupfen. Dann untersucht man einen Tropfen der Flüssigkeit im Mikroskop und überzeugt sich, daß sich die Spermien bewegen. Hierauf tötet man ein Weibchen, öffnet die Bauchhöhle, entnimmt dem Uterus vorsichtig mit einem Spatel ohne Quetschung die Eier, breitet sie in flacher Schicht auf dem Boden einer Schale aus und übergießt sie mit der Samenflüssigkeit, die man durch Hin- und Herneigen der Schale über alle Eier hinweglaufen läßt. 35*

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Embryologische Untersuchungstechnik

§ 2406—2410.

Nach 10 Minuten gießt m a n ab und ersetzt durch reines Wasser, das ö f t e r s zu e r n e u e r n ist. Die die Eier bedeckende Wasserschicht soll, besonders w ä h r e n d der ersten Zeit, nicht zu hoch sein. 2406. Über die Vornahme der künstlichen Befruchtung bei Tritonen s. H e r t w i g (82). 2407. Z u r F i x i e r u n g j u n g e r A m p h i b i e n k e i m e ist die Bouinsche Flüssigkeit sehr zu empfehlen, da sie sowohl Oberflächenbild wie histologische S t r u k t u r gut erhält. Vom Ei- bis Schwanzknospenstadium w e r d e n die K e i m e in den Hüllen fixiert, ä l t e r e w e r d e n vor d e m Einbringen in die F i x i e r u n g s f l ü s sigkeit von denselben b e f r e i t . Auch f ü r die F i x i e r u n g ausgeschlüpfter L a r v e n eignet sich die Bouinsche Flüssigkeit sehr gut, sofern m a n nicht besonderes Gewicht auf u n v e r s e h r t e E r h a l t u n g des Oberflächenbildes legt; in diesem Falle ist bei Bouinfixierung mit der Möglichkeit zu rechnen, daß es nach Ü b e r t r a g e n in den 80°/oigen Alkohol zumal bei älteren wasserreichen K a u l q u a p p e n zu Einziehungen der H a u t o b e r f l ä c h e kommt. Sehr gut bleibt dagegen das Oberflächenbild nach A n w e n d u n g des von mir angegebenen Sublimat-Trichloressigsäuregemisches e r h a l t e n (s. § 346). Man fixiert j e nach Größe der Tiere 5—24 S t u n den u n d ü b e r t r ä g t d a n n in 90°'/oigen Alkohol. In beiden Fällen k a n n m a n auch u n m i t t e l b a r aus der Fixierungsflüssigkeit in Dioxan ü b e r t r a g e n . 2408. Gutes leistet auch die Fixierung in dem Sublimatgemisch von Gilson (§ 340) oder P e t r u n k e w i t s c h (§ 341), wonach sich die Eihüllen mit Nadel und Schere sehr leicht e n t f e r n e n lassen. Gleichzeitig w i r d durch beide Flüssigkeiten auch Oberflächenbild wie I n n e n s t r u k t u r der K e i m e sehr gut erhalten. 2409. Von besonderer Wichtigkeit ist f ü r die U n t e r s u c h u n g j ü n g s t e r E n t wicklungsstadien die E n t f e r n u n g d e r E i h ü l l e n . Dieselbe w i r d vom Ei- bis S c h w a n z k n o s p e n s t a d i u m erst n a c h der F i x i e r u n g vorgenommen, da sich die Keime auf diesem f r ü h e n E n t w i c k l u n g s s t a d i u m in f r i s c h e m Zustand e n t w e d e r ü b e r h a u p t nicht ohne Beschädigung aus den Hüllen n e h m e n lassen oder aber, falls auch die Enthüllung glücken sollte, sich infolge ihrer weichen Beschaffenheit stark deformieren. F ü r die E n t f e r n u n g der Hüllen w u r d e n eine Reihe von Methoden angegeben; bei den einen erfolgt die E n t h ü l l u n g nach geeigneter V o r b e h a n d l u n g m e c h a n i s c h mit Pinzette u n d Schere, bei den anderen c h e m i s c h , indem die Hüllen d u r c h E i n w i r k u n g geeigneter Reagenzien zur Lösung gebracht werden. 2410. A m e m p f e h l e n s w e r t e s t e n ist zur Zeit das V e r f a h r e n von B a u t z m a n n (30), bei d e m die Keime zunächst mit Bouinscher Flüsigkeit fixiert w e r den. A n u r e n - u n d jene Urodelenkeime, die in Ballen abgelaicht w e r d e n (Pleurodeles, Axolotl) w e r d e n vor dem Einlegen einzeln isoliert, wobei man, ohne daß es u n u m g ä n g l i c h n o t w e n d i g wäre, die äußere Gallertschicht e n t f e r n t . Die Eier der T r i t o n a r t e n fixiert m a n in allen Hüllen. F i x i e r u n g s d a u e r 12—24 Std. Z u r E n t h ü l l u n g ü b e r t r ä g t m a n jeweils 4—5 Keime aus Bouin in eine flache Schale mit 80°'/oigem Alkohol und beobachtet u n t e r dem Binokular die Veränderungen, welche die Gallerte unter dem Einfluß des Alkohols erleidet. Schon nach wenigen Minuten w i r d sie opak u n d bald wird u n t e r S c h r u m p f u n g eine fädige F e i n s t r u k t u r sichtbar. Nun ist es Zeit, die Hüllen bei A n u r e n mittels zweier Pinzetten zu fassen und an einer Stelle auseinanderzureißen, w o d u r c h m a n zunächst das D o t t e r h ä u t c h e n ganz oder f a s t ganz freilegt. »Dann f a ß t m a n das D o t t e r h ä u t c h e n mit einer Pinzette, g r e i f t mit der a n d e r e n nach u n d k a n n n u n beides, Gallerte u n d Dotterhaut, leicht in einem abziehen. Wichtig ist, daß m a n im geeigneten M o m e n t der Alkoholeinwirkung mit der mechanischen E n t hüllung beginnt«, da sie v o r h e r wie n a c h h e r nicht oder n u r m a n g e l h a f t gelingt.

§ 2411—2413.

Wirbeltiere (Amphibien)

549

Bei Urodelen sticht man zum angegebenen Zeitpunkt mit der einen Branche der Pinzette durch die ganze Eikapsel hindurch Und preßt dann beide Branchen fest aufeinander: so durchtrennt man die Kapsel fast wie mit einer Schere und der Keim kann leicht aus der klaffenden Kapsel herausgeholt werden. Als besonderen Vorteil der Methode hebt Bautzmann die Kombination mit Bouinscher Flüssigkeit hervor, nach der sich die Präparate durch gute Fixierung, gute Schneidbarkeit und treffliche Färbbarkeit auszeichnen, während bei den älteren Enthüllungsmethoden zum Teil Flüssigkeiten in Anwendung kommen, die irgendeinen oder gar mehrere der genannten Vorzüge vermissen lassen. 2411. Für die Gewinnung von O b e r f l ä c h e n b i l d e r n ist die von O. S c h u l t z e (99) angegebene Fixierungs- und Enthüllungsmethode sehr empfehlenswert. Bei ihr erfolgt die Entfernung der Hüllen ebenfalls auf mechanischem Wege. Zuerst wird am frischen Keim mit der Schere die Gallerthülle bis auf die die Dotterhaut umgebende innerste Gallertschicht entfernt. Dann kommen die Keime f ü r 5 Minuten in eine auf 75, höchstens 80 tf C erhitzte 2°/oige Formollösung (1 : 20). Sie sterben hierin momentan ab und gleichzeitig hebt sich die Hülle soweit ab, daß der Keim mit Hilfe von Nadeln oder Pinzetten leicht herausgeholt werden kann. Das Oberflächenbild iSjt bis in die feinsten Einzelheiten ausgezeichnet erhalten. Die lederartige elastische Konsistenz macht die Keime auch f ü r weitere Präparation unter der Lupe sehr geeignet (Darstellung der Furchungshöhle, der Keimblätter usw.) Durch Einlegen der Keime in Glyceringelatine (hohlgeschliffene Objektträger) lassen sich sehr schöne ungeschrumpft und lange haltbare Demonstrationsapparate gewinnen. Noch besser und empfehlenswerter ist die Einbettung in Celodal (s. § 480). 2412. Nur mehr selten wird die Entfernung der Eihüllen auf chemischem Wege vorgenommen. B a r f u r t h (93) u. a. legen dazu die Eier für 1U—1 Stunde in E a u d e J a v e l l e , das mit 4 Teilen Wasser verdünnt wird (mehrmals umschütteln). Die von der Gallerthülle befreiten Eier sinken zu Boden, werden vorsichtig mit Wasser gewaschen und in steigenden Alkohol übertragen. H e r s t e l l u n g v o n E a u d e J a v e l l e : Man übergießt 3 g Kaliumchlorat (KC103, Vorsicht! nicht pulverisieren, explosibel!) in einem Erlenmeyerkölbchen mit 25 ccm dest. Wasser, fügt 6 ccm Salzsäure (1,16 = 20" Bé) zu und erwärmt gelind. Das Kaliumchlorat wird unter Chlorentwicklung zersetzt und geht unter Gelbfärbung dfer Flüssigkeit vollständig in Lösung. Man fügt nun unter Wasserkühlung eine kalte Lösung von 5 g Kaliumhydroxyd in 30 ccm Wasser zu, worauf sich die Lösung entfärbt. Spez.-gew. 1,10. Von den nach einiger Zeit ausiallenden Kristallen von Chlorkalium gießt man ab und hat eine sofort verwendbare Lösung. Wegen der Chlorentwicklung soll die Lösung nicht in der Nähe von Instrumenten bereitet werden (D o h 1 43). Der wirksame Bestandteil ist das aus dem entstandenen Kaliumhypochlorid frei werdende Chlor. Da die Lösung mit der Zeit unwirksam wird, stellt man sie erst kurz vor Gebrauch her. — Eau de Javelle wird auch zur Herstellung von Korrosionspräparaten gebraucht.

2413. Da Dotter in der Wärme leicht hart und schwer schneidbar wird, wird f ü r Eier und sehr junge Stadien vielfach Einbettung in weiches Paraffin (Schmelzp. 40—50° C) empfohlen. Um in diesen Fällen dünne Schnitte anfertigen zu können, muß der Block beim Schneiden gekühlt werden. K e i b e 1 hing zu diesem Zwecke über das Mikrotom.einen großen doppelwandigen Trichter, dessen Kern mit Eis oder fester Kohlensäure gefüllt wird. Die Ausflußöffnung des Trichters wird derart über dem Paraffinblock angebracht, daß die eisgekühlte Luft ständig auf dem Block herabströmt.

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Embryologische Untersuchungstechnik

§ 2414—2419.

Sehr einfach läßt sich Weichparaffin mit Hilfe eines ten Bergeschen Gefriertisches (s. § 518) schneiden. 2414. L e h m a n n und d e R o c h e (34) empfehlen f ü r dotterreiches Material Einbettung über Dioxan (s. auch § 353 ff.). Die Embryonen werden nach Fixierung aus Wasser direkt in Dioxan I übertragen, das über wasserfreiem K u p f e r s u l f a t steht. Von hier in Dioxan II und III über wasserfreiem Calciumchlorid. A u f e n t h a l t in jeder Stufe ca. I Stunde. Die Objekte liegen dabei auf einem Rost in der oberen Flüssigkeitszone. Einbettung über Benzol in Paraffin (je 15'Min.). Siehe auch § 792. 2415. Das A u f k l e b e n der Schnitte erfolgt am besten nach § 546,3. Hat man das Objekt im Stück gefärbt, so kann man die Schnitte nach Lufttrockenwerden noch mit der Strasserschen Klebemasse (10 Vol. Äther, 10 Vol. Kollodium, 15 Völ. Olei Ricini) mit einem weichen Pinsel in dünner Schicht überstreichen. Nach Trocknen bringt man in Carbolxylol, reines Xylol und Balsam. Will man im Schnitt färben, so verfahre man bei leicht abschwimmenden Objekten nach § 548. 2416. Zur F ä r b u n g junger Amphibienkeime eignet sich sehr gut die Heidenhainsche Pikroblauschwarzlösung, bei der die Zellgrenzen gewöhnlich sehr deutlich hervortreten. Da die Originallösung (s. § 1505) unter Umständen den Dotter zu intensiv gelb f ä r b t und dadurch die feinere Pigmentierung verdeckt, f ä r b t B a u t z m a n n (29) nach Stückfärbung mit Boraxcarmin die Schnitte zweizeitig: zuerst in einer Lösung mit herabgesetztem Pikrinsäuregehalt (auf 50 ccm 50ff/oigen Alkohols etwa 15 Tropfen gesätt. wässr. Pikrinsäure), bis sie schwach gelblich sind, danach f ü r einige Minuten in einer im Verhältnis 1 : 3 mit dest. Wasser v e r d ü n n t e n Lösung von Blauschwarz B (Blauschwarz B i g , Methylalkohol 80 ccm, dest. Wasser 320 ccm). Nach k u r z e m Abspülen in 50l,/oigem Alkohol w i r d in 70°/oigem differenziert. 2417. Zur F ä r b u n g d e r D o t t e r e l e m e n t e empfiehlt P e t er (04) bei Amphibien Eisenalauncochenille. Man koche 10 g gepulverte Cochenille mit 250 ccm dest. Wasser und dampfe das Dekokt unter stetem Umrühren auf etwa 50 ccm ein. Darauf wird destilliertes Wasser zu 150 ccm aufgefüllt, filtriert und auf je 40 ccm des Filtrats 3 Tropfen konzentrierter Salzsäure zugefügt. Der entstehende feine Niederschlag hat sich in 1—2 Tagen gesenkt und die klare orangerote Flüssigkeit ist gebrauchsfertig. Sie kommt unverdünnt zur Anwendung. Man f ä r b t die mit Eiweiß aufgeklebten, paraffinbefreiten Schnitte 18 bis 24 Stunden bei 37°, spült mit dest. Wasser ab (kann auch wegbleiben), und übergießt mit einer l®/oigen Eisenalaunlösung, die, wenn sie schwarz wird, gewechselt werden soll. Nach Va—2 Minuten Abspülen in dest. Wasser und D u r c h f ü h ren durch Alkohol und Xylol in Balsam. 2418. Über ä u ß e r e F a r b m a r k e n n v a c h V o g t und ihre histologische Fixierung s. § 790 ff. 4. Reptilien

2419. Im F r ü h s o m m e r (Mai, Juni) fällt es nicht sehr schwer, trächtige Eidechsen und Schlangen zu erhalten. Die in den Uterusschläuchen liegenden Eier befinden sich noch auf f r ü h e n Entwicklungsstadien, da die Tiere, sofern es sich nicht u m eine ovovivipare Art handelt, die befruchteten Eier verhältnismäßig frühzeitig ablegen. Die an geeigneten Legeplätzen aufzufindenden Gelege enthalten dagegen meist schon ältere Entwicklungsstadien. Wenn die Schalenhaut dieser Eier etwas kollabiert ist, so bringt man sie in feuchtes Moos od. dgl., wo sie in kurzer Zeit ihre ursprüngliche Spannung wiedergewinnen.

§ 2420—2423.

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Wirbeltiere (Reptilien) TABELLE 14

Tierart

Paarung

Lacerta agilis . . . . „ muralis . . . „ vivípara . . . Anguis fragilis . . . . Pelias berus Coronelía austriaca

. .

Tropidonotus natrix . .

Mai bis Juni April Ende April Mai Anfang April bis Mai Mitte April Mitte Mai

Gebär- bezw. Legezeit

Juli Mitte Juli August (sogar Oktober) Ende August bis Anfang September Ende August bis Anfang September Mitte Juli bis Ende August

2420. Zur A u f z u c h t v o n R e p t i l i e n e i e r bringt man nach R ö t h i g die zu verschiedenen Zeiten abgelegten Eier der Ringelnatter in einen weiten Glaszylinder, dessen Boden mit einer Schichte Sägespänne und frischem Pferdemist bedeckt ist. Darauf kommen die zuerst abgelegten Eier. Dann streut man wieder eine Schicht Sägespänne auf, die wieder mit einer Lage Pferdemist bedeckt wird, auf den man dann die jüngeren Eier legt usf. Man erhält so verschiedene Etagen von Eiern, die sich alle gut entwickeln und von denen die untersten die ältesten sind. 2421. Die F i x i e r u n g d e r K e i m e i n u n v e r l e t z t e m Z u s t a n d bereitet nur bei den frühen, dem Uterus entnommenen Stadien einige Schwierigkeiten. Sie erfolgt entweder nach Entfernung der Eischale oder, was für den Anfänger ratsamer ist, in Ungeschältem Zustand. Im ersteren Fall entfernt man die Schalenhaut am besten unter 0,7°/oiger Kochsalzlösung. Man faßt dazu die Eischale mit einer spitzen Pinzette derartig, daß sich eine niedre Falte bildet, die man dann mit einem l a n g e n Scherenschnitt entfernt. (Ist die Öffnung zu klein geworden, so kommt es zur Bildung eines Extraovates, welches in der Regel mit dem Platzen der Dotterhaut bzw. Ausfließen des Dotters und Zugrundegehen des Keimes endet.) In der Fortsetzung des Schnittes hebe man abermals eine Falte auf und schneide weiter ringsum, bis das Ei aus der Schalenhaut fällt. 2422. Ist es gelungen, das Ei ohne Verletzung von den Eihüllen zu befreien, so wird es mit einem passenden Hornlöffel in die Fixierungsflüssigkeit übertragen. Als solche eignet sich das Gemisch von Bouin, Helly, Petrunkewitsch od. dgl., die je nach der Größe des Keimes eine bis mehrere Stunden zur Einwirkung kommen. Hierauf werden die Eier in 70"/oigen Alkohol (bz. in Wasser) übertragen, die A r e a e m b r y o n a l i s bzw. vasculosa, mit einer scharfen, spitzen Schere u m s c h n i t t e n und isoliert weiterbehandelt. Bei sehr jungen Entwicklungsstadien ist es zu empfehlen, die Eier" zunächst im ganzen bis zum 30"/oigen Alkohol weiter zu führen und erst dann die Keimscheibe mit einem scharfen Rasiermesser abzuschneiden. 2423. Zur F i x i e r u n g d e r E i e r i n u n g e s c h ä l t e m Z u s t a n d legt n a n dieselben in toto f ü r 5—6 Stunden in Pikrin-Salpetersäure (§ 313) oder Pikrin-Schwefelsäure (§ 312) oder f ü r 24 Stunden in Boveris Pikrin-Essigsäure § 2381). Überträgt man sie dann in dest. Wasser, so läßt sich die Schalenhaut iiit Pinzette und Schere mit Leichtigkeit entfernen. Hierauf wird der Keim n üblicher Weise weiterbehandelt.

552

Embryologische Untersuchungstechnik

§ 2424—2431.

2424. Ähnlich ist folgende Methode, die bei Eidechsen und Blindschleicheneiern auch bei jüngsten Stadien sehr gute Resultate gibt ( O p p e l 91, 92). Die Eier kommen ungeschält f ü r 2—3 Stunden in Sublimat-Eisessig (100 : 5) und von hier f ü r 8—12—24 Stunden in gesättigte wässerige Pikrinsäure. Hierauf überträgt man, wie in § 2423, in Wasser, entfernt die Eischale und behandelt das Ei in steigendem Alkohol weiter. Im 80°7oigen Alkohol wird dann die Keimscheibe mit einem scharfen Rasiermesser abgeschnitten. 2425. R ö t h i g (04) fixiert jüngere und ältere Reptilieneier (Blindschleiche, Eidechse, Ophidier) in l°/oiger Chromsäure 30, konz. Sublimatlösung 30, Eisessig 3, Formalin 10, Aqu. dest. 27 Vol. 24 Stunden, wäscht ebensolange in fließendem Wasser und schält erst in Alkohol.

2426. Bei älteren Entwicklungsstadien bereitet die Fixierung keinerlei Schwierigkeiten. Bei ihnen entfernt man die Eischalen unter 0,7'Voiger Kochsalzlösung und überträgt den vom Dotter abgelösten, mehr oder weniger spiralig aufgerollten Embryo in einem Löffel in ein geeignetes Fixierungsgemisch wie z. B. Bouinsche oder Zenkersche Flüssigkeit. 5. Vögel 2427. Das b e q u e m s t e M a t e r i a l zur Untersuchung von Vogeleiern sind die H ü h n e r e i e r , von denen nur die ersten Furchungsstadien schwer zu bekommen sind, da sich dieselben noch im unteren Teile des Eileiters und im sog. Uterus gleichzeitig mit der Bildung des Eiweißes und der Schalenhäute vollziehen. Beim frisch gelegten Ei sind meist schon die beiden ersten Keimblätter sichtbar. Um frühere Stadien zu bekommen, muß man also die Henne töten. Einzelne Vögel, z. B. Kanarienvögel, legen die Eier nach R a ub e r (76) jedoch in viel jüngeren Stadien ab. Um die weitere Entwicklung der abgelegten Eier verfolgen zu können, werden sie in einem geeigneten B r u t a p p a r a t (z. B. von Sartorius, Göttingen) bebrütet. 2428. Im Notfall läßt sich auch ein gewöhnlicher Thermostat, dessen Thermoregulator auf 38—39° C eingestellt ist, verwenden. 39° C sollen jedoch nicht überschritten werden. Von geringerer Bedeutung ist eine vorübergehende Temperatursenkung. Um das Innere des Brutraumes feucht zu halten, stellt man am Boden desselben eine flache Schale mit Wasser auf; andernfalls trocknen die Eier aus. Ferner ist für Zutritt von frischer Luft zu sorgen, z. B. dadurch, daß man mehrmals am Tage kurze Zeit die Türe öffnet. Die Eier müssen jeden Tag etwas um ihre Längsachse gedreht werden, etwa um 90°. Man macht am besten mit dem Bleistift auf eine Seite des Eies ein Kreuz und auf die gegenüberliegende einen Kreis, dann sieht man immer, um wieviel man gedreht hat. Die Drehung soll stets nach einer Richtung, z. B. im Sinne des Uhrzeigers erfolgen. Durch zu vieles Drehen können namentlich auf frühen Stadien leicht Mißbildungen (z. B. 2 bis 3 Medullarrohre u. dgl. entstehen. Wichtig ist, die Eier täglich auch etwas abzukühlen. Sie werden dazu täglich anfangs 2—5 Minuten, gegen Ende der Bebrütung (15.—21. Tag) •/ Anat. u. Entwg. Bd. 66, S. 211—214. B r a u n , B., 33. Die Isolierung elastischer Gewebe aus Bindegewebe durch Kochen in gesättigter wäßriger Harnstofflösung. Z. mikr.-anat. F. Bd. 32, S. 353—358. B r a u n m ü h 1 , A.- v., 2 9. Eine einfache Schnellmethode zur Darstellung der senilen Drusen. Z. ges. Neurol. Bd. 122, S. 317—322. B r a u s , H., 9 6. Untersuchungen zur vergleichenden Histologie der Leber der Wirbeltiere. Semons Zool. Forschungsreisen. Bd. 2. B r e m e r , L., 82. Über die Endigungen der markhaltigen u n d marklosèn Nerven im quergestreiften Muskel. A. m. A. Bd. 21, S. 663—671. B r e s s l a u , zit. nach P. Mayer, Zoomikrotechnik, S. 151. B r e ß 1 a u , E., 2 1. 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E b n e r , V. v., 10. Histologie der Zähne. Scheffs Handb. der Zahnheilkunde. 3. Aufl. —, 1 8. Über den feineren Bau der Flügelmuskelfasern der Insekten. Sitz.-Ber. Akad. Wiss. Wien. Math.-naturw. Kl. Abt. 3. 127. —, 2 0. Uber den feineren Bau der Herzmuskelfasern. 1. und 2. Teil. Sitz.-Ber. Akad. Wiss. Wien. Math.-naturw. Kl. Abt. 2. 129. Band. E d i n g e r , L., 8 4. Notiz, betreffend die Behandlung von P r ä p a r a t e n des Zentralnervensystems, welche zur Projektion mit dem Scioptikon 'dienen sollen. Z. w. M. Bd. 1, S. 126. —, 1 3. Ersatz des Kanadabalsams durch Gelatine an mikroskopischen Präparaten. Neurol. Zbl. Bd. 32, S. 927—928. E h r i n g h a u s , 3 8. Das Mikroskop. 2. Aufl. 156 S. Leipzig-Berlin. Teubner. E h r l i c h , P., 76. Beiträge zur Kenntnis der Anilinfärbungen und ihrer Verwendung in der mikroskopischen Technik. A. m. A. Bd. 13. —, 8 5. Das Sauerstoffbedürfnis des Organismus. Eine farbenanalytische Studie. Berlin. —, 8 6. (Hämatoxylinlösung.) Z. w. M. Bd. 3, S. 150. •—, 9 1. Farbenanalytische Untersuchungen zur Histologie und Klinik des Blutes. I. T. (Enthällt gesammelte Abhandlungen von ihm und Arbeiten seiner Schüler W e s t phal, Spilling, Schwarze.) —, 9 3. Uber Neutralrot. Allg. med. Zentralzeitung, 04. —, 0 6. Experimentelle Carcinomstudien an Mäusen. Arb. Inst, exper. Ther. F r a n k f u r t a. M. E i n a r s o n , L„ 3 2. A method for progressive selective staining of Nissl and nuclearsubstance in nerve cells. Amer. Journ. of Path. Bd. 8, S. 295—307. —, 3 4. Die Gallocyanin-Chromlackreaktion als Grundlage eines Zelläquivalentbildes. Laeknabladid Bd. 20, S. 142. — und K. B e n t s e n , 3 9. Bemerkungen zur progressiv-selektiven färberischen Darstellung der Nervenzellen in P a r a f f i n - und Zelloidinschnitten. Z. w. M. Bd. 56, S. 265—272. E i s e n b e r g , 10. Über Fettfärbung. Virch. A. 199. —, 1 6. Allgem. Methode der histologischen F ä r b u n g in Enzykl. mikr. Techn. 3. Aufl., Bd. 1, S. 686—697. E l l e n b e r g e r , W., 0 6. Beiträge zur Frage des Vorkommens, des anat. Verhältnisses u n d der physiol. Bedeutung des Caecums, des Processus vermiformis und des cytoplastischen Gewebes in der Darmschleimhaut. Arch. Anat. Physiol. E l l e r m a n n , V., 1 9. Über G r a n u l a f ä r b u n g in Schnitten der blutbildenden Organe beim Menschen. Z. w. M. Bd. 36. S. 56—67. E l l i n g e r , Ph. u n d A. H i r t , 2 9 a . Mikroskopische Untersuchungen an lebenden Organen. I. Mitt. Methodik der Intravitalmikroskopie. Z. Anat. Entw. g. Bd. 90, S. 791—802. —, 2 9 b. II. Mitt. Zur Funktion der Froschniere. A. f. exp. Path. u. Pharm. Bd. 145, S. 193—210. —, 3 0. Eine Methode zur Beobachtung lebender Organe mit stärksten Vergrößerungen im Luminiszenzlicht (Intravitalmikroskopie) in Handb. der biol. Arbeitsmeth. Abt. V. T. 2/2, S. 1753—1764. —, 3 1. IV. Mitt. Zur Funktion der Froschniere. Arch. f. exp. Path. u. Pharm. Bd. 159, S. 11—127. E 1 s c h n i g , A., 9 3. Zur Technik der Celloidineinbettung. Z. w. M. Bd. 10. S. 443—446. E n b o m , G., 3 8. Ein Schnellverfahren zur Rekonstruktion in Plastilin nebst a n d e r e n technischen Beiträgen. Z. w. M. Bd. 55, S. 150—165. E n c y k l o p ä d i e der mikroskopischen Technik, 0 3. Herausgegeben von E h r l i c h , R. K r a u s e , M a x M o s s e , H. R o s i n und K a r l W e i g e r t . Berlin u n d Wien. 1. Aufl. — 1 0 , 2. Aufl. — 2 6 — 2 7., 3. Aufl. Bd. 1—3. E n g e l m a n n , Th. W., 6 8. Über die Flimmerbewegung. Jen. Z. Nat. Bd. 4, S. 355. E r d h e i m und S t u m m e , 0 9. Über die Schwangerschaftsveränderungen der H y pophyse. Ziegl. Beitr. Bd. 46, S. 17. E r l e n m e y e r , E., 7 1. Darstellung von absolutem Alkohol. Liebigs Annal. d. Chemie. Bd. 159, S. 249—250. E r ö s , G., 2 8. K a l k - und Zellkernfärbung mittels alaunsauerem Fuchsin. Zbl. Path. Bd. 42, S. 97—102. —, 3 2. Eine neue Darstellungsmethode der sog. »gelben« argentaffinen Zellen des Magen-Darmtraktus. Zbl. Path. Bd. 54. 37

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

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P i e a n d t , H. v., 3 2. Ein Vakuumverfahren der Celloidineinbettung. Z. w. M. Bd. 49, S. 60—68. —, 3 3. Ein Verfahren zum Aufkleben von Gefrierschnitten. Z. w. M. Bd. 50, S. 323 bis 328. — und A. S a x e n , 3 2. Ein Beitrag zur Technik der kombinierten Celloidin-ParaifinEinbettung. Z. w. M. Bd. 49, S. 69—83. — und A. S a x e n , 3 6. Weitere Beiträge zur Technik der kombinierten CelloidinParaffin-Einbettung. Z. w. M. Bd. 53, S. 137—150. — und A. S a x e n , 3 6. Über die Darstellung des Golgischen Netzapparates mittels einer modifizierten Bielschowsky-Methode. Z. w. M. Bd. 53. S. 125—136. F i s c h e 1, A., 0 8 a. Über eine vitale und spezifische Nervenfärbung. Z. w. M. Bd. 25, S. 154—157. —, 0 8 b. Untersuchungen über vitale Färbung usw. Leipzig. —, 1 0. Vitale Färbung. Encykl. mikr. Technik. 2. Aufl., S. 589—601. F i s c h e 1, Richard, 0 5. Technik der K r o m a y e r sehen Epithelfaserfärbung. Zbl. Path. Bd. 16. F i s c h e r , A., 9 3. Zur Kritik der Fixierungsmethoden und der Granula. An. An. Bd. 9. —•, 9 9. Fixierung, Färbung und Bau des Protoplasmas. Jena, G. Fischer. F i s c h e r , A., 2 5. A simple apparatus for making extracts of parenehymatous tissue. A. exp. Zellf. Bd. 1, S. 122—124. —•, 2 7 a. Technik der Gewebezüchtung. In Handb. d. biol. Arbeitsmethod. her. von Abderhalden. Abt. 5, T. 1, H. 4, S. 637—674, Lief. 228. —, 3 3. Gewebezüchtung. Handbuch der Biologie der Gewebezellen in vitro. 3. Aufl., 661 S. München. F i s c h e r , B., 02. Über die Fettfärbung mit Sudan III und Scharlach R. Zbl. Path. Bd. 13. F i s c h e r , E., 3 3 a. Untersuchung getrockneter und luftgefüllter Gewebe mit dem Ultropak. Beitr. path. Anat. Bd. 92, S. 270—289. —, 3 3 b. Eine einfache Methode zur Darstellung der Lymphgefäße durch parenchymatöse Injektion von Luft. A. klin. Chir. Bd. 176, S. 17—37. —, 3 3 c. Weitere Erfolge mit der Methode der selbsttätigen Luftfüllung. Darstellung der Lymphgefäße. An. An. Bd. 76, S. 289—352. F i s c h e r , I., 3 9/4 0. Vitale Kernfärbungen bei Stenobothrus. Chromosoma Bd. I, S. 157—177. —•, 4 2. Grundriß der Gewebezüchtung. Jena. G. Fischer. F i s c h e r , O. v., 2 5. Zur Behandlung von Zelloidinserien. Z. w. M. Bd. 42, S. 171—173. F i s c h l e r , 0 4. Über die Unterscheidung von Neutralfetten, Fettsäuren und Seifen im Gewebe. Zbl. Path. Bd. 15, S. 913. F i s c h 1 e r F. und K. W. R o e c k 1, 3 8. Über das Auftreten dunkler Leberzellen unter' experimenteller Beeinflussung der Leberfunktion. Z. mikr. anat. F. Bd. 44, S. 563—605. F i 11 i n g. Über Wasserimmersionen mit Fassungen aus rostfreiem Stahl. Z. w. M. Bd. 44, S. 478—480. F l a u m , E., 3 1. Blut und blutbildende Organe. 2. Meerschweinchen, S. 179—191; 3. Ratte, S. 192—204. In Anatomie und Pathol. der kleinen Laboratoriumstiere. Herausg. von R. Jaffe, Berlin. F l e c h s i g , P., 76. Die Leitungsbahnen im Gehirn und Rückenmark des Menschen. Leipzig. F 1 e m m i n g , W., 6 8. Über den Ciliarmuskel der Haussäugetieie. A. m. A. Bd. 4, S. 353. —, 8 2. Zellsubstanz, Kern und Zellteilung. ,p. VIII und 424 S. 24 Fig. u. 8 Taf. Leipzig. —, 8 9 a. Über die Löslichkeit osmierten Fettes und Myelins in Terpentinöl. Z. w. M. Bd. 6, S. 39—40. —, 8 9 b. Weiteres über die Entfärbung osmierten Fettes in Terpentin und anderen Substanzen. Z. w. M. Bd. 6, S. 178—181, —, 9 1a. Uber Teilung und Kernformen bei Leukozyten usw. A. m. A. Bd. 37, S. 249 bis 298. —, 9 1b. Neue Beiträge zur Kenntnis der Zelle. A. m. A. Bd. 37, S. 685—751. —, 9 5 a. Über die Wirkung von Chromosmiumessigsäure auf Zellkerne. A. m. A. Bd. 45, S. 162—166. —, 9 5 b. Über den Bau der Spinalganglien bei Säugetieren usw. A. m. A. Bd. 46, S. 379 bis 394. 37*

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H a m p e r 1, H., 2 6. Die färberische Darstellung der Hauptzellengranula in der menschlichen Magenschleimhaut. Virch. A. Bd. 259, S. 179—185. —, 3 1. Beiträge zur, normalen und pathalogischen Histologie menschlicher Speicheldrüsen. Z. mikr.-anat. F. Bd. 27, S. 1—55. —, 3 2. W a s sind argentaffine Zellen? Virch. A. Bd. 286, S. 811—833. H a n n , F. und F. S a u b e r e r , 34. Elektrisch heizbare Modellierspatel. Z. w. M. Bd. 51, S. 370—373. H a n s e n , Fr. C. C., 9 5. Eine schnelle Methode zur Herstellung des Böhmerschen Hämatoxjrlins. Zool. Anz. Nr. 473. —, 9 8 a. Eine zuverlässige Bindegewebsfärbung. An. An. Bd. 15, S. 151—153. —, 9 8 b. Ü b e r die Genese einiger Bindegewebssubstanzen. An. An. Bd. 16, S. 417—438. •—, 0 5. Untersuchungen über die Gruppe der Bindesubstanzen. I. Der Hyalinknorpel. Anat. II. Bd. 27. —, 0 8. U b e r die Ursachen der metachromatiischen Färbung bei gewissen basischen Farbstoffen. 1. Abschn. Z. w. M. Bd. 25, S. 145—153. H a r r i s , H. F., 98. A new method of ripening haematoxylin. Micr. Bull. 1898, S. 47. H a r r i s o n , R. G., 0 8. Embryonic transplantation and development of the nervous system. Anat. Ree. Bd. 2, S. 385—410. —•, 1 0. T h e outgrowth of the nerve flbre as a mode of protoplasmic movement. Journ. Exp. Zool. Bd. 9, S. 787. H a r t m a n n , A., 28. Milz im »Handbuch der mikrosk. Anatomie«, her. von W. v. Möllendorff, Bd. VI., 1. Teil, S. 397—563. H a r t o c h , . W . , 3 2. Mikroskopische Lebendbeobachtung der Säugetierschilddrüse. Klin. Woch. II, 1224. H a r v a r t h , zit. nach Hallmann 4 1. Klin. Chemie usw. H a s e b r o c k , K., 2 1. Untersuchungen zum Problem des neuzeitlichen Melanismus der Schmetterlinge. Fermentforschung Bd. 5, S. 1 ff. H a s e g a w a , 2 3. Über die Carcinoide des Wurmfortsatzes und des Dünndarms. Virch. A. Bd. 244. H a u g , R., 91. Die gebräuchlichsten Entkalkungsmethoden. Eine technisch-histologische Studie. Z. w. M. Bd. 8. H e e r f o r d t , C. F., 0 0. Studien über den Musculus dilatator pupillae. Anat. H. Bd. 14, S. 487—558. H e i d e n h a i n , M., 9 2. Über Kern und Protoplasma. Festschr. f. Kölliker. Leipzig. S. 109—166, Taf. 9—11. —, 9 4. Neue Untersuchungen über die Zentralkörper und ihre Beziehungen zum Kernund Zellprotoplasma. A. m. A. Bd. 43, S. 423—758, T. 25—31. —, 9 6. Noch einmal über die Darstellung der Zentralkörper durch Eisenhämatoxylin nebst einigen allgemeinen Bemerkungen über die Hämatoxylinfarben. Z. w. M. Bd. 13, S. 186—199. —, 0 1. Über eine Paraffineinbettung mit Schwefelkohlenstoff als Durchgangsmedium. Z. w. M. Bd. 18, S. 166—170. —, 0 2. Uber chemische Umsetzungen zwischen Eiweißkörpern u n d Anilinfarben. Pflüg. A. Bd. 90. —, 0 3 a. Über die Verwertung der Zentrifuge bei Gelegenheit der Herstellung von P r ä p a r a t e n isolierter Zellen zu Kurszwecken. Z. w. M. Bd. 20, S. 172—187. —, 0 3 b. Uber die zweckmäßige Verwendung des Kongo und a n d e r e r Amidoazokörper, sowie über neue Neutralfarben. Z. w. M. Bd. 20, S. 179—186. —, 0 3 c. Neue Versuche über die chemischen Umsetzungen zwischen Eiweißkörpern und Anilinfarben, insbesondere u n t e r Benutzung der Dialyse. Pflüg. A. Bd. 96. —, 0 5 a. Über die Massenfärbung mikroskopischer Schnitte auf Glimmerplättchen. Z. w. M. Bd. 22, S. 330—336. —, 0 5 b. Trichloressigsäure als Fixierungsmittel. Z. w. M. Bd. 22, S. 321—324. —, 0 5 c. Über F ä r b u n g von Knochenknorpel f ü r Kurszwecke. Z. w. M. Bd. 22, S. 325 bis 330. —, 0 5 d. Über die Anwendung des Azokarmins und der Chromotrope. Z. w. M. Bd. 22, S. 337—343. —, ö 7. P l a s m a und Zelle. 1. Abt., 1. Lief. Jena. —, 0 8 a. Über die Haltbarkeit mikrosk. P r ä p a r a t e usw. Z. w. M. Bd. 25, S. 397—400. —, 0 8 b. Über Vanadiumhämatoxylin, Pikroblauschwarz und Kongo-Korinth. Z. w M. Bd. 25, S. 401—410. —, 1 1. P l a s m a u n d Zelle. 1. Abtlg. 2. Lief. Jena.

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H e i d e n h a i n , M., 1 3. Über die Bearbeitung der Sehnen zu Kurszwecken. Z. w. M. Bd. 30, S. 161—167. —, 1 5. Übet die Mallorysche Bindegewebsfärbung mit Karmin u n d Azokarmin als Vorfarben. Z. w. M. Bd. 32, S. 361—372. —, 1 6. Das A n h a u c h e n des Blockes als Hilfsmittel beim Abziehen der Paraffinschnitte. Z. w. M. Bd. 33, S. 235—237. —, 1 6. 25 J a h r e Eisenhämatoxylin. Z. w. M. Bd. 33, S. 225—231. —, 1 7. Über neuere Sublimatgemische. Z. w. M. Bd. 33, S. 232—234. —, 1 8. Über progressive Veränderungen der Muskulatur bei Myotonia atrophica. Ziegl. Beitr. Bd. 64, S. 1-98—225. —, 2 0. Neue Grundlegungen zur Morph, der Speicheldrüsen. An. An. Bd. 52, S. 308 ff. —, 2 1. Über die teilungsfähigen Drüseneinheiten oder Adenomeren. A. Entw. Mech. Bd. 49, S. 8 ff. —, 2 6. Artikel Benzolichtbordeaux in Enzyklop. 3. Aufl. Bd. 1. S. 158. —, 2 6. Artikel »Färbungen« in Enzykl. mikr. Techn. 3. Aufl., 1. Bd. S. 680—687. H e i d e n h a i n , R., 7 0. Untersuchungen ü b e r den Bau der Labdrüsen. A. m. A. Bd. 6, S. 368—406, 2 Taf. —, 8 0. Physiologie der Absonderungsvorgänge. H a n d b u c h der Physiol. von L. H e r mann. Bd. 5, S. 1—420. —, 8 6. Eine A b ä n d e r u n g der Färbung mit Hämatoxylin und chromsauren Salzen. A. m. A. Bd. 27, S. 383—384. —, 8 8. Beiträge zur Histologie und Physiologie der Dünndarmschleimhaut. Pflüg. A. Bd. 43, Suppl. H e i d e r m a n n s , C., und W u r m b a c h , H., 3 4. Eine Methode zum histochemischen Nachweis geballten Phosphats im Gewebe. Z. w. M. Bd. 51, S. 375—378. H e i m , L. u n d F. S k e 11, 31. Anleitung zur Mikrophotographie. 92 S. Jena. H e i m s t ä d t , O., 2 1. Ein stereoskopischer Aufsatz f ü r Mikroskope. Z. w. M. Bd. 38. S. 321—333. —, 2 3. Eine neue Strahlenleitung f ü r stereoskopische Mikroskopie. Z. w. M. 40. S. 271 bis 278. H e i n e , H., 31. Der Ultropak. Z. w. M. 48, S. 450—465. H e i n e k e , H., 0 5. Experimentelle Untersuchungen über die Einwirkung der Röntgenstrahlen auf das Knochenmark usw. Deutsche Zeitschrift f ü r Chirurgie. Bd. 78. H e l d , H., 09. Über die Neuroglia marginalis der menschlichen Großhirnrinde. Monatsschr. f. Psych, u. Neurol. Ergänzgh. zu Bd. 26, Festschr. f. Flechsig, S. 360—416. —, 0 9. Untersuchungen über den feineren Bau des Ohrlabyrinthes der Wirbeltiere. II. Teil. Abhandl. K. Sächs. Ges. Wiss. math.-physik. Kl. Bd. 31, S. 195—294. —, 1 7. Untersuchungen über den Vorgang der Befruchtung. I. Der Anteil des Protoplasmas an der Befruchtung von Asc. megal. A. m. A. Bd. 89 II, S. 65—76. H e l'l m a n n , T. Z., 2 2. Studien über das lymphoide Gewebe. 4. Zur -Frage des status lymphaticus. Z. Konstitut. Bd. 8, S. 191—219. H e 11 y , K., 0 4. Eine Modifikation der Zenkerschen Fixierungsflüssigkeit. Z. w. M. Bd. 20. —, 1 3. Wiederherstellung vertrockneter Präparate. Verh. D. path. Ges. H e n c k e 1, K. O., 2 9. Die Mikroveraschung. Handb. biol. Arb. Methoden. Abt. V. T. 212, S. 1471—1477. H e n k e und Z e l l e r , 05. Aceton zur Paraffinschnelleinbettung. Zbl. Path. Bd. 16. H e n l e , J . , 4 1 . Allgemeine Anatomie. Leipzig. 6. Bd. des S ö m m e r i n g sehen H a n d buches: »Vom Bau des menschlichen Körpers«. —, 7 1. Handbuch der systematischen Anatomie des Menschen. Bd. 3, Abt. 2 Vorrede). H e n n e g u y , 9 1. Nouvelles recherches sur la division cellulaire indirecte. Journ. Anat. Physiol. Bd. 27, S. 397—422. H e r f o r t , 0 0. Die Reifung und Befruchtung des Eies von Petrom. fluv. A. m. A. Bd. 57, S. 54—94. H e r i n g a , G. C., 2 8. Die Herstellung mikroskopischer Dauerpräparate; in Peterfi Method. d. wiss. Biol. Bd. I, S. 587—638. —, 3 1. Kleine Notiz bezügl. der Gelatinegefriermethode. Z. w. M. Bd. 48, S. 79. —, 3 3. Reticulin u n d Kollagen. Z. mikr.-anat. F. Bd. 34, S. 459—484. —, 3 9. Chemische und färberische Fettdarstellung in der Zelle. Z. exp. Zeilf. Bd. 22, S. 632—636. — und t e n B e r g e , B. S., 23. Eine Gelatine-Gefriermethode f ü r die Anfertigung mikroskopischer P r ä p a r a t e . Z. w. M. Bd. 40, S. 166—177.

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H e r m a n n , F., 93. Technik. Methoden zum Studium des Archiplasmas und der Centrosomen tierischer und pflanzlicher Zellen. Erg. Anat. Entw. Bd. 2, Abt. 2, S. 23—36. —•, 9 4. Notiz über die Anwendung des Formalins als H ä r t u n g s - u n d Konservierungsmittel. An. An. Bd. S. 112—115. H e r r e r a , J. M., 3 2. Méthode de coloration ä l'oxalate ethylamino-argentique. Trav. Labor. Rech. Biol. Univ. Madrid, Bd. 27. H e r t w i g , G., 29. Allgemeine mikroskopische Anatomie der lebenden Masse in Handb. d. mikr. Anat. d. Menschen, hrsg. von v. Möllendorff, Bd. I, I. Teil. —, 3 0. Das Verhalten der Nervenzellen gegenüber der Nuklealreaktion. Sitzber. N a turf. Ges. Rostock, III. F., Bd. 3. —, 3 1. Der Einfluß d e r Fixierung auf das K e r n - und Zellvolumen. Z. mikr.-anat. Forschg. Bd. 23, S. 484—504. H e r t w i g , O., 83. Die Entwicklung des mittleren Keimblattes der Wirbeltiere, Jena, u n d P o l l , H., 07. Zur Biologie der Mäusetumoren. Abh. K. Preuß. Akad. Wiss. H e r w e r d e n , M. A. van 2 5. Reversible Gelbildung in Epithelzellen der Froschlarve u n d ihre Anwendung zur P r ü f u n g auf Permeabilitätsunterschiede in der lebenden Zelle. A. exp. Zellf. Bd. 1, S. 145—159. —-, 2 5. U m k e h r b a r e Gelbildung in den Zellen eines mehrzelligen Organismus. Biol. Z.bl. Bd. 44, S. 579—582. —, 2 6. U m k e h r b a r e Gelbildung u n d histologische Fixierung. Prot. Bd. 1, S. 366—371. H e r x h e i m e r , G., 0 1. Über Fettfarbstoffe. D. med. Woch. S.- 607. —-, 0 9. Über eine neue Fibrinmethode. Münch, med. Woch., S. 1695. —, 1 2. Technik der pathol.-histolog. Untersuchung. Wiesbaden. — 1 5. Über die Darstellung m e m b r a n a r t i g e r Bildungen im menschlichen Gewebe. Berl. klin. Woch. Bd. 52, S. 1040. H e r x h e i m e r , K., 8 9. Über eigentümliche Fasern in der Epidermis usw. A. Derm a l Syphil. Bd. 21. H e r z e n b e r g , H., 2 4. Über vitale F ä r b u n g des Amyloids. Virch. A. Bd. 253, S. 656 bis 660. —, 2 6. Über vitale Färbung des Amyloids. 2. Mitt. Virch. A. Bd. 260, S. 467—473. H e r z f e l d , E„ 17. Über die N a t u r der am lebenden Tier erhaltenen granulären F ä r bungen bei Verwendung basischer und saurer Farbstoffe. Anat. H. Bd. 54, S. 447 bis 523. H e r z o g , 2 6. Artikel »Auge« in der Enz. d. mikr. Technik. 3. Aufl. Bd. I, S. 95—135. H e s s e - D o f l e i n , 10, 14. Tierbau u n d Tierleben. Bd. II. Das Tier als Glied des Naturganzen von Fr. Doflein. Leipzig und Berlin, Teubner. H e u d o r f e r , K., 2 1. Über den Bau der Lymphdrüsen. Z. f. Anat. u. Entw. Bd. 61, S. 365—401. —, 2 1. Über das Hauptpigment und seine Beziehungen zur Addisonschen Krankheit. Münch. Med. Woch. H i c k s o n , J. S., 01. Staining with Brazilin. Quart. Journ. of Micr. Sc. Bd. 44, N. F. H i 11 a r p , Nils-Ake, 4 6. S t r u c t u r e of the Synapse and the peripheral innervation a p p a r a t u s of the autonomie nervous system. Acta Anatomica, Supplement 4, 153 S. H i n t z s c h e , E., 3 8. Das Aschenbild tierischer Gewebe und Organe (Methodik und Ergebnisse). Erg. Anat. Entw. Bd. 32, S. 63—136. —• und W e r m u t h , 3 2. Beitrag zur Histochemie der Knochenbruchheilung. Z. mikr.-anat. Forschg. Bd. 28, S. 1—46. H i r s c h , G. Ch., 3 2 a. Die Lebendbeobachtung der Restitution des Sekretes im P a n kreas. I. Teil. Die Restitution der Granula nach Pilokarpinreizung. Z. f. Zellf. Bd. 15, S. 35—68. —, 3 1b. Desgl. II. Teil. Analse der Restitution mittels Röntgenstrahlen. Arch. f. Entw.mech. Bd. 123. S. 792. —, 3 1. Desgl. III. Teil. Die wechselnde Permeabilität der Pankreaszelle als limitierender F a k t o r der vitalen Neutralrotfärbung. Z. f. Zellf. Bd. 14, S. 517—543. —, 3 2 d. Desgl. IV. Teil. Die Restitution der Drüse als Ganzes nach Pilokarpinreizung. Z. f. Zellf. Bd. 15, S. 290—310. —, 3 9. F o r m - und Stoffwechsel der Golgi-Körper. Protoplasma-Monographien. Bd. 18, 394 S. — und L. H. B r e t s c h n e i d e r , 3 7. Intraplasmatischer Stoffwechsel bei Ascaris. I. Arbeitsräume in der Darmzelle, die Einwirkung des Hungerns auf die Sekretbildung. Cytologia, Festschrift F u j i i 424.

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H i r s c h , G. Ch., und L. H. Bretschneider, 3 8. II. Die Adsorption von Eisen in den Darmzellen und die Beteiligung der Golgi-Körper hierbei. Prot, Bd. 29, S. 9—30. — und J a c o b s , W., 2 6. Experimentelle Untersuchungen über das Wesen der Fixierung. Z. f. Zellf. Bd. 3, S. 198—228. H i r s c h f e l d , H., 3 7. Eine einfache neue Oxydasereaktion. Fol. haemat. Bd. 56, S. 46—48. —• u n d H i t t m a i r , 2 5. Ergebnisse und Fehlerquellen bei der supravitalen F ä r bung des Blutes. Fol. Haem. Bd. 31. H i r s c h 1 e r , J., 4 3. Grundsätzliches über Osmiumfixierung u n d Osmiumfärbung. Z. w. M. Bd. 59, S. 113—130. —• und R o m a n i s z y n , W., 4 0. Strecken von Paraffinschnitten in einer Feuchtkammer. Z. w. M. Bd. 57, S. 301—304. H i r t , A., 3 0. Zur Innervation der Niere und Nebenniere des Frosches. Z. Anat. Entw. Bd. 91, S. 580—593. —, 3 8 / 3 9. Luminiszenzmikroskopische Untersuchungen an den Mastzellen der lebenden Maus. Verh. Anat. Ges. 1938, S. 97—104. —, 3 9. Luminiszenzmikroskopische Untersuchungen am Nervensystem des lebenden Tieres. Verh. anat. Ges. 1939, S. 25—42. —, J. A n s o r g e und H. M a r k s t r a h l e r , 3 9. Luminiszenzmikroskopische U n t e r suchungen an der lebenden Frosch- und Rattenleber. Die Ausscheidung von Fluorescin und Trypaflavin. Z. Anat. Entw. Bd. 109, S. 1—32. H i s , W., 6 1. Untersuchungen über den Bau der Lymphdrüsen. Z. w. Zool. Bd. 11. 24 S., Taf. 8, 9. —, 6 8. Untersuchungen über die erstç Anlage des Wirbeltierleibes. Leipzig. —•, 8 7. Über die Methoden der plastischen Rekonstruktion usw. An. An. Bd. 2, S. 382. H o c h s t e 11 e r , F., 3 1. Über eine Abänderung des Objektträgers der von Greil angegebenen Einrichtung zur photographischen A u f n a h m e der Körperoberfläche von Embryonen bei schwacher Vergrößerung.. Z. mikr. anat. F. Bd. 26, S. 309—326. H ö b e r , 14. Physikal. Chemie der Zellen und Gewebe. 4. Aufl., S. 81. H o e h l , E., 97. Zur Histologie des adenoiden Gewebes mit 2 Taf. A. Anat. Physiol., Anat. Abt. 1897, S. 133—152. H o e p k e , H., 3 0. Histologische Technik der Haut. 211 S. Berlin, Springer. —, 3 9. Ceiodal, ein neues Einbettungsmittel. Richtlinien f ü r seine Anwendung. Z. w. M. Bd. 56, S. 453—458. H o e r r , N. L., 3 6. Histological studies on lipins. I. On osmic acid as a microchemical reagent with special reference to lipins. Anat. Ree. Bd. 66, S. 149—171. —, 3 6. Histological studies on lipins. II. A cytological analysis of t h e liposomes in the adrenal cortex of the guinea pig. Anat. Ree. Bd. 66, S. 317—342. —, 3 6. Cytological studies by the Altmann-Gersh freezing-drying-method. I. Recent advances in the technique. Anat. Ree. Bd. 65, S. 293—318. H o f f m a n n , E., 21. Über die als Leuchtbildmethode bezeichnete Art der Dunkelfeldbeleuchtung. Med. Klin. H. 29. Und Handbuch der mikro-biologischen Technik von Kraus-Uhlenhut. Bd. 1, S. 70—76, 1923. H o l b o l l , 4 1. zit. nach L. Hallmann, Klin. Chemie u. Mikroskopie. 2. Aufl. Leipzig. H o 11 a n d e , A. Ch., 1 8. Enrichissement du liquide fixateur de Bouin en acide picrique, par addition d'acétate neutre de cuivre. C. R. Soc. biol. Bd. 81. S. 17. H o 11 a t z , W., 2 2. Das Massenverhältnis von Rinde zu Mark in der Niere des Menschen und einiger Säugetiere und seine Bedeutung f ü r die Nierenformen. Z. f. Anat. u. Entw. Bd. 65, S. 482—494. H o 11 b o r n , K., 3 6. Eine neue Universalfärbemethode. Z. w. M. Bd. 53, S. 46—47. —, 3 7. Welche Vitalfärbemittel lösen sich im Meerwasser? Z. w. M. Bd. 54, S. 98. H o 1 m a n n , J. L. H. A., 2 4. Recherches sur la localisation de l'urée dans le rein. Bull, d'hist. appl. Bd. 1, S. 256. H o 1 m e r , A. J., 2 7. Histologische Untersuchung über den Bau der Gallenkapillaren beim Menschen mit Hinsicht auf die Funktion der Leberzellen. Utrecht. Diss. H o l m g r e n , E., 99. Weitere Mitteilungen über den Bau der Nervenzellen. An. An. Bd. 16, S. 388—397. —, 0 1. Beiträge zur Morphologie der Zelle. 1. Nervenzellen. Anat. Hefte. Bd. 18, H. 59, S. 267—325. H o l m g r e n , F., 74. Methode zur Beobachtung des Kreislaufs in der Froschlunge. Beiträge zur Anat. u n d Physiol. Festgabe f ü r Ludwig, Leipzig.

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H o 1 m g r e n , H., 3 3. Beitrag zur Erkenntnis der Funktion der Leber. Z. mikr.-anat. F. Bd. 32, S. 306—332. —, 3 7 / 3 8. Funktion und Chemie der Ehrlichschen Mastzellen. Verh. Anat. Ges. 1937, S. 31—37. —, 3 8. Eine neue Methode zur Fixierung der Ehrlichschen Mastzellen. Z. w. M. Bd. 55, S. 419—461. —, 4 0. Studien über Verbreitung und Bedeutung der chromotropen Substanz. Z. mikr.anat. F. Bd. 47, S. 489—521. — u n d O. W i l a n d e r , 3 7. Beitrag zur Kenntnis der Chemie und Funktion der Ehrlichschen Mastzellen. Z. mikr.-anat. F. Bd. 42, S. 242—278. H o l t f r e t e r , J., 3 1. Über die Aufzucht isolierter Teile des Amphibienkeimes. Arch. f. Ent. Mech. Bd. 124, S. 404—466. H o l z e r , W., 2 1. Über eine neue Gliafärbung. Allgem. Ztschr. f. Psychiat. Bd. 77, S. 358. — , 2 1. Über eine neue Methode der Gliafaserfärbung. Z. ges. Neur. Bd. 69, S. 354—363. H o m a n n , E., 2 5. Zum Problem der Konservierung makroskopischer P r ä p a r a t e f ü r pathologisch-anatomische L e h r - und Schausammlungen. Z. w. M. Bd. 42, S. 383 bis 395. H o m a n n , H., 2 4. Der Vertikalilluminator als Augenspiegel bei kleinen Augen. Biol. Zbl. Bd. 44, S. 582—591. H o p k i n s , A. E., 2 4. The appareance of Nißlsubstance in nerve cells following v a riations in fixation. Anat. Ree. Bd. 28, S. 157—163. H o r n o w s k i , H., 13. Über die gleichzeitige Färbung der elastischen Fasern u n d des Fettgewebes. Zbl. Path. Bd. 24, Nr. 20. H o w e l l , W. H. and H o l t , 18. Two new factors in blood Coagulation-Heparin a n d Proatithrombin. Amer. Journ. Physiol. Bd. 47, S. 328—341. H o y e r , H., 9 0. Über den Nachweis des Muzins in Geweben mittels der F ä r b e methode. A. m. A. Bd. 36, S. 310—374. —, 1 0. Injektion der Blut- u n d Lymphgefäße. Enzykl. mik. Technik. 2. Aufl. S. 634 bis 697. H r u b y , J., 41. Untersuchungen a n der Schilddrüse mit der Tannin-Eisenmethode. Z. mikr.-anat. F. Bd. 49, S. 626—643. H u b e r , P., 4 2. Dioxan, seine mikrotechnische Verwendung und seine Gefahren. Mikrokosmos Jahrg. 35, S. 179—181. H u e c k , W., 12. Pigmentstudien. Ziegl. Beitr. Bd. 54, S. 68—232. —, 2 1. Die pathologische Pigmentierung im Handbuch der Allgem. Pathol., her. von K r e h l - M a r c h a n d . 3. Bd., 2. Abt., S. 298—481. H u e t e r , C., 1 1. Zur Technik der Bindegewebsfärbung. Zbl. Path. Bd. 22. H ü r t h 1 e , K., 3 1. Zur Kenntnis der S t r u k t u r des ruhenden u n d des tätigen Froschmuskels. 2. Mitt. Über die Fixierung des Muskels im Zustand der Verkürzung durch tiefe Temperatur. Pflüg. A. Bd. 227, S. 585—608. J a c k s o n , C. J., 04. Zur Histologie und Histogenese des Knochenmarkes. A. Anat. Physiol., Anat. Abt., S. 33—70. J a c o b , 43. Die „ P r ä p a r a t e - K a r t e i " und ihre Nutzanwendung. Mikrokosmos J a h r gang 36, S. 73—75. J a c o b j , W., 4 2. Die verschiedenen Arten des gesetzmäßigen Zellwachstums und ihre Beziehung'zur Zellfunktion, Umwelt, Krankheit, maligner Geschwulstbildung u n d i n n e r e m Bauplan. Roux Archiv Bd. 141, S. 584—693. J a c o b s , W., 2 7. Der Golgische Binnenapparat. Ergebnisse u n d Probleme. Erg. Biol. Bd. 2, S. 357—415. J a c o b s t h a l , E., 0 9. Über intravitale Färbung. Verh. deutsch, path. Ges. Leipzig. S. 380—385. J a c o b y , W., 2 3, 2 4. Untersuchungen über Formaldehydgangrän. A. exp. Path. Bd. 98, S. 55—74 und Bd. 102, S. 93—138. J ä r v i , O., 4 0. Über die sog. »Lipochondrien« von Ries in der Pankreaszelle und ihre Beziehungen zu den Pigmenten. Z. Zellf. Bd. 31, S. 1—42. J a f f e , R. H. und L o e w e n f e l d , W., 1 2. Versuche einer A n w e n d u n g der UnnaPappenheimschen Färbung an drüsigen Organen. Virch. A. Bd. 210, S. 419—425. — u n d —, 1 4. Beiträge zur Kenntnis der Langerhansschen Inseln im Pankreas. Virch. Arch. Bd. 216, S. 10—25. J a 1 o w y , B., 3 8. Kollagen, Elastin und Retikulin der Haut. Z. Zellf. Bd. 27, S. 667 bis 690.

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J a 1 o w y , B., und B. C h r z a n o w s k i , 3 9. Einige Bemerkungen über den Versilberungsprozeß. Z. w. M. Bd. 56, S. 334—344. J a s s w o i n , G., 3 2. Eine zuverlässige Herstellungs- und Färburigsmethode der Häutchen des lockeren Bindegewebes.-Z. w. M. Bd. 49, S.. 191—194. I d e - R o z a s , A., 3 5. Zwei neue Färbungsmethoden mit Hämatoxylin. Z w. M. Bd. 52, S. 1—7. —, 3 5. Über ein Macerationsmittel und seine Anwendungsmöglichkeiten in der Histologie. Z. w. M. Bd. 52, S. 172—174. J e k e r , L., 3 3. Über die kernlosen Platten im Alveolarepithel der Lunge. An. An. Bd. 77, S. 65—80. J e l i n e k , 9 4. Stabilit zum Aufkleben von Celloidinpräparaten. Z. w. M. Bd. 11, S. 237—242. J e n t s c h , 13. Das binokulare Mikroskop. Z. w. M. Bd. 30, S. 299—318. —, 1 4. Beobachtungen an einem binokularen Mikroskop. Physik. Ztschr. Bd. 15, S. 56 bis 62. l m h ä u s e r , K., 2 7. Über das Vorkommen des Plasmalogens. II. Mitt. Biochem. Z. Bd. 186, S. 360—375. J o ë 1, K., 3 9. Imbedding of séminal fluid. A contribution of the morphology of semen. J. Labor, a. clin. Med. Bd. 24, S. 970—972. J o e l und S c h ö n h e i m e r , 24. Studien zur vitalen Fettfärbung. Zbl. Path. Bd. 34, S. 625—628. J o h n , F., 40. Zur mikroskopischen Anatomie der Gefäß- und Schweißdrüsennerven in der menschlichen Haut. Z. Zellf. Bd. 30, S. 297—320. J o h n , K., 29. Uber die Konstanz der Schnittdicke beim Schneiden mit dem Mikrotom. Z. w. M. Bd. 46, S. 201—214. —, 3 7. Über einige neue Hilfsgeräte für die Mikroskopie usw. Z. w. M. Bd. 54, S. 414 bis 419. —, 4 0. Die optische Färbung des Objektes und ihre Anwendung auf biologische Untersuchungen. Z. w. M. Bd. 57, S. 172—177. J o 11 y , 10. Sur la survie des cellules en dehors de l'organisme. C. R. Soc. Biol. Bd. 69, S. 86. —, 1 3. Nouvelles observations sur la survie des leucocytes. C. R. Soc. Biol. Bd. 74. J o n e s , R. L., 3 6. On the préparation of microscopie sections for making fiber counts of nerves containing unmyelinated fibers. Anat. Ree. Bd. 65, S. 247—254. J o r d a n , 0 0. Anwendung von Celloidin in Mischung mit Zedernholzöl. Z. w. M. Bd. 17, S. 191—198. J o r e s , 13. Demonstration einer zweckmäßigen Modifikation des Konservierungsverfahrens. Verh. D. Path. Ges. 16. Tg., S. 357. J o y e t - L a v e r g n e , Ph., 2 8. La recherche qualitative de glutathion, Bull, d'histol. appl. Bd. 5, S. 331. —, 3 7. Une nouvelle technique pour la recherche du chondriome et du nucléole dans la cellule vivante. C. R. Soc. Biol. Bd. 125, S. 598. —, 3 8. La vitamine A dans la cellule. Prot. Bd. 28, S. 131—147. I w a n o f f , X., 3 6. Über das Aufkleben von Gefrierschnitten. Z. w. M. Bd. 53, S. 48. K a b s c h , 12. Zur Paraffintechnik. Z. w. M. Bd. 29, S. 548, 552. K a e w e l , 2 8. Mazeration von Knochenpräparaten mittels Antiformin. Zbl. Path. Bd. 41. K a h l d e n , v., 9 5 und 9 8. Technik der histologischen Untersuchung pathologischanatomischer Präparate. 4. Aufl. 1895 und 5. Aufl. 1898. Jena. G. Fischer. K a i s e r , E., 80. Verfahren zur Herstellung einer tadellosen Glyzeringelatine. Biol. Zbl. Bd. 1, S. 25. K a i s e r , M., 4 1. Ein einfaches Verfahren zum Reinigen von Objektträgern und Deckgläsern. Zbl. Bakter. I. Orig. Bd. 147, S. 351. K a i s e r l i n g , K., 2 2. Rückblicke auf Theorie und Praxis der farbigen Konservierung. Virch. A. Bd. 237, S. 467—474. —, 2 6. Encykl. mikr. Technik. 3. Aufl., Bd. 2, S. 1435—1442. —• und G e r m e r , R., 9 3. Über den Einfluß der gebräuchlichen Konservierungs- und Fixationsmethoden auf das Größenverhältnis tierischer Zellen. Virch. A. Bd. 133, S. 79—104. K a 11 i u s , E., 9 2. Ein einfaches Verfahren, um G o 1 g i sehe Präparate f ü r die Dauer zu fixieren. Anat. Hefte, 1. Abt., 5. Heft, S. 271—275.

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K a 11 i u s , E., 2 6. Artikel »Golgische Methoden« in Enzyklop. d. mikr. Techn. 3. Aufl. Bd. 2, S. 900—944. —, 0 8. Über die E n t f e r n u n g der Gallerthülle des Amphibienlaiches. An. An. Bd. 33. K a m p t n e r , E., 3 6. Gehärteter Kopal-Öllack als Deckglaskitt f ü r mikroskopische D a u e r p r ä p a r a t e mit wäßrigem Einschlußmedium. Z. w. M. Bd. 58, S. 170—177. K a n z l e r , 2 9. Eine Modifikation der Darstellung der Hortegaschen Gliazellen f ü r Formolmaterial. Z. Neur. Bd. 122, S. 416—419. K a p p e r s , A. C. U., 15. Über ein neues, billigeres Gemisch f ü r Wachsrekonstruktionen. Z. w. M. Bd. 32, S. 294—296. K a r e z a g , L. und P a u n z , L., 2 3. Über eine neue Vitalfärbungsmethode mit Sulfosäurefarbstoffen. D. Med. Woch. Jahrg. 49, S. 1231—1233. K a r d a s e w i t s c h , B. 2 5. Äthylalkohol als fixierende Flüssigkeit in der mikroskopischen Technik. Z. w. M. Bd. 42, S. 1—25. —, 2 5. Eine Methode zur Beseitigung der Formalinsedimente (Paraform) aus mikroskopischen Präparaten. Z. w. M. Bd. 42, S. 322—324. K a r d o s , E., 11. Zur Kenntnis der neutrophilen und azurophilen Körnung, nebst einer neuen Färbemodifikatiori. Fol. haem. Bd. 12, S. 39. K a r p o v a , L., 2 5. Beobachtungen über den A p p a r a t von Golgi (Nebenkern) in den Samenzellen von Helix pomatia. Z. Zellf. u. m. Anat., Bd. 2, S. 495—514. K a s a r i n o f f , 10. Vergleichende "Untersuchungen zur Histologie der Lipoide. Ziegl. Beitr. Bd. 49, S. 490—500. K a s p e r , A . , 2 4 . Der Abbesche Zeichenapparat — ein Universalzeichenapparat. Z. w. M. Bd. 41, S. 176—189. K a s t s c h e n k o , N., 8 6. Methode zur genaueren Rekonstruktion kleinerer makroskopischer Gegenstände. Arch. f. Anat. S. 388—394. —, 8 7. Die graphische Isolierung. An. An. Bd. 2, S. 426—435. —, 8 8. Über das Beschneiden mikroskopischer Objekte. Z. w. M. Bd. 5, S. 173—181. K a t s c h , G., 2 2. Das apparative Rüstzeug f ü r operative Eingriffe, Asepsis. Die beste Narkose der gebräuchlichsten Tierarten. Vorbereitung und Nachbehandlung. In H a n d b u c h der biol. Arbeitsmethoden, herausg. von Abderhalden. Abt. V, Teil 3 B, H e f t 1 (Lieferung 62). K a t s u n u m a , S., 2 4. Intracelluläre Oxydation und Indophenolbläusynthese. 232 S. Jena, G. Fischer. K a u f m a n n , C. und E. L e h m a n n , 2 6. Sind die in der histologischen Technik gebräuchlichen Fettdifferenzierungsmethoden spezifisch? Virch. Arch. Bd. 261, S. 623—648. — u n d —, 2 6. Kritische Untersuchungen über die Spezifitätsbreite histochemischer Fettdifferenzierungsmethoden. Zbl. Path. Bd. 37, S. 145—152. — u n d —, 2 8. Über den histochemischen Fettnachweis im Gewebe. Untersuchungen u n t e r besonderer Berücksichtigung des von Ciaccio angegebenen Färbeverfahrens. Virch. Arch. Bd. 270, S. 360—398. — u n d —, 2 9. Zur Technik der Sudanfärbung. Z. mikr.-anat. Forschg. Bd. 16, S. 58u bis 597. K a u f m a n n , C., E. L e h m a n n u n d H. B a n i e c k i . Zur Frage der E x t r a h i e r b a r keit der »Organlipoide« mit organischen Lösungsmitteln. Zbl. Path. Bd. 39, S. 2Zi bis 236, 1927. K a w a m u r a , R., 11. Die Cholesterinverfettung. G. Fischer, Jena. K e l l e r , K., 24. Vergleichende Physiologie der weiblichen Sexualorgane bei den Säugetieren. Biol. Pathol. d. Weibes. Bd. 1, S. 761—802. K e l l e r R., 2 5. Die Elektrizität in der Zelle. 2. Aufl. Mährisch-Ostrau. 320 S. — u n d G i c k 1 h o r n , J., 2 8. Methoden der Bioelektrostatik in Handb. d. biol. A r beitsmethode. Abt. V, T. 2. — — u n d —, 3 0. Der elektrische Faktor des Wassertransportes im Lichte der Vitalfärbung. Erg. Physiol. Bd. 30. K e m p t , R., 10. Allgemeine Laboratoriumstechnik. In Abderhaldens Handb. biochem. Arbeitsmethoden I, S. 1—281. Berlin. K i h n , B., 2 4. Über die Anwendbarkeit einiger künstlicher Beizenfarbstoffe in der Histopathologie des Nervensystems. Z. w. M. Bd. 41, S. 39—79. K i m m e 1 s t i e 1, P., 2 5. Erfahrungen mit der Schultzschen Cholesterinreaktion. Zbl. Path. Bd. 36, S. 491—493. ,K i ß , Fr., und P. v. M i h ä 1 i k , 3 0. Über die Markreifung im peripherischen Nervensystem. An. Anz. Bd. 69, S. 433—444.

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K i s s e r , J., 2 3. Über die Brauchbarkeit Bechers neuer Kernfarbstoffe nach Beobachtungen an pflanzlichen Objekten. Z. w. M. Bd. 40, S. 115—141. —, 2 4. Ein neues Mikrotom zum Schneiden h a r t e r Objekte. Z. w. M. Bd. 41, S. 376—383. —, 2 6. Die Art des Schliffes der Mikrotommesser und ihre Zurichtung f ü r dünnste Schnitte. Z. w. M. Bd. 43, S. 361—370. —, 2 7 a. Die Bestimmung des Schmelzpunktes der Paraffine und die Herstellung von Paraffinmischungen von bestimmtem Schmelzpunkt. Z. w. M. Bd. 44, S. 443—451. —, 2 7 b. Methoden zur Bestimmung der Winkelgrößen an Mikrotommessern. Z. w. M. Bd. 44, S. 452—459. — 2 9. Die theoretischen u n d praktischen Grundlagen f ü r die Ausschaltung des absoluten Alkohols in der botanischen Mikrotechnik. Z. w. M. Bd. 46, S. 269—285. —, 3 4. Bemerkungen zum Einschluß in Glyzeringelatine. Z. w. M. Bd. 51, S. 372—374. —, 3 4/3 5. Rasche Herstellung von Celloidinlösungen. Mikrokosmos 28. S. 50 K i t t s t e i n e r , C., 0 9. Untersuchung über die Einwirkung des denaturierten Alkohols auf tierische Organe usw. Z. w. M. Bd. 26, S. 191—202. K i y o n o , K., 14. Zur Frage der histiozytären Blutzellen. Fol. haem. Bd. 18, S. 149 bis 170. —, 1 4. Eine neue Modifikation der Altmannschen G r a n u l a f ä r b u n g ohne Osmiumsäure. Zbl. Path. Bd. 25, S. 481—482. —, 1 4. Die vitale Karminspeicherung. Ein Beitrag zur Lehre von der vitalen F ä r b u n g mit besonderer Berücksichtigung der Zelldiiferenzierungen im entzündeten Gewebe. Jena. 258 S. — und S. A m a n o 3 7. Ergebnis und Theorie der modernen Vitlfärbung im KiyonoInstitut. 282 S. Kyoto. —, S. S u g i y a m a und S. A m a n o , 4 8. Die Lehre von der Vitalfärbung. 236 S. Kyoto. K l a r f e l d nach Spielmeyer, Technik der mikroskopischen Untersuchung des- Nervens. 2. Aufl. S. 122. K 1 e b s , 6 9. Die Einschmelzungsmethode. A. m. A. Bd. 5, S. 164. K 1 e e b e r g , J., 2 3. Untersuchungen über den Fettstoffwechsel der Gewebe. Virch. A. Bd. 244. S. 237—253. K 1 e i n , G., 2 8. Allgemeine und spezielle Methodik der Histochemie; in Methodik der wiss. Biol., hrsg. v. Peterfi, Bd. I, S. 1016—1084. 1929 auch separat erschienen. K l e m e n s i e w i c z , R., 2 1. Verfahren u n d Einrichtungen zur Beobachtung des Blutstromes an Kaltblütern. In Handb. Biol. Arbeitsmeth. her. von Abderhalden. Abt. 5, Teil 4, S. 41. K l i e n e b e r g e r und C a r l , 10. Die Verdauungsleucocytose beim Laboratoriums' tier. Zbl. inn. Med. Nr. 24 und 25. —, 2 7. Die Blutmorphologie der Laboratiumstiere. 2. Aufl. Barth, Leipzig. K l i n g e l h ö f f e r , W., 3 1. Terrarienkunde. Wegner, Stuttgart. K n i p p i n g , H. W., 2 3. Ausschaltung von absteigenden Alkoholreihen durch Verminderung der Oberflächenspannung von Wasser. Z. w. M. Bd. 39, S. 204—205. K n ü s e 1 , O., 2 3. Vitale Färbungen am menschlichen Auge. 2. Zeitschr. f. Augenheilkunde. Bd. 50, S. 23—28. K o c h , A., 2 5. Morphologie des Eiwachstums der Chilopoden. Z. Zellforschg. Bd. 2. K o c h , G. v., 78. Über die Herstellung d ü n n e r Schliffe von solchen Objekten, welche aus Teilen von sehr verschiedener Konsistenz zusammengesetzt sind. Zool. Anz. 1. Jahrg., S. 36—37. K o c h , K., 1 3. Über die Bedeutung der Langerhansschen Inseln im menschlichen Pankreas. Virch. A. Bd. 211, S. 321—330. K o c h , W., 4 1. Das Verhalten der Piasmalreaktion im Genitaltraktus der weiblichen weißen Maus. Z. mikr.-anat. F. Bd. 50, S. 465—494. K o c k e 1 , 9 9. Eine neue Methode der Fibrinfärbung. Zbl. Path. Bd. 10, S. 749—757. K o c k e 1, jr., 3 0. Histochemische Metallnachweise. Virch. A. Bd. 277, S. 856—874. K ö h l e r , A., 04. Mikrophotogr. Untersuchungen mit ultraviolettem Licht. Z. w. M. Bd. 21, S. 129—165. —•, 1 0. Über die Verwendung des Quecksilberlichtes f ü r mikroskopische Arbeiten. Z. w. M. Bd. 27, S. 329—338. —, 2 3. Das Mikroskop und seine Anwendung. In Handb. Biolog. Arbeitsmeth., her. von Abderhalden, Abt. 2. Physikal. Meth. Heft 2. Lieferung 95. —, 24. Die A u f n a h m e von Spektren mit der mikrophotographischen Kamera. Z. w. M. Bd. 41, S. 167—175.

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K ö h l e r , A., 26. Die Verwendung des Polarisationsmikroskopes f ü r biolog. Untersuchungen. Handb. Biol. Arbeitsmeth., her. von Abderhalden. Abt. 2, Teil 2, S. 907—1108. —, 2 7. Mikrophotograpie; in Handb. d. biol. Arbeitsmeth., hrsg. von Abderhalden, Abt. II, T. 2, H. 6; Lief. 245. —, 2 8. Allgemeine mikroskopische Optik; in Meth. wiss. Biol. Bd. 1, S. 203—380. — und L o o s , W., 4 1. Das Phasenkontrastverfahren und seine Anwendung in der Mikroskopie. Naturwiss. Bd. 29, S. 48—61. K o e 11 i k e r , A. v., 8 1. Zur Kenntnis des Baues der Lunge des Menschen. Verh. Physik.-med. Gesellsch. Würzburg. Bd. 16. K o e p p e , L., 2 1. Die ultra- und polarisationsmikroskopische Erforschung des lebenden Auges und ihre Ergebnisse. 296 S. Bonn, Leipzig. —-,2 1 und 2 2. Die Mikroskopie des lebenden Auges. 1. und 2. Band. Berlin (Jul. Springer) 1921 und 1922. K o h a s h i , Y., 3 7. Histologische Untersuchungen der verschiedenen Skelettmuskeln beim Menschen. Fol. anat. japon. Bd. 15, S. 175—188. K o h n , A., 1 0. Über das Pigment der Neurohypophyse des Menschen. A. m. A. Bd. 75, S. 337—374. K o l a t s c h e v , A., 1 6. Recherches cytologiques sur les cellules nerveuses des Molusques. Arch. Russ. d'Anat., d'Histol. et d'Embr. Bd. 1, S. 383—423. K o l m e r , W., 0 9. Über einen sekretartigen Bestandteil der Stäbchen-Zapfenschicht der Wirbeltierretina. Pflüg. A. Bd. 129, S. 35—45. —•, 0 9. Histolog. Studien am Labyrinth mit besonderer Berücksichtigung des Menschen, des Affen und -der Halbaffen. A. m. A. Bd. 74, S. 259—310. —, 1 2. Erfahrungen über Fixation ganzer Tiere. An. An. Bd. 42, S. 47—59. —, 1 8. Zur vergleichenden Histologie der Säugernebenniere. A. m. A. Bd. 91, S. 1—140. — 2 7. Sinnesorgane in Handb. d. mikr. Anat. her. von Möllendorff, Berlin, Bd. III, 1. — und H. L a u b e r , 3 6. Auge in Handb. d. mikr. Anat. her. von Möllendorff, Berlin, Bd. III, 2. 782 S. K o 1 o s s o w , A., 9 8. Eine Untersuchungsmethode des Epithelgewebes, besonders der Drüsenepithelien usw. A. m. A. Bd. 52, S. 1—43. K o l s t e r , R., 1 1. Mitochondria und Sekretion in den Tubuli contorti der Niere. Eine experimentelle Studie. Ziegl. Beitr. Bd. 51, S. 209—226. K om a j a , G., 2 5. Über eine histochemische Nachweismethode der Resorption, Verteilung und Ausscheidung des Wismuts in den Organen. Arch. f. Dermat. u. Syph. Bd. 149, S. 277. K o o p m a n n , H., 2 0. Acetonhärtung und Plasmazellenfärbung. Zbl. Path. Bd. 30, S. 529—531. K o o y , zit. nach H e r i n g a , 2 8. K o p s c h , Fr., 9 6. Erfahrungen über die Verwendung des Formaldehyds bei der Chromsilber-Imprägnation. An. An. Bd. 11, S. 727. —•, 9 8. Die Entwicklung der äußeren Form des Forellenembryos. A. m. A. Bd. 51, S. 181—213. —, 0 2. Die Darstellung des Binnennetzes G o 1 g i in spinalen Ganglienzellen und anderen Körperzellen mittels Osmiumsäure. Sitz.-Ber. K. Preuß. Akad. Wiss. Berlin, Bd. 39. —, 0 4. Über den Kern der Thrombozyten und über einige Methoden zur Einführung in das Studium der Säugetier-Thrombozyten. Intern. Mon. Anat. Physiol. Bd. 21. —•, 0 6. Kleine Mitteilungen z. mikroskopisch. Technik. Intern. Mon. Anat. Physiol. Bd. 23, S, 359 ff. —, 2 6. Das Binnengerüst in den Zellen einiger Organe des Menschen. Z. mikr.-anat. F. Bd. 5, S. 221—284. —, 2 6. Artikel Binnengerüst. Endopegma in: Enzykl. 3. Aufl. Bd. 1, S. 163—173. K o r f f , K., 0 7. Die Analogie in der Entwicklung der Knochen-Zahnbeingrundsubstanz der Säugetiere usw. A. m. A. Bd. 69, S. 515—543. K o r s c h e i t u. H e i d e r , 0 9. Lehrbuch der vergleichenden Entwicklungsgeschichte der wirbellosen Tiere. I—IV. Jena. K 6 s s a , v., 0 1. Nachweis von Kalk. Ziegl. Beitr. Bd. 29, S. 163. K o s t a n e c k i , K. und S i e d 1 e c k i , M., 9 7. Über das Verhältnis der Zentrosomen zum Protoplasma. A. m. A. Bd. 48, S. 181—273. K r a a t z , H., 3 7/3 8. Neuerungen an einem Gefriermikrotom. Mikrokosmos. Bd. 31, S. 52—54. 38

R o m e 1 s , Mikrosle. Technik. 15. Aufl.

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K r a 11 i ji g e r , H. F., 2 8. Eine Vorrichtung zum langsamen Überführen der Gewebestücke aus einer Flüssigkeit in die andere. Z. w. M. Bd. 45, S. 192—195. —-,3 1. Cytologische Studien an einigen Haussäugetieren. Arch. Tierernähr, u. Tierzucht. Bd. 5, S. 127—187. K r a u s , E. J., 12. Die Lipoidsubstanzen der menschlichen Hypophyse und ihre Beziehung zur Sekretion. Ziegl. Beitr. Bd. 54, S. 520—558. —•, 1 2. Zur elektiven Darstellung der eosinophilen Zellen der Hypophyse. Frankf. Z. Path. Bd. 10, S. 161—170. —, 1 4. Das Kolloid der Schilddrüse und Hypophysis des Menschen. Virch. A. Bd. 218, S. 107—128, —,2 3. Erwiderung auf die Arbeit von S. Wail usw. Virch. A. Bd. 244, S'. 299—302. —, 2 4. Erwiderung auf die in Virch. Arch. Bd. 249 erschienene Notiz von Prof A. J. Abrikosoff usw. Virch. A. Bd. 253, S. 421—422. K r a u s e C., 18 4 4. Artikel H a u t in: Handwörterbuch d. Physiol., herausg. von R. Wagner. 2. Bd. Braunschweig. K r a u s e , C., 3 0. Zur Herstellung sog. Plattenpräparate. Zbl. Path. Bd. 48, S. 184—186. K r a u s e , R., 93. Beiträge zur Histologie der Wirbeltierlehre. A. m. A. Bd. 42, S. 53 bis 82. —, 0 9. Eine neue Gefrier- u. Kühlvorrichtung f ü r das Mikrotom. Z. w. M. Bd. 25, S. 289. —, 0 9. Die Herstellung von transparenter roter Leiminjektionsmasse. Z. w. M. Bd. 26, S. 1—4. — , 1 1 . Kursus der normalen Histologie. Berlin-Wien. — , 2 1. Mikroskopische Anatomie der Wirbeltiere in Einzeldarstellungen. 1. Säugetiere. Berlin. 1—186. —, 2 2. 2. Vögel und Reptilien. Berlin. 187—454. —, 2 3. 3. Amphibien. 1923. 455—608. K r a u s e , W., 8 4. Untersuchungsmethoden. Int. Mon. Anat. Physiol. Bd. 1. K r a u s p e , C., 2 2. Beiträge zur Kenntnis der Gitterfasern. Virch. A. Bd. 237. S. 475 bis 491. K r e i b i c h , K., 13. Färbung der marklosen Hautnerven beim Menschen. Berl. klin. Woch. Bd. 50, S. 546—547. —, 1 8. Zu Blochs Dopa-Reaktion. Derm. Woch. Bd. 66, S. 193—195. K r e m e r , J., 3 7. Zum mikrochemischen Eisennachweis im Leber- und Milzpigment der Kaltblüter. Z. w. M. Bd. 54, S. 429—433. K r ö n i g , 8 6. Einschlußkitt f ü r mikroskopische Präparate. A. m. A. Bd. 27, S. 657 bis 658. K r o h n , E., 3 0. Fütterungsversuche an Tritonen. III. Roux. Arch. Bd. 121, S. 545 bis 597. K r o m a y e r , E., 9 2. Die Protoplasmafaserung der Epithelzelle. A. m. A. Bd. 39, S. 141 bis 150. K r d n f e l d , 2 1. Zur Morphogenese des Zwischengewebes der Keimdrüsen nach den Untersuchungen Guileras. A. f. Frauenkunde u. Eugenetik. Bd. 7. Sexualw. Beitr. S. 242. K r o n t o w s k i , A., 2 3. Über die Kultivierung der Gewebe außerhalb des Organismus bei Anwendung der kombinierten Medien. Virch. A. Bd. 241, S. 488—501. K r ü g e r , Fr., 4 0. Benzylbenzoat — ein geruchloses Intermedium mit günstigen Eigenschaften. Zool. An. Bd. 131, 7/8, S. 202—205. —, 4 1/4 2. Uber das Hartwerden in Paraffin eingebetteter Präparate. Z. w. M. Bd. 58, S. 31—42. K r y s p i n - E x n e r , 4 1. Über Zellfärbungen mittels Anthracenblau an chromiertem Material von Z N S . Z. Anat. u. Entw. g. I l l , S. 448—451. K u b i e , L. S. and D a v i d s o n , D., 29. The ammoniacal silver solution used in neuropathology. Their staining properties, chemistry and methods of preparation. Amer. Arch. Neurol, and Psychiat. Bd. 19, S. 888. K u b o , M., 2 3. Experimentelle Untersuchungen über die supravitalen und postmortalen Veränderungen des Ohrlabyrinths. Z. Hals usw. Heilk. Bd. 5, S. 133—175. K ü h n e , W. und C h i t t e n d e n , R. H., 89. Über das Neurokeratin. Z. Biol. Bd. 26. —, und L e a , A. Sch., 7 4. Über die Absonderung des Pankreas. Verh. d. Naturhist. Verh. Heidelberg (N. F.), Bd. 1. K ü s t e r , E., 26. Uber vitale Protoplasmafärbung. Z. w. M. Bd. 43, S. 378. K ü h l , P., 19. Das Blut der Haustiere mit neueren Methoden untersucht (Pferd, Rind, Hund), ^flüg. A. Bd. 176, S. 263—274.

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K ü h l , W., 2 5. Die Anwendung des Zeichenepparates zur Messung von Krümmungen unter dem Mikroskop durch Projektion eines Systems konzentrierter Kreise (oder anderer Kurven) in das mikroskopische Bild. Z. w. M. Bd. 42, S. 265—269. K u l i , H., 13. Eine Modifikation der Altmannschen Methode zum Färben der Chondriosomen. An. An. Bd. 45, S. 153—157. K u l t s c h i z k y , N., 8 7 a . Zur histologischen Technik. II. Celloidin-Paraffin-Einbettung. Z. w. M. Bd. 4, S. 48—49. —, 9 0. Über Färbung der markhaltigen Nervenfasern in den Schnitten des Zentralnervensystems mit Hämatoxylin und Karmin. An. An. Bd. 5, S. 519—584. K u p ff e r , C., 7 6. Über Sternzellen der Leber. A. m. A. Bd. 12, S. 353—358. —-, 8 3. 2. Uber den »Achsenzylinder« markhaltiger Nervenfasern. Sitz.-Ber. Akad. München. Bd. 13, S. 466—475. —•, 8 9. Über den Nachweis der Gallenkapillaren und spezifischen Fasern in den Leberläppchen durch Färbung. Sitz.-Ber. Ges. Morph. Phys. München. Bd. 5, S. 82—86. —, 9 9. Über die sog. Sternzellen der Säugetierleber. A. m. A. Bd. 54, S. 254—288. —• und B e n e c k e , 7 8. Der Vorgang der Befruchtung am Ei der Neunaugen. K u t s c h e r a - A i c h b e r g e n , 2 5. Beitrag zur Morphologie der Lipoide. Virch. Arch. Bd. 256, S. 569—594. —, 2 2. Nebennierenstudien. Frankf. Z. Path. Bd. 28, S. 262—294. K u w a d a , Y., S h i n k e N., und O u r a , G., 38. Artificial uncoiling of the chromonema spirals as a method of investigation of the chromosome structure. Z. w. M. Bd. 55, S. 8—16. L a i d l a v , G. F., 3 2. The Dopa-reaction in normal histology. Anat. Ree. Bd. 53, S. 399—413. L a M a n n a , S. 3 7. Die Markscheidenfärbung. Z. w. M. Bd. 54, S. 257—287. L a m m , H., 30. Ein einfaches Verfahren zum Färben von Wachsplattenmodellen. Z. w. M. Bd. 30, S. 463. L a p d a u , E., 23. Einige Vereinfachungen in der Markscheidenfärbung. Z. w. M. Bd. 40, S. 22—30. —, 2 5. Zur Frage der Markscheidenfärbung ohne primäre Beizung. Z. w. M. Bd. 42, S. 180. L a n d s t r ö m , H., T. C a s p e r s o n und G. W o h l f a r t h , 4 1. Über den Nucleotidumsatz der Nervenzelle. Z. mikr. anat. F. Bd. 49, S. 534—548. L a n e , M. A., 0 8. The cytological Characters of the Areas oï Langerhans. Am. Journ. Anat. Bd. 7, S. 409—422. L a n g , Arnold, 7 8. Konservation der Planarien. Zool. Anz. 1. Jahrg. L a n g e r o n , M., 3 4. Précis de Microscopie, Masson et Cie., Paris, 1205 S. L a n g h a n s , Th., 9 0. Über Glycogen in pathologischen Neubildungen und den menschlichen Eihäuten. Virch. A. Bd. 120, S. 28—67. L a n g 1 e y , J. N., 7 9. On the structure of serous glands in rest and activity. Proceed. Royal Soc. Vol. 29, S. 377—382. L a p i n , M. L., 2 V. Eine neue Methode für die Anfertigung durchsichtiger plastischer Rekonstruktionen (»Gelatinerekonstruktion«). Z. w. M. Bd. 44, S. 134—164. L a u b e n h e i m e r , K., 3 1. Lehrbuch der Mikrophotographie und Mikroprojektion. 2. Aufl. 272 S. Berlin-Wien. L a u c h e , A , 2 3. Ein einfacher Mikroskop-Heizkasten. Zbl. Path. Bd. 33, S. 371—374. L a u d a , E., und Ph. R e z e k , 2 8. Zur färberischen Darstellung bestimmter Kanälchenabschnitte in der Niere. Virch. Arch. Bd. 269, S. 218—238. L a u n o y , zit. nach Enzykl. S. 1790. L a u x , F. J., 2 6. Histologisch-chemischer Cholesterinnachweis. Zbl. Path. Bd. 38, S. 581—582. L a w r e n t j e w , B. J., 2 9. Experimentell-morphologische Studien über den feineren Bau des autonomen Nervensystems. Z. mikr.-anat. Forschg. Bd. 16, S. 383—411, und Bd. 18, S. 233—262. L e b e d k i n , S., 14. Zur Technik der plastischen Rekonstruktion. Z. w. M. Bd. 31, S. 114—119. —, 2 6. »P'rojektionsrekonstruktionen« und »Stereoskopische Rekonstruktionen«, Z. w. M. Bd. 43, S. 1—86. —, 2 8. Das Tischchen für »Projektions«- und »stereoskopische« Rekonstruktion. Z. w. M. Bd. 46, S. 155—162. L e e , A. B. und M a y e r , P., 1 2. Grundzüge der mikroskopischen Technik für Zoologen und Anatomen. Berlin. 4. Aufl. 38*

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L e h m a n n , F. E., 28. Alkoholbeständige Fixation vitaler Färbungen von NilblaUsulfat. Verh. Deutsch. Zool. Gesellsch. 32. Jahresvers. München. —•, 3 2. Die Beteiligung von Implantats- und Wirtsgewebe bei der Gastrulation und Neurulation induzierter Embryonalanlagen. Arch. £. Entw. Mech. Bd. 125, S. 566 bis 639. L e h m a n n , F. E., und d e R o c h e , V., 34. Über die Verwendbarkeit des Dioxans an Stelle von Alkohol bei histologischer Verarbeitung nilblaugefärbter Embryonalgewebe. Rev. Suisse de Zool. Bd. 41, S. 367—369. L e h n e r , J., 2 3. Bemerkungen zur Histologie der Magen- und Duodenaldrüsen des Menschen. Wien. Klin. Woch. Bd. 36, S. 202—205. —, 2 4. Das Mastzellen-Problem und die Metachromasiefrage. Erg. Anat. Entw. Bd. 25, S. 67—184. L e m m e 1, A., 2 1. Die Bedeutung der Dopa-Reaktion für die Beurteilung der M e lanome. Zbl. Path. Bd. 32, S. 89—93. L e n a u v e l , zit. nach L a n g e r o n , 3 4. L e n d v a i , J., 0 9. Apparat zum Schleifen des Mikrotommessers. Z. w. M. Bd. 26, S. 203—205. L e n g g e n h a g e r , 3 6. Eine neue einfache Plättchenzählmethode. Schweiz, med. Woch. S. 1289—1290. L e n h o s s e k , M. v., zit. nach S z e n t - G y ö r g y i , 1 4 , 1. c. S. 31. L e n t z e , H., 2 8. Anisol statt Zedernöl als Immersionsmittel nach Becher. Z. w. M. Bd. 45, S. 200—202. —, 3 0. Deckgläser f ü r große histologische Schnitte (z. B. Hemisphärenschnitte) aus Cellophan. Klin. Woch. 9, S. 1479. L e p e h n e , G., 19. Zerfall der roten Blutkörperchen beim Icterus infectiosus. Ziegl. Beitr. 65, S. 183. L e s c h k e , E., 1 4. Untersuchungen über die Funktion der Niere. Münch, med. Woch. Bd. 61, S. 1498—1499. L e u p o 1 d , E., 18. Untersuchungen über die Genese und Mikrochemie des Amyloids. Ziegl. Beitr. Bd. 64, S. 347--100. —, 2 5. Amyloid und Hyalin. Erg. Path. Bd. 21, I., S. 120—181. L e v i , Giulio, 3 7. Eine neue Methode zur Befestigung der Celloidin-Serienschnitte an Gläsern. Z. w. M. Bd. 54, S. 406—4Q8. L e v i , Giuseppe, 0 4. Il fluoruro di sodio nella tecnica istologica. Monitore zoologico italiano. Anno 15. —, 0 4 a. Ricerche comparative sul volume delle cellule. Rendic. dell. Acad. mediofìsica fiorentine. —, 1 3. Note citologiche sulle cellule somatiche dell'ovario dei mammiferi. A . Zellf. Bd. 11, S 515—556. —, 2 8. Gewebezüchtung; in Methodik d. wiss. Biol., hrsg. von Peterfi, Bd. 1, S. 494 bis 558. L e w i s , W. H. and M. R., 1 2. The cultivation of sympathetic nerves etc. Anat. Ree. Bd. 6, S. 7—31. —, 1 5. Mitochondria in tissue culture. Amer. Journ. Anat. Bd. 17, S. 339—401. L e w i t z k y , G., 11. Die Chloroplastenanlagen in lebenden und fixierten Zellen von Elodea canadensis. Ber. d. d. bot. Ges. Bd. 29, S. 697. —-, 1 1. Vergleichende Untersuchung über die Chondriosomen in lebenden und fixierten Pflanzenzellen. Ber. d. d. bot. Ges. Bd. 29, S. 865. L i e s e g a n g , R. E., 10. Die Veraschung von Mikrotomschnitten. Biochem. Zschr. Bd. 28. —, 1 1. Die Kolloidchemie der histologischen Silberfärbung. Kolloidchem. Beihefte. Bd. 3, H. 1, S. 1. —, 1 1. Das Verhalten minimaler Räume bei einigen Färbungen. Z. w. M. Bd. 28, S. 257—260. —, 1 4. Exogene Fällungen bei der histologischen Färbung. Z. w. M. Bd. 31, S. 466—471. — 2 3. Nachweis geringer Eisen- und Kupfermengen in Leinen, Papier oder tierischem Gewebe. Z. w. M. Bd. 40, S. 14—15. L j e t n i k , S., 2 5. Eine Variation der Spalteholzschen Methode (über das Durchsichtigmachen menschlicher Präparate). An. An. Bd. 59, S. 201—202. L i g n a c , G. O. E., 2 1. Uber das Vorkommen von Hautpigment in Lymphdrüsen. ZbL Path. Bd. 32, S. 201—205.

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L i h o t z k y , E., 2 4. Über Mikroskope und Doppelokulare f ü r binokulare und stereoskopische Betrachtung. Z. w. M. Bd. 41, S. 305—324. L i 11 i e , R. D. and R. E a r 1 e , W., 3 9. The use of Janssens hematoxylin in place of the Weigert acid iron Chloride hematoxylin. Stain Technol. Bd. 14, 2, S. 53—54. L i s o n , L., 3 1. Recherches histochimiques sur les phénols et leurs dérivés. A. de Biol. Bd. 41, S. 343—436. —, 3 4. Sur des nouveaux colorants histologiques spécifiques des lipides. C. R. Soc. Biol. Paris, Bd. 115, S. 202—205. —, 3 5. Sur la détermination du Ph intracellulaire p a r les colorants vitaux indicateurs. L'»erreur métachromatique«. Protopl. Bd. 24, S. 453—465. —, 3 5. Etudes sur la métachromasie. Colorants métachromatiques et substances chromotropes. A. de Biol. Bd. Bd. 46, S. 599—668. —•, 3 6. Recherches histochimiques sur la sécrétion chlorhydrique de l'éstomac. Z. Zellf. Bd. 25, S. 143—159. —, 3 6. Sur la recherche histochimique des oxydases par la réaction du bleu d'indophénol. Le cas lipides. Bull. Soc. de Chimie biol. Bd. 18, S. 185—189. —, 3 6. Une méthode nouvelle de reconstruction graphique perspective. Hist. appl. Bd. 13, S. 357—380. —, 3 6. Sur la fixation histochimique des éléments minéraux des tissues. Bull. Acad. R. Belgique. SI. Sei. V. sér. Bd. 22, S. 951—967. —, 3 6. Histochimie animale. 320 S. Gauthier-Villars, Paris. — und D a g n e 11 e , J., 3 5. Méthodes nouvelles de coloration de la myéline. Bull. Hist. appl. Bd. 12, S. 85—91. L o b o , F. B., 3 7. Sobre una nova técnica de impregnaçâo do sistemo nervosa. Patologia général. Bd. 22, S. 4—7. L o c h t e , Th., 3 8. Atlas der menschlichen und tierischen Haare. 306 S. Leipzig 1938 (P. Schöps). L o c k e , 0 1. Die Wirkung der Metalle des Blutplasmas usw. auf das isolierte Säugetierherz. Zbl. Physiol. Bd. 14, S. 670—672. L o e 1 e , W., 2 0. Über primäre und sekundäre Phenolreaktion. Zbl. Path. Bd. 30. S. 614—616. —, 2 0. Die Phenolreaktion (Aldaminreaktion) und ihre Bedeutung f ü r die Biologie. Klinkhardt, Leipzig. —, 2 6. Untersuchungen über intracelluläre oxydierende Substanzen. Virch. Arch. Bd. 262, S. 39—60. L o w , W., 3 0. Neue Kohlensäure-Gefriervorrichtung der Firma R. J u n g A.-G., Heidelberg. Z. w. M. Bd. 47, S. 465—468. — , 3 1. Bemerkungen über Messerstellung, Schnittbildung, Abziehvorrichtungen u. dgl. Z. u. M. Bd. 48, S 417—426. L ö w e n s t ä d t H . 2 2. Über die Anwendung gelochter Objektträger zur histologischen Technik. Z. w. M. Bd. 39. S. 221—224. L ö w e n t h a 1, H.. 2 7. Über das Kulturmedium f ü r Säugetiergewebe. A. exp. Zellf. Bd. 4, S. 116—121. L ö w i t , 75. Die Nerven der glatten Muskulatur. Wiener Sitz.-Ber. Bd. 71. L o g i n o w , W., 1 2. Zur Frage von dem Zusammenhang von Muskelfibrillen und Sehnenfibrillen. A. Anat. Physiol. Anat. Abt, S. 171—188. L o n d o n , B , 8 1. Das Blasenepithel bei verschiedenen Füllungszuständen der Blase. A. Anat. Physiol., Physiol. Abt., S. 317—330. L o n d o n , E. S., 05. Zur Lehre von dem feineren Bau des Nervensystems. A. m. A. Bd. 63. L o n g , J. A. and H. M., E v a n s , 20. The oestrous cycle in the rat and other studies in the physiology of reproduction. Anat. rec. Bd. 18. —, 2 2. The oestrous Cycle in the r a t and its associated phenomena. Univ. of California Memoirs. Nr. 6, 1485, 11 Taf. 84 Fig. L o r b e r b a u m , L. u n d P. G., U n n a , 25. Das Eleidin. Eine chromolytische Studie. Derm. Woch. 1925, S. 1519. L u b o s c h , W., 0 1. Einige Mitteilungen über Vorkommen, Fang u n d Zucht der Neunaugen. Z. f. Fischerei und deren Hilfswissenschaften. Bd. 9. L u d w i g F e r d i n a n d , Dr., Prinz von Bayern, 8 4. Über Endorgane der sensiblen Nerven in der Zunge der Spechte. Sitz.-Ber. d. Bayer. Akademie d. Wiss. Mathem.physikal. Klasse 1884. H. 1.

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M o 11 i e r , S., 1 1. Über den Bau der kapillaren Milzvenen. A. m. A. Bd. 76, S. 608—657. —, 1 3. Die lymphoepithelialen Organe. Sitz.-Ber. d. Ges. f. Morphol. u. Physiol. Bd. 29. M o m m s e n , H., 2 6. Über den Einfluß der Wasserstoffionenkonzentration auf die Färbung im Blutbild. Klin. Woch. Jahrg. 5, S. 844. —•, 2 9. Die pathologische (toxische) Granulation der feingekörnten Leukocyten, ihre objektive Erkennung und praktische klinische Verwertung. Klin. Woch., 8. Jahrg., S. 2420—2422. M o n n é , L., 3 8. ü b e r Vitalfärbung tierischer Zellen mit Rhodaminen. Z. w. M. Bd. 55, S. 143—149. —, 3 8. Über Vitalfärbung des Golgi-Apparates und der ergastoplasmatischen S t r u k turen in einigen Gastropoden-Zellen. Protopl. Bd. 30, S. 460—464. M o r a n d i , L. P., 4 9. Metodi neuro-istologici impiegati nel laboratorio istologico di Losanna. Monit. Zool. Ital. Bd. 51, S. 282—286. M ü l l e r , Albert, 0 7. Wie ändern die von glatter Muskulatur umschlossenen Hohlorgane ihre Größe? Pflüg. A. Bd. 116. M ü l l e r , Erik, 9 2. Zur Kenntnis der Labdrüsen der Magenschleimhaut. Verh. Biol. Vereins Stockholm. Bd. 4, Nr. 8. M ü l l e r , H., 59. Anatomische Untersuchung eines Mikrophthalmus. Verh. Physik.med. Gesellsch. in Würzburg. Auch in: H e i n r i c h M ü l l e r s Gesammelte und hinterlassene Schriften zur Anatomie und Physiologie des Auges. Bd. 1. G e d r u c k t e s . Herausg. von O. Becker, S. 381. M ü l l e r , Otfried, 3 7, 3 9. Die feinsten Blutgefäße des Menschen in gesunden und k r a n k e n Tagen. 2 Bände, Enke, Stuttgart. M ü n z e r , F. Th., 2 8. Über Darstellung und Vorkommen von Glykogen im Nervensystem. Z. ges. Neur. Bd. 112, S. 288—301. M u r a y a m a , A., T. S u z u k i und M. 11 o h , 3 7. Vergleichende Betrachtungen über vier Arten von Entkalkungsflüssigkeiten sowie über den Einfluß der E r w ä r m u n g auf die Entkalkungsgeschwindigkeit. Trans. Soc. Path. Japon. Bd. 27, S. 99—106. N ä g e l i , Otto, 3 1. Blutkrankheiten und Blutdiagnostik. Lehrbuch der klinischen Haematologie. 5. Aufl. Berlin-Leipzig. N a g e l , A., 33. Ein Verfahren zur quantitaven Wiedergewinnung von Deckgläsern und Objektträgern aus unbrauchbaren mikroskopischen Präparaten. Z. w. M. Bd. 50, S. 181—184. N a g e o 11 e , J., 3 6. Morphologie des gels lipoides, myéline, cristaux liquides, vacuoles. Actualités scientifiques et industrielles. Nr. 431—434, Paris. N a s s o n o v , D., 2 3. Das Golgische Binnennetz und seïne Beziehungen zu der Sekretion. A. m. A. und Entw.-M. Bd. 97, S. 1'36—186. —, 2 4. Das Golgische Binnennetz und seine Beziehungen zu der Sekretion (Fortsetzung). A. m. A. und Entw.-M. Bd. 100, S. 433—472. N e e 1 s e n und S c h i e f f e r d e c k e r , P., 8 2. Beitrag zur Verwendung der ätherischen Öle in der histologischen Technik. A. Anat. Physiol., Anat. Abt., S. 204—206. N e u b e r t , K., 2 2. Der Übergang der arteriellen in die venöse Blutbahn bei der Milz. Z. Anat. Entw. Bd. 66, S. 424—450. —, 4 0. der Feinbau der Lymphknotenkapsel beim Menschen. Z. Anat. Entw. g. Bd. 110, S. 709—725. N e u k i r c h , P., 0 9. Über eine neue Methode der Glykogenfixation. Zbl. Path. Bd. 20, H. 12. N e u m a n n , K. und H u e b e r , J., 2 7. Verbesserte Methode zum U m r a n d e n von Glyzerinpräparaten. Z. w. M. Bd. 44, S. 332. N e u m a y e r , L., 0 7. Ein Beitrag zur Technik der Plattenmodelliermethode. Z. w. M. Bd. 24, S. 140—144. —, 0 8. Zur Technik der Celloidineinbettung. Z. w. M. Bd. 25, S. 38—41. —, 1 1. Neue Instrumente zur Herstellung von Wachsplatten usw. Z. w. M. Bd. 28, S. 291—300. —, 2 2. Injektionstechnik f ü r mikroskopische Untersuchungen. In Hdb. der biol. A r beitsmethoden, her. von Abderhalden. Abt. 9, Teil 1 (Lief. 71). —, 3 2. G u m m i p r ä p a r a t e f ü r Injektionszwecke. Z. w. M., Bd. 49, S. 341—347. N e u w e i 1 e r , N. G., 4 3. Viereckige Okularblenden. Mikrokosmos Jahrg. 36. S. 51 f. N i e l s e n , N., A. O k k e l s u n d S t o c k h o l m - B o r r es s e n , 3 2. Détection histochimique du Glycogène. Acta path. Scandin. Bd. 9, S. 258—268. N i e s s i n g , K., 3 5. Nierenkapsel und Gitterfasersysteme in ihren funktionellen Beziehungen zur Form u n d Architektur der Niere. Morph. J a h r b . Bd. 75, S. 331—373.

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N i k i f o r o w , M. N., 8 8. Mikroskopisch-technische Notizen. Z. w. M. Bd. 5, S. 337 bis 340. N i s h i m u r a , J., 1 0. Vergleichende Untersuchungen über die mikrochemische Eisenreaktion in menschlichen Lebern. Z. Pat-h. Bd. 21, S. 10. N i s s 1, Fr., 9 4 a. Über die sog. Granula der Nervenzellen. Neurolog. Zentralbl. Nr. 19, 21, 22.

—, 9 4 b. Mitteil, über Karyokinese im zentralen Nervensystem. 25. Versammlung des Südwestdeutschen psych. Vereins in K a r l s r u h e 1893. In: Allgem. Zeitschr. f ü r Psychiatrie und psych.-gerichtl. Med. Bd. 51, S. 245—247. — , 9 5 Der gegenwärtige Stand der Nervenzellenanatomie und -pathologie. Zeitschr. f. Psychiatrie. B. 51. N o l l , A. und S o k o 1 o f f , A., 05. Histologie der ruhenden u n d tätigen F u n d u s drüsen des Magens. A. Anat. Physiol., Physiol. Abt. N o y e r , R. du, 1 8. Nouveau lut pour préparations microscopiques. C. R. Soc. Biol. Bd. 81, S. 741. N ü r n b e r g e r , L., 2 8. Zur Kenntnis des Keratohyalins. Klin. Woch. 7, S. 1961 bis 1962. N u z z i , O., 2 2. Il celluloide nella microtecnica. Riforma med. Napoli. Anno 38, No. 35. O b e r n d o r f e r , S. 21. Die pathologischen Pigmente. Ergebn. Pathol. Bd. 19, 2. Abt., S. 47—146. O b r e g i a , 9 0. Serienschnitte mit Photoxylin oder Celloidin. Neurol. Zbl. Bd. 9, S. 295—298. O b s t , P., 99. Untersuchungen über das Verhalten der Nucleolen bei der Eibildung einiger Mollusken und Arachnoiden. Z. wiss. Zool. Bd. 66, S. 161—213. O e 1 z e , F. W., 1 4. Über die färberische Darstellung der Reduktionsorte und Oxydationsorte in Geweben u n d Zellen. A. m. A. Bd. 84, S. 91 ff. —, 1 4. Die Histologie der Oxydations- und Reduktionsorte. Z. w. M. Bd. 31, S. 43—50. —, 1 4. Die Darstellung der Reduktions- und Sauerstofforte der Gewebe. Z. w. M. Bd. 31, S. 307—309. — , 3 4. Methodik der Dunkelfeldmikroskopie in Handb. d. biol. Arbeitsmeth. her. von Abderhalden. Abt. XII, Teil 2, H. 3, Lief. 425, S. 413—482. O e s t r e i c h e r , A., 2 6. Über den Nachweis des Harnstoffes in den Geweben mittels Xanthydrol. Virch. Arch. Bd. 257, S. 614—661. O g a t a , T. und O g a t a , A., 2 3. Über die Henlesche Chromreaktion der sog. chromaffinen Zellen u n d den mikrochemischen Nachweis des Adrenalins. Ziegl. Beitr. Bd. 71, S. 376—387. O k a j i m a , K., 11. F e t t f ä r b u n g durch das Capsicumrot. Z. w. M. Bd. 29, S. 67 f. —, 2 2. Ein neuer Beschneideritzer f ü r die plastische Rekonstruktion. An. An. Bd. 55, S. 199—201 —, 2 6. Über die Färbemethode mit Alizarinmolybdänlack. Fol. anat. jap. Bd. 4, S. 411 (auch Anat. Ree. Bd. 12, 1917). —, 3 5. Färbung durch Eisenchloridalizarinlack (Omnichrom.). Fol. anat. japon. Bd. 13, S. 383—384. O k a m o t o , K., 3 7. Über das Gewebseisen. Act. Schol. medicin. Univ. Imp. Kioto. Bd. 20, S. 413—460. — u n d M. U t a m u r a , 3 8. Biologische Untersuchungen des Kupfers. I. Mitt. Über die histochemische Kupfernachweismethode. Act. Schol. medicin. Univ. Imp. Kioto. Bd. 20, S. 573—580. —, T. A k a g i u n d G. M i k a m i , 3 9. Biologische Untersuchungen des Goldes. 1. Über die histochemische Goldnachweismethode. Act. Schol. medicin. Univ. Imp. Kioto. Bd. 22, S. 373—381. 0 k k e 1 s , H., 2 9. Détection histochimique de l'or et du plomb. C. R. Soc. Biol. Bd. 102, S. 1089. Siehe auch Henriques und Okkels. —, 3 8. L'appareil de Lindbergh et ses applications à l'histophysiologie. Bull. Hist. appl. Bd. 15, S. 24—29. —, 3 8. Messung von Gewebeteilen, Zellen oder Zelleinschlüssen. Eine neue q u a n t i tative histologische Meßmethode. A. exp. Zellf. Bd. 21. S. 400—406. 0 1 i v e i r a , G. de, 3 6. Uber ein neues Verfahren zur Darstellung des Stützgerüstes der Organe. Virch. A. Bd. 298, S. 523—526. O 11, 0 6. Das Aufkleben mikroskopischer Schnitte. Z. w. M. Bd. 23, S. 323—328. O p p e 1, A., 9 1. Uber Gitterfasern der menschlichen Leber und Milz. An. An. Bd. 6, S. 165—173.

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O p p e 1, A., 9 1 b und 9 2. Die Befruchtung des Reptilieneies. An. An. Bd. 6, S. 536—544 u n d A. m. A. Bd. 39, S. 215—290. O p p e n h e i m e r , K., 2 3. Die Ausscheidung von Scharlachrot durch die Leber. Frankf. Z. Path. Bd. 29, 3, S. 342—356. O r t h , J., 83. Notizen zur Färbetechnik. Beri. Klin. Woch. Jahrg. 20, Nr. 28, S. 421 bis 422. —•, 9 6. Über die Verwendung des Formaldehyd im Pathol. Institut in Göttingen. Beri. Klin. Woch. J a h r g . 33, Nr. 13, .S. 273—275. O r t o n , S. T. and J. P o s t , 32. Some experiments with a new embedding material. Bull. Neurol. Inst. New York Bd. 2, S. 302—311. O s t e r t a g , B., 2 5. Über Imprägnieren und Abschwächen zur Erzielung gleichmäßiger P r ä p a r a t e bei der Silberimprägnation am Gewebeblock. Z. w. M. Bd. 42, S. 182. O t a m i , Sadao, 2 6. A new method for the demonstration of the bile capillaries. Proc. of the New York pathol. soc. Bd. 26, Nr. 1/5, S. 2—3. O v e r t o n , E., 90. Mikrotechnische Mitteilungen aus dem botanischen Laboratorium der Universität Zürich. Z. w. M. Bd. 7, S. 9—16. P a i n t e r , T. S., 24. A technic for the study of Mammalian chromosomes. Anat. Ree. Bd. 27, S. 77—86. —, 3 9. An aceto-carmine method for bird and mammalian chromosomes. Science (N. Y.) II. S. 307—308. P a 1, J., 8 6. Ein Beitrag zur Nervenfärbetechnik. Med. J a h r b . Wien. S. 619—631. P a p , T., 30. Eine neue Methode zur Imprägnation des Retikulums. Zbl. Path. Bd. 47, S. 116. P a p p e n h e i m , A., 0 1. Grundriß der Farbchemie* zum Gebrauch bei mikroskopischen Arbeiten. 4765. Berlin. Hischwald. — 0 1. Eine panoptische Triacidfärbung. Deutsch, med. Woch. Nr. 46. —•, 0 8. Zur Kenntnis und Würdigung der Methylgrün-Pyronin-Reaktion. Fol. haem. Bd. 6, S. 51—65. —, 1 0. Neue zytomorphologische Studien an Blutzellen mit farbenanalytischen Methoden. Fol. haem. Bd. 9, S. 572—640. —-,11. Kurze technologische Zusammenstellung der Färbungsvorschriften mit P a n chrom. Fol. haem. Bd. 12, S. 178. — , 1 1 . Grundriß der hämatologischen Diagnostik und praktischen Blutuntersuchung. Leipzig. Der technische Teil 1919 in 2. Aufl. als: Technik und Methodologie der klinischen Blutuntersuchung. Leipzig. —, 1 2. Die kombinierte May-Giemsa-Essigsäure-Färbungsmethode als histologische Universalübersichtsfärbung. An. An. Bd. 42, S. 525—527. —, 1 2. Histologisch-technische Notiz. Zbl. Path. Bd. 23, Nr. 5. —, 1 3 c. Einige Worte über Histiocyten, Splenocyten u n d Monocyten. Fol. haem. Bd. 16. — u n d N a k a n o , J., 13. Beiträge über Beziehungen zwischen Vitalfärbung, Supravitalfärbung und Oxydasereaktion. Fol. haem. Bd. 14, S. 260—294. P a r a t und P a i n l e v é , 24. Oberservations vitales d'une cellule glandulaire en activité. C. R. Soc. Soc. Biol. Bd. 179, H. 13. Weitere Arbeiten s. Jacobs 27. P a r k e r , R. C., 38. Methods of tissue culture. New York. P a s i n i , 05. Über eine Methode zur Demonstration der Epithelfasern in der Haut. Monatsh. prakt. Dermat. Bd. 40. P a s s e r a , 9 6 , 9 7. La rete vascolare sanguigna della m e m b r a n a corio capillare dell uomo. Ree. Labor. Anat. Roma. Bd. 5, S. 133 und Bd. 6. P a s t e e i s et G. L é o n a r d , 3 5. Sur da détection du glycogène dans les coups histologiques. Bull. Hist. appi. Bd. 15, S. 293—299. P a t t e n , Br. M. and P h i 1 p o 11, R., 21. The shrinkage of embryos in the processes preparatory to sectioning. Anat. Ree. Bd. 20, S. 393—413. P a t z e 11, V., 2 3. Über die menschliche Epiglottis. Z. Anat. u. Entw.g. Bd. 70, S. 1 bis 178. —, 2 5. Zum Bau der menschlichen Epidermis. Z. mikr.-anat. F. Bd. 5, S. 371—462. —, 2 8. Glykogen- u n d Schleimfärbung mit Bestschem Carmin. Wien. Klin.. Woch. Nr. 16. —, 2 9. Schleimfärbung mit Bestschem Carmin an Drüsen des menschlichen Verdauungstraktes. An. An. Bd. 67, Erg.-H., S. 226. — u n d K u b i k , J., 12. Acidophile Zellen in der Nebenniere von Rana usw. A. m. ABd. 81, S. 82—91.

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P e k e l h a r i n g , C. A„ 0 2. Mitteilungen über Pepsin. Z. physiol. Chem. Bd. 35, S. 8 bis 30. - -, 13. Über die von Herrn O. Schultze behauptete Kontinuität von Muskelfibrillen und Sehnenfibrillen. An. An. Bd. 45, S. 104—106. P e n f i e l d , W., 2 4. Brain. Bd. 47, S. 430. —, 2 8. A method of staining Oligodendroglia und microglia (Comined method). Amer. Journ. Path, Bd. 24, S. 117. P e r d r a u , J. R., 2 1. The silver reduction method for the demonstration of connective tissue fibres. Journ. of Path. Bd. 24, S. 117. P e r e n y i , J., 8 2. Über eine neue Erhärtungsflüssigkeit. Zool. Anz. 5. Jahrg., S. 459. P e r e z , A. P. R., 32. Distribution de la microglia et existance d'oligodendrocytes de Cajal et Robertson dans la bulbe olfactif. Trav. Lab. Rech. Biol. Madrid Bd. 28, S. 103—122. P e t e r , K., 99. Demonstration des Born-Peterschen Verfahrens zur Herstellung von Richtebenen und Richtlinien usw. An. An. Bd. 16. Ergänz.h., S. 134—136. —, 0 4. Eine neue Dotterfärbung. Z. w. M. Bd. 21, S. 314—320. —, 0 6. Die Methoden der Rekonstruktion. 140 S. Jena. G. Fischer. —, 2 2. Über Rekonstruktion in Schrägansicht. Z. w. M. Bd. 39, S. 138—148. —, 2 2. Rekonstruktionsmethoden in Handb. d. biol. Arbeitsmeth. her. von Abderhalden. Abt. 9, Teil 1 (Lieferung 71). —, 2 7. Artikel Rekonstruktion in Enzykl. 3. Aufl. Bd. 3, S. 1994—2020. —, 3 5. Die Gestalt der Achselstoffdrüsen. Z. mikr.-anat. F. Bd. 38, S. 330—340. —, 4 2. Über das Plattenmodellieren bei Anwendung starker Vergrößerungen. Z. w. M. Bd. 58, S. 209—217. P e t e r f i , T., 13. Untersuchungen über die Beziehungen der Myofibrillen zu den Sehnenfibrillen. A. m. A. Bd. 83, S. 1—42. —, 2 1a. Eine beschleunigte Celloidin-Paraffineinbettung mit Nelkenöl- oder Methylbenzoatcelloidin. Z. w. M. Bd. 38, S. 342—345. —, 2 1b. Die doppelseitige Untersuchung mikroskopisch kleiner Objekte. Z. w. M. Bd. 38, S. 358—362. —, 2 4 a. Mikrurgische Methodik. Handb. der biol. Arbeitsmethoden. Hrg. von Abderhalden. Abt. 5, Teil 2, Lieferung 124, S. 479—516. —, 2 4 b. Neue mikrurgische Nebenapparate. Z. w. M. Bd. 41, S. 263—268. —, 2 7. Die heizbare feuchte Kammer. Z. w. M. Bd. 44, S. 296—308. —, 2 8. Die Technik der Zelloperationen (Mikrugie); in Methodik der wiss. Biol., Bd. I, S. 559—587. P e t e r s e n , H., 2 4. Mikroskopie im gefärbten Licht. Z. w. M. Bd. 41, S. 358—363. —, 2 4. Färben mit Säurealizarinblau. Z. w. M. Bd. 41, S. 363—365. —, 2 6. Über Methoden zum Studium des Knochens. Z. w. M. Bd. 43, S. 355—360. —, 2 9. Kleine Mitteilungen zur mikroskopisch-anatomischen Technik. Z. w. M. Bd. 46, S. 378—381. P e t r i , R. J., 9 6. Das Mikroskop. Berlin. R. Schoetz. 248 S. P e t r y , G., 4 2. Die Lackmethode und ihre Anwendung in der histologischen Technik. Z. w. M. Bd. 58, S. 305—313. P e t r u n k e w i t s c h A. and G. E. P i c k f o r d , 3 6. On the relative acidity of histological fixing fluids. Anat. Ree. Bd. 63, S. 461—465. P f e i f f e r , H., 25. Eine Methode zur kolorimetrischen Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentratio in pflanzlichen Gew-ebsschnitten ohne Anwendung von Moderatoren. Z. w. M. Bd. 42, S. 396—414. —, 2 7. Der gegenwärtige Stand der kolorimetrischen Azidimetrie in der Gewebsphysiologie. Protopl. Bd. 1, S. 434—465. — und A. J a r i s c h , 2 0. Über Veränderungen des Nebennierenorganes nach nervösen und toxischen Schädigungen. Z. ges. exp. Med. Bd. 10, S. 1—102. P f u h l , W., 3 0. Untersuchungen über zweikernige Zellen. I. Die Berechnung der zweikernigen Zellen nach der Auszählung im mikroskopischen Schnitt. Z. mikr.anat. Forsch. Bd. 22, S. 557—578. —, 3 1. Untersuchungen über die Fixierung der vitalen Trypanblauspeicherung. Z. Zellf. Bd. 13, S. 783—803. —, 3 2. Die Zellen des normalen lockeren Bindegewebes unter besonderer Berücksichtigung der Klasmatozyten. Z. mikr.-anat. F. Bd. 31, S. 18—107. —, 3 2. Die Leber in Handb. d. mikr. Anat. her. v. Möllendorff, V. 2, S. 235—425.

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S c h a b a d a s c h , A., 3 0 b . Zur Theorie und Praxis des Fixierens der Methylenb l a u f ä r b u n g des Nervensystems. Z. Zellforschg. Bd. 10, S. 244—253. —, 3 0 c. Die Nerven des Magens der Katze. Z. Zellforschg. Bd. 10, S. 254r—319. —, 3 0 d. I n t r a m u r a l e Nervengeflechte des Darmrohrs. Z. Zellforschg. Bd. 10, S. 320 bis 385. —•, 3 5. Theoretische und experimentelle Studien zur Methylenblaufärbung des N e r vengewebes. Acta morphologica H. 1. Staatsverl. Gorky. —•, 3 7. Morphology of glycogen distribution and transformations. 1. Principles of fixation and staining of glycogen for micro- and macromicroscopie study. Bull. Biol. et Med. exp. U. R. S. S. Bd. 4, S. 13—16. S c h a f f e r , J., 8 8. Die Färberei zum Studium der Knochenentwicklung. Z. w. M. Bd. 5. 9 3. Die Methode der histologischen Untersuchung des Knochengewebes. Z. w. M. Bd. 10. 9 3 b. Beiträge zur Histologie und Histogenese der quergestreiften Muskelfasern usw. Sitz.Ber. Wien. Akad. Bd. 102, Abt. 3, S. 7—148. 9 6. Mikrotechnisches. Histologisches. Geschichte des Mikroskops. Wien. klin. Wochenschrift. Jahrg. 1896, Nr. 45. 9 9. Zur Kenntnis der glatten Muskelzellen, insbesondere ihrer Verbindung. Z. w. Z. Bd. 66, S. 214—268. 9 9 b. Eine einfache Vorrichtung zum raschen Entwässern histologischer Objekte. Z. w. M. Bd. 19. 0 2. Versuche mit Entkalkungsflüssigkeiten. Z. w. M. Bd. 19, S. 308—328, 441—463. 0 6. Über den feineren Bau u n d die Entwicklung des Knorpelgewebes und über v e r w a n d t e Formen der Stützsubstanzen. II. Teil. Z. w. Z. Bd. 80. 0 7. Uber das Färben der grobkörnigen sog. Mastzellen. Zbl. Physol. Bd. 21, S. 258 bis 262. 0 8. Zur Histologie der Unterkieferspeicheldrüsen bei Insektivoren. Z. w. Z. Bd. 89, S. 1—27. 1 4. Kleinere histologische Mitteilungen. 3. Über eine isolierte Färbung der H a a r cuticula. Verh. anat. Ges., S. 99—101. 1 7. Beitr. zur Histologie menschlicher Organe. VIII. Glandula bulbourethralis und vestibularis maior. Sitz.-Ber. k. Akad. Wiss. Wien. 126, S. 27—45. 1 8. Veränderungen an Gewebselementen durch einseitige Wirkung der Fixierungsflüssigkeit u. Allgem. üb. Fixierung. An. An. Bd. 51, S. 353. 2 2. Lehrbuch der Histologie und Histogenese. 2. Aufl. Leipzig. W. Engelmann. 2 6. Artikel Knochen u n d Zähne in Enzykl. mikr. Techn. 3. Auflage. Bd. 2, S. 1148 bis 1200. 2 6. Artikel Knorpel in Enzykl. mikr. Techn. 3. Aufl., Bd. 2, S. 1200—1235. 4 0. Die Hautdrüsenorgane der Säugetiere. 464 S. Berlin-Wien. S c h a p e r , A., 0 4. Eine Methode zur Durchschneidung großer Wachsmodelle. Z. w. M. Bd. 21, S. 200—206. S c h a r p f f , W., 2 6. Ein Beitrag zur Technik der histologischen Untersuchung menschlicher Hautkapillaren. Z. w. M. Bd. 43, S. 240—243. S c h a r r e r , E., 3 3. Zelloidinserien. Z. w. M. Bd. 50, S. 187—188. S c h e f f e r , W., 11. Wirkungsweise u n d Gebrauch des Mikroskops. 113 S. Leipzig. S c h e i d , K. F., 3 0. Histologische Studien am Gehirn mit Hilfe der Schnittveraschung. Virch. A. Bd. 277, S. 673—693. S c h e u r i n g , 13. Die Augen der Arachnoiden. Zool. Jahrb., Abt. Morph. Bd. 33, S. 553—636. S c h i e f f e r d e c k e r , P., 8 2. Über die Verwendung des Zelloidins in der anatomischen Technik. A. Anat. Physiol., Anat. Abt., S. 199—203. —, 8 6. Methode zur Isolierung von Epithelzellen. Z. w. M. Bd. 3, S. 483. —, 2 1. Über das A u f t r e t e n der elastischen Fasern in der Tierreihe usw. A. m. A. Bd. 95, S. 134—185. S c h i l l e r , W., 3 0. Gewebsfixierung u n t e r Erhaltung der basischen K e r n f ä r b u n g . Z. Zellf. Bd. 11, S. 63—178. S c h i l l i n g , V., 33. Anleitung zur Diagnose im dicken Bluttropfen. 4. Aufl. Jena. —, 3 8. Praktische Blutlehre. 8./9. Aufl. S c h i m e r t , J., 3 8. Die Endigungsweise des Tractus vestibulospinalis. Z. Anat. Entw.g. Bd. 108, S. 353—364. 39*

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S c h l e m m e r , A., 10. Über die Herstellung der ammoniakalischen Silbersalzlösung bei der Imprägnationsmethode Bielschowsys. Z. m. M. Bd. 27, S. 22. S c h m e e r , K., 4 0. Die Berechnung der Nierenkörperchenzahl beim Hunde. An. An. Bd. 89, S. 353—364. S c h m e l z e r , W., 9 6. Studien über den pathol.-anat. Befund bei der Wismutvergiftung. Diss. Dorpat. —, 3 2. Das Kollodiumhäutchenverfahren. Z. w. M. Bd. 49, S. 357—361. —, 3 3. Herstellung von Trockenpräparaten aus Schleimhäuten usw. zur Betrachtung ihrer Oberflächengestaltung im aulfallenden Licht mittels Binokularmikröskop. Z. w. M. Bd. 50, S. 335—339. —, 3 3. Der mikrochemische Nachweis von Eisen in Gewebselementen mittels Rhodanwasserstoffsäure und die Konservierung der Reaktion in Paraffinöl. Z. w. M. Bd. 50, S. 99—102. —, 3 3. Hecheln und Raspeln, angewandt auf tierische Gewebe. Z. w. M. Bd. 51, S. 516 bis 518. S c h m i d t , F. W., 1 0. Die Aufhebung der Formalin-Härtung usw. Z. w. M. Bd. 27, S. 214—218. S c h m i d t , Gustav, 0 6. Uber die Resorption von Methylenblau durch das Darmepithel. Pflüg. A. Bd. 113, Heft 9 u. 10. S c h m i d t , J . E., 05. Beiträge zur normalen und pathologischen Histologie einiger Zellarten der Schleimhaut des menschlichen Darmkanals. A. m. A. u. Entw. M. Bd. 66, S. 12—40. S c h m i d t , M. B., 24. Über vitale Fettfärbung in Geweben und Sekreten durch Sudan und geschwulstartige Wucherungen der ausscheidenden Drüsen. Virch. A. Bd. 253, S. 432—451. S c h m i d t , V., 2 7. Die Histogenese der quergestreiften Muskelfaser und des Muskelsehnenüberganges. Z. mikr.-anat. F. Bd. 8, 97—184. S c h m i d t , W. J., 10. Studien am Integument der Reptilien. I. Z. w. Zool. Bd. 99. 1 3. Studien usw. IV. Zool. Jahrb. anat. Abt. Bd. 36, S. 377—464. 1 4. Studien usw. V. Ebenda. Bd. 38, S. 1—102. 1 7. Die Chromatophoren der Reptilienhaut. A. m. A. Bd. 90, I, S. 98—259. 1 8. Zur Kenntnis der lipochromführenden Farbzellen in der Haut nach Untersuchungen an Salam. mac. Derm. Zeitschr. Bd. 25, S. 324—328. 1 8. Über die Methoden zur mikroskopischen Untersuchung der Farbzellen und Pigmente in der Haut der Wirbeltiere. Z. w. M. Bd. 35, S. 1—43. 2 0. Vom Polarisationsmikroskop und seiner Anwendung. Z. w. M. Bd. 37, S. 1—35. 2 0. Über die Untersuchung tierischer Hartsubstanzen mittels Opakilluminators. Z. w. M. Bd. 37, S. 101—119. 2 3. Über die Bedeutung polarisationsmikroskopischer Forschungen in der Zoologie. Z. w. M. Bd. 40, S. 97—114. 2 4. Die Bausteine des Tierkörpers in polarisiertem Lichte. XII, 528 S. Bonn. 2 4. Anleitung zur polarisationsmikroskopischen Untersuchung für Biologen. 64 S. Bonn. 2 4. Der neue automatisch regulierende elektrische Heiztisch von E. Leitz. Z. w. MBd. 41, S. 335—342. 2 5. CBMP von E. Leitz, Wetzlar, ein Polarisationsmikroskop für Biologen. Z. w. M. Bd. 42, S. 313—321. 2 8. Polarisationsmikroskopie; in Meth. wiss. Biol. Bd. 1, S. 380—417. 3 1. Dichroitische Färbung tierischer und pflanzlicher Gewebe. Handb. biol. Arbeitsmethoden. Hersg. von Abderhalden. Abt. V. Teil 2/2. S. 1835—1924. 3 2. Über Paraffinreste in Zellkernen und anderen Gewebeanteilen bei Schnittpräparaten. Z. w. M. Bd. 49, S. 84—91. • 3 2. Uber Bedeutung und Herstellung kollagenfreier Knochenschliffe. Z, w. M. Bd. 49, S. 417—426. 3 2. Beiträge zur Doppelbrechung des menschlichen Kopfhaares. Z. Zellf. Bd. 15, S. 188—206. 3 5. Polarisationsoptische Analyse des submikroskopischen Baues von Zellen und Geweben. Handb. d. biol. Arbeitsmethoden, her. v. Abderhalden. Abt. V. Teil 10. Lief. 429, S. 435—665. 3 5. Silber- und Golddichroismus quergestreifter Muskelfasern. Z. w. M. Bd. 52, S. 397—405.

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S c h m i d t , W. J., 37. Desosmierung, Gold- u n d Manganbehandlung osmierter N e r venfasern und ihr Einfluß auf die Polarisationsoptik. Z. w. M. Bd. 54, S. 390—397. —, 3 7. Die Doppelbrechung von Karyoplasma, Cytoplasma und Metaplasma. Protpl. Monograph. Bd. 11, Berlin 1937. —•, 3 8. Neuere polarisationsoptische Arbeiten auf dem Gebiete der Biologie. I. P r o topl. Bd. 29, S. 300—312 und 435—467. —, 3 9. Über Doppelbrechung und Feinbau der K e r n m e m b r a n . Protopl. Bd. 32, S. 193 bis 198. —, 3 9. Herstellung von P r ä p a r a t e n zur polarisationsoptischen Untersuchung der Chromosomen in den Speicheldrüsenkernen der Chironomuslarven. Z. w. M. Bd. 56, S. 1—7. —, 3 9. Der molekulare Bau der Zelle. Nova Acta Leopoldina 7, N. 45, S. 1—24. —, 3 9. Uber den polarisationsoptischen Nachweis des Chitins bei Tieren und P f l a n zen. Z. w. M. Bd. 56, S. 24—51. —, 4 0. Doppelbrechung der Kernspindel und Zugfasertheorie der Chromosomenbewegung. Chromosoma I, S. 253—264. —, 4 0. Neuere polarisationsoptische Arbeiten auf dem Gebiete der Biologie II. Protopl. Bd. 34, S. 237—313. —•, 4 1. Einiges über optische Anisotropie und Feinbau von Chromatin und Chromosomen. Chromosoma Bd. 2, S. 86—110. S c h m i d t m a n n , M., 2 4. Über eine Methode zur Bestimmung der Wasserstoffzahl im Gewebe und in einzelnen Zellen. Biochem. Z. Bd. 150, S. 253—255. —, 2 8. Mikroskopischer Nachweis der Zellpigmente und Lipoide; in Meth. wiss. Biol. Bd. 1, S. 981—1015. S c h m i n c k e , A., 16. Uber die normale und pathologische Physiologie der Milz. Münch. Med. Woch. Heft 28, 29, 30 und 31. —, 2 1. Methoden zur morphologischen Untersuchung der Milz. Handb. der biochem. Arbeitsmethoden Abderhald. Abt. VIII. Berlin. S c h m o r l , G., 3 1. Zur Technik der Knochenuntersuchung. Ziegl. Beitr. Bd. 87, S. 585—598. —, 3 4. Die pathologisch-histologischen Untersuchungsmethoden. Hrg. von P. Geipel. '16. Aufl. Leipzig. S c h o u t e n , S. L., 3 4. Der Mikromanipulator. Z. w. M. Bd. 51, S. 421—515. S c h ö n f e l d , M., 3 5. Morphologisch-experimentelle Untersuchungen über die K e r n s t r u k t u r der Leukocyten.. Protopl. Bd. 22, S. 179—192. S c h r i d d e , H., 10. Methoden zur Fixierung u n d Einbettung von embryologischem Material. Z. w. M. Bd. 27, S. 360—365. — und N ä g e 1 i , O., 10. Die hämatologische Technik VI, 135 S. Jena. S c h r o e d e r , K., 3 9. Eine weitere Verbesserung meiner Markscheidenmethode am Gefrierschnitt. Z. ge?. Neur. Bd. 166, S. 588—593. S c h u b e r g , A., 0 3. Untersuchungen über Zellverbindungen. Z. w. Z. Bd. 74. —•, 0 9. Über die F ä r b u n g von Schnittpräparaten mit der Giemsaschen Azur-EosinMethode Deutsche med. Wochenschrift. S. 2106. —, 1 0. Zoolog. P r a k t i k u m . Bd. I. Leipzig. S c h ü l e , Frd., 3 5. Ein Vergleich zwischen dem Muskelfaserende im normalen u n d im Narbengewebe. Z. mikr.-anat. F. Bd. 37, S. 501—518. S c h u e n i n o f f , S., 0 8. Eine Fibrintinktionsmethode. Zbl. Path. Bd. 19. S c h ü r h o f f . P . N . , 2 2 . Gefärbte P r ä p a r a t e bei Bitumi-Betrachtung. Z. w. M. Bd. 39, S. 29—30. S c h u h m a n n , A. Das Kaninchen. Kosmos, Stuttgart, o. J. S c h u l e m a n n , W., 1 7. Die vitale F ä r b u n g mit sauren Farbstoffen in ihrer Bedeutung f ü r Anatomie, Physiologie, Pathologie und Pharmakologie. Biochem. Zeitschr. Bd. 80, S. 1—142. S c h u l t e , A., 2 4 / 2 5. Eine Methode des mikrochemischen Cholesterinnachweises a m Gewebsschnitt. Zbl. Path. Bd. 35, S. 314—316. S c h u l t e n , H., 37. Die Sternalpunktion als diagnostische Methode. 82 S. Thieme, Leipzig. S c h u l t z , A., 3 1. Experimentelle Studien zur Harnsäure-Ausscheidung. Verh. d. Deutsch. Path. Ges. 26. Tagung, S. 174—180. — , 3 1 . Über die Verwendung von Leuchtgas zur Herstellung anatomischer P r ä p a r a t e in natürlichen Farben. Klin. Woch. 10. 7., S. 213—214.

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S c h u l t z , A., u n d L o h r , G., 25. Zur Frage der Spezifität der mikrochemischen Cholesterinreaktion mit Eisessig-Schwefelsäure. Zbl. Path. Bd. 36, S. 529—533. — u n d W. S c h m i d t , 31. Histologische Darstellungsmethoden der H a r n s ä u r e und Urate. Virch. A. Bd., 280, S. 529—533. S c h u l t z - B r a u n s , O., 2 9. Histö-topochemische Untersuchungen an k r a n k h a f t v e r ä n d e r t e n Organen unter Anwendung der Schnittveraschung. Virch. A. Bd. 273, S. 1—50. —, 3 1. Die Vorteile des Gefrierschneidens unfixierter Gewebe f ü r die histologische Technik. Zbl. Path. Bd. 50, S. 273—277. —',3 1. Eine neue Methode des Gefrierschneidens f ü r histologische Schnelluntersuchungen. Klin. Woch. 10. Jahrg., S. 113—116. —, 3 1 a . Die Methode der Schnittveraschung unfixierter tierischer Gewebe. Z. w. M. Bd. 48, S. 161—191. —, 3 2. Verbesserungen und Erfahrungen bei der Anwendung der Methode des Gefrierschneidens unfixierter Gewebe. Zbl. Path. Bd. 54, S. 225—234. S c h u 1 t z e , M., 6 4. Die Anwendung mit Jod konservierter tierischer Flüssigkeiten als mazerierendes u n d konservierendes Mittel bei histologischen Untersuchungen. Virch. A. Bd. 30, S. 263—265. —,. 7 1. Essigsaures Kali zum Aufbewahren mikroskopischer Präparate. A. m. A. Bd. 7. — u n d R u d n e f f , M., 6 5. Weitere Mitteilungen über die Einwirkung der Überosmiumsäure auf tierische Gewebe. A. m. A. Bd. 1. S c h u 11 z e , O., 8 7. Untersuchungen über Reifung und Befruchtung des Amphibieneies. Z. w. Z. Bd. 45. —, 9 7. G r u n d r i ß der Entwicklungsgeschichte des Menschen und der Säugetiere. Leipzig. —, 9 9. Über das erste Auftreten der bilateralen Symmetrie im Verlauf der Entwicklung. A. m. A. Bd. 55, S. 171—230. —, 0 4. Über Stückfärbung mit Chromhämatoxylin. Z. w. M. Bd. 21, S. 5—9. —, 0 6. Uber den frühesten Nachweis der Markscheidenfärbung im Nervengewebe. Sitz.-Ber. phys.-med. Ges. Würzburg. —, 0 7. Über den Bau und die Bedeutung der Außencuticula der Amphibienlarven. A. m. A. Bd. 69, S. 544—562. —, 10 a. Neue Methoden der histologischen, aufhellenden und korrodierenden Technik usw. Vrh. physik.-med. Ges. Würzburg. N. F. Bd. 40, Nr. 7, S. 157—168. —, 1 0 b. Über die Anwendung der Osmiumsäure und eine neue Osmiumhämatoxylinmethode. Z. w. M. Bd. 27, S. 465—475. —, 1 1. Über den direkten Zusammenhang der Muskelfibrillen und Sehnenfibrillen. A. m. A. Bd. 79, S. 307—331. —, 1 8. Neues zur mikroskopischen Untersuchung des Zentralnervensystems. Sitz.Ber. Physikal. med. Ges. Würzburg. S. 1—5. S c h u 11 z e , W. H., 0 9. Die Oxydasereaktion an Gewebsschnitten u n d ihre Bedeut u n g f ü r die Pathologie. Ziegl. Beitr. Bd. 45. —, 1 7. Zur Technik der Oxydasereaktion. Zbl. Path. Bd. 28, S. 8. —, 1 7. Über das Paraphenylendiamin in der histologischen Färbetechnik und über eine neue Schnellfärbemethode der Nervenmarkscheidcn am Gefrierschnitt. Zbl. Path. Bd. 36, S. 639—640. S c h u l z e , F. E , 7 1. Die Lungen. Strickers Handbuch der Lehre von den Geweben. Leipzig. S c h u l z e , P., 2 2. Ein neues Verfahren zum Bleichen und Erweichen tierischer Hartgebilde. Sitz.-Ber. d. Ges. naturf. Freunde, Jahrg. 1922, S. 135—139. —, 2 2. Über Beziehungen zwischen pflanzlichen und tierischen Skelettsubstanzen und über Chitinreaktionen. Biol. Zbl. Bd. 42, S. 388—394. — u n d K u n i k e , G , 2 3. Zur Mikrochemie tierischer Skelettsubstanzen. Biol. Zbl. Bd. 43, S. 556—559. S c h u l z e , W., 2 5. Die Anwendung neuerer, mikrochemischer Elektrolytreaktionen auf das Verkalkungsproblem bei der Osteogenese. A. Entw.-Mech. Bd. 106, S. 62 bis 74. S c h u m a c h e r , J., 3 4. Eine einfache Methode zur Angleichung der Bild- und Zeichenflächenhelligkeit bei Zeichenapparaten und -okularen. Z. w. M. Bd. 51, S. 392. S c h u m a c h e r , S. v., 12. Bau, Entwicklung und systematische Stellung der Blutlymphdrüsen. A. m. A. Bd. 81, S. 92—150.

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S c h u m m e r , Ch., 3 5. Ein neues Mittel (»Plastoid«) u n d Verfahren zur Herstellung korrosionsanatomischer Präparate. An. An. Bd. 81, S. 177—201. S c h u s c i k , O., 2 0. Über die Methode zum mikroskopischen Nachweis von Kalk im ossifizierenden- Skelett. Z. w. M. Bd. 37, S. 215—232. S c h u u r m a n n - S t e c k h o v e n j r., 3 1. Haaröse u n d Haarspatel, zwei mikroskopische Hilfsmittel. Zoolog. Anz. Suppl. Bd. 5, S. 321. S c h w a l b e , E., 0 1. Technische Bemerkungen zur K a r m i n f ä r b u n g des Zentralnervensystems. Zbl. Path. Bd. 12. S c h w a r z , F., 33. Untersuchungen über vorteilhafte Stückfärbung mit Karminen. Z, w. M. Bd. 50, S. 305—322. S c o 11, G. H., 3 4. A critical study and review of the method of mjcrocineration. Protopl. Bd. 20, S. 133—151. — and P. S. W i l l i a m s , 3 6. A simplified cryostat for the dehydration of frozen tissues. Anat> Ree. Bd. 66, S. 475—481. S e e 1 i g e r , M., 3 7. Uber den Bau des Gallengangsystems bei den Carnivoren usw. Z. Zellf. Bd. 26, S. 578—602. S e e m a n n , G., 29. Uber den feineren Bau der Lungenalveole. Beitr. path. Anat. Bd. 81. —, 3 0. Zur Technik d e r Supravitalfärbung. Z. w. M. Bd. 47, S. 323—325. —-,3 1. Histobiologie der Lungenalveole. Jena. S e h r t , E., 27. Histologie und Chemie der Lipoide der weißen Blutzellen und ihre Beziehungen zur Oxydasereaktion usw. Thieme, 53 S. Leipzig. S e h r w a 1 d , E., 8 9. Die Vermeidung der peripheren Niederschläge bei Golgis Chromsilberfärbung. Z. w. M. Bd. 6, S. 456—461. S e i f r i e d , O., 2 7. Die wichtigsten Krankheiten des Kaninchens. München, Bergmann. —, 3 9. Neuzeitliche Sammlung und Ordnung histologischer Schnitte. Z. w. M. Bd. 56, S. 367—371. S e k i , M., 3 3. Zur physikalischen Chemie der histologischen Färbung. Z. Zellf. Bd. 18, S. 1—55. —, 3 2 — 3 4. Zur physikalischen Chemie der histologischen Färbung. I—VII. Fol anat. japon. Bd. 10, 11 und 12. —, 3 3. Studien der elektrischen Ladung und F ä r b b a r k e i t der Erythrocyten in Rücksicht auf die Beziehungen zwischen Stroma u n d Hämoglobin. I—IV. Z. Zellf. Bd. 17, S. 139—159; Bd. 18, S. 544—554; Z. ges. exp. Med. Bd. 91, S. 593—601. —, 3 3. Zur Kenntnis der i n t r a - und supravitalen Färbung. I—IV. Z. Zellf. Bd. 19, S. 238—308. —, 3 7. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. I. Fixierung von Geweben in nicht wäßrigen Flüssigkeiten. Z. Zellf. Bd. 26, S. 305—320. —, 3 7. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. II. S c h r u m p f u n g von fixierten Geweben während der U b e r f ü h r u n g von Wasser bis in Paraffin. Z. Zellf. Bd. 26, S. 321—337. —•, 3 7. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. III. E r f a h r u n g e n auf dem Gebiete der Zelloidineinbettung. Z. Zellf. Bd. 26, S. 338—350. —, 3 7. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. IV. Kombinierte CelloidinParaffineinbettung. Z. Zellf. Bd. 27, S. 278—281. —, 3 7. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. V. Feingewebliche Veränderungen, die bei Fixierung u n d Einbettung durch verschiedene nicht wäßrige Flüssigkeiten verursacht werden. Z. Zellf. Bd. 27, S. 282—300. —, 3 8. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. VII. Anwendung von Anilin, Karbolsäure und Pyridin zur Färbung lipoidreicher Gebilde. Beiträge zur Theorie der Bakterien- und Plastosomenfärbung. Z. Zellf. Bd. 27, S. 620—636. —, 3 9. Untersuchungen mit nicht wäßrigen Flüssigkeiten. VIII. Darstellung der Neurogliafasern. Z. Zellf. Bd. 29, S. 553—561. —, 4 0 a. Zur Theorie der histologischen Silberschwärzung. I. Gliazellendarstellung. Z. Zellf. Bd. 30, S. 529—547. —, 4 0 b. Zur Theorie der histologischen Silberschwärzung. II. Neurofibrillendarstellung. Z. Zellf. Bd. 30, S. 548—566. S e l i g m a n n , S., 9 9. Die mikroskopischen Untersuchungsmethoden des Auges. S e 1 1 e , R. M„ 2 2. Changes in the Vaginal Epithelium of the Guinea-Pig during thp Oejtrous Cycle. Am. Journ. Anat. Bd. 30, S. 429—449. S e r e n i , 0 4. Bull. Acad. Meo. Roma. Anno 30, S. 131.

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S e v e r i n g h a u s , A., 3 2. A cytological technic for the study of the anterior lobe of the hypophysis. Anat. Ree. Bd. 53, S. 1—5. S h i p 1 e y , angegeben nach M c C l u n g , 3 7. S e y f a r t h , C., 2 7. Experimentelle und klinische Untersuchungen über die vitalf ä r b b a r e n Erythrocyten. Fol. haematol. Bd. 34, S. 7—38. S i e b e r , E., 3 6. Histochemischer Bleinachweis im Knochen. Naunyn-Schmiedeberg Arch. Bd. 181, S. 273—280. S i e d e n t o p f , H., 0 8. Über mikroskopische Beobachtungen bei Dunkelfeldbeleuchtung. Z. w. M. Bd. 25, S. 273—282. —, 0 9. Über ultramikroskopische Abbildung. Z. w. M. Bd. 26, S. 391—410. —, 1 2. Über ultramikroskopische Abbildung linearer Objekte. Z. w. M. Bd. 29, S. 1 bis 47. —•, 1 5. Über das Auflösungsvermögen der Mikroskope bei Hell- Und Dunkelfeldbeleuchtung. Z. w. M. Bd. 32, S. 1—42. —•, 2 4. Über farben-mikrostereoskopische Täuschungen und ihre Vermeidung. Z. w. M. Bd. 41, S. 16—24. S i h 1 e r , Chr. Über Muskelspindeln und intramuskuläre Nervenendigungen bei Schlangen u n d Fröschen. A. m. A. Bd. 46, S. 709—721. S i k o r a , H., 16. Beiträge zur Anatomie, Physiologie und Biologie der Kleiderlaus. Arch. Schiffs- und Tropenhyg. Bd. 20. Beitr. 1. S j ö b r i n g , U., 0 0. Über das Formol als Fixierungsflüssigkeit. An. An. Bd. 17, S. 273—304. S j ö v a 11, E., 0 5. Über Spinalganglienzellen und Markscheiden. Zugleich ein Versuch, die Wirkungsweise der Osmiumsäure zu analysieren. Anat. H. Bd. 30, S. 259—392. S k r a u p , S., 16. Über Vitalfärbung mit einfachsten Farbstoffen u n d ihre Fixierung. Ber. deutsch, ehem. Ges. Bd. 49, S. 2142—2154. —, 17. Ü b e r ' V i t a l f ä r b u n g mit einfachsten Farbstoffen und ihre Fixierung. Sitz.-Ber. physik.-med. Ges. Würzburg. 9—16. S k r o b a n s k y , 0 4. Eine Methode der nachträglichen F ä r b u n g mit Bleu de Lyon und Pikrinsäure. Int. Mon. Anat. Physiol. Bd. 21, S. 21—22. S 1 o m i n s k i , P., 2 7. Über die Darstellung winziger Blutgefäße mittels der Benzidinprobe. Z. w. M. Bd. 44, S. 1—8. — u n d J. L a p i n s k i , 3 2. Zur Methodik des histochemischen Nachweises von H ä m o globin und dessen Verbindungen. Z. Zellf. Bd. 16, S. 653—658. S m i t h , Lorrain, 0 6. Journ. Pathol. and Bacteriol. Bd. 5, S. 410. S n o o k , Th., 3 9. Preservation of trypan blue and neutral red within the cells of loose connective tissue. Stain Technol. Bd. 14, S. 139—142. S o b o 11 a , E., 9 5. Die Befruchtung und F u r c h u n g des Eies der Maus. A. m. A. Bd. 45, S. 15—93. S o 1 g e r , B., 8 9. Kohlensaurer Ammoniak, ein Mittel zur Darstellung des Sarkolemmas. Z. w. M. Bd. 6, S. 189. —, 9 6. Über den feineren Bau der Glandula submaxillaris des Menschen, mit besonderer Berücksichtigung der Drüsengranula. Festschr. 70. Geb. von Gegenbaur. Bd. 2, S. 179—248. S p a l t e h o l z , W., 0 4. Mikroskopie u n d Mikrochemie. Leipzig. —, 1 4. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. 2. Aufl. Leipzig. —, 2 2. Das Durchsichtigmachen als biologische Arbeitsmethode. Handb. der biol. Arbeitsmeth., her. von Abderhalden. Abt. 9, Teil 1 (Lief. 71). —, 2 7. Artikel »Verdauung, kunstliche«. Enz. mikr. Techn. 3. Aufl. Bd. 3, S. 2220 bis 2248. S p a n n e r , R., 25. Der Pfortaderkreislauf in der Vogelniere. Morphol. J a h r b u c h . Bd. 54, S. 560—632. —, 2 7. Die Bearbeitung des Celluloids zum Montieren makroskopischer Sammlungspräparate. An. An. Bd. 62, S. 227—235. —, 2 9. Der Bauchsympathicus der Blindschleiche und seine Beziehungen zur I n n e r vation der Niere. Z. Zellforschg. Bd. 8, S. 470. — , 3 1. Die Entwicklung der Darmzotten der Maus durch Knospung u n d Spaltung, untersucht a m Gefäßbaum. Morph. J a h r b . Bd. 67, S. 235—261. —, 3 7. Der Abkürzungskreislauf der Glandula submaxillaris. Z. Anat. Entw.g. Bd. 107, S. 124—153.

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S p a n n e r , R., 38. Die Kleisterinjektion, ihre praktische Anwendung und Verbesserung für Aufhellungspräparate. An. An. Bd. 85, S. 299—304. S p a t z , H., 1 8. Beiträge zur normalen Histologie des Rückenmarks des neugeborenen Kaninchens. Histol. und histopath. Arb. her. von Nißl. Bd. 6, S. 477—604. —, 2 2. Über den Eisennachweis im Gehirn, besonders in Zentren des extrapyramidalmotorischen Systems, 1. T., Z. ges. Neur. Bd. 77, S. 261—390. —, 2 3. Versuche zur Nutzbarmachung der Goldmannschen Vitalfarbstoffe für die Pathologie des Zentralnervensystems. Z. f. Psych, u. Physiol. d. Sinnesorgane. Bd. 80, S. 285—288. —, 2 3 a. Uber Säurebildung bei Formolfixierung. Verh. path. Ges., 19. Tagung, S. 222 bis 227. —, 2 3 b. Zur anatomischen Schnelldiagnose der progressiven Paralyse. Zbl. Path. Bd. 33, S. 313—320. —, 2 4. Untersuchungen über Stoffspeicherung und Stofftransport im Nervensystem. Z. f. ges. Neur. u. Psych. Bd. 89, S. 130—137. —, 3 3. Die Bedeutung der vitalen Färbung für die Lehre vom Stoifaustausch zwischen dem Zentralnervensystem und dem übrigen Körper. A. f. Psychiatr. Bd. 101, S. 267—358. S p e e , Graf F., 8 5. Leichtes Verfahren zur Erhaltung linear geordneter lückenloser Schnittserien mit Hilfe von Schnittbändern. Z. w. M. Bd. 2, S. 7—12. —, 8 7. Über die ersten Vorgänge der Ablagerung des Zahnschmelzes. An. An. Bd. 2, S. 89—92. S p e m a n n , H., 18. Über die Determination der ersten Organanlagen des Amphibienembryo. A. Entw. mech. Bd. 43, S. 448—555. —, 2 1. Mikrochirurgie in Handb. bioch. Arbeitsmeth. her. von Abderhalden. Abt. V, 3a (Lief. 18). —, 4 2. Uber das Verhalten embryonalen Gewebes im erwachsenen Organismus. Roux Arch. Bd. 141, S. 704, Anm. S p i e g e 1, L., 0 7. Zur Kenntnis der Weigertschen Elastinfarbstoffe. Virch. A. Bd. 189, S. 17—21. S p i e l m e y e r , W., 3 0. Technik der mikroskopischen Untersuchung des Nervensystems. 168 S. 4. Aufl. Berlin, Springer. S p r i n g f e 1 d , H., 3 5. Zur Technik der Zelloidin-Schnittserien. Z. w. M. Bd. 52, S. 175—176. S p u l e r , A., 2 6. Artikel »Cochenille« in Enzyklop. d. mikr. Techn. 3. Aufl. Bd. 1, S. 394—398. —, 2 7. Artikel »Sublimat«. Enüykl. d. mikrosk. Technik. I. Aufl. Bd. 3, S. 2124—2135. S s o b o l e w , L. W., 9 9. Zur Technik der Safraninfärbung. Z. w. M. Bd. 16, S. 196 bis 220. S t a d e , G. und H. S t a u d e , 39. Mikrophotographie. VI und 202 S. Leipzig. Akad. Verl.ges. S t a d t m ü l l e r , Fr., 2 1. Historische Darstellung zur Deutung des Wesens der Silbermethode an nicht fixierten Objekten usw. Anat. H. Bd. 59, S. 77—210. S t a r k e , J., 9 5. Uber Fettgranula und eine neue Eigenschaft des Osmiumtetraoxydes. A. Anat. Physiol. Abt., S. 70—79. S t e c k e l m a c h e r , S., 18. Versuche mit vitaler Doppelfärbung. Frankf. Z. Pathol. Bd. 21, S. 1—25. S t e p p e s , 18. Rationelle Meerschweinchenzucht. Berlin. S t e r n , J. B., 30. Neue Goldimprägnationsmethode zur Darstellung der Markscheiden, insbesondere der feineren Markfasern der Groß- und Kleinhirnrinde (an Celloidinserienschnitten anwendbare Methode). Z. w. M. Bd. 50, S. 205—208. -—, 3 2. Neue Silberimprägnationsversuche zur Darstellung der Mikro- und Oligodendroglia (an Celloidinserienschnitten anwendbare Methode). Z. ges. Neur. Bd. 183. —, 3 3. Neue Goldimprägnationsversuche zur Darstellung der Makroglia an Celloidinserienschnitten anwendbare Methode. Z. w. M. Bd. 50, S. 189—205. S t e r n , S., 05. Über Sehpurpurfixation. Arch. Ophth. Bd. 61, S. 561—563. S t i e v e , H., 13. Zur Oogenese des Haushuhnes. Sitz. Ges. Morph. Phys. München. —, 1 8. Über experimentell, durch veränderte äußere Bedingungen erzeugte Rückbildvingsvorgänge am Eierstock des Haushuhnes. A. Ent. Mech. Bd. 44, S. 530—588. —, 1 8. Die Entwicklung der Eierstockeier der Dohle. A. m. A. Bd. 92, II, S. 137—288. —, 1 8. Die Spermatogenese des Grottenolmes. An. An. Bd. 51, S. 321—349.

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S t i e v e , H., 1 9. Das Verhältnis der Zwischenzellen zum generativen Anteil im Hoden der Dohle. Arch. f. Entw.-Mech. Bd. 45, S. 455. —, 2 0 , 2 1. Die Entwicklung der Keimzellen des Grottenolmes 1. u. 2. Teil. A. m. A. Bd. 93 u n d 95. —, 2 3. Untersuchungen über die Wechselbeziehungen zwischen Gesamtkörper und Keimdrüsen. 2. Beobachtungen und Versuche an männlichen Feldmäusen. A. m. A. und Entw. Mech. Bd. 99, S. 390—570. —, 2 6. Die regelmäßigen Veränderungen der Muskulatur u n d des Bindegewebes der menschlichen Gebärmutter in ihrer Abhängigkeit von der Follikelreife u n d der Ausbildung eines gelben Körpers, nebst Beschreibung eines menschlichen Eies im Zustand der ersten Keifeteilung. Z. mikr.-anat. F. Bd. 6, S. 351—397. —, 2 7. Der Halsteil der menschlichen Gebärmutter, seine Veränderungen während der Schwangerschaft, der Geburt und des Wochenbettes u n d ihre Bedeutung. Z. mikr.-anat. F. Bd. 11, S. 291—441. —, 2 9. Muskulatur und Bindegewebe in der Wand der menschlichen Gebärmutter außerhalb und während der Schwangerschaft, w ä h r e n d der Geburt und des Wochenbettes. Z. mikr.-anat. F. Bd. 17, S. 371—518. S t i n z i n g . R., 9 9. Zur S t r u k t u r der Magenschleimhaut. Festschrift f ü r v. Kupffer, S. 53—56. S t o c k a r d , C. R. und P a p a n i c o l a o u , G. N., 17. Existence of a typical oestrous cycle in the guinea pig with a study of its histological and physioloical changes. Am. Journ. Anat. Bd. 22. S t ö c k 1 i . A., 2 3. Beobachtungen über die Entwicklungsvorgänge am Rumpfskelett des Schweines. Morph. J a h r b . Bd. 52, S. 153—196. S t ö h r , Ph. d. Ä., 9 4 und 9 8. Lehrbuch der Histologie 6. Aufl. 1894 und 8. Aufl. 1898. 17. Aufl. 1918 von O. Schultze, Jena, G. Fischer, 20. Aufl. 1924 von W. v. Möllendorff. S t ö h r , Ph. d. J., 2 1. O. Schultzes Natronlauge-Silbermethode zur Darstellung der Achsenzylinder und Nervenzellen. An. An. Bd. 54, S. 529—537. —, 2 2. Über die Innervation der Pia Mater u n d des Plexus choriodeus des Menschen. Z. Anat. Entw.g. Bd. 63, S. 562—607. —, 3 0. Mikroskopische Studien zur Innervation des Magen-Darmkanales. Z. Zellf. Bd. 12, S. 66—154. —, 3 9. Über »Nebenzellen« u n d deren Innervation in Ganglien des vegetativen Nervensystems, zugleich ein Beitrag zur Synapsenfrage. Z. Zellf. Bd 29, S. 569—612. S t ö l t z n e r . Helene, 0 6. Der Einfluß der Fixierung auf das Volumen der Organe. Z. w. M. Bd. 23. S. 14—25. S t ö l t z n e r . W., 05. Über Metallfarben im verkalkten Gewebe. Virch. A. Bd. 180. S t r a s s e r , H., 8 6. Über das Studium der Schnittserien u n d über die Hilfsmittel, welche die Rekonstruktion der zerlegten Form erleichtern. Z. w. M. Bd. 3, S. 179 bis 195. —, 8 7. Über die Methoden der plastischen Rekonstruktion Z. w. M. Bd. 4, S. 168—208 u. S. 330—339. S t r a s s m a n n , R., 0 9. Beitrag zur Technik der Oxydasereaktion an Gewebsschnitten. Z. allg. Path. Bd. 20, S. 577—579. S t r a u b , J., 4 3. Chromosomenstruktur. Naturw. 31. Jahrg., S. 97 ff. S t r a u b , W., 2 0. Das Problem der physiologischen Salzlösung in Theorie und Praxis. Münch. Med. Woch. 67. Jahrg., S. 249—251. S t r a u s s , A., 3 2. Über die Bleichung des Melanins. Z. w. M. Bd. 49, S. 123—125. S t r u g g e r , S., 3 8. Die Vitalfärbung des Protoplasmas mit Rhodamin B und 6 G. Protopl. Bd. 30, S. 85—100. —, 4 0. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen über die A u f n a h m e u n d Speicherung des Akridinorange durch lebende und tote Pflanzenzellen. Jen. Z. f. Naturw. Bd. 73, S. 97—134. S t u d n i c k a , F. K., 0 6/0 7. Über die Anwendung von Bielschowsky zur I m p r ä g nation von Bindegewebsfibrillen im Knochen, Dentin- u n d Hyalinknorpel. Z. w. M. Bd. 23. —, 3 3. Über die S t r u k t u r des frischen Glaskörpers. An. An. Bd. 76, S. 28—32. — 3 8. Ein Gefäß zum F ä r b e n von auf Glas aufgeklebten Mikrotomschnitten. Z. w. M. Bd. 55, S. 43—44. S t ü b e 1, H., 2 1. Der mikrochemische Nachweis von Harnstoff in der Niere mittels Xanthydrol. An. An. Bd. 54, S. 236—239.

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S t ü 1 e r , 2 3. Der biochemische Nachweis der reduzierenden Kohlehydrate. Zbl. Path. Bd. 33, S. 89—97. S t u r m a n n , F. J., 15. Die Herstellung und F ä r b u n g von Serienpräparaten der Gehirne kleiner Tiere. Z. w. M. Bd. 32, S. 152—159. S u z u k i , T., 12. Zur Morphologie der Nierensekretion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. G. Fischer, Jena. S w a n k , R. L. and H. A. D a v e n p o r t , 3 4. Marchis staining method: Studies of some of the underlying mechanism involved. Stain Techn. Bd. 9, S. 11—19. S z a t m a r i , A., 3 6. Über eine Modifikation der Gros-Schultzeschen Imprägnation. Z. Zellf. Bd. 24, S. 239—240. S z e n t - G y ö r g y i , A . , 14. Die histologische Darstellung des Glaskörpers. Z. w. M. Bd. 31, S. 23—35. S z o m b a t h y , K., 17. Neue Methode zum Aufkleben von Paraffinschnitten. Z. w. M. Bd. 34, S. 334—336. S z ü t s , A. v., 14. Eine neue Hämatoxylinlösung. Z. w. M. Bd. 31, S. 17—18. T a g u c h i , K., 3 8. Uber kalte" Injektion mit japanischer Tusche. A. m. A. Bd. 31, S. 565—567. T a l a j e w , 2 4. Zur Technik der Anfertigung der pathologisch-anatomischen Plattenpräparate. Zbl. Path. S. 281. T a n d l e r , J., 0 1. Mikroskopische Injektionen mit kaltflüssiger Gelatine. Z. w. M. Bd. 18. —, 2 4. Konservierung von Plattenmodellen durch Verkupfern. An. An. Bd. 58, S. 123 bis 124. —, 2 6. Über die Konservierung anatomischer P r ä p a r a t e in Zucker. An. An. Bd. 60, S. 62—63. T a r t a k o w s k y , 0 3. Die Resorptionswege des Eisens beim Kaninchen. Pflüg. A. Bd. 100, S. 586—610. T a v a r e s d e S o u s a , A., 3 6 , 3 8. Sur la présence et la signification de cellules avec granulations tannophiles dans l'hypophyse cérébrale du boeuf. Fol. anat. Univ. Conimbr. Bd. 11, f e r n e r Bd. 13. T e h v e r , 3 6. Zur Darstellung der Knochenkanäle mittels Korrosionsmethode. Z. w. M. Bd. 53, S. 42—45. T e l l y e s n i c z k y , K. v., 9 8. Über die Fixierungs-(Härtungs-)Flüssigkeiten. A. m. A. Bd. 52, S. 202—247. — 0 2. Fixation im Lichte neuerer Forschungen. Erg. Anat. Bd. 11, S. 3—35. —, 0 2 a. Zur Kritik der Kernstrukturen. A. m. A. Bd. 60. S. 681—706. —, 0 5. Ruhekern u n d Mitose. A. m. A. Bd. 66, S. 367—433. —, 2 6. Artikel »Fixation« in der Enzyklop. d. mikr. Techn. 3. Aufl., Bd. 2, S. 750—785. T e r n i , T., 14. Condriosomi, idiozoma e formazioni periidiozomiche nella spermatogenesi degli Anfibii. A. Zellf. Bd. 12, S. 1—96. T h a l e r , H., 3 0/3 1. Die Bestimmung des Brechungsindex unter dem Mikroskop. Mikrokosmos. Bd. 24, S. 22. T h a y s s e n u n d H e s s , E., 15. Einige kritische Bemerkungen zur histochemischen Grundlage der Cholesterinsteatose. Zbl. Path.'Bd. 26, S. 433. T h i e s , 0 5. Wirkung der Radiumstrahlen auf verschiedene Gewebe und Organe. Mitt. aus d. Grenzgebiet. Med. u. Chir. Bd. 14. T h o m a , 9 4. Ein Apparat zum raschen Fixieren u n d Härten von Gewebsteilen. Z. w. M. Bd. 19, S. 333. T h o m è e , S., 2 8. Über Glasrekonstruktion. Z. w. M. Bd. 45, S. 356—373. T i 11 m a n s , H., 7 4. Beiträge zur Histologie der Gelenke. A. m. A. Bd. 10, S. 401—440. T i m m , Fr., 3 2. Zellmikrochemie der Schwermetallgifte. Habil.schrift Leipzig. —, 3 2. Neues zum Giftnachweis im Gewebe. D. Z. gerichtl. Med. Bd. 20, S. 582—588. —, 3 6. Der histochemische Nachweis des »normalen« Bleis in menschlichen H a r t geweben. Virch. A. Bd. 297, S. 502—508. T i r m a n n , J., 9 8. Einiges zur Frage der Hämocytolyse u n d Genese der Gallenfarbstoffbildung bei Vergiftungen. — Uber den Zerfall roter Blutkörperchen bei Diphtherie und akuter Leberatropie. Görbersdorffers Veröff., 2. Heft, S. 111. T ö r ö , E., 2 9. Uber enterochromaffine Zellen. Verh. Anat. Ges. 38. Versig. S. 49—57. T o n k o f f , 0 0. Die Entwicklung der Milz bei den Amnioten. A. m. A. Bd. 56, S. 392 bis 458. T o n u 11 i , E., 3 8. Ergebnisse histochemischer Vitamin-C-Untersuchungen. Protopl. Bd. 31, S. 151—158.

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T o n u t t i , E., 4 0. Die Vitamin-C-Darstellung im Gewebe u n d ihre Bedeutung zur funktionellen Analyse von Histosystemen. Z. mikr. anat. F. Bd. 48, S. 1—53. — und E. P l a t e , 38. Über das Vitamin C in der menschlichen Placenta. A. Gynäk. Bd. 164, S. 385—397. T r e t j a k o f f , D. und C h i n k u s , F., 2 7. Das Knochengewebe der Fische. Z. Anat. Entw.gesch. Bd. 83, S. 363—396. T r e u t i e r , K., 3 l.'Über das w a h r e Alter junger menschlicher Embryonen. An. An. Bd. 71, S. 209—304. T r i e p e 1, H., 18. Über ein neues Modellierverfahren. Z. w. M. Bd. 35, S. 89—94. —, 2 0. Modellieren mit vereinfachten Richtzeichen. Z. w. M. Bd. 37, S. 288—292. T s c h a s c h i n , S., 13. Über die ruhenden »Wanderzellen« u n d ihre Beziehungen zu den anderen Zellformen des Bindegewebes und zu den Lymphocyten. Fol. haem. Bd. 17, S. 317—397. T s c h o p p , E., 2 9. Die Lokalisation anorganischer Substanzen in den Geweben Spodographie); in Handb. d. mikr. Anat. (hrsg. von v. Möllendorff), Bd. 1, S. 569—600. T s i m i n a k i s , Y., 2 8. Methodisches zur Darstellung der Ganglienzellen an gechromtem Material. Z. w. M. Bd. 45, S. 50. T s u - Z o n g - Y u n g , 2 3. Le rhythme vaginal chez la lapine et ses relations avec le cycle oestrien de l'ovaire. C. R. Soc. Biol. Paris. Bd. 89, S. 1107—1109. U k a i , S., 2 3. Beiträge zur Kenntnis der •"'-Granula in den peripherischen Nervenfasern. Mitt. über allg. Pathol. und pathol. Anat. Universität Sendai, J a p a n . 2. Bd., S. 65—105. U n d r i t z , E., 3 7. Die Brauchbarkeit der »Granulofilocytenfärbung im Trockenpräparat« nach Hirschfeld. Fol. Haemat. Bd. 56, S. 185—188. U n n a , P. G., 91. Notiz, betreffend die Tänzersche Orceinfärbung des elastischen Gewebes. Mon. prakt. Dermat. Bd. 12, S. 394—396. —, 9 1. Über die Reifung unserer Farbstoffe. Z. w. M. Bd. 8, S. 475—487. —, 9 4. Die Färbung der Epithelfasern. Monatsh. Prakt. Derm. Bd. 19, S. 1—10. —, 9 4. Elastin und Elacin. Monatsh. Prakt. Derm. Bd. 19, S. 397-402. —, 9 8. Der Nachweis des Fettes in der H a u t durch sekundäre Osmierung. Mon. prakt. Dermat. Bd. 26, S. 601—613. —, 10. Plasmazellen. Enzykl. mikr. Technik. 2. Aufl., p. 744. —, 10 a. Histotechnik der leprösen Haut. Hamburg-Leipzig. —, 2 8. Histochemie der Haut. 163 S. Leipzig-Wien. — und G a n s , O., 14. Zur Chemie der Zelle IV. Die Nissl-Körper. Berl. Klin. Woch. Nr. 10. •— u n d P. U n n a , 2 9. P. G. Unnas Färbemethoden in Handb. d. H a u t - und Geschlechtskrankh. I. Bd., 2. Teil, S. 575—658. Berlin. U o t i 1 a , N. und V. J ä ä s k e l a i n e n , 3 7. Über die Schwankungen der Schilddrüsenfunktion, gedeutet mit Hilfe der Schnittveraschungsmethode. Acta Soc. Med. fenn. Bd. 20, S. 1. U y a m a , Y., 2 6. Untersuchungen über die Verbreitung der Neurofibrillen in der Netzhaut bei den Wirbeltieren. Fol. anat. jap. Bd. 4, S. 389—410. V a s t a r i n i - C r e s i , 15. Chiasma gustativo nella lingua dell'uomo e di alcuni mammiferi. Int. Mon. Anat. Physiol. Bd. 31, S. 380—410. V e h , R. v., 3 2. Eine vereinfachte Schneidemethode zur Herstellung von Schnittbändern aus Paraffinblöcken und ein dieselbe ermöglichender Hilfsapparat. Z. w. M. Bd. 49, S. 451—454. V e i t , O., 32. Zur Konservierung von Wachsplattenmodellen. An. An. Bd. 73, S. 416. V e r h o e f f , F. H., 2 6. Some improvements in histological te'chnique. Contrib. to ophth. science, Jackson birthday-Bd. S. 47—51. V e r n e , J., 26. Les pigments dans l'organisme animal. Encycl. scientif. Paris Doin. —, 2 8. Recherches sur la réaction de Schiff en histochimie. C. R. Assoc. Anat. Bd. 23, 465—470. —-, 2 9. Étude histochimique des substances aldéhydiques formées au cours du métabolisme des corps gras. Ann. de Physiol. Bd. 5, S. 245—267. —•, 3 6. Observations histochimiques sur l'oxydation des lipides et ses rapports avec les caroténoides. Bull. Hist. appl. Bd. 13, S. 4 3 3 ^ 4 0 . V e r o c a y , J., 0 8. Beseitigung der »Formolniederschläge« aus mikroskopischen Schnitten. Zbl. Path. Bd. 19, H. 19. —, 0 8. Über ein neues Verfahren zur F ä r b u n g des Bindegewebes. Verh. Ges. D. Naturf. u. Ärzte. 80. Ver., Cöln II, 2, S. 52—55.

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V e r s e , 12. Über die Cholesterinverfettung. Ziegl. Beitr. Bd. 52, S. 1 ff. V e t t e r , H., 23. Über Gewebekulturen und Vitalfärbung. Dissert. Zürich. 1—50. V i h v e l i n , H., 3 2. Über die Muskelspindeln der Amphibien. Z. Zellf.Bd. 16, S. 597 bis 607. V i m t r u p , Bj., 2 2. Beiträge zur Anatomie der Kapillaren. 1. Über kontraktile Elemente in der Gefäßwand der Blutkapillaren. Z. Anat. Entw.g. Bd. 65, S. 150—182. —, 2 3. Desgl. 2. Weitere' Untersuchungen über kontraktile Elemente in der Gefäßwand der Blutkapillaren. Z. Anat. Entw.g. Bd. 68, S. 469—482. V i r c h o w , H., 8 5. Über die Einwirkung des Lichtes auf Gemische von chromsauren Salzen, Alkohol und extrahierten organischen Substanzen. A. m. A. Bd. 24, S. 117 bis 119. V o g t , A., 30. Lehrbuch und Atlas der Spaltlampenmikroskopie des lebenden Auges. Berlin. —, W., 2 5. Gestaltungsanalyse am Amphibienkeim mit örtlicher Vitalfärbung. 1. A. Entw.-Mech. Bd. 106, S. 542—610. V o 1 k m a n n , R. v., 2 9. Uber zwei Knorpel- und Knochenfärbungen mittels modifizierten Eisenhämatoxylins. Z. w. M. Bd. 46, S. 385—390. —, 3 2. Die Vermeidung von Alkohol beim Einschluß mikroskopischer Präparate in Balsam. Z. w. M. Bd. 49, S. 456. —, 3 2. Über elektive Darstellung des Abnutzungspigmentes und seiner Vorstufen mittels Anilinfarben. Z. w. M. Bd. 49, S. 457—460. — und F. S t r a u ß , 3 4. Ein Ersatz für die Hornowskysche Kombination zur Darstellung von Elastin, Muskulatur und Kollagen auf der Basis der Azanmethode Z. w. M. Bd. 51, S. 244—249. V o l t e f r a , M., 2 3. II metodo del Del Rio Hortega per il tessuto connettivo reticolare ed una sua utile modificazione. Monit. Zool. Ital. Bd. 34. V o n w i l l e r , P., 18. Uber den Bau des Plasmas der niedersten Tiere. —, 2 3. Uber Vitalfärbung am Menschen. Verh. d. anat. Ges. A. A. Bd. 57. Ergänzungsheft. S. 164—166. —•, 2 1. Intravitale Färbung von Protozoen. In Handb. der biol. Arbeitsmethoden, her. von Abderhalden. Abt. 5, Teil 2, Lief. 21. —, 2 5. Neue Wege der Gewerbelehre. II. Histolog. Untersuchungen mittels der Mikroskopie im auffallenden Licht. Z. Anat. Entw.g. Bd. 76, S. 497—533. Ferner 24. Z. w. M. 41. —, 2 7. Neue Wege der Gewebelehre. III. Experimentelle Histologie. Z. Anat. Entw.g. Bd. 84, S. 476—510. —. 2 8. Vitalfärbung; in Methoden d. wiss. Biol., hrsg. von Peterfi, Bd. 1, S. 475—487. —. 3 2. Über den heutigen Stand der Mikroskopie im auffallenden Licht. Z. w M. Bd. 49, S. 289—304. — und R. A l t e m a n n , 2 9. Vital-anatomische Untersuchungen an der lebenden Kaninchenniere. Bruns Beitr. Bd. 149, S. 227—247. — und L o w , W., 2 6. Das Kreisschnittmikrotom und die Mikrotomie regelmäßig gewölbter, zylinder-, kegelmantel- und kugelschalenförmiger Körper. Z. w. M. Bd. 43, S. 215—233. —, L ö w und S c h i l l i n g , 3 0. Über die Mikrotomie des menschlichen Knochengewebes. Z. w. M. Bd. 47, S. 47—57. — und V a n n o t t i , 2 9. Die Capillaroskopie mit starken Vergrößerungen. Handb d. biol. Arb.-Meth., Abt. V, Teil II, S. 1529—1562. — — •—,3 1. Neue Wege der Gewebelehre. IV. Die Karyoskopie an lebenden Pflanzen, lebenden Tieren und am lebenden Menschen nebst Beiträgen zur Lymphangioskopie. Z. Anat. Entwg. Bd. 95, -S. 512—530. V o ß , H., 2 3. Die Verwendung des Tetralins in- der mikroskopischen Technik. An. An. Bd. 56, S. 368—371. —, 2 4. Die Herstellung makroskopischer Präparate von den Lymphfollikeln des menschlichen Darmes. Z. Anat. Entw.g. Bd. 70, S. 317—320. —, 2 6. Kernfärbung im Stück mit der Nuclealreaktion. Z. w. M. Bd. 43. S. 115. —, 2 7. Beobachtungen über das Vorkommen der Plasmalfärbung. Z. f. mikr.-anat. F. Bd. 10, S. 583—601. —, 4 0. Vergleichende histotopochemische Untersuchungen über das Verhalten der Nebenniere zur Piasmaireaktion. Z. Zellf. Bd. 31, S. 43—53. W a c h e n f e l d t , S. v., 25. Ein neues Modellierwerkzeug für Wachsrekonstruktionen. Z. w. M. Bd. 42, S. 441.

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W a d a , B., 3 8. Experimentelle Untersuchungen lebender Zellen in der Teilung. I. Cytologia (Tokyo) Bd. 9, S. 97—109; II. Ebd. S. 110—119; III. Ebd. S. 4 6 0 ^ 7 9 ; V. Cytologia Fujii Festschr. S. 785—795. W a l l , 22. Uber die Sekretion der Schilddrüse. Virch. A. Bd. 240, S. 290—300. W a 1 d e y e r , W., 8 2. Untersuchungen über die Histogenese der Horngebilde, insbesondere der Haare und Federn. Beiträge zur Anat. u. Embryol. als Festgabe f ü r J. Henle, Bonn. W a 11 a r t , J., 0 6. Über gleichzeitige Darstellung von Fettkörnern, eisenhaltigem Pigment und Zellkernen in Gefrierschnitten. Münch, med. Woch. 45. —, 3 5. Une modification de la méthode argentique de Bielschowsky pour organes riches en lipoides. Bull. Histol. appl. Bd. 12, S. 254—256. — und H o u e 11 e , Ch., 3 0. Eine rasche Dreifachfärbung durch Abänderung der Massonschen Trichrommethode. An. Anz. Bd. 69, S. 43—46. — , 3 4. Une coloration trichromique rapide à l'Hematoxyline, la Fuchsine acide et le J a u n e solide. Bull. Hist. appl. Bd. 10, S. 404—407. W a 11 r a f f , J., 3 9. Beitrag zur Morphologie und Morphogenese der Hypophysenzellen des erwachsenen Menschen. Z. mikr.-anat. F. Bd. 45, S. 631—667. —, 4 2. Histochemische Untersuchungen am Nervensystem des erwachsenen Menschen mit der Piasmalreaktion. 1. Peripheres Nervensystem. Z. mikr.-anat. F. Bd. 51, S. 206—229. — und M. B e d n a r a - S c h ö b e r , 4 3. Vergleichende Untersuchungen über die Darstellbarkeit des Leberglykogens nach Best und nach Bauer. Z. mikr.-anat. F. Bd. 53, S. 102—121. W ,a 1 s e m , G. C. van, 9 4. Beitrag zur Technik des Schneidens und der weiteren Behandlung der Paraffinschnittbänder. Z. w. M. Bd. 11, S. 207—236. —, 1 6. Die Thermoregulierung beim Paraffinbänderschneiden. Z. w. M. Bd. 33, S. 26 bis 29. —, 2 5 a. Praktische Notizen aus dem mikroskopischen Laboratorium. No. 15. Die Reinigung der Objektträger. Z. w. M. Bd. 42, S. 438. —, 3 2. Praktische Notizen aus dem mikroskopischen Laboratorium. No. 73. Uber die oligodynamische Wirkung gewisser schwerer Metalle und deren Verwertung in der Mikroskopie. Z. w. M. Bd. 49, S. 469. W a l t e r , K., 1 7. Sind die Sommerzellen in der Nebenniere des Frosches acidophil? A. m. A. Bd. 89, S. 245—247. W a l t e r , L., 29. Neuartige Anwendung des Pasinischen Farbengemisches zur feineren Untersuchung des Bindegewebes. Z. w. M. Bd. 46, S. 457—464. —, 3 0. Nachtrag zu meiner Mitteilung über eine Modifikation der Pasinischen Bindegewebsfärbung. Z. w. M. Bd. 47, S. 346. W a l z , K., 20. Über pathologisch-histologische Momentdiagnose. Zbl. Path. Bd. 30, S. 442. W a n k e 11, Fr., 2 1. Über Reduktion basischer Farbstoffe im lebenden Protoplasma. Ber. Naturf. Ges. Freiburg i. Br. Bd. 23. W a r t h i n , 2 4. Journ. of laborat. and clinic. med. Bd. 9, S. 554—561. W a s s e r m a n n , Fr., 2 1. Celloidin-Paraffin-Einbettung kleiner Objekte. Z. w. M. Bd. 38, S. 67—70. W a t a n a b e , 2 5. Studien über Flimmerbewegung, gleichzeitig eine neue Paraffineinbettungsmethode. Z. Anat. Entw.g. Bd. 75, S. 733—759. W a t e r m a n , H. C., 3 9. The préparation of hardened embedding paraffins having low melting points. Stain Technol. Bd. 14, S. 55—62. W e i d e n r e i c h , Fr., 0 5. Studien über das Blut und die blutbildenden und -zerstörenden Organe. II. Bau und morphologische Stellung der Blutlymphdrüsen. A. m. A. Bd. 65, S. 1—77. —, 0 6. Weitere Mitteilungen über rote Blutkörperchen. A. m. A. Bd. 69, S. 389—43Ö. —•, 0 8. Beiträge zur Kenntnis der granulierten Leukocyten. A. m. A. Bd. 72, S. 209 bis 326 —, 2 3. Knochenstudien. 1. Über Aufbau und Entwicklung des Knochens und den Charakter des Knochengewebes. Z. Anat. Entw.g. Bd. 69, S. 382—466. —, 2 5. Über den Bau und die Entwicklung des Zahnbeins in der Reihe der Wirbeltiere. Z. Anat. Entw.g. Bd. 76, S. 218—260. —, 2 6. Über den Schmelz der Wirbeltiere und seine Beziehungen zum Zahnbein. Z. f. Anat. Entw.g. Bd. 79, S. 292—351.

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W e i d e n r e i c h , Fr., 2 6. Ein Färbeglas mit Glasfilterboden f ü r wasserfrei zu haltende Reagentien. Z. w. M. Bd. 43, H. 4, S. 511—512. W e i g e r t , C., 78. Bismarckbraun als Färbemittel. A. m. A. Bd. 15. —•, 8 5. Uber Schnittserien von Celloidinpräparaten des Zentralnervensystems zum Zwecke der Markscheidenfärbung. Z. w. M. Bd. 2, S. 490—495. —, 8 6. Über Aufhellung der Schnittserien aus Celloidinpräparaten. Ges. Abh. Bd. II, S. 562. —',9 1. Zur Markscheidenfärbung. Deutsche med. Woch. Nr. 42, S. 9. —, 9 4. Technik. Erg. Anat. Entw. Bd. 3, S. 1—23. —, 9 5. Beiträge zur Kenntnis der normalen menschlichen Neuroglia. Festschrift 50jähr. Jub. ärztl. Ver. zu F r a n k f u r t a. M. —, 9 6. Die G o 1 g l sehe Methode. Erg. Anat. Entw. Bd. 5, S. 7—29. —, 9 7. Die Markscheidenfärbung. Erg. Anat. Entw. Bd. 6, S. 3—25. —, 9 8. Die M a r c h i sehe Methode. Erg. Anat. Entw. Bd. 7, S. 3—8. —, 9 8. 'Über eine Methode zur F ä r b u n g elastischer Fasern. Zbl. Path. Bd. 9, S. 289 bis 292. —, 0 4. Eine kleine Verbesserung der Hämatoxylin-v a n G i e s o n - Methode. Z. w. M. Bd. 21. W e i 1, A., 3 0. The influence of formalin fixation on the lipoids of the central nervous system. Journ. Biol. Chem .Bd. 83, S. 601—609. W e i 11 , P., 19. Uber die leukocytären Elemente der Darmschleimhaut der Säugetiere. A. m. A. Bd. 93, I, S. 1—81. W e i s e , W., 3 3 , 34. Über die Giemsafärbung mit gepuffertem Wasser. A. f. Schiffsu n d Tropenhygiene. Bd. 37, S. 327—337 und Bd. 38, S. 210. W e i ß , E., 15. Beobachtung und mikrophotographische Darstellung der Hautkapillaren a m lebenden Menschen. D. A. klin. Med. Bd. 119. —, 2 1. Methoden zur mikroskopischen Beobachtung und mikrophotographischen Darstellung der Oberflächenblutgefäße am lebenden Menschen, insbesondere der Kapillaren. In Handb. der biol. Arbeitsmethoden, her. von Abderhalden. Abt. 5, Teil 4, H. 1. Hier auch weitere Literatur. W e i ß , P., 30. Methodik der Messung kurzschenkliger Winkel an biologischen Objekten; in Handb. d. biol. Arb. meth. Abt. V, 2. H. 15, S. 1803—1814. W e i s s c h e d e l , E. und R. J u n g , 39. Die anatomische Auswertung und das Studium der sekundären Faserdegeneration nach lokalisierter subcorticaler Ausschaltung durch Elektrokoagulation. Z. Anat. Entw.g. Bd. 109, S. 374—395. W e l t m a n n , O., 13. Über das doppeltbrechende Lipoid der Nebenniere. Ziegl. Beitr. Bd. 56, S. 278—324. W e n t s c h e r , J., 9 8. Experimentelle Studien über das Eigenleben menschlicher Epidermiszellen außerhalb des Organismus. Ziegl. Beitr. Bd. 24, S. 101—162. —, 0 3. Das Verhalten der menschlichen Epidermismitosen in exstirpierten Hautstücken. Ziegl. Beitr. Bd. 34, S. 410—444. W e n t z l a f f , A., 2 4. Untersuchungen über die Vitalfärbung an Froschlungen. Z. Zellf. Bd. 1, S. 562—589. W e r m e 1, E., 2 7. Untersuchungen über die Kernsubstanzen und die Methoden ihrer Darstellung. I. Mitt. Über die Nuclealreaktion und die chromolytische Analyse. Z. Zellf. Bd. 5, S. 400—414. W e r n e c k e , F., 16. Die Pigmentierung der Farbenrassen von Mus musculus und ihre Beziehung zur Vererbung. A. E n t . Mech. Bd. 42, S. .72—106. W e r n e r , Cl. F., 32. Über Volumenveränderungen der Cupula terminalis im Ohrlabyrinth insbesondere durch Fixation, Entkalkung und Einbettung. Z. Zellf. Bd. 16, S. 471—483. —, 3 4. Über den Einfluß von Temperatur u n d Druck auf das Ergebnis der histologischen Fixation. Z. Zellf. Bd. 20, S. "(46—753. —, 3 4. Die postmortalen Veränderungen des Innenohres unter dem Einfluß der Temperatur. Z. Hals- usw. Heilk. Bd. 35, S. 564—580. —, 3 5. Der S ä u r e g r a d der Fixationslösung in Abhängigkeit vom fixierten Präparat. Z. w. M. Bd. 52, S. 406—418. —, 3 5 , 36. Die histologische Fixation des Innenohres. I. Teil. Z. Hals- usw. Heilk. Bd. 39, S. 125—135; II. Teil, Bd. 41, S. 15--43. —, 3 6. Die Dauer der Fixation. Z. w. M. Bd. 53, S. 440—442. —, 3 7. Über artifizielle Veränderungen des Innenohres und ihre Beziehungen zu den pathologischen Vorgängen. Mon. Ohrenheilk. usw. Bd. 71, S. 1017—1044.

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W e r z b e r g , A., 11. Studien zur vergleichenden Hämozytologie einiger poikilot h e r m e r Vertebraten mit besonderer Berücksichtigung der Thrombocyten. Fol. haem. Bd. 11, S. 17—193. W e s t b l a d , E., 2 4. Eine Methode zur Fixxierung und zum Einschluß mit Alizarin vitalgefärbter Objekte. Zool. Anz. Bd. 59, S. 219—223. W i c k 1 e i n , E., 9 1. Untersuchungen über den Pigmentgehalt der Milz bei verschiedenen physiol. u n d pathol. Zuständen. Virch. A. Bd. 124, S. 1. W i e n e r , A., 16. Beitrag zum mikrochemischen Nachweis des Eisens in der Pflanze, insbesondere des maskierten. Biochem. Z. Bd. 77, S. 27—50. W i e s e l , J., 02. Beiträge zur Anatomie u n d Entwicklung der menschlichen Nebenniere. Anat. Hefte. Bd. 19, S. 481. W i e s e r , W. v., 1 2. Ein Durchspülungsapparat zur Fixierung ganzer Tiere. Z. w. M. Bd. 29, S. 535—539. W i l d e r , H. C., 35. An irnproved technique for silver impregnation of reticulum flbers. Am. J. Path. Bd. II, S. 817—819. W i m m e r , K., 3 9. Die Stellung des Reticuloendothels im Vitaminstoffwechsel nach luminiszenzmikroskopischen Beobachtungen a m lebenden Tier. Verh. Anat. Ges. Erg. h. zu An. An. Bd. 88, S. 42—68. W i n i w a r t e r , H . v. und S a i n m o n t , G,, 08. E r f a h r u n g e n über die Flemmingsche Dreifärbung. Z. w. M. Bd. 25, S. 157—162. —, 2 3. Technique de la triplecoloration. Arch. de Biol. Bd. 33, S. 329—341. W i n k 1 e r , L. W., 0 5. Die Darstellung reinen Äthylalkohols. Ber. deutsch, ehem. Ges. Bd. 38, S. 3612. W i 11, O. N., 1 0. Färbung, Enzyklop. Mikr. Tech. 2. Aufl. Bd. 1, S. 412—429. W i t t m a a c k , 0 6. Zur histo-pathologischen Untersuchung des Gehörorgans usw. Zeitschrift f. Ohrenheilkunde. Bd. 51, S. 148. W o l f , J., 25. Über histologischen Zuckernachweis. Zbl. Path. Bd. 36, S. 12—15. —, 3 9. Die Rotationstrommel zur Beschleunigung der Durchtränkung der Objekte bei der Fixation u n d Einbettung. Z. w. M. Bd. 56, S. 65—67. —, .3 9. Die Glycerinmethode der Zelloidineinbettung. Z. w. M. Bd. 56, S. 57—62. —, 3 9. Uber die Herstellung mikroskopischer P r ä p a r a t e der Oberflächen verschiedener Objekte mit Hilfe der Adhäsionsmethode. Z. w. M. Bd. 56, S. 181—201. —, 3 9. Die innere S t r u k t u r der Zellen des S t r a t u m desquamans der menschlichen Epidermis. Z. mikr.-anat. F. Bd. 46, S. 170—202. —, 4 0. Das Oberflächenrelief der menschlichen Haut. Z. mikr.-anat. F. Bd. 47, S. 351 bis 400.. W o l f - H e i d e g g e r , G., 3 9. Die Anwendung von K a v a - K a v a bei der Fixierung des D ü n n d a r m s und anderer Hohlorgane. Z. w. M. Bd. 56, S. 417—452. W o 1 h y n s k i , Th., 2 8. Innervation des H e r z k a m m e r - und Vorhofseptums des K a l bes. Z. Anat. Entw.g. Bd. 86, S. 608—638. W o l t e r s , M., 9 0. Drei neue Methoden zur M a r k - und Achsenzylinderfärbung m i t tels Hämatoxylin. Z. w. M. Bd. 7, S. 466—473. W o r c e s t e r , zit. nach M c C l u n g , 3 7. W o r o b i e w , W., 2 5. Methodik der Untersuchungen von Nervenelementen des m a k r o - und makromikroskopischen Gebietes. Berlin. Kommissionsverlag von O. Rothacker. W o r o n i n , 9 8. Eine neue histologische Methode. Arbeiten aus d. therap. Klinik von P. M. Popoff, Moskau. (Russisch.) W y c h g r a m , E., 11. Über Mikrophotographie in natürlichen Farben. Z. w. M. Bd. 28, S. 174—182. Z a c h , O., 3 8. Die naturgemäße Zelloidineinbettung. Z. w. M. Bd. 55, S. 299—307. Z a c h a r i a s , E., 09. Die chemische Beschaffenheit von Protoplasma u n d Zellkern. Progr. rei botan. Bd. 3, S. 67. Z a r e t z k y , 10. Versuche über vitale Färbung des Embryo. Virch. A. Bd. 201. Z e i g e r , K., 28. Das Ausstrichverfahren mit gelatinierenden Farbstofflösungen, eine einfache Methode zur Anfertigung ungefärbter D a u e r p r ä p a r a t e von Spermien. Z. Anat. Entw.g. Bd. 85, S. 317—321. —, 3 0 a. Der Einfluß von Fixationsmitteln auf die Färbbarkeit histologischer Elemente. Z. Zellforschg. Bd. 10, S. 481—510. —•, 3 0 b. Zur F r a g e der Wirkungsweise des Formaldehyds bei der histologischen F i xation. Z. w. M. Bd. 47, S. 273—293. —, 3 5. Zum Problem der vitalen Struktur des Zellkerns. Z. Zellf. Bd. 22, S. 607—632.

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Z e i g e r , K., 36. Das Ladungsmosaik der Epidermis. Z. Zellf. 23, S. 431—441. —, 3 6. Kolloidhistologische Untersuchung an Epithelien. Z. Zellf. Bd. 24, S. 11—41. —, 3 6. Über Äquivalentbilder und Äquivalentwerte in der Elektrohistologie des fixierten Präparates. Z. w. M. Bd. 53, S. 279—294. —•, 3 7. Zur Methodik der Bestimmung des Umladebereiches histologischer Elemente im fixierten Zustand. Z. w. M. Bd. 54, S. 82—87. —•, 3 8. Physiko-chemische Grundlagen der histologischen Methodik. Dresden und Leipzig. —, 3 9. Liesegangs Diffusionshistologie. Kolloid-Z. Bd. 89, S. 115—124. — und S c h r e i b e r , H., 2 7. Das Querstreifungsbild des überlebenden Froschmuskels unter dem Einfluß differenter Neutralsalze. Z. Zellf. u. mikr. Anat. Bd. 4, S. 617—651. Z e 11 e r , H., 4 2. Der Einschluß in Glycerin. Z. w. M. Bd. 58, S. 314—320. Z e n k e r , K., 94. Chromkali-Sublimat-Eisessig als Fixierungsmittel. Münch, med. Woch. Jahrg. 41, p. 532—534. Z e t h r a e u s , S., 3 7. Modifikation der Schultz-Braunsschen Gefrierschnittmethode. Z. w. M. Bd. 54, S. 408—411. Z i e g 1 e r , H. E., 0 2. Lehrbuch der vergleichenden Entwicklungsgeschichte der niederen Wirbeltiere. Jena. Z i e g 1 e r , P., 9 9. Ein Beitrag zur Technik der histologischen Untersuchung des Knochens. Festschrift zum 70. Geburtstag von Kupffers, S. 49—52. Z i 11, R., 2 4. Die subepithelialen Hautdrüsen von Helix pomatia und einigen anderen Landgehäuseschnecken. Z. Anat. Entw.g. Bd. 71, S. 1—40. Z i l l i a c u s , W., 0 5. Utbredningen af skif och cylinderepithel i mäniskans struphufrud under olika äldrar. Helsingfors. Ref. von K o l s t e r : Ztbl. f. norm. Anat. u. Mikrotechn. Z i m m e r m a n n , A. 9 5. Das Mikroskop. Ein Leitfaden der wiss. Mikr. Leipzig und Wien. s. auch Metzner. Z i m m e r m a n n , K. W., 9 8. Beiträge zur Kenntnis einiger Drüsen und Epithelien. A. m. A. Bd. 52, S. 552—706. —, 2 3. Der feinere Bau der Blutkapillaren. Z. Anat. Entw.g. Bd. 68, S. 29—109. —, 2 5. Beitrag zur Kenntnis des Baues u. der Funktion der Fundusdrüsen im menschlichen Magen. Ergeb. Physiol. Bd. 24, S. 281—307. —, 2 7. Die Speicheldrüsen der Mundhöhle und die Bauchspeicheldrüse in Handb. d. mikr. Anat. her. von v. Möllendorff. Bd. 5, 1, S. 61—244. Z i r k l e , C., 28. The effects of hydrogen -ion concentration upon the fixation image of various salts of chromium. Protopl. Bd. 4, S. 201—227. —, 2 9. Fixation images with Chromates and acetates. Protopl. Bd. 5, S. 511—534. — , 3 3. Cytological fixation with the lower fatty acids, their compounds and derivations. Protopl. Bd. 18, S. 90—111. —, 3 4. Aldehydes as cytological fixatives. Protopl. Bd. 20, S. 169—170. Z ö b i s c h , C. G., 3 4. Anordnung und Verteilung der markhaltigen Nerven in einigen Oberschenkelmuskeln des Frosches. Morphol. Jahrb. Bd. 74, S. 515—549. Z o n d e k , B., 31. Die Hormone des Ovariums und des Hypophysenvorderlappens. 343 S. Berlin. J . Springer. — und A s c h h e i m , S., 2 6. Der Scheidenzyklus der weißen Maus als Testobjekt zum Nachweis des Ovarialhormones. Klin. Woch. 5. Jahrg., S. 979—985.

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R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

Autorenverzeichnis A b b e 31, 72, 82. Abrikosoff 2239. A c h a r d 1281. A c h ü c a r r o 1544. A d a m s 791, 793. A d d i s o n 1764. A d e r m a n 2244. A d r i o n 467, 477. A g d u h r 1792. A k a g i 1227. A k k e r i n g a 1793. A l b a c h 921. A l e x a n d e r 1614, 1967. A l e x a n d e r s o n 891. A l e x a n d r o v 921. Alfieri 1121. A l l a r a 1195. Allen E. 310, 311, 371, 373, 415, 942, 946, 2175, 2447. A l t m a n n 350, 427, 697, 964, 984 991 A l z h e i m e r 1758, 1844, 1877, 1879. A m a n n 809, 810. A m a n o 799. A m b r o n n 92, 1887. A n d e r s 662. A n i t s c h k o w 558, 568, 968. A o y a m a 1007, 1019, 1023. A p ä t h y v. 92, 192, 200, 330, 391, 416, 419, 422, 424, 442, 450, 453, 455, 456, 460, 463, 464, 467, 468, 482, 486, 498, 500, 511, 529, 546, 567, 667, 812, 872, 933, 1783, 1784. A r d e n n e v. 92, 491. A r i m a 2018. A r n d t , H. J . 1052, 1091, 1107. A r n d t , W. 386. A r n o l d , E. 1301, 2464. A r n o l d , J . 773, 787. A r t o m 2384. A s c h h e i m 2452. Aschoff 1031, 1419. A ß m a n n 1356. A u r e l l 852, 870. A v e r y 2455. A y n a u d 1281. B a b e s 694. B a b l i k 503. B a c s i c h 370, 1829. B a e c k e r 686, 2070. B a k e r 170.

B ä l i n t 1343, 1368. Ballowitz 1141, 1147, 1152, 2169, 2323. B a l t z e r 791, 794. B a n g 968, 980. B a n i e c k i 1037. B a r f u r t h 2412. B a r g m a n n 2239. B a r t a 122, 370. B a r t e l s 1989. B a t s o n 506. B a u e r , H. 1092, 1095, 1096, 1104, 1105, 1234, 1238, 1239, 2037. B a u e r , K. F. 167, 169, 173, 176, 184, 459, 1876. B a u - K i e n - T s i n g 2400. B a u m g a r t e n 719. B a u t z m a n n 2410, 2416. B e a m s 1005. B e c h e r , H. 1242, 1991. B e c h e r , S. 26, 606, 625, 731, 746, 949, 1583, 1626, 1629. Beck 63. B e c k e r , J. 274. B e c k e r , W. A. 754, 799, 921. B e c k e r t 1105. B e d n a r a - S c h ö b e r 1104. B e e l d s n y d e r 4. B e h n s e n 1738. Belaf 46, 328, 441, 912, 957, 2143, 2377, 2387, 2388. B e l l i n g 641, 927. B e n d a 296, 932, 942, 952, 970, 984, 996, 997, 1070, 1832. B e n d i e n 273. B e n e k e 1428, 2390. Bengtsson 905. B e n n h o l d 1575. Benninghoff 1721, 1959, 1960. B e n o i t 2209. B e n s l e y 973, 1248, 2224, 2227, 2228. B e n t s e n 1750. B e r b l i n g e r 2197. B e r g 201, 202, 283, 1238, 1249, 1250, 1251, 1254, 1539, 2088. Berge, B. S. t e n 389, 467, 471, 472, 518. B e r n a r d , C l a u d e 1096. B e r n a u e r 61. B e r n e r 887.

B e s t 1096,-1102. B e t h e 200, 320, 595, 1780, 1782, 1902, 1936, 1938, 1940. B e t t m a n n 149. Biasi Di 274. B i e d e r m a n n 1028, 1153,2012. Bielschowsky 1518, 1525, 1540, 1786, 1788, 1789, 1790, 1791, 1873, 1909, 1911. B j ö r k e n h e i m 1472, 1478. B i o n d i 721, 1844, 1882. Bito 1894. Bizzozero 937. B l o c h 1139, 1178, 1180. B l o c h m a n n 506, 539. B l o m 2244. Bloom 2230. Blotevogel 767, 1603. B l u m 202, 253, 265, 271. B o c k 1631. B o d i a n 1816, 1817, 1908. B ö d e c k e r 1662. Boegehold 12, 78. B ö h m A. A. 1999 2102, 2129, 2397. B ö h m e r 667, 1632. B ö h m i g 467, 470. B o e h m , G. 898a. B o e k e 1912, 2335, 2399. B o e m i n g h a u s 1Ö37, 1066. B o e n i g 894. B o e r n e r - P a t z e l t 1692, 1693. B o g g o m 1839. Bolcek 306. B o r b e r g 2212, 2213. B o r c h a r d t 1226. B o r e l l 770. B o r n 111, 538, 870, «78, 879, 880, 2404. B o r n s t e i n 779. B o r s t 76. B o u i n 305. B o u r n e 1186, 1188. B o v e r i 2378 2381. B o w e n 1006, 1014, 1026. Bozler 1214. B r a n d i n o 1228. B r a n d t , T h . 1442. B r a n d t , W. 1810. B r a s i l s. D u b o s c q - B r a s i l . B r a u n 1465. B r a u n m ü h l v. 1880. B r a u s 2103.

Autorenverzeichnis

§§

B r e m e r 1905. B r e ß l a u , E. 2167. B r e s s l a u 642. B r e t s c h n e i d e r 989, 1207. B r i n c k m a n n 1298. B r o d e r s e n 1576. Browicz 274. B r u c h 412. B r ü c k e 1690. B r u n s w i k 1080, 1081, 1253. B r u y n de 1044, 1382. B u b e n a i t e 1763, 1773. Bucher, O. 2235. B u c h e r , R. 1432. B u c h n e r , P. 2143, 2183, 2377. B ü c k l e r s 2310. B ü r k e r 1315, 1442. B ü s i n g 1645. B u g g e 539. B u g y i 619. B u k a t s c h 923, 955. B u l l i a r d 1255. B u n g a r t z 2457. B u r c h a r d t 248. Burgdorf 2197. B u r k e 260, 267. B u r k e t 429, 1674, 1675. B u r r o w s 154, 171. B u y t e n d i j k 1262.

627

§§

Ciaccio 1082, 1083, 1085. C l a r a 688, 1183, 1256, 1516, 1717, 2023, 2029, 2031, 2032, 2036, 2037, 2038, 2074, 2076, 2104, 2106, 2111, 2113, 2114, 2115, 2128, 2187. C l a r k 1260, 2224. C l a r k , W. E. L e G r o s 1839. C l a u s e n 891. C l e v e l a n d 2201. Coccius 1282. Cohn 637. C o h n h e i m 1300, 1440. Collier 1342, 1400. Colombo 787. C o l q u h o u n 1669. Colucci 841. C o r d i e r 1229, 2077, 2212. C o r n i n g 1775. Coronini 411. C o r r e n s 1893. Corti 632. C o u j a r d 2046. Courier 2456. C o w d r y 781, 973, 983, 984, 990, 995, 1026, 1753, 1759, 1807. Cox 1774. C r é t i n 1220, 1225. C r e u t z f e ì d 1827. C a j a l 716, 1019 1020, 1761, C r i n i s de 1777. 1769, 1797 ££., 1806, 1844, Cristol 1202. 1849, 1854, 1856, 1871, C r o s s m o n 1488, 1494. C u n g e 1966. 2101, 2354, 2355. C u r t i s 708a. Calle ja 715, 1508. Carazzi 434, 560. C a r e r e - C o m e s 1214, 1215, D a b e l o r 2293. D a d d i 1044, 1045. 1417, 1731. Da F a n o s. F a n o . Carl 1297. Dagnelle 1837, 1841. C a r l e t o n 202, 708a, 1099, D a h l b e r g 905. 2126. D a m , v a n 1298. Carlson 905. D a n k m e i j e r 898. C a r n o y 226, 2404. D a n t s c h a k o f f 557. C a r r e l 154, 163, 170, 171, D a v e n p o r t 1839, 1908, 1922. 173. Davidoff 2129. Casangin 1840. D a v i d s o n 1531, 1536, 1536a. Cas pers s on 67, 919, 1754, D e e t j e n 1309. C a s t r o de 1689. D e g k w i t z 1316. Cesaris D e m e l 759. D e i k u n 1528. C h a l a t o w 1031. C h a m b e r s 153, 352, 1259. D e l a u n a y 1605, 1607, 1619. C h a m p y 298, 972, 2046. D e m u t h 154. C h a r i p p e r 1289. Deyl, v a n 4. C h e v r e m o n t 1255a. Di Biasi s. Biasi. C h i n k u s 1672. D i e t r i c h 387, 860, 1087. Chiodi 2114. Dippel 92. Chlopin 164, 166. Dobell 729. C h r i s t e l l e r 479, 519, 1230. D ö t t l 2447, 2453. C h r i s t o f f e r s e n 905. Doflein 2458. C h r z a n o w s k i 1281. Dogiel 1929, 1936, 1939, C h r z o n s z c z e w s k y 2098. 1940, 1941, 2356. 40»

§§

D o h e r t y 1967. Dohl 2412. D o l l a n d 4. D o m a g k 660, 662, 707, 710, 732, 740, 745, 837," 1044, 1047, 1488, 1492. D o m a r u s 1376, 1453. D o m i n i c i 726. Donaggio 1780. 1781, 1842. D o n a l d s o n 2453. Doyon 968. D r a g a n e s c o 1840. D r a h n 411, 574, 826, 855, 857. D r a s c h 2012, 2443. D r ü n e r 81. D u b o s c q - B r a s i l 308. D u b r a u s k y 1870. D u b r e u i l 978. D u b r i n g 2453. D u d i c h 107. D ü r c k 1964. D u e s b e r g 992, 996. D u n c a n 1814. D u v a l 389. E a r l e 677. E b e r t h 2116. E b n e r v. 1612, 1617, 1678, 1689, 1691, 1692, 1700, 1701, 1717. E d i n g e r 83, 251, 822, 1822. E h r i n g h a u s 92. E h r l i c h 602, 650, 666, 721, 772, 784, 1328, 1373, 1928, 1929, 1941. E i n a r s o n 753, 1749, 1750. E i s e n b e r g 1052. E l l e n b e r g e r 2083. E l l e r m a n n 1390, 1395. E l l i n g e r 71, 151, 2094, 2119. E l s c h n i g 382. E n b o m 897. E n g e l m a n n 2351. E r d h e i m 2196. E r l e n m e y e r 381. E r o e s 1634, 2071. E s a k i S h i r o 186. E s c h e r 1031, 1054, 1055, 1065, 1070. E v a n s 2453. E w a l d , A. 1272, 1440, 1466, 1467, 1569, 1588. E w a l d O. 1567. F a i r c h i l d 361. F a l k 207, 1251. F a l k e n b e r g 1205. F a n o D a 1019, 1022, 1026. F a r r a n t 813. F a u t r e z 1177. F a w o r s k y 1919.

Autorenverzeichnis

628

§§

Fedorow 288. Ferner 2231. Feulgen 1233, 1234, 1238, 1239, 1241, 1243, 1244. Fex 1077. Feyrter 1898, 2034. Fick 2266. Fieandt v. 562, 1025. Fischel 754, 1171. Fischer, A. 198, 200, 283, 592, 603. Fischer, A. 154, 156, 163, 168, 181, 782. Fischer, B. 1566. Fischer, E. 1991, 1992, 1993. Fischer, J. 154, 161, 164, 920. Fischer, O. v. 565. Fischer 1904, "1905. Fischler 1068, 2089. Fitting 28. Flaum 1297. Flechsig 1831. Fleisch 124. Flemming 287, 290, 691, 693, 961, 1666. Flesch 1598. Flinser 1282. Flint 1477, 2002. Foley 1813, 1814, 1815, 1924. Fonio 1450 Fontana 1129, 1535. Foot 185, 1529, 1531, 1555. Forel 1778. Forsgren 2095, 2096. Frankel 2238. Franke 2403. Frankenberger 1225. Fraunhofer 4. Frédéric 1255a. Frederikse 1511. Freeborn 1506. Freudenberg 1217. Frey-Wyßling 956. Friedeberg 1665. Friedenthal 348. Friedländer 667. Fritsch 1297. Froboese 1045. Froriep 1723. Fry 439. Furno 1372. Furrer 1669. Fyg 637, 638, 707, 791, 794. Gad 1713. Gärtner 1851. Gans 273, 1755. Gariaeff 1782. Garmus 760. Garnier 207, 2120. Garten 92. Gaskell 389, 467, 469.

§§

Gebhardt 87. Gedda 2244. Gehuchten van 226. Geitler 915, 928, 932, 934, 936 937. Gelei'933, 939, 1106. Gelfand 2476. Gendre 1093, 1100. Georgi 906. Gérard 1050, 1229, 1242, 2077, 2212. Gerlach, J. 1778. Gerlach, W. u. W. 1232. Germer 201. Gerota 1989. Gersch 954. Gersh 351, 1248. Geyer 2377. Ghiron 760. Gicklhorn 595, 754, 757, 789, 799, 1252. Giemsa 730, 1337, 1338, 1339, 1340, 1357, 1358, 1360, 1363, 1366, 1401, 1402. Giercke, v. 1155, 1157. Gieson, van 707. Gilson 340. Giroud 1184, 1186, 1188, 1255. Glaeßner 2062. Globus 1844, 1852, 1867. Gmelin 1136. Gömöri 1222, 1529, 1531, 1533, 1534, 1535, 1639, 1714. Göppert 632. Goldhammer 1608. Goldmann, E. 762, 769. Goldmann, J. 1381, 1382. Goldner 1495, 1498, 1711. Goldschmidt 161. Golgi 1764, 1770. Golodetz 1081. Golowin 787. Gottlieb 796, 1680. Grabower 1905. Gräff 389, 467, 469, 1155, 1157, 1158, 1160, 1161, 1379, 2314. Gräper 776. Graham 1378. Grandis 1219. Graupner 353. Greeff 2358. Greenman 2453. Greenough 81. Grenacher 639. Groat 838. Grobéty 2477. Groll 105. I Gros 1793.

§§

Groß, W. 198, 203, 269, 807, 1044, 1047. Grosser 1978, 2469. Grosso 725. Groth 909. Grünwald 1352, 1355. Grützner 1469. Grynfeltt 1202. Guiliiermond 966. Guizzetti 2033. Gutherz 944, 948. Haam 1297. Haberland, F. O. 110. Haberlandt, L. 1312. Hackmann 351a, 1194. Haden 1340, 1341. Hadorn 794. Hadjioloff 1035, 1049. Hacker 2143, 2152, 2377. Häggquist 682. Hällsten 1440. Haff 2086. Haitinger 71, 923, 955. Haie 352. Hallheimer 1158. Hallmann 1324. Hamburger 104. Hamburger, H. J. 1978. Hammar 253, 805, 904, 905, 1037, 2243, 2244. Hammond 2456. Hamperl 71, 1129, 2060, 2062, 2072. Hance 196, 206, 290, 297, 942. Hann 893. Hansen 278, 603, 669, 681, 687, 707, 709, 747, 1578, 1598. Harris 670, 2081. Harrison 154. Hartmann 2008. Hartoch 2232. Harvarth 1324. Hasebroek 1181. Hasegawa 1129. Haug 1614. Hayem 1302. Hedinger 517. Heerfordt 2337. Heidenhain, M. 96, 286, 325, 328, 332, 343, 344, 315, 409, 671, 672, 676, 688, 692, 959, 1488, 1489, 1490, 1505, 1507, 1512, 1704, 1709, 1710, 1722, 1723, 1941, 2087, 2180. 2259. Heidenhain, R. 32, 2125. Heider 2377. Heidermanns 1641. Heim 78. Heimstädt 72.

Autorenverzeichnis

§§

H e i n e 64. H e i n e c k e 2000. Heitz 927, 928, 938. H e l d 240, 686, 1753, 1759, 1875, 1887. H e l l m a n n 905, 1994, 2080. Helly 214, 337. H e n c k e l 1199. H e n k e 216. Hienle 2211. H e n n e g u y 546. H e r f o r t 2389. H e r i n g a 389, 467, 471, 472, 475, 476, 505, 506, 534, 811, 1029, 1537. H e r m a n n 293, 295, 2179. H e r r e r a 1871. H e r r i c h 905. H e r t w i g , G. 201, 219. H e r t w i g , O. 208, 1283, 2404, 2406. H e r t w i g , R. 1283. H e r w e r d e n 252, 914, 1312, 1755. H e r x h e i m e r , G. 1044, 1046, 2291. H e r x h e i m e r , K . 2264. H e r z e n b e r g 797. H e r z f e l d 786. H e r z o g 2358. Hesse 2458. H e u d ö r f e r 1180, 2003. H i c k s o n 948. Hill 2476. H i l l a r p 1941, 1945. H i n t z s c h e 1199. H i r s c h 147, 202, 754, 757, 760, 772, 780, 968, 989, 1026, 1207, 2012, 2015, 2016. H i r s c h f e l d 1306a, 1380. H i r s c h l e r 539, 1010. H i r t 71, 151, 1188a, 1884, 2094, 2119. His 873, 1998. H o c h s t e t t e r 132, 133. H ö b e r 202. H o e h l 1479. H o e p k e 381, 480. H o e r r 1056, 1063. H o f f m a n n 58. Holboll 1306. H o l l a n d e 309, 1154. H o l l a t z 905. H o l l b o r n 778. H o l m a n n 2140. H o l m e r 2104. H o l m g r e n , E. 343. H o l m g r e n , F. 1440. H o l m g r e n , H. 1257, 1408, 1410, 2096. Holt 159.

H o l t f r e t e r 120. Holzer 1844, 1848. H o m a n n , E. 859, 862. H o m a n n , H . 2306. Hopkins, A. E. 1754. H o r n o w s k y 1563. H o r t e g a s. R i o - H o r t e g a . H o u e t t e 712, 1497, 1711. H o w e l l 159. H o y e r 1989. H r u b y 2236. H u b e r 354, 945. H u e b e r 814. H u e c k 1110,1111, 1116, 1123, 1130, 1202, 1208. H u e t e r 1514. H ü r t h l e 1705. H y r t l 1985.

629

§§

K a p p e r s 888. K a p s e n b e r g 156. K a r e z a g 798. K a r d a s e w i t s c h 223, 274. K a r d o s 1370, 1407. K a r p o v a 1002. Kasarinoff 1084. K a s p e r 82. K a s t s c h e n k o 874. K a t s c h 113. K a t s u n u m a 1155, 1180. K a u f m a n n 1031, 1037, 1044, 1054, 1065, 1068, 1079, 1086, 1088. K a w a m u r a 1031. K e i b e l 2413. K e l l e r 595, 754, 775, 789, 799. K e m p f 408. I d e - R o z a s 374. K e s s e l y a k 107. I k e d a 546. K e y s e r 1814. I m h ä u s e r 1242, 1243. K i h n 753. Iwanoff 568. K i m m e l s t i e l 1079. Kiss 1887. J a c k s o n 1480. K i s s e r 370, 425, 443, 499, J a c o b 853. 500, 737, 806. J a c o b j 908. K i t t s t e i n e r 386. J a c o b s 202, 968, 1026. K i y o n o 754, 770, 799, 979. J a c o b s t h a l 795. K l a r f e l d 1545. J a c o b y 271. K l e b s 389. J ä ä s k e l a i n e n 1193. K l e e b e r g 1Q67. J ä g e r 594. K l e i n 506. J ä r v i 1026. K l e i n e n b e r g 312. J a f f e 2226. K l e m e n s i e w i c z 149, 760, J a l o w y 1281, 1537. 1441. J a n s s e n 677. K l i e n e b e r g e r 1297. J a r i s c h 2214. K l i n g e l h ö f f e r 2377. J a ß w o i n 1484. K n i p p i n g 516. J e k e r 2116. K n ö l l 156. J e l i n e k 485. K n ü s e l 2307, 2335. J e n n e r 1352, 1355. Koch, A. 1239. J e n t s c h 72. Koch, G. v. 1671. Joel 795, 2166, 2172. Koch, K. 2226. J o h n , F. 2296. Koch, W. 1245. J o h n , K. 50, 496. K o c k e l 1208, 1210, 1429. Jolly 208. K ö h l e r 26, 42, 59, 66, 76, J o n e s 1900. 78, 92. J o r d a n 402, 462, 559. Koelliker 2115. J o r e s 860. KönigsdÖrffer 76. J o y e t - L a v e r g n e 1182, 1188, K o e p p e 150, 2305. 1255. K o h a s h i 1504. J u n g 1838, 1839. K o h n 1124, 2209. K o l a t s c h e w 1009. K a b s c h 427. K o l m e r 202, 212, 239, 241, K a d a n o f f 1810. 2358, 2360, 2364, 2368 K a e w e l 869a. 2375. K a i s e r , E. 806. Kolossow 1287. Ka i s e r , M. 98a. K o l s t e r 977. K a i s e r l i n g 201, 858, 902. K o m a j a 1230. K a l l i u s 1776. K o o p m a n n 217. K a m p t n e r 815, 816. Kooy 534. K a n z l e r 1844, 1869.

630

Autorenverzeichnis

§§

K o p s c h 243, 976, 1008, 1009, 1013, 1017, 1119, 1772, 2392, 2398. K o r f l v. 1653. K o r s c h e i t 2377. K o s s a 1222, 1634, 1637. K o s t a n e c k i 2383. K r a a t z 521. K r a l l i n g e r 310, 373, 941, 942, 943, 947, 2175. K r a u s , E. J . 2195, 2202, 2237. K r a u s e , C. 865, 1282. K r a u s e , C u r t 862. K r a u s e , R. 112, 213, 643, 718, 722, 842, 1695, 1700, 1704, 1765, 1779, 1929, 1931, 1934, 1947, 1981, 2097, 2133, 2334, 2364, 2374. K r a u s e , W . 2349. K r a u s p e 732, 735. K r e i b i c h 1171, 1180. K r e m e r 1122. K r o h n 1598. K r o m a y e r 2264. K t o m p e c h e r 1645. K r o n f e l d - G u i l e r a 2154. K r o n t o w s k i 161. K r ü g e r 398, 420. K r y s p i n - E x n e r 1751. K u b i e 1531, 1536, 1536a, 2222. K u b o 239. K ü h n e 147, 1467, 1895, 2352. K ü s t e r 921. K ü h l , P . 1297. K ü h l , W . 909. K u l i 972, 984, 994. K u l t s c h i t z k y 1820, 1825. K u n i k e 1672. K u p f f e r 1982, 2091, 2102, 2390. K u t s c h e r a - A i c h b e r g e n 1028, 2213. K u w a d a 930. L a g u e s s e 1537, 1714. L a i d l a v 1179, 1531. L a M a n n a 1836. L a m m 894. L a n d a u 1796, 1834. L a n d s t r ö m 1754. L a n e 2227. L a n g 323, 331.L a n g e r o n 29, 307, 843. L a n g h a n s 1099. L a n g l e y 147, 2019. L a p i n e 897. L a p i n s k i 1437. L a u b e n h e i m e r 78. L a u b e r 2358. L a u c h e 175.

§§ L a u d a 2131. L a u n o y 2040. L a u x 1079. L a w r e n t j e w 1915, 1953. L e a 147. L e b e d k i n 874, 876, 891. L e b l o n d 1184, 1186. L e b r u n 2404. L e G r o s C l a r k s. C l a r k , L e Gros. L e h m a n n , E. 1031, 1037, 1044, 1065, 1068, 1079, 1086, 1087. L e h m a n n , F . E. 791, 792, 14. L e h n e r 558, 603, 1391, 1411, 2023, 2033, 2036, 2055. L e i s h m a n 1355. L e m m e l 1180. L e n a u v e l 29. L e n d v a i 499. L è n g g e n h a g e r 1452. L e n h o s s e k 2319. L e n t z e 26, 95. L é o n a r d 1092. L e p e h n e 1436. L e s C h k e 2139. L e u p o l d 1572. L e v i , G i u l i o 566. Levi, Giuseppe 154, 174, 177, 1276, 1726, 2149, 2346. L e w i s 2203. L e w i s , M. R. 122, 170, 174, 178, 782, 932. L e w i s , W. H . 169, 174, 178, 782. L e w i t z k y 932. L h e r m i t t e 1796a, 1912. L i e s e g a n g 1190, 1206, 1214. L j e t p i k 856. L i g n a c 1130, 1133. L i h o t z k y 72. L i l l i e 677. L i n d b e r g 154, 173. L i s o n 603, 876, 1050, 1051, 1054, 1056, 1067, 1068, 1146, 1088, 1104, 1129, 1176, 1180, 1153, 1154, 1202, 1208, 1209, 1210, 1214, 1216, 1217, 1220, 1232, 1242, 1256, 1258, 1837, 1841, 2064, 2072, 2073, 2077, 2212. L o b o 1811. L o c h t e 2284, 2286. L o c k e 122. L o e l e 1155, 1162, 1163, 1164, 1165, 1167, 1170, 1171, 1172, 1173, 1175, 1181. L ö f f l e r 182. L o h r 1079. L o w 489, 490, 497, 500, 1599.

L ö w e n f e l d 2226. L ö w e n s t ä d t 624. L ö w e n t h a l 250. L ö w i t ' 1904, 1905. L o g i n o w 1463, 1716. L o h a u s 198, 203, 807. L o m b a r d 149. L o n d o n , B. 2141. L o n d o n , E . S. 1783. L o n g 2453. L o o s 59. L o r b e e r b a u m 2268. L u b o s c h 2392. L u b s 1260. Ludwig Ferdinand v o n B a y e r n 2297. L ü d i c k e 1978a. L ü d t k e 1452. L u n d g r e n 905. L u n d v a l l 1596. L u s t g a r t e n 1121.

§§

M a a s 49. M a c a l l u m 520, 1208, 1209, 1214, 1221. M ä r k 531. M a g n u s 1990. M a i n i n i 1219. M a i n l a n d 880. M a l l 1466. M a l l o r y 685, 1486, 1513,1874. M a l o n e 500. M a n n 212, 259, 728. M a n s o n 1376. M a r c h i 1821, 1838, 1839. M a r c u s 1712. M a r e s c h 1518. M a r k o v i t i n 1937. M a r l o f f 1297. M a r t i n o t t i 1290, 2250, 2253, 2268, 2271, 2272. M a s i o w a 785. M a s s o n 685, 711, 843, 844, 1495, 1496, 2027, 2077. M a t h i s 582, 661. M a t s u u r a 1568. M a u r e r 2203. M a x i m o w 186, 338, 557, 730, 1389, 1390, 2402. M a y 1352, 1355. M a y e r , A . 1031. M a y e r , M. 1347. M a y e r , P. 93, 282, 313, 322, 324, 326, 327, 385, 405, 411, 440, 441, 495, 541, 587, 615, 619, 631, 639, 642, 643, 644, 647, 649, 650, 651, 653, 697, 714, 733, 833, 1118, 1574, 1590, 1597, 1656, 1752, 2025, 2028. M a y e r , P a u l a 1822.

631

Autoren Verzeichnis

§§

Mayer 1031. Mays 1279. McClung 310, 357, 358, 428, 429, 841, 851, 1303, 2436. McGill 1487. McKinney 185. Meitzer, H. 1213. Menard 1531. Menner 1740. Meola 968. Mercier 336. Merkel 319. Mettler 1839. Metz, A . 1865. Metz, C. 87, 1449. Metzner, P. 92. Metzner, R. 697, 698, 991, 2018, 2020, 2021, 2069. Meves 297, 971, 983, 996, 1308, 2184, 2385, 2386. Meyer, A. 283, 932, 1693. Meyer, Erich 2000. Michaelis 315, 551, 599, 601, 614, 780, 781, 1040, 1042, 1043, 1159, 1226. Michailow 1940, 1953. Michel 78. Mihalik 1887, 1925. Mikami 1227. Miller Ch. 1904, 1907. Miller, W. S. 897. Milovidov 640. Minot 488. Minouchi 941, 942. Mislawsky 2042. Mitamura 787. Möllendorff, von 592, 593, 594, 603, 606, 724, 755, 757, 762, 765, 768, 775, 776, 786, 799, 1483, 2124, 2132, 2472. Moeligard 520. Mönckeberg 200, 1902. Moleschott 1725. Moll 2158.

Nakano 1379. Nassonow 1009, 1010, 1015. Naylor 595. Neri 1364. Neubauer 1442. Neuberg 383. Neubert 131, 1509, 1729, 1730, 2007. Neukirch 1091. Neumann 814, 1682. Neumayer 564, 582, 894, 1987. Neuweiler 90. Nielsen 1096, 1101. Nießing 1485. Nikiforoff 1327. Nishiniura 1202. Nissl 1741, 1742, 1743. Nocht 730. Noll 1089. Nöyer du 819. Nürnberger 2265. Nuzzi 94. Oberndorfer 1153. Obregia 548, 563. Obst 950. Oelze 58. Oestreicher 2140. Ogata 1129, 2212, 2219. Okajima 752, 882. Okamoto 1212, 1224, 1227. Okkels 907, 1096, 1193, 1199. Oliveira 1555. Olt 549, 561, 569. Oppel 1999, 2424. Oppenheimer 2101. Orth 244, 247, 636. Orton 430. Ostertag 1541. Otami 2105. Overton 145, 288, 374.

Painleve 1004. Painter 929, 941. Pal 1826. Moller 2301, 2302, 2303. Mollier 2007, 2050, 2086. Pansch 1965, 1988. Mommsen 1345, 1361, 1362, Pap 1532. 1368. Papanicolau 2454. Pappenheim 602, 699, 723, Monn6 924, 1000, 1003. 724, 730, 1303, 1367, 1369, Morandi 1796 1834. 1375, 1379, 1384, 1403, Müller, A. 1732. 1405, 1453. Müller, E. 2063. Panse 2361. Müller, Heinr. 244. Parat 1004. Müller, O. 149. Parker 154, 1874. Münzer 1091. Pasini 1499. Murayama 1621. Passera 2341. Pasteeis 1092. Nachet 63. Patten 201, 305. Nägeli 1294, 1453. Patzelt 1102, 1594, 2055, Nagel 100. 2059, 2068, 2069, 2070, Nageotte 1088.

§§

2078, 2085, 2222, 2258, 2262. Paunz 798. Peckelharing 1468. Penfiel d 1844, 1853, 1867, 1868. Perdrau 1524, 1531, 1844, 1883. Perenyi 322. Perez 1871, 1920. Peter 875, 878, 879, 880, 881, 886, 888, 898, 2294, 2417. Peterfi 55, 153, 175, 369, 389, 392, 394, 440, 1693, 1710, 1717. Petersen 45, 512, 748, 749, 837, 845, 1488, 1491, 1626, 2288.

Petri 92. Petry 552a. Petrunkewitsch 280, 341. Pfeiffer 2214. Pfuhl 335, 346, 463, 466, 554, 763, 766, 768, 908, 1183, 2087. Philpott 201, 305. Pickford 280. Pickworth 1965, 1967. Pieper 1915. Pischinger 199, 594, 595, 603, 1242, 1244, 1264, 1692, 1693, 1703, 1748, 1898. Plank 517. Plate 376. Plate, E. 1187. Platner 1002. Plecnik 410. Plenk 1546, 1714, 1961,2085. Plotnikow 757. Podhrasky 1923. Podwyssozki 692. Pötter 1845. Policard 206, 207, 266, 968, 1190, 1193, 1199, 1200, 1232, 2114, 2120. Politzer 777, 889. Poll 208, 348, 717. Pollak 2166. Poller 898. Pommer 1622, 1633. Poska-Teiß 1271. Poso 416. Post 430. Pranter 416, 1558. Pratje 889. Prenant 1181. Prikett 1840. Pröll 796. Prudden 668. Przesmiky 787. Pulcher 595.

Autorenverzeichnis

632

§§

Q u a s t l e r 902. R a b l , C. 314, 317, 318, 2344. R a b l , C. R . H. 1217. R a b l , H. 1059. R a c h o w 2377. R a m s t h a l e r 65. R a n k e 375. R a n s o n 1812. R a n v i e r 1270, 1280, 1458, 1576, 1668, 1739, 1904, 1906, 2328, 2329, 2331, R a s m u s s e n 905. R a s p a i l 1190. R a t h , O. v o m 316. R a t h e r y 1031. R a u b e r 2427. R a w i t z 299. R e d e n z 539. R e g a u d 243, 976, 988, R e g e n d a n z 1392. R e i c h 1899. R e i c h a r d t 397. K e i c h e n o w 1392. R e i m a n n 229. R e i n e r t 78. R e i s i n g e r 1493. Retzius 1701. R e u m o n t 1912, 1796a. Rezek 2131. R i b b e r t 1514. R i c h a r d s 1521. R i c h m a n 2476. R i c h t e r , D. 1602. R i c h t e r , O. 1201. R i e c k e n b e r g 377. Riegele 2093. Rienhoff 2233. Ries 147, 754, 920, 956, , 1001,

1026,

1088,

2343,

1454, 1719, 2097, 2376.

2182.

1000, 1181,

1189, 1258, 1260, 1263. R i n g e r 119. Rio H o r t e g a 963, 999, 1291, 1546, 1547, 1548, 1550, 1553, 1844 1857, 1859, 1860, 1861, 1864, 1866, 2263. R o c h e i d e 792, 2414. R o d i e r 118. R o d i n o 1840. Roeckl 2089. R ö h l 1222, 1640. Rose 1671. R ö t h i g 1826, 1830, 2377, 2420, 2425. Rogers 1926. R o h r , K . 1422, 1453. R o h r , M. v. 92. R o j a s 1921. Rollet 1458, 1699, 1701, 2324.

Roishoven 877. R o m a n 757, 799. R o m a n i s z y n 539. R o m a n o w s k y 1357. R o m e i s 78, 171, 314, 733, 905, 980, 1040, 1044, 1048, 1095, 1127, 1185, 1561, 1586, 2194, 2198, 2205, 2206, 2207, 2209. R o s e n t h a l 1029. R o s k i n 785. Roß 1323. Rost 650. Rostock 121. R u b a s c h k i n 557, 983. R u c k e r 2201. R u d b e r g 2243. R u d n e f f , M. 280. R u d n e w , W. 230. R ü t e r 779. R u p p r i c h t 1645. R u i j t e r 818. R u y t e r 547, 553, 1579. R u z i c k a 1472. R y d b e r g 1871.

§§

346, 1041, 1104, 1585, 2204, 2208,

S a l a z a r 2155 2199. S a l i e r 2447. S a n d e g r e n 2244. S a n d m a n n 1696. Sanfelice 944. S a n n o m i y a 342, 1894. S a p h i e r 574. S a u b e r e r 893. S a v i n i 1381. S a x e n 1025, 2368. S c h a b a d a s c h 1094,1928,1941, 1942, 1944, 1945, 2085. S c h a e f f e r 1031. S c h ä f f l e r 1715. S c h a f f e r 222, 228, 314, 452, 1059, 1411, 1506, 1580, 1587, 1589, 1590, 1594, 1598, 1611, 1613, 1652, 1665, 1669, 1672, 1681, 1689, 1728, 2023, 2057, 2187, 2281, 2295 S c h a p e r 892. S c h a r p f l 2251. S c h a r r e r 556. S c h a u d i n n 330, 1402. S c h e f f e r 92. S c h e i d 1195, 1214. S c h e u r i n g 2298. S c h i e f f e r d e c k e r 389, 1508, 2256. Schiller 201, 202, 268, 272, 342 348 723. Schiliing 490, 1323, 1453, 1599.

S c h i m e r t 1843. S c h l e m m e r 1528. S c h m e e r 905. S c h m e l z e r 129, 130, 867, 1204, 1211. S c h m i d t , J . E. 2072. S c h m i d t , M. B. 795. S c h m i d t 956. S c h m i d t , V. 1717. S c h m i d t , W. 2134, 2138. S c h m i d t , W. J . 60, 61, 62, 175, 277, 288, 1039, 1141, 1144, 1152, 1153, 1591, 1664, 1665, 1667, 1689, 2304. S c h m i d t m a n n 1153, 1259. S c h m i n c k e 2008. S c h m o r l 479, 869a, 1156, 1632, 1643, 1644, 1682. S c h ö n f e l d 199. S c h ö n h e i m e r 795. S c h o u t e n 153. S c h r e i b e r 1693. S c h r i d d e 247, 1383. S c h r o e d e r 1833. S c h u b e r g 205, 363, 627, 695, 2257. S c h u e n i n o f f 1430, 1514. S c h ü l e 1715, 1717. S c h ü r h o f f 72. S c h u h m a n n 2457. S c h u l e m a n n 755, 756, 2132. S c h u l t e n 1453. Schultz, A. 858, 861, 2134, 2138. Schultz-Brauns 137, 512, 520, 525, 1189, 1190, 1191, 1197, 1198, 1199, 1223. Schultze, A. 1079. Schulze, M. 280, 1274, 1739. S c h u l tze, O. 200, 287, 684, 808, 982, 1284, 1657, 1717, 1762, 1793, 1808, 1831, 2146, 2411. Schultze, W. H. 1154, 1155. Schulze, F. E. 280, 2115. Schulze, P. 1120, 1672, 2300. Schulze, W. 1599. S c h u m a c h e r 82. S c h u m m e r 866, 1965, 1985. S c h u s c i k 1635. S c h u u r m a n n 132. S c h w a l b e 1778. S c h w a r z 635, 1376. Scott 351, 352, 1198, 1199, 1223. Seeliger 2024. S e e m a n n 783, 1304, 2114. S e h r t 1381, 1382. S e h r w a l d 1767. S e i f r i e d 853,

Autorenverzeichnis

§§

S e k i 189, 197, 223, 227, 231, 399, 454, 457, 466a, 597, 633, 648, 799, 986, 993, 998, 1787, 1795, 1845, 1846, 1851, 1872, 2032. S e l e n k a 898. S e l i g m a n n 2358. Seile 2454. S e r e n i 701. S e v e r i n g h a u s 2200. S e y f a r t h 1305. S h a r p e y 1649. S hipley 1608. S i e b e r 1231. Siedentopf 52, 72. Siedlecki 2383. Sihler 1713. S i k o r a 464. S j ö b r i n g 202, 264. S j ö v a l l 968, 980, 1018. Skell 42, 78. S k r a u p 787. S l o n i m s k i 1437, 1965, 1966. S m i t h , L. 1064. Snook 786. Sobotta 2461. Solger 1694, 2014. S p a l t e h o l z 854, 1596. S p a n n e r 863, 866, 1946, 1965, 1972, 1977, 1984, 1985, 1986, 1988. S p a t z 273, 1202, 1'435, 1738, 1865, 1878. S p e e 426. S p e m a n n 111. Spiegel 1562. S p i e l m e y e r 1744, 1745, 1825 1832, 1846, 1847. S p r ö h n l e 1045. S p u l e r 327, 328, 336, 421, 645. Ssobolew 696. S t a d e 78. S t a d t m ü l l e r 1282. S t a r k e 1054. S t a u d e 78. S t e c k e l m a c h e r 786. S t e k h o v e n 132. S t e p p e s 2455. S t e r n , J . B. 1851, 1871. S t e r n , S. 2352. S t e v e n s 1840. S t i e v e 333, 347, 482, 905. 913, 961, 1483, 1728, 2143, 2159, 2174. S t i n t z i n g 2061. S t o c k a r d 2454. S t o c k h o l m 1096, 1101. Stöckli 854. S t ö h r d. Ä. 2031. S t ö h r d. J . 1808, 1809, 1895,

633

§§

1896, 1908, 1914, 2078, 2085, 2297. S t ö l t z n e r , H. 202, 329. S t ö t z n e r , W. 1222, 1632, 1637. S t o v e r 880. S t r a ß e r 886. S t r a s s m a n n 1155. S t r a u b , J . 930. S t r a u b , W. 121. S t r a u ß 1117, 1565. S t r u g g e r 199, 923, 924, 967, 1033. S t u d n i c k a 580, 2316. S t ü b e l 1252, 2140. S t ü l e r 1108. S t u m m e 2196. S t u r m a n n 1736, 1747. S u g i y a m a 799. S u k 1967. S u z u k i 2132. S w a n k 1839. S z a t m a r i 1794. S z e n t - G y ö r g y i v. 1183, 2317, 2318, 2319. S z o m b a t h y 550. S z ü t s v. 569a.

U k a i 1899. U n d r i t z 1306a. U n n a 219, 229, 531a, 616, 628, 670, 723, 1290, 1412, 1415, 1501, 1556, 1570, 1755, 2260, 2261, 2268, 2269, 2282, 2289, 2290. Uotila 1193. U t a m u r a 1224. U y a m a 2355.

§§ 596, 965, 1500, 1571, 2265, 2283,

V a n o t t i 150. V a s t a r i n i - C r e s i 1828. Veh, v. 507. Veit 895. V e r a t t i 1121. Verhoeff 2311. V e r m e s 862. V e r n e 1153, 1245a, 1246. Verocay 274, 276, 1515. Versé 1037. V e t t e r 124. Vihvelin 1713. V i m t r u p 1960. V i r c h o w , H. 249, 2398. Vogt, A. 150, 2305, 2335. Vogt, W. 790, 791. T ä n z e r 1556. Voit 1241. T a g u c h i 1978. V o l k m a n n , v. 834, 1125, T a l a j e w 862. 1126, 1565, 1654. T a n d l e r 862, 895, 1983. T a r t a k o w s k y 1207. V o l t e r r a 1546, 1549. T a v a r e s de Sousa 2199. V o n w i l l e r 150, 489, 490, 760, T e h v e r 1670. 787, 799, 1599, 2307. T e i c h m a n n 1433. Voss 411, 1234, 1240, 1243, Tellyesniczky 196, 201, 202, 1246, 2082. 204, 222, 236, 237, 244, 283, 304, 317, 348. W a c h e n f e l d t , v. 893. T e r n i 967, 2183. W a d a 917. T h a l e r 801. Wail 2239. T h a y s s e n 1077. W a l d e y e r 646, 2267. T h i e s 2000. W a l l a r t 712, 1495, 1497, T h o m a 1442, 1614. 1510, 1711, 1913. T h o m e e 876, 877. Walraff 1095, 1104, 1105, T i l l m a n n s 1592. 1243, 1246, 1897, 2199. T i m m 1189, 1231. W a l s e m , v a n 98, 427, 613. T i r m a n n 1204. W a l t e r , K . 2222. T i s c h u t k i n 727. W a l t e r , L. 1502, 1503. Törö 1129. Walz 270. T o g a r i 2447. W a n k e l l 757. T o m a s i de 1235. W a r t h i n 539. T o m i t a 606. W a s s e r m a n n 465. T o n k o f i 720. W a t a n a b e 982. T o n u t t i 1187, 1188. W a t e r m a n 429. T r e t j a k o f f 1672. W e i d e n r e i c h 581, 1330, 1332, T r i e p e l 891, 896. 1333, 1610, 1649, 1658, T s c h a s c h i n 2097. 1684. T s c h o p p 1196, 1199. W e i g e r t 565, 677, 700, 707, T s i m i n a k i s 1746. 1424, 1426, 1560, 1820, T s u - Z o n g - Y u n g 2456. 1821, 1822, 1824, 1844, T ü r c k 1442. 1845.

634

Autorenverzeichnis

§§

Weil 253, 273, 275, 1671, 1734. Weill 2084. Weise 1340, 1344. Weiss, E. 149, 1441, 1960. Weiss P. 909. W e i ß b e r g e r 353. Weisschedel 1838, 1839. W e l t m a n n 2221. W e n t s c h e r 208. W e n t z l a f l 760. W e r m e l 1237. W e r n e c k e 2286. W e r n e r 189, 201, 202, 203, 2Q4, 208, 210, 212, 239, 240, 242, 244, 2362, 2363, 2369. W e r z b e r g 1329, 1384. W e s t b l a d 789. Wetzel 397. W i c k l e i n 1205. W i e n e r 1208. Wiesel 2217. W i e s e r 212.

§§

W i l d e r 1529, 1532, 1536. Williams 351. V/ilson 898. W i m m e r 1188a. W i n d a u s 1080. W i n i w a r t e r , v. 297, 691, 692, 961, 962. W i n k l e r 381, 1154. W i t t g e n s t e i n 2062. W i t t m a a c k 239, 2362, 2365. W o e r d e m a n 1262. W o h l f a h r t 1754. Wolf 195, 452, 458, 869. W o l f e 2201. W o l f - H e i d e g g e r 1733, 2065. Wolhynski- 1953. W o l t e r s 1820, 1827. W o r c e s t e r 334. W o r o n i n 2007, 1288. W u 1437. W ü s t 807. Wulff 261, 1339. W u r m b a c h 1641.

§§

Z a c h 456, 461. Z a c h a r i a d i s 1466, 1600. Z a c h a r i a s 1208. Z e i g e r 104, 189, 190, 191, 199, 219, 223, 254, 273, 283, 595, 597, 606, 754, 912, 914, 920, 1264, 1693, 1763, 2167. Z e l l e r 216. Zeller, H. 815. Z e n k e r 244, 336. Z e r n i c k e 59. Z e t h r a e u s 522. Z e t t n o w 97. Ziegler, H. E. 912. Ziegler, P . 1616. Zill 1638. Zilliacus 1292. Z i m m e r m a n n , A. 92. Z i m m e r m a n n , K. W. 1961, 2058, 2063, 2091, 2127. Z i r k l e 203. Zöbisch 1892. Z o n d e k 2452.

Sachregister §§

A. Abbesche Testplatte 29 Abbescher Beleuchtungsapparat . 31 Abbildungsmaßstab 14 Abbiendung 8, 36, 42 Abnutzungspigmente 1137 Absoluter Alkohol . . . . . . 380 ff. , Fixierung in 220 , Herstellung von 381 , Prüfung 383, 385 — —, Reinigung 384 Absorptionsuntersuchung . . . . 919 Abstrichpräparate von Organen, Herstellung 1335 Abziehen (Mikrotom-Messer) . . . 499 — (Rasiermesser) 135 Acetalphosphatide . 1241 Aceton 216 f. —, Differenzieren mit — . . . . 1401 —, Entwässern mit — 835 —, — von Schnitten 835 —, Fixieren von Blutpräparaten . 1325 —, Fixieren von Gewebe . . . . 216 —, Nachweis in Methylalkohol . . 1326 —, Reinigung 217 —, Verhalten 390 Aceton-Celluloid (Umranden) . . 817 Acetonchloroform 103 Aceton-Eisessig-Formol-Sublimat . 2317 Aceton-Methylenblau-Erythrosin (Nißl-Körper) 1753 Aceton-Paraffin 216 Aceton-Scharlach R 1046 Aceton-Xylol nach Giemsa . . . . 1401 Achromate 12 Achromatische Zellbestandteile (Darstellung) 957 ff. Achromatischer Kondensor . . . . 35 Achromatisches Filter 44 Achselstoffdrüsen 2294 Achsenfaden (Spermium) . . . . 2168 Achsenzylinder . . . . 1780 ff., 1901 ff. Achsenzylinder s. auch Neurofibrillen Achucarros Tannin-Silbermethode. 1543 — Modifikation v. Rio-Hortega . 1546 ff. Acidophile Granulationen in Blutzellen 1372 ff. Hypophyse 2194 ff. Nebenniere 2222 Acidophilie 602 Adams Fixier, v. Vitalfärb. . . . 793 Adhäsionsmethode n. Wolf . . . 859 a-Drüsen 2294 Adjektive Färbung 605

§§

A.-F.-A.-Gemisch 1915 Agarfarbmarken n. Vogt . . . . 790 Agarlösung f ü r Blutpräparate . . 1310 Agduhrs Modifikation der Bielschowsky-Methode 1792 Alaun (als Diff^renzierungsmittel) . 657 Alauncarmin 639 Alaunhämatoxylin n. Hansen . . . 669 Alcarin 909a Aldamine 1167 Aldaminreaktion 1167 Alflens Bleichmethode 1121 Alizarin für Knochenfärbung . . . 796, 1601, 1602 Alizarin z. Vitalfärbung von Nerven 788, 789 Alizarinalkohol 1596c Alizarinbordeaux 743 Alizarincyanin 738 — Säurefuchsin-Pikrinsäure . . . 747 Alizarinrot S 746 Alizarinsulfosaures Natrium . 796, 996 Alizarin-Toluidinblau . . . . 1596b Alizarinviridin 746 Alkalisches Fixationsbild . . . . 203 Alkohol —, Entwässern mit 364 ff. —, — des — 381 ff. —, Fixierung mit 220 ff. —, Ersatz 386, 387 —•, Konzentrationsprüfung . . . . 376 —, Prüfung auf Reinheit . . 383, 385 —, Reinigung von gebrauchtem — . 384 —, Verdünnungsbestimmung . . . 377 386 — vergällt —, Verhalten 390 Alkoholäther 443, 450Alkohol-Äther-Celloidin zur Fixierung 230 Alkohol-Benzolgemische 370 Alkohol-Celloidin, Aufblocken . . 484 , Aufkleben der Schnitte . . 555 ff. , Einbetten 450 f. , — nach v. Apäthy . . . . 450 — —, — — Zach ' 457 , Schneiden 510 , Weiterbehandlung der Schnitte 584 Alkohol-Chloroform nach Seki . . 454 zur Celloidinhärtung . . . . 454 Alkohol-Chloroform-Eisessig . , . 226 Alkohol-Chlorzink 229 Alkohol, Drittel-(Ranvier) . . . . 1270 Alkohol-Eisessig 225 Alkohol-Eisessig-Chloroform . . . 226

636

Sachregister

§§

Alkohol-Fixierung 218 ff. Alkoholflucht des Glykogens . 1090, 1093 Alkohol-Formol 228 Alkohol-Formol-Eisessig (Scheuring) 2298, (Stieve) . . . 2159 Alkohol-Formol-Pikrinsäure . . . 2311 Alkoholische Boraxcarminlösung . 634 Alkoholische Jodjodkalilösung . . 327 Alkoholometer 376 Alkohol-Osmiumsäure 1106 Alkohol-Salpetersäure (Entkalken) . 1614 Alkohol-Salzsäure (Differenzieren) . 634 Alkohol-Sublimat 330 Alkoholtabelle 378, 379 Alkohol-Toluidinblaufärbung . . 1596b Alkoholverdünnung 377 rt.iKonolvergällung 386 Aliens Fixierungsmethode . . 310, 2175 Allochromasie 603 AUophoren 1147 Allylisopropylbarbitursaures Diäthylamin 109 Altersbestimmung menschlicher Embryonen 2469 Alterspigment 1137 Altmanns Darstellung des intergranulären Netzwerks . . . . P64 A l t m a n n s c h e F ä r b u n g . . 991 — Modifikation von Cowdry . . . 995 Kuli 994 Metzner 2020 Seki 993 — Fixierung 974 — Gefriertechnik 350 — Paraffingemisch 427 — Trockenmethode 350 Aluminiumobjektträger 940 Aluminiumsulfatcarmin 638 Alveolarphagocyten 2114 Alveolenepithel der Lunge . . 2113 ff. Alzheimers Färbung amöboider Gliazellen 1877 — Säurefuchsin Lichtgrünmethode 1758 .Amakrine Zellen (Netzhaut) . . . 2355 Amanns Einschlußflüssigkeit . . . 810 Ameisensaures Blei (Ganglienzellen) 1775 Ameisensäure (Entkalken) . . . . 1621 Ameisensäure (Goldimprägnation) . 1784 Ameisensäure-Chromogengdmisch (Weigert) 1845 Ameisensäure-Kaliumbichromat (Ciaccio) 1082 Aminogruppe in Farbstoff . . . . 599 Ammoniakalische Silberlösung n a c h Agduhr 1792 Bielschowsky (für Bindegewebe) 1527 (für Achsenzylinder) . 1790 Cajal 1854 Davenport . . . . . . . 1922 • Davidson 1536 f.

§§

Ammoniakalische Silberl ö s u n g (Forts.) n a c h Deikun 1528 Fontana 1129 Foot 1555 — — — Gömöri 1535 Kubie 1536 f. Laguesse 1538 Lobo 1811 Perdrau 1883 Rio Hortega 1551 Schlemmer 1528 Schultze O. — Gros . . . 1793 Ammoniakcarmin (für Ganglienzellfortsätze)1778 — nach Best 1103 Ammoniumbichromat (Beize für Glia) 1828 — (Isolierungsmittel) 1275 Ammoniumbichromat-Fluorchrom (Vastarini Cresi) 1828 Ammoniumbromid 1849 Ammoniumcarbonat 1694 Ammoniumjodid 1945 Ammoniummolybdat . . . 626 ff., 1936 Ammoniummolybdat-Wasserstoffsuperoxyd 1938 Ammoniumpikrat . . . . . 1939 Ammoniumrhodanid . . . . . 1945 Amniosflüssigkeit . 117 Amöboide Gliazellen . . . . 1877 ff. Amphibieneier 2403 ff. Amphophilie . 602 Amphoterer Farbstoff . . . . . 599 Amylnitrit . 1973 Amyloid . 1572 —, Nachweis mit Congorot . . . 1575 Jod . 1573 • Methylviolett . . . . 1574 Trypanblau . . . . 1575 Vitalfärbung . 797 Analysator . 63 Anatomische Präparate . . . 858 ff. Anilin 390, 415 Anilinblau 1486 1638 Anilinblau für Knochenschliffe Anilinblau-Orange-Säurefuchsin . 1486 (Mallory) . . 1487 —, M o d i f i k a t i o n Mc. Gill . 1489 —, — M. Heidenhain . . . . Anilinblau-Säurefuchsin-Oxalsäure 1684 Anilinfarbstoffe, Allgemeines 599 ff. 610 —, Einfluß der Fixierung . —, Einteilung 599 626 ff. —, Fixierung der Färbung . —, Haltbarkeit 625 619 —, Reinheit Anilinöl 415 1424 Anilinöl-Xylol nach Weigert 1428 Benecke 617 Anilinwasser (Herstellung)

Sachregister

§§

Anilinwasser-Gentianaviolett (Gram.) 703 Anilin wasser-Kristall violett (Mitochondrien) 996 Anilinwasser-Methylviolett (Kromayer) 2264 Anilinwasser-Methylviolett (Weigert) 1426 Anilinwasser-Safranin 694 Anilinwasser-Säurefuchsin (Altmann) 992 Anisol 26, 2038 Anisotropie 60 Anitschkows Aufklebemethode 558, 568 Ansäuern der Farblösung . . . . 659a Anschaffung eines Mikroskopes . . 91 Anthracenblau 732, 741 Anthracenblau nach Einarson . . 1750 Krypsin-Exner 1751 Anthracenblau-AluminiumsulfatChromalaun 1750 Anthracengelb 1629 Antiformin 214, 869a Antimonelektrode 1262 Antimontrichlorid (Vitamin A) . . 1182 Apäthys v., Aufklebemethode . . 546 — Beschriftung 529 — Celloidineinbettung " . . . . . 450 — Celloidinparaffineinbettung . . 464 — Gelatineeinbettung 468 1783 — Ooldmethode — Gummisyrup 812 — Nelkenölcelloidin 486 — ölgemisch 460 — ölcelloidin 460 — ölgelatine 468 — Paraffineinbettung . . 391, 419, 422 — Sublimat-Alkohol 330 Apertur 8, 15, 16, 21, 34 Aplanatischer Kondensator . . . 35 Apochromat 12 Apokrine Drüsen 2293 f. Apparate von Golgi-Rezzonico . 1921 f. Apparato reticolare interno . . 1002 ff. in Nervenzellen 1760 Aqua bidestillata 1521 Aqua dest., Prüfung desselben bei Blutfärbung 1337 ff. , Silbermethoden . . . 1521 Aqua Javelli (Herstellung) . . . . 2412 zur Entfernung der Eihüllen 2412 Äquivalentbild von Nissl . . . . 1742 Areoläres Gewebe 1459 Argentaffinität 1129 Argentophilie • 1131 Argentum colloidale 2091 Argent. nitricum ammoniakalisch . 1527 — zum Calciumnachweis . . . . 1222 Kalknachweis 1637 ff. — zur Imprägnation s. Silbermethoden Argyrophile 1129, 1131

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§§

Arkansasölstein 135 Arnold E., Vitalfärbung an Eiern . 2464 Arnold J., Methode der Blutzellenuntersuchung 1301 Arosäure 1740 Arsenige Säure-Formol-AlkoholGemisch 1915 Artefakte (Fixierung) 191 914 — (vital) Arterien 1954 Arteriovenöse Anastomosen . . . 1953 Artoms Fixierungsmethode . . . . 2384 Ascaris megalocephala . . . . 2378 ff. Aschenanalyse 1190 ff. Aschenbild 1190 ff. Asepsis bei Gewebekulturen . . 155 f. Asphalt (Paraffinzusatz) 428 Asphaltlack 821 Aßmanns Blutfärbung 1356 Asterias Eier 2143 Äther zum Entfetten 1477 —, Entwässern dess 448 —, Prüfung auf Wasser- u. Alkoholgehalt 449 — Reinigung dess 448 Äther-Alkohol (Blutfixierung) . . 1327 — für Celloidineinbettung . . . . 450 Ätherische öle 414 Äthyläther, Verhalten 390 Äthylalkohol, Verhalten 333 Äthylurethan (Fixierung) . . . 1630 Atmungsorgane 2108 ff. Atraktosomen . . . . 18t)j, 2038, 2187 —, Färbung nach Clara 2033 —, Schaffer 2187 2016 Atropin Ätzkalk 381 Auerbachscher Plexus . . . . 208 > Aufbewahren der Gelatineblöcke . 476 — mikroskop. Präparate . . . . 853 Aufblättern bindegewebiger Membranen 1435 Auf blocken von Celloidinblöcke.i . 484 Paraffinblöcken 482 Aufhellung von Schnitten . . . . 852 Embryonen . . . . 85* ff., 2410 f. Knorpelknochenpräparaten . 1596 sehr dicken Schnitten . . . 851 — nach Aurell 852, 909i Lundvall 1513 Spalteholtz 854 O. Schlitze 1657 Aufklebemethoden s. unter Aufklebeverfahren Aufkleben brüchiger Objekte (Dotter) 2415 Aufklebeverfahren, Allgemeines . . 520 Aufklebeverfahren für Ce11oidinschnitte nach Anitschkow 553 — Apäthy 567 — Carazzi 560

638

Sachregister

§§

A u f k l e b e v e r f a h r e n (Forts.) f ü r C e 11 o i d i n s c h n i 1 1 e nach Dantschakoif 557 — v. Fieandt 562 — Jordan 559 — Levi 566 — Maximow 557 — Obregia 563 — Olt. 561 — Weigert 565 für Celloidin-Paraffinschnitte nach R u y t e r 553 — Pfuhl 554 für Gefrierschnitte nach Anitschkow 568 — Heringa ,471 — Iwanoff 568 — Olt 569 — v. Szüts 569a f ü r ö 1 c e i l o i d i n s c h ni tte nach Apäthy 567 für Paraffinschnitte mit Celloidin 548 — Collodium-Ricinusöl . . . . 2415 — Eiweiß 541 ff. — Gelatine 549, 550 — Serumalbumin 543 — Wasser 533 ft. nach Apäthy 546 — Henneguy 546 — Mayer 541 — Michaelis 551 — Obregia 548, 562 — Olt 549 — Ruyter 547 — Straßer 2415 — Szombathy 550 f ü r Paraffin-Celloidinschnitte s. u. Celloidin-Paraifinschnitte Auflichtmikroskopie . . 63 ff., 68, 151 Auflösungsvermögen . . . . 1 6 , 33, 66 Aufspannen der Nerven . . . . 1890 f. Aufspannen von Darmstücken Membranen usw 2052 Aufsuchen jüngster Entwicklungsstadien 2460 ff. Aufzucht von Reptilieneiern . . . 2420 Auge 2305 ff. Chorioidea 2340 ff. Fixierung in toto 2308 ff. Glaskörper 2316 ff. Hornhaut 2320 ff. Iris 2337 ff. Linse 2343 ff. Netzhaut 2347 ff. Augenlinse (Okular) 11 Aurantia-Eosin-Indulin (Blut) . . 1372 Aurantia-Säurefuchsin-Toluidinblau (Mitochondrien) 994 Ausblasen der P r ä p a r a t e . . . . 630 Auspinseln von Schnitten . . . . 1998

§§

Ausschütteln von Schnitten . . . 1999 Ausstrichpräparat von Blut 1317 ff. — Organen 925, 1335 — Spermien 2167 Fixierung durch Hitze 1328 — Methylalkohol 1325 — Osmiumsäure 932 — Jod-Formol-Osmiumsäure . . 1329 Färbung mit Carminessigsäure 927 — Gentiana violett 937 — Opalblau 2167 — Safranin-Lichtgrün . . . . 936 Auswaschen . 360 ff. Auswaschen der Schnitte . . . . 583 Autogenes Blutplasma 166 Autoklav 156 Automatische Behandlung der P r ä p a r a t e 2475 Autotechnicon 2475 Azanfärbung 1489 A-Zellen (Pankreas) nach Bensley 2227 ff. Bloom 2230 Ferner 2231 Grobety 2477 Lane 2227 Azetalphosphatide 1241 Azeton, s. Aceton Azofuchsin . 2270 Azocarmin 1489 Azocarmin-Pasini 1504 Azophloxin 664, 1498 Azosäure 1740 Azur II Eosin (Schnittfärbung) . . 1396 , Ausstrichfärbung . . . 1357 ff. Azur-Granula 1357 Azurpräcipitation 1370 Azur-Tanninmethode nach H e r x h e i m e r 2291 B. B-15 310 Babes Safraninlösung 6J4 Bakterienfilter 125 Balints Puffergemisch . . . . 1343, 1368 Balsamflasche 839 Bänderschneiden 505 Bariumbichromat 248 Bariumchlorid (Erzeugung von Systole) 1947 — (n. Forsgren f. Gallennachw.) 2094 f. Bariumsulfid 113 Bartels, Lymphgefäßinjektion . . . 1989 Barytwasser (Einwirkung auf Bindegewebe) 1458 Basalfilamente 2043 Basalgekörnte Zellen . . . 2067, 2071 ff. , Färbung 2075 f. , Fixierung 2072 ff.

Sachregister

§§

Basalgekörnte Zellen, frisch . . .2071 , Silberreaktion 2077 Basalzellen (Drüsen) 2044 Basiplastin 724 Basische Farbstoffe . . . 600, 689, 690 Basische Vitalfärbung 772 ff. Basisches Bleiacetat 1408 Basophile Punktierung (Erythrocyten) 1376 ff. Basophile Zellen d. Hypophyse . 2196 ff. Basophilie 602 Basophilpunktierte Erythrocyten 1306a Bauchspeicheldrüse 2039 ff. Bauer, H., Glykogenfärbung . . . 1104 —, Nuklealfärbung 1238 Bauer, K. F., Gewebekultur 169, 176, 184 —, Gliafärbung 1876 —, Pyridin-Celloidin 459 Bautzmann, Entfernung der Eihüllen 2410 —, Pikroblauschwarz Modif. . . . 2416 Becher, H., Darstellung von Kanälchen durch Lufteinschluß 1991 —, Piasmaireaktion . . . . ' . . 1245 Becher, S., Färbemethoden . . . 731 ff. Becherzellen 2069 Beckesche Linie 801 Befruchtung 2378 ff. —, künstliche (Fische) 2395 —, — (Amphibien) 2405 —, Säugetiere 2461 ff. —, Vögel 2427 Beize (Färbung) 606 Beizenfarbstoffe 731 ff. Beiars Einbett.-Meth 2387 Belebungsflüssigkeit f. Spermien . 2166 Belegzellen 2058, 2061 ff. Beleuchtungsapparat 31 Beleuchtung zum Mikroskopieren 37, 82 Beleuchtung nach Köhler . . . . 42 Bellings, Carminessigsäuremeth. . . 927 Bemalen des Wachsmodells . . . 894 Bendas Markscheidenfärbung . . . 1832 — Mitochondrienfärbung . . . . 996 Mitochondrienfixierung . . . 970 — Safranin-Lichtgrünfärbung . . 952 Bennholds Amyloidfärbung . . . 1575 Bensley, Inselmeth 2224 —, Millons Reagens 1248 —, Mitochondrienfärbung . . . . 995 —, Mitochondrienfixierung . . . 973 Benutzung des Mikroskopes . . . 20 Benzidin 1171, 1378, 1436 Benzidin-Perhydrol 1966 Benzidinpçroxydasereaktion 1171, 1378 Benzin 390 Benzoesaures Benzyl 398 Benzoesaures Methyl 392 Benzol (Durchtränken) 400 — Prüfung 402 — Reinigung 403 — Verhalten 390

639 '88

Benzolichtbordeaux . . . . 676, 1507 Benzoylperoxyd (Wiederauffrischen) 630 Benzylalkohol 390, 848 Benzylbenzoat . . . . . 390, 398, 854 Beobachtungflüssigkeiten, indifferente 116 ff. Berblinger, Hypophysenfärbung . 2197 Berg, Differenzierung von Silberimprägnation 1539 —, Ninhydrinreaktion 1249 Bergamottöl 390, 414, 415 Berlinerblau f. Injekt. v. Blutgefäßen 1982 Gallenkapillaren . . . . 2097 Lymphgefäßen . . . . . 1989 Berlinerblau-Reaktion (Eisen) . . 1205 Bernauer, Polarisationsfilter . . . 61 Bernsteinlack 816, 821 Bernsteinlackkitt 865 Beschneideritzer 882 Beschriften der Objektträger . . 528 ff. Beseitigung der Silberimprägnation 1542 Bestimmen des Brechungsindex . . 801 — der Pole 41 — des Schmelzpunktes von Paraffin 425 — der Stromart 41 — der Vergrößerung . . . 84 f., 899 ff. Bests Glykogenfärbung 1102 Betäubung von Wassertieren. 103, 107 Bethes Darstellung der Neurofibrillen i. Zentralnervensystem 1782 peripheren Nerven . 1902 — Fixierung der vital. Methylenblau-Färbung 1936 ff. Bewegung, aktive, der Leukocyten 1309 Bichromat-Schwefelsäure . . . . 97 'Bielschowsky-Maresch 1518 B i e 1 s c ho w s k y s M e t h o d e f. B i n d e g e w e b e . . . . 1525 ff. — Differenzierung 1539 — Modif. nach Foot 1531 f. N e r v e n e n d i g u n g e n . 1911 ff. f. N e u r o f i b r i l l e n im Z e n t r a l n e r v e n s y s t e m 1786 ff. — Modifik. mit Pyridin . . . 1788 ff. — nach Agduhr 1792 Gros-Schultze 1793 Reumont-Lhermitte . . 1796 a f. N e u r o f i b r i l l e n d e r p e r i p h e r e n N e r v e n . . 1909 ff. — Modifikation nach Boecke . . 1912 Reumont-Lhermitte . . .1912 f. N e u r o g l i a 1873 Billrothsche Milzkapillaren . . . 2007 Bindegewebe 1454 ff. —, argentophiles 1517 —, chromophiles 1508 —, chromophobes 1508 —, elastisches . . . 1463 ff., 1556 ff. —, gallertiges 1461 —, kollagenes . . . . 1454 ff., 1483 ff. —, retikuläres . . . . . . . 1460

640

Sachregister

Bindegewebe, Färbemethoden m i t Alizarinrot S 746 — Alizarinviridin 746 — Anilinblau-Orange-Säurefuchsin (Mallory) 1486 — Azan 1489 —• Azocarmin-Amlinblau-Orange (Heidenhain) 1489 — Azophloxin 664, 1498 — Chromotrop 2 K 1507 — Chromsäure-Hämatoxylin (Verocay) 1515 — Goldchlorid-Sublimat (Biondi) 1882 — Hämatoxylin-SäurefuchsinAnilinblau (Masson) . . . . 1496 — Kernechtrot 745 — Kernechtrot-AmiinblauOrange 1492 1511 — Naphtholschwarz — Orcein (Taenzer-Unna) . . . 1556 — Phosphorwolframsäurehämatoxylin (Hueter) . . . 1514 —• Pikroblauschwarz . . . . 1505 — Pikronigrosin 1506 — Resorcinfuchsm 1560 — Resorcinfuchsin-Pikrinsäurefuchsin 1563 — Resorcinsfuchsin-Scharlach R 1566 1491 — Säurealizarinblau — Säurefuchsin-OrangeLichtgrün 1494 — Säurefuchsin-Pikrins ä u r e (van Gieson) . . . . 707 , Modif. von Curtis . . . 708a , Hansen 709 , — — Weigert 708 — Silber , nach Achucarro . . . . 1544 , — Bielschowsky . . . 1525 ff. 1531 — —, — Foot , — Gömöri 1533 , — Klarfeld 1545 • , — Laguesse 1537 , — Laidlav 1531 , — Oliveira 1555 , — Pap 1532 , — Perdrau 1883 — —, — Rio Hortega . . . 1547 ff. , — Volterra 1549 , — Wilder 1536 — Thiazinrot-Pikrinsäure . 710, 1509 — Tuchechtgelb 712 — Wasserblau-Orcein-EosinSäurefuchsin 1499 n a c h Achucarro 1544 — Becher 746 — Bielschowsky 1525 ff. — Biondi 1882 — Calle ja 715, 1508 — Crossmon 1494 — Curtis 708a — Domagk 1492

§§ Bindegewebe, Färbemethoden n a c h Foot 1531 — Gömöri 1533 . 1498 Goldner . 709 Hansen . 1489 Heidenhain . . . . 1509 Heidenhain-Neubert . Ii 63 Hornowsky . . . . 1514 Hueter . 15-:5 — Klarfeld . 1504 — Kohashi . 1537 — Laguesse . 1532 — Laidlav . 1486 — Mallory . 1496 — Masson . 1555 — Oliveira . 1529 — Pap . 1499 — Pasini . 1883 — Perdrau . 1491 — Petersen . 1493 — Reisinger — Ribbert 1514 — Rio Hortega 1546 ff. — Salazar 2155 — Taenzer-Unna 1556 — van Gieson .70 — Verocay . . 1515 — Volkmann u. Strauß . . . 1563 — Volterra 1549 . . . 7 1 2 , 1497 — Wallart-Houette — Walter 150? — Weigert 713, 1561 — Wilder . . . . 1530, 1532, 1533 Bindegewebe, frisches Präparat . l-:51 ff. —, Verdauungsmethoden . . . . 1467 ff. —, Verhalten gegen Reagenzien 1456 ff. Bindegewebsknorpel 1595 Binnenapparat 1002 ff. nach Aoyama 1023 1020 — Cajal (Urannitrat) — Da Fano 1022 — Kolatschew 1009 — Kopsch 1009, 1016 — Nassonow . . . 1009, 1010, 1015 — Sjövall 1018 — der Ganglienzelle 1760 —, Vitale Beobachtung . . . . 1002 ff. 3 Binokulare Lupe — Fernrohrlupe 80 — Mikroskop 79, 81 3 — Stirnlupe Binokularer Tubusaufsat2 . . . . 72 Biondi-Ehrlichs MethylgrünOrange-Säurefuchsin . . . 721, 722 Biondis Goldimprägnation (Bindegew.) 1882 Bismarckbraun 730 Bitukni 72 Bitumi 72 Bizzozero, Färbung von Ausstrichpräparaten 937

Sachregister

§§

Blaues Polychrom 1415 Orange 2290 Orcein 2289 Blaufilter 47, 49 Blauglasscheibe 42 Blauschwarz 1505 Blei (Nächweis) 1225, 1231 Bleiacetat (Mastzellenfixierung) . . 1408 Bleiacetat-Förmol n. Lison . . . 2073 Bleichen natürlicher Farbstoffe . 1114 ff. — osmierter Präparate . . . 983, 1013 — von Golgi-Substanz . . . . 1013 f. Mitochondrien 983 Bleichung m i t Chloralkohol 1118 — Diaphanol 1120 — freiem Chlor 1118 — Kaliumpermanganat-Oxalsäure 1121 — unterchloriger Säure . . . . 1119 — Wasserstoffsuperoxyd . . .1116 — Wasserstoffsuperoxyd-Kalilauge 1117 n a c h Alfieri 1121 983 — Cowdry — Kopsch 1119, 1013 — Lustgarten 983 — Mayer, P 1118 — Pal 983 — Schultze, P 1120 — Strauß 1117 — Veratti 1121 Bleimethode n. Corning 1775 Bleivergiftung, basophile Punktierung 1376 Blende • . . . 7 Bleu de Lyon 719 — Carmin 719 Mucicarmin 1586 Bleu BZL 1051, 1841 Blockimprägnation n a c h Bielschowsky . . . . 1789 f. — Agduhr 1792 1912 — Boeke — Castro de 1689 — Cajal 1797 ff. —• Faworsky 1919 — Foley 1813 — Perez 1920 — Ranson 1812 Blum, Formolfixierung 264 Blut 1293 ff. Blutausstrich 1317 ff. dickes Tropfenpräparat . . 1323, 1365 Entnahme 1293 ff. Färbung 1336 ff. — m i t Azur-Eosin 1357 Benzidin 1378 Dahlia 1373 Karbolfuchsin . . . . 1384 f. Lugol-Methylenblau . . . 1380 Methylenblau . . . 1374, 1376 41

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aull.

641

§§

B l u t a u s s t r i c h (Forts.) Färbung — - m i t Panchrom 1369 Panoptisch 1367 Sudan 1381 Triacid (Ehrlich) . . . . 1375 (Pappenheim) . . . . 1375 Triglyzeringemisch . . . 1372 — n a c h Aßmann 1356 Giemsa 1357 ff. Goldmann 1381 Hirschfeld 1380 Jenner 1352 Kardos-Pappenheim . . . 1370 May-Grünwald 1352 Pappenheim 1367 Savini 1381 Sehrt . 1381 Fixierung — des feuchten ^ Ausstriches . 133011. lufttrockenen Ausstriches 1325 ff. frisches Präparat — rote Blutkörperchen . . . 1298 ff. — Verhalten geg. Reagenzien 1299 ff. — Untersuchung nach Arnold . 1301 — Beobachtungsflüssigkeiten . . 1302 — Reticulocyten 1305 ff. — weiße Blutzellen 1309 — Supravitalfärbung 1303 — Blutplättchen . . . . . . 1314 ff. Schnittpräparat Färbung 1396 — m i t Azur-Eosin Blaues Polychrom . . . 1415 eosinsaurem Methylenblau 1395 Giemsalösung . . . . . 1401 Kardosgemisch 1407 Kresylechtviolett . . . . 1411 Methylgrün-PyroninOrange 725 Panchrom-Gemisch . . . 1406 panoptischem Gemisch . . 1403 Phosphormolybdäns.-sulfalizarins. Natrium . . . . 752 polychrom. Methylenblau . 1412 Siena-Orangereagens . . 1417 Toluidinblau . . . 1408, 1411 — n a c h Carere-Comes . . . . 1417 Dominici 726 Ellermann 1395 Giemsa . . . . . . . . 1401 Holmgren 1408 Kardos 1407 Lehner 1411, Lepehne 1436 Maximow 1396 Nocht 1396 Okajima 752 Pappenheim panchrom . . 1405 panoptisch 1403 Slonimski u. Lapinski . . 1437 Unna 1412

642

Sachregister

§§ Blutbildungsherde 1389 — Dotter — Leber 2086 Blutfarbstoffe 1134 ff., 1433 ff. Blutfibrin, Färbung nach Kockel . 1429 —, — — Schueninoff 1430 —, Weigert 1424 Blutgefäße 1954 ff. —, Elastinfärbung . . . 1556 ff., 1955 ff. —, Endothelien 1280, 1963 ff. —, Injektion 1968 ff. —, Korrosion 1985 —, Lebendbeobachtung a. Menschen 149 1439 ff. —, — an Tieren Blutgerinnsel, Entfernung . . . . 1443 Blutkörperchen —, isolierte Darstellung im Schnitt 1417, 1436, 1437 —, Verhalten geg. Reagenzien . 1299 ff. —, Zählung 1442 ff. Blutkreislauf 149, 1439 ff. Blutkristalle 1433 f. Blutlanzette 1293 Blutlaugensalz z. Eisennachweis 1204 ff. Boraxlösung nach Weigert . . 1822 Lithiumcarbonat nach Kultschitzky 1825 Blutpigment 1134 ff., 1433 ff. Blutplättchen Ausstrich-frisch 1314 nach Degkwitz 1316 — Fonio 1450 — Lenggenhager 1452 im Schnitt 1419 Zählung 1450, 1452 Blutplasma, Gewinnung 157 —, autogen, homogen 166 Blutplasma-Gel 1432' Blutplättchenfixativ 1316 Blutserum 1302 Blutzellen, Lipoidfärbung . . . . 1381 Bodian, Silbermethode 1816 Böhmersches Hämatoxylin . . . . 1632 Böhmigs Gelatineauflösung . . . 470 Boeke's Darst. der Nervenend. . . 1912 Bolcek's Gemisch 306 Bonner-Lösung 1155 Borat-Glyceringelatine 807 Boratpuffer 807 Boraxcarmin (alkol.) 634 — (wässerig) 634 Bleu de Lyon 719 Gelatine 1981 Lichtgrün 950 Pikrinsäure 713 Borax-Ferricyankaliumlösung (Markscheidenfärbung) . . . . 1822 Borbergs Nebennierenfixierung . . 2213 Bordeaux-Hämalaun 2282 Bordeaux R 2282, 2283 Borns Plattenmodelliermethode . . 878 — Wärmetischchen 538

§§

B o u i n s Fixierungsgemisch . . . 305 — Modif. nach Allen 310 Duboscq-Brasil 308 Hollande 309 — Krällinger 943 Langeron 307 Bouin, Celloidineinbettung nach . . 306 Boveris Fixier-Gemisch 2381 1699 Bowmannsche Scheiben Brandt'sche Netzteilung 1442 Brasilin 948 Braunmühl v., Silbermeth 1880 Brechungsindex 801 Brechweinstein (Fixierung von Anilinfärbung) 627 Brenztraubensaures Natrium . . . 1944 Bresslau's Opalblau 2167 Brillant-Kresylblau 1305 f. Brillantkresylviolett (Indikator) . . 1262 — (Vitalfärbung) 2464 Brillantvitalrot (Indikator) . . . . 1262 2464 — (Vitalfärbung) Brillenglaskondensator 34 Brillenglasdunkelfeldkondensator . 55 Bromalin-Silbermethode . . . .1873 Bromammonium 1849 Brom-Formol n. Cajal 1849 Silbermethode 1854 Bromwasserstoffsäure 1852 Brunnersche Drüsen 2078 Brunstzyklus 2446, 2447, 2453 f., 2456 Brunsterscheinungen 2446 ff. Brunstzeit 2394, 2403, 2419, 2458 ff. Brunswick, Histidinnachweis . . . 1253 Brutapparat 2427 Brütezeiten 2430 Bubenaites Golgi Modif 1773 Buchenholzkreosot 1858 Burgdorf, Hypophysenfärbung . . 2197 Burke, Fixierung 267 Butylalkohol 358 —, Verhalten 390 — und Celloidin . 387 B-Zellen (Pankreas) nach Bensley 2227 ff. — — — Bloom 2230 — — — Ferner 2231 — Grobety 2477 Lane 2227 C. Cadmiumchlorid-Glycerin . . . . 805 Caedax 837 C a j a l - Methoden f ü r Achsenzylinder . . . . 1797 ff. Brom-Formol-Silber 1854 f ü r Ganglienzellen 1769 — Gefrierschnitte 1806 mod. von Cowdry . . . . 1807 — Glia 1849 ff. — Golgiapparat s. Golgi-Substanz

Sachregister C a j a 1 - Methoden (Forts.) Golgimethode 1769 Goldsublimat 1849 für Kleinhirn . . . 1799, 1805, 1806 — Nerven 1797 ff., 1918 1797 ä . — Neurofibrillen — Retina 2354 f. Silbermethoden 1798 ff. Uran-Formol 1856 Urannitratmethode 1020 Cajeputöl 1753 Calcium (metall., z. Entwäss.) . . 381 Nachweis - . . 1216 ££. 1220 — nach Crétin Erös 1634 Gömöri 1639 Grandis u. Mainani . . . 1219 Kossa 1637 Macallum 1221 Pommer 1633 Rabl 1217 Roehl 1640 Calciumbichromat (Fixierung) . . 248 Calciumcarbonat (Neutralis. v. Formol) 257 Calciumchlorid (Celloidineinb.) . . 457 408 — (zum Entwässern) — (als Zusatzflüssigkeit) . . . . 122 Calciumoxyd (zum Entwässern) . . 381 Calciumphosphat-Nachweis 1638, 1640, 1641 Cilcium salicylicum-Formol (Fettseifen-Nachweis) 1072 Callejas Bindegewebsfärbung . . .. 715 Camsal 851 Canadabalsam 840 ff. —, Lösung 842 —, Neutralisierung 841 — n. P." Masson 843 Carbolfuchsin 1385 Carbol-Kreosot-Xylol 1858 Carbolthionin 1643 Carbolwasser-Gentianaviolett . . . 704 Carbolxylol 831 Carboxylgruppe und Farbstoff . . 599 Carere-Comes (Erythrocytenfärbung) 1417 (glattes Muskelgewebe) 1731 (Kalium-Nachweis) 1215 Carmalaun-Indigocarmin 714 Carmin 631 —, isoelektr. Punkt . . 633 —, Prüfung 631 927 Carminessigsäure-Methode Carminfibrin 1469 Carmingelatine (Injektion) 1980 Carminlösungen Alauncarmin . . . . 639 Aluminiumsulfatcarmin 638 Ammoniakcarmin . . 1778 641 n. Belling 1103 n. Best 634 Boraxcarmin alkoh. . 41*

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C a r m i n l ö s u n g e n (Forts.) Boraxcarmin wäßr 484 Carmalaun (P. Mayer) . . . . 642 Carminessigsäure 640 Chromalauncarmin 637 Cochenilletinktur 645 Eisenalauncochenille . . . 645, 2417 n. Forel 1778 n. Fyg 637, 638 n. Gerlach 1778 n. Grenacher 639 n. Krause 643 Lithiumcarmin 636, 770 Methylcarmin 635 n. P. Mayer . . 642, 643, 644, 2025 Mucicarmin 2025 Neutrales Carmin (Injektion) . . 1980 n. Orth 636 Paracarmin (n. P. Mayer) . . . 643 n. Schneider 640 n. Schwarz 635 f. Vitalfärbung 770 Carmin-Mehrfachfärbungen — Bleu de Lyon 719 — Indigocarmin 714 — Lichtgrün 950 — Methylenblau-Chromotrop . . . 1585 — Methylviolett 2060 — Pikrinsäure 713 Carminsäure 631 Carminvitalfärbung 770 Carnoysche Flüssigkeit 226 Carotinalbumine 1146 Carotinoide 1109, 1142, 1143 Carrels Gewebekulturflaschen . . 171 Caspersson, Absorptionsmessung . 919 —, Ultraviolettmikroskopie . . . . 67 Cedernöl, Brechzahl 846 — f. Celloidirieinbettung . . 460, 462 — f. Durchtränken 416, 417 — f. Einschluß 846 — f. Immersion 25, 847 — Prüfung 847 — Verhalten 390 Cedernöl-Celloidin 402 Cedukol 445 — f ü r Methylbenzoatgemisch . . . 395 Celloidin 442 ff. A u f b l o c k e n von Celloidinmaterial 484 ff. A u f k l e b e n von Celloidinschnitten 555 ff. Celloidinparaffinschnitten 553 f. B e r e i t u n g der Lösung . . . 543 E i n b e t t u n g in Alkoholcelloid. 450 ff. , Celloidinparaöin 463 548 Glycerincelloidin 457 Methanolcelloidin 460 ölcelloidin . . 459 Pyridincelloidin

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Sachregister

C e 11 o i d i n (Forts.) E i n b e t t u n g nach v. Apathy . 450 Bauer • . 459 Seki 454, 457 Wolf 458 — — Zach 455 E n t k a l k e n nach Celloidineinbettung 1608, 1611 S c h n e i d e n v. Alkoholcelloid. 510 Ölcelloidin 511 Weiterbehandlung von Alkoholcelloidinschnitten . 584 — Celloidinparaffinschnitten . 588 — ölcelloidinschnitten . . . 585 Celloidineinbettung von BouinMaterial 306 Celloidinieren 1095 Celloidinparaffin 463 — n. Apathy 464 Pfuhl 466 Seki 466a Wassermann 465 Celloidintrockenmethode . . . . 460 ff. Celloidinüberzug 1095 Cellophan (Eindecken) 95 877 — (Rekonstruktion) Cellophanfolie z. Schnittaufkleben 569a Cellophan-Schiebemodell 877 Celluloid-Aceton (Umranden) 817 Celluloidfolien 877, 897 863 Celluloidplatten (Montage) . 897 — (Rekonstruktion) . . . 480 Celodal Centrainervensystem s. Nervensystem Centrifuge (zum Auswaschen usw.) 1277 Centrophormien 1760 957 ff. Centrosom Cesaris-Demels Frischfärbung . 759 298, 972 Champys Fixierungsgemisch Chinin z. Fixierung . . . 1777 945a Chironomus, Speicheldrüsen Chitin 1104, 1672 . 2298 —, Aufhellen 2300 ff. —, Erweichen . 2298 —, Fixierung . 2064 Chlor (ionisiert), Nachweis —, nascierendes z. Bleichen 1118 Chloralhydrat (f. Hämalaun) 651 1947 — (Erzeugung von Diastole) 1689 — (Darst. von Nervenendig.) 1689 Choralhydrat (z. Fixierung) 1980 — (Zusatz z. Injektionsmasse) Chloralhydrat-Formalin (Konservierung nach Jores) 860 Chloralhydrat-Glycerin . 805 1118 Chloralkohol 2025 Chloraluminium . . . . 2303 Chlordioxyd (Herstellung) Chlordioxyd-Essigsäure 2300 Chlordioxyd-Salpetersäure 2301 Chlordioxyd-Schwefelsäure 2301 Chloreton 103

Chloroform 406, 390 — f. Narkose 102 —, Reinigung 408 —, Verhalten 39Q —, Verwendung z. Härtung v. Celloidin 450, 465, 466 Chloroform-Alkohol-Eisessig gemisch n. Carnoy 226 Chlorophyll 1052 —• Einschlußflüssigkeit, für . . . 810 Chlorophyll-Carmmfärbung . . . 1052 Chlorwasser (Bleichen) 1119 Chlorzink (Fixierung) 229 Cholesterin 1074 ff. Cholesterinester 1074 Cholesterinnachweis mit Digitonin . 1080 1079 — nach A. Schultze Cholinergische Nerven 2046 Chondriokonten s. Mitochondrien . 966 Chondriosomen s. Mitochondrien . 966 Chondroitinschwefelsäure . . 1257, 1580 Chondromucoid 1580 Chorioidea 2340 Christeller (Gefrierschnitt) . . . . 519 — (Wismutnachweis) 1230 Chromaffines Gewebe 221011. Chromaffine Reaktion 2211 ff. , Ausführung 2213 , Wesen ders 22i2 Chromalaun (Fixierungszus.) . . . 977 Chromalauncarmin 637 — Pikrofuchsin 707 Chromalaun-Essigsäure-Kupferbeize n. Weigert 1822 Chromatin, Färbung 925 ff. —, Untersuchungsmethoden . . 910 ff. Chromazonrot 2270 Chrom-Essigsäuregemisch (Fixierung) 233 (Entfernung des Dotters) . . 2398 Chromogen 599 Chromogen-Ameisensäure-Natriumsulfit n. Weigert 1845 Chromolipoide 1109, 1137 Chromophiles Bindegewebe - . . 1508 Chromophobes Bindegewebe . . . 1508 Chromophor 599 Chrom-Osmium-Essigsäuregemisch nach Flemming, stark . . . 290 ff. — schwaches Gemisch 292 — nach Fol 292 Chromosomen, Carminessigsäuremethode 927 ff. —, Gentianaviolett n. Geitler . . . 937 —, Lebendbeobachtung . . . . 912 ff. —, Safranin-Lichtgrün n. Geitler . 936 —, Spiralstruktur 930 —, Ultraviolettphotographie n. Caspersson 919 —, Totalpräparat 925 ff. —, Vitalfärbung 920 Chromotrope Lipoide 1898

Sachregister

§§

Chromotrope Substanz, Nachweis . 1257 Chromotrop 2 R •. 665, 1507 Chromotrop-Methylenblau . . . . 1585 Chromreaktion (Nebenniere) . . 2211 ff. — (basalgekörnte Zellen) . . . . 2072 Chromsäure Fixierung 232 Ganglienzellisolierung . . . . 1739 Hämatoxylinfärbung (Verocay) . 1515 als Isoliermittel 1275 Chromsäure-Gemische Chromsäure-Eisessig 233 Chromsäure-Formol-Eisessig . . 944 Chromsäure-OsmiumsäureEisessig 290 ff. Chromsäure-Sublimat-Eisessig 290 ff. Chromsaurer Ammoniak (neutral) 2125 Chromschwefelsäure (zum Reinigen von Glas) . . 97 Chrysoidin (Vitalfärb, von Golgisubstanz) 1003 Chrzonszczewskys Methoden . . . 2098 Ciaccios Lipoiddarstellung . . . . 1082 — Differenzierung zw. Lipoidenu. Neutralfetten 1083 Ciliarkörper 2340 f. Clara, Alveolarepithel 2113 —, basalgekörnte Zellen 2076 —, Gallenkapillaren . . . . 2108, 2106 —, Hämatoxylin 687 —, Lunge 2111 —, Niere 2128 Cochenille-Eisenalaun 2417 Cochenille-Tinktur 645 Cochlea 2359 ff. Coelestinblau . . 742 — f. Schleimfärbung 2035 Coerulein A 1628 Collier, Puffergemisch 1342 Colloxylin 446 Conchiolin 1672 Congorot f ü r Amyloid 1575 — — Belegzellen 2061 elast. Gewebe 1568 Keratin 2272 Schmelzprismen 1681 Congorot-Phosphormolybdänsäure . 1568 Coriphosphin O 955 Corium 2287 Cornea 2320 ff. Corneafibrillen 2324 Cornein 1672 Comings Bleimethode 1775 Cortisches Organ 2360 ff. Cox, Einschlußmedium 1774 —, Ganglienzelldarst 1774 Cowdrys Mitochondrienfärbung 990, 995 Cresylechtviolett 2266 Crinis de, Goldsublimatmethode . . 1777 Crossmon, Bindegewebsfärbung . . 1494 Cuprum aceticum bei CowdryBensleys Mitochondrienfärbung . 990

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§§

Cuprum aceticum bei Weigerts Markscheidenfärbung . . . . 1822 — bichromic. (Fixierung) . . . . 248 — sulfuricum (z. Entwässern von Alkohol) 382 Curare 110 Cutisbindegewebe 2288 ff. Cyankali zur Differenzierung von Silberpräparaten 1539 — zur E n t f e r n u n g von Silberniederschlag 1542 Cyanwasserstoff zum Bleichen von Silberpräparaten 1819 Cytoplasma 957 ff. D. Da Fano, Silbermethode . . . 1022, 2131 Dahlia (zur F ä r b u n g der Mastzellengranula) 1373 — (Vitalfärbung v. Ergastoplasma) 1000 — ( Golgi-Substanz) . . . . 1003 — (für Zellverbindungen) . . . . 2257 Dammarharz (Einfechlußmedium) 845 — mit Cedernöl verdickt . . . . 1991 Dammarlack 845 Dampfgemisch nach Werzberg (zur Fixation) 1329 Darm, Untersuchung . . . . . 2065 ff. Dauer der Celloidin-Durchtränkung 450 Fixierung 209 P a r a f f i n d u r c h t r ä n k u n g . . . 419 Davenport, Nervendarstellung . . 1992 Deckgläschen 94 ff. —, Ersatz durch Cellophan . . . . 95 —, Gelatine 822 —, Glimmer 94 —, Reinigung 97 Deckglasdicke 18 Deckglaskultur 152 ff. Deckglaspräparate bei Blutuntersuchung 1318 —, Umranden 814 ff. Deckglastaster • 18 v Deckweiß-Gelatine . 1984 Deckzellen (Lunge) 2113 f. 2128 — (Niere) Definierflächen 874 Degeneration von Deckglaskultur . 163 Degeneration der Achsenylinder . 1883 Markscheiden 1838 ff. Degkwitz, Blutplättchenfärbung . . 1316 Dekahydronaphthalin 399 Dekalin 390, 399 Delafields Hämatoxylin 688 , Schleimfärbung . . 2029 Delamination 2423 Demaskieren, Eisen 1208 ff. —, Eisen in Pigment 1122 —•, Fibrillen in Knorpel 1591 Denaturierter Alkohol 386 Dentinfibrillen 1683, 1684

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Sachregister

§§ 1682 Dentinröhrchen Descemetsches Endothel . . . . 2322 f. Destillationsapparat nach Richards 1521 Destilliertes Wasser Destillieren 1521 Prüfung 1339 Neutralisieren 1338 Pufferung 1340 ff. Diacetin 1047 Diäthylendibxyd • 355 Diäthylsafranin 781 Dial 108 Diallylbarbitursäure 108 Diamantfuchsin = Fuchsin Diaphanol (Bleichen) 1120 — (Erweichen von Hartsubstanz) 2300 Diastole (Herz) 1947 Diazetin-Scharlachlösung . . 1047 Diazine Green 781 Diazokupplungsreaktion . . . . 1256 Dichroismus 62 Dichromsaures Kalium s. Kalium bichromicum Dichromsaures Silber 2102 Dicker Schnitt, Einschluß . . . 852 Dickes Bluttropfenpräparat . 1323, 1365 Dielektrizitätskonstante und Fixierung . 197 Dietrich-Smiths Lipoidfärbung . . 1086 Differenzierung — Allgemeines . 604 — nach Hämatoxylin mit Alaun . 656 — mit Boraxferricyanid . . . . . 1822 — mit Salzsäure . 656 — nach Carmin 634 lì. — nach Silberimprägnation . . . 1539 Diffusfärbungen . 758 Diffusionsgeschwindigkeit nicht wässeriger Flüssigkeiten . 197 Diffusionsvermögen d. Fixierungs flüssigkeit . 193 Digamma . 1189 Digitonin . 1080 Dimedon . 1234 Dimethylcyclohexadion . . . . . 1234 Dimethylparaphenylendiamin 1155, 1180 ff. Dioestrus . 2446 Dioxan . 353 —Giftwirkung . 354 —, Verhalten . 390 —, zum Entwässern von Schnitten . 836 Dioxangemische . 357 Dioxan-Pikrinsäure . 1092 Dioxyphenylalanin . 1178 Dipolmoment und Fixierung . . . 197 Direkte Färbung . 1252 Dixanthydrolharnstoff Dobells Modif. d. Mannfärbung . . 729 ' Dogiels Fixierung der vitalen Methylenblaufärbung . . . . . 1936

§§ Domagk, Eosinlösung . . . . . . 660 662, 664 —, Azophloxin . . 663 —, Kernechtrot —, Thiazinrot-Pikrinsäure . . 707, 710 . . 726 Dominicifärbung —, Modif. von Tischutkin . . . . 727 Donaggio, Neurofibrillenfärbung . 1781 —, primäre Degeneration . . . . 1842 Dopa-Reaktion . . 1179 nach Laidlav Doppelbrechende Lipoide (Neben. . 2221 niere) Doppelbrechung . . . . 60, 1039, 1074 . . 956 — in Cytologie Doppelchromsaures Kalium s. Kaliumbichromat Doppelfärbung (allgemeines) . . . 607 Doppelmesser Doppelokular Doppelt destilliertes Wasser . . . 1521 Doppeltkohlensaures Natrium Natriumbicarbonat = Natriumhydrocarbonat . . 2398 Dotterentfernung . . 2417 Dotterfärbung 2434, 2436 Dotterhaut . . 2152 Dotterkern . . 2301 Drahn (Diaphanol) — (Tetralin) 390 411, 855 Drasch (Delamination) . . . . . 2443 Dreifachfärbting (van Gieson) . . 707 f. D r i t t e l a l k o h o l (Ranvier): 1008 (Epith.), 1722 (gl. Musk.), 1739 (Ganglz.), 1956 (Gefäße), 1930 (Linse), 1961 (Nasenschleimhaut) Drittes Element (Glia) . . . . . 1864 Drüsen (Untersuchung) . . . . . 2011 ff. . . 1880 Drüsen (Gehirn) Duboscq, Fixierungsgemisch . . . 308 . . 1870 Dubrausky, Gliadarst Dubreuils Mitochondrienfixierung . 978 Dünndarm . . 2065 ff. —, basalgekörnte Zellen . . . . 2071 ff. . . 2069 —, Becherzellen —, Brunner'sche Drüsen . . . . . 2078 . . 2068 —, 'Cuticularsaum —, oxyphile Zellen . . . . 2067, 2070 —, Panethsche Zellen . . . 2067, 2070 . 2067 f. —, Saumzellen . . . < . . . 2065 —, Zottenflxierung Dunkelfeldbeleuchtung . . . . . 51 — f ü r Blutzellenuntersuchung . . 1313 Pigmentzellenuntersuchung . 1132 51, 52 ff. Dunkelfeldkondensor . . . . . 58 —, Einstellung . . 54 Dunkelfeld-Trockenkondensor . . 2089 Dunkle Leberzellen Durchfärbung . . 732 mit Beizenfarbstoffen — Carmin . . . . 634, 636, 642, 643 . . 645 — Cochenille 683, 684 — Hämatoxylin . . . .

Sachregister

Durchfärbung mit Nuklealfärbung . . . . . . . . — Piasmaireaktion Durchsichtigmachen s. Aufhellung Durchspülen zur Fixierung . . . Durchströmungskompressorium . Durchtränkung, Allgemeines . . mit Benzol-Paraffin . . . . — Celloidin — CelloidinparafEin . . . . — Gelatine . . . . . . . — Methylbenzoat — Paraffin — Vormedien Durchtränkungsfärbung . . . . Dürcksche Fasern

§§ 1240 . 1246 . 212 . 912 388 ff. 418 . 450 463 ff. 467 ff. 392 419 391 ff. 593 1823

E. Eau de Javelle (Herstellung) . . . 2412 — — zur Entfernung von Eihüllen 2412 Ebners Entkalkungsflüssigkeit . . 1617 Echinuseier 2143 Echtrotsalz B 1256 Edingers Gelatineeinschlußmethode 822 — Zeichenapparat 83 Ehrlich-Biondilösung 721 Ehrlichs Dahlialösung 1373 — Einteilung der Anilinfarbstoffe . 602 —• Fixierung von Blutausstrichen . 1328 — Hämatoxylin 666 — Triacidgemisch . . . . 731 ff., 1375 — Triglyceringemisch 1372 — vitale Methylenblaufärbung . 1928 ff. Ejakulat, Fixierung 2172 Eidechseneier 2419 ff. Eier, Untersuchung im frischen Präparat 2143 — im fixierten Präparat . . 2148 ff. Isolierung von Eizellen 2145 ff., 2460 von Amphibien 2403 2393 — Fischen — Neunaugen 2390 — Reptilien . 2419 — Säugetieren . . . . 2145, 2445 ff. — Vögeln 2144, 2427 ff. — Wirbellosen . . . . 2143, 2377 11. Eierstock 2144 ff. igenfluoreszenz 69 ihüllenentfernung (Amphibien) 2409 ff. Eileiter 2156 Einarson Tigroidfärbung . . 1749, 1750 Einbetten 388 ff. i n Celloidin 442 ff. — Celloidin-Paraffin 463 — Celodal 480 — Gelatine 467 — Glycerin-Celloidin 458 — Glykostearat 430 — Kautschukparaffin 428 — Methanol-Celloidin . . . . 457 — Methylbenzoat-Paraffin . . . 392

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§§

E i n b e t t e n (Forts.) i n Ölcelloidin 460 — Paraffin 391, 432 ff. 459 — Pyridin-Celloidin — Wachsparaffin 427 — Weichcelloidin . . . . 5 1 2 , 2288 Einbetten n a c h Allen 415, 2175 — Apäthy v. (Gelatine) . . . . 468 — Bauer 459 — Belaf 2388 — Gaskell-Gräff 469 — Heringa 471 — Jordan, ölcelloidin . . . . 462 — Krüger 398 — P. Mayer 441 — Peterfi 392, 440 — Petersen 2288 — Pfuhl 466 — Pranter 417 399, 457, 466a — Seki — Wassermann 465 — Wolf 458 Einbetträhmchen . 432 Einbettungsgefäß für Celloidin . . 455 Einbettungsmedium f. Projektionspräparate 838 Eindecken 138 Eindringungsvermögen der Celloidinlösung 451 Einfluß von Dämpfen auf lebende Zellen 917 Eingetrocknete Präparate . 214 Einschluß von dicken Schnitten 852 Knochenschliffen . . . . 1666 Präparaten 800 ff Einschlußfärbung n. Feyrter . . . 1898 Einschlußmittel Alcarin 852 Benzylalkohol 848 Caedax 837 Canadabalsam 840 ff. Cedernöl 846 Dammarharz 845 Euparal 850 Gelatine 822 Gelatinebalsam 575 Glycerin 802 Glycerin-Cadmiumchlorid . . . 805 Glyceringelatine (Glycerinleim) . 806 Glycerin-Pikrat-Gelatine . . . 1945 Gummisirup 812 Kalium aceticum 808 Kolophonium 852, 909a Lactophenol 809 Laevulose 811 Nevillite 838 Paraffinum liquid 849 Salizyl-Canadabalsam . . . . 844 Sandarak-Dioxan 851 Terpineol 848 Terpineol-Canadabalsam . . . 842

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Sachregister

§§ Einschlußmittel für dicke Schnitte 909a — n a c h Cox 1774 Farrant 813 Einspannen des Objektes ins Mikrotom 495 Einstellen mit Mikroskop . . . . 20 Einteilung der Vitalfarbstoffe . .761 Einverleibung des Vitalfarbstoffes . 750 Einzel Vergrößerung 14 Eisen, Beseitigung 1071 —, Nachweis s. Eisennachweis Eisenalaun 672 Eisenalauncochenille . . . . 645, 2417 Eisenalizarin-Anilin-Fuchsin (Seki) 998 Eisen-Ammoniakalaun 672 Eisenammoniumsulfat = Eisenalaun Eisenchlorid (Elastinfärbung) . . . 1561 — (Hämatoxylin) 682 Eisenchloridalizarinlack 752 Eisenhämatoxylin f ü r Kern- und Zellfärbung . . 672 — Markscheiden 1822 ' — Ossifikation 1654 n a c h Häggquist 682 — Hansen 681 — Heidenhain 672 — Janssen 677 — Regaud 988 — Weigert (Kerne) 677 — — (Markscheiden) 1822 — v. Volkmann 1654 Eisenhämatoxylin-Benzolichtbordeaux 676 Bordeaux R 1507 Nachfärbung 676 Pikrofuchsin 709 Resorcinfuchsin-PikrinsäureThiazinrot 1563 Phosphorwolframsäure . . . . 1654 Thiazinrot 710, 1509 Eisennachweis m i t Berlinerblau 1205 1210 — Rhodan wasser stofl — Schwefelammonium . . 1204, 1209 — Turnbullblau 1204 n a c h Kockel 1210 — Liesegang 1206 — Macallum 1209 — Meitzer 1213 — Okamoto 1212 — Schmelzer 1211 — Spatz 1435 — Tartakowsky 1207 — Tirmann und Schmelzer . . 1204 — Wicklein und Falkenberg . . 1205 Eisenoxydammonium (z. Beize) Eisenalaun 672 Eisentrioxyhämatein 681 Eisessig 252 Eisessig-Alkohol-Chloroform . . . 226 Eisessig-Sublimat 331 Eisplasma Methode 158

§§ Eiweiß als Aufklebemittel für Schnitte 541 — bei Fixierung 198 — zur Injektion 1978 Tusche (Glastinte) 530 — als Zusatzflüsigkeit 117 Eiweißabbaustoffe 1247 ff. Eiweißdrüsen 2039 Eiweißglyzerin 542 Eiweißkristalle (Hoden) 2185 Eiweißreaktionen 1247 ff. Elacin 1580, 1571 Elastisches Gewebe frisch 1463 ff. Isolierung 1464 f. Verhalten gegen Reagenzien . . 1464 Verdauung 1467 ff. Färbung m i t Elastin H 1567 — Gentianaviolett 1569 — Kongorot 1568 — Kresofuchsin 1562 — Orcein 1556 ff. — Resorcinfuchsin 1560 — Resorcin-Gentianaviolett . • 1565 — Wasserblau-Orcein . . . . 1500 n a c h Ewald 1569, 1567 — Fischer 1566 — Hollborn 1567 — Hornowsky 1563 — Matsuura 1568 — Pranter 1558 — Spiegel 1562 — Taenzer-Unna 1556 — v. Volkmann u. Strauß . . . 1565 — Weigert 1560 Elastische Fasern in Blutgefäßen 1956 — Haut 2289 — Knorpel 1594 Elastische Membran (isolieren) . . 1956 — Netze 1463 — Scheiden 1569 Elastischer Knorpel . . . . . 1594 Eleidin 2268 Elektive Vitalfärbung . . . . 754, 788 Elektrischwerden der Schnitte . . 506 Elektrohistologische Färbungsreaktion . . " . . . . 595, 754, 1264 Elektrolyse und Entkalkung . . . 2476 Elektrometrische H'-Bestimmung . 1262 Elektronenmikroskop 92 Elektrostatische Färbetheorie . . . 595 Eilermanns Blutfärbung 1395 Embryologische Untersuchungstechnik 2377 ff. Embryonales Bindegewebe . . . . 1461 — Skelett (Totalpräparate) . . . 1596 ff. 1655 ff. Embryonal-Extrakt 166 , Herstellung .168 Empfindlichkeitsgrenze 1189

Sachregister

§§

Endocyten 2091 Endokard 1719, 1952 Endothel der Blutgefäße . . 1280, 1963 Lymphdrüsen 1997 Endocelluläres Neurofibrillennetz . 1781 Enterochromaffine Zellen . 2067, 2071 ff. Entfernung von Eihüllen . . . . 2409 — — Eisen 1071 Formolniederschlag . . . . 274 — — Immersionsöl 27 Kalk 1071, 1604 ff. Luftbläschen 801 Pikrinsäure 303, 306 — — Silberniederschlag . . . . . 1519 Subliipatniederschlag . . . 327 Entfettung von Deckgläsern und Objektträgern . . . 8 f., 97 ff., 1478 — — Knochen 1658 — — Organen 1477 ff. Entgelatinieren des Schnittes . . . 474 Enthaaren 113 Enthärtung nach Formolfixierung . 277 En tj oden 328 E n t k a l k e n , Allgemeines . . 1604 ff. m i t Ameisensäure 1621 — Ameisensäure-Salzsäuregemisch 2476 — Ebnerscher Flüssigkeit . . . 1617 — Elektrolyse 2476 — Flemmingscher Flüssigkeit . 1612 — Müllerscher Flüssigkeit . . . 1622 — Pikrinsäure 1620 — Pikrinsalpetersäure . . 313, 1620 — Salpetersäure 1613 — Salpetersäure-Alkohol . . . 1614 — Salpetersäure-Formol . . . 1614 — Salpetersäure-Phloroglucin . 1614 — Salzsäure 1617 — Salzsäure-Kochsalz . . . . 1617 — Schwefliger Säure 1615 — Trichloressigsäure 1619 n a c h Alexander 1614 — Ebner v 1617 — Haug 1614 — Heidenhain 1619 — Richman 2476 — Schaffer 1613 — Ziegler 1615 f. Entkalkung im Vakuum . . 1605, 1607 —, Prüfung auf Calcium 1608 —, — durch Röntgenstrahlen . . . 1608 — von Knochen 1604 ff. — von Zähnen 1674 Entnahme von Knochenmark . . . 1420 Entparaffinierung 570 Entschlacken (Nervengewebe) . . 1808 Entsilbern 1539 Entspriten 392 f. Entwässern m i t Aceton (nach Färbung) . . 1403 (nach Fixierung) . . . 231711. — Alkohol (nach Färbung) . . 823 ff.

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E n t w ä s s e r n (Forts.) m i t Aceton (nach Fixierung) 364 ff. — Butylalkohol 358 — Calcium 381 — Calciumchlorid 408 — Calciumoxyd 381, 1326 — Dioxan 353 — Kupfersulfat 382 — Natrium .448 —• Natriumsulfat 460 v o n Aceton 217 381 — Alkohol — Äther 448 — Celloidinschnitten . . . . 831 ff. — Chloroform 408 — Dioxan 355 — Methanol 1326 Entwässerungsmethode nach Overton 145 E os in 660 ff. Aurantia-Indulin 1372 Formol-Methylenblau . . . 1395 Hämalaun 659 Methylblau n. Mann . . . . 728 Eosinsaures Methylenblau . . . . 1352 Eosinophile Zellen (Blut) . . . . 1372 (Hypophysis) . . 2195, 2197, 2198 Epicyten (Lunge) 2113 f. — (Niere) 2128 Epidermicula 2281 Epidermiszellen 2256 ff. Epikondensor 64 Epinephele janira 30 Epiobjektiv 64 Epiphysis 2245 11. Epithelfasern 1290, 2259 Eärbung n. Beneke 1428 Heidenhain 2259 K. Herxheimer 2264 Kromayer 2264 Pasini 1499 Patzelt 2262 Rio-Hortega . . . . 1291, 1547 Unna 2265 Epithelkörperchen 218911. Epithelien 1267 ff. — der Nasenschleimhaut . . ' . 2371 ff. Epitheloide Zellen 1958 Epithelverteilung 1292 Erdheim, Hypophyse 2196 Erfassungsgrenze 1189 Ergastoplasma 1000, 2043 Erhitzen der Blutpräparate . . . - . 1328 Erlickische Flüssigkeit 245 Erösp Kalknachweis 1634 Erwärmbarer Objekttisch . . . . 175 Erythrocyten 1298 ff. — basophile Punktierung 1305 ff. — Färbung . . . 1417, 1418, 1436 f. mit Siena-Orange-Gemisch . 1417 — Zählung 1442 ff. Erythrophoren 1143

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Sachregister

§§

Erythrosin 660 — Methylenblau (Held) . . . 1753, 1759 Esakis NeurofibrillenmetHode . . 186 f. Essigsäure 252 —, Einwirkung auf Blutkörperchen 1299 —, —•—• elastisches Gewebe . . . 1464 —, kollagenes Gewebe . . . 1456 Essigsäurecarmin 632 Essigsaures Blei 1408, 2073 808 — Kalium (Einschluß) — Kupfer (Neurogliabeize) . . . . 1845 Esterschwefelsäuren (Nachweis) . . 1257 Euparal (Einschlußmittel) . . . . 850 Explanation 152 ff. Extraktionsapparat für Objektträger- und Deckglasreinigung . 100 F. Facette des Mikrotommessers . . 497 ff. Fair Childs Porzellansiebe . . . . 361 Färbegestell nach Hauser . . . . 582 582 — nach Neumeyer Färbegläser 579 Färbemethoden siehe unter den einzelnen Farbstoff- und Autorenbezeichnungen Färben unaufgeklebter, nicht entparaffinierter Schnitte . . 1752, 1955 Färbetechnik, Einübung 622 Färbewanne nach Mathis . . . . 582 Färbewännchen nach Giemsa . . . 1346 Färbung, adiektive 605 —, Allgemeines ' 590 ff. —, Differenzierung . . . . . . 604 —, direkte 605 —, Dopoelfärbung 607, 706 —, Einfluß der Fixierung . . . . 610 —, Fixierung der Färbung . . . . 626 —, Herstellung der Farblösung . . 612 —, mikrochemische 591 —, progressive 604 —, regressive 604 —, simultane 607 —substantive 605 —•, succedane 607 —, Theorie der 591 ff. —, vitale , 574 ff. — von Wachsmodell 894 — — Erythrocyten mit SienaOrange-Reagens 1417 Gelatineschnitten . . . 478, 677 osmierten Ausstrichen . . . 934 Pigment 1124 ff Vaginalausstrichen . . . . 2449 Wachsmodell 894 Farbfilter 42 ff. Farbfixierlösung n. Giemsa . . . 1363 Farbmarken aus Agar nach Vogt . 790 — Fixierung n. Adams 793 Fyg-Ballzer 794 Lehmann 792

§§

Farbschicht auf Objektträger . . 1303 f. Farbstoffe, Reinheit der 619 Farbstofftabletten 1354, 1359 Farrants Einchlußmittel 813 Faserglia (s. a. unter Neuroglia) 1845 ff. Faworsky, Silbermethode . . . .1919 Feinbewegung (Mikroskop) . . . 10 Fermente, Nachweis 1154 ff. Fernrohrlupe 80 Ferriammoniumsulfat 672 Ferricyankalium = rotes Blutlaugensalz Ferricyankalium (Eisennachweis) . 1204 Boraxlösung (z. Differenzieren) 1822 Lithiumcarbonat (z. Differenzieren) 1825 Ferridammonium tartaricum . . . 1479 Ferrocyankalium = gelbes Blutlaugensalz Ferrocyankalium (Eisennachweis) . 1205 Fett 1027 ff. — und Eisen 1052 — und elastisches Gewebe . . . . 1566 —, Entfernung aus Geweben bei Gefrierschnitten 517 —, — bei Silbermethode . . 1913 —, bei Verdauung . . 1477 ft. Fett, Färbung m i t Aceton-Scharlach R . . . 1046 — Bleu BZL 1051 — Chlorophyll 1052 — Diazetin-Scharlachrot . . . 1047 — hydrotropen Lösungen . . . 1049 — kolloidaler Sudanlösung . . 1048 — Nilblausulfat 1046 ff. — Osmiumsäure 1053 ff. — Scharlach R 1046 ff. — Sudan III 1045, 1048 ff. — Sudanschwarz B 1050 n a c h Ciaccio 1082 ff. — Daddi 1045 — Domagk 1047 — Eisenberg 1052 — Fischler 1068 f. — Gross 1047 — Hadjioloff 1049 — Herxheimer 1046 — Hoerr 1063 — Kleeberg 1067 — Lison 1050 f. — Michaelis 1046 — Romeis 1048 — Smith-Dietrich 1086 — Smith 1064 — Starke 1056 Fett, Fixierung — n a c h Ciaccio 1082 ff. — m i t Formol 103? Osmiumsäure . . . . 1053 ff. F e t t , frisches Präparat . . . . 1038 — und Eiweißabbaustoffe . . . . 1251 — und Glykogen 1106, 1107

Sachregister §§ Fe 11 und polarisiertes Licht 1036, 1074 —, Vitalfärbung 795, 1033 ff. Fette, Neutral- . . . . . . . . 1064 Fettige Infiltration 1028 Fettknorpel 1593 Fettresorption 2068 Fettsäuren: Färbung 1064 ff. —, Nachweis 1068 —, Kalium- und Natriumsalze der 1072 —, Unterscheidung von Eisen . . 1071 Fettsaurer Kalk 1071 Fettsaure Seifen 1073 Fettsubstanzen 1030 Feuchte Kammer 142 (heizbar n. Peterfi) . . . . 175 Feulgens Nuklealreaktion . . . 1233 ff. —, Piasmaireaktion . . . 795, 1033 ff. Feyrter, Einschlußfärberei . . . . 1898 —, Markscheidenfärbung . . . . 1898 —, Schleimfärbung 2034 Fibrillen des Bindegewebes . . 1486 ff. Epithels • . . . 1290, 1291, 2259 Dentins 1683 — der Ganglienzellen 1780 ff. — des Knochens . . . . . . . 1648 ff. Knorpels 1591 Muskels 1706 ff. — der Nerven 1780 ff. Fibrinfärbung n. Beneke 1428 — Kockel 1429 — Schueninoff 1430 — Weigert 1424 Fibroblasten 1483 Fieandt v., Aufkleben von Celloidinschnitten 562 Filterflüssigkeiten 44 f. Filterpapier zum Abtrocknen . . . 829 Firnissen der Deckglasumrandung . 821 Fischeier 2393 ff. Fischer, Elastin-Fettfärbung . . . 1566 Fischer, E., Luftinjektion . . . 1991 ff. Fischler, Nachweis der Fettsäuren . 1068 —, Fettseifen 1073 F i x a t i o n , Allgemeines . . . 187 ff. —, Bedeutung des Diffusionsvermögens 193 —, Bedeutung der Temperatur . 204 ff. —, Dauer 209 —, Einfluß des Lichtes 249 — durch Injektion 212 —, Nachbehandlung 353 ff. Fixation von Blutausstrichen . . 1325 ff. Gewebekulturen . . . . 176 ff. Organausstrichen 1335 Spermien 2170 ff. Fixationsdauer 210 Fixationslabile Strukturen . . . . 190 F i x a t i o n s m e t h o d e n s. unter den Bezeichnungen der Bestandteile und der einschlägigen Autoren

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§§ Fixationsstabile Strukturen . . . 190 Fixiernatron zur Jodentfernung . 328 Silberentfernung 1539 F i x i e r u n g , Allgemeines . . 187 ff. —, Einfluß auf Azidität . . . . 254 —, Färbung 610 —, Strukturbild des Kernes . 199 — bei Körpertemperatur . 204, 2362 f. Untertemperatur 350 — durch Trocknen in der Kälte . . 350 — für anatom. Präparation . . . 346 Schnelldiagnose 357 — in Dioxangemisch 357 — — Dioxan-Pikrinsäure . . . . 1092 — — Formol-Pyridin 267 Joddämpfen 145 — von Blutpräparaten . . . . 1325 ff. — — Färbungen . . 626 ff., 698, 766, 787, 791 ff., 1935 ff., 1945 Gewebekulturen 176 941 — — Kernstrukturen Methylenblaufärbung . . . 1945 Nervenfärbung . . . 1935 ff., 1945 Vitalfärbung . . 766, 787, 791 ff. Flächenhafte Rekonstruktion . . 873 ff. Flechsigsche Methode 1831 Fleischsche Lösung 124 Flemmings Dreifachfärbung . . 961 ff. Flemmingsche Flüssigkeit (stark) 290 ff. (schwach) 272 Flemming-Heitz 1238 Flimmerepithelien 1267 f. Fluorchrom-Kaliumbichromat (Markscheidenbeize) 1822 Fluorchrom-Essigsäure-Kupferbeize (Gliabeize) 1822 Fluoreszein 151 Fluoreszenz-Mikroskopie . . . . 68 ff. Fluoritsystem 12 Fluoritimmersion 21 Flüssige ,Luft zum Gefrieren . . . 351 Flüssigkeiten, indifferente . . . . 116 Foley, Silbermethode t613 Folienkolorimeter 1339 Folsches Gemisch 292 Fonios Blutplättchen-Zählung . . 1450 Fontanasche Silberlösung . . . . il29 Foots Silberimprägnation . . . . 185 — Silberlösung 1555 Förderliche Vergrößerung . . . . 16 Forelleneier 2397 Form zum Einbetten 532 Formaldehyd s. Formol F o r m a l i n = F o r m o l . . . 253 ff. — Anwendungsweise 264 — Nachfixierung 278 — Neutralisiere^ 257 — Niederschlag (Entfernung) . . . 274 — Prüfung des Prozentgehaltes . . 256 — Prüfung der Reaktion . . . . 261 — Säurebildung 273 — Überfixierung 277

652

Sachregister

§§

F o r m a l i n = F o r m o l (Forts.) — Verdünnung 263 271 — Wirkungsweise F o r m o1g e m is ch e mit Aceton-Eisessig-Sublimat . . . 2317 Alkohol 228 — (für Blutfix.) . . . . 1391 Ammoniumbromid n. Cajal . . 1849 — n. Rio-Hortega 1859 ff. Bleiacetat 2073 Calcium salicylicum 1072 Chloralhydrat-Glyzerin n. Jores 858 Eosin-Methylenblau 1395 Hydrochinon 1798 ff. Kaliumbichromat 243 Essigsäure 238 n. Ciaccio 1082 Kalium nitr.-Kal. acetic. . . . 858 Kochsalz 266 Magnesiumacetat 268 Müllersche Flüssigkeit (Orth) . 244 Müllersche Flüssigkeit-Sublimat 337 Osmiumsäure 338 Pikrinsäure-Eisessig 305 Pyridin 267 Pyrogallol 1798 ff. Salpetersäure 321, 2436 Silbernitrat 2319 Sublimat-Eisessig 333 Urannitrat 1856 Formolmetachromasie 1898 Forsgren, Bariumchloridmethode . 2094 —, Gallenbildung 2095 Fränkels S ä u r e f u c h s i n - T a n n i n lösung 2238 Franckescher Schnepper 1293 Friedländers Hämatoxylin . . . . 667 Frisches P r ä p a r a t 116, 127 durch Hecheln 129 Raspeln 130 Zupfen 128 Frischfärbung n. Cesaris Demel . 759 Frommannsche Linien 1893 Frontlinse 11 Froschlymphe, Gewinnung . . . . 160 Frostschnitte 512 ff. Fuchsin 701 — f ü r Knochenzellen . . . . . 1645 Hämalaun-Lichtgrün . . . . 2040 Pikrinsäure-Indigocarmin . . 716 F u c h s i n S siehe unter S ä u r e fuchsin Fuchsinschweflige Säure . . . . 1 ^35 zu Kohlehydratreaktion . . • 1104 Fundstellen f ü r Pigmente . . . 1109 ff Fygs Carminlösungen . . 6S7, 638, 1708Fyg-Baltzer, Fix. v. Vitalfärb. . . 794 G. Galaktogen Galaktolipoide

1104 1734

§§ Gallaminblau 732, 736 Galle (Einfluß auf Blutkörperchen) 1239 1999 — (zum Isolieren) Gallein • 1626 Aluminiumchlorid . . . . . 1626 Gallenbildung 2095 Gallenblase 2107 Gallenkapillaren, Darstellung durch Bariumchloridmethode . . . . 2095 —, Färbung 2104 ff. —, Injektion 2097 —, Lebendbeobachtung . . 2094 —, Selbstinjektion . . . . 2098 —, Silbermethode . . . . 2102 Gallenkapillaren, Färbung nach Böhm 2102 — Braus 2103 — Chrzonszczewsky 2098 — Clara 2104, 2106 — Forsgren 2095 2104 — Holmer — Krause 2097 — Otami 2105 — Ranvier 2097 Gallertgewebe 1461 Gallerthüllen der Amphibieneier 2409 ff. Gallocyanin 732, 734, 735 — (Tigroidsuhst., Einarson) . . . 1749 Gallussäure-Formol 1220 Galvanisches Verkupfern des Wachsmodells 895 Ganglien, sympathische 1802, 1808, 1811 Ganglienzellen Darstellung der Form (Isolierung) 1739 ff. — — Golgisubstanz 1760 Kernstruktur . . . . 1741 ff. Mitochondrien . . . . 1756 ff. — des Netzapparates . . . . 1760 ff. — der Neurofibrillen . . . . 1780 ff. — — Neurosomen 1756 — — Nißl-Substanz . . . . 1742 ff. Trigroidschollen . . . 1742 ff. Zellfortsätze . . . . 1762 ff. Ganglienzellen, Darstellung durch ameisensaures Blei 1775 ammoniakalisches Carmin . . 1778 f. — Silbernitrat 1786 ff. Ammon. Molvbd.-Thionin . . 1780 ff. Toluidinblau 1782 Anthracenblau 1750, 1751 Azosäure 1740 Erythrosin-Methylenblau . . . 1753 Gallocyanin 1749 gepufferte Farblösung . . . . 1748 Goldchlorid-Sublimat . . . . 1777 Kaliumbichromat-FormolSilbernitrat 1772 Osmiumsäure-Silbernitrat . 1764 Silbernitrat 1770 ff. Sublimat 1774

Sachregister §§ G a n g l i e n z e l l e n , (Forts.) Darstellung durch Methylenblau-Pufferlösung . . 1748 Methylenblau-Seifenlösung . .1742 Metallimprägnation . . . . 1762 ff. Nachvergoldung 1784 Plumbum aceticum 1775 Pyridin-Silbermethode . . . 1790 ff. Pyronin-Weinsteinsäure . . . 1752 Säurefuchsin-Lichtgrün . . . 1758 Supravitalfärbung 1779 Thionin-Weinsteinsäure . . . 1752 Toluidinblau 1744 Vitalfärbung 1738 Vorvergoldung 1784 Ganglienzellen, Darstellung nach Agduhr 1792 Alzheimer 1758 Apäthy 1784 f. Bacsich 1818 Bethe 1782 Bethe-Fluck 1755 Bielschowsky 1786 ff. Bodian 1816 Bubenaite 1773 Cajal (Golgi-Substanz) . . . . 1761 — (Modifikat. Golgi-Methode) . 1769 — (Neurofibrillen) 1797 ff. Corning 1775 Cowdry 1759 Cox 1774 Crinis de 1777 Donaggio 1781 Einarson 1749 Foley 1813 Forel 1778 Gerlach 1778 Golgi 1764 ff. Gros-Schultze 1793 Held 1753, 1759 Kallius 1776 Kopsch 1772 Kryspin-Exnör 1751 Landau 1796 Mayer, P 1752 Menner 1740 Nissl 1742 Pischinger 1748 Ranson 1812 Schultze, 0 1808 Stuurmann 1747 Szatmari 1794 Gaskells Gelatineeinbettung . . . 469 Gebärmutter 2157 ff. Geballtes Phosphat, Nachweis . . 1641 Gebrauchter Alkohol, Reinigung . 384 Gebrauchtes Toluol, Reinigung . . 575 Gedehnte Milz 2007 Gefäße, Lebendbeobachtung 149, 1439 ff.

653

§§ Gefäße im Aufhellungspräparat 1966 f., 1977, 1984 —, Darstellung durch Benzidinmethode 1966 f. —, Gelatineinjektion . . . 1979 —, Kautschukinjektion . . 1987 —, Kleisterinjektion . . . 1988 —, Korrosion 1985 —, Lufteinschluß . . . . 1990 ff. —, Plastoid 1985 —, Tuscheinjektion . . . . 1977 —, Scriptol 1978a —, Endothel 1963 —, Färbung 1966 ff. —, Fixierung 1958 ff. —, Injektionsmethoden . . . . 1968 ff. Gefensterter Objektträger . . . . 940 Gefrieren 469, 513, 524 Gefriermethode nach AltmannGersh 351 Gefriermikrotom 512 Gefrierschnitte, Auffangen derselben 469, 471, 516 —, Aufkleben . . 469, 471, 473, 513, 524 —, Entfetten 517 —, Weiterbehandeln 589 Gefriertisch nach ten Berge . . . 518 Gegenfärbung nach Foley . . . . 1815 Gehirn s. Zentralnervensystem Gehörorgan 2359 Geitler, Ausstrichverfahren . . . 932 Gelatine zum A u f k l e b e n v o n Celloidinschnitten . . . . 561 — Gefrierschnitten . . .471 f., 569 549 — Paraffinschnitten Gelatinebalsam 475 — nach Heringa 475 Gelatinebeseitigung . . 470, 471, 474 Gelatine-Carminmasse 1980 Gelatineeinbettung nach Apäthy 468 — Gaskell 469 — Gräff 469 471 — Heringa Gelatineeinschluß (Deckglasersatz) . 822 Gelatinefolien 897 Gelatine-Glycerin 806 Gelatine f. Injektion 1979 ff. Gelatine, kaltflüssig 1983 Gelatinekapseln zum Einbetten . . 441 Gelatinelösung n. Heringa . . . . 472 Gelatinemasse n. Spanner . . . . 1984 Gelatineplatten f. Rekonstruktion . 897 Gelbfilter 46, 49 Gelbgrünfilter 45, 49 Gelbe Zellen (Darm) . . . 2067, 2071 ff. s. auch basalgekörnte Zellen Gelbildung, reversible 914 Geleis Glykogendarstellung . . . 1106 Gendre, Glykogenfixierung 1093 —, Jodreaktion 1100 Genitalorgane 2142 ff.

654

Sachregister

§§ Gentianaviolett 702 — für Chromosomen 937 — nach Ewald 1569 Geitler 937 Gentianaviolett-Anilinwasser nach Gram 703 1424 — Weigert Gentianaviolett-Orange (Bensley) . 2228 (Epithelfibr.) 1289 Gentiana violett-Safranin-Orange (Flemming) 961 Gerbsäure 1543 Gerbsäurefestes Kolloid 2237 Gerinnen von Plasma 157 —, Verhinderung desselben . . . . 159 Gerlachs Carminmethode . . . . 1778 Gerotas Injektionsmasse für Lymphgefäße 1989 Geruchsorgan 2370 ö. Geschlechtsorgane 2142 ff. Geschmacksknospen 2048 Geschmacksnerven 2049 Gewebekultur 152 ff. —, Anlegen derselben . . 155 ff., 162 —, Einfluß der Temperatur . . . 163 —, Färbung 180 ff. —, Fixierung 176 ff. —, Umsetzen 165 —, Vitalfärbung 174 Gewebesaft 117 Gewebekulturflaschen 171 Gewebs-Nadi-Reaktion 1157 Gewebs-Oxydase-Reaktion . . . 1157 Giemsafärbung Allgemeines 1336 ff. Ausstrich . . . . . . . . . 1357 937 — für Chromosomen Schnittpräparat n. Giemsa 1401 — Maximow 1396 Giemsalösung, Herstellung . . . 1359 —, Verdünnung . . . . . 1358, 1340 Giemsalösung-Tannin 2291 Giemsas Färbewännchen . . . . 1346 — Farbfixierlösung 1363 — Schneflfärbemethode . . . . 1363 Gierkes v., Oxydasereaktion . . . 1155 G i e s o n sehe van, Färbung . . . 708 Modifikation von Curtis . . . . 708a Domagk 710 Hansen 709 — — Weigert 708 Gilsonsche Flüssigkeit 340 Gipsniederschlag 312 Gipsplättchen (Polarisation) . . . 1039 Gipsreaktion (Ca-Nachweis) . . . 1218 Giroud, Vitamin C 1184, 1186 Gitterfasern nach Achucarro . . . 1544 Bielschowsky 1525 Cajal 1508 Gömöri 1533 Laguesse 1537

§§

Gitterfasern nach Oliveira . . . . 1555 Pap 1532 Rio Hortega 1547 ff. Volterra 1549 Wilder 1536 Gitterfasern der Leber 2090 — — Milz 2006 Glandula bulbo-urethralis . . . . 2187 — parathyreoidea 2189 ff. Glaskörper 2316 Glasplattenrekonstruktion . . . . 877 Glastinte 529, 531 Glasverschlußkappe nach Knöll . . 156 Glatte Muskulatur 1721 ff. 1729 ff. — Färbung — Isolierung • 1722 ff. — Lähmung (in Gefäßen) . . . . 1973 Gleichstrom, Bestimmung . . . . 41 Glia s. Neuroglia Gliasyncytium 1874 ff. Gliazellen, amöboid 1877 Glimmer, Deckglas aus 94 Glimmerplatten 552 Gliosomen . . . . ' . 1856 Globus, Modif. d. Goldsublimatmethode von Cajal 1852 —, Hortega-Meth 1867 Glutathion (Nachweis) 1255 Glycerin (Einschluß) 802 —, Verhalten 390 Glycerin-Äthermischung (nach Unna) 1414 Glycerin-Boratgelatine 807 Cadmiumchlorid 805 Celloidinmethode 458 Chloralhydrat 805 Eiweiß (Aufkleben) 542 Gelatine (Aufkleben) . . 549, 550 (Einbettung) 469 ff. (Einschluß) 806 Glyceringemisch für Kaiserlingsche Methode 858 Glycerin-Pikrat-Gelatine . . . . 1945 Glycerin-Zinkjodid 805 Glykogen . . . . • . . . . 1089 ff. —, Darstellung nach H. Bauer . . 1104 —, Best . 1102 f. —, Fixierung mit Alkohol-Calciumpikrat-Förmol 1094 —, Formol-Pikrinsäure . 1093 —, Dioxan-Pikrinsäure . . 1092 —, — nach H. Bauer 1092 —, Gendre 1093 —, Neukirch 1091 —, — — Pasteeis u. Leonard . . . 1092 —, Schabadasch 1094 —, Jodreaktion nach Langhans . . 1099 —, Nielsen u. Okkels . . . 1101 G l y k o g e n u n d F e t t gleichzeit. nach Gelei 1106 — Arndt 1107 Glykogenbildung (Rhythmus) . . . 2096

Sachregister

§§

Glykokollösung 1159 Glykolstereat-Paraffin 430 Gmelinsche Reaktion (Hämatoidin) 1136 G-Nadi-Reaktion 1157 ff. Gömöri, Bindegewebsimprägnation . 1533 —, Kalknachweis 1639 Gold (Nachweis) 1226 f. Goldchlorid, braunes — gelbes . . 1850 Goldchlorid-Ameisensäure . . . 1784 f. Goldchlorid, f. Vitamin C-Nachweis 1187 Goldimprägnation von Auerbach Plexus 2086 — Bindegewebe (Zentralnervensystem) 1882 — Cornea 2331 1784 — Ganglienzellen — Meißner-Plexus 2086 — Nervenendigungen . . . 1904 ff. — Neurofibrillen 1783 f. — Neuroglia 1849 — Vitamin C 1187 Goldmann- Lipoidfärbung . . . . 1381 Goldmethoden n a c h Apäthy 1784 — Biondi 1882 — Cajal . 1849 — Crinis de 1777 — Fischer . . . • . . ' . . . . 1905 — Loewit-Fischer 1905 — Miller 1907 — Ranvier 1906 — Rollet 1701 Goldner, Bindegewebsfärbung . . 1498 Goldsublimatmethode (Cajal) . . . 1849 — nach Crinis de 1777 Penfield 1853 Golgi-Substanz . . . . 1002 ff. n a c h Aoyama 1023 — Cajal 1020 — Da Fano 1022 — Kolatschew 1009 — Kopsch . . . . 1008, 1009, 1016 — Nassonow . . . 1009, 1010, 1015 — Sjövall Iftl8 — in Nervenzellen 1760 — vitale Beobachtung 1002 Golgis Silbermethode (langsame) . 1770 (rasche) 1764 (modif. von Bubenaite) . . . 1773 ( Cajal) 1769 r ( Corning) 1775 ( Cox) 1774 ( Kopsch) 1772 ( Kallius) 1776 Golgi-Methode für Sekretkapillaren 2063 Golgi-Rezzonico-Apparat . . . . 1921 Golodetz' Cholesterinnachweis . . 108)1 Graffs Oxydasereaktion 1157 Graham, Peroxydasereaktion . . . 1378 Grams Anilinwassergentiana- . violett 703 — Jodjodkaliumlösung 705

655

§§

Grandrysche Körperchen . . . . 2297 Granoplasma 965 G r a n u l a , Granula-Methode Altmanns 974, 991 Granula in Blutzellen . . . . 1336 ff. , Trennung von a- und ßGranulationen 1372 , Darstellung von y -Granulationen . . .' 1373 , — — ¿-Granulationen . 1374 , ^-Granulationen . 1375 —, basophile Punktierung . . 1376 und »Dopa«-Reaktion . . 1379 und Oxydasereaktion . . 1377 —• und Peroxydasereaktion . 1378 — in Eiweißdrüsenzellen . . . 2039 ff. Hypophysenzellen . . . 2195 ff. Leberzellen 2087 f. Muskelzellen . . . . 1692, 1695 Nebennierenzellen . . . . 2222 Nervenfasern 1899 Nervenzellen 1758 ff. „-Granula 1899 Pankreaszellen 2040 Schleimdrüsenzellen . . . 2018 ff. Granulofilocyten 1306a Granulosazellen 2154 Graphische Isolierung 874 — Rekonstruktion 873 Grenachers Carmin 639 Grenzscheiden 1646 —, Isolierung 1647 Grobbewegung (Mikroskop) . . . 10 Grobety, Färbung d. Langerh.-Inseln 2477 Gros-Schultze, Silbermethode . . . ,1793 , —, Mod. n. Landau . . . . 1796 , —, Szatmari . . . . 1794 Groß, Borat-Glyceringelatine . . . 807 —, Fettfärbung 1047 Großers Injektionsmasse . . . . 1978 Größenbestimmung durch Messung 900 Schätzung 899 Grundplatte zum Einbetten . . . 432 Grüne Flüssigkeit n. Held . . 176, 240 Grünfilter 45, 49 Grünhagensche Räume 2065 Gruppenquadrat (Zählplatte) . . . 1442 Guaninkristalle 1150 Guanophoren 1150 ff. Gullstrands Spaltlampe 2305 Gummi (Injektion) . .' 1987 Gummisirup 812 — nach Kasarinoff 1084 Gußverfahren für Rekonstruktion . 898a H. H-Ionenkonzentration der Fixierungsflüssigkeit 203 Haare 2277 ff. Haarentwicklung 2278 Haaröse 132

656

Sachregister

Haarscheiden 2283 Haarspatel 132 Haase'sche Regel 2469 Hadens Puffergemisch 1341 Häggquist, Hämatoxylin 682 Halbeintrocknung, Ranviers Methode der — 1454 Hämalaun 650 ff. — saures, nach P. Mayer . . . . 651 — -Azophloxin 664 Eosin 659 —• -Eosin-Orange 661 Erythrosin-Safran 711 — -Indigokarmin 714 —• -Kernechtrot 663 Magentarot-Lichtgrün . . . . 2040 Metanilgelb-Mucicarmin . . . 2027 Hämatein 647 JH. Hämatoidinkristalle 1109, 1114, 1123, 1434 Hämatoxylin 646 isoelektrischer P u n k t 648 nach Apäthy 667 — Böhmer 667 — Clara 688 — Delafield 668 — Ehrlich . 666 — Friedländer 667 — Häggquist 682 — Hansen, Alaunhämatoxylin . 669 — —•, Eisentrioxyhämatein . . 681 , Molybdathämatein . . . 687 — Harris 2081 — Heidenhain M 672 ff. — — R 683 — Held . . 686, 1875 — Janssen 677 — Kultschitzky 1825 — Mallory 685, 1511 — P. Mayer, Hämalaun . . . 651 ff. , Muchämatein 2028 — Pal 1826 — Regaud 988 — Schueninoff 1514 — Schultze, 0 684 — Seki 986 — Unna 670 — Weigert (Lithiumh.) . . . . 1824 — — für Kernfärb 677 f ü r Marksch 1822 Hämatoxylin-Azophloxin . . . . 644 Benzolichtbordeaux 676 — -BestSches Carmin-Aurantia . . 2059 Congorot (Amyloid) 1575 (Magenschleimhaut) . . . . 2061 Eisessig 666 Eosin 660 Eosin-Orange 661 Erythrosin 660 Fuchsin, S - P i k r i n s ä u r e . . . . 707 nach Curtis 708a — — v a n Gieson 708 — Hansen 709

§§

Hämatoxylin (Forts.) Fuchsin, nach Weigert . . . . 708 Indigocarmin 714 663 — -Kernechtrot Lichtgrün 676 Orange G 665, 676 Orcein 1559 —• -Pikrinsäure-Thiazinrot . . . 710 Ponceau S 708a Resorcinfuchsin-Pikrofuchsin . 1563 Resorcinfuchsin-PikrinsäureThiazinrot 1563 Säurefuchsin 707 ff. Säurefuchsin-Orange-Lichtgrün 1494 — -Säurefuchsin-Tuchechtgelb . . 712 Thiazinrot . . . . 707, 710, 1509 Hamburgers Injektionsmasse . . . 1978 Häminknstalle 1433 Hämofuscin 1137 Hämoglobin 1436 —, F ä r b u n g 1436 —, — n. Lepehne 1436 —, — n. Slonimski 1437 —, Fixierung 1393 Hämolymphe 161 Hämolymphdrüsen 1995 Hämosiderin . . . . 1109, 1114, 1435 Nachweis 1435 Hämostix 169 Hängesteckkarten 853 Härtung 188 — des Celloidinblocks 450 — von Paraifin 429 Häutchenpräparat 1483 f. H a m m a r s Berechnungsmethoden . 904 — Thymusuntersuchung . . . . 2244 Hamperl, Hauptzellen des Magens . 2060 Hance, Modif. der Flemming'schen Flüssigk 290, 297 Hansens Alaunhämatoxylin . . . 669 — Bindegewfbsfärbung . . . . 709 —• Eisentrioxyhämatein 681 — Hämatoxylinreifung 669 —^ Knorpeldemaskierung . . . . 1591 — Molybdathämatein 687 709 — Pikrofuchsin Hardersche Drüse 2358 Harnblase 2141 Harnkanälchen 2121 ff. H a r n s ä u r e (Nachweis) 2134 ff. Harnsäureinfarkt 2135 Harnstoff (Nachweis) . 1252, 2139, 2140 — (zur Fixierung) 196, 290, 297, 310, 942 — (zum Isolieren v. elast. Gewebe) 1465 Hartosol 387 Hartschneidemikrotom 490 Haugs Phloroglucin-Salpetersäure . 1614 Hauptzellen 2060 Haut . : 2249 ff. Einbettung 2254, 2288 Eleidin 2269 Epithelfasern 2259

Sachregister

657

Haut (Forts.) Herz 1947 ff. Fixierung 2250 Herzmuskel 1718, 1949 Haare 2277 Herznerven 1953 Hornsubstanzen 2271 Heß'sche Lupe 3 Kapillaren 149 Heterogenes Blutplasma 166 Keratin 2271 Hicksons' Brasilinfärbung . . . . 948 Keratohyalin 2265 Hirnteil (Hypophyse) 2205 kollagenes Gewebe 2289 ff. His'sche Pinsel- und SchüttelNagel/ . 2273 methode 1998, 1999 Nerven 2296 Histidin (Nachweis) 1253 Pigment 2292 Histochemische Methoden . . . 1189 ff. Trichohyalin 2282 Histologische Gewebsrekonstruktion 877 Histo-physikochemische Methoden 1258 ff. Häutchenpräparat 1483 Hautknochen 2304 Histospektrographie 1232 Hayemsche Flüssigkeit 1302 Hitzefixation von Blutpräparaten . 1328 Heber nach Mays 1279 Hoden 2173 ff. Hecheln von Präparaten . . . . 129 —, interstitielle Zellen 2176 Heidenhain, M., Azanfärbung . . . 1489 —Mengenbestimmung 905 Azokarmin 1489 Hoepke, Celodaleinbettung . . . . 480 Chromotrop 1507 Hohlspiegel 6 Fixierungsgemische . . 332, 344 Holboll, Reticulocyten 1306 Eisenhämatoxylin . . . . 672 Hollande'sche Flüssigkeit . . . . 309 —• — Pikroblauschwarz 1505 Hollborn, Grübler Farbstoffe . . . 618 Sublimat-Formol 332 - Höllenstein s. Silbernitrat Holmer, Gallenkapillaren . . . . 2103 »Subtrie« 345 »Susa« 344 Holmgrensche Kammer 1440 Thiazinrotfärbung . . . . 1509 Holmgren, chromotrope Substanz . 1257 Thiazinrot-Thionin . . . . 1709 —, Mastzellen 1408 ; Vanadiumhämatoxylin . . . 688 Holtfreters Modif. d. Ringerlösung . 120 Heidenhain, R., Hämatoxylin . . . 683 Holundermark (zum Einklemmen) Heidermanns Phoshatnachweis . . 1641 134, 144 Heißluftsterilisator 156 — (Gewinnung) 134 Heitz, Carminessigsäure 927 1301 — (für Blutpräparate) . . . . —, Flemming Modif 1238 1848 Holzers Methode für Faserglia —, Kochmethode 928 970 Holzessig —, Nuklealquetschmethode . . . 938 78 Homal Heizbare feuchte Kammer . . . . 175 898 Hominit Heizbarer Objekttisch 175 21 Homogene Immersion . . . . Heizplatte z. Strecken der Schnitte 539 2355 Horizontalzellen (Netzhaut) Heizsonne 539 Hornhaut 2320 ff. Heiztisch 175 Hornhautkörperchen 2328 ff. Heids Fixierungsflüssigkeit . . . . 240 Hornhautmikroskop 2305 — Gliafärbung 1875 Hornowskys Bindegewebsfärbung . 1563 — Granulafärbung in GanglienHornsubstanz 2271 zellen 1753, 1759 —, Erweichen ders 2300 fl. . . . . 686 — Molybdänhämatoxylin Hortega s. Rio-Hortega Helldunkelfeldkondensor . . . . 53 . 1868 Hortegas Kreosotgemisch . Helle Muskeln 1702 Hortegazellen . 1864 Hellysche Flüssigkeit 337 . 1514 Hueters Bindegewebsfärbung Henlesche Schleife 2120 Hühnereiweiß zur Injektion . 1978 Heparin 159, 1410 Huygensches Okular . . . . 13 Heparinplasmamethode 159 Hyaliner Knorpel . . . . 1576 ff. Herapathitfilter 61 . 62 Hydrazinhydrat Herbst'sche Körperchen 2297 Hydrargyrum bichloratum Heringas Gelatineeinbettung . . . 471 s. Sublimat Hermanns Fixierungsgemisch . . 293 Hydrochinonlösung n. Schultze . . 1808 Herstellung v. Ausstrichpräparaten 925 Hydrochinon-Entwickler n. Kallius 1776 Farblösungen 612 Formol (NeurofibrillenHerxheimers Azur-Eosin-Tannindarstellung) . . 1798 ff., 1808, 1816 färbung 2291 Hydrotrope Lösungen 1049 — Epithelfibrillenfärbung . . . . 2264 599 — Scharlach R 1046 Hydroxylgruppe 42

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. Aufl.

658

Sachregister

§§ Hypophyse 2193 ff. —, Färbung nach Berblinger und Burgdorf 2197 —, Cleveland, Rucker u. Wolf 2201 —, Erdheim u. Stumme . . 2196 —, Kohn 2209 —, Kraus 2195, 2202 —, — — Maurer u. Lewis . . . . 2203 —, Romeis 2198 —, Severinghaus 2200 —, Tavares de Sousa . . . 2199 —, Wallraff 2199 Hyposulfitweiß 785 J. Janusgrün 780 ff. —, Vitalfärbung 78011. —, Langerh.-Zellinseln (Pankreas) . 2224 —, Mitochondrien . . . . 781, 782, 967 Janusgrün-Neutralrot 783 Japanische Aufklebemethode . . . 546 Jatex 1987 Jeker, Silbernitratmethode . . . . 2116 Jenners Blutfärbung 1352 Idiosom 2180 Imidogruppe 599 Immersion, Anwendung 21 Immersionskondensor 34 Immersionslinsen 21 Immersionsöl 25 Immersol 25 India rubber 428 Indifferente Farbstoffe . . . 599, 600 Indifferente Lösungen 116 ff. Indigocarmin 714 Pikrinsäure 715 ff. Indikatorlösungen 1260 Indirekte Färbung . . . . . . . 605 — Vitalfärbung . . . . 798 Indophenolblau-Reaktion . . . . 1154 n. Winkler-Schultze . . . . 1155 Indulin-Aurantia-Eosin 1372 Infrarotes Licht 757 Injektion (Blutgefäße, Allgemeines) 1968 — (Lymphgefäße) 1989 — (zur Fixierung) 212 Injektionsapparat 1970 Injektion mit Berlinerblau 1982 Carmin 770 Carmingelatine 1980 Fixierungsflüssigkeit 212 Gelatinemassen 1979 Kautschukmasse 1987 Kleister 1988 Luft 1992 Methylenblau 1779, 1930 ff., 1941 ff. Osmiumsäure 1287 Perhydrol 1990 Plastoid 866, 1985

§§

I n j e k t i o n m i t (Forts.) Pyrrolblau 769 Silbergelatine 1963 Silberlösungen 1963 Skriptol 1978a Trypanblau 762 Tusche 1977 Vitalfarben 759 Zinnober 1984 Injektion nach Bartels 1989 E. Fischer 1992 Gerota 1989 Goldmann 769 Kiyono 770 Kolmer 212 Kolossow 1287 Krause 213, 1981 Neumayer 1987 Pansch . . • 1988 Ribbert 770 Spanner 1977, 1984 ff. Schabadasch 1941 ff. Spanner 1977, 1984 ff. I n j e k t i o n von Blutgefäßen (für Nervendarst.) 1930 ff., 1941 ff. Darm 2052 Gallenkapillaren 2097 Gefäßen 1968 ff. Gesamtkörper 212 Hoden 2173 Leber 2092 Lunge 2111 f. Lymphknoten 1997 Lymphgefäßen 1989 f. Milz 2007 Niere 2127 Organen 212 Ureter 2141 Injektionskanülen 1971 Injektionsmassen aus Gelatine 1979 ff. — Gummi 1987 — Kautschuk 1987 — Kleister 1988 — Plastoid 866, 1985 — silberhaltiger Gelatine . . . 1963 nach Bartels 1989 — Gerota 1989 — Grosser 1978 — Hamburger 1978 — Krause 1981 — .Neumayer 1987 — Spanner 1984 — Tandler 1983 Injektionsspritze 1969 — für Lymphgefäße 1989 Inkretorische Organe 2188 ff. Insekten, Einlegen in Balsam . . . 2298 Instrumente bei Sublimatfixierung . 323 | Versilberung 1285

Sachregister

§§

Intercellularbrücken 1287 ff. Intercellularlücken 2258 Interferenzzellen 11'50 Intergranuläres Netzwerk . . . . 964 Interstitielle Zellen . . . .2153, 2176 Interterritoriale Substanz . . . . 1590 Intraepidermale Nervenendigung . 2296 Intrakardiales Nervensystem . . . 1953 Intravitale Färbung 754 ff. Involution der Thymus 2243 J o d , Amyloidnachweis 1573 —, Entfernung durch Fixiernatron . 328 —, Fibrinfärbung 1432 —, Glykogennachweis . . . . 1097 ff. —, Isolierungsflüssigkeit . . 1274, 1739. — zur Fixierung 145, 1329 v. Gewebekulturen . . . 178 —. zur Sublimatentfernung . . . . 327 Jodalkohol . 327 Jod-Bleu de Lyon 720 Jodeosin 660 Jod-Formol-Osmiumsäure-Eisessig . 1329 Jodjodkalium, alkoholisch . . . . 327 —, wässerig (Lugolsche L.) . . . 705 Jodreaktion ayf Amyloid . . . . 1573 Glykogen 1097 n. Gendre 1100 n. Langhans 1099 n., Nielsen-Okkels . . . . 1101 Jodserum 1274 Jodtinktur 327 Joel, Ejakulatflxierung 2172 —, Spermienbeobachtung . . . . 2166 Ionisiertes Chlor, Nachweis . . '. 2064 Jordans Celloidinparaffinmethode . 462 — ölcelloidinmethode 466a Jores Konservierungsmethode • . 860 Joyet-Lavergne, Glutathionnachweis 1255 , Vitamin A-Nachweis . . . 1182 Iridocyten 1150 Iris 2337 ff. Irisblende 7 Isaminblau 769 Isobutylalkohol 358 Isoelektrischer Punkt (Bestimmung) 1264 von Carmin 633 Hämatoxylin 648 Isolationsmittel . . . . 1269 ff. Ammoniumbichromat . . . .1275 Ammoniumcarbonat 1694 Ammoniummonochromat . . . 2125 Barytwasser 1458 Chromsäure 1275, 1739 Chromsaures Ammonium . . . 2125 Drittelalkohol (Epithel) . . . . 1270 — (Ganglienzellen) 1739 — (Gefäße) 1956 — (glatte Muskulatur) . . . . 1722 — (Linse) 2346 — (Niere) 2125 — (Riechzellen) 2376 42«

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§§

I s o l a t i o n s m i t t e l (Forts.) Harnstoff 1465 Jodserum 1274 Kalilauge (elast. Gewebe) . . . 1466 1724 — (glatte Musk.) — (Haar) 2285 — (Nagel) 2275 Kaliumbichromat . . . .1275, 1739 Kalkwasser 1458 Kochsalz (Haut) 2287 2168 — (Spermien) Müllersche Flüssigkeit . . . . 1275 Natriumfluorid (Epithel) . . . 1276 — (glatte Muskulatur) . . . . 1726 — (Linse) 2346 Neutral, chroms. Ammonium . . 2125 Osmiumsäure 1273 1739 — (Ganglienzellen) — (Magen- und Darmepithel) . 2056 Pankreatin 2256 Salicylsäure 1723 Salicylsaurer Alkohol 1698 Salpetersäure (Grenzscheiden) . 1647 — (Niere) 2123 Salzsäure 2121, 2233 Schwefelsäure 2285 Schweflige Säure (Muskel) . . 1696 Trichloressigsäure 1697 Trypsin 1475 Isolierung elastischer Membranen 1464, 1465, 1466 2256 — der Epidermiszellen Fasernetze 1464, 1465 Grenzscheiden 1647 Keimblätter 2443 Knochenkörperchen . . . . 1647 Knochenlamellen 1650 Spermien 2168 Isopropylalkohol 387, 390 Isosafrol 854 Isotonische Lösungen 116 Jugendliche Erythrocyten . . . 1306a Junßsches (Thoma) Mikrotom . . . 493 Iwanoff, Aufkleben von Celloidinschnitten 568 K. Käfermuskel 1691, 1699 Kältefixierung 350 ff. Kaformacet 239 Kaiserlingsche Konservierungsflüssigkeit 858 Kalialaun (z. differenzieren) . . . 657 Kalilauge, Anregung der Flimmerbewegung 1268 —, Einwirkung auf kollagene Bindegewebe 1457 —, elast. Gewebe 1464 —, glatte Muskulatur . . . 1724 Kalisalpeter-Schwefelsäure . . . 126

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Sachregister

§§

Kalium aceticum 808 808 — zum Aufhellen Einschluß .808 Konservieren anat. Präparate 858 Kalium, Nachweis nach Carere Comes . 1215 —, Macallum 1214 —, — mit Siena-Orangelösung . . 1215 Kaliumbichromat 234 ff. — (zur Isolierung von Ganglienzellen) 1739 Gelatine (Umranden) . . . . 818 KaliumbichromatGemische Kaliumbichromat- Ammoniummolybdat-Eisessig 791 Kaliumbichromat-ChromalaunFormol (Mitochondrien) . . . 977 Kaliumbichromat-Essigsäure . 236 Kaliumbichroma t-Fluorchrom (Markscheidenbeize) . . . . 1822 Kaliumbichromat-Formol nach Kopsch 243, 976 — Regaud 243, 976 Kaliumbichromat-FormolAmeisensäure nach Ciaccio . 1082 Kaliumbichromat-Formol-Eisessig 238 nach Ciaccio . . . . 1082 nach Held 240 nach Kolmer . . . . 241 nach Regaud . . . .2182 — nach Wittmaack . 2362, 2365 Kaliumbichrofnat-Natriumsulfat 244 —• -Osmiumsäure 974 Salpetersäure 2021 Schwefelsäure (Glasreinigung) 97 Sublimat-Formol-Osmiumsäure nach Levi 2149 Kaliumbichromatgemisch nach Held . . '. 240 Kaliumbichromat-Trichloressigsäure-Uranylacetat . . . . 2348 Kaliumcarbonat = Pottasche Kaliumpermanganat zum Bleichen natürl. Pigm. . . 1121 — — osmierter Präparate . . . 983 — — beitMarkscheidenfärb. (Pal) 1826 — z. Acetonreinigung 217 — für Hämatoxylinreifung . . . 637 — vor Bielschowsky 1525 Kaliumsulfit-Oxalsäure (Pal) . . . 1826 Kalium sulfurosum = Kaliumsulfit Kalk 1216 ff. Nachweis n. Cretin 1220 Erös 1634 Gömöri 1639 Grandis u. Mainini . . . 1219 Kossa 1637 Macallum 1221 i Pommer 1633 ;!! Rabl 1217 ; Roehl 1640 ii

§§

K a l k {Forts.) Nachweis n. Stoeltzner . . . . 1637 Zill 1638 Gipsreaktion 1218 fettsaurer Kalk, Nachweis n. Fischler 1072 kohlensaurer Kalk 1638 phosphorsaurer Kalk . . . • . . 1638 Purpurinfärbung 1219 Nachweis am veraschten Präparat 1223 — im Knochen 1630 ff. Kalknadeln 1627 Kalkorte, Färbung nach Becher . . 1627 Kalkwasser, Einfluß auf Bindegewebe 1458 Kallius Ganglienzelldarstellung . . 1776 — Entfernung der Eihüllen . . 2409 ff. K a n a d a b a l s a m s. Canadabalsam Kaninchen (Fortpflanzung) . . 2456 f. Kanzler, Gliadarst 1869 Kapillaren (Blut) 1960 —, — Färbung mit Benzidinr. . 1966 f. —, mit Siena-Orange . . . 1417 —, — Injektion 1968 ff. —, — Lebendbeobachtung 149, 1439, 1960 —, Gallenkapillaren 2094 —, Lymphkapillaren . . 1989, 1990 ff. —, Versilberung 1280, 1963 Kapillarmikroskop 149 Kapselzellen •. . 1914 Kapsenbergkappe 156 Karbolbenzol . . . 466 Karbolfuchsin ..." 1385 Karbolsäurehämatoxylin . . . . 986 Karbol-Säurefuchsin n. Seki . . . 993 Karbolthionin (Knochenhöhlen) . . 1643 Karbolwasser-Gentianaviolett . . 704 Karbolxylol 831 Kardioidkondensor 52 Kardosfärbung 1370, 1371 Kardosgemisch 1371 Karl'sbadersalz (Konservierung) . . 860 Karmin usw. siehe unter Carmin Karyokinesen 925 ff. Kautschukmasse (Injektion) . . . 1987 Kautschukparaffin 428 Kasarinoffs Gummisirup 1084 Kava-Kava Extrakt . . . . 1733, 2065 Kehlkopf •. . . . 2108 Keilschnittmethode 491 Keilschnittmikrotom 491 Keimbläschen 2404 Keimdrüse . . . • 2142 ff. Keimepithel 2151 Kennzeichnung kleiner Objekte . . 438 Kephaloppdenknorpel 1578 Keratin 2271 Keratohyalin 2265 ff. Kern, Färbung 925 —, — nach Becher 731 —, Fixierung 925 ff. —, frisches Präparat 912

Sachregister

§§

Kern, Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop . . . . 955 —, — im UV . 919 —, — d u r c h Verdauung 939 —, V e r h a l t e n ' gegen Reagenzien 916, 920 —, Vitalfärbung 920 K e r n e c h t r o t (für Kernfärbung) . . 743 — (für Plasmafärbung) 663 — wäßrige Lösung 745 Kernechtrot-Anilinblau 1492 n. Domagk 1492 Gram'sche F ä r b u n g 744 Liqu. Alumin. subacet. . . . 1493 Kernlose Platten (Lunge) . . . 2115 f. Kernmembran 956 K e r n s t r u k t u r , Beeinflussung durch Fixierung 199 Kernteilung 925 ff. Kiemenblättchen 945 Kisser, Glyceringelatine 806 Kitt f ü r Präparatengläser . . 864, 865 Kittlinien (Knochen) 1626 Kittlinienfärbung 672, 684 Kittlinienversilberung . . . . 1280 ff. Kittsubstanz (Schmelz) 1679 Kiyonos Mitochondrienfixierung . . 979 Klarfelds Tanninsilbermethode . . 1545 Klassifikation d. Teerfarben . . 599 ff. Klebwachs 139 Kleinenbergs Fixierungsgemisch . . 312 Kleinhirn (Nervenimprägn.) . . . 1798, 1799, 1805, 1806 Kleisterinjektion 1988 Knochen 1599 ff. —•, Allgemeines 1604 —, E n t f e t t u n g 1658 —, Entkalkung allgem. . . 1604 ff., 2476 —, Entwicklung 1651 —•, F ä r b u n g nach — Becher 1626 ff. — Bielschowsky 1649 — Bock 1631 — Erös 1634 — Korff 1653 — Lundvall 1596 — P. Mayer 1656 — Petersen 1626 — Pommer 1633 — Rupprecht 1645 — Schaffer 1652, 1669 — Schmorl 1643, 1644 — Stoeltzner 1632 —• Weidenreich 1649 —, Fibrillen 1648 ff. —, frisches P r ä p a r a t 1599 ff. —, Grenzscheiden 1646 —, Isolierung von Lamellen . . . 1650 —, Kalknachweis . . . 1630 ff., 1634 ff. —, Körperchen 1642 ff. —, Schliffe 165811. —, Sharpeysche Fasern 1649

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j i \ ] I

K n o c h e n (Forts.) —, Totalpräparate . . . 1596 ff., 1655 ff. —, Vitalfärbung 796, 1601 ff. Knochenkanälchen und Knochenkörperchen Knochenkörperchen, Darstellung durch Anilinblau . 1668 —, Delafield'sches Hämatoxylin 1642 —, Fuchsin 1645 —, Korrosion 1670 —, — — Mazeration 1647 —, Sublimat-Schwefelammonium 1669 —, Thionin-Phosphorwolframsäure 1644 —, Thionin-Pikrinsäure . . 1643 — — nach Ranvier 1668 —, Ruppricht 1645 —, Schaffer 1669 —, Schmorl 1643 —, — — TehVer 1670 Knochenmark 2009 —, Entnahme durch Punktion . . 1420 ff. Knorpel 1576 ff. Knorpelfärbung . . . . 1582 ff. 1583 — mit Coelestinblau Gallaminblau 1583 — nach Lundvall 1596 P. Mayer 1597 Romeis 1585, 1586 Schaffer 1587, 1589 ff. Knorpelsklett (Totalpräparat) . . . 1596 Knorpelzellen, verzweigte . . . . 1578 Knorpelzellkapseln 1589 Kobaltnitratmethode 1022 Kobaltnitrat (z. Kaliumnachw.) . . 1214 Kochmethode (Carminessigsäure) . 928 Kochsalzlösung, physiol 118 Kochsalz-Neutralrot 1456 Kochsalz-Salzsäure (Entkalken) . . 1617 Kochsalz-Sublimat 332 v. Kochsche Methode 1671 Kockeis Eisennachweis 1210 — Fibrinfärbung 1429 Köhlersches Beleuchtungsprinzip . 42 Kohlehydratnachweis 1108 Kohlehydratreaktion nach H. Bauer 1104 Kohlensäure (Gefriermikrotom) . . 513 Kohn (Hpyophysenpigment) . . . 2209 Kokain (zu Narkose) 107 Kolatschew, Darstellung d. Binnenapparates 1009 Kollagenes Bindegewebe 1454 ff., 146711., 1483 ff. F ä r b u n g nach Achücarro . 1544 — Beneke 1428 — Bielschowsky 1525 ff. — Biondi 1882 — Cajal 1854 — Calle ja 715, 1508

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Sachregister

§§

K o l l a g . B i n d e g e w e b e (Forts.) F ä r b u n g nach Crossmon . . 1494 710, 1492 — Domagk — Frederikse 1511 — van Gieson 708 — Goldner 1498 — Hansen 709 — Herxheimer 2291 — Heidenhain (Azan) . . . . 1489 (Chromotrop) 1507 (Pikroblauschwarz) . . . 1505 (Thiazlnrot) 1509 — Hortega 1547 ff. — Hueter 1514 — Klarfeld 1545 — Kohashi 1504 — Mallory 1486 1496 — Masson — Oliveira 1555 — Pasini 1499 — Petersen 1491 — Ribbert 1514 154711. — Rio-Hortega — Schaffer 1506 — Schiefferdecker 1508 — Unna 1290 — Verocay 1515 — Wallart u. Houette . . 712, 1497 — Walter 1502, 1503 Frisches Präparat 1454 Verhalten gegen Reagenzien . . 1466 Verdauung 1467 ff. Verhütung der Quellung . . . 238 Kollagenfreie Knochenschliffe . . 1667 Kollargol 2091 Kollektor 38 Kollektorblende 38 Kollodinieren der Schnitte . . 548, 2415 Kollodiumwolle 443 Kolloid (Hypophyse) 2202 — (Schilddrüse) 2235 ff. Kolloidale Sudanlösung n. Romeis 1044, 1048 Kolloidfärbung n. Kraus 1823 Kolmer, Fixierungsgemisch . . . . 241 —, (Gehörorganfix.) 2364 — (Netzhautfixierung) 2348 Kolophonium (für dicke Schnitte) . 852 — z. Einschluß (Nisslpräparat) . . 1753 Kolophoniumbalsam n. Spanner . . 1984 Kolophoniumgemische 909a Kolophonium-Lanolin 819 Kolorimetrische H-Bestimmung . 1258 ff. Kolossows Osmiumsäure-TanninMethode 1287, 1288 Kolsters Mitochondrienfixierung . . 977 Komajas Reagenz 1230 Kompensationsokular 13 Komplanatisches Okular 13 Kondensor 31 ff.

§§

Kongorot für Amyloid 1575 Belegzellen 2061 Elast. Gewebe 1568 Keratin 2272 Ossifikation 1651 — Schmelzprismen 1681 Kongorot-Phosphormolybdäns. . . 1568 Konservierung in natürlichen Farben n. Jores 860 — nach Kaiserling 858 286 — der Osmiumschwärzung . . . . Konservierung von Schnittpräparaten s. Einschlußmittel Kontraktionsknoten (Muskel) . . . 1728 Kontrastmikrometer 87 Kopal-Emaillack (Umranden) . . . 815 Kopal-Öllack 816 Kopfkappe (Spermium) . . . . . . 2180 Kopsch Bleichmethode 1013 — Mitochondrien-Fixierung . . . 867 — Netzapparat 1008, 1009 — Silbermethode (Ganglienz.) . . 1772 Korbzellen (Drüsen) 2044 Korium 2288 ff. Korkklammern 583 Korrektion d. Überfärbung . . . . 604 Korrektionsfassung 18 Korrektionsflüssigkeit 880 Korrosionspräparate 866 — n. Schummer • 866 Spanner 1985 — von Knochenkanälchen . . . . 1670 Kossas Kalknachweis 1637 Kostaneckis Fixierungsmeth. . . . 2383 Krallingers Fi'xierungsgemisch . . 943 Krappfärbung . . . . 796, 1601, 1602 Kraus' Kolloidfärbung . . 2202, 2237 f. Krausesche Endkolben 2297 Kreisschnittmikrotom 489 Kreosot (als Intermedium) . . . . 398 Kreosot-Gemisch (Hortega) . . . 1558 Kresazanfärbung n. Romeis . . . 2198 Kresofuchsin 1562 Kresolrot 1260 Kresylechtviolett — (als Indikator) 1262 — für Eizellen u. Keime . . . . 2464 — für Mastzellen 1411 — für frische Muskelpräparate . . 1695 Kresylviolett 702 Kreuztisch 9 Kreuze Ranviers 1893 Kristallponceau 1264 Kristallviolett 996, 1848 Kromayers Epithelfibrillenfärbung . 2264 Kühne, Neurokeratin 1895 — Trypsinverdauung 1467 Kulis Mitochondrienfärbung . . . 994 Kultschitzkys Markscheidenfärbung 1825 Künstliche Befruchtung 2389, 2395, 2405 — Härtung von Paraffin . . . . 429

Sachregister

§§

Künstlicher Nährboden 170 Kupfer, Nachweis 1224 Kupferalauncarmin 1708 Kupferazetat-Hämatoxylin . . . . 990 Kupferbichromat 248 Kupferchromalaun-Essigsäurebeize (Weigert) 1822 Kupferoxydfilter 44 Kupfersulfat (Entwässern) . . . . 382 Kupfersulfat-Chromalaun'fllter . . 44 Kupffersche Sternzellen 2091 Kurspräparate auf Vorrat . . . . 552 L. Labile Oxydasereaktion 1157 Labyrinth 2360 ff. Lack zur Umrandung 821 Lackverfahren (Glimmerersatz) . . 552a Lactophenol 809 Lactophenol-Kupferazetat . . . . 810 Lagebestimmung des Hühnerembryos 2432 Laguesse, Silbermethode 1537 Lähmung der Gefäßmuskulatur . . 1973 Laichzeit (Amphibien) 2403 — (Fische) 2394 2392 — (Neunaugen) Laidlav, Dopareaktion) 1179 La Manna, Markscheidenfärbung . 1836 Landau, Markscheidenfärbung . . 1834 —, Neurofibrillendarstellung . . . 1796 Lanes Methode für Lang.-Ins. . . 2227 Langerhanssche Inseln . . . 2224, 247 7 Lanolin-Kolophoniummasse . . . 819 Lantermannsche Segmente . . . . 1894 Latente Strukturen 191 Lauthsviolett 1898 Lävulose (Einschluß) 811 Lebendbeobachtung markloser Nervenfasern 1884 Lebendes Präparat 146 ff. Leber 2087 ff. —, Bindegewebe 2090 —, Gallenkapillaren 2094 ff. —, Glykogen 2094 —, Nerven 2093 —, Sternzellen 2091 Lebergangszellen (Schnecke) . . . 1267 Lebersche Turnbullblaumethode . . 2333 Leberzelle 2087 Lederhaut 2336 Lehmann's Fixierung v. Vitalf. . . 792 Lehner, metachromatische Schleimfärbung 2036 Leidenfrostsches Phänomen . . . 1328 Leinöl 1055 Leishmannfärbung f. Blut . . . . 1355 Lendvais Schleifapparat . . . . 499 Lenggenhager, Thrombocytenzählung 1452

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§§ Lenhosseks Fibrillenmethode . . . 2319 Lepehnes Hämoglobinfärbung . . 1436 Leuchtbildkondensor 56 Leuchtfeldblende 38, 58 Leuchtgas (z. Konservierung) . . . 861 Leukocyten 1309 ff. Leukocytenbewegung 1309 Leukocytengranula 1352 ff. —, acidophile 1352 —, basophile 1352, 1357 —, Lipoide der — 1381, 1382 —, neutrophile 1352 ff. —, Oxydasereaktion . . . .1377, 1380 —, Peroxydasereaktion 1378 —, pseudoacidophile 1372 — in Schnittpräparaten . . . . 1388 ff. —, vitale Färbung 1303, 1304 Leukophoren 1150 Leuko-Säurefuchsin 1176 Levi G., Aufkleben von Celloidinschnitten 566 Levi, Fixierungsflüssigkeit . . . . 2149 — Isolier.-Flüss 2346 Lewis Jodfixierung 178 Lösung 122 Leydigsche Zellen 2176 Lezithin 1082 ff. Lichtfilter 42 ff. Lichtgrün 665 Carmin 936 Safranin 952 Lieberkühnsche Spitzenlöcher . . 2065 Liebermann-Burchards Cholesterinreaktion 1079 Lifafilter 43 f., 49 Ligroin 417 Ligroin-Paraffinmethode von Pranther 417 Lindberg, Durchströmungsflasche . 173 Linolensäure 1055 Linse 2343 Linsenfasern 2346 Lipochondrien 1026 Lipochrome 1142 Lipofucsin 1137 Lipoide 1082 ff. —, Darstellung n. Ciaccio . . . . 1082 — in Blutzellen 1381 — Nachweis n. Goldmann (Blut) . 1381 —, Savini (Blut) 1381 —, Sehrt (Blut) 1381 —, Smith-Dietrich 1086 Lipomelanin 1137, 1142 Lipophanerose 1028, 1044 Lipdphoren 1142 ff., 1144 Liquor fer. sesquichlor 678 Lison,Bleiacetat-Formal 2073 —, Chlornachweis 2064 —, Fettfärbung 1050 —, Markscheidenfärbung . . . . 1837 —, Peroxydasereaktion 1176 —, Sudanschwarz 1050

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Sachregister

Lithiumcarbonatlösung, Herstellung 770 Lithiumcarbonat-Ferricyankalilösung (zum Differenzieren) . . 1825 Lithiumhämatoxylin (Weigert) . . 1824 Lithiumcarmin (f. Färbung) . . . 636 770 — (£. Vitalfärbung) Lithiumsulfat (n. Entkalken) . 1609, 1613 — (n. Fixieren gegen Quellung) . . 238 Lobo, Silbermethode 1811 Lochte (Haaruntersuchung) . . . . 2284 Lockesche Lösung 122 Loeles Aldaminreaktion 1167 — Naphtol-Peroxydasereakt. . . .1172 — Phenol-Gentianaviolettmethode . 1165 — Phenolreaktion 1162 Löfflers Methylenblau .182 Löschpapier zu Rekonstruktion . . 897 Lösen von Eisen 1071 Fett 1036 ^ormolniederschlag 274 Glykogen 1097 Lipoiden 1085 Pikrinsäure 302 f., 306 osmierten Substanzen 288, 1057 ff. Silberniederschlag 1519 Sublimatniederschlag . . . 327 Löslichkeit osmierter Substanzen 288, 1057 ff. Löwit-Fischersche Goldmethode . . 1905 Lorbeerwachs 429 Lufteinschluß in Gefäße . . . . 1990 Luftfüllung der Gefäße . . . . 1990 ff. Lugolsche Lösung, wäßr. z. Färbung 705 —, alkoh. z. Sublimatentfernung . 327 Luminiszenzmikroskop 68 1884 — (Nervenfaser) Lundvalls Knochenfärbung . . . . 1596 — Knorpelfärbung 1596 Lunge 2111 ff. —, Epicyten 2113 —, respirat. Epithel 2113 —, elastische Fasern 1464 Lupen 2 —, aplanatisch 2 —, binokular 3 Luteinzellen 2153 Lymphdrüsen 1994 ff. —, Mengenbestimmung 905 Lymphe als Kulturmedium . 154, 160 Lymphgefäße 1962 Lymphocyten, Azurgranula . 1357, 1367 —, Darstellung durch Luftfüllung 1990 ff. —, Injektion 1989 Lymphknoten 1994 II. —, Cytoplasmafärbung 1384 —, Mitochondrien (Schriddesche Granula) 1383 M. Macca 77 Macerationsmittel s. Isolationsmittel Maceration von Spermien . . . . 2168

Mac Gills Modifikation der MalloryFärbung 1487 Ma-Effekt 1157 Magen, Belegzellen 2061 —, Chlornachweis 2064 —, Hauptzellen 2060 —, Neutralrotfärbung 2062 —, Oberflächenzellen 2057 —, Sekretkapillaren 2063 —, vitale Farbstoffspeicherung . . 2062 —, Zellarten 2055 Magenta, Magentarot = Fuchsin . 701 Magentarot-Hämalaun-Lichtgrün . 2040 Magentarot-Pikroindigocarmin . . 716 Magnesiumacetat-Formol . . . . 268 Magnesiumbromid 1944 Magnesiumcarbonat 259 Magnesiumsalze und Nervenfärbung 1944 Maha-Hängerregistratur . . . . 853 Mainini's Kalknachweis 1219 Makroglia 1854 Malachitgrün (Vitalf. von Kern) . 921 M a 11 o r y s Bindegewebsfärbung . 1486 Modifikation von Heidenhain . 1489 — Hämatoxylin 685, 1874 1875 — mod. von Held —•>— von Hueter 1514 von Ribbert 1514 — Neurogliafärbung 1874 Manganoxydbeseitigung mit Oxalsäure 983 Manns Methylblau-Eosinfärbung . 728 —• mod. von Alzheimer 1877 Manson-Schwarz, Färbung nach . . 1376 Marchis Markscheidenfärbung . . 1839 Mareschs Bindegewebsimprägnation 1518 Marginale Glia 1875 Markhaltige Nervenfasern (peripher) 1885. 1890 ff. Marklose Nervenfasern . . . 1884, 1886 Markscheidenbeize 1822 M a r k s c h e i d e nf ä r b u n g m i t Bleu BZL 1841 Einschlußfärbung 1898 Hämatoxylin 1822, 1825, 1826, 1829, 1832, 1833 Osmiumsäure-Hämatoxylin . . 1831 Paraphenylendiamin . . . 1835 Piasmalreaktion 1897 Sudan-Schwarz 1837 Thionin-Weinsteinsäure . . .' . 1898 Markscheidenfärbung nach Bacsich 1829 Benda 1832 Feyrter 1898 Kultschi tzky 1825 La Manna 1836 Landau 1834 Lison u. Dagnelle . . . . 1837, 1841 Marchi 1838 ff. Pal 1826 Schroeder 1833

Sachregister

Markscheidenfärbung nach O. Schultze 1831 W. H. Schul tze 1835 Spielmeyer 1832 Vastarini Cresi 1828 Weigert 1820 ff., 1822 Wolters 1827 Markscheidennachweis mit polarem Licht 1840 Martinottis Färbemethoden . . 2270 ff. — Fixierung der Haut 2253 Maskenlack 821 Maskiertes Eisen 1208 ff. Maskierte Strukturen 191 Massons Canadabalsam 843 — Bindegewebsfärbung . . . . 1495 ff. — Hämalaun-Erythrosin-Safranfärbung 711 — Hämatoxylinfärbung 685 —, Schleimfärbung 2027 —, Trichromfärbung . . . . 1495, 1496 Mastisol 114 Mastzellen (im Gewebe) . . . . 1408 ffMastzellenfärbung nach Holmgren . 1408 Mastzellengranula 1409 Mastzellen-Plasmazellen . . . .1412 Matsuuras Congorotmethode . . . 1568 Mattscheibe 42 Maus (Fortpflanzung) . . . . 2447, 2461 Maximows Azur-Eosinfärbung . . 1396 — Fixierungsgemisch . . . . 338, 1389 P. Mayer, Aufklebemethode . . . 541 —, Carmalaun 642 —, Einbettungsverfahren . 405, 440, 441 —, Farbstoffprüfung 619 —, Ganglienzellfärbung 1752 —, Hämalaun 651, 653 —, Knorpelfärbung 1597 —, Muchämatein 2028 —, Mucicarmin 2025 —, Paracarrhin 643 —, Pigmentbleichung 1148 —, Tetrander 495 May-Giemsa n. Pappenheim für Ausstriche 1367 ff. Schnitt 1403 — Panchrom n. Pappenheim für Ausstriche 1369 Schnitte 1403 May-Grünwaldsche Färbung . . . 1352 —, mod. von Aßmann 1356 Mays Heber 1279 Mazeration s. Isolierung Mazerieren von Knochen . . . . 869a McClung, Salpetersäure-Formolgemisch . . . 2436 Medium (Gewebekultur) . . . . 157 ff. Meerschweinchen (Fortpflanzung) . 2454 Mehrfachfärbung 706 ff. Meißnersche Körperchen 2297 Meißnerscher Plexus 2085

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Melanin 1138 ff. —, Bleichung 1114 ff. Melanin, Nachweis durch DopaReaktion 1139, 1178 Melanophoren 1138 ff. Membrana propria der Nierenkanälchen 2130 Mengenbestimmung von Organanteilen 903 ff. Merkeische Flüssigkeit 319 Mesenterium 1280 Messen des Präparates (Mikrometer) 84 ff., 900 ff. Messen kurzschenkeliger Winkel . . 909 Messer f. Mikrotome 497 —, Schleifen ders 499 Messerhalter 494 Messerneigung 498 Messerschlitten 494 f. Messerstellung 498, 505 Messertiefkühler 521 — nach Zethraeus 522 Meßokular 54 ff. Meßplättchen 84 Meßtisch 89, 902 Meßtrommel 10 Metachromasie 603 Metachromatischer Fehler . . . . 1258 Metachromatische Färbung m i t Bleiacetat-Toluidinblau . . 1257 — Coelestinblau 2035 — Einschlußfärbung 1898 — Molybdänhämatoxylin . . . 2036 — Safranin 2033 — Thionin 2033 — Thionin-Weinsteinsäure . . 1898 — Toluidinblau 2033 n a c h Clara 2036 — Feyrter 1898, 2475 — Guizetti 2033 — Holmgren 1257 2036 — Lehner Metallnachweis n. Timm . . . . 1231 Metallring n. Lewis 169 Metanilgelb 2027 Methanol = Methylalkohol — Entwässerung 1326 — Fixierung von Blutpräparaten . 1325 — Prüfung 1326 —, Verhalten 390 Methanol-Celloidinmethode . . . 457 Methylbenzoat 390, 392 ff. — (Immersionsfl.) 26 Methylbenzoat-Celloidin (Einbettung) 392 ff. (Orientierung) 440 Methylblau-Eosin n. Mann . . . . 728 Mod. nach Dobell 729 Methylcarmin 634 Methylenazur 1359 Methylenblau Blutpräparat 1374

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M e t h y l e n b l a u (Forts.) Eosin 1352 f. Erythrocyten 1376 Erythrosin 1753 Fixierung 1935 ff., 1945 Ganglienzellfärbung . . 1742 ff., 1748 Kernfärbung 702 Knorpelfärbung 1585, 1588 nach Löffler 182 nach Manson-Schwarz . . . . 1376 nach Schabadasch . . . . 1941, 1944 Nervenfärbung 1928 ff. polychrom s. d 1412 ff. Seifenlösung (Nissl) 1742 Vitalfärbung 784 f. Methylenweiß 785 Methylgrün 699 — für Gewebsschnitte (Kern) . . . 699 — für Knorpelfärbung (Totalpräparat) 1596 Methylgrün-Fuchsin S-Orange . . 721 Methylgrün-Orange (Pappenheim) . 1371 Methylgrün-Orange-Giemsa nach ' Pappenheim-Kardos 1370 Methylgrün-Pyronin nach Pappenheim-Unna 723 für Plasmazellen 1416 (Langerhanssche Zellinseln) . 2226 Methylgrün-Pyronin-Orange . . . 725 Methylrot 1260 Methyl violett B 1847 1847 — 5 B — f. Amyloid 1574 — f. Blut 1308 — f. Epithelfaserfärbung . . . . 2264 — f. Knochen 1633 — Neurogliafärbung 1847 — Randfaden 1308 — Vitalfärbung von Kern . . . . 921 — Vitalfärbung von Mitochondrien 967 Metz' Blutkörperzählapparat . . . 1449 Metzners Färbemethode 698 — Fixierungsmethode für Schleimgranula 2020 Meves Mitochondrienmethode 971, 2385 Michaelis Fixier.-Gemisch . . . . 315 — Mitochondrienfärbung m. Janusgrün 780 ff. Michailows Darstellung des intrakardialen Nervensystems . . . 1953 Microcolor 1006 Mi-Effekt 1157 Miflex 77 Mikrocineration 1190 ff. M i k r o g l i a , Darstellung n a c h Cajal 1854 f. — Dubrausky 1870 — Globus 1867 — Hortega 1864, 1866 — Kanzler 1869 — Penfield 1868 — Seki 1872

Mikroglyptar 2 Mikroinjektion in Zelle 1259 Mikroluminar 2 Mikromanipulator 153 Mikrometer 84 ff. Mikrometerschraube (Mikroskop) . 10 — (Mikrotom) 496 Mikrometerwert 900 Mikrophotogr. Okular 77 Mikrophotographie 78 — im Ultraviolett 919 Mikroplanar 2 Mikropolar 2 Mikropolychromar 50 Mikrosummar 2 Mikroskop 1 ff. —, Anschaffung 91 —, Benutzung 20 Mikroskopierlampe 37, 38 Mikrotar 2 Mikrotom 488 ff. —, Anleitung zum Gebrauch . . . 508 —, Gefriermikrotom 512 ff. —, Modell H von Jung 495 —, Tetrander von P. Mayer . . . 495 Mikrotommesser 497 —, Schutzhülse für 503 Mikroveraschung 1190 ff. Mikrurgie 153 Millonsche Reaktion 1248 Milz 2004 ff. — Durchspülung 2007 M-Nadi-Reaktion 1155 Mischpipetten 1442 Mislawskys Mitochondrienmethode 2042 Mitochondrien —, Bleichen 983 —, Einbettung 981 f. —, Einwirkung von Hitze und Kälte 968 Färbung nach Altmann 991 Benda 970, 984, 996 Cowdry 990, 995 Frederiksen 1511 Heidenhain 986 Hirsch u. Bretschneider . . . . 989 Kuli 994 Meves 991 Michaelis 780 ff. Regaud i . . . . 988 Rio-Hortega 999, 1547 Seki 993, 998 F ä r b u n g mit Eisenalizarin-Anilin-Fuchsin . . 998 Eisenalizarin-Kristallviolett . . 996 Eisenhämatoxylin 986 ff. Erythrosin-Methylenblau . . . 1753 Janusgrün 780 Kristallviolett 996 Kupferacetat-HämatoxylinKaliumchrömat 990 Säurefuchsin-Lichtgrün . . . . 1758

Sachregister

§§

M i t o c h o n d r i e n (Forts.) Färbung mit Säurefuchsin-Pikrinsäure . . . 991 Säurefuchsin-PikrinsäureNaphthol-Schwarz 1511 Säurefuchsin-Methylgrün . . . 995 Säurefuchsin-ToluidinblauAurantia 994 Fixierung nach Altmann 991 Bang-Sjövall 980 Benda 970 Bensley- Cowdry 973 Champy 972 Cowdry 973 Dubreuil 978 Kiyono 979 Kolster 977 Kopsch 976 Levi 2149 Meves 971 Mislawsky 2042 Regaud 988 Schultze 0 684 Mitochondrien, Lebendbeobachtg. 966 ff. —, Vitalfärbung 967, 780 f. Mitosen 925 ff. Modellierspatel 892 f. Modiolus 2360 Mohrsches Salz 48 Mollier's Milzgefäßdarstellung . . 2007 Molybdathämatein 686 Molybdänhämatoxylin s. Molybdänsäure-Hämatoxylin Molybdänsaures Ammonium . . . 626 zur Fixierung von Neurofibrillenfärbung 1935 ff. zur Neuroflbrillenfärbung nach Bethe 1782 Molybdänsäure-Hämatoxylin f ü r basalgekörnte Zellen . . . 2076 — Bindegewebe 1513 f. — Gliafärbung 1875 — Schleimfärbung 2036 nach Clara 688 — Held 686, 1875 — Mallory 1513 Molybdänverfahren n. Donaggio 1780 f. Mommsens Puffergemisch . . 1345, 1368 Monobrombenzol 852 Monochromat 24 Monochromatische Filter . . . . 49 Monochromatisches Licht 49 Monochromator 49 Monokulare Fernrohrlupe . . . . 80 Mononatriumurat 2137 Montage anatomischer Präparate . 863 Morphium 102 M S 22 (Narcoticum) 104 Muchämatein 2028 Mucicarmin 2025 Mucicarmin-Bleu de Lyon . . . . 1586

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§§ Mucicarmin-Metanilgelb 2027 Mucoitinschwefelsäüre . . . 1257, 2031 Müllersche Flüssigkeit 244 für Entkalkung 1622 —• Fixierung 244 — Mazeration (Epithel) . . . . 1275 •— Nervensystem 1734 Müller-Formolgemisch nach Orth . 247 Müller-Osmiumgemisch nach Marchi 1839 Müller-Sublimatgemisch n. Held . 240 Helly 337 Maximow 338 Zenker 336 Mukös-mukoid Unterschied . . . 2023 Mukoide Substanzen 2036 f. Mundhöhlenschleimhaut 2046 Muskel 1690 ff. —, glatt 1721 ff. —, Herzmuskulatur 1718 ff. —, Maceration 1696, 1722 —, quergestreift frisch 1690 —, Skelettmuskulatur . . . . 1690 ff. —, Supravitalfärbung 1695 Muskelfibrillendarstellung . 1691, 1701, 1710 ff. Muskelspindeln 1713 Muskel und Sehne 1717 Muzin s. Mucin Myelinscheide 1891 Myelintropfen 1885 Myelocyten 1377 Myelo-Oxydase-Reaktion . . . . 1155 Myofibrillen, Färbung .1706 ff., 1715 11. — Isolierung 1691, 1697 Myokard 1949 ff. N. Nabelstrang 1461 Nachbehandlung fix. Präparate . 353 ff. Nachfixierung von Formolpräparaten 278 Nachvergoldung 1784 Nachversilberung 1280 Nadelhechel 129 Nadipuffergemisch 1159 Nadireaktion 1157 ff. Nadireaktion nach Formolfixierung 1161 Nagel, Untersuchung des — . . . 2273 Nährboden (künstl.) 170 Nähseide, sterilisieren 156 Naphthalin 855 Tetralin 855 Xylol 856 Napthazarin 738 Azophloxin 740 Naphthol-Gentianaviolettlösung . . 1165 Naphtholgrün 746 Naphthol-Oxydase Reaktion für Blutpräparate 1377

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Sachregister

§§

Naphthol-OxydaseR e a k t i o n (Forts.) nach Giercke 1157 — Gräff 1157 ff. 1380 — Hirschfeld — Loele 1162 — Schmorl 1156 1155 — W. H. Schultze Naphtholperoxyddasereaktion . . .1172 Naphtholpurpurin 743 Naphtholreaktion 1154 ff. Naphtholschwarz 1511 Narkose mit Äther 102 Chloreton 103 Chloroform 102 Curare 110 Dial 108 Kokain 107 Morphium 102 — — M S 22 104 — Novonal •. . . 104 Numal 109 — — Strychnin 107 -TS22 104 Urethan 106 Nasenschleimhaut, Untersuchung der — . 2370 ff. Natrium (z. Entwässern von Äther) 448 — (Vernichtung von gebraucht. N.) 448 Natriumbisulfit 1235 Natriumcarbonat = Soda Natriumchlorid s. Kochsalz —, Nachweis (Niere) 2139 Natriumeitrat 1324 Natriumfluorid . . . 1276, 1726, 2346 Natriumjodat 651 Natrium jodid 651 Natriumparadipicrylamin . . . . 1215 Natriumphosphate 1159 Natriumsulfat = Natrium sulfuricum = Glaubersalz (für Fixierung) . 244 — nach Entkalkung . . . . 1609, 1613 —• zum Entwässern 460 Natriumsulfid (Osmiumschwärzung) 286 Natriumsulfit = Natrium sulfurosum 1845 Natriumsulfit-Chromogen-Ameisensäure (Weigert) 1845 Natrium sulfuric. = Natriumsulfat s. d. — sulfurosum = Natriumsulfit s. d. Natriumthiosulfat (Fixiernatron) nach Jod 328 Natriumthiosulfat nach Metallimprägnierung 1525 Natriumthiosulfatlösung 1/io n . . . 785 Natronlauge, Normallösung . . . 1159 Natronlauge zur Mazeration . . . 1956 Natronlauge-Silbermethode (Schultze) 1808 — Modif. nach Lobo 1811

§§ Nebenniere 2210 —•, argentaffine Substanz . . . . 2218 —, chromaffine Reaktion . . . . 2211 —•, Färbung nach Wiesel . . . . 2217 —, Fixierung 2210 ff. —, Lipoide 2220 Nebenzellen 1914 Negativer Pol (Bestimmung) . . . 41 Negative Versilberung (Hornhaut) . 2328 Negocoll . 898 Nelkenöl 390, 587 — zur Celloidinentfernung beim Aufkleben 557 — Ersatz durch Methylbenzoat . . 587 — Sichtbarmachen verblaßter Injektionen •. 1982, 2100 — Verhalten 390 Nelkenöl-Celloidin zum Aufblocken 486 Nematoden (Befrucht.) 2387 Nerv (peripher) frisches Präparat . 1885 — marklos 1886 — markhaltig 1885 — Lebendbeobachtung 1884 Nervendarstellung in Paraffinschnitten 1922 ff. N e r v e n e n d i g u n g in Cornea . 2335 Cutis 2297 Darm 2086 Entenschnabel 2296 Epidermis 2297 Gehörorgan 2368 Geruchsorgan 2374 Geschmacksknospen 2048 Herz 1953 Knochen 1689 Leber 2093 Muskel 1934 Zahn 1689 Nervenendigungen, Darstellung durch Färbung 1928 ff. mit Methylenblau . . . 1929 ff. — Silberimprägnation . . . 1908 ff. — Vergoldung 1904 ff. — im frischen Präparat . . . . 1888 Nervenendigung, Darstellung nach Bethe 1902 Bielschowsky . . . . . . . . 1909 Boeke 1912 Cajal 1918 de Castro 1689 Davenport 1922 Dogiel 1936 ff. Ehrlich 1929 ff. Faworsky 1919 Foley 1813 Gad 1713 Gros-Schultze 1793 Lawrentjew 1915

Sachregister

§§

N e r v e n e n d i g u n g (Forts.) Darstellung nach Kadanoff 1810 Loewit 1905 Miller 1907 Perez 1920 Ranson 1812 Ranvier 1906 Rogers 1926 Rojas 1921 Schultze 0 1793, 1808 Sihler 1713 Wallart 1913 N e r v e n f a s e r , Darstellung des Achsenzylinders 1901 ff. — der Lantermannschen Segmente 1921 — der Markscheide . . 1891, 1896 ff. — des Myelins 1891 — der Neurofibrillen . . . . 1902 f. — des Neurokeratins 1895 1899 — der ^-Granula — der Ranvierschen Einschnürung 1885, 1891 f. Kreuze 1893 Nervenzelle s. Ganglienzelle Nervensystem Achsenzylinder . . . 1780 ff., 1901 ff. Allgemeines 1734 ff. Bindegewebe 1881 ff. Binnenapparat 1760 ff. Ganglienzellen (Fortsätze) . . 1739 ff. Isolierungsmethoden . . . . 1739 ff. Kern und Tigroidsubstanz . . 1741 ff. Markscheiden (Gehirn) . . . 1820 ff. — (peripher) 1885, 1890 Nervenendigungen 1908 if. Nervenfaser 1884 ff. Neurofibrillen (Gehirn) . . . 1780 if. — Goldmethoden 1783 ff. — Molybdänmethoden . . . 1780 ff. — Silbermethoden 1785 ff. Neurofibrillen (periph.) . . . 1901 ff. Neuroglia 1844 ff. Neurosomen u. Mitochondrien 1756 ff. Periphere Nerven 1884 Vitalfärbung (Gehirn) . . . . 1756 (peripher) 1928 Netzapparat 1002 ff. Netzhaut 2347 ff. Netzknorpel 1594 ff. Netzkörbchen 361 Netzteilung (Zählkammer) . . . . 1442 Neubauersche Zählkammer . . . 1443 Neukirchs Glykogenfixierung . . . 1091 Neumannsche Zahnscheiden . . . 1682 Neumayers Färbegestell 582 — Injektionsmethode 1987 Neunaugen, Fixierung der Eier . . 2391 Neunaugenfundstätten 2392 Neurilemm 1891

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§§

N e u r o f i b r i l l e n (Forts.) Darstellung durch Ammon. molybd.-Toluidinblau (zentral) 1780 ff. — (peripher) 1902 Goldmethode 1783 Natronlauge-Silber 1808 Silber 1785 ff., 1908 ff. Silbernitrat-Hydrochinon . . 1793 ff., 1798 ff. Neurofibrillen, Darstellung nach Apäthy 1783 f. Agduhr 1792 Bacsich 1818 Bethe 1782 Bethe-Mönckeberg 1902 Bielschowsky 1786, 1909 Bodian 1816 f. Boecke 1912 Cajal 1797 ff. Cowdry 1807 Donaggio 1781 Esaki 186 f. Foley 1813 Gros 1793 Lobo 1811 Ranson 1812 Reumont-Lhermitte . . 1796a, 1912 Rogers 1926 Schul tze 0 1808 Uyama 2355 Neurofibrillen in Gewebekultur . . 186 Neurogene Nebenzellen 1914 N e u r o g l i a , Allgemeines . . . 1844 Neuroglia, D a r s t e l l u n g mit Ammoniumbromid-Formol . . 1859 Brom-Formol-Silber 1854 Säurefuchsin-Lichtgrün . . . . 1758 Gold-Sublimat 1849 Kristallviolett 1848 Mallory-Hämatoxylin . . . . 1874 Methylblau-Eosin 1877 Methylviolett 1847 f. Molybdänhämatoxylin . . . 1874 ff. Trypsin 1844 Uranformol 1856 Verdauung 1844 Neuroglia, Darstellung nach Alzheimer 1758, 1877 ff. Bielschowsky 1873 Cajal 1849 ff., 1854 ff. Dubrausky 1870 Globus 1852, 1867 Held 1875 Holzer 1848 Kanzler 1869 Mallory 1874 Penfield 1868 Rio-Hortega 1857 ff. Spielmeyer 1847

670

Sachregister

§§

N e u r o g l i a (Forts.) Darstellung nach Weigert 1845 Neuroglia, Einfluß von Verdauung . 1844 Neurogliabeize 1822 Neurokeratin 1865 Neurosomen 1758 f. Neutraler Farbstoff 599 Neutralfette, Nachweis . . . . 1064 ff. Neutralisieren des Formols . . . . 257 durch Pyridin 260 Kanadabalsams 841 Neutralrot (Krall-Cogit) 1006 1261 f. — als Indikator Neutralrot-Janusgrün 783 Neutralrot, Knochenfärbung . . . 1599 — Vacuom 1004 f. — Vitalfärbung 722 ff. Fixierung 773 Neutrophile Granulationen . . . 1352 ff. Neutrophilic 602 Nevillite V 838 Nickhautdrüsen 2012 Nicolies Carbolthionin 1643 Niederschlag nach Chromfixierung . 250 Formolfixierung, Entfernung . 274 Sublimatfixierung, Entfernung 326 f. Niederschlagsfärbung 593 Niedervoltlampe 39 Niere, frisches Präparat 2119 —, Bindegewebe 2130 —, Bürstenbesatz 2120 —, Darstellung der Salze . . . 2134 ff. —, Epithelien 2128 —, Zellgrenzen 2129 —, Deckzellen 2128 —, Epicyten 2128 —, Fixierung 2126 f. —, Fluoreszenzmikroskopie . . . 2119 '—, Isolationspräparat mit Salzsäure 2121 —, Salpetersäure 2128 Niere, Lebendbeobachtung . . . .2119 —, Leichenerscheinungen . . . . 2120 —, Vitalfärbung 2119, 2124 Nigrosin 1506 Nilblau-Bordeaux 2283 Nilblausulfat, Fettfärbung . . . 1064 ff. —, Fixierung 787 —, Vitalfärbung 761 Ninhydrinreaktion 1249 Nisslkörper 1741 ff. —, bei Nuklealreaktion 1754 Nissls Äquivalentbild 1742 ff. — Seifenmethylenblaulösung . . 1742c Nisslfärbung bei chromiertem Material 1746 Formolmaterial 1745 Nitrobenzol 852 Nitrogruppe 599 Nitroprussidlösung 1966 Nochts Azur-Eosinfärbung . . . . 1396

§§

Noduli lymphatici 1994 Normal-Essigsäure 1159 Normal-Natronlauge 1159 Normal-Salzsäure 680 Normosallösung 121 Novonal 104 Noyers Umrandungsmasse . . . . 819 Nuklealfärbung 1233 ff. — (Keratohyalin) 2265 — (Nisslsubstanz) 1754 Nuklealquetschmethode 938 Nukleinsäurelokalisation . . . . 919 Nukleolen 954 Nukleolenfärbung nach Obst . . . 950 Numal 109 Numerische Apertur . . . 8, 13, 15, 16 Numerieren von Celloidinschnitten 555 f. — — Objektträgern 528 O. Oberflächenpräparate n. Wolf . . . 869 Oberflächenzellen des Magens . . 2057 Objekthalter 495 Objektiv 11 Objektiv für Dunkelfeld 54 Objektivfassung rostfrei 28 Objektivrevolver 11 Objektivschlitten 11 Objektivzwischenstück 45 Objektmikrometer 84 Objektschlitten 495 Objekttisch 9 — heizbarer 175 Objektträger 93 —, Beschriften 528 —, Entfetten f ü r Blutpräparate . . 1295 —, — für Verdauungspräparate . 1477 ff. — aus Quarz 66 —, Heinigen . . . .' 97 ff. —, Signieren 528 ff. Obregias Aufklebemethode . . . 563 Obsts Nukleolenfärbung . . . . . 950 Odontoblasten 1686 Oestrus 2446 Officinelle Salzsäure 679 Ogatas Silbermethode 2219 Ohr 2359 ff. Behandlung nach Kolmer . . . 2364 Wittmaack 2365 Entkalken 2362 ff. Untersuchung des Labyrinths . 2360 Zerlegen nach Panse 2361 Okajima, Beschneideritzer . . . . 882 —, Eisenchloridalizarinlack . . . 752 Okamoto, Eisennachweis . . . . 1212 —, Goldnachweis 1227 —, Kupfernachweis 1224 Okkels, photometrische Meßmethode 907 Okkultes Eisen . . . . . . . 1208 ff. Okular 11 f.

Sachregister

Okularblende , . . 90 Okularmikrometer . . . 85 fl-, 900. f. ölcelloidin, Aufblocken 486 —, Aufkleben der Schnitte . 558, 567 —, Einbetten in — 46011. —, Schneiden 511 —, Weiterbehandeln unaufgeklebter Schnitte 585 ölcelloidineinbettung n. Apäthy . 460 Jordan 462 Lee Wolfrum 462 Zach 461' öle, ätherische 390, 414 ölen des Mikrotoms 508 ff. Oleinhaltige Substanzen . . . . 1054 ff. ölgemisch nach Apäthy . . . . 460 Bolcek 306 Oligodendrogliazellen . . 1844, 1861 f. — nach Globus 1867 Hortega 1861 Penfleld 1868 Seki 1872 ölimmersion 21 ölkugeln (Nötzhaut) 2353 örtliche Vitalfärbung n. Vogt . . 790 ölstein 135 Ölsäure 1055, 1085 Oliveira, Bindegewebsimprägnation 1555 Omnichrom 752 Opakilluminator 63 ff. Opalblau 2160 Opticolorkondensor 50 Optische Färbung 57 Optimale Tubuslänge 17 Orangefilter 49 Orange G 665 Orange G-Anilinblau-Säurefuchsin nach Mallory i486 Anilinblau-Azocarmin n. Heidenhain 1489 Eisenhämatoxylin 665 Eosin 661 Eosin-Toluidinblau 726 Erythrosin-Toluidinblau . . . 727 Methyleosin-Wasserblau . . . 2271 Methylgrün 1371 Methylgrün-Pyronin 725 Methylgrün-Säurefuchsin . . . 721 Rubin S 1653 Orange G-Säurefuchsin-Methylgrün 721 Orbitaldrüsen 2358 Orcein «lach Unna-Taenzer . . . . 1556 Pranter 1558 — f ü r Knorpelfärbung 1597 Orcein-Blaues Polychrom . . . . 2289 Orcein-Hämatoxylin (MuskelSehne) 1716 Orcein-Wasserblau nach Unna . 1500 ff. Orcein-Wasserblau-Eosin . . . . 1290 Organausstrich 1335 OrganexiJlantation 173

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Organextrakt (Gewebekultur) . . 166 ff. Orientieren bei Einbettung . . . 439 ff. Orientierungsapparat (Mikrotom) . 495 Origanumöl 390 — zum ölgemisch nach Apäthy . . 460 Orths Fixierungsgemisch . . . . 247 — Lithiumcarmin 636 Osmiumjodidmethode n. Champy . 2046 Osmiumräucherung 285 Osmiumsäure 280 ff. Ansetzen der Lösung . . . 280, 281 Anwendung zur Fixierung . . . 284 Bleichen 1013 Blutfixierung 1330 Blutplättchenkonservierung . .1314 Einbettung osmiert. Präparate 981 f. Entfernung aus Schnitten . 288, 983, 1013 Fettnachweis 1053 ff. nach Hoerr 1063 Gemische 289 Golgi-Substanz 1007 fl. Lösung beim Durchtränken . 1057 f. Unlöslichmachen durch Natriumsulfid 286 Unlöslichmachen von Gelatine . 1982 Wirkungsweise 283 z u r F ä r b u n g von Zellstrukturen nach O. Schultze . 684 • Markscheiden nach O. Schultze 1831 Tannin nach Woronin . 1288 z u r F i x i e r u n g von Ausstrichen 932 Gewebekültur 176 Spermien 2170 Zellen (Fixierung durch Dämpfe) 285 zur Isolierung von Epithelien . . 1273 von Ganglienzellen . . . 1739 Osmiumsäure-Formol-Jod-Eisessig 1329 Osmiumsäuregemische nach Altmann 974 — Benda 296 — Bensley (Cowdry) 973 — Cajal 1769 — Champy 298 (mit NaJ) 2046 Flemming, schwach . . . 292 , stark 290 ff. — Flemming-Heitz 1238 — Gelei 933 — Golgi 1764 — Hance 290 — Hermann 293 — Kolatschew 1009 — Kopsch 1008 f. — Levi 2149 — Marchi 1839 — Maximow 338, 1390 — Metzner 2020, 2021

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O s m i u m s ä u r e g e m i s c h e (Forts.) nach Meves 297 1329 — Werzberg — Wittmaack 2365 Osmiumsäure für Isolierung . 1273, 1739 Osmiumsäure-Hämatoxylin . . . 684 (Markscheiden) 1831 Osmiumsäure-Kaliumbichromat . . 974, 2020

Osmiumsäure-Kaliumbichromat.Salpetersäure 2021 — für Markscheidendarstellung nach O. Schultze 1831 Osmiumsäure-Natriumjodid . . . 2046 Osmiumsäure-Pikrin-Essigsäure . . 316 Pikrin-Essigsäure-Platinchlorid 316 Salpetersäure 1283 Silbernitrat 1284 Tannin 1288 Osmiumtetroxyd s. Osmiumsäure Osmotischer Druck (Fixierung) . . 202 Ösophagus 2051 Ossifikation 1651 ff. Otolithen 2369 Ovarien 2143 ff. —, interstitielle Drüse . . . . 2154 f. Overton, Fixierung usw. von Zupfpräparaten 145 Oxalsäure bei Bleichung osmierter 1013 Präparate — beim Bleichen von Pigmenten . 1121 —, Entfernung von Eisen . . . . 1071 1524 —, vor Bielschowskymethode . Oxalsäure-Methylviolett (für Neuroglia) 1845 Oxaulsaures Natrium 159 Oxyplastin 724 Oxydasereaktionen 1154 ff. Oxydasereaktion nach Gräff . . 1157 ff. — n. Hirschfeld 1380 Winkler-Schultze 1155 — an Blutausstrichen 1277 ff. —, Einfluß der Fixierung und Art der Farblösung 1154 Oxydase-Schnellreaktion . . . . 1380 Oxydations-Reduktionspotential . . 1263 Oxyphyle Zellen (Darm) . . 2067, 2070

^-Granula 1899 Paarungszeit (Amphibien) . . . . 2403 — (Reptilien) 2419 Pacinische Körperchen 2297 Painter, Carminessigsäure . . . . 929 Palladiumchlorür bei Injektionspräparaten 1982 Palsche Bleichmethode . . .1013, 1826 —• Markscheideiifärbung . . . . 1826 Panchromfärbung nach Pappenheim für Anstriche 1369 Schnittpräparate . . . 1405

Panchromgemisch n. Pappenheim . 1406 . 2067, 2070 Panethsche Zellen . Pankratischer Kondensor . . . . 36 Pankreas 2039 ff. — Langerh.-Ins 2224 ff. Pankreatinum siccum 1468 Panoptische Färbung (May-Giemsa) n. Pappenheim für Ausstriche . 1367 f ü r Schnittpräparate . . . . 1403 Panoptische Knochenfärbung . . . 1644 Pansch, Kleisterinjektion . . . . 1988 Panses Methode für das Gehörorgan 2361 Pap, Bielschowskymodifikation . . 1529 Papillen der Zunge 2047 Pappenheims Methylgrün-Pyroninfär'oung 723 — Panchromfärbung . . . . 1369, 1405 — panoptische Färbung (MayGiemsa) 1367, 1403 . 1371 — Methylgrün-Orangemischung — Methylgrün-Pyronin-Orange . . 725 — Kardoslösung . . . 1370, 1371, 1407 — Triacid 1375 Paraboloidkondensor 52 Paracarmin 643 Paraffin 390, 419 Befreiung 570 ff. Bestimmung des Schmelzpunktes 425 Celloidin-Einbettung . . . . 463 ff. Entfernung aus dem Schnitt . . 570 Schneiden 504 ff. Sorten 423 Überhitztes — nach Spee . . . 426 Zusätze 427 ff. Paraffindurchtränkung . . . . 419 ff. nach Allen 2175 — Meves (für Ascariseier) . . 2385 — Peterfi 392 — Poso 416 — Pranter 417 Paraffingemisch nach Altmann . . 427 — Kabsch 427 — Mc Clung 428 — Orton u. Post 430 — v. Walsen 427 — Waterman 429 Paraffineinbettung 432 ff. 880 Born-Petersche Richtplatte 441 in Gelatinekapseln n. P. Mayer 440 Orientierung kleiner Objekte 880 —• für Rekonstruktionen . . 390 Paraffinöl 915 —•, als Beobachtungsmedium . . 849 •—• für Einschluß von Präparaten 25 Immersion — als Luftabschluß von Farb. 688 lösungen Paraffinlösende Flüssigkeiten . . . 390 423 ff. Paraffinsorten . 426 —, überhitztes — Paraffin-Ligroin-Einbettung . . . 417 Paraffin mit Wachszusatz . . . . 427

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§§

Parafïinum liquidum s. Paraffinöl Paraformaldehyd 255 Paraganglien, Untersuchung . . 2211 ff. Paraphenylendiamin (SchultzeWinkler) 1155 ff. 1835 — (für Markscheiden) Paraplasma (Blutzellen) 1384 Parathyreoidea 2189 f. Parenchymatöse Luftinjektion . . 1992 Parotis 2039 ff. Parthenogenese 2387 Pasinis Färbung 1499 , Modif. nach Walter . . . . 1502 Pasteeis, Fixierung 1092 Patentblau n. Fautrez 1177 Pathologische Granulierung . . . 1362 Patzelt, Epithelfasern 2262 —, Intercellularlücken 2258 —, Magenschleimhaut 2059 —, Saftbahnen 2258 Penfield, Goldsublimatmethode . . 1853 —, Hortegamethode 1868 Pepsinverdauung . . . 1467 ff., 1481 f. —, Kerne 939 Perdrau, Bindegewebsdarstellung . 1883 Perenyische Flüssigkeit 322 Perez, Silbermethode 1920 Perhydrol 1171 Perhydrolmethode nach Magnus . 1990 Pericyten 1961 Perikard 1952 Periphere Nerven 1884 ff. Periplanatisches Okular . . . . 13, 78 Peroxdasereaktionen 1171 ff. 1378 — f. Blutzellen — n. Lison 1176 Péterfis Einbettungsmethode . . . 392 — heizbare feuchte Kammer . . . 175 — Mikromanipulator 153 — Orientierungsmethode . . . . 440 Peters Dotterfärbung 2417 Petersen, Bindegewebsfärbung . . 1491 —, Knochenfärbung 1626 —, Säurealizarinblaufärbung 748, 1491 —, Weichcelloidinmethode . . 512, 2288 Petrischale (für Blutfärbung) . . . 1346 (bei Gewebekulturen) . . . . 156 Petroläther (Ligroin) . . . . 390, 417 Petrunkewitsch' Fixierungsgemisch 341 Peyersche Plaques 2079 PFA3 311 Pflasterepithelien 1292 Pfuhl, Aufkleben von CelloidinParaffin-Schnitten 554 —, Einbettung in Cell.-Paraff. . . 466 —, Fixierungsflüss 335 PH-Indikatoren 1260 Phaeochrome Zellen (Chromaffine Zellen) 2211 ff. Phasenkontrastverfahren . . . . 918 Phenolderivate, Nachweis . . . . 1256 Phénol-Gentianaviolettmethode . . 1156 43

R o m e i s , Mikrosk. Technik. 15. A u f l .

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§§

Phenolreaktion 1162 — primär 1164 ff. — sekundär 1167 Phenolrot 1260 Phloroglucin-Salpetersäure . . . 1614 Phormien 1760 Phosphate (Nachweis in der Niere) . 2139 Phosphatpuffer . . 1149, 1341 ff., 1944 Phosphormolybdänsäure bei Malloryhämatoxylin 1513 Ribberts Bindegewebsfärbung 1514 Phosphormolybdän-Hämatoxylin . 686, 687, 1513, 1875 Phosphorwolframsäure (Fixierg.) . 299 1499 — bei Pasinis Methode Phosphorwolframsäure-Hämatoxylin 685, 1874 — f. Bindegewebsfärbung (Hueter) 1514 Fibrinfärbung (Schueninoff) . 1430 Neurogliafärbung . . . . 1874 ff.. Phosphorwolframsäure-Thionin (Knochenfärbung) 1644 Photpmetrische Meßmethode . . . 907 Photoxylin 446 Physiologische Kochsalzlösung . . 118 — Selbstinjektion 2098 f. Picein 864 Pickworth, Gefäßdarstellung . . . 1967 Pigment 1109 ff. Abnutzungspigment 1137 Allophoren . • 1147 ff. Autogene Pigmente 1109 Argentaffinität 1129 Argyrophilie 1131 Bleichung 1114 ff. Blutpigmente 1109, 1134 Carotinoide 1142 Carotinalbumin 1146 Eisennachweise 1122 Erythrophoren . . . . , . 1143 Färbung 1123 ff. — mit Gentianaviolett . . . . 1126 Neutralrot 1124 polychrom. Methylenblau . 1127 — nach Kohn 1124 Romeis 1127 v. Volkmann 1126 Fetthaltig 1142 Fixierung 1110 Fundstellen 1135 Guanin 1150 ff. Guanaphoren 1150 ff. Hämatoidin 1136 Hämosiderin 1135 Interferenzzellen 1150 Iridocyten 1150 Leukophoren 1150 Lipochrome 1142 Lipofuscin 1137 Lipophoren 1142 ff. Löslichkeit 1112 Lutein 1142

674

Sachregister

P i g m e n t (Forts.) Malariapigment 1109 Melanin 1138 ff. —, Vorstufe dess. . . . . 1139, 1178 Melanophoren 1141 ff. Nachweis durch Dopareaktion . 1178 Trennung der Pigmente . . 1110 f. Xantophoren 1143 Pikrinsaures Ammonium . . 1939, 1940 Pikrinsäure 300 zur Differenzierung 991 Einfluß auf Schmelzprismen . . 1679 Entfernung 302 f., 306 zur Entkalkung 1620 — Färbung 707, 713 — Fixierung 300 f. Pikrinsäuregemische zur F ä r b u n g Pikrinsäurealkohol n. Metzner . 991 713 Pikrinsäure-Carmin Pikrinsäure-Thiazinrot 707, 710, 1509 Pikrinsaures Ammonium . 1939, 1940 1505 Pikroblauschwarz . . . . 707 Pikrofuchsin nach Fyg . . 708 van Gieson . . . . 709 Hansen . . . . . 709 Weigert . . . 715 ff., 718 Pikroindigocarmin . . Pikroindigocarmin-Magenta . . 716 Pikronigrosin 1506 Pikrinsäuregemische zur Fixierung Pikrin-Alkohol-Formol-Eisessig 308 Pikrin-Ammoniumbichromat . . 1518 Pikrin-Dioxan-Alkohol-Eisessig 357 Pikrinessigsäure . 238 Pikrin-Formol-Eisessig . . . 305 ff. Pikrin-Kupferazetat-FormolEisessig . . 309 . 316 Pikrin-Osmium-Essigsäure Pikrin-Osmium-PlatinchloridEssigsäure 316 Pikrin-Salpetersäure 313 Pikrin-Salpetersäure zum Entkalken 313, 1620 Pikrin-Schwefelsäure . . . . -312 Pikrin-Sublimat 314 Pikrin-Sublimat-Eisessig . . . 314 Pikrin-Sublimat-Formol-Eisessig 335 Pikrin-Sublimat-Osmiumsäure . 316 Pikrin-Trichloressigsäure-Formol 347 Pikrinsäuregemische zur Fixierung n a c h Allen 310 — Bouin 305 — Boveri 2381 — Dubosq-Brasil 308 — Hollande 309 — Kleinenberg 312 — Langeron 307 — Mayer P 313

Pikrinsäuregemische z u r F i x i e r u n g (Forts.) n a c h Michaelis 315 — Pfuhl 335 — Rabl 314 — Rath v 316 — Schaffer 314 347 — Stieve Pikrofuchsinmethode 708 Pikro-Nigrosin 1506 Pikroblauschwarz 1505 — mod. n. Bautzmann 2416 Pilokarpin 2016 Pinealzellen 2247 Pinselmethode 1998 Pischinger, Ganglienzellfärbung . . 1748 —, isoelektr. Punkt 1264 —, Piasmalreaktion . . . . 1242, 1244 Pituicyten 2206 Plättchenzählmethode n. Lenggenhager 1452 Planachromat 12 Planimeter 906 Planmonochromatimmersion . . . 24 Planspiegel 6 Plasma als Medium 166 ff. Plasmalogen 1241 Piasmalreaktion 1242 — f ü r Markscheiden 1897 Plasmastückfärbung 1246 Plasinazellen: —, Färbung mit MethylgrünPyronin 1416 —, polychromem Methylenblau 1412 Plastelin zur Rekonstruktion . . . 897 Plastische Rekonstruktion . . . . 878 Plastoid . 866 —, Injektion 1985 Piastosomen s. Mitochondrien Platinchlorid (Fixierung) . . . 317 ff. — Chromsäure 319 — Osmiumsäure-Eisessig . . . . 316 — Sublimat 318 Plattendiagrammethode 877 Plattenmodelliermethode . . . . 878 Plattenpräparate 863 Pleurosigpaa angulatum 30 Plumbum formicicum 1775 Pluspol, Bestimmung 41 Polarisationsfilter n. Bernauer . . 61 Polarisationsmikroskop . . . . 60 ff. — Untersuchung mit . . . . 1039, 1074 Polbestimmung 41 Polpapier 41 Polstrahlen 961 ff. Polychromasie d. Erythrocyten . . 1376 Polychromatische Erythrocyten . 1306a Polychromes Methylenblau für — Hypophysis 2202 — Mastzellen 1413 — Plasmazellen 1413

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Sachregister

§§

Polychromes Methylenblau für — Thyreoidea 2237 Polychromes Methylenblau-Karbolfuchsin 1389 Polychromes Tannin 2237 Polysaccharidreaktion für Glykogennachweis 1104 Schleimfärbung 2037 Pommers Darstellung von kalkhaltigem und kalkfreiem Knochen . 1631, 1633 Ponceau de Xylidine 1498 Ponceau S 708a Ponceau-Fuchsin 1498 Portland-Zement-Gußverfahren . . 898a Porzellansiebe (zum Wässern) . . 361 Pottasche = Kaliumcarbonat Prämucingranula . . . v. . . . 2022 Präparatekartei 853 Präparierdunkelfeldkondensor . . 55 Präparierfederchen 132 Präpariermikroskop 79 Präparierwechselkondensor . . . 55 Pranters Einbettungsmethode . . . 417 1558 — Elastinfärbung Primäre Fluoreszenz 69, 70 Primäre Nervendegeneration . . . 1842 Primäres Natriumphosphat . . 1159, 1944 Primitivröhrchen (Knochen) . . 1642 ff., 1663, 1668 ff. Proerythrocyten 1306a Progressive Färbung 604 Projektionszeichenapparat . . . . 83 Projektive Rekonstruktion . . . 874 ff. Propylalkohol, zum Entwässern von Celloidinschnitten 832 —, Präparaten 387 —, zur Fixierung 231 —, Verhalten 390 Protoplasma, Vitalfärbung . . . . 924 Protoplasmafärbung bei Blutzellen . 1384 Protoplasmastrukturen . . . . 957 ff. Protozoen, Chromatinfärbung . . . 1357 Prüfung des Äthers 449 Prüfung des Auflösungsvermögens . 30 Prüfung des dest. Wassers für Giemsafärbung 1339 Prüfung der Entkalkung 1608 Prune pure (Indikator) 1261 (Vitalfärbung) 2464 Prüfung des Mikroskopobjektives . 2 Puffergemisch für Gewebsnadireaktion 1159 Pufferlösung bei Fixierung . . . 203 Puffergemisch nach Bâlint . . . . 1343 Collier 1342 Fleisch-Vetter 124 Gräff 1159 Haden 1341 Michaelis 1264, 1265 Mommsen 1345 Pischinger 1264,1265 43*

§§

Puffergemisch nach Schabadasch . 1944 Weise 1344 Pufferung von dest. Wasser . . 1341 ff. Pulpa (Zahn) 1686 Punktlichtlampe 40 Purinkörper 2139 Purkinjesche Fäden . 1719, 1720, 1951 Purpurin 743 — (Kalknachweis) 1219 Purpurincarboxylsäure 1602 Pyridin als Formolzusatz . . . . 260 Pyridin-Celloidineinbettung . . . 459 Pyridin-Paraffineinbettung . . . 459 Pyridin-Silbermethode n. Agduhr . 1792 . . . . 1790 f., 1909 — Bielschowsky 1912 — Bocke — v. Szatmari 1794 — Wallart 1913 Pyrogallussäure bei Kalkreaktion . 1637 * Neurofibrillen 1798 Pyronin-Methylgrün 723 —• für Blutpräparate 1416 Darmschleimhaut 2084 — nach Dopa-Reaktion 1178 — für Gewebsschnitte 728 Plasmazellen 1416 Pyronin-Tannin-Weinsteinsäure (Ganglienzellen) 1752 Pyrrholblau 769 Q. Quarzgläser 66 Quarz-Quecksilberbrenner . . . . 68 Quecksilber (Nachweis) 1228 Quarzquecksilberlampe 68 Quecksilberchlorid s. Sublimat Quecksilberoxydnitrat (z. Harnstoffnachweis) 2139 Quellen vertrockneter Präparate . 214 Quellung bei Fixierung 201 Quellzellen 1958 Querstellung des Mikrotommessers 505 Querstreifung der Muskulatur . 1706 ff. R. Rabis (C. R. H.) Kalknachweis . . 1217 Rabis Fixierungsgemische . . 314, 317 f. Rachen 2108 Radiumbestrahlung lymphoiden Gewebes 2000 Radix Kava subtilis 2065 Ramon y Cajal s. Cajal Randfaden von Erythrocyten . . . 1308 — der Spermien 2168 Ranson, Silbermethode 1812 Ranviers Bearbeitung der Cornea 2328 ff. des Gehörorganes 2367 der Regio olfactoria . . . . 2376 — Drittelalkohol 1270 — Einschnürungen 1891 — Goldmethode 1906, 2331

676

Sachregister

§§ Ranviers Bearbeitung der Kreuze . 1893 — Versilberungsmethode . . . . 1280 Rasierklingen 134 Rasiermesser 134 ff. Raspeln 130 v. Raths Gemische 316 Ratte (Fortpflanzung) 2453 Räucherung mit Formoldämpfen . 269 Osmiumsäure 285 — nach Hirschfeld 1380 Weidenreich 1330 Werzberg 1329 — von Blutpräparaten 1329, 1330, 1380 Gewebekulturen 176 Spermien 2170 Redoxpotential 1263 Regauds Mitochondrien-Fixierung . 976 Färbung 988 Regenbogenhaut . ' 2337 fl. Regressive Färbung 604 Regulator s. Thermoregulator Reichs Granula 1899 Reifen des Ammoniakcarmins . . 1778 647 ff. — der Farblösung — des Hämatoxylins . . . 647 fl., 651 Beschleunigung nach Hansen 669, 681 , Harris 204 , P. Mayer 651 , Unna 670 Reifungsvorgänge (Amphibienei) . 2404 Reinheit der Farbstoffe 619 Reinigung des Äthers 448 — des Acetons 217 gebrauchten Alkohols . . . 384 Benzols 403 Chloroforms : 408 — von Glasfiltern 126 Glaswaren 97 ff., 126 Methylgrün 699 97 ff. — der Deckgläser der Objektträger 97 ff. mit Tierkohle 98a 20 — der Optik — des gebrauchten Toluols . . . 575 Reizleitungssystem 1719 Rekonstruktionsmethoden . . . 870 ff. Rekordspritze 1969 Reptilieneier 2420 Reptilienhaut 2304 Resorcin (Nervenfärb.) 1944 Resorcinfuchsin 1560 — Azophloxin-Lichtgrün . . . . 1565 — Azophloxin-Orange-Lichtgrün . 1564 — Hämatoxylin-PikrinsäureSäurefuchsin 1563 — Pikrinsäure-Thiazinrot . . . . 1563 — Scharlach R 1566 Resorcin-Gentianaviolett . . . . 1565 Azocarmin-Naphtolgrün . . 1565 Resorcin-Gentianaviolett-Naphtholgrün 1565

§§

Respirationsorgane 2108 fl. Respiratorisches Epithel . . . . 2111 ff. Retikuläres Gewebe , Darstellung durch Auspinseln 1998 , Ausschütteln . . . . 1999 , Färbung 1517 , Röntgenbestrahlung . 2000 , Silbermethoden . . 1517 ff. , Tannin-Silbermethoden 1543 fl. , Verdauung . . . . 1467 ff. , Verhalten gegen Reagenzien 1466 Reticulocyten 1305 —, Färbung nach Hirschfeld . . 1306a —, Holboll 1306 —, Seyfarth 1305 —, Zählung 1451 Retikulumfasern 1460 — (Gewebekultur) 185 Retina 2347 fl. — von Dunkeltier 2351 —, Nervenfibrillen 2355 fl. Retziussche Streifen 1677 Reversible Gelbildung 914 Revertex 1987 Revolverblende 7 Rezzonico-Apparat 1921 Rheotaxis der Spermien .2165 Rhodamin (für Eleidin) 2270 Rhodamin B, Vitalfärbung von Cytoplasma 924 , Fettsubstanz . . . . 1033 , Mitochondrien . . . . 967 Rhodanprobe (auf Eisen) . . . 1210 f. — n. Schmelzer 1211 Rhodanwasserstoffgas 1210 Ribberts Bindegewebsfärbung . . 1514 — Modifikation von Hueter . . . 1514 — vitale Carminfärbung . . . . 770 Richards Destillationsapparat . . . 1521 Richtebene 879 Richtfläche 879 Richtleisten 879 Richtlinien bei Celloidinblöcken . . 881 — bei Paraffinblöcken 880 — mit Beschneideritzer 882 Richtungskörper (Eizelle) . .2397, 2461 Ricinusöl als Paraffinzusatz . . . 427 Riechepithel 2371 Rillentrog 582 Ringersche Flüssigkeit 119 Ringer-Lewislösung 783 Rio Hortegas ammoniak. Silberlösung (Bindegewebe) . . . . 1551 Astrocytenmethode . . . . 1859 Fasermethoden 1546 ff. — — Gliamethoden 1857 fl. Glia- und Eisenfärbung . . 1865 Glia- und Fettfärbung . . . 1865 Kreosotgemisch 1858 Mikrogliamethode 1864 Oligodendrogliamethode . . 1861

Sachregister

Rio Hortegas protoplasmatische Glia 1859 Silbercarbonatlösung . . . . 1554 für Astrocyten 1860 = schwache Silbercarbonatlösung 1863 starke Silbercarbonatlösung . 1862 Silbercarbonatlösung 1927 . . 1866 Zirbelimprägn 2247 Rio Hortega-Zellen 1844, 1864 Rippenknorpel 1590 Röhls Calcium-Nachweis . . . . 1640 Rogers, Silbermethode 1926 Rohantiformin 869a Rollets Goldmethode 1701 Romanowsky-Färbung 1357 Romeis, Fettfärbung 1048 —, Fixierungsgemisch 346 —, Knorpelfärbung 1585 f. —, Kolloidale Sudanlösung . . . 1048 —, Kresazanfärbung 2198 —, Neurohypophyse 2205 ff. —, Pituicyten 2206 —, Resorcinfuchsin (Herstell.) . . 1561 Röntgenbestrahlung lymphoid. Gewebe 2000 Röntgenbestrahlung, Thymus . . . 2243 Röntgenphotographie von Rekonstruktion 889 Röthig, Aufzucht von Rept.-Eiern . 2420 —, Nachfärbung von Mafkscheidenpräparaten 1830 —, Fixier-Methode 2425 Rosanilinhydrochlorid 955 Rostfreie Objektivfassung . . . . 28 Rotationstrommel 195, 452 Rote Blutkörperchen, Ausstrich (Herstellung) 1317, 1376 , basophile Punktierung . . 1305 ff. , Entnahme 1293 ff. , Färbung mit Brasilin . . . 1418 .—, Benzidin . . . . 1436, 1437 , Siena-Orange . . . . 1417 , — nach Carere-Comes . . . 1417 , Lepehne 1436 , Slonimski 1437 , frisches Präparat . . . . 1298 ff. , Schnittpräparat . . . . 1388 ff. , Zählung 1442 ff. Rotfilter 49 Rougetsche Zellen 1960, 1961 Rubaschkins Aufklebemethode . . 557 Rubeanwasserstoffsäure 1224 Rubin-Fuchsin 701 Rubin S-Säurefuchsin . . . 665, 707 Rubin S-Orange 1653 Rückenmark s. Nervensystem Rufigallol 738 Ruppricht, Knochenzellenfärbung . 1645 Russische Aufklebemethode . . . 557 Rutheniumrot 1512 Ruyters Aufklebemethode . . . . 547

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S. Säubern von Glasfiltern 126 Glaswaren 97 ff. Membranen 131 Säugetiereier 2145 f., 2460 ff. Säurealizarinblau 748, 1491 — f ü r glatte Muskulatur . . . . 1730 S ä u r e f u c h s i n »= Fuchsin S 665, 707 Säurefuchsin-Alaun 1634 Anilinblau-Orange 1486 mod. von Heidenhain . . . 1489 — Kristallviolett-Aurantia . . 994, 1016 — Lichtgrün 1758 — Methylgrün (Cowdry) . . . . 995 Orange 721 ff. — Orange 1653 Säurefuchsin-Pikrinsäure: nach Altmann 991 van Gieson 708 Hansen 709 Metzner 991 Weigert 708 — Pikrinsäure-Anilinblau (Masson) 1496 — Pikrinsäure-Lichtgrün (Alzheimer) 1758 — Pikrinsäure-Resorcinfuchsin . . 1563 —' Tanninlösung nach Fraenkel . . 2238 — Toluidinblau-Aurantia . . . . 994 — Tuchechtgelb (Wallart) . . . . 712 Säurefuchsin nach Seki 993 Säurebildung bei Formolfixierung . 273 Säureviolett-Säurefuchsin . . . . 2203 Safran 711 S afr anin 691 nach Babes 694 — Flemming 693 2179 — Hermann — Schuberg 695 — Winiwarter 692 — Gentianaviolett . . . . . . . 2179 — Gentianaviolett-Örange . . . . 961 — Lichtgrün (Benda) 952 — Pikroindigocarmin 718 — Toluidinblaufärbung (chromaffine Zellen) 2217 — Wasserblau-Orcein-Eosin (Bdg.) 1290 Safranin zur Schleimfärbung . . . 2033 Saftbahnen (Haut) 2258 Salazars Tannin-Eisenmethode . . 2155 Salicylsäure-Balsam 844 Salol 851 Salpetersäure, Verdünnung und Säuregehalt 320 Salpetersäure zur Entkalkung . . . . 1613 —, alkoholisch 1614 — mit Formalin 1614 — mit Phloroglucin 1614 —, wässerig 1613

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Sachregister

§§

S a l p e t e r s ä u r e (Forts.) zur F i x i e r u n g . . . 320 — für Embryonen . . . . 2436 — für Neurofibrillen . . . 1782 als Mazerierungsmittel . . 2123 2442 Salpetersäure-Silbernitrat . . S a l z s ä u r e für Eisenreaktion . . 1206 —, n680, 1235 —, officinell 679 — zur Entkalkung 1617, 1618 mit Kochsalz . . . 1617 — zur Korrektion von Hämat. Uberfärbung 656 Carminüberfärbung . . 634 Sandrac-Dioxangemisch . . . 851 Sanfelices Fixiergs.-Gem. . . 944 Sarkolemm 1694, 1714 Sarkoplasma 1703 Sarkosomen (frisch) . . . . 1692 — gefärbt 1695 Sauerstoffzufuhr bei Nervenfärbung 1941 Saumzellen (Darm) . . . . . 2067 f. Saure Farbstoffe 599, 600 — Teerfarben 599, 600 Saures Fixationsbild . . . . 203 — Hämalaun 651 Savini's Lipoidfärbung . . . 1381 Schabadasch, Glykogenfixierung . . 1094 — Nervenfärbung 1941 Schäffler, Methode f. Myofibrillen und Bindegewebe . . . . 1715 Schätzung, Größenbestimmung durch . .' 899 Schaffer, Atraktosonjen . . . 2187 —, Entkalkung von Knochen . 1611, 1613 — Formolalkohol 228 — Haar-Kutikulafärbung . . 2281 —, Hautdrüsenorgane . . . 2295 — Knochenfärbung . . . . 1652 — Sphleimdrüsenfixierung . . 2022 —• Wässerungskörbchen . . . 361 1040 Scharlach R — f. Färbung d. Gallenkapillaren . 2101 795 Vitalfärbung 1047 — nach Groß Herxheimer 1046 1046 Michaelis Scharlach-R-Aceton . . . . 1046 Scharlachstadium der Nerven1841 degeneration Scharrer, Numerieren v. Celloidin556 schnitten 330 Schaudinns Sublimat-Alkohol 2160 Scheide . 2446 ff. Scheidenausstrich 2298 Scheurings Fixierungsgem. . . Schießbaumwolle 443 Schiff'sches Reagens . . . . 1233, 1235 Schilddrüse 2232 2233 Schilddrüsenfollikel, Isolierung Schillers Magnesiumacetat-Formol . 268 — Uranylacetatlösung . . . 348

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§§

Schläfenbein-Entkalkung . . . 2362 ff. — Fixierung . 2362 — Orientierung — Zerlegung . 2361 . 2420 Schlangeneier Schleifen, Knochen 1648 ff. —, Mikrotom-Messer . 499 ,—, Rasiermesser . 135 —, Zähne 1676 ff. . 499 Schleifmittel . 2018 Schleimdrüsen S ch1 e i m f är b un g mit Polysaccharidreaktion . . . . 2037 . 2035 Coelestinblau Delafieldschem Hämatox. . . . 2029 Molybdänhämatoxylin . . . . 2023 Muchämatein . 2028 Mucicarmin . 2025 Safranin, Thionin oder Toluidinblau . 2033 Sch1e i m f ä r b u n g n a c h Becher . 2035 Clara . 2036 Feyrter . 2034 Guizzetti . 2033 . 2036 Lehner Masson . 2027 Mayer P 2025 ff. Metzner . 698 Schaffer . 2187 S c h 1 e i m f i x i e r un g nach Metzner . 2020 Schaffer . 2022 Schleimgranula 2018 ff. Schlemmers ammoniakalische Silberlösung . 1528 Schlittenmikrotom 492 ff. Schlußleistennetz . 1286 Schmeckbecher . 2048 Schmelz 1677 ff. — Kittsubstanz 1679 ff. Schmelzer, Eisennachweis . . . . 1211 Schmelzers und Tirmanns Eisenreaktion . 1204 Schmelzprismen, Isolierung ders. . 1677 —, Auflösung ders . 1674 Schmelzpunkt des Paraffins . . . 423 Schmelzpunktbestimmung (Paraffin) . 425 Schmidt, Kollagenfreie Knochenschliffe . 1667 Schmidt-Lantermannsche Segmente 1894 Schmorls Darstellung der Knochenhöhlen 1643, 1644 — Modifikation d. Oxydasefärbung 1156 Schnecke (Gehörorgan) . . . . 2360 ff. jächneckenextrakt für Phenolreaktion . 1167 Schneiden 504 ff. Bänderschneiden . 505 brüchiger Objekte . 2413 bei Celloidineinbettung . . . . 510

Sachregister

S c h n e i d e n (Forts.) 513 ff. mit Gefriermikrotom . . . . 524 bei Messertiefkühlung . 469 bei Gelatineeinbettung . . . 504 mit Mikrotom 505 f. bei Paraffineinbettung . . . 134 mit Rasiermesser . . . . Schneider, Carminessigsäure . 632, 640 1845 Schnellbeize Sthnelldiagnose, Fixierung für 216, 357 . 270 —, nach Walz . 496 Schnittdicke . 608 Schnittfärbung . 539 Schnittstrecken mit Heizsonne 1190 ff. Schnittveraschung Schnittverdauung n. Björkenhein . 1478 . 1479 Hoehl . 1480 Jackson . 88 Schraubenmikrometer . . . 33 Schräge Beleuchtung . . . . 905 Schrägschnittfehler . . . . 1678 Schregersche Streifen . . . . 528 Schreibdiamant . . . . , Schroeder, Markscheidenmethode . 1833 . 201 Schrumpfung bei Fixierung . . 1514 Schueninoffs Hämatoxylin . . . 1999 Schüttelmethode 2134 ff. Schultz A., Harnsäurenachweis . 861 — Leuchtgasmeth . 1079 Schultze A., Cholesterinreaktion . 1274 Schultze M., Jodserum . . . Schultze O., Aufhellungsmethode 1657 von Embryonen 2411 Eihüllenentfernüng . . . 808 Einschlußflüssigkeit . . . 684 Osmiumhämatoxylinmethode Markscheiden-Imprägnierung 1831 m. Osmiumsäure . . . 684 Mitochondriendarstellung . 1808 Natronlauge-Silbermethode 1808 Silbermethode 1793 —, Modifik. v. /Gros . . . 1284 Versilberungsmethode . . Schultze W. H., Markscheiden. 1835 färbung . 1155 — Oxydasereaktion . . . . Schummer, Plastoid . . . . 866, 1985 . 38 Schusterkugel . 503 Schutzhülse f. Mikrotommesser Schutzleisten für Deckgläschen 139 ff. (Wachsfüßcfyen) . 1569 Schwalbesche Scheiden . . . . 2459 Schwangerschaftsdauer . . . . 1891 Schwannsche Scheide (Nerv) . . 635 Schwarz, Methylcarinin . . . Schwefelammonium (Herstellung) . 1204, 1209 — f ü r Eisennachweis . . . . 1204, 1209 Kaliumnachweis 1214 Schwefelbleiimprägnierung . . . 1775 Schwefel calcium (Enthaaren) . . . 113 Schwefeldioxydwasser 1235

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Schwefelester u. Metachromasie . . 603 Schwefelkohlenstoff . . . . 390, 409 Schwefelsaures Eisenoxydammoniak 672 Schwefelsäure, Cholesterinreaktion 1079 — bei Calciumnachweis 1218 Celloidineinbettung . . . . 450 — Fixierung 312 — Gläserreinigung 97 — Glasfilterreinigung 126 — Lichtfilterherstellung 44 — für Lipochromnachweis . . . . 1142 — bei Pigmentcharakterisierung . 1112 — zur Reinigung von Äther . . . 448 — zur Reinigung von gebr. Toluol . 575 Schwefelsäure-Eisessig (Cholesterinreaktion) 1079 Schwefelsäure-Formoi (Cholesterinnachweis) 1081 Schwefelsäure-Kaliumbichromat (Gläserreinigung) 97 Schwefelsäure-Pikrinsäure . . . . 312 Schweflige Säure zum Entkalken . 1615 zum Mazerieren 1696 Schweineembryonen 2468 Scintillin 1672 Sclera 2336 Sedimentierverfahren 1279 Seeigeleier 2143 Seesterneier 2143 Segallsche Ringe 1921 Sehne 1512 Sehne-Muskel 1717 Sehnerv 2357 Sehorgan 2305 ff. Sehpurpur 2352 Sehrt's Lipoidfärbung 1381 Seifen, Nachweis 1072 f. Seifenmethylenblau 1743 Seignettesalzformolgemisch . . . 1791 Seitliche Beleuchtung . . . . 32, 33 Seki, Eisenalizarin-Fuchsin . . . 998 —, Hämatoxylin 986 —, Mikroglia 1872 —, Methanol-Celloidin 457 —, Oligodendroglia 1872 —, Säurefuchsin 993 Sekretkapillaren 2044 Sekundäre Fluoreszenz 70 Sekundäres Natriumphosphat . . . 1577 Selbstinjektion der Gallenkapillaren 2098 Selbsttätige Luftfüllung der Gefäße 1993 Semiapochromat 12 Sempersches Verfahren 867 Senkverfahren 407 Senile Drusen 1880 Sensible Nervenendigungen 1901 ff. Darstellung durch Färbung 1902 ff. Vergolden 1904 ff. Versilbern 1908 ff.

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Sachregister

§§

Sensible Nervene n d i g u n g e n (Forts.) Darstellung nach Agduhr 1792 Bethe 1902 ff. Bielschowsky 1909 Boecke 1912 Cajal . 1799, 1802, 1804, 1806, 1918 ff. de Castro 1689 Davenport 1922 Ehrlich 1929 ff. Faworsky 1919 Foley 1813 Gad 1713 Gros-Schultze 1793 Lawrentjew 1915 Loewit 1905 Michailow 1953 Miller 1907 Perez 1920 Ranson 1812 Ranvier 1906 Rogers 1926 Schabadasch 1941 O. Schultze 1808 Sihler 1713 Stöhr d. J 1809 Wallart 1913 Serienschneiden 505, 526 Serienschnitte, Aufkleben ders. s. unter Aufkl. Serum als Beobachtungsmedium . 117 Serumalbumin für Eiweißglyzerin . 543 Severinghaus, Hypophyse . . . . 2201 Seyfarth, Färbung d. Reticulocyten 1305 Sharpeysche Fasern 1649 ISiebdosen (zum Wässern) . . . . 361 Siena-Orangelösung 1215 , f. Erythrocyten 1417 , f. glattes Muskelgewebe . . 1731 , f. Kaliumnachweis . . . . 1215 Sihlersche Methode 1713 Silbercarbonatlösungen n. RioHortega für Astrocyten . . . . 1860 Bindegewebe 1554 Methode von 1927 . . . . 1866 — Oligodendroglia schwach . 1863 stark 1862 Silberchromatlösung 1555 Silberdiaminocarbonat . . . . 1536a Silberdiaminohydroxyd 1536 Silbergelatine (Endotheldarst.) . . 1963 Silberi'mprägnation, Beseitigung . . 1542 —, Differenzierung 1539 Silberlösung nach Fontana . . . . 1129 S i 1 b er m e t h o d e n f ü r Achsenzylinder 1785 ff. Bindegewebe 1517 ff. Binnenapparat 1019 ff. Calciumnachweis 1637 ff. Chlornachweis 2064 Cornea 2328 f.

§§

S i l b e r m e t h o d e n (Forts.) f ü r Epithelfasern 1291 Ganglienzellen 1762 ff. Glaskörperfibrillen 2318 Harnsäurenachweis 2139 Hornhaut 2328 Kalknachweis 1637 ff. Kochsalznachweis 2139 Nebenniere 2219 Nervenendigungen 1909 ff. Neurofibrillen (zentral) . . . 1785 ff. — (peripher) 1909 ff. Neuroglia 1854 ff. Pigmente 1129 Ranviersche Kreuze 1893 Retina 2355 f. Zellgrenzen 1280 Zentrosom 1547 Si1bermethoden nach Achücarro 1544 Agduhr 1792 Bacsich 1818 Bauer 1796a Bielschowsky (Achs.-Zyl) zentr.) 1786 — (Achs-Zyl. periph.) . . . 1909 ff. — Bindegewebe 1525 Bodian 1816 Boeke 1912 Bubenaite 1773 Ca.ial für Achsenzylinder . . 1797 ff. — Binnenapparat . . . . 1019, 1020 - i n Nervenzellen . . . . 1761 — Ganglienzellen . . . 1769, 1797 ff. — Glia 1854 — Kleinhirn . . . 1798, 1805, 1806 — Neurofibrillen 1797 ff. — Neuroglia 1849 ff. —1 Periphere Nerven . . . . 1918 ff. — Retina 2355 — Sympath. Gangl.Z 1802 de Castro 1689 Cowdry 1807 Da Fano 1022 Davenport 1922 Davidson '1536a Faworsky 1919 Flinser 1282 Foley 1813 Fontana 1129 Foot 1555 Gömöri (Bindegew.) 1533 — (Kalk) 1639 Golgi 1762 ff., 1770 Gros-O. Schultze 1793 Hamperl 1129 Hertwig 1283 Kallius 1776 Klarfeld 1545 Kopsch 1772 Kossa 1637 Krause C 1282 Kubie . 1536, 1536a

Sachregister

§§

S i l b e r m e t h o d e n (Forts.) n a c h Laguesse . . . 1537 Lawrentjew 1915 Lenhossek 2319 Lhermitte 1796a, 1917 Lobo 1811 Masson 1129 Mihalik 1925 Ogata 2219 Perdrau 1883 Perez 1920 Podhradsky 1923 Ranson 1812 Ranvier 1280, 2328, 2376 Reumont 1796a, 1912 Rio-Hortega . . . . 1546 ff., 1857 ff. Rogers 1926 Rojas 1921 Schultze (Zellgrenzen) . . . . 1284 — (Nerven) 1808 Volterra 1549 Wallart 1913 Wilder 1536 Silberniederschlag, Entfernung 1542, 1819 — Differenzieren 1539 ff. Silbernitratgelatine 1963 Silbernitratmethode f. Lunge . . . 2116 Silbernitrat für Vitamin C-Nachweis 1184 ff. Silberoxydlösung n. Cajal . . . . 1854 Silberreaktion basalgekörnter Zellen 2077 Silberzellen (Nebenniere) . . . . 2219 — (Pankreas) 2231 Simultane Färbung 607 Sjöbring's Formolfixierung . . . 264 Skelettmuskel, kontrahiert . . . . 1705 Sklera 2336 Skriptol f. Injektion 1978a Slonimski, Gefäßdarstellung . . 1965 f. Smith-Dietrichs Lipoid-Färbung . 1086 Sodalösung (= Natriumcarbonat) — zum Sterilisieren 156 — für Verdauung 1475 Sommerzellen (Nebenniere) . . . 2222 Somniphen 1689 Sonderobjektiv für Dunkelfeld . . 54 Sonderokulare 72 ff. Spalteholz' Aufhellungsverfahren . 854 Spaltlampe 2305 Spanner, Gefäßinjektion . . 1972, 1977, 1984 f., 1988 —, Gelatinemasse 1984 —, Kolophoniumbalsam 1984 —, Kleisterinjektion 1988 —, Montage von Präparaten . . . 863 —, Tuscheinjektion 1977 Spatz' Hämosiderin-Nachweis . . 1435 Speicheldrüsen 2011 ff. Speichelkörperchen 1268 Speichelreaktion (Glykogen) . . . 1097 Speiseröhre . . . . . . . . . 2051 -Spektralanalysenmikrbskop . . . 76

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§§

Spektralokular 76 Spermatogenese 2173 ff. Spermien 2163 ff. —, Belebungsflüssigkeit 2166 —, Darstellung nach Zeiger . . . 2167 —, Fixierung 2170 ff. —, Mazeration 216» f. —, Supravitalfärbung 2166 Sphaerokristalle 1074 Spiegel am Mikroskop 6 Spielmeyers Markscheidenfärbung . 1832 — Modif. d. Gliafärbung . . . . 1847 Spinalganglien 1737, 1809 Spindelfäden 957 ff., 961 Spindelzellen (Blut) 1384 Spiralstruktur d. Chromosomen . . 930 Splitterpinzette 133 Spodogramm 1190 ff. Spongiolin 1672 Spongioplasma (Unna) 964 — (Blutzellen) 1384 Sprimoloidlack 552a, 853a Spritlösliches Eosin 660 Stäbchenschicht 2350 f. Stabilit 482 Stabile Oxydasen .1155 Stearin-Paraffin-Wachsgemisch . . 427 Stechapfelform der roten Blutkörperchen 1289 Stereo-Aufsatz 72 f. Stereoskopkamera 81 Stereoskopisches Mikroskop . . 72, 79 Sterilisieren von Instrumenten . . 156 Sternalpunktion 1420 ff. Sternalpunktionsnadel 1421 Sternzellen (Leber) 2091 Stieves Pikrinsäuregemisch . . . 347 — Sublimatgemisch 333 Stiftgläschen 623 Stigmatometer 29 Stirnlupe 3 Stöhr d. Ä., Schleimfärbung . . . 2031 Stöhr d. J., Silbermethode . . 1808, 1809 Stöltzner, Kalknachweis 1637 Strassersche Klebemasse . . . . 2415 Stratum corneum 2271 — granulosum 2265 — lucidum 2269 — spinosum 2259 ff. Strecken der Paraffinschnitte . . 535 ff. Streichriemen 135 Stromart, Bestimmung 41 Strontiumsulfid (Enthaaren) . . . 113 Struktur färben 1153 Strychnin (f. Narkose) 107 Stückfärbung 608 — mit Beizenfarbstoffen . . . . 732 Carmin 634, 642 fuchsinschwefliger Säure . . 1240 Cochenille 645 Hämalaun 652 Piasmaireaktion 1246

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Sachregister

Stückverdauung 1477 Stufenmikrometer 87 Stufenzählmethode 2015 Subcutis 2287 Sublimat 323 —, Entfernung .desselb 327 Sublimatgemische : Sublimat-Alkohol 330 — nach Schaudinn 330 Sublimat-Chromsäure-Eisessig . 2013, 2024 Eisessig 331 Formol 332 Formol-Eisessig . . . 333, 334 Kochsalzlösung 329 Pikrinsäure-Formol-Eisessig 335 Rohrzucker 329 340 — -Salpetersäure Salpetersäure-EisessigAlkohol 340 Trichloressigsäure-Formol 344, 346 Trichloressigsäure-FormolEisessig 345 Sub1 i m atge m i s c h e n a c h v. Apäthy 330 Gilson 340 Heidenhain (Formol) 332 — (Subtrie) 345 — (Susa) 344 Helly 337 Lang 331 Maximow 338 — Petrunkewitsch 341 Pfuhl 335 Romeis 346 Schaudinn 330 Stieve 333 Worcester 334 Zenker 336 Sublimatmethode n. Cox . . . . 1774 Sublimatniederschläge 326 Sublimat-Schwefelammonium (Knochen) 1669 Submikroskopische Morphologie . . 956 Substantia granulofilamentosa . . 1305 Substantive Färbung 605 Subtrie 345 Succedane Färbung 607 Sudan-Gelb 1041 Sudan-Orange 1041 Sudan-Rot 1041 Sudan III 1040 — für Vitalfärbung 795 — nach Daddi 1045 — —,Froboese 1045 Goldmann 1382 Romeis 1048 Sudan III-Resorcinfuchsin . . . . 1566 Sudanschwarz B 1050 — für Markscheiden 1837

Sulfalizarinsaures Natron (Benda, Mitochondrien) 996 — — (Seki, Mitochondrien) . . . . 998 , Vitalfärbung 796 Sulfhydrylgruppe (Nachweis) 1255, 1255a 599 Sulfogruppe . 798 Sulfosäurefarbstoffe . . . 342 Sulfosalicylsäure . . . . . 335 Supiformeis (Pfuhl) . . 1303 ff. Supravitalfärbung (Blut) . 1928 ff. — (Nerven) . 774 — (Zupfpräparate) . . . . 30 Surirella gemma . . . . . 344 Susa „ 1802 Sympathische Ganglien . . 2046 — Innervation der Drüsen . 1945 Synapse . 1947 Systole durch Bariumchlorid Szent-Györgyis Fixierungsgemisch . 2317 T. Taenzer-Unnas Orcein . . . . . . 1556 Tageslichtfilter : . 44 Talgdrüsen 2292 Talgpräparat 2082 Talkum 113 Tandlers kaltflüssige Gelatinemasse 1983 — Konservierung mit Zucker . . 862 — Verkupfern von Wachsmodellen 895 Tanninlösung zur Fixierung von Anilinfärbung 627 Tannin-Eisenmethode 2155 Tannin-Eisen-Toluidinblau . . . 2199 Tannin-Giemsalösung 2291 Tanninmethode nach Herxheimer . 2291 — — Salazar 2155 Tavares de Sousa 2199 Wallralf 2199 Tannin-polychromes Methylenblau (Schilddrüse) 2237 Tannin-Osmiumsäure 1288 Tannin-Silbermethade nach Achüccaro 1544 Klarfeld 1545 Rio-Hortega 1546 II. Volterra 1549 Tannophile Substanz 2155 Tasthaare 2279 Tastscheiben 2297 Tauchlinsen 21 Tavares de Sousa (Tanninmethode) 2199 Teerfarben 599 fl. Teichmannsche Kristalle . . . . 1433 Tellyeniczkys Gemisch 236 Temperatur bei Gewebekultur . 163 f. Temperatureinfluß bei Fixierung 204 ff. Terminalreticulum 1908 Terpentinöl 390, 416 — als Intermedium 416 Terpentinöl-Berlinerblau . . . . 1989

Sachregister §§ Terpineol 833, 848 — bei Celloidineinbettung . . 460, 461 — zum Eindecken . . 848 — Entwässern . . 833 — für ölcelloidin . . 461 — für ölcelloidinschnitte . . . . 567 —, Verhalten . . 390 Terpineol-Canadabalsam . . . . 842 Tetrachlorkohlenstoff . . . . 390, 410 Tetralin 390, 411, 826 Tetralin-Naphthalin . . . . . . 855 Tetrander . . 495 Thekazellen . . 2154 Thjermoregulator . . 431 . . 431 Thermostat 707, 710 Thiazinrot Thiazinrot-Eisenhämatoxylin . . . 1710 Thiazinrot-Pikrinsäure-Eisenhämatoxylin 710, 1509 Thiazinrot-Thionin . . . . . . 1709 Thienyl-Chinolin-Carbonsäure . . 799 Thionin für Ganglienzellfärbung . 1744 nach P. Mayer . . . . . 1752 . . 697 Kernfärbung Knochenkörperchen . . . 1643 f. Knorpelfärbung . . . . . 1589 Schleimfärbung . . . . . 2033 nach Metzner . . . . 698 Thioninfärbung, Fixierung ders. 698 Thionin-Phosphorwolframsäure (Knochenkörperchen) . . . . . 1644 Thionin-Pikrinsäure (Knochenkörperchen) . . 1643 Thionin-Weinsteinsäure n. Feyrter 1898 nach P. Mayer . . . . . . 1752 Thoma-Zeiss'scher Blutkörperchen. . 1442 Zählapparat Thomasches Wasserrad . . . . . 1607 Thrombozyten frisch . . . . . 1314 f; — Färbung n. Giemsa . . . . . 1357 nach Degkwitz . . . . . . 1316 — Schnitt . . 1419 — Zählung 1450, 1452 Thymen 616, 628 Thymol . . 612 Thymolwasser . . 472 Thymonukleinsäure . . . . . 1233«. Thymus . 2240 ff. Thyreoida . 2232 ff. Tiefkühler nach v. Veh . . . . . 507 Tierkohle zur Reinigung . . . . . 98a Tigroidsubstanz . 1741 ff. Tirmann u. Schmelzers Eisenreaktion . . 1204 Tolanrot . . 2270 Toluidinblau . . 697 — Fixierung der Färbung . . . . 698 — Eisenalaun . . 698 — für Knorpel . . 1584 Mastzellen 1408, 1411 —i— Nissl-Substanz . . . . . . 1744 Schleimfärbung , . .

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§§ . . 726 Toluidinblau, Orange-Eosin . 2217 — Safranin . 994 — Säurefuchsin-Aurantia . . . 1411 — saure Lösung 390, 413 Toluol . 575 —, Reinigung dess . 2050 Tonsille Totalpräparat von Embryonen . . 2440 . 2298 —• —• Insekten . 925 ff. Kernen Töten der Tiere Toxische Granulierung . . . . . 1362 . . 2108 Trachea . . 2358 Tränendrüse . 814 Tragacanth . . 814 Traganth . 93 Tragglas Tragzeiten 2447, 2453 ff. Traubenzucker bei Nervenfärbung . 1944 Triacidfärbung nach Ehrlich-Biondi . . 721 (für Schnitte) . 1375 für Blutausstriche —•, Mod. nach Pappenheim , . . . 1375 . 1616 Tricalciumphosphat . . . . Trichloraethylen 390, 412 . 1619 Trichloressigsäure z. Entkalken . 343 — zum Fixieren — Kaliumbichrom.-Uranylacetat . 1932 — Pikrinsäure-Formol . . . . 347 — Sublimat-Eisessig . . . . — Sublimat-Formol . . . . . 346 . 344 —• Sublimat-Formol-Eisessig . — Uranylacetat . 348 Trichohyalin . . 2282 Trichromfärbung n. Masson . 1495 ff. Wallart-Houette . . . . 1497 Triglyzeride . 1065 Triglyzeringemisch . 1372 Triolein . 1064 f. Trioxymethylen Tripiform (Stieve) . 347 Trockenfarbschichtmethode . 1303 . 350 Trockenmethode nach Altmann Trockenpräparate . 867 Trockensystem . 41 Trocknen in der Kälte . . . . 350 Trocknung bei Paraffineinbettung . 420 Tropfen, hängender . . . . . . 152 Tropfenpräparat (Blut) . . . 1323, 1365 Tropfglas . 623 Trübe Muskelfasern . . . . . . 1702 Trypaflavin . 151 — f. Nervenfärbung . . . . . . 1884 Trypanblau . 762 — für Amyloid . . 1575 — Fixierung . . 766 — 'Nachfärbung . . 768 Trypanblaumarken . . 763 Trypsin, Ausführung der Verdauung . 1475 ff. — Herkunft . . 1*468 — Herstellung der Lösung . . . 1475

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Sachregister

§§

Trypsin, Prüfung der Lösung . . . 1469 1478 ff. — Schnitt Verdauung1 1477 — Stückverdauung 939 — Verhalten der Kerne 2156 Tube •—, Behandlung bei Untersuchung junger Entwicklungsstadien . . 2463 72 Tubusaufsatz 17 Tubus des Mikroskops Tubuslänge, mechanische . . . . 17 712 Tuchechtgelb Tunicin . 1104, 1672 Turnbullblaureaktion (Eisen) . . . 1204 Turnbullblau-Methode f. Hornhaut 2333 Tusche (Beschriften v. Glas) . . . 530 — für Injektion 1965, 1977 — Sternzellen der Leber . . . . 2091 123 Tyrodelösung 1181 Tyrosinase-Reaktion

Unnas Wasserblau-Orcein. Eosinfärbg — Wasserblau-Orceinlösung . . . — Wurzelscheidenfärbung . . . . Unna-Ziehlsche Färbung . . . . Unterchlorige Säure (Bleichen) . . Unterchlorigsaures Kali . . . . . Unterschwefligsaures Natron (= Natriumthiosulfat = Fixier. natron)

§§ 1290 1500 2283 1384 1119 2412 . 328

Urannitrat = Uranylnitrat . . . . 1020 Uran-Formolmeth. von Cajal (Glia) 1856 Uransilbermethode Cajals . . . . 1020 . 348 Uranylacetat — Trichloressigsäure-Kalium. 2348 bichromat . 1020 Uranylnitrat 348 Uranylsulfat 2135 ff. Uratnachweis . 2141 Ureter Urethan-Narkose 106 f. Uterus 2157 ff. . 2446 — bei Brunst Schwangerschaft . . . . Uterusbindegewebe . 2160 ÜV-Glas UV-Lampe . 68

U. 604 Überfärbung Überimprägnation, Abhilfe . . . 1814 Überlebendes Präparat . . . . 146 ff. Überosmiumsäure s. Osmiumsäure Übertragen von Schnitten n. Petry 853a 191 Ultrastruktur 66 Ultraviolettes Licht 68 für Fluorescenz V. Ultraviolettmikroskopie 66 f. 64 Ultropak 1005 f. Valcuom 914 Umkehrbare Gelbildung Vagina Umrandung 814 ff. 2446 ff. Vaginalausstrich 815 Vanadiumhämatoxylin . . . . . 688 — mit Balsam 816a Bernsteinlack Van Gehuchtens Gemisch . . . . 226 817 Celluloid Van Giesonsche Färbung . . . 708 ff. 818 Kaliumbichromat-Gelatine Varicak . 1409 816 Kopal-Emaillack Vastarini-Cresis MarkscheidenLanolinkolophonium . . . . 819 färbung . 1828 820 Wachs Vater-Pacinische Körperchen . . . 2297 . 1743 Umrandungsmasse nach Noyer . . 819 Venetianische Seife Kamptner 816, 816a Venetianisches Terpentin . . . . 139 818 ' Veraschungsmethode Ruyter 1190 ff. Zeller 815 Veratti, Bleichmethode . . . . . 1121 65 Verband der Operationswunden . . 114 Universalilluminator Verbrennungsofen Unnas blaues Polychrom . . . . 1415 . 1196 — Elacinfärbung 2289 Verdauungsmethoden . 1467 1556 — Elastinfärbung Verdauungsorgane 2046 ff. Verdauung von Kernen . . . . . 939 — Eleidinfärbung 2268 ff. — Epithelfaserfärbung . . . 1290, 2260 Neuroglia . 1844 1414 — Glycerinäther Verdünnen des Alkohols . . . . . 377 — Keratohyalindarstellung . . . 2265 —• auf bestimmte Konzentration . 377 1412 — Mastzellenfärbung Vergällung des Alkohols . . . . 386 — Methylgrün-Pyroninfärbung . . 728 Vergleichsmikroskop . 75 531a — Objektträgertinte Vergleichsokular . 75 — Oxydation von Hämatoxylin . '. 670 Vergoldungsmethoden s auch Gold—• Plasmazellenfärbung . . . 1412, 1416 methoden Unnas Polychrome Methylenblau— für Bindegewebe . 1882 färbung 1412 Glia . 1849 — Polychrome Methylenblaulösung 1413 — Trichohyalinfärbung 2282 Myofibrillen

Sachregister

§§

Vergoldungsmethoden f ü r Nervenendigungen . . . . 1904 Neurofibrillen 1783 f. Vergrößerung, Bestimmen ders. 14, 899, 900 f. Verhoefis Fixierungsgemisch . . . 2311 Verjüngung (Gewebekultur) . . . 165 Verkalkter Knorpel 1581 Verkohlung 1196 Verkupfern des Wachsmodells . . 895 Vermeiden von absol. Alkohol . . 831 Schwachprozent. Alkohol . . 828 —, völliges, von Alkohol . . . . 835 f. Verne, Piasmaireaktion 1246 Verocays Bindegewebsfärbung . . 1515 — Entfernung von Formolniederschlägen 274 Verschlußkappe nach Knöll . . . 156 Versilberungsmethoden s. Silbermethoden Versteinerungsmethode 1671 Vertikalilluminator 63 Vertrocknete Präparate, Rettung ders 214 Verzweigte glatte Muskelfasern . . 1721 Vestibulum 2161 Viereckige Okularblende . . . . 90 Violettfilter 49 Viskosität und Fixierung . . . . 197 Vitale Artefakte 914 — Farbstoffspeicherung im Magen . 2062 Vitalfärbung, Allgemeines 754 ff. Amyloid 797, 1575 Cytoplasma . , 924 Deckglaskultur 174 Doppelfärbung 783, 756 Einfluß des Lichtes 765 Einteilung der Farbstoffe . . . 761 Einverleibung der Farbstoffe . . 759 Elastin 797 Elektive Vitalfärbung . . . 788 f. Ergastoplasma 1000 Fett 795, 103311. Golgi-Substanz 1003 indirekte 798 Kern 920 ff. Knochen 796, 1601 Mitochondrien 967, 780 f. Nervenfasern 1884 Nervenzellen (zentral) . . . . 1738 — (peripher) 1928 Pigment . 2209 örtliche 790 Protoplasma 924 an Säugetiereiern 2464 — Säugetierkeimen 2464 Vi t a 1 f ä r b u n g , F i x i e r u n g mit Ammoniumpikrat-Ammoniumjodid 1945 — Formol 766

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§§

Vita 1färbu n g , Fixierung mit Formol-Trichloressigsäure 766 Jod 178 •— Kaliumbichromat-Ammoniumniolybdat 791 — molybdäns. Ammonium . . 1936 — pikrinsaurem Ammonium . . 1939 — Sublimat 787 — Zenker 792, 793 V i t a l f ä r b u n g mit Alizarin 789 Bismarckbraun 772 Brillantkresylblau (Auge) . . . 2307 — (Reticulocyte^ 1305 Carmin 770 Congorot 797 Hyposulfitweiß 785 Janusgrün 780 ff. — (Gewebekultur) 174 Janusgrün-Neutralrot . . . . 783 Janusschwarz 178 Krapp 796, 1601 Lithiumcarmin 770 Methylenblau 784 Neutralrot 772 Nilblausulfat 776, 778 Pyrrolblau 769 — (Gewebekultur) 174 Sudan III 795 sulfalizarinsaurem Natrium . . 796 Sulfosäurefarbstoffe . . . . . 798 Thienyl-Chinolin-Carbonsäure . 799 Trypanblau 762 ff., 1603 — (Gewebekultur) 174 Vitalgranulierte 1306a Vital-Scharlach VIII 1830 Vitamin A, Nachweis . . . 1182, 1188a Vitamin B t 1188a Vitamin B 2 1188a 1183 Vitamin C , Nachweis nach Bourne . . . 1186 , Giroud und Leblond 1184 ff. , Tonutti und Plate . .1187 Vogeleier 2427 ff. —, Bebrütung 2427 ff. —, Fixierung 2434 ff. —, Lagebestimmung 2432 Vogelfedern (Strukturfarben) . . .1153 Vogts örtliche Vitalfärbung . . . 790 Volkmanns Eisenhämat.-Färbung . 1654 — Elastinfärbung 1565 Volterras Tanninsilbermethode . . 1549 Vorvergoldung 1784 Vorversilberung 1280 Vonwillers Augenbeobachtung . . 2307 — Auflichtmikroskopie 150 — Kreisschnittmikrotom . . . . 489 W. Wachenfeldts Modellierspatel . . . 893 Wachs für Deckglasumrahmung . . 820

686

Sachregistei

Wachsfüßchen 139 Wachskerzchen (z. Umranden) . . 820 Wachsmasse für Rekonstruktion . . 888 Wachsmodellierapparat n. Berner . 887 Strasser 886 Wachsparaffin 427 Wachsplatten 886 Wachsschale 111 Wachszusatz zum Paraffin . . . . 427 Wärmbarer Objekttisch 175 Wärmeofen 431 Wärmestrahlen, Absorption . . . 48 Wärmetischchen 538 Wässerungsvorrichtungen . . . . 361 Wallart, Säurefuchsin-Tuchechtgelb 712 —, Trichrom 1497 —, Nervenimprägnation 1913 Wallraff, Piasmaireaktion . . 1243, 1246 —, Tannineisen-Toluidinblau . . . 2199 Walters Färbemethode 1502 Wasser für Giemsalösung . . . 1337 ff. Wasserblau-Orcein n. Unna . . . 1500 Wasserblau-Orcein-Eosin . . . . 1290 Wasserfreier Alkohol 380 ff. Wasserimmersion 28 Wasserstoffionenkonzentration . 1258 ff. — bei Nervenfärbung 1944 Wasserstoffsuperoxyd als Bleichmittel natürlicher Farbstoffe . .1116 von osmierten Präparaten 1013 —• als Oxydationsmittel 670 — z. Wiederauffrischen der Färbbarkeit 630 Wechselkondensor 53, 55 Wechselstrom, Bestimmung . . . 41 Weibliche Geschlechtsorgane . . 214311. Weichcelloidin 512, 2288 Weidenreichs Anilinblau-Säurefuchsin-Oxalsäure 1684 1330 — Blutfixierung W e i g e r t s Borax-Ferricyankaliumlösung f. Markscheidenfärbung . 1822 — Celloidinaufklebemethode . . . 565 — Chromogen-Ameisensäure . . . 1845 — Eisenhämatoxylin f ü r Kerne . . 677 Markscheiden . . . 1822, 1824 — Elastinfärbung 1560 — Fibrinfärbung 1424 — Kaliumbichromat-Fluörchrombeize 1822 — Lithium-Hämatoxylin f ü r Markscheiden 1824 — Markscheidenfärbung . . . 1820 ff. — Markscheidenbeize 1822 — Modifikation der van Giesonfärbung 708 — Neurogliabeize 1822 — Neurogliafärbung 1845 — Resorcinfuchsin 1560 Weise's Puffergemisch 1344 Weiße Blutzellen 1309 ff. , Zählung 1446

Weiße Beschriftung 528 — Muskeln 1702 Weißschedel, Marchi-Methode . . 1839 Weiterbehandlung aufgeklebter Schnitte: 586 — Alkoholcelloidin — Celloidinparaffin 588 — Gefrierschnitte 589, 525 — Gelatineschnitte . . 471, 525, 569a — ölcelloidin 586 570 ff. — Paraffin Weiterbehandlung unaufgeklebter Schnitte: — Alkoholcelloidin 584 — Celloidinparaffin 588 471, 525 — Gefrierschnitte — ölcelloidin 585 — Paraffin 577 Werner, Fixierung, Allgemeines 189, 204, 210, 212 —, Fixierung des Gehörorganes . . 2362 Werzbergs Dampfgemisch . . . . 1329 Wiederauffrischen d. Färbbarkeit . 630 Wiesels Nebennier.enmethode . . . 2217 Wilder, Bindegew.-Imprägnation . 1536 Windaus Digitoninreaktion . . . . 1080 Winkel zum Einbetten 432 Winkelmessung 909 Wintergrünöl 854 Wismut (Nachweis) 1230 Wittmaacks Methoden f ü r das Gehörorgan 2365 Wolf-Heidegger, Fixierung von Dünndarm 2065 Wolters Markscheidenfärbung . . 1827 Worcesters Fixierungsflüssigkeit . 334 Woronins Osmiumsäure-Tanninmethode 1288 Wundverband 114 Wurzelscheiden der Haare . . . . 2283 Wurzelspitzen (Kernteilung) . . . 945 X. Xanthophoren Xanthoproteinreaktion Xanthydrol Xylol — Reinigung Xylolaceton Xylol-Carbolsäure Xylol-Kolophonium

1143 1247 1252, 2140 390, 413, 570 575 835 831 1743

Zählapparat für Blutkörperchen — von Metz . . . . Thoma-Zeiss Zählkammer Zählung von Blutplättchen n. Fonio . . . . Lenggenhager . Erythrocyten . . . .

. . . . . . . .

1442 1449 1442 1442 1450 1450 1452 1444

Sachregister

§§

Zählung von Nervenfasern . . . . 1900 Reticulocyten 1451 weißen Blutzellen 1446 Zellen 90 Zählplatte n. Metz 1449 Zahn 1673 ff. Zahnpulpa 1686 Zahnscheiden 1682 Zahnzement 1685 Zapfenschicht 2350 Zedernholzöl 390 — in Apäthys ölgemisch . . . . 460 — bei Celloidineinbettung . 460, 462 — für Einbettung in Paraffin . . 416 ff. Zedernöl für Immersion 25 — als Einschlußmittel 846 Zeichenapparat nach Abbe . . . . 82 Edinger 83 Zeichnen f ü r Rekonstruktion . . . 885 Zeigers Spermiendarstellung . . . 2167 Zeitdauer der Paraffindurchtränkung 419 Zellbrückendarstellung . . . . 1287 ff. Zelle, Untersuchung ders. . . . 910 ff. Zeller, Umrandung mit Balsam . . 815 Zellgranula Altmanns 991 Zellgranula in Blutzellen . . . 1352 ff. Zellgrenzen, Darstellung durch Ver silbern 1280 ff., 1963 Zellhof (Knorpel) 1589 Zellkern, Untersuchung dess. . . 910 ff. Zelloidin s. Celloidin Zelluloid-Amylacetat 1485 Zellulose 1104, 1672 Zement (Zahn) 1685 Zement für Rekonstruktion . . . 898a Zenkers Fixierungsgemisch . . . 336 Modif. von Held 240 — Helly 337 241 — Kolmer — Levi 2149 — Maximow 338

687

§§

Zentralblende 51 Zentralnervensystem s. Nervensystem Zentrierung d. Kreuztisches . . . 9 Zentrifuge 1277 Zentrosom 957 ff. Zerbrochener Objektträger, Übertragen der Schnitte 853a Zettnowfllter 45, 49 Zettnowsche Flüssigkeit 97 Zieglers Entkalkungsmethode . . . 1615 Ziehl's Karbolfuchsin 1385 Zimmermann, Magenschleimhaut . 2058 —, Nierenfixierung 2127 Zinkjodid-Glycerin 805 Zink-Leuko 1176 Zinkoxyd 113 — für weiße Schriftzeichen . . . 528 Zinnober-Gelatine 1984 Zirbeldrüse 2245 ff. Zitronensaft-Goldchloridmethode . 1906 Zonula Zinnii 2342 Zotten 2045 — Trockenpräparat 867 Zuchtreife der Maus 2447 2453 — — Ratte Zucker zum Konservieren . . . . 862 Zuckerformolgemisch n. Biel= schowsky 1791 Zuckerlösung für Aufkleben . . . 563 Zuckernachweis 1108 Zunge 2047 f. Zupfnadeln 128 Zupfpräparate 128 Zusatzflüsigkeiten 116 ff. Zusatz zu Paraffin 427 Zweikernige Zellen, Berechnung . 908 Zwischenflüssigkeiten 390 Zwischenlappen (Hypophyse) . . . 2203 Zwischenzellen 2176 Zwiebelwurzel (Kernteilung) . . . 945

Anhang

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