Praktikum der Molekulargenetik [1 ed.] 9783540211662, 3540211667

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Springer-Lehrbuch

Ulrich Kück (Hrsg.)

Praktikum der Molekulargenetik unter der Mitarbeit von A. Bunse, H. Holländer-Czytko, S. Jeske, C. Klämbt, R. Klapper, I. Kubigsteltig, F. Meinhardt, J. Nickelsen, M. Nowrousian, S. Pollmann, S. Pöggeler, T. Strasser, E. Weiler, G. Wolff, K. Wolff

Mit 83 Abbildungen und 40 Tabellen

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Professor Dr. ULRICH KÜCK Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik ND 7/131 Süd Fakultät für Biologie Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum E-mail: [email protected]

ISBN 3-540-21166-7 Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben auch bei nur auszugsweiser Verwertung vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer ist ein Unternehmen von Springer Science+Business Media springer.de © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2005 Printed in Germany Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Produkthaftung: Für Angaben über Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewähr übernommen werden. Derartige Angaben müssen vom jeweiligen Anwender im Einzelfall anhand anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Satz: Druckfertige Vorlagen G. und K. Wolff Einbandgestaltung: deblik Berlin Titelbilder: Arabidopsis thaliana (links); Sordaria macrospora: Meiosporen (rechts) 29/3150WI - 5 4 3 2 1 0 - Gedruckt auf säurefreiem Papier

Vorwort

Die molekulare Genetik ist heute fester Bestandteil einer modernen universitären Ausbildung in den Biowissenschaften. Ihre Entwicklungen und Erfolge bei der Beantwortung aktueller Fragen der Lebenswissenschaften sind eng mit dem Einsatz genetischer Modellorganismen verknüpft. Das Praktikum der Molekulargenetik stellt beispielhaft molekulargenetische Experimente mit pro- und eukaryotischen Modellorganismen dar, bei denen konventionelle und molekulare Methoden zur Anwendung kommen. Die Verbindung von Lehrbuchtext und Experimentalanleitungen bietet eine Einführung in die Grundlagen der pro- und eukaryotischen Genetik für Studierende des Grund- und Hauptstudiums verschiedener Fachrichtungen. Neben der Biologie zählen hierzu die Fächer Biochemie, Biotechnologie, Medizin sowie Geo-, Agrar- und Ernährungswissenschaften. Dieses Praktikumsbuch ist zum Aufbau eines Experimentalkurses im Diplom- bzw. Bachelor-/Masterstudiengang gut geeignet, da die Mehrheit der molekulargenetischen Experimente mit vertretbarem Aufwand innerhalb eines modular aufgebauten Studienganges etabliert werden kann. Bei der Konzeption des Buches wurden besonders geeignete Modellorganismen ausgewählt, an denen die hier beschriebenen molekulargenetischen Techniken optimal dargestellt werden können. Das Spektrum reicht von den Bakterien Escherichia coli und Bacillus subtilis, über die Pilze Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa und Sordaria macrospora, die Alge Chlamydomonas reinhardtii, die höhere Pflanze Arabidopsis thaliana bis zur Taufliege Drosophila melanogaster. Um den Bezug zu den verschiedenen Modellorganismen zu erleichtern, wurden Abbildungen und Tabellen durchgängig dreistufig nummeriert. Einführend wird die Biologie der Experimentalorganismen behandelt und durch formalgenetische Experimente ergänzt. In den anschließenden Kapiteln werden folgende Themen behandelt: DNA-Transformation zur Herstellung und Analyse transgener Organismen, PCR- und RNA-Analytik, Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen, heterologe Genexpression, Einsatz von Reportergenen und Bioinformatik sowie eine Auswahl von Standardmetho-

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Vorwort

den der Molekulargenetik. Das Buch schließt mit einem Glossar, Angaben zu weiterführender Literatur und Internetadressen zu Bezugsquellen und relevanten Sachthemen. Die Realisierung dieses Buchprojektes war nur durch die Mithilfe vieler Personen möglich. Wir bedanken uns bei all denen, die zum Gelingen des Buches beigetragen haben, besonders bei E. Jung, G. Frenßen-Schenkel, E. Szczypka und E. Köster sowie bei B. Bongartz, I. Engh, S. Glanz, B. Hoff, J. Kamerewerd, B. Klinkert, K. Kopke, S. Mayrhofer, N. Nolting, C. Rattay und C. Rech für die technische Umsetzung des Textes und der Abbildungen. Insbesondere danken wir auch den Mitarbeitern des Springer-Verlages, Frau I. Lasch-Petersmann und Frau E. Werner für die redaktionelle Betreuung sowie Herrn K.-H. Winter für die Unterstützung bei der Erstellung des Layouts.

Bochum, im Juli 2004

Die Autoren

Autoren

Dr. Astrid Bunse (Kap. 5.1, 6) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum derzeitige Adresse: QIAGEN GmbH, QIAGEN Straße 1, 40724 Hilden [email protected] Dr. Heike Holländer-Czytko (Kap. 2.5) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum heike.hollä[email protected] Prof. Dr. Christian Klämbt (Kap. 1.7, 2.6, 3.6, 4.5.3, 5.2, 8.4, 8.5) Dr. Robert Klapper Dr. Thomas Strasser Institut für Neuro- und Verhaltensbiologie Westfälische Wilhelms-Universität Münster Badestraße 9 48149 Münster [email protected]

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Autoren

Dr. Ines Kubigsteltig (Kap. 3.5, 4.5.2, 8.3) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected] Prof. Dr. Ulrich Kück (Kap. 1.4, 2.3, 8.1, 10) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected] Prof. Dr. Friedhelm Meinhardt (Kap. 1.1, 1.2, 2.1, 3.1) Dipl.-Biol. Stefanie Jeske Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie Westfälische Wilhelms-Universität Münster Correnstr. 3 48149 Münster [email protected] HD Dr. Jörg Nickelsen (Kap. 1.5, 2.4, 3.4) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected] Dr. Minou Nowrousian (Kap. 4.1–4.4, 4.5.1, 4.5.4, 9) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected]

Autoren

HD Dr. Stefanie Pöggeler (Kap. 1.3, 2.2, 3.2, 3.3, 7, 8.1, 8.2) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected] Dr. Stephan Pollmann (Kap. 8.3) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected] Prof. Dr. Elmar Weiler (Kap. 1.6) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie Ruhr-Universität Bochum Universitätsstraße 150 44801 Bochum [email protected] Dr. Gabriele Wolff (Copyediting) Dipl.-Math. Kai Wolff Oesterstraße 9 44309 Dortmund [email protected]

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Inhalt

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Modellorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.1.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.1.4 Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.1.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.2 Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.2.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.2.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.2.4 Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.2.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.3 Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 1.3.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.3.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1.3.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 1.3.4 Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 1.3.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 1.4.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 1.4.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 1.4.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 1.4.4 Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 1.4.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 1.5 Chlamydomonas reinhardtii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 1.5.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 1.5.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 1.5.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 1.5.4 Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

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Inhalt

1.5.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6 Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6.4 Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7 Drosophila melanogaster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.1 Historisches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.2 Lebenszyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.3 Technische Entwicklungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.4. Biologische Fragestellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.5 Genetische Ressourcen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Genetische Kreuzungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 2.1 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 2.1.1 Konjugation von E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 2.2 Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 2.2.1 Zufallssporenanalyse bei S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora . . . . . . . . . . . . . . . . 102 2.3.1 Einfaktorkreuzung mit Farbspormutanten . . . . . . . . . . . . . 105 2.3.2 Kopplungsanalyse mit transgenen Stämmen . . . . . . . . . . . 108 2.4 Chlamydomonas reinhardtii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 2.4.1 Tetradenanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 2.5 Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 2.5.1 Kreuzung von Arabidopsis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 2.5.2 Kartierung mit CAPS-Markern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 2.6 Drosophila melanogaster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 2.6.1 Balancer-Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 2.6.2 Fliegenzucht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 2.6.3 Genetische Kreuzungen mit Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . 132

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DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Transformation von E. coli nach der CalciumchloridMethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2 Natürliche Kompetenz von B. subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3 Transformation von B. subtilis durch Elektroporation . . . .

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Inhalt

3.1.4 Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien . . . . . . . . . . . . . 3.1.5 Isolation von chromosomaler DNA aus Bacillus subtilis . . . 3.2 Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Transformation von S. cerevisiae mit der Gefriermethode . . 3.2.2 Transformation von S. cerevisiae durch Elektroporation . . . 3.2.3 Isolierung von Gesamt-DNA aus S. cerevisiae zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation . . . . . . . . . . . 3.3 Sordaria macrospora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Transformation von S. macrospora . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Pilz-Stämmen zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation . . . . . . . . . . . 3.4 Chlamydomonas reinhardtii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1 Kerntransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Chloroplastentransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.3 Isolierung von Gesamt-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5 Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.1 Herstellung stabil transformierter Linien . . . . . . . . . . . . . . 3.5.2 Isolierung von genomischer DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5.3 Transiente Transformation steril angezogener Keimlinge . . 3.6 Drosophila melanogaster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.1 Nachweis eines markierten P-Elements . . . . . . . . . . . . . . . 3.6.2 Genetische Kartierung einer P-Element-Insertion . . . . . . . 3.6.3 Isolierung genomischer DNA aus Drosophila . . . . . . . . . . . 4

PCR-Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1 Das Prinzip der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Bedeutung der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Polymerasen für die PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 PCR-Varianten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.1 Nested PCR, lineare PCR, RAPD-PCR . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.2 Die RT (reverse Transkription)-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.3 Die Real-Time-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Experimentalteil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.1 PCR-Analyse von transgenen Pilz-Stämmen . . . . . . . . . . . 4.5.2 PCR zum Integrationsnachweis eines Transgens in Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.3 Inverse PCR zur molekularen Kartierung einer P-ElementInsertion bei Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.4 Nachweis eines Transkriptes mittels RT-PCR . . . . . . . . . . .

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Inhalt

RNA-Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1 Transkriptanalysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1 RNA-Prozessierung bei C. reinhardtii . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 RNA-Isolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.3 RNA-Gelelektrophorese und Northern Blot . . . . . . . . . . . 5.1.4 Radioaktive Markierung eines Oligonukleotids und Hybridisierung mit filtergebundener RNA . . . . . . . . . . . . 5.2 In-situ-Hybridisierungen an Drosophila-Embryonen . . . . . . . .

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Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen . . . . . . . . . . . . . 265 6.1 In-vivo-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 6.1.1 Hefe-HYBRID-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 6.1.2 Die Wechselwirkung eines Transkriptionsfaktors mit einem Promotorelement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 6.1.3 ONE-HYBRID-Analysen durch Selektion von HefeTransformanten auf Histidin-Prototrophie . . . . . . . . . . . . . 273 6.1.4 ONE-HYBRID-Analysen mit Hilfe von LacZ-Tests ausgewählter Hefe-Transformanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 6.2 In-vitro-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276 6.2.1 Nachweis einer Interaktion durch Gelretentionsanalysen . . 278 6.2.2 Herstellung von Hefe-Proteinextrakt für Bindungsanalysen 280 6.2.3 Herstellung einer radioaktiv markierten Ziel-DNA (bait) . 283 6.2.5 Gelretentionsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286

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Heterologe Genexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.1 Strategien zur Optimierung der Expression in E. coli . . . . . 7.1.2 Heterologe Synthese eukaryotischer Proteine in E. coli . . . . 7.2 Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.1 Strategien zur Optimierung der Expression in S. cerevisiae . 7.2.2 Heterologe Genexpression in S. cerevisiae und Isolierung Virus-ähnlicher Partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Reportergene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1 Häufig verwendete Reportergene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1.1 Ƣ-Galactosidase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1.2 Ƣ-Glucuronidase (GUS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1.3 Das grün fluoreszierende Protein (GFP). . . . . . . . . . . . . . . 8.2 Expression des egfp-Gens in Hyphenpilzen . . . . . . . . . . . . . . .

323 323 324 324 325 327

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Inhalt

8.2.1 Nachweis der GFP-Fluoreszenz in Sordaria macrospora . . . 8.3 Nachweis der Ƣ-Glucuronidase-Aktivität in Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3.1 Histochemischer GUS-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3.2 Photometrischer GUS-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4 X-Gal-Färbungen zur Detektion von Enhancer-trapInsertionen in Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.1 Nachweis der Ƣ-Galactosidase-Expression im Embryo . . . . 8.4.2 Nachweis der Ƣ-Galactosidase-Expression in Imaginalscheiben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.3 Nachweis der Ƣ-Galactosidase-Expression durch eine Antikörperfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5 Ektopische Expression von Genen in Drosophila melanogaster . 8.5.1 Experimentalstrategien zur Funktionsanalyse von Drosophila-Genen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5.2 Überexpression und ektopische Expression eines Transgens

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328 332 333 335 337 339 341 342 344 344 347

9

Bioinformatik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 9.1 Homologie-Suche in Datenbanken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 9.1.1 Der BLAST-Algorithmus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 353 9.1.2 Die Signifikanz von Alignments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 9.1.3 Wichtige Parameter für die Datenbanksuche . . . . . . . . . . . 356 9.1.4 Beispiele zur Datenbanksuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 9.2 EST- und Gesamtgenom-Datenbanken . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 9.2.1 ESTs (expressed sequence tags) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 358 9.2.2 Beispiele zu ESTs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359 9.2.3 Gesamt-Genom-Sequenzen am Beispiel von Neurospora crassa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 360 9.2.4 Beispiele zu Arbeiten mit einer Gesamtgenomdatenbank . . 361 9.2.5 Beispiele zur Intron-Identifikation mit Hilfe von ESTs und Gesamtgenomdatenbanken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 9.3 Unbekannte Sequenz — Was tun? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365 9.4 Phylogenie-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367 9.4.1 Grundlagen der Stammbaum-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . 368 9.4.2 Vorgehen bei der Erstellung eines Stammbaumes . . . . . . . . 370 9.4.3 Beispiele zur Phylogenie-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371

10

Grundtechniken der molekularen Genetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375 10.1 Phenolisieren von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375

XVI

Inhalt

10.2 Fällungen von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.3 Extraktion von DNA aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.3.1 Phenolextraktion aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.3.2 Freeze-and-squeeze-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.4 Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . 10.5 Southern Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.6 Markierung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.6.1 Oligo-primed-labelling-Technik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.6.2 5’-Markierung von Oligonukleotiden . . . . . . . . . . . . . . . . 10.7 DNA-DNA-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

376 378 378 379 380 382 383 384 385 386

Referenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Internetadressen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hersteller und Bezugsquellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stammsammlungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Internetportale, Datenbanken und Programme. . . . . . . . . . . . . . . .

389 389 396 396 397 397

Glossar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401 Abkürzungen und Symbole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411 Sachverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413

1 Modellorganismen

Wesentliche biologische Erkenntnisse der letzten Jahrzehnte wurden an Modellorganismen gewonnen. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Laborarbeit genetisch angepasst wurden und viele Mutanten dieser Organismen bekannt sind. Diese dienen als genetische Marker und können zusammen mit Daten der Genomsequenzierung zur Beantwortung von entwicklungsbiologischen, physiologischen oder morphologischen Fragestellungen genutzt werden. Typische Beispiele für Modellorganismen sind die Bakterien Escherichia coli und Bacillus subtilis, die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, die Schimmelpilze Neurospora crassa und Sordaria macrospora, die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, die Acker-Schmalwand Arabidopsis thaliana sowie die Taufliege Drosophila melanogaster, die im Folgenden vorgestellt werden. Neben der Angabe der systematischen Einteilung, der Genomdaten und einer Zeittafel werden folgende Themen, die mit dem Modellorganismus in Zusammenhang stehen, angesprochen: historisch wichtige Ergebnisse, der Lebenszyklus, wesentliche technische Entwicklungen, generelle biologische Fragestellungen und genetische Ressourcen.

1.1 Escherichia coli «Tout ce qui est vrai pour le Colibacille est vrai pour l’ éléphant.» Jacques Monod, 1972 Die Klassifizierung von Bakterien berücksichtigt heutzutage — wie auch für Pflanzen und Tiere — weitgehend die natürlichen Abstammungs- und Verwandtschaftsverhältnisse. Eines der ältesten, aber heute noch gebräuchlichen, Einteilungskriterien ist die Gramfärbung. Sie basiert auf Unterschieden in der Zellwandstruktur (Abb. 1.1.1). Grampositive Bakterien behalten bei Anfärbung mit Kristallviolett/Jod den blauschwarzen Farbstoffkomplex nach

2

1 Modellorganismen

grampositiv

gramnegativ ÄM

Mur

Mur

CM

CM CY

CY

Abb. 1.1.1. Schematische Darstellung des Zellwandaufbaus bei Bakterien. Bakterien lassen sich durch die Gramfärbung in grampositiv und gramnegativ differenzieren. Grampositive Zellhüllen bestehen aus einer Cytoplasmamembran (CM) die das Cytoplasma (CY) umgibt und einem vielschichtigen Mureinsacculus (Mur). Gramnegative Zellhüllen besitzen sowohl eine Cytoplasmamembran (CM) als auch eine äußere Membran mit Lipopolysacchariden (ÄM), zwischen denen sich der periplasmatische Raum mit einer einschichtigen (maximal zweischichtigen) Mureinschicht (Mur) befindet

Behandlung mit Ethanol, während gramnegative Bakterien entfärbt werden. Typische und genetisch sehr gut charakterisierte Vertreter dieser phylogenetisch sehr divergenten Gruppen sind das gramnegative Darmbakterium Escherichia coli und das grampositive Bodenbakterium Bacillus subtilis. E.-coli-Bakterien, Vertreter der Enterobacteriaceae, sind gramnegative, kurze, stumpfe Stäbchen (ca. 0,6 × 1–2 µm) mit peritricher Begeißelung, die zur aeroben Atmung und anaeroben Fermentation (fakultativ anaerob) befähigt sind. Sie kommen in der normalen intestinalen Flora des Menschen, anderer Säuger und von Vögeln vor, machen in aller Regel jedoch nur etwa 1 % der mikrobiellen Population aus. Im Erdreich oder Wasser können sie nur kurze Zeit überleben. Neben dem harmlosen E.-coli-K12-Stamm und seinen Derivaten, zu denen in aller Regel heutige Laborstämme zählen, existieren jedoch auch pathogene Stämme. Die Popularität und Eignung als Modellorganismus beruht weniger auf herausragenden Fähigkeiten oder Charakteristika von E. coli, sondern vielmehr auf zweckmäßigen Eigenschaften wie einfacher Handhabung, guter Kultivierbarkeit, geringer Virulenz sowie der historischen Bedeutung. Durch die Entdeckung des Austausches von genetischer Information bei E. coli (Konjugation) wurde auch der methodische Grundstein für weitere genetische Untersuchungen gelegt. In einem selbstverstärkenden Prozess dienten die erhaltenen Ergebnisse und neu entwickelten Methoden wiederum als Ansporn für neue Forschungen, so dass E. coli bis heute als eines der bedeutendsten Modellsysteme der molekularen Biologie und Biotechnologie gilt.

1.1 Escherichia coli

3

Systematische Einteilung Domäne: Phylum: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung:

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia

Genomsteckbrief • • • •

zirkuläres Genom (Bakterienchromosom, Nukleoid) Genomgröße bei Escherichia coli K12: 4,64 Mb Anzahl der ORFs: 4491 Gesamtzahl tRNA-Gene: 86, zusätzlich 1 Selenocystein tRNA-Gen und 1 potentielles Pseudogen • Gesamtzahl rRNA-Gene: 22 in 7 Operons • G+C -Gehalt: 50,8 % • Plasmide möglich: episomale DNA, zirkulär, kovalent geschlossen 1.1.1 Historisches 1885 1919 1925 1943 1946 1947 1951 1953 1953 1955

Entdeckung durch Theodor Escherich (Bacterium coli commune) Umbenennung in Escherichia coli Kreuzungsversuche mit Ernährungsmutanten, Veröffentlichung jedoch erst 1937 „Fluktuationstest“: Mutationen treten zufällig auf erstmalige Beschreibung von parasexuellen Vorgängen bei Bakterien: Konjugation von Auxotrophiemutanten Erstellung einer ersten Genkarte durch Kreuzungen und Komplementation Entdeckung des Phagen Lambda und der Transduktion Identifikation des F-Faktors Charakterisierung eines Hfr-Donors Erstellung einer Genkarte durch Konjugation und unterbrochene Paarung

4

1 Modellorganismen

1961 1963 1973 1982

Untersuchung der Regulation des lac-Operons (Operonmodell) zirkuläres Bakterienchromosom Herstellung des ersten gentechnisch veränderten Organismus der pathogene Stamm E. coli O157:H7 tritt erstmals in Erscheinung (Diarrhö und letale Nierenschäden) 1987 komplette Restriktionskarte des E.-coli-Chromosoms 1997 Abschluss der Genomsequenzierung Dezember 2002 Abschluss der fünften und bisher letzten Genomsequenzierung (E. coli CFT073) Der Kinderarzt und Bakteriologe Theodor Escherich isolierte und beschrieb im Jahre 1885 erstmals ein von ihm Bacterium coli commune genanntes Bakterium, welches 1919 durch A. Castellani und A. J. Chalmers in Escherichia coli umbenannt wurde. Erst 1943 begann jedoch mit dem von E. Luria und M. Delbrück durchgeführten Fluktuationstest, welcher die Auffassung von Mutation als einem ungerichteten, vom selektierenden Agens unabhängigen Prozess belegte, die Aera der Bakteriengenetik. Erste Versuche zur Kreuzung von E.-coli-Ernährungsmutanten, die sich in einem Merkmal unterschieden, wurden durch Sherman und Wing 1925 durchgeführt und 1937 veröffentlicht, 1946 konnten dann in stabilen, doppelt auxotrophen E.-coli-Mutanten parasexuelle Prozesse gezeigt werden (E. L. Tatum und J. Lederberg). Die Konjugation stellte im Folgenden einen entscheidenden Faktor für die Entwicklung der Bakteriengenetik und Molekularbiologie dar, da sich hierdurch die Möglichkeit zur Genkartierung und gezielten, genetischen Manipulation ergab. Der Austausch genetischen Materials durch Bakteriophagen konnte ebenfalls 1946 durch A. Hershey und M. Delbrück gezeigt werden. Ein Jahr später, 1947, gelang es J. Lederberg und Cavalli und Heslot auf Basis von Kreuzung und Komplementation eine erste, überraschend genaue genetische Karte von E. coli (K12) zu erstellen. Im Rahmen der Untersuchungen zur Mutagenese konnte 1949 von Kelner an UV-Abtötungskurven gezeigt werden, dass Bakterien in der Lage sind, Schäden, die durch UV-Licht hervorgerufen werden, bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht zu überleben (Photoreparatur), was 1950 durch Dulbecco bestätigt werden konnte. Im Jahr 1951 entdeckte Esther Lederberg den temperenten Bakteriophagen Lambda in E. coli und J. Lederberg und N. D. Zinder das Phänomen der DNAÜbertragung durch Bakteriophagen (Transduktion). Im Jahr 1952 prägte J. Lederberg den Begriff „Plasmid“. Er charakterisierte Plasmide anhand ihrer

1.1 Escherichia coli

5

Eigenschaften als episomale, ringförmig geschlossene und autonom replizierende DNA-Moleküle. Obwohl parasexuelle Prozesse seit 1946 belegt waren, konnte der verantwortliche F-Faktor (fertility) erst im Jahr 1953 (Joshua Lederberg, Luigi Cavalli-Sforza und Esther Lederberg) identifiziert und hochfrequent rekombinierende Donorstämme (HFr, high frequency of recombination) charakterisiert werden (W. Hayes). Das Wissen um die Fähigkeit von Hfr-Stämmen, Teile ihres Genoms auf die Empfängerzelle zu übertragen, ermöglichte 1955 die Erstellung einer Genkarte für E. coli auf Basis der „unterbrochenen Paarung“ (E. L. Wollman und F. Jacob). Zur Erkenntnis, dass E. coli ein zirkuläres Bakterienchromosom besitzt, kam man jedoch erst acht Jahre später (J. Cairns 1963). 1961 zeigte T. Watanabe, dass Plasmide als übertragbare Resistenzträger fungieren können und F. Jacob und J. Monod erläuterten erstmals das heute als Paradigma für Regulationsprozesse bekannte lac-Operon. Weitere Untersuchungen der Wirt-Virus-Interaktion an E. coli und Lambda führten zur Entdeckung der wirtskontrollierten Modifikation und Restriktion von DNA. Die Entdeckung von Restriktionsenzymen und ihrer Anwendungsmöglichkeiten (Arber 1969) sowie die Beschreibung spezifischer Restriktionsenzyme (H. O. Smith 1970) legten den Grundstein für die 1972 beginnende DNA-Rekombinationstechnik. Fast 20 Jahre waren bis dato seit der erstmaligen Beschreibung des Phänomens der Restriktion 1953 (Bertani und Weigle) vergangen. 1972–73 gelang H. W. Boyer und S. N. Cohen die Herstellung des ersten gentechnisch veränderten Organismus: Funktionelle Plasmide mit Fremd-DNA wurden in vitro kombiniert, diese in E. coli übertragen und die genetische Information in der Empfängerzelle ausgeprägt. Die komplette Restriktionskarte des E.-coli-Genoms wurde 1987 veröffentlicht, zehn Jahre später konnte das Genom-Sequenzierprojekt der University of Wisconsin und der Nara Universität, Japan, abgeschlossen werden (Blattner et al. 1997), und bis zum Dezember 2002 lagen die Daten von insgesamt fünf Escherichia coli Gesamtgenomen vor. Pathogene Human- und tierpathogene Vertreter sind: DAEC: Diffus adherierende E. coli EAggEC: Enteroaggregative E. coli EHEC: Enterohaemorrhagische E. coli EIEC: Enteroinvasive E. coli EPEC: Enteropathogene E. coli

6

1 Modellorganismen

ETEC: NMEC: UPEC:

Enterotoxische E. coli Neonatal meningitis E. coli Uropathogene E. coli

E. coli kommt als harmloser Kommensalist im unteren Teil des Ileums (Dickdarm) beim Menschen und anderen Warmblütern vor. Da ein Überleben auch außerhalb des natürlichen Habitats zumindest für kurze Zeit möglich ist, lässt er sich häufig z. B. auf rohen Speisen und in unserer direkten Umgebung finden. Seit der in Rindern vorkommende E. coli O157:H7 (ein EHEC Vertreter) 1982 erstmals als Auslöser blutiger Diarrhö und tödlichen Nierenversagens identifiziert wurde, ist dieser bis heute ein häufiger Lebensmittelvergifter. Bei der Untersuchung des Erregers stellte sich heraus, dass dessen Genom etwa um ein Viertel größer ist als das seiner harmlosen Verwandten. Beide teilen eine genetische Grundausstattung von etwa 4000 Genen, E. coli O157:H7 besitzt jedoch zusätzlich 1387 Gene. Diese durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene werden in stammspezifischen Clustern unterschiedlicher Größe zusammengefasst. Dazu gehören z. B. Virulenz- oder Adhäsionsfaktoren und das Shiga-Toxin. Das in großen Mengen produzierte Toxin ähnelt stark dem Shigella-dysenteriae-Toxin. Produkte anderer Gene sorgen dafür, dass ein oral aufgenommener pathogener Stamm die Magenpassage unbeschadet übersteht und somit schon wenige hundert Zellen für eine erfolgreiche Infektion genügen. 1.1.2 Lebenszyklus E. coli erreicht in Vollmedium bei optimaler Wachstumstemperatur (37 °C) eine Verdopplungszeit von etwa 20 min. In glucosehaltigem Minimalmedium beträgt die Verdopplungszeit bei optimaler Temperatur jedoch bereits 60– 90 min. Der symmetrischen Zweiteilung einer Bakterienzelle geht die Replikation des Bakterienchromosoms voraus. Die Initiation der Replikation beginnt am Replikationsstartpunkt, dem oriC. Der DNA-Entwindung und Bildung der Replikationsgabeln folgt die bidirektionale Replikation, welche am Replikationsterminator terC stoppt. Eine Replikationsrunde benötigt ca. 40 min, weitere 20 min später findet die Zellteilung mit der Verteilung der Genome auf die Tochterzellen statt. Um eine Generationszeit von 20 min zu erreichen (s. o.), muss deshalb an den noch replizierenden Genomen erneute Replikationsinitiation stattfinden, so dass eine Verteilung von replizierenden Genomen auf die Tochterzellen erfolgt.

7

log (Zellzahl)

1.1 Escherichia coli

I

II

III

IV

V

VI

a Zeit

1 2

7

3

6

b

4

5

Abb. 1.1.2 a, b. (a) Schema der vegetativen Vermehrung von Bakterienzellen. Die Wachstumskurve einer Kultur, der Logarithmus (log) der Zellzahl in Abhängigkeit von der Zeit, teilt sich in sechs Phasen. Phase I, lag-Phase ohne Zellteilung, Phase II, die Beschleunigungsphase mit beginnender Teilung, und Phase III, die exponentielle Wachstumsphase mit maximaler Verdopplungsrate. In Phase IV verlangsamt sich die Teilung (Verzögerungsphase), um in der stationären Phase aufzuhören (Phase V). Phase VI ist die Absterbephase, in der die Biomasse der Kultur abnimmt. Zellteilung findet in den Phasen II–IV statt. (b) Die Zellteilung beginnt mit der Theta-Replikation des Bakterienchromosoms, ausgehend vom Origin (1), und die DNA lagert sich in der Zellmitte an (2). Nun wird eine neue Membran mittig von außen nach innen gebildet (3, 4) und die Zellwand vervollständigt, bis beide Zellen getrennt sind (5, 6). Die Tochterzellen durchlaufen nun ihrerseits den Zellteilungszyklus (7). In der Zelle ist die chromosomale DNA (schwarze Zirkel) mit dem Replikationsursprung (grauer Bereich) dargestellt

In der Zellmitte erfolgt bei der eigentlichen Zellteilung die Bildung eines irisblendenartig von der äußeren Zellwand nach innen wachsenden Septums (Abb. 1.1.2 b). Da das Bakterienchromosom an der Zellmembran angeheftet ist, werden die Kopien bei der Zellteilung gleichmäßig auf beide Tochterzellen verteilt; eventuell vorhandene Plasmide liegen jedoch frei im Cytoplasma vor und werden zufällig verteilt.

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1 Modellorganismen

Verfolgt man das Zellwachstum, zeigt die Wachstumskurve (Abb. 1.1.2 a) den typischen Verlauf mit lag-, exponentieller, stationärer und Absterbe-Phase. In der lag-Phase findet die Adaption der Zellen an die äußeren Bedingungen wie beispielsweise das Nährstoffangebot statt. Mit der ersten Zellteilung beginnt die Beschleunigungsphase, welche mit dem Erreichen der maximalen Teilungsrate in die exponentielle Wachstumsphase übergeht. Unter optimalen Wachstumsbedingungen findet nun theoretisch unbegrenztes, exponentielles Wachstum durch Zweiteilung statt. Durch Limitierung und Hemmung, wie die Abnahme des Nährstoffgehalts, die Anhäufung von Stoffwechselprodukten sowie die steigende Populationsdichte, tritt die Kultur in die Verzögerungsphase ein. Die Teilung verlangsamt sich, um in der stationären Phase gänzlich aufzuhören. Nach einiger Zeit beginnen die Zellen abzusterben — die Biomasse der Kultur nimmt ab. 1.1.3 Technische Entwicklungen E. coli ist heute ein unverzichtbares Instrument biologischer Grundlagenforschung und Anwendung. Kaum ein molekulargenetisch oder -biologisch arbeitender Wissenschaftler wird auf E. coli als Klonierungs- oder Expressionswirt verzichten können. Der Phage Lambda Das 1951 in E. coli K12 entdeckte und für Menschen ungefährliche Virus (Phage Lambda) entwickelte sich unter anderem aufgrund seiner ausgeklügelten Genregulation zu einem Modellsystem und wichtigen Werkzeug der molekularen Genetik. In einem Bakterienrasen verursacht eine Infektion mit diesem Phagen trübe Plaques, in denen resistente Kolonien heranwachsen: Da Lambda ein temperentes („gemäßigtes“) Virus ist, kann die Infektion sowohl lytisch als auch lysogen erfolgen, was entweder zur Lyse der infizierten Zelle und so zur Phagenfreisetzung führt oder zum Einbau der Phagen-DNA in das Bakteriengenom (Abb. 1.1.3). Dieser Prophage wird an nachfolgende Generationen weitergegeben und kann durch DNA-schädigende Einflüsse, die das SOS-Reparatursystem der Zelle aktivieren, wieder in den lytischen Zyklus eintreten. Aufgrund seiner Morphologie, einer ikosaedrischen Kopfstruktur aus 72 Capsomeren (60 nm Durchmesser) und einem flexiblen, nichtkontraktilen Schwanz (etwa 150 × 8 nm) mit Schwanzfaser wird Lambda den Siphoviridae zugeordnet. In seinem Kopf liegt das doppelsträngige, ca. 50 Gene umfassende, DNA-Genom von 48 502 bp, dessen Sequenz bereits seit 1982

1.1 Escherichia coli

9

I VI

X V

IX

VII

II

XI

VIII IV

III

Abb. 1.1.3. Der Vermehrungszyklus des temperenten E. coli-Phagen Lambda. Nach Andocken des Phagen an die Maltoserezeptoren der Zellmembran und Injektion der Virus-DNA (grau dargestellt) zirkularisiert diese intrazellulär über die cos-Stellen (I). Nun können der lytische (II-VI) oder der lysogene Zyklus (VII–XI) eingeschlagen werden. Beim lytischen Zyklus kommt es zunächst zur Theta-Replikation der Lambda-DNA (II) und dann zur Konkatemerbildung (III), zur Verpackung einzelner Genome in Phagenköpfe und zum Phagenzusammenbau (IV). Phagenproteine lysieren die Zelle (V) und setzen reife Phagen frei (VI), die ihrerseits neue Zellen infizieren können. Wird der lysogene Weg eingeschlagen, so wird das Phagengenom über „Attachment“-Stellen in die chromosomale DNA des Bakteriums integriert (zwischen dem gal- und bio-Operon) (VII). Bei jeder Zellteilung erhalten die Tochterzellen so je ein Phagengenom (VIII, IX). Kommt es zur Induktion des lytischen Zyklus (X) unter Exzision des Lambda-Genoms aus dem Bakterienchromosom, so tritt der Phage in den lytischen Zyklus ein (XI). Die cos-Stellen der Lambda-DNA sind schwarz gekennzeichnet

bekannt ist, in linearer Form vor. Nach der Infektion einer Bakterienzelle über Maltoserezeptoren kommt es, vermittelt durch die 12 bp langen, 5’-überhängenden, zueinander komplementären cos-Enden (kohäsive-), zur Zirkularisierung der Phagen-DNA. Diese wird, abhängig vom physiologischen Zustand der Wirtszelle und dem damit korrelierenden Gehalt an Proteasen, entweder in das Genom integriert oder durch zelleigene Enzyme repliziert. Zunächst werden ca. 50 Genomkopien nach dem bidirektionalen Mechanismus repliziert. Anschließend nach dem Prinzip des rollenden Ringes mehrere Genome lange, verpackungsfähige, konkatemere DNA-Moleküle abgeschrieben, die über die cos-Stellen verknüpft sind. Jede DNA, die cos-Stellen im Abstand von ca. 48,5 kb (eine Genomgröße) besitzt, wird in Phagenköpfe eingefädelt

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1 Modellorganismen

und verpackt. Im Anschluss daran erfolgt der vollständige Zusammenbau der Phagen und die Freisetzung durch Zelllyse. Auf Basis dieses Verpackungsmechanismus werden Lambda-Vektoren in der Gentechnik verwendet, um beispielsweise große Fragmente, wie sie bei der Herstellung von Genbanken benötigt werden, klonieren zu können. Sehr große Fragmente von bis zu 46 kb lassen sich in Cosmiden klonieren, die neben einem Replikationsursprung und einer selektierbaren Marke für E. coli nur noch die für die Verpackung nötigen Elemente wie cos-Stellen tragen. Da Genbanken vollständig und überlappend sein müssen, benötigt man eine Abschätzung für die Anzahl der notwendigen Klone. Für deren statistische Mindestanzahl N gilt N = ln(1–p) / ln(1–f ) Dabei ist p die erwünschte Wahrscheinlichkeit, mit der das Gen in der Bank vorkommen soll und f das Verhältnis der durchschnittlich eingebauten Fragmentgröße zur Gesamtgenomgröße (nach Clarke und Carbon 1976). Mutanten Um Auslösung und Wirkung von Mutationen zu studieren, sind haploide Genome wie das von E. coli generell gut geeignet, da bei Haplonten der Phänotyp dem Genotyp entspricht. Viele Eukaryoten (z. B. Arabidopsis thaliana oder Drosophila melanogaster) besitzen ein diploides Genom, welches Mutationsstudien erschwert. Genetische Nomenklatur Prokaryotische Gene werden mit einem Kürzel aus drei kursiven Kleinbuchstaben bezeichnet, häufig mit Bezug zur Funktion des Gens. Diesem folgt ein Großbuchstabe, der eine Differenzierung verschiedener Loci, welche den gleichen Phänotyp beeinflussen, ermöglicht (proA, proB). Werden neue Mutationen eines Gens isoliert, erfolgt ihre Unterscheidung durch eine zusätzliche Nummerierung (proA52). Ein Bindestrich ersetzt den Großbuchstaben zwischen Kürzel und Nummer, falls Unklarheit über den genauen Gen-Locus herrscht. Seit Genomsequenzierprojekte eine Fülle von hypothetischen Genen ohne Funktionszuweisung identifizieren, erfolgt ihre Nomenklatur zunächst durch eine systematische Buchstaben- und Zahlenkombination. Diese wird in der Regel später durch einen funktionsbezogenen Namen ersetzt. Der Phänotyp wird durch das Kürzel in Normalschrift bezeichnet, dessen erster Buchstabe groß geschrieben wird (Pro –, Prolin-auxotroph). Soll ein Protein benannt werden, so wird das Kürzel des Gens in Normalschrift verwendet und der erste

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Buchstabe groß geschrieben. Der dem Kürzel folgende Großbuchstabe und die Nummer bleiben unverändert (ProA, ProB). Mutagenese Spontan auftretende Mutationen (10 –6 –10 –10 Mutationen pro Generation und Gen) bilden in Kombination mit der Selektion und Rekombination die Basis der genetischen Evolution. Neben fehlerhafter DNA-Replikation durch zufälligen Falscheinbau von Nukleotiden, was mit einer durchschnittlichen Häufigkeit von 10 –7–10 –11 pro eingebautem Basenpaar erfolgt, findet man induzierte Mutationsauslösung. Mutagene sind sowohl physikalischer Natur (z. B. UV-Licht, Röntgen- oder radioaktive Strahlung), chemische Agenzien (z. B. das im Labor häufig zur Mutationsauslösung verwendete Ethylmethansulfonat, EMS) als auch biologische Faktoren („springende Gene“: IS-Elemente oder Transposons). Eine Basensubstitution durch Austausch einzelner Nukleotide resultiert in der Regel in „Missense“- oder „Nonsense“-Mutationen. Missense-Mutationen können aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes still sein, d. h. keine Veränderung der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins bewirken. Wird die Primärstruktur jedoch geändert, kann dies Auswirkungen auf die Funktion haben, wenn beispielsweise die Proteinfaltung beeinträchtigt wird oder katalytische Zentren betroffen sind. Konditional letale Mutanten entstehen, wenn temperatursensitive Proteine gebildet werden, d. h. ein Protein kann bei 25 °C funktionsfähig sein, während die Funktion bei über 30 °C beeinträchtigt ist. Die Entstehung eines Stoppcodons bewirkt vorzeitige Termination der Translation, was zu einem verkürzten und häufig nicht mehr funktionalen Protein führt (Nonsense-Mutation). Durch Insertion oder Deletion von Basen hervorgerufene Mutationen führen dann, wenn die Anzahl der inserierten oder deletierten Basen nicht einem Vielfachen von drei entsprechen, ebenfalls zu funktionsunfähigen Proteinen, da das Triplettraster verschoben wird (Rasterschub-Mutation). Reparaturmechanismen Nicht jede DNA-Schädigung führt zwangsläufig zu einer Mutation. Bis zu einem gewissen Grad ist E. coli wie jede andere Zelle befähigt, diese Schäden zu reparieren. Hierbei bestimmen Art und Ausmaß der Schädigung den Reparaturmechanismus. Generell gilt, dass Mutationen aus fehlerbehafteter Reparatur resultieren. Bei schweren DNA-Schäden wird in der E.-coli-Zelle ein Notfallprogramm induziert (SOS-Antwort), in dessen Verlauf es zur Anhäufung von einzel-

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strängiger DNA und schließlich zur fehlerbehafteten Reparatur kommt. Das in jeder Zelle vorkommende Rekombinationsprotein RecA (7200 Moleküle/ Zelle) erlangt durch Bindung an einzelsträngige DNA Apoproteaseaktivität. Die Spaltung des Transkriptionsrepressors LexA führt zur Induktion von mehr als 20 SOS-Genen. Unter anderem wird die Zellteilung blockiert (sfiAGen) und die Expression von umuD und C (error prone repair, fehlerbehaftete Reparatur) sowie der uvr-Gene (Excisionsreparatur) ermöglicht. Geringe DNA-Schädigungen stellen kein Problem dar, die durch UV-Licht induzierten Thymin-Dimere werden nämlich außerhalb der SOS-Reparatur entweder durch eine Photolyase aufgelöst oder durch eine spezielle Exzisase entfernt. DNA-vermittelte Transformation Die Fähigkeit einer Zelle, freie DNA aus dem umgebenden Medium aufzunehmen, wird als Kompetenz definiert. E. coli muss, wie viele andere Organismen, einer besonderen Behandlung unterzogen werden, um einen transformationskompetenten Zustand zu erreichen. Hierzu bieten sich verschiedene Möglichkeiten an: Behandlung mit zweiwertigen Ionen, z. B. bei der Calciumchlorid-Methode (Mandel und Higa 1970) und bei der Hanahan-Methode (Hanahan 1983), die Magnesiumchlorid verwendet, und Elektroporation. Da nur ein relativ kleiner Teil einer Bakterienpopulation tatsächlich transformiert werden kann, ist eine Selektion vonnöten, was bei E. coli in der Regel durch Resistenzmarker ermöglicht wird. Ein Beispiel ist die häufig verwendete Ampicillinresistenz (Amp), vermittelt durch die Ƣ-Lactamase (bla), welche ƢLactam-Antibiotika spaltet. Je nach Schicksal der eingebrachten DNA unterscheidet man zwischen transienter und stabiler Transformation. Im ersteren Fall verlieren die Transformanten wegen des Abbaus der DNA den mit der eingebrachten Information korrelierten Phänotyp. Stabile Transformanten erhält man durch Verwendung replikationsfähiger Plasmide oder durch Integration in das Genom. Verfügbarkeit der Gesamtgenomsequenz Die Abstände von Genen werden bei einer durch Konjugation und unterbrochene Paarung erstellten, physikalischen Genomkarte in Minuten angegeben. Die Einheit ist auf die DNA-Menge bezogen, die von einer durchschnittlichen Hfr-Zelle in 1 min transferiert wird. Das Gesamtgenom ist demzufolge 100 min lang, die Positionsangabe der genetischen Marker erfolgt, da es sich

1.1 Escherichia coli

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um ein zirkuläres Genom handelt, relativ zum „Nullpunkt“ (thr) im Uhrzeigersinn. Diese Karten sind zwar überraschend exakt, die Sequenzierung des E.-coli-Gesamtgenoms hat jedoch eine bis dato nicht gekannte Genauigkeit ermöglicht. Mit 4,64 Mb liegt die Größe des E.-coli-K12-Nukleoids um das Tausendfache unter der Genomgröße des Menschen mit etwa 3 ⋅ 103 Mb (auf 46 Chromosomen in der diploiden Zelle). Für ein Bakterium ist das Genom jedoch recht groß. Im Vergleich dazu liegen die Größen anderer bakterieller Genome zwischen etwa 0,5 Mb DNA bei Mycoplasmen und ca. 8,0 Mb bei Actinomyceten. Zu den kodierten 4491 Genen können weiterhin nicht essentielle Gene auf Plasmiden hinzukommen. Der G+C -Gehalt der E.-coli-DNA erscheint mit 50,8 % ausgewogen und ist bei den bisher sequenzierten Stämmen gleich. Repetitive Elemente Im Genom von E. coli finden sich insgesamt nur 88 tRNA-Gene, von denen 86 für die 20 proteinogenen Aminosäuren kodieren. Zusätzlich finden sich eine tRNA für die 21. Aminosäure Selenocystein und ein potentielles Pseudogen. Die Gesamtzahl der rRNA-Gene beträgt 22 (arrangiert in sieben Operons). Trotz der Seltenheit der rRNA- und tRNA-Gene im Verhältnis zu den proteinkodierenden, stellen diese RNA-Spezies den größten Anteil an der Gesamt-RNA-Menge in E. coli. Der mRNA-Anteil beträgt nur ca. 5–10 %, wohingegen die tRNA etwa 15 % der Gesamt-RNA einer Zelle ausmacht. Ein E.-coli-Ribosom besteht zu 40 % aus Proteinen und 60 % aus verschiedenen rRNA-Spezies: Die kleine Untereinheit enthält 16S rRNA und die große Untereinheit 23S und 5S rRNA. Zusätzlich kann das Genom von E. coli transponierbare Elemente ( „springende Gene“) enthalten, welche in der Lage sind, von einer Position zu einer anderen auf dem gleichen oder einem anderen DNA-Molekül zu wechseln. Dazu gehören bis zu zehn Kopien von IS-Elementen (Insertionselemente) und Transposons, in manchen Zellen auch transponierbare Phagen. Die Größe von IS-Elementen liegt im Durchschnitt bei 800–2000 bp, und sie besitzen kurze, terminale, invers repetitive Sequenzen (10–50 bp). Diese kodieren zentral gelegene Gene für Transpositionsproteine (Transposase). Zur näheren Kennzeichnung wird eine Ziffer benutzt, z. B. IS 1, 2, 5, 10. Größer als IS-Elemente und mit zusätzlichen Resistenzgenen ausgestattet sind Transposons (Tn), die sich nach ihrem Aufbau in zwei Klassen differenzieren lassen. Die zusammengesetzten Transposons der Klasse I bestehen aus einem zentralen Abschnitt, der von IS-Elementen eingerahmt wird (z. B. Tn 5, 9, 10). Die komplexen Transposons der Klasse II besitzen zentral kodierte Transpositionsproteine,

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1 Modellorganismen

die von kurzen, invers repetitiven Sequenzwiederholungen eingerahmt werden (z. B. Tn 3, 501, 1000). Plasmide Neben dem Nukleoid enthalten einige E.-coli-Stämme zusätzliche DNA in Form episomaler Plasmide, deren Größe von etwa 6,4 kb (Col E1) bis über 100 kb (z. B. F-Faktor, ca. 100 kb) reicht und deren Replikation unabhängig vom Bakterienchromosom erfolgt. Auf ihnen kodierte Informationen sind nicht essentiell, bieten unter bestimmten Bedingungen jedoch Selektionsvorteile. Charakteristika von Plasmiden sind, neben der Größe, die Kopienzahl, der Mechanismus der Replikation oder die Übertragbarkeit auf andere Organismen. Auch das Wirtsspektrum, welches in der Regel durch die Abhängigkeit der Replikation von zellulären Proteinen bestimmt wird, sowie vorhandene selektierbare Marken unterscheiden Plasmide. Ihre Kopienzahl wird über den Replikationsursprung reguliert. Sie kann von 1–10 Kopien bei stringenter Kontrolle (low copy) über eine mittlere Kopienzahl (10–100), bis hin zur Hochkopienzahl von über 100 Plasmiden (high copy) bei relaxierter Replikationskontrolle reichen. Ebenfalls von der Beschaffenheit des Origin hängt ab, nach welchem Mechanismus die Replikation stattfindet. Die meisten Plasmide replizieren nach dem Ring-zu-Ring Mechanismus, der Theta-Replikation, seltener nach dem Prinzip des rollenden Ringes (rolling circle), was vor allem bei kleinen high-copy-Plasmiden oder der konjugativen Übertragung des F-Plasmids der Fall ist. Bei nichtkonjugativen Plasmiden erfolgt die Weitergabe während der Zellteilung an die Tochterzellen (vertikal). Konjugative Plasmide können zudem im Rahmen parasexueller Prozesse horizontal zwischen verschiedenen E.-coliZellen und manchmal sogar durch Interspezieskonjugation weitergegeben werden. Die Mobilisierbarkeit dieser Plasmide (z. B. F-Plasmid) versetzt Bakterien in die Lage, beispielsweise Resistenzen „einzusammeln“ und sich so ihrer Umwelt besser anzupassen. Ein besonders interessantes Beispiel für ein mobilisierbares Plasmid ist das 200 kb große Ti (Tumor induzierendes)-Plasmid des phytopathogenen, Wurzelhalsgallen bildenden Bakteriums Agrobacterium tumefaciens. Der Auslöser der Tumorbildung ist ein 20 kb großer Bereich des Ti-Plasmids, die T (transferred)-DNA. Nach Übertragung und Integration in das Genom der Pflanzenzelle wird diese zur Produktion von Phytohormonen und Opinen angeregt. Opine (Octopin, Nopalin, Agropin) dienen dem Pathogen als Nährstoffquelle. A. tumefaciens ist jedoch nicht nur in der Lage Pflanzenzellen zu transformieren, sondern findet in der Molekularbiologie sogar bei der Interspezieskonjugation mit anderweitig schwer zu transformierenden Hyphenpilzen Verwendung (Kap. 3.3 und 3.5).

1.1 Escherichia coli

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1.1.4 Biologische Fragestellungen Aufgrund der guten Transformierbarkeit und der Vielzahl von Vektoren ist E. coli zum idealen Klonierungszwischenwirt geworden. So stehen beispielsweise zur Anlage von Genbanken verschiedenste Systeme mit einer Aufnahmekapazität von bis zu 300 kb (BAC, bacterial artificial chromosome) zur Verfügung. Diese sind idR. Derivate des F-Faktors und aufgrund ihrer stabilen Replikation ein häufig verwendetes System. Ebenso finden phagenbasierte Systeme (z. B. vom Phagen Lambda abgeleitete Vektoren und Cosmide) Verwendung bei der Klonierung größerer DNA-Fragmente. Besondere Eignung besitzt E. coli auch bei komplexeren Klonierungen, da relativ kleine, optimierte Vektoren zur Verfügung stehen. Sie können DNA von bis zu 10 kb oder mehr an definierten Restriktionsschnittstellen aufnehmen, lassen sich einfach transformieren und auch wieder schnell und einfach isolieren. Viele dieser Klonierungsvektoren besitzen zudem die Fähigkeit, in mehr als einem Organismus stabil und selektierbar zu sein. Diese Shuttle-Vektoren tragen sowohl für E. coli als auch einen anderen, pro- oder eukaryotischen Wirt, wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, einen Replikationsursprung und selektierbare Marken (Kap. 3.2). Hierdurch wird die Übertragung von in E. coli hergestellten Konstrukten in den Zielorganismus ermöglicht. Das Wissen um seine Biologie, um Funktion, Regulation und Interaktion zellulärer Proteine hat E. coli auch zum universellen Expressionsorganismus für viele heterologe Proteine in Forschung und Industrie werden lassen. Biotechnologisch bedeutsam ist auch die schnelle und einfache Kultivierbarkeit dieses harmlosen Bakteriums auf preiswerten, einfachen Substraten und die Vielzahl der zur Verfügung stehenden Plasmide und Mutanten. Beispiele für Proteine mit großer medizinischer oder biotechnologischer Bedeutung, deren Expression bereits gelungen ist, sind humanes Insulin, eine Vorstufe des Calcitonins (Osteoporose-Behandlung), humanes Wachstumshormon, Gewebeplasminogenaktivator, Interleukin-2 oder Interferon alpha, beta und gamma. 1.1.5 Genetische Ressourcen Informationen zum E.-coli-K12 (MG1655)-Genom und seiner Biochemie bietet EcoCyc, Encyclopedia of E. coli K12 Genes and Metabolism (www. ecocyc.com), deren Name sich von eclipse und encyclopedia ableitet. Diese regelmäßig überarbeitete Enzyklopädie behandelt neben dem Genom mit Genposition und Funktion die Transkriptionsregulation mit Operons, Promotoren und Transkriptionsfaktoren inklusive ihrer Bindestellen. Membrantrans-

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1 Modellorganismen

porter mit zugehörigen Transportreaktionen werden ebenso beschrieben wie Stoffwechselwege, Signaltransduktion sowie alle metabolischen Proteine mit ihren Cofaktoren, Aktivatoren, Inhibitoren und ihrer Untereinheitenstruktur. Zusätzlich finden sich Links zu anderen biologischen Datenbanken. Zudem ist es möglich, neben E. coli K12 auch verschiedene andere Genome auf Proteinoder Nukleinsäureebene zu „blasten“. Vom Institut Pasteur wird mit Colibri (genolist.pasteur.fr/Colibri/) ebenfalls eine Datenbank für E. coli K12 angeboten, die neben dem kompletten Genom auch eine Proteindatenbank umfasst. Sequenzvergleiche auf Nukleinsäure- oder Proteinebene sind hier ebenfalls möglich. Diese Datenbank basiert auf den Sequenzdaten des E.-coli-Genomprojekts der Universität WisconsinMadison (www.genome.wisc.edu) und den Annotationen der EcoGene-Datenbank (bmb.med.miami.edu). Die Genobase-Datenbank des Nara Institute of Science and Technology in Japan, befasst sich mit E. coli K12 (W3119) und bietet die Möglichkeit, neben der Genomsequenz auch Informationen über das Proteom, Transkriptom und die Regulation zu erhalten (ecoli.aist-nara. ac.jp). Eine Sammlung von Artikeln zum Thema E. coli K12 befindet sich hier ebenfalls; über 4000 Artikel befassen sich beispielsweise mit E.-coli-Mutanten. Zum Thema Operon- oder Transkriptionsregulation finden sich allein 700 Transkriptstartpunkte im Genom von E. coli K12 (W3110). Die 1995 als Linksammlung zum Modellorganismus E. coli erstellte Webseite The E. coli Index (ecoli.bham.ac.uk) entwickelte sich zu einer umfassenden Datensammlung mit den beiden Plattformen EchoBASE (seit 1998) und coliBASE. EchoBASE befasst sich unter anderem mit der Charakterisierung neuer Gene im Genom mit dem Ziel, Funktionsvorhersagen für die ca. 1500 Genprodukte, denen bisher keine physiologische Funktion zugeordnet werden konnte, zu treffen. Dies erfolgt u. a. durch Studien des Proteoms, der Protein-Protein-Interaktion, Microarrays und in-silico-Bioinformatik. Die coliBASE dient der vergleichenden Genomanalyse nicht nur mit E. coli K12 sondern für ein Spektrum das E. coli, Salmonella und Shigella umfasst. Eine weitere Möglichkeit, Informationen zum Genom des Modellorganismus E. coli K12 in gesammelter Form zu erhalten, bietet die Justus-Liebig-Universität Gießen mit der E. coli Database Collection (ECDC, www.uni-giessen.de/~gx1052/ECDC/ecdc.htm). Diverse E.-coli-Stämme und Plasmide sind über bekannte, allgemeine Stammsammlungen erhältlich; das E. coli Genetic Stock Center der amerikanischen Yale Universität (CGSC, cgsc.biology.yale.edu) bietet zudem Derivate des nichtpathogenen Laborstammes E. coli K12, einschließlich Kombinationen von 2–29 Mutationen aus 3500 Mutationen in mehr als 1000 unterschiedlichen Loci (cgsc.biology.yale.edu/cgsc.html).

1.2 Bacillus subtilis

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1.2 Bacillus subtilis Der apathogene, ubiquitär verbreitete Heubacillus Bacillus subtilis ist ein grampositives, aerobes, Endosporen bildendes, stäbchenförmiges Bakterium (ca. 0,8 × 2–3 µm). Es ist durch peritriche Begeißelung beweglich und besitzt eine Kapsel aus Polyglutamat. Die Bildung einer zentral liegenden, stark lichtbrechenden, ovalen Endospore (Durchmesser ca. 1,2 µm) ermöglicht das Überdauern extrem ungünstiger Umweltbedingungen. Die widerstandsfähigen Sporen vermitteln Lösungsmittel-, Austrocknungs- sowie Hitze- und Strahlungsresistenz. Nach Pasteurisation können Vertreter der Gattung Bacillus somit beispielsweise aus Heuaufgüssen oder Erdproben leicht isoliert und kultiviert werden. An der strikt regulierten Sporulation ist eine Kaskade von Transkriptionsfaktoren beteiligt. Als einer der bei Prokaryoten seltenen, zeitlichen und kompartimentspezifischen Differenzierungsprozesse ist die Endosporenmorphogenese von B. subtilis ein ideales Modellsystem für das Studium dieser biologischen Grundphänomene. Zusätzlich besitzen Mitglieder der Gattung Bacillus aufgrund ihrer Fähigkeiten, eine Vielzahl von Proteinen effizient in das umgebende Medium zu sekretieren, große biotechnologische Bedeutung. Neben den sekretierten, degradativen Enzymen wie z. B. Proteasen, Amylasen und Cellulasen besitzt B. subtilis auch die Fähigkeit zur aeroben Vitamin-B12-Bildung. Sogar an der Nahrungsmittelherstellung in Japan ist B. subtilis (natto) durch Fermentation von Sojabohnen beteiligt. Seine Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten haben B. subtilis insbesondere seit der Entdeckung der natürlichen Kompetenz (Fähigkeit, aus dem umgebenden Medium DNA aufzunehmen) durch Spizizen 1958 zum intensiv genutzten Objekt genetischer und molekularbiologischer Forschung gemacht. Systematische Einteilung Domäne: Phylum: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung:

Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus

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1 Modellorganismen

Genomsteckbrief • • • • • • •

zirkuläres Genom (Bakterienchromosom, Nukleoid) Genomgröße: 4,215 Mb Anzahl der ORFs: 4221 Gesamtzahl tRNA-Gene: 88 Gesamtzahl rRNA-Gene: 30 in 10 Operons G+C -Gehalt: 43,52 % Plasmide möglich: episomale DNA, zirkulär, kovalent geschlossen

1.2.1 Historisches 1835 1872 1895 1941 1947 1958 1975 1997

erstmalige Beschreibung durch Ehrenberg als Vibrio subtilis Umbenennung durch Cohn in Bacillus subtilis Zuordnung zur Gattung Bacillus durch Fischer Medizinische Verwendung durch die deutsche Wehrmacht zur Behandlung der Ruhr Mutanteninduktion: indole requiring mutant (Burkholder und Giles) Entdeckung der natürlichen Kompetenz (Spizizen) erste zirkuläre Karte erste vollständige Sequenz eines grampositiven Bakteriums

1835 beschrieb Ehrenberg erstmals Vibrio subtilis, seine Umbenennung in Bacillus subtilis erfolgte 1872 durch einen Studenten Robert Kochs, Ferdinand Cohn. Die Zuordnung zur gleichnamigen Gattung ließ jedoch noch 23 Jahre auf sich warten und erfolgte erst 1895 durch Fischer. In arabischen Ländern war die heilende Wirkung von B. subtilis bei Diarrhön bereits seit langem bekannt. Die erste dokumentierte, medizinische Anwendung von, aus Kameldung gewonnenem, B. subtilis gegen Durchfallerkrankungen erfolgte 1941 durch die Sanitätsabteilung des deutschen Afrikakorps in Libyen. Die Induktion von Mutanten erfolgte 1947 erstmals durch Burkholder und Giles: indole requiring mutant. Seit 1958 ist die natürliche Kompetenz (Spizizen) bekannt und 1975 wurde die erste zirkuläre Karte des B.-subtilis-Genoms erstellt. Im Jahr 1997 erfolgte die Veröffentlichung der Gesamtgenomsequenz, ermittelt durch ein europäisch-japanisches Konsortium. Es war die erste Veröffentlichung des Genoms eines grampositiven Bakteriums.

1.2 Bacillus subtilis

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Pathogene B. subtilis ist ein harmloser Vertreter der Bacilli, unter denen sich nur wenige Pathogene befinden; diese sind insekten-, tier- und humanpathogen. Nur zwei, nämlich Bacillus cereus als Auslöser von Lebensmittelvergiftungen und Bacillus anthracis als Erreger des Milzbrands, besitzen medizinische Bedeutung: Insektenpathogen:

Bacillus thuringiensis (Toxinproduzent) Bacillus larvae, Bacillus popilliae, Bacillus lentimorbis Lebensmittelvergifter: Bacillus cereus Milzbranderreger: Bacillus anthracis 1.2.2 Lebenszyklus B. subtilis teilt sich in Vollmedium bei optimaler Wachstumstemperatur (toleriert werden 5–55 °C, optimal jedoch 25–37 °C) etwa alle 25 min. Die vegetative Vermehrung erfolgt durch äquale (symmetrische) Zweiteilung (Abb. 1.1.2). Bei Nährstoffmangel oder hoher Zelldichte kann es jedoch zur Sporenbildung (Abb. 1.2.1) kommen, die mit einer inäqualen (asymmetrischen) Zellteilung beginnt. Zunächst wird das Nukleoid repliziert und als Axialfilament angeordnet. Nun findet Septierung durch Ausbildung einer asymmetrisch angeordneten Membran statt, welche eine Plasmaportion mit einem vollständigen Genom von der Mutterzelle abtrennt. Diese Präspore wird von der Membran der Mutterzelle umwachsen und im Zwischenraum wird Peptidoglycan eingelagert. Eine dicke Sporenwand (Cortex, darin enthalten Dipicolinsäure und Ca 2+) mit einer umgebenden, komplexen Proteinschicht umhüllt nun die Vorspore. Die reife Endospore wird durch Lyse der Mutterzelle freigesetzt und kann viele Jahrzehnte bis zur Auslösung der Keimung überdauern. Am Prozess der Sporenbildung sind über 125 Gene beteiligt, die über das gesamte Genom verstreut sind. Zur Regulation der hochkomplexen morphologischen und biochemischen Veränderungen während der Sporulation wird der unter vegetativen Bedingungen aktive Transkriptionsfaktor ƳA (entspricht Ƴ70 in E. coli) durch eine strikt geregelte Abfolge alternativer Sigmafaktoren ersetzt. Diese Faktoren ändern jeweils die Spezifität der RNA-Polymerase für die verschiedenen Promotoren der an der Sporulation beteiligten Gene und ermöglichen so den kontinuierlichen Ablauf der Regulationskaskade.

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1 Modellorganismen

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Abb. 1.2.1. Schema der Sporulation bei Bacillus. Das Genom der Zelle repliziert und die Nukleoide organisieren sich zum Axialfilament (I). Nun wird eine Membran asymmetrisch eingezogen (II) und so eine Plasmaportion mit einem vollständigen Genom abgeschnürt (III). Die Mutterzelle umwächst die Vorspore (IV, V), bis die Spore vollständig von Cytoplasma umgeben ist und von zwei Membranen umhüllt wird (VI). In den Raum zwischen den Membranen wird Peptidoglycan eingelagert und der Cortex wird gebildet (grau dargestellt) (VII). Durch Lyse der Mutterzelle (VIII) wird die reife Spore freigesetzt (IX) und es kann nach Auskeimen und vegetativen Zyklen erneut die Sporulation eingeleitet werden (X)

1.2.3 Technische Entwicklungen Mutanten Die genetische Nomenklatur folgt den allgemeinen Konventionen, die unter Kap. 1.1.3. am Beispiel E. coli bereits erläutert wurden. Schwere DNA-Schädigungen ruft, wie für E. coli beschrieben, die SOSAntwort der B.-subtilis-Zelle hervor. Im Zuge dieser Antwort kommt es zu fehleranfälliger Reparatur und somit zur Etablierung von Mutationen (s. Kap. 1.1.3.).

1.2 Bacillus subtilis

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DNA-vermittelte Transformation Natürliche genetische Kompetenz, definiert als Fähigkeit, DNA aus dem Medium aufzunehmen und in das eigene Genom zu integrieren, ist bei Bakterien weit verbreitet und für B. subtilis seit den Untersuchungen von Spizizen (1958) bekannt (Abb. 1.2.2). In der stationären Phase (s. Kap. 1.1.2.) entwickeln ca. 10–20 % der Zellen diese Fähigkeit. Dabei gelangt zunächst die freie, hochmolekulare DNA durch den vielschichtigen Mureinsacculus an die Cytoplasmamembran, und es erfolgt die sequenzunspezifische Bindung an eine von ungefähr 50 auf jeder kompetenten B.-subtilis-Zelle lokalisierten Bindestellen. Nach Fragmentierung (13,5–18 kb) der Doppelstränge erfolgt während des Einzugs durch die Zellmembran eine Spaltung in 6–15 kb lange Einzelstränge. Die eingebrachte DNA kann nun Heteroduplexbereiche mit homologen Genomabschnitten bilden und mit diesen rekombinieren. An der Kompetenzentwicklung sind die Produkte der com-Operons maßgeblich beteiligt; so ist das integrale Membranprotein ComEA das DNA-Rezeptorprotein und ComEC bewerkstelligt den Transport.

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I

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Abb. 1.2.2. Schema der DNA-Aufnahme in B. subtilis durch natürliche Kompetenz. Zunächst wird die freie DNA sequenzunspezifisch von einem Protein der Membran (hellgrauer Zirkel) gebunden (I) und fragmentiert (II). Bei der Durchschleusung durch die Membran wird der Gegenstrang abgebaut, so dass nur Einzelstrang-DNA in die Zelle gelangt (III). Diese wird durch das Rekombinationsprotein RecA gebunden. Falls sich homologe Sequenzen auf dem Bakterienchromosom (grau dargestellt) finden, kommt es zur Ausbildung einer Heteroduplex-Region (IV). Nach erfolgtem Austausch und Replikation trägt die Zelle die veränderte Sequenz (V) und kann ihrerseits wieder das Stadium der natürlichen Kompetenz erreichen (VI)

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1 Modellorganismen

Da natürliche Kompetenz nur unter bestimmten Bedingungen ausgeprägt und die DNA wegen der Fragmentierung und Auflösung in Einzelstränge sehr instabil ist, erfolgt die Transformation von B. subtilis im Labor in der Regel mittels Elektroporation oder Protoplastentransformation (Kap. 3.1). Verfügbarkeit der Gesamtgenomsequenz Verschiedene Bacillus-Spezies sind zwar zur Konjugation und Übertragung von Fertilitätsplasmiden befähigt, die Übertragung genomischen DNA-Materials konnte jedoch noch nie beobachtet werden. Zur Erstellung physikalischer genetischer Karten wird mit Komplementation nach Transformation und Transduktion gearbeitet. Solche Genkarten sind jedoch weniger genau als die in E. coli nach der Methode der unterbrochenen Paarung ermittelten, da nur kleine Fragmente übertragen werden. Die vergleichsweise geringe Anzahl verfügbarer B.-subtilis-Mutanten erschwerte die Genomkartierung noch zusätzlich. Es verwundert daher nicht, dass erst im Jahr 1978 die Zirkularität des Genoms experimentell bestätigt wurde. Der G+C-Gehalt liegt bei 43,52 % und damit im Durchschnitt anderer Bacillus-Spezies (32 – 69 %), wobei sogar innerhalb einer Art beträchtliche Abweichungen auftreten können (B. megaterium: 36 – 45 % G+C). Die Funktion von etwa 1500 der 4221 identifizierten Gene ist bislang ungeklärt. Es gelang jedoch, 1200 dieser unbekannten Gene systematisch zu mutieren und so einen ersten Einblick in die möglichen Genfunktionen zu erhalten. Repetitive Elemente Das Genom von B. subtilis enthält als repetitive Elemente tRNA- und rRNAGene, die wie bei Bakterien üblich in Operons, d. h. transkriptionellen Einheiten, zusammengefasst sind. Die Summe der tRNA-Gene beläuft sich auf 88 und die Gesamtzahl der rRNA-Gene auf 30, was im Vergleich zu Eukaryoten wenig ist. Die rRNA-Gene sind im B.-subtilis-168-Typstamm in 10 Operons (rrnA, B, D, E, G-J, W, O) arrangiert, von denen fünf in zwei eng benachbarten Regionen als Cluster vorliegen, die anderen sind über das Genom verstreut. Sie besitzen eine bei Bakterien verbreitete Anordnung von 16S rRNA, 23S rRNA und 5S rRNA, jeweils durch intergenische Regionen (ISR, intergenic spacer region) voneinander abgesetzt (16S – ISR – 23S – ISR – 5S), was die Prozessierung zur „reifen“ rRNA nötig macht. IS-Elemente fehlen bei B. subtilis völlig, während sein Verwandter B. halodurans 115 Kopien von 16 verschiedenen IS-Elementen besitzt. B. subtilis besitzt jedoch zehn Kopien von 190 bp großen, repetitiven Elementen und

1.2 Bacillus subtilis

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zehn Prophagen oder Reste von diesen. Transposons können aber verwendet werden; so lässt sich das konjugative Transposon Tn916, welches ein breites Wirtsspektrum besitzt, von Enterococcus faecalis und Streptococcus bovis auf Bacillus subtilis und von diesem wiederum auf Lactococcus lactis übertragen. Plasmide B.-subtilis-Vertreter besitzen ebenso wie E. coli Plasmide, die sowohl nach dem Theta-, als auch nach dem rolling-circle-Mechanismus replizieren. Beispiele für rolling-circle- (RCR, rolling circle replication) Plasmide aus B. subtilis sind die pTA-Plasmide wie pTA1015 (5,8 kb) oder das pBAA1-Plasmid (6,8 kb). Da die Plasmide aus B. subtilis in der Regel kryptisch sind, wird für molekulargenetische Arbeiten auf selektierbare Plasmide anderer grampositiver Spezies, wie Staphylococcus aureus oder Streptococcus faecalis, zurückgegriffen. 1.2.4 Biologische Fragestellungen Die Sporulation ist als zellulärer Differenzierungsprozess geeignet, die Regulationskaskaden und die Signaltransduktion an einem relativ einfachen Organismus zu studieren. Koordinierte Genexpression zwischen Spore und Mutterzelle erfordert einen crosstalk dieser Kompartimente. Das Verständnis der Vorgänge mag zu Modellen führen, die über die Bakterien hinaus Bedeutung haben können. Aufgrund der hocheffizienten Sekretion von Proteinen ist B. subtilis nicht nur als Modell zum Studium einer weitgehend konservierten Sekretionsmaschinerie, sondern auch als Expressionswirt interessant. Es steht eine Palette von Vektoren zur Expression von Genen sekretierter Proteine zur Verfügung. Die Proteinisolation kann so erheblich vereinfacht, die Bildung unlöslicher Proteinaggregate (inclusion bodies) verhindert und die Expression von intrazellulär nachteilig wirkenden Proteinen ermöglicht werden. Die mit Vertretern der Bacilli produzierten Enzyme in Waschmitteln (Proteasen und Amylasen) belegen beispielhaft die biotechnologische Relevanz. Durch die „funktionelle Genomanalyse“ mit DNA-Chips auf Basis der Genomsequenz sind Transkriptom- und Proteomanalysen in B. subtilis möglich. Hierbei wird die Gesamtheit aller mRNA-Spezies oder Proteine unter bestimmten Bedingungen erforscht und ihr Zusammenspiel ermittelt.

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1 Modellorganismen

1.2.5 Genetische Ressourcen Eine der bekanntesten speziellen Genomdatenbanken für B. subtilis ist SubtiList (genolist.pasteur.fr/SubtiList/), eine Einrichtung des französischen Institut Pasteur. Diese bietet neben dem vollständigen, annotierten B.-subtilis-168-Genom auch die bisher bekannten Proteinsequenzen sowie Möglichkeiten zur text- oder sequenzbasierten Suche innerhalb der Bank. Links zu weiteren online verfügbaren Ressourcen und eine regelmäßige Aktualisierung der Daten sind hier selbstverständlich. BSORF ist die B.-subtilis-Genomdatenbank (bacillus.genome.ad.jp) des Bioinformatics Center der japanischen Universität Kyoto und des Nara Institute of Science and Technology. Neben dem vollständigen Genom bietet sie eine Zusammenstellung von B.-subtilis-Mutanten mit Referenzen, DNA-Array-Daten, sowie die Möglichkeit zur BLAST-Suche sowohl gegen die Genomsequenz als auch gegen kodierende Sequenzen. Micado, die Microbial Advanced Database Organization (genome.jouy. inra.fr/cgi-bin/micado/index.cgi) des Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Jouy-en-Josas, Frankreich (www.jouy.inra.fr/anglais/ index-en.shtml), bietet ebenfalls nicht nur Gesamtgenomsequenzen. Diverse Stoffwechselwege mit beteiligten Proteinen, eine Zusammenstellung von verschiedensten B.-subtilis-Mutanten, eine Transkript-Kollektion sowie die physikalische Karte des Genoms gehören ebenso zum Angebot. Durch Kooperation des japanischen NIG (National Institute of Genetics), des Schweizer Instituts für Bioinformatik (Genf) sowie des französischen Institut Pasteur und der Universität Lyon ist die non-redundant B. subtilis database (NRSub, pbil.univ-lyon1.fr/nrsub/nrsub.html) entstandenen. Sie enthält neben der vollständigen Genomsequenz mit funktionellen Regionen Zusatzinformationen wie die Genlokalisierung oder den Codon-Gebrauch für einzelne, proteinkodierende Gene. Zusätzlich finden sich Querverweise zu anderen Datenbanken wie SWISS-PROT (www.ebi.ac.uk/swissprot/index. html) und ENZYME (www.expasy.org/enzyme/). Eine ständige Aktualisierung der Informationen zu Promotoren oder Proteinstrukturen erfolgt ebenso wie die Sammlung aller vollständigen Genomsequenzen. Anders als beispielsweise EMBL-Einträge finden sich die Genome hier als ein kompletter „Contig“. Weitere Links zu Internetseiten, die sich mit B. subtilis befassen, sind ebenfalls vorhanden. Die B.-subtilis-Abteilung der Kyoto Encyclopedy of Genes and Genomes (KEGG) des Bioinformatics Center der Universität Kyoto, Japan (www. genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext?B.subtilis.kegg+B), bietet eine nach Stoffwechselwegen geordnete Zusammenstellung bekannter Gene inklusive ihrer

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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Protein- und Nukleotidsequenz. Zudem besteht die Möglichkeit, mit diesen Sequenzen direkt BLAST-Recherchen durchzuführen. Seit 1999 bietet die DBTBS (Database of Transcriptional Regulation in Bacillus subtilis, dbtbs.hgc.jp) des Human Genome Center (HGC) im Institut für Medical Science der Universität Tokyo eine umfassende Zusammenstellung von 633 B.-subtilis-Promotoren von 525 Genen sowie von 114 Transkriptionsfaktoren. Es können mögliche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren auf übermittelten Sequenzen identifiziert, Informationen zu regulierten Genen oder zu Regulons und Operons abgerufen werden. Bacillus-Stämme und -Plasmide sind über bekannte Stammsammlungen, in der Regel gegen eine geringe Gebühr, zu bestellen. Spezielle Bacillus-Stämme und Verwandte oder beispielsweise Tn917-Mutanten, Shuttle-Plasmide und E.-coli-Stämme mit klonierter Bacillus-DNA sind über das 1978 gegründete Bacillus Genetic Stock Center (BGSC, www.bgsc.org) erhältlich. Bestellungen durch nicht kommerzielle Anwender können hier gegen eine freiwillige Abgabe getätigt werden.

1.3 Saccharomyces cerevisiae Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der älteste biotechnologisch genutzte Eukaryot und wird seit 1970 als Modellorganismus für Molekulargenetik und Zellbiologie eingesetzt. Im Jahr 1996 wurde die Sequenz des Gesamtgenoms der Bäckerhefe veröffentlicht. Sie stellt damit den ersten Eukaryoten dar, dessen Erbinformation komplett entschlüsselt wurde. Die Bäckerhefe lässt sich als Eukaryot außerordentlich leicht kultivieren und genetisch manipulieren. Da sie sowohl aerob als auch anaerob wachsen kann, ist sie zudem sehr gut für die Mitochondrien-Genetik geeignet. Systematische Einteilung Abteilung: Klasse: Unterklasse: Ordnung: Familie: Gattung:

Mycophyta Ascomycetes Ascomycetidae Endomycetales Saccharomycetaceae Saccharomyces

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1 Modellorganismen

Genomsteckbrief • • • • • • • •

nukleäres Genom 13,5 Mb (ohne repetitive Elemente 12,1 Mb) Zahl der proteinkodierenden Gene: 5726 Zahl Intronen: 284 Zahl tRNA-Gene: 276 mitochondriales Genom 86 kb Zahl der proteinkodierenden Gene: 20 Zahl Intronen: 11 Zahl tRNA-Gene: 24

1.3.1 Historisches 6000 v. Chr. „Domestizierung“ von Hefe zum Bierbrauen, Backen und zur Weinherstellung 1680 n. Chr. Hefezellen unter dem Mikroskop (Antonie van Leeuwenhook) 1835 Alkohol-Fermentation wird mit der Hefe in Verbindung gebracht 1837 der taxonomische Name Saccharomyces cerevisiae wird kreiert 1857–1876 Korrelation der Fermentation mit dem Metabolismus von S. cerevisiae (Louis Pasteur) 1877 der Begriff Enzym (en zymē = in Hefe) wird geprägt und unterschieden von den Mikroorganismen, die Enzyme produzieren (Wilhelm Friedrich Kühne) 1880 Isolierung einer einzelnen Hefezelle (Emil Hansen) 1897 Eduard Buchner demonstriert, dass die Fermentation von Kohlenhydraten durch Enzyme aus der Hefe und nicht durch die Hefe selber geschieht 1948 erste genetische Karte der Hefe durch Carl C. Lindgren 1978 erste Transformation von S. cerevisiae durch A. Hinnen, J. B. Hicks und G. R. Fink (Hinnen et al. 1978) 1985 elektrophoretischer Karyotyp von S. cerevisiae mit Hilfe der Pulsfeld-Gelelektrophorese (Carle und Olson 1985) 1990–1994 erste pharmazeutisch relevante Produkte aus rekombinanten Hefen 1992 erste vollständige Sequenzierung eines eukaryotischen Chromosoms (Chromosom III der Bäckerhefe, Oliver et al. 1992)

1.3 Saccharomyces cerevisiae

1996

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erstes vollständig sequenziertes Genom eines Eukaryoten (Goffeau et al. 1996)

Der Begriff „Hefe“ wird umgangssprachlich meistens für die Bäcker- oder Brauhefe Saccharomyces cerevisiae genutzt. Systematisch gehören Hefen zu den Pilzen und unterscheiden sich von Hyphenpilzen dadurch, dass sie unter normalen Wachstumsbedingungen als Einzeller vorkommen. Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist einer der ältesten domestizierten Mikroorganismen und wurde schon um 6000 v. Chr. von Sumerern und Babyloniern zum Bierbrauen und von den Ägyptern zur Weinherstellung sowie zur Bereitung von Sauerteig eingesetzt. Erstmalig mikroskopisch untersucht wurde S. cerevisiae von dem Niederländer Antonie van Leuwenhook. Im Jahr 1680 sandte er die Beschreibungen seiner Beobachtungen und Zeichnungen von Hefezellen an die Royal Society in London. Im 19. Jahrhundert trug die Hefe S. cerevisiae wesentlich zum Verständnis biochemischer Prozesse in lebenden Zellen bei. Charles Cagniard-Latour beobachtete 1837 zunächst, dass Bierhefe aus runden Körpern besteht, die sich vermehren können. Der deutsche Zellbiologe Theodor Schwann nannte diese Zellen Zuckerpilze und Friedrich Kutzing kreierte daraus den griech./lat. Namen Saccharomyces. Etwa zur gleichen Zeit entbrannte ein wissenschaftlicher Disput darüber, ob die Fermentation von Zucker zu Alkohol und CO2 eher auf eine chemische Reaktion oder auf die Aktivität von lebenden Organismen zurückzuführen sei. Louis Pasteur konnte durch seine Arbeiten (1857–1876) zeigen, dass die Fermentation von Zucker eindeutig mit Stoffwechselprozessen der lebenden Hefezellen korreliert ist. Im Jahr 1877 wurde von Wilhelm Friedrich Kühne der Begriff Enzym (en zymē = in Hefe) eingeführt, um auszudrücken, dass Zucker fermentierende Komponenten aus der Hefe stammen. Denn diese isolierten Produkte können die Fermentation ohne die lebende Zelle durchführen. Von dem Dänen Emil Christian Hansen wurden 1880 erstmalig einzelne Hefezellen isoliert und diese als Stammkultur für das Bierbrauen eingesetzt. Der Genetiker Carl Lindegren beschrieb 1949 das Kreuzungs-System und die erste genetische Karte der Bäckerhefe. Um 1970 wurde S. cerevisiae schließlich als Experimentalsystem für die molekularbiologische Forschung entdeckt. Die erste Transformation von S. cerevisiae, d. h. das Einbringen von fremder DNA, gelang Hinnen und Kollegen (Hinnen et al. 1978) mit der Insertion des LEU2-Gens in das chromosomale Genom der Hefe. Die Möglichkeit, die Hefe gentechnisch zu verändern, wurde bereits ab 1983 dazu genutzt, pharmakologisch relevante Proteine in der Bäckerhefe zu produzieren. Bereits im Jahr 1990

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1 Modellorganismen

wurde z. B. ein heterolog in S. cerevisiae hergestelltes Hepatitis-B-Antigen zur Immunisierung eingesetzt. Mit Hilfe der Pulsfeldgelelektrophorese gelang es 1985 Carle und Olson, die 16 Chromosomen der Hefe in einem Gel aufzutrennen. Damit konnte die DNA einzelner Chromosomen isoliert und kloniert werden. Sieben Jahre später wurde mit dem 316.613 bp langen Chromosom III die erste vollständige Sequenz eines eukaryotischen Chromosoms veröffentlicht (Oliver et al. 1992). Kurze Zeit später war bereits das Genom von S. cerevisiae komplett sequenziert und wurde 1996 als erstes eukaryotisches Gesamtgenom publiziert (Goffeau et al. 1996). 1.3.2 Lebenszyklus Die Bäckerhefe S. cerevisiae kommt in der freien Natur vorwiegend als diploide Einzelzelle vor. Unter günstigen Wachstumsbedingungen vermehrt sie sich vegetativ durch Knospung. Dabei stülpt sich eine Mutterzelle blasenartig aus. Die zunächst kleine Knospe wächst bis zur Größe der Mutterzelle heran. Gleichzeitig teilt sich der Zellkern durch eine Endomitose, d. h. die Kernmembran wird nicht aufgelöst und einer der Zellkerne wandert gemeinsam mit einem Teil der Zellorganellen in die Tochterzelle. Diese schnürt sich danach vollständig von der Mutterzelle ab (Abb. 1.3.1). Nach jeder Knospung bleibt auf der Zellwand der Mutterzelle eine „Geburtsnarbe“ zurück. Die Anzahl der Narben gibt Aufschluss darüber, wie oft sich eine Zelle geteilt hat. Nach ca. 30 Knospungsereignissen ist eine Zelle von Narben übersät und kann sich nicht mehr teilen. Bei Nährstoffmangel geht die diploide Zelle in den sexuellen Zyklus über und durchläuft die Meiose. Die Produkte der Meiose, vier runde haploide Sporen (Ascosporen), befinden sich in einem Sporangium, dem Ascus. Die vier Produkte der Meiose werden im Ascus zusammengehalten. Man nennt die vier Ascosporen deshalb auch Tetrade. Die Ascosporen einer Tetrade unterscheiden sich in ihrem Kreuzungstyp. Zwei Sporen eines Ascus besitzen den Kreuzungstyp ơ und zwei den Kreuzungstyp a. Nach dem Zerfall des Ascus entsteht aus jeder Spore eine haploide Zelle. Im Regelfall fusionieren diese Zellen unmittelbar nach Verlassen des Ascus wieder paarweise miteinander, wobei eine a-Zelle immer nur mit einer ơ-Zelle fusionieren kann und umgekehrt. Eine Fusion von zwei a-Zellen oder zwei ơ-Zellen ist dagegen nicht möglich. Die Erkennung des entsprechenden Kreuzungspartners wird über ein Pheromon-Rezeptorsystem gesteuert. Finden zwei Zellen einen Partner mit entgegengesetztem Kreuzungstyp wird der Zellzyklus in der G1-Phase arretiert und beide Zellen bilden eine Ausstülpung aus, einen „shmoo“ (benannt

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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G2

M

S

haploider (1n) vegetativer Zyklus a

G1 α

Ascus mit Ascosporen

sexueller Zyklus

Befruchtung

Meiose G1

Karyogamie α/a S

diploider (2n) vegetativer Zyklus M G2

Abb. 1.3.1. Lebenszyklus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. M Mitose, S SPhase des Zellzyklus, G1 G1-Phase des Zellzyklus, G2 G2-Phase des Zellzyklus

nach einem kleinen, rundlichen Fabelwesen, das der Comiczeichner Al Capp 1948 geschaffen hat). Nach der Fusion der Zellen kommt es direkt zur Karyogamie und die entstehende diploide ơ/a-Zelle vermehrt sich vegetativ durch Knospung, solange der Nährstoffgehalt ausreichend ist. Im Labor können Hefezellen auch als haploide Kulturen vermehrt werden. Dazu isoliert man mit Hilfe eines Mikromanipulators die haploiden Sporen direkt aus dem Ascus. Haploide Zellen können sich wie diploide Hefezellen bei ausreichendem Nährstoffangebot vegetativ durch Knospung vermehren

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1 Modellorganismen

Tabelle 1.3.1. Unterschiede zwischen haploiden und diploiden Zellen Merkmal Größe Volumen Gesamtgewicht Trockengewicht DNA RNA Protein

[µm] [µm3] [10 –12g] [10 –12g] [10 –12g] [10 –12g] [10 –12g]

Haploide Zelle ∅4 70 60 15 0,017 1,2 6,0

Diploide Zelle 5×6 120 80 20 0,034 1,7 8,0

(Abb. 1.3.1). Eine haploide Zelle unterscheidet sich von der diploiden Zelle durch ihre Größe, ihr Gewicht, das Zellvolumen und den Gehalt an Nukleinsäuren und Proteinen (Tabelle 1.3.1). Diploide Zellen sind Rotationsellipsoide, während haploide Zellen nahezu rund sind. Ein haploider Laborstamm hat bei 30 °C in Vollmedium (YPD) eine Verdopplungszeit von ca. 90 min, in synthetischem Medium (SD) jedoch von ca. 140 min. In Vollmedium erreichen die Zellen eine maximale Dichte von 2 ⋅ 108 Zellen / mL. Unter optimierten Bedingungen, d. h. geregeltem pH-Wert und kontinuierlicher Zugabe von Nährstoffen, kann sogar eine Dichte von 2 ⋅ 109 Zellen / mL erreicht werden. 1.3.3 Technische Entwicklungen Aufgrund vieler technischer Fortschritte hat sich die Bäckerhefe im Laufe der letzten 40 Jahre zu einem äußerst flexiblen System für die Analyse molekularbiologischer Fragestellungen in eukaryotischen Zellen entwickelt. Tetradenanalyse Die Bäckerhefe stellt ein bevorzugtes Objekt der Formalgenetik dar, da sie sowohl in der haploiden, als auch in der diploiden Phase im Labor kultiviert werden kann. Zudem werden die vier Produkte der Meiose (Tetrade) im Ascus zusammengehalten und können leicht analysiert werden. Wie bei vielen anderen Mikroben, ist eine kostengünstige Anzucht in der Lage, eine große Zahl von Zellen für die Untersuchungen bereitzustellen. Dies erhöht die statistische Genauigkeit genetischer Experimente, und es können auch seltene Ereignisse noch festgestellt werden. Bei einer Kreuzung bringt man haploide Zellen eines ơ-Stammes mit haploiden Zellen eines a-Stammes auf einer Platte mit Vollmedium in Kontakt.

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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Bereits nach wenigen Stunden entstehen diploide Zygoten, die sich sofort vegetativ durch Knospung vermehren. Überführt man die diploiden ơ/a-Zellen auf Sporulationsmedium, das keinen Stickstoff und als nicht fermentierbare Kohlenstoffquelle Acetat enthält, bilden sich nach ein bis drei Tagen Asci mit je vier Ascosporen aus. Durch Inkubation der Asci mit Zymolyase, einem Enzym, das die Wand der Asci andaut, können die Ascosporen mit Hilfe eines Mikromanipulators isoliert und vereinzelt werden. Bei einem Mikromanipulator handelt es sich um ein Mikroskop, das eine Vorrichtung für eine fein ausgezogene Glasnadel besitzt, die mit Hilfe eines Joysticks µmgenau zu bewegen ist. Meist ist der Mikromanipulator so ausgestattet, dass eine mit dem Boden nach oben liegende Petrischale direkt auf dem Kreuztisch eingespannt werden kann. Man kann durch das Medium hindurch sehen und mit der von unten an das Medium herangeführten Nadel die Ascosporen auf dem Medium unter mikroskopischer Beobachtung bewegen.

Der Ascus von S. cerevisiae ist eine ungeordnete Tetrade. Dies bedeutet, dass die Produkte der Meiose zwar zusammen bleiben, die Reihenfolge ihrer Entstehung aber nicht nachvollzogen werden kann (vgl. geordnete Tetrade bei Neurospora crassa und Sordaria macrospora). Die Tetradenanalyse ermöglicht die direkte Analyse einer einzelnen Meiose. Sie wurde traditionell zur Genkartierung genutzt, d. h. um die Kopplung von Genen auf einem Chromosom und die Abstände von Genen auf einem Chromosom zu bestimmen. Obwohl solche Analysen nach Aufklärung der Genomsequenz nicht mehr benötigt werden, wird die Tetradenanalyse heute noch für unterschiedliche Zwecke eingesetzt. Beispielsweise ermöglicht sie den Nachweis, inwieweit eine Mutation einen oder mehrere Genorte betrifft oder aber zu einem letalen Phänotyp führt. Durch Kreuzung und anschließende Tetradenanalyse können Stämme konstruiert werden, die Merkmalskombinationen beider Elternstämme aufweisen. In der Praxis besteht z. B. oft das Problem, einen interessanten Gendefekt mit einem Auxotrophiemarker für Transformationsexperimente zu verknüpfen. Mit einer Komplementationsanalyse wird durch Kreuzung gegen Markerstämme oder andere erzeugte Mutanten überprüft, ob beide Mutanten die Mutation im selben oder in verschiedenen Genen tragen. Indem zwei Mutantenstämme gekreuzt werden, können auf einfache Weise Doppelmutanten erzeugt werden. Der Phänotyp solcher Doppelmutanten gibt Aufschluss darüber, inwieweit sich Mutationen in einzelnen Genen gegenseitig beeinflussen. Addieren sich die Phänotypen beider Einzelmutanten zum Phänotyp der Doppelmutante, wirken beide Mutationen wahrscheinlich unabhängig voneinander. Entspricht jedoch der Phänotyp der Doppelmutante dem einer der Einzelmutanten, ist

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1 Modellorganismen

davon auszugehen, dass ein Gen die Wirkung eines anderen beeinflusst. In diesem Fall spricht man von Epistasie. Mutanten Die Bäckerhefe S. cerevisiae wird häufig dazu genutzt, Gene mit Hilfe von Mutagenese zu identifizieren oder zu analysieren. Mutationen an bestimmten Genorten resultieren in einem Verlust einer Zellfunktion (loss of function) oder in einem Zugewinn neuer Eigenschaften (gain of function) und lassen so Rückschlüsse auf die Funktion des durch die Mutation betroffenen Gens zu. Ein Vorteil der Bäckerhefe gegenüber anderen Eukaryoten besteht darin, dass heterothallische Stämme der Bäckerhefe im Labor sowohl in der haploiden, als auch in der diploiden Phase stabil kultiviert werden können. Dies erleichtert in vielen Fällen die Analyse der Mutation. Andere Pilze wie Neurospora crassa oder die Alge Chlamydomonas sind obligate Haplonten, während Tiere obligate Diplonten sind und höhere Pflanzen die überwiegende Zeit in ihrer Entwicklung diploid sind und nur eine kurze haploide Phase haben. Bei Diplonten müssen mindestens zwei Generationen abgewartet werden, bis der Phänotyp, der von einer homozygot rezessiven Mutation stammt, sichtbar wird. In Haplonten werden die Auswirkungen von rezessiven Mutationen dagegen direkt sichtbar. Ein Vorteil von diploiden Zellen ist dagegen, dass hier letale rezessive Mutationen analysiert werden können. Genetische Nomenklatur Eine Zusammenstellung der genetischen Nomenklatur für S. cerevisiae ist in Tabelle 1.3.2 wiedergegeben. Jedes Gen, jedes Allel oder jeder Locus wird nach Möglichkeit durch drei Buchstaben und eine Zahl beschrieben. Ein dominantes Allel wird durch kursiv geschriebene Großbuchstaben symbolisiert (z. B. HIS3) und steht für einen bestimmten Genort, der z. B. für ein bestimmtes Protein (Imidazol-Glycerinphosphat-Dehydrogenase) kodiert. Ein rezessives Allel dieses Genortes ist durch kursiv geschriebene Kleinbuchstaben gekennzeichnet (z. B. der Auxotrophiemarker his3). Wildtyp-Allele werden mit einem hochgestellten „plus“ symbolisiert (z. B. HIS3 +). Allele dieses Genortes werden durch einen Bindestrich und eine weitere Zahl beschrieben (z. B. bezeichnen his3-1 und his3-2 unterschiedliche Mutationen im selben Gen). Gene, die eine Resistenz oder eine Sensitivität vermitteln, werden durch ein hochgestelltes R bzw. S gekennzeichnet (CANS bezeichnet Sensitivität gegenüber dem toxischen Arginin-Analogon Canavanin, CANR Resistenz gegenüber Canavanin).

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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Tabelle 1.3.2. Genetische Nomenklatur bei der Bäckerhefe S. cerevisiae am Beispiel das HIS3-Gens Symbol His + His – HIS + HIS3 His3p his3 his3 – HIS3 + his3-1 his3-ƅ1 HIS3::LEU2 his3::LEU2 cyc1-his3 Pcyc1-HIS3

Definition ein Stamm, der Histidin-prototroph ist ein Stamm, der Histidin-auxotroph ist alle Wildtyp-Allele, die Histidinbedürftigkeit regulieren ein Genort oder ein dominantes Allel Protein, das vom HIS3-Gen kodiert wird ein Locus oder rezessives Allel, das Histidinbedürftigkeit vermittelt irgendein his3-Allel, das zu Histidinbedürftigkeit führt Wildtyp-Allel spezifisches Allel eine spezifische partielle oder komplette Deletion des HIS3-Gens Insertion eines funktionellen LEU2-Gens am HIS3-Locus, das HIS3-Gen bleibt dominant und funktionell Insertion eines funktionellen LEU2-Gens am HIS3-Locus, das HIS3-Gen verliert seine Funktion eine Fusion des CYC1-Gens mit dem HIS3-Gen, wodurch beide Gene ihre Funktion verlieren eine Fusion zwischen dem Promotor des CYC1-Gens und dem HIS3-Gen, das HIS3-Gen ist funktionell

Mutagenese Um eine Mutation mit erkennbarem Phänotyp zu entdecken, wird eine haploide Kultur physikalisch (z. B. durch UV-Strahlung) oder chemisch (z. B. durch Ethylmethansulfonat, EMS) mutagenisiert. Diese Mutagene sind sehr effizient und induzieren Mutationen mit einer Rate von 5 ⋅ 10 –4 – 1 ⋅ 10 –2 pro Gen ohne die Zellen nachhaltig zu schädigen. Wenn beispielsweise ein Gen aus dem Histidinbiosyntheseweg identifiziert werden soll, wird eine Kultur haploider Zellen mutagenisiert und auf einem Vollmedium ausplattiert. Nach der Mutagenese bilden überlebende Zellen auf diesem Medium Kolonien. Die Zellen werden durch Replika-Plattierung auf ein Minimal-Medium transferiert, das kein Histidin enthält. Kolonien, die eine Mutation in einem Gen besitzen, das essentiell für die Histidin-Biosynthese ist, können auf diesem Medium nicht wachsen. Durch Vergleich des Koloniewachstums auf der Platte mit Vollmedium und der Platte mit Minimalmedium können Histidin-auxotrophe Kolonien identifiziert und anschließend weiteren Analysen unterzogen werden.

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1 Modellorganismen

Neben der Selektion auf Auxotrophien existieren bei der Bäckerhefe zahlreiche andere Selektionsverfahren, mit denen bestimmte Phänotypen identifiziert werden können. Zum Beispiel weisen konditionale Mutanten unter permissiven Bedingungen einen Wildtyp-Phänotyp auf und bilden erst unter restriktiven Umweltbedingungen den Mutanten-Phänotyp aus. Häufig handelt es sich bei konditionalen Mutanten um temperatursensitive Mutanten, die ein geringes Koloniewachstum bei hohen Temperaturen zeigen, bei niedrigen Temperaturen jedoch wie der Wildtyp wachsen. Konditionale Allele eignen sich somit hervorragend dazu, essentielle Gene zu isolieren und zu analysieren. Mitochondriale Mutationen Die Bäckerhefe S. cerevisiae eignet sich in besonderem Maße zur Aufklärung von Mutation im Mitochrondrien-Genom. Denn S. cerevisiae ist in der Lage, trotz atmungsdefekter Mitochondrien mit Hilfe der Gärung weiter zu leben. Da solche Mutanten ihre Energie ausschließlich durch Gärung gewinnen können, bilden sie im Gegensatz zum Wildtyp auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen nur kleine Kolonien, sogenannte „petite“ (franz. petit = klein) Kolonien aus. Auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen können petite-Mutanten nicht wachsen. Bei petite-Mutanten kann man drei verschiedene Vererbungsmuster unterscheiden. Bei dem ersten Typ handelt es sich um Segregations-petites, da nach Kreuzung mit einem Wildtyp-Stamm die Hälfte der Ascosporen den petite-Phänotyp und die andere Hälfte den Wildtyp-Phänotyp aufweisen. Ein Segregationsmuster von 2:2 ist charakteristisch für eine chromosomale Mutation und weist auf eine Mutation im Zellkern hin. Solche nukleären Mutationen werden durch Abkürzung pet symbolisiert. Extrachromosomale petite-Mutationen verändern dagegen die mitochondriale DNA und werden nicht nach den mendelschen Regeln vererbt. Entweder tritt nach Kreuzung mit dem Wildtyp der Atmungsdefekt in den Nachkommen nicht mehr auf (neutrale petite-Mutanten) oder in der Nachkommenschaft finden sich Ascosporen, die zu großen oder zu kleinen Kolonien auswachsen. Das Verhältnis von kleinen zu großen Kolonien ist dabei variabel und von Stamm zu Stamm verschieden (suppressive petite-Mutanten). Molekularbiologische Untersuchungen ergaben, dass extrachromosomale petite-Mutanten kleinere und große Deletionen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) aufweisen. Solche Mutanten werden auch als rho – -Mutanten bezeichnet. Petite-Mutanten, die Mitochondrien ohne mtDNA besitzen, nennt man rho0 -Mutanten. Mitochondrien-Mutanten, die nur Punktmutationen in einzelnen mitochondrialen Genen aufweisen, werden als mit– -Mutanten bezeichnet. Auch solche Mutationen führen zu Defekten in der Atmungskette oder der oxidativen Phosphorylierung.

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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Neben den atmungsdefekten petite-Mutanten gibt es eine weitere große Klasse von Hefemutanten, die als antR-Mutanten bezeichnet werden und resistent gegen Antibiotika wie Chloramphenicol (capR ), Erythromycin (eryR ), Paramomycin (parR) und Oligomycin (oliR ) sind. DNA-vermittelte Transformation Die Transformation einer Hefezelle bedeutet die Einführung von exogen zugeführter DNA in die Zelle und die stabile Vererbung und Expression der eingeführten Gene. Um die erfolgreiche Aufnahme von DNA nachzuweisen, bedarf es geeigneter Selektionssysteme. In der Regel besteht dieses System bei der Bäckerhefe in der Komplementation von genetischen Defekten der Wirtszelle. Als Selektionsmarker haben sich Gene des Aminosäure- oder des Purin- bzw. des Pyrimidinstoffwechsels durchgesetzt. Solche Gene können entsprechende auxotrophe Wirtsstämme funktionell komplementieren, in dem sie der Zelle Prototrophie verleihen (Tabelle 1.3.3). Jedes Hefegen, für das eine Mutation bekannt ist, kann im Prinzip als Selektionsmarker in einem Transformationsexperiment verwendet werden. In einigen Fällen werden aber auch Vektoren eingesetzt, die eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum oder einer toxischen Verbindung vermitteln (Tabelle 1.3.4). Es können nicht nur zirkuläre Vektoren in Hefe transformiert werden, sondern auch lineare DNA. Zirkuläre Vektoren enthalten in der Regel einen hefespezifischen Replikationsursprung (Kap. 3.2), damit sie in der Hefezelle vermehrt werden können. Lineare DNA integriert dagegen in das Genom, Tabelle 1.3.3. In S. cerevisiae selektierbare Marker Gen LEU2 HIS3 HIS1 LYS2 TRP1 TRP5 ARG4 ADE1 ADE2 URA3 HOM3

Enzym Ƣ-Isopropylmalat-Dehydrogenase Imidazol-Glycerinphosphat-Dehydrogenase ATP-Phosphoribosyltransferase ơ-Aminoadipatreduktase N-(5’Phosphoribosyl)-Anthralinat-Isomerase Tryptophan-Synthetase Argininosuccinat-Lyase Phosphoribosylamino-Imidazol-Succinocarbozamid-Synthetase Phosphoribosylamino-Imidazol-Carboxylase Orotidin-5’-Phosphat-Decarboxylase Aspartat-Kinase

Selektion Leucin Histidin Histidin Lysin Tryptophan Tryptophan Arginin Adenin Adenin Uracil Methionin und Threonin

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1 Modellorganismen

wenn sie Sequenzen enthält, die zu entsprechenden Abschnitten im Hefegenom homolog sind. Die durch homologe Rekombination eingefügte DNA ist fest in einem Chromosom verankert und wird mit diesem mitotisch und meiotisch stabil vererbt. Über die Wahl der homologen DNA ist ein gezielter Einbau linearer DNA möglich. Bei der linearen DNA kann es sich um einen linearisierten Vektor, PCR-Fragmente oder sogar Oligonukleotide handeln. Bereits ca. 20 bp an homologer Sequenz reichen aus, um ein Genkonstrukt mit mehr als 95 % Genauigkeit an seinen Zielort zu bringen. Dies ist eine hervorragende Eigenschaft der Bäckerhefe, deren Rekombinationssystem einen gerichteten Einbau von homologen Sequenzen ermöglicht. Bei anderen eukaryotischen Modellorganismen, wie dem Hyphenpilz Neurospora crassa, der Alge Chlamydomonas reinhardtii oder der höheren Pflanze Arabidopsis thaliana, ist homologe Rekombination weit weniger effizient und ein gezielter Einbau homologer DNA gelingt eher selten. Hauptsächlich werden vier Methoden eingesetzt, um S. cerevisiae zu transformieren: die Sphaeroplastierungsmethode, die Lithium-Acetat-Methode, die Gefrier-Methode und die Elektroporation (Kap. 3.2). Die Mitochondrien von S. cerevisiae können mit Hilfe der Partikelkanone transformiert werden (Kap. 3.4).

Tabelle 1.3.4. Dominante Selektionsmarken für S. cerevisiae Gen

Resistenz gegen

Genprodukt

CUP1

Kupfer

Metallothionin

CAN1

Sensitivität gegenüber Arginin-Permease Canavanin, bei Mutation Resistenz Gentamycin-Derivat Aminogylcosid-Phosphotransferase Kanamycin Neomycin-Phosphotransferase

G418 KanR HygR

Hygromycin

CmR

Chloramphenicol

HerkunftsOrganismus CUP1-Gen aus S. cerevisiae CAN1-Gen aus S. cerevisiae

Transposon Tn601 aus E. coli nptII-Gen aus dem Transposon Tn5 von E. coli Hygromycin-Phospho- hph-Gen aus E. coli transferase ChloramphenicolTranposon Tn9 aus Acetyltransferase E. coli

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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Verfügbarkeit der Gesamtgenomsequenz Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist der erste Eukaryot, dessen gesamtes Genom sequenziert wurde. Seit dem Jahr 1996 steht die Sequenz zur Verfügung. Das 13,5 Mb-Genom von S. cerevisiae ist auf 16 Chromosomen verteilt. Die Chromosomen haben eine Größe von 230 kb – 2200 kb. Damit ist das Genom von S. cerevisiae ungefähr dreimal so groß wie das von E. coli und dreimal so klein wie das des Hyphenpilzes N. crassa. Die chromosomale DNA enthält offene Leserahmen (open reading frames = ORFs), die für rund 5700 Proteine kodieren. Davon sind ca. 5500 ORFs für Proteine mit mehr als 100 Aminosäuren und knapp 200 offene Leserahmen, die für kleine Proteine mit weniger als 100 Aminosäuren kodieren. Ein durchschnittlicher ORF der Bäckerhefe ist 1450 bp lang. Interessanterweise sind nur weniger als 5 % der ORFs durch Intronen unterbrochen. Von der Gesamtzahl der Gene und der Genomgröße kann darauf geschlossen werden, dass alle 2000 bp ein neues Gen beginnt. Dies lässt wenig Raum für intergenische Bereiche und im Vergleich zu höheren Eukaryoten liegt mit 70 % kodierender Region eine sehr hohe Gendichte vor. Etwa 2/3 der ORFs entsprechen schon bekannten Hefegenen oder haben starke Sequenzähnlichkeiten zu Genen anderer Organismen. Damit ist bei ca. 1/3 der Gene die Funktion unbekannt. Internationale Projekte haben sich deshalb die Aufgabe gestellt, jedem identifizierten Leserahmen eine Funktion zuzuordnen (functional genomics; s. u.). Dazu werden durch homologe Rekombination alle bekannten Gene einzeln durch die Insertion eines Markergens an homologer Stelle im Genom ausgeschaltet. Mit Hilfe eines solcher gene replacements sollen Funktionen aller Hefegene systematisch untersucht werden. Es stellte sich heraus, dass nur ca. 15 % aller Gene der Bäckerhefe essentiell, d. h. für das Überleben im Labor notwendig sind. Im Allgemeinen werden solche Genzerstörungen an diploiden Zellen vorgenommen, der gezielte Einbau des Genkonstruktes findet normalerweise nur auf einem Chromosom statt. Lässt man die Hefe sporulieren, besitzen zwei der vier Ascosporen das zerstörte Gen, die anderen beiden nicht. Wenn ein Gen essentiell ist, werden nur zwei Sporen auskeimen. Ist das zerstörte Gen nicht essentiell, keimen dagegen alle vier Sporen aus. Eine geringe Beeinträchtigung durch das Fehlen des Gens zeigt sich in einer geringeren Größe der Sporenkolonie (Abb. 1.3.2). Repetitive Sequenzen Repetitive Sequenzen sind bei der Bäckerhefe selten. Auf dem Chromosom XII findet man etwa 100 Kopien des rRNA-Operons, das für die 28S rRNA, die 5,8S rRNA und die 18S rRNA kodiert. Daneben existieren noch 276 tRNAGene. Diese Gene sind über das gesamte Genom verstreut und liegen, bis auf

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1 Modellorganismen Paar homologer Chromosomen

URA3

MLG1 MLG1

Doppel-Crossing-over mlg1::URA3 URA3

MLG1

Sporulation Ascus mit Sporen

Tetradenanalyse

a

b

MLG1 nicht essentiell

c

MLG1 essentiell MLG1 nicht essentiell, jedoch Beeinträchtigung des Wachstums

Abb. 1.3.2 Homologe Rekombination und gezielte Genzerstörung am Beispiel des Gens MLG1 (Mein-Lieblings-Gen 1). Nach Transformation eines linearen Fragmentes integriert dieses homolog in eines der beiden homologen Chromosomen. Nach Sporulation und Tetradenanalyse können Rückschlüsse auf die Funktion des Gens gezogen werden. Das Gen ist entweder nicht essentiell (a) oder es hat nur geringe Auswirkungen auf das Wachstum (b) oder es ist essentiell (c)

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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vier co-transkribierte tRNA-Gene, als einzelne Transkriptionseinheiten vor. Daneben kommen als repetitive Elemente Transposonen im Hefegenom vor. Bei den Ty (transposon yeast)-Elementen handelt es sich um Retrotransposonen, die Ähnlichkeiten mit Retroviren und Retrotransposonen aus Pflanzen und Tieren aufweisen. Es existieren insgesamt 52 Kopien der Ty-Elemente, die sich auf fünf verschiedene Ty-Elemente (Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 und Ty5) aufteilen. Am häufigsten kommen das Ty1- (32-mal) und das Ty2-Element (13mal) vor. Verteilt auf die 16 Chromosomen der Bäckerhefe findet man ca. 750 ARS-Elemente. Als ARS (autonomously replicating sequence) werden bei der Hefe S. cerevisiae DNA-Sequenzen bezeichnet, die als Replikationsursprung der DNA-Verdopplung dienen. Das 2µm-Plasmid Neben der chromosomalen DNA findet man im Zellkern der meisten Laborstämme und in 80 % aller Wildisolate von S. cerevisiae etwa 50–100 Kopien eines zirkulären Plasmids, das wegen seiner Größe als 2µm-Plasmid bezeichnet wird. In diploiden Zellen macht die 2µm-DNA rund 2,5 % der Gesamtmenge der DNA aus. Die biologische Funktion des 2µm-Plasmids ist nicht bekannt, denn plasmidfreie (cir0 -Stämme) und plasmidhaltige (cir + -Stämme) Hefestämme sind phänotypisch nicht unterscheidbar. Bei dem 2µm-Plasmid handelt es sich um ein 6318 bp langes, doppelsträngies DNA-Molekül, das als autonom replizierendes Element neben vier ORFs auch einen Ursprungsort der DNA-Replikation, einen ARS-Bereich, enthält (Abb. 1.3.3). Jedes Plasmid wird nur ein einziges Mal während des Zellzyklus repliziert. Die Genprodukte der Gene REP1, REP2 und RAF sind an der Aufteilung der 2µm-DNA während der Zellteilung und an der Regulation der Kopienzahl beteiligt. Die STB-Region ist für die Weitergabe des Plasmids während der Kernteilung essentiell, da das Plasmid über diese Region durch die Proteine Rep1p und Rep2p mit der Kernmatrix verbunden ist. Das FLP-Gen kodiert eine sequenzspezifische Rekombinase (FLP), die der inter- und intramolekularen Rekombination der 2µm-DNA dient. Sie induziert eine Rekombination an den FRT-Sequenzen, die in den IR-Bereichen liegen (vgl. Kap. 2.6.3). Eine intramolekulare Rekombination findet jeweils über die invers repetitiven Sequenzen (IR-Bereiche) der 2µm-DNA statt. Dabei kommt es zu einer Umordnung der einzelnen Gene. Die 2µm-DNA kann in zwei Konformationen vorliegen, die als A- und B-Form bezeichnet werden. Das mitochondriale Genom Neben dem Zellkern besitzen auch Mitochondrien DNA. Die mitochondriale DNA (mtDNA) macht ca. 15 % der Gesamtmenge der DNA einer Hefezelle

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1 Modellorganismen EcoRI 1 HindIII 105 XbaI 703

FLP IR2

AvaI 4764

2µm-DNA A-Form

REP2

HindIII 1017

REP1

6318 bp PvuI 1755

IR1 RAF ARS XbaI 3945

HindIII 2331 EcoRI 2407

STB AvaI 3258

HpaI 2964

PstI 2652 PvuI 2729

Abb. 1.3.3. Physikalische Karte des 2µm-Plasmids der Bäckerhefe in der A-Form. Dargestellt sind die vier Gene des Plasmids (FLB, RAF, REP1 und REP2), der ARSund der STB-Bereich sowie die invers repetitiven Sequenzen (IR1 und IR2)

aus. Es wird geschätzt, dass ca. 50 Kopien der mtDNA pro Organell vorliegen. Hefemitochondrien sind dynamische Organellen, deren Größe, Form und Anzahl abhängig von den Wachstumsbedingungen ist. Unter aeroben Bedingungen sind die Mitochondrien zahlreich und weisen eine typische Innenstruktur mit einer vielfach eingestülpten Innenmembran auf. Unter anaeroben Bedingungen liegen die Mitochondrien in geringer Anzahl und relativ unstrukturiert als Promitochondrien vor. In der mtDNA sind wesentliche Informationen gespeichert, die zum Aufbau und zur Funktion der Mitochondrien notwendig sind. Die Bäckerhefe besitzt eine ringförmige mtDNA von 86 kb Länge, die für insgesamt 20 Proteine kodiert. Unter diesen befinden sich Untereinheiten für die Cytochrom-Oxidase, Cytochrom b, 6 Untereinheiten der NADH-Dehydrogenase,

1.3 Saccharomyces cerevisiae

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ATPase-Untereinheiten und Spleißfaktoren. Daneben enthält sie die genetische Information für rRNAs (16S rRNA und 23S rRNA) sowie für 24 tRNAs. Es wird vermutet, dass neben der tRNA Lys ca. 400 Proteine, die von der chromosomalen DNA kodiert werden und im Cytoplasma synthetisiert werden, in die Mitochondrien transportiert werden. Die importierten Proteine fügen sich hier mit den mtDNA-kodierten Proteinen zu funktionsfähigen Komplexen zusammen. Bei der Hefe S. cerevisiae werden nach erfolgter Kreuzung von aund ơ-Zellen die Mitochondrien beider Partner auf die Zygote übertragen. Es kann auch zur Fusion von Mitochondrien beider Eltern kommen und genetisch verschiedene mtDNA-Moleküle können miteinander rekombinieren. 1.3.4 Biologische Fragestellungen Die Bäckerhefe wird in vielen Fällen ähnlich dem Bakterium E. coli als Werkzeug der Molekulargenetik eingesetzt. So werden künstliche Hefechromosomen (YACs, yeast artificial chromosomes, Kap. 3.2) als Klonierungsvektoren für die Isolierung und Kartierung großer Genomfragmente bei Genomsequenzierprojekten verwendet. Wenn bakterielle Expressionssysteme z. B. wegen des Fehlens der eukaryotischen posttranskriptionellen Modifikation nachteilig sind, wird S. cerevisiae auch für die Expression eukaryotischer Gene benutzt (Kap. 7.2). Schließlich bieten die HYBRID-Systeme der Bäckerhefe die Möglichkeit, Protein-Protein-, DNA-Protein und RNA-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu analysieren (Kap. 6.1). Während der Evolution vom Einzeller zum Mehrzeller sind viele Grundmechanismen der eukaryotischen Zelle erhalten geblieben, und aufgrund der langjährigen Erfahrung in der Hefegenetik und der leichten Manipulierbarkeit wurden und werden eine Vielzahl von Lebensprozessen der eukaryotischen Zelle in der Bäckerhefe S. cerevisiae eingehend untersucht. Diese betreffen Fragestellungen zur Regulation der eukaryotischen Genexpression, der Regulation des vegetativen Zellzyklus oder der Meiose sowie Mechanismen der Signaltransduktion. Darüber hinaus werden an der Bäckerhefe grundlegende Stoffwechselleistungen der eukaryotischen Zelle, wie die Kontrolle der Aminosäurebiosynthese, analysiert oder die Proteinsekretion untersucht. Modellhaft wird auch die Biogenese der eukaryotischen Zellorganellen, wie der Mitochondrien und Peroxisomen in der Bäckerhefe, erforscht.

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1 Modellorganismen

1.3.5 Genetische Ressourcen Im Rahmen des Hefe-Genomprojektes wurde bereits 1996 das Genom von S. cerevisiae veröffentlicht und die Sequenz jedes beliebigen Gens kann in gängigen Genbank-Datenbanken eingesehen werden, z. B. am National Center for Biotechnologie Information (NCBI) oder der European Molecular Laboratory (EMBL). Es können hier auch unbekannte Sequenzen gegen das Hefegenom verglichen werden. Daneben existieren spezielle Datenbanken, die sich ausschließlich mit allen Facetten des S.-cerevisiae-Genoms widmen. Am Münchener Informationszentrum für Protein Sequenzen (MIPS, Munich Information Center for Protein Sequences) wurde eine Hefegenom-Datenbank (CYGD Comprehensive Yeast Genome Database, mips.gsf.de/genre/ proj/yeast/index.jsp) installiert, die Daten zu Gensequenzen, Proteinen, sowie deren biologischer Funktion und Literaturhinweise zusammenfasst. Auch in der Saccharomyces Genome Database (SGD, www.yeastgenome.org) werden umfassende Erkenntnisse über den Organismus Saccharomyces cerevisiae aufgeführt. Auf beiden Internetseiten können Sequenzvergleiche durchgeführt werden, und mit Suchfunktionen können gezielt Informationen über bestimmte Gene und Proteine eingeholt werden. Daneben kann auch überprüft werden, welche Proteine der Hefe miteinander interagieren. Insgesamt sind mittlerweile 10 570 verschiedene Protein-Protein-Interaktionen in den Genbanken annotiert. Die Hefe besitzt zwar knapp 6000 Gene, jedoch werden nicht alle Gene jederzeit exprimiert. Es liegen demnach nicht immer alle Proteine, die durch die Gene kodiert werden, in jedem Zelltyp vor. Mit der Transkriptom-Analyse ist es möglich, die Transkription aller Hefegene unter bestimmten Parametern zu messen (z. B. in haploiden Zellen oder in diploiden Zellen, während der Sporulation oder unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen). Die Standford Microarray Database (SMD; genome-www5.stanford.edu) gibt einen Überblick über alle Transkriptom-Analysen, die bei S. cerevisiae durchgeführt wurden. Mit einer Suchfunktion kann gezielt nach der Expression eines speziellen Gens unter definierten Bedingungen gesucht werden. Durch Proteom-Analysen kann anhand eines Protein-Profils einer Kultur direkt auf das synthetisierte Protein zurückgeschlossen werden. Die Ermittlung des Protein-Profils beruht auf der Kombination von zweidimensionaler Elektrophorese (2D-Elektrophorese) und der Massenspektroskopie-Technik. Das Computerprogramm Melanie des Expasy Servers (us.expasy.org) sowie andere Internetseiten des Servers (z. B. us.expasy.org/ch2d/) ermöglichen die Detektion und Zuordnung von Protein-Spots.

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

43

Die Kenntnis einer Gesamtsequenz und der Expressionsdaten einzelner Gene reicht jedoch noch nicht aus, um die Funktionsweise eines bestimmten Gens zu erklären. Neben der Kenntnis aller Gene muss deshalb auch die Funktion der Genprodukte untersucht werden. Durch systematische Genfunktionsanalyse in einem nationalen und in einem internationalen Netzwerkverbund erfolgt zur Zeit die Analyse aller Hefegene. Durch homologe Rekombination werden alle der ca. 6000 Gene einzeln deletiert. Zu diesem Zweck wurde EUROSCARF, eine Datenbank mit Hefe-Deletionsmutanten und Hefe-Deletionsplasmiden, aufgebaut. Gegen geringe Kosten können Deletionsmutanten bei EUROSCARF (European Saccharomyces cerevisiae Archive for Functional Analysis, www.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html) bestellt werden. Im Jahr 2003 wurde als weiterer Bestandteil einer globalen Analyse des Hefegenoms versucht, alle ORFs des Hefegenoms mit dem gfp-Gen der Meeresqualle Aequorea victoria zu fusionieren und die Fusionsproteine anhand ihrer Fluoreszenz in der Zelle zu lokalisieren. Dies ist mittlerweile für 75 % aller Hefeproteine gelungen. Eine Datenbank (yeastgfp.ucsf.edu) mit integrierter Suchfunktion fasst die ermittelten Daten zusammen. Weiterhin sind genetisch verschiedene Hefestämme in internationalen Stammkulturen bestellbar. Z. B. erhält man am Yeast Genetic Research Resource Center (YGRRC) der American Type Culture Collection (ATCC) 25 000 Hefestämme, 400 verschiedene Hefevektoren und 20 Genom- oder cDNA-Banken.

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora Die Ascomyceten (Schlauchpilze) stellen die artenreichste Gruppe innerhalb der Pilze dar. Zu ihnen gehören auch die nahe miteinander verwandten Gattungen Neurospora und Sordaria. Bei beiden existieren sowohl heterothallische als auch homothallische Arten, die traditionell für genetische Studien eingesetzt werden. Dies schließt sowohl die heterothallische Art Neurospora crassa als auch die homothallische Art Sordaria macrospora ein. Zwar sind die ökologische Verbreitung und der Lebenszyklus in Details verschieden, doch zeigen beide Pilze deutliche morphologische und cytologische Gemeinsamkeiten, die eine detaillierte genetische Analyse ermöglichen. Das Produkt der Meiose, die Tetrade, kann in Form von haploiden Meiosporen (Ascosporen) isoliert werden und steht für weitergehende morphologische, physiologische oder molekularbiologische Analysen zur Verfügung. Grundsätzlich sind beide Organismen

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1 Modellorganismen

für die Beantwortung genetischer Fragestellungen gleichwertig. Im Folgenden wird vornehmlich auf die Leitart N. crassa eingegangen, da für diesen Organismus innerhalb der Myzel bildenden Pilze die meisten Informationen vorliegen. An geeigneter Stelle wird zusätzlich auf S. macrospora verwiesen, weil dieses Objekt für verschiedene Experimente in diesem Buch empfohlen wird. Systematische Einteilung Abteilung: Klasse: Unterklasse: Ordnung: Familie: Gattung:

Mycophyta Ascomycetes Ascomycetidae Sphaeriales (Sordariales) Sordariaceae Neurospora (bzw. Sordaria)

Genomsteckbrief (N. crassa) • • • • •

nukleäres Genom: 39 900 Mb Zahl der Chromosomen: 7 Zahl der proteinkodierenden Gene: 10 082 mitochondriales Genom: 65 kb Zahl der proteinkodierenden Gene: 20

1.4.1 Historisches 1843 1927 1941 1945 1955 1982 1986

erste Beschreibung von Neurospora-Arten, die in kontaminierten Bäckereien in Paris entdeckt wurden die Gattung wird benannt, Arten werden beschrieben, O. Dodge initiiert genetische und cytologische Untersuchungen George Beadle und Edward Tatum nutzen Neurospora crassa, um die ersten biochemischen Mutanten zu erhalten Barbara McClintock identifiziert die 7 Chromosomen und beschreibt Meiose und postmeiotische Prozesse Mary Mitchell benutzt die Ascus-Analyse, um den ersten sicheren Nachweis der Genkonversion zu demonstrieren die ersten physikalischen und genetischen Karten der mitochondrialen DNA werden publiziert erste Beschreibung von RIP-Mutanten, bei denen durch DNA-Wiederholungen Punktmutationen verursacht wurden

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

1992 1997

45

Entdeckung des Quelling-Phänomens in Neurospora crassa Quelling-defiziente (RNAi) Mutanten werden genutzt, um zu zeigen, dass eine RNA-abhängige RNA-Polymerase für das gene silencing verantwortlich ist 2002 Veröffentlichung der vollständigen Genomsequenz von Neurospora crassa (1. vollständig sequenziertes Genom eines Hyphenpilzes) Bereits 1843 wurden französische Bäckereien von einem Schimmelpilz befallen, der aufgrund seiner pudrig wirkenden orangefarbigen Konidiosporen auffällig war. Dieser Pilz fand sich häufig auf kohlenhydratreicher Nahrung wie z. B. Brot und wurde als Monilia sitophila bezeichnet. Erst viele Jahrzehnte später wurden die Fruchtkörper (Perithezien) beschrieben, die im Verlaufe der Sexualentwicklung entstehen, und der Pilz konnte in die neue Gattung Neurospora eingeordnet werden. Insbesondere O. Dodge, der die ersten Kreuzungen mit diesem Pilz durchführte, etablierte N. crassa als genetisch wichtigen Organismus. Unter anderem gelang ihm der physiologische Nachweis, dass zwei Kreuzungstypen existieren, deren Gene im Verhältnis 4 : 4 in den achtsporigen Asci aufgespalten werden. Diese Arbeiten wurden später durch Carl Lindegren in Kalifornien weiterentwickelt, der die ersten morphologischen Mutanten isolierte und 1936 die erste genetische Karte publizierte. In den Folgejahren entwickelte sich N. crassa zum Lehrbuchbeispiel, da deutlich wurde, dass die vier Produkte der Meiose, die Tetrade, in Form von Ascosporen isoliert werden konnten. Mit Hilfe der Tetradenanalyse gelang es, die Phänomene des Crossing-over und der Interferenz zu erklären, die typischerweise bei allen Eukaryoten im Verlauf der Meiose auftreten. Ein weiterer Durchbruch mit dem Modellorganismus N. crassa gelang Tatum und Beadle. Sie konnten 1941 zum ersten Mal Mutanten beschreiben, die individuelle Nahrungsdefizienzen (Auxotrophien) aufwiesen. Mit Hilfe der Mendelgenetik zeigten sie, dass die fundamentalen Lebensprozesse durch Gene kontrolliert werden. Ihnen gelang es mittels Mutanten, die für verschiedene Vitamine bedürftig waren, eine Brücke zwischen Genetik und Biochemie zu schlagen und eine neue Ära der biochemischen Genetik und der molekularen Biologie zu initiieren. Sie konnten 1945 die „Ein Gen - Ein Enzym“-Hypothese aufstellen, die besagt, dass enzymkatalysierte Biosyntheseschritte unter genetischer Kontrolle stehen. In der Folgezeit wurden zahlreiche physiologische Mutanten isoliert, die u. a. auch zur Bestimmung von Zwischenschritten in Biosynthesewegen führten. Die Vielzahl der Mutanten führte schließlich dazu, dass N. crassa der erste Pilz war, bei dem 1954 alle Kopplungsgruppen genetisch kartiert worden waren. Für die mitochondriale DNA gelang es 1982 zum ersten Mal, physikalische und genetische Karten in Einklang zu bringen. In der Folgezeit wurden

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1 Modellorganismen

verschiedene Phänomene, die bei N. crassa zuerst entdeckt und beschrieben worden waren, auf ihren molekularen Ursprung zurückgeführt. Hierzu zählt auch das RIP-Phänomen (repeat-induced-point mutation), das auftritt, wenn duplizierte DNA-Sequenzen (z. B. nach DNA-Transformation) sexuell weitergegeben werden. Dabei stattfindende Punktmutationen führen zu ihrer Inaktivierung. Neurospora crassa ist schließlich auch der erste Hyphenpilz, für den 2003 die vollständige Genomsequenz veröffentlicht wurde (Galagan et al. 2003). Von diesen Daten abgeleitete Erkenntnisse können maßgeblich für viele Hyphenpilze sein, da die Isolation und Funktionsanalyse von heterologen Genen auf der Basis dieser Genomsequenz entscheidend erleichtert wird. Im Gegensatz zur Gattung Neurospora, die vor allem in tropischen Vegetationszonen zu finden ist, kommen die koprophilen Vertreter der Gattung Sordaria in gemäßigten Vegetationszonen vornehmlich auf dem Dung von herbivorer Tiere vor. Zwei Arten, S. macrospora und S. fimicola, sind besonders erwähnenswert, da sie seit den 40er Jahren des vorigen Jahrhunderts als genetische Objekte ausgewählt worden sind. Auch wenn die Anwendung molekulargenetischer Methoden bei den Sordaria-Arten im Vergleich zu N. crassa weniger gut etabliert ist, so können doch entscheidende technische Entwicklungen inzwischen auch für die Arbeit mit S. macrospora verzeichnet werden. Dies schließt sowohl die DNA-Transformation als auch die Expression heterologer Gene in diesem Ascomyceten ein.

1.4.2 Lebenszyklus Neurospora crassa ist ein heterothallischer Hyphenpilz, dessen Lebenszyklus durch Monözie, überlagert durch Inkompatibilität, bestimmt wird. Es können zwei Kreuzungstypen („Geschlechter“) unterschieden werden, die durch die Bezeichnung „A“ und „a“ gekennzeichnet werden. „A“- und „a“-Stämme tragen unterschiedliche Kreuzungstyp-Gene, die das Sexualverhalten bei diesem Pilz bestimmen. In Abb. 1.4.1 wird der sexuelle Zyklus mit der Bildung der Konidien gezeigt, welche zusätzlich Ausgangspunkt des asexuellen (vegetativen) Zyklus sind. Die Ascosporen sind als Produkte der sexuellen Vermehrung Ausgangspunkt für ein zweidimensional wachsendes Myzel mit einer Wuchsrate von 3,0 cm/ Tag. An diesem differenzieren sich sowohl weibliche Gametangien (Ascogone) als auch männliche Gameten (Mikro- und Makrokonidien). Nur wenn zwei Stämme mit unterschiedlichem Kreuzungstyp aufeinandertreffen, kann der Sexualzyklus vollendet werden. Die Trichogyne, eine spezialisierte Hyphe, die

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

47

Konidien Ascogon

Myzel

Neurospora crassa heterothallisch

Trichogyne

Ascosporen

a A

Ascus

Protoperithezien

Ascus Perithezium Protoperithezium Ascospore

Sordaria macrospora homothallisch

Myzel Ascogon

Abb. 1.4.1. Vergleich der Lebenszyklen von Neurospora crassa und Sordaria macrospora. Bei N. crassa ist die Kreuzung von zwei Stämmen mit entgegengesetztem Kreuzungstyp-Locus (A und a) die Voraussetzung für eine sexuelle Vermehrung. Im Gegensatz dazu kann aufgrund einer autogamen Befruchtung bei Sordaria macrospora eine Selbstung stattfinden, um den sexuellen Zyklus einzuleiten. Weitere Details im Text

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1 Modellorganismen

aus dem Ascogon heraus wächst, kann durch Hyphenanastomose eine Mikrooder Makrokonidie aufnehmen. Durch die Zellfusion kommt es zur Hetererokaryonbildung, einer Voraussetzung für die Ausbildung ascogener Hyphen. Diese treten zahlreich in den einzelnen Fruchtkörpern auf. Ascogene Hyphen entwickeln sich zu Hakenzellen, in denen die Karyogamien je zweier haploider, genetisch verschiedener Kerne stattfinden. Bei der Karyogamie entsteht ein diploider Kern, der nachfolgend eine Meiose durchführt. Nach der ersten und zweiten meiotischen Teilung erfolgt eine postmeiotische Mitose, die schließlich zu acht haploiden Kernen führt. Diese acht Kerne sind der Ursprung von acht Ascosporen, die linear in den länglichen Asci angeordnet sind. Die lineare Anordnung wiederum spiegelt die Vorgänge im Verlaufe der Meiose wider und erlaubt die Kartierung des Gen-Centromer-Abstandes, der aufgrund der Postreduktionshäufigkeit (second-division segregation frequency) bestimmt werden kann. Bei der Tetradenanalyse, die — wie bereits oben beschrieben wurde — für konventionelle genetische Kartierungen angewandt wird, werden die acht haploiden Ascosporen phänotypisch analysiert. Der vegetative Zyklus beginnt mit der Keimung der Mikro- oder Makrokonidien, welche sich ausschließlich durch mitotische Teilungen vermehren. An den dabei entstehenden Myzelien können wiederum Konidien gebildet werden, die als orangefarbene Beläge makroskopisch erkennbar sind. Im Gegensatz zu Neurospora crassa ist Sordaria macrospora ein homothallischer Pilz, d. h. der Organismus ist zur Selbstung befähigt. Die Entwicklung der Fruchtkörper erfolgt innerhalb eines Stammes ohne die Anwesenheit eines zweiten Kreuzungspartners. Man spricht in diesem Fall von einer apandrischen Entwicklung mit einem autogamen Befruchtungsmodus. Trichogynen, die für den Befruchtungsmodus bei N. crassa wesentlich sind, fehlen bei S. macrospora vollständig. Wie für alle homothallischen Arten der Gattung Neurospora und Sordaria typisch, fehlt ein vegetativer Zyklus. Daher können bei S. macrospora keine Mikro- oder Makrokonidien beobachtet werden. Der Organismus weist somit einen vergleichsweise einfachen Lebenszyklus auf (Abb. 1.4.1), der im Labor innerhalb von sieben Tagen vollzogen werden kann. Ausgehend von einer Ascospore wird ein Myzel gebildet, an dem sich Ascogone ausdifferenzieren, die sich zu ascogenen Hyphen entwickeln. Durch Septierung entstehen Spitzenzellen, in denen es zur Dikaryonbildung kommt (vgl. Abb. 2.3.1). Die Spitzenzellen schließlich sind der Ausgangspunkt der Ascusentwicklung. In den jungen Asci finden Karyogamie und Meiose statt, welche die Voraussetzung für die Bildung der Ascosporen sind. Ähnlich wie bei N. crassa werden kugelrunde Protoperithezien (Vorfruchtkörper) mit einem Durchmesser von ca. 30–50 µm gebildet. Im Verlaufe der weiteren Differenzierung entwickeln sich diese zu flaschenähnlichen Fruchtkörpern, den Perithezien, mit einer Größe

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

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von ca. 250 µm. Ähnlich wie bei N. crassa werden in den Fruchtkörpern bis zu 200 Asci gebildet, in denen sich je acht linear angeordnete, schwarze Ascosporen finden. Die Ascosporengröße und -form ist wichtig für eine taxonomische Einteilung unterschiedlicher Spezies. Die Ascosporen von S. macrospora haben eine Größe von 17 × 31 µm und werden ähnlich wie bei N. crassa durch das Ostiolum, eine perforierte Stelle an der Spitze des Peritheziums, ausgeschleudert. Dieser Mechanismus dient der Verbreitung der Sporen. Zusammengefasst weicht der Lebenszyklus von Sordaria macrospora von dem von Neurospora crassa wie folgt ab: 1. Es findet keine vegetative Vermehrung durch Makro- oder Mikrokonidien statt. 2. Die Protoperithezien bilden keine Trichogynen aus. Die Entwicklung erfolgt apandrisch, die Befruchtung ist autogam. S. macrospora ist selbstbefruchtend und Inkompatibilitätsmechanismen sind nicht beschrieben. 3. Der Entwicklungszyklus ist mit ca. sieben Tagen relativ kurz, die im Vergleich zu N. crassa großen Ascosporen keimen leicht ohne Hitzeschock oder Keimruhe. 4. Die Wuchsrate von S. macrospora beträgt ca. 1,6 cm pro Tag. 1.4.3 Technische Entwicklungen An dieser Stelle können nicht sämtliche methodisch-technische Entwicklungen, die bei Neurospora crassa in den letzten 50 Jahren stattgefunden haben, aufgezählt werden. Deshalb werden beispielhaft experimentelle Voraussetzungen erwähnt, die grundsätzlich dazu beigetragen haben, N. crassa zu einem zentralen Objekt der Genetik werden zu lassen. Tetradenanalyse Die Tetradenanalyse untersucht die vier Produkte der Meiose, bei der die Allele im Verhältnis 2 : 2 (Mendelaufspaltung) segregieren. Dabei werden fundamentale Informationen zu Meiose und Crossing-over geliefert, welche die Grundlagen zur Aufstellung von Chromosomenkarten darstellen. Außerdem werden Untersuchungen zu Chromosomenumlagerungen oder zur nicht-mendelschen Vererbung der Mitochondrien-DNA unterstützt. In der Regel wird bei der Anwendung der Tetradenanalyse die Anordnung der Produkte unberücksichtigt gelassen. Allerdings bietet der schlauchförmige Ascus von N. crassa oder S. macrospora die Möglichkeit, anhand der linearen Sporenanordnung Prozesse im Verlaufe der Meiose detailliert zu analysieren. So kann mit Hilfe der Postre-

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1 Modellorganismen

duktionshäufigkeit der Abstand von Genen zum Centromer bestimmt werden (Kap. 2.3). Die acht Meiosporen im linearen Ascus der beiden Ascomyceten entstehen aufgrund einer mitotischen Duplikation der Meioseprodukte. Physiologische und morphologische Mutanten Bereits bei den ersten genetischen Untersuchungen an Neurospora crassa wurde deutlich, dass sowohl morphologische als auch physiologische Mutanten geeignet sind, um Vererbungsprozesse zu verfolgen. Mutationen können spontan auftreten oder gezielt durch Bestrahlung der Konidien mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht erzeugt werden. Alternativ bieten sich verschiedene chemische Agenzien an, wie z. B. Ethylmethansulfonat (EMS). Die ersten Mutanten von N. crassa waren konditional-physiologisch, deren MutantenPhänotyp nur bei erhöhten Temperaturen (temperatursensitive Mutanten), bei ungewöhnlichen pH-Werten oder osmotischen Bedingungen offensichtlich wurde. Konditionale Mutanten sind oft nicht lebensfähig bei erhöhten Temperaturen, und dieses Defizit kann auch nicht durch Medienzusätze umgangen werden. Bei den morphologischen Mutanten fielen vor allen Dingen solche auf, die Veränderungen der Ascosporenfarbe oder -morphologie zeigten oder bei denen das Myzel einen vom Wildtyp abweichenden Phänotyp, wie z. B. eine abweichende Pigmentierung, aufwies. Zu den morphologischen Mutanten gehören auch sterile Stämme, bei denen die Asco- oder Konidiosporenbildung verhindert ist. Physiologische Mutanten sind insbesondere durch die Arbeiten von Tatum und Beadle bekannt geworden. Sie konnten die ersten NährstoffmangelMutanten isolieren, die unfähig sind, auf Minimalmedien zu wachsen. Zu diesem Mutantentyp gehören solche, die die Fähigkeit verloren haben, Aminosäuren, Nukleinsäurevorläufermoleküle, Lipide, organische Säuren oder Vitamine zu synthetisieren. Für Sordaria macrospora wurden bislang deutlich weniger Mutanten beschrieben, und erst vor kurzem konnten die ersten auxotrophen Stämme (ura5, ura3, leu1) isoliert werden. Erwähnenswert sind Farbspormutanten, da sie eine direkte mikroskopisch-genetische Beobachtung der Ascosporen und somit eine einfache formalgenetische Analyse ermöglichen (Kap. 2.3). Außerdem kennt man eine Vielzahl von sterilen Entwicklungsmutanten, die einen Defekt in der Fruchtkörperbildung aufweisen. Gegenüber N. crassa können derartige Mutanten von S. macrospora einfach isoliert werden. Der apandrische Lebenszyklus ermöglicht eine leichte Isolation derartiger Mutanten, ohne dass mit Stämmen eines entgegengesetzten Kreuzungstyps gekreuzt werden muss.

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

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DNA-vermittelte Transformation Nachdem 1978 mit der Transformation von Saccharomyces cerevisiae die erste DNA-Transformation bei einem eukaryotischen Organismus gelungen war, konnte bereits 1979 die erfolgreiche Transformation eines Hyphenpilzes molekulargenetisch bewiesen werden. Dies gelang mit Rezipientenstämmen von Neurospora crassa, die einen Defekt in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren aufwiesen. Inzwischen werden bei DNA-Transformationen von N. crassa und S. macrospora dominante Resistenzmarkergene wie das prokaryotische Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gen (hph) eingesetzt. Alternativ finden oft auch Auxotrophiemarkergene, ähnlich wie bei S. cerevisiae (Kap. 1.3), Anwendung. Eine wichtige Voraussetzung für den Erfolg der Transformation war die Möglichkeit, die Zellwand der Hyphen abzubauen und damit die Aufnahme der exogenen DNA zu erleichtern. Alternativ wird inzwischen bei N. crassa die Elektroporation der Konidien zur DNA-Transformation genutzt. In der Regel wird die DNA bei allen Hyphenpilzen in beliebige Orte der chromosomalen DNA der Rezipientenstämme integriert, und nur in seltenen Fällen (0,5– 10 %) findet eine Integration am homologen Locus aufgrund von homologer Rekombination statt. Die integrierte DNA kann stabil auf die Nachkommen vererbt werden: Im Gegensatz zu frei replizierender DNA, die oft cytoplasmatisch lokalisiert ist, findet kein Verlust der transformierten DNA im Verlaufe von Zellteilungsvorgängen statt. Die Möglichkeit, Hyphenpilze mit exogener DNA zu transformieren, eröffnet viele neue Ansätze einer molekularen Analyse von Genstruktur, Genexpression und Evolution. Verfügbarkeit der Gesamtgenomsequenz Das haploide Genom von Neurospora crassa besteht aus 39,9 Megabasenpaaren (Mb) der chromosomalen DNA mit einem GC-Gehalt von 54 %. Die sieben Chromosomen variieren in ihrer Größe zwischen 4 und 10,3 Mb. Die Zahl der Chromosomen ist nicht nur cytologisch beobachtbar, sondern kann auch durch Pulsfeld-Gelelektrophorese elektrophoretisch dargestellt werden. Mit Ausnahme der ribosomalen DNA (rDNA), 5Sr-DNA und der Centromer- und Telomer-DNA existieren nur wenige repetitive DNA-Sequenzen im N.-crassaGenom. Der Vergleich von konventionellen und molekulargenetischen Daten liefert Hinweise dafür, dass eine Karteneinheit 30–80 Kilobasen entspricht. Bislang konnten die bei N. crassa charakterisierten Mutationen 700 Genen zugeordnet werden. Dabei verteilen sich diese Gen-Loci gleichmäßig auf die sieben Chromosomen. Die computergestützte DNA-Annotation hat offene Leserahmen (ORFs) für 10 082 Proteine ermittelt, allerdings steht bei einem Großteil der biochemische oder funktionelle Nachweis noch aus.

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1 Modellorganismen

Für Sordaria macrospora ist die Gesamtgenomsequenz bisher noch nicht ermittelt worden. Allerdings kann aufgrund des hohen Verwandtschaftsgrades zwischen S. macrospora und N. crassa die Genomsequenz von N. crassa für Analysen bei S. macrospora herangezogen werden. 1.4.4 Biologische Fragestellungen An Neurospora crassa sind in den letzten Jahren verschiedene epigenetische Phänomene beobachtet worden, die der „Genomverteidigung“ (genome defense) dienen. Derartige Phänomene werden nicht durch die primäre Expression der genetischen Information bestimmt, sondern ihre Steuerung findet auf einem übergeordneten Entwicklungsniveau statt. Sie tragen dazu bei, dass sich fremde Nukleinsäuren wie z. B. transponierbare Elemente oder Viren nicht in dem Genom etablieren können. Hierzu zählen das Quelling (to quell = niederschlagen, überwinden), das meiotic silencing by unpaired DNA (MSUD) und der RIP-Mechanismus (repeat-induced point mutation). Quelling Das Phänomen des Quelling ist mit der RNA interference (RNAi) in Pflanzen, Nematoden, Drosophila melanogaster und Säugern verwandt. Beim Quelling werden duplizierte Sequenzen im Verlaufe des vegetativen Wachstums vom Organismus erkannt und auf RNA-Ebene inaktiviert. Dabei ist eine RNAabhängige RNA-Polymerase beteiligt sowie ein Protein ähnlich dem Dicer, der beim RNAi-Silencing der Säuger ein Rolle spielt. meiotic silencing by unpaired DNA (MSUD) Dieses Phänomen ist bisher nur für Neurospora crassa beschrieben worden. Hierbei werden im Verlaufe der Meiose ungepaarte DNA-Sequenzen erkannt und durch einen RNA-vermittelten Silencing-Prozess, der alle Gene der ungepaarten Region einschließt, inaktiviert. MSUD kann bei N. crassa durch phänotypische Beschreibung der Ascosporen beobachtet werden, die aufgrund ihrer unkonventionellen oder abnormen Morphologie erkannt werden können. Auch bei diesem Prozess spielen RNA-abhängige RNA-Polymerasen eine entscheidende Rolle.

1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

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repeat-induced point mutation ( RIP) Das RIP-Phänomen wurde zuerst 1986 bei Neurospora crassa beobachtet. Bei diesem werden duplizierte Sequenzen, die länger als 400 bp lang sind, erkannt und im Verlaufe der prämeiotisch-dikaryotischen Phase mutiert. Dabei entstehen Punktmutationen, bei denen eine hohe Zahl von C:T- bzw. G:A-Transitionen zu beobachten sind. Bevorzugt werden CpA-Dinukleotide verändert. Durch diesen Prozess wird die Wahrscheinlichkeit von Nonsenscodonen erhöht, und die häufige Methylierung der mutierten Sequenzen führt schließlich zur Geninaktivierung. Die Genomanalyse von N. crassa hat ergeben, dass aufgrund des RIP-Phänomens weniger Multigen-Familien bei N. crassa festzustellen sind als bei vielen anderen Eukaryoten. Entsprechend können bei N. crassa lediglich acht Genpaare identifiziert werden, die eine Identitiät von > 80 % aufweisen. Damit unterscheidet sich dieser Organismus deutlich von Hefen und anderen Hyphenpilzen. Das Genomprojekt hat schließlich auch deutlich gemacht, dass nahezu die Hälfte aller zu beobachtenden repeat-induzierten Mutationen zu einer Inaktivierung mobiler genetischer Elemente führte. In der Praxis wird das RIP-Phänomen genutzt, um Gene gezielt zu inaktivieren. Durch die Transformation von Genkopien werden sämtliche dieser Genkopien im Genom von N. crassa durch das RIP-Phänomen inaktiviert. Dabei stellt das RIP-Phänomen eine exzellente Alternative zum Knock-out-Ansatz dar, der bei vielen Organismen genutzt wird. Beim Knock-out wird ein Zielgen durch Insertion von Fremd-DNA zerstört und ermöglicht so die Analyse der Genfunktion. Bemerkenswert ist, dass ein RIP-Phänomen, wie für N. crassa oben beschrieben, bisher bei Sordaria macrospora nicht beobachtet werden konnte. Dies ist insofern experimentell interessant, da das Fehlen des RIP-Phänomens die Expression heterologer Gene auch nach meiotischer Teilung uneingeschränkt ermöglicht. 1.4.5 Genetische Ressourcen Die bereits in den vorausgegangenen Abschnitten beschriebenen physiologischen und morphologischen Mutanten von Neurospora crassa bieten eine ausgezeichnete Basis, um unterschiedliche biologische Phänomene zu analysieren. Die entsprechenden Mutanten sind in verschiedenen Stammkulturen erhältlich. Herausragend ist hier das Fungal Genetics Stock Center, welches eine ständig aktualisierte Internetseite unterhält (www.fgsc.net). Unter dieser Adresse sind auch Stämme der Gattung Sordaria erhältlich.

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1 Modellorganismen

Ähnlich wie der Wildtyp von Drosophila melanogaster wurde der Wildtyp von N. crassa sehr früh gut definiert. Deshalb sind Mutationen, die vom Wildtyp abweichen, gut beschreibbar. Der Wildtyp und die Mutanten werden in Stammsammlungen aufbewahrt. Die entsprechenden Organisationen (z. B. FGSC) sind durch die Initialen vor der Stamm-Nummer gekennzeichnet. Identische Stämme werden oft von verschiedenen Stammsammlungen mit unterschiedlichen Nummern angeboten. Die Definition zur Nomenklatur einzelner Mutanten wird auf der o. g. Webseite angegeben. Zusätzliche Informationen können bei Perkins (1996) und Davis (2000) eingesehen werden. Neben den Mutantenstämmen sind eine Vielzahl von DNA-Sonden und Plasmiden von N. crassa erhältlich. Auch in diesem Fall ist das Fungal Genetics Stock Center in Kansas City sehr hilfreich bei der Katalogisierung und Beschaffung entsprechender Materialien. Dort werden auch Informationen über die Verfügbarkeit von cDNA-, EST- und Cosmid-Banken gegeben. Außerdem sind Verweise auf Array-Analysen erhältlich. Im Jahr 2003 wurde die DNA-Sequenzierung des N.-crassa-Genoms vom Center for Genome Research in Cambridge (Massachusetts, USA) vervollständigt und die entsprechende Annotation weitgehend durchgeführt. Ähnlich wie für das Hefegenom (Kap. 1.3.5) können unterschiedliche Serviceleistungen über eine zentrale Webseite in Anspruch genommen werden (www.broad. mit.edu/annotation/fungi/neurospora/index.html). Zur Zeit werden auch verschiedene andere pilzliche Genome von dieser Institution sequenziert. Inzwischen sind auch Initiativen gegründet worden, um DNA-Chips, die das N.-crassa-Genom repräsentieren, herzustellen. Es ist abzusehen, dass entsprechende Materialien in näherer Zukunft auch der Allgemeinheit zur Verfügung stehen. Die Gattung Neurospora ist auch für populationsgenetische Untersuchungen sehr geeignet. Sie kommt meist in tropischen und semitropischen Arealen vor und umfasst vier heterothallische Arten, nämlich N. crassa, N. sitophila, N. tetrasperma und N. intermedia. Insgesamt wurden 4 600 Stämme dieser vier heterothallischen Arten untersucht, die vom Fungal Genetics Stock Center erhältlich sind. Derartige Kollektionen waren bereits die Basis für populationsgenetische Arbeiten, um vegetative Inkompatibilitätsgene zu charakterisieren. Solche Gene sind für Unverträglichkeitsreaktionen zwischen Zellen verschiedener Stämme einer Art verantwortlich. Interessant ist, dass bei den verschiedenen Stämmen eine hohe genetische Variabilität festgestellt wurde, die eine nicht-klonale Verbreitung der Gattung Neurospora nahe legt.

1.5 Chlamydomonas reinhardtii

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1.5 Chlamydomonas reinhardtii Die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einem häufig benutzten genetischen Modellorganismus entwickelt, an dem zell- und molekularbiologische Fragestellungen untersucht werden. Die Tatsache, dass es sich bei C. reinhardtii um einen Einzeller handelt, sowie ihre leichte formalgenetische und molekulargenetische Manipulierbarkeit haben dieser Alge häufig den Spitznamen „grüne Hefe“ eingebracht. Insbesondere stellt C. reinhardtii zur Zeit den photoautotrophen Eukaryoten dar, dessen Chloroplasten routinemäßig und sehr effizient transformiert werden können. Systematische Einteilung Abteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung:

Chlorophyta Chlorophyceae Volvocales Chlamydomonadaceae Chlamydomonas

Genomsteckbrief • • • • • •

nukleäres Genom: 95,4 Mb Chromosomenzahl: 17 mitochondriales Genom: 15,8 kb Zahl der proteinkodierenden Gene: 8 chloroplastidäres Genom: 203,4 kb Zahl der proteinkodierenden Gene: 64

1.5.1 Historisches 1888

Beschreibung und Benennung der Spezies Chlamydomonas reinhardtii durch Dangeard 1918 Pascher beschreibt erstmals die Segregation von genetischen Differenzen in Kreuzungen von C. reinhardtii 1930–1940 erstmalige Beschreibungen von Gamonen (Pheromonen) 1946–1955 Etablierung von Laborstämmen und Selektion der ersten Mutanten durch Lewin und Sager

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1988 1993 2002 2003

1 Modellorganismen

erstmalige Chloroplastentransformation mit Hilfe einer Partikelkanone komplette Sequenz des mitochondrialen Genoms von C. reinhardtii entschlüsselt Sequenzierung des plastidären Genoms abgeschlossen erste Veröffentlichung der Sequenz des Kerngenoms

Der Name Chlamydomonas (griechisch: chlamys, Mantel; monas, einzeln) wurde im Jahre 1833 erstmals von C. G. Ehrenberg benutzt. Allerdings ist bis heute unklar, welche Art genau von ihm damals untersucht wurde. P. A. Dangeard beschrieb nachfolgend 1888 schließlich die Spezies Chlamydomonas reinhardtii und benannte sie nach dem ukrainischen Botaniker L. Reinhardt. Die heute verwendeten Laborstämme von C. reinhardtii stammen interessanterweise alle von einer einzelnen Zygospore ab, die 1945 aus einer Bodenprobe von einem Kartoffelacker in Amherst (Massachusetts) von G. M. Smith isoliert wurde und den Namen 137c erhielt. Für diese Stämme wurden Anzuchtmethoden und Kreuzungstechniken etabliert. Arbeiten von R. Sager, B. Ebersold und P. Levine in den 50er Jahren begründeten die eigentliche Chlamydomonas-Genetik, die zur Isolierung einer Vielzahl von Mutanten mit Defekten in verschiedensten Zellfunktionen führte. Die Entdeckung der uniparentalen Vererbung von Antibiotika-Resistenzen durch R. Sager eröffnete 1954 erstmals das Feld der experimentellen Organellen-Genetik. Dafür stellt C. reinhardtii noch heute eines der besten Modellsysteme dar. Seit den 60er Jahren hat sich diese Grünalge außerdem zu einem herausragenden Modell für die Analyse der Photosynthese und seit kürzerem für die Biogenese des Chloroplasten entwickelt. Das andere Hauptarbeitsfeld der Chlamydomonas-Genetiker betrifft den Bewegungsapparat der Alge. Dieser besteht aus zwei gleichlangen Geißeln, die von einem Paar Basalkörpern ausgehen und am apikalen Pol der Zelle lokalisiert sind. 1988 erlangte C. reinhardtii weltweite Aufmerksamkeit, weil es J. E. Boynton et al. mit Hilfe dieses Organismus erstmals gelang Chloroplasten zu transformieren. Das Einbringen von Nukleinsäuren in das Organell galt bis dahin als nahezu unmöglich, da der Chloroplast von einer Doppelmembran umgeben ist. Durch den Einsatz einer Partikelkanone konnte DNA erfolgreich in das Organell eingeführt werden. Neben dem im Jahre 1990 erstmals transformierten Tabak ist C. reinhardtii noch heute den einzigen Organismus, dessen Chloroplasten mit geringem Aufwand routinemäßig transformiert werden können.

1.5 Chlamydomonas reinhardtii

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1993 wurde das relativ kleine Mitochondriengenom von 15,8 kb und 2002 das Chloroplastengenom von 203,4 kb sequenziert. Die Sequenz des aus 17 Chromosomen bestehenden Kerngenoms wird zur Zeit ermittelt und eine erste Version der nahezu vollständigen Sequenz steht seit dem Jahre 2003 der Öffentlichkeit zur Verfügung (Shrager et al. 2003). Eine verbesserte Version wird für den Herbst 2004 erwartet und stellt das erste bekannte Genom einer eukaryotischen Alge dar. 1.5.2 Lebenszyklus Chlamydomonas reinhardtii ist ca. 13 × 7,5 µm groß und lässt sich als Einzeller sowohl auf Agarplatten als auch in flüssigen Medien leicht kultivieren. Als Haplont besitzt die Grünalge einen einfachen Chromosomensatz. Dies bedeutet für genetische Analysen, dass jede Mutation — auch rezessive — sofort ihre phänotypische Ausprägung erfährt. Unter optimalen Wachstumsbedingungen vermehrt sich C. reinhardtii vegetativ durch die Bildung von Planosporen. Dabei teilen sich die Protoplasten nach Abwerfen der Geißeln und der Bildung von Tocherkernen zwei- seltener auch dreimal in Längsrichtung, so dass vier bzw. acht Aplanosporen die inzwischen vergrößerte Mutterzelle verlassen. Der einzelne Chloroplast teilt sich ebenfalls während der Zytokinese. Nach 2–3 h haben sich die Tochterzellen vollständig ausdifferenziert und einen Geißelapparat aufgebaut. Unter Laborbedingungen lassen sich die Zellteilungen innerhalb einer Kultur durch alternierende 12 h Licht/12 h Dunkel-Rhythmen synchronisieren. Die Mitose beginnt nach ca. 12 h, also zu dem Zeitpunkt, an dem die Zellen in die Dunkelheit überführt werden. Die Tochterzellen werden ungefähr nach 23 h, also kurz vor Beginn des nächsten Licht-Zyklus, aus der Mutterzelle entlassen. C. reinhardtii ist heterothallisch und isogam. Der Kreuzungstyp, der entweder + oder − ist, wird in einer Zelllinie permanent ausgeprägt und verhält sich in Kreuzungen wie ein einzelner mendelscher Locus. Außerdem unterscheiden sich + und −Gameten morphologisch nicht. Das Fortpflanzungssystem der Alge wird daher als physiologische Diözie bezeichnet. Die sexuelle Fortpflanzung von C. reinhardtii wird durch Nährstoffmangelbedingungen (z. B. Stickstoffmangel) eingeleitet, die die Differenzierung der vormals vegetativ wachsenden Zellen in Gameten induzieren. Geschlechtsspezifische Pheromone sorgen danach für die Agglutination von + und −Gameten, nachdem es zu einem Geißelkontakt zwischen ihnen gekommen ist. Die Geißeln ändern ihre Morphologie und Kreuzungsstrukturen werden ausgebildet, die zu einer röhrenförmigen Verbindung der Gameten führen. Nach dem Auflösen der

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1 Modellorganismen

Zellwand durch Autolysine kommt es dann zur lateralen Zell- und Kernfusion und der Ausbildung einer tetraflagellaten Zelle, die in der Folge die Geißeln abwirft und sich mit einer derben Zellwand umgibt. Diese diploide Zygote durchläuft ohne weitere Mitosen die beiden meiotischen Teilungen und entlässt nach wenigen Tagen vier haploide Mitglieder einer Tetrade (Abb. 1.5.1). Obwohl es sich bei C. reinhardtii grundsätzlich um einen Haplonten handelt, beobachtet man bei Kreuzungen, dass ca. 1–5 % der fusionierenden Gametenpaare keine meiotische Zygote bilden, sondern sich weiter mitotisch teilen und somit vegetative diploide Linien erzeugen. Diese lassen sich im Labor leicht selektionieren und kultivieren, indem man zwei Stämme kreuzt, die einander komplementierende Auxotrophie-Marker enthalten. Auf Minimalmedium können dann nur diploide Zellen wachsen, während die Elternstämme nicht überlebensfähig sind. Für den Genetiker sind diese Linien von großer Bedeutung, da ihr Phänotyp sofort den rezessiven bzw. dominanten Charakter einer eingebrachten Mutation widerspiegelt. 1.5.3 Technische Entwicklungen Neben den seit langem etablierten Methoden der klassischen Kreuzungsgenetik konnten im Laufe der letzten 15 Jahre „molekulare Werkzeuge“ für C. reinZygote diploid

2n

–

+/–

+

2n

Meiose

–

+

– Kreuzungstyp +

+– – +

Kreuzungstyp – Mitosen haploid –N

+

–

Mitosen haploid –N

+

Abb. 1.5.1. Lebenszyklus von C. reinhardtii. –N Stickstoffmangel, n haploider Chromosomensatz

1.5 Chlamydomonas reinhardtii

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hardtii entwickelt werden, die eine umfassende Analyse und Manipulation des genetischen Materials erlauben. Tetradenanalyse Die vier haploiden Produkte der meiotischen Reduktionsteilungen, die man als Tetrade bezeichnet, liegen ungeordnet vor und können — ähnlich wie bei Pilzen — manuell separiert und getrennt angezogen werden. Dadurch wird die Analyse meiotischer Rekombinationsvorgänge qualitativ und quantitativ möglich. Des Weiteren können die Erbgänge von genetischen Markern untersucht werden, um festzustellen, ob diese im Kerngenom oder womöglich extrachromosomal, in einem der Organellengenome, lokalisiert sind. Im Unterschied zu kernkodierten Genen, werden die Organellengenome in C. reinhardtii uniparental vererbt. Interessanterweise wird das Mitochondriengenom vom −Partner weitergegeben und das Chloroplastengenom vom +Partner. Die molekularen Ursachen für diese Vererbungsmuster sind noch nicht völlig verstanden, allerdings scheint im Falle der Chloroplasten eine +spezifische Nuklease in frühen Zygoten gezielt die Chloroplasten-DNA (aber nicht den Chloroplasten) des −Partners zu zerstören. Die Kontrolle dieses Prozesses ist eng an den Lebenszyklus von C. reinhardtii gekoppelt und wird ebenso wie die Gametendifferenzierung und Zygotenreifung vom Kreuzungstyp-Locus determiniert. Als Konsequenz aus den uniparentalen Vererbungsmustern der Organellengenome findet man bei Tetradenanalysen keine 2 : 2 Aufspaltung von Phänotypen in der Nachkommenschaft, sondern eine 4 : 0 bzw. 0 : 4 Segregation plastidärer bzw. mitochondrialer Marker (Abb. 1.5.2). Weitere Anwendungen der Tetradenanalyse schließen Komplementationsanalysen (Kap. 1.3.3) ein, sowie die Herstellung von Stämmen, die multiple Mutationen tragen und dadurch Aussagen über mögliche funktionelle Beziehungen zwischen Genen erlauben (Epistasie-Analyse). Insbesondere Mutationen, die Zellwanddefekte (cw = cell wall) hervorrufen, werden oft in Stämme eingekreuzt, da reduzierte Zellwände sowohl die DNA-vermittelte Transformation von C. reinhardtii (Kap. 3.4.1) als auch die Isolierung von subzellulären Fraktionen (z. B. Organellen) wesentlich erleichtern. Mutanten Seit der Etablierung von C. reinhardtii als genetischem Modellorganismus in den 50er Jahren sind eine Vielzahl von Mutanten mit Defekten in unterschiedlichsten Zellfunktionen isoliert und charakterisiert worden. Solche Mutanten werden in der Regel verwendet, um in einem vorwärts gerichteten genetischen

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1 Modellorganismen

Mitochondrien Nukleus Chloroplast mt+

mt–

Karyogamie Meiose

mt+

mt–

mt+

mt–

Abb. 1.5.2. Kreuzung von C. reinhardtii. Während Kerngene den mendelschen Gesetzen gehorchend im Verhältnis 2 : 2 aufspalten, werden die Organellengenome uniparental in Abhängigkeit vom Kreuzungstyp (mt) vererbt. Der untere Teil der schematisch dargestellten Algenzellen soll den Chloroplasten repräsentieren, der kleine Kreis darüber stellt den Zellkern dar und das Oval im oberen Teil die Mitochondrien

Ansatz (forward genetics) die jeweils betroffenen Gene zu identifizieren und ihre Funktion auf molekularer Ebene zu analysieren. Für die gezielte Herstellung von Mutanten wurden ursprünglich entweder physikalische oder chemische Mutageneseprogramme durchgeführt (s. a. Kap. 1.3.3). Heutzutage bedient man sich meistens molekularer Mutagenesemethoden, wie z. B. der Insertionsmutagenese (Kap. 3.4). Neben Arginin-Mutanten und Vitamin-Co-Faktor-auxotrophen Mutanten, Mutanten im Schwefel-, Phosphor- und Stickstoff-Metabolismus, der Stärkesynthese, der Atmung u. a. eignet sich C. reinhardtii insbesondere für die Isolierung von photosynthetischen Mutanten und Stämmen mit Defekten im flagellaren Bewegungsapparat der Zelle. Photosynthese-Mutanten Die Herstellung von photosynthesedefekten Mutanten wird entscheidend dadurch erleichtert, dass C.-reinhardtii-Zellen in der Lage sind, heterotroph

1.5 Chlamydomonas reinhardtii

61

zu wachsen. Dazu muss im Medium, anstatt des für photoautotrophes Wachstum notwendigen CO2, Acetat als alternative Kohlenstoffquelle zur Verfügung stehen. Acetat wird über den Glyoxylat-Zyklus assimiliert. Außerdem kann die Grünalge im Gegensatz zu einigen anderen photoautotrophen Organismen auch im Dunkeln Chlorophyll synthetisieren, so dass auch unter heterotrophen Bedingungen eine korrekte Assemblierung photosynthetischer Komplexe stattfindet. Dadurch werden indirekte, durch Lichtstress hervorgerufene Effekte bei der Anzucht von Mutanten-Material ausgeschlossen. Die Identifizierung von Photosynthese-Mutanten erfolgte über ReplikaPlattierungsverfahren, in denen Einzelklone nach der Mutagenese sowohl auf Minimalmedium ohne Acetat als auch auf Medium mit Acetat angezogen wurden. Diejenigen Linien, die aufgrund eines Photosynthesedefekts nur auf Acetat-haltigem Medium wuchsen, wurden dann als Acetat-bedürftige (acetate requiring) oder ac-Mutanten bezeichnet, von denen es weltweit Hunderte gibt. Die Verbesserung digitaler Messmethoden erlaubt es heutzutage, die Chlorophyllfluoreszenz von einzelnen Klonen sehr schnell quantitativ zu erfassen. Damit lassen sich sogenannte hcf (high chlorophyll fluorescence)-Phänotypen, die durch einen gestörten photosynthetischen Elektronen-Transport hervorgerufen werden, leicht in größeren Klonpopulationen identifizieren. Die Messung der Fluoreszenzinduktion in Abhängigkeit von der Zeit erlaubt des Weiteren die Darstellung von Kinetiken, die charakteristisch für Defekte in einzelnen photosynthetischen Komplexen sind. Aus diesen und anderen biophysikalischen und biochemischen Daten lassen sich bereits erste Hinweise darauf erhalten, welche Teilaspekte der Photosynthese in einzelnen Mutanten betroffen sind. Die Genisolation von Photosynthese-Mutanten hat gezeigt, dass Untereinheiten der photosynthetischen Komplexe mutiert sind, die entweder im Chloroplastengenom oder im Kerngenom kodiert sein können. Interessanterweise erhielt man aber auch Mutanten, in denen die photosynthetischen Vorgänge nur indirekt betroffen sind. Aufgrund neuerer Erkenntnisse ist bekannt, dass in diesem Falle oft Faktoren beteiligt sind, die die Expression der Photosynthesegene insbesondere im Chloroplastengenom regulieren und damit eine koordinierte Organellen-Biogenese vermitteln. Solche Regulatoren bilden ein intrazelluläres Kommunikationssystem zwischen Kern- und Chloroplastengenom und stellen einen aktuellen Schwerpunkt in der molekulargenetischen Forschung der pflanzlichen Zellbiologie dar. Flagellen-Mutanten Mutanten, in denen die beiden gleichlangen Geißeln von C. reinhardtii betroffen sind, gehörten zu den ersten Stämmen, die von Genetikern näher

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1 Modellorganismen

untersucht wurden. Aufgrund ihrer Unbeweglichkeit waren diese Mutanten leicht zu erkennen und wurden als pf (paralyzed flagella)-Mutanten bezeichnet. Heutzutage sind Mutationen für nahezu alle Komponenten des Flagellen-Axonems bekannt, das einen typischen mikrotubulären Aufbau nach dem (9 + 2)-Muster aufweist. Insgesamt sind mehr als 75 verschiedene Loci beschrieben, die an der Assemblierung sowie der Funktion der Flagellen beteiligt sind. Mehr als 40 Gene wurden bisher isoliert, deren Produkte flagellare Komponenten darstellen. Ein besonderes Augenmerk wird dabei in der aktuellen Forschung auf das vor zehn Jahren erstmals in C. reinhardtii entdeckte Phänomen des intraflagellaren Transports (IFT) gelegt. IFT ist notwendig für die Assemblierung der Geißeln und besteht aus einer bidirektionellen Bewegung von Protein-Komplexen entlang des Axonems. Interessanterweise zeigen die beteiligten Faktoren weitgehende Homologien zu tierischen Komponenten von Cilien und Flagellen, deren Mutation, z. B. in Säugern, schwerwiegende Krankheiten der Niere oder des Auges hervorrufen können. DNA-vermittelte Transformation Die erfolgreiche Transformation von C.-reinhardtii-Zellen wurde lange Zeit dadurch behindert, dass geeignete homologe Selektionsmarker nicht zur Verfügung standen. Antibiotika-Resistenzmarker aus anderen Organismen konnten ebenfalls nicht zur Selektion genutzt werden, da der spezielle Codon-Gebrauch der Alge die Expression der Fremdgene verhinderte. Der Durchbruch gelang dann im Jahre 1989 durch Arbeiten von J.-D. Rochaix und K. Kindle, die die C.-reinhardtii-eigenen Gene Arg7 (Argininsuccinat-Lyase) bzw. Nit1 (NitratReduktase) als Selektionsmarker nutzten, die Defekte in den entsprechenden auxotrophen Mutanten arg7 und nit1 komplementierten. Das Repertoire an nukleären Selektionsmarkern hat sich seitdem wesentlich verbessert, was insbesondere durch die künstliche Anpassung des Codon-Gebrauchs der Fremdgene an den von C. reinhardtii ermöglicht wurde (Kap. 3.4). Für das Einbringen von DNA in das Kerngenom wurde im Jahre 1990 eine noch heute gebräuchliche, sehr kostengünstige Methode entwickelt, die auf der Agitation der Zellen mit Glaskügelchen basiert. Die Integration dieser DNA erfolgt durch heterologe Rekombination und daher zufällig in die Rezipienten-DNA. Die Tatsache beschleunigte die Entwicklung der Insertionsmutagenese zu einem Mittel der genetischen Markierung und Isolierung nukleärer Loci (Kap. 3.4). Von herausragender Bedeutung für die genetische Analyse von Chloroplasten war 1988 die Entwicklung eines biolistischen Transformationssystems. Mit Hilfe einer Partikelkanone werden dabei kleine, mit DNA beladene Wolfram-Partikel in die Zellen geschossen. Die ersten Transformanten wurden

1.5 Chlamydomonas reinhardtii

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durch die Komplementation plastidärer Deletionsmutanten des atpB-Gens (Ƣ-Untereinheit der ATP-Synthase) selektionierbar. Heutzutage stehen eine Reihe positiv selektionierbarer Marker für die Chloroplastentransformation zu Verfügung, die im Wesentlichen auf Antibiotika-Resistenzgenen beruhen (Kap. 3.4). In Chloroplasten, wie auch in Mitochondrien, existiert ein homologes Rekombinationssystem für die Integration von eingeführter DNA in das Genom. Dies lässt sich leicht nachvollziehen, wenn man bedenkt, dass Organellen der Endosymbiontentheorie nach ihren phylogenetischen Ursprung in ehemals freilebenden Prokaryoten haben. Offensichtlich blieb deren Rekombinationssystem im Laufe der Evolution in Chloroplasten und Mitochondrien erhalten. Damit sind „revers genetische“ Ansätze im Rahmen der Chloroplasten-Genetik möglich, und in der Tat sind nahezu alle bekannten Leserahmen des Chloroplasten im Laufe der letzten 15 Jahre durch ortsgerichtete Mutagenese untersucht worden. Verfügbarkeit der Gesamtgenomsequenz Kerngenom Das haploide Kerngenom von C. reinhardtii besteht aus ungefähr 100 bis 110 Mb, die in 17 genetischen Kopplungsgruppen (Chromosomen) organisiert sind. Der G+C -Gehalt der chromosomalen DNA ist ungewöhnlich hoch (nahezu 65 %), was sowohl ihre Klonierung als auch ihre Sequenzierung in der Vergangenheit erschwert hat. Vor kurzem konnte eine molekulare Karte des Kerngenoms erstellt werden, die die Positionen von 264 molekularen Markern und 200 genetischen Markern vereint. Dabei wurde die Abdeckung mit molekularen Markern so gewählt, dass von jeder beliebigen Genomposition ein Marker innerhalb der nächsten 2 cM (entspricht 150–200 kb) erreicht werden kann. Zur Zeit wird die vollständige Genomsequenz in den USA ermittelt. Eine erste Version der fast vollständigen Sequenz steht seit dem Frühjahr 2003 der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung. Bis zum Herbst 2004 soll diese Sequenz komplett und annotiert sein. Des Weiteren ist eine BAC (bacterial artificial chromosomes)-Genbank erhältlich, die aus 15 000 Klonen besteht und das nukleäre Genom ungefähr achtmal enthält. Jeder dieser Klone wurde von beiden Seiten ansequenziert, was in Kombination mit der molekularen Karte und der Genomsequenz die Anordnung von „BAC contigs“ erlaubt. Am Ende dieser Arbeiten wird ein Satz an definierten, überlappenden BAC-Klonen verfügbar sein, der das nukleäre Genom vollständig abdeckt.

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1 Modellorganismen

Neben der Entschlüsselung der genomischen DNA Sequenz wurden vor wenigen Jahren EST (expressed sequence tags)-Sequenzierungsprojekte initiiert, die ausgehend von verschiedenen cDNA-Banken bis zum heutigen Zeitpunkt Sequenzdaten von 200 000 Einzelklonen geliefert haben. Diese Klone stellen nun die Basis für die Herstellung erster Mikroarrays dar, die eine genomweite Analyse der Genexpression erlauben. Organellengenome Die Sequenz des mitochondrialen Genoms von C. reinhardtii wurde bereits im Jahre 1993 ermittelt. Es ist linear, nur 15,7 kb groß und enthält dementsprechend auch nur 13 Gene, von denen drei tRNA-Gene sind. Auffällig ist, dass die beiden ribosomalen Gene in mehrere kleinere Module aufgeteilt sind, deren RNA-Produkte sich erst posttranskriptionell zu einer funktionalen rRNA assemblieren müssen. Das Chloroplastengenom dagegen umfasst 203,4 kb und enthält eine inverse Sequenzwiederholung (inverted repeat) von 21,2 kb, die die rRNA-Gene trägt und zwei Einzelkopie-Regionen von ungefähr 80 kb voneinander trennt. Seit 2002 ist die vollständige Sequenz des plastidären Genoms bekannt. Es enthält 99 Gene einschließlich eines kompletten Satzes von 30 tRNA-Genen und eine Vielzahl an kurzen Sequenzwiederholungen. Diese sogenannten SDRs (short dispersed repeats) finden sich in intergenischen Bereichen und machen ca. 20 % des Genoms aus. Ihre Funktion ist bis jetzt noch unklar, aber es wird vermutet, dass sie etwas mit der lichtabhängigen Regulation der DNA-Konformation oder rekombinatorischen Ereignissen zu tun haben. 1.5.4 Biologische Fragestellungen Wie bereits erwähnt, werden an der einzelligen Alge C. reinhardtii verschiedene biologische Fragestellungen bearbeitet. Dabei sind insbesondere die aus der eukaryotischen Zellbiologie hervorzuheben, die nicht in dem einzelligen Modellorganismus S. cerevisiae (Kap. 1.3.4) untersucht werden können. Dazu zählen zum einen alle Funktionen, die mit der photoautrophen Ernährungsweise von C. reinhardtii zu tun haben und solche, die notwendig für die Bewegung der Zelle sind. Wie in Kap. 1.5.3 ausgeführt, bilden dabei eine Vielzahl an charakterisierten Mutanten den Ausgangspunkt für die Identifizierung der beteiligten Gene und damit ihre weitergehende molekulare Analyse. Im Laufe der letzten zehn Jahre wurden eine Reihe von kernkodierten regulatorischen Faktoren sowohl in C. reinhardtii als auch A. thaliana entdeckt, die die Genexpression im Chloroplasten steuern und damit eine zelluläre Integration des Organells ermöglichen. In C. reinhardtii wirken diese Faktoren offen-

1.5 Chlamydomonas reinhardtii

65

bar hauptsächlich auf posttranskriptioneller Ebene, indem sie die Stabilität und Reifung plastidärer RNAs kontrollieren oder ihre Translation ermöglichen. Die Kartierung der plastidären RNA-Elemente, die von diesen Faktoren erkannt werden, lässt sich insbesondere in C. reinhardtii durch elegante genetische Ansätze mit transplastomen Linien durchführen (Kap. 2.4). Neben der Biogenese der Chloroplasten hat sich C. reinhardtii aufgrund der effizienten Transformierbarkeit seines Chloroplasten außerdem für detaillierte Struktur/Funktionsanalysen angeboten. So sind z. B. viele Untereinheiten von photosynthetischen Komplexen gezielt durch Punktmutationen verändert worden, um die Bedeutung einzelner Aminosäuren für den Aufbau und die Funktion dieser Einheiten zu verstehen. Wie bereits in Kap. 1.5.3 erwähnt, stellt der Bewegungsapparat einen weiteren Schwerpunkt der wissenschaftlichen Arbeit mit C. reinhardtii dar. Neben den Komponenten, die die Flagellen aufbauen und ihre Funktion gewährleisten, sind in jüngster Zeit besonders die Aspekte der gerichteten, in der Regel phototaktischen Bewegung und der damit verbundenen Lichtperzeption in den Vordergrund des Interesses gerückt. 1.5.5 Genetische Ressourcen Mutanten von C. reinhardtii werden in verschiedenen Laboren weltweit hergestellt und aufbewahrt. Die wichtigste internationale Sammelstelle stellt das „Chlamydomonas Genetics Center“ in den USA dar, von dem Wildtypund Mutantenstämme sowie genomische und cDNA-Klone nukleärer, mitochondrialer und plastidärer Gene angefordert werden können. Anhand einer übersichtlichen Internetseite (www.biology.duke.edu/chlamy/) lassen sich außerdem Hintergrundinformationen zu den Stämmen und Klonen erhalten sowie weitere Informationen, z. B. über Praktikumsversuche mit C. reinhardtii. Zusätzlich gibt es zwei weitere wichtige Datenbanken für C. reinhardtii. „ChlamyEST“ enthält Informationen zu cDNA-Sequenzanalysen und die genomische Sequenz ist zugänglich am „JGI Chlamydomonas Genome Portal“ (www.jgi.doe.gov/chlamy/). In Zukunft sollen diese Datenbanken in einer generischen Modellorganismen-Datenbank zusammengefasst werden, entsprechend der „FlyBase“ von Drosophila melanogaster (Kap. 1.7). Die Sequenzinformation zum Chloroplastengenom der Alge ist ebenfalls über die Internetseite des „Chlamydomonas Genetics Center“ erreichbar.

66

1 Modellorganismen

1.6 Arabidopsis thaliana Die Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) ist eine kleinwüchsige, annuelle Crucifere (Brassicaceae, Brassicales), die seit fast anderthalb Jahrzehnten zum herausragenden Modellobjekt der pflanzlichen Molekularbiologie, Physiologie und Entwicklungsbiologie avanciert ist. Abb. 1.6.1 zeigt den Habitus von Pflanzen verschiedener Linien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Systematische Einteilung Abteilung: Klasse: Ordnung: Familie: Gattung:

Streptophyta Magnoliopsida Brassicales Brassicaceae Arabidopsis

Genomsteckbrief • • • • • • •

nukleäres Genom: 125 Mb Chromosomenzahl (haploid): 5 Zahl der proteinkodierenden Gene: etwa 25 500 mitochondriales Genom: 154 478 bp Zahl der proteinkodierenden Gene: 58 chloroplastidäres Genom: 366 924 bp Zahl der proteinkodierenden Gene: 158

1.6.1 Historisches vor ca. 40 Millionen Jahren: Infolge eines Bastardisierungsereignisses zweier verwandter Arten entsteht irgendwo in Eurasien ein tetraploider Organismus, aus dem sich die Gattung Arabidopsis entwickelt. Durch Chromosomeneliminierung entsteht dabei im Laufe der Zeit erneut ein diploider Organismus (haploider Chromosomensatz n = 5). Die ursprüngliche Tetraploidie lässt sich heute noch anhand der riesigen Duplikationen im Genom, die 60 % des gesamten Nucleoms umfassen, nachweisen

1.6 Arabidopsis thaliana

1588 1753 1842 1900 1907

1945 1972 1974 1986

1993 2000

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erste Beschreibung der Art durch den sächsischen Arzt Johannes Thal (1542/43–1583) Linnaeus führt die Pflanze als Pilosella siliquosa minor in seinem Werk „Species Plantarum“ (Lawrentius Salvius, Holmiae) auf Gustav Heynhold (1800 – ca. 1860), endgültige Zuordnung zur Gattung Arabidopsis (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Wiederentdeckung der mendelschen Vererbungsregeln durch von Seysenegg, Correns und de Vries Laibach, ein Schüler Eduard Strasburgers in Bonn, weist die Kontinuität der Chromosomen von Arabidopsis thaliana während der Interphase nach und schließt, dass die mendelsche Segregation von Erbanlagen durch das Verhalten der Chromosomen während der Zellteilung erklärt werden kann. Die Chromosomentheorie der Vererbung geht also auf Arabidopsis zurück (erst 1910 entdeckte Morgan das Gen für Weißäugigkeit bei Drosophila). Beginn der Genetik an Arabidopsis thaliana Reinholz führt während des 2. Weltkriegs die ersten Untersuchungen zur mendelschen Segregation an Arabidopsis thaliana durch Sparrow weist den geringen DNA-Gehalt von Arabidopsis thaliana anhand von Feulgen-gefärbten Zellkernen nach Schell et al. entdecken das Ti-Plasmid in Agrobacterium tumefaciens erste erfolgreiche Transformation von Arabidopsis thaliana mittels Agrobacterium tumefaciens unter Verwendung gentechnisch hergestellter, nicht-onkogener Ti-Plasmide Entwicklung der Vakuum-Infiltrationsmethode zur ArabidopsisTransformation (Bechthold, Caboche et al.) am 14. Dezember wird im Heft Nr. 6814 der Zeitschrift Nature die komplette Sequenz des Nukleoms von Arabidopsis thaliana publiziert (The Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 408 (2000) 794–815). Es handelt sich um die erste komplette Entschlüsselung der Basenabfolge eines pflanzlichen Genoms

Das natürliche Verbreitungsgebiet der Acker-Schmalwand umfasst Europa und die gemäßigten Klimazonen Mittel- und Ostasiens. Vermutlich auf den Seewegen wurde die Pflanze an die Küsten Nordamerikas, Südamerikas, Afrikas, Ostaustraliens und Neuseelands verfrachtet, wo zahlreiche disjunkte Vorkommen dokumentiert sind, darunter eines in Feuerland (Sitte et al. 2002).

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1 Modellorganismen

Die ursprüngliche Heimat der Acker-Schmalwand ist nicht genau bekannt, ein eurasischer Ursprung jedoch gesichert. Aufgrund der Genomstruktur, die durch riesige, etwa 60 % des Genoms umfassende, Duplikationen gekennzeichnet ist, lässt sich auf einen tetraploiden Ursprung der Art rückschließen. Die Analyse der DNA-Sequenzdivergenzen in den duplizierten Genombereichen ergibt ein ungefähres Alter von 40 Mio. Jahren, die seit der Tetraploidisierung vergangen sein müssen: Etwa in dieser Zeit ist demnach die heutige Gattung Arabidopsis infolge einer Hybridisierung zweier verwandter, diploider Ausgangsarten entstanden. Durch Chromosomeneliminierung entwickelte sich aus dem tetraploiden Bastard im Laufe der Zeit erneut eine diploide Art. Der Chromosomensatz der Acker-Schmalwand im diploiden Zustand beträgt 2n = 10, im haploiden Zustand also n = 5. Seit 1842 trägt die Art ihren bis heute gültigen Namen. Die Zuordnung nahm Gustav Heynhold in der 1842 erschienenen Flora Saxoniae vor. Einen Meilenstein der Genetik verdanken wir der Arbeit Laibachs an der Acker-Schmalwand. Dem Schüler Eduard Strasburgers gelang es, an dieser Species die Kontinuität der Chromosomen während der Interphase nachzuweisen. Laibach kam 1907 zu dem Schluss, dass die erst 1900 wiederentdeckte mendelsche Aufspaltung der Erbanlagen sich durch das Verhalten der Chromosomen erklären ließ — der Grundstein zur Chromosomentheorie der Vererbung war gelegt, dank der Acker-Schmalwand. Die Mitte des 20. Jahrhunderts gemachten Befunde, dass Arabidopsis thaliana einen sehr kleinen DNA-Gehalt besitzt und sich sehr gut mutagenisieren lässt, machte die Pflanze für Genetiker zunehmend interessant. So avancierte sie in den 80er Jahren des 20. Jahrhunderts zur „grünen Drosophila“, und in einer weltweiten Kooperation gelang es, bis zum Jahre 2000 die gesamte DNASequenz von Arabidopsis thaliana mit großer Genauigkeit zu bestimmen. 1.6.2 Lebenszyklus Die Acker-Schmalwand ist eine anspruchslose, rasch wachsende Pflanze. Frisch geerntete Samen weisen eine milde Dormanz auf, die durch Aufbewahrung der Samen in gequollenem Zustand beseitigt werden kann (2–5 Tage bei 4–6 °C; am besten stellt man die Aussaatschalen nach Einsäen und Angießen des Saatguts — oder bei steriler Anzucht die Petrischalen mit aufgebrachtem Saatgut — kühl; dabei muss nicht belichtet werden). Die Keimung erfolgt danach (im Licht oder im Dunkeln) innerhalb von 2–3 Tagen. Die sehr feinen Samen (Tausendkorngewicht ca. 19 mg) behalten ihre Keimfähigkeit nur wenige Monate. Sie sollten (trocken!) bei 4 °C gelagert werden, um möglichst lange keimfähig zu bleiben.

1.6 Arabidopsis thaliana

C24

Col-0

1 cm

1 cm

a

b

C24

Col-0

c

69

1 cm

d

1 cm

Abb. 1.6.1 a–d. Habitus der Acker-Schmalwand. (a) Linie C24, Alter 10 Wochen, (b) Linie Col-0, Alter 10 Wochen, (c) Linie C24, Alter 6 Wochen, (d) Linie Col-0, Alter 6 Wochen

70

1 Modellorganismen

Die Anzucht im Gewächshaus erfolgt am besten auf einem Gemisch von lockerer Standarderde, Torf, Bimskies, Quarzsand und Vermiculit (6 : 1,5 : 1,5 : 2 : 2 Volumenteile) bei einer Nachttemperatur von 16–18 °C, einer Tagtemperatur von 22–24 °C und einer relativen Luftfeuchte von 50–70 % bei einer photosynthetisch aktiven Strahlung von 100–200 µmol m–2 s–1 Photonen (PAR). Als Lichtquelle reichen neutralweiße Neonröhren aus. Die gleichmäßige Aussaat wird erreicht durch Übersieben des Saatguts (evtl. mit feinem Sand vermischt); 25 mg Saatgut, auf einer Fläche von 30 × 40 cm ausgebracht, sind optimal. Abdeckung mit einer feinen Schicht Sand verhindert das Austrocknen der keimenden Samen und erhöht somit die Gleichmäßigkeit des Angehens. Jungpflanzen pikiert man am besten in einem Alter von 2–4 Wochen im Abstand von ca. 5 cm zwischen benachbarten Pflanzen. Da es sich bei Arabidopsis thaliana um eine fakultative Langtagpflanze handelt, blüht sie auch im Kurztag (9–12 h Licht pro 24 h Tag) nach etwa 12 Wochen (unterschiedlich je nach Linie), kann jedoch durch Langtagbedingungen (≥ 16 h Licht pro 24 h Tag) zum früheren Blühen (nach etwa 8 Wochen) gebracht werden. Steril in abgedeckten Gefäßen gehaltene Pflanzen blühen meist erheblich früher (zur Sterilaufzucht von Arabidopsis thaliana, Kap. 3.5). 1.6.3 Technische Entwicklungen Neben der leichten Anzucht und kurzen Generationszeit sprechen weitere Gründe für die Verwendung der Acker-Schmalwand als Modellorganismus: 1. Die Pflanze ist ein obligater Selbstbefruchter und dadurch leicht reinerbig zu halten. Es treten — im Unterschied zu Fremdbefruchtern — keine Inzuchtdepressionen auf. 2. Arabidopsis thaliana besitzt innerhalb der Blütenpflanzen das kleinste Kerngenom. Es besteht im haploiden, unreplizierten Zustand aus etwa 125 Millionen Basenpaaren DNA-Sequenz (125 Mb), verteilt auf fünf Chromosomen (s. u.). 3. Die DNA im Zellkern weist eine hohe Gendichte auf, es gibt weniger als ein Viertel nicht kodierende DNA-Abschnitte. Dadurch lässt sich die Acker-Schmalwand leicht mutagenisieren. Die Pflanze spricht gut auf gängige Mutageneseverfahren an, wie z. B. chemische Mutagenese mit Ethylmethansulfonat und T-DNA-Insertionsmutagenese mit Agrobacterium tumefaciens (s. u.). 4. Die Pflanze lässt sich mit Agrobacterium tumefaciens sehr leicht und mit verhältnismäßig hoher Effizienz (≥ 1 %) transformieren (Kap. 3.5.1). 5. Die geringe Individuengröße (voll ausgewachsene Blattrosetten besitzen einen Durchmesser von 5–7 cm, blühende und fruchtende Pflanzen eine

1.6 Arabidopsis thaliana

71

Höhe von ca. 15–20 cm) erlaubt es, auf kleiner Fläche große Individuenzahlen anzuziehen, was für genetische Experimente wichtig ist. 6. Die Pflanze bildet zahlreiche Samen (bis zu 1000 Stück pro Individuum) und lässt sich so effizient vermehren. Diesen Vorteilen stehen auch (wenige) Nachteile gegenüber. Die AckerSchmalwand ist empfindlich gegen Staunässe. Die nur 2–2,5 mm großen Blüten in Verbindung mit einer unmittelbar vor oder nach Öffnen der Blüte eintretenden Selbstbestäubung machen gezielte Kreuzungsexperimente diffizil (Kap. 2.5.1). Allerdings kennt man heute verschiedene männlich sterile Mutanten, die für viele Kreuzungsexperimente u. U. geeignet sind. Ein dritter Nachteil schließlich ist bedingt durch die geringe Größe: Arabidopsis thaliana eignet sich nur bedingt für biochemische bzw. enzymologische Arbeiten, da man hier nicht selten Pflanzenmaterial im kg-Maßstab benötigt. Eine ausgewachsene Blattrosette der Acker-Schmalwand wiegt etwa 1 Gramm! Allerdings steigert sich die Nachweisempfindlichkeit vieler Methoden mit der Zeit, so dass heute selbst Spurenkomponenten wie Pflanzenhormone in geringsten Gewebeproben nachgewiesen werden können (Müller et al. 2002). Gene und Genome Die Sequenz des Arabidopsis-thaliana-Kerngenoms (sequenziert wurde die DNA der Linie Col-0) wurde in der Zeitschrift Nature am 14. Dezember 2000 publiziert. Bekannt sind auch die Nukleotidsequenzen des Mitochondriengenoms und des Plastidengenoms, so dass die Acker-Schmalwand die erste Art war, deren DNA-Bestand vollständig sequenziert werden konnte. Ein Zugang zu den Genomsequenzen sowie zu der inzwischen gewaltig angewachsenen Information über Arabidopsis thaliana ist gegeben über arabidopsis.org, die Startseite von TAIR (The Arabidopsis Information Resource). Sehr große Sammlungen an Mutanten, die heute bereits nahezu jedes bekannte Gen erfassen und die von unterschiedlichen Labors unabhängig voneinander angelegt wurden, kann man für wissenschaftliche Zwecke gegen eine moderate Gebühr nutzen — stellenweise erst nach Unterzeichnung eines Kooperationsabkommens. Die öffentliche Verfügbarkeit nahezu sämtlicher Informationen, Mutanten und weiteren Werkzeuge, die für Arabidopsis thaliana entwickelt wurden, haben den an dieser Pflanze Forschenden ein einmaliges Instrumentarium an die Hand gegeben, welches ständig vervollkommnet wird — durch die Beiträge aller. Da sämtliche entwicklungsrelevanten Gene dem Nukleom zuzurechnen sind, erfährt dieses Subgenom die Hauptaufmerksamkeit der Molekular- und

72

1 Modellorganismen

Entwicklungsbiologen. Mutationen und eine Analyse der durch sie hervorgerufenen phänotypischen Veränderungen sind ein wichtiges Instrument in der Analyse vieler Entwicklungsprozesse, aber auch zahlreicher anderer Lebensprozesse. Heute werden fast ausschließlich zwei Mutagene eingesetzt: 1. Das Alkylierungsmittel Ethylmethansulfonat, welches infolge chemischer Veränderung der DNA-Basen durch Alkylierung an deren O- bzw. NAtomen Punktmutationen hervorruft bzw. 2. die T-DNA als Insertionsmutagen. Das Prinzip der Insertionsmutagenese mittels einer modifizierten T-DNA wird in Abb. 1.6.2 dargestellt und in der Legende erläutert (vgl. Kap. 3.5). Nomenklatur Vielfach werden heute zur Bezeichnung von Genen, Proteinen und Mutanten Akronyme verwendet. Dabei haben sich die an Arabidopsis Forschenden auf bestimmte Konventionen geeinigt, deren Kenntnis die Orientierung erleichtert. Tabelle 1.6.1 fasst die Übereinkünfte zusammen, nach denen A.-thalianaMutanten, Gene und Proteine benannt werden. 1.6.4 Biologische Fragestellungen Die Acker-Schmalwand eignet sich insbesondere zur Klärung entwicklungsbiologischer, weniger für biochemische Fragestellungen, letzteres wegen der Schwierigkeit, große Mengen an Pflanzenmaterial für Aufarbeitungszwecke heranzuziehen. Gerade die leichte Herstellbarkeit von Mutanten, das kompakte Genom sowie der kurze Generationszyklus prädestinieren Arabidopsis thaliana zur Bearbeitung entwicklungsgenetischer Fragestellungen, und so ist es kein Zufall, dass auf diesem Gebiet nicht nur in den vergangenen Jahren herausragende Fortschritte erzielt wurden, sondern diese auch für die weitere Zukunft erwartet werden können (Bowman 1994; Meyerowitz und Somerville 1994). Zu den wissenschaftlichen Durchbrüchen, die durch Arbeiten an A. thaliana erzielt wurden, gehören 1. die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung des kompletten Satzes pflanzlicher Photorezeptoren (5 Phytochrome, 2 Cryptochrome, 2 Phototropine); 2. die Identifizierung der ersten pflanzlichen Hormonrezeptoren (für Ethylen und Cytokinine) und der Nachweis, dass diese zu den für Prokaryoten typischen Phosphorelais-Regulatoren zählen);

1.6 Arabidopsis thaliana

73

v ir-

ori

R e gio n

HelferPlasmid

ori ori

vi r- R e gio n

modifiziertes Ti-Plasmid

Ti-Plasmid

LB LB

T- D N A

RB T- D N A

a

Insertion der T-DNA in die pflanzliche DNA

RB

selektierbares Markergen, z.B. npt pflanzliche DNA

b

pflanzliches Gen

Abb. 1.6.2 a, b. Insertionsmutagenese mittels T-DNA. (a) Das tumorinduzierende Plasmid (Ti-Plasmid) von Agrobacterium tumefaciens enthält einen DNA-Abschnitt (die T-DNA), der in das Kerngenom von Wirtspfl anzen übertragen und dort stabil an beliebiger Stelle in die DNA des Euchromatins (transkriptionsaktive Bereiche der Chromosomen) integriert wird. Entscheidend sind die als LB (left border) und RB (right border) bezeichneten Grenzen der T-DNA, bei denen es sich um kurze, 25 Basenpaare umfassende, invertierte Sequenzwiederholungen handelt. DNA-Bereiche zwischen den Grenzen werden zusammen mit diesen in das Pflanzengenom integriert. Dazu bedarf es einer Reihe von Genfunktionen, die in der Virulenz-Region (vir-Region) des Ti-Plasmids kodiert werden. (b) Das Ti-Plasmid ist Grundlage für moderne binäre Plasmidsysteme, bei denen die vir- und die übrigen Funktionen des Ti-Plasmids getrennt vorliegen. Verwendet man Agrobacterium-Stämme, die die virRegion auf einem Helferplasmid tragen, muss man nur noch das Teil-Ti-Plasmid mit der T-DNA dahingehend modifizieren, dass die gewünschte DNA zwischen die LBund RB-Region integriert wird. Das Teil-Ti-Plasmid ist (im Gegensatz zur Darstellung) viel kleiner und daher besser handhabbar als das Ti- oder das Helferplasmid. Im Falle eines Insertionsmutagenesevektors verwendet man ein selektierbares Markergen wie npt, welches eine Antibiotikaresistenz kodiert (npt kodiert Neomycinphosphotransferase, ein Enzym, das durch Phosphorylierung Antibiotika wie Neomycin und Kanamycin inaktiviert). Pflanzen mit ins Genom eingebauter T-DNA werden daher antibiotikaresistent. Integriert die T-DNA in den Kodierungsbereich eines Gens, so führt dies in den meisten Fällen zum Totalausfall der Genfunktion

74

1 Modellorganismen

Tabelle 1.6.1. Konventionen zur Bezeichnung von Arabidopsis-thaliana-Mutanten, Kerngenen und von diesen kodierten Proteinen. Zusätzlich zu den hier aufgeführten Konventionen werden bisweilen zur Bezeichnung von mRNAs Codes der Form Xxx verwendet (drei kursive Buchstaben, erster groß, folgende klein) Bezeichnungsklasse Mutante bzw. deren Phänotyp mutiertes Gen

Beispiel ethylene resistant

Erläuterung Kleinbuchstaben, kursiv

etr 1-1

drei Kleinbuchstaben, aus der Mutantenbezeichnung gebildet, kursiva ETR Wildtypgen drei Großbuchstaben, kursiv kodiertes Protein ETR drei Großbuchstaben, normalb a die erste Zahl vor dem Bindestrich gibt entweder das — in der Reihenfolge der Entdeckung nummerierte — Allel oder, bei einer aus der Nukleotidsequenz abgeleiteten Isogenfamilie, die Isogen-Nummer an. Nach dem Bindestrich werden allelische Varianten (z. B. verschiedene Punktmutanten innerhalb des gleichen Gens) aufgeführt. Der Dreibuchstabencode zur Bezeichnung von Genen ist weitgehend erschöpft (die Anzahl der Buchstaben des Alphabets reicht nicht aus, um alle Gene mit einem solchen Code zu versehen: 263 = 17 576). Daher verwendet man heute einen Vierbuchstabencode (264 = 456 976). Älteste Genbezeichnungen kamen noch mit zwei Buchstaben aus und bleiben gültig. b bei Proteinen mit prosthetischer Gruppe, z. B. Photorezeptoren mit kovalent gebundenem Chromophor, bezeichnen die normalen Buchstaben das Apoprotein (z. B. PHYB, Phytochrom B); das Holoprotein wird mit drei normalen Kleinbuchstaben bezeichnet (z. B. phyA, Phytochrom-A-Holoprotein mit gebundenem Chromophor)

3. die Entdeckung einer sehr großen Membranrezeptorfamilie (über 250 Vertreter), der LRR-Rezeptorkinasen, und ihrer Bedeutung für die Pathogenabwehr, Symbiose und „Erkennung“ von Peptid-Signalstoffen; 4. die Aufklärung grundlegender Prozesse der Embryogenese und Meristementwicklung sowie der Festlegung von Organidentitäten beim Übergang eines Sprossmeristems zum Blütenmeristem; 5. die Entdeckung zahlreicher neuer und pflanzenspezifischer Typen von Transkriptionsfaktoren, welche die entwicklungsbiologische Eigenständigkeit von Pflanzen deutlich belegen. Eine Reihe hervorragender Übersichtsartikel bietet „The Arabidopsis book“, das online unter www.bioone.org frei verfügbar ist.

1.7 Drosophila melanogaster

75

1.6.5 Genetische Ressourcen Hunderte Aufsammlungen von unterschiedlichen Standorten weltweit werden in Stammsammlungen wie z. B. dem Arabidopsis Biological Resource Center an der Michigan State University (Ohio, USA) bewahrt und repräsentieren den „Genpool“ dieser Art. In der Grundlagenforschung zumeist verwendete Linien sind Landsberg erecta, eine durch Röntgenbestrahlung hergestellte Mutante der ursprünglichen Linie Landsberg, Col-0 (aus dem ursprünglich heterogenen Landsberg-erecta-Saatgut an der Columbia-Universität isolierte, homogene Linie), Wassilewskaja und C24. Daneben sind hunderte weitere Aufsammlungen von natürlichen Standorten verfügbar. Sämtliche relevanten Datenbanken und Informationen über die genetischen Ressourcen können angewählt werden über die Internetseite arabidopsis.org. Eine Aufstellung der großen Anzahl an weltweiten Informationsquellen erübrigt sich daher, sie lassen sich über das angegebene Eingangsportal anwählen.

1.7 Drosophila melanogaster Viele Arbeiten der letzten Jahre haben übereinstimmend gezeigt, dass die Analyse von Modellorganismen zu systemübergreifenden Erkenntnissen führt. Insbesondere Forschungen an der Taufliege Drosophila melanogaster haben in den vergangenen Jahren zu wesentlichen Einblicken in die genetische Steuerung der Entwicklung auch bei Säugetieren und beim Menschen geführt. Drosophila wird seit fast 100 Jahren genetisch untersucht. Der Organismus ist experimentell relativ leicht handhabbar und wird nicht zuletzt wegen der geringen Zuchtkosten häufig auch im Schulunterricht eingesetzt. Eine Vielzahl von molekulargenetischen Techniken erlaubt in Kombination mit der im letzten Jahrhundert aufgebauten genetischen Methodik eine effiziente und weit reichende Analyse einzelner Genfunktionen. Viele der in den letzten Jahren erzielten Forschungsergebnisse zeigen, dass die wesentlichen Entwicklungs- und Funktionsprinzipien während der Evolution stark konserviert sind. Systematische Einteilung Stamm: Arthropoda Klasse: Insecta Unterklasse: Neoptera

76

1 Modellorganismen

Ordnung: Familie: Gattung:

Diptera Drosophilidae Drosophila

Genomsteckbrief • • • • •

nukleäres Genom: ca. 170 Mb Chromosomenzahl: 4 Zahl der proteinkodierenden Gene: ca. 14 000 mitochondriales Genom: 19 517 bp Zahl der proteinkodierenden Gene: 13

1.7.1 Historisches 1907

1908 1913 1914 1927 1969 1978 1980

1982 1983

Thomas Hunt Morgan führt Drosophila melanogaster als Untersuchungsobjekt in die Genetik ein. Mit seinen Schülern Alfred Sturtevant, Calvin Bridges und Hermann Muller beweist er in den Folgejahren die Chromosomentheorie der Vererbung (Nobelpreis 1933) Morgan entdeckt und beschreibt die erste Drosophila-Mutation white Sturtevant erstellt die erste Genkarte und zeigt damit die lineare Abfolge der Gene auf den Chromosomen Bridges entdeckt das non-disjunction-Phänomen und zeigt, dass die Chromosomen Träger der Gene sind Muller entdeckt die mutagene Wirkung der Röntgenstrahlung (Nobelpreis 1946) Joseph G. Gall und Mary-Lou Pardue führen die in-situ-Hybridisierung an Polytänchromosomen ein Edward Lewis entwickelt das Konzept der homöotischen Gene (Nobelpreis 1995) Christiane Nüsslein-Volhard und Eric Wieschaus decken in einem großangelegten Mutageneseexperiment die Grundmechanismen der Segmentierung auf (Nobelpreis 1995) Gerald Rubin und Allan Spradling erzeugen transgene Fliegen William McGinnis und Walter Gehring beschreiben die Homöobox

1.7 Drosophila melanogaster

1987 1989 1993

2000

77

Cahir O’Kane und Walter Gehring entwickeln die Enhancer-trapTechnik Kent Golic und Susan Lindquist führen das FLP/FRT-System der Hefe zur ortsspezifischen Rekombination ein Andrea Brand und Norbert Perrimon übertragen das GAL4/UASTransaktivationssystem aus der Hefe in das Fliegengenom und ermöglichen damit die gezielte ektopische Expression von Genen erste Veröffentlichung der euchromatischen Genom-Sequenz von Drosophila melanogaster (Adams et al. 2000)

Als vor etwa 100 Jahren die Taufliege Drosophila melanogaster als Untersuchungsobjekt in das Labor von Thomas Hunt Morgan (1866–1945) einzog, ahnte wohl noch niemand, welchen Siegeszug dieser Organismus sowohl in der Forschung als auch in der Lehre durchlaufen würde. Schnell wurde mit Hilfe dieser Tiere der Genbegriff gefestigt und nach Isolation der ersten Mutationen (die erste gefundene Drosophila-Mutation war white, eine rezessive Xchromosomale Mutation, die zu weißen Augen führt), konnte bereits 1913 von Alfred Sturtevant (1891–1970), einem Schüler von T. H. Morgan, die erste Genkarte gezeichnet werden, die eine lineare Abfolge der Gene auf dem Chromosom darlegt. 1915 haben T. H. Morgan und A. Sturtevant zusammen mit Calvin Bridges (1889–1938) das Buch „The Mechanism of Mendelian Heredity“ veröffentlicht, das Drosophila zu einem der Schlüsselorganismen der Genetik machte. Viele der uns heute vertraut und selbstverständlich erscheinenden Grundlagen wurden an Drosophila erarbeitet. Der Erfolg hatte eine Reihe von Gründen: Die Taufliegen sind klein, sehr leicht im Labor zu halten und stellen keine großen Ansprüche an die Zuchtbedingungen. Darüber hinaus erwies es sich als Glücksfall, dass das Genom von Drosophila aus nur vier Chromosomenpaaren besteht, von denen drei etwa gleich groß sind und das vierte so klein ist und so wenig Gene enthält, dass es in den meisten Kreuzungsexperimenten vernachlässigt werden kann. Die von C. Bridges 1935 gezeichneten Polytänchromosomen-Karten werden auch heute noch im Laboralltag verwendet. Zu Beginn des 21. Jahrhunderts erscheint uns Drosophila fast als gläserner Organismus: Das Genom ist vollständig sequenziert und eine sehr große Zahl von Mutationen beschrieben und über verschiedene Stammsammlungen frei verfügbar (fbserver.gen.cam.ac.uk). Es gibt heute eine Vielzahl von Methoden, die eine fast beliebige Manipulation des Genoms erlauben und damit eine relativ einfache Analyse selbst komplexester Fragestellungen wie der nach der genetischen Steuerung von Verhaltensmustern ermöglichen.

78

1 Modellorganismen

1.7.2 Lebenszyklus Drosophila ist ein holometaboler Organismus; die Larvalstadien und das Adultoder Imaginalstadium sind durch die während der Verpuppung stattfindende Metamorphose getrennt (Abb. 1.7.1). Die Weibchen legen bis zu 100 Eier pro Tag, die etwa 0,5 mm lang sind und einen Durchmesser von etwa 0,2 mm aufweisen. Das Ei zeigt bereits deutlich eine anterior-posteriore sowie eine dorso-ventrale Polarität (Abb. 1.7.1). Bei einer Temperatur von 25 °C entwickelt sich aus dem Ei innerhalb eines Tages eine Larve. Diese ist deutlich segmentiert: neben drei eingestülpten und damit verborgenen Kopfsegmenten sind drei thorakale und acht abdominale Segmente sichtbar. Das erste Larvenstadium dauert wiederum etwa einen Tag, danach häutet sich die Larve und lebt für einen weiteren Tag im zweiten Larvenstadium. Nach einer erneuten Häutung bleibt die Larve für 2–3 Tage im dritten Larvenstadium. Alle Larvenstadien sind von einem enormen Größenwachstum begleitet. Innerhalb nur weniger Tage nimmt das Gewicht um das etwa 200fache zu. Am Ende des dritten Larvenstadiums setzt die Wanderschaft (Wanderlarve) ein, in der ein trockener Platz zur Verpuppung gesucht wird. Anschließend kontrahiert sich die Larve allmählich und die vorderen Enden der beiden Haupttracheen, die anterioren Spirakel, werden nach außen gestülpt. Die larvale Kutikula wird zur Puppenhülle (Puparium) umgebildet, wobei sie zunächst noch weiß und weich ist und innerhalb von zwei Stunden eine braune Farbe annimmt und aushärtet (Vorpuppe). 4–6 Stunden nach Bildung des Pupariums löst sich die Epidermis von der Puppenhülle (Apolysis), und die Puppe wird während einer weiteren Häutung innerhalb des Pupariums gebildet. Innerhalb des fünf Tage dauernden Puppenstadiums wird der Organismus komplett umgebildet (Metamorphose). Während der Metamorphose werden einige Organe vollständig abgebaut (z. B. Fettkörper, Speicheldrüsen) andere werden umorganisiert (z. B. Malpighische Gefäße, Gehirn), wieder andere werden neu gebildet (z. B. die äußeren Strukturen der Fliege, die fast alle aus den Imaginalscheiben entstehen). In der Regel schlüpfen die Fliegen in den frühen Morgenstunden des fünften Tages nach der Verpuppung und sind bei einer Entwicklungstemperatur von 25 °C schon nach etwa vier Stunden geschlechtsreif. Der gesamte Generationszyklus dauert bei 25 °C also nur ca. zehn Tage. Allerdings ist die Entwicklungszeit stark temperaturabhängig, was für den Genetiker von großer praktischer Bedeutung ist. So kann beispielsweise nach einer Absenkung der Zuchttemperatur auf 18 °C der Beginn der Geschlechtsreife auf etwa 24 Stunden nach dem Schlüpfen der Fliegen aus der Puppenhülle gedehnt werden.

1.7 Drosophila melanogaster

Männchen

79

Weibchen

Puppe

1. Larvenstadium

Vorpuppe 2. Larvenstadium

3. Larvenstadium Abb. 1.7.1. Lebenszyklus von Drosophila melanogaster

Dies erleichtert die tägliche Kreuzungsarbeit enorm, da unbefruchtete (virginelle) Weibchen zum gezielten Weiterkreuzen nicht alle vier Stunden aus einem Zuchtgefäß abgesammelt werden müssen. Je nach Haltungsbedingungen können Drosophila-Fliegen zwei bis drei Monate alt werden. Embryonalentwicklung Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Befruchtung und ist in 17 verschiedene Stadien eingeteilt worden (Abb. 1.7.2). Während der ersten 2,5 Stunden der Entwicklung finden 13 sehr schnelle synchrone Kernteilungen statt. Bis auf einige wenige Kerne, die im Zentrum verbleiben ( Vitellophagenkerne), wandern die meisten in die Peripherie der Eizelle. Es liegt ein Synzytium vor, d. h. es sind noch keine Zellmembranen um die einzelnen Kerne eingezogen worden. Die ersten vom Embryo gebildeten Zellen sind die Polzellen, die sich nach ca. zwei Stunden am posterioren Pol abschnüren. Anschließend findet

80

1 Modellorganismen

auch die Zellularisierung der restlichen peripheren Kerne statt, was zum zellulären Blastoderm-Stadium (Stadium 5) führt. Bis zu diesem Zeitpunkt findet im Embryo kaum Transkription statt. Die meisten Genprodukte, die diese frühen Entwicklungsschritte steuern, sind bereits vor der Befruchtung vom mütterlichen Genom (maternale Gene) in der Eizelle deponiert worden. So wird auch die genetische Festlegung der Körperachsen durch maternale Informationen gesteuert. Ab dem zellulären Blastoderm-Stadium setzt die zygotische Genexpression ein. Die Segmentierungsgene (Gap-Gene, Paarregel-Gene, Segmentpolaritätsgene) unterteilen den Körper in die verschiedenen Segmente. Danach beginnt die Gastrulation. Die auf der Ventralseite liegenden präsumptiven Mesodermzellen verlagern sich in das Innere des Embryos. Gleichzeitig streckt sich der später sichtbar segmentierte Teil des Embryos, der auch als Keimstreif bezeichnet wird und umwächst den posterioren Pol, um schließlich eine U-förmige Position einzunehmen. Nach ca. vier Stunden (Stadium 9) beginnen sich die Anlagen des Vorder- und Enddarms einzustülpen. Mit diesen werden auch die beiden Primordien, die den späteren Mitteldarm bilden, ins Innere verlagert. Die Polzellen liegen nun in einer von der posterioren Mitteldarmanlage gebildeten Tasche. Nach der Ausstreckung des Keimstreifes wird die Segmentierung zunächst im Kopfbereich sichtbar. Sobald die segmentale Organisation des Embryos deutlich erkennbar ist, beginnt die Keimstreif-Verkürzung (Stadium 12). Gleichzeitig wächst die laterale Epidermis nach dorsal aus und umschließt den sich bildenden Mitteldarm. Nachdem der Embryo dorsal geschlossen ist, wird die zunehmende Unterteilung des Mitteldarms ein wichtiges Kriterium für die Altersbestimmung der Embryonen. Die Entwicklung des Nervensystems beginnt nach der Keimstreifausstreckung und endet kurz vor Schlüpfen der Larve. Die wichtigsten Stadien sind in der Abb. 1.7.2 zusammengefasst. Bei 20 °C dauert die Embryonalentwicklung etwa 24 Stunden, bei 18 °C etwa 40 Stunden (Campos-Ortega 1997). Larvalentwicklung Einen Tag nach dem Schlüpfen der Larve aus dem Ei findet die erste Häutung statt, nach einem weiteren Tag die zweite Häutung. Das dritte Larvenstadium (L3) dauert 2–3 Tage. Die Häutungen werden hormonell durch unterschiedliche Titer von Juvenilhormon und Ecdyson gesteuert. Während der Larvalstadien wächst die Larve enorm, wobei die Größenzunahme im Wesentlichen nicht durch Zellvermehrung sondern durch Zellwachstum hervorgerufen wird. Diese außerordentliche Syntheseleistung wird durch eine Polyploidisierung der larvalen Zellkerne ermöglicht. Etwa 24 h vor Einset-

1.7 Drosophila melanogaster Stadium

Zeit

81

Entwicklung

1– 4

0:00 – 2:10 h

Kernteilungen

5

2:10 – 2:50 h

Blastoderm

6 –7

2:50 – 3:10 h

Gastrulation

8 –11

3:10 – 7:20 h

KeimstreifVerlängerung

12–13

7:20 – 10:20 h

KeimstreifVerkürzung

14 –15

10:20 – 13:00 h

Dorsalschluss und Kopfeinstülpung

16–17

13:00 – 22:00 h

Differenzierung

Abb. 1.7.2. Embryonalentwicklung von Drosophila melanogaster

zen der Verpuppung beginnt die Larve aus dem Futterbrei herauszukriechen. Während im Verlaufe der Metamorphose fast alle differenzierten larvalen Zellen zugrunde gehen, werden die Strukturen der Imagines von diploiden, undifferenzierten Zellen neu gebildet. Diese Zellen wurden bereits im Embryo bzw. in der frühen Larve in Form von Imaginalscheiben, imaginalen Ringen und Histoblasten-Nestern angelegt. Aus den Histoblasten werden die ektodermalen Zellen des Abdomens gebildet. Alle weiteren ektodermalen Zellen, wie zum Beispiel die des peripheren Nervensystems, leiten sich aus den Imaginalscheiben ab. Ein prominentes Beispiel ist hier die Entwicklung des adulten Komplexauges aus der Augen-Antennen-Imaginalscheibe (Abb. 1.7.3). Das Schicksal der späteren Imaginalscheiben wird bereits in der Mitte der Embryonalentwicklung determiniert. Hier werden jeweils ca. 16 ektodermale Zellen eingestülpt und bilden eine sackähnliche Struktur aus. Die eine Hälfte dieser Einstülpung wird zur Peripodialmembran und besteht aus flachen, breitgestreckten Zellen. Die andere Hälfte behält die typischen epithelialen

82

1 Modellorganismen

Merkmale und proliferiert stark während der larvalen Entwicklungstadien. (Abb. 1.7.3 a). In der Augen-Antennen-Imaginalscheibe (Abb. 1.7.3 b) beginnt am Ende des dritten Larvalstadiums die Entwicklung des Komplexauges. Das Komplexauge von Drosophila setzt sich aus etwa 750 bis 800 Einzelaugen, den Ommatidien, zusammen. Jedes einzelne Ommatidium besteht aus acht Photorezeptorzellen (R1–R8), vier Linsenzellen und verschiedenen Pigmentzellen (Abb. 1.7.3 c). Die Methoden der klassischen und modernen Genetik haben zu einem detaillierten Verständnis der diesem Entwicklungsprozess zugrunde liegenden Mechanismen geführt: Während des dritten Larvalstadiums wandert eine epitheliale Einsenkung, die morphogenetische Furche, von posterior nach anterior über die Imaginalscheibe (Abb. 1.7.3 b). In dieser Furche werden zunächst in einem regelmäßigen Abstand die R8-Photorezeptorzellen determiniert. Diese rekrutieren anschließend im Kielwasser der Furche über direkte Zell-Zell-Interaktionen die weiteren Zellen des Ommatidiums. Hierbei lässt sich eine sequentielle Abfolge beobachten; zunächst beginnen die Zellen R2 und R5, danach die Zellen R3 und R4 mit der neuronalen Differenzierung. Nachdem sich diese Fünfergruppe gebildet hat, teilen sich die umliegenden epithelialen Zellen. Aus dem nun vorhandenen Zellpool werden dann die Rezeptorzellen R1 und R6 und schließlich die Rezeptorzelle R7 rekrutiert. Die Linsenzellen werden ebenfalls noch während der Larvalentwicklung gebildet, während die Pigmentzellen in der Puppe in die ommatidialen Einheiten eingegliedert werden (Bate und Martinez Arias 1993). Fliegen haben ein Exoskelett Ein wichtiges Untersuchungskriterium des Modellorganismus Drosophila ist das reich strukturierte Exoskelett, das als Kutikula von der Epidermis abgeschieden wird (Demerec 1994). Es erlaubt sowohl bei Larven als auch Fliegen eine einfache Unterscheidung vieler verschiedener Merkmale und hat damit die genetische Analyse von Drosophila erst möglich gemacht. Vor Beginn der Kreuzungsexperimente muss man Männchen und Weibchen unterscheiden können, was anhand der unterschiedlichen Geschlechtsorgane und der kleineren Augen und Flügel der Männchen gelingt. Außerdem sind bei den Männchen die drei letzten Abdominalsegmente in der Aufsicht komplett schwarz, während bei den Weibchen nur die beiden letzen Segmente einfarbig schwarz gefärbt sind. Ein weiteres sicheres Merkmal sind die Geschlechtskämme (sex combs), die sich auf dem ersten Beinpaar der Männchen befinden. Die sex combs sind — wie auch alle anderen Borsten der Fliege — Teile von sensorischen Organen. Man sollte daher nie den Begriff „Haare“ verwenden

1.7 Drosophila melanogaster anterior

83

posterior

Peripodialmembran

a

Imaginalscheiben-Epithel

b

morphogenetische Furche

Ommatidium Linse Pigmentzellen R4 R3 R5 R2 R6

R1 R7

R8

c Abb. 1.7.3 a–c. Entwicklung der Augen-Antennen-Imaginalscheibe. (a) Einstülpung zu Beginn der Imaginalscheibenentwicklung. (b) Augen-Antennen-Imaginalscheibe mit morphogenetischer Furche; der posteriorer Anteil differenziert zum Auge, der anteriore Anteil zur Antenne. (c) Komplexauge von Drosophila in der Übersicht und im Detail. R1–R8: Photorezeptorzellen. Weitere Erläuterungen im Text

(Haare sind nicht innervierte Fortsätze einzelner Epidermiszellen). Die Makrochaeten (große Borsten) und Mikrochaeten (kleine Borsten) sind in einem sehr regelmäßigen Muster auf dem Notum der Fliege angeordnet, welches sich aus dem Scutum (Rückenschild) und dem Scutellum (kleines Rückenschild hinter dem Scutum) zusammensetzt (Abb. 1.7.4). Diese stereotype Anordnung ist für die Analyse der genetischen Steuerung der Neurogenese von großer Bedeutung. Auch die Larve weist eine Vielzahl von kutikulären Markern auf, die z. B. eine Unterscheidung zwischen verschiedenen abdominalen Segmenten oder zwischen dorsalen und ventralen Körperregionen erlauben. In der Abb. 1.7.5 sind die wichtigsten Marker eingezeichnet. Das prominente Kopfskelett mar-

84

1 Modellorganismen Mikrochaeten Humerus-Borsten I

Scutum

II III

A IV Scutellum

P V Haltere

Makrochaeten

Abb. 1.7.4. Dorsalansicht des Thorax mit Flügel und Haltere einer adulten Drosophila melanogaster. I–V Längsadern, A anteriore Querader, P posteriore Querader

kiert das anteriore Ende der Larve, die ventralen Zähnchenbänder, die stets im anterioren Bereich eines Segments liegen, erlauben die Identifizierung der verschiedenen Segmente und erleichtern eine Bestimmung der Position innerhalb eines Segmentes. Die umfassende Analyse mutanter larvaler Kutikulastrukturen hat zu bahnbrechenden Erkenntnissen über die genetische Steuerung der Embryonalentwicklung geführt, für die Christiane Nüsslein-Volhard und Eric Wieschaus 1995 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet worden sind. 1.7.3 Technische Entwicklungen Die Methoden der klassischen Genetik sind in den letzten Jahrzehnten durch rekombinante DNA-Technologien massiv erweitert worden. Bereits in den ersten Tagen der Molekulargenetik wurde 1969 von Joseph G. Gall und MaryLou Pardue die in-situ-Hybridisierung an Polytänchromosomen entwickelt. Die Hybridisierungstechniken wurden verfeinert, bis 1983 Michael Akam die direkte Visualisierung der Genexpression in der whole-mount-in-situ-Hybridisierung gelang. 1982 wurde von Gerald Rubin und Allan Spradling die Keimbahntransformation etabliert, die heute Routine geworden ist. 1989 wurde von Kent Golic und Susan Lindquist eine Methode eingeführt (FLP/FRTMethode), die es ermöglicht, eine mitotische Rekombination zu einem definierten Zeitpunkt an einer spezifischen Position zu induzieren. Dies erlaubt beispielsweise, Aussagen zur Autonomie von Genfunktionen zu machen (Kap. 2.6.3). 1993 beschrieben Andrea Brand und Norbert Perrimon die sogenannte GAL4/UAS-Methode, die es inzwischen ermöglicht, ein Gen zu beinahe jedem Zeitpunkt in jeder beliebigen Zelle zu exprimieren (Kap. 8.5). Diese Technologien werden von der kürzlich von Rich Carthew vorangetriebe-

1.7 Drosophila melanogaster

anterior

85

posterior dorsal ventral

Thorax

Abdomen

1 Segment

Abb. 1.7.5. Das Kutikula-Muster einer Drosophila-Larve. Die drei Thorakal- und acht Abdominalsegmente sind durch charakteristische Zähnchenbänder gekennzeichnet

nen RNAi-Technologie komplementiert, mit deren Hilfe jedes Gen zu einem definierten Zeitpunkt ausgeschaltet werden kann (Kap. 8.5). Um eine genetische Analyse durchführen zu können, brauchen wir Mutationen in den verschiedenen Genen. Im Jahre 2004 sind in Stammsammlungszentren etwa die Hälfte der 14 000 Gene durch Transposon-Insertionen markiert und so einer detaillierten Analyse zugänglich. Die Anwendung dieser umfassenden Techniken wurde durch die vollständige Verfügbarkeit der DNA-Sequenz von Drosophila melanogaster erheblich vereinfacht (Celniker und Rubin 2003). Die kürzlich veröffentlichte Sequenz von der nahe verwandten Spezies Drosophila pseudoobscura erlaubt vergleichende Einblicke in die Genom-Organisation und die Regulation einzelner Gene. Wir haben heute eine Reihe von Methoden in der Hand, um einzelne Genfunktionen zu identifizieren. Nach Mutation einzelner Gene können Phänotypen beschrieben werden. Wir können Gene nach ihrem Expressionsmuster identifizieren. Hier findet die Enhancer-trap- oder die Protein-trap-Methode eine Anwendung. Alternativ kann die Gesamtzahl der in einer bestimmten Zelle exprimierten Gene mit Hilfe von DNA-Chips aufgenommen werden und z. B. über die Zeit verglichen werden. Wir sind heute an einem Punkt angekommen, an dem uns die Methodenvielfalt ein sehr tiefgreifendes Verständnis von Entwicklungs- und Funktionszusammenhängen erlaubt.

86

1 Modellorganismen

1.7.4. Biologische Fragestellungen Mit Hilfe des Modellorganismus Drosophila und der an und mit ihm entwickelten molekulargenetischen Methoden konnten einige der wichtigsten Fragen der Entwicklungsbiologie und Genetik beantwortet werden. Welches sind die Träger der Erbinformation? Wie lassen sie sich untersuchen und experimentell modifizieren? Was sind die genetischen Grundlagen der frühen Muster- und Gestaltbildung? Existieren Morphogene? Durch die Aufdeckung der Mechanismen, die den zeitlich und räumlich geordneten Differenzierungsprozessen eines höheren Eukaryoten zugrunde liegen, wurde erstmals ein theoretischer und praktischer Zugang zur Beantwortung der Frage nach den entwicklungsgenetischen Prinzipien der Ontogenese geschaffen. Ausgehend von diesen Befunden eröffnen sich nun nicht nur neue aufregende Fragestellungen, sondern auch neue Möglichkeiten, experimentelle Antworten zu finden. Wodurch wird das Entwicklungsschicksal unterschiedlicher Zellen bestimmt? Wie können relativ einfach gebaute Zellen so hochkomplexe Gewebe wie z. B. ein Nervensystem aufbauen? Woher wissen die sich bildenden Neurone, in welche Richtung sie wachsen müssen, um Reize aufzunehmen oder weiterzuleiten? Wie können Gene das Verhalten eines Individuums beeinflussen? 1.7.5 Genetische Ressourcen Das Berkeley Drosophila Genome Project (www.fruitfly.org) hat zusammen mit der Firma Celera die Sequenzierung des Drosophila-Genoms betrieben. Auf diesen Seiten, die eng mit FlyBase vernetzt sind, kann man Informationen zu den Gensequenzen, den verfügbaren cDNA Klonen und verschiedenen Expressionsmustern erhalten. Im Bloomington Drosophila Stock Center (flystocks.bio.indiana.edu) kann man für wenig Geld (oft auch umsonst) Fliegenstämme bestellen. Hier werden alle wichtigen Mutanten, GAL4-Stämme, P-Element-Stämme, FRT-Stämme, Balancer Defizienz- und Duplikationsstämme gehalten. Über das Rescource Center (dgrc.cgb.indiana.edu) kann man die cDNAKlone, Vektoren usw. beziehen. Bei der Hybridoma-Bank (www.uiowa.edu/~dshbwww/) sind viele monoklonale Antikörper z. B. auch gegen Drosophila-Proteine erhältlich. Drosophila-Entwicklung im Internet Eine neue Möglichkeit, sich mit der Embryogenese weiter vertraut zu machen und die komplexen morphogenetischen Bewegungen eingehender zu

1.7 Drosophila melanogaster

87

verfolgen, bietet das Projekt „FlyMove” (flymove.uni-muenster.de). Dort findet sich auch eine umfassende Darstellung der verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung von Drosophila. Zusammen mit der Datenbank „Interactive Fly” (sdb.purdue.edu/fly/aimain/1aahome.htm), die eine Beschreibung vieler Genfunktionen enthält (keine Bilder) und der Datenbank „FlyBase” (flybase.net), die eine genaue Beschreibung der Gene und Sequenzen enthält, kann man sich einen sehr guten und aktuellen Überblick über die Möglichkeiten verschaffen, die das Drosophila-System bietet.

2 Genetische Kreuzungen

Unter einer Kreuzung versteht man die Paarung von zwei genetisch verschiedenen Individuen einer Art, in deren Verlauf genetisches Erbmaterial ausgetauscht wird. Dies gilt für Pro- und Eukaryoten gleichermaßen. Bei dem Bakterium E. coli wird der Paarungsprozess als Konjugation bezeichnet, bei dem ein gerichteter Gentransfer von einer Donorzelle auf eine Rezipientenzelle stattfindet. Bei Eukaryoten ist der Rekombinationsprozess in der Regel reziprok. Es ist grundsätzlich zwischen haploiden und diploiden Eukaryoten zu unterscheiden. Zur ersteren Gruppe gehören Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Sordaria macrospora und Chlamydomonas reinhardtii. Bei ihnen kann in der Regel vom Phänotyp auf den Genotyp geschlossen werden. Die vier haploiden Produkte der Meiose werden als Tetrade bezeichnet und stehen einer genetischen Analyse unmittelbar zur Verfügung. Bei Diplonten, wie Arabidopsis thaliana und Drosophila melanogaster, liegen nahezu alle Gene in jedem Kern in zwei Allelen vor. Dies erschwert die Analyse von Erbgängen, da nicht wie bei haploiden Organismen vom Phänotyp auf den Genotyp zu schließen ist. Bei heterozygoten Allelen ist zwischen Dominanz und Rezessivität zu unterscheiden. Bei dominanten Allelen ist der Phänotyp auch im heterozygoten Zustand erkennbar, bei rezessiven nur im homozygoten Zustand. Die folgenden Experimente bieten unterschiedliche Möglichkeiten, die genetische Rekombination durch Kreuzungsversuche zu demonstrieren. Dabei werden neben konventionellen Methoden zur Genlokalisation auch Beispiele geliefert, in denen die Kombination von Formal- und Molekulargenetik zur genetischen Analyse herangezogen wird.

90

2 Genetische Kreuzungen

2.1 Escherichia coli Eine Reihe von Bakterien, darunter auch E. coli, haben die Möglichkeit, genetische Information zu übertragen. Dieser Prozess wird Konjugation genannt (Abb. 2.1.1). Er führt zu einem horizontalen Gentransfer von einer Donor- auf eine Rezipientenzelle. Physikalische Grundlage dieses Phänomens ist ein ca. 100 kb großes lowcopy-Plasmid, der F (fertility)-Faktor. Er trägt alle für die Konjugation benötigten Informationen. Man unterscheidet bei E. coli zwischen F + -, Hfr- (high frequency of recombination) und F’-Zellen: Erstere besitzen ein bis drei frei im Cytoplasma liegende F-Plasmide, während in den hochrekombinativen HfrStämmen der F-Faktor im Genom integriert vorliegt. Bei F’-Zellen hat eine irreguläre Exzision eines ehemals integrierten Faktors stattgefunden, so dass dieser eine veränderte Struktur besitzt. Rezipientenstämme sind F-Plasmidfrei und werden als F– bezeichnet. An der Konjugation sind neben den 25 tra (transfer)-Genen, deren Genprodukte in trans aktiv werden, und der mob-Region der cis-aktive oriT (transfer origin) beteiligt. Zunächst werden von einer F + -Zelle lange Pili von 8 nm Außen- und 2 nm Innendurchmesser gebildet, die aus Pilin-Proteinen (TraA) bestehen. Nach der Kontaktaufnahme des Pilus mit der Membran einer Rezipientenzelle verkürzt sich dieser, was zum direkten Zellkontakt führt. Nun bindet die Relaxase (Mob) spezifisch an den oriT und erzeugt dort einen Einzelstrangbruch (nick). Das 5’-Ende des gespaltenen Stranges wird abgelöst und unidirektional (5’-3’-Richtung) in die Rezipientenzelle übertragen, während die DNA-Polymerase das Plasmid in der Ausgangszelle ähnlich dem rcMechanismus (rolling circle) kontinuierlich repliziert. In der Empfängerzelle erfolgt die diskontinuierliche Gegenstrangsynthese und eine Ligase schließt die verbliebenen Lücken. Bei Hfr-Zellen wird wie bei F + -Zellen am oriT des in diesem Fall in das Bakterienchromosom integrierten F-Plasmids die replikative Übertragung eingeleitet. Im Unterschied zu F + -Zellen wird dabei auch genomisches Material übertragen. Für die Integration in das Bakterienchromosom sind neben dem Rekombinationsprotein RecA die auf dem F-Plasmid liegenden IS-Elemente von Bedeutung, da diese mit IS-Elementen des E.-coli-Genoms homolog rekombinieren können. Da die Größe natürlicher, konjugativer Plasmide in der molekulargenetischen Praxis schwerwiegende Nachteile mit sich bringt, wurden kleine, leicht handhabbare Derivate konstruiert. Als besonders zweckmäßig haben sich kleine, Resistenzgene tragende Plasmide ohne tra-Gene erwiesen, die aber

2.1 Escherichia coli

91

I

II VII 3' 5'

III VI

3'

V

5'

IV

Abb. 2.1.1. Schema der Konjugation bei E. coli. Die Donorzelle hat mit einem FPilus (Pili strahlenförmig dargestellt) Kontakt zur Zellmembran einer Rezipientenzelle aufgenommen (I). Durch Verkürzung des Pilus wird Zell-Zell-Kontakt erreicht und die Relaxase erzeugt einen Einzelstrangbruch an der nic/bom-Stelle des oriT (II). Die Übertragung des DNA-Stranges findet in 5’-3’-Richtung, ausgehend von dessen freiem 5’-Ende, statt. Dabei bleibt das 5’-Ende jedoch noch an der Kontaktstelle proteingebunden (III). Der übertragene Strang wird diskontinuierlich in der Rezipientenzelle repliziert (III, IV), während in der Donorzelle kontinuierliche Replikation ähnlich dem rolling-circle-Mechanismus stattfindet, wodurch der zu übertragende Strang verdrängt wird (III, IV). Nach erfolgreicher Replikation (V) werden Lücken durch eine Ligase geschlossen und die Zellen trennen sich voneinander (VI). Beide Zellen besitzen nun jeweils einen F-Faktor und können als Donorzellen diesen wiederum auf F-Plasmid-freie Zellen übertragen (VII). Dargestellt ist das F-Plasmid (doppelter Ring), 3’: OH-Ende und 5’: Phosphat-Ende eines DNA-Stranges, graue Pfeile: neu synthetisierter DNA-Strang, Pfeilrichtung entspricht Replikationsrichtung

92

2 Genetische Kreuzungen

einen oriT besitzen und somit mobilisierbar sind. Als Beispiel mag das hier verwendete pBBR1MCS dienen. Zur Übertragung wird ein Helferplasmid benötigt, um die fehlenden Funktionen zu komplementieren. Es ist auch möglich, die Transfer-Gene in das E.-coli-Genom zu integrieren, um so universelle „Überträgerstämme“ zu erhalten. Ein Beispiel ist der hier verwendete E.-coliStamm S17-1. Dieser trägt genomisch die tra-Gene des ursprünglich aus Pseudomonas aeruginosa stammenden 56,4 kb großen konjugativen Plasmids RP4. Als Rezipientenstämme sind F-Episomen-freie Stämme geeignet, die sich in mindestens einer selektierbaren Eigenschaft von Donor und Plasmid unterscheiden müssen, z. B. der Streptomycin-resistente E. coli JM83. 2.1.1 Konjugation von E. coli Ziel ist die Herstellung von Transkonjuganten durch Übertragung des Plasmids pBBR1MCS-3 von E. coli S17-1 auf E. coli JM83. Als Beispiel für Genübertragung und zur Selektion soll der Tetracyclin-sensitive Rezipientenstamm durch das Plasmid Resistenz gegen dieses Antibiotikum erlangen. Gegenselektion findet mit Streptomycin statt, da nur der Rezipient eine genomisch kodierte Resistenz aufweist. Plasmid pBBR1MCS-3 (5,1 kb): tet (TetR), mob +, tra – lacPOZ’ (NCCB Nr. 3435) kann über die NCCB (Nr. 3435) in E. coli DH5ơ bezogen werden. Donorstamm E. coli S17-1: ƅrecA, endA1, hsdR17, supE44, thi-1, tra (DSMZ 9079). Rezipientenstamm E. coli JM83: F–, lambda–, ara ƅ(pro-lac), rpsL, thi, phi80 dlacZƅM15lambda–, strA (StrR) (DSMZ 3947). Das hier vorgestellte System aus Überträgerstamm und Plasmid kann auch zur Transformation von diversen anderen, mitunter kaum oder nur sehr schwer transformierbaren, gramnegativen Bakterien verwendet werden. An singulären Restriktionsschnittstellen in der multiple cloning site (mcs) kann der Vektor Fremd-DNA aufnehmen, was durch Blau-Weiß-Selektion (Kap. 3.1) auf speziellen Medien überprüft werden kann. Eine grundsätzliche Voraussetzung für solche Experimente ist, dass eine Differenzierung zwischen Donor, Rezipient und Transkonjugante aufgrund unterschiedlicher Phänotypen möglich sein muss.

2.1 Escherichia coli

93

Material • • • • •

• • • • •

Zentrifuge für sterile 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße sterile 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße Drigalski-Spatel, Ethanol zum Sterilisieren, Bunsenbrenner, sterile Zahnstocher sterile Kochsalzlösung 0,9 % (w/v) NaCl LB-Medium (Luria-Bertani) 1 % (w/v) Fleischpepton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl pH 7,5 Festmedien: zusätzlich 1,5 % (w/v) Agar LB+Streptomycin wie LB-Medium, Zugabe von 1 µL Streptomycin-Stammlösung/mL Medium nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf ca. 55 °C LB+Tetracyclin wie LB-Medium, Zugabe von 1 µL Tetracyclin-Stammlösung/mL Medium nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf ca. 55 °C LB(+Tetracyclin+Streptomycin)-Festmedium wie LB-Festmedium, Zugabe von je 1 µL Tetracyclin- und Streptomycin-Stammlösung/mL Medium nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf ca. 55 °C Streptomycin-Stammlösung 100 mg/mL in A. dest., sterilfiltriert, Lagerung bei –20 °C Tetracyclin-Stammlösung 12,5 mg/mL in Ethanol (96 %), Lagerung lichtgeschützt bei –20 °C

Methode Das Plasmid pBBR1MCS-3 muss zunächst isoliert (Kap. 3.1.4) und dann in E. coli S17-1 transformiert werden (Kap. 3.1.1). Transformanten werden durch Tetracyclin selektiert und Plasmide durch Dauerselektion stabil gehalten. Der erzeugte Donorstamm E. coli S17-1 (pBBR1MCS-3) kann als Gefrierkultur bei –70 °C gelagert werden. 1. Die Anzucht von Donor- und Rezipientenstamm erfolgt separat im Schüttelkolben über Nacht bei 37 °C in jeweils 30 mL Flüssigmedium. Der Rezipientenstamm wird in LB+Streptomycin-Medium kultiviert, der Donorstamm in LB+Tetracyclin-Medium, um auf das Plasmid zu selektieren. 2. Die jeweilige Zellernte erfolgt durch Zentrifugation (10 min, 5000 g, 4 °C) und Verwerfen des Überstands. 3. Die Zellen werden in jeweils 1,5 mL LB-Medium resuspendiert.

94

2 Genetische Kreuzungen

4. Von beiden Suspensionen werden jeweils 200 µL Aliquots vorsichtig miteinander vermengt und auf frisch hergestellte, reichlich Medium enthaltende LB-Agarplatten aufgetropft. 5. Die Platten werden über Nacht bei 37 °C inkubiert. 6. Der Bakterienrasen wird mit 2 mL steriler Kochsalzlösung abgeschwemmt. 7. Mit der Zellsuspension wird eine Verdünnungsreihe (in steriler Kochsalzlösung) angelegt: unverdünnt, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000 und 1:100 000. Dazu wird in 5 × 1,5 mL-Reaktionsgefäßen je 900 µL sterile Kochsalzlösung vorgelegt. In das erste Gefäß werden 100 µL der unverdünnten Zellsuspension gegeben und gründlichst gemischt! Aus diesem Gefäß werden 100 µL Suspension in das zweite Gefäß überführt, usw. 8. Zur Transkonjuganten-Selektion auf LB(+Tetracyclin+Streptomycin)Festmedien werden je 2 × 200 µL jeder Verdünnungsstufe (unverdünnt bis 1:100 000) ausplattiert und bebrütet (über Nacht bei 37 °C). 9. Ausgewählte, transkonjugante Einzelkolonien werden zur Plasmidisolation (Kap. 3.1.4) angezogen und durch Restriktion mit EcoRI und Agarosegelelektrophorese überprüft (Kap. 10.4). Hinweise zur Auswertung 1. Ermittlung eines Resistenzspektrums für Donor- und Rezipientenstamm sowie eine Auswahl von mehreren hypothetischen Transkonjuganten durch Überimpfen von Klonen auf LB+Streptomycin-, LB+Tetracyclinund LB(+Streptomycin+Tetracyclin)-Festmedien. Ein Beispiel für eine Zusammenstellung sieht folgendermaßen aus: LB LB LB(+Streptomycin +Streptomycin +Tetracyclin +Tetracyclin) Donor Rezipient Transkonjugante 1 Transkonjugante 2

− + + +

+ − + +

− − + +

2. Das Vorhandensein der Plasmide wird für Transkonjuganten verifiziert, die das erwartete Resistenzspektrum zeigen. Dazu wird die Größe der Restriktionsfragmente bestimmt und mit der erwarteten Größe (s. o.) verglichen.

2.2 Saccharomyces cerevisiae

95

2.2 Saccharomyces cerevisiae Jeder Ascus, der bei der sexuellen Reproduktion der Bäckerhefe S. cerevisiae entsteht, enthält die vier Produkte einer einzelnen Meiose. Nach der Vereinzelung der Sporen kann der Phänotyp jedes Meioseproduktes bestimmt werden und gibt so Aufschluss über die Kopplung sowie den Abstand von Genen zueinander und zum Centromer. Kreuzt man zwei Hefestämme, die für zwei Marker heterozygot (AB × ab) sind, findet man drei verschiedene Grundtypen von Asci (Abb. 2.2.1): Parentaltyp (P), Rekombinationstyp (R) und Tetratyp (T). Die Position beider Marker im Genom bestimmt die Häufigkeit des Vorkommens der drei Ascustypen. Bei ungekoppelten Loci liegen beide Marker auf verschiedenen Chromosomen oder weit voneinander entfernt auf einem Chromosom vor. Dann werden sie unabhängig auf die Nachkommen vererbt und es ergibt sich eine Verteilung von P : R : T von 1 : 1 : 4. Kommen überwiegend Asci des P-Typs vor,

haploide Zellen

ab

AB

Zygote

AaBb

P

R

T

AB AB ab ab

aB aB Ab Ab

AB Ab ab aB

Ascustypen

Abb. 2.2.1. Tetradentypen nach Kreuzung von zwei haploiden Stämmen mit den Markergenen A, a, B, b. In einem Parentaltyp (P)-Ascus liegen die Sporen im Verhältnis 2:2 vor, sie entsprechen dem Genotyp ihrer Eltern. In einem Rekombinationstyp (R)-Ascus kommen Sporen im Verhältnis 2:2 vor, die jeweils eine Neukombination des Genotyps ihrer Eltern darstellen. Im Tetratyp (T)-Ascus kommen die Sporen im Verhältnis 1:1:1:1 vor und zwar jeweils der Genotyp der Eltern sowie die beiden neukombinierten Genotypen

96

2 Genetische Kreuzungen

Tabelle 2.2.1. Mögliche Ergebnisse und Interpretation einer Zwei-Faktor-Kreuzung Häufigkeit Ascus-Typen alle Asci P-Typ P=R=4T P>T>R P=R>T

Aussage bezüglich der Kopplung der Marker allelische Marker ungekoppelte Marker gekoppelte Marker ungekoppelte Marker, centromernah

sind beide Marker eng gekoppelt. Liegen beide Marker auf unterschiedlichen Chromosomen, aber jeweils in der Nähe des Centromers ist P = R und T < 4 (Tabelle 2.2.1). Die Frequenz der P-, R- und T-Typen kann dazu genutzt werden, den Abstand von zwei gekoppelten Genen zu ermitteln. Die genetische Kartierungseinheit (map unit = m. u.) ist der Abstand von zwei Markern, wenn eines von hundert Meioseprodukten bezüglich dieser Marker rekombinant ist. Eine Rekombinationshäufigkeit von 0,01 (= 1 %) entspricht 1 m. u. Zu Ehren des Drosophila-Genetikers Thomas Hunt Morgan wird eine Kartierungseinheit auch als Centimorgan (cM) bezeichnet. In einem T-Ascus enthalten zwei Ascosporen rekombinierte Marker in einem R-Ascus vier und in einem P-Ascus enthält keine der Ascosporen rekombinierte Marker (Abb. 2.2.1). Grundlage der Berechnung ist die Tatsache, dass Asci vom T-Typ durch ein Einzel-Crossing-over zwischen zwei Nicht-Schwesterchromatiden oder durch ein Doppel-Crossing-over zwischen drei Chromatiden entstehen (Abb. 2.2.2). Asci vom P-Typus entstehen dann, wenn kein Crossing-over oder ein DoppelCrossing-over zwischen zwei Nicht-Schwesterchromatiden stattfindet. Dagegen kommt es zur Ausbildung von Asci des R-Typus nur dann, wenn ein Doppel-Crossing-over stattfindet, an dem alle vier Chromatiden beteiligt sind (Abb. 2.2.2). Aus P = Anzahl der Asci des Parentaltypus T = Anzahl der Asci des Tetratypus R = Anzahl der Asci des Rekombinationstypus berechnet man die Rekombinationshäufigkeit r zu T + 6R

r = 

2(P +T +R)

Im Mittel ist bei S. cerevisiae ein Kartenabstand 1 cM = 3 kb groß, was bedeutet, dass auf einem Chromosom von 300 kb Länge während jeder Meiose mindestens ein Crossing-over stattfindet.

2.2 Saccharomyces cerevisiae kein einfaches Crossing-over Crossing-over

doppeltes Crossing-over 2-Chromatiden

A

a

B

b A A B B

a b

P

a b

A B

A a a b B b

T

97

A A a B B b

P

a b

3-Chromatiden

A A a a B b B b

T

3-Chromatiden

A B

A a a b B b

T

4-Chromatiden

A b

A a b B

a B

R

Abb. 2.2.2. Unterschiedliche Tetradentypen (P, T und R) entstehen aus einer Kreuzung AB × ab dadurch, dass entweder kein, ein einfaches oder eine doppeltes Crossing-over zwischen den beiden Markern stattfindet. Die Häufigkeit der einzelnen Tetradentypen gibt an, ob A und B gekoppelt sind. Wenn eine Kopplung vorliegt, kann aus den Werten der Abstand beider Marker berechnet werden

Da die Ascosporen von S. cerevisiae mit ca. 3 µm sehr klein sind, können sie nur mit Hilfe eines Mikromanipulators, d. h. unter der Zuhilfenahme eines Mikroskops, vereinzelt werden (Kap. 1.3.3). Wenn beispielsweise durch eine Kreuzung ein Stamm mit neuen genetischen Eigenschaften konstruiert werden soll, ist dieser technische Aufwand nicht nötig und es kann auch eine Zufallssporenanalyse durchgeführt werden. Im Gegensatz zur Tetradenanalyse beruht eine Zufallssporenanalyse auf der statistischen Analyse der Verteilung von Markern in haploiden Zellen, die aus der Sporulation eines Diploiden hervorgegangen sind. Meiose und Sporulation sind unter Laborbedingungen innerhalb von vier Tagen abgeschlossen. Eine sporulierende Kultur enthält eine Mischung von diploiden Zellen, Asci mit vier Sporen und Asci mit weniger als vier Sporen. Sporen keimen normalerweise nicht auf dem Sporulationsmedium aus und können deshalb für mehrere Monate ohne den Verlust ihrer Lebensfähigkeit im Kühlschrank aufbewahrt werden. Bei der Zufallssporenanalyse werden die Tetraden durch die Behandlung mit dem Zellwand-lysierenden Enzym Zymolyase wahllos aufgeschlossen. Da nicht 100 % einer diploiden Kultur sporulieren (s. o.), müssen haploide Sporen, die aus einer Sporulation hervorgehen, durch geeignete Selektion gegenüber den Diploiden angereichert werden. Zur Selektion der haploiden Sporen wird häufig die can1-Mutation in einem der beiden Kreuzungspartner verwendet. Das Gen CAN1 kodiert für eine membrangebundene Arginin-Permease, die

98

2 Genetische Kreuzungen

für die Aufnahme der Aminosäure Arginin und des toxischen Arginin-Analogons Canavanin verantwortlich ist. Zellen, die das Wildtyp-Allel CAN1 enthalten, sind sensitiv gegenüber Canavanin (Can1S ). Haploide Zellen, die das mutierte Allel can1 enthalten, können weder Arginin noch Canavanin aufnehmen und sind daher resistent gegenüber Canavanin (Can1R ). Da der Defekt can1 rezessesiv ist, können diploide CAN1/can1-Zellen und haploide CAN1Zellen nicht auf Canavanin-haltigem Medium wachsen. 2.2.1 Zufallssporenanalyse bei S. cerevisiae Durch Kreuzung wird ein diploider Stamm aus folgenden Kreuzungspartnern hergestellt (Adams et al. 1998): 1. TSY812 MATơ (can1, hom3, leu2, lys2, ura3) und 2. TSY813 MATa (ade2, his1, lys2, trp1) Mit Hilfe der Zufallssporenanalyse sollen Stämme mit neuen Genotypen erzeugt werden. Die Genprodukte der Gene LEU2, LYS2, URA3, ADE2 und TRP1 und CAN1 wurden bereits in Kap. 1.3 beschrieben oder sind in der Tabelle 1.3.3 aufgeführt. Die Gene URA3 und CAN1 sind auf dem linken Arm des Chromosoms V und die Gene HIS1 und HOM3 auf dem rechten Arm von Chromosom V lokalisiert. Nach der Kreuzung findet die Selektion der diploiden Zellen auf einem Medium statt, dem die Aminosäure Lysin zugeführt wurde. Nach Übertragen der Diploiden auf ein Sporulationsmedium werden die aus der Sporulation hervorgegangenen Tetraden ungeordnet aufgeschlossen. Die haploiden Zellen können gegenüber Diploiden durch Selektion auf die can1-Mutation angereichert werden. Nach Vereinzelung der Sporen erfolgt die Überprüfung der Genotypen durch Überimpfen auf Selektionsmedien. Material • • • • • • •

sterile Zahnstocher steriles H2O Zentrifuge für 10 mL-Röhrchen sterile 10 mL-Röhrchen Drigalski-Spatel Ethanol zum Sterilisieren Bunsenbrenner

2.2 Saccharomyces cerevisiae

99

• sterile Glasperlen ∅ 0,5 mm; HCl-behandelt • YPD-Platten 10 g/L Hefeextrakt (Bacto) 20 g/L Pepton 30 g/L Dextrose (Glucose) 20 g/L Agar • SD +Lys 6,7 g/L Bacto-Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 20 g/L Glucose 20 g/L Agar 30 mg/L Lysin HCL (Stammlösung 1 g/100 mL; davon 3 mL/L) • SC −Arg (+Canavanin) 6,7 g/L Bacto-Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 20 g/L Glucose 20 g/L Agar 100 mL drop-out-Lösung –Arg nach dem Autoklavieren 3 mL/L Canavanin-Stammlösung zugeben (=60 mg/L Canavanin) • Canavanin-Stammlösung 20 mg/mL Canavanin-Sulfat in A. dest., sterilfiltrieren, aufbewahren bei 4 °C • 10× drop-out-Lösung –Arg [g/L] Isoleucin 0,3; Valin 1,5; Adenin 0,2; Lysin 0,3; Methionin 0,2; Phenylalanin 0,5; Threonin 2; Tryptophan 0,2; Tyrosin 0,3; Leucin 1,0; Histidin 0,2; Uracil 0,2 • Sporulations-Medium-Platten 10 g/L Kalium-Acetat 1 g/L Hefeextrakt (Bacto) 0,5 g/L Glucose 20 g/L Agar • Sporulations-Medium (flüssig) 10 g/L Kalium-Acetat 0,25 g/L Glucose • 10× drop-out-Lösung –Ura [g/L] Isoleucin 0,3; Valin 1,5; Adenin 0,2; Lysin 0,3; Methionin 0,2; Phenylalanin 0,5; Threonin 2; Tryptophan 0,2; Tyrosin 0,3; Leucin 1,0; Histidin 0,2 • 10× drop-out-Lösung –Met [g/L] Isoleucin 0,3; Valin 1,5; Adenin 0,2; Lysin 0,3; Phenylalanin 0,5; Threonin 2; Tryptophan 0,2; Tyrosin 0,3; Leucin 1,0; Histidin 0,2; Uracil 0,2 • 10× drop-out-Lösung –His [g/L] Isoleucin 0,3; Valin 1,5; Adenin 0,2; Lysin 0,3; Methionin 0,2; Phenylalanin 0,5; Threonin 2; Tryptophan 0,2; Tyrosin 0,3; Leucin 1,0; Uracil 0,2 • SC –Ura-Platten 6,7 g/L Bacto-Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 20 g/L Glucose

100

2 Genetische Kreuzungen

20 g/L Agar 100 mL drop-out-Lösung –Ura • SC –Met-Platten 6,7 g/L Bacto-Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 20 g/L Glucose 20 g/L Agar 100 mL drop-out-Lösung –Met • SC –His-Platten 6,7 g/L Bacto-Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) 20 g/L Glucose 20 g/L Agar 100 mL drop-out-Lösung –His • Ƣ-Glucuronidase (Sigma-Aldrich)

Methode Der Versuch kann bis zum Punkt 5 vorbereitet werden. 1. Kreuzung der Stämme TSY812 und TSY813. Auf einer YPD-Platte wird Zellmaterial der haploiden Stämme TSY812 und TSY813 mit einem sterilen Zahnstocher verrührt. Wenn die haploiden Zellen von einer Platte genommen werden, können zur besseren Mischung einige Tropfen steriles H2O zugegeben werden. Die Platte wird mind. 5 h bei 30 °C bebrütet, wobei die Zygotenbildung mikroskopisch verfolgt wird. 2. Um diploide Zellen anzureichern, werden die Zygoten nach mind. 5 h auf einer SD+Lys-Platte ausgestrichen und für 2–3 Tage bei 30 °C bebrütet. 3. Kolonien diploider Zellen werden auf YPD-Platten ausgestrichen und über Nacht (max. 16 h) bei 30 °C inkubiert. 4. Von der YPD-Platte wird eine Kolonie (ca. von der Größe eines Streichholzkopfes) in 2,5 mL flüssiges Sporulationsmedium überführt und bei 25 °C auf einem Schüttler inkubiert. Gleichzeitig wird auch eine Kolonie auf Sporulationsplatten ausplattiert. Der Verlauf der Sporulation wird unter dem Lichtmikroskop verfolgt. Nach 2–10 Tagen sollten mehr als 5 % der Zellen sporuliert sein. Sporulationsplatten können im Kühlschrank aufbewahrt werden. 5. Je 1 mL der sporulierenden Kultur (bzw. Zellmaterial von der Sporulationsplatte) wird in ein steriles 10 mL-Röhrchen überführt. Die Asci werden durch 5 min Zentrifugation bei 3000 rpm sedimentiert. Der Überstand wird vollständig abgenommen und das Sediment anschließend in 0,2 mL sterilem H2O resuspendiert. Zum Andauen der Ascuswände werden 5 µL Ƣ-Glucuronidase (= 500 U[Sigma-Aldrich]) eingesetzt. 6. Die Zellen werden 1 h bei 30 °C im Schüttler inkubiert.

2.2 Saccharomyces cerevisiae

101

7. Zum Aufschluss werden 0,15 g sterile Glasperlen zugefügt und die Zellen werden wieder für 1 h bei 30 °C auf dem Schüttler inkubiert. 8. Es wird 1 mL steriles H2O zugefügt und der Ansatz wird für 1–2 min stark gevortext. Die Zerstörung der Ascuswände wird unter dem Lichtmikroskop kontrolliert. 9. Nach der Zugabe von 4 mL H2O werden Verdünnungen von 10 −1 bis 10 −3 hergestellt. 10. Je 200 µL des unverdünnte Ansatzes und der Verdünnungen werden auf SC-Arg − + Canavanin-Platten mit einem sterilen Drigalski-Spatel ausplattiert. 11. Die Platten werden für 3 Tage bei 30 °C bebrütet. Nachdem sich Kolonien gebildet haben, werden 45 Einzelkolonien mit sterilen Zahnstochern auf YPD-Platten überführt. Zur Kontrolle werden auch der diploide Stamm (TSY812 × TSY813) sowie beide Ausgangsstämme TSY812 und TSY813 auf der YPD-Platte angeimpft. Die Platten werden für 1–2 Tage bei 30 °C inkubiert. 12. Durch Replika-Plattierung werden die 45 Kolonien und die Kontrollstämme mit einem sterilen Zahnstocher auf folgende Selektionsplatten überimpft: SC-Ura−, SC-His −, SC-Met−, und SC-Arg − + Canavanin. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. 13. Nach 1–2 Tagen können die Platten ausgewertet werden. Hinweise zur Auswertung 1. Bestimmung des Phänotyps jeder Kolonie nach folgendem Schema (Wachstum (+), kein Wachstum (−)): Kolonie Nr. 1 2 M 45

CanR

Ura

His

Met

+ +

+ −

− −

− +

2. Bestimmung der Rekombinationsfrequenz zwischen den Marken CAN1, URA3, HIS1 und HOM3.

102

2 Genetische Kreuzungen

2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora Bei der sexuellen Kreuzung von Pilzen können die Produkte der Meiose, die haploiden Meiosporen, für konventionelle und molekulargenetische Analysen eingesetzt werden. Bei Ascomyceten werden die Meiosporen als Ascosporen bezeichnet, die in einem Sporangium, dem Ascus, gebildet werden. Die vier Produkte der Meiose werden als Tetrade bezeichnet und bei der genetischen Analyse phänotypisch ausgewertet. Während bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae ungeordnete Tetraden auftreten (Kap. 2.2), bilden viele filamentös wachsende Pilze, wie z. B. Neurospora crassa und Sordaria macrospora, geordnete Tetraden, welche Vorteile bei der genetischen Analyse bieten. Wie in Kap. 1.4 erläutert, ist die Bildung ascogener Hyphen in den Fruchtkörpern die Voraussetzung zur Bildung haploider Sporen. Die Prozesse der Karyogamie sowie der meiotischen und postmeiotischen Teilung werden in der Abb. 2.3.1 noch einmal verdeutlicht und zeigen, dass diese Vorgänge zu einem Ascus mit acht linear angeordneten Ascosporen führen. Die lineare Anordnung in geordneten Tetraden spiegelt die Vorgänge im Verlaufe der Meiose wider. Dabei kann, wie bereits in Kap. 2.2 erläutert, grundsätzlich zwischen der Trennung eines Allelpaares nach der ersten bzw. nach der zweiten meiotischen Teilung unterschieden werden. Im ersten Fall spricht man von einer Präreduktion (first division segregation), im zweiten von Postreduktion (second division segregation). Voraussetzung für die Postreduktion ist ein Crossing-over-Ereignis zwischen Nicht-Schwesterchromatiden.

K

MI

M II

PM

SB

Abb. 2.3.1. Entwicklung von linear angeordneten Tetraden in den Asci von Neurospora crassa und Sordaria macrospora. In den Hakenzellen kommt es nach der Karyogamie (K) zur Bildung von diploiden Kernen. Die anschließenden Schritte der Meiose I (MI) und Meiose II (MII) führen zur Bildung von vier haploiden Kernen, die sich nach der Meiose mitotisch (postmeiotische Mitose = PM) teilen. Anschließend wird bei der Sporenbildung (SB) um jeden Kern eine Sporenwand gebildet. Das Resultat sind acht linear angeordnete Sporen (verändert nach Esser 2000)

2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

103

Nach diesem Rekombinationsereignis befinden sich verschiedenene Allele auf den Schwesterchromatiden eines Chromosoms, die dann erst in der Meiose II getrennt werden. Dies wird in der Abb. 2.3.2 illustriert und macht deutlich, dass bei der Betrachtung eines einzelnen Allelpaares ein Crossing-over zwischen Centromer und Gen stattfindet. Generell kann angenommen werden, dass ein Crossing-over um so häufiger auftritt, je weiter sich das Allelpaar vom Centromer befindet. Somit ist die Rekombinationsfrequenz ein relatives Maß Präreduktion

K

Postreduktion

Centromer Crossing Over

MI

M II

PM

Typ

Typ

1

3

2

4 5 6

Abb. 2.3.2. Aufspaltung eines Allelenpaares durch Prä- oder Postreduktion im Verlaufe der Meiose (MI und MII) und postmeiotischen Mitose (PM). Die lineare Anordnung der Ascosporen gibt Auskunft darüber, inwieweit ein Allelpaar nach der ersten oder zweiten meiotischen Teilung getrennt wurde. Die Ascustypen 1 und 2 weisen auf eine Präreduktion, die Typen 3 bis 6 auf eine Postreduktion hin

104

2 Genetische Kreuzungen

für den Abstand eines Allelpaares vom Centromer. Bei der Einfaktorkreuzung kann der Abstand eines Gens vom Centromer durch die Berechnung der Postreduktionsfrequenz bestimmt werden. Diese Analyse ist nur mit geordneten Tetraden möglich. Hier werden prä- und postreduzierte Asci unterschieden (Abb. 2.3.3). Bei der Kreuzung von N. crassa werden grundsätzlich Stämme mit gegensätzlichem Kreuzungstyp („A“ und „a“) verwandt. Zur Kreuzung wird eine Konidiensuspension auf Myzel des Kreuzungspartners gegeben. Bei S. macrospora werden zwei Stämme gegenüber auf einer Petrischale mit Festmedium angeimpft. Bei diesem homothallischen Pilz werden üblicherweise nicht-allelische Sterilmutanten eingesetzt, die keine Selbstbefruchtung zeigen. In beiden Fällen bilden sich in den Myzelien Fruchtkörper, die eine Vielzahl von Asci (bis zu 200) enthalten. Durch mechanische Präparation können die Fruchtkörper unter dem Stereomikroskop isoliert und anschließend aufgebrochen werden.

A

B

A

C B

A B

Abb. 2.3.3. Mikroskopisches Bild einer Ascusrosette mit zweifarbigen Asci. Deutlich können prä- (A) von postmeiotisch (B) reduzierten Asci unterschieden werden. Unreife Asci (C) mit acht hellen Sporen werden bei der Auswertung nicht berücksichtigt

2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

105

Die einfachste genetische Analyse der Ascosporen kann unter dem Mikroskop stattfinden, wenn die Mutation z. B. an der Ascosporenfarbe direkt erkennbar wird. Allerdings sind auch indirekte und deshalb arbeitsaufwändigere Analysen der Ascosporen nach Einzelsporisolation möglich. Aufgrund der Größe von 16 × 20 µµm (N. crassa) bzw. 18 × 28 µm (S. macrospora) ist die Vereinzelung und Übertragung der Sporen auf Sterilmedien unter dem Stereomikroskop nach kurzer Einübung leicht möglich. 2.3.1 Einfaktorkreuzung mit Farbspormutanten In den folgenden Kreuzungen werden Farbspormutanten von Neurospora crassa bzw. von Sordaria macrospora eingesetzt, um den Abstand des Gen-Locus, der für die Farbspormutation verantwortlich ist, zum Centromer aufgrund der Postreduktionsfrequenz zu bestimmen. Die Postreduktionsfrequenz P wird nach der Formel P = (Ascustyp3–6 / Ascustyp1–6) berechnet (Ascustypen s. Abb. 2.3.2) und gewöhnlich in Prozent angegeben. Davon ausgehend erhält man für den Gen-Centromer-Abstand ƹ ƹ [KE]= P[%] / 2 Der Abstand wird wahlweise in Karteneinheiten, map units oder Centimorgan angegeben (1 KE = 1 m. u. = 1 cM). Die Trennung von Allelen in der zweiten meiotischen Teilung setzt mindestens ein Crossing-over voraus. Die Postreduktionsfrequenz P ist deshalb bei der Einfaktorkreuzung ein Maß für den Abstand des Centromers vom Gen. Von den sechs möglichen Tetradentypen einer Einfaktorkreuzung (Abb. 2.3.2) sind vier rekombinant, was einem Wert von 2/3 (= 66,67 %) entspricht. Bei freier Aufspaltung der Allele sind alle Tetradentypen gleich wahrscheinlich, so dass man eine maximale Postreduktionsfrequenz von 66,67 % erhält. Eine Tetrade kann sowohl rekombinante als auch nicht-rekombinante Meioseprodukte enthalten. Wenn z. B. nur ein Crossing-over auftritt, so sind nur zwei der vier Meioseprodukte rekombinant. Deshalb wird die Postreduktionsfrequenz durch zwei dividiert, wenn der Abstand des Gen-Locus zum Centromer bestimmt wird. Nur die Hälfte der vier Chromatiden ist bei einem einzelnen Crossing-over beteiligt. Deshalb beträgt der maximale Kartenabstand nur 33,33 cM.

106

2 Genetische Kreuzungen

Auf den ersten Blick mag dieser Wert verwirrend erscheinen, da man einen maximalen Kartenabstand von 50 cM bei einer Rekombinationsfrequenz von 50 % vermutet. Der Grund für diese Diskrepanz liegt im Auftreten vieler Crossing-over bei großen Abständen, so dass die einfache Linearität nicht mehr gegeben ist. Um große Abstände zu berechnen, ist es daher besser, die Abstände von mehreren, eng benachbart liegenden Genen zu bestimmen und aufzuaddieren.

Material A. NEUROSPORA-CRASSA-Stämme: • fl a (no.H579) Dieser Stamm trägt die fluffy (fl)-Mutation und eignet sich besonders, da er wenige Konidien, aber viele Protoperithezien bildet. • cys-3 A (FGSC#4347) Dieser Stamm hat ein reduziertes Myzelwachstum, produziert aber ausreichende Mengen an Konidien. Das cys-3-Gen kodiert für einen Regulator des Schwefelmetabolismus und ist verantwortlich für die Ausbildung weißer Ascosporen. B. SORDARIA-MACROSPORA-Stämme: • r2/pro11 Die pro11-Mutation ist verantwortlich für den sterilen Phänotyp, die r2-Mutation führt zu roten Sporen. • lu2 Die Mutation lu2 (lutea) ist verantwortlich für gelbe Sporen, außerdem ist die Fertilität stark reduziert. • per5 Diese Sterilmutante bildet keine Ascosporen. Allerdings werden nach Kreuzungen, in denen die Sterilität restauriert wird, schwarze Ascosporen produziert. C. N.-CRASSA-Kreuzungsmedium (SC-Medium) • 5× Westergaards Stammlösung (Angaben pro 1 L) KNO3 5,0 g KH2PO4 5,0 g MgSO4 × 7 H2O 2,5 g NaCl 0,5 g 3 M CaCl2 1,5 mL Spurenelemente 0,5 mL • Biotin-Stammlösung 0,1 mg/mL in Ethanol (50 %) • Westergaards Kreuzungsmedium (Angaben pro 1 L) 5× Westergaards Stammlösung 200 mL Saccharose 20 g Biotin-Stammlösung 1 mL Agar 15 g pH 6,5

2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

107

D. S.-MACROSPORA-Kreuzungsmedium • Maiswasser (Angaben pro 1 L) 25 g Maismehl in 1 L Leitungswasser 10 min aufkochen und über Nacht bei 60 °C extrahieren. Durch ein Mulltuch filtrieren und wenn nötig auf 1 L auffüllen • Biomalz-Mais-Medium (BMM) 8 g Biomalz in 1 L Maiswasser, pH 6,4–6,6 mit KOH einstellen

Methode A. N.-crassa-Kreuzung 1. Der fl-Stamm von N. crassa wird in einem Reagenzglasröhrchen auf das Kreuzungsmedium geimpft. 2. Nach 5–6 Tagen bei 23–25 °C können idR. Protoperithezien und Trichogynen erkannt werden. 3. Eine Konidiensuspension des cys-3-A-Stammes einer einwöchigen Kultur wird durch Abschwemmungen mit sterilem destillierten Wasser hergestellt. 4. Der fl a-Stamm wird durch 2 mL der Konidiensuspension befruchtet. 5. 8–10 Tage nach der Befruchtung können die Perithezien geerntet werden. 6. 10–20 Perithezien werden von der Agarfläche mir einer sterilen dünnen Nadel auf einen Objektträger transferiert. 7. Die Perithezien werden mit einem Tropfen Wasser bedeckt und mit einer Pinzette zerdrückt. 8. Der Perithezieninhalt wird mit einem Deckglas bedeckt, und unter dem Mikroskop können die zweifarbigen Asci ausgewertet werden. B. S.-macrospora-Kreuzung 1. Auf eine Petrischale mit BMM-Medium wird der per5-Stamm gegen die Farbspormutante lu2 bzw. r2 gekreuzt. 2. Im Bereich der Kontaktzone beider Myzelien können nach 10–12 Tagen (25 °C) reife Perithezien beobachtet werden. 3. Ab hier wie bei Neurospora crassa Schritte 6–8 verfahren. Hinweise zur Auswertung Die Postreduktionsfrequenz ist in allen Kreuzungen zu berechnen und damit der relative Abstand zum Centromer zu bestimmen.

108

2 Genetische Kreuzungen

2.3.2 Kopplungsanalyse mit transgenen Stämmen Bei vielen eukaryotischen Organismen ist die homologe Rekombination ein eher seltenes Ereignis. In der Regel werden DNA-Moleküle, obwohl sie homologe Sequenzen zur genomischen DNA aufweisen, ektopisch in das Genom inseriert. Die Mehrzahl der in der Transformation eingesetzten rekombinanten Moleküle „findet“ demnach nicht das Zielgen. Die homologe Insertion muss deshalb durch entsprechende Verfahren bei ausgewählten Transformanten nachgewiesen werden. Zu den Verfahren zählt die Tetradenanalyse oder — wie hier beschrieben — die Zufallssporenanalyse. Alternativ kann die PCRAnalytik gewählt werden (Kap. 4). In dem hier durchgeführten Experiment wird überprüft, inwieweit Genmarken gekoppelt bzw. nicht-gekoppelt auf einem oder mehreren Chromosomen lokalisiert liegen. Diese Analyse ist z. B. dann entscheidend, wenn Knock-out-Stämme hergestellt werden, um Gene gezielt zu inaktivieren. Die Geninaktivierung wird genutzt, um die Funktion eines Genproduktes zu bestimmen. Beim Knock-out wird die homologe Rekombination genutzt. Hierzu werden Markergene, z. B. Resistenzgene oder Auxotrophiegene, in das Zielgen inseriert, um so seine Zerstörung zu erreichen. Die dabei notwendige sequenzspezifische Rekombination erfolgt über homologe DNA-Sequenzen. Kurze Sequenzen (50 bp) sind z. B. bei der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausreichend, während bei Hyphenpilzen deutlich längere Sequenzen von ca. 0,5 bis 1 kb notwendig sind. In dem Experiment werden zwei verschiedene Sordaria-macrospora-Transformanten untersucht, bei denen das Hygromycin-B-Resistenzgen (hph) durch Transformation in das Kerngenom eingefügt wurde. Das hph-Resistenzgen wird von Sequenzen des ura3-Auxotrophiegens flankiert. Dieses ura3-Gen kodiert für die Orotidin-5’-Decarboxylase, ein Enzym der Pyrimidin-Biosynthese. Das Zerstören des ura3-Gens führt zu Uracil-Auxotrophie der entsprechenden Wirtsstämme. Es soll untersucht werden, ob bei den Transformanten eine homologe Insertion der transformierten DNA in das ura3-Gen des Rezipientenstammes erfolgt ist, bzw. ob die DNA heterolog in das Genom des Rezipientenstammes integriert wurde. Mittels der Zufallssporenanalyse soll überprüft werden, inwieweit die erhaltenen Sporen Hygromycin-B-Resistenz aufweisen, bzw. Uracil-auxotroph sind. Die Zufallssporenanalyse liefert ähnlich wie die Tetradenanalyse einen Hinweis auf Kopplung zweier Gene. Im Gegensatz zur Tetradenanalyse sind bei diesem Verfahren jedoch wesentlich größere Stichproben notwendig, um eine gesicherte Aussage treffen zu können. Bei den Sporen wird grundsätzlich nur auf Resistenz bzw. Nicht-Resistenz und Auxotrophie bzw. Prototrophie

2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora

109

hin getestet. Die beiden eingesetzten Stämme werden gegen einen sterilen Testerstamm (pro11) gekreuzt, der zusätzlich ein Farbsporgen (fus1) trägt. Durch das fus1-Gen kommt es zur Störung in der Melanin-Biosynthese; die Ascosporen sind rötlich-braun. Es werden ausschließlich rötliche Sporen analysiert, da diese grundsätzlich aus Rekombinationsasci stammen. Material A. SORDARIA-MACROSPORA-Stämme: • Tr 7 Hierbei handelt es sich um eine S.-macrospora-Transformante, die mit dem hphGen transformiert worden ist. Das hph-Gen wurde in diesem Fall von ca. 2 kb langen Sequenzen des ura3-Gens flankiert. Die Insertion erfolgte homolog. • Tr 9 Wie Tr 7, allerdings ist das hph-Gen ektopisch integriert. • fus1 / pro11 Hier handelt es sich um eine Farbspormutante, bei der eine Mutation des fus1Gens zur Ausbildung rotbrauner Ascosporen führt. Die pro11-Mutation ist für die Sterilität verantwortlich. B. Medien • Maiswasser (Angaben pro 1 L) 25 g Maismehl in 1 L Leitungswasser 10 min aufkochen und über Nacht bei 60 °C extrahieren. Durch ein Mulltuch filtrieren und wenn nötig auf 1 L auffüllen • Biomalz-Mais-Medium (BMM) 8 g Biomalz in 1 L Maiswasser, pH 6,4–6,6 mit KOH einstellen • Biomalz-Mais-Medium mit Hygromycin B (BMMH) BMM 110 U/mL Hygromycin B (nach dem Autoklavieren zugeben) • Sporenkeimungsmedium (BMM + Natrium-Acetat) 8 g Biomalz 5 g Natrium-Acetat 1 L Maiswasser 15 g Agar, pH 6,5 mit KOH einstellen 20 min bei 121 °C autoklavieren • Mineralkonzentrat 5 g Zitronensäure × 1 H2O 5 g ZnSO4 × 7 H2O 1 g Fe(NH4)2 (SO4)2 × 6 H2O 0,25 g CuSO4 × 5 H2O 0,05 g MnSO4 × 1 H2O 0,05 g H3BO4 (Anhydrat) 0,05 g Na 2MoO4 × 2 H2O

110

2 Genetische Kreuzungen

Die oben angegeben Bestandteile werden sukzessive in 95 mL destilliertem Wasser unter Rühren bei RT gelöst. Das Endvolumen beträgt etwa 100 mL. Als Konservierungsmittel wird 1 mL Chloroform hinzugefügt, Lagerung bei RT. • Minimalmedium (MM) Bestandteil

55,5 mM Glucose 1,8 mM KH2PO4 1,7 mM K 2HPO4 × 3 H2O 8,3 mM Harnstoff 1,0 mM MgSO4 × 7 H2O Mineralkonzentrat Agar

Stammlösung

25 g/L H2O 52 g/L H2O 49 g/L H2O 51 g/L H2O

für 500 mL 1000 mL Medium 5,5 g 11 g 5 mL 10 mL 5 mL 10 mL 5 mL 10 mL 5 mL 10 mL 50 mL 100 mL 10 g 20 g

pH 6,6–6,8, autoklavieren bei 112 °C, nach dem Autoklavieren: 5,0 mM Biotin

1 mM

2,5 mL

5 mL

Methode 1. Ansetzen der Kreuzungen: 1. Tr 7 × fus1, 2. Tr 9 × fus1. 2. Nach ca. 14 Tagen können vom Deckel der Petrischale rotbraune Sporen isoliert werden, die nur von rekombinanten Asci stammen können. Die Sporen werden unter dem Stereomikroskop mit einer feinen sterilen Impfnadel auf Sporenkeimungsmedium überführt und so vereinzelt. 3. Nach 1–2 Tagen werden die gekeimten Sporen auf BMM-Medium überimpft. 4. Die Sporenisolate werden auf BMMH-Medium überimpft (Ermittlung des Resistenzverhaltens). 5. Die Sporenisolate werden auf Minimalmedium überimpft (Ermittlung der Prototrophie bzw. der Auxotrophie) Hinweise zur Auswertung Aufgrund der Resistenz- bzw. Auxotrophieeigenschaften ist zu bestimmen, inwieweit eine homologe Insertion des hph-Gens in das ura3-Gen vorliegt. Eine Kopplung bzw. Nicht-Kopplung der beiden Gene (hph, ura3) wird aufgrund dieser physiologischen Eigenschaften ermittelt. Welche verschiedenen Phänotypen sind grundsätzlich bei den Sporenisolaten zu erwarten?

2.4 Chlamydomonas reinhardtii

111

2.4 Chlamydomonas reinhardtii Die sexuelle Fortpflanzung von C. reinhardtii wird im Labor in der Regel durch Anzucht der Stämme in Stickstoffmangelmedium (TAP–N) induziert. Kreuzungspartner mit unterschiedlichen Paarungstypen werden nach der Differenzierung der Gameten gemischt und ausplattiert. Nach wenigen Tagen können Tetraden isoliert werden, die die Meiosporen ungeordnet enthalten. Anhand solcher Kreuzungen lassen sich sehr schnell erste Charakterisierungen von Mutationen durchführen. Die Aufspaltung der Phänotypen während einer Kreuzung geben einen wichtigen Hinweis auf das von der Mutation betroffene genetische Kompartiment der Zelle. Nukleäre Mutationen werden gemäß den mendelschen Gesetzen vererbt und segregieren nach einer Kreuzung im Verhältnis 2 : 2 (Abb. 2.4.1). Werden zwei nukleäre Marker während der Kreuzung verfolgt, so kann man prinzipiell drei Typen von Tetraden beobachten: parentale Ditypen (PD), nicht-parentale Ditypen (NPD) und Tetratypen (T). Diese entsprechen den bereits erwähnten P-, R- und T-Ascustypen der Bäckerhefe (Abb. 2.2.1 und Abb. 2.2.2) und erlauben daher ebenfalls Rückschlüsse auf die mögliche Kopplung zweier Marker. Außerdem können die Frequenzen des Auftretens der Tetradentypen für die Bestimmung des Abstandes zweier gekoppelter Loci bzw. ihres Abstandes zum Centromer herangezogen werden. Die Vererbung von Organellengenomen erfolgt uniparental (Abb. 1.5.2 und Abb. 2.4.1), so dass alle vier Nachkommen einer Tetrade die Chloroplasten-DNA des +Partners und die Mitochondrien-DNA des −Partners erhalten. In der Regel werden vier Meiosporen aus einer Tetrade isoliert. Je nach Alter der Zygote und in Abhängigkeit der verwendeten Stämme kann es aber auch zur Bildung von 8 oder sogar 16 Sporen kommen, wenn eine bzw. zwei mitotische Teilungen auf die Meiose folgen. Diese Sporen sind sehr klein (ca. 10 µm) und müssen daher unter einem Binokular mit Spezialwerkzeugen voneinander getrennt werden. Dafür haben sich in der Vergangenheit Glaswerkzeuge aus Eigenherstellung bewährt, die aus langen Pasteurpipetten bestehen, deren Spitzen in einer Bunsenbrennerflamme geschmolzen und fein ausgezogen werden. Einzelne Sporen werden damit im Abstand von 0,5 cm in Linien oder im Karree angeordnet. Im Folgenden soll ein Beispiel für den kombinierten Einsatz von Kreuzungsanalysen und molekulargenetischen transgenen Ansätzen vorgestellt werden. Diese experimentelle Strategie erlaubt die Identifizierung plastidärer Zielsequenzen für kernkodierte regulatorische Faktoren der ChloroplastenBiogenese.

112

2 Genetische Kreuzungen

Wie bereits erwähnt, sind in C. reinhardtii eine ganze Reihe nukleärer Loci beschrieben worden, deren Genprodukte die Genexpression im Chloroplasten zum Großteil sehr genspezifisch kontrollieren und damit eine Kommunikation zwischen Kern- und Chloroplastengenom vermitteln. Die zur Zeit bekannten Faktoren werden posttranslational in den Chloroplasten importiert und wirken dort, soweit bekannt, auf posttranskriptioneller Ebene. Sie beinflussen entweder die Stabilität/Reifung einzelner plastidärer Transkripte oder sie sind an der Translation von mRNAs beteiligt. Eine wichtige Frage im Hinblick auf die molekulare Wirkungsweise dieser Faktoren ist die genaue Identifizierung derjenigen Elemente der plastidären RNAs, die von den kernkodierten Faktoren spezifisch erkannt werden. Dazu werden zuerst Genkon5' NTR

3' NTR

aadA

biolistische Chloroplasten-Transformation

×

aadA

Tcg13, mt +

aadA

mbd1, mt −

Tetradenanalyse

PS Res

Sp

aadA

aadA

aadA

aadA

+

−

+

−

+

−

+

−

Abb. 2.4.1. Strategie zur Identifizierung des Wirkortes von Mbd1 auf der psbDmRNA. Durch biolistische Transformation wird ein Reportergenkonstrukt in den Chloroplasten eingebracht (Abb. 3.4.2), das entweder die 5’- oder 3’-NTR des psbDGens fusioniert mit dem aadA-Reportergen enthält. Dieser Stamm (Tcg13) mit dem Kreuzungstyp + (mt+) wird mit der nukleären Mutante mbd1, die den Kreuzungstyp – besitzt (mt–) genetisch gekreuzt und die resultierenden Tetraden charakterisiert. Der nukleäre Wildtypkern ist weiß und der von mbd1 dunkel unterlegt. PS photosynthetisches Wachstum, ResSpec Resistenz gegen Spectinomycin

2.4 Chlamydomonas reinhardtii

113

strukte, welche die putativen regulatorischen Regionen fusioniert mit einem Reportergen tragen, in den Chloroplasten durch biolistische Transformation eingebracht (Kap. 3.4.2). Danach werden diese transplastomen Stämme mit der nukleären Mutante gekreuzt, in welcher der interagierende regulatorische Faktor defekt ist. Enthält das Reportergenkonstrukt die Zielsequenz des regulatorischen Faktors, so entsteht eine Co-Segregation von Reportergenaktivität und nukleärem Marker. 2.4.1 Tetradenanalyse Im praktischen Teil wird der transplastome Stamm Tcg13 (Kreuzungstyp +) mit der nukleären Mutante mbd1 (Kreuzungstyp −) gekreuzt. Während alle Nachkommen das transgene Chloroplastengenom des +Elters erben (und somit das Reportergen enthalten), wird das Kergenom nach Mendel im Verhältnis 2 : 2 vererbt, so dass zwei der vier Nachkommen die mbd-Mutation im Kern tragen und zwei nicht. Nach Ausplattieren der resultierenden isolierten Nachkommen-Linien auf Medium, das entweder auf photoautotrophes Wachstum (HSM) oder auf Spectinomycin-Resistenz (Spec) selektioniert, erkennt man die mbd1-bedingte Co-Segregation von Photosynthese-Defizienz und Spectinomycin-Sensitivität (Abb. 2.4.1). Diese Ergebnisse belegen also, dass der 5’-NTR der psbD-mRNA ausreichend für die Vermittlung der RNA-stabilisierenden Funktion von Mbd1 ist. Der nukleären Mutante mbd1 fehlt ein Faktor, der für die Stabilisierung der plastidären psbD-mRNA notwendig ist. Das psbD-Gen kodiert für das D2-Protein des Photosystems II. In der Photosynthese-defizienten Mutante werden im Chloroplasten psbD-Transkripte synthetisiert, die anschließend sofort wieder abgebaut werden, so dass sie nicht akkumulieren können. Die RNA-Bereiche, die Elemente für die Bestimmung der Transkript-Halbwertszeiten enthalten und damit putative Zielregionen für den Mbd1-Faktor darstellen würden, sind in der Regel entweder in den 5’-oder den 3’-nichttranslatierten Regionen (NTR) von mRNAs lokalisiert. Deshalb soll überprüft werden, ob das aadA-Reportergen (Abb. 3.4.2), das mit dem 5’-Bereich des psbD-Gens aus C. reinhardtii fusioniert wird, genau wie das endogene psbD-Gen in Abhängigkeit von Mbd1 exprimiert wird. Damit wäre die Zielregion dieses Faktors auf den psbD-5’-NTR eingegrenzt.

Für die Kreuzung sollten beide Stämme vital sein, sie werden deshalb im Vorfeld mindestens zweimal im Abstand von einer Woche auf Agarplatten überimpft. Der endgültige Ausstrich sollte nicht älter als zwei Tage sein. Alle Arbeiten werden idealerweise unter einer Sterilarbeitsbank durchgeführt.

114

2 Genetische Kreuzungen

Material • • • • • • • • • • • • • •

•

•

•

•

Impföse ausgezogene Pasteurpipetten aus Glas Bunsenbrenner Ethanol Rasierklingen Binokular Reagenzgläser Chloroform in Glas-Petrischale Glaspipetten TAP–N-Flüssigmedium 4 %ige TAP-Agarplatten (gewaschener Agar) HS-Agarplatten (Test auf photoautotrophes Wachstum) TAP + Spec-Agarplatten (Test auf Spectinomycin-Resistenz) Beijerincks-Lösung 10 g NH4Cl 0,4 g MgSO4× 7 H2O 0,20 g CaCl2× 1 H2O ad 1 L mit H2O Beijerincks-Lösung–N 0,4 g MgSO4 × 7 H2O 0,20 g CaCl2× 1 H2O ad 1 L mit H2O Phosphat-Lösung 28,8 g K 2HPO4 14,4 g KH2PO4 ad 1 L mit H2O, pH 7,0 mit KOH einstellen Spurenelemente-Lösung In 550 mL H2O werden die folgenden Substanzen in dieser Reihenfolge gelöst und auf 100 °C erhitzt: 11,40 g H3BO3 22,00 g ZnSO4× 7 H2O 5,06 g MnCl2× 4 H2O 4,99 g FeSO4× 7 H2O 1,61 g CoCl2× 6 H2O 1,57 g CuSO4× 5 H2O 1,10 g (NH4) 6Mo7O24× 4 H2O 50 g EDTA Na 2 werden in 250 mL H2O durch Erwärmen gelöst und bei 100 °C zur ersten Lösung gegeben. Dann wird die gesamte Lösung mit 100 mL 20 % KOH bei 85 °C auf pH 6,5–6,8 eingestellt und das Volumen ad 1 L gebracht. HS-Medium (Minimalmedium) 25 mL Beijerincks-Lösung

2.4 Chlamydomonas reinhardtii

115

25 mL Phosphat-Lösung 1 mL Spurenelemente-Lösung (20 g Agar für Festmedium) ad 1 L mit A. dest. • TAP-Medium (Vollmedium) 2,42 g Tris 1 mL Spurenelemente-Lösung 1 mL Phosphat-Lösung 25 mL Beijerincks-Lösung (20 g Agar für Festmedium) ad 1000 mL A. dest. pH 7,0–7,2 mit Eisessig (ca. 1 mL) einstellen • TAP–N-Medium TAP-Medium, das mit Beijerincks-Lösung–N angesetzt wurde • TAP+Spec-Medium TAP-Medium, in das sterifiltrierte Spectinomycin-Lösung nach dem Autoklavieren zugegeben wurde (Endkonzentration: 50 µg Spectinomycin/mL)

Methode 1. Mit der Impföse wird sowohl vom Stamm Tcg13 als auch vom Stamm mbd1 eine erbsengroße Zellmenge in jeweils 3 mL TAP–N Medium (Stickstoffmangelmedium) inokuliert und über Nacht im Schwachlicht leicht geschüttelt. 2. Am nächsten Morgen werden jeweils 1 mL der beiden Kulturen gemischt. Nach ca. 2 h kann die Kreuzungseffizienz am Mikroskop durch Zählen der Tetraflagellarstadien verfolgt werden. Wenn ungefähr 40 % der Zellen dieses Stadium der Verschmelzung erreicht haben, kann von einer guten Kreuzungseffizienz ausgegangen werden. 3. Von dem Zellgemisch werden 0,1 mL mit einer sterilen Glaspipette auf 4 %ige Agarplatten im Zickzackmuster verteilt, so dass neben den Zygoten Platz für die spätere Separierung der Meiosporen vorhanden ist. Der Agar für diese Kreuzungsplatten sollte intensiv gewaschen sein, um störende Kontaminationen zu entfernen (100 g Agar in 5 L destilliertem Wasser für eine Woche mit täglichem Wasserwechsel waschen). Pro Kreuzung sollten mindestens drei Platten angelegt werden. 4. Platten werden im Licht über Nacht inkubiert und dann für 5 Tage im Dunkeln (Verpackung in Aluminiumfolie) belassen. Während dieser Zeit reifen die Zygoten heran. 5. Am nächsten Morgen werden die Platten morgens geöffnet und mit einer sterilen Rasierklinge (abgeflämmt mit Alkohol) mit gleichbleibendem mittleren Druck abgezogen. Vegetative Zellen werden so zerstört bzw. entfernt,

116

2 Genetische Kreuzungen

während die harten Zygoten in den Agar gedrückt werden. Restliche vegetative Zellen werden dann durch eine Chloroform-Bedampfung (KopfüberLagerung der Platte auf einer Glas-Petrischale mit Chloroform) für 30 s abgetötet. 6. Die Platten werden nun über Nacht ins Licht gestellt. Die Meiosporen können am nächsten Tag durch ausgezogene Glas-Pasteurpipetten unter dem Binokular isoliert bzw. separiert werden. Danach belässt man die Platten im Schwachlicht (ca. 7 Tage), bis einzelne Sporen zu sichtbaren Kolonien gewachsen sind und mit Zahnstochern auf eine neue TAP-Platte überführbar werden. Nachdem diese Klone ausreichend Zellmaterial gebildet haben, können Replika-Platten mit den HS- und TAP+Spec-Testmedien angelegt werden, um die Phänotypen der Kreuzungsprodukte zu überprüfen. Hinweise zur Auswertung Der Phänotyp der Kreuzungsprodukte wird anhand des Wachstums dokumentiert. Dabei sollen die vier Klone, die aus einer Tetrade stammen, immer in einer Reihe nebeneinander angeimpft werden. Es werden mindestens vier vollständige Tetraden analysiert und protokolliert: Wachstum =„+“; kein Wachstum = „−“.

2.5 Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana besitzt Zwitterblüten und ist in der Regel autogam, d. h. Selbstbestäuber. Diese Selbstung führt zu leichter Gewinnung von rezessiven Mutanten. Mutanten entstehen auf natürliche Art, induziert durch Röntgenstrahlung, Behandlung mit chemischen Mutagenen wie z. B. EMS (Ethylmethansulfonat) oder durch molekulare Methoden wie z. B. das Einführen von T-DNA-Insertionen (Kap. 1.6). Zur Kartierung einer Mutante, der Identifizierung eines Gens, ist es notwendig, Selbstbestäubung zu verhindern und die Mutante mit einem Wildtyp zu kreuzen, bei dem die Lage möglichst vieler genetischer Marker auf der Genkarte bekannt ist. Die Blüten der Mutante werden emaskuliert und mit den Pollen des entsprechenden Wildtyps bestäubt. Die aus den Samen der entstehenden Schote hervorgehenden F1-Pflanzen, die genetisch heterozygot sind, werden geselbstet und die Individuen der F2-Generation untersucht. Aus dem Anteil der F2-Pflanzen, die rekombinant sind, d. h. die neue Merkmals-

2.5 Arabidopsis thaliana

117

kombination tragen, kann man abschätzen, ob die Mutation gekoppelt mit einem bereits kartierten Merkmal auf demselben Chromosom liegt und wie weit ggf. der Abstand ist. Als Merkmale eignen sich die klassischen phänotypischen Merkmale wie z. B. Trichommutationen oder Mutationen der Wachsschicht, oder aber die Verwendung von molekularen Markern. Voraussetzung für letztere ist, dass allelische Sequenzunterschiede zwischen den Individuen oder Ökotypen bestehen, die in den Genen oder intergenischen Bereichen liegen können und zu unterschiedlichen Größen der homologen DNA führen. Folgende Marker werden verwendet: RFLP (restriction fragment length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism), SNP (single nucleotide polymorphism), SSLP (simple sequence length polymorphism) und CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence). In diesem Kapitel soll die Methode der künstlichen Bestäubung einer Blüte von Arabidopsis beschrieben werden, und als Beispiel für eine Anwendung dient die Kartierung einer Mutation mit CAPS-Markern, da diese Methode, wenn gewisse Sequenzinformationen vorhanden sind, einfach und relativ schnell durchzuführen ist. 2.5.1 Kreuzung von Arabidopsis Die Auskreuzungshäufigkeit von Arabidopsis unter Laborbedingungen ist äußerst gering. Daher muss bei genügend großem Abstand der Einzelpflanzen voneinander im Wesentlichen darauf geachtet werden, dass vor oder während des Experiments keine Selbstbestäubung erfolgt. Zur Kreuzung sollte der Genotyp, der das rezessive Merkmal trägt, als „weibliche“ Pflanze genommen werden, da damit ungewollte Selbstung in der F1-Generation geprüft werden kann. Häufig, aber nicht immer, wird die Mutante die rezessive Eigenschaft tragen. Arabidopsis thaliana gehört zu den Kreuzblütern. Die Blüte ist vierwirtelig und besteht aus vier Kelchblättern (Sepalen) und vier Kronblättern (Petalen). In der Mitte der Blüte befindet sich der aus zwei miteinander verwachsenen Fruchtblättern bestehende Pistill. Er ist umgeben von vier langen medialen und zwei kurzen lateralen Staubblättern (Stamina) (Abb. 2.5.1). Material • feine Pinzetten, gerade und gebogen, ohne Riefen • 95 % Ethanol • Stereomikroskop oder Stereolupe

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2 Genetische Kreuzungen

• kleine Papiertüten und Etiketten zur Markierung • „weibliche“ Pflanzen, Beginn der Blüte, Pistilldonatoren, z. B. Mutante, 4–8 Wochen alt, je nach Anzuchtbedingungen • „männliche“ Pflanzen, Beginn der Blüte, Pollendonatoren, z. B. Wildtyp, 4–8 Wochen alt, je nach Anzuchtbedingungen

Methode 1. Man beginnt mit den „weiblichen“ Pflanzen und sollte nur einige wenige junge Knospen an der Spitze der Hauptfloreszenzachse nehmen. Alle anderen Knospen und Nebenfloreszenzen werden entfernt. Es werden Knospen genommen, die noch geschlossen sind und bei denen die weißen Kronblätter gerade zu sehen sind. In diesem Stadium sind die Staubblätter kurz, unreif und sehen gelblich-grün und glänzend aus. Knospen, die sich bereits geöffnet haben, dürfen nicht verwendet werden, da sonst die Gefahr besteht, dass es schon zu einer Bestäubung gekommen ist. Mit sterilisierten Pinzetten (Ethanol) werden zunächst vorsichtig die Kelchblätter (schwierig), dann die Kronblätter und zum Schluss die Staubblätter abgezupft, so dass nur das Fruchtblatt übrigbleibt. Griffel, Narbe und Fruchtknoten dürfen dabei keinesfalls verletzt werden, die Bestäubung verläuft nur bei intakten Geweben erfolgreich. 2. Die zur Bestäubung verwendete „männliche“ Blüte muss voll geöffnet sein (Abb. 2.5.1). In diesem Stadium entlassen die Staubblätter in der Regel den Pollen. Dieses sollte aber unter der Stereolupe überprüft werden. Staubblät-

Narbe

Staubblatt

Kronblatt

Kelchblatt

Abb. 2.5.1. Darstellung einer voll geöffneten Blüte von Arabidopsis thaliana

2.5 Arabidopsis thaliana

119

ter, die Pollen entlassen, sehen nicht mehr glänzend gelbgrün aus, sondern sind gelb bis gelborange und „pudrig“. Sind die Staubblätter zu alt, nehmen sie eine bräunliche Farbe an. Man nimmt nun entweder die ganze Blüte oder nur die Staubblätter nach Entfernen mindestens der Kronblätter und „pinselt“ die Narbe der zuvor präparierten „weiblichen“ Blüte mit den Pollen ein. Unter der Lupe wird kontrolliert, ob Pollenpäckchen auf der Narbe abgelegt worden sind. 3. Die bestäubten Blüten werden mit einem Etikett an der Infloreszenzachse markiert, ggf. vorübergehend mit einem Tütchen geschützt und die Pflanzen unter geeigneten Bedingungen (nicht zu trockene Luft) weitergezogen. 4. Eine erfolgreiche Bestäubung ist daran zu erkennen, dass nach 3–4 Tagen die Entwicklung einer Schote sichtbar wird. Diese ist meist nach 2–3 Wochen (abhängig von den Anzuchtbedingungen, Kap. 1.6) ausgereift und verfärbt sich gelb bis braun. Die Schoten werden vorsichtig geerntet, bevor sie sich öffnen, und die Samen werden noch ca. eine Woche bei 30 °C nachgetrocknet. 2.5.2 Kartierung mit CAPS-Markern Die genetische Kartierung einer Mutation bei Arabidopsis thaliana wird dadurch erleichtert, dass das Genom komplett sequenziert ist und eine große Anzahl morphologischer und molekularer Marker vorliegen, deren Lage auf der Genkarte von Arabidopsis bekannt ist. Kartierung mit molekularen Markern beruht auf DNA-Polymorphismen zwischen Allelen eines Gens in unterschiedlichen Linien, die mit Hilfe der PCR (Polymerasekettenreaktion, Kap. 4) und ggf. dem Einsatz von Restriktionsenzymen, die die Allele unterschiedlich schneiden, sichtbar gemacht werden können. Um mit den Markern Kopplungsgrade zwischen Genen festzustellen, muss eine segregierende Population untersucht werden. Dieses wird erreicht, indem die Mutante, die möglichst homozygot sein sollte, mit einem Ökotyp von Arabidopsis gekreuzt wird, der ein unterschiedliches Allel des ausgewählten Markers trägt. Die F1-Pflanzen werden geselbstet. In der F2-Generation werden die Mutation und die Marker segregieren. Eine ausreichende Anzahl von Einzelpflanzen der F2-Generation (30–100) wird untersucht und die Rekombinationshäufigkeit zwischen Mutation und Marker bestimmt. Bei Verwendung von CAPS-Markern, die codominant sind, können Einzelpolymorphismen zwischen zwei DNA-Proben festgestellt werden. Die Marker werden durch PCR der aus den F2-Pflanzen isolierten DNA amplifiziert, anschließend mit dem vorgegebenen Restriktionsenzym verdaut und die Produkte auf einem Agarosegel aufgetrennt. Bei Polymorphismus der Eltern

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2 Genetische Kreuzungen C/C

L/L

C/L R R

R

PCR, Restriktion, Agarosegel

Abb. 2.5.2. CAPS-Marker-Analyse durch Agarosegelelektrophorese. Dargestellt ist die Analyse mit dem CAPS-Marker BGL1, bei dem das Restriktionsenzym das von der DNA durch PCR amplifizierte Fragment nicht (Col; C/C) oder einmal (Ler; L/L) schneidet. R stellt die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms dar. Im unteren Teil der Abbildung ist skizzenhaft das Ergebnis der Gelelektrophorese aufgetragen, nachdem DNA aus den Eltern und einer Heterozygoten mit PCR amplifiziert, das Produkt mit dem Restriktionsenzym geschnitten und dann über eine Gelelektrophorese aufgetrennt wurde. Man erkennt, dass die Heterozygote (C/L) sowohl die Banden aus dem C/C- als auch aus dem L/L-Elter trägt. Die Skizze ist beispielhaft für den CAPS-Marker BGL1, der auf dem Chromosom 3 liegt. Das Produkt des Markers nach PCR wird mit Sau3A1 geschnitten und ergibt für den Wildtyp Col eine Größe von 1269 bp, während im Ler-Background Produkte von 875 bp und 395 bp entstehen

schneidet das Restriktionsenzym das Produkt in unterschiedlich große Stücke, was auf dem Gel zu sehen ist. Rekombinante, heterozygote Organismen weisen das Bandenmuster beider Eltern auf (Abb. 2.5.2). Die Methode, CAPS-Marker zu verwenden, wurde von Konieczny und Ausubel (1993) vorgestellt, die 18 CAPS-Marker in unterschiedlichen Positionen für die fünf Chromosomen von Arabidopsis entwickelten. Damit war die Zuordnung eines Gens zu einem definierten Chromosom bzw. Chromosomenarm möglich. In der Zwischenzeit sind etliche zusätzliche CAPS-Marker

2.5 Arabidopsis thaliana

121

entwickelt worden, so dass die Methode heute auch eine feinere Kartierung ermöglicht. Die meisten Marker finden sich für die Linien Ler und Col. Eine Liste der vorhandenen Marker ist über die TAIR (Arabidopsis Information Resource)-Datenbank erhältlich (www.arabidopsis.org). Dort findet man auch die Basensequenz des zugehörigen Primerpaares, Hybridisierungstemperaturen, das jeweilige Restriktionsenzym und die Größe der entstehenden DNA-Produkte. Durchführung der Kartierung mit CAPS-Markern Eine komplette Kartierung z. B. einer Mutation, angefangen mit dem Kreuzen von Mutante und Wildtyp, zieht sich über mehrere Monate. Für Praktikumsversuche können daher nur Teilbereiche durchgeführt werden, z. B. Üben der Kreuzung und dann Weiterarbeit mit zur Verfügung gestellten F2-Pflanzen. Kreuzung und Erzeugung der F2-Population Die Kreuzung wurde im vorangegangenen Abschnitt ausführlich beschrieben. Wünschenswert ist eine homozygote Mutante. Liegt die Mutation z. B. im Ökotyp Landsberg erecta (Ler), Beispiel: senescence (sen1) vor, wäre es sinnvoll, mit dem Col-Wildtyp als Pollengeber zu kreuzen. Die F1-Pflanzen erfahren Selbstbestäubung, das Saatgut wird gesammelt und die daraus gezogenen F2Pflanzen werden im Alter von ca. vier Wochen (abhängig von den Anzuchtbedingungen) verwendet. Das Saatgut der verschiedenen Linien, aber auch Saatgut von einer Reihe bereits kartierter Mutanten (für Praktikumsversuche) kann über die Saatgutzentren ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, OH, USA) und NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, Loughborough, UK) bezogen werden. Verweise zu diesen Saatgutzentren sind über die Internetseite: www.arabidopsis.org zu erhalten. DNA-Isolierung Zur Analyse wird genomische DNA aus den Elternpflanzen (Mutante sen1 in Ler, Wildtyp Col) und Pflanzen der F2-Generation isoliert, wie in Kap. 3.5.2 beschrieben. CAPS-Reaktion Zunächst sollten CAPS-Marker zur Kartierung für jedes Chromosom verwendet werden, die nahe am Centromer liegen, und danach weiter entfernte, so dass festgestellt werden kann, mit welchem Chromosom und Chromosomenarm die Mutation gekoppelt ist. Eine genauere Kartierung kann mit weiteren CAPS-Markern erfolgen, oder andere molekulare Marker (s. Einleitung) müssen verwendet werden. Nach PCR und Restriktion der DNA erfolgt die

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2 Genetische Kreuzungen

Auftrennung über 1,5 %ige Agarosegele (Konzentration abhängig von Produktgröße). Material • Arabidopsis-Linien: Wildtyp Col und Mutante sen1 (Ler) • genomische DNA aus Eltern und F2-Generation • Primerpaar für die PCR, spezifisch für den gewählten CAPS-Marker, hier BGL1, Chromosom 3, siehe www.arabidopsis.org • Reagenzien für die PCR dNTPs (2,5 mM) Taq-Polymerase 10× Taq-Puffer • Restriktionsenzym • 10× Restriktionspuffer • Thermocycler, Heizblock, Hütchen für die PCR-Reaktion • Material für die Agarosegelelektrophorese

Methode (nach Glazebrook et al. 1998) 1. Zu 1 µL DNA-Probe (10–50 ng) werden 0,5 µL der 2,5 mM dNTPs, je 1 µL der beiden Primer (20 ng/µL), 1 µL 10× Taq-Puffer, 0,1 µL Taq-Polymerase (0,5 U) und 5,5 µL A. dest. gegeben. 2. PCR (ggf. über Nacht); Programmparameter müssen u. U. variiert werden: a. b.

c. (d.

Phase Denaturierung der dsDNA Amplifizierungszyklen (50×) Denaturierung Hybridisierung Polymerisation terminale Elongation langsame Abkühlung auf 4 °C)

Dauer 2 min

Temperatur 95 °C

1 min 1 min 3 min 10 min

95 °C 56 °C 72 °C 72 °C

3. Restriktion: zum PCR-Ansatz 2 µL 10× Restriktionspuffer, 8 µL A. dest., 2–10 U des entsprechenden Restriktionsenzyms geben, 2 h bei 30–35 °C inkubieren (vollständige Restriktion ist essentiell!). 4. Zugabe von 2 µL Ladepuffer, Auftragen auf ein Agarosegel und Auftrennung. 5. Visualisierung im UV nach Anfärbung durch Ethidiumbromid. Ein Beispiel für die Darstellung eines Polymorphismus mit dem CAPS-Marker BGL1 ist in Abb. 2.5.2 gegeben.

2.5 Arabidopsis thaliana

123

Hinweise zur Auswertung Je näher der Marker und der Mutationsort beisammen liegen, umso wahrscheinlicher ist eine Cosegregation und umso geringer ist die Rekombinationswahrscheinlichkeit. Für die Rekombinationshäufigkeit r gilt A + 2A

he ho r = 

2A F2

mit

A F2 = Gesamtzahl der ausgetesteten F2-Pflanzen Ahe = Anzahl der heterozygoten Individuen Aho = Anzahl der Wildtyp-homozygoten Individuen nach Segregation in der F2-Generation und näherungsweise für die Entfernung D zwischen dem Locus der Mutation und dem Marker D [cM] ≈ r [%] Genauer gilt für Arabidopsis die Kosambi-Gleichung (s. Koornneef et al. 1988) 100 + 2r

D = 25 ln  100 − 2r

Beispiel sen1-Mutante in Ler-Background, gekreuzt mit dem Wildtyp Col, CAPSMarker BGL1 (Rojas-Pierce und Springer 2003): Unter den sind und

A F2 = 35 getesteten F2-Pflanzen Ahe = 1 Col/Ler-Heterozygote, Aho = 6 Col-Homozygote 28 Ler-Homozygote.

Daraus ergibt sich eine Rekombinationshäufigkeit von 1+2⋅6

r =  = 18,6 % 2 ⋅ 35

und eine Entfernung D von ca. 18,6 cM oder genauer 100 + 2 ⋅18,6 %

D = 25 ln  = 19,5 cM 100 − 2 ⋅18,6 %

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2 Genetische Kreuzungen

2.6 Drosophila melanogaster Die kurze Generationszeit, die leichte Handhabbarkeit, das reich strukturierte Exoskelett und die Riesenchromosomen haben den Siegeszug von Drosophila melanogaster als ein beliebtes und viel benutztes Objekt der klassischen Genetik ermöglicht. T. H. Morgan, H. J. Muller, A. Sturtevant und C. Bridges haben die Befunde von Gregor Mendel aufgegriffen und bereits in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts die wesentlichen Aussagen der klassischen Genetik erarbeitet. Heute ist Drosophila mit ihren vielfältigen genetischen und molekulargenetischen Möglichkeiten zu einem wichtigen Modellsystem für weite Bereiche der Lebenswissenschaften geworden. Grundbegriffe der Drosophila-Genetik Zunächst sollen einige wichtige Grundbegriffe definiert werden. Drosophila ist ein diploider Organismus, d. h. fast alle Gene liegen in zwei Kopien vor. Eine Ausnahme stellen die heterosomalen Gene beim Männchen dar. Die Diploidie erschwert die Analyse von Erbgängen, da nicht immer — wie bei haploiden Organismen — vom Phänotyp eindeutig auf den Genotyp geschlossen werden kann. Organismen in der freien Natur weisen normalerweise einen einheitlichen Phänotyp auf, der als Wildtyp bezeichnet wird. Der einheitliche Phänotyp lässt auf einen weitgehend einheitlichen Genotyp schließen, d. h. die meisten der Gene liegen in identischen Allelen vor: Für diese Gene wird der Genotyp als +/+ abgekürzt. Ein Gen kann in unterschiedlichen Erscheinungsformen ausgeprägt sein, die wir als Allelformen bezeichnen. In der Sprache der Genetik wird dies wie folgt geschrieben: a1 /a2

(sprich „a1 über a2 “)

Der Buchstabe entspricht dem Gennamen, die hochgesetzten Zeichen spezifizieren das Allel. Mutationen in einem Gen werden als rezessiv klassifiziert, wenn sich ein Phänotyp nur dann ausprägt, wenn das Allel homozygot vorliegt. Ist das erste gefundene Allel eines Gens rezessiv gegenüber dem Wildtyp, beginnt der Genname mit einem kleinen Buchstaben (auch am Satzbeginn). Wenn ein Allel als dominant klassifiziert wird, prägt sich der Phänotyp auch im heterozygoten Zustand aus. Ein Gen, dessen erste beschriebene Mutation dominant gegenüber dem Wildtyp war, erhält einen Namen mit großem Anfangsbuchstaben.

2.6 Drosophila melanogaster

125

Die meisten der untersuchten Allele wurden durch Mutagenese-Experimente erzeugt. Wir sprechen von einer Mutagenese, wenn Gene verändert werden. Das Mutagen kann z. B. Röntgenstrahlung, ein mobiles DNA-Element (Transposon) oder eine DNA-modifizierende Chemikalie sein. Mutagenesen sind in der Regel ungerichtet. Demnach müssen wir aus den vielen zufällig induzierten Mutationen die für die jeweilige Fragestellung interessanten Kandidaten heraussuchen. Mutationstypen Die einfachste Art ein Gen zu verändern ist, es physikalisch zu entfernen. Wir sprechen dann von einer Defizienz (Df). Wenn ein Gen vollständig fehlt, sprechen wir auch von einem Nullallel oder amorphen Allel. Um zu bestimmen, ob eine Mutation tatsächlich zu einem vollkommenen Verlust der Genfunktion führt, wird der Phänotyp des homozygoten Allels mit dem Phänotyp verglichen, der sich ergibt, wenn das Allel heterozygot über der Defizienz dieses Gens vorliegt (Heterozygose). Sind beide Phänotypen gleich, liegt ein amorphes Allel vor. Man kann sich natürlich auch vorstellen, dass ein Gen nur einen mehr oder weniger kleinen Teil seiner Funktion eingebüßt hat. Solche Mutationen werden auch als hypomorphe Mutationen bezeichnet. Dies wird z. B. nach Punktmutationen häufig beobachtet. Der Phänotyp eines homozygoten hypomorphen Allels ist schwächer als in Heterozygose über der Defizienz des Gens, das heißt, die Tiere prägen einen Phänotyp aus, der zwischen dem Phänotyp des amorphen Allels und dem Wildtyp liegt. Da sowohl amorphe als auch hypomorphe Mutationen zu einem Funktionsverlust gegenüber der Wildtyp-Situation führen, werden diese Mutationen im Englischen als „loss of function“ bezeichnet und oft mit LOF abgekürzt. Eine Mutation kann aber auch eine Verbesserung der Genfunktion bewirken, z. B. könnte die Aktivität eines Enzyms nach der Mutation erhöht sein, ein Transkriptionsfaktor könnte seine DNA-Zielsequenz besser binden oder ein Stukturprotein stabiler und länger haltbar sein. In solchen seltenen Fällen führt das Mutationsereignis zu einem hypermorphen Allel. Ein solches Allel wird auch als gain-of-function-Allel, abgekürzt GOF, bezeichnet. Um festzustellen, ob eine Mutation zu einem hypermorphen Allel geführt hat, wird der Phänotyp in Heterozygose über der Defizienz bzw. der Duplikation des jeweiligen Gens analysiert. Eine Mutation kann auch zu einer gänzlich neuen Genfunktion führen. Dies kann z. B. durch eine Veränderung des Ortes der Genexpression erfolgen (Enhancer-Mutationen, regulatorische Mutationen). Wenn beispielsweise ein

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2 Genetische Kreuzungen

Tabelle 2.6.1. Mutationstypen und ihre Auswirkungen. Weitere Erklärungen im Text Mutationstyp amorph hypomorph hypermorph neomorph antimorph

Phänotyp keine Funktion weniger Funktion mehr Funktion neue Funktion antagonistische Funktion

Ausprägung a/a = a/Df a/a < a/Df a/a > a/+ > a/Df a/+ = a/Df = a/Dup a/+ > a/Dup

a mutantes Allel, Df Defizienz, Dup Duplikation

Gen, das die Entwicklung des Beins steuert, nach Mutation in der Antenne exprimiert wird, wird dort statt einer Antenne ein Bein gebildet (AntennapediaMutante). Wir sprechen von einer neomorphen Mutation, die sich unabhängig vom Genotyp des zweiten Allels ausprägt. Schließlich können Mutationen auch entgegengesetzt zur normalen Funktion wirken. Sie werden dann als dominant negativ bezeichnet und man spricht von antimorphen Allelen. Über einer Duplikation wird der Phänotyp abgeschwächt. Tabelle 2.6.1 fasst die verschiedenen Mutationstypen und ihre Auswirkungen zusammen. Ein Beispiel: Ein homozygot vorliegendes Allel (a/a) wird einen schwächeren mutanten Phänotyp (hypermorph) ausprägen als heterozygot über einer Defizienz (a/Df). Warum? Versuchen Sie sich im Gedankenexperiment unter Verwendung beliebiger selbstgewählter Mutationen klar zu machen, wie man anhand der unterschiedlichen Ausprägungen auf die zugrunde liegenden Mutationstypen schließen kann. Chromosomale Aberrationen als Hilfsmittel der Genetik Chromosomen-Mutationen oder chromosomale Aberrationen sind mehr oder weniger umfangreiche Umstellungen in der Reihenfolge ganzer Chromosomenabschnitte. Um sie zu erzeugen, müssen zunächst z. B. durch Röntgenstrahlung DNA-Doppelstrangbrüche induziert werden. Manchmal werden diese anschließend irregulär repariert, was zu einer Rekombination an nichthomologen Positionen des gleichen Chromosoms oder mit einem nicht-homologen Chromosom führt. Voraussetzung hierfür ist eine räumliche Nähe der beteiligten Chromosomenabschnitte. Der Entstehungsmechanismus von chromosomalen Aberrationen ist daher als illegitimes Crossing-over zu verstehen. Im Fall von Drosophila können Aberrationen, die mehr als 100 kb umspannen, an irregulären Abfolgen der typischen Bandenmuster der Polytänchromoso-

2.6 Drosophila melanogaster

127

Tabelle 2.6.2. Chromosomen-Mutationen und die gebräuchlichen Abkürzungen Chromosomen-Mutation Defizienz Duplikation Translokation Ring-Chromosom Inversion a

Abkürzunga Df(n)Name Dp(n)Name T(n;m)Name R(n)Name In(n)Name

n und m steht für den Chromosomenarm, z. B. 3L; 3. Chromosom, linker Arm

men leicht erkannt werden. Tabelle 2.6.2 gibt eine Übersicht über die Chromosomen-Mutationen und ihre abkürzenden Schreibweisen; die ausführlichen Definitionen findet man im Glossar. 2.6.1 Balancer-Chromosomen Sehr viele der in den Stammsammlungen vorhandenen Mutationen führen in Homozygose zu Letalität oder Sterilität, d. h. sie resultieren in einem schlechten Überleben oder in geringen Nachkommenzahlen. Solche Mutationen müssen also heterozygot gehalten werden. Um zu verhindern, dass die Mutationen mit wildtypischen Allelen des homologen Chromosoms rekombinieren, verwendet man eindeutig markierte Balancer-Chromosomen als „Gegenchromosomen“. Diese Chromosomen müssen die folgenden Kriterien erfüllen: 1. Sie tragen mehrere, z.T. kompliziert ineinander verschachtelte Inversionen, wodurch die in der Meiose der Weibchen generierten Rekombinationsprodukte eliminiert werden. Die Namensgebung lässt das durch die Inversionen betroffene Chromosom erkennen: First Multiple (FM), ein Balancer für das erste Chromosom, Second Multiple (SM) und Third Multiple (TM) für das zweite und dritte Chromosom. 2. Sie tragen eine oder mehrere dominante Markermutationen, um ihr Vorhandensein in einem gegebenen Individuum auch in Heterozygose eindeutig nachweisen zu können (z. B. die Mutation Curly (Cy) auf dem 2. Chromosom, die zu gebogenen Flügeln führt). 3. Autosomale Balancer-Chromosomen tragen rezessive Letalfaktoren, die homozygote Balancer-Tiere verhindern. Im Fall der Heterosomen ist die Letalmarkierung natürlich nicht möglich, da das Balancer-Chromosom sonst nicht über die (hemizygoten) Männchen weitergegeben werden könnte. In diesem Fall werden rezessive female-sterile-Mutationen verwendet. Homozygote (= weibliche) Balancer-Tiere gibt es zwar, aber diese Tiere sind steril.

128

2 Genetische Kreuzungen

Tabelle 2.6.3. Häufig verwendete Balancer Balancer CyO

Mutationen In(2LR)O, Cy dplvI pr cn2 Achtung: Der Marker Cy ist temperatursensitiv

TM2 TM3 TM3, Sb TM3, Ser TM3, Sb Ser TM6B MKRS

In(3LR)Ubx130, emc2 Ubx130 es In(3LR)TM3, y + ri pp sep l(3)89Aa bx34e e wie TM3, zusätzlich mit Sb markiert wie TM3, zusätzlich mit Ser markiert wie TM3, zusätzlich mit Sb und Ser markiert In(3LR)TM6B, Hu e Tb Tp(3;3)MKRS, M(3)76A, kar ry2 Sb

Tabelle 2.6.4. Dominante Balancer-Marker Balancer-Marker Cy Curly Hu Humeral Sb Stubble Ser Serrate Sp Sternopleural Tb Tubby Ubx Ultrabithorax

phänotypisches Merkmal Flügel nach oben gebogen mehr Humeral-Borsten kurze, dicke Borsten Flügel an den Enden eingekerbt mehr Sternopleural-Borsten Larven, Puppen und Adulte kürzer als der Wildtyp vergrößerte Halteren, z.T. mit Borsten

Mit Hilfe der Balancer-Chromosomen kann man Mutationen über beliebig viele Generationen stabilisieren. Tabelle 2.6.3 führt häufig verwendetete Balancer auf; einige dominante Markermutationen und ihre zugehörige phänotypische Ausprägung sind in Tabelle 2.6.4 zusammengefasst. 2.6.2 Fliegenzucht Material • Drosophila-Standardmedium 8,5 g Agar und 72 g Maismehl in 1 L Leitungswasser geben und unter Rühren aufkochen, 18 g Trockenhefe, 10 g Sojamehl, 72 g Malzextrakt, 36 g Rübensirup hinzugeben, auf 60 °C abkühlen lassen und schließlich

2.6 Drosophila melanogaster

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4,0 mL Propionsäure und 15 mL Nipagin-Stammlösung hinzugeben • Nipagin-Stammlösung: 100 g Nipagin in 70 % Ethanol • Plastikröhrchen ca. 40 mL (z. B. Sarstedt-Röhrchen Art. Nr.: 62/555) • Kosmetik-Wattebäuschchen als Stopfen

Methode Drosophila kann auf einem sehr einfachen Medium gehalten werden. In der Regel werden kleine Zuchtgefäße von 15–150 mL Inhalt verwendet (Abb. 2.6.1), die mit Schaumstoff-, Watte- oder Zellstoffstopfen verschlossen werden. In den größeren „Töpfen“ können bis zu 100 Fliegen gehalten werden. Die Zahl der Nachkommen hängt von folgenden Faktoren ab: 1. der Zahl der Eltern, 2. der Dauer der Eiablage (Tage der Eltern im Topf), 3. der Temperatur (bei 18 °C entwickeln sich die meisten Stämme nur halb so gut wie bei 25 °C), 4. der genetischen Konstitution der Elterntiere und der Nachkommen, 5. der Futterqualität.

Abb. 2.6.1. Drosophila-Zuchtgefäße. Im rechten Gefäß wurde ein Stück Filterpapier in das feuchte Futter gesteckt, um den Futterbrei etwas trockner werden zu lassen und den Larven eine größere Oberfläche zu geben, an der sie sich verpuppen können

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2 Genetische Kreuzungen

In kleinen Töpfen ergeben 3–20 Elterntiere ca. 100 Nachkommen in der F1-Generation, in großen Töpfen können 10–40 Elterntiere ca. 500 Nachkommen produzieren. Für die Nachkommenzahl ist die Zahl der Väter nicht sehr entscheidend, es können 5-mal so viel Weibchen wie Männchen verwendet werden. Da die Weibchen mitunter sehr schnell eine große Zahl von Nachkommen produzieren, sollte die Elterngeneration nach einigen Tagen (sobald der Futterbrei zu „leben“ beginnt) in ein frisches Gefäß überführt oder entfernt werden. Hierzu setzt man sich ein Fliegengrab an: Eine 1 L-Flasche wird mit etwa 0,5 L vergälltem Alkohol gefüllt und mit einem großen Trichter versehen. Hier hinein können die überzähligen Fliegen geschüttet werden. Das Überführen der Fliegen von einem Gefäß in ein anderes oder in das Fliegengrab erfordert das Öffnen des Zuchtgefäßes. Dies ist zumindest anfänglich mit einer großen Flucht der Fliegen verbunden. Um dies zu vermeiden, sollte man mit den Fingern an die Gefäßwand trommeln. Die Fliegen können bei Erschütterungen nicht losfliegen und verbleiben somit im Gefäß. Nachdem die Fliegen geschlüpft sind, sollten die Töpfe möglichst nicht länger als eine Generation aufgehoben werden. Vor der Entsorgung der Zuchtgefäße sollten diese zum Abtöten der Kulturen für 1–2 Tage in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden. Die Entwicklungszeiten sind stark temperaturabhängig. Von der Eiablage bis zum Schlüpfen der erwachsenen Fliegen vergehen: 1. ca. 3 Wochen bei 18 °C, 2. ca. 12–14 Tage bei Zimmertemperatur (20 °C), 3. ca. 10 Tage bei 25 °C. Die Weibchen schlüpfen in der Regel als erste aus der Puppenhülle. Selektion virgineller Weibchen Männchen und virginelle Weibchen (Jungfrauen) sind am leichtesten an ihrer Form zu erkennen. Männchen haben ein dunkleres, „stumpfes“ Abdomen, Jungfrauen haben ein spitzeres, größeres Abdomen. Die Jungfräulichkeit von frisch geschlüpften Weibchen hängt vom Alter ihrer Brüder ab, die zur Geschlechtsreife die folgenden Zeiten brauchen: 1. ca. 24 Stunden bei 18 °C, 2. ca. 6 Stunden bei Zimmertemperatur. Regel: Am Abend (1800 Uhr) alle Fliegen aus den Töpfen entfernen. Töpfe bei Zimmertemperatur stehen lassen, wenn man um 900 Uhr morgens Jungfrauen sammeln will oder über Nacht auf 18 °C stellen, wenn man erst später am Vormittag zum Jungfrauen-Sammeln kommt. Dies ist möglich, da die Fliegen erst in den frühen Morgenstunden aus der Puppenhülle schlüpfen.

2.6 Drosophila melanogaster

131

Geschlechtskämme

Meconium

B

A

C

Abb. 2.6.2. Die Männchen sind an den Geschlechtskämmen des ersten Beinpaares und dem deutlich dunkleren Abdomen leicht zu erkennen. Weibchen tragen keine Geschlechtskämme. Frisch geschlüpfte Weibchen und damit Jungfrauen sind an dem im Darm befindlichen Meconium zu erkennen

Über Tag ca. alle 5–6 Stunden die frisch geschlüpften Jungfrauen sammeln. Wenn man abends nicht alle Fliegen entfernt hat, bzw. morgens der Zeitpunkt verpasst wurde, dürfen nur die ganz jungen, frisch geschlüpften Fliegen gesammelt werden (Abb. 2.6.2). Alle Weibchen mit einem braun durchschimmernden Darm (Meconium) können verwendet werden. Bei sehr kritischen Experimenten sollte man die Jungfrauen vor dem Kreuzen altern lassen und das Futter auf Larven hin untersuchen (auch jungfräuliche Weibchen legen nach etwa zwei Wochen Eier, die allerdings unbefruchtet sind). Ein übersehenes Männchen kann sehr großen Schaden anrichten, da dieses etwa drei Weibchen pro Tag begatten kann! Als Anfänger sollte man die Jungfrauen daher besser in kleineren Portionen sammeln (20 Fliegen/Topf). Das Alter der Männchen ist für die Kreuzung relativ unerheblich. Allerdings können Männchen, wenn sie zu lange mit CO2 betäubt wurden, steril werden.

Monokulturen haben Feinde Leider finden sich in Laborstämmen häufig nicht nur Fliegen, sondern auch Milben, die eine Zucht oder Kreuzungsarbeit deutlich erschweren können. Um einem Befall vorzubeugen, sollten die geschlüpften Fliegen recht rasch auf neue Zuchttöpfe umgesetzt werden. Da Milben einen etwas längeren Generationszyklus haben, gelingt es mit dieser einfachen Maßnahme oft, das Problem in den Griff zu bekommen. Ein weiterer Störfaktor in der Zucht von Drosophila sind Pilze und Bakterien, die im Futter unkontrolliert wachsen und schnell zur Konkurrenz für die Fliegen werden. Aus diesem Grund werden dem Futter

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2 Genetische Kreuzungen

das Fungizid Nipagin und Propionsäure beigemischt. Falls eine solche Futtermischung nicht möglich ist, hilft es oft, die Fliegen in hinreichender Dichte (ca. 50 Fliegen auf 30 mL Futter) in einem Zuchtgefäß zu halten. 2.6.3 Genetische Kreuzungen mit Drosophila Morphologie der adulten Fliegen Um zwei Fliegenstämme gezielt zu kreuzen, müssen Jungfrauen und Männchen der jeweiligen Genotypen selektioniert und anschließend in einem Zuchtgefäß zusammengesetzt werden. Dieser erste wichtige Schritt einer Kreuzung erfordert zunächst etwas Übung im Erkennen von Weibchen/Jungfrauen und Männchen. Ein zweiter und ebenso wichtiger Punkt, den wir bei der Drosophila-Genetik beachten müssen, ist, dass die verschiedenen Chromosomen der Fliege natürlich frei rekombinieren können, d. h. nach den Gesetzen von G. Mendel in jeder Generation neue Chromosomen und damit Merkmalskombinationen hervorbringen können. (Die zumindest in Weibchen ebenfalls auftretende intrachromosomale Rekombination wollen wir hier zunächst einmal vernachlässigen.) Daher ist es zweckmäßig, wenn man die einzelnen Chromsomen von „außen“ verfolgen kann. Hierzu werden in der Genetik verschiedene dominante Mutationen verwendet, die zu leicht erkennbaren mutanten Phänotypen führen. So kann man z. B. das zweite Chromosom mit dem Cy-Marker versehen, der zu charakteristisch gebogenen Flügeln führt. Im Allgemeinen werden Mutationen verwendet, die zu Veränderung der Morphologie der Flügel, der Borsten oder der Augen führen. In der ersten Übungseinheit sollten Sie sich daher mit der Morphologie des Wildtyps eingehend auseinander setzen. Es soll eine detailgetreue Zeichnung von Notum und Flügeln des Wildtyps von Drosophila melanogaster angefertigt werden. Der Zeitbedarf kann mit 1–2 Stunden angesetzt werden. Betäuben Sie die Fliegen mit CO2, legen Sie sie auf die CO2-Betäubungsplatte (Abb. 2.6.3) und schauen Sie sich die Fliegen gründlich an! Hinweise zur Auswertung Zunächst sollten die Weibchen von Männchen getrennt werden. Vergleichen Sie ebenfalls Flügelgrößen bei Männchen und Weibchen. Liegen die Mikro- und Makrochaeten des Notums in einem stereotypen Muster vor? Zeichnen Sie das Muster der Flügelvenen. Welche sensorischen Organe (PNS, peripheres Nervensystem) gibt es?

2.6 Drosophila melanogaster

133

Fliegengrab

”

Schnorchel“ Etherisierer Pinzetten Pinsel

CO2-Betäubungsstation Abb. 2.6.3. Ein typischer Arbeitsplatz für die Drosophila-Genetik. Das Fliegengrab ist mit Isopropanol gefüllt und dient zur Abtötung der Fliegen. Durch eine Fritte fließt CO2-Gas und betäubt die Fliegen. Die Bauanleitung wird auf Nachfrage zur Verfügung gestellt. Die Fliegen werden mit einem Pinsel sortiert und mit dem „Schnorchel“ in die Zuchtgefäße transferiert. Der Schnorchel besteht aus einem Stück Schlauch, in das an einem Ende ein Mundstück und an das andere Ende eine Pasteurpipette gesteckt wird. Die Spitze der Pasteurpipette wird etwa auf die Größe einer Fliege abgebrochen und mit dem Bunsenbrenner glatt geschmolzen. Am anderen Ende der Pasteurpipette verhindert ein Stück Schaumstoff, dass man die Fliegen einatmet

Identifikation von Mutanten Eine genetische Analyse ist nur dann möglich, wenn der Verlust einer bestimmten Genfunktion an einem wie immer gearteten Phänotyp erkannt werden kann. Eine elegante Funktionsanalyse erlaubt es, selbst komplizierte Vorgänge, wie z. B. die Entwicklung des Drosophila-Embryos, effizient zu untersuchen. Am Beispiel von Kutikula-Präparationen verschiedener Segmentierungsmutanten werden wir die bahnbrechenden Experimente von C. Nüsslein-Volhard und E. Wieschaus nachvollziehen, die 1995 zum Nobelpreis geführt haben (Nüsslein-Volhard und Wieschaus 1980). Alle zu untersuchenden Mutanten sind embryonal letal. Die Embryogenese wird jedoch in jedem Fall vollendet und die entstandene Epidermis sezerniert eine Kutikula. Fehlen bestimmte Bereiche der Epidermis, wird an dieser Stelle

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2 Genetische Kreuzungen

auch keine Kutikula gebildet. Der Phänotyp der Segmentierungsmutanten erlaubt daher Rückschlüsse auf die normale Funktion der betroffenen Gene. Man unterscheidet maternale und zygotische Mutationen, je nachdem, ob die entsprechenden Genfunktionen während der Oogenese vom Genom der Mutter oder später vom zygotischen Genom bereitgestellt werden. Im Versuchteil werden nur zygotische Effekte untersucht. Die Kutikula-Präparation erlaubt es natürlich nur, auf die Epidermis zu schauen. Das Studium von Genen, die die Entwicklung der inneren Organsysteme regulieren, ist mit dieser Methode also nicht möglich. Um interne Strukturen zu betrachten, verwendet man heute daher Antikörperfärbungen, die wir im Kap. 8.4 besprechen. Weiterhin erlaubt die Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) der Qualle Aequorea victoria Entwicklungsprozesse und Genaktivitäten in vivo zu verfolgen (Kap. 8.5). Material Die folgenden Drosophila-Stämme werden verwendet (die Fliegen können unter den angegebenen BL-Nummern in Bloomington (flystocks.bio.indiana.edu) bestellt werden) • knirps9 (kni9 ) / TM3 Sb [gap gene, BL 3332] • hairy25 (h25 ) / TM3 Sb [pair rule gene, BL 1781] • fushi tarazu11 (ftz11) / TM3 Sb [pair rule gene, BL 1841] • wingless1–8 (wg1–8 ) / CyO [segment polarity gene, BL 3375] • patched9 (ptc9 ) / CyO [segment polarity gene, BL 3377] • Hoyers Medium 30 g Gummi arabicum in 50 mL H2O unter Rühren über Nacht lösen; 200 g Chloralhydrat in kleinen Mengen hinzufügen; wenn sich alles gelöst hat, 20 g Glycerin dazu geben und ungelöste Bestandteile abfiltrieren • Natrium-Hypochlorid 10–15 % aktives Chlor (Chlorbleichlauge), 1:1 mit Wasser verdünnt • Ablagegefäße (z. B. Tri Pour Becher 100 mL (Plano G3351)) kleine Belüftungslöcher mit Nadel stechen

Methode 1. 3,6 % Agar in H2O kochen, mit etwas Essig versetzen. In passende Ablageschalen, z. B. 5 cm Petrischalen, füllen und nach Erkalten mit Bäckerhefe bestreichen. 2. Die verschiedenen Fliegenstämme werden zur Ablage gebracht und die Ablagen täglich gewechselt. Die so gesammelten Embryonen werden für

2.6 Drosophila melanogaster

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1–2 Tage bei 25 °C gehalten. Die schlüpfenden Wildtyp-Larven (bzw. Tiere die Balancer-Chromosomen tragen) werden in die Hefe kriechen und können abgesammelt werden. Die homozygot mutanten Embryonen werden die Embryonalentwicklung nicht abschließen und bleiben auf der Ablageschale liegen. Sie können an einer brauen Farbe, die durch eine Melanisierungsreaktion entsteht, erkannt werden. Die homozygoten CyO-Tiere, die in der Ablage ebenfalls vorkommen, sterben als Larven und stören daher die Analyse nicht. 3. Die toten Embryonen werden mit einer Nadel gesammelt. Das Chorion wird mit Hilfe von Natrium-Hypochlorid entfernt (Vorsicht! NatriumHypochlorid bleicht auch Kleider). 4. Anschließend werden die Embryonen in einen kleinen Tropfen Hoyers Medium auf einen Objektträger überführt und mit einem Deckglas (18 mm × 18 mm) eingedeckelt. Es sollte nicht zu viel Hoyers Medium verwendet werden. Durch einen sanften Druck auf das Deckglas können die Embryonen von der Vitellinmembran befreit werden. 5. Danach werden die Präparate über Nacht bei 65 °C gebacken und anschließend im Phasenkontrast betrachtet. Hinweise zur Auswertung Das Kutikulamuster einer Wildtyp-Larve ist in der Abb. 1.7.5 zu erkennen und sollte im Versuch zunächst nachvollzogen werden. knirps-mutanten Embryonen fehlen die abdominalen Segmente A2 bis A6, in fushi-tarazuund hairy-mutanten Embryonen fehlt jedes zweite Segment (welche Segmente fehlen?). In wingless- und patched- mutanten Tieren ist die Polarität der Segmente geändert. Allerdings erschließt sich dieser Phänotyp bei patched-mutanten Tiere nur bei einer genauen Analyse der Zähnchenbänder. Achten Sie hier auf die Orientierung der einzelnen Zähnchen. Weitere Informationen finden Sie in FlyMove: flymove.uni-muenster.de. Komplementationsanalyse Das Ziel dieses Versuchsteils ist es festzustellen, ob zwei Mutationen allelisch zu einander sind oder nicht. Verwendet werden können beliebige Allele. Werden rezessive Letalfaktoren in der Kreuzung eingesetzt, muss in der F1-Generation geprüft werden, ob transheterozygote Tiere auftreten. Wenn nicht, sind die Allele 1 und 2 in trans letal und tragen daher wahrscheinlich Mutationen im gleichen Gen.

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2 Genetische Kreuzungen

Material Die folgenden Drosophila-Stämme werden verwendet

• hairy25 (h25 ) / TM3, Sb [pair rule gene, BL 1781] • hairy22 (h22 ) / TM3, Sb [pair rule gene, BL 3375] • fushi tarazu11 (ftz11) / TM3, Sb [pair rule gene, BL 1841]

Methode Die Komplementationskreuzung wird in allen Kombinationen angesetzt, so dass drei verschiedene Kreuzungen resultieren. Es müssen keine reziproken Kreuzungen angesetzt werden. Hinweise zur Auswertung In den Kreuzungen der hairy-Allele gegen das fushi-tarazu-Allel werden auch Tiere mit dem Genotyp hairy / fushi tarazu schlüpfen. Diese zeigen nicht mehr den dominanten Marker Sb und entsprechen phänotypisch dem Wildtyp. Die Mutationen sind nicht allelisch. Klonale Analyse und die Zellautonomie einer Genfunktion Die Untersuchung von homozygoten Mutanten muss sich nicht auf das Studium homozygot mutanter Tiere beschränken. So möchte man häufig die Effekte einer Mutation für postembryonale Entwicklungsstadien analysieren, obwohl die Mutation selbst bereits im Embryo zur Letalität führt. Hierzu sind zum einen konditionale Mutationen hilfreich, die es z. B. nach Änderung der Zuchttemperatur von der permissiven zur restriktiven Temperatur erlauben, eine Genfunktion zu einem definierten Zeitpunkt auszuschalten. Allerdings sind solche konditionalen Mutationen relativ selten und daher nicht generell anwendbar. Einen alternativen experimentellen Ansatz stellt die Methode der mitotischen Rekombination dar. Hier wird — früher durch Röntgenstrahlen induziert, heute enzymatisch vermittelt — ein Rekombinationsereignis während der Mitose einer Zelle induziert (Abb. 2.6.4). Diese Rekombination führt in der Folge zu einer homozygot mutanten und einer wildtypischen Tochterzelle. Die beiden nach dem mitotischen Rekombinationsereignis entstandenen Zellen bilden Zwillingsflecken (twin spots). Der Organismus vereint nach der mitotischen Rekombination also drei Genotypen: Die heterozygoten Ausgangszellen, die wildtypischen Zellen und die homozygot mutanten Zellen.

2.6 Drosophila melanogaster

137

Abb. 2.6.4. Die mitotische Rekombination. Weitere Erläuterungen im Text

Mit Hilfe der Technik der mitotischen Rekombination lässt sich eine Reihe von wichtigen Fragen beantworten. Zum einen kann man den Effekt einer Mutation in späteren Entwicklungsstadien untersuchen. Zum anderen kann die Autonomie der Genfunktion geklärt werden. Was versteht man unter diesem wichtigen Begriff? Eine Genfunktion ist dann zellautonom, wenn der Phänotyp sich stets in der mutanten Zelle ausprägt. Dies ist zum Beispiel für Mutationen in einem membranständigen Rezeptor zu erwarten. Betrifft die Mutation jedoch die Generierung eines diffusiblen Signals (z. B. Hormon), dann kann der Phänotyp eines mutanten Zellklons von den umgebenden Zellen, die dieses Signal nach wie vor noch produzieren können, gerettet werden. Man spricht dann von einem nicht-zellautonomen Verhalten. Die mitotische Rekombination wurde in den 70er Jahren entwickelt und basierte auf dem Einsatz von Röntgenstrahlen. Diese Methode bringt allerdings eine Reihe von Nachteilen mit sich: Die Ereignisse sind relativ selten, sie treten zufällig ein und der Ort lässt sich nicht vorherbestimmen. Außer-

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2 Genetische Kreuzungen

dem müssen relativ hohe Röntgendosen verwendet werden. Um all diese Nachteile zu vermeiden, setzt man bei Drosophila seit Anfang der 90er Jahre das so genannte FLP/FRT-System ein. Die FLP ist eine sequenzspezifische Rekombinase, die eine Rekombination an den FRT-Sequenzen induziert (vgl. Kap. 1.3.3, Abb. 1.3.3). Mit Hilfe dieses aus der Hefe stammenden Rekombinationssystems ist es möglich, die Effizienz der mitotischen Rekombination gewaltig zu steigern (Xu und Rubin 1993). Zudem stellt die Generierung von genetischen Mosaiken nur noch ein einfaches Kreuzungsexperiment dar und erfordert keinerlei apparativen Aufwand. Neben einem FRT-Element tragen diese Chromosomen weitere Marker, die die genetischen Arbeiten vereinfachen (s. Stammsammlungszentrum in Bloomington). Bringt man mit Hilfe klassischer Rekombinationstechniken eine Mutation auf ein FRT-Chromosom, kann man die Mutation mit einem Balancer stabil halten und mit Hilfe klassischer Methoden analysieren. Kreuzt man jedoch solche FRT-Stämme gegen einen Stamm, der zusätzlich zu einem FRT-Chromosom ein P-Element-Transposon mit dem Flipase-Gen ( flp) der Hefe trägt und exprimiert, wird in den Nachkommen dieser Kreuzung mitotische Rekombination ausgelöst. Allerdings findet diese nur dort statt, wo die FLP-Rekombinase tatsächlich exprimiert wird. Die Kontrolle der flp-Expression kann über einen Hitzeschock-Promotor erfolgen und erlaubt dann eine zeitliche Kontrolle der Induktion der mitotischen Rekombination. Alternativ kann das Flipase-Gen unter die Kontrolle eines beliebigen transkriptionellen Enhancers gestellt werden. Hierdurch wird die Rekombination nur in einem bestimmten Gewebetyp induziert. Im Folgenden ist ein Versuch zur effizienten Induktion von Augenklonen beschrieben. Material Die folgenden Drosophila-Stämme werden verwendet • w; P[FRT 42] / TM6 • w P[eyFLP]/ Y; P[white +] P[FRT 42] / P[white +] P[FRT 42] Ein P-Element ist ein Drosophila-Vektor, der zur Herstellung von transgenen Fliegen verwendet wird. Der Vektor wird stets mit dem Symbol P[] bezeichnet. In der eckigen Klammer werden die klonierten genetischen Elemente angegeben, zum Beispiel das white-Gen.

Methode Die Fliegen werden gekreuzt und die Nachkommenschaft wird auf mögliche Mosaikaugen untersucht.

2.6 Drosophila melanogaster

139

Hinweise zur Auswertung Prinzipiell werden alle Augen der F1-Generation rotäugig sein, da sie ein P[white +]-Element auf dem dritten Chromosom tragen. Die unter der Kontrolle des eyeless-Enhancers spezifisch im Auge exprimierte FLPRekombinase induziert die mitotische Rekombination. Der mutante Zellklon trägt kein white-Gen mehr und die Zellen werden daher weiß sein. Der Zwillingsfleck besteht aus homozygoten P[white +] P[FRT 80B]Zellen und wird daher rot erscheinen. Aufgrund der höheren Kopienzahl des P[white+]-Elements erscheint der Zwillingsfleck dunkler gefärbt als das umgebende heterozygote Gewebe. Je nach Interesse können verschiedene Mutationen zur klonalen Analyse verwendet werden. Im hier skizzierten Ansatz werden nur white-Mosaikaugen erzeugt.

3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

Entscheidend für den erfolgreichen Einsatz eines genetischen Modellorganismus ist die Möglichkeit, ihn durch DNA-vermittelte Transformation genetisch zu verändern. Dabei wird in der Regel in vitro rekombinierte DNA eingesetzt, um transgene Stämme zu erhalten. DNA-Moleküle, die für die DNATransformation eingesetzt werden, tragen Selektionsmarken, die transgene von nicht transgenen Organismen unterscheiden lassen. Dies ist notwendig, da der DNA-Transformationsprozess ein eher seltenes Ereignis darstellt. Die meisten Organismen sind nicht in der Lage, unter natürlichen Bedingungen DNA aufzunehmen. Eine Ausnahme stellt das Bakterium Bacillus subtilis dar, welches ein Stadium der natürlichen Kompetenz als Teil seines Lebenszyklus durchläuft und dabei DNA aufnehmen kann. Das Darmbakterium Escherichia coli war der erste Organismus, bei dem 1973 die DNA-vermittelte Transformation gelang. In der Folgezeit wurden für viele Lebewesen Methoden entwickelt, um mit Hilfe rekombinanter DNA transgene Organismen zu schaffen. Dabei bediente man sich unterschiedlicher Methoden, um die Zellen für die DNA-Aufnahme kompetent zu machen. Neben biochemischen Verfahren wurden auch Partikelkanonen eingesetzt, um die DNA einzuführen. Bei der Pflanzentransformation hat sich außerdem das Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens als „Hilfsmittel“ erwiesen, um DNA aufgrund eines natürlichen Prozesses in die Wirtszellen einzuführen. Schließlich verwendet man bei der Taufliege Drosophila melanogaster Transposonen, um entsprechend modifizierte Vektoren für die DNA-Transformation zu nutzen. Die folgenden Kapitel beschreiben einige Methoden, transgene Stämme der verschiedenen Modellorganismen herzustellen und geben Verfahren an, um die DNA der entsprechenden Linien zu isolieren. Die DNA-Isolation wiederum ist Voraussetzung, um eine entsprechende Nukleinsäureanalytik durchzuführen. Dies kann beispielsweise durch die Southern-Hybridisierung oder PCR-Amplifikation (Kap. 4) erfolgen.

142

3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis Sowohl E. coli als auch B. subtilis können DNA aufnehmen. Sie unterscheiden sich jedoch darin, dass B. subtilis im Gegensatz zu E. coli ein Stadium natürlicher Kompetenz als Teil seines Lebenszyklus durchläuft, wohingegen E. coli in jedem Fall durch besondere Behandlung erst „kompetent gemacht“ wird. Bei der Auswahl geeigneter Transformationsmethoden steht in der Regel die Effizienz im Vordergrund, d. h. eine, bezogen auf die eingesetzte DNAMenge, möglichst große Anzahl Transformanten. Unter Umständen kann es jedoch sinnvoll sein, einer weniger effizienten Methode den Vorzug zu geben, z. B. wenn schnelle Durchführbarkeit, Kostenfaktoren aber auch der Zweck der Transformation berücksichtigt werden müssen. Besondere Anforderungen stellt beispielsweise das Klonieren letaler Faktoren (z. B. Proteasen). Transformationsmethoden für E. coli und B. subtilis E. coli und B. subtilis unterscheiden sich bezüglich der Transformierbarkeit nicht nur in der genetischen Ausstattung (Kompetenzgene), sondern auch hinsichtlich ihres Zellwandaufbaus. Die DNA muss bei grampositiven Organismen zunächst den vielschichtigen Mureinsacculus und dann die Cytoplasmamembran überwinden. Bei den gramnegativen bilden die zwei Membranen die wesentlichen Transformationsbarrieren. Phospholipidmembranen, mit ihren negativ geladenen Oberflächen, stellen für die aufgrund des Zucker-Phosphatrückgrates ebenfalls negativ geladene DNA ein ernstzunehmendes Hindernis dar. Auf Überwindung der elektrostatischen Abstoßung zielen die folgenden Methoden: Elektroporation, Behandlung mit zweiwertigen Ionen und Hitzeschock sowie die PEG-vermittelte Protoplastentransformation. Beide Bakterien sind durch die Methode der Elektroporation transformierbar, die sich durch hohe Effizienz und relativ einfache Handhabung auszeichnet. Obwohl das Prinzip für beide Organismen identisch ist, gelten jeweils individuelle Parameter für Kulturführung, Pulsstärke usw. Generell gilt: Die Bedingungen für eine erfolgreiche DNA-Aufnahme benötigen eine stammspezifische Optimierung. Häufig wird zur Transformation von E. coli CaCl2 verwendet. Es stehen jedoch auch Systeme auf Basis anderer Ionen zur Verfügung (Rubidium- oder Magnesiumchlorid), falls die Verwendung von CaCl2 nicht möglich sein sollte. Diverse Bacilli, unter ihnen B. subtilis, B. megaterium und B. amyloliquefaciens, lassen sich nach Protoplastierung transformieren. Dazu wird zunächst durch Lysozym der vielschichtige Mureinsacculus entfernt und durch Polyethylenglycol (PEG) die Quervernetzung von Membranen in Anwe-

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

143

senheit der DNA vermittelt. Die erreichbaren Transformationseffizienzen sind denjenigen der Elektroporation zu vergleichen, wobei der technische Aufwand jedoch erheblich höher ist. Selektionsmarker und Wirtsstämme Da nie alle eingesetzten Zellen auch tatsächlich DNA aufnehmen, muss eine Selektion auf die eingebrachte DNA erfolgen. Die verwendeten Vektoren müssen ihrem Träger mindestens eine selektierbare Eigenschaft vermitteln. Plasmidtragende Stämme sollten unter permanentem Selektionsdruck gehalten werden, um Verluste durch Segregation von plasmidfreien Zellen zu vermeiden. Als prokaryotische Selektionsmarken sind Resistenzen gegen Antibiotika (s. u.) oder Schwermetalle weit verbreitet, manchmal werden auch Auxotrophiemarken verwendet (z. B. thi, Thiaminsynthese). Die wohl gebräuchlichste Selektionsmarke für E. coli ist die Resistenz gegen das Ƣ-Lactamantibiotikum Ampicillin (Amp). Die vom bla-Gen kodierte ƢLactamase ist ein periplasmatisches Enzym, das eine Resistenz bis 125 µg/mL bewirkt. Andere häufig verwendete Resistenzgene sind cat, das für eine Chloramphenicol-Acetyltransferase kodiert (Resistenz bis 170 µg/mL), kan, das eine Aminoglycosid-Phosphotransferase kodiert, die Resistenz gegen Kanamycin (bis zu 50 µg/mL) vermittelt und tet, welches seinem Träger Resistenz durch eine Effluxpumpe für Tetrazyklin (bis zu 12,5 µg/mL) verleiht. Es ist fast selbstverständlich, dass Klonierungsvektoren möglichst klein sein sollten und neben einer selektierbaren Marke geeignete Restriktionsschnittstellen zur Aufnahme von Passagier-DNA tragen müssen. Liegen diese Stellen in einem Gen, das durch DNA-Insertion inaktiviert wird, lassen sich Träger von rekombinanten Plasmiden phänotypisch von solchen mit dem Ausgangsplasmid unterscheiden. In den heute üblicherweise verwendeten Vektoren sind auf engstem Raum mehrere solcher Schnittstellen in einer mutiple cloning site (mcs) lokalisiert, die sich häufig im 5’-Bereich der kodierenden Region des lacZ-Genfragments befindet (z. B. pUC18, DSMZ Nr. 3424). Das vorhandene LacZ-Fragment ist zur ơ-Komplementation eines Defektes der ƢGalactosidase fähig, so dass durch das Plasmid in entsprechenden Mutanten (z. B. E. coli JM109, DSMZ Nr. 3423) eine funktionsfähige Ƣ-Galactosidase restauriert wird, falls in der mcs keine Insertion vorhanden ist. Auf Medien, die neben einem der Selektion dienenden Antibiotikum auch ein chromogenes Substrat für die Ƣ-Galactosidase enthalten, erscheinen die Träger rekombinanter Plasmide wegen der erfolgten Insertionsinaktivierung des lacZ-Fragments farblos, während die Träger der Ursprungsplasmide gefärbt sind. Zur Induktion des Ƣ-Gal-Promotors wird dem Medium in der Regel auch der nicht zu

144

3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

verstoffwechselnde Induktor Isopropyl-Ƣ-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugesetzt. Als chromogenes Substrat findet fast ausschließlich Bromchlorindolyl-Ƣ-D-Galactopyranosid (X-Gal) Verwendung (Blau-Weiß-Unterscheidung). Für nahezu alle erdenklichen Anwendungen stehen maßgeschneiderte E.-coliStämme zur Verfügung, die den unterschiedlichsten Anforderungen genügen. Im Vergleich zu E. coli erscheint das Reservoir an Stämmen und Vektoren für B. subtilis relativ bescheiden, jedoch sind auch für diesen eine Reihe von resistenzvermittelnden kleinen Plasmiden mit singulären Schnittstellen verfügbar. Häufig verwendet werden Plasmide aus Staphylococcus oder Streptococcus (z. B. pC194). In der Regel werden notwendige Konstruktions- und Klonierungsschritte in E. coli vorgenommen und die erzeugten Konstrukte mit Hilfe von Shuttle-Plasmiden übertragen. Charakterisierung von Transformanten Zur Charakterisierung von Transformanten, die den Erwartungen phänotypisch entsprechen, werden diese auf das Vorhandensein der eingebrachten DNA überprüft. Hier muss zwischen in das Genom integrierter und vektorständiger DNA unterschieden werden. Zur Charakterisierung von Plasmiden werden diese zunächst isoliert. Eine einfache, jedoch relativ grobe Überprüfung kann dann durch Bestimmung der Plasmidgröße erfolgen. Hierzu wird das Plasmid mittels einer Restriktionsendonuklease linearisiert und die Größe im Agarosegel ermittelt (Kap. 10.4). Das Auflösungsvermögen eines Agarosegels (abhängig von der Agarosekonzentration) ist begrenzt, daher können kleine Unterschiede kaum erkannt werden. Zur Verfeinerung werden deshalb verschiedene Restriktionsenzyme im Einzel- oder Doppelverdau verwendet, durch die das Plasmid in mehrere (jedoch nicht zu viele) unterschiedlich große Fragmente gespalten wird. Eine solche Restriktionsanalyse ermöglicht eine schnelle, einfache und verhältnismäßig preiswerte Charakterisierung unbekannter — sowie die Bestätigung der Identität bekannter Plasmide. Auch die DNA-DNA-Hybridisierung mit spezifischen oder heterologen Sonden im Southern Blot ist eine gängige Methode Transformanten zu untersuchen (Kap. 10.5–10.7). Bei Verwendung von DNASequenzen, die natürlicherweise nicht im Wirtsstamm vorkommen, kann auch einfach ein Dot-Blot oder die Filterhybridisierung von Kolonien durchgeführt werden, deren Aussage sich jedoch auf das bloße Vorhandensein der gesuchten Sequenzen beschränkt. Kleine Sequenzveränderungen wie z. B. Punktmutationen können, falls sie nicht die Erkennungssequenz eines der verwendeten Restriktionsenzyme zerstören, durch Sequenzierung erfasst werden. Heute wird in aller Regel nach der

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

145

Didesoxy-Methode nach Sanger gearbeitet. Dazu ist es erforderlich, einen Teil der DNA-Sequenz zu kennen, da ein spezifisches Oligonukleotid als Primer verwendet werden muss. Dies gilt auch für die PCR-Analyse, die z. B. durch einen Größenunterschied eine Integration von DNA in den Bereich zeigt, der von den Primern eingeschlossen wird (s. Kap. 4). Diese Techniken dienen dem Nachweis von Plasmiden oder klonierter DNA, alternativ können aber auch gebildete Proteine nachgewiesen werden und durch Darstellung in einem SDSGel oder durch Protein-Protein-Hybridisierung im Western Blot identifiziert werden. Aussagen zur Funktionsfähigkeit erfordern allerdings meist einen enzymatischen Test. Für in das Genom integrierte DNA können prinzipiell die gleichen Methoden angewandt werden, jedoch muss in aller Regel eine Restriktionsanalyse aufgrund der Vielzahl von entstehenden Fragmenten durch eine SouthernAnalyse ergänzt werden. Für Sequenzanalysen wird das gewünschte Fragment zunächst mittels PCR amplifiziert. 3.1.1 Transformation von E. coli nach der CalciumchloridMethode Die klassische Art, DNA in E.-coli-Zellen zu übertragen schließt eine Behandlung mit Calciumchlorid (CaCl2) und Hitzeschock ein (Abb. 3.1.1) (Mandel und Higa 1970). Aufgrund der Dauer der Prozedur ist diese Methode nicht, wie z. B. die Elektroporation, für die Übertragung instabiler Nukleinsäuren wie mRNA geeignet. Da man immerhin bis zu 107 Transformanten/µg DNA

I

II

Ca++

42°C

Abb. 3.1.1. Schema der Calciumchlorid-Transformation von E. coli. Sowohl die Membranen der E.-coli-Zelle als auch die zu transformierende DNA (Zucker-PhosphatRückgrat) sind negativ geladen und stoßen sich somit ab. Werden zweiwertige Ionen in die Lösung gegeben, so kompensieren diese die negativen Ladungen, indem sie sich an die Membran und die DNA anlagern und die Abstoßung aufheben (I). Durch einen Hitzeschock wird nun die Membranfluidität erhöht und die DNA gelangt in die Zelle (II). Die transformierende DNA ist als schwarzer, das Bakterienchromosom als grauer Kreis und die zweiwertigen Ionen sind als hellgraue Punkte dargestellt

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3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

erhält, wird diese einfache und preiswerte Methode häufig angewandt. Hier soll das Plasmid pBR322 in den Ampicillin- und Tetracyclin-sensitiven Empfängerstamm E. coli JM83 transformiert werden. Es handelt sich um einen Vektor mittlerer Kopienzahl (etwa 20 pro Zelle) und engem Wirtsspektrum. Neben dem Replikationsursprung für E. coli trägt er zwei selektierbare Funktionen: Das bla-Gen vermittelt Resistenz gegen Ampicillin und das tet-Gen gegen Tetracyclin. Durch Einfügung von DNA in singuläre Schnittstellen eines der beiden Resistenzgene kann dieses disruptiert werden (Insertionsinaktivierung), was eine phänotypische Unterscheidung der plasmidtragenden Zellen erlaubt. Material • Rezipient E. coli JM83: F– lambda– ara, ƅ(proAB-lac,) rpsL, thi, phi80 dlacZƅM15lambda–, (StrR) (DSMZ 3947) • Plasmid pBR322 (4,4 kb): tet, bla (DSMZ Nr. 3879) • Zentrifugen für 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße • sterile 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße • Drigalski-Spatel, Ethanol zum Sterilisieren, Bunsenbrenner • Thermoschüttler (oder temperierbares Schüttel-Wasserbad) • Photometer und Küvetten • Eisbad • LB-Medium 1 % (w/v) Pepton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl pH 7,3 Festmedium: zusätzlich 1,5 % (w/v) Agar • LBA-Selektionsplatten wie LB-Festmedium, zusätzlich 1 µL Ampicillin-Stammlösung pro mL Medium, Zugabe nach dem Autoklavieren bei ca. 55 °C • Ampicillin-Stammlösung 100 mg/mL in A. dest., sterilfiltriert, Lagerung bei –20 °C • Regenerationsmedium LB-Medium mit 2 % (w/v) Glucose, vor Verwendung 1 µL Thiamin-Stammlösung pro mL Medium zugeben • Thiamin-Stammlösung 10 mg/mL in A. dest., sterilfiltriert; Lagerung bei –20 °C • 15 mM NaCl, pH 7,0 (eiskalt) • 100 mM CaCl2, pH 7,0 (eiskalt)

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

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Methode Ab Punkt 3 werden alle Schritte auf Eis durchgeführt. Kompetente Zellen (s. Punkt 9) können bei 4 °C über Nacht gelagert werden. 1. Vorkultur: 7 mL LB-Medium werden mit einer E.-coli-Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln angezogen. 2. Inokulation von 50 mL LB-Medium mit 0,5 mL Vorkultur (entspricht 1 %igem Animpfen). Kultivierung bei 37 °C im Schüttelwasserbad. Vor dem Animpfen dieser Hauptkultur einen Referenzwert, LB-Medium, für die photometrischen Messungen entnehmen! 3. Bei Erreichen einer OD546 = 0,6–0,7 wird die Kultur für 10 min auf Eis gestellt. 4. Zellernte durch Zentrifugation (5 min, 5000 g, 4 °C), Überstand entfernen. 5. Die Zellen werden in eiskalter 15 mM NaCl-Lösung resuspendiert. 6. Zentrifugation (5 min, 5000 g, 4 °C), Verwerfen des Überstandes. 7. Resuspendieren des Zellpellets in eiskalter 100 mM CaCl2-Lösung, Inkubation auf Eis für 30 min. 8. Zentrifugation (5 min, 5000 g, 4 °C), Überstand verwerfen. 9. Pellet in 2 mL eiskalter 100 mM CaCl2-Lösung aufnehmen, bis zur Verwendung auf Eis lagern. 10. Herstellung der Transformationsansätze: Ansatz 1: 200 µL Zellsuspension + 1 µg pBR322-DNA Ansatz 2: 200 µL Zellsuspension + 20 µL A. dest. 11. Inkubation der Ansätze für 30 min auf Eis. 12. Hitzeschock: 90 s, 42 °C (stammspezifische Unterschiede beachten). 13. Zugabe von 800 µL Regenerationsmedium. Mischen und Regeneration durch Inkubation für 30 min bei 37 °C (450 rpm, Thermoschüttler). 14. Ausplattieren von 2 × 50 µL, 2 × 100 µL, 2 × 150 µL und 2 × 200 µL-Aliquots auf LBA-Selektionsplatten, Bebrütung über Nacht bei 37 °C.

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3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

Hinweise zur Auswertung 1. Auszählung der erhaltenen Kolonien der einzelnen Ansätze und Ermittlung der Transformationseffizienz bezogen auf 1 µg transformierende DNA: Transformationseffizienz = (Anzahl erzeugter Transformanten) / (Menge der eingesetzten DNA in µg) 2. Überprüfung auf das Vorhandensein von Plasmiden durch Plasmidisolation mehrerer ausgewählter Transformanten (Kap. 3.1.4), Linearisierung des Plasmids mit singulär schneidendem Restriktionsenzym, z. B. PstI bei pBR322 und gelelektrophoretische Überprüfung der Fragmentgröße (Kap. 10.4). 3.1.2 Natürliche Kompetenz von B. subtilis Beim Übergang von der exponentiellen in die stationäre Wachstumsphase entwickeln ca. 10–20 % der B.-subtilis-Zellen eine genetische Kompetenz. Zugabe von Wildtyp-DNA zu dem auxotrophen Rezipienten B. subtilis 168 (trp) während dieser Phase führt wegen der Aufnahme der DNA zu einer Vielzahl dann wieder prototropher Transformanten. Material • Donorstamm Bacillus subtilis NRS 744, prototroph (DSMZ Nr. 10), alternativ andere prototrophe Stämme. z. B. NP40 (DSMZ Nr. 6887) oder WB 672 (DSMZ Nr. 6395) • Nukleinsäure Isolierte Gesamt-DNA eines prototrophen Donorstamms (s. o.), welche zuvor isoliert worden ist (wie unter Kap. 3.1.5 beschrieben) • Rezipientenstamm Bacillus subtilis 168 (trp) (DSMZ Nr. 402) • Zentrifugen für 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße • sterile 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße • Thermoschüttler (oder temperierbares Schüttel-Wasserbad) • sterile 1 L-Glasflaschen mit Deckel und Reagenzgläser • Photometer und Küvetten • LB-Medium (s. Kap. 3.1.1) • Glycerin 86 % (v/v) • Spizizen-Salze (10 ×) 6 % (w/v) KH2PO4

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

• •

•

•

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14 % (w/v) K 2HPO4 2 % (w/v) (NH4)SO4 1 % (w/v) Na-Citrat × 2 H2O pH 7,0 Spizizen-Salze (2 ×) 200 mL Spizizen-Salze (10 ×) 800 mL A. dest. Minimal-Agar-Lösung 4 mL Na-Citrat (10 % (w/v)) 12,4 g Bacto-Agar (Difco) 400 mL A. dest. Kompetenz-Minimal-Festmedium 400 mL Minimal-Agar-Lösung 400 mL Spizizen-Salze (2 ×) 2 mL MgCl2 (1 M) 1 mL Natrium-Glutamat (40 % (w/v)) 8 mL Glucose (40 % (w/v)) 8 mL MnCl2 (0,1 M) 8 mL A. dest. Endvolumen 827 mL Kompetenzmedium 500 mL Spizizen-Salze (1 ×) 5 mL Hefeextrakt (10 % (w/v)) 5 mL Casamino-Acids (2 % (w/v)) 5 mL Glucose (50 % (w/v)) 2,5 mL Tryptophan (10 mg/mL) 2,5 mL MgCl2 (0,5 M) 0,5 mL MgSO4 × 7 H2O (0,2 mg/mL) Stammlösungen (Hefeextrakt, Glucose, Tryptophan, MgCl2, MgSO4 × 7 H2O) getrennt ansetzen, autoklavieren, Lagerung bei RT. Kompetenzmedium nach dem Ansetzen sterilfiltrieren.

Methode Die Transformation erfolgt nach einem Einstufen-Transformationsprotokoll (verändert nach Albano et al. 1987). Die Anzucht des Rezipientenstammes B. subtilis 168 (trp) bis zum Erreichen der Kompetenz (Schritte 1–7) kann vorbereitet werden. Die Zellen können bei –70 °C gelagert werden. Es empfiehlt sich, mehrere gleichartige Transformationsansätze herzustellen. 1. Vereinzelungsausstrich des Rezipientenstammes B. subtilis 168 (trp) auf einer LB-Platte, Bebrütung über Nacht bei 37 °C.

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3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

2. Resuspendieren einer Einzelkolonie in 1 mL Kompetenzmedium in einem 1,5 mL-Reaktionsgefäß. 3. Inokulieren von 10 mL Kompetenzmedium (in großem, 4-SchikanenErlenmeyerkolben, Belüftung!) mit 100 µL der Zellsuspension (Punkt 2). 4. Kultivierung bei 37 °C unter sehr starkem Schütteln bis zum Erreichen des Endes der exponentiellen Phase, die OD546 wird dabei regelmäßig photometrisch bestimmt (Dauer ca. 3–4 h). 5. Nach Erreichen des Endes der exponentiellen Wachstumsphase werden die Zellen für 2 h weiter geschüttelt (Punkt 4), um den Zeitpunkt der optimalen Kompetenz zu erreichen. 6. Zugabe von 1,75 mL Glycerin (86 % (v/v)) zur Kultur (entspricht 15 % (v/v) Glycerin), gründlich mischen. 7. Aliquotierung der kompetenten Zellen in 500 µL-Portionen, Lagerung bei –70 °C. 8. Pro Transformationsansatz 500 µL gefrorene Zellen zügig bei RT auftauen, in sterile Reagenzgläser überführen. 9. Herstellen der Transformationsansätze: • Ansatz 1: 500 µL kompetente Zellen + 5 µg chromosomale Bacillus-subtilis-Donor-DNA • Ansatz 2: 500 µL kompetente Zellen + 20 µL A. dest. Ansätze gut mischen. 10. Inkubation der Ansätze für 45 min bei 37 °C unter extremer Schräglage und starkem Schütteln (Belüftung!). 11. Zentrifugation in 1,5 mL-Reaktionsgefäßen (12 000 g, 5 min, RT), vorsichtiges Entfernen von 400 µL des Überstandes mit einer Pipette. Über dem Zellpellet verbleibt ein Volumen von 100 µL. 12. Resuspendieren der Zellen im verbliebenen Überstand. 13. Jeweils das gesamte Ansatzvolumen auf einer Kompetenz-Minimal-Festmedienplatte ausspateln, Bebrütung über Nacht bei 37 °C. Hinweise zur Auswertung Auszählung der jeweils erhaltenen Kolonien und Ermittlung der Transformationseffizienz bezogen auf 1 µg transformierende DNA: Transformationseffizienz = (Anzahl erzeugter Transformanten) / (Menge der eingesetzten DNA in µg).

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

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3.1.3 Transformation von B. subtilis durch Elektroporation Die Elektroporation ist eine effiziente Transformationsmethode (bis zu 106 Transformanten /µg DNA) bei der ein elektrischer Impuls, generiert durch Entladung eines Kondensators, zur transienten Depolarisierung der Bakterienmembran führt. Durch die partielle Desintegration und die Beschleunigung der Nukleinsäure in Richtung Anode wird diese in die Zelle gezwungen (Abb. 3.1.2). Wegen der Schnelligkeit der Prozedur können auch kurzlebige Nukleinsäuren, wie mRNA elektroporiert werden. Das E.-coli-B.-subtilis-Shuttle-Plasmid pMK3, welches in B. subtilis Kanamycin-Resistenz vermittelt, soll in den Kanamycin-sensitiven B.-subtilis-Stamm 168 (trp) transformiert werden. Es ist darauf zu achten, dass sowohl die elektrokompetenten Zellen als auch die zu transformierende DNA salzfrei sind. Eine ausgedehnte Dialyse der DNA oder eine Phenol-Chloroformextraktion (Kap. 10.1) mit anschließender Alkoholfällung (Kap. 10.2) sind erforderlich. Material • Plasmid pMK3 (7,2 kb): bla (E. coli: AmpR), kan (B. subtilis: KanR), lacZ (DSMZ Nr. 4874) • Rezipientenstamm Bacillus subtilis 168 (trp) (DSMZ Nr. 402) • Zentrifugen für 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße • sterile 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße

I

II

III

+ + + + + Abb. 3.1.2. Schema der Elektroporation von Bakterien. Zellen und Plasmid-DNA befinden sich in der Elektroporationsküvette, deren Elektroden geladen sind (I). Durch plötzliche Entladung (II) zwischen den Kondensatorplatten wird die DNA durch die kurzfristig depolarisierte Membran in die Zelle gezwungen (III). DNA ist als Kreis dargestellt (schwarz: Plasmid-DNA, grau: Bakterienchromosom), D: positiv, E: negativ geladene Kondensatorelektrode, Blitz: elektrischer Puls

152 • • • • • • •

• • • •

•

3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

Photometer und Küvetten Eisbad Thermomixer Elektroporator Elektroporationsküvetten: steril, –20 °C kalt, Elektrodenabstand 1 mm (Spaltbreite) LB-Medium (s. Kap. 3.1.1) LBS-Medium 1 % (w/v) Pepton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl 9,11 % (w/v) Sorbitol pH 7,5 Glycerin-Lösung (86 % (v/v)) LBKm-Platten LB-Festmedium, nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 55 °C Zugabe von 0,7 µL Kanamycin-Stammlösung pro mL Medium Kanamycin-Stammlösung 10 mg/mL Kanamycin in A. dest., sterilfiltriert, Lagerung bei –20 °C Elektroporationsmedium 0,5 M Mannitol 0,5 M Sorbitol 10 % (v/v) Glycerin-Lösung Regenerationsmedium 1 % (w/v) Pepton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,5 % (w/v) NaCl 9,11 % (w/v) Sorbitol 6,92 % (w/v) Mannitol pH 7,5

Methode Die Herstellung der elektrokompetenten Zellen (Schritte 1–7) kann vorbereitet werden; Lagerung der Zellen bei –70 °C ist möglich. 1. Vorkultur: 10 mL LB-Medium werden mit einer Einzelkolonie von B. subtilis 168 (trp) angeimpft; Inkubation über Nacht bei 37 °C unter langsamem Schütteln. 2. 50 mL LBS-Medium werden 3 %ig (v/v) mit der Vorkultur inokuliert und bei 37 °C im Schüttelwasserbad kultiviert (Probe für Referenzwert vor Inokulation entnehmen!).

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

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3. Bei Erreichen einer OD600 von 0,85–0,95 wird die Kultur für 10 min auf Eis gekühlt. 4. Zellernte durch Zentrifugation (5000 g, 5 min, 4 °C). 5. 4-maliges Waschen der Zellen: Jeweils Resuspendierung des Pellets in 5 mL eiskaltem Elektroporationsmedium, zentrifugieren (5000 g, 5 min, 4 °C) und Verwerfen des Überstandes. 6. Das Pellet in 1,25 mL eiskaltem Elektroporationsmedium aufnehmen (Einstellen der Zellzahl auf 1010 bis 1,3 ⋅ 1010 Zellen/mL). 7. Aliquotieren der elektrokompetenten Zellsuspension zu je 60 µL. Lagerung bei –70 °C möglich. 8. Pro Transformationsansatz ein 60 µL-Aliquot (Punkt 7) langsam auftauen (auf Eis). 9. Herstellen der Transformationsansätze: • Ansatz 1: 60 µL Zellsuspension + 5 µL Plasmid-DNA (1 µg/µL, salzfrei) • Ansatz 2: 60 µL Zellsuspension + 5 µL A. dest. Rasch vermischen. 10. Der Transformationsmix wird in eine eiskalte Elektroporationsküvette pipettiert und darin 1 min auf Eis inkubiert. 11. Elektroporation durch einen elektrischen Puls (Kapazität 25 µF, Widerstand 200 Ω, Spannung 1,6–2,1 kV). Die Zeitkonstante sollte 4,5–5,0 ms betragen. 12. Die Zellen schnell in 1 mL Regenerationsmedium aufnehmen, in ein steriles 1,5 mL-Reaktionsgefäß überführen. 13. Regeneration für 3 h bei 37 °C (450 rpm, Thermoschüttler). 14. Aliquots von je 2 × 50, 2 × 100, 2 × 150 und 2 × 200 µL zur Selektion auf LBKm-Platten ausplattieren, Bebrütung über Nacht bei 37 °C. Hinweise zur Auswertung Siehe Kap. 3.1.1 3.1.4 Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien Escherichia coli Da es sich um ein gramnegatives Bakterium handelt, kann seine Zellhülle mittels Alkalibehandlung zerstört werden. Hierdurch wird gleichzeitig die Gesamt-DNA denaturiert. Bei der anschließenden Renaturierung können die kleineren Plasmide im Vergleich zur großen, chromosomalen DNA schneller

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ihre natürliche Konformation annehmen, so dass diese durch Zentrifugation von den löslichen Plasmiden abgetrennt werden kann. Nach Alkoholpräzipitation (Kap. 10.2) können diese weiter bearbeitet werden. Material • Stamm diverse plasmidtragende E.-coli-Stämme, unter Selektionsdruck (abhängig vom Plasmid) kultiviert. • Zentrifuge für 1,5 mL-Reaktionsgefäße • sterile 1,5 mL-Reaktionsgefäße • 10 M NaOH-Lösung • 25 % (w/v) SDS-Lösung • TE-Puffer 10 mM Tris/HCl 1 mM EDTA pH 8,0 • TENS-Puffer (frisch hergestellt) 1 % (v/v) NaOH-Lösung (10 M) 2 % (v/v) SDS-Lösung (25 % (w/v)) in TE-Puffer • Kalium-Acetat-Lösung 2,55 M Kalium-Acetat pH 4,8 (mit Eisessig eingestellt)

Methode 1. 1,5 mL einer unter Selektionsdruck angezogenen, plasmidtragenden Kultur von E. coli (in LB-Selektionsmedium) werden durch Zentrifugation geerntet (5 min, 15 000 g) und der Überstand verworfen. 2. Zellpellet in 200 µL TE-Puffer resuspendieren und erneut pelletiert (5 min, 15 000 g), um Medienreste zu entfernen. 3. Überstande verwerfen, das Pellet in 50 µL TE-Puffer resuspendieren.

!

Schritte 4 und 5 schnell und ohne die Erzeugung von Scherkräften durchführen.

4. Zugabe von 300 µL TENS-Puffer und kurzes, behutsames Mischen durch 4-maliges Invertieren zur Zelllyse. 5. Nach höchstens 5 min Inkubation bei RT Zugabe von 150 µL KaliumAcetat-Lösung und sofortiges Mischen durch Invertieren (zum Stoppen der Reaktion). Es bildet sich weißes, flockiges Präzipitat.

3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis

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6. Abtrennung von Zelltrümmern, denaturierten Proteinen und chromosomaler DNA durch Zentrifugation (10 min, 15 000 g) 7. Der Überstand muss vorsichtig, ohne das weißliche Präzipitat mit zu überführen, in neue 1,5 mL-Reaktionsgefäße pipettiert werden. 8. Wiederholung der Schritte 6 und 7. 9. Der plasmidhaltige Überstand wird einer Alkoholpräzipitation unterzogen (Kap. 10.2). Hinweise zur Auswertung Photometrische Bestimmung der Reinheit und Konzentration der DNA-Isolation. Dazu Bestimmung der Absorption bei 260 nm, dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren (OD260), bei 280 nm, dem Absorptionsmaximum von Proteinen (OD280) und bei 320 nm zur Ermittlung der Grundabsorption (OD320). Für die Reinheit R der Präparation und die Konzentration c von reiner DNA gilt: R = (OD260 – OD320)/(OD280 – OD320) c [µg/µL] = 0,05 ⋅ (OD260 – OD320) ⋅ Verdünnungsfaktor Bei reiner DNA erhält man R = 1,8 bis 2,0. Bacillus subtilis Da B. subtilis als grampositiver Organismus eine sehr widerstandsfähige Zellwand besitzt, muss diese vor der alkalischen Lyse der Zelle durch Behandlung mit einem Zellwand-lytischen Enzym (Lysozym) entfernt werden. Eine direkte alkalische Lyse ohne Vorbehandlung wie bei E. coli (s. o.) ist nicht möglich. Diese Eigenschaft wird beispielsweise beim KOH-Test genutzt, einem GramSchnelltest auf Basis der alkalischen Lyse (Zugabe von 3 %iger (w/v) Kaliumhydroxid-Lösung). Material • • • •

Zentrifuge für 1,5 mL-Reaktionsgefäße sterile 1,5 mL-Reaktionsgefäße Thermoschüttler (oder temperierbares Schüttel-Wasserbad) Eisbad

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3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

• alkalischer Lysepuffer 200 mM NaOH 1 % (w/v) SDS • Neutralisationspuffer 3 M Kalium-Acetat pH 5,5 • TE (H) 150 mM Tris/HCl 20 mM EDTA pH 8,0 • Lysozym-Stammlösung 20 mg/mL in A. dest., Lagerung bei 4 °C

Methode Plasmidtragende Stämme werden unter permanentem Selektionsdruck gehalten! 1. Je 1,25 mL der B.-subtilis-Kultur (LB-Selektionsmedium) werden zweimal nacheinander im selben 1,5 mL-Reaktionsgefäßes durch Zentrifugation geerntet (je 5 min, 15 000 g), Überstand jeweils verwerfen. 2. Zellpellet in 200 µL TE(H)-Puffer resuspendieren. 3. Protoplastierung durch Zugabe von 10 µL Lysozym-Stammlösung, gründliches Mischen und Inkubation für 15 min bei 37 °C unter Schütteln (Thermomixer). 4. Alkalische Zelllyse durch Zugabe von 200 µL alkalischem Lysepuffer und Inkubation bei RT für 5 min. 5. Zugabe von 200 µL Neutralisationspuffer und sofortiges Mischen stoppen die Reaktion. 6. Inkubation der Ansätze auf Eis (10 min). 7. Zentrifugation (20 min, 15 000 g, 4 °C) pelletiert Zelltrümmer, denaturierte Proteine und chromosomale DNA. 8. Der plasmidhaltige Überstand wird mittels Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt (Kap. 10.1). Hinweise zur Auswertung Photometrische Bestimmung der Reinheit und Konzentration der DNAIsolation; s. o. unter E. coli.

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3.1.5 Isolation von chromosomaler DNA aus Bacillus subtilis Material • • • • • •

•

•

• • • • •

Zentrifuge für 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße sterile 50 mL- und 1,5 mL-Reaktionsgefäße unten zugeschmolzene 200 µL-Plastikpipettenspitze Lichtmikroskop LB-Medium (s. Kap. 3.1.1) TEN-Puffer 10 mM Tris/HCl 10 mM NaCl 1 mM EDTA pH 7,5 SET-Puffer 50 mM Tris/HCl 50 mM EDTA 20 % (w/v) Saccharose pH 7,5 TE-Puffer 10 mM Tris/HCl 1 mM EDTA pH 7,5 Lysozym-Stammlösung 10 mg/mL in SET-Puffer 10 % (w/v) SDS-Lösung Proteinase-K-Stammlösung 20 mg/mL in SET-Puffer Isopropanol p. a., –20 °C RNaseA-Stammlösung 10 mg/mL in A. dest., 10 min im Wasserbad kochen, Lagerung bei 4 °C

Methode 1. 10 mL LB-Medium mit einer Einzelkolonie inokulieren, Inkubation über Nacht bei 37 °C und starkem Schütteln. 2. Zellernte durch Zentrifugation (5 min, 5000 g, 4 °C). 3. Waschen: Resuspendieren des Zellpellets in 5 mL TEN-Puffer und Zentrifugation (5 min, 5000 g, 4 °C), Überstand verwerfen. 4. Pellet in 4,5 mL SET-Puffer resuspendieren, Zugabe von 500 µL LysozymStammlösung und Inkubation für 1–2 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln.

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3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

5. Mikroskopische Kontrolle der Protoplastierung (sollte etwa 95 % betragen). 6. Zugabe von 20 µL (10 % (w/v))-SDS-Lösung und 100 µL Proteinase-KStammlösung (Zelllyse und Proteinabbau). 7. Inkubation für 2 h bei 37 °C unter Schütteln. 8. Aufteilung des Ansatzes zu je 700 µL und Überführung in sterile 1,5 mLReaktionsgefäße, alle Ansätze parallel weiterbearbeiten. 9. Zugabe von je 700 µL eiskaltem Isopropanol (–20 °C) und vorsichtiges Invertieren des Ansatzes bis zum Ausfallen eines weißlichen Flockens (chromosomale DNA). 10. Mittels zugeschmolzener Plastikpipettenspitze den Flocken aus der Lösung fischen und in 500 µL TE-Puffer überführen. 11. Zugabe von 1 µL RNaseA-Stammlösung, Lösen der DNA (über Nacht bei 37 °C). 12. Aufreinigung der DNA mittels Phenol-Chloroform-Isolation (Kap. 10.1) und Alkoholpräzipitation (Kap. 10.2). Hinweise zur Auswertung 1. Überprüfung der DNA-Isolation auf persistierende Sporen: Inkubation eines Aliquots für 10 min bei 80 °C, ausplattieren auf LB-Festmedium und Bebrütung über Nacht bei 37 °C. Tyndallisierung (sukzessive dreimal bei 100 °C für jeweils 20 min im Abstand von je 24 h) zur Eliminierung auskeimender Sporen ist idR. nicht erforderlich. 2. Photometrische Bestimmung der Gesamt-DNA-Konzentration (vgl. Kap. 3.1.4).

3.2 Saccharomyces cerevisiae Die eukaryotische Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae kann mit geringem Aufwand und hoher Effizienz transformiert werden. Für ein erfolgreiches Transformationensexperiment müssen verschiedene Voraussetzungen gegeben sein: (1) Etablierte Transformationsmethoden, damit die zu transformierende DNA in die Zelle aufgenommen wird. (2) Selektierbare Marker und Wirtsstämme, die mit den Markergenen korrespondieren. (3) Vektoren, die eine Amplifikation von klonierter DNA in E. coli und in S. cerevisiae erlauben. (4) Erprobte Methoden zur Charakterisierung der erzeugten transgenen Stämme.

3.2 Saccharomyces cerevisiae

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Transformationsmethoden Für die Transformation von S. cerevisiae existieren fünf Transformationsmethoden, die sich nicht nur in ihrer Effizienz, sondern auch bezüglich des experimentellen Aufwandes unterscheiden. Grundsätzlich hängt die Transformationsrate (Transformanten/µg eingesetzter Plasmid-DNA) bei allen Methoden von den Wirtsstämmen und der Vektor-DNA ab. Bei der zuerst entwickelten und recht aufwändig durchzuführenden Sphäroplastierungsmethode werden durch die Behandlung der Hefezellen mit Zellwand-abbauenden Enzymen in einer isotonischen Lösung Sphäroplasten hergestellt. Die Sphäroplasten werden anschließend in Gegenwart von Calciumchlorid und Polyethylenglykol (PEG) 4000 mit der zu transformierenden DNA inkubiert und nehmen diese auf (Hinnen et al. 1978). Bei dieser Methode wird eine Transformationsrate von bis zu 2 ⋅ 105 Transformanten/ µg Plasmid erreicht. Eine etwas einfacher durchzuführende und sehr effektive Methode stellt die Lithium-Acetatmethode dar (Ito et al. 1983). Die Hefezellen werden bei dieser Methode durch Inkubation mit Lithium-Acetat kompetent gemacht. Die Transformation erfolgt in Gegenwart von PEG 2000. Ursprünglich wurden mit dieser Methode nur 104 Transformanten/µg Plasmid erreicht. Durch zahlreiche Verbesserungen, wie der Zugabe von einzelsträngiger RNA zur Plasmid-DNA und einem kurzeitigen Hitzeschock, können mit dieser Methode inzwischen bis zu 2,2 ⋅ 107 Transformanten/µg Plasmid erreicht werden (Gietz und Woods 1994). Eine sehr einfach und schnell durchzuführende Methode ist die Gefriermethode. Bei dieser Methode werden die Zellen mit Ethylenglykol versetzt und eingefroren. Die Transformation erfolgt während des Auftauens in Gegenwart von Polythylenglykol 1000 (Klebe et al. 1983). Die Transformationsrate ist bei dieser Methode mit 103 Transformanten/µg DNA vergleichsweise niedrig. Technisch aufwändig, aber sehr effektiv ist die Elektroporationsmethode. Bei dieser Methode werden die Zellmembranen durch kurze (10 µs) Pulse hoher Feldstärke (1,5 kV/cm) für die Plasmid DNA durchlässig gemacht. Der Vorteil dieser Methode besteht neben der hohen Transformationsrate von bis zu 106 Transformanten/µg Plasmid darin, dass nur geringe Mengen an Plasmid-DNA (zwischen 25 und 100 ng) zur Transformation eingesetzt werden müssen. Ähnlich anspruchsvoll wie die Elektroporation ist die biolistische Transformation von Hefezellen. Hier werden mit Hilfe einer Partikelkanone DNAbeschichtete Gold- oder Wolfram-Partikel in die Zelle geschossen. Die Partikel sind sehr klein, so dass sie keinen dauerhaften Schaden in der Zelle verursachen. Ursprünglich wurden die Partikel tatsächlich mit Schießpulver beschleunigt.

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3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen

Heute wird dagegen komprimiertes Helium zur Beschleunigung verwendet. Die biolistische Methode hat sich für die Transformation von Hefemitochondrien bewährt, wegen des hohen technischen Aufwands jedoch nicht für die Transformation des Zellkerns. Die hier im praktischen Teil vorgestellte Hefe-Transformation nach der Gefriermethode liefert zwar wesentlich niedrigere Transformationsraten als die Sphäroplastierungsmethode oder die Lithium-Acetatmethode, ist aber weniger aufwändig und völlig ausreichend, wenn ein Plasmid in eine Hefezelle eingebracht werden soll. Alternativ wird hier die Elektroporationsmethode vorgestellt, die dann eingesetzt wird, wenn möglichst viele Transformanten erzielt werden sollen. Dies ist zum Beispiel bei der Transformation einer Genbank der Fall, da in einer solchen Genbank mehrere Tausend verschiedene Plasmide vorliegen. Selektionsmarker und Wirtsstämme Bei einer Transformation sollte die zu komplementierende chromosomale Auxotrophiemutation rezessiv sein und nur mit sehr geringer Frequenz von