Principios de virología molecular 9788420011356, 8420011355

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Principios de virología molecular

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Alan J. Cann Este libro de Principios de virología molecular, que es la traducción de la cuarta edición en inglés ha tenido éxito extraordinario. Constituye una introducción esencial a la virología moderna, desde un enfoque molecular; es una obra clara y concisa, siendo este uno de sus más importantes logros. El libro explora y explica los aspectos fundamentales de la virología, entre otros, la estructura délas partículas víricas y su genoma, la replicación, la expresión de los genes, la infección y la patogenia y supervivencia de las partículas víricas. He aquí algunas de las opiniones acerca de este libro: AsíTrendsinG enetics opina:

«Un texto de virología excelente para los estudiantes que es recomendado en muchas universidades para

Otras obras de interés Vacunación de los animales domésticos. Indicaciones, propiedades y aplicaciones de las vacunas Selbitz, I. H.

Virología veterinaria Fenner,E

los cursos de licenciatura».

Microbiología y enfermedades infecciosas veterinarias

Para Societyfor General Microbiology Quarterly

Quinn,P,J.yoLros

«Es una obra excelente que contiene muchos ejemplos prácticos y una atractiva puesta al día de manera clara y didáctica que es sin duda muy recomendable».

Inmunología clínica veterinaria

Halliwell, E,W. R. yGonnan,T.N.

Principios de virología m olecular

Alan J. Cann University o f Leicester, UK

Traducción de Javier Buesa Gómez D o cto r en M edicina P rofesor Titular de U niversidad D epartam ento de M icrobiología y E cología U niversidad de Valencia

Editorial ACRIBIA, S.A. ZARAGOZA (España)

Título original: Principies o f Molecular Virology, 4a. ed. Autor: Alan J. Cann Editorial: Elsevier Academic Press ELSEVIER INC 200 Wheeler Road, óthfloor, Burlington, MA 01803, USA Esta edición de Principies o f Molecular Virology, 4a. ed., de Alan J. Cann se publica con acuerdo con ELSEVIER INC, 200 Wheeler Road, 6th floor, Burlington, MA 01803, USA

Copyright © 2005, Elsevier Inc. All rights reserved © De la edición en lengua española Editorial Acribia, S.A., Apartado 466 50080 ZARAGOZA (España)

El autor hace valer sus derechos morales. La traducción ha sido realizada para Editorial Acribia, S. A. por Dr. Javier Buesa Gómez.

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Tanto ELSEVIER INC como Editorial Acribia no asumen ninguna responsabilidad por cualquier ofensa y/o perjuicio a personas o propiedades como resultado de infracciones de la propiedad intelectual o derechos reservados, producto de negligencia o cualquier otra circunstancia o motivo, o por el uso de ideas, instrucciones, procedimientos, productos o métodos contenidos en el texto.

ISBN: 978-84-200-1135-6 www.editorialacribia.com

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Reservados todos los derechos p ara los países de habla española. Este libro no podrá ser reproduci­ do en fo rm a alguna, total o parcialmente, sin el perm iso de los editores.

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Imprime: TipoLínea, S. A. - Isla de Mallorca, 13 - 50014 Zaragoza, 2010

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I n d ic e

Prefacio Prefacio Prefacio Prefacio

a a a a

de c o n t e n id o

la cuarta edición................................................................................. la tercera edición................................................................................ la segunda edición................................................................... la primera edición...............................................................................

ix xi xiii xv

Capítulo 1 Introducción ....................................................................................... Los virus son distintos de los organismos vivos................................................ La historia de la virología.................................................................................... Sistemas de huéspedes vivos............................................................................... Métodos de cultivo celular.................................................................................. Métodos serológicos/inmunológicos................................................................... Estudios ultraestructurales................................................................................... «Biología molecular»........................................................................................... Bibliografía...........................................................................................................

1 2 3 5 7 8 9 17 22

Capítulo 2 P a rtíc u la s............................................................................................. Función y formación de las partículas víricas.................................................... Simetría de la cápside y arquitecturade virus................................................... Virus envueltos..................................................................................................... Virus de estructura compleja............................................................................... Interacciones proteína-ácido nucleico y empaquetamiento del genom a Receptores víricos: Reconocimiento y unión..................................................... Otras interacciones de la cápside vírica con la célula hospedadora................. Resumen................................................................................................................ Bibliografía...........................................................................................................

25 25 27 39 42 47 51 52 52 53

Capítulo 3 Genom as............................................................................................... Estructura y complejidad de los genomas virales.............................................. Genética molecular............................................................................................... Genética vírica......................................................................................................

55 55 58 61

Mutantes víricos........................................................................................................ Supresión.................................................................................................................. Interacciones genéticas entre virus.......................................................................... Interacciones no genéticas entre virus..................................................................... Genomas «grandes» de A D N .................................................................................. Genomas «pequeños» de ADN................................................................................ Virus ARN de cadena positiva................................................................................ Virus ARN de polaridad negativa........................................................................... Virus con genomas segmentados y multipartitos................................................... Transcripción inversa y transposición..................................................................... Evolución y epidemiología...................................................................................... Resumen.................................................................................................................... Bibliografía...............................................................................................................

63 66 67 70 71 74 78 81 83 87 95 99 99

Capitulo 4 R eplicación............................................................................................. 101 Generalidades de la replicación v íric a ................................................................... 101 Investigación de la replicación vírica..................................................................... 103 El ciclo de replicación......................................................................................... 107 Resumen................................................................................................................... 128 Bibliografía.............................................................................................................. 128 Capítulo 5 E xpresión................................................................................................ Expresión de la información genética.................................................................... Control de la expresión génica en procariotas...................................................... Control de la expresión en el bacteriófago X ........................................................ Control de la expresión génica en eucariotas........................................................ Estrategias de codificación del genoma................................................................. Control transcripcional de la expresión................................................................. Control post-transcripcional de la expresión........................................................ Resumen.................................................................................................................... Bibliografía..............................................................................................................

129 129 130 131 135 137 148 153 161 162

Capítulo 6 Infección.................................................................................................. Infecciones víricas de plantas................................................................................. Respuestas inmunitarias a las infecciones víricas en animales ........................... Virus y apoptosis...................................................................................................... Interferones.............................................................................................................. Evasión de la respuesta inmunitaria por los virus................................................. Interacciones virus-hospedador.............................................................................. El curso de las infecciones víricas.......................................................................... Vectores virales y terapia génica............................................................................ Quimioterapia de las infecciones víricas................................................................ Resumen................................................................... Bibliografía..............................................................................................................

163 164 167 172 174 178 181 190 197 198

VI

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Capítulo 7 Patogénesis................................................................ Mecanismos de lesión celular.............................................................................. Virus e inmunodeficiencia................................................................................... Enfermedades relacionadas con v iru s................................................................ Bacteriófagos y enfermedad hum ana................................................................. Transformación celular por v iru s........................................................................ Virus y cáncer....................................................................................................... Virus nuevos y emergentes.................................................................................. Zoonosis................................................................................................................ Bioterrorismo........................................................................................................ Resumen................................................................................................................ Bibliografía...........................................................................................................

207 209 211 220 223 224 236 239 245 246 247 247

Capítulo 8 Agentes subvirales: genomas sin virus, virus sin genom as Satélites y viroides................................................................................................ P riones.................................................................................................................. Resumen................................................................................................................ Bibliografía...........................................................................................................

249 249 253 267 267

Apéndice 1

Glosario y abreviaturas...................................................................

269

Apéndice 2

Clasificación de los agentes infecciosossubcelulares...................

283

Apéndice 3

La historia de la virología...............................................................

297

Indice alfabético.........................................................................................................

305

iTOTfi

P r e f a c io

a la c u a r t a e d ic ió n

Esta edición de Principios de virología molecular contiene una actualización com­ pleta, además de diversos textos añadidos e ilustraciones nuevas; por ejemplo, incluye información sobre temas como el SARS o el bioterrorismo. Sin embargo, la mayoría de los cambios se han hecho en el CD*. Además de un nuevo formato, el contenido se ha revisado completamente y hemos sido capaces de incluir por primera vez una serie de animaciones cubriendo temas importantes como la simetría de la cápside, la replicación viral, el reconocimiento inmunológico y la destrucción de las células infectadas por vi­ rus. Existe además en cada capítulo un examen interactivo de autovaloración, para que puedas juzgar por tí mismo tus conocimientos de virología. Quema extender mi agradecimiento al personal de Elsevier por su ayuda durante la preparación del libro. Estoy convencido de que los lectores encontrarán esta edición tan útil como las precedentes. Alan J. Cann Universidad de Leicester, R.U., alan.cann@leicester. ac. uk Abril 2005

* N. del Editor. El CD acompaña a la edición inglesa.

IX

CAPÍTULO

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I n t r o d u c c ió n

Objetivos del aprendizaje Al completar este capítulo, el lector deberá ser capaz de: ■ Saber lo que es un virus y comprender en qué se diferencian los virus de todos los demás organismos. ■ Resumir la historia de la virología y explicar cómo se ha alcanzado el estado actual de conocimientos sobre los virus. ■ Describir las técnicas más frecuentemente utilizadas para estudiar los virus.

Existe una mayor diversidad biológica entre los propios virus que entre todo el conjunto de bacterias, plantas y animales. Este hecho es el resultado del éxito que estos agentes tienen parasitando todos los grupos conocidos de organismos vivos, y com­ prender esta diversidad es la clave para entender las interacciones entre los virus y sus organismos hospedadores. Este libro trata sobre «virología molecular» en un sentido bastante amplio; esto es, «virología a nivel molecular» o quizá incluso «moléculas y virus». Las interacciones proteína-proteína, pro teína-ácido nucleico y proteína-lípido determinan la estructura de las partículas víricas, la síntesis y la expresión de los genomas virales y los efectos que los virus tienen sobre la célula hospedadora. Esto es virología a nivel molecular. Sin embargo, antes de entrar en materia, es necesario comprender la naturaleza de los virus. Sería útil también conocer algo sobre la historia de la virología o, más exac­ tamente, de cómo surgió la virología como una disciplina independiente para entender mejor sus objetivos actuales y sus direcciones futuras. Estos son los propósitos de este capítulo introductorio. Algunos lectores pueden desconocer los fundamentos de algu­ nas técnicas mencionadas en el mismo. Para ellos podría ser de ayuda la consulta de la 1

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bibliografía citada al final del capítulo para familiarizarse con estos métodos. En éste y en los capítulos siguientes, las palabras escritas en color se definen en el glosario (Apéndice 1).

LOS VIRUS SON DISTINTOS DE LOS ORGANISMOS VIVOS Los virus son parásitos obligados, submicroscópicos e intracelulares. Esta defini­ ción, simple pero útil, describe y distingue a los virus de los demás grupos de organis­ mos vivos; sin embargo, es en sí misma inadecuada. Está claro que no es ningún pro­ blema distinguir los virus de los organismos macroscópicos. Incluso con una defini­ ción amplia del concepto de microbiología abarcando los organismos procariotas y los eucariotas microscópicos tales como algas, protozoos y hongos, en la mayoría de los casos sería suficiente. Unos pocos grupos de organismos procariotas, sin embargo, tienen ciclos vitales parasitarios intracelulares y pueden confundir la definición ante­ rior. Estos son las bacterias de las familias Rickeítsiae y Chlamydiae, parásitos intrace­ lulares obligados que han evolucionado hasta encontrarse tan asociados a las células que infectan, que sólo pueden sobrevivir fuera de las células de sus hospedadores du­ rante breves periodos de tiempo. Por ello es necesario añadir algunas cláusulas a la definición de lo que constituye un virus: ■ Las partículas víricas se producen mediante el ensamblaje de componentes preformados, mientras que otros agentes crecen por un incremento de la suma de sus componentes y se reproducen por división. ■ Las partículas víricas (viriones) no crecen ni sufren división. ■ Los virus carecen de información genética que codifique estructuras necesarias para la generación de energía metabólica o para la síntesis de proteínas (ribosomas). Ningún vims conocido posee el potencial genético o metabólico para generar la ener­ gía necesaria para desarrollar todos los procesos biológicos (por ej., la síntesis de macromoléculas). Son por tanto totalmente dependientes de la célula hospedadora para esta función. A menudo se plantea la pregunta de si los vims están vivos o no. Una opinión es que dentro de la célula hospedadora los vims están vivos, mientras que fuera son simple­ mente ensamblajes de compuestos químicos metabólicamente inertes. Esto no quiere decir que no se produzcan cambios químicos en los vims extracelulares, como se expli­ cará en otro lugar, pero no son en el sentido del «crecimiento» de un ser vivo. Un error frecuente es considerar que los vims son más pequeños que las bacterias. Aunque esto es cierto en la mayoría de los casos, el tamaño solo no sirve para distin­ guir entre ambos. Los vims más grandes conocidos (Mimivims, por mimetizar micro­ bios) tienen 400 nm de diámetro, mientras que las bacterias más pequeñas (por ej., Mycoplasma, Ralstonia pickettii) tiene sólo de 200 a 300 nm de longitud. Aunque siempre habrá algunas excepciones e incertidumbres en los casos de organismos de­ masiado pequeños para ser observados y en muchos casos difíciles de estudiar, en la mayoría, las directrices anteriormente expuestas son suficientes para definir un vims.

Introducción

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Un número de agentes patógenos nuevos poseen propiedades que confunden la definición anterior, aunque son claramente más similares a virus que a otros organis­ mos. Estos agentes son los viroide , los virusoides y los priones. Los viroides son moléculas circulares de ARN muy pequeñas (200-400 nucleótidos) con una estructura secundaria en forma de barra. Carecen de cápside o envoltura y se asocian a algunas enfermedades de plantas. Su estrategia de replicación es semejante a la de los virus: son parásitos intracelulares estrictos. Los virusoides son moléculas similares a viroides, satélites, algo mayores que los viroides (aproximadamente 1.000 nucleótidos) que de­ penden de la replicación de un virus para su multiplicación (de ahí el término «satéli­ te»); se empaquetan en cápsides víricas como pasajeros. Los priones son agentes in­ fecciosos que se consideran constituidos por un solo tipo de molécula proteica sin ningún ácido nucleico en su composición. El hecho de que tanto la proteína priónica como el gen que la codifica se encuentren en células sanas «no infectadas» sembró confusión. Estos agentes se asocian a enfermedades por «virus lentos» como el síndro­ me de Creutzfeldt-Jakob en humanos, la tembladera (scrapie en inglés) de las ovejas y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en las vacas. El Capítulo 8 trata de estos agentes infecciosos subvirales con más detalle. Además, diversos análisis genómicos han demostrado que el 10% del genoma de la célula eucariota está compuesto por elementos móviles similares a retrovirus (retrotransposones), que han podido tener un papel considerable en la formación de estos genomas complejos (Capítulo 3). Asi­ mismo, ciertos genomas de bacteriófagos se parecen en su estructura y en la forma en que se replican a plásmidos bacterianos. Muchas investigaciones han revelado que la relación entre los virus y otros organismos vivos es quizá más compleja de lo que previamente se pensaba.

LA HISTORIA DE LA VIROLOGÍA Es frecuente considerar los sucesos que ocurrieron antes de nuestra propia expe­ riencia personal como prehistóricos. Se ha escrito mucho sobre la virología como una «nueva» disciplina en biología, y esto es cierto en lo referente al reconocimiento for­ mal de los virus como agentes diferentes a otros seres vivos. Sin embargo, hoy com­ prendemos que nuestros antepasados no sólo eran conscientes de los efectos de las infecciones víricas, sino que en ocasiones desarrollaron estudios sobre las causas y la prevención de estas enfermedades. Probablemente el primer registro escrito de una enfermedad vírica aparezca en un jeroglífico de Menfis, la capital del imperio antiguo de Egipto, dibujado aproximadamente en el año 3700 a.C., que representa a un sacer­ dote del templo mostrando los signos típicos de una poliomielitis paralítica. El faraón Ramsés V, que murió en 1196 a.C. y cuya momia extraordinariamente bien preservada se conserva en un museo de El Cairo, se cree que falleció de viruela: el parecido entre las lesiones pustulosas del rostro de la momia y otras de pacientes más recientes es asombroso. La viruela fue endémica en China hacia el año 1000 a.C. Como defensa se desarro­ lló la práctica de la variolización. Tras reconocer que los supervivientes de brotes de

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viruela quedaban protegidos de posteriores contagios, los chinos inhalaron las costras secas de lesiones de viruela como si se tratase de rapé o, en modificaciones posterio­ res, inocularon el pus de lesiones realizando escoriaciones en el antebrazo. La variolización se practicó durante siglos, y se mostró como un método efectivo para prevenir la enfermedad, aunque arriesgado, porque el resultado de la inoculación era siempre incierto. ¡El propio Edward Jenner estuvo a punto de morir como resultado de la variolización a los 7 años de edad! No es sorprendente que esta experiencia le im­ pulsase a encontrar un tratamiento alternativo más seguro. El 14 de mayo de 1796 utilizó material de una infección por viruela de las vacas de la mano de Sarah Nemes, una ordeñadora de Berkeley, su villa natal en el condado de Gloucestershire, para va­ cunar con éxito al niño de 8 años James Phipps. Aunque al principio fue discutida, la vacunación frente a la viruela fue casi universalmente adoptada durante el siglo XIX. Este éxito temprano, aunque triunfo de la observación científica y del razonamien­ to, no se basó en una verdadera comprensión de la naturaleza de los agentes infeccio­ sos, que surgió independientemente de otra línea de pensamiento. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), un comerciante holandés, construyó los primeros micros­ copios simples con los que identificó bacterias como los «animálculos» que observó en sus preparaciones. Sin embargo, no fue hasta que Robert Koch y Louis Pasteur allá por 1880 conjuntamente propusieran la «teoría germinal» de la infección que la relevancia de los microorganismos se hiciera evidente. Koch definió sus cuatro famosos criterios conocidos como «postulados de Koch», que todavía son considerados generalmente como la prueba de que un agente infeccioso es responsable de una enfermedad especí­ fica: ■ El agente debe estar presente en cada caso de la enfermedad. ■ El agente debe aislarse del huésped y cultivarse in vitro. ■ La enfermedad debe reproducirse cuando un cultivo puro del agente se inocula a un hospedador susceptible sano. ■ El mismo agente tiene que ser recuperado de nuevo del hospedador infectado expe­ rimentalmente. Posteriormente, Pasteur trabajó intensamente en rabia, la cual identificó como una enfermedad causada por un «virus» (que significa «veneno» en latín), pero a pesar de ello no distinguió entre bacterias y otros agentes productores de enfermedad. En 1892, Dimitri lwanowski, un botánico ruso, demostró que extractos de plantas de tabaco enfermas podían transmitir la enfermedad a otras plantas tras pasar a través de filtros de cerámica suficientemente finos para retener las bacterias más pequeñas conocidas. Desafortunadamente, no llegó a comprender el significado de sus observaciones. Unos pocos años después (1898), Martinus Beijerinick confirmó y amplió los resultados de lwanowski con el virus del mosaico del tabaco (VMT) y fue el primero en desarrollar el concepto moderno de virus, que él describió como contagium vivum fluidum («ger­ men vivo soluble»). Freidrich Loeffler y Paul Frosch (1898) demostraron que un agen­ te similar era responsable de la fiebre añosa del ganado, pero, a pesar de la compren­ sión de que estos agentes recién descubiertos causaban enfermedades tanto en animales como en plantas, la gente no aceptó la idea que de que podían tener algo que ver con

Introducción

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enfermedades humanas. Esta resistencia fue finalmente disipada en 1909 por Karl Landsteiner y Erwin Popper, quienes demostraron que la poliomielitis era causada por un agente filtrable: la primera enfermedad humana reconocida como causada por un virus. Frederick Twort (1915) y Félix d’Herelle (1917) fueron los primeros en reconocer que los virus infectan bacterias, que d'Herclíe denominó bacteriófagos («devoradores de bacterias»). En 1930 y en las décadas siguientes, virólogos pioneros como Salvador Luria, Max Delbruck y muchos otros utilizaron estos virus como sistemas modelo para investigar muchos aspectos de la virología, incluida la estructura (Capítulo 2), genéti­ ca (Capítulo 3) y replicación de los virus (Capítulo 4). Estos agentes relativamente simples han demostrado ser, desde entonces, muy importantes para nuestro conoci­ miento de todos los tipos de virus, incluyendo los de los humanos, que son mucho más difíciles de propagar y estudiar. La continuación de la historia de la virología es un relato del desarrollo de herramientas experimentales y de sistemas con los cuales los virus puedan ser examinados, que han abierto nuevas áreas de la biología, incluyendo no sólo la biología de los propios virus sino también, inevitablemente, la biología de las células hospedadoras de las que estos agentes son totalmente dependientes.

SISTEMAS DE HUÉSPEDES VIVOS En 1881 Louis Pasteur comenzó a estudiar la rabia en animales. Durante varios años desarrolló métodos para producir preparaciones de virus atenuados desecando progresivamente médulas espinales de conejos experimentalmente infectados con ra­ bia, las cuales, administradas a otros animales, los protegerían frente a un inoculo de virus rábico virulento. En 1885, inoculó a un niño, Joseph Meister, con este preparado, la primera vacuna vírica producida artificialmente (ya que la antigua práctica de la variolización y el uso por Jenner del virus de la viruela de las vacas para la 'acuña­ ción se basaban en virus naturales). Plantas enteras se han empleado para estudiar los efectos de los virus de plantas tras la infección, desde que el virus del mosaico del tabaco fuera descubierto por Iwanowski. Generalmente estos estudios implican frotar preparaciones conteniendo partículas víricas sobre las hojas o el tronco de la planta. Durante la guerra de Cuba entre España y los Estados Unidos a finales del siglo XIX y la posterior construcción del canal de Panamá, el número de americanos falleci­ dos de fiebre amarilla fue realmente colosal. La enfermedad también parecía estar extendiéndose lentamente hacia el norte en los Estados Unidos. En 1990, mediante la transmisión experimental a ratones. Walter Reed demostró que la fiebre amarilla era producida por un virus transmitido por mosquitos. Este descubrimiento permitió a Max Theiler en 1937 propagar el virus en embriones de pollo y producir una vacuna atenua­ da -la cepa 17D- que se emplea hoy todavía. El éxito de esta estrategia condujo a muchos otros investigadores entre los años 30 y 50 a desarrollar modelos animales con los qúe identificar y propagar virus patógenos. Las células eucariolas pueden ser cultivadas in vitro (cultivo celular) y los virus se pueden propagar en estos cultivos, pero estas técnicas son caras y técnicamente exi­

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Principios de virología molecular

gentes. Algunos viras replican en tejidos vivos de huevos embrionados de gallina, como los viras gripales o influenza. Las cepas de viras gripales adaptadas a crecer en huevos embrionados replican muy bien en ellos y alcanzan títulós muy elevados. Estos huevos embrionados de gallina se utilizaron por vez primera para cultivar viras en las primeras décadas del siglo XX. Este método ha mostrado ser muy eficaz para aislar y cultivar muchos viras, particulanuente cepas de viras influenza y varios poxviras (por ej., el viras vacuna). El recuento de las pústulas (pocks en inglés) producidas por la replicación de viras vacuna en la membrana corioalantoidea constituyó el primer ensa­ yo cuantitativo utilizado en virología. Sistemas de huéspedes animales todavía tienen aplicaciones en virología: ■ Para producir viras que no pueden estudiarse eficazmente in vitro (por ej., el viras de la hepatitis B). ■ Para estudiar la patogénesis de infecciones víricas (por ej., los viras coxsackie). h Para analizar la seguridad de vacunas (por ej., la vacuna oral del viras de la polio). No obstante, están siendo paulatinamente abandonados por los siguientes motivos: ■ La cría y el mantenimiento de animales infectados con viras patógenos son caros. ■ Los animales son seres vivos complejos en los que a veces resulta difícil discernir procesos por separado. ■ Los resultados no son siempre reproducibles, debido a variaciones de los indivi­ duos hospedadores. ■ El uso innecesario o exagerado de animales de experimentación es moralmente repugnante. ■ Están siendo sustituidos por técnicas más modernas: cultivos celulares y biología molecular. El empleo de plantas enteras como organismos hospedadores no plantea el mismo tipo de objeciones morales que el de animales vivos, y sigue constituyendo una parte importante del estudio de los viras de plantas, aunque semejantes sistemas son a veces lentos en ofrecer resultados y costosos de mantener. En los últimos años se ha empleado una tecnología totalmente nueva para estudiar los efectos de los viras sobre los organismos hospedadores. Consiste en la creación de plantas y animales transgénicos mediante la inserción de todo el genoma o una por­ ción del mismo en el ADN del organismo experimental, provocando la expresión de ARN mensajeros (ARNm) víricos y de proteínas en células somáticas (y a veces en células de la línea germinal). De este modo se pueden estudiar en seres vivos los efec­ tos patogénicos de proteínas víricas, individualmente o en varias combinaciones. Se han desarrollado ratones «SCID-hu» con líneas inmunodeficientes de animales tras­ plantados con tejidos humanos. Estos ratones constituyen un modelo muy interesante para estudiar la patogénesis del viras de la inmunodeficiencia humana (VIH), ya que no existen alternativas reales para estudiar las propiedades de este importante viras in vivo. Aunque estas técnicas han provocado el mismo tipo de objeciones morales que las «anticuadas» infecciones experimentales de animales por viras, constituyen unas herramientas muy prometedoras para el estudio de la patogenicidad viral. Se ha anali­

Introducción

zado por estos métodos un número creciente de genes de virus animales y de plantas, pero los resultados no han sido siempre los esperados, y en muchos casos ha resultado difícil comparar las observaciones realizadas con las recogidas de infecciones experi­ mentales. No obstante, este método va a ser sin duda ampliamente utilizado conforme se vayan resolviendo las dificultades técnicas asociadas a la construcción de organis­ mos transgénicos.

MÉTODOS DE CULTIVO CELULAR Los cultivos celulares comenzaron a principios del siglo XX con cultivos de órga­ nos completos, luego progresaron a métodos que comprendían células individualizadas, bien cultivos de células primarias (células somáticas de un animal de experimenta­ ción o tomadas de un paciente humano, que pueden mantenerse en cultivo durante un periodo breve de tiempo) o bien líneas celulares inmortalizadas, que, en las condicio­ nes adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo indefinidamente. En 1949, John Enders y sus colegas fueron capaces de propagar virus de la polio en cultivos de células humanas primarias. Este logro marcó el comienzo de lo que algu­ nos han considerado «la edad de oro de la virología» y condujo al aislamiento y la identificación durante los años 50 y 60 de muchos virus asociados con enfermedades humanas: por ejemplo, muchos entero virus y virus respiratorios, tales como los adenovirus. El aislamiento de virus ampliamente distribuidos en la población hizo compren­ der que las infecciones víricas subclínicas son muy comunes; por ejemplo, incluso durante las epidemias por las cepas más virulentas de virus de la polio se producen aproxim adam ente 100 infecciones subclínicas por cada caso de parálisis por poliomielitis. Renato Dulbecco fue el primero que en 1952 cuantificó con precisión virus anima­ les utilizando un ensayo de placas de lisis. En esta técnica se preparan diluciones del virus con las que se infectan células crecidas en monocapas, que después se recubren con agar blando para impedir la difusión del virus. Este destruye las células en focos localizados que se observan como calvas o placas al teñirse la monocapa (Figura 1.1). Mediante el recuento del número de placas se determina directamente el número de partículas víricas infecciosas inoculadas al cultivo. La misma técnica puede ser aplica­ da para clonar un virus (es decir, aislar una forma pura a partir de una mezcla de tipos). Esta técnica fue usada durante un tiempo para cuantificar el número de partículas víricas infectivas en suspensiones de bacteriófagos aplicadas a «céspedes» confluentes de bacterias en placas de agar, pero su aplicación a virus de eucariotas permitió rápidos avances en el estudio de la replicación viral. Los ensayos de plaqueo reemplazaron las técnicas anteriores de dilución límite, tal como el análisis de la dosis infecciosa al 50% en cultivo celular («iissue culture infectious dose», TCID50en inglés), que consiste en un método estadístico para medir la población vírica en cultivo; las técnicas de dilu­ ción Emite pueden utilizarse todavía en algunas circunstancias, por ejemplo con virus que no son citopáticos y no producen placas (por ej., el virus de la imnunodeficiencia humana).

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Principios de virología molecular

Los ensayos de plaqueo se realizan aplicando una dilución adecuada de una preparación de virus a una monocapa confluente o semiconfluente de células susceptibles. Tras dejar un tiempo para que el virus se fije a las células y las infecte, el medio líquido se sustituye por un medio de cultivo semisólido que contenga un polímero como agarosa o carboximetílcelulosa, que restringe la difusión de las partículas víricas desde las células infectadas. Tras un periodo de incubación, el medio generalmente se retira y las células se tifien para hacer más fácilmente visibles los agujeros (placas o calvas) en la monocapa. Cada placa resulta por tanto de la infección por una sola unidad formadora de placa (u.f.p.).

Cuando la disciplina de la virología estaba desarrollándose, también lo estaban haciendo las técnicas de inmunología y, al igual que ha sucedido más recientemente con la biología molecular, ambas disciplinas han estado siempre muy relacionadas. La comprensión de los mecanismos de inmunidad en las infecciones virales ha sido, por supuesto, muy importante. Recientemente se ha reconocido el papel que el propio sis­ tema inmunológico desempeña en la patogénesis de las infecciones virales (ver Capí­

Introducción

tulo 7). La inmunología ha contribuido de propio derecho al desarrollo de muchas de las técnicas clásicas en virología (Figura 1.2). En 1941 George Hirst observó la hemaglutinación, es decir, la aglutinación de hematíes por virus influenza (ver Capítulo 4). Esta técnica se mostró de gran utilidad en el estudio no sólo de la gripe sino también de otros grupos de virus, por ejemplo el virus de la rabeóla. Además de medir el título, es decir, la cantidad relativa de viras presente en cualquier preparación, esta técnica también sirve para determinar el tipo antigénico de un virus. La hemaglutinación no se produce en presencia de anticuerpos que reconocen y bloquean a la hemaglutinina viral. Si un antisuero se titula frente a un número determinado de unidades hemaglutinantes, se puede establecer el título de inhibición de la hemaglutinación y la especificad del antisuero. También se puede de­ terminar el tipo antigénico de un virus desconocido utilizando antisueros de especifici­ dad conocida para inhibir la hemaglutinación. En 1960 y durante los años siguientes se desarrollaron o mejoraron muchos métodos para la detección de virus, tales como: ■ Reacción de fijación del complemento. ■ Radioinmunoanálisis. ■ Inmunofluorescencia (detección directa de antígenos virales en células infectadas o tejidos). ■ Enzimoinmunoanálisis (ELISA). ■ Radioinmunoprecipitación. ■ Inmunoblot o Western blot. Estas técnicas son sensibles, rápidas y cuantitativas. En 1975, George Kohler y Cesar Milstein aislaron el primer anticuerpo monoclonal de clones de células seleccionadas in vitro para producir un anticuerpo de una sola especificidad, dirigido frente a una diana antigénica particular. Esto permitió a los prólogos estudiar no un virus entero, sino regiones específicas -epitopos- de antígenos virales individuales (Figura 1.3). Esta posibilidad ha incrementado considerablemente nuestro conocimiento sobre las funciones de las proteínas víricas. Los anticuerpos monoclonales están encontrando amplias aplicaciones en otros tipos de ensayos serológicos (por ej., ELISAs), aumentando su reproducibilidad, sensibilidad y especi­ ficidad. No sería adecuado dedicar aquí mucho espacio a exponer los detalles técnicos de lo que es un campo en rápida evolución; sin embargo, recomiendo a los lectores que no estén familiarizados con las técnicas anteriormente mencionadas que profundicen en estos temas mediante la lectura de uno o varios de los textos citados en la bibliografía de este capítulo. El tiempo invertido en ello les compensará a los lectores durante la lectura del resto de este libro.

ESTUDIOS ULTRAESTRUCTURALES Los estudios ultraestructurales pueden ser considerados de tres tipos: métodos físi­ cos, métodos químicos y microscopía electrónica. Las mediciones físicas de partículas

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Principios de virología molecular

Figura 1.2 Es difícil no sobreestimar la importancia de las técnicas serológicas en virología. Los cuatro ensayos ilustrados en los diagramas de esta figura se han utilizado durante muchos años y tienen una amplia aplicación, (a) La reacción de fijación del complemento se basa en que el complemento es secuestrado por complejos antígeno-anticuerpo. Glóbulos rojos «sensibilizados» recubiertos de anti­ cuerpos, complemento a una concentración conocida, antígeno vírico y el suero problema se añaden a pocilios de una placa de microtitulación. En ausencia de anticuerpos frente al antígeno vírico, el com­ plemento libre causa la lisis de los glóbulos rojos sensibilizados (hemolisis). Si, por el contrario, el suero contiene anticuerpos frente al virus a un título suficientemente alto, el complemento será «fijado» y no quedará disponible para producir hemolisis. Se calcula el título del suero problema efectuando diluciones seriadas del mismo y midiendo cuantitativamente la cantidad de anticuerpos antivirus que contiene, (b) La inmunofluorescencia se realiza con anticuerpos conjugados covalentemente con una m olécula fluorescente que emite una luz coloreada característica cuando se ilumina por luz de una longitud de onda diferente, tal como la rodamina (roja) o la fluoresceína (verde). En la inmunofluores(icontinúa)

Introducción

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víricas comenzaron a realizarse en la década de 1930 con las primeras determinaciones de sus proporciones mediante filtración a través de membranas coloidales de varios tamaños de poro. Experimentos de este tipo condujeron a las primeras estimaciones (bastante inexactas) del tamaño de las partículas víricas. La exactitud de estas medi­ ciones se incrementó considerablemente con estudios de las propiedades de sedimen­ tación de los virus en ultracentrífugas realizados en los años 60 (Figura 1.4). La centri­ fugación diferencial demostró ser de gran utilidad en la obtención de preparaciones purificadas y muy concentradas de muy distintos virus, libres de contaminación con componentes de la célula hospedadora. que pueden ser sometidas así a análisis quími­ cos. La densidad relativa de partículas víricas, medidas en soluciones de sacarosa o de CsCl, resulta también una característica particular, proporcionando información sobre las proporciones de ácido nucleico y proteína en las partículas. Las propiedades físicas de los virus puede ser determinada por espectroscopia, utili­ zando bien luz ultravioleta para examinar el contenido en ácido nucleico de la partícula o bien luz visible para determinar sus propiedades de dispersión de la luz. La electroforesis de partículas virales intactas ha proporcionado información limitada, sin embargo, los análisis electroforéticos de las proteínas individuales del virión y, especialmente de los ácidos nucleicos genómicos (Capítulo 3), han resultado muy valiosos. No obstante, el método más importante, con gran diferencia, para elucidar la estructura de los virus ha sido el uso de la difracción de rayos X sobre formas cristalinas de virus purificados. Esta técnica permite determinar la estructura de viriones a un nivel atómico.

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 p r

Total de bases secuenciadas: 9.719 pb

T jr r r r r r r r

TTT

l proteína sor 23K poliproteína pol proteína R a proteína tat o poliproteína env exón o exón

TTT

pollproteína gag

LTR región repetida

¡ntrón Leyenda:

secuencia codifica nte/intrón/exón I""!""!

21

9.719

e n proteína 27K - o proteína trs

exón □ exón

■■LTR * ■ región repetida m ARNm HXB2 genómico ~ transcrito primario

señal poli-A

intrón ARN

l otras características

-1.000-2.000 nt

* LTR = long terminal repeat = secuencia terminal larga y repetida.

Figura 1.9 Un ejemplo del empleo de un ordenador para alm acenar y procesar información digitalizada de una secuencia de ácido nucleico. Esta figura muestra un análisis de todas las pautas de lectura abier­ tas (open readingfram es, ORFs en inglés) presentes en un provirus de VIH-1. Se muestran los ORFs presentes en los tres genes principales de los retrovirus, gag, p o l y env. Este complejo análisis duró solamente unos segundos con un ordenador personal corriente. De forma manual, este trabajo habría costado varios días.

y/o genéticos. No obstante, cuando la estructura de una proteína haya sido determina­ da por cristalografía de rayos X o RMN su forma puede ser modelada y explorada en tres dimensiones en computadores (Figura 1.10).

Figura 1.10 Estructura tridimensional del dominio de unión al ADN del antígeno T de SV40 recons­ truido utilizando un ordenador a partir de datos obtenidos por resonancia magnética nuclear (RMN).

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Principios de virología molecular

Tabla 1.1

Comparación de genomas de diferentes organismos.

Organismo Virus de la hepatitis B SV40 Virus herpes simplex Mímivirus Escherichia coli Levadura Caenorhabditis elegans Drosophila Arabidopsis R atón Hombre

Número de genes

Porcentaje (%) de genes con función conocida o deducida

4 6 80 900 4.288 6.600 19.000 14.000 25.000 100.000 100.000

75 100 95 10 60 40 40 25 40 10 10

Mientras que el genoma consiste en el ácido nucleico que comprende la información genética completa de un organismo, por extensión, «genómica» es el estudio de la com­ posición y función del material genético de un organismo. La genómica de virus comen­ zó con la secuencia completa de un genoma viral (el bacteriófago X174 en 1977). Se han recopilado enormes bases de datos con información de secuencias de nucleótidos y de proteínas, y se puede acceder rápidamente a ellas para comparar secuencias nuevas con aquellas cuyas funciones han sido estudiadas con gran detalle. En el momento de esta publicación, se han publicado las secuencias completas de los genomas de al menos 1.500 virus diferentes, apareciendo más casi cada semana (Tabla 1.1). Hemos llegado, en cierto sentido, a recorrer un círculo completo en nuestras inves­ tigaciones sobre virus —de las partículas a los genomas y de vuelta a las proteínas- y hemos terminado con un conocimiento más profundo de estos organismos; sin embar­ go, el ritmo actual de la investigación en virología nos dice que hay mucho más que necesitamos saber.

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Introducción

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CAPÍTULO

2

P a r t íc u l a s

Objetivos deí aprendizaje Tras completar este capítulo, el lector deberá ser capaz de: ■ Comprender las razones por las que los virus codifican proteínas para construir partículas. ■ Identificar los principales tipos estructurales de partículas. ■ Explicar por qué las cápsides víricas interaccionan tanto con la célula hospedadora como con el genoma viral durante su replicación.

FUNCIÓN Y FORMACIÓN DE LAS PARTÍCULAS VÍRICAS Gran parte de la información sobre las estructuras víricas es fundamentalmente de naturaleza visual y resulta difícil representarla impresa adecuadamente. En la Figura 2.1 se representan de manera aproximada las formas y los tamaños de diferentes familias de virus. ¿Por qué molestarse en formar partículas víricas para contener el genoma? De hecho, algunos agentes infecciosos, como los viroides, no lo hacen (ver Capítulo 8); sin embar­ go, el hecho de que los virus pugnen por la carga genética y bioquímica necesaria para codificar y ensamblar los componentes de las partículas, indica que esta estrategia debe aportar algún beneficio. A un nivel muy simple, la función de las capas más superficiales de una partícula vírica es proteger al frágil ácido nucleico genómico de cualquier daño físico, químico o enzimático. Tras abandonar la célula hospedadora, el virus se encuentra en un ambiente hostil, que fácilmente podría inactivar un genoma desprotegido. Los ácidos nucleicos son susceptibles a los daños físicos, como roturas por fuerzas mecáni­ cas, y a modificaciones por la luz ultravioleta (la luz solar). El medio ambiente natural está repleto de nucleasas derivadas de células muertas o lesionadas, o deliberadamente 25

Principios de virología molecular

V irus ADN

Poxviridae

Asfarviridae

Herpesviridae

Adenoviridae

Virus con transcripción inversa Papovaviridae

Parvoviridae

Circovirídae

Hepadnaviridae

Retroviridae

Virus ARN

Reoviridae

Birnaviridae

Paramyxoviridae

Rhabdoviridae

Bornaviridae

c Filoviridae

% # Orthomyxoviridae

Bunyaviridae

Arenaviridae

(Coronavirus)

(Torovirus)

Coronaviridae

Arteriviridae

Picornavirídae

Caliciviridae

Astroviridae

Togavirídae

Pie de figura

Flavivirídae

Partículas

27

secretadas por vertebrados como defensa contra la infección. En los virus con genomas de una sola cadena, la rotura de un simple enlace fosfodiéster o la modificación química de un solo nucleótido es suficiente para inactivar esa partícula vírica, haciendo imposible la replicación de su gen orna. ¿Cómo se consigue la protección frente a todo esto? Las subunidades proteicas de una eápside vírica son múltiples y redundantes (es decir, exis­ ten muchas copias por partícula). El daño ocasionado a una o más subunidades puede afectar a su función, pero rara vez un daño restringido destruye la infectividad de la partícula vírica completa. Esto convierte a la eápside en una barrera eficaz. Las capas de proteína que rodean a la partícula vírica son muy resistentes, tan fuertes como un plástico duro, como el Perspex® o el Plexiglás®, aunque, por supuesto son solamente una milmillonésima parte de un metro más o menos de diámetro; sin embargo, también son elásticas y capaces de deformarse hasta un tercio sin romperse. Esta combi­ nación de fuerza, flexibilidad y tamaño pequeño significa que físicamente es difícil (aun­ que no imposible) romper partículas víricas mediante presión física. La superficie externa de un virus es también responsable del reconocimiento y la primera interacción con la célula hospedadora. Inicialmente, esto consiste en la unión específica de una proteína vírica de adhesión a una molécula receptora de la célula. Sin embargo, la eápside juega también un papel iniciando la infección al entregar el genoma de una forma en que puede interaccionar con la célula hospedadora. En algunos casos éste es un proceso simple que consiste en descargar el genoma dentro del citoplas­ ma de la célula. En otros casos, esta etapa es mucho más compleja; por ejemplo, los retrovirus llevan a cabo intensas modificaciones del genoma viral cuando todavía está dentro de la partícula vírica, convirtiendo dos moléculas de ARN de simple cadena en una molécula de ADN de doble cadena, antes de conducirlo al núcleo celular. Por tanto, el papel de la eápside es vital para que los virus puedan establecer una infección. Para conseguir formar partículas infecciosas, los virus deben superar dos problemas fundamentales. Primero, tienen que ensamblar la partícula utilizando la información dis­ ponible en los propios componentes que forman la partícula. Segundo, las partículas adquieren formas geométricas regulares, a pesar de que las proteínas de las que están fabricadas tienen formas irregulares. ¿Cómo resuelven estos organismos tan simples es­ tas dificultades? La solución a ambos problemas radica en las leyes de la simetría.

S im e t r ía d e l a c á p s id e y a r q u it e c t u r a d e v ir u s Es posible imaginar una partícula vírica cuya cubierta extema (la cápside) consistie­ ra en una sola proteína hueca, que al plegarse para adquirir su conformación madura

X174 también muestra que una porción del genoma de ADN interacciona con residuos de arginina expuestos a la superficie interna de la cápside, de forma similar que en VMVJ. Parece que se está produciendo un consenso respecto al estado físico de los ácidos nucleicos en el interior de cápsides víricas icosaédncas. De forma similar a como las cápsides icosaédricas de muchos virus no relacionados genéticamente se basan en monó­ meros con un motivo estructural común en «barril |3 de ocho cadenas antiparalelas», los genomas en su interior también parecen mostrar una simetría icosaédrica, cuyos vértices interaccionan con aminoácidos básicos en la superficie interna de la cápside. De esta manera, estos motivos estructurales comunes pueden con el tiempo explicar cómo los virus empaquetan selectivamente los ácidos nucleicos genómicos necesarios, e incluso podrían llegar a ofrecer la posibilidad de diseñar drogas específicas que inhiban estas interacciones.

RECEPTORES VÍRICOS: RECONOCIMIENTO Y UNIÓN Actualmente están identificadas las moléculas que utilizan diversos virus de grupos taxonómicos diferentes como receptores celulares. La interacción de la superficie exter­ na de un virus con un receptor celular es un acontecimiento importante, que determina

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Principios de virología molecular

los sucesos posteriores en la replicación y el resultado de las infecciones. Esta unión es la que activa a las partículas víricas inertes extracelularroente e inicia el ciclo replicativo. La unión al receptor se considera en detalle en el Capítulo 4.

OTRAS INTERACCIONES DE LA CÁPSIDE VÍRICA CON LA CÉLULA HOSPEDADORA Tal como se afirmó al principio de este capítulo, la función de la cápside vírica no es solamente proteger al genoma sino también entregarlo a la célula hospedadora adecuada y, más específicamente, al compartimento celular más apropiado de la célula (en el caso de células eucariotas) para permitir que la replicación tenga lugar. Un ejemplo lo cons­ tituyen las proteínas de la nucleocápside de virus que replican en el núcleo celular. Estas moléculas contienen en su secuencia aminoacídica primaria «señales de localización nuclear» que son las responsables de la migración de los genomas virales con sus proteí­ nas asociadas al núcleo, donde se produce la replicación. De nuevo, estos acontecimien­ tos se comentan en el Capítulo 4. Los viriones no son estructuras inertes. Muchas partículas víricas contienen una o más actividades enzimáticas, aunque en la mayoría de los casos éstas no son activas fuera del ambiente bioquímico de la célula hospedadora. Todos los virus con genomas de ARN de polaridad negativa deben contener una ARN polimerasa ARN-depcncliente,' porque la mayoría de las células eucarióticas no disponen de mecanismos para la poli­ merización ARN-dependiente de ARN, de manera que la replicación no podría llevarse a cabo si esta enzima no estuviese incluida en la partícula vírica. La transcripción inversa de los genomas de retrovirus ocurre en un complejo particulado, y no libre en solución. Los virus ADN más complejos (por ej., herpesvirus y poxvirus) contienen muchas enzi­ mas, la mayoría de ellas relacionadas con algunos aspectos del metabolismo de los áci­ dos nucleicos.

RESUMEN Este capítulo no intenta ser una lista completa de todas las estructuras víricas que se conocen actualmente, sino que intenta ilustrar con ejemplos algunos de los principios que controlan el ensamblaje de virus y las dificultades del estudio de estas diminutas estructuras. Los lectores deberán consultar artículos científicos y bases de datos para conocer los detalles de las estructuras víricas conocidas y de muchas que continuamente aparecen. No obstante, existe una serie de motivos estructurales repetidos que se encuen­ tran en muchos grupos diferentes de virus. Lo más obvio es considerar la división de muchas estructuras víricas en aquellas basadas en simetrías helicoidal e icosaédrica. Más sutilmente, estructuras proteicas comunes como el motivo estructural en «barril (3 de ocho cadenas antiparalelas» encontrado en muchas cápsides icosaédricas T= 3 y el plegamiento icosaédrico del ARN genómico presente en el interior de algunos de estos virus empiezan a conocerse. Las partículas víricas no son inertes. Muchas están dotadas

Partículas

53

de una variedad de enzimas que desempeñan un abanico de reacciones complejas, con frecuencia involucradas en la replicación del genoma.

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