Química Clínica principios: principios, procedimientos y correlaciones

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Principios, procedimientos y correlaciones Quinta edición

Michael L. B i s h o p

Química clínica PRINCIPIOS, PROCEDIMIENTOS Y CORRELACIONES QUINTA EDICIÓN

Química clínica PRINCIPIOS, PROCEDIMIENTOS Y CORRELACIONES QUINTA EDICIÓN

M ic h a e l L. B is h o p , MS, CLS, MT(ASCP) Application Specialist Global Customer Service Knowledge Center 6 bioMérieux Durham, North Carolina

E dw ard P. Fody, MD Chief Departament of Pathology Erlanger Medical Center Chattanooga, Tennessee

L arry E. S c h o e f f , MS, MT(ASCP) Director and Associate Professor, Medical Laboratory Science Program University of Utah School of Medicine Education Consultant, ARUP Laboratories Salt Lake City, Utah T r a d u c c ió n :

IQ Francisco Sánchez Fragoso QFB Carina Amador Vázquez

ERRNVPHGLFRVRUJ MÉXICO · BOGOTÁ · BUENOS AIRES · CARACAS · GUATEMALA LISBOA · MADRID · NUEVA YORK · SAN JUAN · SANTIAGO · SAO PAULO AUCKLAND · LONDRES · MILÁN · MONTREAL · NUEVA DELHI SAN FRANCISCO · SIDNEY · SINGAPUR · ST. LOUIS · TORONTO

A Sheila, Chris, y Carson por su apoyo y paciencia MLBA A Nancy, mi esposa, por su continuo apoyo y dedicación EPF A mi esposa, Anita, por su amor y apoyo LES

Prólogo Parece que fue hace poco que escrib í el prólogo de la cuarta edición de este libro. No obstante, desde entonces encu en­ tro que han sido introducidas m uchas pruebas de diagnós­ tico nuevas y que, b ajo las recientes norm as ADA/HSS, las pruebas m ás antiguas, in clu so la de la glucosa, tien en que cum plir fu nciones más dem andantes. N uestro laboratorio ha cam biado la m ayor parte de sus sistem as analíticos, in s­ talado un nuevo sistem a de inform ación y ha sido reorga­ nizado para satisfacer las necesidades siem pre crecientes de u n sistem a de atención de la salud que depende en gran m edida de pruebas de laboratorio. M u cho ha cam biado desde la cuarta edición, y es m érito de los editores y cola­ boradores de este libro que estén com prom etidos a m an­ tener el contenid o educacional actual con los cam bios que ocu rren en la m edicina de laboratorio. M uchas pruebas, m étodos y sistem as de m ed ición nuevos con tin ú an siendo introd ucid os en el m ercado de aten ción de la salud que cada vez es m ás com petitivo. Las pruebas de laboratorio parecen fáciles de realizar; sin em bargo, los procesos de análisis suelen requerir tecn o­ logía com pleja que es más difícil entender. Nuevas prue­ bas están evolucionando com o resultado de hallazgos de investigación recientes, ju n to con nuevos procesos de m edición que, otra vez, dependen de tecnología com pleja. E l único constante es, al parecer, el conocim iento creciente requerido para entender la ciencia del laboratorio clínico actual. Este cam bio rápido y evolución de las pruebas de labo­ ratorio h ace cada vez m ás difícil captar el conocim iento que define el estado actual de la práctica para los cien tí­ ficos del laboratorio clínico. La tarea del profesional de laboratorio se vuelve más im ponen te y tam bién m ás críti­ ca con cada año que pasa. Por fortuna, los editores y cola­ boradores de este texto han estado dispuestos a enfrentar esta tarea en apariencia im posible para apoyar y desarro­ llar la profesión. ¡D eseo agradecerles y felicitarlos! La quinta edición de Química clínica: principios, proce­ dimientos y correlaciones continú a su m isión de atender las necesidades de la edu cación form al de nuestros estu­ diantes en la ciencia del laboratorio clín ico , así com o las necesidades continu as de los profesionales del área. Ésta

facilita el proceso educacional al identificar los objetivos del aprendizaje, enfocándose en concep tos e ideas clave, y aplicando la teoría a través de casos prácticos. Cubre los aspectos básicos del análisis de laboratorio, así com o m uchas áreas especiales de las pruebas de laboratorio clí­ nico. Y, aún es posible llevar este libro a clase, al laborato­ rio, la oficina o a casa para estudiar. Por haber trabajado de form a personal con algunos de los editores y colaboradores, sé que tien en gran nivel, tanto en el laboratorio com o en el salón de clases. Sus intereses y bases proveen un balance excelen te entre lo académ ico y lo p ráctico , lo que asegura que tanto estudiantes com o profesionales tengan ante sí una base b ien desarrollada de con o cim ien to que ha sido refinada de m anera cuidadosa por la experiencia. Proveen el cribado y selección necesa­ rios para separar el trigo de la paja, y proveer el sustento real para nuestros estudiantes y n osotros m ism os. Para la m u ltitud de estudiantes a quienes va dirigido este libro, perm ítanm e transm itirles algunas recom end a­ ciones de m i am igo y m entor O laf el vikingo. Al parecer su jo v e n h ijo se estaba em barcando en un viaje al m undo real de trabajo. E l h ijo de O laf le pregunta, “¿C óm o llego a la cim a ?” la recom en d ación de O laf fue, “ ¡Tienes que em pe­ zar desde abajo y com enzar a s u b ir!” D espués de reflexio­ nar esto por un m om ento, su h ijo preguntó, “¿C óm o llego al fo n d o ?” O laf contestó, “¡Tienes que co n o cer a a lg u ien !” Al igual que los estudiantes de la cien cia del laboratorio clín ico , se debe estudiar y prestar atención a las recom en ­ d aciones de este libro; sin em bargo, se debe buscar tam ­ b ién a los m entores. Los autores de este libro, así com o sus instructores de curso y sus profesores en el laboratorio, son claves para in iciar su carrera. ¡Búsquelos y benefíciese de su aprendizaje y experiencia! Estos profesionales co n o ­ cen lo últim o, y poseen el con o cim ien to actual del área y, sobre todo, están dedicados a ayudarlo.

Ja m e O. Westgard, PhD Professor, Pathology and L aboratory M edicine University o f Wisconsin Madison, Wisconsin

vii

Prefacio La quím ica clín ica continú a siendo una de las áreas de la m ed icina de laboratorio que avanza con más rapidez. Desde la p u blicación de la prim era ed ición de este libro en / 1 9 8 5 , han tenido lugar m u chos cam bios. Nuevas tec­ nologías y técnicas analíticas han sido introducidas, con u n im pacto im presionante en la práctica de la quím ica clínica. Adem ás, el sistem a de aten ción de la salud está cam biando. Hay m ayor énfasis en m ejo rar la calidad de la atención del pacien te, los resultados de cada uno de los pacien tes, la responsabilidad financiera y la adm inistra­ ció n de calidad total. La prueba en el lugar de la atención (PLDA ) está tam bién a la vanguardia de la práctica de la aten ción de la salud, y ha puesto de m anifiesto retos y oportunidades para los laboratoristas clín icos. A hora, más que n u nca, los laboratoristas necesitan interesarse en las correlaciones de enferm edad, interpretaciones, resolución de problem as, aseguram iento de la calidad y efectividad de costos; n ecesitan saber n o sólo el cóm o de las pruebas sino tam bién el qué, p o r qué y cuándo. Los editores de Química clínica: principios y procedim ientos han designado la quinta ed ición com o u n recurso in clu so m ás valioso para estu­ diantes y profesionales. Al igual que las cuatro ediciones anteriores, la quinta edi­ ció n de Química clínica: principios, procedim ientos y corre­ laciones es com pleta, actualizada y fácil de entender para estudiantes de todos los niveles. Tam bién pretende ser un recurso organizado de m anera práctica para profesores y profesionales. Los editores h an intentad o m antener la legi­ bilidad del libro y m ejorar su contenid o. D ebido a que los laboratoristas clínico s usan sus habilidades interpretativas

y analíticas en la práctica diaria de la quím ica clín ica, se ha h echo un esfuerzo para m antener u n equilibrio apropiado entre principios analíticos, técnicas y las correlaciones de resultados con los estados m orbosos. E n esta quinta edición, los editores han h echo varios cam bios im portantes en respuesta a peticion es de lecto ­ res, alum nos, profesores y profesionales. Los contenid os de capítulo, objetivos, térm inos clave y resúm enes han sido actualizados y ampliados. Cada capítulo ahora in clu ­ ye estudios de caso com unes, actualizados, y preguntas o ejercicios de práctica. Se ha am pliado el glosario de térm i­ nos. Para proveer u n estudio actualizado y com pleto de la quím ica clín ica, todos los capítulos h an sido actualiza­ dos y revisados por profesionales que p ractican la quím i­ ca clín ica y la m edicina de laboratorio todos los días. Los proced im ientos básicos de los proced im ientos analíticos analizados en los capítulos reflejan las técnicas m ás recien ­ tes o ejecutadas com únm ente en el laboratorio de quím ica clínica. Los procedim ientos detallados han sido om itidos debido a la diversidad de equipo y con ju n tos com ercia­ les em pleados en los laboratorios clín ico s actuales. Los m anuales de instrum ento e in stru ccion es de los co n ju n ­ tos son las referencias más confiables para in stru ccion es detalladas o procedim ientos analíticos actuales. Todo el m aterial de los capítulos ha sido actualizado, m ejorad o y reorganizado para m ejo r continuidad y legibilidad.

M ichael L. Bishop Edward P. Fody Larry E. S ch oeff

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Colaboradores Dev Abraham, MD

Elizabeth L. Frank, PhD

A ssistant Professor in M edicine U niversity o f U tah School o f M edicine

A ssistant Professor— Clinical D epartm ent o f Pathology

Salt Lake City, U tah

U niversity o f U tah Health Sciences Center Salt Lake City, U tah

John J, Ancy» MA, RRT D irector o f Respiratory Services St. Elizabeth's Hospital Belleville, Illinois

Michael J. Bennett, PhD, FRCPath, FACB, DABCC Professor o f Pathology and Pediatrics M ary Q uincy Parsons and Kelsey Louise W right Profes­ sor o f M itochond rial D isease Research U niversity o f Texas Southw estern M edical Center D allas, Texas

Vicki S. Freeman, PhD, MT(ASCP)SC C hair and A ssociate Professor D epartm ent o f C linical Laboratory S cience S chool o f Allied H ealth Science T h e U niversity o f Texas M edical B ranch at G alveston G alveston, Texas

Lynn R. Ingram, MS Program D irector C linical Laboratory Sciences U niversity o f Tennessee, M em phis

Larry H. Bernstein, MD Chief, C linical Pathology New York M ethodist H ospital W eill C ornell Brooklyn, New York

Larry A, Broussard, PhD, DABCC, FACB Professor C linical Laboratory Sciences LSU H ealth Sciences Center New O rleans, Louisiana

M em phis, Tennessee

Robert E. Jones, MD, FACP, FACE A d ju nct A ssociate Professor o f M edicine and Pediatrics U niversity o f U tah S chool o f M edicine D iabetes Scientific M anager Aventis Pharm aceuticals Salt Lake City, U tah

Lauren E. Knecht, BA Salt Lake City, U tah

Ellen Carreiro-Lewandowski, MS, CLS Professor D epartm ent o f M edical Laboratory S cience U niversity o f M assachusetts D artm outh N orth D artm outh, M assachusetts

Thomas P. Knecht, MD, PhD A ssociate Professor o f M edicine D ivisión o f E ndocrinology U niversity o f U tah School o f M edicine Salt L ake City, U tah

George S. Cembrowski, MD, PhD A ssociate Professor D epartm ent o f Laboratory M edicine and Pathology U niversity o f Alberta D irector, M edical B iochem istry Regional Laboratory Services Capital H ealth A uthority E dm onton, A lberta, Cañada

Daniel H, Knodel, MD, FACP, JD A ssociate Professor o f M edicine— C linical D ivisión o f E nd ocrinology and M etabolism U niversity o f U tah S ch ool o f M edicine Salt Lake City, U tah

Robín Gaynor Krefetz, MEd, MT(ASCP), CLS(NCA) CLT Program D irector

Sharon S. Ehrmeyer, PhD, MT(ASCP) Professor, P athology and Laboratory M edicine D irector, MT/CLS U niversity o f W isco n sin M adison, W isco n sin

C om m unity College o f Philadelphia Philadelphia, Pennsylvania

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xii

COLABORADORES

Ronald H, Laessig, PhD

Joan E. Polancic, MSEd, CLS(NCA)

Professor, Popu lation Health

D irector o f E du cation & P ro ject Planning

Professor, Pathology and Laboratory M edicine D irector, W isco n sin State Laboratory o f Hygiene U niversity o f W isco n sin M adison, W isco n sin

A m erican Society for C linical Laboratory Science Bethesda, M aryland

Elizabeth E. Porter, BS, MT(ASCP) Lab A lliance, C incinnati, O hio

Louann W, Lawrence, DrPH, CLS(NCA) Professor and D epartm ent Head C linical Laboratory Sciences S chool o f Allied H ealth Professions L ouisiana State U niversity H ealth Sciences C enter New O rleans, Louisiana

Barbara i. Lindsey, MS, CLSp(C), C(ASCP), ART(CSLT) Chair, D epartm ent o f C linical Laboratory Sciences Virginia C om m onw ealth U niversity R ichm ond , Virginia

Roberta A. Martindale, BSc(MLS), MLT, MT(ASCP) Lecturer/Clinical Instru ctor D ivisión o f M edical Laboratory S cience D epartm ent o f Laboratory M edicine and Pathology U niversity o f Alberta E dm onton, A lberta, Cañada

Technical Specialist, P oin t of Care T h e H ealth A lliance, Laboratory Services . C in cin nati, O hio

Alan T. Remaley, MD, PhD N ational Institutes o f H ealth Sénior Staff D epartm ent o f Laboratory M edicine Bethesda, M aryland

Wiiliam L. Roberts, MD. PhD A ssociate Professor D epartm ent o f Pathology University o f U tah H ealth Sciences Center Salt Lake City, UT

Frank A. Sedor, PhD, DABCC D irector, C linical C hem istry Services D uke U niversity M edical Center D urham , N orth Carolina

Gwen A, McMillin, PhD A ssistant Professor (C lin ical) o f Pathology

Carol J. Skarzynski, BA, SC(ASCP)

U niversity o f U tah School o f M edicine M edical D irector, C linical Toxicology ARUP Laboratories, Inc. Salt Lake City, U tah

C linical Instru ctor D epartm ent o f Pathology and Laboratory M edicine Hartford H ospital S chool o f Allied Health Hartford, C o nnecticu t

Judith R. McNamara, M I

LeAnne Swenson, MD

Lipid M etabolism and Cardiovascular Research

D ivisión o f E nd ocrinology

Laboratories Je a n M ayer USDA H um an N utrition Research C enter on Aging at Tufts U niversity and G erald J . and D orothy R. Fried m an S ch oo l o f N utrition

D epartm ent o f M edicine U niversity o f U tah Salt Lake City, U tah

Science and Policy Tufts U niversity B oston , M assachusetts

David P. Thorne, PhD, MT(ASCP) M edical Technology Program M ichigan State U niversity E ast Lansing, M ichigan

A. Wayne Meikle, MD Professor o f M edicine and Pathology U niversity o f U tah School o f M edicine D irector, E nd ocrine Testing Laboratory ARUP Laboratories Salt Lake City, U tah

Susan Orton, PhD, MS, MT(ASCP) Sénior C linical Im m unology Fellow M cL end on C linical Labs U niversity o f N orth Carolina H ealthcare Chapel H ill, N orth Carolina

John G. Toffalettí, PhD A ssociate Professor o f Pathology C o-D irector o f C linical C hem istry Services D uke U niversity M edical C enter D urham , N orth Carolina

COLABORADORES

AVP, Director of Corporate Safety ARUP Laboratories Salt Lake City, Utah

Alan H, B. Wu, PhD Director, Clinical Chemistry Laboratory Hartford Hospital Hartford, Connecticut

G, Russell Warnick, MS, MBA

James T. Wu

President Pacific Biometrics Research Foundation Issaquah, Washington

Professor of Pathology Department of Pathology University of Utah Health Sciences Center Salt Lake City, Utah

Tolmie E. Wachter, SLS(ASCP)

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Agradecimientos U n proyecto tan grande com o éste requiere la asistencia y apoyo de m u chos individuos. Los editores desean expresar su agradecim iento a los colaboradores de esta quinta edi­ ción de Química clínica: principios, procedim ientos y corre­ laciones -lo s profesionales de laboratorio y educadores dedicados a quienes los editores han tenido el privilegio de con o cer y con quienes han intercam biado ideas durante años. Estas personas fueron seleccionadas por su experien­ cia en áreas particulares y su com prom iso con la educación de los laboratoristas clínicos. M uchos han pasado su vida profesional en el laboratorio clín ico , en la m esa de trabajo, enseñando a los alum nos o intercam biando ideas con espe­ cialistas clínicos. E n estas posiciones de prim era línea, han desarrollado una perspectiva de lo que es im portante para la siguiente generación de laboratoristas clínicos. Se extiende el agradecim iento a los alum nos, colegas, profesores y m entores en la profesión que han ayudado a conform ar nuestras ideas acerca de la práctica de la quím i­ ca clín ica y la educación. Tam bién, querem os agradecer a

las m u chas com pañías y organizaciones profesionales que proporcionaron inform ación de productos y fotografías, o autorizaron reproducir diagram as y cuadros de sus pu bli­ caciones. M u chos docum entos del N ational Com m ittee fo r Clinical Laboratory Standards (NCCLS) han sido tam bién recursos de inform ación im portantes. Estos docum entos están referidos de m odo directo en los capítulos apropia­ dos. Los editores recon o cen la co n trib u ció n y esfuerzo de las personas que participaron en ediciones anteriores. Sus esfuerzos proporcionaron el m arco para m u chos de los nuevos capítulos. Por ú ltim o, se recon o ce co n grati­ tud la coo p eració n y asistencia del personal de L ipp incott W illiam s & W ilk in s, en particular a K evin D ietz por sus recom end aciones y apoyo. Los editores se esfuerzan de form a continu a para m e jo ­ rar ediciones futuras de este libro. De nuevo se pide y se da la bienvenida a com entarios, críticas e ideas de nuestros lectores para el m ejoram ien to de este libro.

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Contenido CÓM O CREAR CONCIENCIA DE LA SEGURIDAD ENTRE EL PERSONAL DEL LABORATORIO / 35 Responsabilidad sobre la seguridad / 35 Señalización y etiquetado / 36 EQUIPO DE SEGURIDAD / 36 Campanas / 36 Equipo de almacenamiento químico / 36 Equipo de protección personal / 37 SEGURIDAD BIOLÓGICA / 38 Consideraciones generales / 38 Derrames / 38 Plan de control de exposición a patógenos llevados por la sangre / 38 Patógenos llevados por el aire / 39 Envío / 39 SEGURIDAD QUÍMICA / 39 Comunicación de riesgos / 39 Hoja de datos de segundad del material (HDSM) / 39 Estándar de laboratorio / 40 Efectos tóxicos de sustancias peligrosas / 40 Almacenamiento y manejo de sustancias químicas / 40 SEGURIDAD EN RELACIÓN CON LA RADIACIÓN / 41 Protección ambiental / 41 Protección del personal / 41 Radiación no ionizante / 41 SEGURIDAD CONTRA INCENDIOS / 42 Química del fuego / 42 Clasificación de incendios / 42 Tipos y aplicaciones de extintores de fuego / 42 CONTROL DE OTROS RIESGOS / 43 Riesgos eléctricos / 43 Riesgos con gases comprimidos / 43 Riesgos con materiales criogénicos / 44 Riesgos mecánicos / 44 Riesgos ergonómicos / 44 ELIMINACIÓN DE MATERIALES PELIGROSOS / 44 Desechos químicos / 44 Desechos radiactivos / 45 Desechos biopeligrosos / 45 DOCUMENTACIÓN E INVESTIGACIÓN DE ACCIDENTES / 45 RESUMEN / 46 PREGUNTAS DE REPASO / 46 LECTURAS RECOMENDADAS / 47

Prólogo / vii Prefacio / ix Colaboradores /xi A gradecim ientos / xv pa rte

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Principios básicos y práctica de la química clínica / 1_________________ 1

Principios básicos y práctica / 2 Eileen Carreiro-Lewandowski UNIDADES DE M ED ID A / 3 REACTIVOS / 4 Sustancias químicas / 4 Materiales de referencia / 5 Especificaciones para el agua / 5 Propiedades de la solución / 6 MATERIALES DEL LABORATORIO CLÍNICO / 8 Termómetros y temperatura / 9 Material de vidrio y de plástico / 9 Desecadores y desecantes / 1 5 Balanzas / 16 TÉCNICAS BÁSICAS DE SEPARACIÓN / 17 Centrifugación / 17 Filtración / 18 Diálisis /1 8 MATEMÁTICAS Y CÁLCULOS DE LABORATORIO / 19 Cifras significativas / 19 Logaritmos / 19 Concentración / 20 Diluciones / 23 Agua de hidratación / 25 CONSIDERACIONES ACERCA DE LA MUESTRA / 26 Tipos de muestras / 26 Procesamiento de la prueba / 29 Variables de la muestra / 29 Cadena de custodia / 31 RESUMEN / 31 PREGUNTAS DE REPASO / 31 REFERENCIAS / 32

2

Seguridad y regulaciones en el laboratorio / 34 Tolmie E. Wachter SEGURIDAD Y REGLAS EN EL LABORATORIO / 35 Ley de Seguridad y Salud Ocupacional (OSHA) / 35 Otras reglas y normas / 35

3

Control de calidad y estadística / 48 George 5. Cembrowski y Roberta A. Martindale CONCEPTOS ESTADÍSTICOS / 49 Estadística descriptiva / 4 9 Estadísticas ¡nferenciales / 55 INTERVALOS DE REFERENCIA (ALCANCE NORMAL) / 57 Definición del intervalo de referencia / 57 Recolección de datos para estudios de intervalo de referencia / 58

xvii

CONTENIDO

Análisis estadístico de los datos del intervalo de referencia / 58 EFIC A C IA D EL DIAGNÓSTICO / 61 Teoría del valor predictivo / 61 M ÉTO D O DE SELECCIÓN Y EVALU ACIÓ N / 64 Método de selección / 64 Método de evaluación / 64 Medición de la imprecisión / 64 Medición de la inexactitud / 65 Experimento de comparación de métodos / 66 A SEG U R A M IEN TO Y CO N TRO L DE LA C A LID A D / 69 Control de calidad / 70 Operación general de un sistema de control de calidad estadístico / 71 Respuesta de las reglas de control al error / 72 Uso de datos del paciente para control de calidad / 79 Control de calidad externo / 80 Prueba en el lugar de la atención: la dificultad más reciente / 81 Hacia la atención de calidad del paciente / 83 PRO B LEM A S DE PRÁCTICA / 84 PREG U N TAS DE REPASO / 86 REFEREN CIAS / 87

INSTRUMENTACIÓN PARA PROTEÓM ICA / 115 Electroforesis bidimensional / 116 Espectrometría de masas MADI-TOF y SELDI-TOF / 116 O SM O M ETRÍA/ 117 Osmómetro de punto de congelamiento / 118 TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN (PLDA) / 119 RESUMEN / 120 PREGUNTAS DE REPASO / 121 REFERENCIAS / 122

5

William L. Roberts HISTORIA DE LOS ANALIZADORES AUTOMATIZADOS / 125 FUERZAS IMPULSORAS HACIA MÁS AUTOMATIZACIÓN / 125 ENFOQUES BÁSICOS HACIA LA AUTOMATIZACIÓN / 126 PASOS DEL ANÁLISIS AUTOMATIZADO / 127 Preparación e identificación de la muestra / 127 Medición de la muestra y entrega / 129 Sistemas de reactivos y entrega / 132 Fase de reacción química / 133 Fase de medición /1 3 6 Procesamiento de la señal y manejo de datos /1 3 8 SELECCIÓN DE ANALIZADORES AUTOMATIZADOS / 139 AUTOMATIZACIÓN TOTAL DEL LABORATORIO / 140 Fase preanalítica (procesamiento de la muestra) / 140 Fase analítica (análisis químicos) / 141 Fase posanalítica (manejo de datos) / 142 TENDENCIAS FUTURAS EN LA AUTOMATIZACIÓN / 142 RESUMEN / 142 PREGUNTAS DE REPASO / 143 REFERENCIAS / 144

Técnicas analíticas e instrum entación / 90 Alan H. B. Wu ESPEC TR O FO TO M ETR ÍA Y FO TO M ETRÍA / 91 Ley de Beer / 91 Instrumentos espectrofotométricos / 93 Elementos de un espectrofotómetro / 93 Aseguramiento de la calidad del espectrofotómetro / 96 Espectrofotómetro de absorción atómica / 97 Fotometría de flama / 98 Fluorometría / 98 Quimioluminiscencía /1 0 0 Turbidez y nefelometría /1 0 0 Aplicaciones láser / 101 E L E C T R O Q U ÍM IC A /101 Celdas galvánicas y electrolíticas /101 Semiceidas /101 Electrodos selectivos de iones (ESI) / 102 Electrodos de pH / 102 Electrodos detectores de gas /1 0 4 Electrodos de enzimas / 104 Cloridómetros coulométricos y voltametría de separación anódica / 105 ELECTR O FO R ESIS / 105 Procedimiento /1 0 5 Materiales de soporte / 106 Tratamiento y aplicación de la muestra / 106 Detección y cuantificación /1 0 6 Electroendosmosis /1 0 7 Enfoque isoeléctrico / 107 Electroforesis capilar / 107 C R O M A TO G R A FÍA / 108 Modos de separación / 108 Procedimientos cromatográficos /1 0 9 Cromatografía líquida de alta presión (CLAP) /1 1 0 Cromatografía de gases /111

Principios de autom atización quím ica clínica I 124

6

Inrnunoensayos y técnicas con sonda de ácido nucleico / 145 Susan Orton INMUNOENSAYOS / 146 Consideraciones generales / 146 Inrnunoensayos no marcados / 147 Inrnunoensayos marcados /151 SONDAS DE ÁCIDO NUCLEICO / 160 Química del ácido nucleico / 161 Técnicas de hibridación / 161 Aplicaciones de la sonda de ácido nucleico / 164 RESUMEN / 164 PREGUNTAS DE REPASO / 165 REFERENCIAS / 166

7

Pruebas en el lugar de la atención / 168 Elizabeth E. Porter ADMINISTRACIÓN Y ESTRUCTURA / 169 Licencia y regulación CU A / 169

CONTENIDO

Personal de apoyo / 169 Estandarización / 171 Estructura de supervisión / 172 COMUNICACIÓN / 172 Manejo de una petición para PLDA nueva o adicional / 172 Selección preliminar de dispositivos o métodos / 172 Validación / 173 Negociación de contrato /1 7 3 Ejecución / 173 EXAMEN DE APTITUD / 174 APLICACIONES EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN / 175 Determinación de glucosa en el LDA /1 7 5 Constituyentes químicos y gases sanguíneos determinados en el LDA / 175 Coagulación en el LDA / 175 Hematología en el LDA / 176 Conectividad en el LDA / 176 RESUMEN / 176 PREGUNTAS DE REPASO / 177 REFERENCIAS /1 7 7 PARTE II

Correlaciones clínicas y procedimientos analíticos / 178____________________________ 8

Am inoácidos y proteínas / 179 Barbara J. Lindsey AMINOÁCIDOS / 180 Estructura básica / 180 Metabolismo /1 8 0 Aminoacidopatías / 180 Análisis de aminoácidos / 186 PROTEÍNAS / 186 Características generales / 186 Síntesis / 191 Catabolismo y balance de nitrógeno / 192 Clasificación /1 9 2 Función general de las proteínas /1 9 2 Proteínas plasmáticas / 193 Proteínas diversas /1 9 9 Anormalidades de proteína total / 202 Métodos de análisis / 203 Proteínas en otros líquidos corporales / 211 RESU M EN / 215 PREGUNTAS DE REPASO / 216 R E FER E N C IA S /217

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CREATININA/CREATINA / 223 Bioquímica / 223 Correlaciones de enfermedad / 223 Métodos analíticos para creatinina / 225 Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren / 227 Fuentes de error / 227 Intervalo de referencia / 227 Métodos analíticos para creatina / 227 ÁCIDO ÚRICO / 227 Bioquímica / 227 Correlaciones de enfermedad / 28 Métodos analíticos / 2239 Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren / 230 Intervalo de referencia / 230 AMONIACO / 231 Bioquímica / 231 Correlaciones de enfermedad / 231 Métodos analíticos / 231 Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren / 231 Fuentes de error / 232 Intervalo de referencia / 232 RESUMEN / 232 PREGUNTAS DE REPASO / 233 REFERENCIAS / 234

Com puestos de nitrógeno no proteínico / 219 Elizabeth L. Frank UREA / 220 Bioquímica / 220 Correlaciones de enfermedad / 220 Métodos analíticos / 221 Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren / 222 Intervalo de referencia / 223

Enzim as / 236 Robín Gaynor Krefetz y Gwen A. McMillin PROPIEDADES GENERALES Y DEFINICIONES / 237 CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS Y NOMENCLATURA / 237 CINÉTICA DE ENZIMAS / 238 Mecanismo catalítico de enzimas / 238 Factores que afectan las reacciones enzimáticas / 239 Medición de la actividad enzimática / 242 Cálculo de la actividad enzimática / 243 Medición de la masa de enzima / 243 Enzimas como reactivos / 243 ENZIMAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA / 243 Cinasa de creatina / 243 Deshidrogenasa de lactato / 248 Aminotransferasa de aspartato / 250 Aminotransferasa de alanina / 251 Fosfatasa alcalina / 252 Fosfatasa ácida / 253 y-Glutamiltransferasa / 255 Amilasa / 256 Lipasa / 257 Deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato / 258 RESUMEN / 259 PREGUNTAS DE REPASO / 259 REFERENCIAS / 260

xix

xx

11

CONTENIDO

Carbohidratos / 262 Vicki 5. Freeman DESCRIPCIÓN GENERAL DE LOS CARBOHIDRATOS / 263 Clasificación de los carbohidratos / 263 Estereoisómeros / 264 Monosacáridos, disacáridos y polisacáridos / 264 Propiedades químicas de los carbohidratos / 264 Metabolismo de la glucosa / 265 Destino de la glucosa / 265 Regulación del mecanismo de carbohidratos / 267 HIPERGLUCEMIA / 268 Diabetes mellitus / 268 Fisiopatología de la diabetes m e llitu s/271 Criterios para el diagnóstico de la diabetes mellitus / 271 HIPOGLUCEMIA / 273 Defectos genéticos en el metabolismo de carbohi­ dratos / 274 FUNCIÓN DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Y EL TRATAMIENTO DE PACIENTES CON ALTERACIONES METABÓLICAS DE LA GLUCOSA / 274 Métodos de medición de glucosa / 275 Automonitoreo de glucosa sanguínea (AMGS) / 276 Tolerancia a la glucosa y pruebas posprandiales de dos h o ra s /276 Hemoglobina glucosilada / 277 Cetonas / 278 Microalbuminuria / 279 Prueba de autoanticuerpo insulínico de los islotes / 279 RESUMEN / 279 PREGUNTAS DE REPASO / 280 REFERENCIAS / 281

Arteriosclerosis / 293 Hiperlipoproteinemia / 294 Hipercolesterolemia / 295 Hipertrigliceridemia / 295 Hiperlipoproteinemia combinada / 296 Incremento de Lp(a) / 296 Hipolipoproteinemia / 296 Hipoalfalipoproteinemia / 296 ANÁLISIS DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS / 298 Medición de lípidos / 298 Medición de colesterol / 298 Medición de triglicérido / 299 Métodos de lipoproteína / 300 Métodos de H D L/ 300 Métodos para LDL / 302 Analizadores compactos / 303 Métodos de apolipoproteína / 303 Medición de fosfolípidos / 303 Medición de ácidos grasos / 303 ESTANDARIZACIÓN DE ENSAYOS DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS / 304 Precisión / 304 Exactitud / 304 Interacciones de matriz / 305 Red de laboratorios para el método de referencia de colesterol del CDC / 305 Objetivos de desempeño analítico / 305 Control de calidad / 305 Recolección de la muestra / 305 RESUMEN / 306 PREGUNTAS DE REPASO / 306 REFERENCIAS / 307

Electrólitos / 314 Joan E. Polancic

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Lípidos y lipoproteínas / 282 Alan T. Remaley, Judith R. McNamara y G. Russell Warnick QUÍMICA DE LÍPIDOS / 283 . Ácidos grasos / 283 Triglicéridos / 284 Fosfolípidos / 284 Colesterol / 285 ESTRUCTURA GENERAL DE LIPOPROTEÍNAS / 285 Quilomicrones / 286 Lipoproteínas de muy baja densidad / 287 Lipoproteínas de baja densidad / 287 Lipoproteína (a) / 287 Proteínas de alta densidad / 287 FISIOLOGÍA Y METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEÍNAS / 287 Absorción de lípidos / 288 Vía exógena / 288 Vía engógena / 289 Vía inversa de transporte de colesterol / 289 DISTRIBUCIONES DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS EN LA POBLACIÓN / 290 PREVENCIÓN, DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD / 293

A G U A / 315 Osmolalidad / 315 ELECTRÓLITOS / 317 S o d io /317 Potasio / 322 Cloruro / 324 Bicarbonato / 326 Magnesio / 327 Calcio / 331 Fosfato / 334 Lactato / 336 INTERVALO ANIÓNICO / 338 ELECTRÓLITOS Y FUNCIÓN RENAL / 339 RESUMEN / 340 PREGUNTAS DE REPASO / 341 REFERENCIAS / 341

G ases en la sangre, pH, y sistem as am ortiguadores / 343 Sharon 5. Ehrmeyer, Ronald H. Laessig y John J. Ancy DEFINICIONES: ÁCIDO, BASE, DISOLUCIÓN AM ORTIGUADORA / 344

CONTENIDO

EQUILIBRIO ACIDOBASE / 344 Mantenimiento del H+/ 344 Sistemas amortiguadores: regulación del H +/344 Regulación del equilibrio acidobase: pulmones y riñones / 345 VALORACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ACIDOBASE / 346 El sistema amortiguador de bicarbonato y la ecuación de Henderson-Hasselbalch / 346 Trastornos acidobase: acidosis y alcalosis / 348 INTERCAMBIO DE OXÍGENO Y GAS / 349 Oxígeno y bióxido de carbono / 349 Transporte de oxígeno / 351 Cantidades relacionadas con la evaluación del estado de oxigenación del paciente / 352 Disociación hemoglobina-oxígeno / 353 MEDICIÓN / 353 Determinación espectrofotométrica (cooxímetro) de la saturación del oxígeno / 353 Analizadores de qas en la sangre: pH, PCO, y P 02 / 354 Medición de P02 / 354 M ediciones de pH y P C 0 2/ 356 Tipos de sensores electroquímicos / 356 Sensores ópticos / 357 Calibración / 357 Parámetros calculados / 358 Corrección de la temperatura / 358 ASEGURAM IENTO DE LA CALIDAD / 358 Consideraciones preanalíticas / 358 Evaluaciones analíticas: control de calidad y prueba de eficiencia / 360 Interpretación de los resultados / 361 RESUMEN / 361 PREGUNTAS DE REPASO / 362 REFERENCIAS / 362

Funciones bioquímicas del cobre / 369 Deficiencia de cobre / 370 Exceso de cobre / 370 Evaluación en laboratorio del estado de cobre / 370 CINC / 370 Requisitos dietéticos de cinc / 370 Absorción, transporte y excreción del cinc / 370 Funciones bioquímicas del cinc / 370 Deficiencia y toxicidad del cinc / 371 Evaluación en laboratorio del estado de cinc / 371 COBALTO / 371 CROMO / 371 FLÚOR / 371 MANGANESO / 372 MOLIBDENO / 372 SELENIO / 373 RESUMEN / 373 PREGUNTAS DE REPASO / 374 REFERENCIAS / 375

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Porfirinas y hem oglobina / 377 Louann W. Lawrence y Larry A. Broussard PORFIRINAS / 378 Función de las porfirinas en el cuerpo / 378 Química de las porfirinas / 378 Síntesis de la porfirina / 378 Significado clínico y correlación de la enfermedad / 379 Métodos para el análisis de p o rfirin a s/381 HEMOGLOBINA / 383 Papel en el cuerpo / 383 Estructura de la hemoglobina / 383 Síntesis y degradación de la hemoglobina / 384 Significado clínico y correlación de la enfermedad / 385 Metodología / 390 Tecnología del DNA / 393 MIOGLOBINA / 393 Estructura y función en el cuerpo / 393 Significado clínico / 394 Metodología / 394 RESUMEN / 394 PREGUNTAS DE REPASO / 395 REFERENCIAS / 396

O ligoelem entos / 364 John G. Toffaletti CONSIDERACIONES GENERALES DE LA RECOLECCIÓN, EL PROCESAMIENTO Y LA DETERMINACIÓN EN LABORATORIO DE LOS OLIGOELEM ENTOS / 366 HIERRO / 366 Distribución del hierro / 366 Requisitos dietéticos de hierro / 366 Absorción del hierro / 366 Transporte del hierro / 366 Excreción del hierro / 366 Funciones bioquímicas del hierro / 367 Trastornos clínicos de la deficiencia de hierro / 367 Trastornos clínicos del exceso de hierro / 368 Papel del hierro en el daño tisular / 368 Evaluación en laboratorio del estado de hierro / 368 Contenido de hierro total (hierro sérico) / 368 Capacidad total de fijación del hierro / 369 Saturación porcentual / 369 Transferrina y ferritina / 369 C O B R E /3 6 9 Requerimientos dietéticos de cobre / 369 Absorción, transporte y excreción de cobre / 369

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PARTE III

Valoración de las funciones del sistema orgánico / 398_______________ 17

Introducción a ías horm onas y la función hipofisaria / 399 Robert E. Jones EMBRIOLOGÍA Y ANATOMÍA / 400 ASPECTOS FUNCIONALES DE LA UNIDAD HIPOTALÁMICA-HIPOFISARIA / 400 HORMONAS HIPOFISIOTRÓPICAS O HIPOTALÁMICAS / 402 HORMONAS DE LA HIPÓFISIS ANTERIOR / 402 HORMONA DEL CRECIMIENTO / 402 Acciones de la hormona del crecimiento / 403 Pruebas / 404

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CONTENIDO

Acromegalia / 404 Deficiencia de la hormona del crecimiento / 405 PRO LA CTIN A / 405 Prolactinoma / 406 Otras causas de hiperprolactinemia /4 0 6 Evaluación clínica de ¡a hiperprolactinemia /4 0 6 Control del prolactinoma / 406 Galactorrea idiopática / 407 H IPO PITU ITARISM O / 407 Etiología del hipopituitarismo / 407 Tratamiento del panhipopituitarismo / 408 H O RM O N A DE LA HIPÓFISIS PO STERIO R / 408 Oxitocina / 409 Vasopresina / 409 PREG U N TAS DE REPASO / 409 R E F E R E N C IA S / 410

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OVARIO / 432 Anatomía funcional del ovario / 432 Producción hormonal por los o v a rio s/432 Ciclo menstrual / 432 Control hormonal de la ovulación / 433 Desarrollo puberal femenino / 433 Anormalidades del ciclo menstrual /4 3 3 Hipogonadismo hipogonadotrópico / 434 Hlrsutlsmo / 435 Terapia del reemplazo de estrógeno /4 3 6 TESTÍCULOS / 436 Anatomía funcional del aparato reproductor masculino / 436 Fisiología de los testículos / 437 Trastornos del desarrollo sexual e hipofunción testicular / 438 Diagnóstico del hipogonadismo / 441 Terapia de reemplazo de testosterona / 441 Monitoreo de la terapia de reemplazo de testosterona / 442 PREGUNTAS DE REPASO / 442 REFERENCIAS / 443 LECTURAS RECOMENDADAS / 444

Función suprarrenal / 412 LeAnne Swenson y Daniel H. Knodel LA G LÁ N D U LA SU PRA R R EN A L: UN PAN O RAM A G E N E R A L / 413 EM BR IO LO G ÍA Y A N A TO M ÍA / 413 LA CO RTEZA SU PRA R R EN A L POR ZO N A / 414 Esteroidogénesis de la corteza / 414 Hiperplasla suprarrenal congénlta / 415 DIAG N Ó STICO D EL A LD O STER O N ISM O PRIM ARIO / 417 Algoritmo del diagnóstico / 417 IN SUFICIEN CIA SU PRA R R EN A L (EN FER M ED A D DE AD D ISO N ) / 418 Diagnóstico de insuficiencia suprarrenal / 418 Tratamiento con insuficiencia suprarrenal / 419 H IPERCO RTISO LISM O / 419 SÍN DRO M E DE CUSHÜNG / 419 Diagnóstico del síndrome de Cushing / 420 Cuando se confirma Cushing, las pruebas de estimula­ ción de la CRH ayudan a determinar la dependen­ cia de la ACTH (por lo general innecesaria)/421 Procedimientos de localización /4 2 2 Algoritmo para la determinación de Cushing /4 2 2 Tratamiento / 423 EXCESO DE AN D RÓ G EN Q / 423 Diagnóstico de la producción excesiva de andrógeno / 423 Tratamiento para la sobreproducción andrógena suprarrenal / 423 M ÉD U LA SU PRA RREN A L / 424 Desarrollo / 424 Biosíntesis y almacenamiento de las catecolaminas / 424 Degradación de las catecolaminas / 424 Mediciones de ias catecolaminas urinarias y plasmá­ ticas / 425 Causas de hiperactividad simpática / 426 Diagnóstico del feocromocitoma /4 2 6 Tratamiento del feocromocitoma / 427 Resultado y pronóstico / 427 IN CID EN TALO M A / 427 PREG U N TAS DE REPASO / 429 REFEREN CIA S / 429

Función gonadal / 431 Dev Abraham y A. Wayne Meikle

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Función de la glándula tiroides / 445 Daniel H. Knodel LA TIROIDES / 446 Anatomía y desarrollo de la tiroides / 446 Síntesis de la hormona tiroidea / 446 Unión proteica de la hormona tiroidea /4 4 7 Control de la función de la tiroides / 448 Acciones de la hormona tiroidea / 448 PRUEBAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA TIROIDES / 448 Pruebas sanguíneas / 448 OTROS INSTRUMENTOS PARA LA EVALUACION DE LA TIROIDES / 449 Evaluación por medicina n u c le a r/449 Ultrasonido de la tiro id e s/450 Aspiración con aguja fina / 450 TRASTORNOS DE LA TIROIDES / 450 Hipotiroidismo / 450 Tirotoxicosis / 451 Enfermedad de G ra v e s /451 Adenomas tóxicos y bocios multinodulares / 453 DISFUNCIÓN DE LA TIROIDES INDUCIDA POR FÁRMACOS / 453 Enfermedad de la tiroides inducida por amiodarona / 453 Tiroiditis subaguda / 454 ENFERMEDAD NO TIROIDEA / 454 NODULOS TOROIDEOS / 454 RESUMEN / 454 PREGUNTAS DE REPASO / 455 REFERENCIAS / 455

CONTENIDO

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INSUFICIENCIA CARDÍACA CONGESTIVA / 500 SÍNDROME CORONARIO AGUDO / 501 CARDIOPATÍA HIPERTENSIVA / 503 CARDIOPATÍA INFECCIOSA / 504 DIAGNÓSTICO DE LA CARDIOPATÍA / 505 Diagnóstico de laboratorio para el infarto agudo del miocardio / 505 Marcadores de trastornos inflamatorios y de coagulación / 507 Marcadores de insuficiencia cardíaca congestiva / 509 Otros marcadores / 509 Pruebas cardíacas centradas en el paciente / 510 El papel del laboratorio en la vigilancia de la cardiopatía / 511 TRATAMIENTO / 511 Tratamiento con fármacos / 512 Tratamiento quirúrgico / 514 RESUMEN / 514 PREGUNTAS DE REPASO / 514 REFERENCIAS / 515

Función paratiroidea y control de la hom eostasis del calcio / 457 Thomas P. Knecht y Lauren E. Knecht HOMEOSTASIS DEL CALCIO / 458 Control hormonal del metabolismo del c a lc io / 458 FISIOLOGÍA ORGANICA Y METABOLISMO DEL CALCIO / 461 Sistema gastrointestinal / 461 Sistema renal / 461 Sistema óseo / 462 HIPERCALCEMIA / 462 Signos y síntomas de la hipercalcemia / 463 Causas de la hipercalcemia / 463 HIPOCALCEMIA / 465 Signos y síntomas de hipocalcemia / 4 6 6 Causas de hipocalcemia / 466 FÁRMACOS QUE AFECTAN EL METABOLISMO DEL CALCIO / 468 ENFERMEDADES ÓSEAS METABÓLICAS / 469 Raquitismo y osteomalacia / 469 Osteoporosis / 470 RESUMEN / 472 PREGUNTAS DE REPASO / 472 REFERENCIAS / 473

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ANATOM ÍA RENAL / 518 FISIOLOGÍA RENAL / 519 Filtración giomerular / 519 Función tubular / 519 Eliminación de los compuestos nitrogenados no proteicos / 521 Homeostasis del agua, electrolítica y acidobásica / 522 Función endocrina / 523 1,25-Dihidroxivitamina D3/ 524 PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS / 524 Mediciones de eliminación / 524 Electroforesis de la orina / 525 |32-Microglobuiina / 525 Mioglobina / 525 Microalbúmina / 525 Cistatina C / 526 Urianálisis / 526 FISIOPATOLOGÍA / 529 Enfermedades glomerulares / 529 Enfermedades tubulares / 530 Infección/obstrucción del tracto urinario / 531 Cálculos renales / 531 Insuficiencia renal / 531 RESUMEN / 536 PREGUNTAS DE REPASO / 536 REFERENCIAS / 537

Función hepática / 475

Función cardíaca / 496 Lynn R. Ingram CARDIOPATÍA / 497 Síntomas de cardiopatía / 497 CARDIOPATÍA CONGÉNITA / 498

Función renal / 517 Caro! J. Skarzynski y Alan H. B. Wu

Edward P. Fody ANATOMÍA / 476 Unidad estructural / 476 FISIOLOGÍA / 477 Función excretora y secretora / 477 Actividad principal de sín te sis/479 Desintoxicación y metabolismo de fármacos / 480 TRASTORNOS DEL HÍGADO / 480 Ictericia / 480 Cirrosis / 480 Tumores / 480 Síndrome de Reye / 481 Trastornos relacionados con fármacos y alcohol / 481 EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA / 481 Análisis de la bilirrubina / 481 Urobilinógeno en orina y heces / 483 Medición de los ácidos biliares en el suero / 484 Pruebas enzimáticas en la enfermedad hepática / 484 Pruebas de medición de ia capacidad sintética del h íg a d o /485 Pruebas de medición del metabolismo del nitró g eno /485 Hepatitis / 486 RESUMEN / 491 PREGUNTAS DE REPASO / 492 REFERENCIAS / 492

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25

Función pancreática / 538 Edward P. Fody FISIOLOGÍA DE LA FUNCIÓN PANCREÁTICA / 538 ENFERM EDADES DEL PÁNCREAS / 540 PRUEBAS DE LA FUNCIÓN PANCREÁTICA / 541 Prueba de secretina / CC K / 542 Análisis de la grasa fecal / 543 Determinaciones de electrólitos en sudor / 544 Enzimas séricas / 544 Otras pruebas de la función pancreática / 545

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CONTENIDO

RESUMEN / 545 PREGUNTAS DE REPASO / 546 REFERENCIAS / 546 LECTURAS RECOMENDADAS / 546

26

FARMACOCINÉTICA / 575 RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA / 576 FÁRMACOS CARDIOACTIVOS / 577 Digoxina / 577 Lidocaína / 578 Quinidina / 578 Procainamida / 578 Disopramida / 579 ANTIBIÓTICOS / 579 Aminoglucósidos / 579 Vancomicina / 579 FÁRMACOS ANTIEPILÉPTICOS / 580 Fenobarbital / 580 Fenitoína / 580 Ácido valproico / 581 Carbarmacepina / 581 Etosuximida / 581 FÁRMACOS PSICOACTIVOS / 581 L it io / 581 Antidepresivos tricíclicos / 581 BRONCODILATADORES / 582 Teofilina / 582 FÁRMACOS INMUNOSUPRESIVOS / 582 Ciclosporina / 582 Tacrólimo / 583 ANTINEOPLÁSICOS / 583 Metotrexato / 583 RESUMEN / 583 PREGUNTAS DE REPASO / 584 REFERENCIAS / 585 LECTURAS RECOMENDADAS / 586

Función gastrointestinal / 547 Edward P Fody FIOSIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA DE LA SECRECIÓN GÁSTRICA / 547 ASPECTOS CLÍNICOS DEL ANÁLISIS GÁSTRICO / 548 PRUEBAS DE LA FUNCIÓN GÁSTRICA / 548 Mediciones del ácido gástrico en pruebas secretorias básales y máximas / 548 Medición del ácido gástrico / 548 Gastrina plasmática / 549 FISIOLOGÍA INTESTINAL / 549 ASPECTOS CLINICOPATOLÓGICOS DE LA FUNCIÓN INTESTINAL / 550 PRUEBAS DE LA FUNCIÓN INTESTINAL / 550 Prueba de tolerancia a la lactosa / 550 Prueba de absorción de la D-xilosa / 550 Carotenoides séricos / 551 Análisis de la grasa fecal / 551 Otras pruebas de malabsorción intestinal / 551 RESUMEN / 552 PREGUNTAS DE REPASO / 552 REFERENCIAS / 553 LECTURAS RECOMENDADAS / 553

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A n álisis de los líquidos corporales / 554 Frank A. Sedor LÍQUIDO AMNIÓTICO / 555 LÍQUIDO CEREBROESPINAL / 560 SUDOR / 563 LÍQUIDO SINOVIAL / 564 LÍQUIDOS SEROSOS / 564 Líquido pleural / 565 Líquido pericárdico / 565 Líquido peritoneal / 565 RESUMEN / 566 PREGUNTAS DE REPASO / 566 REFERENCIAS / 567 LECTURAS RECOMENDADAS / 567

PARTE IV

Áreas de especialidad de la química clínica / 569________________________________ 28

M onitoreo de fárm acos terapéuticos / 570 David P. Thorne VÍAS DE ADMINISTRACIÓN / 571 ABSORCIÓN / 571 FÁRMACOS LIBRES EN COMPARACIÓN CON COM ­ BINADOS / 572 DISTRIBUCIÓN DEL FÁRMACO / 572 ELIMINACIÓN DE FÁRMACOS / 572 Eliminación metabólica / 574 Eliminación renal / 575

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Toxicología / 587 David P. Thorne EXPOSICIÓN A TOXINAS / 588 VÍAS DE EXPOSICIÓN / 588 RELACIÓN DOSIS-RESPUESTA / 588 Toxicidad aguda y crónica / 589 ANÁLISIS DE LOS AGENTES TÓXICOS / 589 TOXICOLOGÍA DE AGENTES ESPECÍFICOS / 589 Alcohol / 589 Monóxido de carbono / 592 Agentes cáusticos / 593 Cianuro / 593 Metales / 593 Pesticidas / 596 TOXICOLOGÍA DE LOS FÁRMACOS TERAPÉUTICOS / 597 Salicilatos / 597 Acetaminofeno / 597 TOXICOLOGÍA DE FÁRMACOS DE ABUSO / 598 Anfetaminas / 599 Esteroides anabólicos / 600 Canabinoides / 600 Cocaína / 600 Opiáceos / 601 Fenciclidina / 601 Hipnóticos sedantes / 601 RESUMEN / 601 PREGUNTAS DE REPASO / 602

CONTENIDO

REFERENCIAS / 603 LECTURAS RECOM ENDADAS / 603

Vitaminas solubles en agua / 622 Requerimiento dietético recomendado (RDR) / 626 Metabolismo vitamínico / 626 Dietas especiales / 627 ÁCIDOS GRASOS ESENCIALES / 627 RIESGO DE DESNUTRICIÓN / 628 Personas en riesgo de desnutrición / 628 Respuesta inflamatoria sistémica y la dicotomía adaptativa nutricional dependiente / 629 Hipermetabolismo por estrés / 629 EVALUACIÓN NUTRICIONAL / 632 Programa de prevención del riesgo de desnutrición / 632 índice creatinina/altura / 632 Pruebas inmunológicas / 632 Composición corporal / 632 Pruebas funcionales / 633 Marcadores proteínicos en la evaluación nutricional / 633 Nutrición parenteral total / 636 RESUMEN / 638 PREGUNTAS DE REPASO / 639 REFERENCIAS / 639

M arcadores tum oraies en circulación: conceptos básicos y aplicaciones clínicas / 604 James T. Wu CONCEPTOS BÁSICOS / 605 Regulación del crecimiento / 605 Neoplasia e hiperplasia / 605 Diferencias entre células normales y cancerígenas / 605 Tumores benignos y malignos / 605 Metástasis / 605 Vía de transducción de la señal / 605 Ciclo c e lu la r/606 Apoptosis / 606 Angiogénesis / 607 Adhesión / 607 ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD / 608 UTILIDADES CLÍNICAS DE LOS MARCADORES TUM ORALES / 608 Valoración / 608 Monitoreo en el tratamiento / 608 Pronóstico / 609 Detección temprana / 609 Terapia objetivo / 609 TIPOS DE MARCADORES TUM ORALES / 609 Enzimas, proteínas del suero y hormonas / 609 Proteínas carcinoembriónicas / 610 Marcadores tumoraies definidos monoclonales / 611 Marcadores tumoraies no específicos / 611 Marcadores tumoraies específicos celulares / 611 RECOMENDACIONES PARA LA SOLICITUD DE UNA PR U EBA / 612 Solicitud de pruebas en s e r ie / 612 Uso del mismo equipo / 612 Vida media del marcador tumoral / 612 Efecto de gancho / 612 MARCADORES TUM ORALES SOLICITADOS CON FRECUENCIA / 612 Marcadores tumoraies individuales / 612 Antígeno carcinoembrionario (ACE) / 613 Cromogranina A / 613 Ácido homovanílico (AHV) / 613 Ácido siálico relacionado con lípidos en plasma (ASAL-P) / 614 Antígeno de carcinoma celular escamoso (ACCE) / 614 Ácido vanililmandélico (AVM) / 614 PREGUNTAS DE REPASO / 615 REFERENCIAS / 615 LECTURAS RECOMENDADAS / 616

V itam inas, grasas esenciales y m acronutrientes / 617

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32

Quím ica clínica y el paciente geriátrico I 642 Larry H. Bernstein EL IMPACTO DE LOS PACIENTES GERIÁTRICOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO / 643 TEORÍAS DEL ENVEJECIMIENTO / 644 CAMBIOS BIOQUÍMICOS Y FISIOLÓGICOS DEL ENVEJECIMIENTO / 645 Cambios de la fundón endocrina / 645 Diabetes mellitus y resistencia a la insulina / 647 Cambios en la función renal / 648 Cambios en la función hepática / 649 Función pulmonar y cambios electrolíticos / 649 Cambios lipidíeos y cardiovasculares / 650 Cambios enzimáticos / 650 RESULTADOS DE QUÍMICA CLÍNICA Y ENVEJECIMIENTO / 650 Establecimiento de intervalos de referencia en ancianos / 650 Variables preanalíticas, los ancianos y los resultados químicos / 651 Monitoreo de la terapéutica con fármacos en el anciano / 651 Los efectos del ejercicio y la nutrición en ancianos y resultados químicos / 652 RESUMEN / 652 PREGUNTAS DE REPASO / 653 REFERENCIAS / 653

33 Quím ica clínica pediátrica / 655

Larry H. Bernstein

Michael 1 Bennett

REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS / 618 ENERGÍA DE COMBUSTIBLES / 618 VITAMINAS / 618

CAMBIOS EN EL DESARROLLO DEL NEONATO AL ADULTO / 656 Respiración y circulación / 656

Vitaminas solubles en grasa / 620

Crecimiento / 656

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CONTENIDO

Desarrollo orgánico / 656 Problemas de premadurez e inmadurez / 656 FLEBETOMÍA Y ELECCIÓN DE LA INSTRUMENTACIÓN PARA MUESTRAS PEDIÁTRICAS / 657 Flebotomía / 657 Aspectos preanalítícos / 657 Elección del analizador / 658 ANÁLISIS EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN EN PEDIATRÍA / 658 REGULACIÓN DE LOS GASES SANGUÍNEOS Y DEL pH EN NEONATOS E INFANTES / 659 Medición de! gas sanguíneo y acidobase / 659 REGULACIÓN DE LOS ELECTRÓLITOS Y DEL AGUA: FUNCIÓN RENAL / 660 Trastornos que afectan el equilibrio electrolítico y de! agua / 660 DESARROLLO DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA / 661 Ictericia fisiológica / 661 Metabolismo energético / 661 Diabetes / 662 Metabolismo del nitrógeno / 662 Productos nitrogenados finales como marcadores de la función renal / 663 Pruebas de la función hepática / 663 CALCIO Y METABOLISMO ÓSEO EN PEDIATRÍA / 663 Hipocalcemia e hipercalcemia / 663 FUNCIÓN ENDOCRINA EN PEDIATRÍA / 664 Secreción hormonal / 664 Sistema hipotalámico-hipofisario-tiroideo / 664 Sistema hipotalámico-hipofisario-corteza suprarrenal / 665 Factores del crecimiento / 665 Control endocrino de la maduración sexual / 6 6 6 DESARROLLO DEL SISTEMA INMUNITARIO / 666 Conceptos básicos de inmunidad / 667 Componentes del sistema inmunitario / 667 Producción de anticuerpos en neonatos y lactantes / 668 Trastornos de la inmunidad / 668 ENFERM EDADES GENÉTICAS / 668 Fibrosis cística / 669 Valoración del recién nacido en poblaciones completas / 669 Diagnóstico de enfermedad metabólica en clínica / 669 METABOLISMO DE FÁRMACOS Y FARMACOCINÉTICA / 671

Monitoreo terapéutico del fármaco / 672 Problemas toxicológlcos en química clínica pediátrica / 672 R E S U M E N /672 PREGUNTAS DE REPASO / 673 REFERENCIAS / 673

A péndices / 674 A. UNIDADES BÁSICAS DEL SI / 675 B. PREFIJOS POR UTILIZARSE CON UNIDADES DEL SI / 675 C. CONVERSIONES BÁSICAS DE LABORATORIO CLÍNICO / 675 D. CONVERSIÓN DE UNIDADES TRADICIONALES A UNIDADES DEL SI PARA ANALITOS QUÍMICOS FR EC U EN TE/ 676 E. CONCENTRACIONES DE ÁCIDOS Y BASES USADOS CON FÓRMULAS RELACIONADAS / 677 F. EJEMPLOS DE QUÍMICOS INCOMPATIBLES / 678 G. NOMOGRAMA PARA LA DETERMINACIÓN DEL Á REA DE LA SUPERFICIE CORPORAL / 680 H. NOMOGRAMA DE FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA / 681 I. CENTRIFUGACIÓN: AJUSTE DE LA VELOCIDAD Y EL TIEMPO / 682 J. CUADRO DE CONVERSIÓN DE TRANSMITANCIAABSORBANCIA PORCENTUAL / 682 K. PESOS ATÓMICOS SELECCIONADOS / 684 L. CARACTERÍSTICAS DE LOS TIPOS DE VIDRIO / 685 M. CARACTERÍSTICAS DE LOS TIPOS DE PLÁSTICO / 686 N. RESISTENCIA QUÍMICA DE LOS TIPOS DE PLÁSTICO / 686 O. LIMPIEZA DEL MATERIAL DE LABORATORIO / 687 P. CUADRO DE RESUMEN DE PARÁMETROS FARMACOCINÉTICOS / 688 Q. INFORMACIÓN SELECCIONADA SOBRE FÁRMACOS QUE SUELEN CAUSAR ADICCIÓN / 690 R. TABLA PERIÓDICA DE LOS ELEMENTOS / 692

Glosario / 693 índice / 711

Principios básicos y práctica de la química clínica

C A P Í T U L O

Principios básicos y práctica 1

Eileen Carreiro-Lewandowski C O N T E N I D O

D E L

UN IDADES DE M ED ID A REACTIVO S Sustancias quím icas M ate riales de referen cia Especificaciones para el ag ua P ropiedades de la solución M A TERIA LES DEL LA BO RATO RIO CLÍNICO Term ó m etro s y te m p eratu ra M ate rial de vid rio y de plástico Desecadores y desecantes B alan zas TÉCN ICAS BÁSICAS DE SEPARACIÓN C e n trifu g ació n Filtración D iálisis

C A P I T U L O M A TEM Á TIC A S Y CÁLCULO S DE LA BO RATO RIO C ifras sig n ificativas Lo garitm os C o ncentració n D iluciones A g u a de h id ratació n CO NSIDERACION ES A C ER C A DE LA M U ESTRA Tipos de m uestras Pro cesam iento de la prueba V ariab les de la m uestra Cadena de custodia RESUM EN PREGUN TAS DE REPASO REFEREN CIAS

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Convertir resultados de un form ato de unidad a otro usando el SI. • Describir las especificaciones para cada tipo de agua de laboratorio. • Identificar los diversos grados químicos em plea­ dos en la preparación de reactivos e indicar su uso correcto. • Definir estándar primario, SRM, estándar secundario. • Describir los siguientes térm inos que se rela­ cionan con soluciones y, cuando sea apropiado, proporcionar las unidades respectivas: por ciento, m olaridad, normalidad, m olalidad, saturación, propiedades coligativas, potencial redox, conducti­ vidad y densidad relativa. • Definir una disolución am ortiguadora y dar la fór­ mula para calcular pH y pK. • Usar la ecuación de Henderson-Hasselbalch para determ inar la variable faltante cuando se da el pK y el pH, o el pK y la concentración del ácido débil y su base conjugada.

2



• • • •

• • •

• •

Elaborar una lista de los tipos de termómetros utilizados en el laboratorio clínico, y describir cada uno de ellos. Clasificar el tipo de pipeta cuando se tiene una pipeta real o su descripción. Describir dos form as de calibrar una pipeta. Definir un desecante y explicar cómo se utiliza en el laboratorio clínico. Llevar a cabo de m anera correcta los cálculos matem áticos de laboratorio proporcionados en este capítulo. Identificar y describir los tipos de muestras utiliza­ das en la química clínica. Describir los pasos generales para procesar m ues­ tras de sangre. Identificar las variables preanalíticas, de precolección, colección y poscolección que afectan de manera adversa los resultados de laboratorio. Elaborar una lista con el orden de disposición ade­ cuado para los tubos de colección. Identificar el aditivo o conservador, si está presen­ te, cuando se da un color de tapón de recolección.

CAPÍTULO 1 ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA

T É R M I N O S Absorbancia A Agente oxidante A gua desionizada A gua destilada Agua RO A nalito Anhidra Bureta Calibración de un punto Cáracter Centrifugación Cifras significativas Conductividad Densidad Densidad relativa Desecadro Desecante Diálisis

Dilución Dilución serial Disolución Disolución am ortiguadora Disolvente EDTA Estándar Estándar primario Estándar secundario Filtración Filtrado Flebotomía Fuerza iónica Hemolisis Henderson-Hasselbalch Hidrato Higroscópica Ictericia

E l objetivo principal de u n laboratorio de quím ica clínica es la eje cu ció n correcta de proced im ientos analíticos que p rodu cen inform ación exacta y precisa, lo que con trib u ­ ye al diagnóstico y tratam iento del paciente. E l logro de resultados confiables requiere que el laboratorista clínico use de m anera correcta los m ateriales y el equipo, y com ­ prenda los concep tos fundam entales críticos para cu al­ quier proced im iento analítico. L os tem as de este capítulo son unidades de m ed ición, m ateriales básicos de labora­ torio, m atem áticas de laboratorio a nivel de introd u cción , adem ás de una exp licación breve de la re co lecció n y el procesam iento de m uestras.

UN IDADES DE M EDIDA1 C ualquier resultado de laboratorio cu antitativo im por­ tante inclu ye dos com ponentes. E l prim ero representa el valor real, y el segundo es una etiqueta que identifica las unidades de la expresión. E l núm ero d escribe el valor n u m érico , m ientras que la unidad define la cantidad física o d im ensión (p. e j., m asa, longitud , tiem po o volu m en). A unque las distintas divisiones científicas han utiliza­ do de m anera tradicional varios sistem as de unidades, se prefiere el Sistem a Internacional de Unidades (SI), adop­ tado a nivel internacional en 1 9 6 0 , en las pu blicaciones científicas y los laboratorios clín ico s, y suele ser el ún ico sistem a utilizado en m u chos países. E ste sistem a se diseñó para dar a la com unidad cien tífica global un m étodo u n i­ form e al d escribir cantidades físicas. La unidades del SI (d enom inadas unidades SI) se basan en el sistem a m étrico. E n el SI existen varias clasificaciones de unidades, una de las cuales es la unidad básica. Hay varias unidades básicas (cuadro 1 -1 ), donde longitud (m etro ), m asa (kilogram o) y cantidad de sustancia (m ol) son las que se encu entran con m ás frecuencia. A otro co n ju n to de unidades reconocid as se le d enom ina unidades derivadas. U na unidad derivada,

3

C L A V E ___________________________________________

Ley de Beer Líquido cefalorraquídeo (LCR) Mantisa M ateriales de referencia estándar (SRM) Molalidad Molaridad Nanofiltración NCCLS Normalidad Oxidado Paracentesis Peso equivalente PH Pipeta PK Potencial redox

Presión osmótica Propiedad coligativa Reducida Relación Sangre arterial Sangre total Sistema Internacional de Unidades (SI) Solución en por ciento Soluto Suero Sustancias delicuescentes Termistor Tubo evacuado Ultrafiltración Unidad internacional Valencia Venipunción

com o lo ind ica su nom bre, es una derivada o una fu nción m atem ática de una de las unidades básicas. U n ejem plo de una unidad SI es m etro por segundo (m/s) que se utiliza para expresar velocidad. Sin em bargo, algunas unidades que no son del SI se utilizan tanto que su uso se ha vuelto aceptable con las unidades SI básicas o derivadas (cuadro 1 -1 ). E n tre éstas se inclu yen ciertas unidades antiguas, com o hora, m inu to, día, gram o, litro y ángulos planos expresados com o grados. Estas unidades, aunque se u tili­ zan y reco n o cen , no se clasifican técn icam en te com o u n i­ dades SI básicas ni derivadas. O tra con v en ció n SI es el uso de prefijos estándar u tili­ zados ju n to con una unidad sim ple (cuadro 1 -2 ). Los pre­ fijos se pueden añadir para indicar fraccion es decim ales o m ú ltiplos de una determ inada unidad. Por ejem plo, 0 .0 0 1 L se podría expresar por m edio del prefijo mili, lo que equivaldría a un m ililitro y se escribe com o 1 mi. N ote que el térm ino SI para masa es kilog ram o ; es la ún ica unidad básica que con tien e un prefijo com o parte de su conv en­ ción de nom bre. P or lo general, los prefijos estándar para m asa em plean el térm ino gram o en vez de kilogram o. Los resultados de laboratorio suelen expresarse en tér­ m inos de con cen tració n de sustancia (p. e j., m o les) o la m asa de una sustancia (mg/dl, g/dl, meq/L y U I). Estas unidades fam iliares y tradicionales pueden causar confu ­ sión durante la interpretación. Se recom ienda presentar el inform e de analitos usando m oles de soluto por volu­ m en de d isolu ción (co n cen tració n de su stancia) y que el litro se use com o volum en de referencia.2 L os cuadros en que se presen tan valores de referencia de laboratorio proporcionan valores tradicionales, adem ás de valores SI recom endados. E n el apéndice D, Conversión de unidades

tradicionales a unidades SI p ara analitos quím icos clínicos comunes, se presentan am bas unidades ju n to co n el fac­ tor de con v ersión de unidades tradicionales a unidades SI para analitos com unes.

4

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

CUADRO 1-1. U N ID A D ES D EL SI

CUADRO 1-2. PREFIJO S EM P LEA D O S

CAN TIDAD BASE

NOM BRE

SÍM BO LO

longitud

metro

m

masa

kilogramo

kg

tiem po corriente eléctrica

segundo

s

ampere

A

CON U N ID A D ES SI FACTOR

PREFIJO

SÍM BO LO

10-18

atto

a

10-15

femto

f

•I 0-12

pico

P

10“9 10-6

nano

n

micro

P

mol

10-3

milli

m

candela

cd

10-2

cenli

c

101

deci

d

frecuencia

hertz

Hz

10’

deka

da

fuerza

newton

N

102

hecto

h

tem peratura Celsius

grado Celsius

°C

103

kilo

k

actividad catalítica

katal

kat

104

mega

M

109

giga

G

tem peratura termodinám ica

kelvin

cantidad de sustancia

mol

intensidad luminosa

K

Derivada seleccionada

Selección no aceptada por el SI minuto (tiempo)

(60s)

min

1012

tera

T

hora

(3600s)

h

1015

peta

P

día

(86,400s)

d

1018

exa

E

litro (volumen)

(1 d m 3 = 10~3 m 3)

L

Nota: los prefijos se emplean para Indicar una subunidad o un múltiplo de

angstrom

(0.1 nm = 10"l0m)

Á

una unidad básica del SI.

REACTIVOS Al parecer, en el laboratorio altam ente automatizado de nuestros días hay poca necesidad de que el laboratorista clínico prepare reactivos. Casi todos los fabricantes de instrum entos tam bién elaboran reactivos, por lo com ún en forma de “k it” fácilm ente disponible (es decir, los reactivos necesarios y sus recipientes de alm acenam iento respectivos se preem pacan com o una unidad) o que sólo requieren la adición de agua o disolución am ortiguadora a los com po­ nentes de reactivo preempacados. Una mayor conciencia de los riesgos de ciertas sustancias quím icas y num erosos requisitos de agencias reguladoras han ocasionado que los laboratorios quím ico clínicos elim inen reservas masivas de sustancias quím icas y opten por usar reactivos prepa­ rados. De form a periódica, sobre todo en laboratorios de hospitales relacionados con la investigación y el desarrollo, análisis especializados o validación de m étodos, es posible que el laboratorista tenga que preparar varios reactivos o disoluciones. Com o resultado del deterioro del reactivo, de la oferta y la demanda, o de la in stitución de programas de contención de costos, llega a tom arse la decisión de preparar los reactivos internam ente. Por tanto, es necesario conocer por com pleto sustancias quím icas, estándares, disoluciones, disoluciones am ortiguadoras y requisitos de agua.

Sustancias quím icas3 Las sustancias quím icas analíticas existen en varios grados de pureza: grado reactivo analítico (A R ); ultrapura, quí­ m icam ente pura (C P ); United States P harm acopea (U SP);

N ational Form ulary (N F ), y grado técn ico o com ercial. La A m erican C hem ical Society (ACS) ha establecido especifica­ ciones para sustancias quím icas grado reactivo analíticas, y los fabricantes satisfarán o excederán estos requisitos. Las etiquetas en estos reactivos expresan las im purezas rea­ les de cada lote de su stan cia o en u m eran las im purezas m áxim as perm isibles. Las etiquetas deben estar impresas de m anera clara e in clu ir el porcen taje de im purezas presente y las iniciales AR o ACS, o los térm inos p ara uso en la bo­ ratorio o m ateriales de referencia grado estándar ACS. Las sustancias quím icas de esta categoría son adecuadas para la m ayor parte de los procedim ientos analíticos de labora­ torio. Las sustancias ultrapuras, que pasan por m ás pasos de purificación, se em plean en proced im ientos específicos com o crom atografía, absorción atóm ica, inrnunoensayos, diagnóstico m olecular, estandarización u otras técnicas que requieren sustancias extrem adam ente puras. Estos reactivos podrían llevar las designaciones HPLC o crom atográfica (véase a contin u ació n) en sus etiquetas. D ebido a que las sustancias grado USP y N F se em plean para elaborar fárm acos, las lim itacion es establecidas para este grupo de sustancias se basan sólo en el criterio de que no sean dañinas para los individuos. Las sustancias de este grupo pueden ser suficientem ente puras para usarse en casi todos los proced im ientos quím icos; sin em bargo, se debe recon o cer que sus estándares de pureza no se basan en las necesidades del laboratorio y, por tanto, podrían satisfacer o n o los requ isitos del ensayo. Las designaciones para reactivo de CP o grado puro indican que no se expresan las lim itaciones de impurezas,

CAPÍTULO 1 ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA

y que la preparación de estas sustancias no es uniform e. C on frecuencia se emplea el análisis de tem peratura de fusión para determ inar el intervalo de pureza aceptable. No se recom ienda que los laboratorios clínico s usen estas sus­ tancias para preparación de reactivos a m enos que se in clu ­ ya más pu rificación o un b lanco de reactivo. Los reactivos grado técnico o com ercial se em plean sobre todo en m anu­ factura, y nu nca se deben usar en el laboratorio clínico. Los reactivos orgánicos tam bién tien en varios grados de pureza que difieren de los que se em plean para clasifi­ car reactivos inorgánicos. E stos grados inclu yen un grado p ráctico co n algunas im purezas; quím icam ente puro, con enfoques al nivel de pureza de sustancias quím icas grado reactivo; reactivos orgánicos grado esp ectroscópico (pura desde el pu nto de vista espectral) y crom atográfico (pure­ za m ínim a de 99% determ inada m ediante crom atografía de gases), con niveles de pureza logrados m ediante sus proced im ientos respectivos, y grado reactivo (A C S), que cuenta con certificación de que contiene im purezas por debajo de ciertos niveles establecidos por la ACS. Com o en cu alquier m étodo analítico, la pureza deseada del reac­ tivo orgánico se indica m ediante la ap licación particular. Aparte de los aspectos de pureza de las sustancias quí­ m icas, leyes com o la Occupational Safety and Health Act (O SH A )4 requieren que los fabricantes indiquen co n cla­ ridad el núm ero de lote, m ás cu alquier riesgo físico o b io ­ lógico para la salud y precau cion es necesarias para el uso seguro y alm acenam iento de cu alquier sustancia quím ica. Se requiere que un fabricante proporcione h ojas de datos técn icos de cada sustancia y un d ocum ento llam ado h oja de datos de seguridad del m aterial ( m aterial safety data sheet, M SD S). E n el capítulo 2, Seguridad y regulaciones en el laboratorio, se presenta una exp licación m ás detallada de este tema.

M ateriales de referencia5 9 A diferencia de otras áreas, la quím ica clín ica se relaciona co n el análisis de subproductos b ioq u ím ico s encontrados en el suero, lo que hace casi im posible la purificación y la d eterm inación dé su exacta com p osición . Por esta razón, los estándares definidos de m anera tradicional no se apli­ can estrictam ente en la quím ica clínica. R ecuerde que u n estándar prim ario es una sustancia altam ente purificada que se puede m edir de m odo d irec­ to para producir una sustancia de pureza y con cen tració n conocid a exacta. Las tolerancias de pureza ACS para están­ dares prim arios son 1 0 0 ± 0 .0 2 % . D ebido a que casi no hay constitu yentes biológicos disponibles dentro de estas lim itaciones, se em plean los m ateriales de referencia están­ dar (standard reference m aterials, SRM ) certificados por el NIST, en lugar de los estándares prim arios ACS. E l N IST desarrolló m aterial de referencia certificado (CRM/SRM) para uso en laboratorios quím ico clín ico s. Se les asigna un valor después del análisis cuidadoso, con lo últim o en m étodos y equipo. Así, se certifica la com p osi­ ció n quím ica de estas sustancias; sin em bargo, es posible que no posean el equivalente de pureza de un estándar pri­ m ario. D ebido a que cada sustancia ha sido caracterizada

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para ciertas propiedades quím icas y físicas, se puede usar en lugar de un estándar prim ario ACS en el trabajo clín ico y se em plea con frecuencia para com probar la calibración o evaluaciones de exactitu d y sesgo. M u chos fabricantes utilizan un N IST SRM al producir m ateriales estándar y de calib ració n y, de este m odo, son considerados “localizables según el N IS T ”, y pueden satisfacer ciertos requ isi­ tos de acreditación. Hay m ateriales de referencia estándar para un núm ero lim itado de analitos, inclu so horm onas, fárm acos seleccionados y gases sanguíneos. E stán disponi­ bles los SRM 9 0 9 a y 9 0 9 b para suero hum ano, con el SRM 9 0 9 a certificado para calcio, cloru ro, colesterol, creatinina, glucosa, litio , m agnesio, potasio, sodio, urea, ácido úrico, y los oligoelem entos cadm io, crom o, cobre, hierro, plom o y vanadio; y el SRM 9 0 9 b añade los trig licérid o s.10 Un estándar secundario es una sustancia de m enor pure­ za, cuya concentración se determ ina por com paración con un estándar primario. El estándar secundario no sólo depen­ de de su com posición, que no se puede determ inar de modo directo, sino tam bién del m étodo de referencia analítico. Una vez más, debido a que por lo general no se dispone de estándares prim arios fisiológicos, los quím icos clínicos no tienen por definición estándares secundarios “verdaderos”. Los fabricantes de estándares secundarios incluirán el SRM o el estándar primario utilizado para com paración. Esta inform ación llega a ser necesaria durante procesos de acre­ ditación de laboratorio.

Especificaciones para el ag u a11 E l agua es el reactivo utilizado con más frecuencia en el laboratorio. Debido a que el agua de la llave es inadecuada para aplicaciones de laboratorio, en casi todos los procedi­ m ientos, incluida la preparación de reactivos y estándares, se em plea agua que ha sido purificada en form a sustancial. E l agua que se purifica sólo por destilación da com o resul­ tado agua d estilada ; el agua que se purifica por intercam bio ión ico produce agua desionizada. La osm osis inversa, en que se bom bea agua por una m em brana sem iperm eable, produce agua de osm osis inversa. E l agua se purifica tam ­ b ién m ediante ultrafiltración, luz ultravioleta, esteriliza­ ción o tratam iento con ozono. Los requisitos de laboratorio suelen indicar agua grado reactivo que, según el National Com m ittee fo r Clinical Laboratory Standards (NCCLS), per­ tenece a uno de tres tipos (I, II o III). Se recom ienda deno­ m inar al agua grado reactivo, seguida del tipo relacionado (I, II o III), en vez del m étodo de prep aración.12 La filtración previa elim ina partículas de m ateria de sum inistros de agua m u nicipales antes que cu alquier tra­ tam iento adicional. Los cartu chos de filtración están for­ m ados por vidrio, algodón, carbón activado (que elim ina m ateriales orgánicos y cloro) y filtros de subm icras ( ^ 0 .2 m m ), que elim inan cualquier sustancia más grande que los poros del filtro, incluidas bacterias. El uso de estos fil­ tros depende de la calidad del agua m u nicipal y los otros m étodos de purificación em pleados. Por ejem plo, el agua dura (que con tiene calcio, hierro y otros elem entos clisueltos) podría requ erir prefiltración con un filtro de vidrio o algodón en vez de carbón activado o filtros de subm icras,

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

que se taponan con facilidad y cuya op eración resulta co s­ tosa. Los filtros de subm icras llegan a resultar m ejores des­ pués de la d estilación, d esionización o del tratam iento por osm osis inversa. E l agua destilada se purifica para elim inar casi todos los materiales orgánicos. Se usa una técnica de destilación muy parecida a la que se encuentra en experim entos de destila­ ción de laboratorios de quím ica orgánica en que el agua se hierve y evapora. E l vapor sube y entra al serpentín de un condensador, un tubo de vidrio que contiene un serpentín de vidrio. El agua fría que rodea a este serpentín condensa­ dor disminuye la temperatura del vapor de agua. E l vapor de agua vuelve al estado líquido, que se recolecta después. M uchas impurezas no suben en el vapor de agua, y perm ane­ cen en el aparato de ebullición. E l agua recolectada después de la condensación tiene m enos contam inación. Debido a que los laboratorios usan miles de litros de agua todos los días, se usan alambiques en lugar de pequeños aparatos de condensación; sin embargo, los principios son básicam ente los mism os. E l agua puede ser destilada más de una vez, y en cada ciclo de destilación se elim inan más impurezas. E n el agua desionizada se han elim inado algunos o todos los iones, aunque podría estar presente m aterial orgánico, así que no es pura ni estéril. Por lo general, el agua desio­ nizada se purifica a partir de agua tratada previam ente, com o el agua prefiltrada o destilada. E l agua desioniza­ da se produce por m edio de una resina de intercam bio de aniones o cationes, seguida del reem plazo de las partícu­ las elim inadas con iones hidróxido o hidrógeno. Los iones que se prevé elim inar del agua d eterm inarán el tipo de resina de intercam bio ión ico que se usará. U na colum na es insuficiente para todos los iones presentes en el agua. La com bin ació n de varias resinas producirá diferentes grados de agua desionizada. U n sistem a de doble cam a em plea una resina am ónica seguida de una catión ica. Las dife­ rentes resinas pueden estar en colum nas separadas o en la m ism a. Este proceso es excelen te para elim inar sólidos ionizados y gases disueltos. La osm osis inversa es un proceso que usa presión para forzar el agua por una m em brana sem iperm eable, y pro­ duce agua que refleja u n producto filtrado del agua origi­ nal. No elim ina gases disueltos. La osm osis inversa podría utilizarse com o pretratam iento para el agua. La ultrafiltración y la nanofiltración, al igual que la des­ tilación, son excelen tes para elim inar m ateria particulada, m icroorganism os y cualquier pirógeno o endotoxinas. La oxid ación ultravioleta (elim ina algunos m ateriales orgáni­ cos traza) o los procesos de esterilización (u tilizan long i­ tudes de ondas esp ecíficas), ju n to co n el tratam iento por ozono, destruyen bacterias que dejan productos residua­ les. Estas técnicas se em plean después que se utilizaron otros procesos de purificación. La p rod u cción de agua grado tipo I depende en gran m edida de la con d ició n del agua alim entada. P or lo gene­ ral, el agua se obtiene al filtrarla in icialm en te para elim inar m ateria particulada, seguida de osm osis inversa, d esio­ n izació n y u n filtro de 0 .2 m m o procesos de filtración m ás restrictivos. E l agua tipo III es aceptable para lavar m aterial de vidrio pero no para análisis o preparación de

reactivos. E l agua tipo II es aceptable para casi todos los requ isitos analíticos, inclu id os preparación de reactivos, controles de calidad y estándares. E l agua tipo I se em plea para probar m étodos que requieren interferen cia m ínim a, com o análisis de m etales traza, hierro y enzim as. E l uso con crom atografía líquida de alta resolu ción podría reque­ rir una etapa de filtración final con un filtro m enor de 0 .2 m m . D ebido a que el agua tipo I se debe usar de inm edia­ to, no se recom ienda el alm acenam iento por los cam bios de resistividad. E l agua tipo II se debe alm acenar de m ane­ ra tal que se reduzca cualquier con tam in ació n quím ica o bacteriana y durante períodos cortos. Los proced im ientos de prueba para determ inar la calidad del agua grado reactivo inclu yen m ed iciones de resistencia; pH, cuentas de colonias (para evaluar la con ta­ m in ación b acteriana) en m edios selectivos y no selectivos para la d etección de coliform es, cloro, am oniaco, nitrato o n itrito, hierro, dureza, fosfato, sodio, sílice, d ióxido de carbono, dem anda quím ica de oxígen o (D Q O ) y d etec­ ció n de m etales. Algunas agencias de acred itación 13 re co ­ m ien dan que los laboratorios d ocu m en ten el desarrollo de cultivos, pH y resistencia específica al agua utilizada en la preparación del reactivo. La resistencia se m ide porque el agua pura, desprovista de iones, es un m al con d u ctor de la electricidad. La relación entre pureza del agua y resis­ ten cia es lineal. Por lo general, si se increm en ta la pure­ za, tam bién se increm en ta la resistencia. E sta m ed ición es insu ficiente para d eterm inar la pureza verdadera del agua porque es posible que esté presente u n contam in ante ió n i­ co que tenga poco efecto en la resistencia. E n el cuadro 1-3 se presenta una lista de las esp ecificaciones del agua grado reactivo de cada tipo para parám etros seleccionados de acuerdo co n las norm as del N CC LS. Tome nota de que el agua grado reactivo que satisfa­ ce las esp ecificaciones de otras organizaciones, com o la A m erican Society f o r Testing M aterials (A ST M ), tal vez no sea equivalente a las esp ecificaciones que establece para cada tipo el N C C LS, y se debe ten er cuidado de satisfacer los requ isitos de proced im iento del ensayo respecto a las exigencias de tipo de agua. E n el caso de ciertos p ro ce­ d im ientos, tal vez se requiera agua tipo especialidad que exced e las esp ecificaciones del agua tipo I.

Propiedades de la solución E n la quím ica clín ica se m iden sustancias encontradas en líquidos b iológ icos (p. e j., suero, orina y líquido espinal).

CUADRO 1-3. AGUA PARA REACTIVO TIPO i

TIPO II

TIPO lli

Recuento máximo de colonias (UFCm i)

30

ro 40 o g 30

CD

: 20

|

10

£

20

5

10

2

5

1

2

10

20

30

40

50 .2

GGTP en mujeres (Ul/L): escala lineal

FIGURA 3-10.

.4

.6

.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

TBIL (mg/dl): escala lineal

Gráfica de probabilidad para GGTP: escala lineal. FIGURA 3-11. Histograma de frecuencias de bilirrubina total en 228 varones y mujeres (inserto) y la gráfica de probabilidad correspondien­ te (escala lineal).

de los antiguos, aun cuando se u sen el m ism o instrum ento y m etodología. A ntes de hacer cualquier aju ste en el inter­ valo de referencia, se debe em prender una investigación cuidadosa para d escubrir si ha cam biado el m étodo analí­ tico o la po blació n de referencia. La distribución de datos de pacientes hospitalizados ha sido analizada m ediante varios m étodos com putacionales en un intento por deducir intervalos de referencia relacio­ nados con la salud. M artin y asociados han recom endado que los intervalos de referencia se deduzcan del análisis num érico de datos de distribuciones de pacientes.15 E xisten problem as en este m étodo para la determ inación del inter­ valo de referencia, lo cual explica su falta de aceptación. U n alcance norm al o intervalo de referencia relacion a­ do co n la salud es adecuado para casi todas las pruebas. Hay algunas pruebas, com o la hem oglobina glucosilada (H bAlc), para la cual es deseable un intervalo de referen­ cia alterno. La HbA,le es una medida de la con cen tració n de glucosa sanguínea prom edio del individuo en las 10 sem anas pasadas; la HbAlc se m ide por lo general para determ inar y m ejo rar el cum plim iento de los regím enes de dieta, ejercicio y m edicación. E n el histogram a de fre­ cu encia de la figura 3 -1 2 se com paran los valores de H bA |( de individuos norm ales con los de pacientes co n diabetes. Hay poco traslape entre pacientes sin diabetes y con dia­ betes. E l alcance superior norm al tiene poca significación

para pacientes con diabetes; m u ch os m édicos em plean un lím ite un poco arbitrario de m enos de 7% para designar el con trol diabético excelente. Para HbA,le’, el intervalo de referencia más útil es probable que sea el que se basa en los valores de HbAlc previos del paciente.

60 50

■ Normal ¡üj Diabetes

55 40

O §

o

30

S? 20 10

0

FIGURA 3-12. Comparación de histogramas de frecuencias de hemoglobina A lc para sujetos con glucosas de ayuno y pacientes con diabetes.

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

Validación del intervalo d e referen cia M uchos laboratorios carecen de recursos adecuados para llevar a cabo estudios de intervalos de referencia rigurosos desde el punto de vista estadístico. Incluso sin los pasos de introducción y análisis de datos, el reclutam iento y el m ues­ treo de un m ínim o de 120 individuos es demandante. La mayor parte de los fabricantes de analizadores de labora­ torio clínico proporcionan intervalos de referencia para los analitos m edidos con sus reactivos. U n laboratorio no nece­ sita elaborar su propio intervalo de referencia para un nuevo analizador y reactivos. Más bien, necesita hacer un estudio de validación m ucho más pequeño descrito en el m ism o docu­ m ento de la N CCLS C28-A.14 Sólo se requieren muestras de 20 individuos de referencia para análisis en un instrum ento de prueba, si el laboratorista determ ina que el instrum en­ to de prueba y la población de individuos son sim ilares a los descritos en las instrucciones del fabricante. Los lím ites de referencia de 95% que describe el fabricante podrían ser considerados válidos si no más de 2 a 2 0 individuos exa­ m inados quedan fuera de los lím ites descritos originales. Si tres o más resultados de prueba están fuera de estos límites, es necesario obtener otras 2 0 muestras de referencia; si no más de dos de estos nuevos resultados están fuera de los lím ites del fabricante, entonces se pueden usar los lím ites del fabricante. Si fracasa el segundo intento en la validación, el laboratorista debe exam inar de nuevo el procedim iento analítico e identificar las diferencias entre la población del laboratorio y la que usó el fabricante para la inform ación del instructivo. En caso de no identificar diferencias, podría ser necesario que el laboratorio lleve a cabo el estudio com pleto de intervalos de referencia con 120 individuos.

EFICACIA DEL DIAGNÓSTICO E l m aterial de esta sección perm ite al lecto r analizar los datos de prueba del paciente, y calcular la sensibilidad diagnóstica y especificidad y el valor predictivo de una prueba. E l lecto r tam bién podrá com parar las eficacias d iagnósticas de varias pruebas de laboratorio y d eterm inar la prueba m ás útil.

Teoría del valor predictivo M ientras que los radiólogos de principios de la década de 1 9 5 0 em pleaban los térm inos sensibilidad diagnóstica, especificidad y valor predictivo, no fue sino hasta la década de 1 9 7 0 que los laboratoristas se fam iliarizaron con sus significados. La sensibilidad diagnóstica no debe confu n­ dirse con la analítica. Para una prueba que se em plea para diagnosticar determ inada enferm edad, la sensibilidad diag­ nóstica es la proporción de individuos co n esa enferm e­ dad que dan positivo con la prueba. La sensibilidad suele expresarse com o porcentaje: 100 X el número de individuos i v i , /n/■, enfermos con una prueba positiva Sensibilidad (% ) = -------------------------------------------------número total de individuos enfermos examinados (Ec. 3-16)

61

La especificidad de una prueba se define com o la pro­ p orción de individuos sin la enferm edad con resultados de prueba negativos para la enferm edad. La especificidad (% ) se define com o sigue: 100 x el número de individuos sin la enfermedad con una Especificidad (% ) =

prueba negativa

(Ec. 3-17)

número total de individuos examinados sin la enfermedad

De m anera ideal, la sensibilidad y la especificidad deben ser cada una de 100% . La sensibilidad y especificidad de una prueba dependen de la distribución de los resultados de la prueba para individuos enferm os y no enferm os, y tam bién de los valores de prueba que definen los niveles anorm ales. E n la figura 3 -1 3 se m uestran los histogram as de frecu encia de antígeno específico de próstata (PSA) de dos p oblaciones de pacientes. Estas dos p oblaciones son su b con ju n tos de un grupo de 4 9 6 2 varones volu nta­ rios, con edades de 5 0 años o más en quienes se evaluó la presencia de cáncer de próstata m ediante exam en rectal digital de la próstata y una m ed ición de PSA.16 De estos voluntarios, 7 7 0 tuvieron hallazgos anorm ales. E l h isto ­ grama de frecu encia superior representa el su b con ju n to de 5 7 8 pacientes con valores de PSA anorm ales o exám enes rectales digitales anorm ales a quienes se les p racticó una biopsia para determ inar cáncer de próstata y se encontró que no tenían la enferm edad. E l histogram a de frecu en­ cia inferior representa el su b con ju n to de 1 9 2 pacientes con valores de PSA anorm ales o exám enes rectales digi­ tales anorm ales a quienes se les practicó una biop sia y se en con tró que tenían cáncer de próstata. Se puede ver que, aunque los pacien tes con carcinom a de próstata tienden a tener valores más altos de PSA, hay gran cantidad de tras­ lape entre las dos poblaciones. La sensibilidad y la especificidad se pueden calcular para cu alquier valor de PSA. Si los valores altos de PSA se usan para in dicar la presencia de enferm edad (es decir, si los valores que pasan de 3 5 ng/ml se em plean para indicar cáncer de próstata), entonces la especificidad de la prueba será 100% (todos los pacien tes con cán cer de próstata se clasifican com o negativos con la pru eba). Sin em bargo, la sensibilidad es b aja (2 .6 % ); sólo 5 de 1 9 2 pacientes con carcinom a tienen valores de PSA m ayores que 3 5 ng/ml. La sensibilidad se puede increm en tar al dism inuir el valor de prueba. P or tanto, si los valores de PSA m ayores que 4 .0 ng/ml (el lím ite de referencia superior aceptado) se em plean para diagnosticar carcinom a, la sensibilidad se increm enta a 79% . No obstante, la especificidad dism inu­ ye a 4 6 % . Hay pocas pruebas de laboratorio con sen sibili­ dades y especificidades cercanas a 100% . La sensibilidad y especificidad de la fracción M B de la creatina cinasa para el diagnóstico de infarto de m iocardio son casi de 95% cada una. La troponina, aunque con casi la m ism a sen si­ bilidad para diagnosticar infarto de m iocardio, tiene una especificidad m ejorada, alrededor de 98% . Las pruebas de em barazo con gonadotropina corión ica hum ana (h C G ) en suero y orina empleadas en el laboratorio clín ico tienen

62

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

160 140

Hipertrofia prostética benigna N =578

.2 100

20 30 40 Antígeno prostético específico

50

60

160 140

Carcinoma prostético N = 192

120 ■g 100 C O 3

80

u-

60

0)

40 20

0 10

B

20 30 40 Antígeno prostático específico (ng/ml)

sensibilidades que se aproxim an a 100% . M uchas pruebas tien en sensibilidades y especificidades que son cercanas a 50% . G alen y G am bino han expresado que si la sum a de la sensibilidad y especificidad de una prueba es casi 100% , la prueba no es m ejo r que lanzar un a m oneda al aire.17 La sensibilidad y la especificidad se pueden calcular a partir de relaciones sim ples. Los pacientes co n enferm e­ dad que son clasificados de m anera correcta m ediante una prueba com o portadores de la enferm edad se llam an posi­ tivos verdaderos (T P ). Los pacientes sin la enferm edad que son clasificados m ediante la prueba com o no portadores de la enferm edad se llam an negativos verdaderos (T N ). Los pacientes con la enferm edad que son clasificados m edian­ te la prueba com o libres de la enferm edad se llam an nega­ tivos fa lso s (F N ). Los pacien tes sin la enferm edad que son clasificados de m anera incorrecta com o portadores de la enferm edad se llam an positivos fa lso s (F P ). La sensibilidad se puede calcular a partir de la fórm ula 1 0 0 TP/(TP + FN ). La especificidad se puede calcular de 1 0 0 TN/(TN + F P ). O tras tres relaciones son im portantes en la evaluación de pruebas de diagnóstico: valor predictivo de una prue­ ba positiva (PV +), valor predictivo de una prueba negativa (PV~) y la eficiencia. PV+ es la fracción de pruebas positivas que son positivos verdaderos: PV+ (% ) = 1 0 0 TP/(TP + F P ).

50

60

FIGURA 3-13. Histogramas de frecuen­ cias de resultados de PSA (ensayo Hybritech Tándem) de pacientes evaluados para posible cáncer de próstata. (A) En la gráfica superior se muestra el PSA de pacientes a los que se les realizó una blopsla sin cáncer de próstata; (B) la gráfica Inferior muestra el PSA de pacientes con cáncer de próstata detectado mediante blopsia. (Adaptada de Catalona WJ, Richie JP, deKernlon JB y col. Comparación de la concentración de antí­ geno prostático específico en la detección oportuna de cáncer de próstata: curvas características de operación del receptor. J Urol 1994; 152:2031.)

PV“ es la fracción de pruebas negativas que son negativos verdaderos: PV'a (% ) = 1 0 0 TN/(TN + FN ). La eficiencia de u n prueba es la fracción de los resultados de prueba que son positivos verdaderos o negativos verdaderos: eficiencia (% ) = 1 0 0 (T P + TN)/(TP + TN + F P + F N ). Los cálculos de sensibilidad, especificidad y valores predictivos para PSA que pasan de 4 .0 ng/ml se m uestran en el cuadro 3 -3 . Si un paciente tiene u n resultado de prueba negativo, tiene una probabilidad de 87% de no tener cáncer. La probabilidad de que un paciente tenga cáncer si tiene una prueba posi­ tiva es bastante baja, alrededor de 33% . E l valor predictivo de una prueba se puede expresar com o una fu n ció n de la sensibilidad, especificidad y prevalencia de enferm edad, o la proporción de individuos en la población que tien en la enfermedad:

PV =

prevalencia x sensibilidad

1 ----------------------------------------

(Ec. 3-18)

(prevalencia) (sensibilidad) + (1 - prevalencia) (1 - especificidad) E l PV+ para PSA para varias prevalencias y un lím ite de 4 .0 ng/ml (sensibilidad =, especificidad =) se m uestran en el cuadro 3 -4 . Se puede observar que, inclu so en la situa­ ción en que la enferm edad tiene una prevalencia alta (0 .2 ,

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

CUADRO 3-3. CÁ LCU LO D E M U ESTRA DE SEN SIB ILID A D , ESP EC IFIC ID A D , P V , PV C A LC U LA D A PARA V A LO R ES DE PSA DE > 4 .0 NG/IVIL

63

Y EFIC IEN C IA

NÚM ERO DE PACIENTES CON PSA

NÚM ERO DE PACIENTES CON

POSITIVO (> 4 .0 ng/ml)

PSA NEGATIVO (4.0 ng/ml)

Número de pacientes con cáncer de próstata

TP (151)

FN (41)

Número de pacientes sin cáncer de próstata

FP (313)

TN (265)

Sensibilidad = 100 X TP/(TP + FN) = 100 X 151/192 = 79%. Especificidad = 100 X TN/(TN + FP) = 100 X 265/578 = 46%. PV+ = 100 X TP/(TP + FP) = 100 X 154/464 = 33%. PV- = 100 X TN/(TN + FN) = 100 X 265/306 = 87%.

o una quinta parte de la p o b lació n ), la probabilidad de que una prueba indique en verdad carcinom a es 27% . D ebido a que la selección de un nivel lím ite para definir ha sido con m u cha frecuencia arbitrario, es preferible cal­ cular y graficar la sensibilidad y la especificidad para todos los valores de una prueba. E sto perm ite la com paración de sensibilidades de dos o más pruebas a especificidades definidas o la com paración de especificidades para cier­ tas sensibilidades. Las curvas características de operación del receptor (C O R ), que son gráficas de sensibilidad (tasa positiva verdadera) contra 1 - especificidad (tasa positiva falsa), han sido usadas para com parar diferentes pruebas de laboratorio.18 E n la figura 3 -1 4 se ilustran dos curvas de C O R distintas. La curva A es una curva C O R para una prueba en la cual hay una separación am plia entre los valo­ res de prueba de pacientes con la enferm edad y sin ésta. La curva B ilustra la curva C O R obtenida de una prueba para la cual hay poca separación entre pacientes enferm os y no. La parte inferior izquierda de la curva, donde la tasa posi­ tiva falsa está cerca de 0 (1 0 0 % de especificidad) y la tasa positiva verdadera está cerca de 0 (0% de sensibilidad), corresponde a valores de prueba extrem os en la población enferm a. La parte superior derecha de la curva, en la cual tanto la tasa positiva verdadera com o la positiva falsa son altas, corresponde a valores de prueba representativos en la población no enferm a. Para valores de prueba interm e­ dios, una buena prueba debe tener una sensibilidad alta

(tasa positiva verdadera alta) y una especificidad alta (tasa positiva falsa b aja) y formará una curva C O R co n pun­ tos cerca de la esquina superior izquierda de la gráfica. La curva A corresponde a tal prueba. La prueba representada m ediante la curva B, en la cual la tasa positiva falsa es igual a la tasa positiva verdadera, no transm ite inform ación de d iagnóstico útil. Cada vez m ás evaluaciones clínicas de pruebas diagnósticas se presentan en la form a de curvas COR. La N C C LS ha publicado norm as para pruebas de laboratorio de evaluación clín ica, in clu so una guía com ­ pleta para curvas C O R .19 E n la figura 3 -1 5 se m uestra la curva C O R de los datos de PSA de la figura 3 -1 3 . Tam bién las con cen tracio n es de PSA a las que se calculó la sensibilidad y especificidad. Se puede ver que ningún valor de PSA ofrece tanto sen si­ bilidad alta com o especificidad alta. E n la actualidad los urólogos recom iend an una variante m ás específica de la prueba de PSA: el porcen taje de PSA lib re.20

CUADRO 3-4. D EPEN D EN CIA D EL VA LO R PRED ICTIV O EN LA P R EV A LEN C IA DE LA E N FER M ED A D * PREVALENCIA DE LA EN FERM EDAD

PV+

0.001

0.1%

0.01

1.5%

0.10

14.0%

0.2

26.8%

0.5

59.4%

‘ Sensibilidad = 79%; especificidad = 46%.

Tasa positiva falsa (especificidad 1)

FIGURA 3-14. Curvas COR. La curva A corresponde a una prueba con separación entre los pacientes enfermos y no enfermos. La curva B corresponde a una prueba que no proporciona más información.

64

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

la m uestra. Las estim aciones de la in exactitu d de los in s­ trum entos se puede obten er estudiando los resúm enes de program as de análisis de capacidad que usan plasm a nu e­ vo o suero (se pueden hacer com paraciones engañosas a partir de program as de capacidad que analizan producto liofilizado recon stitu id o). Las estim aciones de im precisión intrainstrum ento están disponibles de inform es de resu­ m en que proporcionan los vendedores de productos de con trol de calidad.

M étodo de evaluación

Tasa positiva falsa

FIGURA 3-15. Curva COR para PSA (ensayo Hybritech Tándem) para el diagnóstico de cáncer de próstata. (Adaptada de Catalona WJ, Richie JP, deKernion JB y col. Comparación de la concentración de antígeno prostático específico contra densidad de antígeno prostático específico en la detección temprana de cáncer de próstata: curvas características de operación del receptor. J Urol 1994; 152:2031.)

M ÉTO D O DE SELECCIÓN Y EVALUACIÓN M étodo de selección Antes de que se introduzca al laboratorio una nueva pru e­ ba o m etodología, se debe reun ir y consid erar de m ane­ ra cuidadosa la inform ación adm inistrativa y técnica. La inform ación se debe recopilar de m uchas fuentes d istin­ tas, inclu so del fabricante y los representantes de ventas, colegas, presentaciones científicas y p u blicaciones. La inform ación adm inistrativa debe in clu ir costo del in stru ­ m ento, rend im iento, volum en de m uestra, requisitos de personal, costo por prueba, tipos de m uestras, tam año del instrum ento y requisitos de energía y am bientales. La inform ación técnica debe in clu ir sensibilidad analítica, especificidad analítica, lím ite de d etección, alcance lineal, sustancias interferentes y estim aciones de im precisión e inexactitud . La sensibilidad analítica o lím ite de detección se refiere a la con cen tració n más pequeña que se puede m edir con exactitud. U n grupo profesional ha definido el lím ite de detección com o igual a tres veces la desviación estándar del b lan co , o b ien com o el lugar localizado tres desviacio­ nes estándar arriba del blanco m edido.21 La especificidad se refiere a la capacidad del m étodo para m edir sólo el analito de interés. E l alcan ce lineal (denom inado a veces alcan ce analítico o dinám ico ) es el intervalo de con cen tració n en el que la con cen tració n medida es igual a la con cen tració n real sin m odificación del m étodo. M ientras m ás am plio sea el alcance lineal, m enos frecuentes serán las d iluciones de

Cuando se lleva u n m étod o o in stru m en to al in te rio r de la organización , el laboratorista debe volverse h áb il en su uso. C on a n tela ció n a la evaluación com p leta, se debe p ra ctica r una evalu ación in icia l, breve. Esta evaluación p relim in ar debe in c lu ir el análisis de un a serie de están ­ dares para com p robar el alcance lin eal y el análisis de d uplicado (p o r lo m enos 8 in stru m en to s) de dos c o n ­ troles para o b ten er estim acion es de im p recisión de corto plazo. Si algunos resultados no alcan zan las esp ecifica­ cio n es pu blicad as en la h o ja de in fo rm a ció n de produ cto del m étod o (p ro sp e cto ), se debe co n su lta r a q u ién ela­ b o ró el m étod o. Sin m ejo ra en éste, carecen de sen tid o evaluaciones m ás am p lias.22 E n la figura 3 -1 6 se m u estra una form a sim p le de in tro d u cció n de datos que se puede usar para sim p lificar la re co lecció n de datos de evalua­ ció n del m étodo. Cuando se reúnen datos de evaluación de m étodo, la im precisión e in exactitu d de u n m étodo se estim an y com paran con el error m áxim o perm isible, el cual por lo com ún se basa en criterios m édicos. Si la im precisión o in exactitu d excede este error m áxim o perm isible, se c o n ­ sidera que el m étodo es inaceptable, y se debe m odificar y evaluar de nuevo o rechazar. La imprecisión, la dispersión de m ed iciones repetidas respecto de la m edia, se debe a la presencia de error analítico aleatorio. La im precisión se estim a a partir de estudios en los que las alícuotas de una m uestra co n una con cen tració n constan te de analito se exam inan de m anera repetida. La inexactitud, la diferen­ cia entre un valor m edido y su valor verdadero, se debe a la presencia de error analítico sistem ático, que puede ser constan te o proporcional. La in exactitu d se puede estim ar a partir de tres estudios: recuperación, interferen cia y un estudio de m étodos de com paración.

M edición de la imprecisión El prim er paso en la evaluación del m étodo es el estudio de

precisión. E ste estudio estim a el error aleatorio relacionado co n el m étodo de prueba y señala algunos problem as que afectan la reproducibilidad. Se recom ienda que este estu­ dio se realice en un período de 10 a 2 0 días, incorporand o una o dos ejecu cion es analíticas por día.23 24 Una ejecución an alítica se define com o un grupo de m uestras de pacien ­ tes y m ateriales de con trol que son analizados, evaluados y descritos ju n to s. La im precisión se debe m edir a m ás de una con cen tració n , co n m ateriales de con trol que abarcan el intervalo de con centracio n es co n sentido clínico. Por

CAPITULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

COMPARACIONES ENTRE PACIENTES:

PRECISION: BAJA

MÉTODO COM PARATIVO :____________________________

FECHA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

CO M P.

ALCANCE BAJO

PRUEBA

FECHA

COMP.

ALCANCE ALTO

PRUEBA

FECHA

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

A

B

C

D

FIGURA 3-16.

ALTA

C O M P . PRUEBA

X

SD CV

PRODUCTO DE CONTROL:

I:____________ II:___________ III:

__________

FECHA

I

II

III

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

LINEALIDAD OBJETIVO 1 2 3 MEDIDA

MEDIA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

MÉTODO DE P R U E B A _________________________________ ALCANCE MEDIO

65

E

13 14 15 16 17 18 19 20 X DE CV

Formulario de introducción de datos para el experimento de evaluación de métodos. (Cortesía de Kristen Lambrecht.)

ejem p lo, la glucosa se debe estudiar en los hipoglucém icos ( - 5 0 mg/dl) e hiperglucém icos ( - 1 5 0 mg/dl). U na vez que se reúnen los datos de precisión, se calcula la m edia, la desviación estándar y el coeficiente de varia­ ción. E l error aleatorio, o im precisión, relacionado con el proced im iento de prueba se indica m ediante la desviación estándar y el coeficien te de variación. La im precisión den­ tro de la e jecu ció n se indica m ediante la desviación están­ dar de los controles analizados dentro de una ejecu ción . La im p recisión total se puede obtener de la desviación estándar de datos de con trol con uno o dos pu ntos de datos acum ulados por dia. Se puede usar una técnica es­ tadística, análisis de varianza, para analizar todos los datos de p recisión disponibles para proveer estim aciones de la

im precisión dentro de la ejecu ció n , entre ejecu cion es y total.25

M edición de la inexactitud Cuando se estim a y considera adecuada la im precisión de corto plazo del m étodo, pueden em pezar los experim entos de exactitu d.24 La exactitud se puede estim ar de tres m ane­ ras: recuperación, interferencia y estudios de com paración de m uestras de pacientes. E l fabricante debe llevar a cabo y docum entar los estudios de recuperación e interferencia. D ebido a que estos dos tipos de estudios pueden ser prohi­ bitivos en térm inos de esfuerzo y m ateriales, por lo general se realizan en laboratorios clínico s más grandes. Los expe­

66

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

rim entos de recuperación m ostrarán si un m étodo mide todo o sólo parte del analito. E n un experim ento de recu ­ p eración, se prepara una m uestra de prueba añadiendo una alícuota pequeña de analito concentrado en diluyente a la m uestra del paciente. Otra m uestra del paciente se dilu­ ye añadiendo el m ism o volum en de diluyente solam ente. Am bas m uestras diluidas se analizan entonces m ediante el m étodo de prueba. La cantidad recuperada es la dife­ rencia entre los dos valores m edidos. Se debe tener cu i­ dado de asegurar que las m uestras originales del paciente se diluyan no m ás de 10% ; de esta m anera, la m atriz de d isolu ción de las m uestras es afectada en form a m ínim a. E l m étodo com parativo se puede usar tam bién para m edir las m uestras diluidas24 y, por tanto, asegurar la preparación apropiada de la m uestra. En el cuadro 3 -5 se da u n ejem plo de un cálculo de recuperación para la m uestra; los resulta­ dos se expresan com o porcentaje recuperado. E l experim ento de interferencia se usa para m edir erro­ res sistem áticos debidos a sustancias distintas del analito. U n m aterial interferente puede causar varios errores siste­ m áticos en varias formas. E l interferente puede reaccionar con el reactivo analítico o puede m odificar la reacción entre el analito y los reactivos analíticos. La hem olisis y la turbidez pueden oscurecer la absorbancia del analito medido. E n el experim ento de interferen cia,26 el interferente p oten­ cial se agrega a la m uestra del paciente. E n el cuadro 3 -6 se m uestra un cálculo de interferencia. La concentración del m aterial en potencia interferente debe estar en el intervalo de máxima concentración. Si se observa un efecto, su concen­ tración se debe dism inuir para descubrir la concen tración a la que los resultados de prueba se invalidan prim ero. Los m ateriales por probar se deben seleccionar de revisiones de p u b licacio n es y referen cias recien tes esp ecíficas del

m étodo. Young17 y Siest y Galteau28 han publicado listados extensos de los efectos de fárm acos en pruebas de laborato­ rio. Las interferencias com unes (com o hem oglobina, lípidos, bilirrubina, anticoagulantes y conservadores) tam bién deben ser probados por el fabricante. G lick y Ryder2930 han presentado “interferogram as” para varios instrum en­ tos de quím ica, estas gráficas relacionan la concen tración medida del analito contra la con cen tració n interferente. E llos han dem ostrado que decenas de m iles de dólares de corrección del trabajo se pueden ahorrar m ediante la adqui­ sición de instrum entos que reducen al m ínim o la interfe­ rencia de hem oglobina, triglicérido y bilirrubina.31

Experim ento de com paración de m étodos E n un estudio de com paración de m étodos, las m uestras del paciente se analizan m ediante el m étodo que está siendo evaluado (m étodo de prueba) y uno com parativo. La cali­ dad del m étodo com parativo afectará la interpretación de los resultados experim entales. E l m ejor m étodo com parati­ vo es el método de referencia ; un m étodo con inexactitud insignificante en com paración con su im precisión. Los m étodos de referencia pueden ser laboriosos y tardados (com o el m étodo de referencia para colesterol). Debido a que la m ayor parte de los laboratorios carecen del personal y equipo para llevarlos a cabo, los resultados del método de prueba se com paran por lo general con los del m étodo de uso rutinario. El m étodo rutinario tendrá ciertas inexac­ titudes, tanto conocidas com o desconocidas, dependiendo de cuán b ien las haya estudiado el laboratorio o qué tan bien esté docum entado el m étodo en las publicaciones. Si el m étodo de prueba va a reemplazar al com parativo, se deben caracterizar bien las diferencias entre los dos métodos.

CUADRO 3-5. EJEM P LO DE UN ESTUD IO DE R ECU PERACIÓ N Preparación de la muestra Muestra 1: 2.0 ml de suero + 0.1 mi de H20 Muestra 2: 2.0 ml de suero + 0.1 ml de estándar de calcio de 20 mg/dl Muestra 3: 2.0 ml de suero + 0.1 ml de estándar de calcio de 50 mg/dl Concentración CALCIO

CALCIO

CALCIO

M EDIDO

A G R EG A D O

RECUPERADO

% RECUPERACIÓN

Muestra 1

7.50 mg/dl

Muestra 2

8.35 mg/dl

0.95 mg/dl

0.85 mg/dl

89

Muestra 3

9.79 mg/dl

2.38 mg/dl

2.29 mg/d!

96

Cálculo de recuperación ^

^

ml de estándar ml de estándar + ml de suero

Concentración recuperada = concentración (prueba diluida) - concentración (base) Recuperación =

concentración recuperada K

concentración añadida

X

100%

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

67

CUADRO 3-6. EJEM PLO DE UN ESTUD IO D E IN TERFER EN CIA Preparación de la muestra M uestra 1: 1.0 ml de suero + 0.1 ml de H20 M uestra 2: 1.0 ml de suero + 0.1 ml de estándar de magnesio de 10 mg/dl M uestra 3: 1.0 ml de suero + 0.1 ml de estándar de magnesio de 20 mg/dl CALCIO M EDID O

M AGN ESIO A G R EG A D O

INTERFERENCIA

M uestra 1

9.80 mg/dl

M uestra 2

10.53 mg/dl

0.91 mg/dl

0.73 mg/dl

M uestra 3

11.48 mg/dl

1.81 mg/dl

1.68 mg/dl

Cálculo de interferencia ^ ^, . Concentración agregada = concentración del estándar x

ml de estándar ml de estándar + ml de suero

Interferencia = concentración (prueba diluida) - concentración (base)

W estgard y co l.24 y la N C C LS32 recom endaron que con am bos m étodos se ejecu ten entre 4 0 y 1 0 0 m uestras, pero se deberá abarcar el alcance clín ico y representar m uchas cond iciones patológicas diferentes. Se recom iend an análi­ sis por duplicado de cada m uestra con cada m étodo. Las m uestras duplicadas se analizarán en ejecu cion es distintas y en orden de análisis d istinto en las dos ejecu ciones. E l análisis m ediante am bos m étodos se debe efectuar el m is­ m o día, de preferencia dentro de 4 horas. Si n o se analizan los duplicados, la validez de los resul­ tados experim entales se debe com probar al com parar los resultados de los m étodos de prueba y com parativo después del análisis, identificando las m uestras con dife­ rencias grandes y, si es necesario, repitiendo el análisis. Si se com paran 4 0 m uestras, dos a cin co se deben analizar diario durante un m ínim o de 8 días. Si se com paran 100 m uestras, el estudio de com paración se debe llevar a cabo durante el estudio de rep licación de 2 0 días. U na gráfica de los datos del m étodo de prueba (graficados en el eje y ) contra los datos del m étodo com parativo (graficados en el eje x) ayuda a ver los datos de com pa­ ración de m étodos (fig. 3 -5 ). Los datos se deben graficar diario y adem ás en necesario insp eccionar la linealidad y los valores atípicos. De esta m anera, las m uestras origina­ les pueden estar disponibles para volver a analizarlas. La confirm ación visual de la linealidad suele ser adecuada; sin em bargo, tal vez en algunos casos sea necesario eva­ luar la linealidad de m anera más cu antitativa.33 M uchos analistas han em pleado la prueba F , la prueba t por pares y el coeficiente de correlación para la in terp retación de los datos experim entales. La prueba F se usa para com parar la m agnitud de la im precisión del m étodo com parativo. La prueba t por pares se em plea para com parar la m agnitud del sesgo (la diferencia entre las m edias de la prueba y la del m étodo com parativo) con la del error aleatorio. Tanto la prueba F com o la prueba t ind ican sólo si existe una diferencia estadística significativa entre las dos desviacio­ nes estándar o m edias, de m anera respectiva. Las pruebas

no proporcionan inform ación acerca de la m agnitud del error existen te en relación con los lím ites de error clín ica­ m ente perm isibles.6 A pesar de las advertencias regulares acerca del mal uso del coeficiente de correlación r, los laboratoristas lo siguen usando com o un indicad or de la aceptabilidad del m étodo de prueba. E l valor de r se puede increm en tar si aum enta el alcance de las m uestras de pacientes. La apli­ cación principal del coeficiente de correlación en estudios de evaluación de m étodos debe ser para determ inar el tipo de análisis de regresión que se usará. Si el coeficiente de correlación es 0 .9 9 o mayor, el alcance de m uestras de pacientes es adecuado para el análisis de regresión lineal estándar descrito en la secció n de estadísticas. Si r es m en or que 0 .9 9 , entonces se debe usar otro análisis de regresión.1'3435 E l análisis de regresión lineal es por m ucho m ás ú til que la prueba t o la prueba F para evaluar datos de com paración de m étod os.6 E l error sistem ático con s­ tante se puede estim ar a partir de la ordenada al origen y , el error sistem ático proporcional de la pend iente, y el error aleatorio del error sistem ático de la estim ación (sy/x) . Si hay una relación no lineal entre los valores de prueba y com parativo, entonces la relación lineal sólo se puede usar en el alcance lineal. D ebido a que los pu ntos atípicos son ajustados en gran medida en una regresión lineal, es im portante asegurar que estos puntos atípicos sean genuin os y no resultado de error de laboratorio. Cuando se calculan todas las estim acion es de im pre­ cisión e inexactitud , se com paran con lím ites predefini­ dos o error analítico m édicam ente p erm isib le.16 Si el error aleatorio y el error sistem ático son m ás pequeños que el error perm isible, el desem peño se considera aceptable. Si el error es más grande que el error perm isible, se deben reducir los errores o rechazar el m étodo. E l error analítico perm isible representa el error total e incluye com ponentes del error aleatorio y del sistem ático. Se han em pleado m uchos m étodos para estim ar el error m éd icam ente perm isible, in clu so usar m ú ltiplos del inter-

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

CUADRO 3-7. ESTÁNDARES DE DESEMPEÑO PARA ANALITOS DE QUÍMICA CLÍNICA COMUNES SEGÚN LA DEFINICIÓN CLIA41 Calcio, total

Objetivo ± 1.0 mg/dl

Cloruro

Objetivo ± 5%

Colesterol, total

Objetivo ± 10%

Colesterol, HDL

Objetivo ± 30%

Glucosa

Mayor que el objetivo ± 6 mg/dl o ± 10%

Potasio

Objetivo ± 0.5 mmol/L

Sodio

Objetivo ± 4 mmol/L

Proteínas totales

Objetivo ± 10%

Triglicéridos

Objetivo ± 25%

Nitrógeno ureico

Mayor que el objetivo ± 2 mg/dl o ± 9%

Ácido úrico

Objetivo ± 17%

valo de referencia,12 em plear op iniones de patólogos,38 y variación fisiológica.39,40 Bajo la ley federal, las enm iendas de 1 9 8 8 para el m ejoram iento del laboratorio clín ico ( C li­

nical L aboratory Improvement Amendments o f 1988, CLIA 8 8 ), la A dm inistración de financiam iento de aten ción de la salud ( H ealth Care Financing Administration, HCFA) ha publicado errores perm isibles para una serie amplia de pruebas de laboratorio clín ico .41 Aunque los lím ites de error perm isible CLIA se em plean para especificar el error m áxim o perm isible en pruebas de com petencia por orden federal, estos lím ites se utilizan ahora com o guías para determ inar la aceptabilidad de analizadores de quí­ m ica clín ica.42,43 E n el cuadro 3 -7 se m uestran los lím ites CLIA para pruebas de quím ica clín ica com unes. W estgard y co l36 han recom endado dos con ju n tos d istintos de cri­ terios para la evaluación del error: criterios de interva­ lo de confianza y de un solo valor. Com o resultado de la com plejidad de los criterios de intervalo de confianza, se refiere al lecto r a la d escripción original.44 Los criterios de un solo valor se encuentran en el cuadro 3 -8 . Al usar los criterios de u n solo valor, las estim acion es del error

CUADRO 3-8. CRITERIOS DE VALOR SIMPLE DE W ESTGARD Y COL58 ERROR AN ALÍTICO

CRITERIO

Error aleatorio (EA)

2.58 s < EAa

Error proporcional (EP)

I (Recuperación

Error constante (EC)

I Sesgo i < E a

-

100) x X Q/100)I

< ea

Error sistemático (ES) \ (y0 + m X ) - X 0\ < E a Error total

2.58 s + I (y0 + mXc) - X c \ < EA

(ET = EA + ES) Ea = error médicamente permisible. X . = concentración crítica.

aleatorio y el sistem ático se calculan y luego se com paran co n el perm isible. Las estim acion es del error dependen de la co n cen tració n m edida del analito y, por lo general, se calcu lan a con cen tracio n es críticas del analito. Al aplicar estos criterios de desem peño, los errores analítico y alea­ torio deben ser m enores que el perm isible para que un m étodo se ju zg u e com o aceptable. De lo contrario, se debe rechazar o m odificar el m étodo analítico para reducir el error. Com o u n últim o criterio, W estgard y col36 sugieren un criterio de error total, que com bina los com ponentes aleatorio y sistem ático del error, para estim ar la m agni­ tud del error que se puede esperar cuando se m ide una m uestra del paciente. E l uso de los criterios de un solo valor se ilustra en el cuadro 3 -9 , en el cual el potasio de sangre com pleta m edido m ediante u n m étodo de lugar de atención se com para con el potasio plasm ático del labo­ ratorio central. E l experim ento de evaluación de m étodos para esta com paración se gráfica en la figura 3 -5 . E l lím ite de error CLIA para el potasio es 0 .5 mmol/L. E n la actualidad, hay desacuerdo en relación co n la selección del m ultiplicador de la desviación estándar en el cálculo del error aleatorio. W estgard y col, sugirieron al principio 1 .9 6 , que perm ite que 5% de observaciones queden fuera de los lím ites de error perm isible. La elección de un m ultiplicador un poco m ás grande perm itiría con si­ derar pocos valores atípicos; por ejem plo, si el m u ltiplica­ dor fuera 2 .5 8 , no más de 1% de las observaciones podrían quedar fuera de los lím ites de error perm isible. Las regla­ m entaciones CLIA obligaron a los laboratoristas a revaluar la proporción de valores atípicos aceptables que ellos acep­ tarían, los cuales caen fuera de los lím ites CLIA. Los labo­ ratorios clínico s están en alto riesgo de no pasar la prueba de com petencia si em plean analizadores que producen 5% de resultados que se desvían en más que los lím ites CLIA. Se recom ienda a los laboratorios usar un m ultiplicador de por lo m enos 2 .5 8 para calcular el error aleatorio. Aunque algunos autores han propuesto m ultiplicadores tan altos com o 4 .0 , la m ayor parte de los instrum entos actuales no logran tal desem peño. Antes de que el uso de un m étodo se vuelva rutinario, es necesario validar o in clu so restablecer el intervalo de referencia del fabricante, escribir o actuali­ zar el procedim iento y capacitar al personal en el uso del m étodo. Se debe poner en práctica un program a de co n ­ trol de calidad para el procedim iento, usando los datos de control acum ulados para establecer lím ites de control de calidad. Podría ser necesario ajustar los lím ites de control una vez que el procedim iento está en servicio rutinario. Com o resultado de las restriccion es de personal, tiem ­ po y presupuesto, un laboratorio podría ser incapaz de llevar a cabo experim entos com pletos de com paración de m étodos en cada nuevo m étodo introducido. Com prender los principios de evaluación del m étodo y estar fam iliari­ zado con las pruebas estadísticas perm itirá al supervisor del laboratorio elegir u n m étodo que es probable que se aju staría a los criterios de desem peño del laboratorio.45 Se podría em prender entonces una serie de experim entos abreviados para estim ar la im precisión y la in exactitu d .3 E l N CC LS pu blicó en fechas recientes norm as para tal aplicación abreviada. E ste protocolo, D em ostración de

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

CUADRO 3-9. EJEM PLO D E LA A PLIC A CIÓ N D E LOS CRITERIO S DE V A LO R SIM PLE D E W ESTG A R D Y CO L36 PARA DATOS DE EV A LU A CIÓ N D E POTASIO* ________________ ___ 1. Error aleatorio (EA) = 2.58 s. El error aleatorio se estima de analizar un producto de control una vez al día durante 20 días. X = 5.5 mmol/L, s = 0.07 mmol/L RE = 2.58 X s = 2.58 X 0.07 mmol/L = 0.18 Debido a que el EA < EA, el EA es aceptable. 2. Error proporcional (EP) = I (Recuperación - 100) x (Xc/100) I. El error proporcional se estima de una serie de experi­ mentos de recuperación, después de los cuales se calcula la recuperación promedio. Recuperación promedio de potasio = 99% EP = I ( 9 9 - 100) X (5.5/100) I = 0.05 mmol/L 3. Error constante (EC) = sesgo. El error constante se estima del sesgo I Y - X I, derivado del experimento de comparación de métodos. EC = I Y - X I = I 5.31 - 5.28 I = 0.03 mmol/L Debido a que EC < EA, EC es aceptable. 4. Error sistemático (ES) = I (Ya + mXc) - X c I. El error sistemático se estima de la ecuación anterior en la cual Y0 y m se derivan de experimentos de com­ paración de métodos (fig. 3-5). Y0 = ES = = =

-0.057, m = 1.02 I (-0.057 + 1.02 X 5.5) - 5.5) I I 5 .5 5 - 5 .5 I 0.05

Debido a que ES < EA, ES es aceptable. 5. Error total (ET) = EA + ES. El error total se estima a partir de la suma de EA y ES como se calculó antes. ET = 0.18 + 0.05 = 0.23 mmol/L Debido a que ET < EA, el método es aceptable. *EI error permisible (EA) para el potasio, definido según las reglamenta­ ciones CHA, es 0.5 mmol/L.

precisión y exactitu d para el usuario, se puede usar para dem ostrar que un laboratorio puede obtener desem peño de precisión y exactitu d coherente co n las afirm aciones del fabricante. Debido a que estos estudios de precisión y exactitu d se pueden com pletar en cin co días de trabajo, es probable que m u chos laboratorios u tilicen las norm as para preparar nuevos m étodos.

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A SEGU RAM IEN TO Y CONTROL DE LA CALIDAD E l sistem a d e control de calid ad es el sistem a de laboratorio para re co n o cer y red ucir al m ínim o errores a n a lítico s.46'47 E l co n tro l de calidad es un com p o n en te del sistem a de aseguram iento de la calidad, que ha sido definido com o las a ccio n es sistem áticas n ecesarias para proveer la co n fian ­ za adecuada de que los servicios de lab o rato rio satisfarán necesid ades m éd icas para la a ten ció n del p a cien te.48 E l sistem a de asegu ram iento de la calidad abarca factores p rean alítico s, an alítico s y p o san alíticos. Las m onografías L aboratory Quality M anagem ent (C e m b ro w sk iy C arey),49 C ost-E jfective Quality Control (W estgard y B a rry )50 y B asic QC Practices (W estg ard )1 p ro p orcion an in form a­ ció n detallada acerca de p rácticas de co n tro l de calidad y asegu ram iento de la calidad en el laboratorio de quím ica clín ica. Elay m u ch os factores p rean alítico s que pu ed en influ ir en los resultad os an alítico s, in clu so la p rep aración del p acien te, la re co lecció n de la m u estra, el m an ejo de ésta y el alm acen am ien to . Young p rop orciona las revisiones más com p letas de factores p rean alítico s en pru ebas de q u ím ica .27,51 Los factores p rean alítico s so n d ifíciles de m o n ito rear y co n tro lar debido a que la m ayor parte o cu ­ rren fuera del laboratorio. Los p rofesion ales de la aten­ ció n de la salud, en p articu lar m éd ico s y enferm eras, d eben volverse m ás co n scien tes de la im p ortan cia de la p rep aración del p acien te y cóm o ésta puede afectar las pruebas de laboratorio. E l laboratorio debe proveer in s­ tru ccio n es, en form a de u n m anu al de p ro ced im ien to ,52 para la p rep aración adecuada del p acien te y la ad qu isi­ ció n de la m uestra. Este m anu al de p ro ced im ien to debe en con trarse en todas las unidades de enferm ería y, por tanto, estar d isponible para todo el p erson al m éd ico. Adem ás, para los p acien tes extern o s d eben estar d isp o n i­ b les fo lletos fáciles de entender. Los proced im ientos de reco lecció n de m uestras deben seguir norm as específicas com o las que establece la N C C L S.53,56 Los equipos de reco lecció n de sangre deben ser instruidos de m anera periódica acerca de la norm as para la d uración de aplicación de torniqu etes y tipos de tubos de reco lecció n de m uestras y anticoagulantes que se em plearán. Los m étodos de transporte de m uestras, separación, preparación de alícuotas y alm acenam iento son m uy im portan tes.57,58 E l tiem po transcurrido entre la extracció n y la separación del suero o plasm a de las células puede ser u n factor en la prueba analítica. Por ejem plo, los leu cocitos y eritrocitos m etabolizan glucosa y causan una d ism in u ción estable en la con cen tració n de glucosa en sangre coagulada no centrifugada. La centrifu gación y la ad ición de alícuotas a recipientes secundarios podría ser m uy im portante.55-5S La contam in ación de la m uestra pue­ de ocu rrir en este punto, lo cual la hace subóptim a para prueba analítica. P or ejem plo, los recip ientes secundarios para m uestras enviados para análisis de plom o deben ser lim piados de form a escrupulosa debido a la presencia u b i­ cua del plom o y las bajas con cen tracio n es de este elem en­ to que se deben m edir con exactitud.

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CÜNICA

E l alm acenam iento de la m uestra puede originar erro­ res en los resultados descritos. Para cada analito se deben establecer norm as sobre los requisitos para m uestras. Éstas podrían verse afectadas por la evaporación (p. ej., e lectró lito s), exp o sición a la luz (b ilirru b in a), refrigera­ ció n (lactato deshidrogenasa [L D ]) y congelam iento. Los errores de copiado podrían ocu rrir en cu alquier etapa del procesam iento de las m uestras. Aunque el uso de com ­ putadoras ha sim plificado las tareas adm inistrativas, una m uestra podría ser confundida por otra. Es obvio que tales errores se deben reducir al m ínim o. E l laboratorista puede al m enos controlar los factores analíticos, que en prim er lugar dependen de la in stru m en­ tación y los reactivos. U n program a de m antenim iento preventivo diario y m ensual es esencial para cada pieza de equipo. Las com probaciones de fun cionam ien to del in s­ trum ento efectuadas de m odo ru tinario deben ser detalla­ das en el m anual de procedim iento y se debe docum entar su desem peño. La N CC LS ha elaborado estándares para m onitorear variables com o la calidad del agua,59 la calibra­ ció n de balanzas analíticas, la calibración de m aterial de vidrio volu m étrico y pipetas, la estabilidad de la energía eléctrica,60 y la tem peratura de instrum entos controlados term ostáticam ente.61 Se debe anotar la fecha de cuándo se recib en los reactivos y cajas de accesorios, y tam bién cu án­ do fueron abiertos. Los lotes nuevos de reactivos deben ser probados ju n to con los lotes de reactivos viejos antes de ser usados para el análisis. Si los reactivos se van a usar com o estándares o cali­ bradores, es necesario em plear productos quím icos de la m ás alta pureza, grado reactivo o grado A m erican C hem ical Society (ACS). D iferentes tipos de estándares están dispo­ nibles. U n estándar prim ario es una sustancia no higros­ cóp ica de alta pureza que puede ser secada, de preferencia a 104° a 110°C sin un cam bio de com posición. Así, los estándares prim arios se pueden secar y después pesar para preparar soluciones de con cen tracio n es seleccionadas. Cuando se com pran, los estándares prim arios son sum i­ nistrados con u n registro de análisis para elem entos co n ­ tam inantes, que no deben exced er 5% en peso. Algunos estándares han sido certificados com o puros por varios cuerpos oficiales com o el N ational Institute f o r Standar­ dization and Technology (N IST ) y el C ollege o f A m erican Pathologists (C A P). U n estándar prim ario es la sustancia de m ás alta pure­ za disponible en la actualidad que puede ser pesada con exactitu d de m anera analítica. U n estándar secundario es aquél cuya con cen tració n suele determ inarse m ediante análisis por m edio de un m étodo de referencia aceptable que se calibra con un estándar prim ario. Su con cen tració n no se puede determ inar de m anera directa a partir del peso del soluto y el volu m en de la solución. Los calibradores se em plean en los procesos de calibración para establecer con cen tracio n es de m uestras de pacientes. Los m ateriales de calibración deben satisfacer los requisitos de identidad, etiquetado y desem peño de la norm a N C C LS Tentative

G uideline f o r Calibration M aterials in Clinical Chemistry ( C 2 2 ).62 Siem pre que sea posible, los calibradores deben tener sus con cen tracio n es asignadas por el uso de m éto­

dos de referencia u otros m uy específicos. La respuesta analítica com parativa del calibrador y las m uestras provee la base para calcular valores para m uestras de pacientes. El m ism o m aterial no debe servir com o calibrador y control. E l error de laboratorio se puede reducir al m ínim o si se presta atención a los procedim ientos y técn icas de labo­ ratorio adecuados. E l sistem a de con trol de calidad para m etodologías de prueba individuales se puede enfocar en el con trol de variables específicas de prueba. Los factores posanalíticos con sisten en el registro e inform e de datos del pacien te al m édico dentro del intervalo de tiem po apropiado. C on la autom atización e inform es de pacientes generados por com putadora, la incid en cia de errores en la fase posanalítica ha dism inuido en gran medida.

Control de calidad El propósito del sistem a de con trol de calidad es m o n ito ­ rear procesos analíticos, detectar errores an alíticos duran­ te el análisis y evitar inform ar valores in correcto s del paciente. Los m étodos analíticos se m onitorean de form a norm al al m edir m ateriales de con trol estables y com pa­ rar después los valores m edidos con su valor esperado. E l presupuesto de laboratorio debe reflejar la im portan­ cia del con trol de calidad. E l com prom iso m om entáneo es im portante a fin de asegurar u n sistem a adecuado para el m onitoreo y m ejoram iento del desem peño del labo­ ratorio. E l sistem a estadístico usado para interpretar las con cen tracio n es medidas de controles se llam a sistem a de control de calidad estadística. A principios del siglo pasado Shew hart63 estableció los principios de con trol de calidad estadísticos. E n 1 9 5 0 , Levey y je n n in g s 64 em plearon estos m ism os principios básicos cuando in trod u jeron el control de calidad estadístico al laboratorio clínico. Desde 1 9 5 0 , los sistem as de con trol de calidad estadístico en el labora­ torio h an experim entado m uchas m odificaciones. E l error analítico puede ser separado en com ponentes de error aleatorio y error sistem ático (fig. 3 -2 7 ). E l error aleatorio afecta la precisión y es la base para variar diferen­ cias entre m ediciones repetidas. Los increm entos de error aleatorio pueden ser causados por variaciones en la técnica. E l error sistem ático surge de factores que contribuyen a una diferencia constan te, ya sea positiva o negativa. E l error sistem ático puede ser causado por varios factores, incluso estándares o reactivos m al preparados, instrum entación defectuosa y procesos escritos de m anera deficiente. Los m ateriales de control d e calidad se deben com por­ tar com o m uestras reales, estar disponibles en cantidad suficiente para durar por lo m enos u n año, ser estables durante ese período, estar disponibles en volúm enes de viales convenientes y tener una variación m ínim a en co n ­ cen tración y com p osición de un vial a otro.65 E l m aterial de control debe parecerse m ucho a la m uestra que está sim ulando tanto en el aspecto físico com o quím ico. El m aterial de con trol se dehe probar de la m ism a m anera que las m uestras de pacientes. Los m ateriales de control deben abarcar el alcance clínicam ente im portante de las con cen tracio n es de analitos. Los niveles de con trol deben estar en los niveles de d ecisión apropiados; por ejem plo,

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

Errores analíticos

FIGURA 3-17. Representación esquemática de distribuciones de datos de control. (A) Situación sin ningún error analítico; (B) error incrementado aleatorio; (C) desplazamiento sistemático.

para el sodio, podrían estar en 1 3 0 y 1 5 0 mmol/L, niveles que definen hiponatrem ia e hipernatrem ia. Para control de calidad de quím ica general, suelen em plearse dos nive­ les de control; para inm un oquím ica, tres. E l fabricante de controles puede evaluar sus controles con varios in stru ­ m entos y m etodologías; luego, elaborar alcances objetivo disponibles para sus productos de control. Si b ien estos controles “probados” son m ás caros, se pueden usar com o com probaciones externas para la exactitud. Casi todos los m ateriales de con trol preparados de for­ m a com ercial son liofilizados y requieren recon stitu ción antes de usarse. E n la reconstitu ción , el diluyente se debe agregar con cuidado y mezclar. E l m ezclado in com p le­ to produce una partición del líquido sobrenadante y el sedim ento subyacente, y dará com o resultado valores de con trol in correcto s. Con frecuencia, el m aterial recon sti­ tuido será m ás turbio que la m uestra real del paciente. Los controles congelados estabilizados no requieren recon sti­ tu ció n pero pueden com portarse de m anera diferente a las m uestras de pacientes en algunos sistem as analíticos. Es im portante evaluar con cuidado estos con troles estabiliza­ dos con cualquier sistem a de instrum entos nuevo. E n un tiem po, los laboratorios de quím ica preparaban sus m ateriales de con trol.66 Com parados con los controles

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com erciales, estos m ateriales de con trol “h ech os en casa” son m ás susceptibles a deterioro y con tam in ación . Es difí­ cil reducir el riesgo de enferm edad in feccio sa de esta cla­ se de m ateriales. De vez en cuando, es necesario preparar m ezclas de con trol para analitos seleccionados, com o por ejem plo fárm acos probados rara vez. Se deben seguir los procedim ientos adecuados,66 pero la tarea es m ás m aneja­ b le porque se requieren cantidades m u cho m ás pequeñas que para una m ezcla para todo el laboratorio. La m ayor parte de los m ateriales de con trol se producen a partir de suero. C on m ayor énfasis en la co n ­ ten ción de costos, m ás laboratorios están usando m ate­ riales de con trol de bovino, que cu estan m enos que los m ateriales de hum ano. La estabilidad de los m ateriales de control de bovino es sim ilar a la de los m ateriales de hum ano. Para la m ayor parte de los analitos, los m ateriales de bovino satisfacen los requisitos necesarios para m onitorear la im p recisión .67 D ebido a que las proteínas de bovi­ no difieren en gran medida de las proteínas hum anas, el m aterial de bovino es inapropiado para ensayos inm unoquím icos de proteínas específicas; tam bién es inapropia­ do para algunos procedim ientos de en lace con colorantes para albúm ina y ciertos m étodos de bilirrubina. E l m ate­ rial de bovino se puede usar com o un con trol en la elec­ troforesis, pero su patrón electroforético difiere del de un suero de con trol hum ano y se asem eja a una gam m apatía policlonal.

O peración general de un sistem a de control de calidad estadístico E l sistem a de con trol de calidad estadístico en el laborato­ rio clín ico se em plea para m onitorear y controlar las varia­ ciones analíticas que ocurren durante la prueba. E n ciertos casos, estas variaciones pueden ser sistem áticas y son cau­ sadas por errores de procedim iento debidos a la técnica, in stru m en tación o fallas de reactivos u otros m ateriales. E n otros casos, sin em bargo, podrían aparecer cada vez m ás variaciones aleatorias a pesar de m étodos analíticos b ien calibrados, controlados de m anera estricta. E l program a de con trol de calidad estadístico se puede consid erar com o u n proceso de tres etapas: 1. E stablecer lím ites estadísticos perm isibles de variación para cada m étodo analítico. 2. Usar estos lím ites com o criterios para evaluar los datos de con trol de calidad generados para cada prueba. 3. Tom ar la acción correctiva cuando sea indicado (com o hallar causas de errores, rectificarlos y reanalizar datos de con trol y del pacien te). Para establecer el con trol de calidad estadístico en un nuevo instrum ento o nuevos lotes de m aterial de control, los d istintos niveles de m aterial de con trol se deben ana­ lizar entre 5 y 2 0 días. Para ensayos que son m uy pre­ cisos (C V s l % ) com o los gases sanguíneos, 5 días son adecuados; para ensayos m enos precisos se n ecesitan 10 a 2 0 días. D espués, se calculan las m edias ( x ) y las des­ viaciones estándar (s) de estos datos de control. Debido al pequeño núm ero de observaciones y posibles valores

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

atípicos en los nuevos datos de control, estas estim acio­ nes iniciales podrían no ser del todo confiables y se deben revisar a medida que se tienen m ás datos. Al cam biar a u n nuevo lote de m aterial sim ilar, m u ch os laboratoristas utilizan la m edia recién obtenida com o el objetivo pero retienen la desviación estándar previa em pleada. Confor­ m e se obtienen m ás datos, todos se deben prom ediar para derivar las m ejores estim aciones de la m edia y la desvia­ ció n estándar.68 L os valores de con trol pueden ser com parados de form a nu m érica o visual con lím ites estadísticos en una gráfica de control. E sta gráfica es sim plem ente una exten sión de la curva de distribución gaussiana (fig. 3 -1 8 ), con el tiem ­ po expresada en el eje x. E l eje y por lo general se gradúa para proveer concentraciones h echas de x - 3s a x + 3s. Las líneas horizontales que correspond en a m últiplos de s se trazan alrededor del eje x. Las líneas 2s correspond en a los lím ites de 9 5 .5 % para el control. Si el p roceso analítico está b ajo con trol, casi 95% de los puntos estarán dentro de estos lím ites y alrededor de 5% de los pu ntos estarán fuera de estos lím ites. Los lím ites 3s corresponden a casi los lím ites de 9 9 .7% . Si el proceso está b ajo control, no m ás de 0.3 % de los puntos estarán fuera de los lím ites 3s. Se consid era que un m étodo analítico está b ajo co n ­ trol cuando hay distribución sim étrica de valores de control respecto de la m edia y hay pocos valores de control fuera de los lím ites de control 2s. Algunos laboratorios definen que un m étodo analítico está fuera de con trol si un valor de control cae fuera de sus lím ites 2s. O tros laboratorios h an em pleado los lím ites 2s com o lím ites de advertencia y los 3s com o lím ites de error. Para estos laboratorios, un valor de con trol entre 2s y 3s alertaría al tecnólogo de un posible problem a. U n punto fuera de los lím ites 3s reque­ riría a cció n correctiva. Se han em pleado criterios diferentes para ju z g a r si los resultados de con trol indican situaciones fuera de co n ­ trol. W estgard y G rothhave estudiaron las capacidades de d etección de errores de la m ayor parte de estos criterio s.69 E llos em plearon el térm ino regla de control para indicar el criterio para ju zg ar si el proceso analítico está fuera de control. Para sim plificar la com paración de los distintos valores de con trol, W estgard y asociados em plearon abre­ viaciones para las diferentes reglas de control. E n el cuadro

3 -1 0 se em plearon de m anera frecuente reglas de con trol y sus abreviaturas. Las abreviaturas tienen la form a A , don­ de A es un sím bolo para una estadística o es el núm ero de observaciones de con trol por e jecu ció n analítica y L es el lím ite de co n tro l.70 por ejem plo, una v iolación de regla l 2s indica la situ ación en la cual una observación de control está fuera de los lím ites x ± 2s. Una ejecución an alítica se define com o u n co n ju n to de m uestras de control, y del p aciente, probadas, evaluadas y descritas ju n tas. De m anera ideal, si un m étodo está b ajo control, n in ­ guna de las reglas de control debe ser violada y no debe haber rechazo de la ejecu ció n analítica. D esafortunada­ m ente, algunas ejecu cion es analíticas serán rechazadas com o fuera de con trol aun cuando no haya error analítico adicional. P or ejem plo, cuando se usa la regla de control l 2s co n un solo con trol que se analiza por e jecu ció n ana­ lítica, entonces 5% de las ejecu cion es estarán fuera de los lím ites 2s cuando sólo la variación analítica está presen­ te. Cuando m ás de un control es analizado por ejecu ció n analítica y no se presenta un error adicional, existe una probabilidad alta de que por lo m enos un control estará fuera de los lím ites 2s. Cuando se usan dos controles, hay casi una probabilidad de 10% de que por lo m enos u n co n ­ trol quede fuera de los lím ites 2s; cuando se usan cuatro controles, hay una probabilidad de 17% . Por esta razón, m u chos analistas no investigan el m étodo analítico si un solo con trol exced e los lím ites 2s cuando se usan dos o m ás controles. E llos sólo reanalizan los controles o toda la e jecu ció n analítica. D esafortunadam ente, este m étodo intuitivo para el con trol de calidad logra un nivel d esconocido de calidad. Lo que se necesita es un sistem a que señale de m anera confiable la presencia de error analítico significativo pero que responda a errores pequeños. D efinir tal sistem a de con trol requiere com prender la respuesta de las reglas de con trol al error analítico.

Respuesta de las reglas de control al error W estgard y asociados69 han estudiado la respuesta de la reglas de control, ya sea por separado o en grupos, a la pre­ sencia de error sistem ático o aleatorio. Los diferentes pro­ cedim ientos de con trol (grupos de reglas de con trol) tienen

FIGURA 3-18. Gráfica de control que muestra la relación de límites de control con la distribución gaussiana. Se grafi­ can los valores de control diarios, y muestran ejemplos de un desplazamiento, un cambio abrupto en el proceso analítico y una tendencia, un cambio gradual en el proceso analítico.

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

73

CUADRO 3-10. R EG LA S D E CONTROL CO M U N ES Empléela como un rechazo o advertencia cuando una observación de control excede los límites de control x ± 2s; por lo regular se emplea como una advertencia

Se emplea en exceso. Sólo se debe usar con ensayos manuales con pocos analitos o materiales de control.

Rechace una ejecución cuando una observación de control excede los límites de control x ± 3s

Detecta el error aleatorio y errores sistemáticos grandes

Rechace una ejecución cuando dos observaciones de control consecutivas están del mismo lado de la media y exceden los límites de control x + 2s + x - 2s

Detecta error sistemático

Rechace una ejecución cuando cuatro observaciones de control consecutivas están del mismo lado de la media y exceden los límites de control x + 1s o x - 1s

Detecta error sistemático pequeño; muy pocas aplicaciones

10-

Rechace una ejecución cuando diez observaciones de control consecutivas están del mismo lado de la media

Detecta errores muy pequeños: no se use

R4S

Rechace una ejecución si el alcance o diferencia entre la observación de control máxima y mínima de entre las 4 a 6 observaciones de control excede 4s

Detecta errores aleatorios; empléela dentro de la ejecución

X0.01

Rechace una ejecución si la media de por lo menos N observaciones de control excede los límites de control que dan una frecuencia de 1 % de rechazo falso (Pfr = 0.01)

Subutilizada

R0.01

Rechace una ejecución si el rango de por lo menos N observaciones de control excede los límites de control que dan una frecuencia de 1 % de rechazo falso (Pfr = 0.01)

Subutilizada

2*

s, desviación estándar; x, media.

respuestas distintas, dependiendo de las reglas de control y el núm ero de observaciones de con trol (n ) empleadas. W estgard y G roth71 sim ularon el análisis de m ateriales de con trol m ediante instrum entos con d istintos niveles de error. Se realizaron un gran núm ero de sim ulaciones en cada nivel de error, con la proporción de situaciones fuera de con trol tabuladas y graficadas después contra el tamaño del error. Las gráficas resultantes, que ilu stran la probabi­ lidad de rechazo contra el tam año del error analítico, se llam an funciones exponenciales. De m anera ideal, una regla de control debe tener una probabilidad de 0% de detectar errores pequeños y una probabilidad de 100% de detec­ tar error significativo. E n la figura 3-19A se m uestra una gráfica de una fam ilia de fu nciones exponenciales para la d etección de error sistem ático m ediante la regla de control l 2s. La probabilidad de rechazo se gráfica contra el tam año del error sistem ático. E l tam año del error sistem ático varía de 0 a 5s, donde s es la desviación estándar. Las diferen­ tes líneas corresponden a d istintos núm eros de controles analizados. Cuando se em plea u n control y no hay error, la probabilidad de rechazo en ausencia de error es casi de 5%. La probabilidad de rechazo cuando no está presente n in ­ gún error se llam a probabilidad de rechazo falso (P ). La probabilidad de d etección de error (P d) es la probabilidad de rechazar una ejecu ció n analítica com o fuera de control cuando existe un error. La Ped se puede determ inar para cu alquier tam año de error al rechazar el tam año del error en un eje y erigir una línea vertical que interseca la curva de fu nción exponencial para la n deseada. De esta in tersec­ ción , se traza una línea horizontal hasta el eje y. E l valor de

la probabilidad en el eje y es la Ped. E n la figura 3-19A , Ped para la regla de con trol 1 y un error sistem ático de 2s es 0 .5 si se analiza un control. Las gráficas de fu nción expo­ n encial se pueden usar para determ inar la efectividad de varios proced im ientos de control en la d etección de errores analíticos. Se requieren dos con ju n tos de fu nciones expo­ nenciales, uno para el error sistem ático (desplazam iento de la m edia) y un o para el error aleatorio (in crem ento en la im precisión). En la figura 3 -1 9 B se m uestra una fam i­ lia de fu nciones exponenciales para la d etección de error aleatorio m ediante la regla de con trol l 2s. D ebido a que los procesos analíticos siem pre con tien en error aleatorio, el eje x se origina en ls . En la figura 3 -1 9 B , Ped para la regla de con trol 1 y una d uplicación del error aleatorio es 0 .3 si se analiza un control. E l m ejo r procedim iento de control es el que tiene la m en or Pfr y la m ayor Ped para detectar errores analíticos de un tam año que puede com prom eter la calidad de los resultados analíticos. E n la figura 3 -1 9 se m uestra la fu nción exponencial para proced im iento ideal. A unque la regla de control 1 , da com o resultado una alta d etección de errores sistem áticos de tam año m oderado, su Pfr es tan alta que resulta inaceptable. La figura 3-20A y B m uestra las fu nciones exponenciales para la regla de co n ­ trol 1 para error sistem ático y aleatorio, respectivam ente. La regla de con trol 13 da m enor respuesta a increm entos m oderados en el error sistem ático pero tiene una Pfr baja. W estgard y asociados han sugerido una aplicación m anual de una com binación de reglas de con trol con por lo m enos dos observaciones de con trol por ejecu ció n a n alítica.68 Además de usar la regla 1 com o una regla de

74

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

Regla de control 1

Regla de control 1

O

Q.

1

2 3 Error sistemático (S)

4

B

Error aleatorio (S)

Regla de control 13s

Regla de control 13s

O 0.

A

Error sistemático (S)

B

Error aleatorio (S)

FIGURA 3-19. Curvas de fundón exponencial para la regla de control 12s para el error sistemáti­ co (A) y error aleatorio (B). (Proporcionada por P. Douville.)

FIGURA 3-20. Curvas de función exponencial para la regla de control 13s para el error sistemáti­ co (A) y error aleatorio (B). (Proporcionada por P. Douville.)

75

CAPÍTULO 3 ■ CONTROL DE CALIDAD Y ESTADÍSTICA

advertencia y la regla 1 para rechazo, este sistem a tam ­ b ién incluyó las reglas 2 2s, R4s, 4 y 10-. Las reglas de con teo (las reglas 2 2s, 4 ]s y 1 0 -) son efectivas en la d etección de error sistem ático. Como las reglas 4 1Sy 10 detectan cam bios

pequeños que suelen carecer de im portancia clínica, exhibi­ dos p or la m ayor p arte de los analizadores, no se recom ienda su uso. Las reglas R y 1 son efectivas en la d etección de error aleatorio. La regla 13 tam bién puede detectar error sistem ático. Los ejem plos de violaciones de las reglas ante­ riores se m uestran en la figura 3 -2 1 . Para aplicar de form a m anual el proced im iento de co n ­ trol m ultirreglas clásico de W estgard, se evalúan los nuevos resultados de con trol para asegurar que están dentro de sus lím ites ± 2 s . Si es así, no se requiere más insp ección. De lo

Violación 12S

Violación 1

3S

-+3s

* +3s

-+3S

-+3s

-+2s

-+2s

-+2s

-+ 2 s

-+ 1 s

-+1s

-+1s

-+ 1 s

- x

- x

-

-

- -1s

- -1s

- -1s

- -1s

- -2s

- -2s

- -2s

--2 s

— 38

- -3s

Violación 2?s

X

X

- -3s

Violación 4 1S -+3s

-+3s

-+3s

-+ 2s

-+2s

-+ 2s

-+1s

_+1s

-+1s

-+ 1s

- x

-

-

-

- -1s

--18

- -1s

- -1s

- -2s

--2 s

--2 s

—28

--3 s

- -3s

--3 s

- -3s

-+3s -+2s

X

Violación 10*

X

X

Violación R* -+3s

-+3s

-+3s

-+ 2s

-+2s

-+ 2s

-+1s

-+ 1s

-+1s

-+ 1s

-

- x

-

-

--18

- -1s

- -1s

-

- -2s

--2 s

- -2s

—2s

- -3 s

- -3s

--3 8

- -38

-+3s -+2s

FIGURA 3-21.

contrario, se aplican las otras reglas en este orden: 2 2s, 4ls, 1 0 - y R4¡_. La regla 2 2s se invoca siem pre que dos observa­ ciones de con trol consecutivas del m ism o lado de la media exced an los lím ites de control x + 2s o x - 2s. Esta regla responde en la m ayor parte de los casos a errores sistem á­ ticos. La regla 2 2s se aplica al in icio a las observaciones de control dentro de la ejecu ció n analítica más reciente (en los m ateriales y dentro de la eje cu ció n ). La regla se puede aplicar entonces a las dos últim as observaciones en el m is­ m o m aterial de con trol pero de ejecu cion es consecutivas (dentro de los m ateriales y en las ejecu cio n es) o se puede aplicar a las dos últim as observaciones consecutivas de los diferentes m ateriales de control (en los m ateriales y en las ejecu cio n es).

X



X

X

-18

Ejemplos de violaciones de las seis reglas que comprenden el procedimiento de control multirreglas de Westgard.

76

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

La regla 4 ls se viola cuando cuatro observaciones de con trol consecutivas del m ism o lado de la m edia exced en los lím ites de con trol x + ls o x - ls . Tiene un a m ayor res­ puesta a errores sistem áticos. Estas reglas se aplican den­ tro los m ateriales y las ejecu cion es, y en los m ateriales y las ejecu cion es. La regla 1 0- es sen sible a error sistem ático y se viola cuando 10 observaciones de con trol con secu ti­ vas caen en un lado de la m edia. E sta regla se aplica den­ tro de los m ateriales y en las ejecu cion es, así com o en los m ateriales y en las ejecuciones. La regla R4s se viola cuando el alcance o diferencia entre las observaciones de con trol superior e inferior dentro de la e jecu ció n pasa de 4 . Esta regla es m ás sen sible a error aleatorio o m ayor im precisión. La regla se invoca cuando una observación de control m aterial exced e un lím ite +2s y la otra observación excede un lím ite - 2 s . Las dos obser­ vaciones están fuera de los lím ites 2s pero en d irecciones opuestas, lo que da com o resultado un alcance que excede 4s. La regla del alcance está diseñada para uso dentro de una sola e jecu ció n con un m áxim o de cuatro a seis obser­ vaciones de control, no en las ejecu ciones. La com bin ació n de las reglas de con trol l v l 3s, 2 , 4 j , 1 0 - y R+s em pleadas ju n to co n una gráfica de control se co n o cen com o procedim iento multirreglas de Shewhart. Las fu nciones exponenciales para este proced im iento de varias reglas se m uestran en la figura 3 -2 2 . E ste proced i­ m ien to m ultirreglas produce m ayor d etección de errores sobre el uso de la regla l 3s solam ente. La in clu sió n de las reglas 1 y R4s m ejora la d etección del error aleatorio, y las reglas 2 2s, 4 ls y 1 0 - increm en tan la d etección de error sis­ Multirreglas (12s, 13s, 22s, 4 ls, 10-, R4s)

tem ático. Cuando se em plea co n sistem as im precisos, este proced im iento de m últiples reglas ofrece al laboratorio una m ejo r d etección de errores y m enor rechazo falso de ejecu cion es analíticas. Se adapta con facilidad a procedi­ m ientos de con trol existentes y se ha vuelto m uy popular desde su d escripción in icial en 1 9 8 1 . La aplicación del procedim iento m ultirreglas conlleva lo siguiente: 1. E l cálculo de las m edias y las desviaciones estándar de las diferentes concentraciones de m ateriales de control. 2. La con stru cción de gráficas de control, con líneas que indican los lím ites de desviación estándar 0 , ± 1 , 2 y 3. 3. A nálisis de diferentes niveles de m aterial de con trol en cada e jecu ció n analítica, con la graficación de los datos de con trol en la gráfica apropiada. 4 . A ceptar la e jecu ció n analítica si cada observación cae dentro de los lím ites 2s. 5. Com probar si se violan las reglas 1 , 2ls, R4s y 1 0 - cu an­ do uno de los m ateriales de con trol está fuera de sus lím ites 2s. Si no se viola ninguna de las reglas, se acepta la ejecu ción . Si ha ocurrido la violación de una regla, se rechaza la ejecu ció n , y se determ ina el tipo de error m ás probable (aleatorio contra sistem ático). U na vez que se identifica y corrige la con d ició n de error, se ana­ lizan de nuevo las m uestras de control y del paciente. E n la figura 3 -2 3 se m uestra el diagram a de con trol de dos niveles que sim plifica la aplicación de un proced im ien­ to m ultirreglas. Esta aplicación a un sistem a de con trol de dos niveles se ilustra en la figura 3 -2 4 . La interpretación

Multirreglas (12s, 13s, 22s, 4ls, 10-, R J

1.0,—

1

2 3 4 Error sistemático (S)

5

1

2

3 4 Error aleatorio (S)

1

FIGURA 3-22. Funciones exponenciales para el procedimiento de control multirreglas para error sistemático (A) y error aleatorio (B). (Proporcionada por P. Douville.)

IN S TR U M EN TO ^ ACA______ ANALITO: ____C 6 a £ _ _ 6 A ü £ g S g _ p r o d u c t o d e 00: Q u a n t im e ^ n ’x

a-s-< \Q 2 .- U 2 .- 1 3 2.-11» 2 -1 4 2 - 2 .2 . Z -Z 3 J-L,

FECHA j T E C . LO T E DE R E A C T IV O # DE EXP.l

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COMENTARIOS

^

vN —H+c r + o h * sc h 2c h 3

FIGURA 4-27. Equilibrio químico de resinas de intercambio iónico. (A) Resina de intercambio iónico. (B) Resina de intercambio aniónico.

Puntos de aplicación de muestra y estándar FIGURA 4-28.

- Disolvente en el fondo de la cámara

Placa de CCF en una cámara cromatográfica.

110

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

(C C FA R ).16 La absorbancia de cada punto eluido se mide con u n densitóm etro, y la con cen tració n se calcula por com paración co n un estándar de referencia som etido a cro­ matografía en condiciones idénticas.

Crom atografía líquida de alta presión (CLAP) La crom atografía líquida m oderna em plea presión para separaciones rápidas, tem peratura controlada, detectores en línea y técnicas de elu ció n de grad iente .1718 E n la figura 4 -2 9 se ilustran los com ponentes básicos.

Bombas Una bom ba fuerza a la fase m óvil a pasar por la colum na a una velocidad m u cho m ayor que la lograda m ediante colum nas de gravedad. E xisten bom bas neum áticas, de je rin g a, reciprocantes o am plificadoras hidráulicas. La bom ba de m ás uso en la actualidad es la bom ba recip ro­ cante m ecánica, que se emplea com o una bom ba pluricabezales con dos o m ás pistones reciprocantes. D urante el bom beo, los pistones operan fuera de fase (1 8 0 ° para dos cabezales, 120° para tres cabezales) para proveer flujo constante. Las bom bas neum áticas se em plean para pro­ pósitos preoperativos; las bom bas de am plificador hidráu­ lico ya no son de uso com ún.

U n empaque de colum na uniforme, fino, da com o resultado ensancham iento de banda m ucho menor, pero requiere pre­ sión para forzar la fase móvil a pasar. El empaque también puede ser pelicular (un núcleo inerte con una capa porosa), de partículas pequeñas e inertes o de partículas m acroporosas. E l material más com ún empleado para el empaqueta­ m iento de colum nas es el gel de sílice. Es m uy estable y se puede usar de diferentes formas. Se puede usar com o empa­ que sólido en cromatografía líquido-sólido o cubierto con un disolvente, que sirve com o la fase estacionaria (líquidolíquido). Com o resultado de la corta duración de las partícu­ las recubiertas, las m oléculas del líquido de la fase móvil se enlazan ahora con la superficie de las partículas de sílice. La CLAP de fase invertida en la actualidad es m uy popu­ lar; la fase estacionaria son m oléculas no polares (p. ej., el hidrocarburo C -1 8 octadecilo) unidas a partículas de gel de sílice. Para este tipo de empaque de colum na, la fase m óvil empleada por lo com ún es acetonitrilo, m etano, agua o cualquier com binación de disolventes. U na colum na de fase invertida se puede usar para separar m uestras iónicas, no iónicas e inonizables. Se usa una d isolu ción am ortigua­ dora para producir las características iónicas deseadas y pH para la separación del analito. Los em paques de colum na varían en tam año (3 a 2 0 m m ). Las partículas más peque­ ñas se usan sobre todo para separaciones analíticas y las más grandes para separaciones preparativas.

Colum nas La fase estacionaria se empaca en largas colum nas de acero inoxidable. La CLAP se ejecuta por lo com ún a tempera­ turas am biente, aunque las colum nas se pueden colocar en un horno y calentar para increm entar la tasa de partición.

Inyectores de m uestra Una jerin g a pequeña se puede usar para introd u cir la m uestra en la trayectoria de la fase m óvil que la lleva hacia la colum na (fig. 4 -2 9 ). Sin em bargo, el m ejo r m étod o y

Jeringa pequeña para inyectar la

Eluyente

FIGURA 4-29. Componentes básicos de CLAP. (De Bender GT. Chemical Instrumentation: A Laboratory Manual Based on Clinical Chemistry. Filadelfla: WB Saunders, 1972.)

CAPITULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

m ás em pleado es el inyector de bucle. La m uestra se in tro­ duce en u n b u cle de volum en fijo. Cuando se conm uta el b u cle, la m uestra se coloca en la trayectoria de la fase m óvil en m ovim iento y se descarga en la colum na. Los inyectores de bucle tienen reproducibilidad alta y se usan a presiones altas. M uchos instrum entos de CLAP tien en inyectores de bucle que pueden ser program ados para in y ección autom ática de m uestras. Cuando el tam año de m uestra es m en or que el volu m en del b u cle, la jerin g a que contiene la m uestra se llena con la fase m óvil hasta el volu m en del b u cle antes de llenar el bucle. Esto evita la posibilidad de m eter aire a la colum na porque esta prácti­ ca podría reducir la duración del em paque de la colum na.

Detectores Los detectores de CLAP m odernos m onitorean el eluido a m edida que sale de la colum na y, de m anera ideal, produ­ cen una señal electrónica proporcional a la con cen tració n de cada com p onente separado. Los espectrofotóm etros que d etectan absorbancias de luz visible o ultravioleta son los que se em plean con m ás frecuencia. E l CFD y otros detectores de exploración rápida se usan tam bién para com paraciones espectrales e id entificación y pureza de com puestos. E stos detectores han sido em pleados para análisis de fárm acos en la orina. O btener una exploración ultravioleta de un com puesto a medida que se eluye en la colum na puede proveer in form ación im portante en cu an ­ to a su identidad. Las sustancias desconocidas se pueden com parar contra espectros alm acenados en una b ib liote­ ca de una m anera sim ilar a la espectrom etría de m asas. A diferencia de la crom atografía de gases/espectrometría de m asas, que requiere volatilización de com puestos específi­ cos, la crom atografía líquida/conjunto de fotodiodos (C U C F D ) perm ite la in y ección directa de m uestras de orina acuosas. D ebido a que m uchas sustancias biológicas fluorescen de form a intensa, los detectores de fluorescencia tam bién se pueden usar, lo que conlleva los m ism os principios des­ critos en la sección de m ediciones espectrofotom étricas. O tro detector de CLAP com ún es el d etector am perom étrico o electroqu ím ico, que m ide la corriente producida cuando el analito de interés se oxida o se reduce a cierto potencial fijo establecido entre un par de electrodos. U n espectróm etro de masas (E M ) se puede usar tam ­ b ién com o detector, no sólo para la id entificación y cuantificació n de com puestos sin o tam bién para inform ación estructural y d eterm inación de peso m olecular .19 La m ues­ tra en u n EM se volatiliza prim ero y luego se ioniza para form ar iones m oleculares cargados y fragm entos que se separan de acuerdo con su relación de m asa a carga (m /z); la m uestra se m ide entonces m ediante un detector, que da la intensidad de la corriente de iones para cada especie. La id en tificació n de la m olécula se basa en la form ación de fragm entos característicos. E l acoplam iento de un crom atógrafo de líquidos con un espectróm etro de m asas es difícil debido a la gran cantidad de disolvente en el elu i­ do. La técnica de electrodispersión (E D ) perm ite transferir los iones de la disolu ción a la fase de gas .20 La m uestra se pasa por una punta capilar m etálica y se convierte, b a jo la

111

influencia de un cam po eléctrico alto ( 1 0 6 V/m), en una niebla fina de pequeñas gotas co n carga positiva, de la cual el disolvente se evapora rápido. Los iones de soluto que p erm anecen se transfieren después a un espectróm etro de m asas para ser analizados.

Registradores E l registrador se em plea para registrar la señal del detector en fu n ció n del tiem po que la fase m óvil tarda en pasar por el instrum ento, em pezando desde el m om en to de inyec­ ció n de la m uestra. La gráfica se llam a crom atogram a (fig. 4 -3 0 ). E l tiem po de reten ció n se em plea para identificar com puestos cuando se com para con tiem pos de retenció n estándar obtenidos en con d iciones idénticas. E l área de pico es proporcional a la con cen tració n de los com puestos que producen los picos. Cuando la fuerza de elu ción de la fase m óvil es con s­ tante en la separación, se llam a elución isocrática. Para m uestras que con tien en com puestos de com posiciones relativas que difieren m u ch o, la elecció n del disolvente es u n com prom iso. Los com puestos eluidos prim ero pueden tener tiem pos de retención cercanos a cero, lo que pro­ duce una separación mala (reso lu ció n ), com o se m uestra en la figura 4-30A . Los com puestos básicos suelen tener tiem pos de reten ció n bajos porque las colum nas C -1 8 no toleran pases m óviles con pH alto. La adición de reactivos form adores de pares de cationes (p. e j., ácido sulfón ico de octano) puede dar com o resultado una m ejo r reten ció n de com puestos con carga negativa en la colum na. Los com puestos de elu ción tardía pueden tener tiem pos de reten ció n largos, y producen bandas am plias que dan com o resultado una sensibilidad m enor. E n algunos casos, ciertos com ponentes de una m uestra pueden tener una gran afinidad con la fase estacionaria que no experim enta elu ció n en absoluto. La elu ción de gradiente es una técn i­ ca de CLAP que se puede usar para superar este problem a. La com p osición de la fase m óvil se m odifica para proveer un increm en to contin u o en la fuerza del disolvente de la fase m óvil que entra a la colum na (fig. 4 -3 0 B ). La m ism a elu ción de gradiente se puede efectuar co n un cam bio más rápido en la con cen tració n de la fase m óvil (fig. 4 -3 0 C ).

Crom atografía de gases La crom atografía de gases se em plea para separar m ezclas de com puestos que son volátiles o se pueden h acer volá­ tiles .21 La crom atografía de gases puede ser crom atogra­ fía gas-sólido (C G S ), con una fase estacionaria sólida, o crom atografía gas-líquido (C G L ), con una fase estacio­ naria de líquido n o volátil. La C G L se usa por lo com ún en laboratorios clínicos. En la figura 4 -3 1 se ilu stran los com ponentes básicos de u n sistem a crom atográfico de gases. La configu ración es sim ilar a la CLAP, excep to que la fase m óvil es un gas, y las m uestras se dividen entre una fase m óvil gaseosa y una fase estacionaria líquida. E l gas portador puede ser nitrógeno, helio o argón. La selecció n del gas portador se determ ina por el d etector em pleado en el instrum ento. E l instrum ento puede ser operado a una tem peratura constan te o ser program ado para fu ncionar a

112

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

t (min)

t (min)

t (min)

FIGURA 4-30. Cromatogramas: (A) la fase móvil de separación de Intercambio iónico ¡socrático contiene 0.055 M de NaN03. (B) Gradiente de fase móvil-elución de gradiente de 0.01 a 0.1 M de NaN03 a 2%/minuto. (C) Elución de gradiente, 5%/mlnuto. (De Horváth C. High Performance Liquid Chromatography, Advances and Perspectives. Nueva York: Academic Press, 1980.)

diferentes tem peraturas si la m uestra tiene com ponentes co n volatilidades distintas. La m uestra, que es inyectada por u n septo, se debe iny ec­ tar com o un gas, o la tem peratura del puerto de inyección debe estar arriba del punto de ebu llición de los com po-

Regulador de gas

Jeringa Septo y calentador (puerto de inyección)

nentes para que se evaporen al inyectarlos. La m uestra de vapor pasa rápido por la colum na en parte com o un gas y en parte disuelta en la fase líquida. Los com puestos volátiles que están presentes, sobre todo en la fase gas, tendrán un coeficien te de partición bajo y se m overán con rapidez por la colum na. Los com puestos con puntos de ebu llición más altos se m overán con lentitud por la colum na. E l efluente pasa por un detector que produce una señal eléctrica pro­ porcional a la concentración de los com ponentes volátiles. C om o en la CLAP, el crom atogram a se usa para identificar los com puestos por el tiem po de reten ción y para d eterm i­ nar su con cen tració n por el área b ajo el pico.

Colum nas Cilindro de fase móvil (gas portador)

Horno del detector Detector de concentración

FIGURA 4-31. Componentes básicos de CGL. (De Bender GT. Che­ mical Instrumentation: A Laboratory Manual Based on Clinical Chemistry. Filadelfia: WB Saunders, 1972.)

Las colum nas de C G L están hechas de vidrio o acero in o x i­ dable y existen en diversas configu raciones de espiral y tam años. Las colum nas em pacadas se llenan con partícu­ las inertes com o tierras diatom áceas o polím ero poroso o cu entas de vidrio cubiertas con una fase líquida no volátil (estacion aria). Estas colum nas son por lo com ú n de 1/8 a Vi de pulgada de ancho y 3 a 12 pies de largo. Las colu m ­ nas tubulares abiertas, cubiertas, de pared capilar, tienen diám etros in ternos en el intervalo de 0 .2 5 a 0 .5 0 m m y son de hasta 6 0 m de largo. La capa líquida va sobre las pare­

CAPÍTULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

des de la colum na. U n soporte sólido recubierto con una fase estacionaria líquida puede a su vez estar im pregnado en las paredes de la colum na. La fase estacionaria líquida debe ser n o volátil a las tem peraturas em pleadas, térm icam ente estable y no reac­ cionar con los solutos por separar. La fase estacionaria se d enom ina no selectiva cuando la separación se basa ante todo en la volatilidad relativa de los com puestos. Las fases líquidas selectivas se em plean para separar com puestos con base en la polaridad relativa (co m o en la crom atogra­ fía líqu id o-líquido).

Detectores Aunque hay m u chos tipos de detectores, sólo se analizan la conductividad térm ica (C T ) y los detectores de ioniza­ ció n de flama porque son los m ás estables (fig. 4 -3 2 ). Los detectores de conductividad térm ica con tien en alam bres (filam entos) que cam bian la resistencia eléctrica con el cam bio de tem peratura. Los filam entos form an los bra­ zos opuestos de u n puente de W h eatston e y se calientan eléctricam ente para elevar su tem peratura. E l h elio, que tiene una conductividad térm ica alta, es por lo com ún el gas portador. E l gas portador de la colum na de referencia fluye de m anera estable en u n filam ento, enfriándolo un Lado sensor

Lado de referencia

Gas portador

Salida

FIGURA 4-32. (A) Esquema de un detector de conductividad tér­ mica. (B) Esquema de un detector de ionización de flama. (De Tíetz NW, ed. Fundamentáis of Clinical Chemistry. Filadefia: WB Saunders, 1987.)

113

poco. E l gas portador y los com puestos separados form an el flujo de colum na de la m uestra en el otro filam ento. Los com ponentes de la m uestra tien en por lo com ún una co n ­ ductividad térm ica m enor, lo que increm en ta la tem pera­ tura y la resistencia del filam ento de m uestra. E l cam bio de resistencia produce u n circuito de puente desequilibrado. E l cam bio eléctrico se am plifica y alim enta al registrador; es proporcional a la con cen tració n del analito. Los detectores de ion ización de flama se usan m ucho en el laboratorio clín ico. No son m ás sensibles que los detectores de CT. E l efluente de la colum na se alim enta hacia una pequeña flama de hidrógeno que arde en exceso de aire u oxígeno atm osférico. E l chorro de flama y un electrodo co lecto r alrededor de la flama tienen potencia­ les opuestos. Cuando se quem a la m uestra, se form an los iones y se m ueven hacia el colector cargado. Así, se form a una corriente proporcional a la con cen tració n de los iones y se alim enta al registrador.

Espectrom etría de masas La id entificación definitiva de las m uestras que salen de las colum nas crom atográficas de gas es posible cuando se utiliza u n espectróm etro de m asas com o detector .20 E n la figura 4-3 3 A y B se m uestra un diagram a de bloqu es de tetrapolo y espectróm etros de m asas con tram pa de iones. Las sustancias separadas de u n crom atógrafo de gases entran a la fuente donde las m uestras son bom bardeadas con electrones para form ar iones m oleculares cargados y fragm entos. Las m oléculas se d escom ponen en fragm en­ tos característicos de acuerdo con su estructura m olecu ­ lar (fig. 4 -3 4 ). Estas partículas son concentradas para que entren al sector de filtración de m asas donde son clasifica­ das según su relación m asa a carga (m /z) y son contadas m ediante un m u ltiplicador de electrones. Tanto el tetra­ polo com o los detectores de tram pa de iones contienen varillas o placas que se cargan con voltajes variables de CA y CD para form ar cam pos eléctricos. E n el tetrapolo, los iones form an selectivam ente órbitas sinusoidales estables y atraviesan el secto r de filtración donde llegan al detector y son m edidos. E n la tram pa de ion es, éstos tam bién for­ m an órbitas estables, pero son desestabilizados de form a selectiva a fin de que lleguen al detector. Los patrones de fragm entación característicos que producen estos iones se emplean para identificación. Las bibliotecas por com pu­ tadora y algoritm os de com p aración están disponibles dentro del instrum ento para com parar resultados espec­ trales de m asas de una sustancia conocid a obtenida de una m uestra con la b iblioteca de referencia. Los sistem as CG/ EM se em plean de m anera extensa para m edir drogas en confirm aciones toxicológicas de orina. E n la figura 4 -3 5 se ilustra el espectro de masa de A9 9-carboxitetrahid rocannabinol, un m etabolito de la m arihuana. Las drogas y m etabolitos deben ser extraídos de los líquidos corporales y, por lo com ún, reaccion an co n reactivos de derivación para form ar com puestos que son m ás volátiles para proce­ sos de crom atografía de gases. Los espectróm etros de m asa en tándem (CG/EM/EM), obtenidos al añadir un segundo espectróm etro a un sis­ tem a CG/EM, se pueden usar para m ayor selectividad y

114

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLINICA

Introducción de la muestra

FIGURA 4-33. Esquema de un cromatógrafo de gases conectado a un tetrapolo (A) y espectrómetros de masas con trampa de iones (B).

182

303

i

i I

FIGURA 4-34. El bombardeo electrónico rompe la cocaína en frag­ mentos, con número y tamaño cuantificados. A diferencia del vaso de vidrio ilustrativo, el resultado de la fragmentación de masa de cocaína u otros compuestos químicos es predecible y reproducible.

CAPÍTULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

115

FIGURA 4-35. Espectro de masa del derivado trlmetilsilano de A9 9-carboxltetrahidrocannablnol (metabollto de la marihuana).

m enores lím ites de d etección. E l prim er espectróm etro de masa perm ite que sólo los iones de una relación específica m iz pasen al segundo espectróm etro, donde se lleva a cabo una fragm entación y análisis ad icional (fig. 4 -3 6 ).

INSTRUMENTACIÓN PARA PROTEÓM ICA La siguiente generación de biom arcadores para enferm e­ dades hum anas será descubierta por m edio de técnicas encontradas dentro de los cam pos de investigación de la genóm ica y la proteóm ica. La genóm ica em plea secuencias conocid as del genom a hum ano com pleto para determ inar el papel de la genética en ciertas enferm edades hum anas. La proteóm ica es la investigación de los productos proteín icos codificados por estos genes. La expresión de proteí­ nas es igual a y, en m u chos casos, m ás im portante para la

d etección de enferm edades que la genóm ica porque estos productos determ inan lo que está ocu rriendo actualm en­ te dentro de una célula, en vez de los genes, que indican lo que una célula p odría ser capaz de efectuar. Además, m u chos cam bios (postraslacionales) pueden ocu rrirle a la proteína, ya que se ve afectada por otras proteínas y enzi­ m as, que no se pueden predecir co n facilidad m ediante el con o cim ien to a nivel genóm ico. Con frecuencia se emplea un m étodo asistem ático, b as­ tante general, en el d escubrim iento de nuevos m arcado­ res bioqu ím icos. Las proteínas de m uestras (p. e j., suero, orina, extracto de tejid o) de individuos norm ales se com ­ paran con las obtenidas de pacientes con la enferm edad que se está estudiando. Las técnicas, com o la electroforesis bid im ensional, se pueden em plear para separar proteínas en puntos o bandas individuales. Las proteínas que sólo

FIGURA 4-36. Espectrómetro de masa con tetrapolo triple.

G C / M S / MS Tándem en espacio

■(¿Él Ionización

Análisis de masa

Disociación Análisis de masa Detección

Tándem en tiempo Ionización Análisis de masa Disociación Análisis de masa

Detección

116

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

aparecen en las m uestras norm ales o m órbidas se estudian aún m ás. E x isten program as de com putadora que com pa­ ran geles en form a digital para determ inar puntos o áreas que son diferentes. Cuando se han encontrado las proteí­ nas candidato, los puntos pueden ser aislados y som eti­ dos a análisis de espectrom etría de masas avanzado para identificar la proteína y algunas m odificaciones postraslacionales que pueden haber ocurrido. C on este m étodo, el investigador no tiene precon cepcion es o sesgos en cuanto a qué direcciones o proteínas particulares buscar.

Electroforesis bidim ensional E ste ensayo de electroforesis com bina dos d im ensiones de electroforesis distintas para separar proteínas de m atrices com p lejas com o suero o tejido. E n la prim era dim ensión, las proteínas se resuelven de acuerdo con sus puntos iso ­ eléctricos (p l), usando gradientes de pH inm ovilizados. L os gradientes com erciales están disponibles en diver­ sos rangos de pH. E n la segunda d im ensión, las proteí­ nas se separan de acuerdo con su tamaño relativo (peso m olecular), usando electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilam ida (SD S-PA G E). U n esquem a de este procedimiento se muestra en la figura 4-3 7 . Los geles se pue­ den correr en cond iciones desnaturalizantes o no desna­ turalizantes (p. e j., para el m antenim iento de la actividad enzim ática) y ver m ediante diversas técnicas, in clu so el uso de tintes colorim étricos (com o el azul de Coom assie o tin ció n de plata), radiográficas, fluorom étricas o de qui-

m iolu m iniscencia de polipéptidos m arcados de m anera apropiada. Estas últim as técnicas son m ás sen sibles a los tintes colorim étricos.

Espectrom etría de m asas MADI-TOF y SELDI-TOF La espectrom etría de m asa de tiem po de vuelo con ioniza­ ció n y d esorción láser asistida por m atriz ( m atrix-assísted láser desorption ionization time-of-flight, M A L D I-T O F) se em plea para el análisis de biom olécu las, com o péptidos y proteínas. Las m uestras de proteínas, com o las aisladas de u n electroforetogram a, se m ezclan co n u n disolvente m atricial apropiado y se depositan com o pu ntos en una p laca de acero inoxid able. Se seca el disolvente y la placa se introd u ce en el sistem a de vacío del analizador MALD I-T O E Com o se m uestra en la figura 4 -3 8 , un im pulso láser radia la m uestra causando desorción e ionización de la m atriz y la m uestra. Debido a que el alcance espectral de m asa m on itoread o es alto ( > 5 0 0 d a lto n s), la io n iza­ ció n de la m atriz de b a jo peso m olecular se puede d istin­ guir fácilm ente de los péptidos y proteínas de alto peso m olecular y no interfiere con la prueba de la proteína. Los iones de la m uestra se centran hacia el espectro de masas. E l tiem po requerido para que una m asa llegue al detector es una fu nción lineal de la m asa; así, los iones grandes requieren más tiem po que los pequeños. E l peso m olecular de las proteínas adquirido m ediante el espectro de m asas se em plea para determ inar la identidad de la m uestra, y es útil en la d eterm inación de m odificaciones postraslacionales que pudieron h aber ocurrido. Para proteínas m uy

Ia

1

2 Espetrometría de masas de tiempo de vuelo

Láser i \

-

Analito

A

V

O

\w o

FIGURA 4-37. Ejemplo hipotético de un electroforetograma bidimenslonal de un paciente con una enfermedad (panel 1) comparado con un individuo normal (panel 2). El paciente exhibe una proteína (óvalo) que no se expresa en el individuo normal. Esta proteína podría ser un marcador potencial para esta enfermedad. (Geles cortesía de Kendrick Laboratories, Madison, Wl.)

O

Ma,riz

+

FIGURA 4-38. Proceso de desorción de la muestra previo al análisis MALDI-TOF. (Diagrama cortesía de Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA.)

CAPÍTULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

OSM O M ETRÍA

grandes, las m uestras se pueden preparar con tripsina, que rom pe los enlaces peptidicos entre la lisina y la arginina, para producir fragm entos de m enor peso m olecular que entonces se pueden medir. E l lím ite de d etección de esta prueba es casi 10 '15 a 1 0 '18 m oles. Una m od ificación de la espectrometría de masas M ALDI-TOF es la espectrometría de m asas de tiem po de vuelo con ion izació n y d esorción láser m ejorada por superficie ( surface-enhanced láser desorption ionization time-of-flight, S E L D I-T O F ), en la cual las proteí­ nas son captadas de m anera directa en un b ioch ip crom atográfico sin que se requiera la preparación de la muestra. E n la figura 4 -3 9 se ilustra el proceso SE LD I-T O E

U n osm óm etro se em plea para m edir la con cen tració n de partículas de soluto en un a d isolución. La d efinición m atem ática es O sm olalidad = cp X n X C

Lavado

MAE

Seleccionar el sistema: Hidrófobo Aniónico Catiónico De enlace con metal Anticuerpo Eliminar las proteínas no enlazadas, sales u otros contaminantes

Láser

Desorción/ionización

< 0}

Ácido sináptico (SPA) o ácido cinamínico a-ciano-4-hidroxi (CHCA)

®

Tubo de vuelo

Lector SELDI (PBSIi) r—

i

-a

to

•g Espectros '« originales ®

Escala de grises (gel) A

Baja FIGURA 4-39.

Masa/carga

(Ec. 4-13)

donde cp = coeficiente osm ótico n = núm ero de partículas disociables (ion es) por m olécula en la disolu ción C = concentración en m oles por kilogram o de disol­ vente

Muestra

d+D

117

Alta

Estación de trabajo

Esquema general del proceso SELDI-TOF. (Diagrama cortesía de Ciphergen Biosystems, Fremont, CA.)

118

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

1. Aplicar el sobrenadante de las células CD8+ El sobrenadante de los cultivos estimulados y no estimulados de células C D 8+ normal, LTPN y progresor se agrega a un conjunto de trozos de proteína. Las proteínas se unen con el producto químico o los sitios de “amarre” biológico en la superficie del sistema por una interacción de afinidad. 2. Lavar el conjunto de proteínas Las proteínas que se enlazan de modo no específico y los contaminantes de la disolución amortiguadora se lavan, y de esta manera se elimina ruido muestral.

3. Añadir moléculas absorbentes de energía o “matriz” Después de procesar la muestra, se seca el sistema y se aplican M AE a cada punto para facilitar la desorción y la ionización.

4. Analizar en un lector de trozos de proteína Las proteínas que son retenidas en el sistema se detectan en el lector de trozos de proteína.

B FIGURA 4-39.

E l coeficiente osm ótico es un factor derivado de for­ m a experim ental para corregir el h ech o de que algunas de las m oléculas, inclu so un com puesto altam ente disociado, existen com o m oléculas y no com o iones. Las cu atro propiedades físicas de una d isolu ción que cam bian con variacion es en el nú m ero de partículas d isu eltas en el d isolvente son p resió n osm ó tica, presión de vapor, p u nto de eb u llició n y p u nto de co n g elam ien ­ to. Los osm óm etros m id en la osm olalidad de m anera in d irecta al m ed ir una de estas propiedades coligativas, que cam b ian en p ro p orción co n la p resió n osm ótica. Los o sm óm etros de uso clín ico m id en la d ep resión del pu nto de con g elam ien to o la depresión de la p resión de vapor; los resultad os se exp resan en m iliosm o les p o r kilogram o (m osm /kg).

(CONTINUACIÓN)

Osm óm etro de punto de congelam iento E n la figura 4 -4 0 se ilu stran los com ponentes básicos de un osm óm etro de pu nto de congelam iento. La m uestra en un pequeño tubo se introduce en una cám ara con refrige­ rante frío que circula desde una unidad de enfriam iento. Se sum erge un term istor en la m uestra. Para m edir la tem pe­ ratura, se em plea un alam bre con el que se agita de m anera suave la m uestra hasta que se enfría varios grados debajo de su punto de congelam iento. Es posible enfriar agua a una tem peratura tan b aja com o - 4 0 ° C y aún tener agua líquida, siem pre que n o estén presentes cristales o m ate­ ria particulada. Ésta se denom ina disolución superenfriada. La agitación vigorosa cuando se superenfría la m uestra da com o resultado congelam iento rápido. E l congelam iento tam bién se puede in iciar al sem brar cristales en una diso-

CAPITULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

FIGURA 4-40. Osmómetro de punto de congelamiento. (De Coiner D. Basic Concepts in Laboratory Instrumentaron. Bethesda, MD: ASMT Education and Reserarch Fund, 1975-1979.)

lu ción superenfriada. Cuando la d isolu ción superenfriada com ienza a congelarse com o resultado de la agitación rápida, se form a aguanieve y la disolu ción en realidad se calienta hasta su tem peratura de pu nto de congelam iento. E l aguanieve, un equilibrio de líquido y cristales de hielo, perm anecerá a la tem peratura del punto de congelam iento hasta que se congela la m uestra sólida y cae debajo de su punto de congelam iento. Las im purezas en un disolvente dism inuirán la tem pe­ ratura a la que ocurre el congelam iento o la fusión al redu­ cir las fuerzas de enlace entre las m oléculas de disolvente, de m anera que las m oléculas se separan entre sí y existen com o u n fluido a una m enor tem peratura. La dism inu­ ción en la tem peratura de congelam iento es proporcional al núm ero de partículas disueltas presentes. El term istor es un m aterial que tiene m enos resistencia cuando aum enta la tem peratura. La lectura em plea un cir­ cu ito de puente de W h eatstone que detecta el cam bio de tem peratura com o proporcional al cam bio en la resistencia del term istor. La depresión del punto de congelam iento es proporcional al núm ero de partículas de soluto. Los están­ dares de con cen tració n conocid a se em plean para calibrar los instrum entos en mosm/kg.

119

espectrom etría, técnicas electroanalíticas y crom atografía. Com o tal, los m ism os pasos necesarios para llevar a cabo un análisis en el laboratorio central, se requieren para la PLDA, inclu so validación de instrum entos, calibración de ensayo periódica, prueba de control de calidad, capacita­ ción del operador y prueba de com petencia. En el capítulo 7, Pruebas en el lugar de la atención, se da una exp licación a fondo de esta tecnología. Las técnicas analíticas empleadas en estos dispositivos se dan en esta sección . Los dispositivos de PLDA m ás com unes em pleados al lado de la cam a, en los consu ltorios y en el hogar son los m onitores de glucosa sanguínea de p u nción digital. Los dispositivos de prim era generación usan un m étodo fotom étrico, por el cual la glucosa produce peróxido de hidró­ geno co n oxidasa de glucosa inm ovilizada en las tiras de prueba. E l H , 0 , se acopla con la peroxidasa para producir un color cuya intensidad se m ide com o una fu n ció n de la con cen tració n y por m edio de fotom etría de reflectancia. U n esquem a de esta técnica se m uestra en la figura 4 -4 1 . En estas tiras se mide la con cen tració n de glucosa sin necesidad de retirar la sangre de las tiras. La tecnología de tiras en una plataform a de PLDA se puede usar tam bién para m edir proteínas y enzim as, por ejem plo, m arcadores cardíacos. La separación de analitos de la m atriz se lleva a cabo m ediante crom atografía en papel, en la que los anticuerpos específicos inm ovilizados en la superficie crom atográfica captan el analito objetivo cuando pasa. Para análisis cualitativo, la d etección se hace por m edios visuales. Los m edidores de reflectancia sim ila­ res a los que se em plean para glucosa tam bién están dispo­ nibles para m ed iciones cuantitativas. La siguiente generación de dispositivos para PLDA em plean b iosen sores .22 Un b iosen sor acopla un biod etector esp ecífico, com o una enzim a, anticuerpo o sonda de ácido n u cleico , co n un tran sd u ctor para la m ed ición directa de un analito objetivo sin necesidad de separarlo de la m atriz (fig. 4 -4 2 ). E l área ha sido explotada en años

Muestra de sangre en una tira

TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN (PLDA) Los dispositivos de análisis en el lugar donde se da la aten­ ció n se em plean m ucho para diversas aplicaciones clínicas, inclu so consu ltorios m édicos, departam entos de urgen­ cias, unidades de cuidado intensivo y aún para autoa­ nálisis. D ebido a que quienes dan la atención prim aria pueden h acer los análisis al lado del pacien te, la principal atracción de la PLDA es el tiem po de respuesta reducido necesario para entregar resultados. En algunos casos es posible reducir los costos totales si el dispositivo elim ina la necesidad de em plear instrum entación de laboratorio o si los tiem pos de respuesta m ejorados dan lugar a estancias más cortas en el hospital. La PLDA depende de las m ism as técnicas analíticas que la instrum entación de laboratorio:

Detector de señal

LED # 1

FIGURA 4-41. Fotometría de reflectancia de longitud de onda dual empleada en el monitoreo de glucosa en el lugar de la atención. Una membrana hldrofílica microporosa se emplea como depósito de la muestra para filtrar material celular sólido desde el depósito y proveer una superficie óptica, lisa, para mediciones de reflectancia. (Figura cortesía de Lifescan Inc. One touch System technology. Challenges In Diabetes Management: Clinical Protocols for Professlonal Practice. Nueva York: Health Education Technologies, 1988.)

120

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

Barrera de membrana

*

Producto de biodetección

* *

*

* *

Analitos objetivo Agente de Transductor biodetección !___________________________________________II_________________ II____________________________________________________ I BIODETECCIÓN T R AN SD U C CIÓ N ELECT R Ó N ICA

FIGURA 4-42.

Esquema de un biosensor. (De Rosen A. Biosensors: where do we go from here? MLO Med Lab Obs

1 995;27(3):24.)

recientes con el desarrollo de la fabricación de m icrocircu itos de silicio porque es posible m iniaturizar los b iosensores y d istribuirlos a bajo costo. E n una sola oblea de silicio se puede producir un sistem a de b iosensores para producir un m ultipanel de resultados, com o un perfil de electrólito. Los dispositivos com erciales de PLDA em plean b iosensores electroqu ím icos (com o los electrodos selecti­ vos de m icroiones ) y ópticos para la m ed ición de glucosa, electrólitos y gases sanguíneos arteriales. C on la inm ovi­ lización de anticuerpos y secu encias de DNA específicas, las sondas biosensoras pronto estarán disponibles para la d etección de horm onas, fárm acos y drogas, y bacterias d ifíciles de cultivar y virus com o C hlam ydia, de tu bercu lo­ sis o de inm unod eficiencia hu m ana .22

RESUM EN Las técnicas y principios generales em pleados en u n lab o ­ ratorio de quím ica clínica son idénticos a los utilizados en otros laboratorios de prueba analítica. Los laboratorios clín ico s tien en necesidades especiales que requieren que los analizadores tengan alto rendim iento y tiem pos de res­ puesta para la m uestra. La generación actual de analizado­ res quím icos opera b ajo el m odo de “acceso aleatorio”; es decir, cu alquier com binación de pruebas se puede llevar a cabo en una m uestra desde un m enú de analitos. Para los analitos de quím ica general, com o glucosa o fósforo, la esp ectrofotom etría es la técnica que más se em plea. Para electrólitos com o sodio o potasio, los electrodos específi­ cos de iones son m uy usados y han reem plazado en gran m edida a los fotóm etros de flama. La espectrofotom etría de absorción atóm ica se em plea todavía para m etales com o cin c y cobre, y es el m étodo de referencia para cal­ cio y m agnesio. Sin em bargo, los ensayos colorim étricos y

los ESI ahora se usan de m anera rutinaria para estos dos últim os m etales. La electroforesis es todavía una técnica im portante en los laboratorios clín ico s, aunque el desarrollo de nuevos ensayos ha puesto en duda su función. Por ejem plo, la electroforesis de lipoproteínas ha sido desplazada en gran m edida por la m ed ición directa de colesterol de lipopro­ teínas de alta densidad (H DL) y el cálculo de colesterol de lipoproteínas de b aja densidad (L D L ). E l desarrollo de u n ensayo específico para colesterol LD L dism inuirá más la fu n ció n de la electroforesis. C on el desarrollo de inm unoensayos específicos para la form a MB de la isoenzim a cinasa de creatina (C K -M B) y ensayos de in h ib ició n para la form a 1 de la deshidrogenasa de lactato (L D 1 ), la elec­ troforesis ya n o es tan com ún com o antes; sin em bargo, en fechas recientes se puso en circu lación u n ensayo de electroforesis autom atizado para isoform as CK-M B. La electroforesis desem peñará un papel im portante en el área de patología m olecular para la id entificación de produc­ tos génicos y m utaciones. La electroforesis bid im ensional perm ite la separación de m ezclas com plejas, y es una herram ienta im portante para el descu brim iento de nuevos biom arcadores para enferm edad (p roteóm ica). La iden­ tificación de proteínas específicas se puede llevar a cabo m ediante instrum entos de espectrom etría de masas con desorción asistida por láser. La electroforesis capilar es una tecnología in cip ien te que prom ete tener m u chas apli­ caciones clínicas. C on el desarrollo de inm unoensayos, el papel de la crom atografía líquida ha pasado del m onitoreo de fárm acos terapéuticos a la toxicología. La CLAP con detectores U V de exploración rápida se em plea para iden­ tificaciones com pletas de fárm acos. Los sistem as CG/EM son el sostén principal para confirm ación.

CAPÍTULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

P R E G U N T A S 1. De lo que se m enciona a con tin u ació n , ¿qué n o es necesario para obtener el espectro de u n com puesto de 1 9 0 a 5 0 0 nm ? a) F u en te lum inosa de deuterio. b ) E spectrofotóm etro de doble haz. c) Cubetas de cuarzo. d) Fu en te lum inosa de tungsteno. e) Fotom ultiplicador. 2. La luz parásita en un esp ectrofotóm etro lim ita: d) La sensibilidad. b) E l alcance superior de linealidad. c) La exactitu d fotom étrica abajo de 0 .1 unidades de absorbancia. d) La capacidad para m edir el alcance UV e) E l uso de un m onocrom ad or de rejilla. 3. ¿C uál de las siguientes fuentes de luz se em plea en la espectrofotom etría de absorción atóm ica? a) Lám para de cátodo hueco. b ) Lám para de arco de xenón. c) Luz de tungsteno. d) Lám para de deuterio. e) Láser. 4. De lo que se m enciona a con tin u ació n , ¿qué es cierto en relación con la fluorom etría? a) Las longitudes de onda de em isión se establecen siem pre a longitudes de onda m enores que la excitación. b ) E l detector se coloca siem pre en ángulo recto res­ pecto al haz de excitación. c) Todos los com puestos experim entan fluorescencia. d) La fluorescencia es una técnica inherentem ente m ás sen sible que la absorción. e) L os fluoróm etros requieren detectores especia­ les. 5. ¿Cuál de las siguientes técnicas tiene la m ayor sen si­ bilidad posible? a) Q uim iolum iniscencia. b) Fluorescencia. c) Turbidim etría. d) N efelom etría. e) Fosforescencia.

6 . ¿Cuál ensayo electroqu ím ico m ide la corrien te a p otencial fijo? a) V oltam etría de sep aración anódica. b) Am perom etría. c) Coulom etría. d ) A nálisis con electrodos selectivos de iones. e) Electroforesis. 7. De lo siguiente, ¿qué se refiere al m ovim iento de los iones de la d isolu ción am ortiguadora y al disolvente en relación con el soporte fijo? a) Enfoqu e isoeléctrico. b) Iontoforesis.

DE

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R E P A S O c) E lectroforesis de zona. d) Elctroendósm osis. e) Plasm aferesis.

8. La crom atografía líquida de fase invertida se refiere a: a) U na fase m óvil polar y fase estacionaria no polar. b ) U na fase m óvil no polar y fase estacionaria polar. c) D istrib u ción entre dos fases líquidas.

d) Tam año em pleado para separar solutos en lugar de carga. e) Carga em pleada para separar solutos en vez de tam año. 9. De lo siguiente, ¿cuál no es una ventaja de la electro­ foresis capilar? a ) Tam año de m uestra m uy pequeño. b ) A nálisis rápido. c) U so de detectores tradicionales. d) Se puede analizar varias m uestras al m ism o tiem ­ po en una inyección. e) Los cationes, sustancias neutras y aniones se m ueven en la m ism a d irección a velocidades dis­ tintas. 10. Los espectróm etros de m asa en tándem: a) Son dos espectróm etros de masa colocad os en serie entre sí. b) Son dos espectróm etros de masa colocad os en paralelo entre si. c) Requieren el uso de u n crom atógrafo de gases. d) Requieren el uso de un a interfase de electrodispersión. e) No requieren una fuente de ionización. 11. De lo que se m enciona a con tin u ació n , ¿qué es falso en relación con los prin cipios de los dispositivos de prueba en el lugar de la atención? a) E m plean principios que son id én ticos para la in s­ tru m en tación de laboratorio. b) Los biosensores han perm itido la m iniaturización recom endable en particu lar para prueba en el lugar donde se brinda la atención. c) Los dispositivos no requieren prueba de control de calidad. d) Las m icrocom putadoras de a bordo controlan las fu nciones del instrum ento y la red u cción de datos. e) E l análisis de sangre com pleta es el m odelo prefe­ rido. 12. ¿C uál es el d etector m ás sensible para esp ectrofoto­ m etría? a) Fototu bo. b) Fotom ultiplicador. c) M u ltiplicador electrónico. d) Sistem a o con ju n to de fotodiodos. e) Todos son igualm ente sensibles.

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

13. ¿C uál de las siguientes es la ley de Beer? a) % T = I/I0 X 100 b) E = ítv c) e = ApH X 0 .5 9 V d )A = e X b X c e) O sm olalidad = X n X C 14. De lo siguiente, ¿qué clasifica de m anera correcta la rad iación electrom agnética de b aja energía a alta ener­ gía? a) C ósm ica, gam m a, rayos X , U y visible, infrarroja, m icroondas. b ) UV, visible, infrarroja, m icroondas, rayos X , có s­ m ica, gamma. c ) U y visible, infrarroja, cósm ica, gam m a, m icroo n ­ das, rayos X. d) M icroondas, infrarroja, visible, UV, rayos X , gam ­ ma, cósm ica. e) V isible, U y infrarroja, cósm ica, gam m a, m icroondas, rayos X. 15. ¿Cuál es el propósito del interrup tor giratorio en un espectrofotóm etro de absorción atóm ica? a) C orregir la cantidad de luz em itida por la flama. b ) Corregir la intensidad fluctuante de la fuente de luz. c) C orregir la sensibilidad fluctuante del detector. d) C orregir las diferencias en la tasa de aspiración de la m uestra. e) Corregir la presencia de luz parásita. 16. De lo que se m enciona a con tin u ació n , ¿qué describe m ejo r el proceso de fluorescencia? a) Los átom os em iten un fotón cuando se excitan los electrones. b) Las m oléculas em iten un fotón cuando se excitan los electrones. c) Las m oléculas em iten un fotón a la m ism a energía cuando los electrones excitad os vuelven al estado basal. d) Las m oléculas em iten un fotón a m ayor energía cuando los electrones excitad os vuelven al estado basal. e) Las m oléculas em iten u n fotón a m enor energía cuando los electrones excitad os vuelven al estado basal.

REFEREN CIAS 1. Christian GD, et al. Instrumental Analysis, 2nd ed. Boston: Allyn and Bacon, 1986. 2. Willard HH, et al. Instrumental Methods of Analysis. Belmont, CA: Wadsworth, 1981. 3. Coiner D. Basic Concepts in Laboratory Instrumentation. Bethesda, MD: ASMT Education and Research Fund, 1975-1979. 4. Ingle JD , Crouch SR. Spectrochemical Analysis, Upper Saddle River, NJ: Prentice-Hall, 1988.

17. ¿Q ué es lo m ás exacto en relación con los electrodos selectivos de iones? a) E l electrodo de pH usa una m em brana de estado sólido. b) E l electrodo de calcio no requiere un electrodo de referencia. c) Las m em branas específicas de gas son necesarias para electrodos de oxígeno y dióxido de carb o­ no. d ) E l electrodo de sodio usa u n portador selectivo de iones (valinom icina). e) E l ESI para la urea emplea ureasa inm ovilizada. 18. De lo siguiente, ¿qué es FALSO en relación con la espectrom etría de masas? a) Los iones se form an por el bom bardeo de electro­ nes. b) E l cuadripolo y los sectores de tram pas de iones separan iones de acuerdo con su relación m asa a carga. c) Cada com puesto quím ico tiene un espectro de masa único. d ) La espectrom etría de masas detecta crom atografía de gas y líquido. e) Los espectróm etros de m asas se pueden usar para secu en ciar DNA. 19. De los siguientes enunciados, ¿cuál no es u n objetivo de la investigación proteóm ica? a) Identificar proteínas novedosas com o posibles nuevos m arcadores para enferm edad. b ) Identificar m odificaciones postraslacionales de proteínas. c) Com prender el m ecanism o de las enferm edades. d) Identificar m utaciones génicas específicas. e) D eterm inar cuáles genes están expresados y cu á­ les están inactivos. 2 0 . ¿Cuál de los siguientes procedim ientos no se em plea en la actualidad o de m anera rutinaria para los dispo­ sitivos de prueba en el lugar de la atención? a) Inm unocrom atografía. b) Biosensores. c) D etección colorim étrica. d) D etección electroquím ica. e) R eacción en cadena de la polim erasa.

5. Holland JF, et al. Mass spectrometry on the chromatographic time scale: realistic expectations. Anal Chem 1983;55:997A. 6. Guilbault GG. Practical Fluorescence, Theory, Methods and Techniques. New York: Marcel Dekker, 1973. 7. Kricka LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin Chem 1991 ;37:1472. 8. Wild D. The Immunoassay Handbook. London: Macmillan Press, 1994. 9. Svelto O, et al. Principies of Lasers, 2nd ed. New York: Plenum Press, 1982.

CAPÍTULO 4 ■ TÉCNICAS ANALÍTICAS E INSTRUMENTACIÓN

10. Coulter Hematology Analyzer: Multidimensional Leukocyte Differential Analysis, Vol. 11 (1). Miami: Beckman Coulter, 1989. 11. Weast RC. CRC Handbook of Chemistry and Physics, 61st ed. Cle­ veland: CRC Press, 1981. 12. Burtis CA. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd ed. Philadelphia: W B Saunders, 1993. 13. Heiger DN. High-Performance Capillary Electrophoresis: An Introduction, 2nd ed. Waldbronn, Germany: Hewlett-Packard, 1992. 14. Monnig CA, Kennedy RT. Capillary electrophoresis. Anal Chem 1994;66:280R. 15. Parris NA. Instrumental Liquid Chromatography: A Practical Manual on High Performance Liquid Chromatographic Methods. New York: Elsevier, 1976.

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16. Jurk H. Thin-Layer Chromatography. Reagents and Detection Methods, Vol. la. Weinheim, Germany: Verlagsgesellschaft, 1990. 17. Bender GT. Chemical Instrumentation: A Laboratory Manual Based on Clinical Chemistry. Philadelphia: WB Saunders, 1972. 18. Horváth C. High Performance Liquid Chromatography, Advances and Perspectives. New York: Academic Press, 1980. 19. Constantin E, et al. Mass Spectrometry. New York: Ellis Horwood, 1990. 20. Kebarle E, Liang T. From ions in solution to ions in the gas phase. Anal Chem 1993;65:972A. 21. Karasek FW, Clement RE. Basic Gas Chromatography: Mass Spec­ trometry. New York: Elsevier, 1988. 22. Rosen A. Biosensors: where do we go from here? MLO Med Lab Obs 1995;27(3):24.

Principios de automatización química clínica William L. Roberts C O N T E N I D O

DE L

HISTORIA DE LOS ANALIZADORES AUTOMATIZADOS FUERZAS IMPULSORAS HACIA MÁS AUTOMATIZACIÓN ENFOQUES BÁSICOS HACIA LA AUTOMATIZACIÓN PASOS DEL ANÁLISIS AUTOMATIZADO Preparación e identificación de la muestra Medición de la muestra y entrega Sistemas de reactivos y entrega Fase de reacción química Fase de medición Procesamiento de la señal y manejo de datos

C A P Í T U L O SELECCIÓN DE ANALIZADORES AUTOMATIZADOS AUTOMATIZACIÓN TOTAL DEL LABORATORIO Fase preanalítica (procesamiento de la muestra) Fase analítica (análisis químicos) Fase posanalítica (manejo de datos) TENDENCIAS FUTURAS EN LA AUTOMATIZACIÓN RESUMEN PREGUNTAS DE REPASO REFERENCIAS

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Definir los siguientes términos: autom atización, canal, flujo continuo, análisis discreto, tiem po de perm anencia, bandera, acceso aleatorio y rendi­ miento. • Describir la historia del desarrollo de los analizadores autom atizados en el laboratorio de química clínica. • Listar cuatro fuerzas im pulsoras detrás del desa­ rrollo de nuevos analizadores autom atizados. • Nombrar tres métodos básicos para el análisis de muestras que emplean los analizadores automatizados. • Explicar los pasos principales en el análisis automatizado.



Proporcionar ejem plos de analizadores de química discretos disponibles en el comercio y sistem as modulares. • Com parar los distintos enfoques para el análisis autom atizado que emplean los fabricantes de ins­ trumentos. • Discriminar entre un sistema de reactivos abierto contra uno cerrado. • Relacionar tres consideraciones en la selección de un analizador autom atizado. • Explicar el concepto de autom atización total del laboratorio. • Diferenciar las tres fases del proceso de prueba de laboratorio. • Explicar las tendencias futuras en el desarrollo del analizador autom atizado.

T É R M I N O S Acceso aleatorio Análisis discreto Autom atización Autom atización total del laboratorio

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Bandera Canal Código de barras Flujo continuo Modular

C L A V E

Muestreo de tubo cerrado Placa de química seca Robótica

Rotor Sonda

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

E n el laboratorio m oderno de quím ica clín ica se em plea un alto grado de autom atización. M uchas etapas en el proce­ so analítico que antes se llevaban a cabo de form a m anual ahora se pueden realizar autom áticam ente, lo que perm i­ te al operador centrarse en tareas que no son posibles de autom atizar con facilidad e increm entar tanto la eficiencia com o la capacidad. El proceso analítico se puede dividir en tres fases principales: preanalítica, analítica y posanalítica, que corresponden al procesam iento de la m uestra, el análisis quím ico y el m an ejo de datos, respectivam ente. M ejoram ien tos sustanciales han ocurrido en las tres áreas durante la década pasada. Siete vendedores principales de diagnóstico venden analizadores autom atizados y reacti­ vos. E stos vendedores perfeccionan de m anera continu a sus productos para hacerlos m ás fu ncionales y am igables con el usuario. La fase analítica es la más autom atizada, y en la actualidad más investigación y esfuerzos de desa­ rrollo se enfocan en increm en tar la autom atización de los procesos pre y posanalíticos.

HISTORIA DE LOS ANALIZADORES AUTOM ATIZADOS D espués que Technicon introd u jo en 1 9 5 7 el prim er anali­ zador autom atizado, los instrum entos de este tipo proliferaron de m u chos fabricantes .1 Este prim er “AutoA nalyzer” (AA) fue u n analizador de lotes secu encial, de canal ún ico y flujo con tin u o capaz de proveer un solo resultado de prueba en casi 4 0 m uestras por hora. La siguiente gene­ ración de instrum entos Technicon que se desarrolló fue la serie de analizadores m últiples sim ultáneos (Simultaneous M últiple A nalyzer, SM A). SMA -6 y SM A -12 fueron anali­ zadores con canales m últiples (para pruebas d iferentes), que trabajaban de m anera sin crón ica para producir 6 a 12 resultados de prueba por hora. No fue sino hasta m edia­ dos de la década de 1 9 6 0 que estos analizadores de flujo con tinu o tuvieron alguna com petencia im portante en el m ercado. En 1 9 7 0 , se introd u jo el prim er analizador centrífugo com ercial com o una tecnología subproducto de la inves­ tigación del espacio exterior de la NASA. E l Dr. N orm an A nderson desarrolló un prototipo en 1 9 6 7 en el O ak Ridge N ational Laboratory com o una alternativa para la tecn olo­ gía de flujo continu o, la cual tenía problem as de acarreo im portantes y un costoso derroche de reactivo. É l quería llevar a cabo análisis en paralelo y tam bién aprovechar los avances de la tecnología de las com putadoras. La segunda generación de estos instrum entos (1 9 7 5 ) fue más exitosa, com o resultado de la m iniaturización de las com putadoras y avances en la industria de los polím eros para la fabrica­ ción de cubetas ópticas de plástico de gran calidad. E l siguiente desarrollo im portante que revolucionó la instru m entación de quím ica clínica ocu rrió en 1 9 7 0 con la introd u cció n del A utom atic C linical Analyzer (ACA) (D u P o n t [ahora, Dade B eh rin g ]). É ste fue el prim er ana­ lizador discreto de flujo con tin u o, así com o tam bién el prim er instrum ento en tener capacidades de acceso a lea ­ torio, m ediante el cual se podían analizar m uestras STAT fuera de la secu encia del lote según se requiriera. Paquetes

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plásticos de prueba, identificación positiva del pacien te y calib ració n infrecuente estaban entre las características únicas del ACA. O tros h itos im portantes fueron la in tro ­ d u cción de la tecnología de análisis de capa fina en 1 9 7 6 y la introd u cció n del analizador Kodak E ktachem (ahora, V itros) en 1 9 7 8 (en la actualidad, O rth o -C lin ical D iagnostics). E ste instrum ento fue el prim ero en usar volúm enes de m icrom uestra y reactivos en placas para análisis quí­ m ico por vía seca, y en incorporar de m anera extensa la tecnología de com putadoras en su diseño y uso. Desde 1 9 8 0 han sido desarrollados varios analizadores, sobre todo discretos, que in corp oran características com o electrodos selectivos de iones (E S I), fibra óptica, análisis policrom ático, softw are y hardware de com putadora cada vez m ás avanzado para el m anejo de datos y m enús de prueba m ás grandes. Los analizadores populares y más exitosos que em plean estas y otras tecnologías desde 1 9 8 0 son los analizadores Astra (ahora, S y nchron ) (B eckm an C oulter) que em pleaban de m anera extensa E SI; Param ax (D ade) utiliza sum inistro de tabletas de reactivo y m uestreo de tubo prim ario; el analizador H itachi (B oehringer M annheim ; ahora, R oche D iagnostics) con discos de reacción reutilizables y configu raciones fijas de diodos para m apeo espectral, y el Chem 1 de T echnicon (ahora, B ayer), que em pleaba segm entos de aceite encapsulados de m uestra y reactivos en u n solo tubo de flujo continu o. Los sistem as autom atizados de uso com ún en la actualidad en los laboratorios de quím ica clín ica son los analizado­ res A eroset y A RCH 1TECT (A bbott L aboratories), Advia (B ayer), Synchron (B eckm an C ou lter), D im ensión (Dade B eh ring ), AU (O lym pu s), V itros (O rth o -C lin ical D iagnos­ tics) y varias líneas de analizadores R oche. Los fabricantes de estos sistem as de instrum entos han adoptado las características y tecnologías m ás exitosas de otros instrum entos, donde es posible, para h acer cada g eneración de su producto m ás com petitiva en el mercado. Las diferencias entre los instrum en tos de los fabricantes, principios de op eración y tecnologías son m enos distintas ahora que en los prim eros años de la autom atización del laboratorio.

FUERZAS IM PULSORAS HACIA MÁS AUTOM ATIZACIÓN Desde 1 9 9 5 , el ritm o de cam bios co n los analizadores quím icos de rutin a actuales y la introd u cció n de nuevos han dism inuido de forma considerable, en com paración con la prim era m itad de la década de 1 9 9 0 . E n efecto, los analizadores son m ás rápidos y fáciles de usar com o resul­ tado de los refinam ientos continu os de transform ación y electrónicos. Los m étodos son m ás precisos, sensibles y específicos, aunque algunos de los m ism os principios se encuentran en los instrum entos de hoy com o en los m odelos anteriores. Los fabricantes han trabajado de m anera exitosa hacia la autom atización con capacidades de independencia e interven ción m ínim a del operador .2 Los fabricantes tam bién han respondido al deseo de los m édicos de llevar la prueba de laboratorio al paciente. La introd u cció n de analizadores de b anco fáciles de operar,

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PARTE ¡ ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

portátiles y pequ eños, en laboratorios de consu ltorios (L C ), así com o en unidades de aten ción quirúrgica y crí­ tica que dem andan resultados de laboratorio inm ediatos, ha dado com o resultado un d om inio enorm em ente exi­ toso de analizadores que se em plean en el lugar donde se presta la a ten ció n .3 O tra área especializada con u n arsenal de analizadores de rápido desarrollo es la inm unoquím ica. Las técnicas inm unológicas para exam inar fárm acos, pro­ teínas especificas, m arcadores de tum ores y horm onas han evolucionado a un nivel de autom atización increm entado. Los instrum entos que usan técnicas com o el inm unoensayo de polarización por fluorescencia (F P IA ), nefelom etría e inm unoensayo com petitivo y no com petitivo con d etec­ ción quim iolu m iniscente se han vuelto populares. El hito más reciente en el desarrollo de analizadores de quím ica ha sido la com bin ación quím ica e in m un oen sa­ yo en u n solo analizador m odular. E l analizador D im en­ sión R xL con un m ódulo de inm un oensayo heterogéneo se introd u jo en 1997. Este diseño perm ite la con solid a­ ción ad icional de la estación de trabajo con m ejoras con ­ siguientes en la eficiencia operacional y m ás red ucciones en el tiem po de respuesta. Los analizadores m odulares que com bin an las capacidades de quím ica e inm unoensayo ahora se pueden obtener de varios vendedores (fig. 5 -1 ). O tras fuerzas están im pulsando tam bién el m ercado hacia m ás autom atización enfocada. E l m ayor volum en de análisis y el tiem po de respuesta más rápido han dado com o resultado una m enor cantidad de laboratorios tron­ cales m ás centralizados que llevan a cabo análisis más com p leto s .4 E l uso de grupos de expertos de laboratorio o perfiles ha dism inuido, con las pruebas individuales diri­ gidas de m anera m ás diagnóstica según d ictan los cam bios de política recientes de M edicare y M edicaid. Es del co n o ­ cim iento de los investigadores, durante m u chos años, que los paneles de quím ica sólo cond u cen en ocasiones a nu e-

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FIGURA 5-1. Analizadores modulares de química e inmunoensa­ yo. (A) Dade Behring Dimensión RxL (fotografía cortesía de Dade Behring); (B) Roche MODULAR ANALYTICS (fotografía cortesía de Roche Diagnostics); (C) Abbot ARCHITEC c¡8200 (fotografía cortesía de Abbott Diagnostics); y (D) Beckman Coulter Synchron LXi 725 (fotografía cortesía de Beckman Coulter).

vos d iagnósticos en pacientes que parecen salu d ables .5 La expectativa de resultados de calidad con m ayor exactitu d y p recisión nu nca está presente con los estándares nor­ m ativos que establecen las Enm iendas de M ejoram ien to del Laboratorio C línico (C LIA ), la C om isión C on ju nta sobre A creditación de O rganizaciones de A tención de la Salud (JC A H O ), el Colegio de Patólogos Estadounidenses (C A P) y otros. La intensa com petencia entre los fabrican­ tes de instrum entos ha im pulsado la autom atización hacia analizadores m ás com p lejos con tecnologías creativas y características únicas. Además, los costos disparados han estim ulado la reform a de atención de la salud y, de m anera m ás específica, la aten ción gestionada y los am bientes de capitación dentro de los cuales los laboratorios están for­ zados a operar.

EN FOQUES BÁSICOS HACIA LA AUTOM ATIZACIÓN Hay m uchas ventajas en relación con la autom atización de los procedim ientos. U n propósito es in crem en tar el nú m e­ ro de pruebas que lleva a cabo u n laboratorio en un deter­ m inado período. La m ano de obra es un artícu lo caro en los laboratorios clínicos. A través de la m ecanización, se reduce el com ponente de m ano de obra dedicado a cual­ quier prueba sim ple, y esto baja de m odo efectivo el costo por prueba. U n segundo propósito es m inim izar la varia­ ció n en los resultados de un laboratorio a otro. Al repro­ ducir los com ponentes de un proced im iento de la form a más idéntica posible, se reduce el coeficiente de variación y se increm en ta la reproducibilidad. Así que la exactitud no depende de la habilidad o carga de trabajo de un ope­ rador particu lar en un día específico. Esto perm ite com pa­ rar m ejo r los resultados día a día y de una sem ana a otra. N o obstante, la autom atización no corrige las d eficien­ cias inh erentes a la m etodología. U na tercera ventaja se obtien e debido a que la autom atización elim ina los errores potenciales de los análisis m anuales com o etapas de pipe­ teo volu m étrico, cálculo y tran scripción de resultados. Se acum ula una cuarta ventaja debido a que los instrum entos pueden usar cantidades m uy pequeñas de m uestras y reac­ tivos. Esto perm ite extraer m enos sangre de cada paciente. Además, el uso de pequeñas cantidades de reactivo dism i­ nuye el costo de productos de consum o. Hay tres enfoques básicos con los instrum entos: flujo con tin u o, análisis centrífugo y análisis discreto. Los tres pueden usar análisis por lotes (es decir, gran núm ero de m uestras en una eje cu ció n ), pero sólo los analizadores discretos ofrecen acceso aleatorio o capacidades STAT. E n flu jo continuo, los líquidos (reactivos, diluyentes y m uestras) se bom bean por un sistem a de tubería continua. Las m uestras se introd u cen de m anera secuencial, y cada una fluye por la m ism a red. Una serie de burbujas de aire a intervalos regulares sirven com o m edios de separación y limpieza. E l flujo continu o, por tanto, resuelve la con si­ deración im portante de uniform idad en pruebas de rendi­ m iento porque cada m uestra sigue la m ism a trayectoria de reacción. E l flujo continu o tam bién ayuda al laboratorio que necesita ejecutar m uchas m uestras que requieren el

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

m ism o procedim iento. Los analizadores de flujo continuo m ás com plejos em pleaban canales sim ples paralelos para ejecutar pruebas m últiples en cada m uestra; por ejem plo, SMA y SMAC. Las desventajas principales que contribu ­ yeron a la desaparición final de los analizadores de flujo continu o tradicionales (es decir, AA, SMA y SM AC) en el mercado fueron los problem as im portantes de acarreo y el despilfarro de reactivos en flujo continuo. La respuesta de Technicon a estos problem as fue un analizador discreto de flujo no continu o (el R A 1 0 0 0 ), que usa fluido de acceso aleatorio (u n líquido de hidrocarburo para reducir la ten­ sión de superficie entre m uestras o reactivos y su tubería) y, por tanto, reduce el acarreo. D espués, Technicon desarro­ lló el Chem 1 en el que se em plea tubería y aceite de teflón, con lo cual se elim inan los problem as de acarreo. E l Chem 1 es un analizador de flujo continu o pero com parable sólo rem otam ente con el principio de flujo continu o original. E l análisis centrífugo em plea la fuerza que genera la centrifu gación para transferir y después con ten er líquidos en cubetas separadas para m ed ición en el perím etro de un rotor giratorio. Los analizadores centrífugos tien en m ayor capacidad para ejecutar m uestras m últiples, una prueba a la vez, en un lote. E l análisis por lotes es su principal venta­ ja porque las reacciones en la cubetas se leen casi al m ism o tiem po, y no lleva más tiem po correr u n rotor com pleto de casi 3 0 m uestras que lo que llevaría correr unas cuantas. L os laboratorios co n una carga de trabajo alta de pruebas individuales para análisis de rutina por lotes pueden usar estos instrum entos. De nuevo, cada cubeta debe tener una correspondencia uniform e con las demás para m antener el m anejo de calidad de cada m uestra. E l analizador CobasBio (R o ch e D iagnostics), con una lám para de destello de x en ó n y cubetas longitud inales ,6 y el IL M onarch, con un diseño de uso fácil com pletam ente integrado, son dos de los analizadores centrífugos m ás exitosos. El análisis discreto es la separación de cada m uestra y reactivos adicionales en un recip iente separado. Los anali­ zadores discretos tienen la capacidad de ejecu tar pruebas m últiples co n una m uestra a la vez o varias con una prue­ ba a la vez. Son los analizadores más populares y versátiles y han reem plazado casi por com pleto a los analizadores centrífugos y de flujo continu o. Sin em bargo, debido a que cada m uestra está en un recip iente de reacción separado, la uniform idad de la calidad se debe m antener en cada cubeta para que la calidad de una determ inada m uestra no sea vea afectada por el espacio particular que ocupa. La lista de analizadores del cuadro 5 -1 son ejem plos de ana­ lizadores discretos de corriente con capacidad de acceso aleatorio.

PASOS DEL ANÁLISIS AUTOM ATIZADO E n el análisis clínico, la autom atización es la m ecanización de los pasos en u n procedim iento. Los fabricantes dise­ ñan sus instrum entos para im itar técnicas m anuales. Los pasos principales en un proced im iento se pueden listar com o sigue: • Preparación e identificación de la m uestra • M ed ición de la m uestra y entrega

• • • •

127

Sistem as de reactivos y entrega F ase de reacción quím ica Fase de m ed ición P rocesam iento de señal y m anejo de datos

Cada paso del análisis autom atizado se explica en esta secció n y se analizan varias aplicaciones. Se han elegi­ do varios instrum entos porque tien en com ponentes que representan ya sea características com unes em pleadas en la instru m entación quím ica o un m étodo ú n ico de auto­ m atizar un paso en un procedim iento. N inguno de los in s­ trum entos representativos se describe por com pleto, sino más b ien los com ponentes im portantes se presentan en el texto com o ejem plos.

Preparación e identificación de la m uestra La preparación de la m uestra para análisis ha sido y es u n proceso m anual en la m ayor parte de los laboratorios. E l tiem po de coagu lación (si se utiliza su ero), la cen tri­ fu gación y la transferencia de la m uestra a una taza del analizador (a m enos que se use m uestreo de tipo prim a­ rio) cau san retraso y gasto en el p roceso de prueba. Una alternativa a la preparación m anual es autom atizar este proceso m ediante la robótica, o autom atización frontal, para “m an ejar” la m uestra por estos pasos y cargarla en el analizador. O tra op ción es evitar por com pleto la prepa­ ración de la m uestra m ediante el uso de sangre com pleta para el análisis; por ejem plo, A bbott-V ision. La robótica para la preparación de la m uestra ya es una realidad en varios laboratorios clínico s en E stados U nid os y algunos países. O tro m étodo es usar u n tubo separador de plasm a y llevar a cabo el m uestreo de tubo prim ario co n plasm a heparinizado. E sto elim ina la necesid ad de esperar a que se coagule la m uestra y tom ar alícuotas. Más adelante en este capítulo se am plía la exp licació n acerca del pro ce­ sam iento p reanalítico de la m uestra, o autom atización frontal. La m u estra se debe id en tificar de m anera apropiada y su u b ica ció n en el analizador se debe m o n ito rear en toda la prueba. E l m edio m ás sim p le de id en tificar una m u estra es co lo ca r una taza de m u estra m arcada de for­ m a m an u al en u n a p o sició n de análisis num erada en el analizador, de acuerdo con una h o ja de trabajo preparada a m ano o una lista de carga generada por com putadora. El m étod o m ás co m p lejo que se usa p o r lo com ú n en la actu alid ad em plea u n código de barras fijo en el tubo de re c o le cc ió n prim ario. Esta etiq u eta co n tien e datos d em o­ gráficos del p acien te y tam b ién puede in clu ir p eticio n es de prueba. Los tubos m arcados co n código de barras se transfie­ ren a la zona de carga del analizador, donde se explora el código y la inform ación se alm acena en la m em oria de la com putadora. E l analizador es en ton ces capaz de m onitorear las fu nciones de identificación, órdenes de prueba y parám etros y la po sició n de la m uestra. C iertos anali­ zadores pueden tom ar peticiones de prueba, descargadas del sistem a de inform ación del laboratorio y ejecutarlas cuando la m uestra apropiada sea identificada y esté lista para ser pipeteada.

128

CUADRO 5-1. RESUMEN DE LAS CARACTERÍSTICAS PARA ANALIZADORES DE QUÍMICA CLÍNICA SELECCIONADOS BAYER

BECKMAN COULTER

DADE BEHRING

OLYM PUS

ORTHO-CLIN ICAL

DIAGNOSTICS

A D V IA

SYNCHRON

DIMENSION

A M ERICA

DIAGN OSTICS

ROCHE CO BAS

M ODULAR AN ALYTICS

VEN DED O R

A ER O SET

1650

LX20 PRO

RXL

A U 640

V ITRO S 950

INTEGRA 800

P M O DULE

Vendido primero en EUA

1998

1999

2001

1997

2002

1995

2001

1998

600-1200 360-540

288-500

800

600-700

472-708

600-1200

Rendimiento (pruebas/h, de­ pende de la mezcla de prueba)

1600

ROCHE DIAGN O STICS

49

41/71

48/95

51

75

72

47

Canales abiertos

100

62

41/71

10

95

Sistema cerrado

Canales de instalación disponibles

5

Canales de electrodo selectivo de iones

3

3

5

4

3

3

4

3

Volumen de muestra mínimo aspirado

2 |xL

2 |xL

3 |xL

2 |xL

1 |xL

6 pl

2 (cL

2 nL

Volumen muerto de taza de muestra pediátrica

50 pcL

50 |xL

40 |xL

20 |xL

No disponible 30 |j,L

50 n i

50 |xL

Perforación de la tapa de tubo primario

No

No

Yes

No

No

No

No

No

Volumen de reacción final mínimo

160 |a L

80 |xL

210 |xL

350 |a L

150 |xL

No aplicable

200 |xL

180 nL

Detección corta de muestra

















Detección de coágulo

No













No

Mediciones de índice







No



No

No



Dilución automática de muestra del paciente y repetición de la prueba











No





Inventario autom ático de prueba a bordo

















Solución de problemas remota m ediante módem

No









No





Información obtenida de Aller RD. Chemistry analyzers branching out. CA P Today 2002; julio: 84-106(34) y directamente de los vendedores.

CLÍNICA

59

DE LA QUÍMICA

Ensayos a bordo al mismo tiempo

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA

ABBOTT

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

FIGURA 5-2. Vitros. Las cuatro bandejas de cuadrante, cada una con diez muestras, ajustan en un portador de bandeja. (Fotografía cortesía de Ortho-Clinical Dlagnostics.)

M edición de la m uestra y entrega La m ayor parte de los instrum entos em plean carruseles circulares o rejillas rectangulares com o contenedores de m uestras para sujetar tazas de m uestra desechables o tubos de m uestra prim arios en la zona de carga o pipeteo del ana­ lizador. Estas tazas o tubos contienen estándares, con tro­ les y m uestras del paciente que serán pipeteados hacia las cám aras de reacción de los analizadores. Las ranuras en las bandejas o rejillas por lo com ún están num eradas para ayu­ dar en la identificación de la muestra. Las bandejas o rejillas se m ueven de form a autom ática en etapas de una p osición a velocidades preseleccionadas. La velocidad determ ina el núm ero de m uestras que se analizarán por hora. Com o una conveniencia, el instrum ento puede determ inar el núm e­ ro de ranura que contiene la últim a m uestra y term inar el análisis después de esa m uestra. E l m icroprocesador de la m uestra retiene en la m em oria el núm ero de m uestras y aspira sólo en las posiciones que con tienen muestras. E n el analizador Vitros, las bandejas de tazas de m ues­ tra son cuadrantes que sostienen 10 muestras cada una en tazas con fondos cónicos. Los cuatro cuadrantes ajustan en

FIGURA 5-3.

Rejilla de 5 lugares Roche/HItachl.

129

un portador de bandeja (fig. 5 -2 ). Aunque el portador de bandeja acomoda sólo 4 0 muestras, se pueden programar más bandejas de muestras y después ser cargadas en lugar de bandejas completadas m ientras las pruebas en otras ban­ dejas están en progreso. Una punta de m uestra desechable se carga a mano adyacente a cada taza de m uestra en la bandeja. Los analizadores Roche/Hitachi pueden usar rejillas de cinco posiciones para sujetar las muestras (fig. 5 -3 ). U n analizador m odular puede acom odar hasta 6 0 de estas rejillas a la vez. E n los analizadores centrífugos, la carga de las m uestras y reactivos se lleva a cabo pipeteando el líquido apropiado en un rotor con 2 0 o más posiciones. Cada p o sició n co n ­ tiene un com partim iento de m uestra, un com partim iento de reactivo y una cubeta localizada en la periferia del rotor (fig. 5 -4 ). E l Param ax perm ite m uestrear de los tubos de recolec­ ció n prim arios, o para m uestras lim itadas, hay tubos de m icrom uestra. Los tubos se co lo can en una bandeja circu ­ lar que con tiene 9 6 m uestras a la vez. Las etiquetas de cód i­ go de barras para cada m uestra, que in clu y en el nom bre y núm ero de identificación del pacien te, se pueden im pri­ m ir a p etición del operador (fig. 5 -5 ). E sto perm ite que las m uestras sean cargadas en cu alquier orden. E l carru­ sel de carga sum inistra los tubos a un o de transferencia, a partir del cual ocurre el m uestreo, y luego las m uestras son transferidas a u n carrusel sin carga (fig. 5 -6 ). Tanto el analizador Param ax com o el D im ensión hacen uso de una banda con tinu a de cubetas desechables de plástico, flexi­ bles, llevadas por el baño de agua del analizador en una pista de con d u cció n principal. Las cubetas se cargan en el analizador desde u n con ju n to rotor continu o. Estas cu be­ tas pasan por el instrum ento a una tasa de una cada 5 seg, y se cortan en seccion es o grupos según se requiere. E n la figura 5 -7 se muestra un esquema del sistem a de producción

FIGURA 5-4.

Rotor de analizador centrífugo.

130

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

FIGURA 5-5. Paramax. Los tubos de recolección de muestra se identifican con etiquetas de código de barras. (Fotografía cortesía de Dade International.)

y lectura de cubetas D im ensión RxL. La exposición de la m uestra al aire puede causar la evaporación de ésta y pro­ ducir errores en el análisis. La evaporación de la m uestra podría ser im portante y originar que la con cen tració n de los constitu yentes que se analizan aum ente 50% en cuatro h oras .7 C on los instrum entos que m id en electrólitos, el dióxido de carbono presente en la m uestra se pierde hacia la atm ósfera, lo que da com o resultado valores b ajos de d ióxido de carbono. Los fabricantes han diseñado diversos m ecanism os para reducir este efecto; por ejem plo, cubier­ tas para bandejas y tapas individuales que pueden ser per­ foradas, que inclu ye muestreo en tubo cerrado de tubos de reco lecció n prim arios .8 La m ed ición real de cada alícuota para cada prueba debe ser m uy exacta. E sto se hace en general a través de la aspiración de la m uestra en una sonda. Cuando el in s­ trum ento discreto está en operación, la sonda se sum erge de form a autom ática en cada taza de m uestra y aspira una porción del líquido. D espués de u n intervalo de tiem po preestablecido, controlado por la com putadora, la sonda sube rápidam ente desde la taza. Las sondas de m uestreo en los instrum entos que usan tazas de m uestreo esp ecí­ ficas se program an o aju stan para alcanzar una profun­ didad prescrita en esas tazas a fin de m axim izar el uso de m uestra disponible. Los analizadores capaces de aspirar la m uestra desde tubos de re co lecció n prim arios norm al­ m ente tien en una sonda paralela sen sible al nivel del líq u i­ do que controlará la entrada de la sonda de m uestreo hasta una trayectoria m ínim a debajo de la superficie del suero, perm itiendo la aspiración com pleta de la alícuota al m is­ m o tiem po que se evita el taponam iento de la sonda con gel separador de suero o la coagu lación (fig. 5 -8 ). E n los analizadores de flujo con tin u o, cuando la sonda de m uestra sube desde la taza, el aire es aspirado durante un tiem po específico para producir una burbuja entre los tapones de líquido de m uestra y reactivo. Luego, la sonda desciende hacia u n recipiente donde se extrae d isolución de lavado hacia la sonda y por el sistem a. Por lo general, la d isolu ción de lavado es agua desionizada, posiblem en­ te con un tensoactivo añadido. Ya que todas las m uestras

FIGURA 5-6. Paramax. El carrusel de carga distribuye tubos a uno de transferencia, del cual ocurre el muestreo, y después las muestras son transferidas a un carrusel de descarga. (Fotografía cortesía de Dade International.)

siguen la m ism a trayectoria, la necesidad de contar con una d isolu ción de lavado entre éstas es evidente. La inm er­ sión de la sonda en el depósito de lavado lim pia el exterior, m ientras que la aspiración de una alícuota de solu ción lim ­ pia la abertura. E l depósito se reabastece de form a con ­ tinua con un exceso de d isolución nueva. La alícuota de lavado, más la burbuja de aire antes m encionada, m antiene la integridad de la m uestra y m inim iza el acarreo de ésta. Ciertos dispositivos de pipeteo em plean una punta desechable y una jerin g a con desplazam iento de aire para m edir y entregar reactivo. Cuando se em plea esto, se pue­ de reprogram ar el dispositivo de pipeteo a fin de m edir con facilidad m uestra y reactivo para lotes de pruebas distintas desde un punto de vista com parativo. Además de elim inar el esfuerzo de cebar el sistem a de entrega de reactivo con la nueva d isolu ción, ningún reactivo se desperdicia o co n ­ tam ina debido a que nada a excep ción de la punta de la pipeta entra en con tacto con él. La lim pieza de la sonda y la tubería después de cada des­ carga para reducir el acarreo de una m uestra a la siguiente es una preocu pación con m uchos instrum entos. E n algu­ nos sistem as, el reactivo o diluyente se dispersa tam bién en la cubeta por la m ism a tubería y sonda. Se puede sum i­ n istrar agua desionizada a la cu beta después de la m ues­ tra para producir una d ilución especificada de la m uestra y tam bién para enjuagar el sistem a de sum inistro. E n el analizador T echn icon (ahora, Bayer) R A 1 0 0 0 , un fluido de acceso aleatorio es el m edio de separación. E l fluido fluorocarbono es una sustancia viscosa, inerte, inm iscible, no m ojante, que cubre el sistem a de descarga. La capa en los lados del sistem a de descarga evita el acarreo debido al m ojado de las superficies y, al form ar u n tapón de la disolu ción entre m uestras, evita el acarreo por difusión. U na pequeña cantidad (1 0 pl) de este fluido se transfiere a la cubeta co n la m uestra. La ten sió n superficial deja un recubrim iento del fluido en el sistem a de transferencia. Si se em plea una soda o punta separada para cada m u es­ tra y se desecha después de usarla, com o en el analizador V itros, la cu estión del acarreo es debatible. V itros tiene un

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

Rueda de cubetas

Estación de sellado en U

Manómetro de presión Al recipiente de desecho de cubetas

Interruptor de presión Compresor de cubetas FIGURA 5-7.

Sistema de producción del analizador para cubetas selladas. (Fotografía cortesía de Dade Behring.;

FIGURA 5-8. Sondas de muestra dobles del analizador Hitachi 736. Note el sensor de nivel de líquido a la izquierda de las sondas. (Foto­ grafía cortesía de Boehringer Mannheim.)

131

132

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

sistem a ú n ico de distribución de m uestra. U na probóscide h ace presión en punta en la bandeja de m uestra, la levanta y se m ueve sobre la m uestra a fin de aspirar el volum en requerido para las pruebas program adas para esa m uestra. La punta se m ueve después sobre el bloque de m ed ición de placa. Cuando una placa está en p o sició n para recibir una alícuota, la probóscide se baja de m odo que una gota de 10 pl transferida toque la placa, donde es absorbida desde la punta no m ojante. U n ém bolo propulsado por un m otor paso a paso controla la aspiración y la form ación de gotas. La precisión de descarga se especifica en ± 5 % . E n varios sistem as discretos, la sonda está unida por m edio de una tubería no m ojante a jerin g a s de precisión. Las jerin g as extraen una cantidad específica de m uestra hacia la sonda y la tubería. Luego, la sonda se posiciona sobre una cu beta, en la que se descarga la m uestra. El analizador H itachi 7 3 6 utiliza dos sondas para aspirar de form a sim ultánea un volum en doble de m uestra en cada sonda sum ergida en u n recip iente de m uestra y, por tanto, entregarla en cuatro canales de prueba individuales, todo en un paso op eracional (fig. 5 -9 ). Las sondas cargadas pasan por un fino baño de niebla antes de la entrega para lavar cu alquier residuo de m uestra adherido a la superficie externa de las sondas. Después de la entrega, las sondas se m ueven a una estación de enjuague para lim piar las super­ ficies interna y externa de las sondas. La estación de llenado ACA Star (D ade) coloca las can ­ tidades apropiadas de m uestra y diluyente en cada paquete de prueba analítica. U na taza de m uestra llena en la b an ­ d eja de carga va seguida de los paquetes de prueba para las pruebas requeridas en la m uestra. Cuando se activa el sistem a, una lanzadera em puja a la izquierda la prim era taza de m uestra a la po sició n de m uestreo. M ientras la m uestra se m ueve a la izquierda, u n im pulsor de paquete accionad o por resorte em puja el prim er paquete de pru e­ ba sobre el riel de la estación de llenado debajo de una placa decodificadora. E l decodificador detecta el código binario en la parte superior del paquete de prueba. Este código, cuando se traduce, proporciona in stru ccion es al instrum ento, inclu so el volum en de m uestra, tipo de dilu­ yente y características de m anejo especiales. Por la b o m ­ ba se hace pasar el diluyente que se usará para el m étodo p articular con la finalidad de purgar las líneas y la aguja antes de la adm isión de diluyente. La aguja se coloca sobre la taza de m uestra, se introduce y se aspira el volum en

adecuado de m uestra. La aguja sale de la taza y se m ueve a la derecha a una p o sició n sobre el paquete de prueba. La m uestra y el diluyente se inyectan en el paquete de prueba por una abertura especial de llenado de paquete. D espués que se llena el paquete, se enjuagan la aguja, la tubería y la bom ba. E l paquete de prueba se mueve sobre el sistem a de transporte. E l instrum ento transfiere tam bién el nú m e­ ro de esp ecificación de la m uestra del pacien te sobre el paquete al sistem a de p resentación de resultados. E l analizador Param ax em plea m otores de avance gra­ dual controlados por com putadora para m over las jerin g as de m uestreo y lavado. Cada 5 s, la sonda de m uestreo entra a un recip iente de m uestra, extrae el volu m en requerido, se m ueve a la cubeta y transfiere la alícuota con u n volu ­ m en de agua para lavar la sonda. E l volu m en de lavado se ajusta para producir el volum en de reacció n final. Si se excede el alcance de linealidad del proced im iento, el siste­ m a recupera el tubo de m uestra original, repite la prueba con u n cuarto del volu m en de m uestra original y calcula u n nuevo resultado tom ando en cuenta la dilución. La econom ía del tam año de m uestra es una consideración im portante en el desarrollo de procedim ientos autom atiza­ dos, pero las m etodologías tienen lim itaciones para m ante­ ner niveles de sensibilidad y especificidad apropiados. Los factores que gobiernan la m edición de m uestra y reactivo son interdependientes. E n general, si se reduce el tamaño de m uestra, entonces se deben reducir el tam año de la cube­ ta de reacción y el volum en de reacción final, o increm entar la concentración de reactivo para asegurar suficiente form a­ ción de color para lecturas fotom étricas exactas.

Sistem as de reactivos y entrega Los reactivos se pueden clasificar com o sistem as líquidos o secos para uso con analizadores autom atizados. Los reactivos líquidos se pueden com prar en recip ientes de volum en a granel o en paquetes de dosis unitarias com o una conveniencia para la prueba STAT en algunos anali­ zadores. Los reactivos secos se em pacan en varias formas. Pueden ser envasados com o polvo liofilizado, que requiere reco n stitu ció n con agua o una disolu ción am ortiguadora. A m enos que el fabricante provea el diluyente, la calidad del agua disponible en el laboratorio es im portante. Otros reactivos secos pueden estar en form a de tableta, com o los que se em plean en los analizadores ACA Star y Param ax.

FIGURA 5-9. Operación de muestreo del analizador Hitachi 736. (Cortesía de Boehringer Mannheim.)

Baño Recipiente de muestra

Canal 1

Canal 2

Canal 3

Canal 4

Baño de enjuague

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

E l analizador ACA Star tritura y disuelve las tabletas de reactivo en la bolsa de prueba plástica a bordo del instru­ m ento. E l analizador Param ax em plea una b ocin a ultra­ sónica para rom per y disolver la tableta en una cubeta de plástico llena de agua. U n tercer y ún ico tipo de reactivo seco es la p la ca de quím ica seca m ulticapas para el analiza­ dor Vitros. Estas placas tien en capas m icroscópicam ente delgadas de reactivos secos m ontadas en un soporte plás­ tico. Estas placas son casi del tam año de una estam pilla postal y no m uy gruesas. E l m anejo del reactivo varía según las capacidades del instrum ento y m etodologías. M u chos proced im ientos de prueba u san reactivos de trabajo sensibles de corta dura­ ción ; así, los analizadores contem poráneos em plean diver­ sas técnicas para conservarlos. Una técnica es m antener refrigerados los reactivos hasta el m om ento de usarlos y luego preincubarlos rápido a la tem peratura de reacción o alm acenarlos en un com partim iento refrigerado en el ana­ lizador que alim enta directam ente al área de distribución. O tro m edio de conservación es proveer los reactivos en form a de tableta seca y recon stitu irlos cuando se va a eje ­ cu tar la prueba. U na tercera es elaborar el reactivo en dos com ponentes estables que se com binarán en el m om ento de la reacción. Si se em plea este m étodo, el prim er com ­ ponente tam bién podría ser em pleado com o un diluyente para la m uestra. Los distintos fabricantes suelen usar com ­ binaciones de estas técnicas de m anejos de reactivos. Los reactivos tam bién deben ser transferidos y m edi­ dos con exactitud. M uchos instrum entos em plean reacti­ vos a granel para dism inuir la preparación y el cam bio de reactivos. Los instrum entos que no usan reactivos a granel em plean un empaquetado de reactivos único. En los anali­ zadores de flujo continuo, los reactivos y diluyentes se sum i­ nistran desde contenedores a granel en los que la tubería está suspendida. E l diámetro interno, o calibre, de la tubería gobierna la cantidad de líquido que será distribuido. Una bom ba de dosificación, ju n to con un múltiple, introduce, proporciona y bom bea de m anera continua y precisa líqui­ dos y burbujas de aire por el sistem a de flujo continuo. Para entregar los reactivos, m u ch os analizadores dis­ cretos em plean técnicas sim ilares a las usadas para m edir y entregar las m uestras. Las jerin g as, m ovidas m ediante u n m otor de avance gradual, pipetean los reactivos en recipientes de reacción. Las bom bas propulsadas por pis­ tón, conectadas m ediante tubería, tam bién pueden distri­ bu ir reactivos. O tra técnica para transferir reactivos a los recip ientes de reacción em plea frascos de reactivos presurizados conectad os m ediante tubería a válvulas de dis­ tribu ción. La com putadora controla la apertura y cierre de las válvulas. E l volum en de llenado de reactivo en el recip iente de reacción se determ ina m ediante la cantidad precisa de tiem po que la válvula perm anece abierta. Los analizadores Vitros em plean placas para contener su sistem a com pleto de quím ica de reactivos. Las capas m últi­ ples en la placa van sobre un soporte de poliéster claro. La m ism a cubierta va entre soportes de plástico. Hay tres o más capas: a) una capa de dispersión, que acepta la m uestra; b) una o más capas centrales, que pueden alterar la alícuota y c) una capa de indicador, donde se puede cuantificar el

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analito de interés (fig. 5 -1 0 ). E l núm ero de capas varía en fu nción del ensayo por realizar. E l color que se form a en la capa del indicador varía con la con cen tració n del anali­ to en la m uestra. Las reacciones físicas o quím icas pueden ocurrir en una capa, donde el producto de estas reaccio­ nes avanza a otra capa en la que pueden ocu rrir reacciones posteriores. Cada capa puede ofrecer un am biente único y la posibilidad de llevar a cabo una reacción com parable a la ofrecida en un ensayo quím ico o podría prom over una actividad distinta por com pleto que no ocurre en la fase líquida. La capacidad para crear m últiples sitios de reac­ ción perm ite la posibilidad de m anejar y detectar com pues­ tos en form as no posibles en procedim ientos quím icos en disolución. Los m ateriales interferentes pueden quedar rezagados o alterados en las capas superiores. Los reactivos para los analizadores ACA están con te­ nidos en paquetes de prueba especiales, que son sobres de plástico divididos. U n paquete separado se usa para cada prueba llevada a cabo en una m uestra (fig. 5 -1 1 ). Los com partim entos a lo largo de la parte superior del sobre con tien en reactivos líquidos o en tableta. E l nom bre de clave y el código binario que ilustra la prueba están im pre­ sos en una barra de plástico en la parte superior de cada paquete de prueba. Todos los paquetes de prueba requ ie­ ren alm acenaje refrigerado.

Fase de reacción química Esta fase consiste en m ezclado, separación, in cu b ació n y tiem po de reacción . E n la m ayor parte de los analiza­ dores discretos, los reactivos quím icos se m antienen en

FIGURA 5-10. Placa Vitros con varias capas que contienen todo el sistema químico de reactivos. (Cortesía de Ortho-Clinical Diagnostics.)

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

cu betas de paso directo, y las lectu ras ópticas se tom an durante el flujo de fluidos reactivos. E l analizador Chem 1 em plea este m étodo co n su tubo de teflón de trayectoria analítica ún ica (fig. 5 -1 3 ).

M ezclado

FIGURA 5-11. ACA. Un paquete de prueba con código binario en una barra en la parte superior. (Fotografía cortesía de Dade Behring.)

recip ientes m óviles individuales que son desechables o reutilizables. E stos recipientes de reacción tam bién fu n­ cion an com o cubetas para análisis óptico. Si las cubetas son reutilizables, entonces se preparan las estaciones de lavado inm ediatam ente después de las estaciones de le c ­ tura para lim piar y secar estos recip ientes (fig. 5 -1 2 ). Esta configu ración perm ite al analizador operar de m anera co n ­ tinua sin reemplazar las cubetas. Ejem plos de este m étodo son los analizadores Advia (Bayer H ealth), Aeroset (A bbott Laboratories), H itachi (R o ch e D iag n o stics), AU (O lym ­ pus) y Synchron (B eckm an C oulter). Com o alternativa, los reactivos se pueden colocar en una cám ara de reacción estacionaria (co m o A stra), en la cual un proceso de flujo directo de la m ezcla de reacción ocurre antes y después de la lectu ra óptica. E n los sistem as de flujo con tin u o, se usan

FIGURA 5-12. Las estaciones de lavado en el analizador Hitachi llevan a cabo lo siguiente: a) aspirar el desecho de la reacción y dis­ tribuir el agua; b) aspirar y distribuir el agua de enjuague; c) aspirar agua de enjuague y distribuirla para la medición del blanco de celda; d) aspirar el agua del blanco de celda a sequedad. (Fotografía cortesía de Boehringer Mannheim.)

U n com ponen te vital de cada proced im iento es el m ezcla­ do adecuado de los reactivos y la m uestra. Los fabrican­ tes de instrum entos contem plan grandes distancias para asegurar el m ezclado com pleto. Las m ezclas no uniform es pueden producir ruido en el análisis de flujo con tin u o y p recisión deficiente en el análisis discreto. E l m ezclado se lleva a cabo en analizadores de flujo con tin u o (co m o el C hem 1) m ediante el uso de tubería en espiral. Cuando la corrien te de reactivo y m uestra pasan por las espiras, el líquido gira y cae en cada espira. La tasa diferencial de líquidos que caen entre sí produce el m ez­ clado en la espiral. E l R A I0 0 0 em plea una acción rápida de inicio-p aro de la bandeja de reacción. Esto causa una a cció n de b ailo­ teo contra las paredes de las cubetas, que m ezcla los com ­ ponentes. Los analizadores centrífugos pueden usar una secu encia de ro tació n inicio-p aro o bu rb u jear aire por la m uestra y el reactivo para m ezclarlos m ientras estas d iso­ lu cion es se m ueven del disco de transferencia al rotor. Este proceso de transferencia y m ezclado ocurre en sólo un os segundos. E l m ezclado se debe a la fuerza centrífuga, y ésta em puja la m uestra desde su com partim iento, sobre una partición en un com partim iento lleno de reactivo y, por últim o, hacia el espacio de la cubeta en el perím etro del rotor. E n la tecnología de placa V itros, la capa de dispersión provee una estructura que perm ite una d isem inación rápi­ da y uniform e de la m uestra sobre la capa o capas de reac­ tivo para la form ación uniform e de color. Los analizadores ACA tienen com ponentes diseñados en especial para el m ezclado: los m ezcladores-rom pedo­ res. Las platinas presionan de m anera selectiva y colapsan los com partim ientos de reactivo a lo largo de la parte supe­ rior del paquete de prueba, y de esta m anera se liberan los reactivos en el in terio r del paquete. M ientras tanto, una platina inferior presiona contra la porción del fondo de la envoltura del paquete de prueba para forzar los fluidos

FIGURA 5-13. Esquema general del sistema Technicon. Trayectoria analítica Chem 1 de tubo de teflón único. (Cortesía de Bayer.)

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUIMICA CLÍNICA

hacia los com partim ientos de reactivo rotos. Luego, con u n m ovim iento de golpeteo ligero el m ezclador-rom pedor m ezcla por com pleto los reactivos con los fluidos. E l analizador Param ax em plea ondas sonoras u ltrasóni­ cas durante 4 5 s para disolver las tabletas de reactivo en el agua desionizada en cada cubeta. E l ultrasonido se emplea tam bién para m ezclar la m uestra con los reactivos prepa­ rados antes y para mezclar, si es necesario, el contenid o de las cubetas después de una segunda ad ición de reactivo. Los analizadores H itachi utilizan paletas de agitación que se sum ergen en el recip iente de reacció n durante unos segundos para agitar la m uestra y los reactivos, después de lo cual vuelven al depósito de lavado (fig. 5 -1 4 ). O tros instrum entos, com o Astra, usan barras de agitación m ag­ néticas que yacen en el fondo del recip iente de reacción que, cuando se activan, producen un m ovim iento de rem o­ lino para mezclar. O tros em plean una distribución forzada para llevar a cabo el m ezclado.

S ep ara ción E n las reacciones quím icas, los constitu yentes indeseables que interfieren con el análisis pueden requerir ser separa­ dos de la m uestra antes de que otros reactivos sean introd u­ cidos al sistem a. Las proteínas causan m ayor interferencia en m u chos análisis. U n m étodo sin separar la proteín a es usar una relación reactivo a m uestra m uy alta (la m uestra está m uy diluida), de m odo que el espectrofotóm etro no detecta alguna turbidez a causa de la proteína precipitada. O tro m étodo es acortar el tiem po de reacció n para elim i­ nar los interferentes que reaccionan m ás lento. E n los sistem as de flujo continuo antiguos, un dializador era el módulo de separación o filtración. Éste llevaba a cabo el equivalente de los procedim ientos manuales de precipitación, centrifugación y filtración, por medio de una m em brana de celofán de poro fino. En la tecnología de placa Vitros, la capa de dispersión de la placa capta células, crista­ les y otra materia particulada pequeña, pero tam bién retiene m oléculas grandes, com o proteína. En esencia, lo que pasa por la capa de dispersión es un filtrado libre de proteína.

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M u chos analizadores discretos n o cu entan con una m etodología autom atizada m ediante la cual puedan sepa­ rar sustancias interferentes de la m ezcla de reacción. Por tanto, se han elegido m étodos que tien en pocas interferen­ cias o que tienen interferen cias conocid as que se pueden com pen sar m ediante el instrum ento (p. e j., usar fórm ulas de corrección ). E l uso de cromatografía de colum na automatizada en algu­ nos m étodos proporciona al ACA la capacidad de rem over de la m uestra sustancias que podrían afectar de m anera adversa la reacción. Se pueden usar tres tipos de colu m ­ nas: filtración en gel, intercam bio de iones y elim inación de proteína. La colum na se localiza en la parte superior del paquete de prueba, debajo del encabezado del paquete de plástico. Si el paquete con tien e una colum na crom a­ tográfica, la m uestra y la cantidad prescrita de diluyente se inyectan en el sitio de llenado de la colum na opuesto al sitio usual de llenado de m uestra y diluyente. La m ues­ tra se m ueve por la colum na m ediante la presión del dilu­ yente y hacia el paquete de prueba para análisis.

Incubación U n baño de calentam iento en los sistem as discretos o de flujo con tin u o m antiene la tem peratura requerida de la m ezcla de reacción y provee el retraso necesario para com ­ pletar el desarrollo de color. Los com ponentes principales del baño de calentam iento son el m edio de transferencia de calor (es decir, agua o aire), el elem ento de calenta­ m ien to y el term orregulador. U n term óm etro se ubica en el com partim iento de calentam iento del analizador y es m onitoreado m ediante la com putadora del sistem a. E n m u chos sistem as analizadores discretos, las m u lticubetas se in cu b an en un baño de agua m antenido por lo general a una tem peratura constan te de 37°C . La tecnología de placa incuba placas colorim étricas a 37°C . Hay una estación de acondicionam iento previo para llevar la tem peratura de cada placa cerca de 37 °C antes de que entre al incubador. E l incubador m ueve las placas a intervalos de 12 s, de tal m anera que cada placa está en la salida del incubador cuatro veces durante el tiem po de in cu ­ b ación de 5 m in. Esta característica se em plea para m éto­ dos de velocidad de dos puntos y perm ite que la prim era lectura puntual sea tomada en parte a través del tiem po de incubación. Las placas potenciom étricas se m antienen a 25°C . Las placas se m antienen a esta tem peratura durante 3 m in para asegurar estabilidad antes de la lectura.

Tiem po d e reacción

FIGURA 5-14. Paletas de agitación en el analizador Hitachi 736. (Fotografía cortesía de Boheringer Mannheim.)

A ntes que el espectrofotóm etro realice la lectu ra óptica, el tiem po de reacció n puede depender de la velocidad de transporte por el sistem a para la estación de “lectu ra”, las adiciones de reactivo programadas con cám aras de reac­ ció n m óviles o estacionarias, o una com bin ació n de am bos procesos. Es necesario m antener un am biente con d u cen ­ te para la term inación de la reacció n el tiem po suficiente antes de realizar el análisis esp ectrofotom étrico del pro­ ducto. E l tiem po es una lim itación definitiva. Para m ante­ ner la ventaja de análisis m últiples rápidos, el instrum ento debe producir resultados lo m ás pronto posible.

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

E s posible m onitorear no sólo la term inación de una reacción, sino tam bién la rapidez de la reacción . E l in s­ trum ento podría retardar la m ed ición durante u n tiem po predeterm inado o presentar las m ezclas de reacción para m ed ición a intervalos constan tes de tiem po. E l uso de reacciones de velocidad puede tener dos ventajas: se acor­ ta el tiem po de análisis total y se pueden anular los crom ógenos que reaccionan de m anera lenta. La velocidad de reacción se controla m ediante la tem peratura; por tanto, el reactivo, el tiem po y las fu nciones esp ectrofotom étricas se deben coord inar para que fu ncion en en arm onía co n la tem peratura elegida. E l ACA tiene cin co estaciones de retardo localizadas en el área de procesam iento de paquetes. E n estos puntos, el instrum ento no lleva a cabo operaciones en los paque­ tes. E ste intervalo perm ite un tiem po de reacción sufi­ ciente para alcanzar el punto final o que se com pleten las reacciones del blanco. Toda el área de procesam iento de paquetes se m antiene a 37 °C en u n am biente cerrado con ventiladores circulantes. E l Param ax tiene ocho estaciones fotom étricas lo cali­ zadas a lo largo de la pista de cubetas. La ad ición de la m uestra inicia cada reacción , que se m onitorea de 4 0 s a 10 m in m ediante las estaciones fotom étricas para reaccio­ nes de punto final o de velocidad. E l am biente de la cubeta se m antiene a tem peratura constan te m ediante un baño de agua en el que se m ueve la cubeta.

Fase de medición Después que se com pleta la reacción, se deben cuantificar los productos form ados. Casi todos los sistem as disponi­ bles para m ed ición han sido em pleados, com o fotom etría ultravioleta, fluorescente y fotom etría de flama; electrodos esp ecíficos de iones; contadores gam m a, y lum inóm etros. No obstante, el m ás com ún es la espectrom etría de luz visible y ultravioleta, aunque se han vuelto populares las adaptaciones de m ed ición de fluorescencia tradicional, com o la polarización de fluorescencia, quim iolu m iniscen cia y biolum iniscen cia. E l analizador A bbot AxSYM por ejem plo, es u n instrum ento popular para análisis de fárm acos que em plea polarización de fluorescencia para m edir reacciones de inm unoensayo. Los analizadores que m iden luz requieren un m onocro­ m ador para alcanzar la longitud de onda deseada del com ­ ponente. Por tradición, en los analizadores se han empleado filtros o ruedas de filtros para separar la luz. E n los autoanalizadores antiguos se usaban filtros que se colocaban de m anera m anual en la trayectoria de la luz. M uchos instru­ m entos aún utilizan ruedas con filtros giratorios que son controlados por m icroprocesadores de m odo que el filtro adecuado se coloque en la trayectoria de la luz. Sin em bar­ go los sistem as más nuevos y sofisticados ofrecen una m ayor resolución derivada de rejillas de difracción para lograr la separación de la luz en los colores que la com po­ nen. M uchos instrum entos en la actualidad em plean tales m onocrom adores con rejillas rotatorias m ecánicas o una rejilla fina que dispersa sus longitudes de onda com ponen­ tes sobre u n con ju n to fijo de fotodiodos; por ejem plo, los analizadores H itachi (fig. 5 -1 5 ). Esta últim a configuración

FIGURA 5-15. Fotómetro para al analizador Hitachi 736. La rejilla de difracción fija separa la luz en longitudes de onda específicas y las refleja en un sistema fijo de 11 fotodetectores específicos. El fotóme­ tro no tiene partes móviles. (Cortesía de Boehringer Mannheim.)

de rejilla, así com o las ruedas de filtros rotatorias, acom o­ da con facilidad análisis de luz policrom ática, que ofrecen sensibilidad y especificidad m ejoradas sobre la m edición m onocrom ática. Al registrar las lecturas ópticas a diferen­ tes longitudes de onda, la com putadora del instrum ento puede usar estos datos para corregir respecto a las interfe­ rencias de m ezcla de reacción que pudieran ocu rrir a longi­ tudes de onda adyacentes, así com o a la deseada. M u chos instrum entos más recientes em plean fibra óptica com o un m edio para transportar señales de luz des­ de estaciones de lectura rem otas de regreso a un detector m onocrom ad or central para análisis de estas señales. El Param ax tiene cables de fibra óptica, o “tuberías de lu z” com o suelen llam arse, conectados desde m últiples esta­ ciones rem otas donde residen las m ezclas de reacción, hasta una unidad detectora centralizada con rueda de fil­ tros que, ju n to con la com putadora, secu encia y analiza u n volu m en grande de señales de luz de m últiples reac­ ciones (fig. 5 -1 6 ). Los recipientes que contienen la m ezcla de reacción tam bién desem peñan u n papel vital en la fase de m edi­ ción. E l volu m en de reactivo y, por tanto, el tam año de la m uestra, la velocidad de análisis y la sensibilidad de la m ed ición son algunos aspectos que se ven afectados por el m étodo de análisis. Se em plea una cubeta de flujo directo en el análisis de flujo continu o. La corriente de reactivo b a jo análisis fluye de form a continu a por la tubería de cel­ das de flujo. E l C hem 1 “capta” las señales de absorbancia entre las burbujas de aire de la corriente en m ovim ien­ to (fig. 5 -1 7 ). Esto significa que no se requiere elim inar las burbujas com o en los analizadores antiguos de flujo continu o. A m edida que la corrien te fluye por la celda de flujo, se enfoca un haz de luz estable por la corriente. La cantidad de luz que sale de la celda de flujo la determ ina sobre todo la absorbancia de luz por parte de la corriente.

CAPITULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

FIGURA 5-16. Sistema fotoóptico de instrumento Paramax: (1) Fuente con reflector, (2) lente de enfoque fijo, (3) rueda de filtros, (4) motor de flecha doble, (5) haz óptico de fibra, (6) cubeta, (7), rueda de filtros, (8) tubo fotomultiplicador. (Cortesía de Dade International.)

La luz que sale choca con un fotodetector, que convierte la luz en energía eléctrica. Los filtros y los com ponentes que enfocan la luz perm iten que la longitud de onda desea­ da de la luz llegue al fotodetector. E l fotóm etro detecta en form a continu a el voltaje de salida del fotod etector de m uestra y, com o es el proceso en la m ayor parte de los ana­ lizadores, lo com para con u n voltaje de salida de referen­ cia. Los im pulsos eléctricos son enviados a u n dispositivo de lectura, com o una im presora o una com putadora, para alm acenam iento y recuperación. E n los analizadores discretos, com o los sistem as Hita­ chi, Synchron o ACA, la cubeta em pleada para el análisis es tam bién el recip iente de reacció n en el que ha ocurrido todo el procedim iento. E l fotóm etro ACA Star consta de un dispositivo que form a la cubeta y un sistem a fotom étrico para hacer las m ed iciones de absorbancia. Cuando se com prim e m edian­ te los dispositivos de su jeción del fotóm etro, el paquete de prueba form a una cubeta entre las ventanas de cuarzo. Se introd u ce una d isolu ción m ojante entre las ventanas de cuarzo y las paredes del paquete de prueba para lograr una buena interfase óptica. La m ed ición del análisis centrífugo ocurre m ientras el ro tor gira a una velocidad constan te de casi 1 0 0 0 rpm . Las lectu ras consecutivas se tom an de la m uestra, la corriente oscura (lecturas entre cubetas) y la cubeta de referencia.

Detector de burbuja

Colorimétrico

Nefelométrico

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Cada cubeta pasa por la fuen te de luz cada pocos m ilisegundos. D espués que se han determ inado los puntos de datos, se detiene la centrifugación y se im prim en los resultados. Se retira el rotor del analizador y se desecha. Para análisis de punto final, se m ide un a absorbancia in i­ cial antes de que los constituyentes hayan tenido tiem po de reaccionar, por lo general pocos segundos, y se co n si­ dera una m ed ición de blanco. D espués que ha transcu rri­ do tiem po suficiente para que se com plete la reacción, se tom a otra lectu ra de absorbancia. Para análisis de veloci­ dad, se m ide la absorbancia in icial y luego se perm ite un tiem po de retraso (prefijado en el in strum ento para cada análisis). Para cada ensayo, se determ inan varios puntos de datos a un intervalo de tiem po program ado. E l in stru ­ m ento m onitorea las m ediciones de absorban cia en cada punto de los datos y calcula el resultado. La tecnología de placa depende de la espectrofotom etría de reflectancia, a diferencia de la fotom etría de transm i­ tancia tradicional, para proveer un resultado cu antitati­ vo. La cantidad de crom ógeno en la capa del indicad or se lee después que pasa la luz por la capa de éste, se refleja desde el fondo de una capa que con tien e pigm ento (por lo general la capa de dispersión) y se regresa por la capa del indicador a u n detector de luz. Para determ inaciones colorim étricas, la fuente de luz es una lám para de tungs­ teno-halógeno. E l haz se cen tra sobre un a rueda de filtros que sostiene hasta och o filtros de interferen cia separados por un espacio oscuro. El haz se dirige a un ángulo de 45° hacia la superficie del fondo de la placa, y el fotodiodo de silicio detecta la p orción del haz que se refleja. Las lecturas se tom an para que la com putadora obtenga la densidad de reflectancia. Las tres señales registradas tom adas son a) la rueda de filtros que bloqu ea al haz, b) la reflectancia de una superficie blanca de referencia con el filtro progra­ m ado en el haz y c) la reflectancia de la placa con el filtro seleccionado en el haz (fig. 5 -1 8 ). D espués que se lee una placa, es lanzada hacia atrás en la d irección de la que provino, donde una puerta de tram ­ pa perm ite que b aje hacia u n cubo de basura. Si la lectura fue la prim era para una prueba de velocidad de dos pu n­ tos, la puerta de la tram pa perm anece cerrada, y la placa vuelve a entrar al incubador.

FIGURA 5-17. Detector de reacción en línea. Cubeta de paso directo para el analizador Chem 1. (Cortesía de Bayer.)

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

FIGURA 5-18. Componentes del sistema para hacer determinaciones colorimétricas con la tecnología de placa. (Cortesía de Ortho-Clinical Diagnostics.)

E l Advia Centaur (Bayer), un sistem a de inm u n oen sa­ yo de acceso aleatorio, autom atizado por com pleto (fig. 5 -1 9 ), em plea tecnología de quim iolu m iniscencia para análisis de reacción. E n los ensayos de q uim iolu m iniscen­ cia, la cu antificación de un analito se basa en la em isión de luz que resulta de una reacción q u ím ica .9 Los principios de los ensayos de quim iolu m iniscencia son sim ilares a los de radioinm unoensayo (R IA ), excepto que se em plea un éster de acridinio com o el trazador, y las partículas param agnéticas com o la fase sólida. La m uestra, el trazador y el reactivo de partículas param agnéticas se agregan e in cu ­ ban en cubetas de plástico desechables, lo que depende del p rotocolo de ensayo. Después de la in cu b ació n , la sepa­ ración m agnética y el lavado de las partículas se llevan a cabo de m anera autom ática. Las cubetas son transportadas hacia una cám ara de lum inóm etro sellada a la luz, donde se añaden los reactivos para in iciar la reacción quim iolum iniscente. E n la in yección de los reactivos en la cubeta de m uestra, el lum inóm etro del sistem a detecta la señal quim iolu m iniscente. Los lum inóm etros son sim ilares a los contadores gam m a en que utilizan un detector de tubo

FIGURA 5-19. Sistema de quimioluminiscencia automatizado Advia Centaur. (Foto cortesía de Bayer Diagnostics.)

fotom ultiplicador; sin em bargo, a diferencia de los con ta­ dores gam m a, los lum inóm etros n o requieren u n cristal para convertir los rayos gamma a fotones de luz. Los fo to­ nes de luz de la m uestra se d etectan de m anera directa, son convertidos a im pulsos eléctricos y, luego, se cuentan.

Procesam iento de ia señal y m anejo de datos D ebido a que la m ayor parte de los instrum entos auto­ m atizados im prim en los resultados en form a de reporte, la calibración exacta es esencial para obtener inform ación exacta. Hay m uchas variables que pueden entrar en el uso de estándares de calibración. Las m atrices de los están­ dares y sustancias desconocidas pueden ser diferentes. D ependiendo de la m etodología, esto podría representar problem as o no. Si se em plean estándares secundarios para calibrar u n instrum ento, se deben con o cer los m éto­ dos em pleados para obtener los valores de los con stitu ­ yentes del estándar. Los estándares que con tien en m ás de un analito por vial pueden causar problem as de interferen­ cia. D ebido a que no hay estándares prim arios disponibles para las enzim as, se pueden usar estándares secundarios o factores de calib ració n con base en los coeficientes de extin ción m olares de los productos de las reacciones. M uchas veces, u n laboratorio tendrá más de un in s­ trum ento capaz de m edir el constituyente. A m enos que haya alcances norm ales diferentes pu blicad os para cada m étodo, los instrum entos se deben calibrar de m odo que los resultados sean com parables. La ventaja de calibrar un instrum ento autom atizado es la estabilidad a largo plazo de la curva estándar, que se requiere m onitorear sólo con controles todos los días. Algunos analizadores em plean estándares de b aja y alta con cen tració n en el com ienzo de cada ejecu ción , y luego usan las absorbancias de las reacciones de los estándares para producir de form a elec­ trónica una curva estándar para cada ejecu ción . O tros in s­ trum entos se calibran por sí m ism os después de analizar las d isolu cion es estándar.

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

E n los analizadores de flujo con tin u o originales se em pleaban seis estándares analizados al prin cipio de cada e jecu ció n para producir una curva de calib ració n para un lote particular. Ahora, los analizadores de flujo contin u o em plean un calibrador de nivel ún ico para calibrar cada e jecu ció n con el uso de agua para establecer la línea base. E l analizador centrífugo emplea estándares pipeteados en cubetas designadas en cada ejecución para análisis de punto final. Después que se ha obtenido la absorbancia del­ ta de cada muestra, la com putadora calcula los resultados m ediante la determ inación de una constante para cada están­ dar. Las constantes se obtienen al dividir la concentración del estándar (preintroducida en la com putadora) entre la absorbancia delta y promediar las constantes para cada uno de los estándares para obtener un factor. La concentración de cada control e incógnita se determ ina m ultiplicando la absorbancia delta de la incógnita por el factor. Si la concen­ tración de una incógnita excede el alcance de los estándares, el resultado se imprime con una bandera. La actividad de la enzim a se obtiene m ediante un ajuste de regresión lineal de la absorbancia delta en función del tiem po. La pendiente de la recta producida se m ultiplica por el factor de enzima (preintroducido) para calcular la actividad. La tecnología de placa necesita cálculos más avanzados para producir resultados. Los m ateriales de calibración requieren una m atriz de proteínas debido a la necesidad de que los calibradores se com porten com o suero al reaccio­ nar con las distintas capas de las placas. Los líquidos cali­ bradores se basan en suero de bovino, y la con cen tració n de cada analito se determ ina m ediante m étodos de refe­ rencia. Las pruebas de pu nto final precisan tres líquidos calibradores, las pruebas que requieren b lanco necesitan cuatro líquidos calibradores y los m étodos enzim áticos tres calibradores. Las pruebas colorim étricas em plean ajuste de ranura para producir la estandarización. E n el análisis de enzim as, u n algoritm o de aju ste de curvas estim a el cam bio en la densidad de reflexión por unidad de tiem po. E sto se convierte en absorbancia o cam bio de densidad de transm isión por unidad de tiem po. Luego, una ecuación cuadrática convierte el cam bio en la densidad de transm i­ sió n a actividad de volum en (U/L) para cada ensayo. E l ACA Star retiene las calibraciones para cada lote de un m étodo particular hasta que el laboratorista program a el instrum ento para recalibración. La calibración del in s­ trum ento se inicia o com prueba m ediante el análisis de un m ínim o de tres niveles de estándares prim arios o, en el caso de enzim as, m uestras de referencia. Los valores obte­ nidos se com paran con las con centracio n es conocid as por m edio de la regresión lineal, con el eje x que representa los valores esperados y el e je y la m edia de los valores ob ten i­ dos. La pendiente (factor de escala) y la ordenada al origen (co m p ensació n) son los parám etros aju stables en el ACA. E n los prim eros m odelos de este instrum ento, el opera­ dor determ inaba e introducía los parám etros de m anera m anual a la com putadora del instrum ento; sin em bargo, en los m odelos posteriores m ás autom atizados, el in stru ­ m ento lleva a cabo la calibración en form a autom ática a solicitu d del operador. D espués que se lleva a cabo la calib ració n y están en progreso o se com pletan los aná­

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lisis quím icos o eléctricos de la m uestra, la com putadora del instrum ento pasa al m odo de ad qu isición de datos y cálculo. Quizá se requiera prom ediar la señal proceso, lo que im plicaría cien tos de im pulsos de datos por segundo, com o con el analizador centrífu go, y fórm ulas de supre­ sión y correcció n para interferentes que son program adas en la com putadora para el cálculo de resultados. Los instrum entos autom atizados avanzados tienen algún m étodo para reportar los resultados im presos con un vínculo para identificación de la m uestra. E n los sistem as com plejos, la inform ación dem ográfica de la m uestra se introduce en la com putadora del instrum ento ju n to con las pruebas requeridas. Después, se im prim e la identificación de la m uestra con los resultados de prueba. E l Param ax im prim e etiquetas de código de barras para la identifica­ ción de la m uestra después que el operador introduce la inform ación del paciente y las pruebas requeridas en la ter­ m inal de la com putadora. Cuando se aplica la etiqueta a la m uestra, está se puede cargar en el analizador. Los m icroprocesadores controlan las pruebas, reactivos y el tiem ­ po, m ientras se com prueba el código de barras para cada m uestra. Éste es el vínculo entre los resultados reportados y la identificación de la m uestra. Incluso el más sim ple de los sistem as num era de form a secu encial los resultados de prueba para proveer una con exió n con las m uestras. D ebido a que en la actualidad la m ayor parte de los in s­ trum entos tiene integrado o ad ju nto u n m o nito r de video, los program as de software avanzados que vienen co n el instrum ento se pueden m ostrar para determ inar el estado de los diferentes aspectos de los procesos de análisis. E l m onitoreo com putadorizado está disponible para parám e­ tros com o la linealidad de la reacció n y el instrum ento, datos de con trol de calidad co n varias op cion es para pre­ sen tació n estadística e interpretación, d etección corta de m uestra co n banderas en la im presión, resultados anor­ m ales del paciente indicados con banderas, d etección de coágulos, tem peratura del recip iente de reacción o cám ara de prueba e inventarios de reactivo. La im presora tam bién puede m ostrar los resultados del paciente, así com o varias advertencias m encionadas antes. La m ayor parte de los fabricantes de instrum entos ofrecen softw are de com puta­ dora para programas y algoritmos de mantenim iento preven­ tivo para so lu ció n de problem as de d iagnóstico. Algunos fabricantes instalan m ódem s de teléfono en el analizador para tener un enlace de com u nicación directa entre el in s­ tru m ento y el centro de servicio para solu ción de proble­ m as instantánea y diagnóstico de problem as.

SELECCIÓN DE ANALIZADORES AUTOM ATIZADOS Cada enfoque del fabricante para la autom atización es úni­ co. Los instrum entos que son evaluados se deben calificar de acuerdo con las necesidades identificadas antes. U n labo­ ratorio podría requerir el analizador STAT, m ientras que otro tal vez necesite un analizador por lotes para volúm enes de alta concentración. Al considerar el costo hay que con­ siderar el precio del instrum ento y, lo más im portante, el costo total de consum ibles. E l alto costo de capital de un

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

instrum ento puede ser pequeño en realidad cuando se divi­ de entre un gran núm ero de m uestras que serán procesadas. Tam bién es im portante calcular el costo total por prueba para cada instrum ento que se considera. Además, un análi­ sis de punto de equilibrio para estudiar la relación de costos fijos, costos variables y ganancias puede ser útil al analizar la ju stificación financiera y el im pacto económ ico en un laboratorio. Por supuesto, el m odo de adquisición, es decir, com pra, arrendam iento, etcétera, se debe tener en cuenta en el análisis. E l costo variable de consum ibles se increm enta a medida que se llevan a cabo más pruebas o se analizan más muestras. La capacidad para usar reactivos producidos por más de un proveedor (sistem as de reactivo abiertos contra cerrados) puede dar a un laboratorio la posibilidad de per­ sonalizar la prueba y, tal vez, ahorrar dinero. El com ponente de trabajo se debe evaluar tam bién. Los instrum entos más antiguos pueden tener asignadas las unidades de registro de carga de trabajo del CAP; esto provee una base excelente para com paración, por medio de estudios de m ovim iento en el tiem po. D esafortunadam ente, los instrum entos más recientes en el mercado quizá no hayan sido regulados para trabajo y, por tanto, este ju icio podría ser más subjetivo de lo deseado. Con el gran núm ero de instrum entos disponi­ bles en el m ercado, el objetivo es encontrar el instrum ento correcto para cada situación .10 O tra consideración im portante en relación con la selec­ ción de un instrum ento son sus capacidades analíticas. ¿Cuáles son las características de desempeño del instru­ m ento para exactitud, precisión, linealidad, especificidad y sensibilidad (que pueden ser dependientes del m étod o ), estabilidad de la calibración y estabilidad de los reactivos (vida de anaquel y de abordo o reconstituidos)? La m ejor form a de com probar estas características de desempeño de un analizador antes de tom ar una decisión acerca del ins­ trum ento es tenerlo en operación. De m anera ideal, si un fabricante pone a prueba un instrum ento en el laboratorio del posible comprador, entonces se puede evaluar su desem ­ peño analítico para la satisfacción del cliente con estudios para com probar la exactitud, precisión y linealidad. Al m is­ m o tiem po, el personal del laboratorio puede observar las características de diseño com o m enús de prueba, capacidad real de independencia, facilidad de uso, y el espacio que el instrum ento y sus consum ibles ocupan en el laboratorio. La instrum entación de quím ica clínica provee velocidad y precisión para los ensayos que de otro m odo se lleva­ rían a cabo de forma manual. Las m etodologías elegidas y la adhesión a los requisitos del ensayo proveen exactitud. Nadie puede asum ir que el resultado producido es el valor correcto. Los m étodos automatizados se deben evaluar por com pleto antes de ser aceptados com o rutina. Es im portan­ te entender cóm o funciona en realidad cada instrum ento.

AUTOMATIZACIÓN TOTAL DEL LABORATORIO11 Las presiones de la reform a de aten ción de la salud y la aten ción adm inistrada han causado interés creciente en m ejo rar la productividad de las fases preanalítica y posanalítica del análisis de laboratorio. E n cu anto al proce­ so analítico en sí, los analizadores de rutina en quím ica clín ica tien en en la actualidad casi toda la m ecanización

que necesitan. La siguiente generación de autom atización reproducirá la práctica jap on esa de laboratorios de “caja negra”, en los que la m uestra entra en un extrem o y por el otro sale el resultado im preso .12 Se ha dedicado m ucho esfuerzo durante la década pasada en el desarrollo de alim entación “frontal” autom atizada de la m uestra en la “c a ja ” analítica, y el m an ejo autom atizado y com putadorizado de los datos que salen de la caja. Ha habido m u chos avances en las tres fases del proceso de prueba de labo­ ratorio; es decir, preanalítica (procesam iento de la m ues­ tra), analítica (análisis quím ico) y posanalítica (m an ejo de d atos) a medida que se fusionan en el sistem a integrado de autom atización total del laboratorio (A T L ). Los vendedores de equipo de autom atización están desarrollando com p o­ nen tes de arquitectura abierta que proveen m ás flex ibili­ dad en la e jecu ció n de la autom atización .13

Fase preanalítica (procesamiento de la muestra) E l protocolo de m anejo de la m uestra disponible en la actu a­ lidad en los principales analizadores de quím ica es usar el tubo de recolección de m uestra original (m uestreo de tubo prim ario) de cualquier tam año (después de la separación del plasm a o el suero) com o la taza de m uestra en el anali­ zador y lectores de código de barras, tam bién en el analiza­ dor, para identificar la m uestra. U n proceso autom atizado está reem plazando poco a poco el m anejo m anual y la pre­ sen tación de la m uestra al analizador. Increm entar la efi­ cien cia m ientras se reducen los costos ha sido un im pulso im portante para que los laboratorios com ien cen a integrar algún aspecto de la autom atización total del laboratorio en sus operaciones. Desde un punto de vista conceptual, la ATL se refiere a dispositivos autom atizados y robots inte­ grados con los analizadores existentes para llevar a cabo todas las fases del análisis de laboratorio. A la fecha se ha prestado más atención al desarrollo de los sistem as fronta­ les que pueden identificar y m arcar las m uestras, cen trifu ­ garlas y preparar alícuotas, y clasificar y entregar m uestras al analizador o para alm acen aje .14 Los sistem as de extre­ m o posterior pueden inclu ir la elim inación de m uestras del analizador y transporte para alm acen aje, recuperación desde el alm acenaje para repetir el análisis, tom ar nuevas alícuotas o elim inación, así com o el m anejo com pleto de los datos del analizador y la in teracción con el sistem a de inform ación del laboratorio (SIL). E l Dr. Sasaki y colaboradores instalaron el prim er labo­ ratorio clín ico por com pleto autom atizado en el m undo en la escuela m édica de K oshi en Ja p ó n 15; desde en tonces, el concepto se ha vuelto de m anera gradual y constan te una realidad en Estados U nidos. La U niversidad de N ebraska y la de Virginia han sido pioneras para el desarrollo del sistem a ATL. E n 1 9 9 2 , se desarrolló en la Universidad de N ebraska un prototipo de plataform a de autom atiza­ ció n del laboratorio, donde los com ponentes clave son u n sistem a de transporte, m uestras con código de barras y un paquete de softw are de com putadora para controlar el m ovim iento de la m uestra y el segu im iento, y la coor­ d inación de robots co n los instrum entos com o celdas de tra b a jo .16 A lgunos de los prim eros laboratorios autom a­

CAPITULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

tizados en Estados U nidos han inform ado sus experien­ cias con la autom atización frontal con una gran cantidad de in form ació n para los interesados en la tecn olog ía .1718 E l prim er hospital de laboratorio en instalar un sistem a autom atizado fue el hospital de la Universidad de Virginia en C harlottesville en 1 9 95 . Su C entro de Investigación de A u tom atización M édica cooperó con Jo h n so n & Jo h n so n y C oulter C orporation para usar u n Vitros 9 5 0 conectado a u n carril “U ” Coulter/IDS para m uestreo directo de un transportador de m uestra sin usar robótica interm ed ia .19 E l prim er sistem a llave en m ano disponible a nivel com er­ cial fue el Clinical Laboratory Automation System (CLA S) (Boehringer-M annheim D iagnostics; ahora, R oche Diag­ n o stics). É ste acopla la lín ea de analizadores H itachi con un sistem a de banda transportadora para proveer u n siste­ m a com pletam ente operacional con las interfaces .20 La robótica y la autom atización frontal están cam bian­ do la fisonom ía del laboratorio c lín ico .21 G ran parte del beneficio derivable de la ATL se puede com prender sólo m ediante la autom atización frontal. La planificación, eje ­ cu ción y evaluación del desem peño de un sistem a de trans­ porte y clasificación autom atizado en un laboratorio de referencia grande han sido descritas en detalle .22’23 Varios fabricantes de instrum entos trabajan en la actualidad en dispositivos frontales de interfaz, o ya los com ercializan, ju n to con softw are para sus propios analizadores de quím i­ ca. Jo h n s o n & Jo h n so n in trod u jo el sistem a V itros 9 5 0 AT (A utom ation Technology) en 1 9 9 5 con un diseño de arqui­ tectu ra abierta para perm itir a los laboratorios seleccionar de m u chos sistem as de autom atización frontales en vez de estar encerrados en una interfaz de propietario. Ahora está disponible una interfaz Lab-Track en el D im ensión R xL de Dade B ehring C hem istry System s que es com patible con los principales vendedores de autom atización y perm ite el m uestreo directo desde un sistem a de pistas. Tam bién, en la actualidad existe tecnología para que los separadores m icrocentrífugos sean integrados en los analizadores de quím ica clín ica .24 Otros cuantos sistem as están ahora en el m ercado, inclu so el sistem a Advia L abC ell, que em plea un enfoque m odular para la autom atización. E l Pow er Processor Core System (B eckm an C oulter) lleva a cabo clasi­ ficación, centrifu gación y elim in ación de tapas. E l enG en Series A utom ation System (O rth o -C lin ical D iagnostics) provee clasificación, centrifugación, elim inación de tapas y fu nciones de alm acenam iento de la m uestra e interfaz de form a directa con u n analizador V itros 9 5 0 AT. E stán dis­ p onibles tres sistem as de autom atización de O lym pus que pueden efectuar clasificación, centrifu gación, elim inación de tapas, tom a de alícuotas y capacidades de interfaz direc­ ta co n el instrum ento. E l G énesis F E 5 0 0 (Tecan) es un ejem plo de un sistem a frontal independiente que clasifica, centrifuga, retira tapas y tom a alícuotas. Algunos laborato­ rios han adoptado un enfoque m odular de extrem o en fase con dispositivos para sólo ciertas fu nciones autom atiza­ das. C iba-C ornin g C linical Laboratories instaló sistem as autóm atas en varios laboratorios regionales .19 Lo prim or­ dial es que la robótica y la autom atización frontal están aquí para perm anecer. Conform e m ás y m ás laboratorios clín ico s cam bian hacia la autom atización total del labo­

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ratorio, ellos están construyendo laboratorios n ú cleo que contienen todos sus analizadores autom atizados com o la prim era etapa necesaria para enlazar con m ás facilidad los distintos in strum entos en u n sistem a ATL .25

Fase analítica (análisis quím icos) Ha habido cam bios y m ejoras que ahora son com unes para m uchos analizadores de quím ica en general. Entre otros están el m icrom uestreo siempre más pequeño y la entrega de reactivo con m últiples adiciones posibles desde reactivos restituidos al azar; m enús de prueba totales y expandidos a bordo, en particular fárm acos y horm onas; tiem pos de reacción acelerados con características quím icas para rendi­ m iento m ás rápido y m enor tiem po de perm anencia; mayor óptica de resolución con m onocrom adores de rejilla y con­ ju n to s de diodos para análisis policrom ático; electrodos de flujo directo m ejorados; software interactivo m ejorado de fácil m anejo para control de calidad, m antenim iento y diag­ nóstico; m ódem s integrados para solución de problem as en línea; sistem as de m anejo de datos con interfaz para el SIL; frecuencias reducidas de calibración y controles; m odos automatizados para calibración, dilución, repetición de la ejecu ción y m antenim iento; así com o m ejoras de diseño ergonóm icas y físicas para facilidad del operador, funcio­ nalidad y reducción de m antenim iento. De acuerdo con los datos de estudio recientes del CAP, los ocho analizadores de quím ica más populares son Aeroset (A bbott D iagnostics); Advia (Bayer H ealth); sistemas AU (O lym pus); D im ensión (Dade B eh rin g ); sistem as H itachi (R oche D iagnostics); siste­ mas Integra (R oche D iagnostics); sistem as Synchron (B eck­ m an Instru m ents), y Vitros (O rtho-C linical D iagnostics ).26 Las características y especificaciones de estos ocho sistemas se resum en en el cuadro 5-1. Una ventaja principal de los analizadores de quím ica modulares es la escalabilidad. Con­ form e aum enta la carga de trabajo, se pueden agregar más módulos para increm entar el rendim iento. U n esquema del sistem a M ODULAR ANALYTICS (R oche) se m uestra en la figura 5-2 0 . Este sistem a puede acom odar desde uno has­ ta cuatro módulos D, P o E. Esto provee flexibilidad para adaptar a cargas de trabajo cam biantes. Es posible com binar las pruebas de inm unoensayo y quím ica, sin considerar la necesidad de dividir las muestras. Las pruebas repetidas se pueden llevar a cabo de forma autom ática con la disolución amortiguadora de reejecución, que soporta todas las m ues­ tras hasta com pletar todo el análisis. Línea de reejecución

Disolución amortiguadora de entrada

Disolución amortigua- Disolución amorti­ dora de reejecución guadora de salida

FIGURA 5-20. Esquema del sistema Roche MODULAR ANALYTICS. (Foto cortesía de Roche Diagnostics.)

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PARTE ¡ ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

Fase posanalítica (m anejo de datos) Aunque la m ayor parte de la atención en años recientes en el concepto de autom atización del laboratorio se ha dedicado a sistem as frontales para el m anejo de muestras, varios fabricantes han estado desarrollando y m ejorando el m anejo de datos de extrem o posterior. La com unicación bidireccional entre el (los) analizador(es) y la com putadora central o SIL se ha vuelto un enlace absolutam ente esen­ cial para solicitar pruebas e introducir datos demográficos del paciente, transferir de form a autom ática esta infor­ m ación personalizada al analizador, así com o enviar los resultados al registro del paciente. La evaluación y m anejo de datos desde el m om ento del análisis hasta el envío se ha vuelto una tarea más com pleja y automatizada con la integración de administradores de estaciones de trabajo en todo el sistem a de com unicación .27 La mayor parte de los dispositivos de m anejo de datos son m ódulos de com pu­ tadoras personales con software patentado de los fabri­ cantes que interactúa con uno o más de sus analizadores y el SIL anfitrión. Ellos ofrecen m anejo automatizado de datos de control de calidad con alm acenaje y evaluación de resultados contra los perímetros de control de calidad del laboratorio predefinidos del laboratorio con capacidades de graficación, representación visual e inform ación de resulta­ dos. La revisión y edición de resultados del paciente antes de la com probación y transm isión a la com putadora cen ­ tral se increm enta m ediante los perím etros definidos por el usuario para lím ites de alcance declarables, lím ites de valo­ res de pánico, com probaciones delta y com paraciones de control de calidad para cam bio clínico, pruebas repetidas y análisis de algoritm o. E l inventario de reactivos y el control de calidad, ju n to con el m onitoreo de las funciones del ins­ trum ento, son controlados m ediante el software de la esta­ ción de trabajo. La mayor parte de vendedores de SIL tienen software de interconexión disponible para los principales analizadores quím icos. Algunas necesidades de m anejo de datos relacionadas con la autom atización no se pueden m an ejar de m anera adecuada m ediante la m ayor parte de los SIL actuales. Por ejem plo, la m ayor parte de los analizadores actuales son capaces de evaluar el grado de hem olisis de la m uestra, ictericia y lipidem ia (cuadro 5 -1 ). Sin em bargo, h acer que esta inform ación esté disponible y sea útil para el m édico clín ico o el laboratorista de un m odo autom atizado requie­ re m anejo adicional de los datos. De m odo ideal, se requie­ ren d eterm inar las pruebas solicitadas para la m uestra, el um bral para interferencia de cada m uestra por cada uno de los tres agentes, y si la interferencia es positiva o nega­ tiva. E n el caso de la lipidem ia, los resultados para pruebas afectadas se deben m antener hasta que se pueda clarificar la m uestra y volver a ejecutar las pruebas. Para los siste­ m as SIL actuales es difícil o im posible efectuar esta últim a tarea. Es necesario contar con un vín cu lo entre el in stru ­ m ento y el SIL. U na com pañía, D ata Innovations, ha desa­ rrollado un sistem a denom inado In stru m en t Manager, que enlaza al analizador co n el SIL y provee la capacidad para que el usuario defina reglas para la lib eración de inform a­ ció n al SIL. Además, se pueden m ostrar banderas al ope­ rador del instrum ento para la e jecu ció n de operaciones

adicionales, com o clarificación de la m uestra y repetición del análisis. La capacidad para autom atizar por com pleto la revisión de datos por m edio del análisis basado en reglas es u n factor clave para pasar hacia la ATL.

TENDENCIAS FUTURAS EN LA AUTOMATIZACIÓN La autom atización de la quím ica clínica continuará evolu­ cionando a un paso rápido de 2 0 0 4 a 2 0 1 0 com o en la déca­ da de 1 9 9 0 . C on la m ayor parte de las m ism as fuerzas que im pulsan el mercado de autom atización en 2 0 0 5 , com o las analizadas en este capítulo, los analizadores continuarán desem peñándose de m anera más eficaz en cuanto a cos­ tos y con eficiencia. Más integración y m iniaturización de com ponentes y sistem as persistirá para acom odar analiza­ dores portátiles más avanzados para el exitoso mercado de pruebas en el lugar de la atención. La com un icación efec­ tiva entre los participantes de la autom atización para un determ inado proyecto es clave para la ejecu ció n exitosa .28 Se desarrollarán más pruebas nuevas para m enús expan­ didos, con una com binación de técnicas de m edición empleadas en los analizadores para inclu ir más inm unoensayos y ensayos basados en RCP. E l m apeo espectral, o el m onitoreo de longitud de onda m últiple, con los fotóm etros de alta resolución en los analizadores será rutina para las m uestras y pruebas conform e se diseñan más instrum entos con el dispositivo m onocrom ador en la trayectoria de la luz después de la cubeta, no antes. Las capacidades de m apeo espectral perm itirán el análisis sim ultáneo de diversos ana­ litos en el m ism o recipiente de reacción. Esto tendrá un im pacto trem endo en el rendim iento y tiem po de respuesta de los resultados de prueba. La espectrom etría de masas y la electroforesis capilar se usarán de m anera más extensa en los laboratorios clínicos para identificación y cu antificación de elem entos y com puestos en concentraciones en extrem o pequeñas. E n los años venideros ocurrirá más integración de sistem as y flujo de trabajo con la robótica y el m anejo de datos incluso autom atización total del laboratorio .29 Para llevar a cabo esto, más com pañías form arán alianzas para colocar sus productos de instrum entación en los laborato­ rios. La incorporación de inteligencia artificial en los siste­ mas analíticos evolucionará, con sistem as expertos y redes neurales .3031 Esto hará que avancen en gran medida las tec­ nologías de la robótica, el procesam iento digital de datos, el diagnóstico asistido por com putadora y la integración de datos con registros electrónicos. Por últim o, los avances tecnológicos en chips y biosensores acelerarán el desarrollo del análisis in vivo no invasi­ vo .32'34 E l m onitoreo transcutáneo ya está disponible con algunos gases sanguíneos. Los valores “verdaderos” o diná­ m icos del m onitoreo in vivo de constituyentes en la sangre u otros líquidos corporales revolucionarán la m edicina de laboratorio com o la conocem os hoy. Esto suena futurista, pero así pasó con el prim er autoanalizador hace 5 0 años.

RESUMEN Desde la introd u cción del prim er analizador por Techni­ con, los instrum entos autom atizados han proliferado en el laboratorio de quím ica clínica. E ntre las fuerzas im pul­

CAPÍTULO 5 ■ PRINCIPIOS DE AUTOMATIZACIÓN QUÍMICA CLÍNICA

soras detrás del desarrollo y m ejoram ien to de los analiza­ dores están el volum en increm entado de prueba, tiem po de respuesta más rápido y costos disparados. Los analiza­ dores autom atizados pueden usar uno de los tres m étodos básicos para análisis de m uestras: flujo continu o, análisis centrífugo y análisis discreto, pero la m ayor parte en la actualidad usan análisis discreto. Los fabricantes han dise­ ñado sus instrum entos para im itar los pasos en un procedi­ m iento m anual para inclu ir la preparación e identificación de m uestras, m edición de la m uestra y entrega, sistem as de reactivos y prueba, fase de reacción quím ica, fase de m edi­ ción y procesam iento de señales y m anejo de datos. Cada enfoque del fabricante para la autom atización es único. Al seleccionar un analizador autom atizado para el labo­ ratorio de quím ica clínica es necesario consid erar varios

P R E G U N T A S 1. De lo siguiente, ¿cuál no es una fuerza im pulsora para más autom atización? á) Prueba de alta con centración . b ) Tiem po de respuesta rápido. c) Esperanza de resultados más exacto s de alta cali­ dad. d ) M ayor uso de paneles de quím ica. 2. ¿Cuál de los siguientes enfoques para la autom atiza­ ció n del analizador puede usar paletas de m ezclado para agitar? a ) A nálisis para centrifugar. b) F lu jo continuo. c) A nálisis discreto. d) A nálisis de placa quím ica seca. 3. ¿Cuál de los siguientes tipos de analizadores ofrecen capacidad de acceso aleatorio? a) A nalizadores de flujo continu o. b ) A nalizadores centrífugos. c) A nalizadores discretos. d) N inguno de los anteriores. 4. Las siguientes son consid eraciones prim arias en la selecció n de u n analizador de quím ica autom atizado EXC EPTO : a) E l costo de consum ibles. b) E l costo total del instrum ento. c) E l com ponente de trabajo. d) C óm o se agregan o m ezclan los reactivos. 5. U n ejem plo de un analizador de inm un oensayo auto­ m atizado sería: a) Advia Centaur. b) Param ax. c) Synchron. d ) Vitros.

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factores: necesidades del laboratorio, consu m ibles, capa­ cidades analíticas, espacio y facilidad de uso. La autom ati­ zación quím ica clín ica continuará evolucionando. La ATL provee en la actualidad la integración de las tres fases del análisis de laboratorio, y enlaza el procesam iento de m ues­ tra frontal y el m anejo de datos de extrem o posterior con la fase analítica. Las tendencias futuras inclu irán sin duda m ás capacidad de com putadora, m ás probabilidad, uso increm en tado de robótica, m apeo espectral, m ejo ram ien ­ to con tinu o en el software de com putadora, y el desarro­ llo de sistem as com putarizados con inteligencia artificial. Nuevas tecnologías, com o las reacciones en cadena de la polim erasa y el análisis in vivo no invasivo, tendrán tam ­ b ién u n gran im pacto.

DE

R E P A S O

6 . E l tiempo de perm anencia se refiere a: a) N úm ero de pruebas que u n instrum ento puede m anejar en un tiem po especificado.

b ) La capacidad del instrum ento para efectuar una car­ ga de trabajo definida en un tiempo especificado. c) E l tiem po entre la in iciació n de una prueba y la term inación del análisis. d) N inguna de las anteriores. 7. ¿En qué año se introd u jo el prim er analizador cen trí­ fugo com ercial? a) 1957. b) 1967. c) 1970. d) 1976.

8. Las siguientes son ventajas para la autom atización EXC EPTO : a) E l núm ero cada vez mayor de pruebas efectuadas. b) El com ponente de trabajo m inim izado. c) La correcció n de deficiencias inherentes en las m etodologías. d) E l uso de cantidades pequeñas de m uestras y reactivos en com paración con los procedim ientos m anuales. 9. ¿C uáles de los pasos siguientes en la autom atización es por lo general u n proceso m anual en la m ayor parte de los laboratorios? a) Preparación de la m uestra. b ) M ed ición de la m uestra y entrega. c) Entrega de reactivo. d) Fase de reacción quím ica. 10. ¿Cuál de los siguientes analizadores de quím ica emplean placas para contener todo el sistem a de reactivos? a) A nalizadores Vitros. b) A nalizadores ACA. c) A nalizadores Param ax. d) N inguno de los anteriores.

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

REFEREN CIAS 1. HodnettJ. Automated analyzers have surpassed the test of time. Adv Med Lab 1994;8. 2. Schoeff L, et al. Principies of Laboratory Instruments. St. Louis: Mosby-Year Book, 1993. 3. Jacobs E, Simson E. Point of care testing and laboratory automation: the total picture of diagnostic testing at the beginning of the next century. Clin Lab News 1999;December:12-4. 4. Boyce N. Why hospitals are moving to core labs. Clin Lab News 1 9 9 6 ;2 2 ( ll) :l- 2 . 5. Boyce N. Why labs should discourage routine testing. Clin Lab News 1996;22(12):1, 9. 6. Eisenwiener H, Keller M. Absorbance measurement in cuvets lying longitudinal to the lightbeam. Clin Chem 1979;25(1): 117-121. 7. Burtis CA. Factors influencing evaporation from sample cups, and assessment of their effect on analytic error. Clin Chem 1975;21:19071917. 8. Burtis CA, Watson JS. Design and evaluation of an anti-evaporative cover for use with liquid containers. Clin Chem 1992;38:768-775. 9. Dudley RE Chemiluminescence immunoassay: an alternative to RIA. Lab Med 1990;21(4):216. 10. Haboush L. Lab equipment management strategies: balancing costs and quality. Clin Lab News 1997;23(6):20-21. 11. Schoeff L. Clinical instrumentation (general chemistry analyzers). Anal Chem 1997;69(12):200R -203R . 12. Ringel M. National survey results: automation is everywhere. MLO Med Lab Obs 1996;28:38-43. 13. Douglas L. Redefining automation: perspectives on today’s clinical laboratory. Clin Lab News 1997;23(7):48-49. 14. Felder R. Front-end automation. In: Kost G, ed. Handbook of Clinical Laboratory Automation and Robotics. New York: Wiley, 1995. 15. Sasaki M. A fully automated clinical laboratory. Lab Inform Mgmt 1993;21:159-168. 16. Markin R, Sasaki M. A laboratory automation platform: the next robotic step. MLO Med Lab Obs 1992;24:24-29. 17. Bauer S, Teplitz C. Total laboratory automation: a view of the 21st century. MLO Med Lab Obs 1995;27:22-25. 18. Bauer S, Teplitz C. Laboratory automation, Part 2. Total lab automa­ tion: system design. MLO Med Lab Obs 1995;27:44-50.

19. Felder R. Cost justifying laboratory automation. Clin Lab News 1996;22(4): 10-11, 17. 20. Felder R. Laboratory automation: strategies and possibilities. Clin Lab News 1996;22(3): 10-11. 21. Boyd J , Felder R, Savory J. Robotics and the changing face of the clinical laboratory. Clin Chem 1996;42(12):1901-1910. 22. Hawker CD, Garr SB, Hamilton LT, Penrose JR , Ashwood ER, Weiss RL. Automated transpon and sorting system in a large reference laboratory: Part 1. Evaluation of needs and alternatives and development of a plan. Clin Chem 2002;48(10):1751-1760. 23. Hawker CD, Roberts WL, Garr SB, Hamilton LT, Penrose JR, Ashwood ER, Weiss RL. Automated transport and sorting system in a large reference laboratory: Part 2. Implementation of the sys­ tem and performance measures over three years. Clin Chem 2002; 4 8(10): 1761-1767. 24. Richardson P, Molloy J , Ravenhall R, et al. High speed centrifugal separator for rapid Online sample clarification in biotechnology. J Biotechnol 1996;49(1—3 ):1 11-118. 25. Zenie E Re-engineering the laboratory. Autom Chem 1996;18(4): 135-141. 26. CAP Surveys, Proficiency Testing Program. Northfield, IL: College of American Pathologists, 2002. 27. Saboe T. Managing laboratory automation. J Autom Chem 1995; 1 7(3):83-88. 28. Fisher JA. Laboratory automation: communicating with all stakeholders is the key to success. Clin Lab News 2000Ju ly :38-40. 29. Brzezicki L. Workflow integration: does it make sense for your lab? Adv Lab 1996;23:57-62. 30. Place J, Truchaud A, Ozawa K, et al. Use of artificial intelligence in analytical Systems for the clinical laboratory. J Autom Chem 1995;17(1):1-15. 31. Boyce N. Neural networks in the lab: new hope or just hype? Clin Lab News 1 9 9 7 ;2 3 (l):2 -3 . 32. Boyce N. Tiny “lab chips” with huge potential? Clin Lab News 1996;22(12):21. 33. Rosen S. Biosensors: where do we go from here? MLO Med Lab Obs 1995;27:24-29. 34. Aller RD. Chemistry analyzers branching out. CAP Today 2002; Ju ly :84-106.

Inmunoensayos y técnicas con sonda de ácido nucleico Susan O rto n C O N T E N I D O INM UNOENSAYOS Consideraciones generales Inmunoensayos no marcados Inmunoensayos marcados SONDAS DE ÁCIDO NUCLEICO Química del ácido nucleico Técnicas de hibridación Aplicaciones de la sonda de ácido nucleico

D E L

C A P I T U L O RESUM EN PREGUNTAS DE REPASO REFEREN CIAS

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Enunciar el principio de cada uno de los siguientes métodos: ■ Difusión doble ■ Inmundifusión radial ■ Inmunoelectroforesis ■ Electroforesis de inmunofijación * Nefelometría ■ Turbidimetría ■ Inmunoensayo competitivo ■ Inmunoensayo no competitivo ■ Inmunotransferencia ■ Inmunocitoquímica directa ■ Inmunocitoquímica indirecta ■ Inmunofenotipia por citometría de flujo ■ Reacción en cadena de la polimerasa ■ Southern blot ■ Hibridación in s itu ■ Polimorfismo de la longitud del fragm ento de restricción • Comparar y contrastar los tipos generales de mar­ cadores empleados en inm unoensayos.

Clasificar un inm unoensayo, dado su formato, como hom ogéneo o heterogéneo, competitivo o no competitivo y mediante su marcador. Explicar cómo se relaciona la concentración del analito en la muestra de prueba con la cantidad de reactivo marcado enlazado para inm unoensayos competitivos y no competitivos. Describir los tres métodos empleados para separar reactivo marcado no enlazado de reactivo marca­ do enlazado. Describir la reducción de datos en el radioinmunoensayo competitivo clásico. Comparar y contrastar las metodologías, EMIT, DELFIA, MEIA, RIA, FPIA, ELISA, CEDIA, ICON y OIA. Explicar ios principios de la hibridación. Expresar el papel de la transcriptasa, polimerasa y endonudeasa de restricción en los ensayos con sonda de ácido nucleico. Describir el principio de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia como se emplea en el ensayo de la reacción en cadena de la poli­ merasa en tiem po real.

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

___________________________________________ T É R M I N O S Afinidad Amplicón Anillar Anticuerpo Antígeno Avidez Citometría de flujo Contrainmunoelectroforesis Dúplex Electroforesis por inmunofijación (EIF) Epitopo Fase sólida Hapteno (Hp) Hibridación

Hibridación in situ índice de DNA (ID) Inmunocitoquímica Inmunodifusión radial (RID) Inm unoelectroforesis (IEF) Inmunoensayo competitivo Inmunoensayo heterogéneo Inmunoensayo homogéneo Inm unoensayo no compe­ titivo Inmunofenotipia Inmunofluorescencia directa (IFD) Inmunofluorescencia indi­ recta (IFI)

E n este capítulo se introducen dos m étodos analíticos genéricos em pleados en el laboratorio clín ico: uno con lle­ va el enlace de anticuerpo a antígeno y el otro depende del enlace a una secuencia de ácido nucleico con su secu en­ cia com plem entaria de ácido nu cleico blanco. Com unes a am bos m étodos son la naturaleza com plem entaria de los reactivos, que determ ina la especificidad, y el sistem a detector, que determ ina el alcance de la reacción de enlace y se relaciona con la sensibilidad analítica. E n inm unoensayos, un antígeno se une a un anticuerpo. Las interacciones antígeno-anticuerpo podrían tener que ver con reactivos no marcados en técnicas m enos sensibles desde el punto de vista analítico o con un reactivo m arcado en técnicas más sensibles. E l diseño, marcador y sistem a de d etección se com binan para crear m uchos ensayos distintos, que perm i­ ten la m ed ición de una amplia variedad de m oléculas. E n el enlace de ácido n u cleico, por lo com ú n, una sonda se unirá con una secuencia de ácido n u cleico com plem en­ taria. E l ácido n u cleico blanco puede ser am plificado o no antes de la d etección o cuantificación, o am bas cosas. Así, los m étodos basados en ácido n u cleico están diseñados para detectar cam bios en la con cen tració n de DNA o RNA y no en detectar u n producto génico sintetizado, com o una proteina detectada en inrnunoensayos. De nuevo, m u chos diseños de ensayo usan sondas. Para dar una exp licación m ás clara, los inrnunoensayos serán considerados por separado de los ensayos con sonda de ácido nu cleico . En este capítulo se revisan los con cep tos del enlace, se des­ cribe la naturaleza de los reactivos em pleados y se analiza el diseño de ensayo básico de técnicas seleccionadas u tili­ zadas en el laboratorio clín ico; com o tal, pretende ser un repaso y no una revisión exhaustiva.

INM UNOENSAYOS

C L A V E

Inmunohistoquímica Inmunotransferencia Monodonal Nefelometría Northern blot Policlonal Polimorfismo de la longi­ tud del fragm ento de restricción Postzona Prozona Reacción en cadena de la ligasa (LCR) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Reacción en cadena de la transcriptasa polimerasa inversa (RT-PCR) Reactividad cruzada Replicación de secuencia autosostenida (3SR) Sonda de ácido nucleico Southern blot Técnica del cohete Transferencia de energía por resonancia de fluo­ rescencia (FRET) Trazador Turbidimetría W estern blot

puede ser un antígeno o un an ticuerpo. E l en lace se relacion a co n la co n cen tra ció n de cada reactivo, la esp e­ cificidad del an ticu erp o para el an tig en o, la afinidad y avidez para am bas y las con d icio n es am bientales. A u n­ que este cap ítu lo se en foca en inrnunoensayos que u san u n a m o lécu la de anticuerpo com o el reactivo de enlace, otros ensayos, com o los de recep tor y los de proteín a de en lace, com p etitivos, em plean p roteínas receptoras o de tran sp orte com o reactivo de enlace, respectivam ente. L os m ism os p rin cip io s se aplican a estos ensayos. Una m olécu la de anticu erp o es una inm u n og lo bu lin a co n un d om inio fu n cio n al con o cid o com o F (a b ); esta área de la proteín a de inm u n og lo bu lina se un e co n un sitio en el antígeno. É ste es relativam ente grande y co m p le jo y, por lo com ún, tiene sitios m últiples que se pu ed en u n ir a anticu erp os co n d iferentes esp ecificid ad es; cada sitio en el antígeno se co n o ce com o un d eterm inan te an tig én ico o epitopo. E xiste cierta con fu sión en la term inología usada: algunos inm u n ólogos se refieren a un inmunógeno com o la m olécula que induce la respuesta biológica y síntesis de anticuerpo, y algunos usan antígeno para referirse a lo que se un e co n el anticuerpo. Sin em bargo, todos concuerd an que el sitio antig énico al que se puede u n ir F (a b ) es el epitopo. El grado de enlace es una consid eración im portante en un inm unoensayo. E l enlace de u n anticuerpo con u n an tí­ geno se relaciona de m odo directo con la afinidad y avidez del anticuerpo para el epitopo, así com o la con cen tració n del anticuerpo y el epitopo. E n cond icion es estándar, la afinidad de u n anticuerpo se m ide usando un hapteno (Hp) porque éste es un antígeno de peso m olecular b ajo que se considera tiene sólo un epitopo. La afinidad hacia el hap­ teno se relaciona co n la probabilidad para enlazar o con el grado de naturaleza com plem entaria de cada uno. La reacción reversible se resum e en la ecu ación 6- 1 :

Consideraciones generales E n u n inm u n oensayo, una m olécu la de anticuerpo re co ­ n o ce y se une con un antígeno. La m olécu la de interés

Hapteno + anticuerpo

v* com plejo hapteno-anticuerpo (Ec. 6-1)

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

E l enlace entre u n hapteno y el anticuerpo obedece la ley de acción de m asas y se expresa m atem áticam ente en la ecu ación 6- 2 :

K = kí = [HP ~ fl k2 [Hp] [Ab]

(Ec. 6-2)

Ka es la constan te de afinidad o equilibrio y representa el recíproco de la con cen tració n de hapteno libre cuando están ocupados 50% de los sitios de enlace. M ientras mayor sea la afinidad del hapteno hacia el an ticuerpo, m enor es la con cen tració n del hapteno necesaria para saturar 50% de los sitios de enlace del anticuerpo. P or ejem plo, si la constan te de afinidad de un anticuerpo m o n oclon al es 3 X 1 0 n L/mol, significa que una con cen tració n de hap­ teno de 3 X 10 !l mol/L es necesaria para ocupar la mitad de los sitios de enlace. Por lo com ú n, la constan te de afi­ nidad de anticuerpos que se em plea en procedim ientos de inm unoensayo varia de 10 9 a 1 0 11 L/mol, m ien tras que la constan te de afinidad para proteínas de transporte varía de 1 0 7 a 10 8 L/mol, y la afinidad para los receptores va de 10 8 a 1 0 11 L/mol. C om o con todas las reacciones quím icas (m olecu lares), las consid eraciones iniciales de los reactivos y productos afectan el grado de enlace com p lejo. En inm unoensayos, la reacción es directa (hacia la derecha) (ecu ación 6- 1 ) cuando la con cen tració n de los reactivos (Ag y Ab) excede la con cen tració n del producto (co m p lejo Ag-Ab) y cuando hay una constan te de afinidad favorable. Las fuerzas que agrupan a un determ inante antigénico y u n anticuerpo son enlaces reversibles, no covalentes, que resultan de los efectos acum ulados de fuerzas hidrófobas, hidrofílicas, de puente de hidrógeno y de van der W aals. E l factor m ás im portante que afecta la resistencia acu m u­ lada de enlace es la bondad (o cercanía) de ajuste entre el anticuerpo o el antígeno. La resistencia de la m ayor parte de estas fuerzas interactivas se relaciona de m anera inver­ sa con la d istancia entre los sitios interactivos. M ientras m ás se aproxim en el anticuerpo y el oxígen o, m ayores son las fuerzas de atracción. D espués que se form a el com p lejo antígeno-anticuerpo, la probabilidad de separación (que se relaciona de m anera inversa co n la tensión de en lace) se con o ce com o avidezÉsta representa un fenóm eno de valor añadido en el que la resistencia de enlace de todos los pares anticuerpo-epitopo exced e la sum a del enlace ún ico anticuerpo-epitopo. E n general, m ientras más fuertes sean la afinidad y la avi­ dez, m ayor es la posibilidad de reactividad cruzada. La especificidad de un anticuerpo se describe en la m ayor parte de los casos m ediante el antigeno que indujo la produ cción de anticuerpo, el antígeno hom ólogo. De m anera ideal, este anticuerpo reaccionaría sólo con ese antígeno. Sin em bargo, un anticuerpo puede reaccionar co n un antígeno que en estructura es sim ilar con el antí­ geno hom ólogo; esto se con o ce com o reactividad cru za­ da. C onsiderando que u n determ inante antigénico puede tener cinco o seis am inoácidos o u n azúcar inm unodom inante, n o es sorprendente que sea com ún ia sim ilitud del antígeno. M ientras m ayor sea la sim ilitud entre el antígeno

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de reacción cruzada y el hom ólogo, más fuerte es el enlace co n el an ticu erp o .1 La producción de anticuerpo de reac­ tivo se logra m ediante técnicas policlonales o m onoclonales. En la p rod u cción de anticuerpo policlonal, el antígeno estim ulante se inyecta en u n anim al sensible al antígeno; el anim al detecta este antígeno extraño y prepara una res­ puesta inm une para elim inar el antígeno. Si parte de esta respuesta inm une incluye produ cción intensa de anticuer­ po, entonces se colecta la sangre y se recoge el anticuerpo, caracterizado y purificado para producir el reactivo anti­ sérico com ercial. E ste reactivo de anticuerpo policlonal es una m ezcla de especificidades de anticuerpo. Algunos anticuerpos reaccionan con los epitopos estim ulantes y algunos son endógenos para el huésped. M últiples anti­ cuerpos dirigidos contra los epitopos m últiples en el antí­ geno están presentes, y pueden form ar un enlace cruzado con el antígeno m ultivalente. Los anticuerpos policlonales se em plean por lo com ún com o anticuerpos de “captu ra” en inm unoensayos de emparedado o indirectos. En contraste, una línea de células inm ortales produce anticuerpos m onoclonales ; cada línea produce un anticuer­ po específico. E ste m étodo se desarrolló com o una e xten ­ sión del trabajo de hibridom a que pu blicaron K ohler y M ilstein en 1 9 7 5 .2 E l proceso com ienza con la selección de células con las características que perm itirán la síntesis de un anticuerpo hom ogéneo. Prim ero, un huésped (por lo com ún, un ratón) se inm uniza con u n antígeno (aquél para el que se desea un anticuerpo); después, se recogen del bazo los lin focitos sensibilizados. Segundo, una línea de células inm ortales (por lo regular una línea de células de m ielom a de ratón no secretoria que es deficiente en fosforribosiltransferasa de guanina h ip oxantin a) se requiere para asegurar que sea viable la propagación con tinu a in vitro. Estas células se m ezclan en presencia de un agente de fusión, com o el glicol de polietileno, que prom ueve la fusión de dos células para form ar u n hibridom a. E n un m edio de crecim iento selectivo, sólo sobrevivirán las célu ­ las híbridas. Las células B tien en un lapso de vida natural lim itado in vitro y no pueden sobrevivir, y las células de m ielom a no fusionadas no sobreviven debido a su defi­ ciencia de enzim as. Si las células fusionadas viables sin te­ tizan anticuerpo, entonces se evalúan la especificidad y el isotipo de cu alquier anticuerpo. El reactivo de anticuerpo m on oclonal se produce en el com ercio m ediante el cre­ cim iento de hibridom a en cultivo de tejid o o en anim a­ les com patibles. Una característica im portante acerca del reactivo de anticuerpo m onoclon al es que el anticuerpo es hom ogéneo (u n solo anticuerpo, no una m ezcla de anti­ cu erp os). P or tanto, reconoce sólo un epitopo o un antige­ no m ultivalente, y no puede form ar u n enlace cruzado con un antígeno m ultivalente.

Inm unoensayos no m arcados Precipitación in m u n e en g el E n uno de los inm unoensayos no m arcados m ás sim ples introducidos en el laboratorio clínico, el anticuerpo no m ar­ cado se im pregnó en la parte su p erior del antígeno no marcado (am bos en la fase de líqu id o); durante el período

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

de in cu b ació n , el anticuerpo y el antígeno se difundieron y se registró la presencia de precipitación . La p recipitación ocu rrió porque cada anticuerpo recon o ció u n epitopo, y los antígenos m ultivalentes form aron enlaces cruzados co n anticuerpos m últiples. Cuando el com p lejo antígenoanticuerpo es de tam año suficiente, la in teracció n co n el agua es lim itada, de m odo que el com p lejo se vuelve d iso­ luble y precipita. Se ha observado que si se increm enta la concen tración de antígeno m ientras la con cen tració n de anticuerpo per­ m anece constan te, la cantidad formada de precipitado se relaciona con el anticuerpo a antígeno. Com o se m uestra en la figura 6- 1 , hay una relación óptim a entre la co n cen ­ tración de anticuerpo y la con cen tració n de antígeno que da com o resultado la precipitación m áxim a; es decir la zona de equivalencia. Fuera de esta zona, la cantidad de preci­ pitado se reduce o está ausente debido a que la relación de anticuerpo a antígeno está fuera de proporción y se reduce el entrecruzam iento de antígeno. Cuando la con cen tra­ ción de anticuerpo está en exceso y se reduce el entrecru­ zam iento, el ensayo está en prozona. A la inversa, cuando la con cen tració n de antígeno está en exceso y dism inuye el entrecruzam iento, el ensayo está en poszona. Aunque en un principio se describió con reacciones de precipitación, este concepto se aplica a otros ensayos en los que la rela­ ció n de anticuerpo a antígeno es m uy im portante. Las reacciones de precipitación en gel se llevan a cabo por lo com ún en el laboratorio clínico actual. E l gel es aga­ rosa diluida (por lo regular m enos de 1 %) disuelta en una disolución amortiguadora acuosa. Esto provee un medio sem isólido por el que puede pasar con facilidad el antígeno soluble y el anticuerpo. Los com plejos inm unes precipita­ dos son más fáciles de discernir en gel en oposición a una suspensión líquida. Los m étodos de precipitación inm une en gel se pueden clasificar com o m étodos pasivos o los que usan electroforesis, y se resum en en el cuadro 6-1. E l m étodo

CUADRO 6-1. MÉTODOS DE PRECIPITACIÓN INMUNE___________________________ Gel Pasivo Difusión doble (técnica de Ouchterlony) Difusión simple (inmunodifusión radial)

Electroforesis Contrainmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis Electroforesis de ¡nmunofijación Electroforesis de cohete

Fase soluble Turbidimetría Nefelometría

m ás sim ple y m enos sensible es la difusión doble (la técnica de O uchterlony ).3 La agarosa se coloca en una superficie sólida y se perm ite que solidifique. Los pozos se cortan en la agarosa. Una plantilla com ún son seis pozos de anticuer­ po, que rodean un solo pozo de antígeno en el centro. El antígeno y el anticuerpo solubles se agregan para separar los pozos y ocurre la difusión. Se interpretan la intensidad y el patrón de la banda de precipitación. Com o se ilustra en la figura 6- 2 , la banda de precipitina de una m uestra descono­ cida se com para con de una muestra que se conoce contiene el anticuerpo. U n patrón de identidad confirm a la presencia del anticuerpo en la m uestra desconocida. Los patrones de

O

© Incremento de la concentración de antígeno FIGURA 6-1. Curva de precipitina que muestra la cantidad de preci­ pitado en función de la concentración de antígeno. La concentración de anticuerpo es constante.

FIGURA 6-2. Esquema que demuestra el patrón de identidad. El pozo del centro contiene el antígeno, extracto de timo de conejo. El pozo 1 se llena con un suero que contiene anticuerpo Sm. Los pozos de prueba están en los pozos 2 y 3; el patrón de identidad, la línea continua entre los tres pozos, confirma la presencia de anticuer­ po Sm en los sueros de prueba. El pozo 4 se llena con un suero que contiene anticuerpo U1-RNP. Los sueros de prueba en los pozos 5 y 6 también contienen anticuerpo U1-RNP confirmado por el patrón de identidad entre el suero conocido y los sueros de prueba.

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

identidad parcial y sin identidad son ambiguos. Esta técnica se em pleó para detectar anticuerpos relacionados con enfer­ m edades, com o Sm y RNP detectados en lupus eritem atoso sistém ico, SSA y SSB en el síndrom e de Sjógren y S cl-7 0 en la esclerosis sistém ica progresiva. La técnica de difusión sim ple, inmunodifusión radial (RID), es un m étodo de precipitación inm un e empleado para cuantificar proteína (el antígeno). E n este m étodo, el antisuero m onoespecifico se agrega a la agarosa líqu i­ da; luego, la agarosa se vacía en una placa y se enfría. Los pozos se cortan en la agarosa solidificada. Los estándares m últiples, una o más m uestras de control de calidad, y m uestras del paciente se añaden a los pozos. E l antlgeno se difunde desde el pozo en todas direcciones, se une al anticuerpo soluble en la agarosa y form a un com plejo visto com o un anillo de precipitina concéntrico (fig. 6 -3 ). E l diám etro del anillo se relaciona con la concentración del antígeno que se difunde desde el pozo. Se construye una curva estándar para determ inar la concentración en las m uestras de control de calidad y del paciente. E l alcan­ ce analítico utilizable está entre los estándares m ínim o y m áxim o. Si el anillo es m ayor que el estándar superior, se debe diluir la m uestra y volverla a analizar. Si el anillo es m enor que el estándar m ínim o, la m uestra se debe ejecutar en una placa de concentración baja. E xisten dos variantes: el m étodo de punto final (M ancini )4 y el m étodo cinético (Fahey-M cKelvey ).5 El método de punto final requiere que el antígeno se difunda desde el pozo, y la concentración del antígeno se relaciona con el cuadrado del diámetro del anillo de precipitina; la curva estándar se gráfica en papel de grá­ fica lineal y es la recta del m ejo r ajuste. Para asegurar que se ha difundido todo el antígeno, el tiem po de incubación es 4 8 a 7 2 horas, lo que depende del peso m olecular del antígeno; por ejem plo, la cu antificación de IgG requiere 4 8 horas, IgM requiere 72 horas. E n cam bio, el m étodo cinéti­ co requiere que los anillos sean m edidos en un tiem po fijo de 18 horas; una m u estra c o n u n a c o n c e n tra c ió n m ayor se d ifu n d irá a un a m ayor rapidez y será más grande un

FIGURA 6-3. Una placa de inmunodifusión radia! para detectar haptogloblna. El diámetro del círculo de precipitina se relaciona con la concentración de haptoglobina en el suero.

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tiem po fijo. Si se utiliza papel de gráficas sem ilogarítm ico, la concentración del antígeno se gráfica contra el diám etro del anillo de precipitina; la línea se dibuja punto a punto. Para los que llevan a cabo RID , se favorece el m étodo de punto final debido a su estabilidad e indiferencia a varia­ ciones de tem peratura; sin em bargo, el tiem po de respuesta es más grande com parado con el m étodo cinético. La contrainmunoelectroforesis es un m étodo de precipita­ ción inm une que emplea un cam po eléctrico para hacer que el antígeno y el anticuerpo migren uno hacia el otro. Se cor­ tan dos líneas de pozos paralelas en la agarosa; el anticuerpo se coloca en una línea y el antígeno en la otra. E l anticuer­ po migrará hacia el cátodo y el antígeno hacia el ánodo; una línea de precipitina se forma donde se encuentran. La prue­ ba cualitativa es útil para detectar ciertos antígenos bacte­ rianos en el líquido cefalorraquídeo y otros líquidos cuando se necesita una respuesta de laboratorio rápida. La inmunoelectroforesis (IEF) y la electroforesis de inmunofijación (EIF) son dos m étodos em pleados en el labo­ ratorio clín ico para caracterizar proteínas m onoclonales en suero y orina. E n 1 9 6 4 , G rabar y B urtin pu blicaron m étodos para exam inar proteínas séricas por m edio de electroforesis acoplada con reacciones inm unoquím icas en agarosa .6 Las proteínas de suero se separan electroforéticam ente y después el anticuerpo de reactivo se coloca en un canal que corre paralelo a las proteínas separadas. E l reactivo de anticuerpo y las proteínas séricas separadas se difunden; cuando el anticuerpo de reactivo recon o ce la proteína sérica y la reacción es en la zona de equiva­ lencia, se ve un arco de precipitina (fig. 6 -4 ). La placa de agarosa se tiñe (por lo com ún, con una tin ció n de pro-

FIGURA 6-4. Inmunoelectroforesis. Los p o zo s 1, 3, 5 j 7 contienen suero humano normal, y los po zo s 2, 4 y 6 contienen el suero de prueba. El reactivo antisérico está en los canales: A contiene suero completo antihumano: B contiene IgG antihumana: C contiene IgA antihumana; D contiene IgM antihumana; E contiene k antihumana; F contiene X antihumana. Las flechas en la parte superior apuntan hacia una cadena y anormal que reacciona con el reactivo anti-lgG. Una banda similar se muestra en el fondo con el reactivo anti-K. Tam­ bién hay un patrón de identidad con el reactivo anti-K que muestra cadenas k libre en el suero de prueba.

150

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

teína com o el negro de Am ido 1 0 ), se destiñe y seca para increm en tar la legibilidad de los arcos de precipitina, en particular los arcos débiles. E l tam año, form a, densidad y u b icació n de los arcos ayuda en la interpretación de la pro­ teína. Toda la interpretación se hace com parando los arcos de la m uestra del paciente con los de control de calidad, un suero hu m ano norm al. D ebido a que la IE F se em plea para evaluar una proteína m o n oclonal, se debe determ i­ nar la clase de cadena pesada y el tipo de cadena ligera. Para evaluar las proteínas m onoclonales más com unes, se u san los siguientes antisueros: suero com pleto antihu­ m ano (que con tien e una m ezcla de anticuerpos contra las proteínas séricas principales), IgG antihum ana (específica de cadena y), IgM antihum ana (específica de cadena u), IgA antihum ana (específica de cadena a ) , X antihum ana (específica de cadena K) y k antihum ana (específica de cadena k ) . E l tiem po de respuesta de prueba y la sutileza en la interp retación han disuadido de usar la IE F com o la técnica prim aria para evaluar anticuerpos m onoclonales. La E IF 7 ha reem plazado a la IE F en m u chos laborato­ rios. Se coloca una m uestra de suero, orina o líquido cefa­ lorraquídeo en los seis carriles de un gel de agarosa y se som ete a electroforesis para separar las proteínas. E l aceta­ to de celulosa (o algún otro m aterial poroso) se satura con reactivo de anticuerpo y se aplica después a u n carril de la proteína separada. Si el reactivo de anticuerpo recon o ce la proteína, se form a un com p lejo insolu ble. D espués de teñir y secar la película de agarosa, la interpretación se basa en la m igración y apariencia de las bandas. Com o se m uestra en la figura 6 -5 , la proteína m o n oclon al aparece­ rá com o una banda discreta (co n un antisuero m onoespecífico de cadena pesada y ligera que está en la m ism a p o sició n ). Las proteínas policlonales lo h acen com o una banda difusa. La con cen tració n de la m uestra del paciente

FIGURA 6-5.

Electroforesis de inmunofljación. A. Inmunoglobulina monoclonal IgG k . B. Inmunoglobina monoclonal IgA k con cadenas ligeras de k libre. C. Inmunoglobulinas biclonales IgG X e IgM k . D. Banda de cadena pesada de IgA difusa sin una cadena ligera corres­ pondiente.

podría requerir aju ste para asegurar que la reacción está en la zona de equivalencia. E l últim o m étodo de precipitación in m u n e en gel que se analiza es la técnica de cohete (técn ica de Laurell o electroinm unoensayo ).8’9 E n esta técnica cuantitativa, el anti­ cuerpo de reactivo se m ezcla co n agarosa; el antígeno se coloca en el pozo y se som ete a electroforesis. Conform e el antígeno se m ueve por la agarosa, reacciona co n el an ti­ cuerpo de reactivo y form a un “co h ete”, con precipitación a lo largo de los bordes. La altura del cohete es proporcio­ nal a la con cen tració n de antígeno presente; la con cen tra­ ció n se determ ina co n base en una curva de calibración. E l alcance estrecho de linealidad podría requ erir d ilu ción o co n cen tració n de la m uestra desconocida.

D etección d e com plejos d e antígeno-anticuerpo en fa s e líquida U na estrategia diferente para cu antificar los com p lejos antígeno-anticuerpo es usar un instrum ento para detectar los com plejos antígeno-anticuerpo solubles cuando interactú an co n luz. Cuando el antígeno y el anticuerpo se com binan, se form an com plejos que actúan com o partí­ culas en suspensión y, por tanto, pueden dispersar luz. E l tam año de las partículas determ ina el tipo de dispersión que dom inará cuando la d isolu ción interactúa con luz casi m o n ocro m ática .10 Cuando la partícula, com o albúm ina o IgG, es relativam ente pequeña en com paración co n la longitud de onda de la luz in cid ente, la partícula disper­ sará luz de form a sim étrica, hacia delante y hacia atrás. U n m ínim o de luz dispersada es d etectable a 9 0 ° de la luz incid ente. Las m oléculas más grandes de com p lejos an tí­ g eno-anticu erpo tienen diám etros que aproxim an la lo n ­ gitud de onda de la luz incid ente y dispersan luz con una intensidad m ayor en la d irección directa. La longitud de onda de la luz se seleccio n a con base en su capacidad para ser dispersada en d irección directa y la capacidad de los com p lejos antígeno-anticuerpo para absorber la longitud de onda de la luz. La turbidim etría m ide la luz transm itida y la n efelom e­ tría la luz dispersada. Los turbidlm etros (esp ectrofotó­ m etros o colorím etros) están diseñados para m ed ir la luz que pasa por una d isolu ción , de m odo que el fo tod etector está colocad o a un ángulo de 1 8 0 ° desde la luz incid ente. Si la absorban cia de luz es insign ificante, la turbidez se puede expresar com o la absorbancia, q ue está relacionada de form a directa co n la co n cen tració n de partículas su s­ pendidas y la longitud de la trayectoria. Los nefelóm etros m id en la luz a u n ángulo d istinto a 1 8 0 ° a partir de la luz in cid en te; la m ayor parte m id en luz directa dispersada a m enos de 9 0 ° porque la sen sibilid ad se in crem en ta (véa­ se el capítu lo 4 , T écnicas an alíticas e instrum entación). La co n cen tració n relativa del reactivo de anticu erp o y el antígeno es m uy im portante para asegurar que el tam año del com p lejo generado sea m ejo r d etectad o por el n efelóm etro o tu rbid ím etro, y que la reacció n in m u n e n o esté en poszona o prozona. P or tanto, podría ser im portante probar m ás de una co n cen tra ció n de m u estra del p acien ­ te, m onitorear la presen cia de anticu erp o en exceso o añadir m ás antisuero y vigilar la tasa m áxim a. E l exceso

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

de anticu erp o indicaría que hay poco antígeno y que se subestim ó la reacción. Para turbidim etría y nefelom etría, todos los reactivos y sueros deben estar libres de partículas que podrían disper­ sar luz. E l pretratam iento de suero con p o lietileng licol, un polím ero hidrofílico, no ión ico , m ejora la in teracció n antígeno-anticu erpo. D ebido a que el polím ero es m ás hidro­ fílico que el antígeno o el anticuerpo, el agua es atraída desde el antígeno y el anticuerpo al polietilenglicol. Esto da com o resultado una tasa m ás rápida y m ayor cantidad de form ación de com p lejo antlgeno-anticuerpo. Am bos m étodos se pueden efectuar en un m odo de pu nto final o cinético. E n el m odo de pu nto final, se toma una m ed ición al com ienzo de la reacción (la señal de fon­ do) y otra en u n tiem po fijo en la reacció n (señal de m ese­ ta o punto final); la con cen tració n se determ ina por m edio de una curva de calibración. E n el m odo cin ético , la tasa de form ación de com plejo se m oni torea sin interrup ción y se d eterm ina la tasa m áxim a. É sta se relaciona de m ane­ ra directa con la con cen tració n del antígeno, aunque esto no necesariam ente es lineal. Así, se requiere una curva de calibración para determ inar la con cen tració n de m uestras d esconocidas.

Inm unoensayos m arcados C o n sideracio nes g en era les P or lo general, en todos los inm unoensayos m arcados, u n reactivo (antígeno o anticuerpo) se m arca al u n ir una partícula o m olécula que se d etecta m ejo r a m enores co n ­ centraciones de los com plejos an tígeno-anticuerpo. Por tanto, el m arcador m ejora la sensibilidad analítica. Todos los ensayos tienen un reactivo de enlace, que puede unir­ se al antígeno o ligando. Si el reactivo de enlace es un anticuerpo, el análisis es un inm unoensayo. Si el agente

151

de enlace es un receptor (p. e j., receptor de estrógeno o p ro g estero n a), el ensayo es un análisis de receptor. Si el reactivo de enlace es una proteína de transporte (com o g lobulina ligadora de tiroxina o tran scortin a), el ensayo se puede llam ar prueba com petitiva de enlace a proteína. E n la actualidad los inm unoensayos se em plean casi de m odo exclusivo, con dos excep cion es notables: ensayos de receptor de estrógeno y progesterona, y la relación de en lace de horm ona tiroidea, que em plea globulina ligado­ ra de tiroxina. Los inm unoensayos se pueden d escribir co n base en su m arcador; cuál reactivo está m arcado, la con cen tració n relativa y la fuente del anticuerpo, el m étodo em pleado para separar reactivos libres de los m arcados por enlace, la señal que se m ide y el m étodo utilizado para asignar la con cen tració n de analito en la m uestra. P or tanto, el diseño de inm unoensayo tien e m uchas variables por con ­ siderar, que cond u cen a diversos ensayos.

M arcadores La form a más sim ple de identificar un ensayo es m ediante el m arcador utilizado. E n el cuadro 6 -2 se listan los m arca­ dores de uso com ú n y los m étodos em pleados para d etec­ tarlos. M arcadores rad iactiv os. L os átom os con n ú cleos ines­ tables que em iten radiación en form a espontánea son radiactivos y se co n o cen com o radionúclidos. La em isión se con o ce com o decaim iento radiactivo y es independiente de los parám etros quím icos o físicos, com o tem peratura, presión o con cen tració n . De las tres form as de radiación, sólo se em plean beta y gamma en el laboratorio clín ico . En la em isión beta, el nú cleo puede em itir electrones con car­ ga negativa o partículas con carga positiva llam ados p osi­ trones. Los electrones em itidos se con o cen tam bién com o partículas beta. E l tritio (3H) es el radionúclido empleado

CUADRO 6-2. M A R C A D O R ES Y M ÉTO D O S D E D ETECCIÓ N INM UNOENSAYO

M AR CA D O R COM ÚN

M ÉTO D O DE DETECCIÓN

RIA

3H

Contador de centelleo líquido

125l

Contador gamma

Peroxidasa de rábano

Fotómetro, fluorómetro, luminómetro

Fosfatasa alcalina

Fotómetro, fluorómetro, luminómetro

p-D-Galactosidasa

Fluorómetro, luminómetro

Deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato

Fotómetro, luminómetro

Derivado de isoluminol

Luminómetro

Ésteres de acridinio

Luminómetro

Fluoresceína

Fluorómetro

EIA

CLA

FIA

Europio

Fluorómetro

Ficobiliproteínas

Fluorómetro

Rodamina B

Fluorómetro

Umbeliferona

Fluorómetro

RIA, radioinmunoensayo; EIA, inmunoensayo enzimático; CLA, ensayo quimioluminiscente; FIA, inmunoensayo fluorescente.

152

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

por lo com ún en ensayos de inm un ología celu lar para diagnóstico e investigación. La em isión gam m a es rad iación electrom agnética con longitudes de onda m uy cortas que se originan de nú cleos inestables. Cuando u n radionúclido libera energía y se vuelve más estable, se desintegra o decae, liberando ener­ gía. U n espectro específico de niveles de energía se rela­ ciona con cada radionúclido. La unidad estandarizada de radiactividad es el becquerel (B q ), que es igual a una desintegración por segundo. La unidad trad icional es el curie (C i), que es igual a 3 .7 X 1 0 10 Bq; 1 q C i = 3 7 kBq. La vida m edia del radionúclido es el tiem po necesario para que 50% del radionúclido decaiga y se vuelva m ás estable. M ientras m ás larga sea la vida m edia, decae con m ayor lentitu d y, por tanto, se increm enta el tiem po en que se puede medir. Para sustancias radiactivas em pleadas en pruebas diagnósticas, es preferible que la em isión tenga u n nivel de energía apropiado, y que la vida m edia sea relativam ente larga; 125I satisface estos requisitos y es el radionúclido de em isión gamma que m ás se utiliza en el laboratorio clínico. Los radionúclidos de em isión gam m a son detectados por m edio de u n detector de centelleo de cristal (co n o ci­ do tam bién com o contador gam m a). La energía liberada durante el decaim iento excita una fluorita, com o el yodu­ ro de sodio activado con talio. La fluorita excitada libera u n fotón de luz visible, que es am plificada y detectada por un tubo fotom ultiplicador; la energía de luz am plificada se traduce entonces en energía eléctrica. E l decaim iento d etectable del radionúclido se expresa com o cuentas por m inuto (C PM ). E n los inm unoensayos, un reactivo se radiom arca. En ensayos com petitivos, el antígeno se m arca y se le d en o­ m ina trazador. E l radiom arcador debe perm itir al trazador ser fu ncional por com pleto y com petir por igual con el antígeno no m arcado por los sitios de enlace. Cuando el anticuerpo detector se radiom arca, el sitio de com bina­ ció n con antígeno debe perm anecer activo biológicam ente y libre. M a r c a d o r e s e n z im á ti c o s . Las enzim as se em plean por lo com ún para m arcar el antígeno/hapteno o anticuerpo .11’12 La peroxidasa de rábano (H R P), fosfatasa alcalina (ALP) y deshidrogenasa de glucosa- 6-fosfato se em plean en la m ayor parte de los casos. Las enzim as son catalizadores biológicos que increm entan la tasa de conversión de sus­ trato a producto y no se consum en en la reacción. Com o tal, una enzim a puede catalizar m uchas m oléculas de sus­ trato y, por consiguiente, am plificar la cantidad de produc­ to generado. La actividad de la enzim a se puede m onitorear de m anera directa al medir el producto form ado o el efec­ to del producto en una reacción acoplada. D ependiendo del sustrato em pleado, el producto puede ser fotom étrico, fluorom étrico o quim iolum iniscente. Por ejem plo, una reacción fotom étrica representativa con anticuerpo m arca­ do con HRP (Ab-HRP) y el sustrato (u n peróxido) generan el producto (oxígeno). E l oxígeno puede oxidar entonces u n crom ógeno reducido (ortofenilendiam ina reducida [O P D ]) para producir un com puesto coloreado (O PD o x i­ dada) que se m ide por medio de un fotóm etro.

Ab - HRP + peróxido —*■Ab = HRP + 0 2 0 2 + O PD reducida —> OPD oxidada + 1 1 ,0

(Ec. 6-3)

M a r c a d o r e s f l u o r e s c e n te s . Los m arcadores fluores­ centes (fluorocrom os o fluoróforos) son com puestos que absorben energía radiante de una longitud de onda y em i­ ten energía radiante de una longitud de onda más grande en m enos de 1 0 '4 segundos. Por lo com ún , la luz em itida se detecta a u n ángulo de 90° desde la trayectoria de luz de excita ció n con un fluoróm etro o u n esp ectrofotóm e­ tro m odificado. La diferencia entre la longitud de onda de excitación y la de em isión (cam bio de Stokes) varía entre 2 0 y 8 0 n m para la m ayor parte de los fluorocrom os. Algu­ nos inm unoensayos de fluorescencia sim plem ente su stitu ­ y en un m arcador fluorescente (co m o la fluoresceína) por un m arcador enzim ático y cuantifican la fluorescen cia .13 O tro m étodo, el inm unoensayo de fluorescencia de reso­ lu ción en el tiem po, utiliza un m arcador fluorescente m uy eficaz, com o un quelato de europio ,14 que fluoresce casi 1000 veces m ás lento que la fluorescencia de fondo n atu ­ ral y tiene un cam bio de Stokes am plio. E l retraso perm ite que el m arcador fluorescente sea detectado con interferen­ cia m ínim a desde la fluorescencia de fondo. E l cam bio de Stokes largo facilita la m ed ición de rad iación de em isión al tiem po que se excluye la radiación de excitación. E l ensa­ yo resultante es m uy sensible y de resolu ción en el tiem po, con fluorescencia de fondo m inim izada. M a r c a d o r e s l u m in is c e n t e s . Los m arcadores lu m inis­ centes em iten u n fotón de luz com o resultado de una reacció n eléctrica, bioqu ím ica o q u ím ica .1516 Algunos com puestos orgánicos se excitan cuando se oxid an y em i­ ten luz cuando vuelven al estado basal. Los oxidantes inclu yen peróxido de hidrógeno, h ip oclorito u oxígeno. A veces se requiere un catalizador, com o peroxidasa, fosfata­ sa alcalina o iones m etálicos. E l lum inol, el prim er m arcador quim iolu m iniscente em pleado en inm unoensayos, es una diacilhidracida cícli­ ca que em ite energía lum inosa en cond iciones alcalinas en presencia de peróxido o peroxidasa. D ebido a que la peroxidasa puede servir com o catalizador, en los ensayos se puede usar esta enzim a com o m arcador; el sustrato quim iolum inogénico, lu m inol, producirá luz que es directa­ m ente proporcional a la cantidad de peroxidasa presente (ecu ación 6 -4 ):

L um inol + 2H 20 2 + OH" Peroxidasa » 3-am inoftalato + luz (4 2 5 nm )

(Ec. 6-4)

U n m arcador quim iolum iniscente popular, ésteres de acridinio, es una m olécula orgánica de anillo triple enlaza­ da m ediante un enlace de éster con una cadena orgánica. E n presencia de peróxido de hidrógeno y en condiciones alca­ linas, el enlace de éster se rompe y perm anece una m olécu­ la inestable (N -m etilacridón). La luz es em itida cuando la m olécula inestable vuelve a su estado basal más estable. É ster de acridinio + 2 1 1 ,0 , + OH- —* N -m etilacrid ón + C 0 2 + H ,0 + luz (4 3 0 nm ) (Ec. 6-5)

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

La fosfatasa alcalina conjugada por lo com ún con un anticuerpo ha sido em pleada en los analizadores de inm u­ noensayo autom atizados para producir algunos de los ensayos quim iolu m iniscentes m ás sensibles. La ALP cata­ liza los sustratos fosfato de arilo 1 , 2-d ioxetano adam antilo (A M PPD ) para liberar luz a 4 7 7 nm . E l lím ite de d etección se aproxim a a 1 zm ol, o aproxim adam ente 6 0 2 m oléculas de enzim a .17,18

D iseño del ensayo Inrnu noensayos com p etitivo s. E l prim er ensayo fue un inmunoensayo competitivo en el que el antígeno radiom arcado (Ag*; llam ado tam bién trazador) com pite con antí­ geno no marcado (Ag) por un núm ero lim itado de sitios de enlace (A b) (fig. 6- 6). La proporción de Ag y Ag* que se une con el Ab se relaciona con la co n cen tració n de Ag y Ag* y requiere anticuerpo lim itado en la reacción. E n el ensayo com petitivo, la con cen tració n de Ag* es constan te y lim itada. A medida que aum enta la con cen tració n de Ag, m ás se enlaza con el an ticuerpo, lo que da com o resultado m enos enlace de Ag*. Estos ensayos de reactivo lim itado eran m uy sensibles porque las con cen tracio n es bajas de antígeno no m arcado produ jeron una señal m ensurable grande a partir del antígeno enlazado m arcado. Si el ensa­ yo com petitivo está diseñado para alcanzar el equ ilibrio, los tiem pos de in cu b ació n suelen ser largos. La reacció n de antígeno-anticuerpo se puede realizar en una etapa cuando el antígeno marcado (Ag*), el antígeno no m arcado (Ag) y el anticuerpo de reactivo (A b) se in cu ­ b an de form a sim ultánea ju n to s para producir antígeno enlazado m arcado (Ag*Ab), antígeno no m arcado enlaza­ do (AgAb) y m arcador libre (Ag*) com o se m uestra en la figura 6-6 y la ecuación 6- 6: Ag* (reactivo fijo) + Ag + Ab (reactivo lim itado) —* Ag*Ab + AgAb + Ag*

(Ec. 6-6)

U n ensayo sim ultáneo com petitivo, genérico, heterogé­ n eo, com ienza al pipetear la m uestra de prueba (control de calidad, calibrador o m uestra del p acien te) en tubos de ensayo. A continu ación, se añaden el antígeno m arcado y

FIGURA 6-6.

Inmunoensayo marcado competitivo. Durante la incu­ bación simultánea, el antígeno marcado( ^ ) y el antígeno no mar­ cado ( Q ) compiten por los sitios de enlace de anticuerpo (= ^ ). Con frecuencia se mide el marcador enlazado en el precipitado.

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los reactivos de anticuerpo. D espués de la in cu b ació n y la sep aración de antígeno libre marcado (no enlazado), se m ide el antígeno enlazado marcado. Com o opción, el ensayo com petitivo se puede llevar a cabo en etapas sucesivas. Prim ero, el antígeno m arcado se incuba con el anticuerpo de reactivo y luego se agrega el antígeno m arcado. Después de un tiem po de in cu b a­ ció n largo y u n paso de separación, se m ide el antígeno enlazado m arcado. E ste m étodo increm en ta la sensibilidad analítica del ensayo. Considere el ejem plo del cuadro 6 -3 . U n núm ero rela­ tivam ente pequeño, pero constan te, de sitios de com bi­ n ació n de Ab están disponibles para com binarse con una cantidad constan te, relativam ente grande, de Ag* (traza­ dor) y calibradores co n concentracio nes de antígeno co n o ­ cidas. D ebido a que la cantidad de trazador y anticuerpo son constan tes, la ún ica variable en el sistem a de prueba es la cantidad de antígeno no m arcado. Cuando se incre­ m enta la con cen tració n de antígeno no m arcado, aum enta la con cen tració n (o porcen taje) de trazador libre. Si se em plean varios calibradores, se establece una cur­ va de respuesta. Cuando se increm en ta la concentración de Ag n o m arcado, dism inuye la con cen tració n de trazador que se un e con el Ab. E n el ejem plo presentado en el cuadro 6 -3 , si la cantidad de antígeno no m arcado es cero, el tra­ zador m áxim o se com binará con el anticuerpo. Cuando no está presente el antígeno no m arcado, es posible el m áxim o enlace m ediante el trazador;’ esto se con o ce com o E_, E m a. x ’, 0’ enlace m áxim o o el estándar cero. Cuando la cantidad de antígeno n o marcado es la m ism a que el trazador, cada uno se unirá co n igual cantidad de anticuerpo. A medida que la con cen tració n de antígeno se increm enta en un ensayo com petitivo, la cantidad de trazador que se acom pleja con el reactivo de enlace disminuye. Si el trazador es de bajo peso m olecular, con frecuencia se m ide el trazador libre. Si el trazador es de alto peso m olecular, se m ide el traza­ dor enlazado. Los datos se pueden graficar en una de tres m aneras: enlazado/libre contra la dosis aritm ética de antí­ geno no m arcado; porcentaje enlazado contra el log de la dosis del antígeno no m arcado; y logit enlazado/EQcontra el log de la dosis del antígeno no marcado (fig. 6 -7 ). La fracción enlazada se puede expresar en varios for­ m atos. Enlazado/libre (E/L) son las CPM de la fracción enlazada com parada con las CPM de la fracción libre. E l p orcen taje enlazado (% E) es la CPM de la fracción enlaza­ da com parada co n la CPM del enlace m áxim o del trazador (E Q) m ultiplicadas por 100. La transform ación logit E/Efl es el log natural de (E/E0)/ (l - E/E0). Al usar papel para gráficas logit-log en el que E/E0se grá­ fica en el eje de las ordenadas y el log de la dosis del antígeno no marcado se gráfica en el eje de las abscisas, se produce una recta con una pendiente negativa. La mayor parte de las veces, las m icrocom putadoras calculan la m ejor recta por medio de la regresión lineal; los valores del paciente se pue­ den calcular m ediante la com putadora con esta relación. Es im portante recordar que el m ejo r tipo de técnica de aju ste de curva se determ ina m ediante experim ento, y no hay certeza de que la gráfica logit-log de los datos gene­ re siem pre una recta. Para determ inar el m ejo r m étodo,

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

C U A D R O 6-3. EJEMPLO DE ENSAYO DE ENLACE COMPETITIVO Ag

+

Ag*

+

Ab

AgAb

Ag*

Ab

AgAb

0

200

100

50

200

CONCENTRACIÓN DE REACTIVOS

Ag

+

A g *A b

+

Ag*

CONCENTRACIÓN DE PRODUCTOS

Ag*Ab

Ag*

0

100

100

100

20

80

120

100

200

100

34

66

134

200

200

100

50

50

150

400

200

100

66

34

166

CÁ LCU LO S DE M U ESTRA

DOSIS DE [Ag]

B/F

% B

0

1 0 ° = 50 200

50

80 - = 40 200

100

60 _ gg 200 ~~

200

— 200

400 200

100 100

1

JO -=.67 120 -® 6 _= .4 9 134

=

25

J O - -.33 150

=

17

34 166

=

.20

se deben probar varios de graficación de datos cuando se introd u ce u n nuevo ensayo. Cada vez que se lleva a cabo el ensayo, se debe preparar una curva de respuesta de dosis para com probar el desem peño del ensayo. Recuerde que el error relativo para todas las curvas de respuesta de dosis de radioinm unoensayo (RIA ) es m ínim o cuando E/E0 es 0 .5 y se increm en ta a concentracio nes altas y b ajas de la gráfica. C om o se m uestra en la gráfica de E/E0 contra log de la con cen tració n de antígeno (fig. 6 -7 ), un cam bio rela­ tivam ente grande en la con cen tració n en cualquier extre­ m o de la curva produce poco cam bio en el valor de E/E . Los valores del pacien te obtenidos de un valor de E/E0 m ayor que 0 .9 o m enor que 0 .1 se debe interpretar con precaución. Cuando se m uestran los m ism os datos usando la gráfica logit-log, es fácil pasar por alto el error en cual­ quier extrem o de la recta. Inmunoensayos no competitivos. C onocid os a veces com o ensayos inm un om étricos, los inmunoensayos no competitivos em plean un anticuerpo de reactivo marcado para detectar el antígeno. Se requiere exceso de anticuerpo m arcado para asegurar que el anticuerpo de reactivo m ar­ cado no lim ita la reacción. La con cen tració n del antígeno es directam ente proporcional al anticuerpo m arcado en la­ zado com o se m uestra en la figura 6- 8. La relación es lineal hasta u n lím ite y luego está sujeta al efecto de gancho de dosis alta. FIGURA 6-7. Curvas de respuesta de dosis en un ensayo competiti­ vo. E = antígeno enlazado marcado. F = antígeno libre marcado. Eo = enlace máximo. % E = E/E„ x 100.

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CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

% JK 0

O P \

+! < é f ~ o % II

o ___ /

x—

A

B

/

\ V

__

c

FIGURA 6-10. Ensayo de emparedado no competitivo de dos sitios para detectar anticuerpo. El antígeno inmovilizado ( 0 ) capta al anticuerpo (= ^ ) . Entonces, se añade el anticuerpo marcado (=í4(), se enlaza con el anticuerpo captado y se detecta. Concentración del analito FIGURA 6-8. competitivo.

Curva de dosis respuesta en un Inmunoensayo no

E n el ensayo de emparedado para detectar antígeno (co n ocid o tam bién com o ensayo de captación de antí­ gen o), el anticuerpo no m arcado, inm ovilizado, capta el antígeno. D espués del lavado para elim inar m oléculas que no reaccionaron, se añade el anticuerpo d etector m arca­ do. D espués de otro lavado para elim inar el anticuerpo detector marcado libre, la señal del anticuerpo m arcado enlazado es proporcional al antígeno captado. E ste form a­ to depende de la capacidad del reactivo de anticuerpo para reaccionar con un solo epitopo en el antígeno. La especi­ ficidad y cantidad de anticuerpos m onoclon ales ha perm i­ tido la expansión rápida de diversos ensayos. E n la figura 6 -9 se m uestra un esquema. E l ensayo de emparedado es otro estudio no com petiti­ vo em pleado para detectar an ticuerpo, en el cual el antíge­ n o inm ovilizado capta anticuerpo específico. D espués de lavar, el anticuerpo detector m arcado se añade y se enlaza co n el anticuerpo captado. La cantidad de anticuerpo m ar­ cado enlazado es directam ente proporcional a la cantidad de anticuerpo específico presente (fig. 6 -1 0 ). Este estudio

FIGURA 6-9. Ensayo de emparedado no competitivo de dos sitios para detectar antígeno. El anticuerpo inmovilizado ( = 0 capta al antígeno (=f^)- Entonces, se añade el anticuerpo marcado ( 0 ), se enlaza con el antígeno captado y se detecta.

se puede m odificar para determ inar la clase de inm unoglobulina del anticuerpo específico presente en el suero. P or ejem p lo, si el anticuerpo detector fuera m arcado y no específico (p. e j., IgM antihum ana de co n ejo [específica de cadena p ]), detectaría y cuantificaría sólo la IgM hum ana captada por el antígeno inm ovilizado.

T écnicas d e separación Los inm un oensayos requieren que el reactivo m arcado libre se distinga del m arcado enlazado. E n ensayos hetero­ géneos, la separación física es necesaria y se logra m ediante absorción, p recipitación o in teracció n con una fase sólida com o se lista en el cuadro 6 -4. M ientras m ejo r sea la sepa­ ración del reactivo enlazado del libre, m ás confiable será el ensayo. Esto contrasta con los ensayos hom ogéneos en los que la actividad o expresión del m arcador depende de si el reactivo m arcado está libre o enlazado. No se requiere ninguna etapa de separación en ensayos hom ogéneos. A d s o r c i ó n . Las técnicas de adsorción em plean partículas para captar antígenos pequeños, marcados o no marcados. Por lo com ún se usa una m ezcla de carbón vegetal y dextrano entrecruzado. E l carbón vegetal es poroso y se com bina fácil con m oléculas pequeñas para elim inarlas de la disolu­ ción; el dextrano evita que proteína no específica se enlace con el carbón vegetal. E l tamaño del dextrano afecta el de la molécula que puede ser absorbida; mientras m enor sea el peso m olecular del dextrano empleado, más pequeño es el peso m olecular del antígeno libre que puede ser absorbi­ do. Otros adsorbentes son sílice, resina de intercambio iónico o Sephadex. Después de la absorción y la centrifugación, el antígeno libre marcado se encuentra en el precipitado. P r e c i p i t a c i ó n . La precipitación no inm un e ocurre cuando el am biente se m odifica afectando la solubilidad de la proteína. Los com puestos com o el sulfato de am onio, sulfato de sodio, p olietilenglicol y etanol precipitan pro­ teína de m anera no específica; precipitarán tanto anticuer­ po libre com o com plejos antígeno-anticuerpo. E l sulfato de am onio y el sulfato de sodio “separan” las globulinas libres y los com p lejo s antígeno-anticuerpo. E l etanol des­ naturaliza proteína y com plejos antígeno-anticuerpo, y causa precipitación. E l polietilenglicol precipita moléculas

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CÜNICA

CUADRO 6-4. CARACTERÍSTICAS DE TÉCNICAS DE SEPARACIÓN TÉCN ICA DE SEPARACIÓN

Adsorción

EJEM PLO

Carbón vegetal

ACCIÓN y

dextrano

Sílice

Trampas de antígeno libre marcado Separación por centrifugación

Resina de intercambio iónico Sephadex Precipitación No inmune

Etanol

Desnaturaliza al antígeno enlazado marcado

Sulfato de amonio

Separación por centrifugación

Sulfato de sodio Polietilenglicol Inmune

Segundo anticuerpo

Se reconoce al anticuerpo primario y se forma complejo insoluble

Proteína estafilocócica A Fase sólida

Poliestireno

Separación por centrifugación

Membranas

Se absorbe un reactivo o se une por enlace covalente con la superficie inerte

Partículas magnetizadas

Separación por lavado

de proteína m ás grandes con o sin el antígeno unido. Idealm ente, después de la centrifu gación, todo el antígeno enlazado marcado estará en el precipitado, y dejará al antí­ geno libre m arcado en el sobrenadante. Los com p lejos solubles antígeno-anticuerpo pueden ser precipitados m ediante u n segundo anticuerpo que recon o ce al anticuerpo prim ario en el com p lejo soluble. El resultado es un com p lejo más grande que se vuelve in solu ­ b le y precipita. La centrifu gación se utiliza de nuevo para ayudar a la separación. Este m étodo de separación inm une se con o ce tam bién com o m étodo de anticuerpo doble o segundo anticuerpo. Por ejem plo, en un ensayo de hor­ m ona de crecim iento, el anticuerpo prim ario o específico de antígeno producido en un co n ejo recon o ce a la h orm o­ na de crecim iento. E l segundo an ticuerpo, producido en una oveja o cabra, reconocería al anticuerpo de con ejo. L os com p lejos antígeno-anticuerpo m arcados, com p lejos antígeno-anticuerpo no marcados y an ticuerpos prim arios libres precipitan con el segundo anticuerpo. Este m étodo de separación es más específico que la p recipitación no inm une porque sólo precipita el anticuerpo prim ario. Una separación sim ilar ocurre cuando la proteína estafilocócica A (SPA) sustituye al segundo anticuerpo. La SPA se une con IgG hum ana y causa precipitación. F a s e s ó lid a . E l uso de una fa s e sólida para inm ovilizar anticuerpo de reactivo o antígeno provee un m étodo para separar reactivo marcado enlazado del libre después de lavar. E l soporte de fase sólida es una superficie inerte a la que se une el antígeno del reactivo o anticuerpo. E l soporte de fase sólida puede ser, pero no está lim itado a, superficies de poliestireno, m em branas y cuentas m agnéticas. E l antígeno inm ovilizado o anticuerpo puede ser absorbido o enlazado de form a covalente con el soporte de fase sólida; el enlace covalente evita la liberación espontánea del antígeno inm o­

vilizado o anticuerpo. Los inm unoensayos con separación de fase sólida son más fáciles de efectuar y automatizar, y su ejecu ción requiere m enos m anipulación y tiem po que otros inm unoensayos. Sin embargo, es necesaria una cantidad relativam ente grande de anticuerpo de reactivo o antígeno para cubrir la superficie de la fase sólida y es difícil lograr la cobertura uniform e de la fase sólida. Cuesta más producir ensayos de fase sólida y requieren mayor habilidad técnica a fin de m inim izar la variabilidad intraensayo e interensayo. E l lavado insuficiente es una fuente de error com ún.

E jem plos d e inm unoensayos m arcados E l inm unoensayo de in h ib ición tu rbid im étrico m ejo ra­ do por partículas (P ETIN IA ) es un inm unoensayo com ­ petitivo hom ogéneo en el que los haptenos de b ajo peso m olecular enlazados a partículas com piten con analito no marcado por u n anticuerpo específico. E l grado de aglu­ tinación de partículas es inversam ente proporcional a la con cen tració n de analito no m arcado y se evalúa m idiendo el cam bio en la luz transm itida en un analizador clín ico autom ático (ACA) (D uPont; ahora, D ade ).19 Los análisis de inm un oabsorción ligados a enzim as (E L ISA ), un grupo popular de inm un oensayos heterogé­ neos, tien en un m arcador enzim ático y usan una fase sóli­ da com o la técnica de separación. Cuatro form atos están disponibles: un ensayo com petitivo con antígeno m arca­ do, un ensayo com petitivo co n anticuerpo m arcado, un ensayo no com petitivo para detectar antígeno y u n ensayo no com petitivo para detectar anticuerpo. U no de los prim eros ensayos hom ogéneos fue la téc­ nica de inm un oensayo de m u ltip licación de enzim as (E M IT ), un ensayo enzim ático que produce en la actu a­ lidad Syva C o rp oration .20 Com o se m uestra en la figura 6- 1 1 , los reactivos en la m ayor parte de los sistem as de

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

FIGURA 6-11. Técnica de inmunoensayo multiplicado por enzima. (A) Cuando el antígeno marcado con enzima se une con el anticuer­ po, se inhibe la actividad enzimática. (B) El antígeno libre del paciente se une con el anticuerpo y evita que éste se enlace con el antígeno marcado. El sustrato indica la cantidad de antígeno libre marcado.

prueba inclu yen u n antígeno m arcado con enzim a (por lo com ún, un analito de b ajo peso m olecular, com o un fár­ m aco ), u n anticuerpo dirigido con tra el antígeno, el sus­ trato y el antígeno de prueba. La enzim a es catalíticam ente activa cuando el antígeno m arcado está libre (no enlazado al anticuerpo). Se cree que el anticuerpo se com bina con el antígeno m arcado, el anticuerpo im pide estéricam ente a la enzim a. Los cam bios conform acionales que ocurren durante la in teracció n antígeno-anticuerpo inhib en la actividad enzim ática. E n este ensayo h om ogéneo, el antí­ geno n o m arcado en la m uestra com pite con el antígeno m arcado por los sitios de enlace de an ticuerpo; cuando se increm en ta la con cen tració n de antígeno no m arcado, m enos antígeno m arcado con enzim a se puede un ir al anticuerpo. P or tanto, más antígeno m arcado está libre, y la actividad enzim ática es mayor. Los inrnunoensayos de donador de enzim a clonada (C ED IA ) so n ensayos hom ogéneos com petitivos en los que el m arcador diseñado genéticam ente es |3-galactosidasa .21 La enzim a está en dos piezas inactivas: el aceptor y el donador de enzim a. Cuando se u n en estas dos piezas, se restablece la actividad enzim ática. E n el ensayo, el antí­ geno m arcado con el donador de enzim a y el antígeno no m arcado en la m uestra com piten por sitios específicos de enlace de anticuerpo. Cuando el anticuerpo se un e con el antígeno m arcado, el aceptor de enzim a no se puede unir co n el donador de enzim a; por tanto, la enzim a no se res­ tablece y perm anece inactiva. Más antígeno no m arcado en la m uestra da com o resultado m ás actividad enzim ática. E l inm unoensayo enzim ático de captación de m icropartículas (M EIA ) es un análisis autom atizado disponible en el IM x (A bbott Laboratories). Las m icrop artículas sir­ ven com o fase sólida, y una m atriz de fibra de vidrio sepa­ ra el reactivo marcado enlazado. E stán disponibles tanto estudios com petitivos com o no com petitivos. A unque el m arcador es una enzim a (fosfatasa alcalina), el sustrato (fosfato de 4-m etillu m beliferilo ) es fluorogénico.

157

Los inrnunoensayos de fluorescencia de fase sólida (SP FIA ) son análogos a los m étodos ELISA excepto que el m arcador fluoresce. De especial im portancia es FIA X (B ioW hittaker, W alkersville, M D ). E n este ensayo, el anti­ cuerpo en la fase sólida capta al antígeno no m arcado de fase líquida; después de lavar, el anticuerpo d etector (co n u n m arcador fluorescente adherido) reaccion a co n el antí­ geno captado de fase sólida. E l inm unoensayo de fluorescencia por con cen tració n de partículas (P C F IA ) es un inm unoensayo com p etiti­ vo, heterogéneo, en el cual las partículas se em plean para localizar y con cen trar la fluorescencia. E l antígeno m arca­ do y el antígeno no marcado en la m uestra com piten por el anticuerpo enlazado a partículas de poliestireno. Las par­ tículas son captadas y se m ide la fluorescencia. E l ensayo se puede diseñar tam bién de m odo que el anticuerpo m ar­ cado y el anticuerpo no m arcado com pitan por antígeno fijado en las partículas. E l inm unoensayo de transferencia de excita ció n por fluorescencia (F E T I) es un inm un oensayo hom ogéneo, com petitivo, con dos fluoróforos (co m o la fluoresceína y la rodam ina ).22 Cuando los dos m arcadores están próxim os, la luz em itida de la fluoresceína la absorbe la rodam ina. Así, se extingue la em isión de la fluoresceína. E l antíge­ no m arcado con fluoresceína y el antígeno no marcado com piten por el anticuerpo m arcado co n rodam ina. Más antígeno no m arcado dism inuye la cantidad de antígeno m arcado con fluoresceína que se u n e; por tanto, hay más fluorescencia (m enos extin ció n ). E l inm unoensayo de fluorescencia de nivel de sustra­ to (SL FIA ) es otro análisis h om ogéneo, com petitivo. Esta vez, el hapteno se m arca co n u n sustrato; cuando se cata­ liza m ediante una enzim a apropiada se genera producto fluorescente. E l hapteno m arcado con sustrato y el no m ar­ cado en la m uestra com piten con el anticuerpo; la enzim a n o puede catalizar al hapteno m arcado enlazado. E l inm unoensayo de polarización por fluorescencia (FP IA ) es otro ensayo en el que se em plea u n m arcador flu o rescente .23,24 Este inm unoensayo hom ogéneo em plea luz polarizada para excitar al m arcador fluorescente. La luz polarizada se crea cuando la luz pasa por filtros espe­ ciales y consta de ondas lum inosas paralelas orientadas en u n plano. Cuando se em plea luz polarizada para excitar u n m arcador fluorescente, la luz em itida podría ser pola­ rizada o despolarizada. Las m oléculas pequeñas, com o el hapteno marcado fluorescente libre, giran con rapidez y al azar, interrum piendo la luz polarizada. Las m oléculas más grandes, com o las que se crean cuando el hapteno fluores­ cente m arcado se un e a un anticuerpo, giran co n m ás len ­ titud y em iten luz polarizada paralela a la de excitación . La luz polarizada se m ide a un ángulo de 90 ° en com paración con la trayectoria de la luz de excitación . E n u n FP IA com ­ petitivo, el hapteno m arcado fluorescente y el no marcado en la m uestra com piten por sitios de anticuerpo lim itados. Cuando no hay hapteno n o m arcado, el m arcado se une al m áxim o con el anticuerpo, así que se crean com plejos grandes que giran con lentitu d y em iten un nivel alto de luz polarizada. Cuando el hapteno está presente, com pite con el m arcado por los sitios de anticuerpo; a m edida que

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

se increm en ta la con cen tració n de hapteno, m ás hapteno marcado es desplazado y está libre. E l hapteno marcado libre gira co n rapidez y em ite m enos luz polarizada. El grado de desplazam iento de hapteno marcado se relaciona de m odo inverso con la cantidad de hapteno no m arcado presente. E l fluoroinm unoensayo de lantánido m ejorado por d isociación (D E L FIA ) es un sistem a autom atizado (Phar­ m acia) que m ide la fluorescencia retardada en el tiem po del m arcador europio. Este análisis se puede designar com o un ensayo heterogéneo, com petitivo o u n ensayo heterogéneo no com petitivo (em paredado ).23 E l RIA clásico es un ensayo com petitivo, heterogéneo, con un trazador .26 Cuando se m ide el trazador enlazado, la señal del m arcador (cu entas por m inuto) está relacionada inversam ente co n la con cen tració n del antígeno no m ar­ cado en la m uestra.

In m unoensayo rápido La sensibilidad y especificidad de los estudios m arcados autom atizados y la tendencia para el exam en de laborato­ rio descentralizado han originado el desarrollo de estudios que son fáciles de usar, sim ples (m u ch o s clasificados com o descartados o m oderadam ente com p lejos en relación con las Enm iendas de 1 9 8 8 de M ejoram ien to del L aboratorio C lín ico ), rápidos, de sitio neutro y sin requisito de in stru ­ m entación. Los descritos aquí son representativos de equ i­ pos com erciales disponibles en la actualidad; sin em bargo, esta d escripción no pretende ser exhaustiva. Surgen tres categorías de inm unoensayos rápidos: a) partículas látex para visualización de la reacción, b ) flujo de líquido y reac­ tivo m arcado y c) cam bios en la propiedad física o quím ica después del enlace antígeno-anticuerpo. Las prim eras pruebas rápidas fueron aquéllas en las que se añadió suspensión de partículas látex a la m uestra; si el com ponente inm unorreactivo unido a la partícula reco ­ n ocía a su contraparte en la m uestra, ocurría aglutinación m acroscópica. Ahora están disponibles partículas látex coloreadas para facilitar la lectu ra de la reacción. H an surgido dispositivos independientes que usan la naturaleza líquida de la m uestra. E n los sistem as de flu­ jo directo, un reactivo de captación se inm oviliza en una m em brana, la fase sólida. La naturaleza porosa de las m em branas increm en ta el área superficial a la que puede enlazar el reactivo de captación. M ientras más reactivo de cap tación se una a la m em brana, m ayor es la sensibilidad del ensayo potencial. Después que el reactivo de captación se une a la m em brana, otros sitios de enlace se saturan con u n com puesto quím ico de bloqueo no reactivo para redu­ cir el enlace no específico m ediante sustancias en la m ues­ tra del paciente. E n el ensayo, se perm ite que la m uestra que contiene al analito pase por la m em brana y el analito se enlace con el reactivo de captación. P or lo com ún, el líquido es atraído por la m em brana m ediante un m aterial absorbente. E l analito es detectado m ediante u n reactante m arcado, así com o la señal del reactante marcado. E l siguiente paso en el desarrollo de los dispositivos de u n solo uso, autónom os, fue incorporar controles internos. U n esquem a para detectar gonadotropina corión ica h u m a­

na, el ensayo de in m u n ocon cen tración (Im m u n o C on cen tration Assay [IC O N ; H ybritech ]),27,28 crea tres zonas en las que se depositan partículas tratadas de m odo esp ecí­ fico. E n la zona de ensayo, las partículas están cubiertas con anticuerpo de reactivo específico para el ensayo; en la zona de con trol negativa, las partículas están cubiertas con anticuerpo no inm un e; y, en la zona de con trol p ositi­ va, las partículas están cubiertas con u n com p lejo inm un e para el ensayo. La m uestra del pacien te (suero u orina) pasa por la m em brana, y en la zona de ensayo el anticuer­ po de reactivo específico capta al analito. A con tin u ació n , el anticuerpo m arcado pasa por la m em brana, que fija al com p lejo inm une específico form ado en la zona de ensayo o en la zona de control positiva. Después de la form ación de color, se nota una reacción positiva cuando se colorean las zonas de ensayo y positiva. U n segundo inm unoensayo hom ogéneo conlleva el flu­ jo tangencial de líquido por una m em brana. E l líquido se disuelve y se enlaza con el reactivo de captación seco; el com p lejo fluye hacia el área de d etección, donde se c o n ­ centra y observa. U n tercer inm unoensayo hom ogéneo, la inm un ocrom atografía enzim ática, tiene que ver con flujo de líquido a lo largo de una m em brana .29 Éste es cu antitativo y no requiere ninguna instrum entación. Una tira de papel seco con anticuerpo inm ovilizado se sum erge en la d isolu ción de analito no m arcado y un analito marcado con enzim a; el líquido asciende por la tira m ediante a cción capilar. C onform e m igran el analito marcado y el no m arcado, com piten y se une co n el anticuerpo inm ovilizado. Se absorbe una cantidad finita de m ezcla de analito m arcado y no m arcado. La distancia de m igración del analito m ar­ cado se observa cuando la tira reacciona con un reactivo de sustrato y se form a un producto de reacció n coloreado. Com parar la distancia de m igración de la m uestra con el calibrador perm ite asignar la con cen tració n de ligando no marcado. La siguiente generación de inm un oensayos rápidos se relaciona co n el cam bio de las propiedades físicas o q u í­ m icas después que ocurre una in teracció n antígeno-anti­ cuerpo. U n ejem plo es el inm unoensayo óp tico (O IA ).30 Se em plea una oblea de Silicon para soportar una película fina de recubrim iento óptico; luego, ésta se cubre con el anticuerpo de captación. La m uestra se aplica d irectam en­ te al dispositivo. Si se form a un com p lejo an tíg en o-anti­ cuerpo, el espesor de la superficie óptica se increm enta y cam bia la trayectoria óptica de la luz. E l color cam bia de dorado a púrpura. A lgunos estudios hacen pensar que este m étodo tiene una m ejo r sensibilidad analítica en com pa­ ración con los inm unoensayos, que dependen del flujo de líquido.

Inm uno tra nsferencia s Casi todos los estudios descritos hasta aquí están d iseña­ dos para m edir un solo analito. E n algunas circunstan­ cias, es b enéfico separar m últiples antígenos m ediante electroforesis para poder detectar al m ism o tiem po m ú l­ tiples anticuerpos séricos. La Western blot es una técnica de transferencia que se emplea para detectar anticuerpos

CAPITULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

específicos. C om o se ilustra en la figura 6 -1 2 , m últiples antígenos de proteina (co m o los relacionados con el virus de la inm unod eficiencia hum ana [H IV ]) se aíslan, des­ naturalizan y separan m ediante dodecil sulfato de sodioelectro fo resis en gel de poliacrilam ida (SD S-PA G E). El SDS desnaturaliza la proteína y añade un a carga negativa global proporcional al peso m olecu lar de la proteína. La PAGE de proteínas tratadas co n SDS perm ite la separación de proteína con base en el peso m olecular. Las proteí­ nas separadas se transfieren en ton ces a un nuevo m edio (co m o m em brana de nylon, nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilid eno). Las proteínas separadas se fijarán en el nuevo m edio y se pueden teñir para asegurar la sepa­ ración. Cada carril en la m em brana se incuba con una

1 2

Extracto de proteína de cepa

B

3 4

+ Electroforesis SDS-PAG

o

1 2 □



3 4





cm cm cm cm

Proteínas separadas transferidas

c m tm

im

cm

1 2

3 4

=>

[=□ t i i

i

i

i

cm

E + Revestimiento con Ig-HRP antihumana

F

+ Anticuerpo visualizado del paciente

FIGURA 6-12. inmunotransferenda (W estern blot) para detectar anticuerpos para antígenos de HIV. (A) Se desestabiliza al HIV y se extrae para generar sus antígenos. (B) Los antígenos de HIV son separados mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida. (C) Se vizualizan los antígenos separados y luego se transfieren a una membrana. (D) Cada carril de la membrana se recubre con un suero de paciente o de control. (E) Después de la incu­ bación y el lavado los carriles se recubren con reactivo de anticuerpo marcado. (F) Se detecta el anticuerpo enlazado marcado.

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m uestra del pacien te o de control. E l anticuerpo recon o ce al antígeno y se enlaza con él para form ar u n com p lejo insoluble. D espués del lavado, un reactivo de anticuerpo m arcado detecta el com plejo. D ependiendo del marcador, se podría obtener u n producto fotom étrico, fluorescente o quim iolu m iniscente que aparece com o una banda. Las bandas de la m uestra del pacien te se com paran con las del con trol que con tien en anticuerpo que reaccionará con antígenos con ocid os. Los m arcadores de peso m olecular se separan tam bién y se tiñen para proveer una guía para la interpretación del peso m olecular.

Inm unocitoquím ica e inm unohistoquím ica Cuando los reactivos de anticuerpo se em plean para detec­ tar antígenos en células o tejidos, los m étodos se co n o cen com o inmunocitoquímica e inmunohistoquím ica, respecti­ vam ente. Cuando el antígeno es una parte integral de la célula o el tejid o, éste es u n análisis directo. U na segun­ da estrategia, el análisis indirecto, em plea células o te ji­ do com o sustrato; este com plejo se detecta en ton ces por m edio de un reactivo de anticuerpo m arcado. Los m arcadores fluorescentes son los m ás com unes en inm u n ocitoq u ím ica o inm unohistoquím ica. Cuando se em plean para identificar m icroscópicam ente bacterias o constitu yentes en tejid o (co m o com p lejos inm unes depo­ sitados in vivo), el m étodo se llam a inmunofluorescencia directa (IF D ) o ensayo de fluorescencia directa (E F D ). Se requiere un m icroscopio de fluorescencia configurado de m odo especial. Se seleccion an longitudes de onda de luz m ediante un filtro m onocrom ador para excitar el m arca­ dor fluorescente; éste em ite luz de una segunda longitud de onda que se selecciona para ver por u n segundo filtro m onocrom ador. E jem plos de E FD son la d etección de Trepon em a pallidum en líquido de lesión o d etección de com ­ p lejos inm unes en la glom erulonefritis relacionada con el síndrom e de Goodpasture y nefritis del lupus. Cuando se em plea un m arcador fluorescente en el aná­ lisis indirecto, éste es inmunofluorescencia indirecta (IFI) o un ensayo de inm unofluorescencia in directo (E IF ). E l sustrato se coloca en una placa de m icroscopio, se cubre con una capa de suero y se perm ite que reaccione con el antígeno, y el anticuerpo enlazado se detecta m ediante el reactivo de globulina antihum ana m arcada. La placa se ve con un m icroscopio de fluorescencia. E l E IF más com ún llevado a cabo en el laboratorio clín ico detecta anticuer­ pos para antígenos nucleares (AAN ). Tanto el título com o el patrón de fluorescencia proveen inform ación útil para diagnosticar enferm edad tisular conectiva. O tros autoanticuerpos y anticuerpos para enferm edad in feccio sa se pue­ den detectar m ediante el EIE

Inm unofenotipia U n avance im portante y más reciente en la in m u n ocito­ quím ica es el uso de un citóm e tro de flujo para detectar antígenos de superficie intracelulares y celulares. Esta téc­ nica, inmunofenotipia, se em plea para clasificar lin a je celu ­ lar e identificar la etapa de m ad uración de la célula. En particular, la inm unofenotipia ayuda en el diagnóstico de leucem ias y linfom as. D iferenciar entre leucem ia m ielóge-

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUIMICA CLÍNICA

na aguda y leu cem ia linfoblástica aguda es d ifícil, desde el punto de vista m orfológico, y requiere m ás inform ación para identificar las m oléculas expresadas fenotípicam ente. E n las leu cem ias linfoides y linfom as, la identificación de células tum oraies, com o lin focitos T o B, puede ser un pred ictor im portante de resultado clínico. O tra aplicación es determ inar la relación CD4/CD8 (la relación del núm ero de lin focitos T colaboradores a lin focitos T cito tó xico s) y, m ás reciente, el núm ero absoluto de células positivas CD 4. É ste es el m étodo estándar para diagnosticar in fec­ ción , e iniciar y m onitorear el tratam iento aunque la cuantificación de carga viral sea considerada por m u chos com o un m ejo r marcador. La inm unofenotipia com ienza con una suspensión de células vivas. Las células pueden provenir de sangre peri­ férica, m édula ósea o tejido sólido. Los leu cocitos o células m ononu cleares se pueden aislar por m edio de separación de gradiente de densidad (cen trifu gación por Licoll-H ypaque) o m ediante lisis de eritrocitos. E l tejid o, com o ganglio linfático o m édula ósea, requiere elim inación de m ecánica de células del tejido para colectar una suspensión de célu ­ las. C o n base en los antecedentes del pacien te y el tipo de m uestra, se em plea un panel de an ticuerpos m onoclonales (M Ab) m arcados con fluorocrom o. Los fluorocrom os de uso com ú n en inm un ofenotipia son isotiocian ato de fluoresceína, ficoeritrina, clorofila de peridinina, CY-5, aloficocianin a e isotiocian ato de tetram etil rodam ina. Una alícuota de la suspensión celular se incuba con uno o más MAb, lo cual depende del diseño del citóm etro de flujo. Si la célula expresa el antígeno, entonces el MAb m arca­ do se enlaza y se puede detectar el m arcador fluorescente. La citom etría de flu jo se basa en células transportadas b ajo presión fluídica pasando una por una por un haz láser. La dispersión de luz directa, la dispersión de luz lateral y la em itida de m arcadores fluorescentes se d etectan m ediante tubos fotom ultiplicadores. La dispersión de luz directa se relaciona con el tam año de la célu la, y la dispersión late­ ral con la granularidad de la célula. Cuando se em plean estos dos parám etros ju n to s en u n diagram a de dispersión (histogram a de dos parám etros), la población de células deseada se puede seleccion ar por m edios electrón icos. En esta población de células se evalúa tam bién la em isión del MAb m arcado. Para un solo parám etro, la frecuencia de las células contra la intensidad de fluorescencia (el núm ero de canal) se registra y presenta com o un histogram a de un solo parám etro. P or otro lado, si se evalúan dos parám e­ tros en la m ism a celda, se genera u n diagram a de disper­ sión que m uestra la expresión de dos antígenos en form a sim ultánea. C on un panel de M Ab, se puede identificar la célu la y determ inar el núm ero relativo o absoluto de la célula.

A nálisis d e D N A m ediante citom etría d e flu jo E n la citom etría de flujo, otro uso del citóm etro de flujo es m edir el contenid o de ácido d eso xirribo n u cleico (DNA) nu clear y la capacidad proliferativa de las células m alig­ nas. E sto ayuda a distinguir entre enferm edad benigna y m aligna, para vigilar el avance de la enferm edad y predecir la respuesta al tratam iento. Las células norm ales en reposo

están en la fase G 0y G t del ciclo celular, y el contenid o de DNA nu clear son dos con ju n tos de 2 3 crom osom as, co n o ­ cido com o diploide. Cuando una célula se prepara para la replicación , se sintetiza DNA (fase S) y el contenid o de DNA es aneuploide. Siguen la m itosis (fase M ) y la divi­ sió n celular. E l estado de ploidía reflejado en el índice de DNA (DNA index, DI) com para la cantidad de DNA m edi­ do en las células tum oraies con el de las células norm ales (ecu ación 6 -7 ): ^

núm ero de canales máximo del pico aneuploide G 0!G l número de canales máxim o del pico diploide G 0/GT (Ec. 6-7)

Si se m idieran las células diploides norm ales, en ton ­ ces el DI es uno. Si el D I no es u n o, entonces las células son aneuploides. Si el DI es m enor que uno, las células son hipodiploides; a la inversa, un DI m ayor que uno es hiperploide. E l porcentaje de células en la fase S se determ ina tam bién y por lo regular es m enor que 5%. Es posible em plear células nuevas fijadas en alcoh ol o células rehidratadas rem ovidas de un bloqu e de parafina. Las células se tratan con un detergente para perm itir que la tin ció n entre al n ú cleo. Las tinciones, com o el yoduro de piridinio o el de etidinio, intercalan el DNA, y la fluo­ rescen cia se m ide con el citóm etro de flujo. E l contenido de DNA se relaciona con la intensidad de fluorescencia (núm ero de can ales). M edir el D I y el porcentaje de célu ­ las de la fase S son indicadores de pron óstico en cán cer de m am a, ovario, vejiga y colorrectal.

SONDAS DE ÁCIDO NUCLEICO E l exam en m olecular es un área en rápida expan sión en el laboratorio clínico. Los laboratorios de investigación han em pleado estas técnicas durante m u chos años; sin em bargo, es reciente el desarrollo de los estudios apro­ bados por la FD A para la d etección y cu antificación de DNA y RNA en m uestras quím icas. A suntos de calidad im portantes que se atenderán en cualquier estudio clín ico basado en DNA son la calidad y preparación de la m uestra, sensibilidad de los reactivos a contam inantes inactivadores, sesgo de la am plificación y variabilidad, selecció n de controles apropiados, desem peño de la enzim a de restric­ ción , y reproducibilidad y contam in ación cruzada de reac­ ciones de am p lificación .31 Los ácidos n u cleico s alm acenan toda la inform ación genética y dirigen la síntesis de pro­ teínas específicas. Al evaluar ácidos n u cleico s, se podría in ten tar com prender m ejo r los cam bios celulares antes de poder detectar productos proteín icos específicos. Las enferm edades con base genética, presencia de organism os in fecciosos, diferencias entre individuos para propósitos forenses y de trasplantes y la regulación del crecim iento celu lar alterado son áreas que han sido investigadas con h ibrid ación de ácido n u cleico. E l avance m ás reciente es el uso de sistem as m oleculares (hasta 105 a 106sondas por sistem a) para análisis de alta velocidad de ligandos m ú lti­ ples y el análisis de expresión génica.

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

Q uím ica del ácido nucleico E l DNA alm acena inform ación genética hum ana y dicta la secu encia de am inoácidos de péptidos y proteínas. El DNA está com puesto de dos hebras de n u cleótid os; cada una es un polím ero de m oléculas de desoxirribosa unidas m ediante enlaces fuertes de 3 ' 5 ' fosfodiéster que u n en al grupo 3 ' hidroxilo de un azúcar con el grupo 5 ' fosfato de un segundo azúcar. Una base de purina o pirim idina está unida tam bién a cada azúcar. Las dos hebras están dispuestas en una hélice doble con las bases apuntando hacia el centro. Las hebras son antiparalelas, de m odo que el extrem o 3 ' 5 ' de una hebra se enlaza con una hebra en la d irección 5 ' 3 '. D ebido a que los ésteres de fosfato son ácidos fuertes y se d isocian a pH neutro, la hebra tie­ ne una carga negativa que es proporcional a su longitud. Las bases de purina (adenina [A] y tim ina [T] y las bases de pirim idina (citosina [C] y guanina [G ]) m antienen la doble hélice al form ar puentes de hidrógeno entre pares de bases com o se m uestra en la figura 6 -1 3 . La adenina form a pareja con la tim ina con dos puentes de hidrógeno, y la citosin a se ju n ta con la guanina co n tres puentes de h id ró­ geno. Las hebras son com plem entarias debido a la m anera fija m ediante la cual se enlazan los pares de bases. Bajo con d icio n es fisiológicas, la estructura helicoidal del DNA de doble hebra (dsDN A) es estable debido a los num erosos puentes de hidrógeno, aunque débiles, entre los pares, y la in teracció n hidrófoba entre las bases en el centro de la hélice. Sin em bargo, los enlaces débiles se pue­ d en rom per in vitro al cam biar las cond icion es am bienta­ les; las hebras se desnaturalizan y separan entre sí. Una vez desnaturalizadas, la carga negativa de cada hebra im pide

5'

3'

161

que una se acerque a la otra. Las dos hebras com plem en­ tarias se pueden volver a un ir o anillar si las cond iciones cam bian y favorecen esto. La renaturalización seguirá las reglas de la form ación de pares de bases de m odo que se recupere la m olécula original de DNA. E l ácido ribo n u cleico (RN A) tam bién está presente en las células hum anas y es sim ilar al DNA desde el punto de vista quím ico. E l RNA difiere del DNA en tres form as: a) la ribosa sustituye a la desoxirribosa com o el azúcar; b ) el uracilo reem plaza a la tim ina com o una purina base, y c) el RNA es de una sola hebra. E l DNA y el RNA trabajan ju n to s para sintetizar proteínas. E l dsDNA genóm ico es dividido por enzim as en sus dos hebras, una de las cuales sirve com o la plantilla para la síntesis de RNA m ensajero com plem entario (m RN A ). Cuando el mRNA se libera de la plantilla de DNA, la hebra de DNA se vuelve a anillar. El mRNA especifica el am inoácido que se añadirá a la cadena de péptido m ediante RNA de transferencia, que transporta el am inoácido al ribosom a, donde se prolonga la cadena peptídica. Esta d escripción de síntesis de proteínas rem arca que desde el punto de vista fisiológico el DNA se desnatura­ liza de form a rutin aria, se un e con el RNA y se vuelve a anillar para restablecer el DNA original, siguiendo siem ­ pre las reglas de pares de bases. Estos procesos form an la base de los estudios de hibridación de ácido n u cleico en los que las hebras com plem entarias de ácido n u cleico de fuentes no relacionadas se u nen para form ar un híbrido o dúplex. E l exam en m olecular en el laboratorio clínico consiste en dos áreas principales: a ) el uso de sondas de DNA para detectar de m anera directa o caracterizar un b lan co específico, y b) el uso de tecnologías de amplificación de ácido n u cleico para detectar o caracterizar un DNA o RNA b lanco específico. Entre los proced im ientos en los que se em plean sondas están los estudios de fase sólida (hibrid ación de captación, Southern blot y Northern blot ), estudios con base en d isolu ción (estudios de p rotección , análisis de captación de híbrid o) y estudios de hibrid a­ ción in situ. Los procedim ientos de am plificación inclu yen am plificación de ácido n u cleico (reacción en cadena de la polim erasa, am plificación de secu encia con base en ácido n u cleico , am plificación m ediada por tran scripción, am pli­ ficación por desplazam iento de h ebra), am plificación de sonda (reacción en cadena de la ligasa) y am plificación de señal (ensayo de DNA de cadena ram ificada).

Técnicas de hibridación

FIGURA 6-13.

Representación de una molécula de DNA.

Una sonda de ácido nucleico es una hebra corta de DNA o RNA de una secu encia conocid a que está b ien carac­ terizada y es com plem entaria para la secu encia base en el b lan co de prueba. Las sondas pueden ser fragm entos de ácidos n u cleico s genóm icos, DNA clonado (o RNA) o DNA sin tético. Los ácidos n u cleico s genóm icos se aíslan de organism os purificados. Algunas sondas son clonadas m olecularm ente en el huésped bacteriano. Prim ero, la secu encia de DNA que se em pleará com o sonda debe ser aislada por m edio de endonucleasas de restricció n b acte­ rianas para el DNA en una secu encia base específica. La secuencia base deseada (la sonda) se inserta en un vector

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

plasm ldico, dsDNA circular. E l v ector co n el inserto se incorpora en una célula huésped, com o E scherichia coli, donde se duplica el vector. La secu encia base deseada duplicada se aísla y purifica. Para fragm entos de DNA cor­ tos, se puede sintetizar una sonda de oligonucleótido por m edio de u n proceso autom atizado; si se con o ce la secu en­ cia de am inoácido de la proteína, es posible determ inar la secu encia base a partir de la secu encia de am inoácido. E n una reacció n de hibrid ación, la sonda debe ser detec­ tada. La sonda se puede m arcar de form a directa con una radionúclido (co m o 32P ), enzim a o biotina. 32P se detecta m ediante autorradiografía cuando el m arcador radiactivo expone la pelícu la de rayos X siem pre que la sonda esté localizada. Si la sonda se m arca de form a directa con una enzim a, se debe añadir un sustrato apropiado para generar u n producto colorim étrico, fluorescente o quim iolu m iniscente. Las sondas m arcadas con biotina se pueden un ir a avidina, que es acom plejada a una enzim a (co m o ALP o H R P ); entonces se puede d etectar la actividad enzim áti­ ca. P or otro lado, la sonda biotinilad a se puede detectar m ediante un reactivo de anticuerpo de avidina marcado. Las técnicas con sonda que se analizan se listan en el cuadro 6 -5 . U n m étodo clásico para el análisis de DNA, atribuido a EM Sou thern ,31 es la Southern blot. E n este m étodo, el DNA se extrae de una m uestra co n un reactivo fenólico y luego se digiere de form a enzim ática por m edio de endonucleasas de restricció n para producir fragm entos de DNA. E stos fragm entos se separan después m ediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragm entos de DNA se desnaturalizan y transfieren a un m edio de soporte sólido; la m ayor parte de las veces, nitrocelulosa o una m em brana

de nylon con carga. La transferencia ocurre por la acción capilar de una disolu ción salina, y el DNA se transfiere a la m em brana, o bien , se usa corriente eléctrica para transfe­ rir el DNA. Cuando el DNA está en la m em brana, se añade una sonda que se un e con la secu encia base com plem en­ taria y aparece com o una banda. E n un m étodo sim ilar, la N orthern blot, el RNA experim enta extracció n , digestión, electroforesis, transferencia y, por últim o, sondeo. La reacción en cadena de la p olim erasa (PCR) que desa­ rrollo KB M ullis de Cetus Com pany 32-33 es una técnica de hibrid ación am plificada que sintetiza de form a enzim áti­ ca m illones de copias del DNA b lanco para increm entar la sensibilidad analítica. La m ezcla de reacció n de prueba inclu ye la m uestra de DNA (células disueltas o tejido dige­ rido enzim áticam ente con RNAasa y proteinasa y extraí­ do d espués), cebadores de oligonucleótido, polim erasa de DNA term oestable (p. ej., polim erasa Taq, de Thermus aquaticus ) y trifosfatos de nucleótido (ATP, GTP, C T P y T T P ) en una disolu ción am ortiguadora. E l proceso, m os­ trado en la figura 6 -1 4 , com ienza co n el calentam iento de

A DNA blanco

>"» i "n r ^ m T i i i i T"H~t~3 o

B Desnaturali­ zación

o C Adición de reactivos

D Extensión

CUADRO 6-5. TÉCNICAS CON SONDA__________ _ No amplificada

'1

O lili ri i iT T Z 2 L Z 1 ... TI.f 1 5' O

Southern blot Northern blot Hibridación in situ

3'

E Desnaturali­ zación

Polimorfismo de la longitud del fragm ento de restricción (PLFR) Amplificación del blanco

o

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Reacción en cadena de la transcriptasa polimerasa inversa (RT-PCR)

F Ciclo repetido 20 - 30X

r/_ w

Replicación de secuencia autosostenida (3SR) Amplificación de sonda

O

Replicasa Q-beta Reacción en cadena de la ligasa (LCR) Amplificación de señal Múltiples marcadores por sonda Múltiples sondas por blanco Sistema de sonda de estratificado doble Ensayo de DNA ramificado (bDNA)

G Producto 3'a FIGURA 6-14. Reacción en cadena de la polimerasa. (A) La secuen­ cia de DNA blanco se indica mediante la línea en negrita; (B) el DNA de doble hebra se desnaturaliza (separa) por calentamiento; (C) se añaden los reactivos, y el cebador se une con la secuencia de DNA blanco; (D) la polimerasa extiende los cebadores, y (E-G) se repiten el calentamiento, anillado del cebador y la extensión.

CAPITULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

DNA b lanco para desnaturalizarlo, separando las hebras. D os cebadores de oligonucleótido (sondas) que recon o cen los bordes del DNA blanco se añaden y anillan al DNA blanco. La polim erasa de DNA term oestable y los trifos­ fatos de d inucleótido extienden el cebador. E l proceso de d esnaturalización por calor, enfriar para perm itir que los cebadores anillen y calentar de nuevo para extend er los cebadores, se repite m uchas veces (1 5 a 3 0 veces o m ás). La P C R es una reacción de am plificación expon encial en la que después de n ciclos hay (1 + x )n veces la cantidad de b lanco que estuvo presente al in icio , donde x es la eficien­ cia m edia de la reacción para cada ciclo . E n teoría, unos 20 ciclo s producirían casi 1 m illón de veces la cantidad de DNA b lanco presente en un principio. Sin em bargo, en realidad, nu nca se alcanzan los m áxim os teóricos, y se requieren m ás ciclo s para alcanzar tales niveles de am pli­ ficación. Las secu encias de DNA b lanco am plificadas, co n o ci­ das com o am plicones , se pueden analizar m ediante elec­ troforesis en gel, Southern blot o con sondas marcadas de m odo directo. Cuando el b lan co es RNA o mRNA m icro­ biano, el RNA debe ser convertido de form a enzim ática a DNA m ediante la transcriptasa inversa; el produ cto, DNA com plem entario (cD N A ), se puede analizar en ton ces por PCR. E ste m étodo se denom ina reacción en cadena d e la transcriptasa p olim erasa inversa (RT-PCR). Al principio, la PC R era un ensayo cualitativo, pero se han desarrollado estudios que perm iten la cu antificación de am plicones. La RT-PCR cuantitativa se usa para m edir cargas virales en p acientes infectados con H IV y hepatitis C. Estos n ú m e­ ros perm iten a los m édicos determ inar el estado m órbi­ do y evaluar la eficacia de los tratam ientos antivirales. La reciente innovación de la P C R es el desarrollo de la RTP C R de “tiem po real”, que perm ite la m ed ición directa de acu m ulación de am plicón durante la fase expon encial de la reacción. D os hallazgos im portantes con d u jeron al des­ cubrim iento de la PC R de tiem po real. Prim ero, encontrar que la polim erasa Taq posee actividad de 5'-> 3 '-e x o n u cleasa34,35; segundo, la con stru cción de sondas de oligo­ nu cleótid o con m arcador dual que em iten una señal de fluorescencia sólo en la división, con base en el principio de la transferencia de energía de resonancia p o r fluorescencia (FRET).36 La F R E T conlleva la transferencia no rad iacti­ va de energía de una m olécula donadora a una m olécula aceptora. Los sistem as basados en sonda, com o las sondas Taq-M an ,37 guías m oleculares 38 y cebadores Sco rp io n ,39 dependen de la proxim idad de los fluoróforos donadores y las m oléculas aceptoras de no fluoróforo (supresores) en la sonda no hibridada, de m odo que se genera poca señal o ninguna cuando el acéptor extingue la fluorescencia del donador. E n la hibrid ación para el b lanco, el fluoróforo y el supresor se separan por cam bios conform acionales (guías m oleculares y cebadores S corp ion) o división enzi­ m ática del fluoróforo desde el supresor com o resultado de la actividad de nucleasa 5 ' a 3 ' de la polim erasa de Taq. La d etección en tiem po real ocu rre cuando la em isión de fluorescencia de la sonda reportera (im pulsada por la acu­ m u lación de am plicones) se m onitorea ciclo a ciclo . Los resultados están disponibles de inm ediato y, lo más im por­

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tante, n o hay procesam iento de la m uestra de posam plificación , así que se reduce la probabilidad de contam inar otras m uestras con productos am plificados. La P C R está lim itada por el gasto, la necesidad de co n ­ tar con term ocicladores, posible con tam in ació n con aero­ sol de una m uestra a otra, anillado n o específico y grado de tirantez. La rigidez se relaciona con la estabilidad del enlace entre el DNA o RNA b lan co y la sonda, y se basa en el grado de correspondencia y la longitud de la son ­ da. La estabilidad del dúplex es afectada enérgicam ente por la tem peratura, pH y fuerza ión ica de la disolu ción de hibridación. E n con d iciones de b aja rigidez (tem p era­ tura b aja o fuerza ión ica increm en tad a), ocu rre un enlace im perfecto. Se han desarrollado otras técnicas para vencer algunos de estos defectos, para estandarizar m étodos de uso en laboratorios clín ico s o proveer nuevos m étodos patenta­ dos. Se ha descrito la am plificación del b lan co , la sonda y la señal. E l m étodo clásico de am plificación del blanco, PCR, increm en ta el núm ero de ácidos n u cleico s b lanco de m odo que se puedan usar sistem as sim ples de d etección de señal. O tro m étodo de am plificación del b lan co es la replicación de secuencia autosostenida (3SR), que detecta RNA b lanco y se relaciona co n ciclo s isotérm icos co n ti­ nuos de tran scripción inversa .40,41 U n cebador (polim erasa T 7R N A ) se une co n el RNA y la transcriptasa inversa extiende el cebador anillado. La ribonucleasa H se degrada a RNA y perm ite que se una el segundo cebador, seguida de la síntesis de las secu encias de cDNA y RNA. E l cDNA sirve com o plantilla para la prod u cción de m últiples copias de RNA antisentid o, que se convierte a cDNA. Así, el ciclo se perpetua por sí m ism o. La reacción en cadena de la lígasa (LCR) es una técn i­ ca de am plificación de sonda en la que se em plean dos pares de sondas marcadas que son com plem entarias para dos secu encias de DNA b lanco cortas m uy p ró xim as .42 Después de la hibrid ación, la ligasa de DNA interpreta la rotura entre los extrem os com o una m ella y un e los pares de sondas. El sistem a de replicasa Q -beta utiliza replicasa Q -beta para sintetizar copias adicionales de la secu encia MDV-1 del RNA Q -beta de doble h ebra .43 D espués que se calienta el DNA o RNA b lan co para desnaturalizarlo, se añade una sonda con la secu encia específica de b lan co y la secuencia de MDV-1 y se hibrida. Se elim ina la sonda no ligada, se añaden la replicasa Q -beta y las bases de ribon u cleótid o en exceso, y la am plificación sigue. Los m étodos de am plificación de señal están diseña­ dos para increm en tarla al aum entar la co n cen tració n del marcador. U na sonda puede tener m últiples m arcadores unidos, o b ien podrían estar marcadas varias sondas cor­ tas com plem entarias para cada uno de los blancos. Se ha desarrollado un sistem a de sonda con doble estratificación en el cual parte de la sonda prim aria se un e al DNA blanco y otra parte se extiende lejos del DNA blanco. Se añaden sondas secundarias marcadas que hibrid an la porción de la sonda prim aria, que no está ligada al DNA b lan co. Un poderoso sistem a de am plificación de señal em plea sondas m últiples. Las sondas prim arias m últiples se em plean para

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

enlazar al DNA blanco. Un brazo de una sonda secundaria puede recon o cer un extrem o de la sonda prim aria; una sonda terciaria marcada co n enzim a recon o ce los otros brazos de la sonda secundaria. E l ensayo de DNA ram ifi­ cado (bD N A ) es un ejem plo del últim o m étod o .44 La hibridación in situ se lleva a cabo en células, tejido o crom osom as que se fijan en una placa de m icrosco p io .45 D espués que el DNA se desnaturaliza por calentam ien­ to, se añade una sonda marcada e hibridará la secu encia b lan co después de que se enfría la placa. P or lo com ún se em plean productos colorim étricos o fluorescentes. Una ventaja de este m étodo es el co n tex to m orfológico en el que se considera la localización del DNA blanco. E l polim orfism o de longitud del fragm en to de restricción (PLFR) es una técnica que evalúa diferencias en las secu en­ cias de DNA g en óm ico .46 Esta técnica puede ayudar a esta­ b lecer la identidad o no identidad en el exam en forense o de paternidad, o para identificar un gen relacionado con una enferm edad. E l DNA genóm ico se extrae de una m ues­ tra (co m o leu cocitos sanguíneos periféricos) y se purifica y cuantifica. Se añade una endonucleasa de restricció n, que rom pe las secu encias de DNA en un sitio esp ecífico. Si hay una m u tación o cam bio en el fragm ento de DNA, esto p o d ría cau sar que la lo n g itu d del frag m en to de D NA difiera de la usual. La transferencia Southern se pue­ de usar para identificar las longitudes diferentes de los fragm entos de DNA. Se podría usar una sonda específica marcada para identificar una aberración específica. La PC R se puede usar para am plificar la secu encia de DNA blanco antes del análisis de PLFR.

Aplicaciones de la sonda de ácido nucleico Las sondas de ácido n u cleico se em plean para detectar m icroorganism os infecciosos; detectar configuraciones de genes, translocaciones crom osóm icas o rotura crom osóm ica; detectar cam bios en los oncogen es y factores supresores de tum ores; ayudar en el diagnóstico prenatal de una enferm edad heredada o estado portador; identifi­ car m arcadores polim órficos em pleados para establecer la identidad o no identidad, y para ayudar en la selecció n de donadores. Las sondas de ácido n u cleico son útiles para identificar m icroorganism os en una m uestra de paciente o confirm ar un m icroorganism o aislado en cultivo. En la actualidad se dispone de sondas para confirm ar espe­ cies de M ycobacterium , de Legionella, Salm onella, cepas de E scherichia coli diarreógenas, S higella y especies de Cam pylobacter. Tam bién hay sondas para identificar h o n ­ gos com o B lastom yces derm atitidis, C occidioides immitis, Cryptococcus neoform ans e H istoplasm a capsulatum. La id entificación directa de m icroorganism os en m uestras de p acien tes inclu ye C hlam ydia trachom atis, N eisseria gonorrhea, citom egalovirus, virus de Epstein-Barr y virus de herpes sim ple. Además, el exam en de carga viral para HIV y el virus de la hepatitis C se d etectan por m edio de tec­ n ología de sonda. Los estudios de reconfiguración génica m ediante trans­ ferencia Southern son útiles para distinguir entre lin aje de lin focitos T y B .47 Asim ism o, se ha detectado y m on ito-

reado la tran slocación crom osóm ica relacionada con la m ayor parte de los linfom as foliculares no hod gkinian os y ciertos linfom as difusos de grandes células. E l crom osom a Filadelfia en la leucem ia m ielógena cró n ica se relaciona con la tran slocación que da com o resultado la d etección del gen de fusión bcr/abl.48 E l diagnóstico prenatal de enferm edades genéticas com o la anem ia drepanocítica, fibrosis q u ística ,49 corea de H u ntin gton ,30 distrofia m uscular tipo D u ch en n e ,51 y la enferm edad de W illebrand ha sido posible con el uso de la tecnología de sondas. Además, se puede determ inar el estado portador en la distrofia m u scular tipo D uchenne y la enferm edad de W illebrand. La P C R ha sido utilizada para detectar polim orfism o del com p lejo principal de histocom patibilidad clases I y II .53 La exactitud increm entada de diferencias de detección en los genes, en vez del producto génico, se ha em pleado para m ejorar la com patibilidad de trasplante. L os sistem as m oleculares son con ju n tos ordenados de m oléculas de sonda de DNA únicas unidas a un sopor­ te sólid o .34 Los sistem as consisten en cientos y cien tos de sondas de DNA en lugares determ inados co n precisión en el sustrato fijo. Los sistem as m oleculares se desarrollaron a partir del trabajo de Southern en la década de 1 9 7 0 que dem ostró que las sondas de DNA marcadas se podían usar para interrogar a las m oléculas de DNA unidas a un soporte sólid o .31 Los m icrosistem as se em plean para dos ap licacio­ n es principales, a) determ inación de secu encias de DNA y d etección de m u tación y b ) d eterm inación de expresión génica. E n la actualidad, Affym etrix, Inc. ha desarrollado G eneC hips, m icrosistem as patentados de alta densidad que con tien en 1 0 0 0 0 a 4 0 0 0 0 0 sondas de DNA cortas, diferentes, en una oblea de vidrio de 1.2 por 1.2 cm . Los G eneC hips están disponibles para genotipia de H IV-1 ,55 análisis de m utación de gen supresor tum oral p 53 hum ano, y análisis de m utación de gen p 4 5 0 citocrom o hu m ano, con otros G eneC hips actualm ente en desarrollo.

RESUM EN E n este capítulo se in trod u jeron las bases de los in m u ­ noensayos y las técnicas de sonda de ácido nu cleico . En todos los inm unoensayos se em plean an ticuerpos para d etectar analitos blanco. Los inm unoensayos no m arca­ dos en gel inclu y en m étodos para caracterizar proteínas m on oclonales e identificar anticuerpos esp ecíficos para com ponentes nucleares. Los inm unoensayos no m arca­ dos en la fase soluble se tipifican m ediante nefelom etría y turbidim etría. Los inm unoensayos m arcados han incre­ m entado la sensibilidad analítica. La diversidad de diseños de ensayo, la especificidad m ejorada y confiable de anti­ cuerpos m on oclonales y la autom atización han h ech o a los inm unoensayos cada vez m ás populares en el laborato­ rio clín ico . Los inm unoensayos se describen en térm inos del m arcador utilizado, el m étodo para detectar el m arca­ dor, el requisito para realizar la sep aración (hom ogénea o heterogén ea), el enlace com petitivo o no com petitivo, y la m ed ición cualitativa o cuantitativa. Las técnicas especiali­ zadas en las que se em plean anticuerpos inclu y en inmuno-

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

1. La resistencia del enlace entre un antígeno y un anti­ cuerpo se relaciona con: a) C o ncentración de antígeno y anticuerpo. b ) Fu en te de produ cción de anticuerpo porque los anticuerpos m onoclonales enlazan m ejor. c) Bondad del ajuste entre el epitopo y el F (a b ). d ) Especificidad del anticuerpo. 2. E n la produ cción de anticuerpo m o noclonal, la espe­ cificidad del anticuerpo se determ ina m ediante: a) La línea celu lar de m ielom a. b) Los linfocitos B sensibilizados. c) Los linfocitos T sensibilizados. d ) E l m edio de crecim iento selectivo. 3. ¿Cuál m étodo de precipitación inm une no m arcado se usa para cuantificar proteín a sérica? a) D ifusión doble. b ) fnm unodifu sión radial. c) C ontrainm unoelectroforesis. d) E lectroforesis de inm un ofijación. 4. E n la electroforesis de inm u n ofijación , las bandas dis­ cretas aparecen en el m ism o lugar electroforético; una que reacciona con reactivo de IgA antihum ana (espe­ cífica de cadena a ) y la otra que reacciona con reacti­ vo de 7. antihum ana. E sto se describe m ejo r com o: a) U na proteína m o n oclon al IgA X. b ) U na proteína p o liclo nal IgA X. c) Proteínas b iclonales de IgA. d ) Reactividad cruzada. 5. E n la nefelom etría, la form ación del com p lejo antíge­ no-anticuerpo se increm enta en presencia de: a) D isolu ción salina de fuerza iónica alta. b ) D iso lu ció n salina norm al. c) P olietilenglicol. d) Com plem ento.

6 . E n un RIA heterogéneo, com petitivo, clásico, para m edir T 4, ¿cuáles enunciados son ciertos y cuáles son falsos? a) E l ensayo requiere un paso de separa­ ción. ________ b) E l trazador es T 4 con un radiom arcador.

DE

R E P A S O c)

La m olécula detectora es anti-TT radiomarcado. d) Cuando se increm en ta la con cen tració n de analito en la m uestra de prueba, dis­ m inuye la con cen tració n de la m olécula m arcada enlazada. 7. ¿Cuál inm unoensayo no hom ogéneo depende de in h i­ b ir la actividad del m arcador enzim ático cuando se enlaza a reactivo de anticuerpo para elim inar reactivo de separación marcado libre del reactivo marcado enla­ zado? a) EMIT. b) CEDIA. c) MEIA. d) ELISA.

8. N um ere los pasos en una Western blot en el orden de ejecu ción . E l paso 1 es el prim er paso en el ensayo. a ) Se aíslan y desnaturalizan los antígenos de proteína. b ) E l suero de prueba se in cuba con las pro­ teínas. ________ c) Las proteínas se transfieren a una m em ­ brana de nitrocelulosa. d) Las proteínas se separan m ediante SDSPAGE. e) Se evalúa el reactivo de antisuero m arca­ do que reaccionó.

_

P R E G U N T A S

El futuro de los inm unoensayos y la tecnología de son ­ da de ácido n u cleico será h acer m ás pruebas de form a sim ultánea en una sola m uestra en un solo recip iente de reacción o en una sola superficie de chip. La capacidad para detectar diferentes m arcadores y recon o cer m oléculas de captación perm itirá la d etección sim ultánea de u n núm ero exp onencial de analitos o secu encias. E l análisis m últiple reem plazará al panel de prueba, que ahora consiste en pruebas individuales preform adas por separado.

_

transferencias, in m un ocitoquím ica, inm un ohistoquím ica y citóm e tría de flujo. Las sondas de ácido n u cleico , em pleadas para detec­ tar secu encias de DNA o RNA en genom a hum ano, b ac­ teriano o viral, son un grupo diverso de m étodos que son m uy específicos en con d iciones rigurosas. Las técnicas no am plificadas se utilizan por lo general para identificar cam ­ b ios cualitativos. Las técnicas am plificadas que increm en­ tan la cantidad de ácido n u cleico b lanco, sonda o señal se em plean para increm entar la sensibilidad analítica.

165

9. E n la citóm e tría de flujo, el portador lateral reacciona con: a) E l contenid o de DNA de la célula. b) La granularidad de la célula. c) E l tam año de la célula. d) E l núm ero de células en G 0y G r 10.

Los reactivos que se requieren para una reacción de P C R son: a ) Polim erasa de DNA term oestable. b ) D esoxirribonucleótidos individuales. c ) Cebadores de oligonucleótido. d ) Polim erasa Taq. e) Todo lo anterior.

166

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

11. La técnica de ácido n u cleico en la que el RNA se co n ­ vierte a cDNA, que después se am plifica, se con o ce com o: a) PCR. b) RT-PCR. c) PLFR. d ) H ibridación in situ.

1 2 -1 4 .

REFEREN CIAS

20. Rubenstein KE, Schneider RS, Ullman EE “Homogeneous” enzyme immunoassay. A new immunochemical technique. Biochem Biophys Res Commun 1972;47:846. 21. Henderson DR, Freidman SB, Harris JD , et al. CEDIA, a new homo­ geneous immunoassay system. Clin Chem 1986;32:1637. 22. Ullman EE Schwartzberg M, Rubinstein KD. Fluorescent excitation transfer assay: a general method for determination of antigen. J Biol Chem 1976;251:4172. 23. Dandliker WB, Dandiker BJ, Levison SA, et al. Fluorescence methods for measuring reaction equilibria and kinetics. Methods Enzymol 1978;48:380. 24. Dandliker WB, Kelly RJ, Dandiker BJ, et al. Fluorescence polarization immunoassay: theory and experimental methods. Immunochemistry 1973;10:219. 25. Diamandis EP. Immunoassays with time-resolved fluorescence spectroscopy: principies and applications. Clin Biochem 1988;21:139. 26. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest 1960;39:1157. 27. Valkirs GE, Barton R. ImmunoConcentration: a new format for solid-phase immunoassays. Clin Chem 1985;31:1427. 28. Rubenstein AS, Hostler RD, White CC, et al. Particle entrapment: application to ICON immunoassay. Clin Chem 1986;32:1072. 29. Zuk RF, Ginsberg VK, Houts T, et al. Enzyme immunochromatography: a quantitative immunoassay requiring no instrumentation. Clin Chem 1985;31:1144. 30. Harbeck RJ, Teague J , Crossen GR, et al. Novel, rapid optical immu­ noassay technique for detection of group A streptococci from pharyngeal specimens: comparison with standard culture methods. J Clin Microbiol 1993;31:839. 31. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:503. 32. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987; 155:335. 33. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 1990;262:56. 34. Foy CA, Parkes HC. Emerging homogenous DNA-based technologies in the clinical laboratory Clin Chem 2001;47(6):990. 35. Holland PA, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. Detection of specific polymerase chain reaction by utilizing the 5' to 3' exonuclease activity of Thermus aquatícus DNA polymerase. Proc Nati Acad Sci USA 1991;88:7276. 36. Szoflosi J, Damjanovich S, Matyus L. Application of fluorescence resonance energy transfer in the clinical laboratory: routine and research. Cytometry 1998;15:159. 37. Livak K, Flood S, Marmaro J, Giusti W, Deetz K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Meth Appl 1995;4:357.

1. Sheehan C. An overview of antigen-antibody interaction and its detection. In: Sheehan C, ed. Clinical Immunology: Principies and Laboratory Diagnosis, 2nd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1997:109. 2. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predeñned specificity. Nature 1975;256:495. 3. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel. Acta Pathol Microbiol Scand 1949:26:507. 4. Mancini G, Carbonara AO, Heremans JE Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry 1965;2:235. 5. Fahey JL , McKelvey EM. Quantitative determination of serum immunoglobulins in antibody-agar plates. J Immunol 1965;98:84. 6. Grabar P, Burtin P Immunoelectrophoresis. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier, 1964. 7. Alper CC, Johnson AM. Immunofixation electrophoresis: a technique for the study of protein polymorphism. Vox Sang 1969; 17:445. 8. Laurell CB. Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies. Anal Biochem 1966;15:45. 9. Laurell CB. Electroimmunoassay. Scand J Clin Lab Invest 1972;29(suppl 124):21. 10. Kusnetz J , Mansberg HP: Optical considerations: nephelometry. In: Ritchie RF, ed. Automated Immunoanalysis. Part 1. New York: Marcel Dekker, 1978. 11. Engvall E, Perlmann R Immunochemistry 1971;8:871. 12. Van Weemen BK, Schuurs AHWM. Immunoassay using antigenenzyme conjugales. FEBS Lett 1971;15:232. 13. Nakamura RM, Bylund DJ. Fluorescence immunoassays. In: Rose NR, deMarcario EC, Folds JD , Lañe HC, Nakamura RM, eds. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5th ed. Washington, D.C.: ASM Press 1997;39. 14. Diamandis EP, Evangelista A, Pollack A, et al. Time-resolved fluoroimmunoassays with europium chelates as labels. Am Clin Lab 1989;8(8):26. 15. Kricka LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin Chem 1991;37:1472. 16. Kricka LJ. Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays. Clin Chem 1994:40:347. 17. Bronstein I, Juo RR, VoytaJC. Novel chemiluminescent adamantyl 1,2-dioxetane enzyme substrates. In: Stanley PE, Kricka LJ, eds. Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status. Chichester, England: Wiley, 1991;73. 18. Edwards B, Sparks A, Voyta JC , et al. In: Campbell AK, Kricka LJ, Stanley PE, eds. Bioluminescence and Chemiluminescence: Funda­ mentáis and Applied Aspects. Chichester, England: Wiley 1994. 19. Litchfield W J. Shell-core particles for the turbidimetric immunoas­ says. In: Ngo TT, ed. Nonisotopic Immunoassay. New York: Plenum Press, 1988.

Com pare el m étodo co n la d escripción apropia­ da. 12. Southern blot 13. Northern blot 14. Western blot a) E l DNA de doble hebra es el blanco. b ) E l RNA m ensajero es el blanco. c) Las proteínas son el blanco.

CAPÍTULO 6 ■ INMUNOENSAYOS Y TÉCNICAS CON SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO

38. Tyagi S, and Kramer E Molecular Beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 1996;14:303. 39. Whicombe D, Theaker J , Guy S, Brown T, Little S. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat Biote­ chnol 1999;17:804. 40. Guatelli JC , Whitfield KM, Kwoh DY, et al. Isothermal in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc Nati Acad Sci USA 1990;87:1874. 41. Fahy E, Kwoh DY, Gingeras TR. Self-sustained sequence replication (3SR): an isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCRM eth Appl 1991;1:25. 42. Barany E Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proc Nati Acad Sci USA 1991;88:189. 43. Klinger JD , Pritchard CG. Amplified probe-based assay: possibilities and challenges in clinical microbiology. Clin Microbiol Newsletter 1990;12:133. 44. Wiedbrauk DL. Molecular methods for virus detection. Lab Med 1992;23:737. 45. Hankin RC. In situ hybridization: principies and applications. Lab Med 1992;23:764. 46. Bishop JE , Waldholz M. Genome. New York: Simón & Schuster, 1990. 47. Farkas DH. The Southern blot: application to the B- and T-cell gene rearrangement test. Lab Med 1992;23:723. 48. Ni H, Blajchman MA. Understanding the polymerase chain reaction. Transfusión Med Rev 1994;8:242.

167

49. Gasparini P, Novelli G, Savoia A, et al. First-trimester prenatal diag­ nosis of cystic fibrosis using the polymerase chain reaction: report of eight cases. Prenat Diag 1989;9:349. 50. ThiesU , Zuhlke C, BockelB, etal. Prenatal diagnosis ofHuntington’s disease (HD): experience with six cases and PCR. Prenat Diag 1992;12:1055. 51. Clemens PR, Fenwick RG, Chamberlain JS, et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide repeat polymorphism. A m J Hum Genet 1991;49:951. 52. Peake IR, Bowen D, Bignell P Family studies ad prenatal diagno­ sis in severe von Willebrand disease by polymerase chain reaction amplification of variable number tándem repeat región of the von Willebrand factor gene. Blood 1990;76:555. 53. Erlich H, Tugawan T, Begovich AB, et al. HLA-DR, DQ, and DP typing using PCR amplification and immobilized probes. Eur J Immunogenet 1991;18:33. 54. Southern E, Mir K, and Shchepinov M. Molecular interactions on microarrays. Nati Genet 1999;21(Suppl):5. 55. Vahey M, Ñau ME, Barrick S, et al. Performance of the Affymetrix GeneChip HIV PRT 440 platform for antiretroviral drug resistance genotyping of human immunodeficiency virus type 1 clades and viral isolates with length polymorphisms. J Clin Microbiol 1999; 37:2533.

7

CAPÍTULO

Pruebas en el lugar de la atención Elizabeth E. Porter C O N T E N I D O

DE L

ADM IN ISTRACIÓ N Y ESTRU CTU RA Licencia y regulación CHA Personal de apoyo Estandarización Estructura de supervisión COM UNICACIÓN Manejo de una petición para PLDA nueva o adicional Selección preliminar de dispositivos o métodos Validación Negociación de contrato Ejecución

C A P Í T U L O EXA M EN DE A PTITU D APLICACIO N ES EN EL LU G AR DE LA ATENCIÓN Determinación de glucosa en el LDA Constituyentes químicos y gases sanguíneos determ inados en el LDA Coagulación en el LDA Hematología en el LDA Conectividad en el LDA RESUM EN PREGUN TAS DE REPASO REFEREN CIAS

O B J E T I V O S Al completar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Definir la prueba en el lugar de la atención (PLDA). • Explicar qué estructura básica se requiere para m anejar un programa de PLDA • Explicar los aspectos generales de poner en práctica una prueba en el lugar de la atención.

T É R M I N O S Conectividad Enmiendas de 1988 de M ejoram iento del Labo­ ratorio Clínico (CLIA 88)

168

Estandarización M ejoramiento del desempeño

Enunciar los principios básicos en que se sustentan estas aplicaciones comunes de PLDA. ■ Glucosa en el LDA ■ Determinación de componentes químicos y gases sanguíneos en el LDA ■ Coagulación en el LDA ■ Hematología en el LDA ■ Conectividad en el LDA

C L A V E Prueba en el lugar de la atención (PLDA) Prueba exenta

Prueba moderadamente compleja Prueba m uy compleja

CAPÍTULO 7 ■ PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN

169

E l C ollege o f American Pathologists (CAP) ha definido a la pru eba en el lugar de la atención (PLDA) com o “las activi­

La supervisión y aplicación de CLIA 88 ocurre vía la Food and Drug Administration (FDA) y centros para servicios de

dades analíticas de exam en del pacien te proporcionadas dentro de la institu ción, pero llevadas a cabo fuera de las instalaciones físicas de los laboratorios clín ico s ”.1 E l personal de enferm ería, perfusión o terapia respirato­ ria o m édicos residentes o tratantes pueden llevar a cabo la PLDA. Estos m iem bros del personal de atención de la salud por lo com ún no son capacitados de m anera específica en ciencia del laboratorio clínico. Los especialistas del labora­ torio clín ico y de laboratorio profesional están calificados de m anera única para apoyar, asistir y proveer supervisión para tal prueba. De ese m odo, se m ejoran la calidad de los resultados de la PLDA y la de la atención del paciente. Los laboratorios actuales, laboratoristas e institu ciones de atención de la salud pueden llevar a cabo esto si:

M edicare y M edicaid (C M S), antes HCFA. CLIA 88 incluye regulaciones de control de calidad y estándares de personal y divide las pruebas en categorías de com plejidad básicas. Las pruebas exentas constan de ensayos “sim ples”. La lista de pruebas exentas original sólo contenía m etodologías para nueve analitos; ahora, se incluyen m uchos otros analitos. En el cuadro 7-1 se listan las pruebas exentas en la actualidad. Las pruebas moderadamente complejas incluyen casi 75% de alrededor de 1 2 0 0 0 m étodos de prueba. Estas pruebas se realizan según las instrucciones del fabricante sin nin­ guna m odificación, los reactivos se obtienen con facilidad y se requieren pocos pasos de toma de decisión por parte del operador. El 25% restante son métodos de prueba muy com plejos. Las pruebas muy complejas pueden m odificarse en relación con las instrucciones del fabricante o se pueden desarrollar dentro de cada laboratorio, o requerir habilidad y toma de decisiones significativas por parte del operador. La licen cia CLIA se debe ajustar a la prueba que se lleva a cabo (es decir, com plejidad apropiada). La in stitu ción tam bién debe hacer varias eleccio nes respecto a la con ­ cesión de licen cias CLIA. La in stitu ció n puede optar por efectuar la PLDA b a jo la licen cia del laboratorio clínico. P or otro lado, se puede obtener una licen cia CLIA inde­ pendiente para la PLDA. La in stitu ción debe decidir qué agencias de inspección y certificación aplicar a su program a de PLDA. Algunas agencias tienen reputación, lo que significa que la acredita­ ción que otorgan estas agencias es aceptable b ajo CLIA 88. Éstas son la Join t Commission on Accreditation o f H ealthcare Organizations (JC A H O ), el College o f American Pathologists (CAP) y la Commission o f Office Laboratory Accreditation (C O LA ). Todas las institu ciones, y en particular las no acreditadas por una agencia reputada, están sujetas a los CMS o insp ección estatal de pruebas (cuadro 7 -2 ).

1. C onstru yen una administración y estructura para apo­ yar y facilitar la calidad de la PLDA. 2. M antienen la base de conocimiento y habilidad para poner en práctica de m anera apropiada la PLDA. 3. Transform an la PLDA preexisten te en cum plim iento norm ativo y produ cción de resultados de alta calidad para el paciente.

ADM INISTRACIÓN Y ESTRUCTURA Los com ponentes esenciales para establecer un program a de PLDA se inclu yen en el recuadro 7-1.

Licencia y regulación CLIA Hay un concepto erróneo de que la PLDA puede estar exenta a veces del organism o de regulación que se aplica al exam en llevado a cabo en el laboratorio clín ico . Todas las pruebas, sin im portar la u b icació n , caen dentro del ám bito de las Enmiendas de 1988 de M ejoram iento del L aborato­ rio Clínico (CLIA 88). CLIA 88 es un organism o de regu­ lación federal de Estados U nidos. H istóricam ente, CLIA 88 se puso en práctica, en parte, com o una respuesta al “escán dalo” percibido de la prueba de Papanicolaou (pap) de la década de 1 9 8 0 . Ciertos laboratorios clín ico s y labo­ ratorios de consu ltorios tuvieron operaciones de pruebas problem áticas, com o falta de d ocu m en tación y resultados de prueba de m ala calidad que originaron ausencia de con ­ fianza clínica.

R E C U A D R O 7-1 E L E M E N T O S D E L

L icencias CLIA apropiadas Agencia de inspección o certificación elegida Personal de apoyo Estandarización Una estructura que define autoridad, responsabili­ dad y rend ición de cuentas C om u nicación y relaciones interdisciplinarias (redes)

R equisitos p a ra p ru e b a d e m icroscopía realiza da p o r el p ro v eed o r (MRP) La M RP es una subcategoría de prueba de com plejidad m oderada. Estas pruebas requieren u n m icroscopio. Por lo regular no existen m ateriales de con trol de calidad para estas pruebas. E n general, las m uestras son lábiles y no sobreviven al transporte al laboratorio clín ico . E l sitio debe tener certificación M RP (al m enos). Se puede supo­ n er que para m édicos u od ontólogos la com petencia está dentro del alcance de su especialidad. E l personal de nivel m edio (es decir, personal que no es m édico u od on tólo­ go) debe tener com o m ínim o u n certificado de secundaria, ju n to con su capacitación y orien tación específicas para ejecutar la prueba.

Personal de apoyo Las siguientes posiciones son útiles para establecer y m an­ tener u n program a PLDA de calidad.

• Director. P or lo general, la p o sició n la ocupa un investigador con doctorado, m aestría, o un d octor en osteopatía o patólogo. Las responsabilidades inclu yen

170

PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

CUADRO 7-1. A N A LITO S E X E N T O S A CTU A LM EN TE NOMBRE DEL ANALITO________________________________________________________

NOMBRE DEL ANALITO_______________________________________________________

Ácid o ascórbico, tira s reactivas para orina

H em atócrito

Ácid o láctico (lactato )

H em oglobina glucosilada (HbA1c)

A lb ú m in a u rin a ria

H em oglobina por su lfa to de cobre, no au to m atiza d a

A lco ho l en la saliva A m in a

HGB, instru m en to para a n alito sim ple con características ind ep end ien tes

A m in o tran sfe ra sa de ala n in a (ALT) (SGPT)

H orm ona estim u lan te del fo lícu lo (FSH)

A n a lito s en tira s reactivas o en ta b le ta para o rin a, no a u to m atiza d o

H orm ona lu te in iza n te (LH) In flu en za A

A n fe ta m in a

In flu en za A/B

A n ticu e rp o de HIV-1

In flu en za B

A n ticu e rp o s de Helicobacter pylori

Instrum ento para m ed ir la glucosa (uso au to rizad o por la FDA/uso en el hogar)

A n ticu e rp o s de la enferm ed ad de Lyme (Borrelia burgdorferi ABS)

Leucocitos, tira s reactivas para orina

A n ticu e rp o s de m ononucleosis infecciosa (M ONO)

M etab o lito de la cocaína

A n tíg e n o relacio nad o con tu m o r de la vejiga

M eta n f eta m ina/a n f eta m i n a

B ilirru b in a , tiras reactivas para o rin a

M etan feta m in as

C an ab in o id e (THC)

M icro albúm ina

C atalasa, o rin a

M icro hem ató crito ce n trifu g ad o

Cetona en o rin a

M o rfina

Cetona en sangre

N icotina, o m etabo litos, o am bos

Ceto na, tiras reactivas para orina

N itrito , tira s reactivas para orina

Colesterol

N -telopéptidos e n tre lazad o s tip o I de co lágeno (N TX)

Colesterol de HDL

O piáceos

Com puestos quím icos, tiras reactivas para orina

PH

C rea tin in a

pH de la vag in a

C re a tin ín a , tira s reactivas para o rin a

pH gástrico

Densidad relativa, tiras reactivas para orina

pH, tiras reactivas para orina

Estreptococo, grupo A

P ro teína, tira s reactivas para orina

Etano l (alcohol) Fenciclid ina (PCP)

Prueba de o vulació n (LH) por com paración visual de color

Fructosam ina

Prueba del h elécho en saliva

Glucosa

Sangre oculta en el tu b o digestivo

Glucosa líquida (apro bada por la FDA para uso en el hogar)

Sangre o culta en heces

~~

Sangre, tira s reactivas para orina

G lucosa, tiras reactivas para orina

Semen

G lucu ró nid o de estrona-3

Tasa de sedim entació n e ritro cítica , e xe n ta , no a u to m a­ tiza d a

hCG en la orina HCG en o rin a por pruebas visuales por co m p aración de colores

Tiem p o de p ro tro m b ina (PT)

Helicobacter pylori

U ro b ilin ó g en o , tiras reactivas para orina

Triglicéridos

Fuente: www.fda.gov/cdrh/ciia. Base de datos actualizada 8/03.

d ecisiones sobre qué política seguir, adm inistrativas, financieras y técnicas. E l director provee vincu lación co n la adm inistración de alto nivel para la in stitu ción de aten ción de la salud. U n b u en director será experto en resolu ción de problem as, relacionados con cu estio­ nes técnicas e interacciones de personal.

• C oord inad or del LDA (C LD A ). E l coordinador del lugar de la atención es responsable de ejecutar y coordi­ nar las pruebas del paciente en el lugar de la atención, y facilitar el cum plim iento de procedim ientos y p o líti­ cas y requisitos adm inistrativos. E l CLDA lleva a cabo la revisión en el lugar donde se aplican las pruebas al

CAPÍTULO 7 ■ PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN

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CUADRO 7-2. CENTERS FOR MEDICAID SERVICES (CMS) O INSPECCIÓN ESTATAL DE LA PRUEBA EXENTA

M O D ER A D A

ALTA

Se requiere certificado de exención CLIA.

Se requiere certificado de acreditación.

Se requiere certificado de acreditación.

El personal ha sido capacitado y orientado específicamente para ejecutar la prueba.

El personal tiene capacitación y orientación específicas para llevar a cabo la prueba. Se debe docum entar la competencia en forma constante. El personal debe tener por lo menos certificado de bachillerato. Debe haber un director de laboratorio/ asesor técnico/asesor clínico.

El personal tiene capacitación y orientación específicas para llevar a cabo la prueba. Se debe docum entar la competencia en forma constante. El personal debe tener por lo menos un grado de licenciatura o equivalente. Debe haber un director de laborato­ rio/asesor técnico/asesor clínico.

Es necesario apegarse a las instrucciones del fabricante cuando se efectúa la prueba.

Es necesario apegarse a las instrucciones del fabricante al efectuar la prueba. Por lo menos dos niveles de material de control al día. Verificación de la calibración cada seis meses. Prueba de competencia. Normas definidas: manual para el procedimiento, acción correctiva, conservación de registros.

Si las instrucciones del fabricante no se observan, se tienen que cumplir muchos requisitos para validar la prueba. Por lo menos dos niveles de material de control al día. Verificación de la calibración cada seis meses. Prueba de competencia. Normas definidas: manual para el procedimiento, acción correctiva, conservación de registros. Muchas normas rigurosas adicionales, las cuales son difíciles de cumplir fuera del laboratorio clínico. Rara vez ejecutada como PLDA.

paciente, control de calidad y registros de m antenim ien­ to, e inform a los problem as e incum plim ientos norm a­ tivos al personal adm inistrativo apropiado. E l CLDA facilita y garantiza d ocum entación de capacitación de aptitud y supervisa la term inación de program as de pruebas de capacidad. E l CLDA coordina la resolución de problem as para PLDA y provee asistencia de recursos técnicos in situ al personal que brinda la aten ción para resolución de problem as relacionados con el control de calidad y desem peño del instrum ento. E l CLDA facilita la com unicación entre el personal a cargo de las pruebas en el lugar de la atención y el personal del laboratorio clínico. E l CLDA facilita el control de inventario ade­ cuado del lugar de la atención. E l CLDA debe exhibir excelentes habilidades de servicios al cliente, com o apti­ tudes de com unicación superiores y buenas habilidades analíticas y de resolución de problem as. Tam bién son im portantes las aptitudes de adm inistración del tiem po, planificación y organizacionales. Cualquier individuo que busque la posición del CLDA debe poseer m oti­ vación propia y no requerir supervisión continua de la adm inistración para asegurar desem peño en el trabajo. E l CLDA debe exh ibir aptitudes técnicas de alto nivel y tener excelentes habilidades interpersonales.

• Contactos o instructores designados en departamentos distintos al laboratorio. Para cada unidad, piso, clínica, que ejecuta la PLDA, es im portante tener com o contacto una persona o instructor designado. Esta persona facilita en gran medida la eficacia del programa de PLDA y es un

enlace de com unicación entre el CLDA y el personal que ejecuta las pruebas. Asimismo, facilitan las actividades de capacitación y aptitud cuando se emplea un proceso de “capacitar al instructor”. (E n el proceso de capacitar al instructor, el coordinador del LDA puede capacitar al contacto o instructor designado, quien después capacita a otro personal del LDA en el departamento.) Esto es útil en particular para cuestiones relacionadas con turnos en horas en las que no se está de servicio y fines de semana.

Estandarización La estandarización es el uso congruente del m ism o in stru ­ m ento, reactivo o m étodo de prueba para cu alquier analito en el sistem a de atención de la salud designado. La estan­ darización produce los siguientes beneficios: • La com paración de los resultados en u b icaciones pro­ duce atención m ejorada del paciente. E sto reduce la confu sión del m édico clín ico acerca de la interpreta­ ció n de resultados de prueba d istintos para el m ism o analito, sin im portar dónde se realizó la prueba. • Ahorra costos. Casi todos los vendedores n eg ocian los precios con base en volúm enes de prueba. Cuando la estandarización está presente, los volúm enes de prue­ ba serán m ayores para el vendedor elegido que si se em plearan varios vendedores. Se pueden lograr ahorros de costo im portantes. • Ahorra tiem po y trabajo. C on la estandarización, hay sólo u n m étodo de prueba, en vez de m últiples, para los

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

que se deben m antener proced im ientos, listas de co m ­ probación de capacitación y recertificación , registros en papel y equivalencias. • Conform idad adm inistrativa de las instalaciones. Los distintos m étodos presentes en una sola in stitu ción h acen difícil m antener los factores antes m encionados y tam bién casi im posible la conform idad adm inistrativa congruente en relación co n la com paración del resulta­ do de prueba.

Estructura de supervisión Es im portante establecer una estructura para las PLDA que defina la autoridad, responsabilidad y ren d ición de cuentas. Los propósitos de tal estructura son: • Facilitar el desempeño exacto y a tiempo de las pruebas del paciente cuando se llevan a cabo fuera del laboratorio. • Facilitar el cum plim iento con las agencias reguladoras (co m o JC A H O , CAP, CLIA 88). • F acilitar un proceso de estandarización en las m últiples instalaciones y sitios que llevan a cabo la PLDA, que dé com o resultado calidad m ejorada de prueba, eficiencia y co n ten ció n de costos. • C oordinar y facilitar la com u n icació n entre el labora­ torio, enferm ería y vendedores de instrum entos, sum i­ nistros, reactivos o m ateriales de con trol de calidad utilizados en el lugar de la atención. • F acilitar la educación del personal de PDLA m ediante la provisión de m ateriales para cap acitación o recertifi­ cación , o am bas cosas. Los com ponentes de tal estructura inclu yen por lo regular m étodos o com ités de dirección, o am bos. Este tipo de com ités puede supervisar el cum plim iento, la u ti­ lización, la selecció n de m étodos o instrum entos, estanda­ rización, cu estiones de proced im iento y d ecisiones acerca de la expansión o lim itación de las pruebas. Estos com ités fu ncionan m ejo r cuando son m u ltid isciplinarios o son de varios hospitales donde es aplicable (es decir, sistem as de hospitales). Su estructura y fu nción se deben docum entar m ediante póliza escrita.

COMUNICACIÓN La estructura descrita antes com prende la porción for­ m al del program a. E l trabajo o colabo ración en red es la p orción inform al del programa. La colabo ración en red tiene igual im portancia para un program a de PLDA com ­ pletam ente fu ncional y debe ser en las disciplinas (p. e j., laboratorio, enferm ería, perfusión, terapia respiratoria). El trabajo en red se facilita cuando el personal cu enta con las habilidades de com u nicación y diplom acia, así com o cu estiones técnicas. E l program a efectivo de PLDA da alta prioridad para con stru ir y m antener relaciones.

M anejo de una petición para PLDA nueva o adicional D ocu m ente la solicitu d , de preferencia vía una form a de p etición estandarizada. En el recuadro 7 -2 se indica cierta

inform ación necesaria. Evalúe la p etición con la estru c­ tura de program a descrita antes. Podría haber diversas ju stifica cio n es clín icas para ejecu tar la PLDA. A ntes de establecer cu alquier prueba, es im portante consid erar si está disponible alguna prueba en el laboratorio clín ico central. Algunas preguntas a consid erar son: • ¿Cuál es el tiem po de respuesta prom edio y el costo prom edio para pruebas que realiza el laboratorio clín i­ co contra las PLDA? • Si la PLDA puede reducir el tiem po de respuesta, ¿el tiem po de respuesta más corto dará com o resultado un m en or tiem po de estancia o m ayor satisfacción del cliente? • ¿El tiem po de respuesta más corto producirá eficiencia operacional m ejorada para el departam ento? • ¿Q ué otra op ción , además del desem peño de la PLDA, existe para alcanzar los objetivos deseados? Las in stitu cion es deben consid erar tam bién otras op ciones, com o transportar m uestras al laboratorio cen ­ tral m ediante sistem as de tubos neum áticos, usar “rieles” para transportar m uestras, o restructurar el flujo de tra­ bajo. Es im portante determ inar si la PDLA puede lograr una relación costo a beneficio favorable. Por ejem plo, si el volum en de prueba esperado es pequeño, podría no ser efectivo en cuanto a costos capacitar personal, m antener y d ocu m entar la com petencia, com prar reactivos de control de calidad, así com o supervisar la prueba.

Selección preliminar de dispositivos o m étodos Flaga una selecció n prelim inar del m étodo e instru m en ta­ ción para efectuar la prueba solicitada. Revisar las d istin­ tas op cion es que hay en el mercado y lim itar la selecció n a varios m étodos o instrum entos. Los criterio s para selec­ ció n podrían in clu ir la facilidad de uso, costo , m enú de prueba, com paración con la instrum en tación de laborato­ rio clín ico , com pra de contratos de grupo y características de software. E l m an ejo de datos y la conectividad (véase Conectividad del LDA en este capítu lo) son criterio s im por­ tantes a considerar, co n un énfasis en la capacidad para interconectar los datos producidos m ediante el dispositivo LDA.

R E C U A D R O 7-2 R EQ U IS IT O S D E IN FO R M A C IÓ N PA RA S O LIC IT A R UN A N U EV A P LD A P rueba(s) solicitad a(s) O bjetiv o(s) ¿Q uién ejecu ta la prueba? Cantidad de pruebas estimada ¿C óm o se d ocum entarán o se alim entarán los datos? ¿Esta prueba se ejecu ta en la actualidad m ediante otro m étodo? Si es así, ¿cuáles son los problem as con el m étodo actual?

CAPITULO 7 ■ PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN

Realice una investigación bibliográfica para los datos existen tes acerca del desem peño del instrum ento o el m étodo. La inform ación escrita que proporciona el ven­ dedor puede ser ú til, pero se debe com probar siem pre con datos adicionales. Tam bién, con tacte a otros usuarios para referencias y la posible d istribución de validación de datos. E fectúe una validación prelim inar, lim itada, que incluya una m inicorrelación con la instru m entación de su laboratorio clínico. Se puede revisar la inform ación del proveedor de prueba de com petencia para el coeficiente de variación (C V ) esperado. Los estudios de p recisión y linealidad pueden ser útiles sobre una base lim itada. En este pu nto, se debe hacer una selecció n de m étodo de prueba o instrum ento, de preferencia con una estructura de program a LDA descrito con anticipación.

Validación No se puede dar dem asiada im portancia a la validación del m étodo. Además de los requisitos adm inistrativos que se deben satisfacer, la validación del m étodo es necesaria para asegurar resultados de prueba confiables que son necesa­ rios para la atención de calidad del paciente. La validación del m étodo inclu ye lo siguiente (según sea pertin ente): • E xactitu d (resultado clínicam ente correcto). • Precisión (m ism o resultado clín ico repetidas veces). • Sensibilidad y especificidad, incluso sustancias interferentes (la probabilidad de que una prueba positiva lo sea en realidad y una prueba negativa sea en verdad negativa). • A lcance y linealidad que es posible inform ar (lím ites superior e inferior de la prueba). • A lcance de referencia (resultados esperados para un individuo norm al). • C orrelación de m uestra dividida contra m étodo de refe­ rencia. Los m étodos y m uestras se deben validar tam bién. Lleve a cabo correlaciones de m uestra dividida para determ inar la concordancia entre la PLDA y los m étodos em pleados en el laboratorio. Tome en cuenta la variabilidad entre produc­ tos de diferentes vendedores. La correspondencia entre la PLDA y el análisis en el laboratorio clín ico es más probable si en ambas instalaciones se em plean productos del m ism o vendedor. Sin embargo, aun cuando se usa el m ism o ven­ dedor, podría haber variación entre diferentes instrum en­ tos. Al llevar a cabo las validaciones, es im portante inclu ir tanto m uestras positivas com o negativas, o valores altos y b ajos para los analitos que serán incluidos en el inform e. Además, para obtener resultados más confiables, se debe reducir al m ínim o cualquier retraso entre los análisis en el instrum ento de laboratorio y el utilizado para la PLDA.

Negociación de contrato Sólo después que ha sido validado por com pleto el m étodo de prueba se debe negociar un con trato co n el vendedor. La m ayor parte de las in stitu ciones tien en departam entos de com pra para ayudar con este proceso. M uchas insti­ tu ciones son tam bién parte de grupos de com pra; estos contratos deben ser considerados en el proceso.

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Ejecución R ecolección d e m ateriales Antes de com enzar co n la e jecu ció n del p roceso se deben reunir los siguientes m ateriales: • • • • • •

M anual o m anuales del instrum ento. In stru ccio n es de em pleo para reactivos. In stru cciones de em pleo para con troles de calidad. H oja de datos de seguridad de los m ateriales (H D SM ). P roced im iento de m uestra del vendedor. M ateriales de m uestra para capacitación obtenidos del vendedor. • P roced im iento de otra in stitu ción para la prueba. • Estándares norm ativos o de certificación aplicables (es decir, estándares N CC LS [N ational C om m ittee for C li­ nical Laboratory Stand ard s], estándares de laboratorio JC A H O , lista de com probación del CAP).

Procedim iento o política E l prim er paso en el proceso de eje cu ció n es escribir el proced im iento o política para la prueba o m étodo. In icie co n su plantilla de form ato de su institu ción . (N ota: los procedim ientos para PLDA con frecu encia deben cu m ­ plir co n los requisitos de form ato de otros departam entos aparte del laboratorio además de satisfacer los requisitos básicos con los que están fam iliarizados los laboratoris­ tas.) No haga conjetu ras acerca del proceso de prueba, sino m ás bien detalle los pasos requeridos. E l nivel de escritura debe ser com prendido por una persona que no sea labora­ torista. Tam bién se debe seguir el form ato N CCLS. • Principio. Exprese de m anera breve el tipo de reacción, o reaccion es, que está ocurrien do. Tam bién es ú til in clu ir la razón clínica para efectuar la prueba. • Personal para la prueba. D escriba quién está calificado para llevar a cabo la prueba (categoría de empleo, requi­ sitos de com petencia, discrim inación de color). Se deben seguir las regulaciones CLIA 88 y las de la agencia de ins­ pección de la institución. Para pruebas exentas, el perso­ nal debe tener capacitación específica y orientación para realizar la prueba. Para pruebas m oderadam ente com ple­ ja s, el personal debe tener un certificado de educación media, y la adm inistración debe designar las posiciones de director de laboratorio, asesor técnico y asesor clínico. Com o siempre, todo esto se debe documentar. Cada ins­ titución debe determ inar si todo el personal, incluso las enfermeras y los asistentes de enferm ería, recibirá capa­ citación, o si ésta se limitará a ciertas áreas de responsabi­ lidad y aptitudes. Mientras más reducido sea el personal y con mayor frecuencia un m iem bro del personal realice pruebas, es probable que sea m ayor la calidad de la prue­ ba. Sin embargo, también se deben considerar las nece­ sidades de personal y planificación. Podría ser útil pedir que el departamento de enfermería designe instructores (com o el m étodo de capacitar al instructor). • M u estra. Incluya requisitos para preparación del pacien te, tipo de m uestra requerida, requisitos de esta­ bilidad y alm acenam iento (o el requisito de analizar de inm ediato la m u estra), criterios para acep tación de la m uestra y consid eraciones de m anejo.

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUÍMICA CLÍNICA

• R eactiv os, su m in istro s y equ ipo. E num ere todos los reactivos requeridos, sum inistros y equipo. Incluya requ isitos de alm acenaje y estabilidad, inclu so requi­ sitos de fechado y m arcado, y cu alquier advertencia de seguridad aplicable. • M an ten im ien to. Provea las in stru ccion es para m ante­ ner el instrum ento, incluida la frecuencia requerida. • P oten cia. D escriba la fuente de energía para el in stru ­ m ento (C A contra batería, o am bas). Si se em plean baterías, identifíquelas. Si son aplicables baterías recar­ gables, expliqu e cóm o recargarlas. • C alib ración y com probación de la calibración. Identifi­ que los m ateriales requeridos y la frecuencia requerida. • C o n tro l de calid ad (C C ). Identifique los m ateriales de C C , frecuencia, el proceso para llevar a cabo el CC, cóm o determ inar el éxito o fracaso del C C y el proce­ d im iento para solucionar la falla del CC. (Asegúrese de in clu ir CC del líquido e in stru ccion es de CC electró n i­ cas cuando sea apropiado.) • P roced im ien to p ara exam en d el p acien te. E scriba las in stru ccion es detalladas por pasos. No om ita los pasos sim ples con base en la suposición. • A lcan ces de referen cia y tera p éu tico , lím ites té cn ico s, valores crítico s. Se deben in clu ir estos valores (de pre­ ferencia en form ato de cuadro). • In fo rm e de resu ltad os. D escriba en detalle cóm o la in stitu ció n a la que pertenece registrará y dará a co n o ­ cer los resultados del paciente. • T ran sferen cia de d atos, d ocu m en tació n e le ctró n ica , con figu racion es. Es útil docum entar estos asuntos (específicos para su in stitu ción ) en el procedim iento. E sto servirá com o una herram ienta de referencia ú til y tam bién facilitará la estandarización, en particu lar en sistem as m ultihospitales. • L im itacio n es, n otas. Incluya sustancias interferentes y lim itaciones de prueba. Es posible listar precaucion es especiales. Se debe in clu ir inform ación relacionada con posibles fuentes de error, situacion es clínicas que afec­ tan los resultados y aplicaciones clínicas. • E xam en de aptitu d. D ocum ente los requisitos de exa­ m en de aptitud y el proceso. • Recepción de reactivos y lote de control: identifique el proceso a seguir para la recepción de reactivos y controles. • M ejo ram ien to de la calid ad (M C ). D escriba el proceso de M C de su in stitu ción para la prueba o m étodo. • Solución de problemas: explique cómo dar solución a re­ sultados inesperados, errores y problemas de instrumentos. • M étodo altern ativ o. Exprese el proceso a seguir si el instrum ento o prueba no están disponibles. Para PLDA, esto tiene que ver por lo com ún con tom ar prestado o reem plazar el instrum ento o enviar la m uestra al labo­ ratorio clín ico para análisis. • R eferen cias. Incluya la in form ació n escrita del produ c­ to que proporciona el fabricante, referencias de libros utilizados, pu blicaciones de estándares y cualquier referencia aplicable de artículos científicos.

Lista d e com probación de capacitación Em piece con su plantilla de lista de com probación. La lista de com probación de capacitación debe ser clara y

con detalles suficientes que el in stru cto r no p erten ecien ­ te al laboratorio recordará para explicar con claridad las cu estion es de capacitación. La lista de com probación de capacitación debe docum entar toda la cap acitación del operador. Es m ás eficaz usar un sistem a de dos copias: una para el archivo de edu cación con tin u a del em pleado y otra para la oficina de PLDA. E n la lista de com probación se deben in clu ir los sigu ien­ tes asuntos: • • • • • • • • • • •

P rocedim iento de lectura. M antenim iento. Reactivos. C ontrol de calidad. R equisitos de m uestra. O bservación directa (efectuar una prueba sim ulada del p a cien te). Inform e de resultados: softw are o d ocu m en tación en papel, o am bos, alcances de referencia y crítico. Seguridad. In form ación del operador (nom bre, núm ero de identificación del operador, piso). Firm a del instructor. Puede com plem entar con cuestionario.

Lista d e com probación d e recertificación CLIA y otras agencias de certificación tam bién requieren d ocu m en tación de aptitud de continuid ad para personal que lleva a cabo pruebas o recertificación. La lista de com ­ p robación de recertificación puede ser m ás corta que la lista de com probación de capacitación. Se debe adaptar o m odificar según los problem as observados cuando se reali­ za la prueba. Espere hasta que la prueba se esté realizando durante un tiem po para poder observar estos problem as.

C r e a r fo rm a s o registros en papel A m enos que el instrum ento o prueba tenga docum entación o conectividad electrónica com pleta, las form as de papel serán necesarias para cum plim iento y m onitoreo. Podrían ser necesarias algunas, o todas las form as siguientes: • • • •

Registro de con trol de calidad. Registro de pruebas del paciente. Registro de problem as o acción correctiva. Form a de m ejoram iento de la calidad.

La m ayor parte de estas form as, si no es que todas, pue­ den ser elim inadas co n una buena conectividad.

EXAM EN DE APTITUD E l exam en de aptitud es una parte de la buena práctica de laboratorio que com prueba la capacidad para produ­ cir resultados confiables de prueba del paciente. M uchas agencias reguladoras y de certificación tam bién la requ ie­ ren. Para satisfacer estos objetivos, los pasos siguientes facilitan la organización y docum entación: • • • • •

Asegúrese de tener una estructura. O rdene la prueba apropiada. D ocu m ente el recibo de envíos de PA. Program e la distribución. D istribuya al departam ento de PLDA.

CAPITULO 7 ■ PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN

• Dé a co n o cer los resultados al proveedor de PA. • M antenga la docum entación.

C om unicación Antes de po n er en práctica una nueva prueba o m étod o, es im portante n otificar a todas las partes afectadas y usuarios de la ejecu ció n , com o m édicos, departam entos de enfer­ m ería, adm inistradores y laboratoristas clínicos. La n o ti­ ficación debe in clu ir una d escripción corta de la prueba o m étodo y los usos esperados.

M antenim iento Ciertos procesos adm inistrativos deben ser m onitoreados para asegurar el cu m plim iento norm ativo y buenas prácti­ cas de laboratorio, incluso: • A ñadir núm eros de serie a su lista de instrum entos. • C ontribu ir a su program a para com paraciones y com ­ probaciones de calibración. • Agregar sum inistros y reactivos requeridos a su lista de inform ación de pedido. • Añadir la prueba a su registro de cuenta de volum en de prueba. • Agregar la prueba al program a de exam en de aptitud.

M ejoram iento del desem peño Al igual que con todas las pruebas de laboratorio, debe existir un proceso de mejoramiento del desempeño (M D) para asegu­ rar la calidad. Entre las cuestiones que se deben monitorear está el control de calidad (C C ). ¿Se realizó el CC? ¿Estuvo dentro del alcance aceptable? Es necesario hacer un m onitoreo regular de la media y la desviación estándar. Los asuntos de CC son importantes porque el CC evalúa el instrum ento, reactivos, operador (persona que lleva a cabo la prueba) y el proceso de prueba. E l mismo personal que analiza las m ues­ tras del paciente debe ejecutar el CC. Se debe notar que el CC para la PLDA tiene la misma importancia que la prueba de laboratorio clínico. La teoría básica de CC establece que cuando una prueba está funcionando de manera apropiada y con el tiempo se ejecutan muestras de concentración conoci­ da, hay una distribución gaussiana de valores .2No es función de este capítulo describir con detalle el proceso de CC (para más inform ación consulte el capítulo 3 , control de calidad y

estadística). Se debe observar tam bién el desem peño de m onitores n o relacionados con el CC. Se debe vigilar la aptitud de las personas que ejecutan la PLDA (es decir, operadores válidos). Es necesario d ocu m entar el uso de identificación correcta del paciente al ejecu tar la PLDA. M antenga un registro para asegurar que el m antenim iento del equipo se lleva a cabo de m anera apropiada. El proceso de m ejoram iento del desem peño debe in clu ir com u n icació n con la unidad o el adm inistrador del LDA, un p roceso de acción correctiva y seguim iento claro. E ste proceso posibilitará la confianza del operador en los resultados de prueba producidos y la confianza del m édico en los resultados de prueba del paciente.

In fo rm e d e resultados Los resultados de prueba del pacien te y de control de cali­ dad deben ser docum entados. La prueba m anual tiene

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que ver, por lo general, con d ocu m en tación en registros en papel, aunque están en desarrollo algunos sistem as electró nico s para registrar pruebas m anuales. E l registro m anual en gráficas de pacientes introduce la posibilidad de errores de tran scripción. Los resultados se deben registrar de m odo que se cum pla co n las regulaciones aplicables, com o fecha y hora de la prueba, persona que la realizó, unidades de m ed ición y ám bitos de referencia. Todo esto requiere cap acitación y coop eración de los que llevan a cabo las pruebas. E n la actualidad, m ucho del análisis in s­ trum entado tiene la capacidad de transferencia electrónica a un adm inistrador de datos y, posiblem ente, una interfaz para el sistem a de inform ación del laboratorio (S IL ). Una exp licación detallada se da en la sección de Conectividad en el LDA de este capítulo.

APLICACIONES EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN Determ inación de glucosa en el LDA La determ inación de glucosa en el LDA es la prueba de volum en más alto en la m ayor parte de las institu ciones de atención de la salud. Se emplea con frecuenciá para m onitorear el nivel de glucosa en pacientes con diabetes, pero se puede usar para otros propósitos. La m ayor parte de los m edidores de glucosa institucionales actuales utilizados en el LDA inclu yen la capacidad para docum entar la prueba de form a electrónica. Tam bién hay disponibles m uchos m edi­ dores de glucosa de uso dom éstico; la glucosa es la prueba LDA que se emplea con más frecuencia en el hogar. Una pequeña gota de sangre, la m ayor parte de las veces obtenida por p u nció n capilar, se aplica a una tira de prue­ ba. O curre una reacción entre la sangre y los reactivos en la tira de prueba. E l m edidor m ide la reacció n y la co n ­ vierte en u n resultado cuantitativo. La reacción real varía entre fabricantes.

Constituyentes quím icos y gases sanguíneos determ inados en el LDA Varios fabricantes ofrecen instrum entación diseñada para medir constituyentes quím icos (la mayor parte de las veces electrólitos) o gases sanguíneos, o am bos, en el LDA. Casi todos operan sobre el principio de m edir cam bios potenciom étricos, am perom étricos o conductim étricos vía sensores (electrodos). Esto ha sido realizado m ediante sensores no desechables y desechables. Los instrum entos con senso­ res desechables pueden ser configurados para análisis de varias m uestras antes de desecharlos del paquete de reac­ tivo m ultim uestra, que incluye los sensores así com o los reactivos requeridos. Por otro lado, algunos instrum entos LDA em plean un cartucho desechable de una sola muestra que contiene todos los com ponentes del sistem a (reactivos, sensores y recipiente de desechos). E n estos dispositivos, el instrum ento recibe la transm isión de los sensores com o una señal eléctrica y la convierte en un resultado.

Coagulación en el LDA La prueba de coagulación en el LDA es el tiem po de coa­ gulación activado (TC A ). E l TCA, que Elattersley describió prim ero en 1 9 9 6 ,3 se emplea para m onitorear la terapia de

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PARTE I ■ PRINCIPIOS BÁSICOS Y PRÁCTICA DE LA QUfMICA CLÍNICA

heparina. Aunque la terapia de heparina es esencial para m antener la hem ostasis durante m u chos procedim ientos m éd icos, los pacientes pueden variar m ucho en su respues­ ta a la heparina. La sobredosis de heparina puede dar com o resultado hem orragia, y una dosis b aja de heparina origina la form ación de un coágulo de sangre. Esto se puede evitar si se m onitorea la terapia de heparina con u n TCA. La coagu lación in vivo ocurre com o resultado de una in teracció n com pleja de com ponentes vasculares, celu la­ res y no celulares (cascada de coagu lación). E l TC A pro­ vee una m ed ición no especifica in vitro de los com ponentes celulares y no celulares del proceso de coagulación. Los primeros tiempos de coagulación en el LDA se lle­ varon a cabo mediante la extracción de sangre com pleta nueva, luego se mezclaba por períodos de form a manual, o se invertía el tubo y se observaba la form ación del coágulo. En fechas recientes, la gran variabilidad de este proceso se ha reducido mediante: a) la adición de un activador (celita, sílice, caolín o partículas de vidrio), b) m antenim iento de una temperatura estable (37°C ) durante el proceso de coa­ gulación y m edición y c) un sistema de agitación m ecánica o detección de coágulo. Los instrum entos de coagulación en el LDA más recientes con técnicas de m icrom uestreo reducen la variabilidad al automatizar más el proceso, y se requiere m enos técnica del operador para realizar la prueba. Los ins­ trum entos de coagulación más nuevos utilizados en el LDA efectúan pruebas adicionales, com o PT-INR y aPTT.

H em atología en el LDA E n el m om ento actual, sólo ha estado disponible la PLDA de hem atología m ínim a. En años anteriores, el hem atócrito centrifugado era la prueba de hem atología más com ún reali­ zada en el lugar de la atención. E n fechas recientes, m uchas institu ciones están elim inando el hem atócrito centrifugado debido a las cuestiones de seguridad y porque la variabili­ dad en la técnica del operador puede producir variación insignificante en los resultados de prueba. M uchas insti­ tu ciones em plean en la actualidad un sistem a que consiste en cubetas desechables y un analizador. La cavidad de la cubeta contiene reactivos depositados en sus paredes inter­ nas que hem olizan a los glóbulos rojos cuando se extrae la m uestra de sangre en la cavidad por acción capilar. La hem oglobina liberada se convierte en hem oglobina de azida. La cubeta se coloca en el analizador, donde se m ide la absorbancia y se calcula el nivel de hem oglobina .4

Conectividad en el LDA La conectividad ha sido el avance reciente más significa­ tivo en la PLDA. Por tradición, los resultados de la PLDA han sido escritos de form a m anual en el registro m édico del p acien te o, en ocasion es, registrados vía un a im presión de instrum ento que ha sido colocada en el registro médico. La conectividad es la capacidad para d ocu m entar la prueba de form a e le ctró n ica . E n g en eral, el in stru m en to tien e la capacidad de almacenar cierta cantidad de datos. Éste es el segm ento de dispositivo de la conectividad. M últiples instru­ mentos suben los datos vía la red de computadoras hasta una estación de trabajo central. Ésta es la porción de m anejo de

datos de la conectividad. E l sigu iente paso en el proceso de conectivid ad es la tran sm isión de los resultados de la prueba desde el administrador de datos al sistem a de infor­ m ación del laboratorio (SIL). Ésta es la porción de interfaz de la conectivid ad. E x isten estándares para la co n e cti­ vidad de la PLDA, conocidos cono estándares P O C T1-A (point-of-care testing 1-A). Los estándares P O C T 1-A se apli­ can a instrum entación (dispositivos), así com o a estaciones de trabajo de m anejo de datos e interfaces .6,7 M uchos sistem as de conectividad son específicos del vendedor o del instrum ento. Sin em bargo, los sistem as m ás com p lejos recientes m anejan los resultados de varios vendedores vía un sistem a integrado sim ple. Esta clase de sistem a perm ite al coordinador del lugar de la atención supervisar la prueba, el C C , los instrum entos y operadores para varios tipos de equipos de una sola estación de traba­ jo . Algunas ventajas del sistem a son: • La d ocu m en tación electrónica de los resultados del pacien te reduce los errores en la tran scripción y asegu­ ra que los resultados de prueba del pacien te se d ocu ­ m enten de m anera correcta en el registro m édico. • La d ocu m en tación electrónica perm ite un sistem a p rác­ tico para la factu ración por PLDA. • Las configuraciones de instrum entos estandarizadas se pueden m antener en el sistem a. • Se m ejora el cum plim iento norm ativo. • Se elimina el registro en papel o se reduce en gran medida. • M onitorear casi todas las pruebas de m odo eficaz en relación con el tiem po da com o resultado calidad m e jo ­ rada. • Todos los resultados de prueba se pueden ejecu tar por una sola interfaz. • Los operadores para m u chos dispositivos d istintos de m u chos lugares diferentes, ju n to con su d ocum enta­ ció n apropiada, se pueden m anejar de una m anera in te­ grada.

RESUM EN Las pruebas en el lugar de la atención son las actividades analíticas de exam en del paciente provistas dentro de la in stitu ción , pero llevadas a cabo fuera de las instalaciones físicas de los laboratorios clínicos. E l servicio de calidad para el pacien te, así com o el cu m plim iento norm ativo, se facilita por la existen cia de un program a estructurado de PLDA dentro de la institu ción. Los laboratoristas pueden proporcionar ayuda y apoyo al personal que realiza las pruebas. Cuando se pone en práctica la PLDA, se deben contem plar varias etapas preparatorias. E l resultado final de la atención cuidadosa con estos detalles será un progra­ m a de PLDA de calidad que, a su vez, produce resultados de calidad en el exam en del paciente. La PLDA es un área en rápido crecim iento de la m edi­ cina de laboratorio. Com o se describió en este capítu lo, la PLDA proporciona diversas oportunidades para los labo­ ratoristas y otros profesionales de la salud para trabajar de m anera coordinada y proveer resultados confiables, congruentes, de alta calidad siem pre que se lleve a cabo la prueba.

CAPÍTULO 7 ■ PRUEBAS EN EL LUGAR DE LA ATENCIÓN

P R E G U N T A S 1. De lo que se m enciona a con tin u ació n , ¿qué no aplica a la prueba exenta? a) E m plea instrum entos sim ples. b) E l operador debe m ezclar o preparar los reacti­ vos. c) Se siguen las in stru ccion es del fabricante. d) E l personal debe tener capacitación específica para realizar la prueba. 2. ¿Cuál de las siguientes p osiciones no es parte de un program a de PLDA b ien organizado? a ) In stru ctor en el lugar de la atención. b ) Coordinador en el lugar de la atención. c) R epresentante del fabricante. d) Director. 3. La inform ación necesaria para determ inar si se debe usar la PLDA incluye todo lo siguiente excepto: a) ¿Q uién efectuará la prueba? b ) ¿El coordinador del lugar de la atención se lleva b ien con el adm inistrador de la unidad? c) ¿Cuántas pruebas se efectuarán por mes? d ) ¿C óm o se d ocum entarán los resultados de las pruebas? 4. La estandarización produce los siguientes resultados excepto: a) M enor cantidad de trabajo. b ) C om paración de los resultados de prueba entre lugáres separados en el hospital. c) M ayor costo, d ) Cum plim iento norm ativo m ejorado.

DE

177

R E P A S O

6 . ¿C uál de los siguientes enunciados es correcto? a ) Al llevar a cabo validaciones, es im portante inclu ir m uestras positivas y negativas para los analitos que se in clu irán en el inform e. b ) Los resultados de instrum entos aprobados para PLDA siem pre tienen una buena correlación con los m étodos de laboratorio. c) La validación no es necesaria para la PLDA por­ que los m étodos de prueba son sim ples. d) Las regulaciones n o requieren validación de m étodos de PLDA. 7. La regulación federal con la que deben cum plir las ins­ tituciones al poner en práctica u n sistem a de PLDA es: a ) La N ational Accrediting Agency f o r Clinical Labo-

ratory Science. b) E nm iendas de M ejoram ien to del Laboratorio C lí­ nico. c) E l N ational Com m ittee fo r Clinical Láboratory

Standards. d.) La American Society fo r Clinical Laboratory Science.

8 . L lene los siguientes espacios en blanco: TCA sig n ifica ____________ . Los resultados del TC A se em plean para m onitorear la terapia d e ___________ . E l TC A m ide los com ponentes celulares y no celu la­ res del p roceso d e ____________ . La autom atización encontrada en los instrum entos de coagu lación en el LDA reduce l a ___________ del operador al efectuar la prueba de TCA.

5. La validación incluye: a) C orrelación de m uestra dividida contra m étodo de referencia. b) Evaluación de precisión. c) C om probación del alcance notificable. d) Todo lo anterior.

R EFEREN CIAS 1. CAP Commission on Laboratory Accreditation, Laboratory Accreditation Program, Point-of-care Testing Checklist. 2002. 2. Basic QC Practices. Madison, WI: Westgard QC, 2002. Available at: www.westgard.com. 3. Hattersley P Activated coagulation time of whole blood. JAMA 1966:136-436. 4. Hemoglobin data management analyzer operating manual. Mission Viejo, CA: HemoCue, 2003.

5. Point-of-care connectivity; approved standard. NCCLS document POCT1-A, Vol. 21, No. 24 (ISBN 1-56238-450-3). Wayne, PA: NCCLS, December 2001. 6. 2002-2003 Standards for Pathology and Clinical Laboratory Servi­ ces. Oakbrook Terrace, IL: Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations, 2002. 7. Price CP, Hicks JM , eds. Point-of-Care Testing. Washington, D.C.: AACC Press, 1999.

II Correlaciones clínicas y procedimientos analíticos

178

CAPÍTULO

Aminoácidos y proteínas

8

Barbara J. Lindsey

...

C O N T E N I D O

D E L

C A P Í T U L O Función general de las proteínas Proteínas plasmáticas Proteínas diversas Anorm alidades de proteína total Métodos de análisis Proteínas en otros líquidos corporales RESUMEN PREGUNTAS DE REPASO REFEREN CIAS

AM IN O ÁCID O S Estructura básica Metabolismo Aminoacidopatías Análisis de aminoácidos PROTEÍNAS Características generales Síntesis Catabolismo y balance de nitrógeno Clasificación

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Describir las estructuras y propiedades generales de am inoácidos y proteínas, incluso proteínas con­ jugadas y simples. • Describir la síntesis de proteínas y el catabolismo. • Explicar las características generales de las am i­ noacidopatías, incluso el defecto metabólico en cada una y el procedimiento empleado para la detección. • Explicar de manera breve la función e importancia clínica de las siguientes proteínas: ■ prealbúmina ■ albúmina ■ oq-antitripsina ■ cq-fetoproteína ■ haptoglobina ■ ceruloplasmina ■ transferrina ■ fibrinógeno ■ proteína C reactiva ■ inmunoglobulina ■ troponina



Explicar por lo menos cinco causas generales de concentraciones anorm ales de proteína sérica. • Listar los intervalos de referencia para proteína total y albúmina y analizar algunos factores no patológicos que afectan las concentraciones. • Describir y comparar metodologías empleadas en el análisis de proteína total, albúmina y fracciona­ miento de proteína. Incluir las características estruc­ turales o propiedades químicas que son pertinentes a cada medición y el uso clínico de cada una. • Reconocer y nombrar las fracciones, e interpretar cualquier anormalidad en el patrón, y relacionar estos patrones con etapas de enferm edad común dada una exploración densitom étrica de una elec­ troforesis de proteína sérica con el método de rutina (cinco zonas). • Diferenciar los tipos de proteinuria con base en la causa y tipo de proteína encontrada en la orina, y describir el principio de los métodos usados para determinación cualitativa y cuantitativa e identifi­ cación de proteínas en la orina. • Describir las enferm edades relacionadas con alte­ raciones en proteínas de líquido cefalorraquídeo.

179

180

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

___________________________

T É R M I N O S

Albúm ina Aminoácido Am inoacidopatías Anfotérico Balance de nitrógeno

Desnaturalización Enlace peptídico Estructura cuaternaria Fenilcetonuria (PKU) Globulinas

En 1 8 3 9 , el quím ico alem án G .J. M ulder estaba investi­ gando las propiedades de una sustancia encontrada en la lech e y claras de huevo que se coagulaba con el calor. E l cien tífico sueco J .J . Berzelius sugirió a M ulder que estas sustancias se llam aran proteínas (de la palabra griega proteis, que significa prim er rango de im portancia) por­ que sospechaba que podrían ser las más im portantes de todas las sustancias biológicas. M ulder pensó que todas las sustancias proteín icas eran lo m ism o porque con ten ían carbono, nitrógeno y azufre. Se en con tró que esto no era cierto cuando C. Dum as descubrió que el contenid o de nitrógeno variaba un poco en proteína obtenida de fuentes d istintas .1 E n la actualidad se sabe que las proteínas son m acrom oléculas com puestas de polím eros de am inoácidos con enlace covalente, y que participan en todo proceso celular. E n este capítulo se analizan las propiedades generales de los am inoácidos y proteínas, las anorm alidades relacion a­ das co n cada uno y m étodos de análisis.

AM INO ÁCIDO S Estructura básica Los am inoácidos a son biom olécu las pequeñas que co n ­ tien en por lo m enos un grupo am ino (-N H 2) y un grupo carb oxilo (-C O O H ) enlazados al carbono a . D ifieren entre sí por la com p osición quím ica de sus grupos R (cadenas laterales). La estructura general de un am inoácido a se ilustra en la figura 8 -1 . Veinte am inoácidos diferentes se em plean com o bloqu es de co n stru cció n para la proteí­ na. Los grupos R encontrados en estos am inoácidos a se m uestran en el cuadro 8- 1 .

M etabolism o Cerca de la m itad de los 2 0 am inoácidos que requiere el hu m ano no se pueden sintetizar a una tasa su ficientem en­ te rápida para m antener el desarrollo. E stos nueve am i-

C L A V E

Hiperproteinemia Hipoproteinemia Inmunoglobulina mono­ clonal Opsonización

Proteína conjugada Proteína fetal principal Proteína simple Proteinuria Punto isoeléctrico (pl)

n oácid os esenciales desde el punto de vista nu tricion al deben ser aportados en la dieta en la form a de proteínas. E n circunstancias norm ales, las enzim as proteolíticas, com o pepsina y tripsina, digieren por com pleto proteínas de la dieta en sus am inoácidos constitu yentes. E n ton ces los am inoácidos se absorben rápido desde el intestino hacia la sangre portal y después se vuelven parte del grupo corporal de am inoácidos. O tros contribuyentes al grupo de am inoácidos son los recién sintetizados y los que se liberan por la d escom posición norm al de proteínas cor­ porales. E l grupo de am inoácidos se utiliza sobre todo para la sín tesis de proteínas corporales, com o proteínas plasm á­ ticas, intracelulares y estructurales. Los am inoácidos se em plean tam bién para la síntesis de com puestos no proteín icos que con tien en nitrógeno, com o purinas, pirim idinas, porfirinas, creatina, histam ina, tiroxin a, adrenalina y la coenzim a NAD. Además, la proteín a provee 12 a 20% del requisito de energía corporal diaria total. E l grupo am ino se elim ina de los am inoácidos por d esam inación o transam inación. E l cetoácido resultante puede entrar en una vía m etabólica com ú n con carbohid ratos y grasas. Los am inoácidos que generan precursores de la glucosa, por ejem plo, piruvato o un interm ediario del ciclo del ácido n ítrico , se co n o cen com o glucogénicos. E jem p los son alanina, que se puede desam inar a piruvato; arginina, que se convierte a cetoglutarato, y aspartato, que se convier­ te a oxaloacetato. Los am inoácidos que son degradados a acetil-C oA o acetoacetil-C oA , com o la leu cin a o la lisina, se den om inan cetogénicos porque originan cuerpos cetónicos. Algunos am inoácidos pueden ser cetogénicos o glucogénicos porque algunos de sus átom os de carbono surgen en precursores cetónicos y otros aparecen en p osi­ b les precursores de glucosa. E n la figura 8 -2 se m uestran los puntos de entrada de los átom os de carbono de am i­ noácidos en las vías m etabólicas de carbohidratos y grasas. El ion am onio que se produce durante la desam inación de los am inoácidos se convierte en urea en el ciclo de la urea en el hígado.

A m inoacidopatías R Ho N

I

C

COOH

I H FIGURA 8-1.

Estructura general de un aminoácido a.

Las am inoacidopatías son trastornos hereditarios raros del m etabolism o de los am inoácidos. Las anorm alidades exis­ ten en la actividad de una enzim a específica en la vía m eta­ b ólica o en el sistem a de transporte de la m em brana para am inoácidos. Han sido identificadas m ás de 1 0 0 enferm e­ dades que resultan de errores in natos del m etabolism o.

CAPITULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS

181

CUADRO 8-1. AMINOÁCIDOS REQUERIDOS EN LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS_______________________________ AM IN O ÁCID O

AM IN OÁCID O

R

Glicina (Gli)



H

Alanina (Ala)



ch3

O Glutam ina (Gln)

~ Í H3 Valina (Val)*



— c h 2— c h 2— c — n h 2 OH

CH— CH3

Serina (Ser)

ch3

Leucina (Leu)*

R

- ch2 OH |

— CH2— CH— CH3

Treonina (Tr)*

— CH— CH3

Tirosina (Tir)

— c h 2^ ^ >

Lisina (Lis)*

— c h 2— c h 2— c h 2— c h 2— n h 2

Í H3 Isoleucina (lie)*



CH— CH

Cisterna (Cis)



C H — SH

Metionina (Met)*



c h 2— c h 2— s— c h 3



CH3

/T "N H —

CH2—

( I

Arginina (Arg)

Triptófano (Trp)*

—oh

NH, I! — c h 2— c h 2— c h 2— n — c — n h 2 H NH

Histidina (His)* Fenilalanina (Fen)* - "

Asparagina (Asn)

. - O

— C H — C— n h 2

NH

Aspartato (Asp)

— C H — COOH

Glutam ato (Glu)

— C H — C H — COOH

Prolina (Pro)+

-COOH

El grupo R es el grupo unido al carbono a. * Esencial nutrlcionalmente. t La excepción a la unión a del grupo R es la prolina.

Tirosina Fenilalanlna Aspartato

FIGURA 8-2. Conversión de las estructuras de carbono de aminoácidos en piruvato, acetil-CoA o derivados del ciclo del ATA para más catabolismo.

182

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

F en ilceto n u ria La fen ilcetonu ria (PKU) es heredada com o un rasgo rece­ sivo autosóm ico y ocurre en casi 1 de 1 5 0 0 0 nacim ientos. E l efecto autosóm ico en la form a clásica de PKU es una ausencia casi total de actividad de la enzim a hidroxilasa de fenilalanina (PAH) (llam ada tam bién fen ilalanin a-4-m onooxigenasa), que cataliza la conversión de fenilalanina a tirosina (fig. 8 -3 ). En ausencia de la enzim a, la fenilalani­ na se acum ula hasta concentraciones que pasan de 1 200 qmol/L y se m etaboliza m ediante una vía degradativa alter­ na. Los catabolitos son ácido pirúvico, que es el producto de la d esam inación de la fenilalanina; ácido feniláctico, que es el producto de red ucción del ácido fenilpirúvico; ácido fenilacético, que se produce por d escarboxilación y oxid ación de ácido fenilpirúvico; y fenilacetilglutam ina, que es el conjugado de glutam ina del ácido fenilacético. Aunque el ácido fenilpirúvico es el m etabolito prim ario, todos estos com puestos se observan en la sangre y la orina de un paciente fenilceton ú rico, lo que da a la orina un olor a rancio característico. Las variantes de la enferm edad resultan de deficiencias parciales de actividad de PAH y suelen clasificarse com o PKU leve si las concentracio nes de fenilalanina están entre 6 0 0 y 1 2 0 0 iimol/L o hiperfenilalaninem ia leve no PKU que se presenta co n con cen tra­ ciones de fenilalanina en el intervalo de 1 8 0 a 6 0 0 u,mol/L y sin acu m ulación adjunta de fenilcetonas. E n infantes y n iños con este defecto hereditario, ocurre desarrollo m ental retardado com o resultado de los efec­ tos tó xicos del fenilpiruvato en el cerebro o unos de sus subproductos m etabólicos. E l deterioro de la fu n ció n cere­ bral com ienza en la segunda o tercera sem ana de vida. E l daño cerebral se puede evitar si se detecta la enferm edad en el n acim ien to y se m antiene al infante co n una dieta que con tien e con cen tracio n es m uy b ajas de fenilalanina. E n el pasado, la dieta se term inaba cuando el n iñ o llegaba a los 5 o 6 años de edad. Esto se basaba en la creencia de que, a esa edad, el cerebro ya no era vu lnerable a daño por parte de la hiperfenilalaninem ia. Sin em bargo, se c o n o ­ ce que hay una ligera red ucción en el CI después de la d esco n tin u ación de la dieta. Los d escend ientes de m u je ­ res co n PKU que no fueron tratadas durante el em barazo, tam bién fueron siem pre m icrocefálicos y con retraso m en­ tal. Los efectos fetales de la PKU m aterna son prevenibles si se m antiene a la m adre co n una dieta b aja en fenilala­ nina desde antes de la con cep ció n hasta el térm ino. Por estas razones, ahora se recom ienda que el p acien te PKU con tin ú e con el tratam iento a base de dieta por tiem po in d efin id o .2 Hay casos de hiperfenilalaninem ia, sin em bargo, que no responden al tratam iento con dieta. E l defecto en este caso es una d eficiencia en las enzim as necesarias para la rege­ neración y síntesis de tetrahidrobiopterina (BH4). La BH 4 es u n cofactor requerido para la h id roxilació n enzim ática de los am inoácidos fenilalanina, tirosina y triptófano. Una d eficiencia de BH 4 da com o resultado concentracio nes sanguíneas elevadas de fenilalanina y prod u cción d eficien­ te de neurotransm isores de tirosina y triptófano. El exa­ m en de las proteínas de la orina es útil en el diagnóstico. Aunque las d eficiencias de cofactor exp lican sólo 1 a 5%

de los casos de concentraciones elevadas de fenilalanina, se deben identificar de m odo que se puede in iciar el trata­ m iento apropiado. Se debe dar a los pacientes un cofactor activo ju n to con los precursores de neurotransm isor LDOPA y 5-O H trip tófan o .3 E n la actualidad, todos los estados en EUA han prom ul­ gado leyes para exigir el cu m plim iento de program as de d etección de m odo que se puedan tom ar m edidas terapéu­ ticas oportunas para prevenir la discapacidad y m ortalidad resultantes relacionadas con la hiperfenilalaninem ia. U n proced im iento de d etección com ún es el ensayo de in h i­ b ició n bacteriana de G uthrie. E n esta prueba, las esporas del m icroorganism o Bacillus subtilis se incorp oran en una placa de agar que contiene P ,-tienilalanina, un antagonista m etabólico al desarrollo de B. subtilis. E n el agar se coloca un disco de papel filtro im pregnado con sangre del in fan ­ te. Si la con cen tració n de fenilalanina en la sangre excede un intervalo de 2 a 4 mg/dl, la fenilalanina contrarresta al antagonista y ocurre el crecim iento bacteriano. Para evitar resultados falsos negativos, debe tener por lo m enos 24 horas de haber nacido a fin de asegurar el tiem po adecua­ do para que se form en las concentracio nes de enzim as y am inoácidos. Además, la m uestra se debe tom ar antes de la ad m inistración de antibióticos o transfusión de sangre o productos sanguíneos. Los infantes prem aturos pueden m ostrar resultados falsos positivos debido a la inm adurez de los sistem as enzim áticos del hígado. O tro m étodo para la detección de PKU requiere un ensayo m icroflu orom étrico en discos de filtración con sangre seca. Este m étodo produce resultados cu antitati­ vos más que sem icuantitativos de la prueba de G u thrie, es más adaptable a autom atización y no resulta afectado por la presencia de antibióticos. E l proced im iento se basa en la fluorescencia de un com plejo form ado de fenilalaninaninhid rina-cobre en presencia de un dipéptido (es decir, L-leucil-L-alanina). La prueba requiere pretratam iento de la m uestra de papel filtro con ácido tricloroacético (ATC). E l extracto reacciona entonces en una placa de m icrotítu lo con una m ezcla de ninhidrina, su ccin ato y leu cilalanina en presencia de tartrato de cobre. La fluorescencia de un com p lejo se m ide por m edio de longitudes de onda de excitación y tran sm isión de 3 6 0 y 5 3 0 nm , respectiva­ m en te .4 Se debe detectar cualquier resultado positivo en estas pruebas de detección. E l m étodo de referencia para fenila­ lanina sérica cuantitativa es la CLAP; sin em bargo, están d isponibles tanto m étodos fluorom étricos com o enzim áti­ cos. Los lím ites norm ales para con cen tracio n es séricas de fenilalanina para recién nacidos de térm ino varían de 1.2 a 3 .4 mg/dl (7 0 a 2 0 0 qmol/L). E n fechas recientes, la espectrom etría de m asas en tándem (MS/MS) se ha em pleado en la d etección de tras­ tornos hereditarios en recién nacidos. E l sistem a MS/MS com prende dos espectróm etros de m asas tetrapolo sepa­ rados m ediante una cám ara de colisión que fragm enta las m oléculas. Se eluye la sangre de un disco de papel fil­ tro; luego, el eluato se esterifica con butanol. La m uestra obtenida se inyecta en el sistem a donde se ioniza con una técnica de ion izació n “suave” o de b aja energía com o la

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

electrodispersión. E l prim er espectróm etro de m asas sepa­ ra y determ ina las masas de las distintas m oléculas en la m uestra y las transm ite a la cám ara de colisión. Aquí la colisión de las m oléculas con u n gas inerte b ajo presión causa fragm entación. Los fragm entos pasan a un segun­ do espectróm etro de m asas que los separa de acuerdo a m asa y carga. La exp loración de com putadora de los dos espectróm etros de masas relaciona los iones de fragm ento con sus iones m oleculares originales intactos, y perm ite la identificación y cu antificación sim ultáneas de am inoá­ cidos asi com o de otras m oléculas com o las acilcarnitinas (que identifican trastornos de ácidos orgánicos y grasos ).5 Por tanto, se pueden identificar tanto el increm en to de fenilalanina com o la dism inu ción en las concentracion es de tirosina vistas en la PKU y se puede calcular la relación de fenilalanina a tirosina. Usar la relación entre m etabolitos en vez de una con cen tració n individual ha increm en ta­ do la especificidad de la m ed ición y dism inuido la tasa de falsos positivos para PKU a m enos de 0 .0 1 % . Además, la sensibilidad del m étodo detecta con centracio n es m enores de fenilalanina, lo que perm ite diagnosticar PKU en el pri­ m er día de vida. Puesto que MS/MS tiene la capacidad para detectar m ás de 25 trastornos genéticos d istintos con una sola m uestra, este m étodo podría reem plazar los diversos p roced im ientos que se em plean en la actualidad en pro­ gramas de d etección con recién nacidos. E l análisis de orina para ácido fenilpirúvico, aunque no es considerado un procedim iento de d etección inicial, se puede em plear para diagnóstico en casos cu estionables y m onitoreo de terapia dietética. La prueba, que se podría llevar a cabo m ediante tubo o prueba de tira reactiva (Phen istix, M iles D iagnostics, E lkhart, IN ), conlleva la reac­ ció n de cloruro férrico con ácido fenilpirúvico en orina para producir un color verde. E l diagnóstico prenatal y la d etección de estado porta­ dor en fam ilias con PKU están disponibles en la actualidad por m edio de análisis de ácido d eso xirribo nu cleico (D N A ). P or su estructura m olecular, la PKU resulta de m últiples m u taciones independientes (m ás de 4 0 0 identificadas) en el lugar de la hidroxilasa de fenilalanina (PAH). E l análisis, con PAH cDNA hum ano clonado com o sonda, ha revelado la presencia de num erosos polim orfism os de la longitud del fragm ento de restricció n en el gen de PAH. D ebido a que se ha dem ostrado que los patrones del fragm ento de restricció n y el estado m orboso tien en m u cha relación en fam ilias PKU , estos polim orfism os se pueden usar para diagnóstico prenatal .6Sin em bargo, aunque la m ayor parte de las m u taciones de PAH producen fenotipos predecibles, se ha inform ado de inconsisten cias en las que fenotipos de PAH sim ilares produjeron variaciones im portantes en el nivel de actividad de la hidroxilasa de fenilalanin a .7

fenilpirúvico (A PH FP ), que se oxida a ácido hom ogenístico (A H G ). E l AHG se m etaboliza m ás en una serie de reacciones a fum arato y acetoacetato, com o se m uestra en la figura 8 -3 . E l defecto en las anorm alidades de tirosina heredadas es ya sea una deficiencia de am inotransferasa de tirosina, que da com o resultado tirosinem ia ÍI; una defi­ ciencia de oxidasa de ácido 4-hid roxifen ilp irú vico, que da lugar a tirosinem ia tipo 771; o, lo que es m ás com ú n, una d eficiencia de hidrolasa de fu m arilacetoacetato, FAA, que produce tirosinemia I. La hidrolasa de FAA divide al ácido fu m arilacetoacético en ácidos fum árico y acetoacético. La ausencia de estas enzim as origina con cen tracio n es anor­ m alm ente altas de tirosina y, en algunos casos, increm en­ tos en APHFP y m etionina. Las con cen tracio n es altas de tirosina causan daño hepático, lo que podría ser fatal en la infancia, o tiem po después cirrosis y cáncer de hígado. La incidencia de tirosinem ia I es de alrededor de 1 en 100000 nacim ientos. Los criterios de diagnóstico inclu y en una con cen tració n alta de tirosina al usar MS/MS acoplada con

Vía alterna Ácido fenilpirúvico y metabolitos

Fenilalanina

Bloqueado en la fenilcetonuria

Hidroxilasa de fenilalanina

Tirosina

Bloqueado en la tirosinema II

T

Aminotransferasa de tirosina

Ácido p-hidroxifenilpirúvico (APHFP) Oxidasa de 4-hidroxifenilpiruvato Ácido homogentísico (AHG) Bloqueado en la alcaptonuria

+

Oxidasa de homogentisato

Acido malelilacetoacético (AMA) Isomerasa de AM A

Fumarilacetoacetato (FAA)

T irosem ina y trastornos relacionados U na serie de trastornos m etabólicos fam iliares del catabo­ lism o de tirosina se caracteriza por la excreció n de tiro­ sina y catabolitos de tirosina en la orina. Por lo com ún, la trayectoria principal del m etabolism o de la tirosina conlleva la elim inación de u n grupo am ino m ediante la am inotransferasa de tirosina que form a ácido p-hid roxi-

183

Fumarato Acetoacetato— *■Acetil-CoA m

= bloqueo en la vía

FIGURA 8-3.

Metabolismo de la fenilalanina y tirosina.

184

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

una prueba confirm atoria para una con cen tració n alta del m etabolito anorm al su ccin ilaceton a .5

A lcaptonuria E ste trastorno es de interés histórico considerable en cu an­ to a que fue uno de los “errores innatos del m etabolism o” originales descritos. A com ienzos del siglo x x , Archibald Garrod, u n pediatra, recon oció que el síndrom e, que había sido llam ado alcaptonuria, m ostraba un patrón de herencia familiar. Él propuso que la alcaptonuria y ciertos trastornos se debían a defectos genéticos, cada uno de los cuales dio com o resultado falta de actividad de una enzi­ ma m etabólica particular .8 Cuarenta y cin co años después, se confirm ó que el defecto bioqu ím ico en la alcaptonuria es una falta de oxidasa de hom gentisato en la trayectoria catabólica de la tirosina (fig. 8 -3 ). E ste trastorno ocurre en casi 1 de 2 5 0 0 0 0 nacim ientos. Una m anifestación clín i­ ca predom inante de la alcaptonuria es el oscu recim iento de la orina al exponerla a la atm ósfera. Este fenóm eno se debe a la acu m ulación de AHG en la orina, que se oxida para producir u n polím ero oscuro. Los pacien tes alcaptonú rico s no tien en problem as inm ediatos; sin em bargo, la con cen tració n alta de AHG se acum ula poco a poco en el tejido conectivo, lo cual causa pigm entación generalizada de estos tejid os (o cron o sis) y una degeneración parecida a la artritis.

E n ferm ed a d d e la orina con olor a ja r a b e d e a rce C om o indica el nom bre, la característica m ás notable de esta enferm edad hereditaria es el olor a ja ra b e de arce o azúcar quem ada característico de la orina, aliento y piel. La enfer-medad de la orina con olor a ja r a b e de arce (EOOJA ) resulta de actividad nula, o reducida en gran medida ( < 2% ), de la enzim a descarboxilasa de cetoácido a de cadena ram ificada, que bloquea el m etabolism o norm al de los am inoácidos leu cina, isoleucina y valina. En particular,

Leuclna

Isoleucina

t

Valina

1

1

Acido a-cetoisocaproico

Acido a-ceto fS-metilvalórico Descarboxilación

Isovaleril-CoA

Bloqueado en acidemia isovalórica

esta enzim a cataliza la d escarboxilación oxidativa de los cetoácid os a de cadena ram ificada a C 0 2 y sus tioésteres A cil-C oA correspondientes (fig. 8 -4 ). E l resultado de este defecto enzim ático es un a acu m ulación de los am inoáci­ dos de cadena ram ificada y sus cetoácid os correspond ien­ tes en la sangre, orina y líquido cefalorraquídeo (L C R ). P or lo general, los infantes con esta anorm alidad here­ dada parecen norm ales al nacer, pero a los 4 a 7 días, pre­ sen tan letargo, vóm ito y signos de insu ficiencia para crecer. Siguen los síntom as del sistem a nervioso central (S N C ), que inclu yen rigidez m uscular, estupor e irregularidades respiratorias. Si no se trata, la enferm edad causa retraso m ental grave, convulsiones, acidosis e hipoglucem ia. En la form a clásica de la enferm edad, la m uerte ocurre por lo regular durante el prim er año; sin em bargo, se tiene co n o ­ cim iento de form as interm edias. E n estas variantes m enos graves, la actividad de la descarboxilasa es casi 25% de lo norm al. Aunque esto aún origina una elevación persisten­ te de los am inoácidos de cadena ram ificada, con frecu en­ cia las con cen tracio n es se pueden con trolar al lim itar la ingestión de proteínas de la dieta. A unque la incid en cia de la EO O JA es b aja, se presen­ ta en 1 de 2 1 6 0 0 0 nacim ientos, el diagnóstico oportuno es im portante para com enzar el tratam iento d ietético. Por tanto, la prueba para EO O JA se incluye en m uchas de las d eteccion es m etabólicas requeridas por la ley en ciertos estados. Suele em plearse una prueba de G uthrie m odifica­ da para esta d etección neonatal. E l in hibid or m etabólico para B. subtilis , incluido en los m edios de crecim iento, es 4-azaleu cina. En una prueba positiva para EO O JA , una con cen tració n elevada de leucina de un d isco de papel fil­ tro im pregnado con la sangre del infante superará al in h i­ bid or y ocurre crecim iento bacteriano. P or otro lado, un ensayo m icroflu orom étrico para am inoácidos de cadena ram ificada, con deshidrogenasa de leu cina (E C 1 .4 .1 .9 ), se puede usar para la d etección de masa. E n este proce-

IM l

1

Acido a-cetoisovalérlco

Bloqueado en EO O JA

a-Metilbutiril-CoA

f

Isobutiril-CoA

Deshidrogenasa de isovaleril-CoA

p-met¡lcrotonil-CoA

1

Y

AcetlI-CoA

FIGURA 8-4.

Acetil-CoA + Succinll-CoA

Metabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada.

Succinil-CoA

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

d im iento, la m uestra en papel filtro se trata con una m ez­ cla disolvente de m etanol y acetona para desnaturalizar la hem oglobina. La deshidrogenasa de leu cin a se añade a una alícuota de este extracto de m uestra. La fluorescencia del NADH producido en la reacción posterior se m ide a 4 5 0 nm , co n una longitud de onda de excitación de 3 6 0 n m .4 U n diagnóstico confirm ado se basa en hallar m ayo­ res con cen tracio n es plasm áticas y urinarias de los tres am inoácidos de cadena ram ificada y sus cetoácid os, con la leucina con la m ás alta con cen tració n . U na con cen tra­ ció n de leu cina arriba de 4 mg/dl es indicativa de EO O JA . La presencia de aloisoleucina, u n m etabolito inusual de la isoleucina, es característica. La m ed ición de leu cina y sus m etobolitos tam bién es posible con espectrom etría de m asas en tándem . La EO O JA se puede d iagnosticar prena­ talm ente m idiendo la con cen tració n de la enzim a descarboxilasa en células cultivadas de líquido am niótico.

A cidem ia isovalérica La acidem ia isovalérica resulta de una deficiencia de la enzim a deshidrogenasa isovaleril-C oA en la vía degradativa de la leu cina (fig. 8 -4 ). La elevación resultante del conjugad o de glicina del ácido isovalérico, isovalerilglicina, produce un olor característico a “pies sud orosos”. Las con cen tracio n es anorm ales de ácidos orgánicos se pueden identificar m ediante crom atografía o MS/MS.

H om ocistinuria La h om ocisteína es un am inoácido interm ediario en la síntesis de cisteína a partir de m etionina. Esta síntesis se ilustra en la figura 8 -5. E l caso usual de la enferm edad hereditaria, hom ocistin u ria, es un a actividad reducida de la enzim a sintasa |3 de cistationina, que produce co n cen ­ traciones elevadas en plasm a y orina de los precursores h om ocisteína y m etionina. Los recién nacidos no m ues­ tran anorm alidades, pero los defectos físicos se desarrollan p oco a po co con la edad. Los hallazgos clín ico s relaciona­ dos en la infancia tardía in clu yen trom bosis que resulta de la toxicid ad de la hom ocisteína para el endotelio vascular; osteoporosis; lentes dislocados en el o jo que resultan de la falta de síntesis de cisteína esencial para la form ación de colágeno; y, con frecuencia, retraso m ental. La enzim a sintasa (3 de cistation ina requiere vitam ina B e (pirid oxina) com o su cofactor. Los defectos genéticos un poco d istintos originan dos form as de la enferm edad: una form a que responde a la vitam ina B g, en la que el tra­ tam iento consiste en dosis terapéuticas de vitam ina B 6; y una form a que no responde a la vitam ina B 6, en la que el tratam iento es una dieta b aja en m etionina y alta en cistina. La incid encia de hom ocistinu ria es de alrededor de 1 en 2 0 0 0 0 0 nacim ientos. La d etección neonatal se puede lle­ var a cabo con una prueba de G uthrie usando L-m etionina sulfoxim in a com o el inhibid or m etabólico. Las con cen tra­ ciones increm entadas de m etionina plasm ática de infantes afectados darán com o resultado crecim ien to bacteriano. U na con cen tració n de m etion in a m ayor que 2 mg/dl con un proced im iento de CLAP confirm a resultados positivos en la prueba de d etección. P or otro lado, los program as de

185

Metionina

S-adenosilmetionina

S-adenosilhomocisteína

Y Homoclsteína

f

Bloqueado en homocistinuria

(3-Sintasa de cistationina

Cistationina

Y Cisteína FIGURA 8-5.

Síntesis de cisteína.

d etección pueden usar MS/MS para probar las con cen tra­ cion es de m etionina. E l aum ento de h om ocistina urinaria se puede detectar m ediante la prueba de m anch a de cianuro-nitroprusiato. E l cianuro de sodio reduce a la cistina y la h om ocistina a sus form as de tiol libre, cistina y hom ocistína, que pueden reaccionar entonces con nitroprusiato de sodio para producir un color ro jo púrpura. D ebido a que la cistina tam bién produce un resultado positivo, la presencia de hom ocistina se debe confirm ar con una prue­ ba de nitroprusiato de plata. E l nitrato de plata reduce a la hom ocistina pero no a la cistina, perm itiendo que sólo reaccione la hom ocistina con el n itroprusiato y produzca u n color rojizo. La cistina perm anece en la form a oxidada, que n o reacciona con el nitroprusiato de sodio. E l aum ento de las concentraciones de hom ocisteína tam bién es de interés en la investigación de riesgo cardio­ vascular. Se encontró que casi 50% de los individuos con hom ocistinu ria no tratada con concentraciones significati­ vam ente altas de hom ocisteína plasm ática (2 0 0 a 3 0 0 pinol/ L) han experim entado un suceso trom boem bólico antes de los 3 0 años de edad. Además, el aum ento leve de la con ­ centración de hom ocisteína ( > 1 5 pmol/L) ocurre en 2 0 a 3 0 % de pacientes con enferm edad aterosclerótica. Además de la deficiencia de sintasa (3 de cistationina descrita antes, la hiperhom ocistinem ia puede originarse debido a con cen ­ traciones bajas de folato; deficiencia de vitam ina B 12; dis­ m in u ción de la fu nción renal, y una alteración genética en la enzim a reductasa de m etilentetrahidrofolato (M T H FR ), que convierte al negro de hom ocisteína en m etionina.

186

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

A unque hay evidencia de disfunción endotelial en pacientes con concentraciones altas de hom ocisteína, hay desacuerdo en cuanto a si la hiperhom ocistinem ia es un factor causa­ tivo en el desarrollo de enfermedad aterosclerótica o una consecuencia del proceso de la enferm edad .8,9 Una expli­ cación más detallada de los factores de riesgo cardíaco se encuentra en el capítulo 2 3 , Función cardíaca.

A cid u ria argininosuccínica y citrulinem ia E stos trastornos por am inoácidos resultan de deficiencias enzim áticas hereditarias en el ciclo de la urea. La aciduria arginosuccínica resulta de una deficiencia de liasa de ácido arginosu ccínico (AAS), y una dism inu ción en la actividad de la sintetasa de AAS causa citrulinem ia. Hay tam bién varios trastornos relacionados causados por deficiencias en las otras enzim as requeridas para síntesis de urea. Los síntom as inclu yen vóm ito y altas concentraciones de am o­ niaco, y el retraso m etal se relaciona con algunas de las cond iciones. De m anera general, estos trastornos no se inclu yeron en los program as de d etección en recién n aci­ dos; sin em bargo, la tecnología MS/MS ha perm itido la m ed ición de los m etabolitos. La citrulina es el m arcador de diagnóstico para citrulinem ia y aciduria arginosuccínica. E n la citrulinem ia el aum ento de la con cen tració n de citrulina es bastante alto; en la aciduria argininosuccínica, el increm ento de citrulina es más leve, y en infantes de m ayor edad se observan increm entos de ornitina y arginina .5

Cistinuria Esta am inoacidopatía hereditaria se debe a un defecto en el sistem a de transporte de am inoácidos y no a una d eficien­ cia enzim ática m etabólica. N orm alm ente, los am inoácidos se filtran sin dificultad por el glom érulo y luego son reab­ sorbidos de form a activa en los túbulos renales proxim ales. E n la cistinuria, la excreción urinaria de cisteína aum enta 20 a 3 0 veces com o resultado de un defecto genético en el m ecanism o resortivo renal. E l m ecanism o de transporte no es específico para la cistina. La excreción de los otros am i­ noácidos, lisina, arginina y ornitina, se eleva de m odo sig­ nificativo tam bién com o resultado de resorción deficiente. De los cuatro, la cistina es el am inoácido que causa com plicaciones de la enferm edad. D ebido a que la cistina es relativam ente insolu ble, cuando alcanza estas co n cen ­ traciones altas en la orina, tiende a precipitar en los túbulos de los riñones y form a cálculos urinarios. La form ación de cálculos de cistina se reduce si se ingieren m u chos líqu i­ dos y se alcaliniza la orina, lo que hace a la cistina relativa­ m ente más soluble. Si esto no tiene éxito, se puede in iciar el tratam iento co n dosis regulares de p enicilam in a .10 La cistinu ria se puede diagnosticar si se hace un análi­ sis de cisteína de la orina con cianuro-nitrop rusiato, que produce un co lo r ro jo púrpura al reaccionar co n grupos sulfhidrilo. Se deben descartar los resultados falsos p ositi­ vos debido a la hom ocistina.

A n álisis de am inoácidos Las m u estras para análisis de am inoácid os se d eben extraer después de por lo m enos 6 a 8 h de ayuno para el

efecto de am inoácid os absorbid os que se originan de pro­ teínas de la dieta. La m uestra se co le cta en heparina, y el plasm a se elim ina de las células co n prontitud , teniend o cuidado de no aspirar la capa de plaqu etas o leu co cito s. Si este paso n o se efectú a con p recau ció n , el plasm a se con tam in a c o n p laqu etas o am inoácid os de leu co cito s, en los que los co n ten id o s de ácido aspártico y glutám ico, por ejem p lo, so n casi 100 veces m ás altos que en el plasm a. P or la m ism a razón se d ebe evitar la h em olisis. La d esp rotein ización se debe llevar a cabo de inm ediato o se debe alm acen ar la m u estra a una tem peratura de -20 a -4 0 °C . Los análisis de am inoácidos en la orina se pueden efec­ tuar en un a m uestra aleatoria para propósitos de detec­ ción ; sin em bargo, para cuantificación, se requiere orina de 2 4 h conservada co n tim ol y disolventes orgánicos. Tam bién se puede analizar líquido am niótico. Para d etección prelim inar, el m étodo de elecció n es la crom atografía de capa fina. La aplicación de separaciones de una o dos d im ensiones depende del propósito del aná­ lisis. Si se está investigando una categoría particular de am inoácidos, com o los de cadena ram ificada, o inclu so un solo am inoácido, suelen ser suficientes las separaciones u nidim ensionales. Las cond iciones de separación se pue­ d en seleccionar de tal m anera que ofrezcan buena resolu ­ ción del am inoácido en cuestión. Los m apas bid im ensionales son esenciales para d etec­ ció n más general. E n la crom atografía bid im ensional, se perm ite que los am inoácidos m igren a lo largo de un fren­ te de disolvente, y luego se hacen girar 9 0 ° al crom atograma y ocurre una segunda m igración de disolvente. Se han em pleado diversos disolventes, inclu so m ezclas de butan ol-ácid o acético-agua y etanol-am oniaco-agua. E l crom atogram a se ve al teñir con ninhidrina, que da a la m ayor parte de los am inoácidos un color azul. Cuando ha sido indicad a la posibilid ad de u n trastorno por am inoácid o en los pasos prelim inares, los am in oáci­ dos se pueden separar y cu antificar m ed iante cro m ato­ grafía de intercam bio catión ico por m edio de una elu ció n co n d isolu ción am ortiguadora en gradiente, un sistem a de fase invertida de CLAP equipado co n d etección de flu o rescen cia ,11 o electroforesis capilar. O tra técn ica que provee un m étod o m uy esp ecífico y sen sible para la m ed i­ ció n de am inoácid os es la esp ectrom etría de m asas en tándem .

PROTEÍNAS Características generales Las proteínas son una clase esencial de com puestos que com prenden 5 0 a 70% del peso en seco de la célula. Las proteínas se encuentran en todas las células del cuerpo, así com o en los líquidos, secreciones y excreciones.

Tam año m olecular Las proteínas biológicam ente activas son m acrom oléculas que varían en peso m olecular de casi 6 000 para insulina a varios m illones para algunas proteínas estructurales.

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

187

ES T U D IO D E C A S O 8-1 Un niño de 13 m eses de edad fue adm itido a un peque­ ño hospital ru ral .1 Su estado de salud ha sido nor­ m al hasta hace 10 dias, tiem po en el que desarrolló una in fecció n de tracto respiratorio superior. E l niño experim entó problem as crecientes co n su balance y se volvió letárgico. Estos síntom as llevaron a la madre a b uscar atención m édica en el hospital donde los resul­ tados pertinentes de laboratorio en la adm isión m ostra­ ron una con cen tració n de glucosa sérica de 2 3 mg/dl y cetonas moderadas en la orin a y el suero. Se in ició un tratam iento con una d isolu ción intravenosa de dextrosa al 5% para corregir la con cen tració n baja de glucosa. D ebido a que el cuadro clín ico se asem eja al síndrom e de Reye, el n iñ o fue transferido a un centro m éd ico para u n diagnóstico definitivo. Los resultados de laboratorio

en la adm isión al centro m édico aparecen en el cuadro 81.1 del estudio de caso. 1. C am pbell P. Case studies. J Med Tech 1 9 8 5 ;2 :9 .

Preguntas 1. ¿Cuál resultado de laboratorio puede ser útil para des­ cartar el diagnóstico de síndrom e de Reye? 2. ¿Q ué correlaciones se pueden h acer co n el pH de la sangre, P C O , de glucosa sérica y hallazgos de cetona en suero y orina? 3. ¿Q ué otras pruebas de laboratorio se deben llevar a cabo para com probar un defecto en el m etabolism o de proteínas?

CUADRO 8-1.1. DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO EN LA ADMISIÓN AN ÁLISIS DE ORINA

H EM ATO LOGÍA

37%

Hct

Densidad relativa

1.022

128 x 109/L

Proteína

Trazas

Bandas

28%

Acetona

3+

Segmentado

46%

Sangre

1+

Linfocitos

21%

Monocitos

5%

RSC

Q U ÍM ICA (INTERVALO DE REFERENCIA)

Glucosa

133 mg/dl (65-105)

Fos. ale.

129 U/L (20-70)

ÑUS

21 mg/dl (7-18)

AST

154 U/L (10-30)

Na

136 mmol/L (136-145)

ALT

133 U/L (8-20)

K

4.3 mmol/L (3.6-5.1)

CK

36 U/L (25-90)

10 mmol/L (23-29)

LD

119 U/L (45-90)

CI

112 mmol/L (98-106)

Cetona

Moderada

nh3

48 |xmol/L (40-80)

tco

2

GA SES SANGUÍNEO S ARTERIALES

7.17

PC02

23 mm Hg

Q-

90 mm Hg

o

PH

fNJ

E structura Las proteínas com prenden los polím eros de am inoácidos co n enlace covalente. Los am inoácidos están enlazados de u n m odo cabeza a cola; en otras palabras, el grupo carb oxilo de u n am inoácido se com bina con el grupo am in o de otro am inoácido (fig. 8- 6). D urante esta reacción, se elim ina una m olécula de agua y el enlace que se crea se llam a en lace peptídico. E l am inoácido que tiene el gru­

po am ino libre es el extremo term inal N, y el am inoácido que tiene el grupo carboxilo libre es el extremo term inal C. Cuando se u n en dos am inoácidos, la m olécula se llam a dipéptido; tres am inoácidos se llam an tripéptido , y cuatro ju n to s es un tetrapéptido. Cuando aum enta m ás la cade­ na, se llam a polipéptido. En el suero h u m ano, las proteínas prom edian cerca de 1 0 0 a 1 5 0 am inoácidos en la cadena polipeptídica.

188

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

n h 2—

r

c -

i' -COOH

+

NH2

H

C

COOH

! R=

! II

-H ,0

NH5

H

H

i

i

¿ - Ü’ L v Ks __ Hj _ H

I

l_ ¿

___ COOH

I H

Enlace peptídico FIGURA 8-6.

Formación de un dipéptido.

La conform ación (form a) de una proteína se determ i­ na por la in teracció n entre un polipéptido y su am biente acuoso en el que el polipéptido obtiene una estructura tri­ dim ensional estable. Hay cuatro aspectos de la estructura de una proteína que se relacionan con su conform ación. E l núm ero y clases de am inoácidos, así com o su secu en ­ cia en la cadena polipeptídica, constitu yen la estructura prim aria de una proteína. E l enlace peptídico covalente es el ún ico tipo de u n ión que interviene a este nivel. La estructura prim aria es cru cial para la fu n ción y caracte­ rísticas m oleculares de la proteína. Cualquier cam bio en la com p osición del am inoácido puede m odificar de form a significativa a la proteína. Por ejem p lo, cuando el ácido glutám ico sustituye al am inoácido valina en la cadena (3 de la hem oglobina A, se form a hem oglobina S, que da com o resultado anem ia drepanocítica. La estructura secundaria es el enrollam iento de la cade­ na polipeptídica. E l patrón usual que se form a por las pro­ teínas globulares (en su m ayor parte proteínas séricas) es una h élice que requiere 3 .6 am inoácidos para form ar una vuelta en la espiral. Se puede ver tam bién una lám ina ple­ gada (3 o un patrón irregular pero estable. La estructura secundaria se m antiene m ediante puentes de hidrógeno entre los grupos NH y CO de los enlaces peptídicos, ya sea d entro de la m ism a cadena o entre cadenas diferentes en la m ism a m olécula. E n la figura 8 -7 se m uestra el esquem a de una estructura secúndaria. E l siguiente nivel de estructura, la estructura terciaria, se refiere a la form a en la cual la cadena torcida se dobla

hacia atrás sobre sí m ism a para form ar la estructura tridi­ m ensional. Las convoluciones específicas que experim en­ ta un polipéptido se determ inan por in teracció n de los grupos R en la m olécula. Las reacciones de los grupos R inclu yen enlaces de disulfuro, atracciones electrostáticas, puentes de hidrógeno, interacciones hidrófobas y fuerzas de van der W aals. A la estructura terciaria se deben m uchas de las propiedades físicas y quím icas de la proteína. Además de estos prim eros tres niveles que pueden existir en las m oléculas que com prenden una sola cadena peptídica, algunas proteínas m uestran un cuarto nivel de organización llam ado estructura cuaternaria. Ésta es la co n ­ figuración de dos o más cadenas polipeptídicas para for­ m ar una m olécula de proteína funcional. La albúm ina, que está com puesta de una sola cadena polipeptídica, no ten­ dría estructura cuaternaria. Sin embargo, la hem oglobina com prende cuatro cadenas de globina, la deshidrogenasa de lactato consta de cinco cadenas peptídicas y la cinasa de creatina tiene dos cadenas unidas. Las cadenas polipeptídicas están unidas por atracciones no covalentes com o los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas. Cuando se perturba la estructura secundaria, tercia­ ria o cuaternaria de una proteína, ésta puede perder sus características funcionales y m oleculares. E sta pérdida de su carácter original se llam a desnaturalización. E l calor, h idrólisis m ediante ácido fuerte o álcali, a cción enzim ática, exp o sición a urea u otras sustancias, o exp o sición a luz ultravioleta, causan desnaturalización.

C ontenido d e nitrógeno Las proteínas com prenden los elem entos carbono, oxíge­ n o, hidrógeno, nitrógeno y azufre. E l contenid o de n itró ­ geno es el que separa a las proteínas de los carbohidratos y lípidos puros, que no con tien en átom os de nitrógeno. Varía un poco el contenid o de nitrógeno de proteínas séri­ cas; el prom edio es de alrededor de 16% . Esta característi­ ca se usó en un m étodo de m edición de proteína total.

C a rg a y punto isoeléctrico

-C

II

O FIGURA 8-7.

R

o

CH

C

N

CH - -

I

H

Estructura secundaria de proteínas.

D ebido a su com p osición de am inoácidos, las proteínas pueden llevar cargas positivas o negativas (es decir, son an fotéricas). Los grupos reactivos ácidos o básicos que no intervienen en el enlace peptídico pueden existir en dife­ rentes form as cargadas, lo cual depende del pH del m edio circundante. E l ácido aspártico y la lisina son ejem plos de am inoácidos que tien en grupos carb oxilo o am ino libres, respectivam ente (cuadro 8 -1 ). E n la figura 8-8 se m ués-

CAPfTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

♦O C -O ' CH, H I ,0 HN - C - C - O" H

e '- £ I

Disolución alcalina Carga neta negativa

CH c H I HN C - C - O' H+ H

♦° C -O H CH, H I *0 HN - C - C - O" H+ H

Ácido aspártico

Disolución ácida

189

ácido, la ganancia de protones da com o resultado una car­ ga neta positiva. E l pH al que un am inoácido o proteína no tiene carga neta se con oce com o punto isoeléctrico (pl). En otras palabras, para una proteina que com prende varios am inoácidos, el p l es el punto en el que la cantidad de grupos con carga positiva es igual a la cantidad de grupos con carga negativa; a un pH m en or que el p l, la proteína tendrá carga positiva. Las proteínas difieren en el núm ero y tipo de am inoácidos constitu yentes; difieren tam bién en sus valores de pl. Por ejem plo, la albúm ina tiene u n p l de 4 .9 . Los valores de p l de algunas proteínas séricas están en el cuadro 8 -2 . Com o resultado de los diferentes valores de p l, las proteínas llevarán cargas netas diferentes a algún pH especificado. Esta diferencia en la m agnitud de la carga es la base de varios procedim ientos para separar y cuantificar proteínas, com o la electroforesis. E l proced im iento se analiza después en este capítulo.

Solubilidad H NH 1 CH, 1 CH, 1 CH, 1 CH, H 1 *0 HN - C - C - 0*

H NHN+ 1

H Disolución alcalina

\

-O X ro

/

CH, 1 H NHN+ 1

CH, 1 CH,

H+ H

X o

0 1

X

1 0 1

X



CM

1

V

1

\ \

Usina

X

o

H

X

CH, 11 CHo 1 1

CH, H 1 ,0 HN - C - C - OH H+ H

Disolución ácida Carga neta positiva

FIGURA 8-8.

Estados cargados de aminoácidos.

tran estos dos am inoácidos y las cargas que tendrían en d isolu cion es que son alcalinas o ácidas. A un pH de 2 .9 8 , el ácido L-aspártico no tiene carga neta (igual o ninguna ionización de los grupos am ino y carb o x ilo ); m ientras que a u n pH alcalino (pH, 9 .4 7 ), el ácido aspártico tien e una carga negativa neta. La L-lisina no tiene carga neta a un pH de 9 .4 7 pero, en un am biente

Las proteínas en d isolu ción acuosa se h in ch an y en cie­ rran agua. N atelson y N atelson 1 han aconsejad o que, por esta razón, es necesario al recon stitu ir suero liofilizado m ezclar con suavidad el vial reconstitu id o durante por lo m enos 3 0 m in para com pletar el proceso de h in ch am ien to. Las d isolu ciones de proteína son emulsiones coloidales o m icelas porque están cargadas o porque cada m olécula de proteína tiene una envolvente de agua alrededor. La solubilidad de las proteínas es prom ovida por un carácter d ieléctrico alto del disolvente y alta con cen tra­ ció n del agua libre. Asi, las con cen tracio n es b ajas de sal (0 .1 M ) se han em pleado para aum entar la solubilidad de las globulinas en d isolución. Cuando se reduce la natura­ leza d ieléctrica o la cantidad de agua libre, las cargas en la proteína prom ueven la agregación. E n una con cen tració n alta de sal (~ 2 M ), las sales ión icas com piten con la proteí­ na por el agua y, por tanto, dism inuye la cantidad de agua disponible para hidratación de la proteína. La precipita­ ció n resultante de las globulinas se llam a salificación. Al usar diversas con centraciones de sal, se puede separar una am plia variedad de proteínas específicas de una m ezcla. La albúm ina perm anece en disolu ción in clu so a con cen tra­ cion es de sal altas porque tiene u n dipolo m ayor y retiene agua con m ás fuerza y, com o resultado su m enor tam año en relación con las globulinas, no requiere m u cha agua para m antenerse hidratada. Los disolventes orgánicos neutros, m iscibles en agua, se pueden usar tam bién para separar proteínas con base en su solubilidad. Estos disolventes tien en una constan te d ieléctrica m enor que el agua, que suprim e la ionización de los grupos R en la superficie de la proteína y, por co n si­ guiente, reduce la solubilidad.

In m u no gen icida d D ebido a su masa m olecular, contenid o de tirosina y espe­ cificidad por especies, las proteínas pueden ser antígenos eficaces. Cuando se inyectan en otra especie (co m o con e­ jo , cabra o p o llo ), las proteínas séricas hum anas provocan la form ación de anticuerpos esp ecíficos para cada una de las proteínas presentes en el suero. Cuando se hizo posible

190

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 8-2. CA R A C T ER ÍSTIC A S D E LA S PRO TEÍN AS P LA SM Á TIC A S SELEC C IO N A D A S VALOR DE

M ASA

PUNTO

REFERENCIA

M O LECU LAR

ISOELÉCTRICO ,

ELECTRO FO RÉTICA,

(ADULTO, g/L)

(D)

Pl

pH 8.6,1 = 0.1

COM ENTARIOS

Prealbúmina

0.1-0.4

55,000

4.7

7.6

Indicador de nutrición; se une a las hormonas tiroideas y la proteína de enlace a retino!

Albúm ina

35-55

66,300

4.9

5.9

Se une a la bilirrubina, esteroides, ácidos grasos; contribuyente principal a la presión oncótica

Globulinas a, Antitripsina a,

2-4

53,000

4.0

5.4

1 X 105 0.55-1.4

76,000 44,000

2.7

6.1 5.2

Reactante de fase aguda; inhibidor de proteasa Proteína fetal principal Reactante de fase aguda

2.5-3.9

200,000

4.4-5.4

Transporta lípidos

0.3-0.6

68,000

Inter a

0.2-0.7

160,000

Inter a

0.2-0.55

59,000

Inter a

Inhibe proteinasas de serina (p. ej., quimotripsina) Inhibe proteinasas (p. ej., tripsina) Se une a vitamina D y actina

Globulinas a 2 Haptoglobinas Tipo 1-1

1.0-2.2

100,000

4.5

Tipo 2-1 Tipo 2-2 Ceruloplasmina

1.6-3.0 1.2-1.6 0.15-0.60

200,000 400,000 134,000

4.1 4.4

3.5-4.0 3.5-4.0 4.6

Macroglobulina a 2

1.5-4.2

725,000

5.4

4.2

1.5-2.3

250,000

2.04-3.60 0.5-1.0

Fetoproteína a, Ácido a, Glucoproteína ácida a, (orosomucoide) Lipoproteína a, (HDL) Antiquimotripsina a, Inhibidor de intera,-tripsina Globulina Ge

Globulinas |3 Lipoproteína pre p (VLDL) Transferrina Hemopexina

M OVILIDAD

3.4-4.3

Lipoproteína p (LDL) M icroglobulina p2 (B2M)

2.5-4.4 0.001-0.002

11,800

P2

Complem ento C4 Complem ento C3 Complem ento C1 q Fibrinógeno Proteína C reactiva (PCR)

0.20-0.65 0.55-1.80 0.15 2.0-4.5 0.01

206,000 180,000 400,000 341,000 118,000

0.8-1.4 0.8-1.4

8.0-12.0 0.7-3.12 0.5-2.80 0.005-0.2 6 X 1Q4

150,000 180,000 900,000 170,000 190,000

Globulinas y Inmunoglobulina Inmunoglobulina Inmunoglobulina Inmunoglobulina Inmunoglobulina

G A M D E

5.9

3.1 3.1

76,000 57,00080,000 3,000,000

3.1

5.8 6.2

2.1

5.8-7.3

0.5-2.6 2.1 2.1 1.9 2.3

Reactante de fase aguda; se une a hemoglobina Se une a hemoglobina Se une a hemoglobina Actividad de peroxidasa; contiene cobre Inhibe trombina, tripsina, pepsina Transporta lípidos (principal­ mente triglicérido) Transporta hierro Se une a hem Transporta lípidos (sobre todo colesterol) Componente de moléculas clase 1 de antígeno leucocitario humano (HLA) Respuesta inmune Respuesta inmune Respuesta inmune Precursor de coágulo de fibrina Reactante de fase aguda; motiva la fagocitosis en enfer­ medad inflamatoria Anticuerpos Anticuerpos (en secreciones) Anticuerpos (respuesta inicial) Anticuerpos Anticuerpos (reaginas, alergia)

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

E l siguiente paso en la sín tesis de proteínas es obtener el am inoácido para los ribosom as. Prim ero, el am inoáci­ do se activa en una reacción que requiere energía y una enzim a específica para cada am inoácido. E l com p lejo de am inoácido activado se une en ton ces a otra clase de RNA, RNA de transferencia, con la lib eración posterior de la enzim a activadora y m onofostato de adenosina (A M P). El tRNA es una cadena corta de RNA que aparece libre en el citoplasm a. Cada am inoácido tiene un tRNA que contiene tres bases que corresponden a las tres bases en el mRNA. E l tRNA lleva su am inoácido particular al ribosom a y se u n e al m RN A de acuerdo con el cod ón correspondiente. De esta m anera, los am inoácidos se alinean en secuencia. Com o cada nuevo tRNA aporta el siguiente am inoácido, el am inoácido precedente se transfiere al grupo am ino del nuevo am inoácido, y las enzim as localizadas en los ribo so­ m as form an un enlace peptídico. E l tRNA se libera hacia el citoplasm a, donde puede tom ar otro am inoácido, y el ciclo se repite. Cuando se llega al cod ón term inal, se separa la cadena peptídica y se d isocian el ribosom a y el mRNA. E n la figura 8 -9 se ilustra la síntesis de proteínas. Por lo general, las proteínas intracelulares son sintetizadas en ribosom as libres, m ientras que las proteín as que produce el hígado para secreción se elaboran en ribosom as unidos al retículo endoplásm ico rugoso. La síntesis de proteínas ocu rre a la m ism a tasa de casi 2 a 6 enlaces peptídicos por

obtener estos anticuerpos para cada una de las proteínas séricas, se introd u jeron en el laboratorio clín ico m étodos con reacciones antígeno-anticuerpo que son m uy esp ecí­ ficos. Algunos de los m étodos com unes se describen en el capítulo 6 , Inmunoensayos y técnicas con sonda de ácido

nucleico.

Síntesis La m ayor parte de las proteínas plasm áticas se sin tetizan en el hígado y son secretadas por el hepatocito hacia la cir­ cu lación. Las inm unoglobulinas son excep cion es que son sintetizadas en células plasm áticas. Los am inoácid os de una cadena polipeptídica son co lo ­ cados en una secu encia determ inada por una secu encia correspond iente de bases (guanina, citosina, adenina y tim ina) en el DNA que constitu ye el gen apropiado. El DNA de doble hebra se desdobla en el n ú cleo, y una hebra se usa com o plantilla para la form ación de una hebra com ­ plem entaria de RNA m ensajero (m RN A ). E l mRNA, que ahora lleva el código genético del DNA, se m ueve al cito ­ plasm a, donde se une a los ribosom as. Una secu encia de tres bases ( codón ) en el mRNA se requiere para especificar el am inoácido que se transcribirá. E l código en el mRNA tam bién contiene codones de in icio y term inación para la cadena peptídica.

FIGURA 8-9.

191

Resumen esquemático de síntesis de proteína.

Hebra activa T rifosfatos de nucleósido

RNA mensajero Núcleo Citoplasma

X i

if

Aminoácidos

t

8 0 % ) y transferrina. Cuando la lesión glom erular se h ace m ás grave, la m em brana se vuelve no selectiva, y las proteínas de todos los tam años, inclu so las inm un oglob ulinas, pasan a la orina. E l daño a la m em brana glom eru-

CUADRO 8-8. M ÉTO D O S D E PRO TEÍNA URIN ARIA MÉTODO

PRINCIPIO

COMENTARIO

Métodos turbidimétricos (ácido sulfosalicílico, ácido tricloroacético o cloruro de bencetonio)

Las proteínas precipitan como finas partículas, la turbidez se mide espectrofotométricamente

Rápido, fácil de usar; sensibilidad desigual para proteínas individuales

Biuret

Las proteínas se concentran por precipitación, se disuelven de nuevo en álcali, luego reaccionan con Cu2+; el Cu2+ forma un complejo coloreado con los enlaces peptídicos

Exacto

Folin-Lowry

Reacción de biuret inicial; oxidación de tirosina, Muy sensible triptófano y residuos de histidina por reactivo fenólico de Folin (mezcla de ácidos fosfotúngstico y fosfomolíbdico): medición del color azul resultante

Enlace a colorante (azul de Coomassie, Ponceau S

Enlace de proteína a colorante, causa cambio en el máximo de absorción

Linealidad limitada; sensibilidad desigual para proteínas individuales

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

213

ES T U D IO D E C A S O 8-6 U n varón de 55 años de edad, sin antecedentes de enferm edad, recibió un golpe en la cabeza. Estaba in con scien te cuando ingresó al hospital y perm aneció en ese estado hasta su m uerte 15 días después. Se inser­ tó un tubo nasogástrico para adm inistrar los n u trientes requeridos (proteína, carbohid ratos, grasa, m inerales y vitam inas). La ingestión de agua total fue 1 5 0 0 ml/día. Al in icio del día 5 , su tensión arterial b a jó de form a gra­ dual. Los volúm enes de orina de 2 4 h registrados desde un catéter perm anente fueron com o sigue: d ía d e s p u é s d e l a a d m is ió n

E l análisis quím ico sanguíneo en el día 13 reveló lo siguiente: Proteína total

9.4 g/dl

Albúmina

6.0 g/dl

ÑUS

80 mg/dl

Na

175 mmol/L

K

4.0 mmol/L

Cl

134 mmol/L

VO LU M EN DE ORIN A (M L/24 H)

6

1500

Preguntas

8

1300

10

1200

1. ¿Cuál es la causa más probable de con cen tració n elevada de proteínas?

12

1100

2. ¿Q ué otros resultados soportan esta con clu sión ?

14

900

3. ¿Por qué es elevada la con cen tració n de ÑUS?

Las con cen tracio n es de hem atócrito y hem oglobina del paciente fueron altas.

lar ocurre en enferm edades com o diabetes, am iloidosis y trastornos de disglobulinem ia y colágeno. La presencia de agentes tó xico s en la sangre, com o m ercurio y heroína, pueden dar com o resultado tam bién pérdida de integridad m olecular. U n indicador in icial de d isfu nción glom erular es la presencia de m icroalbum inuria. E l térm ino m icroalbuminuria se em plea para d escribir las con cen tracio n es de albúm ina en la orina que son m ayores de lo norm al pero no detectables con ensayos com unes de tira reactiva con orina (co n cen tracion es de albúm ina m enores que el lím ite de d etección inferior). Los estudios de pacien tes con dia­ betes m ellitus m uestran que la m icroalbum inuria precede a la nefropatía relacionada con la diabetes, en particular en la diabetes tipo 1 (diabetes m ellitus dependiente de insulina ).40 E l avance de la m icroalbu m inuria a nefropatía clín ica se puede retrasar con terapia intensiva para nor­ m alizar la glucosa sanguínea y la tensión sanguínea. Por tanto, se recom ienda que se realice un análisis anual de m icroalbum inuria con los enferm os de diabetes. La tasa de excreció n norm al de albúm ina es < 2 0 ug/min o < 3 0 mg/ día. La m icroalbum inuria se puede m edir por radioinm unoensayo, inm unod ifu sión radial, inm unonefelom etría e inm unoensayo enzim ático. La p roteinu ria tubular es un resultado de los túbulos renales que son incapaces de llevar a cabo su fu nción usual de reabsorción com o resultado de disfu nción, o porque la cantidad de proteína que aparece en el líquido tubular

exced e la capacidad absortiva de u n túbulo con fu n cio­ nam iento norm al. E n la proteinuria tubular, las m oléculas de proteín a pequeñas que pasan norm alm en te por el glom érulo y son reabsorbidas, com o m icroglobulin a f>2 (PM , 1 1 8 0 0 ), proteína de enlace a retinol (PM , 2 1 0 0 0 ) y m icroglobulina a , (PM , 3 0 0 0 0 ) , aparece en la orina. La proteinuria por sobreflujo es una sobreabundancia de proteínas del suero que aparece en con cen tracio n es tan altas en el filtrado glom erular que se supera la capacidad de los túbulos para reabsorberlas. E ste tipo de proteinu­ ria se tipifica m ediante la con cen tració n increm entada de cadenas ligeras de inm unoglobu lina en m ielom a m últiple (proteína de B en ce Jo n e s ). La d eterm inación de proteínas específicas produce m ucho m ás inform ación que la proteí­ na urinaria total, en particular en el estudio de proteinuria tubular. Para determ inar el tipo que se excreta, la m ayor parte de los m étodos requiere con cen tració n inicial de la orina. Esto se lleva a cabo por precipitación, ultrafiltración, diáli­ sis o técnicas de filtración en gel. La orina se puede som eter entonces a electroforesis por u n m étodo sim ilar al descrito para el suero. La m edición cuantitativa de proteínas de ori­ na específicas se puede hacer m ediante el uso de m étodos inm unoquim icos, com o radioinm unoensayo, inm unodifu­ sión radial, electroinm unoensayo e inm unonefelom etría. U na proteína que por lo com ú n se halla en la ori­ na pero no en el suero es la proteína de Tam m -H orsfall,

214

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

ES T U D IO D E C A S O 8-7 Una m u jer de 8 4 años de edad residente en un hospicio para ancianos fue adm itida al hospital para tratam ien­ to de dolor de espalda b aja resultante de una caída. El exam en radiológico reveló una fractura por com pre­ sió n vertebral. D ebido a que m ostró signos de deterioro general, se realizó una evaluación m édica adicional. Un exam en neurológico y una exp loración de T C resulta­ ron norm ales. Los exám enes serológicos para enferm e­ dad vascular del colágeno tam bién fueron negativos, aunque la tasa de sed im entación eritrocítica m ostró un in crem en to m odesto. La electroforesis de proteína séri­ ca se hizo para descartar m ielom a m últiple. Las frac­ ciones de proteína sérica fueron com o sigue: albúm ina, 3 .2 g/dl; globulinas cq, 0 .3 1 g/dl; globulinas cq, 1.59 g/dl (co n con cen tració n alta en una banda estrecha); globulinas (3, 0 .7 2 g/dl; y globulinas y, 0 .9 6 g/dl.

una m u coproteína producida en los túbulos renales. Es el constitu yente proteín ico principal de cilind ros urina­ rios. Su con cen tració n en la orina es 4 0 .0 mg/día. Una IgA (secretoria) se produce tam bién en el riñón, y se excretan 1.1 mg/dla.

Proteínas d e líquido cefalorraqu ídeo E l L C R se form a en el plexo coroideo de los ventrículos del cerebro por ultrafiltración de sangre plasm ática. La m ed ición de proteína es una prueba que se requiere en el L C R , adem ás de la con cen tració n de glucosa y el recuento diferencial, cultivo y sensibilidad. E l intervalo de referen­ cia aceptado para pacientes entre 10 y 4 0 años de edad es 15 a 4 5 mg/dl de proteína de LCR. La proteína total de L C R se puede determ inar m ediante varios de los m étodos quím icos y óp ticos m ás sensibles m encionad os antes en la exp licación sobre proteínas u ri­ narias. Los proced im ientos em pleados con m ás frecu en­ cia son tu rbid im étricos con ATC, ácido su lfosalicílico con sulfato de sodio o cloruro de b en ceton io . Tam bién están disponibles m étodos de enlace a coloran te (es decir, azul brillan te de C o om assie), una reacció n de b iu ret cin ética y el m étodo de Low ry con un reactivo fenólico de F olin .

Importancia fisiológica del análisis de proteína de LC R . Las proteínas de L C R total increm entadas anorm al­ m ente se pueden hallar en cond icion es en las que hay una m ayor perm eabilidad de la barrera end otelial capilar a través de la cual ocurre la filtración. E jem p los de tales cond iciones inclu yen m eningitis bacteriana, viral y fúngica; golpeteo traum ático; esclerosis m ú ltiple; ob stru c­ ción ; neoplasm a; h erniació n de disco e infarto cerebral. E l grado de perm eabilidad se puede evaluar m idiendo la albúm ina de L C R y com parándola con la albúm ina sérica. La albúm ina suele em plearse com o proteína de referencia para perm eabilidad porque no se sintetiza en el SN C. E l valor de referencia para la relación de albúm ina de LCR/

Preguntas 1. ¿Cuál serla el siguiente paso en la evaluación de este paciente? 2. Dado el siguiente resultado adicional, ¿qué cond i­ ció n explicaría su patrón de electroforesis de protelna anorm al? • H aptoglobina: 4 1 6 mg/dl 3. ¿Q ué otras proteínas esperaría que sean anorm ales?

albúm ina sérica es m enor que 2 .7 a 7 .3 . U n valor m ayor que éste indica que el increm ento en la albúm ina del L C R provino del suero debido a una barrera hem atoencefálica dañada. Los valores de proteína de L C R b a jo s se hallan en el hipertiroidism o y cuando se fuga líquido del SNC. A unque las con centraciones de proteína total en el L C R son inform ativas, el diagnóstico de trastornos específicos requiere m ed ición de cada una de las fraccion es de p roteí­ na. E l patrón de tipos de pro teína presentes se puede ver por electroforesis del L C R que haya sido concentrado casi cien veces. E sto se puede llevar a cabo en acetato de celu ­ losa o gel de agarosa. E l patrón obtenido norm alm en te del L C R lum bar del adulto m uestra prealbúm ina, una banda de albúm ina sobresaliente, globulina cq com puesta sobre todo de antitripsina oq, una banda ex, que consiste p rin ­ cipalm ente de haptoglobina y ceruloplasm ina, una banda Pj constituid a de transferían, y una transferrina específica de L C R que es deficiente en carbohidrato, conocid a com o p roteín a T, en la zona P ,. La globulina presente en la banda y es por lo regular IgG co n una pequeña cantidad de IgA. Los patrones electroforéticos de L C R de pacientes con esclerosis m últiple tienen m últiples bandas distintas en la zona y. Esto se llam a distribución oligoclonal. Más de 90% de pacientes con esclerosis m últiple tienen bandas oligoclonales, aunque las bandas tam bién han sido encontradas en enferm edad neurológica inflam atoria e infecciosa. La identificación de bandas discretas en la región y que están presentes en el L C R pero no en el suero se relacionan con la producción de IgG en el LCR, un hallazgo característico de las enferm edades de desm ielinización, com o la esclerosis m últiple. Estas bandas no se pueden ver en la electroforesis rutinaria de acetato de celulosa sin o requieren una técnica de alta resolución en la que suele em plearse agarosa. La con cen tració n alta de IgG en el L C R no es única para la esclerosis m últiple. Debido a que el in crem en to en IgG de L C R puede resultar de la síntesis intratecal o per­

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

m eabilidad increm entada de la barrera hem atoencefálica, las con cen tracio n es de IgG tam bién se pueden increm en­ tar en las cond iciones listadas antes, com o la m eningitis. Para identificar la fuente de las con cen tracio n es altas de IgG en el LC R, se puede calcular el ín d ice de IgG -albúm ina com o sigue: índice de IgG _ IgG de LC R (mg/dl) x albúmina sérica (g/dl) del LCR

215

de 17 a 100 ng/ml se determ inaron m ediante radioinm unoensayo. E n la d esm ielinización lenta, ocu rren valores de 6 a 16 ng/ml y, en rem isión, los valores fueron m enores que 4 ng/ml. Adem ás de la esclerosis m ú ltiple, otras con ­ d iciones indu cen la d esm ielinización del SN C y, por tan­ to, las con cen tracio n es altas de p roteína básica de m ielina inclu y en m eningoencefalitis, lupus eritem a toso sistém ico del SN C , diabetes m ellitus e in su ficien cia renal crónica.

IgG sérica (g/dl) x albúmina de LC R (mg/dl)

RESUM EN (Ec. 8-2)

La co n cen tració n de albúm ina de L C R corrige la per­ m eabilidad increm entada. E l intervalo de referencia para el índ ice es 0 .2 5 a 0 .8 0 . E l índ ice es elevado cuando hay una m ayor produ cción de IgG del SN C com o ocurre en la esclerosis m últiple. La p rod u cción de IgG se reduce cu an­ do se com prom ete la integridad de la barrera h em ato ence­ fálica, com o en algunas form as de m eningitis y tum ores. O tro índ ice para ayudar a d iscrim inar la fuente de la IgG en el L C R es el cálculo de la tasa de síntesis de IgG por m edio de la fórm ula de T ou rtellotte .41 E l intervalo de refe­ rencia para las tasa de sín tesis es - 9 . 9 a + 3.3 mg/día. E n la investigación de la esclerosis m ú ltiple, las pro­ teínas básicas de m ielina presentes en el L C R se evalúan tam bién porque estas proteínas pueden proveer u n índ ice de d esm ielinización activa. Las proteínas básicas de m ie­ lina son constituyentes de la m ielina, la vaina que rodea a m u chos de los axones del SN C. E n d esm ielinización m uy activa, las concentracio n es de proteínas básicas de m ielina

Los am inoácidos son los elem entos fundam entales de las proteínas. Las anormalidades hereditarias en el m etabolis­ mo de los am inoácidos originan varias condiciones, de las cuales la m ayor parte se relaciona con retraso m ental. La síntesis de la m ayor parte de proteínas ocurre en el hígado, con excepción de las inm unoglobulinas, que se producen en las células plasmáticas. La secuencia lineal de am inoá­ cidos en la proteína, que com pone la estructura prim aria, se define m ediante el código genético en el DNA celular. Las proteínas pueden ser sim ples, com prendidos sólo los am inoácidos, o conjugadas, en las que la cadena peptídica se une con una m itad no proteína. C on la gran cantidad de proteínas en el plasma (más de 5 0 0 identificadas), la funcio­ nes son diversas. Por ejem plo, la presión osm ótica coloidal se debe sobre todo a la albúmina; la haptoglobina y la transferrina son proteínas de transporte, y se unen con hem oglo­ bina libre y hierro, respectivam ente; las inm unoglobulinas y los com ponentes del sistema del com plem ento ayudan a proteger al cuerpo contra infección, y otras proteínas, com o

ES T U D IO D E C A S O 8-8 Una m u jer de 3 6 años de edad se queja de visión borro­ sa interm itente, y entum ecim iento y debilidad en su pierna izquierda que ha persistido durante m ás de tres sem anas. E n el exam en, se notó nistagm o vertical (m ovi­ m ientos involuntarios en vaivén o circulares de los ojos) en la mirada hacia arriba. Se extrajo L C R y la m ues­ tra fue clara e incolora con recuento celular norm al. La concentración de proteína total del L C R fue de 4 9 mg/dl con una IgG de 8 .1 mg/dl. La electroforesis del suero del paciente y el L C R revelaron el siguiente patrón:

Preguntas 1. ¿Cuál es el significado de las bandas de proteína indicadas por las flechas? 2. ¿Q ué con d icio n es producirían este tipo de patrón de electroforesis de proteína? 3. ¿Q ué otras pruebas serían útiles en la investigación de este diagnóstico del paciente? 4 . ¿Q ué prueba de laboratorio puede ser útil para m onitorear el cu rso de esta con d ició n del paciente?

216

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

el fibrinógeno, ayudan en el m antenim iento de la hem ostasis. Las concentraciones bajas de proteína total pueden ser un resultado de pérdida excesiva, síntesis reducida o cata­ bolism o acelerado, m ientras que las concentraciones altas se relacionan con deshidratación o producción excesiva. E l m étodo que m ás se usa para m edir las con cen tra­ cion es de proteína sérica total es la reacción de biuret, en la cual los iones cú pricos se acom p lejan con dos o más enlaces peptídicos. Para determ inar la fracción de albú­ m ina, las técnicas de enlace de coloran te se em plean con V BC o PBC. E l colorante, cuando se une a la albúm ina, es un color d istinto al coloran te libre. E l fraccion am iento ad icional de las proteínas séricas se puede llevar a cabo

P R E G U N T A S 1. E l exam en de d etección de G u thrie para fenilalanina sérica increm entada se basa en: a) U n m étodo fluorom étrico, en el cual se h ace reac­ cionar la fenilalanina con ninhidrina. b) E l p ro ced im ien to m icro b io ló g ico , en el que la fen ilalan in a co n trarresta los efectos de u n a n ta ­ gon ista m etab ó lico en el cre cim ie n to de B. sub­

tilis. c) El m étodo de crom atografía de capa fina, en el que la id entificación se hace por com paración del valor de R f de la sustancia d esconocida con los valores de R f de la sustancia conocida. d) U n proced im iento de tira reactiva, en el cual la fenilalanina se convierte en ácido fenilpirúvico y luego se hace reaccionar con cloru ro férrico. 2. La configu ración espacial trid im ensional de una sola cadena de polipéptido que se determ ina m ediante enlaces de disulfuro, puentes de hidrógeno, atraccio­ nes electrostáticas y fuerzas de van der W aals se co n o ­ ce com o: a ) E structura prim aria. b ) E structura secundaria. c) E structura terciaria. d) E structura cuaternaria. 3. La proteína plasm ática a la cual se debe p rincipalm en­ te el m antenim iento de la presión osm ótica coloidal in vivo es: a ) H em oglobina. b) Fibrinógeno. c) M acroglobulina cq. d) A lbúm ina. 4. Cada una de las diferencias en las concentraciones de proteína sérica total atribu ibles a posturas erectas contra recostadas son: a) 0 a 0 .5 g/dl (casi ninguna d iferencia). b ) Alrededor de 0 .5 g/dl. c) Casi 2 g/dl. d) A proxim adam ente 5 g/dl.

m ediante electroforesis, que em plea las características de carga de la proteína por separación. La EPS rutinaria dis­ pone las proteínas en cin co bandas: la albúm ina viaja más lejo s hacia el ánodo, seguida de las globulinas a p a 2, p y y. La EAR separa la proteín a en 12 zonas. La electroforesis capilar perm ite la separación más rápida. La proteína se puede m edir tam bién en otros líquidos corporales. E l daño glom erular o la d isfu nción tu bu­ lar origina con cen tracio n es altas de proteín as urinarias. La proteína de L C R increm entada de m anera anorm al se encuen tra en cond iciones donde hay una m ayor per­ m eabilidad de la barrera endotelial capilar o aum ento en la síntesis intratecal.

DE

R E P A S O

5. E l estado n u tricion al calórico-p roteínico d eficiente se relaciona con: a) U na con cen tració n b aja de globulinas y. b) Una con cen tració n alta de haptoglobina. c) U na con cen tració n reducida de prealbúm ina. d) U na m ayor con cen tració n de fetoproteína oq.

6 . ¿E n cuál de las cond iciones siguientes se esperaría una con cen tració n norm al de m ioglobina? a) M ielom a m últiple. b) Infarto de m iocardio agudo. c) Insuficien cia renal. d ) Traum atism o contund ente recibido en un a cci­ dente cardíaco. 7. Se valora la proteína total en suero de un pacien te con m ielom a m últiple. E l resultado con el m étodo de b iu ­ ret fue m enor que el resultado obtenido con el m éto­ do de K jeldhal. La discrepancia fue u n resultado del h ech o de que: a) E l m étodo de proteína total de Kjeldhal mide todos los com puestos que con tien en nitrógeno, incluso proteínas y nitrógenos no proteínicos y, por tanto, sobrestim a la concentración de pro teína. b ) Los dos m étodos se basan en principios diferen­ tes; no se espera un resultado com parable. c) E n el m étodo de biuret, las proteínas anorm al­ m ente pequeñas producen un com p lejo que tiene una tonalidad de color distinta a la de las proteí­ nas norm ales; así que se subestim a la co n cen tra­ ción de proteínas. d) La hem olisis eleva de m anera falsa el m étodo de K jeld hal, pero no tiene efecto en la con cen tració n de proteínas determ inadas m ediante el m étodo de biuret.

8. E l patrón electroforético p roteín ico del plasm a, com ­ parado con el del suero, revela un: a) Increm en to am plio en las globulinas y. b) P ico de fibrinógeno co n las globulinas cq. c) P ico de albúm ina reducido. d) P ico de fibrinógeno entre las globulinas P y y.

CAPÍTULO 8 ■ AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

9.

Se obtiene el siguiente patrón de electroforesis de pro­ teínas séricas: albúm ina: reducida globulinas cq y cq: increm entadas globulinas y: norm ales ¿De cuáles de las siguientes con d iciones es caracterís­ tico este patrón? a) Cirrosis. b ) Inflam ación aguda (respuesta p rim aria). c) Síndrom e nefrótico. d) Gam m apatía.

10. U na de las ventajas de la electroforesis de alta reso­ lu ción en agarosa sobre la electroforesis de corriente m enor es: a) Los procedim ientos de alta resolu ción detectan bandas m onoclonales y oligoclonales a co n cen ­ traciones más bajas. b) Se requiere un volu m en de m uestra m enor. c) Los resultados se ob tien en con m ás rapidez. d) Se puede aplicar más m uestra al medio de soporte. 11. Cuando se disuelve una pro teína en una disolu ción am ortiguadora, cuyo pH es m ás alcalino que el p l, y se pasa una corriente eléctrica por la d isolu ción, la proteína actuará com o: a) U n anión y m igrará hacia el ánodo. b) U n catión y m igrará hacia el cátodo. c) U n anión y m igrará al cátodo. d ) U na partícula cargada y n o se moverá.

REFERENCIAS 1.

2. 3. 4.

5.

6. 7.

8. 9.

Natelson S, Natelson E. Principies of Applied Clinical Chemistry Plasma Proteins in Nutrition and Transport. Vol. 3. New York: Pienum, 1980. Phenylketonuria (PKU): Screening and management. NIH Consensus Statement 2 0 0 0 ;1 7 (3 ):l-3 3 : Levy HL, Albers S. Genetic screening of newborns. Annu Rev Genomies Hum Genet 2000;1:139-177. Yamaguchi A, Mizushima Y, Fukushi M, et al. Microassay system for newborn screening for phenylketonuria, maple syrup uriñe disease, homocystinuria, histidinemia and galactosemia with use of a fluorometric microplate reader. Screening 1992;1:49. Chace DH, Kalas TA, Naylor EW The application of tándem mass spectrometry to neonatal screening for inherited disorders of intermediary metabolism. Annu Rev Genomics Hum Genet 2002;3:17-45. Lidsky A, Guttler F, Woo S. Prenatal diagnosis of elassie phenylketo­ nuria by DNA analysis. Lancet 1985;1:549. Kayaalp E, Treacy E, Waters PJ, Byck S, Nowacki P, Scriver CR. Human phenylalanine hydroxylase mutations and hyperphenylalaninemia phenotypes: a metanalysis of genotype-phenotype correlations. A m J Hum Genet 1997;61:1309-1317. Brattstróm L, W ilcken DEL. Homocysteine and cardiovascular disease: cause or effect? A m J Clin Nutr 2 0 00;72(2):315-323. Ueland PM, Refsum H, Beresford SAA, Vollset SE. The controversy over homocysteine and cardiovascular risk. Am J Clin Nutr 2 000;72(2) :324-332.

12.

217

La alta con cen tració n de proteína total sérica con con ­ centraciones altas de albúm ina y globulinas suelen observarse en: a) M acroglobulinem ia de W aldenstróm . b ) G lom erulonefritis. c) Cirrosis. d ) D eshidratación.

R elacione la proteína sérica de la colum na A con su fu n­ ció n específica en la colum na B: Colum na A

C olum na B

13. La transferrina_

a) transporta cobre

14. La haptoglobina _

b ) in h ib e enzim as proteolíticas

15. La anti tripsina a .

c) es un factor en la for­ m ación de un coágulo in vivo

d) transporta hierro e) se un e con h em oglobi­ na libre

f ) regula la con cen tració n m uscular g) se com bina con antíge­ nos específicos h) es una catalizador en el ciclo de la urea

10. Stephens AD. Cystinuria and its treatment: 25 years experience at St. Bartholomew’s Hospital. J InheritMetab Dis 1989;12:197. 11. Deyl Z, Hyanek J , Horokova M. Profiling of amino acids in body fluids and tissues by means of liquid chromatography. J Chromatogr 1986;379:177. 12. Hitzig WH, Joller PW. Developmental aspeets of plasma proteins. In: Ritzmann SE, Killingsworth LM, eds. Body Fluids, Amino Acids, and Tumor Markers: Diagnostic and Clinical Aspeets, 3rd ed. New York: A lanLiss, 1983:1. 13. Haferkamp O, Schlettwein-Gsell D, Schwick HG, et al. Serum protein in an aging population with particular reference to evaluation of immune globulins and antibodies. Gerontología 1966;12:30. 14. KeyserJW. Human Plasma Proteins. New York: Wiley, 1979:280. 15. Gabant P, Forrester L, Nichols J , et al. Alpha-fetoprotein, the major fetal serum protein, is not essential for embryonic development but is required for female fertility. Proc Nati Acad Sci USA 2002;99(20): 12865-12870. 16. Rubin H. The biology and biochemistry of antichymotrypsin and its potential role as a therapeutic agent. Biol Chem Hoppe Seyler 1992;373(7):497. 17. Balduyck M, Mizo J. Inter-alpha-trypsin inhibitor and its plasma and uriñe derivatives. Ann Biol Clin 1991;49(5):273. 18. Levy AP, Hochherg I, Jablonski K, et al. Haptoglobin phenotype is an individual risk factor for cardiovascular disease in individuáis with diabetes: the strong heart study. J Am Coll Cardiol 2002; 40(11): 1984-1990.

218

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

19. Lyngbye J , K rollJ. Quantitative immunoelectrophoresis of proteins in serum from a normal population: season, age and sex-related variations. Clin Chem 1971;17:495. 20. Ridker PM. Clinical application of C-reactive protein for cardiovas­ cular disease detection and prevention. Circulation 2003;107: 3 6 3 372. 21. LeGrys VA. The use of high sensitivity C-reactive protein in assessing the risk for coronary heart disease. Clin Lab Sci 2001; 1 4(4):2 4 3 -2 4 6 . 22. Wong SS. Strategic utilization of cardiac markers for the diagno­ sis of acute myocardial infarction. Ann Clin Lab Sci 1996;26(4): 301. 23. Mair J , Dienstl E Puschendorf B. Cardiac troponin T in the diagnosis of myocardial injury. Crit Rev Clin Lab Sci 1992;29(1):31. 24. Christenson RH. Cardiac troponin T in the risk assessment of acute coronary syndromes. Am Clin Lab June 1997:18. 25. Ohman EM, et al. Cardiac troponin T levels for risk stratification in acute myocardial ischemia. N Engl J Med 1996;335(18):1333. 26. Li D, Keffer J , Corry K, et al. Nonspecific elevation of troponin T levels in patients with chronic renal failure. Clin Biochem 1995; 28(4):474. 27. Antman EM, et al. Cardiac-specific troponin I levels to predict the risk of mortality in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med 1996;335(18):1342. 28. Katrukha AG, et al. Troponin I is released in bloodstream of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex. Clin Chem 1997;43:1379. 29. Pankov R, Yamada KM. Fibronectin at a glance. J Cell Sci 2002; 115:3861-3863. 30. Koenn ME. Fetal fibronectin. Clin Lab Sci 2 0 02;15(2):96-98.

31. Peters T Jr, Biamonte ET, Doumas BT. Protein (total) in serum, uri­ ñe, cerebrospinal fluid, albumin in serum. In: Faulkner WR, Meites S, eds. Selected Methods in Clinical Chemistry. Vol. 9. Washington, D.C.: American Association for Clinical Chemistry, 1982:317. 32. Lines JG , Raines DN. Refractometric determination of serum concentration: 2. Comparison with biuret and Kjeldahl determination. Ann Clin Biochem 1970;7:6. 33. Chromy V, Fischer J. Photometric determination of total protein in lipemic serum. Clin Chem 1977;23:754. 34. Doumas BT, Watson WA, Biggs HG. Alhumin standards and the measurement of serum albumin with bromcresol green. Clin Chem Acta 1971;31:87. 35. Speicher CE, W idishJR, Gaudot FJ, et al. An evaluation of the overestimation of serum albumin by bromcresol green. Am J Clin Pathol 1978;69:347. 36. Gustafsson JEC. Improved specificity of serum albumin determina­ tion and estimation of “acute phase reactants” by use of the bromocresol green reaction. Clin Chem 1976;22:616. 37. Maguire G, Price C. Bromcresol purple method for serum albumin gives falsely low valúes in patients with renal insufficiency. Clin Chem Acta 1986;155(1):83. 38. Keren D. High resolution electrophoresis aids detection of gammopathies. Clin Chem News 1989;14. 39. McElderry LA, Tarbit IF, Cassells-Smith AJ. Six methods for urinary protein compared. Clin Chem 1982;28:356. 40. Cembrowski G. Testing for microalbuminuria: promises and pitfalls. Lab Med 1990;21 (8):491. 41. Tourtellotte WW, Staugaitis SM, Walsh MJ, et al. The basis of intra-blood-brain-barrier IgG synthesis. Ann Neurol 1985;17(1): 21-27.

CAPÍTULO

Compuestos de nitrógeno no proteínico Elizabeth L. Frank C O N T E N I D O

DE L

9

C A P Í T U L O Métodos analíticos Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren Intervalo de referencia AM O N IACO Bioquímica Correlaciones de enfermedad Métodos analíticos Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren Fuentes de error Intervalo de referencia RESUM EN PREGUNTAS DE REPASO REFEREN CIAS

U REA Bioquímica Correlaciones de enfermedad Métodos analíticos Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren Intervalo de referencia CREATINI NA/CREATINA Bioquímica Correlaciones de enfermedad Métodos analíticos para creatinina Requisitos de la muestra y sustancias que interfieren Fuentes de error Intervalo de referencia Métodos analíticos para creatina ÁCID O ÚRICO Bioquímica Correlaciones de enfermedad

O B J E T I V O S Al completar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Listar las sustancias de nitrógeno no proteínico en la sangre y reconocer sus estructuras químicas y concentraciones fisiológicas relativas. • Describir la biosíntesis y excreción de urea, creati­ nina, creatina, ácido úrico y amoniaco. • Describir las condiciones clínicas y metabólicas principales relacionadas con las concentraciones plasmáticas incrementadas y reducidas de urea, creatinina, creatina, ácido úrico y amoniaco. • Describir el uso de la relación de nitrógeno de urea/creatinina para distinguir entre causas de uremia prerrenal, renal y posrenal. • Relacionar la solubilidad del ácido úrico con las consecuencias patológicas del ácido úrico plasm á­ tico incrementado. • Describir los efectos tóxicos relacionados con una concentración increm entada de amoniaco plasmático.



Expresar los requisitos de recolección de muestra, transporte y almacenaje necesarios para determ i­ naciones de urea, creatinina, creatina, ácido úrico y amoniaco. • Explicar los métodos de uso común para la deter­ minación urea, creatinina, creatina, ácido úrico y amoniaco en plasma y orina. Identificar fuentes de error y variabilidad en estos métodos y describir los efectos de las mediciones de laboratorio en el servicio clínico. • Reconocer los intervalos de referencia para urea, creatinina, ácido úrico y amoniaco en plasma y orina. Expresar los efectos de la edad y género en estos valores. • Sugerir posibles condiciones clínicas relacionadas con los resultados, dados valores del paciente para urea, creatinina, ácido úrico y am oniaco, adem ás del historial clínico.

219

220

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

___________________________________________ T É R M I N O S Acido ureico A daram iento de creatinina Amoniaco Azoem ia Creatina Creatinina Filtrado libre de proteína

Gota Hiperuricemia Hipouricemia Método cinético de medición Método enzim ático aco­ plado

La d eterm inación de sustancias de nitrógeno no proteín i­ co en la sangre ha sido em pleado de ordinario para m on itorear la fu n ció n renal. E l térm ino nitrógeno no proteínico (NNP) se originó en los prim eros días de la quím ica clínica cuando la m etodología analítica requería la elim inación de proteína de la m uestra antes del análisis. La con cen tració n de com puestos que contien en nitrógeno en este filtrad o libre de proteínas se cuantificó espectrofotom étricam ente m ediante la conversión de nitrógeno en am oniaco, y la reacció n posterior con el reactivo de N essler (HgI 2/KI) para producir un co lo r am arillo .1 Este m étodo tiene difi­ cultades técnicas, pero es considerado com o el más exacto para la d eterm inación de la co n cen tració n de NNP total. Sin em bargo, la inform ación clín ica más ú til se obtiene al analizar en una m uestra del pacien te cada uno de los com ponentes de la fracción de NNP. La determ inación del nitrógeno de la orina es de valor en la evaluación del balance de nitrógeno para m anejo n u tricio n a l .23 La fracción de NNP com prende cerca de 15 com pues­ tos de interés clín ico (cuadro 9 -1 ). La m ayor parte de estos com puestos proviene del catabolism o de las proteínas y ácidos nucleicos.

UREA Bioquím ica E l com puesto de NNP presente en con cen tració n más alta en la sangre es la urea (fig. 9 -1 ). Se sin tetiza en el hígado

C L A V E Nitrógeno no proteínico (NNP) Posrenal Prerrenal Reabsorción Relación de nitrógeno de urea/creatinina

de C 0 2 y el am oniaco que proviene de la d esam inación de am inoácid os en las reacciones del ciclo de la urea. Esta últim a es el producto excretorio principal del m etabolis­ m o de p roteín as .4 D espués de la síntesis en el hígado, la urea es llevada en la sangre hacia el riñ ón , donde se filtra fácil desde el plasm a por el glom érulo. La m ayor parte de la urea en el filtrado glom erular se excreta por la orina, aunque hasta 40% se reabsorbe por difusión pasiva duran­ te el paso del filtrado por los túbulos renales. La cantidad reabsorbida depende del flujo de orina y el grado de deshi­ dratación. Pequeñas cantidades de urea ( < 1 0 % del total) se excretan por el tubo digestivo (T D ) y la piel. La co n ­ cen tración de urea en el plasm a se determ ina por fu nción renal y perfusión, el contenido de proteína de la dieta y la cantidad de catabolism o de proteína. E l térm ino nitrógeno de urea sanguíneo (ÑUS) se ha em pleado para referirse a la d eterm inación de urea porque los ensayos h istóricos para urea se basaban en la m ed ición de nitrógeno. N itrógeno de urea (N de urea) es un térm ino m ás apropiado.

Correlaciones de enferm edad Una con cen tració n alta de urea en la sangre se flama a z o e­ mia. La con cen tració n de urea plasm ática m uy alta acom ­ pañada de insu ficiencia renal se llam a urem ia, o síndrome urém ico. Tiene consecuen cias fatales si no se trata m ediante diálisis o trasplante. Las cond iciones que provocan in cre­ m entos de urea plasm ática se clasifican según la causa en tres categorías principales: prerrenal, renal y posrenal.

CUADRO 9-1. COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO DE IMPORTANCIA CLÍNICA CONCENTRACIÓN PLASM ÁTICA CO M PU ESTO

APRO X IM A D A (% DE NNP TOTAL)

Urea

45

Aminoácidos

20

Ácido úrico

20

Creatinina

Secreción Tasa de filtración glom erular (TFG) Urea Uremia o síndrome urémico

o

h 2n '

nh2

nh2

5

Creatina

1 -2

h2n

Amoniaco

0 .2

FIGURA 9-1.

Estructura de la urea.

221

CAPITULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

E l flujo sanguíneo renal reducido causa azoem ia prerrenal. M enos sangre y, por tanto, m enos urea se entregan al riñón; y, en consecu encia, se filtra m enos urea. Los factores causantes son insuficiencia cardíaca congestiva, choqu e, hem orragia, deshidratación y otros factores que dan com o resultado una d ism inución im portante en el volum en san­ guíneo. La cantidad de m etabolism o de pro teína tam bién causa cam bios prerrenales en la con cen tració n de urea en la sangre. Una dieta con alto contenid o de proteína o catabolism o proteín ico increm en tado, com o ocurre en la fiebre, enferm edad mayor, estrés, terapia con corticosteroides y hem orragia gastrointestinal, pueden increm entar la con cen tració n de urea. La con cen tració n de urea plasm á­ tica se reduce durante períodos de b aja ingestión de pro­ teínas o síntesis increm entada de éstas, com o durante el em barazo tardío y la infancia. La fu nción renal reducida causa u n in crem en to en la co n cen tració n de urea plasm ática com o resultado de la excreció n com prom etida de urea. Las causas renales de aum ento de urea inclu yen insu ficiencia renal aguda y cró ­ nica, nefritis glom erular, necrosis tubular y otra enferm e­ dad renal intrínseca (véase el capítulo 2 4 , Función renal). La azoem ia posrenal puede ser debida a o b stru cción del flujo de orina en cualquier parte del tracto urinario por cálculos renales, tum ores de la vejiga o próstata, o in fec­ ció n grave. Las causas principales de concentración de urea plasmáti­ ca reducida son ingestión reducida de proteínas y enfermedad hepática grave. Las condiciones que afectan a la concentra­ ción de urea plasmática se resumen en el cuadro 9-2. E l cálculo de la relación nitrógeno de urea]creatinina, que norm alm en te es 10:1 a 20: 1 , ayuda a la diferenciación de la causa de con cen tració n anorm al de urea. Las con d i­ ciones prerrenales tienden a aum entar la urea plasm ática, m ientras que la creatinina plasm ática perm anece norm al,

CUADRO 9-2. CAUSAS DE CONCENTRACIÓN DE UREA PLASM ÁTICA ANORMAL Concentración incrementada Prerrenal

Insuficiencia cardíaca congestiva Choque, hemorragia Deshidratación Catabolismo de proteína incrementado

lo que causa una relación alta de N de urea/creatinina. E n con d icio n es posrenales se observa por lo com ú n una relación alta de N de urea/creatinina con una co n cen tra­ ció n de creatinina increm entada. U na relación b aja de N de urea/creatinina se observa en con d iciones relacionadas co n p rod u cción reducida de urea, com o ingestión b aja de proteínas, necrosis tubular aguda y hepatopatía grave.

M étodos analíticos Las m ediciones de urea se realizaron al principio en un filtrado libre de proteínas de sangre total y con base en la medición de la cantidad de nitrógeno. Los métodos analíticos actuales han retenido esta costumbre y, por lo com ún, la urea se expresa en términos de la concentración de nitrógeno en vez de la con cen tració n de urea. La co n cen tració n de nitrógeno de urea se puede convertir a concentración de urea multiplican­ do por 2 .1 4 , com o se muestra en la ecuación 9-1.

1 mg de N de urea ^ 1 m m ol N x 1 m m ol urea di

14 mg N 6 0 mg urea

x

2 m m ol N

2 .1 4 mg urea

------- = ----------T ------

1 m m ol urea

(Ec 9-1)

di

La con cen tració n de nitrógeno de urea en m iligram os por decilitro se puede convertir a con cen tració n de urea en m ilim oles por litro al m u ltip licar por 0 .3 6 . Se han em pleado dos m étodos analíticos para evaluar la urea. E l m ás antiguo y el que se usa con m ás frecuencia conlleva la hidrólisis de urea m ediante la enzim a ureasa (am idohidrolasa de urea, E C 3 .5 .1 .5 ), seguida de la cuantificació n de ion am onio (NH4+) producido en la reacción. C on los prim eros m étodos co lorim étricos se em pleaba el reactivo de N essler o la reacción de B erth elot con nitroprusiato para detectar NH ++.5 E l m étodo cin ético m ás com ún em pleado clín icam en te acopla la reacció n de ureasa con la deshidrogenasa de L-glutam ato (G LD H , E C 1 .4 .1 .3 ) y m ide la tasa de desaparición del d inucleótido de n icotin am ida y adenina (NADH reducido) a 3 4 0 nm (fig. 9 -2 ).6 Se ha descrito una m odificación de este m étodo con ureasa b acteriana para m edir urea en m uestras de o rin a .7 E l am onio de la reacción de ureasa se puede m edir tam ­ b ién por el cam bio de color relacionado con un indicad or

Terapia de corticosteroides Renal

Insuficiencia renal aguda y crónica Nefritis glom erular

Posrenal

Obstrucción del tracto urinario

Concentración reducida

Ingestión baja de proteínas

U re a

Ureasa

2NH4+ + H C 0 3~

GLDH NH4+ + 2-oxoglutarato^=— NADH

glutamato NAD+ + H+

Hepatopatía grave Vómito y diarrea intensos Embarazo

GLDH = deshidrogenasa de glutamato (EC 1.4.1.3) FIGURA 9-2.

Ensayo enzimático para la urea.

222

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

de pH. Este m étodo ha sido incorporado en instrum entos que usan reactivos líquidos, u n form ato de película m ulticapas, y tiras de reactivo .8'10 Se puede usar un electrodo para m edir la tasa de incre­ m ento en la conductividad cuando se producen iones am onio de la urea .11 Debido a que se m ide la tasa de cam ­ bio en la conductividad, la con tam in ación con am oniaco no es u n problem a com o co n otros m étodos. Se han desa­ rrollado m étodos p o ten ciom étricos en los que se usa un electrodo selectivo de iones am o n io .12 La urea puede m edirse por cond en sación con diacetil m onoxim a con la presencia de u n ácido fuerte y u n agente oxid ante para form ar un derivado de diacina am arillo .13 E l hierro (III) y la tiosem icarbacida se ad icionan para esta­ bilizar la reacció n m ixta a color .14 La ventaja principal de este m étodo directo de m ed ición de urea es que el am onia­ co n o interfiere. E n otro m étodo d irecto la urea reacciona con el o-ftalaldehído y la naftiletilendiam ina para form ar u n crom ógeno que se puede m edir .15 Se ha propuesto la esp ectrom etría de m asa con d ilu­ ció n de isótopo com o un m étodo definitivo para u rea .16

E l ensayo en zim ático acoplado de ureasa/GLDH realizado en un filtrado libre de proteína ha sido usado com o un m étod o de referen cia .17 Los m étod os an alítico s se resu­ m en en el cuadro 9 -3 .

Requisitos de la m uestra y sustancias que interfieren La concen tración de urea se puede m edir en plasma, suero u orina. Si se recolecta plasma, se deben evitar los iones am o­ nio y las concentraciones altas de citrato de sodio y fluoruro de sodio. E l citrato y el fluoruro inhiben la ureasa. Aunque el contenido de proteína de la dieta afecta la concentración de urea, el efecto de una sola com ida que contenga proteína es m ínim o y, por lo regular, no se requiere m uestra de ayu­ no. Se recom ienda una m uestra no hemolizada. La urea es susceptible a descom posición bacteriana, así que se deben refrigerar las m uestras (en particular orina) que no se vayan a analizar en pocas horas. Las m uestras de orina program a­ da se deben refrigerar durante el período de recolección. Los m étodos para plasma o suero pueden requerir modifi-

ES T U D IO D E C A S O 9-1 U n varón de 6 5 años de edad es admitido por primera vez para tratamiento de enfermedad pulm onar obstructiva crónica, insuficiencia renal y cardiomegalia significativa. Los datos de laboratorio pertinentes en la admisión (5/31) se muestran en el cuadro 9-1.1 de estudio de caso. D ebido a la dificultad respiratoria grave, el paciente fue transferido a la unidad de cuidado intensivo, se le colocó en u n respirador y se le adm inistraron diuré­ ticos y líquidos intravenosos (IV ) para prom over diu­ resis. Este tratam iento trajo una m ejo ría significativa en el gasto cardiaco y la fu n ció n renal, com o m uestran los resultados de laboratorio varios días después (6/3). D espués de dos días más en el respirador con terapia IV, la función renal del pacien te volvió a la norm alidad y, cuando se le dio de alta, sus resultados de laboratorio fueron norm ales (6/7). E l paciente fue admitido de nuevo 6 meses después debido a que su familia no pudo reanimarlo. E n la admi­ sión, el paciente presentó un corazón muy agrandado con enfermedad pulm onar grave, insuficiencia cardiaca y probable insuficiencia renal. Los estudios de laboratorio en la adm isión fueron com o se muestra en el cuadro 91.2 de estudio de caso. Se hicieron num erosos intentos para m ejorar la función cardiaca y pulm onar del pacien­ te, todos en vano, y éste m urió cuatro días después.

Pregunta 1. ¿Cuál es la causa más probable de la elevada co n ­ centración de nitrógeno de urea del paciente? ¿Q ué datos apoyan su con clu sión?

CUADRO 9-1.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO (PRIMERA ADMISIÓN) __________ PRUEBA

5/31

6/3

6/7

N de urea, mg/dl

45

24

11

Creatinina, mg/dl N de urea/creatinina pH

1.8 25 7.22

1.3

0.9

18.5

12.2

7.5

PC02, mmHg

74.4

48.7

P02, mmHg

32.8

57.6

Oz, sat, %

51.3

91.0

CUADRO 9-1.2 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO (SEGUNDA ADMISIÓN)___________________ N de urea, mg/dl

90

C re a tin in a , mg/dl

3.9

Á cid o úrico, mg/dl

1 2 .0

N de urea/creatin in a

23

PH

7.35

P C 0 2, mmHg

59.9

P 0 2, mmHg

34.6

0 2, sat, %

63.7

CAPÍTULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

223

C U A D R O 9-3. RESUMEN DE MÉTODOS ANALÍTICOS, UREA MÉTODOS ENZiMÁTICOS Ureasa U rea + H2Q ---------* 2NH4+ + CO 3-2

Los m étodos em p lean un prim er paso sim ilar En zim ático acoplado a GLDH

GLDH NH4+ + 2-oxogl uta rato + N A D H ---------* N A D ++ g !utam ato + H 2Q

C o lo ran te ind icado r

NH3++ ind icado r de p H ---------* cam bio de color

C o nd uctim étrico

La conversión de urea no io nizad a a NH4+y H C 0 32_ da com o resu ltado au m en to de la co nductividad NH4+ + SNaQCI 2fen o l

B erth elo t

Em pleado en instru­ m entos autom atizados; m ejor como m edición cinética; posible m éto­ do de referencia

N itroprusiato/O H ----------------------- » indofenol + 5NaC! + 5H2Q

Métodos químicos H+ M ono xim a de d ia c e tilo + H 20 ---- * d iace tilo +H O N H 2 Calor

M ono xim a de diacetilo

H+ U re a + d iacetilo ---- » diacina (a m arilla) + 2H 20 H+ U rea + o -ftalald eh ído ---- » isoindolina

o -Ftaldehído

Em pleado en reactivos de película multicapa, tiras de reactivo en polvo y sistemas autom atizados Específico y rápido No esp ecífico; m uy sensible a in te rfe re n ­ cia de NH 3 endó geno

No esp ecífico; em plea reactivo s tóxicos

Em pleado en instru­ m entos auto m atizado s; n inguna interferencia de NH3, interferencia de sulfam idas

H' Iso indolina + N -(1-n aftil)e tilen d iam in a ---- > producto co lo reado

cación para uso con m uestras de orina debido a la alta con ­ centración de urea y la presencia de am oniaco endógeno.

Intervalo de referencia18 N itrógeno de urea Adulto Suero o plasm a O rina de 2 4 h

6 -2 0 mg/dl

(2 .1 -7 .1 mmol/L de urea) 12 a 2 0 g/día (0 .4 3 -0 .7 1 mol/día de urea)

CREATININA/CREATINA Bioquímica La creatina se sintetiza sobre todo en el hígado a partir de arginina, glicina y m etionina .4Luego, es transportada a otro tejido, com o el m úsculo, donde se convierte en fosfocreatina, que sirve com o una fuente de alta energía. E l fosfato de creatina pierde ácido fosfórico, y la creatina pierde agua para form ar creatinina, que pasa hacia el plasma. Las estruc­ turas de estos com puestos se m uestran en la figura 9-3.

La creatinina se libera hacia la circulación a una tasa rela­ tivamente constante, que se ha demostrado es proporcional a una masa muscular individual. Se elimina de la circulación por filtración glomerular y se excreta por la orina. El túbulo próxi­ mad secreta cantidades adicionales de creatinina. Los túbulos renales pueden reabsorber también cantidades pequeñas .19 La concentración de creatinina plasmática es una función de la masa m uscular relativa, la tasa de recam bio de creatina y la función renal. La cantidad de creatinina en la corriente sanguínea es razonablem ente estable, aunque el contenido proteínico de la dieta afecta la concentración plasmática. Com o resultado de la constancia observada de producción endógena, la determ inación de excreción de creatinina ha sido empleada com o una m edición de la integridad de las recolecciones de orina de 2 4 h en un determ inado individuo, aunque puede ser que este m étodo sea poco confiable .20

Correlaciones de enferm edad C reatinina La alta con cen tració n de creatinina se relaciona con la fu n ció n renal anorm al, en particular cuando se relaciona

224

PARTE II ■ CORRELACIONES CLINICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALITICOS

h 2o

+ A TP CK

ADP + Creatinina

Fosfato de creatina FIGURA 9-3. Interconversión de creatina, fosfato de creatina y creatinina.

C K = cinasa de creatina (EC 2.7.3.2)

con la fu nción glomerular. La tasa d e filtración glom erular (GFR) es el volum en de plasm a filtrado (V) por el glom éru lo por unidad de tiem po (t). V

GFR = -

t

(Ec. 9-2)

Suponiendo que se puede m edir una sustancia, S, y es fil­ trada sin dificultad en el glom érulo, y los túbulos n u nca la secretan o reabsorben, el volum en de plasm a filtrado sería igual a la masa de S filtrada (Ms) dividida entre su co n cen ­ tración plasm ática (Ps). V= ^ -

(Ec. 9-3)

La m asa de S filtrada es igual al producto de su co n cen ­ tración en la orina (L7S) y el volum en de orina (V L,).

Ms = U sVu

(Ec. 9-4)

Si se co n o cen las con cen tracio n es de S en orina y plas­ m a, el volum en de orina colectado y el tiem po en el que se recolectó la m uestra, se puede calcular la T F G . G

F R A

(Ec. 9-5)

PSt E l aclaram iento de una sustancia es el volum en de plas­ ma del cual se elim inó esa sustancia por unidad de tiem ­ po. La fórm ula para el aclaram iento de creatinina (CrCl) se

expresa com o sigue, donde U Cr es co n cen tració n de crea­ tinina en la orina y PCr es la con cen tració n de creatinina en el plasma.

C r C l^ ^ JL

(Ec. 9-6)

Pcfi Por lo general, el aclaram iento de creatinina se expre­ sa en unidades de ml/min, y se puede corregir por área de superficie corporal (véase el capítulo 2 4 , Función renal). El aclaram iento de creatinina sobrestim a la T F G porque los túbulos renales reabsorben una pequeña cantidad de creati­ nina y secretan hasta 10% de creatinina de orina. Sin embar­ go, el A Cr provee una aproxim ación razonable de T F G .21 De la ecu ación 9 -6 , se ve que la co n cen tració n de creatinina en plasm a es inversam ente proporcional al aclaram iento de creatinina. P or tanto, cuando aum enta la co n cen tració n de creatinina plasm ática, dism inuye la T F G , lo que indica daño renal. Por desgracia, la creatinina plasm ática es una m arcador de cierta form a in sensible y existe la posibilidad de que no se increm en te de m anera m ensurable hasta que la fu nción renal se haya deteriora­ do m ás de 5 0 % .4 La relación observada entre la creatinina plasm ática y la T F G y la observación de que las co n cen ­ traciones de creatinina plasm ática son de cierta m anera constan tes y n o afectadas por la dieta, hacen que la creati­ n ina sea un buen analito para la evaluación de la fu n ción renal. Sin em bargo, debido a las dificultades encontradas al analizar la cantidad pequeña de creatinina que por lo regular está presente (véase la exp licación en Métodos an a­ líticos), es posible que la m edición de creatinina plasm á-

CAPÍTULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

225

ES T U D IO D E C A S O 9-2 Una m u jer de 8 0 años de edad fue admitida con diagnós­ tico de hipertensión, insuficiencia cardíaca congestiva, anem ia, posible diabetes e insuficiencia renal crónica. Fue tratada con diuréticos y líquidos IV y dada de alta cuatro días después. Sus resultados de laboratorio se m uestran en el cuadro 9-2 .1 de estudio de caso. C inco m eses después, fue adm itida de nuevo para tratam iento de ataques de disnea. Se le asignó una dieta especial y m edicam entos para con trolar su h ip erten ­ sión y fue dada de alta. E l personal m édico cree que la paciente no está tom ando su m edicam ento com o se le prescribió, así que se le asesoró en relación con la im portancia de tom ar dosis regulares.

Preguntas 1. ¿C uál es la causa más probable de la alta con cen tra­ ció n de nitrógeno de urea de la pacien te? ¿Q ué datos apoyan su conclu sión? 2. N ote que el diagnóstico de adm isión de esta paciente es “posible d iabetes”. Si la paciente en realidad tiene d iabetes, con con cen tració n alta de glucosa sanguí­ nea y acetona positiva, ¿que efecto tendría esto en los valores m edidos de creatinina? E xplique.

CUADRO 9-2.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO S E G U N D A A D M IS IÓ N

P R IM E R A A D M ISIÓ N 2/11

2/15

7/26

7/28

N de u re a , mg/dl

58

*

*

6 1.0

C re a tin in a , mg/dl

6.2

6.2

6.4

6 .0

10.0

*

*

9.2

9.4

*

*

10.1

113

*

Á c id o ú rico , mg/dl N d e u re a /c re a tin in a G lu co sa, mg/dl *

86

80

Indica prueba no realizada.

tica no provea sensibilidad suficiente para la d etección de disfu nción renal leve. Han sido propuestos varios analitos, inclu so la cistatina C, para m onitorear la T F G .22

C rea tin a E n la enferm edad del m ú sculo com o distrofia m uscular, p oliom ielitis, hipertiroidism o y traum atism o, las co n cen ­ traciones de creatina plasm ática y creatinina urinaria sue­ len ser altas. Las con cen tracio n es de creatinina plasm ática por lo regular son norm ales en estos pacientes. La m edi­ ció n de cinasa de creatina se em plea para el diagnóstico de enferm edad del m úsculo porque los m étodos analíti­ cos para creatina no están d isponibles con facilidad en los laboratorios clín ico s. E n la enferm edad renal no aum enta la con cen tració n de creatina plasm ática .19

M étodos analíticos para creatinina L os m étod os em pleados co n m ás frecu en cia para m edir creatin in a se basan en la re a cció n de Ja ffe d escrita por prim era vez en 1 8 8 6 .23 E n esta rea cció n , la creatin in a reaccio n a co n el ácido p ícrico en d iso lu ció n alcalina para form ar u n crom ógeno ro jo -n a ra n ja . E n 1 9 1 9 F o lin y W u ad optaron la reacció n para la m ed ición de creatinina san g u ín ea .24 La reacció n es in esp ecífica y está su jeta a in terferen cia positiva de u n g ran nú m ero de com p u estos,

com o aceto a ceta to , acetona, asco rb ato , glucosa y piruvato. Se o b tien en resultados m ás e xa cto s cu ando la cre a ti­ n ina en un filtrado libre de proteín a se absorbe en tierra de F u lle r (silica to de m agnesio de alu m in io) o reactivo de Lloyd (silica to de alum inio de so d io ), luego se eluye y se h ace rea ccio n a r con p icrato a lc a lin o .25 D ebido a que este m étod o es tardado y no se autom atiza co n facilidad, n o se em plea de form a ru tinaria. Se han em pleado dos m étodos para in crem en tar la especificidad de m étodos de análisis para creatinina: un m étodo de Ja ffe cinético y reacción con varias enzim as. En el m étodo de Ja ffe cin ético, el suero se m ezcla con picrato alcalino y se m ide la tasa de cam bio en la absorban cia .26 Aunque este m étodo elim ina algunos de los reactantes no esp ecíficos, está su jeto a interferen cia por cetoácid os a y cefalosporinas .27 La bibrrubina y la hem oglobina pueden causar un sesgo negativo, probablem ente u n resultado de su d estrucción en la base fuerte utilizada. U n estudio del m étodo de Ja ffe cinético y varios m étodos enzim áticos indicaron que aún se tiene que lograr la elim in ación de interferencia en la m edición de la creatinina sérica .28 E l m étodo de Ja ffe cinético se em plea de form a rutinaria a pesar de estos problem as porque no es caro, es rápido y fácil de realizar. En un esfuerzo por increm entar la especificidad de la reac­ ción de Jaffe, se han elaborado varios métodos enzimdticos

226

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

acoplados.29’30 E l m étodo con creatininasa (am idohidrolasa de creatin in a [E C 3 .5 .2 .1 0 ] ) , creatinasa (am id in oh id ro lasa de creatina [EC 3 .5 .3 .3 ]), oxidasa de sarcosina (EC 1 .5 .3 .1 ) y peroxidasa (E C 1 .1 1 .1 .7 ) ha sido adaptado para uso en un analizador de placa seca .31 O tro m étodo para el análisis de creatinina ha sido la m ed ición del color form ado cuando la creatinina reacciona

con 3 ,5 -d in itro b en z o a to .32 Este m étodo ha sido adaptado co n éxito a una tira reactiva. Sin em bargo, el color produ­ cido es m enos estable que el del crom ógeno de Ja ffe .ls Se han desarrollado m étodos de crom atografía líquida de alta presión (CLA P). E n uno de los m étodos se emplea el pretratam iento de la m uestra con ácido tricloracético para rem over proteína, cromatografía de intercam bio iónico y

CUADRO 9-4. RESUMEN DE MÉTODOS ANALÍTICOS» CREATININA Métodos químicos basados en la reacción de Jaffe Jaffe-cinético

Jaffe con adsorbente

Jaffé sin adsorbente

Reacción de Jaffe efectuada directam ente en la muestra; detección de form ación de color programada para evitar interferencia de cromógenos no creatinínicos

Sesgo positivo de a-cetoácidos y cefalosporinas; requiere equipo autom atizado para precisión

“OH Creatina +picrato complejo rojo-anaranjado Creatinina en el filtrado libre de proteína es adsorbida en tierra de Fuller (silicato de alum inio y magnesio); luego, se hace reaccionar con picrato alcalino para fo rm ar un complejo coloreado

El adsorbente mejora la especificidad; método de referencia considerado pre­ viam ente

La creatinina en el filtrado libre de proteína reacciona con picrato alcalino para form ar complejo coloreado

Sesgo positivo de ácido ascórbico, glucosa, glutatió n, a-cetoácidos, ácido úrico y cefalosporinas

Métodos enzimáticos

Creatininasa-CK

. . Creatinina Creatininasa + H , 0 * Creatina

Requiere muestra grande; no se emplea de forma amplia

CK

Creatina + ATP ——» fosfato de creatina + ADP ADP+ fosfoenolpiruvato

Piruvato + NADH + H+

Creatininasa-H20 2

Creatinina + H ,0

Creatina + H20

PK

LD

* piruvato + ATP

lactato + NAD+

Creatininasa

Creatinasa

Sarcosina + 0 2 + H20

» Creatina

sarcosina + urea

Oxidasa de sacosina Glicina + CH20 + H20 2

H20 2 + sustrato incoloro

A daptado para uso como método de placa seca; potencial para reem plazar a Jaffe; ninguna interfe­ rencia del acetoacetato o cefalosporinas; algún sesgo positivo debido a iidocaína

Peroxidasa producto coloreado+ H20

Otros métodos Ácido 3,5-dinitrobenzoico (DNBA)

Creatinina + D N B A

CLAP

Crom atografía de fase inversa o de intercambio catiónico

“OH » producto púrpura

Empleado en tiras reacti­ vas; producto coloreado inestable A ltam ente específico; método de referencia propuesto

CAPÍTULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

d etección ultravioleta (U V) de creatinina .33 Otro m étodo com bina la separación por CLAP con determ inación enzi­ m ática de concentración de creatinina .34 Am bos m étodos han sido recom endados com o m étodos de referencia para creatinina sérica. La espectrom etría de masas con dilución de isótopo ha sido propuesta com o un m étodo definitivo .35 E l desarrollo y uso de m étodos más exactos para crea­ tinina plasm ática que tien den a dar valores m enores ten­ drá un efecto significativo en los resultados obtenidos para aclaram iento de creatinina porque los resultados para creatinina urinaria no están su jetos a tantas interferencias com o la creatinina plasm ática. E l uso de m étodos más esp ecíficos para la m ed ición de creatinina plasm ática pue­ de dar com o resultado tasas de aclaram iento en apariencia m ás altas. E stos resultados requerirán interpretación cu i­ dadosa .21 Los m étodos analíticos para creatinina se resu­ m en en el cuadro 9-4.

Requisitos de la m uestra y sustancias que interfieren La creatinina se puede m edir en plasm a, suero u orina. Las m uestras hem olizadas e ictéricas se deben evitar en particular si se em plea un m étodo de Jaffe. Las m uestras lipém icas pueden producir resultados erróneos en algunos m étodos. No se requiere una m uestra de ayuno, aunque la ingestión alta de proteínas puede elevar de form a tran sito­ ria las con cen tracio n es séricas. La orina se debe refrigerar después de la recolección o congelar si se requieren más de 4 días de alm acen aje .18

Fuentes de error E l ascorbato, glucosa, a-cetoácid os y el ácido úrico pueden increm entar la concentración de creatinina medida por la reacción de Jaffe, en particular a temperaturas superiores a 30°C . Esta interferencia se reduce de form a im portante cuando se aplica una m edición cinética. Dependiendo de la concentración de los reactivos y el tiem po de m edición, la interferencia de los a-cetoácid os puede persistir en métodos de Jaffe cinéticos. Algunas de estas sustancias interfieren en los m étodos enzim áticos para m edición de creatinina. La bilirrubina causa un sesgo negativo en los m étodos de Jaffe y enzim áticos. E l ascorbato interferirá en los m étodos enzi­ m áticos que em plean peroxidasa com o reactivo .28 Los pacientes que tom an an tibióticos de cefalosporina pueden tener resultados elevados falsam ente cuando se em plea la reacción de Jaffe. Se ha dem ostrado que otros fárm acos increm en tan los resultados de creatinina. La dopam ina, en particular, afecta tanto a los m étodos enzi­ m áticos com o a los de Jaffe. La lidocaína causa un sesgo positivo en algunos m étodos en zim ático s .36 U n estudio del m étodo de Ja ffe cin ético y varios m éto­ dos enzim áticos indicaron que aún se tiene que lograr la elim inación de interferencia en la m ed ición de creatinina sérica .28 E l uso de una técnica de ajuste de curvas m u ltipunto y no la d eterm inación trad icional de tiem po fijo de dos puntos para calcular la co n cen tració n de creatinina es una so lu ció n propuesta .37

227

CUADRO 9-5. INTERVALOS DE REFERENCIA PARA CREATININA EN PLASM A O SUERO mg/dl (¡¿mol/L) _ _ _ _ _ _ _ _ _ JAFFE

POBLACIÓN

ENZIMÁTICO

A d u lto M ujer

0 .6 -1 .1 (5 3 -9 7 )

0 .5 -0 .8 (4 4 -7 1 )

Varón

0 .9 -1 .3 (8 0 -1 1 5 )

0 .6 -1 .1 (5 3 -9 7 )

0 .3 -0 .7 (2 7 -6 2 )

0 -0 .6 (0 -5 3 )

Niño

Intervalo de referencia18 Los intervalos de referencia varían co n el tipo de ensayo, edad y g én ero .18 La con cen tració n de creatinina dism inuye con la edad com enzando en la quinta década de la vida. Los intervalos de referencia del suero se enum eran en el cuadro 9 -5. Creatinina A dulto, m u jer

O rina de 24 h

A dulto, varón

600 a 1800 mg/día 800 a 2000 mg/día

(5 .3 a 15.9 mmol/día) (7 .1 a 17.7 mmol/día)

M étodos analíticos para creatina E l m étodo tradicional para la m ed ición de creatina depen­ de del análisis de la m uestra con un m étodo de Jaffe de p u nto final para creatinina antes y después de que se caliente en disolu ción ácida. E l calentam ien to convierte a la creatina en creatinina y la diferencia entre las dos m ues­ tras es la con cen tració n de creatina. Las tem peraturas altas podrían originar la form ación de crom ógenos adicionales, y la p recisión de este m étodo es d eficiente. Se han desa­ rrollado varios m étodos enzim áticos; un o es el ensayo de creatininasa. Se om ite la enzim a in icial y la cinasa de crea­ tina (E C 2 .7 .3 .2 ), cinasa de piruvato (E C 2 .1 .7 .4 0 ) y la deshidrogenasa de lactato (E C 1 .1 .1 .2 7 ) se acop lan para p roducir un producto coloreado m ensu rable .38 La creatina se puede m edir m ediante CLA E 39,40

ÁCIDO ÚRICO Bioquímica E n los prim ates superiores, com o hum anos y sim ios, el

ácido úrico es el producto de d escom posición final del m etabolism o de la pu rin a .4 La m ayor parte de los m am ífe­ ros tienen la capacidad para catabolizar purinas a alantoína, un producto final más soluble en agua. E sta reacción se m uestra en la figura 9-4. Las purinas, com o la adenosina y la guanina de la des­ com posición de ácidos nu cleicos ingeridos o de la destruc­ ción de tejid o, son convertidas en ácido úrico, sobre todo en el hígado. E l ácido úrico es transportado en el plasma del hígado a los riñones, donde se filtra a través del glom érulo. La reabsorción de 9 8 a 100% del ácido úrico en el filtrado glom erular ocurre en los túbulos proxim ales. Los túbulos

228

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

O H -N

-O

4-

0 2 + 2 H20

NH2

Uricasa

-O + C 0 2 + 2 H20 2

"NH Acido úrico

Alantoína FIGURA 9-4.

Conversión de ácido úrico a alantoína.

distales secretan pequeñas cantidades de ácido úrico en la orina. Esta ruta representa casi 70% de la excreción diaria de ácido úrico. E l resto se excreta hacia el tubo digestivo y las enzim as bacterianas se encargan de degradarlo. Casi todo el ácido ú rico en el plasm a se presenta com o urato m onosód ico. E n el pH del plasm a, el urato es rela­ tivam ente insolu ble; a con cen tracio n es m ayores que 6 .4 mg/dl, el plasm a se satura. Com o resultado, los cristales de urato se pueden form ar y precipitar en el tejido. E n la orina a un pH < 5 .7 5 , el ácido ú rico es la especie predom i­ n an te y se podrían form ar cristales de ácido úrico.

Correlaciones de enferm edad Tres estados m orbosos principales se relacionan con la co n cen tració n plasm ática alta de ácido ú rico: gota, cata­ bolism o increm entado de ácidos n u cleico s, y enferm edad renal. La gota es una enferm edad hallada sobre todo en los varones y, por lo com ún, se diagnostica entre los 3 0 y 5 0 años de edad. Los pacien tes tienen dolor e inflam ación de las articulaciones a causa de la p recipitación de uratos de sodio. E n 2 0 a 30 % de estos pacien tes, la hiperuricem ia es u n resultado de la sobreprod ucción de ácido ú rico, aun­ que la hiperuricem ia puede ser exacerbada por una dieta rica en purina, fárm acos o alcohol. La co n cen tració n de ácido ú rico plasm ático en estos pacientes es por lo regular m ayor que 6 .0 mg/dl. Los pacientes con gota son m uy sus­ ceptibles a desarrollar cálculos renales, aunque no todos los pacientes co n concentraciones altas de urato sérico presentan esta com plicación. E n las m u jeres, la co n cen ­ tración de urato aum enta después de la m enopausia. Las m u jeres posm enopáusicas pueden desarrollar h iperurice­ m ia y gota. E n casos graves, los depósitos de uratos llam a­ dos tofos, se form an en el tejid o y causan deform idades. O tra causa com ún de con cen tració n plasm ática alta de ácido ú rico es el m etabolism o increm en tado de n ú cleos de célu las, com o ocu rre en pacien tes con quim ioterapia para enferm edades proliferativas com o leu cem ia, linfom a, m ie­ lom a m últiple y policitem ia. E l m onitoreo de ácido úrico en estos pacientes es im portante para evitar n efro toxicidad. E l alopu rinol, que inhibe a la oxidasa de xantin a (E C 1 .1 .3 .2 2 ), una enzim a en la vía de síntesis de ácido ú rico, se em plea com o tratam iento. Los pacientes con anem ia h em olítica o m egaloblástica pueden exh ibir con cen tració n alta de ácido úrico. La

enferm edad renal cró n ica causa u n aum ento en la co n cen ­ tración de ácido úrico porque se d eterioran la filtración y la secreción. Sin em bargo, el ácido ú rico no es ú til com o indicad or de la fu n ció n renal porque m u chos otros facto­ res afectan su con cen tració n plasm ática. Las co n cen tra cio ­ nes de urato en el plasm a arriba de 6 mg/dl se relacionan co n el desarrollo de com plicaciones de gota (cuadro 9 -6 ). La con cen tració n alta de ácido ú rico es secundaria a la enferm edad de alm acen aje de glucógeno (d eficiencia de glucosa- 6-fosfatasa, E C 3 .1 .3 .9 ) y otras deficien cias enzim áticas congénitas. Se producen cantidades excesivas de m etabolitos, com o lactato y triglicéridos, y com piten con el urato para excreció n renal en estas enferm edades .19 E l síndrom e de L esch-N yhan es un trastorno genético ligado al crom osom a X (visto sólo en varones) causado por d eficiencia com pleta de guanina hipoxantina fosforrihosiltransferasa (HGPRT, E C 2 .4 .2 . 8), una enzim a im por­ tante en la biosíntesis de purinas. La falta de esta enzim a evita la reutilización de bases de purina en la vía de resca­ te de nu cleótid o. La síntesis increm entada de nu cleótid os

CUADRO 9-6. CAUSAS DE ÁCIDO ÚRICO ______________ PLASMÁTICO IN CREM EN TAD O Mayor ingestión en la dieta Aum ento de la producción de urato Gota Tratamiento de enfermedad mieloproliferativa con fármacos citotóxicos Excreción reducida Acidosis láctica Toxemia de embarazo Enfermedad de almacenaje de glucógeno tipo I (deficiencia de glucosa-6-fosfatasa) Tratamiento con fármacos Venenos: plomo, alcohol Enfermedad renal Defectos enzim ático de la vía catabolítica Síndrome de Lesch-Nyhan

CAPITULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

de purina y del producto de degradación, ácido ú rico, da com o resultado con cen tracio n es altas de ácido ú rico en plasm a y o rin a .41 Síntom as neurológicos, retraso m ental y autom u tilación caracterizan a esta enferm edad bastante rara. Las m u taciones en la sintetasa de fosforribosilpirofosfato (E C 2 .7 .6 .1 ) tam bién causan que aum ente la co n ­ cen tración de ácido ú rico .19 La hiperuricem ia es una característica com ún de toxem ia de em barazo y acidosis láctica presum iblem ente com o resultado de la com petencia por sitios de enlace en los túbulos renales. Las con cen tracio n es altas se pueden en contrar después de la ingestión de una dieta rica en purinas (p. e j., hígado, riñ ón , m ollejas, m ariscos) o una dism inu ción im portante en la ingestión dietética total com o resultado de catabolism o tisular increm en tado o inanición. La hipouricem ia es m enos com ún que la hiperurice­ m ia y, por lo com ún, es secundaria a hepatopatía grave o reabsorción tubular defectuosa, com o en el síndrom e de F an con i. La hipouricem ia puede ser causada por q u im io­ terapia con 6-m ercaptopurina o azatioprina, inhibid ores de la síntesis de purina de novo, así com o el sobretratam ien to con alopu rin ol .19

M étodos analíticos C om o se m uestra en la figura 9 -4 , el ácido ú rico se oxida fácilm ente a alantoína y, por tanto, puede fu ncionar com o u n agente red uctor en las reacciones quím icas. E sta pro­

229

piedad se aprovechaba en los prim eros procedim ientos analíticos para la d eterm inación de ácido úrico. El m étodo más com ú n de este tipo es el de Caraway, que se basa en la oxid ación de ácido úrico en un filtrado libre de p roteí­ na, co n una red ucción posterior de ácido fosfotú ngstico a azul de tu ngsten o .42 E l carbonato de sodio provee un pH alcalino necesario para la form ación de color. E ste m étodo carece de especificidad. Los m étodos en los que se em plea uricasa (oxidasa de urato, E C 1 .7 .3 .3 ), la enzim a que cataliza la oxid ación de ácido ú rico a alantoína, son más específicos. E n el más sim ple de estos m étodos se m ide la absorción diferencial de ácido ú rico y alantoína a 2 9 3 n m .43 La diferencia en absorban cia antes y después de la in cu b ació n con uricasa es proporcional a la con cen tració n de ácido úrico. Se ha propuesto una m odificación de este m étodo com o posi­ ble m étodo de referencia .44 Las proteínas pueden causar absorban cia de fondo alta en este m étod o, lo que reduce la sensibilidad. La interferen cia negativa puede ocu rrir a causa de la hem oglobina y x a n tin a .45 Se han desarrollado métodos con reacciones enzim áticas acopladas para m edir el peróxido de hidrógeno produci­ do cuando el ácido úrico es convertido en alan toín a .46,47 La peroxidasa o catalasa (E C 1 .1 1 .1 .6 ) se em plea para catalizar una reacció n de indicad or quím ico. E l co lo r pro­ ducido es proporcional a la cantidad de ácido ú rico en la m uestra. Los m étodos enzim áticos de esta clase han sido adaptados para uso en analizadores por vía húm eda

ES T U D IO D E C A S O 9-3 Una niña de 3 años de edad fue adm itida con un diag­ n óstico de leucem ia lin focítica aguda. Sus datos de laboratorio de adm isión se m uestran en el cuadro 9 3 .1 de estudio de caso. D espués de la adm isión, la niña fue tratada con concen trados celulares, 2 unidades de plaquetas, líquidos IV y alopurinol. E n el segundo día de hospital, se inició la quim ioterapia, con vincristin a y prednisona IV e inyecciones intratecales de m etotrexato, prednisona y arabinósido de citosin a. C in co días después fue enviada a su casa. C ontinuó con predni­ sona y alopu rinol en su hogar. U n mes después recibió quim ioterapia adicional (11/1) y de nuevo en 11/14. En 12/6 , fue adm itida de nuevo porque tenía llagas dolorosas en su boca y no podía com er.

Preguntas 1. ¿C óm o explicaría las con cen tracio n es significativa­ m ente altas de ácido ú rico en la adm isión? 2. ¿A qué factores se deben las con cen tracio n es n orm a­ les de ácido ú rico en adm isiones posteriores? 3 . ¿Cuál es la causa más probable de con cen tració n anorm alm ente b aja de nitrógeno de urea observada en 12/6? ¿Q ué otro resultado de laboratorio sería ú til para confirm ar sus sospechas?

CUADRO 9-3.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO 10/3 *

10/4

11/14

12/6

12.0

10/2 *

11

40

? n

6/20 *

Creatinina, mg/dl

0.7

*

*

1.0

0.7

*

0.7

Ácido úrico, mg/dl

12.0

9.2

4.0

1.9

2.3

*

3.1

GB, mm3

56,300

10/1 N de urea, mg/dl

* Indica prueba no realizada.

3,700

2,800

3,700

230

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

tradicionales y para analizadores de placa por vía seca. La bilirrubina y el ácido ascórbico que destruyen peróxido pueden interferir. Las preparaciones de reactivos com er­ ciales suelen in clu ir ferrocianuro de potasio y oxidasa de ascorbato para reducir estas interferencias. Se han elaborado m étodos de CLAP co n varios tipos de co lu m n a .48,49 E stos m étodos so n sen sibles y esp ecíficos; podría ser n ecesario el tratam iento previo de la m uestra para elim inar proteína. La esp ectrom etría de m asas con d ilu ción de isótopo ha sido propuesta com o un posible m étod o d efinitivo .50 Los m étod os an alítico s se resum en en el cuadro 9 -7 .

Requisitos de la m uestra y sustancias que interfieren E l ácido ú rico se puede m edir en plasm a heparinizado, suero u orina. E l suero se debe rem over de las células lo m ás pronto posible para evitar la d ilu ción por contenido intracelular. La dieta puede afectar la con cen tració n de ácido ú rico en general, pero una com ida reciente n o tiene efecto im portante y es innecesaria una m uestra en ayuno. Se debe evitar la lipem ia total. U na co n cen tració n alta de b ilirru b ina podría dism inuir de m odo falso los resultados

obtenidos por m étodos de peroxidasa. La hem olisis signi­ ficativa, co n lib eración concom itan te de glutatión, podría dar com o resultado valores b ajos. Se ha dem ostrado que fárm acos com o salicilatos y tiacidas in crem en tan los valo­ res para ácido ú rico .36 E l ácido ú rico es estable en plasm a o suero después de que han sido elim inados los e ritro cito s. Las m uestras de suero pu ed en ser puestas en refrig eració n d uran te 3 a 5 d ías .18

Intervalo de referencia18 L os valores son un poco m enores en n iñ os y m u jeres posm enopáusicas. Á cido ú rico (m étodo de uricasa) M u jer adulta Plasm a 2.6 a 6.0 o suero mg/dl Varón adulto 0 .5 a 7 .2 mg/dl O rina de 250 a 750 24 h mg/día N iño Plasm a 2 .0 a 5 .5 o suero mg/dl

(0 .1 6 a 0 .3 6 mmol/L) (0 .2 1 a 0 .4 3 mmol/L) (1 .4 8 a 4 .4 3 mmol/día) (0 .1 2 a 0 .3 3 mmol/L)

CUADRO 9-7. RESU M EN P E M ÉTO D O S A N A LÍTICO S, Á C ID O ÚRICO M ÉTODOS QUÍMICOS Ácido fosfotúngstico

Na7CO,/OH“ Acido unco + H3PW12O40 + 0 2 — 1— al antoí na + azul de tungsteno + C 0 2

Métodos enzim áticos Primer paso similar Espectrofotométrico

No específico; requiere eliminación de proteína Muy específico

, , Uricasa Acido úrico + 0 2 + 2 H20 ---------- * alantoína + C 0 2 + H20 2 Disminución de absorbancia a 293 nm

Catalasa Enzimático acoplado H20 2 + CH3OH ---------- » H2CO + 2 H20 CH20 + 3 C5Hs0 2 + NH3 -------------- * 3 H20 -t-compuesto coloreado 0)

Posible método de referencia; interfieren hemoglobina y xantina

Por lo común es un método sesgo negativo agentes reductores

Peroxidasa Enzim ático acoplado H20 2 + colorante indicador ---------- * compuesto coloreado + 2 H20 Autom atizado con facilidad;interfieren (II) agentes reductores Otros métodos CLAP

Intercambio iónico, permeación en gel, columnas de fase inversa

Específico; por lo regular requiere extracción de muestra

Dilución isotópica/MS

Muestra diluida con cantidad conocida de isótopo; relación de dos isótopos detectada m ediante un espectrómetro de masas

Método definitivo propuesto

CAPÍTULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

A M O N IACO

de la urea excepto argininosuccinasa (E C 4 .3 .2 .1 ). La m edi­ ción de am oniaco en plasma es im portante en el diagnóstico y m onitoreo de estos trastornos m etabólicos hereditarios.

Bioquím ica E l am oniaco (NH3) surge de la desam inación de aminoácidos, que ocurre sobre todo por la acción de enzim as bacterianas y digestivas en proteínas en el tubo digestivo .19 E l am onia­ co se libera tam bién de reacciones m etabólicas que ocurren en el m úsculo esquelético durante el ejercicio. Las células parenquimatosas del hígado lo consum en para la produc­ ción de urea. E n hepatopatía grave en la que hay circula­ ción colateral im portante o si la función de células hepáticas parenquimatosas está dañada, el am oniaco se elim ina de la circulación y se increm enta la concentración sanguínea. A pH fisiológico norm al, la m ayor parte del am oniaco en la sangre existe com o ion am onio. E n la figura 9-5 se m ues­ tra el equilibrio dependiente del pH entre NH 3 y NH4+. A diferencia de otras sustancias de NNP, la concentración de am oniaco en el plasma no depende de la función renal. La m edición de am oniaco en la orina se puede usar para confir­ m ar la capacidad de los riñones para producir am oniaco. Las concentracion es altas de NH 3 son n eu rotóxicas y se relacionan por lo com ún con encefalopatía. La to x ici­ dad puede ser en parte u n resultado de la con cen tració n increm entada de glutam ato extracelular y el agotam iento posterior de trifosfato de adenosina (ATP) en el cerebro .51 El am oniaco se usa para m onitorear el avance de varias con d icio n es clínicas graves, y debe estar disponible un estudio cu antitativo en los laboratorios de las in stalacio­ nes de aten ción terciaria.

Correlaciones de enferm edad Las cond iciones clínicas en las que la con cen tració n de am oniaco provee inform ación útil son insu ficiencia hepá­ tica, síndrom e de Reye y d eficiencias hereditarias de enzi­ m as del ciclo de la urea. La enferm edad hepática grave es la causa m ás com ún de m etabolism o de am oniaco altera­ do. E l m onitoreo de am oniaco sanguíneo se puede usar para determ inar el diagnóstico, aunque es posible que la correlación entre el grado de encefalopatía hepática y NH 3 p lasm ático no sea congruente. U n estudio reciente indica que la con cen tració n de am oniaco corresponde a la grave­ dad de la encefalopatía h ep ática .52 E l síndrom e de Reye, que ocurre con más frecuencia en niños, es una enfermedad grave que puede ser fatal. De ordi­ nario , la enfermedad va precedida de infección viral, que sue­ le tratarse con aspirina. E l síndrom e de Reye es un trastorno m etabólico agudo del hígado, y los hallazgos de la necropsia m uestran infiltración grasa intensa de ese órgano .41 La con ­ centración de am oniaco en la sangre se puede correlacio­ nar con la gravedad de la enfermedad y el diagnóstico. La supervivencia alcanza 100% si la concentración plasmática de NH 3 perm anece cinco veces debajo de lo norm al .53 La concentración de am oniaco en la sangre se increm en­ ta en la deficiencia hereditaria de todas las enzim as del ciclo

n h 4+ + h2o FIGURA 9-5.

231

n h 3 + h 3o +

Interconverslón de amonio y amoniaco.

M étodos analíticos La m ed ición exacta de laboratorio de am oniaco en plasma es com plicada por su baja con cen tració n , inestabilidad y contam in ación dom inante. Se han em pleado dos m éto­ dos para la m ed ición de am oniaco plasm ático. U no es un m étodo de dos pasos en el que se aísla el am oniaco de la m uestra y luego se valora. E l segundo conlleva la m edición directa de am oniaco por un m étodo enzim ático o electrodo selectivo de iones. Los ensayos detectan NH 3 o NLfi*. U no de los prim eros m étodos analíticos para el am o­ niaco, desarrollado por Conway en 1 9 3 5 , explota la vola­ tilidad del am oniaco para separar el com puesto en una cám ara de m icrod ifu sión .54 E l gas am oniaco de la m uestra se difunde hacia u n com partim iento separado y se absorbe en una disolu ción que contiene un in dicad or de pH. La cantidad de am oniaco se determ ina por titulación. U n segundo m étodo más exitoso para aislar NH 3 es el uso de una resina de intercam bio ión ico (D ow ex 5 0 ) segui­ da de elu ció n de NH 3 con cloruro de sodio y cu antificación por la reacción de B erthelot .55 Estos m étodos de aislam ien­ to son tardados y n o se autom atizan co n facilidad. U n ensayo enzim ático con deshidrogenasa de glutam a­ to es conveniente y es el m étodo m ás com ún em pleado en la actualidad .56 La dism inu ción de absorbancia a 3 4 0 nm cuando el fosfato de d inucleótido de nicotinam ida y adenina (NADPH reducido) se consu m e en la reacció n es pro­ porcional a la con cen tració n de am oniaco en la m uestra. La NADPH es la coenzim a preferida porque es usada de m anera específica por la deshidrogenasa de glutam ato; el NADH participará en reacciones de otros sustratos end ó­ genos, com o el piruvato. E l difosfato de adenosina (ADP) se agrega a la m ezcla de reacción para increm en tar la tasa de reacció n y estabilizar a la G LD H .57 E ste m étodo se usa en m u chos sistem as autom atizados, y se puede obtener de m u chos fabricantes com o un co n ju n to preparado. Se ha desarrollado una m ed ición directa con u n electro­ do selectivo de io n e s .58 E l electrodo m ide el cam bio de pH de una disolu ción de cloruro de am onio cuando el am o­ niaco se difunde por una m em brana sem iperm eable. Está d isponible u n ensayo colorim étrico de pelícu la delgada .59 E n este m étodo, el am oniaco reacciona con u n indicador para producir un com puesto coloreado que es detectado m ediante espectrofotóm etro. Los m étodos analíticos para am oniaco se resum en en el cuadro 9 -8 .

Requisitos de la m uestra y sustancias que interfieren E l m anejo cuidadoso de la m uestra es m uy im portante para estudios de am oniaco plasm ático. La con cen tració n de am oniaco de sangre total aum enta con rapidez después de la re co lecció n de la m uestra com o resultado de la desa­ m in ación de am inoácido in vitro. La sangre venosa se debe obtener sin traum atism o y colocar en hielo de inm ediato.

232

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 9-8. RESUM EN D E M ÉTO D O S A N A LÍTICO S, A M O N IACO Métodos enzim áticos GLDH NH.+ + 2-oxoqlutarato +NADPH

Más común en instru­ mentos autom atiza­ dos; exacto y preciso

> qlutamato + H20 + NADP+

Métodos químicos Intercambio iónico

Método manual tardado; exacto

NH3 absorbido en resina Dowex 50, se eluye y cuantifica con la reacción de Berthelot

Electrodo selectivo de iones Difusión de NH3 a través de membrana selectiva en NH4CÍ que causa cambio de pH, el cual se mide con un potenciómetro

Espectrofotométrico

Buena exactitud y precisión; la estabilidad de la mem­ brana puede ser un problema

NH3 + azul de b ro m o fen o l---- * colorante azul

lactosa, levodopa y varios antibióticos dism inuyen los valo­ res. La glucosa en concentraciones mayores que 6 0 0 mg/dl (3 3 mmol/L) interfiere en m étodos de placa seca.

La heparina y el ácido etilendiam inotetracético (ED TA) son anticoagulantes adecuados. L os recip ientes de reco ­ lecció n com erciales deben ser evaluados para interferen cia de am oniaco antes de utilizar un nuevo lote. Las m uestras se deben centrifugar a 0 a 4 °C dentro de 2 0 m in de la reco lecció n y elim inar el plasm a o suero. Las m uestras se deben evaluar lo más pronto posible o congelar. E l plasm a congelado es estable por varios días a -2 0 ° C . Los eritro­ citos con tien en dos a tres veces tanto am oniaco com o el plasm a; se debe evitar la hem olisis. U na fuente im portante de con tam in ació n con am oniaco se encuentra en pacientes que fum an. Se recom ienda que los pacientes d ejen de fum ar durante varias horas antes de extraer la m u estra .10

Los valores obtenidos varían un poco con el m étodo usado. Las con cen tracio n es m ayores se ven en recién nacidos.

Fuentes de error

Niño (10 días a 2 años)

La con cen tració n de am oniaco es u n problem a potencial en la m ed ición de am oniaco en el laboratorio. Se deben tom ar precau cion es para reducir la con tam in ació n en el laboratorio en el que se lleva a cabo el ensayo. La elim ina­ ció n de fuentes de contam in ación de am oniaco m ejora de form a im portante la exactitu d de los resultados del ensayo de am oniaco. E ntre las fuentes de con tam in ació n están el hum o del tabaco, orina y am oniaco en detergentes, m ate­ rial de vidrio, reactivos y agua. E l contenid o de am oniaco del m aterial de con trol b asa­ do en suero es inestable. Se pueden usar alícuotas congela­ das de albúm ina sérica hum ana que con tien en cantidades conocid as de cloruro o sulfato de am onio. E x isten en el m ercado d isolu ciones que con tien en cantidades co n o ci­ das de sulfato de am onio. M uchas sustancias afectan la concentración de am oniaco in vivo.18-45 Las sales de amonio, asparaginasa, barbituratos, diuréticos, etanol, hiperalim entación, analgésicos narcóticos, y algunos otros fárm acos pueden increm entar el am oniaco en el plasma. La difenhidramina, Lactobacillus acidophilus,

Intervalo de referencia18

a m o n ía c o

Adulto

Plasma

19-60 (xg/dl

(11-35 ¡xmol/L)

Orina de 24 h

140-1500 mg N/día

(10-107 mmol N/día)

68-136 pug/dl

(40-80 íxrnol/L)

RESUM EN L os com puestos de NNP clín icam en te im portantes halla­ dos en el plasm a son urea, creatin in a, creatina, ácido ú rico , am oniaco y am inoácidos. La urea, el producto excreto rio prim ario del m etabolism o de proteín as com ­ prende la m ayor p roporción de la fracción de NNP. Su co n c en tra ció n en plasm a se relaciona co n el con tenid o de proteín a de la dieta, el flujo sanguíneo renal, la cantidad de catabolism o de p roteín a y la fu n ció n renal. Las con d i­ cion es clín icas que cau san co n cen tra cio n es elevadas de urea se clasifican, según la causa, com o prerrenales, rena­ les y posrenales. La relación de nitróg en o de urea/crea­ tinin a se puede usar para d iferenciar estas con d iciones. La urea se m ide por lo com ún m ed iante u n m étodo enzi­ m ático que cu antifica la cantidad de am on iaco producida p or h id rólisis de ureasa de la urea en la m uestra.

CAPÍTULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

La creatinina se form a com o creatina y la fosfocreatina en el m úsculo pierde de form a espontánea agua o ácido fosfórico, respectivam ente. La creatinina se excreta por el plasm a a una tasa constan te relacionada con la m asa del m úsculo. La T F G se puede estim ar calculando el aclara­ m iento de creatinina, que requiere m ed ición de creatinina en plasm a y orina. La creatinina plasm ática se relaciona de form a inversa con la T F G y, aunque es una medida im per­ fecta, se em plea por lo com ún para m onitorear la fu n ción de filtración renal. La m ed ición de creatinina en plasm a y orina se ha realizado de m odo tradicional por m edio de la reacció n de Jaffe. Esta reacción es relativam ente inde­ finida y está sujeta a interferencia de m u chas sustancias, inclu so glucosa, a-ce to á cid o s y proteína. La especificidad de la reacció n se puede m ejo rar si se em plea un m étodo cin ético y no uno de punto final; sin em bargo, el m étodo de Jaffe cin ético está sujeto a interferencia de la b ilirru b i­ na, a-ce to á cid o s y algunos fárm acos. Se han desarrollado m étodos enzim áticos que no tien en am plia aceptación. É l uso de u n m étodo m ás específico para la m ed ición de creatinina puede requerir el reaju ste de intervalos de refe­ rencia para creatinina plasm ática y aclaram iento de creatinina. Sin este aju ste es posible que pase desapercibida la disfu nción renal. El ácido ú rico es el producto de la descom posición de las purinas del catabolism o de ácido n u cleico . Se filtra en el glom érulo, es reabsorbido en los túbulos proxim ales y lo secretan los túbulos distales hacia la orina. Más ácido ú rico es excretado hacia el tubo digestivo y es degradado por enzim as bacterianas. E l ácido ú rico es relativam ente insolu ble en plasm a y, a altas con cen tracio n es, puede ser depositado en las articulaciones y el tejid o, lo que causa inflam ación dolorosa. En situaciones com o gota, catabo-

P R E G U N T A S 1. ¿C uál de las siguientes no es una sustancia de NNP? a) Urea. b) A m oniaco. c) Creatinina. d ) Troponina T. 2. ¿Cuál fracción de NNP constituye casi la m itad de las sustancias de NNP en la sangre? á) Urea. b) Creatina. c) A m oniaco. d ) Á cido úrico. 3. La azoem ia prerrenal es causada por: a ) Insu ficien cia cardíaca congestiva. b ) Insu ficien cia renal crónica. c) Tumores renales. d) N efritis glomerular.

233

lism o increm en tado de ácido n u cleico y enferm edad renal se observa una m ayor con cen tració n de ureato plasm ático. E l aum ento de ácido úrico se observa después de cond i­ ciones que dan com o resultado p rod u cción excesiva de m etabolitos, com o lactato y triglicérid os, que com piten co n el urato para secreción en el túbulo distal. De ordina­ rio, el ácido ú rico se cuan tilica m ediante u n m étodo enzi­ m ático en el que la uricasa oxida al ácido ú rico a alantoína y peróxido. E l peróxido producido se detecta por reacción con diversos colorantes. La bilirrubina en cantidad sufi­ ciente y otras sustancias que destruyen peróxido en la m uestra pueden reducir de m anera falsa los resultados. El am oniaco está presente en el plasm a en b ajas co n cen ­ traciones. É ste proviene de la desam inación de am inoáci­ dos durante el m etabolism o de proteínas, y por lo com ún es elim inado de la circulación y convertido en urea en el hígado. Las concen traciones altas de am oniaco son neurotóxicas. La con cen tració n alta de am oniaco en el plasm a se relaciona con insuficiencia hepática, síndrom e de Reye o una d eficiencia hereditaria en el m etabolism o de la urea. El am oniaco se m ide m ediante u n m étodo enzim ático con deshidrogenasa de glutam ato. Se m ide el cam bio de absor­ bancia cuando la NADPH se convierte en NADPL La reco­ lecció n y m anejo cuidadosos de la m uestra son necesarios para controlar errores de m ed ición. La con cen tració n de am oniaco de sangre recién extraída aum enta con rapidez en reposo. Las m uestras se deben colocar en hielo después de la reco lecció n para evitar u n increm en to de NFI3 com o resultado de la d esam inación de am inoácidos. E l plasm a se debe separar y analizar lo m ás rápido posible. La con ­ tam inación con am oniaco en el laboratorio y el hum o del cigarrillo son fuentes potenciales de con tam in ació n de la m uestra.

DE

R E P A S O

4 . Una relación alta de N de urea/creatinina con una con ­ centración alta de creatinina se ve por lo com ún en: a) Hepatopatía. b) B aja ingestión de proteínas. c) N ecrosis tubular. d) C ond iciones posrenales. 5. N orm alm ente las concentracio nes de am oniaco se m id en para evaluar: a) Insu ficien cia renal. b ) Estado ácido-base. c) E ncefalopatía hepática. d) F iltra ció n glomerular.

6 . U n especialista obtiene un valor de N de urea de 61 mg/dl y un valor de creatinina sérica de 3 .1 mg/dl en u n paciente. E stos resultados indican: a) Insu ficien cia renal. b) Falla del riñón. c) Gota. d) Insuficien cia prerrenal.

234

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

7. E n la reacció n de Jaffe, se form a un crom ógeno ro jonaranja cuando la creatinina reacciona con: a) Á cido pícrico. b ) N aptiletilendiam ina. c) M onoxim a de diacetilo. d ) N itroferricianuro.

9. U n especialista obtiene una con cen tració n de N de urea de 9 mg/dl. ¿C uál es la co n cen tració n de urea? a ) 1 8 .3 mg/dl. b) 1 9 .3 mg/dl. c) 1 0 .3 mg/dl. d) 9 .3 mg/dl.

8 . Las sustancias que increm en tan los resultados al m edir

10. E l ácido ú rico es el producto de d escom posición final de: a) M etabolism o de la urea. b) M etabolism o de la purina. c) M etabolism o de la glucosa. d) M etabolism o de la bilirrubina.

creatinina m ediante la reacción de Ja ffe inclu yen a las siguientes E X C E P T O : a) G lucosa. b) A scorbato. c) a-C eto ácid o s. d ) Bilirrubina.

REFEREN CIAS 1. Gentzkow CJ. An accurate method for determination of blood urea nitrogen by direct nesslerization. J Biol Chem 1942;143:531. 2. Skogerboe KJ, Labbe RF, Rettmer RL, et al. Chemiluminescent measurement of total urinary nitrogen for accurate calculation of nitrogen balance. Clin Chem 1990;36:752. 3. Konstantinides FN, Konstantinides NN, Li JC , et al. Urinary urea nitrogen: too insensitive for calculating nitrogen balance studies in surgical clinical nutrition. JPEN J Parenter Enteral Nutr 1991;15:189. 4. Hristova EN, Henry JB . Metabolic intermediates, inorganic ions and biochem ical markers of bone metabolism. In: Henry JB , ed. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 20th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2001:180. 5. Berthelot MPE. Report Chim Appl 1859,1:282. 6. Talke H, Schubert GE. Enzymatische hamstoffbestimmung im blut und serum im optischen test nach warburg. Klin Wochenschr 1965;43:174. 7. Scott P, Maguire GA. A kinetic assay for urea in undiluted uriñe specimens. Clin Chem 1990;36:1830. 8. Orsonneau J , Massoubre C, Cabanes M, et al. Simple and sensitive determination of urea in serum and uriñe. Clin Chem 1992; 38:619. 9. Ohkubo A, Kamei S, Yamanaka M, et al. Multilayer-film analysis for urea nitrogen in blood, serum, or plasma. Clin Chem 1984; 30:1222. 10. Akai T, Naka K, Yoshikawa C, et al. Salivary urea nitrogen as an index to renal function: a test-strip method. Clin Chem 1983; 29:1825. 11. Paulson G, Ray R, Sternberg J. A rate sensing approach to urea measurement. Clin Chem 1971;17:644. 12. Georges J. Determination of ammonia and urea in uriñe and of urea in blood by use of an ammonia-selective electrode. Clin Chem 1979;25:1888. 13. Veniamin MP, Vakirtzi-Lemonias C. Chemical basis of the carbamidodiacetyl micromethod for estimation of urea, citrulline, and carbamyl derivatives. Clin Chem 1970;16:3. 14. Marsh WH, Fingerhut B, Miller H. Automated and manual direct methods for determination of blood urea. Clin Chem 1965; 11:624. 15. Pesce AJ, Kaplan LA. Methods in Clinical Chemistry. St. Louis: CV Mosby, 1987. 16. Kessler A, Siekmann L. Measurement of urea in human serum by isotope dilution mass spectrometry: a reference procedure. Clin Chem 1999;45:1523.

17. Sampson EJ, Baird MA, Burtis CA, et al. A coupled-enzyme equilibrium method for measuring urea in serum: optimization and evaluation of the AACC Study Group on urea candidate reference method. Clin Chem 1980;26:816. 18. Tietz N. Clinical Guide to Laboratory Tests. Philadelphia: W B Saun­ ders, 1995. 19. Newman DJ, Price CP. Renal function and nitrogen metabolites. In: Burtis CA, Ashwood ER, eds. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders, 1999:1204. 20. Narayanan S, Appelton H. Creatinine: a review. Clin Chem 1980;26:1119. 21. Perrone RD, Madias NE, Levey AS. Serum creatinine as an index of renal function: new insight into oíd concepts. Clin Chem 1992; 38:1933. 22. Laterza OF, Price CP, Scott MG. Cystatin C: an improved estimator of glomerular filtration rate? Clin Chem 2002;48:699. 23. Jaffe M. Uber den niederschlag welchen pikrinsaure in normalen harn erzeugt und uber eine neue reaktion des kreatinins. Z Physiol Chem 1886;10:391. 24. Folin O, Wu H. System of blood analysis. J Biol Chem 1919;31:81. 25. Haeckel R. Assay of creatinine in serum with use of Fuller’s earth to remove interferents. Clin Chem 1981;27:179. 26. Larsen K. Creatinine assay by a reaction kinetic principie. Clin Chem Acta 1972;41:209. 27. Bowers LD, Wong ET. Kinetic serum creatinine assays. II. A critical evaluation and review. Clin Chem 1980;26:555. 28. Weber JA, van Zanten AP. Interferences in current methods for measurements of creatinine. Clin Chem 1991;37:695. 29. Moss GA, Bondar RJL, Buzzelli DM. Kinetic enzymatic method for determining serum creatinine. Clin Chem 1975;21:1422. 30. Fossati P, Prencipe L, Berti G. Enzymic creatinine assay: a new colorimetric method based on hydrogen peroxide measurement. Clin Chem 1983;29:1494. 31. Creatinine test methodology. Kodak Ektachem clinical chemistry products. Rochester, NY: Eastman Kodak Company, 1992;Pub No MP2-49. 32. Langley WD, Evans M. The determination of creatinine with sodium 3,5-dinitrobenzoate. J Biol Chem 1936;115:333. 33. Rosano TG, Ambrose RT, Wu AHB, et al. Candidate reference method for determining creatinine in serum: method development and interlaboratory validation. Clin Chem 1990;36:1951. 34. Linnet K, Bruunshuus I. HPLC with enzymatic detection as a candidate reference method for serum creatinine. Clin Chem 1991;37:1669.

CAPÍTULO 9 ■ COMPUESTOS DE NITRÓGENO NO PROTEÍNICO

35. Welch MJ, Cohén A, Hertz HS, et al. Determination of serum creatinine by isotope dilution mass spectrometry as a candidate definitive method. Anal Chem 1986;58:1681. 36. Young DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 5th ed. Washington, D.C.: American Association for Clinical Chemistry Press, 2000. 37. Bacon BL, Pardue Hl. Kinetic study of the Jaffe reaction for quantifying creatinine in serum: evaluation of buffered reagent and comparison of different data processing options. Clin Chem 1989; 35:360. 38. Beyer, C. Creatine measurement in serum and uriñe with an automated enzymatic method. Clin Chem 1993;39:1613. 39. Murakita H. Simultaneous determination of creatine and creatinine in serum by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 1988;431:471. 40. Yang YD. Simultaneous determination of creatine, uric acid, cre­ atinine and hippuric acid in uriñe by high performance liquid chro­ matography. Biomed Chromatogr 1998;12:47. 41. Harrison’s Online. Available at: http://harrisons.accessmedicine. com. Accessed Winter 2003. 42. Caraway WT. Uric acid. In: Seligson, D, ed. Standard Methods of Clinical Chemistry. New York: Academic Press, 1965:239. 43. Feichtmeier TV, Wrenn HT. Direct determination of uric acid using uricase. Am J Clin Pathol 1955;25:833. 44. Duncan PH, Gochman N, Cooper T, et al. A candidate reference method for uric acid in serum: I. Optimization and evaluation. Clin Chem 1982;28:284. 45. Young DS. Effects of Preanalytical Variables on Clinical Laboratory Tests, 2nd ed. Washington, D.C.: American Association for Clinical Chemistry Press, 1997. 46. Gochman N, Schmitz JM. Automated determination of uric acid with use of a uricase-peroxidase system. Clin Chem 1971;17:1154. 47. Kageyama N. A direct colorimetric determination of uric acid in serum and uriñe with uricase-catalase system. Clin Chim Acta 1971;31:421.

235

48. Ingebretsen OC, Borgen J, Farstad M. Uric acid determinations: reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detection compared with kinetic and equilibrium adaptations of the uricase method. Clin Chem 1982;28:496. 49. Tanaka M, Hama M. Improved rapid assay of uric acid in serum by liquid chromatography. Clin Chem 1988;34:2567. 50. Ellerbe P, Cohén A, Welch MJ, et al. Determination of serum uric acid by isotope dilution mass spectrometry as a new candidate refe­ rence method. Anal Chem 1990;62:2173. 51. Monfort P, Kosenko E, Erceg S, et al. Molecular mechanism of acute ammonia toxicity: role of NMDA receptors. Neurochem Int 2002;41:95. 52. Ong JP, Aggarwal A, Krieger D, et al. Correlation between ammo­ nia levels and the severity of hepatic encephalopathy. Am J Med 2003;114:188. 53. Fitzgerald JF, Clark JH , Angelides AG, et al. The prognostic significance of peak ammonia levels in Reye’s syndrome. Pediatrics 1982;70:997. 54. Green A. W hen and how should we measure plasma ammonia? Ann Clin Biochem 1988;25:199. 55. Routh JI. Liver Function. In: Tietz NW, ed. Fundamentáis of Clinical Chemistry. Philadelphia: WB Saunders, 1976:1052. 56. Mondzac A, Ehrlich GE, Seegmiller JE . An enzymatic determi­ nation of ammonia in biological fluids. J Lab Clin Med 1965; 66:526. 57. Ammonia test methodology. Roche/Hitachi products. Indianapolis, IN: Roche Diagnostics Corporation, 2001. 58. Willems D, Steenssens W. Ammonia determined in plasma with a selective electrode. Clin Chem 1988;34:2372. 59. VITROS AMON Slides. Instructions for use. VITROS Chemistry Products. Rochester, NY: Ortho-Clinical Diagnostics, 2002;Pub No MP2-90.

Enzimas Robin Gaynor Krefetz y Gwen A. McMillin

C O N T E N I D O

DE L

PRO PIED AD ES G EN ERALES Y DEFINICIONES CLASIFICACIÓN DE ENZIM AS Y N O M EN CLATU RA CIN ÉTICA DE ENZIM AS Mecanismo catalítico de enzimas Factores que afectan las reacciones enzimáticas Medición de la actividad enzimática Cálculo de la actividad enzimática Medición de la masa de enzim a Enzimas como reactivos ENZIM AS DE IM PO RTAN CIA CLÍN ICA Cinasa de creatina Deshidrogenasa de lactato

C A P I T U L O Aminotransferasa de aspartato Aminotransferasa de alanina Fosfatasa alcalina Fosfatasa ácida Y-Glutamiltransferasa Amilasa Lipasa Deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato RESUM EN PREGUN TAS DE REPASO REFEREN CIAS

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Definir el térm ino enzim a, incluso su composición química y estructura. • Clasificar las enzim as de acuerdo con la Internatio­ nal Union o f Biochem istry (IUB). • Describir diferentes factores que afectan la veloci­ dad de una reacción enzimática. • Explicar la cinética de enzim as incluso la cinética de orden cero y primer orden. • Explicar por qué la medición de las concentracio­ nes de enzim a sérica es útil desde el punto de vis­ ta clínico.

T E R MI N Activadores Apoenzim a Cinética de orden cero Cinética de primer orden Coenzim a Cofactor

236

Complejo enzim a-sustrato (ES) Constante de MichaelisMenten Energía de activación Ensayo cinético

Describir qué enzim as son útiles en el diagnóstico de varios trastornos, incluso cardíacos, hepáticos, óseos, musculares, malignos y pancreatitis aguda. Explicar las fuentes de tejido, importancia diag­ nóstica y ensayos, además de fuentes de error, para las siguientes enzim as: CK, LD, AST, ALT, ALP, ACP, GGT, am ilasa, lipasa, colinesterasa y G-6-PD. Evaluar las concentraciones de enzim as séricas del paciente en relación con los estados morbosos.

OS

C L A V E

Enzima Hidrolasa Hoioenzima Isoenzima Isoformas Oxidorreductasa

Patrón de LD descontrolado Transferasa Unidad internacional (UI) Zimógeno

CAPÍTULO 10 ■ ENZIMAS

Las enzim as son proteínas biológicas específicas que cata­ lizan reacciones bioqu ím icas sin alterar el punto de equ i­ librio de la reacció n o sin ser consum idas o experim entar algún cam bio en su com posición . Las otras sustancias en la reacción son convertidas a productos. Las reacciones son con frecu encia específicas y esenciales para fu nciones fisiológicas, com o la hidratación de dióxido de carbono, con d u cció n nerviosa, degradación de nu trientes y uso de energía. Halladas en el tejido corporal, las enzim as con frecu encia aparecen en el suero después de lesión celu ­ lar o, algunas veces, en pequeñas cantidades, de células degradadas. Ciertas enzim as, com o las que facilitan la coa­ gulación, son específicas para el plasm a y, por tanto, están presentes en concentraciones significativas en el plasma. P or tanto, las con cen tracio n es de enzim as de plasm a o suero suelen ser útiles en el diagnóstico de enferm edades particulares o anorm alidades fisiológicas. E n este capítulo se analizan las propiedades y principios generales de las enzim as, aspectos que se relacionan con la im portancia diagnóstica clínica de enzim as fisiológicas específicas, y m étodos de ensayo para esas enzim as.

PROPIEDADES GEN ERALES Y DEFINICIONES Las enzim as catalizan m uchas reacciones fisiológicas espe­ cíficas. E stas reacciones se facilitan por la estructura de la enzim a y otros cuantos factores. Com o una proteína, cada enzim a com prende una secu en cia de am inoácido esp ecí­ fica ( estructura prim aria), co n la to rsión de las cadenas peptídicas resultantes (estructura secundaria ), que luego se pliega ( estructura terciaria ) y da com o resultado cavida­ des estructurales. Si una enzim a contiene m ás de una u n i­ dad polipeptídica, la estructura cuaternaria se refiere a las relaciones espaciales entre las subunidades. Cada enzim a contiene u n sitio activo, a m enudo una cavidad sin agua, donde la sustancia sobre la que actúa la enzim a (el sus­ trato) interactúa con residuos particulares de am inoácidos con carga. U n sitio alostérico — una cavidad distinta al sitio activo— puede enlazar m oléculas reguladoras y, por tanto, ser significativo para la estructura enzim ática básica. Aun cuando una determ inada enzim a m antiene la m is­ m a fu nción catalítica en el cuerpo, esa enzim a puede exis­ tir en diferentes form as dentro del m ism o individuo. Estas form as pueden ser diferenciadas entre sí co n base en cier­ tas propiedades físicas, com o m ovilidad electroforética, solubilidad o resistencia a desactivación. E l térm ino isoenzim a se usa por lo general cuando se analiza esa clase de enzim as; sin em bargo, la International Union o f Biochem istry (IU B) recom ienda restringir este térm ino a m últiples form as de origen genético. Una isoform a resulta cuando una enzim a está sujeta a m odificaciones p ostraslacionales. Las isoenzim as e isoform as contribuyen a la h eterogenei­ dad en las propiedades y fu n ción de las enzim as. Además de la estructura básica de la enzim a, una m o­ lécula no proteín ica, llam ada cofactor, puede ser necesaria para actividad enzim ática. G ofactores inorgánicos, com o los iones cloruro o m agnesio, se llam an activadores. Una coenzim a es u n factor orgánico, com o el dinu cleótid o de nicotinam ida y adenina (N A D ). Cuando se une fuerte­

237

m ente a la enzim a, la coenzim a se llam a grupo prostéti­ co. La p orción de enzim a (ap oen zim a), con su respectiva coenzim a, form a u n sistem a com pleto y activo, una holo-

enzima. Algunas enzim as, en su m ayor parte enzim as digesti­ vas, son secretadas al principio del órgano de produ cción en una form a estructuralm ente inactiva, llam ada proenzi­ m a o zim ógeno. O tras enzim as alteran después la estru ctu ­ ra de la proenzim a para hacer disponibles los sitios activos hidrolizando residuos específicos de am inoácido. Este m ecanism o evita que las enzim as digestivas digieran su lugar de síntesis.

CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS Y NOM ENCLATURA Para estandarizar la nom enclatura de enzim as, la Enzyme Com m ission (E C ) de la IUB adoptó un sistem a de clasifi­ cación en 1 9 6 1 ; los estándares fueron revisados en 1 9 7 2 y 1 9 7 8 . E l sistem a IUB asigna un nombre sistem ático a cada enzim a, que define al sustrato en el que actúa, la reacción catalizada y, posiblem ente, el nom bre de la coenzim a que participa en la reacción . D ebido a que m u chos nom bres sistem áticos son extensos, el sistem a IUB asigna tam bién un nom bre recom endado trivial, m ás p rá ctico .1 Además de nom brar las enzim as, el sistem a IUB id enti­ fica cada una m ediante un código n u m érico E C que co n ­ tiene cuatro dígitos separados por pu n tos decim ales. E l prim er dígito coloca a la enzim a en una de las seis clases siguientes: 1. O xidorreductasas: catalizan una reacció n de oxid aciónred ucción entre dos sustratos. 2. Transferasas: catalizan la transferencia de un grupo dis­ tinto al hidrógeno de un sustrato a otro. 3. Hidrolasas: catalizan la hidrólisis de varios enlaces. 4 . Liasas: catalizan la elim inación de grupos de sustratos sin hidrólisis. E l producto con tiene enlaces dobles. 5. Isom erasas: catalizan la interconversión de isóm eros geom étricos, óp ticos y posicionales.

6 . Ligasas: catalizan la u n ión de dos m oléculas de sustra­ to, ju n to con la rotura del enlace de pirofosfato en tri­ fosfato de adenosina (ATP) o un com puesto similar. Los dígitos segundo y tercero del núm ero de código EC representan la subclase y subclases de la enzim a, respecti­ vam ente, divisiones que se h acen de acuerdo co n criterios esp ecíficos a las enzim as en la clase. E l núm ero final es el núm ero serial específico para cada enzim a en una su bcla­ se. E n el cuadro 10-1 se dan los núm eros de código E C , así com o los nom bres sistem ático y recom endado, para enzi­ mas m edidas con frecu encia en el laboratorio clínico. En el cuadro 10-1 se listan tam bién las abreviaturas usual y estándar para enzim as analizadas com únm ente. Sin la recom end ación IUB, las letras m ayúsculas han sido utilizadas com o conveniencia para identificar las enzim as. Las abreviaturas com unes, construidas a veces de nom bres aceptados antes para las enzim as, se em plearon hasta que

238

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 10-1. C LA SIFIC A C IÓ N DE EN ZIM A S C U A N TIFIC A D A S CON FR ECU EN C IA ABREVIATU RA

ABREVIATU RA

N ÚM ERO DE

NOM BRE

CLASE

NOM BRE RECO M EN DAD O

COM ÚN

ESTÁN DAR

CÓ D IG O EC

SISTEM ÁTICO

Oxidorreductasas

Deshidrogenasa de lactato

LDH

LD

1.1.1.27

L-Lactato: NAD+ oxidorreductasa

Deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato

G-6-PDH

G-6-PD

1.1.1.49

D-Glucosa-6fosfato: NADP+ 1-oxidorreductasa

Aminotransferasa de aspartato

GOT (transaminasa AST de glutamato y oxaloacetato)

2.6.1.1

L-Aspartato: 2oxaloglutarato aminotransferasa

Aminotransferasa de alanina

GPT (transaminasa ALT de glutamato)

2.6.1.2

L-Alanina: 2oxaloglutarato aminotransferasa

Cinasa de creatina

CPK (fosfocinasa de creatina)

CK

2.73.2

ATP: cretina N-fosfotransferasa (5-Glutamilo)

y--Glutamiltransferasa

GGTP

GGT

23.2.2

Péptido: aminoácido-5glutamil-transferasa

Fosfatasa alcalina

ALP

ALP

3.1.3.1

de monoéster ortofosfórico (óptimo alcalino)

Fosfatasa ácida

ACP

ACP

3.1.3.2

Fosfohidrolasa de monoéster ortofosfórico (óptimo ácido)

a-Amilasa

AMY

AMS

3.2.1.1

1,4-D-Glucano glucanohidrolasa

LPS

3.1.1.3

Triacilglicerol acilhidrolasa

CHS

3.1.1.8

Acilcolina acilhidrolasa

Transferasas

Hidrolasas

Lipasa de triacilglicerol Colinesterasa

CHS

Adaptado de Competence Assurance, ASMT. Enzymology, An Educational Program. Bethesda, MD: RMI Corporation, 1980.

se elaboraron las abreviaturas estándar listadas en el cu a­ d ro .2,3 Estas abreviaturas estándar se em plean en Estados U nidos y se u san después en este capítulo para indicar enzim as específicas.

CINÉTICA DE ENZIMAS M ecanism o catalítico de enzim as U na reacció n quím ica puede ocu rrir de form a espontánea si la energía libre o la cin ética disponible es m ayor para los reactantes que para los productos. La reacció n procede en ton ces hacia la energía más b aja si u n núm ero suficiente de m oléculas reactantes posee suficiente energía en exceso para rom per sus enlaces quím icos y colisionar para form ar nuevos enlaces. La energía en exceso, llam ada energía de activación, es la que se requiere para elevar todas las m olé­ culas en 1 m ol de un com puesto a cierta tem peratura al

estado de tran sició n en el pico de la barrera de energía. E n el estado de tran sición, cada m olécula tiene las m ism as probabilidades de participar en la form ación de producto o perm anecer sin reaccionar. Los reactantes que poseen energía suficiente para vencer la barrera de energía p artici­ pan en la form ación de productos. Una m anera de proveer más energía para una reacción es increm en tar la tem peratura y, por tanto, colision es in ter­ m oleculares; sin em bargo, esto no ocurre norm alm ente a nivel fisiológico. Las enzim as catalizan reacciones fisioló­ gicas dism inuyendo el nivel de energía de activación que los reactantes ( sustratos ) deben alcanzar para que ocurra la reacció n (fig. 1 0 -1 ). La reacción puede ocu rrir en ton ­ ces m ás fácil en u n estado de equilibrio en el que no hay reacció n directa o inversa, aun cuando no se altere la co n s­ tante de equilibrio de la reacción. E l grado al que avanza la reacció n depende del núm ero de m oléculas de sustrato que pasan la barrera de energía.

CAPÍTULO 10 ■ ENZIMAS

239

una m olécula de sustrato puede facilitar el enlace de más m oléculas de sustrato.

Barrera de energía

Factores que afectan las reacciones enzimáticas C o n cen tra ción d e sustrato

FIGURA 10-1. Energía contra avance de la reacción, que indica la barrera de energía que el sustrato debe superar para reaccionar con y sin catálisis enzimática. La enzima reduce de forma considerable la energía libre necesaria para activar la reacción.

La relación general entre enzim a, sustrato y producto se puede representar com o sigue: E + S ^ E S ^ E

+ P

(Ec . 10-1)

donde E S ES P

= = = =

enzim a sustrato com p lejo enzim a-sustrato producto

E l com plejo ES es un enlace físico de un sustrato al sitio activo de una enzim a. La d isposición estructural de resi­ duos de am inoácido dentro de la enzim a hace que el sitio activo trid im ensional esté disponible. A veces, la un ión de ligando prom ueve una nueva d istribución para activar el sitio. E l estado de tran sición para el com p lejo ES tiene m enor energía de activación que el estado de tran sición de S solo, de m odo que la reacció n procede después que se form a el com plejo. E n una reacción real puede haber varios sustratos y productos. Las diferentes enzim as son esp ecíñcas para sustratos en d istintos alcances o aspectos. Ciertas enzim as exhiben especificidad absoluta, lo que signiñca que la enzim a se com bina con sólo un sustrato y cataliza sólo la reacción correspondiente. O tras enzim as son específicas de grupo porque se com binan con los sustratos que con tien en un grupo particular, com o un éster de fosfato. Aún otras enzi­ mas son específicas a enlaces quím icos y, por consig u ien­ te, exh iben especificidad de enlace. La especificidad estereoisom étrica se refiere a enzim as que de m anera predom inante se com bin an con sólo un isóm ero óp tico de cierto com puesto. Adem ás, un a enzim a puede unirse a m ás de una m olécula de sustrato y esto puede ocu rrir por cooperación. Por tanto, la u n ió n de

La velocidad a la que procede una reacción enzim ática, y si ocurre la reacción directa o inversa dependen de varias cond icion es de reacción. U na influencia principal en las reacciones enzim áticas es la con cen tració n de sustrato. E n 1 9 1 3 , M ichaelis y M enten plantearon la hipótesis del papel que desem peña la con cen tració n de sustrato en la form a­ ción del com plejo enzim a-sustrato (ES). De acuerdo con su hipótesis, representada en la figura 10- 2 , el sustrato se une fácil con la enzim a libre a una con cen tració n de sustrato baja. C on la cantidad de enzim a m ayor que la cantidad de sustrato, la velocidad de reacción se increm enta de form a estable a medida que se agrega más sustrato. La reacción sigue una cinética de prim er orden porque la velocidad de reacción es directam ente proporcional a la concentración de sustrato. Sin embargo, en algún m om ento, la con cen tra­ ción de sustrato es bastante alta para saturar toda la enzim a disponible, y la velocidad de reacción alcanza su m áxim o. Cuando se form a el producto, la enzim a libre resultante se com bina de inm ediato con el exceso de sustrato libre. La reacción está en cinética de orden cero, y la velocidad de reacción depende sólo de la con cen tració n de enzim a. La constan te de M ichaelis-M enten (K ' nr),’ derivada de la teoría de M ichaelis y M enten, es una constan te para una enzim a y sustrato específicos b a jo cond icion es de reacción definidas, y es una expresión de la relación entre la velo­ cidad de una reacció n enzim ática y la co n cen tració n de sustrato. Se supone que el equilibro entre E, S, E S y P se establece con rapidez, y que la reacció n E + P - » Es es insig­ nificante. E l paso que lim ita la velocidad es la form ación de producto y enzim a a partir del com p lejo ES. E n ton ces, se fija la velocidad m áxim a, y la velocidad de reacción es

FIGURA 10-2. Curva de Michaelis-Menten de velocidad en fundón de la concentración de sustrato para reacción enzimática. Kmes la concentración de sustrato a la que la velocidad de la reacción es la mitad del nivel máximo.

240

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

una fu n ció n de sólo la con cen tració n de enzim a. C om o se designa en la figura 1 0 -2 , Km es esp ecíficam ente la co n c en ­ tración de sustrato a la que la enzim a produce la m itad de la velocidad m áxim a posible. Por tanto, Km indica la ca n ­ tidad de sustrato necesaria para una reacción enzim ática particular. La hipótesis de M ichaelis-M enten de la relación entre la velocidad de reacción y la con cen tració n de sustrato se puede representar m atem áticam ente com o sigue: VmaxL . [S]1

■y

(Ec. 10-2)

K m+IS] donde V = velocidad de reacción medida Vm ax = velocidad m áxim a [S] = con cen tració n de sustrato

K m = constan te de M ichaelis-M enten de enzim a para sustrato específico E n teoría, Vmíx y después Km se podrían determ inar de la gráfica de la figura 10 -2 . Sin em bargo, es d ifícil deter­ m inar Vmáx de la gráfica hiperbólica, y a m enudo no se logra de m anera exacta en reacciones enzim áticas porque es posible que las enzim as no fu n cio n en de form a óptim a en presencia de sustrato excesivo. U na d eterm inación más exacta y conveniente de Vmax . Jy K m se *puede hacer co n una J gráfica de Linew eaver-Burk, una gráfica recíproca doble de la constan te de M ichaelis-M enten, que produce una re c­ ta (fig. 1 0 -3 ). Se tom a el recíproco de la con cen tració n de sustrato y la velocidad de un a reacció n enzim ática. La ecu ación se convierte en

1 V

Km

1

Vmáx[S]

1 (Ec. 10-3)

FIGURA 10-3. Transformación de Lineweaver-Burk de la curva de Michaelis-Menten. Vmáx es el recíproco del intercepto x de la recta. Km es el recíproco negativo del intercepto x de la misma recta.

C o n cen tra ción d e en zim a D ebido a que las enzim as catalizan reacciones fisiológicas, la co n cen tració n de enzim a afecta la velocidad de la reac­ ció n catalizada. Tan p ronto com o la con cen tració n de sus­ trato excede la con cen tració n de enzim a, la velocidad de la reacció n es proporcional a la con cen tració n de la enzim a. M ientras m ás alta sea la con cen tració n de enzim a, la reac­ ció n procederá con m ás rapidez porque m ás enzim a está presente para unirse al sustrato.

pH Las enzim as son proteínas que llevan cargas m oleculares netas. Los cam bios de pH pueden desnaturalizar una enzi­ m a o afectar su estado ión ico, lo que da com o resultado cam bios estructurales o u n cam bio en la carga de u n resi­ duo am inoácido en el sitio activo. Por consiguiente, cada enzim a opera dentro de un intervalo de pH específico. La m ayor parte de las reacciones enzim áticas fisiológicas ocu rren en el intervalo de pH de 7 .0 a 8 .0 , pero algunas enzim as son activas en intervalos de pH m ás am plios que otras. E n el laboratorio, el pH de un a reacció n se controla de m anera cuidadosa en el pH óptim o por m edio de d iso­ lu cion es am ortiguadoras apropiadas.

T em pera tura Al subir la tem peratura norm alm ente se increm en ta la velocidad de una reacción quím ica porque aum enta el m ovim iento de las m oléculas, la tasa a la que ocurren las colisiones interm oleculares, y la energía disponible para la reacción. É ste es el caso con las reaccion es enzim áticas hasta que la tem peratura es lo suficien tem ente alta para desnaturalizar la com p osición de proteín a de la enzim a. Por cada increm en to de tem peratura de 10 grados, la velo­ cidad de la reacción aum enta casi el doble hasta que, por supuesto, se desnaturaliza la proteína. Cada enzim a funciona de m anera óptim a a un a deter­ m inada tem peratura, que se ve afectada por otras variables de reacción, en particular el tiem po total para la reacción. La tem peratura óptim a por lo regular es cercana a la del m edio fisiológico de la enzim a; sin em bargo, puede ocu ­ rrir cierta d esnaturalización a la tem peratura fisiológica hum ana de 3 7 °C . La tasa de desnaturalización se in cre­ m enta conform e sube la tem peratura, y norm alm ente es significativa de 4 0 a 50°C . D ebido a que las tem peraturas b ajas vuelven reversi­ blem ente inactivas a las enzim as, m uchas m uestras de suero o plasm a para m ed ición de enzim a se refrigeran o congelan para evitar pérdida de actividad hasta el análi­ sis. Los proced im ientos de alm acenaje pueden variar de una enzim a a otra com o resultado de las características de estabilidad individuales. No obstante, la cong elación y descongelación repetidas tienden a desnaturalizar la pro­ teína, y esto se debe evitar. Debido a su sensibilidad a la tem peratura, las enzim as se deben analizar bajo condiciones de temperatura controladas en form a estricta. Las temperaturas de incubación deben ser exactas dentro de ± 0 . 1°C. Por lo general, los laboratorios intentan establecer una temperatura de análisis para m edi­ ción rutinaria de enzim as de 2 5 , 3 0 o 37°C . Han sido en

CAPITULO 10 ■ ENZIMAS

vano los intentos por establecer una tem peratura universal para el análisis de enzimas y, por tanto, los intervalos de referencia para concentraciones de enzim as pueden variar de form a im portante entre laboratorios. Sin embargo, en Estados U nidos, es com ún usar la temperatura de 37°C .

C ofactores Los cofactores son entidades no p roteínicas que se deben enlazar co n enzim as particulares antes de que ocu rra una reacción. L os activadores com unes (cofactores inorgáni­ cos) son m etálicos (C a2+, F e 2+, M g2+, M n2+, Zn2+ y K +) y no m etálicos (B r “ y C l"). E l activador puede ser esencial para la reacció n o sólo increm en tar la velocidad de la reacción en proporción con la con cen tració n hasta el punto en el que el activador en exceso com ienza a in h ib ir la reacción. Los activadores tienen com o fu n ción alternar la configu­ ración espacial de la enzim a para la u n ión con el sustrato apropiado, enlazar el sustrato a la enzim a o coenzim a, o experim entar oxid ación o reducción. Algunas coenzim as com unes (cofactores orgánicos) son fosfatos de nu cleótid o y vitam inas. Las coenzim as sirven com o segundos sustratos para reaccion es enzim á­ ticas. Cuando se enlazan fuertem ente co n la enzim a, las coenzim as se llam an grupos prostéticos. P or ejem plo, el NAD com o cofactor se puede reducir a fosfato de dinucleótido de nicotinam ida y adenina (N A D P) en una reac­ ción en la que se oxida el sustrato prim ario. Increm entar la con cen tració n de enzim a increm entará la velocidad de una reacció n enzim ática de una m anera com parable con la con cen tració n de sustrato creciente. Al cuantificar una enzim a que requiere un cofactor particular, el cofactor se debe proveer siem pre en exceso para que el alcance de la reacción no dependa de la con cen tració n del cofactor.

241

Inhibidores Las reacciones enzim áticas no avanzan de m anera norm al si una determ inada sustancia, u n inhibidor, interfiere con la reacción. Los inhibidores competitivos se u n en físicam en­ te con el sitio activo de una enzim a y com piten con el sustrato por el sitio activo. C on una co n cen tració n de sus­ trato m u cho m ayor que la co n cen tració n del inhibidor, la in h ib ició n es reversible porque el sustrato tiene m ás pro­ babilidades que el inhibid or de un irse con el sitio activo y no se ha destruido la enzim a. U n inhibidor no competitivo se un e co n una enzim a en u n lugar d istinto al sitio activo, y puede ser reversible en el sentido de que algunas sustancias m etabólicas presen­ tes de m odo natural se com binan en form a reversible con ciertas enzim as. La in h ib ición no com petitiva tam bién puede ser reversible si el inhibid or destruye parte de la enzim a que participa en la actividad catalítica. D ebido a que el inh ibid or se une con la enzim a independientem ente del sustrato, increm entar la con cen tració n de sustrato no invierte la in h ib ición . La inhibición no com petitiva es otra clase de in h ib ició n en la que el inhibid or se un e con el com p lejo ES; incre­ m entar la co n cen tració n de sustrato produce m ás com ple­ jo s ES con los que se une el inhibid or y, por consiguiente, se increm enta la inh ibición . E l com p lejo enzim a-sustratoinhibid or no da producto. Cada una de las tres clases de in h ib ició n es ú n ica con respecto a los efectos en las reacciones enzim áticas Vmáx y Km de las reacciones enzim áticas (fig. 1 0 -4 ). E n la in h ib i­ ción com petitiva, el efecto del in hibid or se contrarresta si se añade exceso de sustrato para unirse co n la enzim a. La cantidad de inhibid or es insignificante entonces por com ­ paración, y la reacció n procederá m enos rápido pero con

[S ] FIGURA 10-4. Gráfica normal de Lineweaver-Burk (recta continua) comparada con cada tipo de inhibición enzímética (línea discontinua). (A) Inhibición competitiva Vmjx sin cambio; Kmaparece incrementada. (B) Inhibición no competitiva Vméx reducida; Kmsin cambio. (C) Inhibición no competitiva Vméx reducida; Kmaparece reducida.

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PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

la m ism a velocidad que una reacción inhibida. La K m es una constan te para cada enzim a y no puede ser alterada. Sin em bargo, debido que la cantidad de sustrato necesaria para lograr una velocidad particular es m ayor en presencia de un inhibid or com petitivo, la K m al parecer aum enta al m ostrar el efecto del inhibidor. E l sustrato y el inhibidor, por lo general un ion m etá­ lico, pueden unirse co n una enzim a al m ism o tiem po en in h ib ició n no com petitiva. E l inhibid or puede inactivar ya sea un com p lejo ES o sólo la enzim a causando cam ­ b ios estructurales en ésta. In clu so si el inhibid or se une de form a reversible y no desactiva la enzim a, la presencia del inhibid or cuando se une con la enzim a dism inuye la velocidad de la reacción. P or tanto, por in h ib ició n com pe­ titiva, no se puede lograr la velocidad de reacción m áxim a. Increm entar las concentracio n es de sustrato no tiene efec­ to en el enlace de un inhibid or no com petitivo, de m odo que la Km no cam bia. D ebido a que la in h ib ició n no com petitiva requiere la form ación de u n com plejo ES, aum entar la con cen tració n de sustrato increm en ta la in h ib ición . Por tanto, no se pue­ de lograr una velocidad m áxim a igual a la de una reacción no inhibida, y la K m aparece reducida.

M edición de la actividad enzim ática D ebido a que las enzim as norm alm en te están presentes en cantidades m uy pequeñas en los líquidos biológicos y co n frecu encia es difícil aislarlas de com puestos sim ilares, u n m étodo conv eniente para la cu an tiñ cación de enzim as es la m ed ición de la actividad catalítica. E n ton ces la acti­ vidad se relaciona con la con cen tració n . E n los m étodos com unes se podría m edir con un potencióm etro u n in cre­ m ento en la con cen tració n de producto, una dism inu ción en la co n cen tració n de sustrato, una red u cción en la co n ­ cen tración de coenzim a o un aum ento en la con cen tració n de una coenzim a alterada. Si la cantidad de sustrato y cualquier coenzim a está en exceso en una reacció n enzim ática, la cantidad de sustrato o coenzim a em pleada, o producto o coenzim a alterada for­ m ada, dependerá sólo de de la cantidad de enzim a presen ­ te para catalizar la reacción. Por tanto, las concentracio nes de enzim a son ejecutadas siem pre en cin ética de orden cero, co n el sustrato en exceso suficiente para asegurar que no más de 20% del sustrato disponible se convierte en producto. C ualquier coenzim a tam bién debe estar en exceso. E l NADH es una coenzim a que frecu entem ente se m ide en el laboratorio. El NADH absorbe luz a 3 4 0 nm , m ientras que el NAD no lo hace, y se m ide con facilidad un cam bio de absorbancia a 3 4 0 nm . E n m etodologías de laboratorio específicas, son n ece­ sarias otras sustancias distintas al sustrato o la coenzim a y deben estar presentes en exceso. El NAD o NADH suele ser conv eniente com o reactivo para u n ensayo de enzim aacop lad a cuando NAD ni NADH son coenzim as para la reacción. E n otros ensayos de enzim a acoplada, se añade m ás de una enzim a en exceso com o u n reactivo y se cata­ lizan m últiples reacciones. D espués que la enzim a b ajo análisis cataliza su reacción específica, un producto de esa

reacción se convierte en sustrato en el que actúa una enzim a auxiliar interm ediaria. U n producto de la reacción interm e­ diaria se convierte en el sustrato para la reacción final, que emplea com o catalizador una enzim a indicadora y, por lo general, tiene que ver con la conversión de NAD a NADH o viceversa. Al efectuar una cu an tiñ cación enzim ática en cinética de orden cero, no debe haber inhibid ores, y es necesario controlar de m anera cuidadosa otras variables que pudie­ ran afectar la velocidad de la reacción . Se debe m antener un pH constan te por m edio de una d isolu ción am ortigua­ dora apropiada. La tem peratura debe ser constan te dentro de ± 0 . 1°C en todo el ensayo a una tem peratura a la cual la enzim a es activa (norm alm ente, 2 5 , 3 0 o 3 7 °C ). D urante el avance de la reacción, el período para el aná­ lisis tam bién debe ser seleccionado con cuidado. Cuando la enzim a se introduce al inicio a los reactivos y el sustrato en exceso se com bina de forma estable con la enzim a dispo­ nible, aum enta la velocidad de la reacción. Después que se satura la enzim a, las tasas de form ación de producto, libe­ ración de enzim a y recom binación con más sustrato proce­ den de form a lineal. Después de ese tiem po, de ordinario 6 a 8 m in después del inicio de la reacción, la velocidad dism inuye a medida que se agota el sustrato, la reacción inversa es m ás notable y el producto com ienza a inhibir la reacción. Por tanto, las cuantificaciones de enzim a se deben llevar a cabo durante la fase lineal de la reacción. Es posible usar uno de dos m étodos para m edir el alcan­ ce de una reacción enzim ática: a ) de tiem po fijo y b) ensayo de m onitoreo continuo o cinético. E n el método de tiempo fijo , los reactantes se com binan, la reacción procede por un tiem po designado, se detiene la reacción (por lo regular al desactivar la enzim a con un ácido débil) y se hace una m edi­ ción de la cantidad de reacción que ha ocurrido. Se supone que la reacción es lineal con el tiem po de reacción; m ientras más grande sea la reacción, más enzim a está presente. E n los ensayos de monitoreo continuo o cinéticos, se hacen m ediciones múltiples, norm alm ente de cam bio de absorban­ cia, ya sea a intervalos de tiempo específicos (cada 3 0 o 60 s) o en forma continua mediante un espectrofotóm etro de registro continuo. Estos ensayos ofrecen ventajas sobre los m étodos de tiem po fijo porque la linealidad de la reacción se puede com probar de forma más adecuada. Si la absorban­ cia se mide a intervalos, son necesarios varios puntos para increm entar la exactitud de la evaluación de linealidad. Se prefieren las m ediciones continuas porque cualquier desvia­ ción respecto de la linealidad se observa sin dificultad. La causa m ás com ún de desviación respecto de la linea­ lidad ocurre cuando la con cen tració n de la enzim a es tan alta que se usa todo el sustrato al in icio del tiem po de reacción. Para el resto de la reacción, el cam bio de velo ci­ dad es m ínim o, lo que indica que la co n cen tració n de la enzim a es m uy baja. Con el monitoreo continuo, el laborato­ rista puede observar u n cam bio rep entino en la velocidad de la reacción (desviación de la cinética de orden cero) de una d eterm inación particular y puede repetirla con m enos m u estra del p a cien te. La d ism in u ció n en la can tid ad de m uestra del pacien te opera com o un a dilución, y la respuesta obtenida se puede m u ltip licar por el factor de

CAPÍTULO 10 ■ ENZIMAS

dilución para obtener la respuesta final. La m uestra en sí no se diluye para que el diluyente no interfiera con la reacción. (La d ilu ción de la m uestra con disolu ción salina puede ser necesaria para m inim izar los efectos negativos en el análisis a causa de hem olisis o lipem ia.) Las m edi­ ciones de actividad enzim ática pueden ser inexactas si las cond iciones de alm acenaje com prom eten la integridad de la proteína, si hay inhibidores enzim áticos o si no están presentes cofactores necesarios.

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control de calidad y prueba de com petencia para todos los laboratorios. Los problem as con m ateriales de con trol de calidad para prueba de enzim as han sido un tem a im por­ tante. Las diferencias entre m uestras clín icas y sueros de control in clu yen especies de origen de la enzim a, integri­ dad de las especies m oleculares, form as de isoenzim as, m atriz de la d isolu ción , ad ición de conservadores y proce­ so de liofilización. Se han realizado m u ch os estudios para asegurar m ed iciones exactas de enzim as y b u enos m ate­ riales de con trol de calidad .4

Cálculo de la actividad enzim ática Cuando se realiza la cu antificación de las enzim as con respecto a su actividad y no con una m ed ición directa de con cen tració n , las unidades em pleadas para expresar las con cen tracio n es de enzim a son unidades de actividad. La definición para la unidad de actividad debe consid e­ rar variables que pudieran alterar los resultados (p. ej., pH, tem peratura, sustrato). A través de la historia, quie­ nes elaboraban m étodos específicos solían establecer sus propias unidades para expresar resultados, y era com ún que designaran a las unidades con su nom bre (es decir, unidades Bodansky y K ing). Para estandarizar el sistem a para expresar resultados cu antitativos, la E C definió la unidad internacional (UI) com o la cantidad de enzim a que catalizará la reacció n de un pinol de sustrato por m inuto en cond iciones específicas de tem peratura, pH, sustratos y activadores. Debido a que las con d iciones especificadas pueden variar entre laboratorios, los valores de referencia son aún específicos del laboratorio. La co n cen tració n de enzim a se expresa por lo regular en unidades por litro (UI/ L ). La unidad de actividad enzim ática reconocid a por el Sistem a Internacional de U nidades ( Systém e Internationale d ’Unités [SI]) es el katal (mol/s). E l m ol es la unidad para la con cen tració n de sustrato, y la unidad de tiem po es el segundo. La con cen tració n de enzim a se expresa entonces com o katals por litro (kat/L). 1.0 U I = 17 nkat. Cuando las enzim as se cu antifican m idiendo el aum en­ to o d ism inu ción de NADH a 3 4 0 nm , la absortividad m olar (6 .2 2 X 10 3 mol/L) de NADH se em plea para calcu­ lar la actividad enzim ática.

Enzim as como reactivos Las enzim as se pueden usar com o reactivos para m edir m uchos constitu yentes no enzim áticos en el suero. Por ejem plo, la glucosa, el colesterol y el ácido ú rico se cu anti­ fican con frecuencia por m edio de reacciones enzim áticas, que m id en la con cen tració n del analito debido a la espe­ cificidad de la enzim a. Las enzim as se em plean tam bién com o reactivos para m étodos de cu antificación de analitos que son sustratos para las cuantificaciones enzim áticas correspondientes. U n ejem plo, la deshidrogenasa de lactato, puede ser un reactivo cuando se evalúan las con cen tra­ ciones de lactato o piruvato. Para esta clase de m étod os, la enzim a se añade en exceso en una cantidad suficiente para proveer una reacción com pleta en un período corto. Las enzim as inm ovilizadas se enlazan quím icam ente a adsorbentes, com o la agarosa o ciertos tipos de celu lo­ sa, m ediante grupos azida, diazo y triacina. Las enzim as actúan com o reactivos recuperables. Cuando se pasa el sus­ trato por la preparación, se recupera el producto y se ana­ liza, y la enzim a está presente y libre para reaccionar con más sustrato. Las enzim as inm ovilizadas son convenientes para análisis por lotes y m ás estables que las enzim as en una d isolu ción. Las enzim as se em plean tam bién com o reactivos en im nunoensayos com petitivos y no com p etiti­ vos, com o los que se usan para m edir an ticuerpos de HIV, fárm acos terapéuticos y antígenos de cáncer. Las enzim as de uso com ú n son peroxidasa de rábano, fosfatasa alcali­ na, deshidrogenasa de glucosa- 6-fosfato y p-galactosidasa. La enzim a en estos ensayos funciona com o u n indicador que refleja la presencia o ausencia del analito.

M edición de la m asa de enzim a Tam bién están disponibles las m etodologías de inm u n oen­ sayo que cu antifican la con cen tració n de enzim a p or masa, y se em plean de m anera rutinaria para la cu antificación de algunas enzim as, com o CK-M B. Los inm unoensayos pue­ den sobrestim ar la enzim a activa com o un resultado de posible reactividad cruzada con enzim as inactivas, com o zim ógenos, isoenzim as inactivas, m acroenzim as o enzim a digerida en parte. La relación entre actividad enzim áti­ ca y cantidad de enzim a es por lo general lineal pero se debe determ inar para cada enzim a. Las enzim as se pueden determ inar y cuantificar tam bién por técnicas electroforéticas, que proveen resolución de isoenzim as e isoform as. Asegurar la exactitud de las m ed iciones de enzim as ha sido por m u cho tiem po una preocu pación de los laboratoristas. La ley de 1 9 8 8 de E nm iendas de M ejoram ien to del Laboratorio C línico (CLIA 88) ha establecido norm as para

ENZIMAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA E n el cuadro 10 -2 se listan las enzim as analizadas com ú n ­ m ente, in clu so sus nom bres sistem áticos e im portancia clínica. Cada enzim a se analiza en este capítulo con respecto a fuente tisular, im portancia diagnóstica, m étodo de ensayo, fuente de error e intervalo de referencia.

Cinasa de creatina La cinasa de creatina (C K ) es una enzim a con u n peso m olecular de casi 8 2 000, que por lo general está relaciona­ da con la regeneración de ATP en sistemas contráctiles o de transporte. Su función fisiológica predominante ocurre en las células de músculo, donde participa en el alm acenaje de fos­ fato de creatina de alta energía. Todo ciclo de contracción del

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PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 10-2. ENZIMAS PRINCIPALES DE IMPORTANCIA CLÍNCA ENZIMA

IM PORTANCIA CLÍNICA

Fosfatasa ácida (ACP)

Carcinoma prostático

Aminotransferasa de alanina (ALT)

Trastorno hepático

Fosfatasa alcalina (ALP)

Trastorno hepático Trastorno óseo

Amilasa (AMS)

Pancreatitis aguda

Aminotransferasa de aspartato (AST)

Infarto de miocardio Trastorno hepático Trastorno del músculo esquelético

Cinasa de creatina (CK)

Infarto de miocardio Trastorno del músculo esquelético

y-Glutamiltransferasa (GGT)

Trastorno hepático

Infarto de miocardio Trastorno hepático Carcinoma

Lipasa (LPS)

Pancreatitis aguda

Seudocolinesterasa

Envenenam iento por organofosfato Variantes genéticas

(PChE)

m úsculo origina el uso de fosfato de creatina, con producción de ATE Esto da com o resultado concentraciones relativa­ m ente constantes de ATP de músculo. La reacción reversible catalizada por CK se muestra en la ecuación 10-4. CK

C reatina + ATP

fosfato de creatina + ADP (Ec. 10-4)

ES T U D IO U n hom bre cau cásico de 51 años de edad con sobrepe­ so visita a su m édico fam iliar con d olencias de “in d i­ gestió n” de cin co días de duración. Tam bién ha tenido ataques de sudoración, m alestar general y cefalea. Su tensión arterial es de 140/105; sus antecedentes fam i­ liares inclu yen un padre con diabetes que m urió a la edad de 6 2 años de IMA secundario a diabetes m ellitus. U n electrocardiogram a reveló cam bios de uno efectua­ do seis m eses antes. Los resultados del análisis de la sangre del pacien te son los siguientes: CK CK -M B LD LD A ST

129 U/L 4% 2 8 0 U/L Isoenzim as 35 U/L

La CK está distribuida de form a am plia en el tejid o, con las actividades m ás altas halladas en el m úsculo esquelético, m ú sculo cardíaco y tejid o cerebral. La CK está presente en cantidades m u cho m ás pequeñas en otras fuentes de te ji­ do, com o vejiga, placenta, tubo digestivo, tiroides, útero, riñón , pulm ones, próstata, bazo, hígado y páncreas.

Im portancia diagnóstica

Deshidrogenasa de Anem ia hemolítica inducida glucosa-6-fosfato (G-6-PD) por fármacos Deshidrogenasa de lactato (LD)

F u e n te d e tejido

(3 0 A 6 0 ) ( < 6% ) (1 0 0 a 2 2 5 ) L D -l> L D -2 (5 a 3 0 )

Com o resultado de las altas concentraciones de CK en el tejido muscular, las concentraciones de CK suelen elevarse en trastornos de m úsculo cardíaco y esquelético. Se consi­ dera que la concentración de CK es un indicador sensible de infarto de m iocardio agudo (IMA) y distrofia muscular, en particular tipo D uchenne. C oncentraciones notablem ente altas de CK ocurren en la distrofia m uscular tipo D uchenne, con valores que alcanzan 5 0 a 100 veces el lím ite superior norm al (LSN ). Aunque las concentraciones totales de CK son indicadores sensibles de estos trastornos, no lo son del todo específicos, ya que el aum ento en la concentración de CK se halla en otras anormalidades del m úsculo cardíaco y esquelético. Las concentraciones de CK varían tam bién con la masa de m úsculo y, por tanto, pueden depender del géne­ ro, raza, grado de acondicionam iento físico y edad. Las concen tracion es de CK altas se observan de form a ocasional en trastornos del sistem a nervioso central com o accidente cerebrovascular, convulsiones, degeneración nerviosa y choque del sistem a nervioso central. E l daño de la barrera hem atoencefálica perm ite la lib eración de enzim a a la circulación periférica. O tras con d iciones fisiopatológicas en las que ocurren con cen tracio n es altas de CK son hipotiroid ism o, hiperpirexia m aligna y síndrom e de Reye. E n el cuadro 1 0 -3 se listan los principales trastornos relacionados con co n cen ­ traciones anorm ales de CK. Las con cen tracio n es de CK sérica y la relación CK/progesterona han sido útiles en el diagnóstico de em barazos ectó p ico s .5 Las con cen tracio n es de CK sérica total se han em pleado tam bién com o una herram ienta de diagnóstico in icial para identificar pacien ­ tes con in feccio n es de Vibrio vulnijicus.6

C A S O 10-1 Preguntas 1. ¿Puede desecharse un diagnóstico de IMA en este paciente? 2. ¿C uáles m arcadores cardíacos ad icionales pueden aplicarse en este paciente? 3. ¿D ebe adm itirse a este paciente en el hospital?

CAPITULO 10 ■ ENZIMAS

CUADRO 10-3. ISOENZIMAS DE CINASA DE CREATINA (LOCALIZACIÓN DEL TEJIDO Y FUENTES DE AUMENTO DE CONCENTRACIÓN) ISOENZIMA

TEJIDO

CONDICIÓN

CK-MM

Corazón Músculo esquelético

Infarto de miocardio Trastorno del músculo esquelético Distrofia muscular Polimiositis Hipotiroidismo Hipertermia maligna Actividad física Inyección intramuscular

CK-MB

Corazón Músculo esquelético

Infarto de miocardio Lesión miocárdica Isquemia Angina Enfermedad cardíaca inflamatoria Cirugía cardíaca Distrofia muscular tipo Duchenne Polimiositis Hipertermia maligna Fiebre manchada de las Montañas Rocosas Fiebre exantemática Envenenam iento por monóxido de carbono

CK-BB

Cerebro

Choque del sistema nervioso central Encefalopatía anóxica Accidente cerebrovascular Convulsión Traumatismo placentario o uterino Carcinoma Síndrome de Reye Envenenam iento por monóxido de carbono Hipertermia maligna Insuficiencia renal aguda y crónica

Vejiga Pulmón Próstata Utero Colon Estómago Tiroides

D ebido a que el aum ento de la con cen tració n de enzi­ m a se halla en num erosos trastornos, la separación de CK total en sus distintas fraccion es de enzim a se considera un indicad or más específico de diversos trastornos que las con cen tracio n es totales. P or lo general, la im portancia clín ica de la actividad de CK depende m ás del fraccion a­ m ien to de isoenzim a que de con cen tracio n es totales. La CK aparece com o un dímero que consta de dos subun id ad es que se sep aran c o n facilid ad en tres form as m oleculares distintas. Las tres isoenzim as han sido designa­ das com o CK -BB (tipo cerebral), CK -M B (tipo h íb rid o) y CK-M M (tipo m u scular). E n la sep aración electroforética, la CK -BB m igrará más rápido hacia el ánodo y, por tanto, se llam a C K -1. La CK-BB va seguida de CK -M B (C K -2) y, por últim o, CK -M M (C K -3 ), que exhibe la m ovilidad más

Cátodo

oíd

o o o Ar

MI | MM Macro MB Origen

245

BB

CK

FIGURA 10-5. Patrón de migración electroforético de isoenzimas de CK normales y atípicas.

b aja (fig. 1 0 -5 ). E n el cuadro 10-3 se indica la localiza­ ción tisular de las isoenzim as y las con d icio n es principales relacionadas con concentraciones altas. La separación de isoform as de C K se puede ver tam bién m ediante separa­ ción electroforética de alto voltaje. Las isoform as aparecen después de la rotura del am inoácido c-term inal de la subunidad M por carboxipeptidasa N sérica. Se han descrito tres isoform as para CK-M M y dos isoform as para CK -M B; la im portancia clín ica no está b ien establecida. La isoenzim a principal en el suero de personas saludables es la forma MM. Los valores para la isoenzim a BB varían de indetectables a trazas ( < 6% de CK total). Al parecer la CKBB está presente tam bién en pequeñas cantidades en el suero de personas saludables; sin embargo, la presencia de CK-BB en el suero depende del método de detección. La m ayor par­ te de las técnicas no detectan CK-BB en suero normal. La CK-M M es la fracción de isoenzim a principal hallada en m úsculo estriado y suero norm al. E l m ú sculo esquelé­ tico contien e casi por com pleto CK -M M , con una pequeña cantidad de CK-M B. La m ayor parte de la actividad de CK en el m ú sculo cardíaco se atribuye tam bién a CK -M M , con casi 20% que resulta de C K -M B .7 E l suero norm al co n s­ ta de alrededor de 9 4 a 100% de CK -M M . La lesión del m úsculo cardíaco y esquelético representa la m ayor parte de los casos de aum ento en la con cen tració n de CK-M M (cuadro 1 0 -3 ). E l hipotiroidism o produce aum ento en la con cen tració n de CK-M M debido a que tiene que ver el tejid o m uscular (m ayor perm eabilidad de la m em brana), el efecto de la horm ona tiroidea en la actividad enzim ática y, posiblem ente, el aclaram iento desacelerado de CK com o resultado de m etabolism o m ás lento. La actividad leve a extenu ante puede con trib u ir al aum ento de las con cen tracio n es de CK, com o tam bién las inyecciones intram usculares. E n la actividad física, el grado de aum ento es variable. Sin em bargo, el grado de ejercicio en relación co n la capacidad de ejercicio del indi­ viduo es el factor m ás im portante para determ inar el grado de in crem en to .8 Los pacientes co n buena con d ició n físi­ ca m uestran m enos grados de aum ento que los pacientes cuya con d ición física es d eficiente. Las con cen tracio n es pueden aum entar durante 4 8 horas después del ejercicio. Por lo general, los incrementos de CK son menores que 5 X LSN después de inyecciones intramusculares, y no son evidentes después de 4 8 horas, aunque podrían persistir durante una semana. La isoenzima predominante es CK-MM. La cantidad de CK-BB en el tejido (cuadro 1 0 -3 ) suele ser pequeña. La cantidad pequeña, ju n to co n su vida media relativam ente corta (1 a 5 h ), da com o resultado actividades de CK-BB que por lo general son bajas y transitorias, y por

246

PARTE II ■ CORRELACIONES CLINICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

lo com ún no se pueden m edir cuando hay daño tisular. Las concentraciones más altas se hallan en el sistem a nervioso central, el tubo digestivo y el útero durante el embarazo. A unque el tejid o del cerebro tiene con cen tracio n es altas de CK, el suero rara vez con tiene CK -BB de origen cere­ bral. D ebido a su tam año m olecular ( 8 0 0 0 0 ) , su paso por la barrera hem atoencefálica está im pedido. Sin em bargo, cuando ha ocu rrid o daño extenso en el cerebro, a veces se d etectan cantidades im portantes de CK-BB en el suero. Se ha observado que la CK -BB puede estar en co n cen ­ traciones significativam ente altas en pacientes con car­ cinom a de varios órganos. Se ha hallado en relación con carcinom a prostático no tratado y otros adenocarcinom as. E stos hallazgos indican que la CK-BB puede ser un m arca­ dor ú til en relación co n tum ores .9 Las causas m ás com unes de increm en tos de CK-BB son daño del sistem a nervioso central, tum ores, parto y la pre­ sen cia de CK m acro, u n com plejo de enzim a-in m unoglobulina. En la m ayor parte de los casos, la co n cen tració n de CK -BB es m ayor que 5 U/L, por lo general en el intervalo de 10 a 5 0 U/L. O tras con d icio n es listadas en el cuadro 1 0 -3 m uestran actividad de CK-BB abajo de 10 U/L.10 E l valor de la separación de isoenzim a CK se puede hallar sobre todo en la detección de daño de miocardio. E l tejido cardíaco contiene cantidades significativas de CK-MB, casi 20% de toda la CK-MB. Mientras que la CK-MB se encuentra en pequeñas cantidades en otro tejido, el miocardio es en esencia el único tejido del que la CK-M B entra al suero en cantidades importantes. La dem ostración de concentracio­ nes altas de CK-M B, mayores o iguales a 6% de la CK total, se considera un buen indicador de daño m iocárdico, en par­ ticular IMA. Se ha encontrado que otras proteínas no enzi­ m áticas, llamadas troponinas, son incluso más específicas y pueden tener una concentración alta en ausencia de concen­ traciones altas de CK-MB. Después del infarto de m iocardio,

las concentraciones de CK-MB com ienzan a subir dentro de 4 a 8 h, alcanzan el m áxim o en 12 a 2 4 h y vuelven a la nor­ malidad dentro de 4 8 a 72 h. Este margen de tiem po se debe considerar al interpretar las concentraciones de CK-MB. La actividad de la CK-M B ha sido observada en otros trastornos cardíacos (cuadro 1 0 -3 ). P or tanto, las cantid a­ des increm entadas no son del todo específicas para IMA sino que reflejan probablem ente algún grado de daño car­ díaco isquém ico. La especificidad de las concentracio nes de CK-M B en el diagnóstico de IM A se puede increm entar si se interpretan ju n to con isoenzim as de deshidrogenasa de lactato (LD ) o troponinas, o am bas, y si se m id en de form a secu en cial durante un período de 4 8 h para detectar el aum ento y dism inu ción característicos de la actividad enzim ática vista en el IM A (fig. 1 0 -6 ). La isoenzim a MB tam bién ha sido detectada en el suero de pacientes co n trastornos no cardíacos. Las co n ­ centraciones de CK -M B halladas en estas con d iciones es probable que representen filtración desde el m úsculo esquelético, aunque en la distrofia m uscular tipo D u chen­ ne puede haber tam bién cierta in terven ció n cardíaca. Las con cen tracio n es de CK -M B en el síndrom e de Reye tam ­ b ién pueden reflejar daño m iocárdico. A pesar de los hallazgos de concentraciones de CK-MB en trastornos distintos al infarto de m iocardio, su presencia aún es un indicador im portante de IM A .11 E l curso de tiem ­ po representativo de aum ento en la concentración de CKMB después del IMA no se encuentra en otras condiciones. Las proteínas no enzim áticas (troponina I y T ) han sido em pleadas com o un m arcador m ás sen sible y específico de daño m iocárd ico. Estas proteínas se liberan hacia el torrente sanguíneo antes y persisten durante m ás tiem po que la CK y su coenzim a CK-M B. Más in form ació n sobre estos m arcadores de proteína de IMA se encuentra en el capítulo 8, Am inoácidos y proteínas.

10

L D -2 ).19 Este patrón descontrolado es alusivo a IMA. Sin embargo, la LD no es específica para teji­ do cardíaco y no es un m arcador preferido de diagnóstico de IMA. Las relaciones LD -l/LD -2 mayores que 1 se pue­ den observar tam bién en m uestras de suero hem olizadas .20 El increm ento en las concentraciones de LD -3 ocurren con más frecuencia en afectación pulm onar y se observan tam­ bién en pacientes con varios carcinom as. Las isoenzim as L D -4 y LD -5 se encuentran sobre todo en el hígado y tejido de m úsculo esquelético, con una fracción de LD -5 predo­ m inante en estos tejidos. Las concentraciones de LD -5 tie­ nen mayor im portancia clínica en la detección de trastornos hepáticos, en particular trastornos intrahepáticos. Los tras­ tornos del m úsculo esquelético revelarán concentraciones altas de L D -5, com o se ilustra en distrofias m usculares. Se ha identificado una sexta isoenzim a de LD, que m igra catódica respecto a L D -5 .21"23 La LD -6 es deshidro­ genasa de alcohol. En estudios de sum inistro de datos, la

CUADRO 10-5. ISO EN ZIM A S D E LD CO M O UN PORCEN TAJE DE LD TO TAL19 ISOENZIMA

%

LD-1

1 4 -2 6

LD-2

2 9 -3 9

LD-3

2 0 -2 6

LD-4

8 -1 6

LD-5

6 -1 6

LD -6 ha estado presente en pacientes con insuficiencia cardiovascular arteriosclerótica. Se cree que su presencia significa un pronóstico grave y m uerte inm inente. La LD -5 se increm enta al m ism o tiempo con la aparición de LD - 6, lo que es probable que represente congestión hepática debi­ do a enferm edad cardiovascular. Se sugiere, por tanto, que la LD -6 podría reflejar lesión hepática secundaria a insufi­ cien cia circulatoria grave. Se ha m ostrado que la LD form a com p lejos co n inm u ­ noglobulinas y revela bandas atípicas en la electroforesis. La LD se acom pleja con IgA e IgG , y por lo regular migra entre L D -3 y L D -4. Este com p lejo m acrom olecular no se relaciona co n ninguna anorm alidad clín ica específica. E l análisis de isoenzim as de LD se puede llevar a cabo m ediante electroforesis, por in m u n oin h ib ición de m éto­ dos de in h ib ició n quím ica, o por diferencias en afinidad de sustrato. D ebido a la utilidad clín ica lim itada, este tipo de pruebas no es de uso com ún. E l proced im iento elec­ troforético ha sido utilizado de m odo extenso desde hace m u cho tiem po. D espués de la separación electroforética, las isoenzim as se detectan ya sea de form a fluorom étrica o colorim étrica. La LD puede usar otras sustancias además de lactato; por ejem p lo, a-h id ro x ib u tirato . Las subunidades H tien en una m ayor afinidad para el a-h id ro x ib u tirato que para las subunidades M. Esto ha cond u cid o al uso de este sustrato en u n in ten to por m edir la actividad de L D -1, que consiste por com pleto en subunidades H. E l ensayo quím ico, cono cid o com o la m ed ición de la actividad de deshidrogenasa de a-h id ro x ib u tirato (a -H B D ), se d escri­ be en la ecu ación 10 - 8. CH 3

ch 3

I

,

a- HBD

CH 2 + NADH + H+ ^ HC =

O

^

'

CH 2 + NAD+ HC — OH

CO O H

COOH

a -C eto b u tira to

a-H id roxib u tirato (Ec. 10-8)

La a-H B D no es una enzima separada y distinta pero se considera que representa la actividad de LD-1 de LD total. Sin embargo, la actividad de a-H B D no es del todo especí­ fica para la fracción LD-1 porque L D -2, LD -3 y L D -4 con­ tienen distintas cantidades de la subunidad H. La actividad

250

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

de HBD se increm enta en condiciones en las que se incre­ m entan las fracción LD-1 y LD-2. La LD se em plea por lo com ún para m edir ácidos lácti­ co y pirúvico o com o una reacció n acoplada.

E nsayo p a ra actividad enzim ática La LD cataliza la interconversión de ácidos láctico y pirúvico con la coenzim a NAD+. La secu encia de reacción se d escribe en la ecuación 10-9: L actato + NAD+

: piruvato

NADH + H + (Ec. 10-9)

La reacció n puede proceder ya sea en d irección directa (lactato [L ]) o inversa (piruvato [P ]). Am bas reacciones han sido usadas en ensayos clínicos. La velocidad de la reacció n inversa es casi tres veces m ás rápida, lo que per­ m ite volúm enes de m uestra más pequeños y tiem pos de reacció n m ás cortos. Sin em bargo, la reacció n inversa es m ás susceptible al agotam iento de sustrato y pérdida de linealidad. E l pH óptim o para la reacció n directa es 8 .3 a 8 .9 ; para la reacción inversa es 7.1 a 7.4.

F u e n te d e e r ro r Los eritrocitos contienen una con cen tració n de LD de casi 100 a 150 veces que se halla en el suero. Por tanto, cu alquier grado de hem olisis debe volver inaceptable una m uestra para análisis. La actividad de LD es inestable en suero sin im portar la tem peratura a la que se alm acenó. Si la m uestra no se puede analizar de inm ediato, se debe alm acenar a 25°C y analizar dentro de 4 8 horas. La LD -5 es la isoenzim a más lábil. La pérdida de actividad ocurre con m ás rapidez a 4°C que a 25°C . Las m uestras de suero para el análisis de la isoenzim a LD se deben alm acenar a 25°C a analizar dentro de 2 4 horas de la recolección .

Intervalo d e referen cia LD , 1 0 0 a 2 2 5 U/L (3 7 °C ).

A m in otransferasa de aspartato La am inotransferasa de aspartato (A ST) es una enzim a que pertenece a la clase de transferasas. Suele conocerse com o transam inasa e interviene en la transferencia de u n gru­ po am ino entre aspartato y a-ce to á cid o s. La term inología m ás antigua, transam inasa glu tám ica-oxaloacética sérica (SGOT o GOT), tam bién se puede usar. E l fosfato de pirid oxal funciona com o una coenzim a. La reacció n procede de acuerdo con la ecuación 10- 10 : CO O H CH 2 HCCO O H

COOH ir,

ch2

CO O H AST

, ------

ch 2

CO O H + ch 2

ch2

c= o

ch2

c= o

CO O H

H C — NH 2

COOH a -C e to glutarato

CO O H O xaloa­ cetato

G lutam ato

La reacción de tran sam inación es im portante en el m etabolism o interm ediario com o resultado de su fu nción en la síntesis y degradación de am inoácidos. Los cetoáci­ dos que se form an en la reacción son oxidados en últim a instancia por el ciclo del ácido tricarb oxílico para proveer una fuente de energía.

F u e n te d e tejido La AST está distribuida de m anera extensa en el tejido hum ano. Las concen tracion es m ás altas se encuentran en el tejid o cardíaco, hígado y m ú sculo esqu elético, con cantidades más pequeñas halladas en el riñ ón , páncreas y eritrocitos.

Im portancia diagnóstica E l uso clínico de AST se limita sobre todo a la evaluación de trastornos hepatocelulares y participación del m úsculo esquelético. E n el IMA, las concentraciones de AST com ien­ zan a subir dentro de 6 a 8 h, alcanzan el m áxim o en 2 4 h y, por lo regular, regresan al nivel norm al en 5 días. Sin embar­ go, debido a la amplia distribución de tejido, las concentra­ ciones de AST no son útiles en el diagnóstico de IMA. Las con cen tracio n es altas de AST se encu entran con frecu encia en em bolism o pulm onar. D espués de la insu­ ficiencia cardíaca congestiva, las con cen tracio n es de AST se pueden increm en tar tam bién, lo que es probable que refleje participación hepática com o resultado de sum inis­ tro sanguíneo inadecuado a ese órgano. Las co n cen tra cio ­ nes de AST son más altas en los trastornos hepatocelulares agudos. E n la hepatitis viral, las con cen tracio n es pueden alcanzar 1 0 0 veces el LSN. En la cirrosis, se d etectan sólo concentraciones moderadas — alrededor de cuatro veces el LSN— (véase el capítulo 22, Función hepática ). Los trastor­ nos del m úsculo esquelético, com o las distrofias m usculares, y condiciones inflam atorias tam bién causan increm entos en ias concentraciones de AST (4 a 8 X LSN ). La A ST existe com o dos fracciones de isoenzim a lo ca­ lizadas en el citoplasm a y m itocondrias de la célula. La con cen tració n intracelu lar de A ST puede ser 7 0 0 0 veces m ayor que la con cen tració n extracelular. La isoenzim a citoplásm ica es la form a predom inante que aparece en el suero. E n los trastornos que producen necrosis celular, com o la cirrosis hepática, la form a m itocond rial se puede increm entar de form a significativa. E l análisis de iso en ­ zim a de AST no se lleva a cabo de m anera rutinaria en el laboratorio clínico.

Ensayo p a ra actividad enzim ática Los m étodos de ensayo para AST se basan por lo gene­ ral en el principio del m étodo de Karm en, que incorpora una reacción enzim ática acoplada co n deshidrogenasa de m alato (M D ) com o la reacción de indicador, y m onitorea el cam bio de absorbancia a 3 4 0 nm de m odo con tinu o cuando el NADH se oxida a NAD+ (ec. 1 0 -1 1 ). E l pH óp ti­ m o es 7 .3 a 7.8. AST

Aspartato + a-cetog lu tarato oxaloacetato + glutam ato O xaloacetato + NADH + ! i '

(Ec. 10-10)

m alato + N A D + (Ec. 10-11)

251

CAPÍTULO 10 ■ ENZIMAS

F u e n te d e e rro r

Im portancia diagnóstica

La hem olisis se debe evitar porque puede increm en tar de m anera decisiva la con cen tració n de AST sérica. La acti­ vidad de A ST es estable en el suero durante 3 a 4 días a tem peraturas refrigeradas.

Las aplicaciones clínicas de los ensayos de ALT están co n ­ finadas sobre todo a evaluación de trastornos hepáticos. E n trastornos hepatocelulares se hallan concentracio nes m ayores que en trastornos obstructivos extrahep áticos o intrahepáticos. E n cond icion es inflam atorias agudas del hígado, las concentracio nes de ALT son con frecuencia m ayores que las de AST y tienden a p erm anecer elevadas durante m ás tiem po com o resultado de la vida m edia más larga de la ALT en suero (1 6 y 2 4 h, respectivam ente). El tejido cardíaco contiene una pequeña cantidad de acti­ vidad de ALT, pero la concentración sérica perm anece nor­ mal en el IMA a m enos que haya ocurrido daño hepático posterior. Las concentraciones de ALT han sido comparadas históricam ente con las concentraciones de AST para ayudar a determ inar la fuente de una concentración de AST alta y detectar la participación concurrente con lesión miocárdica.

Intervalo d e referen cia AST, 5 a 3 0 U/L (3 7 °C ).

A m inotransferasa de alanina La am inotransferasa de alanina (A LT) es una transferasa con actividad enzim ática sim ilar a AST. De m anera espe­ cífica, cataliza la transferencia de un grupo am ino de alanina a a-cetog lu tarato con la form ación de glutam ato y piruvato. La term inología m ás antigua era transam inasa glutám ica-pirúvica sérica (SGPT o GPT). La ecu ación 1012 indica la reacció n de transferasa. E l fosfato de piridoxal actúa com o la coenzim a. CH 3

ch 3

COOH i

ALT

c = o ===^ c = CO O H

ch 2

CO O H O

COOH

+ H C — NH 2 ch 2

ch 2

ch 2

COOH

CO O H

E nsayo p a ra actividad enzim ática E l proced im iento de ensayo característico para ALT co n ­ siste en una reacción enzim ática acoplada con LD com o la enzim a indicadora, que cataliza la red u cción de piruvato a lactato co n oxid ación sim ultánea de NADH. E l cam bio de absorban cia a 3 4 0 nm m edido de m anera continu a es d irectam ente proporcional a la actividad de ALT. La reac­ ción procede de acuerdo con la ecu ación 10 -3 . E l pH ópti­ m o es 7 .3 a 7.8. ALT

Alanina

a -C e to glutarato

Piruvato

G lutam ato

Alanina + a-cetog lu tarato ^=4- piruvato 4- glutam ato Piruvato + N A D H + H 4

LD

lactato + N AD 4 (Ec. 10-13)

(Ec. 10-12)

F u e n te d e e rr o r

F u e n te d e tejido

La ALT es estable durante 3 a 4 días a 4°C . Casi no la afec­ ta la hem olisis.

La ALT está distribuida en m u chos tejidos, con con cen tra­ ciones com parativam ente altas en el hígado. Se considera que es la enzim a hepatoespecífica de las transferasas.

ALT, 6 a 3 7 U/L (3 7 °C ).

Intervalo d e referen cia

ES TU D IO D E C A S O 10-2 M ientras cam inaba a casa una anciana de 71 años desde un centro com ercial, se desvanece y cae. Una amiga la lleva a casa. Allí, se percata que sangra de la boca y está ligeram ente desorientada. Al parecer se hirió al caer, pero no recuerda haber tropezado o caído. La m u jer es llevada al departam ento de urgencias local. E l m édico que la exam ina determ ina que hubo pérdida de la co n ­ cien cia; para determ inar la razón, el m édico ordena una CT de la cabeza y un E C G y las siguientes pruebas de laboratorio: CBC , PT, APTT, CK, LD , AST y troponina T e l . Todas las pruebas están dentro de los lím ites nor­ males. A la m u jer se le suturan las lesion es de la b oca y es adm itida en una unidad de observación de 2 4 h.

Preguntas 1. ¿Q ué posibles d iagnósticos considera el m édico? 2. ¿Q ué pruebas de laboratorio serían elevadas a 6 , 12 y 2 4 h si la pacien te hubiera sufrido un IMA? 3. ¿Q ué pruebas de isoenzim a serían útiles co n esta paciente?

252

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

Fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina (A LP) pertenece a un grupo de enzi­ m as que catalizan la hidrólisis de varios fosfom onoésteres a u n pH alcalino. E n consecu en cia, la ALP es un a enzim a no específica capaz de reaccionar co n m u chos sustratos d istintos. De m anera específica, la ALP funciona para lib e­ rar fosfato inorgánico de un éster de fosfato orgánico con la p rod u cción concom itante de un alcohol. La reacción procede de acuerdo co n la ecu ación 1 0 -1 4 : 0 R— P— O 1

O + H20 - ACP - R — OH + H O — P — O pH 9-10

j

OF osfo m on o éster

OA lcoh ol

Io n fosfato (Ec. 10-14)

E l pH óptim o para la reacción es 9 .0 a 1 0 .0 , pero el pH óptim o varía co n el sustrato em pleado. La enzim a requiere M g+ com o activador.

F u e n te d e tejido La actividad de la ALP se presenta en superficies celulares en la m ayor parte del tejid o hum ano. Las concentracio nes más altas se encuentran en el in testin o , hígado, huesos, bazo, placenta y riñón. En el hígado, la enzim a se locali­ za en m em branas canaliculares sinusoidales y biliares; la actividad en el hueso está confinada a los osteoblastos, las células que intervienen en la p rod u cción de m atriz ósea. La localización específica de la enzim a dentro de este te ji­ do explica las concentracio nes más predom inantes en ciertos trastornos.

Im portancia diagnóstica Los increm en tos de ALP tienen una gran im portancia diagnóstica en la evaluación de trastornos hepatobiliares y óseos. E n los trastornos hepatobiliares, los increm en tos son m ás predom inantes en cond iciones obstructivas que en trastornos hepatocelulares; en trastornos óseos, los increm entos se observan cuando intervienen osteoblastos. E n la ob stru cción tractobiliar, las con cen tracio n es de ALP abarcan tres a 10 veces el lím ite superior norm al (L SN ). Los increm en tos son sobre todo u n resultado de la síntesis acrecentada de la enzim a inducida por colestasis. E n contraste, los trastornos hepatocelulares, com o la hepatitis y cirrosis, m uestran sólo increm en tos ligeros, por lo general m enores que tres veces el LSN. Com o resultado del grado de traslape de los increm en tos de ALP que ocurre en varios trastornos hepáticos, se dificulta interpretar una sola con cen tració n alta de ALE Adopta m ás im portancia diagnóstica cuando se evalúa ju n to co n otras pruebas de fu nción hepática (véase el capítulo 2 2 , Función hepática). Las con cen tracio n es altas de ALP se p resentan en varios trastornos óseos. Q uizá los increm en tos m ayores de acti­ vidad de ALP ocu rren en la enferm edad de Paget (o steí­ tis deform an te). O tros trastornos óseos son osteom alacia, raquitism o, hiperparatiroidism o y sarcom a osteogénico.

Además, las con cen tracio n es altas se observan en fracturas óseas en recup eración y durante períodos de crecim iento óseo fisiológico. E n el em barazo norm al, la m ayor actividad de ALP, que en prom edio es casi una y media veces el LSN , se puede detectar entre las sem anas 16 y 2 0 . La actividad vuelve a la norm alidad en 3 a 6 días .24Los increm en tos se observan en com plicaciones del em barazo com o hipertensión , preeclam psia y eclam psia, así com o en am enaza de aborto. Las concentracio nes de ALP dism inuyen de form a im portante en la con d ició n heredada de hipofosfatasia. La actividad subnorm al es u n resultado de la ausencia iso en ­ zim a ósea y produce calcificación ósea inadecuada. La ALP existe com o una cantidad de isoenzim as, que han sido estudiadas m ediante diversas técnicas. Las iso en ­ zim as principales, que se encuentran en el suero y han sido estudiadas de m anera extensa, son las derivadas del hígado, hueso, in testino y p lacen ta .23 La electroforesis es considerada la técnica sim ple más ú til para el análisis de isoenzim a ALP. Sin em bargo, debi­ do a que puede haber aún cierto grado de traslape entre las fraccion es, la electroforesis en com binació n con otra técn ica de separación puede proveer la inform ación más confiable. E n la actualidad está disponible un m étodo inm un oquím ico directo para la m ed ición de la ALP rela­ cionada con el hueso; esto en m u chos casos ha h echo innecesaria la electroforesis de ALE La fracción hepática es la que m igra m ás rápido, seguida por la del hu eso, placenta y fracciones intestinales. Com o resultado de la sim ilitud entre las fosfatasas hepática y ósea, co n frecu encia no hay un a separación clara entre ellas. La cu antificación m ediante un densitóm etro resulta difícil a veces debido al traslape entre los dos picos. La isoenzim a hepática se puede dividir en dos fracciones, la banda hepá­ tica principal y una fracción m ás pequeña llam ada hígado rápido o hígado cq, que migra anodal a la banda principal y corresponde a la fracción cq de electroforesis de proteínas. Cuando se increm en tan las con centracio n es de ALP total, la fracción hepática es la que aum enta con m ás frecuencia. M uchas cond icion es hepatobiliares causan increm en tos de esta fracción, por lo general al inicio en el curso de la enferm edad. La fracción hígado rápido ha sido d eterm ina­ da en carcinom a m etastático del hígado, así com o en otras enferm edades hepatobiliares. Su presen cia es considerada com o un indicad or valioso de enferm edad hepática ob s­ tructiva. Sin em bargo, se presenta en form a ocasional en ausencia de algún estado m orboso detectable. La isoenzim a ósea se increm enta debido a actividad osteoblástica y, por lo general, se increm en ta en los niños d urante períodos de crecim iento y en adultos m ayores de 5 0 años. E n estos casos, una con cen tració n alta de ALP podría ser difícil de interpretar .26 La presencia de isoenzim a de ALP intestin al en el sue­ ro depende del grupo sanguíneo y el estado secretor del individuo. Los individuos que tien en grupo sanguíneo B u O y son secretores tien en m ás probabilidades de tener esta fracción . E n apariencia, los eritrocitos del grupo A se u n en con la ALP intestinal. Además, en estos indivi­ duos, los increm en tos de ALP intestinal ocu rren después

CAPÍTULO 10 ■ ENZIMAS

de consu m ir una com ida grasosa. La ALP intestin al puede aum entar en d istintos trastornos, com o las enferm edades del tubo digestivo y cirrosis. Las con cen tracio n es altas se hallan tam bién en pacientes que experim entan hem odiálisis crónica. La diferencia de estabilidad térm ica es la base de un segundo m étodo empleado para identificar la fuente de isoenzim a de una ALP de alta concentración. Por lo gene­ ral, la actividad de ALP se m ide antes y después de calentar el suero a 56°C durante 10 m in. Si la actividad residual después del calentam iento es m enor que 20% de la activi­ dad total antes del calentam iento, entonces se supone que el increm ento de ALP es un resultado de la fosfatasa ósea. Si perm anece más de 20% de la actividad, el increm ento es probable que sea resultado de la fosfatasa hepática. Estos resultados se basan en el hallazgo de que la ALP placentaria es la más estable al calor de las cuatro fracciones principa­ les, seguida de las fracciones intestinal, hepática y ósea en orden de estabilidad térm ica. La ALP placentaria resistirá la desnaturalización térm ica a 6 5 ° durante 3 0 m inutos. La d esactivación térm ica es un m étodo im preciso para d iferenciación porque la d esactivación depende de m u chos factores, com o el con trol correcto de tem peratura, tiem po y m étodos analíticos con la sensibilidad suficiente para detectar pequeñas cantidades de actividad residual de ALP. Además, hay cierto grado de traslape entre la desac­ tivación térm ica de las fraccion es hepática y ósea tanto en enferm edades hepáticas com o óseas. U n tercer m étodo de identificación de las isoenzim as de ALP se basa en la inhibición quím ica selectiva. La fenilalani­ na es uno de varios inhibidores que han sido utilizados. La fenilalanina inhibe la ALP intestinal y placentaria a un gra­ do m ucho mayor que la ALP hepática y ósea. Sin embargo, con el uso de fenilalanina es im posible diferenciar la ALP placentaria de la intestinal o la ALP hepática de la ósea. Además de las cuatro fracciones principales de isoen­ zim a de ALP, ciertas fraccion es anorm ales se relacionan con neoplasm as. Las que se observan con más frecuencia son las isoenzim as de Regan y Nagao. É stas se den om i­ nan fosfa ta sas alcalinas carcinoplacentarias debido a sus sim ilitudes co n la isoenzim a placentaria. La frecu encia de intervalos de aparición varía de 3 a 5% en pacientes con cáncer. La isoenzim a de Regan ha sido caracterizada com o un ejem plo de una produ cción ectópica de una enzim a por tejido m aligno. Ha sido detectada en varios carcino­ m as; por ejem plo, de pulm ón, m am a, ovario y colon, con las incid encias m ás altas en cánceres de ovario y g inecoló­ gicos. Com o resultado de su b aja in cid encia en pacientes co n cáncer, el diagnóstico de m alignidad rara vez se basa en su presencia. Sin em bargo, es útil en el m onitoreo de los efectos del tratam iento porque desaparecerá si el trata­ m iento resulta exitoso. La isoenzim a de Regan m igra a la m ism a po sició n que la fracción ósea y es la más estable al calor de todas las isoenzim as de ALE Resiste la d esnaturalización a 65°C durante 3 0 m inutos. La fenilalanina in h ib e su actividad. La isoenzim a de Nagao puede ser considerada una variante de la isoenzim a de Regan. Sus propiedades electro­ foréticas, estabilidad térm ica e in h ib ició n p or fenilalanina

253

son idénticas a las de la fracción de Regan. Sin em bargo, la leu cina in h ib e tam bién a la isoenzim a de Nagao. Su presencia ha sido detectada en carcinom a m etastático de superficies pleurales, y en ad enocarcinom a del páncreas y el ducto biliar.

Ensayo p a ra actividad enzim ática Com o resultado de la no especificidad relativa de la ALP en relación con sustratos, ha sido propuesta una diversidad de m etodologías para su análisis, y en la actualidad aún no están en uso. Las diferencias principales entre éstas se rela­ cionan con la concentración y los tipos de sustrato y disolu­ ción am ortiguadora empleados y el pH de la reacción. Una técnica de m onitoreo continua basada en un m étodo dise­ ñado por Bowers y M cC om b perm ite calcular la actividad de ALP con base en la absortividad m olar de p-nitrofenol. La reacción procede de acuerdo con la ecuación 10-15:

a

,o %

N

S

HO-

HO — P — O O p-N itrofenil-

p-N itro fenol

Io n fosfato

fosfato (Ec. 10-15)

E l p-nitrofenilfosfato (incoloro) se hidroliza a p-nitrofenol (am arillo) y se mide el increm ento de absorbancia a 405 nm , que es directam ente proporcional a la actividad de ALE

F u e n te d e e rr o r La hem olisis puede causas ligeros increm en tos porque la ALP está concentrada alrededor de seis veces m ás en los eritrocitos que en el suero. Los ensayos de ALP se deben ejecu tar lo m ás pronto posible después de la recolección . La actividad en suero se increm en ta casi 3 a 10% si se m antiene a 25 o 4 °C durante varias horas. La dieta puede ind u cir increm en tos en la actividad de ALP de individuos del grupo sanguíneo B u O que son secretores. L os valores pueden ser 25 % m ás altos después de la ingestión de una com ida con alto contenid o de grasa.

Intervalo d e referen cia ALP, 3 0 a 9 0 U/L (3 0 °C ).

Fosfatasa ácida La fosfatasa ácida (A CP) pertenece al m ism o grupo de enzim as de fosfatasa que la ALP y es una hidrolasa que

254

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

cataliza el m ism o tipo de reacciones. La diferencia p rin ci­ pal entre ACP y ALP es el pH de la reacción. La ACP fun­ ciona a un pH óptim o de alrededor de 5 .0 . E n la ecuación 1 0 -1 6 se d escribe la secuencia de reacción: 0 R— P— 0 “ 1

O ACP

!

pH 5

|

+ H 20 ^ = ± R — OH + H O — P — 0 “

OFosfo m ono éster

OA lcoh ol

Io n fosfato (Ec. 10-16)

F u e n te d e tejido La actividad de ACP se halla en la próstata, hueso, híga­ do, bazo, riñ ón , eritrocitos y plaquetas. La próstata es la fuente m ás rica, con m uchas veces la actividad hallada en otro tejido.

Im portancia diagnóstica D esde hace tiem po, la m ed ición de ACP se ha em pleado com o auxiliar en la d etección de carcinom a prostático, en particular carcinom a m etastático de la próstata. Las d eterm inaciones de ACP total son técn icas relativam ente insensibles, que perm iten detectar con cen tracio n es altas de ACP que resultan de carcinom a prostático en la m ayor parte de los casos sólo cuando el tum or es m etastásico. Los m arcadores más recientes, com o el antígeno esp ecí­ fico de próstata (P SA ), son las herram ientas de d etección y diagnóstico m ás útiles (véase el capítulo 3 0 , M arcadores tum oraies en circulación ). U no de los sustratos más específicos para ACP prostá­ tico es el m onofosfato de tim olftaleína. Los m étodos de in h ib ició n quím ica em pleados para diferenciar la porción prostática em plean tartrato com o inhibidor. E l tartrato inhib e la fracción prostática. E l suero y el sustrato se in cu ­ ban con y sin la ad ición de L- tartrato. La actividad de ACP que perm anece después de la in h ib ició n con L-tartrato se resta de la actividad de ACP total determ inada sin in h ib i­ ción , y la diferencia representa la p orción prostática: ACP total - ACP después de la in h ib ició n con tartrato = ACP prostática (Ec. 10-17) La reacció n no es del todo específica para ACP pros­ tática, pero otras fuentes de tejid o están desinhibidas en gran medida. N inguno de estos m étodos de d eterm inación de ACP es sen sible a carcinom a prostático que no se encuentre m etastásico. P or lo general, los valores son norm ales en la m ayor parte de los casos y, de h echo, pueden ser altos sólo en 50% de los casos de carcinom a prostático que están m etastásicos. U na técnica con m ucha más sensibilidad sobre los ensa­ yos de ACP ordinarios es el m étodo inm un ológico con anticuerpos que son específicos para la porción prostática. Sin em bargo, las técnicas inm unoquím icas no son de valor com o pruebas de d etección para carcinom a prostático. E l PSA tiene más probabilidades que la ACP de per­ m anecer en una con cen tració n alta en cada etapa de

carcinom a prostático, aun cuando se puede hallar una con cen tració n norm al de PSA en tum ores de etapa D. El PSA es en particular ú til para m onitorear el éxito del trata­ m ien to; sin em bargo, el PSA es controversial com o prueba de d etección para m alignidad prostática porque el in cre­ m ento de PSA puede ocurrir en cond icion es distintas a las del carcinom a prostático, com o hipertrofia prostática benigna y p ro statitis .27'29 O tras cond iciones prostáticas en las que se han hallado increm en tos de ACP son la hiperplasia de la próstata y la cirugía prostática. Hay inform es contrad ictorios de in cre ­ m entos después del exam en rectal y m asaje de la próstata. E n ciertos estudios se han descrito con cen tracio n es altas de ACP, y en otros n o se ha hallado cam bio detectable. Cuando se hallan increm en tos, las con cen tracio n es vuel­ ven por lo regular a la norm alidad en 2 4 h o ra s .30 Se ha encontrado que los ensayos de la ACP son útiles en la quím ica clín ica forense, en particular en la inves­ tigación de violación. Los lavados vaginales se exam inan para detectar actividad de líquido seminal-ACP, que puede p ersistir durante hasta cuatro d ías .31 La actividad alta es supuesta evidencia de violación en tales casos. La actividad de la ACP sérica puede ser alta la m ayor parte de las veces en la enferm edad ósea. Se ha m ostra­ do que la actividad se relaciona con los osteoclastos .32 Se h an observado concentracio nes altas en enferm edad de Paget; cáncer de m am a con m etástasis ósea, y enferm edad de G aucher, en la que células de G au cher ricas en activi­ dad de ACP se infiltran en la m édula ósea y otro tejido. D ebido a la actividad de ACP en las plaquetas, se observan increm en tos cuando ocurre daño plaquetario, com o en la trom bocitopenia que resulta de la d estru cción excesiva de plaquetas por púrpura idiopática trom bocitopénica.

E nsayo p a ra actividad enzim ática E n los procedim ientos para ACP total se em plean las m is­ mas técnicas que en los ensayos para ALP pero se efectúan a pH ácido: ACP

p-N itrofenolfosfato pH 5

p-nitro fenol + ion fosfato

(Ec. 10-18)

Los productos de la reacción son incoloros al pH ácido de la reacción, pero la ad ición de álcali detiene la reacción y transform a los productos en crom ógenos, que se pueden m edir por m edios espectrofotom étricos. Ya se han analizado algunas especificidades de sustrato e inhibid ores quím icos para m ediciones de ACP prostática. E l m onofosfato de tim olftaleína es el sustrato de elecció n para reacciones de pu nto final cuantitativas. Para m étodos de m onitoreo con tin u o, se prefiere el a -n a ftil fosfato. Las técnicas inm unoquím icas para ACP prostática usan diversos m étodos, com o RIA, contrain m unoelectroforesis e inm un oprecip itación. Tam bién, u n ensayo inm unoenzim ático (tándem E ) inclu ye in cu b ació n con un anticuerpo a ACP prostática seguida de lavado e in cu b ació n con p-N FE El p-N F formado, medido fotom étricam ente, es pro­ porcional al ACP prostático en la m uestra.

CAPÍTULO 10 M ENZIMAS

F u e n te d e e rro r E l suero se debe separar de los eritrocitos tan pronto com o se coagula la sangre para evitar fuga de ACP de eritrocitos y plaquetas. La actividad sérica dism inuye en 1 a 2 h si se deja la m uestra a tem peratura am biente sin la adición de un conservador. La actividad reducida es un resulta­ do de la pérdida de dióxido de carbono del suero, con un in crem en to resultante de pH. Si no se realiza de inm ediato el ensayo, el suero se debe congelar o acidificar a un pH m enor que 6 .5 . C o n la acidificación, la ACP es estable por dos dias a tem peratura am biente. Se debe evitar la hem oli­ sis debido a la contam in ación co n ACP eritrocítica. Los proced im ientos de RIA para m ed ición de ACP p rostática requieren m uestras de suero n o acidificadas. La actividad es estable durante dos días a 4°C .

Intervalo d e referen cia ACP prostática, 0 a 3 .5 ng/ml.

y-Glutam iitransferasa La y-glutam iltransferasa (G G T ) es una enzim a que inter­ viene en la transferencia del residuo y-glutam ilo de pépti­ dos de y-glutam ilo a am inoácidos, H 20 y otros péptidos pequeños. E n la m ayor parte de los sistem as b iológ icos, el glutatión sirve com o donador de y-glutam ilo. E n la ecua­ ció n 1 0 -1 9 se describe la secu encia de reacción: G lutatión + am inoácido glutam ilo-péptido + L -cisteinilglicina

(Ec. 10-19)

La fu n ció n fisiológica específica de la G G T n o ha sido establecida con claridad, pero al parecer la G G T in tervie­ ne en la síntesis de péptido y proteína, la regulación de las con cen tracio n es de glutatión tisular y el transporte de am inoácid os por m em branas celu lares .33

F u e n te d e tejido La actividad de G G T se halla sobre todo en el tejido del riñ ón , cerebro, próstata, páncreas e hígado. Sin em bargo, las aplicaciones clínicas de ensayo están confinadas sobre todo a evaluación de trastornos del sistem a hepático y biliar.

tos enzim áticos pueden alcanzar con cen tracio n es cuatro veces el LSN. D ebido a los efectos del alcoh ol en la actividad de GGT, las con cen tracio n es altas de G G T podrían indicar alcoh o­ lism o, en particular alcoholism o cró n ico . Por lo general, las con cen tracio n es altas de enzim a en personas alcoh óli­ cas o bebedores asiduos abarcan dos a tres veces el LSN, aunque han sido observadas con cen tracio n es m ás altas. Los ensayos de G G T son útiles para m onitorear los efectos de ab stención de alcohol, y los centros de tratam iento del alcoholism o los em plean com o tales. Las concentracio nes vuelven a la norm alidad en dos a tres sem anas después del cese, pero pueden volver a aum entar si se reanuda el consum o de alcohol. Com o resultado de la susceptibilidad a la ind u cción de enzim as, cu alquier in terp retación de las concentracio nes de G G T se debe hacer tom ando en co n si­ d eración los efectos posteriores de fárm acos y el alcohol. Las con cen tracio n es de G G T tam bién son altas en otras con d iciones; por ejem plo, pancreatitis aguda, diabetes m ellitus e infarto de m iocardio. La fuente de increm ento en la pancreatitis y la diabetes probablem ente es el pán­ creas, pero se d esconoce la fuente de G G T en el infarto de miocardio. Los ensayos de G G T son de valor limitado en el diagnóstico de estas condiciones y no se requiere de manera rutinaria. La actividad de G G T es útil para diferenciar la fuente de una con cen tració n alta de ALP porque las co n cen tracio ­ nes de G G T son norm ales en los trastornos esqu eléticos y durante el em barazo. Es en particu lar útil en la evaluación de la participación hepatobiliar en ad olescentes porque la actividad de ALP se increm entará siem pre com o resultado del crecim iento óseo.

Ensayo p a ra actividad enzim ática E l sustrato más aceptado para uso en el análisis de G G T es el y-glutamilo-p-nitroanilido. E l residuo de y-glutamilo es trans­ ferido a glicilglicina, liberando p-nitroanilina, un producto crom ogénico con una absorbancia fuerte a 4 0 5 a 4 2 0 nm. La reacción, que se puede usar com o un método de m onitoreo continuo o de punto fijo, se describe en la ecuación 10- 20: ftO O C — CHNH 2 — CH 2— CH2— CO

\ — N 02

HN — ¿

Im portancia diagnóstica E n el hígado, la G G T se localiza en los canalículos de las células hepáticas, y en particular en las células epiteliales que revisten los canalillos biliares. Debido a estas localizaciones, la G G T aum enta en casi todos los trastornos hepatobiliares, lo que la convierten en uno de los ensayos enzim áticos más sensibles en estas condiciones (véase el capítulo 2 2 , Función hepática). Las concentraciones más altas se observan por lo general en obstrucción de la vía biliar. D entro del parénquim a hepático, la G G T existe en gran medida en el retículo endoplásm ico liso y, por tanto, está sujeta a ind u cción m icrosóm ica hepática. P or con ­ siguiente, las concentraciones de G G T se increm entan en pacientes que reciben fárm acos que indu cen enzim as com o w arfarina, fenobarbital y fenitoína. Los increm en ­

255

y-Glutamil-p-nitroanilido

' ----

+ h 2n — c h 2— c o n h — c h 2— COOH Glicilglicina H O O C — c h n h 2— c h 2— c h 2— CO I H N — CH 2— CONH— CH2— COOH Y-glutamil-glicilglicina

+

GGT pH 8. 2

H2N —

— N 02

p-Nitroanilina

(Ec. 10-20)

256

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

F u e n te d e e rro r La actividad de G G T es estable, sin ninguna pérdida de actividad durante una sem ana a 4°C . La hem olisis no interfiere con las concentracio n es de G G T porque la enzi­ ma carece de eritrocitos.

Intervalo d e referen cia GGT: varón, 6 a 4 5 U/L (3 7 °C ); m ujer, 5 a 3 0 U/L (3 7 °C ) Los valores son m enores en las m ujeres presum ible­ m ente com o resultado de la supresión de la actividad enzim ática que resulta de horm onas estrogénicas o progestacionales.

A m ilasa La amilasa (AMS) es una enzim a que pertenece a la clase de hidrolasas que catalizan la descom posición del alm idón y el glucógeno. E l alm idón consta de am ilosa y am ilopectina. La am ilosa es una cadena larga no ram ificada de m oléculas de glucosa, unida por enlaces 1 -4 glucosldicos; la am ilopectina es u n polisacárido de cadena ram ificada con uniones a , 1-6 en los puntos de ram ificación. La estructura del glucógeno es sim ilar a la de la am ilopectina pero es más ramificada. La a-am ilasa ataca sólo los enlaces glucosídicos a , 1-4 para producir productos de degradación que consisten en glu­ cosa; m altosa, y cadenas interm ediarias, llamadas dextrinas, que contienen enlaces de ram ificación a , 1-6. La celulosa y otros polisacáridos estructurales que consisten en enlaces no son atacados por a-A M S. Por tanto, la AMS es una enzi­ ma im portante en la digestión fisiológica de alm idones. La reacción procede de acuerdo con la ecuación 10- 2 1 : CH 2OH

c h 2o h

c h 2o h

AMS

HO OH

OH

glucosa, -maltosa, dextrinas

OH (Ec. 10-21)

La AMS requiere iones calcio y cloruro para su activa­ ción.

F u e n te d e tejido Las células acinares del páncreas y las glándulas salivales son las fuentes tisulares principales de AMS sérica. C o n­ centraciones m enores se encuentran en el m úsculo esque­ lético y el in testin o delgado y trom pas de Falop io. La AM S es la enzim a m ás p equ eñ a, c o n u n peso m o le cu la r de 5 0 0 0 0 a 55 0 0 0 . D ebido a su tam año pequ eño, se filtra con facilidad en el glomérulo y también aparece en la orina. La digestión de almidones comienza en la boca con la acción hidrolltica de la AMS salival. Sin embargo, la actividad de la AMS salival es de corta duración porque, al deglutir, se inactiva por la acidez del contenido gástrico. La AMS pancreá­ tica lleva a cabo entonces una mayor acción digestiva de los almidones una vez que los polisacáridos llegan al intestino.

Im portancia diagnóstica La im portancia diagnóstica de las m ed iciones de AMS del suero y la orina es en el diagnóstico de pancreatitis aguda .34 Trastornos del tejido d istinto al páncreas pueden

producir increm en tos en las con cen tracio n es de AMS. Por tanto, una co n cen tració n alta de AMS es un hallazgo no específico. Sin em bargo, el grado de increm en to de AMS es ú til, en cierto grado, en el diagnóstico d iferencial de pancreatitis aguda. Además, otras pruebas de laboratorio (co m o m ediciones de concentraciones de AMS urinaria, estudios de aclaram iento de AM S, estudios de isoenzim as de AM S y m ediciones de concentraciones de lipasa sérica [L P S ]), cuando se em plean ju n to con la m ed ición de AMS sérica, increm en tan la especificidad de las m ed iciones de AMS en el diagnóstico de pancreatitis aguda. E n la pancreatitis aguda, las con cen tracio n es de AMS sérica com ienzan a subir 2 a 12 h después del in icio de un ataque, alcanzan el m áxim o en 2 4 h y vuelven a los niveles norm ales en 3 a 5 días. Los valores varían por lo general de 2 5 0 a 1 0 0 0 unidades Somogyi/dl (2 .5 5 X LSN ). Los valo­ res pueden alcanzar con cen tracio n es m u cho m ás altas. O tros trastornos que causan una con centración sérica alta de AMS son las lesiones de las glándulas salivales, com o paperas y parotiditis y otras enferm edades intraabdom inales, com o úlcera hepática perforada, obstru cción intestinal, colecistitis, rotura de embarazo ectópico, infarto m esentérico y apendicitis aguda. Además, han sido descritas co n ­ centraciones altas en insuficiencia renal y cetoacidosis diabética. Las concentraciones de AMS sérica en cond icio­ nes intraabdom inales distintas a la pancreatitis aguda son por lo general m enores que 5 0 0 unidades Somogyi/dl. U na condición en apariencia asintom ática de hiperam ilasem ia ha sido notada en alrededor de 1 a 2% de la población. Esta condición, llamada m acroam ilasem ia , resulta cuando la m olécula de AMS se com bina con inm unoglobulinas para form ar un com plejo que es demasiado grande para ser fil­ trado a través del glom érulo. Las concentraciones séricas de AMS se increm entan debido a la reducción del aclaram iento renal norm al de la enzim a y, en consecuencia, la excreción urinaria de AMS es anorm alm ente baja. La im portancia diagnóstica de la macroam ilasem ia radica en la necesidad de diferenciarla de otras causas de hiperamilasemia. E n fechas recientes se ha puesto m ucho interés en el posible uso diagnóstico de las m ed iciones de isoenzi­ ma de A M S .34,35 La AM S sérica es una m ezcla de diver­ sas isoenzim as que se pueden separar por diferencias en propiedades físicas, de m anera m ás notable electroforesis, aunque tam bién han sido aplicados la crom atografía y el enfoque iso eléctrico. E n el suero hum ano norm al, se pue­ den observar dos bandas principales y unas cuatro bandas m enores. Las bandas se designan com o isoam ilasa tipos P y S. La isoam ilasa P se deriva del tejido pancreático; la S se obtien e del tejid o de glándulas salivales, así com o de las trom pas de Falopio y el pulm ón. Las isoenzim as de origen salival m igran con m ás rapidez ( S I , S2, S 3 ), m ien tras que las de origen pancreático son m ás lentas ( P l , P2, P 3 ). E n el suero hum ano norm al, las isoam ilasas m igran en regio­ nes que correspond en a las regiones de la (3 a a -g lo b u lin a de electroforesis de proteínas. Las fraccion es que se obser­ van co n m ás frecu encia son P2, S I y S2. E n la pancreatitis aguda, suele haber u n increm en to en la actividad del tipo P, co n P3 com o la isoenzim a m ás pre­ d om inante. Sin em bargo, P3 ha sido detectada en casos de

257

CAPITULO 10 ■ ENZIMAS

insu ficiencia renal y, por tanto, no es del todo específica para pancreatitis aguda. La isoam ilasa tipo S representa casi dos tercios de la actividad de AMS de suero norm al, m ientras que el tipo P predom ina en la orina norm al.

Hexocinasa

5-G lu co sa + 5 ATP 5 -g lu cosa-6-fosfato 4- 5 ADP r

r

5,6-fosfog lu co n olacton a + 5 NADH

Ensayo p a ra actividad enzim ática E l estudio de la AM S se puede realizar m ediante diversos m étodos, los cuales se resum en en el cuadro 10-6. Los cua­ tro m étodos principales se clasifican com o am iloclástico, saccarogénico, crom ogénico y de m onitoreo continu o. E n el m étodo am iloclástico, se perm ite que la AMS actúe sobre un sustrato de alm idón al que se ha añadido yodo. Cuando la AMS hidroliza la m olécula de alm idón en unidades más pequeñas, se libera yodo y ocu rre una dism inu ción en la intensidad de color azul oscuro inicial del com plejo alm idón-yodo. La d ism inu ción de co lo r es proporcional a la con cen tració n de AMS. E l m étodo sacarogénico emplea un sustrato de alm idón que se hidroliza m ediante la acción de AMS en sus m olécu­ las de carbohidrato constituyentes que tienen propiedades reductoras. Así, la cantidad de azúcares reductoras se mide d ond e la co n c e n tra c ió n es p ro p o rcio n a l a la activid ad de AMS. E l m étodo sacarogénico, el m étodo de referencia clásico para la determ inación de actividad de AMS, se expre­ sa en unidades Somogyi. Las unidades Som ogyi son una expresión del núm ero de m iligram os de glucosa liberados en 3 0 m in a 37°C en condiciones de ensayo específicas. Los m étodos crom ogénicos em plean alm idón com o el sustrato en el que se ha añadido un coloran te crom ogéni­ co, que form a un com plejo insolu ble colorante-sustrato. Cuando la AMS hidroliza el sustrato de alm idón, se pro­ ducen fragm entos más pequeños de coloran te-sustrato, y éstos son hidrosolubles. E l increm en to en la intensidad de color de la disolu ción de coloran te-sustrato soluble es proporcional a la actividad de AMS. E n fechas recientes, se han em pleado sistem as de enzi­ ma acoplada para determ inar la actividad de AMS m edian­ te una técnica de m onitoreo con tin u o en el que se m ide el cam bio de absorbancia de NAD+ a 3 4 0 nm . La ecuación 10-22 es u n ejem plo de u n m étodo de m onitoreo co n ti­ nuo. Para actividad de AM S, el pH óptim o es 6.9. ALT

M altopentosa

m altrotriosa + m altosa

M altrotriosa + m altosa

a-glucosidasa

5-glucosa

(Ec. 10-22)

Debido a que la AMS salival es inhibid a preferencialm ente por lectina de germ en de trigo, la AMS salival y pancreática se puede estim ar m idiendo la AM S total en presencia y ausencia de lectina. Tam bién están inm un oensayos específicos para m edir isoenzim as de AMS.

F u e n te d e e rro r La AMS en el suero y la orina es estable. O curre poca pér­ dida de actividad a tem peratura am biente durante una sem ana o a 4°C durante dos m eses. D ebido a que los triglicéridos plasm áticos suprim en o inhib en la actividad de la AMS sérica, los valores de AMS pueden ser norm ales en p ancreatitis aguda co n hiperlipem ia. La adm inistración de m orfina y otros opiáceos para ali­ viar el dolor antes del m uestreo sanguíneo darán lugar a concentraciones de AMS sérica falsam ente altas. Se presume que los fárm acos causan constricción del esfínter de Oddi y conductos pancreáticos, con elevación posterior de presión inarticulada que causa regurgitación de AMS en el suero.

Intervalo d e referen cia AMS: suero, 25 a 13 0 U/L; orina, 1 a 15 U/hora. Com o resultado de los d istintos proced im ientos de AMS en la actualidad en uso, la actividad se expresa de acuerdo con cada procedim iento. No hay expresión uniform e de actividad de AM S, aunque con frecu encia se em plean u n i­ dades Som ogyi. E l factor de conversión aproxim ado entre unidades Som ogyi y unidades intern acionales es 1.85.

Lipasa La lipasa (LP S) es una enzim a que hidroliza los enlaces de éster de las grasas para producir alcoholes y ácidos grasos. De m anera específica, la LPS cataliza la hidrólisis parcial de triglicéridos de la dieta en el in testin o al interm edia­ rio 2-m onoglicérid o, con p rod u cción de ácidos grasos de cadena larga. La reacción procede de acuerdo con la ecua­ ción 1 0 -2 3 :

CUADRO 10-6. M ETO D O LO G ÍA S D E A M IL A S A Amiloclástica

Mide la desaparición del sustrato de almidón

Sacarogénico

Mide la apariencia del producto

Cromogénico

Mide el incremento de color de la producción de un producto unido con un tinte cromogénico

Monitoreo continuo

vj-u-r l»

5-g lu co sa-6-fo sfato + 5 NAD ^ — —

Unión de varios sistemas de enzim as para vigilar la actividad de la amilasa

O

CH2— O — C— R i

CH2OH

O

O LPS

C H — O — C — R 2 + 2 H 20 '■ ‘ CH — O — C —R 2 + |

o

2 ácidos grasos

c h 2o h

c h 2— o — c — r 3 Triacilglicerol

2-Monoglicérido

(E c 10-23)

258

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

La actividad enzim ática de la LPS pancreática es específi­ ca para los residuos de ácidos grasos en las posiciones 1 y 3 de la m olécula de triglicérido, pero el sustrato debe ser una em ulsión para que ocurra actividad. La velocidad de reac­ ción se acelera por la presencia de colipasa y una sal biliar.

F u e n te de tejido La co n cen tració n de LPS se encuentra sobre todo en el páncreas, aunque está presente tam bién en el estóm ago y el in testin o delgado.

Im portancia diagnóstica Los ensayos clínicos de m ediciones de LPS sérica están con ­ finados casi de m anera exclusiva al diagnóstico de pancrea­ titis aguda. Es sim ilar en este respecto a las m ediciones de AMS pero más específica para trastornos pancreáticos que la m edición de AMS. Tanto la concentración de AMS com o la de LPS aum entan con rapidez, pero los increm entos de LPS persisten por casi 5 días en pancreatitis aguda, m ien­ tras que los increm entos de AMS persisten durante sólo 2 a 3 días. E l alcance de los increm entos no tiene correlación con la gravedad de la enfermedad. Las concentraciones altas de LPS se pueden hallar tam bién en otras cond icio­ nes intraabdom inales, pero con m enos frecuencia que los increm entos de AMS sérica. Se han determ inado increm en ­ tos en casos de úlceras duodenales penetrantes y pépticas perforadas, obstru cción intestinal y colecistitis aguda. En contraste con las concentraciones de AMS, las concentra­ ciones de LPS son norm ales en condiciones de interacción de las glándulas salivales. Por tanto, las concentraciones de LPS son útiles para diferenciar el increm ento de AMS sérica com o resultado de interacción pancreática contra salival. De las tres isoenzim as de lipasa, se considera que L2 es la más específica y sensible desde el punto de vista clínico.

La LPS es estable en suero, con pérdida insignificante de actividad a tem peratura am biente durante una sem ana o por tres sem anas a 4°C . Se debe evitar la hem olisis porque la hem oglobina inhibe la actividad de la LPS sérica, y cau­ sa valores falsos bajos.

Intervalo d e referen cia LPS, 0 a 1 .0 U/ml.

D eshidrogenasa de glucosa-6-fosfato La deshidrogenasa de glucosa- 6 -fosfato (G - 6-PD ) es una oxidorreductasa que cataliza la oxid ación de glucosa- 6-fosfato a 6-fosfogluconato o la lacton a correspondiente. La reacción es im portante com o prim er paso en la derivación de pentosa-fosfato del m etabolism o de la glucosa con la p rod u cción últim a de NADPH. La reacció n se describe en la ecu ación 10 -2 5 : OH H C ---------HC — OH G-6-PD

HO — CH

0 4 NADP+

HC — OH H C ----------CH 2O P 0 3 =

E nsayo p a ra actividad enzim ática Los proced im ientos em pleados para m edir actividad de LPS inclu yen estim ación de ácidos grasos liberados y m étodos tu rbidim étricos. La reacció n se describe en la ecu ación 10-24: Triglicérido + 2 H20

F u e n te d e e r r o r

G lucosa- 6-fosfato O II C ------------

(p H , 8 .6 -9 .0 )

H C — OH

2-m onoglicérido + 2 ácidos grasos

! H O — CH

(Ec. 10-24) L os prim eros m étodos para LPS fueron h istóricam en ­ te deficientes. E n el m étodo clásico de C herry-C randall se em pleaba un sustrato de aceite de oliva y se m edían los ácidos grasos liberados por titu lación después de una in cu b ació n de 2 4 h. Las m odificaciones del m étodo de C herry-C randall han sido com plicadas por la falta de sus­ tratos estables y uniform es. Sin em bargo, la trioleína es un sustrato que se em plea en la actualidad com o una form a m ás pura de triglicérido. L os m étodos tubidim étricos son m ás sim ples y más rápidos que los ensayos titulom étricos. Las grasas en disolu ción crean una em ulsión turbia. C onform a la LPS hidroliza las grasas, las partículas se dispersan, y la tasa de aclaram iento se puede m edir com o una estim ación de la actividad de la LPS. Los m étodos co lorim étricos están dis­ p onibles y se basan en reacciones acopladas co n enzim as com o la peroxidasa y la cinasa de glicerol.

0 4 NADPH 4 H+

! H C — OH H C ---------CH 20 P 0 3=

6-F osfogluconato

(Ec. 10-25)

F u e n te d e tejido Las fuentes de G - 6-PD inclu yen la corteza suprarrenal, bazo, tim o, nodos linfáticos, glándula m am aria lactante y eritrocitos. Se encuentra poca actividad en el suero nor­ mal.

CAPÍTULO 10 ■ ENZIMAS

E S T U D IO D E C A S O 10-3 U na m u jer hispana de 3 6 años de edad acude al departam ento de urgencias con dolor abdom inal, debilidad y pérdida del apetito; no ha viajado en los m eses recientes, tam poco ha estado b ien durante varios días.

259

Las con cen tracio n es increm entadas de G - 6-PD en el suero han sido descritas en infarto de m iocardio y anem ias m egaloblásticas. E n los trastornos hepáticos no se obser­ van increm en tos. Sin em bargo, las con cen tracio n es de G6-PD no son ejecutadas de form a rutin aria com o m edios auxiliares de diagnóstico en estas cond iciones.

E nsayo p a ra actividad enzim ática E l proced im iento de ensayo para actividad de G - 6-PD se describe en la ecu ación 10 -2 6 :

Preguntas 1. ¿Q ué pruebas de laboratorio se deben ordenar para ayudar al diagnóstico de esta paciente? 2. ¿Q ué pruebas enzim áticas serían útiles en el diag­ nóstico de esta paciente? 3. ¿Q ué par de diagnósticos es m ás probable para esta paciente?





,

G -6 -P D

G lucosa 6-fosfato + NADP+ ^



6-fosfogluconato + NADPH + H + (Ec. 10-26)

Se em plea u n hem olizado de eritrocitos para valorar la deficiencia de la enzim a; el suero se em plea para evalua­ ción de increm en tos enzim áticos.

Intervalo d e referen cia G - 6-PD , 10 a 15 U/g Hgb.

Im portancia diagnóstica C asi todo el interés de la G - 6-PD se cen tra en su fu nción en el eritrocito. Aquí, fu ncion a para m antener al NADPH en form a reducida. Se requiere una con cen tració n ade­ cuada de NADPH para regenerar proteínas que contienen sulfhid rilo, com o el glutatión, del estado oxidado al redu­ cido. E l glutatión en la form a reducida, a su vez, protege a la hem oglobina de oxid ación por agentes que podrían estar presentes en la célula. U na d eficiencia de G - 6-PD da com o resultado un sum inistro inadecuado de NADPH y, en últim a instancia, en la capacidad para m antener con ­ centraciones reducidas de glutatión. Cuando se exponen los eritrocitos a agentes oxid antes, ocurre hem olisis com o resultado de la oxid ación de hem oglobina y daño a la m em brana celular. La d eficiencia de G - 6-PD es u n rasgo hereditario rela­ cionado con el sexo. E l trastorno puede originar diferen­ tes m anifestaciones clín icas, una de las cuales es anem ia h em olítica inducida por fárm acos. Cuando son expuestos a un fárm aco oxidante com o la prim aquina, un fárm aco antipalúdico, los individuos afectados experim entan un episodio h em olítico. La gravedad de la hem olisis se rela­ ciona con la con cen tració n del fárm aco. La d eficiencia de G - 6-PD es m ás com ún en afroestadounidenses, pero ha sido descrita en todo grupo étnico.

P R E G U N T A S 1.

Cuando se lleva a cabo una reacció n en cin ética de orden cero: a) La con cen tració n de sustrato es m uy baja. b) La velocidad de reacció n es directam ente propor­ cional a la con cen tració n de sustrato. c) La velocidad de reacción es independiente de la con cen tració n de sustrato. d) La con cen tració n de enzim a es m uy alta.

RESUMEN Las enzim as, halladas en todos los tejidos del cuerpo, son proteínas que catalizan reacciones bioquím icas. Las reacciones catalizadas son específicas y esenciales para el bienestar fisiológico. En la lesión o en m u chos estados m orbosos, se liberan ciertas enzim as de sus ubicaciones norm ales y aparecen en cantidades increm entadas en la circulación general. E n el diagnóstico y tratam iento de ciertos estados m orbosos es ú til com prender la im portan­ cia biológica de las enzim as y las reacciones que catalizan. E n este capítulo se revisaron las propiedades generales de las enzim as y su clasificación y m ecanism os catalíticos. Se analizaron tam bién varios factores que afectan la velo­ cidad de las reacciones enzim áticas y los m étodos genera­ les para m edir actividad enzim ática. M uchas enzim as son clín icam en te im portantes. Cuantificar las concen traciones séricas de ciertas enzim as o isoenzim as puede ayudar en el diagnóstico y pronóstico de trastornos hepáticos, del m ú sculo esqu elético, óseos, cardíacos; m alignidad, o pancreatitis aguda. E n este capí­ tulo se analizó la fuente de tejid o, la im portancia diagnós­ tica, las m etodologías en ensayo preferidas y los intervalos de referencia de varias enzim as im portantes desde el p u n­ to de vista clínico.

DE 2.

R E P A S O La energía de activación es: a) La energía necesaria para que se detenga una reacció n enzim ática. b) Increm entada por enzim as. c) M uy alta en reacciones catalizadas. d) Reducida por enzim as.

260

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

3. Las velocidades de reacciones enzim áticas se incre­ m entan al aum entar las tem peraturas hasta que alcan­ zan el punto de d esnaturalización en: a) 4 0 a 60°C . b) 25 a 35°C . c) 100°C . d) 37°C . 4. U n ejem plo de usar enzim as com o reactivos en el laboratorio clón ico es: a) E l m étodo de nitrógeno ureico sanguíneo (Ñ U S) m onoxim a de diace tilo. b ) E l m étodo de la hexocin asa glucosa. c) E l m étodo de creatinina de picrato alcalino. d) E l m étodo de proteína total de biuret. 5. Se puede determ inar la actividad de las enzim as en el suero y no la con cen tració n porque: a) La tem peratura es dem asiado alta. b ) La cantidad de enzim a es m uy b aja para medir. c) No hay sustrato suficiente. d ) La cantidad de enzim a es m uy alta para medir.

6 . Las con cen tracio n es de las isoenzim as L D -4 y LD -5 son altas en: a) E m bolism o pulm onar. b) Enferm edad hepática. c) Enferm edad renal. d ) Infarto de m iocardio.

REFERENCIAS 1. Enzyme Nomenclature 1978, Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classification of Enzymes. New York: Academic Press, 1979. 2. Barón DN, Moss DW, Walker PG, et al. Abbreviations for ñames of enzymes of diagnostic importance. J Clin Pathol 1971;24:656. 3. Barón DN, Moss DW, Walker PG, et al. Revised list of abbreviatio­ ns for ñames of enzymes of diagnostic importance. J Clin Pathol 1975;28:592. 4. Rej R. Accurate enzyme measurements. Arch Pathol Lab Med 1998;117:352. 5. Spitzer M, Pinto A. Early diagnosis of ectopic pregnancy: can we do it accurately using a Chemical profile? J Women’s Health Gender Based Med 2000;9:537. 6. Na Kafusa J , et. al. The importance of serum creatine phosphokinase levels in the early diagnosis, and as a prognostic factor, of Vibrio vulnificus infection. Br M edJ 2001;145:2. 7. Galen RS. The enzyme diagnosis of myocardial infarction. Human Pathol 1975;6:141. 8. W ilkinsonJH . The Principies and Practice of Diagnostic Enzymology. Chicago, IL: Year Book Medical Publishers, 1976:395. 9. Silverman LM, Dermer GB, Zweig MH, et al. Creatine kinase BB: a new tumor-associated marker. Clin Chem 1979;25:1432. 10. Lang H, ed. Creatine Kinase Isoenzymes: Pathophysiology and Cli­ nical Application. Berlin: Springer-Verlag, 1981.

7. ¿Q ué isoenzim a de CK tiene una co n cen tració n alta en enferm edades m usculares? d) CK-BB. b ) CK-M B. c) CK-M M . d) CK-N N .

8. Por lo general, el increm ento en la con cen tració n de am ilasa y lipasa séricas se observa en: fl) A pendicitis aguda. b) P ancreatitis aguda. c) Enferm edad de la vesícula biliar. d) Enferm edad de reflujo ácido. 9. E l m étodo saccarogénico para d eterm inaciones de am ilasa mide: a) La cantidad de producto producida. b) La cantidad de sustrato consum ido. c) La cantidad de yodo presente. d) La cantidad de alm idón presente. 10.

E l increm en to de la con cen tració n de enzim as tisulares en el suero se puede usar para detectar: a) Presencia de toxinas. b) Enferm edades infecciosas. c) N ecrosis o daño tisular. d) D iabetes m ellitus.

11. Irvin RG, Cobb FR, Roe CR. Acute myocardial infarction and MB creatine phosphokinase: relationship between onset of symptoms of infarction and appearance and disappearance of enzyme. Arch Intern Med 1980:140:329. 12. Bark CJ. Mitochondrial creatine kinase— a poor prognostic sign. J Am Med Assoc 1980;243:2058. 13. Batsakis J , Savory J , eds. Creatine kinase. Crit Rev Clin Lab Sci 1982;16:291. 14. Lang H, Wurzburg U. Creatine kinase, an enzyme of many forms. Clin Chem 1982;28:1439. 15. Lott JA. Electrophoretic CK and LD isoenzyme assays in myocardial infarction. Lab Management 1983:Feb:23. 16. Pesce MA. The CK isoenzymes: findings and their meaning. Lab Management 1982;Oct:25. 17. Roche Diagnostics. Isomune-CK package insert. Nutley, NJ: Hoffman-La Roche, 1979. 18. Faulkner WR, Meites S, eds. Selected Methods for the Small Clinical Chemistry Laboratory: Selected Methods of Clinical Chemistry. Vol. 9. Washington, D.C.: American Association for Clinical Chemistry, 1982:475. 19. Lott JA, Stang JM. Serum enzymes and isoenzymes in the diagnosis and differential diagnosis of myocardial ischemia and necrosis. Clin Chem 1980:26:1241. 20. Leung FY, Henderson AR. Influence of hemolysis on the serum lactate dehydrogenasel/lactate dehydrogenase-2 ratio as determined by an accurate thin-layer agarose electrophoresis procedure. Clin Chem 1981;27:1708.

CAPÍTULO 10 « EN Z IM A S

21. Bhagavan NV, Darm JR, Scottolini AG. A sixth lactate dehydrogenase isoenzyme (LD-6) and its significance. Arch Pathol Lab Med 1982; 106:521. 22. Cabello B, Lubin J, Rywlin AM, et al. Significance of a sixth lac­ tate dehydrogenase isoenzyme (LDH6). Am J Clin Pathol 1980; 73:253. 23. Goldberg DM, Werner M, eds. LD-6, A Sign of Impending Death From Heart Failure, Selected Topics in Clinical Enzymology. New York: Walter de Gruyter, 1983:347. 24. Posen S, Doherty E. The measurement of serum alkaline phosphatase in clinical medicine. Adv Clin Chem 1981;22:165. 25. Warren BM. The isoenzymes of alkaline phosphatase. Beaumont, TX: Helena Laboratories, 1981. 26. Fleisher GA, Eickelberg ES, Elveback LR. Alkaline phosphata­ se activity in the plasma of children and adolescents. Clin Chem 1977;23:469. 27. Gittes RE Carcinoma of the prostate. N Engl J Med 1991;324:236.

261

28. Gittes RE Prostate specific antigen. N Engl J Med 1987;318:954. 29. Oesterling JE. Prostate specific antigen: a critical assessment of the most useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate. J Urol 1991;145:907. 30. Griffiths JC. The laboratory diagnosis of prostatic adenocarcinoma. Crit Rev Clin Lab Sci 1983;19:187. 31. Lantz RK, Berg MJ. From clinic to court: acid phosphatase testing. Diagn Med 1981;Mar/Apr:55. 32. Yam LT. Clinical significance of the human acid phosphatases. A review. Am J Med 1974;56:604. 33. Rosalki SB. Gamma-glutamyl transpeptidase. Adv Clin Chem 1975;17:53. 34. Salt WB II, Schenker S. Amylase: its clinical significance. A review of the literature. Medicine 1976;4:269. 35. Murthy U, et al. Hyperamylasemia in patients with acquired immunodeficiency syndrome. A m J Gastroenterol 1992;87(3):332.

C A P Í T U L O

11

Carbohidratos Vicki S. Freeman

C O N T E N I D O ■ DESCRIPCIÓN G EN ER A L DE LOS CARBO H ID RATO S Clasificación de los carbohidratos Estereoisómeros Monosacárídos, disacáridos y polisacáridos Propiedades químicas de los carbohidratos Metabolismo de la glucosa Destino de la glucosa Regulación del mecanismo de carbohidratos ■ H IPERG LU CEM IA Diabetes mellitus Fisiopatología de la diabetes mellitus Criterios para el diagnóstico de la diabetes mellitus ■ H IPO G LU CEM IA Defectos genéticos en el metabolismo de carbohidratos

D EL

C A P Í T U L O

■ FUNCIÓN DEL LA BO RATO RIO EN EL DIAGNÓ STICO D IFEREN C IAL Y EL TRATAM IEN TO DE PACIENTES CON ALTERAC IO N ES M ETABÓ LICAS DE LA G LU CO SA Métodos de medición de glucosa Autom onitoreo de glucosa sanguínea (AMGS) Tolerancia a la glucosa y pruebas posprandiales de dos horas Hemoglobina glucosilada Cetonas Microalbuminuria Prueba de autoanticuerpo insulínico de los islotes ■ RESUM EN ■ PREGUNTAS DE REPASO ■ REFEREN CIAS

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Clasificar los carbohidratos en sus respectivos grupos. • Explicar el metabolismo de los carbohidratos en el cuerpo y el modo de acción de las hormonas en el metabolismo de carbohidratos. • Diferenciar los tipos de diabetes m ediante sínto­ mas clínicos y hallazgos de laboratorio de acuerdo con la American Diabetes Association (ADA) • Explicar la importancia clínica de los tres cuerpos cetónicos. • Relacionar los resultados de laboratorio esperados y los síntom as clínicos para las siguientes compli­ caciones metabólicas de la diabetes. ■ cetoacidosis ■ coma hiperosmolar

262

• •



• •

Distinguir entre hipoglucemia reactiva y espontánea. Describir el principio, muestra de elección, y las ventajas y desventajas de los métodos de análisis de la glucosa. Describir los tres métodos hallados por lo común para hemoglobina glucosilada, muestra de elec­ ción y fuente de error. Describir el uso de hemoglobina glucosilada en el monitoreo a largo plazo de la diabetes. Explicar los métodos de análisis, y las ventajas y desventajas de los cuerpos cetónicos.

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

T E R M I N O S Carbohidratos Cetona Diabetes mellitus Disacárido Glucagon

Glucógeno Glucogenólisis Glucólisis Gluconeogénesis Hemoglobina glucosilada

Los organism os dependen de la oxid ación de com pues­ tos orgánicos com p lejos para obtener energía. Tres tipos generales de esta clase de com puestos son carbohidratos, am inoácid os y lípidos. Aunque los tres se em plean com o fuente de energía, los carbohid ratos son la fuente prim a­ ria del cerebro, eritrocitos y células retinales en hum anos. L os carbohidratos son la fuente de alim ento principal y sum inistro de energía del cuerpo, y se alm acenan sobre todo com o glucógeno del hígado y m úsculo. Los estados m orbosos relacionados con carbohid ratos se dividen en dos grupos: hiperglucem ia e hipoglucem ia. La d etección oportuna de diabetes m ellitus es el objetivo de las norm as de la A m erican Diabetes Association establecidas en 1997. Las com plicaciones aguda y crónica se pueden evitar con el diagnóstico, m onitoreo y tratam iento. E l laboratorio desem peña u n papel im portante a través de m ediciones periódicas de hem oglobina glucosilada y m icroalbúm ina.

DESCRIPCIÓN GEN ERAL DE LOS CARBOHIDRATOS Los carbohidratos son com puestos que con tien en C, H y O. La fórm ula general para un carbohidrato es Cx(H 20 ) y. Los carbohid ratos contien en los grupos fu ncionales C = 0 y -O H . Hay algunos derivados de esta fórm ula básica porque los derivados de carbohidratos se pueden form ar m ediante la ad ición de otros grupos quím icos, com o fosfatos, sulfatos y am inas. La clasificación de carbohidratos se basa en cuatro propiedades distintas: a ) el tam año de la cadena de carbono base, b) la ub icació n del grupo fu ncional C O , c) el núm ero de unidades de azúcar y d) la estereoquím ica del com puesto.

263

C L A V E

Hiperglucémico Hipoglucémico Insulina Microalbuminuria Monosacárido

Poiisacárido Proyección de Fisher Proyección de Haworth Triosa Vía de Em bden-M yerhof

Los carbohidratos son hidratos de derivados de aldehi­ do o cetona con base en la u b icació n del grupo funcional CO (fig. 1 1 -1 ). Las dos form as de carbohid ratos son aldosa y cetosa (fig. 1 1 -2 ). La aldosa tiene u n aldehido com o su grupo funcion al, m ientras que la cetosa tiene una cetona com o el grupo funcional. E l carbono en el grupo fu ncional se llam a carbono anom érico. Se em plean varios m odelos para representar carb ohi­ dratos. La proyección de F isher de un carbohidrato tiene al aldehido o ceton a en la parte superior del d ibujo. Los carbonos se nu m eran com enzando en el extrem o aldehido o cetona. E l com puesto se puede representar com o una cadena recta o se podría u n ir para m ostrar una represen­ tación de la form a hem iacetal cíclica (fig. 1 1 -3 ). La pro­ yección d e H aworth representa al com puesto en la form a cíclica que es más representativa de la estructura real. Esta estructura se form a cuando el grupo fu ncional (ceton a o aldehido) reacciona con un grupo alcoh ol en el m ism o azúcar para form ar u n anillo llam ado el anillo hem iacetal (fig. 1 1 -4 ).

O

H

V

c h 2o h

H— C — OH I R Aldosa FIGURA 11-2.

c= o I R Cetosa

Dos formas de carbohidratos.

Clasificación de los carbohidratos Los carbohidratos se pueden agrupar en clasificaciones gené­ ricas con base en el número de carbonos en la molécula. Por ejem plo, las triosas contienen tres carbonos, las tetrosas cua­ tro, las pentosas cinco y las hexosas seis. En la práctica real, el carbohidrato más pequeño es el gliceraldehído, un com ­ puesto de tres carbonos.

O

R

II

R— C — R

H— C = 0

Cetona

Aldehido

FIGURA 11-1.

Estructuras de un aldehido y una cetona.

H— C= 0

I

H— C — OH

HO— C — H I H— C — OH I H— C — OH c h 2o h

H— C — OH

I

H— C — OH

I

HO— C — H

I

H— C — OH H— C --------c h 2o h

FIGURA 11-3. Proyección de Fisher de la glucosa. La figura de la izquierda es la proyección de Fisher de cadena abierta, y la figura de la derecha es una proyección de Fisher cíclica.

264

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

M onosacáridos, disacáridos y polisacáridos

Estereoisóm eros Los carbonos centrales de un carbohidrato son asim étri­ cos — cuatro grupos d istintos están un idos a los átom os de carbono. E sto perm ite tener varias configuraciones espa­ ciales de m oléculas de carbohidrato llamadas estereoisóme­ ros. É stos tien en el m ism o orden y tipos de enlaces pero diferentes d isposiciones espaciales y propiedades d istin­ tas. Por cada carbono asim étrico, hay 2 n isóm eros posi­ bles; por tanto, hay 2 1, o dos, form as de gliceraldehído. Estos isóm eros son im ágenes especulares. D ebido a que una aldosa contiene cuatro carbonos asim étricos, hay 24 o 16 isóm eros posibles, dos de los cuales son estereoisóm e­ ros designados D-glucosa y L-glucosa. D y L son térm inos em pleados para d escribir algunos de los posibles isóm eros óp ticos de glucosa y otros com puestos que existen com o estereoisóm eros. Son im ágenes especulares que n o se p u e­ den superponer. La configuración D tiene al -O H en el m enor carbono asim étrico a la derecha; la form a L tiene al -O H a la izquierda. En la figura 1 1 -5 , la D-glucosa se representa en la proyección de F ish er con el grupo hidroxi en el carbono núm ero 5 colocado a la derecha. La L-gluco­ sa tiene al grupo hidroxi en el carbono cin co ubicado a la izquierda. La m ayor parte de los azúcares en los hum anos están en la form a D.

H— C = 0 I H— C— OH I HO— C— H ! H— C— OH ! H— C — OH c h 2o h

D-Glucosa

FIGURA 11-5.

H— C = 0 HO— C — H HO— C — H H— C — OH I H— C — OH c h 2o h

L-Glucosa

O tra cla sifica ció n de los carb o h id rato s se basa en el nú m ero de un id ad es de azúcar en la cad en a: m o n o sacá­ rid os, d isacárid os, o lig o sacárid os y p o lisacárid os. E ste en cad en am ien to de azúcares depende de la fo rm a ció n de en laces g lu co sid ico s que son p u en tes de áto m os de ox íg en o. C uando se u n en dos m o lécu la s de ca rb o h id ra­ to, se produ ce una m o lécu la de agua. C uand o se divi­ den, se em plea una m o lécu la de agua para form ar los com p u estos individ uales. Esta re a cció n se llam a h id ró­ lisis. E n los en laces g lu co sid ico s de ca rb o h id ra to puede p articip ar cu a lq u ier nú m ero de ca rb o n o s; sin em bargo, d ep end iend o del carb oh id rato se fav orecen cierto s car­ b on o s. Los m onosacáridos son azúcares sim ples que no pueden hidrolizarse a una form a más sim ple. E stos azúcares co n ­ tien en tres, cuatro, cin co y seis o m ás átom os de carbono (co n ocid o s com o triosas, tetrosas, pentosas y h exosas, res­ pectivam ente). Los m ás com unes son glucosa, fructosa y galactosa. Los disacáridos se form an en la in teracció n de grupos entre dos m onosacáridos con la p rod u cción de una m o lé­ cu la de agua. E n la hidrólisis, los disacáridos serán divi­ didos en dos m onosacáridos por enzim as de disacárido (co m o la lactasa) localizadas en las m icrovellosidades del intestino. E stos m onosacáridos son absorbidos de m ane­ ra activa. Los disacáridos más com unes son m altosa (que com prende m oléculas de 2-|3-D-glucosa en u n enlace 1—» 4 ), lactosa y sucrosa. Los oligosacáridos son los encad enam ientos de dos a 10 unidades de azúcar, m ientras que los p olisacáridos se for­ m an m ediante el enlace de m uchas unidades de m onosacárido. E n la hidrólisis, los polisacáridos producirán más de diez m onosacáridos. La am ilasa hidroliza al alm idón a disacáridos en el duodeno. Los polisacáridos más com u ­ nes son alm idón (m olécu las de glucosa) y glucógeno (fig. 11 - 6 ).

Propiedades quím icas de los carbohidratos Algunos carbohid ratos son sustancias reductoras; éstos pueden reducir u oxidar otros com puestos. Para ser una sustancia reductora, el carbohidrato debe con ten er un grupo cetona o aldehido. E jem plos de sustancias reductoras son glucosa, m altosa, fructosa, lactosa y galactosa. Esta propiedad se usó en m u chos m étodos de laboratorio en el pasado en la d eterm inación de carbohidratos. Los carbohidratos pueden form ar enlaces glucosidicos con otros carbohidratos y con no carbohidratos. La aldosa o

Estereoisómeros de la glucosa.

FIGURA 11-6.

Enlace de monosacáridos.

CAPITULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

grupo ceton a en el carbohidrato form a un enlace de oxíg e­ no. Si el enlace se form a con uno de los otros carbonos en el carbohid rato distintos al carbono anom érico, este ú lti­ m o (grupo fu ncional) no sufre ningún cam bio y el grupo resultante es una sustancia reductora. Si el enlace se form a con el carbono anom érico en el otro carbohidrato, el com puesto resultante y a no es una sustancia reductora. Los carbohid ratos n o reductores no tienen u n grupo cetona o aldehido activo. No oxid arán o reducirán otros com puestos. E l azúcar no red uctor más com ún es la sucrosa, azúcar de m esa (fig. 1 1 -7 ). Los m onosacáridos y m u ch os d isacáridos son agentes reductores. E sto se debe a que el aldehido o cetona libre (la form a de cadena abierta) se puede oxid ar b a jo cond i­ cion es apropiadas. Com o un d isacárido, uno de los alde­ hidos o ceton as suele ser alfa para al enlace glucosíd ico. E l otro aldehido o cetona aún está libre para fu ncion ar com o agente reductor. Sin em bargo, cuando am bos alde­ hidos o cetonas son alfa respecto al en lace glucosíd ico, com o en la sucrosa, entonces el disacárido es capaz de experim entar m utarrotación y es, por tanto, incapaz de fu n ­ cion ar com o u n agente reductor. Tanto la m altosa com o la lactosa son agentes reductores, m ien tras que la sucrosa no lo es.

M etabolism o de la glucosa La glucosa es la fuente prim aria de energía para los hum a­ nos. E l sistem a nervioso, inclu so el cerebro, depende por com pleto de la glucosa del líquido extracelular circund an­ te (L E C ) para la energía. E l tejid o nervioso no puede con ­ centrar o alm acenar carbohidratos; por tanto, es crítico m antener un sum inistro perm anente de glucosa para el tejido. P or esta razón, la con cen tració n de glucosa en el L E C se debe m antener en un intervalo reducido. Cuando la con cen tració n cae abajo de cierto nivel, el tejido ner­ vioso pierde la fuente de energía prim aria y es incapaz de m antener la fu n ció n n orm al.

Destino de la glucosa La m ayor parte de los carbohid ratos que ingerim os son polím eros, com o el alm idón y el glucógeno. La digestión de estos polím eros no absorbibles a d extrinas y d isacári­ dos, que luego son hidrolizados a m onosacáridos por la m altasa, una enzim a liberada por la m ucosa intestinal, se debe a la am ilasa salival y a la pancreática. La sucrasa y la

FIGURA 11-7.

Proyección de Haworth de la sucrosa.

265

lactasa son otras dos enzim as im portantes derivadas del in testin o que hidrolizan la sucrosa a glucosa, y la fructosa y lactosa a glucosa y galactosa. Cuando los disacáridos son convertidos a m onosa­ cáridos, son absorbidos por el in testin o y transportados al hígado por el sum inistro sanguíneo venoso del portal hepático. La glucosa es el ú n ico carbohidrato que se usa de m anera directa para energía o se alm acena com o glucó­ geno. La galactosa y la fructosa deben convertirse a gluco­ sa antes que se puedan usar. D espués que la glucosa entra a la célula, es desviada con rapidez hacia una de tres posi­ bles vías m etabólicas, dependiendo de la disponibilidad de sustratos o del estado n u tricion al de la célula. El o b je ­ tivo final de la célula es convertir la glucosa en dióxido de carbono y agua. D urante este proceso, la célula obtiene la m olécula de alta energía trifosfato de adenosina (ATP) de fosfato inorgánico y difosfato de adenosina (A D P). La célula requiere oxígeno para las etapas finales en la cade­ na de transporte de electrones (C T E ). E l d inucleótido de nicotinam ida y adenina (N AD) en su form a reducida (NADH) actuará com o un interm ediario para acoplar la oxid ación de glucosa a la C T E en las m itocond rias donde se obtiene m u cho del ATP. E l prim er paso para las tres vías requiere que la glucosa sea convertida a glucosa- 6-fosfato por m edio de la m olé­ cula de alta energía, ATP. Esta reacció n se cataliza m edian­ te la enzim a hexocinasa (fig. 1 1 -8 ). La glucosa 6-fosfato puede entrar a la vía de E m bdm -M yerhoj o a la vía del m onofosfato de hexosa o se puede convertir en glucógeno (fig. 1 1 -8 ). Las prim eras dos vías son im portantes para la g eneración de energía a partir de glucosa; la conversión a la vía del glucógeno es im portante para el alm acenam iento de glucosa. E n la vía de Em bden-M yerhof, la glucosa se d escom ­ pone en dos m oléculas de tres carbonos de ácido pirúvico que pueden entrar al ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo ATC) en la conversión a acetil-coenzim a A (acetil-C oA ). Esta vía requiere oxígeno y se denom ina vía aerób ica (fig. 1 1 -8 ). O tros sustratos tienen la oportunidad de entrar a la vía en varios puntos. E l glicerol liberado de la h id ró­ lisis de triglicéridos puede entrar en 3-fosfog licerato, los ácidos grasos y cetonas, y algunos am inoácidos pueden ser convertidos o catabolizados a acetil-C oA , que es par­ te del ciclo del ATC. O tros am inoácidos entran a la vía com o piruvato o com o a-ce to á cid o s o a -o x o á cid o s des­ anim ados. La conversión de am inoácidos por el hígado y otro tejido especializado, com o el riñ ón , a sustratos que pueden ser convertidos a glucosa se llam a gluconeogénesis. Esta últim a tam bién com prende la conversión a glicerol, lactato y piruvato a glucosa. La glucólisis anaeróbica es im portante para tejid o com o el m ú sculo, que con frecuencia tiene requ isitos de energía im portantes sin u n sum inistro adecuado de oxígen o. Estos tejidos pueden derivar ATP de la glucosa en un am biente con d eficiencia de oxígeno al convertir el ácido pirúvico en ácido láctico. E l ácido láctico se difunde desde las célu ­ las del m úsculo, entra a la circu lació n sistém ica y luego el hígado lo tom a y em plea (fig. 1 1 -8 ). Para que ocurra la glucólisis anaeróbica, se deben con su m ir dos m oles de

266

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

G LUCO SA EXTRACELULAR

GLUCÓGENO '

Slntasa de

ATP^ CO Sa

G A L A C T O S A \ \ 9 luc°9 en0 Hexocinasa

Glucosa 1-PO¿

j

T

Glucosa-6-fosfatasa (sólo hígado)

ADPGlucosa 6 -PO 4

Acido 6 -fosfoglucónico

I

Pentosas Fructosa 6 -P 0 4 ATP Fosfofructooinasa 1 Fructosa-1,6 -bisfosfatasa ADP-«rí Fructosa 1,6 -dlfosfato

M AÑ O SA

Gliceraldehído 3-P 0 4 (2)

il

3-Fosfogliceról fosfato (2) 2 NAD+ 2 AD P LIPIDOS Glicerol Acidos grasos. PROTEÍNA

2 NADH 2 ATP 3-Fosfogl¡cerato (2)

Fosfoenolpiruvato (2)

2AD P^ I A ^Cinasa de piruvatoj 2 NADH 2 A T P -< < Y I Piruvato (2)

2 NAD+

-
glucosa Incrementa la gluconeogénesis: Ácidos g raso s-------- » acetil-CoA -------- » cetona Pro teín as-------- » aminoácidos

de glucosa. La som atostatina, producida por las células 5 de los islotes de Langerhans del páncreas, increm en ta las con cen tracio n es de glucosa plasm ática m ediante la in h i­ b ició n de insulina, glucagon, horm ona del crecim iento y otras horm onas endocrinas.

hígado, m ú sculo y tejid o adiposo. Tam bién altera las vías m etabólicas de la glucosa. La hiperglucem ia, o con cen tra­ cion es altas de glucosa plasm ática, es causada por un des­ equilibrio de horm onas.

D iabetes m ellitus HIPERGLUCEM IA La hiperglucem ia es u n increm ento en las concentraciones de glucosa plasm ática. En pacientes saludables, durante u n estado de hiperglucem ia, las células (3 de los islotes pancreáticos de Langerhans secretan insulina. Ésta in cre­ m enta la perm eabilidad de la m em brana a células del

La diabetes mellitus es en realidad un grupo de enferm e­ dades m etabólicas caracterizadas por hiperglucem ia que resultan de defectos en la secreción de insulina, a cción de ésta, o am bas. E n 1 9 7 9 , el grupo N ational D iabetes D ata elaboró u n esquem a de clasificación y diagnóstico para la diabetes m ellitu s .1 E n este esquem a se incluyó la diabetes

ES T U D IO D E C A S O 11-1 U n estudiante de preparatoria de 18 años de edad con una historia de cuatro años de diabetes m ellitus es lle­ vado al departam ento de urgencias debido a som n olen ­ cia excesiva, vóm ito y diarrea. Su diabetes ha estado b ien controlada con 4 0 unidades de insulina NPH dia­ ria hasta hace varios días cuando presentó sed excesi­ va y poliuria. D urante los tres días anteriores tam bién había experim entado cefalea, m ialgia y fiebre de m enor grado. La diarrea y el vóm ito com enzaron hace un día. ANÁLISIS DE ORINA

Densidad relativa

QUÍMICA DE RESULTADOS DE PRUEBA

1.012

Sodio

126 mEq/L

pH

5.0

Potasio

6.1 mEq/L

Glucosa

4+

Cloruro

87 mEq/L

Cetona

Gran cantidad

Bicarbonato

6 mEq/L

Glucosa plasmática

600 mg/dL

ÑUS

48 mg/dL

Creatinina

2.0 mg/dL

Cetonas séricas

4+

Preguntas 1. ¿C uál es el diagnóstico probable de este paciente con base en los datos presentados? 2. ¿Q ué p ru eba(s) de laboratorio se debe llevar a cabo para h acer un seguim iento de este pacien te y ayudar a ajustar las concen tracio nes de insulina? 3. ¿P or qué son positivas las cetonas de la orina? 4 . ¿Q ué m étodos se em plean para cu antificar la ce to ­ nas de la orina? ¿Q ué cetonas se detectarán?

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

m ellitus en dos categorías am plias: tipo 1 , diabetes m elli­ tus insulinodependiente (D M ID ), y tipo 2, diabetes m elli­ tus no insulinodepend iente (D M N ID ). E stablecid o en 1 9 9 5 , el C om ité de E xpertos In tern acio­ nal en el D iagnóstico y C lasificación de la D iabetes M elli­ tus, trabajando b ajo el p atrocinio de la ADA, se le asignó la tarea de actualizar el sistem a de clasificación de 1979. Los cam bios propuestos inclu yeron elim inar los térm inos antiguos DM ID y DM NID. Se retuvieron las categorías de tipo 1 y 2 , co n la adopción de núm eros arábigos en lugar de núm ero rom anos (cuadro 1 1 -3 ).2 P or tanto, las norm as de la ADA y la O rganización M undial de la Salud (O M S) recom endaron las siguientes categorías de diabetes: • • • •

D iabetes tipo 1 D iabetes tipo 2 O tros tipos específicos de diabetes D iabetes m ellitus gestacional (D M G )

La diabetes tipo 1 se caracteriza por hiperglucem ia inapropiada que es resultado sobre todo de la d estrucción de células (3 de los islotes p ancreáticos y una tendencia a cetoacidosis. La diabetes tipo 2 , en contraste, inclu ye casos de hiperglucem ia que resultan de resistencia a la insulina

CUADRO 11-3. C LA SIFIC A C IÓ N D E LA D IA B ETES M ELLITUS PATOGÉNESIS

Tipo 1

Destrucción de células |3 Deficiencia de insulina absoluta Autoanticuerpos • Autoanticuerpos de células de los islotes • Autoanticuerpos de insulina • Autoanticuerpos de descarboxilasa de ácido glutámico • Autoanticuerpos IA-2 y IA-2B de fosfatasa de tirosina

Tipo 2

Resistencia a la insulina con un defecto secretorio de insulina Deficiencia de insulina relativa

Otra

Relacionada con condiciones secundarias • Defectos genéticos de la función de las células |3 • Enfermedad pancreática • Enfermedad endocrina • Inducida por fármacos o sustancias químicas • Anormalidades del receptor de insulina • Otros síndromes genéticos

Gestacional

Intolerancia a la glucosa durante el embarazo Debida a cambios metabólicos y hormonales

269

con u n defecto secretorio de insulina. U na etapa interm e­ dia, en la que la glucosa de ayuno se increm en ta arriba de los lím ites norm ales pero no a la con cen tració n de diabe­ tes, ha sido denom inada glucosa de ayuno alterada. Se retu­ vo el térm ino intolerancia a la glucosa para indicar valores de tolerancia a la glucosa arriba de lo norm al pero abajo de las con cen tracio n es de diabetes. A sim ism o, se retuvo el térm ino diabetes mellitus gestacional para m ujeres que d esarrollan intoleran cia a la glucosa durante el embarazo. La diabetes m ellitus tipo 1 es un resultado de la d estruc­ ción autoinm une m ediada por células de las células (3 del páncreas, que causa una d eficiencia absoluta de secreción de insulina. E l lím ite superior de 1 1 0 mg/dl en la glucosa plasm ática de ayuno se designa com o el lím ite superior de la glucosa sanguínea norm al. E l tipo 1 constitu ye sólo 10 a 20% de toda la diabetes y, por lo general, ocu rre en la niñez y la adolescencia. Esta enferm edad se in icia norm al­ m ente por u n factor am biental o in fecció n (por lo regular un virus) en individuos con pred isposición genética y cau­ sa la d estru cción inm un e de las células |3 del páncreas y, por tanto, una produ cción reducida de insulina. Las carac­ terísticas de la diabetes tipo 1 in clu y en in icio abrupto, dependencia de insulina y tendencia a cetoacid osis. E l tipo diabético está relacionado de m anera genética. U no o más de los m arcadores siguientes se encuentra en 8 5 a 90% de los individuos con hiperglucem ia de ayuno: autoanticuerpos de las células de los islotes, autoanticuerpos de insuli­ na, autoanticuerpos de descarboxilasa de ácido glutám ico y anticuerpos de fosfatasa de tirosina IA -2, IA -2B. Los signos y síntom as inclu yen polidipsia (sed ex ce ­ siva), polifagia (m ayor ingestión de alim en to s), poliuria (prod ucción excesiva de orin a), pérdida rápida de peso, hiperventilación, confusión m ental y posible pérdida de la con cien cia (debido a m ayor cantidad de glucosa para el cerebro). E ntre las com plicaciones están los proble­ mas m icrovasculares com o nefropatía, neuropatía y retinopatía. U na m ayor cardiopatía tam bién se encuentra en pacientes con diabetes. En el cuadro 1 1 -4 se listan los hallazgos de laboratorio en la hiperglucem ia. La diabetes idiopática tipo 1 es una form a de diabetes tipo 1 que no tiene causas conocid as, depende m u cho de la herencia y no tiene autoinm unidad de células (5. Los individuos con esta form a de diabetes tienen requisitos episódicos para reem plazo de insulina. La diabetes mellitus tipo 2 se caracteriza por hiperglu­ cem ia com o resultado de la resistencia de un individuo a la insulina con u n defecto secretorio de insulina. Esta

CUADRO 11-4. H A LLA ZG O S D E LABORATO RIO EN H IP ER G LU CEM IA _____________________________________ Concentración alta de glucosa en plasma y orina Mayor densidad relativa de la orina Mayor osmolalidad de suero y orina Cetonas en suero y orina (cetonemia y cetonuria) pH reducido de sangre y orina (acidosis)

Desequilibrio electrolítico

270

PARTE II ■ CORRELACIONES CLINICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

resistencia origina una deficiencia de insulina relativa no absoluta. E l tipo 2 constituye la m ayor parte de los casos de diabetes. La m ayoría de los pacientes co n este tipo de diabetes son obesos o tienen u n alto porcen taje de distri­ b u ció n de grasa corporal en la región abdom inal. E ste tipo de diabetes suele no ser diagnosticada durante m uchos años y se relaciona con una fuerte predisposición genéti­ ca, donde los pacientes con m ayor riesgo son los de m ayor edad, con obesidad y falta de ejercicio físico. De ordinario, las características inclu yen in icio de la enferm edad en la edad adulta y síntom as más leves que en la diabetes tipo 1 . P ocas veces se presenta cetoacidosis. Sin em bargo, estos pacientes tien en m ás probabilidades de entrar en un com a hiperosm olar y poseen m ayor riesgo de desarrollar com ­ plicaciones m acro y m icrovasculares.

Otros tipos específicos de diabetes se relacionan con cier­ tas cond icion es (secund arias), que inclu yen defectos gené­ ticos de la fu nción de las células |3 o acción de la insulina, enferm edad pancreática, enferm edades de origen end o­ crino, anorm alidades de receptores de insulina inducidas por fárm acos o com puestos quím icos y ciertos síndrom es genéticos. Las características y pron óstico de esta form a de diabetes dependen del trastorno prim ario. La diabetes de la ju v en tu d de in icio en la madurez (M O D Y) es una form a rara de diabetes que es heredada en un m odo dom inante au tosóm ico .3 La diabetes mellitus gestacional (DMG) es “cualquier grado de in toleran cia a la glucosa con in icio o prim er reco ­ nocim iento durante el em barazo ”.4 Las causas de DM G son cam bios m etabólicos y horm onales. Las pacien tes con

ES T U D IO D E C A S O 11-2 U n varón obeso de 5 8 años de edad co n orina frecuente acude a consu lta co n su m éd ico de atención prim aria. Se realizó el siguiente trabajo de laboratorio, y se obtu ­ vieron los siguientes resultados: Glucosa plasmática casual

225 mg/dl

Preguntas 1. ¿C uál es el diagnóstico probable de este paciente? 2. ¿Q ué otra p ru eba(s) se debe realizar para confirm ar esto? ¿C uál es la prueba preferida? 3. D espués del diagnóstico, ¿qué p ru eba(s) se debe lle­ var a cabo para m onitorear esta cond ición?

A nálisis de orina Color y apariencia

Pálido/claro

Sangre

Negativo

pH

6.0

Bilirrubina

Negativo

Densidad relativa

1.025

Urobilinógeno

Negativo

Glucosa

2+

Nitritos

Negativo

Cetonas

Negativo

Esterasa de leucocitos

Negativo

E S T U D IO D E C A S O 11-3 U n estudiante de 14 años de edad recibe aten ción de un m édico. Sus dolencias principales son fatiga; pérdida de peso; e increm en to del apetito, sed, y m icció n frecu en­ te. D urante las tres a cuatro sem anas pasadas ha tenido sed excesiva y orina cada pocas horas. Em pezó a levan­ tarse tres a cuatro veces en la n o ch e a orinar. E l pacien ­ te tiene antecedentes fam iliares de diabetes m ellitus. Datos de laboratorio Glucosa plasmática de ayuno

160 mg/dl

Análisis de orina

Densidad relativa

1.040

Glucosa

4+

Cetonas

Cantidad moderada

Preguntas 1. C on base en la inform ación anterior, ¿se puede diag­ nosticar que este paciente tiene diabetes? 2. ¿Q ué pruebas ad icionales se pueden realizar para con firm ar el diagnóstico? 3. De acuerdo con la American D iabetes A ssociation, ¿qué criterios se requieren para el diagnóstico de diabetes? 4 . Suponiendo que este pacien te tiene diabetes, ¿de qué tipo sería?

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

D M G con frecu encia vuelven a la norm alidad después del parto. Sin em bargo, esta enferm edad se relaciona con com ­ plicaciones perinatales increm entadas y un m ayor riesgo de desarrollar diabetes m ellitus en años posteriores. Los infantes que nacen de m adres con diabetes tienen m ayor riesgo de síndrom e de dificultad respiratoria, hip ocalcem ia e hiperbilirrubinem ia. La secreción de insulina fetal es estim ulada en el neonato de una madre con diabetes. Sin em bargo, cuando nace el infante y se corta el cordón um bilical, se interrum pe de m anera abrupta el sum inistro en exceso del infante, lo cual causa hipoglucem ia aguda.

Fisiopatología de la diabetes m ellitus E n la diabetes tipo 1 y tipo 2, el individuo tendrá hiperglu­ cem ia, que puede ser grave. La glucosuria tam bién pue­ de ocu rrir después que se satura el sistem a de transporte tubular renal para la glucosa. E sto sucede cuando la co n ­ cen tración de glucosa del plasm a excede casi 1 8 0 mg/dl en u n individuo con fu nción renal y produ cción de orina norm ales. A medida que con tinú a la sobreprod ucción de glucosa hepática, la con cen tració n de glucosa plasm ática se estabiliza en alrededor de 3 0 0 a 5 0 0 mg/dl (1 7 a 28 mmol/L). Siem pre que se m antenga la produ cción renal, la excreció n de glucosa corresponderá con la sobreproduc­ ción , que causa el nivel relativam ente estable. E l individuo con diabetes tipo 1 tiene una m ayor ten­ dencia a producir cetonas. Los pacientes con diabetes tipo 2 pocas veces generan cetonas, pero en cam bio tienen una m ayor tendencia a desarrollar estados no cetósicos hiperosm olares. Al parecer la diferencia en las concen tracion es de glucagon e insulina en estos dos grupos causa la gene­ ración de cetonas a través de la oxid ación (3 increm entada. E n el tipo 1, hay ausencia de insulina con un exceso de glucagon. E sto perm ite que ocu rran la gluconeogénesis y la lipólisis. E n el tipo 2 , la insulina está presente com o tal (a veces) en la hiperinsu linem ia; por tanto, el glucagon está atenuado. En el tipo 2 se inhib e la oxid ación de áci­ dos grasos. E sto causa que los ácidos grasos se in corp oren en los triglicéridos para lib eración com o lipoproteínas de m uy b aja densidad. Los hallazgos de laboratorio de u n pacien te con dia­ b etes o cetoacid osis tienden a reflejar deshidratación, alteración de electrólitos y acidosis. E l acetoacetato, el |3hidroxibutirato y la cetona se producen de la oxid ación de ácidos grasos. Los dos prim eros cuerpos cetón icos co n tri­ buyen a la acidosis. E l lactato, ácidos grasos y otros ácidos orgánicos tam bién pueden con trib u ir en m enor grado. De ordinario, las con cen tracio n es de bicarbonato y dióxido de carbono total son bajas debido a la respiración de K ussm au l-K ien (respiraciones profundas). É ste es un m ecanis­ m o de com p en sación para expulsar d ióxido de carbon o y elim inar iones hidrógeno en el proceso. E l intervalo am ó­ n ico en esta acidosis puede exced er 16 mmol/L. La osm olalidad sérica es alta com o resultado de hiperglucem ia; las con cen tracio n es de sodio tienden a ser m ás b ajas en parte debido a las pérdidas (poliuria) y en parte a un cam bio de agua de las células com o resultado de la hiperglucem ia. E l valor del sodio no se debe subestim ar falsam ente com o

271

resultado de la hipertrigliceridem ia. La con cen tració n de triglicéridos increm entada en dem asía desplazará al volu­ m en plasm ático y dará la apariencia de una m enor canti­ dad de electró litos cuando se em pleen fotom etría de flama o electrodos específicos de ion es, prediluidos, para deter­ m inaciones de sodio. La hiperpotasem ia casi siem pre está presente com o resultado del desplazam iento de potasio de las células en la acidosis. E sto es un poco engañoso porque p or lo general la con cen tració n de potasio en el cuerpo del pacien te es baja. Más representativo del paciente con diabetes tipo 2 sin tratam iento es el estado hiperosm olar no cetósico. E l individuo que presenta este síndrom e tiene una sobre­ produ cción de glucosa; sin em bargo, al parecer hay un desequilibrio entre produ cción y elim inación en la orina. Con frecuencia, este estado es precipitado por cardiopatía, accidente cerebrovascular o pancreatitis. Las con cen tra­ cion es de glucosa exced en los 3 0 0 a 5 0 0 mg/dl (1 7 a 2 8 mmol/L) y hay d eshidratación intensa. É sta contribuye a la incapacidad para excretar glucosa en la orina. La m or­ talidad es alta con esta condición. No se observa presencia de cetonas porque el estado hiperosm olar agudo inhibe la capacidad del glucagon para estim ular la lipólisis. Los hallazgos de laboratorio de com a hiperosmolar no cetósico incluyen valores de glucosa plasmática mayores que 1000 mg/dl (5 5 mmol/L), con centracio n es norm ales o altas de sodio y potasio en el plasm a, co n cen tració n u n poco baja de bicarbonato, con cen tracio n es altas de nitrógeno ureico sanguíneo (Ñ U S) y creatinina e increm en to de la osm olalidad. E l aum ento total de glucosa y osm olalidad, el in cre­ m ento de ÑUS y la ausencia de cetonas distinguen a esta con d ició n de la cetoacidosis diabética. O tras form as de m etabolism o dañado de la glucosa que no satisfacen los criterios para diabetes m ellitus inclu yen glucosa de ayuno alterada e in tolerancia a la glucosa. Estas form as se analizan en la siguiente sección .

Criterios para el diagnóstico de la d iabetes m ellitus E l C om ité de E xpertos de EUA m odificó los criterios de diagnóstico para la diabetes m ellitus a fin de perm itir la d etección oportuna de la enferm edad. Según las reco­ m end aciones de la ADA, los adultos con m ás de 4 5 años deben solicitar un a m ed ición de la glucosa sanguínea de ayuno cada tres años a m enos que la persona esté enterada que tiene diabetes. La prueba se debe realizar a una edad m en or o con más frecuencia en persona que m uestren: • Obesidad (1 2 0 % del peso corporal deseable o índ ice de masa corporal [1MC] de 2 7 kg/m2). • A ntecedentes fam iliares de diabetes en un pariente de prim er grado. • P ertenencia a una población m inoritaria de alto riesgo (p. e j., afroestadounidense, hispanoam ericano, nativo am ericano o asiaestadounidense). • A ntecedentes de DM G o dar a luz u n b eb é > 4 . 1 kg. • H ipertensión (> 1 4 0 / 9 0 ) • C oncentraciones bajas de colesterol de lipoproteínas de alta densidad (H D L) (p. e j., < 3 5 mg/dl)

272

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 11-5. C R IT E R IO S D E D IA G N Ó S T IC O

CUADRO 11-6. C A T E G O R ÍA S D E G L U C O S A

PARA. D IA B E T E S M E L L IT U S

P LA SM Á TIC A D E AYUNO

1. Glucosa plasmática aleatoria >200 mg/dl (11.1 mmol/L) + síntomas de diabetes

Glucosa de ayuno normal

GSA 110 mg/dl y 126 mg/dl

Diagnóstico provisional de diabetes

GSA >126 mg/dl

2. Glucosa plasmática de ayuno >126 mg/dl (7.0 mmol/L) 3. Glucosa plasmática de dos horas >200 mg/dl (11.1 mmol/L) durante una POTG Se deben confirmar tres criterios cualesquiera en un día posterior por cualquiera de los tres métodos.

CUADRO 11-7. C A T E G O R ÍA S D E TO LER A N C IA DE G LU C O SA O RAL

• C o n centraciones altas de triglicéridos (co m o > 2 5 0 mg/ di) • A ntecedentes de glucosa de ayuno alterada e in toleran­ cia a la glucosa Los criterios listados en los cuadros 1 1 -5 , 1 1 -6 y 11 -7 sugieren tres m étodos de diagnóstico, cada uno de los cu a­ les se debe confirm ar en u n día posterior m ediante cu al­ quiera de los tres m étodos. E stos m étodos son a) síntom as de diabetes m ás una con cen tració n plasm ática aleatoria 2:200 mg/dl, b) glucosa plasm ática de ayuno > 1 2 6 mg/dl o c) una prueba oral de tolerancia a la glucosa (P O T G ) con una co n cen tració n de poscarga de 2 h (carga de glucosa de 75 g) 2 :2 0 0 mg/dl. La prueba preferida para diagnóstico de diabetes es la m ed ición de la con cen tració n de glucosa plasm ática en ayuno. M ediante dos m étodos se definió un grupo in term e­ dio que no cum plió co n los criterios de diabetes m elli­ tus pero que tuvo concen tracio nes de glucosa arriba de lo norm al. Prim ero, a los pacientes con concentraciones de glucosa de ayuno 2 1 1 0 mg/dl pero < 1 2 6 mg/dl se les

Tolerancia a la glucosa normal

GP de 2 h 140 mg/dL y 200 mg/dL

asignó el nom bre de grupo con glucosa de ayuno alterada. O tro co n ju n to de pacien tes que tuvieron concen traciones de PO T G de 2 h 2 1 4 0 mg/dl pero < 2 0 0 m/dl se definió com o intolerancia a la glucosa. Los criterios de diagnóstico para diabetes gestacional siguen las norm as establecidas por el A m erican C ollege o f Obstetrics and Gynecology. La d etección de DM G es sólo para pacientes de alto riesgo. Los criterios para m ujeres en riesgo alto son cualquiera de los siguientes: edad de m ás de 2 5 años; sobrepeso; antecedentes fam iliares de diabetes; o bien ser afroestadounidense, hispanoam erica­ na o nativa am ericana. Las pruebas de d etección inclu yen la m ed ición de glucosa plasm ática una hora después de la carga (carga de 5 0 g de glucosa). Si el valor es 2 1 4 0 mg/dl

ES T U D IO D E C A S O 11-4 U na adolescente de 13 años de edad sufre un colapso en el patio de la escuela. Cuando se contacta a la m adre, m enciona que su h ija ha estado perdiendo peso y que va con frecu encia al baño durante la n och e. La brigada de rescate notó un aliento con olor a frutas. Al ingresar al departam ento de urgencias sus signos vitales fueron los siguientes: Presión arterial

98/50

Respiraciones

Rápidas

Temperatura

37.2°C

Los resultados del laboratorio incluyeron ORINA ALEATO RIA

QU ÍM ICA DEL SUERO

pH

5.5

Glucosa

500 mg/dl

Proteína

Negativo

Cetonas

Positivo

Glucosa

4+

ÑUS

6

Cetonas

Moderada

Creatinina

0.4 mg/dl

Sangre

Negativo

mg/dl

Preguntas 1. Identifique el tipo más probable de diabetes de esta paciente. 2. C on base en su identificación , circule las caracterís­ ticas m ás com unes relacionadas con el tipo de diabe­ tes en el estudio de caso anterior. 3. ¿C uál es la causa de aliento con olor a frutas?

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

(7 .8 mmol/dl), entonces es necesario llevar a cabo una P O TG con una carga de 1 0 0 g de glucosa. La DM G se diag­ n ostica cuando se satisfacen o exced en dos de los cuatro valores siguientes: ayuno, > 1 0 5 mg/dl, 1 hora, < 1 9 0 mg/ di; 2 horas, S 1 6 5 mg/dl; o 3 h, ^ 1 4 5 mg/dl.

H IPO GLUCEM IA La hípoglucem ia tiene que ver con con cen tracio n es redu­ cidas de glucosa plasm ática y puede tener m u chas causas -alg u n as son transitorias y relativam ente insignificantes; otras pueden ser una am enaza para la vida. La con cen tra­ ción de glucosa plasm ática a la que se liberan glucagon y otros factores glucém icos está entre 6 5 y 7 0 mg/dl (3 .6 a 3 .9 mmol/L); en cerca de 5 0 a 5 5 mg/dl (2 .8 a 3 .0 mmol/ L ), aparecen síntom as observables de hípoglucem ia. Los signos y síntom as de advertencia de hípoglucem ia están relacionados con el sistem a nervioso. La lib eración de adrenalina hacia la circulación sistém ica y noradrenalina en las term inales nerviosas de neuronas específicas actúan ju n to con el glucagon para increm en tar la glucosa plas­ mática. E l glucagon se libera de las células de los islotes del páncreas e inhibe a la insulina. La adrenalina se libera de la glánd u la su p rarren al e in cre m en ta el m e ta b o lism o de la glucosa e inhib e a la insulina. Además, el cortisol y la horm ona del crecim iento se liberan e increm entan el m eta­ bolism o de la glucosa. H istóricam ente, la hípoglucem ia se clasificó com o posabsortiva (de ayuno) y posprandial (reactiva). Sin em bargo, la hípoglucem ia reactiva sólo describía el m om en­ to de la hípoglucem ia, n o la causa. Los enfoques actuales h acen pensar en una clasificación con base en las caracte­ rísticas clínicas. Esta clasificación separa a los pacientes en los que parecen estar saludables y los que están enferm os

273

(cuadro 1 1 -8 ).5 E ntre los pacien tes que en apariencia son saludables, están aquéllos con una enferm edad coexisten te com pensada o sin ella. En esta categoría se incluye a indi­ viduos en los que las m ed icaciones pueden ser la causa de la hípoglucem ia por ingestión incid ental a causa de error de dispensación. Es posible que las personas enferm as tengan una enferm edad que predispone a hípoglucem ia, o b ien pueden experim entar in teracció n entre el fárm aco y la enferm edad que origina hípoglucem ia. La hípoglucem ia en pacientes hospitalizados se puede adscribir a factores yatrogénicos. Los síntom as de hípoglucem ia son m ucha ham bre, sudación, náusea y vóm ito, m areo, nerviosism o y agitación, habla titubeante y visión borrosa y confu sión m ental. Los hallazgos de laboratorio inclu y en con cen tra­ ciones b ajas de glucosa plasm ática durante el episodio

CUADRO 11-8. C A U SA S DE H IPO G LU CEM IA El paciente parece saludable Enfermedad no coexistente

Fármacos Insulinoma Hiperplasia de los islotes/ nesidioblastosis Hípoglucemia facticial de insulina o sulfonilurea Hípoglucemia cetósica

Enfermedad coexistente compensada

Fármacos

El paciente parece enfermo Fármacos Enfermedad predisponentes Paciente hospitalizado

ES T U D IO D E C A S O 11-5 Una m u jer de 2 8 años de edad da a luz a un infante de 4 .3 kg. E l peso y longitud del infante estuvieron arriba del percentil 9 5 . La historia de la madre fue in com p le­ ta; afirm ó no haber tenido aten ción m édica durante su em barazo. P oco después del nacim ien to, el infante se volvió letárgico y flácido. E n la enferm ería se realizó un análisis de glucosa sanguínea com pleta y de calcio ionizado con los siguientes resultados: Glucosa sanguínea completa

25 mg/dl

Caldo ionizado

4.9 mg/dl

Se extrajo glucosa plasm ática y se analizó en el labora­ torio principal para confirm ar los hallazgos de sangre com pleta. Glucosa plasmática

33 mg/dl

Se in ició una disolu ción de glucosa intravenosa, y se m idió cada hora la glucosa sanguínea com pleta.

Preguntas 1. Dé la exp licación posible para el gran peso y tam año del infante al nacer. 2. Si la madre fuera una persona con diabetes gestacio­ nal, ¿por qué su bebé fue hipoglucém ico? 3. ¿Por qué hubo discrepancia entre la con cen tració n de sangre com pleta y la de glucosa plasm ática? 4. Si la m adre hubiera sido m onitoreada durante el em barazo, ¿qué pruebas de laboratorio debieron haber sido realizadas, y qué criterio s habrían ind ica­ do que tenía diabetes gestacional?

274

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

ES T U D IO D E C A S O 11-6 Se realizaron pruebas de laboratorio en una m u jer cau­ cásica, delgada, de 5 0 años de edad durante un exam en físico anual. Ella no tiene an tecedentes de diabetes, y tam poco se co n o ce que haya tenido con cen tracio n es altas de glucosa durante sus em barazos.

Preguntas 1. ¿Cuál es el diagnóstico probable de esta paciente? 2. Describa el seguim iento adecuado para esta paciente. 3. ¿Cuál es la prueba de d etección preferida para diabe­ tes en m u jeres adultas no embarazadas?

Resultados de laboratorio Glucosa sanguínea de ayuno (GSA)

90 mg/dl

Colesterol

140 mg/dl

HDL

40 mg/dl

Triglicéridos

90 mg/dl

hipoglucém ico y concentracio n es altas de insulina en pacientes con tum ores pancreáticos de células |3 (insu lin om a). Para investigar un insulinom a, se requiere que el p acien te ayune en cond iciones controladas. Los varones y las m u jeres tien en diferentes patrones m etabólicos en ayunos prolongados. E l varón saludable m antendrá una con cen tració n de glucosa plasm ática de 5 0 a 6 0 mg/dl (3.1 a 3 .3 mmol/L) durante varios días. Las m ujeres saludables producirán cetonas con más facilidad y perm itirán que la glucosa plasm ática dism inuya a 4 0 mg/dl (2 .2 mmol/L) o m enos. Los criterios de diagnóstico para un in su lin o­ m a inclu yen un cam bio en la co n cen tració n de glucosa m ayor o igual que 25 mg/dl (1 .4 mmmol/L) coinciden te con una con cen tració n de insulina >6 qU/ml (3 6 pmol/ L ), con cen tracio n es de péptido C S O .2 nmol/L; co n cen ­ traciones de proinsulina > 5 pmol/L, y/o concentraciones de [3-hidroxibutirato < 2 .7 mmol/L .6

Defectos genéticos en el m etabolism o de carbohidratos Las enferm edades de alm acenam iento de glucógeno son resul­ tado de la deficiencia de una enzim a específica que causa una alternancia del m etabolism o del glucógeno. La form a congénita más com ún de enferm edad por alm acenam ien­ to de glucógeno es la deficiencia tipo 1 de glucosa- 6-fosfatasa, que se llam a tam bién enferm edad de von Gierke, una enferm edad recesiva autosóm ica. Esta enferm edad se caracteriza por hipoglucem ia grave que coincid e con acidosis m etabólica, cetonem ia y concen traciones altas de lactato y alanina. La hipoglucem ia ocurre porque el glucó­ geno no se puede convertir de nuevo a glucosa por m edio de la gluconeogénesis hepática. E n el hígado se halla una acu m ulación de glucógeno, que causa hepatom egalia. Por lo general, los pacientes tienen hipoglucem ia, hiperlipidem ia, uricem ia y retardo del crecim iento graves. Una biopsia hepática m ostrará una tinción de glucógeno positiva. Aun­ que la acum ulación de glucógeno es irreversible, se puede tener b ajo control la enferm edad si se evita el desarrollo de hipoglucem ia. E l trasplante de hígado corrige la cond ición hipoglucém ica. La deficiencia de enzim as com o sintasa de

4 . ¿C uáles son los factores de riesgo que indicarían la posibilidad de que esta paciente desarrollara diabe­ tes?

glucógeno, fru c to sa -l, 6-bisfosfatasa, carboxicinasa de fosfoenolpiruvato y carboxilasa de piruvato causan hipogluce­ mia. La deficiencia de enzim a desram ificante de glucógeno no causa hipoglucem ia pero causa hepatom egalia. La galactosem ia, una causa de síndrom e de retraso del desarrollo en infantes, es una deficiencia congénita de una de las tres enzim as que intervienen en el m etabolism o de la galactosa, y da com o resultado un increm ento de las concentraciones de galactosa en el plasma. La deficiencia de enzim a más com ún es la transferasa de uridilo galactosa-l-fo sfato. La galactosem ia ocurre com o resultado de la in h ib ición de glucogenólisis y va acom pañada de diarrea y vóm ito. La galactosa se debe elim inar de la dieta para evitar el desarrollo de com plicaciones irreversibles. Si se deja sin tratam iento, el paciente desarrollará retraso m ental y catara­ tas. E l trastorno se puede identificar m idiendo la actividad de la galactosa- 1 -fosfato uridiltransferasa en los eritrocitos. Los hallazgos de laboratorio incluyen hipoglucem ia, hiperbilirrubinem ia y acum ulación de galactosa en la sangre, tejido y orina después de la ingestión de leche. Otra defi­ ciencia de enzim a, fru ctosa-l-fosfato aldolasa, causa náusea e hiperglucem ia después de la ingestión de fructosa. Los errores innatos específicos del m etabolism o de am inoácidos y la oxid ación de ácidos grasos de cadena larga son tam bién causa de hipoglucem ia. Asim ism o, hay hipoglucem ias alim entarias e idiopáticas. La hipoglucem ia alim entaria al parecer es causada por un increm en to en la lib eración de insulina en respuesta a absorción rápida de nu trientes después de una com ida o la secreción rápida de factores gástricos que liberan insulina. La hipoglucem ia posprandial idiopática es un diagnóstico controversial que es posible que se em plee dem asiado .7

FUNCIÓN DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓS­ TICO DIFERENCIAL Y EL TRATAM IENTO DE PACIENTES CON ALTERACIONES M ETABÓLI­ CAS DE LA G LU CO SA La d em ostración de hiperglucem ia o hipoglucem ia en cond icion es específicas se em plea para d iagnosticar dia­ betes y cond iciones hipoglucém icas. Se han desarrollado

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

275

ES T U D IO D E C A S O 11-7 D urante tres m eses con secutivos una paciente fue som etida a exám enes de glucosa en ayuno y hem oglo­ bina glucosilada. Los resultados son los siguientes: PRIMER

SEGU N D O

TERCER

TRIM ESTRE

TRIM ESTRE

TRIM ESTRE

Glucosa en ayuno (GSA)

280 mg/dl

Hgb glucosilada

7.8%

85 mg/dl

15.3%

91 mg/dl

8.5%

Preguntas 1. ¿E n qué trim estre estuvo m ejo r controlada la glu­ cosa del paciente? ¿En cuál trim estre el con trol fue m ínim o? 2. ¿C oncuerdan la GSA y la Hgb glucosilada? ¿P or qué sí o por qué no? 3. ¿Q ué m étodos se em plean para m edir la hem oglobi­ na glucosilada? 4 . ¿Q ué cond icion es potenciales podrían causar resul­ tados erróneos?

Hgb = hem oglobina.

otras pruebas de laboratorio para identificar insulinom as y m onitorear el con trol glucém ico y el desarrollo de com ­ plicaciones renales.

M étodos de medición de glucosa La glucosa se puede m edir del suero, plasm a o sangre com ­ pleta. E n la actualidad, la m ayor parte de las m ediciones de glucosa se realizan en suero o plasm a. La con cen tració n de glucosa en sangre com pleta es alrededor de 15% más b aja que la con cen tració n de glucosa en suero o plasm a. E l suero o el plasm a se deben refrigerar y separar de las célu ­ las en el plazo de una hora para evitar la pérdida sustancial de glucosa por fraccionam iento celular, en particular si es alta la cu enta de leu cocitos. Se em plean iones de fluoru­ ro de sodio com o anticoagulante y conservador de sangre com pleta, en particular si se retrasa el análisis. E l fluoruro inhibe las enzim as glucolíticas. La glucosa sanguínea de ayuno (G SA ) se debe obten er después de u n ayuno de casi 10 horas (no > 1 6 h ). E l líquido cefalorraquídeo y la orina tam bién se pueden analizar. La m ed ición de glucosa en la orina no se emplea en el diagnóstico de la diabetes; sin em bargo, algunos pacientes usan esta m ed ición para pro­ pósitos de m onitoreo. La capacidad de la glucosa para fu ncionar com o un agente reductor ha sido ú til en la d etección y cu antifi­ cación de carbohidratos en líquidos corporales. La glucosa y otros carbohidratos son capaces de convertir los iones cú pricos en d isolu ción alcalina a iones cuprosos. La d iso­ lu ción pierde su color azul intenso y se form a u n precipi­ tado ro jo de óxido cuproso. Los reactivos de B en ed ict y Fehling, que contienen una d isolu ción alcalina de iones cú pricos estabilizados por citrato o tartrato, respectiva­ m ente, han sido utilizados para detectar agentes reductores en la orina y otros líquidos corporales. O tra característica quím ica que se aprovecha para cu antificar carbohidratos es la capacidad de estas m oléculas para form ar bases de Sch iff con am inas arom áticas. La O -tolu id ina en una diso­ lu ción ácida caliente producirá un com puesto coloreado con una absorbancia m áxim a a 6 3 0 nm . La galactosa, una

aldohexosa, y la m añosa, una aldopentosa, reaccionarán tam bién co n O -toluidina y producirán un com puesto coloreado que puede interferir con la reacción. La reac­ ción de base de S ch iff con O -tolu id ina es sólo de interés h istórico y ha sido reem plazada por m étodos enzim áticos m ás específicos, que se analizan en la siguiente sección. E n los m étodos más com unes de análisis de glucosa se em plean las enzim as oxidasa de glucosa o hexocinasa (cuadro 1 1 -9 ). La oxidasa de glucosa es la enzim a más específica que reacciona sólo con p-D-glucosa. La oxidasa de glucosa convierte a la p-D-glucosa en ácido glucónico. La m utarrotasa se puede añadir a la reacció n para facili­ tar la conversión a-D -glucosa en fl-D-glucosa. Se consum e oxígeno y se produce peróxido de hidrógeno. La reacción se puede m onitorear polarográficam ente ya sea m idiendo la tasa de desaparición de oxígeno con un electrodo de oxígeno o consum iendo peróxido de hidrógeno en una reacción secundaria. La peroxidasa de rábano se em plea para catalizar la segunda reacción, y el peróxido de h id ró­ geno se em plea para oxidar un com puesto colorante. Dos crom ógenos de uso com ún son la hidrazona de 3-m etil2-ben zotiazolinona y la N ,N -dim etilanilina. El cam bio de absorbancia se puede m onitorear esp ectrofotom étricam ente y es proporcional a la cantidad de glucosa presen­ te en la m uestra. E sta reacción acoplada se co n o ce com o reacción de Trinder. Sin em bargo, la reacción de acop la­ m iento de peroxidasa em pleada en el m étodo de oxidasa de glucosa está sujeta a interferencia positiva y negativa. Las con cen tracio n es altas de ácido ú rico , bilirrubina y áci­ do ascórbico pueden causar valores reducidos falsos com o resultado de que la peroxidasa oxida a estas sustancias, lo que evita la oxid ación y d etección de crom ógeno. Las sustancias oxidantes fuertes, com o el blanqueador, causan valores altos falsos. Se puede usar un electrodo de co n ­ sum o de oxígeno para efectuar una m ed ición directa de oxígeno m ediante la técnica polarográfica, que evita esta interferencia. Se m ide el agotam iento de oxígeno y es pro­ porcional a la cantidad de glucosa presente. Los analiza­ dores polarográficos de glucosa m id en la tasa de consum o de oxígeno porque la glucosa se oxida en cond iciones de

276

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 11-9. MÉTODOS DE MEDICIÓN DE GLUCOSA Oxidato de glucosa

oxidasa de glucosa

Glucosa + 0 2 + H20 --------------------- » ácido glucónico + H20 2 peroxidasa

H20 2 + cromogeno reducido -------------» cromógeno oxidado + H20

Hexocinasa

hexocinasa

Glucosa + ATP -------------» glucosa 6-P04 + ADP G-6-PD

Glucosa 6-P04 + NADP -------------* NADPH + H+ + 6-fosfogluconato Clinitest

Sustancia reductora + Cu+2--------------- » Cu+10

prim er orden con el reactivo oxidasa de glucosa. E l H 20 , form ado se debe elim inar en una reacción lateral para evi­ tar la reacció n inversa. E l m olibdato se puede usar para catalizar la oxid ación del yoduro a yodo con o se puede usar la catalasa para catalizar la oxid ación de etanol con H , 0 2 para form ar acetaldehído y H 20 . Se considera que el m étodo de hexocinasa es m ás exacto que los m étodos de oxidasa de glucosa porque la reacción de acoplam iento con deshidrogenasa de glucosa- 6-fosfato es m uy especifica; por tanto, tiene m enos interferencia que el proced im iento de oxidasa de glucosa. La h e x o ci­ nasa en presencia de ATP convierte a la glucosa en glu­ cosa 6-fosfato. La glucosa 6 -fosfato y el cofactor NADP+ se convierten a 6-fosfogluconato y NADPH m ediante la deshidrogenasa de glucosa- 6-fosfato. E l NADPH tiene un m áxim o de absorbancia fuerte a 3 4 0 nm ; la tasa de apa­ rició n del NADPH se puede m onitorear por m edio de un espectrofotóm etro y es proporcional a la cantidad de glu­ cosa presente en la m uestra. Aceptado en general com o m étodo de referencia, este m étodo no es afectado por el ácido ascórbico o el ácido ú rico. La hem olisis total y la con cen tració n extrem adam ente alta de bilirrubina puede causar una d ism inu ción falsa en los resultados. E l m étodo de la hexo cin asa se puede llevar a cabo en suero o plasma recolectado co n heparina, ácido etilendiam inotetracético (ED TA ), fluoruro, oxalato o citrato. E l m étodo se puede usar tam bién para orina, líquido cefalorraquídeo y líqu i­ dos serosos.

Los m étodos no específicos de m ed ición de glucosa aún se usan en la secció n de análisis de orina del laboratorio sobre todo para detectar sustancias reductoras d istintas a la glucosa. E l m étodo siguiente es una m odificación de B ened ict, llam ada tam bién reacción Clinitest.

A utom onitoreo de glucosa sanguínea (AM GS) La ADA ha recom endado que individuos con diabetes deben autom onitorear sus con cen tracio n es de glucosa sanguínea en un esfuerzo por m antener las con cen tra­ ciones lo m ás norm al posible. Para personas con diabetes tipo 1, la recom end ación es 3 a 4 veces/día; para personas con diabetes tipo 2, se d esconoce la frecu encia óptim a. Es im portante enseñar a los pacientes cóm o usar d isolu cio­ nes de con trol y calibradores para asegurar la exactitu d de sus resultad os .9 La prueba de glucosa en orina se debe reem plazar por el AM GS; sin em bargo, la prueba de cetona en orina se conserva para la diabetes tipo 1 y gestacional.

Tolerancia a la glucosa y pruebas posprandiales de dos horas Las norm as para el desem peño e interp retación de la pru e­ b a posprandial de 2 h las estableció el C om ité de Expertos. U na variación de esta prueba es usar una carga estandari­ zada de glucosa. Se adm inistra una disolu ción que co n tie ­ n e 75 g de glucosa, y 2 h después se extrae una m uestra

ES T U D IO D E C A S O 11-8 Una paciente saludable de 2 5 años de edad se queja de m areo y sacudidas una hora después de ingerir una gran com ida co n alto contenid o de carbohidratos. El resultado de una prueba aleatoria de glucosa efectuada vía una p u n ció n de digital fue 6 0 mg/dl.

Preguntas 1. Identifique las características de la hipoglucem ia en este estudio de caso. 2. ¿Q ué p ru eba(s) se debe efectuar a con tin u ació n para determ inar el problem a de esta jo v en ? 3. ¿E n qué categoría de hipoglucem ia se inclu iría a esta persona? 4. ¿Q ué criterios se em plearían para d iagnosticar un posible insulinom a?

277

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

para m ed ición de glucosa plasm ática. B ajo estos criterios, el pacien te bebe una carga de glucosa estandarizada (7 5 g) y dos horas después se tom a una m ed ición de glucosa. Si la con cen tració n es a 2 0 0 mg/dl y se confirm a en un día posterior ya sea m ediante una con cen tració n aleatoria increm entada o de glucosa de ayuno, el diagnóstico para el pacien te es de diabetes (véase la exp licación a n te rio r). La pru eba oral de toleran cia a la glucosa (POTG) no se recom ienda para uso ru tinario b a jo las norm as de la ADA. E ste procedim iento es in con v en iente para p acien­ tes, y los m édicos no lo usan para d iagnosticar diabetes. Sin em bargo, si se usa la P O T G , la OM S recom ienda los criterios listados en el cuadro 11 -7 . Es im portante que se prepare de m anera adecuada al pacien te antes de efectuar la prueba. E l paciente debe estar en ayuno durante por lo m enos 10 horas y no m ás de 16, y la prueba se debe reali­ zar en la m añana debido al efecto diurno horm onal sobre la glucosa. Ju sto antes de la tolerancia y m ientras la prueba está en progreso, los pacien tes deben evitar h acer ejerci­ cio, com er, b eber (excepto que el pacien te pueda tom ar agua) y fumar. Los factores que afectan los resultados de tolerancia inclu yen m ed icaciones com o dosis grandes de salicilatos, diuréticos, anticonvulsivos, anticonceptivos orales y corticosteroides. Asim ism o, los problem as gas­ trointestinales com o problem as de m alabsorción, cirugía gastrointestinal y vóm ito y d isfunciones endocrinas pue­ den afectar los resultados de la P O TG . Las norm as reco­ m iendan que sólo se m idan la m uestra de ayuno y la de dos horas, excepto cuando se trata de una em barazada. La dosis de adulto de la disolu ción de glucosa (glucola) es 75 g; los n iños reciben 1.75 g/kg de glucosa hasta una dosis m áxim a de 75 g.

H em oglobina glucosilada E l objetivo del tratam iento del p aciente diabético es m antener la con cen tració n de glucosa sanguínea co n un núm ero m ínim o de fluctuaciones. U n laboratorio puede m edir las concentracio nes de glucosa sérica y plasm ática; adem ás, el pacien te puede autom onitorear las con cen tra­ ciones de glucosa sanguínea com pleta. La regulación de glucosa sanguínea de largo plazo se puede seguir m ediante la m ed ición de hem oglobinas glucosiladas. H em oglobina glucosilada es el térm ino em pleado para describir la form ación de un com puesto de hem oglobina que se co n ju n ta cuando la glucosa (u n azúcar red uctor) reacciona con el grupo am ino de la hem oglobina (una pro­ teína). La m olécula de glucosa se une de m anera no enzi­ m ática a la m olécula de hem oglobina en una estructura de cetoam ina para form ar una cetoam ina. La tasa de form a­ ció n es directam ente proporcional a las concen tracion es de glucosa plasm ática. D ebido a que los eritrocitos prom e­ dio viven casi 120 días, la con cen tració n de hem oglobina glucosilada en cualquier m om en to refleja la con cen tració n de glucosa sanguínea prom edio en los 2 a 3 m eses pre­ vios. Por tanto, la m ed ición de h em oglobina glucosilada provee al especialista clín ico una representación de tiem ­ po prom edio de la con cen tració n de glucosa sanguínea del paciente en los tres m eses pasados. La hem o-globina

A lc (H bAlc), la hem oglobina glucosilada detectada con más frecu encia, es una m olécula de glucosa unida a una o am bas valinas N term inales de las cadenas de |3-polipéptido de la hem oglobina de adulto n o rm al .10 La HbAlc es u n m étodo confiable para m onitorear el con trol de la diabetes de largo plazo en vez de la glucosa plasm ática aleatoria. Los valores norm ales van de 4 .5 a 8 .0 . C on un m odelo de regresión lineal, R ohlfing y co l., determ inaron que por cada cam bio de 1% en el valor de HbAlc, hay un cam bio de 3 5 mg/dl (2 mmol/L) en la glucosa plasm áti­ ca prom edio (cuadro 1 1 -1 0 ).11 Recuerde que dos factores determ inan las con cen tracio n es de hem oglobina glucosi­ lada: la con cen tració n de glucosa prom edio y el lapso de vida de los eritrocitos. Si se reduce el lapso de vida de los eritrocitos debido a otro estado m orboso com o las hem oglobinopatías, la hem oglobina tendrá m enos tiem po para glucosilarse y, por tanto, será m enor la con cen tració n de h em oglobina glucosilada. E l requisito de m uestra para m ed ición de H bAlc es una m uestra de sangre com pleta con EDTA. A ntes del análisis se debe preparar un hem olisato. Los m étodos de m ed ición se agrupan en dos categorías principales: a) con base en las diferencias de carga entre la hem oglobina glucosilada y la m onoglucosilada y b ) características estructurales de glucogrupos en la hem oglobina (crom atografía de afini­ dad e inm un oensayo). No hay con senso sobre el m étodo de referencia y ningún estándar sim ple disponible que se usará en los ensayos. Com o resultado de esto, los valores de HbAlc varían con el m étodo y el laboratorio que los realiza (cuadro 11 - 1 1 ). La crom atografía de afinidad es el m étodo de m ed ición preferido. E n este m étodo, la hem oglobina glucosilada se une al grupo boron ato de la resina y se eluye de m odo selectivo de la cam a de resina con una disolu ción am or­ tiguadora. E ste m étodo no depende de la tem peratura y no es afectado por hem oglobina F, S o C. O tro m étodo de m ed ición em plea crom atografía de intercam bio catiónico en el que las hem oglobinas con carga negativa se un en a

CUADRO 11-10. CO RRELA CIÓ N E ST IM A D A ENTRE CO N CEN TRA CIO N ES PRO M ED IO DE G LU C O SA P LA SM Á TIC A Y DE A 1C10__________ G LU C O SA PLASM ÁTICA M EDIA

65 mg/dl (3.5 mmol/L)

A ,« (% )

4

100 mg/dl (5.5 mmol/L)

5

135 mg/dl (7.5 mmol/L)

6

170 mg/d! (9.5 mmol/L)

7

205 mg/dl (11.5 mmol/L)

8

240 mg/dl (13.5 mmol/L)

9

275 mg/dl (15.5 mmol/L)

10

310 mg/dl (17.5 mmol/L)

11

345 mg/d! (19.5 mmol/L)

12

278

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 11-11. MÉTODOS DE MEDICIÓN DE HEMOGLOBINA GLUCOSILADA Métodos basados en diferencias estructurales Inmunoensayos

Anticuerpos policlonales o monoclonales hacia el grupo N terminal glucosilado de la cadena p de Hgb

Crom atografía de afinidad

Separa con base en la estructura química usando No depende de la temperatura borato para enlazar proteínas glucosiladas No es afectada por otras hemoglobinas

Métodos basados en diferencias de carga Crom atografía de intercambio iónico

Cama de resina con carga positiva

Muy dependiente de la temperatura Afectada por hemoglobinopatías

Electroforesis

La separación se basa en diferencias de carga

Interfieren valores de Hgb F >7%

Enfoque isoeléctrico

Tipo de electroforesis con punto isoeléctrico para separar

Interfiere con pre-Hgb A 1c

Crom atografía líquida de alta presión (CLAP)

Una forma de cromatografía de intercambio iónico

Separa todas las formas de gluco Hgb: A ,a A 1b A 1c

Hgb = hemoglobina.

la cam a de resina cargada positivam ente. La hem oglobina glucosilada se eluye de m odo selectivo de la cam a de resi­ na con una d isolu ción am ortiguadora de pH específico en la que las glucohem oglobinas son las que tien en m ás carga negativa y eluyen prim ero de la colum na. Sin em bargo, este m étodo depende m ucho de la tem peratura y es afec­ tado por hem oglobinopatlas. La presencia de hem oglobi­ na F produce con cen tracio n es increm entadas falsas, y la de hem oglobinas S y C produce con cen tracio n es red uci­ das falsas. La crom atografía líquida de alta presión y los m étodos de electroforesis se em plean tam bién para sepa­ rar varias form as de hem oglobina. C on la crom atografía líquida de alta presión, se pueden separar todas las form as de hem oglobina glucosilada, A la, A]b, A

Cetonas A través del m etabolism o de ácidos grasos el hígado pro­ duce cuerpos cetónicos para proveer una fuente de ener­ gía de lípidos alm acenados a veces de b aja disponibilidad de carbohidratos. Los tres cuerpos cetón icos son acetona (2 % ), ácido acetoacético (2 0 % ) y ácido 3-p -h id ro xibu tírico (7 8 % ). U na con cen tració n b aja de cuerpos cetónicos está presente en el cuerpo todo el tiem po. Sin em bargo, en casos de falta o uso reducido de carbohid ratos com o en la diabetes m ellitus, in an ición o ayuno, dietas con alto contenid o de grasas, vóm ito prolongado y enferm edad de

H O H I II I

-C — C — C — H I I H

H

Acetona

H O H O I II I II H— C — C — C — C — OH

I

H

I

H

alm acenam iento de glucógeno, las con cen tracio n es san ­ guíneas se in crem en tan para satisfacer las necesidades energéticas. E l térm ino ketonem ia se refiere a la acum u­ lación de cetonas en la sangre, y el térm ino cetonuria a la acu m ulación de cetonas en la orina (fig. 1 1 -9 ). La m edi­ ción de cetonas se recom ienda para pacientes con diabetes tipo 1 durante enferm edad aguda, estrés, em barazo, co n ­ centracion es de glucosa sanguínea arriba de 3 0 0 mg/dl, o cuando el pacien te tiene signos de cetoacidosis. E l requisito de m uestra es suero u orina recientes; la m uestra se debe cerrar h erm éticam ente y analizar de in m e­ diato. N ingún m étodo em pleado para la d eterm inación de cetonas reacciona co n los tres cuerpos cetón icos. E n la prueba h istórica (de G erhardt), el cloruro férrico se hacía reaccion ar con cloruro férrico para producir un color rojo. E l proced im iento tenía m uchas sustancias interferentes, in clu so salicilatos. E n un m étodo más com ún , el nitroprusiato de sodio (N a F e[C N ] 5N O ) reacciona con ácido acto acético en un pH alcalino para form ar un co lo r púr­ pura. Si el reactivo con tien e glicerina, en ton ces se detecta acetona. Este m étodo se emplea con la prueba de tira reac­ tiva para orina y tabletas Acetest. U n m étodo enzim ático m ás reciente adaptado a algunos instrum entos autom ati­ zados em plea la enzim a deshidrogenasa de p-hid roxibu tirato para detectar ya sea ácido p-h id roxibu tírico o ácido acetoacético, dependiendo del pH de la d isolu ción. U n pFl de 7 .0 hace que la reacción proceda hacia la derecha (la

H H H O I I I II H— C — C — C — C — OH

I I I

H O H

Ácido acetoacético Ácido p-hidroxibutírico

FIGURA 11-9.

Los tres cuerpos cetónicos.

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

279

C U A D R O 1 1-12. MÉTODOS DE MEDICIÓN DE CETONAS pH alcalino

Nitroprusiato

Ácido acetoacético + nitroprusiato --------------» color púrpura

Enzimático

NADH + H+ + ácido acetoacético *- --------- *• NAD -i-ácido p-hidroxibutirico

P-HBD

absorbancia dism inuye); un pH de 8 .5 a 9 .5 causa que la reacción proceda a la izquierda (se increm en ta la absor­ bancia, cuadro 1 1 - 12 ).

M icroalbum inuria La diabetes m ellitus causa cam bios progresivos a los riñ o ­ nes y en últim a instancia produce nefropatía renal diabé­ tica. Esta com plicación avanza durante años y es posible retrasarla m ediante con trol glucém ico constante. U n pri­ m er indicio de la presencia de nefropatía es u n increm ento de albúm ina urinaria. Las m ed iciones de m icroalbúm ina son útiles para ayudar en el diagnóstico en una etapa in i­ cial y antes del desarrollo de proteinuria. Las con cen tra­ ciones de albúm ina están entre 2 0 y 3 0 0 mg/día.12 Aunque están disponibles tres m étodos para d etección de m icroal­ buminuria, se recom ienda el uso de una reco lecció n de pu nto aleatoria para la m ed ición de la relación albúm ina a creatinina. Las otras dos alternativas, una recolección de 2 4 h o una programada de 4 h durante la n och e, se requiere pocas veces. Se determ ina que u n pacien te tiene m icroalbu m inuria cuando dos de tres m uestras obtenidas en un período de 6 m eses son anorm ales .13

Prueba de autoanticuerpo insulínico de ios islotes La presencia de autoanticuerpos para las células de los islotes |3 del páncreas es característica de la diabetes tipo 1. Sin em bargo, la prueba de autoanticuerpos de los islotes n o se recom ienda en la actualidad para diagnóstico de dia­ betes. E n el futuro, con esta prueba se podría identificar a

ES TU D IO D E C A S O 11-9 Una enferm era que atiende a pacien tes co n diabetes efectúa una prueba de glucosa por p u nción digital en m o nito r de glucosa A ccu -C h eck y obtiene un valor de 2 0 0 mg/dl. Una m uestra de plasm a, recolectada al m ism o tiem po por un flebotom ista y analizada en el laboratorio produce u n valor de glucosa de 2 2 5 mg/dl.

Preguntas 1. ¿Estos dos resultados son significativam ente dis­ tintos? 2. E xplique.

pacientes prediabéticos en riesgo. Las m ed iciones de in su ­ lina no se requieren para diagnóstico de diabetes m ellitus. Sin em bargo, en ciertos estados hipoglucém icos, es im por­ tante con o cer la con cen tració n de insulina en relación con la con cen tració n de glucosa plasm ática.

RESUM EN Los carbohidratos tienen la fórm ula general Cx(El20 ) n. La glucosa es una aldohexosa de seis carbonos. Hay 3 2 isó ­ m eros posibles de aldohexosas diferentes con la fórm ula quím ica. La glucosa y otros azúcares pueden existir en la form a de cadena abierta o anillo. La form a de cadena abier­ ta perm ite al carbonilo reducir los reactivos de B en ed ict y F ehling. La p-D-glucosa es una fuente de energía prim ara para los hum anos. La energía en la form a de ATP se puede obtener de la glucosa por la vía anaeróbica. La energía adi­ cional se obtiene entonces del producto piruvato cuando pasa por el ciclo de ATC. E l sistem a nervioso depende sólo de la glucosa para energía en circunstan cias norm ales. Por tanto, es im portante m antener la co n cen tració n de gluco­ sa dentro de un intervalo norm al. La insulina, producida en las células p del páncreas, capta la glucosa en las células y reduce la glucosa plasm á­ tica posprandialm ente. La insulina tam bién prom ueve la glucogenólisis y la síntesis de triglicéridos. E l glucagon, producido tam bién en las células P del páncreas, se op o­ ne a la acción de la insulina. Tanto el glucagon com o la adrenalina in crem en tan la glucosa plasm ática al activar la gluconeogénesis y la glucogenólisis en el hígado. La glu­ coneogénesis es la form ación de glucosa a partir de lacta­ to, am inoácidos, piruvato y glicerol. La diabetes m ellitus se puede clasificar com o tipo 1 o tipo 2. E l desarrollo de la diabetes tipo 1 al parecer se rela­ ciona en parte co n el genotipo de antígeno de leu cocito hum ano (HLA) de un individuo. E l tipo 1 tam bién pue­ de tener un com ponen te am biental que se cree activa una reacció n inm un e, que cond u ce a una respuesta autoinm une y causa d estru cción de células p. La hiperglucem ia no tratada en la diabetes por lo general no es m ayor que 5 0 0 mg/dl (2 8 mmol/L) cuando la fu nción renal está presente. La cetoacid osis es m ás com ún en el tipo 1; se in crem en ­ ta la osm olalidad, aum enta la co n cen tració n de potasio en el plasm a y se reduce u n poco el sodio plasm ático. La co n cen tració n de bicarbonato dism inuye en respuesta a la acidosis. Se piensa que la diabetes tipo 2 tam bién tiene u n fac­ tor genético. Los individuos con diabetes tipo 2 no tienen d estrucción de células P y pueden tener con cen tracio n es

280

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

de insulina reducidas, norm ales o increm entadas, pero son resistentes a insulina en el tejido. Hay una tendencia m ayor en el tipo 2 hacia com a no cetósico. E l tipo 2 se caracteriza por una con cen tració n de glucosa m ayor que 6 0 0 mg/dl (3 3 mmol/L) y una ausencia de cetonas. E l ÑUS y la osm olalidad se increm entan y se reduce la produ cción de orina. La D M G se puede relacionar con el tipo 2. Las tres pruebas definitivas para la diabetes son a) síntom as de diabetes más una con cen tració n de glucosa plasm áti­ ca aleatoria >200 mg/dl, b ) glucosa plasm ática de ayuno S :1 2 6 mg/dl o c) una P O TG con una con cen tració n de poscarga de 2 h (carga de glucosa de 75 g) ^ 2 0 0 mg/dl. Cualquiera de los tres criterios se debe confirm ar en un

P R E G U N T A S

día posterior m ediante cualquiera de los tres m étodos. El m onitoreo a largo plazo del pacien te co n diabetes incluye el autom onitoreo de glucosa sanguínea, hem oglobina glucosilada periódica y con cen tracio n es de m icroalbúm ina anuales. La hipoglucem ia se clasifica en la actualidad con base en los síntom as clín ico s, con categorías divididas entre p acientes que parecen saludables y los que parecen enfer­ m os. La hipoglucem ia neonatal, congénita y cetósica o cu ­ rre en los niños. Las form as congénitas de hipoglucem ia inclu yen la enferm edad de von G ierke. La galactosem ia es otra variedad de hipoglucem ia congénita relativam ente com ún.

DE

R E P A S O

1. ¿C uál de las siguientes horm onas prom ueve la g lu co­ neogénesis? a) H orm ona del crecim iento. b) H idrocortisona. c) Insulina. d) Tiroxina.

7. Seleccio n e la enzim a que es m ás específica para la (5D-glucosa. a) O xidasa de glucosa. b) D eshidrogenasa de glucosa- 6-fosfato. c) H exocinasa. d) Fosfohexisom erasa.

2. La oxidasa de glucosa oxida la glucosa a ácido glucónico y:

8 . Seleccio ne la enzim a de acoplam iento em pleada en el

a) H20 2. b) C 0 2. c ) H C 0 3. d) h 2o.

m étodo de h exo cin asa para la glucosa. a) D eshidrogenasa de glucosa. b ) G lu co sa- 6-fosfatasa. c) D eshidrogenasa de glucosa- 6-fosfato. d) Peroxidasa.

3. De la glucosa y ATP, la hexocin asa cataliza la form a­ ció n de: a ) A cetil-CoA . b ) F ru ctosa 6-fosfato. c) G lucosa 6-fosfato. d ) Lactosa.

9. Las siguientes son características de la enferm edad de von G ierke E X C E P T O : a) H ipoglucem ia. b) H ipolipidem ia. c) L actato plasm ático increm entado. d) R espuesta subnorm al a adrenalina.

4. ¿Cuál es la muestra preferida para el análisis de glucosa? a) Plasm a y EDTA. b) Plasm a y oxalato de fluoruro. c) Plasm a heparinizado. d) Suero.

10. La prueba de detección preferida para diabetes en m ujeres adultas no embarazadas es la m ed ición de: a ) G lucosa plasm ática de ayuno. b) G lucosa plasm ática aleatoria. c) G lucohem oglobina. d) G lucosa plasm ática de 1 h después de carga de 5 0 g de carbohidrato.

5. E l factor hiperglucém ico producido por el páncreas es: a) H orm ona foliculoestim ulante (FSH ). b ) G lucagon. c) Insulina. d) H orm ona luteinizante (LH ).

6 . ¿En qué principio se basan los m étodos polarográficos de ensayo de glucosa? a) O xid ación no enzim ática de glucosa. b ) Tasa de agotam iento de oxígeno medida. c) Q uim ilu m iniscencia causada por form ación de ATE d) Cam bio de potencial eléctrico cuando se oxida la glucosa.

11. Según las norm as de la ADA de 2 0 0 3 , los tiem pos de m ed ición para con centraciones de glucosa plasm ática durante un a PO T G en pacientes no em barazadas son a) Ayuno y 2 horas. b ) Ayuno y 6 0 m inutos. c) 3 0 , 6 0 , 9 0 y 1 2 0 m inutos. d) Ayuno, 3 0 , 6 0 , 9 0 y 1 2 0 m inutos.

CAPÍTULO 11 ■ CARBOHIDRATOS

12. M onitorear las con centraciones de cuerpos cetónicos en la orina vía reactivos de nitroprusiato provee una m edida sem icuantitativa de: a) A cetoacetato. b) 3-|3-hidroxibutirato. c) Acetona. d) Los tres cuerpos cetón icos. 13. U n factor, distinto a los valores prom edio de glucosa plasm ática, que determ ina la con cen tració n de h em o­ globina glucosilada es: a ) C oncentración de cuerpos cetón icos en el suero. b ) Lapso de vida de los eritrocitos. c) Ingestión de ácido ascórbico. d) C oncentraciones de triglicéridos increm entadas.

REFERENCIAS 1. National Diabetes Data Group. Classification and diagnosis of dia­ betes mellitus and other categories of glucose tolerance. Diabetes 1979;28:1039-1057. 2. Expert Committee on the Diagnosisand Classification of Dia­ betes Mellitus. Report of the Expert Committee on the Diagno­ sis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 2003; 26(Suppl 1):S7. 3. Malchoff CD. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Conn Med 1991;55(11):625. 4. Expert Committee on the Diagnosisand Classification of Dia­ betes Mellitus. Report of the Expert Committee on the Diagno­ sis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 2003; 26(Suppl 1):S10. 5. Service FJ. Classification of hypoglycemic disorders. Endocrinol Metab Clin 1999;28(3):501-517. 6. Service FJ. Medical progress: hypoglycemic disorders. N Engl J Med 1 995;332(17): 1144-1152.

281

14. E l m onitoreo de las con centraciones de cuerpos cetó­ n icos en la orina: a) Es considerado esencial sobre una base diaria para los pacientes diabéticos. b ) Es un m étodo confiable para evaluar el control glucém ico a largo plazo. c) Se recom ienda para pacien tes con diabetes tipo 1 en días m órbidos. d) No lo recom ienda la ADA.

7. Cryer PE. Glucose homeostasis and hypoglycemia. In: Wilson JD , Foster DW, eds. Williams Textbook of Endocrinology. Philadelphia: WB Saunders, 1992. 8. American Diabetes Association. Tests of glycemia in diabetes. Diabe­ tes Care 2003;26(Suppl 1):S106. 9. Higgis PJ, Bunn HE Kinetic analysis of the nonenzymatic glycosylation of hemoglobin. J Biol Chem 1981;256:5204-5208. 10. Eckfeldt JH , Bruns DE. Another step towards standardization of methods for measuring hemoglobin Alc. Clin Chem 1997;43(10): 1811-1813. 11. Rohlfing CL, Wiedmeyer HM, Little RR, et al. Defining the relationship between plasma glucose and HbAlc. Diabetes Care 2 0 02;25(2):275-278. 12. Stehouwer CDA, Donker AJM. Clinical usefulness of measurement of urinary albumin excretion in diabetes mellitus. Neth J Med 1993;42:175. 13. American Diabetes Association. Standards of medical care for patients with diabetes mellitus. Diabetes Care 2003;26(Suppl 1): S42-43.

Lípidos y lipoproteínas Alan T. Remaley, Judith R. McNamara y G. Russell Warnick

C O N T E N I D O

DE L

Q U ÍM IC A DE LÍPIDOS Ácidos grasos Triglicéridos Fosfolípidos Colesterol ESTRU CTU RA G EN ER A L DE LIPOPRO TEÍN AS Quilomicrones Lipoproteínas de muy baja densidad Lipoproteínas de baja densidad Lipoproteína (a) Proteínas de alta densidad FISIO LO G ÍA Y M ETABO LISM O DE LAS LIPOPRO TEÍN AS Absorción de lípidos Vía exógena Vía endógena Vía inversa de transporte de colesterol DISTRIBUCIO NES DE LÍPIDOS Y LIPOPRO TEÍN AS EN LA POBLACIÓ N PREVENCIÓ N, DIAGNÓ STICO Y TRATAM IEN TO DE LA EN FERM ED AD Arteriosclerosis Hiperlipoproteinemia Hípercolesterolemia Hipertrigliceridemia Hiperlipoproteinemia combinada Incremento de Lp(a)

C A P Í T U L O Hipolipoproteinemia Hipoalfalipoproteinemia AN ÁLISIS DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS Medición de lípidos Medición de colesterol Medición de triglicérido Métodos de lipoproteína Métodos de HDL Métodos para LDL Analizadores compactos Métodos de apolipoproteína Medición de fosfolípidos Medición de ácidos grasos ESTAN DARIZACIÓ N DE ENSAYOS DE LÍPIDOS Y LIPOPRO TEÍN AS Precisión Exactitud Interacciones de matriz Red de laboratorios para el método de referencia de colesterol del C.DC Objetivos de desempeño analítico Control de calidad Recolección de la muestra RESUM EN PREGUN TAS DE REPASO REFEREN CIAS

O B J E T I V O S Al term inar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Explicar la fisiología y metabolismo de lípidos y lipoproteínas. • Definir lipoproteína, exógeno, endógeno, quilo­ micrones, ácidos grasos, fosfolípidos, triglicéridos, colesterol, VLDL, LDL, HDL y Lp(a). • Describir las pruebas clínicas em pleadas para eva­ luar lípidos y lipoproteínas, incluso principios y procedimientos. • Evaluar el estado de lípidos o lipoproteínas de! paciente, considerando los datos clínicos.

282

• • •



identificar los intervalos de referencia para los principales lípidos analizados. Explicar la interacción en el cuerpo entre lípidos y lipoproteínas y ias distintas hormonas. Relacionar la importancia clínica de valores de lípi­ dos y lipoproteínas en la medición de cardiopatía coronaria. Describir la incidencia y tipos de anorm alidades de lípidos y lipoproteínas.

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

T É R M I N O S Ácidos grasos Arteriosderosis Cálculo de Friedewald Colesterol

Dislipidemias Endógeno Exógeno Fosfolípidos

Las lipoproteínas constitu yen la “industria del p etró leo” del cuerpo. Com o los grandes buques tanque que reco­ rren los océanos del m undo transportando p etróleo para necesidades de com bu stible, los grandes quilom icrones llevan triglicéridos dietéticos por el sistem a circulatorio a las células, y por fin llegan al hígado a depositar los quilo­ m icron es restantes. Las lipoproteínas de muy b aja densidad (VLDL) son com o cam iones tanque, que llevan triglicéri­ dos ensam blados en el hígado hacia las células para n ece­ sidades de energía o para alm acenam iento com o grasa. Las lipoproteínas de b a ja densidad (LDL), ricas en colesterol, son los m ism os buques tanque casi vacíos que entregan colesterol a las células p eriféricas después que han sido descargados. Las lipoproteínas de b aja densidad (LDL) son el equipo de lim pieza que recoge el colesterol extra para llevarlo de regreso al hígado. E l colesterol, que con trib u ­ ye en exceso a la cardiopatía, es em pleado por el cuerpo para fu nciones útiles com o facilitar el transporte de trigli­ céridos para atender las necesidades de com bu stible del cuerpo y m antener las m em branas de las células, y com o precursor para síntesis de horm onas. Los lípidos y lipoproteínas, que son prim ordiales para el m etabolism o del cuerpo, se han vuelto cada vez más im portantes en la práctica clínica, sobre todo debido a su relación co n la cardiopatía coronaria (C C ). E n m uchos estudios epidem iológicos nacionales e in ternacionales se ha dem ostrado que, sobre todo en países ricos co n alto consu m o de grasa, hay una clara relación entre las co n cen ­ traciones de lípidos en la sangre y el desarrollo de aterosclerosis. Décadas de investigación básica han contribuido al con o cim ien to acerca de la naturaleza de las lipoproteí­ nas y sus constituyentes lipídicos y p roteín icos, así com o su fu n ció n en la patogénesis del proceso aterosclerótico. La m ed ición exacta de los d istintos parám etros de lípidos y lipoproteínas es crítica en el diagnóstico y trata­ m ien to de pacientes con dislipidem ia. Los esfuerzos inter­ nacionales para reducir el im pacto de la CC en la salud p ú blica han centrado la aten ción en m ejorar la confiabilidad y conveniencia de los ensayos de lípidos y lipopro­ teínas. Paneles de expertos han elaborado norm as para la d etección y tratam iento de colesterol alto, así com o o b je­ tivos de desem peño de laboratorios y recom end aciones detalladas para m edición confiable de analitos de lípidos y lipoproteínas. E ste capítulo com ienza con u n repaso de la quím ica de lípidos y m etabolism o de lipoproteínas, seguido del diagnóstico y tratam iento de la dislipidem ia. P or últim o, la m ed ición de laboratorio clín ico de lípidos y lipoproteínas se analizará en el con tex to de las norm as del N ational Cholesterol Education Program (N C E P ).

283

C L A V E ___________________________________________ HDL LDL Lipoproteína Lp(a)

Quilomicrones Triglicéridos VLDL

QUÍM ICA DE LÍPIDOS Los lípidos, a los que suele conocérseles com o grasas, tie­ n en una fu nción dual. Prim ero, debido a que están com ­ puestos sobre todo de enlaces carbono-hidrógeno (C -H ), son un a rica fuente de energía y una form a eficiente para que el cuerpo alm acene exceso de calorías. C om o resulta­ do de sus propiedades físicas únicas, los lípidos son tam ­ bién una parte integral de las m em branas celulares y, por tanto, desem peñan tam bién una fu n ció n estructural en las células. Los lípidos transportados por las lipoproteínas; a saber, ácidos grasos, fosfolípidos, colesterol y ésteres de colesterilo, son los lípidos principales hallados en las célu ­ las y el tem a principal de esta sección .

Ácidos g rasos1 Los ácidos grasos, com o se ve en la estructura m ostrada en la figura 12 - 1 , son sim ples cadenas lineales de enla­ ces carbono-hidrógeno (C -H ) que term inan con u n grupo carboxilo (-C O O H ). E n el plasm a, sólo una cantidad rela­ tivam ente pequeña de ácidos grasos existe en la form a no esterificada libre, de la cual la m ayor parte está enlazada a albúm ina. E n cam bio, la m ayor parte de los ácidos gra­ sos plasm áticos se hallan com o un con stitu yente de trigli­ céridos o fosfolípidos (fig. 1 2 -1 ). Los ácidos grasos están enlazados de form a covalente a la estructura de glicerol de triglicéridos y fosfolípidos m ediante un en lace éster que se form a entre el grupo carboxilo en el ácido graso y el grupo hidroxilo (-O H ) en el glicerol (fig. 1 2 -1 ). Los ácidos grasos tien en longitud variable y se pueden clasificar com o ácidos grasos de cadena corta (4 a 6 átom os de carb o n o ), media (8 a 12 átom os de carbono) o larga (> 12 átom os de carbo­ n o ). La m ayor parte de los ácidos grasos de la dieta son de cadena larga y con tien en u n núm ero par de átom os de car­ bono. No todos los átom os de carbono en los ácidos gra­ sos están saturados por com pleto o enlazados con átom os de hidrógeno; algunos de ellos pueden en cam bio form ar enlaces dobles carb on o-carb on o (C = C ). D ependiendo del núm ero de enlaces dobles C=C, los ácidos grasos se pue­ den clasificar com o saturados (sin enlaces d o b le s), m onosaturados (u n enlace doble) o poliinsaturados (dos o más enlaces d obles). Por lo general, los enlaces dobles C=C de ácidos grasos insaturados están dispuestos en la form a cis, con am bos átom os de hidrógeno en el m ism o lado del enlace doble C=C, que causa una curvatura en su estruc­ tura (fig. 1 2 -1 ). Estas curvas in crem en tan el espacio que requieren los ácidos grasos insaturados cuando se em pa­ can en una capa lipídica y, com o resultado, estos ácidos

284

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

0 li H 3C — (CH2)n —■C —OH

H o H3C — (CH 2)n— C . h [I \ C — (CH 2)n— C ~ O H Ácido graso insaturado cis

Ácido graso saturado

O H2C--OH

o

O H -C H

r 2-

H2C - 0 - C - R i

C -0 -C H

H2C —OH

O

H2C - 0 —C — R3

Glicero!

Triglicérido O

II



H 2C — O — C —Ri

I

r 2— C— O — CH

O

H2C —O —p —O —CH2CH2 — N+(CH3)3 OFosfolípido (fosfatidilcolina)

Colesterol

Ácido biliar (ácido cólico)

grasos son m ás fluidos porque no se autod isocian tan fácil. Los enlaces dobles C=C de los ácidos grasos tam bién pue­ d en ocu rrir en la configuración trans, con am bos átom os de hidrógeno en el lado opuesto del enlace doble C=C. D ebido a la orien tación espacial de sus enlaces dobles, los ácidos grasos trans no se curvan y tienen propiedades físicas sim ilares a las de los ácidos grasos saturados. Los ácidos grasos trans no se encuentran por lo com ún en la naturaleza; sin em bargo, están presentes en la dieta debido a que en la hidrogenación quím ica em pleada en el proceso de conv ertir los aceites vegetales poliinsaturados en m ar­ garina sólida se introd u cen enlaces dobles trans.

FIGURA 12-1. Estructuras químicas de lípidos. Los ácidos grasos se abrevian como (R) para triglicéridos y fosfolípidos.

que con tien en ácidos grasos insaturados cis, co n curvas en su estructura (fig. 12 - 1 ), por lo general form an acei­ tes a tem peratura am biente. Casi todos los triglicéridos de origen vegetal, com o el m aíz, sem illas de girasol y de cártam o, son ricos en ácidos grasos poliinsaturados y son aceites, m ientras que los triglicéridos de fuentes anim ales con tien en principalm ente ácidos grasos saturados y, por lo general, son sólidos a tem peratura am biente. Com o puede verse al insp eccionar la estructura del triglicérido (fig. 12 1 ), no hay grupos cargados o grupos polares hidrofílicos, lo que lo hace m uy hidrófobo y casi insolu ble en agua.

Fosfolípidos35 Triglicéridos2 C om o se puede inferir del nom bre, los triglicéridos co n ­ tien en tres m oléculas de ácidos grasos unidas a una m olé­ cu la de glicerol por enlaces de éster (fig. 1 2 -1 ). D ebido al gran núm ero de form as posibles de ácidos grasos, cada ácido graso en la m olécula de triglicérido puede ser p o ten ­ cialm ente distinto en estructura, lo que origina m uchas form as estructurales posibles de triglicéridos; los que co n ­ tien en ácidos grasos saturados, sin curvas en su estructura (fig. 12 - 1 ), están m ás agrupados y tienden a ser sólidos a tem peratura am biente. E n contraste, los triglicéridos

L os fosfolíp id os son sim ilares en estructura a los triglicéri­ dos, excepto que sólo tienen dos ácidos grasos esterificados (fig. 1 2 -1 ). La tercera posición en la estructura del glicerol contien e un grupo principal fosfolípido. Hay varios tipos de grupos principales fosfolípidos, com o colin a, in ositol, serina y etanolam ina, que son de naturaleza hidrofílica. Los fosfolípidos se nom bran con base en el tipo de gru­ po principal fosfolípido presente. La fosfatid ilcolina (fig. 12 - 1 ), por ejem plo, tiene un grupo principal colin a y es el fosfolípido más com ú n hallado en lipoproteínas y en m em branas celulares. Los dos ácidos grasos en fosfolipi-

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

dos tien en por lo regular 14 a 2 4 átom os de carbono, con u n ácido graso saturado y el otro insaturado. D ebido a que los fosfolípidos con tien en cadenas hidró­ fobas de ácido graso C-H y un grupo principal hidrofílico, son por definición m oléculas lipídicas anfifáticas y, com o tales, se hallan en la superficie de capas de lípidos. E l gru­ po principal hidrofílico, polar, está orientado hacia fuera al am biente acuoso, m ientras que las cadenas de ácido gra­ so apuntan hacia dentro lejos del agua en una orien tación perpendicular con respecto a la superficie lipídica.

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Fosfolípido

C olesterol68 E l colesterol es u n alcoh ol esteroideo no saturado que contiene 4 anillos (A, B, C y D ), y tiene una sola cadena lateral C-H sim ilar a u n ácido graso en sus propiedades físicas (fig. 1 2 -1 ). La única parte hidrofílica del colesterol es el grupo hidroxilo en anillo A. Por tanto, el colesterol es tam bién un lípido anfifático y se halla en la superficie de capas lipídicas ju n to con fosfolípidos. E l colesterol está orientado en capas de lípido para que los cuatro anillos y el extrem o de cadena lateral estén enterrados en la m em ­ brana en una orientación paralela a las cadenas de acilo de ácidos grasos en las m oléculas de fosfolípido adyacen­ tes. El grupo hidroxilo polar en el anillo A del colesterol está orientado hacia fuera, lejo s de la capa lipídica, lo que le perm ite interactuar con el agua m ediante puentes de hidrógeno no covalentes. E l colesterol puede existir tam bién en una form a esterificada llam ada éster de colesterilo, co n el grupo hidroxilo conjugado por u n enlace de éster con un ácido graso, en la m ism a form a que en los triglicéridos. E n contraste con el colesterol libre, no hay grupos polares en los ésteres de colesterilo, lo que los hace m uy hidrófobos. Com o resul­ tado de su naturaleza hidrófoba, los ésteres de colesterilo no se encuentran en la superficie de capas lipídicas sino en el centro de gotas de lípido, ju n to con los triglicéridos. E l colesterol es sintetizado casi de m anera exclusiva por los anim ales, pero las plantas con tien en otros esteró­ les sim ilares en estructura al colesterol; tam bién es ún ico en que a diferencia de otros lípidos, n o es catabolizado de form a fácil por la m ayor parte de las células y, por tan­ to, no sirve com o una fuente de com bustible. Sin em bar­ go, el colesterol puede convertirse en el hígado a ácidos biliares prim arios, com o ácido có lico (fig. 12 - 1 ) y ácido quen od eso xicólico , que prom ueven la absorción de grasa en el in testino al actuar com o detergentes. C iertos tejidos, com o la glándula suprarrenal, los testículos y los ovarios, pueden convertir una pequeña cantidad de colesterol en h orm onas esteroideas, com o glucocorticoides, m ineralocorticoid es y estrógenos. Por últim o, una pequeña can ti­ dad de colesterol, después de ser convertida prim ero en 7-d esh id rocolesterol, se puede transform ar en vitam ina D 3 cuando la p iel recibe radiación solar.

ESTRUCTURA GENERAL DE LIPOPROTEÍNAS912 La estructura prototíp ica de una partícula de lipoproteína se m uestra en la figura 12 -2 . Por lo general, las lipoproteínas son de form a esférica y su tam año varía de 10 a 1200

nm (cuadro 1 2 -1 ). Com o lo indica su nom bre, las lipoproteínas están com puestas de lípidos y proteínas, llam adas apolipoproteínas.13 E l colesterol anfifático y las m oléculas de fosfolípido se hallan sobre todo en la superficie de lipoproteínas com o una m onocapa sim ple, m ientras que el triglicérido h idrófobo y las m oléculas de éster de colesterilo se hallan en la región central o n ú cleo (fig. 1 2 -2 ). D ebido a que la fu n ció n principal de las lipoproteínas es la entre­ ga de com bu stible a las células periféricas, el nú cleo de la partícula de lipoproteína representa en esencia la carga que es transportada por las lipoproteínas. E l tam año de la p artícula de lipoproteína se correlaciona con su con ten i­ do de lípido. Las partículas de lipoproteína m ás grandes tien en en correspondencia regiones nucleares m ás gran­ des y, por tanto, contienen relativam ente m ás triglicérido y éster de colesterilo. Las partículas de lipoproteína más grandes tam bién contienen m ás lípido en relación con la proteín a y, por tanto, son de m enor densidad. Las d istin­ tas partículas de lipoproteína se separaban en u n principio por ultracentrifu gación en fraccion es de distinta densidad (quilom icrones [quilos]; lipoproteínas de m uy b aja den­ sidad [V LD L]; lipoproteínas de b aja densidad [LD L], y lipoproteínas de alta densidad [H D L ]), que aún form an la base para la m ayor parte del sistem a de clasificación de lipoproteínas em pleado (cuadro 12 - 1 ). Las apolipoproteínas se localizan sobre todo en la super­ ficie de partículas de lipoproteína (cuadro 1 2 -2 ). Ayudan a m antener la integridad estructural de las lipoproteínas y tam bién sirven com o ligandos para los receptores de célu ­ las y com o activadores e inhibid ores de varias enzim as que m odifican las partículas de lipoproteína (cuadro 12 2 ). Las apolipoproteínas con tien en un adorno estructural llam ado h élice anfifática ,14 que explica la capacidad de estas proteínas para enlazar lípidos. Las hélices anfifáticas son segm entos de proteína dispuestos en espiras para que

286

PARTE I! ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 12-1. CARACTERÍSTICAS DE LAS PRINCIPALES LIPOPROTEÍNAS HUMANAS CARACTERÍSTICAS

QUILOMICRONES

VLDL

LDL

HDL

Densidad (g/ml)

5 0 0 mg/dl (5 .6 mmol/L ).73 La hipertrigliceridem ia puede derivar de anorm alidades genéticas, conocid a com o hipertrigliceride­ m ia fa m iliar, o de causas secundarias, com o anorm alida­ des horm onales relacionadas con el páncreas, glándulas suprarrenales e hipófisis, o de diabetes m ellitus o nefrosis. La diabetes m ellitus origina m ayor desviación de gluco­ sa en la vía de la pentosa, lo que causa m ayor síntesis de ácidos grasos. La nefrosis reduce la elim in ación de con s­ tituyentes de alto peso m olecular com o triglicéridos, que causan m ayores con centraciones séricas. La h ip ertriglice­ ridem ia es por lo general un resultado de un desequilibrio entre la síntesis y aclaram iento de V LD L en la circula­ ció n 128'123 E n la m ayor parte de los estudios, la hipertri­ gliceridem ia no ha sido im plicada por estadísticas com o un factor de riesgo independiente para C C , pero m u chos pacientes con CC tien en concen tracio n es m oderadam ente altas de triglicéridos ju n to co n con cen tracio n es reducidas de colesterol H D L .132-133 Es difícil separar el riesgo rela­ cionado con con centracio n es altas de triglicéridos del de una con cen tració n b aja de colesterol HDL porque los dos están relacionados y las con centraciones séricas tam bién lo están, por lo general, de m anera inversa. Los triglicéridos están afectados por varias horm onas, com o la insulina pancreática y el glucagon, la horm ona de crecim iento pituitaria, la horm ona adrenocorticotróp ica (A C TH ) y la tirotropina y la adrenalina y noradrenalina de la m édula suprarrenal del sistem a nervioso. La adrenalina y la noradrenalina afectan las con cen tracio n es de trigli­ céridos séricos al activar la produ cción de lipasa sensible a horm ona, que se localiza en el tejid o ad iposo .134 O tros procesos del cuerpo que provocan la actividad de la lipasa sen sible a horm onas son el crecim iento celu lar (h o rm o­ na del crecim ien to ), la estim u lación suprarrenal (A C TH ), estim u lación de la tiroides (tirotropina) y el ayuno (gluca­ gon). Cada proceso, por su acción en la lipasa sensible a horm ona, da com o resultado un increm en to en la valores de triglicéridos séricos. Aunque la hipertrigliceridem ia grave ( > 5 0 0 mg/dl [5.6 mmol/L]) no se relaciona con riesgo alto para C C , es una anorm alidad con posibilidad de poner en riesgo la vida porque puede causar pancreatitis (in flam ación del pán­ creas) aguda y recu rren te .121-134-133 Por tanto, es im perativo d iagnosticar a estos pacientes y tratarlos con m ed icación para dism inuir triglicéridos y vigilarlos de cerca. Por lo

296

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

general, la hipertrigliceridem ia grave es causada por una d eficiencia de LPL o por una deficiencia de apolipoproteína C -II, que es un cofactor necesario para actividad de L PL .136 N orm alm ente, la LPL hidroliza los triglicéridos llevados en quilom icrones y V LD L para proveer células con ácidos grasos libres para energía desde fuentes de tri­ glicéridos exógenas y endógenas. Una d eficiencia en la actividad de LPL o apo C -II evita que los triglicéridos sean elim inados, y los triglicéridos séricos perm anecen en co n ­ centraciones m uy altas, aun cuando el pacien te ha ayuna­ do durante 12 a 14 horas. E l tratam iento de la hipertrigliceridem ia consiste en m odificaciones d ietéticas, aceite de pescado, fárm acos que dism inuyen los triglicéridos (sobre todo, derivados de ácido fíb rico) en casos de hipertrigliceridem ia grave o cuando u n valor de colesterol H DL b a jo indica riego de CC y a veces aceites co n com posicion es específicas de áci­ dos grasos .137,138 Es posible que sólo ciertas subespecies de quilom icrones y V LD L sean aterogénicas. Los remanentes de quilom icrones y las lipoproteínas de m uy b aja densidad (V LD L) representan subespecies que han sido hidrolizadas en parte por lipasas, y se considera que son en parti­ cular aterogénicas .139"143 La nueva m etodología para aislar rem anentes de quilom icrones y V LD L posibilita estudiar en la actualidad la aterogenicidad p otencial de estas par­ tícu las .144"146

Hiperlipoproteinem ia com binada La hiperlipoproteinem ia com binada se define por lo general com o la presencia de con cen tracio n es altas de colesterol sérico total y triglicéridos. Se considera que los individuos que presentan este síndrom e tien en m ayor riesgo de CC. E n la form a derivada genéticam ente, llam ada hiperlipopro­ teinem ia com binada fa m ilia r (HCF), algunos individuos de la fam ilia afectada pueden tener sólo colesterol alto; otros, sólo concentración alta de triglicéridos, e incluso otros, co n ­ cen tracion es altas de ambos. O tra form a genética rara de hiperlipoproteinem ia com ­ binada se llam a disbetalipoproteinem ia fa m iliar, o h ip erli­ poproteinem ia tipo III. E l nom bre hiperlipoproteinem ia tipo III es un vestigio de u n sistem a de clasificación que d esarrollaron Fred rickson y co is .147 que por lo dem ás en general ya no se usa. La enferm edad resulta de un a acu ­ m u lación de V LD L rica en colesterol y rem anentes de qui­ lom icrones com o resultado del catabolism o defectuoso de estas partículas. La enferm edad se relaciona tam bién con la presencia de una form a relativam ente rara de apo E , lla­ mada apo E2/2. Los individuos con hiperlipoproteinem ia tipo III con frecuencia tendrán valores de colesterol total de 2 0 0 a 3 0 0 mg/dl (5 a 8 mmol/L) y triglicéridos de 3 0 0 a 6 0 0 mg/dl (3 a 7 mmol/L). Para d istinguirlos de los indi­ viduos con otras hiperlipoproteinem ias com binadas, es necesario aislar prim ero la fracción de V LD L de su suero por centrifugación. U na relación obtenida de la con cen tra­ ció n de colesterol de VLDL a triglicéridos séricos totales será > 0 .3 0 en presencia de hiperlipoproteinem ia tipo III. Si la fracción de V LD L está sujeta a electroforesis de aga­ rosa, las partículas m igrarán en una región (3 amplia, en

vez de en la región pre-(3 norm al. El diagnóstico definitivo requiere una d eterm inación de isoform as apo E m ediante enfoque iso eléctrico o tipificación de DNA, lo que da com o resultado hom ocigosidad de apo E2/2 o, rara vez, d eficien­ cia de apo E. Sin em bargo, el tratam iento no depende por com pleto del diagnóstico porque estos pacientes se pue­ den tratar con terapia estándar de dieta, niacin a, genfibrozilo e inhibidores de H M G -CoA reductasa, com o dictan los resultados clín ico s de lipoproteína. Com o resultado de la com p osición rica en colesterol de estas partículas, el uso de la ecu ación de Friedew ald 148 para calcular las con cen tracio n es de colesterol LD L dará com o resultado una subestim ación de colesterol VLD L y, por tanto, una sobrestim ación de colesterol LDL, en com paración co n la b etacu an tificació n .149150

Increm ento de Lp(a) Se consid era en la actualidad que los in crem en tos en la co n cen tra ció n sérica de L p (a) confieren u n m ayor ries­ go de C C y E C V 151"155 Se han observado co n c en tracio ­ nes altas de L p (a) en pacientes con CC que en su jetos de con trol norm ales, aunque en los estudios prospectivos no se ha determ inado de m anera con clu y en te la relación p ositiva .156,157 La L p (a) es una variante de la LD L co n una apoliproteína extra, llam ada apo (a ); el tam año y las co n ­ cen tracion es séricas de L p (a) están determ inadas genéti­ ca m en te .158 D ebido a que la apo (a) tiene u n alto grado de hom ología co n el facto r de coagu lación , p lasm in ó g en o ,159 la hip ótesis aterogénica general tien e que ver co n la com ­ p etencia entre plasm inógen o y apo (a) por sitios de enlace de fibrin a .160'162 B ajo esta hipótesis, la com p eten cia exito ­ sa por apo (a) bloqu eará al plasm inógen o, y se form an coágulos a lo largo de la pared arterial que no se d isol­ verán. La m ayor parte de los fárm acos que dism inuyen a la LD L no tien en efecto en la co n cen tra ció n de L p (a), aun cuando se reduzca el colestero l en form a sig n ificati­ va. Los dos fárm acos que han m ostrado algún efecto son la n iacina y el estrógeno de reem plazo en m u jeres posm enopáusicas. Sin em bargo, hasta que se confirm e m ediante estud ios prospectivos la aterogenicidad de la L p (a ), no se recom iend a el tratam iento con n iacina excep to ju n to con otras con d icio n es dislipidém icas en las que está indicada la niacina.

Hipolipoproteinem ia Las hipolipoproteinem ias son anorm alidades m arcadas por con cen tracio n es reducidas de lipoproteína. Hay dos cate­ gorías principales: hipoal/alipoproteinem ia y hipobetalipoproteinem ia. La hipobetalipoproteinem ia se relaciona con concen tracion es b ajas aisladas de colesterol L D L (es decir, sin otros trastornos lipoproteínicos adicionales), pero debido a que por lo general no está relacionada con CC , no se analiza más.

Hipoalfalipoproteinem ia La hipoalfalipoproteinem ia indica una red u cción aislada de HDL circulante, definido en la actualidad por el N CEP

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

ES T U D IO D E C A S O 12-3 A un varón de raza blanca de 4 3 años de edad se le diagnosticó hiperlipidem ia a la edad de 13 años cuando su padre m urió de infarto de m iocardio a la edad de 3 4 años. E l abuelo del paciente m urió a la edad de 3 4 años, tam bién de infarto de m iocardio. E n la actualidad, el h om bre está activo y asin tom ático co n respecto a CC. Toma 4 0 m g de lovastatina (M ev acor), 2 veces/día (dosis m áxim a). Antes había tom ado niacin a, pero no la toleraba debido a que le provocaba rubor y trastor­ nos gastrointestinales, tam poco podía tolerar la resina colestiram ina (Q u estran ). Su exam en físico es notable por engrosam iento y xantom as del tendón de A quiles y u n ruido carotídeo derecho.

CUADRO 12-3.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO Triglicéridos

91 mg/dl

Colesterol total

269 mg/dl

Colesterol HDLI

47 mg/dl

Colesterol LDL

204 mg/dl

Aminotransferasa de aspartato (AST)

34 U/L

Aminotransferasa de alanina (ALT)

36 U/L

Fosfatasa alcalina (ACP)

53 U/L

Electrólitos y glucosa en ayuno normal

normal

Preguntas 1 . ¿Cuál es su diagnóstico? 2. ¿R equiere un estudio diagnóstico adicional? 3. ¿Q ué otras pruebas de laboratorio se deben hacer? 4. ¿N ecesita tratam iento farm acológico adicional? En caso afirm ativo, ¿cuál?

ES T U D IO D E C A S O 12-4 Una m u jer de 6 0 años de edad acude a consu lta con su m édico porque tiene problem as urinarios. Com o antecedentes clínicos tiene hipertensión y episodios de edema. E l m édico ordenó varias pruebas de laboratorio en sangre extraída en su consu ltorio. Los resultados se m uestran en el cuadro 1 2 -4 .1 de estudio de caso.

Preguntas 1. ¿C uáles son los resultados anorm ales en este caso? 2. ¿Por qué se considera que los triglicéridos son anor­ males? 3. ¿Cuál es la enferm edad principal que exh iben los datos de laboratorio para este paciente?

CUADRO 12-4.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO VALO RES DEL

INTERVALO DE

PACIENTE

REFERENCIA

A N A LITO

Na+

149

135-143 mEq/L

K+

4.5

3.0-5.0 mEq/L

ci-

120

98-103 mEq/L

Contenido de C 0 2

12

22-27 mmol/L

Proteína total

5.7

6.5-8.0 g/dl

Albúmina

2.3

3.5-5.0 g/dl

Calcio

7.6

9.0-10.5 mg/dl

Colesterol

201

140-200 mg/dl

Ácido úrico

15.4

3.5-7.9 mg/dl

Creatinina

4.5

0.5-1.2 mg/dl

ÑUS

87

7-25 mg/dl

Glucosa

88

75-105 mg/dl

Bilirrubina total

1.3

0 .2 - 1 .0

Triglicéridos

327

65-157 mg/dl

mg/dl

Deshidrogenasa de lactato

200

90-190 IU/L

Trasaminasa de aspartato

45

8-40 IU/L

Amilasa

380

76-375 IU/L

297

298

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

com o una con cen tració n de colesterol HDL < 4 0 mg/dl (1 .0 mmol/L ),73 sin la presencia de hipertrigliceridem ia. E l térm ino a lfa denota la región en que m igra la HDL en electroforesis de agarosa. Hay varios defectos, con frecu en­ cia determ inados genéticam ente, que se relacionan con hipoalfalipoproteinem ia .163-168 Casi todos estos defectos se relacionan co n un m ayor riesgo de CC prem atura. Una form a extrem a de hipoalfalipoproteinem ia, enferm edad de Tangier, se relaciona con con cen tracio n es de colesterol HDL tan b ajas com o 1 a 2 mg/dl (0 .0 3 a 0 .0 5 mmol/L) en h om ocigotos, acom pañadas por con cen tracio n es de coles­ terol total de 5 0 a 8 0 mg/dl (1 .3 a 2.1 mmol/L). E l tratam iento de individuos co n d ism inu ciones aisla­ das de colesterol H DL está lim itado. La niacin a es un poco eficaz pero tiene efectos adversos, com o hepatoxicidad, que a veces im posibilita su uso, aunque preparaciones de liberación program ada más recientes pueden corregir esos efectos; el reem plazo de estrógeno en m ujeres posm enopáusicas tam bién es efectivo .110'121,169'170 La h ip oalfalip op roteinem ia tran sitoria, aguda, puede verse en casos de estrés fisiológico grave, com o in fe c c io ­ nes agudas (sob re todo virales), otras enferm edades agu­ das y p ro ced im ien to s q u irú rg icos .171 E l co lestero l LD L, así com o las co n cen tra cio n es de co lestero l total, se p u e­ den red u cir en form a significativa en estas co n d icio n es, pero volver al nivel norm al cu ando proced e la recu p era­ ció n . P or esta razón, las co n cen tra cio n es de lip op roteín a extraídas durante la hospitalización o con un estado m or­ b o so co n o cid o se deben volver a evaluar en el estado salu d able fuera del hosp ital antes de con sid erar la in ter­ ven ción .

ANÁLISIS DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS M edición de lípidos Los lípidos y las lipoproteínas son indicadores im portan­ tes de riesgo de C C , que es una razón im portante para su m ed ición en la investigación y en la práctica clínica. E n el caso de los laboratorios individuales o fabricantes de diagnóstico, resulta im práctico establecer sus propios p u ntos de corte con los lípidos com o suele hacerse para otros analitos. E n cam bio, el N C EP ha desarrollado p u n­ tos de corte de d ecisión para caracterizar el riesgo de CC co n base en la consid eración de distribuciones poblacionales de grandes estudios epidem iológicos, estudios de in tervención que dem ostraron la eficacia de regím enes de tratam iento y efectividad de co sto s .73 Para m ejorar la confiabilidad de las m ediciones analíticas, se pusieron en práctica program as de estandarización para los laborato­ rios de investigación que realizan estudios poblacionales y de intervención, que ayudaron a hacer com parables los resultados entre laboratorios y con el tiem po .172 En fechas m ás recientes, los program as de estandarización se han am pliado a los fabricantes de diagnóstico y laboratorios clín ico s ru tinarios para facilitar la clasificación confiable de pacientes por m edio de los puntos de corte de d ecisión nacionales. Así, la exactitud y estandarización de resulta­ dos es especialm ente im portante co n los analitos de líp i­ dos y lipoproteínas.

M edición de colesterol E l estudio diagnóstico de lípidos suele com enzar con la m ed ición de colesterol sérico total. Las lipoproteínas se cu antifican tam bién en general co n base en su co n ten i­ do de colesterol. E n los prim eros m étodos analíticos se em pleaban ácidos fuertes (p. e j., ácido sulfú rico o acético ) a veces ju n to con otros com puestos quím icos (co m o an h í­ drido acético o cloruro férrico) para producir un color m ensurable con colestero l .173 D ebido a que las reacciones de ácido fuerte son relativam ente inespecíficas, la extrac­ ció n parcial o com pleta m ediante disolventes orgánicos se em pleaba a veces para m ejorar la especificidad. E n el m étodo de referencia actual para colesterol se emplea extracció n con h exano después de la h idrólisis con KOH alcohólica seguida de la reacción con reactivo de co lo r de Lieberm ann-Burchard, que com prende los ácidos su lfú ri­ co y acético y anhídrido acético .174,173 E ste m étodo m anual de varios pasos es com plicado pero da buena concord an­ cia con el m étodo estándar desarrollado y aplicado en el U.S. N ational Institute for Standards and Technology, el denom inado m étodo definitivo, por m edio de espectrom e­ tría de masas con d ilu ción iso tóp ica .176 E n años recien tes, los reactivos en zim áticos h an reem ­ plazado en general a los ácidos fuertes em pleados en las reaccio nes quím icas. Las enzim as, seleccionad as para especificidad co n el analito de in terés, proveen cu an tifica­ ció n bastante exacta sin la necesidad de e xtra cció n u otro tratam iento previo. L os reactivos enzim áticos son suaves com parados con los reactivos ácidos an teriores y son más adecuados para la generación m oderna de in stru m entos ro bótico s autom atizados controlad os por m icrop roce­ sador. Las lipoproteínas, HDL y a veces LD L, se cu an ti­ fican en general con base en su con ten id o de colesterol por m edio de los m ism os reactivos enzim áticos. Así, las m ed icion es de colestero l total, LD L y H D L, ju n to co n tri­ glicéridos, se pueden com pletar de m anera ru tin aria en paneles en analizadores autom atizados discretos o por lotes. Aunque han sido descritas varias secu encias de reacción enzim áticas, una secu en cia (fig. 1 2 -4 ) es la más com ún para m edir colestero l .177 179 La enzim a hidrolasa de éster de colesterilo se em plea para rom per el residuo de ácido graso de ésteres de colesterilo, que com prenden cerca de dos tercios de colesterol circulante, y los ésteres de coles­ terilo se convierten en colesterol no esterificado o libre. El colesterol libre se h ace reaccionar m ediante la segunda enzim a, oxidasa de colesterol, y se produce peróxido de hidrógeno, que es el sustrato para una segunda reacción de color enzim ática co n peroxidasa de rábano para aco­ plar dos com puestos quím icos in coloro s en un com puesto coloreado. La intensidad del color resultante, proporcio­ nal a la cantidad de colesterol, se puede m edir m ediante u n espectrofotóm etro, por lo general a una longitud de onda alrededor de 5 0 0 nm . Las enzim as y reactivos han m ejorad o de m odo que se pueda esperar que los reactivos com erciales calibrados de m anera apropiada den resulta­ dos confiables. Esta secu encia de reacció n se em plea por lo general en suero sin u n paso de extracció n pero puede estar sujeta a interferencia. Por ejem plo, la vitam ina C y

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

299

P c t o r f l c f l r io r n l o c t o r i l n

1. Éster de colesterilo + H20 2. Colesterol + 0 2

*- Colesterol + Ácido graso Colestenona + H20 2

Oxidasa de colesterol

3. H20 2 + Colorante--—-r°” -asa > Color

FIGURA 12-4.

la bilirrubina son agentes reductores que pueden interferir co n la reacció n de color catalizada por peroxidasa .180

M edición de triglicérido La m ed ición de triglicéridos séricos ju n to con el colesterol es útil para detectar ciertos trastornos genéticos y otros tipos de trastornos m etabólicos, así com o para caracterizar el riesgo de desarrollar enferm edad coronaria. E l valor de triglicérido se em plea tam bién por lo com ún en la esti­ m ación de colesterol LD L m ediante la ecu ación de Friedewald. Varias secuencias de reacció n enzim áticas están disponibles para m edición de triglicéridos. En todas se em plean lipasas para separar los ácidos grasos del glice­ ro l .181 E l glicerol liberado participa en cualquiera de las d istintas secu encias enzim áticas. E n una de las prim eras reacciones m ás com unes, que finaliza en un producto m edido en la región ultravioleta (U V ), se em plean cinasas de glicerol y de piruvato, y term ina en la conversión de NADH a NAD+ con una d ism inu ción correspondiente de ab so rban cia .182 Esta reacción es susceptible a interferencia y reacciones secundarias. E l punto final U V es tam bién m enos conv eniente para los analizadores m odernos, así que esta y otras secu encias U V han sido reem plazadas de form a gradual por una segunda secu encia (fig. 1 2 -5 ) en la que intervienen cinasa de glicerol y oxidasa de glicerol-fosfato, acoplada con la m ism a reacció n de color de peroxidasa descrita para el co lestero l .183 Las secu encias enzim áticas de reacción de triglicéri­ dos tam bién reaccionan con glicerol libre endógeno, que está universalm ente presente en el suero y constitu ye una fuente im portante de in terferen cia .184185 E n casi todas las m uestras, el glicerol libre endógeno contribuye co n una sobrestim ación de triglicéridos de 10 a 2 0 mg/dl. Cerca de 20% de las m uestras tendrán alto contenid o de glice­ rol, con concentracio nes increm entadas en ciertas cond i­ ciones com o diabetes y hepatopatía o por m edicaciones basadas en glicerol. La m ayor parte de los laboratorios de investigación incorporan una correcció n para glicerol

Lipasa bacteriana

1. Triglicérido + H20

libre endógeno, pero esta práctica es po co com ú n en los laboratorios clínicos. La corrección m ás com ún, designada “b lanco de cubeta d oble”, se lleva a cabo co n una segunda m ed ición paralela por m edio de un reactivo de triglicéri­ do sin la enzim a lipasa para cu antificar sólo el b lan co de glicerol libre. La m ed ición del b lanco de glicerol se resta de la m ed ición de glicerol total obtenida con el reactivo com pleto para determ inar u n resultado de triglicérido corregido por b la n co .186 O tro m étodo, designado “b lan ­ co de cubeta sim ple”, com ienza con el reactivo sin lipasa. Después de una in cu b ació n breve, se tom a una lectu ra del b lan co para m edir sólo glicerol libre endógeno. La enzi­ m a lipasa se agrega entonces com o u n segundo reactivo separado y, después de in cu b ació n adicional, se tom a una lectura final que, posterior a realizar la co rrección respecto al blanco m ediante el instrum ento, da u n valor neto o de triglicérido con supresión de g licerol .187 E stán disponibles reactivos com erciales con supresión de glicerol, pero su alto costo n o se ju stifica tan fácil m ediante los requisitos de exactitu d en la práctica clín ica rutinaria. U na alterna­ tiva conveniente puesta en práctica, que no increm enta el costo, designada puesta a cero de calibración, se pue­ de h acer al aju star los puntos de ajuste del calibrador a valores netos o corregidos por b lan co para com pensar el contenid o prom edio de glicerol libre de las m uestras. Este m étodo em pleado por ciertas com pañías que elaboran reactivos para diagnóstico, suele ser m uy exacto porque las con cen tracio n es de glicerol libre son en general relati­ vam ente b ajas y bastante coherentes en la m ayor parte de las m uestras. Casi todas las m uestras tendrán una co rrec­ ció n por b lanco razonablem ente buena y sólo algunas m uestras estarán subcorregidas pero aún m ejo r que sin el aju ste de calibración. E l m étodo de referencia de triglicérido conlleva hidróli­ sis alcalina, extracció n con disolvente y reacció n de color con ácido cro m otróp ico ,188 un ensayo que es tedioso, está m al caracterizado y sólo se aplica en el laboratorio de estandarización de lípidos en los C entros para C ontrol y P revención de la Enferm edad de Estados U nidos (C D C ).

,

----------------►Acido graso + Glicerol Glicerocinasa

2. Glicerol + ATP

►Glicerofosfato + ADP Oxidasa de glicerofosfato

3. Glicerofosfato + 0 2

► Dihidroxiacetona + H20 2 Peroxidasa

4. H20 2 + Colorante

Secuencia de ensayo enzimático, colesterol.

► Color

FIGURA 12-5.

Secuencia de ensayo enzimática, triglicéridos.

300

PARTE II ■ CORRELACIONES CLINICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

Se ha desarrollado u n m étodo de com paración designado m ás adecuado con extracció n por disolvente seguido de u n ensayo enzim ático óptim o, el cual en fechas recientes han adoptado algunos laboratorios de estandarización. Sin em bargo, se debe notar que la exactitu d en las m edi­ ciones de triglicéridos para propósitos clín ico s podría ser considerada m enos im portante que para el colesterol por­ que la variación fisiológica es grande, co n coeficiente de variación (C V ) en el intervalo de 2 5 a 30% , lo que hace que la con trib u ción de la variación analítica sea relativa­ m ente insignificante.

M étodos de lipoproteína Se han em pleado varios m étodos para la separación y cu an tiñ cación de lipoproteínas séricas, que aprovechan las propiedades físicas com o densidad, tam año, carga y co n te­ nido de apolipoproteínas. E l intervalo de densidad obser­ vado entre las clases de lipoproteínas es una fu nción del contenid o relativo de lípidos y perm ite el fraccionam iento por ultracentrifu gación. Las separaciones electroforéticas aprovechan las diferencias de carga y tam año. Los m éto­ dos de p recipitación quím icos, que son m ás com unes en laboratorios clín ico s, dependen del tam año de partícula, carga y diferencias en el contenid o de apoliproteína. Se pueden usar anticuerpos esp ecíficos para enlazar y sepa­ rar clases de lipoproteínas. Los m étodos crom atográficos aprovechan las diferencias de tam año en m étodos de cri­ bado m olecu lar o la com posición en m étodos de afinidad con, por ejem plo, sefarosa de heparina. E n el laboratorio de investigación se han em pleado m u chos m étodos de ultracentrifu gación, pero ésta es poco com ú n en el laboratorio c lín ico .189 E l m étodo más com ún, llam ado ultracentrifugación preparativa, em plea ajustes de densidad sucesivos de suero para fraccionar las clases de lipoproteína m ayores y m enores .190 Los m étodos de gra­ diente de densidad, ya sea técn icas de no equilibrio en las que las separaciones se basan en la tasa de flotación, o técnicas de equilibrio en las que las lipoproteínas se sepa­ ran con base en su densidad, perm iten el fraccionam iento de varias de las subclases en una sola corrid a .191195 E n los m étodos disponibles se em plean diferentes tipos de roto­ res de ultracentrifugadora: cubeta rotatoria, ángulo fijo, vertical, zonal. Los m étodos m ás recientes tienden hacia las separaciones de m enor escala en rotores pequeños co n ultracentrifugadoras de m esa .196197 La u ltracen trifu ­ gación, aunque tediosa, cara y técnicam en te dem andante, aún es un m edio útil para la separación de lipoproteínas para fines cuantitativos y aislam ientos preparativos. La ultracentrifu gación se emplea tam bién en los m étodos de referencia para cu an tiñ cación de lipoproteínas, que es apropiada porque las lipoproteínas se definen de m anera clásica en térm inos de densidad hidratada. L os m étodos electroforéticos perm iten la separación y cu an tiñ cación de las principales clases de lipoproteínas y proveen una representación visual útil para detectar patro­ nes inusuales o variantes .198,199 E l gel de agarosa ha sido el m edio m ás com ún para la separación de lipoproteínas intactas, y provee una base clara y uso con v en ien te .200'203

Los m étodos electroforéticos, en general, han sido co n ­ siderados útiles para análisis cualitativo pero m enos que deseables para cu antiñ cación de lipoproteínas debido a la escasa precisión y sesgos sistem áticos grandes en com pa­ ración co n otros m étod o s .204 Las evaluaciones de sistem as electroforéticos autom atizados com erciales m ás recientes, sin em bargo, dem uestran que la electroforesis puede ser precisa y e x acta .205 La electroforesis en geles de poliacrilam ida se em plea para la separación de clases de lip op roteína ,206 subclases y las apolipoproteínas .207,208 De particular interés son los m étodos que fraccion an subclases de LD L para caracte­ rizar las fraccion es más aterogénicas, pesadas, sin lípidos y m ás pequeñas contra las subclases m ás grandes y lige­ ra s .209 La precipitación quím ica, por lo regular con polianiones, com o la heparina y cationes divalentes, com o el m anganeso, se puede usar para separar las lipoproteínas, pero son m ás com unes para H D L .210'212 La apo B en V LD L y LD L es rica en am inoácidos co n carga positiva, que de preferencia form a com plejos con polianiones. La adición de cationes divalentes neutraliza los grupos cargados en las lipoproteínas, lo que hace que se agreguen y se vuelvan insolu bles y, com o resultado, precipitan y d ejan a la HDL en disolución. A concentracio nes apropiadas de p olianión y catión divalente, la separación es bastante específica. E n los m étodos inm unoquím icos, usár anticuerpos específicos para epitopos en las apolipoproteínas, ha sido ú til en m étodos de investigación y de ru tin a .213,214 Los anticuerpos han sido inm ovilizados en soportes sólidos, com o una m atriz de colum na o cuentas de látex. Por ejem ­ plo, las lipoproteínas que con tien en apo B, com o un gru­ po se pueden enlazar m ediante anticuerpos a la apo B. La selectividad dentro de las lipoproteínas que con tien en apo B, com o en la elim in ación de V LD L m ientras se retiene LD L, se puede obtener al inclu ir anticuerpos para apoli­ poproteínas m enores. La HDL se puede enlazar de m anera selectiva co n anticuerpos a la apo A-I, la proteína p rin ci­ pal de HDL. C om o ejem plo, los anticuerpos m onoclonales inm ovilizados han sido usados para separar una fracción de lipoproteínas rem anentes designada PPR (partículas parecidas a las rem anentes ).144'146

M étodos de HDL La m ed ición de colesterol HDL ha asum ido cada vez más im portancia en las norm as de tratam iento N CEP ATP III, liberadas en 2 0 0 1 . E n las prim eras norm as, el colesterol HDL se m edía com o factor de riesgo pero de otro m odo no se consideraba en las decisiones de tratam iento. Siguiendo las recom end aciones de un grupo de consenso patrocin a­ do por los Institu tos N acionales de Salud ,96 las norm as de 1 9 9 3 N C EP ATP II inclu ían la m ed ición de colesterol HDL con colesterol total en el prim er estudio diagnóstico m éd ico, que se reforzaron m ediante las norm as ATP III de 2 0 0 1 .73 D ebido al riesgo relacionado con el colesterol HDL se expresa sobre un intervalo de con cen tració n rela­ tivam ente pequeño, la exactitud en la m ed ición adquiere im portancia especial.

CAPITULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

301

ES T U D IO D E C A S O 12-5 U n derm atólogo envía a su pacien te, una m u jer de 4 9 años de edad, a una evaluación de lípidos después de m anifestar exantem a papular en tronco y brazos. El exantem a consistió en lesion es m últiples rojas, pro­ tuberantes con centros am arillos. La paciente no tenía antecedentes de tal exantem a ni de trastornos lipídicos o de CC. La paciente pasa por la m enopausia y se está tratando con reem plazo de estrógenos estándar; por lo dem ás es saludable.

Preg untas 1. ¿Q ué es el exantem a? ¿C u ál es la causa de su exan ­ tem a? 2. ¿C ontribuye su estrógeno oral? 3. ¿C ontribuye su glucosa? 4. ¿Q ué tratam ientos están garantizados y cuál es su riesgo m ás agudo?

CUADRO 12-5.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO SUERO

MUY LIPÉMICO

Triglicéridos

6200 mg/dl

Colesterol total

458 mg/dl

Glucosa en ayuno

160 mg/dl

Pruebas de función hepática y electrólitos

normal

Para propósitos de diagnóstico ru tinario, la HDL ha sido separada casi de form a exclusiva por precipitación quím ica y, durante m u chos años, la m ed ición de coles­ terol HDL ha requerido un proced im iento de dos pasos con pretratam iento m anual. U n reactivo de precipitación añadido al suero o plasm a agrega proteínas no HDL, que se sedim entan por centrifugación. Los prim eros m étodos em pleaban fuerzas de centrifu gación de alrededor de 1 5 0 0 X gravedad, que requerían tiem pos de centrifu gación pro­ longados de 10 a 3 0 m in. Los nuevos m étodos pasaron a centrifu gación con fuerzas de 10 0 0 0 a 15 0 0 0 X gravedad, y los tiem pos de centrifu gación se redujeron a 3 m in. La HDL se cu antifica entonces com o colesterol en el sobre­ nadante norm alm en te por uno de los ensayos enzim áticos m odificados para el intervalo m enor de colesterol HDL. E n el prim er m étodo de precipitación com ún se em plea­ ba heparina en com binació n con m anganeso para preci­ pitar las lipoproteínas que con ten ían apo B .215-218 D ebido a que el m anganeso interfería co n los ensayos enzim áti­ cos, se elaboraron otros reactivos .219 E l fosfotungstato de sod io 220,221 con m agnesio se volvió com ún en el uso ru tin a­ rio pero, com o resultado de su sensibilidad a cond iciones de reacción y m ayor variabilidad, fue reem plazado en gran m edida por sulfato de d extrano (una heparina sin tética) con m agnesio .222 E n los prim eros m étodos con sulfato de d extrano se em pleaba m aterial de 5 0 0 kD , que se reem pla­ zó por un m aterial de 5 0 kD , considerado m ás esp ecífico .212 E l p o lietilenglicol tam bién precipita lipoproteínas, pero requiere concentraciones de reactivo 100 veces m ayores con reactivos altam ente viscosos, difíciles de pipetear con p recisión .223-225. N um erosas versiones com erciales de estos reactivos de precipitación llegaron a estar disponibles pero a m enudo daban resultados bastante diferentes en los pri­

m eros años com o resultado de la falta de estandarización. Sin em bargo, con u n proceso de estandarización disponi­ ble para los fabricantes de reactivo para certificación de exactitud, las diferencias han tendido a dism inuir. U n problem a significativo con m étodos de precipita­ ción de HDL es la interferencia de con cen tracio n es altas de triglicérid o .226 Cuando V LD L y quilom icrones ricos en triglicérido están presentes, la baja densidad de las lipoprotelnas agregadas puede evitar que sedim enten o inclu so causar flotación durante la centrifugación. Esta sedim en­ tación incom pleta, indicada por turbiedad o m aterial com puesto por partículas que flotan en el sobrenadante, da com o resultado sobrestim ación de colesterol HDL. La centrifu gación de alta velocidad reducirá la proporción de sobrenadante turbio. La d ilu ción previa de la m uestra tam bién prom ueve el aclaram iento, pero puede cond u cir a errores en el análisis de colesterol. Los sobrenadantes turbios tam bién se pueden clarificar por ultrafiltración, un m étodo que es confiable pero tedioso e ineficiente. D ebi­ do a estas desventajas y a la falta de autom atización com ­ pleta, los m étodos de precipitación se fueron quedando rezagados en relación con el laboratorio clín ico m oderno autom atizado. E l resultado ha sido el desarrollo de una nueva clase de m étodos directos, denom inados a veces hom ogéneos, que agilizan la cu antificación de HDL. Polím eros específicos, detergentes e in clu so enzim as m odificadas, se em plean para suprim ir la reacción enzim ática de colesterol en lipo­ proteínas distintas a H DL .227 Los reactivos son aptos para autom atización com pleta con la m ayor parte de los anali­ zadores de quím ica y son m uy adecuados para el laborato­ rio m oderno. E n general, se agrega un prim er reactivo para “b loq u ear” liproproteínas no HDL, seguido de u n segundo

302

PARTE II ■ CORRELACIONES CLINICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

reactivo con las enzim as para cuantificar el colesterol a cce­ sible (H D L ). Los ensayos hom ogéneos, que al parecer son m uy precisos y bastante exactos, fueron adoptados con rapidez y en general reem plazaron a los m étodos de pretratam iento en el laboratorio ru tin ario .228 Sin em bargo, se ha m ostrado que los m étodos carecen de especificidad para H DL en m uestras inusuales (com o de pacientes con cond i­ cion es hepáticas o renales ).229 Asim ism o, los reactivos han estado su jetos a m odificaciones frecuentes por parte de los fabricantes en u n esfuerzo por m ejo rar el desem peño, que puede afectar los resultados en estudios de largo plazo. Por estas razones, los m étodos no han sido recom endados para uso en laboratorios de investigación. E l m étodo de referencia aceptado para colesterol HDL es u n proced im iento de tres pasos desarrollado en el CDC. E ste m étodo conlleva centrifu gación para elim inar V LD L, p recipitación con m anganeso de heparina desde el líqu i­ do subnadante de 1 .0 0 6 g/ml para elim inar LD L y análisis de colesterol sobrenadante m ediante el ensayo de A bellK end all .175 D ebido a que este m étodo es tedioso y caro, el CDC N etw ork Laboratory Group ha validado un m étodo de p recipitación directa más sim ple com o un m étodo de com paración designado, por m edio de precipitación d irec­ ta con sulfato de dextrano (5 0 k D ) de suero con análisis de colesterol A bell-K end all .172

M étodos para LDL E l colesterol LD L, bien validado com o una factor de riesgo tratable para C C , es la base prim aria para decisiones de tra­ tam iento en las norm as clínicas del NCEP .73 E l m étodo de investigación m ás com ún para cu antificación de colesterol LD L y la base para el m étodo de referencia ha sido desig­ nado betacuantificación , donde beta se refiere al térm ino electroforético para LDL. La betacu antificación com bina ultracentrifu gación y precipitación q u ím ica .218,230 La ultracentrifu gación de suero en la densidad nativa de 1 .0 0 6 g/L se em plea para hacer flotar VLD L y quilom icrones para separación. Las fracciones se recuperan pipeteando después de separar las fracciones al cortar en seccion es el tubo. La centrifugación ha sido preferida para separación de V LD L porque otros m étodos, com o la precipitación, no son específicos para VLD L y pueden estar sujetos a interfe­ rencia de quilom icrones. E n general, la ultracentrifugación es una técnica robusta pero tediosa que puede dar resulta­ dos confiables siem pre que la técnica sea m eticulosa. E n un paso separado, la precipitación quím ica se em plea para separar HDL del suero com pleto o del sub­ nadante obtenid o por ultracentrifugación. E l colesterol se cu antifica en el suero, en el subnadante de 1 .0 0 6 g/ml, y en el sobrenadante de HDL por m étodos enzim áticos u otros m étodos de ensayo. E l colesterol LD L se calcula com o la diferencia entre el colesterol m edido en el sub­ nadante y en la fracción de HDL. E l colesterol V LD L se calcula por lo general com o la diferencia entre el suero total y la cantidad en la fracción de subnadante. E l requi­ sito para la necesidad de una ultracentrifugadora ha lim i­ tado en general la betacu antificación a laboratorios con especialidad en lípidos. La b etacu antificación es tam bién

la base para el m étodo de referencia aceptado para LDL. E l m étodo es el m ism o que el d escrito antes para HDL con el colesterol HDL m edido restado del de la fracción del fondo para ob ten er colesterol LDL. U n m étodo m ás com ún que evita la ultracen trifu gación, que se em plea tanto en los laboratorios de investigación com o los de rutina, es el cálculo de Friedew ald o betacuan­ tificación derivada.1*8 E l colesterol HDL se cu antifica ya sea después de la precipitación o por m edio de un o de los m étodos directos, y el colesterol total y los triglicéridos se m iden en el suero. E l colesterol V LD L se estim a com o tri­ glicéridos divididos entre 5 (cu and o se em plean unidades de mg/dl), una aproxim ación que funciona bastante bien en la m ayor parte de las m uestras norm olipém icas. La pre­ sen cia de con cen tracio n es altas de triglicéridos (4 0 0 mg/dl es el lím ite aceptad o), quilom icrones y (3-VLDL caracterís­ tica de la hiperlipoproteinem ia tipo III rara im posibilita esta estim ación. E l colesterol V LD L estim ado y el coleste­ rol HDL m edido se restan del colesterol sérico total para estim ar o derivar el colesterol LDL. LD L = colesterol total - LD L - trig/5. E ste m étodo, conocid o com únm ente com o panel de lípidos y em pleado casi de m anera universal para estim ar el colesterol LD L en la práctica clín ica rutinaria, ha sido recom endado por las norm as N C EP ATP III. Las investigaciones en los labora­ torios de especialidad de lípidos h an llevado a pensar que el m étodo es confiable para la clasificació n de pacientes, siem pre que las m ediciones subyacentes se realicen con exactitu d y p recisión adecuadas .231,232 Sin em bargo, ha habido interés acerca de la confiabilidad en los laborato­ rios rutinarios porque el error al calcular el colesterol LD L se com bina co n el error en las m ed iciones subyacentes: colesterol total, triglicéridos y colesterol HDL. E l grupo de expertos de laboratorio del N CEP revisó los datos de desem peño y conclu yó que el nivel de desem peño an alíti­ co requerido para derivar colesterol LD L con la exactitud suficiente para satisfacer las necesidades clínicas estaba m ás allá de la capacidad de la m ayor parte de los laborato­ rios rutinarios. Para cum plir con el objetivo de precisión requerido N C EP de CV de 4% para colesterol LD L (cuadro 12 - 6), u n laboratorio tendría que lograr la m itad de los objetivos N C EP para cada una de las m ed iciones subya­ centes. E l grupo del N CEP concluyó que son necesarios m ejores m étodos para uso diagnóstico ru tin ario, de prefe­ rencia m étodos que separan LD L de m anera directa para cu an tificación de colestero l .71 E n respuesta a la petición del NCEP, se han desarrollado o refinado m étodos directos de colesterol LD L para uso general, que son sim ilares a los ensayos hom ogéneos para colesterol H D L .230,233 Además de lograr la autom atización com pleta de la estim ulante separación de colesterol LD L, estos ensayos tienen el potencial para agilizar la m edición m ientras se m ejora la precisión. Sin em bargo, separar LDL con especificidad adecuada de otras lipoproteínas de esta m anera es más estim ulante inclu so que la de HDL, y las pocas evaluaciones de los m étodos directos no h an sido prom etedoras .234 Se requerirá más experien cia, en particu­ lar con las m uestras de com posición inusual, para ju zg ar la conveniencia de las separaciones hom ogéneas .235

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

A n alizad ores com pactos L os lípidos y lipoproteínas com unes se pueden m ed ir con sistem as de análisis com pactos diseñados para uso en las pruebas realizadas en el lugar de la aten ció n al lado de la cam a del pacien te, en el con su ltorio m éd ico, en centros de salud e in clu so en el hogar .236 Los prim eros sistem as, introd u cid os en la década de 1 9 8 0 , eran relativam en­ te grandes y m edían colestero l y triglicéridos así com o otros analitos com unes, casi siem pre por separado y en secu encia. Las separaciones de HDL que conllevan pretratam iento fuera de línea se d esarrollaron después. Los sis­ tem as posteriores se volvieron m ás pequeños y com p lejos, y ofrecían la separación integrada de HDL y análisis de colestero l y triglicéridos al m ism o tiem po a partir de san ­ gre obtenida por p u n ció n digital. Ahora un sistem a puede m ed ir colesterol, triglicéridos, colesterol HDL y glucosa en form a sim ultánea a partir de una m uestra obtenida por p u nción digital. Tam bién están disponibles sistem as sin in stru m entos para colesterol total. Estas nuevas tecn o lo ­ gías ofrecen la capacidad de m edir lípidos y lipoproteínas co n confiabilidad razonable fuera del laboratorio conv en ­ cional.

M étodos de apolipoproteína Los lípidos por naturaleza tienden a ser in solu bles en el m edio acuoso de la circulación; por consiguiente, las lipoproteínas inclu yen varios constitu yentes proteín icos, designados apolipoproteínas, que adem ás de increm entar la solubilidad desem peñan otras fu nciones (cuadro 12 2 ). E n la investigación suelen m edirse apolipoproteínas, y algunos laboratorios de especialidades capaces de llevar a cabo prácticas cardiovasculares o estudios clín ico s las m id en de m anera rutinaria adem ás de las lipoproteínas. Para propósitos de diagnóstico clín ico , tres apolipoproteí­ nas en particu lar han sido de interés. La apo B, la proteína principal de LD L y VLDL, es un indicad or de con cen tra­ ció n com binada de LD L y V LD L que se puede m edir de m anera directa en el suero de inm u n oen sayo .237 Algunos investigadores pueden sugerir apo B com o una alternati­ va para la separación y m ed ición del colesterol L D L .238 La Apo A-I, es la m ejo r proteína de HDL, puede m edir de form a directa en suero en lugar de la separación y análisis de colesterol HDL; sin em bargo, debido a que la cuantificación en térm inos del contenid o de colesterol es más com ún, esta últim a práctica ha prevalecido. La L p (a), la variante de LDL, que se ha m ostrado es un indicador independ iente de riesgo de C C , se determ ina a veces para tratar a los pacientes. La m ed ición de estas tres apolipo­ proteínas puede ser útil cuando m édicos expertos tratan al paciente, pero no ha sido aceptada o recom endada en alguna de las norm as de consenso para uso en la práctica rutinaria. Los resultados de estudios prospectivos han sido incon sisten tes en dem ostrar que son predictores indepen­ dientes de riesgo de CC. La L p (a) tiene m ovilidad pre-|3 en la electroforesis de agarosa y puede ser cuantificada por esta técnica. Sin em bargo, las apolipoproteínas suelen m edirse m ediante inrnunoensayos de varios tipos, con varios m étodos de

303

equipos com erciales d isponibles .237 M ás com ú n en los laboratorios rutinarios son los ensayos n efelom étricos para nefelóm etros dedicados. E n particular para apo B y L p (a), estos ensayos de dispersión de luz pueden estar sujetos a interferencia de lipoproteínas más grandes ricas en tri­ glicéridos (quilom icron es) y VLDL. Tam bién han estado disponibles los m étodos de análisis de inm un oabsorción ligado a enzim as (E L IS A ), la inm un od ifu sión radial (ID R ) y el radioinm unoensayo, pero estos dos últim os m étodos se están volviendo cada vez m enos com unes. Los anticuer­ pos em pleados en los inrnunoensayos pueden ser m o n o­ clonales o policlonales. Los esfuerzos internacion ales para desarrollar m ateriales de referencia y program as de estan­ darización para los ensayos están en progreso. D ebido a que la L p (a) es heterogénea desde el punto de vista gené­ tico, y las con centracio n es y riesgo de C C se correlacionan con el tam año de la isoform a, la evaluación cualitativa de la distribución de isoform as tam bién puede ser im portan­ te .138

M edición de fosfolípidos La m ed ición cuantitativa de fosfolípidos es rara en la p rác­ tica clín ica rutinaria. A veces en la investigación se m iden fosfolípidos (p. e j., en estudios de influencias d ietéticas). Los fosfolípidos lecitina, lisolecitina y esfingom ielina que con tien en colin a, que explican por lo m enos 95% de los fosfolípidos totales en el suero, se pueden m edir m ediante una secu encia de reacción enzim ática con fosfolipasa D, oxidasa de colina y peroxidasa de ráb an o .239,240 Los m éto­ dos de equipo con esta secu encia enzim ática están dispo­ nibles de form a com ercial. A ntes de la disponibilidad de reactivos enzim áticos, el m étodo cuantitativo com ún tenía que ver co n la extracció n y digestión ácida con análisis de fósforo total ligado a líp id os .241 C iertos fosfolípidos que con tien en colina y, en algunas aplicaciones, sus relaciones, han sido determ inados en el laboratorio clín ico . Por ejem plo, la m adurez pulm onar fetal ha sido evaluada de patrones característicos de fosfo­ lípidos en líquido am niótico. E n este caso, los fosfolípidos pueden ser recuperados por extracció n con disolventes, aplicados a una placa de gel de sílice para separación al tratar con vapor de yodo. La relación de lecitin a a esfin­ gom ielina ha sido empleada para predecir la m adurez pul­ m onar fetal.

M edición de ácidos grasos A unque los estudios indican que los ácidos grasos tie­ nen p otencial para evaluar el riesgo de C C , el análisis se em plea principalm ente en laboratorios de investigación para estudios de d ieta .82 M enos com ún es su m ed ición en el diagnóstico de cond iciones genéticas raras. Por lo gene­ ral, los ácidos grasos se analizan m ediante crom atografía gas-líquido, después de la extracció n , hidrólisis alcalina y conversión a ésteres de m etilo de diazom etano. U n están­ dar de referencia contiene por lo general laurato, m iristato, palm itato, palm itoleato, fitanato, estearato, oleato, linoleato, araquidato y araquidonato .242

304

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

ES T U D IO D E C A S O 12-6 E n una clín ica se tiene a tres pacientes en observación: • El paciente uno es un varón de 4 0 años de edad con hipertensión , que tam bién fum a, pero n o se le ha diagnosticado CC. Su padre m anifestó CC a la edad de 5 3 años. É l está en ayuno, y los resultados de sus lípidos inclu yen una con cen tració n de colesterol total de 2 1 0 mg/dl, triglicéridos de 1 5 0 mg/dl y un valor de colesterol HDL de 4 5 mg/dl. Tiene una c o n ­ cen tración de glucosa en ayuno de 9 8 mg/dl. • E l pacien te dos es una m u jer de 6 0 años de edad sin antecedentes fam iliares de C C , que es norm otensa y n o fum a, co n una con cen tració n de colesterol total de 2 2 0 mg/dl, triglicéridos de 8 5 mg/dl y u n valor de colesterol de 8 0 mg/dl. Su con cen tració n de glucosa de ayuno es de 8 5 mg/dl. • E l paciente tres es un varón de 4 9 años de edad sin antecedentes personales de C C , y que es hipertenso y n o fum a. Su con cen tració n de colesterol total en ayunas es de 2 6 0 mg/dl, sus triglicéridos son 5 0 5 mg/dl, su colesterol LD L es de 2 5 mg/dl y su co n cen ­ tración de glucosa es de 1 3 4 mg/dl.

ESTANDARIZACIÓN DE ENSAYOS DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS Precisión La p recisión es un requisito para la exactitud; un m éto­ do puede no tener error sistem ático o sesgo global; sin em bargo, si es im preciso, será in exacto en m ediciones individuales. C on el cam bio a analizadores autom atizados m odernos, la variación analítica se ha vuelto por lo gene­ ral m enos interesante que la b iológica y otras fuentes de variación preanalítica. Las con cen tracio n es de colesterol son afectadas por m uchos factores que pueden ser clasi­ ficados en fuentes biológicas, clín icas y de m u estreo .243,244 Los cam bios en el estilo de vida que afectan los patrones usuales de dieta, ejercicio, peso y h ábito de fum ar pueden dar com o resultado fluctuaciones en los valores obser­ vados de colesterol y triglicéridos, y la d istribución de lipoproteínas. De m anera sim ilar, la presencia de con d i­ ciones clín icas, diversas enferm edades o las m ed icaciones em pleadas en su tratam iento, afectan a las lipoproteínas circulantes. Las cond icion es durante la reco lecció n de sangre, com o el estado de ayuno, postura, la elecció n de anticoagulante en el tubo de reco lecció n y las con d icio­ nes de alm acenam iento, pueden alterar las m ediciones. La variación b iológica observada característica durante m ás de un año para colesterol total prom edia alrededor de 6.1% CV E n el pacien te prom edio, las m ed iciones hechas en el curso de un año caerían 66% de las veces dentro

Preguntas Para cada paciente visto en la clínica: 1. ¿C uál es la con cen tració n de colesterol LDL, ca lcu ­ lada con la ecu ación de Friedewald? 2. ¿Q ué paciente, si hay alguno, debe solicitar una m ed ición de su colesterol LD L, adem ás de ser calcu ­ lado? ¿P or qué? 3. ¿C uántos factores de riesgo de CC conocid os tiene cada paciente? 4. C o n base en lo que se con o ce, ¿son recom endados estos pacien tes para terapia de lípidos (dieta o fár­ m acos) y, en caso afirm ativo, en qué base?

de ± 6 .1 % de la con cen tració n m edia de colesterol y 95% de las veces dentro de dos veces este intervalo. Algunos pacientes pueden exh ib ir sustancialm en te más variación biológica. Así, la variación preanalítica por lo general es algo grande en relación con la variación analítica usual, que suele ser m en or de 3% CV, y se debe consid erar al interpretar los resultados de colesterol. A lgunos factores com o la postura y la reco lecció n de sangre, se pueden estandarizar para m inim izar la variación. Las norm as de N C EP recom iend an prom ediar por lo m enos dos m ed icio­ nes sucesivas para reducir los efectos de las fuentes prea­ nalítica y an alítica .73 E l uso de punto de corte escalonados tam bién reduce el efecto práctico de la variación.

Exactitud La exactitu d se asegura al dem ostrar rastreo o acuerdo a través de la calibración para el m étodo de referencia res­ pectivo. Con el colesterol, el sistem a de referencia es avan­ zado y com pleto, habiendo servido com o m odelo para la estandarización de otros analitos de laboratorio .172,177 El m étodo definitivo en el N ational Institutefor Standards and Technology proporciona el últim o objetivo de exactitu d pero es dem asiado caro y com plicado para uso frecu en­ te .176 E l m étodo de referencia desarrollado y aplicado en el CD C , y calibrado por un estándar de referencia prim a­ rio aprobado para el m étodo definitivo, proporciona un enlace de referencia práctico, tran sferible .173 E l m étodo de referencia se ha h ech o accesible de m anera conveniente a

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

través de una red de laboratorios estandarizados, la Red de laboratorios para el m étodo de referencia de colesterol. Esta red fue establecida en Estados U nidos y algunos de los países europeos y asiáticos para am pliar la estandariza­ ció n a fabricantes y laboratorios c lín ico s .172 La red propor­ cion a com paraciones de exactitud con m uestras de suero nativo nuevo necesarias para la transferencia exacta con ­ fiable debido a problem as de in teracció n analito-m atriz en m ateriales de referencia p rocesad os .245'247

Interacciones de m atriz E n las prim eras etapas de estandarización de colesterol, que estaban dirigidas hacia fabricantes de diagnóstico y laboratorios rutinarios, se em pleaban m ateriales liofilizados. E stos m ateriales, hech os en grandes cantidades, a m enudo con ad ición artificial de analitos, se analizaban m ediante m étodos definitivos o de referencia, o am bos, y se d istribuían de m anera am plia para transferencia de exactitud. P osteriorm ente, se observaban los sesgos en ensayos enzim áticos en m uestras nuevas del paciente. A unque tales m ateriales de referencia fabricados son co n ­ venientes, estables y recom endables para envío a tem pera­ turas am biente, el proceso de m anufactura, en particular la ad ición artificial y la liofilización , m odificaba las propie­ dades de m ed ición en ensayos enzim áticos, de m odo que los resultados no eran representativos de los de las m ues­ tras del paciente. Para lograr la retroalim entación confia­ b le en la exactitu d y facilitar la transferencia de la base de exactitud, se determ inó que eran necesarios m étodos de referencia en las m uestras reales del p acien te .172

Red de laboratorios para el m étodo de referencia de colesterol del CDC E n respuesta, se organizó el program a de red de coleste­ rol del CD C. (Inform ación disponible en: http://www.cdc. gov/nceh/dls/crmln/crmln.htm). La red ofrece program as de certificación form ales para colesterol total, HDL y LDL, así que los laboratorios y fabricantes pueden docum entar el seguim iento para los sistem as de referencia n aciona­ le s .172 A través de este program a, los laboratorios clín i­ cos pueden identificar m étodos com erciales certificados. La certificación no asegura todos los aspectos de calidad en u n sistem a reactivo pero asegura principalm ente que la exactitu d es fácil de seguir para m étodos de referencia dentro de lím ites aceptados, y que la p recisión puede satis­ facer los objetivos del NCEP. E l proceso de certificación es u n poco tedioso y, por tanto, m ás eficiente a través de los fabricantes, pero los laboratorios individuales que desean confirm ar el desem peño de sus sistem as pueden com pletar u n p rotocolo de certificación reducido para el colesterol.

O bjetivos de desem peño analítico Los grupos de laboratorio N C EP han establecido ob je­ tivos de desem peño analítico requeridos co n base en las necesidades clínicas para m ed iciones rutinarias (cuadro 1 2 -6 ).70'72 177 Para análisis de colesterol total, el objetivo

305

de desem peño para error total es 8.9 % . Es decir, el error global debe ser tal que cada m ed ición de colesterol caiga dentro de ± 8 .9 % del valor del m étodo de referencia. En realidad, debido a que los objetivos se basan en certidu m ­ bre de 95 % , 9 5 de 1 0 0 m ediciones deben caer dentro del lím ite de error total. Se puede valorar una m uestra m uchas veces y calcular la m edia para determ inar el valor usual o la tendencia central. La dispersión o variación aleatoria en torno a la m edia se describe m ediante la d esviación están­ dar, un intervalo alrededor de la m edia que inclu ye, por d efinición, dos tercios de las observaciones. E n el labo­ ratorio, debido a que la dispersión o im precisión es con frecu encia proporcional a la con cen tració n , la variación aleatoria suele especificarse en térm inos relativos com o CV, el coeficiente de variación de la d esviación estándar relativa, calculada com o la desviación estándar dividida entre la m edia. La exactitud global o error sistem ático se describe com o sesgo, la diferencia entre la m edia y el valor verdadero. E l sesgo es principalm ente una fu nción de la calibración del m étodo y puede variar por concentración. De m ayor interés en este con tex to es el sesgo en los pun­ tos de corte de d ecisión NCEP. E l sesgo y los objetivos de CV presentados en el cuadro 1 2 -6 son representativos del desem peño que satisfará los objetivos N C EP para el error total.

Control de calidad E l desem peño analítico aceptable alcanzable requiere el uso de m ateriales de control de calidad confiables, que de preferencia deben em ular las m uestras reales del pacien ­ te. E n la actualidad, los m ejores m ateriales se preparan a partir de suero del paciente recién recolectado, del cual se tom an alícuotas que se depositan en viales b ien sella­ dos, se congelan con rapidez y se alm acen an a -7 0 ° C . Esta clase de fondos com unes de suero congelado nuevo están m enos su jetos a interaccion es m atriciales que los m ate­ riales com erciales usuales, m ás im portante es m onitorear la exactitu d en la separación y análisis de lipoproteínas, y preferible para m onitorear colesterol y otras m ed icio­ nes de lípidos. Se deben analizar por lo m enos dos fondos com unes, de preferencia co n con cen tracio n es en o cerca de los puntos de d ecisión para cada analito.

Recolección de la m uestra E l suero, recolectado por lo general en tubos al vacío con separador de suero con intensificadores de coagulación, ha sido el líquido de elecció n para m ed ición de lipopro­ teínas en el laboratorio clín ico rutinario. E l plasm a con ácido etilendiam inotetracético (ED TA) era la elecció n tra­ dicional en los laboratorios de investigación de lípidos, especialm ente para separaciones de lipoproteínas, por­ que el anticoagulante increm enta la estabilidad m ediante la q u elación de iones m etálicos. E l EDTA tiene desven­ tajas potenciales que desalientan el uso ru tinario. Los m icrocoágulos, que se form an en el plasm a durante el alm acen am iento, taponan las sondas de m uestreo de los analizadores quím icos m odernos. E l EDTA extrae osm óti­

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PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

cam ente agua de los glóbulos ro jos, de m odo que se d ilu­ yen los constitu yentes, y el efecto de d ilución puede variar dependiendo de factores com o el volu m en de llenado, el analito que se está m idiendo y el grado de m ezcla. D ebido a que los pu ntos de corte N CEP se basan en valores de suero, las m ed iciones de colesterol hechas en plasm a de EDTA requieren corrección por el factor de 1.03.

RESUM EN Las lipoproteínas son partículas com plejas que interactúan con m u chas otras vías m etabólicas del cuerpo. Su hom eostasis puede ser afectada por d esequilibrios de otras vías com o d esequilibrios horm onales y diabetes y, de igual

P R E G U N T A S 1. ¿C uáles de los siguientes m étodos para electrofore­ sis de lipoproteínas depende de la carga y el tam año m olecular? a) Papel. b) Gel de poliacrilam ida. c) A cetato de celulosa. d ) Agarosa. 2. ¿Cuál de los siguientes enunciados relacionado con los quilom icrones es falso? a ) Esta lipoproteína se produce en la m ucosa in tes­ tinal. b ) La fu n ció n principal es llevar lípidos dietéticos (exógen os) al hígado. c) E l lípido principal que transporta esta lipoproteí­ na es colesterol. d ) P erm anece en el origen (pu nto de aplicación) durante la electroforesis de lipoproteínas. 3. La lipoproteína que contien e la m ayor cantidad de proteína se llama: a) Q uilom icrón. b) VLDL. c) HDL. d ) LDL. 4. Las lipoproteínas pre-p (V LD L) m igran m ás hacia el ánodo en gel de poliacrilam ida que en acetato de celu ­ losa o agarosa. a) Verdadero. b) Falso. 5. Varios m étodos enzim áticos de triglicéridos m iden la prod u cción o consum o de: a) Á cidos grasos. b) G licerol. c) Lutidina de diacetilo. d) NADH.

m anera, el m etabolism o anorm al de lipoproteínas pue­ de perturbar el sistem a del cuerpo y causar enferm edad, com o se observa en la pancreatitis y la enferm edad corona­ ria. Algunos aspectos del desequilibrio de lipoproteínas se determ inan de m anera genética (es decir, género, enzim a o defectos de recep tor), m ientras que otros se pueden co n ­ trolar a través de dieta, red ucción del consu m o de tabaco, ejercicio y el m onitoreo de la presión arterial. Las m ed icio­ nes precisas y exactas de lípidos y proteínas son esenciales para el diagnóstico apropiado y tratam iento de dislipidemias. Por últim o, las medidas de salud pú blica para educar a la población sobre factores de riesgo es im portante en la prevención de enferm edades que se desarrollan com o consecu encia de dislipidem ia, com o coronariopatía.

DE

R E P A S O

6 . La causa más probable para que el suero o el plasm a tengan una apariencia “lech o sa” es la presencia de: a) VLDL. b ) LDL. c) HDL. d) Q uilom icrones. 7. E n la d eterm inación colorim étrica de colesterol, con la enzim a oxidasa de colesterol, el agente que oxida al com puesto orgánico incoloro 4-am inoantip irina a un com p lejo rosa es: a) C o lest-4-en e-3-on a. b ) NAD. c) Peroxidasa de hidrógeno. d) Fenol.

8. ¿Cuál lipoproteína es el portador principal de coleste­ rol ai tejid o periférico? a) Q uilom icrones. b) VLDL. c) LDL. d ) HDL. 9. Las con cen tracio n es altas de apolipoproteína A-I se relacionan con el m ayor riesgo de coronariopatía. a) Verdadero. b) Falso. 1 0 -1 1 . U n pacien te es adm itido al hospital con dolores de tórax intensos. E l m édico de aten ción prim aria del p acien te solicita al m éd ico del departam ento de urgencias que ordene varias pruebas, entre otras un perfil de lípidos co n fraccionam iento de colesterol. Considerando los resultados del pacien te provistos a con tin u ació n , con teste las dos preguntas siguientes. C olesterol total = 4 0 0 mg/dl; triglicéridos = 3 0 0 mg/ di; colesterol H DL = 100 mg/dl; electroforesis LP, p en­ diente

CAPÍTULO 12 ■ LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

10. E l colesterol LD L para este paciente, considerando los resultados anteriores, sería: á) 160 mg/dl. b ) 200 mg/dl. c) 2 4 0 mg/dl. d ) 3 0 0 mg/dl. 11. E l colesterol LD L del pacien te es: a) Ó ptim o. b) D eseable. c) Lím ite. d) Alto. 12. Com o parte de una fenotipia de lipoproteínas, es necesario llevar a cabo d eterm inaciones de colesterol total y triglicéridos, así com o la electroforesis de lipo­ proteínas. Los resultados de prueba obtenidos de tales estudios fueron: • Triglicérido, 3 4 0 mg/dl (intervalo de referencia, < 1 5 0 mg/dl). • C olesterol total, 180 mg/dl (intervalo de referen­ cia, ■ piruvato ----->■

■ >■acetil-CoA - — ► ciclo del ácido cítrico

La fosforilación oxidativa en las mitocondrias rápidamente oxida a la NADH de nuevo en NAD+ se producen 38 moles de ATP

Metabolismo anaerobio 1 mol de glucosa

>- piruvato ----- )(-----► aceti-CoA -- N A D H

■ — N AD + lactato

Sin la fosforilación oxidativa, la NADH se acumula, lo cual favorece la conversión de piruvato a lactato

se producen 2 moles de A TP

FIGURA 13-7.

Metabolismo aeróbico contra anaeróbico de glucosa.

la e s ta s is v e n o s a in c r e m e n ta r á la s c o n c e n t r a c i o n e s d e l a c ­

la g lu c ó lis is sin a f e c ta r la c o a g u l a c i ó n , s o n p o r lo g e n e r a l

ta to . Si s e e m p le a u n to r n iq u e te , la s a n g re s e d e b e r e c o l e c ­

a d itiv o s s a tis f a c to r io s , p e ro se d e b e n c o n s u l ta r la s in d ic a ­

ta r d e in m e d ia to y el p a c ie n te n o d e b e e je r c ita r la m a n o

c io n e s e s p e c if ic a s d el m é to d o .

a n te s o d u r a n te la r e c o l e c c i ó n .10 D e s p u é s d e la r e c o l e c ­

Métodos.

A u n q u e el l a c ta t o es u n in d ic a d o r s e n s ib le d e

c i ó n , la g lu c o s a s e c o n v ie r te a la c to s a p o r m e d io d e g lu ­

o x ig e n a c i ó n tis u la r in a d e c u a d a , el u s o d e m e d ic io n e s d e

c ó lis is a n a e ro b ia y s e d e b e e v ita r. L a s a n g re h e p a r in iz a d a

la c ta t o s a n g u ín e o h a sid o o b s ta c u liz a d o p o r q u e lo s m é t o ­

s e p u e d e u s a r p e ro s e d eb e e n tr e g a r e n h ie lo y s e p a r a r c o n

d o s m á s v ie jo s e ra n le n to s y la b o r io s o s . Se h a n e m p le a ­

ra p id e z el p la s m a . E l y o d o a c e t a to o flu o r u r o , q u e in h ib e n

d o o tr o s m é t o d o s p a r a s e g u ir la p e rfu s ió n u o x ig e n a c i ó n ,

FIGURA 13-8. Efectos metabólicos de hipoxia, que conduce a muerte celular.

338

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

CUADRO 13-20. INTERVALOS DE REFERENCIA PARA LACTATO

E s to s v a lo r e s s e p u e d e n u s a r p a ra a p r o x im a r el intervalo amónico (IA), q u e e s la d ife re n c ia e n tr e a m o n e s n o m e d i­ d o s y lo s c a t io n e s n o m e d id o s . N u n c a h a y u n “i n t e r v a l o ”

M ÉTO D O ENZIM ÁTICO,

e n tr e las c a r g a s c a t ió n ic a s to ta le s y las c a r g a s a n ió n ic a s .

PLASM A

E l IA s e c r e a p o r la d ife re n c ia d e c o n c e n t r a c i ó n e n tr e lo s

Venoso

0.5 a 2.2 mmol/L (4.5 a 19.8 mg/dl)

Arterial

0.5 a 1.6 mmol/L (4.5 a 14.4 mg/dl)

c a tio n e s m e d id o s c o m ú n m e n te (N a + K ) y lo s a n io n e s (C l + H C 0 3) , c o m o s e ilu s tr a en la fig u ra 1 3 - 9 . E l IA es ú til p a ra i n d ic a r u n in c r e m e n to e n u n o o m á s d e lo s a n io n e s

LCR

1.1 a 2.4 mmol/L (10 a 22 mg/dl)

n o m e d id o s e n el s u e r o y ta m b ié n c o m o u n a f o r m a d e c o n tr o l d e c a lid a d p a ra el a n a liz a d o r e m p le a d o p a ra m e d ir

c o m o lo s c a té te r e s in te r n o s p a ra m e d ir flu jo d e s a n g re , o x ím e t r o s d e p u ls o , d e te r m in a c io n e s d e e x c e s o y m e d i­ c i o n e s d e c o n s u m o d e o x íg e n o ( V 0 2) . L o s m é t o d o s e n z i­ m á t i c o s a c tu a le s fa c ilita n la d e te r m i n a c i ó n d e l a c ta t o . E n el m é t o d o e n z im á tic o c o m ú n s e e m p le a o x id a s a d e l a c ta t o p a ra p r o d u c i r p ir u v a to y H 2O z. .

t

.

t

Oxidasa de lactato

.

.

,,

L a c ta t o + 0 2 --------------------> p ir u v a to + H 20 2

(Ec. 13-6)

e s to s e le c tr ó lito s . L o s e s p a c io s a m ó n ic o s c o n s is t e n te m e n ­ te a n o r m a le s e n el s u e r o d e p e r s o n a s sa lu d a b le s p u e d e n in d ic a r u n p ro b le m a d el in s tr u m e n to . H a y d o s m é to d o s c o m u n e s p a r a c a l c u l a r el in te rv a lo a n ió n ic o . L a p r im e r a e c u a c ió n es IA = N a + - ( C L + H C 0 3- )

(Ec. 13-8)

E s e q u iv a le n te a a n io n e s n o m e d id o s m e n o s lo s c a t io ­ n e s n o m e d id o s e n e s ta fo rm a :

S e p o d r ía u s a r e n to n c e s u n a d e las d o s r e a c c io n e s a c o ­

IA = ( p r o te ín a + á c id o s o r g á n ic o s +

p la d a s . L a p e r o x id a s a s e e m p le a p a r a p r o d u c i r u n c r o m ó g e n o c o l o r e a d o a p a r t ir d e H 20 2.

P 0 4“ + 2 S 0 42- ) - (K + + 2 C a +2 + M g +2) (Ec. 13-9) E l in te rv a lo d e r e f e re n c ia p a ra el IA c o n e ste c á l c u l o es

H 20 2 + d o n a d o r d e H + c r o m ó g e n o c o l o r a n t e c o lo r e a d o + 2 1 1 ,0

(Ec. 13-7)

7 a 1 6 m m o l/L .3 E l s e g u n d o m é t o d o d e c á l c u l o es IA = ( N a + + K +) - ( C L + H C 0 3)

(E c. 13-10)

Intervalos d e referen cia 5 É s te tien e u n in te rv a lo d e referen cia d e 1 0 a 2 0 m m o l/L .3

V é a s e el c u a d r o 1 3 - 2 0 .

U n intervalo aniónico elevado p o d r ía s e r c a u s a d o p o r

INTERVALO ANIÓNICO

u re m ia e in s u fic ie n c ia re n a l, q u e c o n d u c e a r e t e n c ió n d e

L a m e d ic ió n d e r u tin a d e e le c tr ó lito s n o r m a lm e n te tie n e

c ió n

q u e v e r s ó lo c o n N a +, K +, C l" y H C 0 3" ( c o m o C 0 2 t o t a l ).

e tile n g lic o l, o s a lic ila to ; a c id o s is lá c ti c a ; h ip e r n a tr e m ia , y

P 0 4- y S 0 42-; c e to a c id o s is , c o m o s e v e e n c a s o s d e in a n i­ o d ia b e te s ; m e t a n o l , e ta n o l, e n v e n e n a m ie n to p o r

ES T U D IO D E C A S O 13-4 C o n s id e r e lo s s ig u ie n te s r e s u lta d o s d e l a b o r a to r io d e

Preguntas

tre s p a c ie n te s a d u lto s : 1.

¿ Q u é c o n ju n t o d e re s u lta d o s d e la b o ra to rio ( c a s o A , B o C ) es el m á s p ro b a b le r e la c io n a d o c o n c a d a u n o d e lo s s ig u ie n te s d ia g n ó s tic o s : •

H ip e rp a ra tir o id is m o p rim a r io



M a lig n id a d



H ip o c a lc e m ia h ip o m a g n e s é m ic a

CUADRO 13-4.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO INTERVALOS DE REFERENCIA

CASO

ION Ca*2

Mg*2 TO TAL

p o 4-

1.16-1.32 mm ol/L

0.63-1.0 mm ol/L

0.87-1.45 mm ol/L

HORM ON A PARATIROIDEA INTACTA H EM ATÓCRITO 3 5 -4 5 %

13-64 ng/L

A

1.44

0.90

0.85

42

100

B

1.08

0.50

0.90

40

25

C

1.70

0.98

1.43

30

12

CAPÍTULO 13 ■ ELECTRÓLITOS

Na=142

H S 0 4=2

H P 0 4, H S04= 2 Ácido orgánico = Proteina=17

Ácido orgánico =

H C 0 3=28

H C 0 3=22

Cl=103

Normal Intervalo aniónlco = 15 (14 2 + 4 )-(1 0 3+ 2 8 )

339

Proteína = 17

Na=141

Cl= 103

FIGURA 13-9. Demostración del intervalo aniónico a partir de concentraciones de aniones y cationes en estado normal y en acidosis láctica.

Acldosis de lactato Intervalo aniónico = 21 (141 + 5)—(103+22)

e r r o r d e l in s t r u m e n t o . L o s v a lo r e s bajos d el intervalo anió­ nico s o n r a r o s p e ro se p u e d e n v e r c o n h ip o a lb u m in e m ia ( d i s m i n u c i ó n d e a n io n e s n o m e d id o s ) o h ip e r c a lc e m ia g ra v e ( in c r e m e n t o d e c a tio n e s n o m e d i d o s ) .

é) E l c l o r u r o es r e a b s o rb id o , e n p a r t e , p o r tr a n s p o r te p a s iv o e n el tú b u lo p r o x im a l a lo la rg o d el g ra d ie n te d e c o n c e n t r a c i ó n c r e a d o p o r N a +.

f ) E l p o ta s io s e re a b s o rb e m e d ia n te d o s m e c a n is m o s : •

L a re a b s o r c ió n a c tiv a e n el tú b u lo p r o x im a l c a si c o n s e r v a p o r c o m p le to K +.

ELECTRÓLITOS Y FUNCIÓN RENAL •

E l in te r c a m b io c o n N a + es e s tim u la d o p o r a ld o s ­ te ro n a . H + c o m p ite c o n K + p a r a e s te c a m b io .

E l r i ñ ó n e s el c e n tr o p a ra la re g u la c ió n y c o n s e r v a c i ó n d e e l e c tr ó li t o s e n e l c u e r p o . P a ra u n a r e v is ió n d e la e s t r u c ­ tu r a d e l r i ñ ó n , re fié ra se a la fig u ra 1 3 - 1 0 y el c a p ítu lo 2 4 ,

Función renal. E l s ig u ie n te es u n r e s u m e n d e e x c r e c i ó n y c o n s e r v a c i ó n d e e le c tr ó lito e n u n in d iv id u o s a lu d a b le : 1. G lo m é ru lo : e s ta p o r c ió n d e la n e fro n a a c t ú a c o m o u n filtro , re tie n e la s p ro te ín a s g ra n d e s y lo s c o n s titu y e n te s

Túbulo distal Túbulo proximal

e n la z a d o s a p r o te í n a m i e n tr a s q u e o tr o s c o n s t i t u y e n ­ te s p la s m á tic o s p a s a n h a c ia el filtra d o . L a s c o n c e n t r a ­ c io n e s e n e l p la s m a filtra d o d e b e n s e r c a s i ig u a le s a la

Na

p r o te ín a s in L E C .

Ducto colector

HCO3 — c o 2 + h 2o

2 . T ú b u lo s re n a le s : a ) L a P T H in h ib e la r e a b s o r c ió n d e fo sfa to y el 1 ,2 5 d ih id r o x ic o le c a lc if e r o l la in c r e m e n ta . L a c a lc ito n in a e s tim u la la e x c r e c i ó n d e P 0 4.

b) E l c a lc io e s re a b s o rb id o b a jo la in f lu e n c ia d e P T H y 1 ,2 5 - d i h i d r o x ic o l e c a l c i f e r o l . L a c a l c i to n in a e s tim u la

Vaso sanguíneo

tfiO

1 ¡ con ADH presente K+oH +

e x c r e c i ó n d e c a lc io . c ) L a r e a b s o r c ió n d e m a g n e s io o c u r r e e n g ra n m e d id a

con aldosterona presente

e n e l e x t r e m o a s c e n d e n te g r u e s o d el a s a d e H e n le .

d ) L a r e a b s o r c ió n d e s o d io p u e d e o c u r r i r p o r tre s m e c a ­ n is m o s : A lr e d e d o r d e 7 0 % d e l s o d io e n el filtra d o es re a b ­ s o rb id o e n lo s tú b u lo s p r o x im a l e s p o r re a b s o rc ió n i s o o s m ó t ic a . S in e m b a rg o , e stá lim ita d a p o r la c a p a ­ c id a d d e l c lo r u r o p a ra m a n t e n e r la n e u tr a lid a d e lé c ­

Asa de Henle

tric a . E l s o d io e s re a b s o rb id o e n in te r c a m b io p o r H +. E s ta r e a c c i ó n e stá e n la z a d a c o n H C 0 3 y d e p e n d e d e la a n h id r a s a c a r b ó n ic a . E s tim u la d o p o r a ld o s te r o n a , el N a + es re a b s o rb i­ d o e n in te rc a m b io p o r K + e n lo s tú b u lo s d ista le s. (H + c o m p i te c o n K + p o r e s te i n te r c a m b io .)

FIGURA 13-10. renales.

Resumen de movimientos de electrólito en túbulos

340

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

ES T U D IO D E C A S O 13-5 L o s p a d re s d e u n a m u c h a c h a d e 1 5 a ñ o s d e e d a d e n e s ta ­

Preguntas

d o d e c o m a la lle v a ro n al d e p a r ta m e n to d e u rg e n c ia s . E lla p a d e c e d ia b e te s y h a s id o d e p e n d ie n te d e in s u lin a

1. ¿ C u á l es el d ia g n ó s tic o ?

p o r s ie te a ñ o s . S u s p a d r e s e x p r e s a r o n q u e a n te s h a b la

2 . C a lc u le el in te rv a lo a n ió n ic o . ¿ C u á l es la c a u s a d el

te n id o v a r io s e p is o d io s d e h ip o g lu c e m ia y c e t o a c id o ­

re s u lta d o d e in te rv a lo a n ió n ic o e n e s ta p a c ie n te ?

s is , y q u e su h ija c o n fr e c u e n c ia e s ta b a “d e m a s ia d o o c u p a d a ” p a ra t o m a r su s i n y e c c i o n e s d e in s u lin a . L o s

3 . ¿ P o r q u é s o n re d u c id a s las c o n c e n t r a c i o n e s d e c l o ­

r e s u lta d o s d e l a b o r a to r io o b te n id o s e n la a d m is ió n se

r u r o y b ic a r b o n a to ? ¿ C u á l es la i m p o r ta n c ia d el v a lo r

m u e s tr a n e n el c u a d r o 1 3 - 5 .1 d e e s tu d io d e c a s o .

a lto d e p o ta s io ? 4 . ¿ C u á l es la im p o rta n cia d e la o sm o lalid ad p la sm á tica ?

CUADRO 13-5.1 DE ESTUDIO DE CASO. RESULTADOS DE LABORATORIO RESULTADOS

Sangre venosa

Sangre arterial

INTERVALO DE REFERENCIA

Sodio

145 mmol/L

136 a 145 mmol/L

Potasio

5.8 mmol/L

3.4 a 5.0 mmol/L

Cloruro

87 mmol/L

98 a 107 mmol/L

Bicarbonato

8 mmol/L

22 a 29 mmol/L

Glucosa

1050 mg/dl

70 a 110 mg/dl

Nitrógeno de urea

35 mg/dl

7 a 18 mg/dl

Creatinina

1.3 mg/dl

0.5 a 1.3 mg/dl 0.5 a 2.2 mmol/L

Lactato

5 mmol/L

Osmolalidad

385 mOsmol/kg

275 a 295 mosm/kg

pH

7.11

7.35 a 7.45

P02

98 mm Hg

83 a 100 mmHg

PC02

20 mm Hg

35 a 45 mmHg

Glucosa

4+

Negativa

Cetonas

4+

Negativa

Orina

Normal

g ) E l b ic a r b o n a to s e r e c u p e ra d el filtrad o g lo m e ru la r y

n e g a tiv a y s e m u e v e n h a c ia el á n o d o ; lo s c a t io n e s tie n e n

s e c o n v ie rte e n C 0 2 c u a n d o se e x c r e ta H + en la o rin a .

u n a c a r g a p o s itiv a y m ig r a n h a c ia el á n o d o . L o s e l e c tr ó li ­

A sa d e H e n le : c o n la f u n c ió n n o r m a l d e A D H ,

to s s o n e s e n c ia le s p a ra n u m e r o s o s p r o c e s o s e n el c u e r p o ,

crea u n

g r a d ie n te o s m ó t i c o

q u e la

c o m o la re g u la c ió n d el v o lu m e n y la p r e s ió n o s m ó t i c a ,

d e a g u a s e i n c r e m e n te o d is m in u y a

r it m o y c o n tr a c ti l id a d m io c á r d ic a , a c tiv a c ió n d e e n z im a s ,

e n r e s p u e s ta a c a m b io s d e líq u id o s c o r p o r a l e s d e

r e g u la c ió n d e las b o m b a s d e io n e s d e A T P a sa , e q u ilib rio

r e a b s o r c ió n

q u e p e r m ite

o s m o la lid a d . D u c to s c o le c to r e s : ta m b ié n b a jo la in f lu e n c ia d e

a c id o b a s e , c o a g u l a c i ó n

d e s a n g re , e x c ita b ilid a d n e u r o -

m u s c u la r , y la p r o d u c c i ó n y u s o d e A T P a p a r t ir d e g lu ­

A D H , é s te e s el lu g a r d o n d e s e h a c e el a ju s te fin al d e

c o s a . L o s e le c tr ó lito s a n a liz a d o s e n e s te c a p ítu lo fu e ro n

e x c r e c ió n d e agua.

s o d io , c a l c i o , fo s fa to , c l o r u r o , b ic a r b o n a to , m a g n e s io , c a l­ c i o , fo sfa to y l a c ta t o . E n e ste c a p ítu lo ta m b ié n s e e s tu d ió

RESUMEN

la fisio lo g ía m e ta b ó lic a y la re g u la c ió n d e c a d a e le c tr ó lito , a s í c o m o lo s m é t o d o s d e e v a lu a c ió n c o m ú n m e n te u s a d o s .

L o s e le c tr ó lito s s o n io n e s c a p a c e s d e lle v a r u n a c a r g a e l é c ­

L a re g u la c ió n d e c o n c e n t r a c i o n e s d e e le c tr ó lito e n lo s

tr ic a . Se c la s ific a n c o m o a n io n e s o c a tio n e s c o n b a se e n

in te rv a lo s fis io ló g ic o s re d u c id o s es lle v a d a a c a b o s o b re

el tip o d e c a r g a q u e lle v a n . L o s a n io n e s tie n e n u n a c a r g a

to d o p o r lo s riñ o n e s .

CAPÍTULO 13 ■ ELECTRÓLITOS

P R E G U N T A S 1. ¿ C u á l e s el c a t ió n in t r a c e l u la r p rin c ip a l?

DE

341

R E P A S O

7 . L a d if e re n c ia p rin c ip a l e n tr e u n m é t o d o d e E S I d ir e c to e in d ir e c to es:

a ) C a lc io . b) M a g n e s io .

a) E l tip o d e m e m b r a n a q u e s e u sa .

c ) S o d io .

b ) Q u e lo s E S I d ir e c to s e m p le a n u n e le c tr o d o d e

d) P o ta s io .

r e f e re n c ia m ie n tr a s q u e lo s E S I in d ir e c t o s n o . c ) L a m u e s t r a s e d ilu y e e n el m é to d o i n d ir e c t o , n o el

2 . ¿ C u á l e s el c a t ió n e x t r a c e l u l a r p rin c ip a l?

m é to d o d ir e c to .

a) C lo r u r o . b ) S o d io .

d) L a s m u e s tr a s d e s a n g re c o m p le ta s e p u e d e n m e d ir c o n el m é t o d o d ir e c to y n o c o n el in d ir e c to .

c ) M a g n e s io .

d ) C a lc io .

8 . ¿ C u á l m é to d o d e a n á lisis p r o p o r c io n a r á lo s re s u lta d o s d e e le c tr ó lito m á s e x a c t o s si s e e m p le a u n a m u e s tr a

3 . L a o s m o la lid a d se p u e d e d e fin ir c o m o u n a m e d id a d e

m u y lip é m ic a ?

la c o n c e n t r a c i ó n d e u n a d is o lu c ió n c o n b a se en :

a ) E l E S I in d ir e c to .

a ) E l n ú m e r o d e p a r tíc u la s i ó n ic a s p re s e n te s .

b) E l E S I d ir e c to .

b) E l n ú m e r o y ta m a ñ o d e p a r tíc u la s d is u e lta s .

c ) L a f o to m e tr ía d e e m is ió n d e flam a.

c ) E l n ú m e r o d e p a r tíc u la s d isu e lta s.

d) L a a b s o r c ió n a tó m ic a .

di) D e n s id a d d e las p a r tíc u la s d is u e lta s . 4 . L a h ip o n a tr e m ia p u e d e s e r c a u s a d a p o r c a d a u n a d e

9 . L a c a u s a m á s f r e c u e n te d e h ip e rm a g n e s e m ia s e d e b e a:

la s s ig u ie n te s c o n d ic io n e s E X C E P T O :

a) In g e s tió n in c r e m e n ta d a .

a ) H ip o m a g n e s e m ia .

b ) H ip o a ld o s te r o n is m o .

b) D e fic ie n c ia d e a ld o s te ro n a .

c ) A c id o s is .

c ) V ó m ito p r o lo n g a d o y d ia rre a .

d) I n s u fic ie n c ia re n a l.

d) In s u fic ie n c ia re n a l a g u d a o c r ó n i c a . 5 . L a h ip o p o ta s e m ia p u e d e s e r c a u s a d a p o r c a d a u n a d e la s s ig u ie n te s c o n d ic io n e s E X C E P T O :

a) A c id o s is . b) V ó m ito p ro lo n g a d o y d ia rre a . c ) H ip o m a g n e s e m ia .

d) H ip o a ld o s te r o n is m o .

10.

U na

m u e stra

h e m o liz a d a

ca u sa rá

c o n c e n tra c io n e s

in c r e m e n ta d a s falsas d e lo s ig u ie n te E X C E P T O :

a) P o ta s io . b) S o d io . c ) F o s f a to .

d) M a g n e s io .

6 . L a h ip e rp o ta s e m ia p u e d e s e r c a u s a d a p o r c a d a u n a d e la s s ig u ie n te s c o n d ic io n e s E X C E P T O :

a) In s u fic ie n c ia re n a l a g u d a o c r ó n i c a . b) H ip o a ld o s te r o n is m o . c ) A lc a lo s is .

d ) H e m o lis is d e m u e s tr a .

REFERENCIAS 1. Rose BD, ed. Clinical Physiology of Acid-Base and Electrolyte Disor­ ders, 5th ed. New York: McGraw-Hill, 2001:163-228, 2 4 1-257, 3 7 2 -4 0 2 , 6 9 6 -7 9 3 , 836-930. 2. Burtis CA, Ashwood ER, eds. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Philadelphia: WB Saunders, 1999:1058, 1066-1068. 3. Tietz NW, ed. Clinical Guide to Laboratory Tests. Philadelphia: WB Saunders, 1995:56, 100-105, 110, 124-126, 418, 4 5 6 -4 5 8 , 486, 5 0 2 -5 0 6 , 562 -5 6 4 . 4. Oh MS. Pathogenesis and diagnosis of hyponatremia. Nephron 2002;92(Suppl. l):2 - 8 . 5. Kumar S, Tomas B. Sodium. Lancet 1998;352:220-228. 6. Crook M. The investigation and management of severe hyponatre­ mia. J Clin Pathol 2002;55:883.

7. Vitros Na* package insert, Versión 2.0. Rochester, NY: Ortho-Clini­ cal Diagnostics, 2003. 8. Gennari FJ. Disorders of potassium homeostasis: hypokalemia and hyperkalemia. Crit Care Clin 2002;18:273-288. 9. Gennari FJ. Hypokalemia. N Engl J Med 1998;339(7):451-458. 10. Burtis CA, Ashwood ER, eds. Tietz Fundamentáis of Clinical Che­ mistry. Philadelphia: WB Saunders, 2001:496, 451. 11. Elin RJ. Magnesium: The fifth but forgotten electrolyte. Am J Clin Pathol 1994;102(5):616-622. 12. Polancic JE . Magnesium: metabolism, clinical importance, and analysis. Clin Lab Sci 1991;4(2):105-109. 13. Whang R. Clinical disorders of magnesium metabolism. Comp Ther 1997;23(3): 168-173.

342

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

14. Schlingman KP, Weber S, et al. Hypomagnesemia with secondary hypocalcemia is caused by mutations in TRPM6, a new member of the TRPM gene family. Nat Genet 2002;31:166-170. 15. Whang R, Sims G. Magnesium and potassium supplementation in the prevention of diabetic vascular disease. Med Hypoth 2000;5 5 :2 6 3 265. 16. Ringer S. A further contribution regarding the influence of diffe­ rent constituents of blood on contractions of the heart. J Physiol 1883;4:29.

17. McLean FC, Hastings AB. A biological method for estimation of calcium ion concentration. J Biol Chem 1934;107:337. 18. Bushinsky DA, Monk RD. Calcium. Lancet 1998;352:23. 19. Wandrup J. Critical analytical and clinical aspeets of ionized cal­ cium in neonates. Clin Chem 1989;35:2027. 20. Shiber JR , Mattu A. Serum phosphate abnormalities in the emergency department. J Emerg Med 2002;23:395-400.

Gases en la sangre, pH, y sistemas amortiguadores Sharon S. Ehrmeyer, Ronald H. Laessig y John J. Ancy C O N T E N I D O DEFINICIONES: ÁCIDO, BASE, DISOLUCIÓN AMORTIGUADORA EQUILIBRIO ACIDOBASE Mantenim iento del H+ Sistemas amortiguadores: regulación del H+ Regulación del equilibrio acidobase: pulmones y riñones VALORACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ACIDOBASE El sistema am ortiguador de bicarbonato y la ecuación de Henderson-Hasselbalch Trastornos acidobase: acidosis y alcalosis INTERCAMBIO DE OXÍGENO Y GAS Oxígeno y bióxido de carbono Transporte de oxígeno Cantidades relacionadas con la evaluación del estado de oxigenación del paciente Disociación hemoglobina-oxígeno MEDICIÓN Determinación espectrofotométrica (cooxímetro) de la saturación del oxígeno

D E L

C A P Í T U L O A nalizadores de gas en la sangre: pH, PC02y P02 Medición de PO-, Mediciones de pH y P C 0 2 Tipos de sensores electroquímicos Sensores ópticos Calibración Parámetros calculados Corrección de la temperatura ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD Consideraciones preanalíticas Evaluaciones analíticas: control de calidad y prueba de eficiencia Interpretación de los resultados RESUMEN PREGUNTAS DE REPASO REFERENCIAS

O B J E T I V O S Al completar este capítulo, el laboratorista clínico podrá: • Describir los principios que participan en la medición de pH, PC02, P02 y las especies de hemoglobina. • Delinear la interrelación de los mecanismos de amortiguación del bicarbonato, el ácido carbónico, y la hemoglobina. • Explicar el significado clínico de los siguientes pará­ metros en gas sanguíneo y pH: pH, P C 0 2, P 0 2, bicarbonato real, ácido carbónico, exceso de base, saturación de oxígeno, oxihem oglobina fraccional, capacidad de oxígeno ligado a la hem og­ lobina, contenido de oxígeno y C 0 2 total. • Determ inar si los datos son normales o represen­ tan acidosis o alcalosis respiratorias o metabólicas usando la ecuación de Henderson-Hasselbalch y los datos de gas en la sangre. Identificar si los datos representan condiciones de compensación o descompensación. • Identificar algunas causas comunes de la acidosis y la alcalosis no respiratoria y respiratoria, y de anorm alidades mixtas. Determ inar la manera en que el cuerpo trata de compensar (riñón y pulmo­ nes) las diversas condiciones.

Describir el significado de la curva de disociación oxígeno-hemoglobina y el impacto de pH, 2,3difosfoglicerato (2,3-DPG), tem peratura, pH y PC 02, sobre su forma y liberación de 0 2 a los tejidos. Discutir los problemas en la recolección y manejo de muestras para el análisis de pH y de gas en la sangre, además de las precauciones que se deben tomar. Incluir en la discusión jeringas, anticoagu­ lantes, mezcla, recubrimiento y m uestras capilares, venosas y arteriales. Describir métodos de aseguramiento de la calidad, incluido el control de calidad (controles líquidos comerciales, tonometría, exámenes de competencia y chequeos delta) para evaluar la calidad analítica. Discutir las razones para posibles discrepancias, entre los datos de saturación de oxígeno calcu­ lados por el analizador de gas en la sangre y los medidos por el cooxímetro. Calcular la presión parcial del P C 0 2 y el P 0 2 para varios porcentajes de dióxido de carbono y oxíge­ no. Al realizar estos cálculos, tendrá en cuenta la presión barométrica y la de vapor del agua.

343

344

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

___________________________________________ T É R M I N O S Acidemia Acidosis Alcalemia Alcalosis

Compensación Error analítico Error preanalitico Exceso de base

C L A V E f io 2

Oxihem oglobina fraccional Saturación de oxígeno

Hiperventilación Hipoventilación Hipoxemia h 2c o

U n a s p e c to im p o r t a n t e d e la b io q u ím ic a c lín ic a es la in f o r­ m a c ió n s o b re el e q u ilib rio a c id o b a s e y la h o m e o s ta s is d e

3

' H C 0 3- + H +

Á c id o c a r b ó n ic o

B ic a r b o n a to

(Ec. 14-1)

g a s e n la s a n g re d e l p a c ie n te . E s to s d a to s s u e le n u s a rs e p a ra e v a lu a r a p a c ie n te s e n s itu a c io n e s q u e a m e n a z a n su

E l v a lo r d e r e f e r e n c ia p a ra e l p H d e l p la s m a s a n g u ín e o

v id a . D e b id o a q u e lo s p a r á m e tr o s d e p ru e b a e s tá n in te -

e s 7 . 4 0 . W e is b e r g c i ta u n e je m p lo p a r a d e m o s t r a r la e f e c ­

r r e l a c io n a d o s , é s to s se u s a n p a ra re a liz a r c u a d r o s , q u e

tiv id a d d e la s s o l u c i o n e s a m o r ti g u a d o r a s s a n g u í n e a s .1 Si

f r e c u e n te m e n te s e c o m p le m e n ta n

el p H d e 1 0 0 m i d e a g u a d e s tila d a es 7 . 3 5 y s e a g r e g a u n a

co n

p a rá m e tro s ca l­

c u la d o s . Si s e to m a s ó lo u n re s u lta d o d e p r u e b a , p u e d e n

g o ta d e 0 . 0 5 N d e H C 1, el p H c a m b i a r á a 7 . 0 0 . P a r a c a m ­

e n c o n t r a r s e r e s u lta d o s e n g a ñ o s o s .

b ia r 1 0 0 m i d e s a n g r e n o r m a l d e u n p H d e 7 . 3 5 a u n o d e

E n e s te c a p ítu lo se a n a liz a el in te r c a m b io d e lo s g a s e s ,

7 .0 0 ,

s o n n e c e s a r i o s c a s i 2 5 m i d e 0 . 0 5 N d e H C 1. C o n

d ió x id o d e c a r b o n o y o x íg e n o , j u n t o c o n lo s m e c a n is m o s

5 .5

L d e sa n g re en u n cu e rp o n o rm a l, se n e c e s ita n m ás de

d e l c u e r p o p a ra m a n t e n e r el e q u ilib rio a c id o b a s e . T a m ­

1 3 0 0 m i d e H C 1 p a ra o b te n e r el m is m o c a m b io e n el p H .

b ié n s e d e s c r ib e n la i n te r p r e ta c ió n d e lo s d a to s , a p a r t ir d e la m e d i c ió n d e l p H y o tr o s p a r á m e t r o s d e g a s e n la s a n g re ;

EQUILIBRIO ACIDO BASE

la s té c n i c a s y la i n s t r u m e n t a c ió n u s a d a s e n e s ta s m e d i­ c i o n e s ta m b ié n s o n d e s c rita s . Se t r a ta n las c o n s id e r a c i o ­ n e s p r e a n a lític a s ( r e c o l e c c i ó n y m a n e jo d e m u e s t r a s ) q u e a f e c ta n c o n s id e r a b le m e n te la c a lid a d d e lo s r e s u lta d o s d e la p ru e b a . T a m b ié n s e p r e s e n ta n lo s m é to d o s d e a s e g u r a ­ m ie n to d e la c a lid a d p a ra el a n á lis is d e g a s e n la s a n g re .

M antenim iento del H+ L a c o n c e n t r a c i ó n n o r m a l d e H + e n el flu id o c o r p o r a l e x t r a c e lu la r es d e 3 6 a 4 4 n m o l/L (p H d e 7 .3 4 a 7 . 4 4 ) ; sin e m b a r­ g o , a tra v é s d el m e ta b o lis m o , el c u e r p o p r o d u c e c a n tid a d e s m á s g ra n d e s d e H +. M e d ia n te u n m e c a n is m o fin o q u e in c lu y e a lo s p u lm o n e s y lo s r iñ o n e s , el c u e r p o c o n tr o l a y

DEFINICIONES: ÁCIDO, BASE, DISOLUCIÓN AM O RTIGU AD O RA

e x c r e ta H + p a ra m a n t e n e r la h o m e o s ta s is d el p H . C u a lq u ie r v a lo r d e H + fu e ra d el in te rv a lo p u e d e c a u s a r a lte r a c io n e s e n el eq u ilib rio d e las r e a c c io n e s q u ím ic a s d e n tro d e la c é lu la

U n a d is c u s ió n d e l e q u ilib rio a c id o b a s e r e q u ie r e u n a re v i­ s ió n d e v a r io s c o n c e p t o s b á s ic o s : á c id o , b a s e , d is o lu c ió n a m o r ti g u a d o r a , p H y p K , a d e m á s d e lo s p r in c ip io s d el e q u ilib rio y la le y d e a c c i ó n d e m a s a s . U n ácido e s u n a s u s ta n c ia q u e p u e d e c e d e r u n io n h id r ó ­

y a fe c ta r m u c h o s d e lo s p ro c e s o s m e ta b ó lic o s d el c u e r p o , y p u e d e o c a s io n a r a lte r a c io n e s d e la c o n c ie n c i a , irrita b ilid a d n e u r o m u s c u la r , te ta n ia , c o m a y m u e rte . L a e s c a la d el p H lo g a r ítm ic o e x p r e s a la c o n c e n t r a c i ó n d e H + ( c es la c o n c e n t r a c i ó n ) :

g e n o (H +) o u n o h id r o n io c u a n d o se d is u e lv e e n a g u a . U n a

base e s u n a s u s ta n c ia q u e p u e d e c e d e r io n e s h id r o x ilo s (O H " ). L a s fu e rz a s re la tiv a s d e á c id o s y b a s e s , su c a p a c i ­

pH = lo g — cH

= - lo g cH +

(Ec. 14-2)

d a d p a ra d is o c ia r s e e n a g u a , s e r e p r e s e n ta n m e d ia n te su c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n (o v a lo r K , c o n s ta n te d e io n iz a ­

E l v a lo r d e re f e re n c ia p a ra el p H d e la s a n g re a rte r ia l es

c i ó n ) . L o s c u a d r o s s e e n c u e n tr a n e n c a s i c u a lq u ie r lib ro

7 . 4 0 y es e q u iv a le n te a u n a c o n c e n t r a c i ó n H + d e 4 0 n m o l/

d e b io q u ím ic a . E l p K , d e fin id o c o m o el lo g a r itm o n e g a tiv o

L . D e b id o a q u e el p H es el lo g a r itm o n e g a tiv o d e la c H +,

d e la c o n s ta n te d e io n iz a c ió n , es ta m b ié n el p H e n q u e las

u n in c r e m e n to e n la c o n c e n t r a c i ó n d e H + d is m in u y e el p H ,

f o r m a s p r o to n a d a y n o p r o to n a d a e s tá n p re s e n te s e n c o n ­

m ie n tr a s q u e u n d e c r e m e n to lo a u m e n ta . U n p H p o r d e b a ­

c e n tr a c i o n e s ig u a le s . L o s á c id o s fu e rte s tie n e n v a lo r e s d e

j o d e l r a n g o d e r e f e re n c ia ( < 7 . 3 4 ) im p lic a acidosis, m i e n ­

p K m e n o r e s d e 3 . 0 , m ie n tr a s q u e la s b a s e s fu e rte s tie n e n

tra s q u e u n p H p o r a rr ib a d el r a n g o d e re f e re n c ia ( > 7 . 4 4 )

v a lo r e s d e p K m a y o r e s d e 9 .0 . E n el c a s o d e lo s á c id o s , el

es u n a alcalosis. T é c n i c a m e n te , el su fijo -osis a lu d e a u n

a u m e n to d e l p H p o r a rr ib a d el p K o c a s io n a q u e e l á c id o se

p r o c e s o c o r p o r a l ; el su fijo -em ia , al e s ta d o c o r r e s p o n d ie n ­

d is o c ie y c e d a u n H +. E n el c a s o d e las b a s e s , la d is m in u ­

te e n la s a n g re (la -osis es la c a u s a d e la -em ia ).

c ió n d e l p H p o r d e b a jo d el p K o c a s i o n a q u e la b a se lib e re

E l p H a rte r ia l es c o n tr o la d o p o r s is te m a s q u e re g u la n

O H ". V a ria s e s p e c ie s tie n e m á s d e u n p K , lo q u e sig n ifica

la p r o d u c c i ó n y r e t e n c ió n d e á c id o s y b a s e s . E s to s i n c l u ­

q u e p u e d e n a c e p ta r o d o n a r m á s d e u n H +.

y e n s o lu c io n e s a m o r tig u a d o r a s , el c e n tr o r e s p ir a to r io y lo s

U n a disolución amortiguadora, la c o m b i n a c i ó n d e u n a

p u lm o n e s , y lo s r iñ o n e s .

b a se d é b il o u n á c id o d éb il y s u s a l, es u n s is te m a q u e re s is te lo s c a m b io s d e p H . L a e fic ie n c ia d e u n a d is o lu c ió n a m o r tig u a d o r a d e p e n d e d el p K d e l s is te m a a m o r tig u a d o r

Sistem as am ortiguadores: regulación del H+

y d e l p H d e l m e d io e n q u e s e c o l o c a . E n el p la s m a , el s is te ­

L a p rim e ra lín ea d e d efen sa d el c u e rp o h u m a n o c o n tr a c a m ­

m a b i c a r b o n a t o - á c i d o c a r b ó n ic o , q u e tie n e u n p K d e 6 .1 ,

b io s e x te r n o s e n la c o n c e n tr a c ió n d e H + s o n lo s siste m a s

es u n o d e lo s p rin c ip a le s a m o r tig u a d o re s .

a m o rtig u a d o re s p re s e n te s en to d o s lo s flu id o s c o rp o ra le s .

CAPITULO 14 ■ GASES EN LA SANGRE, pH, Y SISTEMAS AMORTIGUADORES

345

T o d as las s o lu c io n e s a m o r tig u a d o ra s e stá n in te g ra d a s p o r

L o s p u lm o n e s y lo s r iñ o n e s j u e g a n p a p e le s im p o r t a n ­

u n á c id o d éb il, c o m o el á c id o c a r b ó n ic o ( H ,C O ,), y su sal

te s e n la r e g u la c ió n d el p H s a n g u ín e o . L a i n te r r e la c ió n d e

o b a se co n ju g a d a , el b ic a r b o n a to C H C O y ), p a ra el siste m a

lo s p u lm o n e s c o n lo s riñ o n e s e n el m a n te n im ie n to d e l

a m o r tig u a d o r b ic a r b o n a to -á c id o

p H s e d e s c rib e c o n la e c u a c ió n d e H e n d e rs o n -H a s s e lb a l-

c a r b ó n ic o . E l H ,C O , es

u n á c id o d éb il p o rq u e n o se d iso cia p o r c o m p le to e n H + y

c h ( e c u a c i ó n 1 4 - 4 ) . E l n u m e r a d o r ( H C 0 3“) re p r e s e n ta la

H C 0 3“. ( E n c o n tr a s te , u n á c id o fu e rte , c o m o el H C 1, se d iso ­

f u n c ió n d el r i ñ ó n , m ie n tr a s q u e el d e n o m in a d o r ( P C O „

cia to ta lm e n te e n H + y C l“ en d is o lu c ió n ). C u a n d o s e ag reg a

q u e re p r e s e n ta al H 2C 0 3) d e n o ta la f u n c ió n p u lm o n a r. L o s

u n á c id o al siste m a b ic a r b o n a to -á c id o c a r b ó n ic o , el H C O y

p u lm o n e s re g u la n el p H a tra v é s d e la r e t e n c ió n o e lim i­

p u e d e c o m b in a r s e c o n el H + d el á c id o p a ra fo r m a r H 2C 0 3

n a c ió n d e C O ,, c a m b ia n d o la p r o p o r c ió n y el v o lu m e n d e

C u a n d o se a g re g a u n a b a se , el H ,C O , se c o m b in a c o n el g ru ­

v e n tila c ió n . L o s r iñ o n e s re g u la n el p H e x c r e ta n d o á c id o ,

p o O H p a ra f o r m a r H 20 y H C 0 3“. E n a m b o s c a s o s , h a y u n a

p rin c ip a lm e n te el io n a m o n io , y r e c u p e r a n d o H C 0 3“ d e l

v a ria c ió n m á s p e q u e ñ a e n el p H d e la q u e se o b te n d ría al

filtra d o g lo m e ru la r .

a g re g a r el á c id o o b a se a u n a d is o lu c ió n n o a m o rtig u a d o ra . A u n q u e el siste m a b ic a rb o n a to -á c id o c a rb ó n ic o tien e u n a ca p a cid a d d e a m o rtig u a c ió n b aja, to d av ía es u n a m o rtig u a ­ d o r im p o rta n te p o r tres ra z o n e s: a ) H 2C 0 3 se d iso cia e n C O z

Regulación del equilibrio acidobase: pulm ones y riñones

y H , 0 , lib e ra n d o C 0 2, q u e es elim in ad o p o r los p u lm o n e s

E l d ió x id o d e c a r b o n o , el p r o d u c t o fin al d e la m a y o r p a rte

y d e se ch a n d o E E c o m o a g u a; b) lo s ca m b io s en C 0 2 m o d i­

d e lo s p r o c e s o s m e ta b ó lic o s a e r ó b ic o s , s e d ifu n d e d e fo r m a

fica n la tasa d e v e n tila ció n (re s p ir a c ió n ); y c ) lo s riñ o n e s

fá c il fu e ra d el te jid o d o n d e s e p r o d u c e , h a c ia el p la s m a y

p u e d e n a lte ra r la c o n c e n tra c ió n d e H C 0 3~. A d e m á s, e ste sis­

lo s g ló b u lo s r o jo s d e lo s c a p ila re s c ir c u n d a n te s . E n e l p la s ­

te m a a m o rtig u a d o r c o n tra rre s ta in m e d ia ta m e n te lo s efecto s

m a , u n a c a n tid a d p e q u e ñ a d e C O , s e d is u e lv e f ís ic a m e n te

d e á cid o s n o v o lá tiles fijos (H +A “) lig an d o el io n h id ró g e n o

o se c o m b in a c o n p ro te ín a s p a ra f o r m a r c o m p u e s to s d e

d iso cia d o ( H 'A + I i C O , = H 2C 0 3 + A "). E l H 2C 0 3 re su lta n te

c a r b a m in o . C a s i to d o el C O , s e c o m b in a c o n H 20

se d iso cia , y el H + es n e u tra liz a d o p o r la c a p a cid a d a m o rti­

f o r m a r H 2C 0 3, q u é rá p id o s e d is o c ia e n H + y H C 0 3“ (fig .

p a ra

g u a d o ra d e la h e m o g lo b in a. E n la fig u ra 1 4 - 1 se m u e s tra la

1 4 - 1 ) . L a r e a c c i ó n es a c e le ra d a p o r la e n z im a a n h id r a s a

m u tu a re la ció n e n tre la h e m o g lo b in a d e lo s g ló b u lo s ro jo s y

c a r b ó n ic a e n c o n t r a d a e n la m e m b r a n a d e lo s g ló b u lo s

el H + d el siste m a a m o rtig u a d o r d e b ica rb o n a to .

ro jo s . L a d is o c ia c ió n d e H , C 0 3 c a u s a q u e la c o n c e n t r a c i ó n

O tr a s s o lu c io n e s a m o r tig u a d o r a s ta m b ié n s o n im p o r ­ ta n te s .

El

s is te m a

a m o r ti g u a d o r

de

fo sfa to

d e H C O ; s e i n c r e m e n te e n lo s g ló b u lo s r o jo s y s e d ifu n d a

( H P 0 4-2

e n el p la s m a . P a ra m a n t e n e r e le c tr o n e u tr a lid a d (e l m is ­

- H , P 0 4“) j u e g a u n p a p e l im p o r t a n t e e n el p la s m a y lo s

m o n ú m e r o d e io n e s c a r g a d o s p o s itiv a y n e g a tiv a m e n te

g ló b u lo s r o jo s , y p a r tic ip a e n el in te r c a m b io d el io n d e

e n c a d a s itio d e la m e m b r a n a d e l g ló b u lo r o j o ) , s e d ifu n d e

s o d io e n la o rin a p o r el H + filtra d o . L a p r o te ín a d el p la s ­

c l o r u r o e n la c é lu la . A e sto s e le c o n o c e c o m o cambio de

m a , p r in c ip a lm e n te lo s g r u p o s im id a z o l d e la h is tid in a ,

cloruro. L a s p r o te ín a s y lo s a m o r tig u a d o r e s d el p la s m a se

ta m b ié n f o r m a n u n s is te m a a m o r ti g u a d o r im p o r ta n te en

c o m b in a n c o n lo s H + p a ra m a n t e n e r u n p H e sta b le .

e l p la s m a . C a s i to d a s las p ro te ín a s c ir c u la n te s tie n e n u n a c a r g a n e g a tiv a n e ta y s o n c a p a c e s d e e n la z a r s e c o n H +.

E n lo s p u l m o n e s , el p r o c e s o se in v ie rte . E l 0 2 in s p i­ r a d o s e d ifu n d e d e lo s a lv é o lo s a la s a n g r e y s e lig a a la h e m o g lo b in a p a r a f o r m a r la o x ih e m o g l o b i n a ( 0 , H b ) . E l H + q u e es t r a n s p o r ta d o p o r la h e m o g lo b in a ( r e d u c i d a ) d e n tr o d e la s a n g re v e n o s a es lib e ra d o p a r a c o m b i n a r s e c o n el H C 0 3“ p a r a f o r m a r H , C 0 3, q u e a s u v e z s e d is o ­ c i a e n H 20 y C 0 2. E l C 0 2 s e d ifu n d e e n lo s a lv é o lo s y se e lim in a a tr a v é s d e la v e n tila c ió n . E l e f e c to d e la i n t e r a c ­ c i ó n d e e s to s d o s s is te m a s d e a m o r ti g u a c ió n es u n c a m ­ b io m ín im o e n la c o n c e n t r a c i ó n d e H + e n tr e la c i r c u l a c ió n a r te r ia l y v e n o s a . C u a n d o lo s p u lm o n e s n o e lim in a n el C 0 2 e n p r o p o r c ió n a su p r o d u c c i ó n ( c o m o r e s u lta d o d e v e n t i la c i ó n d is m in u id a o e n f e r m e d a d ) , é s te s e a c u m u la e n la s a n g r e , c a u s a n d o u n a u m e n to e n la c o n c e n t r a c i ó n d e H +. P e ro si la e lim in a c ió n d e C 0 2 es m á s rá p id a q u e la p r o d u c c i ó n ( h i p e r v e n t i l a c i ó n ) , la c o n c e n t r a c i ó n d e H + d is m in u ir á . P o r t a n t o , la v e n t i la c i ó n a f e c ta el p H d e la s a n g re . U n c a m b io e n la c o n c e n t r a c i ó n d e H + e n la s a n ­ g re q u e s e d e b a a d is tu r b io s n o r e s p i r a t o r i o s , o c a s i o n a r á q u e el c e n tr o r e s p ir a to r io r e s p o n d a a lte r a n d o la p r o p o r ­ c ió n d e v e n tila ció n e n u n esfu erzo p o r re s ta u ra r el p H d e la s a n g re a la n o r m a lid a d . L o s p u l m o n e s , e n c u e s ti ó n d e seg u n d o s , ju n to c o n lo s siste m a s a m o rtig u a d o re s, p ro ­

FIGURA 14-1. Interrelación de los sistemas amortiguadores de bicarbonato y de hemoglobina.

p o r c i o n a n la p r i m e r a d e d e fe n s a c o n t r a lo s c a m b i o s e n el e s ta d o a c id o b a s e .

346

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

L o s riñ o n e s ta m b ié n p u e d e n e x c r e t a r c a n tid a d e s v a r i a ­

V a rio s f a c to r e s a fe c ta n la re a b s o rc ió n d e H C 0 3- C u a n d o

b le s d e á c id o o b a s e , p o r lo q u e tie n e n u n p a p e l im p o r ta n te

el n iv e l d e H C 0 3- e n s a n g re o e n p la s m a es m á s a lto q u e 2 6

e n la r e g u la c ió n d e l e q u ilib rio a c id o b a s e . E l p a p e l p r i n c i ­

a 3 0 m m o l/L , el H C 0 3- d e b e s e r e x c r e ta d o . E s im p ro b a b le

p a l d e l r i ñ ó n e n la e sta b ilid a d d e la h o m e o s ta s is a c id o b a ­

q u e el p la s m a e x c e d a u n v a lo r d e H C 0 3- d e 3 0 m m o l/L , a

se e s r e c u p e r a r el H C 0 3- d el filtra d o g lo m e ru la r . S in e sta

m e n o s q u e falle la c a p a c id a d e x c r e t o r i a ( c o m o c u a n d o h a y

r e c u p e r a c i ó n , la p é rd id a d e H C O ,- e n la o rin a d a ría c o m o

in s u fic ie n c ia r e n a l ). S in e m b a rg o , u n a e x c e p c i ó n f r e c u e n ­

r e s u lta d o u n a a c id e z e x c e s iv a e n la s a n g re . E l s itio p r in ­

te es la r e t e n c ió n c o m p e n s a to r ia d e H C 0 3- p o r hipercarbia

cip a l e n la r e c u p e r a c i ó n d el H C 0 3“ es el tú b u lo p r o x im a l

c r ó n i c a c o m o s e h a o b s e rv a d o c o n la e n fe rm e d a d p u l m o ­

(fig . 1 4 - 2 ) . E l filtra d o g lo m e r u la r c o n ti e n e el m is m o n iv e l

n a r cró n ic a .

d e H C 0 3“ q u e el p la s m a . E s te p r o c e s o n o es u n tr a n s p o r te

E l n iv e l d e H C 0 3- p u e d e a u m e n ta r s i u n a c a n tid a d

d ir e c to d e HCC>3- a tra v é s d e la m e m b r a n a tu b u la r e n la

e x c e s iv a d e l a c ta t o , a c e t a to , o H C 0 3- s e in t r o d u c e p o r v ía

s a n g re . E n c a m b io , s e in te rc a m b ia el s o d io ( N a +) d el filtra ­

in tr a v e n o s a . T a m b ié n p u e d e a u m e n ta r si h a y u n a p é rd id a

d o g lo m e r u la r p o r el H + en la c é lu la tu b u la r. E l H + s e c o m ­

e x c e s i v a d e c l o r u r o s in re e m p la z o ( c o m o c u a n d o s e s u d a ,

b in a c o n el H C 0 3~ e n el filtra d o p a r a f o r m a r H 2C 0 3 q u e se

v o m ita o s e p ro lo n g a u n a s u c c i ó n n a s o g á s tr ic a ) d e b id o a

c o n v ie r te e n EI20 y C 0 2 m e d ia n te la a n h id r a s a c a r b ó n ic a .

q u e el H C 0 3- s e r á r e te n id o p o r el tú b u lo p a r a c o n s e r v a r la

E l C 0 2 s e d ifu n d e fá c ilm e n te e n el tú b u lo y r e a c c io n a c o n

e le c tr o n e u tr a lid a d .

H 20

p a ra f o r m a r d e n u e v o H 2C 0 3 y lu e g o H C 0 3“, q u e es

V a rio s f a c to r e s p u e d e n o c a s io n a r la d is m in u c ió n d e lo s

r e a b s o rb id o e n la s a n g re j u n t o c o n el s o d io . E n c o n d i c io ­

n iv e le s d e H C 0 3- . C a si to d o s lo s d iu r é tic o s , sin te n e r e n

n e s a lc a lo id e s , el r i ñ ó n e x c r e ta H C 0 3- p a ra c o m p e n s a r la

c u e n t a el m e c a n is m o d e a c c i ó n , f a v o r e c e n la e x c r e c ió n d e

e le v a c ió n d e l p H s a n g u ín e o . E l in te r c a m b io e n tr e el H + y

H C 0 3- . L a re a b s o rc ió n re d u c id a d el H C 0 3- ta m b ié n o c u r r e

e l N a + s u g ie r e , e n p a r te , p o r q u é lo s m é d ic o s s o lic ita n a n á ­

en c o n d ic io n e s e n q u e h a y u n a p é rd id a e x c e s iv a d e c a t i o ­

lisis q u ím ic o s d e p H y g a se s s a n g u ín e o s j u n t o s , a d e m á s

n e s. E n t r a s to r n o s d el r i ñ ó n ( c o m o n e fritis c r ó n i c a o in f e c ­

d e l d e e l e c tr ó li t o s ( N a +, K + y C l“) , p a ra e v a lu a r al p a c ie n te .

c i o n e s ) , la r e a b s o r c ió n d e H C 0 3- p u e d e v e rs e a fe c ta d a .

(L a absorción o recuperación s e re fie re al p r o c e s o d e re in t r o d u c i r la s a n g re . L a secreción o excreción p o r p a r te d e las c é lu la s tu b u la re s c o n c e n t r a o e lim in a s u s ta n c ia s d el filtra ­ d o . E s ta s r e a c c io n e s d e te r m in a n el pEI d e la o r in a , a d e m á s d e l d e la s a n g r e .) B a jo c o n d i c io n e s n o r m a l e s , el c u e r p o p r o d u c e u n e x c e ­ so n e to (d e 5 0 a 1 0 0 m m o l/L ) d e á c id o (H *) c a d a d ía , el

VALORACIÓN DE LA HOM EOSTASIS A CIDO BASE El sistem a am ortiguador de bicarbonato y la ecuación de Henderson-Hasselbalch

c u a l d e b e s e r e x c r e ta d o p o r el r iñ ó n . D e b id o a q u e el m ín i­

A l e v a lu a r la h o m e o s ta s is a c id o b a s e , s e m id e n y c a lc u la n

m o d e p H e n la o rin a e s ca s i d e 4 . 5 , el r i ñ ó n e x c r e t a p o c o s

lo s c o m p o n e n te s d el s is te m a a m o r tig u a d o r d e b ic a r b o n a ­

H + n o r e g u la d o re s . E l re s to d e lo s H + u r in a r io s s e c o m b i ­

to . D e lo s d a to s , p u e d e n h a c e rs e in fe re n c ia s p ro c e d e n te s

n a n c o n fo sfa to d ib á s ic o ( H P 0 4=) y a m o n ia c o ( N H ) y s o n

d e o tr o s a m o r tig u a d o re s y d e lo s s is te m a s q u e re g u la n la

e x c r e ta d o s c o m o fo s fa to d ih id ró g e n o (H 2P 0 4=) y a m o n io

p r o d u c c i ó n , r e t e n c ió n y e x c r e c ió n d e á c id o s y b a se s. P a ra

(N H 4+) . L a c a n tid a d d e H P O +' d is p o n ib le p a ra c o m b in a r s e

el s is te m a a m o r tig u a d o r d e b ic a r b o n a to , el C 0 2 d is u e lto

c o n H + e s c o n s ta n te ; p o r ta n to , la e x c r e c i ó n d ia ria d e H +

( d C 0 2) e stá e n e q u ilib rio c o n el C 0 2 g a s e o s o , q u e p u e d e

e n o r in a d e p e n d e e n g r a n p a rte d e la c a n tid a d fo r m a d a d e

e x p u ls a rs e p o r v ía p u lm o n a r. P o r ta n to , el s is te m a a m o r ­

N H 4+. D e b id o a q u e la s c é lu la s tu b u la re s re n a le s p u e d e n

tig u a d o r d e b ic a r b o n a to es c o n o c id o c o m o u n s is te m a

g e n e r a r N H 3 a p a r t ir d e la g lu ta m in a y o tr o s a m in o á c id o s , la c o n c e n t r a c i ó n d e N H 3 p u e d e i n c r e m e n ta r s e c o m o r e s ­

abierto, y el d C 0 2 q u e es c o n tr o la d o p o r lo s p u lm o n e s , es el componente respiratorio. L o s p u lm o n e s p a rtic ip a n d e

p u e s ta a u n d e c r e m e n to e n el p H s a n g u ín e o .

in m e d ia to e n la r e g u la c ió n d el p H s a n g u ín e o a tra v é s d e la

ES TU D IO D E C A S O 14-1 U n h o m b r e d e 5 0 a ñ o s lle g a a u rg e n c ia s d e s p u é s d e

Preguntas

v o lv e r d e u n v ia je a l e x t r a n je r o . S u s s ín to m a s in c lu y e n d ia r re a p e r s is te n te ( p o r 3 d ía s ) y r e s p i r a c i ó n rá p id a ( ta q u i p n e a ) . L o s g a s e s e n la s a n g re tr a z a d o s s o n : pH

= 96 mmHg

H C 0 3- = 7 m m o l/L S02

2 . ¿ P o r q u é e l n iv e l d e H C 0 3- es ta n b a jo ?

= 7 .2 1

P C 0 2 = 19 m m H g P 02

1. ¿ C u á l e s el e s ta d o a c id o b a s e d e l p a c ie n te ?

= 9 6 % (c a lc u la d o ) (r a n g o d e re fe re n c ia , > 9 5 % )

3 . ¿ P o r q u é el p a c ie n te tie n e u n a r e s p ir a c ió n rá p id a ?

CAPÍTULO 14 ■ GASES EN LA SANGRE, pH, Y SISTEMAS AMORTIGUADORES

Túbulo renal proximal y distal, ducto colector, o ambos

Célula

Vaso sanguíneo

Luz

■> 0 2 + sustratos — »- C 0 2 + HzO

O, h 2o

;=

-

HgO T

...... ................ — =

H20

PCO , CO ,

CO,

CO,

PCO,2>r

C-A C 0 2 + H20 ^ = ± H 2C 03 H+ + HCO 3 -> Glutamina

Glutamina

Na+ + H CO í Na+

+ h p o 4-

Ácido glutámicoHCO3 + K+ —

t

Na+ —

(Ec. 14-9)

1

E n t r e las c a u s a s d e la a lc a lo s is re s p ir a to r ia s e in c lu y e n

hipoxemia; e s tím u lo q u ím ic o d e l c e n tr o r e s p ir a to r io p o r fá r m a c o s ,

(Ec. 14-7)

N cH C O ,

co m o

s a lic ila to s ; a u m e n to

e n la t e m p e r a t u ­

r a a m b ie n ta l; fieb re; h is te ria ( h i p e r v e n t il a c i ó n ) ; e m b o lia p u l m o n a r ; y fib ro sis p u lm o n a r. L o s r iñ o n e s c o m p e n s a n e x c r e ta n d o H C O y e n la o r in a y r e c u p e r a n d o H + p a ra la s a n g re . E l tr a ta m ie n to p o p u la r p a r a la h ip e r v e n tila c ió n h is té r ic a ( r e s p ir a c i ó n d e n tro d e u n a b o ls a d e p a p e l ), s e e x p lic a p o r sí s o lo .

INTERCAM BIO DE OXÍGENO Y GAS O xígeno y bióxido de carbono

a é re a s y la s p a re d e s a lv e o la re s in c r e m e n ta n el ta m a ñ o d e

L a f u n c ió n d el o x íg e n o e n el m e ta b o lis m o es c r u c i a l p a ra

lo s e s p a c io s a é re o s a lv e o la re s , c o n la r e d u c c ió n r e s u lta n te

to d a la v id a . E n la m ito c o n d r i a d e la c é lu la , lo s p a re s d e

d e l á re a s u p e r fic ia l p u l m o n a r d is p o n ib le p a r a el in t e r c a m ­

e le c tr o n e s d e la o x id a c i ó n d el N A D H y F A D H 2 s e tra n s fie ­

b io d e g a s. C o m o r e s u lta d o , el C O , es re te n id o e n la s a n g re ,

r e n al o x íg e n o m o le c u la r , lo q u e c a u s a la lib e r a c ió n d e la

350

PARTE II ■ CORRELACIONES CLÍNICAS Y PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

ES T U D IO D E C A S O 14-3 Se lle v a a u n e s tu d ia n te g r a d u a d o d e 2 4 a ñ o s a u r g e n ­

Preguntas

c ia s e n e s ta d o c o m a t o s o , d e s p u é s d e q u e s e le e n c o n ­ tró i n c o n s c i e n t e e n su c u a r to . S o b re su c a m a h a b ía u n a

1. ¿ C u á l e s el e s ta d o a c id o b a s e d e l p a c ie n te ?

b o te lla d e s e c o b a rb ita l. N o re s p o n d ía a e s tím u lo s d o l o ­

2 . ¿ Q u é c a u s ó la h ip o v e n tila c ió n p ro fu n d a ?

r o s o s , su r e s p i r a c i ó n e ra a p e n a s p e rc e p tib le y su p u ls o e r a d é b il. Se o b tu v ie ro n lo s g a s e s e n s a n g re y a r r o ja r o n

3 . U n a v e z q u e el c o m p o n e n t e r e s p ir a to r io v u e lv a a la n o r m a lid a d , ¿ c u á l s e r á e l e s ta d o a c id o b a s e e s p e ra d o

lo s r e s u lta d o s s ig u ie n te s :

d e l p a c ie n te ? pH

= 7 .1 0

PCO ,

= 70 mmHg

PC ),

= 58 mmHg

H C 0 3" = 2 0 m m o l/L G 2H b

= 8 0 % (r a n g o d e r e f e re n c ia , > 9 5 % )

e n e rg ía u s a d a p a ra s in te tiz a r A T P a p a r t ir d e la fo s fo rila ­

t o n e s ta b le c e q u e la p r e s ió n a tm o s f é ric a to ta l es la s u m a d e

c ió n d e ADP. A u n q u e la m e d id a d el 0 2 in t r a c e l u la r n o es

las p re s io n e s d e lo s g a s e s in d iv id u a le s . U n a a tm ó s f e ra e je r­

fa c tib le c o n la te c n o lo g ía a c t u a l , la e v a lu a c ió n d el e s ta ­

c e 7 6 0 m m H g d e p r e s ió n y se c o m p o n e d e O , ( 2 0 .9 3 % ) ,

d o d e o x íg e n o d e l p a c ie n te es p o s ib le u s a n d o la p re s ió n

C 0 2 ( 0 ,0 3 % ) , n it r ó g e n o ( 7 8 .1 % ) , y g a s e s in e r te s (a lr e d e ­

p a rc ia l d e o x íg e n o (P O Q m e d id a c o n el p H y P C Ó 2 e n el

d o r d e 1 % ). E l p o r c e n ta je d e c a d a g a s es ig u a l e n to d a s las

a n á lis is d e g a s e n la sa n g re .

a ltitu d e s ; la p r e s ió n p a rc ia l d e c a d a g a s e n la a tm ó s f e ra

P a ra la o x ig e n a c i ó n tis u la r a d e c u a d a , s o n n e c e s a r ia s

es ig u a l a la P B a u n a a ltitu d p a r t ic u l a r m a n te n ie n d o el

la s s ig u ie n te s s ie te c o n d ic io n e s : a) o x íg e n o a tm o s f é r ic o

p o r c e n ta je a p ro p ia d o p a ra c a d a g a s. L a p r e s ió n d el v a p o r

d is p o n ib le , b ) v e n t i la c i ó n a d e c u a d a , c ) in te r c a m b io d e g a s

d e a g u a ( 4 7 m m H g a 3 7 ° C ) d eb e to m a r s e e n c u e n t a al c a l ­

e n tr e lo s p u lm o n e s y la s a n g re a r te r ia l, d) c a r g a d el 0 2 en

c u la r la p r e s ió n p a rc ia l d e lo s g a s e s in d iv id u a le s (fig . 1 4 -

la h e m o g lo b in a , e) h e m o g lo b in a a d e c u a d a , f ) tr a n s p o r te

3 ) . E n el c u