Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula [6 ed.] 9788582714232

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Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6ª edição CAPÍTULO 1 1-1 Falso. Os conjuntos de genes de hemoglobina humana se originaram durante a evolução por duplicação de um antigo gene ancestral de globina; assim, eles são exemplos de genes parálogos. O gene da hemoglobina a humana é ortólogo ao gene da hemoglobina a do chimpanzé, assim como são os genes da hemoglobina b de humanos e chimpanzés, e assim por diante. Todos os genes das globinas, incluindo o gene da mioglobina, mais distantemente relacionado, são homólogos um ao outro. 1-2 Verdadeiro. Em organismos unicelulares, o genoma é a linhagem germinativa, e qualquer modificação é passada adiante para a próxima geração. Em organismos multicelulares, a maioria das células é de células somáticas e não contribuem para a próxima geração; assim, a modificação dessas células por transferência horizontal de genes não terá consequências para a próxima geração. As células germinativas geralmente estão concentradas no interior dos organismos multicelulares, minimizando seu contato com células de outros organismos, vírus e DNA, isolando, dessa forma, a espécie dos efeitos da transferência horizontal de genes. 1-3 Verdadeiro. Os genomas bacterianos parecem ter sido reduzidos à sua essência: a maioria das sequências de DNA codifica proteínas, algumas codificam RNAs funcionais, uma pequena quantidade de DNA é destinada à regulação da expressão gênica, e há poucas sequências desconhecidas e não funcionais. Em contraste, acredita-se que apenas cerca de 1,5% das sequências de DNA do genoma humano codifique proteínas. Mesmo considerando uma grande quantidade de DNA regulador, muito do genoma humano é composto por DNA sem função aparente. 1-4 Superficialmente, a extraordinária resistência do código genético a mutações demonstra que ele foi sujeito a forças de seleção natural. Um pressuposto implícito, que parece razoável, é que a resistência à mutação seja uma característica valiosa do código genético, que permitiria aos organismos manter informações suficientes para especificar fenótipos complexos. Esse raciocínio sugere que teria, de fato, sido um acidente de sorte – cerca de 1 chance em 1 milhão – desenvolver um código à prova de erros como o nosso. Mas não é tudo tão simples. Se a resistência à mutação for uma condição essencial de qualquer código que possa suportar a complexidade de organismos como os humanos, então os únicos códigos que nós poderíamos observar seriam os que são resistentes a erros. Uma pressão seletiva menos favorável, dando origem a um código mais propenso ao erro, poderia limitar a complexidade da vida a organismos que nunca seriam capazes de contemplar seu código genético. Isso está relacionado ao princípio antrópico de cosmologia: muitos universos podem ser possíveis, mas poucos são compatíveis com a vida que pode ponderar a natureza do universo. Além dessas considerações, há ampla evidência de que o código não é estático, e assim pode responder às forças da seleção natural. Versões alternativas do código genético padrão foram identificadas nos genomas mitocondrial e nuclear

2   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. de muitos organismos. Em cada caso, um ou alguns códons adquiriram um novo significado. Referência: Freeland SJ & Hurst LD (1998) The genetic code is one in a million. J. Mol. Evol. 47, 238–248. 1-5 Há várias abordagens que você pode tentar.

1. A análise dos aminoácidos nas proteínas indicaria se o conjunto de aminoácidos presente nos seus organismos difere do conjunto presente nos organismos da Terra. Porém, mesmo os organismos terráqueos possuem mais aminoácidos que o conjunto-padrão de 20; por exemplo, hidroxiprolina, fosfosserina e fosfotirosina resultam, todas, de modificações realizadas depois que uma proteína foi sintetizada. A ausência de um ou mais aminoácidos do conjunto comum seria um resultado mais significativo.



2. Sequenciar o DNA do organismo oriundo de Europa permitiria uma comparação direta com o banco de dados das sequências que já são conhecidas para os organismos da Terra. Identificações a partir do banco de dados poderiam sugerir contaminação. A falta de identificações poderia constituir um argumento menos forte para um organismo novo; é uma observação comum que cerca de 15 a 20% dos genes identificados nas sequências completas de genomas de microrganismos não parecem ser homólogas aos genes no banco de dados. Uma comparação suficientemente extensiva da sequência deve resolver a questão.



3. Outra abordagem poderia ser analisar o código genético do organismo. Nós não temos razões para esperar que um novo organismo baseado em DNA, RNA e proteína tenha um código genético idêntico ao código genético universal da Terra.

1-6 Seja de luz solar ou de compostos químicos inorgânicos, “alimentar-se” significa “obter energia livre e unidades fundamentais”. No caso da fotossíntese, os fótons da luz solar são usados para elevar elétrons de determinadas moléculas a um estado instável de maior energia. Quando eles retornam ao seu estado normal, o basal, a energia liberada é capturada por mecanismos que a usam para promover a síntese de ATP. De modo semelhante, os organismos litotróficos em uma fenda hidrotermal obtêm energia livre pela oxidação de um ou mais dos componentes reduzidos da fenda (p. ex., H2S → S 1 2 H1), usando algumas moléculas comuns no ambiente para aceitar elétrons (p. ex., 2 H1 1 ½ O2 → H2O). Os organismos litotróficos coletam a energia liberada nessas reações de oxidação-redução (transferência de elétrons) para promover a síntese de ATP. Para ambos os organismos, litotróficos e fototróficos, a chave do sucesso é a evolução de um mecanismo molecular que captura a energia livre e acopla à sua síntese de ATP. Para todos os organismos, sejam eles fototróficos, organotróficos ou litotróficos, sua habilidade de obter a energia livre necessária para suportar a vida depende da exploração da condição de algum desequilíbrio. Os fototróficos dependem do fluxo contínuo de radiação solar; os organotróficos dependem de um suprimento de moléculas orgânicas, fornecidas, em última análise, pelos fototróficos, que podem ser oxidadas por energia; e os litotróficos dependem de um suprimento de moléculas inorgânicas reduzidas, fornecidas, por exemplo, por fendas hidrotermais, que podem ser oxidadas para produzir energia. 1-7 Quatro (Figura R1-1). Todos poderiam ter se separado do ancestral comum ao mesmo tempo. As bactérias e arqueias poderiam ter se separado dos eucariotos, A

Figura R1-1  As quatro possíveis relações para a evolução de arqueias (A), bactérias (B) e eucariotos (E).

B

E

A

B

E

A

B

E

B

A

E

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   3 seguido pela separação das bactérias das arqueias. Bactérias e eucariotos poderiam ter se separado das arqueias, seguido da separação das bactérias dos eucariotos. Arqueias e eucariotos poderiam ter se separado das bactérias, seguido pela separação das arqueias dos eucariotos. Embora a transferência horizontal através dessas divisões torne as interpretações problemáticas, acredita-se que primeiramente as arqueias e os eucariotos se separaram das bactérias e, então, as arqueias e os eucariotos se separaram. 1-8 É pouco provável que qualquer gene tenha se originado perfeitamente otimizado para sua função. Acredita-se que os genes altamente conservados, como os genes para RNA ribossômico, foram otimizados por mudança evolutiva rápida durante a evolução do ancestral comum a arqueias, bactérias e eucariotos. Já que os RNAs ribossômicos (e os produtos dos genes mais altamente conservados) participam de processos fundamentais que foram otimizados cedo, não houve pressão evolutiva (e pouca margem) para mudança. Por outro lado, os genes menos conservados – que evoluem mais rápido – têm sido continuamente apresentados com oportunidades de preencher novos nichos funcionais. Considere, por exemplo, a evolução de diferentes genes de globina, cujos produtos são otimizados para fornecer oxigênio para embriões, fetos e tecidos adultos nas placentas dos mamíferos. 1-9 A complexidade é uma explicação lógica para a diferença nas taxas de transferência horizontal de genes (e pode até ser a explicação correta, embora haja outras possibilidades). A transferência com sucesso de um gene contendo “informações” necessitaria que o produto do novo gene se tornasse parte de um complexo funcional preexistente, talvez suplantando a proteína original correspondente. Para que uma nova proteína se torne parte de um complexo com outras proteínas, ela precisaria ter superfícies de ligação que permitissem que ela interagisse com as proteínas certas na geometria apropriada. Se uma proteína nova tiver uma boa superfície de ligação, mas não outras, ela provavelmente romperia o complexo e colocaria o receptor do gene em uma desvantagem seletiva. Por outro lado, um produto de gene que corresponde a uma reação metabólica em si, seria capaz de funcionar em qualquer organismo. Desde que a reação metabólica confira alguma vantagem ao receptor (ou pelo menos nenhuma desvantagem), a transferência gênica poderia ser acomodada. Referência: Jain R, Rivera MC & Lake JA (1999) Horizontal gene transfer among genomes: The complexity hypothesis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 3801–3806. 1-10 Como a maioria das questões sobre as relações evolutivas, essa foi decidida comparando-se as sequências de genes como os de RNA ribossômico. Essas comparações mostraram que os fungos são mais parecidos com animais em relação à sequência gênica do que com plantas, e que provavelmente se separaram da linhagem animal-planta depois que as plantas se separaram dos animais. Assim, considera-se que os fungos nunca tiveram cloroplastos, e considera-se que fungos e plantas desenvolveram as paredes celulares independentemente, como é sugerido pelo uso de celulose nas paredes celulares de plantas e quitina nas paredes celulares fúngicas. 1-11 A. Os dados da árvore filogenética (ver Figura Q1-2) refutam a hipótese de que os genes da hemoglobina de planta originaram-se por transferência horizontal. Observando partes mais familiares da árvore, nota-se que os vertebrados (peixes a humanos) se agrupam como um conjunto de espécies muito relacionadas. E, ainda, as relações mostradas na árvore são compatíveis com a ordem de ramificação que conhecemos das relações evolutivas entre essas espécies: peixes se separaram antes dos anfíbios, répteis antes dos pássaros, e mamíferos por último, em um grupo muito coeso. As plantas também formam um grupo distinto que apresenta

4   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. relações evolutivas consideradas corretas, que a cevada, uma monocotiledônea, divergiu antes do feijão, alfafa e lótus, que são todas dicotiledôneas (e legumes). As sequências das hemoglobinas de plantas parecem ter divergido há bastante tempo ao longo do processo seletivo, no momento, ou até antes, que os moluscos, insetos e nematódeos se originaram. As relações na árvore filogenética indicam que os genes da hemoglobina se originaram por descendência a partir de um ancestral comum.

B. Se os genes da hemoglobina da planta tivessem se originado por transferência horizontal de um parasita nematódeo, então as sequências da planta teriam se agrupado com as sequências de nematódeo na árvore filogenética da Figura Q1-2.

1-12 Três hipóteses gerais foram propostas para explicar as diferenças nas taxas evolutivas em linhagens diferentes. As hipóteses individuais discutidas a seguir não são mutuamente exclusivas e podem todas contribuir de alguma forma. A hipótese de tempo de geração propõe que as diferenças nas taxas são consequência de diferentes tempos de geração. Espécies como o rato, com tempos de geração curtos, passarão por mais gerações e mais ciclos de divisão de células germinativas, e, consequentemente, mais ciclos de replicação de DNA. Essa hipótese assume que erros durante a replicação do DNA sejam a maior fonte das mutações. Os testes dessa hipótese em ratos versus humanos tendem a corroborar sua validade. A hipótese da taxa metabólica postula uma taxa de evolução mais alta para espécies com taxa metabólica mais alta. As espécies com taxas metabólicas mais altas usam mais oxigênio; assim, elas geram mais radicais livres de oxigênio, principal fonte de dano ao DNA. Isso é especialmente relevante para os genomas mitocondriais, pois as mitocôndrias são o principal espaço celular para a utilização do oxigênio e produção de radicais livres. A hipótese da eficiência de reparo propõe que a eficiência no reparo de dano no DNA teria uma pequena fração de eventos de dano que levariam à mutação. Há evidência em células cultivadas humanas e de rato de que tais diferenças no reparo existem, na direção esperada, mas não é claro se tais diferenças existem nas células de linhagem germinativa desses organismos. Referência: Li WH (1997) Molecular Evolution, pp. 228–230. Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc.

CAPÍTULO 2 2-1 Falso. O pH da solução será muito próximo do neutro, essencialmente pH 7, por1 1 que a contribuição de poucos íons H pelo HCl será suplantada pelos íons H da dissociação da água. Não importa o quanto um ácido forte seja diluído, ele nunca poderá originar uma solução básica. Na realidade, cálculos levando em conside1 ração tanto a fonte de íons H quanto os efeitos da dissociação da água resultam 28 em um pH de 6,98 para uma solução 10 M de HCl. 2-2 Falso. Muitas das funções que as macromoléculas realizam baseiam-se nas suas capacidades de se associarem e dissociarem facilmente, o que não seria possível se elas estivessem ligadas por ligações covalentes. Ao associarem as suas macromoléculas de maneira não covalente, as células podem, por exemplo, remodelar seus interiores rapidamente quando elas se movem ou se dividem e transportar com facilidade componentes de uma organela para outra. Deve ser ressaltado que algumas macromoléculas são ligadas por ligações covalentes. Isso ocorre primariamente em situações nas quais é necessário uma estabilidade estrutural extrema, como, por exemplo, na parede celular de muitas bactérias, fungos e plantas, e na matriz extracelular que proporciona o suporte estrutural para diversas células animais.


Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   5 2-3 Verdadeiro. A diferença entre animais e plantas está na maneira como eles obtêm suas moléculas de alimento. Enquanto os animais devem procurar sua comida, as plantas produzem seus próprios alimentos utilizando a energia do sol combinada a CO2 e H2O. 2-4 Verdadeiro. Reações de oxidação-redução são aquelas nas quais há remoção de elétrons de um átomo e sua transferência para outro átomo. Em uma reação química, desde que o número de elétrons se conserve (nem ganho ou perda), a oxidação – remoção de elétrons – deve ser acompanhada de redução – adição de elétrons. 2-5 Falso. A constante de equilíbrio da reação A 3 4 B permanece inalterada; ela é constante. O acoplamento de reações pode converter uma reação desfavorável em uma reação favorável, no entanto isso é feito sem alterar a constante de equilíbrio, mas mudando a relação entre as concentrações de produtos e reagentes. 2-6 Verdadeiro. Uma reação com ∆G° negativo, por exemplo, não ocorrerá espontaneamente sob condições nas quais há um excesso de produtos em relação às concentrações presentes no equilíbrio. De outro modo, uma reação com ∆G° positivo ocorreria espontaneamente em condições em que há um excesso de substrato em relação às concentrações presentes no equilíbrio. 2-7 Falso. Os átomos que fazem parte do CO2 não se originam dos átomos de oxigênio que são consumidos como parte da oxidação da glicose (ou de qualquer outra molécula de alimento). Os elétrons que são tomados da glicose nos vários estágios de sua oxidação são finalmente transferidos para o oxigênio, produzindo água, durante a fosforilação oxidativa. Dessa maneira, o oxigênio usado durante a oxidação dos alimentos termina como átomos de oxigênio da água. Isso pode ser visto diretamente incubando-se células vivas em uma atmosfera que contenha oxigênio molecular enriquecido no isótopo 18O, substituindo o isótopo de ocorrência mais comum 16O. Em experimentos como esse, observa-se que todas as moléculas de CO2 liberadas pelas células contêm apenas 16O. Portanto os átomos de oxigênio da moléculas de CO2 que são liberadas não vêm diretamente da atmosfera, mas, sim, das próprias moléculas orgânicas e da H2O. 2-8 A química orgânica realizada em laboratório, mesmo a melhor, raramente é conduzida em ambiente aquoso devido à baixa solubilidade de alguns componentes e porque a água é reativa e geralmente compete com a reação que se quer fazer. A diferença mais dramática, entretanto, é a complexidade. É crucial que, em um laboratório de química orgânica, sejam utilizados componentes puros para assegurar um alto rendimento do produto desejado. Em contrapartida, as células vivas executam milhares de reações diferentes ao mesmo tempo com bons rendimentos e praticamente sem haver interferência de uma reação na outra. A chave, claramente, é que as células utilizam enzimas como catalisadores e elas ligam as moléculas de substrato em seus sítios ativos, onde ficam isoladas do resto do ambiente. Ali, a reatividade dos átomos individuais é manipulada para estimular a reação correta. É essa capacidade que as enzimas têm de fornecer esse ambiente especial – câmaras de reação em miniatura – que possibilita às células executarem um enorme número de reações simultaneamente sem que uma interfira na outra. 2-9

A. A concentração de etanol na cerveja com 5% de álcool é 0,86 M. O etanol puro tem 17,2 M ([789 g/L] × [mol/ 46 g]) e, então, uma cerveja com 5% deveria ter 0,86 M de etanol (17,2 M × 0,05).



B. Com um limite legal de 80 mg/100 mL, o etanol no sangue deve estar a 17,4 mM ([80 mg/0,1 L] × [mmol/46 mg]).

6   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. O –O

O–

P O

Hidroxila HO

C

O

C

H

CH 2 O –O

O

1,3-bisfosfoglicerato

O – Carboxilato C C

O Carbonila

CH 3 Piruvato

SH

Sulfidrila

CH 2 CH Amino NH 3 +

O C

C. Para chegar ao limite legal (17,4 mM), o etanol da cerveja 5% (0,86 M) deve ser diluído 49,4 vezes (860 mM/17,4 mM). Essa diluição representa 809 mL em 40 L de água corporal (40 L/49,4). Com 355 mL por lata de cerveja isso é igual à 2,3 cervejas (809 mL/355 mL).



D. Levaria quase 4 horas. No dobro do limite legal, a pessoa poderia ter 64 g de etanol ([0,16 g/0,1 L] × 40 L). A pessoa pode metabolizar 8,4 g/hora ([0,12 g/h/kg] × [70 kg]). Portanto, para metabolizar 32 g de etanol (a quantidade que está além do limite legal) seriam necessárias 3,8 horas ([32 g] × [h/8,4 g]).

Fosforila

O–

O

Ácido carboxílico-fosfórico anidrido

2-10 Supondo que a mudança na atividade da enzima seja devido à modificação no estado de protonação da histidina, a enzima deve necessitar que a histidina esteja protonada, estado carregado. A enzima é ativa apenas abaixo do pK da histidina (que, nas proteínas, é normalmente em torno de 6,5 a 7,0), onde se espera que a histidina esteja protonada. 2-11 Os grupos funcionais dessas três moléculas estão indicados e denominados na Figura R2-1. 2-12 As velocidades instantâneas são: H2O = 3,8 × 104 cm/s, glicose = 1,2 × 104 cm/s e mioglobina = 1,3 × 103 cm/s. O cálculo para uma molécula de água, com uma massa de 3 × 10-23 g ([18 g/mol] × [mol/ 6 × 1023 moléculas]) está mostrado a seguir.

Carboxilato

O–

Cisteína

Figura R2-1  Grupos funcionais no 1,3-bisfosfoglicerato, piruvato e cisteína.

Quando esses números são convertidos em km/h, são muito impressionantes. A água move-se a 1.360 km/h, a glicose, a 428 km/h, e a mioglobina, a 47 km/h. Portanto, mesmo as maiores (e mais lentas) dessas moléculas movem-se mais rápido do que o mais rápido velocista humano. E a água move-se a 1,1 vez a velocidade do som! Essas moléculas, ao contrário de um velocista humano ou de um avião a jato, movem-se em linha reta de modo muito lento porque elas estão constantemente colidindo com outras moléculas da solução. Referência: Berg HC (1993) Random Walks in Biology, Expanded Edition, pp. 5–6. Princeton, NJ: Princeton University Press. 2-13 Parece ser contraintuitivo aceitar que a polimerização de subunidades de tubulina livre em microtúbulos que são altamente ordenados possa ocorrer com aumento final da entropia (diminuição da ordem). Mas isso só é contraintuitivo se as subunidades forem consideradas isoladamente. É importante lembrar que a termodinâmica se refere ao sistema como um todo, o que inclui as moléculas de água. As superfícies das subunidades da tubulina que se ligam umas com as outras é fracamente hidrofóbica e forçam (ordenam) as moléculas de água adjacentes. Com a polimerização, essas moléculas de água são liberadas para interagirem com outras moléculas de água. Essa desordem recém-formada excede muito o aumento de ordem nas subunidades da proteína e, portanto, o aumento líquido na entropia (desordem) favorece a polimerização. 2-14 A totalidade da população de moléculas de ATP no corpo humano tem uma reciclagem (turnover) de 1.800 vezes por dia ou um pouco mais do que 1 vez por minuto. A conversão de 3 mols de glicose em CO2 gera 90 mols de ATP ([3 mols de glicose] × [30 mols de ATP/mol de glicose]). O corpo inteiro contém 5 × 10–2 mol de ATP ([2 × 10–3 mol/L] × 25 L). Uma vez que a concentração de ATP não muda,

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   7 cada ATP deve reciclar 1.800 vezes por dia ([90 mols ATP/dia]/[5 × 10–2 mol de ATP]). 2-15 O corpo humano opera a cerca de 70 watts – mais ou menos o mesmo que uma lâmpada incandescente.

2-16 É necessário gastar 2.070 kJ para escalar de Zermatt para o topo do Matterhorn, uma distância vertical de 2.818 m. Substituindo na equação do trabalho

Isso é igual a 1,5 barra de cereal (2.070 kJ/1.360 kJ), de modo que se deve estar preparado para fazer uma parada na cabana Hörnli para comer mais uma barra. Na realidade, o corpo humano não converte energia química em trabalho externo com 100% de eficiência como foi considerado nessa resposta, mas com uma eficiência de cerca de 25%. Além disso, ainda deve se caminhar lateralmente conforme se sobe para o pico da montanha. Assim, seriam necessárias mais de seis barras de cereais para fazer o caminho. Referência: Frayn KN (1996) Metabolic Regulation: A Human Perspective, p. 179. London: Portland Press. 2-17 Na ausência de oxigênio, a energia necessária para as células deve ser suprida pela fermentação a lactato, o que requer uma alta velocidade da glicólise para gerar ATP suficiente. Quando é adicionado oxigênio, a célula pode gerar ATP pela fosforilação oxidativa, que gera ATP com maior eficiência que a glicólise. Portanto, é preciso menos glicose para suprir ATP com a mesma velocidade.

CAPÍTULO 3 3-1 Verdadeiro. Em uma folha β, as cadeias laterais dos aminoácidos em cada fita estão posicionadas em modo alternado acima e abaixo do plano da folha β, e os átomos de oxigênio da carbonila também apresentam posições alternadas. Assim, cada fita em uma folha β pode ser considerada como uma hélice, na qual cada aminoácido apresenta 180° de rotação em relação ao aminoácido anterior. 3-2 Falso. As regiões intrinsicamente desordenadas em proteínas geralmente apresentam sequências de aminoácidos com baixa hidrofobicidade e alta carga total. A baixa hidrofobicidade reduz o efeito da força hidrofóbica, que normalmente induz a proteína a uma conformação mais condensada e organizada. A alta carga total (seja positiva ou negativa) induz a repulsão de regiões da proteína de carga semelhante. Em contrapartida, uma sequência de aminoácido com alta hidrofobicidade e baixa carga total tenderia a colapsar em uma estrutura organizada. 3-3 Verdadeiro. Os grupos químicos dessas alças protuberantes podem frequentemente se localizar ao redor da molécula, permitindo que a proteína estabeleça diversas ligações fracas.

8   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. 3-4 Verdadeiro. Como uma enzima possui um número fixo de sítios ativos, a taxa de reação não pode ser aumentada uma vez que a concentração de substrato seja suficiente para se ligar a todos os sítios ativos. A saturação dos sítios de ligação induz o comportamento da enzima na saturação. 3-5 Falso. O número de turnover é constante, uma vez que o valor Vmáx é divido pela concentração de enzima. Por exemplo, um aumento de 2 vezes na concentração de enzima corresponderá a um aumento de 2 vezes na Vmáx, resultando no mesmo número de turnover: 2 Vmáx/2[E] = k3. 3-6 Verdadeiro. O termo cooperatividade considera a ideia de que alterações na conformação de uma subunidade são transmitidas às outras subunidades em uma estrutura multimérica, de modo que todas as subunidades apresentam a mesma conformação. Em geral, essas subunidades são idênticas; no entanto, na hemoglobina, por exemplo, existem quatro subunidades de dois tipos diferentes. 3-7 Verdadeiro. A cada ciclo de fosforilação-desfosforilação uma molécula de ATP é hidrolisada; no entanto, isso não é considerado desperdício no sentido de não ser benéfico. O ciclo constante permite que as proteínas reguladas mudem rapidamente de um estado para outro em resposta a estímulos que requerem ajustes rápidos do metabolismo celular ou de sua função. Essa é a essência da regulação efetiva. 3-8 Uma vez que existem 20 possíveis aminoácidos em cada posição de uma proteína composta por 300 aminoácidos, existem 20300 (o que corresponde a 10390) proteínas possíveis. A massa de uma cópia de cada proteína possível é

Portanto, a massa de proteína poderia exceder a massa observável do universo (1080 g), mais precisamente por um fator de 10290! 3-9 Em termos gerais, uma identidade de ao menos 30% é necessária. Identidades entre 20 e 30% são problemáticas e difíceis de distinguir do ruído de fundo. A pesquisa por sequências de relação distante utilizando sequências completas geralmente diminui a porcentagem de identidade a valores menores de 30% devido à grande quantidade de regiões não conservadas. Dessa forma, a pesquisa utilizando sequências menores e regiões conservadas de sequências tem maior probabilidade de identificar sequências de relação distante. 3-10 A justaposição das regiões N e C-terminal no domínio kelch o identifica como um domínio do tipo encaixe. Os domínios do tipo lineares apresentam suas regiões N e C-terminal em extremidades opostas do domínio. 3-11

A. Os dados são consistentes com a hipótese de que o comportamento de mola da titina se deve ao desenovelamento sequencial dos domínios Ig. Em primeiro lugar, o fragmento contém sete domínios Ig e existem sete picos no gráfico da força versus extensão. Além disso, os picos correspondem ao comportamento esperado durante o desenovelamento sequencial. Em segundo lugar, na presença de um desnaturante de proteínas, condição em que os domínios já estarão desnaturados, os picos desaparecem e a extensão por unidade de força aumenta. Em terceiro lugar, quando os domínios são submetidos às ligações cruzadas, e portanto incapazes de se desenovelar, os picos desaparecem e a extensão por unidade de força diminui.

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C N



B. O espaçamento entre os picos, de cerca de 25 nm, é quase exatamente o valor calculado para o desenovelamento sequencial dos domínios Ig. O domínio enovelado ocupa 4 nm, mas quando não enovelado, seus 89 aminoácidos apresentam cerca de 30 nm (89 × 0,34 nm), uma variação de 26 nm.



C. A ocorrência de picos individuais separados significa que cada domínio se desenovela quando uma força específica é aplicada, indicando que cada domínio possui estabilidade definida. O conjunto de domínios desenovela em ordem, do menos estável ao mais estável. Assim, é necessário aplicar mais força a cada etapa para desenovelar o próximo domínio.



D. O súbito colapso na força a cada evento de perda de estrutura é reflexo de um importante princípio do desenovelamento de proteínas, a cooperatividade. As proteínas tendem a se desenovelar de maneira “tudo ou nada”. Um pequeno número de ligações de hidrogênio é essencial para manter os domínios enovelados juntos (Figura R3-1). A perda dessas ligações desencadeia o desenovelamento cooperativo. Referência: Rief M, Gutel M, Oesterhelt F, Fernandez JM & Gaub HE (1997) Reversible folding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science 276, 1109–1112.

3-12

A. As concentrações relativas de proteína Src normal e mutante são inversamente proporcionais aos volumes em que estão distribuídas. A proteína mutante Src está distribuída no volume da célula, que é Vcélula = (4/3)πr3 = 4π(10 × 10–6 m)3/3 = 4,1888 × 10–15 m3 A proteína Src normal está confinada a uma camada de 4 nm de espessura localizada abaixo da membrana, com volume igual ao volume da célula menos o volume de uma esfera de raio 4 nm menor que o volume da célula:

Vcamada = Vcélula – 4π(r – 4 nm)3/3 = Vcélula – 4π[(10 × 10–6 m) – (4 × 10–9 m)]3/3 = (4,1888 × 10–15 m3) – (4,1838 × 10–15 m3) Vcamada = 0,0050 × 10–15 m3 Portanto, o volume da célula é 838 vezes maior que o volume da esfera de 4 nm de espessura abaixo da membrana (4,1888 × 10–15m3/0,0050 × 10–15m3). Mesmo considerando as regiões do interior da célula não permeáveis à proteína (núcleo e organelas), a proteína mutante Src ainda apresenta concentração de algumas ordens de magnitude menor da camada abaixo da membrana do que a proteína normal Src.

B. A razão pela qual a proteína mutante Src não induz a proliferação celular é a sua baixa concentração na região da membrana onde seu alvo X está presente. Essa condição pode ser quantificada considerando o equilíbrio de ligação entre Src e seu alvo:

Figura R3-1  Ligações de hidrogênio que mantêm um domínio na sua conformação enovelada. As ligações de hidrogênio indicadas (linhas verdes), quando rompidas, desencadeiam a perda da estrutura do domínio. Se você comparar este diagrama de topologia com a estrutura tridimensional da Figura Q3-2A, é possível identificar as duas folhas β curtas envolvidas na formação destas ligações de hidrogênio.

10   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. A concentração mais baixa da proteína mutante Src na região da membrana deslocará o equilíbrio na direção dos componentes livres, reduzindo a quantidade de complexo formado. Se a concentração for 100 vezes menor, a quantidade de complexo formado será reduzida 100 vezes. Essa grande diminuição de formação de complexos pode ser facilmente considerada responsável pela ausência de efeito da proteína mutante Src na proliferação celular. 3-13 O anticorpo se liga à segunda proteína com constante de equilíbrio, K, igual a 5 × 107 M–1. Uma maneira rápida de considerar questões desse tipo envolve a condição de que ΔG° está relacionado ao log K por um fator –2,3 RT, o que é igual a –5,9 kJ/ mol a 37 °C. Portanto, um aumento de 10 vezes na constante de equilíbrio (aumento do log K em 1 unidade) corresponde a uma diminuição de ΔG° igual a –5,9 kJ/mol. Um aumento de 100 vezes em K corresponde à diminuição de ΔG° igual a –11,9 kJ/mol, e assim sucessivamente. Para cada fator de 10 de aumento de K, ΔG° diminui –5,9 kJ/mol; para cada fator de 10 de diminuição de K, ΔG° aumenta 5,9 kJ/mol. Essa relação permite uma estimativa rápida da alteração da constante de equilíbrio a partir da alteração de energia livre, e vice-versa. Nesta questão, houve aumento de ΔG° igual a 11,9 kJ/mol (uma ligação mais fraca equivale a menos ΔG° negativo). De acordo com a relação matemática anteriormente citada, este aumento em ΔG° requer a diminuição de K por um fator igual a 100 (uma diminuição igual a duas unidades no valor log K); portanto a constante de equilíbrio para a ligação para a segunda proteína é igual a 5 × 107 M–1. A solução desta questão pode ser calculada determinando inicialmente a variação de energia livre representada pela ligação à primeira proteína: ΔG° = –2,3 RT log K Substituindo K,

ΔG° = –2,3 (8,3 × 10–3 kJ/K mol) (310 K) log (5 × 109) ΔG° = –5,92 kJ/mol × 9,7 ΔG° = –57,4 kJ/mol A variação de energia livre associada à ligação da segunda proteína é obtida pela adição de 11,9 kJ/mol à variação de energia livre para a ligação da primeira proteína, obtendo valor igual a –45,5 kJ/mol. Portanto, a constante de equilíbrio para a ligação da segunda proteína é

TABELA R3-1  Valores calculados para a fração de proteína ligada versus concentração de proteína

[Proteína]

Fração ligada (%)

Valor aproximado

104 Kd

99,99

99,99

103 Kd

99,9

99,9

2 10 Kd

99

99

1

10 Kd

91

90

Kd

50

50

–1 10 Kd

9,1

10

10–2 Kd

0,99

1

–3 10 Kd

0,099

0,1

–4 10 Kd

0,0099

0,01

log K = (–45,5 kJ/mol)/(–5,92 kJ/mol) = 7,7 K = 5 × 107 M–1 3-14 Os valores calculados para a fração de tmRNA ligado versus concentração de SmpB estão listados na Tabela R3-1. Também estão listados os valores aproximados, que são mais fáceis de lembrar. Uma vez que a fração ligada = [SmpB]/ ([SmpB] 1 Kd), substituindo os valores de Kd para [SmpB] se obtém os resultados. Por exemplo, quando [SmpB] = 102, a fração ligada é igual a 100/101 = 0,99. Essas relações são úteis não apenas quando consideramos Kd, mas também a cinética enzimática. A velocidade de reação expressa como fração da velocidade máxima é Velocidade/Vmáx = [S]/([S] 1 Km) que equivale à equação para a fração ligada. Portanto, por exemplo, quando a concentração de substrato, [S], é 10 vezes maior que a constante de Michaelis, Km, a velocidade equivale à 90% da velocidade máxima, Vmáx. Quando [S] é 100 vezes menor que Km, a velocidade é 1% de Vmáx.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   11 Essa relação também funciona para a fração de dissociação de grupos ácidos, HA, em função do valor de pH. Quando o pH está 2 unidades acima do valor de pK, 99% dos grupos ácidos estão ionizados. Quando o pH está 1 unidade abaixo do valor de pK, 10% dos grupos ácidos estão ionizados. 3-15 Quando [S] = 0, a velocidade é igual a 0/Km, sendo igual a zero. Quando [S] = Km, a razão de [S]/([S]1Km) é igual a ½ e a velocidade é igual a ½ Vmáx. Quando [S] é infinita, a razão [S]/([S]1Km) é igual a 1 e a velocidade é igual a Vmáx. 3-16

A. Espera-se que uma enzima composta inteiramente por imagens especulares dos aminoácidos se enovele em uma conformação estável que também equivale à imagem especular da enzima normal; ou seja, será como a enzima normal refletida em um espelho.



B. Espera-se que a enzima especular reconheça a imagem especular do substrato normal. Dessa forma, espera-se que a hexocinase “D” adicione um fosfato à l-glicose e ignore a d-glicose. Esse experimento foi realizado para a protease do HIV. A protease especular reconhece e cliva substratos especulares. Referência: Milton RC, Milton SC & Kent SB (1992) Total chemical synthesis of a D-enzyme: the enantiomers of HIV-1 protease show reciprocal chiral substrate specificity. Science 256, 1445–1448.

3-17 Essa questão simples precisou de décadas de pesquisa para que uma resposta completa e satisfatória fosse obtida. No nível mais simples, a hemoglobina se liga ao oxigênio de modo eficaz nos pulmões devido à alta concentração (pressão parcial) de oxigênio. Nos tecidos, a concentração de oxigênio é menor, pois é consumido de modo constante pelo metabolismo. Dessa forma, a hemoglobina tende a liberar (ligar menos) oxigênio nos tecidos. Essa tendência natural – efeito do equilíbrio de ligação – é exacerbada pelas interações alostéricas entre as quatro subunidades da molécula de hemoglobina. Como consequência, mais oxigênio é liberado nos tecidos do que seria esperado simplesmente pelo equilíbrio de ligação. 3-18 Uma hipótese razoável seria que o excesso de AMP inibe, por retroalimentação negativa, a enzima que converte E em F, e o excesso de GMP inibe, também por retroalimentação negativa, a etapa E para H. O intermediário E, que então seria acumulado, inibiria a etapa de conversão de R5P em A. Algumas vias ramificadas são controladas dessa forma. A síntese de nucleotídeos, porém, é regulada de modo ligeiramente diferente (Figura R3-2). AMP e GMP regulam a conversão de E em F e E em H, como descrito anteriormente, mas também regulam a etapa de conversão de R5P em A. A regulação por AMP e GMP nesta etapa parece problemática uma vez que sugere que um aumento na concentração de AMP, por exemplo, inibiria toda a via, mesmo na ausência de GMP. As células utilizam uma estratégia bastante inteligente para evitar este problema. Individualmente, o excesso de AMP ou de GMP inibe a enzima a 50% da sua atividade normal; juntos eles inibem a enzima completamente.

R5P

50% A 50%

100% B

C

D

F

G

AMP

H

I

GMP

E 100%

Figura R3-2  Padrão de inibição da via metabólica de síntese de nucleotídeos de purina.

12   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.

CAPÍTULO 4 4-1 Verdadeiro. O cariótipo humano é composto por 22 autossomos e dois cromossomos sexuais, X e Y. As mulheres possuem 22 autossomos e dois cromossomos X, um total de 23 cromossomos diferentes. Os homens também possuem 22 autossomos, mas possuem um cromossomo X e um Y, portanto um total de 24 cromossomos diferentes. 4-2 Verdadeiro. Todas as histonas do cerne são ricas em lisina e arginina, com cadeias laterais básicas – com carga positiva – que podem neutralizar a carga negativa da cadeia principal de DNA. 4-3 Falso. Usando a energia da hidrólise do ATP, os complexos de remodelagem da cromatina podem catalisar o movimento dos nucleossomos pelo DNA ou mesmo dissociar completamente um nucleossomo do DNA. 4-4 Verdadeiro. Humanos e camundongos divergiram a partir de um ancestral comum por um período suficientemente longo para alterar cerca de dois a cada três nucleotídeos através de mutações aleatórias. As regiões que foram conservadas são aquelas com importância funcional, em que as mutações com efeitos deletérios seriam eliminadas por seleção natural. As outras regiões não foram conservadas porque a seleção natural não pode atuar na eliminação de alterações em DNA não funcional. 4-5 Verdadeiro. A duplicação de segmentos cromossômicos, contendo um ou mais genes, permite que uma das duas cópias do gene possa divergir com o passar do tempo, adquirindo funções diferentes, porém relacionadas. Acredita-se que o processo de duplicação do gene e sua divergência tiveram uma importância fundamental na evolução da complexidade biológica. 4-6 Em todas as amostras de DNA de fita dupla, o número de As e Ts (portanto, suas porcentagens) é igual, pois eles sempre formam par entre si. O mesmo ocorre entre Gs e Cs. Um resultado como esse foi considerado estranho em uma época anterior à estrutura do DNA ser conhecida. Atualmente, está claro que, embora todo DNA celular seja composto por uma fita dupla, alguns vírus contêm DNA de fita simples. O DNA genômico do vírus M13, por exemplo, é composto por uma fita simples. Em DNA de fita simples, o A não forma par com T, nem o C com G, portanto a regra A=T e C=G não se aplica. 4-7 O segmento de DNA na Figura Q4-1 representa, de cima para baixo, 5-ACT-3. Os carbonos no açúcar ribose são numerados no sentido horário em volta do anel, sendo que inicia em C1, o carbono ao qual a base está ligada, e termina em C5, o carbono que fica por fora do anel de ribose. 4-8 Como o C sempre forma par com G na fita dupla de DNA, suas porcentagens molares devem ser iguais. Então, a porcentagem molar de G, que é igual a C, é 20%. A porcentagem molar de A e T completam os 60% restantes. Como A e T sempre formam par, cada um corresponde à metade do valor em porcentagem molar: 30% cada. 4-9 O cromossomo intermediário e os sítios das inversões estão indicados na Figura R4-1. Primeira inversão

Figura R4-1  Inversões e cromossomo intermediário na evolução do cromossomo 3 em orangotangos e humanos.

Orangotango

Segunda inversão

Intermediário

Humano

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   13 4-10 Com base nas informações dadas, o DNA está compactado 27 vezes nas fibras de 30 nm em relação ao DNA estendido. O comprimento total da dupla-hélice de DNA em 50 nm da fibra é 1.360 nm ([20 nucleossomos] × [200 pb/nucleossomo] × [0,34 nm/pb] = 1.360 nm); 1.360 nm de dupla fita reduzidos a 50 nm de fibra de cromatina representa uma condensação de 27 vezes ([1.360 nm/50 nm] = 27,2). Esse nível de compactação representa 0,27% (27/10.000) da condensação total que ocorre na mitose, ainda bem além do necessário. 4-11 O resultado biológico associado à metilação das histonas depende do sítio modificado. Cada sítio de metilação tem um contexto envolvendo o aminoácido, que permite a ligação de complexos de leitura diferentes. É a ligação dessas diferentes proteínas efetoras que produz os diferentes efeitos biológicos. 4-12 Um cromossomo dicêntrico é instável porque os dois cinetocoros podem interferir entre si. Normalmente, os microtúbulos dos dois polos do aparato do fuso ligam-se às faces opostas de um único cinetocoro para separar as cromátides individuais na mitose. Se um cromossomo contiver dois centrômeros, na metade das vezes, os microtúbulos de um dos polos se ligarão aos dois cinetocoros associados a uma cromátide, enquanto os microtúbulos do outro polo se ligarão aos dois cinetocoros associados a outra cromátide. Nesse caso, a divisão pode ocorrer de forma satisfatória. Mas, na outra metade, os microtúbulos de cada polo se ligarão aos cinetocoros associados às diferentes cromátides. Quando isso ocorre, cada cromátide será puxada para os polos opostos com força suficiente para quebrá-la. Portanto, dois centrômeros são ruins para um cromossomo, provocando quebras – tornando-o instável. 4-13 As colônias são agregados de células originadas a partir de uma única célula fundadora e crescem expandindo-se para fora à medida que as células dividem-se repetidamente. Na colônia vermelha da Figura Q4-3, o gene Ade2 foi inativado por estar localizado próximo ao telômero. A inativação é herdada, porém o gene é reativado a uma frequência muito baixa. Isso origina as células brancas, cujos descendentes também são brancos (produzindo os setores brancos), mesmo que o gene não tenha trocado de posição. Esse padrão demonstra que a inativação de um gene próximo ao telômero é passado às células-filhas de um modo não completamente estável, e que os dois estados, ativo e inativo, são herdados. Um mecanismo epigenético parece estar envolvido, com base na tendência de o estado condensado da cromatina ser herdado logo após a replicação do DNA. 4-14 O bloco de genes Hox é compactado com complexas sequências de intensa regulação que asseguram a expressão adequada de determinados genes Hox nos momentos e locais corretos durante o desenvolvimento. A inserção de elementos transponíveis nos blocos Hox é eliminada pela seleção de purificação, provavelmente porque estes interrompem a regulação adequada dos genes Hox. Comparações das sequências de blocos Hox em camundongos, ratos e babuínos revelam a alta densidade de segmentos não codificadores conservados, confirmando a presença da alta densidade de elementos reguladores. Referência: Lander ES, Linton L, Birren B et al. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860–921.

CAPÍTULO 5 5–1 Verdadeiro. Cada vez que o genoma é copiado antes da divisão celular, há o risco de que erros (mutações) sejam introduzidos. A taxa de mutação em humanos é 10 estimada em 1 alteração nucleotídica a cada 10 nucleotídeos por evento de re9 plicação do DNA. Como existem 6,4 × 10 nucleotídeos por célula diploide, uma média de 0,64 mutação aleatória é introduzida no genoma cada vez que este é co-

14   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. piado. Então, as duas células-filhas de uma mesma divisão celular normalmente apresentam diferenças entre si e diferem também da célula-mãe que as originou. Mesmo genomas copiados com perfeição, que produzem células idênticas, sofrerão alterações nos ciclos de replicação subsequentes. A proporção de células idênticas depende da taxa de mutação exata. 5-2 Verdadeiro. Se a forquilha de replicação se desloca a 500 pares de nucleotídeos por segundo, o DNA à frente deve sofrer uma rotação com velocidade de 48 revoluções por segundo (500 nucleotídeos por segundo/10,5 nucleotídeos por volta da hélice) ou 2.880 revoluções por minuto. O caos que esse desenrolamento causaria no cromossomo é evitado por uma DNA-topoisomerase que introduz quebras temporárias bem na frente da forquilha de replicação. Essa ação limita a rotação a um pequeno segmento de DNA de fita simples. 5-3 Verdadeiro. As duas extremidades de uma única fita de DNA parental serão copiadas na mesma direção. Em uma das forquilhas da bolha de replicação, ela corresponderá à fita-líder; na forquilha do outro lado, ela corresponderá à fita retardada. 5-4 Verdadeiro. Considere uma única fita-molde, com a extremidade 5 à esquerda e a extremidade 3 à direita. Não interessa qual a origem, a síntese na fita da esquerda será contínua (fita-líder) e a síntese da fita à direita será descontínua (fita retardada). Assim, quando forquilhas de replicação oriundas de origens adjacentes colidirem, uma fita que se desloca pela direita (retardada) sempre encontrará uma fita que se desloca à esquerda (líder). 5-5 Falso. O reparo de lesões de uma única fita pelo reparo de excisão de bases ou excisão de nucleotídeos, por exemplo, depende somente das duas cópias de informação genética contida nas duas fitas da dupla-hélice de DNA. Por outro lado, o reparo correto de lesões nas duas fitas da hélice – uma quebra de fita dupla, por exemplo – necessita de informação de uma segunda hélice dupla, ou seja, uma cromátide-irmã ou um homólogo. 5-6 A variação na frequência de mutantes em culturas diferentes reflete os diferentes períodos em que as mutações surgiram. Por exemplo, culturas com apenas uma bactéria mutante devem ter adquirido a mutação na última geração; culturas com duas mutantes provavelmente adquiriram a mutação na penúltima geração e produziram duas células-filhas mutantes; culturas com quatro mutações provavelmente adquiriram a mutação na antepenúltima geração e a célula mutante se dividiu duas vezes. As culturas com um número maior de mutantes adquiriram a mutação mais cedo durante o cultivo, e essas células mutantes se dividiram várias vezes. Para entender essa variabilidade, é melhor pensar em taxa de mu9 tação (1 mutação por 10 pb por geração) como uma probabilidade: uma chance –9 de 10 de produzir uma mutação cada vez que um par de nucleotídeos é copiado. 9 Dessa forma, algumas vezes uma mutação ocorrerá antes ou depois que os 10 nucleotídeos tenham sido copiados. Análises da variação das frequências entre culturas cultivadas dessa forma (conhecida como análise de flutuação) são um método comum para determinar as taxas de mutação. Luria e Delbrück desenvolveram originalmente o método que demonstra que as mutações preexistem nas populações de bactérias; isto é, elas não surgem como resultado de métodos seletivos usados para revelar sua presença. Referência: Luria SE & Delbrück M (1943) Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28, 491–511. 5-7 O reparo de pareamento incorreto normalmente corrige o erro na fita recém-sintetizada (fita nova) usando a informação na fita-mãe original. Caso a fita-mãe

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   15 fosse “corrigida” usando a fita nova contendo o erro como molde, o erro se tornaria uma mutação permanente no genoma, e a informação “correta” seria perdida no processo. Portanto, se as enzimas de reparo não distinguirem as duas fitas, teriam apenas 50% de chance de corrigir um determinado erro. No final, um reparo assim, indiscriminado, introduziria o mesmo número de mutações, que seriam inseridas se o sistema de reparo não existisse. Na ausência do reparo, o pareamento incorreto permaneceria até a próxima replicação. Quando a forquilha de replicação passar por malpareamento e as fitas estiverem separadas, os nucleotídeos serão pareados corretamente na fita oposta ao pareamento incorreto. Um duplex normal não mutante será produzido a partir da fita contendo a informação original, e um duplex mutante será produzido a partir da fita que continha o erro. Dessa forma, o evento original de pareamento incorreto produziria uma progênie 50% mutante e 50% não mutante. Esse resultado é igual ao caso do reparo indiscriminado: em média todos os eventos de malpareamento, o reparo indiscriminado também produziria uma progênie 50% mutante e 50% não mutante. 5-8 Apesar de parecer um desperdício, esse processo fornece uma solução harmônica à dificuldade de correção de erro durante a formação do iniciador. Para começar um novo iniciador em um segmento de DNA de fita simples, um nucleotídeo deve ser colocado na posição e ligado a um segundo nucleotídeo, e este, a um terceiro e assim por diante. Mesmo se esses primeiros nucleotídeos forem perfeitamente complementares à fita-molde, um oligonucleotídeo tão curto seria ligado com uma afinidade muito baixa e seria difícil de diferenciar as bases corretas das incorretas durante a correção. O objetivo da primase é “apenas fixar um segmento que se ligue razoavelmente bem, sem se importar com a precisão”. Mais tarde, essas sequências serão removidas e substituídas pela DNA-polimerase, que utiliza iniciadores de DNA sintetizados com precisão a partir dos fragmentos de Okazaki adjacentes. A DNA-polimerase possui a vantagem – que falta na primase – de inserir um novo nucleotídeo ao final de um segmento de uma fita que já existe. O nucleotídeo recém-adicionado é mantido firmemente na posição, e a precisão do pareamento de bases ao próximo nucleotídeo na fita-molde pode ser avaliado corretamente. Conforme a DNA-polimerase preenche o intervalo, ela pode fazer a correção de erros desde o início da fita que sintetiza. O que parece, à primeira vista, um desperdício de energia é, na verdade, um preço a ser pago pela precisão. 5-9 Obviamente, as DNA-polimerases devem ser capazes de alongar um iniciador mal pareado de vez em quando; caso contrário, não haveria malpareamento no DNA recém-sintetizado. A maior parte dos pareamentos incorretos é removida pela exonuclease 3’-5’ de correção de erro associada à DNA-polimerase. Quando a exonuclease não remove o erro, a polimerase pode alongar a cadeia crescente. De fato, a DNA-polimerase e a exonuclease de correção competem entre si. No caso da DNA-polimerase do bacteriófago T7, existem dados que ilustram essa competição. Normalmente, a DNA-polimerase de T7 sintetiza DNA a 300 nucleotídeos por segundo, enquanto a exonuclease remove os nucleotídeos terminais a 0,2 nucleotídeo por segundo, sugerindo que 1 a cada 1.500 (0,2/300) nucleotídeos corretos é removido pela exonuclease. Quando um nucleotídeo incorreto é incorporado, a taxa de remoção aumenta 10 vezes até 2,3 nucleotídeos por segundo e a taxa de polimerização diminui de 3 × 104 vezes até 0,01 nucleotídeo por segundo. A comparação dessas taxas para um iniciador mal pareado sugere que cerca de 1 em 200 (0,01/2,3) iniciadores mal pareados será estendido pela DNA-polimerase de T7. Referência: Johnson KA (1993) Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. Annu. Rev. Biochem. 62, 685–713. 5-10 Como sempre, você obtém sucesso. Embora inicialmente tenha ficado perplexo pela variedade de estruturas, você rapidamente percebe que as formas “H” são

16   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. exatamente como as bolhas, exceto que a clivagem ocorre dentro da bolha em vez de ser por fora. Após, você identifica que, ordenando as moléculas de acordo com o aumento do tamanho da bolha (e virando algumas estruturas de ponta a ponta), poderia apresentar um caso visualmente convincente de replicação bidirecional que se distancia a partir de uma única origem de replicação (Figura R5-1). A replicação bidirecional é clara, porque uma replicação unidirecional produziria um conjunto de bolhas com um lado em comum. A replicação a partir de uma única origem é provável, mas não é certa, porque não se pode excluir a possibilidade de haver duas origens, uma de cada lado e equidistantes do sítio de restrição usado para linearizar o DNA. A repetição do experimento com uma nuclease de restrição diferente resolve essa questão e define a posição exata da origem, ou origens, no DNA viral. Seu supervisor estará satisfeito. Figura R5-1  Replicação bidirecional a partir de uma única origem.

5-11

A. As regiões de rastros densas com grãos de prata correspondem aos segmentos de DNA que estavam sendo replicados quando a concentração de 3H-timidina estava alta. As regiões menos densas marcam os segmentos de DNA que estavam sendo replicados quando a concentração de 3H-timidina estava baixa.



B. A diferença na disposição das seções claras e escuras dos rastros refletem a diferença na estratégia de marcação dos dois experimentos. No primeiro experimento (ver Figura Q5-2A), a 3H-timidina foi adicionada imediatamente após a liberação do bloqueador de sincronização. Dessa forma, a replicação foi iniciada nas origens já com a presença de 3H-timidina, produzindo uma seção escura contínua em ambos os lados da origem. Quando a concentração do marcador foi reduzida, a replicação continuou em ambas direções se distanciando da origem, criando seções mais claras nos dois lados das seções escuras. No segundo experimento (ver Figura Q5-2B), a replicação foi iniciada nas origens sem a presença de 3 H-timidina, então a origem não foi marcada. A adição de uma alta concentração de marcador seguida pela baixa concentração originou a seção escura com a seção clara em uma extremidade. As seções escuras adjacentes são parte da mesma molécula de DNA replicante; elas estão unidas por um segmento não marcado (portanto invisível) que contém as origens de replicação.



C. A velocidade aproximada do movimento da forquilha pode ser estimada a partir dos tempos de marcação e do comprimento das seções marcadas. No primeiro experimento, segmentos com cerca de 100 μm de comprimento foram marcados durante os 45 minutos de marcação. Como há duas forquilhas de replicação envolvidas na síntese de cada segmento marcado, cada forquilha de replicação sintetiza cerca de 50 μm de DNA em 45 minutos. Assim, a velocidade de deslocamento de cada forquilha é cerca de 1,1 μm/min (50 μm/45 min). No segundo experimento, segmentos com cerca de 50 μm de comprimento foram marcados; porém cada um foi sintetizado por apenas uma forquilha de replicação. Então, a taxa de deslocamento foi também de 1,1 μm/min. Essa informação não é suficiente para estimar o tempo necessário para replicar todo o genoma. A informação que falta é o número de origens de replicação ativas e sua distribuição. Supondo que todas as origens sejam ativadas ao mesmo tempo e todas as forquilhas se movam com a mesma velocidade, o tempo mínimo necessário para replicar o genoma (independentemente do seu tamanho) é dado pela distância entre as duas origens mais distantes entre si. Referência: Huberman JA & Riggs AD (1968) On the mechanism of DNA replication in mammalian chromosomes. J. Mol. Biol. 32, 327–341.

5-12 Nas células de vertebrados, muitos sítios na sequência 5-CG-3 são seletivamente metilados na base citosina. A desaminação espontânea de metil C produz T. Uma DNA-glicosilase especial reconhece esse par de base incorreto envolvendo o T na sequência TG e o remove. Esse mecanismo de reparo de DNA não é 100% eficiente, e os nucleotídeos com C metilado são sítios comuns de mutação no

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   17 DNA de vertebrados. Com o tempo, essa taxa aumentada de mutações nos dinucleotídeos CG resultou na sua perda preferencial, causando, portanto, sua sub-representação no genoma humano. 5-13 Caso as quebras corrigidas de forma incorreta estivessem distribuídas pelo genoma, seria esperado que 2% delas afetassem informações codificadoras ou reguladoras essenciais. Dessa forma, as funções de cerca de 40 genes (0,02 × 2.000) seriam comprometidas em cada célula, embora os genes específicos sejam diferentes em cada célula. Como nem todos os genes são expressos em todas as células, mutações gênicas em algumas células não trariam consequências. Além disso, como o genoma humano é diploide, o efeito das mutações na função celular dos genes expressos seria minimizado pelo outro alelo. Para a maioria dos lócus, um alelo funcional (50% da proteína normal) é adequado para a função celular normal; porém, para outros lócus, 50% não são suficientes. Seria esperado, portanto, que as mutações comprometessem as funções de algumas células. Referência: Lieber MR, Ma Y, Pannicke U & Schwarz K (2003) Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 712–720. 5-14 A junção de Holliday dupla resultante da invasão de fitas está ilustrada na Figura R5-2. Duas representações são mostradas, ambas corretas. A de cima parece mais simples porque o duplex invasor sofreu uma rotação, e a extremidade 5’ marcada está na parte inferior. Essa disposição minimiza o número de linhas que devem atravessar, por isso a maioria dos diagramas é mostrada dessa forma. A representação na parte de baixo está perfeitamente correta, mas aparenta ser mais complicada. Observe que os dois diagramas representam exatamente a mesma estrutura molecular. A síntese de DNA usa a extremidade 3’ do duplex invasor como um iniciador e preenche a lacuna de fita simples pela síntese 5’-3’ como indicado. 5-15 Uma enorme porcentagem do genoma humano é formado por elementos repetitivos, como as sequências Alu, que estão distribuídas pelos cromossomos. Se, por exemplo, a recombinação fosse ocorrer entre duas dessas sequências em diferentes cromossomos, produziria uma translocação. A recombinação irrestrita entre tais elementos repetitivos rapidamente provocaria rearranjos no genoma que impediriam seu reconhecimento. Rearranjos diferentes em indivíduos diferentes resultariam em um alto número de progênies inviáveis, ameaçando a espécie. Essa calamidade é evitada pela ação do sistema de reparo de pareamento incorreto. As sequências repetidas no genoma apresentam uma pequena porcentagem de diferença entre suas sequências. Quando intermediários da recombinação são formados entre essas sequências, diversos pareamentos incorretos estão presentes nas regiões de heteroduplex. E, quando o sistema de reparo de pareamento incorreto detecta uma frequência muito alta de malpareamento, o processo de recombinação é abortado. Esse mecanismo de vigilância assegura que as sequências que sofrem a recombinação sejam praticamente idênticas, como é esperado para sequências localizadas em um mesmo lócus em cromossomos homólogos.

3

5

3

5

3

5

3 ou

5

3

5

3

Figura R5-2  Junção de Holliday dupla. A síntese de DNA novo é indicada por linhas onduladas em azul.

a

b

a

c

d

a

b

b

c

d

a

b

c

d

c

d

a

5-16 A recombinação mediada por Cre entre dois sítios LoxP com orientação oposta inverte a sequência entre os sítios, enquanto a recombinação entre sítios LoxP na mesma orientação remove a sequência do genoma, liberando-a como um círculo (Figura R5-3). Como o círculo não tem uma origem de replicação, ele será perdido quando a célula se dividir. A maneira mais fácil de trabalhar os produtos é alinhar os sítios LoxP e acompanhar a permuta entre eles.

5

c

b

d

a

d +

c

b

Figura R5-3  Produtos da recombinação mediada por Cre entre sítios LoxP com orientação oposta e repetição direta.

18   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.

CAPÍTULO 6 6-1 Verdadeiro. Os erros na replicação do DNA têm o potencial de afetar as gerações futuras de células, enquanto os erros na transcrição não levam a qualquer consequência genética. Os erros na transcrição levam a falhas em uma pequena fração de moléculas de RNA, cujo funcionamento ainda será monitorado por outros mecanismos de controle de qualidade. Eles não são repassados para células-filhas. Em contrapartida, os erros na replicação do DNA alteram o gene e, desse modo, afetam todas as cópias de RNA (e proteína) produzidas na célula original e em todas as células descendentes. Essas considerações se refletem nas taxas intrínsecas de erro das RNA-polimerases e DNA-polimerases: RNA-polimerases normalmente cometem 1 erro a cada 104 nucleotídeos copiados, enquanto DNA-polimerases cometem cerca de 1 erro a cada 107 nucleotídeos. Tais diferenças significativas nas taxas de erro sugerem que a seleção natural é mais forte contra erros na replicação do que contra erros na transcrição. 6-2 Falso. Embora sequências de íntrons sejam majoritariamente dispensáveis, elas devem ser removidas com precisão. Um erro de um único nucleotídeo durante a remoção mudaria a fase de leitura na molécula de mRNA e produziria uma proteína aberrante. 6-3 Falso. O pareamento oscilante ocorre entre a terceira posição no códon e a primeira posição no anticódon. 6-4 Falso. O pareamento correto de bases é apenas cerca de 10 a 100 vezes mais estável do que pareamentos incorretos. Assim, mecanismos adicionais, além da simples termodinâmica do pareamento de bases, devem ser utilizados para alcançar a precisão da síntese proteica que é rotineiramente alcançada nas células. Dois desses mecanismos são o ajuste induzido, onde o ribossomo se enovela em torno dos pares de bases corretos, e a revisão cinética, que introduz intervalos que permitem a dissociação de bases inadequadamente pareadas. 6-5 Falso. Apesar de apenas alguns tipos de reações estarem representados entre as ribozimas nas células atuais, as ribozimas que foram selecionadas em laboratório podem catalisar uma ampla variedade de reações bioquímicas, com taxas de reação que se aproximam daquelas das proteínas. Diante desses resultados, não está clara a razão das ribozimas serem tão pouco representadas nas células modernas. No entanto, parece lógico que a disponibilidade de 20 aminoácidos contra 4 bases permita às proteínas um maior número de estratégias catalíticas em relação às ribozimas, além de dar-lhes uma capacidade de se ligarem de forma produtiva a uma gama mais ampla de substratos (p. ex., substratos hidrofóbicos, com os quais as ribozimas têm dificuldade de interação). 6-6 A RNA-polimerase deve mover-se da direita para a esquerda na Figura Q6-1. Se a RNA-polimerase não gira em torno do molde enquanto se move, ela vai induzir uma supertorção no DNA à sua frente, provocando supertorções positivas, e vai desenrolar o DNA na sua região posterior, provocando supertorções negativas. Se a RNA-polimerase estiver livre para girar em torno do molde enquanto se move ao longo do DNA, não ocorrerá pressão ou desenrolamento do DNA, e não serão geradas supertorções. Referência: Liu LF & Wang JC (1987) Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84, 7024–7027.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   19 (A)

Figura R6-1  Rotação da fita dupla de DNA devido ao movimento relativo da RNA-polimerase. (A) Sentido da rotação da microesfera magnética. (B) Direção da rotação da fita dupla de DNA.

(B) Ímã

Direção da rotação

Microesfera magnética

DNA RNA RNA-polimerase RNA Lâmina de vidro

6-7 A microesfera giraria no sentido horário a partir da perspectiva do ímã, como mostrado na Figura R6-1A. Como mostrado na Figura R6-1B, o movimento da hélice em relação a uma RNA-polimerase fixa provoca uma rotação na hélice. Referência: Harada Y, Ohara O, Takatsuki A, Itoh H, Shimamoto N & Kinosita K (2001) Direct observation of DNA rotation during transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Nature 409, 113–115. 6-8 A afirmativa C é a única que é necessariamente verdadeira para os éxons 2 e 3. Ela é também a única verdadeira para os éxons 7 e 8. Embora as condições dadas em A e B possam ocorrer, elas não são obrigatórias. No entanto, visto que a sequência da proteína codificada é a mesma em segmentos de mRNA que correspondem aos éxons 1 e 10, nenhuma escolha de éxons alternativos (2 versus 3, ou 7 versus 8) pode permitir que haja uma alteração na fase de leitura. Para manter a fase de leitura normal – seja ela qual for –, os éxons alternativos devem ter um número de nucleotídeos que, quando dividido por 3 (o número de nucleotídeos de um códon), gere o mesmo resultado. Uma vez que a sequência do gene da α-tropomiosina é conhecida, podemos verificar a veracidade desta questão. Ambos os éxons 2 e 3 contêm o mesmo número de nucleotídeos, 126, que é divisível por 3. Os éxons 7 e 8 também contêm o mesmo número de nucleotídeos, 76, que, quando dividido por 3, deixa uma sobra de 1. 6-9 As únicas atribuições de códon consistentes com as mudanças observadas e com o pressuposto de que apenas mudanças de nucleotídeo único foram envolvidas são GUG para valina, GCG para alanina, AUG para metionina e ACG para treonina. É pouco provável que você fosse capaz de isolar um mutante de valina para treonina em um único passo, pois seriam necessárias duas alterações de nucleotídeos. Normalmente, é esperado que duas mudanças ocorram com uma frequência igual ao produto das frequências de cada uma das alterações individuais; consequentemente, o mutante duplo seria muito raro. 6-10 Deleções de um único nucleotídeo perto do início do gene (2) seriam mais prejudiciais, visto que alterariam a fase de leitura no início da sequência de codificação. Como resultado, a proteína codificada conteria uma sequência de aminoácidos distinta da original e provavelmente truncada. Em contrapartida, uma mudança da fase de leitura que ocorre próximo à extremidade final da sequência de codificação, como descrito em 1, resultará em uma proteína majoritariamente correta, que poderá ser funcional. Uma deleção de três nucleotídeos consecutivos, como no cenário 3, leva à deleção de um aminoácido, caso elimine um códon completo, ou à deleção de

20   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. um aminoácido e a substituição de outro, caso a deleção sobreponha dois códons adjacentes. É importante salientar que a deleção de três nucleotídeos não alteraria a fase de leitura. O aminoácido eliminado (ou alterado) pode ou não ser importante para o enovelamento ou para a atividade da proteína. Em muitos casos, essas mutações são silenciosas; ou seja, elas apresentam consequências insignificantes para o organismo. A substituição de um nucleotídeo por outro, como no cenário 4, em geral é completamente inofensiva, desde que não seja alterado o aminoácido codificado. Em outros casos, pode ocorrer a troca de um aminoácido, e as consequências podem ser deletérias ou benignas, dependendo da localização e da significância funcional daquele aminoácido em particular. Muitas vezes, o tipo de alteração mais deletério, em se tratando de alteração de um único nucleotídeo, cria um novo códon de terminação, o que dá origem a uma proteína truncada. 6-11 Um mRNA quebrado, quando traduzido, produziria uma proteína truncada que poderia ser prejudicial à célula. Um fragmento de proteína pode reter algumas das funções da proteína, o que permitiria, por exemplo, ligar-se a uma proteína-alvo, mas prendendo-a em um complexo improdutivo. Alternativamente, um fragmento de proteína pode exibir superfícies de ligação novas, aberrantes, que lhes permitam ligar-se a novos parceiros, interferindo na sua função. Finalmente, a deleção poderia remover a porção da proteína que normalmente controla a sua atividade. Nesse caso, a proteína truncada poderia estar bloqueada em seu estado ativo, com consequências desastrosas para a célula. 6-12 Em uma proteína adequadamente enovelada, a maioria dos aminoácidos hidrofóbicos estará sequestrada no interior, longe da água. Assim, porções hidrofóbicas expostas indicam que uma proteína é, de alguma forma, anormal. Algumas proteínas possuem um enovelamento inicial com porções hidrofóbicas expostas que são, então, usadas para se ligarem a outras proteínas, em última instância protegendo os aminoácidos hidrofóbicos. Como resultado, aminoácidos hidrofóbicos geralmente não são expostos na superfície de uma proteína, e qualquer porção significativa deles é um bom indicador de que algo errado ocorreu. A proteína pode não ter conseguido enovelar-se corretamente após deixar o ribossomo, pode ter sofrido um acidente que a desenovelou parcialmente em um momento posterior, ou pode não ter conseguido encontrar uma subunidade parceira normal em um complexo proteico maior. 6-13 Chaperonas moleculares passam pelo processo de enovelamento como qualquer outra proteína. Durante a síntese nos ribossomos, essas moléculas são ligadas a chaperonas hsp70. Além disso, moléculas enoveladas de forma incorreta são auxiliadas por chaperonas semelhantes à hsp60. O fato de atuarem como chaperonas quando maduras e adequadamente enoveladas em nada interfere na forma como são tratadas antes de atingirem sua conformação funcional final. Obviamente, chaperonas semelhantes à hsp60 e hsp70 funcionais já devem estar presentes para ajudar a enovelar as chaperonas recém-produzidas. Na divisão celular, cada célula-filha herda da célula parental um conjunto inicial dessas chaperonas. 6-14 O RNA tem a capacidade de armazenar a informação genética como o DNA e a capacidade para catalisar reações químicas, como as proteínas. Ao identificarmos um único tipo de molécula que apresenta ambas as características essenciais para a “vida” é mais fácil entender como a vida pode ter surgido a partir de matéria inanimada. A utilização de moléculas de RNA como catalisadores em várias reações fundamentais pelas células atuais apoia essa ideia. No entanto, ainda não é possível delimitar um caminho plausível que leve da sopa “primordial” até um mundo de RNA. Visto que moléculas de RNA são altamente suscetíveis a quebras de cadeia (ver adiante), muitos têm especulado que pode ter existido uma

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   21 molécula precursora “semelhante ao RNA” – essa molécula teria as propriedades catalíticas e de armazenamento de informações, mas teria sido mais estável. O açúcar desoxirribose do DNA torna a molécula muito menos suscetível à ruptura. O grupo hidroxila no carbono 2 do açúcar ribose é um agente para a catálise da ligação fosfodiéster 3-5 adjacente que une os nucleotídeos no RNA. Sua ausência no DNA elimina esse mecanismo de quebra de cadeia. Além disso, a estrutura de dupla-hélice do DNA fornece duas cadeias complementares, permitindo que danos em um dos filamentos sejam reparados com precisão utilizando a sequência da segunda fita como referência. Finalmente, a utilização de T no DNA em vez de U, como no RNA, protege contra os efeitos da desaminação – uma forma comum de dano. A desaminação de T produz uma base aberrante (metil C), ao passo que a desaminação de U gera C, uma base normal. O trabalho da célula em reconhecer bases danificadas é facilitado quando o dano produz uma base anormal.

5’ -G-C-A 3’ -C-G-U

C-U

A-C

6-16 A molécula de RNA não será capaz de catalisar sua própria replicação. Como molécula individual com um único sítio catalítico, não poderá atuar simultaneamente como molde e catalisador. (Para visualizar a dificuldade inerente à situação, tente imaginar como o sítio ativo da molécula de RNA poderia copiar a si mesmo.) Se uma segunda molécula, seja ela molde ou catalisador, for gerada, a replicação poderá ter início. Referência: Bartel DP & Szostak JW (1993) Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences. Science 261, 1411–1418.

CAPÍTULO 7 7-1 Verdadeiro. Tanto o motivo hélice-alça-hélice quanto o motivo zíper de leucina são motivos estruturais que possibilitam que reguladores transcricionais dimerizem, de modo que cada membro do par pode posicionar uma α-hélice no sulco maior do DNA. 7-2 Falso. Mesmo células especializadas devem responder constantemente a mudanças no seu ambiente, o que elas fazem, em muitos casos, alterando o padrão de transcrição dos genes. 7-3 Verdadeiro. Em regiões não metiladas do genoma, a desaminação espontânea de C (um evento muito comum) dá origem a uma nova base no DNA, uracila, que pode ser precisamente reconhecida e reparada. Em contraste, desaminação de 5-metil C dá origem a T, uma base normal de DNA, que é mais difícil para a maquinaria de reparo celular de ser reconhecida como incorreta. Como consequência, dinucleotídeos CG metilados na linhagem germinativa tenderam a ser perdidos durante a evolução, deixando as ilhas de CG encontradas nos genomas modernos. 7-4 Verdadeiro. Existem vários mecanismos epigenéticos de herança que possibilitam às células reter uma memória dos padrões de expressão gênica das suas células parentais, incluindo reguladores transcricionais que ativam sua própria transcrição, metilação de DNA e estrutura da cromatina, entre outros. 7-5 Cada fosfato adicionado altera a carga em uma unidade, mas tem relativamente pouco efeito na massa molecular. Como consequência, proteínas que diferem

G-G-C

U

5’-GCACUCCGUCGGCAUGC- 3’ 3’-CGUGAGGCAGCCGUACG- 5’

5’ -G-C-A-U 3’ -C-G-U-G

6-15 O complemento desse RNA em grampo também pode formar um grampo similar, como mostrado na Figura R6-2. As duas estruturas seriam idênticas em relação às regiões de cadeia dupla que envolvem pares G-C e A-U padrão. Elas seriam diferentes nas sequências das regiões de fita simples. Como pares de bases G-U podem se formar no RNA, o que não ocorre para pares de bases C-A, poderíamos prever a existência de um par de bases adicional no grampo, como ilustrado.

C-C-G

G

A

C-C-G G-G-C

A

Figura R6-2  Grampos formados por uma fita de RNA e pelo segmento complementar da cadeia. Um RNA (preto) e sua fita complementar (azul) são mostrados sob a forma de RNA de fita dupla no centro. As estruturas formadas pelo pareamento de cada fita são mostradas acima e abaixo do duplex. O pareamento de bases não convencional G-U no grampo inferior está realçado pela linha tracejada.

Menor

Figura R7-1  Manchas (spots) de proteínas em um gel bidimensional que podem diferir pelo número de fosfatos associados. Uns poucos conjuntos de manchas horizontais que poderiam estar relacionadas por fosforilação estão indicados. (Imagem original cortesia de Tim Myers e Leigh Anderson, Large Scale Biology Corporation).

Maior

22   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.

Ácido

Básico

somente no número de fosfatos associados aparecerão como se tivessem o mesmo tamanho, mas terão diferentes pontos isoelétricos, formando um conjunto de manchas horizontais, como mostrado para algumas poucas proteínas na Figura R7-1. É importante considerar que um arranjo horizontal de manchas não prova que as proteínas sejam relacionadas por fosforilação; elas poderiam ser proteínas diferentes com a mesma massa molecular e pontos isoelétricos ligeiramente diferentes, ou poderiam representar a mesma proteína com um tipo diferente de modificação que afete a carga da proteína. O tratamento das proteínas com uma proteína-fosfatase antes da separação por eletroforese em gel poderia ser usado para resolver esse problema. 7-6 Ainda que seja verdade que as células cancerosas se diferenciam das suas precursoras normais, elas normalmente diferem na sua expressão em relativamente poucos genes (oncogenes e genes supressores de tumor). Quando os padrões globais de mRNAs em células cancerosas são comparados aos padrões de mRNAs em tecidos normais, eles se correspondem para a vasta maioria dos mRNAs. Essa assinatura de RNA possibilita que um tumor seja definitivamente assinalado a um tipo de tecido em particular. 7-7 Os dois componentes básicos de comutadores genéticos são as sequências de DNA regulador cis-atuantes e os reguladores transcricionais que se ligam a elas.

Proteína ativadora

RNA-polimerase

Proteína de curvatura de DNA

Figura R7-2  Função de uma proteína de curvatura em aproximar reguladores transcricionais distantes.

7-8 Sob condições especificadas (concentrações equivalentes de DNA e regulador transcricional), uma proteína iria ocupar seu sítio de reconhecimento igualmente bem no núcleo eucariótico e em uma bactéria. Uma maneira não matemática de pensar sobre isso seria imaginar um pequeno volume do núcleo eucariótico, igual em tamanho a aquele da bactéria e contendo o sítio de ligação. Esse pequeno volume no núcleo eucariótico é diretamente comparável ao interior da bactéria. Nesses volumes equivalentes, a capacidade do regulador transcricional de encontrar seu sítio de ligação é equivalente. Desde que as concentrações do DNA e do regulador transcricional sejam as mesmas, o volume total não exerce influência alguma. Isso significa, obviamente, que o número total de moléculas do regulador transcricional é 500 vezes superior em um único núcleo do que em uma única bactéria. Referência: Ptashne M (1986) A Genetic Switch: Gene Control and Phage λ, p. 114. Oxford, UK: Blackwell Scientific Press. 7-9 Proteínas que promovem curvatura podem ajudar a aproximar regiões distantes do DNA que raramente entram em contato em uma situação normal (Figura R7-2). A atividade de tais proteínas resulta em um aumento da concentração local de reguladores transcricionais na vizinhança da RNA-polimerase. As proteínas de curvatura são encontradas em procariotos e em eucariotos e estão envolvidas em muitos exemplos de regulação transcricional.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   23 7-10 Em um certo sentido, o DNA atua como uma corrente, mantendo as proteínas próximas umas às outras, de modo que interações inerentemente fracas entre elas possam prontamente ocorrer. 7-11 A indução de um ativador transcricional que estimula sua própria síntese cria uma alça de retroalimentação positiva que pode, dependendo da estabilidade da proteína A, da sua afinidade pela sua sequência reguladora cis-atuante e de outros parâmetros, levar à memória celular. A síntese autoestimulada continuada do ativador A pode, em princípio, perdurar por muitas gerações celulares, servindo como um constante lembrete de um evento no passado distante. Em contraste, a indução de um repressor transcricional que inibe sua própria síntese cria uma alça de retroalimentação negativa que garante uma resposta transitória a um estímulo passageiro. Como o repressor R desliga sua própria síntese, a célula irá rapidamente retornar ao estado existente antes do sinal transitório. 7-12 Os indivíduos afetados possuem um gene deletado e um gene inativo devido ao imprinting. Os indivíduos que portam a deleção irão produzir uma prole afetada somente se eles cruzarem com indivíduos cujo sexo corresponda a aquele em que o imprinting ocorre. Portanto, fêmeas que carregam a deleção estão sob risco de ter uma prole afetada somente se o gene sofrer imprinting paterno. Similarmente, machos que carregam a deleção estão sob o risco de ter uma prole afetada somente se o gene sofrer imprinting materno. No heredograma mostrado na Figura Q7-3A, somente as fêmeas que carregam a deleção têm filhos afetados. Portanto, o heredograma A deve envolver imprinting paterno. Similarmente, no heredograma B, somente os machos que carregam a deleção têm filhos afetados; portanto, esse heredograma deve envolver imprinting materno. Referência: Hartwell LH, Hood L, Goldberg ML, Reynolds AE, Silver LM & Veres RC (2000) Genetics: From Genes to Genomes, pp. 408–410. Boston: McGraw-Hill Companies. 7-13 A hipótese mais razoável é a de que o gene da b-galactosidase defeituoso esteja sendo transcrito e processado em piRNAs. Agrupamentos de piRNAs são transcritos em um único grande RNA a partir do qual muitos piRNAs individuais são processados por clivagem e “poda”. De acordo com essa hipótese, algumas sequências de b-galactosidase, que seriam transcritas juntamente com os piRNAs, são processadas do mesmo modo que piRNAs normais. Os piRNAs da β-galactosidase iriam, então, silenciar a expressão do gene da b-galactosidase normal do mesmo modo que piRNAs silenciam a expressão de genes de elementos transponíveis. Se essa hipótese estiver correta, então você deveria ser capaz de encontrar sequências de b-galactosidase na população de piRNAs. Isso é o que de fato se observa. Referência: Ronsseray S, Josse T, Boivin A, Anxolabéhère D (2003) Telomeric transgenes and trans-silencing in Drosophila. Genetica 117, 327–335.

CAPÍTULO 8 8-1 Falso. Um anticorpo monoclonal reconhece um sítio antigênico específico, mas isso não significa que ele se ligará apenas a uma proteína específica. Existem dois fatores complicadores. Em primeiro lugar, os sítios antigênicos que são similares, mas não idênticos, podem ligar o anticorpo com afinidades diferentes. Se muito anticorpo for utilizado em um experimento, o anticorpo pode se ligar a uma proteína com alta afinidade e a outras com baixa afinidade. Em segundo lugar, não é incomum que diferentes proteínas tenham o mesmo sítio antigênico; ou seja, o mesmo conjunto de cinco ou seis cadeias laterais de aminoácidos na sua superfície. Isso é especialmente verdadeiro para membros de famílias proteicas,

24   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. que possuem sequências de aminoácidos similares e muitas vezes são idênticas nas regiões funcionais conservadas. 23 8-2 Falso. Existem 6 × 10 moléculas por mol; portanto, apenas 0,6 molécula em um yoctomole. O limite de detecção é uma molécula, ou 1,7 yoctomole. Nenhum instrumento pode detectar menos do que 1 molécula (ela está, ou não, presente no instrumento).

Referência: Castagnola M (1998) Sensitive to the yoctomole limit. Trends Biochem. Sci. 23, 283. 8-3 Verdadeiro. Se cada ciclo duplica a quantidade de DNA, então 10 ciclos equivalem 10 20 6 a 2 amplificações (que são 1.024), 20 ciclos a 2 (que são 1,05 × 10 ) e 30 ciclos a 30 9 10 3 2 (que são 1,07 × 10 ). (É bom relembrar que 2 é praticamente 10 ou 1.000. Essa simples relação nos permite estimar a resposta a este problema rapidamente sem recorrer à calculadora. Se torna útil em uma variedade de contextos.) 8–4 Verdadeiro. Sem os detalhes quantitativos, seria impossível saber se as interações iriam ocorrer nas células em geral, e, se ocorrerem, saber se é uma interação estável com uma meia-vida longa ou uma interação dinâmica com uma rápida ligação e dissociação. 8–5 Verdadeiro. É uma premissa fundamental na análise das reações bioquímicas. Se aplica da mesma forma a complexos moleculares (como A:B, que se forma quando as proteínas A e B se ligam uma a outra, e desaparece quando A:B dissociam) e reações metabólicas (p. ex., quando o metabólito B se forma por modificação química do metabólito A, e desaparece quando é convertido no metabólito C). 8–6 Falso. Uma proteína com uma taxa rápida de degradação alcançará sua concentração do novo estado estacionário mais rapidamente. A taxa para chegar ao novo estado estacionário é inversamente relacionada à meia-vida da proteína. 8–7 As células em um tecido estão unidas umas às outras por ligações mediadas por proteínas e a uma matriz extracelular contendo colágeno. O tratamento com tripsina, colagenase e EDTA rompe essas ligações. A tripsina é uma protease que cliva a maioria das proteínas, mas geralmente apenas aquelas porções de uma proteína nativa que não estão estruturadas. A estrutura em tripla-hélice do colágeno, por exemplo, é um substrato pobre para tripsina. A colagenase, que é uma protease específica para o colágeno, digere o principal componente da matriz 21 extracelular. O EDTA quela Ca que é necessário para as proteínas da superfície 21 celular, conhecidas como caderinas, ligarem-se. A remoção do Ca previne esta ligação e assim diminui a afinidade das ligações entre as células. O tratamento não mata as células, pois os danos ocorrem nos componentes extracelulares que as células podem restabelecer. Enquanto a membrana plasmática não for rompida, as células sobrevivem. 8-8 A velocidade de sedimentação depende do tamanho e da forma da proteína. A hemoglobina quase esférica sedimentará mais rápido do que a forma mais alongada da tropomiosina, mesmo que a tropomiosina seja a proteína maior. A forma tem importância, pois as moléculas que passam por uma solução por força centrífuga experimentam o equivalente a de resistência à fricção. Uma proteína esférica, com sua menor proporção entre superfície e volume, experimentará menos resistência do que uma com forma bastão e, portanto, sedimentará mais rápido. Você pode demonstrar essa diferença usando duas folhas de papel. Amasse uma na forma de uma esfera e enrole a outra como um tubo. Deixe-as cair. A folha amassada atingirá mais rapidamente o chão do que a enrolada. Nessa demons-

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   25 tração, a força centrífuga é substituída pela gravidade, e a resistência na solução é substituída pela resistência do ar. Os princípios fundamentais são os mesmos. 8–9 Embora tenha valor inestimável, a tecnologia do hibridoma é bastante trabalhosa e demorada requerendo alguns meses para isolar uma linhagem celular de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal de interesse. Além disso, não existe garantia de que a linhagem celular produzirá um anticorpo monoclonal com as propriedades específicas que você está procurando. É muito mais simples – apenas alguns dias de trabalho – adicionar um epítopo-alvo na proteína, usando tecnologia de DNA recombinante, e utilizar um anticorpo comercialmente disponível bem testado contra esse epítopo. A possibilidade do epítopo alterar a função da proteína é uma questão crucial, mas você pode adicioná-lo facilmente à extremidade N ou C-terminal da proteína e testar seu efeito sobre a função proteica. Na maioria dos casos, um marcador em uma ou outra extremidade da molécula será compatível com sua função. 5 8-10 Você precisaria 10 cópias de uma proteína de 120 kD em uma célula de mamífero (e 100 cópias em uma célula bacteriana) para poder detectá-la em um gel. O cálculo tem duas partes: quantos equivalentes a células podem ser aplicados em um gel e quantas cópias de uma proteína podem ser detectadas na banda. Como mostrado abaixo para células de mamíferos, 100 µg correspondem a 5 × 5 8 10 células de mamíferos e 5 × 10 células bacterianas.

Existem 5 × 1010 proteínas de 120 kDa em uma banda de 10 ng.

Portanto, se você pode detectar 5 × 1010 proteínas em uma banda e pode aplicar o 5 5 equivalente a 5 × 10 células de mamíferos por gel, então deve haver 10 cópias da 10 5 proteína por célula (5 × 10 /5 × 10 ) para que ela seja detectada como uma banda em um gel corado com prata. Para uma célula bacteriana, deve haver 100 cópias 10 8 da proteína por célula (5 × 10 /5 × 10 ). 8-11 Uma diferença na m/z de 80 corresponde a um fosfato. A adição de um fosfato à hidroxila de uma serina, treonina ou tirosina acrescentaria 3 átomos de O (48), 1 átomo de P (31) e 2 átomos de H, no lugar de um átomo de H do grupamento hidroxila para uma adição de 80. Sob condições utilizadas na análise por espectrometria de massa, não existe carga no fosfato. 8-12 Os iniciadores corretos são o 1 (5-GACCTGTGGAAGC) e o 8 (5-TCAATCCCGTATG). O primeiro hibridizará com a fita inferior e realizará a síntese para a direita. O segundo hibridizará com a fita superior e realizará a síntese para a esquerda. (Lembre-se que fitas complementares no DNA são antiparalelas). Os dois iniciadores do meio de cada lista (2, 3, 6 e 7) não hibridizariam com nenhuma fita. O par restante (4 e 5) hibridizaria, mas realizariam a síntese para direção incorreta, ou seja, para fora, para longe do segmento central de DNA. Escolhas incorretas como estas foram feitas uma ou outra vez na maioria dos laboratórios que utilizam PCR. A confusão geralmente surge porque as convenções para escrever as sequências de nucleotídeos foram ignoradas. Por convenção, as sequências nucleotídicas são escritas da extremidade 5 para 3, com a extremidade 5 à esquerda. Para DNA de fita dupla, a extremidade 5 da fita superior fica à esquerda.

26   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. Figura R8-1  Os produtos de PCR gerados durante os três primeiros ciclos. O DNA que foi sintetizado durante um ciclo está mostrado nas linhas laranjas. As posições dos iniciadores nos produtos novos e velhos estão mostradas como setas azuis. Os primeiros produtos de tamanho correto estão marcados no ciclo 3.

PRIMEIRO CICLO DE PCR 5

3 SEGUNDO CICLO 5

3 TERCEIRO CICLO 5

3

8-13 Na amplificação por PCR, um fragmento de fita dupla do tamanho correto é gerado no terceiro ciclo (Figura R8-1). 8-14 Uma mutação de ganho de função aumenta a atividade do produto proteico do gene, tornando-o ativo em circunstâncias inapropriadas ou originando uma nova atividade. A mudança na atividade muitas vezes tem uma consequência fenotípica mesmo quando a proteína normal estiver presente. Por isso tais mutações normalmente são dominantes. Uma mutação dominante negativa dá origem a um produto gênico mutante que interfere com a função do produto gênico normal, causando um fenótipo de perda de função mesmo na presença de uma cópia normal do gene. Essa habilidade de um único alelo defeituoso determinar o fenótipo é a razão pela qual tal alelo é dito dominante. 8-15 Essa sentença é verdadeira. O diabetes é uma das doenças mais antigas descritas em humanos, datando no mínimo do tempo da Grécia Antiga. O próprio termo “diabetes” vem da palavra grega para “sifão”, que era usada para descrever um dos principais sintomas – produção aumentada de urina: “A doença foi chamada diabetes por parecer um sifão, uma vez que converte o corpo humano em um cano para o fluxo dos humores líquidos.” Se não existisse a doença humana, o papel da insulina não nos chamaria atenção tão cedo, como aconteceu. Não é exagero salientar a importância das doenças em concentrar nossos esforços na compreensão molecular. Mesmo hoje, a missão para entender e aliviar a doença humana é o principal estímulo na pesquisa biomédica.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   27 8-16 Esses resultados são o esperado caso o mRNA sofra splicing alternativo. O número de leituras para o éxon 4 versus o restante do mRNA sugere que cerca da metade do mRNA foi processada para incluir os cinco éxons, enquanto o restante foi processado para omitir o éxon 4. Assim, o mRNA produzido a partir desse gene inclui duas espécies relativamente abundantes. 8-17 Dos motivos de rede na Figura Q8-5, A, B e C são ciclos de retroalimentação positiva, enquanto o motivo em D é um ciclo de retroalimentação negativa. Você pode analisar esses motivos etapa por etapa. Para o motivo A, quando a expressão do gene X é ativada, o repressor X inativa o gene Y, que elimina a expressão do repressor Y, ativando, assim, o gene Z, que ativa a expressão do ativador Z, que estimula a expressão do gene X, completando o ciclo de retroalimentação positiva. Para o motivo B, quando a expressão do gene X está ativada, o repressor X inativa o gene Y, que elimina a expressão do ativador Y, inativando, dessa forma, o gene Z, que elimina a expressão do repressor Z, que estimula a expressão do gene X, completando o ciclo de retroalimentação positiva. Os outros motivos podem ser analisados da mesma forma. Ao completar essa análise, um padrão deve ser reconhecido. Nos motivos de rede, dois negativos originam um positivo, mas um número ímpar de negativos ainda origina um negativo. Ao aplicar essa regra simples, vemos que os motivos A, B e C contêm duas etapas inibitórias; assim, eles são ciclos de retroalimentação positiva. O motivo D contém uma única etapa negativa; assim, é um ciclo de retroalimentação negativa. 8-18 Se o sistema perturbado estivesse exatamente no limite entre as duas regiões de atração – os dois estados estacionários –, seu equilíbrio seria facilmente perturbado. Uma flutuação aleatória mínima direcionaria o sistema para um ou outro dos dois estados estacionários. 8-19

A. Comparação dos níveis de repressão com cada operador individual (Figura Q8-7, construções 4, 6 e 7) mostra que apenas O1 dá origem a um nível significativo de repressão. O2 e O3 produzem o mesmo nível de expressão (sem repressão) como uma construção sem operadores (construção 8).



B. Enquanto as combinações dos operadores contiverem O1, o operador dimérico causa repressão significativa; entretanto a repressão está apenas levemente aumentada (menos que 2 vezes) em relação à construção 4, que contém apenas o operador O1. Assim, com um repressor dimérico, a atividade de O1 não é aumentada substancialmente pela presença de O2 ou O3. Em contraste, operadores adicionais aumentam bastante a repressão pelo repressor tetramérico em 10 vezes (construção 3 vs. construção 4) para 50 vezes (construção 1 vs. construção 4). Esses resultados sugerem que a presença de múltiplos sítios de ligação permite que o repressor tetramérico, mas não o repressor dimérico, ligue-se a dois sítios ao mesmo tempo, criando uma alça no DNA. Essa alça pode ser um meio mais eficiente para excluir a RNA polimerase do promotor, aumentando, assim, a repressão.



C. A capacidade do repressor tetramérico de se ligar a O3 quando está na presença de O1 é um exemplo de ligação cooperativa. A ligação forte do repressor a O1 aumenta a concentração local na vizinhança de O3, o que aumenta a eficiência com a qual o repressor pode se ligar a O3. Referência: Oehler S & Müller-Hill B (2010) High local concentration: a fundamental strategy of life. J. Mol. Biol. 395, 242–253.

CAPÍTULO 9 9-1 Falso. Embora não seja possível ver o DNA por microscopia óptica na ausência de um corante, os cromossomos são claramente visíveis por microscopia de contraste de fase ou por contraste de interferência diferencial de Nomarski quando

28   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. eles se condensam durante a mitose. Os cromossomos humanos condensados têm mais de 1 µm de largura, bem acima do limite de resolução de 0,2 µm. 9-2 Verdadeiro. Comprimentos de onda mais longos correspondem a energias mais baixas. Como parte da energia é perdida durante a absorção e reemissão, o fóton emitido é sempre de baixa energia (comprimento de onda mais longo) do que o fóton absorvido. 9-3 Na lente seca, a porção da luz que ilumina é refletida internamente na interface entre a lâmina de cobertura e o ar. Em contraste, na lente de imersão no óleo, não existe interface pois o vidro e o óleo de imersão têm o mesmo índice de refração; ainda, nenhuma luz é perdida na reflexão interna. Em essência, a lente de imersão no óleo aumenta a largura do cone de luz que alcança a objetiva, o que é uma limitação-chave na resolução. 9-4 A principal refração no olho humano ocorre na interface entre o ar (índice de refração 1,00) e a córnea (índice de refração 1,38). Por causa das pequenas diferenças no índice de refração entre a córnea e a lente e entre a lente e o humor vítreo, a lente serve como um ajuste fino para o foco no olho humano. 9-5 Os humanos enxergam pouco embaixo da água porque o índice de refração da água (1,33) é muito próximo ao da córnea (1,38), eliminando, assim, a principal força refratária da córnea. Óculos melhoram a visão embaixo da água, pois colocam ar em frente à córnea, restaurando a diferença normal nos índices refratários nessa interface. A imagem ainda é distorcida pelas mudanças no índice de difração nas interfaces água-vidro e vidro-ar dos óculos, mas a distorção é pequena o bastante para que a imagem ainda possa ser focada na retina, permitindo-nos ver corretamente. 9-6 Resolução se refere à habilidade de ver dois objetos pequenos como entidades separadas, que é limitada pelo comprimento de onda da luz utilizada para ver os objetos. Magnificação se refere ao tamanho da imagem em relação ao tamanho do objeto. É possível magnificar uma imagem para um tamanho maior arbitrário. É importante lembrar que a magnificação não altera o limite da resolução. 9-7 Anticorpos marcados fluorescentemente e anticorpos marcados com enzimas possuem a vantagem de amplificar o sinal inicial fornecido pela ligação do anticorpo primário. Para os anticorpos secundários marcados fluorescentemente, a amplificação normalmente é de algumas vezes; para os anticorpos ligados a enzimas, a amplificação pode ser de mais de mil vezes. Embora a amplificação extensiva torne os métodos ligados a enzimas muito sensíveis, a difusão do produto da reação (muitas vezes um precipitado colorido) para longe da enzima limita a resolução espacial. 9-8 Os comprimentos de onda nos quais o cromóforo é excitado e nos quais ele emite luz fluorescente depende bastante do seu ambiente molecular. Utilizando uma variedade de procedimentos de mutagênese e seletivos, os investigadores geraram proteínas fluorescentes mutantes que fluorescem na faixa visível. Essas proteínas fluorescentes modificadas possuem uma variedade de aminoácidos diferentes em torno do cromóforo, que sutilmente influenciam sua capacidade de interagir com a luz. Referência: Service RF (2004) Immune cells speed the evolution of novel proteins. Science 306, 1457. 9-9 O aumento na FRET depende da fosforilação da proteína, uma vez que nenhum aumento ocorre na ausência da proteína Abl ou ATP, ou quando o fosfato é removido por uma tirosina-fosfatase (ver Figura Q9-4B). Assim, a fosforilação deve fazer CFP e YFP se aproximarem. Uma possível explicação é que a adição de um

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   29 (A) NÃO FOSFORILADA

Figura R9-1  Alteração conformacional na proteína-repórter FRET após fosforilação da tirosina.

(B) FOSFORILADA

434 nm 476 nm

434 nm

P

FR ET

CF

Cinase + ATP

CF

P

Peptídeo substrato

Fosfatase

YF

P

526 nm YFP

Proteína de ligação à fosfotirosina

P

fosfato à tirosina no substrato permite que o segmento da proteína altere sua conformação para se ligar ao domínio adjacente de ligação da fosfotirosina, diminuindo a separação dos domínios CFP e YFP (Figura R9-1).

CAPÍTULO 10 10-1 Verdadeiro. O interior hidrofóbico da bicamada lipídica atua como uma barreira contra a passagem dos grupos das cabeças lipídicas hidrofílicas que devem ocorrer durante o flip-flop. O custo energético desse movimento efetivamente impede o flip-flop dos lipídeos e raramente ocorre na ausência de catalisadores específicos, conhecidos como translocadores fosfolipídicos. 10-2 Falso. O carboidrato na membrana interna é direcionado para longe do citosol em direção ao lúmen de um compartimento ligado à membrana interna. Lembre-se que o lúmen de um compartimento interno é topologicamente equivalente ao lado externo da célula. 10-3 Falso. Além das balsas lipídicas, que são microdomínios com composição lipídica distinta, as superfícies apicais e basolateral das células epiteliais, que são separadas por meio das junções compactas intercelulares, também possuem composição lipídica distinta. 10-4 As mesmas forças que ditam que determinados lipídeos irão formar bicamadas, em vez de micelas, atuam no reparo do desgaste da bicamada. O desgaste irá regenerar de forma espontânea, porque a bicamada possui uma organização mais favorável energeticamente. Os lipídeos que formam a bicamada têm forma cilíndrica e, portanto, não formam micelas (ou uma hemimicela) facilmente, que requerem lipídeos em forma de cone. 10-5 O óleo vegetal é convertido em margarina por meio da redução das ligações duplas (pela hidrogenação), que converte os ácidos graxos insaturados em saturados. Essa alteração permite que as cadeias de ácidos graxos nas moléculas lipídicas se arranjem mais compactamente uma contra a outra, aumentando a viscosidade, transformando o óleo em margarina. 10-6 Uma balsa de 70 nm de diâmetro terá uma área de 3,8 × 103 nm2 (3,14 × 352), e uma molécula lipídica de 0,5 nm de diâmetro terá uma área de 0,20 nm2 (3,14 × 0,252). Portanto, haverá cerca de 19 mil moléculas lipídicas por monocamada de balsa (3,8 × 103/0,20 = 19.000) e cerca de 38 mil moléculas na bicamada da balsa. A uma taxa de 50 lipídeos por proteína, a balsa acomodaria cerca de 760 moléculas de proteína. A verdadeira proporção de lipídeo e proteína em uma balsa não é conhecida. 10-7

A. A sequência A é o segmento de a-hélice que atravessa a membrana da glicoporina, uma proteína transmembrana dos eritrócitos. Ela é composta, predominan-

30   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. temente, por aminoácidos hidrofóbicos, embora não contenha os aminoácidos polares não carregados treonina (T) e serina (S), os quais não são comuns em a-hélices que atravessam a membrana. Não é provável que a sequência B seja um segmento que atravesse a membrana porque contém três prolinas (P), as quais perturbariam uma α-hélice e, portanto, exporiam os grupos polares ao ambiente hidrofílico da bicamada lipídica. A sequência C também não deve ser um segmento transmembrana porque contém três aminoácidos carregados, o ácido glutâmico (E), a arginina (R) e o ácido aspártico (D), cuja presença na bicamada lipídica hidrofóbica seria energeticamente desfavorável. 10-8 A sugestão de seu amigo é baseada em uma importante diferença entre o avesso e o direito (externo) das vesículas. Vesículas com contaminação no lado externo terão um carboidrato exposto e, portanto, devem ser retidas na coluna de afinidade com lectina. Por outro lado, as vesículas do avesso não terão carboidratos expostos e deverão passar pela coluna. 10-9 Os domínios transmembrana que são compostos somente por cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos obviamente não podem interagir por meio de ligações de hidrogênio ou atrações eletrostáticas, as duas maneiras mais importantes de ligar proteína de modo não covalente. Mesmo assim, elas podem interagir especificamente por meio de atrações de van der Waals. Se suas superfícies são complementares, elas podem se encaixar suficientemente bem para fazer inúmeros contatos de van der Waals, que podem mantê-las unidas. Entretanto, deve-se observar que o segmento transmembrana da glicoporina contém poucos aminoácidos polares que podem participar no processo de dimerização. 10-10 As proteínas citosólicas que se ligam à membrana podem induzir protrusões na membrana de várias maneiras. Por exemplo, uma proteína que se liga a uma superfície côncava da membrana, em vez de uma superfície convexa, apresentada na Figura Q10-2B, iriam flexionar a membrana induzindo a protrusão. Alternativamente, uma proteína que liga fosfolipídeos com grupos de cabeças pequenas na camada citosólica da membrana, em vez de grupos de cabeças grandes como apresentado na Figura Q10-2C, ou que removem os grupos de cabeças dos fosfolipídeos, induzirão uma curvatura côncava na membrana, originando a protrusão. Quanto ao terceiro método de curvatura da membrana apresentado na Figura Q10-2A – inserindo um segmento de proteína na camada citosólica –, é difícil visualizar como esse mecanismo pode ser usado para induzir uma protrusão. Referência: Prinz WA & Hinshaw JE (2009) Membrane-bending proteins. Crit. Ver. Biochem. Mol. Biol. 44:278-291.

CAPÍTULO 11 11-1 Verdadeiro. Os transportadores ligam moléculas específicas e sofrem uma série de mudanças conformacionais para mover a molécula ligada através de uma membrana. Eles podem transportar passivamente a favor do gradiente eletroquímico ou podem associar as mudanças conformacionais a uma fonte de energia metabólica, como a hidrólise de ATP, para realizar o transporte ativo. Por outro lado, canais formam poros aquosos que podem ser abertos ou fechados, mas sempre transportam a favor do gradiente, ou seja, passivamente. Canais interagem muito mais fracamente com o soluto a ser transportado, e eles não sofrem mudanças conformacionais para realizar o transporte. Como consequência, o transporte através de canais não pode ser associado a uma fonte de energia e é sempre passivo.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   31 11-2 Falso. Transportadores e canais saturam. Acredita-se que os íons permeáveis devam perder a maioria de suas moléculas de água associadas a fim de passar, em fila única, através do filtro de seletividade, a parte mais estreita do canal. Esse requisito limita sua velocidade e taxa de passagem. Assim, conforme as concentrações de íons aumentam, o fluxo de íons através de um canal aumenta proporcionalmente, mas então os níveis saturam em uma taxa máxima. 11-3 Verdadeiro. Uma diferença de apenas um pequeno número de íons é suficiente para o estabelecimento de um potencial de membrana. 11-4 A ordem é: CO2 (pequena e não polar) > etanol (pequena e levemente polar) > 21 H2O (pequena e polar) > glicose (grande e polar) > Ca (pequena e com carga) > RNA (muito grande e altamente carregado). Esta lista ilustra muito bem as duas propriedades básicas que regem a capacidade de difusão das moléculas através de uma bicamada lipídica: tamanho (pequena > grande) e polaridade (apolar > polar > carregada). 11-5 A distribuição de equilíbrio de uma molécula através de uma membrana depende do gradiente químico (concentração) e do gradiente elétrico (potencial de membrana). Uma molécula não carregada não sofrerá a ação do gradiente elétrico e, portanto, estará em equilíbrio quando sua concentração estiver igual em ambos os lados da membrana. Uma molécula carregada responde a ambos os componentes do gradiente eletroquímico e sua distribuição ocorrerá de acordo 1 com esses princípios. Os íons de K , por exemplo, estão próximos à sua distribuição de equilíbrio através da membrana plasmática, mesmo se considerando que eles são aproximadamente 30 vezes mais concentrados no interior da célula. A diferença de concentração é balanceada pelo potencial de membrana (negativo no interior), que se opõe ao movimento de cátions para o exterior da célula. 11-6

1 1 A. Sim, eles podem normalizar tanto a concentração de H quanto de Na . Para 1 1 1 1 cada três ciclos do antiportador Na -H , que importa um Na e exporta um H , a 1 1 1 bomba de Na -K cicla uma vez, exportando três íons Na em cada operação. (Você pode ter se perguntado como lidar com a hidrólise de ATP que ocor1 1 re a cada ciclo da bomba de Na -K . Quando o ATP é hidrolisado pela H2O, os – – produtos são ADP e H2PO4 . H2PO4 tem um pK de 6,86, o que significa que apro1 2– ximadamente 70% dele será ionizado em HPO4 e H no pH intracelular de 7,2. 1 Acontece que você não precisa se preocupar com esse H , pois, em outros pontos na célula, outros processos reconvertem os produtos da hidrólise novamente em ATP para manter uma concentração em equilíbrio).



1 1 B. A ação associada dessas duas bombas movimenta 3H para fora para cada 2K que são trazidos para dentro da célula, aumentando, dessa forma, tanto a con1 centração interna de K quanto o potencial de membrana.

11-7 De acordo com as barras de escala da Figura Q11–1, cada microvilosidade equivale a um cilindro de aproximadamente 0,1 μm de diâmetro e 1,0 μm de altura. A proporção da área dos lados de um cilindro, que representa a nova membrana (nova área de superfície), em relação à parte superior de um cilindro (que é equivalente à membrana plasmática que estaria presente de qualquer forma, caso não tivessem sido formadas as microvilosidades), fornece o aumento da área de superfície devido a uma microvilosidade individual. A área das laterais de um 2 cilindro (2πra, onde r é o raio e a é a altura) é de 0,31 μm (2 × 3,14 × 0,05 μm × 1,0 2 2 2 μm); a área do topo do cilindro (πr ) é igual a 0,0079 μm (3,14 × [0,05] ). Assim, 2 o aumento na área de superfície para uma microvilosidade é 0,31 μm /0,0079 2 μm ou 40 vezes. Esse valor é uma superestimativa do aumento para a membrana plasmática inteira, no entanto, as microvilosidades ocupam apenas uma parte

32   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. da superfície. A fração da membrana plasmática ocupada por microvilosidades pode ser estimada a partir do corte transversal da Figura Q11-1. Uma estimativa conservadora é que cerca de metade da membrana plasmática seja recoberta por microvilosidades. Assim, as microvilosidades aumentam a área da superfície em contato com o lúmen do intestino em aproximadamente 40/2 ou 20 vezes. Referência: Adaptado de Krstic′ RV (1997) Ultrastructure of the Mammalian Cell, p. 207. Berlin, Germany: Springer-Verlag. 11-8 Assim como um corpo em queda livre atinge uma velocidade final dependente do atrito, um íon em água também atinge uma velocidade final dependente do atrito com as moléculas de água. Um íon na água irá acelerar por menos de 10 nanossegundos antes que atinja a velocidade final. 4

3

11-9 O volume da semiesfera (ou hemisfério) explorado pela bola é de 2,05 × 10 nm 3 –20 ([2/3] × 3,14 × [21,4 nm] ). Este volume corresponde a 2,05 × 10 litros ([2,05 × 4 3 7 3 3 10 nm ] × [cm/10 nm] × [litro/1.000 cm ]). Uma bola neste volume corresponde –5 –20 23 a 8,13 × 10 M ou 81,3 μM ([1 molécula/2,05 × 10 litros] × [mol/6 × 10 moléculas]). Assim, a concentração local de uma bola amarrada é aproximadamente a mesma concentração de peptídeo livre necessária para inativar o canal. Referência: Zagotta WN, Hoshi T & Aldrich RW (1990) Restoration of inactivation in mutants of shaker potassium channels by a peptide derived from ShB. Science 250, 568–570. 1

11-10 O potencial de membrana esperado devido a diferenças na concentração de K através da membrana em repouso é

Para o Na1, um cálculo equivalente dá um valor de 148 mV. A suposição de que o potencial de membrana deve-se exclusivamente ao 1 K leva a um valor próximo ao do potencial de repouso. A suposição de que o 1 potencial de membrana deve-se exclusivamente ao Na leva a um valor próximo ao do potencial de ação. Esses pressupostos aproximam-se aos potenciais de repouso e de ação por1 1 que o K é principalmente responsável pelo potencial de repouso e o Na é responsável pelo potencial de ação. Uma membrana em repouso é cem vezes mais 1 1 1 permeável ao K do que é ao Na devido à presença de canais de escape de K 1 (ou canais de vazamento). Os canais de escape permitem que K saia da célula até que o potencial de membrana suba o suficiente para se opor ao gradiente de 1 concentração de K . O gradiente máximo teórico (com base em cálculos como os 1 apresentados anteriormente) é relativamente reduzido pela entrada de Na , que carrega cargas positivas para a célula (compensando a perda das cargas positivas 1 1 1 1 pela saída de K ). Se não fosse a bomba de Na -K , que remove Na continuamente, o potencial de repouso da membrana seria completamente dissipado. 1 O potencial de ação é devido a um canal diferente, um canal de Na controlado por voltagem. Esses canais são abertos quando a membrana é estimulada, 1 permitindo que os íons de Na penetrem na célula. A magnitude do potencial de 1 membrana resultante é limitada pela diferença nas concentrações de Na através 1 da membrana. O influxo de Na reverte o potencial de membrana localmente, o 1 que abre canais de Na adjacentes e, em última instância, faz um potencial de ação propagar a partir do sítio original de estímulo. Referência: Hille B (1992) Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd ed., pp. 23–58. Sunderland, MA: Sinauer.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   33 11-11

A. Existem dois tipos de canais de cátion na membrana das células musculares de ratos – um canal de 4 pA e um canal de 6 pA. É possível afirmar isso devido às quantidades características de corrente que eles carreiam. Observe que um canal de 6 pA não pode ser confundido com a abertura simultânea de dois canais de 4 pA, pois isso geraria uma corrente de 8 pA.



1 B. O número de íons Na que flui através de um canal de 4 pA a cada milissegundo 4 4 1 é de 2,5 × 10 . O canal de 6 pA carrega 1,5 vezes este valor (3,8 × 10 íons de Na ) a cada milissegundo.

Referência: Sakmann B (1992) Elementary steps in synaptic transmission revealed by currents through single ion channels. Science 256, 503–512.

CAPÍTULO 12 12-1 Falso. O interior do núcleo e do citosol comunicam-se por meio de complexos do poro nuclear, que permitem a passagem de íons e de pequenas moléculas. O citoplasma e o núcleo são ditos topologicamente equivalentes porque as membranas interna e externa do núcleo são contíguas uma com a outra, então o fluxo do material entre o núcleo e citosol ocorre sem passagem pela bicamada lipídica. Em contrapartida, o lúmen do RE e o exterior da célula são cada um separados do citosol por uma camada de membrana. Portanto, eles são topologicamente diferentes do citosol, mas topologicamente equivalentes um ao outro. 12-2 Verdade. Todos os ribossomos começam a tradução dos mRNAs no citosol. Os mRNAs para certas proteínas codificam uma sequência-sinal para a membrana do RE. Tão logo essa sequência-sinal tenha sido sintetizada, ela dirige a proteína nascente, juntamente com ribossomos e mRNA, para a membrana do RE. Ribossomos traduzindo mRNAs que não possuem tal sequência permanecem livres no citosol. 12-3 Falso. Poros nucleares individuais medeiam o transporte em ambas as direções. Não está claro como os poros coordenam essas duas vias de tráfego para evitar colisões. 12-4 Falso. Todas as células eucarióticas contêm peroxissomos. 12-5 Na ausência de sinal de endereçamento, uma proteína permanecerá no citosol. 12-6 Se o equivalente a 1 membrana plasmática transita o RE a cada 24 horas e proteínas de membrana individuais permanecem no RE a cada 30 minutos (0,5 hora), então a qualquer momento, 0,021 (0,5 h/24 h) equivalentes de membrana plasmática estão presentes no RE. Uma vez que a área da membrana do RE é 20 vezes maior que a área da membrana plasmática, a fração de proteínas da membrana plasmática no RE é 0,021/20 = 0,001. Assim, a razão de proteínas da membrana plasmática para outras proteínas de membrana no RE é de 1 para 1.000. A cada 1.000 proteínas da membrana do RE apenas 1 está sendo dirigida para a membrana plasmática. Como esse cálculo ilustra, o endereçamento de proteínas para a membrana plasmática representa uma purificação substancial da mistura de proteínas do RE. 12-7

A. A porção de nucleoplasmina responsável pela localização no núcleo deve estar localizada na cauda. A cabeça de nucleoplasmina não se localiza no núcleo

34   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. quando injetada no citoplasma, sendo o único componente injetável em que está faltando uma cauda.

B. Esses experimentos sugerem que a cauda da nucleoplasmina carrega um sinal de localização nuclear e que seu acúmulo no núcleo não é resultado de difusão passiva. Observações envolvendo nucleoplasminas completas ou caudas de nucleoplasminas não fazem distinção entre difusão passiva e importação ativa; elas apenas dizem que a cauda carrega a parte importante da nucleoplasmina – seja isso um sinal de localização ou um sítio de ligação. As observações-chave que argumentam contra a difusão passiva estão nos resultados com as cabeças de nucleoplasminas. Elas não difundem para o citoplasma quando são injetadas no núcleo, nem difundem para o núcleo quando injetadas no citoplasma, sugerindo que cabeças são muito grandes para passar através de poros nucleares. Uma vez que a forma de maior massa da nucleoplasmina, contendo a cauda, passa através de poros, a difusão passiva foi descartada. Referência: Dingwall C, Sharnick SV & Laskey RA (1982) A polypeptide domain that specifies migration of nucleoplasmin into the nucleus. Cell 30, 449-458.

12-8 Cada complexo do poro nuclear deve transportar cerca de 1 molécula de histona a cada segundo, em média, ao longo de um dia:

Porque as histonas são sintetizadas e importadas para o núcleo apenas durante a fase S, o que dura normalmente cerca de 8 horas, a taxa de transporte está por volta de 3 histonas a cada segundo por poro, durante a fase S (e nada durante o resto do ciclo celular). 12-9 A. A concentração das repetições FG nos poros nucleares de levedura está em torno de 289 mM, quase 6 vezes mais alta que concentrações usadas in vitro. Assim, a concentração dentro do poro certamente é suficiente para permitir a formação do gel. O volume de um poro nuclear de levedura (v = πr2a) é 28,8 × 103 nm3 (3,14 × [35 nm/2]2 [30 nm] = 28,849 nm3); 5.000 repetições de FG nesse volume corresponde a uma concentração de 289 mM.



B. Com um coeficiente de difusão de 0,1 μm2/s, demoraria cerca de 4,5 ms para a fusão importina-MBP-GFP atravessar o poro nuclear da levedura.

Essa taxa de difusão parece rápida o bastante para satisfazer as necessidades biológicas e corresponde razoavelmente bem com taxas de 5 a 10 ms medidas para a importação de várias proteínas através de poros nucleares. Referências: Frey S & Görlich D (2007) A saturated FG-repeat hydrogel can reproduce the permeability properties of nuclear pore complexes. Cell 130, 512–523.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   35 Frey S & Görlich D (2009) FG/FxFG as well as GLFG repeats form a selective permeability barrier with self-healing properties EMBO J. 28, 2554–2567. 12-10 Células normais que carregam o gene Ura3 modificado produzem uma forma da proteína Ura3 que é importada para a mitocôndria. Por consequência, ela não está disponível para realizar uma reação essencial na via metabólica da síntese da uracila. Essas células se comportam como se não tivessem a enzima em nenhuma forma, e irão crescer apenas quando o meio for suplementado com uracila. Em contraste, em células que são defectivas para importação mitocondrial, Ura3 é impedida de entrar na mitocôndria e permanece no citosol onde pode funcionar normalmente na via da síntese da uracila. Assim, células com defeitos em importação para a matriz mitocondrial podem crescer na ausência de uracila, pois podem sintetizá-la. Referência: Maarse AC, Blom J, Grivell LA & Meijer M (1992) MPI1, an essential gene encoding a mitochondrial membrane protein, is possibly involved in protein import into yeast mitochondria. EMBO J. 11, 3619–3628. 12-11 A ligação de metotrexato ao sítio ativo impede a enzima de se desenovelar, o que é necessário para a importação para a mitocôndria. Evidentemente, o metotrexato liga-se tão firmemente que bloqueia a enzima em sua conformação dobrada e impede proteínas chaperonas de desenovelá-las. Referência: Eilers M & Schatz G (1986) Binding of a specific ligand inhibits import of a purified precursor protein into mitochondria. Nature 322, 228–232. 12-12 Os poros formados por porinas são grandes o suficiente para todos os íons e intermediários metabólicos, mas não o são para muitas proteínas. O ponto de corte para passagem livre através dos poros de porinas mitocondriais é de mais ou menos 10 quilodáltons. 12-13 Como mostrado na Figura R12-1, seria de se esperar que a eliminação do primeiro segmento transmembrana (tornando-o hidrofílico) desse origem a uma proteína com o segmento N-terminal no citosol (não glicosilado), mas com todos os outros segmentos transmembrana, na sua orientação original. Na proteína não modificada, o primeiro segmento transmembrana serve como um sinal de início de transferência, orientado de modo a fazer o segmento N-terminal passar através da membrana do RE. O próximo segmento transmembrana também é um sinal de início de transferência, mas orientada de modo que ele passe o fragmento C-terminal da proteína através da membrana até alcançar o próximo segmento transmembrana, que serve como um sinal de parada de transferência. Dois pares a mais de sinais de início e parada similarmente orientados, originam a disposição final. A eliminação do primeiro sinal de início de transferência permitiria que o segundo sinal de início de transferência iniciasse a transferência. A disposição DISPOSIÇÃO ORIGINAL

NOVA DISPOSIÇÃO NH 2

COOH

COOH 1

3

5

3

1

5 CITOSOL

CITOSOL

LÚMEN DO RE 2 NH 2

4

6

LÚMEN DO RE 2

4

6

Figura R12-1  Disposição da proteína transmembrana de passagem múltipla original e a nova proteína após o primeiro segmento hidrofóbico ser convertido em um segmento hidrofílico.

36   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. dos aminoácidos carregados que flanqueiam o sinal poderia orientá-lo na membrana, assim, sua terminação positivamente carregada fica para o citosol, justamente como na proteína inicial. Começaria, então, a transferência do segmento C-terminal, tal como acontece na proteína original não modificada. 12-14 A simetria dos fosfolipídeos nos dois folhetos da membrana do RE é gerada por um translocador de fosfolipídeos, chamado scramblase, que rapidamente inverte fosfolipídeos de todos os tipos de um lado para o outro entre as monocamadas da bicamada. Como ele inverte fosfolipídeos indiscriminadamente, os diferentes tipos de fosfolipídeos tornam-se igualmente representados na membrana interna e externa da bicamada; assim, eles se tornam simetricamente distribuídos. A membrana plasmática contém um tipo diferente de fosfolipídeo translocador, que é específico para fosfolipídeos que contém grupos amino livres (fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina). Essas enzimas removem esses fosfolipídeos específicos do folheto externo e transferem para o interno da membrana plasmática, gerando, assim, uma distribuição assimétrica.

CAPÍTULO 13 13-1 Verdadeiro. Os folhetos citosólicos das duas bicamadas da membrana são os primeiros a entrarem em contato e fundirem-se, seguidos pelos folhetos não citosólicos. É esse padrão de fusão de folhetos que mantém a topologia das proteínas de membrana, de forma que os domínios proteicos que estão face ao citosol permanecem sempre dessa forma, independentemente do compartimento que ocupam. 13-2 Verdadeiro. Uma proteína mal enovelada é seletivamente retida no RE pela ligação de proteínas chaperonas como a BiP e a calnexina. Somente depois de ser liberada desta proteína chaperona – e assim aprovada como propriamente enovelada – é que a proteína se torna substrato de saída do RE. 13-3 Verdadeiro. As cadeias de oligossacarídeos são adicionadas nos lúmens do RE e do aparelho de Golgi, que são topologicamente equivalentes ao exterior da célula. Essa topologia básica é conservada em todos os eventos de brotamento e de fusão de membrana. Assim, as cadeias de oligossacarídeos estão sempre topologicamente fora da célula, seja por estarem em um lúmen ou na superfície da célula. 13-4 Se o fluxo de membranas entre os compartimentos celulares não fosse balanceado em uma célula hepática que não está em divisão, alguns compartimentos cresceriam em tamanho e outros encolheriam (na ausência de síntese de nova membrana). Manter todos os compartimentos relativamente do mesmo tamanho é essencial para o funcionamento adequado de uma célula hepática. A situação é diferente em uma célula em crescimento como uma célula do epitélio intestinal. No curso de um único ciclo celular, todos os compartimentos devem duplicar o tamanho para gerar duas células-filhas. Assim, haverá um desequilíbrio em favor do fluxo para o exterior, que será suportado pela síntese de nova membrana em quantidade igual à soma total de toda a membrana celular. 13-5 As SNAREs celulares são todas ligadas à superfície citosólica em qualquer membrana que estejam. Elas funcionam por justaposição às superfícies citosólicas de duas membranas a serem fundidas. Em contraste, um vírus envelopado precisa se fundir com a membrana celular trazendo sua superfície externa para junto da superfície externa da membrana da célula. Assim, os vírus envelopados não podem usar as SNAREs de uma célula porque elas estão localizadas no lado errado da membrana. É por essa razão que os vírus envelopados possuem suas próprias proteínas de fusão, que estão situadas apropriadamente na sua superfície externa.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   37 13-6 O volume de um cilindro de 1,5 nm de diâmetro e 1,5 nm de altura é 2,65 nm3 2 –24 3 7 3 (3,14 × [0,75 nm] × 1,5 nm), que é igual a 2,65 × 10 L × (2,65 nm × [cm/10 nm] 3 3 × [L/10 cm ]). Há cerca de 88 moléculas de água nesse volume.

Em cada monocamada em um círculo de membrana de 1,5 nm de diâmetro, há 2 2 cerca de 9 fosfolipídeos (PL) (3,14 × [0,75 nm] × [PL/0,2 nm ] = 8,8 PL). Assim, há cerca de 5 moléculas de água por fosfolipídeo na área de aproximação íntima das duas membranas. Esse número é um pouco menos do que a metade do número (10-12) estimado que esteja associado a grupos de cabeças de fosfolipídeos em circunstâncias normais. Isso significa que quando uma vesícula e sua membrana-alvo são unidas em preparação para a fusão, algo em torno de um pouco mais da metade das moléculas de água que normalmente se ligam às membranas devem ser espremidas para fora. Referência: Meuse CW, Krueger S, Majkrzak CF, Dura JA, Fu J, Connor JT & Plant AL (1998) Hybrid bilayer membranes in air and water: infrared spectroscopy and neutron reflectivity studies. Biophys. J. 74, 1388–1398. 13-7 Para gerar a atividade máxima da fosfatase alcalina, vesículas de cada linhagem devem portar tanto t-SNAREs como v-SNAREs (ver Figura Q13-2B, experimento 1). Se cada vesícula não tiver v-SNAREs ou t-SNAREs, a atividade da fosfatase alcalina é reduzida a 30 a 60% do máximo (ver experimentos 3, 4, 6, 7, 8 e 9). Se em ambas as vesículas está faltando v-SNAREs (ver experimento 2) ou t-SNAREs (ver experimento 5), a atividade da fosfatase alcalina é muito baixa, assim como quando ambas as SNAREs não estão presentes em uma vesícula (ver experimentos 10 e 11). Para um nível de fusão razoáveis, SNAREs complementares devem estar presentes nas vesículas. Não importa que tipo de SNARE esteja em vesículas da linhagem A, desde que as vesículas da linhagem B tenham a SNARE complementar (compare os experimentos 3 e 4, experimentos 6 e 7 e experimentos 8 e 9). Você pode ter pensado por que há uma atividade basal baixa de fosfatase, mesmo onde não é esperada a fusão (ver experimentos 2, 5, 10 e 11). Se novas vesículas devem quebrar, liberando pequenas quantidades de pró-Pase e protease, então uma pequena quantidade de fosfatase alcalina pode ser gerada na ausência de fusão de vesículas. Referência: Nichols BJ, Ungermann C, Pelham HRB, Wickner WT & Haas A (1997) Homotypic vacuolar fusion mediated by t- and v-SNAREs. Nature 387, 199–202. 13-8 A PDI modificada estaria localizada fora da célula. Se a PDI estivesse perdendo o sinal para recuperação do RE, seu fluxo gradual para fora do RE ao aparelho de Golgi não seria contraposto pela sua captura e retorno ao RE, como normalmente ocorre. Semelhantemente, seria esperado que ela saísse do aparelho de Golgi pela via padrão, misturada com outras proteínas que a célula estivesse secretando. Não seria esperado que fosse retida em nenhum outro lugar ao longo da via secretora porque, presumivelmente, ela não tem sinais que promovam sua localização. Referência: Munro S & Pelham HR (1987) A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell 48, 899–907. 13-9 O receptor de KDEL se liga aos seus ligantes mais fortemente no aparelho de Golgi, onde ele captura proteínas que escaparam do RE, para que ele possa retorná-las. O receptor se liga aos ligantes mais fracamente no RE, de forma que aquelas proteínas que foram capturadas no aparelho de Golgi possam ser liberadas à me-

38   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. dida que retornam ao RE. Acredita-se que a base para as diferentes afinidades de ligação são as leves diferenças de pH; o lúmen do aparelho de Golgi é levemente mais ácido do que o do RE, que é neutro. Uma vez que o trabalho primário do receptor de KDEL é capturar proteínas que escaparam do RE, seria razoável projetar um sistema de forma que os receptores se encontrassem em maior concentração no aparelho de Golgi. Isso é, de fato, a forma como ocorre na célula. Você estaria correto se previu que o receptor de KDEL não tem um sinal clássico de recuperação para o RE; além de tudo, o receptor é designado a passar a maior parte do seu tempo no aparelho de Golgi, e um sinal clássico garantiria seu retorno eficiente ao RE. Ele tem, entretanto, um sinal de recuperação “condicional”; com a ligação de uma proteína do RE no aparelho de Golgi, sua conformação é alterada para que um sítio de ligação para as subunidades de COPI fique exposto. Esse sinal permite que ele seja incorporado em vesículas revestidas por COPI, que são destinadas a retornar ao RE. Referência: Teasdale RD & Jackson MR (1996) Signal-mediated sorting of membrane proteins between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 27–54. 13-10 As enzimas lisossômicas são todas hidrolases ácidas, que têm atividade ótima em pH baixo (cerca de 5,0) no interior dos lisossomos. Se um lisossomo se partisse, as hidrolases ácidas se encontrariam em pH 7,2, o pH do citosol, e, portanto, fariam pouco dano aos constituintes celulares. 13-11 As proteínas adaptadoras, em geral, medeiam a incorporação de proteínas-carga específicas em vesículas revestidas por clatrina pela ligação do revestimento de clatrina aos receptores de carga específicos. Como os melanossomos são lisossomos especializados, é razoável que o defeito na AP3 afete a via para entrega de grânulos de pigmento da rede trans de Golgi, que envolve as vesículas revestidas por clatrina. A AP3 se localiza para as vesículas revestidas brotando da rede trans de Golgi, o que é consistente com uma função em transporte do Golgi para os lisossomos. Interessantemente, humanos com o distúrbio genético síndrome de Hermansky-Pudlak apresentam mudanças semelhantes na pigmentação, e eles também têm problemas de sangramento e fibrose pulmonar. Acredita-se que todos esses sintomas reflitam deficiências na produção de lisossomos especializados, que resultam de um único defeito bioquímico. References: Kantheti P, Qiao X, Diaz ME, Peden AA, Meyer GE, Carskadon SI, Kapfhamer D, Sufalko D, Robinson MS, Noebels JL & Burmeister M (1998) Mutation in AP-3 delta in the mocha mouse links endosomal transport to storage deficiency in platelets, melanosomes, and synaptic vesicles. Neuron 21, 111–122. Zhen L, Jiang S, Feng L, Bright NA, Peden AA, Seymour AB, Novak EK, Elliott R, Gorin MB, Robinson MS & Swank RT (1999) Abnormal expression and subcellular distribution of subunit proteins of the AP-3 adaptor complex lead to platelet storage pool deficiency in the pearl mouse. Blood 94, 146–155.

CAPÍTULO 14 14-1 Verdadeiro. Embora os três complexos enzimáticos respiratórios possam existir como entidades independentes na membrana mitocondrial interna, as transferências de elétrons entre os três complexos mediada pelos dois carreadores móveis – ubiquinona e citocromo c – são facilitadas pela formação de uma estrutura maior. 14-2 Verdadeiro. As subunidades c agem como dentes em uma roda de engrenagem. Quando o suprimento de prótons é limitado, como nas mitocôndrias, há menos subunidades do que quando o gradiente de próton é alto, como nos cloroplastos.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   39 14-3 Verdadeiro. A herança de genomas organelares é muito diferente da herança de genes nucleares, que é governada pelas regras mendelianas. É improvável que um padrão de herança que não siga as regras mendelianas seja devido a um gene nuclear, que deixa os genomas organelares – os únicos outros genomas da célula. 14-4 Na presença do oxigênio, a levedura pode gerar cerca de 15 vezes mais ATP a partir de cada molécula de glicose na ausência de oxigênio. Assim, para alcançar suas necessidades energéticas, elas precisam processar cerca de 15 vezes menos moléculas de glicose; por isso a queda dramática no consumo de glicose quando o O2 é introduzido. 14-5 O coração levaria 6 segundos para consumir seus níveis basais de ATP. Como cada par de elétrons reduz um átomo de oxigênio, os 12 pares de elétrons gerados pela oxidação de uma molécula de glicose reduziriam seis O2. Assim, 30 ATPs são gerados para cada seis O2 consumidos. No estado basal, a taxa de produção de ATP se iguala à taxa de consumo. O tempo em segundos necessário para consumir o nível de ATP basal é

14-6 Os íons H1 se movem muito mais rápido que os íons Ca21através de uma solu1 ção aquosa porque seu “movimento” é virtual; o íon H que aparece em um lado 1 da célula não é o mesmo que começou no outro lado. O movimento do íon H , em vez disso, depende de trocas das ligações de hidrogênio por ligações cova21 lentes em uma cadeia de moléculas de água. Em contraste, os íon Ca devem realmente se difundir através do meio. A diferença na natureza dos movimentos desses dois íons não pode ser mais bem ilustrada do que pelo seu comportamento no gelo. Como esperado, 21 a taxa de difusão dos íons Ca diminui de forma considerável. Surpreendente1 mente, os íons H se movem ainda mais rápido. Isso ocorre porque o movimento 1 do H depende das cadeias das moléculas de água. No gelo, a maioria das mo1 léculas de água estão ligadas em cadeias, permitindo que os íons H se movam muito rapidamente por longas distâncias. Na água líquida, as cadeias envolvem apenas poucas moléculas de água, o que significa que há atrasos periódicos con1 forme os íons H3O se conectam com uma nova cadeia. 14-7 As taxas de oxidação dos carreadores de elétrons, se medidas suficientemente rápido, revelam sua ordem na cadeia respiratória. Os carreadores mais próximos do oxigênio serão oxidados primeiro, e aqueles mais longe do oxigênio serão oxidados por último. Essa lógica permite que você deduza a ordem do fluxo de elétrons através dos carreadores. Os citocromos b e c1 são parte da citocromo c redutase, e os citocromos a e a3 são parte da citocromo oxidase.

14-8 Apenas nas quantidades certas um desacoplador, como o dinitrofenol, promoveria a perda de peso por desacoplar parcialmente o fluxo de elétrons da síntese de ATP, diminuindo, dessa forma, a eficiência da fosforilação oxidativa. Por exemplo, se desacoplador suficiente for ingerido para reduzir a eficiência da fosforilação oxidativa em 50%, o dobro de calorias (da comida ou de reservas internas, principalmente gordura) teriam que ser queimadas para gerar a mesma quantidade de ATP. O dinitrofenol não é mais prescrito porque seu uso levou a diversas mortes; se a cadeia fosforilativa for comprometida demais, não será gerado ATP suficiente para suprir as funções celulares essenciais, e a morte é o resultado.

40   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. 14-9 O número de prótons na matriz de uma mitocôndria de fígado em respiração ativa em pH 7,5 (3,16 × 10–8 M H1) é cerca de 10.

Se a matriz da mitocôndria começou em pH 7 (10–7 M H1), ela originalmente tinha cerca de 31 prótons (31,4). Assim, para alcançar o pH de 7,5, seria necessário bombear cerca de 21 prótons para fora. Esses são resultados notáveis. Independentemente das características de tamanho e valores exatos de pH das mitocôndrias, está claro que somente algumas dezenas de prótons estão normalmente envolvidas em estabelecer a força motriz protônica. Mais do que qualquer coisa, esses resultados enfatizam a natureza dinâmica do bombeamento de prótons e a síntese de ATP. 4-10 1

A. Presumivelmente, a hidrólise de uma molécula de ATP individual proporciona a força motriz para a rotação de 120° da subunidade γ, consequentemente, a revolução correspondente ao filamento de actina. Uma vez que uma baixa concentração de ATP foi utilizada nestes experimentos, as pausas representam os tempos variáveis com que a molécula de ATP seguinte se liga. A rotação através de 120° corresponde a um dímero αβ, a unidade de hidrólise do ATP (ou de síntese na direção normal da ATP sintase).



B. Se três moléculas de ATP devem ser hidrolisadas para direcionar uma rotação completa da subunidade γ, então, na sua operação normal, a ATP sintase deve sintetizar três moléculas de ATP por rotação da subunidade γ. Referência: Masaike T, Mitome N, Noji H, Muneyuki E, Yasuda R, Kinosita K & Yoshida M (2000) Rotation of F1-ATPase and the hinge residues of the β subunit. J. Exp. Biol. 203, 1–8.

4-11 1

A. A energia de um mol de fótons em qualquer comprimento de onda em particular é a energia de um fóton multiplicado pelo número de Avogadro (N). Assim, a energia de um mol de fótons no comprimento de onda de 400 nm é

Esse cálculo, para os comprimentos de onda de 680 nm e 800 nm, resulta em E = 175 kJ/mol para luz a 680 nm E = 149 kJ/mol para luz a 800 nm

B. Se 1 metro quadrado recebe 1,3 kJ/s de luz a 680 nm, que equivale a 175 kJ/mol de fótons, então o tempo que levará para que 1 metro quadrado receba um mol de fótons é



C. Se leva 135 segundos para que 1 metro quadrado de folhas de tomateiro receba 1 mol de fótons, e oito fótons são necessários para fixar uma molécula de CO2, levará quase 2 horas para sintetizar 1 mol de glicose.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   41

A eficiência real da captura de fótons é consideravelmente menor que 100%. Sob condições ideais, para algumas plantas de crescimento rápido, a eficiência de utilização dos fótons que alcançam as folhas é cerca de 5%. Entretanto, mesmo este valor exagera bastante a eficiência verdadeira de utilização da energia da luz solar. Por exemplo, um campo de beterrabas converte apenas cerca de 0,02% da energia que chega a ele durante a temporada de crescimento. Muitos fatores limitam a eficiência total, incluindo a saturação dos fotossistemas muito abaixo da luz solar máxima, disponibilidade de água e baixas temperaturas.

D. Em contraste à eficiência muito baixa da utilização da luz solar, a eficiência de conversão da energia luminosa em energia química após a captação dos fótons é de 33%.

14-12 Os prótons bombeados através da membrana da crista para dentro do espaço da crista podem sair para o espaço intermembranas, que se equilibra com o citosol, 1 um grande reservatório de H . Ambos a matriz mitocondrial (pH 8) e o citosol (pH 7,4) sediam várias reações metabólicas que requerem um pH ao redor da 1 neutralidade. A maior diferença na concentração de H entre a matriz mitocondrial e o citosol que é compatível com o funcionamento é, então, relativamente pequena (menos que 1 unidade de pH). Muito da energia armazenada no gradiente eletroquímico mitocondrial é, em vez disso, devida ao potencial de membrana (cerca de 140 mV dos 200 mV da diferença de potencial é devido ao potencial de membrana). Em contraste, os cloroplastos possuem um compartimento dedicado me1 nor – o espaço tilacoide – para o qual os íons H são bombeados. Diferenças de concentração muito maiores são alcançadas (mais de três unidades de pH), e quase toda a energia armazenada no gradiente eletroquímico tilacoide é devido à diferença entre o estroma e o espaço tilacoide. 14-13 A variegação ocorre porque as plantas possuem uma mistura de cloroplastos normais e defeituosos. Eles se separaram pela segregação mitótica para formar regiões verdes e amarelas nas folhas. Muitas das regiões verdes possuem células que ainda mantêm os cloroplastos defeituosos em adição aos normais. À medida que tais regiões crescem, elas podem segregar células adicionais que possuem somente cloroplastos defeituosos, originando, com a divisão celular, uma ilha de células amarelas em um mar de verdes. Em contraste, as regiões amarelas são devido a células que mantiveram apenas cloroplastos defeituosos. Assim, as células amarelas não podem originar células verdes pela segregação mitótica; por isso, não há ilhas verdes cercadas de amarelas.

CAPÍTULO 15 15-1 Falso. A maioria dos segundos mensageiros, incluindo o AMP cíclico, Ca21 e IP3, são hidrossolúveis e se difundem livremente pelo citosol; contudo segundos mensageiros como o diacilglicerol são lipossolúveis e se difundem no plano da membrana. 15-2 Falso. As proteínas que se ligam a GTP estão ativas quando ligadas ao GTP e inativas quando o GDP está ligado a elas; assim, as GEFs as ativam e as GAPs as

42   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. inativam. O mesmo não é verdade para proteínas-cinase e fosfatase. A ligação de um fosfato ativará algumas proteínas-alvo e inativará outras. De fato, a ligação de um fosfato a um determinado local na proteína pode ativá-la, enquanto a fosforilação em um local diferente pode inativar a mesma proteína. Assim, enquanto as proteínas-cinase acionam o comutador molecular, não o fazem sempre no mesmo sentido. 15-3 Verdadeiro. As vias de sinalização intracelular que envolvem enzimas ou canais iônicos podem amplificar significativamente o sinal. Uma vez ativada, uma proteína-cinase, por exemplo, pode fosforilar centenas de proteínas-alvo. De modo similar, a ativação de um canal iônico aumenta, em muitas vezes, a concentração de um íon crítico. 15-4 Falso. A interação com o ligante normalmente faz o receptor tirosina-cinase se organizar em dímeros, os quais, devido à sua proximidade, ativam os domínios cinase. Os receptores então fosforilam a si mesmos e iniciam a cascata de sinalização intracelular. Em alguns casos, o receptor da insulina, por exemplo, existe na forma de dímero e acredita-se que a interação com o ligante rearranje suas cadeias, promovendo a aproximação dos domínios cinase. 15-5 Verdadeiro. As tirosinas-fosfatase, ao contrário das serinas-treoninas-fosfatase, removem os grupos fosfato somente de fosfotirosinas selecionadas em um subgrupo de proteínas fosforiladas nas tirosinas. 15-6 Falso. Embora exista alguma sobreposição nas moléculas de comunicação célula-célula em animais e plantas, existem muitas diferenças significativas. Por exemplo, as plantas não usam as proteínas da família dos receptores nucleares, Ras, JAK, STAT, TGFβ, Notch, Wnt ou Hedgehog. 15-7 A uma concentração circulante de hormônio igual a 10–10 M, 1% dos receptores –10 –10 –8 terá uma molécula de hormônio ligada {[R-H]/[R]total = 10 M/(10 M 1 10 M) = 0,0099}. Metade dos receptores terá uma molécula do hormônio ligada quando a –8 –8 concentração do hormônio for igual ao Kd; ou seja, a 10 M {[R-H]/[R]total = 10 M/ –8 –8 (10 M 1 10 M) = 0,5}. Assim, a concentração do hormônio tem que aumentar cem vezes para provocar uma resposta. 15-8

A. Uma conversa telefônica é análoga à sinalização sináptica no sentido de ser uma comunicação privada entre duas pessoas, normalmente a alguma distância e algumas vezes a uma grande distância. Ela difere da sinalização sináptica porque é (geralmente) uma troca de duas vias, enquanto a sinalização sináptica é uma comunicação unilateral.



B. Uma conversa em um coquetel é análoga à sinalização parácrina, que ocorre entre células (indivíduos) diferentes e é localmente restrita.



C. Um anúncio na rádio é análogo a um sinal endócrino, que é enviado para todo o corpo (a audiência), e somente células-alvo (indivíduos que estão sintonizando a estação de rádio específica) são afetadas por ele.



D. Falar consigo mesmo é análogo a um sinal autócrino, que é um sinal enviado e recebido pela mesma célula.

15-9 Em ambos os casos, as próprias via de sinalização são rápidas. Se a via modifica uma proteína que já está presente na célula, sua atividade é alterada imediatamente, conduzindo a uma resposta rápida. Se a via modifica a expressão de um gene, contudo, existe um retardo correspondente ao intervalo de tempo para que

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   43 o mRNA e a proteína sejam sintetizados e para que os níveis celulares da proteína sejam suficientemente alterados para evocar uma resposta, o que pode demorar 1 hora ou mais. 15-10 Células com receptores idênticos podem responder de maneira diferente à mesma molécula de sinalização devido a diferenças na maquinaria interna à qual os receptores estão acoplados. Mesmo quando toda a via de sinalização for a mesma, as células apresentam respostas diferentes se expressarem proteínas efetoras diferentes no ponto final das vias. 15-11 A fosforilação/desfosforilação oferece uma solução, simples e universal, ao problema do controle da atividade proteica. Em uma via de sinalização, as atividades de várias proteínas devem ser modificadas rapidamente do estado ativo para inativo, e vice-versa. A ligação de um fosfato carregado negativamente a uma proteína é uma maneira efetiva de alterar sua conformação e atividade. E, é uma modificação facilmente reversível. É uma solução universal no sentido de que uma atividade – a da proteína-cinase – pode ser usada para ligar um fosfato, e uma segunda atividade – a da proteína-fosfatase – pode ser usada para removê-lo. Cerca de 2% dos genes do genoma humano que codificam proteínas codificam proteínas-cinase, que presumivelmente surgem por duplicação e modificação gênicas para criar a especificidade adequada. Uma vez que as serinas, treoninas e tirosinas são aminoácidos comuns na superfície das proteínas, as proteínas-alvo podem evoluir para possuir sítios de fosforilação em locais que alterarão sua conformação. Finalmente, fosforilação/desfosforilação proporciona uma resposta flexível que pode ser ajustada para promover respostas rápidas do tipo liga-desliga ou mudanças de duração mais longa. Todos esses atributos da fosforilação/desfosforilação são perdidos com os reguladores alostéricos. Embora seja possível, em princípio, que pequenas moléculas ativem e inativem proteínas, isto não é uma solução universal. Moléculas específicas têm que ser “projetadas” para cada proteína-alvo, o que requer o desenvolvimento de uma via metabólica para a síntese e degradação de cada molécula reguladora. Mesmo que tal sistema seja desenvolvido para uma proteína-alvo, esta solução específica não será útil no desenvolvimento de um sistema para outras proteínas-alvo. Além disso, a regulação por interação com moléculas pequenas é muito sensível à concentração do regulador. Para uma proteína-alvo monomérica, a concentração da molécula pequena deveria aumentar em cem vezes para ir de 9% de ligação a 91% – um comutador molecular mínimo. Poucos metabólitos na célula variam em quantidade de forma tão ampla. 15-12 O uso de uma proteína de suporte para ligação das três cinases em um complexo de sinalização aumenta a velocidade de transmissão do sinal e elimina interferências em outras vias; contudo existe uma chance relativamente pequena de amplificação do sinal do receptor para a terceira cinase. As cinases difusíveis livremente oferecem a chance de maior amplificação do sinal uma vez que a primeira cinase pode fosforilar muitas moléculas da segunda cinase, que, por sua vez, pode fosforilar muitas moléculas da terceira cinase. É provável que a velocidade de transmissão do sinal seja mais lenta, a menos que a concentração das cinases seja suficientemente alta para compensar a distância entre elas. Finalmente, três cinases oferecem o potencial para disseminar o sinal para outras vias de sinalização e para outras partes da célula. A organização utilizada por uma célula para uma via de sinalização específica depende da atividade que essa via deve executar. 15-13

1. Se mais de uma molécula efetora precisa se ligar para ativar a molécula-alvo, a resposta estará na dependência do número de moléculas efetoras necessárias. Em baixas concentrações do efetor, a maioria das proteínas-alvo pos-

44   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. suem um único efetor ligado (estando, por isso, inativas). Em concentrações aumentadas do efetor, as proteínas-alvo com o número necessário de efetores ligados aumenta bruscamente, produzindo um aumento abrupto correspondente na resposta celular.

RESPOSTA GRADUAL

RESPOSTA “TUDO OU NADA”



2. Se o efetor ativa uma enzima e inibe outra que catalisa a reação inversa, a reação direta responde abruptamente a um aumento gradual na concentração do efetor. Essa é uma estratégia comum utilizada em vias metabólicas envolvidas na produção e no consumo de energia.



3. Os mecanismos anteriormente citados geram respostas abruptas, mas a resposta “tudo ou nada” verdadeira pode ser gerada se a molécula efetora desencadear um circuito de retroalimentação positiva no qual uma molécula-alvo ativada contribui para sua própria ativação adicional. Por exemplo, se o produto de uma enzima ativada se liga à enzima para ativá-la, será produzida uma resposta “tudo ou nada” autoaceleradora.

MAP-cinase ativa (%)

100

50

0

0,001 0,01 0,1 1 Progesterona ( µ M)

10

Figura R15-1  Resposta gradual ou resposta “tudo ou nada” em ovócitos individuais que geram, na população, uma resposta gradual.

15-14 A análise de ovócitos individuais de rã mostra claramente que a resposta à progesterona é do tipo “tudo ou nada”, sem nenhuma ativação parcial da MAP-cinase. Assim, a resposta gradual na população resulta de uma resposta “tudo ou nada” nos ovócitos individuais, com diferentes misturas de ovócitos imaturos com totalmente maduros, com a geração de níveis intermediários de ativação da MAP-cinase. (Figura R15-1). Não está muito claro porque os ovócitos individuais respondem de modo diferente a diferentes concentrações de progesterona, embora exista uma variabilidade significativa em termos de idade e tamanho entre os ovócitos (e provavelmente no número de receptores de progesterona, nas concentrações dos componentes do módulo de sinalização da MAP-cinase e nos alvos). Se uma resposta gradual em uma população de células indica uma resposta gradual em cada célula ou uma mistura de respostas “tudo ou nada” é uma questão que surge em muitos contextos na biologia. Referência: Ferrell JE & Machleder EM (1998) The biochemical basis of an all-ornone cell fate switch in Xenopus oocytes. Science 280, 895–898. 15-15 Qualquer mutação que gere uma subunidade reguladora incapaz de se ligar à subunidade catalítica produzirá uma PKA permanentemente ativa. Quando a subunidade catalítica não está ligada à subunidade reguladora, ela é ativa. Dois tipos gerais de mutação na subunidade reguladora podem produzir uma PKA permanentemente inativa. Uma subunidade reguladora que tenha sido alterada de forma que possa se ligar à subunidade catalítica, mas não possa se ligar ao AMP cíclico, não liberará a subunidade catalítica, produzindo uma PKA permanentemente inativa. De modo semelhante, uma subunidade reguladora mutante que possa se ligar ao AMP cíclico, mas não sofre a mudança de conformação necessária para liberar a subunidade catalítica, inativará permanentemente a PKA. 15-16 O tempo que a subunidade catalítica da cinase permanece na sua conformação ativa depende da extensão das modificações nas suas subunidades reguladoras. Cada modificação por fosforilação ou por ligação ao Ca21 desloca o equilíbrio para a conformação ativa da subunidade; isto é, cada modificação aumenta o tempo de permanência no estado ativo. Pela soma das informações de múltiplas vias dessa forma, a fosforilase-cinase integra o sinal que controla a degradação do glicogênio. 1 5-17 As células das moscas com o genótipo heterozigoto DshΔ/1 provavelmente produz a metade da quantidade normal de Dishevelled. Assim, uma superexpressão dessa proteína corrige o fenótipo multi-hair gerado pela superexpressão de Frizzled. Essa relação sugere que Frizzled age em uma etapa anterior a

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   45 Dishevelled; é fácil imaginar como a subexpressão de um componente que age em uma etapa posterior pode corrigir a superexpressão de um que age em uma etapa anterior. Tudo isso faz sentido, já que Frizzled é um receptor de Wnt e Dishevelled é uma proteína de sinalização intracelular. Entretanto, se você não sabe nada sobre a função de Dishevelled e de Frizzled, será possível, somente com a interação genética como guia, imaginar relações mais complexas (que envolvam outros componentes desconhecidos) com Dishevelled agindo em uma etapa anterior a Frizzled que podem explicar os fenótipos apresentados neste problema. Veja se você pode esquematizar semelhante via. Referência: Winter CG, Wang B, Ballew A, Royou A, Karess R, Axelrod JD & Luo L (2001) Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton. Cell 105, 81–91.

CAPÍTULO 16 16-1 Verdadeiro. Quando o ATP nos filamentos de actina (ou o GTP nos microtúbulos) é hidrolisado, grande parte da energia livre liberada pela clivagem da ligação de alta energia é armazenada na estrutura do polímero, fazendo a energia livre do polímero que contém ADP ser maior do que a do polímero contendo ATP. Isso desloca o equilíbrio rumo à despolimerização, e os filamentos de actina que contém ADP se dissociam mais facilmente do que os filamentos de actina que contém ATP. 21 21 16-2 Falso. A entrada de Ca através dos canais de Ca sensíveis à voltagem em túbulos T não é suficiente, por si só, para provocar a rápida contração do músculo. 21 21 Em vez disso, essa explosão inicial de Ca abre canais de liberação de Ca do re21 tículo sarcoplasmático, que inundam o citoplasma com Ca , iniciando a rápida contração muscular através da ligação à troponina C.

16-3 Falso. O centrossomo, que estabelece o principal arranjo de microtúbulos na maior parte das células animais, controla a nucleação do crescimento de microtúbulos na extremidade menos (-). Assim, as extremidades mais (+) dos microtúbulos estão próximas da membrana plasmática e as extremidades menos (-) estão ligadas ao centrossomo, no centro da célula. Essa orientação do arranjo requer que motores direcionados para as extremidades mais (+) sejam utilizados para o transporte de carga para a periferia da célula e que motores direcionados para a extremidade menos (-) sejam utilizados para a entrega de cargas no centro da célula. 16-4 Nas células, a maior parte das subunidades de actina está ligada à timosina, o que bloqueia a actina em uma forma que não pode hidrolisar seu ATP ligado e não pode ser adicionada a qualquer das extremidades de um filamento. A timosina reduz a concentração das subunidades de actina livres para próximo da concentração crítica. As subunidades de actina são recrutadas a partir desse conjunto inativo pela profilina, cuja atividade é regulada de modo que a polimerização da actina ocorre quando e onde é necessário. A vantagem de tal disposição é que a célula pode manter um grande conjunto de subunidades disponíveis para um crescimento explosivo no local e momento de sua escolha.

3,6

1,0 Disco Z

1,6

1,0 I

2,2

2,0

II

III 1,6

IV

16-5 Esquemas representando os sarcômeros referentes a cada uma das setas da Figura Q16-1 são mostrados na Figura R16-1. Como ilustrado nestas imagens, o aumento na tensão com a diminuição do comprimento do sarcômero no segmento I é devido ao aumento do número de interações entre as cabeças da miosina e a actina. No segmento II, a actina começa a sobrepor-se à zona sem miosina, atingindo um patamar em que o número de cabeças de miosina que interagem permanece constante. No segmento III, os filamentos de actina começam a se so-

1,3

Figura R16-1  Diagramas esquemáticos de sarcômeros nos pontos indicados pelas setas da Figura Q16-1.  Os números referem-se ao comprimento em micrômetros.

46   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. brepor uns aos outros, interferindo na excelente interação da actina e da miosina e provocando uma diminuição na tensão. No segmento IV, o espaçamento entre os discos Z é menor do que o comprimento dos filamentos espessos da miosina, causando sua deformação e uma queda abrupta da tensão muscular. Referência: Gordon AM, Huxley AF & Julian FJ (1966) The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres. J. Physiol. 184, 170–192. 16-6 A velocidade de crescimento de 2 mm/min (2.000 nm/60 s = 33 nm/s) corresponde à adição de 4,2 dímeros de αβ-tubulina ([33 nm/s] × [αβ-tubulina/8 nm] = 4,17 dímeros/s) para cada um dos 13 protofilamentos, ou cerca de 54 dímeros de αβ-tubulina/s às extremidades de um microtúbulo. Referência: Detrich HW, Parker SK, Williams RC, Nogales E & Downing KH (2000) Cold adaptation of microtubule assembly and dynamics. J. Biol. Chem. 275, 37038–37047. 16-7 Uma vez que a primeira associação lateral tenha ocorrido, o próximo dímero αβ pode se ligar muito mais facilmente porque é estabilizado por contatos tanto laterais quanto longitudinais (Figura R16-2). A formação de um segundo protofilamento estabiliza ambos os protofilamentos, permitindo a rápida adição de novos dímeros de αβ-tubulina para formar protofilamentos adjacentes e para estender os protofilamentos já existentes. Em um dado momento, o conjunto de tubulina se recurvará em tubo para formar o microtúbulo. Referência: Leguy R, Melki R, Pantaloni D & Carlier M-F (2000) Monomeric g-tubulin nucleates microtubules. J. Biol. Chem. 275, 21975–21980. 16-8 O centrossomo nucleia um arranjo tridimensional estrelado de microtúbulos que cresce até encontrar um obstáculo, em última análise, a membrana plasmática. A instabilidade dinâmica dos microtúbulos, acoplada à exigência de igualdade de força entre microtúbulos em oposição, leva como resultado, ao posicionamento do centrossomo no meio da célula. Uma forma de imaginar a questão de forças iguais e opostas é lembrar que os microtúbulos não são estruturas absolutamente rígidas. Imagine-se empurrando um objeto com uma haste de aço curta ou com uma haste muito longa; a haste curta transmite a força de forma eficaz, mas a haste longa irá se curvar, transmitindo menos força. O mesmo princípio opera na célula, com microtúbulos de igual comprimento transmitindo a mesma força. Quando todos os microtúbulos em direções opostas provenientes de um centrossomo tiverem o mesmo comprimento, o centrossomo estará no centro da célula. 16-9

A. O movimento unidirecional da cinesina sobre um microtúbulo é conduzido pela energia livre da hidrólise do ATP. A ligação e a hidrólise do ATP são acopladas a uma CRESCIMENTO LINEAR

Figura R16-2  Adição rápida de dímeros de αβ-tubulina à estrutura em nucleação (Resposta 16-7).

ASSOCIAÇÃO LATERAL

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   47 série de alterações conformacionais na cabeça da cinesina que resultam no deslocamento unidirecional dos domínios motores da cinesina sobre o microtúbulo.

B. No traçado, a cinesina percorre 80 nm em 9 segundos, uma velocidade média de cerca de 9 nm/s. Essa velocidade é cerca de cem vezes mais lenta do que a velocidade in vivo, pois as condições experimentais (concentração de ATP e força exercida pelo padrão de interferência) foram ajustadas para retardar os movimentos da cinesina para que passos individuais pudessem ser observados.



C. Como pode ser visto na Figura Q16-3B, foram necessários 10 passos para a molécula de cinesina percorrer 80 nm, o que indica que o comprimento de um passo individual é de cerca de 8 nm.



D. Visto que o comprimento do passo e o intervalo entre as subunidades de β-tubulina sobre um protofilamento de microtúbulos são ambos de aproximadamente 8 nm, uma cinesina parece se mover saltando de uma β-tubulina para a próxima ao longo do protofilamento. Considerando que a cinesina tem dois domínios que podem se ligar à β-tubulina, ela provavelmente mantém um domínio ancorado enquanto lança o outro domínio para a próxima β-tubulina – como uma pessoa que percorre um caminho pavimentado, saltando de pedra em pedra.



E. Os dados da Figura Q16-3B não contêm informação sobre o número de moléculas de ATP hidrolisadas. Outros experimentos realizados por esses mesmos pesquisadores sugerem que a hidrólise de um ATP não provoca múltiplos passos. Ao diminuir as concentrações de ATP para retardar o movimento sobre o microtúbulos, os pesquisadores mostraram o mesmo tipo de padrão de movimento ilustrado na Figura Q16-3B, embora em uma escala de tempo mais longa. Se a hidrólise de um único ATP pudesse causar vários passos, seria esperado um agrupamento de passos nestas condições experimentais. Nenhum desses experimentos exclui a possibilidade de necessidade de hidrólise de mais de uma molécula de ATP para cada passo. Referência: Svoboda K, Schmidt CF, Schnapp BJ & Block SM (1993) Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature 365, 721–727.

16-10 A mitocôndria é cerca de 12 vezes mais rápida. Ela se move a 106 comprimentos corporais por dia. O nadador se move a 100 comprimentos corporais/1,75 min, ou seja, 8,2 × 104 comprimentos de corpo por dia. 16-11 A cofilina liga-se preferencialmente à actina-ADP. Quando a cofilina se liga a filamentos de actina contendo ADP, ela introduz tensão no filamento pela torção desse filamento, o que torna o filamento mais fácil de ser quebrado e torna mais fácil a dissociação das subunidades actina-ADP. Visto que a polimerização é mais rápida do que a hidrólise de ATP, as subunidades recentemente adicionadas são resistentes à despolimerização por cofilina. Assim, a cofilina dissocia de maneira eficiente os filamentos mais velhos na célula, pois eles contêm mais subunidades de actina-ADP. 16-12 As unidades fundamentais – as subunidades solúveis – dos três tipos de filamentos são a base para as suas diferenças de polaridade. As unidades fundamentais para os filamentos de actina (um monômero de actina) e para os microtúbulos (ab-tubulina) apresentam polaridade – têm extremidades distintas – e, assim, formam um polímero com extremidades diferentes quando estão ligados. Por outro lado, a unidade fundamental dos filamentos intermediários é um tetrâmero simétrico com extremidades idênticas. Assim, quando essas subunidades estão ligadas entre si, as extremidades do filamento resultante também são idênticas. 16-13 O movimento unidirecional de um lamelipódio é resultado da nucleação e do crescimento dos filamentos de actina na borda anterior da célula e da despolimerização

48   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. da rede de actina antiga mais distal. A cofilina desempenha um papel fundamental na diferenciação entre os filamentos de actina novos e os antigos. Visto que a cofilina se liga cooperativa e preferencialmente a filamentos de actina contendo ADP, os filamentos mais recentes na borda anterior, que contém actina-ATP, são resistentes à despolimerização mediada por cofilina. Conforme os filamentos envelhecem e a hidrólise de ATP prossegue, a cofilina pode, de maneira eficiente, dissociar os filamentos mais velhos. Assim, a hidrólise de ATP é a base para um mecanismo que mantém um processo de rolamento unidirecional e eficiente no lamelipódio.

CAPÍTULO 17 17-1 Falso. Embora um número de células equivalentes em um ser humano adulto seja substituído a cada três anos, nem todas as células são substituídas na mesma taxa. As células do sangue e células que revestem o intestino são substituídas a uma taxa elevada, enquanto as células na maioria dos órgãos são substituídas mais lentamente, e neurônios são raramente substituídos. 17-2 Verdadeiro. Se o comprimento do ciclo celular fosse mais curto do que é preciso para a célula dobrar de tamanho, a célula ficaria progressivamente menor com cada divisão; se fosse mais longo, as células ficariam cada vez maiores. 17-3 Verdadeiro. O complexo de reconhecimento da origem tem função de organização estrutural na origem da replicação em células eucarióticas, em torno das quais outras proteínas são agrupadas e ativadas para iniciar a replicação de DNA. 17-4 Falso. Forças iguais e opostas que puxam os cromossomos em direção aos dois polos do fuso tenderiam a posicioná-los em localizações aleatórias entre os polos. A força em direção aos polos em cada cromossomo se opõe por uma força de ejeção polar que empurra a partir do cromossomo para fora dos polos. A força de ejeção é mediada por motores de cinesinas controlados por extremidades mais (1) nos braços de cromossomos que interagem com microtúbulos interpolares e transportam os cromossomos para longe dos polos do fuso. Esse equilíbrio de forças tende a posicionar os cromossomos no ponto médio entre polos à placa metafásica. 17-5 Falso. No início da meiose, cada célula diploide contém dois conjuntos de homólogos: um da mãe e outro do pai. Durante a meiose, esses dois conjuntos de homólogos são variados aleatoriamente para que os espermatozóides e óvulos tenham um conjunto de homólogos, mas cada um deles vai ser uma mistura de homólogos paternos e maternos. 17-6 Falso. A senescência (envelhecimento) do organismo é distinta da senescência de células replicativas, que ocorre na ausência da telomerase. Acredita-se que o envelhecimento dependa em grande parte do dano oxidativo progressivo a macromoléculas. Estratégias para reduzir o metabolismo, por exemplo, restrição calórica, diminuem a produção de espécies reativas de oxigênio, e pode estender o tempo de vida dos animais em experimentos. 17-7 As enzimas, na maioria das reações metabólicas, funcionam isoladamente; isto é, a sua competência enzimática não depende de interações críticas com outras proteínas. Assim, desde que a enzima se enovele adequadamente e a sua pequena molécula substrato esteja presente, a reação prosseguirá. Por outro lado, as proteínas do ciclo celular devem interagir com muitas outras proteínas para formar os complexos que são críticos para a progressão coordenada do ciclo celular. A capacidade de várias proteínas do ciclo celular humano de interagir com componentes de levedura implica que as superfícies de ligação responsáveis por

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   49 essas interações foram preservadas através de mais de um bilhão de anos de evolução. Isso é notável.

B. As distribuições de fluorescência para células tratadas com agentes que bloqueiam o ciclo celular em G1, as fases S e M são mostradas na Figura R17-1B, C, e D. As células bloqueadas tanto em G1 ou em M formam distribuições concentradas porque todos as células têm a mesma quantidade de DNA (diploide para G1 e para tetraploide para M). As células tratadas com um inibidor que bloqueia em fase S dá origem a uma distribuição bifásica. As células que se encontravam em fase S no momento em que o inibidor foi adicionado, mostraram uma distribuição ampla porque as células são distribuídas através de todas as fases de replicação. As células que estavam em outras fases do ciclo celular, no entanto, acumularam-se no início da fase S, gerando um pico individual com um teor de DNA muito próximo daquele de células G1.

17-9 Coesinas devem estar presentes durante a fase S somente enquanto o DNA está sendo replicado para que cromátides-irmãs possam ser identificadas de maneira confiável pela maquinaria celular que os une. Uma vez que as cromátides-irmãs estejam separadas, é impossível para uma proteína não específica de ligação a DNA, como a coesina, identificar quais cromossomos são irmãos. E seria praticamente impossível para qualquer proteína distinguir cromátides-irmãs de cromossomos homólogos. Se cromátides-irmãs não forem mantidas ligadas após a sua formação, elas podem não ser precisamente segregadas para duas células-filhas durante a mitose. Referência: Uhlmann F & Nasmyth K (1998) Cohesion between sister chromatids must be established during DNA replication. Curr. Biol. 8, 1095–1101. 17-10 A dose de cafeína necessária para interferir com o mecanismo do ponto de verificação da replicação do DNA é muito maior do que o montante absorvido mesmo para os bebedores mais excessivos de cafés e colas. A concentração de cafeína em uma xícara de café é de cerca de 3,4 mM.

Uma vez que a concentração em uma xícara é menor do que os 10 mM necessários para interferir no mecanismo do ponto de verificação de replicação do DNA, você não pode obter uma maior concentração bebendo-a e diluindo-a no volume de água do corpo. Se você assumir, para efeitos de cálculo, que a cafeína não é metabolizada ou excretada (mas que todo o líquido é), então você pode perguntar quantas xícaras de café que você precisaria beber (a 100 mg de cafeína por copo) para atingir uma concentração de 10 mM em 40 L de água do corpo. A resposta é: você precisaria beber 784 xícaras de café! 17-11 Há 46 cromossomos humanos, cada um com dois cinetocoros, um para cada cromátide-irmã; assim, há 92 cinetocoros em uma célula humana em mitose.

Número de células

G2 + M S

0

1

2

1

2

1

2

(B) Número de células



A. As relações entre a fluorescência e a posição de células no ciclo celular estão indicadas na Figura R17-1A. Como a Hoechst 33342 liga-se ao DNA, a fluorescência celular é proporcional ao conteúdo de DNA. O pico com a menor fluorescência corresponde a células em G1, que são diploides. O pico com a maior fluorescência corresponde a células em G2 e M, que tenham terminado a replicação e são tetraploides (e, portanto, têm o dobro da fluorescência das células G1). As células na fase S, que estão replicando seu DNA, estão entre diploides e tetraploides e, portanto, têm níveis intermediários de fluorescência.

0 (C) Número de células



G1

0 (D) Número de células

17-8

(A)

0 1 2 Fluorescência relativa por célula

Figura R17-1  Relações entre fluorescência e ciclo celular.  (A) Distribuição de células fluorescentes entre as fases do ciclo celular para uma população normal de células em divisão. (B) Uma população de células bloqueadas em G1. (C) Uma população de células bloqueadas em S. (D) Uma população de células bloqueadas em M.

50   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. 17-12 Prófase (Figura Q17-2E), prometáfase (Figura Q17-2D), metáfase (Figura Q17-2C), anáfase (Figura Q17-2A), telófase (Figura Q17-2F) e citocinese (Figura Q17-2B). 17-13 A alta frequência de trissomia não significa que os cromossomos sejam difíceis de serem segregados. Para uma criança apresentar uma trissomia, duas condições devem ser atendidas. Em primeiro lugar, os cromossomos devem sofrer não disjunção durante a meiose. Em segundo lugar, o complemento do cromossomo do óvulo fertilizado tem que ser suficiente para permitir o desenvolvimento embrionário. A síndrome de Down, que ocorre em uma frequência de 1 indivíduo afetado por 700 nascidos vivos, e a síndrome de Edwards, que ocorre com uma frequência de 1 por 3 mil nascidos vivos, são as trissomias autossômicas mais comuns que satisfazem ambas as condições. A trissomia mais comum envolve o cromossomo 16, que ocorre em mais do que 1% das gestações, mas não é compatível com um desenvolvimento normal. 17-14 Uma vez que a variedade de homólogos é uma escolha binária para cada cromossomo, o número de combinações possíveis é 223, que é 8,4 × 106. Se na recombinação foram permitidas quaisquer posições possíveis entre homólogos, como é, na realidade, o número de combinações possíveis aumentaria imensamente.

CAPÍTULO 18 18-1 Verdadeiro. Tecidos de adultos são mantidos em tamanho constante, desse modo deve haver um balanço entre morte e divisão celular. Se não fosse assim, o tecido iria crescer ou encolher. 18-2 Verdadeiro. O citocromo c medeia sinais da apoptose dentro de células de mamífero – a via intrínseca da apoptose. Isso tem se confirmado diretamente pela geração de fibroblastos de embriões de camundongos (MEFs) deficientes em citocromo c por meio de genética reversa. Embora camundongos nocaute de genes do citocromo c morram aproximadamente na metade da gestação devido a problemas com função mitocondrial, fibroblastos vindos desses embriões podem ser cultivados sob condições especiais e testados para sensibilidade a vários sinais apoptóticos. Eles são resistentes a uma variedade de agentes que induzem a via intrínseca da apoptose. Referência: Li K, Li Y, Shelton JM, Richardson JA, Spencer E, Chen ZJ, Wang X & Williams RS (2000) Cytochrome c deficiency causes embryonic lethality and attenuates stress-induced apoptosis. Cell 101, 389–399. 18-3 A superexpressão de uma proteína secretada que se liga ao ligante Fas poderia proteger células tumorais do ataque de linfócitos matadores. Por meio da ligação ao ligante Fas na superfície de linfócitos matadores, a proteína secretada impediria o ligante Fas de se ligar ao receptor de morte Fas na superfície de células tumorais, isolando-o assim de interações de indução de morte com linfócitos matadores. As proteínas secretadas que ligam ao ligante Fas são comumente conhecidas como receptores de engodo. Elas desempenham um papel normal na modulação da morte induzida pelas interações entre ligante Fas e Fas. Quando células tumorais produzem demasiadamente tais receptores de engodo, elas subvertem seu mecanismo normal em uma defesa contra morte celular mediada por Fas. Referência: Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, Roy M, Kischkel FC, Dowd P, Huang A, Donahue CJ, Sherwood SW, Baldwin DT, Godowski PJ, Wood WI, Gurney AL, Hillan KJ, Cohen RL, Goddard AD, Botstein D & Ashkenazi A (1998) Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Nature 396, 699–703.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   51 18-4 Surpreendentemente, o citocromo c não parece ser necessário para a apoptose em C. elegans. No entanto, mesmo se fosse requerido, mutantes de C. elegans defeituosos para o citocromo c não teriam sido isolados porque não seriam viáveis. O citocromo c é um componente essencial da cadeia transportadora de elétrons na mitocôndria. Sem ele, não seria possível a produção de ATP por fosforilação oxidativa, e tal organismo mutante não poderia sobreviver. Referência: Ellis HM & Horvitz HR (1986) Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell 44, 817–829. 18-5 Após microinjeção de citocromo c, ambos os tipos celulares entram em apoptose. A presença do citocromo c no citosol é um sinal para a montagem dos apoptossomos e eventos posteriores que levam à apoptose. As células que são defeituosas para Bax e Bak não podem liberar citocromo c da mitocôndria em resposta a sinais a montante (upstream), mas não há defeito na parte a jusante (downstream) da via que é disparada por citocromo c no citosol. Assim, a microinjeção sobrepõe os defeitos nas células duplamente deficientes, disparando a apoptose. Referência: Wei MC, Zong W-X, Cheng EH-Y, Lindsten T, Panoutsakopoulou V, Ross AJ, Roth KA, MacGregor GR, Thompson CB & Korsmeyer SJ (2001) Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292, 727–730. -/ 18-6 A retenção de células dos tecidos interdigitais de camundongos Apaf1 indica que Apaf1 é essencial para a apoptose dessas células, presumivelmente em conjunto com citocromo c. A ausência de células interdigitais em camundongos -/Casp9 indica que caspase-9 não é necessária para a apoptose de células de tecidos interdigitais. Essas observações sugerem que Apaf1 poderia ativar uma caspase diferente nessas células além ou invés da caspase-9.

Referência: Earnshaw WC, Martins LM & Kaufmann SH (1999) Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu. Rev. Biochem. 68, 383–424. 18-7 As duas células na Figura Q18-2 liberaram citocromo-c-GFP de todas as suas mitocôndrias dentro de poucos minutos: em 6 minutos para a célula na Figura Q18-2A e em 8 minutos para a célula na Figura 18-2B. O tempo após a exposição da luz UV na qual a liberação ocorreu variou drasticamente para as duas células: após 10 horas para a célula na Figura Q18-2A e após 17 horas para a célula na Figura Q18-2B. Essas observações indicam que células individuais liberam citocromo c de todas as suas mitocôndrias rapidamente, mas essa liberação é disparada em diferentes células em tempos amplamente variados após a exposição aos níveis de luz UV necessários para induzir apoptose. Referência: Goldstein JC, Waterhouse NJ, Juin P, Evan GI & Green DR (2000) The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nat. Cell Biol. 2, 156–162. 18-8

A. Seria esperado que um oitavo dos complexos Fas-ligante Fas nos linfócitos de um indivíduo com SLPA fosse composto inteiramente por subunidades Fas normais. Uma vez que metade das proteínas Fas nos linfócitos é normal e existem três subunidades Fas por complexo, a probabilidade de três subunidades Fas normais 3 estarem juntas em um complexo é ( ) .



B. Em um indivíduo heterozigoto para uma mutação que elimina a expressão de Fas, toda a proteína Fas expressa seria normal; assim, 100% dos complexos Fas-ligantes Fas seria composto inteiramente por subunidades Fas normais. O número total de moléculas Fas, no entanto, seria metade do número presente em um indivíduo com dois genes normais para Fas.

52   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.

C. Mutações Fas associadas com SLPA são dominantes porque reduzem o número de complexos normais de Fas-ligantes Fas por um fator de oito em heterozigotos. As mutações que eliminam a expressão de Fas são recessivas porque reduzem o número de complexos Fas-ligantes Fas por apenas um fator de dois. Referência: Siegel RM, Chan FK-M, Chun HJ & Lenardo MJ (2000) The multifaceted role of Fas signaling in immune cell homeostasis and autoimmunity. Nat. Immunol. 1, 469–474.

CAPÍTULO 19 19-1 Falso. Embora as células possam ser facilmente dissociadas pela remoção do Ca21 do meio externo, é pouco provável que a adesão célula-célula dependente de Ca21 seja regulada por alterações na concentração de Ca21 do ambiente. As células não possuem uma forma de controlar a concentração de Ca21 do seu ambiente. 19-2 Verdadeiro. As barreiras formadas pelas proteínas das junções compactas restringem o fluxo de moléculas entre as células e a difusão das proteínas (e lipídeos) da porção apical até a porção basolateral e vice-versa. 19-3 Falso. A elasticidade das fibras de elastina deve-se à ausência de estrutura secundária. A elastina forma torções aleatórias que são facilmente esticadas. A série de ligações de hidrogênio que estabiliza uma α-hélice é muito forte, no agregado, para que seja rompida pelos tipos de foças que deformam a elastina. 19-4 Verdadeiro. A tensão, um sinal mecânico, aplicada a uma integrina, faz ela se prender ainda mais às estruturas extra e intracelulares, incluindo não somente o citoesqueleto e os componentes da matriz, mas também complexos de sinalização molecular intracelulares. Igualmente, a perda da tensão pode afrouxar a ligação de modo que complexos de sinalização moleculares se separem dos dois lados da membrana. Portanto, a tensão sobre a integrina pode ativar ou inibir a sinalização molecular. 19-5 Essa citação está correta no geral, mas incorreta nos detalhes. Warren Lewis estava tentando chamar a atenção para a importância das propriedades de adesão das células nos tecidos em uma época em que o problema era absolutamente ignorado pelos biólogos. A citação está incorreta porque grande parte do nosso corpo é formada por tecido conectivo, como os ossos e tendões, cuja integridade depende da própria matriz e não das células ali localizadas. Não é fácil dissociar as células de um tecido, como qualquer um pode perceber quando come um pedaço de carne dura. 19-6 Anticorpos IgG contém dois sítios de ligação idênticos, portanto são capazes de ligar duas moléculas que eles reconhecem de forma cruzada (esse é o princípio básico da imunoprecipitação). Se anticorpos inteiros forem usados para bloquear a agregação, eles podem estabelecer ligações cruzadas entre as células, e não inibir a agregação. Por outro lado, fragmentos Fab monovalentes não podem realizar ligações cruzadas entre as células. Eles se ligam às moléculas de adesão, impedindo-as de se ligarem às suas parceiras, prevenindo a agregação celular (Figura R19-1).

TRIPSINA, EDTA

Figura R19-1.  Os fragmentos dos anticorpos Fab boqueiam a adesão celular.

LAVAR, ADICIONAR Fab

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   53 Referência: Beug H, Katz, FE & Gerisch G (1973) Dynamics of antigenic membrane sites relating to cell aggregation in Dictyostelium discoideum. J. Cell. Biol. 56, 647-658. 19-7

A. Mesmo que toda a claudina-4 tenha desaparecido, as células ainda expressam a claudina-1, que não é afetada pela toxina. Usando anticorpos específicos para a claudina-1, os autores mostraram que essa proteína permaneceu intacta nos locais das junções compactas na presença da toxina.



B. Como as junções compactas impedem a penetração das moléculas, a toxina terá acesso somente a um lado da junção. Essa incapacidade de atuar na porção apical sugere que os sítios de ligação da molécula de claudina-4 estão acessíveis somente na porção basolateral. Se a toxina se liga a monômeros, como sugerido anteriormente, então pode ser que os monômeros sejam levados para o domínio basolateral da membrana e, portanto, acessíveis somente naquele local da camada epitelial. Alternativamente, se todas as fitas das moléculas de claudina estiverem orientadas na mesma direção, isto é, com suas superfícies “superiores” voltadas para o lado apical e suas superfícies “anteriores” voltadas para a porção basolateral, como esperado pelo princípio da simetria, então o sítio de ligação da toxina na superfície inferior estará acessível somente pelo lado basolateral. Referência: Sonoda N, Furuse M, Sasaki H, Yonemura S. Katahira J, Horiguchi Y & Tsukita S (1999) Clostridium perfringens enterotoxina fragment removes specific claudins from tight junction strands: evidence for direct involvement of claudins in tight junction barrier. J. Cell. Biol. 147, 194-204.

19-8 Camundongos homozigotos nocaute do gene do nidogênio-1 ou do nidogênio-2 provavelmente não possuem o fenótipo porque as duas formas do nidogênio podem substituir uma a outra. Camundongos homozigotos para a forma mutante da laminina γ-1, que não se liga ao nidogênio, possuem um fenótipo mais grave do que com qualquer um dos nocautes dos genes do nidogênio porque a mutação elimina a capacidade dos dois nidogênios se ligarem à laminina. Assim, esses camundongos não formam uma lâmina basal adequada e morrem ao nascer com graves defeitos renais e nos pulmões. Se essa explicação estiver correta em relação às observações genéticas, então você poderá prever que camundongos homozigotos para os nocautes dos dois genes dos nidogênios apresentarão um fenótipo extremamente grave quando comparado com o mutante da laminina γ-1. Esses camundongos já foram produzidos e realmente apresentaram fenótipos graves. Referência: Sasaki T, Fassler R & Hohenester E (2004) Laminina: the crux of the basement membrane assembly. J. Cell. Biol. 164, 959-963. 19-9 Essa afirmação engloba nosso crescente reconhecimento das diversas funções desempenhadas pela lâmina basal. Embora ela forneça um suporte estrutural para as células que se apoiam sobre ela, a estabilidade mecânica é somente uma das várias funções desempenhadas pela lâmina basal. Por exemplo, durante a regeneração dos músculos ou neurônios motores, a junção neuromuscular é restabelecida baseada na informação contida na lâmina basal. Moléculas especiais presas na lâmina basal, como mensagens em um quadro de avisos, marcam o local das junções e permitem que elas sejam reconstituídas com exatidão. Muitas evidências indicam que processos similares ocorrem durante o desenvolvimento original dos músculos e das junções neuromusculares. Referência: Sanes JR (2003) The basement membrane/basal lamina of skeletal muscle. J. Biol. Chem. 278, 12601-12604. 9-10 O alto nível de ativação quando a alanina foi substituída por D723 na cadeia β, 1 ou por R995 na cadeia α, indica que aqueles resíduos são, de alguma forma, im-

54   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. portantes para manter as integrinas αIIbβ3 em um estado inativo. O experimento de “troca de carga”, que mostrou que a D723R pareada com R995D era tão inativa quanto a forma selvagem, sugere que esses dois resíduos formam uma atração eletrostática, uma ponte salina, que auxilia a manter a integrina αIIbβ3 na sua configuração inativa. Depreende-se disso que a sinalização de dentro para fora, provavelmente é desencadeada pela quebra dessa ponte salina. Referência: Hughes PE, Diaz-Gonzalez F, Leong L, Wu C, McDonald JA, Shattil SJ & Ginsberg MH (1996). Breaking the integrin hinge: A defined structural constraint regulates integrin signaling. J. Biol. Chem. 271, 6571-6574. 1 9-11 A alta densidade de cargas negativas nos componentes polissacarídicos dos proteoglicanos faz as cadeias de açúcares serem estendidas, ocupando um grande volume. As cargas negativas nos proteoglicanos aprisionam uma quantidade equivalente de cátions para manter a neutralidade elétrica. As forças eletrostáticas restringem estas cargas, tanto as cargas negativas fixas dos polissacarídeos quanto os cátions móveis, ao volume ocupado pelo proteoglicano. A concentração das partículas no volume do proteoglicano é maior do que na solução circundante, portanto a água flui para o interior na tentativa de equilibrar as concentrações do interior e do exterior. Assim, os proteoglicanos aprisionam a água para formar um gel hidratado, extraindo moléculas de água por osmose. Na ausência de cargas negativas, as cadeias de açúcar irão ruir em fibras ou grânulos, alterando drasticamente as propriedades da matriz extracelular. 19-12 Como a racemização do l-aspartato para d-aspartato ocorre lentamente, as proteínas de rápida renovação terão baixos níveis de d-aspartato – se é que terão algum. As proteínas que são degradadas e substituídas mais lentamente devem conter alto percentual de d-aspartato, com o nível absoluto dependendo da sua taxa de renovação. O que torna extraordinária as observações sobre a elastina é o modo como os níveis de d-aspartato dependem da idade. Essas observações têm sido interpretadas como um indicativo de que nosso suprimento de elastina para toda a vida é produzido muito cedo e nunca degradado. Além disso, estudos com seres humanos que usaram inadvertidamente marcação metabólica com 14C devido aos testes atmosféricos de armas nucleares, levou à conclusão de que a síntese da elastina ocorre quase exclusivamente na vida fetal e no período pós-natal do desenvolvimento. Experimentos com camundongos comprovaram essa teoria. Referência: Shapiro SD, Endicott SK, Province MA, Pierce JA & Campbell EJ (1991) Marked longevity of human lung parenchymal elastic fibers deduced from prevalence of D-aspartate and nuclear weapons-related radiocarbon. J. Clin. Invest. 87, 1828-1834. 19-13 Se você mergulhar uma alface em água da torneira, ela absorverá a água por osmose e ficará tenra. Se você mergulhar a alface em água salgada ou em água com açúcar sofrerá um efeito contrário, a água sairá da alface ficando ainda mais murcha. A alface de um dia já passou do ponto no qual a fotossíntese poderia auxiliar e a luz irá secá-la ainda mais. 19-14 A 0,1 MPa, a condutividade hidráulica de um único canal de aquaporina é de 4,4 × 10–23 m3/s ([4,4 × 10–22 m3/s Mpa] × 0,1 Mpa = 4,4 × 10–23 m3/s). Portanto, a questão passa a ser quantas moléculas de água estão presentes em 4,4 × 10-23 m3. Há 3,33 × 1028 moléculas de água/m3 ([55,5 mols/L] [103 L/m3] [6 × 1023 moléculas de água/ mol]). Portanto, 1,5 × 106 moléculas de água flui, em um canal de água, a cada segundo com 1 atmosfera de pressão ([4,4 × 10–23 m3/s] [3,33 × 1028 moléculas de água/m3]). Referência: Tyerman Sd, Bohnert HJ, Maurel C, Steudle S & Smith JAC (1999) plant aquaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. J. Exp. Bot. 50, 1055-1071.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   55

CAPÍTULO 20 20-1 Falso. Não é que DMBA seja um mutagênico específico, mas sim o gene Ras que é convertido em sua forma ativada, gerando um câncer por uma alteração particular de A para T que leva a uma mudança específica de aminoácido. O DMBA gera mutações ao longo do genoma, mas apenas aquelas no local específico do gene Ras dão origem a células que possuem propriedades cancerosas e, assim, são identificadas no ensaio. 20-2 Verdadeiro. Esse é o motivo pelo qual oncogenes mutados superativos tendem a conduzir ao crescimento celular e à proliferação, e porque a perda de genes supressores de tumor remove paradas reguladoras nessas vias, o que também promove o crescimento celular e a proliferação. 20-3 Verdadeiro. Muitos cânceres aparentam ser mantidos por uma pequena população de células-tronco. Normalmente, essas células se dividem mais lentamente do que células da massa tumoral, e elas são menos sensíveis aos tratamentos que atingem células em rápida divisão. Caso as células-tronco não sejam mortas, o câncer provavelmente retornará. 20-4 Falso. Embora seja comum se pensar dessa forma, existem poucas evidências para apoiar essa ideia, com exceção de casos bem específicos, como os da 2-naftilamina e do amianto. 20-5 A principal diferença nas incidências de câncer de cólon e osteossarcomas é o tamanho da população de células sob risco de desenvolver doença. O câncer de cólon surge de uma população de células em proliferação no cólon, que estão presentes praticamente na mesma quantidade ao longo da vida. Essa população acumula mutações ao longo do tempo, dando origem ao aumento dependente da idade na incidência desse câncer. Por outro lado, as células sob risco de desenvolverem um osteossarcoma estão presentes em um número muito maior durante a adolescência, quando a proliferação celular é necessária para aumentar o tamanho dos ossos, do que quando são crianças ou adultos. É nessa grande população em proliferação que é mais provável ocorrer uma linhagem anormal de células cancerosas. Nesse caso, é o número de células sob risco que é o fator determinante mais importante para a frequência do câncer. Referência: Knudson AG (2001) Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat. Rev. Cancer 1, 157-162. 20-6 O desenvolvimento da maioria dos cânceres necessita uma acumulação gradual de mutações em alguns genes diferentes. Na presença contínua de fumaça de cigarro, essas mutações evidentemente acumulam-se a uma taxa elevada (maior do que na ausência do cigarro). Ao parar de fumar, um indivíduo retoma a taxa lenta normal de acumulação de mutações. Assim, quaisquer que sejam as mutações que continuem a ser geradas em um fumante que parou, elas são geradas a uma taxa mais lenta do que em um fumante contínuo. A taxa lenta de acumulação de mutações se traduz em um baixo risco cumulativo. Referência: Peto R, Darby S, Deo H, Silcocks P, Whitley E & Doll R (2000) Smoking, smoking cessation, and lung cancer in the UK since 1950: com- bination of national statistics with two case-control studies. Br. Med. J. 321, 323–329. 20-7

A. A observação principal a respeito desses rearranjos múltiplos localizados é que eles geram um número de cópias de 0 ou 1. Como pode ser visto por análise do cromossomo rearranjado no modelo de rearranjo progressivo, segmentos diferentes estão presentes em 0 cópias (I), 1 cópia (A, E, G, H, J), 2 cópias (B, D, F) e 3

56   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. Figura R20-1  Variação do número de cópias associada aos cromossomos rearranjados gerados por rearranjo progressivo ou por catástrofe cromossômica.

Modelo de rearranjo progressivo

Número de cópias

B

C

D

E

F

C

D

G

H

I

J

G

H

I

J

H

C

G

B

F

A

J

3 2 1 0 A

B

C

D

E

F

Modelo de catástrofe cromossômica

Número de cópias

I

F

C

B

D

H

3 2 1 0 A

B

C

D

E

F

cópias (C) (Figura R20-1). Por outro lado, no modelo de catástrofe cromôssica, os segmentos estão presentes em 0 cópias (A, E, G, J) ou em 1 cópia (B, C, D, F, H, I) (Figura R20-1). Simulações computacionais indicam que é praticamente impossível para uma sequência de rearranjos produzir um cromossomo no qual cada segmento está presente uma vez ou nenhuma vez.

B. Os autores do artigo sugerem duas explicações possíveis para como tais cromossomos quebrados podem surgir. Uma possibilidade é a radiação ionizante, a qual normalmente gera quebras na fita dupla. Um pulso de radiação ionizante passando através de um cromossomo mitótico condensado poderia quebrá-lo em múltiplos lugares próximos, dando origem a terminações que podem ser reunidas de forma aleatória. Uma segunda possibilidade é que o dano seja desencadeado pela fusão de dois cromossomos que perderam suas telomerases. Quando os dois centrômeros de tais cromossomos dicêntricos são puxados para células-filhas opostas durante a anáfase, eles formam um elemento chamado de ponte de anáfase. Não está claro como essas pontes são resolvidas, porém elas aparentam induzir a formação de micronúcleos contendo DNA fragmentado nas células-filhas. Essa fragmentação pode contribuir para os rearranjos cromossômicos múltiplos localizados que observamos. Precisaremos aguardar por novos experimentos para sabermos qual (se alguma) das duas explicações é a correta.



C. Esses rearranjos certamente possuem a capacidade de serem eventos condutores. Rearranjos podem inativar uma cópia de um gene supressor de tumor por meio de deleção completa ou parcial, ou ainda dividindo-a em dois pedaços. De forma semelhante, rearranjos podem ativar um oncogene acrescentando na sua proximidade um promotor mais ativo ou fusionando-o com outro gene para gerar uma proteína híbrida com propriedades oncogênicas. Exemplos desses dois tipos de eventos foram encontrados ao longo de conjuntos de cânceres examinados pelos autores do trabalho. Referência: Stephens PJ, Greenman CD, Fu B et al. (2011) Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell 144, 27–40.

20-8 Os pró-mielócitos da LPA são bloqueados em uma fase intermediária no seu desenvolvimento, em um ponto onde eles ainda se dividem e aumentam em número. É esse aumento não verificado que causa problemas para o paciente com câncer. Normalmente, tais células precursoras dividem-se apenas algumas poucas vezes antes de se diferenciarem por completo em uma célula sanguínea que não se divide. Por desencadear a diferenciação dos pró-mielócitos em neutrófilos

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   57 diferenciados, que não se dividem mais, o tratamento com ácido trans-retinoico elimina o problema gerado pela proliferação não verificada. A LPA surge como um dos poucos tipos de translocação que fusiona o gene do receptor do ácido retinoico (RAR) no cromossomo 17 com um gene em um outro cromossomo que gera uma proteína híbrida que interfere com o programa normal de desenvolvimento. Ainda não está claro como a proteína fusionada bloqueia o desenvolvimento, embora ela provavelmente faça isso interferindo com a função normal do RAR. De algum modo, o tratamento com ácido trans-retinoico permite que as células da LPA atravessem o bloqueio. Referência: Warrell RP Jr, de Thé H, Wang Z-Y & Degos L (1993) Acute promyelocytic leukemia. N. Engl. J. Med. 329, 177–189. 20-9 Os produtos de oncogenes são os únicos alvos viáveis para moléculas pequenas desse tipo. O produto de um oncogene tem um efeito dominante de promoção do crescimento na célula. Assim, caso o produto promotor de crescimento do oncogene tenha sido inibido, a célula deve retornar a um estado mais normal. Esse é o racional para a busca por novos fármacos que inibem oncoproteínas. Em contraste, os produtos de genes supressores de tumor não são alvos para o desenvolvimento de fármacos anticâncer. Os genes supressores de tumor causam o câncer por não gerarem seus produtos. Dessa forma, não há produto anormal para ser inibido nas células cancerosas que surgem por mutação de genes supressores de tumor. 20-10 Indivíduos que são heterozigotos para mutações no gene Brca1 são suscetíveis ao câncer de mama e ovário porque Brca1 é um importante supressor de tumor nesses tecidos. A perda da cópia funcional remanescente do gene Brca1 – por mutação, perda cromossômica ou silenciamento genético – conduz as células afetadas para o fenótipo cancerígeno. Como consequência, as células cancerosas que surgem nesses tecidos não podem realizar recombinação homóloga pois elas não possuem a Brca1. Em contraste, a cópia boa do gene que está presente nas células normais dos pacientes produz Brca1 suficiente para tornar as células eficientes para recombinação homóloga. Assim, quando esses pacientes são tratados com olaparibe, as células cancerosas morrem porque são incapazes de fazer recombinação homóloga para reparar as quebras de fita dupla que surgem com a inibição de PARP. As células normais dos pacientes, por outro lado, que possuem a cópia boa do Brca1, reparam suas quebras muito bem. Referência: Fong PC, Boss DS, Yap TA et al. (2009) Inhibition of poly(ADP- ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. N. Engl. J. Med. 361, 123–134. 20-11 Os cariótipos altamente rearranjados e suas similaridades de tumor para tumor sugerem que as próprias células cancerosas sejam transmitidas de um diabo-da-tasmânia para outro. É extremamente improvável que um agente infeccioso, como um vírus ou um microrganismo, possa induzir o mesmo conjunto de rearranjos complexos em diferentes animais. Mais importante, a existência de uma inversão do cromossomo 5 em um diabo-da-tasmânia, que não está presente no cromossomo 5 de suas células tumorais, defende fortemente que os tumores não são gerados das próprias células do animal. Parece que esse câncer surgiu de uma linhagem nociva de células cancerosas, de um tumor de origem desconhecida, que tem adquirido a capacidade para existência parasitária. Esse é um dos apenas dois exemplos conhecidos de transmissão natural do câncer por células tumorais, o outro é uma doença venérea em cães. Um caso especial de tal transmissão ocorre ocasionalmente durante o transplante de órgãos humanos. Porém os requisitos para o transplante de órgãos – combinando tecido e supressão imune – destaca apenas o quão pouco comum é a transmissão natural. As células cancerosas responsáveis por tumores faciais em diabos-da-tasmânia devem de alguma forma invadir as defesas imunes do hospedeiro.

58   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. Referência: Pearse A-M & Swift K (2006) Allograft theory: Transmission of devil facial-tumour disease. Nature 439, 549.

CAPÍTULO 21 21-1 Verdadeiro. Os mRNAs e proteínas maternas depositados no ovo são responsáveis pelas etapas iniciais do desenvolvimento, até que – em determinado momento no estágio de blástula – o mRNA e as proteínas maternas são degradados e o genoma do embrião é ativado. 21-2 Falso. O plano corporal básico e os eixos estabelecidos em versão miniaturizada durante a gastrulação são preservados na vida adulta, apesar dos complexos rearranjos de desenvolvimento que ocorrem durante esse processo. 21-3 Verdadeiro. Durante o estágio de blástula, as células têm potencial de dar origem a todos, ou quase todos, os tipos celulares do organismo adulto; no entanto as opções de desenvolvimento de cada célula são progressivamente restritas quando se tornam comprometidas com uma das camadas germinativas, um órgão e um tipo celular. A determinação das células tem início nas etapas iniciais do desenvolvimento e as opções de desenvolvimento se tornam mais restritas conforme a célula progride por uma série de etapas intermediárias, formando, por fim, tipos celulares altamente especializados no organismo adulto. Embora alguns tipos celulares no organismo adulto mantenham algum grau de pluripotência, a sua gama de opções é geralmente pequena. 21-4 Verdadeiro. Um número pequeno de vias de sinalização altamente especializadas, incluindo as vias do fator de crescimento transformador  (TGF), receptor de tirosina-cinase (RTK), Wnt, Hedgehog e Notch, controlam a maior parte dos eventos indutores do desenvolvimento animal. 21-5 Falso. O DNA codificador dos genes envolvidos no desenvolvimento é bastante conservado entre as espécies. São as alterações nas sequências reguladoras não codificadoras que parecem ser mais importantes para as diferenças no processo de desenvolvimento entre espécies. Os elementos de regulação determinam quando, onde e com qual intensidade um gene é expresso; portanto, essas sequências podem alteram o funcionamento das redes de regulação dos genes e alterar o resultado do desenvolvimento. 21-6 Falso. Embora existam exemplos de onde as células alteram seu estado de maturação de modo dependente da divisão celular, esta não é uma regra geral. Por exemplo, os neuroblastos no embrião de Drosophila em desenvolvimento mantêm sua cronologia normal de desenvolvimento e diferenciação mesmo quando as divisões celulares são interrompidas artificialmente. A maioria das células em desenvolvimento é capaz de alterar sua condição sem requerer divisões celulares. 21-7

1. Proliferação celular, que dá origem a diversas células a partir de uma.



2. Interações célula-célula, que coordenam o comportamento de cada célula com o de suas vizinhas.



3. Especialização celular, ou diferenciação, que dá origem a células com características distintas em locais diferentes.



4. Movimento celular, que reorganiza as células formando tecidos organizados e órgãos.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   59 21-8 As três camadas germinativas são ectoderme, endoderme e mesoderme. A ectoderme dá origem à epiderme e ao sistema nervoso. A endoderme dá origem ao tubo digestório, pulmões, pâncreas e fígado. A mesoderme dá origem a músculos, tecido conectivo, sangue, rins e diversos outros componentes. 21-9 Nas etapas iniciais do embrião de Drosophila, uma série rápida de divisões nucleares ocorre sem que ocorram divisões celulares, dando origem a um sincício que contém diversos núcleos em um mesmo citoplasma. A organização inicial do embrião de Drosophila ocorre nesse sincício através da difusão direta de reguladores da transcrição e de moléculas de mRNA. 21-10 Os padrões representados pelas bandeiras do Japão e França podem ser estabelecidos pelo gradiente de um simples morfógeno, enquanto o padrão da bandeira da Noruega requer o gradiente de dois morfógenos. O padrão da bandeira japonesa é compreendido facilmente. Se as células no centro do círculo vermelho secretarem o morfógeno, sua concentração irá diminuir em um padrão circular conforme ele se difunde a partir da sua fonte. Células próximas à fonte, expostas à concentração acima de um determinado limiar, se tornarão vermelhas; aquelas mais distantes, exposta à concentração abaixo do limiar, permanecerão brancas. O padrão para a bandeira francesa pode ser gerado por um morfógeno secretado por uma faixa de células em uma das extremidades da bandeira, onde a alta concentração de morfógeno dá origem às células vermelhas, uma concentração intermediária dá origem às células brancas, e a baixa concentração dá origem às células azuis. O padrão mais complexo da bandeira da Noruega pode ser estabelecido com o gradiente de dois morfógenos secretados por faixas de células localizadas em ângulo reto entre si. Padrões mais complexos podem ser gerados pela combinação de outros morfógenos ou por morfógenos que interagem entre si. O famoso matemático Alan Turing modela o comportamento que pode ser gerado pela interação de dois morfógenos que interagem entre si, revelando como complexos padrões biológicos relevantes podem ser gerados. Referência: Kondo S & Miura T (2010) Reaction-diffusion model as a framework for understanding biological pattern formation. Science 329, 1616–1620. 21-11 O comportamento das duas células precursoras revela que a interação entre elas requer contato celular e que Lin12 é essencial para a comunicação entre as duas. Na ausência de Lin12, a célula não recebe o sinal necessário para alterar seu destino de uma célula AC para VU e permanece na forma AC. Para se tornar uma célula VU, e célula requer um sinal que envolve Lin12, e, necessariamente o sinal deve vir de uma célula AC. O mosaico genético fornece a evidência mais conclusiva: na ausência de Lin12, as células se tornam AC, e células com Lin12 hiperativa se tornam VU. Se Lin12 fosse necessária como molécula de sinalização para alterar o destino celular de AC para VU, as células sem Lin12 no mosaico genético se tornariam VU, sendo capazes de receber o sinal, mas não de enviá-lo. Esses experimentos não abordam o papel específico de Lin12, mas Lin12 compartilha características estruturais com Notch, sugerindo que Lin12 é também um receptor de superfície celular. Em vermes do tipo selvagem, as duas células precursoras trocam sinais, com pequenas diferenças iniciais na proporção entre sinal e receptores sendo magnificadas até que a sinalização seja apenas unidirecional: da célula precursora que se tornará AC para a célula precursora que se tornará VU através do receptor Lin12. Esse é um exemplo clássico de inibição lateral. Referência: Seydoux G & Greenwald I (1989) Cell autonomy of lin-12 function in a cell fate decision in C. elegans. Cell 57, 1237–1245.

60   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. 21-12 Os resultados desses experimentos são consistentes com a substância morfogenética ser o mRNA materno codificador de fosfatase alcalina. Espera-se que puromicina, um inibidor da tradução, bloqueie a expressão, o que de fato ocorre. Não se espera que actinomicina-D, um inibidor da transcrição, iniba a expressão, e isso não ocorre. Uma vez que o tratamento com actinomicina-D teve resultado negativo, o autor do estudo testou outros inibidores da transcrição: todos com o mesmo resultado. Além disso, estes inibidores bloquearam a transcrição de outros genes. Os resultados com citocalasina B mostram que a expressão da fosfatase alcalina foi programada para ocorrer de modo independente das divisões celulares nas etapas iniciais do desenvolvimento do embrião. Referência: Whittaker JR (1977) Segregation during cleavage of a factor determining endodermal alkaline phosphatase development in ascidian embryos. J. Exp. Zool. 202, 139–153. 21-13 Essas observações indicam o papel dominante das sequências reguladoras cis-atuantes na diversificação dos genes Hox. Como HoxA3 e HoxD3 podem substituir um ao outro, as duas proteínas Hox devem ser funcionalmente equivalentes. No entanto, essa equivalência só se manifesta quando os genes se encontram no mesmo contexto de sequências reguladoras. São as sequências reguladoras cis-atuantes do lócus HoxA3 que permitem que o gene translocado HoxD3 seja expresso em quantidades adequadas nas células adequadas para a organização correta das estruturas da faringe. De modo similar, as sequências reguladoras cis-atuantes do lócus HoxD3 permitem que o gene HoxA3 translocado estabeleça o esqueleto axial normal. São essas mesmas sequências reguladoras que impedem que os genes translocados HoxA3 e HoxD3 desempenhem suas funções “normais”. Referência: Greer JM, Puetz J, Thomas K & Capecchi M (2000) Maintenance of functional equivalence during paralogous Hox gene evolution. Nature 403, 661–665. 21-14 Espera-se que a remoção dos íntrons reduza o tempo de retardo, pois reduz o tempo necessário para transcrição do gene, um dos componentes do tempo de retardo da expressão de Hes7. Se o modelo for correto, espera-se que a remoção dos íntrons reduza o retardo, acelerando o intervalo de oscilações da expressão de Hes7. Se as demais variáveis forem mantidas constantes, as oscilações mais rápidas darão origem a somitos com menor espaçamento. Os resultados do experimento são ainda mais informativos. A remoção de um íntron não tem muito efeito, provavelmente por não alterar o tempo de retardo significativamente. A remoção de dois íntrons, no entanto, leva ao resultado esperado: a formação de somitos ocorre de modo mais rápido que o normal, e os somitos apresentam espaçamento menor. O camundongo apresenta mais vértebras do que o normal! A remoção dos três íntrons interrompe a cronologia do processo, pois as oscilações da expressão de Hes7 foram abolidas. Evidentemente, o tempo de retardo deve estar entre limites específicos para que o sistema funcione. Referência: Harima Y, Takashima Y, Ueda Y, Ohtsuka T & Kageyama R (2013) Accelerating the tempo of the segmentation clock by reducing the number of introns in the Hes7 gene. Cell Rep. 3, 1–7. 21-15 Na ausência de Delta, cada célula continua a oscilar devido à retroalimentação negativa mediada por Her7 na sua própria transcrição e devido ao intervalo inerente nos processos de transcrição e tradução. No entanto, as oscilações nas células adjacentes não são mais acopladas. Mesmo que iniciem no mesmo intervalo de tempo, conforme ilustrado pelos somitos inicialmente formados de modo adequado (Figura Q21-2B), elas eventualmente se tornam fora de fase devido às diferenças estocásticas aleatórias entre as células. Na presença de Delta, no entanto, um padrão de via de sinalização recíproca é estabelecido entre as células adjacentes, mantendo as células em sincronia (Figura Q21-2C). Na realidade, esse diagrama relativamente simples (Figura Q21-2D) é difícil de ser analisado

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   61 de modo intuitivo, não sendo óbvio que o sistema atue para manter as células adjacentes em oscilações sincronizadas. No entanto, o modelo matemático do sistema é convincente. Referência: Soza-Ried C, Öztürk E, Ish-Horowicz D & Lewis J (2014) Pulses of Notch activation synchronise oscillating somite cells and entrain the zebrafish segmentation clock. Development 141, 1780–1788. 21-16 Como a massa extra de tecido das asas é composta por células de aparência normal, Dpp deve estimular tanto a divisão celular, para aumentar o número de células, quanto o crescimento celular, para que as células extras tenham o tamanho normal. Referências: Edgar BA & Lehner CF (1996) Developmental control of cell cycle regulators: a fly’s perspective. Science 274, 1646–1652. Prober DA & Edgar BA (2001) Growth regulation by oncogenes–new insights from model organisms. Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 19–26. Zecca M, Basler K & Struhl G (1995) Sequential organizing activities of engrailed, hedgehog and decapentaplegic in the Drosophila wing. Development 121, 2265–2278. 21-17 Nos vertebrados, os neurônios controlam a discriminação do próprio e não próprio utilizando proteínas transmembrana semelhantes às caderinas, que são expressas em diferentes combinações a partir do lócus Protocaderina, e que codifica 58 proteínas relacionadas semelhantes à caderina. O reconhecimento homofílico resulta na repulsão dos próprios dendritos oriundos de um mesmo neurônio. Dendritos oriundos de neurônios diferentes expressam protocaderinas distintas e evitam a repulsão.

CAPÍTULO 22 22-1 Falso. As células-filhas de uma divisão de célula-tronco na cripta tomam de modo independente a decisão de permanecer como células-tronco ou de comprometer-se com a diferenciação definitiva. Em média, cerca de 50% das células-filhas permanecem como células-tronco, enquanto as restantes se diferenciam. 22-2 Falso. Há muitos tipos diferentes de células-tronco, cada um especializado na geração de diferentes classes de células diferenciadas terminalmente. 22-3 Falso. Os hepatócitos do fígado e as células β do pâncreas são células diferenciadas que podem se dividir para substituir as células perdidas. A renovação ocorre predominantemente pela divisão dessas células diferenciadas, mesmo que ambos, fígado e pâncreas, mantenham pequenas populações de células-tronco. 22-4 Verdade. A ação excessiva de osteoclastos, que degradam a matriz óssea, ou a ação deficiente de osteoblastos, que produzem e acumulam matriz óssea, pode enfraquecer os ossos, fazendo com que se tornem quebradiços. 22-5 O padrão de marcação esperado para as células-tronco seria o aumento súbito de células com núcleos marcados, que aumentariam em número ao longo de períodos curtos e depois desapareceriam com o tempo. Esse padrão de marcação foi observado não só em células do epitélio pavimentoso, mas também nas criptas do intestino delgado e grosso. Os outros dois padrões de marcação não são consistentes com as expectativas de células-tronco. Isso é óbvio para o padrão caracterizado pela não marcação em tudo, mas o que acontece com as raras células marcadas que persistem? A renovação pela diferenciação de células-tronco implica um fluxo através de uma via, como ocorre no intestino, na pele e no siste-

62   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. ma sanguíneo: células nascem e morrem e devem ser substituídas. Uma célula-tronco marcada perderá progressivamente a sua marcação enquanto se divide para produzir células descendentes. Referência: Messier B & Leblond CP (1960) Cell proliferation and migration as revealed by radioautography after injection of thymidine-H3 into male rats and mice. Am. J. Anat. 106, 247–285. 22-6 É evidente, a partir das imagens na Figura Q22-1, que a maioria das criptas tornase monoclonal – expressa apenas uma proteína fluorescente – ao longo do tempo. O pequeno número de células-tronco e a competição constante por contato com as células de Paneth quase garante que criptas se tornarão monoclonais. Em média, leva cerca de três meses para uma cripta intestinal em camundongos tornar-se monoclonal. Referência: Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD & Clevers H (2010) Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 143, 134–144. 22-7 Esses resultados corroboram a hipótese de que a maioria, se não todas, as novas células β são geradas a partir de células β preexistentes. Se todas as novas células β fossem geradas a partir de células-tronco, seria esperado que a frequência de células que expressam HPAP diminuísse de 30% para menos de 5% (30%/6,5) em 12 meses, uma vez que da mesma forma que suas ancestrais células-tronco, nenhuma das células β recém-formadas deveria expressar HPAP. Essa diminuição não encontra apoio nos dados na Figura Q22-2. Por outro lado, se todas as novas células β fossem derivadas de células β preexistentes, a porcentagem de células que expressam HPAP deveria, então, permanecer relativamente constante em cerca de 30 %, um resultado que corresponde melhor aos dados da Figura Q22-2. Referências: Dor Y, Brown J, Martinez OI & Melton DA (2004) Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature 429, 41–46. Rais Y, Zviran A, Geula S et al. (2013) Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency. Nature 502, 65–70. 22-8 Se as colônias do baço surgiram a partir do transplante de células individuais, então todas as células de uma colônia deveriam mostrar o mesmo rearranjo do genoma. Por outro lado, se as colônias surgiram a partir de várias células, então apenas uma porção das células na colônia teria um rearranjo ou outro. A probabilidade de que várias células em um agregado tenham todas o mesmo rearranjo é muito pequena. Os resultados desses experimentos mostram claramente que células individuais dão origem a colônias do baço. Referência: Becker AJ, McCulloch EA & Till JE (1963) Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature 197, 452–454. 22-9 Uma vez que foram necessárias 10 células na população enriquecida para gerar uma colônia no baço, como mostrado pela intercepção para as células enriquecidas na Figura Q22-3, e apenas 1 em 10 células transplantadas se aloja no baço, é provável que a população enriquecida consista quase inteiramente de células-tronco. Para ter certeza de que as células enriquecidas eram células-tronco verdadeiras, você precisaria saber se as prováveis células-tronco, poderiam repovoar todos os vários tipos de células do sangue. Os autores desse estudo demonstraram esse ponto em experimentos adicionais. As curvas na Figura Q22-3 são separadas por um fator de cerca de 1.000, sugerindo que cerca de 1 em 1.000 células da medula óssea é uma célula-tronco hematopoiética.

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   63 Referência: Spangrude GJ, Heimfeld S & Weissman IL (1988) Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science 241, 58–62. 22-10 Em geral, existem três maneiras diferentes para transferir os reguladores de transcrição OSKM: como DNA, RNA ou proteína. Cada método tem seus desafios. Vários métodos baseados em DNA incluem vetores de integração, que podem subsequentemente ser excisados do genoma, e vetores como DNA de plasmídeo e vetores adenovirais, que não se integram no genoma. Transfecções de mRNAs que codificam os reguladores de transcrição OSKM também provaram ser um sucesso; no entanto transfecções de RNA tendem a desencadear respostas antivirais, que diminuem a eficiência de reprogramação. Várias modificações – assegurando que todos os mRNAs têm quepes de guanina, substituindo 5-metilcitidina por citidina e pseudouridina por uridina, e atenuando a resposta do interferon – aumentaram significativamente reprogramação, de modo que até 2% de fibroblastos foram convertidos em células iPS. A introdução de proteínas também funciona, mas o desafio consiste em gerar e purificar as proteínas nas quantidades necessárias. Referência: Warren L, Manos PD, Ahfeldt T et al. (2010) Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified RNA. Cell Stem Cell 7, 618–630.

CAPÍTULO 23 23-1 Verdadeiro. Existem cerca de 1014 células de bactérias, fungos e protozoários no corpo humano e, aproximadamente, 1013 células humanas. 23-2 Falso. Os microbiomas – os genomas combinados da microbiota – variam consideravelmente entre os indivíduos, até mesmo entre parentes próximos e gêmeos idênticos. 23-3 Falso. Ainda que muitos patógenos causem doença somente após entrarem nas células hospedeiras, patógenos extracelulares não necessitam disso; eles causam seus efeitos deletérios secretando toxinas ou ejetando proteínas efetoras diretamente nas células hospedeiras. 23-4 Falso. A maior parte dos vírus de DNA replicam seus genomas no núcleo, mas a maioria dos vírus de RNA replicam-se no citosol. (O influenzavírus é um dos vírus de RNA que replicam no núcleo, onde ele realiza o seu processo incomum de apropriação do quepe 5’ para iniciar a síntese de mRNA.) 23-5 Verdadeiro. Antibióticos não são efetivos contra infecções virais. Eles são direcionados a componentes das bactérias, para interferir na sua proliferação ou matá-las. O uso de antibióticos para tratar doenças virais pode contribuir para o problema crescente de resistência a antibióticos e pode modificar o perfil da microbiota. Existe uma classe de fármacos conhecidos como antirretrovirais que são efetivos contra infecções virais. Esses fármacos atuam com o mesmo princípio dos antibióticos, atacando componentes exclusivos dos vírus. Por exemplo, os antivirais usados para tratar pacientes com Aids atuam na transcriptase reversa, que copia o genoma de RNA do HIV em DNA, e na protease do HIV, que é necessária para processar componentes do vírion. 23-6 Os patógenos devem ser capazes de: (1) colonizar o hospedeiro; (2) encontrar um nicho nutricionalmente compatível no corpo do hospedeiro; (3) evitar, subverter ou lograr a resposta imune adaptativa do hospedeiro; (4) replicar-se, usando os recursos do hospedeiro; e (5) sair de um hospedeiro e espalhar-se para outros.

64   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. 23-7 O transplante de microbiota é efetivo porque restaura a composição adequada de espécies microbianas que normalmente habitam o intestino e protegem contra a colonização por Clostridium difficile. Tratamentos com antibióticos afetam a microbiota do intestino, reduzindo a diversidade de espécies normalmente presentes. Análises de genes de RNA ribossômico 16S em amostras de intestino demonstraram que pacientes com infecções recorrentes tratados com antibióticos diminuíram a diversidade e o número de filos, e perderam os dois filos predominantes: Bacteroidetes e Firmicutes. Não está claro como a microbiota normal do intestino protege contra a germinação de esporos de C. difficile e a recolonização (reinfecção), mas ela o faz muito efetivamente. Referência: Austin M, Mellow M & Tierney WM (2014) Fecal microbiota transplantation in the treatment of Clostridium difficile infections. Am. J. Med. 127, 479–483. 23-8 Os três mecanismos de transferência horizontal de genes são a transformação natural por DNA liberado, transdução por bacteriófago e troca sexual por conjugação. 23-9 YopJ bloqueia a via de sinalização de TAK1 impedindo a fosforilação de TAK1 (Figura Q23-1, canaleta 3). A YopJ inativa não impede a fosforilação (canaleta 2). Como YopJ impede a fosforilação da TAK1 não foi definida por esses experimentos. Entretanto, já que YopJ é uma serina-treonina acetilase, faz sentido supor que YopJ interfere na fosforilação da TAK1 pela acetilação de serinas ou treoninas da TAK1. Em princípio, tal acetilação poderia alterar a conformação da TAK1, impedindo a sua fosforilação. De fato, YopJ é muito mais precisa: ela acetila os muitos resíduos que estão normalmente fosforilados, bloqueando quimicamente, assim, a ativação da TAK1. Referência: Paquette N, Conlon J, Sweet C, Rus F, Wilson L, Pereira A, Rosadini CV, Goutagny N, Weber ANR, Lane WS, Shaffer SA, Maniatis S, Fitzgerald KA, Stuart L & Silverman N (2012) Serine/threonine acetylation of TGFβ-activated kinase (TAK1) by Yersinia pestis YopJ inhibits innate immune signaling. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 12710–12715. 23-10 Já que SopE e SptP atuam sobre a GTPase monomérica Rac, é razoável predizer que SopE deveria atuar como uma GEF (fator de conversão de nucleotídeos de guanina) para ativar a Rac promovendo a liberação de GDP e a captação de GTP, e que a SptP deveria atuar como uma GAP (proteína ativadora de GTPase) para inativar a Rac promovendo a hidrólise de GTP a GDP. A ação sequencial de duas proteínas injetadas simultaneamente deveria ser contabilizada de duas maneiras gerais. A proteína que age mais tarde (SptP) deve necessitar ser ativada por um processo celular, atrasando o início da sua função. Alternativamente, a proteína que atua inicialmente (SopE) deveria ser inativada de alguma forma com o passar do tempo, permitindo a atividade da SptP predominar em momentos posteriores. Como os autores desse estudo demonstraram, SopE é inativada ao longo do tempo por degradação no proteassomo, permitindo que SptP retorne à sua forma inativa contendo 6DP mais tarde, assim suprimindo o pregueamento da membrana. Referência: Kubori T & Galán JE (2003) Temporal regulation of Salmonella virulence effector function by proteasome-dependent protein degradation. Cell 115, 333-342. 23-11 O que Snow mostrou muito claramente foi que os casos estavam agrupados em torno de uma única bomba de água pública. Ele sugeriu uma hipótese razoável de que a água da bomba central fosse a fonte da cólera, mas ele não conseguiu encontrar nada que parecesse suspeito na água. A maioria dos cientistas permaneceram céticos, pois Snow apresentou nada mais que uma correlação entre a localização da doença e a bomba de água; ele não fez mais experimentos para testar sua conclusão. Alguém que acreditasse no “ar ruim” deveria procurar na distribuição das

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   65 vítimas e concluir que havia uma fonte centralizada de “ar ruim”, uma enorme fossa, talvez. Eles poderiam, também, argumentar que as vítimas próximo às periferias da distribuição provavelmente obtiveram sua água de bombas de água públicas próximas, e não da central; assim, não se esperava que eles contraíssem a doença. É importante lembrar que, em 1854, Louis Pasteur ainda não tinha formulado a teoria do germe da doença, e Robert Koch ainda estava por observar bactérias no microscópio, crescê-las em cultura e reinoculá-las em um hospedeiro para provar sua capacidade de causar doença. Assim, a impossibilidade de Snow convencer os céticos é compreendida. De fato, foi Koch que resolveu o quebra-cabeça da cólera nos anos 1880. Ele identificou um bacilo em forma de vírgula associado a uma doença e demonstrou que ele conseguia infectar porquinhos-da-índia com ele e causar cólera. Ele encontrou essas bactérias em abastecimentos de água usadas pelos pacientes infectados, assim como Snow havia predito. 23-12 Ainda não está claro quais mecanismos explicam a variabilidade sazonal das epidemias de influenza. Muitas suposições são feitas, embora nenhuma seja completamente satisfatória. Explicações têm sido propostas em três categorias, como sintetizado abaixo. 1. Variações sazonais das taxas de contato. As taxas de contato entre indivíduos infectados e suscetíveis aumentam durante as estações chuvosas e o inverno, pois aumenta o tempo de permanência dentro de casa. Mas o aumento é notavelmente pequeno – 1 a 2 horas a mais no inverno e 0,5 hora na estação chuvosa – se comparado ao tempo – das 21 às 22 horas – que passamos, normalmente, dentro de casa. Ainda, no sudoeste dos Estados Unidos, temperaturas altas levam as pessoas para ambientes fechados no verão, sem aumento nos níveis de gripes. Entretanto, existe forte relação entre a transmissão da influenza e aglomerações – em aeronaves, em festivais, entre soldados –, sugerindo que as taxas de contato são um fator importante. 2. Variações sazonais na sobrevivência do vírus. A transmissão da influenza por aerossóis e contato direto significa que o vírus deve sobreviver exposto a condições ambientais. A sobrevivência viral aumenta com o declínio da temperatura, com a diminuição da umidade absoluta e com a diminuição da radiação ultravioleta. Considerando que esses três fatores variam conjuntamente, com menores condições suportáveis no verão, elas oferecem uma explicação para os picos de influenza no inverno nas zonas temperadas, mas são menos satisfatórias para os trópicos, onde a temperatura não varia muito e a umidade mais elevada – a condição menos favorável – coincide com o pico de gripe na estação chuvosa. 3. Variações sazonais na resistência humana. Mudanças sazonais nas funções fisiológicas que permitem um indivíduo evitar ou atenuar infecções após exposição ao vírus poderiam estar relacionadas aos picos de influenza. Por exemplo, a temperatura e a umidade podem afetar a passagem nasal e a sua suscetibilidade à infecção. De modo semelhante, em zonas temperadas, existem variações sazonais nos níveis de vitamina D, que é importante para a função imune humana. Baixos níveis de vitamina D coincidem com o inverno nas zonas temperadas, e com estações chuvosas nos trópicos. Quais dessas possíveis explicações, ou combinações delas, na verdade contribuem para as variações sazonais de infecções com influenza é algo que não está definido. Distinguir as relações causais das associações causais, tem sido, até agora, um desafio imenso. Referência: Tamerius J, Nelson MI, Zhou SZ, Viboud C, Miller MA & Alonso WJ (2011) Global influenza seasonality: reconciling patterns across temperate and tropical regions. Environ. Health Perspect. 119, 439–445. 23-13 A segmentação genômica permite um rápido teste das mutações geradas por diferentes vírus. Por exemplo, quando dois influenzavírus diferentes – com dife-

66   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. rentes histórias mutacionais – infectam a mesma célula, eles podem gerar uma progênie viral híbrida que carrega 28 diferentes combinações de segmentos de RNA. Mutações independentes de segmentos após seleções aleatórias em infecções mistas na mesma célula oferecem uma maneira fácil de explorar novas capacidades. Em 2009, a cepa H1N1 do influenzavírus surgiu com genes derivados (segmentos de RNA) de influenzavírus de porcos, aves e de humanos. Referência: Weber M & Weber F (2014) Segmented negative-strand RNA viruses and RIG-I: divide (your genome) and rule. Curr. Opin. Microbiol. 20, 96–102. 3-14 Já que as células de suínos possuem cadeias de carboidratos na superfície ce2 lular com ambos os tipos de ligações ácido siálico-galactose, os influenzavírus aviários, humanos e suínos conseguem infectá-las. Se influenzavírus diferentes infectarem simultaneamente a mesma célula suína, seus diferentes segmentos de RNA podem ser rearranjados e gerar novas combinações com propriedades a que a população humana ainda não tenha sido exposta – uma situação potencialmente perigosa. 2 3-15 Os microrganismos produzem compostos antimicrobianos como armas e proteção na sua competição com outros microrganismos. Pesquisas com bactérias do solo que nunca foram expostas aos antibióticos usados na medicina moderna revelam que as bactérias geralmente são resistentes a muitos dos antibióticos em uso atualmente. No desenvolvimento de compostos de origem natural clinicamente úteis, nós simplesmente aproveitamos a “pesquisa” evolutiva das bactérias para nosso próprio benefício. 3-16 Muitas bactérias de ocorrência natural secretam uma enzima que hidrolisa anti2 bióticos com uma estrutura semelhante à penicilina. Essas enzimas, conhecidas como β-lactamases, são muito difundidas na natureza, e acredita-se que tenham surgido em resposta a lutas biológicas entre microrganismos. Referência: Florey HW (1944) Penicillin: a survey. Br. Med. J. 2, 169–171. 2 3-17 A ideia principal dos antibióticos é combater o microrganismo sem afetar o hospedeiro. De fato, muitas substâncias que mataram bactérias em cultura foram descobertas antes da penicilina, porém elas foram muito tóxicas para células humanas. Desse modo, o controle de Chain foi fundamental. Se a penicilina fosse inofensiva aos camundongos, seria muito provável que ela fosse inofensiva aos seres humanos também. Agora, sabe-se que a penicilina interfere na síntese de parede celular bacteriana, um processo que não está relacionado a nenhum processo nas células humanas. Referência: Florey HW (1944) Penicillin: a survey. Br. Med. J. 2, 169–171.

CAPÍTULO 24 24-1 Falso. As células T em desenvolvimento, cujos receptores de células T interagem fortemente com o complexo peptídeo MHC próprio são induzidas a morrer no timo, no processo de seleção negativa, embora algumas sejam selecionadas positivamente para tornarem-se células T reguladoras naturais, as quais deixarão o timo juntamente com outras células T selecionadas positivamente. 24-2 Falso. Uma subpopulação de células epiteliais no timo expressa o regulador de transcrição AIRE, que induz pequenas quantidades de transcrição de muitos genes que codificam proteínas que não são normalmente expressas no timo. 24-3 Verdadeiro. No homem, a união combinatória dos segmentos gênicos das ca6 deias pesadas e leves das imunoglobulinas podem produzir cerca de 1,5 × 10

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   67 diferentes sítios de ligação do antígeno. Diferentemente, a perda ou ganho aleatório de nucleotídeos, que ocorre quando um segmento gênico é unido, aumenta essa diversidade em até 108 vezes. 24-4 As árvores, como todos os outros organismos, mantêm um sistema de defesa ativo contra invasores, uma forma de imunidade inata que permite que elas cresçam e floresçam no solo que contém os micróbios que, por sua vez, causarão sua decomposição quando morrerem. Elas possuem uma série de receptores semelhantes ao Toll que atuam como receptores de reconhecimento de padrões nas respostas imunes inatas contra diversos patógenos. As plantas também secretam defensinas que rompem as membranas de muitos patógenos. Bruce Beutler, na sua palestra do Prêmio Nobel, relembrou uma conversa com seu pai: “Eu lembro quando caminhava com meu pai no bosque de sequoias no Parque Nacional das Sequoias. Eu tinha uns 10 ou 12 anos de idade. ‘Por que é que as árvores simplesmente não apodrecem?’, perguntei a ele, sabendo que as plantas não possuíam as células linfoides ou mieloide que conferem a imunidade aos vertebrados. Ele explicou que havia tanino e talvez outras moléculas nas árvores que as tornavam resistentes ao apodrecimento. ‘Mas elas apodrecem depois que morrem, e o tanino continua presente’, eu retruquei. A conversa continuou, e nos aventuramos a respeito da infecção de plantas vivas, como a batata e o trigo, e eu concluí que as plantas deveriam ter alguma forma de imunidade que era mantida ativamente de maneira dependente de sua vitalidade. Mas, pelo menos para nós dois, não se sabia muito a esse respeito.” Referência: Bruce A. Beutler. Nobel Lecture, Physiology or Medicine, 2011. 24-5 Em cada clivagem proteolítica que produz dois produtos ativos, o pequeno produto de difusão livre, atua como uma atração para os neutrófilos, que fagocitam os patógenos revestidos pelo complemento. Os produtos grandes, que podem realizar as clivagens seguintes da sequência, permanecem ligados à superfície dos patógenos onde se iniciou a reação. Assim, os componentes tardios do complexo de ataque à membrana permanecem ligados à membrana onde se iniciou a reação. Em ambos os casos, as moléculas ativadas normalmente possuem um tempo de vida curto, garantindo que o ataque não atinja as células hospedeiras. 24-6 No primeiro ciclo de replicação, o erro G:U será convertido em G-C (um par de bases normais) em uma das fitas duplas filhas e em um par de bases anormais A-U na outra fita dupla filha. No próximo ciclo de replicação, o par de bases A-U dará origem a um par de base A-T e a um par de base A-U. Finalmente, o A-U, se não corrigido por outros processos, será diluído e desaparecerá. Na progênie bacteriana final analisada, o original G-C se tornará A-T ou, como descrito na questão, G→A e C→T. Assim, o resultado dos experimentos bacterianos são consistentes com a ideia de que as mutações induzidas pela AID surgem pela desaminação de uma base C para uma base U no DNA. Referência: Petersen-Mahrt SK, Harris RS & Neuberger MS (2002) AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature 418, 99-103. 24-7

A. O único peptídeo que sensibilizou as células-alvo para a lise pela incubação com as células T citotóxicas inclui os resíduos 365-380 da cepa 1968 do influenzavírus. O peptídeo correspondente à cepa 1934 não sensibilizou a célula-alvo, indicando que as duas trocas de aminoácidos, DA para ET, nas posições 372 e 373 são críticas. A observação de que o peptídeo 369-382 da cepa 1968 não sensibilizou as células-alvo sugere que os aminoácidos 365-368 provavelmente também são críticos para a sensibilização. Esses experimentos foram uma clara demonstração

68   Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed. da importância dos fragmentos peptídicos de um antígeno proteico no reconhecimento das células T. Somente esse peptídeo, e nenhum outro, funcionou nesse experimento, porque esse experimento usa um clone específico de células T citotóxicas, que expressa um receptor de célula T específico. Esse receptor possui uma especificidade de ligação: o peptídeo identificado no sulco de ligação de uma determinada molécula do MHC de classe I. Se você pudesse isolar todas as diferentes células T citotóxicas que são estimuladas durante uma infecção por influenzavírus, você esperaria encontrar, entre elas, células que respondem a diferentes peptídeos virais nos sulcos das diferentes proteínas do MHC de classe I.

B. O transporte das proteínas do MHC de classe I e de classe II para a superfície celular depende da sua associação com o peptídeo, normalmente derivado de proteínas citosólicas celulares com as moléculas do MHC de classe I e proteínas extracelulares endocitadas com as moléculas do MHC de classe II. Assim, todas as moléculas do MHC na superfície celular já devem ter um peptídeo em seu sulco de ligação ao peptídeo. Acredita-se que o experimento funcionou porque alguns peptídeos ligados inicialmente foram substituídos por peptídeos extracelulares, que se encontravam em altas concentrações e porque somente um pequeno número de complexos peptídeo-MHC específicos eram necessários na superfície da célula-alvo para que a célula T citotóxica reconheça e mate a célula-alvo. Referência: Townsend ARM, Rothbard J, Gotch FM, Bahadur G, Wraith D & McMichael AJ (1986) The epitopes of influenza nucleoprotein recognized by cytotoxic T lymphocytes can be defined with short synthetic peptides. Cell 44:959-968.

24-8

A. As células T se desenvolvem no timo, passando por uma série de estágios que levam à formação dos diferentes tipos de células T. Somente as células T que sofrem seleção positiva é que amadurecem e deixam o timo, as restantes morrem. A seleção positiva depende de uma interação fraca entre o receptor de células T e as moléculas do MHC próprio ligadas com os peptídeos próprios que são apresentados pelas células apresentadoras de antígenos (APCs) no timo. No timo de um camundongo heterozigoto tipo-d/tipo-k, as APCs terão as moléculas do MHC de classe I ligadas ao tipo-d e o tipo-k em sua superfície, ambas apresentando os peptídeos próprios. Elas irão desencadear a maturação das células T citotóxicas que poderão interagir com qualquer uma das moléculas do MHC de classe I. Algumas irão interagir fortemente se peptídeos estranhos estiverem ligados à proteína do MHC. Portanto, as células T citotóxicas de camundongos heterozigotos infectados devem ser capazes de lisar os dois tipos de células, as infectadas com o tipo-d e as infectadas com o tipo-k.



B. Novamente, como as células T em desenvolvimento aprendem a reconhecer os peptídeos em associação com as proteínas do MHC próprio no timo, espera-se que as células T citotóxicas que se desenvolvem no timo transplantado tipo-d reconheçam os peptídeos somente em associação ao MHC de classe I do tipo-d, mesmo se as células no restante do camundongo expressarem ambos os tipos de MHC, d e k. Assim, espera-se que as células T citotóxicas lisem as células tipo-d infectadas mas não as células tipo-k. Referência: Rolf M. Zinkernagel. Nobel Lecture, Physiology or Medicine, 1996.

24-9 Conforme a Figura Q24-3B, parece que as células dendríticas fazem contato nas vizinhanças de 100 células T a cada 10 minutos, ou cerca de 600 por hora. Com essa taxa, levará 100 minutos para que 100 células dendríticas avaliem 105 células T, ou 1.000 minutos para avaliar 106 células T. Os autores mostraram que sua metodologia poderia subestimar a verdadeira taxa de encontros entre as células T e as células dendríticas porque elas são incapazes de detectar contatos com os finos processos dendríticos, os quais são invisíveis por meio dessa técnica. Outros estudos estimaram que as células dendríticas poderiam avaliar as células

Respostas das questões da obra Biologia molecular da célula, 6.ed.   69 T até 10 vezes essa taxa, o que reduziria o tempo médio para encontrar as células T específicas para 10 a 100 minutos. De qualquer maneira, é evidente que as células dendríticas nos linfonodos são capazes de avaliar de maneira eficiente o repertório de células T e iniciar uma resposta mediada por células T de forma relativamente rápida. Referências: Bousso P & Robey E (2003) Dynamics of CD81 T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585. Miller MJ, Hejazi AS, Wei SH, Cahalan MD & Parker I (2004) T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 998-1003. 24-10 A seleção positiva para células T que se ligam fracamente tem uma função essencial: elas identificam as células T cujos receptores podem se ligar às moléculas do MHC próprias. Como os antígenos estranhos são apresentados para as células T como peptídeos ligados às moléculas do MHC próprio, somente aquelas células T que podem reconhecer tais complexos serão imunologicamente úteis. As células T em desenvolvimento que não podem reconhecer os complexos peptídeo-MHC próprio serão inúteis. O timo se livra de células T potencialmente perigosas, aquelas que podem ativar uma resposta autoimune, induzindo as células T que se ligam fortemente aos complexos peptídeo MHC próprio para, ou se suicidarem, ou se tornarem células T reguladoras. 24-11 Os resultados mostram claramente que as proteínas CD4 promovem uma resposta de células T aos complexos peptídeo-MHC nas APCs. Na presença de um CD4 funcional, as células T respondem até mesmo a um ou a dois complexos peptídeo-MHC por meio da captura do Ca21. Quando o anticorpo se liga ao CD4, impedindo-o de se ligar à molécula do MHC, as células T não respondem até que haja 25 a 30 complexos peptídeo-MHC na interface. Assim, o CD4 aumenta drasticamente a sensibilidade das células T em responder ao seu antígeno específico na superfície de uma APC. Referência: Irvine DJ, PurBhoo MA, Krogsgaard M & Davis MM (2002) Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature 419, 845-849.