Nuevo método de valoración de la vitamina D

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N U E V O

M E T O D O DE

DE

V A L O R A C I O N

LA

V I T A M I N A

D

ProQ uest N u m b e r: 10291501

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uest ProQuest 10291501 Published by ProQuest LLC(2017). C opyright of the Dissertation is held by the Author. All rights reserved. This work is protected against unauthorized copying under Title 17, United States C o d e M icroform Edition © ProQuest LLC. ProQuest LLC. 789 East Eisenhower Parkway P.O. Box 1346 Ann Arbor, MI 4 8 1 0 6 - 1346

Universidad de Madrid. Facultad de Ciencias.

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UNjyÉRSiPAD COMPLUTENSE

1

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'fO*0 NUEVO METODO DE VALORACION DE IA VITAMINA D

Memoria que presenta para aspirar al grado de Doctor (Sección de Químicas) el Licenciado en Ciencias (Sección de Químicas y de Físico-quí­ micas ). Universidad complutense - áudríd jj

D. JOSE LUIS FONTAN CANDELA.

Faculic'.d de Cier.c.as Q u ím ic a s

I

B I B L I O T E C A

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N- R e g istro

o— iiMnir«WfmiMiat

Madrid. Sección de Bioquímica del Instituto Español de Fisiología y Biocuímica. Años 1947, 48 y

49

*

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'■f'&OCó Q,

j man' • & xüu, í

ar Bespetable Tribunal* Terminadas nie lácemela turas en la Facultad de Ciencias de Badrid y careada» leu asignaturas rol Boctoradof Inicié nio experiencias en el campo de lo lnve 8ti¿;aGlón en el Instituto Hapofcol d© Fifloloio y Bioquímico del C»S#X«C#;en cuya Sección de Bioquímica realicé el pre­ sente trabajo(quo versa sobre un nuevo nótodo de valoración quínlca de Ion vitaminas B), que te'mso el honor do presentar coro Tesis Poo- • toral on lo Sección de Clónelas Químicas* i>s un (Tfito deber pe ra ni el expresar 9I profundo reconocimiento a P* Anrrel Bastos Buis por nu dirección 2 ©sínicno al Br* Villar Pa­ inel por su colaboración# Bebo de conci¿^ner temblón que tila experiencias han po ido ser lle­ vador a cabo gracias o la íQUda económica que percibí cor.o becario del In; ti tuto Kspatol de Fisiología y Bioquímica primeramente p deopuÓs cono becario cel Patronato "Juan de le Cir

I N D I C E

Al Tribunal........ ....................... . Indice

......................................

.......... ¡r

i^AHTE TEORICA Las vitaminas D 1. Generalidades 1. 1. H i s t o r i a .................. .. • • . . 1. 2. diversidad . ........................

.......... .>

1. 5. Eroniedades............ v............. ............ 1 *

1. 4. Aislamiento..........................

.......... is

2. determinación 2. 1. Métodos biológicos ..................

............ iñ

2. 2. Métodos físicos .....................

............

2. 3. Métodos químicos ....................

u

\r 3. necesidad de un buen método de valoración • • • • • * • •

éf

¿\1HTK JBLPJilUJálSNSAL 1. Estudio de una nueva reacción coloreada que permite eva­ luar cuantitativamente lae vitaminas

• *

1. 1. Primeras experiencias* i*ey de #eer* • « • * • • • * 3 3 1. 2. necesidad de un reductor*........... • • « * • • •

3?

1* 3. necesidad de un deshidratante y de un generador protónico « • • • • • • • • • » * • • • • • • • « • • • •

4Z

1. 4* Influencia del disolvente • • • * • • • « • • • • •

W

1* 5* Ihsayos térmicos a) ‘Temperatura de formación • « • • • * • • • * • • b) Variación térmica* • • • • • • « • • • * • • • • 1*

6*

4Í

Influenciade la luz* * ................ • • * • • 1 ' /

2* Reactivos y aparatos empleado» 2*

1*

naturaleza

de los reactivos• • • • • • « • • • • *

2*

2*

«oluoionespreparadas.........

• • • • • * . . * 3 7

fí

& 3. Matracas, pipetas y soporte* • • •

• « $7

2. 4» Oslo fotómetro, antetas y filtro. 2. 3. Solución re hitos

*S (

3. 'léanlos do la recocida

*íf

4. fttsayoa son vitamina

aislada, y estudio da los errores

que se puedan constar en su análisis • 4. 1. Obtención da la curra da calibrado » • • *

•••*•£/

4. S« Variación dal furfural » + 4» 3. Variación dal Aoldo sulfúrico. • • » • • • • • • ,

» ¿s

4. 4. Variación dal agua 4. 6* Varlaeióa as al t i e m p o ............* * * * • • • • • 5. Aplicación da la reacción a la determinación cuantitati­ va da la vitamina B an asaltas. 5. 1. Vitaminas flgy %

aisladas................• • • • • ? /

5. 2. Oon vitamina A an asaltas anímalas

5» 3. Con ^ caroteno en aceites vegetales........ • • • » • ? / 6* Comportamiento de la reacción con substancias eateroídlcaa análogas . . . . . . .

.............. CQNSIDKRACIONKS

1. Consideraciones sobre los resultados • 2. Intento de explicación teórica de los fenómenos observados * //? CONCLUSIONES.............. figuras

. • ./3/

........ ............ ..

bibliografía............ ......................... .. • • * • • / S i

U

Ü ti I C i

Uáü ?xfmsMJ& B 1» Generalidades. 1 . 1 . UXíflíoaXA» I*a enfermedad denominada raquitismo» faé deserite por primera res en 1610 por el médico inglés ttlisson (8 ££); pe» ro la enfermedad» como es xdgioo» debe de Haber existido desde la apariolén de la vida sobre la tierra» como nos lo diora» bira alara»» mente» los huesos de animales hallados en terrenos de las primeras edades» %

I M S » Trousseau (Y 8) reeomieada el empleo del aceite de

hígado de bacalao ra la cura del raquitismo»y ra la misma época Snladeefei (tf 11) habla también de otra suerte de curaciones» las efectuadas por medio de los rayos solares» Hojéelos sugiere ra 1006 (H 1?) (& 18)» que la causa del raquitismo es la ausraola» en la die­ ta» de ciertos alimentos -medicinas- necesarios}y ra 1913 Haeaynski estudia el beneficioso influjo ejercido por la lus solar sobre la asliall&olán del oalelo en los perros» (ü 1)

3 Mellaaby trabajando con oachorros» tn 1919 (M 4 y 5) » observa que alimentándolos especialmente» sa lea ganara raquitismo» y que, aña» di ando a au di ata grasas anímalas» las desaparece la enfermedad; por tanto afirma qua axi&te un "factor aatlrraquitico*, y qua ésta» o as la vitamina A f

o

as otra substancia que ooexlste con alia* %

al mis­

mo año prueba Muldschlnaky ÍH 19 y 20) que el raquitismo puede cu­ rarse por la aooldn de la luz ultravioleta» tn 1922 ¿ucker y otros (2 1) descubran que el factor antirraquitl»e oo se encuentra en la fracción Insaponifleable de los aceites de hí­ gado de peces» lio» Collum y sus colaboradores(0 5 y 6 ) aseguran que el factor antlrraquítloo no es la vitamina a, puesto que aquel» a tlfarenóla de ésta» no se destruya cuando as atravesado por burbujas de aire callente» Al mismo tiempo» otros Investigadores (ü 21 y 3 13) trabajando aisladamente determinan también la diversidad existente (mtre la vitamina A y el faotor antirraquítico» al comprobar que la luz no podía curar los efectos causados por la falta de vitamina a

tiess y £utman (H 11) expresan la opinión da qua al efecto curativo qua producían loa aceites de hígado de peces» ae debía a la miaña causa que el producido por la lúa» eli minación del colorante usado para hacer visibles las capas orometográfleas , esta­ rificación con cloruro de 3,5 dinitrobenceno, disolución en benceno-

•bencina, y vuelta a tratarlo con Al(OH),. Aunque Hosemberg (R 6) manifiesta que son loa mejores, sin embargo Rltsert (R 5) igpllca claramente, como era natural, que estos métodos que no alelan bien la vitamina D, no pueden ser analíticamente perfectos* Ejemplo® del tercer método son: él de Dalmer (Di) con anhídrido aaléloof el de Ündaua (W Ib) oon anhídrido oitracónico, y el de almona y ¿Cuákero (3 16) y Jhder ( 1 3 y 4) oon anhídrido ftfilioo; y del euarto método el de Hesleroood y Drummond (H 4)y el de Hiokman (H le), "(Heilbron (H 10é, °arr (C g), Druramond (D 6) y Hume (H 88). Hatos di timo o mé­ todos tampoco son cuantitativos* Qalmer también reconoce que oon el suyo se obtiene solamente un 90 % de Dureza. 3e debe observar que, operando con este último método, fué nomo se descubrid la vitamina

S

Dot «mlnaoidn •

Los métodos empleados para la determinación da la vitamina £, se clasifican en tres

grupost biológicos, físicos y qulmloos,

Zm 1, MHífoJüL BIOLOGICOS.- 3« basan en la producción de raquitis­ mo en los animales en que se experimenta, y a continuación se va su­ ministrando, a algunos de ellos, diferentes oantldades de vitamina £ basta su euraoión# #e emplean ratas o pollos, y se preelsa un lo­ te míuliúo de ICO animal es para que el error no rebase de un 4 jé. Loa métodos que desoribe la bibliografía son* a) Análisis del sálelo y fósforo de los huesos* Propuesto por sherm n y oteibaling (3 14); se funda en la menor proporción de calcio y fósforo que existe en huesos desengraáaéos de animales raquíticos, en oomparaoión

oon la de los apíñales sanos* *e realiza en fému­

res* b) Aumento de peso* desarrollado por Ooward (08). Se basa en la

¿o relación observada en animales Jóvenes, entre su peso y le cantidad de vitamina 8 que se les proporciona» c)

Histológico. Ideado por Uo Collum 7 colaboradores (0 7)» ¿onela­

te en la observación de la línea que surge en las zonas d« caleifieaclón que está constituida por Ga^lPO^Jg „ ¿ie realiza 00* tibias, oúbltos o radios, a los cuales se hace una sección antes ¿e sumergir* los en ¿tiPOgt para que el

se transforme en

*15^

4}• ^e

lavan oon agua destilada» y se les expone a una fuerte lu*9 basta que las áreas calcificadas formen una mancha negra; se observe visual o \

fotográficamente la metáflsls» para apreciar la linea de falsifica­ ción. d) P|| de las heces. oephcott y Baoharaoh (8 ll) observaron que el Ptf de las hoces es alcalino en el raquitismo y que la curta de va­ riación hacia la acidez, va paralela a la ouraclón» e) Radiográfico» Poulson y Lovenakiold (P 7) estudian «on él las dependencias del raquitismo oon la deoaloifieaolón» o sea, la irre-

4/ gularldad de la r^ona do osificación, el espesor de la zona no e&lelfloa la óiafiao-epifisaria, y cuando ha lugar ,1a

lnourvaeión de la

dláflsia de la tibia. f)

ilelaoión oenizas/mataria orgánioa de loe huesos, '¿hlek y otros

(C 3) observaron que la relación oenizas/materia orgánica fluotuaba de 0,4 a O , a ati las ratas raquíticas y que ea 1,5 en la rata normal. 2. 2. óllírODüS FISICOS.- Sólo existe uno de Heerink y *ÍJk lM Q # H 4 y T 6) que consiste en la medición de la intensidad del espee» tro de absorción en el ultravioleta, en el cual, las vitaminas * presentan un máximo en los 2ó5m Jk . «tete método sólo es valedero cuando le vitamina U se encuentra en ausenoia de otros compuestos de análogo espectro de absorción; por tanto, no se puede utilizar en crudos de irradiación de le ergosterina, ni en aceites de pescado. •fin este último ceso ha recomendado Marcussen (M l) la saponificación y separación de esterinas IS 16) y de vitamine A por adroreión selectiva con ALgOa. Fuchs (F 1 y M 7) ha efectuado también determi-

nucióles en aceites de oliva y séaa&o, aeí cono £ n a u t? 8) en otroe aceites.

2.

r ¿0 í\m¿wü

mímicos .-

a) Reaooión de £rooknann y Uhatt (B 7). i-a vitamina B mas BpGl3 en eoluoióu dorofómica, produce una coloración anaranjado-amarillen­ ta, con un máximo de absorción en las SOOn JA . B» deterrainable, por tanto, oolorimótrica o espectroscóricamente. »e han analizado median­ te ella, sube tandas naturales que contenían oooas #

de vitamina

i> (i 2, B e y d 26). Una modificación de este método se efectúa agre­ gando cloruro de ocafilo (B 4)« ^anto para la determinación colorimdtrioa, como para la eepeotroscóploa, se recomienda la separación de vitamina i con tierra montana, y de esterinas con ligitoalna, por dar estas substancias, en análogas condiciones, coloraciones y es­ pectro o idénticos* Miles y sus colaboradores IM 7) han tratado tam­ bién de mejorarlo* b) Reacción de «ruz-Coke (C 9)* üna soluoióa alcohólica de vita-

mina J*9 calentada a 80 • C. aon ácido clorhídrico concentrado* produoe una coloración Tarda oolorl^etreable. Un pequeño exceso de MCi, o una dlsminuolón de la temperatura» produce un precipitado blanco, oon cata reacción ae puedan daterminar aproximadamente unas 500 Y de Titamina U. o)

Reacción de R&lden y *fzonl (H 1 y g y *r 9 ), Una mezcla de Tita-

mina O mas pirogalol en solución elorofórmica9 (o da atar da petró­ leo o benoénloa) se oonoentra en baño da marta. *e la añada una soluolón recién preparada da ¿iGl^ en alcohol absoluto» y siguiendo en el baño de agua, a los éuatro minutos origina una coloración Tioleta obscura que se pueda daterminar colorimátrl cadente, o con al fo­ tómetro da JPulfrloh, °e necesita Titamina pura9 pues la taqulsterina y supraaterina también producen dicha coloración, «o se puede reali­ zar en aceites. d)

Reacción da £&gl"-Xieeefcer (K 1 y Y 5). Re dlsuelTa Titamina u

en acético glacial, se hierra con HgSQ4 concentrado, se le añade una

solución de Brg en acético glacial, y aparece una ooloraoión roja que pasa a Tarde* 9a exceso de Brg destruye la coloración* Rl Brg puede substituirse por Glg * I e * anhídridos de ácidos orgánicos9 y aldehidos* £1 BgSG^ puede siib stituirse por otros ácidos minerales* Las coloraciones que se producen en estas Tari antes son9 principal­ mente» Tioletas, Tardes y asples* Kigl describió esta reacción para esterinas* Bek y Xhomas ( X I ) la aplicaron sobre hormonas* e) Reacción de Liebermana (t 2)* Titamina B en eontaeto con BGGlg, ñas anhídrido acético y ácido suirdrioo concentrado 9 produce

un ani -

lio amarillo-rojo-Tioleta en la intarfase, quedando Tarde el cloro­ formo* Beta es una antigua reacción de esterinas que Burehard (B 11) sistematizó* Beldusehfca IB ó) estudió con ella la ergosterina* lieland y Bcibert (14- manifiestan que la luaistcrina, taqulsterinay suprasterina

dan lugar a esta reacción

y

de un modo muoho mas débil

que la Titamina B* f) Reacción de Meesenmaeoker (M 3)* ¿nadiendo una soloción cloro-

fórmica de Titamina 0 (o crgosterinaU SnGlg

y anhídrido

acético,

ee obaerran coloraciones que Tiran del rosa al verde esmeralda* Rl ZnClg puede substituirse por PgQg* g) Reacción de Sath (W 1 y S)* Titamina B mas acetato mercúrico en acético glaoial y ácido sulfúrico,concentrado forman un anillo amarillo verdoso* h) Reacción de floller* (R 5) • Vitamina B oon cloruro eatannoso en cloruro de tionilo genera una coloración rojo-anaranjada* U n c u s (0 l) emplea

SbCl^ en vez del RnClg*

i) Reacción de Pregl (P Q)* Vitamina £ con Hgfipg concentrado pro­ duce un color rojo intenso* R1 autor y Bañe (0 2) estudiaron así los ácidos biliares, Birscherl y Billinken (D 5) hormona¿ y Roker y intener (« 19 a 25) la vitamina B* jjReaoción de Pettenkofer (F 4). Re llama asi ia reacción que afee tdan diversas substancias al mezclarlas con sacarosa en solución acuo­ sa y ácido sulfúrico* La vitamina 3, en estas condiciones, da lugar

a un anillo laterfásleo da v a H a a tonalidades, que de arriba a abajo son: Tarda» violeta y rojiza* Se agrupan a oontinuaeión muohaa experienoiae posteriores que» aunque difieran da asta reaeoldn» se pue­ dan ooneiderar variaciones suyas» iba y Kavaguti (i 1 y 2) emplean vainillina y áoido fosfórico, bamarsten (b 5) glucosa y Aoido clor­ hídrico* ianka (J 1) fosfórico y furfural. bazlro y Shimara (K 6 y 7) benzaldehido y

Ohyama (0 1 ) fructosa y b81» Sbfcaitlgger (8 *)

diversos aldehidos» 82884 y trazas da dehido y

Soherrer (8 8 i benzal­

Schmidt (8 9) y Kerr (K 6 ) eftetdanla en alcohol»

Volcar y Antener (V 80 a £5) son Hgfl04 y furfural» como antiguamente la realizó Udranslqr (¥ 1 )» be de destacar la experiencia de Villar Palas! (V 2 ) que» realizan­ do la reacción en la forma primitiva» pero en medio alcohólico» con­ siguió un color azul homogéneo» y por tanto» eolorimetreable» 1) Heaeeión de SaUcowslcy (8 1 y H 6) * ¿a vitamina 0 en solución clorofómioa con beS0 4 » colorea de rojigo la capa sulfúrica»

& 1)

Reacción de Shear (8 12)* Vitamina 8 oon una memela de anili­

na y clorhídrico, a la temperatura de ebullición» produce un eolor rojo* bata reacción la consiguen también substancias diversas, no aotivables, como la ergopinaoona y el peróxido de ergosterina» m) Reacción de 3obel»(S 17)* Vitamina D oon cloroformo mas la 1,5

dlolorhldrina de la glioerlna y cloruro de aoetilo genera un

eolor amarillo que pasa a verde azulado coloriretreable* Pirlot y Rouir (P b) la consideran mejor que la de Broefcmann» aunque no sigue la Rey de Bear» Trabajando sobre aceites (R 16) la valoran sin preo­ cuparse de las substancias que la acompañan y que desde luego inter­ fieren la reacción» n) Reacción de Stoeltzner (3 £5), Vitamina

en solución aceitosa,

mas POI5 forma un color rojo pardo que va obscureciendo hasta que­ dar negro» ¿ata reacción la dan todas las vitaminas y hormonas (0 4 )« o) Reacción de Tortelli y Jaffé (X 7)* Retos dos italianos deseubrieron esta reacción trabajando sobre grasas, otros investigadores

(fl S ; 9, P 3 y V 3) la apllsaron a la Titanias D»

Vitamina D en so-

luoión aceitosa «as solución clorofórmica da ftre origina un anillo azul su la lnterfase, a difarañóla da la ergo8terina que lo da Tarda» Santos ftuiz y Villar l'alasí (S 3 y 4) Demostraron que el bromo efec­ túa la acción fundamental» p) Beaoeión da Witt y Bullirán (V 18|» Después da separar ororaatogrifloamente la substancias que acamparían a la Titanias D, utilizan SbClg en 1,2 dloloroetano y cloruro da aoetilo»

# 8

Necesidad de un buen método do raloraoidau

Loo métodos de raloración de Xa vitamina D expuestos en el eapltulo anterior, eegdn telenques (V X) $o son perfectos. Los bloldgioos son mas perfectos, adcgás lncXuyen Xa reata Ja de necesitar me* ñores cantidades de Titamina que los de los otros grupos, %

cambio

encierran grandes incoaren!entes i larga ejeoueién, peligros de fra­ caso debido a muertes, infecciones etc,, ser menos económicos; sin embargo para que oon aten de una gran exactitud, se necesita que los anímalos que sufren la experimentación, sean todos descendientes de una misma rama, y es imposible contar oon tantos animales de Xa mis­ ma camada; además precisan que los antecesores hayan estado anterior­ mente sometidos a dietas apropiadas, Los métodos físicos o espeotrosoófioos no son prácticos (P 5) por el hecho de que Xas substancias que normalmente aeom^ñan a las rita-

minas 0 , presenten máximos áe absorción precisamente en las miañas longitudes de onda que ellas* De los numerosos métodos químicos expuestos, la mayoría sea sim­ ples reacciones cualitativas, y las que incluyen

posibilidades oolo-

rimétricas, ofrecen las desvéntala de no ser específicos, y de que las substancias que se encuentran junto a la vitamina 0 produsean co­ loraciones análogas, y oomo ya se ha visto en el capítulo 1 lo labo­ rioso que resulta el aislamiento de la vitamina 0 cuando se trata de obtenerla, parece incongruente el repetir esas experiencias al ana­ lizar unas pocas gammas de dicha substancia* Aparte de ello, les mas importantes el da Balden y *soni y el de Bobel, aunque permiten ca­ lorimetrías, no siguen la ley de leer* Unicamente queda exceptuado de este repaso, el de Brockmann jr tihen, pero ya se ha visto por les reformas en él introducidas, como debido a la inestabilidad del reas tivo, y a las anchas precauciones que son necesarias para una buena reproduetibllidad, es ya

dificil su perfecta ejecución cuando se

3/ encuentra aislada Xa vitamina; mas lo difioil se transforma en lnpor sible cuando ella se encuentra unida a Xa vitamina A« &e puado decir, por tanto, oon toda justicia, que el problema da Xa valoración da Xa vitamina J* no está resuelto todavía, y como aumenta cada vea mas Xa importancia da las vitaminas, debido a Xa mul­ tiplicidad da funcionas cataXítieas que realizan en los organismos, es cada ves mas ingente el volumen de su producción, y mas Inminente por ende Xa resolución del problema de su valoración, Pusímonos pus*, a trabajar en ello, y después de repasar la multi­ tud de reacciones que describe Xa bibliografía, se prestó atención preferente, al hecho recién descubierto por el doctor tillar Palasi (V 2) de que Xa vitamina 2>g, expuesta a la reacción de fettenkofer, modificada en el sentido de emplear medio alcohólico en vea de acuoso, y después de agitarla, producía una coloración azul celeste oolorimetreable,

Pi HTI

I I P I H I U 1 N T AL

1*

üstudio de una nuera reacción ool oreada

que permite evaluar cuantitativamente laa vitaminas 1. 1. PHlMüftAS JBLPriRIis&lCIAS. JUflí DJS BAEH.- Se ooaeasd este trebajo, repitiendo las experiencias descritas por V* Villar ?alasl (V 8 ). " 1-2 ngs* de saoarosa, en unión de 1-2 mgs. de vitamina se disuelven en 1-8 co* de alcohol etílico* #e añaden unas gotas de áoido aulfúrloo concentrado* Ai agitar, se obtiene una ooloraoidn azul oeleste estable"* Colocada la doble solución en un tubo de ensayo, se dejan eaer sobre las paredes de éste, unas gotas de ácido sulfúrico concentra­ do* AL áoido, debido a su gran densidad, llega al fondo, formando una fase diferenciable de la alcohólica; A medida que es mayor el número de gotas ácidas introducidas, se va acentuando un color rojo claro en la capa áoida. Ai la interfase, se forma un anillo de ñas

3* fuerte coloración, que se compone de varias tonalidades. ai agitar queda generalmente un dnieo color, el aual, no eoneuerda sienpre oon el azul oeleete previsto; algunas veces resulta violetat verdoso o rojiza# %

ha parte inferior del anillo tira a rojo o eastaño y en

la superior violeta, verdoso o azulado; la fase situada enelma de él siempre queda inoolora# hs curioso seílalar que a esa coloración azul que muchos ensayos presentan en la interfase, cuando se la agita oon una varilla (pero sólo a ella, junto oon la fase superior) , el color azul se difunde por la zona superior homogéneamente, pero no de modo estable, puesto que con el tiempo vuelve a caer a la interfase# Contrariamente, agi­ tando conJtintamente todas las fases, sea azul el color resultante o eea otro cualquiera, permanece

difundido de modo estable y homogé­

neo durante varios cientos de horas# Se observa también que, cuando en el anillo interfásioo se descu­ bre el color azul, entre otroe, tete color es el dnico que

persiste

después de la agitación, y cuando aquel color no apareoe en la Inter* fase» tampoco lo hace posteriormente a la agitación# Meriendo descubrir le eausa de las distintas coloraciones que sur» gen en la reacción» se fueron modificando sistemáticamente las oondl d o n e s descritas por villar ¿’alasl, para poder fijar las bases de una*buena repetibtildad. así en una serle de ensayos ea los cuales todo era idéntico menos la cantidad de sacarosa, la cual se iba Incremen­ tando gradualmente, se observa que, a medida que va amentando la can­ tidad de dlobo dlbolósido, van pasando los colores finales» después de la agitación, de azul celeste a azul grisáceo» violeta y lila# %

lo que respecta al ácido sulfdrico» se observó lo siguientes

Con pocas gotas de ácido ( £ a 10), sólo se obtiene le coloración ro­ jo rosáoea en la fase Acida, pero no se forma ( o en tan pequeña masa que no es perceptible) anillo azulado y, al agitar, tampoco se ve di­ cho color» sino una dilución del rojo, con transformación a tonos rosáeeos o amarillentos#

Cuando el áoido sulfúrico oe introduoo en Xa disolución oon amplios intervalos entra la adición da una gota cualquiera y la 8iguianta9 no as tan intensa la odoración del anillo interfásloo» en comparación oon la obtenida efectuando rápidamente el goteo9 a mas da tardar de 15 a SO segundos m producirse» Guando

** forma al anillo» después

de agitarlo, toma el todo una ooloraoión de Tino clarete, *1 minino necesario para producir la reacción son 16 a 80 gotas de ácido sul­ fúrico; pero cuando las cantidades de sulfúrico» añadidas son mayores que las reseñadas» y el goteo se produoe muy lentamente» llega un mo­ mento en que el único efecto visual observable» es un simple decre­ cimiento del color rojo de la capa sulfúrica» o sea» una dilución de la reacción con su consiguiente decolorado» **1 la reacción se veri­ fica oon una gran cantidad de sulfúrico introducido rápidamente» ios colores que se obtienen al agitar son ocres, Hespecto a la función del alcohol se observa oue» a medida que va siendo mayor su concentración acuosa» la reacción se va efectuando

con un grado menor de intensidad, 91 la mezcla del ácido con la solución etánoliea se efectúa al re vás de cono se he señalado hasta ahora, o sea, vertiendo la solución «obre el ácido, la reacción se produce igual e instantáneamente, üeta coloración ezul que se produce, está o no expuesta la solución a la luz, con el tlomeo se ve obscureciendo, y así, un azul que re­ cién obtenido sea pálido, a los dos otros día se convierte ya en un azul merino, Cuando se efectúa une dilución a gran volumen ñor medio de adloió^n de agua, ee forma un precipitado negruzco, do carácter esponjoso» e igualemente se origine este precipitado negruzco cuando la dilución ecuosa se efectúe sobre una solución de los míenos

reactivos sin vi -

tamlna ¿>e observe asimismo que, cupndo la capa azul homogénea formada en la reacción, ne diluye con etanol, nasa a verdosa* ©n cambio» si la dilución se efectúe en

colusión ie sulfúrico on etanol de la mis-

*1

nii

concentración que Xa total que existe eu la solución productora

del Color azul» dicho azul permanece durante días. ¿¿ominada ya la siet and tica da una reorodueiMlldad de la reacción » produjéronce una eeriu de ensayos que solamente se diferenciaron en la cantidad de vit¿aniña Ug presente, llevados a un colorímetro ocular, se dtseoubriá stua ¿ a reacción entudlada aigas la Igy. M

*SML,

h««J»

fuo¿aaeatal para Xa reuilzaoión de una buena colox’imetria, y pera que reconocida su importancia, tuviera objetivo práctico el continuar es­ tudiándola. 1» £. m&CiSSIíUD DS m RKX3UCT0R*- Reemplazando la sacarosa por las substancias indicadas en el cuadro I, y mezclándolas oon Aoido sulfú­ rico y vitamina ¿te» se obtienen los resultados indicados en dicho cuadro* íh vista de que tanto con reactivos inorgánicos como oon substan­ cias orgánicas de la mas variada oondición, se consigue el mismo re-

3f

H O I Coloraciones obserradas oon reduotoros dlrersos O V A D

Substanoia tratada

Idrnraia fíW -flft-QH

Beacolón en blanoo

fln presencia da Titamina D%

Boje obseuro

Bajo obseuro

Anaranjado

Anal

Anaranjado

Anaranjado

Fenantrenoqulnona

Amarillo

Amarillo

fnrfural

Violáceo

Anuí

▲oatona Banzaldehldo

o.* -

Benzofenona 0 O

Glucosa

cí

ty-í

Yioláeeo

Azul

Maltosa

C/t Kt¿ ou

Violáceo

Azul

Bosioeo

Boaáeeo

Anaranjado

Anaranjado

2 motil 1,4 naftoqulnona Vtloool 6 £metil 3ox: 1,4 naftoquinona

O t > #

--------- < 2----- _

sic*

4o

C U A D R O I (continuación) Coloraciones observadas con reductores diversos Substancia tratada

Fórmula

naftoquinona 1,4. dlmetllsmlno bensaldehldo p. qulnona

5 ^-O-cd

•o -»

Yainlllina

Reacción en blanco

Rn presenoia da vitamina Bg

Pardusco

Pardusco

Amarillento

Azul

Pardusco

Pardusco

AnaHllcnto

Anal

Acido oxálico

0 H S M OCR

Incolora

Asul

Bisulfito sódico

■otao^H)

Incolora

Anuí

Pirogalol Hlpofusfito sódico

_GH £% W HatHífiHg)

Rosa pálido

Parda

Blanco amarill .naranja

sultado 9 ee pensó producir ceta reaooión por medios electroquímicos, y para ello se montó la instalación indicada en la figura X* Un aeumuiador genera corriente eléctrica, que ae la hace atravesar una re* aleteada variable; a continuación se coloca un mlorovoltlaetro, con objeto de controlar el voltaje con que se apera# Si circuito ae ele* rra mediante unos electrodos de platino introducidos en una solución de ácidos sulfúrico en alooSol etílico ( 2 oo» de ácido sulfúrico ea 5 oc# de etanol) que contiene asimismo 50 ¿ de vitamina % • % t a cu* ba electrolítica se introduce en un fcran baño de agua en el cual se mantiene la temperatura a 76* 0» (mas adelante ae expondrá detall»» damgute cóno ae puede obtener la misma coloración

asul, produciendo

la reacción oon los miamos reactivos, después de haber Irradiado ya éstos su calor de dilución, siempre que se les suministre suficien­ te energía exterlómente) • Verificados los ensayos con voltajes di* ferantes (de 0,25 a 1,50 voltios) en todos ellos se observa el mis* mo fenómeno, que en el cátodo se desprenden unas burbujas incoloras

de hidrógeno, mientras que en el ánodo, se desprende» un herró per* duzoo* que pooo a poeo Te oubriendo el fondo de la oubeta» Esta gran masa parda ae origina igualmente en ausencia de vitamina % , al ope­ rar en las mismas condiciones* 1. 3. NECESIDAD DB UN DESHIDRATANTE Y DE UN GENERADOR PROTONICO. A continuación se investigó la naturaleza de la función ejercida por el ácido sulfúrico* la cual podfá

provenir de algunas de sus prople-

dades^ácido, deshidrantante, oxidante o ión sulfato. Realizando las experiencias expuestas en el cuadro II* queda fijada

dicha natura-

losa. (Ninguna de las reacciones descritas en el euadro II producen coloración efectuadas en ausencia de vitamina Dg).

O ü ▲ B B O

ZZ

Ooloraolonos obs«rradas oon substanolae

^abatanólas reaooionantes

ü t w m i

Hi aontanto de Til. ü£

Tttrfural, KOI y atanol

Azul Terdoao débil a loe SO1

Jorfural, Zadlg» M i 7 atanol

Violeta «— b aaul

Jurfural*

ZnGlg 7

Inooloro

atanol

furfural, Pgdgt CWgOüóM (gla*)y ü a n o l Xnooloro /urrural, £49$»

OQlgOQQK 7

atanol

Indoloro

Tortural, ?£® b » M I 7 atanol

Violeta « 4 anal

Kalttjl), inflg» M I y atanol

Anal Yerdoso

OOt&UOOQK, ZnOlg, M I y atanol

Anal Yerdoso

SnCtlg» fttdlg, M i y atanol

Azul Yerdoso

SnGlg, AlCl£ y atanol

Azul Yerdoso débil

1 , 4» JUTUJm ciA DSL nZ80J-rK»TK.-. Comprobada ya la necesidad da la presencia cu la reacción, da un reductor, da un ácido fuerte y de un deshidratante, ae consideró la fu n dó n del alcohol etílico; para ello ee substituye el etanol por otras substanolae análogas* »e efectúan ensayos con los alcoholes siguientest Metílico, etílico, iflppsopilioo, n. butilico,fséfeutílloo, amílico, isoanllloo, ootllioo y bencílico, en presencia de furfural y ácido sulfúrico# vodos es­ tos alcohol es, en presencie de vitamina Mg, producen una fuerte oo* loraoldn anuí, y en su ausencia, coloracidn violeta; pero en el ben­ cílico, ,cdcmáo de obeervarse estas coloraciones, se efectúa una fuer­ te reacción exotérmica, con producción de un precipitado esponjoso de color blanco y desprendimiento gaseoso asimismo de blanca colora­ ción# Posteriormente, a las poeao horas, se va cuajando el líquido sobrenadante, siendo este nuevo precipitado ligeramente ooloreado, pero de m oolor indefinido, y este fenómeno se origina de igual mo­ do en presencia que en ausencia de la vitamina % , y hasta en ausen-

•la da furfural. üi loa «Majos cea furfural, a las £4 Horas pasa al todo a una nasa negruzca, y en los ensayos realizados solamente en presenola de sulfdrieo y alcohol benoilico, en igual ndnero de horas está todo en conjunto preoipitado* Hete preeipitado es amarillento y de naturaleza mas fluida que el anterior, recordando su aspecto al de la glioerina» ue ensayó también ácido aoátleo glacial como disolvente de la vita­ mina i)g y del furfural, añedido áeido sulfúrico, y oaluntado el total 109 en un termostato a 74* G*

se obtienen las ademas coloraciones

de siempre azules y violáceas» 1 . 6» SKMkXGS TSHttlCOS.-

a) Temperatura de foranolón. se mezcla una

disolución etanólloa de ácido sulfúrico con una gota de disolución etanólioa de furfural y con otra gota de disolución etanólioa de vi­ tamina f>g (estas do8 últimas soluolones se encuentran saturadas res­ pecto a las substancias en eSas disueltas)»

Mx esta mezcla, al re-

lucirse q un nínlno el color de dilución que corrientemente produln el ácido sulfúrico, permite observar ei se produce la reacción a La temperatura de ©•

irodeado de hielo el matre* en que ae efec­

túa la mezcla). 9a una hora de observación, no ee advierte en ella fea mas mínima coloración. t*e realizan con la misma mesóla una serie le ensayos en un termostato, efectuando ceda ensayo con un incremen­ to de *10* 0, sobre el anterior, nc observándose en ninguno de ellos % producción de color, ni en el realizado a 70* C,.¿tetando este últino ensayo ya muy próximo a le temperatura de ebullición del etanol, se realizan loo siguientes encayos con une variación de £ en 2 grados* £1 efectuado © 7b* Q. dló une ooloreoión azul. Verificados otros en­ sayos sin vítenlos %

den el mismo resultado. Resumiendo, mientras

La temperatura es inferior a 78* 0., el producto resulta incoloro; a dicha temperatura, se colorea de azul en presencia de vitamina % f de violeta en su ausencia. b) Variación térmica.- iín un termostato a 78* 0# se introduce un

tubo de ensayo ooa solución etanólioa de sulfúrico, el cabo de unos minutos se añade une gota de disolución etanólioa saturada de furfUral y vitamina

conjuntamente, %

el teto, se observe en el t e n ó ­

metro Introducido en la mésala reaoalosante, la temperatura de 79# 0 • Se observa también que aneado la reacción se efectúa en el termostato, la coloración obtenida ea loe primeros minutos no se tan intensa cobo la originada adicionando normalmente el ácido sulfúrico a la solu­ ción etanólioa. 1 , c. &¡yi#£NQXA nx LA X&2 »-

de reclinan cuarteo ensayos en las

siguientes condiciones i 0a primero9 expuesto directamente a los ra­ jos solares, el tubo con la reacción* 0a segundo, en la penumbra. Un tercero, en la cámara obscura, expuesto a la luz de una lámpara eléctrica, y un cuarto ensayo sin la menor cantidad de lux. ▲ los sesenta minutos de haberse efeetuadcTios cuatro «isayos el contac­ to de las soluciones de furfural y vitamina Jfe con el ácido sulfúrleop

se introducen los cuatro tubos en un celofotónetro, y se observa que no existe la menor variación en la corríante eléctrica generada por cada uno de ello.

Vf 8

Beaetlvos y aparatos empleados*

Sfactuado el anterior estudio sobre la marcha de la reacción, se fijan unas condiciones determinadas oon objeto de poder realizar un estudio cuantitativo* 8 . 1. HjaURÁiJCáA UM W tí HJaCTIVOd.-

aleohol etílico cus se uti­

liza en todos los trabajos, se destila previamente para su purifica*- ' elón; luego se le transforma en aleohol absolutof siguiendo la téc­ nica de tfllts (B 4 y K 2 ) , que consiste en tratar el aleohol oon óxi­ do cáloioo a reflujo durante 14 horas, y a continuación, m a simple destilación* JQL reflujo se efeotáa en baño de maría y a la presión ordinaria9 tratando 0 &ga* de @e alón, para que fucru del contacto atmoférlco no eufra posterioras hidrataolonen, y con ello alteraciones en loe resudados. ¿1 furfural, al llegar al laboratorio se encentraba de oolor ro­ jo debido a su polimerización; para purificarlo se le trata durante 30* a reflujo con carbón en polvo, y a continuación ee le destila on baño de aceite. ¿>o&de lo primera a la d?tima, todas las gotas del destilado resultan completamente incoloras. tteclén efectuada la des­ tilación, se pesa la cantidad obtenida y ac disuelve en aloohol. Se­ ta solución, después de transcurríden muchos meaes sigue incolora, cono es de esperar, estando el furfural purificado eegdn describen Üdraansky y Buell (V 1) (B 10}. La vitamina

utilizada, ee recrlrtallza en acetona consiguién­

dose cristales blancos de punto de fusión 1£8¿»118,$* 6. Realizada su disolución alcohólica, re preserve también de la acción de la luz y del oxígeno encerrándole en frasco topacio y en sitio fresco; de este modo, durante todo el tiempo que dura la investigación, per-

**/

nsittt incalerá* &

ielde eulfdrlee empleada 9 de dtntlAad lt039 y eenpletamate

inodUn#

2* 2* 80LTJCX0NES PHXPAHAPA3.- Xa solueidn CtaaiUee da Tita*!** ee prepara efectuando primeramente una salud Sn M d r t da 0*01 gre* da vitamina an 100 ee* da ctanel| parte da apta eolucifa ai** va da tena para foxmar atrae dea marea solucionas, da concentra*» doñee 0fl y 09&

reapeete da la primara*

Xa eoneantradln da la aaluelAa furfuríllea eea gue aa apara ea da 1 gr* da furfural en 100 e#e* de alcohol etílica* la aaluelAa eulfArica aa la raaultanta da dieolrer (con lenta •glttdfet para na preduelr ebulllelenea alaohdlioaa) 100 ce* da í d d o sulfdrice an 290 ee* da alcohol* 2*3* MATRACB3f PIPETAS JT SOPOTTE*- Para raallsar la rcacciín.

aa utilizan siempre unos natraoitoe Aa fondo plano de 80 aa» da aa* pao idad y 4 n a * da $

$ ;y cuello, de 8 aa* da longitud y 1,0 an* Aa

, lo eual permite efectuar la agitación an mejoras condiciones

que en las que se hubiera enerado utilizando tubos da ensayos cuello de loa matraces as suficientemente largo para evitar proyacr

clones* l4is pipetas utilizadas, debidamente contrastadas, son siempre las mismas; una de 8,8 ce* para medir la solueidn vitamínica, otra da 0,8 ce* para cfóadir la solueidn furfuráliea, otra de 8 es* para agre gar

alcohol,

otra da 1 se* para el ácido salfdriec y otra de 5 so*

para la disolución sulfúrica* e restituye al centro oon el mando A» Ahora, cambiendo la cubeta patrón por la que conten­ ga la solución que se vaya a medir, ésta, mes coloreada que la ante­ rior, hará que vuelva a girar h ad a la derecha la fleoha indicadora del circuito W* 8e restituye al centro con el mando A t y cuando en ¿1 se halle, se lee el número que esté indicado en la ranura **F

C U A D R O

VII

(oont limación)

Jfetudio de Xa rarlaolón en el tiempo Vit .Dg

Minutos

Densidades óptloas

Densidades óptloas

transcurridos

Sb8erradas

80

15

315,7

318,2

30

30

333,5

330,5

30

£5

347

342,8

30

30

352

855,0

40

5

343

346,5

40

10

356,5

361,5

40

15

372

376,3

40

30

394

390,8

40

25

399,5

405,5

40

30

4X9

420

calculadas

m el sentido do ir teniendo mono* inclioselfo, aunqueesda vef sea menor el glrq efectuado* Lee experlenoles descritas en este capítulo descubren loe medí» fiaecionee que cofre le corvo de calibrado *1 corlar loe factores lea la Influencian* Con ello ae han ampliado loa conooiaientoe ao» \• --r * i bre la reeoelSa, se ha expuesto una Infinidad de curva* de calibre* do/ y se ha visto como influyen, y de que modo toa distinto, las versos reactivos que intervienen en la reaoal*¿nt por tanto d

na

poderse condensar en una fórmala matemática tant% variables indopendientes, y querer expresar la exactitud del mátodo prepuesto, se deben con «id erar esas causas de error junto a las restantes de» bldas a los aparatos y al observador* Se observa en las determinad o n e s ya citadas en los diversos cuadres, sino el «rrer absoluto va en aumento en razón directa con la densidad óptica que s a l e e en el colorímetro, pero que no varía por esta causa el error re—

letié**

«•

tanto, este eeri e l e r r e r que se produsea el

de ana sola

ninaoión* ahozm bien, *1 en vea de realisar solamente ana eia* ae efectúan varias e n l a a minias producen cea la mlapm intensidad errores el error habrá desaparecido prácticamente,

debido a

í/

5* Aplicación A« la reacción a la determinación cuantitativa da la vitamina B aa aceites» 5« 1# YITAftUHAS Dg Y D3 AISLADAS*« Se ha estudiado hasta ahora la forma da verificar la reacción andítioa da la vitamina %

cuando ésta

se encuentra en solución etanóliea. es considera ahora al caso de que se halla en una solución aceitosa de un preparado medicinal» %

astas

condiciones la acompañan esterinas y otras substancias que también producen color con los reactivos empleados (M 3); por ello as necesa­ ria la saponificación y librar da esterinas el insaponlflcable» Se efectúa la saponificación (con la técnica de Santos % i s y Có­ rrela £alha«S-8«») a una solución oleosa de vitamina bg e Independien­ temente a otra solución oleosa de vitamina %

y se separan las esteri­

nas por el método de la digitonina (después de ensayar los dos méto­ dos descritos en la parte teórica se emplea w¡k del digltónido, por

su mayor rápidos puesto que, oonooiendo la cantidad da eatarinaa preaentes an el aoalta (B e )9 se pueda realisar su extracción satisfaotoriamente an una sola operaolón)» da disuelve al residuo en aleohol absoluto y ae verifica la reacción da nodo normal comprobándose que* 1*.- Una cantidad determinada de vitamina %

disuelta en aleohol

produce la misma densidad óptica que otra cantidad igual de vitamina disuelta en aceita y tratada an la forma descrita, £*•• Cantidades equlraoleoulares da vitamina ¿ftgy vitamina %

ori­

ginaa igual ndmero aa al colorímetro. 5, £• CON VITAMINA A ST A0XITJ5S ANXMAXJSS.- Al estudiar los resulta dos colorimátrlcos obtenidos con mezolas da vitamina A y vitamina ^5 en unos preparados que contienen distintas cantidades Colativas da estas dos substancias (cuyo material da origen ha sido previamente sa ponifieado y excluido de esterinas) sa observa que, a medida que la relación vitamina A / %

sa va haciendo mayorf para una cierta oantl-

« dad tija da vitamina %

presarte, Xas densidades óptloas tan experi­

mentando un oierto aumento* Matonees sa pausó que, si an cualquier concentración relativa, distintas cantidades presentes seguían le Ley da Bear, sus curvas da calibrado podrían resolver al problema da la determinación de la vitamina P sin necesidad da separarla de la vita­ mina

K

Para ratificar esta supuesto, prepárense una serle de solu­

ciones en las cuales varían las cantidades relativas da vitamina A y Dg gradualmmnte* Las concentraciones relativas da estas solucionas son defiO,

15,

da vitamina A

10,

7,5,

5,

8,5,

1,85,

por 1 0. I. de vitamina

1,

0,75,

0,50

en todas ellas*

y 0,85 Ü.I.

*ti cada

una

de estas soluoiones se realizan una serie da ensayos con objeto de determinar sus curvas de calibra ja, y se comprueba que efectivamente todas cumplen la Ley da Bear, y que la variación da las inclinaciones te estas curvas va siendo menor a medida que la reiáeión vitamina a /B

se Laca mayor* Los resultados obtenidos están representados en

el cuadro VIII y en la figura 13 ( en órdenadas O. I. de vitamina

o u ▲

0

* e

m i

fe«ayos re a liz a d o s en m asólas de T ita n ia s

«.I. da A ante 1 O.I. da 0

0B

A

15 «• B

eon T ita n ia s A

da 100 daoaldadas dptieaa aa oorraaponda ooa a 0.1. da a 0.1. da A

Ae a

OaÁds 75 U.X. de A < > a las dena,dpt. sigo

Ü6

o,om

9,00

•9,4

83,1

108

19

0,0049

9,79

99,0

19,8

184

10

0,109

4,90

49,0

14,0

178,8

v,e

0,117

4,40

58,8

11,?

813

s

0,147

9,00

£9,5

9,84

894

0.S49

0,98

84,9

8,31

900 f5

8?9

1

a is *

w C U A D R O

TIU

(eoatlnuaeldn)

Jdtsayos realizados an aazalaa da vitamina %

U.I. da A anta 1 U,Z* da »

ln¿

y da

oon vitamina

da 100 densidades éptieas sa eorrespoade ooa a;

B 8*1* da * U.I. de A Y de A

a

OnA da 75 U.I, da A < > a las deas. 6pt. »ig«

0~ .-.... -.1,85

0,4*1

18,04

28,5

7,81

338,5

1

0,847

81,9

21,9

7,30

341

0,7*

0,713

. fe»*

21,5

7,13

590,5

0,90

1,01

40,7

80,3

6,79

848

0,2*

1,75

70,0

17,5

5,84

428

0

10,9

748

0

0

y «n abolsas densidades óptloas frente al < . agua}»*e ella se ha ob­ tenido la curra de la figura 14 (en ordenadas número de U # I* de Titamina a por 1 U, X« de rltaolna b, y an abciáas número de U. I. de vi­ tamina ® que comprende una variación da 100 números del colorímetro)* La curva de la figura 15 (en ordenadas número de O. X* de vitamina A por 1 0 * X* de vitamina o, y en aheleas incremento con que responde el colorímetro, en una solución cualquiera, a un incremento absoluto de 75 U. X* de vitamina A) deducida de las figuras 15 y 14 resuelve el problema de la determinación de la vitamina O cuando ésta se en­ cuentra junto a la vitamina K

ai procedimiento seguido para dicha

determinación es al siguiente* 1"»- Una vez saponificad* 7 separadas las esterinas del aceite de que se parta, se forma con la mazóla de vitamina A 7 1, una solución alcohólica de volumen Y; an una ciarte fracción de f se analiza cuan­ titativamente la vitamina A presente en ella por medio de la reamelón de Oarr 7 Prloe, utilizando el fotómetro de Pulfrleh, 7 expresando

•1 resultado en U* X» segdn Xas equivalencias encontradas por Bitsert y &ults (D 7, H B y Y ©)• E**- In una cierta fracción V a aa practica Xa raaoaldn estudiada ea este trabajet y se Xee ea eX oelofotómetro el resultado* *e realisa Xa misma operaeldn eoa 8V a ,

Sf/at ó V n * •.. hasta obtener la cur­

va de eallbrado (normalmente son sufleientes d ensayos para tener Xa seguridad de haber conseguido, oon sus resultados, Xa reota de cali­ brado)* 3*,- Obtenida Xa curra de calibrado, se determina en ella el in­ cremento de densidades ópticas que corresponde a un incremento de 73 O* X* de vit&*nina a* de lleva este valor a la curva de la figura 15, y la ordenada de ese punto espresa la relación V & , obteniéndose inmediatamente, puesto que ya se ha determinado previamente la canti­ dad absoluta de vitamina A presente en tamina 9 en

la cantidad absoluta de vi­

n *, *. < m

a m t m m

m

Aaiasm

ymkalbs.-

a*

trata una solución

alcohólica da q caroteno da punto da fusión 184»8* V¿ con furrural y ácido sulfúrico an condiciones normales9 y se comprueba que, al igaal que la vitamina 8 y la vitamina a, al

caroctano produce las mismas

coloraciones» violada an pequeña cantidad y azulada an mayor. *1 mis­ mo tiempo sa fija su curra da calibrado que sigua la ¿»ey da Bear. % v; vista da alio sa realizan da modo análogo al efectuado an las mezclas da vitaminas A y % , una serla da coludo*** alcohólicas an las que varían las concentraciones relativas da (3

caroteno y vitamina

para tratar da hallar alguna relación entra ellas» como suceda an al caso da las dos vitaminas. #e consideran las curvas da calibrado da las siguientes soluciones* 1 U* I. da vitamina % 0,75»

0*60»

0,45,

0,S0>9ft,18,

por 18»

6,

3»

1,5,

0,045* y 0 ,018Yde (3. caroteno. %tas

solucionas, teniendo ea cuanta la acción biológica del a . caroteno, sa corresponda con los siguientes valores da vitamina A en w, I. 1 80, 10,

5,

8,5,

1,85,

1,00,

0,75,

0,80,,0,80,

0,075 y 0 ,030# % t o s

último» valorea «oa ios que a» «tnoiomn en lo sucesiva# tbdaa laa soluciones expresadas aa comportan da acuerde eon la ley da Bear, laa tangentes da sao curvas da calibrado, Tan sufriendo menor variación a andida que ra cimentando la relación ^ caroteno/lfc* Astea tangentea Tienen dibujadas en la figura 16 (an ordenadas í da Titanias djBft y en abolsas denaidadaa ópticas frente al agua)* data Yariaoidn pue­ de estudiarse aaa claramente en la figura 1? (en ordenadas santidad relativa da

^ caroteno-expresada en su equivalente da

mina A- an funoién da 1 8 * 1« da vitamina

X. da vita»

presante, y en abalase

densidades ópticas frente al agua)* #e comprueba claramente que astas curvas son del mismo tipo que laa obtenidas en las méselas de vltam!» na A y vitamina % • la curva da la figura 18» análoga a la da la figura 15, resuelve el problema de la determinación de la vitamina %

cuan­

do se halle mezclada con ^ caroteno* l*os resultados de los distin­ tos calibrajas» vienen Incluidos an el cuadro XX. 8o observa que» lo mismo se expresen los resultados de A

caroteno y vitamina A «b

#

a las daña ópt. ala, dPt0

90 fÜ

89t0 S8#7

0,80

x&fo

aso

«0,0

48#W

0,078

15t9

ese

07f7

8816

107

0,030

17t8

90S

81*0

18 f8

506

0

19 f8

788

0

0

« que «a Y # I# no coinciden «Hbac curvas# ¿SLlo «o debido a que ambos a cortos fiante* de Xa vitamina ®g. no producen la reaoción eon la miaña intensidad* ¿te aate trabajo ae obtiene la reeolueión del problema de la determinaeida de la vitamina ¿* aneado ae baila aeaelada eon ^ caroteno, y el procedimiento a

seguir ea el siguiente*

1**~ be saponifiea y ae separan esterinas* *e forma eon el residuo una solución alcohólica de oolumen Y, ae m i d a em una fracatén de Y la cantidad de ^ caroteno presante (d 1 y M 13), 8*»~ de determinan colorimétri sámente, mediante la técnica dada en el eapitnlo 3, diversas fracciones de Y, basta conseguir la recta de calibrado# 3*#» ¿te observa en dicha recta el incremento de densidad óptica que eorr*8T>ende a una cantidad de

caroteno equivalente a 73

de vi-

\

tamlna

a

(an actitidad biológica), be lleva este valor a la figura 18

y la ordenada de ese punto proporciona la relación j^ oaroteno/bfc, ob­

teniéndose inminentemente, puesto que ya se ha averiguado anterior­ mente la cantidad absoluta de t caroteno presente, la cantidad absoluta de vitamina

que existe en la solucidn.

6*

Lamport amianto dt la m e c i d a

•on substancias esteroídleas análogas. ¿e preparan soluciones alcohólicas de las siguientes substancias* ¿rgosterina (b) de punto de fusión 16fc* °*t p

*¿tosterlaa (c) de

punto de fusión l4M°C.f colesterina Id) de punto se fusión 149,5* 0. f ácido eólioo te) de punto de fusión 193* G# y áoldo desoxixólloo (f) de punto de fusión 174,5* 0. Considérese que todas estas substañólas poseen un miaño ndoleo elolopontaaoperhldrofenantrénieo , aunque con distintas cadenas; y además, que sostienen un grupo oxhidrilo en 3 camón.(Hubiese sido de desear tratar asimismo substancias que ttnriesen bloqueado el grupo © H f pero estos ásteres son insolubles en aleo* holy y por tanto no se pueden maneja? en las oondloiones fijadas). He realizan unos cuantos ensayos oca onda subetañóla, ( seis por lo general), y se obtienen sus curras de oalibrade, comprobándose

Ergo/terLaa

V il amena

j

5 5

Acido cólico Aciéofksoxicdlico

Co_lz/Uriod°

%YWC M ‘ X

jd S ^

#

p /ilo j terina ®

14 C U A D R O

X

Estudio realizado son substancias esteroidieas análogas a la ?lt, Substancia

a áa densi~ sadea óptlsaa m una da 109*

daff aa & uná da 109 dansidadas ópticas a

dansidadas 6p1t* en un n*« da* igual a m paso molar/l¡00

fórmula

faao

aspiriea

mol*

W

390

860

19,8

89,59

Xrgoat#

W

394

301

32,8

11,91

^ Ütoat*

V

414

107,5

80,6

8,17

380

318

45,8

8,41

406

831

45,8

9,01

tratada

n*.

%

Colest»

**0

V W »

Asido oólioo / .«

Asido dase oxioóliso Üg4H4°U4

49S

03,7

157

8,49

nue las coloraciones obtenidas siguen le Ley de ®eér. Loe resultados están expresados en el cuadro X. Loe ensayos efectuados en todas estase substancias cuyas densidades ópticas frente al agua son menores, apro­ ximadamente, de 300, salea violáceos y con densidades mayores se van azulando» Los resultados del ouadro X vienen expresados gráficamente en la figura 19 ( en ordenadas número de veces que eotd contenida una cantidad de if igual al peso aoleeular/lOO de cada especie química con siderada, y en abcisas densidades ópticas frente al agua)»

a0#SXD*HA0igj«*8

X, %

CONSIDERACIONES SOBRE L08 RESULTADOS.

Xa parta experimental aa ha comprobado la importancia da la

téonloa propuesta, que permite -ya que sa ajusta a la Ley da Bear» re­ solver al problema da la valoración da la vitamina B, bien esté ais­ lada, o sa halle maselada con vitamita A o

caroteno* Creyendo ha­

ber estudiado experimentaimante la reacción desde los mas Interesantes puntos de vista, se exponen a continuación las deducciones que surgen al oonsiderar en detalla al protocolo de laboratorio» *1 primar dato obtenido sobre la substancia producto de la reacción investigada, se deriva de que al agitar conjuntamente la interfase asul con la fase alcohólica, sólo quedan unidas un corto tiempo, al cabo de al cual vuelvan a diferenciarse; ello manifiesta que al producto de la reacción es insoluble en alcohol etllioo, por lo que se pueda prosuponer que fiJi aglfavAa 02 22022 OtilSfe «runo OXhlirllO. EL heoho de que con tanta facilidad varíe el color del producto fl-

nal tarace indicar que, o bien laa substancias originadas m la reac­ ción son tan lábiles que una pequeña modificación da un abanta exter­ no es suficiente para hacerles cambiar» o bien exlatan en eetaa con­ diciones varios proaaaoa posibles, y segdn sean las cantidades o ac­ tividades da las substancian en presencia» asi sa originan unos u cifroa Uono al segundo supuesto es mas fácil da observar directamente, se efectúan ensayos en los que se varía únicamente la cantidad presente de sacarosa» la graduaclán de la tonalidad del color resultante» Jun­ to al color Illa obtenido en el ensayo sin vitamina» indica claramen­ te que la coloración obtenida -como se suponía- es una mésela del co­ lor produoido por la sacarosa con el ácido» y del color originado ñor la vitamina con dichas dos substancias; parees» pues, evidente que la segunda teoría es la verdadera, o sea» que el color total es una agre­ gación de otros colores, y como tal, suma variable según la magnitud de sus componentes. *1 hecho de que existe una correspondencia blunívooa

e identidad

101 catre la coloración final da la solución total y la ooloraelón predominante en la zona Interfásica, manifiesta que la substancia caucante de dichas coloraciones es la misma, y además, la mas intensamente ooloreada de todas las restantes, puesto que su oolor es el que predomina al fin. Consecuencia de que no se ooloree el anillo lnterfásieo cuando la adición

de

una gota de sulfúrico se realiza mucho tiempo después que

la anterior «a diferenola del modo normal en el que el goteo se rarifi­ ca rápidamente-, ai parecer, la única diferencia consiste en que e& el primer caso no llega a poseer,el tubo de ensayo,tanta temperatura enw*e# en el segundo(por existir en el primer método mas tiempo para efectuar­ se la irradicación del calor producido en la dilución sulfúrica) y por tanto se puede suponer:

isl Tgggglfa gsggglía. wm. sirria. igragjatJHa. para, m, gánenla, (energía de activación tan corriente en. las reacciones orgánioaa) 8*,* rmadas, d glucosa y d fructosa, encontrándose en me­ dio sulfúrico sufren posteriormente una deahldrataolón, produciendo metilf urfural *

GHQH — rtHfíu

OH —

m

debido a que tanto las monosas como el derivado furfurálico tienen

•catai el grupo

Bi—

se estudia el comportamiento de diversas

substancias que poseen esta característica, para lo que se opere en les mismas oondioiones en que se trató la sacarosa» o sea, se prepaven soluoiones etanólioas 0,005 M y se les añade la soluoldn de Titamina iíg y el Acido sulfúrico* ¿*e ensayan de este modo las siguientes substancias: Acetona» bensaldehido» benzofenona, fenantrenoquinona» furfural» glucosa, maltosa -aunque no contiene grupo 0 0 9 debe generad­ lo «n las condiciones expuestas igual que la sacarosa- 2metÍlnaftoS quinona 1-4» 8metil3oxinaftoquinona 1-4» ^ naftoquinona» paradlmetilaminobenzaldehido, paraquinona y Tainillina, o sea» las mss dispares subBtanoias con grupo

%

» aldehidos grasos y aromáticos,

oetonas grasas y aromáticas y qUinonaa; pues bien» los resultados ex­ puestos en el cuadro I no pueden ser mas concluyentes» las seis subs­ tancias aldehldlcas don reacción positiva, y las siete que no lo son, no* Reacciones en blanco -con los mismos reactivos menos la vitamina v

flg- originan color violáceo las de los azúcares y furfural» y anaran-

jado la* de los demás aldehidos tratados* ¿ate estos resultados posi­ tivos de la función aldehídica, y dado que esta fundón es esencial­ mente reductores se ensayan otros reductores^ tales como ácido oxálico 9 plrogalol, y sulfito sódico e hipofosfito sódico -preparando, como pa­ ra las anteriores substancias, disoluciones etanólioas 0 t005

ái

COOH - COQH, al igual que el Ha(S0gB) produce en la oapa áolda, el típico color rojo, y al agitar va efectuando las transformaciones co­ nocidas, rojo -% violeta -ti lila 000

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C U R V A S De VARIACION DElFORFUfrAl

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