Principi di Biochimica
 9788808974563

Table of contents :
Prefazione......Page 1
Indice......Page 7
Capitolo 1......Page 18
Capitolo 2......Page 40
Capitolo 3......Page 62
Capitolo 4......Page 102
Capitolo 5......Page 119
Capitolo 6......Page 155
Capitolo 7......Page 209
Capitolo 8......Page 253
Capitolo 9......Page 278
Capitolo 10......Page 330
Capitolo 11......Page 360
Capitolo 12......Page 402
Capitolo 13......Page 445
Capitolo 14......Page 489
Capitolo 15......Page 527
Capitolo 16......Page 574
Capitolo 17......Page 610
Capitolo 18......Page 641
Capitolo 19......Page 687
Capitolo 20......Page 724
Capitolo 21......Page 782
Capitolo 22......Page 841
Appendice......Page 874
Indice Analitico......Page 879

Citation preview

P R E FA Z I O N E

La biochimica non può più essere considerata una materia specialistica, ma piuttosto parte del nucleo centrale delle conoscenze dei chimici e dei biologi attuali. Inoltre, la familiarità con i principi biochimici è diventata una componente sempre più preziosa nella formazione medica. Nel redigere questo testo, ci siamo chiesti: “Possiamo fornire agli studenti delle solide basi di biochimica, unite alla capacità di problem-solving per mettere in pratica ciò che hanno appreso?”. Abbiamo concluso che è più importante che mai andare incontro alle esigenze di un programma di studi di biochimica, connettere questa materia alle sue basi chimiche e analizzare i modi in cui la biochimica può dare conto della salute e delle malattie umane. Volevamo anche fornire agli studenti l’opportunità di sviluppare le capacità pratiche di cui avranno bisogno per affrontare le sfide scientifiche e cliniche del futuro. Questo volume, Principi di biochimica – estratto da Fondamenti di biochimica, quarta edizione condotta sulla quinta edizione americana – si focalizza sui principi di base sfruttando anche le nuove tecniche per favorire la comprensione. Poiché siamo convinti che gli studenti apprendano ponendosi continuamente delle domande, sono presenti delle serie di problemi al termine di ogni capitolo, domande all’interno del testo e risorse online per un’ulteriore valutazione. Ci siamo impegnati per fornire agli studenti un libro di testo che fosse completo, scritto in modo chiaro e pertinente.



mazioni nel contesto di ciò che hanno già incontrato in altri corsi di studio. CONCETTI DI BASE Lo stato stazionario Sebbene molte reazioni siano vicine all’equilibrio, un’intera via metabolica – e il metabolismo cellulare nel suo complesso – non raggiunge mai l’equilibrio. Questo perché i materiali e l’energia entrano ed escono continuamente dal sistema, che si trova in uno stato stazionario. Le vie metaboliche procedono, come se cercassero di raggiungere l’equilibrio (principio di Le Châtelier), ma non riescono mai a raggiungerlo, perché continuano ad arrivare nuovi reagenti, mentre i prodotti non si accumulano.

Impostazione grafica

La possibilità degli studenti di capire e interpretare al meglio i grafici biochimici, le illustrazioni e i processi svolge un ruolo molto importante nella loro comprensione sia dell’insieme sia dei dettagli della biochimica. Le figure sono intese ad aiutare gli studenti a utilizzare le immagini di concerto con il testo.

• Quesiti nelle figure. Per sottolineare ulteriormente l’importanza di interpretare varie immagini e diversi dati, abbiamo incluso delle domande alla fine delle didascalie delle figure per incoraggiare gli studenti ad affrontare con impegno il materiale e verificare la loro comprensione del processo appena illustrato.

La didattica

Abbiamo dato un’importanza significativa all’aspetto didattico, cercando di perfezionare e armonizzare sempre meglio il testo, per favorire l’apprendimento. In questa direzione abbiamo introdotto i seguenti elementi. • I concetti chiave all’inizio di ogni paragrafo per favorire l’identificazione dei concetti più importanti, fornendo così la traccia necessaria a una migliore individuazione degli argomenti. • Concetti di base Brevi affermazioni poste ai margini per riassumere alcuni dei concetti generali che sono alla base della biochimica moderna, come l’evoluzione, la relazione struttura/funzione delle macromolecole, la trasformazione materia/energia e l’omeostasi. Questi richiami aiutano gli studenti a sviluppare una conoscenza più ricca quando integrano nuove infor-

1,0 0,8 pH 7,2 YO

0,6

pH 7,4

2

pH 7,6 0,4 0,2 0

0

20

40

60 80 pO2 (torr)

100

120

140

Figura 7.11 L’effetto Bohr. L’affinità per l’O2 dell’emoglobina aumenta con l’aumentare del pH. La linea tratteggiata indica la pO2 nel muscolo in attiva respirazione. [Benesch, R.E. e Benesch, R. (1974). Adv. Protein Chem. 28, 212.]

L’effetto del pH sul legame con l’ossigeno è maggiore alle alte o alle basse concentrazioni di ossigeno?

IV

PREFAZIONE © 978-88-08-42096-1

• Immagini molecolari. Le immagini molecolari sono molto dettagliate, più chiare e più facili da interpretare; in molti casi sono il risultato dei più recenti affinamenti della tecnologia di visualizzazione delle molecole che hanno portato a modelli macromolecolari aventi una risoluzione maggiore o che hanno rivelato nuove caratteristiche dei meccanismi.

SCHEMA DI PROCESSO

Primo anticorpo

Immobilizzazione 1 del primo anticorpo su un supporto solido.

Supporto solido Proteina

Incubazione con un 2 campione contenente la proteina.

Siti di legame dell’insulina

Secondo anticorpo

Figura 13.4 Struttura ai raggi X dell’ectodominio del recettore

Enzima

dell’insulina. È rappresentato uno dei suoi protomeri αβ in modello a nastro con i suoi sei domini colorati secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno, con il dominio N-terminale in blu e il C-terminale in rosso. L’altro protomero è rappresentato con un‘immagine della sua superficie colorata nello stesso modo. La subunità β è composta da gran parte del dominio arancione e da tutto il dominio rosso. La proteina è rappresentata con la membrana plasmatica sotto e il suo doppio asse verticale. Nel recettore integro, una singola elica transmembrana connette ciascuna unità β al suo dominio PTK citoplasmatico C-terminale. [Basato sulla struttura ai raggi X di Michael Weiss, Case Western Reserve University, e Michael Lawrence, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Victoria, Australia, PDBid 3LOH].

Aggiunta di un secondo anticorpo legato 3 covalentemente a un enzima che si può dosare.

Lavaggio e dosaggio dell’attività dell’enzima. La quantità di substrato 4 convertito in prodotto indica la quantità di proteina presente. Prodotto rilevabile

• I punti di verifica, una cospicua dotazione di domande che compaiono alla fine di ciascun paragrafo, utili agli studenti per verificare la loro padronanza dei concetti più importanti del paragrafo che hanno appena studiato. Le risposte non sono state fornite per incoraggiare gli studenti a risfogliare il testo del capitolo, per consolidare l’apprendimento, un procedimento che rinforza la familiarità dello studente con la materia. • Frasi chiave scritte in corsivo per facilitare e rendere più veloce la loro identificazione visiva. • Figure che riassumono la visione d’insieme di molti processi metabolici. • Figure poste all’interno del testo che illustrano in modo dettagliato i meccanismi enzimatici. • Schemi di processo. Queste illustrazioni graficamente differenziate e subito individuabili mettono in risalto i processi biochimici importanti e integrano il testo descrittivo all’interno della figura, sfruttando un metodo di apprendimento più legato alle immagini. Seguendo il processo che viene illustrato

Substrato

Figura 5.3 Dosaggio con immunoassorbimento legato a

enzimi. (1) Su un solido inerte, come per esempio il polistirene, viene immobilizzato un anticorpo contro la proteina di interesse. (2) Sulla superficie rivestita di anticorpo è applicata la soluzione da dosare; l’anticorpo lega la proteina di interesse, mentre le altre molecole proteiche sono rimosse. (3) Il complesso proteinaanticorpo viene fatto reagire con un secondo anticorpo proteinaspecifico a cui è unito un enzima. (4) Il legame del secondo complesso anticorpo-enzima è misurato mediante il dosaggio dell’attività dell’enzima. La quantità di substrato convertito in prodotto indica la quantità di proteina presente. Come potreste dosare la proteina di interesse se il secondo anticorpo avesse legato a sé un gruppo fluorescente o un radioisotopo invece che un enzima?

PREFAZIONE © 978-88-08-42096-1

passo per passo, è molto più facile che gli studenti acquistino padronanza dei principi chiave invece di memorizzare semplicemente i dettagli senza seguire un criterio. • Codici di identificazione PDB, inseriti nelle didascalie delle figure, sono forniti per ogni struttura molecolare in modo che gli studenti possano scaricare dalla rete ed esplorare le strutture per conto loro. • Rassegna dei principi chimici che stanno alla base dei fenomeni biochimici, tra cui la termodinamica e gli equilibri, le cinetiche chimiche e le reazioni di ossidoriduzione. • Esempi di calcolo che presentano le modalità con cui gli studenti possono applicare le equazioni ai dati reali.







Ð ESEMPIO DI CALCOLO 10.1

Mostrate che ∆G < 0 quando gli ioni Ca2+ si spostano dal reticolo endoplasmatico (dove [Ca2+] = 1 mM) al citosol (in cui [Ca2+] = 0,1 μM). Ipotizzate che ∆Ψ sia 0. Il citosol rappresenta l’interno, mentre il reticolo endoplasmatico è l’esterno.

DG

RT ln

[Ca2 ]interno

[Ca2 ]esterno 10 7 RT ln 10 3 RT ( 9,2)

Quindi, ∆G è negativo.

• Schede per evidenziare gli argomenti principali, che introducono gli studenti in ambiti che vanno al di là della biochimica di base, per esempio trattazioni sull’acidificazione degli oceani (Scheda 2.1), sulla produzione di molecole complesse attraverso la sintesi di polichetidi (Scheda 20.3) e sul microbioma intestinale (Scheda 22.1). – La biochimica nella salute e nella malattia, schede che mettono in evidenza l’importanza della biochimica nella pratica clinica, focalizzandosi sui meccanismi molecolari delle malattie e sui loro trattamenti farmacologici. – Le prospettive della biochimica forniscono materiali di approfondimento che altrimenti avrebbero interrotto il filo del discorso seguito dal testo. Questi materiali si trovano in schede separate dal testo, in modo che gli studenti possano conoscere alcuni metodi sperimentali e applicazioni pratiche tipici della biochimica. – Le scoperte della biochimica offrono dei profili sulle esperienze di scienziati che hanno avuto un ruolo pionieristico in diversi campi, dando agli studenti un’idea delle personalità e delle sfi-

• •

V

de scientifiche che hanno edificato la biochimica moderna. Il simbolo caduceo evidenzia le discussioni presenti nel testo su argomenti pertinenti all’ambito medico, sanitario o farmacologico. Fra gli argomenti trattati vi sono le patologie più comuni quali il diabete e le malattie neurodegenerative, così come anche argomenti di patologia meno noti che rivelano aspetti caratteristici e molto interessanti della biochimica. Focus sull’evoluzione Un’icona che rappresenta un albero evolutivo indica i passaggi nel testo che chiariscono alcuni esempi evolutivi a livello biochimico. Riassunti dei capitoli organizzati secondo i titoli dei paragrafi principali, finalizzati ancora una volta a guidare gli studenti nella focalizzazione dei punti più importanti presenti all’interno di ciascun paragrafo. Termini chiave evidenziati in grassetto. Serie di problemi I problemi di fine capitolo sono di due tipi in modo che gli studenti e i docenti possano valutare meglio il maggiore o minore impegno. I Problemi consentono agli studenti di verificare la loro comprensione dei concetti e di applicarli in modo diretto alla soluzione del problema. Le Domande difficili richiedono competenze più avanzate e la capacità di collegare tra loro argomenti diversi. La maggior parte dei problemi è disposta in coppie che si rifanno agli stessi argomenti o ad argomenti tra loro molto simili. Le soluzioni complete ai problemi dispari sono disponibili online (online.universita.zanichelli. it/voet-principi).

Allo scopo di facilitare il processo di apprendimento degli studenti sono presentati anche:

• Esercizi di bioinformatica, progetti aggiornati, redatti da Paul Craig del Rochester Institute of Technology. Questi progetti introducono  al contenuto e all’uso di database relativi agli acidi nucleici, alle sequenze proteiche, alla struttura delle proteine, all’inibizione enzimatica e a diversi altri argomenti. Gli esercizi si riferiscono a dati reali, pongono domande specifiche e inducono gli studenti a ricavare informazioni dalle banche dati online e ad accedere agli strumenti informatici per analizzare queste informazioni. • Casi di studio (ideati da Kathleen Cornely, Providence College) per favorire la comprensione di concetti biochimici utilizzando un tipo di apprendimento basato su problematiche concrete. Ogni caso riporta infatti dati presenti in letteratura e pone domande per rispondere alle quali occorre da parte degli studenti l’applicazione dei principi appresi a situazioni completamente nuove, facendo anche ricorso ad argomenti trattati in capitoli differenti del volume. Infine, viene introdotto un Approfondimento, una tipologia di domande che amplia argomenti presentati e trat-

VI

PREFAZIONE © 978-88-08-42096-1

tati nel testo oppure che invita gli studenti a informarsi e a scoprire temi non trattati, arricchendo così il proprio bagaglio culturale.

• Bibliografie, alla fine di ogni capitolo, i cui riferimenti sono stati selezionati per la loro pertinenza e facilità di consultazione. • Glossario disponibile on line contenente oltre 1200 termini e relative definizioni (online.universita.zanichelli.it/voet-principi).



L’organizzazione

Il testo comincia con due capitoli introduttivi che trattano l’origine della vita, l’evoluzione, la termodinamica, le proprietà dell’acqua e la chimica degli acidi e delle basi. Nel Capitolo 3 vengono discussi i nucleotidi e gli acidi nucleici. Tale collocazione è dovuta al fatto che la comprensione delle strutture e delle funzioni di queste molecole facilita lo studio seguente dell’evoluzione delle proteine e del metabolismo. Sono quattro (dal 4 al 7) i capitoli che analizzano la chimica degli amminoacidi, i metodi per analizzare e sequenziare le proteine, la struttura delle proteine dalla secondaria fino alla quaternaria, il ripiegamento delle proteine, e le correlazioni tra struttura e funzione nell’emoglobina, nelle proteine muscolari e negli anticorpi. Il Capitolo 8 (I carboidrati), il Capitolo 9 (I lipidi e le membrane biologiche) e il Capitolo 10 (Il trasporto di membrana) completano la trattazione delle molecole fondamentali della vita. I tre capitoli seguenti prendono in esame le proteine in azione, prima introducendo gli studenti ai meccanismi enzimatici (Capitolo 11), per poi portarli alle discussioni sulle cinetiche enzimatiche, sugli effetti degli inibitori e sulla regolazione enzimatica (Capitolo 12). Questi temi vengono poi ripresi nel Capitolo 13 che descrive le componenti delle vie di trasduzione del segnale. Il metabolismo costituisce l’argomento principale dei nove capitoli successivi, iniziando con uno di introduzione (Capitolo 14) che offre un quadro d’insieme delle vie metaboliche, della termodinamica dei composti “ad alta energia” e della chimica redox. Le vie metaboliche fondamentali sono presentate in dettaglio (per esempio, la glicolisi, il metabolismo del glicogeno e il ciclo dell’acido citrico nei Capitoli 15, 16 e 17), in modo che gli studenti possano comprendere il modo in cui i singoli enzimi catalizzano le reazioni e lavora-

no di concerto per portare a termine funzioni biochimiche complesse. I successivi Capitoli 18 (Il trasporto di elettroni e la fosforilazione ossidativa) e 19 (La fotosintesi) completano una sequenza che pone l’accento sulle vie di produzione dell’energia. Non tutte le vie sono trattate in maniera approfondita, in particolare quelle connesse con i lipidi (Capitolo 20) e gli amminoacidi (Capitolo 21). Sono invece messe in evidenza le reazioni enzimatiche considerate chiave per i loro processi chimici o per la loro rilevanza nei meccanismi di regolazione. Questa parte del libro include altresì un capitolo sull’integrazione del metabolismo (Capitolo 22), con l’intento di chiarire la specializzazione degli organi e la regolazione metabolica che i mammiferi hanno raggiunto.



Risorse multimediali

Sul sito web online.universita.zanichelli.it/voet-principi sono disponibili numerose risorse multimediali per lo studente. Alcune risorse sono strettamente collegate alle figure o agli esercizi contenuti nel libro e sono in lingua inglese. • Casi di studio: descrivono dati presenti in letteratura e richiedono agli studenti di analizzarli applicando quanto studiato. • Esercizi di bioinformatica: invitano gli studenti a usare la grande varietà di informazioni e di software presenti in rete, evidenziando la connessione tra i concetti teorici e la biochimica applicata.

Le seguenti risorse sono invece state create appositamente per l’edizione italiana del testo. Alcune di queste sono protette e per accedervi è necessario registrarsi su my.zanichelli.it inserendo la chiave di attivazione stampata sul bollino SIAE nella prima pagina del libro.

• Test interattivi: in modalità allenamento, senza limiti di tempo e con la possibilità di rispondere nuovamente, e in modalità test, con limite di tempo, valutazione e pagella. • Tecniche biochimiche: brevi animazioni che illustrano le più importanti tecniche analitiche utilizzate in biochimica. • Videolezioni: filmati che spiegano come risolvere esercizi chiave, con brevi cenni ai relativi spunti teorici. • Animazioni 3D: illustrano alcuni importanti processi biochimici.

R I N G R A Z I A M E N T I Questo testo è il risultato della fatica di molte persone, parecchie delle quali meritano un ringraziamento speciale: prima di tutti la nostra editor, Joan Kalkut, che ci ha sempre perfettamente organizzato permettendoci di rispettare i tempi. Madelyn Lesure è responsabile della grafica e Tom Nery della copertina. Billy Ray è il responsabile della ricerca iconografica mentre Deborah Wenger, caporedattrice, ha dato una forma definitiva al manoscritto eliminando errori grammaticali e tipografici. Elizabeth Swain, la direttrice tecnica, ha seguito con grande capacità la produzione del volume. Kristine Ruff è il supervisore al marketing. Un ringraziamento speciale ad Aly Rentrop, AssociaAlabama Nagarajan Vasumathi, Jacksonville State University Arizona Cindy Browder, Northern Arizona University Wilson Francisco, Arizona State University Matthew Gage, Northern Arizona University Tony Hascall, Northern Arizona University Andrew Koppisch, Northern Arizona University Scott Lefler, Arizona State University Kevin Redding, Arizona State University Arkansas Kenneth Carter, University of Central Arkansas Sean Curtis, University of Arkansas-Fort Smith California Thomas Bertolini, University of Southern California Jay Brewster, Pepperdine University Rebecca Broyer, University of Southern California Paul Buonora, California State University Long Beach William Chan, Thomas J. Long School of Pharmacy Daniel Edwards, California State University Chico Steven Farmer, Sonoma State University Andreas Franz, University of the Pacific Blake Gillespie, California State University Channel Islands Christina Goode, California State University Tom Huxford, San Diego State University Pavan Kadandale, University of California Irvine Douglas McAbee, California State University Long Beach Stephanie Mel, University of California San Diego

te Development-Editor e ad Amanda Rillo, Editorial Program Assistant. Le coordinate atomiche di molte proteine e acidi nucleici di cui compaiono le illustrazioni in questo volume sono state ricavate dal Protein Data Bank (PDB) del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Le figure sono state disegnate utilizzando i seguenti programmi di grafica molecolare: PyMOL di Warren DeLano; RIBBONS di Mike Carson; GRASP di Anthony Nicholls, Kim Sharp e Barry Honig. Vorremmo ringraziare tutti i colleghi che hanno dedicato il loro tempo fornendo importanti commenti e osservazioni sulla quinta edizione. Fra i revisori ringraziamo:

Jianhua Ren, University of the Pacific Harold (Hal) Rogers, California State University Fullerton Lisa Shamansky, California State University San Bernardino Monika Sommerhalter, California State University East Bay John Spence, California State University Sacramento Daniel Wellman, Chapman University Liang Xue, University of the Pacific Colorado Johannes Rudolph, University of Colorado Les Sommerville, Fort Lewis College Connecticut Andrew Karatjas, Southern Connecticut State University JiongDong Pang, Southern Connecticut State University Florida Deguo Du, Florida Atlantic University Dmitry Kolpashchikov, University of Central Florida Harry Price, Stetson University Reza Razeghifard, Nova Southeastern University Evonne Rezler, Florida Atlantic University Vishwa Trivedi, Bethune Cookman University Solomon Weldegirma, University of South Florida Georgia Caroline Clower, Clayton State University David Goode, Mercer University Chalet Tan, Mercer University Christine Whitlock, Georgia Southern University Daniel Zuidema, Covenant College Hawaii Jon-Paul Bingham, University of Hawaii Idaho Todd Davis, Idaho State University Owen McDougal, Boise State University Rajesh Nagarajan, Boise State University

Joshua Pak, Idaho State University Illinois Marjorie Jones, Illinois State University Valerie Keller, University of Chicago Richard Nagorski, Illinois State University Gabriela Perez-Alvarado, Southern Illinois University Indiana Ann Kirchmaier, Purdue University Andrew Kusmierczyk, Indiana UniversityPurdue University Indianapolis Paul Morgan, Butler University Mohammad Qasim, Indiana UniversityPurdue University Fort Wayne Iowa Ned Bowden, University of Iowa Olga Rinco, Luther College Kentucky Mark Blankenbuehler, Morehead State University Diana McGill, Northern Kentucky University Stefan Paula, Northern Kentucky University Louisiana Marilyn Cox, Louisiana Tech University August Gallo, University of Louisiana at Lafayette Sean Hickey, University of New Orleans Neil McIntyre, Xavier University of Louisiana Kevin Smith, Louisiana State University Wu Xu, University of Louisiana at Lafayette Maryland Peggy Biser, Frostburg State University Edward Senkbeil, Salisbury University James Watson, University of Maryland Massachusetts Philip Le Quesne, Northeastern University Joseph Kuo-Hsiang Tang, Clark University Samuel Thomas, Tufts University Dean Tolan, Boston University

VIII

PREFAZIONE

Michigan Rupali Datta, Michigan Technological University Charles Hoogstraten, Michigan State University Lesley Putman, Northern Michigan University Scott Ratz, Alpena Community College Ronald Stamper, University of Michigan Minnesota Bynthia Anose, Bethel University Eric Fort, University of St. Thomas St. Paul David Mitchell, College of Saint BenedictSaint John’s University Ken Traxler, Bemidji State University Mississippi Robert Bateman, William Carey University Douglas Masterson, University of Southern Mississippi Gerald Rowland, Mississippi State University Missouri Ruth Birch, St. Louis University Michael Lewis, Saint Louis University Anthony Toste, Missouri State University Mary Vedamuthu, Missouri Baptist University Brent Znosko, Saint Louis University Nebraska Jodi Kreiling, University of Nebraska at Omaha Madhavan Soundararajan, University of Nebraska New Jersey Gerald Frenkel, Rutgers University Bruce Hietbrink, Richard Stockton College David Hunt, The College of New Jersey Subash Jonnalagadda, Rowan University Robert D. Rossi, Gloucester County College New Mexico Donald Bellew, University of New Mexico New York Scott Bello, Rensselaer Polytechnic Institute Mrinal Bhattacharjee, Long Island University Costel Darie, Clarkson University Brahmadeo Dewprashad, Borough of Manhattan Community College Barnabas Gikonyo, State University of New York at Geneseo Glen Hinckley, Farmingdale State College Swapan Jain, Bard College Joe LeFevre, State University of New YorkOswego Pan Li, State University of New York at Albany Ruel McKnight, State University of New York at Geneseo Galina Melman, Clarkson University Daniel Moriarty, Siena College Suzanne O’Handley, Rochester Institute of Technology Wendy Pogozelski, State University of New York at Geneseo Gloria Proni, City College of New YorkHunter College

RINGRAZIAMENTI © 978-88-08-42096-1

Wilma Saffran, City University of New York-Queens College David Vuletich, The College at Brockport, SUNY North Carolina Erik Alexanian, University of North Carolina-Chapel Hill Brad Chazotte, Campbell University College of Pharmacy & Health Sciences Jahangir Emrani, North Carolina Agricultural & Technical State University Harold Goldston, High Point University Brian Love, East Carolina University Jim Parise, Duke University Cornelia Tirla, University of North Carolina-Pembroke Wei You, University of North CarolinaChapel Hill North Dakota Bryan Schmidt, Minot State University Karla Wohlers, North Dakota State University Ohio Neil Ayres, University of Cincinnati E. J. Behrman, Ohio State University Venkat Gopalan, Ohio State University Benjamin Gung, Miami University Allan Pinhas, University of Cincinnati Lawrence Prochaska, Wright State University Joel Shulman, University of Cincinnati Oklahoma Joseph Ahlander, Northeastern State University Donna Nelson, University of OklahomaNorman Campus Oregon Patricia Flatt, Western Oregon University Angela Hoffman, University of Portland Pennsylvania Felicia Corsaro-Barbieri, Gwynedd Mercy College Lydia Daniels, University of Pittsburgh Tom Hagan, Elizabethtown College Joseph Kremer, Alvernia University Tami Mysliwiec, Penn State Berks Matthew Price, California University of Pennsylvania Joel Ressner, West Chester University of Pennsylvania Julian Snow, University of the Sciences Robert Stanley, Temple University Sandra Turchi, Millersville University Frank Wilkinson, Philadelphia University Rhode Island Kathleen Cornely, Providence College South Carolina Verne Biddle, Bob Jones University Carl Heltzel, Clemson University South Dakota Grigoriy Sereda, University of South Dakota Tennessee William Boadi, Tennessee State University Ramez Elgammal, University of Tennessee Knoxville

Scott Handy, Middle Tennessee State University Beng Ooi, Middle Tennessee State University Alisha Russell, Trevecca Nazarene University Aleksey Vasiliev, East Tennessee State University Texas Jeff Allison, Austin Community College Hays Campus Shawn Amorde, Austin Community College Rachell Booth, Texas State University-San Marcos Billy Britt, Texas Woman’s University Jennifer Irvin, Texas State University-San Marcos Douglas Root, University of North Texas Robert W. Shaw, Texas Tech University Utah Steven Wood, Brigham Young University Vermont Roger Sandwick, Middlebury College Virginia Kimberly Lane, Radford University Washington Kyle Craig, Walla Walla University West Virginia Derrick Kolling, Marshall University Robert Warburton, Shepherd University Wisconsin Richard Amasino, University of Wisconsin Elizabeth Glogowski, University of Wisconsin Eau Claire Nicholas Silvaggi, University of WisconsinMilwaukee Tehshik Yoon, University of WisconsinMadison

• Referenti internazionali Canada British Columbia Jeremy Wulff, University of Victoria Ontario France-Isabelle Auzanneau, University of Guelph Eric Gauthier, Laurentian University Masoud Jelokhani-Niaraki, Wilfrid Laurier University Paesi Bassi Peter-Leon Hagedoorn, Delft University of Technology Filippine Evangeline Amor, University of the Philippines Diliman Singapore Y. Adam Yuan, National University of Sciences Taiwan Shun-Fen Tzeng, National Cheng Kung University Thailandia Sunanta Ratanapo, Kasetsart University

I N D I C E

CAPITOLO 1

SCHEDA 2.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Introduzione alla chimica della vita C

1

L’origine della vita

2

A

Le molecole biologiche si sono formate da sostanze inanimate

2

I sistemi complessi autoreplicanti si sono evoluti da molecole semplici

B

Le conseguenze dell’acidificazione degli oceani

36

I tamponi resistono alle variazioni di pH

38

SCHEDA 2.2 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Il sistema tampone del sangue

41

RIASSUNTO

42

3

PROBLEMI

42

BIBLIOGRAFIA

44

2

L’architettura della cellula

5

A

Le cellule svolgono reazioni metaboliche

6

B

Esistono due tipi di cellule: quelle procariotiche e quelle eucariotiche

7

I dati molecolari rivelano l’esistenza di tre domini evolutivi di organismi

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

9

1

I nucleotidi

2

Introduzione alla struttura degli acidi nucleici

49

A

Gli acidi nucleici sono polimeri di nucleotidi

49

C

CAPITOLO 3

SCHEDA 1.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Lynn Margulis e la teoria dell’endosimbiosi

10

Gli organismi continuano a evolversi

11

3

La termodinamica

11

A

La prima legge della termodinamica afferma che l’energia viene conservata

D

12

SCHEDA 1.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Le convenzioni usate in biochimica

La seconda legge della termodinamica afferma che l’entropia tende ad aumentare

C

La variazione di energia libera determina la spontaneità di un processo

D

Le variazioni di energia libera possono essere calcolate in base ai valori delle concentrazioni all’equilibrio

16

La vita raggiunge l’omeostasi obbedendo alle leggi della termodinamica

19

RIASSUNTO

21

PROBLEMI

21

E

BIBLIOGRAFIA

Il DNA forma una doppia elica

50

C

L’RNA è un acido nucleico a singolo filamento

53

3

Uno sguardo alla funzione degli acidi nucleici

54

A

Le informazioni genetiche sono contenute nel DNA

54

B

La sintesi proteica è diretta dai geni

55

4

Il sequenziamento degli acidi nucleici

57

A

Le endonucleasi di restrizione tagliano il DNA a livello di sequenze specifiche

58

B

L’elettroforesi separa gli acidi nucleici in base alla loro dimensione

59

C

Il metodo tradizionale di sequenziamento del DNA utilizza la tecnica di terminazione della catena

60

D

Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione sono a elevato parallelismo

63

E

Sono stati sequenziati interi genomi

64

13 14

22

CAPITOLO 2

SCHEDA 3.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

L’acqua 1

Le proprietà fisiche dell’acqua

24

A

L’acqua è una molecola polare

24

B

Le sostanze idrofiliche si sciolgono in acqua

27

C

L’effetto idrofobico causa l’aggregazione delle sostanze non polari in acqua

28

L’acqua si muove per osmosi, mentre i soluti si muovono per diffusione

31

2

Le proprietà chimiche dell’acqua

33

A

L’acqua si ionizza formando ioni H+ e OH–

34

B

Gli acidi e le basi alterano il pH

35

D

B

13

B

46

Francis Collins e il gene della fibrosi cistica

65

F

L’evoluzione è il risultato delle mutazioni nelle sequenze

67

5

La manipolazione del DNA

70

A

Il DNA clonato è una sua copia amplificata

70

B

Le librerie di DNA sono raccolte di DNA clonati

74

C

Il DNA è amplificato per mezzo della reazione a catena della polimerasi

76

SCHEDA 3.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

L’“impronta digitale” (fingerprinting) del DNA D

77

La tecnologia del DNA ricombinante ha moltissime applicazioni pratiche 77

X

INDICE © 978-88-08-42096-1

SCHEDA 3.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA Gli aspetti

80

RIASSUNTO

81

PROBLEMI

82

BIBLIOGRAFIA

84

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi 1

La struttura degli amminoacidi

La spettrometria di massa determina la massa molecolare dei peptidi

122

Le ricostruzioni delle sequenze proteiche sono conservate nelle banche dati

125

4

L’evoluzione delle proteine

126

A

Le sequenze delle proteine rivelano l’esistenza di relazioni evolutive

127

B

Le proteine si evolvono per duplicazione dei geni o di segmenti genici

130

RIASSUNTO

133

PROBLEMI

134

BIBLIOGRAFIA

137

D

etici legati alla tecnologia del DNA ricombinante

E

85

SCHEDA 4.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA William C.

Rose e la scoperta della treonina

86

A

Gli amminoacidi possono essere ioni dipolari

89

B

I legami peptidici uniscono gli amminoacidi nelle proteine

89

C

Le catene laterali degli amminoacidi possono essere non polari, polari o cariche

89

D

I valori di pK dei gruppi ionizzabili dipendono dall’ambiente circostante

91

E

I nomi degli amminoacidi sono abbreviati

92

2

La stereochimica

93

SCHEDA 4.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

CAPITOLO 6

Le proteine: struttura tridimensionale 1

La struttura secondaria

139

A

Il gruppo peptidico planare limita le conformazioni di un polipeptide

139

SCHEDA 6.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Linus Pauling B

e la biochimica strutturale

142

Le strutture secondarie più comuni sono l’α-elica e il foglietto β

143

Le proteine fibrose hanno strutture secondarie ripetitive

147

Il sistema RS

95

3

I derivati degli amminoacidi

97

A

Nelle proteine, le catene laterali possono essere modificate

97

SCHEDA 6.2 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Le malattie associate al collageno

Alcuni amminoacidi sono biologicamente attivi

97

D

La maggior parte delle proteine contiene strutture non ripetitive

152

98

2

La struttura terziaria

153

RIASSUNTO

100

A

PROBLEMI

100

BIBLIOGRAFIA

101

Le strutture delle proteine vengono determinate tramite la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare (NMR) e la microscopia crioelettronica

153

La localizzazione delle catene laterali varia in base alla polarità

159

B

C

SCHEDA 4.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

La proteina con fluorescenza verde

B

CAPITOLO 5

Le proteine: struttura primaria

150

C

Le strutture terziarie contengono combinazioni di strutture secondarie

160 164

1

La diversità dei polipeptidi

102

D

La struttura è più conservata della sequenza

2

Purificazione e analisi delle proteine

104

E

A

La purificazione di una proteina richiede una strategia da seguire

105

La bioinformatica strutturale fornisce gli strumenti per immagazzinare, visualizzare e confrontare le informazioni sulla struttura di una proteina 165

B

La tecnica del salting out separa le proteine sfruttando la loro solubilità

3

Struttura quaternaria e simmetria

168

108

4

La stabilità delle proteine

169

La cromatografia si basa su interazioni con una fase mobile e una stazionaria

109

A

Le proteine sono stabilizzate da diverse forze

170

L’elettroforesi separa le molecole in base alla carica e alla dimensione

B

112

Le proteine possono andare incontro a denaturazione e rinaturazione

172

L’ultracentrifugazione separa le molecole in base alla massa

115

Il sequenziamento delle proteine

116

C D E

3

SCHEDA 5.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Frederick

Sanger e il sequenziamento delle proteine

117

La prima tappa consiste nel separare le subunità

119

B

Le catene polipeptidiche vengono scisse

120

C

La degradazione di Edman rimuove il primo residuo amminoacidico di un peptide

121

A

SCHEDA 6.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Le proteine termostabili

172

C

Le proteine sono strutture dinamiche

174

5

Il ripiegamento delle proteine

175

A

Le proteine seguono percorsi specifici per il ripiegamento

176

SCHEDA 6.4 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA Previsione

della struttura delle proteine e progettazione di proteine B

178

Gli chaperoni molecolari facilitano il ripiegamento delle proteine 178

INDICE © 978-88-08-42096-1

C

B

I polisaccaridi

243

A

Il lattosio e il saccarosio sono disaccaridi

243

184

RIASSUNTO

188

PROBLEMI

189

SCHEDA 8.1 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA L’intolleranza al lattosio

BIBLIOGRAFIA

191

B

Il legame dell’ossigeno alla mioglobina e all’emoglobina

193

La mioglobina è una proteina monomerica in grado di legare l’ossigeno

193

L’emoglobina è un tetramero che assume due conformazioni

197 197

SCHEDA 7.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Max Perutz C D

e la struttura e la funzione dell’emoglobina

198

L’ossigeno si lega cooperativamente all’emoglobina

200

Le due conformazioni dell’emoglobina mostrano affinità differenti per l’ossigeno

I dolcificanti artificiali

244

L’amido e il glicogeno sono polisaccaridi di immagazzinamento

246

D

I glicosamminoglicani formano gel molto idratati

248

3

Le glicoproteine

251

A

I proteoglicani contengono glicosamminoglicani

251

B

Le pareti cellulari dei batteri sono costituite da peptidoglicani

252

SCHEDA 8.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Gli antibiotici specifici per

i peptidoglicani

254

C

Molte proteine eucariotiche sono glicosilate

254

D

Gli oligosaccaridi possono determinare la struttura, la funzione e il riconoscimento delle proteine

256

RIASSUNTO

258

PROBLEMI

259

BIBLIOGRAFIA

260

202

SCHEDA 7.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA L’adattamento alle elevate altitudini

207

Le mutazioni possono alterare la struttura e la funzione dell’emoglobina

210

2

La contrazione muscolare

213

A

Il muscolo striato è costituito da filamenti spessi e sottili interdigitati tra loro

E

CAPITOLO 9

I lipidi e le membrane biologiche 1

La classificazione dei lipidi

261

213

A

Le proprietà degli acidi grassi dipendono dalle loro catene idrocarburiche

262

215

B

I triacilgliceroli contengono tre acidi grassi esterificati

264

C

I glicerofosfolipidi sono molecole anfifiliche

265

SCHEDA 9.1 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Il tensioattivo polmonare (surfattante)

267

SCHEDA 7.4 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Hugh Huxley

e il modello a scorrimento dei filamenti

244

C

SCHEDA 7.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA Altre

proteine di trasporto dell’ossigeno

La cellulosa e la chitina sono polisaccaridi strutturali

244

SCHEDA 8.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

La funzione delle proteine: la mioglobina e l’emoglobina, la contrazione muscolare e gli anticorpi

A

2

Diverse malattie sono causate da un errato ripiegamento delle proteine

CAPITOLO 7

1

XI

La contrazione del muscolo avviene quando le teste della miosina si spostano lungo i filamenti sottili

221

Nelle cellule non muscolari l’actina forma i microfilamenti

223

D

Gli sfingolipidi sono derivati di amminoalcoli

268

3

Gli anticorpi

225

E

Gli steroidi sono molecole a quattro anelli fusi

270

A

Gli anticorpi hanno regioni costanti e variabili

226

F

Altri lipidi svolgono molti ruoli metabolici

273

B

Gli anticorpi riconoscono una vasta gamma di antigeni

2

I doppi strati lipidici

276

A

La formazione di un doppio strato è guidata dall’effetto idrofobico

276

I doppi strati lipidici hanno proprietà simili a quelle dei fluidi

277

B

C

228

SCHEDA 7.5 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Gli anticorpi monoclonali

229

RIASSUNTO

232

PROBLEMI

233

3

Le proteine di membrana

279

BIBLIOGRAFIA

235

A

Le proteine integrali di membrana interagiscono con le porzioni idrofobiche dei lipidi

279

B

SCHEDA 9.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Richard

CAPITOLO 8

I carboidrati B

1

I monosaccaridi

236

A

I monosaccaridi sono aldosi o chetosi

236

B

I monosaccaridi possono avere configurazioni e conformazioni diverse

C

Gli zuccheri possono essere modificati e legati covalentemente

238 240

C

Henderson e la struttura della batteriorodopsina

282

Le proteine legate ai lipidi sono ancorate al doppio strato

285

Le proteine periferiche sono debolmente associate alla membrana

286

4

Struttura e organizzazione delle membrane 287

A

Il modello a mosaico fluido spiega la diffusione laterale

287

INDICE

XII

© 978-88-08-42096-1

Lo scheletro di membrana aiuta a definire la forma della cellula

288

I lipidi di membrana sono distribuiti in modo asimmetrico

292

La via di secrezione genera le proteine secrete e quelle transmembrana

295

E

Vescicole intracellulari trasportano le proteine

299

F

Le proteine mediano la fusione delle vescicole

304

B C D

SCHEDA 9.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Le tossine tetanica e botulinica scindono

le SNARE in maniera specifica

305

RIASSUNTO

309

PROBLEMI

310

BIBLIOGRAFIA

312

CAPITOLO 10

Il trasporto di membrana

3

I meccanismi di catalisi

351

SCHEDA 11.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA A

Illustrazione dei meccanismi di reazione

352

La catalisi acido-base avviene per trasferimento protonico

352

SCHEDA 11.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Gli effetti del pH sull’attività enzimatica

354

B

La catalisi covalente richiede un nucleofilo

354

C

Gli ioni metallici agiscono da catalizzatori

357

D

La catalisi è favorita dalla vicinanza e dall’orientamento

358

Gli enzimi catalizzano le reazioni legando preferenzialmente lo stato di transizione

360

4

Il lisozima

361

A

Il sito catalitico del lisozima è stato definito tramite la costruzione di modelli

362

B

Nella reazione del lisozima si forma un intermedio covalente

365

E

La termodinamica del trasporto

313

5

Le serina proteasi

369

2

Il trasporto mediato passivo

315

A

A

Gli ionofori trasportano gli ioni attraverso la membrana

I residui amminoacidici del sito attivo sono stati identificati per marcatura chimica

369

315

B

Le porine contengono barili β

316

SCHEDA 11.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA I veleni che colpiscono il sistema nervoso 370

C

I canali ionici sono altamente selettivi

317

D

Le acquaporine mediano il movimento dell’acqua attraverso la membrana

324

Le proteine di trasporto possono assumere due conformazioni

326

1

E

Le strutture ai raggi X forniscono informazioni sulla catalisi, sulla specificità di substrato e sull’evoluzione

371

C

Le serina proteasi utilizzano differenti meccanismi di catalisi

374

D

Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi

379

B

SCHEDA 10.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Le giunzioni comunicanti

326

SCHEDA 10.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

SCHEDA 11.4 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA La cascata di coagulazione del sangue

380

Le differenze tra trasporto mediato e non mediato

329

3

382

Il trasporto attivo

RIASSUNTO

330

La (Na+-K+) ATPasi trasporta gli ioni in direzioni opposte

PROBLEMI

382

A

BIBLIOGRAFIA

384

SCHEDA 10.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA L’azione dei glicosidi cardiaci

Ca2+

ATPasi pompa ioni

Ca2+

fuori dal citosol

331 333

CAPITOLO 12

333

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

B

La

C

I trasportatori ABC sono i responsabili della resistenza ai farmaci

335

D

Il trasporto attivo può essere guidato dai gradienti ionici

337

RIASSUNTO

339

PROBLEMI

340

BIBLIOGRAFIA

342

1

La cinetica delle reazioni

385

A

Le equazioni della velocità descrivono la cinetica chimica

386

La cinetica enzimatica segue spesso l’equazione di Michaelis-Menten

388

B

SCHEDA 12.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

J.B.S. Haldane e l’azione degli enzimi CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica Le proprietà generali degli enzimi

344

A

Gli enzimi sono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano

345

Gli enzimi agiscono su substrati specifici

345

C

Alcuni enzimi necessitano di cofattori

2

L’energia di attivazione e la coordinata di reazione

Cinetica e teoria dello stato di transizione

393

Dai dati cinetici è possibile calcolare i valori di Vmax e di KM

393

Le reazioni a due substrati seguono una delle diverse equazioni di velocità

396

2

L’inibizione enzimatica

398

A

Nell’inibizione competitiva l’inibitore si lega al sito attivo dell’enzima

398

SCHEDA 12.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Gli inibitori enzimatici dell’HIV

401

C

1

B

390

SCHEDA 12.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

D

347 348

INDICE © 978-88-08-42096-1

B

Nell’inibizione incompetitiva l’inibitore si lega al complesso enzima-substrato

C

404

Nell’inibizione mista l’inibitore si lega sia all’enzima in forma libera sia al complesso enzima-substrato

406

3

Il controllo dell’attività enzimatica

407

A

Il controllo allosterico riguarda il legame a un sito diverso dal sito attivo

C

D

408

XIII

L’adenilato ciclasi sintetizza AMP ciclico per attivare la proteina chinasi A

456

Le fosfodiesterasi limitano l’attività del secondo messaggero

459

SCHEDA 13.4 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA I farmaci e le tossine che influenzano

le segnalazioni cellulari

460

4

La via del fosfoinositide

461

A

L’associazione del ligando al recettore determina 462 il rilascio dei secondi messaggeri IP3 e Ca2+

Il controllo per modificazione covalente avviene solitamente mediante fosforilazione delle proteine

412

B

4

La calmodulina è un modulatore attivato dal Ca2+

463

La progettazione di farmaci

416

C

A

La scoperta di nuovi farmaci utilizza una grande varietà di tecniche

Il DAG è un secondo messaggero liposolubile che attiva la proteina chinasi C

466

416

La biodisponibilità di un farmaco dipende dal suo assorbimento e trasporto nel corpo

Epilogo: i sistemi complessi hanno proprietà emergenti

467

418

RIASSUNTO

469

PROBLEMI

470

BIBLIOGRAFIA

471

B

B C D

D

Le sperimentazioni cliniche verificano l’efficacia e la sicurezza di un farmaco

419

I citocromi P450 sono spesso coinvolti nelle reazioni sfavorevoli causate dai farmaci

420

RIASSUNTO

423

CAPITOLO 14

PROBLEMI

424

Introduzione al metabolismo

BIBLIOGRAFIA

427

1

Una panoramica del metabolismo

473

A

La nutrizione: assunzione e utilizzazione degli alimenti

473

B

Le vitamine e i minerali facilitano le reazioni metaboliche

474

C

Le vie metaboliche sono costituite da serie di reazioni enzimatiche

475

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica 1

Gli ormoni

428

SCHEDA 13.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Rosalyn Yalow e il dosaggio radioimmunologico (radioimmunoassay o RIA) A B C

430

Gli ormoni delle isole pancreatiche controllano il metabolismo dei combustibili

430

L’adrenalina e la noradrenalina preparano l’organismo all’azione

431

Gli ormoni steroidei regolano una grande varietà di processi metabolici e sessuali

432

L’ormone della crescita si lega ai recettori presenti nei muscoli, nelle ossa e nelle cartilagini

433

2

I recettori con attività tirosina chinasica

435

A

I recettori con attività tirosina chinasica trasmettono segnali attraverso la membrana cellulare

D

SCHEDA 14.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA Gli stati

di ossidazione del carbonio

477

La termodinamica stabilisce la direzione e la capacità di regolazione delle vie metaboliche

479

E

Il flusso metabolico deve essere controllato

480

2

I composti “ad alta energia”

483

D

SCHEDA 14.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA A

486

435

Reazioni accoppiate guidano i processi endoergonici

486

recettore-ligando può essere quantificato

436

C

Le cascate delle chinasi trasferiscono segnali al nucleo

Altri composti fosforilati hanno elevati potenziali di trasferimento del gruppo fosforico

488

439

D

I tioesteri sono composti ad alta energia

492

443 445

Le proteina fosfatasi sono di diritto proteine di segnalazione

448

3

Le proteine G eterotrimeriche

451

A

I recettori associati alle proteine G contengono sette eliche transmembrana

453

B

484

ATP e DG

Alcuni recettori sono associati a tirosina chinasi non recettoriali

D

L’ATP ha un elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico

B

SCHEDA 13.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Gli oncogeni e il cancro C

483

SCHEDA 14.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

SCHEDA 13.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA Il legame B

Fritz Lipmann e i composti “ad alta energia”

Le proteine G eterotrimeriche si dissociano in seguito ad attivazione

454

3

Le reazioni di ossidoriduzione

493

A

NAD+ e FAD sono trasportatori di elettroni

493

B

L’equazione di Nernst descrive l’energetica delle reazioni di ossidoriduzione

494

La spontaneità di una reazione può essere determinata dalle differenze dei potenziali di riduzione

496

4

I metodi sperimentali di studio del metabolismo

499

A

I metaboliti marcati possono essere usati come traccianti

499

C

XIV B C

INDICE © 978-88-08-42096-1

Lo studio delle vie metaboliche spesso prevede l’uso di agenti perturbanti

C

501

La biologia dei sistemi è entrata a far parte dello studio del metabolismo

502

RIASSUNTO

506

PROBLEMI

507

BIBLIOGRAFIA

509

6

La via del pentosio fosfato

546

A

Nella fase 1 le reazioni ossidative producono NADPH

548

Nella fase 2 il ribulosio-5-fosfato viene isomerizzato o epimerizzato

549

Nella fase 3 avvengono le reazioni di scissione e di formazione di legame carbonio-carbonio

549

La via del pentosio fosfato deve essere regolata

551

B C D

CAPITOLO 15

SCHEDA 15.4 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA La carenza di glucosio-6-fosfato

Il catabolismo del glucosio SCHEDA 15.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

1

511

Una panoramica della glicolisi

512

PROBLEMI

554

BIBLIOGRAFIA

556

Le reazioni della glicolisi

514

L’esochinasi utilizza la prima molecola di ATP

514

B

La fosfoglucosio isomerasi converte il glucosio-6-fosfato in fruttosio-6-fosfato

515

La fosfofruttochinasi utilizza la seconda molecola di ATP

517

L’aldolasi converte un composto a 6 atomi di carbonio in due molecole a 3 atomi di carbonio

517

E

F G H

CAPITOLO 16

La triosio fosfato isomerasi interconverte tra loro il diidrossiacetone fosfato e la gliceraldeide-3-fosfato

518

La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi forma il primo intermedio “ad alta energia”

522

La fosfoglicerato chinasi produce la prima molecola di ATP

524

La fosfoglicerato mutasi interconverte il 3-fosfoglicerato e il 2-fosfoglicerato

J

3 A

B C

La demolizione del glicogeno

558

A

La glicogeno fosforilasi degrada il glicogeno a glucosio-1-fosfato

559

C

525

Cori e il metabolismo del glucosio

560

L’enzima deramificante del glicogeno agisce come una glucosiltransferasi

562

La fosfoglucomutasi interconverte glucosio-1-fosfato e glucosio-6-fosfato

563

SCHEDA 16.2 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Le malattie da accumulo di glicogeno

564

2

La sintesi del glicogeno

566

A

La UDP-glucosio pirofosforilasi attiva le unità glucosidiche

566

La sintesi di 2,3-bisfosfoglicerato negli eritrociti e il suo effetto sulla capacità di trasportare l’ossigeno nel sangue

527

L’enolasi forma il secondo intermedio “ad alta energia”

B

La glicogeno sintasi allunga le catene di glicogeno 567

527

C

La piruvato chinasi produce la seconda molecola di ATP

L’enzima ramificante del glicogeno trasferisce segmenti di glicogeno di sette residui

528

SCHEDA 16.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

La fermentazione: il destino anaerobico del piruvato La fermentazione omolattica converte il piruvato in lattato

530

La fermentazione alcolica converte il piruvato in CO2 ed etanolo

532

La fermentazione è energeticamente favorita

535 535

4

La regolazione della glicolisi

536

A

La fosfofruttochinasi è il principale enzima che controlla il flusso della glicolisi nel muscolo

537

B

Il ciclo del substrato regola finemente il flusso

539

5

Il metabolismo di esosi diversi dal glucosio

541

Il fruttosio viene convertito in fruttosio-6-fosfato o gliceraldeide-3-fosfato

542

570

3

Il controllo del metabolismo del glicogeno

571

A

La glicogeno fosforilasi e la glicogeno sintasi sono sotto controllo allosterico

571

B

La glicogeno fosforilasi e la glicogeno sintasi sono sottoposte a controllo per modificazione covalente

571

Il metabolismo del glicogeno è soggetto a controllo ormonale

576

4

La gluconeogenesi

578

A

Il piruvato viene convertito in fosfoenolpiruvato in due tappe

579

Reazioni idrolitiche aggirano quelle irreversibili della glicolisi

583

La gluconeogenesi e la glicolisi sono regolate in modo indipendente

583

Le altre vie biosintetiche dei carboidrati

585

C

B C

Il galattosio viene convertito in glucosio-6-fosfato 544

569

L’ottimizzazione della struttura del glicogeno

531

La produzione glicolitica di ATP nel muscolo

B

1

B

SCHEDA 15.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

A

Il metabolismo del glicogeno e la gluconeogenesi

SCHEDA 16.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Carl e Gerty

SCHEDA 15.2 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

I

552 553

Otto Warburg e gli studi sul metabolismo

A

D

deidrogenasi

RIASSUNTO

2

C

Il mannosio viene convertito in fruttosio-6-fosfato 545

5

SCHEDA 16.4 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

La sintesi del lattosio

586

INDICE © 978-88-08-42096-1

RIASSUNTO

589

PROBLEMI

590

BIBLIOGRAFIA

592

CAPITOLO 17

I mitocondri contengono una membrana interna altamente ripiegata

626

Gli ioni e i metaboliti entrano nei mitocondri tramite sistemi di trasporto

627

2

Il trasporto degli elettroni

630

A

Il trasporto degli elettroni è un processo esoergonico

630

A B

Il ciclo dell’acido citrico 1

Una panoramica del ciclo dell’acido citrico

594

SCHEDA 17.1 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Hans Krebs

e il ciclo dell’acido citrico

596

2

La sintesi dell’acetil-CoA

597

A

La piruvato deidrogenasi è un complesso multienzimatico

597

Il complesso della piruvato deidrogenasi catalizza cinque reazioni

599

B

XV

B

I trasportatori degli elettroni agiscono in sequenza 631

C

Il complesso I accetta elettroni dal NADH

634

D

Il complesso II contribuisce al trasferimento degli elettroni al coenzima Q

639

SCHEDA 18.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

I citocromi sono proteine con gruppi eme che trasportano elettroni

640

E

Il complesso III trasloca protoni tramite il ciclo Q

641

F

Il complesso IV riduce l’ossigeno ad acqua

645

SCHEDA 17.2 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA L’avvelenamento da arsenico

603

3

La fosforilazione ossidativa

648

3

Gli enzimi del ciclo dell’acido citrico

603

A

A

La citrato sintasi unisce un gruppo acetilico all’ossalacetato

La teoria chemiosmotica mette in relazione il trasporto degli elettroni con la sintesi dell’ATP

649

603

B

L’aconitasi interconverte reversibilmente citrato e isocitrato

605

C

L’isocitrato deidrogenasi NAD+-dipendente rilascia CO2

606

D

Il complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi è simile al complesso della piruvato deidrogenasi

607

E

La succinil-CoA sintetasi produce GTP

607

F

La succinato deidrogenasi genera FADH2

609

G

La fumarasi produce il malato

610

H

La malato deidrogenasi rigenera l’ossalacetato

610

4

La regolazione del ciclo dell’acido citrico

610

A

Il complesso della piruvato deidrogenasi viene regolato per inibizione da prodotto e modificazione covalente

B

5 A B

613

Le reazioni correlate al ciclo dell’acido citrico

615

Altre vie usano gli intermedi del ciclo dell’acido citrico

615

Il trasporto di elettroni nei batteri e la fosforilazione ossidativa

651

B

L’ATP sintasi è alimentata dal flusso dei protoni

652

C

Il rapporto P/O correla la quantità di ATP sintetizzato al quantitativo di ossigeno ridotto

658

D

La fosforilazione ossidativa può essere disaccoppiata dal trasporto degli elettroni

659

SCHEDA 18.4 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Il disaccoppiamento nel tessuto adiposo bruno produce calore

660

4

Il controllo del metabolismo ossidativo

661

A

La velocità della fosforilazione ossidativa dipende dalle concentrazioni di ATP e di NADH

661

B

Il metabolismo aerobico ha alcuni svantaggi

663

SCHEDA 18.5 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA La carenza di ossigeno nell’attacco

cardiaco e nell’ictus

664

RIASSUNTO

666

PROBLEMI

667

BIBLIOGRAFIA

669

CAPITOLO 19

L’evoluzione del ciclo dell’acido citrico

618

Il ciclo del gliossilato condivide alcune tappe con il ciclo dell’acido citrico

618

1

I cloroplasti

RIASSUNTO

621

A

PROBLEMI

622

Le reazioni alla luce avvengono nella membrana tilacoide

671

B

Le molecole di pigmento assorbono la luce

672

2

Le reazioni alla luce

675

A

L’energia luminosa viene trasformata in energia chimica

676

B

Il trasporto di elettroni nei batteri fotosintetici segue una via ciclica

677

C

Il trasporto di elettroni a due centri è una via lineare che produce O2 e NADPH

680

BIBLIOGRAFIA

623

CAPITOLO 18

Il trasporto di elettroni e la fosforilazione ossidativa 1

650

616

SCHEDA 17.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA C

Mitchell e la teoria chemiosmotica SCHEDA 18.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

612

Tre enzimi controllano la velocità del ciclo dell’acido citrico

Alcune reazioni riforniscono il ciclo dell’acido citrico di intermedi

SCHEDA 18.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA Peter

Il mitocondrio

626

La fotosintesi 671

XVI D

INDICE © 978-88-08-42096-1

Il gradiente protonico guida la sintesi di ATP per mezzo della fotofosforilazione

690

6

La sintesi di altri lipidi

745

A

I glicerofosfolipidi sono costruiti a partire da intermedi della sintesi del triacilglicerolo

745

B

Gli sfingolipidi sono costruiti a partire dal palmitil-CoA e dalla serina

749

SCHEDA 19.1 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

La segregazione del PSI e del PSII

691

3

Le reazioni al buio

693

A

Il ciclo di Calvin fissa il CO2

693

B

I prodotti del ciclo di Calvin sono convertiti in amido, saccarosio e cellulosa

697

C D

Il ciclo di Calvin è controllato indirettamente dalla luce

698

La fotorespirazione compete con la fotosintesi

700

RIASSUNTO

704

PROBLEMI

705

BIBLIOGRAFIA

706

SCHEDA 20.4 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA La degradazione degli sfingolipidi e le

malattie da accumulo di lipidi

750

C

Gli acidi grassi a 20 atomi di carbonio (C20) sono i precursori delle prostaglandine

751

7

Il metabolismo del colesterolo

752

A

Il colesterolo è sintetizzato a partire dall’acetil-CoA

753

B

L’HMG-CoA riduttasi controlla la velocità della sintesi del colesterolo

756

C

Un trasporto alterato del colesterolo porta all’aterosclerosi

759

RIASSUNTO

761

PROBLEMI

762

BIBLIOGRAFIA

764

CAPITOLO 20

Il metabolismo dei lipidi 1 A B

Digestione, assorbimento e trasporto dei lipidi

707

I triacilgliceroli vengono digeriti prima di essere assorbiti

708

I lipidi vengono trasportati sotto forma di lipoproteine

710

CAPITOLO 21

Il metabolismo degli amminoacidi 1

La degradazione delle proteine

765

A

I lisosomi degradano molte proteine

766

B

L’ubiquitina marca le proteine che devono essere degradate

766

C

Il proteasoma svolge la struttura e idrolizza peptidi ubiquitinati

768

2

La deamminazione degli amminoacidi

771

Le transamminasi utilizzano il PLP per trasferire i gruppi amminici

772

Il glutammato può essere deamminato per via ossidativa

775

2

L’ossidazione degli acidi grassi

715

A

Gli acidi grassi vengono attivati mediante il legame al coenzima A

716

La carnitina trasporta i gruppi acilici attraverso la membrana mitocondriale

716

La β-ossidazione degrada gli acidi grassi ad acetil-CoA

718

A

L’ossidazione degli acidi grassi insaturi richiede ulteriori enzimi

721

B

L’ossidazione degli acidi grassi a catena dispari produce il propionil-CoA

723

3

Il ciclo dell’urea

776

A

Cinque enzimi portano avanti il ciclo dell’urea

776

B

Il ciclo dell’urea è regolato dalla disponibilità del substrato

779

4

La degradazione degli amminoacidi

780

725

A

La β-ossidazione perossisomiale si differenzia dalla β-ossidazione mitocondriale

Alanina, cisteina, glicina, serina e treonina sono degradate a piruvato

781

728

B

3

I corpi chetonici

Asparagina e aspartato sono degradati a ossalacetato

784

730

4

C

La biosintesi degli acidi grassi

731

Arginina, glutammato, glutammina, istidina e prolina sono degradate ad α-chetoglutarato

784

A

L’acetil-CoA mitocondriale deve essere trasportato nel citosol

732

Metionina, treonina, isoleucina e valina sono degradate a succinil-CoA

786

SCHEDA 21.1 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA L’omocisteina, un marcatore di malattie

789

B C D E

SCHEDA 20.1 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA

La carenza di vitamina B12

723

SCHEDA 20.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Dorothy Crowfoot Hodgkin e la struttura della vitamina B12 F

D

B

L’acetil-CoA carbossilasi produce malonil-CoA

733

C

L’acido grasso sintasi catalizza sette reazioni

734

SCHEDA 20.3 LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA La

sintesi dei polichetidi D E

5

E

Leucina e lisina sono degradate solo ad acetil-CoA e/o acetoacetato 791

F

Il triptofano è degradato ad alanina e acetoacetato 791 Fenilalanina e tirosina sono degradate a fumarato e acetoacetato

739

Gli acidi grassi possono essere allungati e desaturati

740

G

Gli acidi grassi vengono esterificati per formare i triacilgliceroli

741

La regolazione del metabolismo degli acidi grassi

SCHEDA 21.2 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA La fenilchetonuria e l’alcaptonuria

742

derivano da difetti nella degradazione della fenilalanina

793

794

INDICE © 978-88-08-42096-1

XVII

5

La biosintesi degli amminoacidi

795

E

A

Gli amminoacidi non essenziali vengono sintetizzati a partire da metaboliti comuni

797

F

Le piante e i microrganismi sintetizzano gli amminoacidi essenziali

801

2

Gli altri prodotti del metabolismo degli amminoacidi

Il controllo ormonale del metabolismo energetico

834

807

A

Il rilascio dell’insulina è stimolato dal glucosio

834

L’eme è sintetizzato a partire dalla glicina e dal succinil-CoA

B

807

Il glucagone e le catecolammine contrastano gli effetti dell’insulina

836

L’omeostasi metabolica: la regolazione del metabolismo energetico, dell’appetito e del peso corporeo

839

La proteina chinasi AMP-dipendente segnala i livelli di combustibile cellulare

839

Gli adipociti e altri tessuti coadiuvano la regolazione del metabolismo energetico e dell’appetito

841

La spesa energetica può essere controllata dalla termogenesi adattativa

843

B

6 A

SCHEDA 21.3 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Le porfirie

3 809

Il rene filtra i prodotti di scarto e mantiene il pH del sangue

832

Il sangue trasporta i metaboliti nelle vie metaboliche di collegamento tra gli organi

832

Gli amminoacidi sono i precursori delle ammine fisiologicamente attive

811

C

L’ossido di azoto deriva dall’arginina

812

7

La fissazione dell’azoto

814

A

La nitrogenasi riduce l’N2 a NH3

814

B

L’azoto fissato viene assimilato nelle molecole biologiche

818

RIASSUNTO

820

4

I disturbi del metabolismo energetico

844

PROBLEMI

821

A

Il digiuno porta ad aggiustamenti metabolici

844

BIBLIOGRAFIA

823

B

Il diabete mellito è caratterizzato da elevati livelli ematici di glucosio

846

B

Il metabolismo energetico dei mammiferi: integrazione e regolazione

C

C

1

La specializzazione degli organi

825

A

Il cervello necessita di un costante rifornimento di glucosio

826

Il muscolo utilizza glucosio, acidi grassi e corpi chetonici

827

SCHEDA 22.1 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA Il microbioma intestinale

B

SCHEDA 22.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

CAPITOLO 22

B

A

D

Frederick Banting, Charles Best e la scoperta dell’insulina

847

L’obesità solitamente è causata da un’eccessiva assunzione di alimenti

850

Il metabolismo del cancro

851

RIASSUNTO

854

PROBLEMI

854

BIBLIOGRAFIA

856

828

C

Il tessuto adiposo immagazzina e rilascia acidi grassi e ormoni

829

D

Il fegato è la centrale di smaltimento metabolico del corpo

830

APPENDICE

857

INDICE ANALITICO

862

I N D I C E

D E L L E

Dieta e nutrizione Acidi grassi essenziali, 740 Amminoacidi essenziali, 801 Carenza di tiamina, 534 Carenza di vitamina B12, 723 Carenza di vitamina D, 272 Digiuno, 844 Dolcificanti artificiali, 244 Fruttosio, 542 Grassi trans, 264 Intolleranza al lattosio, 244 Pellagra, 475 Riboflavina, 494 Scorbuto, 150 Treonina, 86 Farmaci e tossine Aspirina, 751 Avvelenamento acuto, 807 Avvelenamento da arsenico, 603 Avvelenamento da metanolo, 403 Bacitracina, 589 Eparina, 249 Farmaci anti-influenzali, 399 Farmaci enantiomerici, 96 Farmaci per trattare la malaria, 416 Glicosidi cardiaci, 333 Inibitori dell’acido grasso sintasi, 738 Inibitori della COX-2, 752 Inibitori enzimatici dell’HIV, 401 Interazioni farmaco-farmaco, 421 Penicillina e vancomicina, 254 Progettazione di farmaci, 417 Recettori adrenergici, 432 Resistenza ai farmaci, 335 Steroidi anabolizzanti, 433 Sulfamidici, 788 Terapia di reidratazione orale, 337 Tossine tetanica e botulinica, 305 Trattamenti per le forme di diabete, 849 Veleni che colpiscono il sistema nervoso, 370 Viagra, 461 Evoluzione e biochimica comparata Anemia falciforme e malaria, 211, 212 Chimica dei tioesteri, 492 Conservazione della struttura proteica, 164 Domini della vita, 9 Duplicazione genica, 131 Endosimbiosi, 10 Enzimi con barili α/β, 521 Evoluzione del ciclo dell’acido citrico, 618 Evoluzione del citocromo c, 127 Evoluzione dell’acido grasso sintasi, 734 Evoluzione della globina, 131 Evoluzione delle serina proteasi, 373

A P P L I CA Z I O N I Evoluzione prebiotica, 3 Evoluzione umana, 69 Metabolismo aerobico, 593 Metabolismo anaerobico, 473 Proteine di trasporto dell’ossigeno, 197 Resistenza ai farmaci dell’HIV, 402 Selezione naturale, 11 Sintesi delle vitamine, 475 Trasporto di elettroni nei batteri, 650 Salute e malattia Acidosi e alcalosi, 41 Adattamento alle elevate altitudini, 207 Adrenoleucodistrofia, 729 Alcaptonuria, 794 Anemia perniciosa, 723 Aterosclerosi, 759 Attacco cardiaco e ictus, 664 Cancro, 443 Carenza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, 552 Ciclo del gliossilato nei batteri patogeni, 621 Coagulazione del sangue, 380 Colera e pertosse, 460 Diabete, 846 Distrofia muscolare, 220 Enfisema polmonare, 378 Eritrociti con deficit enzimatici, 527 Fenilchetonuria, 794 Fibrosi cistica, 336 Galattosemia, 545 Gruppi sanguigni ABO, 258 Iperammonemia, 775 Ipercolesterolemia, 758 Itterizia, 811 Leptina e obesità, 842 Leucemia, 447 Lipoproteine, 710 Malattia delle urine a sciroppo d’acero, 791 Malattia di Gaucher, 751 Malattia di Tangier, 760 Malattia di Tay-Sachs, 750 Malattie associate al collageno, 150 Malattie autoimmuni, 231 Malattie causate da un errato ripiegamento delle proteine, 184 Malattie da accumulo di glicogeno, 564 Malattie da accumulo di lipidi, 750 Malattie genetiche, 68, 69 Malattie neurodegenerative, 665 Metabolismo muscolare del glucosio, 535 Microbioma intestinale, 828 Morbo di Addison, 271 Mucolipidosi (I-cell disease), 302 Obesità, 843 Omocisteina come marcatore di malattie, 789 Oncogeni e cancro, 443

INDICE DELLE APPLICAZIONI © 978-88-08-42096-1

Pancreatite acuta, 379 Patologie legate alla crescita, 433, 434 Peste bubbonica, 449 Porfirie, 809 Sferocitosi ereditaria, 291 Sindrome di Cushing, 272 Sindrome di morte improvvisa del lattante (morte in culla), 719 Sindrome di Zellweger, 729 Sindrome metabolica, 851 Sistema tampone del sangue, 41 Spina bifida e anencefalia, 789, 790 Tensioattivo polmonare (surfattante), 267 Termogenesi, 541 Tessuto adiposo bruno, 660 Varianti dell’emoglobina, 210

Tecniche di laboratorio e strumenti clinici Anticorpi monoclonali, 229 Bypass gastrico, 850 Dialisi, 32 Dosaggio radioimmunologico, 430 Fingerprinting del DNA, 77 Legame recettore-ligando, 436 Progettazione di proteine, 178 Proteina fluorescente verde, 98 Sequenziamento delle proteine, 117 Sintesi dei polichetidi, 739 Sperimentazioni cliniche, 419 Tecnologia del DNA ricombinante, aspetti etici, 80 Terapia genica, 80 Transamminasi, 775 Trapianti di organo, 451

XIX

C A P I T O L O

1

Introduzione alla chimica della vita La struttura di questa cellula di Paramecium e i processi che si verificano al suo interno possono essere spiegati in termini chimici. Tutte le cellule contengono tipi analoghi di macromolecole e tutte vanno incontro a reazioni chimiche simili per acquisire energia, crescere, comunicare e riprodursi. [M. I. Walker/Science Source Images.]

Da un punto di vista strettamente letterale la biochimica è lo studio della chimica della vita; sebbene si sovrapponga ad altre discipline, tra le quali la biologia cellulare, la genetica, l’immunologia, la microbiologia, la farmacologia e la fisiologia, essa si occupa sostanzialmente di un numero limitato di argomenti. 1. Quali sono le strutture chimiche e tridimensionali delle molecole biologiche? 2. Come interagiscono tra loro le molecole biologiche? 3. Attraverso quali vie la cellula sintetizza e degrada le molecole biologiche? 4. In che modo la cellula conserva e utilizza l’energia? 5. Quali sono i meccanismi che organizzano le molecole biologiche e coordinano le loro attività? 6. In che modo le informazioni genetiche sono conservate, trasmesse ed espresse?

Analogamente ad altre scienze moderne, la biochimica utilizza strumentazioni sofisticate per analizzare l’architettura e il funzionamento di sistemi spesso inaccessibili alle facoltà sensoriali dell’uomo. Oltre agli strumenti di cui il chimico dispone per separare, quantificare e analizzare i materiali di cui sono costituiti gli esseri viventi, i biochimici sfruttano gli aspetti eminentemente biologici della loro materia di studio esaminando le storie evolutive degli organismi, i sistemi metabolici e le singole molecole. Oltre alle implicazioni sulla salute umana, la biochimica svela il funzionamento del mondo naturale, consentendoci di comprendere e apprezzare l’unicità e i misteri di quella condizione che noi chiamiamo “vita”. In questo capitolo introduttivo rivedremo alcuni concetti di base della chimica e della biologia – tra cui le basi dell’evoluzione, i differenti tipi di cellule e i principi fondamentali della termodinamica – per inserire la biochimica in un contesto più ampio e al contempo introdurre alcuni dei temi che ricorrono più volte in questo libro.

2

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

1 L’origine della vita CONCETTI CHIAVE

• Le molecole biologiche vengono costruite a partire da un numero limitato di elementi.

• I differenti tipi di biomolecole sono caratterizzati dalla presenza di specifici gruppi funzionali e legami chimici.

• Le molecole più complesse e i polimeri si sono formati, durante l’evoluzione chimica, dalla condensazione dei composti più semplici.

• Le molecole in grado di autoreplicarsi sono state sottoposte a selezione naturale. Alcune peculiarità biochimiche sono comuni a tutti gli esseri viventi: per esempio, il modo in cui le informazioni ereditarie sono codificate ed espresse e il meccanismo attraverso cui le molecole biologiche sono prodotte e degradate per scopi energetici. L’unitarietà genetica e biochimica di base condivisa dagli organismi moderni indica la loro comune discendenza da un unico progenitore ancestrale; sebbene sia impossibile descrivere esattamente in che modo la vita sia apparsa sulla Terra, studi paleontologici e di laboratorio hanno consentito di approfondire le nostre conoscenze circa la sua origine.

A Le molecole biologiche si sono formate da sostanze inanimate

TABELLA 1.1 Gli elementi più

abbondanti nel corpo umanoa Elemento

Peso secco (%)

C

61,7

N

11,0

O

9,3

H

5,7

Ca

5,0

P

3,3

K

1,3

S

1,0

Cl

0,7

Na

0,7

Mg

0,3

a

0

10 mm

20

Calcoli di Frieden, E. (1972). Sci. Am. 227(1), 54-55.

Figura 1.1 Microfossile di cellule

batteriche filamentose. Il fossile (mostrato insieme a un suo disegno illustrativo) proviene da una roccia dell’Australia occidentale risalente a circa 3,4 miliardi di anni fa. [Per gentile concessione di J. William Schopf, UCLA.]

La materia vivente è costituita da un numero relativamente piccolo di elementi (Tabella 1.1). Per esempio, gli elementi C, H, O, N, P, Ca ed S ammontano a circa il 97% del peso secco del corpo umano (circa il 70% del peso dell’organismo umano, così come quello della maggior parte degli organismi, è rappresentato da acqua); gli esseri viventi possono altresì contenere tracce di numerosi altri elementi, tra cui B, F, Al, Si, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Br, Mo, Cd, I e W, anche se non tutti gli organismi utilizzano ciascuna di queste sostanze. Le prime testimonianze fossili della vita risalgono a circa 3,5 miliardi di anni fa (Figura 1.1), mentre l’era prebiotica precedente, che ebbe inizio con la formazione del nostro pianeta approssimativamente 4,6 miliardi di anni or sono, non ha lasciato tracce dirette. Gli scienziati sono però in grado di riprodurre sperimentalmente i tipi di reazioni chimiche che possono aver dato origine agli organismi viventi durante un lasso di tempo durato circa un miliardo di anni. L’atmosfera primitiva presente sulla Terra era verosimilmente costituita da piccoli e semplici composti quali H2O, N2, CO2, e da piccole quantità di CH4 e NH3. Negli anni ’20, Alexander Oparin e J. B. S. Haldane ipotizzarono, l’uno indipendentemente dall’altro, che le radiazioni ultraviolette provenienti dal Sole o le scariche dei fulmini avessero favorito reazioni tra le molecole dell’atmosfera primordiale portarono alla formazione di composti organici (composti contenenti carbonio) non complessi. Tale processo fu riprodotto nel 1953 da Stanley Miller e Harold Urey, i quali sottoposero una miscela di H2O, CH4, NH3 e H2 a scariche elettriche per circa una settimana. La soluzione che si generò conteneva composti organici solubili in acqua, tra cui svariati amminoacidi (cioè i costituenti delle proteine) e altre sostanze rilevanti sotto il profilo biochimico. Le ipotesi a sostegno dell’esperimento di Miller-Urey, sostanzialmente la composizione della fase gassosa usata come materiale di partenza, sono state poste in discussione da alcuni scienziati, i quali hanno proposto che le prime molecole biologiche si siano generate in condizioni molto diverse, cioè al buio e in un ambiente acquoso. Le fonti idrotermali presenti sui fondali oceanici che emettono soluzioni di solfuri metallici a temperature che raggiungono i 400 ¡C

CAPITOLO 1

3

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

Figura 1.2 Una fonte idrotermale. Tali formazioni localizzate sul fondo degli oceani sono

note come “black smokers” poiché i solfuri metallici disciolti nell’acqua surriscaldata che emettono precipitano a contatto con quella molto più fredda dell’oceano. [Per gentile concessione della Woods Hole Oceanographic Institution.]

(Figura 1.2) possono aver fornito le condizioni opportune per la formazione di amminoacidi e di altre piccole molecole organiche a partire da composti semplici presenti nell’acqua del mare. Indipendentemente dall’effettiva origine, le prime molecole organiche divennero i precursori di una straordinaria varietà di molecole biologiche, classificabili in base alla loro composizione e reattività chimica. A questo punto diventa importante prendere in esame i gruppi funzionali (le parti reattive) delle molecole e i tipi di legame (cioè i modi in cui i vari elementi o gruppi funzionali si uniscono) che, in ultima analisi, determinano l’attività biologica di tali molecole. Nella Tabella 1.2 sono riportati alcuni tra i più comuni gruppi funzionali e tipi di legame presenti nelle molecole biologiche.

B I sistemi complessi autoreplicanti si sono evoluti da molecole semplici

Nella prima fase dell’evoluzione chimica, le molecole organiche semplici si condensarono per formare strutture più complesse o si combinarono a livello delle reciproche estremità formando polimeri di unità ripetute. In una reazione di condensazione vengono perduti gli elementi della molecola di acqua; quindi la velocità di condensazione di composti semplici per dare luogo a un polimero stabile deve essere superiore a quella di idrolisi (la scissione mediante aggiunta degli elementi che compongono una molecola di acqua; Figura 1.3). Nell’ambiente prebiotico è possibile che minerali quali le argille potessero catalizzare reazioni di polimerizzazione e rimuovere i prodotti della reazione dall’acqua. Le dimensioni e la composizione delle macromolecole prebiotiche sarebbero state così limitate dalla disponibilità dei materiali molecolari di partenza, dall’efficienza con cui questi si sarebbero potuti unire e dalla loro resistenza alla degradazione. La Tabella 1.3 riporta alcuni tra i principali polimeri biologici e le unità costituenti (monomeri) da cui traggono origine. Ovviamente, la combinazione di monomeri differenti e dei loro diversi gruppi funzionali in una singola molecola di grandi dimensioni determina un aumento della versatilitˆ chimica di tale molecola, consentendole di portare a termine, sotto il profilo chimico, funzioni superiori rispetto a quanto non siano in grado di fare molecole più semplici. (Tale principio che concerne proprietà emergenti può essere espresso come “l’insieme supera la somma delle sue parti”.) Le diverse macromolecole con disposizioni complementari (appaiamento reciproco) dei loro gruppi funzionali possono associarsi l’una all’altra (Figura 1.4), dando luogo

Gruppo carbossilico

O

+NH 3

C

R

C

+

OH

Condensazione

H H

N

R9

Idrolisi

H2O

H2O O R

C

NH

R9

Figura 1.3 Reazione di un acido

carbossilico con un’ammina. Nel corso di una condensazione gli elementi che compongono l’acqua sono rilasciati, mentre nel processo inverso – l’idrolisi – l’acqua viene aggiunta al fine di scindere il legame amidico. Nei sistemi viventi le reazioni di condensazione non sono liberamente reversibili.

CONCETTI DI BASE Gruppi funzionali Le diverse classi di molecole biologiche sono caratterizzate da tipi differenti di gruppi funzionali e di legami chimici. Una biomolecola può contenere più gruppi funzionali.

Macromolecola

Gruppo amminico

O

OÐ Figura 1.4 Associazione tra

Macromolecola

molecole complementari. Il gruppo amminico, carico positivamente, interagisce per via elettrostatica con quello carbossilato a carica negativa.

4

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 1.2 Gruppi funzionali e tipi di legame comunemente riscontrabili in biochimica

Nome del composto Ammina b

Strutturaa

Gruppo funzionale o tipo di legame

RNH2

o

RNH3

R2NH

o

R2NH2

R3N

o

R3NH

N

o

N

(gruppo amminico)

Alcol

ROH

OH

(gruppo ossidrilico)

Tiolo

RSH

SH

(gruppo solfidrilico)

Etere

ROR

O

O R

Aldeide

C

O H

C

O R

Chetone

C

Acido carbossilico

R

C

C

R O OH o R

C

O R

Estere

C

R

C

(gruppo carbonilico)

O O

C O

OH (gruppo carbossilico) o

C

O

(gruppo carbossilato)

O OR

C

O

Tioestere

(gruppo carbonilico)

O

O b

(legame etere)

O O

(legame estere) R

O SR

C

(gruppo acilico) c

C O

S

(legame tioestere) R

C

(gruppo acilico) c

O R

Amide

C

NH2

O R

C

O NHR

O

C

N

(gruppo amidico) R

C

N

o

S

S

(ponte disolfuro)

O

(gruppo fosforilico)

C

(gruppo acilico) c

O

Immina (base di Schiff)b

Disolfuro

R

C

NR 2

R

NH o R

NH2

R

NR o R

NHR

R

S

S

R

O b

R

Estere fosfato

O

P

O

R

O

P

P O

O

O

P OH

O O

P

Diestere fosfato

R

O

P O

O O

O

O b

(gruppo imminico)

OH

O

Estere difosfato

N

O

OH b

C

P

O

(gruppo fosfoanidridico)

OH O

O

R

O

P

O

(legame fosfodiesterico)

O

a

R rappresenta un qualsiasi gruppo contenente carbonio. In una molecola con più di un gruppo R, i gruppi possono essere uguali o differenti. b In condizioni fisiologiche questi gruppi sono ionizzati, quindi hanno una carica positiva o negativa. c Se unito a un atomo diverso dal carbonio. Coprite la colonna “Struttura” e disegnate la struttura di ciascuno dei composti elencati a sinistra. Fate poi la stessa cosa per ogni gruppo funzionale o legame riportato nella tabella.

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

5

TABELLA 1.3 I principali polimeri di interesse biologico

e i monomeri che li compongono

Polimero

Polimero

Monomero

Proteina (polipeptide)

Amminoacido

Acido nucleico (polinucleotide)

Nucleotide

Polisaccaride (carboidrato complesso)

Monosaccaride (carboidrato semplice)

Figura 1.5 Replicazione tramite complementarità. In questo semplice

caso un polimero funge da stampo per la costruzione di una molecola complementare, la quale, in virtù della complementarità intramolecolare, è una copia esatta dell’originale.

Complementarità intramolecolare

Molecole complementari

Distinguete i legami covalenti dalle interazioni non covalenti in questo polimero.

a strutture molecolari ancora più complesse e contraddistinte da una gamma di possibilità funzionali ancora maggiore. L’accoppiamento specifico tra gruppi funzionali complementari consente a un membro di una coppia di determinare l’identità e l’orientamento dell’altro membro; tale complementarità fa sì che una macromolecola possa replicarsi, o copiare se stessa, dirigendo la produzione di una nuova molecola a partire da unità complementari più piccole. La replicazione di un polimero semplice dotato di complementarità intramolecolare è illustrata nella Figura 1.5; questo processo è fondamentale per la funzione del DNA, in cui la sequenza di basi su un filamento (per esempio, A-C-G-T) specifica in maniera assoluta la sequenza di basi sul filamento con cui il primo si appaia (T-G-C-A). Quando il DNA si replica, i due filamenti si separano dirigendo la sintesi di filamenti figli complementari; la complementarità costituisce anche il fondamento della trascrizione del DNA in RNA e della traduzione di quest’ultimo in proteine. Un momento cruciale nell’evoluzione chimica fu il passaggio dai sistemi costituiti da molecole generate in modo casuale ad altri in cui esse erano organizzate ed erano replicate in maniera specifica. Una volta che le macromolecole ebbero acquisito la capacità di autoreplicarsi, l’ambiente primordiale si arricchì di molecole capaci di sopravvivere e moltiplicarsi; i primi sistemi dotati di replicazione furono senza dubbio in qualche misura poco precisi, caratterizzati da progenie molecolari non perfettamente complementari ai composti parentali. Nel corso del tempo la selezione naturale, il processo competitivo per cui l’organismo più adatto ha un vantaggio riproduttivo, avrebbe poi favorito le molecole in grado di produrre copie più accurate di se stesse.

2 L’architettura della cellula CONCETTI CHIAVE

• La compartimentazione delle cellule favorisce l’efficienza dei processi attraverso il mantenimento di elevate concentrazioni di reagenti a livello locale.

• Le diverse vie metaboliche si sono evolute in modo da sintetizzare molecole e generare energia.

• Le cellule più semplici sono i procarioti. • Gli eucarioti sono caratterizzati dalla presenza di numerosi organelli delimitati da membrane, tra i quali anche il nucleo.

• L’albero filogenetico della vita comprende tre domini: batteri, archea ed eucarioti. • Si ha evoluzione quando la selezione naturale agisce su modificazioni che compaiono casualmente tra gli individui.

PUNTO DI VERIFICA

• Quali sono i quattro elementi presenti praticamente in tutte le molecole biologiche?

• Riassumete quali sono le fasi principali dell’evoluzione chimica.

• Esercitatevi scrivendo una semplice reazione di condensazione e una di idrolisi.

• Spiegate la motivazione secondo la quale la complementarità sarebbe stata necessaria per lo sviluppo delle molecole autoreplicanti.

6

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

I tipi di sistemi descritti sino a questo punto avrebbero dovuto competere con tutti gli altri presenti sulla Terra primordiale per le risorse disponibili; un sistema isolato e protetto all’interno di una qualche forma di confine avrebbe avuto un vantaggio selettivo. Come questi confini siano comparsi o da che cosa abbiano tratto origine è ancora un argomento senza risposta. Una teoria sostiene che vescicole membranose (piccole sfere ricolme di fluidi) si sarebbero unite dapprima a sistemi in grado di autoreplicarsi per poi racchiuderli; tali vescicole si sarebbero trasformate nelle prime cellule.

A Le cellule svolgono reazioni metaboliche La compartimentazione comporta svariati vantaggi; oltre a conseguire un certo livello di protezione nei confronti degli eventi ambientali sfavorevoli, un sistema chiuso è in grado di mantenere concentrazioni locali elevate di componenti che altrimenti diffonderebbero all’esterno. Sostanze più concentrate possono reagire in maniera più rapida, aumentando l’efficienza della polimerizzazione e di altri tipi di reazioni chimiche. Un compartimento circondato da una membrana capace di proteggere il proprio contenuto può presentare una composizione piuttosto differente da ciò che lo circonda. Le cellule attuali contengono alte concentrazioni di ioni, di piccole molecole e di grandi aggregati molecolari che sono invece presenti solo in tracce all’esterno della cellula. Per esempio, una cellula del batterio Escherichia coli (E. coli) contiene milioni di copie di circa 3000-6000 molecole differenti (Figura 1.6), mentre una tipica cellula animale può contenerne 100 000 tipi diversi. Le prime cellule dipendevano dall’ambiente per quanto concerne l’approvvigionamento delle loro sostanze costitutive. Quando alcune delle componenti essenziali del brodo prebiotico cominciarono a scarseggiare, la selezione naturale favorì gli organismi che svilupparono vie metaboliche, meccanismi atti a sintetizzare i composti necessari a partire da precursori più semplici, ma più abbondanti. Le prime reazioni metaboliche possono aver fatto uso di catalizzatori metallici o a base di argilla cooptati dal circostante ambiente inorganico (un catalizzatore è una sostanza che accelera una reazione chimica, non subendo trasformazioni alla fine del processo). Di fatto, gli ioni metallici costituiscono ancora una parte essenziale di molte reazioni chimiche che avvengono nelle nostre cellule. Alcuni catalizzatori possono

Figura 1.6 Sezione trasversale

di una cellula di E. coli. Il citoplasma è reso compatto dalle macromolecole. A questo ingrandimento (~1 000 000×), i singoli atomi sono troppo piccoli per poter essere distinti gli uni dagli altri. Le strutture verdi visibili sulla destra comprendono i componenti della membrana interna ed esterna e una parte di un flagello. Le diverse proteine presenti all’interno della cellula sono mostrate in blu, mentre i ribosomi sono colorati in viola. Il DNA e le proteine che legano il DNA sono visibili sotto forma di strutture rispettivamente colorate in giallo e arancione. In una cellula vivente, lo spazio rimanente è riempito dall’acqua e da molecole più piccole. [David Goodsell (2009), D.S., The Machinery of Life (2a ed.), Springer. Riprodotto con permesso.]

CAPITOLO 1 © 978-88-08-42096-1

Introduzione alla chimica della vita

7

altresì aver tratto origine da molecole polimeriche che possedevano gli opportuni gruppi funzionali. In genere le reazioni di biosintesi richiedono energia; di conseguenza le prime reazioni cellulari avevano bisogno di una fonte energetica. Il definitivo esaurimento, nell’ambiente prebiotico, di sostanze preesistenti ricche di energia avrebbe favorito lo sviluppo di vie metaboliche per la sua produzione. Per esempio, la fotosintesi si è evoluta piuttosto precocemente per trarre vantaggio da una fonte di energia praticamente inesauribile: la luce del Sole. Tuttavia l’accumulo di O2 generato a partire da H2O mediante questo processo (ai nostri giorni l’atmosfera contiene il 21% di ossigeno molecolare) determinò un’ulteriore sfida per gli organismi adattati alla vita in un’atmosfera povera di questo elemento gassoso. Alla fine, i continui miglioramenti metabolici consentirono agli esseri viventi non solo di evitare i danni ossidativi, ma anche di impiegare l’O2 in un nuovo metabolismo, una forma di metabolismo energetico più efficiente rispetto a quello anaerobico. Le vestigia della vita primordiale sono ancora visibili nel metabolismo anaerobico di alcuni organismi moderni. Gli organismi primordiali che svilupparono strategie metaboliche volte a sintetizzare molecole biologiche, a conservare e utilizzare l’energia in maniera controllata e a replicarsi all’interno di un compartimento protettivo furono in grado di propagarsi in una gamma sempre più vasta di habitat. L’adattamento delle cellule a differenti condizioni esterne condusse, in definitiva, alla diversità di specie attualmente presenti; la specializzazione delle singole cellule ha reso possibile a gruppi di cellule differenziate di svolgere insieme certe funzioni negli organismi pluricellulari.

B Esistono due tipi di cellule: quelle procariotiche e quelle eucariotiche

Tutti gli organismi attuali si fondano sulla stessa unità morfologica, la cellula. Le cellule si dividono in due categorie: gli eucarioti (dal greco eu, “buono” o “vero”, e karyon, “nucleo” o “noce”), che possiedono un nucleo circondato da membrana che contiene il loro DNA, e i procarioti (dal greco pro, “prima”), che sono privi di nucleo. I procarioti, di cui fanno parte vari tipi di batteri, presentano strutture relativamente semplici e sono quasi esclusivamente unicellulari (sebbene possano formare filamenti o colonie di cellule indipendenti). Gli eucarioti, che possono essere pluricellulari o unicellulari, sono Spirillum di gran lunga più complessi dei procarioti. (I virus sono entità molto più semplici in confronto alle cellule e non sono classificati come Una spirocheta organismi viventi poiché sono privi dell’apparato metabolico necessario per riprodursi all’esterno dei loro ospiti cellulari.) Anabaena (un cianobatterio) I procarioti sono gli organismi più diffusi sul nostro pianeta, grazie al fatto che il loro metabolismo è altamente adattabile a una straordinaria gamma di habitat. Le loro dimensioni variano da 1 a 10 μm, mentre le loro forme sono di tre tipi (Figura 1.7): sferoidale (cocchi), a bastoncello (bacilli) ed elicoidale (spirilli). A eccezioEscherichia coli ne della membrana cellulare esterna che, nella gran parte dei casi, è circondata da una parete cellulare con funzione protettiva, quasi Un grosso Bacillus tutti i procarioti sono privi di membrane interne. Tuttavia il loro citoplasma (ossia il contenuto della cellula) non è assolutamente Staphylococcus omogeneo e le diverse funzioni metaboliche sono portate a termine in regioni differenti (Figura 1.6). Il procariote meglio caratterizzaRickettsia Tre specie di to è Escherichia coli, un batterio a forma di bastoncello e di dimenMycoplasma sioni pari a 2 μm per 1 μm che risiede nel colon dei mammiferi. 10 μm Le cellule eucariotiche hanno un diametro generalmente compreso tra 10 e 100 μm, di conseguenza il loro volume è da mille a un milione di volte maggiore rispetto a quello dei tipici procarioti; tuttavia Figura 1.7 Rappresentazione in scala la caratteristica peculiare di tali cellule non sono le dimensioni ma piuttosto la di alcune cellule procariotiche.

8

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

Membrana nucleare Nucleolo Cromatina Reticolo endoplasmatico liscio

Reticolo endoplasmatico ruvido Nucleo

Vacuolo Centrioli

Ribosomi liberi

Mitocondrio

Ribosomi legati al RER

Membrana cellulare Lisosoma

Apparato di Golgi

Figura 1.8 Rappresentazione schematica di una tipica

cellula animale e fotografie al microscopio elettronico che mostrano alcuni organelli. Gli organelli circondati da membrana comprendono il nucleo, il reticolo endoplasmatico, i lisosomi, i perossisomi (non rappresentati), i mitocondri, i vacuoli e l’apparato di Golgi. Il nucleo contiene la cromatina (un complesso formato da DNA e proteine) e il nucleolo (la sede della sintesi dei ribosomi). A differenza di quello liscio, il reticolo endoplasmatico rugoso è costellato da ribosomi, mentre una coppia di centrioli aiuta a organizzare gli elementi del citoscheletro. Una tipica cellula vegetale si contraddistingue

per la presenza di una parete cellulare esterna e di cloroplasti nel citosol. [Reticolo endoplasmatico liscio © Dennis Kunkel Microscopy, Inc./Phototake; reticolo endoplasmatico rugoso © Pietro M. Motta & Tomonori Naguro/Photo Researchers, Inc.; Nucleo © Tektoff-RM, CNRI/Photo Researchers; mitocondrio © CNRI/Photo Researchers; apparato di Golgi © Secchi-Lecaque/ Roussel-UCLAF/CNRI/Photo Researchers; lisosoma © Biophoto Associates/Photo Researchers.] Coprendo le scritte della figura, ricordate il nome di tutte le parti della cellula eucariotica rappresentata.

presenza al loro interno di una moltitudine di organelli circondati da membrane (Figura 1.8). Oltre a un nucleo, gli eucarioti possiedono un reticolo endoplasmatico, che rappresenta la sede della sintesi di numerose componenti cellulari, alcune delle quali sono successivamente modificate nell’apparato di Golgi. In quasi tutti gli eucarioti la maggior parte delle reazioni del metabolismo aerobico avviene nei mitocondri, mentre le cellule fotosintetiche contengono i cloroplasti che convertono l’energia dei raggi solari in energia chimica. Altri organelli, come per esempio i lisosomi e i perossisomi, eseguono funzioni specializzate. I vacuoli sono invece ampiamente presenti nelle cellule vegetali e fungono solitamente da depositi. Il citosol, che equivale al citoplasma privato dei suoi organelli circondati da membrana, è organizzato per mezzo del citoscheletro, una diffusa rete di filamenti che conferisce inoltre alla cellula la sua forma tipica e la capacità di movimento. I vari organelli responsabili della compartimentazione delle cellule eucariotiche rappresentano un livello di complessità in gran parte assente in quelle procariotiche. Ciò nondimeno, i procarioti evidenziano per molti aspetti un’efficienza superiore rispetto agli eucarioti: i primi hanno sfruttato i vantaggi dovuti alla semplicità e alle dimensioni molto contenute, e l’elevata velocità di crescita permette loro di occupare nicchie ecologiche in cui possono avvenire anche drastiche fluttuazioni dei nutrienti a disposizione. La complessità degli eucarioti fa sì che tali organismi abbiano dimensioni maggiori e una crescita più lenta rispetto ai procarioti, ma conferisce loro un vantaggio competitivo in ambienti

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

9

stabili con risorse limitate. È perciò errato ritenere i procarioti cellule evoluzionisticamente primitive rispetto agli eucarioti, bensì entrambi i tipi di organismi si sono adattati in maniera soddisfacente ai loro rispettivi stili di vita.

C I dati molecolari rivelano l’esistenza di tre domini evolutivi di organismi

La consuetudine di accorpare tutti i procarioti in una singola categoria sulla base della loro caratteristica comune, cioè la mancanza del nucleo, tende a nascondere invece la loro diversità metabolica e la loro storia evolutiva. La considerevole differenziazione morfologica tipica degli organismi eucariotici (basta osservare le diversità anatomiche tra un’ameba, una quercia e un essere umano) nasconde la loro fondamentale analogia esistente invece a livello cellulare. I tradizionali schemi tassonomici (la tassonomia è la disciplina scientifica che si prefigge di operare una classificazione degli esseri viventi), che si basano sulla morfologia macroscopica, si sono mostrati inadatti a descrivere le effettive relazioni tra gli organismi, come ci ha rivelato la loro storia evolutiva (la filogenesi). Rispetto agli schemi di classificazione biologica basati esclusivamente sulla morfologia degli individui adulti, quelli che traggono spunto dalle strategie riproduttive o di sviluppo rispecchiano in maniera più accurata la storia evolutiva. Le relazioni filogenetiche si deducono in modo migliore confrontando le molecole polimeriche, l’RNA, il DNA o le proteine, derivanti da organismi differenti. Per esempio, l’analisi dell’RNA portò Carl Woese a riunire tutti gli organismi in tre domini (Figura 1.9). Gli archea (noti anche come archeobatteri) sono un gruppo di procarioti correlati alla lontana agli altri procarioti (i batteri, talvolta definiti eubatteri) e agli eucarioti (eucaria). Gli archea comprendono alcuni organismi insoliti: i metanogeni (che producono CH4), gli alobatteri (che vivono in soluzioni saline concentrate) e determinati termofili (che risiedono nelle sorgenti molto calde). La disposizione delle ramificazioni nell’albero filogenetico del diagramma di Woese indica la divergenza dei vari tipi di organismi (ciascun punto di ramificazione rappresenta un progenitore comune). Lo schema a tre domini mostra altresì che gli animali, le piante e i funghi costituiscono solo una piccola parte di tutte le forme di vita. Questi alberi filogenetici integrano i dati ottenuti dai reperti fossili, che forniscono una testimonianza frammentaria della vita prima di circa 600 milioni di anni fa (la comparsa degli organismi pluricellulari risale approssimativamente a 700-900 milioni di anni or sono). È improbabile che gli eucarioti discendano da un procariote altamente sviluppato poiché le differenze tra eubatteri, archea ed eucarioti sono molto pro-

Batteri

Batteri verdi non solforici Gram-positivi

Archea

Eucaria Muffe del fango Animali Entamebe Funghi

Metanosarcini Metanobatteri Alofili Metanococchi

Flagellati

Batteri purpurei Cianobatteri

Piante Cigliati

Thermoproteus Pyrodicticum

Figura 1.9 Albero filogenetico

T. celer Tricomonadi Microsporidie

Flavobatteri Thermotoga

Diplomonadi

che illustra i tre domini in cui sono suddivisi gli esseri viventi. Le ramificazioni indicano la modalità di divergenza da un progenitore comune. Analogamente ai batteri, gli archea sono procarioti ma hanno alcune peculiarità degli eucarioti. [Wheelis, M.L., Kandler, O. e Woese, C.R. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2931.]

10

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

fonde. Sembra invece probabile che gli eucarioti si siano evoluti dall’associazione di cellule di archeobatteri e di eubatteri. Il materiale genetico eucariotico presenta caratteristiche che suggeriscono un’origine dagli archeobatteri. Inoltre, i mitocondri e i cloroplasti delle cellule eucariotiche attuali ricordano i batteri sia nelle loro dimensioni sia nella loro forma. I due tipi di organelli contengono un proprio materiale genetico e sono anche dotati di un meccanismo completo di sintesi proteica. Evidentemente, come è stato proposto da Lynn Margulis, i mitocondri e i cloroplasti si sono evoluti a partire da batteri aerobici allo stato libero che avevano instaurato relazioni simbiontiche (mutuamente benefiche) con le cellule eucariotiche primordiali (Scheda 1.1). Tale ipotesi è avvalorata dal riscontro che determinati eucarioti privi di mitocondri o di cloroplasti contengono in via permanente batteri simbiontici.

SCHEDA 1.1

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Lynn Margulis e la teoria dellÕendosimbiosi Lynn Margulis (1938-2011)

Lynn Margulis è cresciuta nella città di Chicago e a sedici anni si è iscritta all’Università di Chicago con l’intenzione di diventare una scrittrice. Il suo interesse per la biologia è nato con la frequentazione di un corso obbligatorio di scienze durante il quale ebbe modo di leggere i trattati degli esperimenti di genetica che Gregor Mendel condusse utilizzando le piante di pisello come modello sperimentale. La dottoressa Margulis ha proseguito i suoi studi all’Università di Madison, Wisconsin, e all’Università di Berkeley, California, dove ha ottenuto il dottorato nel 1963. La sua profonda, particolare e accurata conoscenza delle strutture intracellulari l’ha spinta a ipotizzare che le cellule eucariotiche avessero avuto origine da una serie di eventi endosimbiontici, in cui fossero stati coinvolti molti organismi procariotici. Il termine endo (dal greco “all’interno”) si riferisce a una particolare condizione in cui una cellula si viene a trovare all’interno di un’altra. All’epoca (1967), però, quell’ipotesi è stata considerata quantomeno oltraggiosa, mentre molte altre idee della Margulis hanno cominciato invece a essere ampiamente accettate. L’endosimbiosi intesa come spiegazione dell’origine dei mitocondri era già stata proposta nel 1927 da Ivan Wallin, il quale aveva notato che mitocondri e batteri erano molto simili per dimensione, forma e colorazioni citologiche. L’ipotesi di Wallin fu considerata troppo fantasiosa e priva di veri fondamenti scientifici, e venne ignorata fino al momento in cui non fu nuovamente riconsiderata dalla Margulis. Dagli anni ’60 a oggi le conoscenze sui mitocondri e sui cloroplasti sono aumentate enormemente, e si è anche scoperto che contengono DNA e si replicano per divisione. La Margulis non focalizzò la sua attenzione sull’origine dei singoli organelli, ma al contrario cercò di fornire una spiegazione sull’origine dell’intera cellula eucariotica, che contiene anche i centrioli considerati un’altra possibile vestigia batterica. La pubblicazione del suo articolo intitolato “Sull’origine delle cellule mitotiche” fu inizialmente rifiutata da diverse riviste scientifiche prima di essere accettata dalla rivista Journal of Theoretical Biology. Il concetto che una cellula eucariotica complessa potesse svilupparsi da una sorta di consorzio di cellule procariotiche reciprocamente dipendenti le une dalle altre era incompatibile con il punto di vista allora prevalente, secondo il quale l’evoluzione avveniva attraverso serie di piccoli passaggi. La teoria evoluzionistica dell’epoca non lasciava spazio alla sensazionale fusione tra cellule, e del loro materiale genetico,

che la Margulis aveva proposto nella sua teoria. Tuttavia, l’ipotesi della Margulis prese ugualmente forza e dopo la pubblicazione del suo libro intitolato Symbiosis in Cell Evolution, nel 1981, venne accettata dalla maggior parte della comunità scientifica biologica. Due principi fondamentali su cui si basa la teoria della Margulis, cioè che i mitocondri sono i discendenti dei batteri capaci di utilizzare ossigeno e che i cloroplasti sono derivati da batteri fotosintetici, sono quasi universalmente accettati. Al contrario, l’idea secondo la quale il citoplasma eucariotico è la parte rimanente di una cellula archeobatterica è ancora messa in discussione. La dottoressa Margulis, al momento della scomparsa, era impegnata nella raccolta di prove a sostegno di una sua quarta ipotesi, quella secondo cui i ciliati, i flagellati e alcune strutture sensoriali quali le cellule fotosensibili dell’occhio sono i discendenti di batteri spirocheti a vita libera. L’indicazione originale della Margulis in cui affermava che gli organelli come i mitocondri possono essere isolati e mantenuti in coltura non ha ancora trovato riscontro. Esiste però una serie di prove inconfutabili che conferma il trasferimento di materiale genetico tra questi organelli e il nucleo, osservazioni a supporto anche della teoria dell’endosimbiosi della Margulis. Infatti, alcune teorie evolutive più recenti indicano tra i fattori necessari al cambiamento alcune piccole mutazioni casuali e lo scambio di materiale genetico tra gli organismi, proprio come ipotizzato in precedenza dalla Margulis. Probabilmente attraverso l’ampliamento del suo lavoro sull’endosimbiosi batterica, la Margulis ha potuto anche intuire che le interazioni tra organismi diversi e quelle tra organismi e ambiente circostante costituiscono un singolo sistema capace di autoregolarsi. Questa nozione fa parte dell’ipotesi, conosciuta come Gaia, formulata da James Lovelock, secondo la quale la Terra è considerata come una sola entità vivente (Gaia era la dea greca della Terra). Però la Margulis era in assoluto disaccordo con coloro che cercavano di costruire una moderna mitologia basata su Gaia, ribadendo l’importanza di utilizzare strumenti e ragionamenti scientifici per scoprire la verità. Per questo motivo anche il modo di pensare secondo cui gli esseri umani sono al centro della vita sulla Terra non era per lei accettabile. La Margulis sosteneva invece che la sopravvivenza degli esseri umani sulla Terra dipende dalla nostra relazione con il riciclaggio dei rifiuti, con la purificazione delle acque e con i batteri produttori di ossigeno, insieme ai quali ci siamo evoluti per miliardi di anni, alcune volte in modo endosimbiontico. Sagan, L., On the origin of mitosing cells, J. Theor. Biol. 14, 255-274 (1967).

CAPITOLO 1 © 978-88-08-42096-1

Introduzione alla chimica della vita

11

D Gli organismi continuano a evolversi La selezione naturale che guidò l’evoluzione prebiotica continua a indirizzare quella degli esseri viventi attuali. Richard Dawkins ha paragonato l’evoluzione a un orologiaio privo della vista che produce schemi complessi per caso; tuttavia tale similitudine non riesce a rendere conto del grande arco di tempo e della modalità a piccoli passi, per tentativi ed errori, da cui trassero origine gli organismi complessi. In conseguenza di danni chimici o di errori inerenti al processo di replicazione compaiono in modo casuale piccole mutazioni (alterazioni nel materiale genetico di un individuo); una mutazione che aumenti le possibilità di sopravvivenza dell’individuo determina un incremento della probabilità che tale mutazione venga trasmessa alla generazione successiva. Le mutazioni vantaggiose tendono a diffondersi con rapidità in una popolazione, mentre quelle dannose portano alla scomparsa degli organismi che le contengono. La teoria dell’evoluzione per selezione naturale, formulata per la prima volta da Charles Darwin intorno al 1860, è stata confermata mediante osservazioni sperimentali. È quindi utile evidenziare e ricordare alcuni rilevanti, ma spesso fraintesi, principi dell’evoluzione. 1. L’evoluzione non ha un obiettivo particolare. Essa procede grazie a mutamenti casuali che possono influire sulla capacità di un essere vivente di riprodursi nelle condizioni predominanti; quando queste ultime cambiano, un organismo ben adattato al suo ambiente può trovarsi meglio o peggio. 2. Le variazioni tra gli individui consentono agli organismi di adattarsi ad alterazioni inaspettate. Ciò rappresenta uno dei motivi per cui le popolazioni geneticamente omogenee (per esempio, una varietà di granoturco) sono molto suscettibili a un singolo stimolo (per esempio, una ruggine fungina). Nelle popolazioni più eterogenee è più probabile che esistano individui maggiormente capaci di resistere alle avversità e quindi di riprendersi. 3. Il passato determina il futuro. Nuove strutture e funzioni metaboliche si generano da elementi preesistenti. Per esempio, le ali degli insetti non sono comparse spontaneamente, ma sembra si siano sviluppate gradualmente da piccole strutture preposte allo scambio di calore. 4. L’evoluzione è un processo in corso, sebbene non proceda esclusivamente verso una maggiore complessità. Una visione antropocentrica pone l’essere umano al culmine di uno schema evolutivo, ma già un semplice sguardo alle diversità tra le forme viventi rivela che le specie più semplici non si sono estinte e non hanno smesso di evolversi.

3 La termodinamica CONCETTI CHIAVE

• L’energia deve essere conservata ma può assumere diverse forme. • Nella maggior parte dei sistemi biologici l’entalpia è equivalente al calore. • L’entropia, una misura del disordine di un sistema, tende ad aumentare. • La variazione di energia libera di un processo è determinata dal cambiamento di entalpia e di entropia.

• Un processo spontaneo avviene con un decremento di energia libera. • Il cambiamento di energia libera di una reazione può essere calcolato in base alla temperatura, alla concentrazione e alla stechiometria dei reagenti e dei prodotti.

• I biochimici definiscono come condizioni standard quelle di un sistema a 25 °C, a una pressione di 1 atm e a un pH di 7,0.

• Gli organismi sono sistemi aperti non all’equilibrio che scambiano costantemente materiale ed energia con ciò che li circonda mantenendo l’omeostasi.

• Gli enzimi aumentano la velocità con cui una reazione si avvicina all’equilibrio.

PUNTO DI VERIFICA

• Spiegate quali sono i vantaggi selettivi della compartimentazione e delle vie metaboliche.

• Discutete le differenze tra i procarioti e gli eucarioti.

• Elencate i principali organelli eucariotici e le loro funzioni.

• Spiegate come mai una tassonomia basata sulle sequenze molecolari sia più accurata di una basata sulla morfologia.

• Quali dei tre domini sono procariotici? Quale dominio è più simile agli eucarioti?

• Spiegate in che modo i cambiamenti individuali fanno sì che l’evoluzione avvenga.

• Perché un cambiamento evolutivo è vincolato dal suo passato ma impossibile da prevedere?

12

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

Le normali attività degli esseri viventi, come il movimento, la crescita e la riproduzione, esigono un’immissione quasi costante di energia; persino a riposo una porzione considerevole del loro apparato biochimico è preposta all’acquisizione e all’utilizzazione dell’energia. Lo studio di quest’ultima e dei suoi effetti sulla materia rientra nell’ambito della termodinamica (dal greco thermón, “calore”, e dynamos, “potenza”). Anche se i sistemi viventi cercano di sfidare la termodinamica, la vita obbedisce in modo assoluto alle leggi di questa disciplina. La comprensione della termodinamica è importante non solo per descrivere in termini quantitativi un processo come una reazione biochimica, ma anche per poter stabilire anticipatamente se quel dato processo può realmente avvenire, cioè se il processo è spontaneo. Cominceremo rivedendo le leggi fondamentali della termodinamica, per poi focalizzare la nostra attenzione sull’energia libera e sul modo in cui essa è collegata alle reazioni chimiche. Infine, ci occuperemo del modo in cui i sistemi biologici gestiscono le leggi della termodinamica.

A La prima legge della termodinamica afferma che l’energia viene conservata

In termodinamica un sistema è definito come la porzione di universo di interesse, come per esempio la provetta in cui avviene una reazione, oppure un organismo; la parte rimanente dell’universo è definita come ambiente circostante. Il sistema possiede una certa quantità di energia (U). La prima legge della termodinamica stabilisce che l’energia è conservata e non può essere creata o distrutta. Quando un sistema va incontro a un cambiamento, una parte della sua energia può essere utilizzata per compiere un lavoro. La variazione energetica di un sistema è definita come la differenza tra il calore (q) che il sistema assorbe dall’ambiente circostante e il lavoro (w) svolto dal sistema sull’ambiente circostante. La lettera greca ∆ (delta) indica la variazione. ∆U = Ufinale – Uiniziale = q – w

[1.1]

Il calore è un riflesso del movimento casuale delle molecole, mentre il lavoro, definito come la forza moltiplicata per la distanza percorsa sotto la sua influenza, si associa al movimento organizzato. La forza può assumere numerose forme differenti, quali la forza gravitazionale esercitata da una massa su un’altra, la forza di espansione determinata da un gas, la forza tensionale esercitata da una molla o da una fibra muscolare, la forza elettrica di una carica su un’altra e le forze dissipative dell’attrito e della viscosità. Dato che l’energia può essere utilizzata per compiere diversi tipi di lavoro, a volte è più utile e corretto riferirsi all’energia come a qualcosa in grado di assumere diverse forme, come l’energia meccanica, l’energia elettrica e l’energia chimica, tutte forme di energia molto importanti nei sistemi biologici. La maggior parte dei processi biologici avviene a pressione costante e in queste condizioni il lavoro svolto dall’espansione di un gas (lavoro pressione-volume) è dato da P∆V. Diventa così utile definire una nuova entità termodinamica, l’entalpia (dal greco enthalpein, “riscaldare”), abbreviata in H: H = U + PV

[1.2]

Quando il sistema subisce un cambiamento a pressione costante, ∆H = ∆U + P∆V = qP – w + P∆V

[1.3]

dove qP è definito come calore a pressione costante. Dal momento che sappiamo già che in questo sistema w = P∆V ∆H = qP – P∆V + P∆V = qP

[1.4]

In altre parole, la variazione di entalpia è equivalente al calore. Inoltre, nella maggior parte delle reazioni biochimiche le variazioni di volume sono tra-

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

scurabili (P∆V ≈ 0), e così anche le differenze tra i loro valori di ∆U e di ∆H. Di conseguenza, la variazione di energia nei vari sistemi di reazione equivale alla variazione di entalpia. L’entalpia, analogamente all’energia, al calore e al lavoro, è espressa in unità joule (alcune unità e costanti biochimiche di comune utilizzo e altre convenzioni sono riportate nella Scheda 1.2). La termodinamica si rivela utile al fine di stabilire la spontaneità di un dato processo. Un processo spontaneo avviene senza l’immissione di altra energia dall’esterno del sistema (la spontaneità termodinamica non ha nulla a che vedere con la velocità con cui un processo si verifica). La prima legge della termodinamica, tuttavia, non è in grado di per sé di determinare se un processo è spontaneo o meno. Prendiamo in considerazione due oggetti a temperature differenti in contatto tra loro: il calore passa spontaneamente da quello più caldo a quello più freddo e mai viceversa; questo trasferimento di calore obbedisce alla prima legge della termodinamica, dal momento che l’energia complessiva (la somma dell’energia dei due oggetti) non varia. Si rende quindi necessario un ulteriore criterio per definire la spontaneità.

SCHEDA 1.2

13

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Le convenzioni usate in biochimica Per le misurazioni termodinamiche e di altra natura la biochimica moderna fa uso delle unità del Sistema Internazionale (SI), che utilizza il metro (m), il kilogrammo (kg) e il secondo (s), nonché le loro unità derivate. La tabella che segue elenca le unità e le costanti biochimiche di comune utilizzo e un certo numero di fattori di conversione. Unità Energia, calore, lavoro Potenziale elettrico

joule (J) volt (V)

kg ∙ m2 ∙ s−2 o C ∙ V J ∙ C−1

Prefissi impiegati per le unità mega (M) 106 kilo (k) 103 milli (m) 10−3 micro (μ) 10−6

nano (n) pico (p) femto (f ) atto (a)

10−9 10−12 10−15 10−18

Conversioni angstrom (Å) caloria (cal) kelvin (K)

10−10 m 4,184 J gradi Celsius (°C) + 273,15

Costanti Numero di Avogadro (N) Coulomb (C) Faraday (ℱ) Costante dei gas (R) Costante di Boltzmann (kB) Costante di Planck (h)

6,0221 × 1023 molecole ∙ mol−1 6,241 × 1018 cariche elettroniche 96 485 C ∙ mol−1 o 96 485 J ∙ V−1 ∙ mol−1 8,3145 J ∙ K−1 ∙ mol−1 1,3807 × 10−23 J ∙ K−1 (R/N) 6,6261 × 10−34 J ∙ s

In tutto il libro le masse molecolari delle particelle sono espresse in unità dalton (D), definite come 1/12 della massa di un atomo di carbonio 12C (1000 D = 1 kilodalton, kD). I biochimici utilizzano anche il peso molecolare, quantità adimensionale definita come il rapporto tra la massa della particella e 1/12 della massa di un atomo di carbonio 12C, che viene indicata dal simbolo Mr (che sta per massa molecolare relativa).

B La seconda legge della termodinamica afferma che l’entropia tende ad aumentare

In base alla seconda legge della termodinamica i processi spontanei sono contraddistinti dalla conversione dell’ordine in disordine; in tale contesto, il disordine è definito come il numero di modi, W, energeticamente equivalenti di disporre i componenti di un sistema. Consideriamo un sistema costituito da due palloni di uguale volume, uno dei quali contiene molecole di un gas ideale (Figura 1.10); quando il rubinetto posto sul collegamento tra i due palloni è aperto, le molecole si distribuiscono in maniera casuale, ma equivalente, tra i due recipienti (ogni molecola di gas ha il 50% di probabilità di trovarsi nel pallone di sinistra, quindi ci sono 2N modi differenti di distribuire le molecole casualmente tra i due palloni, dove N è il numero di molecole di gas; si noti che anche nel caso in cui N sia piccolo, per esempio 100, 2N è un numero enorme). La distribuzione di un numero uguale di molecole di gas in ogni pallone non dipende da alcuna legge del movimento, ma dal fatto che le probabilità di tutte le altre distribuzioni sono estremamente basse. Pertanto la probabilità che tutte le molecole del sistema si spostino spontaneamente nel pallone di sinistra (la condizione iniziale in cui W = 1) è pari a zero, anche se l’energia e l’entalpia di questa distribuzione sono esattamente le stesse di quelle delle molecole suddivise uniformemente tra i due palloni. Allo stesso modo, l’energia meccanica (lavoro) di un nuotatore che si tuffa in una piscina riscalda l’acqua (aumenta il movimento casuale delle sue molecole), ma il processo inverso, cioè un nuotatore che viene espulso dall’acqua grazie al movimento

(a)

(b)

Figura 1.10 Illustrazione dell’entropia. In (a), un gas occupa la parte sinistra dell’apparato formato da due palloni di uguali dimensioni, per cui l’entropia è bassa. Quando il rubinetto di separazione viene aperto (b), l’entropia aumenta mentre le molecole di gas diffondono avanti e indietro tra i palloni, raggiungendo, alla fine, una distribuzione uniforme, metà in ciascun pallone.

Il calore totale di questo sistema cambia quando il rubinetto di separazione viene aperto?

14

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

organizzato delle molecole di acqua che lo circondano, non è mai stato osservato, anche se questo processo non viola nessuna legge del moto. Dato che W è un numero molto grande e poco pratico da usare, il livello di casualità di un sistema è indicato dalla sua entropia (dal greco en, “in”, e tropé, “rotazione”), abbreviata con il simbolo S:

S = kB ln W

[1.5] −1

dove kB è la costante di Boltzmann. Le unità di S sono in J ∙ K (la temperatura assoluta, in gradi Kelvin, è un fattore da considerare, poiché l’entropia varia con la temperatura; per esempio, il disordine di un sistema aumenta all’aumentare della sua temperatura). La disposizione più probabile di un sistema è quella che rende massimo W e di conseguenza S. Se un processo spontaneo, come quello illustrato nella Figura 1.10, presenta variazioni complessive di energia e di entalpia (∆U e ∆H) pari a zero, la sua variazione di entropia (∆S) deve essere superiore a zero, cioè il numero di modi equivalenti per disporre il sistema nello stato finale deve essere superiore a quello dello stato iniziale. Inoltre, poiché ∆Ssistema + ∆Sambiente = ∆Suniverso > 0

[1.6]

tutti i processi aumentano l’entropia, cioè il disordine, dell’universo. Nei sistemi chimici e biologici è poco pratico, se non impossibile, determinare l’entropia di un sistema contando tutte le disposizioni equivalenti dei suoi componenti (W); tuttavia per l’entropia esiste un’espressione assolutamente equiparabile che si applica alle trasformazioni a temperatura costante tipiche dei sistemi biologici: per un processo spontaneo, ⌬S ⱖ

q T

[1.7]

Pertanto, in un processo la variazione di entropia può essere determinata per via sperimentale partendo da misurazioni di calore e temperatura.

C La variazione di energia libera determina la spontaneità di un processo

Non è possibile prevedere la spontaneità di un processo in base alla conoscenza della sola variazione di entropia di un sistema. Per esempio, 2 mol H2 e 1 mol O2, quando una scintilla le innesca, reagiscono (con reazione esplosiva) per formare 2 mol H2O; nelle molecole di acqua, i tre atomi che le compongono sono forzati a stare insieme e quindi presentano un ordine superiore rispetto alle tre molecole biatomiche libere da cui si sono formati. La reazione avviene quindi con un decremento dell’entropia del sistema. Qual è, allora, il criterio termodinamico che guida un processo spontaneo? Le equazioni 1.4 e 1.7 indicano che, a temperatura e pressione costanti: q P ⌬H ⫽ T T

[1.8]

∆H – T∆S ≤ 0

[1.9]

⌬S ⱖ

Pertanto,

Questo è l’effettivo criterio per la spontaneità, come lo formulò, nel 1878, J. Willard Gibbs, il quale definì l’energia libera di Gibbs (G, chiamata generalmente solo energia libera) come: G = H – TS

[1.10]

La variazione di energia libera per il processo è ∆G. Conseguentemente, a temperatura e pressione costanti, per i processi spontanei:

∆G = ∆H – T∆S < 0

[1.11]

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

I processi in cui ∆G è negativo sono definiti esoergonici (dal greco ergon, “lavoro”), mentre quelli non spontanei, che presentano valori di ∆G positivi (∆G > 0), sono detti endoergonici e devono essere spinti da un rifornimento di energia libera. Se un processo è esoergonico, il suo inverso è endoergonico e viceversa. Il valore di ∆G per un processo indica così se il processo può avvenire spontaneamente nella direzione in cui è stato scritto (vedi l’Esempio di calcolo 1.1). I processi all’equilibrio, quelli in cui le reazioni diretta e inversa si bilanciano in modo esatto, sono caratterizzati da ∆G = 0. I processi che avvengono con ∆G ≈ 0, per cui il sistema in effetti resta in equilibrio durante la trasformazione, sono detti reversibili. I processi che invece hanno ∆G ≠ 0 sono detti irreversibili. Un processo irreversibile con ∆G < 0 è detto favorito, o che avviene spontaneamente, mentre un processo irreversibile con ∆G > 0 è detto sfavorito. Un processo accompagnato da un incremento di entalpia (∆H > 0), fenomeno che si oppone alla trasformazione durante il processo, può procedere spontaneamente se la variazione di entropia è sufficientemente positiva (∆S > 0; Tabella 1.4); al contrario, un processo che presenta una diminuzione di entropia (∆S < 0) può avvenire se la sua variazione di entalpia è sufficientemente negativa (∆H < 0). È importante rilevare che un valore di ∆G ampiamente negativo non garantisce che un processo, come una reazione chimica, possa procedere con una velocità misurabile; quest’ultima dipende dal meccanismo della reazione, che non è subordinato a ∆G (Paragrafo 11.2) L’energia libera, e anche l’energia, l’entalpia e l’entropia sono funzioni di stato e i loro valori dipendono unicamente dalle condizioni o proprietà del sistema e non dalla via percorsa per raggiungere lo stato finale. Quindi le misurazioni termodinamiche si possono condurre prendendo in considerazione soÐ ESEMPIO DI CALCOLO 1.1

L’entalpia e l’entropia degli stati iniziali e finali di un sistema di reazione sono riportate nella tabella. H (J ∙ mol–1)

S (J ∙ K−1 ∙ mol−1)

Stato iniziale (prima della reazione)

54 000

22

Stato finale (dopo la reazione)

60 000

43

a. Calcolate la variazione di entalpia e la variazione di entropia della reazione. b. Calcolate la variazione di energia libera della reazione a una temperatura di 4 °C. La reazione è spontanea? c. A 37 °C, la reazione è spontanea? a. ∆H = Hfinale – Hiniziale = 60 000 J ∙ mol−1 – 54 000 J ∙ mol−1 = 6000 J ∙ mol−1 ∆S = Sfinale – Siniziale = ∆S = 43 J ∙ K−1 ∙ mol−1 – 22 J ∙ K−1 mol−1 – 21 J ∙ K−1 ∙ mol−1 b. Per prima cosa convertite la temperatura dai gradi centigradi (°C) in gradi Kelvin (K): 4 + 273 = 277 K. Applicate poi l’equazione 1.11. ∆G = ∆H – T∆S ∆G = (6000 J ∙ mol−1) – (277 K)(21 J ∙ K−1 ∙ mol−1) = 6000 J ∙ mol−1 – 5820 J ∙ mol−1 = 180 J ∙ mol−1 Il valore di ∆G è maggiore di zero, quindi a 4 °C questa reazione è endoergonica e non avviene spontaneamente. c. Per prima cosa convertite la temperatura dai gradi centigradi (°C) in gradi Kelvin (K): 37 + 273 = 310 K. ∆G = ∆H – T∆S ∆G = (6000 J ∙ mol−1) – (310 K)(21 J ∙ K−1 ∙ mol−1) = 6000 J ∙ mol−1 – 6510 J ∙ mol−1 = – 510 J ∙ mol−1

Il valore di ∆G è minore di zero, quindi a 37 °C questa reazione è esoergonica e avviene spontaneamente.

15

CAPITOLO 1

16

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 1.4 Variazione della spontaneità di una reazione (segno di ∆G) rispetto ai segni di ∆H e di ∆S

∆H

∆S

∆G = ∆H − T∆S



+

La reazione è favorita sia dalla variazione dell’entalpia (è esotermica) sia da quella dell’entropia. È spontanea (esoergonica) a tutte le temperature.





La reazione è favorita dalla variazione dell’entalpia, ma non da quella dell’entropia. È spontanea unicamente a temperature inferiori a T = ∆H/∆S.

+

+

La reazione è sfavorita dalla variazione dell’entalpia (è endotermica), ma favorita da quella dell’entropia. È spontanea unicamente a temperature superiori a T = ∆H/∆S.

+



La reazione è sfavorita sia dalla variazione dell’entalpia sia da quella dell’entropia. Non è spontanea (endoergonica) a tutte le temperature.

lo gli stati iniziale e finale del sistema e ignorando tutte le graduali variazioni di entalpia e di entropia che si verificano tra questi. Per esempio, in un organismo vivente (in vivo) è impossibile stabilire direttamente la variazione di energia per la reazione del glucosio con l’O2 a causa delle numerose altre trasformazioni chimiche concomitanti. Tuttavia, poiché ∆G dipende esclusivamente dagli stati iniziale e finale, si può analizzare la combustione del glucosio in un qualunque altro apparato adatto, facendo uso dei medesimi materiali di partenza (glucosio e O2) e prodotti finali (CO2 e H2O) che si ottengono in vivo. Un sistema può andare incontro a una trasformazione irreversibile ciclica che lo riporta al suo stato iniziale e quindi, per questo sistema, ∆G = 0. Tuttavia questa trasformazione deve essere accompagnata da un incremento di entropia (o disordine) dell’ambiente, per cui nel caso dell’universo ∆G < 0. Notate che il calore (q) e il lavoro (w) non sono funzioni di stato. Questo perché, come indica l’equazione 1.1, esse sono forme di energia intercambiabili, quindi queste quantità variano in base al percorso seguito nel cambiamento di stato del sistema. Non ha senso perciò parlare del contenuto di calore o del contenuto di lavoro di un sistema (come non avrebbe senso descrivere i soldi nel proprio conto in banca come se fossero composti da un numero prefissato di un certo tipo di monete e banconote).

D Le variazioni di energia libera possono essere calcolate in base ai valori delle concentrazioni all’equilibrio

L’entropia (cioè il disordine) di una sostanza aumenta con il suo volume; per esempio, un insieme di molecole di gas, nell’occupare tutto il volume a sua disposizione, rende massima la propria entropia (cioè assume una disposizione più disordinata). Analogamente, le molecole disciolte si distribuiscono in maniera uniforme in tutto il volume della soluzione che le contiene; perciò l’entropia è una funzione della concentrazione. Se l’entropia varia con la concentrazione, lo stesso deve avvenire per l’energia libera; pertanto la variazione di energia libera di una reazione chimica dipende dalla concentrazione sia delle sue sostanze che reagiscono tra loro (reagenti) sia di quelle generate dalla reazione (prodotti). Questo fenomeno riveste un significato rilevante, dato che molte reazioni biochimiche si svolgono nell’una o nell’altra direzione in base alle concentrazioni relative dei loro reagenti e prodotti. Le costanti di equilibrio sono correlate a ∆G.

È possibile misurare esclusivamente le variazioni di energia libera, entalpia ed entropia (∆G, ∆H e ∆S), non i loro valori assoluti (G, H ed S). Per confrontare queste variazioni fra sostanze differenti è perciò necessario esprimere i loro valori in relazione a uno stato standard (come per esempio indichiamo l’altitudine delle località geografiche rispetto al livello del mare, cui è assegnata in modo arbitrario altitudine zero). Descriveremo di seguito le convenzioni dello stato standard.

CAPITOLO 1

17

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

La relazione tra concentrazione ed energia libera di una sostanza A è pari approssimativamente a: – – [1.12] G A = GA° + RT ln[A] – dove G A è l’energia libera molare parziale o potenziale chimico di A (la sbarÐ retta indica la quantità per mole), G A° è l’energia libera molare parziale di A nel suo stato standard, R è la costante dei gas e [A] è la concentrazione molare di A; pertanto, per la reazione generale

aA + bB 34 cC + dD la variazione di energia libera è – – – – ∆G = cGC + dGD – aGA – bGB

[1.13]

– – – – ∆G° = cGC° + dGD° – aGA° – bGB°

[1.14]

e poiché le energie libere sono additive e la loro variazione nel corso di una reazione è pari alla somma delle energie libere dei prodotti meno quelle dei reagenti. Sostituendo tali relazioni nell’equazione 1.12 si ottiene:

DG

DG °

C

c

Dd

[1.15] Aa Bb dove ∆G° è la variazione di energia libera della reazione quando tutti i suoi reagenti e prodotti sono nel loro stato standard (vedi più avanti). Di conseguenza, l’espressione inerente alla variazione di energia libera di una reazione è costituita da due parti: (1) un termine costante il cui valore dipende esclusivamente dal tipo di reazione che avviene e (2) un termine variabile legato alle concentrazioni dei reagenti e dei prodotti, alla stechiometria della reazione, nonché alla temperatura. In una reazione all’equilibrio non vi è uno scambio netto (le velocità delle reazioni diretta e inversa sono uguali), dal momento che la variazione di energia libera della reazione in una direzione è bilanciata in maniera esatta da quella di segno contrario; allora, ∆G = 0, cosicché l’equazione 1.15 diventa: RT ln

∆G° = −RT ln Keq

[1.16]

– ESEMPIO DI CALCOLO 1.2

La variazione di energia libera standard di una reazione A n B è pari a −15 kJ ∙ mol−1; qual è la costante di equilibrio di tale reazione?

Dal momento che il valore di ∆G° è nodove Keq è la costante di equilibrio della reazione: to, l’equazione 1.17 può essere usata per c d C eq D eq DG ° RT calcolare Keq; ipotizzate che la tempera[1.17] e Keq tura sia di 25 °C (298 K): A aeq B beq Keq = e−∆G°/RT Il deponente “eq” indica le concentrazioni all’equilibrio dei reagenti e dei pro= e−(−15000 J·mol )/(8,314 J·mol ·K )(298 K) dotti (in generale, la condizione di equilibrio è chiaramente indicata dal conte= e 6,05 sto della situazione, così le concentrazioni all’equilibrio sono solitamente espres= 426 se senza deponente). La costante di equilibrio di una reazione può quindi essere calcolata a partire dai valori di energia libera – ESEMPIO DI CALCOLO 1.3 standard e viceversa (vedi l’Esempio di calcoUtilizzando i dati riportati nell’Esempio di calcolo 1.2, calcolate quale sia la realo 1.2). La reale variazione di energia libera le variazione di energia libera per la reazione A n B a 37 °C nel caso in cui sia di una reazione può essere calcolata dalla va[A] = 10,0 mM e [B] = 0,100 mM. riazione dell’energia libera standard (∆G°) e dall’effettiva concentrazione dei reagenti e Usate l’equazione 1.15 e ricordate che le unità di misura per la concentrazione sono moli per litro. dei prodotti (vedi l’Esempio di calcolo 1.3). Le equazioni dalla 1.15 alla 1.17 indica3B4 DG DG ° RT ln no che quando in un processo i reagenti sono 3A4 presenti in eccesso rispetto alle loro concen−1 ∆G = – 15 000 J ∙ mol + (8314 J ∙ mol−1 K−1)(37 + 273 K) ln(0,0001/0,01) trazioni di equilibrio la reazione netta pro= – 15 000 J ∙ mol−1 – 11 900 J ∙ mol−1 cederà verso destra fino a quando l’eccesso = – 26 900 J ∙ mol−1 dei reagenti non sarà stato tutto convertito −1

−1

−1

18

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

in prodotti e si sarà quindi raggiunto l’equilibrio. Al contrario, quando sono i prodotti a essere presenti in eccesso, la reazione netta procederà nella direzione opposta. Così, come affermato dal principio di Le Châtelier, qualsiasi deviazione dall’equilibrio stimola un processo che tende a riportare il sistema all’equilibrio. Nelle cellule parecchie reazioni metaboliche sono liberamente reversibili (∆G ≈ 0) e la direzione della reazione può invertirsi a seconda che vengano aggiunti reagenti alla cellula o che i prodotti siano rimossi dalla cellula stessa. Alcune reazioni metaboliche, però, sono irreversibili; esse procedono in una sola direzione (∆G 0. • La costante di equilibrio di un dato processo è correlata alla variazione di energia libera standard per tale processo. • Gli organismi viventi sono sistemi aperti che mantengono uno stato stazionario non all’equilibrio (omeostasi).

PROBLEMI 1. Quale dei gruppi funzionali della Tabella 1.3 conferisce alla

molecola una carica positiva? Quale invece conferisce una carica negativa? 2. Identificate i gruppi funzionali e i legami presenti all’interno dei circoletti nel composto seguente. O H N

C B

CH2CH2

CH2 CH2

N

C

C

C

O C

H

H

CH2

SH

2O

D

P

H2C

O

+

H2O

CO2

P

O

OH OPO322

COO2 HC H2C

OPO322 OH

2-Fosfoglicerato

e l’entalpia aumenta?

H

22O PO 3

E

2 NH3

8. Un processo può avvenire se l’entropia del sistema diminuisce

O

H

+

0,5 M NaCl

3-Fosfoglicerato

CH2 O

OH H

H

OH F

3. Quali reazioni sono generalmente caratterizzate da un incre-

mento dell’entropia: le reazioni di condensazione o di idrolisi? 4. Il batterio Thiomargarita namibiensis – di diametro circa 0,1-

0,3 mm – è visibile a occhio nudo. Qual è la sua dimensione rispetto alla dimensione di una tipica cellula procariotica? Qual è in confronto alla dimensione di una tipica cellula eucariotica? 5. In base ai dati sulle sequenze molecolari, a quale gruppo di procarioti sono più strettamente correlati gli eucarioti? 6. (a) Presenta un’entropia maggiore l’acqua allo stato liquido a 0 °C oppure il ghiaccio alla stessa temperatura? (b) Di quanto è diversa, se lo è, l’entropia del ghiaccio a −5 °C da quella a −50 °C? 7. Nei seguenti processi l’entropia aumenta o diminuisce? 2 NH3 (a) N2 + 3 H2 O

NH2

COO2 HC

O

A

C Urea

(d)

O

2O

(b) H2N

(c) 1 M NaCl

OH CH3

H

O

9. Indicate se le seguenti affermazioni sono vere o false.

(a) Si dice che una reazione è spontanea quando può procedere sia nella direzione in avanti sia nella direzione inversa. (b) Un processo spontaneo è sempre molto rapido. (c) Una reazione non spontanea procederà spontaneamente nella direzione inversa. (d) Un processo spontaneo può verificarsi con un’ampia diminuzione di entropia. 10. Considerate una reazione con ∆H = 15 kJ e ∆S = 50 J ∙ K−1. (a) A 10 °C e (b) a 80 °C la reazione è spontanea? 11. La variazione di entalpia a 298 K per la reazione A n B è pari a −7 kJ ∙ mol−1, mentre la variazione di entropia è di −25 J ∙ K−1 ∙ mol−1. La reazione è spontanea? Nel caso non lo fosse, per rendere la reazione spontanea bisognerebbe aumentare o diminuire la temperatura? 12. Quando la reazione A + B 34 C è all’equilibrio, le concentrazioni dei reagenti e dei prodotti sono le seguenti: [A] = 2 mM, [B] = 3 mM, [C] = 9 mM. Quanto vale la variazione di energia libera standard della reazione? 13. Calcolate ∆G°′ della reazione A + B 34 C + D a 25 °C, quando le concentrazioni all’equilibrio sono [A] = 10 μM, [B] = 15 μM, [C] = 3 μM e [D] = 5 μM. In condizioni standard, la reazione è esoergonica o endoergonica?

22

CAPITOLO 1

Introduzione alla chimica della vita

© 978-88-08-42096-1

14. Calcolate la costante di equilibrio della reazione

glucosio-1-fosfato + H2O n glucosio +

H2PO4−

a pH 7,0 e 25 °C (∆G°′ = −20,9 kJ ∙ mol−1). 15. La reazione di isomerizzazione

glucosio-1-fosfato (G1P) 34 glucosio-6-fosfato (G6P) ha un ∆G°′ di −7,1 kJ ∙ mol−1. Calcolate il rapporto all’equilibrio tra [G1P] e [G6P] a 25 °C. DOMANDE DIFFICILI 16. Perché la membrana cellulare non costituisce una barriera as-

soluta tra il citoplasma e l’ambiente esterno? 17. La maggior parte del volume della cellula di T. namibiensis (ve-

di Problema 4) è occupata da un grande vacuolo centrale. Perché gli scienziati sono rimasti sorpresi nello scoprire una cellula batterica che contiene un vacuolo? 18. Un batterio sferoidale di diametro pari a 1 μm contiene due molecole di una particolare proteina. Qual è la concentrazione molare della proteina? 19. Quante molecole di glucosio contiene la cellula del Problema 18 quando la concentrazione di glucosio al suo interno è 1,0 mM? 20. Per convertire il reagente A nel prodotto B, la variazione di entalpia è 7 kJ ∙ mol−1 e la variazione di entropia è 20 kJ ∙ K−1 ∙ mol−1. Sopra quale temperatura la reazione avviene spontaneamente?

21. La costante di equilibrio della reazione Q n R è 25.

(a) Se misceliamo 50 µM di Q con 50 µM di R, secondo quale via procederà la reazione? Procederà verso la maggiore produzione di Q o di R? (b) Calcolate le concentrazioni di equilibrio di Q ed R. 22. A 10 °C, la Keq per una reazione è 100. A 30 °C, Keq = 10. Durante la reazione l’entalpia aumenta o diminuisce? 23. Due reazioni biochimiche hanno la stessa Keq = 5 × 108 alla temperatura T1 = 298 K. Però, la reazione 1 ha ∆H° = −28 kJ ∙ mol−1, mentre la reazione 2 ha ∆H° = + 28 kJ ∙ mol−1. Le due reazioni utilizzano gli stessi reagenti. Un vostro collega ha ipotizzato che otterreste una resa migliore dai vostri reagenti se seguiste la via della reazione 2 piuttosto che procedere secondo la reazione 1 diminuendo la temperatura della reazione. Funzionerà davvero questa strategia? Di quanto bisognerebbe aumentare o diminuire la temperatura per cambiare il valore del rapporto K2/K1 da 1 a 10?

APPROFONDIMENTO Prendete in considerazione i metanogeni e i metanotrofi. Dove si incontrano tali organismi? Riassumete in che modo questi organismi ottengono energia e materia dall’ambiente che li circonda. Disegnate poi uno schema per illustrare l’indipendenza metabolica dei metanogeni e dei metanotrofi.

BIBLIOGRAFIA Origine ed evoluzione della vita Anet, F.A.L. (2004), The place of metabolism in the origin of life. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 654-659. [Discute diverse ipotesi proponendo che la vita si sia originata come un sistema in grado di autoreplicarsi o come un insieme di polimeri catalitici.] Bada J.L., e Lazcano, A. (2003), Prebiotic soup – revisiting the Miller experiment, Science 300, 745-756. McNichol, J. (2008), Primordial soup, fool’s gold, and spontaneous generation, Biochem. Mol. Biol. Ed. 36, 255-261. [Una breve introduzione sulla teoria, sulla storia, e sulla filosofia della ricerca dell’origine della vita.] Nisbet, E.G., e Sleep, N.H. (2001). The habitat and nature of early life. Nature 409, 1083-1091. [Illustra alcune ipotesi circa la Terra primordiale e l’origine della vita, compresa la possibilità che quest’ultima abbia avuto inizio presso le fonti idrotermali.]

Le cellule Reece, J.B., Urry, L.A., Cail, M.L., e Wasserman, S.A. (2014), Campbell Biology (10a ed.), Benjamin/Cummings. (Trad. it. Biologia, 2a ed. italiana condotta sulla 6a ed. americana, Zanichelli, Bologna 2004.) [Questo e altri esaurienti testi di biologia generale forniscono dettagli inerenti alle strutture dei procarioti e degli eucarioti.]

DeLong, E.F., e Pace, N.R. (2001), Enviromental diversity of bacteria and archea, Syst. Biol. 593, 470-478. [Descrive alcune delle sfide della classificazione tra i tre domini degli organismi microbici.] Goodsell, D.S. (2009), The Machinery of Life (2a ed.), Springer. Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Bretscher A., Ploegh, H., Amon, A., e Scott, M.P. (2012), Molecular Cell Biology (7a ed.), W.H. Freeman. (Trad. it. Biologia molecolare della cellula, 3a ed. italiana condotta sulla 6a ed. americana, Zanichelli, Bologna 2009) [Questo e altri libri di testo di biologia cellulare presentano rassegne approfondite sulla struttura della cellula.]

La termodinamica Kuriyan, J., Konforti, B., e Wemmer, D. (2013), The Molecules of Life. Physical and Chemical Principles, Capitoli 6-10, Garland Science. Tinoco, I., Jr., Sauer, K., Wang, J.C., Puglisi, J.C., Harbison, G., e Rovnyak, D. (2014), Physical Chemistry. Principles and Applications in Biological Sciences (5a ed.), Capitoli 2-4, Prentice-Hall. [La maggior parte dei testi di chimica fisica tratta in modo abbastanza approfondito la termodinamica.] van Holde, K.E., Johnson, W.C., e Ho, P.S. (2006), Principles of Physical Biochemistry (2a ed.), Capitoli 2 e 3, Prentice-Hall.

C A P I T O L O

2

LÕacqua Sulla superficie di una foglia l’acqua forma delle minuscole sfere, a causa dalla coesione fra le molecole d’acqua, dovuta ai legami idrogeno tra di esse. Queste interazioni deboli hanno un ruolo centrale anche nelle strutture e nelle funzioni delle molecole biologiche. [Kuttelvaserova Stuchelova/Shutterstock.]

Qualsiasi studio che riguardi la chimica della vita deve comprendere un’analisi dell’acqua; le molecole biologiche e le reazioni a cui queste vanno incontro possono essere comprese meglio se sono analizzate nel contesto del loro ambiente acquoso. Gli organismi sono costituiti per la maggior parte da acqua (nel caso del corpo umano in una percentuale di circa il 70%); inoltre sul nostro “pianeta blu” ne siamo completamente circondati. Oltre alla sua abbondanza, ai fini della biochimica l’acqua riveste un ruolo centrale per i seguenti motivi.

1. Quasi tutte le molecole biologiche assumono la forma che è loro peculiare (e quindi la loro funzione) in risposta alle proprietà fisiche e chimiche dell’acqua circostante. 2. L’acqua è il mezzo in cui avviene la maggior parte delle reazioni biochimiche. I reagenti e i prodotti delle reazioni metaboliche, i nutrienti, come pure i prodotti di eliminazione, sono trasportati dall’acqua all’interno delle cellule o scambiati tra loro. 3. L’acqua partecipa attivamente a molti tipi di reazioni chimiche che sostengono la vita; i reagenti effettivi sono spesso le sue componenti ioniche, gli ioni H+ e OH−. La reattività di numerosi gruppi funzionali presenti sulle molecole biologiche è in funzione delle concentrazioni relative di ioni H+ e OH− nel mezzo circostante. Tutti gli esseri viventi hanno bisogno di acqua, dagli organismi marini che vi trascorrono tutta la loro esistenza, a quelli terrestri che devono preservare l’acqua contenuta al loro interno tramite la cute protettiva. Non sorprende quindi di trovare forme di vita ogni volta che vi sia presenza di acqua allo stato liquido, come nei camini idrotermali, che possono raggiungere temperature anche di 121 °C, o nelle spaccature e fenditure tra le rocce a centinaia di metri al di sotto della superficie terrestre. Gli organismi che sopravvivono alla disidratazione, come i semi o le spore, sono in grado di farlo solo perché assumono uno stato di dormienza. Un esame dell’acqua dal punto di vista biochimico richiede un’analisi delle sue proprietà fisiche, del suo potere come solvente, nonché del suo comportamento chimico, vale a dire della natura degli acidi e delle basi nello stato acquoso.

24

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

1 Le proprietà fisiche dell’acqua CONCETTI CHIAVE

• Le molecole d’acqua, che sono polari, possono formare legami idrogeno con altre molecole.

• Nel ghiaccio le molecole d’acqua sono mantenute in una disposizione cristallina da legami idrogeno, ma quando l’acqua è in forma liquida i legami idrogeno si rompono e si riformano molto velocemente, originando un reticolo irregolare.

• Le forze di attrazione che agiscono sulle molecole biologiche comprendono le interazioni ioniche, i legami idrogeno e le interazioni di van der Waals.

• Le sostanze ioniche e polari si possono sciogliere in acqua. • L’effetto idrofobico spiega l’esclusione di gruppi non polari come un modo di rendere massima l’entropia delle molecole d’acqua.

• Le sostanze anfifiliche formano micelle o doppi strati (bilayers) che nascondono i loro gruppi idrofobici e contemporaneamente espongono i loro gruppi idrofilici all’acqua.

• Le molecole si diffondono attraverso membrane che sono permeabili a esse dalle regioni in cui la loro concentrazione è più elevata alle zone in cui la loro concentrazione è minore.

• Nella dialisi i soluti diffondono attraverso una membrana semipermeabile dalle regioni a concentrazione più elevata alle zone in cui la concentrazione è minore. Sacca di van der Waals Raggio di van der Waals dell’H = 1,2 Å

Raggio di van der Waals dell’O = 1,4 Å Lunghezza del legame covalente O ÑH = 0,958 Å

O

La natura incolore, inodore e insapore dell’acqua rende meno evidente la sua fondamentale importanza per gli esseri viventi. Nonostante il suo aspetto colpisca poco i nostri sensi, questo composto è tutt’altro che inerte. Le sue proprietà fisiche, uniche tra le molecole di dimensioni analoghe, le conferiscono una efficienza senza eguali come solvente. Le limitazioni a questa sua proprietà determinano rilevanti implicazioni per le strutture e le funzioni delle molecole biologiche.

A L’acqua è una molecola polare H

104,5°

H

(a) Coppie di elettroni che non fanno parte del legame

(b)

O

H

Figura 2.1 Struttura della molecola

di acqua. (a) Il profilo ombreggiato rappresenta la sacca di van der Waals, l’effettivo “spazio” occupato dalla molecola. (b) Gli orbitali sp3 dell’atomo di ossigeno sono disposti nella direzione degli spigoli di un tetraedro; due di essi contengono coppie di elettroni che non formano legami. Identificate le regioni ricche di elettroni e quelle povere di elettroni nella molecola di acqua.

Una molecola di acqua è costituita da due atomi di idrogeno uniti da un atomo di ossigeno; la distanza del legame O−H è pari a 0,958 Å (1 Å = 10−10 m), mentre l’angolo formato dai tre atomi è di 104,5° (Figura 2.1). Gli atomi di idrogeno non sono disposti lungo una linea retta, poiché i quattro orbitali ibridi sp3 dell’atomo di ossigeno si estendono approssimativamente verso i vertici di un tetraedro; gli atomi di idrogeno occupano due vertici del tetraedro e le coppie elettroniche dell’ossigeno non utilizzate per legami sono situate in corriH spondenza degli altri due (in una molecola tetraedrica perfetta, come per esempio il metano, CH4, gli angoli di legame sono di 109,5°); la deviazione dell’angolo di legame dell’acqua dall’angolo esatto di un tetraedro è dovuta alla maggiore repulsione esistente tra le coppie di elettroni nei due orbitali isolati rispetto a quella tra le coppie di elettroni meno ravvicinate che formano i legami C−H. La geometria angolare della molecola di acqua ha implicazioni fondamentali per i sistemi viventi. L’acqua è una molecola polare: l’atomo di ossigeno con i suoi elettroni non condivisi ha una parziale carica negativa (δ−) pari a −0,66e, mentre a ciascuno degli atomi di idrogeno è associata una parziale carica positiva (δ+) pari a +0,33e, dove e è la carica dell’elettrone. Le attrazioni elettrostatiche tra i dipoli di molecole di acqua sono fondamentali per le proprietà dell’acqua stessa e per il suo ruoLe molecole di acqua formano legami idrogeno.

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

25

Figura 2.2 Un legame idrogeno

H

O

H

O H H

tra due molecole d’acqua. Il legame idrogeno è rappresentato dalla linea punteggiata. La forza dell’interazione è massima quando il legame covalente O–H di una molecola è sulla linea retta che unisce il legame e la nuvola elettronica di un doppietto di elettroni dell’altra molecola.

lo di solvente biochimico. Le molecole di acqua adiacenti tendono a orientarsi in modo che il legame O−H di una molecola di acqua (l’estremità positiva) punti verso una delle coppie elettroniche dell’altra molecola (l’estremità negativa). La risultante associazione bidirezionale intermolecolare è nota come legame idrogeno (Figura 2.2). In genere è possibile rappresentare un legame idrogeno come D−H···A, dove D−H è un gruppo “donatore” debolmente acido, come per esempio O−H, N−H e A è un atomo “accettore” debolmente basico, con una coppia di elettroni non utilizzata come O o N. I legami idrogeno sono strutturalmente caratterizzati da una distanza H···A che deve essere almeno 0,5 Å più corta rispetto alla distanza di van der Waals (cioè la distanza minima tra due atomi non legati). Nell’acqua, per esempio, la distanza spaziale del legame idrogeno O···H è pari a circa 1,8 Å, rispetto a 2,6 Å della corrispondente distanza di van der Waals. I gruppi C−H, nella maggior parte dei casi, non formano legami idrogeno a causa della loro scarsa polarità (gli atomi C e H hanno elettronegatività quasi uguale). Una singola molecola di acqua contiene due atomi di idrogeno che possono essere “donati” e due coppie di elettroni non condivisi che possono invece agire da “accettori”. Ogni molecola è in grado di partecipare a un massimo di quattro legami idrogeno con altre molecole di acqua. Sebbene l’energia di un singolo legame idrogeno (∼20 kJ ∙ mol−1) sia relativamente bassa (per esempio, l’energia di un legame O−H covalente è pari a 460 kJ ∙ mol−1), l’altissimo numero di legami idrogeno presenti in un campione di acqua è alla base delle sue importanti proprietà. La struttura del ghiaccio offre un esempio della forza cumulativa di numerosi legami idrogeno. Studi di diffrazione dei raggi X e dei neutroni hanno consentito di stabilire che nel ghiaccio le molecole di acqua sono disposte in una struttura inusitatamente aperta. Ogni molecola di acqua nel ghiaccio è circondata da quattro molecole circostanti disposte a tetraedro e unite mediante legami idrogeno (Figura 2.3). In conseguenza della sua conformazione aperta, l’acqua è una delle pochissime sostanze che si espandono durante il congelamento (a 0 °C la densità dell’acqua allo stato liquido è di 1,00 g ∙ mL−1, mentre la densità del ghiaccio è pari a 0,92 g ∙ mL−1). L’espansione dell’acqua nel corso del congelamento ha conseguenze di estrema rilevanza per la vita sulla Terra. Supponiamo che l’acqua si possa contrarre durante il congelamento, cioè che la sua densità aumenti anziché diminuire. Come conseguenza di questa contrazione, il ghiaccio tenderebbe ad accumularsi sul fondo dei laghi e degli oceani invece che galleggiare sulla loro superficie. A parte un sottile strato di liquido superficiale generato dal riscaldamento del sole, anche quando la temperatura è elevata i mari rimarrebbero costantemente allo stato solido (a grandi profondità, persino nei mari tropicali, la temperatura dell’acqua si avvicina a 4 °C, la temperatura della sua densità massima). Pertanto il nostro pianeta sarebbe rimasto letteralmente congelato in una permanente età glaciale e forse la vita non avrebbe mai fatto la sua comparsa.

Il ghiaccio è un cristallo di molecole di acqua unite da legami idrogeno.

Figura 2.3 La struttura del ghiaccio.

Ciascuna molecola di acqua interagisce con altre quattro assumendo disposizioni tetraedriche. Gli atomi di ossigeno sono colorati mentre quelli di idrogeno sono bianchi e i legami idrogeno sono rappresentati da linee tratteggiate. [Da Pauling (1960), L., The Nature of the Chemical Bond, 3a ed. p. 465, Cornell University Press.] Espandete questo cristallo di ghiaccio disegnando altre molecole di acqua con i legami idrogeno appropriati.

CONCETTI DI BASE Comportamento molecolare Quando descriviamo le proprietà di una sostanza, come l’acqua o un’altra molecola, in realtà stiamo descrivendo il comportamento medio di una grande popolazione di molecole. La maggior parte dei metodi biochimici non è in grado di stabilire il comportamento di una singola molecola.

26

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

La fusione del ghiaccio induce il collasso dell’orientamento strettamente tetraedrico delle molecole di acqua unite da legami idrogeno, sebbene questi ultimi permangano tra le sue molecole quando essa passa allo stato liquido. Di fatto l’acqua allo stato liquido mostra un contenuto in legami idrogeno solo di circa il 15% inferiore rispetto al ghiaccio. [L’entalpia di sublimazione dell’acqua (il ∆H necessario alla conversione di un solido in un gas) è di 47 kJ ∙ mol−1, di cui solo circa 6 kJ ∙ mol−1 sono attribuibili all’energia cinetica delle molecole di acqua in fase gassosa. Quindi, 6 kJ ∙ mol−1 dell’entalpia di fusione dell’acqua (il ∆H necessario per convertire un solido in un liquido) rappresentano (6 × 100)/(47 − 6) = 15% dell’energia necessaria per rompere tutti i legami idrogeno intermolecolari dell’acqua (le molecole di acqua in fase gassosa a 1 atm non hanno interazioni intermolecolari significative).] Inoltre, il punto di ebollizione dell’acqua (100 C°) è 264 °C più alto rispetto a quello del metano (−164 C°), una sostanza con massa molecolare molto simile a quella dell’acqua ma che non è in grado di formare legami idrogeno (sostanze che presentano associazioni intermolecolari simili e masse molecolari equivalenti dovrebbero avere punti di ebollizione vicini). Questo e altri fenomeni, come l’elevata tensione superficiale dell’acqua, dimostrano la straordinaria coesione interna dell’acqua allo stato liquido, che deriva dai suoi legami idrogeno intermolecolari.

Dal momento che ogni molecola di acqua allo stato liquido si riorienta circa una volta ogni 10−12 secondi, sono molto poche le tecniche sperimentali in grado di indagare l’istantanea disposizione di tali molecole. Considerazioni teoriche ed evidenze spettroscopiche indicano che, nell’acqua allo stato liquido, ciascuna molecola è unita mediante legami idrogeno alle quattro adiacenti più vicine, come accade nel ghiaccio; tuttavia questi legami idrogeno sono distorti e i reticoli di molecole interconnesse sono irregolari e di forme diverse. Per esempio, nell’acqua allo stato liquido di solito si osservano anelli di molecole unite da legami idrogeno composti da tre-sette membri (Figura 2.4), che si differenziano dagli anelli a sei membri caratteristici del ghiaccio (Figura 2.3). In più, questi reticoli si decompongono e si riformano ogni 2 × 10−11 secondi circa; perciò l’acqua allo stato liquido consiste di un reticolo tridimensionale (cluster), in rapida fluttuazione, di molecole unite da legami idrogeno. Dato che il ∆H di fusione e quello di sublimazione del ghiaccio sono entrambi quantità positive e che ∆G = ∆H − T∆S deve essere negativo perché il processo sia spontaneo (Paragrafo 1.3C), è l’incremento di ∆S a guidare il processo, cioè il disordine delle molecole di acqua allo stato gassoso. La struttura dell’acqua allo stato liquido è irregolare.

Figura 2.4 Anelli di molecole

d’acqua. Questi modelli contenenti tre, quattro o cinque molecole si fondano su previsioni teoriche e dati spettroscopici. [Liu, K., Cruzan, J. D., Saykally, R. J. (1996), Science 271, 929.]

I legami idrogeno e altre interazioni deboli nelle molecole biologiche. I biochimici si interessano non solo dei legami covalenti forti che definiscono la struttura chimica delle molecole, ma anche delle forze deboli che agiscono in condizioni fisiche relativamente blande. Le strutture della maggior parte delle molecole biologiche sono determinate dall’influenza collettiva esercitata da numerose interazioni singolarmente deboli. Le forze elettrostatiche deboli di cui si occupa la biochimica includono le interazioni ioniche, i legami idrogeno e le forze di van der Waals. L’energia di associazione di due cariche elettriche, q1 e q2, immerse in un mezzo con costante dielettrica D e separate da una distanza r, è data dalla legge di Coulomb:

U5

kq 1q 2 Dr

[2.1]

dove k = 9,0 × 109 J ∙ m ∙ C−2 è una costante di proporzionalità. La costante dielettrica varia con la polarità del mezzo; assume valore 1 (per definizione) nel vuoto, è in un intervallo da 1,5 a 3 per gli idrocarburi, è 78,5 nell’acqua allo stato liquido. In generale l’energia di associazione di due gruppi carichi (corrispon-

CAPITOLO 2

TABELLA 2.1 Energie di legame nelle biomolecole

Tipo di legame Covalente

Non covalente Interazioni ioniche Forze di van der Waals Legame idrogeno Interazione dipolo-dipolo

(a) Interazioni tra dipoli permanenti

Esempio

Energia di legame tipica (kJ · mol–1)

OOH C OH C OC

460 414 348



+

H3NO

O

H

O

C

O

C

δ+ δ–

C H

86



H

C



+

δ+ δ–

H3 C

C=O

δ+

δ–

9,3 (c) Forze di dispersione di London

H H

δ+ δ–

C=O

(b) Interazioni dipolo-dipolo indotto

20 O



+

C=O

+

OCOO

H

Forze di dispersione di London

27

L’acqua

© 978-88-08-42096-1



+



+

0,3

H

dente all’energia necessaria per separarli completamente nel mezzo di interesse) è inferiore all’energia di un legame covalente ma maggiore rispetto a quella di un legame idrogeno (Tabella 2.1). Le associazioni non covalenti tra molecole neutre, note complessivamente come forze di van der Waals, si instaurano a partire da interazioni elettrostatiche tra dipoli permanenti o indotti (il legame idrogeno rappresenta un tipo particolare di interazione dipolare). Le interazioni tra dipoli permanenti, come per esempio i gruppi carbonilici (Figura 2.5a), sono più deboli rispetto alle interazioni ioniche. Inoltre, la loro energia varia in base a r−3, quindi queste forze si riducono rapidamente con la distanza. Un dipolo permanente induce altresì un momento dipolare in un gruppo adiacente distorcendo elettrostaticamente la sua distribuzione elettronica (Figura 2.5b). Tali interazioni dipolo permanente-dipolo indotto sono comunemente molto più deboli rispetto a quelle dipolo-dipolo. In ogni istante le molecole non polari presentano un piccolo momento dipolare orientato in modo casuale che deriva dal rapido movimento fluttuante dei loro elettroni; tale momento dipolare transitorio può polarizzare gli elettroni in un gruppo adiacente (Figura 2.5c) e quindi i gruppi si attraggono reciprocamente. Queste interazioni, dette forze di dispersione di London, sono estremamente deboli e diminuiscono in maniera così rapida con la distanza (r−6) da risultare significative solo per i gruppi che si trovano in stretto contatto. Esse sono ugualmente importanti nel determinare le strutture delle molecole biologiche, le quali contengono al loro interno numerosi gruppi vicini tra loro (è importante notare che le forze di dispersione di London si instaurano tra tutti gli atomi, a differenza degli altri tipi di interazioni non covalenti, che avvengono solo tra atomi con differente elettronegatività).

B Le sostanze idrofiliche si sciolgono in acqua La solubilità dipende dalla capacità di un solvente di interagire con un soluto più fortemente di quanto non facciano tra loro le particelle di quest’ultimo. L’acqua viene detta anche “solvente universale”. Ovviamente questa affermazione non può essere presa alla lettera; è però vero che l’acqua ha la capacità di far sciogliere più tipi di sostanze e in quantità superiori rispetto a qualsiasi altro solvente. In particolare, il carattere polare dell’acqua la rende un solvente eccellente per i materiali polari e ionici, che per questo motivo sono definiti idrofilici (dal greco hydro, “acqua”, e philos, “amante di”). D’altro canto, le sostanze non polari sono praticamente insolubili in acqua (“l’olio e l’acqua non si miscelano”) e, di conseguenza, sono definite idrofobiche (dal greco phobos, “paura”). Le sostanze

CH3

δ+

δ–

H3 C

δ+

δ–

Figura 2.5 Interazioni dipolo-dipolo. La forza di ciascun dipolo è indicata dallo spessore della relativa freccia. (a) Interazione tra dipoli permanenti. (b) Interazione dipolo–dipolo indotto. (c) Forze di dispersione di London.

CONCETTI DI BASE Interazioni intermolecolari Nei sistemi biologici, i legami covalenti tengono insieme gli atomi per formare molecole, ma le interazioni non covalenti – come le interazioni ioniche, i legami idrogeno e altre interazioni di van der Waals – determinano come queste molecole possano “riconoscere” o interagire con altre molecole.

28

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

H

H

δ+

δ+ O δ–

H

O δ–

H

Na+ δ– O

H

δ– O

δ+

H δ+

H

H

δ– O H δ+ H H

Cl–

δ+ δ– O H

H δ+ O H

δ–

Figura 2.6 Solvatazione degli

ioni. I dipoli delle molecole di acqua circostanti sono orientati secondo la carica dello ione. Qui è mostrato un solo strato di molecole di solvente. Questa figura non mostra il reale comportamento dell’acqua; le rapide fluttuazioni delle molecole di acqua in soluzione fanno sì che esse assumano un ordine solo parziale intorno agli ioni a cui sono associate.

non polari, tuttavia, sono solubili nei solventi non polari, per esempio CCl4 ed esano. Queste proprietà possono essere riassunte nella massima “il simile scioglie il suo simile”. Per quale motivo i sali quali NaCl si sciolgono in acqua? I solventi polari come l’acqua indeboliscono le forze di attrazione esistenti tra ioni con cariche opposte (per esempio, Na+ e Cl−) e possono quindi tenerli separati (nei solventi non polari gli ioni di carica opposta si attraggono reciprocamente in modo così forte da unirsi e formare un sale solido). Uno ione immerso in un solvente polare come l’acqua attrae le estremità dei dipoli del solvente dotate di cariche opposte alla sua (Figura 2.6) e così lo ione viene circondato da uno o più strati concentrici di molecole di solvente orientate, che essenzialmente disperdono la carica ionica su un volume molto più grande. Tali ioni sono detti solvatati oppure idratati (quando il solvente è l’acqua). Le molecole di acqua negli strati di idratazione che circondano uno ione si muovono più lentamente rispetto a quelle non coinvolte nella solvatazione dello ione. In una massa d’acqua il costo energetico della rottura di un legame idrogeno è basso, poiché è probabile che vi sia la contestuale formazione di un altro legame idrogeno. Il costo energetico è superiore per le molecole di acqua relativamente ordinate appartenenti allo strato di idratazione. L’energetica della solvatazione svolge una funzione anche nell’ambito delle reazioni chimiche, poiché, per potersi avvicinare a un altro gruppo, un reagente deve liberarsi delle sue molecole di acqua di idratazione (le molecole presenti negli strati di idratazione). I dipoli presenti nei legami di molecole polari non cariche le rendono solubili in acqua per gli stessi motivi indicati per le sostanze ioniche. Le solubilità delle sostanze polari e ioniche aumentano quando esse contengono gruppi funzionali, per esempio i gruppi ossidrilico (OH), carbonilico (CPO), carbossilato (COO−) o ammonio (NH+ 3 ), che possono formare legami idrogeno con l’acqua come illustrato nella Figura 2.7. Quindi le biomolecole solubili in acqua, come le proteine, gli acidi nucleici e i carboidrati, sono ricche di questi gruppi polari. Al contrario, le sostanze non polari, come il metano o altri idrocarburi, sono prive di gruppi donatori e accettori di legami idrogeno.

C L’effetto idrofobico causa l’aggregazione delle sostanze non polari in acqua Figura 2.7 Formazione di legami

Identificate i donatori e gli accettori dei legami idrogeno.

(a) R O

Quando una sostanza non polare viene aggiunta a una soluzione acquosa non si discioglie, ma piuttosto è esclusa dall’acqua. La tendenza dell’acqua a rendere minimi i propri contatti con le molecole idrofobiche • definita effetto idrofobico. Come vedremo, numerose molecole e aggregati molecolari di grandi dimensioni, come le proteine, gli acidi nucleici e le membrane cellulari, assumono almeno in parte la loro specifica conformazione in risposta all’effetto idrofobico.

(b)

H H

H

R

H

C

H

O. . .

R9 R

C

H



H

R

H

H

H

H... O

+

N

O

H

H

H

O

O

O

H

O

...

O

O

...

O

...

H

R

H

(d) H

H

...

O

H... O

H

...

...

H

(c) O

...

idrogeno con gruppi funzionali. L’acqua forma legami idrogeno con (a) gruppi ossidrilici, (b) gruppi chetonici, (c) ioni carbossilato e (d) ioni ammonio.

H

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

29

TABELLA 2.2 Variazioni termodinamiche relative al trasferimento di idrocarburi dall’acqua a solventi non polari a 25 °C

𝚫H (kJ ∙ mol−1)

−T𝚫S (kJ ∙ mol−1)

𝚫G (kJ ∙ mol−1)

CH4 in H2O 34 CH4 in C6H6

11,7

−22,6

−10,9

CH4 in H2O 34 CH4 in CCl4

10,5

−22,6

−12,1

C2H6 in H2O 34 C2H6 in benzene

9,2

−25,1

−15,9

C2H4 in H2O 34 C2H4 in benzene

6,7

−18,8

−12,1

C2H2 in H2O 34 C2H2 in benzene

0,8

−8,8

−8,0

Benzene in H2O 34 benzene liquidoa

0,0

−17,2

−17,2

Toluene in H2O 34 toluene liquidoa

0,0

−20,0

−20,0

Processo

Dati misurati a 18 °C. Fonte: Kauzmann, W. (1959). Adv. Protein Chem. 14, 39.

a

Consideriamo la termodinamica del trasferimento di una molecola non polare da una soluzione acquosa a un solvente non polare. In tutti i casi la variazione di energia libera è negativa e quindi questi trasferimenti sono spontanei (Tabella 2.2). È interessante rilevare che tali processi di trasferimento sono endotermici (∆H positivo) o isotermici (∆H = 0); dal punto di vista dell’entalpia, è più o meno ugualmente favorevole per le molecole non polari disciogliersi in acqua o in solventi non polari. La variazione di entropia (espressa come −T∆S) è invece sempre ampia e negativa. È chiaro che il trasferimento di un idrocarburo da un mezzo acquoso a uno non polare è governato per via entropica (vale a dire la variazione di energia libera è dovuta precipuamente a un cambiamento di entropia). L’entropia, o “disordine”, è una misura della disposizione delle molecole in un sistema (Paragrafo 1.3B). Se l’entropia aumenta quando una molecola non polare abbandona una soluzione acquosa, deve diminuire nel momento in cui tale molecola passa nell’ambiente acquoso. Il decremento di entropia che si ha quando una molecola non polare è solvatata dall’acqua è stato osservato sperimentalmente, non è quindi una conclusione teorica. Le variazioni di entropia sono però troppo ampie per rispecchiare esclusivamente i mutamenti nelle conformazioni degli idrocarburi; pertanto le variazioni che si osservano nei valori di entropia devono trarre origine prevalentemente da una sorta di ordine che compare nell’acqua stessa. Qual è la natura di questo ordine? L’esteso reticolo di legami idrogeno delle molecole di acqua allo stato liquido viene interrotto in presenza di un gruppo non polare. Un gruppo non polare non è in grado né di accettare né di donare legami idrogeno, e così le molecole di acqua sulla superficie della cavità occupata dal gruppo non polare non possono formare legami idrogeno con altre molecole come avviene di solito. Per rendere massima la loro capacità di formare legami idrogeno, queste molecole di acqua superficiali si orientano formando un reticolo di legami idrogeno che racchiude la cavità (Figura 2.8). Questo orientamento genera un aumento nell’ordine delle strutture che l’acqua assume, dal momento che il numero di modi in cui le sue molecole possono formare legami idrogeno intorno alla superficie di un gruppo non polare è inferiore rispetto a quello di molecole di acqua in condizioni normali. Le molecole di acqua possono sempre formare lo stesso numero di legami idrogeno, ma per farlo devono rinunciare in parte alla loro libertà di rotazione e di traslazione. Purtroppo la continua fluttuazione dell’organizzazione strutturale dell’acqua allo stato liquido non ha ancora consentito di ottenere una descrizione dettagliata di questo processo di ordinamento. Un modello propone che l’acqua formi delle “gabbie” di legami idrogeno, analogamente a quanto si osserva nel caso del ghiaccio, intorno ai gruppi non polari, come mostrato nella Figura 2.8. Le

Soluto non polare

Figura 2.8 Orientamento di molecole

di acqua intorno a un soluto non polare. Al fine di rendere massimo il numero di legami idrogeno, le molecole di acqua formano una “gabbia” intorno al soluto; le linee tratteggiate rappresentano i legami idrogeno.

30 (a)

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

(b)

Figura 2.9 Aggregazione di

molecole non polari in acqua. (a) L’idratazione di singole molecole non polari disperse (in marrone) determina una diminuzione dell’entropia del sistema poiché le molecole di acqua di idratazione (in blu) non sono altrettanto libere di interagire con altre molecole di acqua come fanno invece in assenza delle molecole non polari. (b) L’aggregazione delle molecole non polari fa aumentare l’entropia di sistema, dal momento che il numero di molecole di acqua necessarie per idratare i soluti aggregati è inferiore a quello di molecole di acqua necessarie per idratare le molecole di soluto disperso. Tale incremento di entropia spiega l’aggregazione spontanea delle sostanze non polari in acqua. Spiegate perché non è corretto descrivere l’aggregazione delle sostanze non polari come il risultato di “legami idrofobici”.

molecole di acqua formano gabbie tetraedriche, e la disposizione ordinata delle molecole di acqua si estende per svariati strati oltre il primo in contatto con il soluto non polare. La sfavorevole energia libera di idratazione di una sostanza non polare, determinata dall’aumento che essa produce dell’ordine delle molecole di acqua circostanti, ha come risultato finale l’esclusione della sostanza non polare dalla fase acquosa; ciò accade in quanto l’area di superficie di una cavità contenente un aggregato di molecole non polari è inferiore alla somma delle aree di superficie delle cavità che ciascuna di queste molecole occuperebbe singolarmente (Figura 2.9). In tal modo l’aggregazione dei gruppi non polari riduce al minimo l’area di superficie della cavità, rendendo quindi massima l’entropia dell’intero sistema; in un certo senso, è come se i gruppi non polari fossero “spinti fuori” dalla fase acquosa. Quasi tutte le molecole biologiche presentano segmenti polari (o carichi) e non polari, e sono quindi contemporaneamente idrofiliche e idrofobiche. Le molecole di questo tipo, come gli ioni degli acidi grassi (i saponi; Figura 2.10), sono dette anfifiliche o anfipatiche (dal greco anphi, “entrambi”, e pathos, “sofferenza”). In che modo le sostanze anfifiliche interagiscono con un solvente acquoso? L’acqua tende a idratare la porzione idrofilica di un composto anfipatico, ma tende anche a escludere la regione idrofobica; conseguentemente, le sostanze anfifiliche si aggregano in strutture sostanzialmente ordinate. Per esempio, le micelle sono globuli che possono arrivare a contenere numerose migliaia di molecole anfifiliche disposte in modo che i gruppi idrofilici siano sulla superficie del globulo e possano interagire con il solvente acquoso; i gruppi idrofobici sono invece ammassati al centro, lontano dal solvente (Figura 2.11a). Ovviamente il modello presentato nella Figura 2.11a è oltremodo semplificato, in quanto è geometricamente impossibile che tutti i gruppi idrofobici occupino il centro della micella. Le molecole anfipatiche tendono a raggrupparsi in un modo più disorganizzato, che porta ugualmente a nascondere quasi tutti i gruppi idrofobici, lasciando esposti quelli polari (Figura 2.12). In alternativa, le molecole anfifiliche possono disporsi in modo da formare foglietti o vescicole a doppio strato (bilayer) in cui i gruppi polari sono in contatto con la fase acquosa (Figura 2.11b). Sia nelle micelle sia nei doppi strati l’aggregato è stabilizzato dall’effetto idrofobico, cioè dalla tendenza dell’acqua a escludere i gruppi idrofobici. Sovente le conseguenze dell’effetto idrofobico sono denominate forze idrofobiche o “legami” idrofobici; tuttavia, il termine legame implica una relazione direzionale distinta tra due entità, mentre l’effetto idrofobico agisce indirettamente sui gruppi non polari ed è privo di direzionalità. Sebbene si sia tentati di attribuire un certo grado di attrazione reciproca a un insieme di gruppi non polari presenti in un ambiente acquoso, la loro esclusione è dettata in larga misura dall’entropia delle molecole di acqua circostanti, non da una determinata “forza idrofobica” tra di essi (le forze di dispersione di London tra i gruppi non polari sono relativamente deboli). I composti anfifilici formano micelle e doppi strati.

O CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2

C

O–

Palmitato (C15H31COO–) Figura 2.10 Anioni di acidi grassi (saponi). Il palmitato e l’oleato sono composti anfifilici; ciascuno presenta un gruppo carbossilato polare e una lunga catena idrocarburica non polare.

CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2

H

H

C

C

O CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2

Oleato (C17H33COO–)

C

O–

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

31

Figura 2.11 Struttura delle

(a) Micella

H2O

“Code” idrocarburiche

micelle e dei doppi strati. In soluzione acquosa le “teste” polari delle molecole anfipatiche sono idratate, mentre le “code” non polari si aggregano per esclusione dall’acqua. (a) Una micella è un aggregato sferoidale. (b) Un doppio strato è un aggregato planare esteso.

Gruppi polari o “teste” (b) Doppio strato o bilayer H2O

D L’acqua si muove per osmosi, mentre i soluti si muovono per diffusione Il fluido in cui sono immerse le cellule degli organismi pluricellulari e quello interno a ogni singola cellula contengono molte sostanze disciolte che vanno dai piccoli ioni inorganici ai grandi aggregati molecolari. Le concentrazioni di tali soluti influiscono sulle proprietà colligative dell’acqua, cioè su quelle proprietà fisiche che dipendono dalla concentrazione delle sostanze disciolte piuttosto che dalle loro peculiarità chimiche. Per esempio, i soluti provocano una diminuzione del punto di congelamento dell’acqua e un innalzamento del suo punto di ebollizione, rendendo più difficile la cristallizzazione delle molecole di acqua sotto forma di ghiaccio o il loro trasferimento dalla soluzione alla fase gassosa. Anche la pressione osmotica è una proprietà colligativa. Quando una soluzione è separata dall’acqua pura per mezzo di una membrana semipermeabile che consente il passaggio delle molecole di solvente, ma non di quelle dei soluti, l’acqua tende a passare nella soluzione per uniformare la propria concentrazione su entrambi i lati della membrana. L’osmosi è il movimento del solvente da una regione ad alta concentrazione (in questo caso, l’acqua pura) a una a concentrazione relativamente più bassa (acqua contenente soluto disciolto). La pressione osmotica di una soluzione è la pressione che si deve applicare alla soluzione per bilanciare il flusso di acqua attraverso la membrana in entrambe le direzioni (la pressione applicata spinge più acqua a passare dalla soluzione attraverso la membrana); essa è proporzionale alla concentrazione del soluto (Figura 2.13). Per una soluzione 1 M, la pressione osmotica è pari a 22,4 atm. Prendiamo in considerazione gli effetti della pressione osmotica sulle proprietà delle cellule viventi, che possono essere paragonate a sacchetti semipermeabili contenenti una soluzione acquosa. Al fine di ridurre al minimo l’ingresso di acqua per osmosi, che provocherebbe la rottura della membrana cellulare, la cui resistenza alla tensione è relativamente debole, molte cellule animali sono normalmente immerse in una soluzione a pressione osmotica uguale a quella della soluzione interna alla cellula (così il flusso netto di acqua è pari a zero). Un’altra strategia, impiegata da quasi tutte le cellule delle piante e da gran parte dei bat-

Figura 2.12 Modello di una micella. In questo modello spaziale generato al computer di una micella sono mostrate venti molecole di ottilglucoside (un detergente costituito da una catena a otto atomi di carbonio con una testa polare zuccherina). Gli atomi polari di O dei gruppi glucosidici sono in rosso e quelli di C in grigio; per chiarezza quelli di H sono stati omessi. Le simulazioni al computer indicano che tali micelle hanno strutture irregolari in rapida fluttuazione (diversamente dall’aggregato rappresentato nella Figura 2.11a, che è sfericamente simmetrico, una conformazione inattuabile dal punto di vista sterico). In ogni istante porzioni delle code idrofobiche sono esposte sulla superficie della micella. [Per gentile concessione di Michael Garavito e Shelagh Ferguson-Miller, Michigan State University.]

32

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

(a)

(b)

(c)

Pressione

Soluzione concentrata Acqua Membrana permeabile all’acqua

Figura 2.13 La pressione osmotica. (a) Una membrana permeabile all’acqua separa dall’acqua pura una soluzione concentrata presente in un tubo. (b) Quando l’acqua passa per osmosi nella soluzione, l’altezza del liquido contenuto nel tubo aumenta. (c) La pressione che si oppone all’entrata dell’acqua è detta pressione osmotica (22,4 atm per una soluzione 1 M).

teri, consiste nel racchiudere la cellula con una parete cellulare rigida in grado di sostenere la pressione osmotica generata all’interno. Quando una soluzione acquosa è separata dall’acqua pura da una membrana permeabile all’acqua e ai soluti, questi ultimi possono passare dalla soluzione all’acqua e contemporaneamente l’acqua può entrare nella soluzione. Le molecole si spostano, o diffondono, in modo casuale sino a quando la concentrazione di soluto è uguale su entrambi i lati della membrana; a questo punto si stabilisce l’equilibrio e non si osserva alcun ulteriore flusso netto di acqua o di soluto (per esempio, le molecole continuano a spostarsi da una parte all’altra della membrana). È interessante notare che la tendenza dei soluti a diffondere da una zona a elevata concentrazione a una in cui la loro concentrazione è più bassa (come accade per esempio in risposta a un gradiente di concentrazione) è simile al flusso netto di molecole di gas da una regione ad alta pressione verso una a bassa pressione (Figura 1.10); entrambi i processi sono termodinamicamente favoriti perché comportano un aumento dell’entropia. La diffusione dei soluti è alla base della tecnica di laboratorio della dialisi, processo nel quale i soluti di dimensioni inferiori a quelle dei pori della membrana di dialisi passano liberamente tra il campione in dialisi e la soluzione sino al raggiungimento dell’equilibrio (Figura 2.14). Le sostanze più grandi non possono attraversare la membrana e rimangono nel compartimento di origine. La dialisi si rivela utile in particolare per separare molecole di grosse dimensioni, come per esempio proteine o acidi nucleici, da altre di grandezza inferiore. Dal momento che le piccole particelle solubili si spostano liberamente tra il campione e il mezzo circostante, la dialisi può essere ripetuta svariate volte allo scopo di sostituire il mezzo in cui è immerso il campione con un’altra soluzione. Gli individui che presentano danni renali sono mantenuti in vita grazie a procedure di dialisi in cui il sangue viene pompato attraverso un macchinario contenente una membrana semipermeabile. Mentre il sangue fluisce lungo una faccia della membrana, un fluido chiamato “dializzato” fluisce in direzione opposta sull’altra faccia della membrana. Questo procedimento, che sfrutta soluzioni in controcorrente tra loro, massimizza la differenza di concentrazione esistente tra le due soluzioni in modo che i materiali di scarto come l’urea e la creatinina (presenti nel sangue in elevate concentrazioni) possano efficacemente diffondere attraverso la membrana passando nel dia-

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

(a) All’inizio della dialisi

(b) All’equilibrio

33

PUNTO DI VERIFICA

• Disegnate un diagramma raffigurante una molecola d’acqua e indicate quali sono le estremità con le cariche parziali positive e negative.

• Confrontate le strutture del ghiaccio e Membrana di dialisi Solvente

Soluzione concentrata

dell’acqua allo stato liquido in base al numero e alle geometrie dei legami idrogeno che le caratterizzano.

• Quale tra i gruppi funzionali elencati nella Tabella 1.2 potrebbe funzionare da donatore in un legame idrogeno? Quale invece potrebbe essere un accettore in un legame idrogeno?

• Descrivete la natura e la forza relativa dei legami covalenti, delle interazioni ioniche e delle interazioni di van der Waals (legami idrogeno, interazioni dipolodipolo e forze di dispersione di London).

Figura 2.14 La dialisi. (a) Una soluzione concentrata è separata da un grande volume di

• Qual è la relazione tra polarità e idrofobicità?

solvente da una membrana di dialisi (qui mostrata come un sacchetto allungato annodato a entrambe le estremità); solo le molecole di piccole dimensioni possono diffondere attraverso i pori della membrana. (b) All’equilibrio, le concentrazioni delle molecole piccole sono quasi equivalenti su entrambi i lati della membrana, mentre le macromolecole rimangono all’interno del sacchetto di dialisi.

• Spiegate perché le sostanze polari si

Disegnate delle frecce nella Parte (a) per indicare la direzione di diffusione delle molecole di acqua e dei piccoli soluti.

• Spiegate il motivo per cui le sostanze

sciolgono in acqua e perché ciò non accade per le sostanze non polari.

• Qual è il ruolo svolto dall’entropia nell’effetto idrofobico? anfifiliche, in acqua, formano delle micelle o dei doppi strati lipidici.

• In che cosa l’osmosi si differenzia dalla lizzato (dove la loro concentrazione è minore). In tal modo anche l’acqua in eccesso può essere eliminata poiché essa si sposta nel dializzato per osmosi. Il sangue “purificato” viene poi fatto rifluire nel paziente. Alcune problematiche della dialisi clinica sono rappresentate dalla difficoltà di trovare acqua ultrapura per preparare il dializzato e dall’esigenza di monitorare il bilanciamento idrico e salino del paziente per tempi molto lunghi.

2 Le proprietà chimiche dell’acqua CONCETTI CHIAVE

• Una molecola d’acqua si dissocia formando gli ioni H+ e OH– con una costante di dissociazione di 10–14.

• L’acidità di una soluzione viene espressa sotto forma di un valore di pH, dove pH = –log[H+].

• Un acido è un composto in grado di donare un protone. Una base è un composto in grado di accettare un protone.

• La costante di dissociazione varia in funzione della forza di un acido. • L’equazione di Henderson-Hasselbalch mette in relazione il pH di una soluzione di un acido debole alla pK e alle concentrazioni dell’acido e della sua base coniugata.

• Una curva di titolazione dimostra che se le concentrazioni di un acido e della sua base coniugata sono vicine la soluzione è tamponata nei confronti delle variazioni di pH che potrebbero avvenire nel momento in cui alla soluzione venisse aggiunto un acido o una base.

• Molte molecole biologiche contengono gruppi ionizzabili che le rendono sensibili alle variazioni di pH.

L’acqua non è solamente una componente passiva della cellula o dell’ambiente extracellulare; le sue proprietà fisiche definiscono la solubilità di altre sostanze. Analogamente, le sue proprietà chimiche determinano il comportamento di altre molecole in soluzione.

diffusione? Quale di questi due processi avviene durante la dialisi?

• Descrivete quali sono le difficoltà dal punto di vista osmotico che una cellula deve affrontare nel caso in cui venga immersa in acqua pura o in una soluzione a elevata concentrazione salina.

CAPITOLO 2

L’acqua

O+ Salti protonici

H O

H

H

...

O

H

H

H

. . .O

H

... O H

...

Disegnate uno schema simile per mostrare un salto di ioni ossidrilici (OH–).

H

H

H

O

H

H H

O ... H

...

Figura 2.15 I salti protonici. I salti protonici avvengono più rapidamente rispetto alla migrazione molecolare diretta. Questo processo è alla base delle elevate mobilità ioniche osservate per gli ioni idronio (e per quelli ossidrilici) nelle soluzioni acquose.

© 978-88-08-42096-1

...

34

H

O

H

A L’acqua si ionizza formando ioni H+ e OH− L’acqua è una molecola neutra che ha una tendenza molto bassa alla ionizzazione. Esprimiamo la reazione di ionizzazione come

H2O 34 H+ + OH− In realtà il protone libero (H+) non esiste in soluzione; esso è associato a una molecola di acqua, in forma di ione idronio, H3O+. L’unione di un protone con un gruppo di molecole di acqua dà origine a strutture che hanno formule H5O2+, H7O3+, e così via. Per ragioni di semplicità, tuttavia, frequentemente indicheremo questi ioni soltanto come H+. L’altro prodotto di ionizzazione dell’acqua è lo ione ossidrile (idrossido), OH−. Il protone di uno ione idronio può saltare rapidamente da una molecola di acqua a un’altra e così via (Figura 2.15); per tale motivo le mobilità degli ioni H+ e OH− in soluzione sono molto più alte di quelle di altri ioni, che devono muoversi diffondendo attraverso la massa dell’acqua e portando con sé anche le molecole di acqua di idratazione. I salti protonici spiegano perché le reazioni acido-base sono le reazioni più veloci tra quelle che avvengono in soluzione acquosa. La reazione di ionizzazione (dissociazione) dell’acqua è descritta da un’espressione di equilibrio in cui la concentrazione della sostanza reagente è al denominatore, mentre quelle dei prodotti dissociati sono al numeratore:

K 5

[H1][OH 2] [H 2 O ]

[2.2]

K è la costante di dissociazione (in tutto il testo, le parentesi quadre simboleggiano le concentrazioni molari delle sostanze indicate, che in molti casi differiscono solo in modo trascurabile dalle loro attività; Paragrafo 1.3D). Poiché la concentrazione dell’acqua indissociata ([H2O]) è molto più alta rispetto alle concentrazioni degli ioni con cui è in equilibrio, essa può essere ritenuta costante ([H2O] = 1000 g ∙ L−1∕18,015 g ∙ mol−1 = 55,5 M) e quindi può essere incorporata in K per generare un’espressione per la ionizzazione dell’acqua, Kw = [H+] [OH−]

[2.3]

Il valore di Kw, il prodotto ionico dell’acqua, è pari a 10−14 M2 a 25 °C. L’acqua pura deve contenere quantità equimolari di H+ e OH−; quindi [H+] = [OH−] = (Kw)1/2 = 10−7 M. Dal momento che [H+] e [OH−] sono correlate reciprocamente per mezzo dell’equazione 2.3, quando [H+] è superiore a 10−7 M, [OH−] deve essere inferiore a questo valore in misura corrispondente e viceversa. Le soluzioni con [H+] = 10−7 M sono dette

CAPITOLO 2

Neutralità

Acidità

Basicità

Figura 2.16 Relazione tra il pH e le concentrazioni di H+ e OH– in acqua. Poiché il prodotto di [H+] e [OH–] è una costante (10–14), [H+] e [OH–] sono in relazione reciproca. Le soluzioni con una quantità relativamente maggiore di H+ sono acide (pH < 7), mentre quelle in cui è prevalente la quantità relativa di OH– sono basiche (pH > 7); infine, le soluzioni in cui [H+] = [OH–] = 10–7 M sono neutre (pH = 7). Si noti la scala logaritmica per la concentrazione ionica.

1 Concentrazione ionica (M)

35

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

[H1]

[OH2]

1024

1028

10212

1

3

5

7 pH

9

11

13

neutre, quelle in cui [H+] > 10−7 M sono dette acide, mentre le soluzioni nelle quali [H+] < 10−7 M sono definite basiche. La maggior parte delle soluzioni fisiologiche presenta concentrazioni di ioni idrogeno che si avvicinano alla neutralità; per esempio, il sangue umano è di norma leggermente basico, con [H+] = 4,0 × 10−8 M. Per quasi tutte le soluzioni i valori di [H+] sono così bassi da risultare poco pratici da utilizzare; una entità più pratica, introdotta nel 1909 da Søren Sørenson, è nota come pH: 1 [2.4] [H1] Quanto maggiore è il pH, tanto inferiore è la concentrazione di H+ e viceversa (Figura 2.16). Il pH dell’acqua pura è 7,0, mentre le soluzioni acide presentano valori di pH inferiori a 7,0 e quelle basiche hanno valori di pH superiori a 7,0 (vedi l’Esempio di calcolo 2.1). Si noti che soluzioni che differiscono di una unità di pH variano, per quanto concerne il valore di [H+], di un fattore pari a 10. Nella Tabella 2.3 sono riportati i valori di pH di alcune sostanze comuni. pH 5 – log[H1] 5 log

B Gli acidi e le basi alterano il pH Gli ioni H+ e OH− derivati dall’acqua sono fondamentali per le reazioni biochimiche che incontreremo in seguito in questo libro. Le molecole biologiche, come le proteine e gli acidi nucleici, possiedono numerosi gruppi funzionali che agiscono da acidi o da basi, per esempio i gruppi carbossilici o quelli amminici. Queste molecole influenzano il pH del mezzo acquoso circostante e le loro strutture e reattività dipendono a loro volta dal pH dell’ambiente. La conoscenza della chimica delle reazioni acido-base è quindi essenziale per comprendere il contesto di molti processi biologici. Gli effetti dell’acidificazione dell’oceano sulla vita marina sono descritti nella Scheda 2.1.

Ð ESEMPIO DI CALCOLO 2.1

1,0 × 10−4 moli di H+ (in forma di HCl) sono aggiunte a 1 litro di acqua pura. Determinate il pH finale della soluzione.

Il pH dell’acqua pura è 7, così [H+] = 10−7 M. La concentrazione degli H+ aggiunti è 10−4 M, che supera di molto la [H+] già presente. Quindi la [H+] complessiva è pari a 1,0 × 10−4 M, in modo che il pH è uguale a –log[H+] = –log(1,0 × 10−4) = 4.

TABELLA 2.3 Valori di pH

di alcune sostanze comuni Sostanza

14

Ammoniaca per uso domestico

12

Acqua di mare Sangue

HA + H2O 34 H3O+ + A−

8 7,4

Latte

7

Saliva

6,6

Succo di pomodoro

4,4

Aceto Succo gastrico

Secondo una definizione formulata nel 1923 da Johannes Brønsted e Thomas Lowry, un acido è una sostanza in grado di donare un protone, mentre una base è una sostanza che può accettare un protone. In base alla definizione di Brønsted-Lowry, una reazione acido-base può essere scritta nel modo seguente:

Un acido può donare un protone.

pH

NaOH 1 M

HCl 1 M

3 1,5 0

36

CAPITOLO 2

L’acqua

SCHEDA 2.1

© 978-88-08-42096-1

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Le conseguenze dell’acidificazione degli oceani Il crescente aumento nell’atmosfera della concentrazione del biossido di carbonio prodotto dagli esseri umani, che sembra contribuire notevolmente ai cambiamenti climatici sotto forma di riscaldamento globale del pianeta, sta avendo effetti anche sulla chimica degli oceani terrestri. Il CO2 atmosferico si scioglie in acqua e la reazione tra queste due componenti produce acido carbonico, che si dissocia immediatamente formando protoni e bicarbonato:

organismi che devono adattarsi alle nuove condizioni. Diversi organismi marini, compresi molluschi, molti coralli e alcune varietà di plancton, utilizzano gli ioni carbonato per costruire le loro conchiglie protettive costituite da carbonato di calcio (CaCO3). Però gli ioni carbonato si possono combinare anche con gli H+ formando bicarbonato:

CO2 + H2O 34 H2CO3 34 H+ + HCO3−

Di conseguenza, l’aumento dell’acidità dell’oceano potrebbe far diminuire la disponibilità di ioni carbonato e quindi diminuire la velocità di crescita degli organismi che si costruiscono le conchiglie di carbonato di calcio. Alcuni esperimenti hanno infatti dimostrato che in condizioni acide la calcificazione è notevolmente ridotta in alcuni organismi marini quali i ricci di mare e i coralli. È inoltre possibile che l’acidificazione dell’oceano dissolva le barriere coralline attualmente esistenti costituite principalmente da carbonato, che rappresentano degli ecosistemi molto ricchi di specie marine e un anello fondamentale della catena alimentare marina.

La dissociazione di ioni idrogeno dall’acido carbonico originato dal CO2 porta a un abbassamento del valore del pH. Ora gli oceani terrestri sono leggermente basici e hanno un pH di circa 8,0. È stato stimato che nei prossimi 100 anni il pH dell’oceano potrebbe scendere fino a valori di circa 7,8. Sebbene gli oceani agiscano da “scarico” del CO2 aiutando a compensare l’aumento del CO2 atmosferico, l’aumento dell’acidità dell’ambiente marino rappresenta un enorme problema per gli

CO32− + H+ 34 HCO3−

CaCO3 + H+ 34 HCO3− + Ca2+ È interessante altresì notare che non tutti gli organismi che si costruiscono da soli le conchiglie rispondono allo stesso modo ai livelli elevati di CO2. Alcuni esperimenti condotti sui coccolitoforidi (o coccolitofori, organismi eucariotici costituiti da una singola cellula racchiusi in piastre di carbonato di calcio; vedi illustrazione) dimostrano che almeno in alcune condizioni l’aumentato CO2 porta all’incremento del bicarbonato, che contribuisce effettivamente all’aumento della calcificazione: Ca2+ + 2 HCO3− 8n CaCO3 + CO2 + H2O

[STEVE GSCHMEISSNER / Photolibrary.]

CONCETTI DI BASE Chimica degli acidi e delle basi Un acido può agire da acido (donatore di elettroni) solo se è presente una base (accettore di elettroni), e viceversa. L’acido deve avere una base coniugata, e la base deve avere un acido coniugato. Se nell’espressione dell’equilibrio sembra che manchi un reagente, considerate come reagente l’acqua o i suoi ioni coniugati, H3O+ o OH−.

I risultati ottenuti da questi esperimenti indicano che l’impatto sugli organismi marini dell’aumentato CO2 può non essere una semplice questione di decremento del pH, ma può essere invece una funzione più complessa dei quantitativi relativi di tutte le specie carboniche disciolte presenti, che comprendono CO2, HCO3− e CO32−.

Un acido (HA) reagisce con una base (H2O) per dare luogo alla base coniugata dell’acido (A−) e all’acido coniugato della base (H3O+). Lo ione acetato (CH3COO−) è quindi la base coniugata dell’acido acetico (CH3COOH), mentre lo ione ammonio (NH4+) è l’acido coniugato dell’ammoniaca (NH3). La reazione acido-base è sovente abbreviata in:

HA 34 H+ + A− in cui la partecipazione di H2O è implicita. Un’espressione alternativa per una sostanza basica B è: HB+ 34 H+ + B Per una reazione acido-base la costante di equilibrio è espressa come costante di dissociazione, con le concentrazioni dei “reagenti” al denominatore e quelle dei “prodotti” al numeratore: [H O1][ A2 ] K5 3 [2.5] [HA ][H2O] La forza di un acido è specificata dalla sua costante di dissociazione.

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

Tuttavia, dato che nelle soluzioni acquose diluite il termine [H2O] = 55,5 M è essenzialmente costante, generalmente viene combinato con la costante di dissociazione, che quindi diventa: [H1][ A2 ] [2.6] K a 5 K [H 2 O ] 5 [HA ] Per ragioni di brevità, tuttavia, d’ora in avanti ometteremo il deponente “a”. Nella Tabella 2.4 sono elencate le costanti di dissociazione di alcuni acidi comuni. A volte può essere complesso usare le costanti di dissociazione; come nel caso dei valori di [H+], esse sono trasformate in valori di pK per mezzo della formula: pK = −log K

[2.7]

che è analoga all’equazione 2.4. Gli acidi possono essere classificati in base alle loro forze relative, cioè in base alla loro capacità di trasferire un protone all’acqua. Quelli elencati nella Tabella 2.4 sono noti come acidi deboli poiché sono solo parzialmente ionizzati in una soluzione acquosa (K < 1). Molti dei cosiddetti acidi minerali, come per esempio HClO4, HNO3 e HCl, sono acidi forti (K >> 1); dal momento che gli acidi forti trasferiscono rapidamente tutti i loro protoni all’acqua, l’acido più forte che può esistere in forma stabile nelle soluzioni acquose è H3O+ e, parimenti, nelle soluzioni acquose non può esistere una base più forte di OH−. Tutte le reazioni TABELLA 2.4 Costanti di dissociazione e valori di pK a 25 °C di alcuni acidi

K

Acido Acido ossalico

−2

5,37 × 10

pK 1,27 (pK1)

H3PO4

7,08 × 10−3

2,15 (pK1)

Acido formico

1,78 × 10−4

3,75

Acido succinico −

Ossalato Acido acetico −

−5

4,21 (pK1)

−5

4,27 (pK2)

−5

4,76

−6

5,64 (pK2)

−7

6,17 × 10 5,37 × 10

1,74 × 10

Succinato Acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES)

2,29 × 10

8,13 × 10

6,09

H2CO3

4,47 × 10−7

6,35 (pK1)a

Piperazina-N,N ′-bis(acido 2-etansolfonico) (PIPES)

1,74 × 10−7

6,76

H2PO4−

−7

6,82 (pK2)

Acido 3-(N-morfolino)propansolfonico (MOPS)

−8

7,08 × 10

7,15

Acido N-2-idrossietilpiperazin-N′-2-etansolfonico (HEPES) Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)

3,39 × 10−8

7,47

8,32 × 10−9

8,08

Acido borico

5,75 × 10−10 9,24 5,62 × 10−10 9,25

NH4+ Glicina (gruppo amminico) HCO3− Piperidina HPO42−

1,51 × 10

1,66 × 10−10 9,78 4,68 × 10−11 10,33 (pK2) 7,58 × 10−12 11,12 4,17 × 10−13 12,38 (pK3)

pK per la reazione complessiva CO2 + H2O 34 H2CO3 34 H+ + HCO3−; vedi la Scheda 2.2. Fonte: Dawson, R.M.C., Elliott, D.C., Elliott, W.H., Jones, K.M. (1986). Data for Biochemical Research, 3a ed., Oxford Science Publications, pp. 424-425; Good, N.E., Winget, G.D., Winter, W., Connolly, T.N., Izawa, S., Singh, R.M.M. (1966). Biochemistry 5, 467.

a

Quale delle sostanze elencate qui è l’acido più forte?

37

38

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

acido-base che avvengono nei sistemi biologici coinvolgono H3O+ (e OH−) e acidi deboli (e le loro basi coniugate). Il pH di una soluzione è determinato dalle concentrazioni relative di acidi e basi.

La relazione tra il pH di una soluzione e le concentrazioni di un acido e della sua base coniugata sono facilmente derivabili. L’equazione 2.6 può essere trasformata in: [HA ] [2.8] [H1] 5K 2 [A ] Estraendo il logaritmo negativo di ciascun termine (e ponendo pH = −log[H+]; equazione 2.4), si ottiene: [ A2 ] [2.9] pH 5 – log K 1 log [HA ] Sostituendo −log K con pK (equazione 2.7), si ottiene: pH 5 pK 1 log

[ A2 ] [HA ]

[2.10]

Questa relazione è nota come equazione di Henderson-Hasselbalch. Quando le concentrazioni molari di un acido (HA) e della sua base coniugata (A–) sono uguali, log ([A–]/[HA]) = log 1 = 0, e il pH della soluzione è numericamente equivalente al pK dell’acido. L’equazione di Henderson-Hasselbalch è molto utile per il calcolo, per esempio, del pH di una soluzione contenenÐ ESEMPIO DI CALCOLO 2.2 te una quantità nota di un acido debole e della sua base coniugata Calcolate il pH di 2 L di soluzione contenente (vedi l’Esempio di calcolo 2.2). Poiché questa equazione non tiene 10 mL di acido acetico 5 M e 10 mL di acetato conto della ionizzazione dell’acqua stessa, non può essere usata per di sodio 1 M. ricavare il pH di soluzioni di acidi o basi forti. Per esempio, in una soluzione 1 M di un acido forte, [H+] = 1 M e pH = 0; in una soluPer prima cosa calcolate le concentrazioni dell’acido zione 1 M di una base forte, [OH−] = 1 M, così [H+] = [OH−]/Kw e della base coniugata, esprimendole tutte in unità = 1 × 10−14 M e pH = 14. di moli per litro. Acido acetico: (0,01 L)(5 M)/(2 L) = 0,025 M Acetato di sodio: (0,01 L)(1 M)/(2 L) = 0,005 M

C I tamponi resistono alle variazioni di pH

Aggiungendo un volume di 0,01 mL di HCl 1 M a 1 L di acqua pura, il pH di quest’ultima varia da 7 a 5, in quanto si ha un aumento pari a 100 volte nella [H+]. Un tale cambiamento di pH non potrebbe essere tollerato dalla maggior parte dei sistemi biologici, in quanto anche variazioni molto più piccole di questo parametro possono influire drapH = pK + log([acetato]/[acido acetico]) sticamente sulle strutture e funzioni delle molecole biologiche. ManpH = 4,76 + log(0,005/0,025) pH = 4,76 – 0,70 tenere il pH relativamente costante diventa così di importanza fondapH = 4,06 mentale per i sistemi viventi. Al fine di comprendere come sia possibile impedire variazioni di pH, prendiamo in considerazione la titolazione di un acido debole con una base forte. La Figura 2.17 illustra come variano i valori di pH di soluzioni di acido ace− tico, di H2PO4− e di ione ammonio (NH+ 4 ) in seguito all’aggiunta di OH . È possibile costruire curve di titolazione come queste partendo da osservazioni sperimentali oppure utilizzando l’equazione di Henderson-Hasselbalch, per calcolare i punti lungo la curva (vedi l’Esempio di calcolo 2.3). Quando OH− reagisce con HA, i prodotti sono A− e acqua: Si sostituiscono le concentrazioni dell’acido e della base coniugata nell’equazione di Henderson-Hasselbalch, quindi dalla Tabella 2.4 si ottiene il pK per l’acido acetico.

HA + OH− 34 A− + H2O

Si possono ora analizzare diversi aspetti delle tre curve di titolazione della Figura 2.17. 1. Le curve presentano andamenti simili, ma sono spostate in senso verticale lungo l’asse del pH.

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

Punto intermedio (pH = pK ) [HA] 5 [A2]

Punto di partenza

14

[HA] > [A2]

Punto finale

[HA] < [A2]

13 12 11

39

Figura 2.17 Curve di titolazione per l’acido acetico, il fosfato e l’ammoniaca. Nel punto iniziale predomina la forma acida, ma via via che viene aggiunta una base forte (per esempio, NaOH) l’acido è convertito nella sua base coniugata. Nel punto intermedio della titolazione, nel quale pH = pK, le concentrazioni dell’acido e della base coniugata si equivalgono. Nel punto finale (punto di equivalenza) la base coniugata è prevalente e la quantità totale di OH– aggiunta coincide con l’ammontare di acido presente al punto di partenza. Le zone ombreggiate indicano gli intervalli di pH lungo i quali la soluzione corrispondente può agire da tampone.

Qual è il pK approssimato di ciascun acido?

10 1 NH 4

9 8 pH

2

H 2PO 4

7 6

1

NH 3 1

H

22 HPO 4

1H

2

H

OO CH 3C

5

Ð ESEMPIO DI CALCOLO 2.3

1

OO CH 3C

Calcolate il pH di 1 L di soluzione contenente acido formico 0,1 M e formiato di sodio 0,1 M prima e dopo l’aggiunta di 1 mL di NaOH 5 M. Di quanto varierebbe il pH se l’NaOH fosse aggiunto a 1 L di acqua pura?

1

1H

4 3 2 1 0 0

0,1

0,2

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Ioni H1 dissociati/molecola

0,8

0,9

1,0

2. Il pH nel punto intermedio (metà titolazione) di ciascuna curva è numericamente equivalente al pK dell’acido corrispondente; in questo punto, [HA] = [A−]. 3. La pendenza di ogni curva di titolazione è minore in prossimità del suo punto intermedio rispetto alle estremità; ciò indica che, quando [HA] è circa uguale a [A–], il pH della soluzione è relativamente insensibile all’aggiunta di una base forte o di un acido forte. Una tale soluzione, nota come soluzione tampone acido-base, si oppone alle variazioni di pH, poiché le piccole quantità di H+ o di OH− aggiunte reagiscono, rispettivamente, con A− o con HA, senza alterare di molto il valore di log([A−]/[HA]).

In base alla Tabella 2.4 il pK dell’acido formico è 3,75; dal momento che [formiato] = [acido formico], il termine log([A−]/[HA]) dell’equazione di Henderson-Hasselbalch è 0 e pH = pK = 3,75. L’aggiunta di 1 mL di NaOH non altera in misura significativa il volume della soluzione, così la [NaOH] è (0,001 L) (5 M)/(1 L) = 0,005 M. Poiché NaOH è una base forte, si dissocia completamente e [OH−] = [NaOH] = 0,005 M. Questi OH− reagiscono con l’acido formico per produrre formiato e H2O, conseguentemente la concentrazione di acido formico diminuisce, mentre quella di formiato aumenta di 0,005 M. La nuova concentrazione di acido formico è 0,1 M – 0,005 M = 0,095 M, mentre la nuova concentrazione di formiato è 0,1 M + 0,005 M = 0,105 M. Sostituendo tali valori nell’equazione di Henderson-Hasselbalch si ottiene pH = pK + log([formiato]/[acido formico]) pH = 3,75 + log(0,105/0,095) pH = 3,75 + 0,04 pH = 3,79

In assenza del sistema tampone dell’acido formico, [H+] e quindi pH possono essere calcolati direttamente a partire da Kw; poiché Kw = [H+][OH−] = 10−14, [H ] pH

10 14 [OH ] log[H ]

Le sostanze che possono perdere più di un protone, o che vanno incontro a più di una ionizzazione, come per esempio H3PO4 o H2CO3, sono definite acidi poliprotici; le loro curve di titolazione, come illustrato nella Figura 2.18 per H3PO4, sono più complesse rispetto a quelle degli acidi monoprotici come l’acido acetico. Un acido poliprotico presenta molteplici valori di pK, uno per ogni reazione di ionizzazione; H3PO4, per esempio, ha tre costanti di dissociazione poiché la carica ionica prodotta dalla dissociazione di un protone inibisce elettrostaticamente la dissociazione degli altri protoni, incrementando in tal modo i corrispondenti valori di pK. Una moleco-

10 14 2 (0,005) log (2 10

10 12

12

M

) 11,7

40

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

Punto di partenza

Primo punto di equivalenza

Secondo punto di equivalenza

Terzo punto di equivalenza

Terzo punto intermedio 22 32 [ HPO4 ] 5 [ PO4 ]

14

12

10

Secondo punto intermedio [ H 2PO42 ] 5 [ HPO422]

8 pH 6

4

Primo punto intermedio [ H 3 PO4 ] 5 [ H 2 PO42 ]

2

0 0,5

Figura 2.18 Titolazione di un acido poliprotico. Il primo e il secondo punto di equivalenza per la titolazione di H3PO4 sono situati nelle regioni della curva a pendenza maggiore. Il pH nel punto intermedio di ogni fase fornisce il valore di pK della ionizzazione corrispondente.

Disegnate la curva di titolazione per l’acido succinico diprotico e contrassegnate i punti intermedi e di equivalenza.

1,5 1,0 2,0 Ioni H2 dissociati/molecole

2,5

3,0

la contenente più di un gruppo ionizzabile ha valori di pK distinti per ciascun gruppo. In una biomolecola che contiene numerosi gruppi ionizzabili con valori di pK diversi, i molti eventi di dissociazione possono portare a una curva di titolazione priva delle tipiche inflessioni. Nei fluidi biologici, intracellulari o extracellulari, il pH è fortemente tamponato; per esempio, nelle persone sane il pH del sangue è mantenuto a un valore pari a 7,4 ± 0,05 (Scheda 2.2). Gli ioni fosfato e bicarbonato, presenti in quasi tutti i fluidi biologici, sono importanti agenti tamponanti, in quanto i valori dei loro pK sono in questo intervallo (Tabella 2.4). Oltre a ciò, molte molecole biologiche, quali le proteine e alcuni lipidi, ma anche numerose piccole molecole organiche, contengono molteplici gruppi acido-base che possono funzionare da tamponi al pH fisiologico. Il concetto che le proprietà delle molecole biologiche variano con l’acidità della soluzione in cui sono disciolte non era riconosciuto appieno prima del XX secolo; numerosi tra i primi esperimenti di biochimica venivano intrapresi senza controllare l’acidità del campione, così i risultati sovente erano difficilmente riproducibili. Oggi le preparazioni biochimiche di norma sono tamponate, al fine di simulare le proprietà dei fluidi biologici naturali. Sono stati prodotti numerosi composti di sintesi da impiegare come tamponi, alcuni dei quali sono citati nella Tabella 2.4. La capacitˆ tamponante di questi acidi deboli (ossia la loro capacità di opporsi alle variazioni di pH in seguito all’aggiunta di un acido o di una base) è massima quando il pH è uguale al pK. Vale la pena di ricordare che un acido debole è nel suo intervallo tamponante utile quando ricade in un ambito compreso tra valori di mezza unità di pH in più o in meno rispetto al suo valore di pK (per esempio, le regioni a diverso colore nella Figura 2.17). Al di fuori di questo intervallo, quando il rapporto [A−]/[HA] > 10, il pH della soluzione varia rapidamente con l’aggiunta di una base forte. Analogamente, un tampone diventa inefficace

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

SCHEDA 2.2

41

LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA

Il sistema tampone del sangue Il bicarbonato è il tampone più importante nel sangue umano; sono presenti anche altri agenti tamponanti, tra cui le proteine e gli acidi organici, ma a concentrazioni molto inferiori. La capacità tamponante del sangue dipende in primo luogo da due equilibri: (1) tra il CO2 disciolto nel sangue e l’acido carbonico che si forma dalla reazione CO2 + H2O 34 H2CO3 e (2) tra l’acido carbonico e il bicarbonato che si forma dalla dissociazione di H+ H2CO3 34 H+ + HCO3− Il pK complessivo per queste due reazioni sequenziali è 6,35. (L’ulteriore dissociazione di HCO3− a CO32−, pK = 10,33, non assume rilevanza a pH fisiologico.) Quando il pH del sangue diminuisce a causa della produzione di H+ da parte del metabolismo, l’equilibrio bicarbonato-acido carbonico si sposta verso un aumento di acido carbonico; allo stesso tempo l’acido carbonico perde acqua per trasformarsi in CO2, che viene in seguito eliminato in forma gassosa dai polmoni tramite l’espirazione. Di contro, quando il pH del sangue aumenta, si forma una quantità relativamente maggiore di HCO3−; la respirazione è regolata in modo da reintrodurre nel sangue grandi quantità di CO2 attraverso i polmoni per essere riconvertito in

acido carbonico; in tale maniera è possibile mantenere una concentrazione quasi costante di ioni idrogeno. Anche i reni svolgono una funzione nell’equilibrio acido-base, dato che operano l’escrezione di HCO3− e NH4+. Alterazioni a carico del sistema tampone del sangue possono condurre a condizioni note rispettivamente come acidosi, nella quale il pH può abbassarsi sino a 7,1, o come alcalosi, in cui il pH può arrivare fino a 7,6; entrambe, in casi estremi, possono essere fatali. Per esempio, le malattie polmonari ostruttive, che impediscono un’efficiente espirazione del CO2, possono essere causa di acidosi respiratoria, mentre l’iperventilazione accelera la perdita di biossido di carbonio, determinando alcalosi respiratoria. Un’eccessiva produzione di acidi organici a partire da precursori della dieta o dovuta a repentine impennate nei livelli dell’acido lattico durante l’attività fisica, o al diabete non controllato (Paragrafo 22.4B), può portare ad acidosi. Il modo migliore per ridurre gli squilibri acido-base consiste nel correggere il problema fisiologico di base. Nel breve periodo l’acidosi è comunemente trattata somministrando per via endovenosa NaHCO3. Invece l’alcalosi è più difficile da curare: la sua forma metabolica risponde talvolta a KCl o a NaCl (il Cl− aggiuntivo aiuta a rendere minima la secrezione di H+ da parte dei reni), mentre quella respiratoria può essere lenita inalando un’atmosfera ricca di CO2.

quando, in seguito all’aggiunta di un acido forte, il suo pH supera il valore di pK di più di una unità. In laboratorio il pH desiderato della soluzione tamponata determina quale composto tamponante deve essere utilizzato; di regola la forma acida della sostanza e uno dei suoi sali solubili sono disciolti in un rapporto quasi equimolare necessario a ottenere il pH desiderato. Con l’ausilio di un pH-metro, il pH della soluzione risultante viene regolato mediante aggiunta di piccole quantità di un acido o di una base forte (vedi l’Esempio di calcolo 2.4).

PUNTO DI VERIFICA

• Quali sono i prodotti della ionizzazione dell’acqua? In che modo le loro concentrazioni sono correlate?

• Quale sarà il pH di un campione di acqua Ð ESEMPIO DI CALCOLO 2.4

nei casi in cui KW sia pari a 10–10 o 10–20?

Quanti millilitri di una soluzione 2,0 M di acido borico devono essere aggiunti a 600 mL di una soluzione 10 mM di sodio borato per ottenere un pH di 9,45?

• Descrivete in che modo è possibile

Riarrangiate l’equazione di Henderson-Hasselbalch estraendo il termine [A−][HA] :

• Fornite una definizione di acido e base. • Qual è la relazione esistente tra la forza

pH log

pK [A ] [HA]

[A ] [HA]

log pH log (pH

[A ]

di un acido e il suo valore di pK?

[HA]

• Spiegate perché è più complicato calcolare il pH di una soluzione di un acido o di una base debole, piuttosto che di una soluzione di un acido o di una base forte.

pK pK)

• Cercate di disegnare una curva di titolazione e di contrassegnare le sue parti sia per un acido monoprotico sia per un acido poliprotico.

Sostituite il valore noto di pK (dalla Tabella 2.4) e il pH voluto:

[A ] [HA]

10(9,45

9,24)

100,21 L−1)

calcolare il pH partendo dai valori della concentrazione degli ioni H+ o OH–.

• Che cosa deve includere una soluzione

1,62 (A−).

La soluzione di partenza contiene (0,6 L)(0,01 mol ∙ = 0,006 mol di borato La quantità di acido borico necessaria è 0,006 mol1,62 = 0,0037 mol. Poiché la soluzione di acido borico è 2,0 M, il volume da aggiungere è (0,0037 mol) (2,0 mol ∙ L−1) = 0,0019 L, cioè 1,9 mL.

tampone per resistere alle variazioni di pH in seguito all’aggiunta di un acido o di una base?

• Perché è importantissimo mantenere molecole biologiche in una soluzione tampone?

CAPITOLO 2

42

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

RIASSUNTO 1 Le proprietà fisiche dell’acqua

2 Le proprietà chimiche dell’acqua

• L’acqua è essenziale per tutti gli organismi viventi. • Le molecole di acqua possono formare legami idrogeno con altre molecole in quanto possiedono due atomi di H che possono funzionare da donatori e due coppie di elettroni non condivisi che possono fungere da accettori. • L’acqua allo stato liquido è un reticolo irregolare di molecole di tale composto, ciascuna delle quali forma sino a quattro legami idrogeno con altre molecole di acqua circostanti. • Le sostanze idrofiliche, come per esempio gli ioni e le molecole polari, si sciolgono facilmente in acqua. • L’effetto idrofobico è la tendenza dell’acqua a rendere minimi i contatti con le sostanze non polari. • Le molecole di acqua si spostano per osmosi da regioni ad alta concentrazione verso altre in cui la concentrazione è bassa; i soluti si muovono per diffusione da regioni ad alta concentrazione verso altre a bassa concentrazione.

• L’acqua si ionizza a H+ (che rappresenta lo ione idronio, H3O+) e OH–. • Nelle soluzioni la concentrazione di H+ è espressa come valore di pH; nelle soluzioni neutre il pH è 7, nelle soluzioni acide il pH è inferiore a 7 e in quelle basiche il pH è superiore a 7. • Gli acidi possono donare protoni e le basi possono accettarli. La forza di un acido è espressa dal suo valore di pK; più forte è un acido, più basso è il suo pK. • L’equazione di Henderson-Hasselbalch pone in relazione il pH di una soluzione con il pK e le concentrazioni di un acido e della sua base coniugata. • Le soluzioni tampone si oppongono alle variazioni di pH in un ambito pari al valore di pK più o meno mezza unità di pH.

PROBLEMI 1. Identificate nelle seguenti molecole i potenziali donatori e ac-

cettori di legami idrogeno: (a)

(b)

O

H

N1

6

2

H2N

3

N

5

7

4

9

N3

8

N H

N

NH2

O

2

4 1

(c)

COO–

H

C

5

CH2

OH

NH+3

6

N H

2. Valutate la solubilità in acqua dei seguenti composti:

(a) H3C

CH2

O

CH3

O

(b) H3C

(d) H3C

O

(c) H2N

C

C

NH2

CH2

CH3

NH2 O

(e) H3C

CH2

CH

6. Dove si ripartirebbero le seguenti sostanze se poste in acqua

contenente micelle di acido palmitico? (a) H3C−(CH2)11−COO−, (b) H3C−(CH2)11−CH3. 7. Descrivete ciò che accade quando un sacchetto da dialisi contenente acqua pura viene immerso in un recipiente con acqua di mare; che cosa accadrebbe se la membrana di dialisi fosse permeabile all’acqua ma non ai soluti? 8. La concentrazione salina all’interno di un globulo rosso è di circa 150 mM. La cellula viene posta in un becker contenente una soluzione la cui concentrazione salina è pari a 500 mM. (a) Assumendo che la membrana cellulare sia permeabile all’acqua e non agli ioni, descrivete che cosa accadrà alla cellula in termini di osmosi. (b) Se la membrana cellulare fosse invece permeabile agli ioni, in quale direzione dovrebbero diffondere i soluti: verso l’interno o verso l’esterno della cellula? 9. Disegnate le strutture delle basi coniugate dei seguenti acidi: (a) COO– CH

3. Approssimativamente quante molecole di H2O ci sono in un

cucchiaio di acqua, assumendo che contenga circa 18 mL?

4. Una cellula di E. coli contiene circa 2,6 × 108 ioni, che costi-

tuiscono circa l’1% della massa della cellula, e ogni ione ha una massa molecolare media di 40 g. a) Quale è la massa approssimativa della cellula? b) La stessa cellula contiene circa 2 × 108 molecole di carboidrati, che hanno una massa molecolare media di 150 g ∙ mol−1. Approssimativamente quale percentuale della massa della cellula è composta da carboidrati? c) La massa molecolare del DNA di E. coli è circa 5,6 × 109 g ∙ mol−1 e costituisce circa lo 0,6% della massa cellulare. Quante molecole di DNA sono presenti nella cellula? 5. Dove si ripartirebbero le seguenti sostanze se poste in acqua contenente micelle di acido palmitico? (a) +H3N−CH2−COO−, (b) +H3N−(CH2)11−COO−.

COOH

(b) H

C

H

NH+3

HC COOH

10. Disegnate le strutture delle basi coniugate dei seguenti acidi: COO–

(a) H

C

H

NH+3

COO–

(b) H

C

CH2

COOH

NH+3

11. Indicate quali sono le specie ioniche di ammoniaca che predo-

minano a pH 4, 8 e 11. 12. Indicate quali sono le specie ioniche di acido fosforico che pre-

dominano a pH 4, 8 e 11 13. Calcolate il pH di una soluzione di 200 mL di acqua pura a

cui sono stati aggiunti 50 mL di HCl 1 mM.

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

14. Calcolate il pH di 1 L di soluzione contenente (a) 10 mL di

NaOH 5 M, (b) 10 mL di glicina 100 mM e 20 mL di HCl 5 M, (c) 10 mL di acido acetico 2 M e 5 g di acetato di sodio (peso formula 82 g ∙ mol−1). 15. Viene preparata una soluzione miscelando 50 mL di K2HPO4 2,0 M e 25 mL di KH2PO4 2,0 M. Essa è diluita sino a un volume finale pari a 200 mL. Qual è il pH della soluzione finale? 16. Qual è il pK dall’acido debole HA se una soluzione contenente HA 0,1 M e A− 0,2 M presenta un pH = 6,5? 17. (a) In ogni istante, quante molecole di acqua si trovano nello stato ionizzato in 1 L di acqua pura a pH 7,0? (b) Esprimete questo numero come percentuale delle molecole di acqua totali. 18. (a) A pH 5 ha più potere tamponante l’acido fosforico o l’acido succinico? (b) A pH 9 l’ammoniaca o la piperidina? (c) A pH 7,5 l’HEPES o il Tris? DOMANDE DIFFICILI 19. Usate la legge di Coulomb (equazione 2.1) per spiegare perché

un cristallo di NaCl rimane intatto nel benzene (C6H6) mentre si dissocia in ioni nell’acqua. 20. Ricavate la variazione di energia libera standard per la dissociazione dell’HEPES. 21. Alcuni gruppi COH possono formare legami idrogeno deboli. Perché un gruppo simile dovrebbe essere più incline a formare legami idrogeno quando C è vicino a N? 22. Spiegate perché l’acqua forma goccioline quasi sferiche sulla superficie di un’automobile appena lucidata con la cera. Per quale motivo l’acqua non si dispone in aggregati sferici su un parabrezza pulito? 23. Molti alimenti vengono refrigerati per impedire che si guastino e inibire o rallentare la crescita microbica. Spiegate come mai il miele, che è costituito per circa l’82% del suo peso da carboidrati, è resistente alla crescita dei microrganismi microbici anche a temperatura ambiente. 24. Il vostro campione è costituito da una proteina contenuta in una soluzione del volume di 5 mL la cui concentrazione salina di NaCl è pari a 0,5 M. Trasferite il campione proteina/sale all’interno di un tubo da dialisi (come mostrato nella Figura 2.14) e trasferite poi il tubo in un becker più grande contenente acqua distillata. Se il vostro obiettivo è quello di rimuovere dal campione il maggior quantitativo di NaCl possibile, che cosa sarebbe più efficace: (1) porre il tubo da dialisi in 4 L di acqua distillata per 12 h, o (2) porre il tubo da dialisi in 1 L di acqua distillata per 6 h e successivamente in un altro becker contenente 1 L di acqua distillata per altre 6 h? 25. I pazienti che soffrono di danni renali sviluppano frequentemente anche acidosi metaboliche. Se questi pazienti fossero sottoposti a dialisi, il dializzato conterrebbe bicarbonato di sodio in concentrazioni superiori a quelle presenti nel torrente circolatorio. Spiegate come mai questo fenomeno porterebbe dei benefici al paziente. 26. In alcuni organismi, la finalità dei reni è anche quella di eliminare l’ammoniaca dal torrente circolatorio. Basandovi sul valore di pK dell’ammoniaca, sapreste dire qual è la forma ionica di ammoniaca predominante nel sangue? Questa molecola sarebbe in grado di diffondere liberamente attraverso il doppio strato costituito dalla membrana lipidica idrofobica di una cellula renale? Spiegate perché. 27. Il marmo è composto soprattutto da carbonato di calcio (CaCO3). Salsa di pomodoro rovesciata su una lastra di mar-

43

mo ne corrode la superficie. Spiegate che cosa avviene da un punto di vista chimico. 28. I batteri Burkholderia in rapida crescita producono normalmente ammoniaca come prodotto di scarto. L’accumulo di ammoniaca uccide i batteri mutanti che sono incapaci di produrre anche acido ossalico. Spiegate come mai invece le cellule normali di Burkholderia evitano la morte. 29. Quanti grammi di succinato sodico (massa molecolare 140 g ∙ mol−1) e di succinato disodico (massa molecolare 162 g ∙ mol−1) devono essere aggiunti a 1 L di acqua per avere una soluzione con pH 6,0 e una concentrazione totale di soluti di 50 mM? 30. Calcolate il volume di una soluzione di NaOH 5 M che si deve aggiungere a 100 mL di una soluzione 100 mM di acido fosforico per portare il pH da 4 a 9. 31. Nel procedimento di purificazione di una proteina avete bisogno di disporre di un tampone a pH 7,5 mantenuto alla temperatura di 4 °C. Avete scelto il Tris, la cui pK è 8,08 e il ∆H° = 50 kJ ∙ mol−1. Preparate con attenzione un tampone Tris 0,01 M a pH 7,5 a 25 °C e poi conservatelo nella camera fredda per equilibrarlo con la temperatura di purificazione della vostra proteina. Quando misurate il pH del tampone una volta che ha raggiunto la temperatura di 4 °C trovate che il pH è aumentato fino al valore di 8,1. Qual è la spiegazione di questo aumento di pH? Come potreste evitare questo tipo di inconvenienti? 32. La glicina idrocloruro (Cl−H3N+CH2COOH) è un acido diprotico che contiene un gruppo acido carbossilico e un gruppo amminico ed è per questo chiamata amminoacido. Questo composto è spesso utilizzato nella preparazione dei tamponi per uso biochimico. (a) Qual è il protone che si dissocia a bassi valori di pH, il protone del gruppo dell’acido carbossilico o del gruppo amminico? (b) Scrivete le equazioni chimiche che descrivono la dissociazione del primo e del secondo protone di Cl−H3N+CH2COOH. (c) Una soluzione contenente 0,01 M Cl−H3N+CH2COOH e 0,02 M della sua specie monodissociata ha un pH di 2,65. Qual è il valore di pK di questa dissociazione? (d) In analogia con quanto riportato nella Figura 2.18, disegnate la curva di titolazione di questo acido diprotico.

CASO DI STUDIO Caso 1 Overdose acuta di aspirina: correlazione con il sistema tampone del sangue Concetto chiave: il sistema tampone acido carbonico-bicarbonato risponde a un’overdose di aspirina. Prerequisiti: Capitolo 2 • Conoscenza dei principi di acidi e basi, compresi pK ed equazione di Henderson-Hasselbalch. • Il sistema tampone del sangue acido carbonico-bicarbonato.

APPROFONDIMENTO Paragonate le strategie utilizzate per l’eliminazione dell’azoto di scarto (sotto forma di ammoniaca) e del biossido di carbonio in diversi organismi quali: (a) i mammiferi terrestri; (b) i pesci che vivono in acqua dolce; (c) i pesci che vivono in acqua salata. Assicuratevi di tenere in considerazione gli effetti osmotici e l’equilibrio acido-base.

44

CAPITOLO 2

L’acqua

© 978-88-08-42096-1

BIBLIOGRAFIA Finney, J.L. (2004), Water? What’s so special abouti it? Philos. Trans. RR. Soc. London B Biol. Sci. 29, 1145-1163. [Comprende una dissertazione sulla struttura delle molecole d’acqua, dei legami idrogeno, della struttura del ghiaccio e dell’acqua in forma liquida. Inoltre viene preso in considerazione anche il modo in cui queste strutture si relazionano con le funzioni biologiche.] Gerstein, M., e Levitt, M. (1998). Simulating water and the molecules of life. Sci. Am. 279(11), 101-105. (Trad. it.: “Simulare molecole biologiche in acqua”, Le Scienze, Milano, gennaio 1998.) [Descrive la struttura dell’acqua e le sue modalità di interazione con altre molecole.] Good, N.E., Winget, G.D., Winter, W., Connolly, T.N., Izawa, S., e Singh, R.M.M. (1966). Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry 5, 467-477. [Classico lavoro riguardante i tamponi usati in laboratorio.] Halperin, M.L., Goldstein, M.B., e Kamel, K. (2010). Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Physiology: A Problem-Based Approach (4a ed.),

Saunders-Elsevier. [Comprende ampie serie di problemi con le spiegazioni delle conoscenze di base e gli effetti clinici dei disordini acido-base.] Jeffrey, G. A., e Sanger, W. (1994). Hydrogen Bonding in Biological Structures. Springer, capp. 1, 2 e 21. [Passa in rassegna la chimica dei legami idrogeno e la sua rilevanza in riferimento alle molecole di piccole dimensioni e alle macromolecole.] Lynden-Bell, R.M., Morris, S.C., Barrow, J.D., Finney, J.L., e Harper, C.L., Jr. (2010), Water and Life. The Unique Properties of H2O, CRC Press. Segel, I. H. (1976). Biochemical Calculations. Wiley, 2a ed., cap. 1. [Discussione di livello intermedio riguardante gli equilibri acido-base, corredata di problemi risolti.] Tanford, C. (1980). The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. Wiley-Interscience, 2a ed., capp. 5 e 6. [Discute le strutture dell’acqua e delle micelle.]

C A P I T O L O

3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche Nonostante le notevoli differenze nello stile di vita e nell’aspetto macroscopico, è sorprendente la somiglianza che gli esseri vi278 venti presentano a livello molecolare. Le 1031 strutture e le attività metaboliche di tutte le cellule si fondano su una gamma comune 303 Riso 1441 di molecole, tra le quali vi sono gli ammi39 049 766 447 25 489 304 noacidi, i carboidrati, i lipidi e i nucleotidi, 2980 insieme alle loro forme polimeriche. Ogni 276 234 tipo di composto ha una sua caratteristica 208 88 332 struttura chimica unita a una capacità di in212 68 8443 teragire con altre molecole e a una funzio95 414 ne fisiologica altrettanto specifiche. Diamo 587 59 38 inizio alla nostra rassegna sulle biomoleco1635 85 348 le con una discussione concernente i nu136 37 cleotidi e i loro polimeri, gli acidi nucleici. 293 Orzo fl-cDNA 179 839 234 I nucleotidi sono coinvolti in quasi tutti 23 585 17 345 gli aspetti della vita cellulare; essi partecipano alle reazioni di ossidoriduzione, al traAe. tauschii 812 sferimento di energia, alle vie di segnalazio32 660 Sorgo 23 705 ne intracellulare e alle reazioni di biosinte34 496 si. I loro polimeri, gli acidi nucleici DNA e 26 722 RNA, sono direttamente coinvolti nei processi di immagazzinamento e decodificazioLe regioni sovrapposte rappresentano ne delle informazioni genetiche. I nucleotidi e gli acidi nucleici svolgono nelle famiglie di geni condivise da cinque cellule funzioni strutturali e catalitiche; nessun’altra classe di molecole prende differenti specie di grano. Identificando parte a una serie così varia di funzioni essenziali per la vita. i geni presenti in un campione di DNA, È sempre più evidente che la comparsa dei nucleotidi abbia consentito l’ei ricercatori possono concentrarsi sulle caratteristiche genetiche che hanno voluzione di organismi che erano in grado di prelevare e immagazzinare energia uno scopo comune o che forniscono dall’ambiente circostante e di produrre copie di se stessi. Sebbene le proprietà funzioni specifiche a un organismo. chimiche e biologiche delle prime forme di vita possano solo essere ipotizzate, è [Jizeng Jia et al., Nature, 496, 91-95 un fatto incontrovertibile che la vita come la conosciamo dipende dalla chimi(4 Aprile 2013), doi:10.10138/ nature/2028.] ca dei nucleotidi e degli acidi nucleici. In questo capitolo esamineremo le strutture dei nucleotidi e degli acidi nucleici DNA e RNA; prenderemo inoltre in considerazione le modalità mediante cui la chimica di tali molecole consente loro di conservare le informazioni biologiche sotto forma di sequenze nucleotidiche. Queste informazioni sono poi trasferite per mezzo della trascrizione da un segmento di DNA a uno di RNA, che a sua volta viene in seguito tradotto per dare origine a proteine. Dal momento che la struttura e la funzione di una cellula dipendono in ultima analisi dalla sua costituzione genetica, discuteremo come le sequenze genomiche forniscono informazioni circa l’evoluzione, il metabolismo e le malattie. Infine, analizBrachypodium 26 552 22 405

CAPITOLO 3

46

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

zeremo alcune delle tecniche impiegate per manipolare il DNA in laboratorio. Nei capitoli successivi studieremo in maggior dettaglio in che modo i nucleotidi e gli acidi nucleici partecipano ai processi metabolici. Nel Capitolo 24 sono riportate altre informazioni sulla struttura degli acidi nucleici, sulle interazioni del DNA con le proteine e sul modo in cui il DNA è impacchettato all’interno delle cellule, necessarie a introdurre i numerosi capitoli in cui viene discusso il ruolo degli acidi nucleici nell’immagazzinamento e nell’espressione delle informazioni genetiche.

1 I nucleotidi CONCETTI CHIAVE

• Le basi azotate dei nucleotidi comprendono due tipi di purine e tre tipi di pirimidine. • Un nucleotide è costituito da una base azotata, da uno zucchero ribosio o deossiribosio e da uno o più gruppi fosforici.

• Il DNA contiene i deossiribonucleotidi adenina, guanina, citosina e timina, mentre l’RNA contiene i ribonucleotidi adenina, guanina, citosina e uracile.

I nucleotidi sono molecole ubiquitarie, dotate di una considerevole diversità strutturale. Sono otto i tipi comuni di nucleotidi, ciascuno composto da una base azotata unita a uno zucchero al quale è legato almeno un gruppo fosforico. Le basi dei nucleotidi sono molecole planari, aromatiche, eterocicliche e sono derivati strutturali della purina o della pirimidina (sebbene non siano sintetizzate in vivo a partire dall’uno o dall’altro di tali composti organici). 6

N1 2

N

5 3

7

4

9

8

N3 2

N

N

4 5 1

6

N

H Purina (a) –2

O3PO

Base

59

CH2 O H

49 H H 19 39 29

OH

H OH

59-Ribonucleotide (b) HO

59

Base

CH2 O 49 H H 19 39 29 H H –2 O3PO H

39-Deossinucleotide

Figura 3.1 Strutture chimiche di

nucleotidi. (a) Un 5‘-ribonucleotide e (b) un 3’-deossinucleotide. La base purinica o pirimidinica è unita al C1’ del pentosio, a cui è anche attaccato almeno un gruppo fosforico (in rosso). Un nucleoside è formato da una base unita a un pentosio. Confronta la carica netta di un nucleoside e di un nucleotide.

Pirimidina

Le purine più diffuse sono l’adenina (A) e la guanina (G), mentre le principali pirimidine sono la citosina (C), l’uracile (U) e la timina (T). Le purine formano legami con uno zucchero a cinque atomi di carbonio (un pentosio) attraverso i loro atomi N9, mentre le pirimidine utilizzano per questo legame il loro atomo N1 (Tabella 3.1). Nei ribonucleotidi lo zucchero a cinque atomi di carbonio è il ribosio, mentre nei deossiribonucleotidi (o solamente deossinucleotidi) lo zucchero è il 2′-deossiribosio (cioè il carbonio in posizione 2′ è privo del gruppo ossidrilico). HO

59

CH2 O H

OH

49H H 19 39 29

OH Ribosio

H OH

HO

59

CH2 O H

49H H 19 39 29

OH H

OH H Deossiribosio

Si noti che i numeri con il suffisso “primo” si riferiscono agli atomi di carbonio del pentosio, mentre quelli che ne sono privi si riferiscono agli atomi della base azotata. In un ribonucleotide o in un deossiribonucleotide, uno o più gruppi fosforici sono uniti all’atomo C3′ oppure all’atomo C5′ del pentosio generando rispettivamente un 3′-nucleotide oppure un 5′-nucleotide (Figura 3.1). Quando il gruppo fosforico è assente, il composto è detto nucleoside; di conseguenza, un 5′-nucleotide può essere pure chiamato nucleoside-5′-fosfato. I nucleotidi più comuni contengono da uno a tre gruppi fosforici in posizione C5′ e sono definiti nucleosidi monofosfato, difosfato e trifosfato.

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

47

TABELLA 3.1 Nomi e abbreviazioni delle basi, dei nucleosidi e dei nucleotidi presenti negli acidi nucleici

Formula della base

Base (X = H)

Nucleoside (X = ribosioa )

Nucleotideb (X = ribosio fosfatoa )

Adenina

Adenosina

Acido adenilico

Ade

Ado

Adenosina monofosfato

A

A

AMP

Guanina

Guanosina

Acido guanilico

Gua

Guo

Guanosina monofosfato

G

G

GMP

Citosina

Citidina

Acido citidilico

Cyt

Cyd

Citidina monofosfato

C

C

CMP

Uracile

Uridina

Acido uridilico

Ura

Urd

Uridina monofosfato

U

U

UMP

Timina

Deossitimidina

Acido deossitimidilico

Thy

dThd

Deossitimidina monofosfato

T

dT

dTMP

NH2 N

N

N

N

X O H

N

N

N

N

H2N

X NH2 N N

O

X O H

N N

O

X O H O

CH3

N N dX

a La presenza di una unità di 2´-deossiribosio al posto del ribosio, come si osserva nel DNA, è indicata dai prefissi “deossi” o “d”. Per esempio, il deossinucleoside dell’adenina è la deossiadenosina o dA; tuttavia, per i residui contenenti timina, che si riscontrano solo di rado nell’RNA, il prefisso è ridondante e può essere omesso. La presenza di una unità di ribosio può essere indicata in maniera esplicita dal prefisso “ribo”. b La posizione del gruppo fosforico in un nucleotide può essere specificata esplicitamente come, per esempio, nel caso del 3´-AMP e del 5´-GMP.

Indicate il nome di ogni base e del suo corrispondente nucleoside senza guardare la tabella.

Nella Tabella 3.1 sono elencati le strutture, i nomi e le abbreviazioni delle basi, dei nucleosidi e dei nucleotidi più diffusi. I ribonucleotidi sono componenti dell’RNA (acido ribonucleico), mentre i deossinucleotidi sono componenti del DNA (acido deossiribonucleico). Le basi adenina, guanina e citosina si ritrovano nei ribonucleotidi e nei deossinucleotidi (rappresentano sei degli otto nucleotidi presenti in questi polimeri); l’uracile invece è prevalentemente in forma di ribonucleotide e la timina in quella di deossinucleotide. I nucleotidi liberi sono anioni e nelle cellule si associano solitamente al Mg2+. In qualsiasi cellula la maggior parte dei nucleotidi è presente in forme polimeriche come il DNA o l’RNA, le cui funzioni primarie sono l’immagazzinamento o il trasferimento I nucleotidi partecipano alle reazioni metaboliche.

48

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

delle informazioni genetiche. Tuttavia i nucleotidi liberi e i derivati dei nucleotidi svolgono una vasta gamma di compiti metabolici che non sono legati alla gestione delle informazioni genetiche. Il nucleotide meglio conosciuto è l’adenosina trifosfato (ATP), che contiene adenina, ribosio e un gruppo trifosforico; esso è spesso ritenuto erroneamente una forma di accumulo dell’energia, anche se è più appropriato definirlo un vettore energetico o agente di trasferimento dell’energia. Il processo della fotosintesi o la scissione di carburanti metabolici, come i carboidrati e gli acidi grassi, conduce alla formazione di ATP a partire da adenosina difosfato (ADP): Adenosina NH2

NH2 N

N O HPO24–

+

HO

P

O O

O–

P

N

N O

O –O

CH2 O

O–

H

O

P

O

P

O–

H

H

O O

P

O–

comunemente riscontrabili negli acidi nucleici.

• Esercitatevi disegnando le strutture dell’adenina, dell’adenosina e dell’adenilato.

• Descrivete le differenze chimiche esistenti tra un ribonucleoside trifosfato e un deossiribonucleoside monofosfato.

+

CH2 O H

H2O

H H

OH OH Adenosina trifosfato (ATP)

Adenosina difosfato (ADP)

• Identificate le purine e le pirimidine

O

H

H

N

N

O–

OH OH

PUNTO DI VERIFICA

N

N

L’ATP diffonde in tutta la cellula per fornire l’energia necessaria per il lavoro cellulare, come le reazioni di biosintesi, il trasporto di ioni e il movimento cellulare. L’energia chimica potenziale dell’ATP è resa disponibile quando questa molecola trasferisce uno (o due) dei suoi tre gruppi fosforici a un’altra molecola. Questo processo è sostanzialmente l’inverso della reazione precedente, cioè la scissione dell’ATP ad ADP. (Come vedremo nei capitoli successivi, nella cellula l’interconversione tra ATP e ADP non è liberamente reversibile e i gruppi fosforici liberi solo di rado sono rilasciati direttamente dall’ATP.) Il coinvolgimento dell’ATP nelle ordinarie attività cellulari è illustrato dai calcoli che indicano che, pur essendo la concentrazione di ATP cellulare relativamente modesta (circa 5 mM), in media un essere umano utilizza ogni giorno una quantità di ATP equivalente al suo peso corporeo. I derivati dei nucleotidi prendono parte a un’ampia serie di processi metabolici; per esempio, nelle piante la sintesi di amido procede grazie ad aggiunte successive di unità di glucosio donate dall’ADP-glucosio (Figura 3.2). Altri derivati dei nucleotidi, come vedremo nei prossimi capitoli, contengono gruppi che partecipano a reazioni di ossidoriduzione; il gruppo sostituente può essere una piccola molecola, per esempio il glucosio (Figura 3.2) o anche un altro nucleotide unito al primo nucleotide attraverso un ponte mono- o difosforico.

Glucosio

Figura 3.2 L’ADP-glucosio.

ADP

NH2

H

CH2OH O H OH H

H O

HO H

OH

N

N O P O–

O O

P

N

N O

CH2 O

O–

H H HO

H H OH

In questo derivato nucleotidico il glucosio (in blu) è unito all’adenosina (in nero) per mezzo di un gruppo pirofosforico (in rosso). Indicate i legami che si formano come risultato delle reazioni di condensazione.

CAPITOLO 3

49

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

2 Introduzione alla struttura degli acidi nucleici CONCETTI CHIAVE

• Nel DNA e nell’RNA i residui nucleotidici sono collegati dai legami fosfodiesterici. • Nella doppia elica del DNA due filamenti antiparalleli di polinucleotidi si avvolgono uno intorno all’altro interagendo tra loro tramite i legami idrogeno che si formano tra le basi dei filamenti opposti.

• Le molecole di RNA sono normalmente a catena singola, ma possono formare appaiamenti intramolecolari tra le basi.

I nucleotidi possono essere uniti l’uno all’altro per formare i polimeri che ci sono familiari con i nomi di RNA e di DNA. In questo paragrafo descriveremo alcune delle caratteristiche generali di questi due acidi nucleici; ulteriori informazioni sulla struttura degli acidi nucleici sono riportate nel Capitolo 24.

A Gli acidi nucleici sono polimeri di nucleotidi Gli acidi nucleici sono catene di nucleotidi in cui i gruppi fosforici uniscono le posizioni 3′ e 5′ di unità di ribosio adiacenti (Figura 3.3). Poiché i gruppi fosforici di questi polinucleotidi sono acidi, gli acidi nucleici a pH fisiologico sono quindi polianioni. Il legame tra i singoli nucleotidi è detto legame fosfodie(a)

(b)

NH2 Estremitˆ 59

N1 2

–O –O

P

O

O

59

6

3

N

5

7

4

9

A

8

29

N

N

H

H 39

p 29

H

59

O

59

O

H

5

29

39 p

H 39

6

1

H 29

19

OH

39 p

29

OH

39

OH

p

P

59

59

59

OH

4

2 59

O

O

49

H

H

H

39

5

1

29

19

H

OH

O 6

HN 1 2

O –

O

P O

C

6

N

CH2 O

O

Figura 3.3 Struttura chimica di un acido

NH2

H

O –O

59

U (T)

N3

39

OH

N

CH2 O 49

(CH3)

4

2

O

29

G

O

OH

O P

OH

C

19

H

HN 3

–O

U

39

CH2 O 49

A

3

H2N O

N

5

7

4

9

8

N

N 59

CH2 O 49

H

H 39

HO

H 29

19

H

OH

Estremità 39

G

nucleico. (a) È mostrato il tetraribonucleotide adenilil-3’,5’-uridilil-3’,5’-citidilil-3’,5’-guanilato. Gli atomi dello zucchero sono indicati con il segno “primo” per distinguerli da quelli delle basi. Per convenzione, una sequenza polinucleotidica è scritta con l’estremità 5’ a sinistra e quella 3’ a destra; di conseguenza, leggendo da sinistra verso destra, il legame fosfodiesterico unisce residui di ribosio adiacenti in direzione 5’ n 3’ . La sequenza qui illustrata può essere abbreviata in pApUpCpG oppure solo in pAUCG (la “p” a sinistra del simbolo di un nucleoside indica un gruppo 5’ fosforico). Il corrispondente deossitetranucleotide, in cui i gruppi 2’ -OH sono sostituiti da H e l’uracile (U) è rimpiazzato da timina (T), è abbreviato in d(pApTpCpG) o in d(pATCG). (b) Rappresentazione schematica di pAUCG; una linea verticale denota un residuo di ribosio, la base attaccata è indicata da una singola lettera, mentre una linea diagonale con al centro una “p”, che non è obbligatorio inserire, rappresenta un legame fosfodiesterico. I numeri degli atomi del residuo di ribosio possono essere omessi. La rappresentazione equivalente di d(pATCG) si differenzia unicamente per l’assenza del gruppo 2’ -OH e per la sostituzione di U con T.

CAPITOLO 3

50

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

sterico, in quanto il gruppo fosforico è contemporaneamente esterificato a due unità di ribosio; ogni nucleotide incorporato nel polinucleotide è detto residuo nucleotidico. Il residuo terminale il cui C5′ non è unito a un altro nucleotide è definito estremità 5′, mentre quello il cui C3′ non è legato a un altro nucleotide è chiamato estremità 3′. La sequenza di residui nucleotidici in un acido nucleico per convenzione è scritta, da sinistra verso destra, partendo dall’estremità 5′ verso quella 3′. Le proprietà di un polimero quale un acido nucleico possono variare considerevolmente rispetto a quelle delle singole unità, o monomeri, prima della polimerizzazione. Dal momento che le dimensioni del polimero aumentano da dimero, a trimero, a tetramero e così via sino a oligomero (dal greco oligos, “poco”), proprietà fisiche come la carica e la solubilità possono mutare considerevolmente. Inoltre, un polimero costituito da residui non identici presenta una peculiarità che i monomeri separati non possiedono: la sequenza dei residui del polimero è un modo per conservare informazioni. Le regole di Chargaff descrivono la composizione in basi del DNA. Anche se sem-

bra che non esistano regole che governano la composizione in nucleotidi delle tipiche molecole di RNA, il DNA presenta un uguale numero di residui di adenina e di timina (A = T) e anche il numero dei residui di guanina corrisponde a quello dei residui di citosina (G = C). Queste relazioni, note come regole di Chargaff, furono scoperte negli anni ’40 da Erwin Chargaff, il quale ideò i primi metodi quantitativi affidabili per analizzare la composizione del DNA. La composizione in basi del DNA varia da un essere vivente all’altro, passando da circa il 25 al 75% in moli di G + C in specie batteriche differenti. Tuttavia essa è più o meno costante nelle specie correlate; per esempio, nei mammiferi il contenuto in G + C è compreso tra il 39 e il 46%. Il significato delle regole di Chargaff non fu subito colto, ma ora sappiamo che la loro base strutturale dipende dalla natura a doppio filamento del DNA. Figura 3.4 Forme tautomeriche

delle basi. Sono mostrate alcune possibili forme tautomeriche (a) della timina e (b) della guanina. La citosina e l’adenina possono subire spostamenti protonici analoghi. Disegnate i tautomeri di adenina e citosina.

(a)

O H

CH3

N O

N

H

R Timina (forma chetonica o lattamica) (b)

O H

N

N

H H 2N

N

N R

Guanina (forma chetonica o lattamica)

B Il DNA forma una doppia elica La determinazione, nel 1953, della struttura del DNA da parte di James Watson e Francis Crick è considerata la scoperta che ha portato alla nascita della moderna biologia molecolare. La struttura di Watson e Crick dell’acido deossiribonucleico non solo fornì un modello di quella che si ritiene la molecola fondamentale della vita, ma indicò anche il meccanismo molecolare dell’ereditarietà. Le conclusioni a cui giunsero i due scienziati, reputate una delle conquiste intellettuali più imH O portanti della scienza, si basavano in parte su due evidenze sperimentali, oltre che sulle reCH3 N gole di Chargaff: le corrette forme tautomeriche delle basi e le indicazioni che il DNA H O N è una molecola di forma elicoidale (spirale). Le basi puriniche e pirimidiniche degli R acidi nucleici possono assumere forme tautoTimina (forma enolica o lattimica) meriche differenti (i tautomeri sono isomeri facilmente interconvertibili che differiscono H unicamente per le posizioni degli atomi di O idrogeno; Figura 3.4). Indagini ai raggi X efN fettuate mediante risonanza magnetica nuN H cleare (NMR) e spettroscopia consentirono N di stabilire chiaramente che le basi degli acidi H 2N N nucleici si trovano in misura preponderanR te nelle forme tautomeriche chetoniche illuGuanina strate nella Figura 3.3. Nel 1953 queste in(forma enolica o lattimica)

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

formazioni non erano tuttavia ancora completamente disponibili; le forme tautomeriche dominanti delle basi furono fornite da Jerry Donohue, un collega di Watson e Crick che condivideva con loro l’ufficio, esperto di strutture ai raggi X delle piccole molecole organiche. La prova che il DNA è una molecola con una struttura elicoidale si ebbe con l’immagine della diffrazione dei raggi X di una fibra di DNA ottenuta da Rosalind Franklin (Figura 3.5). Questa immagine consentì a Crick, che aveva una preparazione cristallografica, di dedurre che (a) il DNA è una molecola elicoidale e (b) che le sue basi aromatiche planari si impilano l’una sull’altra formando un’organizzazione parallela all’asse della fibra. Le limitate informazioni strutturali, unitamente alle regole di Chargaff, fornirono solo alcuni indizi sulla struttura del DNA: il modello di Watson e Crick derivò, in larga misura, dalla loro immaginazione e da studi supportati dalla costruzione di modelli molecolari. Dopo la pubblicazione, la struttura proposta per il DNA fu rapidamente e universalmente accettata sia per la sua fondamentale semplicità, sia per la palese rilevanza sotto il profilo biologico. Indagini successive hanno confermato la generale correttezza di tale struttura, sebbene essa abbia subito alcune modifiche nei dettagli. Le caratteristiche principali del modello di Watson e Crick sono le seguenti (Figura 3.6). 1. Due catene polinucleotidiche si avvolgono intorno a un asse comune per dar luogo a una doppia elica. 2. I due filamenti di DNA sono antiparalleli (ossia hanno direzionalità opposte); ciascun filamento forma un’elica destrorsa (la differenza tra elica destrorsa e sinistrorsa è mostrata nella Figura 3.7). 3. Le basi occupano la parte centrale dell’elica, mentre le catene zucchero-fosfato si snodano nella parte periferica, rendendo in tal modo minime le repulsioni tra i gruppi fosforici carichi negativamente. La superficie della doppia elica contiene due scanalature di differente ampiezza: la scanalatura maggiore e la scanalatura minore. 4. Ogni base forma legami idrogeno con un’altra del filamento opposto, dando luogo a una coppia di basi planare. La struttura proposta da Watson e Crick può avere esclusivamente due tipi di coppie di basi: ciascun residuo di adenina deve appaiarsi con uno di timina e viceversa, mentre ogni residuo di guanina deve unirsi a uno di citosina e viceversa (Figura 3.8). Queste interazioni mediante legami idrogeno, un fenomeno conosciuto come appaiamento delle basi complementari, determinano un’associazione specifica delle due catene della doppia elica. La struttura di Watson e Crick può accogliere qualsiasi sequenza di basi su un filamento polinucleotidico se quello opposto presenta una sequenza di basi complementari; ciò dà immediatamente ragione delle regole di Chargaff. Questa osservazione indica che ogni filamento di DNA può fungere da stampo per la sintesi di quello complementare e, di conseguenza, che le informazioni ereditarie sono codificate nella sequenza di basi presenti sull’uno o sull’altro filamento. La maggior parte delle molecole di DNA ha dimensioni molto grandi. La dimen-

sione estremamente grande delle molecole di DNA è perfettamente adatta al loro ruolo di depositarie delle informazioni genetiche nella cellula. Ovviamente il genoma di un organismo, il suo contenuto in DNA, può essere ripartito tra vari cromosomi (dal greco chróma, “colore”, e sóma, “corpo”), ciascuno dei quali contiene una molecola di DNA distinta. Si noti che numerosi organismi sono diploidi, ossia contengono due serie equivalenti di cromosomi, ciascuna proveniente da un organismo parentale. Il loro contenuto in DNA specifico (aploide) è pari alla metà di quello totale; per esempio, l’uomo è un organismo diploide che ha 46 cromosomi in ogni cellula, quindi il numero aploide è 23.

51

Figura 3.5 Immagine della

diffrazione dei raggi X di una fibra di DNA orientata in senso verticale. Questa immagine, determinata da Rosalind Franklin, fornì la prova fondamentale per la comprensione della struttura proposta da Watson e Crick. L’andamento centrale a forma di X indica un’elica, mentre i contorni ad arco, di colore nero, nella parte superiore e in quella inferiore del profilo di diffrazione rivelano la spaziatura delle basi impilate (3,4 Å). [Per gentile concessione di Maurice Wilkins, King’s College, Londra.]

CONCETTI DI BASE Interazioni non covalenti La sequenza di nucleotidi in una catena polinucleotidica è determinata da legami covalenti, ma i legami idrogeno, che sono molto più deboli, permettono a una catena di interagire con l’altra mediante appaiamento delle basi.

52

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

Figura 3.6 Struttura tridimensionale

del DNA. La ripetizione dell’elica si fonda sulla struttura del dodecamero autocomplementare d(CGCGAATTCGCG) determinata da Richard Dickerson e Horace Drew. In questo modello a sfere e bastoncini la vista è perpendicolare all’asse dell’elica. Gli scheletri di zuccherofosfato (in blu, con contorni a nastro verdi) si avvolgono intorno alla parte periferica della molecola, mentre le basi (in rosso) formano coppie unite da legami idrogeno che occupano la porzione centrale; gli atomi di H sono stati omessi per semplicità. I due filamenti corrono in direzioni opposte. [Illustrazione, Irving Geis, immagine della Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical lnstitute. I diritti sono proprietà dell’HHMI. Riproduzione soggetta ad autorizzazione.]

Scanalatura maggiore

Scanalatura minore

Figura 3.7 Rappresentazioni che

illustrano un’elica destrorsa e una sinistrorsa. In entrambi i casi le dita sono ripiegate nella direzione di avvolgimento delle eliche, mentre i pollici puntano verso la direzione di avanzamento dell’elica. Si noti che, se le eliche vengono capovolte, la disposizione delle mani rimane immutata.

Sinistrorsa

Destrorsa

CAPITOLO 3

53

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

Data la loro notevole lunghezza, le molecole di DNA sono descritte in termini di numero di coppie di basi (bp) o di migliaia di coppie di basi (kilobasi, o kb). Le molecole di DNA presenti in natura hanno lunghezze variabili da circa 5 kb nei piccoli virus contenenti acido deossiribonucleico fino a oltre 250 000 kb nei cromosomi umani di maggiori dimensioni. Sebbene le molecole di DNA siano estese e relativamente rigide, presentano un certo grado di flessibilità. Vedremo in seguito che la doppia elica del DNA forma avvolgimenti e anse quando viene condensata dentro una cellula. A seconda della sequenza dei nucleotidi, il DNA può anche adottare conformazioni elicoidali leggermente differenti. Infine, in presenza di altre componenti cellulari, il DNA può ripiegarsi in modo netto oppure i due filamenti possono svolgersi parzialmente (analizzeremo in maggior dettaglio la struttura del DNA nel Capitolo 24).

H N Adenina

N

N

H

O

N

H

N

CH3 Timina N

N O H N Guanina

N

C L’RNA è un acido nucleico a singolo filamento Il DNA a singolo filamento è molto raro, essendo presente in prevalenza come materiale ereditario in determinati virus; l’RNA è invece quasi sempre sotto forma di filamenti singoli, che producono di solito strutture compatte piuttosto che lunghe catene libere (l’RNA a doppio filamento costituisce il materiale ereditario di alcuni agenti virali). Un filamento di RNA, identico a uno di DNA eccetto che per la presenza dei gruppi 2′-OH e dell’uracile che sostituisce la timina, si può appaiare a un filamento complementare di RNA o di DNA. In questa struttura A si appaia a U (oppure a T nel DNA), mentre G si unisce a C. Frequentemente l’appaiamento delle basi avviene all’interno di una stessa molecola, dando origine a strutture a stelo e ansa (o forcine; Figura 3.9) o, quando le anse interagiscono una con l’altra, a conformazioni più complesse. Le complicate strutture che le molecole di RNA a singolo filamento possono potenzialmente assumere forniscono un’ulteriore prova del fatto che l’RNA può svolgere altre funzioni oltre a quella di immagazzinamento e trasmissione delle informazioni genetiche. Numerosi studi hanno riscontrato che determinate molecole di RNA sono in grado di unirsi in modo specifico a piccole molecole organiche, catalizzando reazioni in cui sono coinvolte le molecole legate. Queste osservazioni avvalorano in maniera sostanziale le teorie che sostengono che molti dei processi essenziali per la vita ebbero inizio grazie alla versatilitˆ chimica di piccoli polinucleotidi (un’ipotesi nota come “mondo a RNA”). Analizzeremo ulteriormente la struttura e la funzione dell’RNA nel Paragrafo 24.2C.

O

H

N

N

H

N

Citosina N

N N

H

O

H

Figura 3.8 Appaiamento delle basi

complementari nel DNA. L’adenina di un filamento si appaia con la timina presente sull’altro filamento, formando specifici legami idrogeno (linee tratteggiate). La guanina si appaia con la citosina allo stesso modo. Due catene polinucleotidiche si associano mediante appaiamento delle basi per dare origine a una molecola di DNA a doppio filamento. Indicate quale dovrebbe essere la sequenza 5′n 3′ complementare all’acido nucleico mostrato nella Figura 3.3a.

PUNTO DI VERIFICA

• Utilizzando come guida la Figura 3.3a, disegnate la struttura completa di un nucleoside trifosfato prima e dopo la sua incorporazione all’interno di una catena polinucleotidica. Disegnate la struttura che esso dovrebbe assumere se il legame fosfodiesterico neoformato dovesse essere idrolizzato.

• Spiegate le basi strutturali delle regole di Chargaff.

• Utilizzando un modello computerizzato

Figura 3.9 Formazione di una struttura

a stelo e ansa. L’appaiamento delle basi in sequenze complementari di un filamento di RNA consente al polinucleotide di ripiegarsi su se stesso formando una struttura a forcina.

della molecola di DNA (come quello riportato nell’Esercizio interattivo 1), identificate ognuna delle seguenti caratteristiche strutturali: le estremità 3’ e 5’ di ogni filamento, gli atomi che costituiscono lo scheletro zuccherofosfato, le scanalature principali e secondarie, le basi all’interno delle diverse coppie di basi e gli atomi che partecipano ai legami idrogeno presenti nelle coppie di basi A ∙ T e C ∙ G.

• Elencate le differenze strutturali esistenti tra il DNA e l’RNA.

54

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

3 Uno sguardo alla funzione degli acidi nucleici CONCETTI CHIAVE

• Il DNA contiene l’informazione genetica nella sua sequenza di nucleotidi. • La sequenza dei nucleotidi del DNA viene trascritta nella sequenza dei nucleotidi dell’RNA messaggero che viene a sua volta tradotta in una proteina, cioè in una sequenza di amminoacidi.

Il DNA trasporta le informazioni genetiche in tutte le cellule e in numerosi virus; eppure per arrivare alla scoperta del ruolo biologico dell’acido deossiribonucleico dovette trascorrere un lasso di tempo di oltre 75 anni dalla formulazione delle leggi sull’ereditarietà da parte di Gregor Mendel. A tutt’oggi molti dettagli inerenti alle modalità di espressione delle informazioni genetiche e della loro trasmissione alle generazioni future sono ancora da chiarire. Il lavoro di Mendel sui piselli odorosi portò a stabilire che una singola pianta contiene una coppia di fattori (che ora noi chiamiamo geni), ciascuno ereditato da un genitore. La teoria di Mendel sull’ereditarietà, pubblicata nel 1866, fu quasi universalmente ignorata dai suoi contemporanei, le cui conoscenze di anatomia e di fisiologia non permettevano di comprenderla. Più tardi venne ipotizzato che i geni facessero parte dei cromosomi, accelerando così in maniera straordinaria le ricerche in campo genetico.

A Le informazioni genetiche sono contenute nel DNA Fino agli anni ’40 si riteneva che i geni fossero costituiti da proteine, in quanto queste erano le uniche entità biochimiche che, a quel tempo, sembravano dotate di una complessità tale da renderle agenti dell’ereditarietà. Si presumeva che gli acidi nucleici, isolati per la prima volta nel 1869 da Friedrich Miescher, presentassero sequenze di nucleotidi ripetute in maniera monotona e che per questo non fossero coinvolti nella trasmissione delle informazioni genetiche. Furono gli sforzi compiuti da Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty a dimostrare che nel DNA sono conservate le informazioni genetiche. I loro esperimenti, completati nel 1944, provarono che l’acido deossiribonucleico, e non le proteine, estratto da un ceppo virulento (patogeno) del batterio Diplococcus pneumoniae, era la sostanza che trasformava (cioè alterava in via permanente) un ceppo non patogeno di questo organismo in uno virulento (Figura 3.10). All’inizio la scoperta di Avery fu accolta con scetticismo, ma influenzò profondamente Erwin Chargaff, le cui regole (Paragrafo 3.2A) condussero in seguito alla formulazione di modelli della struttura e funzione del DNA. La natura a doppio filamento, o duplex, del DNA agevola la sua replicazione; quando una cellula si divide, ogni filamento di DNA funge da stampo per

Figura 3.10 Pneumococchi trasformati. Le colonie grandi sono costituite da pneumococchi virulenti che derivano dalla trasformazione di batteri non patogeni (le colonie di dimensioni inferiori) con DNA estratto dal ceppo virulento; ora sappiamo che tale DNA conteneva un gene difettoso nel ceppo non patogeno. [Avery, O.T., MacLeod, C.M., McCarty, M. (1944). J. Exp. Med. 79, 153. Copyright © 1944 Rockefeller University Press.]

CAPITOLO 3

55

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

Figura 3.11 La replicazione del DNA. Ciascun filamento di DNA parentale (in blu) funge da stampo per la sintesi di un filamento figlio complementare (in rosso). Quindi le due molecole a doppio filamento prodotte sono identiche.

Vecchio

Quali tipi di legami e interazioni si formano durante la replicazione del DNA?

la produzione di un filamento complementare (Figura 3.11). Di conseguenza, ogni cellula della progenie contiene una molecola completa di DNA (oppure una serie di molecole, negli organismi il cui genoma contiene più di un cromosoma). Ogni molecola di DNA è costituita da un filamento parentale e da uno appena prodotto (figlio); questi nuovi filamenti sono sintetizzati mediante la polimerizzazione graduale di nucleotidi che si appaiano in maniera specifica con le basi dei filamenti parentali. Il meccanismo della replicazione, sebbene semplice in linea di principio, nella cellula è straordinariamente complesso, poiché è necessario un gran numero di fattori cellulari per poter procedere in modo fedele ed efficiente, come avremo modo di osservare nel Capitolo 25.

B La sintesi proteica è diretta dai geni

. .TVecchio T. . .A A. . .T

A.

G G. . . C G . . .C T. . .A C. . . G T A.

. .T . .C C. . . G A. . .T

G.

T T. G C

C. C.

. .G . .G

trascrizione

RNA

traduzione

proteina

Nello schema riportato in questa illustrazione le frecce mostrano quando l’informazione viene trasferita attraverso la replicazione per produrre nuove molecole di DNA, quando il DNA viene trascritto in RNA e quando l’RNA viene tradotto in una proteina. Proprio come i filamenti di DNA figli sono sintetizzati a partire da deossinucleosidi trifosfato liberi le cui basi si appaiano con quelle del filamento di DNA parentale, i filamenti di RNA sono prodotti da ribonucleosidi trifosfato che si appaiano con le basi complementari del filamento di DNA di un gene (la trascrizione è trattata più dettagliatamente nel Capitolo 26). L’RNA che corrisponde a un gene che codifica proteine (denominato RNA messaggero, o mRNA) si associa a un ribosoma, un organello composto in gran parte da

C.

C. . .G

Nuovo Nuovo

Fu necessario un certo periodo di tempo per rispondere alla domanT. . .A da sul modo in cui le sequenze di nucleotidi controllano le caratteriA. . .T stiche degli esseri viventi. Nel corso di esperimenti condotti intorno T. . .A al 1940 con la muffa Neurospora crassa, George Beadle ed Edward T. . .A Tatum riscontrarono che esiste una relazione specifica tra i geni e gli G enzimi, cioè formularono la teoria un gene-un enzima. I due ricercatori dimostrarono che, per poter crescere, certe varietà mutanti di A. . .T .A . . T Neurospora generate mediante irradiazione con i raggi X richiedeva. . . T A no sostanze nutritive addizionali. La progenie delle cellule dannegNuovo giate dalle radiazioni era probabilmente priva degli specifici enzimi Vecchio necessari per sintetizzare tali nutrienti. L’anello di congiunzione tra il DNA e gli enzimi (i quali sono per lo più molecole di natura proteica) è l’RNA. Il DNA di un gene è trascritto per generare una molecola di RNA, complementare al DNA; in seguito la sequenza di RNA è tradotta nella corrispondente successione di amminoacidi per dare luogo a una proteina (Figura 3.12). Tali passaggi di informazioni biologiche sono riassunti nel cosiddetto dogma centrale della biologia molecolare, formulato da Crick nel 1958.

DNA

C

A

G

replicazione

. .A

. .G

T G

G T. . .A A. . .T T. . .A T. . .A G A. . .T . T . .A . T . .A

Nuovo

Vecchio

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

Figura 3.12 La trascrizione e la traduzione. Un filamento di DNA dirige la sintesi dell’RNA messaggero (mRNA); la sequenza di basi dell’RNA trascritto è complementare a quella del filamento di DNA. Il messaggio viene tradotto quando molecole di RNA di trasporto (tRNA) si uniscono all’mRNA mediante appaiamento di basi complementari tra sequenze di tre nucleotidi note come codoni. Ogni tRNA trasporta uno specifico amminoacido, e gli amminoacidi sono uniti covalentemente per formare una proteina. La sequenza di basi del DNA specifica quella di amminoacidi della proteina.

© 978-88-08-42096-1





A T

DNA

G C

A T

G C

G C

T A

G C

C G

T A



5ʹ Trascrizione Codone

Codone

Codone

5ʹ mRNA



A U

G C

A U

G C

G C

U A

G C

C G

U A

tRNA

Gly

Arg

Cosa può accadere se una mutazione modifica uno dei nucleotidi del DNA?

Ala

56

Traduzione

Proteina

Arginina

Glicina

Alanina

RNA (RNA ribosomiale, o rRNA). Sul ribosoma, ogni tripletta di nucleotidi dell’mRNA si appaia a una sequenza di tre nucleotidi complementari in una piccola molecola di RNA chiamata RNA di trasporto, o RNA transfer, o tRNA (Figura 3.13). Ogni molecola di tRNA lega uno specifico amminoacido. Il ribosoma catalizza il legame tra gli amminoacidi, che costituiscono le unità monomeriche delle proteine (la sintesi proteica è descritta in modo approfondito nel Capitolo 27). Gli amminoacidi sono aggiunti alla catena proteica in fase di allungamento secondo l’ordine con cui le molecole di tRNA si associano temporaneamente all’mRNA. Dal momento che la se-

NH3+

Catena proteica crescente RNA transfer

Figura 3.13 La traduzione. Le molecole di tRNA caricate con gli amminoacidi si legano a sequenze complementari composte da tre nucleotidi (i codoni) presenti sull’mRNA. Il ribosoma agevola l’allineamento del tRNA e dell’mRNA, catalizzando l’unione degli amminoacidi per produrre una catena proteica. Quando viene aggiunto un nuovo amminoacido, il tRNA precedente è espulso e il ribosoma procede lungo l’mRNA.

5ʹ mRNA

OH

NH3+

NH3+

Residuo amminoacidico

3ʹ Ribosoma Direzione del movimento del ribosoma lungo la molecola di mRNA

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

quenza nucleotidica dell’mRNA rispecchia a sua volta quella contenuta nel gene, il DNA dirige la sintesi delle proteine. Quindi variazioni a carico del materiale genetico di un organismo (mutazioni) possono manifestarsi come proteine con strutture e funzioni alterate. Servendosi delle tecniche descritte nei paragrafi seguenti e in altre parti di questo libro, i ricercatori sono in grado di compilare un catalogo delle informazioni codificate all’interno di una molecola di DNA di un organismo. Lo studio della dimensione, dell’organizzazione e del contenuto genico del genoma è conosciuto con il nome di genomica. Per analogia, la trascrittomica si riferisce allo studio dell’espressione genica, mentre il gruppo di molecole di mRNA sintetizzate in particolari circostanze da una cellula viene chiamato trascrittosoma. Infine, la proteomica è lo studio delle proteine (il proteoma), vale a dire del risultato finale dei processi di trascrizione e traduzione. Anche se il genoma di un organismo rimane essenzialmente immutato per tutta la durata della sua vita, il trascrittosoma e il proteoma dello stesso organismo possono invece variare notevolmente a seconda del tessuto, delle fasi dello sviluppo e delle condizioni ambientali.

4 Il sequenziamento degli acidi nucleici CONCETTI CHIAVE

• In laboratorio, gli acidi nucleici possono essere tagliati a livello di sequenze ben precise utilizzando gli enzimi di restrizione.

• I frammenti di acido nucleico si possono separare a seconda della loro dimensione utilizzando l’elettroforesi.

• Nel metodo della terminazione della catena, la DNA polimerasi genera frammenti di DNA interrotti a caso. L’identificazione del nucleotide che termina la catena di ogni frammento permette di risalire alla sequenza del DNA di origine.

• Il genoma umano contiene approssimativamente 21 000 geni, corrispondenti a circa l’1,2% dei suoi tre miliardi di nucleotidi.

• Le differenze esistenti tra le sequenze rivelano i cambiamenti evolutivi. La maggior parte di ciò che sappiamo circa la struttura e la funzione delle proteine deriva da informazioni ottenute non dalle molecole proteiche stesse ma, per via indiretta, dai loro geni. L’essere in grado di determinare la sequenza di nucleotidi degli acidi nucleici ha reso possibile dedurre le sequenze amminoacidiche delle proteine da essi codificate e, in una certa misura, le strutture e le funzioni di tali proteine. Il sequenziamento degli acidi nucleici ha rivelato anche informazioni sulla regolazione dei geni. Alcune parti dei geni che in realtà non sono trascritte in RNA possono ugualmente influenzare la frequenza con cui un gene è trascritto e tradotto, cioè la sua velocità di espressione; inoltre, gli sforzi tesi a chiarire le sequenze di regioni finora non mappate del DNA hanno consentito di scoprire nuovi geni e nuovi elementi di regolazione. Se è nota la sua sequenza, un acido nucleico può essere duplicato, modificato ed espresso, permettendo di studiare proteine che altrimenti non si potrebbero ottenere in quantità utili. In questo paragrafo descriveremo le modalità di sequenziamento degli acidi nucleici e le informazioni che si possono ottenere dalle loro sequenze. Nel paragrafo successivo discuteremo come vengono manipolate le sequenze degli acidi nucleici purificati. La strategia complessiva usata per sequenziare un qualsiasi polimero composto da unità non identiche prevede tre fasi. 1. Scissione del polimero in frammenti specifici di dimensioni sufficientemente piccole da poter essere sequenziati in modo completo. 2. Determinazione della sequenza dei residui presenti in ciascun frammento. 3. Ordinamento dei frammenti del polimero originale mediante l’allineamento dei frammenti che contengono sequenze sovrapposte.

57

CONCETTI DI BASE Il dogma centrale Sebbene il nucleo della cellula sia spesso considerato una sorta di centro di controllo, esso non trasmette informazioni al resto della cellula. Invece, come ci ricorda il dogma centrale, l’informazione genetica presente nel DNA è relativamente inerte e viene semplicemente copiata, mediante replicazione o trascrizione. PUNTO DI VERIFICA

• Spiegate perché la natura a doppio filamento del DNA è importante per copiare e trasmettere l’informazione genetica nel momento in cui una cellula si divide.

• Riassumete le fasi del dogma centrale. Qual è il ruolo dell’RNA in ciascuna fase?

58

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

GC A C UUGA Fosfodiesterasi di veleno di serpente GC A C UUGA GC A C UUG GC A C UU GCACU GCAC GCA G C + Mononucleotidi

Figura 3.14 Determinazione della sequenza di un oligonucleotide mediante enzimi non specifici. L’oligonucleotide viene digerito parzialmente con fosfodiesterasi di veleno di serpente, che rompe i legami fosfodiesterici tra i residui nucleotidici a partire dall’estremità 3’ dell’oligonucleotide. Si genera una miscela di frammenti di tutte le lunghezze, che in seguito vengono separati. Confrontando la composizione in basi di una coppia di segmenti che differiscono di un solo nucleotide è possibile stabilire l’identità del nucleotide 3’-terminale del tratto più lungo. L’analisi di ogni coppia di frammenti svela la sequenza dell’oligonucleotide originale.

© 978-88-08-42096-1

Durante i primi tentativi volti a sequenziare l’RNA si sfruttavano enzimi non specifici allo scopo di produrre frammenti relativamente brevi, la cui composizione in nucleotidi veniva quindi determinata mediante digestione parziale con un enzima che rimuoveva selettivamente i nucleotidi da un’estremità o dall’altra (Figura 3.14). Il sequenziamento dell’acido ribonucleico con questa procedura richiedeva molto tempo. Infatti, Robert Holley, utilizzando questa metodica, impiegò sette anni per ottenere la sequenza di una molecola di tRNA costituita da 76 residui. Dopo il 1975 furono compiuti straordinari progressi nella tecnologia del sequenziamento degli acidi nucleici, resi possibili dalla scoperta di enzimi in grado di scindere il DNA a livello di siti specifici, nonché dallo sviluppo di tecniche di sequenziamento del DNA molto più rapide. Dato che la maggior parte delle sequenze specifiche di DNA è di norma presente in singola copia, la maggior parte dei metodi di sequenziamento trae enormi vantaggi dall’amplificazione di segmenti di DNA tramite il clonaggio o copiandoli (Paragrafo 3.5).

A Le endonucleasi di restrizione tagliano il DNA a livello di sequenze specifiche

Molti batteri hanno la possibilità di resistere alle infezioni causate dai batteriofagi (virus specifici per i procarioti) grazie a un sistema di modificazione e restrizione. Il batterio modifica determinati nucleotidi presenti in specifiche sequenze del proprio DNA mediante aggiunta di un gruppo metilico (−CH3) nel corso di una reazione catalizzata da una metilasi di modificazione. Una endonucleasi di restrizione, che riconosce la stessa sequenza nucleotidica individuata dalla metilasi, taglia qualunque DNA che non è stato modificato su almeno uno dei suoi due filamenti (una endonucleasi scinde legami interni al filamento polinucleotidico di un acido nucleico, mentre una esoTABELLA 3.2 Siti di riconoscimento e di taglio di alcuni nucleasi rimuove uno dei residui terminali dell’acido enzimi di restrizione nucleico). Questo sistema distrugge il DNA esogeno Sequenza (fagico) contenente un sito di riconoscimento che non Enzima di riconoscimentoa Microrganismo è stato modificato tramite metilazione. Il DNA ospite AluI AGgCT Arthrobacter luteus è sempre metilato almeno per metà e quindi, anche se g il filamento figlio non è metilato subito dopo essere BamHI G GATCC Bacillus amyloliquefaciens H stato sintetizzato, quello parentale, a cui quest’ultimo BglII AgGATCT Bacillus globigii è appaiato, è già modificato (e pertanto protegge enEcoRI GgAATTC Escherichia coli RY13 trambe le catene di DNA dal taglio da parte dell’engCC(TA)GG EcoRII Escherichia coli R245 zima di restrizione). EcoRV GATgATC Escherichia coli J62 pLG74 Le endonucleasi di restrizione di tipo II hanno una g particolare utilità in laboratorio: sono enzimi che taHaeII RGCGC Y Haemophilus aegyptius gliano il DNA all’interno della sequenza di 4-8 basi HaeIII GGgCC Haemophilus aegyptius riconosciuta dalla loro corrispondente metilasi di moHindIII AgAGCTT Haemophilus influenzae Rd dificazione. (Le endonucleasi di restrizione di tipo I e HpaII CgCGG Haemophilus parainfluenzae di tipo III scindono il DNA in corrispondenza di siti MspI CgCGG Moraxella species diversi dalle loro sequenze di riconoscimento.) Sono stati caratterizzati più di 11 000 enzimi di restrizione PstI CTGCAgG Providencia stuartii 164 di tipo II, con oltre 270 differenti sequenze di ricoPvuII CAGgCTG Proteus vulgaris noscimento. Nella Tabella 3.2 sono elencati alcuni deSalI GgTCGAC Streptomyces albus G gli enzimi di restrizione più utilizzati. La prima letteTaqI TgCGA Thermus aquaticus ra del nome di questi enzimi deriva dal genere, menXhoI CgTCGAG Xanthomonas holcicola tre la seconda e la terza derivano dalla specie batteria La sequenza di riconoscimento è abbreviata; è indicato un solo ca da cui sono stati ottenuti; seguono poi il sierotipo filamento, scritto nella direzione da 5′ a 3′. Il sito di taglio è o l’indicazione del ceppo del batterio, se ne esistono, rappresentato dalla freccia (g). R e Y indicano, rispettivamente, un e un numero romano se il procariote contiene più di nucleotide purinico e uno pirimidinico. un tipo di enzima di restrizione. Per esempio, EcoRI Fonte: Roberts, R. J., Macelis, D. REBASE (la banca dati degli enzimi di restrizione), http://rebase.neb.com. è prodotto dal ceppo RY13 di E. coli.

CAPITOLO 3

59

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

È interessante notare che gran parte delle endonucleasi di restrizione di tipo II riconosce e taglia sequenze di DNA palindromiche. Un palindromo è una parola o un’espressione che può essere letta in un senso o nell’altro; in lingua inglese due esempi sono “refer” e “Madam, I’m Adam”. In un segmento di DNA palindromico, la sequenza di nucleotidi è la stessa su ciascun filamento e si dice che tale tratto presenta una simmetria doppia (Figura 3.15). Quasi tutti gli enzimi di restrizione tagliano le due catene di DNA a livello di posizioni sfalsate, dando origine a frammenti provvisti di estensioni complementari a singolo filamento. I frammenti di restrizione che presentano questo tipo di estremità coesive possono associarsi, mediante appaiamento delle basi, ad altri frammenti di restrizione prodotti dallo stesso enzima di restrizione; al contrario, determinate endonucleasi di restrizione scindono i due filamenti di DNA in corrispondenza dell’asse di simmetria, generando frammenti di restrizione con estremità nette (piatte) in cui tutte le basi sono appaiate.

(a) EcoRI

59

39

G . . . C

A A T T . . . . . . . . . . . . T T A A

C . . . G

39

T . . .

C . . .

39

A

G 59

59

Sito di taglio

(b)

EcoRV

59

G . . . C

B L’elettroforesi separa gli acidi nucleici in base alla loro dimensione Il trattamento di una molecola di DNA con una endonucleasi di restrizione produce una serie di frammenti specifici che è possibile separare in base alle loro dimensioni. La metodica che viene usata comunemente per questo scopo è l’elettroforesi su gel. In linea di principio, una molecola carica si sposta in un campo elettrico con una velocità proporzionale alla sua densità di carica complessiva, alla sua dimensione e alla sua forma. Per le molecole che presentano una composizione relativamente omogenea (come per esempio gli acidi nucleici), la forma e la densità di carica sono costanti, e la velocità di migrazione dipende principalmente dalle dimensioni. L’elettroforesi è condotta in una matrice gelatinosa, costituita di solito da agarosio (polimeri di carboidrati che formano un reticolo a maglie poco compatte) o da poliacrilamide (un polimero di sintesi più rigido con legami trasversali). Di norma il gel è mantenuto in posizione da due lastre di vetro (Figura 3.16) o è collocato all’interno di uno stretto tubo capillare (Paragrafo 5.2D). Le molecole da separare sono applicate a un’estremità del gel e migrano attraverso i pori della matrice sotto l’influenza del campo elettrico. Le molecole più piccole si spostano con maggiore rapidità attraverso il gel e quindi, in un dato tempo, migrano più lontano dal punto di origine. Alla fine dell’elettroforesi le molecole che sono state separate possono essere visualizzate nel gel grazie a una tecnica opportuna, come l’aggiunta di un colorante che si lega saldamente al DNA, una marcatura di tipo radioattivo, oppure

Catodo

Campione Pozzetti per i campioni

Ð Tampone

Lastra di vetro Gel

+ Anodo Tampone

39

A . . . T

T . . . A

A . . . T

Doppio asse di simmetria Figura 3.15 I siti di restrizione. Le

sequenze di riconoscimento per le endonucleasi di restrizione di tipo II sono palindromi, cioè sequenze che presentano un doppio asse di simmetria. (a) Sito di riconoscimento per EcoRI, che genera frammenti di DNA con estremità coesive. (b) Sito di riconoscimento per EcoRV, che produce frammenti con estremità piatte.

Figura 3.16 Apparato per elettroforesi su gel. I campioni sono applicati in pozzetti situati nella parte superiore del gel e sottoposti a elettroforesi in corsie parallele. Le molecole cariche negativamente come il DNA migrano attraverso la matrice del gel verso l’anodo in risposta al campo elettrico applicato. Poiché le molecole di dimensioni più piccole si spostano più velocemente, il contenuto di ogni corsia è separato in base alle rispettive dimensioni. Dopo l’elettroforesi è possibile visualizzare i campioni mediante colorazione o fluorescenza.

Che cosa accadrebbe se il campione contenesse molecole cariche positivamente?

CAPITOLO 3

60

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

Figura 3.17 Elettroferogramma di prodotti digeriti per restrizione. Il plasmide pAgK84 è stato digerito con (A) BamHI, (B) PstI, (C) BglII, (D) HaeIII, (E) HincII, (F) SacI, (G) XbaI e (H) HpaI. La corsia I contiene il batteriofago λ digerito con HindIII come standard, poiché i frammenti prodotti da questo enzima hanno dimensioni note. I frammenti di restrizione in ogni corsia sono visualizzati mediante fluorescenza su uno sfondo nero. [Slota, J.E., Farrad, S.F. (1982). Plasmid 8, 180. Copyright © 1982 by Academic Press.]

la fluorescenza. In base alle dimensioni del gel e alla metodica di visualizzazione impiegata, con l’elettroforesi su gel è possibile separare campioni contenenti meno di un nanogrammo di materiale e rilevarli. Si possono far correre svariati campioni contemporaneamente; per esempio, i frammenti ottenuti digerendo del DNA con differenti endonucleasi di restrizione possono essere visualizzati l’uno di fianco all’altro (Figura 3.17) e le dimensioni dei vari frammenti possono essere determinate confrontando le mobilità elettroforetiche con quelle di molecole di DNA a lunghezza nota.

C Il metodo tradizionale di sequenziamento del DNA utilizza la tecnica di terminazione della catena In questo paragrafo discuteremo la procedura più utilizzata, fino a pochi anni fa, per sequenziare il DNA, ossia il metodo di sequenziamento mediante terminazione della catena, ideato da Frederick Sanger. La prima tappa consiste nella preparazione di polinucleotidi a filamento singolo; le catene di DNA complementare possono essere separate con il calore, che rompe i legami idrogeno tra le basi. In seguito vengono generati frammenti di polinucleotidi che terminano in posizioni corrispondenti a ciascuno dei quattro nucleotidi; infine questi frammenti sono separati e rilevati.

Questa metodica, nota anche come metodo dei dideossi, utilizza un enzima di E. coli per sintetizzare copie complementari del DNA a singolo filamento da sequenziare. L’enzima è una parte della DNA polimerasi I, uno degli enzimi coinvolti nella replicazione del DNA dei batteri (Paragrafo 25.2A); impiegando il filamento di DNA singolo come stampo, la DNA polimerasi I unisce i quattro deossinucleosidi trifosfato (dNTP), dATP, dCTP, dGTP e dTTP, in una catena polinucleotidica complementare che poi si allunga in direzione 5′ n 3′ (Figura 3.18). La DNA polimerasi copia un filamento stampo.

Stampo

39 p

p

p

p

p

... 59

p

...

p

p

...

p

p

p

p

p

p

...

...

T

C

A

A

A

T

C

DNA polimerasi I

T

C

A

G

T

G ...

...

G

G

...

T

...

G

...

A

...

C ...

...

G

T

C

A

C

A

A

T T

PPi OH p ... 59

p

p

+

OH ppp

OH + ecc.

+

OH p

ppp

p

p

p

+

OH

+ ecc.

ppp

... Primer

39

dCTP

dTTP

Figura 3.18 Funzionamento della DNA polimerasi I. Usando un singolo filamento di DNA come stampo, l’enzima allunga il primer mediante aggiunta sequenziale di nucleotidi complementari; i nucleotidi in entrata si appaiano con le basi del filamento stampo e vengono uniti al filamento polinucleotidico in fase di allungamento nella direzione 5’ n 3’. La reazione catalizzata

dalla polimerasi richiede un gruppo 3’-OH libero sul filamento in crescita; a ogni aggiunta di nucleotidi viene rilasciato pirofosfato (P2O74–; PPi). Elencate i substrati e i prodotti della reazione della DNA polimerasi.

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

61

La DNA polimerasi I può aggiungere deossinucleotidi in successione unicamente all’estremità 3′ di un polinucleotide che è appaiato con il filamento stampo; la replicazione inizia in presenza di un breve polinucleotide (un primer) complementare all’estremità 3′ del DNA stampo, che diventa quindi l’estremità 5′ del nuovo filamento. Se il DNA da sequenziare è un frammento di restrizione, come avviene solitamente, inizia e termina con un sito di restrizione. Il primer può perciò essere una breve sequenza di DNA che possiede la sequenza di tale sito di restrizione. Nella tecnica di sequenziamento mediante terminazione della catena (Figura 3.19), il DNA da sequenziare è incubato con la DNA polimerasi I, un primer opportuno e i quattro dNTP che fungono da substrati (i reagenti nelle reazioni enzimatiche) per la reazione di polimerizzazione. Il componente fondamentale della miscela di reazione è una piccola quantità di un 2′,3′-dideossinucleoside trifosfato (ddNTP), La sintesi del DNA termina dopo basi specifiche.

Base P

P

P

OCH2 O H

H

H

H

H

H

29,39-dideossinucleoside trifosfato

che è privo del gruppo 3′-OH presente nei deossinucleotidi. Quando l’analogo dideossi è incorporato all’interno del polinucleotide in crescita al posto del corrispondente nucleotide normale, l’allungamento della catena si interrompe poiché l’aggiunta del nucleotide successivo richiede un gruppo 3′-OH libero. Usando una piccola quantità di ddNTP, si genera una serie di catene troncate, ciascuna delle quali finisce con l’analogo dideossi in una delle posizioni oc39 Stampo: Primer o innesco: 59

59

CCGGTAGCAACT GG 39

DNA polimerasi

dATP + dCTP + dGTP + dTTP + ddATP + ddCTP + ddGTP + ddTTP GGCCATCGTTGA GGCCATCGTTG GGCCATCGTT GGCCATCGT GGCCATCG GGCCATC GGCCAT GGCCA GGCC GGC

Migrazione del DNA

Laser

Segmenti di DNA marcati con colorante

I segmenti di DNA marcati con un colorante vengono sottoposti a elettroforesi in un capillare contenente un gel

Rivelatore

Figura 3.19 Il metodo di sequenziamento del DNA mediante terminazione della catena (o dei dideossi). Le miscele di reazione comprendono il DNA a singolo filamento da sequenziare (lo stampo), un primer, i quattro deossinucleosidi trifosfato (rappresentati come dATP, ecc.) e uno dei quattro dideossinucleosidi trifosfato (ddATP, ecc.). L’estensione del primer, grazie all’azione della DNA polimerasi, genera tratti di DNA che terminano quando viene aggiunto un dideossinucleotide. Il risultato è la produzione di un insieme di frammenti di DNA che differiscono gli uni dagli altri per un solo nucleotide. L’elettroforesi su gel nel tubo capillare separa poi i vari frammenti in base alla loro dimensione. Nel momento in cui ogni polinucleotide passa all’interno del rivelatore, il suo nucleotide 3’-terminale viene identificato a seconda della propria emissione fluorescente quando è stimolato dalla luce laser incidente.

62

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

AG T T C T AG AG C G GC C GCC AC CG CGGTGGNAG C T C C AGC T T T T G T T CCC T T T A GT G A GGG TT AA T T T C G A G C T T G G CGT A A T C A T G G T C A T AG C T G T T T C 0 110 120 130 140 150 160 170 180 190

CC T G T G T G A A AT T G T T A T C C G CT C A C A A T T CC A C A C A A C A T A C G A G C C G G A A G C A T A A A G T G T A A A G C C T G G G G T G C C T A A T G A G T G A G C T 200 210 220 230 240 250 260 270 280 2

Figura 3.20 Dati di sequenziamento

del DNA. Ognuna delle quattro curve colorate rappresenta il profilo elettroforetico dei frammenti contenenti uno dei dideossinucleotidi: il verde, il rosso, il nero e il blu corrispondono ai frammenti che terminano rispettivamente con ddATP, ddTTP, ddGTP e ddCTP. La base 3’-terminale di ogni oligonucleotide è identificata per mezzo della fluorescenza della sua banda di gel ed è indicata da una singola lettera (A, T, G o C); questa porzione di lettura corrisponde ai nucleotidi da 100 a 290 del frammento di DNA che viene sequenziato. [Per gentile concessione di Mark Adams, The Institute for Genomic Research, Rockville, Maryland.]

Figura 3.21 L’ordine dei frammenti

sequenziati nel loro DNA di origine è determinato dall’abbinamento delle sequenze di frammenti sovrapposti. Quindi, l’estremità 3’ del frammento 1 è identica all’estremità 5’ del frammento 2, la cui estremità 3’ è identica all’estremità 5’ del frammento 3 e così via.

cupate dalla base corrispondente. Ogni ddNTP è caratterizzato da un’“etichetta” fluorescente diversa, in modo che i prodotti della reazione della polimerasi possano essere facilmente individuati. L’elettroforesi su gel separa i segmenti di DNA neosintetizzati che differiscono tra loro per un solo nucleotide. In tal modo la sequenza del filamento replicato può essere letta direttamente sul gel. Si tenga però in considerazione che la sequenza ottenuta grazie al metodo di terminazione della catena è complementare al filamento di DNA che si sta sequenziando. Gli strumenti di sequenziamento più avanzati che utilizzano il metodo di terminazione della catena identificano ogni segmento di DNA nel momento in cui esso fuoriesce dal tubo capillare in cui ha luogo l’elettroforesi. Così facendo, i dati ottenuti si presentano come una serie di picchi (Figura 3.20). Poiché sia la preparazione del campione sia l’analisi dei dati sono ormai completamente automatizzate, si possono ottenere sequenze di DNA (chiamate “letture”, reads) lunghe fino a 1000 nucleotidi partendo da una sola miscela di reazione iniziale prima che errori cumulativi riducano l’identificazione della base a livelli inaccettabili. In quasi tutti i sistemi più avanzati il gel di separazione è contenuto in una serie di tubi capillari, il cui numero può arrivare a 384; quindi questi apparati sono in grado di sequenziare simultaneamente fino a 384 segmenti di DNA. Le numerose letture che sono state sequenziate devono essere disposte in un ordine corretto per formare il filamento molto più lungo di DNA da cui sono state originate. Ciò si ottiene mediante la sovrapposizione delle letture di sequenze, come è indicato schematicamente nella Figura 3.21. I gruppi di frammenti di DNA sovrapposti sono generati tagliando il DNA separatamente con almeno due endonucleasi di restrizione che hanno sequenze bersaglio differenti. In alternativa, i frammenti possono essere generati sottoponendo una soluzione del DNA a doppio filamento a onde sonore ad alta frequenza, un processo chiamato sonicazione, che rompe meccanicamente il DNA in corrispondenza di siti casuali. Anche per cromosomi relativamente piccoli (il genoma di E. coli ha 4600 kb; un cromosoma umano medio ha 125 000 kb), l’ordinamento delle letture è un processo computazionale molto impegnativo. Inoltre, il metodo di terminazione della catena ha un tasso di errore di circa lo 0,1% (che porterebbe a circa 125 000 errori in un cromosoma di 125 000 kb). Per ridurre al minimo questi errori, il DNA deve essere sequenziato indipendentemente molte volte, normalmente ripetendo il processo almeno dieci volte.

DNA intatto

59–ACTCGGAGTAACGCTATGAAGCATTCGCATTTGTCGAGTCT–39 ACTCGGAGTAACG Frammento 1 TAACGCTATGAAGCATT Frammento 2 AGCATTCGCATTTG Frammento 3 ATTCGCATTTGTCGAGTCT Frammento 4

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

D Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione sono a elevato parallelismo L’importanza delle informazioni contenute nella sequenza del DNA, in particolare l’enorme quantità di dati ottenuta sequenziando genomi interi, ha favorito lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, che rappresentano un buon compromesso tra costi, velocità e accuratezza. Come il metodo di terminazione della catena, molti dei metodi più nuovi sfruttano la capacità del filamento di DNA di dirigere la sintesi di una sua copia complementare (una procedura nota come sequenziamento per sintesi). In aggiunta, questi metodi possono determinare simultaneamente da centinaia di migliaia a miliardi di letture diverse; cioè portano avanti reazioni di sequenziamento a elevato parallelismo. Di seguito sono descritte due delle diverse tecnologie di sequenziamento oggi in uso. Nel pirosequenziamento (che utilizza una strumentazione prodotta da 454 Life Science, Inc, e conosciuta quindi anche come sequenziamento 454) i frammenti di DNA da sequenziare vengono immobilizzati sulla superficie di microscopiche sferette di plastica in condizioni di diluizione tale che non più di una singola molecola di DNA sia attaccata a una singola sferetta. Il DNA di ciascuna sferetta è poi replicato (amplificato) molte volte mediante una variante del processo descritto nel Paragrafo 3.5C, e le sferette si depositano nei pozzetti di una piastra in fibra ottica che può contenere una sola sferetta per pozzetto. Ai campioni vengono poi aggiunti un primer e la DNA polimerasi, dopodiché viene introdotto un dNTP substrato. Se la DNA polimerasi aggiunge quel determinato nucleotide al nuovo filamento di DNA, viene rilasciato pirofosfato (PPi) innescando una reazione chimica che coinvolge l’enzima delle lucciole luciferasi, che a sua volta produce un lampo di luce. Le soluzioni contenenti ognuno dei quattro dNTP vengono successivamente aggiunte allo stampo di DNA immobilizzato e un rivelatore registra se si ha produzione di luce in presenza di quel particolare dNTP. Ripetendo molte volte questo processo è possibile dedurre la sequenza di nucleotidi complementare al filamento stampo. Il pirosequenziamento è in grado di effettuare accuratamente letture fino a 700 nucleotidi, quindi più corte delle sequenze rivelate dal metodo di sequenziamento mediante terminazione della catena. Ogni piastra in fibra ottica contiene numerosi pozzetti, quindi possono essere sequenziati simultaneamente circa un milione di filamenti stampo. Di conseguenza, il sistema del pirosequenziamento è circa 1000 volte più veloce dei più avanzati metodi di sequenziamento mediante terminazione della catena. Il metodo di sequenziamento Illumina (che usa una strumentazione prodotta da Illumina, Inc.) è un altro sisema di sequenziamento per sintesi, in cui numerosi segmenti di DNA sono attaccati su un vetrino e amplificati sul posto per formare gruppi di milioni di molecole di DNA identiche. Per determinare le loro sequenze, viene aggiunta al vetrino una soluzione contenente i quattro dNTP, ognuno legato a un gruppo fluorescente diverso e bloccato chimicamente in posizione 39, in modo che a ogni filamento primer venga aggiunto dalla DNA polimerasi un solo nucleotide. I dNTP che non hanno reagito vengono rimossi mediante lavaggio, i gruppi fluorescenti che sono legati ai filamenti primer vengono eccitati da un laser e identificati in base al loro colore di fluorescenza da una fotocamera digitale (Figura 3.22). I gruppi fluorescenti bloccati in posizione 39 sono poi rimossi chimicamente e viene ripetuto il ciclo di sintesi e identificazione. Il sistema Illumina può determinare accuratamente sequenze da 30 a 300 nucleotidi, molto più corte di quelle dei metodi di terminazione della catena e di pirosequenziamento, ma può determinare fino a 3 miliardi di letture per volta. Molte altre tecnologie di sequenziamento del DNA ad alta efficienza sono già in uso o in via di sviluppo. Forse i metodi più interessanti sono quelli in cui

63

64

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

Figura 3.22 Diagramma schematico

di sei cicli successivi con lo strumento di sequenziamento Illumina. I derivati di ciascun differente nucleotide (C, A, T e G) emettono ognuno una fluorescenza di colore diverso. [Ristampato con autorizzazione da Macmillan Publishers Ltd: Nature Review Genetics, Vol 11, Num 1, 31-46, Copyright (2009)]

Ciclo 1

© 978-88-08-42096-1

Ciclo 2

Ciclo 3

C

A

T

G

Ciclo 4

Ciclo 5

Ciclo 6

In alto: CATCGT In basso: TCAGCT

un singolo filamento di DNA viene fatto passare tramite elettroforesi attraverso dei nanopori (pori delle dimensioni di una molecola) di una membrana, e la sua sequenza è rivelata dalle piccole variazioni delle proprietà elettriche dei pori quando vengono attraversati dalle diverse basi. Questa tecnica a singola molecola, se condotta in modo sufficientemente affidabile, potrebbe rivelare la sequenza di un filamento di DNA in pochi secondi o minuti (invece delle ore o giorni necessari con i metodi precedenti). Inoltre, non richiederebbe di amplificare il DNA prima del sequenziamento, eliminerebbe la necessità di enzimi e reagenti costosi, e le sue lunghe letture ridurrebbero molto gli sforzi computazionali necessari per assemblare le varie sequenze nei cromosomi. Tutti i risultati ottenuti con i progetti di sequenziamento, siano essi di grande o di piccola entità, vengono conservati in banche dati accessibili in Internet, come GenBank (vedi i Progetti bioinformatici 1). A metà del 2015 erano stati raccolti oltre 450 milioni di sequenze contenenti circa 1,2 trilioni di nucleotidi, e questi numeri raddoppiano circa ogni 18 mesi. Il sequenziamento degli acidi nucleici è divenuto un procedimento di routine, in quanto la determinazione diretta della sequenza amminoacidica di una proteina (Paragrafo 5.3) richiede molto più tempo rispetto alla deduzione della sequenza in basi del suo gene. Il sequenziamento degli acidi nucleici è quindi fondamentale per lo studio dei geni i cui prodotti non sono ancora stati identificati; se è possibile sequenziare il gene, la probabile funzione del prodotto proteico da esso codificato può essere dedotta confrontando la sequenza di basi con quelle di geni i cui prodotti sono già stati caratterizzati (vedi la Scheda 3.1). Le sequenze nucleotidiche sono conservate nei database.

E Sono stati sequenziati interi genomi Con le nuove tecniche di sequenziamento su larga scala è stato possibile realizzare il sogno di sequenziare interi genomi. Il principale ostacolo tecnico per ottenere queste informazioni non è rappresentato dal sequenziamento del DNA stesso, ma piuttosto dal disporre le decine di migliaia di segmenti sequenziati nel corretto ordine sul cromosoma. A tal fine era necessario lo sviluppo di protocolli di sequenziamento automatizzato e di sofisticati algoritmi matematici informatici. La prima sequenza genomica completa determinata, quella del batterio Haemophilus influenzae, fu riportata nel 1995 da Craig Venter, mentre intorno alla metà del 2015 sono state rese note le sequenze complessive dei genomi di oltre 33 000 procarioti (e molte di più erano quelle in corso di determinazione) e le sequenze di oltre 2200 eucarioti, compresi uomo, animali, piante, funghi, patogeni umani e organismi utilizzati in laboratorio (Tabella 3.3). Sono stati sequenziati anche i genomi di diversi organismi estinti, incluso l’uomo di Neanderthal, il nostro parente più stretto, e del mammut dal pelo lungo.

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

SCHEDA 3.1

65

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Francis Collins e il gene della fibrosi cistica Francis S. Collins (1950-) Intorno alla metà del XX secolo erano state comprese le basi molecolari di svariate patologie umane. Per esempio, si sapeva che l’anemia falciforme (Paragrafo 7.1E) era provocata da una forma anormale della proteina emoglobina e, alla fine, ricerche condotte sull’emoglobina falciforme svelarono il difetto genetico di base, una mutazione nel gene di tale proteina. Si ritenne perciò possibile ricondurre altre malattie a geni alterati. Per numerose affezioni genetiche, persino quelle con sintomi ben caratterizzati, non era stata però ancora identificata alcuna molecola proteica anormale. Uno di tali esempi era la fibrosi cistica, contraddistinta in primo luogo dalla secrezione di muco denso che ostruisce le via aeree e crea un ambiente ideale per la crescita dei batteri. La fibrosi cistica rappresenta una malattia ereditaria piuttosto comune nelle etnie dell’Europa settentrionale (colpisce circa un neonato su 2500) e conduce al decesso prima del raggiungimento dell’età adulta a causa di danni irreversibili a livello polmonare. Si presumeva che l’identificazione del difetto molecolare avrebbe portato a una migliore comprensione della malattia e alla possibilità di attuare terapie più efficaci. A questo punto entra in gioco Francis Collins, il quale iniziò la propria carriera vincendo un dottorato in chimica fisica, ma poi si iscrisse alla facoltà di medicina e fu uno degli artefici della rivoluzione della biologia molecolare. In qualità di medico-scienziato, egli sviluppò metodiche atte ad analizzare lunghi tratti di DNA allo scopo di allocare direttamente specifici geni, compreso quello che, quando è mutato, causa la fibrosi cistica. Analizzando l’acido deossiribonucleico di individui affetti dalla malattia (i quali presentavano due copie del gene difettoso) e di loro familiari che erano portatori asintomatici (cioè con una copia del gene normale e una difettosa), Collins e i suoi collaboratori identificarono la

posizione del gene responsabile della fibrosi cistica sul braccio lungo del cromosoma 7. Il gruppo di ricercatori circoscrisse gradualmente un segmento di DNA che sembra essere presente in un certo numero di specie di mammifero, il che indica che tale frammento contiene un gene essenziale. Il gene per la fibrosi cistica fu infine identificato nel 1989: Collins aveva dimostrato che era possibile identificare un difetto genetico in assenza di altre informazioni molecolari. Una volta individuato il gene, fu relativamente semplice dedurre la probabile struttura e funzione della proteina da esso codificata: un canale di membrana per gli ioni cloruro. Quando funziona normalmente, la proteina agevola la regolazione della composizione ionica e della viscosità delle secrezioni extracellulari. La scoperta del gene per la fibrosi cistica rese altresì possibile elaborare dei test rivolti all’identificazione dei portatori, in modo che questi potessero avvalersi della consulenza genetica. Nel corso di tutto il suo lavoro sul gene della fibrosi cistica e anche durante successive ricerche mirate alla scoperta dei geni che determinano la neurofibromatosi e la corea di Huntington, Collins si è sempre preoccupato delle implicazioni etiche connesse con la nuova scienza della genetica molecolare, ritenendo fondamentale l’obbligo della riservatezza sulle informazioni genetiche, pur riconoscendo contestualmente il potenziale utilizzo terapeutico di tali dati. Durante la sua permanenza alla carica di direttore del Progetto genoma umano, Collins si è impegnato a rendere liberamente e prontamente accessibili i risultati, ritenendo che ne debbano usufruire sia i ricercatori sia le persone che potrebbero trarre beneficio da terapie innovative fondate sulla genetica molecolare. Attualmente è direttore del National Institute of Health (NIH). Riordan, J.R., Rommens, J. M., Kerem, B.-S., Alon, N., Rozmahel, R., Grzelczak, Z., Zielenski, J., Lok, S., Plavsic, N., Chou, J.-L., Drumm, M.L., Iannuzzi, M.C., Collins, F.S., Tsui, L.-C. (1989). Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA, Science, 245, 1066-1073.

Nel sequenziamento metagenomico, le sequenze di DNA di diversi organismi vengono analizzate come se fossero un unico gruppo di dati. Questo tipo di approccio viene solitamente utilizzato per caratterizzare comunità microbiche molto complesse, come quelle presenti nell’ambiente marino, nel terreno, e nell’apparato digerente degli animali. Molte delle specie di queste comunità non possono essere coltivate e sequenziate singolarmente (si stima che solo l’1% circa dei microrganismi esistenti sia stato coltivato in laboratorio). I dati provenienti dalle sequenze metagenomiche indicano il numero di geni totali e forniscono una stima sulle capacità metaboliche collettive della comunità. Con l’analisi metagenomica dei microrganismi che colonizzano l’intestino umano sono stati identificati, per esempio, oltre tre milioni di geni, che rappresentano circa 1000 specie batteriche. Il cosiddetto microbioma, che di norma è composto da circa 100 trilioni di cellule (molte di più di quelle che costituiscono l’intero corpo umano) favorisce la digestione in quanto scompone alcuni carboidrati che l’uomo altrimenti non sarebbe in grado di digerire, fornisce alcune vitamine, e promuove lo sviluppo del sistema immunitario. Nonostante la maggior parte degli individui abbia in comune un totale di circa 60 tipi di microrganismi intestinali, sembra che le differenze siano legate in modo significativo ad alcune variabili metaboliche come la massa corporea. Microbiomi intestinali atipici sono anche associati ad alcune malattie, come le malattie infiammatorie intestinali.

66

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 3.3 Alcuni dei genomi sequenziati

Organismo Mycoplasma genitalium (parassita umano)

Dimensioni del genoma (kb)

Numero di cromosomi

580

1

Rickettsia prowazekii (presunta relazione con i mitocondri)

1112

1

Haemophilus influenzae (patogeno umano)

1830

1

Escherichia coli (simbionte umano)

4639

1

Saccharomyces cerevisiae (lievito per panificazione)

12 070

16

Plasmodium falciparum (protozoo responsabile della malaria)

23 000

14

Caenorhabditis elegans (nematode)

97 000

6

Arabidopsis thaliana (pianta dicotiledone)

119 200

5

Drosophila melanogaster (moscerino della frutta)

180 000

4

Oryza sativa (riso)

389 000

12

Danio rerio (pesce zebra)

1 700 000

25

Gallus gallus (pollo)

1 200 000

40

Mus musculus (topo)

2 500 000

20

Homo sapiens

3 038 000

23

Qual è la relazione, se esiste, tra la dimensione del genoma e il numero dei cromosomi?

Il genoma umano contiene un numero relativamente piccolo di geni. La deter-

minazione della sequenza del genoma umano, composto da circa tre miliardi di nucleotidi, è stata un’impresa titanica, che ha coinvolto centinaia di scienziati suddivisi in due gruppi di lavoro, uno guidato da Venter e l’altro da Francis Collins (Scheda 3.1), Eric Lander e John Sulston ed è costata 300 milioni di dollari. Dopo tredici anni di intensi sforzi, all’inizio del 2001 è stata ottenuta una “prima bozza” della sequenza del genoma umano, mentre quella “definitiva”, che copriva circa il 99% dell’intero genoma, è stata resa nota nel 2004. Questo straordinario risultato può rivoluzionare il modo di considerare e mettere in pratica la biochimica e la medicina, anche se potranno servire ancora molti anni per comprendere appieno il significato di queste scoperte. Si possono ugualmente trarre alcune importanti considerazioni, come quelle indicate di seguito.

1. 2. 3. 4.

Circa la metà del genoma umano è costituita da vari tipi di sequenze ripetute. Fino all’80% del genoma può essere trascritto in RNA. Solo l’1,2% del genoma codifica proteine. Il genoma umano sembra contenere circa 21 000 geni che codificano proteine, conosciuti anche come schemi di lettura aperti (ORF, open reading frame), invece dei 35 000-140 000 che erano stati in precedenza previsti. Tale numero è in accordo con i circa 6000 ORF del lievito, i circa 13 000 ORF

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

della Drosophila, i circa 19 000 ORF del C. elegans e i circa 26 000 ORF dell’Arabidopsis (si tenga però presente che questi valori numerici quasi certamente cambieranno quando avremo migliorato la nostra capacità, al momento imperfetta, di riconoscere gli ORF). 5. Solo una piccola frazione delle proteine umane è tipica dei vertebrati; la maggior parte è presente in molte altre forme di vita, se non in tutte. 6. Due genomi umani scelti a caso differiscono, in media, per un solo nucleotide su 1000; due persone qualsiasi hanno quindi una probabilità superiore al 99,9% di avere identità genetica.

È poco probabile che la superiore complessità degli esseri umani (vertebrati) rispetto agli invertebrati sia dovuta al numero relativamente più alto di ORF codificati dai vertebrati. Le proteine stesse dei vertebrati sono invece più complesse rispetto a quelle degli invertebrati, cioè le proteine dei vertebrati possiedono in genere più domini (moduli) rispetto a quelle degli invertebrati. Questi moduli sono molto spesso espressi selettivamente attraverso splicing alternativo del gene (un processo in cui un dato trascritto genico può essere elaborato in molteplici modi, così da produrre proteine differenti quando viene tradotto; Paragrafo 26.3B). Infatti, numerosi geni dei vertebrati codificano proteine diverse, anche se simili.

F L’evoluzione è il risultato delle mutazioni nelle sequenze Una delle ricadute più rilevanti della tecnologia del sequenziamento degli acidi nucleici riguarda le informazioni che essa rende disponibili circa i meccanismi dell’evoluzione. Le proprietà chimiche e fisiche del DNA, come per esempio la sua forma tridimensionale regolare e il processo della replicazione, possono dare l’impressione che i dati genetici siano relativamente statici. In realtà il DNA è una molecola dinamica, soggetta a mutamenti che alterano le informazioni genetiche. Per esempio, l’errato appaiamento delle basi nel corso della replicazione introduce nei filamenti figli errori noti come mutazioni puntiformi. Le mutazioni possono anche insorgere nel DNA per effetto di agenti chimici o di radiazioni. Alterazioni più estese delle informazioni genetiche sono causate da difetti nella ricombinazione (lo scambio di DNA tra cromosomi) e dalla trasposizione di geni internamente a un cromosoma o tra cromosomi e, in determinati casi, da un organismo all’altro. Tutti questi cambiamenti apportati all’acido deossiribonucleico costituiscono la base della selezione naturale. Quando un gene mutato è trascritto e l’RNA messaggero è successivamente tradotto, la proteina che ne risulta può possedere nuove proprietà che conferiscono un certo vantaggio all’individuo. Dato che si trasmette da una generazione alla successiva, un cambiamento benefico entra a far parte della normale costituzione genetica della specie; ovviamente, con l’evoluzione di quella specie si verificano molte variazioni, e non tutte semplici o graduali. Le relazioni filogenetiche possono essere rilevate confrontando le sequenze di geni analoghi in organismi diversi: il numero di differenze nucleotidiche tra geni corrispondenti in due specie fornisce un’indicazione approssimativa del loro grado di divergenza nell’arco del processo evolutivo. La suddivisione dei procarioti in archea e batteri (Paragrafo 1.2C) in base alle sequenze di rRNA presenti in tutti gli organismi è un risultato di queste analisi. Il sequenziamento degli acidi nucleici rivela inoltre che specie differenti per fenotipo (per caratteristiche fisiche) mostrano nondimeno spiccate analogie a livello molecolare. Per esempio, l’uomo ha in comune con lo scimpanzé circa il 99% del suo DNA; studi condotti sul granoturco (o mais) e sul suo presunto progenitore, il teosinto, indicano che tali piante differiscono unicamente per alcuni geni che dirigono lo sviluppo dei chicchi (quelli di teosinto sono racchiusi in un rivestimento non commestibile, Figura 3.23).

67

68

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

Figura 3.23 Il mais e il teosinto. Nonostante le considerevoli differenze di fenotipo, dal momento che il mais (in basso) possiede centinaia di chicchi che si possono mangiare, mentre il teosinto (in alto) ne ha solo pochi e non commestibili, le due piante si differenziano solo per un basso numero di geni. Si ritiene che il progenitore del mais fosse una forma mutante del teosinto in cui i chicchi erano più esposti. [(In alto) Per gentile concessione di John Doebley, University of Winsconsin; (in basso) Marek Mnich/Stockphoto.]

Piccole mutazioni nel DNA sono responsabili di salti evolutivi piuttosto considerevoli; ciò forse non sorprende più di tanto se si tiene conto della natura delle informazioni genetiche. Una mutazione in un segmento genico che non codifica proteine potrebbe interferire con il legame di fattori cellulari che influenzano la sequenza temporale del processo di trascrizione, mentre una mutazione in un gene che codifica un RNA potrebbe ostacolare il legame di fattori che influenzano l’efficienza della traduzione. Un riordinamento scarsamente rilevante di geni potrebbe interrompere un certo processo evolutivo, portando alla comparsa di una nuova specie. Nonostante l’elevata probabilità che la gran parte dei mutamenti improvvisi possa condurre a una diminuzione delle capacità individuali o all’impossibilità di riprodursi, i risultati di queste alterazioni repentine nelle informazioni genetiche si possono riscontrare nei reperti fossili. Queste discontinuità, determinate verosimilmente da rapidi cambiamenti genetici, hanno dato in passato sostegno alle tesi avverse alla teoria di Charles Darwin sull’evoluzione mediante selezione naturale. Le variazioni delle sequenze possono essere collegate a patologie umane.

A oggi circa 5000 mutazioni sono state collegate a diverse forme di patologie, note come malattie monogenetiche, quali la fibrosi cistica (vedi la Scheda 3.1); si tratta comunque di malattie abbastanza rare. La maggior parte delle patologie ha origine da interazioni tra diversi geni e da fattori ambientali. Gli scienziati sperano però che la genomica possa portare a una migliore comprensione di come l’informazione genetica influisca sulla salute e sulla suscettibilità ad ammalarsi. Hanno avuto particolare successo due aree di studio: gli screening dei neonati per le malattie genetiche curabili e l’identificazione di individui adulti portatori di una malattia genetica recessiva, cioè di coloro che hanno un fenotipo normale ma sono portatori di una copia del gene difettoso che può essere trasmesso ai figli. Sono attualmente disponibili diversi test clinici per identificare alcune centinaia di questi singoli difetti genici (Tabella 3.4). Alcuni risultati preliminari indicano che man mano che cresce il numero di genitori che divengono consapevoli del loro stato di portatori sani, nascono meno bambini malati. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione hanno reso possibile sequenziare un genoma umano completo in pochi giorni al costo di circa 1000 dollari, somme che ci si aspetta possano ridursi notevolmente nei prossimi anni. In ogni caso, le sequenze di 50-300 nucleotidi generate dal sistema di sequenziamento Illumina sono troppo corte per poter essere messe in ordine in modo preciso all’interno dei cromosomi. Piuttosto, confrontando queste sequenze relativamente corte con un genoma umano di sequenza nota, un processo chiamato risequenziamento, si possono determinare facilmente le differenze di sequenza fra i cromosomi di individui diversi. Questo ha reso possibile sequenzia-

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

69

TABELLA 3.4 Alcune malattie genetiche diagnosticabili con test di screening

Patologia

Sintomi

Atassia telangiectasia

Perdita del controllo motorio, immunodeficienza, accresciuto rischio di insorgenza del cancro

Beta talassemia

Grave anemia, crescita rallentata

Galattosemia

Disabilità mentale, danni agli organi

Malattia di Niemann-Pick

Perdita delle abilità motorie e intellettuali, accumulo di lipidi

Malattia di Tay-Sachs

Perdita delle abilità motorie e intellettuali, morte intorno ai 3 anni

Malattia di Usher

Sordità e perdita progressiva della vista

Cancro al seno, all’ovaio, alla prostata

Proliferazione incontrollata delle cellule tumorali

re completamente, entro la metà del 2015, decine di migliaia di genomi umani, e questo numero sta crescendo rapidamente. Molte delle differenze tra i vari genomi umani sono dovute a polimorfismi di singolo nucleotide (SNPs, pronunciato “snips”, in cui la sequenza di DNA differisce fra gli individui per una singola posizione nucleotidica). Tuttavia, si verificano anche inserzioni e delezioni di singoli nucleotidi o di brevi sequenze di DNA. Sono stati catalogati circa 10 milioni di SNP. Grazie a studi condotti su migliaia di soggetti normali o con alcune complesse patologie, come il cancro e il diabete di tipo 2, i ricercatori sono riusciti a identificare molti SNP associati all’aumento del rischio di incidenza di tali condizioni patologiche. La sfida futura consiste nel fatto che ogni variante genetica associata a una patologia solitamente accresce il fattore di rischio per quella malattia solo in una percentuale limitata di persone, quindi la probabilità individuale di sviluppare una particolare patologia sembra essere più simile a una funzione complicata ricca di variabili. Inoltre, è stata identificata solo una piccola percentuale dei fattori di rischio (si stima circa il 5-20%) . Quindi, nonostante molte aziende offrano servizi di sequenziamento genomico individuale, fino al momento in cui l’informazione genetica potrà realmente essere tradotta in un’effettiva prevenzione delle malattie il riscontro pratico della “genomica personale” è abbastanza limitato. Oltre ad avere ampliato enormemente la nostra conoscenza della biologia umana e dei processi patologici, il confronto di numerose sequenze genomiche umane ha fornito dati senza precedenti sull’evoluzione degli essere umani e sulle loro migrazioni. Per esempio, i neandertaliani erano una sottospecie di ominidi che viveva in Europa e nel Medio Oriente e si sono estinti circa 40 000 anni fa. I frammenti di DNA ricavati dalle loro ossa hanno permesso a Svante Pääbo di determinare la sequenza del loro genoma. Si è scoperto che i genomi degli attuali europei e asiatici, ma non degli africani, hanno circa l’1-4% di DNA uguale a quello dell’uomo di Neanderthal, che geneticamente equivale grosso modo ad avere un bis-bis-bis-nonno neandertaliano. Sembra che gli attuali esseri umani siano migrati dall’Africa verso il Medio Oriente per popolare il resto del mondo (i resti fossili indicano che i neandertaliani hanno occupato l’Europa e il Medio Oriente almeno 230 000 anni fa, mentre gli esseri umani attuali sono migrati dall’Africa circa 100 000 anni fa). Nel 2010, le analisi genomiche di un osso di dito di 41 000 anni trovato nella grotta di Denisova in Siberia hanno rivelato l’esistenza di una seconda sottospecie di ominidi estinti, che sono stati chiamati Denisoviani. Anche questi ominidi si sono incrociati con gli attuali esseri umani, sebbene, curiosamente, solo con gli antenati delle popolazioni che attualmente occupano le isole del Sudest asiatico e l’Oceania.

PUNTO DI VERIFICA

• Spiegate come fanno gli enzimi di restrizione a generare sia estremità adesive sia estremità tronche.

• Perché i frammenti più piccoli di DNA migrano più lontano durante le corse elettroforetiche?

• Elencate tutti i componenti della miscela di reazione utilizzata per il metodo di sequenziamento del DNA dei dideossi e indicate le loro funzioni.

• Descrivete la metodologia alla base delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione.

• Riassumete le informazioni conosciute sulla dimensione e sul contenuto genico del genoma umano.

• Spiegate perché l’evoluzione è il risultato delle mutazioni a carico del DNA.

70

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

5 La manipolazione del DNA CONCETTI CHIAVE

• I segmenti di DNA possono essere clonati o riprodotti in un organismo ospite. • Una libreria di DNA è una raccolta di porzioni clonate di DNA che può essere sottoposta a screening alla ricerca di un singolo gene.

• La reazione a catena della polimerasi amplifica un segmento di DNA sintetizzando ripetutamente filamenti complementari.

• La tecnologia del DNA ricombinante può essere utilizzata per manipolare geni per l’espressione di proteine o per la produzione di organismi transgenici.

Le tecniche per manipolare il DNA in vitro e in vivo (cioè in provetta o nei sistemi viventi), congiuntamente a quelle di sequenziamento degli acidi nucleici, hanno consentito di ottenere progressi straordinari in biochimica, biologia cellulare e genetica. In molti casi questa tecnologia del DNA ricombinante ha reso possibile purificare specifiche sequenze di DNA e prepararle in quantità sufficienti per un’indagine accurata. Prendiamo in considerazione il problema dell’isolamento di un frammento lungo 1000 bp del DNA cromosomico di E. coli. Dieci litri di una coltura cellulare con una densità batterica di circa 1010 cellule ∙ mL−1 contengono solo 0,1 mg circa del DNA di interesse. È praticamente impossibile separare questo frammento dal resto dell’acido deossiribonucleico facendo uso di metodiche di separazione classiche (Paragrafi 5.2 e 24.3). La tecnologia del DNA ricombinante, detta anche clonaggio molecolare o ingegneria genetica, permette di isolare, amplificare e modificare sequenze specifiche di DNA.

A Il DNA clonato è una copia amplificata L’approccio illustrato di seguito viene usato per ottenere e amplificare un segmento di DNA.

1. Viene generato un segmento di DNA delle dimensioni opportune mediante digestione con enzimi di restrizione e successiva PCR (Paragrafo 3.5C) o sintesi chimica. 2. Il frammento è incorporato all’interno di un’altra molecola di DNA nota come vettore, che contiene le sequenze necessarie per dirigere la replicazione del DNA. 3. Il vettore, unitamente al DNA di interesse, è introdotto nelle cellule, dove viene replicato. 4. Le cellule contenenti il DNA desiderato sono identificate o selezionate. Il clonaggio si riferisce alla produzione di un elevato numero di organismi identici, derivati da un unico progenitore. Il termine clone indica un insieme di cellule contenenti il vettore che porta il DNA di interesse oppure lo stesso DNA. In un organismo ospite adatto, per esempio E. coli o il lievito, è possibile produrre grandi quantità del DNA di interesse. Il DNA clonato può essere purificato e sequenziato (Paragrafo 3.4); in alternativa, se un gene clonato è fiancheggiato dalle sequenze di regolazione posizionate in maniera corretta per la sintesi di RNA e di proteine, l’ospite è in grado di produrre anche grandi quantità dell’RNA e delle proteine specificati dal gene. Pertanto il clonaggio fornisce il materiale (acidi nucleici e proteine) per intraprendere nuovi studi e rende disponibile un sistema per indagare l’espressione genica in condizioni controllate. Come vettori di clonaggio si usano i plasmidi, una gamma di piccole molecole di DNA circolare a replicazione autonoma, con una lunghezza compresa tra 1 e 200 kb, contenute nei batteri o nelle cellule di lievito. I plasmidi possono essere considerati parassiti molecolaI vettori di clonaggio trasportano DNA esogeno.

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

71

NdeI, HgiEII ri, ma in molti casi sono utili all’ospite, in quanto mettono a dispoNarI sizione dell’organismo o della cellula nuove funzioni, come EcoO109 AatII BglI la resistenza agli antibiotici, di cui esso è privo. SspI MstI Alcuni tipi di plasmidi sono presenti in una celPvuI lula in un numero molto limitato di copie e si rePvuII 0 lacZ Sito di clonaggio plicano quando viene duplicato anche il croXmnI multiplo mosoma batterico. Tuttavia, quelli utilizzati (o polilinker) ampR per il clonaggio sono presenti in centinaia ScaI di copie per cellula e possono essere indotlacI ti alla replicazione sino a che la cellula non PvuII PvuI pUC18 conterrà 2-3 migliaia di copie (circa la metà AvaII 2000 (2,69 kb) del DNA totale della cellula). I plasmidi costruiti per fini di laboratorio sono relativaMstI Af lIII mente piccoli, si replicano facilmente, conAvaII tengono geni che specificano la resistenza nei 1000 BglI confronti di uno o più antibiotici e un certo numero di siti per endonucleasi di restrizione, localizzati in posizioni opportune, all’interno dei quali è possibile inserire DNA esogeno. I vettori plaHgiEII smidici possono essere impiegati per clonare segmenti di DNA di dimensioni che non superano le 10 kb circa. Il plasmide di E. coli denominato pUC18 (Figura 3.24) è un vettore di clonaggio Figura 3.24 Il plasmide pUC18. rappresentativo (“pUC” significa plasmid-Universal Cloning, plasmide di Come mostrato nel disegno, questo plasmide circolare contiene molteplici clonaggio universale). siti di restrizione, compresa la sequenza Il batteriofago λ (Figura 3.25) rappresenta un vettore di clonaggio alternati- di un sito di clonaggio multiplo (o vo in grado di ospitare inserti di DNA fino a 16 kb. La parte centrale del geno- polilinker) contenente 13 siti di ma fagico (circa un terzo di 48,5 kb totali) non è necessaria per l’infezione e può restrizione che non si osservano in altri punti del plasmide. I tre geni che quindi essere sostituita con DNA esogeno di dimensioni analoghe. Il ricombi- quest’ultimo esprime sono: ampR, che nante (o chimera; dal nome del mostro mitologico con testa di leone, corpo di conferisce resistenza all’antibiotico capra e coda di serpente) così prodotto viene racchiuso all’interno di particelle ampicillina; lacZ, che codifica l’enzima fagiche e può essere inserito nelle cellule ospiti. Un vantaggio insito nell’utilizzo 𝛃-galattosidasi; e lacI, che codifica un fattore preposto al controllo della dei vettori fagici consiste nel fatto che il DNA ricombinante è prodotto facil- trascrizione di lacZ (come descritto nel mente in grandi quantità e in forma purificata. I baculovirus, che infettano le Paragrafo 28.2A). cellule degli insetti, sono impiegati in maniera analoga per il clonaggio in colQuali enzimi di restrizione ture di cellule di insetti. potreste usare per inserire un gene I segmenti di DNA di dimensioni molto maggiori (fino a molte centinaia senza influenzare la resistenza di migliaia di coppie di basi) possono essere clonati in grandi vettori noti come all’ampicillina della cellula ospite? cromosomi artificiali batterici (BAC) o cromosomi artificiali di lievito (YAC). Questi ultimi sono molecole di DNA lineare che contengono tutte le strutture cromosomiche richieste per la normale replicazione e segregazione durante la divisione cellulare di lievito. I BAC che si replicano in E. coli derivano da plasmidi circolari che di norma duplicano lunghe regioni di DNA e sono presenti approssimativamente in una sola copia per cellula (proprietà simili a quelle dei cromosomi veri).

La ligasi unisce due segmenti di DNA. Un segmento di DNA da clonare è ottenuto di solito mediante l’azione di endonucleasi di restrizione. Gran parte di questi enzimi taglia il DNA generando estremità coesive (Paragrafo 3.4A). Come Janet Mertz e Ron Davis dimostrarono per la prima volta nel 1972, un frammento di restrizione può essere inserito in un taglio prodotto in un vettore di clonaggio per mezzo dello stesso enzima di restrizione (Figura 3.26). Le estremità compleFigura 3.25 Il batteriofago 𝛌. Nel corso dell’infezione, il DNA del fago contenuto nella “testa” della particella fagica (il capside) penetra nella cellula batterica, dove viene replicato circa 100 volte e impacchettato per dare origine alla progenie fagica. [Per gentile concessione di Michael Wurtz, Universitët Basel, Svizzera, Science Source Images.]

72

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

mentari dei due DNA si appaiano e lo scheletro zucchero-fosfato è legato covalentemente dall’enzima DNA ligasi. (Una ligasi sintetizzata da un batteriofago è in grado di unire anche frammenti di restrizione a estremità piatte.) Un considerevole vantaggio che si ha dall’impiego di un enzima di restrizione per costruire una molecola di DNA ricombinante è che l’inserto di DNA può in seguito essere asportato in maniera precisa dal vettore clonato tagliandolo con lo stesso enzima di restrizione. La selezione identifica la presenza di un DNA clonato. L’espressione di un plasmide chimerico in una cellula batterica ospite fu dimostrata per la prima volta nel 1973 da Herbert Boyer e Stanley Cohen. Un ospite batterico è in grado di captare un plasmide quando il vettore si stabilisce in via permanente nel batterio ospite (trasformazione) con un’efficienza pari solo allo 0,1% circa. Tuttavia una sola cellula trasformata può moltiplicarsi senza limite, producendo grandi quantità di DNA ricombinante. Le cellule batteriche sono piastrate su un mezzo di crescita semisolido a una densità sufficientemente bassa da poter osservare le singole colonie che traggono origine da una singola cellula. È essenziale selezionare esclusivamente quegli organismi ospiti che sono stati trasformati e che contengono un vettore costruito nella maniera voluta. Nel caso della trasformazione plasmidica è possibile operare la selezione attraverso l’impiego di antibiotici e/o di sostanze cromogeniche (che generano colore). Per esempio, il gene lacZ contenuto nel plasmide pUC18 (vedi la Figura 3.24) codifica l’enzima β-galattosidasi che scinde il composto incolore X-gal generando un prodotto di colore blu: Cl HOCH 2 O

HO H OH

Br

O

N H

H

H

H H

OH

5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galattoside (X-gal) (incolore)

β-galattosidasi

H 2O

HOCH 2

Cl O

HO H OH

H H

Br

1

H

H

HO

OH

OH

b-D-Galattosio

N H 5-Bromo-4-cloro-3-idrossindolo (blu)

Le cellule di E. coli trasformate da un plasmide pUC18 non modificato formano colonie blu, ma se il plasmide contiene un inserto di DNA esogeno nella regione del suo sito di clonaggio multiplo le colonie sono incolori poiché il frammento interrompe la sequenza che codifica la proteina del gene lacZ e non viene sintetizzata β-galattosidasi funzionale. Anche i batteri che non hanno captato alcun plasmide sono incolori a causa dell’assenza di β-galattosidasi, ma queste cellule possono essere eliminate aggiungendo l’antibiotico ampicillina al terreno di crescita (il plasmide comprende il gene ampR, che conferisce resistenza a questo antibiotico). Di conseguenza, solo le cellule trasformate con successo formano colonie incolori in presenza di ampicillina. I geni come ampR sono noti come marcatori di selezione.

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

73

SCHEMA DI PROCESSO

Il vettore di clonaggio e il DNA esogeno sono tagliati con la medesima endonucleasi di restrizione.

Le estremità coesive del vettore e dei frammenti del DNA esogeno si appaiano e vengono unite covalentemente dalla DNA ligasi.

1

2

DNA esogeno

Vettore di clonaggio

Il risultato è un DNA chimerico contenente una porzione del DNA esogeno, inserito all’interno del vettore.

Estremità coesive

DNA chimerico

I vettori derivati da batteriofagi λ geneticamente ingegnerizzati contengono siti di restrizione che fiancheggiano la parte centrale superflua del genoma del fago. Questo segmento può essere sostituito con DNA esogeno, ma il DNA chimerico viene racchiuso nelle particelle fagiche solo se ha una lunghezza compresa tra il 75 e il 105% di quella totale del genoma (48,5 kb) del fago λ (Figura 3.27). Di conseguenza, i vettori del fago λ che non sono stati in grado di acquisire inserti di DNA esogeno non possono propagarsi poiché sono troppo corti per formare particelle fagiche infettive. La produzione di particelle fagiche infettive non consente la formazione di colonie batteriche ma genera una placca, una regione di cellule batteriche lisate, visibili su una piastra di coltura contenente un “tappeto” di batteri ospiti. Il DNA ricombinante, ora amplificato molte volte, può essere recuperato dalle particelle fagiche presenti nella placca.

Figura 3.26 Costruzione di una molecola di DNA ricombinante.

Questo metodo funzionerebbe usando un enzima di restrizione che produce frammenti con estremità piatte?

SCHEMA DI PROCESSO

Non necessario per l’infezione litica

48,5 kb

Fago λ infettivo contenente il frammento di DNA esogeno.

Taglio per mezzo di un enzima di restrizione e separazione dei frammenti. 1

DNA del fago λ ~36 kb

2

3 Impacchettamento in vitro.

DNA chimerico

Figura 3.27 Clonaggio mediante il batteriofago 𝛌.

La rimozione di una porzione non essenziale del genoma del fago consente l’inserimento di un segmento di DNA

Il rimanente DNA del fago λ contiene i geni in grado di causare l’infezione ma ha dimensioni troppo ridotte per essere impacchettato. +

Frammento di DNA esogeno da ~15 kb

Appaiamento e ligazione.

esogeno, che può essere impacchettato all’interno di una particella fagica infettiva unicamente se esso è di dimensioni opportune.

74

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

B Le librerie di DNA sono raccolte di DNA clonati Per poter clonare un particolare frammento di DNA, questo deve essere dapprima ottenuto in forma relativamente pura. Si può valutare la difficoltà a cui si va incontro considerando che, per esempio, un segmento di DNA umano da 1 kb rappresenta solo lo 0,00003% del genoma della nostra specie, composto da 3 miliardi di coppie di basi. Ovviamente il riconoscimento di un particolare frammento di DNA esige un certo grado di conoscenza della sua sequenza nucleotidica o del suo prodotto proteico; in pratica, è più difficile identificare e quindi clonare un particolare segmento di DNA da un organismo, di quanto non sia clonare tutto il DNA dell’essere vivente che potrebbe contenere il DNA di interesse, e poi risalire ai cloni contenenti la sequenza desiderata. Una libreria genomica racchiude tutto il DNA di un organismo. La serie clonata

Ð ESEMPIO DI CALCOLO 3.1

Quanti cloni dovranno essere ottenuti dalla Drosophila per essere sicuri al 99% che essi includano un particolare frammento di 10 kb?

Servitevi dell’equazione 3.2 e della dimensione del genoma della Drosophila riportata nella Tabella 3.3. In questo caso, f = 10 kb/180 000 kb = 5,56 × 10−5. N = log(1 − P)/log(1 − f ) = log(1 − 0,99)/log(1 − 5,56 × 10−5) = −2/(−2,413 × 10−5) = 83 000

di tutti i frammenti di DNA derivanti da un particolare organismo è nota come libreria genomica. Queste particolari raccolte vengono generate per mezzo di una procedura conosciuta come clonaggio shotgun, nel quale il DNA cromosomico di un determinato essere vivente è isolato, tagliato in frammenti di dimensioni che si possono clonare e inserito all’interno di un vettore di clonaggio. Di solito il DNA è frammentato solo parzialmente da una digestione per restrizione e quindi la libreria genomica può includere alcuni geni di tale organismo ancora intatti, compresi quelli che contengono siti di restrizione. Il DNA in soluzione può anche essere tagliato in frammenti di dimensioni casuali mediante sonicazione (Paragrafo 3.4C). Date le dimensioni considerevoli del genoma rispetto ai singoli geni, la metodica di clonaggio shotgun è soggetta alle leggi della probabilità. Il numero di frammenti generati in modo casuale, che devono essere clonati al fine di garantire un’elevata probabilità che una sequenza desiderata sia rappresentata almeno una volta nella libreria genomica, si calcola così: la probabilità P che una serie di cloni N contenga un frammento che costituisce una frazione f, in coppie di basi, del genoma del dato organismo è P = 1 − (1 − f )N

[3.1]

N = log(1 − P)/log(1 − f )

[3.2]

Di conseguenza, Pertanto, per un valore di P = 0,99 per frammenti lunghi in media 10 kb, N è uguale a 2116 per il cromosoma da 4600 kb di E. coli (vedi l’Esempio di calcolo 3.1). L’impiego di librerie genomiche basate su BAC o YAC, con i loro frammenti di lunghezza estesa, riduce perciò notevolmente gli sforzi necessari per ottenere un dato segmento genico a partire da un genoma ampio. Dopo aver identificato un clone, derivato da BAC o YAC, contenente il DNA desiderato (vedi più avanti), il suo lungo inserto di acido deossiribonucleico può essere ulteriormente frammentato e clonato di nuovo (subclonato) al fine di isolare il DNA di interesse. Un genere diverso di libreria di DNA contiene unicamente le sequenze espresse partendo da un particolare tipo cellulare. Questa libreria di cDNA viene costruita isolando tutti gli mRNA della cellula e quindi copiandoli in DNA, sfruttando un tipo specializzato di DNA polimerasi nota come trascrittasi inversa, poiché questa sintetizza DNA da stampi di RNA (Scheda 25.2). Le molecole di DNA complementare (cDNA) sono successivamente inserite all’interno di vettori di clonaggio per generare una libreria di cDNA. Una libreria di cDNA può anche essere utilizzata per costruire un DNA microarray (o DNA chip), in cui ogni diverso cDNA è immobilizzato in una posizione specifica su un vetrino. Un DNA chip Una libreria di cDNA contiene le sequenze espresse.

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

75

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

può essere utilizzato per identificare la presenza di mRNA in un campione biologico (se presente, l’mRNA si lega al cDNA complementare; Paragrafo 14.4C). Il DNA che corrisponde all’insieme completo di mRNA di una cellula è conosciuto come esoma (il trascrittoma, invece, corrisponde a tutte le molecole di RNA di una cellula). L’esoma umano rappresenta solo l’1% circa del suo genoma (circa 30 000 kb), ma contiene circa l’85% delle mutazioni che causano malattie. Di conseguenza, sono state sequenziate diverse centinaia di migliaia di esomi umani, principalmente con l’obiettivo di caratterizzare le malattie genetiche. Una volta ottenuto il numero richiesto di cloni, la libreria genomica deve essere analizzata per accertare la presenza del gene desiderato. Questa operazione può essere effettuata grazie a un processo noto come ibridazione di colonie o ibridazione in situ (dal latino in situ, “in posizione”; Figura 3.28). Le colonie di lievito, quelle batteriche o le placche fagiche clonate che devono essere analizzate sono trasferite, mediante piastratura per replica, da una piastra madre a un filtro di nitrocellulosa (la piastratura per replica si usa inoltre per trasferire colonie su piastre contenenti un terreno di crescita differente). In seguito il filtro è trattato con NaOH, che lisa le cellule o i fagi e separa il DNA in filamenti singoli, i quali hanno una tendenza a legarsi alla nitrocellulosa. Il filtro viene quindi asciugato per fissare in posizione il DNA e viene incubato con una sonda marcata, un corto frammento di DNA o di RNA la cui sequenza è complementare a una porzione del DNA di interesse. Dopo aver eliminato mediante lavaggio la sua quota non legata, la presenza della sonda sulla nitrocellulosa è rilevata mediante una tecnica appropriata al marcatore impiegato (per esempio, l’esposizione a una pellicola per raggi X nel caso di una sonda radioattiva, processo noto come autoradiografia, oppure l’illuminazione con una luce a lunghezza d’onda appropriata se la sonda è fluorescente). Solo le colonie o placche contenenti il gene desiderato si legano alla sonda e sono quindi rilevate dalla macchina della sonda. I cloni corrispondenti possono essere poi recuperati dalla piastra madre; impiegando tale metodica, una libreria genomica umana composta di circa un milione di cloni può essere prontamente sottoposta a screening per valutare la presenza di un particolare segmento di DNA. La scelta di una determinata sonda per un gene a sequenza ignota richiede un certo grado di perizia. Si può utilizzare il corrispondente mRNA come una sonda se quest’ultimo è prodotto in quantità sufficienti da poter essere isolato. In alternativa, se si conosce la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene, la sonda può essere composta da una miscela di oligonucleotidi sintetici complementari a un segmento della sequenza di basi del gene dedotta da quella della proteina. Numerosi geni correlati a malattie sono stati isolati facendo uso di sonde specifiche per marcatori vicini, come per esempio le sequenze di DNA ripetuto, di cui già si conosceva la correlazione con i geni di una data patologia.

SCHEMA DI PROCESSO Supporto Velluto Colonie cresciute sulla piastra madre

Il velluto viene 1 premuto, fatto aderire alla piastra madre e trasferito su un filtro di nitrocellulosa.

In una libreria può essere ricercato il gene di interesse.

Figura 3.28 Ibridazione di colonie (o in situ). Le colonie sono trasferite da una piastra di coltura madre mediante piastratura per replica e i cloni contenenti il DNA di interesse sono identificati grazie alla capacità di legarsi a una sonda specifica; a questo punto il legame è rilevato sovrapponendo al filtro essiccato una pellicola per raggi X. Dal momento che le colonie presenti sulla piastra madre e sul filtro hanno la medesima distribuzione spaziale, è possibile recuperare agevolmente quelle positive.

Filtro di nitrocellulosa

DNA a singolo filamento legato al filtro

2

Il trattamento con NaOH lisa le cellule e separa il DNA nei suoi singoli filamenti.

Appaiamento della sonda 3 marcata, lavaggio ed essiccamento. Sonda marcata

Sonda marcata

DNA di interesse DNA

Autoradiografia e 4 raffronto con la piastra madre. Pellicola per autoradiografia

Le macchie scure rappresentano le colonie contenenti il DNA desiderato.

CAPITOLO 3

76

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche SCHEMA DI PROCESSO

CICLO 1 DNA duplex bersaglio da cui si parte 3ʹ 5ʹ 5ʹ 3ʹ

Primer (inneschi)





5ʹ 3ʹ

5ʹ 2

Estensione da parte della DNA polimerasi.

5ʹ 3ʹ Filamenti di lunghezza variabile







3ʹ 5ʹ

3ʹ CICLO 2

Primer

Separazione 3 dei frammenti al calore, raffreddamento e appaiamento degli inneschi.







5ʹ 5ʹ

3ʹ 5ʹ





5ʹ 3ʹ

5ʹ dNTP

Figura 3.29 La reazione a catena della polimerasi (PCR). Il numero di filamenti a “lunghezza determinata” raddoppia con ciascun ciclo dopo il secondo. Scegliendo primer specifici per ogni estremità di un gene, è possibile amplificarlo oltre un milione di volte.

Perché per la PCR si utilizza una polimerasi termostabile?

Separazione 1 dei frammenti al calore, raffreddamento e appaiamento dei primer.



dNTP

© 978-88-08-42096-1

4

Estensione da parte della DNA polimerasi.

5ʹ 3ʹ

5ʹ 5ʹ



3ʹ 5ʹ



Filamenti di lunghezza determinata 5ʹ 3ʹ



3ʹ 3ʹ 5ʹ

5ʹ 3ʹ Il ciclo si ripete

C Il DNA è amplificato per mezzo della reazione a catena della polimerasi Sebbene le tecniche di clonaggio molecolare siano indispensabili per la moderna ricerca biochimica, la reazione a catena della polimerasi (PCR) rappresenta sovente una metodica più veloce e comoda per amplificare uno specifico DNA, con la quale si possono amplificare segmenti lunghi sino a 6 kb. La PCR, ideata da Kary Mullis nel 1985, prevede che un campione di DNA sia separato nei filamenti singoli e incubato con DNA polimerasi, dNTP e due oligonucleotidi primer le cui sequenze fiancheggiano il frammento di DNA di interesse; i primer guidano la DNA polimerasi nella sintesi di filamenti complementari del DNA bersaglio (Figura 3.29). Molti cicli di tale processo, ciascuno dei quali raddoppia la quantità del DNA bersaglio, amplificano in modo geometrico l’acido deossiribonucleico partendo persino da un gene in singola copia. Durante ogni ciclo i due filamenti del DNA duplex sono separati per mezzo del calore, poi la miscela di reazione viene raffreddata per permettere ai primer di appaiarsi ai frammenti a essi complementari sul DNA. Successivamente, la DNA polimerasi dirige la sintesi dei filamenti complementari. L’impiego di una DNA polimerasi stabile al calore, come per esempio la Taq polimerasi isolata da Thermus aquaticus, un batterio che vive a 75 °C, consente di non dover aggiungere nuovo enzima a ogni ciclo di riscaldamento (il calore inattiva gran parte degli enzimi). Quindi, in presenza di quantità sufficienti di primer e di dNTP, la PCR è portata avanti variando semplicemente la temperatura in maniera ciclica. Venti cicli di PCR portano a un incremento della quantità della sequenza bersaglio pari a milioni di volte (∼220) con specificità elevata. La reazione a catena della polimerasi è in grado di amplificare un DNA bersaglio presente in singola copia in un campione di 105 cellule. Questo metodo può essere usato senza che il DNA debba essere prima purificato, e l’acido deossiribonucleico amplificato può essere in seguito sequenziato o clonato. L’amplificazione tramite PCR si è trasformata in uno strumento indispensabile: in clinica è impiegata per diagnosticare malattie infettive e rilevare eventi patologici rari, quali per esempio mutazioni che portano allo sviluppo di tumori. In medicina legale il DNA ottenuto da un singolo capello o spermatozoo può essere amplificato mediante PCR per identificarne il donatore (Scheda 3.2). La tradizionale analisi dei gruppi sanguigni ABO richiede una goccia di sangue delle dimensioni di una monetina, mentre per la PCR bastano campioni di fluido biologico grandi come una capocchia di spillo. I tribunali ora considerano le sequenze di DNA come un mezzo atto a identificare le persone in modo inoppugnabile, proprio come nel caso delle impronte digitali, poiché la possibilità che due individui abbiano in comune sequenze di DNA estese è pari di norma a una su un milione o più. In alcune circostanze la PCR ha consentito di cambiare in modo sensazionale il verdetto, determinando il rilascio di persone ritenute in prima istanza colpevoli; alcuni condannati sono stati infatti scarcerati sulla base dei risultati della reazione a catena della polimerasi, che ha consentito di dimostrare la loro innocenza persino molti anni dopo la raccolta delle prove sulla scena del delitto.

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

SCHEDA 3.2

77

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

L’“impronta digitale” (fingerprinting) del DNA

Fluorescenza

Unità ripetuta I test forensi sfruttano i cambiamenti o polimorfismi delle Primer sequenze esistenti tra gli individui. AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC Molti dei polimorfismi genetici Primer non hanno conseguenze funzionali poiché avvengono in regioni del Primer DNA che contengono diverse AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG AATG ripetizioni ma che non codificano TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC TTAC Primer geni. I polimorfismi possono essere utilizzati per tracciare e unità ripetute che va da 13 a 23. La traccia inferiore (in identificare un gene anche se sono situati vicino a un gene rosso) corrisponde al campione che è stato sottoposto al che è coinvolto in una determinata patologia. I moderni test. Questo contiene due alleli: il primo con 16 ripetizioni metodi di fingerprinting del DNA sfruttano queste sequenze e il secondo con 18 ripetizioni. Si possono analizzare ripetitive e non codificanti del DNA presenti nei campioni simultaneamente diversi siti STR tramite l’utilizzo di primer precedentemente amplificati dalla PCR. appropriati e marcando gli stessi con target fluorescenti a Le sequenze di DNA ripetute in coppia sono presenti colorazione differente. nel genoma umano e comprendono le sequenze note Le probabilità che due individui abbiano il fingerprinting come microsatelliti o STR (short tandem repeats sequences) del DNA corrispondente dipende dal numero dei siti STR costituite da quantitativi variabili di segmenti ripetuti di analizzati e dal numero di alleli di ogni sito. Per esempio, se coppie di basi che solitamente vanno da due a sette. I siti una coppia di alleli è presente in un sito con una frequenza STR più conosciuti e utilizzati nell’uso forense contengono del 10% (1/10) all’interno di una popolazione e una coppia ripetizioni tetranucleotidiche. Il numero di ripetizioni a di alleli presente in un secondo sito ha una frequenza livello di ciascun sito del DNA cambia tra i vari individui, del 5% (1/20), la probabilità che le impronte digitali del anche tra membri della stessa famiglia. Ogni diverso numero DNA appartenente a due individui differenti possano di ripetizioni dello stesso sito è chiamato allele e ciascun corrispondere a entrambi i siti è pari a 1 su 200 (1/10 individuo può avere due alleli ricevuti ognuno da uno dei × 1/20), pari cioè alla moltiplicazione delle probabilità due genitori (vedi la figura in alto). di verificarsi che ha ogni singolo evento. Esaminando Dato che la PCR costituisce il primo passo per il processo invece molteplici siti STR, la probabilità di ottenere di analisi del fingerprinting del DNA, è sufficiente avere impronte digitali del DNA tra loro corrispondenti diventa a disposizione per tale procedura una quantità di DNA notevolmente bassa. anche molto bassa, basta che sia pari a circa 1 ng. La regione del DNA contenente l’STR viene amplificata con la PCR utilizzando dei primer complementari a una sola sequenza (non ripetuta) situata attorno alle regioni ripetute. I prodotti amplificati vengono poi separati per elettroforesi e identificati grazie alla presenza sui primer di un bersaglio fluorescente. Un allele STR è sufficientemente piccolo (∼500 bp) da permettere di identificare frammenti di DNA che si differenziano per una ripetizione di quattro basi. La 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 designazione di un allele per ogni sito STR corrisponde generalmente al numero di volte in cui è presente un’unità ripetuta. I siti STR che sono stati scelti e selezionati specificamente per l’utilizzo in ambito forense hanno solitamente da 7 a 30 alleli. Nell’esempio riportato nella figura sulla destra, la traccia superiore (in blu) mostra la fluorescenza dell’elettroferogramma (tracciato elettroforetico) degli 16 18 standard di riferimento costituiti da un set di possibili Dimensione alleli, ciascuno dei quali è identificato da un numero di

D La tecnologia del DNA ricombinante ha moltissime applicazioni pratiche La capacità di manipolare le sequenze di DNA consente di alterare ed esprimere i geni con l’intento di ottenere proteine dotate di migliori proprietà funzionali o di correggere difetti genetici. La produzione di grandi quantità di proteine poco rappresentate nelle cellule o addirittura nuove è un procedimento relativamente agevole solo per quelle di tipo batterico: un gene clonato deve essere inserito all’interno di un vettore di espressione, un plasmide che contiene seI geni clonati possono essere espressi.

78

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

quenze di controllo della trascrizione e della traduzione posizionate in maniera opportuna. La produzione di una proteina di interesse può arrivare al 30% del contenuto complessivo di molecole proteiche dell’ospite, e tali organismi geneticamente ingegnerizzati sono definiti sovraproduttori. Le cellule procariotiche sequestrano di frequente notevoli quantità di proteine prive di utilità e persino tossiche (per il batterio) in forma di inclusioni insolubili; talvolta ciò semplifica il compito di purificare la proteina. I procarioti sono in grado di sintetizzare proteine eucariotiche solo se il DNA ricombinante che contiene la sequenza di basi che codifica la proteina comprende anche le sequenze di controllo trascrizionale e traduzionale del batterio. La sintesi di proteine eucariotiche nei procarioti presenta anche problemi di altra natura. Per esempio, numerosi geni eucariotici sono di grandi dimensioni e contengono sequenze di nucleotidi (gli introni) che sono trascritte ed eliminate prima della traduzione (Paragrafo 26.3A). I batteri sono però privi dei meccanismi preposti all’eliminazione degli introni e inoltre molte proteine degli eucarioti vanno incontro a modificazioni post-traduzionali, come l’aggiunta di carboidrati o altre reazioni. Questi problemi possono essere superati impiegando vettori di espressione che si propagano in ospiti eucariotici, come per esempio il lievito, oppure colture di cellule di insetti o animali. La Tabella 3.5 elenca alcune proteine ricombinanti prodotte per essere impiegate in medicina o in agricoltura. In numerosi casi, per motivi etici o pratici non è possibile purificare direttamente tali molecole proteiche dai tessuti umani o animali, ma i sistemi di espressione permettono di preparare in maniera efficiente e su larga scala le proteine, pur mantenendo minimo il rischio di contaminazione da parte di virus o di altri agenti patogeni presenti nei campioni di tessuto. La mutagenesi sito-diretta altera la sequenza nucleotidica di un gene. Dopo aver isolato un gene, è possibile modificarne la sequenza nucleotidica al fine di alterare quella amminoacidica della proteina codificata. La mutagenesi sito-diretta, una tecnica introdotta da Michael Smith, simula un processo naturale dell’evoluzione e consente di prevedere il ruolo strutturale e funzionale di particolari amminoacidi contenuti in una proteina da studiare in laboratorio. Allo scopo di alterare specificamente i geni attraverso la mutagenesi sito-diretta sono necessari oligonucleotidi sintetici; per dirigere la replicazione del gene si usa un oligonucleotide la cui sequenza è identica a una porzione del gene di interesse, a eccezione dei cambiamenti di basi desiderati. Se le coppie di basi appaiate in maniera errata non sono in numero elevato, l’oligonucleotide si ibrida con la corrispondente sequenza originale (o wildtype, quella presente in natura). L’estensione dell’oligonucleotide, denominato primer, da parte della DNA polimerasi introduce l’alterazione desiderata nel gene (Figura 3.30). Il gene modificato può poi essere inserito all’interno TABELLA 3.5 Alcune proteine prodotte mediante ingegneria genetica

Proteina

Utilizzo

Insulina umana

Trattamento del diabete

Ormone della crescita umano

Trattamento di determinati disordini endocrini

Eritropoietina

Stimolazione della produzione di globuli rossi

Fattori di stimolazione delle colonie

Produzione e attivazione di globuli bianchi

Fattori di coagulazione IX e X

Trattamento dei disordini a carico della coagulazione del sangue (emofilia)

Attivatore tissutale del plasminogeno

Lisi dei coaguli di sangue in casi di attacco cardiaco e di ictus

Ormone della crescita bovino

Produzione di latte nelle mucche

Antigene di superficie dell’epatite B

Vaccinazione contro l’epatite B

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

di un vettore opportuno. Si possono usare primer mutagenizzati per produrre geni alterati mediante PCR. Gli organismi transgenici contengono geni esogeni. Per molti scopi è preferibile

79

SCHEMA DI PROCESSO Primer oligonucleotidico sintetizzato chimicamente Gene

3′ T C G C A G T C G T C A T G T 5′ + AGC T T CAGAGGT ACA 5′ 3′

ottenere un organismo “su misura” piut- da mutare tosto che solo una proteina, vero obiettivo dell’ingegneria genetica. Gli organismi Un oligonucleotide sintetizzato per via pluricellulari che esprimono un gene prochimica che incorpora le sostituzioni di 1 veniente da un altro essere vivente sono detbasi desiderate si appaia al DNA che Oligonucleotidi contenenti codifica il gene da mutare. ti transgenici, mentre il gene esogeno traappaiamenti errati piantato è denominato transgene. Primer C GT Se si vuole che l’alterazione diventi percontenente 3′ T C G A G T C C A T G T 5′ manente, vale a dire ereditabile, un tranappaiamenti A G C T T C A G A G G TACA errati sgene deve integrarsi stabilmente nelle cel5′ 3′ lule germinali di tale organismo. Nel caso dei topi, ciò si ottiene tramite microiniezione del DNA clonato che codifica le alteraLa DNA polimerasi estende il zioni che si vogliono trasferire in un uovo dNTP 2 primer contenente appaiamenti fecondato che viene poi impiantato nell’uerrati generando il gene mutato. tero di una madre sostitutiva. Un esempio ben noto di topo transgenico contiene co3′ 5′ C GT T CG AGT C CATGT pie aggiuntive di un gene per l’ormone delAGC T T CAGAGGT ACA la crescita (Figura 3.31). Gene 5′ 3′ Sono stati sviluppati anche animali da modificato fattoria transgenici; in molti casi i geni di tali animali sono stati modificati per consentire loro di crescere più velocemente con meno cibo o di essere resistenti a particolari malattie. Alcuni animali da fattoria transgenici sono stati ingegnerizzati in Figura 3.30 La mutagenesi sitomodo da secernere nel loro latte proteine di utilità clinica (un processo chia- diretta. Il gene da mutare può essere all’interno di un appropriato mato “pharming”); la raccolta di una tale sostanza dal latte è molto più vantag- inserito vettore di clonaggio ed essere giosa sotto il profilo economico rispetto alla produzione della stessa sostanza in amplificato, espresso o utilizzato per colture batteriche. generare un organismo mutante. Uno degli organismi transgenici di maggior successo è il granoturco (o mais), che è stato modificato geneticamente perché possa sintetizzare una proteina tossica per gli insetti che si nutrono di piante (ma che è innocua per i vertebrati). La tossina è prodotta dal microbo del suolo Bacillus thuringensis, e il suo gene è stato clonato nel granoturco allo scopo di conferirgli protezione nei confronti della piralide del granoturco (Ostrinia nubilalis), un insetto nocivo che trascorre gran parte del ciclo vitale all’interno della pianta del mais, dove è per lo più inaccessibile agli insetticidi chimici. L’impiego di “mais Bt”, che viene attualmente coltivato in maniera diffusa negli Stati Uniti, ha ridotto enormemente l’esigenza di tali sostanze tossiche. Le piante transgeniche sono state ingegnerizzate anche al fine di migliorare la nutrizione umana. Per esempio, i ricercatori hanno sviluppato una varietà di riso contenente geni esogeni che codificano gli enzimi necessari alla sintesi del 𝛃-carotene (un pigmento arancione precursore della vitamina A) e un gene della proteina ferritina, responsabile dell’immagazzinamento del ferro. Il riso geneticamente modificato, chiamato “golden rice”, o riso dorato (Figura 3.32), Figura 3.31 Topi transgenici. Il grosso topo a sinistra è il prodotto di un uovo fecondato

e microiniettato con DNA contenente il gene di ratto per l’ormone della crescita; il suo peso è quasi doppio rispetto all’altro esemplare normale, appartenente alla stessa figliata. [Per gentile concessione di Ralph Brinster, University of Pennsylvania.]

80

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

Figura 3.32 Il riso dorato. I chicchi chiari a sinistra sono di tipo normale, mentre quelli a destra sono stati ingegnerizzati in modo da immagazzinare una quantità di ferro sino a tre volte maggiore e sintetizzare β-carotene, che conferisce loro un colore giallastro. [Per gentile concessione di Ingo Potrykus.]

© 978-88-08-42096-1

dovrebbe aiutare a colmare le carenze di vitamina A (che affliggono circa 400 milioni di persone) e quelle di ferro (secondo una stima, il 30% della popolazione mondiale è soggetta a una carenza di questo elemento). Altre piante transgeniche sono le fragole resistenti al freddo, i pomodori a maturazione lenta e gli alberi che danno frutti a maturazione accelerata, piante da raccolto resistenti alla siccità, all’elevata salinità, ai virus patogeni, o agli erbicidi (in modo che gli erbicidi possano essere utilizzati per eliminare le erbe infestanti senza danneggiare il raccolto, e piante che producono grandi quantità di biocarburanti. Attualmente, soprattutto in Europa, vi è nell’opinione pubblica il diffuso sospetto che i cibi geneticamente modificati (“GM”) possano essere in qualche modo dannosi; tuttavia approfondite ricerche, e anche le esperienze raccolte dai consumatori, non sono state in grado di evidenziare alcun effetto dannoso in relazione a tali alimenti (Scheda 3.3). Gli organismi transgenici hanno consentito di approfondire straordinariamente la nostra comprensione sull’espressione genica. Gli animali ingegnerizzati in modo da contenere un gene difettoso o privi di un intero gene (un cosiddetto knockout genico) sono spesso ottimi modelli sperimentali per le malattie umane. Con il termine terapia genica si intende il trasferimento di nuovo materiale genetico nelle cellule di un individuo, con l’obiettivo di conseguire un effetto terapeutico. Sebbene i potenziali benefici di questa tecnologia ancora allo stadio iniziale siano enormi, dal punto di vista pratico gli ostacoli da superare sono numerosi. Per esempio, i vettori retrovirali (virus contenenti RNA) impiegati solitamente per l’introduzione diretta di geni nell’uomo possono provocare una risposta immunitaria con esito fatale. I difetti genetici possono essere corretti.

SCHEDA 3.3

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Gli aspetti etici legati alla tecnologia del DNA ricombinante Nei primi anni ’70, quando si iniziava a discutere di ingegneria genetica, poco si conosceva circa la sicurezza degli esperimenti proposti. Dopo accesi dibattiti, in seguito ai quali ci si accordò per una moratoria su tali investigazioni, furono stilate delle norme che regolamentano le ricerche sul DNA ricombinante. Esse proibiscono ovviamente la conduzione di esperimenti pericolosi (per esempio, l’introduzione del gene della tossina della difterite in E. coli, che trasformerebbe questo simbionte umano in un patogeno mortale). Altre precauzioni sono tese a limitare il rischio di rilascio accidentale nell’ambiente di organismi potenzialmente dannosi. Per esempio, numerosi vettori devono essere clonati in organismi ospiti con particolari esigenze di sostanze nutrienti, in modo che questi organismi abbiano una bassa probabilità di sopravvivenza al di fuori del laboratorio. L’evidente valore della tecnologia del DNA ricombinante ha ridimensionato le argomentazioni di quasi tutti i suoi primi detrattori. Senza clonaggio non sarebbe stato certamente possibile studiare determinati patogeni, come per esempio il virus responsabile dell’AIDS. Il fatto che sino a oggi non si siano verificate catastrofi genetiche provocate dalla tecnologia ricombinante non ci tutela dall’eventualità che in futuro gli organismi ricombinanti possano avere effetti nocivi sull’ambiente. Le metodiche impiegate dall’ingegneria genetica ricalcano quelle di cui si avvale la natura, cioè le mutazioni e la selezione, e quindi gli organismi naturali e quelli prodotti dall’uomo mostrano un’analogia di base. In ogni caso, già da migliaia di anni l’uomo effettua incroci su

piante e animali, e spesso per gli stessi motivi che sono alla base degli esperimenti con il DNA ricombinante. Ma vi sono pure altre considerazioni etiche che si pongono man mano che diventano disponibili nuove tecniche di ingegneria genetica. L’ormone umano della crescita prodotto nei batteri viene ora prescritto di routine per aumentare la statura di bambini che sono molto al di sotto della media; tuttavia, è lecito consentire agli atleti di utilizzare questa proteina, come già qualcuno sembra aver fatto, per aumentare massa muscolare e forza? Pochi metterebbero in discussione l’impiego della terapia genica, qualora venisse sviluppata, allo scopo di curare malattie genetiche come l’anemia falciforme (Paragrafo 7.1E) e la sindrome di Lesch-Nyhan (Paragrafo 23.1D). Ma se fosse invece possibile alterare caratteri complessi (vale a dire multigenici), quali le prestazioni di un atleta e l’intelligenza, quali cambiamenti sarebbero ritenuti desiderabili e chi deciderebbe se attuarli? Si dovrebbe sfruttare la terapia genica unicamente al fine di correggere i difetti di un individuo o si dovrebbe impiegarla anche per alterare i geni contenuti nelle cellule germinali di una persona in modo che le generazioni successive non debbano ereditare tale condizione? Qualora diventasse facile determinare la costituzione genetica di un individuo, sarebbe giusto fare uso di tali informazioni con l’obiettivo di esaminare chi intende iscriversi all’università o fa domanda per un impiego, oppure vuole stipulare una polizza sulla salute? Queste problematiche hanno condotto alla nascita di una nuova disciplina filosofica che si prefigge di affrontarle, la bioetica.

CAPITOLO 3 © 978-88-08-42096-1

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

Il primo successo documentato della terapia genica è stato il caso di bambini affetti da una forma di immunodeficienza combinata grave (SCID, severe combined immunodeficiency disease) nota come SCID-X1, che in assenza di trattamento, richiederebbe il loro isolamento in un ambiente sterile per prevenire infezioni che altrimenti porterebbero al decesso. La SCID-X1 è causata da un difetto nel gene che codifica il recettore 𝛄c delle citochine, la cui azione è essenziale per il corretto funzionamento del sistema immunitario. Sono state prelevate cellule del midollo osseo (i precursori dei globuli bianchi) da pazienti colpiti da SCID-X1, che sono state incubate con un vettore contenente un gene normale per il recettore γc delle citochine; le cellule sono poi state reintrodotte nell’organismo. Queste cellule transgeniche hanno ripristinato la funzionalità del sistema immunitario. Tuttavia, dato che il vettore virale si integra a caso all’interno del genoma, la posizione del gene trasferito può influenzare l’espressione di altri geni, causando lo sviluppo del cancro. Almeno due di quei bambini hanno sviluppato una leucemia (un tipo di cancro dei globuli bianchi del sangue) in seguito alla terapia genica a cui erano stati sottoposti per curare la SCID-X1. Molte altre malattie ereditarie sono state trattate con successo con tecniche simili, compresa l’amaurosi congenita di Leber, una forma rara di cecità, l’adrenoleucodistrofia collegata al cromosoma X, in cui un difetto a carico di una proteina di trasporto di membrana causa danni al sistema nervoso centrale, la 𝛃-talassemia, un tipo di anemia molto grave, e la sindrome di Wiskott-Aldrich, una sindrome da immunodeficienza. In modo analogo, si è visto che stimolare le cellule del sistema immunitario di un soggetto affetto da cancro ad attaccare le cellule cancerose è una strategia molto promettente per l’eliminazione di alcuni tipi di tumori che non rispondono alle terapie standard.

81

PUNTO DI VERIFICA

• Riassumete le fasi necessarie per amplificare un dato segmento di DNA sia in vivo sia in vitro.

• Confrontate le proprietà dei vettori di

clonaggio pUC18, del batteriofago λ e dei BAC.

• Descrivete le attività degli enzimi necessari alla costruzione di una molecola di DNA ricombinante.

• Spiegate i motivi per cui un vettore di clonaggio solitamente comprende un marcatore selezionabile.

• Che cos’è una libreria di DNA e come può essere consultata per un particolare gene?

• Quali sono i vantaggi della PCR rispetto al clonaggio tradizionale?

• Quali sono le problematiche che si incontrano nell’espressione di un gene eucariotico in una cellula ospite procariotica?

• Spiegate in che modo la mutagenesi sito-diretta può essere usata per produrre una proteina mutata nelle cellule batteriche.

• Qual è la differenza tra manipolare un gene per la terapia genica o per produrre un organismo transgenico?

RIASSUNTO 1 I nucleotidi • I nucleotidi sono costituiti da una base purinica o da una pirimidinica unita a un ribosio al quale è legato almeno un gruppo fosforico. L’RNA è formato da ribonucleotidi, mentre il DNA da deossinucleotidi (che contengono 2′-deossiribosio).

2 Introduzione alla struttura degli acidi nucleici • Nel DNA, due catene antiparallele di nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici si avvolgono l’una sull’altra formando una doppia elica; le basi appartenenti a filamenti opposti si appaiano nel modo seguente: A con T e G con C. • Gli acidi nucleici a singolo filamento, come per esempio l’RNA, possono adottare strutture a stelo e ansa.

3 Uno sguardo alla funzione degli acidi nucleici • Il DNA contiene le informazioni genetiche nella propria sequenza di nucleotidi; quando viene replicato da una DNA polimerasi, ogni filamento funge da stampo per la sintesi di un filamento complementare. • In base al dogma centrale della biologia molecolare, un filamento del DNA di un gene è trascritto in mRNA. L’RNA è poi tradotto in proteine per mezzo dell’aggiunta ordinata di amminoacidi legati a molecole di tRNA che accoppiano le proprie basi con l’mRNA a livello del ribosoma.

4 Il sequenziamento degli acidi nucleici • Le endonucleasi di restrizione riconoscono determinate sequenze di DNA che sono poi tagliate in maniera specifica. • L’elettroforesi su gel viene utilizzata per separare e determinare le dimensioni dei frammenti di DNA.

• Nel metodo di sequenziamento del DNA per terminazione della catena, la sequenza di nucleotidi di un filamento di DNA viene determinata mediante sintesi enzimatica di polinucleotidi complementari che terminano con un analogo dideossi di ciascuno dei quattro nucleotidi. I frammenti polinucleotidici di dimensioni crescenti sono separati mediante elettroforesi per risalire alla sequenza originale. • I metodi di sequenziamento di nuova generazione, come il pirosequenziamento e il sequenziamento Illumina, sono sostanzialmente confrontabili e molto più veloci rispetto ai metodi di terminazione della catena, a discapito tuttavia della lunghezza e dell’accuratezza delle letture. • Le mutazioni e altri cambiamenti nel DNA sono alla base dell’evoluzione degli esseri viventi.

5 La manipolazione del DNA • Nel clonaggio molecolare un frammento di DNA esogeno viene inserito all’interno di un vettore per essere amplificato in una cellula ospite; è poi possibile identificare le cellule trasformate usando marcatori di selezione. • Le librerie genomiche contengono tutto il DNA di un essere vivente. I cloni che hanno particolari sequenze di DNA sono identificati attraverso procedure di screening. • La reazione a catena della polimerasi amplifica sequenze selezionate di DNA. • Le metodiche del DNA ricombinante sono impiegate allo scopo di produrre proteine originali o mutagenizzate in modo selettivo in cellule o in organismi interi.

82

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

PROBLEMI 12. Quanti amminoacidi differenti potrebbero in teoria essere co-

1. Qual è il nome del seguente nucleotide? O H

O –O

H2N

O

P

O

P

O–

N

N

O

N

N

H2C

O

O–

H

H

H

H HO

OH

2. Qual è il nome al seguente nucleotide? NH2 N

N

H H

N

H2 C O

O H

O H P

–O

N

O

H

dificati da acidi nucleici contenenti quattro nucleotidi diversi (a) se un amminoacido fosse codificato da ciascun nucleotide; (b) se un amminoacido fosse codificato da sequenze consecutive di due nucleotidi; (c) se un amminoacido fosse codificato da sequenze consecutive di tre nucleotidi; (d) se un amminoacido fosse codificato da sequenze consecutive di quattro nucleotidi? 13. Il genoma umano contiene migliaia di sequenze note come piccoli schemi di lettura aperti (ORF, open reading frame), alcuni dei quali codificano proteine di circa 30 amminoacidi. Qual è il numero minimo di nucleotidi necessari per codificare una proteina del genere? 14. In media, di quanti nucleotidi differiscono i genomi di due Homo sapiens? 15. La sequenza di riconoscimento dell’enzima di restrizione TaqI è TgCGA; indicate i prodotti della reazione di TaqI con la sequenza di DNA illustrata. 5′-ACGTCGAATC-3′ 3′-TGCAGCTTAG-5′ 16. Usando i dati della Tabella 3.2, identificate gli enzimi di re-

H

OH

3. In molti organismi, il DNA viene modificato dalle metilazio-

ni. Disegnate la struttura della 5-metilcitosina, una base che si riscontra con elevata frequenza nel DNA inattivo. 4. Quando si tratta la citosina con il bisolfito, il gruppo amminico viene rimpiazzato da un gruppo carbonilico. Identificate la base che viene prodotta. 5. Le chinasi sono enzimi che trasferiscono un gruppo fosforico da un nucleoside trifosfato. Quale delle seguenti è una vera reazione catalizzata da una chinasi?

(a) ATP + GDP n ADP + GTP (b) ATP + GMP n AMP + GTP 6. Le chinasi sono enzimi che trasferiscono un gruppo fosfori-

co da un nucleoside trifosfato. Quale delle seguenti è una vera reazione catalizzata da una chinasi? (a) ADP + CMP n AMP + CDP (b) AMP + ATP n 2 ADP 7. Un organismo diploide contenente un genoma aploide da

45 000 kb contiene il 21% di residui G. Calcolate il numero di residui A, C, G e T presenti nel DNA di ogni cellula di tale organismo. 8. Un tratto di DNA lungo 20 bp contiene 7 residui di guanina; quanti sono i residui di adenina presenti nello stesso segmento? Quanti di uracile? 9. Spiegate perché i filamenti di una molecola di DNA vengono separati più facilmente a pH > 11. 10. Spiegate perché un aumento della concentrazione di NaCl determina un incremento della temperatura di fusione dei due filamenti di DNA. 11. Un enzima del virus dell’immunodeficienza umana (l’HIV, responsabile dell’insorgere dell’AIDS) è in grado di sintetizzare DNA partendo da uno stampo di RNA. Spiegate in che modo l’attività di questo enzima va contro il dogma centrale di Crick.

strizione che (a) generano estremità piatte; (b) riconoscono e tagliano la medesima sequenza (definita isoschizomero); (c) producono estremità coesive identiche. 17. Il genoma dell’alga verde Ostreococcus tauri (circa 13 Mb) contiene approssimativamente 8000 geni. Confrontate la densità genica di questo eucariote con quella dell’E. coli (circa 4300 geni) e dell’A. thaliana (circa 25 500 geni). 18. Descrivete com’è possibile selezionare cloni ricombinanti se un DNA esogeno viene inserito all’interno del sito di clonaggio multiplo di pUC18 e in seguito introdotto in cellule di E. coli. 19. Fate riferimento al disegno schematico di pUC18 (Figura 3.24) per determinare quali enzimi di restrizione potreste usare per inserire un gene che interferisca con la produzione di β-galattosidasi da parte della cellula ospite. 20. Fate riferimento al disegno schematico di pUC18 (Figura 3.24) per determinare quali enzimi di restrizione potreste usare per inserire un gene che non interferisca con la resistenza all’ampicillina o con la produzione di β-galattosidasi da parte della cellula ospite. 21. Per quale motivo, per un dato organismo, una libreria genomica è di dimensioni maggiori rispetto a una di cDNA? 22. Perché le librerie di cDNA derivate da tipi cellulari differenti nell’ambito del medesimo essere vivente differiscono tra loro? DOMANDE DIFFICILI 23. Alcune molecole di RNA sono modificate covalentemente

per metilazione sulla posizione N6 dei residui di adenina. Disegnate la struttura del nucleoside modificato. 24. Il nucleoside modificato descritto nella Domanda 23 sarebbe in grado di partecipare all’appaiamento fra basi standard di Watson e Crick? 25. Disegnate le forme tautomeriche dell’adenina 26. Disegnate le forme tautomeriche della citosina. 27. Il valore di pK per N1 dell’adenina è 3,64, mentre il valore di pK per N1 della guanina è 9,50. Spiegate questa differenza.

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

© 978-88-08-42096-1

28. Utilizzate la risposta alla Domanda 27 per determinare i va-

lori relativi di pK di N3 nella citosina e nell’uracile. 29. L’ipoxantina, derivato dell’adenina, può appaiarsi con l’adenina; mostrate le strutture di queste coppie di basi. O H

N

N N

N H

Ipoxantina

30. L’ipoxantina può appaiarsi anche con la citosina. Disegnate la

struttura di questa coppia di basi. 31. Descrivete l’esito di una procedura di sequenziamento di ter-

minazione della catena in cui (a) viene aggiunta una quantità troppo bassa di ddNTP, (b) ne viene aggiunta una quantità troppo elevata. 32. Descrivete l’esito di una procedura di sequenziamento di terminazione della catena in cui (a) sono presenti quantità troppo basse di pri- Macchia di sangue mer, (b) sono presenti quantità troppo alte di primer. 33. Calcolate il numero di cloni richiesti per ottenere, con una probabilità pari a 0,99, uno specifico frammento di 5 kb da C. elegans (Tabella 3.3). 34. State tentando di clonare un frammento di DNA murino di 250 kb in un cromosoma ar- Sospettato 1 tificiale di lievito. Ottenete 5000 cloni di dimensioni equivalenti che rappresentano l’intero genoma del topo. Qual è la probabilità che il frammento di DNA di interesse sia stato clonato? 35. Riportate il possibile risultato di un esperimenSospettato 2 to di PCR in cui (a) uno dei primer è inavvertitamente omesso dalla miscela di reazione; (b) uno dei primer è complementare a diversi siti presenti nel campione di DNA di partenza. 36. Riportate il possibile risultato di un esperimento di PCR in cui (a) vi è un’interruzione in un Sospettato 3 singolo filamento del DNA bersaglio, in una sequenza che è presente in una sola copia nel campione di partenza; (b) vi è un’interruzione in entrambi i filamenti del DNA bersaglio, in una sequenza che è presente in singola copia nel campione di partenza. 37. Scrivete le sequenze dei due primer da 12 reSospettato 4 sidui ciascuno che potrebbero essere impiegati per amplificare mediante PCR il seguente frammento di DNA:

condotta utilizzando primer fluorescenti associati a tre loci STR: D3S1358, vWA e FGA. Nell’illustrazione in basso sono mostrati gli elettroferogrammi risultanti. I numeri riportati sotto ogni picco rappresentano l’allele (riquadro superiore) e l’altezza del picco in unità di fluorescenza relativa (riquadro inferiore). (a) Dal momento che ogni individuo possiede due copie di ogni cromosoma e quindi anche due alleli di ogni gene, che cosa significa l’identificazione di un solo allele in alcuni loci? (b) Da quale tra i sospettati è possibile che provenga il sangue ritrovato? (c) Il sospettato potrebbe essere identificato come colpevole anche utilizzando uno solo dei tre loci STR? (d) Quali conclusioni potete trarre sul quantitativo di DNA ottenuto dal sospettato 1 paragonato a quello estratto dal sospettato 4?

ATAGGCATAGGCCCATATGGCATAAG GCTTTATAATATGCGATAGGCGCTGGTCAG 38. Sono state analizzate tramite PCR una mac-

chia di sangue proveniente dalla scena di un crimine e campioni di sangue prelevati da quattro individui sospetti. L’analisi è stata

83

[Da Thompson, W.C., Ford, S., Doom, T., Raymer, M., e Krane, D.E., Evaluating forensic DNA evidence: Essential elements of a competent defence review, The Champion 27, 16-25 (2003). Ristampata con l’autorizzazione di National Association of Criminal Defense Lawyers.]

84

CAPITOLO 3

Nucleotidi, acidi nucleici e informazioni genetiche

BIOINFORMATICA Progetto 1 Database per lo stoccaggio e la ricerca delle sequenze del genoma 1. Ricerca dei database. Localizzate i database per le sequenze genomiche ed esplorate il significato dei termini a essi correlati. 2. Istituto per la ricerca genomica. Analizzate il genoma procariotico e trovate indicazioni per il genoma eucariotico. 3. Analizzando una sequenza di DNA. Data una certa sequenza di DNA, identificatene lo schema di lettura aperto (open reading frame) e traducetelo in una sequenza proteica.

© 978-88-08-42096-1

4. Omologia di sequenza. Fate una ricerca BLAST per trovare gli omologhi di una sequenza proteica. 5. Plasmidi e clonaggio. Calcolate le dimensioni dei frammenti prodotti dall’azione di diversi enzimi di restrizione sui plasmidi.

APPROFONDIMENTO Prendete in considerazione una delle malattie genetiche elencate nella Tabella 3.4. Quale gene è coinvolto? Qual è la normale funzione della proteina codificata dal gene e in che modo il difetto del gene provoca i caratteristici sintomi? Come potrebbe essere trattata questa patologia utilizzando la terapia genica?

BIBLIOGRAFIA Struttura e funzione del DNA Bloomfield, V.A., Crothers, D.M., e Tinoco, I., Jr. (2000). Nucleic Acids. Structures, Properties, and Functions. University Science Books. Dickerson, R.E. (1992). DNA structure from A to Z. Methods Enzymol. 211, 67-111. [Descrive le varie forme cristallografiche del DNA.] Thieffry, D. (1998). Forty years under the central dogma. Trends Biochem. Sci. 23, 312-316. [Illustra come si è sviluppata dall’inizio l’idea che gli acidi nucleici sono i depositari delle informazioni biologiche.] Watson, J.D., e Crick, F.H.C. (1953). Molecular structure of nucleic acids. Nature 171, 737-738; e Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171, 964-967. [I primi articoli ritenuti universalmente le pietre miliari della moderna biologia molecolare.]

Il sequenziamento del DNA Brown, S.M. (a cura di) (2013). Next-Generation DNA Sequencing Informatics, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Galperin, M.Y., Rigden, D.J., e Fernández-Suárez, X.M., The 2015 Nucleic Acids Research database issue and online molecular biology database collection, Nucleic Acids Res. 43, Database issue D1–D8 (2015). [Questo articolo aggiornato annualmente descrive 1537 database che coprono vari aspetti della biologia molecolare, della biochimica e della genetica. Ulteriori articoli nella stessa pubblicazione forniscono più informazioni sui singoli database. Disponibile gratuitamente su http://nar.oxfordjournals.org ] International Human Genome Sequencing Consortium (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921; e Venter, J.C. et al. (2001). The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351. [Questi e altri articoli

pubblicati sugli stessi numeri di Nature e di Science descrivono i dati che costituiscono il primo abbozzo della sequenza del genoma umano e discutono in che modo si possono impiegare queste informazioni ai fini della comprensione delle funzioni biologiche, dell’evoluzione e della salute dell’uomo.] International Human Genome Sequencing Consortium, Finishing the euchromatic sequence of the human genome (2004). Nature 431, 931-945. [Descrive la versione “terminata“ della sequenza del genoma umano.]” Lander, E.S. (2011). Initial impact of the sequencing of the human genome, Nature 470, 187-197. Mardis, E.R. (2013). Next-generation sequencing platforms, Annu. Rev. Analyt. Chem. 6, 287-303.

La tecnologia del DNA ricombinante Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., e Struhl, K. (2002). Short Protocols in Molecular Biology (5a ed.), Wiley. [Una serie in due volumi.] Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., e Wende, W. (2005). Type II restriction endonucleases: structure and mechanism, Cell. Mol. Life Sci. 62, 685-707. [Comprende una rassegna dei vari tipi di enzimi di restrizione.] Green, M.R. e Sambrook, J. (2012). Molecular Cloning. A Laboratory Manual (4a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory. [Una “bibbia” in tre volumi di protocolli di laboratorio accompagnati dalle spiegazioni dei concetti di base.] Watson, J.D., Meyers, R.M., Caudy, A.A., e Witkowski, J.A. (2007). Recombinant DNA. Genes and Genomes – A Short Course (3a ed.), Freeman. (Trad. it.: DNA ricombinante, Zanichelli, Bologna 2008) [Un’esposizione del metodo, dei risultati e dei punti principali della tecnologia del DNA ricombinante e della ricerca.]

C A P I T O L O

4

Gli amminoacidi

Lo Staphilococcus epidermidis, che cresce sulla pelle umana, lega l’acido glutammico per formare lunghe catene. Queste aiutano a proteggere i batteri dalle variazioni nella concentrazione di sali che si verificano normalmente sulla superficie cutanea. [Eye of Science/Science Source Images.]

Quando, all’inizio del XIX secolo, gli scienziati rivolsero per la prima volta la loro attenzione alla nutrizione, in breve tempo scoprirono che i prodotti naturali contenenti azoto erano essenziali per la sopravvivenza degli animali. Nel 1839 il chimico svedese Jacob Berzelius coniò, per questa classe di composti, il termine proteina (dal greco pr—teios, “che occupa la prima posizione”). A quel tempo i chimici che si occupavano di fisiologia non si resero conto che le proteine erano in realtà formate da costituenti più piccoli, gli amminoacidi, sebbene alcuni di questi composti fossero stati isolati nel 1830. Ancora per molti anni si continuò a ritenere che le sostanze di origine vegetale, comprese le molecole proteiche, fossero incorporate tutte intere nei tessuti animali. Questo equivoco venne chiarito quando si fece luce sul processo della digestione. Fu dimostrato che le proteine ingerite sono frammentate in composti di dimensioni più piccole contenenti amminoacidi e gli scienziati si concentrarono sulle qualità nutrizionali di tali sostanze (Scheda 4.1). I moderni studi sulle proteine e gli amminoacidi devono molto agli esperimenti condotti durante il XIX secolo e l’inizio del XX. Ora sappiamo che gli amminoacidi contenenti azoto sono essenziali per la vita e che sono le unità costitutive delle proteine. La funzione centrale degli amminoacidi in biochimica forse non è sorprendente: svariati di essi sono tra i composti organici che si ritiene siano comparsi in una fase precoce della storia del nostro pianeta (Paragrafo 1.1A) e, trattandosi di molecole antiche e ubiquitarie, vennero cooptati dall’evoluzione per numerosi scopi nei sistemi viventi. Apriamo il capitolo discutendo le strutture e le proprietà chimiche degli amminoacidi comuni, compresa la loro stereochimica, per concluderlo con una breve trattazione delle strutture e funzioni di alcuni composti correlati.

1 La struttura degli amminoacidi CONCETTI CHIAVE

• I 20 amminoacidi standard condividono una struttura comune ma differiscono a livello della loro catena laterale.

• All’interno di una catena polipeptidica, i legami tra gli amminoacidi sono costituiti dai legami peptidici.

• Alcune catene laterali degli amminoacidi contengono gruppi ionizzabili i cui valori di pK possono variare.

86

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

SCHEDA 4.1

© 978-88-08-42096-1

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

William C. Rose e la scoperta della treonina William C. Rose (1887-1985)

L’identificazione dei costituenti amminoacidici delle proteine fu una sfida che trasse origine dagli studi sulla nutrizione animale. All’inizio del XX secolo i chimici-fisici (il termine biochimico non era ancora in uso) riconobbero che non tutti gli alimenti fornivano una nutrizione adeguata. Per esempio, i ratti nutriti con la proteina di mais zeina come loro unica fonte di azoto non crescevano, a meno che alla loro dieta non fossero aggiunti gli amminoacidi triptofano e lisina. A quel tempo la conoscenza del metabolismo si limitava in gran parte a informazioni raccolte qua e là da ricerche in cui l’assunzione di particolari cibi in soggetti sperimentali (compresi gli esseri umani) era posta in relazione con l’escrezione urinaria di vari composti. I risultati di tali indagini erano a favore dell’idea che le sostanze potevano essere trasformate in altre anche se, chiaramente, i nutrienti non erano del tutto intercambiabili. Presso la University of Illinois, William C. Rose concentrò le proprie ricerche su studi nutrizionali tesi a decifrare le relazioni metaboliche tra le sostanze contenenti azoto. Tra l’altro, i suoi studi sulla crescita e la nutrizione dei ratti aiutarono a evidenziare che le purine e le pirimidine derivavano dagli amminoacidi, ma che questi composti non potevano rimpiazzare gli amminoacidi forniti dalla dieta. Al fine di esaminare le esigenze alimentari relative ai singoli amminoacidi, lo scienziato sottopose a idrolisi determinate proteine con l’intento di ottenerne gli amminoacidi costituenti e poi rimuoverne selettivamente alcuni. Nel corso di uno dei suoi primi esperimenti, Rose tolse l’arginina e l’istidina da un idrolisato della proteina del latte caseina. I ratti nutriti con questa preparazione perdevano peso, a meno che al cibo non fosse aggiunta nuovamente istidina; il reinserimento dell’arginina non compensava la richiesta di istidina. Tali conclusioni indussero Rose a indagare le esigenze per quanto concerneva tutti gli altri amminoacidi; impiegando approcci sperimentali analoghi, egli dimostrò

che la cisteina, l’istidina e il triptofano non potevano essere sostituiti con altri amminoacidi. Egli passò dalle preparazioni a base di proteine idrolizzate all’impiego di miscele di amminoacidi puri. Fu possibile purificare 13 tra 19 di quelli noti, mentre gli altri sei furono sintetizzati. I ratti alimentati con questi 19 amminoacidi come loro unica fonte di azoto perdevano peso. Anche se una possibile spiegazione era che le quantità di amminoacidi puri somministrate non erano ottimali, lo scienziato arrivò ugualmente a concludere che doveva esistere un altro amminoacido essenziale, contenuto nelle proteine presenti in natura e nei loro idrolisati, ma non nelle miscele amminoacidiche da lui preparate. Dopo molti anni di sforzi Rose ottenne e identificò l’amminoacido mancante. In un lavoro pubblicato nel 1935 egli dimostrò che, aggiungendo questo amminoacido agli altri 19, era possibile sostenere lo sviluppo dei roditori; fu così che venne scoperto il ventesimo e ultimo amminoacido, la treonina. Esperimenti che si protrassero nell’arco dei successivi 20 anni rivelarono che 10 dei 20 amminoacidi trovati nelle proteine sono essenziali sotto il profilo nutrizionale, tanto che la rimozione di uno di questi amminoacidi determina una mancata crescita e infine la morte degli animali studiati. Gli altri 10 amminoacidi furono ritenuti “non essenziali”, in quanto gli animali erano in grado di sintetizzarne quantità sufficienti. Nei successivi lavori Rose verificò le esigenze amminoacidiche dell’uomo, utilizzando per questi esperimenti un gruppo di studenti. La conoscenza di quali amminoacidi fossero necessari, e in quali quantità, allo scopo di mantenere un corretto stato di salute, rese possibile valutare il potenziale valore nutritivo di differenti tipi di proteine alimentari. Queste conclusioni furono di grande aiuto nelle formulazioni usate per l’alimentazione endovenosa. McCoy, R.H., Meyer, C.E., Rose, W.C. (1935). Feeding experiments with mixtures of highly purified amino acids. VIII. Isolation and identification of a new essential amino acid. J. Biol. Chem. 112, 283-302. [Gratuitamente disponibile su http://www.jbc.org.]

Le analisi di una vasta serie di molecole proteiche provenienti da quasi tutte le fonti disponibili hanno evidenziato che tutte le proteine sono composte di 20 amminoacidi standard. Non tutte le proteine note contengono tutti e 20 i tipi di amminoacidi, anche se la maggioranza ne contiene molti, praticamente tutti. Gli amminoacidi comuni sono noti come 𝛂-amminoacidi, poiché possiedono un gruppo amminico primario (−NH2) in qualità di sostituente dell’atomo di carbonio α, cioè l’atomo di carbonio adiacente al gruppo carbossilico (−COOH, Figura 4.1). L’unica eccezione è rappresentata dalla prolina, che presenta un gruppo amminico secondario (−NH−), ma per ragioni di uniformità considereremo anche questo composto un α-amminoacido. I 20 amminoacidi convenzionali differiscono per quanto concerne la struttura della catena laterale (gruppo R); i loro nomi e strutture chimiche complete sono elencati nella Tabella 4.1. R H2N

Ca COOH H

Figura 4.1 Struttura generale di un 𝛂-amminoacido. I 20 amminoacidi standard si

differenziano per i gruppi R. Identificate i gruppi funzionali in questa struttura

CAPITOLO 4

87

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 4.1 Strutture covalenti e abbreviazioni degli amminoacidi standard delle proteine, della loro fre-

quenza e dei valori di pK dei loro gruppi ionizzabili Nome, simbolo a tre lettere e simbolo Formula a una lettera di strutturaa

Massa del residuo (D)b

Frequenza media nelle proteine (%)c

pK1 𝛂-COOHd

pK2 𝛂-NH3+d

57,0

7,1

2,35

9,78

71,1

8,2

2,35

9,87

99,1

6,9

2,29

9,74

113,2

9,7

2,33

9,74

113,2

6,0

2,32

9,76

131,2

2,4

2,13

9,28

H2 COO⫺ C3 CH 2 4 C2 5 ⫹1 CH 2 N H H2

97,1

4,7

1,95

10,64

COO⫺

147,2

3,9

2,20

9,31

186,2

1,1

2,46

9,41

Amminoacidi con catene laterali non polari Glicina COO⫺ Gly H C H G

pKR catena lateraled

NH⫹ 3

Alanina Ala A

COO⫺ H

C

CH3

NH⫹ 3

Valina Val V Leucina Leu L

COO⫺ CH

3

H

C

CH

CH3 NH⫹ 3 COO⫺ H

C

CH3

CH2 CH CH3

NH⫹ 3

Isoleucina Ile I Metionina Met M

H

COO⫺

CH3

C

C* CH2

NH⫹ 3

H

CH3

COO⫺ H

C

CH2

CH2

S

CH3

NH⫹ 3

Prolina Pro P

Fenilalanina Phe F

H

C

CH2

NH⫹ 3

Triptofano Trp W

COO⫺ H

C

CH2

NH⫹ 3

4 5

3 2

1

N H

6 7

a Le forme ioniche illustrate sono quelle prevalenti a pH 7,0 (ad eccezione di quella dell’istidinaf ), sebbene la massa del residuo sia data per il composto neutro. Gli atomi di Cα, come quelli contrassegnati con un asterisco, sono centri chirali le cui configurazioni sono indicate secondo le formule di proiezione di Fischer (Paragrafo 4.2). Per gli eterocicli si usa il sistema di numerazione convenzionale dei composti organici. b Le masse molecolari dei residui sono date per le specie neutre. Per ottenere le masse molecolari degli amminoacidi corrispondenti bisogna aggiungere 18,0 D, la massa molecolare dell’acqua, a quelle dei residui. Per le masse molecolari delle catene laterali bisogna sottrarre 56,0 D da quelle dei residui, vale a dire la massa di un gruppo peptidico. c La composizione media amminoacidica è disponibile all’interno della banca dati molto completa SWISS-PROT (http://www.expasy.ch/ sprot/relnotes/relstat.html), Release 2013_13. Le singole proteine possono manifestare variazioni anche ampie rispetto a queste quantità. d Dati provenienti da Dawson, R. M. C., Elliott, D. C., Elliott, W. H., Jones, K. M. (1986). Data for Biochemical Research, III ed. Oxford Science Publications, pp. 1-31.

(segue)

88

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 4.1 (continua) Strutture covalenti e abbreviazioni degli amminoacidi standard delle proteine, della

loro frequenza e dei valori di pK dei loro gruppi ionizzabili Nome, simbolo a tre lettere e simbolo a una lettera Amminoacidi Serina Ser S

Formula di strutturaa con catene laterali polari non cariche COO⫺ H

C

CH2

Massa del residuo (D)b

Frequenza media nelle proteine (%)c

pK1 𝛂-COOHd

pK2 𝛂-NH3+d

87,1

6,6

2,19

9,21

101,1

5,3

2,09

9,10

114,1

4,1

2,14

8,72

128,1

3,9

2,17

9,13

163,2

2,9

2,20

9,21

10,46 (fenolica)

103,1

1,4

1,92

10,70

8,37 (sulfidrilica)

128,2

5,9

2,16

9,06

10,54 (ε-NH3+)

156,2

5,5

1,82

8,99

12,48 (guanidinica)

137,1

2,3

1,80

9,33

6,04 (imidazolica)

115,1

5,4

1,99

9,90

3,90 (β-COOH)

129,1

6,8

2,10

9,47

4,07 (γ-COOH)

pKR catena lateraled

OH

NH⫹ 3 COO⫺ H

Treonina Thr T

H

C

C* CH3

NH⫹ 3

OH

COO⫺

Asparaginae Asn N

H

C

CH2

O C

NH⫹ 3

Glutammina Gln Q

NH2

COO⫺

e

H

C

CH2

O CH2

C

NH⫹ 3

Tirosina Tyr Y

NH2

COO⫺ H

C

CH2

OH

NH⫹ 3

Cisteina Cys C

COO⫺ H

C

CH2

SH

NH⫹ 3

Amminoacidi con catene laterali polari cariche Lisina COO⫺ Lys H C CH2 CH2 CH2 CH2 NH⫹ 3 K NH⫹ 3

Arginina Arg R

COO⫺ H

C

CH2

NH2 CH2

CH2

Istidinaf His H

COO2 H

C

CH2

NH1 3

Acido asparticoe Asp D Acido glutammicoe Glu E

5 1

C

CH2

NH⫹ 3

4 3

N H

COO⫺ H

NH1

C

CH2

NH⫹ 3

C

2

O C O⫺

COO⫺ H

NH

NH+2

NH⫹ 3

O CH2

C O⫺

e Per l’asparagina o l’acido aspartico, i simboli a una e a tre lettere sono Asx e B, mentre per la glutammina o l’acido glutammico sono Glx e Z. Il simbolo a una lettera di un amminoacido indeterminato o “non standard” è X. f Le forme non protonata neutra e protonata dell’istidina sono presenti a pH 7,0, dato che il suo pK è prossimo a 7,0. R

CAPITOLO 4

R

A Gli amminoacidi possono essere ioni dipolari I gruppi amminici e carbossilici degli amminoacidi possono andare incontro a ionizzazione. I valori di pK dei gruppi carbossilici (indicati con pK1 nella Tabella 4.1) sono raggruppati in un breve intervallo intorno a 2,2, mentre i valori di pK dei gruppi α-amminici (pK2) sono prossimi a 9,4. A pH fisiologico (∼7,4), i gruppi amminici sono protonati e quelli carbossilici sono nella forma di base coniugata deprotonata (carbossilato) (Figura 4.2). Perciò un amminoacido può fungere sia da acido sia da base. La Tabella 4.1 elenca anche i valori di pK dei gruppi ionizzabili (pKR) presenti in sette catene laterali. Le molecole quali gli amminoacidi, che portano gruppi carichi con polarità opposta, sono note come ioni dipolari o zwitterioni. Gli amminoacidi, come gli altri composti ionici, mostrano una solubilità maggiore nei solventi polari rispetto a quelli non polari. Come vedremo, le proprietà ioniche delle catene laterali influenzano le caratteristiche chimiche e fisiche degli amminoacidi liberi e di quelli contenuti nelle proteine.

B I legami peptidici uniscono gli amminoacidi nelle proteine

89

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

+ H3N

Gli amminoacidi possono polimerizzare per dare luogo a catene lineari; questo processo avviene per mezzo di reazioni di condensazione (la formazione di un legame con l’eliminazione di una molecola di acqua), come illustrato nella Figura 4.3. Il risultante legame CO−NH, un legame amidico, è detto legame peptidico. I polimeri contenenti due, tre, alcune (da 3 a 10) o numerose unità amminoacidiche sono chiamati rispettivamente dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi e polipeptidi; questi composti sono spesso chiamati semplicemente “peptidi”. Dopo essere stati incorporati in un peptide, i singoli amminoacidi (le unità monomeriche) sono denominati residui amminoacidici. I polipeptidi sono polimeri lineari e quindi non presentano ramificazioni. In questa struttura ogni residuo amminoacidico partecipa a due legami peptidici ed è unito ai residui a esso adiacenti secondo un orientamento testa-coda. Ciascun residuo presente alle due estremità del polipeptide partecipa a un solo legame peptidico; il residuo con il gruppo α-amminico libero (per convenzione, quello scritto a sinistra, come illustrato nella Figura 4.3) è definito ammino-terminale o N-terminale, mentre quello con il gruppo α-carbossilico libero (posto all’estremità destra) è chiamato carbossi-terminale o C-terminale. Le proteine sono molecole contenenti una o più catene polipeptidiche. Come avremo modo di osservare nei capitoli successivi, le variazioni nella lunghezza e nella sequenza amminoacidica dei polipeptidi contribuiscono alla diversità di forma e di funzione biologica delle molecole proteiche.

C Le catene laterali degli amminoacidi possono essere non polari, polari o cariche Il modo più semplice per classificare i 20 amminoacidi standard utilizza le polarità delle loro catene laterali. In base a questa classificazione, vi sono tre tipi principali di amminoacidi: (1) quelli con gruppi R non polari, (2) gli amminoacidi con gruppi R polari non carichi e (3) quelli con gruppi R polari carichi. Le catene laterali non polari degli amminoacidi hanno forme e dimensioni diverse.

Gli amminoacidi riuniti in questo gruppo sono nove. Le strutture tridimensionali di alcuni di questi amminoacidi sono mostrate nella Figura 4.4. La glicina è l’amminoacido con la catena laterale più piccola, in quanto è costituita da un solo atomo di H, mentre l’alanina, la valina, la leucina e l’isoleucina presenta-

⫹ H3N

C

COO⫺

H Figura 4.2 Un amminoacido

dipolare. A pH fisiologico, il gruppo amminico è protonato mentre il gruppo carbossilico acido è deprotonato.

R1 C H

O

+

C

H

H + N

R2

H

H

O–

C

O C O–

H2O + H3N

R1

O

C

C

H

R2 N

C

H

H

O C O–

Figura 4.3 Condensazione di due

amminoacidi. La formazione di un legame CO–NH con l’eliminazione di una molecola di acqua produce un dipeptide; il legame peptidico è mostrato in rosso. Il residuo con un gruppo amminico libero è l’N-terminale del peptide, mentre quello con un gruppo carbossilico libero è il C-terminale. Disegnate un tripeptide risultante dalla condensazione di un terzo amminoacido.

CONCETTI DI BASE Visualizzazione molecolare Le rappresentazioni bidimensionali degli amminoacidi e di piccole molecole indicano la disposizione dei legami tra gli atomi. Tuttavia, poiché i legami covalenti fra C, N, P e S sono spesso diretti verso i vertici di un tetraedro, le molecole che contengono questi atomi occupano tre dimensioni, e se gli elettroni di ciascun atomo – quelli nelle coppie di legame e quelli nelle coppie non condivise – sono rappresentati come una nuvola attorno al nucleo di ogni atomo, la molecola può essere mostrata come un oggetto solido. Le formule strutturali, i modelli a sfere e bastoncini e i modelli spaziali possono quindi evidenziare differenti aspetti della stessa struttura molecolare.

90

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

Alanina

© 978-88-08-42096-1

Isoleucina

Figura 4.4 Rappresentazione di alcuni amminoacidi con

catene laterali non polari. Gli amminoacidi sono rappresentati in forma di modelli a sfere e bastoncini inclusi in strutture spaziali

CONCETTI DI BASE Gruppi funzionali e comportamento molecolare Oltre ai gruppi amminico e carbossilico che caratterizzano tutti gli amminoacidi, alcuni amminoacidi hanno delle catene laterali con gruppi acido-base. La protonazione o deprotonazione di questi gruppi funzionali determina se la catena laterale abbia una carica ionica. Di conseguenza, le catene laterali possono partecipare alle reazioni chimiche come acidi e basi, e i loro stati di ionizzazione determinano altri aspetti del comportamento molecolare, compresa la solubilità in acqua e la capacità di interagire elettrostaticamente con altri gruppi carichi o polari.

Fenilalanina

trasparenti. Tutti i modelli sono disegnati nella stessa scala; gli atomi di C sono in colore verde, di H in bianco, di N in blu e di O in rosso.

no catene laterali composte da idrocarburi alifatici con dimensioni variabili da un gruppo metilico, nel caso dell’alanina, a gruppi butilici isomerici, per la leucina e l’isoleucina. La metionina possiede nella catena laterale un gruppo tioetere che ricorda un radicale n-butilico in molte delle sue proprietà fisiche (C e S presentano elettronegatività quasi equivalenti, e S è di dimensioni analoghe a quelle di un gruppo metilenico). La prolina è caratterizzata da una catena laterale pirrolidinica ciclica, invece la fenilalanina (con la sua porzione fenilica) e il triptofano (con il suo gruppo indolico) contengono gruppi laterali aromatici caratterizzati da grande volume e mancanza di polarità. Le catene laterali polari non cariche possiedono gruppi ossidrilici, amidici o tiolici. Gli amminoacidi classificati in questo gruppo sono sei (Tabella 4.1 e Figura 4.5). La serina e la treonina hanno catene laterali di grandezza differente con un gruppo ossidrilico; l’asparagina e la glutammina hanno catene laterali amidiche di varie dimensioni, la tirosina presenta un gruppo fenolico (e, analogamente alla fenilalanina e al triptofano, è aromatica), mentre la cisteina è l’unico tra i 20 amminoacidi a possedere un gruppo tiolico in grado di formare un legame (ponte) disolfuro con un’altra cisteina mediante ossidazione dei due gruppi tiolici (Figura 4.6).

Cinque amminoacidi possiedono catene laterali cariche (Tabella 4.1 e Figura 4.7). A valori fisiologici di pH, le catene laterali degli amminoacidi basici sono cariche positivamente. La lisina presenta una catena laterale costituita da butilammina, mentre l’arginina ha un gruppo guanidinico; come mostrato nella Tabella 4.1, l’istidina contiene un gruppo imidazolico. Si noti che solo l’istidina, il cui pKR è pari a 6,04, si ioLe catene laterali polari cariche sono positive o negative.

Figura 4.5 Modelli di alcuni

amminoacidi con catene laterali polari non cariche. Gli atomi sono rappresentati e colorati come nella Figura 4.4. Si noti la presenza di atomi elettronegativi sulle catene laterali.

Serina

Glutammina

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

91

Figura 4.6 Residui di cisteina H

C

O

C

CH2

NH

+

SH

HS

CH2

NH 1 2

Residuo di cisteina

H

O2

O

C

CH2

NH

H

C

O

Residuo di cisteina

H2O

C

C

uniti da legami (ponti) disolfuro. Il legame disolfuro si forma in seguito a ossidazione dei due gruppi tiolici.

NH S

S

CH2

C

H

C

O

nizza a un pH vicino al pH fisiologico. Di conseguenza, nelle proteine questo residuo può essere sia nella forma neutra sia nella forma cationica. Di fatto, la protonazione-deprotonazione delle catene laterali dell’istidina è una caratteristica comune a numerosi meccanismi di reazioni enzimatiche. Le catene laterali degli amminoacidi acidi, acido aspartico e acido glutammico, sono cariche negativamente a un pH superiore a 3; nello stato ionizzato, tali amminoacidi sono chiamati sovente aspartato e glutammato. L’asparagina e la glutammina sono, rispettivamente, le amidi dell’acido aspartico e dell’acido glutammico. La suddivisione dei 20 amminoacidi nei tre diversi gruppi è in qualche misura arbitraria. Per esempio, la glicina e l’alanina, i due amminoacidi più piccoli, e il triptofano, con il suo anello eterociclico, potrebbero essere parimenti classificati come amminoacidi polari non carichi; analogamente, la tirosina e la cisteina, con le loro catene laterali ionizzabili, potrebbero essere considerate amminoacidi polari carichi, in particolare a valori di pH elevati. In effetti, la catena laterale deprotonata della cisteina (che contiene l’anione tiolato, S–) è presente in una serie di enzimi e partecipa attivamente al loro meccanismo di reazione. L’inserimento di un particolare amminoacido in un gruppo o in un altro rispecchia non solo le proprietà dell’amminoacido isolato, ma pure il suo comportamento quando entra a far parte di un polipeptide. La struttura della maggior parte dei polipeptidi dipende da una tendenza delle catene laterali polari e ioniche all’idratazione e di quelle non polari ad associarsi l’una all’altra piuttosto che all’acqua. Questa proprietà dei polipeptidi è dovuta all’effetto idrofobico (Paragrafo 2.1C). Come vedremo, le proprietà chimiche e fisiche delle catene laterali degli amminoacidi determinano anche la reattività chimica del polipeptide. È importante conoscere le strutture dei 20 amminoacidi stardard per apprezzare in che modo questi variano per polarità, acidità, aromaticità, dimensioni, flessibilità conformazionale, capacità di formare legami crociati o legami idrogeno e reattività nei confronti di altri gruppi.

D I valori di pK dei gruppi ionizzabili dipendono dall’ambiente circostante Gli α-amminoacidi possiedono due o, per quelli con catene laterali ionizzabili, tre gruppi acido-base. A valori di pH molto bassi, questi gruppi sono completamente protonati, mentre a valori di pH molto alti questi gruppi sono deprotonati. A valori intermedi di pH, i gruppi acidi tendono a essere deprotonati mentre i gruppi basici tendono a essere protonati. Quindi, per l’amminoacido glicina, al di sotto del valore di pH 2,35 (corrispondente al valore di pK del suo gruppo carbossilico acido), predomina la forma cationica +H3NCH2COOH. Al di

Aspartato

Lisina Figura 4.7 Alcuni amminoacidi con

catene laterali polari cariche. Gli atomi sono rappresentati e colorati come nella Figura 4.4.

92

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

sopra del valore di pH 2,35, l’acido carbossilico è per lo più ionizzato mentre il gruppo amminico è ancora almeno in parte protonato (+H3NCH2COO−). Al di sopra del valore di pH 9,78 (corrispondente al valore di pK del gruppo amminico), la forma predominante è quella anionica H2NCH2COO−. Si noti che, in soluzione acquosa, la forma neutra non ionizzata (H2NCH2COOH) è presente in quantità trascurabili. Il pH a cui una molecola non porta carica elettrica netta è detto punto isoelettrico, pI. Per gli α-amminoacidi, 1 [4.1] (pKi pK j ) 2 dove Ki e Kj sono le costanti di dissociazione delle due reazioni di ionizzazione che avvengono a carico delle specie neutre. Per gli acidi monoamminici e monocarbossilici, come per esempio la glicina, Ki e Kj rappresentano K1 e K2. Per gli amminoacidi carichi aspartato e glutammato, Ki e Kj sono K1 e KR, mentre per arginina, istidina e lisina, Ki e Kj sono KR e K2 (vedi l’Esempio di calcolo 4.1). I residui amminoacidici che fanno parte di una catena polipeptidica non hanno gruppi α-amminici e α-carbossilici liberi in grado di ionizzarsi, in quanto questi gruppi sono impegnati nei legami peptidici (Figura 4.3). I valori di pK di tutti i gruppi ionizzabili, inclusi quelli N- e C-terminali, possono discostarsi dai valori di pK elencati nella Tabella 4.1, definiti per gli amminoacidi liberi. Per esempio, i valori di pK dei gruppi α-carbossilici nelle proteine non ripiegate variano da 3,5 a 4,0. Negli amminoacidi liberi, i valori di pK sono molto più bassi poiché il gruppo amminico carico positivamente stabilizza elettrostaticamente il gruppo COO− rendendo, di fatto, più semplice al gruppo carbossilico la perdita del protone. Analogamente, i valori di pK dei gruppi α-amminici sono compresi tra 7,5 e 8,5. Negli amminoacidi liberi i valori di pK diventano più elevati a causa della tendenza a sequestrare elettroni del gruppo carbossilico vicino, che rende quindi più difficile al gruppo amminico la deprotonazione. La struttura tridimensionale ripiegata di una catena polipeptidica può portare catene laterali polari e le estremità N- e C-terminali a stretto contatto; le interazioni elettrostatiche risultanti tra questi gruppi possono alterarne i valori di pK anche di svariate unità di pH rispetto ai valori dei corrispondenti amminoacidi liberi. Per questo motivo, il pI di un polipeptide, che è una funzione dei valori di pK dei suoi molti gruppi ionizzabili, non è facilmente prevedibile ed è solitamente determinato sperimentalmente. pI

Ð ESEMPIO DI CALCOLO 4.1

Calcolate il punto isoelettrico dell’acido aspartico. Nella forma neutra, il gruppo α-carbossilico è deprotonato e il gruppo α-amminico è protonato. La protonazione del gruppo α-carbossilico o la deprotonazione del gruppo β-carbossilico dovrebbero entrambe generare specie cariche. Quindi, i valori delle pK di questi gruppi (1,99 e 3,90; vedi la Tabella 4.1) possono essere utilizzati nell’equazione 4.1: pI = (pKi + pKj)/2 = (1,99 + 3,90)/2 = 2,94

E I nomi degli amminoacidi sono abbreviati Le abbreviazioni a tre lettere fornite nella Tabella 4.1 per i 20 amminoacidi standard sono ampiamente utilizzate nella letteratura biochimica; la maggior parte di esse deriva dalle prime tre lettere del nome dell’amminoacido corrispondente e si pronuncia così come è scritta. Glx indica Glu o Gln; analogamente, Asx denota Asp o Asn. Tale ambiguità di simboli deriva dall’esperienza di laboratorio: Asn e Gln, nelle condizioni acide o basiche spesso impiegate per recuperarle dalle proteine, sono facilmente idrolizzate ad Asp e Glu. Senza fare uso di precauzioni particolari, è impossibile stabilire se un Glu identificato in queste condizioni fosse originariamente Glu o Gln; lo stesso vale per Asp e Asn. Nella Tabella 4.1 sono riportati anche i simboli a una lettera degli amminoacidi; questo sistema più sintetico è usato sovente quando si raffrontano le sequenze amminoacidiche di più proteine analoghe. Si noti che di solito il simbolo a una lettera equivale alla prima lettera del nome dell’amminoacido; tuttavia, per quei residui che hanno la prima lettera uguale, questa regola vale solo per quello più abbondante. Nei polipeptidi i residui amminoacidici sono denominati eliminando il suffisso, in genere -ina, nel nome dell’amminoacido e sostituendolo con -ile. Le

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

O

H NH

H

Cα C

O

Cα C

NH

H 2Cβ

H 2Cβ

H 2Cγ

H 2Cγ

Figura 4.8 Nomenclatura degli

COO–

H 2Cδ

amminoacidi con lettere greche. Agli atomi di carbonio sono assegnate in sequenza le lettere dell’alfabeto greco, a iniziare da quello adiacente al gruppo carbonilico.

H 2Cε +

NH3 Lys

93

Glu

catene polipeptidiche sono descritte iniziando dall’N-terminale e proseguendo in direzione del C-terminale. L’amminoacido situato all’estremità carbossilica mantiene il suo nome originale; pertanto, il composto OH

COO– CH3 + H3N

C

C

H

O

Ala

H

CH2

N

C

C

H

O

Tyr

H

CH2

N

C

C

H

O

Asp

H

H

N

C

COO–

H Gly

è la alaniltirosilaspartilglicina. È ovvio che dare un nome a catene polipeptidiche composte da un numero abbastanza cospicuo di residui è estremamente scomodo; il tetrapeptide usato come esempio può essere anche scritto Ala-Tyr-Asp-Gly, usando il codice a tre lettere, oppure AYDG avvalendosi dei simboli a una lettera. I vari atomi delle catene amminoacidiche laterali sono spesso indicati in sequenza impiegando lettere dell’alfabeto greco, a partire dall’atomo di carbonio adiacente al gruppo carbonilico del peptide. Come mostrato nella Figura 4.8, si dice che il residuo di Lys possiede un gruppo ε-amminico, mentre Glu ha un gruppo γ-carbossilico. Purtroppo tale sistema di classificazione si rivela ambiguo per numerosi amminoacidi; di conseguenza, ci si avvale pure degli schemi di numerazione convenzionali per le molecole organiche (indicati nella Tabella 4.1 per le catene laterali eterocicliche).

2 La stereochimica CONCETTI CHIAVE

• Gli amminoacidi, come molti altri composti biologici, sono molecole chirali la cui configurazione può essere rappresentata con le proiezioni di Fischer.

• Gli amminoacidi, nelle proteine, hanno tutti la configurazione stereochimica l. Con l’eccezione della glicina, tutti gli amminoacidi presenti nei polipeptidi naturali sono otticamente attivi, vale a dire che ruotano il piano della luce polarizzata. La direzione e l’angolo di rotazione possono essere misurati usando uno strumento noto come polarimetro (Figura 4.9). Le molecole otticamente attive sono asimmetriche, cioè non sono sovrapponibili alla loro immagine speculare, come la mano sinistra non si può sovrapporre alla sua immagine speculare, la mano destra. Questa situazione è caratteristica delle sostanze contenenti atomi di carbonio tetraedrico che possiedono quattro

PUNTO DI VERIFICA

• Disegnate un amminoacido generico e identificate il carbonio α e i suoi sostituenti.

• Disegnate le strutture dei 20 amminoacidi standard e attribuitegli le corrette denominazioni abbreviate a una e tre lettere.

• Disegnate il tripeptide Cys-Gly-Asn. Identificatene i legami peptidici e le estremità N- e C-terminali. Determinatene poi la carica netta a pH neutro.

• Classificate i 20 amminoacidi standard a seconda della polarità, della struttura, del tipo di gruppo funzionale e delle proprietà acido-base.

• Perché i valori di pK dei gruppi ionizzabili sono diversi negli amminoacidi liberi rispetto a quelli dei residui amminoacidici nei polipeptidi?

CAPITOLO 4

94

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

+

Analizzatore (può ruotare)





+90°

Scala graduata (fissa)

–90° 180°

Tubo polarimetrico Polarizzatore fisso Sorgente di luce

La sostanza otticamente attiva presente nella soluzione del tubo determina una rotazione del piano della luce polarizzata

Figura 4.9 Rappresentazione

schematica di un polarimetro. Tale dispositivo è impiegato per misurare la rotazione ottica.

Cl H

C

F Br

Cl F

Il piano di polarizzazione della luce emergente non è equivalente a quello della luce polarizzata incidente

C

H

Br

Piano dello specchio Figura 4.10 I due enantiomeri del fluoroclorobromometano. I quattro sostituenti sono disposti secondo un tetraedro intorno all’atomo di carbonio centrale. Una linea tratteggiata indica che il sostituente giace sotto il piano del foglio di carta, mentre una linea a forma di cuneo indica che esso è situato sopra tale piano; infine, una linea continua sottile mostra che il sostituente giace sul piano del foglio. Il piano dello specchio, che mette in relazione gli enantiomeri, è rappresentato dalla linea tratteggiata verticale in rosso.

sostituenti differenti. Per esempio, le due molecole rappresentate nella Figura 4.10 non sono sovrapponibili dal momento che sono immagini speculari; i loro atomi centrali sono noti come centri asimmetrici o centri chirali e presentano la proprietà della chiralità (dal greco cheirós, “mano”). Gli atomi di Cα degli amminoacidi (eccettuata la glicina) sono centri asimmetrici. La glicina possiede due atomi di H uniti al suo atomo di Cα, è quindi sovrapponibile alla propria immagine speculare e non è otticamente attiva. Molte molecole biologiche contengono uno o più centri chirali.

Le molecole che sono immagini speculari non sovrapponibili l’una dell’altra sono note come enantiomeri. Le molecole enantiomeriche risultano indistinguibili dal punto di vista fisico e chimico con la maggior parte delle tecniche disponibili; solo quando sono analizzate asimmetricamente, per esempio mediante rotazione del piano della luce polarizzata o per mezzo di reagenti contenenti anch’essi centri chirali, è possibile distinguerle o manipolarle in modo differenziale. Sembra che non esista una relazione chiara tra la struttura di una molecola e l’angolo o la direzione di rotazione del piano della luce polarizzata. Per esempio, la leucina isolata dalle proteine ruota la luce polarizzata di 10,4° verso sinistra, mentre l’arginina la ruota di 12,5° verso destra (gli enantiomeri di questi composti ruotano la luce polarizzata di un uguale angolo, ma in direzioni opposte). Non è dunque possibile prevedere la rotazione ottica partendo dalla struttura di una molecola o derivare la configurazione assoluta (la disposizione spaziale) di gruppi chimici intorno a un centro chirale basandosi su misurazioni di rotazione ottica. I centri chirali danno origine agli enantiomeri.

La convenzione di Fischer descrive la configurazione dei centri asimmetrici.

Per descrivere le forme differenti delle molecole chirali, i biochimici utilizzano in genere la convenzione di Fischer. Con questo sistema la configurazione dei gruppi intorno a un centro asimmetrico è confrontata con quella della gliceraldeide, una molecola che contiene un centro chiralico. Nel 1891 Emil Fischer propose che gli isomeri spaziali, o stereoisomeri, della gliceraldeide fossero designati d-gliceraldeide e l-gliceraldeide (Figura 4.11). Il prefisso l (si noti l’impiego della lettera in maiuscoletto) significa rotazione della luce polarizzata verso sinistra (dal greco levo, “sinistra”), mentre d indica rotazione verso destra (dal greco dextro, “destro”) da parte delle due forme della gliceraldeide. Lo scienziato assegnò i prefissi alle strutture illustrate nella Figura 4.11 senza sapere effettivamente se quella a sinistra e quella a destra fossero, rispettivamente, levogira o

CAPITOLO 4

Figura 4.11 La convenzione di Fischer. Gli enantiomeri della gliceraldeide sono illustrati

Formule geometriche

come formule geometriche (in alto) e come proiezioni di Fischer (in basso). In una proiezione di Fischer le linee orizzontali rappresentano legami che si estendono sopra il piano della pagina, mentre quelle verticali indicano legami che si estendono al di sotto di esso (in alcune proiezioni di Fischer l’atomo di carbonio chirale centrale non è mostrato esplicitamente).

CHO

CHO HO

C

H

H

CH2OH

Disegnate la proiezione di Fisher dei due enantiomeri dell’alanina o, in alternativa, utilizzate un kit per la costruzione dei modelli molecolari per dimostrare che i due isomeri sono immagini speculari non sovrapponibili.

Proiezione di Fischer

HO

destrogira; solo nel 1949 furono compiuti esperimenti che confermarono che la scelta di Fischer era stata realmente corretta. Egli propose altresì un modo abbreviato per riferirsi alle configurazioni molecolari, noto come proiezioni di Fischer, anch’esse riportate nella Figura 4.11. Secondo questa convenzione, i legami orizzontali si estendono sopra il piano del foglio, mentre quelli verticali si estendono sotto il piano del foglio. La configurazione dei gruppi che circondano un qualsiasi centro chirale può essere posta in relazione a quella della gliceraldeide convertendo chimicamente questi gruppi in quelli della gliceraldeide; per gli α-amminoacidi, i gruppi amminico, carbossilico, R e H intorno all’atomo di Cα corrispondono, rispettivamente, ai gruppi ossidrilico, aldeidico, CH2OH e H della gliceraldeide. COO–

CHO C

H

CH2OH L-Gliceraldeide

+ H3N

C

H

R L-a-Amminoacido

Perciò si dice che la l-gliceraldeide e gli l-α-amminoacidi possiedono la medesima configurazione relativa. Ogni amminoacido derivato dalle proteine è nella configurazione stereochimica l; ciò significa che tutti mostrano la stessa configurazione relativa intorno ai loro atomi di Cα. Ovviamente, indicare un amminoacido con l o d non ne sottolinea la capacità di ruotare il piano della luce polarizzata; numerosi l-amminoacidi sono destrogiri. Il sistema di Fischer presenta alcuni inconvenienti, in particolare per le molecole dotate di più centri asimmetrici; ciascuno di questi può avere due configurazioni possibili, così una molecola con n centri chirali possiederà 2n possibili differenti stereoisomeri. La treonina e l’isoleucina, per esempio, hanno ciascuna due atomi di carbonio chirali, e quindi ognuna possiede quattro stereoisomeri, o due coppie di enantiomeri. [Gli enantiomeri (immagini speculari) delle forme l sono le forme d.] Per la maggior parte degli scopi, il sistema di Fischer fornisce una descrizione adeguata delle molecole biologiche; talvolta però i biochimici fanno uso di una nomenclatura più accurata (Scheda 4.2).

SCHEDA 4.2

OH

C

CH2OH

CHO

CHO

HO

95

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

C

H

H

CH2OH

C

OH

CH2OH

Piano dello specchio L-Gliceraldeide

D-Gliceraldeide

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Il sistema RS

Nel 1956 Robert Cahn, Christopher Ingold e Vladimir Prelog idearono un sistema atto a descrivere in modo inequivocabile le configurazioni delle molecole con più di un centro asimmetrico. Nel sistema di Cahn-IngoldPrelog o RS, i quattro gruppi che circondano un centro chirale sono classificati secondo uno schema di priorità specifico quantunque arbitrario: si considerano per primi gli atomi con numero atomico superiore rispetto a quelli con numero atomico più basso (per esempio, −OH viene prima di −CH3). Se però i primi sostituenti atomici sono uguali, allora la priorità è assegnata in base all’atomo successivo esterno rispetto al centro chirale (per esempio, −CH2OH precede −CH3). L’ordine di priorità relativo ad alcuni gruppi funzionali comuni è SH > OH > NH2 > COOH > CHO > CH2OH > C6H5 > CH3 > H Ai gruppi con priorità decrescente sono assegnate le lettere W, X, Y, Z, in modo che il loro ordine di assegnazione di priorità sia W > X > Y > Z. Al fine di stabilire la configurazione del centro chirale, si osserva il centro di asimmetria a partire dal gruppo Z (a priorità più bassa); se l’ordine dei gruppi W n X n Y è in senso orario, la configurazione è denominata R (dal latino rectus, “destro”), mentre se è in senso antiorario è definita S (dal latino sinistrus, “sinistro”). La l-gliceraldeide è (S)-gliceraldeide perché i tre gruppi a priorità più alta sono disposti in senso antiorario quando l’atomo di H (linee tratteggiate) è posizionato dietro l’atomo di C chirale (circoletto a linea continua). CHO(X)

CHO HO

C

H

CH2OH L-Gliceraldeide

q

H (Z)

OH (W)

CH2OH (Y) (S)-Gliceraldeide

Tutti gli l-amminoacidi presenti nelle proteine sono (S)-amminoacidi a eccezione della cisteina, che è (R)-cisteina dato che lo zolfo della sua catena laterale ne aumenta la priorità. Altri composti strettamente correlati che hanno la medesima designazione secondo la convenzione dl di Fischer possono mostrare rappresentazioni differenti con il sistema RS. Quest’ultimo si rivela utile in particolare per descrivere le chiralità di composti dotati di centri asimmetrici multipli; di conseguenza, la l-treonina può essere chiamata pure (2S,3R)-treonina.

96

CAPITOLO 4

Gli amminoacidi

© 978-88-08-42096-1

Consideriamo l’ordinaria sintesi chimica di una molecola chirale, che genera una miscela racemica (che contiene quantità equivalenti di ciascun enantiomero); al fine di ottenere un prodotto con asimmetria netta, è necessario fare uso di un processo chirale. Una delle caratteristiche più sorprendenti della vita è la produzione di molecole otticamente attive; i processi biosintetici danno luogo quasi invariabilmente a stereoisomeri puri. Il fatto che i residui amminoacidici delle proteine siano tutti in configurazione l costituisce solo un esempio di tale fenomeno; inoltre, dal momento che la gran parte delle molecole biologiche è di tipo chirale, una data molecola, presente in una singola forma enantiomerica, si legherà a un unico enantiomero di un altro composto o reagirà esclusivamente con questo. Per esempio, una molecola proteica costituita da residui di l-amminoacidi che reagisce con un particolare l-amminoacido, non lo fa prontamente con la sua forma d. Una proteina composta solo dai residui di d-amminoacidi reagisce prontamente solo con il corrispondente d-amminoacido. I residui d-amminoacidici fanno parte di alcuni polipeptidi batterici relativamente piccoli ( 0, allora è la trasformazione inversa che ‡ cat

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

X‡ Non catalizzata

G

‡ ∆∆Gcat (riduzione del ∆G‡ da parte del catalizzatore)

351

Figura 11.7 Effetto di un catalizzatore sul diagramma dello stato di transizione di una reazione. Qui ∆∆G‡cat = ∆G‡(non cat) – ∆G‡(cat).

Il catalizzatore influenza il ∆Greazione?

Catalizzata A+B A+B

P+Q

P+Q

Coordinata di reazione

avviene spontaneamente. Un enzima non può alterare ∆Greazione, ma è in grado di diminuire il valore di ∆G‡ in modo da consentire alla reazione di raggiungere l’equilibrio (dove le velocità delle reazioni diretta e inversa si equivalgono) con rapidità maggiore di quanto non avviene in assenza di catalizzatore. L’effettiva velocità con cui i reagenti sono convertiti nei prodotti è sottoposta ai principi della cinetica chimica (Paragrafo 12.1).

3 I meccanismi di catalisi CONCETTI CHIAVE

• Le catene laterali degli amminoacidi che sono in grado di donare o accettare protoni possono prendere parte alle reazioni chimiche come catalizzatori acidi o basici.

• I gruppi nucleofilici possono catalizzare le reazioni tramite la formazione di legami covalenti transitori con il substrato.

• Nella catalisi da ioni metallici, le proprietà elettroniche tipiche dello ione metallico favoriscono la reazione.

• Gli enzimi accelerano le reazioni avvicinando i gruppi reagenti e orientandoli correttamente.

• La stabilizzazione dello stato di transizione può diminuire significativamente l’energia di attivazione di una reazione.

Gli enzimi incrementano enormemente la velocità delle loro reazioni utilizzando gli stessi meccanismi di catalisi impiegati dai catalizzatori chimici. Gli enzimi sono stati semplicemente meglio “modellati” nel corso dell’evoluzione. Come gli altri catalizzatori, gli enzimi riducono l’energia libera dello stato di transizione (∆G‡), cioè stabilizzano lo stato di transizione della reazione catalizzata. I catalizzatori sono così efficaci per la loro specificità di legame del substrato, combinata con la disposizione dei loro gruppi catalitici. Come vedremo in seguito, la distinzione tra gruppi di legame al substrato e gruppi catalitici è in qualche misura arbitraria. I tipi di meccanismi di catalisi impiegati dagli enzimi sono stati classificati come:

1. 2. 3. 4. 5.

catalisi acido-base catalisi covalente catalisi da metalli effetti di vicinanza e orientamento legame preferenziale del complesso dello stato di transizione

In questo paragrafo prenderemo in considerazione, uno per volta, ognuno di questi cinque meccanismi enzimatici. È possibile comprendere meglio i meccanismi della catalisi enzimatica analizzando le corrispondenti reazioni di

PUNTO DI VERIFICA

• Disegnate e identificate le varie parti dei diagrammi di transizione di stato di una reazione con e senza il catalizzatore.

• Qual è la correlazione tra ∆G e ∆G‡?

352

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

SCHEDA 11.1

© 978-88-08-42096-1

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Illustrazione dei meccanismi di reazione Per comprendere i meccanismi di reazione talvolta è sufficiente disegnare le strutture dei reagenti e dei prodotti, ma spesso è necessario conoscere come vengono riposizionati gli elettroni e come vengono scissi e poi riformati i legami covalenti. I biochimici utilizzano la convenzione delle frecce curve per descrivere i riordinamenti delle coppie elettroniche che si osservano durante una reazione. Anche se in biochimica avvengono reazioni in cui è interessato un singolo elettrone, noi ci focalizzeremo sulle reazioni più comuni, cioè su quelle in cui sono coinvolte coppie di elettroni. Il movimento di una coppia di elettroni (che può essere o una coppia di elettroni non condivisi oppure una coppia che forma un legame covalente) è indicato simbolicamente per mezzo di una freccia curva che parte dalla coppia elettronica per puntare verso il gruppo o atomo povero di elettroni che attrae la coppia. Per esempio, la scissione di un legame è rappresentata nel modo seguente: X

X+

Y

Y–

+

mentre la formazione di un legame si indica:

+ SY –

X+

X

Y

Un esempio di una reazione molto più complessa che richiede l’utilizzo di molte frecce curve è rappresentato dalla formazione di una immina (base di Schiff), una reazione tra un’ammina e un’aldeide o un chetone che riveste rilevanza biochimica considerevole: H R

NS H

Ammina

H

R9 C

O

R0 Aldeide o chetone

R

Nella prima tappa della reazione, la coppia di elettroni non condivisi dell’azoto amminico va ad attaccare il carbonio carbonilico povero di elettroni. Contemporaneamente, una coppia elettronica si trasferisce dal suo doppio legame C=O all’atomo di ossigeno. Durante la seconda tappa di tautomerizzazione (che consiste nello spostamento di un atomo di idrogeno) la coppia di elettroni non condivisi sull’atomo di azoto attacca l’atomo di carbonio povero di elettroni con l’eliminazione di uno ione idrossido. L’acquisizione di un minimo di familiarità con le elettronegatività relative degli atomi O > N >> C ≈ H può essere utile nel predire i movimenti degli elettroni, in quanto gli elettroni – sia quelli dei legami covalenti sia quelli delle coppie isolate – tendono a muoversi dagli atomi meno elettronegativi verso gli atomi più elettronegativi. Disegnare le coppie isolate di elettroni come puntini può aiutare a identificare gli atomi ricchi di elettroni e quelli poveri di elettroni. Inoltre, in ogni momento si applicano al sistema le regole delle reazioni chimiche; per esempio, un atomo di carbonio non presenta mai cinque legami, così come non si osservano mai due legami che coinvolgono un atomo di idrogeno.

H

R9

N+

C

H

R0



O

tautomerizzazione

R

N

O

R9 C

H OH

R0

Carbinolammina intermedia

R

+ N

R9

+

C

OH



R0

Immina (base di Schiff)

composti modello in assenza di enzimi. Entrambi i tipi di trasformazioni chimiche possono essere descritti facendo uso delle convenzioni riportate nella Scheda 11.1.

A La catalisi acido-base avviene per trasferimento protonico La catalisi acida generale è un processo in cui il trasferimento di protoni da un acido abbassa l’energia libera dello stato di transizione di una reazione. Per esempio, una reazione di tautomerizzazione cheto-enolica non catalizzata procede piuttosto lentamente a causa dell’elevata energia libera del suo stato di transizione, che presenta struttura simile a un carbanione (Figura 11.8a; lo stato di transizione è disegnato in parentesi quadre per indicarne l’instabilità). La donazione di un protone all’atomo di ossigeno (Figura 11.8b), tuttavia, riduce il carattere di carbanione dello stato di transizione, accelerando in tal modo la reazione. Una reazione può essere altresì stimolata mediante catalisi basica generale se la sua velocità viene aumentata mediante rimozione di protoni da parte di una base (per esempio, Figura 11.8c). Alcune reazioni possono essere soggette a entrambi i processi contemporaneamente; si tratta delle reazioni con catalisi acido-base concertata. Molti tipi di reazioni biochimiche possono andare incontro a catalisi acida e/o basica. Le catene laterali dei residui amminoacidici di Asp, Glu, His, Cys, Tyr e Lys presentano valori di pK che rientrano, o che si avvicinano, ai valori

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

Stato di transizione

R (a)

C

R O

H

R

(c)



O

+

H

A

C

O

H

H δ+

R

R

H

+ ..

B

H

O

H

R δ–

δ+

H

δ–

A

C

δ–

O

O

CH2

R

CH 2

CH2

C

δ+

CH2

C



– CH δ2

H

C

R

C

CH2

(b)

Forma enolica

H+

+

A– H2O

CH2 H

A

+

OH –

R δ–

C

O

– CH δ2

H

δ+

δ+

B

Figura 11.8 Meccanismi di tautomerizzazione cheto-enolica. (a) Non catalizzata. (b) Mediata dalla catalisi acida generale. (c) Mediata dalla catalisi basica generale. L’acido è indicato

C H+

O

H

CH2

+

H

H+

B+

B

+ ..

Forma chetonica

353

schematicamente con H–A, la base con O B , mentre δ indica una carica parziale, negativa o positiva.

di pH fisiologici (Tabella 4.1), il che consente loro di agire da catalizzatori acidi e/o basici. La capacità degli enzimi di disporre svariati gruppi catalitici intorno ai loro substrati rende la catalisi acido-base concertata un meccanismo enzimatico comune. L’attività catalitica di tali enzimi è sensibile al pH, dato che quest’ultimo influenza lo stato di protonazione delle catene laterali a livello del sito attivo (Scheda 11.2). La RNasi A è un catalizzatore acido-base. La ribonucleasi A (RNasi A) di pan-

creas bovino costituisce un esempio di catalisi acido-base enzimatica. Questo enzima digestivo (Figura 11.9) è secreto dal pancreas nell’intestino tenue, dove determina l’idrolisi dell’RNA nei suoi nucleotidi liberi. L’isolamento di nucleotidi 2′,3′-ciclici durante la digestione di RNA con RNasi A indica che la reazione idrolitica procede con la formazione di questi nucleotidi intermedi (Figura 11.10), mentre la dipendenza dal pH della velocità della reazione della RNasi A suggerisce il coinvolgimento di due residui ionizzabili con valori di pK intorno a 5,4 e a 6,4. Questi dati, unitamente a indagini di derivatizzazione chimica e a studi ai raggi X, hanno permesso di stabilire che la RNasi A possiede due residui essenziali di His, His 12 e His 119, che agiscono all’unisono come catalizzatori generali acido-base. La reazione catalizzata dall’RNasi è un processo in due tappe (Figura 11.10). 1. His 12 si comporta da base generale e sottrae un protone da un gruppo 2′OH dell’RNA, promuovendone così l’attacco nucleofilico sull’atomo di fosforo adiacente. L’His 119 svolge la funzione di acido generale e favorisce la scissione del legame protonando il gruppo uscente. 2. Dopo l’allontanamento del gruppo uscente, l’acqua entra nel sito attivo e l’intermedio 2′,3′-ciclico viene idrolizzato attraverso un meccanismo che è essenzialmente l’inverso della prima tappa. Quindi l’His 12 ora agisce da acido generale e l’His 119 da base generale per generare l’RNA idrolizzato e l’enzima nel suo stato originale.

354

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

SCHEDA 11.2

© 978-88-08-42096-1

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Gli effetti del pH sullÕattivitˆ enzimatica

Velocitˆ

La maggior parte degli enzimi è attiva solo in un ristretto intervallo di pH, di solito tra 5 e 9. Questo dipende dall’effetto del pH su una combinazione di fattori: (1) il legame del substrato all’enzima, (2) gli stati di ionizzazione dei residui amminoacidici coinvolti nell’attività catalitica dell’enzima, (3) la ionizzazione del substrato e (4) la modificazione della struttura della proteina (che di solito è significativa a valori estremi di pH). Le curve di numerose reazioni enzimatiche hanno un andamento a campana dipendente dal pH. Per esempio, la dipendenza dal pH della velocità della reazione catalizzata dalla fumarasi (Paragrafo 17.3G) genera la curva mostrata nella figura seguente:

0

5

6

7 pH

8

9

[Figura adattata da Tanford, C. (1961). Physical Chemistry of Macromolecules. Wiley, p. 647.]

Questi andamenti riflettono la ionizzazione di determinati residui amminoacidici che devono trovarsi in uno specifico stato di ionizzazione ai fini dell’attività enzimatica. I valori osservati di pK (i punti di flesso della curva) forniscono sovente indizi preziosi per identificare i residui amminoacidici essenziali all’attività enzimatica. Per esempio, un pK osservato di ∼4 indica che un residuo di Asp o di Glu è essenziale per l’enzima; analogamente, un pK di ∼6 o di ∼10 suggerisce la partecipazione, rispettivamente, di un residuo di His o di uno di Lys. Tuttavia il pK di un dato gruppo acido-base può variare anche di diverse unità di pH rispetto al suo valore, a seconda del microambiente in cui si trova (per esempio, un residuo di Asp in un ambiente non polare oppure in vicinanza di un altro residuo di Asp attrae i protoni più fortemente e dunque presenta un pK più elevato). Gli effetti del pH sulla velocità di una reazione enzimatica possono rispecchiare anche la denaturazione dell’enzima oltre che la protonazione o deprotonazione di specifici residui catalitici. La sostituzione di un particolare residuo mediante mutagenesi sito-diretta o i confronti di varianti enzimatiche generate dall’evoluzione costituiscono un approccio molto più affidabile allo scopo di identificare i residui necessari per il legame del substrato o la catalisi. Oltre al pH, la catalisi enzimatica può essere influenzata anche da altri fattori ambientali quali temperatura e concentrazione salina. Il risultato di queste perturbazioni è visibile in una curva di attività a campana, proprio come accade variando il valore di pH della soluzione in cui avviene la reazione. Le condizioni ottimali (corrispondenti al picco della curva di attività) spesso corrispondono alle condizioni ambientali a cui solitamente è esposta una cellula o un organismo, indicando che l’evoluzione ha messo a punto gli enzimi per renderli massimamente efficienti.

Figura 11.9 Struttura ai raggi X della RNasi S di pancreas bovino. Un analogo non idrolizzabile del substrato, il dinucleotide fosfonato UpcA (in rosso), è legato nel sito attivo. La RNasi S è una forma cataliticamente attiva della RNasi A, in cui il legame peptidico tra i residui 20 e 21 è stato idrolizzato. [Illustrazione, Irving Geis/Irving Geis Collection/Howard Hughes Medical Institute. Riproduzione soggetta ad autorizzazione.]

B La catalisi covalente richiede un nucleofilo La catalisi covalente aumenta la velocità di reazione attraverso la formazione temporanea di un legame covalente tra il catalizzatore e il substrato. Di solito questo legame si forma mediante la reazione di un gruppo nucleofilico presente sul catalizzatore con un gruppo elettrofilico del substrato; in qualche caso il proceso viene detto anche catalisi nucleofilica. La decarbossilazione dell’acetoacetato, catalizzata chimicamente dalle ammine primarie, è un esempio di questo pro-

CAPITOLO 11

355

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

SCHEMA DI PROCESSO

–O

RNA 59

O

P

CH2 O

49

O

H

H

H 29

39

H

H

H

–O

N +

1

NH

N

P

O

O

H2O

H

H

O

OH

P

CH2 O H

Base

H

H

O

O H

–O

Base

HO

O

CH2 O H

...

–O

H

O

OH

P

N+

NH

O H

H

Base

H

H

P O

H

O

N H

O –O

His 12

CH2 O

O

P O

His 119

19

H

O

O –O

Base

Nucleotide 29,39-ciclico

S

O

...

...

Per promuovere l’attacco nucleofilico e la scissione del legame, l’His 12 agisce da base generale e l’His 119 da acido generale.

N

H

N H

O

...

O

...

Per promuovere l’idrolisi, l’His 12 2 agisce da acido generale e l’His 119 da base generale.

O –O

P

O

O

CH2 O H –O

Base

H

H

O

O

P

O

O

H

H H

SN

H N+ Figura 11.10 Meccanismo della RNasi A. L’idrolisi dell’RNA catalizzata dalla RNasi A di pancreas bovino è un processo bifasico con la formazione di un intermedio nucleotidico 2’,3’-ciclico.

N H

Assegnate un valore di pK (5,4 o 6,4) a ciascun residuo di His.

cesso (Figura 11.11). Nella prima fase di questa reazione, l’ammina, un nucleofilo, attacca il gruppo carbonilico dell’acetoacetato per dare origine a una base di Schiff (un legame amminico; la stessa reazione mostrata nella Scheda 11.1): H

H N

O

+

C

O

N

O

H

SB

H

A

C

OH

H + N

C

+

Base di Schiff (immina)

OH –

NH

CAPITOLO 11

356

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

Figura 11.11 Decarbossilazione dell’acetoacetato. Il meccanismo della reazione non catalizzata è mostrato in alto, mentre quello catalizzato da ammine primarie è in basso.

O CH3

C

O CH2

CO2

+ H

–O

C

CH3

C

CH2

O CH3

C

CH3

O– Acetoacetato RNH2

OH⫺

R CH3

Acetone

Enolato

⫹ N C

RNH2

H O CH2

R

CO2

..

Aggiungete delle frecce curve per descrivere i movimenti degli elettroni nei passaggi rappresentati dalle frecce verticali.

H

N

C

CH3

C

H+

CH2

OH⫺ R

CH3

⫹ N C

H CH3

O– Base di Schiff (immina)

L’atomo di azoto protonato dell’intermedio covalente agisce come una “trappola” per gli elettroni (Figura 11.11, in basso) allo scopo di ridurre il carattere di enolato ad alta energia dello stato di transizione. La formazione e la decomposizione della base di Schiff avvengono in maniera piuttosto rapida e quindi questa non è la tappa che limita la velocità di questa reazione. La catalisi covalente può essere suddivisa in tre fasi. 1. La reazione nucleofilica tra il catalizzatore e il substrato con formazione di un legame covalente. 2. La sottrazione di elettroni dal centro di reazione da parte del catalizzatore che diventa un elettrofilo. 3. La liberazione del catalizzatore nel corso di una reazione che è essenzialmente l’inverso della fase 1.

Figura 11.12 Gruppi nucleofilici ed elettrofilici di rilevanza biologica. (a) Gruppi nucleofilici come quelli ossidrilici, sulfidrilici, amminici e imidazolici sono nucleofili nelle loro forme basiche. (b) I gruppi elettrofilici contengono un atomo povero di elettroni (in rosso).

La nucleofilicità di una sostanza è in stretta correlazione con la sua basicità. In effetti, il meccanismo della catalisi nucleofilica ricorda quello della catalisi basica, eccetto che non viene rimosso un protone dal substrato, ma si ha un attacco nucleofilico su quest’ultimo da parte del catalizzatore con formazione di un legame covalente. I nucleofili rilevanti sotto il profilo biologico sono carichi negativamente oppure contengono coppie elettroniche non condivise che formano facilmente legami covalenti con gruppi poveri di elettroni (Figura 11.12a). Al contrario, gli elettrofili sono composti da gruppi carichi positivamente, con

Identificate le catene laterali degli amminoacidi che includono i nucleofili e gli elettrofili riportati nella figura.

(b) Elettrofili

(a) Nucleofili

H1

ROH Q O

Forma nucleofila 2 RO QS O

1

H1 Gruppo ossidrilico

RSH Q O

2 RS QS O

1

H1 Gruppo sulfidrilico

1

RNH 3

RNH O 2

HN

NH

1

H

1

H1 Gruppo imidazolico

Gruppo amminico

n1

Ioni metallici

R C

O

Atomo di carbonio carbonilico

C

1 NH

Immina cationica (base di Schiff)

R9

R

R 1

1

M

Protoni

HN

NS

R

R9

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

strati elettronici di valenza incompleti o contenenti un atomo elettronegativo (Figura 11.12b). Un aspetto importante della catalisi covalente risiede nel fatto che quanto maggiore è la stabilità del legame covalente formatosi, tanto minore è la facilità con cui esso tende a rompersi nelle fasi conclusive della reazione. Un catalizzatore covalente soddisfacente deve quindi combinare le proprietà apparentemente contrastanti di una elevata nucleofilicità con la capacità di formare un buon gruppo uscente, cioè di invertire facilmente la fase di formazione del legame covalente. Gruppi a elevata polarizzabilità (con elettroni altamente mobili), come per esempio l’imidazolo e il gruppo tiolico, hanno queste caratteristiche e pertanto sono eccellenti catalizzatori covalenti. Nelle proteine i gruppi funzionali che agiscono in questo modo comprendono il gruppo ε-amminico non protonato della Lys, il gruppo imidazolico della His, il gruppo tiolico della Cys, il gruppo carbossilico dell’Asp e il gruppo ossidrilico della Ser. Anche alcuni coenzimi, come la tiamina pirofosfato (Paragrafo 15.3B) e il piridossalfosfato (Paragrafo 21.2A), agiscono in associazione con i propri apoenzimi in qualità di catalizzatori covalenti. L’ampia gamma di intermedi di reazione enzima-substrato uniti per via covalente che sono stati fino a ora isolati dai ricercatori dimostra che gli enzimi fanno comunemente uso di meccanismi a catalisi covalente.

C Gli ioni metallici agiscono da catalizzatori Quasi un terzo di tutti gli enzimi noti richiede la presenza di ioni metallici per svolgere la propria attività catalitica. Questo gruppo di enzimi comprende i metalloenzimi, contenenti in qualità di cofattori ioni metallici legati saldamente; nei casi più diffusi gli ioni metallici derivano da elementi di transizione come per esempio Fe2+, Fe3+, Cu2+, Mn2+ o Co2+. Questi ioni metallici cataliticamente essenziali si differenziano da Na+, K+ o Ca2+, che negli enzimi frequentemente hanno invece ruoli strutturali. Ioni come Mg2+ e Zn2+ possono svolgere funzioni strutturali o catalitiche. Gli ioni metallici prendono parte al processo di catalisi secondo tre modalità principali. 1. Legano i substrati per orientarli correttamente ai fini della reazione. 2. Mediano reazioni di ossidazione-riduzione attraverso modificazioni reversibili del loro stato di ossidazione. 3. Stabilizzano o schermano cariche di segno opposto.

In numerose reazioni catalizzate dagli ioni metallici, questi agiscono in modo analogo a un protone, neutralizzando una carica negativa. Gli ioni metallici sono molto spesso catalizzatori molto più efficaci dei protoni, in quanto possono essere presenti in concentrazioni elevate a pH neutro (a cui la [H+] = 10−7 M) e possedere cariche superiori a +1. Inoltre, la carica di uno ione metallico rende le molecole d’acqua a esso legate più acide rispetto all’H2O libera, per cui queste diventano una fonte di ioni OH− nucleofilici, persino a pH neutro. Un esempio di tale fenomeno si osserva nel meccanismo catalitico dell’anidrasi carbonica (Scheda 2.2), un enzima ad ampia diffusione che catalizza la reazione + CO2 + H2O 34 HCO− 3 +H

L’anidrasi carbonica contiene uno ione Zn2+ essenziale, che in base alla struttura ai raggi X della proteina è situato nella porzione inferiore del sito attivo profondo 15 Å, dove è tetraedricamente coordinato da tre catene laterali di His, rimaste invariate nel corso dell’evoluzione (Figura 11.13a). Lo ione Zn2+ polarizza una molecola di acqua (non mostrata nella Figura 11.13a). Questa molecola di H2O polarizzata dallo ione Zn2+ si ionizza formando uno ione OH− che, a

357

358

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

(a)

(b) Im Im

Zn

2+

Im

O

Q

O–+ C O

H

Im Im

O

Zn2+

O

Im

H

C – O H2O

Im Im

Zn2+ Im

O O–

+

H+

+

O

H

C – O

H

Im = imidazolo

Figura 11.13 Ruolo dello ione Zn2+ nell’anidrasi carbonica umana. (a) Sito attivo dell’enzima umano. La catena polipeptidica è disegnata in forma di nastro (in oro) con le sue catene laterali mostrate con strutture a bastoncini e colorate secondo il tipo di atomo (con C in verde, N in blu e O in rosso). Lo ione Zn2+ (sfera azzurra) è legato alle catene laterali di tre residui di His e a uno ione HCO3–, che è rappresentato a sfere e bastoncini. Lo ione HCO3– stabilisce anche contatti di van der Waals (superficie ombreggiata) e legami idrogeno (linee grigie tratteggiate) con un residuo di Thr e uno di Glu. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da K.K. Kannan, Bhabha Atomic Research Center, Bombay, India. PDBid 1HCB.] (b) Reazione catalizzata dall’anidrasi carbonica. Im rappresenta il gruppo imidazolico dell’His.

sua volta, effettua un attacco nucleofilico su una molecola di CO2 convertendola in HCO− 3 (Figura 11.13b). Il protone prodotto nella reazione viene trasferito sulla superficie dell’enzima mediante una catalisi basica agevolata da un quarto residuo di His (His 64). Il sito catalitico dell’enzima viene quindi rigenerato grazie al legame e alla ionizzazione di un’altra molecola di H2O in corrispondenza dello ione Zn2+.

D La catalisi è favorita dalla vicinanza e dall’orientamento Sebbene gli enzimi sfruttino meccanismi catalitici simili a quelli delle reazioni organiche modello, la loro efficienza di catalisi è molto superiore. Questa efficienza catalitica dipende dalle specifiche condizioni fisiche in cui si trova il sito catalitico dell’enzima in cui avviene la corrispondente reazione chimica. Tra queste condizioni favorevoli vi sono la vicinanza e l’orientamento: una reazione avviene solo quando i reagenti entrano in contatto tra loro secondo una relazione spaziale corretta. Consideriamo la reazione bimolecolare che coinvolge l’imidazolo e il p-nitrofenilacetato. O

O CH3

C

O

NO2

_ O

+

C

CH3

NO2

N + p-Nitrofenilacetato

N O

p-Nitrofenolato

NH N-Acetilimidazolio

NH Imidazolo

Il progredire della reazione può essere monitorato valutando la comparsa dello ione p-nitrofenolato, di colore giallo intenso; la reazione correlata intramolecolare O

O

C

NO2

O

C

+

N+

N NH

NH

–O

NO2

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

359

si verifica con velocità circa 24 volte superiore. Di conseguenza, quando il catalizzatore imidazolo è legato covalentemente al reagente, la sua efficacia è 24 volte maggiore rispetto a quando si trova libero in soluzione. Questo aumento della velocità si deve a effetti di prossimità e di orientamento. Semplicemente legando i loro substrati, gli enzimi accelerano le reazioni che catalizzano in quattro modi.

1. Gli enzimi portano i substrati in contatto con i loro gruppi catalitici oppure tra di loro nelle reazioni che coinvolgono più di un substrato. Calcoli basati su sistemi modello indicano che la vicinanza dei gruppi reagenti può da sola aumentare la velocità di reazione fino a circa 5 volte. 2. Gli enzimi si legano ai loro substrati nell’orientamento corretto per la reazione. Le molecole non presentano reattività equivalente in tutte le direzioni, ma reagiscono con rapidità maggiore se sono disposte con un orientamento corretto. Per esempio, in una reazione SN2 (sostituzione nucleofilica bimolecolare), il modo migliore per il nucleofilo in entrata di attaccare il proprio bersaglio è nella direzione opposta a quella del legame del gruppo uscente (Figura 11.14). Se il contatto degli atomi che reagiscono devia anche di soli 10° rispetto a questa direzione ottimale, essi si mostrano significativamente meno reattivi. È stato stimato che un corretto orientamento dei substrati può determinare un aumento delle velocità di reazione di un fattore superiore a circa 100. Gli enzimi, come vedremo, allineano i propri substrati e gruppi catalitici in modo da rendere massima la reattività. 3. I gruppi carichi possono essere di ausilio nello stabilizzare lo stato di transizione della reazione, un fenomeno noto come catalisi elettrostatica. La distribuzione di carica intorno ai siti attivi degli enzimi può altresì guidare i substrati polari verso il loro sito di legame. 4. Gli enzimi “bloccano” i movimenti traslazionali e rotazionali dei loro substrati e dei gruppi catalitici. Si tratta di un aspetto determinante della catalisi poiché, nello stato di transizione, i gruppi reattivi hanno una mobilità molto limitata. Esperimenti condotti con composti modello indicano che questo effetto è in grado di promuovere incrementi della velocità superiori a circa 107. Portare i substrati e i gruppi catalitici in contatto con un orientamento corretto che favorisca la reazione comporta un aumento del loro ordine e quindi una diminuzione considerevole dell’entropia. L’energia libera richiesta per superare questa perdita di entropia proviene dall’energia di legame dei substrati all’enzima e contribuisce alla diminuzione del ∆∆G‡. Bisogna però considerare che gli enzimi sono molecole dinamiche che possono assumere una vasta gamma di confor-

Figura 11.14 Geometria di una reazione SN2. (1) Il nucleofilo che compie l’attacco, Y–, deve avvicinarsi all’atomo di C coordinato in modo tetraedrico e quindi con ibridazione sp3 nella direzione opposta a quella del suo legame con il gruppo uscente, X, un processo definito attacco dal retro. Nello stato di transizione della reazione, l’atomo di C assume una coordinazione a doppia piramide triangolare e dunque lo stato di ibridazione è sp2-p, con l’orbitale p (in blu) che dà origine a legami parziali con X e Y. I tre orbitali sp2 formano legami con gli altri tre sostituenti dell’atomo di C (R, R’ e R”), che si sono trasferiti di posizione finendo nel piano perpendicolare all’asse X–C–Y (frecce curve). Qualsiasi deviazione da tale geometria ottimale aumenterebbe l’energia libera dello stato di transizione, ∆G‡, abbassando conseguentemente la velocità della reazione. (2) Lo stato di transizione si separa nei prodotti in cui gli R, R’ e R’’ hanno invertito le loro posizioni intorno all’atomo di C, il quale recupera il suo stato di ibridazione sp3, mentre viene rilasciato X–.

à



X



X–

1

C R

2 R

R0

C

R0

R C

R9

R0 R9

Yδ Y–



Ibridazione sp2-p a livello del carbonio

Y

R9

360

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

mazioni prima e dopo aver legato i loro substrati. Questa flessibilità è infatti cruciale affinché un enzima possa interagire in modo produttivo con i suoi substrati, con gli stati di transizione e con i prodotti durante l’intero corso di una reazione.

E Gli enzimi catalizzano le reazioni legando preferenzialmente lo stato di transizione L’aumento delle velocità che gli enzimi riescono a produrre risulta spesso maggiore rispetto a quanto i meccanismi di catalisi sinora discussi possano ragionevolmente giustificare. Non abbiamo ancora analizzato però uno degli aspetti della catalisi enzimatica maggiormente rilevanti: un enzima può legare lo stato di transizione della reazione che catalizza con affinità superiore a quella dei substrati o dei prodotti. Quando lo si considera insieme ai meccanismi catalitici descritti precedentemente, il legame preferenziale dello stato di transizione dà ragione delle velocità osservate per le reazioni catalizzate dagli enzimi. Il concetto originale di legame dello stato di transizione presumeva che gli enzimi forzassero meccanicamente i loro substrati a raggiungere la geometria dello stato di transizione, attraverso siti di legame nei quali i substrati non distorti non si adattavano in maniera corretta. Tale tensione favorisce numerose reazioni organiche. Per esempio, la velocità della reazione a sinistra è 315 volte più veloce quando R è CH3 anziché H, per effetto della maggiore repulsione sterica tra i gruppi CH3 e quelli reattivi. Il reagente distorto è più simile allo stato di transizione della reazione rispetto al corrispondente reagente non sottoposto a tensione. Pertanto, come Linus Pauling suggerì per la prima volta e Richard Wolfenden e Gustav Lienhard approfondirono in seguito, gli enzimi che si legano di preferenza alla struttura dello stato di transizione ne incrementano la concentrazione, determinando con ciò un aumento proporzionale della velocità di reazione. Quanto più saldamente un enzima si unisce allo stato di transizione della propria reazione rispetto al substrato, tanto maggiore è la velocità della reazione catalizzata rispetto a quella della reazione non catalizzata. La catalisi dipende anche dal legame preferenziale e quindi dalla stabilizzazione dello stato di transizione (Figura 11.15). In altre parole, la differenza di energia libera tra un complesso enzima-substrato (ES) e un complesso enzima-stato di transizione (ES‡) è inferiore alla differenza tra l’energia libera tra S e S‡ in una reazione non catalizzata. Come abbiamo osservato nel Paragrafo 11.2, l’aumento della velocità di una ‡ ‡ reazione catalizzata è dato da e∆∆G cat/RT; dove ∆∆G cat indica la differenza tra i ‡ ‡ valori di ∆G per la reazione non catalizzata (∆G N) e catalizzata (∆G E‡ ). Per tale motivo, un aumento della velocità pari a 106 richiede che un enzima si unisca allo stato di transizione con un’affinità 106 volte maggiore rispetto al substrato; ciò corrisponde a una stabilizzazione di 34,2 kJ ∙ mol−1 a 25 °C, equivalente approssimativamente all’energia libera di due legami idrogeno. Il legame di uno stato di transizione all’enzima con due legami idrogeno che non si possono formare quando il substrato si lega inizialmente all’enzima dovrebbe portare a un incremento della velocità pari a circa 106 solo sulla base di questo effetto. Di solito un enzima può legare substrati poco reattivi con velocità di reazione basse, e anche substrati molto reattivi con velo-

R CH2OH COOH R

R

Tensione sterica

H

H C

+

O

H2O

C R

O

S‡ ∆GN‡ ES‡ G

∆G‡E E+S ES EP Coordinata di reazione

E+P

Figura 11.15 Effetto del legame preferenziale dello stato di transizione. Il diagramma della coordinata di reazione di un’ipotetica reazione a singolo substrato catalizzata da un enzima è in blu, mentre quello corrispondente alla reazione non catalizzata è in rosso. ∆G‡N è l’energia libera di attivazione della reazione non enzimatica e ∆G‡E è l’energia libera di attivazione di quella catalizzata da un enzima. I picchi più piccoli nel diagramma della coordinata di reazione catalizzata da un enzima sono dovuti al legame del substrato e al rilascio del prodotto.

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

361

cità di reazione elevate. Non è detto però che un substrato “reattivo” si unisca all’enzima con affinità elevata; ciò in effetti può accadere solo dopo la sua conversione nello stato di transizione. Il modello a chiave e serratura di Fischer si adatta meglio al legame dello stato di transizione che al legame del substrato. La stabilizzazione dello stato di transizione, almeno per qualche enzima, contribuisce in piccola parte all’aumento della velocità di una reazione. In molti di questi casi, come spiegato da Thomas Bruice, l’enzima promuove la reazione stabilizzando la così detta conformazione di attacco ravvicinato, una tappa della coordinata di reazione in cui i reagenti sono correttamente orientati e si trovano in contatto tra loro tramite interazioni di van der Waals ma non hanno ancora raggiunto lo stato di transizione. Tutto ciò suggerisce che gli enzimi si siano evoluti per poter utilizzare diverse strategie, inclusa la stabilizzazione dello stato di transizione o di qualcosa che sia riconducibile a esso, al fine di accelerare le reazioni chimiche. Gli analoghi dello stato di transizione sono inibitori enzimatici. Se un enzima le-

ga preferibilmente lo stato di transizione del suo substrato, allora ci si può attendere che gli analoghi dello stato di transizione, molecole geometricamente ed elettronicamente simili allo stato di transizione ma resistenti alla catalisi, siano potenti inibitori dell’enzima. Per esempio, si presume che la reazione catalizzata dalla prolina racemasi di Clostridium sticklandii avvenga attraverso la formazione di uno stato di transizione planare: COO

_ H

C N

H

H L-Prolina

+

C

_

H COO

_

H

+

C

N

N

H

H

Stato di transizione planare

COO

_

D-Prolina

La prolina racemasi è inibita dagli analoghi planari della prolina, pirrolo-2-carbossilato e ∆-1-pirrolina-2-carbossilato, (a destra) i quali si legano entrambi all’enzima con un’affinità 160 volte maggiore rispetto alla prolina. È probabile quindi che questi composti siano analoghi dello stato di transizione nella reazione della prolina racemasi. Sono state identificate centinaia di analoghi degli stati di transizione di vari enzimi; taluni sono antibiotici presenti in natura, mentre altri sono stati progettati per studiare il meccanismo di particolari enzimi o per ottenere specifici inibitori enzimatici da utilizzare per scopi terapeutici o in agricoltura. Quindi, la teoria secondo cui gli enzimi legano gli stati di transizione con affinità maggiore rispetto ai substrati rappresenta ora la base razionale per la progettazione di farmaci che utilizzino le conoscenze sugli specifici meccanismi di reazione degli enzimi (Paragrafo 12.4).

4 Il lisozima CONCETTI CHIAVE

• La costruzione di modelli indica che il legame al lisozima distorce un residuo di zucchero del substrato.

• I residui di Asp e Glu del sito attivo del lisozima promuovono l’idrolisi del substrato servendosi di meccanismi di catalisi acido-base e di catalisi covalente, e stabilizzando uno stato di transizione con uno ione ossonio.

Nella parte rimanente del capitolo analizzeremo i meccanismi catalitici ben caratterizzati di alcuni enzimi. Avremo modo di rilevare anche come le molecole enzimatiche utilizzino i principi della catalisi descritti nel paragrafo precedente.

_

COO N H

Pirrolo-2-carbossilato

+ N

COO

_

H ⌬-1-Pirrolina-2-carbossilato

PUNTO DI VERIFICA

• Descrivete come agiscono i gruppi funzionali delle proteine quali catalizzatori acido-base. Come è possibile per una singola catena laterale di un amminoacido comportarsi sia da acido che da base?

• Spiegate in che modo i nucleofili fungono da catalizzatori covalenti. Quali sono gli amminoacidi adatti a fare ciò?

• Elencate i modi in cui gli ioni metallici prendono parte alla catalisi.

• Quali sono i ruoli della prossimità e dell’orientamento nella catalisi enzimatica?

• Perché è improbabile che i catalizzatori non enzimatici agiscano stabilizzando lo stato di transizione?

CAPITOLO 11

362

La catalisi enzimatica

...

H 1

H 3

H

O 1

Punto di idrolisi CH2OH del lisozima O H H O H H

CH2OH O H H OH

H

H

H O

CH2OH O H H

H

O H

...

O

6CH2OH O H 5 H 4 H OH

© 978-88-08-42096-1

2

NH

C

CH3

NH

O

O

C

CH3

NH

O

O

– CH3CHCOO NAG

Figura 11.16 Il sito di idrolisi del lisozima. L’enzima scinde un legame β(1n4) nella catena polisaccaridica delle pareti cellulari batteriche, che ha un’alternanza di unità NAG–NAM.

NAM

C

NAG

H

CH3

NH

O

C

CH3

O

CH3CHCOO– NAM

Il lisozima è un enzima in grado di distruggere le pareti delle cellule batteriche. La sua azione si esplica mediante idrolisi dei legami β(1n4) glicosidici che uniscono l’acido N-acetilmuramico (NAM o MurNAc) alla N-acetilglucosammina (NAG o GlcNAc) nei peptidoglicani della parete cellulare (Figura 11.16 e Paragrafo 8.3B). L’enzima allo stesso modo idrolizza i legami β(1n4) tra le unità di un poli(NAG) (chitina, Paragrafo 8.2B), un componente della parete cellulare della maggior parte dei funghi e il costituente principale dell’esoscheletro degli insetti e dei crostacei. Il lisozima è ampiamente presente nelle cellule e nelle secrezioni dei vertebrati, dove svolge verosimilmente la funzione di agente battericida o agevola l’eliminazione dei batteri dopo che questi sono stati uccisi per altre vie. Il lisozima di albume d’uovo di gallina (HEW) costituisce la forma più ampiamente studiata di lisozima (in parte perché ogni uovo di gallina contiene ∼5 g di lisozima) ed è uno degli enzimi il cui meccanismo di reazione è stato meglio compreso. Si tratta di una proteina piuttosto piccola (14,3 kD) costituita da un’unica catena polipeptidica di 129 residui amminoacidici e unita internamente da legami trasversali formati da quattro ponti disolfuro. Il lisozima catalizza l’idrolisi del proprio substrato a una velocità ∼108 volte superiore a quella della reazione non catalizzata.

A Il sito catalitico del lisozima è stato definito tramite la costruzione di modelli CONCETTI DI BASE Catalisi Un enzima non agisce a distanza abbassando magicamente l’energia di attivazione di una reazione chimica. Anche senza formare un legame covalente, un enzima deve interagire da vicino con i suoi substrati. Questo contatto stretto permette all’enzima di generare un percorso a più bassa energia di attivazione – e quindi più veloce – dai reagenti ai prodotti rispetto al processo senza catalisi.

La struttura ai raggi X del lisozima di bianco d’uovo (Figura 11.17), chiarita da David Phillips nel 1965 (esso rappresenta il primo enzima di cui fu determinata la struttura), mostra che la molecola proteica è di forma approssimativamente ellissoidale, con dimensioni 30 × 30 × 45 Å. La sua peculiarità più rilevante è un’ampia fessura, il sito di legame del substrato, che attraversa una faccia della molecola. Per identificare il meccanismo d’azione di un enzima bisogna prima conoscere la struttura del suo complesso enzima-substrato. Anche se i residui all’interno del sito attivo sono stati identificati tramite mezzi chimici e fisici, per comprendere il funzionamento dell’enzima deve essere nota la loro disposizione tridimensionale rispetto al substrato. Tuttavia un enzima lega i suoi substrati solo in maniera transitoria prima che la catalisi abbia inizio e vengano rilasciati i prodotti. Di conseguenza, gran parte delle informazioni strutturali di cui disponiamo circa i complessi tra enzimi e substrati provengono da indagini ai raggi X, condotte su molecole enzimatiche unite ad analoghi di substrati, i quali rimangono legati stabilmente all’enzima per tutto il tempo richiesto per misurare le intensità di diffrazione dei raggi X del cristallo di una proteina, ma non reagiscono o reagiscono molto lentamente. Nell’analisi strutturale ai raggi X di Phillips il lisozima era legato al trisaccaride (NAG)3, che l’enzima idrolizza solo lentamente. Tuttavia, il lisozima catalizza in modo efficiente l’idrolisi di substrati contenenti almeno sei uni-

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

tà monosaccaridiche e così Phillips si avvalse di modelli di lunghezza diversa per studiare in che modo un substrato di maggiori dimensioni poteva legarsi all’enzima. La fessura del sito attivo del lisozima è lunga abbastanza da poter ospitare un oligosaccaride formato da sei residui (indicati con le lettere da A a F nella Figura 11.17). Tuttavia il quarto (D) sembrava non essere in grado di unirsi all’enzima poiché i suoi atomi C6 e O6 erano troppo vicini alle catene laterali della proteina e del residuo C. Tale interferenza sterica poteva essere eliminata deformando l’anello glucidico in modo da convertirlo dalla sua normale conformazione a sedia a quella a mezza sedia (Figura 11.18). Questa distorsione sposta il gruppo C6 dalla sua consueta posizione equatoriale a una assiale, dove esso non instaura più alcun contatto stretto e può formare un legame idrogeno con il gruppo carbonilico di Gln 57 dello scheletro e con il gruppo NH di Val 109. Gli altri residui glucidici sembrano unirsi all’enzima senza distorsione e con un certo numero di legami idrogeno e contatti di van der Waals favorevoli. Alcuni dei legami idrogeno con cui i sei residui saccaridici del substrato si legano all’enzima sono rappresentati schematicamente nella Figura 11.19. Nel substrato naturale di quest’ultimo, ogni due residui vi è un NAM; la costruzione di modelli ha indicato che una catena laterale lattilica (di acido lattico) non può essere ospitata nei sottositi di legame per i residui C o E, quindi i residui di NAM devono legarsi in corrispondenza delle posizioni B, D e F, come mostrato nella Figura 11.19. Inoltre, dal momento che il lisozima idrolizza (NAG)6 tra i residui D ed E, l’enzima deve scindere il le-

C4

O5

C5

C5

C4

O5

C3

C2 C1 Conformazione a sedia

C3

C2

Conformazione a mezza sedia

C1

363

Figura 11.17 Struttura ai raggi X del lisozima di HEW in complesso con il (NAG)6. La proteina è rappresentata come immagine della superficie trasparente. La sua catena polipeptidica è mostrata in forma di nastro ed è colorata secondo l’ordine dei colori nell’arcobaleno dal suo N-terminale in blu al suo C-terminale in rosso. Il (NAG)6, mostrato come modello strutturale con gli anelli glucosidici indicati con le lettere da A (l’estremità non riducente) a F (l’estremità riducente), si lega in una fessura profonda sulla superficie dell’enzima. Gli anelli A, B e C (colorati a seconda del tipo di atomo con C in verde, N in blu e O in rosso) sono osservabili nella struttura ai raggi X del complesso di (NAG)3 con il lisozima. Le posizioni degli anelli D, E ed F (con gli atomi di C in azzurro) sono state dedotte da studi di costruzione di modelli. Le catene laterali dei residui catalitici del sito attivo del lisozima, Glu 35 e Asp 52, disegnati in modello spaziale (con gli atomi di C in giallo), catalizzano l’idrolisi dei legami glicosidici tra gli anelli D ed E. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da David Phillips, Oxford University, PDBid 1HEW.]

A parte i residui di Asp e Glu del sito attivo, quali residui vi aspettereste di trovare nella tasca di legame al substrato del lisozima?

Figura 11.18 Conformazioni a sedia e a mezza sedia. Di norma gli anelli degli esosi assumono la conformazione a sedia. Tuttavia il legame del lisozima determina una distorsione dell’anello D in quella a mezza sedia, in cui gli atomi C1, C2, C5 e O5 sono coplanari.

Aggiungete i sostituenti appropriati a ciascun carbonio per formare NAG e NAM.

364

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

Figura 11.19 Interazioni del lisozima con il suo substrato. Vista all’interno della fessura di legame; i margini più pronunciati degli anelli saccaridici sono rivolti verso l’esterno dell’enzima e quelli più sottili sono rivolti verso la parte bassa della fessura. [Adattamento da una figura di Irving Geis.]

OH CH2OH

HO O

A NAG –O

C H3C

O

N

C

Asp 101

O

H O R

H

O

O

CH2 B

H

NAM O

N

C H3C

O

O H

Trp 62

O

CH2 N

H

N

O

H

NAG

C

H

N

O Asn 59 N

O

H C

R Anello D in conformazione O a mezza sedia

O

Val 109

CH2O D C

NAM H O O O – C

C

H

O

Gln 57

Asp 52 O Punto di taglio del lisozima

N H

NH2

O

C

C O

H

NH2

O

E NAG

C

C

Glu 35

CH2OH O

O

O

N

O

H3C

Asn 44

Ala 107

C

CH3

O

H

H

Gln 57

Trp 63

O

N

H3C

H Glu C 35

O

O R

H

C

C

Asn 37

O

O

CH2 O

F C

H3C

Phe 34

O

NAM O

O

N H O H

H 2N

H2N + H2N

NH Arg 114

game glucidico del suo substrato naturale tra il residuo NAM nel subsito D e il residuo NAG nel subsito E. Il legame tagliato dal lisozima fu identificato effettuando l’idrolisi catalizzata dal lisozima di (NAG)3 in H218O. Il legame scisso avrebbe potuto essere localizzato sia tra l’atomo C1 e l’ossigeno O1 o tra l’ O1 e il C4 del successivo anello

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

365

glucidico. Il prodotto della reazione di idrolisi aveva un atomo 18O legato all’atomo C1 della nuova estremità riducente, dimostrando così che la scissione del legame si verifica tra C1 e l’ossigeno O1: H

O D

H

C1

O1

NAc

C 4

CH2OH H OH

E

lisozima H218O

H

O D

CH2OH

18

H

H

OH C

+

H

C

H OH

E

HO

NAc

H

Oltre a ciò, questa reazione avviene mantenendo la configurazione, così che il prodotto, l’anello D, rimane nella forma anomerica β.

B Nella reazione del lisozima si forma un intermedio covalente La reazione catalizzata dal lisozima, l’idrolisi di un glicoside, è la conversione di un acetale in emiacetale. L’idrolisi non enzimatica di un acetale è una reazione catalizzata da acidi e implica la protonazione di un atomo di ossigeno reagente, seguita dalla scissione del suo legame C−O (Figura 11.20). Ciò comporta la formazione transitoria di un carbocatione stabilizzato per risonanza, definito ione ossonio. Per raggiungere la stabilizzazione per risonanza, i gruppi R e R′ di tale ione devono essere coplanari con i suoi atomi di C, O e H. Allo ione ossonio viene in seguito aggiunta acqua per generare l’emiacetale e riformare il catalizzatore acido. Un enzima che media l’idrolisi dell’acetale deve quindi reperire un potenziale catalizzatore acido oltre a un gruppo in grado di stabilizzare lo stato di transizione con lo ione ossonio. Glu 35 e Asp 52 sono residui catalitici del lisozima. Gli unici gruppi funzionali situati nelle immediate vicinanze del centro reattivo del lisozima e che hanno le necessarie proprietà catalitiche sono le catene laterali di Glu 35 e Asp 52. Esse, disposte ai lati del legame glicosidico che deve essere scisso (Figura 11.17), si vengono a trovare in ambienti completamente differenti. Il residuo di Asp 52 è circondato da residui polari conservati con cui forma un complesso reticolo tenuto insieme da legami idrogeno. Il gruppo carbossilico di questo amminoacido dovrebbe così avere un valore di pK normale, cioè non dovrebbe essere protonato e dovrebbe quindi essere carico negativamente OR9 OR9 in un ambito di pH compreso tra 3 e 8, nel quale il lisozima pre+ + H C O senta attività catalitica. Pertanto Asp 52 può svolgere la funzione H C O R0 + H di stabilizzare elettrostaticamente lo ione ossonio. Al contrario, il R H R gruppo carbossilico di Glu 35 è affondato in una tasca prevalenteAcetale mente non polare dove rimane protonato a valori di pH insolitamente alti per i gruppi carbossilici (il suo valore di pK, determinato R9 R9 con metodi NMR, è di circa 6,2). Questo residuo può quindi agi+ O O re da catalizzatore acido. Utilizzando reagenti capaci di modificare C C+ le proteine o la mutagenesi sito-diretta (per esempio, variando Asp H R H R 52 in Asn e Glu 35 in Gln) si è stabilito che questi residui sono esCarbocatione (ione ossonio) senziali per la catalisi. stabilizzato per risonanza H2O

H+

Figura 11.20 Meccanismo di idrolisi non enzimatica catalizzata da acidi

di un acetale a emiacetale. La reazione implica la protonazione di uno degli atomi di ossigeno dell’acetale cui segue la scissione del suo legame COO per dare origine a un alcol (R’’OH) e a un carbocatione (ione ossonio) stabilizzato per risonanza. L’aggiunta di acqua allo ione ossonio forma l’emiacetale e rigenera il catalizzatore H+. Si noti che gli atomi di C, O, H, R ed R’ dello ione ossonio giacciono tutti nello stesso piano. Scrivete l’equazione di questa reazione.

OR9 H

C

OH

R Emiacetale

R0

R0OH

CAPITOLO 11

366

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

Il meccanismo catalitico del lisozima avviene nel modo seguente (Figura 11.21).

1. La reazione incomincia quando il lisozima si associa alla parete di una cellula batterica, legandosi a una unità esasaccaridica. Ciò determina una distorsione del residuo D verso la conformazione a mezza sedia. SCHEMA DI PROCESSO

CH2 H O

C

CH2

Glu35

CH2 CH2 Glu35

O

H O HOCH2 O H D H OR9 H

Polisaccaride substrato

O–

1 Legame

O

C

CH2

H

C

O HOCH2 H O

H

H

R O–

Asp52

C

H OR9 H

CH2 Asp52

OH

5

Catalisi basica generale

H

Catalisi acida 2 generale

HO

H

CH2 C



O

O H OR9 H

CH2

Glu35

H



HOCH2 O

H

H

C O

H

R

CH2 CH2 Glu35

O H

HOCH2

H

O E H OH H H

R

H

R

HOCH2 O

H

H

O

HOCH2 H

O E H OH H

O

R CH2 Asp52 CH2 CH2 –

O

C

O

HOCH2

O H OR9 H

H C+ H

H R Ione ossonio (stato di transizione)

O

C

O–

Glu35

H OR9 H H

C

O+ C H

R

O

CH2 Asp52

O

HOCH2

Legame 4 dell’acqua

H H2O

O H OR9 H H

H O

R

3

Catalisi covalente

O CH2 Asp52 Intermedio covalente

Figura 11.21 Meccanismo di reazione del lisozima. Glu 35 svolge la funzione di catalizzatore acido, mentre Asp 52 di catalizzatore covalente; sono mostrati solo gli anelli D ed E del substrato. R rappresenta il gruppo N-acetilico in C2 ed R’ indica il gruppo CH3CHCOO– in C3. Lo stato di transizione con uno ione ossonio stabilizzato per risonanza, richiede che C1, C2, C5 e O5

siano coplanari (ombreggiatura), generando una conformazione a mezza sedia. Nella tappa 5 si forma uno ione ossonio nello stato di transizione non illustrato. Disegnate la struttura dello stato di transizione di questa reazione.

CAPITOLO 11 © 978-88-08-42096-1

La catalisi enzimatica

367

2. Glu 35 trasferisce il suo protone all’atomo O1 che funge da ponte tra l’anello D e l’anello E, facilitando così il taglio del legame C1OO1 (catalisi acida generale). Questa tappa converte l’anello D nello stato di transizione con lo ione ossonio stabilizzato per risonanza, la cui formazione è agevolata dalla distorsione della conformazione a mezza sedia dell’anello D (catalisi da legame preferenziale dello stato di transizione). Lo ione ossonio carico positivamente viene stabilizzato dalla vicinanza del gruppo carbossilico carico negativamente del residuo di Asp 52 (catalisi elettrostatica). L’anello E così prodotto viene rilasciato. 3. Il gruppo carbossilico deprotonato di Asp 52 a questo punto attacca nucleofilicamente il C1 povero di elettroni dell’anello D per formare un intermedio covalente glicosil-enzima (catalisi covalente). 4. Una molecola di acqua rimpiazza l’anello E che è stato prodotto nel sito attivo dell’enzima. 5. L’idrolisi del legame covalente mediata da Glu 35 (catalisi basica generale), che coinvolge un altro ione ossonio nello stato di transizione, rigenera i gruppi del sito attivo. L’enzima rilascia quindi il prodotto, l’anello D, portando a compimento la reazione catalitica.

Il meccanismo di doppia sostituzione rappresentato nella Figura 11.21 consente alla molecola di acqua in entrata di unirsi al residuo D sullo stesso lato a cui era legato il residuo E che essa va a sostituire. Di conseguenza viene mantenuta la configurazione del residuo D. Una reazione a singola sostituzione, in cui l’acqua rimuove direttamente il gruppo uscente, invertirebbe la configurazione a livello di C1 dell’anello D tra il substrato e il prodotto, evenienza che non si osserva. Le evidenze sperimentali supportano il ruolo della distorsione nel meccanismo del lisozima. Molti degli studi inerenti alla struttura e ai meccanismi del lisozima

La spettrometria di massa e la cristallografia ai raggi X confermano la catalisi covalente. L’esistenza di un intermedio di reazione covalente, ma transitorio, era

molto difficile da verificare e quindi da dimostrare. La durata di uno ione ossonio glucosilico nell’acqua è pari a circa 10−12 secondi. Per rilevare sperimentalmente questo intermedio a vita molto breve è necessario rendere la sua velocità di produzione significativamente superiore rispetto a quella di degradazione. Per ottenere ciò, Stephen Withers ha tratto vantaggio da tre fenomeni. In primo

H

CH2OH O H OH

O

H

O

NHCOCH3 H (NAG)3 Analogo d-lattone di (NAG)4

...

si sono focalizzati sul ruolo catalitico della tensione. Per esempio, la struttura ai raggi X del lisozima legato a NAM-NAG-NAM indica che questo trisaccaride si associa, in accordo con quanto previsto, ai sottositi B, C e D del lisozima, con il residuo NAM nel sottosito D distorto nella conformazione a mezza sedia. Questa struttura distorta è stabilizzata da un forte legame idrogeno tra l’O6 dell’anello D e l’NH di Val 109 dello scheletro (come previsto dal modello, Figura 11.19). Infatti, sostituendo la Val 109 con Pro, che è priva del gruppo NH necessario per instaurare il legame idrogeno, l’enzima diventa inattivo. Come abbiamo già visto nel Paragrafo 11.3E, un enzima che catalizza una reazione mediante il legame preferenziale dello stato di transizione presenta un’affinità di legame più elevata per un inibitore che abbia la geometria dello stato di transizione (un analogo dello stato di transizione) rispetto a quanto non faccia nei confronti del proprio substrato. L’analogo δ-lattone del (NAG)4 (Figura 11.22), che si lega saldamente al lisozima, è un analogo dello stato di transizione di quest’ultimo in quanto l’anello lattonico di tale composto si trova nella conformazione a mezza sedia che ricorda, dal punto di vista geometrico, lo stato di transizione con lo ione ossonio proposto per l’anello D del substrato. Gli studi ai raggi X confermano che il trisaccaride inibitore si lega al lisozima in modo che il lattone occupi il sottosito D nella conformazione a mezza sedia.

O

H

CH2OH O H

C+

H

OR

H

H

NHCOCH3

Figura 11.22 Inibizione del lisozima da un analogo dello stato di transizione. L’analogo δ-lattone di (NAG)4 (in alto) è simile allo stato di transizione della reazione del lisozima (in basso). Si noti che gli atomi C1, C2, C5 e O5 appartenenti a ciascuna struttura sono coplanari (come indicato dall’ombreggiatura), compatibilmente con la conformazione a mezza sedia dell’anello dell’esosio.

CAPITOLO 11

368

H HO

La catalisi enzimatica

CH2OH O H OH H H

H O H

NHCOCH3

© 978-88-08-42096-1

CH2OH O H OH H H

F H

F

NAG2FGlcF

PUNTO DI VERIFICA

• Utilizzando il lisozima come esempio, dite che cosa può rivelare la struttura di un enzima relativamente al suo meccanismo catalitico.

• Perché ci si aspettava che uno ione ossonio fosse coinvolto nella reazione del lisozima?

• Descrivete le prove sperimentali che supportano il fatto che la catalisi del lisozima avviene per catalisi acidobase, catalisi covalente e tramite stabilizzazione dello stato di transizione.

Figura 11.23 Posizione dell’anello D durante la catalisi operata da lisozima. La posizione degli anelli C e D del substrato, nonché di Asp 52 catalitico, è illustrata in strutture ai raggi X sovrapposte del complesso covalente tra il lisozima E35Q e il substrato modificato NAG2FGlcF (C in verde, N in blu, O in rosso e F in magenta) e del complesso non covalente tra lisozima e substrato NAM–NAG–NAM (C in giallo, N in blu e O in rosso). Si noti che il legame covalente tra Asp 52 e C1 dell’anello D si forma quando l’anello D del complesso non covalente si rilassa dalla propria conformazione distorta a mezza sedia in una conformazione a sedia non distorta. Anche la catena laterale di Asp 52 subisce una rotazione di 45° intorno all’asse formato dal suo legame Cα–Cβ. [Basata su strutture ai raggi X di David Vocadlo e Stephen Withers, University of British Columbia, Vancouver, Canada, e di Michael James, University of Alberta, Edmonton, Canada. PDBid 1H6M.]

luogo, se, come ipotizzato, la reazione passa attraverso uno stato di transizione rappresentato dallo ione ossonio, tutte le tappe che portano alla sua formazione dovrebbero essere rallentate dall’effetto elettron-attrattore di un atomo di F (fluoro, un elemento molto elettronegativo) sostituito a livello di C2 dell’anello D. In secondo luogo, la mutazione di Glu 35 a Gln (E35Q) rimuove l’acido-base generale che catalizza la reazione, rallentando ulteriormente tutte le tappe che coinvolgono la formazione dello stato di transizione con lo ione ossonio. Infine, l’aggiunta di un altro atomo di F al C1 dell’anello D rende più rapida la formazione dell’intermedio, poiché questo F è un buon gruppo uscente, senza che vi sia l’esigenza della catalisi acida generale. L’insieme di queste tre modificazioni dovrebbe determinare un incremento nella formazione dell’intermedio covalente proposto rispetto alla sua eliminazione e portare quindi a un suo accumulo. Withers ha quindi incubato il lisozima di bianco d’uovo contenente E35Q con NAG-β(1n4)-2-deossi-2-fluoro-β-d-glucopiranosil fluoruro (NAG2FGlcF, a sinistra). La spettrometria di massa con ionizzazione elettrospray (ESI-MS; Paragrafo 5.3D) di questa miscela di reazione ha rivelato un picco netto a 14 683 D, che è compatibile con la formazione dell’intermedio covalente [il lisozima ha una massa molecolare di 14 314 D e quella del gruppo del NAG-β(1n4)2-deossi-2-fluoro-β-d-glucopiranosil fluoruro è di 369 D]. La struttura ai raggi X di questo complesso covalente, rivela in maniera inequivocabile il legame covalente atteso lungo circa 1,4 Å tra l’atomo C1 dell’anello D e un atomo di O carbossilico della catena laterale del residuo di Asp 52. Questo anello D adotta una conformazione a sedia non distorta, indicando con ciò che si tratta di un intermedio di reazione piuttosto che di un’approssimazione dello stato di transizione. La sovrapposizione di tale complesso covalente con quella del complesso illustrato in precedenza di NAM-NAG-NAM con la forma normale del lisozima di bianco d’uovo chiarisce la modalità di formazione di questo legame covalente (Figura 11.23). L’accorciamento della distanza di 3,2 Å tra C1 dell’anello D e l’O di Asp 52 nel complesso di NAM-NAG-NAM sino a 1,4 Å nel complesso covalente avviene quando l’anello D si rilassa dalla conformazione a mezza sedia a quella a sedia e la catena laterale di Asp 52 ruota approssimativamente di 45° intorno al proprio legame CαOCβ.

CAPITOLO 11 © 978-88-08-42096-1

La catalisi enzimatica

369

5 Le serina proteasi CONCETTI CHIAVE

• I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle serina proteasi sono stati identificati per marcatura chimica e analisi strutturale.

• La tasca di legame determina la specificità del substrato delle diverse serina proteasi. • Le serina proteasi catalizzano l’idrolisi del legame peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e stabilizzazione dello stato di transizione.

• Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi. Il prossimo esempio di meccanismo enzimatico è quello utilizzato da un gruppo piuttosto ampio di enzimi proteolitici, noti con il nome di serina proteasi, così chiamati poiché hanno tutti lo stesso tipo di processo catalitico che coinvolge un residuo di Ser particolarmente reattivo. Le serina proteasi sono enzimi digestivi presenti nei procarioti e negli eucarioti, ma fanno parte di questa classe di proteine anche enzimi più specializzati che prendono parte ai processi di sviluppo, di coagulazione del sangue, di infiammazione e a numerosi altri. In questo paragrafo ci concentreremo su alcune delle serina proteasi meglio caratterizzate: chimotripsina, tripsina ed elastasi.

A I residui amminoacidici del sito attivo sono stati identificati per marcatura chimica

CH(CH3)2 O

La chimotripsina, la tripsina e l’elastasi sono enzimi digestivi sintetizzati (Ser attiva) CH2OH + F P O O dal pancreas e secreti nel duodeno (l’ansa superiore dell’intestino tenue). I tre enzimi catalizzano l’idrolisi di legami peptidici (amidici), ma con specificità CH(CH3)2 differenti per le catene laterali che fiancheggiano il legame peptidico suscettibile Diisopropilfosfo(che deve essere tagliato). La chimotripsina è specifica per un gruppo voluminoso fluoridato (DIPF) e idrofobico che deve precedere il legame da scindere; la tripsina richiede invece una catena laterale carica positivamente, mentre l’elastasi è specifica di una catena laterale piccola e neutra (Tabella 5.4). Nel complesso, i tre enzimi formano un potente “sistema proteolitico” che porta avanti il processo della digestione. CH(CH3)2 I gruppi cataliticamente rilevanti della chimotripsina sono stati identificati O mediante studi di marcatura chimica. L’identificazione della catena laterale di un residuo di Ser nel sito attivo della serina proteasi può essere ef- (Ser attiva) CH2 O P O + HF fettuata usando il reagente diisopropilfosfofluoridato (DIPF, a destra), O un composto che inattiva in modo irreversibile l’enzima. Gli altri residui di Ser, CH(CH3)2 compresi quelli contenuti nella stessa proteina, non reagiscono con il DIPF; la maggiore reattività della Ser 195 della chimotripsina nei confronti del DIPF diDIPÐEnzima mostra che il residuo di Ser è parte del sito attivo dell’enzima. Tale specificità conferisce al DIPF e ai composti a esso correlati un’estrema tossicità (Scheda 11.3). Un secondo residuo cataliticamente importante è l’His 57, scoperto mediante marcatura per affinità. In questa tecnica, un analogo del substrato contenente un gruppo reattivo si lega specificamente al sito attivo dell’enzima, dove reagisce formando un legame covalente stabile con un gruppo circostante suscettibile (questi analoghi reattivi dei substrati sono stati soprannominati i “cavalli di + NH3 Troia” della biochimica). Il gruppo o i gruppi marcati per affinità possono essere in seguito isolati e identificati. CH2 La chimotripsina lega specificamente il tosil-l-fenilalanina clorometilCH2 chetone (TPCK), a causa della sua somiglianza strutturale con un residuo di CH2 Phe (uno dei residui preferiti dalla chimotripsina come substrato). Il gruppo clorometilchetonico del TPCK, inserito nel sito attivo, è un CH2 O O forte agente alchilante, ma reagisce unicamente con l’His 57 (Figura CH3 S NH CH C CH2Cl 11.24), inattivando in tal modo l’enzima. La tripsina, che preferisce i O residui basici, è inattivata in modo simile dal tosil-l-lisina cloromeTosilL -lisina clorometilchetone tilchetone (a destra).

370

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

SCHEDA 11.3

© 978-88-08-42096-1

LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA

I veleni che colpiscono il sistema nervoso L’uso di DIPF (diisopropilfosfofluoridato) per inattivare gli enzimi ebbe inizio con la scoperta che i composti organofosforici, come per esempio il DIPF, sono potenti veleni per il sistema nervoso. La neurotossicità di DIPF è dovuta alla sua capacità di inattivare l’acetilcolina esterasi, un enzima che catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina:

O

O 2N

CH2

CH2

O

+

H2O

CH3

CH2

CH3

CH2

O

Colina

OH

O

CH2CH3

+

_

O

CH3

CH

P

S

O

CH3

S

CH2

C

Malathion

O CH2

S

C

O O

acetilcolina esterasi

CH2

P

O CH3

C

Acetilcolina

+ (CH3)3N

CH2CH3

Parathion

O + (CH3)3N

O

C

CH3

+

H

+

O

L’attività esterasica dell’acetilcolina esterasi, come quella della chimotripsina (Paragrafo 11.1B), richiede un residuo di Ser reattivo. L’acetilcolina è un neurotrasmettitore, cioè trasmette gli impulsi nervosi attraverso determinati tipi di sinapsi (Paragrafo 9.4). Di solito l’acetilcolina esterasi contenuta nella sinapsi degrada l’acetilcolina in modo che la durata dell’impulso nervoso sia solo di circa un millisecondo. L’inattivazione di questo enzima impedisce l’idrolisi del neurotrasmettitore e il recettore dell’acetilcolina, che è un canale Na+-K+, rimane aperto per un tempo superiore al normale, interferendo in tal modo con la regolare sequenza degli impulsi nervosi. Il DIPF è così tossico per l’uomo (il decesso soggiunge per l’impossibilità di respirare) da essere stato utilizzato come gas nervino. Composti correlati quali il parathion e il malathion,

trovano impiego come insetticidi poiché sono molto più tossici per gli insetti che per i mammiferi. Le neurotossine come il DIPF e il sarin (che divenne tristemente famoso perché fu rilasciato nel corso di un attacco terroristico nella metropolitana di Tokyo nel 1995) O

O

CH(CH3)2

P

F

CH3 Sarin

sono inattivati dall’enzima paraossonasi, il quale è presente in due isoforme (una con Arg in posizione 192 e l’altra con Gln) che mostrano attività differenti. Le persone esprimono livelli molto variabili dell’enzima. Questi fattori possono spiegare le ampie differenze osservate nella sensibilità degli individui nei confronti dei veleni che colpiscono il sistema nervoso.

Chimotripsina H

CH2 N

Chimotripsina N

O

HCl

CH2 N

His 57

+ N CH2 C O CH3

S

CH2 O NH

CH

C

O

R CH2Cl

O Tosil-L-fenilalanina clorometilchetone (TPCK)

Figura 11.24 Reazione di TPCK con His 57 della chimotripsina.

La reazione di TPCK con His avverrebbe più o meno facilmente a pH più bassi?

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

371

B Le strutture ai raggi X forniscono informazioni sulla catalisi, sulla specificità di substrato e sull’evoluzione

La chimotripsina, la tripsina e l’elastasi presentano considerevoli omologie: le strutture primarie di questi enzimi, formati da circa 240 residui, sono identiche approssimativamente per il 40% (per raffronto, le catene α e β dell’emoglobina umana mostrano il 44% di identità di sequenza). Inoltre tutti questi enzimi possiedono una Ser reattiva e una His cataliticamente essenziale. Non è stato quindi sorprendente che le loro strutture ai raggi X avessero un altrettanto stretto grado di omologia. La struttura della chimotripsina bovina fu chiarita nel 1967 da David Blow; a ciò fece seguito la determinazione di quelle della tripsina bovina (Figura 11.25) da parte di Robert Stroud e Richard Dickerson e dell’elastasi suina ottenuta da David Shotton e Herman Watson. Queste molecole proteiche sono ripiegate in due domini, che presentano entrambi ampie regioni in foglietti β antiparalleli che formano una struttura simile a un barile, ma contengono pochi motivi elicoidali. Per poter confrontare le strutture di questi tre enzimi, useremo la stessa numerazione per i loro residui, cioè seguiremo il sistema utilizzato per il chimotripsinogeno bovino, il precursore, costituito da 245 residui, della chimotripsina (Paragrafo 11.5D). In tutte e tre le strutture i residui di His 57 e Ser 195 cataliticamente essenziali sono localizzati nel sito dell’enzima che lega il substrato (al centro della Figura 11.25). Le strutture ai raggi X mostrano inoltre che il residuo di Asp 102, conservato in tutte le serina proteasi, è immerso in una tasca adiacente inaccessibile al solvente. Questi tre residui invarianti danno origine a una serie di legami idrogeno e sono chiamati triade catalitica (Figure 11.25 e 11.26).

Sito che lega il substrato (tasca di specificità)

L2

L1

Figura 11.25 Struttura ai raggi X della tripsina bovina legata covalentemente al suo inibitore leupeptina. La proteina è ricostruita al computer con la “superficie molecolare” trasparente e la catena polipeptidica in forma di vermicello colorato secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno dall’N-terminale (in blu) al C-terminale (in rosso). Le catene laterali della triade catalitica Ser 195, His 57 e Asp 102 sono rappresentate secondo il modello a sfere e bastoncini e colorate a seconda del tipo di atomo, con C in verde, N in blu e O in rosso. I legami idrogeno sono rappresentati da linee nere tratteggiate. La leupeptina (acetil-Leu-Leu-Arg in cui il gruppo carbossilico terminale è sostituito con un OCHO) è disegnata secondo il modello a bastoncini, con C in azzurro, N in blu e O in rosso e con la sua catena laterale dell’Arg che occupa la tasca di specificità dell’enzima (rete viola). L1 ed L2 sono anse di superficie che attraversano la barriera della tasca di specificità. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Daniel Koshland, Jr., University of California, Berkeley. PDBid 2AGI.]

372

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

Figura 11.26 I residui del sito attivo della chimotripsina. La rappresentazione è approssimativamente nella stessa direzione della Figura 11.25. I residui amminoacidici sono disegnati secondo il modello a sfere e bastoncini con C in verde, N in blu e O in rosso. La triade catalitica è formata da Ser 195, His 57 e Asp 102. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Daniel Koshland, Jr., University of California, Berkeley. PDBid 2AGI.]

© 978-88-08-42096-1

Triade catalitica

Aggiungete gli atomi di H appropriati per completare la struttura.

Le specificità di substrato non sono state completamente spiegate. Le strut-

ture ai raggi X delle tre proteasi suggeriscono le basi molecolari per le differenti specificità di substrato (Figura 11.27).

Legame suscettibile

Phe

Gly 216 Gly 226 Ser 189 Chimotripsina Legame suscettibile

Lys

Gly 226

Gly 216

+ –

Asp 189 Tripsina Legame suscettibile

1. Nella chimotripsina, la voluminosa catena laterale aromatica del residuo preferito di Phe, Trp o Tyr che fornisce il gruppo carbonilico nel legame peptidico suscettibile si inserisce in una tasca idrofobica simile a una fenditura situata vicino ai gruppi catalitici. 2. Nella tripsina il residuo corrispondente alla Ser 189 della chimotripsina, che giace nella porzione inferiore della tasca di legame, è il residuo anionico Asp. Le catene laterali cationiche dei residui preferiti della tripsina, Arg e Lys, possono quindi formare coppie ioniche con questo residuo di Asp. La parte rimanente della tasca di specificità della chimotripsina è conservata nella tripsina, in modo che essa può ospitare le voluminose catene laterali di Arg e Lys (Figura 11.25). 3. L’elastasi deve il suo nome al fatto che idrolizza rapidamente la proteina elastina (una delle componenti principali del tessuto connettivo); è quasi indigeribile da altre proteasi e ricca di Ala, Gly e Val. La tasca di legame dell’elastasi è in gran parte occlusa dalle catene laterali dei residui di Val e Thr che rimpiazzano quelli di Gly che rivestono le tasche di specificità della chimotripsina e della tripsina. Di conseguenza l’elastasi, il cui sito di legame del substrato è in pratica una semplice depressione, taglia in maniera specifica i legami peptidici dopo piccoli residui neutri, in particolare Ala. Al contrario, la chimotripsina e la tripsina idrolizzano molto lentamente i legami peptidici formati da questi residui con piccole catene laterali, in quanto queste piccole strutture non possono essere immobilizzate in misura sufficiente sulla superficie dell’enzima. Nonostante quanto è stato detto, se l’Asp 189 della tripsina viene mutato in Ser tramite mutagenesi sito-diretta (Paragrafo 3.5D) la sua specificità non diventa equivalente a quella della chimotripsina, ma si ottiene piuttosto una proteasi non specifica. La sostituzione di ulteriori residui nella tasca di specificità della tripsina con quelli della chimotripsina non riesce a indurre in maniera significativa un’attività catalitica chimotripsinica. La tripsina viene convertita in un enzima simile alla chimotripsina con una ragionevole efficienza catalitica quando le due anse superficiali L1 (residui 185-188) e L2 (residui 221-225) che unisco-

Ala Thr 216 Val 226

Elastasi

Figura 11.27 Tasche di specificità di tre serina proteasi. Sono mostrate le catene laterali dei residui che determinano le dimensioni e la natura della tasca di specificità insieme a un substrato tipico di ciascun enzima. La chimotripsina mostra una preferenza per la scissione di legami peptidici che seguono grandi catene laterali idrofobiche; invece la tripsina preferisce Lys o Arg e l’elastasi preferisce Ala, Gly o Val. [Da un disegno in Branden, C., Tooze, J. (1999). Introduction to Protein Structure, 2a ed. Garland Publishing, p. 213.]

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

no le pareti della tasca di specificità sono sostituite da quelle della chimotripsina. Tali anse, che sono conservate in ogni enzima, servono in apparenza non per il legame del substrato di per sé, ma al fine di posizionare correttamente il legame suscettibile. Questi risultati pongono in luce un importante ammonimento per gli ingegneri genetici: gli enzimi sono così squisitamente adeguati alle loro funzioni che sovente rispondono in maniera inaspettata a tentativi grossolani di mutagenizzarli. Le serina proteasi mostrano relazioni evolutive divergenti e convergenti.

Abbiamo avuto modo di osservare che le omologie di sequenza e di struttura tra le proteine rivelano i loro rapporti evolutivi (Paragrafi 5.4 e 6.2D). Le considerevoli somiglianze tra la chimotripsina, la tripsina e l’elastasi indicano che queste molecole proteiche ebbero origine da duplicazioni di un gene ancestrale della serina proteasi, cui fece seguito un’evoluzione divergente degli enzimi risultanti. In effetti, vi è una stretta somiglianza conformazionale tra questi enzimi pancreatici e alcune proteasi batteriche; ciò denota che il gene primordiale della tripsina comparve prima della separazione tra procarioti ed eucarioti. Esistono numerose serina proteasi che non hanno relazioni strutturali, né tra loro né con la chimotripsina. Ugualmente anche queste proteine contengono triadi catalitiche in corrispondenza dei loro siti attivi le cui strutture ricordano molto quella della chimotripsina. Tra questi enzimi vi sono la subtilisina, una endopeptidasi isolata originariamente da Bacillus subtilis, e la serina carbossipeptidasi II di germe di grano, una esopeptidasi. Dal momento che, nelle sequenze amminoacidiche di queste serina proteasi, l’ordine dei corrispondenti residui del sito attivo è piuttosto diverso (Figura 11.28), sembra altamente improbabile che esse si siano potute evolvere a partire da un progenitore proteico comune. Questi enzimi costituiscono un esempio di evoluzione convergente: la natura sembra aver scoperto svariate volte e in modo indipendente il medesimo meccanismo catalitico. Subtilisina NH+3

Chimotripsina

Serina carbossipeptidasi II NH+3

NH+3

Asp 32 His 64 His 57

Ser 125 Leu 126 Gly 127

Ser 146

Asp 102

Asp 338 Ser 195 Ser 221

His 397

Ser 214 Trp 215 Gly 216

COO–

COO–

COO–

Figura 11.28 Rappresentazione schematica che mostra le posizioni dei residui appartenenti al sito attivo di tre serina proteasi non correlate. Nella subtilisina, chimotripsina e serina carbossipeptidasi II, ogni triade catalitica è formata da residui di Ser, His e Asp. I gruppi peptidici di Ser 214, Trp 215 e Gly 216 della chimotripsina, e delle loro controparti presenti nella subtilisina, partecipano al legame del substrato. [Robertus, J.D., Alden, R.A., Birktoft, J.J., Kraut, J., Powers, J.C. e Wilcox, P.E. (1972). Biochemistry 11, 2449.]

373

CAPITOLO 11

374

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

C Le serina proteasi utilizzano differenti meccanismi di catalisi Figura 11.29 Meccanismo di catalisi

Il meccanismo di catalisi proposto per questi enzimi si basa su rilevanti dati chimici e strutturali. Considereremo principalmente quello della chimotripsina (Figura 11.29), anche se si può applicare a tutte le serina proteasi e a determinati altri enzimi idrolitici.

delle serina proteasi. Riassumete i ruoli dei residui Asp102, His 57 e Ser 195 in questo meccanismo di reazione.

SCHEMA DI PROCESSO

His 57

Asp 102 CH2

.O

...

H2C

C –

H

....

Ser 195

N1

O

3

.. H

O

R9 Polipeptide substrato

CH2

.O

...

H2C

C –

H

O

3

N+

H

.

....

H

Ser 195

N1 3

CH2

N O H

....

O

CH2

.O

...

C –

H

Ser 195

N1

O

3

CH2

N

3 H2O

O

H

R9NH2

R

R9

Nuovo N-terminale della catena polipeptidica tagliata

C

N

O

H

Intermedio acil-enzima

CH2 H

Ser 195

N N+

CH2

His 57

Asp 102 H2C

CH2

.O

...

C –

O

Ser 195

H N

CH2

N

5

H

Enzima attivo

O

H

Demolizione dell’intermedio tetraedrico tramite catalisi acida generale e formazione del prodotto carbossilico della reazione e dell’enzima attivo.

....

.

C –

H2C

4

Asp 102 H2C

O

H

His 57

Asp 102

C

His 57 O ...

Perdita del prodotto amminico e sua sostituzione da parte di una molecola di acqua.

R O

Formazione dell’intermedio tetraedrico mediante catalisi basica generale e attacco nucleofilico.

O–

Scissione dell’intermedio tetraedrico in acil-enzima 2 mediante catalisi acida generale.

CH2

O

C

H

O

His 57 C –

R N

Intermedio tetraedrico

C

....

H2C

O

R9

Complesso enzima-substrato

O ...

CH2 H

Attacco nucleofilico R

N

Asp 102

Ser 195

N1

1

CH2

N

His 57

Asp 102

....

Formazione dell’intermedio tetraedrico mediante catalisi basica generale e attacco nucleofilico.

+

R O

Intermedio tetraedrico

H

O

R

C O–

Nuovo C-terminale della catena polipeptidica tagliata

O

H

C O

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

1. Dopo che la chimotripsina ha legato un substrato, la Ser 195 attacca nucleofilicamente il gruppo carbonilico del peptide suscettibile, formando lo stato di transizione della reazione (catalisi covalente), che per ragioni storiche, è chiamato anche intermedio tetraedrico. Studi ai raggi X indicano che la Ser 195 si trova in posizione ideale per effettuare questo tipo di attacco nucleofilico (effetti di prossimità e orientamento). L’attacco nucleofilico comporta il trasferimento di un protone all’anello imidazolico di His 57, formando così uno ione imidazolio (catalisi basica generale). Tale processo è agevolato dall’effetto polarizzante dello ione carbossilico deprotonato e non solvatato di Asp 102, che è unito tramite legame idrogeno a His 57 (catalisi elettrostatica). L’esistenza dell’intermedio tetraedrico è ben definita, sebbene transitoria. Vedremo che gran parte del potere catalitico della chimotripsina si deve al suo legame preferenziale dello stato di transizione che porta a questo intermedio (catalisi da stato di transizione). 2. L’intermedio tetraedrico si decompone in un intermedio acil-enzima favorito dalla donazione di un protone dall’atomo N3 dell’His 57 (catalisi acida generale) facilitata dall’effetto polarizzante dell’Asp 102 sulla stessa His 57 (catalisi elettrostatica). 3. Il gruppo amminico uscente (R′NH2, la nuova porzione N-terminale della catena polipeptidica scissa) è rilasciato dall’enzima e sostituito da una molecola di acqua. 4. L’intermedio acil-enzima, che è altamente suscettibile alla scissione per idrolisi, reagisce con la molecola di acqua percorrendo in senso inverso la tappa 2 e formando un secondo intermedio tetraedrico 5. L’inverso della tappa 1 forma il prodotto carbossilato (la nuova porzione C-terminale della catena polipeptidica scissa) rigenerando così l’enzima attivo. Nel corso di questo processo l’acqua è il nucleofilo che compie l’attacco e Ser 195 è il gruppo uscente. Le serina proteasi legano preferenzialmente lo stato di transizione. Approfon-

diti raffronti condotti sulle strutture ai raggi X di diversi complessi serina proteasi-inibitore hanno consentito di chiarire ulteriormente le basi strutturali della catalisi in questi enzimi (Figura 11.30). 1. La distorsione conformazionale che si osserva con la generazione dell’intermedio tetraedrico (la conversione di un atomo di C trigonale con ibridazione sp2 nella sua forma tetraedrica con ibridazione sp3) determina lo spostamento in profondità dell’ossigeno carbonilico ora anionico del legame suscettibile all’interno del sito attivo in modo da occupare una posizione precedentemente vuota definita buco dellÕossianione.

(a)

Ser 195 His 57

N H O C

Gly 193

Cα Cβ

HN

N R¢

Gly 193 O NH ...–O C

Asp 102

...

NH

... O–

O O

C R

N H

...

R

.

C

His 57

N H

O H

O

NH

Aggiungete il gruppo DIP per dimostrare che agisce come analogo dello stato di transizione.

Ser 195

....

Gly 193

Figura 11.30 Stabilizzazione dello stato di transizione nelle serina proteasi. (a) Quando il substrato si lega all’enzima, il carbonio carbonilico trigonale del legame peptidico suscettibile non può legarsi al buco dell’ossianione per limitazioni conformazionali (in alto a sinistra). (b) Nell’intermedio tetraedrico l’ossigeno carbonilico ora carico del peptide (l’ossianione) penetra nel buco dell’ossianione e forma legami idrogeno con i gruppi NH della Gly 193 e della Ser 195 dello scheletro covalente. La successiva distorsione conformazionale consente al gruppo NH della del residuo che precede il legame peptidico suscettibile di dare origine a un legame idrogeno con Gly 193, che altrimenti non si formerebbe. I siti attivi delle serina proteasi legano preferibilmente lo stato di transizione (l’intermedio tetraedrico). [Robertus, J.D., Kraut, J., Alden, R.A. e Birktoft, J.J. (1972). Biochemistry 11, 4302.]

(b)

Buco dell’ossianione

N H

375

O C

Gly 193

Cα Cβ

–O C HN ... H N + N..H.. R¢

Asp 102

376

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

2. In questa posizione l’ossigeno anionico forma due legami idrogeno con l’enzima, che non possono formarsi quando il gruppo carbonilico si trova nella propria disposizione trigonale consueta. Joseph Kraut fu il primo a riscontrare che i due donatori di legami idrogeno che fanno parte dell’enzima occupano posizioni corrispondenti nella chimotripsina e nella subtilisina. Il ricercatore propose l’esistenza del buco dell’ossianione basandosi sulla premessa che l’evoluzione convergente aveva reso funzionalmente identici i siti attivi di questi enzimi non correlati. 3. Inoltre, la distorsione tetraedrica consente la formazione di un legame idrogeno altrimenti impossibile tra l’enzima e il gruppo NH dello scheletro appartenente al residuo che precede il legame peptidico suscettibile.

Questo legame preferenziale dello stato di transizione (o dell’intermedio tetraedrico) rispetto al complesso enzima-substrato oppure all’intermedio acil-enzima è responsabile di gran parte dell’attività catalitica delle serina proteasi. Pertanto, mutando qualcuno o tutti i residui contenuti nella triade catalitica della chimotripsina, si ottengono molecole enzimatiche che aumentano ancora la velocità di proteolisi di circa 5 × 104 volte rispetto alla reazione non catalizzata (in confronto a un incremento di velocità di circa 1010 dell’enzima nativo). Analogamente, il motivo per il quale il DIPF è un inibitore così efficace delle serina proteasi sta nel fatto che il suo gruppo fosforico tetraedrico fa diventare questo composto un analogo dello stato di transizione. I legami idrogeno a bassa barriera possono stabilizzare lo stato di transizione.

Lo stato di transizione della reazione della chimotripsina è reso stabile non solo attraverso la formazione di ulteriori legami idrogeno nel buco dell’ossianione, ma forse anche dall’instaurarsi di un legame idrogeno insolitamente forte. I trasferimenti di protoni tra gruppi che formano legami idrogeno (D−H···A) avvengono a velocità fisiologicamente ragionevoli solo quando il pK del donatore di protoni non supera di 2-3 unità di pH quello della forma protonata dell’accettore di protoni. Quando i pK dei gruppi donatore (D) e accettore (A) di legami idrogeno sono quasi uguali, non si osserva più una distinzione tra questi: l’atomo di idrogeno viene condiviso in misura più o meno equivalente tra di loro (D···H···A). Questi legami idrogeno a bassa barriera sono di solito corti e forti. I loro valori di energia libera, misurati in fase gassosa, arrivano a –40/–80 kJ ∙ mol−1 (rispetto ai –12/–30 kJ ∙ mol−1 dei legami idrogeno normali) e presentano una lunghezza del legame D···A minore di 2,55 Å per O−H···O e minore di 2,65 Å per N−H···O (invece dei 2,8-3,1 Å dei legami idrogeno normali). È poco probabile che questi legami idrogeno a bassa barriera siano presenti in una soluzione acquosa diluita, poiché le molecole di acqua, che sono eccellenti donatori e accettori di legami idrogeno, competono in maniera efficace con D−H e A per i siti riservati a questi legami. Essi si possono formare nei siti attivi, privi di acqua, degli enzimi. In effetti, evidenze sperimentali indicano che, nella triade catalitica delle serina proteasi, i pK delle forme protonate di His e Asp all’incirca si equivalgono e che il legame idrogeno tra His e Asp mostra una distanza N···O insolitamente breve, pari a 2,62 Å, con l’atomo di H centrato approssimativamente tra quelli di N e di O. Tali conclusioni sono coerenti con la formazione di un legame idrogeno a bassa barriera nello stato di transizione. La “strategia” utilizzata dall’enzima consiste quindi nel convertire un legame idrogeno debole del complesso iniziale enzima-substrato in un legame dello stesso tipo, ma forte, nello stato di transizione, rendendo così più facile il trasferimento di protoni dalla Ser 195 alla altrimenti scarsamente basica His57 (Figura 11.29, passaggio 1). La differenza di energia libera esistente tra i legami idrogeno normali e quelli a bassa barriera viene utilizzata per legare preferenzialmente lo stato di transizione.

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

377

Sebbene molte ricerche abbiano rivelato l’esistenza di legami idrogeno insolitamente corti nei siti attivi degli enzimi, è di gran lunga più difficile dimostrare per via sperimentale quanto questi legami siano forti, come è previsto per quelli a bassa barriera. Di fatto, numerosi studi riguardanti la lunghezza di legami idrogeno stranamente corti in composti organici modello in soluzioni non acquose indicano che questi legami idrogeno non sono insolitamente forti. Di conseguenza è sorto un ampio dibattito sul loro significato catalitico. Tuttavia, se gli enzimi non generano questi legami idrogeno particolari, rimane da chiarire come mai la base coniugata di un gruppo acido (per esempio, Asp 102) estrae in modo parziale un protone da un gruppo molto più basico (per esempio, His 57), una peculiarità riscontrata in numerosi meccanismi enzimatici. L’intermedio tetraedrico è simile al complesso della tripsina con il suo inibitore naturale. Forse le prove strutturali più convincenti sull’esistenza dell’intermedio

tetraedrico sono state fornite da Robert Huber con un’indagine ai raggi X del complesso della tripsina con il suo inibitore naturale, una proteina detta inibitore della tripsina di pancreas bovino (BPTI, bovine pancreatic trypsine inhibitor). Il BPTI, una molecola costituita da 58 residui, si lega alla regione del sito attivo della tripsina per dare luogo a un complesso con un’interfaccia altamente condensata e con un intreccio di legami crociati costituiti da ponti idrogeno. Questa interazione impedisce alla tripsina attivata prematuramente nel pancreas di digerire tale organo (Paragrafo 11.5D). La costante di associazione del complesso è di 1013 M−1, una tra le più elevate di tutte le interazioni proteina-proteina note. L’alta affinità tra proteasi e inibitore sottolinea la rilevanza fisiologica del BPTI. La regione di inibitore in contatto con il sito attivo della tripsina è simile al substrato legato. Una specifica catena laterale di Lys del BPTI occupa la tasca di specificità della tripsina (Figura 11.31a), mentre il legame peptidico Lys-Ala dell’inibitore è posizionato come se fosse il legame peptidico suscettibile (Figura 11.31b). Il fatto più significativo circa il complesso BPTI-tripsina è che la sua conformazione è posizionata molto avanti nella coordinata di reazione, verso l’intermedio tetraedrico: l’ossigeno della catena laterale della Ser 195 della tripsina, il residuo di Ser attivo, si trova in contatto più stretto rispetto a quello di van der Waals (2,6 Å) con il carbonio carbonilico, in configurazione piramidale, del peptide “suscettibile” del BPTI. La reazione idrolitica non è in grado di procedere oltre questo punto per la rigidità del complesso, così compatto da non consentire al gruppo uscente di allontanarsi dal sito di reazione e all’acqua di entrare. Gli inibitori delle proteasi si riscontrano con frequenza in natura, dove svolgono funzioni di protezione e di regolazione. Per esempio, determinate piante rilasciano inibitori delle proteasi in risposta alle punture degli insetti, (a)

(b) Ser 195 O

H Ala 16I

O

Ca C

Ca Lys 15I

N H

Figura 11.31 Il complesso tripsinaBPTI. (a) La struttura ai raggi X mostra una sezione generata al computer del complesso che rivela la modalità di legame della tripsina (in rosso) al BPTI (in verde). La sporgenza verde che si estende all’interno della cavità vicino al centro della figura rappresenta la catena laterale della Lys 15 dell’inibitore che occupa la tasca di specificità della tripsina. Si noti lo stretto adattamento complementare delle due molecole proteiche. [Per gentile concessione di Michael Connolly, New York University.] (b) La Ser 195 della tripsina si trova in contatto più stretto rispetto a quello di van der Waals con il carbonio carbonilico del legame peptidico suscettibile del BPTI (quello tra la Lys 151 e Ala 161), che è distorto in senso piramidale verso la Ser 195. La normale reazione proteolitica sembra arrestarsi in un certo punto della coordinata di reazione che precede l’intermedio tetraedrico.

378

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

causando in tal modo la morte per fame dell’animale che le ha attaccate poiché ne inattivano gli enzimi digestivi. Gli inibitori delle proteasi rappresentano circa il 10% delle proteine del plasma sanguigno. Per esempio, l’inibitore della proteasi a1, che viene secreto dal fegato, inibisce l’elastasi dei leucociti (queste cellule sono un tipo di globuli bianchi; si presume che l’azione di questa elastasi prenda parte al processo infiammatorio). Varianti patologiche dell’inibitore della proteasi α1 ad attività ridotta si associano a enfisema polmonare, una malattia degenerativa a carico del polmone dovuta a idrolisi delle fibre elastiche in esso contenute. I fumatori vanno anche incontro a una riduzione dell’attività dell’inibitore della proteasi α1 dal momento che il fumo ossida un suo residuo essenziale di Met. Dal momento che l’intermedio tetraedrico ricorda lo stato di transizione della reazione della serina proteasi, si ritiene che esso abbia una vita breve e che sia instabile. È stata ottenuta una serie di strutture ai raggi X dell’elastasi di pancreas suino con un substrato peptidico che ha evidenziato il progredire della reazione dallo stadio di intermedio acil-enzima fino al rilascio del prodotto. Anche questa seconda fase della reazione di proteolisi contempla un intermedio tetraedrico (Figura 11.29). Questo complesso acil-enzima è stabile a pH 5,0 e ha la struttura prevista, con il residuo C-terminale di Ile del substrato unito covalentemente mediante un legame estere alla Ser 195 (Figura 11.32a). In questa prima fase dell’intermedio acil-enzima di una serina proteasi, il gruppo acilico è completamente planare, senza alcuna distorsione verso una geometria tetraedrica. Una molecola di acqua è disposta nei pressi del legame estere dell’intermedio impegnata in un legame idrogeno con l’His 57 e sembra pronta ad attaccare nucleofilicamente il legame estere. A pH 5,0 l’His 57 è protonata e agisce da donatore di legami idrogeno per l’acqua (a questo pH non può comportarsi da catalizzatore basico). L’intermedio tetraedrico è stato osservato direttamente.

(a)

Figura 11.32 Struttura dell’intermedio acil-enzima e di quello tetraedrico. L’elastasi di pancreas suino è stata incubata con un substrato eptapeptidico (YPFVEPI, sequenza scritta facendo uso del codice a una lettera). Sono visibili solo i residui da 4 a 7. I residui della proteasi sono specificati per mezzo del codice a tre lettere, mentre gli atomi sono colorati in base al tipo, con C dell’elastasi in verde, C del substrato in azzurro, N in blu, O in rosso e S in giallo. (a) A pH 5,0 un legame covalente (in rosso) unisce l’atomo di O della Ser 195 con l’atomo di C (I7) C-terminale del substrato. Una molecola d’acqua (sfera in arancione) sembra sul punto di compiere un attacco nucleofilico sull’atomo di C

(b)

carbonilico dell’acil-enzima. Le linee tratteggiate rappresentano legami idrogeno rilevanti sotto il profilo catalitico, mentre la linea punteggiata indica la traiettoria che la molecola di acqua verosimilmente segue durante l’attacco nucleofilico sull’atomo di C carbonilico del gruppo acilico. (b) Quando il complesso è portato a pH 9,0 e quindi rapidamente congelato, la molecola di acqua diventa un sostituente ossidrilico (in arancione) per l’atomo di C carbonilico, generando in tal modo l’intermedio tetraedrico che ricorda lo stato di transizione. [Basata su strutture ai raggi X determinate da Christopher Schofield e Janos Hadju, University of Oxford, GB. PDBid: (a) 1HAX, (b) 1HAZ.]

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

Per determinare la tappa seguente della reazione, un cristallo di acil-enzima è stato immerso in una soluzione a pH 9,0 (si ricordi che i cristalli delle proteine contengono grandi zone occupate dal solvente e che quindi i protoni e altre piccole sostanze possono diffondere all’interno e all’esterno del sito attivo dell’enzima cristallizzato, Paragrafo 6.2A). La risultante deprotonazione dell’His 57 innesca la reazione idrolitica (tappa 4 della Figura 11.29). Dopo 1-2 minuti i cristalli sono stati congelati in azoto liquido per bloccare la reazione in modo da poter determinare la struttura ai raggi X del complesso dell’enzima. In questo modo è stato possibile intrappolare e osservare l’intermedio tetraedrico (Figura 11.32b). Durante la sua formazione, la struttura del buco dell’ossianione non viene alterata in alcun modo, ma il substrato peptidico si sposta internamente alla sua tasca di legame per distorcersi verso una geometria tetraedrica. L’intermedio tetraedrico presenta la conformazione prevista simile a quella degli inibitori analoghi dello stato di transizione. Però esso non si unisce al gruppo amidico del buco dell’ossianione (Figura 11.30) così saldamente da non potere in seguito dissociarsi.

D Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi Gli enzimi proteolitici sono solitamente biosintetizzati come precursori inattivi di dimensioni più grandi e noti come zimogeni (in generale, i precursori degli enzimi sono conosciuti anche con il nome di proenzimi). Nel caso degli enzimi digestivi il motivo della loro produzione in forma inattiva è evidente: se fossero prodotti in forma attiva, digerirebbero i tessuti di origine. In effetti la pancreatite acuta, un disturbo doloroso e talvolta fatale che può essere provocato da un trauma subito dal pancreas, si contraddistingue per l’attivazione prematura degli enzimi digestivi sintetizzati da quest’organo. Il tripsinogeno, lo zimogeno della tripsina, si attiva quando viene secreto dal pancreas nel duodeno. La enteropeptidasi, una serina proteasi la cui secrezione dalla mucosa duodenale è sotto controllo ormonale, taglia l’esapeptide N-terminale del tripsinogeno scindendo specificamente il suo legame peptidico Lys 15− Ile 16 (Figura 11.33). Dal momento che questo taglio attivante avviene in corrispondenza di un sito riconosciuto anche dalla tripsina (si ricordi che la tripsina taglia dopo i residui di Arg e di Lys), anche una piccola quantità di tripsina prodotta dalla enteropeptidasi catalizza l’attivazione di altro tripsinogeno, generando altra tripsina e così via. Di conseguenza, si dice che l’attivazione del tripsinogeno è autocatalitica. Il chimotripsinogeno è poi attivato mediante proteolisi catalizzata dalla tripsina del suo legame peptidico Arg 15−Ile 16. La proelastasi, lo zimogeno dell’elastasi, è attivato per rottura di un singolo legame peptidico da parte della tripsina, eliminando un breve peptide

+ H3N

10

Val

(Asp)4

15

16

Lys

Ile

...

Val

Tripsinogeno enteropeptidasi o tripsina + H3N

Val

(Asp)4

Lys

+

Ile

Val

...

Tripsina Figura 11.33 Attivazione del tripsinogeno a tripsina. L’eliminazione per via proteolitica dell’esapeptide N-terminale è catalizzata dalla enteropeptidasi o dalla tripsina. Usando il sistema di numerazione impiegato per i residui del chimotripsinogeno, il terminale amminico del tripsinogeno diventa il residuo 10 e l’N-terminale della tripsina diventa il residuo 16.

379

380

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

N-terminale. La tripsina induce pure attivazione delle procarbossipeptidasi A e B e della profosfolipasi A2 pancreatiche (Paragrafo 9.1C). La natura autocatalitica dell’attivazione del tripsinogeno e il fatto che la tripsina attivi altri enzimi idrolitici rendono essenziale che il tripsinogeno non sia attivato nel pancreas. Abbiamo visto che il legame praticamente irreversibile di inibitori della tripsina, come per esempio il BPTI, alla tripsina, costituisce un meccanismo di difesa nei confronti di un’attivazione inopportuna del tripsinogeno. L’attivazione sequenziale dei proenzimi rappresenta un sistema rapido per formare quantità di enzimi attivi in risposta a segnali fisiologici diversi. Per esempio, le serina proteasi responsabili della coagulazione del sangue sono sintetizzate in forma di zimogeni dal fegato e rimangono tali in circolazione fino a quando non sono attivate da una lesione a un vaso sanguigno (Scheda 11.4).

SCHEDA 11.4

LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA

La cascata di coagulazione del sangue Quando un vaso sanguigno viene danneggiato, l’aggregazione delle piastrine (piccole cellule del sangue prive di nucleo) determina la formazione di un coagulo e di un reticolo insolubile di fibrina che intrappola altre cellule del sangue.

[Andrew Syred/Photo Researchers.]

La fibrina è prodotta a partire dalla proteina circolante solubile fibrinogeno attraverso l’azione della serina proteasi trombina, l’ultima di una serie di enzimi di coagulazione attivati in maniera sequenziale mediante proteolisi dei rispettivi zimogeni. Il processo complessivo (pagina seguente) è noto con il nome di cascata della coagulazione, sebbene evidenze sperimentali dimostrino che la via non è strettamente lineare, come l’analogia con una cascata potrebbe far pensare. Ai vari componenti della cascata della coagulazione, che includono enzimi e cofattori proteici non enzimatici, sono assegnati numeri romani, prevalentemente per ragioni storiche che non ne riflettono l’ordine di azione in vivo. Il suffisso «a» indica un fattore attivo. I domini catalitici delle proteasi coinvolte nella coagulazione sono simili a quello della tripsina per sequenza e meccanismo, anche se molto più specifici per i loro substrati. Altri domini mediano le interazioni con i cofattori e agevolano l’ancoraggio delle proteine alla membrana delle piastrine, che serve da “supporto” per numerose reazioni coinvolte nella coagulazione. La coagulazione prende avvio quando una proteina di membrana (fattore tissutale) esposta al flusso ematico in seguito a un danno a un tessuto forma un complesso con

il fattore VII o VIIa circolante (il fattore VIIa è generato a partire dal fattore VII mediante bassissime quantità di altre proteasi attive nella coagulazione, incluso il fattore VIIa stesso). Il complesso fattore tissutale-VIIa converte proteoliticamente lo zimogeno fattore X in fattore Xa, il quale converte poi la protrombina in trombina, che dà successivamente origine alla fibrina a partire dal fibrinogeno. Le tappe della coagulazione che dipendono dal fattore tissutale sono note nel loro insieme come via estrinseca poiché la fonte di fattore tissutale è extravascolare. Questa via è rapidamente attenuata grazie all’azione di una proteina che inibisce il fattore VII, una volta che è stato generato il fattore Xa. Un’attivazione sostenuta della trombina richiede l’attività della via intrinseca (così definita poiché tutte le sue componenti sono presenti in circolo). Essa è stimolata dal complesso fattore tissutale-VIIa, che converte il fattore IX nella sua forma attiva, il fattore IXa. La risultante trombina attiva un certo numero di componenti della via intrinseca, compreso il fattore XI, una proteasi che attiva il fattore IX, allo scopo di innescare la coagulazione in assenza di fattore tissutale o fattore VIIa. La trombina attiva anche i fattori V e VIII, che sono cofattori e non proteasi; il fattore Va promuove l’attivazione della protrombina da parte del fattore Xa a una velocità 20 000 volte più elevata, mentre il fattore VIIIa induce l’attivazione del fattore X, da parte del fattore IXa, con un effetto analogo. Pertanto la trombina promuove la propria attivazione attraverso un meccanismo di retroazione che amplifica i passaggi precedenti della cascata. Anche il fattore XIII è attivato dalla trombina; il fattore XIIIa, che non è una serina proteasi, determina la formazione per via chimica di legami trasversali tra le molecole di fibrina attraverso la costituzione di legami peptidici tra le catene laterali del glutammato e della lisina, generando una robusta rete di fibrina. La via intrinseca della coagulazione può essere indotta dall’esposizione a superfici cariche negativamente, come per esempio il vetro. Di conseguenza, quando il sangue viene raccolto in una provetta di vetro pulita, esso si coagula. In assenza di fattore tissutale, un coagulo di fibrina può non comparire per svariati minuti, ma quando questo è presente si osserva la formazione di coaguli nel giro di alcuni secondi. Ciò indica che una rapida coagulazione del sangue in vivo richiede sia il fattore tissutale sia le proteine coinvolte nella via intrinseca. Ulteriori evidenze a sostegno dell’importanza della via estrinseca stanno nel fatto che individui carenti di fattore VII tendono ad andare incontro a gravi emorragie. ^ (segue)

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

381

SCHEDA 11.4 LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA (continua)

Un sanguinamento anomalo costituisce altresì il risultato di difetti congeniti a carico del fattore VIII (emofilia a) o del fattore IX (emofilia b). Nella cascata della coagulazione l’attivazione sequenziale degli zimogeni conduce a un grande incremento dell’attività trombinica, dal momento che bassissime quantità dei fattori VIIa, IXa e Xa possono attivare grandi quantità dei rispettivi substrati. Le potenzialità dell’amplificazione, nella cascata della coagulazione, si riflettono nelle concentrazioni plasmatiche delle proteine coinvolte in tale processo (vedi la tabella che segue). In ultima analisi la trombina, forse senza che ciò desti sorpresa, attiva meccanismi che interrompono la formazione dei coaguli, limitando

VIA ESTRINSECA Lesione vascolare VIA INTRINSECA Fattore tessutale Fattore XI

Fattore XIa

Fattore IX

Fattore VIIa– Fattore tessutale

Fattore IXa

Fattore VII– Fattore tessutale Fattore IX

VIIIa VIII Fattore X

Fattore Xa

Fattore X

Va V

Protrombina

Trombina Fattore XIII

Concentrazioni plasmatiche inerenti ad alcuni fattori della coagulazione nellÕuomo Fattore

Fibrinogeno

Concentrazione (𝛍M)a

XI

0,06

IX

0,09

VII

0,01

X

0,18

Protrombina

1,39

Fibrinogeno

8,82

a

Concentrazioni calcolate da dati contenuti in High, K.A. e Roberts, H.R. (a cura di) (1995). Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis. Marcel Dekker.

Fibrina Fattore XIIIa Fibrina che forma legami trasversali

[Figura adattata da Davie, E.W. (1995). Thromb. Haemost. 74, 2.]

così la durata del processo della coagulazione e quindi l’ampiezza del coagulo. Tale controllo della coagulazione assume estrema rilevanza fisiologica poiché la formazione di un solo coagulo di sangue nel momento sbagliato della vita di una persona può comportare conseguenze drammatiche.

Dal momento che gli zimogeni della tripsina, della chimotripsina e dell’elastasi contengono tutti i loro residui catalitici, perché non sono enzimaticamente attivi? Confrontando la struttura ai raggi X del tripsinogeno con quella della tripsina si è osservato che il residuo di Ile 16 N-terminale liberato dall’azione dell’enteropeptidasi si sposta dalla superficie della proteina verso una posizione interna, dove il suo gruppo amminico cationico libero forma una coppia ionica con il residuo invariante anionico di Asp 194 situato nei pressi della triade catalitica (Figura 11.26). In assenza di tale variazione conformazionale, l’enzima non può legare in maniera corretta il substrato o stabilizzare l’intermedio tetraedrico poiché la formazione della sua tasca di specificità e del buco dell’ossianione avviene in modo non corretto. Questa circostanza fornisce ulteriori evidenze strutturali a favore del ruolo del legame preferenziale dello stato di transizione nel meccanismo di catalisi delle serina proteasi. Poiché le loro triadi catalitiche sono intatte dal punto di vista strutturale, gli zimogeni delle serina proteasi mostrano in realtà bassi livelli di attività enzimatica, un’osservazione effettuata solo dopo che i confronti strutturali di cui abbiamo parlato avevano suggerito questa ipotesi. Gli zimogeni hanno siti attivi distorti.

PUNTO DI VERIFICA

• Come si possono identificare i residui amminoacidici in un sito attivo?

• Riassumete i ruoli che hanno i residui che costituiscono il sito attivo delle serina proteasi.

• Quali sono i meccanismi catalitici che contribuiscono maggiormente all’aumento della velocità?

• Spiegate la funzione del buco dell’ossianione.

• Qual è il ruolo svolto dai legami idrogeno a bassa energia nella catalisi delle serina proteasi?

• Che cosa rivela l’inibitore della tripsina bovina circa il meccanismo catalitico della tripsina?

• Quali sono i vantaggi nel sintetizzare le proteasi sotto forma di zimogeni?

382

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

RIASSUNTO 1 Le proprietà generali degli enzimi • Gli enzimi, che sono quasi tutti di natura proteica, sono ripartiti in sei classi per quanto riguarda il meccanismo d’azione. • Gli enzimi accelerano le reazioni di un fattore che può arrivare sino a 1015. • La specificità di substrato di un enzima dipende dalle caratteristiche geometriche ed elettroniche del suo sito attivo. • Alcuni enzimi catalizzano le reazioni con l’aiuto di cofattori rappresentati da ioni metallici o di coenzimi organici che svolgono la funzione di cosubstrati capaci di legarsi irreversibilmente o di gruppi prostetici associati in via permanente. Numerosi coenzimi derivano da vitamine.

2 L’energia di attivazione e la coordinata

• Un meccanismo particolarmente importante della catalisi mediata da enzimi è il legame preferenziale dello stato di transizione della reazione catalizzata.

4 Il lisozima • Nel meccanismo di catalisi del lisozima il residuo di Glu 35 nella sua forma protonata agisce da catalizzatore acido per rompere il legame peptidico suscettibile del substrato polisaccaridico tra i suoi anelli D ed E. Il residuo di Asp 52 nel suo stato anionico genera invece un legame covalente con C1 dell’anello D. • La reazione è agevolata dalla distorsione del residuo D nella conformazione planare a mezza sedia che ricorda lo ione ossonio, ossia lo stato di transizione ossianionico della reazione.

5 Le serina proteasi

di reazione • Gli enzimi catalizzano le reazioni diminuendo l’energia libera di attivazione, ∆G‡, che è l’energia libera richiesta per raggiungere lo stato di transizione, ossia il punto a più alta energia libera nella reazione.

3 I meccanismi di catalisi • Gli enzimi sfruttano i medesimi meccanismi catalitici impiegati dai catalizzatori chimici, comprese la catalisi acida generale e basica generale, la catalisi covalente e la catalisi da metalli. • La disposizione dei gruppi funzionali in un sito attivo di un enzima consente la catalisi da prossimità e orientamento, come anche la catalisi elettrostatica.

• Le serina proteasi contengono una triade catalitica Ser–His–Asp nelle vicinanze di una tasca di legame che determina la specificità per il substrato dell’enzima. • Nelle serina proteasi la catalisi avviene attraverso catalisi acido-base, catalisi covalente, effetti di prossimità e orientamento, catalisi elettrostatica e legame preferenziale dello stato di transizione nel buco dell’ossianione. • La sintesi delle proteasi pancreatiche in forma di zimogeni inattivi protegge tale organo dall’autodigestione. Gli zimogeni vengono attivati attraverso specifici tagli proteolitici.

PROBLEMI 4. Quale tipo di enzima (Tabella 11.2) catalizza le seguenti rea-

1. Scegliete la descrizione più appropriata di enzima.

(a) Consente a una reazione chimica di avvenire in maniera estremamente rapida. (b) Determina un aumento della velocità di una reazione chimica rispetto alla velocità della reazione non catalizzata. (c) Rende una reazione favorevole sotto il profilo termodinamico. 2. Quale relazione si osserva tra la velocità di una reazione catalizzata da un enzima e quella della corrispondente reazione non sottoposta a catalisi? Gli enzimi incrementano la velocità delle reazioni non catalizzate lente della stessa entità con cui aumentano quelle delle reazioni non catalizzate veloci? 3. Quale tipo di enzima (Tabella 11.2) catalizza le seguenti reazioni? _ COO

(a) H

_ COO

CH3

C

H3C

(b)

_ COO C CH3

O

_

COO C

O

+

NADH

CH3 _ COO HO

(b)

H+

C

_ COO

CH3

+

O

C

O

+

NAD+

C

O

(CH2)2

C

_ O

+

H

C

(CH2)2

NH+ 3

+

ATP

_ COO O

H

C CH3

H

+

H+

+

NH+ 3

NH+ 3

NH+ 3

(a)

H

H

C

zioni?

NH+ 4

O

+

C NH2

ADP

+

Pi

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

© 978-88-08-42096-1

5. Sul diagramma di energia libera in funzione della coordinata

di reazione che segue, contrassegnate l’intermedio (o gli intermedi), e lo stato di transizione oppure gli stati di transizione se ve ne fossero più di uno. La reazione è favorevole dal punto di vista termodinamico?

G

Coordinata di reazione

6. Disegnate un diagramma dello stato di transizione relativo (a)

Velocitˆ

a una reazione non enzimatica e alla corrispondente reazione catalizzata da enzima in cui (b) S si lega all’enzima debolmente e (c) S vi si lega molto saldamente. Raffrontate il valore di ∆G‡ per ciascun caso. Per quale motivo un legame saldo di S non è vantaggioso? 7. Di quanto, approssimativamente, la nucleasi di stafilococco (Tabella 11.1) diminuisce l’energia libera di attivazione (∆G‡) della sua reazione (l’idrolisi di un legame fosfodiesterico) a 25 °C? 8. Calcolate l’aumento di velocità che si dovrebbe avere utilizzando un enzima che forma un legame idrogeno a bassa barriera con il suo stato di transizione a 25 °C. 9. Spiegate perché l’attività di un enzima varia con la temperatura come mostrato nella figura.

20 40 Temperatura (8C)

10. Il meccanismo di catalisi covalente di una molecola enzimati-

ca dipende da un unico residuo di Cys presente nel sito attivo e il cui pK è pari a 8. Una mutazione in un residuo circostante altera il microambiente e il valore di pK della Cys aumenta fino a 10. La mutazione causa un incremento o un abbassamento della velocità della reazione? Circostanziate le vostre affermazioni. 11. Studi condotti a valori di pH differenti evidenziano che un enzima presenta due residui importanti sul piano catalitico i cui pK sono ∼4 e ∼10. Esperimenti di modificazione chimica indicano che un residuo di Glu e uno di Lys sono essenziali per l’attività catalitica. Fate corrispondere questi ultimi ai relativi pK e spiegate se è verosimile che essi agiscano in qualità di catalizzatori acido-base.

383

12. Spiegate come mai la RNasi A non è in grado di catalizzare l’i-

drolisi del DNA. 13. L’ureasi, il primo enzima a essere stato cristallizzato, è inibito

dalla presenza degli ioni Hg, Cd o Co. Che cosa vi suggerisce questa informazione sul meccanismo catalitico dell’ureasi? 14. Wolfenden ha affermato che non ha senso operare una distinzione tra i “siti di legame” e i “siti catalitici” degli enzimi. Spiegate come mai. 15. Chiarite perché il lisozima scinde il substrato artificiale (NAG)4 circa 4000 volte più lentamente rispetto a (NAG)6. 16. Vi aspettereste che il lisozima idrolizzi la cellulosa? Perché sì o perché no? 17. Disegnate un inibitore dell’elastasi contenente clorometilchetone. 18. Prevedete l’effetto della mutazione di Asp 102 della tripsina in Asn (a) sul legame del substrato e (b) sulla catalisi. 19. Disegnate schematicamente le interazioni mediante legami idrogeno della triade catalitica His–Lys–Ser nel corso della catalisi in un ipotetico enzima idrolitico. 20. Il confronto delle geometrie dei siti attivi della chimotripsina e della subtilisina, ipotizzando che le loro analogie assumano significato catalitico, ha condotto a comprendere più in profondità il meccanismo d’azione di entrambi gli enzimi. Discutete la validità di questa strategia. DOMANDE DIFFICILI 21. Utilizzando come punto di partenza la reazione mostrata

nella Scheda 11.1 (l’attacco di un’ammina sul gruppo carbonilico di un chetone), disegnate le frecce curve che rappresentano la reazione di catalisi basica (quando è presente il gruppo –B:). 22. Utilizzando come punto di partenza la reazione mostrata nella Scheda 11.1 (l’attacco di un’ammina sul gruppo carbonilico di un chetone), disegnate le frecce curve per rappresentare la reazione di catalisi acida (quando è presente il gruppo –A–H). 23. Qual è la caratteristica dell’RNA che gli permetterebbe di funzionare come un ribozima? Perché non ci sono, in natura, molecole di DNA che si comportano come enzimi? 24. Indicate un analogo dello stato di transizione della prolina racemasi che differisca da quelli discussi nel testo. Motivate la vostra scelta. 25. I residui di Asp 101 e Arg 114 del lisozima sono necessari per una catalisi efficiente, sebbene essi siano situati a una certa distanza dal sito attivo formato da Glu 35 e Asp 52. La sostituzione di Ala al posto di Asp 101 o di Arg 114 non altera in misura significativa la struttura terziaria dell’enzima, ma ne riduce considerevolmente l’attività catalitica. Spiegate per quale ragione. 26. Prevedete che effetto avrà sull’attività del lisozima la mutazione di Glu 35 a Asp e la mutazione di Asp 52 a Glu. 27. In determinate condizioni è favorita, sotto il profilo termodinamico, la formazione di un legame peptidico piuttosto che la sua idrolisi. Ci si potrebbe attendere che la chimotripsina catalizzi la formazione di tale legame? 28. Per quale motivo la mancanza di una stretta specificità di substrato evidenziata dalla chimotripsina è vantaggiosa in vivo? Perché ciò costituirebbe un inconveniente per determinate altre proteasi? 29. Il tofu, un prodotto della soia ad alto contenuto di proteine, è preparato in modo da rimuovere l’inibitore della tripsina presente in questa specie vegetale. Spiegate il motivo, oppure i motivi, alla base di questo trattamento.

384

CAPITOLO 11

La catalisi enzimatica

30. Molti degli enzimi idrolitici delle cellule sono localizzati nei li-

sosomi dove il pH è circa 5. Quale sarà il pH ottimale di questi enzimi e perché ciò può proteggere il resto della cellula dal potenziale distruttivo di questi enzimi nel caso in cui, accidentalmente, questo organello si rompesse? 31. Un difetto genetico nel fattore IX della coagulazione è causa dell’emofilia b, una malattia contraddistinta da una tendenza a un’abbondante emorragia in seguito a un trauma molto limitato. Un difetto genetico nel fattore XI della coagulazione non presenta però sintomi clinici. Spiegate tale discrepanza in termini di diverso meccanismo di attivazione delle proteasi della coagulazione mostrate nella Scheda 11.4. 32. Gli emofiliaci a cui manca il fattore IX sono spesso sottoposti a infusioni di fattore VIII per ristabilire la normale attività di coagulazione del sangue. Spiegate perché.

© 978-88-08-42096-1

amminoacidici di Asn e Gln e vengono proposti i possibili meccanismi di queste reazioni. Prerequisiti: Capitoli 5 e 11 • Metodologie analitiche delle proteine, in particolare l’isoelettrofocusing. • Meccanismi enzimatici, in particolare quelli delle proteasi papaina e chimotripsina.

APPROFONDIMENTO Le cellule eucariotiche contengono una classe di proteasi conosciuta con il nome di caspasi. Quali sono i residui catalitici che danno il nome a queste proteasi? Qual è il ruolo di questi residui nella catalisi e in che modo il meccanismo di azione catalitica delle caspasi è paragonabile a quello delle serina proteasi? In che modo vengono attivate le caspasi e qual è il risultato della loro attività all’interno della cellula?

CASO DI STUDIO Caso 11 La deamminazione non enzimatica dei residui di asparagina e glutammina nelle proteine Concetto chiave: vengono esaminati i fattori che influenzano la deamminazione idrolitica nelle proteine dei residui

BIBLIOGRAFIA Generale Benkovic, S.J. e Hammes-Schiffer, S. (2003). A perspective on enzyme catalysis, Science 301, 1196-1202. [Include la storia di alcune delle teorie formulate e degli esperimenti condotti sulla catalisi.] Bruice, T.C. e Benkovic, S.J. (2000). Chemical basis for enzyme catalysis, Biochemistry 39, 6267-6274. Gerlt, J.A. (1994). Protein engineering to study enzyme catalytic mechanisms, Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 593-600. [Descrive in che modo è possibile acquisire informazioni dalla mutagenesi e dall’analisi strutturale degli enzimi.] Hackney, D.D. (1990). Binding energy and catalysis, in Sigman, D.S. e Boyer, P.D. (a cura di), The Enzymes (3a ed.), Vol. 19, pp. 1-36, Academic Press. Kraut, J. (1988). How do enzymes work? Science 242, 533-540. [Rassegna breve e molto scorrevole che tratta la teoria dello stato di transizione e le relative applicazioni.] Schramm, V.L. (2005). Enzymatic transition states and transition state analogues, Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 604-613. Tipton, K.F. (1993). The naming of parts, Trends Biochem. Sci. 18, 113-115. [Trattazione dei vantaggi insiti in un sistema di nomenclatura coerente degli enzimi e delle difficoltà incontrate nel formularne uno.]

Il lisozima Kirby, A.J. (2001). The lysozyme mechanism sorted – after 50 years, Nature Struct. Biol. 8, 737-739. [Breve riassunto delle evidenze teoriche e sperimentali a favore di un intermedio covalente nel meccanismo del lisozima.] McKenzie, H.A. e White, F.H., Jr. (1991). Lysozyme and α-lactalbumin: Structure, function and interrelationships, Adv. Protein Chem. 41, 173-315. Strynadka, N.C.J. e James, M.N.G. (1991). Lysozyme revisited: crystallographic evidence for distortion of an N-acetylmuramic acid residue bound in site D, J. Mol. Biol. 220, 401-424.

Vocadlo, D.J., Davies, G.J., Laine, R., e Withers, S.G. (2001). Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via a covalent intermediate, Nature 412, 835-838. Wolfenden, R. (2011). Benchmark reaction rates, the stability of biological molecules in water, and the evolution of catalytic power in enzymes, Annu. Rev. Biochem. 80, 645-667.

Le serina proteasi Cleland, W.W., Frey, P.A., e Gerlt, J.A. (1998). The low barrier hydrogen bond in enzymatic catalysis, J. Biol. Chem. 273, 2552925532. Davie, E.W. (1995). Biochemical and molecular aspects of the coagulation cascade, Thromb. Haemost. 74, 1-6. [Breve rassegna condotta da uno dei pionieri dell’ipotesi della cascata.] Fersht, A. (1999). Structure and Mechanism in Protein Science, Freeman. [Comprende una trattazione dettagliata dei meccanismi di reazione della chimotripsina e di altre molecole enzimatiche.] Perona, J.J. e Craik, C.S. (1997). Evolutionary divergence of substrate specificity within the chymotrypsin-like protease fold, J. Biol. Chem. 272, 29987-29990. [Riassume le ricerche volte a identificare le basi strutturali della specificità di substrato nel caso della chimotripsina e di altri enzimi.] Radisky, E.S., Lee, J.M., Lu, C-J.K., e Koshland, D.E., Jr. (2006). Insights into the serine protease mechanism from atomic resolution structures of trypsin reaction intermediates, Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 6835-6840. [Sovrapposizioni di strutture ai raggi X che rappresentano il complesso enzima-substrato, l’intermedio tetraedrico e l’intermedio acil-enzima illustrando il progredire della reazione.] Wilmouth, R.C., Edman, K., Neutze, R., Wright, P.A., Clifton, I.J., Schneider, T.R., Schofield, C.J., e Hajdu, J. (2001). X-Ray snapshots of serine protease catalysis reveal a tetrahedral intermediate, Nature Struct. Biol. 8, 689-694. [Riporta le prime evidenze strutturali a sostegno di un intermedio tetraedrico nella reazione di idrolisi catalizzata da una serina proteasi.]

C A P I T O L O

1 2

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

L’atorvastatina (in commercio come Lipitor®) è uno dei farmaci più comunemente prescritti. Essa agisce andandosi a legare all’HMG-CoA reduttasi; l’inibizione dell’attività dell’enzima da parte di questo composto può essere quantificata mediante la cinetica enzimatica. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da John Deisenhofer, University of Texas Medical Center, PDBid 1HWK.]

I primi enzimologi, che spesso lavoravano con preparazioni grezze di lievito o di cellule epatiche, non potevano fare molto di più che osservare la conversione dei substrati nei prodotti catalizzata da enzimi non ancora purificati; per questo motivo, la determinazione delle velocità di tali reazioni si rivelò un validissimo strumento per la caratterizzazione dell’attività enzimatica. L’applicazione di semplici modelli matematici all’attività enzimatica in condizioni variabili e in presenza di substrati o di inibitori tra loro in competizione ha consentito di identificare le probabili funzioni fisiologiche e i meccanismi di regolazione di diversi enzimi. Lo studio delle velocità delle reazioni enzimatiche, o cinetica enzimatica, non è oggi meno importante di quanto non lo fosse all’inizio del XX secolo. In molti casi la velocità di una reazione e il modo in cui essa varia in risposta a condizioni differenti rivelano il percorso seguito dai reagenti, fornendo quindi delle indicazioni sul meccanismo della reazione. I dati cinetici, unitamente a informazioni dettagliate sulla struttura di un enzima e sui meccanismi catalitici, sono le fonti più rilevanti di informazioni riguardo alla funzione biologica dell’enzima e possono suggerire vie per modificarlo a scopo terapeutico. Inizieremo le nostre considerazioni sulla cinetica enzimatica riesaminando la cinetica chimica, poi dedurremo le equazioni fondamentali della cinetica enzimatica e descriveremo gli effetti degli inibitori sugli enzimi. Prenderemo in considerazione anche un esempio di regolazione enzimatica per porre in evidenza diversi aspetti della funzione di un enzima. Infine descriveremo alcune applicazioni pratiche dell’inibizione degli enzimi, come lo sviluppo di inibitori enzimatici da impiegare come farmaci.

1 La cinetica delle reazioni CONCETTI CHIAVE

• Le semplici equazioni della velocità descrivono il progredire delle reazioni di primo e di secondo ordine.

• L’equazione di Michaelis-Menten mette in correlazione la velocità iniziale di una reazione con la velocità massima della reazione e la costante di Michaelis per un particolare enzima e un dato substrato.

• L’efficienza catalitica complessiva di un enzima è espressa come Kcat/KM. • Il grafico di Lineweaver-Burk può essere utilizzato per presentare i dati cinetici e per calcolare i valori di KM e Vmax.

• Le reazioni a due substrati possono avvenire con un meccanismo sequenziale, ordinato o casuale, oppure a ping- pong.

386

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

Le misurazioni cinetiche delle reazioni catalizzate dagli enzimi sono tra le tecniche più importanti per illustrare i meccanismi catalitici degli enzimi. La cinetica enzimatica è una branca della cinetica chimica, pertanto iniziamo questo capitolo passando in rassegna i principi che regolano appunto la cinetica chimica.

A Le equazioni della velocità descrivono la cinetica chimica Una reazione con la stechiometria complessiva AnP dove A rappresenta i reagenti e P indica i prodotti, può in realtà avvenire attraverso una sequenza di reazioni elementari (processi molecolari semplici), come per esempio A n I1 n I2 n P In questo caso I1 e I2 stanno a indicare gli intermedi della reazione. Ogni reazione elementare può essere caratterizzata sulla base del numero di specie reagenti e delle velocità con cui queste interagiscono. Le descrizioni di ciascuna reazione elementare costituiscono complessivamente la definizione meccanicistica dell’intero processo di reazione. Anche una reazione complessa catalizzata da enzimi può essere analizzata in termini delle reazioni elementari che la compongono. L’ordine di reazione indica il numero di molecole che partecipano a una reazione elementare. A temperatura costante, la velocità di una reazione elementare

è proporzionale alla frequenza con cui le molecole dei reagenti entrano in contatto. La costante di proporzionalità è nota come costante di velocità ed è rappresentata con la lettera k. Per la reazione elementare A n P, la velocità istantanea di comparsa del prodotto e di scomparsa del reagente, denominata velocità (v) della reazione, è

v

Ð ESEMPIO DI CALCOLO 12.1

Determinate la velocità della reazione elementare X + Y n Z quando il campione contiene 3 μM di X e 5 μM di Y, e k per la reazione è pari a 400 M−1 ∙ s−1.

Utilizzate l’equazione 12.3 e assicuratevi che tutte le unità siano coerenti: v

k [X][Y] (400 M 1 ⭈ s 1 )(3 ␮M )(5 ␮M ) (400 M 1 ⭈ s 1 )(3 10 6 M ) (5 10 6 M ) 9 6 10 M ⭈ s 1 6 nM ⭈ s 1

d [P]

d [A ]

dt

dt

k [A ]

[12.1]

In altre parole, in ogni momento la velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione del reagente A. Questo è un esempio di reazione di primo ordine. Dal momento che la velocità ha come unità la molarità al secondo (M ∙ s−1), la costante di velocità di primo ordine deve avere come unità il reciproco dei secondi (s−1). L’ordine di reazione di una trasformazione chimica elementare corrisponde alla molecolaritˆ della reazione, che rappresenta il numero di molecole che devono simultaneamente collidere per generare un prodotto. Di conseguenza, una reazione elementare di primo ordine è una reazione unimolecolare. Consideriamo la reazione elementare 2A n P. Questa reazione bimolecolare è di secondo ordine e la sua velocità istantanea è descritta da d [A]

v

k [A ]2

dt

[12.2]

In questo caso la velocità di reazione è proporzionale al quadrato della concentrazione di A, e la costante k di velocità di secondo ordine ha come unità M−1 ∙ s−1. Anche la reazione bimolecolare A + B n P è di secondo ordine, con una velocità istantanea descritta da

v

d [A]

d [B ]

dt

dt

k [A ][B ]

[12.3]

In questa circostanza si dice che la reazione è di primo ordine rispetto ad [A], oppure rispetto a [B] (vedi l’Esempio di calcolo 12.1). Le reazioni unimolecolari e bimolecolari sono comuni, invece le reazioni trimolecolari sono rare, in

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

387

quanto la collisione simultanea di tre molecole è un evento che accade più difficilmente. Non si conoscono reazioni di quarto ordine o superiore. L’equazione della velocità descrive il progredire di una reazione in funzione del tempo. Un’equazione della velocitˆ può essere ricavata dalle equazioni che de-

scrivono la velocità istantanea di reazione. Di conseguenza, un’equazione della velocità di primo ordine si ottiene riordinando l’equazione 12.1 d [A] [12.4] d ln [A] k dt [A] e integrandola da [A]0, la concentrazione iniziale di A, ad [A], la concentrazione di A al tempo t: [A]

t

d ln[A]

k

[A]o

dt

[12.5]

0

Alla fine si ottiene ln[A]

ln[A]o

kt

[12.6]

oppure, ricavando l’antilog da entrambi i termini, [A] = [A]0 e−kt

[12.7]

L’equazione 12.6 è un’equazione lineare del tipo y = mx + b e può essere posta in grafico come illustrato nella Figura 12.1. Perciò, se una reazione è di primo ordine, un grafico di ln[A] in funzione del tempo t sarà una linea retta la cui pendenza è −k (il negativo della costante di velocità di primo ordine), mentre l’intercetta sull’asse delle ordinate ln[A] rappresenta ln[A]0. Una delle caratteristiche di una reazione di primo ordine è che il tempo impiegato da metà del reagente inizialmente presente per trasformarsi, il tempo di dimezzamento o emivita (t1/2), è una costante ed è perciò indipendente dal valore della concentrazione iniziale del reagente. Ciò è facilmente dimostrabile sostituendo la relazione [A] = [A]0/2 quando t = t1/2 nell’equazione 12.6 e riordinando: [A]o 2

ln

kt1 2

[A]o

[12.8]

Quindi t1 2

ln2 k

0,693 k

[12.9]

Le sostanze per loro natura instabili, come per esempio i nuclei radioattivi, si decompongono mediante reazioni di primo ordine (vedi l’Esempio di calcolo 12.2). In una reazione di secondo ordine con un solo tipo di reagente, 2A n P, la variazione di [A] con il tempo è piuttosto diversa da quanto si osserva in una reazione di primo ordine. Riordinando l’equazione 12.2 e integrandola per gli stessi limiti usati per la reazione di primo ordine si ottiene [A]

in modo che

[A]o

1 [A]

d [A] 2

[A]

1 [A]o

t

k

dt

[12.10]

0

kt

[12.11]

L’equazione 12.11 è lineare in quanto le variabili 1/[A] e t sono direttamente proporzionali. Per una reazione di secondo ordine, il tempo di dimezzamento è da-

ln[A]o Pendenza = – k

ln[A]

0

Tempo

Figura 12.1 Grafico relativo a

un’equazione della velocità di primo ordine. La pendenza della linea retta ottenuta quando ln[A] è posto in grafico in funzione del tempo consente di ottenere la costante di velocità k.

Ð ESEMPIO DI CALCOLO 12.2

Il decadimento di un ipotetico radioisotopo ha una costante di velocità pari a 0,01 s−1. Quanto tempo è richiesto perché decada la metà di un campione da 1 g dell’isotopo? Le unità della costante di velocità sono indicative di un processo di primo ordine. Pertanto l’emivita è indipendente dalla concentrazione. L’emivita dell’isotopo (ossia la metà del tempo richiesto per il suo decadimento) è data dall’equazione 12.9: 0,693 ln 2 t1 2 69,3 s k 0,01 s 1

388

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

to da t1/2 = 1/k[A]0 e quindi, al contrario di una reazione di primo ordine, esso dipende dalla concentrazione iniziale del reagente. Le equazioni 12.6 e 12.11 possono essere usate per distinguere una reazione di primo ordine da una di secondo ordine, ponendo in grafico ln[A] in funzione di t e 1/[A] in funzione di t e osservando quale è lineare. Per determinare sperimentalmente la costante di velocità di una reazione di secondo ordine A + B n P, sovente è opportuno aumentare la concentrazione di un reagente rispetto all’altro, per esempio, [B] >> [A]. In queste condizioni [B] non muta in modo significativo durante la reazione. La velocità di reazione dipende pertanto solo da [A], la concentrazione del reagente presente in quantità limitante. Perciò la reazione sembra essere di primo ordine rispetto ad A ed è quindi detta pseudoreazione di primo ordine. La reazione è di primo ordine rispetto a B quando [A] >> [B].

B La cinetica enzimatica segue spesso l’equazione di Michaelis-Menten

Gli enzimi catalizzano una varietà straordinaria di reazioni utilizzando combinazioni differenti di cinque meccanismi catalitici di base (Paragrafo 11.3). Alcuni agiscono su una singola molecola di substrato, mentre altri operano su due o più molecole, il cui ordine di legame può essere vincolante o meno. Determinati enzimi formano complessi intermedi con i propri substrati mediante legami covalenti, altri invece utilizzano approcci diversi. Eppure per tutti gli enzimi è possibile quantificare la velocità di reazione e l’efficienza complessiva. Lo studio della cinetica enzimatica ebbe inizio nel 1902, quando Adrian Brown analizzò la velocità di idrolisi del saccarosio da parte dell’enzima di lievito 𝛃-fruttofuranosidasi: Saccarosio + H2O n glucosio + fruttosio

Egli scoprì che, quando la concentrazione di saccarosio è molto maggiore rispetto a quella dell’enzima, la velocità di reazione diventa indipendente dalla concentrazione del saccarosio: la velocità è di ordine zero rispetto al saccarosio. Lo scienziato propose pertanto che la reazione complessiva fosse composta da due reazioni elementari, in cui il substrato prima si lega all’enzima e in seguito si decompone nei prodotti, rigenerando l’enzima libero: E

k1

k2

S 34 ES 88n P k

E

[12.12]

1

E, S, ES e P in questi equilibri indicano rispettivamente l’enzima, il substrato, il complesso enzima-substrato e i prodotti. Secondo questo modello, quando la concentrazione di substrato diventa sufficientemente alta da convertire completamente l’enzima nella forma ES, la seconda tappa della reazione diventa quella che determina la velocità della reazione che non può essere modificata da ulteriori aumenti della concentrazione del substrato. Ognuna delle reazioni elementari che costituiscono la reazione enzimatica complessiva (gli equilibri mostrati sopra) è caratterizzata da una costante di velocità: k1 e k−1 sono le costanti di velocità della reazione nella direzione in avanti (formazione del complesso ES) e nella direzione inversa (dissociazione di ES); k2 è invece la costante di velocità per la decomposizione di ES in P ed E libero (la seconda reazione). In questo caso, per ragioni di semplicità matematica, assumiamo che la seconda reazione sia irreversibile, cioè che P non sia riconvertito in S. L’equazione di Michaelis-Menten assume che ES sia in uno stato stazionario.

L’equazione di Michaelis-Menten descrive la velocità della reazione enzima-

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

389

tica rappresentata dall’equazione 12.12 in funzione della concentrazione di substrato. In questo schema cinetico la formazione del prodotto da ES è un processo di primo ordine. Di conseguenza, la velocità di formazione del prodotto può essere espressa come il prodotto tra la costante di velocità della reazione che genera il prodotto e la concentrazione del suo intermedio immediatamente precedente. L’espressione generale riferita alla velocità della reazione 12.12 è quindi d [P] k2 [ES] v [12.13] dt La velocità complessiva di produzione di ES è data dalla differenza tra le velocità delle reazioni elementari che portano alla sua formazione e quelle che ne determinano la scomparsa: d [ES] [12.14] k1 [E][S] k21 [ES] k2 [ES] dt Tuttavia questa equazione non può essere integrata senza effettuare alcune assunzioni semplificatrici.

1. Assunzione dell’equilibrio. Nel 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten, basandosi sul lavoro condotto da Victor Henri, ipotizzarono che k−1 >> k2, così che la prima tappa della reazione può raggiungere l’equilibrio:

[E ][S] k 21 [12.15] k1 [ES] Qui KS è la costante di dissociazione della prima tappa della reazione enzimatica; diventa ora possibile integrare l’equazione 12.14. Sebbene questa ipotesi non sia sempre corretta, a riconoscimento della rilevanza di questi studi pionieristici, il complesso enzima-substrato, ES, è noto come complesso di Michaelis. 2. Assunzione dello stato stazionario. La Figura 12.2 illustra le variazioni delle concentrazioni dei vari composti e intermedi che prendono parte alla reazione 12.12 nella condizione fisiologica più comune, cioè che il substrato sia in grande eccesso rispetto all’enzima ([S] >> [E]). Ad eccezione dello stadio iniziale della reazione, che avviene normalmente nei pochi millisecondi neKS

Concentrazione

[S0]

[S]

[P]

[E] T = [E] + [ES] d[ES] _____ =0 dt [E] T

[ES] [E] Tempo

Figura 12.2 Curve di progressione di una semplice reazione catalizzata da un enzima. Ad eccezione della fase iniziale della reazione (prima del riquadro ombreggiato), la pendenza delle curve per [E] ed [ES] è essenzialmente pari a zero, purché [S] >> [E] (all’interno del riquadro ombreggiato). [Da Segel, I.H. (1993). Enzyme Kinetics, Wiley, p. 27.]

Descrivete cosa succede all’estremità sinistra e all’estremità destra, cioè prima e dopo lo stato stazionario.

390

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

cessari a miscelare E ed S, [ES] rimane approssimativamente costante sino a esaurimento quasi totale del substrato. Quindi la velocità di sintesi di ES deve essere equivalente a quella del suo consumo durante quasi tutto il tempo in cui la reazione procede. ES è quindi in uno stato stazionario e il valore di [ES] può essere considerato costante nel tempo: d [ES] 0 [12.16] dt L’ipotesi dello stato stazionario, una condizione più generale rispetto a quella dell’equilibrio, fu proposta per la prima volta nel 1925 da George E. Briggs e John B.S. Haldane (Scheda 12.1). È importante notare che una reazione che raggiunge uno stato stazionario non è all’equilibrio: [S] e [P] variano rapidamente durante l’intervallo in cui [ES] e [E] sono essenzialmente costanti. Per poter essere utili, le espressioni cinetiche delle reazioni complessive devono essere formulate in termini di quantità misurabili per via sperimentale. In generale, le quantità [ES] ed [E] non sono facilmente determinabili, mentre la concentrazione totale dell’enzima

[E]T = [E] + [ES]

[12.17]

è direttamente valutabile. È possibile poi ricavare l’equazione della velocità della reazione enzimatica complessiva in funzione di [S] e [E]. Dapprima l’equazione 12.14 è combinata con l’ipotesi dello stato stazionario (equazione 12.16), dando

k1[E][S] = k−1[ES] + k2[ES]

SCHEDA 12.1

[12.18]

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

J.B.S. Haldane e lÕazione degli enzimi J.B.S. Haldane (1892-1964)

John Burdon Sanderson Haldane, figlio di un noto fisiologo, è stato scienziato e scrittore, i cui contributi principali riguardano l’applicazione della matematica a settori della biologia come la genetica e la cinetica enzimatica. Come scienziato, e anche come filosofo, egli era a conoscenza degli sviluppi della teoria della relatività e della meccanica quantistica, ed era influenzato da una filosofia pratica in base alla quale il mondo naturale obbedisce alle leggi della logica e dell’aritmetica. Quando pubblicò il volume Enzymes nel 1930, l’idea che queste molecole fossero proteine piuttosto che piccoli catalizzatori circondati da un “colloide” amorfo di natura proteica era ancora oggetto di dibattito. Tuttavia, persino in assenza di informazioni strutturali, ricercatori quali Leonor Michaelis e Maud Menten avevano già applicato i principi della termodinamica per ricavare alcune equazioni fondamentali legate alla cinetica enzimatica. Essi, nel 1913, avanzarono l’ipotesi che, nel corso di una reazione, un enzima e il suo substrato si trovino in equilibrio con un complesso formato dai due. Nel 1925 Haldane obiettò che ciò non era vero in senso stretto, dal momento che una certa quota di complesso enzima-substrato non si dissocia in enzima libero e substrato, ma piuttosto procede per dare origine al prodotto. Quando l’enzima e il substrato sono miscelati insieme, la concentrazione del complesso aumenta, per stabilizzarsi però dopo un certo tempo poiché il complesso è costantemente formato e scisso per generare prodotto. Questo principio, la cosiddetta ipotesi dello stato stazionario, è alla base delle moderne teorie dell’attività enzimatica.

Anche senza sapere di cosa fossero costituiti gli enzimi, Haldane mostrò uno straordinario livello di conoscenza della materia cui si era applicato proponendo che una molecola enzimatica possa catalizzare una reazione legando i propri substrati in una struttura distorta o fuori equilibrio. Questa idea rappresenta un passo in avanti rispetto alla precedente proposta di Emil Fischer della “chiave e serratura” (in seguito elaborata ulteriormente da Linus Pauling). Il concetto di Haldane della distorsione fu apprezzato compiutamente solo intorno al 1970, dopo che erano state esaminate le strutture ai raggi X di svariati enzimi, compresi il lisozima e la chimotripsina (Capitolo 11). Oltre alle ricerche come enzimologo, Haldane fece luce sul ruolo dei geni nell’ambito dell’ereditarietà e formulò delle stime matematiche sulle velocità di mutazione molti anni prima che si giungesse a svelare la natura dei geni e la struttura del DNA. Comunque, oltre a essere un teorico, Haldane fu anche uno sperimentatore; spesso portò a termine sperimentazioni poco piacevoli o persino pericolose su se stesso. Ingerì per esempio del bicarbonato di sodio e cloruro di ammonio per indagare il loro effetto sulla frequenza respiratoria. Oltre al laboratorio, Haldane era rinomato per i suoi sforzi rivolti a diffondere la scienza tra il pubblico. In Daedalus, or, Science and the Future, tracciò un quadro dello stato in cui versavano vari settori della scienza intorno al 1924, ipotizzando gli sviluppi futuri. Si ritiene che il suo pensiero e la sua figura abbiano ispirato varie trame e personaggi nei romanzi di fantascienza. Briggs, G.E. e Haldane, J.B.S. (1925). A note on the kinetics of enzyme action. Biochem. J. 19, 339.

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

Lasciando [E] = [E]T – [ES] e riordinando si ottiene ([E]T [ES ])[ S] k 1 k2 [ES] k1

[12.19]

La costante di Michaelis, KM, è definita come KM

k

1

k2

k1

[12.20]

così l’equazione 12.19 può essere riordinata per dare KM [ES] = ([E]T − [ES]) [S]

[12.21]

Risolvendo per [ES], [ES]

[E]T [S] KM

[S ]

[12.22]

L’espressione della velocità iniziale (v0) della reazione, cioè la velocità (equazione 12.13) a t = 0, in tal modo diventa d [P] k2 [E ]T [S] vo k2 [ES] [12.23] dt t 0 KM [S]

[E]T e [S] sono entrambe quantità misurabili sperimentalmente. Al fine di soddisfare le condizioni dell’ipotesi dello stato stazionario, la concentrazione del substrato deve essere molto superiore rispetto a quella dell’enzima, per consentire a ciascuna molecola di enzima di essere continuamente legata a una molecola di substrato, in modo che [ES] sia costante anche se viene generato il prodotto. L’impiego della velocità iniziale (operativamente è la velocità della reazione misurata prima che più del 10% circa del substrato sia stato convertito in prodotto) riduce al minimo le complicazioni create per esempio dalla reversibilità della reazione, dall’inibizione dell’enzima da parte dei prodotti, nonché dalla progressiva inattivazione dell’enzima. Questi sono alcuni dei motivi per cui, nell’equazione 12.12, è possibile assumere che la velocità della reazione nella direzione inversa sia pari a zero. La velocità massima, Vmax, di una reazione si osserva a concentrazioni di substrato elevate, cioè quando l’enzima è saturato ed è completamente nella forma ES: Vmax = k2 [E]T Quindi, combinando le equazioni 12.23 e 12.24, otteniamo Vmax [S ] vo KM [S ]

[12.24]

[12.25]

Questa, l’equazione di Michaelis-Menten, è l’espressione fondamentale della cinetica enzimatica. Essa descrive un’iperbole rettangolare come quella illustrata nel grafico della Figura 12.3. La curva di saturazione per il legame dell’ossigeno alla mioglobina (equazione 7.6) ha la medesima forma algebrica. La costante di Michaelis ha una definizione operativa semplice. Alla concentra-

zione di substrato dove [S] = KM, l’equazione 12.25 diventa v0 = Vmax/2; quindi KM corrisponde numericamente alla concentrazione di substrato a cui la velocità di reazione è pari a metà della Vmax. Di conseguenza, se la KM di un enzima è bassa, esso raggiunge la massima efficienza di catalisi a basse concentrazioni di substrato. Ricordate che quando [S] > KM, l’enzima è saturo (vo = Vmax). La KM è specifica per ogni complesso enzima-substrato: substrati differenti che reagiscono con un determinato enzima presentano valori di KM diversi. Allo stesso modo, enzimi diversi che agiscono sullo stesso substrato non han-

391

CAPITOLO 12

392

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

Vmax vo Vmax 2

0

0

KM

2KM

3KM [S]

Figura 12.3 Grafico della velocità iniziale v0 di una semplice reazione enzimatica in funzione della concentrazione di substrato [S]. I punti sono messi in grafico secondo intervalli di concentrazione di substrato pari a 0,5 KM tra valori compresi tra 0,5 e 5 KM.

Confrontate la curva mostrata in questa figura con la curva di saturazione della mioglobina con ossigeno (Figura 7.4).

© 978-88-08-42096-1

no valori di KM uguali. La grandezza della KM varia in base all’identità dell’enzima e alla natura del substrato (Tabella 12.1) e dipende anche dalla temperatura e dal pH. La costante di Michaelis (equazione 12.20) può essere espressa come k 1 k2 k2 [12.26] KS KM k1 k1 k1 Dal momento che KS è la costante di dissociazione del complesso di Michaelis (equazione 12.15), a una KS minore corrisponde una maggiore affinità dell’enzima per il suo substrato. Perciò KM è anche una misura 4KM 5KM dell’affinità dell’enzima per il substrato, a condizione che il rapporto k2/k1 sia basso rispetto a KS (k2 < k−1), in modo che la reazione ES n P proceda più lentamente di quella in cui ES si trasforma di nuovo in E + S. kcat/KM è una misura dell’efficienza della catalisi. Possiamo definire la costante

catalitica, kcat, di un enzima come Vmax [12.27] [E ]T Questa entità è conosciuta anche come numero di turnover di un enzima, poiché equivale al numero di processi di reazione (turnover) che ogni sito attivo catalizza per unità di tempo. I numeri di turnover relativi ad alcuni enzimi sono forniti nella Tabella 12.1. Si noti che queste quantità variano di oltre otto ordini di grandezza. L’equazione 12.24 indica che, per un sistema semplice come per esempio la reazione tipo Michaelis-Menten (equazione 12.12), kcat = k2. Per gli enzimi contraddistinti da meccanismi più complessi (per esempio, substrati multipli o molti intermedi di reazione), kcat può dipendere da molte costanti di reazione. Mentre kcat è una costante, Vmax dipende dalla concentrazione dell’enzima presente nel sistema sperimentale e infatti aumenta con l’aumentare di [E]T. Quando [S] 10 g). In quantità terapeutiche, il 95% del composto presente è enzimaticamente glucuronidato o solfatato a livello del gruppo OOH nei corrispondenti coniugati, che sono prontamente escreti. Il rimanente 5% è convertito, grazie all’azione del citocromo P450 (CYP2E1), in acetimidochinone (Figura 12.21), che viene poi coniugato con il glutatione (Paragrafo 4.3B). Tuttavia, quando l’acetaminofene è assunto in grandi quantità, le vie di glucuronidazione e solfatazione si saturano e quindi la trasformazione mediata dal citocromo P450 assume rilevanza crescente. Se il glutatione nel fegato viene consumato più velocemente di quanto non sia prodotto, l’acetimidochinone, un composto reattivo, si coniuga invece con i gruppi sulfidrilici delle proteine cellulari, producendo un livello di epatotossicità spesso fatale. In effetti, il sovradosaggio di acetaminofene è la causa principale di insufficienza epatica negli Stati Uniti: circa 450 persone ogni anno muoiono per questo motivo. Alcuni farmaci possono essere usati per inibire un citocromo P450 che degrada un altro farmaco, aumentando in questo modo la biodisponibilità di quest’ultimo. Per esempio, il ritonavir (Scheda 12.3), che era stato sviluppato originariamente come inibitore della proteasi dell’HIV, ma oggi utilizzato raramente per questo scopo, viene invece somministrato a basse dosi per inibire specificamente CYP3A4; ciò ha permesso la cosomministrazione di basse do-

CAPITOLO 12 © 978-88-08-42096-1

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

si di altri inibitori della proteasi dell’HIV, come il darunavir (Scheda 12.3), che viene degradato da CYP3A4. Questo ha aumentato in modo significativo l’efficienza degli altri inibitori della proteasi dell’HIV e ridotto considerevolmente i loro effetti collaterali. Molti dei citocromi P450 presenti nell’uomo sono insolitamente polimorfici, cioè nella popolazione umana esistono svariati alleli (varianti) comuni dei geni che codificano ciascuno di questi enzimi. Per numerosi citocromi P450 sono stati caratterizzati gli alleli che provocano una diminuzione, un aumento o un’alterazione qualitativa delle velocità con cui i farmaci sono metabolizzati. La distribuzione di tali forme alleliche differisce in maniera marcata tra i gruppi etnici e quindi ha avuto probabilmente origine allo scopo di permettere a ciascun gruppo di contrastare le tossine contenute nel proprio particolare regime alimentare. Il polimorfismo in un dato citocromo P450 porta a differenze tra gli individui per quanto concerne la velocità con cui essi metabolizzano determinate sostanze medicinali. Per esempio, in casi di attività assente o diminuita di una variante di citocromo P450, dosi altrimenti convenzionali di un farmaco che l’enzima di norma metabolizza possono far sì che la sua biodisponibilità raggiunga livelli tossici. Se un particolare enzima P450 presenta un potenziamento dell’attività (solitamente perché il gene che lo codifica è stato duplicato una o più volte), si dovrebbero somministrare dosi superiori al normale di un farmaco che l’enzima metabolizza per conseguire l’effetto terapeutico desiderato. Tuttavia, se il farmaco viene metabolizzato in un prodotto tossico, ciò può portare a una condizione pericolosa. Numerose varianti note di P450 hanno specificità di substrato alterate e quindi producono metaboliti insoliti, i quali possono determinare effetti collaterali nocivi. L’esperienza ha ampiamente dimostrato che non esiste alcun farmaco che sia del tutto privo di pericolositˆ. Tuttavia, man mano che vengono caratterizzati gli enzimi e le varianti che partecipano al metabolismo dei farmaci e che vengono sviluppati metodi rapidi e poco costosi di genotipizzazione, sta divenendo possibile adattare il trattamento farmacologico alla costituzione genetica di un dato individuo piuttosto che alla popolazione nel suo complesso. Tale settore di studio in rapido sviluppo è definito farmacogenomica.

423

PUNTO DI VERIFICA

• Confrontate la progettazione basata sulla struttura e quella fondata sulla chimica combinatoria come strumenti per sviluppare molecole candidate a diventare farmaci.

• Elencate i fattori che influenzano la biodisponibilità di un farmaco.

• Riassumete gli obiettivi delle sperimentazioni cliniche dalla fase I alla fase III.

• In che modo il citocromo P450 partecipa al metabolismo dei farmaci?

• Indicate in che modo i farmaci ben tollerati dalla maggioranza della popolazione causano reazioni avverse in alcuni individui.

RIASSUNTO 1 La cinetica delle reazioni • Le reazioni chimiche elementari possono essere di primo, secondo e, in casi rari, di terzo ordine. In ciascuna circostanza l’andamento della reazione in funzione del tempo è descritto dall’equazione della velocità. • L’equazione di Michaelis-Menten descrive la relazione tra velocità iniziale della reazione e concentrazione di substrato in condizioni di stato stazionario. • La KM è la concentrazione di substrato nella quale la velocità di reazione è pari a metà di quella massima. Il valore di kcat/KM è una misura dell’efficienza di catalisi di un enzima. • È possibile determinare KM e Vmax con il grafico dei doppi reciproci. • Le reazioni a due substrati (bisubstrato) sono classificate come sequenziali (a singolo spostamento) oppure a ping-pong (a doppio spostamento). Una reazione sequenziale può procedere grazie a un meccanismo ordinato o casuale.

2 L’inibizione enzimatica • Gli inibitori reversibili riducono l’attività di un enzima legandosi al sito di legame per il substrato (inibizione competitiva), al complesso enzima-substrato (inibizione incompetitiva) oppure

all’enzima e al complesso formato da enzima e substrato (inibizione mista).

3 Il controllo dell’attività enzimatica • L’attività enzimatica può essere regolata per mezzo di effettori allosterici. • L’attività della ATCasi è aumentata dall’ATP e diminuita dal CTP, che alterano la conformazione dei siti catalitici stabilizzando rispettivamente gli stati R e T dell’enzima. • L’attività di un enzima può essere controllata per modificazione covalente. • L’attività enzimatica della glicogeno fosforilasi è controllata per fosforilazione/defosforilazione e per azione dei suoi effettori allosterici.

4 La progettazione di farmaci • È possibile sviluppare un inibitore enzimatico da usare come farmaco attraverso metodi combinatori o basati sulla struttura. In seguito esso deve essere valutato nel corso di sperimentazioni cliniche per quanto riguarda la sicurezza e l’efficacia. • Le reazioni dannose ai farmaci e le interazioni farmaco-farmaco sono spesso mediate da un citocromo P450.

CAPITOLO 12

424

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

PROBLEMI 1. Si consideri la reazione non enzimatica elementare A n B.

8. Spiegate come mai di solito è più semplice calcolare la velo-

Quando la concentrazione di A è 20 mM, la velocità di reazione misurata è 5 μM di B prodotto al minuto. (a) Calcolate la costante di velocità per questa reazione. (b) Quale molecolarità presenta la reazione? L’ipotetica reazione elementare 2A n B + C presenta una costante di velocità pari a 10−6 M−1 ∙ s−1. Qual è la velocità di reazione quando la concentrazione di A è di 10 mM? Se, a t = 0, vi sono 10 μmol di isotopo radioattivo 32P (emivita 14 giorni), quanto ne rimarrà dopo (a) 7 giorni, (b) 14 giorni, (c) 21 giorni e (d) 70 giorni? Calcolate la vita media, in anni, della reazione 2X n Y se la concentrazione di partenza di X è pari a 6 µM e la costante di velocità è 3,6 × 10−3 M−1 ∙ s−1. Per i dati di una reazione mostrati sotto, determinate se si tratta di una reazione di primo o di secondo ordine e calcolate la costante di velocità.

cità di reazione di un enzima partendo dalla velocità di comparsa di un prodotto piuttosto che da quella di scomparsa di un substrato. 9. A quale concentrazione di S (espressa come multiplo di KM) v0 = 0,95 Vmax? 10. Identificate gli enzimi, riportati nella Tabella 12.1, la cui efficienza di catalisi è prossima al limite controllato dalla diffusione. 11. Calcolate KM e Vmax dai seguenti dati:

2.

3.

4.

5.

[S] (μM)

v0 (mM−1 ∙ s)

0,1

0,34

0,2

0,53

0,4

0,74

0,8

0,91

1,6

1,04

Tempo (s)

Reagente (mM)

0

6,2

1

3,1

2

2,1

3

1,6

4

1,3

1/[S] (mM−1)

1/v0 (mM−1 ∙ s)

5

1,1

0,5

2,4

6. Per i dati della reazione mostrati sotto, determinate se si trat-

1,0

2,6

ta di una reazione di primo o di secondo ordine e calcolate la costante di velocità.

1,5

2,9

2,0

3,1

1/[S] (mM−1)

1/v0 (mM ∙ s−1)

12. Spiegate per quale motivo nessuna delle due seguenti serie di

dati ottenuti da un grafico di Lineweaver-Burk è ideale per determinare la KM di una reazione catalizzata da un enzima che segue la cinetica di Michaelis-Menten.

Serie A

Tempo (s)

Reagente (mM)

0

5,4

1

4,6

8

5,9

2

3,9

10

6,8

3

3,2

12

7,8

4

2,7

14

8,7

5

2,3

13. La KM della reazione della chimotripsina con N-acetilvalina eti-

7. Per una data reazione enzimatica, disegnate le curve che mo-

strano le opportune relazioni tra le variabili in ciascun grafico qui sotto.

[P]

[ES]

Tempo

Tempo

vo

[E] T

Serie B

lestere è 8,8 × 10−2 M, mentre quella relativa alla reazione della chimotripsina con N-acetiltirosina etilestere è 6,6 × 10−4 M. (a) Quale substrato mostra la più alta affinità apparente per l’enzima? (b) Quale substrato presenta verosimilmente un valore più elevato di Vmax? 14. L’enzima A catalizza la reazione S n P e presenta una KM di 50 μM e una Vmax pari a 100 nM ∙ s−1. L’enzima B catalizza la reazione S n Q e mostra una KM di 5 mM e una Vmax pari a 120 nM ∙ s−1. Quando si aggiungono 100 μM di S a una miscela contenente quantità equivalenti degli enzimi A e B, dopo un minuto quale prodotto di reazione sarà più abbondante: P o Q? 15. In una reazione a due substrati una piccola quantità del primo prodotto P è marcata con un isotopo (P*) e viene aggiunta all’enzima e al primo substrato A; non è presente alcuna quantità di B o Q. Se la reazione segue un meccanismo a ping-pong, A (= POX) conterrà il tracciante isotopico (A*)? 16. In una reazione a due substrati una piccola quantità del primo prodotto P è marcata con un isotopo (P*) e viene aggiunta all’enzima e al primo substrato A; non è presente alcuna quan-

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

© 978-88-08-42096-1

tità di B o Q. Se la reazione segue un meccanismo sequenziale, A (= POX) conterrà il tracciante isotopico (A*)? 17. In che modo il diisopropilfosfofluoridato (DIPF; Paragrafo 11.5A) incide sulla KM e sulla Vmax apparenti di un campione di chimotripsina? 18. La molecola A è substrato dell’enzima X. Quale sarà più probabilmente un inibitore competitivo dell’enzima X: la molecola B o la molecola C? Spiegatene i motivi. O H3C

425

cosa c’è di sbagliato in questa situazione sperimentale e come sarebbe possibile correggerla? 26. L’enzima X e l’enzima Y catalizzano la stessa reazione e le loro curve di v0 in funzione di [S] sono mostrate in basso. Quale dei due è più efficiente a bassa [S]? Quale invece lo è ad alta [S]?

O COO–

C

H3C

A

C

CH3

Enzima X

B O

H3C

C

NO2

O

vo

Enzima Y

C 19. Determinate il tipo di inibizione di una reazione enzimati-

ca partendo dai seguenti dati ottenuti in presenza e in assenza dell’inibitore. [S] (mM)

v0 (mM ∙ min−1)

v0 con I presente (mM ∙ min−1)

1

1,3

0,8

2

2,0

1,2

4

2,8

1,7

8

3,6

2,2

12

4,0

2,4

20. Stimate KI per un inibitore competitivo quando [I] = 5 mM

dà un valore apparente di KM che è tre volte quello della KM della reazione non inibita. DOMANDE DIFFICILI 21. Per poter calcolare la KM di un enzima, è necessario che le mi-

surazioni della velocità di reazione siano espresse in unità di concentrazione nel tempo (per esempio, M ∙ s−1)? 22. È obbligatorio conoscere [E]T per poter determinare (a) KM, (b) Vmax, (c) kcat? 23. Si sta tentando di stabilire la KM di un certo enzima. A causa di un contrattempo in laboratorio, si dispone di dati per soli due punti:

Concentrazione di substrato (mM)

Velocità della reazione (μM ∙ s−1)

1

5

100

50

Utilizzate tali informazioni per calcolare un valore approssimativo di KM; è probabile che esso rappresenti una sovrastima oppure una sottostima di quello reale? Fornite una spiegazione. 24. State tentando di determinare la KM misurando la velocità di reazione a differenti concentrazioni di substrato, ma senza rendersi conto che quest’ultimo tende a precipitare nelle condizioni sperimentali scelte. In che modo ciò influisce sulla misurazione della KM? 25. State costruendo una curva di velocità rispetto alla [substrato] nel caso di un enzima la cui KM si presume sia 2 μM. La concentrazione della molecola enzimatica è pari a 200 nM, mentre quelle relative ai substrati variano da 0,1 μM a 10 μM. Che

[S] 27. Sulla base di alcune misurazioni preliminari si sospetta che

un campione di enzima contenga un inibitore enzimatico irreversibile. Si decide di diluire il campione di 100 volte e misurare nuovamente l’attività enzimatica. Cosa evidenzierebbero i risultati se l’inibitore contenuto nel campione fosse irreversibile? 28. Per lo stesso enzima riportato come esempio nel Problema 27, cosa otterreste dai vostri risultati se fosse presente un inibitore reversibile? 29. Per una reazione catalizzata da enzima, la presenza di un inibitore reversibile alla concentrazione di 5 nM porta a un valore di Vmax pari all’80% di quello osservato in assenza dell’inibitore, mentre il valore della KM rimane inalterato. (a) Quale tipo di inibizione è probabile si manifesti? (b) Quale quota delle molecole di enzima si è legata all’inibitore? (c) Calcolate la costante di inibizione. 30. La sfingosina-1-fosfato (SPP) è importante per la sopravvivenza della cellula. La sintesi di SPP a partire da sfingosina e ATP è catalizzata dall’enzima sfingosina chinasi. La comprensione della cinetica della reazione della sfingosina chinasi può rivelarsi importante ai fini dello sviluppo di farmaci per il trattamento del cancro. La velocità della reazione che coinvolge la sfingosina chinasi è stata misurata in presenza e in assenza di treo-sfingosina, uno stereoisomero della sfingosina che inibisce l’enzima; i risultati sono mostrati qui sotto.

[Sfingosina] (μM)

v0 (mg ∙ min−1) (assenza di inibitore)

v0 (mg ∙ min−1) (con treo-sfingosina)

2,5

32,3

8,5

3,5

40

11,5

5

50,8

14,6

10

72

25,4

20

87,7

43,9

50

115,4

70,8

426

CAPITOLO 12

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

Costruite un grafico di Lineweaver-Burk per rispondere alle seguenti domande. (a) Quali sono i valori di KM e Vmax in assenza e in presenza dell’inibitore? (b) Che tipo di inibitore è la treo-sfingosina? Motivate la vostra risposta. 31. L’etanolo nel corpo viene ossidato ad acetaldeide (CH3CHO) dall’alcol deidrogenasi epatica (LADH). Anche altri alcol sono ossidati dalla LADH. Per esempio, il metanolo (CH3OH) che è lievemente intossicante, viene ossidato dalla LADH e forma un prodotto abbastanza tossico, la formaldeide (CH2O). Gli effetti tossici dell’ingestione di metanolo (un componente di molti solventi presenti in commercio) possono essere ridotti somministrando etanolo. L’etanolo agisce come un inibitore competitivo del metanolo, rimuovendolo dalla LADH. Ciò fornisce il tempo sufficiente al metanolo per essere escreto dai reni in maniera innocua. Se un individuo ha ingerito 100 ml di metanolo (una dose letale), quanto whisky (con il 50% in volume di etanolo) deve bere per ridurre l’attività della sua LADH verso il metanolo fino al 5% del suo valore originale? Il corpo umano adulto contiene circa 40 litri di fluidi acquosi nei quali gli alcol ingeriti sono mescolati rapidamente e uniformemente. Le densità di etanolo e metanolo sono entrambe di 0,79 g ∙ cm–3. Assumete che i valori di KM della LADH per l’etanolo e il metanolo siano rispettivamente di 1,0 × 10–3 M e 1,0 × 10–2 M e che per l’etanolo KI = KM. 32. Perché si pensa che gli inibitori incompetitivi e misti siano più efficaci in vivo rispetto agli inibitori competitivi?

BIOINFORMATICA Progetto 6 Inibitori enzimatici e progettazione razionale dei farmaci 1. Diidrofolato riduttasi. Esaminate la struttura di un enzima con un inibitore legato a esso. 2. Proteasi dell’HIV. Confrontate le strutture dei complessi contenenti la proteasi dell’HIV e un inibitore. 3. Farmacogenomica e polimorfismo a singolo nucleotide. Utilizzate le banche dati online per trovare informazioni sul polimorfismo del citocromo P450. Progetto 7 Classificazioni EC e allineamenti dei siti catalitici con PyMOL. 1. La classificazione Enzyme Commission e IUPAC degli enzimi. Scoprite le basi sistematiche della classificazione degli enzimi fornita dalla stessa organizzazione (IUPAC) che definisce la nomenclatura sistematica delle molecole organiche. 2. Esplorazione dell’atlante dei siti catalitici (Catalytic Site Atlas). L’atlante dei siti catalitici è una banca dati dei siti attivi degli enzmi. Imparerete a trovare i siti attivi degli enzimi che avete studiato. 3. Allineamento del sito attivo in PyMOL usando il plug-in ProMOL. La combinazione dell’interfaccia di grafica molecolare di PyMOL con il plug-in ProMOL di PyMOL vi permetterà di studiare l’allineamento dei siti catalitici di molti enzimi differenti.

© 978-88-08-42096-1

CASI DI STUDIO Caso 7 Una proteina di immagazzinamento contenuta nei semi della Brassica nigra (senape nera) è un inibitore delle serina proteasi. Concetto chiave: la purificazione di una nuova proteina di immagazzinamento permette l’analisi e la determinazione della struttura secondaria e terziaria della proteina. Prerequisiti: Capitoli 5, 11 e 12 • Tecniche di purificazione delle proteine, in particolare filtrazione su gel e dialisi. • Sequenziamento delle proteine tramite la degradazione di Edman e la sovrapposizione dei peptidi. • Struttura e meccanismo catalitico delle serina proteasi. • Inibizione reversibile degli enzimi. Caso 12 Produzione di metanolo nella maturazione dei frutti. Concetto chiave: il collegamento tra la produzione del metanolo durante la maturazione dei frutti e l’attività della pectina metilesterasi, l’enzima responsabile della produzione del metanolo, viene studiato nei pomodori wild-type e transgenici. Prerequisiti: Capitolo 12 • Cinetica e inibizione enzimatica. Caso 13 Inibizione dell’alcool deidrogenasi. Concetto chiave: si prende in esame l’inibizione dell’alcool deidrogenasi ad opera della formammide. Prerequisiti: Capitolo 12 • Principi di cinetica enzimatica. • Identificazione dell’inibizione utilizzando il grafico di Lineweaver-Burk. Caso 15 Mutagenesi sito-diretta della creatina chinasi. Concetto chiave: la mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per creare enzimi mutanti di creatina chinasi in modo tale da poter comprendere il ruolo di un singolo residuo reattivo di cisteina nel legame e nella catalisi. Prerequisiti: Capitoli 4, 6, 11 e 12 • Struttura degli amminoacidi. • Architettura delle proteine. • Cinetica e inibizione enzimatica. • Meccanismi enzimatici di base. Caso 19 Purificazione della sfingosina chinasi da rene di ratto. Concetto chiave: l’obiettivo di questo studio è l’analisi della purificazione e della cinetica di un enzima che produce un prodotto importante per la sopravvivenza della cellula. Prerequisiti: Capitoli 5 e 12 • Tecniche di purificazione delle proteine e metodi analitici delle proteine. • Cinetica enzimatica di base.

APPROFONDIMENTO Che tipo di inibitore è il warfarin (mostrato nella Figura 12.20) e quale enzima inibisce? Qual è l’obiettivo fisiologico della terapia che utilizza il warfarin? Perché i diversi individui hanno differenti risposte alla dose standard di warfarin? Perché le informazioni sul genotipo di un paziente possono essere di aiuto al medico nella scelta della dose efficace?

CAPITOLO 12 © 978-88-08-42096-1

Cinetica enzimatica, inibizione e regolazione

427

BIBLIOGRAFIA La cinetica

La progettazione di farmaci

Bisswanger, H. (2008). Enzyme Kinetics: Principles and Methods (2a ed.), Wiley-VCH. Cornish-Bowden, A. (2012). Fundamentals of Enzyme Kinetics (4a ed.), Wiley-Blackwell. [Chiaro e dettagliato resoconto della cinetica enzimatica.] Fersht, A. (1999). Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding, W.H. Freeman. Purich, D.L. (2010). Enzyme Kinetics: Catalysis & Control: A Reference of Theory and Best-Practice Methods, Elsevier-Academic Press. [Una esposizione dettagliata.] Segel, I.H. (1993). Enzyme Kinetics, Wiley-Interscience. [Trattato dettagliato e chiaro che illustra in maniera esauriente numerosi aspetti della cinetica enzimatica.]

Corey, E.J., Czakó, B., e Kürti, L. (2007). Molecules and Medicine, Wiley. [Tratta la scoperta, l’applicazione e il meccanismo di azione di numerosi farmaci.] Corson, T.W. e Crews, C.M. (2007). Molecular understanding and modern application of traditional medicines: triumphs and trials, Cell 130, 769-774. Furge, L.L. e Guengerich, F.P. (2006). Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism and chemical toxicology, Biochem. Mol. Biol. Educ. 34, 66-74. Jorgenson, W.L. (2004). The many roles of computation in drug discovery, Science 303, 1813-1818. Katzung, B.G. (a cura di) (2007). Basic & Clinical Pharmacology (10a ed.), McGraw-Hill. Ohlstein, E.H., Ruffolo, R.R., Jr., e Elliott, J.D. (2000). Drug discovery in the next millennium, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, 177-191. White, R.E. (2000). High-throughput screening in drug metabolism and pharmokinetic support of drug discovery, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, 133-157. Williams, P.A., Cosme, J., Ward, A., Angove, H.C., Vinkovic, D.M., e Jhoti, H. (2003). Crystal structure of human cytochrome P450 2C9 with bound warfarin, Nature 424, 464-468. Wlodawer, A. e Vondrasek, J. (1998). Inhibitors of HIV-1 protease: A major success of structure-assisted drug design, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27, 249-284. [Passa in rassegna lo sviluppo di alcuni inibitori della proteasi di HIV-1.]

Controllo allosterico mediante modificazioni covalenti Jin, L., Stec, B., Lipscomb, W.N., e Kantrowitz, E.R. (1999). Insights into the mechanisms of catalysis and heterotropic regulation of Escherichia coli aspartate transcarbamoylase based upon a structure of the enzyme complexed with the bisubstrate analogue N-phosphonacetyl-l-aspartate at 2.1 Å, Proteins 37, 729-742. Johnson, L.N. e Lewis, R.J. (2001). Structural basis for control by phosphorylation, Chem. Rev. 101, 2209-2242. Lipscomb, W.N. (1991). Structure and function of allosteric enzymes, Chemtracts–Biochem. Mol. Biol. 2, 1-15. Perutz, M. (1990). Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins, Cambridge University Press.

C A P I T O L O

1 3

La segnalazione biochimica

La vanillina, un aroma estratto dai baccelli della vaniglia e da altre piante, si lega ai recettori presenti sui neuroni olfattivi e innesca una serie di eventi intracellulari, compresa l’attivazione della proteina G eterotrimerica e la produzione di un secondo messaggero, che generano infine un segnale elettrico diretto al cervello. [Martin Harvey/Getty Images.]

Gli organismi viventi coordinano le loro attività a ogni livello della loro organizzazione strutturale mediante complessi sistemi di segnalazione. I segnali intracellulari sono mediati da messaggeri chimici chiamati ormoni e negli animali superiori da impulsi elettrochimici trasmessi per via neuronale. Le comunicazioni intracellulari sono mantenute dalla sintesi o dall’alterazione di una grande varietà di sostanze che sono spesso componenti integrali del processo che controllano. Per esempio, le vie metaboliche, come abbiamo visto nel Paragrafo 12.3, sono regolate dal controllo retroattivo (feedback) degli enzimi allosterici esercitato dai metaboliti di quelle stesse vie o dalla modificazione covalente degli enzimi. In questo capitolo prenderemo in considerazione la natura dei segnali chimici e il modo in cui questi segnali vengono trasmessi. In genere, ogni via di segnalazione consiste di una proteina recettore che lega in modo specifico un ormone o un altro tipo di ligando, di un meccanismo per la trasmissione all’interno della cellula del messaggio dell’avvenuto legame del ligando e di una serie di risposte intracellulari che possono coinvolgere la sintesi di un secondo messaggero e/o cambiamenti chimici catalizzati da chinasi e fosfatasi. Queste vie coinvolgono spesso cascate enzimatiche, che amplificano notevolmente il segnale originario. Cominciamo discutendo le funzioni di alcuni sistemi ormonali umani più rappresentativi. Tratteremo quindi le tre vie principali attraverso le quali vengono convertiti (trasdotti) i segnali extracellulari in segnali intracellulari. Queste vie possono coinvolgere recettori tirosina chinasici (1), utilizzare proteine G eterotrimeriche (2) e innescare cascate di fosfoinositidi (3). La trasmissione neuronale è discussa nel Paragrafo 10.2C.

1 Gli ormoni CONCETTI CHIAVE

• Gli ormoni endocrini regolano una grande varietà di processi fisiologici. • Gli ormoni pancreatici insulina e glucagone controllano il metabolismo energetico. • Le catecolammine prodotte dalla midollare del surrene si legano ai recettori α- e β-adrenergici presenti nelle cellule bersaglio.

• Gli ormoni steroidei regolano il metabolismo dei combustibili, il bilanciamento idrosalino, nonché la differenziazione e la funzione sessuale.

• L’ormone della crescita esercita i suoi effetti inducendo la dimerizzazione del suo recettore.

Negli animali superiori, le ghiandole endocrine (Figura 13.1) sintetizzano ormoni endocrini che sono rilasciati nel circolo sanguigno in seguito a stimoli ester-

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Figura 13.1 Le ghiandole principali del sistema endocrino umano. Anche altri tessuti, come l’intestino, secernono ormoni endocrini.

ni. Questi ormoni vengono quindi trasportati alle loro cellule bersaglio (Figura 13.2) in cui provocano una risposta. Nell’essere umano il sistema endocrino secerne una grande varietà di ormoni che consentono all’organismo di:

1. mantenere l’omeostasi (cioè uno stato stazionario; per esempio, l’insulina e il glucagone mantengono i livelli di glucosio nel sangue entro limiti molto rigidi, sia dopo un pasto sia durante il digiuno); 2. rispondere a una grande varietà di stimoli esterni (come la preparazione alla condizione “combatti o fuggi” indotta dall’adrenalina e dalla noradrenalina); 3. seguire vari programmi ciclici e di sviluppo (per esempio, gli ormoni sessuali regolano il differenziamento sessuale e la maturazione delle gonadi, il ciclo mestruale e la gravidanza).

Ipotalamo Ghiandola pituitaria (ipofisi) Paratiroide Tiroide

Ghiandole surrenali Pancreas Rene Ovaie

Nonostante esistano importanti eccezioni a questa generalizzazione, molti ormoni sono polipeptidi, polimeri di amminoacidi o steroidi. A ogni modo, solo le cellule dotate dello specifico recettore per un dato ormone risponderanno alla sua presenza anche se tutte le cellule del corpo sono esposte all’ormone. I messaggi ormonali sono quindi indirizzati in modo abbastanza specifico. Discuteremo di ormoni specifici e delle loro funzioni in molti altri capitoli; in questo paragrafo ci occuperemo delle attività degli ormoni prodotti da alcune delle più rappresentative ghiandole endocrine. Queste ghiandole non sono solo una serie di organi secretori indipendenti, ma formano una rete di controllo molto complessa e altamente interdipendente. Infatti, la secrezione di molti ormoni è sotto il controllo retroattivo esercitato dalla secrezione di altri ormoni a cui risponde la ghiandola originaria che secerne l’ormone. Le concentrazioni degli ormoni circolanti sono solitamente misurate utilizzando il dosaggio radioimmunologico sviluppato e messo a punto da Rosalyn Yalow (Scheda 13.1).

Cellule endocrine

Molecole ormonali

Torrente circolatorio

Recettore

Cellule bersaglio

Figura 13.2 Segnalazione endocrina. Gli ormoni prodotti dalle cellule endocrine

raggiungono le cellule bersaglio attraverso il sistema circolatorio. Solo le cellule che espongono i recettori appropriati possono rispondere agli ormoni.

429

Testicoli

430

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

SCHEDA 13.1

© 978-88-08-42096-1

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Rosalyn Yalow e il dosaggio radioimmunologico (radioimmunoassay o RIA) Rosalyn Yalow (1921-2011)

Rosalyn Sussman Yalow nacque il 19 luglio 1921 a New York. I suoi genitori non avevano avuto un’educazione di livello superiore, ma i loro due figli riuscirono a studiare all’università. Mentre Rosalyn frequentava l’Hunter College, l’università femminile del sistema universitario della città di New York (ora City University di New York), Eve Curie aveva appena pubblicato la biografia di sua madre, Madame Marie Curie, un libro che ogni aspirante scienziato donna doveva assolutamente leggere. All’epoca l’obiettivo di Rosalyn era quello di intraprendere la carriera di fisico. Nonostante i consigli dei suoi familiari, che la incoraggiavano a diventare un’insegnante di scuola elementare, lei non si arrese. Nel 1941, dopo essersi laureata, la Yalow ricevette un’offerta di lavoro come assistente di un insegnante di fisica alla University of Illinois a Champaign-Urbana (Illinois). Al primo consiglio di facoltà del College of Engineering scoprì che era l’unica donna tra i 400 membri che componevano la facoltà. Il decano della facoltà si complimentò con lei e le disse che dal 1917 era la prima volta che una donna raggiungeva questo traguardo. L’arruolamento di giovani uomini nelle forze armate, ancor prima che gli Stati Uniti entrassero ufficialmente nella seconda guerra mondiale, aveva reso possibile il suo ingresso all’università. Il primo giorno incontrò Aaron Yalow, che stava anche lui cominciando gli studi all’Università dell’Illinois e che, nel 1943, divenne suo marito. Nel gennaio 1945 la Yalow ricevette il Ph. D. (dottorato di ricerca) in fisica nucleare e ritornò a New York come assistente ingegnere presso il Federal Telecommunications Laboratory, in cui era l’unica donna ingegnere. Nel 1946 ritornò all’Hunter College per insegnare fisica in un programma preingegneristico, rivolto non alle donne ma ai veterani che facevano ritorno a casa. In quel periodo sviluppò un interesse verso le applicazioni mediche dei radioisotopi. Nel dicembre 1947 aderì alla Bronx Veterans Administration (VA) come consulente part-time. Anche se era insegnante a tempo pieno all’Hunter, la Yalow fornì e sviluppò il Servizio Radioisotopi dell’ospedale della VA e, insieme ad altri fisici, iniziò diversi progetti di ricerca. Nel gennaio 1950, la Yalow scelse di lasciare l’insegnamento e di dedicarsi alla VA a tempo pieno. Nella primavera dello

stesso anno il dottor Solomon A. Berson entrò a far parte del Servizio Radioisotopi e iniziò una collaborazione che durò 22 anni e che terminò solo quando lui morì nel 1972. Nei loro studi, la Yalow e Berson si concentrarono sulle applicazioni degli isotopi ai problemi clinici quali i dosaggi ormonali. All’epoca l’insulina era l’ormone in forma altamente purificata più facilmente disponibile. Nello studio della reazione dell’insulina con gli anticorpi, la Yalow e Berson si resero conto che avevano uno strumento potenzialmente in grado di misurare la concentrazione dell’insulina presente in una miscela complessa come il sangue. A partire dal 1959 svilupparono un metodo pratico per quantificare l’insulina presente nel plasma umano, il dosaggio radioimmunologico (radioimmunoassay, RIA). Il RIA è attualmente utilizzato per misurare centinaia di sostanze di interesse biologico. Le concentrazioni seriche dell’insulina e di altri ormoni sono estremamente basse – generalmente rientrano in un intervallo compreso tra 10−12 e 10−7 M – e dovevano quindi essere misurate utilizzando metodi indiretti. Nei RIA, la concentrazione sconosciuta di un ormone H viene determinata misurando la frazione di una quantità nota di ormone H marcato con un radioisotopo (H*) che si lega a una quantità fissa di anticorpo anti-H in presenza di H. Questa reazione di competizione viene facilmente calibrata costruendo una curva standard che indica quanto H* si lega all’anticorpo in funzione di [H]. L’elevata affinità di legame e la specificità degli anticorpi per i loro ligandi conferiscono ai RIA il vantaggio di avere alta specificità e sensibilità. Nel 1977 l’ospedale della Yalow fu affiliato alla Mount Sinai School of Medicine, e la Yalow ricevette il titolo di Distinguished Service Professor. È stata membro della National Academy of Science e ha ricevuto numerosi premi e onoreficenze, compreso il premio Nobel in Fisiologia o Medicina nel 1977 (Berson è morto prima della consegna del premio Nobel e non ha potuto quindi condividerlo). Nel 1988 ha ricevuto anche la National Medal of Science. “L’eccitazione dell’apprendimento è ciò che separa la gioventù dalla vecchiaia”, ha detto Rosalyn Yalow. “Fino a che stai imparando non sei vecchio”.* Per la maggior parte tratto dall’autobiografia di Rosalyn Yalow, Les Prix Nobel. The Nobel Prizes 1977, Wilhelm Odelberg (a cura di), Nobel Foundation, 1978. *Tratto da O, The Oprah Magazine, gennaio 1, 2005.

A Gli ormoni delle isole pancreatiche controllano il metabolismo dei combustibili Il pancreas è una grande ghiandola esocrina preposta alla produzione di enzimi digestivi come la tripsina, l’RNasi A, l’α-amilasi e la fosfolipasi A2. Queste proteine sono secrete nel duodeno tramite il dotto pancreatico. Circa l’1-2% del tessuto pancreatico è tuttavia costituito da gruppi sparsi di cellule, le cosiddette isole (o isolotti) di Langerhans, che comprendono una ghiandola endocrina che funziona nel mantenimento dell’omeostasi energetica. Le isole pancreatiche contengono tre tipi di cellule, ciascuno dei quali secerne un ormone polipeptidico caratteristico.

1. Le cellule α secernono glucagone (29 residui). 2. Le cellule β secernono insulina (51 residui; Figura 5.1). 3. Le cellule δ secernono somatostatina (14 residui).

CAPITOLO 13

431

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

L’insulina, che viene secreta in risposta a un elevato contenuto di glucosio nel sangue, agisce principalmente stimolando i muscoli, il fegato e le cellule del tessuto adiposo a immagazzinare glucosio perché possa essere utilizzato successivamente per la sintesi di glicogeno, proteine e grassi (Paragrafo 22.2). Il glucagone, che viene secreto in risposta a bassi livelli di glucosio ematico, ha essenzialmente l’effetto opposto: stimola il fegato a rilasciare glucosio tramite la demolizione del glicogeno (glicogenolisi; Paragrafo 16.1) e la sintesi di glucosio a partire da precursori non saccaridici (gluconeogenesi; Paragrafo 16.4). Il glucagone stimola anche il tessuto adiposo a rilasciare gli acidi grassi tramite la lipolisi. La somatostatina, che viene secreta anche dall’ipotalamo, inibisce il rilascio di insulina e glucagone dalle loro cellule insulari. Gli ormoni polipeptidici, come altre proteine destinate alla secrezione, sono sintetizzati dai ribosomi sotto forma di pro-ormoni, precursori inattivi che vengono poi rielaborati nel reticolo endoplasmatico rugoso e nell’apparato di Golgi per produrre gli ormoni maturi, e in seguito accumulati nei granuli secretori in attesa del segnale che ne stimoli il rilascio per esocitosi (Paragrafi 9.4D-F). Gli stimoli fisiologici più potenti che portano al rilascio di insulina o di glucagone sono rispettivamente un elevato e un basso livello di glucosio ematico. In tal modo le cellule insulari agiscono da sensori primari di glucosio dell’organismo. Il rilascio degli ormoni è però influenzato anche dal sistema nervoso autonomo (involontario) e da ormoni secreti dal tratto gastrointestinale.

B L’adrenalina e la noradrenalina preparano l’organismo all’azione Le ghiandole surrenali sono costituite da due diversi tipi di tessuto: la midollare (la parte centrale), che in effetti è un prolungamento del sistema nervoso, e la corticale (lo strato più esterno), la parte più tipicamente ghiandolare. In questo paragrafo prenderemo in considerazione solamente gli ormoni secreti dalla parte midollare delle ghiandole surrenali, mentre gli ormoni secreti dalla parte corticale, quelli di tipo steroideo, verranno esaminati nel paragrafo seguente. La midollare del surrene sintetizza due catecolammine (ammine contenenti derivati del catecolo, il 1,2-diidrossibenzene) attive come ormoni: la noradrenalina e il suo derivato metilico adrenalina (a destra). Questi ormoni vengono sintetizzati partendo dalla tirosina, come descritto nel Paragrafo 21.6B, e raccolti in granuli, in attesa di essere rilasciati per esocitosi sotto il controllo del sistema nervoso simpatico. Gli effetti biologici delle catecolammine sono mediati da due classi di recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio, i recettori 𝛂- e 𝛃-adrenergici (noti anche come adrenorecettori). Queste glicoproteine transmembrana sono state originariamente identificate sulla base di cambiamenti nelle loro risposte a certi agonisti (sostanze che si legano a un recettore in modo da provocarne una risposta) e a certi antagonisti (sostanze che si legano a un recettore ma che non ne inducono una risposta, bloccando quindi l’azione dell’agonista). I recettori β- ma non gli α-adrenergici, per esempio, vengono stimolati dall’isoproterenolo ma vengono bloccati dal propanololo, mentre i recettori αma non i β-adrenergici vengono bloccati dalla fentolammina.

HO CH

HO

CH2

+ NH2

OH R5H R 5 CH3

Noradrenalina (norepinefrina) Adrenalina (epinefrina)

H3C

OH

HO HO

CH

CH2

+ NH2

OH Isoproterenolo

CH3

O

CH2

CH

CH2

CH

+ NH2

+ NH

CH3

N CH2 N H

CH CH3

CH3

OH Propanololo

Fentolammina

R

432

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Nei mammiferi i recettori α- e β-adrenergici sono espressi in tessuti diversi e generalmente rispondono alle catecolammine in modo differente e spesso in senso contrario. Per esempio, i recettori β-adrenergici nel fegato stimolano la glicogenolisi e la gluconeogenesi (Paragrafi 16.1 e 16.4), nel muscolo scheletrico la glicogenolisi, nel tessuto adiposo la lipolisi. La stimolazione di questo tipo di recettore porta anche al rilassamento della muscolatura liscia (involontaria) dei bronchi e dei vasi sanguigni che riforniscono il muscolo scheletrico (volontario) e aumenta l’attività contrattile del cuore. Al contrario, i recettori α-adrenergici stimolano la contrazione della muscolatura liscia dei vasi sanguigni che riforniscono gli organi e i distretti periferici quali la pelle e i reni, mentre inducono rilassamento della muscolatura liscia del tratto gastrointestinale e favoriscono l’aggregazione piastrinica. La maggior parte di questi effetti diversi tende a un unico scopo: la mobilizzazione delle riserve energetiche e il loro rapido trasporto nelle sedi in cui sono necessarie per preparare il corpo a entrare velocemente in azione. La distribuzione tissutale dei recettori α- e β-adrenergici e la variabilità delle loro risposte ai differenti agonisti e antagonisti hanno conseguenze terapeutiche molto importanti. Per esempio, il propanololo viene utilizzato per trattare la pressione sanguigna elevata e per prevenire gli attacchi cardiaci, mentre gli effetti broncodilatatori dell’adrenalina la rendono clinicamente utile nel trattamento dell’asma, una patologia respiratoria causata dalla contrazione inappropriata della muscolatura liscia dei bronchi.

C Gli ormoni steroidei regolano una grande varietà di processi metabolici e sessuali La corticale surrenale produce almeno 50 diversi steroidi adrenocorticali, che sono stati classificati a seconda delle risposte fisiologiche che possono indurre (Paragrafo 9.1E). 1. I glucocorticoidi influenzano il metabolismo dei carboidrati, delle proteine e dei lipidi secondo modalità quasi opposte a quelle dell’insulina e influenzano una grande varietà di altre funzioni vitali, comprese le reazioni infiammatorie e la capacità di far fronte allo stress. 2. I mineralcorticoidi servono soprattutto a regolare l’escrezione di sali e di acqua da parte dei reni. 3. Gli androgeni e gli estrogeni influenzano lo sviluppo e la funzionalità sessuale. Sono prodotti in quantità elevate dalle gonadi.

I glucocorticoidi, il più comune dei quali è il cortisolo (conosciuto anche come idrocortisone), e i mineralcorticoidi, il più noto dei quali è l’aldosterone, sono tutti composti C21 (Figura 9.11). Gli steroidi, essendo insolubili in acqua, vengono trasportati nel sangue uniti alla glicoproteina transcortina e, in misura minore, all’albumina. Gli steroidi passano spontaneamente attraverso le membrane delle loro cellule bersaglio e raggiungono il citosol, dove si legano a specifici recettori steroidei. I complessi steroide-recettore migrano poi nel nucleo della cellula, dove agiscono come fattori di trascrizione per indurre, o in taluni casi reprimere, la trascrizione di geni specifici (Paragrafo 28.3B). In questo modo i glucocorticoidi e i mineralcorticoidi influenzano l’espressione di molti enzimi metabolici nei rispettivi tessuti bersaglio. Gli ormoni tiroidei, anch’essi non polari, hanno un meccanismo simile. Tuttavia, come vedremo nei paragrafi seguenti, altri ormoni che non sono liposolubili si devono legare a recettori presenti sulla superficie esterna della membrana plasmatica per poter innescare all’interno delle cellule complesse cascate di eventi che andranno a influenzare la trascrizione e altri processi cellulari.

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

Gli steroidi prodotti dalle gonadi mediano lo sviluppo e la funzionalità sessuale.

Le gonadi (rappresentate dai testicoli nei maschi e dalle ovaie nelle femmine), oltre a produrre sperma e uova, secernono ormoni steroidei (androgeni ed estrogeni) che regolano il differenziamento sessuale, l’espressione delle caratteristiche sessuali secondarie e le tipologie di comportamento sessuale. Sebbene testicoli e ovaie possano sintetizzare sia ormoni androgeni sia estrogeni, i testicoli secernono principalmente androgeni, che sono pertanto conosciuti come ormoni sessuali maschili, mentre le ovaie producono per lo più estrogeni, che sono conseguentemente conosciuti come ormoni sessuali femminili. Gli androgeni, il principale dei quali è il testosterone (Figura 9.11), sono privi del sostituente C2 sull’atomo C17, presente invece nei glucocorticoidi, e sono quindi composti a 19 atomi di carbonio (C19). Gli estrogeni, di cui fa parte il 𝛃-estradiolo (Figura 9.11), sono simili agli androgeni ma sono composti C18. È interessante notare che il testosterone è un intermedio della biosintesi degli estrogeni. Un’altra classe di steroidi ovarici, i composti C21 chiamati progestine, aiutano a regolare il ciclo mestruale e la gravidanza. Gli androgeni hanno un ruolo chiave nel differenziamento sessuale. Se le gonadi di un embrione maschile di mammifero vengono rimosse chirurgicamente, quell’individuo si svilupperà con fenotipo femminile. Evidentemente i mammiferi sono programmati per svilupparsi come femmine a meno che non vengano sottoposti durante il loro stadio embrionale all’influenza degli ormoni testicolari. Infatti, gli individui geneticamente maschi con recettori citosolici per gli androgeni non funzionanti o addirittura assenti sono fenotipicamente femminili, sviluppano cioè una condizione nota come femminilizzazione testicolare. Curiosamente, nonostante siano fondamentali per la maturazione e la funzionalità sessuale femminile, gli estrogeni sembrano non avere alcun ruolo, a livello embrionale, nello sviluppo sessuale femminile. Gli androgeni che favoriscono la crescita muscolare sono noti come steroidi anabolizzanti. Molte persone, nel tentativo di incrementare le loro prestazioni atletiche o semplicemente per ragioni estetiche, hanno assunto steroidi anabolizzanti sia di origine naturale sia di sintesi. Dato che queste sostanze e i loro prodotti metabolici interagiscono con i vari recettori steroidei, il loro utilizzo può causare effetti collaterali negativi, come patologie cardiovascolari, lo sviluppo del tessuto mammario nei maschi, la mascolinizzazione nelle femmine e l’infertilità temporanea in entrambi i sessi; negli adolescenti può provocare un rallentamento della crescita dovuto all’aumentata velocità di maturazione delle ossa e a un precoce e/o esagerato sviluppo sessuale. Di conseguenza, gli steroidi anabolizzanti sono stati classificati tra le sostanze da tenere sotto controllo. Ne è stato vietato l’uso negli sport agonistici, per evitare che chi li assume possa avere un vantaggio non lecito nei confronti degli altri.

D L’ormone della crescita si lega ai recettori presenti nei muscoli, nelle ossa e nelle cartilagini L’ormone della crescita (GH) è un polipeptide di 19 residui prodotto dal lobo anteriore della ghiandola pituitaria (ipofisi). Il suo legame ai recettori stimola direttamente la crescita e il metabolismo delle cellule dei muscoli, delle ossa e delle cartilagini. Il GH agisce anche indirettamente stimolando il fegato a produrre altri fattori di crescita. La produzione eccessiva di ormone della crescita, solitamente dovuta a tumori ipofisari, dà luogo a una crescita eccessiva. Se questa condizione ha inizio mentre lo scheletro è ancora in fase di accrescimento, cioè prima che le sue placche di crescita si siano ossificate, la crescita eccessiva rispetta ugualmente le caratteristiche proporzioni del corpo e si ha il fenomeno del gigantismo. Inoltre, dato che l’eccesso di GH inibisce la produzione di

La segnalazione biochimica

433

434

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

testosterone necessaria all’ossificazione delle placche di crescita, questi “giganti” continuano a crescere durante tutto il corso delle loro brevi vite. Se, però, lo scheletro ha già raggiunto il suo stato di maturazione e quindi si è già ossificato, il GH stimola solamente la crescita dei tessuti molli, portando allo sviluppo di mani e piedi molto grandi e di lineamenti facciali molto più pronunciati e ispessiti, condizione nota come acromegalia. Il problema opposto, cioè la carenza di GH, porta a crescita insufficiente (dwarfismo), che può essere trattata farmacologicamente prima che lo scheletro raggiunga la sua maturazione definitiva mediante iniezioni regolari di GH umano (hGH; il GH animale è inefficace sull’uomo). Poiché l’hGH, inizialmente, era reperibile solamente se prelevato dalla ghiandola pituitaria dei cadaveri, le quantità erano molto scarse. Ora, però, l’hGH può essere sintetizzato in quantità praticamente illimitata utilizzando la tecnica del DNA ricombinante (Paragrafo 3.5D). L’hGH viene infatti assunto anche da coloro che vogliono incrementare le loro prestazioni atletiche, nonostante manchino le prove inconfutabili che l’hGH funzioni anche in tal senso. Però, a causa dei suoi effetti collaterali che comprendono pressione sanguigna elevata, dolore ai muscoli e alle giunzioni articolari e acromegalia, ma anche per eliminare ingiusti vantaggi per gli atleti che utilizzano questo trattamento, l’hGH è stato proibito al di fuori della terapia medica. CONCETTI DI BASE Il legame del ligando Un ormone si lega al suo recettore con alta affinità e alta specificità (in modo molto simile a un substrato che si lega al sito attivo di un enzima), ma le interazioni di legame sono non covalenti e quindi reversibili. Di conseguenza, la cellula risponde all’ormone solo per il tempo in cui l’ormone rimane associato al suo recettore.

Figura 13.3 Struttura ai raggi X dell’ormone della crescita umano (hGH) unito a due molecole del dominio extracellulare (hGHbp) del suo recettore. La proteina è mostrata sotto forma di struttura a nastro: l’hGH è color porpora e le due molecole di hGHbp, che legano una molecola di hGH, sono colorate secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno dal suo N-terminale (in blu) al suo C-terminale (in rosso). Le linee rosse punteggiate indicano il modo in cui si ipotizza che le catene di hGHbp penetrino la membrana (in grigio-azzurro). [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Abraham de Vos e Anthony Kossiakoff, Genentech Inc., South San Francisco, California. PDBid 3HHR.].

Il recettore del GH dimerizza in seguito al legame dellÕormone. Il recettore del GH, una proteina di 620 residui, è un membro di una grande famiglia di proteine strutturalmente correlate. Questi recettori sono costituiti da un dominio N-terminale extracellulare a cui si lega il ligando, da un singolo segmento transmembrana che è quasi certamente un’elica e da un dominio citoplasmatico C-terminale che non ha omologie all’interno della superfamiglia ma che in molti casi funziona come una tirosina chinasi (Paragrafo 13.2A). La struttura ai raggi X dell’hGH unito al dominio extracellulare della sua proteina di legame (hGHbp) rivela che il complesso è costituito da due molecole di hGHbp legate a una singola molecola di hGH (Figura 13.3). L’hGH, come molti altri fattori di crescita proteici, è costituito in larga misura da fasci di quattro eliche. Ogni molecola di hGHbp è formata da due domini strutturalmente omologhi, ognuno dei quali forma un sandwich topologicamente identico, con due foglietti β antiparalleli di tre e quattro filamenti che ricordano il ripiegamento delle immunoglobuline (Paragrafo 7.3B).

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

Le due molecole di hGHbp si legano all’hGH con simmetria all’incirca doppia nei confronti di un asse che è quasi perpendicolare agli assi delle eliche del fascio a quattro eliche dell’hGH e presumibilmente anche al piano della membrana cellulare a cui è ancorato l’intero recettore dell’hGH (Figura 13.3). I domini C-terminali delle due molecole hGHbp sono praticamente paralleli e in contatto uno con l’altro. È interessante notare che le due molecole hGHbp, per legarsi ai siti localizzati dalla parte opposta del fascio di quattro eliche dell’hGH, utilizzano sostanzialmente gli stessi residui, nonostante questi siti non abbiano similitudini strutturali. L’interazione del ligando col dominio extracellulare del recettore induce cambiamenti conformazionali nelle porzioni intracellulari della proteina, la prima fase della trasduzione del segnale. Sebbene i primi modelli dell’azione dell’ormone della crescita proponessero che l’interazione con il ligando inducesse la dimerizzazione delle catene polipeptidiche del recettore, recentemente è stato dimostrato che in assenza dell’ormone anche i recettori di hGH possono formare dei dimeri tramite interazioni relativamente deboli tra i loro segmenti transmembrana. Il legame dell’hGH ai due domini extracellulari identici del recettore induce dei riarrangiamenti strutturali, inclusa la rotazione e l’allontanamento (a forbice) dei domini intracellulari, che si posizionano in modo da interagire con le proteine effettrici citosoliche. Numerosi altri fattori di crescita proteici esercitano i loro effetti tramite recettori simili.

435

La segnalazione biochimica

PUNTO DI VERIFICA

• Spiegate perché solamente alcune cellule rispondono agli ormoni, anche se tutte le cellule del corpo sono esposte agli ormoni.

• Elencate alcuni ormoni prodotti dal pancreas, dalla midollare del surrene e dalla corticale del surrene. Che tipi di molecole sono questi ormoni?

• Riassumete schematizzandoli gli effetti biologici dell’insulina, del glucagone, dell’adrenalina, degli androgeni, degli estrogeni e dell’ormone della crescita.

• In che modo i recettori rispondono ai loro agonisti e antagonisti?

• Perché alcuni recettori ormonali sono proteine intracellulari?

• Indicate alcuni rischi legati all’utilizzo non medico degli steroidi e dell’ormone della crescita.

• Qual è il significato della dimerizzazione del recettore del GH?

2 I recettori con attività tirosina chinasica CONCETTI CHIAVE

• La dimerizzazione e l’autofosforilazione permettono al recettore tirosina chinasi di acquisire un’attività tirosina chinasica.

• Le proteine adattatore contenenti i domini SH2 e SH3 collegano il recettore tirosina chinasi con le proteine G e con ulteriori chinasi, generando una cascata enzimatica.

• Alcuni recettori agiscono mediante tirosina chinasi non recettoriali associate al recettore stesso.

• Le proteina fosfatasi partecipano alle vie di segnalazione rimuovendo i gruppi fosforici dai recettori e dalle proteine bersaglio.

Nel Paragrafo 12.3B abbiamo visto che le attività di molti enzimi sono controllate dalle modificazioni covalenti, rappresentate principalmente dalla fosforilazione di residui di Ser e di Thr. Un processo simile pone le basi di uno dei principali sistemi di segnalazione intracellulare, la fosforilazione dipendente dall’ATP delle catene laterali della Tyr da parte delle proteine con attività tirosina chinasica (PTK; a destra). I residui fosfo-Tyr mediano interazioni proteina-proteina coinvolte in numerose funzioni cellulari. Di conseguenza, le PTK hanno un ruolo fondamentale nella trasduzione del segnale, nella regolazione delle principali vie metaboliche, nel controllo del ciclo cellulare, nonché nella crescita e nel differenziamento cellulare. In questa sezione prendiamo in esame le proteine che partecipano a questo sistema di segnalazione e le modalità con cui le loro attività trasmettono segnali all’interno della cellula.

A I recettori con attività tirosina chinasica trasmettono segnali attraverso la membrana cellulare

La prima tappa in tutte le vie di segnalazione biochimica è rappresentata dal legame di un agonista con il suo recettore. Nella Scheda 13.2 viene descritto il modo in cui è possibile quantificare le interazioni ligando-recettore. L’insulina e molti altri ormoni proteici noti come fattori di crescita si legano a re-

Proteina

CH2

OH ATP ADP O

Proteina

CH2

O P O2

O2

436

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

SCHEDA 13.2

© 978-88-08-42096-1

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Il legame recettore-ligando può essere quantificato I recettori, come le altre proteine, legano i loro ligandi secondo la legge di azione di massa:

F (quindi di [R ∙ L] e di [L]) rispettivamente misurando la radioattività presente sul filtro e quella rimasta in soluzione. Il lavaggio del filtro per rimuovere la parte residua di ligando libero non porta a errori significativi poiché la velocità di dissociazione del ligando è generalmente molto bassa (da minuti a ore). Una volta determinati i parametri di legame del ligando con il recettore, si possono determinare anche le costanti di dissociazione di altri ligandi per lo stesso sito di legame del ligando utilizzando approcci di legame competitivi. Il modello che descrive il legame competitivo è analogo a quello dell’inibizione competitiva di un enzima che segue la cinetica di Michaelis-Menten (Paragrafo 12.2A):

R + L 34 R ∙ L in cui R ed L rappresentano rispettivamente il recettore e il ligando; la costante di dissociazione è espressa da: [R ][L ] ([R ]T [R ? L ])[ L ] [13.1] KL [R ? L ] [R ? L ] dove la concentrazione totale del recettore, [R]T, è uguale a [R] + [R ∙ L]. L’equazione 13.1 può essere rielaborata in modo da ottenere un’equazione simile a quella della cinetica enzimatica di Michaelis-Menten (Paragrafo 12.1B): [R ? L ] [L ] Y [13.2] [R ]T KL [L ] dove Y è uguale alla saturazione frazionale dei siti di legame del ligando. L’equazione 13.2 rappresenta una curva iperbolica (Figura 1a) in cui KL potrebbe essere definito come la concentrazione di ligando a cui il recettore è occupato dal ligando per la metà della sua capacità massima di legame. Sebbene KL e [R]T possano, in linea di principio, essere determinati dal grafico iperbolico come quello riportato nella Figura 1a, è molto più conveniente utilizzare una forma lineare dell’equazione. L’equazione 13.1 può essere riformulata come ([R ]T [R ? L ] [R ? L ]) [13.3] [L ] KL Ora, in linea con la nomenclatura solitamente utilizzata per il legame al recettore, definiamo [R ∙ L] come B (per ligando legato), [L] come F (per ligando libero) e [R]T come Bmax. L’equazione 13.3 diventa quindi (B max B) B [13.4] F KL Il grafico del rapporto B/F in funzione di B, noto come grafico di Scatchard (dal suo ideatore George Scatchard) o Scatchard plot, determina una linea retta la cui pendenza è −1/KL e la cui intercetta sull’asse B è Bmax (Figura 1b). B ed F possono essere determinati utilizzando un metodo di valutazione noto come dosaggio del legame al filtro. La maggior parte dei recettori è costituita da proteine insolubili legate alla membrana e può essere quindi separata dai ligandi liberi e solubili per filtrazione (i recettori solubilizzati possono essere separati dal ligando libero per filtrazione attraverso la nitrocellulosa sfruttando la proprietà della nitrocellulosa di legare le proteine anche se in modo non specifico). Quindi, utilizzando ligandi marcati radioattivamente, si possono determinare i valori di B e di (a)

KL R + L + I

R·L

KI R·I + L

Nessun legame

dove I è il ligando competitivo, la cui costante di dissociazione dal recettore è espressa come: [R ][I] KI [R ? I] Quindi, per analogia con l’equazione che descrive l’inibizione competitiva: [R ]T [l] [R ? L ] [I] KL 1 [L ] KI

[13.5]

[13.6]

Le affinità relative di un ligando e di un inibitore possono quindi essere determinate dividendo l’equazione 13.6 in presenza di inibitore con la stessa equazione formulata in assenza di inibitore: KL

[R ? L ]I [R ? L ]0

KL 1

[L ] [I]

[13.7]

[L ] KI Se il rapporto è pari a 0,5 (equivalente a un’inibizione del 50%), ci si riferisce alla concentrazione del competitore come [I50]. Risolvendo quindi l’equazione 13.7 rispetto a KI al 50% di inibizione si ha: [I50 ]

KI 1

[L ]

[13.8]

KL

(b)

1,0

Bmax KL

[R • L] [R]T

Pendenza = –

0,5 B F

Bmax

KL [L]

B

1 KL Figura 1 Il legame del ligando con il

recettore. (a) Grafico iperbolico. (b) Grafico di Scatchard. In questo caso, B = [R ∙ L], F = [L] e Bmax = [R]T.

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

La segnalazione biochimica

437

cettori i cui domini C-terminali hanno attività tirosina chinasica. Questi recettori con attività tirosina chinasica (RTK) contengono di norma un unico segmento transmembrana, e nello stato privo di ligando sono monomerici. In base a queste caratteristiche strutturali è improbabile che l’interazione tra un ligando e un dominio extracellulare possa indurre un cambiamento conformazionale in un dominio intracellulare (questo tipo di cambiamento appare più probabile in recettori con segmenti multipli transmembrana). In effetti un meccanismo plausibile per l’attivazione dei recettori con attività tirosina chinasica sembra essere il processo di dimerizzazione del recettore indotto dal ligando, che porta alla formazione di omodimeri o eterodimeri. In alternativa, dimeri recettoriali preesistenti possono andare incontro a un riposizionamento a forbice dei loro segmenti transmembrana, come nel caso del recettore per l’ormone della crescita (Figura 13.3), sebbene non abbia attività tirosina chinasica. Il recettore dell’insulina è un dimero anche quando è privo di ligando. In questo caso, l’aggiunta del ligando al recettore dimerico induce effettivamente un cambiamento conformazionale nel recettore che attiva la sua azione tirosina chinasica. L’autofosforilazione induce l’attività tirosina chinasica dei recettori. Quando

un recettore con attività tirosina chinasica dimerizza o cambia la sua conformazione dopo il legame del ligando, i suoi domini citoplasmatici tirosina chinasici (PTK) si avvicinano tra loro in modo da fosforilarsi a vicenda a livello di specifici residui di Tyr. Questa autofosforilazione attiva la tirosina chinasi, che a sua volta può fosforilare altri substrati proteici. Vediamo come avviene questo processo nel caso del recettore dell’insulina. Il recettore dell’insulina è un dimero di protomeri αβ. Ogni protomero è sintetizzato come un singolo precursore di 1382 residui, che viene poi processato proteoliticamente producendo una subunità α di 731 residui, interamente extracellulare, e una subunità β di 620 residui, che è composta da un dominio PTK sul lato citoplasmatico, collegato al dominio extracellulare tramite una singola elica transmembrana. Le subunità α e β all’interno di ogni protomero sono legate mediante un ponte disolfuro, come le due subunità α del recettore. La struttura ai raggi X della porzione extracellulare del recettore dell’insulina, il suo ectodominio (dal greco ektos, esterno) (Figura 13.4) mostra che ciascuno dei suoi protomeri αβ assume una conformazione piegata per formare un dimero a forma di “V”. Le posizioni dei due siti di legame per l’insulina del recettore dimerico, dedotte da vari dati sperimentali, sono troppo lontane perché una singola molecola di insulina possa legare entrambi i siti (come avviene per il legame dell’ormone della crescita umano ai suoi recettori; Figura 13.3). Questo suggerisce che il legame dell’insulina induca un cambiamento conformazionale nell’ectodominio del recettore dell’insulina che avvicina molto i due bracci della V, portando in questo modo i loro domini PTK citoplasmatici abbastanza vicini da potersi fosforilare l’un l’altro. La struttura ai raggi X del dominio PTK di 306 residui della subunità β (Figura 13.5a) rivela una proteina divisa in due lobi da una tasca molto profonda; il suo dominio N-terminale consiste di un foglietto β a cinque filamenti e di un’α-elica, mentre il dominio C-terminale più grande è principalmente ad α-elica. La struttura, come vedremo più volte, è tipica di una grande famiglia di proteina chinasi, enzimi che fosforilano i gruppi OH dei residui di Tyr e/o i residui di Ser e Thr. Il genoma umano codifica infatti 90 PTK e 388 proteina chinasi Ser/Thr; questi geni rappresentano più del 2% del genoma umano e nel loro insieme hanno una capacità fosforilante sufficiente per circa un terzo delle proteine presenti nelle cellule umane. Queste proteine hanno ruoli chiave nelle vie di segnalazione attraverso cui ormoni, fattori di crescita, neurotrasmettitori e tossine influenzano le funzioni delle loro cellule bersaglio.

Siti di legame dell’insulina

Figura 13.4 Struttura ai raggi X

dell’ectodominio del recettore dell’insulina. È rappresentato uno dei suoi protomeri αβ in modello a nastro con i suoi sei domini colorati secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno, con il dominio N-terminale in blu e il C-terminale in rosso. L’altro protomero è rappresentato con un‘immagine della sua superficie colorata nello stesso modo. La subunità β è composta da gran parte del dominio arancione e da tutto il dominio rosso. La proteina è rappresentata con la membrana plasmatica sotto e il suo doppio asse verticale. Nel recettore integro, una singola elica transmembrana connette ciascuna unità β al suo dominio PTK citoplasmatico C-terminale. [Basato sulla struttura ai raggi X di Michael Weiss, Case Western Reserve University, e Michael Lawrence, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Victoria, Australia, PDBid 3LOH].

438

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

(a) Figura 13.5 Struttura ai raggi X del dominio tirosina chinasico del recettore dell’insulina. (a) Il dominio tirosina chinasico è presentato secondo l’orientamento “standard” della proteina chinasi, con il dominio N-terminale in colore rosa, il dominio C-terminale in azzurro e la sua ansa di attivazione in azzurro più chiaro. Le sue tre catene laterali Tyr fosforilate sono indicate nel modello spaziale, con C in verde, N in blu, O in rosso e P in giallo. L’analogo dell’ATP AMPPNP è indicato nel modello spaziale. I sei residui del polipeptide substrato sono mostrati in arancione e il suo residuo fosforilabile di Tyr è indicato in porpora. (b) Le strutture polipeptidiche fondamentali delle forme fosforilate e non fosforilate del dominio del recettore dell’insulina

© 978-88-08-42096-1

(b)

con attività tirosina chinasica sono sovrapposte ai loro lobi C-terminali. La proteina fosforilata è in verde, con l’ansa di attivazione in blu, e la proteina non fosforilata è in giallo, con l’ansa di attivazione in rosso. La freccia azzurra e il segmento nero indicano la rotazione necessaria per allineare i due lobi N-terminali. [La Parte (a), basata su una struttura ai raggi X, e la Parte (b) sono state riprodotte per gentile concessione di Stevan Hubbard, New York University Medical School. PDBid 1IR3 e 1IRK.] Spiegate perché la fosforilazione può far sì che l’ansa rossa della proteina nella Parte (b) modifichi la sua conformazione.

Nella struttura ai raggi X del dominio PTK del recettore dell’insulina (Figura 13.5a), l’analogo non idrolizzabile dell’ATP adenosina-5′-(𝛃,𝛄-immido)trifosfato (AMPPNP o ADPNP, a sinistra) si lega alla tasca presente tra i domini della proteina e il suo gruppo fosforico O O O in posizione γ è in contrapposizione al gruppo OH del residuo berA saglio di Tyr di un substrato peptidico, anch’esso legato alla protei–O P NH P O P CH 2 O na. Tre dei residui di Tyr della PTK localizzati nel dominio C-termiO– O– O– H H nale, nella cosiddetta “ansa di attivazione”, sono fosforilati. Nel suo H H stato non fosforilato, l’ansa di 18 residui si estende attraverso il sito OH OH attivo e impedisce il legame dell’ATP e dei substrati proteici. QuanAdenosina-59-(b,g-immido)trifosfato do i tre residui di Tyr sono fosforilati, l’ansa di attivazione cambia la (AMPPNP) sua conformazione, non occlude più il sito attivo (Figura 13.5b) e diventa parte del sito di riconoscimento del substrato. Infatti, l’attività tirosina chinasica del recettore dell’insulina aumenta con l’aumentare del grado di fosforilazione in corrispondenza delle tre catene laterali di Tyr su cui avviene l’autofosforilazione. I cambiamenti conformazionali nella PTK indotti dalla fosforilazione e dal legame del ligando sono mostrati nella Figura 13.5b. Dopo il legame del ligando e la fosforilazione, il lobo N-terminale della PTK subisce una rotazione di quasi 21° rispetto al lobo C-terminale. Si presume che questa drastica modifica-

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

La segnalazione biochimica

439

zione conformazionale serva a posizionare i residui essenziali per il legame con il substrato e per l’attività catalitica. Quasi tutte le PTK fino a oggi note hanno da uno a tre residui di Tyr autofosforilabili nella loro ansa di attivazione che può assumere conformazioni molto simili in tutte le PTK fosforilate. Inoltre, molte PTK attivate fosforilano anche il recettore opposto a livello dei residui di Tyr citoplasmatici situati al di fuori del dominio della PTK. La specificità della proteina PTK per residui di Tyr e non di Ser o Thr è spiegabile in base all’osservazione che solo le catene laterali di Tyr sono abbastanza lunghe da raggiungere il sito attivo.

B Le cascate delle chinasi trasferiscono segnali al nucleo Alcuni RTK autofosforilati fosforilano direttamente le loro proteine bersaglio finali, mentre altri non sembrano in grado di farlo. Quindi, in che modo vengono attivate queste proteine bersaglio? Vedremo che ciò avviene tramite un diverso e complicato insieme di vie di segnalazione tra loro interconnesse, che coinvolge cascate di proteine associate.

I substrati principali del recettore dell’insulina con attività tirosina chinasica sono noti come IRS-1 e IRS-2 (substrati 1 e 2 del recettore dell’insulina). Quando sono fosforilate, queste proteine possono interagire con un altro gruppo di proteine che contengono uno o due moduli conservati di ∼100 residui, detti domini di omologia Src 2 (SH2), simili alla sequenza di un dominio della proteina nota come Src (pronuncia: “sarc”). I domini SH2 legano i residui di fosfo-Tyr con elevata affinità, ma non legano quelli di fosfo-Ser e fosfo-Thr, molto più abbondanti. Questa specificità ha una semplice spiegazione. Le strutture ai raggi X rivelano che la fosfo-Tyr interagisce con un residuo di Arg sul fondo di una profonda tasca (Figura 13.6): le catene laterali di Ser e Thr sono troppo corte per interagire con questo residuo. Le proteine contenenti SH2 che interagiscono con gli IRS e con altre proteine fosforilate hanno varie funzioni: alcune sono chinasi, altre sono fosfatasi, altre ancora, che legano il GTP, sono note come proteine G (le proteine G hanno un ruolo fondamentale anche nelle vie di segnalazione non dipendenti dai recettori con attività tirosina chinasica, come descritto nel Paragrafo 13.3). Di conseguenza, il legame dell’ormone con il suo RTK è in grado di indurre diverse risposte intracellulari. I domini SH2 si legano ai residui fosfo-Tyr.

I recettori ad attività tirosina chinasica (RTK) attivano indirettamente la proteina G Ras. L’analisi genetica a li-

vello molecolare della segnalazione in organismi distanti dal punto di vista evolutivo ha rivelato l’esistenza di una via notevolmente conservata che regola funzioni essenziali come la crescita e il differenziamento cellulare. Infatti, il legame dei fattori di crescita con il loro recettore con attività tirosina chinasica (RTK) attiva una proteina G monomerica detta Ras, il prototipo di una superfamiglia di proteine G monomeriche che, nell’uomo, è composta da 150 membri. La proteina Ras è ancorata alla superficie interna della membrana plasmatica mediante una coda prenilica (Paragrafo 9.3B). La Ras attivata innesca a sua volta una cascata chinasica, che trasmette il segnale all’apparato di trascrizione nel nucleo. Il legame di un fattore di crescita con il suo recettore dotato di attività tirosina chinasica determina la sua autofosforilazione; l’RTK fosforilato interagisce con una proteina contenente SH2 (Figura 13.7, in alto a sinistra).

Figura 13.6 Struttura ai raggi X del dominio SH2 di Src unito a un peptide bersaglio. La proteina è rappresentata sotto forma di struttura a nastro, colorata secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno dal suo N-terminale (in blu) al suo C-terminale (in rosso) ed è immersa nella rappresentazione schematica semitrasparente della sua superficie molecolare. Al dominio SH2 è legato un polipeptide di 11 residui contenente il tetrapeptide bersaglio fosfo-Tyr-Glu-Glu-Ile (pYEEI) della proteina, disegnato con modello spaziale: il suo scheletro carbonioso (C) è in azzurro, gli atomi di carbonio delle catene laterali sono in verde, gli atomi di N in blu, di O in rosso e di P in arancione. La catena laterale dell’Arg 32 di SH2, che interagisce con il gruppo fosforico del residuo fosfo-Tyr (pTyr) del peptide, è mostrata con il modello a bastoncini. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da John Kuriyan, The Rockefeller University, PDBid 1SPS.]

Disegnate le strutture di fosfo-Thr e di fosfo-Ser e confrontatele con quelle di fosfo-Tyr.

440

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Molte proteine che contengono domini SH2 hanno anche uno o più domini SH3, non correlati, con un numero di residui tra 50 e 75. I domini SH3 legano sequenze ricche di Pro (da 9 o 10 residui; Figura 13.8) e sono presenti anche in alcune proteine prive di domini SH2. Nella cascata di segnalazione mostrata nella Figura 13.7, una proteina di mammifero di 217 residui nota come Grb2 SCHEMA DI PROCESSO Ambiente extracellulare

Fattore di crescita proteico

1

RTK

Membrana plasmatica

Citosol

Dominio SH2

2 P

Y

Y

Ras Dominio (inattiva) SH3 GDP Grb2/ Sem-5

P 3

11

GAP

5

Sos

Ras (attiva) GTP

Sos

Altri effettori (GAP)

6

4 Altri effettori

Altri effettori

Raf 7

Altri effettori

P

MEK

Cascata chinasica

8 Altri effettori

P

MAPK Altre chinasi

9

P Fos 10

P Myc

Nucleo

P Jun

Espressione genica

DNA Jun P

Figura 13.7 La cascata di trasmissione del segnale mediata da Ras. Il legame dell’RTK al corrispondente fattore di crescita (1) induce l’autofosforilazione del dominio citosolico di RTK (2). Grb2/Sem-5 si lega al risultante segmento peptidico contenente fosfo-Tyr mediante il suo dominio SH2 (3), e nello stesso tempo si lega a segmenti ricchi di Pro presenti sulla proteina Sos tramite i suoi due domini SH3 (4). Questo processo induce Sos a scambiare il GDP legato a Ras con GTP (5), attivando quindi Ras, che si lega a Raf (6). In seguito, attraverso una “cascata di chinasi”, Raf, una Ser/Thr chinasi, fosforila MEK (7), che a sua volta fosforila

MAPK (8), che quindi migra nel nucleo (9), dove fosforila fattori di trascrizione come Fos, Jun e Myc (10), regolando in tal modo l’espressione genica. Ras è inattivato dall’idrolisi di GTP (11), un processo accelerato dalle proteine che attivano la GTPasi (GAP). La cascata chinasica ritorna poi al suo stato di riposo mediante l’azione di proteina fosfatasi (Paragrafo 13.2 D) [Egan, S.E. e Weinberg, R.A. (1993). Nature 365, 782.] Indicate le tappe in cui si ha amplificazione del segnale.

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

La segnalazione biochimica

441

Figura 13.8 Struttura ai raggi X del dominio SH3 della proteina Abl associata al suo polipeptide bersaglio di 10 residui, ricco di Pro (APTMPPPLPP). La proteina è rappresentata dall’immagine della sua superficie (in azzurro). Il peptide è raffigurato con una struttura a bastoncino, con il C della Pro in color porpora, l’altro C in verde, l’N in blu, l’O in rosso e l’S in giallo. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Andrea Musacchio, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germania. PDBid 1ABO].

(Sem-5 nel verme nematode Caenorhabditis elegans) è costituita quasi interamente da un dominio SH2 affiancato da due domini SH3 (Figura 13.9). La proteina Grb2/Sem-5 unisce il recettore con attività tirosina chinasica autofosforilato (tramite il suo dominio SH2) alla proteina Sos (tramite il suo dominio SH3). La Ras inattiva ha una molecola di GDP legato nel suo sito di legame del nucleotide. Il complesso Grb2-Sos attiva Ras inducendola a rilasciare il GDP legato e a sostituirlo con una molecola di GTP. Solo il complesso Ras ∙ GTP è in grado di trasmettere il segnale che induce la crescita cellulare innescato dall’RTK. La proteina Ras lega saldamente sia il GDP sia il GTP e quindi per scambiare i due nucleotidi deve interagire con Sos. È per questo motivo che Sos è conosciuta anche come un fattore di scambio dei nucleotidi guaninici (GEF). Come vedremo, la maggior parte delle proteine G ha il suo corrispondente GEF. La struttura ai raggi X di Grb2 (Figura 13.9) suggerisce che il suo dominio SH2 sia collegato in modo flessibile ai suoi due domini SH3. In che modo il legame di questo adattatore flessibile (una regione di collegamento che non ha alcuna attività enzimatica) con un recettore dotato di attività tirosina chinasica fosforilato causa l’attivazione di Ras indotta da Sos? L’interazione tra Grb2 e Sos è così salda da far sì che queste due proteine siano praticamente sempre associate all’interno della cellula. Quindi, quando Grb2 si lega all’RTK fosforilato porta anche Sos sulla superficie interna della membrana plasmatica, dove l’accresciuta concentrazione locale di Sos lo induce a legarsi più prontamente a Ras ancorata alla membrana, agendo quindi come un fattore GEF. Le GAP accelerano le attività GTPasiche delle proteine G. Ras è un enzima (una

GTPasi) che catalizza l’idrolisi a GDP + Pi del GTP a esso legato, limitando quindi l’entità della risposta cellulare al fattore di crescita. Ras idrolizza però due o tre molecole di GTP al minuto, rivelandosi troppo lenta per un’efficace trasduzione del segnale. Inoltre, per un segnale che deve essere molto più che un interruttore da usare una sola volta, bisogna prevedere un meccanismo in grado di spegnerlo ma anche di accenderlo. Queste considerazioni hanno portato alla scoperta di una proteina di 120 kD chiamata RasGAP (GAP) che attiva la GTPasi; quando GAP si lega al complesso Ras ∙ GTP accelera la velocità di idrolisi del GTP di un fattore pari a 105. La maggior parte delle proteine G ha anche una sua corrispondente GAP.

Figura 13.9 Struttura ai raggi X di

Grb2. Il suo dominio SH2 (in verde) è legato ai domini SH3 che lo affiancano (in azzurro e in arancione) da regioni di collegamento di quattro residui apparentemente non strutturati e quindi flessibili. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Arnaud Ducruix, Université de Paris-Sud, Gif sur Yvette Cedex, Francia. PDBid 1GRI.]

442

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Acqua nucleofilica

Ansa a forma di dito

Figura 13.10 Struttura ai raggi X del complesso GAP334 ∙ Ras ∙ GDP ∙ AlF3. Le regioni dei siti attivi delle proteine sono mostrate sotto forma di strutture a nastro in cui Ras è in azzurro, con i suoi 12 residui di Gly in color porpora e GAP334 in giallo, con la sua ansa a forma di dito in rosso. Il GDP, l’AlF3 e le catene laterali del Gln 61 di Ras e dell’Arg 789 di GAP334 sono raffigurate in forma di bastoncini, con gli atomi di C in verde, di N in blu, di O in rosso, di F in giallo-verde, di P in arancione e di Al in rosa. La molecola d’acqua è rappresentata da una sfera rossa, i legami idrogeno sono indicati con linee tratteggiate. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Alfred Wittinghofer, Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie, Dortmund, Germania. PDBid 1WQ1.]

Il meccanismo con cui RasGAP incrementa l’attività GTPasica di Ras è stato rivelato dalla struttura ai raggi X del dominio di 334 residui di RasGAP (GAP334) capace di attivare la GTPasi, legato a Ras unita al GDP e ad AlF3 (Figura 13.10). Il GAP334 interagisce con Ras su una superficie di contatto molto ampia. L’AlF3, che ha geometria trigonale planare, si lega a Ras nella posizione solitamente occupata dal gruppo fosforico in posizione γ del GTP, con l’atomo di Al opposto a una molecola d’acqua che probabilmente dovrebbe essere quella che porta l’attacco nucleofilico nella reazione catalizzata dalla GTPasi. Dal momento che i legami Al-F e P-O hanno lunghezze simili, l’insieme GDP-AlF3-H2O assomiglia allo stato di transizione della reazione GTPasica in cui AlF3 imita il gruppo planare PO3. Il dominio GAP334 si lega a Ras tramite un’ansa a forma di dito inserita nel sito attivo di Ras; in questo modo un residuo di Arg dell’ansa interagisce sia con il fosfato in posizione γ del GDP sia con l’AlF3. Nel complesso Ras ∙ GTP, la catena laterale di questo residuo di Arg si viene a trovare in una posizione ottimale per stabilizzare la carica negativa che si sviluppa nello stato di transizione della reazione della GTPasi. Infatti, le proteine G cataliticamente più efficienti contengono un residuo di Arg che occupa una posizione praticamente identica. La via di segnalazione è completata da una cascata di chinasi. La via di segna-

lazione a valle di Ras è costituita da una cascata lineare di proteina chinasi (Figura 13.7, a destra). La proteina Raf, una Ser/Thr chinasi attivata da una diretta interazione con Ras ∙ GTP, fosforila e attiva una proteina conosciuta come MEK o MAP chinasi chinasi. La MEK attivata fosforila a sua volta una famiglia di proteine note con vari nomi: proteina chinasi attivate da agenti mitogeni (MAPK) oppure chinasi regolate da segnali extracellulari (ERK). Per essere completamente attiva, la MAPK deve essere fosforilata in corrispondenza di residui di Thr e di Tyr nella sequenza Thr-Glu-Tyr. La MEK (il cui nome deriva da MAP kinase/ERK kinase-activating kinase, chinasi che attiva la MAP chinasi e la ERK chinasi) catalizza entrambe le fosforilazioni; è quindi una Ser/Thr chinasi, ma anche una Tyr chinasi. Le MAP chinasi attivate si spostano dal citosol al nucleo, dove fosforilano varie proteine, tra cui Fos, Jun e Myc. Queste proteine sono fattori di trascrizione (proteine che inducono la trascrizione dei loro geni bersaglio; Paragrafo 28.3B). Nella loro forma attivata stimolano vari geni a produrre gli effetti indotti dalla presenza extracellulare del fattore di crescita che ha dato inizio alla cascata di trasduzione del segnale. Quando l’insulina attiva la via di segnalazione mediata da Ras, il risultato è un aumento della sintesi proteica che favorisce la crescita e il differenziamento cellulare, una risposta coerente con le funzioni dell’insulina come segnale di riserve energetiche abbondanti. Le varianti proteiche codificate dagli oncogeni interferiscono con queste vie di segnalazione, inducendo una crescita cellulare incontrollata (Scheda 13.3).

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

SCHEDA 13.3

443

LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA

Gli oncogeni e il cancro La crescita e il differenziamento delle cellule in un organismo sono di norma rigorosamente controllati. Quindi, con poche eccezioni (per esempio, le cellule del sangue e i follicoli piliferi), le cellule di un adulto sono in gran parte quiescenti. Per varie ragioni, tuttavia, una cellula può essere indotta a proliferare in modo incontrollato, originando un tumore. I tumori maligni (cancri) crescono in modo invasivo e sono quasi sempre una minaccia per la vita; negli Stati Uniti sono responsabili del 20% dei casi di morte. Tra le numerose cause che possono far insorgere un cancro vi sono virus che trasportano oncogeni (dal greco ònkos, “massa” o “tumore”). Per esempio, il virus del sarcoma di Rous (RSV), che induce la formazione di sarcomi (forme tumorali del tessuto connettivo) nei polli, contiene quattro geni: tre di questi sono indispensabili per la replicazione del virus, mentre il quarto, v-src (v sta per “virale”, src per “sarcoma”), un oncogene, determina la formazione del tumore. Qual è l’origine di v-src, e come agisce? Studi di ibridazione effettuati da Michael Bishop e Harold Varmus nel 1976 hanno condotto alla straordinaria scoperta che le cellule di pollo non infettate contengono un gene, c-src (c sta per “cellulare”), omologo a v-src e altamente conservato in un’ampia varietà di organismi eucariotici: questo induce a ritenere che si tratti di un gene cellulare essenziale. A quanto pare v-src è stato acquisito in origine dalle cellule a partire da un antenato di RSV non cancerogeno. Sia v-src sia c-src codificano una tirosina chinasi di 60 kD, ma mentre l’attività di c-src è rigorosamente controllata, quella di v-src non subisce questo controllo e quindi la sua presenza mantiene la cellula ospite nello stato proliferativo. Poiché le cellule non sono uccise da un’infezione di RSV, si presume che questo fattore provochi un aumento della velocità di replicazione del virus. Altri oncogeni sono stati collegati in modo simile a processi che regolano la crescita cellulare. Per esempio, l’oncogene v-erbB codifica una versione tronca del recettore per il fattore di crescita epidermico, che ha perduto il dominio di legame per il fattore di crescita epidermico (EGF) ma ha mantenuto il suo segmento transmembrana e il suo dominio con attività tirosina chinasica. In assenza di un segnale extracellulare, questa chinasi fosforila le sue proteine bersaglio, favorendo quindi una proliferazione cellulare incontrollata. L’oncogene v-ras codifica una proteina di 21 kD,

v-Ras, simile alla proteina Ras cellulare ma in grado di idrolizzare il GTP molto più lentamente. Il ridotto effetto frenante esercitato dall’idrolisi del GTP sulla velocità di fosforilazione delle proteine porta a un aumento dell’attivazione delle chinasi che si trovano a valle rispetto a Ras (Figura 13.7). Anche i fattori di trascrizione che rispondono ai segnali mediati da Ras (per esempio, Fos e Jun) sono codificati da proto-oncogeni, analoghi cellulari normali degli oncogeni. I geni virali v-fos e v-jun codificano proteine che sono quasi identiche alle loro controparti cellulari e simulano gli effetti di queste ultime nelle cellule ospiti, ma in modo incontrollato. Gli oncogeni non sono necessariamente di origine virale: in realtà pochi tumori umani sono causati da virus, ma piuttosto da proto-oncogeni che per mutazione si sono trasformati in oncogeni. Per esempio, una mutazione nel gene c-ras, che trasforma Gly 12 in Val nella proteina Ras, riduce l’attività GTPasica di Ras senza influenzare la sua capacità di stimolare la fosforilazione proteica. Questo prolunga il tempo in cui Ras è nello stato attivato e induce quindi una proliferazione cellulare incontrollata. In effetti, gli oncogeni più comunemente coinvolti nei tumori umani sono versioni “oncogeniche” di c-ras, presenti in circa il 30% dei tumori umani. Finora sono stati identificati più di 350 oncogeni cellulari e virali. Gli effetti devastanti dei prodotti degli oncogeni derivano dalle differenze rispetto alle corrispondenti proteine normali: possono avere diverse velocità di sintesi e/o di degradazione, possono avere funzioni cellulari modificate, oppure sfuggire ai controlli dei meccanismi regolatori cellulari. Tuttavia, perché una cellula normale possa subire una trasformazione maligna (cioè diventare una cellula cancerosa), devono determinarsi vari eventi oncogenici indipendenti (in media cinque). Questo aspetto riflette la complessità della rete di segnalazione cellulare (le cellule rispondono a numerosi ormoni, fattori di crescita e fattori di trascrizione, secondo schemi parzialmente sovrapposti) e spiega perché l’incidenza del cancro aumenta con l’età. Eppure, a livello cellulare, la trasformazione maligna costituisce un evento estremamente raro, dato che le mutazioni oncogeniche sono poco frequenti e le cellule posseggono meccanismi di difesa altamente efficaci che le salvaguardano dal cancro.

Immagine a falsi colori basata su una radiografia ai raggi X della sezione trasversale dell’addome di un paziente con cancro del fegato. Il fegato è la grande massa di colore rossastro che occupa quasi tutto l’addome; le zone più chiare visibili nel fegato sono i focolai cancerosi. Una vertebra (in verde scuro) è visibile nella parte bassa della regione centrale dell’immagine. [Salisbury/Photo Researchers.]

444

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Il vantaggio di avere a disposizione una “cascata di chinasi” consiste nella possibilità di amplificare molte volte un limitato segnale all’interno della cellula. La fosforilazione di più proteine bersaglio permette inoltre di attivare contemporaneamente numerosi processi cellulari. In tal modo, come vedremo (Paragrafo 22.2), la segnalazione dell’insulina media i cambiamenti del trasporto delle vescicole, l’attivazione enzimatica e l’espressione genica. Le proteine di sostegno organizzano e posizionano le proteina chinasi. Le

cellule eucariotiche contengono numerose e diverse cascate di segnalazione MAPK, ognuna delle quali è composta da un insieme caratteristico di chinasi, che nei mammiferi comprende almeno 14 MAP chinasi, 7 MAP chinasi chinasi (MKK; per esempio la MEK) e 14 MAP chinasi chinasi chinasi (MKKK, per esempio la Raf, Figura 13.11). Sebbene ogni MAPK sia attivata da una specifica MKK, una data MKK può essere attivata da più di una MKKK. Inoltre, diverse vie possono essere attivate da un singolo tipo di recettore. In che modo quindi una cellula impedisce la comunicazione incrociata (crosstalk) tra le vie di segnalazione strettamente correlate? Un sistema è l’utilizzo di proteine di sostegno che legano alcune o tutte le proteina chinasi di una particolare cascata di segnalazione, in modo da assicurare che le proteina chinasi di una determinata via interagiscano solamente tra loro. Inoltre, le proteine di sostegno possono orientare correttamente e attivare allostericamente le chinasi a loro associate, possono dirigerle verso specifiche localizzazioni cellulari, e in alcuni casi sono soggette esse stesse a regolazione mediante fosforilazione. La prima proteina di sostegno è stata scoperta attraverso l’analisi genetica della cascata della MAP chinasi nel lievito. È stato possibile dimostrare che questa proteina, la Ste5p, lega i componenti MKKK, MKK e MAPK della via e che, in vivo, la mancanza della proteina di sostegno porta all’inattivazione della via. I mammiferi hanno una proteina di sostegno con funzione simile, anche se non correlata come sequenza, chiamata KSR (kinase suppressor of Ras, o chinasi soppressore di Ras). Evidentemente, le interazioni tra le componenti chinasiStimolo extracellulare:

Fattore di crescita

Stress, fattore di crescita, fattore di differenziamento

MKKK

Raf-1, A-Raf, B-Raf, Mos

MKK

MEK1, MEK2

MAPK

ERK1, ERK2

Stress

MEKK1-3, Tpl-2 ?

MEKK4, DLK

MKK5

MKK4, MKK7

MKK3, MKK6

ERK3, ERK5 ERK4

JNK1, JNK2, JNK3

p38α, p38β, p38γ, p38δ

c-Jun, ATF-2, Elk-1, p53, DPC4, NFAT4

Chinasi MAPKAP, ATF-2, Elk-1, Chop, Max, MEF2C

?

TAK1, ASK1, MLK3

PAK

? Fattori di trascrizione e altre chinasi:

p90

rsk, S6 chinasi, Sos,

fosfolipasi A2, recettore EGF, Elk-1, Ets1, Sap1a, c-Myc, Tal, STATS

MEF2C

c-Jun Risposta cellulare:

Crescita, differenziamento

Crescita, differenziamento, Produzione di citochine, sopravvivenza, apoptosi apoptosi

Figura 13.11 Cascata della MAP chinasi nelle cellule di mammifero. Ogni cascata della MAP chinasi è costituita da una MKKK, una MKK e una MAPK. Ognuno dei vari stimoli esterni può attivare una o più MKKK, che a sua volta può attivare una o più MKK. Però le MKK sono relativamente specifiche per le loro MAPK bersaglio. Le MAPK attivate fosforilano specifici fattori di trascrizione, che vengono poi trasferiti nel nucleo insieme a specifiche chinasi. I fattori di trascrizione e le chinasi così attivati inducono risposte cellulari quali crescita, differenziamento e apoptosi (morte cellulare programmata; Paragrafo 28.4C). [Da Garrington, T.P. e Johnson, G.L. (1999). Curr. Opin. Cell Biol. 11, 212.]

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

445

che successive in questa cascata MAP chinasica sono di per sé insufficienti alla trasmissione del segnale.

C Alcuni recettori sono associati a tirosina chinasi non recettoriali Molti recettori per i fattori di crescita presenti sulla superficie cellulare non rispondono al legame dei ligandi con l’autofosforilazione. Tra questi vi sono i recettori dell’ormone della crescita (Figura 13.3), delle citochine (fattori di crescita proteici che regolano il differenziamento, la proliferazione e le attività di numerosi tipi di cellule, principalmente delle cellule del sangue), degli interferoni (fattori di crescita proteici che stimolano le difese antivirali) e dei recettori delle cellule T (che controllano la proliferazione delle cellule del sistema immunitario conosciute anche come linfociti T; Paragrafo 7.3). Il legame del ligando induce questi recettori associati alle tirosina chinasi a dimerizzare (e, in alcuni casi, a trimerizzare), spesso con tipi diversi di subunità, in modo da attivare delle tirosina chinasi non recettoriali (NRTK) a essi associati. La struttura di Src rivela il suo meccanismo autoinibitorio. Molti NRTK appartengono alla famiglia delle Src,

SH3

PTK (lobo N-terminale)

che comprende almeno nove membri, tra cui Src, Fyn e Elica C Lck. Molte di queste proteine di circa 530 residui, anN Y416 corate tramite miristilazione alla membrana, hanno un dominio SH2 o uno SH3, mentre tutte hanno il dominio PTK. Quindi, una chinasi correlata a Src può essere attivata da un recettore PTK autofosforilato. Sebbene SH2 le chinasi correlate a Src siano ognuna associata a diversi recettori, esse fosforilano in pratica lo stesso gruppo di proteine bersaglio. Questa complessa rete di interazioni spiega perché ligandi differenti spesso attivano le stesse pY527 vie di segnalazione. Partendo dall’N-terminale verso il C-terminale, la PTK (lobo C-terminale) struttura di Src consiste di un dominio N-terminale miC ristilato “unico”, diverso in ogni membro della famiglia Src, di un dominio SH3, di un dominio SH2, di un dominio PTK e di una bre- Figura 13.12 Struttura ai raggi X del ve coda C-terminale. La fosforilazione della Tyr 416 nell’ansa di attivazione del complesso Src ∙ AMPPNP con la Tyr 527 fosforilata. La proteina, a cui manca dominio PTK attiva Src, mentre la fosforilazione della Tyr 527 nella coda C-ter- il dominio N-terminale ancorato alla minale la inattiva. In vivo, Src è fosforilata sulla Tyr 416 oppure sulla Tyr 527, membrana, è orientata per far sì che ma non su entrambe. La defosforilazione della Tyr 527 o il legame di ligandi il suo dominio PTK sia visto in modo esterni al dominio SH2 o al dominio SH3 attiva Src, e questa situazione viene “standard” (confrontare con la Figura Il dominio SH3 è in arancione, poi mantenuta dall’autofosforilazione della Tyr 416. Se la Tyr 527 è fosforilata 13.5a). il dominio SH2 è in color porpora, la ma non sono disponibili fosfopeptidi attivatori, i domini SH2 e SH3 funzio- regione di collegamento che unisce nano deattivando il suo dominio PTK. In questo modo Src viene autoinibita. il dominio SH2 al dominio PTK è in La struttura ai raggi X di Src ∙ AMPPNP, priva del dominio N-terminale e verde, con i residui da 249 a 253 che con la Tyr 527 fosforilata, ha rivelato le basi strutturali dell’autoinibizione di Src interagiscono con il dominio SH3, in giallo. Il lobo N-terminale del dominio (Figura 13.12). Come precedenti studi biochimici hanno già dimostrato, il domi- PTK è in rosa, il lobo C-terminale della nio SH2 lega la fosfo-Tyr 527, presente nella sequenza amminoacidica pYNPG proteina è in azzurro, con l’ansa di e non nella sequenza pYEEI, entrambe sequenze caratteristiche dei peptidi ber- attivazione in blu chiaro, mentre la saglio a elevata affinità di Src-SH2. Nonostante che il segmento pYNP si leghi coda C-terminale è rossa. L’AMPPNP è rappresentato con modello spaziale a SH2 come il segmento pYEE mostrato nella Figura 13.6, nella struttura ai e l’Y416 (non fosforilato) e il pY527 raggi X i residui successivi risultano scarsamente ordinati e, inoltre, la tasca di (fosforilato) sono mostrati in forma di SH2 in cui si lega la catena laterale del residuo di Ile di pYEEI non è occupata. bastoncini, in cui tutti gli atomi di C sono In apparenza sembra che il segmento del peptide contenente la fosfo-Tyr 527 in verde, di N sono in blu, di O sono in rosso e di P sono in giallo. [Basata su una si leghi al dominio di Src con affinità ridotta rispetto ai suoi peptidi bersaglio. struttura ai raggi X di Stephen Harrison Il dominio SH3 di Src si lega alla regione di collegamento che unisce il do- e Michael Eck, Harvard Medical School. minio SH2 al lobo N-terminale del dominio PTK. I residui da 249 a 253 della PDBid 2SRC.]

446

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

Figura 13.13 Rappresentazione schematica del processo di attivazione di Src. Nella sua forma autoinibita (a sinistra), il dominio SH2 (in color porpora) della proteina si lega alla fosfo-Tyr 527 e il dominio SH3 (in arancione) si lega a un segmento interno (in giallo) contenente Pro. Il Glu 310 forma un ponte salino con l’Arg 409, l’ansa di attivazione parzialmente a elica (in blu) blocca il sito attivo e la Tyr 416 rimane nascosta. Nella forma attiva (a destra) i domini SH2 ed SH3 si legano all’attivatore di Src, la Tyr 527 è stata defosforilata, l’ansa di attivazione ha subito un cambiamento conformazionale tale per cui espone la Tyr 416 alla fosforilazione, il Glu 310 forma un ponte salino con la Lys 295 e la fosfo-Tyr 416 forma un ponte salino con l’Arg 409. Lo schema di colorazione e la vista della proteina corrispondono a quelli della Figura 13.12. [Da Young, M.A., Gonfaloni, F., Superti-Furga, G., Roux, B. e Kuriyan, J. (2001). Cell 105, 115.]

© 978-88-08-42096-1

regione di collegamento si legano al dominio SH3 più o meno allo stesso modo dei peptidi bersaglio ricchi di Pro di SH3 (Figura 13.8). Tuttavia, l’unica Pro presente in questo segmento è il residuo in posizione 250. La catena laterale polare della Gln 253, che occupa la posizione della seconda Pro nella normale sequenza bersaglio Pro-X-X-Pro di SH3, non entra nella tasca di legame idrofobica che questa seconda Pro dovrebbe occupare (Figura 13.8) e quindi a questo punto la posizione del peptide è deviata rispetto a quella dei peptidi bersaglio ricchi di Pro. In apparenza sembra che anche questa interazione sia più debole di quelle con i peptidi bersaglio di SH3 della Src. Dato che i domini SH2 e SH3 di Src legano il dominio PTK dalla parte opposta al suo sito di attivazione, come viene inibita l’attività PTK? I due lobi del dominio PTK di Src sono, per la maggior parte, molto simili ai loro corrispettivi presenti nei domini PTK delle proteina chinasi fosforilate e quindi attivate (vedi come esempio la Figura 13.5a). L’elica C di Src, l’unica elica presente nel lobo N-terminale della PTK, viene però spiazzata dall’interfaccia tra i lobi N- e C-terminali, posizione che solitamente occupa in altre proteina chinasi attivate (vedi come esempio la Figura 13.5a). L’elica C contiene il residuo conservato Glu 310 (seguendo la numerazione di Src), che in altre proteina chinasi attivate si proietta nella tasca catalitica, dove forma un ponte salino con la Lys 295, un importante ligando dei gruppi fosforici in posizione α e β del substrato ATP. Nella Src inattiva, il residuo di Glu 310 forma un ponte salino alternativo con l’Arg 409, mentre la Lys 295 interagisce con l’Asp 404. Nella Lck attivata, l’Arg 409 forma un ponte salino con la fosfo-Tyr 416. Le precedenti osservazioni strutturali suggeriscono che l’attivazione della Src avvenga nel modo seguente (Figura 13.13). 1. La defosforilazione della Tyr 527 e/o il legame dei domini SH2 e/o SH3 con i loro peptidi bersaglio (per i quali SH2 ed SH3 hanno maggiore affinità di quella che hanno per i loro siti di legame interni di Src) rilascia questi domini dalle posizioni in cui sono legati alla PTK mostrate nella Figura 13.12, diminuendo le costrizioni conformazionali sul dominio PTK. Tutto ciò permette alla tasca del sito attivo di PTK di aprirsi, distruggendo quindi la struttura parzialmente a elica della sua ansa di attivazione (che occupa una posizione

Forma autoinibita

Forma attiva

PXXP

Attivatore di Src N

Dominio PTK (lobo N-terminale)

SH3 Lys 295

ATP Lys 295

N

P

Glu 310

SH2

αC

αC

SH3

Arg 409 P

Regione di collegamento SH2-SH3

P

P

Glu 310 Arg 409

P

P

Tyr 416 P P

SH2 Tyr 527 P

Tyr 416

Tyr 527 C Dominio PTK (lobo C-terminale)

Substrato C

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

447

di blocco nella tasca del sito attivo; Figura 13.12) ed esponendo la Tyr 416 all’autofosforilazione. 2. La fosfo-Tyr 416 così prodotta forma un ponte salino con l’Arg 409 che, stericamente, richiede la riorganizzazione strutturale dell’ansa di attivazione nella sua conformazione attiva non bloccante. La rottura conseguente del ponte salino tra Glu 310 e Arg 409 libera l’elica C e le permette di assumere il suo orientamento attivo, che a sua volta permette a Glu 310 di formare il suo ponte salino con Lys 295, molto importante dal punto di vista catalitico, attivando quindi l’attività della Src. Le PTK sono bersagli delle terapie anticancro. La caratteristica principale

della leucemia mieloide cronica (LMC) è la traslocazione cromosomica specifica in cui il gene Abl, che codifica l’NRTK Abl, si fonde con il gene Bcr, che codifica la proteina Ser/Thr chinasi Bcr. Questa traslocazione dà origine al cosiddetto cromosoma Filadelfia. La parte Abl della risultante proteina di fusione Bcr-Abl è costitutivamente attivata (cioè è priva di regolazione), probabilmente perché la sua porzione Bcr oligomerizza. Le cellule staminali emopoietiche (da cui discendono tutte le cellule del sangue) portatrici del cromosoma Filadelfia sono quindi innescate per sviluppare la LMC (la malignità richiede infatti diverse alterazioni genetiche indipendenti; Scheda 13.3). Senza un trapianto di midollo osseo (procedura comunque ad alto rischio e per di più non alla portata di tutti gli individui a causa della mancanza di donatori compatibili) la LMC ha un esito indubbiamente fatale, con un’aspettativa di vita media di circa sei anni dalla diagnosi. Ci si aspetta che un inibitore di Abl possa impedire la proliferazione delle cellule LMC e persino ucciderle. Per essere un efficace agente anti-LMC, questa sostanza non deve inibire altre proteina chinasi, per non creare effetti collaterali molto seri. I derivati della 2-fenilamminopirimidina si legano ad Abl con affinità e specificità eccezionalmente elevate. Uno di questi derivati, l’imatinib (il cui nome commerciale è Gleevec), N N

N

H

H

N

N

H3 C

N C

N CH3

O

Gleevec (imatinib)

sviluppato da Brian Druker e Nicholas Lydon, ha causato la remissione dei sintomi in oltre il 90% dei pazienti con LMC senza la contemporanea comparsa di effetti collaterali importanti. Questi risultati senza precedenti si sono potuti avere, in parte, perché il Gleevec non si lega ad altre proteina chinasi. L’Abl è simile a Src ma è privo del sito di fosforilazione regolatorio nella regione C-terminale tipico di Src (la Tyr 527; Figure 13.12 e 13.13). La struttura ai raggi X del dominio PTK di Abl unita a una forma tronca di Gleevec (determinata da John Kuriyan; Figura 13.14) rivela che il farmaco si lega nel sito di legame dell’ATP di Abl. Abl assume così una conformazione inattiva, in cui la sua ansa di attivazione, che non è fosforilata, è nella forma autoinibita. Il Gleevec è stato il primo di diversi derivati della 2-fenilamminopirimidina che inibiscono diverse proteina chinasi a essere approvato dall’americana FDA (Food and Drug Administration) per l’utilizzo clinico contro certi tipi di cancro. Inoltre, tra gli agenti anticancro vi sono anche alcuni anticorpi monoclonali (Scheda 7.5) che si legano a specifici PTK oppure a loro ligandi (per esempio il trastuzumab, il cui nome commerciale è Herceptin, che è efficace contro i tipi di

Figura 13.14 Struttura ai raggi X del dominio PTK di Abl associato a una forma tronca di Gleevec. La proteina è vista da destra rispetto alla visione “standard” della proteina chinasi (per esempio vedi le Figure 13.5a e 13.12), con il suo lobo N-terminale in violetto, il suo lobo C-terminale in azzurro e la sua ansa di attivazione in blu chiaro. La forma tronca di Gleevec, che occupa il sito di legame dell’ATP della PTK, è mostrata in forma tridimensionale, con gli atomi di C in verde, di N in blu e di O in rosso. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da John Kuriyan, The Rockefeller University. PDBid 1FPU.]

448

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

cancro della mammella che esprimono in quantità molto più elevate della norma l’RTK chiamato HER2). Queste terapie che tendono a colpire recettori ci fanno sperare che sia possibile controllare, se non addirittura curare, il cancro agendo in modo specifico sulle proteine aberranti che causano i vari tipi di tumore. Al contrario, la maggior parte degli agenti chemoterapici che viene attualmente utilizzata uccide in modo indiscriminato le cellule in rapida crescita e proliferazione, e quindi tende generalmente ad avere effetti collaterali molto debilitanti.

D Le proteina fosfatasi sono di diritto proteine di segnalazione Una volta che il sistema ha inviato il suo messaggio, i segnali intracellulari devono essere “spenti” affinché lo stesso sistema possa trasmettere i messaggi che riceverà successivamente. Nel caso delle proteina chinasi, le loro attività sono bilanciate dalle attività di proteina fosfatasi che idrolizzano i gruppi fosforici attaccati alle catene laterali dei residui di Ser, Thr o Tyr e quindi limitano gli effetti del segnale attivato dalla chinasi. Anche se gran parte dell’attenzione è stata rivolta alle proteina chinasi, le cellule di mammifero esprimono circa 500 fosfatasi (un numero all’incirca pari a quello delle chinasi), con specificità di substrato paragonabile a quella delle chinasi. Le proteina tirosina fosfatasi sono proteine multidominio. Gli enzimi che de-

fosforilano i residui di Tyr, detti proteina tirosina fosfatasi (PTP), non sono semplicemente enzimi espressi costitutivamente (housekeeping), ma rappresentano una categoria di trasduttori di segnale. Questi enzimi, 107 dei quali sono codificati dal genoma umano, sono membri di quattro famiglie. Ciascuna tirosina fosfatasi possiede almeno un dominio conservato di circa 240 residui, contenente la sequenza di “riconoscimento (firma)” costituita da 11 residui [(I/V)HCXAGXGR(S/T)G] detta motivo CX5R, nella quale sono contenuti i due residui catalitici essenziali dell’enzima, Cys e Arg. Durante la reazione di idrolisi, il gruppo fosforico è trasferito dal residuo tirosilico della proteina substrato al residuo essenziale di Cys dell’enzima, formando un intermedio con legame covalente Cys-fosfato che in seguito viene idrolizzato. Alcune proteina tirosina fosfatasi hanno una struttura simile a quella del recettore con attività tirosina chinasica; hanno cioè un dominio extracellulare, una singola elica transmembrana e un dominio citoplasmatico costituito da un dominio catalitico PTP, seguito in molti casi da un secondo dominio PTP con scarsa (o nessuna) attività catalitica. Questi domini PTP inattivi sono tuttavia molto conservati; questo induce a ritenere che abbiano una funzione importante ancora sconosciuta. Le analisi biochimiche e strutturali indicano che la dimerizzazione indotta dal ligando di una PTP simile a un recettore riduce la sua attività catalitica, probabilmente mediante un blocco dei siti attivi. Un secondo gruppo di PTP, le PTP intracellulari, contiene solo un dominio tirosina fosfatasico, affiancato da regioni con domini SH2, che partecipano a interazioni proteina-proteina. La PTP nota come SHP-2, espressa in tutte le cellule di mammifero, si lega a vari recettori fosforilati (cioè attivati da ligando) con attività tirosina chinasica. La struttura ai raggi X della SHP-2 priva dell’estremità C-terminale ha rivelato la presenza di due domini SH2, seguiti da un dominio tirosina fosfatasico (Figura 13.15). Il dominio SH2 N-terminale (N-SH2) funziona da autoinibitore tramite inserzione di un’ansa proteica (contrassegnata come D′E nella Figura 13.15) nella fessura catalitica profonda 9 Å della PTP. Quando N-SH2 riconosce e lega un gruppo di fosfo-Tyr su una proteina substrato, la sua conformazione cambia, liberando il sito catalitico PTP: in questo modo la fosfatasi può idrolizzare un altro gruppo fosfo-Tyr sulla proteina bersaglio (i recettori con attività tirosina chinasica attivati hanno di norma molti residui di Tyr fosforilati).

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

La segnalazione biochimica

449

Figura 13.15 Struttura ai raggi X della proteina tirosina fosfatasi SHP-2. In questo disegno il dominio N-SH2 della proteina è in colore dorato, l’ansa D’E è in rosso, il dominio C-SH2 in verde e il dominio PTP in celeste, con il motivo CX5R di 11 residui in blu. La catena laterale del residuo di Cys, essenziale per l’attività catalitica è mostrata con una struttura a sfere e bastoncini, con C in verde ed S in giallo. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Michael Eck e Steven Shoelson, Harvard Medical School. PDBid 2SHP.]

La fessura che costituisce il sito attivo delle proteina tirosina fosfatasi intracellulari come SHP-2 è troppo profonda per legarsi alle catene laterali fosforilate Ser/Thr. Tuttavia le tasche che costituiscono i siti attivi di un terzo gruppo di PTP, dette proteina tirosina fosfatasi a doppia specificità, sono relativamente poco profonde e possono legare residui di fosfo-Tyr e di fosfo-Ser/Thr. La virulenza della peste bubbonica richiede una PTP. I batteri sono privi di

PTK e quindi non producono residui di fosfo-Tyr. Le PTP sono invece espresse nei batteri del genere Yersinia, più precisamente Yersinia pestis, il patogeno che causa la peste bubbonica (la “morte nera” trasmessa dalle pulci che a partire dal VI secolo ha sterminato 200 milioni di persone; negli anni 13471350 un terzo della popolazione europea morì a causa di questo flagello). La PTP di Y. pestis (YopH), necessaria per la virulenza del batterio, è cataliticamente molto più attiva di tutte le altre PTP note. Quando il batterio inietta la proteina YopH in una cellula, le proteine cellulari contenenti residui di fosfo-Tyr sono drasticamente defosforilate. Anche se YopH e le PTP dei mammiferi hanno solo il 15% di omologia di sequenza, esse presentano un gruppo di residui invarianti e hanno anche strutture ai raggi X simili. Ciò suggerisce che un batterio Yersinia ancestrale abbia ricevuto una PTP da un eucariote. Le proteina Ser/Thr fosfatasi partecipano a molti processi regolatori. Le pro-

teina Ser/Thr fosfatasi delle cellule dei mammiferi appartengono a due famiglie proteiche: la famiglia PPP e la famiglia PPM. Le famiglie PPP e PPM non hanno alcuna relazione tra loro o con le proteina tirosina fosfatasi. L’esame delle strutture ai raggi X ha rivelato che i centri catalitici delle PPP contengono ciascuno uno ione Fe2+ (o possibilmente Fe3+) e uno ione Zn2+ (o possibilmente Mn2+), mentre i centri catalitici delle PPM contengono ciascuno due ioni Mn2+. Questi centri contenenti due ioni metallici attivano in modo nucleofilico le molecole d’acqua per defosforilare i substrati in un’unica tappa di reazione. Il membro della famiglia delle PPP chiamato fosfoproteina fosfatasi 1 (PP1), come vedremo, ha un ruolo molto importante nella regolazione del metabolismo del glicogeno (Paragrafo 16.3B). Il membro delle PPP conosciuto come PP2A partecipa a una grande varietà di processi regolatori, tra cui quelli che governano il metabolismo, la replicazione del DNA, la trascrizione e lo sviluppo. La PP2A è un eterodimero costituito da una subunità di sostegno (A) che si lega sia alla subunità catalitica (C), sia alla subunità regola-

450

(a)

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

(b)

Figura 13.16 Struttura ai raggi X della proteina fosfatasi PP2A. (a) Struttura di una subunità di sostegno (A) isolata. Le ripetizioni delle sequenze HEAT, che sono qui raffigurate in colori diversi, consistono ciascuna di due eliche antiparallele unite da una corta regione di collegamento. Queste regioni tengono distanziate le eliche corrispondenti, che si dispongono in modo quasi parallelo e danno origine a una superelica (un’elica costituita da eliche) con avvolgimento destrorso lunga circa 100 Å e a forma di uncino. [Per gentile concessione di Bostjan Kobe, St Vincent’s Institute of Medical Research, Fitzroy, Victoria, Australia.] (b) Struttura di un eterodimero della PP2A, con la subunità di sostegno orientata approssimativamente come nella Parte (a). Qui le subunità di sostegno (A, 589 residui) e regolatoria (B, 449 residui) sono a forma di vermicello e ognuna di esse è colorata secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno dal loro N-terminale (in blu) al loro C-terminale (in rosso). Inoltre, la subunità A è immersa nella sua superficie molecolare semitrasparente. La subunità catalitica (C, 309 residui) è rappresentata sotto forma di struttura a nastro (in color porpora). Si noti la stretta somiglianza strutturale delle subunità A e B. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Yigong Shi, Princeton University. PDBid 2NPP.]

toria (B). La subunità A, costituita da 15 ripetizioni imperfette di una sequenza di 39 residui detta HEAT (perché si ritrova nelle proteine chiamate Huntingtine, EF3, subunità A di PP2A e TOR1), ha una conformazione particolare in cui le ripetizioni HEAT sono collegate in modo da disporsi in una struttura solenoidale a forma di ferro di cavallo (Figura 13.16a). La struttura ai raggi X di un oloenzima (enzima completo, Figura 13.16b) PP2A rivela inaspettatamente che, nonostante l’assenza di somiglianza di sequenza, la sua subunità regolatoria è formata da otto coppie di ripetizioni simili alle HEAT disposte in modo analogo a quelle della subunità A. La subunità C si lega alla superficie concava lungo una dorsale costituita da catene laterali idrofobiche conservate che si estende attraverso le ripetizioni HEAT dalla 11 alla 15. La subunità regolatoria interagisce con le ripetizioni HEAT dalla 2 alla 8 della subunità A in modo molto simile e si lega anche alla subunità C tramite una struttura che si estende attraverso le ripetizio-

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

La segnalazione biochimica

ni (dalla 2 alla 8) simili alle HEAT. La porzione convessa e altamente acida della subunità regolatoria (parte inferiore della Figura 13.16b) viene quindi lasciata libera, il che suggerisce che questa sia la parte della proteina che interagisce con le proteine substrato. Le subunità di sostegno e catalitica di PP2A hanno entrambe due isoforme, mentre la subunità regolatoria ne ha 16. Tutto ciò porta a un’enorme varietà di combinazioni possibili negli enzimi, che sono trasferiti alle fosfoproteine bersaglio differenti in siti subcellulari distinti durante fasi diverse dello sviluppo. Questa complessità è la causa maggiore della nostra limitata comprensione di come le PP2A svolgano le loro funzioni cellulari, anche se queste proteine rappresentano solamente dallo 0,3 all’1% delle proteine cellulari totali. La famiglia PPP delle fosfatasi comprende inoltre la calcineurina (detta anche PP2B), una Ser/Thr fosfatasi attivata dal Ca2+. La calcineurina ha un ruolo fondamentale nella proliferazione delle cellule T ed è inibita dall’azione di farmaci come la ciclosporina A, impiegata per “spegnere” le funzioni del sistema immunitario dopo i trapianti di organo.

PUNTO DI VERIFICA

451

• In che modo il recettore con attività tirosina chinasica si autofosforila?

• Spiegate in che modo l’ansa di attivazione governa l’accesso del substrato al sito attivo di una proteina tirosina chinasica.

• Riassumete i ruoli dei domini SH2 ed SH3, di Ras, del GTP e delle proteina chinasi nella trasmissione di un segnale da un recettore con attività tirosina chinasica (RTK) a un fattore di trascrizione.

• Qual è la funzione di GEF e di GAP nella trasduzione del segnale?

• Spiegate come funziona una cascata delle chinasi. Perché è vantaggiosa nella segnalazione ormonale?

• Qual è la funzione delle proteine di sostegno?

• Descrivete come i domini SH2 ed SH3

3 Le proteine G eterotrimeriche CONCETTI CHIAVE

• I recettori associati alle proteine G contengono sette eliche transmembrana e vanno incontro a cambiamenti conformazionali in seguito al legame di un ormone.

• Il legame di un agonista a un recettore associato a una proteina G induce la subunità α della proteina G eterotrimerica associata a scambiare il GDP con il GTP e a dissociarsi dalle subunità β e γ.

• L’adenilato ciclasi viene attivata per produrre AMP ciclico, che a sua volta attiva la proteina chinasi A.

• L’attività di segnalazione viene limitata attraverso l’azione della fosfodiesterasi che agisce sull’AMP ciclico e sul GMP ciclico.

La seconda classe principale di vie di trasduzione del segnale su cui ci soffermiamo comprende le proteine G eterotrimeriche. Queste proteine sono membri della superfamiglia di GTPasi regolatorie conosciute collettivamente come proteine G: come abbiamo già visto, esse prendono il nome dalla loro capacità di legare i nucleotidi guaninici GTP e GDP e di idrolizzare GTP a GDP + Pi. Le proteine G monomeriche sono essenziali per una grande varietà di processi, compresa la trasduzione del segnale (per esempio la Ras; Paragrafo 13.2B), il traffico intracellulare delle vescicole (Paragrafo 9.4E), la crescita dei microfilamenti di actina (Paragrafo 7.2C), la traduzione (come fattori accessori dei ribosomi; Paragrafo 27.4) e il trasferimento delle proteine alla sede finale (come componenti della particella di riconoscimento del segnale, o SRP, e del recettore dell’SRP; Paragrafo 9.4D). Le proteine G hanno motivi strutturali comuni capaci di legare i nucleotidi guaninici e di catalizzare l’idrolisi del GTP. Molte proteine G eterotrimeriche partecipano al sistema della trasduzione del segnale che consiste di tre componenti principali (Figura 13.17). 1. Recettori associati alla proteina G (GPCR), proteine transmembrana che legano i loro agonisti (per esempio un ormone) sulla porzione extracellulare; ciò induce un cambiamento conformazionale che si trasmette alla porzione citoplasmatica. 2. Proteine G eterotrimeriche, proteine ancorate alla faccia citoplasmatica della membrana plasmatica che vengono attivate da un GPCR in seguito al legame con il loro agonista. 3. Adenilato ciclasi (AC), un enzima transmembrana che viene attivato (o in alcuni casi inibito) dalle proteine G eterotrimeriche.

e la fosforilazione di residui di Tyr influenzano l’attività dei recettori con attività tirosina chinasica.

• Spiegate perché le cellule contengono numerose proteina fosfatasi e proteina chinasi.

452

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

SCHEMA DI PROCESSO Il legame dell’ormone al suo recettore stimola GDP una proteina G 1 eterotrimerica GTP inattiva a scambiare il GDP legato con il GTP.

Ambiente extracellulare

Ormone

La proteina G si dissocia dall’adenilato ciclasi inattivandola. 4

Adenilato ciclasi GDP Recettore Citosol

Proteina G

GDP

GTP

GTP

Pi

3 La proteina G catalizza l’idrolisi del GTP a essa legato.

2 Il complesso proteina G ? GTP si dissocia dal recettore e attiva l’adenilato ciclasi in modo che produca il secondo messaggero cAMP.

ATP cAMP + PPi Risposta cellulare

Figura 13.17 Visione globale del processo di segnalazione dipendente dalla proteina G eterotrimerica. In questa via di segnalazione abbondantemente utilizzata, il legame dell’ormone al suo recettore stimola una proteina G eterotrimerica inattiva a scambiare il GDP che ha legato a sé con il GTP, innescando un processo che attiva l’adenilato ciclasi affinché produca il secondo messaggero cAMP.

Spiegate perché questa via è irreversibile.

L’AC attivata catalizza la sintesi di adenosina-3′,5′-monofosfato ciclico (3′,5′AMP ciclico o cAMP) a partire dall’ATP. NH2 NH2 N

N

H

N

N

H H O –O

P O–

O O

P O–

O O

P

O

H2C

O–

H

PPi

O H OH

O H

O H P

H HO

N

N

H2 C

adenilato ciclasi

O

H

ATP

N

N

H

O

H H OH

–O 39,59-AMP ciclico (cAMP)

A sua volta il cAMP si lega a una grande varietà di proteine e attiva molti processi cellulari. Quindi, come dimostrò per primo Earl Sutherland, il cAMP è un secondo messaggero, cioè trasmette all’interno della cellula il segnale prodotto dal ligando extracellulare. Quali sono i meccanismi mediante i quali il legame di un agonista con il recettore extracellulare induce l’attivazione dell’adenilato ciclasi e la sintesi di

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

453

cAMP nel citosol? Nel rispondere a questa domanda vedremo che questo sistema di segnalazione ha una complessità sorprendente, che gli conferisce un’immensa capacità sia di amplificazione del segnale sia di flessibilità regolatoria.

A I recettori associati alle proteine G contengono sette eliche transmembrana I GPCR formano una delle più grandi famiglie di proteine fino a ora conosciute (più di 800 specie negli esseri umani, corrispondenti al 4% dei circa 21 000 geni). Questa famiglia comprende recettori per i nucleotidi, per i nucleosidi, per il Ca2+, per le catecolammine (Paragrafo 13.1B) e per altre ammine biogene (per esempio istamina e serotonina; Paragrafo 21.6B), per i vari eicosanoidi (Paragrafo 9.1F) e per una grande varietà di altri peptidi e ormoni proteici. Inoltre, i recettori associati alle proteine G svolgono funzioni sensoriali essenziali. Tra essi troviamo infatti i recettori olfattivi (odorato) e gustativi (gusto); si ritiene che nell’uomo ne esistano circa 460 tipi diversi. Troviamo anche le diverse proteine sensibili alla luce presenti nella retina, note col nome di rodopsine. L’importanza di questi recettori è evidente anche dal fatto che circa il 30% dei farmaci utilizzati oggi in terapia ha come bersaglio specifici GPCR. I recettori associati alle proteine G, la cui caratterizzazione fu iniziata da Robert Lefkowitz e Brian Kobilka, sono tutti proteine integrali di membrana, con sette α-eliche transmembrana la cui dimensione è uniforme e quasi generalmente compresa tra i 20 e i 27 residui, una lunghezza sufficiente ad attraversare completamente un doppio strato lipidico. I loro segmenti N- e C-terminali, che si trovano rispettivamente all’esterno e all’interno della cellula, mentre le anse che collegano le diverse eliche (tre all’esterno e tre all’interno), però, variano considerevolmente in lunghezza. Queste sono le regioni della proteina che partecipano al legame dei ligandi (sul versante extracellulare) e delle proteine G eterotrimeriche (sul versante citoplasmatico). Molti recettori associati alle proteine G sono modificati a livello post-traduzionale mediante N-glicosilazione e/o palmitoilazione di un residuo di Cys. In tal modo questi recettori sono anche delle glicoproteine legate a lipidi (Paragrafo 9.3B). La Figura 13.18 mostra la struttura del recettore associato alle proteine G b2-adrenergico (β2AR) legato a un agonista ad alta affinità chiamato BI167107 (un analogo dell’adrenalina; a destra). Il sito di legame del ligando è costituito da una porzione del nucleo a elica della proteina e dalle anse extracellulari. Al di là di questa localizzazione generica, nei vari recettori associati alle proteine G ci sono poche somiglianze nella struttura dei loro siti di legame. Questa caratteristica è in linea con l’osservazione secondo cui ogni recettore è specifico solamente per uno o pochi ligandi.

CH3

O HN HO

CH2

O CH

H3C

C

CH2

NH2+

CH3

OH BI167107

Extracellulare

Citosol

Figura 13.18 Struttura ai raggi X del recettore 𝛃2-adrenergico umano in complesso con BI167107. La struttura è vista parallelamente al piano della membrana con la sua posizione approssimativa indicata nella figura. La proteina è rappresentata con la superficie semitrasparente e la catena polipeptidica sotto forma di struttura a nastro colorata nell’ordine dei colori dell’arcobaleno dal suo N-terminale (in blu) al suo C-terminale (in rosso). Si noti il fascio delle sette eliche transmembrana quasi parallele tra loro. Il BI167107, che si lega in una cavità tra le sette eliche transmembrana del recettore aperta verso il lato extracellulare della membrana, è rappresentato in modello spaziale con C in porpora, N in blu, e O in rosso. [Basata sulla struttura ai raggi X determinata da Brian Kobilka, Stanford University. PDBid 4LDE.]

454

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

I recettori associati alle proteine G si comportano in modo simile alle proteine allosteriche come l’emoglobina (Paragrafo 7.1). Il recettore, alternandosi tra due conformazioni discrete, una con e una senza l’agonista legato, può trasmettere un segnale all’interno della cellula. Nel caso dei recettori GPCR, questo cambiamento conformazionale viene propagato attraverso le eliche transmembrana del recettore alla porzione citoplasmatica, permettendo così il legame della proteina G eterotrimerica corrispondente. In molti casi, questo aumenta anche l’affinità del recettore associato alle proteine G per il suo agonista. Questo modello di azione del recettore è simile a quello delle proteine di trasporto di membrana (per esempio, vedi la Figura 10.13). Infatti, alcuni recettori legati alla membrana sono canali ionici che passano da una conformazione chiusa a una aperta in risposta al legame di un ligando.

B Le proteine G eterotrimeriche si dissociano in seguito ad attivazione Le proteine G eterotrimeriche, come indica il loro nome, sono costituite da subunità α, β e γ (rispettivamente di 45, 37 e 9 kD). Le strutture ai raggi X di proteine G eterotrimeriche intere sono state determinate in modo indipendente da Alfred Gilman e da Stephan Sprang (Figura 13.19) e da Heidi Hamm e Paul Sigler. La subunità α più grande, detta Gα, è costituita da due domini uniti da due polipeptidi di connessione (Figura 13.19a): (1) un dominio GTPasico altamente conservato, strutturalmente simile a quelli presenti nelle proteine G monomeriche come la Ras, conosciuto come dominio Ras-simile (o tipo Ras); (2) un dominio a elica tipico delle proteine G etero-

(a)

(b)

Extracellulare

␤2AR

Citosol





Dominio Ras-simile

Dominio a elica a

Figura 13.19 Struttura ai raggi X di una proteina G

eterotrimerica. (a) Il dominio Ras-simile della subunità Gα è colorato in rosa, con i segmenti noti come regioni di scambio I, II e III rispettivamente in verde, blu e rosso e il suo dominio elicoidale in arancione chiaro. Una molecola di GDP legata è indicata in modello spaziale con C in verde, N in blu, O in rosso e P in giallo. Il segmento N-terminale della subunità Gβ è in azzurro e ciascuna catena del suo foglietto β (elica β) ha un colore diverso. La subunità Gγ è in color oro. [Basata su una struttura ai raggi X di Alfred Gilman e Stephan Sprang, University of Texas Southwestern Medical Center. PDBid 1GP2]. (b) Struttura ai raggi X di una proteina G eterotrimerica senza nucleotide legato, in



complesso con il recettore β2-adrenergico (β2AR) che lega BI167107. Il complesso β2AR-BI167107 è rappresentato e colorato come nella Figura 13.18. La proteina G eterotrimerica è visualizzata come se fosse vista dall’alto della Parte (a) e colorata nello stesso modo, eccetto per i suoi domini di scambio che sono in rosa. La subunità Gβ (più in basso a sinistra) è orientata in modo da esporre chiaramente la sua elica β. La posizione approssimativa della membrana plasmatica è indicata dalle linee orizzontali. Si noti che il β2AR si lega, quasi esclusivamente, al dominio Ras-simile della subunità α. [Basata su una struttura ai raggi X di Brian Kobilka, Stanford University, PDBid 3SN6].

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

trimeriche. Il dominio tipo Ras contiene, in una fessura molto profonda, il sito di legame del nucleotide guaninico ed è ancorato alla membrana tramite un gruppo miristilico o palmitilico, oppure entrambi, legati con legame covalente alla sua estremità N-terminale. La subunità Gβ, che è ancorata alla membrana tramite una prenilazione della sua estremità C-terminale, è costituita da un dominio a elica N-terminale seguito da un dominio C-terminale comprendente sette foglietti β antiparalleli a 4 filamenti disposti come le pale di un’elica e per questo chiamato elica 𝛃 (Figura 13.19b). La subunità Gγ è formata principalmente da due segmenti elicoidali uniti da un segmento polipeptidico (Figura 13.19b) ed è strettamente associata alla subunità Gβ lungo la sua intera estensione tramite interazioni idrofobiche. La subunità Gγ si lega alla subunità Gβ con un’affinità così elevata che la loro dissociazione può avvenire solo in condizioni denaturanti. Di conseguenza, da questo punto in poi ci riferiremo al loro complesso come Gβγ. Nello stato inattivo, una proteina G eterotrimerica mantiene la propria struttura oligomonomerica in cui la subunità Gα è legata al GDP. Tuttavia, il legame di questo complesso Gα ∙ GDP-Gβγ al rispettivo recettore GPCR unito a un agonista induce la subunità Gα a scambiare il GDP a cui è legata con il GTP. Il complesso ligando-GPCR (per esempio Figura 13.19b) funziona come fattore di scambio del nucleotide guaninico (GEF) della subunità Gα. Quando il GTP è legato a Gα, il gruppo fosforico γ del GTP favorisce le modificazioni conformazionali nelle tre parti di Gα dette regioni di scambio (switch regions) (Figura 13.19a), che provocano la dissociazione di Gα da Gβγ. Questo avviene perché il legame del gruppo fosforico γ del GTP e il legame di Gβγ a Gα si escludono a vicenda: i legami idrogeno con le catene laterali delle regioni di scambio I e II impediscono infatti a questi segmenti di interagire con le anse e i “ripiegamenti” alla base dell’elica β di Gβγ. Le regioni di scambio I e II hanno corrispettivi analoghi in altre proteine G di cui è nota la struttura. Una comparazione tra le strutture ai raggi X del complesso Gα ∙ GDP-Gβγ e della sola Gβγ indica che la struttura di quest’ultima non cambia quando si associa a Gα ∙ GDP. Tuttavia, sia Gα sia Gβγ sono attive nel processo di trasduzione del segnale; esse interagiscono con altri componenti cellulari, come illustreremo in seguito. L’effetto di attivazione delle proteine G è di breve durata, perché Gα è anche una GTPasi, cioè un enzima che catalizza l’idrolisi dello stesso GTP a cui è legato in GDP + Pi, anche se a una velocità relativamente bassa (2-3 min−1). L’idrolisi del GTP determina una riassociazione della proteina G eterotrimerica sotto forma di complesso inattivo Gα ∙ GDP-Gβγ, impedendo che avvengano risposte non controllate quando un ligando si lega a una GPCR. Le proteine G eterotrimeriche attivano altre proteine. Una cellula umana può

contenere numerosi tipi di proteine G eterotrimeriche, poiché esistono 21 tipi di subunità α, 6 tipi di subunità β e 12 tipi di subunità γ. Questa eterozigosi probabilmente permette ai vari tipi cellulari di rispondere in modo diverso a stimoli differenti. Uno dei bersagli principali del sistema delle proteine G è l’enzima adenilato ciclasi (AC; descritto più nel dettaglio nel paragrafo successivo). Per esempio, quando un complesso Gα ∙ GTP si dissocia da Gβγ, può legarsi con elevata affinità all’adenilato ciclasi (AC), attivando l’enzima. Questa proteina Gα è nota come proteina G stimolatrice, o Gsα. Altre proteine Gα, note come proteine G inibitorie, Giα, inibiscono l’attività dell’adenilato ciclasi. Le proteine eterotrimeriche Gs e Gi differiscono per le loro subunità α, ma possono in realtà contenere le stesse subunità β e γ. Altri tipi di proteine G eterotrimeriche, che agiscono tramite le loro unità Gα e Gβγ, stimolano l’apertura di canali ionici, partecipano al sistema di segnalazione del fosfoinositide (Paragrafo13.4), attivano fosfodiesterasi e proteina chinasi.

La segnalazione biochimica

455

CONCETTI DI BASE In che modo le cellule usano ATP e GTP L’attivazione e la successiva inattivazione di una proteina G costano alla cellula l’energia libera della reazione GTP n GDP + Pi. In modo simile, l’attivazione di una proteina bersaglio che viene fosforilata da una chinasi e poi defosforilata da una fosfatasi costa alla cellula l’energia libera della reazione ATP n ADP + Pi. Quindi, l’energia libera dei nucleosidi trifosfato permette alla cellula di fare qualcosa che altrimenti non sarebbe in grado di fare in risposta alla segnalazione ormonale.

456

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Poiché un’unica interazione agonista-recettore può attivare più di una proteina G, questo tappa della via di trasduzione del segnale serve ad amplificare il segnale extracellulare iniziale. Tipi diversi di complessi ligando-recettore possono attivare la stessa proteina G, quindi differenti segnali extracellulari determinano la stessa risposta cellulare.

C L’adenilato ciclasi sintetizza AMP ciclico per attivare la proteina chinasi A I mammiferi hanno nove diverse isoforme di adenilato ciclasi, ciascuna delle quali è espressa in modo tessuto-specifico e differisce nelle sue proprietà regolatorie. Queste glicoproteine transmembrana di circa 120 kD sono costituite da un piccolo dominio N-terminale (N), seguito da due ripetizioni di una unità costituita da un dominio transmembrana (M) seguito da due domini citoplasmatici consecutivi (C), che formano quindi la sequenza NM1C1aC1bM2C2aC2b (Figura 13.20). C1a e C2a, domini identici al 40%, si associano per formare il nucleo catalitico dell’enzima, mentre C1b, C1a e C2a legano proteine regolatorie. Per esempio, Gsα si lega a C2a attivando l’adenilato ciclasi, mentre Giα si lega a C1a e inibisce l’enzima. Altri regolatori dell’attività dell’adenilato ciclasi sono il Ca2+ e alcune Ser/Thr proteina chinasi. Chiaramente le cellule possono modulare i loro livelli di cAMP in risposta a una grande varietà di stimoli. La struttura dell’adenilato ciclasi intatta non è nota, ma studi strutturali ai raggi X dei domini catalitici indicano che Gsα ∙ GTP si lega al complesso C1a ∙ C2a tramite la sua regione di scambio II. Il legame modifica l’orientamento dei domini C1a e C2a in modo da disporre i loro residui catalitici nella posizione migliore per trasformare in modo efficiente l’ATP in cAMP. Quando Gsα idrolizza il GTP legato, la regione di scambio II modifica il proprio orientamento in modo da non potersi più legare a C2a, e l’adenilato ciclasi ritorna nella conformazione inattiva. La proteina chinasi A viene attivata dal legame di quattro molecole di cAMP.

Il cAMP è un secondo messaggero polare e liberamente diffusibile nel ci toplasma. Nelle cellule eucariotiche il suo bersaglio principale è costituito dalla proteina chinasi A (PKA, conosciuta anche come proteina chinasi cAMP-dipendente o cAPK), un enzima che fosforila i residui di Ser o Thr di numerose proteine cellulari. Queste proteine contengono tutte una se-

Ambiente extracellulare Membrana plasmatica

Figura 13.20 Rappresentazione schematica di una tipica adenilato ciclasi di mammifero. Si suppone che i domini M1 e M2 contengano ciascuno 6 eliche transmembrana. Le regioni C1a e C2a formano il nucleo catalitico pseudosimmetrico dell’enzima. Nella figura sono indicati anche i domini con i quali, secondo quanto finora noto, interagiscono varie proteine regolatorie. [Da Tesmer, J. J.G. e Sprang, S.R. (1998). Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 713.]

Citosol

M1

M2

N C1b C

Ca2+, Ca2+ • CaM, PKA

C2b 2+

2Mg

Gsα, PKC, Gβγ

ATP

cAMP + PPi

Giα

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

quenza consenso di riconoscimento per le chinasi, Arg-Arg-X-Ser/Thr-Y, dove Ser/Thr è il sito di fosforilazione, X è qualsiasi piccolo residuo e Y è un grande residuo idrofobico. In assenza di cAMP, la PKA è un tetramero inattivo costituito da due subunità regolatorie (R) e due subunità catalitiche (C), R2C2. I mammiferi hanno tre isoforme della subunità C e quattro della subunità R. Il cAMP si lega alla subunità regolatoria e causa la dissociazione dei monomeri catalitici attivi:

R2C2 + 4 cAMP 34 2C + R2 (cAMP)4 (inattivo) (attivo) Quindi, la concentrazione intracellulare di cAMP determina la quantità di PKA nella forma attiva e di conseguenza la velocità di fosforilazione dei suoi substrati. La Figura 13.21 mostra la struttura ai raggi X della subunità C di 350 residui della PKA di topo, determinata da Susan Taylor e Janusz Sowadski, legata all’ATP e a un inibitore peptidico di 20 residui. La struttura della subunità C è molto simile a quella di altre chinasi (per esempio vedi le Figure 13.5a e 13.12). Nella struttura della PKA, la profonda fessura tra i lobi è occupata dall’ATP e da un segmento del peptide inibitorio simile alla sequenza consenso di 5 residui per la fosforilazione, tranne che per il fatto che la Ser/Thr fosforilata è sostituita da Ala. La subunità C della PKA deve essere fosforilata in corrispondenza del residuo di Thr 197, che fa parte della sua ansa di attivazione, per raggiungere il massimo di attività. Il gruppo fosforico sulla Thr 197 interagisce con l’Arg 165, un residuo catalitico conservato adiacente all’Asp 166, la base catalitica che attiva il gruppo ossidrilico del bersaglio Ser/Thr della proteina substrato per la fosforilazione. In tal modo, il gruppo fosforico della Thr 197 della PKA agisce orientando i residui nel sito attivo della chinasi. La subunità R della proteina chinasi A inibisce competitivamente la sua subunità C. La subunità R ha una struttura ben definita, contenente due domini omologhi RA e RB che legano il cAMP e un segmento autoinibitorio. Nella struttura ai raggi X del complesso inattivo R2C2 (Figura 13.22), il segmento autoinibitorio è simile al substrato della subunità C e si lega nel sito attivo della subunità C (come il peptide inibitorio della Figura 13.21), in modo da impedire il legame del substrato. Quando il cAMP è presente a una concentrazione sufficiente, ciascuna subunità R lega in modo cooperativo due cAMP. Quando nel dominio RB non è presente il cAMP, questo dominio nasconde il dominio RA, impedendogli di legare il cAMP. Il legame del cAMP al dominio RB induce però un profondo cambiamento conformazionale che permette al dominio RA di legare il cAMP e che a sua volta rilascia le subunità C in forma attiva dal complesso.

Figura 13.21 Struttura ai raggi X della subunità catalitica (C) della proteina chinasi A (PKA) di topo in complesso con ATP e con un inibitore polipeptidico. La proteina, mostrata nella figura nella sua vista “standard”, forma un complesso con l’ATP e con un segmento di 20 residui di un inibitore naturale dell’enzima. Il dominio N-terminale è colorato in rosa, il dominio C-terminale in azzurro e l’”ansa di attivazione” contenente la Thr 197 è in blu. L’inibitore polipeptidico è in arancione e la sua pseudosequenza bersaglio, Arg-Arg-Asn-Ala-Ile, è in porpora (Ala che sostituisce Ser o Thr di un vero substrato è in bianco). Il substrato ATP e il gruppo fosforico della fosfo-Thr 197 sono indicati mediante modello spaziale; le catene laterali dei residui cataliticamente fondamentali, Arg 165, Asp 166 e Thr 197, sono rappresentate in forma di bastoncini, con gli atomi colorati in modo diverso (C in verde, N in blu, O in rosso e P in giallo). Si noti che la pseudosequenza dell’inibitore è vicina al gruppo fosforico γ dell’ATP, il gruppo che l’enzima trasferisce a Ser o Thr nella sequenza bersaglio. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Susan Taylor e Janusz Sowadski, University of California, San Diego. PDBid 1ATP.]

457

458

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Figura 13.22 Struttura ai raggi X dell’eterotetramero inattivo R2C2 della proteina chinasi A di topo (PKA). La struttura, mostrata in modello a nastro, è rappresentata lungo il suo doppio asse verticale con le sue subunità catalitiche (C) in alto a sinistra e in basso a destra e le sue subunità regolatorie (R) in alto a destra e in basso a sinistra. La subunità C in alto a sinistra è colorata come nella Figura 13.21 e vista approssimativamente dall’alto, e quella in basso a destra è in giallo. I domini RA e RB della subunità R in alto a destra sono colorati rispettivamente in arancione chiaro e verde chiaro, la subunità R in basso a sinistra è verde, e i segmenti autoinibitori di entrambe le subunità R sono in rosso. Le subunità R e C in basso sono immerse nelle loro immagini della superficie semitrasparente dello stesso colore. I gruppi fosforici sulla Ser 139 e Thr 197 delle subunità C sono rappresentati in modelli spaziali con O in rosso e P in giallo. Si noti che il segmento autoinibitorio di ciascuna subunità R è inserito orizzontalmente nel sito attivo della subunità C adiacente, bloccando in questo modo il legame del substrato. [Basata sulla struttura ai raggi X di Susan Taylor, University of California, San Diego. PDBid 3TNP.]

I bersagli della PKA comprendono enzimi coinvolti nel metabolismo del glicogeno. Per esempio, quando l’adrenalina si lega al recettore β-adrenergico di una cellula muscolare, l’attivazione in successione di una proteina G eterotrimerica, dell’adenilato ciclasi e della PKA determina l’attivazione della glicogeno fosforilasi, rendendo il glucosio-6-fosfato disponibile per la glicolisi, innescando così una risposta “combatti o fuggi” (Paragrafo 16.3). Ciascuna tappa di una via di trasduzione del segnale può essere regolata, quindi la natura e l’ampiezza della risposta cellulare riflettono in ultima analisi la presenza e il grado di attivazione o inibizione di tutti i componenti precedenti della via. Per esempio, la via di segnalazione dell’adenilato ciclasi può essere limitata o invertita tramite attivazione mediante legame di un ligando di un recettore associato a una proteina G inibitoria. L’attività del secondo messaggero cAMP può essere attenuata dall’azione di una fosfodiesterasi che idrolizza cAMP ad AMP (vedi più avanti). Inoltre, alcune reazioni catalizzate dalla PKA sono invertite da proteina fosfatasi che defosforilano le proteine contenenti residui fosfo-Ser e fosfo-Thr (proteine Ser/Thr fosfatasi; Paragrafo13.2D). Alcune caratteristiche della via di segnalazione dell’adenilato ciclasi sono illustrate nella Figura 13.23. Molti farmaci e tossine esercitano i loro effetti modificando i componenti del sistema dell’adenilato ciclasi (Scheda 13.4).

Una caratteristica peculiare dei sistemi di segnalazione biologica è la loro capacità di adattarsi a stimoli a lungo termine riducendo la loro risposta, un processo noto come desensibilizzazione. Questi sistemi di segnalazione rispondono quindi a variazioni nei livelli di stimolazione piuttosto che ai loro valori assoluti. Per esempio, nel caso del recettore β-adrenergico, il suo legame a un agonista come l’adrenalina porta, come abbiamo visto, all’attivazione della PKA attraverso gli intermedi Gsα, adenilato ciclasi e cAMP. La PKA attivata fosforila (tra le altre proteine) la proteina chinasi del recettore chinasi b-adrenergico [b-ARK; conosciuta anche come GPCR chinasi 2 (GRK2)], che, a sua volta, fosforila numerosi residui di Ser e Thr sulla parte C-terminale del complesso ormone-recettore, ma non del recettore libero. Il recettore fosforilato lega diverse proteine note come b-arrestine, bloccando stericamente la formazione del complesso recettore-proteina Gs e portando così a desensibilizzazione. Il complesso recettore- β-arrestina recluta anche diversi membri del macchinario di endocitosi dipendente da clatrina (Paragrafo 9.4E), favorendo l’internalizzazione del recettore in vescicole intracellulari, e diminuendo in questo modo I recettori sono soggetti a desensibilizzazione.

CAPITOLO 13

459

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

SCHEMA DI PROCESSO Ambiente extracellulare

Segnale esterno inibitorio

Segnale esterno stimolatorio

7

1

Adenilato ciclasi

Rs γ sα GDP

β

β

3

GDP G

6

γ

γ

γ

sα GTP

+

4

2 GTP

Ri

H H2O

iα + GTP

10 4ATP

β

9

Citosol



β

Membrana plasmatica

GDP

11

Gsα • GDP + Pi

H 2O

Tossina colerica

Giα • GDP + Pi

8

GTP G

GDP

Tossina della pertosse

4PPi 5

ATP 15 4AMP

12 4cAMP + R2C2 PKA

cAMP fosfodiesterasi

R2 • cAMP4 + 2C

4H2O

ADP

Proteina (inattiva) 13

Pi 14

Proteina– P (attiva)

Fosfoproteina fosfatasi H2O

Risposta cellulare

Figura 13.23 Il sistema di trasmissione del segnale dell’adenilato ciclasi. Il legame dell’ormone a un recettore stimolatorio Rs (1) induce il legame con la proteina G eterotrimerica Gs, che a sua volta stimola la subunità Gsα (2) a scambiare il GDP legato con un GTP. Il complesso Gsα ∙ GTP poi si dissocia da Gβγ (3) e (4) stimola l’adenilato ciclasi (AC) a convertire l’ATP in cAMP (5). Questa stimolazione continua finché Gsα non catalizza l’idrolisi del GTP legato a GDP (6). Il legame dell’ormone al recettore inibitorio Ri (7) innesca una catena di eventi più o meno identica (8-11), se si eccettua il fatto che la presenza del complesso Giα ∙ GTP inibisce l’attività dell’adenilato ciclasi (10). Il cAMP attiva la proteina chinasi A (PKA; rappresentata da R2C2) legandosi al

dimero regolatorio e formando il complesso R2 ∙ cAMP4; a questo punto la subunità catalitica C si dissocia dal dimero regolatorio (12). La fosforilazione di varie proteine cellulari (13) catalizzata dalla chinasi determina la loro attivazione. La figura indica i siti d’azione di alcune tossine. La segnalazione viene limitata dall’azione di fosfatasi (14) e fosfodiesterasi dipendenti dal cAMp (15). Le tossine come quella colerica e della pertosse agiscono bloccando l’idrolisi del GTP sia da parte di Gsα∙ GTP (6) sia da parte di Gia ∙ GTP (8), incrementando la loro attività. Confrontate gli effetti esercitati dalla tossina colerica e dalla tossina della pertosse sulla risposta cellulare.

la sua disponibilità sulla superficie cellulare. Il recettore internalizzato viene lentamente defosforilato e ritorna sulla superficie cellulare, ripristinando la sensibilità iniziale della cellula all’adrenalina.

D Le fosfodiesterasi limitano l’attività del secondo messaggero In ogni sistema di segnalazione basato su messaggeri chimici, la molecola di segnale deve essere eliminata se si vuole controllare l’ampiezza e la durata del segnale e impedire interferenze con la ricezione dei segnali successivi. Nel caso del

460

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

SCHEDA 13.4

© 978-88-08-42096-1

LA BIOCHIMICA NELLA SALUTE E NELLA MALATTIA

I farmaci e le tossine che influenzano le segnalazioni cellulari Alcuni processi elaborati come il sistema di trasmissione del segnale dell’adenilato ciclasi possono essere “sabotati” da vari agenti. Per esempio, i derivati metilati delle purine, la caffeina (contenuta nel caffè e nel tè), la teofillina (contenuta nel tè e usata per la cura dell’asma) e la teobromina (contenuta nel cioccolato), O X

R N

N

O

N

N CH3

R = CH3 R=H R = CH3

X = CH3 X = CH3 X=H

Caffeina (1,3,7-trimetilxantina) Teofillina (1,3-dimetilxantina) Teobromina (1,7-dimetilxantina)

sono stimolanti perché sono antagonisti dei recettori adenosinici, che inibiscono le proteine G: l’antagonismo ha come effetto un aumento della concentrazione intracellulare di cAMP. Alcune tossine batteriche hanno tuttavia un effetto letale, poiché interferiscono con le funzioni delle proteine G eterotrimeriche. La tossina rilasciata da Vibrio cholerae (il batterio che causa il colera) determina una perdita enorme di fluidi sotto forma di diarrea, che supera il litro all’ora. Le vittime muoiono per disidratazione, a meno che l’acqua e i sali perduti non siano rapidamente ripristinati. La tossina del colera, una proteina di 87 kD la cui composizione in subunità è AB5, si lega al ganglioside

GM1 (Figura 9.9) che si trova sulla superficie delle cellule intestinali, mediante le sue subunità B. Questo fattore permette alla tossina di entrare nella cellula, probabilmente attraverso un processo di endocitosi mediata da un recettore, durante il quale è rilasciato un frammento proteolitico di circa 195 residui della sua subunità A. Questo frammento catalizza il trasferimento di una unità ADP-ribosio dal NAD+ alla catena laterale di uno specifico residuo Arg di Gsa. Il complesso ADP-Gsa ribosilato ∙ GTP può attivare l’adenilato ciclasi, ma non è in grado di idrolizzare il GTP legato (Figura 13.23). Di conseguenza, l’adenilato ciclasi è bloccata nel suo stato attivo e i livelli intracellulari di cAMP aumentano di circa 100 volte. Le cellule intestinali, che normalmente rispondono a piccoli aumenti della concentrazione di cAMP secernendo fluido digestivo (una soluzione ricca di sali di HCO3−), riversano all’esterno enormi quantità di questo fluido in risposta alle elevate concentrazioni di cAMP. Altre tossine batteriche agiscono in modo simile. Alcuni ceppi di E. coli causano una diarrea simile a quella del colera, ma meno grave, tramite la produzione di un’enterotossina instabile al calore, una proteina molto simile alla tossina colerica (le loro subunità A e B sono identiche per oltre l’80%) e con lo stesso meccanismo d’azione. La tossina della pertosse (secreta da Bordetella pertussis, il batterio che causa la pertosse, o “tosse convulsa”, una patologia che è responsabile in tutto il mondo della morte di circa 400 000 bambini all’anno) è una proteina AB5, omologa alla tossina colerica, che catalizza l’aggiunta di un gruppo ADP-ribosilico a uno specifico residuo di Cys situato su Gia. La Gia modificata non può scambiare il suo GDP legato con il GTP, e quindi non è in grado di inibire l’adenilato ciclasi (Figura 13.23). O

Gsa

C NH2

(CH2)3 +

Arg

NH

N H

NH+2

C

tossina del colera

NH2 O +

Nicotinamide Gsa (CH2)3

+

C

NH

NH2 O Adenosina

O

O

P

O

P



+

O

N

CH2 O

O +

NAD

Adenosina

O

P

H H

H

H OH OH

O

C NH+2

O O





O

O

P

O

NH

CH2 O



O

H H

H

H OH OH

ADP-Gsa ribosilato

cAMP, questo secondo messaggero viene idrolizzato ad AMP da enzimi noti come cAMP-fosfodiesterasi (cAMP-PDE). La superfamiglia delle PDE, che comprende sia le cAMP-PDE sia le cGMP-PDE (il cGMP è l’analogo guaninico del cAMP), nei mammiferi è codificata da almeno 20 geni differenti raggruppati in 12 famiglie (da PDE1 a PDE12). Inoltre, molti degli mRNA trascritti da questi geni hanno

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

siti di inizio alternativi e siti di splicing alternativo (Paragrafo 26.3B). In tal modo i mammiferi arrivano a esprimere 50 diverse isoforme di PDE. Questi enzimi sono distinguibili a CH3 CH2 livello funzionale sulla base delle loro specificità di substrato (specifiche per il cAMP o per il cGMP o per entrambi), delle proprietà cinetiche e delle loro risposte (o mancanza di risposte) a diversi attivatori e inibitori (vedi più avanti), ma O anche sulla base delle loro distribuzioni tissutali e cellulari, nonché delle localizzazioni intracellulari. Le fosfodiesterasi hanno strutture molecolari caratteristiche, con un dominio catalitico conservato di circa 270 residui localizzato in prossimità del loro C-terminale e domini regolatori o motivi ampiamente divergenti nelle loro porzioni N-terminali. Alcune PDE sono ancorate alla membrana, mentre altre sono citosoliche. L’attività delle fosfodiesterasi, come ci si può aspettare, è controllata in modo molto elaborato. A seconda dell’isoforma, una fosfodiesterasi può essere attivata da una o più varietà di agenti, compresi lo ione Ca2+, la fosforilazione da parte della PKA e della proteina chinasi stimolata dall’insulina. Le PDE fosforilate vengono poi defosforilate da numerose proteina fosfatasi. Le fosfodiesterasi forniscono così un mezzo per creare dialoghi molecolari incrociati tra vie di segnalazione che utilizzano i sistemi di segnalazione basati sul cAMP e quelle che riconoscono altri tipi di segnali. Le PDE sono inibite da una grande varietà di farmaci che hanno effetto su un’altrettanto vasta gamma di patologie quali asma, infarto cardiaco congestizio, depressione, disfunzioni erettili, infiammazione e degenerazione della retina. Il sildenafil (il cui nome commerciale è Viagra, in alto a destra), un composto utilizzato per trattare la disfunzione erettile, inibisce in modo specifico la PDE5 (fosfodiesterasi 5), che idrolizza solo il cGMP. La stimolazione sessuale causa, nei maschi, il rilascio di ossido nitrico (NO) da parte dei nervi del pene. L’NO, a sua volta, attiva la guanilato ciclasi a produrre cGMP dal GTP. Il cGMP induce il rilassamento della muscolatura liscia vascolare nei vasi del pene, facendo accrescere così l’afflusso di sangue. Tutto ciò porta infine all’erezione. Il cGMP così prodotto viene poi idrolizzato dalla PDE5. Il sildenafil costituisce quindi un efficace trattamento per gli uomini che producono quantità insufficienti di NO e quindi di cGMP per poter raggiungere un’erezione soddisfacente.

4 La via del fosfoinositide CONCETTI CHIAVE

• La trasduzione del segnale attraverso la via del fosfoinositide genera il secondo messaggero inositolo trifosfato, che causa il rilascio di Ca2+, e il diacilglicerolo. Quest’ultimo attiva la proteina chinasi C.

• In presenza di Ca2+, la calmodulina si associa e attiva le sue proteine bersaglio. • Il legame ai lipidi attiva la PKC. • Un ormone può attivare molte vie di trasduzione del segnale, scatenando una varietà di risposte intracellulari.

Una discussione sulle vie di trasduzione del segnale sarebbe incompleta se non considerassimo la via del fosfoinositide, che media gli effetti di un’ampia gamma di ormoni. Questa via di segnalazione richiede un GCPR, una proteina G eterotrimerica, una specifica chinasi e un glicerofosfolipide fosforilato, un componente poco rappresentato dello strato interno della membrana plasmatica. In questa via sono prodotti tre secondi messaggeri: l’inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3), il Ca2+ e l’1,2-diacilglicerolo (DAG).

O

CH3 N

HN

O

N N

S

461

CH2

CH2

CH3

O

N

N CH3 Sildenafil (Viagra)

PUNTO DI VERIFICA

• Riassumete le tappe della trasduzione del segnale da un GPCR alla fosforilazione di proteine bersaglio da parte della PKA.

• Spiegate perché un GPCR può essere considerato una proteina allosterica.

• Descrivete in che modo le proteine G vengono attivate e inattivate. Quali proteine agiscono come un GEF?

• Qual è la funzione di un secondo messaggero come il cAMP?

• Come è regolata l’attività della PKA? • In che modo l’attività della PKA ha effetto sulla cellula?

• Perché il sistema di segnalazione dell’adenilato ciclasi comprende le fosfodiesterasi?

• Quali altri fattori limitano o terminano la segnalazione attraverso i GPCR?

462

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

A L’associazione del ligando al recettore determina il rilascio dei secondi messaggeri IP3 e Ca2+ L’associazione dell’agonista al recettore, come per esempio il legame dell’adrenalina al recettore α1-adrenergico, attiva una proteina G eterotrimerica, Gq, la cui subunità α ancorata alla membrana e unita al GTP diffonde lateralmente lungo la membrana plasmatica per attivare l’enzima fosfolipasi C (PLC; Figura 13.24, in alto a sinistra). La PLC attivata catalizza l’idrolisi del fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PIP2) a livello del suo legame glicerofosforico (Paragrafo 9.1C), producendo inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3) e 1,2-diacilglicerolo (DAG; Figura 13.25). La PLC, che nei mammiferi è costituita da un gruppo di 13 isozimi, alcuni dei quali sono varianti derivate da forme di splicing, necessita della presenza del Ca2+ per esplicare l’attività enzimatica. La PLC ha un bordo idrofobico costituito da tre anse proteiche che si ritiene penetri nella regione non polare della membrana durante SCHEMA DI PROCESSO Ambiente extracellulare Segnale esterno 1

Membrana plasmatica 3

PIP2

R γ qα GDP

DAG

γ β

β 2

qα GTP

+

Fosfolipasi C (PLC)

DAG 6

PS

Proteina chinasi C (PKC)

8 GTP

H2O

GDP

Proteina (inattiva)

7

Proteina– P (attiva)

GD GDP + Pi ATP

Risposta cellulare

ADP ADP

Pi

IP2

9

H2O ATP

inositolo polifosfato 5-fosfatasi

IP3

CaM 4

Ca2+ 5

Ca2+ – CaM chinasi

Proteina (inattiva)

IP3

Membrana del RE Citosol

Canale di trasporto del Ca2+

Ca2+

Lume del reticolo endoplasmatico

controllato dall’IP3

Figura 13.24 Il sistema di segnalazione del fosfoinositide. L’associazione di un ligando a un recettore R sulla superficie cellulare (1) attiva la fosfolipasi C (PLC) tramite la proteina G eterotrimerica Gq (2). La fosfolipasi C attivata catalizza l’idrolisi del PIP2 a IP3 e DAG (3). L’IP3 idrosolubile stimola il rilascio di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico (4), che a sua volta attiva numerosi processi cellulari attraverso la calmodulina (CaM; 5). Il DAG non polare resta associato alla membrana, in cui attiva la proteina chinasi C (PKC; 6) per fosforilare e quindi regolare le attività di

numerose proteine cellulari (7). L’attivazione della PKC richiede anche la presenza del lipide di membrana fosfatidilserina (PS) e del Ca2+. La segnalazione del fosfoinositide viene limitata dall’idrolisi del GTP su qα (8) e dalla inositolo polifosfato 5-fosfatasi, che agisce sull’IP3 (9) formando IP2. Quali componenti del sistema di segnalazione sono legati alla membrana e quali invece sono solubili?

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

OR1

OR2

CH2

CH

OR1

OR2

CH2

CH

CH2 OH

CH2

Diacilglicerolo (DAG)

O O

P

HO H

H HO H OH H H

+

fosfolipasi C

O

O–

2– OPO3

H

OPO2– 3

Fosfatidilinositolo-4,5bisfosfato (PIP2)

H2O

–2

O3PO

HO H

H

H HO OH H H

OPO2– 3 H

OPO2– 3

Inositolo-1,4,5trisfosfato (IP3)

la catalisi. Questo spiegherebbe perché l’enzima può catalizzare l’idrolisi del PIP2 e contemporaneamente permettere che il prodotto di reazione, il DAG, resti associato alla membrana. La molecola carica IP3 è un secondo messaggero idrosolubile. L’idrolisi del PIP2

mette in moto gli eventi sia citoplasmatici sia legati alla membrana. Mentre il DAG agisce come secondo messaggero nella membrana (Paragrafo 13.4C), l’IP3 diffonde attraverso il citoplasma fino a raggiungere il reticolo endoplasmatico (RE), dove si lega e induce l’apertura di un canale di trasporto del Ca2+ (un esempio di recettore che è anche un canale ionico), permettendo così l’efflusso di Ca2+ dal RE. Tutto ciò causa l’aumento della concentrazione citosolica del Ca2+, che passa da circa 0,1 µM a 10 µM. L’aumento di Ca2+ a sua volta innesca diversi processi intracellulari, come la mobilizzazione del glucosio e la contrazione muscolare, attraverso l’intermediazione della proteina che lega il Ca2+ chiamata calmodulina (vedi più avanti) e altre simili. Il RE contiene, immerse nella sua membrana, delle Ca2+-ATPasi che pompano attivamente Ca2+ dal citosol indietro nel RE (Paragrafo 10.3B). In assenza di IP3, la concentrazione citosolica di Ca2+ ritorna rapidamente ai suoi livelli basali.

B La calmodulina è un modulatore attivato dal Ca2+ La calmodulina (CaM) è una proteina eucariotica ubiquitaria che lega il Ca2+ e che partecipa a numerosi processi regolatori cellulari. In alcuni casi la CaM agisce come proteina monomerica presente in soluzione in forma libera, mentre in altri è una subunità di una proteina più grande. La struttura ai raggi X di questa proteina altamente conservata di 148 amminoacidi ha una forma peculiare, simile a un manubrio, in cui due domini globulari strutturalmente simili sono collegati da una struttura ad α-elica di sette giri (Figura 13.26). Si noti la somiglianza strutturale tra la CaM e la subunità che lega il Ca2+ TnC della proteina muscolare troponina (Figura 7.31).

Figura 13.26 Struttura ai raggi X della calmodulina di testicolo di ratto. Questa proteina monomerica di 148 residui, colorata secondo l’ordine dei colori dell’arcobaleno dal suo N-terminale (in blu) al suo C-terminale (in rosso), contiene due domini globulari molto simili tra loro, separati da una struttura ad α-elica di sette giri. I due ioni Ca2+ legati a ogni dominio sono rappresentati da sfere bianche. Le catene laterali che legano gli ioni Ca2+ sono raffigurate a forma di bastoncino e sono colorate a seconda del tipo di atomi (gli atomi di C sono in verde, di N in blu e di O in rosso). [Basata su una struttura ai raggi X determinata da Charles Bugg, University of Alabama, Birmingham. PDBid 3CLN.]

463

Figura 13.25 La reazione catalizzata dalla fosfolipasi C (PLC). La fosfolipasi C scinde il PIP2 formando diacilglicerolo (DAG) e inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3), entrambi secondi messaggeri. (I prefissi bis e tris indicano rispettivamente due e tre gruppi fosforici legati separatamente all’inositolo; nei di- e trifosfati i gruppi fosforici sono legati uno dopo l’altro.)

464

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Figura 13.27 La mano EF. I siti di legame per il Ca2+ in molte proteine che agiscono da sensori per il livello del calcio sono costituiti da motivi elica-ansa-elica, detti “mano EF”. [Kretsinger, R. H. (1976). Annu. Rev. Biochem. 45, 241.] Elica E

Ca2+ Elica F

Ognuno dei due domini globulari della CaM contiene due siti di legame ad alta affinità per il Ca2+. Lo ione Ca2+ in ciascuno dei due siti è coordinato ottaedricamente con gli atomi di ossigeno dello scheletro covalente della proteina e delle catene laterali degli amminoacidi, ma anche di una molecola di acqua associata alla proteina. Ciascuno di questi siti di legame per il Ca2+ è costituito da un motivo strutturale elica-ansa-elica, quasi sovrapponibile, conosciuto come mano EF (EF hand; Figura 13.27), che forma i siti di legame per il Ca2+ anche in numerose altre proteine di cui è nota la struttura. La CaM-Ca2+ attiva le sue proteine bersaglio attraverso un meccanismo intrasterico. Il legame del Ca2+ a uno dei due domini della CaM induce nel domi-

Mano EF

nio una modificazione conformazionale che porta all’esposizione di una superficie idrofobica ricca di Met, normalmente “sepolta” all’interno della proteina. Questa zona, a sua volta, si lega con elevata affinità ai domini che legano la CaM di molte altre proteina chinasi regolate dal Ca2+. Questi domini che legano la CaM hanno scarse omologie di sequenza tra loro, ma tutti contengono α-eliche anfifiliche basiche. Nonostante la CaM sembri all’apparenza una proteina con una struttura piuttosto semplice (Figura 13.26), vari studi indicano che entrambi i suoi domini globulari si legano a una singola elica bersaglio. Questo è stato confermato dalla struttura ottenuta tramite NMR (Figura 13.28) dei complessi formati da (Ca2+)4-CaM e da un polipeptide bersaglio, un segmento della chinasi del-

(a)

(b)

Figura 13.28 Struttura determinata mediante l’ NMR della calmodulina unita a un polipeptide bersaglio. Il dominio N-terminale della CaM (del moscerino della frutta Drosophila melanogaster) è in blu, il dominio C-terminale è in rosso, il polipeptide bersaglio di 26 residui tratto dalla chinasi della catena leggera della miosina (MLCK) di muscolo scheletrico di coniglio è in verde, e gli ioni Ca2+ sono rappresentati da sfere azzurre. (a) Immagine del complesso con l’estremità N-terminale del polipeptide bersaglio a destra. (b) Immagine perpendicolare del complesso, vista dal lato destro della struttura mostrata

in (a). In entrambe le immagini lo pseudo-doppio asse di simmetria che collega i domini N- e C-terminale della CaM è approssimativamente verticale. Si noti che il segmento che unisce i due domini è srotolato e curvato [l’ansa inferiore è nella Parte (b)] per far sì che la CaM formi una proteina globulare in grado di racchiudere il polipeptide bersaglio con struttura a elica all’interno di un tunnel idrofobico (in modo simile a due mani che tengono una corda). [Basata su una struttura determinata mediante NMR da Marius Clore, Angela Gronenborn e Ad Bax, National Institutes of Health. PDBid 2BBM.]

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

465

la catena leggera della miosina (MLCK) di muscolo scheletrico. Questo enzima, un omologo della subunità C della PKA, fosforila e quindi attiva le catene leggere della proteina muscolare miosina (Paragrafo 7.2A). Si è così rilevato che l’α-elica centrale della CaM si comporta come una fune flessibile, piuttosto che come uno spaziatore rigido, caratteristica che probabilmente aumenta la gamma delle sequenze polipeptidiche a cui la CaM si può legare. I risultati sperimentali dimostrano che entrambi i domini globulari della CaM sono necessari per l’azione della calmodulina sulle sue proteine bersaglio: i domini separati mediante digestione proteolitica con tripsina si legano ai loro peptidi bersaglio, ma non sono in grado di attivare l’enzima. In che modo la Ca2+-CaM attiva le sue proteine bersaglio? La MLCK contiene un segmento C-terminale la cui sequenza assomiglia a quella del polipeptide bersaglio della MLCK sulla catena leggera della miosina, ma manca del sito di fosforilazione. Il modello della MLCK, basato su una struttura ai raggi X della subunità C della PKA che presenta un 30% di omologia, suggerisce che questo segmento di MLCK agisca da autoinibitore legandosi nel sito attivo della chinasi. Infatti, la rimozione del peptide autoinibitore della MLCK tramite proteolisi controllata attiva in modo permanente l’enzima. Il segmento di legame della Ca2+-CaM della MLCK si sovrappone al peptide autoinibitorio. Pertanto, il legame della Ca2+-CaM al suo segmento peptidico estrae il peptide autoinibitore dal sito attivo della MLCK, attivando quindi lÕenzima (Figura 13.29).

SCHEMA DI PROCESSO Proteina chinasi che si lega alla CaM

Dominio catalitico

Inattiva

Dominio regolatorio Sito di legame della CaM

La Ca2+-CaM si lega al suo sito di legame sul dominio regolatorio di una proteina chinasi in modo da estrarlo dal sito attivo, attivando così l’enzima.

Ca2+– CaM

1 Attiva

Sito attivo

Il sito attivo esposto della proteina chinasi lega una proteina substrato.

2

Proteina substrato

ATP Le proteine substrato vengono fosforilate, inducendo una 3 risposta cellulare.

ADP P

Risposta cellulare

Figura 13.29 Rappresentazione schematica dell’attivazione

Ca2+-CaM dipendente delle proteina chinasi. Le chinasi autoinibite hanno una sequenza “pseudosubstrato” (in rosa) in corrispondenza dell’N- o del C-terminale che si lega all’interno o vicino al sito attivo dell’enzima (in ocra), inibendo la sua funzione. Il segmento autoinibitorio si trova molto vicino

o si sovrappone alla sequenza di legame della Ca2+-CaM. Conseguentemente, la Ca2+-CaM (in verde) si lega alla sequenza in modo da estrarla dal sito attivo dell’enzima, attivando così l’enzima stesso a legare e fosforilare altre proteine (in viola), inducendo una risposta cellulare. [Da Crivici, A. e Ikura, M. (1995). Annu. Rev. Biophys. Struct. 24, 88.]

466

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Altre proteine bersaglio della Ca2+-CaM vengono presumibilmente attivate nello stesso modo. Infatti, la struttura ai raggi X di diverse proteina chinasi omologhe supporta questo processo detto meccanismo intrasterico. Mentre i dettagli del legame della sequenza autoinibitoria sono diversi per ciascuna proteina chinasi, il processo di autoinibizione e di attivazione da parte di Ca2+CaM è lo stesso. La subunità R della PKA, come abbiamo già visto (Paragrafo 13.3C), contiene una sequenza autoinibitoria simile in posizione adiacente ai suoi due doppi domini di legame del cAMP. In questo caso, però, il peptide autoinibitorio viene espulso allostericamente dal sito attivo della subunità C tramite il legame del cAMP alla subunità R (che è priva di un sito di legame della Ca2+-CaM).

C Il DAG è un secondo messaggero liposolubile che attiva la proteina chinasi C Il secondo prodotto della reazione catalizzata dalla fosfolipasi C, il diacilglicerolo (DAG), è un secondo messaggero liposolubile; esso rimane inserito nella membrana plasmatica, dove attiva la proteina chinasi C (PKC) associata alla membrana e va a fosforilare varie proteine cellulari, modulandone quindi l’attività (Figura 13.24, a destra). Si conoscono numerosi isozimi della PKC, diversi per espressione tissutale, localizzazione intracellulare e richiesta di diacilglicerolo per l’attivazione. In condizioni di non stimolazione, la PKC è una proteina citosolica fosforilata. Il diacilglicerolo aumenta l’affinità della PKC per la membrana e aiuta a stabilizzarne la conformazione attiva. Le attività catalitiche della PKC e della PKA sono simili: entrambe le chinasi fosforilano infatti residui di Ser e di Thr. La struttura ai raggi X del segmento della PKC legato al DAG mostra che il motivo a 50 residui è per la maggior parte tenuto insieme da due ioni Zn2+, ciascuno dei quali è legato in una struttura tetraedrica da una catena laterale His e tre Cys (Figura 13.30). Un analogo del DAG, il forbolo-13-acetato, O

HO H3C

18

H3C

2 3

O

1

10

11 9

OH

4

OH

5

12

H

O 13 14

15

C CH3 CH3 17

CH3 16

8 7

6

CH2OH

Forbolo-13-acetato

si lega in una stretta fessura tra due lunghe anse non polari. Pochissime proteine solubili hanno una regione non polare continua così lunga: questo suggerisce che questa parte della PKC si inserisca nella membrana. La completa attivazione della PKC richiede fosfatidilserina (che è presente solo nello strato citoplasmatico della membrana plasmatica, Figura 9.32) e, in alcuni casi, Ca2+ (presumibilmente reso disponibile dall’azione del secondo messaggero IP3). Come altri sistemi di segnalazione, il sistema del fosfoinositide è limitato dalla distruzioFigura 13.30 Struttura ai raggi X di una parte della proteina chinasi C unita al forbolo13-acetato. La proteina lega con una struttura tetraedrica due ioni Zn2+ (sfere celesti) mediante catene laterali di His e di Cys (rappresentate in forma di sfere e bastoncini). Il forbolo-13-acetato (in alto), la cui struttura assomiglia molto a quella del ligando naturale diacilglicerolo, si lega tra due anse proteiche non polari. Gli atomi sono colorati nel modo seguente: C in verde, N in blu e O in rosso. [Basata su una struttura ai raggi X determinata da James Hurley, NIH. PDBid 1PTR.]

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

ne dei suoi secondi messaggeri, per esempio tramite l’azione dell’inositolo polifosfato 5-fosfatasi (Figura 13.24, in basso a sinistra). La PLC agisce su diversi fosfolipidi, rilasciando secondi messaggeri differenti.

I fosfolipidi contenenti colina idrolizzati dalla fosfolipasi C producono diacilgliceroli differenti da quelli rilasciati dal PIP2 e con effetti diversi sulla PKC. La sfingosina, un altro lipide che funziona come secondo messaggero e che è rilasciato dagli sfingolipidi, inibisce la PKC. In alcune cellule la via di segnalazione del fosfoinositide produce un diacilglicerolo, prevalentemente 1-stearil-2-arachidonil-glicerolo. Questa molecola è ulteriormente degradata ad arachidonato, precursore degli eicosanoidi attivi biologicamente (le prostaglandine e i trombossani; Figura 9.12), e quindi la via del fosfoinositide produce fino a quattro secondi messaggeri differenti. In altre cellule l’IP3 e il diacilglicerolo sono rapidamente riciclati per riformare PIP2 nello strato interno della membrana. Alcuni recettori con attività tirosina chinasica attivano una forma di fosfolipasi C che contiene due domini SH2. Questo è un esempio di cross talk tra diverse vie di trasduzione del segnale.

D Epilogo: i sistemi complessi hanno proprietà emergenti I sistemi complessi sono, per definizione, difficili da comprendere e provare. Tra gli esempi più familiari di questi sistemi vi sono il sistema meteorologico della Terra, le economie delle grandi nazioni, i sistemi ecologici di ambienti anche di modeste dimensioni e il cervello umano. I sistemi di trasduzione dei segnali biologici, come vi sarete ampiamente resi conto durante la lettura di questo capitolo, sono dei sistemi complessi. Quindi, un segnale ormonale viene trasdotto di norma attraverso diverse vie di segnalazione intracellulare, ciascuna costituita da numerosi componenti, molti dei quali interagiscono con i componenti di altre vie di segnalazione. Per esempio, il sistema di segnalazione dell’insulina (Figura 13.31), sebbene non sia stato ancora pienamente definito, è chiaramente molto complesso. Una volta legata l’insulina, il recettore dell’ormone si autofosforila a livello di diversi residui di Tyr (Paragrafo 13.2A), dopodiché fosforila le Tyr di proteine bersaglio, attivando così diverse vie di segnalazione che controllano una vasta gamma di effetti.

1. La fosforilazione della proteina adattatore Shc, che genera un sito di legame per il dominio SH2 di Grb2, porta alla stimolazione di una cascata di MAP chinasi (Paragrafo 13.2B) che va a influenzare la crescita e il differenziamento cellulare. 2. La fosforilazione di Gab-1 (Grb2-associated binder-1, proteina di legame associata a GRB-2) attiva in modo simile la cascata di MAP chinasi. 3. La fosforilazione delle proteine substrato del recettore dell’insulina (proteine IRS; Paragrafo 13.2A) determina l’attivazione degli enzimi, come per esempio la fosfoinositide 3-chinasi (PI3K). Questi enzimi aggiungono un gruppo fosforico al gruppo 3′-OH di un fosfatidilinositolo, spesso il 4,5-bisfosfato mostrato nella Figura 13.25. Il lipide fosforilato in posizione 3 attiva la proteina chinasi fosfoinositide-dipendente-1 (PDK1), che a sua volta dà inizio a una cascata che porta alla sintesi del glicogeno (Paragrafo 16.3C) e alla traslocazione di GLUT4 sulla superficie delle cellule che rispondono all’insulina (Paragrafo 22.2), oltre ad avere effetti sulla crescita e sul differenziamento cellulare. 4. La fosforilazione del complesso APS/Cbl (APS sta per proteina adattatore contenente domini omologhi alle plekstrine e domini SH2; Cbl è una proteina di collegamento che lega SH2 ed SH3 prodotta da un proto-oncogene) porta alla stimolazione di TC10 (una proteina G monomerica) e alla regolazione PI3K-indipendente del trasporto del glucosio, in cui si ha la partecipazione delle zattere lipidiche (Paragrafo 9.4C).

La segnalazione biochimica

467

468

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

Insulina

Membrana plasmatica Raf1

Ras

1 Shc

Sos Grb2

pY

4 APS/Cbl

pY 2 Gab-1

SHP-2

IR

pY

pY

CAP pY

TC10

pY

3 Proteine IRS

pY

C3G

CrkII

pY PI3K

SHP-2

MEK

Zattere lipidiche

pY pY Fyn PDK1

MAPK

mTOR

PKB/Akt PKCζ PKCλ

Jun

Myc Fos

p90rsk

Chinasi S6

GSK3β

AS160

S6

DNA/RNA/sintesi proteica

Sintesi del glicogeno

Crescita e differenziamento cellulare Figura 13.31 La trasduzione del segnale dell’insulina. Il legame dell’insulina al suo recettore (IR) induce la fosforilazione di residui di tirosina (pY) che attiva la MAPK attraverso l’attivazione preventiva di Shc (1) e Gab-1 (2). La cascata chinasica indotta da MAPK regola l’espressione di geni coinvolti nella crescita e nel differenziamento cellulare. La fosforilazione delle proteine IRS (3) attiva la cascata enzimatica innescata da PI3K che porta a cambiamenti dello stato di fosforilazione di alcuni enzimi, stimolando la sintesi del glicogeno e altre vie metaboliche. La cascata PI3K partecipa inoltre al controllo del traffico vescicolare, determinando la traslocazione del trasportatore del glucosio GLUT4 in direzione della superficie cellulare e aumentando quindi la velocità di trasporto del glucosio all’interno della cellula. Un controllo sul trasporto del glucosio è esercitato anche dal sistema APS/CbI (4), in un modo indipendente dalla PI3K e che coinvolge

Trasporto del glucosio Metabolismo

invece le “zattere lipidiche” (Paragrafo 9.4C). Altri simboli: Myc, Fos e Jun (fattori di trascrizione), SHP-2 (una proteina SH2 contenente la proteina tirosina fosfatasi o PTP), CAP (una proteina associata a CbI), C3G (un fattore di scambio di nucleotidi guaninici, o GEF), CrkII (una proteina che funziona come adattatore, e che contiene SH2/SH3), PDK1 (una proteina chinasi-1 dipendente dal fosfoinositide), PKB (proteina chinasi B, detta anche Akt), GSK3𝛃 (glicogeno sintasi chinasi-3β, che viene inibita dalla fosforilazione a opera di PKB), mTOR (mammalian target of rapamycin, proteina bersaglio della rapamicina espressa nei mammiferi), una proteina chinasi collegata a PI3K; la rapamicina è un agente immunosoppressore, S6 (una subunità proteica della subunità più piccola dei ribosomi eucariotici, la cui fosforilazione stimola la traduzione), e PKCζ e PKCλ (isoforme atipiche della proteina chinasi C). [Da Zick, Y. (2001). Trends Cell Biol. 11, 437.]

Attivando vie multiple, un ormone come l’insulina è quindi in grado di scatenare una varietà di effetti fisiologici che non sarebbero possibili in un sistema regolatorio del tipo “un ormone-un bersaglio”. La comprensione di un sistema complesso richiede un approccio di tipo integrato. L’approccio predominante nella scienza è di tipo riduttivo: il tentativo

di comprendere un sistema attraverso lo studio dei suoi componenti. I chimici e i biochimici spiegano così le proprietà di una molecola in base alle proprietà

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

degli atomi che la compongono, i biologi cellulari spiegano la natura delle cellule in base alle proprietà delle macromolecole che le compongono e i biologi spiegano le caratteristiche degli organismi multicellulari utilizzando le proprietà delle cellule che li compongono. I sistemi complessi posseggono però proprietà emergenti che non sono facilmente prevedibili in base all’analisi delle parti che li compongono (per esempio, l’intero è più grande della somma delle sue parti). Infatti, la vita stessa è una proprietà emergente che deriva dalle numerose reazioni chimiche che avvengono all’interno di una cellula. Per chiarire le proprietà emergenti di un sistema complesso è necessario un approccio di tipo integrativo. Per i sistemi di trasduzione del segnale, questo tipo di approccio dovrebbe essere in grado di determinare in che modo ciascuno dei componenti di ogni via di segnalazione in una cellula interagisce con tutti gli altri componenti nelle condizioni che ognuno di questi componenti sperimenta all’interno del suo ambiente circostante. Le tecniche attualmente esistenti per poter fare ciò sono, a dir poco, approssimative. Inoltre, questi sistemi non sono affatto statici, ma variano nel tempo in risposta a programmi cellulari e dell’organismo. Di conseguenza, i mezzi per la comprensione delle prestazioni olistiche dei sistemi di trasduzione del segnale cellulare sono solo alle prime fasi di sviluppo. È verosimile che questo tipo di comprensione abbia importanti conseguenze e risvolti biomedici, dal momento che molte patologie, tra cui il cancro, il diabete e molte malattie neurologiche, sono causate da malfunzionamento dei sistemi di trasduzione del segnale.

469

PUNTO DI VERIFICA

• Descrivete il modo in cui il legame del ligando a un recettore porta alla produzione di IP3 e DAG e al rilascio di Ca2+.

• Quali componenti del sistema di segnalazione del fosfoinositide sono solubili e quali, invece, sono associati alla membrana?

• In che modo la calmodulina attiva le proteine bersaglio?

• Spiegate perché l’attività della PKC richiede componenti di membrana.

• Descrivete i meccanismi che limitano la segnalazione attraverso la via del fosfoinositide.

• Confrontate le Figure 13.7, 13.23 e 13.24. Che cos’hanno in comune tutte queste vie? In che cosa, invece, si differenziano?

• In che modo i sistemi di segnalazione biologica suggeriscono l’idea che l’intero sia più grande della somma delle sue parti?

RIASSUNTO 1 Gli ormoni

3 Le proteine G eterotrimeriche

• Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine e da altri tessuti regolano diversi processi fisiologici. Gli ormoni polipeptidici insulina e glucagone controllano il metabolismo dei combustibili. Le risposte del tipo “combatti o fuggi” sono governate dal legame dell’adrenalina e della noradrenalina ai recettori α- e β-adrenergici; gli ormoni steroidei regolano lo sviluppo e la funzione sessuale; l’ormone della crescita stimola direttamente e indirettamente la crescita. • I segnali ormonali interagiscono con i tessuti bersaglio legandosi ai recettori che trasducono il segnale all’interno della cellula.

• I recettori associati alle proteine G (GPCR) sono caratterizzati da una struttura con sette eliche transmembrana. Dopo il legame con l’agonista, questi recettori subiscono un cambiamento conformazionale che attiva una proteina G eterotrimerica. • La proteina G scambia il GDP con il GTP e si dissocia. Le unità Gα e Gβγ possono attivare o inibire bersagli come l’adenilato ciclasi, che produce il cAMP, l’attivatore della proteina chinasi A (PKA). • L’attività di segnalazione viene limitata dalla distruzione del secondo messaggero.

2 I recettori con attività tirosina chinasica

• Nella via del fosfoinositide il recettore dell’ormone è associato alla proteina G, la cui attivazione determina a sua volta la fosfolipasi C. Questo enzima catalizza l’idrolisi del fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato, producendo due secondi messaggeri. • L’inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3), un secondo messaggero solubile, apre i canali del Ca2+, causando un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2+, che a sua volta attiva le proteina chinasi tramite il legame del complesso Ca2+-calmodulina. Il secondo messaggero lipidico diacilglicerolo (DAG) attiva la proteina chinasi C (PKC). • Le vie di segnalazione sono sistemi complessi in cui un singolo segnale extracellulare può innescare eventi intracellulari multipli, alcuni dei quali possono anche essere attivati da altre vie di segnalazione.

• Dopo il legame con il ligando, i recettori con attività tirosina chinasica, come il recettore per l’insulina, subiscono un’autofosforilazione che li induce a fosforilare le loro proteine bersaglio, in alcuni casi innescando una serie di eventi chinasici a catena. • Una via di segnalazione che promuove la crescita coinvolge la proteina G monomerica Ras e porta a un’alterata espressione genica. • Per le interazioni proteina-proteina nelle vie di segnalazione possono essere necessari i domini SH2 ed SH3. • Le proteina chinasi hanno una struttura comune che spesso comprende l’attivazione mediante il dislocamento di un segmento autoinibitorio. • Gli effetti delle proteina chinasi sono invertiti dall’attività delle proteina fosfatasi.

4 La via del fosfoinositide

470

CAPITOLO 13

La segnalazione biochimica

© 978-88-08-42096-1

PROBLEMI 1. L’ormone pancreatico somatostatina ha bisogno di un re-

12. Il trastuzumab (o Herceptin; Paragrafo 7.3) è un anticorpo che

cettore sulla superficie o nel citosol di una sua cellula bersaglio? 2. L’acido retinoico (un derivato della vitamina A, Paragrafo 9.1F) è un ormone che media la funzione del sistema immunitario. L’acido retinoico ha bisogno di un recettore sulla superficie di una sua cellula bersaglio? 3. Quali cambiamenti biochimici sono necessari per convertire la tirosina in (a) noradrenalina e (b) adrenalina? 4. Nella figura è mostrato lo steroide metandrostenolone. (a) In che cosa si differenzia dal testosterone dal punto di vista strutturale? (b) Perché questo farmaco potrebbe essere somministrato ai pazienti ustionati?

si lega al dominio extracellulare del recettore HER2 del fattore di crescita. Spiegate perché il trastuzumab potrebbe costituire un trattamento efficace per quei tipi di tumore che esprimono elevati livelli di HER2. 13. In che modo la presenza di GTPγS, un analogo del GTP scarsamente idrolizzabile (in cui un atomo di O del gruppo fosforico terminale è sostituito da un atomo di S), influenza la produzione di cAMP da parte dell’adenilato ciclasi? 14. Il Mycobacterium tubercolosis è un batterio intracellulare che causa la tubercolosi. Il genoma di M. tubercolosis comprende 17 geni che codificano l’adenilato ciclasi, mentre i batteri a vita libera di solito hanno solo un gene che codifica l’adenilato ciclasi. Perché potrebbe essere vantaggioso per M. tubercolosis avere un’elevata attività dell’adenilato ciclasi? 15. Una delle tossine prodotte dal Bacillus antracis (la causa dell’antrace) è conosciuta come EF, acronimo di fattore edema (un edema è la produzione anormale di fluido extracellulare). EF, che penetra nelle cellule ospiti dei mammiferi, è una adenilato ciclasi attivata dalla calmodulina. Spiegate come questa tossina causa l’edema. 16. Un’altra tossina del B. antracis è il fattore letale LF. Questa tossina è una proteasi che degrada i membri della famiglia delle MAPK chinasi in modo che questi non si possano legare ai loro bersagli MAPK più a valle nella via di segnalazione nelle cellule della linea bianca del sangue. Spiegate come LF inibisce l’attivazione del sistema immunitario durante l’infezione da B. antracis. 17. Il diacilglicerolo è un substrato per l’enzima diacilglicerolo chinasi. Qual è il prodotto di questa reazione? 18. Spiegate perché l’attivazione della diacilglicerolo chinasi dovrebbe limitare la segnalazione che passa per la via del fosfatidilinositide. 19. Lo ione litio, che viene utilizzato per trattare il disturbo bipolare (patologia nella quale i normali stati dell’umore, tristezza e felicità, si presentano ciclicamente amplificati e alternati a periodi di normalità, N.d.T.), interferisce con la via di segnalazione del fosfoinositide inibendo enzimi quali l’inositolo monofosfatasi e l’inositolo polifosfato 1-fosfatasi. Prevedete l’effetto del Li+ sull’apporto di inositolo intracellulare, un precursore del fosfatidilinositolo e del PIP2. 20. La proteina SHP-2 partecipa alla segnalazione dell’insulina attraverso la sua indiretta attivazione da parte del recettore dell’insulina (Figura 13.31), un recettore con attività tirosina chinasica. La SHP-2 è in realtà una proteina con attività tirosina fosfatasica. È un paradosso? Spiegate la vostra risposta.

H3C

H3C OH

H3C

O 5. Calcolate l’affinità di legame di un ligando per il suo recettore

utilizzando i dati riportati nella tabella seguente: [Ligando] (µM)

Saturazione frazionale, Y

1

0,20

2

0,36

4

0,54

6

0,62

8

0,70

6. Calcolate l’affinità di legame di un ligando per il suo recettore

utilizzando i dati riportati nella tabella seguente: [Ligando libero] (mM)

[Ligando legato] (mM)

0,6

2

1,5

4

3,0

6

6,0

8

15,0

10

7. Alcuni sistemi batterici di segnalazione coinvolgono china-

si che trasferiscono un gruppo fosforico alla catena laterale di una His. Disegnate la catena laterale di fosfo-His. 8. Perché un composto che assomiglia all’ADP potrebbe essere utilizzato come un inibitore della proteina chinasi? 9. Spiegate come mai una proteina tirosina fosfatasi dovrebbe comprendere un dominio SH2 oltre al suo dominio fosfatasico. 10. Un fattore di crescita che agisce tramite un recettore con attività tirosina chinasica stimola la divisione cellulare. Formulate una previsione su quale potrebbe essere l’effetto di una proteina virale che inibisce la corrispondente proteina tirosina fosfatasi. 11. I retrovirus portatori di oncogeni infettano le cellule dei loro animali ospiti ma solitamente non trasformano queste cellule in cancerose. Questi retrovirus trasformano invece facilmente le cellule immortalizzate derivate dallo stesso organismo. Spiegate.

DOMANDE DIFFICILI 21. L’ormone A si lega al suo recettore con una KL di 5 µM. In

presenza di una concentrazione pari a 2,5 µM del composto B e di 2,0 µM dell’ormone A, 1,0 µM di ormone A non si lega. Calcolate l’affinità di legame di B per il recettore dell’ormone A. 22. Il propanololo si lega ai recettori β-adrenergici con una KI pari a 8,9 × 10−9 M. Quale concentrazione di propanololo dovrebbe essere necessaria per raggiungere una riduzione del 50% del legame dell’agonista del recettore isoproterenolo, se la concentrazione dell’agonista è 10 nM e la sua costante di dissociazione per il recettore è 4,8 × 10−8 M? 23. Un substrato del recettore dell’insulina (IRS) contiene il dominio cosiddetto di omologia plekstrinica (PH) che si lega al

CAPITOLO 13 © 978-88-08-42096-1

gruppo inositolico presente sulle teste dei lipidi di membrana, un dominio di legame della fosfotirosina (PTB) diverso dal dominio SH2, e da sei a otto residui di Tyr che possono essere fosforilati. Spiegate come ognuna di queste caratteristiche contribuisca alla trasduzione del segnale. 24. Cercate di prevedere l’effetto che una mutazione Sos avrebbe sulla crescita cellulare nel caso in cui la mutazione facesse diminuire l’affinità di Sos per Ras. 25. Le seguenti alterazioni di Src potrebbero essere cancerogene? Spiegate le vostre risposte. (a) Delezione o inattivazione del dominio SH3. (b) Mutazione della Tyr 416 in Phe. 26. Le seguenti alterazioni di Src potrebbero essere cancerogene? Spiegate le vostre risposte. (a) Mutazione della Tyr 527 in Phe. (b) Sostituzione dei residui di Src da 249 a 253 con la sequenza APTMP. 27. Spiegate perché le mutazioni del residuo di Arg in Gsα che viene ADP-ribosilata dalla tossina colerica sono mutazioni oncogeniche. 28. Perché la tossina colerica non causa il cancro? 29. La fosfatidiletanolammina e il PIP2, che contengono residui acilici identici, possono essere idrolizzati con uguale efficienza da una determinata fosfolipasi C. I prodotti di idrolisi che si formano dai due lipidi avranno lo stesso effetto sulla proteina chinasi C? Spiegate la vostra risposta. 30. Come fa la tossina della pertosse a inibire la fosfolipasi C? 31. I globuli bianchi del sangue noti come linfociti T rispondono agli antigeni che si legano in modo specifico al recettore delle cellule T, composto da una proteina transmembrana αβ di legame all’antigene e da un gruppo di proteine di

La segnalazione biochimica

471

segnale transmembrana note come CD3, che sono bersaglio degli NRTK. I domini citoplasmatici delle proteine CD3 sono carichi positivamente e, in assenza di antigene, interagiscono con la superficie intracellulare della membrana plasmatica, in modo da immergere diversi dei loro residui di Tyr nel doppio strato fosfolipidico. Il legame dell’antigene al recettore delle cellule T porta a un afflusso localizzato di ioni Ca2+. (a) Spiegate in che modo un’alta concentrazione di Ca2+ può promuovere la fosforilazione e l’attivazione delle proteine CD3. (b) Questo fenomeno renderebbe i linfociti T più o meno responsivi all’antigene? 32. La diagnosi di alcuni linfomi (tumori delle cellule del sangue) comprende le analisi citogenetiche per la ricerca di anomalie cromosomiche nelle cellule del paziente. I cromosomi sono visibili al microscopio ottico solo durante la divisione cellulare. Le cellule rimosse dal midollo osseo di un paziente possono essere trattate con forbolo miristato acetato (PMA) prima dell’analisi al microscopio. Quale è lo scopo del PMA?

APPROFONDIMENTO Il senso dell’olfatto o odorato, che consiste nella capacità di identificare le molecole odorose, è mediato nella sua azione dai recettori associati alle proteine G. Il numero di questi recettori presenti nel naso degli esseri umani è sufficiente ad assicurare la captazione di tutti i tipi di odori? Che cosa accade nella cellula in seguito al legame del ligando a uno di questi recettori? Come viene trasmessa al cervello la presenza di una molecola odorosa da parte di una cellula olfattiva?

BIBLIOGRAFIA Alonso, A., et al. (2004). Protein tyrosine phosphatases in the human genome, Cell 117, 699-711. Carrasco, S. e Mérida, I. (2007). Diacylglycerol, when simplicity becomes complex, Trends Biochem. Sci. 32, 27-36. [Esamina la via di segnalazione basata sul diacilglicerolo.] Cho, U.S. e Xu, W. (2007). Crystal structure of a protein phosphatase 2A heterotrimeric holoenzyme, Nature 445, 53-57; e Xu, Y., Xing, Y., Chen, Y., Chao, Y., Lin, Z., Fan, E., Yu, J., Stack, S., Jeffrey, P., e Shi, Y. (2006). Structure of the protein phosphatase 2A holoenzyme, Cell 127, 1239-1251. De Meyts, P. (2008). The insulin receptor: A prototype for dimeric, allosteric membrane receptors? Trends Biochem. Sci. 33, 376-384. Di Paolo, G. e De Camilli, P. (2006). Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics, Nature 443, 651-657. Good, M.C., Zalatan, J.G., e Lim, W.A. (2011). Scaffold proteins: Hubs for controlling the flow of cellular information, Science 332, 680-686. Krauss, G. (2014). Biochemistry of Signal Transduction and Regulation (5a ed.), Wiley-VCH. [Un trattazione dettagliata.] Lim, W., Mayer, B., e Pawson, T. (2015). Cell Signaling. Principles and Mechanisms, Garland Science. Lemmon, M.A. e Schlessinger, J. (2010). Cell signaling by receptor tyrosine kinases, Cell 141, 1117-1134. [Una rassegna dettagliata.] Marks, F., Klingmüller, U., e Müller-Decker, K. (2009). Cellular Signal Processing. An Introduction to the Molecular Mechanisms of Signal Transduction, Garland Science. Murphy, L.O. e Blenis, J. (2006). MAPK signal specificity: the right place at the right time, Trends Biochem. Sci. 31, 268-275.

Oldham, W.M. e Hamm, H.E. (2008). Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 9, 60-71. Pawson, T. e Scott, J.D. (2005). Protein phosphorylation in signaling – 50 years and counting, Trends Biochem. Sci. 30, 286-290. Rassmussen, S.G.F., et al. (2011). Crystal structure of the β2 adenergic receptor-Gs complex, Nature 477, 550-557. Rosenbaum, D.M., Rasmussen, S.G.F., e Kobilka, B.K. (2009). The structure and function of G-protein-coupled receptors, Nature 459, 356-362. [Fornisce comparazioni strutturali di quattro GPCR e discute i meccanismi di attivazione indotti dal ligando.] Science Signaling: Database of Cell Signaling. http://stke.sciencemag.org/cm/. [Una banca dati delle molecole segnale e delle loro relazioni reciproche. Per il pieno accesso alla banca dati è necessario un abbonamento individuale o tramite un’istituzione.] Shukla, A.K., Singh, G., e Ghosh, E. (2014). Emerging structural insights into biased GPCR signaling, Trends Biochem. Sci. 39, 594-602. Taylor, S.S., Ilouz, R., Zhang, P., e Kornev, A.P. (2012). Assembly of allosteric macromolecular switches: Lessons from PKA, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 13, 646-658. Venkatakrishnan, A.J., Deupi, X., Lebon, G., Tate, C.G., Schertler, G.F., e Babu, M.M. (2013). Molecular signatures of G-protein-coupled receptors, Nature 494, 185-194. [Una rassegna.] Wittinghofer, A. e Vetter, I.R. (2011). Structure-function relationships of the G domain, a canonical switch motif, Annu. Rev. Biochem. 80, 943-971.

C A P I T O L O

1 4

Introduzione al metabolismo Gli approcci moderni nella comprensione del metabolismo includono l’uso della teoria della rete per studiare l’importanza funzionale dell’interazione fra i componenti cellulari, come le proteine di lievito mostrate qui. [Hawoong Jeong, University Of Notre Dame / Science Source Images.]

La comprensione della composizione chimica e della struttura tridimensionale delle molecole biologiche non è sufficiente per capire come queste ultime si organizzino per costituire organismi, o come possano funzionare per mantenere le condizioni indispensabili per la vita. È quindi necessario esaminare le reazioni tramite le quali le molecole biologiche sono costruite e demolite. È inoltre necessario considerare i processi attraverso i quali l’energia libera è utilizzata per costruire nuovo materiale biologico e per effettuare il lavoro cellulare, e come l’energia libera sia resa disponibile attraverso processi a carico di composti organici o non organici. Il metabolismo, l’insieme delle reazioni con cui gli esseri viventi ricavano e utilizzano energia libera per svolgere le loro numerose funzioni, è tradizionalmente diviso in due parti.

1. Il catabolismo, o degradazione, in cui i nutrienti e i costituenti cellulari sono degradati per riutilizzarne i componenti e/o per rendere l’energia disponibile. 2. L’anabolismo, o biosintesi, in cui le molecole biologiche sono sintetizzate a partire da componenti più semplici.

In generale le reazioni cataboliche attuano l’ossidazione esoergonica delle molecole nutrienti. L’energia libera rilasciata in queste reazioni è usata per effettuare processi endoergonici, come le reazioni anaboliche, lo svolgimento di un lavoro meccanico o il trasporto attivo di molecole contro gradienti di concentrazione. I processi esoergonici ed endoergonici sono spesso sincronizzati tra loro (accoppiati) tramite la sintesi intermedia di un composto “ad alta energia” come l’ATP. Questo semplice principio è alla base di molte reazioni chimiche presentate nei capitoli seguenti. In questo capitolo analizzeremo le caratteristiche generali delle reazioni metaboliche e il ruolo dell’ATP e di altri composti come trasportatori di energia. Inoltre, poiché molte trasformazioni metaboliche sono reazioni di ossidazione-riduzione, ripasseremo la termodinamica di questi processi ed esamineremo infine alcuni metodi di studio delle reazioni metaboliche.

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

1 Una panoramica del metabolismo CONCETTI CHIAVE

• Organismi diversi utilizzano differenti strategie per catturare l’energia libera dall’ambiente che li circonda e possono essere classificati a seconda della loro richiesta di ossigeno.

• La nutrizione dei mammiferi comprende l’assunzione di macronutrienti (proteine, carboidrati e lipidi) e di micronutrienti (vitamine e minerali).

• Una via metabolica è una serie di reazioni catalizzate da enzimi che spesso è localizzata in uno specifico compartimento della cellula.

• Il flusso del materiale attraverso una via metabolica varia in funzione delle attività degli enzimi che catalizzano le reazioni irreversibili.

• Gli enzimi che controllano il flusso delle vie metaboliche sono regolati con meccanismi di tipo allosterico, modificazioni covalenti, cicli del substrato e variazioni dell’espressione genica.

In ogni cellula vivente avviene una varietà straordinaria di reazioni chimiche. Tuttavia i principi che controllano il metabolismo sono gli stessi in tutti gli organismi: questo è il risultato della loro comune origine da un punto di vista evolutivo e dei limiti imposti dalle leggi della termodinamica. Molte reazioni metaboliche fondamentali sono infatti comuni a tutti gli organismi, con alcune varianti dovute principalmente a differenze nella fonte di energia libera che le sostiene.

A La nutrizione: assunzione e utilizzazione degli alimenti La nutrizione, intesa come l’assunzione e l’utilizzazione degli alimenti, influenza la salute, lo sviluppo e le prestazioni dell’organismo. Il cibo fornisce l’energia che alimenta i processi vitali e le materie prime per costruire e riparare i tessuti corporei. Le esigenze nutrizionali di un organismo riflettono la fonte di energia necessaria per il suo metabolismo. Per esempio, alcuni procarioti sono autotrofi (dal greco autós, “stesso”, e trophòs, “nutrimento”): sono quindi in grado di sintetizzare tutti i loro costituenti cellulari a partire da molecole semplici come H2O, CO2, NH3 e H2S. Vi sono due possibili fonti di energia libera per questo processo. I chemiolitotrofi (dal greco lithos, “pietra”) ottengono la loro energia mediante l’ossidazione di composti inorganici come NH3, H2S o addirittura Fe2+: 2 NH3 4 O2 → 2 HNO3 2 H2O H2S 2 O2 → H2SO4 4 FeCO3 O2 6 H2O → 4 Fe(OH)3 4 CO2 I fotoautotrofi ottengono energia mediante la fotosintesi, un processo nel quale l’energia luminosa permette il trasferimento degli elettroni da donatori inorganici a CO2, per produrre carboidrati (CH2O)n, che vengono in seguito ossidati per rilasciare energia libera. Gli eterotrofi (dal greco héteros, “altro”) ottengono energia libera dall’ossidazione di composti organici (carboidrati, lipidi e proteine): in ultima analisi dipendono quindi dagli autotrofi o dai fototrofi per ottenere queste sostanze. È possibile classificare ulteriormente gli organismi in base alla natura dell’agente ossidante usato per la demolizione delle sostanze nutrienti. Gli aerobi obbligati (tra cui gli animali) devono utilizzare O2, mentre gli anaerobi impiegano agenti ossidanti come i solfati o i nitrati. Gli anaerobi facoltativi, come E. coli, sono in grado di crescere in presenza o in assenza di O2. Al contrario, gli anaerobi obbligati sono avvelenati dalla presenza di O2. Si ritiene che il loro metabolismo sia simile a quello delle prime forme di vita, che si sono originate più di 3,5 miliardi di anni fa quando l’atmosfera terrestre era priva di O2. In questo testo la trattazione del metabolismo riguarda principalmente i processi aerobici. Gli animali sono eterotrofi aerobi obbligati, la cui nutrizione dipende dall’assunzione bilanciata di macronutrienti quali proteine, carboidrati e lipidi. Queste

Introduzione al metabolismo

473

474

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 14.1 Caratteristiche delle vitamine comuni

Vitamina

Coenzima prodotto

Reazione mediata

Malattia da carenza nell’uomo

Biotina

Biocitina

Carbossilazione

a

Pantotenato (acido pantotenico; B5)

Coenzima A

Trasferimento di gruppi acilici

a

Idrosolubile

Cobalamina (B12)

Coenzimi cobalaminici

Alchilazione

Anemia perniciosa

Riboflavina (B2)

Coenzimi flavinici

Ossidazione-riduzione

a



Acido lipoico

Trasferimento di gruppi acilici

a

Nicotinamide (niacina; B3) Coenzimi nicotinamidici

Ossidazione-riduzione

Pellagra

Piridossina (B6)

Piridossalfosfato

Trasferimento di gruppi amminici

a

Acido folico (B9)

Tetraidrofolato

Trasferimento di gruppi monocarboniosi

Anemia megaloblastica

Tiamina (B1)

Tiamina pirofosfato

Trasferimento di aldeidi

Beriberi

Acido ascorbico (C)

Ascorbato

Ossidrilazione

Scorbuto

Liposolubile Vitamina A

a

Vista

Cecità notturna

Vitamina D

Assorbimento del

Vitamina E

Antiossidante

a

Vitamina K

Coagulazione sanguigna

Emorragia

Ca2+

Rachitismo

Assenza di nome specifico; nell’essere umano la carenza è rara o non si osserva.

macromolecole vengono demolite dall’apparato digestivo nei loro componenti: amminoacidi, monosaccaridi, acidi grassi e glicerolo. Questi rappresentano, infatti, i principali nutrienti coinvolti nel metabolismo cellulare e vengono successivamente trasportati ai tessuti dal sistema circolatorio. L’utilizzazione metabolica di queste sostanze, gli acidi grassi e il glicerolo, richiede l’apporto di O2 e acqua ma anche di micronutrienti costituiti da vitamine e minerali.

B Le vitamine e i minerali facilitano le reazioni metaboliche

TABELLA 14.2 I principali

minerali essenziali e gli elementi presenti in tracce (oligoelementi) Minerali principali

Elementi in tracce (oligoelementi)

Sodio

Ferro

Potassio

Rame

Cloro

Zinco

Calcio

Selenio

Fosforo

Iodio

Magnesio

Cromo

Zolfo

Fluoro

Quali degli elementi elencati qui si trovano come componenti legati covalentemente nelle molecole biologiche?

Le vitamine sono molecole organiche che un organismo animale non è in grado di sintetizzare e deve, quindi, ottenere dalla dieta. Le vitamine possono essere suddivise in due gruppi, le vitamine idrosolubili e le vitamine liposolubili. Nella Tabella 14.1 sono elencate molte vitamine comuni e i tipi di reazioni o processi a cui prendono parte (considereremo le strutture di queste sostanze e i loro meccanismi di reazione in altri paragrafi). Nella Tabella 14.2 sono elencati i minerali essenziali e gli elementi presenti in tracce (oligoelementi) necessari al metabolismo. Questi prendono parte ai processi metabolici in molti modi. Lo ione Mg2+, per esempio, è coinvolto pressoché in tutte le reazioni a cui partecipa l’ATP e altri nucleotidi, comprese la sintesi del DNA, dell’RNA e delle proteine. Lo ione Zn2+ è un cofattore di molti enzimi, inclusa l’anidrasi carbonica (Paragrafo 11.3C). Lo ione Ca2+, oltre a essere il principale componente minerale delle ossa e dei denti, partecipa ai processi di trasduzione del segnale (Paragrafo 13.4). Molte vitamine idrosolubili sono convertite in coenzimi. Numerosi coen-

zimi (Paragrafo11.1C) sono stati scoperti come fattori di crescita per microrganismi o come sostanze in grado di curare malattie dovute a carenze nutrizionali nell’essere umano e/o negli animali. Per esempio, il componente del NAD+ nicotinamide, oppure il suo analogo di acido carbossilico acido nicoti-

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

nico (niacina; Figura 14.1), cura nell’uomo la malattia dovuta a carenza alimentare, nota con il nome di pellagra. La pellagra (da pelle + agra, o aspra), caratterizzata da dermatite, diarrea e demenza, era endemica nelle zone rurali del sud degli Stati Uniti all’inizio del XX secolo. Molti animali, fra cui l’uomo, possono sintetizzare la nicotinamide a partire dall’amminoacido triptofano. Tuttavia, la dieta ricca di mais (granturco), predominante nelle zone rurali del sud, conteneva poca nicotinamide già disponibile, o triptofano da cui sintetizzarla. (Il mais in realtà contiene quantità significative di niacina, ma in una forma che richiede un trattamento con una base perché possa essere assorbita dall’intestino. Gli Indiani del Messico, che coltivavano la pianta di granturco ma non soffrivano di pellagra, di norma mettevano a bagno la farina di mais in acqua di calce – una soluzione diluita di Ca(OH)2 – prima di usarla per fare il loro piatto tipico, le tortillas.) L’integrazione nella dieta di nicotinamide o niacina ha eliminato quasi del tutto la pellagra nel mondo sviluppato. Le vitamine idrosolubili nella dieta umana sono tutte precursori di coenzimi; quelle liposolubili, eccetto la vitamina K (Paragrafo 9.1F), in genere non fanno parte dei coenzimi, sebbene anch’esse siano necessarie in bassissime quantità nel regime alimentare di molti animali superiori. I progenitori remoti della nostra specie erano probabilmente capaci di sintetizzare le varie vitamine, proprio come fanno numerose piante e microrganismi attuali. Poiché le vitamine sono normalmente disponibili nella dieta degli animali superiori, i quali si cibano di altri organismi, o sono prodotte dai batteri che abitualmente risiedono nel loro sistema digestivo, è probabile che una volta divenuto superfluo, l’apparato cellulare preposto alla loro sintesi sia stato perso nel corso dell’evoluzione. Per esempio, la vitamina C (acido ascorbico) è necessaria unicamente nell’alimentazione dell’uomo, delle api e dei porcellini d’india (Paragrafo 6.1C e Scheda 6.2). Questi animali sono privi di un enzima chiave per la biosintesi dell’acido ascorbico, a quanto pare una perdita evolutiva recente.

Introduzione al metabolismo

475

O C

NH2

N Nicotinamide (niacinamide) O C

OH

N Acido nicotinico (niacina) Figura 14.1 Strutture della

nicotinamide e dell’acido nicotinico. Queste vitamine costituiscono i componenti attivi dei coenzimi nicotinamidici NAD+ e NADP+ nelle reazioni ossidoriduttive (confrontare con la Figura 11.4).

C Le vie metaboliche sono costituite da serie di reazioni enzimatiche Le vie metaboliche sono una serie di reazioni enzimatiche in sequenza da cui si originano prodotti specifici. I reagenti, gli intermedi e i prodotti di queste vie sono detti metaboliti. Le reazioni metaboliche conosciute sono oltre 4000, ognuna delle quali è catalizzata da un enzima distinto. In una data cellula i diversi tipi di enzimi e di metaboliti variano a seconda dell’identità dell’organismo, del tipo cellulare, dello stato nutrizionale e dello stadio di sviluppo. Molte vie metaboliche sono ramificate e interconnesse, quindi evidenziarne una sola, isolandola da una rete che ne comprende migliaia, è un’operazione in un certo senso arbitraria, anche se basata sulla tradizione e sulla logica chimica. In genere le vie degradative e biosintetiche sono in relazione tra loro nel modo descritto qui di seguito (Figura 14.2). Nelle vie degradative i nutrienti principali, detti metaboliti complessi, sono demoliti tramite processi esoergonici in prodotti più semplici. L’energia libera rilasciata in questo processo degradativo è conservata tramite la sintesi di ATP a partiDegradazione re da ADP + Pi, oppure tramite la riduzione del coenzima NADP+ (Figura 11.4) a NADPH. L’ATP e il NADPH rappresentano le principali fonti di energia libera per le reazioni biosintetiche. Più avanti in questo capitolo esamineremo in maggiore dettaglio le proprietà dell’ATP e del NADPH. Una sorprendente caratteristica del metabolismo degradativo sta nel fatto che le vie cataboliche di un numero elevato di sostanze (carboidrati, lipidi e proteine) convergono in pochi in-

Figura 14.2 Ruoli dell’ATP e del

NADP+ nel metabolismo. L’ATP e il NADPH sintetizzati tramite la degradazione dei metaboliti complessi rappresentano la fonte di energia libera per le reazioni di biosintesi e per altre reazioni.

Metaboliti complessi ADP

+ HPO2Ð 4

NADP+

Biosintesi

NADPH ATP Prodotti semplici

476

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

Figura 14.3 Una panoramica sul

catabolismo. I metaboliti complessi come i carboidrati, le proteine e i lipidi sono degradati prima nelle loro unità monomeriche, principalmente glucosio, amminoacidi, acidi grassi e glicerolo, e quindi trasformati nell’intermedio comune acetilCoA. Il gruppo acetilico è ossidato a CO2 nel ciclo dell’acido citrico con la contemporanea riduzione del NAD+ e del FAD a NADH e FADH2. La riossidazione del NADH e del FADH2 ad opera dell’O2 durante la fosforilazione ossidativa produce H2O e ATP.

© 978-88-08-42096-1

Proteine

Carboidrati

Lipidi

Amminoacidi

Glucosio

Acidi grassi e Glicerolo

ADP

ATP Glicolisi

NAD+

NADH

Piruvato CO2

Identificate i tre principali prodotti di scarto del catabolismo.

Acetil-CoA

Ciclo dell’acido citrico

NAD+ FAD

NADH FADH2

NH3 CO2 NAD+

NADH

Fosforilazione ossidativa

FAD

FADH2 O2

ADP ATP

H2O

termedi comuni; in molti casi si tratta di una unità di acetile a due atomi di carbonio legata al coenzima A, l’acetil-coenzima A (acetil-CoA; Paragrafo 14.2D). Questi intermedi sono in seguito metabolizzati in una via ossidativa centrale. Nella Figura 14.3 sono raccolte le vie di degradazione di varie sostanze nutrienti prima convertite nelle loro unità monomeriche e infine in acetil-CoA. Questo processo è seguito dall’ossidazione degli atomi di carbonio del gruppo acetilico a CO2 tramite il ciclo dell’acido citrico (Capitolo 17). Quando una sostanza è ossidata (cioè perde elettroni), un’altra deve essere ridotta (cioè acquista elettroni; Scheda 14.1). Il ciclo dell’acido citrico produce quindi i coenzimi ridotti NADH e FADH2 (Paragrafo 14.3A), che trasferiscono i loro elettroni all’O2 per produrre H2O nei processi di trasporto degli elettroni e della fosforilazione ossidativa (Capitolo 18). Nelle vie biosintetiche avviene il processo opposto. Un numero relativamente basso di metaboliti serve da materiale di partenza per costruire una grande varietà di prodotti. Nei prossimi capitoli esamineremo in dettaglio numerose vie cataboliche e anaboliche. Gli enzimi catalizzano le reazioni delle vie metaboliche. Tranne alcune eccezio-

ni, l’interconversione dei metaboliti nelle vie degradative e biosintetiche è catalizzata da enzimi. In assenza di enzimi, le reazioni avverrebbero troppo lentamente per permettere la vita. La specificità degli enzimi garantisce inoltre l’efficienza delle reazioni metaboliche, impedendo la formazione di prodotti inutili o tossici. Gli enzimi forniscono soprattutto un meccanismo per sincronizzare (accoppiare) una reazione chimica endoergonica (che non avverrebbe spontaneamente) con una reazione energeticamente favorevole, come discusso in seguito.

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

SCHEDA 14.1

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

Gli stati di ossidazione del carbonio Gli atomi di carbonio nelle molecole biologiche possono assumere diversi stati di ossidazione, a seconda dell’atomo (o atomi) a cui sono legati. Per esempio, un atomo di carbonio legato ad atomi di idrogeno meno elettronegativi è maggiormente ridotto rispetto a un atomo di carbonio legato ad atomi di ossigeno fortemente elettronegativi. Il modo più semplice per determinare il numero di ossidazione (e quindi lo stato ossidativo) di un particolare atomo di carbonio è di esaminare ciascuno dei suoi legami e assegnare gli elettroni all’atomo più elettronegativo. In un legame C−O entrambi gli elettroni “appartengono” a O; in un legame C−H entrambi gli elettroni “appartengono” a C; e in un legame C−C ciascun atomo di carbonio “possiede” un elettrone. Il numero di ossidazione di un atomo è il numero di elettroni di valenza sull’atomo libero (4 per il carbonio) meno il numero degli elettroni spaiati e già assegnati. Per esempio, il numero di ossidazione del carbonio nel CO2 è 4 − (0 + 0) = + 4, e il numero di ossidazione del carbonio in CH4 è 4 − (0 + 8) = −4. Ricordate sempre, però, che i numeri di ossidazione sono solo strumenti di calcolo; le cariche atomiche effettive sono in realtà molto vicine alla neutralità. I composti nella tabella sono elencati in ordine di stato ossidativo dell’atomo di carbonio indicato in rosso. In generale, i composti maggiormente ossidati hanno meno elettroni per atomo di C e sono più ricchi di ossigeno, mentre i composti maggiormente ridotti hanno più elettroni per atomo di C e sono più ricchi di idrogeno. Si noti, tuttavia, che non tutti gli eventi di riduzione (acquisto di elettroni) o di ossidazione (perdita di elettroni) sono associati al legame con l’ossigeno. Per esempio, quando un alcano è trasformato in un alchene, la formazione di un doppio legame carbonio-carbonio comporta la perdita di elettroni: si tratta quindi di una reazione di ossidazione, sebbene non sia coinvolto alcun atomo di ossigeno. Conoscere il numero di ossidazione di un atomo di carbonio non è sempre indispensabile, ma aiuta a stabilire se lo stato di ossidazione di un determinato atomo aumenta o diminuisce durante una reazione chimica.

Composto

Formula

Biossido di carbonio

O

C

Acido acetico

H3C

Monossido di carbonio

SC

Acido formico

H

O

4 (il più 4 ossidato) O

C

OH

OS

3 2

O

C

Numero di ossidazione

OH

2

O

Acetone

H3C

C

CH3

2

H

1

O

Acetaldeide

H3C

C O

Formaldeide

H

Acetilene

HC

H

0

CH

1

C

H

Etanolo

H3C

OH

C

1

H

Etene (etilene)

H2C

H

C

H

2

H

Etano

H3C

H

C

3

H H

Metano

H

C H

Vedremo esempi di reazioni catalizzate da tutte e sei le classi di enzimi presentati nel Paragrafo 11.1A. Queste reazioni sono di quattro tipi principali: ossidazioni e riduzioni (catalizzate da ossidoriduttasi), reazioni di trasferimento di gruppi chimici (catalizzate da transferasi e idrolasi), eliminazioni, isomerizzazioni e ridistribuzioni molecolari (catalizzate da isomerasi e mutasi) e reazioni che costruiscono o distruggono legami carbonio-carbonio (catalizzate da idrolasi, liasi e ligasi). Le vie metaboliche hanno luogo in precise localizzazioni cellulari. La comparti-

mentazione del citoplasma degli eucarioti consente a diverse vie metaboliche di agire in localizzazioni diverse. Per esempio, la fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri, mentre la glicolisi (una via di degradazione dei carboidrati) e la biosintesi degli acidi grassi avvengono nel citosol. Nella Figura 14.4 sono riportate le principali funzioni metaboliche degli organelli degli eucarioti. I processi

H

4 (il meno 4 ossidato)

477

478

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Citosol Glicolisi, via del pentosio fosfato, biosintesi degli acidi grassi, molte reazioni della gluconeogenesi.

Reticolo endoplasmatico ruvido Sintesi di proteine legate alla membrana e di proteine secretorie.

Reticolo endoplasmatico liscio Biosintesi dei lipidi e degli steroidi. Mitocondrio Ciclo dell’acido citrico, fosforilazione ossidativa, ossidazione degli acidi grassi, scissione degli amminoacidi.

Apparato di Golgi Modificazione post-traduzionale di proteine di membrana e proteine secretorie; formazione della membrana plasmatica e di vescicole secretorie.

Nucleo Replicazione del DNA e trascrizione, elaborazione dell’RNA.

Perossisomi (gliossisomi nelle piante) Reazioni ossidative catalizzate da amminoacido ossidasi e catalasi; reazioni del ciclo del gliossilato nelle piante. Lisosomi Digestione enzimatica di componenti cellulari e di materiale ingerito.

Figura 14.4 Funzioni metaboliche degli organelli negli eucarioti. I processi degradativi e

biosintetici possono avvenire in compartimenti specializzati della cellula, oppure possono coinvolgere più compartimenti. Senza guardare la figura riassumete le funzioni principali di ogni compartimento cellulare. Identificate poi quali sono i compartimenti dove hanno luogo i processi degradativi e quali quelli in cui avvengono quelli sintetici.

metabolici dei procarioti, che sono privi di organelli, possono essere confinati in aree particolari del citosol. La sintesi di metaboliti in specifici compartimenti delimitati da membrane nelle cellule eucariotiche richiede meccanismi di trasporto per queste sostanze da un compartimento all’altro. Di conseguenza, le proteine di trasporto (Capitolo 10) sono componenti essenziali di molti processi metabolici. Per esempio, è necessaria una proteina di trasporto per trasferire l’ATP sintetizzato nei mitocondri nel citosol, dove è consumato in maggiore quantità (Paragrafo 18.1B). Negli organismi pluricellulari la compartimentazione raggiunge un gradino più elevato a livello di tessuti e organi. Il fegato dei mammiferi, per esempio, è il principale responsabile della sintesi di glucosio a partire da precursori non glucidici (gluconeogenesi; Paragrafo 16.4), in modo da mantenere nel circolo sanguigno un livello di glucosio relativamente costante; il tessuto adiposo è invece specializzato nel costruire riserve di triacilgliceroli. L’interdipendenza tra le funzioni metaboliche dei vari organi è l’argomento del Capitolo 22. Una prova molto interessante della specializzazione dei tessuti e dei compartimenti subcellulari è l’esistenza degli isozimi, enzimi che catalizzano la stessa reazione ma codificati da geni diversi, che presentano quindi proprietà cinetiche o regolatorie differenti. Per esempio, abbiamo visto che i mammiferi esprimono tre isoforme dell’enzima glicogeno fosforilasi nel muscolo, nel sistema nervoso centrale e nel fegato (Paragrafo 12.3B). Analogamente, nei vertebrati sono presenti due forme omologhe dell’enzima lattato dei-

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

479

drogenasi (LDH): il tipo M, predominante nei tessuti soggetti a condizioni anaerobiche, come il muscolo scheletrico e il fegato, e il tipo H, prevalente nei tessuti soggetti a condizioni aerobiche, come il muscolo cardiaco. La lattato deidrogenasi catalizza l’interconversione del piruvato, un prodotto della glicolisi, in lattato (Paragrafo 15.3A). L’isoenzima di tipo M sembra avere un ruolo principalmente nella riduzione del piruvato a lattato utilizzando NADH, mentre l’enzima di tipo H sembra più adatto a catalizzare la reazione inversa. L’esistenza degli isozimi permette di eseguire test diagnostici per alcune malattie. Per esempio, un attacco di cuore causa la morte delle cellule del muscolo cardiaco, che di conseguenza si rompono e rilasciano LDH di tipo H nel flusso sanguigno. Un esame del sangue che riveli la presenza di LDH di tipo H consente di diagnosticare un attacco di cuore.

D La termodinamica stabilisce la direzione e la capacità di regolazione delle vie metaboliche Il fatto di conoscere la localizzazione, i substrati e i prodotti di una via metabolica non rivela però come funziona la via nel quadro generale dei processi biochimici intercorrelati. È necessario anche valutare con quale velocità i prodotti finali sono generati e come la via è regolata in base alle richieste variabili della cellula. È possibile ottenere informazioni sui prodotti di una via metabolica e sulle sue possibili regolazioni dalla termodinamica di ciascun tappa catalizzata da un enzima. Ricordiamo dal Paragrafo 1.3D che la variazione di energia libera (∆G) di un processo biochimico, come nella reazione A + B 34 C + D

dipende dalla variazione di energia libera standard (∆G°′) e dalla concentrazione dei reagenti e dei prodotti (equazione 1.15): ⌬G

⌬G °⬘

RT ln

[C][D ] [A ][B ]

[14.1]

All’equilibrio ∆G = 0, e l’equazione diventa ∆G°′ = −RT ln Keq

[14.2]

Quindi il valore di ∆G°′ può essere calcolato dalla costante di Ð ESEMPIO DI CALCOLO 14.1 equilibrio e viceversa (vedi l’Esempio di calcolo 14.1). Utilizzando le informazioni fornite nella Tabella 14.3 (vedi sezione 14.2A), calcolate la costante di equilibrio per l’idrolisi Quando i reagenti sono presenti a concentrazioni vicine a del glucosio-1-fosfato a una temperatura di 37 °C. quelle dell’equilibrio, [C]eq[D]eq/[A]eq[B]eq ≈ Keq e ∆G ≈ 0. Questo è il caso di molte reazioni metaboliche, dette reazioIl ∆G°′ per la reazione ni vicine all’equilibrio. Poiché i loro valori di ∆G sono vicini a 0, è possibile invertire facilmente la direzione della reazioGlucosio-1-fosfato + H2O n glucosio + Pi ne, modificando il rapporto tra prodotti e reagenti. Quanè di −20,9 kJ ∙ mol−1. All’equilibrio, ∆G = 0 e l’equaziodo i reagenti sono in eccesso rispetto alle loro concentrazione 14.1 diventa ni all’equilibrio, la reazione netta procede in una direzione ∆G°′ = −RT ln K (reazione diretta), fino a quando l’eccesso dei reagenti non è che è l’equazione 14.2. Quindi, stato convertito in prodotti ed è stato raggiunto l’equilibrio. Viceversa, quando i prodotti sono in eccesso, la reazione netK = e−∆G°′/RT ta procede in direzione opposta (reazione inversa), in modo K = e−(−20 900 J ∙ mol )/(8,3145 J ∙ K ∙ mol ) (310 K) da convertire i prodotti in reagenti fino a quando non si ragK = 3,3 × 103 giunge di nuovo il rapporto delle concentrazioni tipico della reazione in equilibrio. Gli enzimi che catalizzano reazioni vicine all’equilibrio tendono ad agire velocemente per ripristinare le concentrazioni all’equilibrio, e le velocità nette di queste reazioni sono regolate in modo efficace dalle concentrazioni relative dei substrati e dei prodotti. −1

−1

−1

480

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

CONCETTI DI BASE Il principio di Le Châtelier Si ricordi dal Capitolo 1 che l’aggiunta o la rimozione di componenti da una reazione all’equilibrio fa sì che la reazione proceda in una direzione o nell’altra finché non viene raggiunto un nuovo equilibrio.

CONCETTI DI BASE Variazione di energia libera Si può pensare alla variazione di energia libera (∆G) di una reazione come a una spinta o a una forza che porta i reagenti verso l’equilibrio. Più è grande la variazione di energia libera, più la reazione è lontana dall’equilibrio e più forte è la tendenza della reazione a procedere. All’equilibrio, ovviamente, i reagenti e i prodotti non subiscono variazioni nette e ∆G = 0.

© 978-88-08-42096-1

Altre reazioni metaboliche hanno luogo in condizioni lontane dall’equilibrio: sono quindi reazioni irreversibili. Questo avviene perché un enzima che catalizza una reazione di questo tipo ha un’attività catalitica insufficiente per consentire alla reazione di raggiungere l’equilibrio (cioè la velocità della reazione catalizzata dall’enzima è troppo bassa) in condizioni fisiologiche. Si accumulano quindi reagenti in ampio eccesso rispetto alla loro concentrazione all’equilibrio, determinando un ∆G vr, il flusso è essenzialmente uguale alla velocità della reazione diretta (J ≈ vf ). Nella via metabolica completa il flusso è stabilito dalla reazione che determina la velocità della via. Per definizione, questa è la reazione più lenta di tutta la via e spesso si tratta della reazione in cui avviene il primo evento “di controllo” del percorso metabolico. In alcune vie il controllo del flusso è distribuito su vari enzimi, ciascuno dei quali contribuisce a determinare la velocità globale del flusso di metaboliti lungo la via. Poiché la reazione che determina la velocità totale della via metabolica è relativamente lenta rispetto alle altre reazioni della stessa via, il suo prodotto è rimosso dalle tappe seguenti della via, prima che possa raggiungere l’equilibrio con i reagenti. Quindi, la tappa che limita la velocità di una via metabolica funziona in una condizione lontana dall’equilibrio e possiede una elevata variazione negativa di energia libera. In modo simile, una diga crea una differenza nei livelli dell’acqua tra il suo lato a monte e quello a valle, determinando una notevole differenza negativa di energia libera a causa del dislivello di pressione idrostatica. La diga può rilasciare acqua per generare elettricità, variandone il flusso a seconda della necessità di energia elettrica. Le reazioni che funzionano in vicinanza dell’equilibrio rispondono rapidamente a cambiamenti di concentrazioni del substrato. Per esempio, se un aumento improvviso della concentrazione di un reagente avviene in una reazione vicina all’equilibrio, l’enzima che la catalizza potrebbe aumentare la velocità totale della reazione in modo da raggiungere rapidamente una nuova situazione di equilibrio. Quindi tutte le reazioni vicine all’equilibrio, in serie e collocate a valle della tappa che determina la velocità della via metabolica, hanno lo stesso flusso. Analogamente, anche il flusso dell’acqua di un fiume è lo stesso lungo tutti i punti del percorso a valle di una diga. Da un punto di vista pratico è spesso possibile individuare i punti di controllo del flusso in una via metabolica identificando le reazioni che hanno notevoli variazioni negative di energia libera. La relativa insensibilità delle velocità di queste reazioni non all’equilibrio nei confronti di variazioni nelle concentrazioni dei loro substrati permette che si stabilisca un flusso di metaboliti in stato stazionario nella via metabolica. Naturalmente, il flusso lungo una via deve variare in risposta alle necessità dell’organismo, in modo da raggiungere un nuovo stato stazionario. I cambiamenti di velocità nelle reazioni che determinano la velocità possono quindi modificare il flusso di materiale lungo l’intera via, spesso per valori pari a un ordine di grandezza o più. Le cellule usano vari meccanismi per controllare il flusso nelle tappe che determinano la velocità di una via metabolica. 1. Il controllo allosterico. Molti enzimi sono regolati in modo allosterico (Paragrafo 12.3A) da effettori che sono spesso substrati, prodotti o coenzimi della via, ma non necessariamente dell’enzima in oggetto. Per esempio, nella re-

481

CONCETTI DI BASE Lo stato stazionario Sebbene molte reazioni siano vicine all’equilibrio, un’intera via metabolica – e il metabolismo cellulare nel suo complesso – non raggiunge mai l’equilibrio. Questo perché i materiali e l’energia entrano ed escono continuamente dal sistema, che si trova in uno stato stazionario. Le vie metaboliche procedono, come se cercassero di raggiungere l’equilibrio (principio di Le Châtelier), ma non riescono mai a raggiungerlo, perché continuano ad arrivare nuovi reagenti, mentre i prodotti non si accumulano.

482

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

golazione retroattiva negativa, il prodotto di una via inibisce una delle prime tappe della via:

A

B

C

P

Quindi, come abbiamo visto, il CTP, un prodotto della biosintesi delle pirimidine, inibisce l’ATCasi, che catalizza la reazione che limita la velocità di questa via metabolica (Figura 12.11). 2. La modificazione covalente. Molti enzimi che controllano i flussi nelle vie metaboliche sono caratterizzati da specifici siti che possono essere fosforilati e defosforilati (Paragrafo 12.3B) tramite enzimi o essere modificati attraverso altri tipi di modificazioni covalenti. I processi di modificazione di tipo enzimatico, che sono a loro volta soggetti a controllo da parte di segnali esterni quali gli ormoni (Paragrafo 13.1), alterano notevolmente le attività degli enzimi modificati. Questo meccanismo di segnalazione coinvolto nel controllo del flusso è discusso nel Capitolo 13. 3. I cicli del substrato. Se vf e vr rappresentano la velocità di due reazioni opposte non all’equilibrio, catalizzate da enzimi diversi, esse possono essere modificate in modo indipendente. A

B

PUNTO DI VERIFICA

• Descrivete le differenze tra autotrofi ed eterotrofi.

r

Ä

• Utilizzate i termini obbligato, facoltativo, aerobico, anaerobico, autotrofo ed eterotrofo per descrivere il metabolismo degli esseri umani, delle querce, dell’E. coli e del Methanococcus jannaschii (un organismo che vive nei sedimenti anossici delle acque profonde).

• Elencate quali sono le categorie di macronutrienti e di micronutrienti necessari al metabolismo dei mammiferi e fornite un esempio di ciascuna categoria.

• Qual è la correlazione tra coenzimi e vitamine?

• Spiegate qual è il ruolo dell’ATP e del NADPH nelle reazioni anaboliche e cataboliche (degradative).

• Perché gli enzimi sono necessari per fare procedere le vie metaboliche?

• Perché tessuti differenti potrebbero esprimere diversi isozimi?

• In che modo sono correlate le variazioni di energia libera alle costanti di equilibrio?

• Spiegate qual è il significato metabolico delle reazioni che avvengono vicino all’equilibrio e qual è, invece, il significato di quelle che avvengono lontano dalle condizioni di equilibrio.

• Discutete i meccanismi tramite i quali possa essere controllato il flusso attraverso una via metabolica. Quali sono i meccanismi in grado di alterare rapidamente il flusso?

C

D

Per esempio, il flusso (vf – vr) può essere aumentato non soltanto incrementando la velocità della reazione diretta, ma anche rallentando quella della reazione inversa. Il flusso lungo questo ciclo del substrato, come vedremo nel Paragrafo 15.4, è più sensibile alle concentrazioni di effettori allosterici rispetto al flusso attraverso una singola reazione non all’equilibrio e non accoppiata a una reazione inversa. 4. Il controllo genetico. Le concentrazioni degli enzimi, e quindi le loro attività, possono essere modificate dalla sintesi proteica, in risposta alle necessità metaboliche. I processi della trascrizione di un gene in RNA messaggero e poi la traduzione dell’RNA in una catena polipeptidica forniscono numerosi punti di regolazione. I meccanismi di controllo genetico delle concentrazioni enzimatiche costituiscono l’argomento principale della Parte V di questo testo.

I meccanismi di regolazione da 1 a 3 rispondono rapidamente (nell’arco di secondi o minuti) agli stimoli esterni e sono quindi classificati come meccanismi di controllo “a breve termine”. Il meccanismo 4 risponde più lentamente ai cambiamenti di condizioni (nell’arco di ore o di giorni negli organismi superiori) ed è quindi considerato un meccanismo di controllo “a lungo termine”. Il controllo della maggior parte delle vie metaboliche richiede varie reazioni non all’equilibrio. Di conseguenza, il flusso di materiali attraverso una via che fornisce intermedi utili per un organismo può dipendere da numerosi effettori la cui importanza relativa riflette le richieste metaboliche globali dell’organismo in un dato momento. Una via metabolica è quindi parte di un processo di domanda-offerta.

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

483

2 I composti “ad alta energia” CONCETTI CHIAVE

• Gli organismi catturano l’energia libera rilasciata dalla degradazione delle sostanze nutrienti sotto forma di composti “ad alta energia” quali l’ATP, la cui demolizione viene utilizzata per alimentare le reazioni endoergoniche.

• L’“alta energia” dell’ATP è correlata all’ampia variazione negativa in energia libera dovuta all’idrolisi dei suoi gruppi fosfoanidridici.

• L’idrolisi dell’ATP può essere accoppiata a una reazione endoergonica in modo che la reazione complessiva sia favorevole.

• I gruppi fosforici vengono trasferiti dai composti a elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico a quelli che hanno bassi potenziali di trasferimento del gruppo fosforico.

• Il legame tioestere nell’acetil-Coa è un legame “ad alta energia”. La completa ossidazione di un combustibile metabolico come il glucosio C6H12O6 + 6 O2 n 6 CO2 + 6 H2O libera una notevole quantità di energia (∆G°′ = −2850 kJ ∙ mol−1). La completa ossidazione del palmitato, un acido grasso tipico, C16H32O2 + 23 O2 n 16 CO2 + 16 H2O è ancora più esoergonica (∆G°′ = −9781 kJ ∙ mol−1). Il metabolismo ossidativo procede a tappe, quindi l’energia liberata può essere accumulata in una forma utilizzabile in corrispondenza di ciascuna reazione esoergonica del processo totale. Questi “pacchetti” di energia sono conservati per la sintesi di pochi tipi di intermedi “ad alta energia”, la cui conseguente demolizione esoergonica fornisce l’energia necessaria per processi endoergonici. Questi intermedi costituiscono quindi una sorta di “moneta” con la quale le reazioni che producono energia libera, come l’ossidazione del glucosio o l’ossidazione degli acidi grassi, “pagano” i processi che consumano energia libera nei sistemi biologici (Scheda 14.2). La cellula usa varie forme di “moneta” energetica, tra cui i composti fosforilati come quelli del nucleotide ATP (la “moneta” energetica principale della cellula), composti contenenti legami tioestere, e coenzimi ridotti come il NADH. Ciascuno di questi rappresenta una fonte di energia libera che la cellula può usare in vari modi, tra i quali la stessa sintesi di ATP. Esamineremo in primo luogo l’ATP e in seguito le proprietà di altre forme di “moneta” energetica.

SCHEDA 14.2

CONCETTI DI BASE Trasformazione di energia L’energia non può essere creata né distrutta, ma può essere trasformata. Le reazioni metaboliche che avvengono nella cellula convertono una forma di energia in un’altra. Molto spesso è coinvolta l’energia dei legami chimici, ma le cellule possono avere a che fare anche con energia termica, energia luminosa, energia meccanica, energia elettrica, energia dei gradienti di concentrazione, e cosi via.

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Fritz Lipmann e i composti “ad alta energia” Fritz Albert Lipmann (1899-1986)

Tra i numerosi scienziati che fuggirono dall’Europa verso gli Stati Uniti negli anni ’30 vi era Fritz Lipmann, un fisico tedesco che in seguito diventò biochimico. Durante la prima parte del XX secolo gli scienziati si erano interessati prevalentemente alle strutture e alla composizione delle molecole biologiche: non si conosceva quasi nulla sulla loro biosintesi. Il contributo di Lipmann a questo campo ha riguardato soprattutto la comprensione dei fosfati “ad alta energia” e degli altri composti “attivi”. Lipmann iniziò la sua carriera di ricercatore studiando la fosfocreatina, un composto che può fornire energia alla contrazione muscolare. Come altri suoi contemporanei, Lipmann era molto incuriosito dall’assenza di un legame evidente tra i composti fosforilati e l’attività metabolica conosciuta di un muscolo in fase di contrazione che

trasforma il glucosio in lattato. Un primo collegamento era stato scoperto da Otto Warburg (Scheda 15.1), che aveva dimostrato che uno dei passaggi della glicolisi era accompagnato dall’incorporazione di fosfato inorganico. Il composto acilico risultante (1,3-bisfosfoglicerato) poteva reagire con ADP formando ATP. Lipmann si chiese se altri composti fosforilati si comportassero nello stesso modo. Poiché la purificazione di questi composti labili (cioè facilmente degradabili) da cellule intere era difficilmente realizzabile, Lipmann li sintetizzò egli stesso, dimostrando che gli estratti cellulari usavano acetil fosfato sintetico per produrre ATP. Lipmann proseguì i suoi studi, avanzando l’ipotesi che le cellule contenessero due classi di composti fosforilati, che denominò “poveri di energia” e “ricchi di energia”: con questi termini intendeva composti con bassa e alta energia libera negativa di idrolisi (e scelse il simbolo ∼, usato ancora oggi, per indicare un legame “ricco di energia”). Lipmann descrisse una sorta di “corrente di fosfato” nella quale la fotosintesi ^ (segue)

484

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

SCHEDA 14.2 LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA (continua)

carbonio a un’altra molecola (acetilazione) richiedeva acetato, ATP e un fattore stabile al calore presente negli estratti di fegato di piccione che usava come sistema sperimentale. Lo scienziato isolò questo fattore e ne determinò la struttura; lo chiamò coenzima A. Per questa scoperta fondamentale Lipmann ricevette nel 1953 il premio Nobel per la Medicina e la Fisiologia. Anche quando comparvero sullo scenario biochimico i tioesteri “ad alta energia” (come l’acetil-CoA), Lipmann rimase fedele alla sua ipotesi riguardante i fosfati “ad alta energia”. Per esempio, si rese conto che il carbamil fosfato (H2N−COO−P32−) poteva funzionare come donatore di un gruppo carbamilico “attivo” nelle reazioni biosintetiche. Egli inoltre contribuì all’identificazione di composti poco conosciuti, le anidridi miste tra fosfato e solfato, come i solfati “attivi” che funzionano come donatori di gruppi solfato.

o la demolizione delle molecole nutritive produceva fosfati “ricchi di energia” che portano alla sintesi di ATP. L’ATP, a sua volta, può fornire energia per eseguire lavoro meccanico, come quello della contrazione muscolare, oppure fare avanzare reazioni biosintetiche. Fino a quel momento (1941), i biochimici che studiavano i processi biosintetici dovevano limitarsi a lavorare con animali o frammenti di tessuti relativamente intatti. Le intuizioni di Lipmann nei confronti del ruolo dell’ATP liberarono i ricercatori dall’uso di sistemi sperimentali faticosi, costosi e i cui risultati erano scarsamente riproducibili: i biochimici potevano semplicemente aggiungere ATP alle loro preparazioni sperimentali acellulari per ricostruire in laboratorio il processo biosintetico. Lipmann fu inoltre molto incuriosito dalla scoperta che un gruppo a due atomi di carbonio, che chiamò “acetato attivo”, funzionava come precursore per la sintesi degli acidi grassi e degli steroidi. Si trattava dello stesso composto chiamato “acetil fosfato”? In realtà non lo era, sebbene Lipmann fosse riuscito a dimostrare che l’aggiunta di una unità a due atomi di

Kleinkauf, H., von Döhren, H. e Jaenicke, L., (a cura di). (1988). The Roots of Modern Biochemistry. Fritz Lipmann’s Squiggle and its Consequences, Walter de Gruyter.

A L’ATP ha un elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico L’intermedio “ad alta energia” adenosina trifosfato (ATP; Figura 14.5) è presente in tutte le forme di vita conosciute. L’ATP è costituito da una unità di adenosina (adenina + ribosio) alla quale sono legati in modo sequenziale tre gruppi fosforici (−PO2− 3 ) tramite un legame fosfoestere seguito da due legami fosfoanidridici. L’importanza biologica dell’ATP risiede nella grande quantità di energia libera che accompagna la scissione dei suoi legami fosfoanidridici. Questo processo avviene quando un gruppo fosforico è trasferito a un altro composto, liberando ADP, oppure quando è trasferito un gruppo nucleotidico (AMP), liberando pirofosfato (P2O4− 7 ; PPi). Quando l’accettore è l’acqua, il processo è detto idrolisi:

ATP + H2O 34 ADP + Pi ATP + H2O 34 AMP + PPi La maggior parte delle reazioni biologiche di trasferimento di un gruppo richiede accettori diversi dall’acqua. Tuttavia la conoscenza dell’energia libera di idrolisi

NH2

legame fosfoestere

–O Figura 14.5 Struttura dell’ATP che

illustra i suoi rapporti con ADP, AMP e adenosina. I gruppi fosforici, iniziando dall’AMP, sono indicati rispettivamente come fosfato α, β e γ. Si noti la differenza tra legami fosfoestere e legami fosfoanidridici. Descrivete i prodotti di idrolisi di ciascuno dei legami indicati.

P



O

O

P



O

O

P

N

N

legami fosfoanidridici O– O– O–

N

N O

CH2 O

O

H H HO

H H OH

Adenosina AMP ADP ATP

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

485

Introduzione al metabolismo

di alcuni composti fosforici permette di calcolare l’energia libera di trasferimento dei gruppi fosforici agli altri accettori determinando la differenza in energia libera di idrolisi tra il gruppo fosforico donatore e quello accettore. I valori di ∆G°′ di idrolisi di alcuni composti fosforilati di grande importanza biologica sono riportati nella Tabella 14.3. La negatività di questi valori è un indice del loro elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico; essi quantificano la tendenza dei composti fosforilati a trasferire i loro gruppi fosforici all’acqua. Si noti che l’ATP ha un potenziale di trasferimento del gruppo fosforico di valore intermedio. In condizioni standard, i composti che nella Tabella 14.3 si trovano in posizione superiore all’ATP possono trasferire spontaneamente un gruppo fosforico all’ADP per formare ATP, che a sua volta può trasferire spontaneamente un gruppo fosforico ad altri gruppi per formare i composti che nella tabella si trovano in posizione sottostante all’ATP. Si noti inoltre che una variazione favorevole di energia libera per una data reazione non indica quanto rapidamente la reazione avvenga. Nonostante i loro elevati potenziali di trasferimento di gruppi fosforici, l’ATP e i composti fosforici correlati sono stabili da un punto di vista cinetico e non reagiscono in modo significativo se non interviene un apposito enzima.

TABELLA 14.3 Energie libere

I legami la cui idrolisi avviene con valori di ∆G °′ molto negativi (di solito inferiori a −25 kJ ∙ mol−1) sono detti legami “ad alta energia”, o legami “ricchi di energia”, e sono spesso indicati con il simbolo (∼). L’ATP può quindi essere rappresentato come AR−P∼P∼P, dove A, R e P simbolizzano rispettivamente i gruppi adenilico, ribosilico e fosforico. Tuttavia, in base alle caratteristiche elettroniche, il legame fosfoestere che unisce il gruppo adenosilico al gruppo fosforico α dell’ATP non sembra tanto diverso dai cosiddetti legami “ad alta energia” che uniscono tra loro i gruppi fosforici α e β e i due gruppi fosforici β e γ. Nessuno di questi legami presenta infatti proprietà particolari, per cui il termine “legame ad alta energia” è in un certo senso improprio: in ogni caso non deve essere confuso con il termine “energia di legame”, definita come l’energia necessaria per rompere (non per idrolizzare) un legame covalente. E allora perché le reazioni di trasferimento del gruppo fosforico dell’ATP sono tanto esoergoniche? A quanto pare le caratteristiche di legame “ad alta energia” dei legami fosfoanidridici, come quelli dell’ATP, sono dovute ad alcuni particolari fattori (Figura 14.6).

Fonte: la maggior parte dei dati proviene da Jencks, W.P. (1976). In Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, a cura di G.D. Fasman, 3a ed. CRC Press, Physical and Chemical Data, Vol. I, pp. 296-304.

Qual è la natura dell’“energia” nei composti “ad alta energia”?

1. La stabilità di risonanza del legame fosfoanidridico è minore di quella dei suoi prodotti di idrolisi. Questo avviene perché i due gruppi fortemente elettronegativi della fosfoanidride devono competere per il doppietto elettronico non condiviso dell’atomo di ossigeno che fa da ponte tra i due gruppi fosforici, mentre questa competizione è assente nei prodotti di idrolisi. In altre parole, le necessità elettroniche dei gruppi fosforici sono meno soddisfatte nel legame fosfoanidridico che nei suoi prodotti di idrolisi. 2. Maggiore importanza ha probabilmente l’effetto destabilizzante causato dalla repulsione elettrostatica tra i gruppi chimicamente carichi di una fosfoanidride rispetto a quelli dei suoi prodotti di idrolisi. All’interno di valori fisiologici di pH, la molecola dell’ATP ha da tre a quattro cariche negative, le cui reciproche repulsioni elettrostatiche sono parzialmente mitigate dall’idrolisi dell’ATP. 3. Un altro fattore destabilizzante di difficile valutazione è la minore energia di solvatazione di una fosfoanidride rispetto a quella dei suoi prodotti di idrolisi. Secondo alcune stime, questo fattore fornirebbe la forza termodinamica di maggiore rilevanza per l’idrolisi delle fosfoanidridi. Naturalmente, per qualsiasi reazione, compreso il trasferimento di un gruppo fosforico da un composto “ad alta energia”, la variazione di energia libera dipende in parte dalla concentrazione dei reagenti e dei prodotti (equazione 14.1). Inol-

standard di idrolisi del gruppo fosforico in alcuni composti di interesse biologico ∆G°′ (kJ · mol−1)

Composto Fosfoenolpiruvato

–61,9

1,3-Bisfosfoglicerato ATP (n AMP + PPi)

–49,4 –45,6

Acetil fosfato

–43,1

Fosfocreatina ATP (n ADP + Pi)

–43,1 –30,5

Glucosio-1-fosfato

–20,9

PPi

–19,2

Fruttosio-6-fosfato

–13,8

Glucosio-6-fosfato

–13,8

Glicerolo-3-fosfato

–9,2

O O

P –O

o

.. O .. o

O P

O

O– H2O

O O

P

.. O ..

H

+

H

–O

.. O ..

O P

O

O–

Figura 14.6 Risonanza e

stabilizzazione elettrostatica in una fosfoanidride e nei suoi prodotti di idrolisi. La competizione tra le forme di risonanza (frecce curve che partono dall’O centrale) e le repulsioni carica– carica (linea rossa a zig zag) tra i gruppi fosforici diminuiscono la stabilità del legame fosfoanidridico rispetto ai suoi prodotti di idrolisi.

486

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

SCHEDA 14.3

© 978-88-08-42096-1

LE PROSPETTIVE DELLA BIOCHIMICA

ATP e DG

Le condizioni standard che si riflettono nel valore di ∆G°′ non si verificano mai negli organismi viventi. Altri composti presenti in elevate concentrazioni e in grado di interagire potenzialmente con i substrati e i prodotti di una reazione metabolica possono influenzare in modo determinante i valori di ∆G. Nelle cellule, per esempio, gli ioni Mg2+ neutralizzano parzialmente le cariche negative presenti sui gruppi fosforici dell’ATP e dei suoi prodotti di idrolisi, diminuendo quindi la repulsione elettrostatica che rende l’idrolisi dell’ATP un processo fortemente esoergonico. In modo simile, i cambiamenti nei valori di pH modificano il carattere ionico dei composti fosforilati, modificando quindi anche la loro energia libera. In una data cellula la concentrazione di molti ioni, coenzimi e metaboliti varia, spesso anche di alcuni ordini di grandezza, in funzione sia della localizzazione sia del tempo. Le concentrazioni intracellulari di ATP sono mantenute entro una gamma piuttosto ristretta, di solito tra 2 e 10 mM, ma le concentrazioni di ADP e di Pi variano maggiormente. Considerate una tipica cellula con [ATP] = 3,0 mM, [ADP] = 0,8 mM e [Pi] = 4,0 mM. Utilizzando l’equazione

14.1, l’effettiva energia libera di idrolisi dell’ATP a 37 °C è calcolata come segue: ⌬G

⌬G°⬘

RT ln

30,5 kJ ? mol ln

(0,8

10

[ADP ][P i ] [ATP] 1 3

(3,0 30,5 kJ ? mol 1 48,1 kJ ? mol 1

(8,3145 J ? K M)(4,0

10

3

1

? mol 1)(310 K)

M)

3

10 M) 17,6 kJ ? mol

1

Questo valore è ancora più alto di quello dell’energia libera standard di idrolisi dell’ATP. Tuttavia, a causa delle difficoltà di misurare con accuratezza concentrazioni di particolari specie chimiche all’interno di una cellula o di un organello, per la maggior parte delle reazioni in vivo i valori di ∆G sono poco più che stime approssimative. Per motivi di coerenza, in questo testo useremo quasi sempre i valori di ∆G°′.

tre, poiché l’ATP e i suoi prodotti di idrolisi sono ioni, il ∆G dipende anche dal pH e dalla forza ionica (Scheda 14.3).

B Reazioni accoppiate guidano i processi endoergonici Le reazioni esoergoniche dei composti “ad alta energia” possono essere accoppiate a processi endoergonici, per indurne il completamento. La spiegazione termodinamica che rende conto dell’accoppiamento di un processo esoergonico con uno endoergonico è basata sulla possibilità di sommare l’energia libera di processi accoppiati. Consideriamo la seguente via a due tappe:

(1) A + B 34 C + D (2) D + E 34 F + G

CONCETTI DI BASE Risonanza Il termine risonanza si riferisce alla delocalizzazione degli elettroni in una struttura chimica. I composti sono stabilizzati per risonanza, che può essere valutata grosso modo in base al numero di modi differenti in cui si può disegnare la struttura.

∆G1 ∆G2

Se ∆G1 ≥ 0, la reazione 1 non potrà avvenire spontaneamente, ma se ∆G2 è tanto esoergonico che ∆G1 + ∆G2 < 0, allora, anche se nella reazione 1 la concentrazione di D all’equilibrio sarà molto piccola, essa sarà in ogni caso maggiore di quella della reazione 2. Poiché la reazione 2 trasforma D nei prodotti, la reazione 1 agirà in modo diretto per ripristinare la concentrazione all’equilibrio di D. La reazione 2, fortemente esoergonica, “guida” quindi (o meglio “trascina”) la reazione 1, endoergonica: si dice che le due reazioni sono accoppiate tramite il loro intermedio comune D. È possibile dedurre che le due reazioni accoppiate procedono spontaneamente sommando le reazioni 1 e 2 per ottenere la reazione totale dove ∆G3 = ∆G1 + ∆G2 < 0. Finché è esoergonica, la via metabolica totale sarà spostata verso destra, in direzione della reazione diretta.

(1 + 2) A + B + E 34 C + F + G

∆G3

Per illustrare questo concetto consideriamo due esempi di reazioni con trasferimento del gruppo fosforico. La tappa iniziale nel metabolismo del glucosio è la sua conversione in glucosio-6-fosfato (Paragrafo 15.2A). La reazione diretta del glucosio con il Pi è tuttavia termodinamicamente sfavorevole (∆G°′ = + 13,8 kJ∙ mol−1; Figura 14.7a). Nelle cellule, tuttavia, questa reazione è accoppiata alla scissione esoergonica dell’ATP (per l’idrolisi dell’ATP, ∆G°′= −30,5 kJ ∙ mol−1), quindi la reazione totale è termodinamicamente fa-

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

G°9 (kJ · mol–1)

(a) Semireazione endoergonica 1

Pi

Semireazione esoergonica 2

ATP

+

H2O

ADP

+

Pi

–30,5

Reazione totale accoppiata

ATP

+

glucosio

ADP

+

glucosio-6-P

–16,7

+

glucosio

glucosio-6-P

+

H2O

+13,8

G°9 (kJ · mol–1)

(b) Semireazione esoergonica 1

487

COO– CH2

O

+

C

H2O

CH3

C

COO–

+

Pi

– 61,9

OPO32– Fosfoenolpiruvato Semireazione endoergonica 2 Reazione totale accoppiata

ADP

Piruvato

+

Pi

ATP

COO– CH2

H2O

+30,5

O

+

C

+

ADP

CH3

C

COO–

+

ATP

–31,4

OPO32–

vorevole (∆G°′ = +13,8 −30,5 = −16,7 kJ ∙ mol−1). L’ATP può essere ripristinato in modo simile (∆G°′= +30,5 kJ ∙ mol−1), accoppiando la sua sintesi a partire da ADP e Pi alla scissione ancora più esoergonica del fosfoenolpiruvato (∆G°′ = −61,9 kJ ∙ mol−1; Figura 14.7b e Paragrafo 15.2J). È da notare che in realtà le semireazioni mostrate nella Figura 14.7 non avvengono nel sito attivo di un enzima così come sono scritte. L’enzima esochinasi, durante la formazione del glucosio-6-fosfato (Figura 14.7a), non catalizza l’idrolisi di ATP, ma il trasferimento di un gruppo fosforico dall’ATP direttamente al glucosio. Allo stesso modo la piruvato chinasi, l’enzima che catalizza la reazione mostrata nella Figura 14.7b, non aggiunge un gruppo fosforico libero all’ADP, ma trasferisce un gruppo fosforico dal fosfoenolpiruvato all’ADP, formando ATP. L’idrolisi dei legami fosfoanidridici guida alcuni processi biochimici. L’energia

libera dei legami fosfoanidridici presenti nei composti “ad alta energia” come l’ATP può essere impiegata per fare avvenire reazioni anche quando i gruppi fosforici non sono trasferiti a un altro composto organico. Per esempio, l’idrolisi dell’ATP (cioè il trasferimento del gruppo fosforico direttamente all’H2O) fornisce l’energia libera necessaria per il funzionamento degli chaperoni molecolari (Paragrafo 6.5B), per la contrazione muscolare (Paragrafo 7.2B) e per il trasporto attivo attraverso la membrana (Paragrafo 10.3). In questi processi le proteine subiscono modificazioni conformazionali in risposta al legame dell’ATP. L’idrolisi esoergonica dell’ATP e il rilascio di ADP e Pi rende irreversibili questi cambiamenti conformazionali, determinando quindi l’avanzamento del processo di reazione. L’idrolisi del GTP funziona allo stesso modo per guidare alcune reazioni dei processi di trasduzione del segnale (Paragrafo 13.3B) e di sintesi proteica (Paragrafo 27.4). In assenza di un enzima appropriato, i legami fosfoanidridici sono stabili, cioè si idrolizzano molto lentamente, nonostante la grande quantità di energia libera che essi conservano e rilasciano. Questo è dovuto al fatto che le reazioni di idrolisi sono caratterizzate da valori insolitamente alti di energia libera di

Figura 14.7 Alcune reazioni

accoppiate che richiedono ATP. (a) Fosforilazione del glucosio con la formazione di glucosio-6-fosfato e ADP. (b) Fosforilazione dell’ADP partendo da fosfoenolpiruvato per formare ATP e piruvato. Ogni reazione è stata idealmente divisa in una tappa di fosforilazione (semireazione 1) e in una tappa di idrolisi dell’ATP (semireazione 2). Entrambe le semireazioni procedono nella direzione che rende esoergonica la reazione totale (∆G < 0). In teoria, il trasferimento di un gruppo fosforico dal fosfoenolpiruvato al glucosio sarebbe spontaneo? E il trasferimento di un gruppo fosforico dal glucosio-6-fosfato al piruvato sarebbe spontaneo?

CAPITOLO 14

488

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

attivazione (∆G‡; Paragrafo 11.2). Di conseguenza, l’idrolisi dell’ATP è favorita da un punto di vista termodinamico ma sfavorita da un punto di vista cinetico. Per esempio, consideriamo la reazione del glucosio con l’ATP che forma glucosio-6-fosfato (Figura 14.7a). Il ∆G‡ per il trasferimento non enzimatico di un gruppo fosforico dall’ATP al glucosio è maggiore di quello per l’idrolisi dell’ATP, quindi la reazione di idrolisi predomina (anche se nessuna delle due reazioni avviene a una velocità significativa dal punto di vista biologico). Tuttavia, in presenza dell’enzima esochinasi (Paragrafo 15.2A) il glucosio-6-fosfato si forma molto più velocemente di quanto l’ATP sia idrolizzato. Questo avviene perché l’attività catalitica dell’enzima riduce l’energia di attivazione per il trasferimento del gruppo fosforico dall’ATP al glucosio a un valore inferiore rispetto a quello dell’energia di attivazione necessaria per l’idrolisi dell’ATP. Questo esempio sottolinea il fatto che anche una reazione favorita dal punto di vista termodinamico (∆G < 0) può non avvenire in un sistema vivente se non è disponibile un enzima specifico in grado di catalizzare la reazione (cioè di abbassare il valore di ∆G‡ per aumentare la velocità di formazione dei prodotti; Scheda 12.2). La pirofosfatasi inorganica catalizza l’ulteriore scissione dei legami fosfoanidridici. Anche se molte reazioni che richiedono ATP producono ADP e Pi (scis-

Figura 14.8 Scissione pirofosforica

nella sintesi di un amminoacil-tRNA. (1) Nella prima tappa della reazione l’amminoacido è adenilato dall’ATP. (2) Nella seconda tappa una molecola di tRNA sostituisce l’unità di AMP, formando un amminoacil-tRNA. (3) L’idrolisi esoergonica del pirofosfato (∆G°’ = –19,2 kJ ∙ mol−1) guida la reazione in avanti. Scrivete la reazione complessiva di questo processo.

sione ortofosforica), altre producono AMP e PPi (scissione pirofosforica). In questi ultimi casi il PPi viene rapidamente idrolizzato a 2Pi dalla pirofosfatasi inorganica (∆G°′= −19,2 kJ ∙ mol−1), in modo che la scissione pirofosforica dell’ATP consumi in ultima istanza due legami fosfoanidridici “ad alta energia”. Un esempio di questo tipo di reazione è l’unione degli amminoacidi alle molecole di tRNA per la sintesi proteica (Figura 14.8 e Paragrafo 27.2B). Le due tappe di questa reazione sono facilmente reversibili perché l’energia libera di idrolisi dei legami che si formano è simile a quella dell’idrolisi dell’ATP. La reazione totale è portata a completamento dall’idrolisi irreversibile del PPi. Anche la biosintesi degli acidi nucleici a partire dai nucleosidi trifosfato rilascia PPi (Paragrafi 25.1 e 26.1). Le variazioni standard di energia libera di queste reazioni sono intorno a 0, quindi una successiva idrolisi di PPi è essenziale anche per la sintesi degli acidi nucleici.

C Altri composti fosforilati hanno elevati potenziali di trasferimento del gruppo fosforico Oltre all’ATP, altri composti “ad alta energia” sono indispensabili per il metabolismo energetico, anche perché aiutano a mantenere un livello relativamente costante di ATP all’interno delle cellule. L’ATP è continuamente idrolizzato e rigenerato. In effetti alcune prove sperimentali indicano che l’emivita metabolica di una molecola di ATP varia da secondi a minuti, in base al tRNA AMP

H R

C

C

NH3+

O–

Amminoacido

O

H

O

+

AMP , P , P

1

R

C ,AMP

C

+

NH3

P ,P PPi

pirofosfatasi inorganica

3 H2O

R

O

C

C

tRNA

NH + 3

Amminoacil-adenilato

ATP

2

H

2Pi

Amminoacil-tRNA

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

ΔG⬘ di idrolisi (kJ ? mol–1)

tipo di cellula e alla sua attività metabolica. Per esempio, le cellule cerebrali hanno una “scorta” di ATP sufficiente solo per pochi secondi (e questo spiega in parte il rapido deterioramento del tessuto cerebrale in condizioni di carenza di ossigeno). Una persona, in condizioni di riposo, consuma e rigenera ATP a una velocità di circa 3 mol (1,5 kg) all’ora e circa dieci volte di più durante un’attività faticosa. Proprio come l’ATP favorisce le reazioni endoergoniche trami–60 te il processo esoergonico del trasferimento del gruppo fosforico e dell’idrolisi del legame fosfoanidridico, l’ATP può essere rigenerato accoppiando la sua formazione a un processo metabolico maggiormente –50 esoergonico. Come indica la Tabella 14.3, nella gerarchia termodinamica degli agenti in grado di trasferire gruppi fosforici l’ATP occupa –40 una posizione intermedia. L’ATP può quindi essere formato a partire dall’ADP tramite il trasferimento diretto di un gruppo fosforico –30 da un composto “ad alta energia” (per esempio, il fosfoenolpiruvato; Figura 14.7b e Paragrafo 15.2J). Questa reazione è nota con il nome di fosforilazione a livello del substrato. Altri meccanismi produco–20 no ATP in modo indiretto, utilizzando l’energia fornita da gradienti di concentrazione protonica transmembrana. Nel metabolismo –10 ossidativo questo processo è detto fosforilazione ossidativa (Paragrafo 18.3), mentre nella fotosintesi è chiamato fotofosforilazione (Paragrafo 19.2D). 0 Il flusso di energia dai composti fosforilati “ad alta energia” verso l’ATP e dall’ATP verso i composti fosforilati “a bassa energia” è riassunto nella Figura 14.9. Queste reazioni sono catalizzate da enzimi detti chinasi, che trasferiscono i gruppi fosforici dall’ATP ad altri composti o da composti fosforilati all’ADP. Questi processi saranno ripresi in esame nella trattazione del metabolismo dei carboidrati nei Capitoli 15 e 16. I composti che presentano potenziali di trasferimento di gruppi fosforici più elevati di quelli dell’ATP risultano ancora più stabili. Per esempio, l’idrolisi degli acil fosfati (anidridi miste fosforico-carbossiliche), come l’acetil fosfato e l’1,3-bisfosfoglicerato, O CH3

C,

OPO23–

–2

O3POCH2

OH

O

CH

C,

OPO23–

1,3-Bisfosfoglicerato

Acetil fosfato

è guidata dalla stessa risonanza competitiva e dagli effetti di solvatazione differenziale che influenzano l’idrolisi delle fosfoanidridi (Figura 14.6). Questi effetti sono maggiormente pronunciati negli acil fosfati che nelle fosfoanidridi, come indica la Tabella 14.3. Al contrario, composti come il glucosio-6-fosfato e il glicerolo-3-fosfato, CH2OPO23– H HO

H

O

OH

H

H

OH

H OH

a-D-Glucosio-6-fosfato

CH2OH HO

C

H

CH2OPO23– L-Glicerolo-3-fosfato

che nella Tabella 14.3 si trovano al di sotto dell’ATP, non hanno alcuna significativa differenza di stabilizzazione per risonanza o di separazione di carica rispetto ai loro prodotti di idrolisi. Le loro energie libere di idrolisi sono molto inferiori a quelle dei composti “ad alta energia” che li precedono. Gli elevati potenziali di trasferimento del gruppo fosforico delle fosfoguanidine, come la fosfocreatina e la fosfoarginina, sono prevalentemente dovuti

489

Fosfoenolpiruvato 1,3-Bisfosfoglicerato ~P ~P

Fosfocreatina

~P Composti fosforilati “ad alta energia” ATP

P P

Composti fosforilati “a bassa energia” Glucosio-6-fosfato Glicerolo-3-fosfato

Figura 14.9 Posizione dell’ATP

rispetto a composti fosforilati “ad alta energia” e “a bassa energia”. I gruppi fosforici passano da donatori “ad alta energia”, mediante il sistema ATP-ADP, ad accettori “a bassa energia”.

490

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

alla risonanza competitiva del gruppo guanidinico, che è ancora più elevata di quella del gruppo fosforico delle fosfoanidridi: + H2N

o

o

O

C

NH O

P

N

X

O–

O–

R R = CH2

CO–2 ; X = CH3

Fosfocreatina

CO–2 ; X = H

Fosfoarginina

NH+3 R = CH2

CH2

CH2

CH

Di conseguenza, la fosfocreatina può trasferire il suo gruppo fosforico all’ADP e formare ATP. La fosfocreatina rappresenta una riserva “ad alta energia” per la formazione di ATP. Le cellule muscolari e nervose, che hanno un elevato ricambio di ATP, di-

pendono dalle fosfoguanidine per rigenerare rapidamente l’ATP. Nei vertebrati la fosfocreatina è sintetizzata per fosforilazione reversibile della creatina da parte dell’ATP, catalizzata dalla creatina chinasi:

ATP creatina 34 fosfocreatina + ADP ∆G°9= + 12,6 kJ ∙ mol−1

Si noti che in condizioni standard questa reazione è endoergonica: tuttavia le concentrazioni intracellulari dei suoi reagenti e dei suoi prodotti sono tali che la reazione agisce in una condizione vicina all’equilibrio (∆G ≈ 0). Di conseguenza, quando la cellula è in condizione di riposo e la concentrazione di ATP ([ATP]) è relativamente alta, la reazione procede verso la sintesi netta di fosfocreatina, mentre quando vi è un’intensa attività metabolica e la [ATP] è bassa, l’equilibrio si sposta in modo da ottenere una sintesi netta di ATP a partire da fosfocreatina e ADP. La fosfocreatina quindi agisce come un “tampone” dell’ATP nelle cellule che contengono la creatina chinasi. Un muscolo scheletrico di vertebrato in condizioni di riposo ha una quantità di fosfocreatina sufficiente a soddisfare le richieste di energia libera per pochi minuti (ma solo per pochi secondi se è in condizioni di massimo sforzo). Nei muscoli di alcuni invertebrati, come gli astici, la stessa funzione è svolta dalla fosfoarginina. Queste fosfoguanidine sono dette fosfageni. I nucleosidi trifosfato si possono interconvertire liberamente. Molti

processi biosintetici, come la sintesi delle proteine e degli acidi nucleici, richiedono nucleosidi trifosfato diversi dall’ATP. Per esempio, la sintesi dell’RNA necessita, oltre che di ATP, dei ribonucleotidi CTP, GTP e UTP, mentre la sintesi del DNA richiede dCTP, dGTP, dTTP e dATP (Paragrafo 3.1). Tutti questi nucleosidi trifosfato (NTP) sono sintetizzati dall’ATP e dal corrispondente nucleoside difosfato (NDP) in una reazione catalizzata dall’enzima non specifico nucleoside difosfato chinasi:

ATP + NDP 34 ADP + NTP

I valori di ∆G °′ per queste reazioni sono vicini a 0, come ci si aspetterebbe dalle somiglianze di struttura tra i vari NTP. Queste reazioni sono indotte dalla carenza di NTP causata dal loro utilizzo esoergonico in reazioni successive. Altre chinasi trasformano in modo reversibile i nucleosidi monofosfato nelle rispettive forme difosfato, a spese dell’ATP. Una di queste reazioni di trasferimento del gruppo fosforico è catalizzata dall’adenilato chinasi: AMP + ATP 34 2 ADP

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Questo enzima è presente in tutti i tessuti e serve per mantenere in equilibrio le concentrazioni dei tre nucleotidi. Quando si accumula AMP, questo viene convertito in ADP, che può essere utilizzato per sintetizzare ATP mediante la fosforilazione a livello di substrato, la fosforilazione ossidativa o la fotofosforilazione. La reazione inversa aiuta a ristabilire i livelli cellulari di ATP, poiché il rapido consumo di ATP provoca un aumento nei livelli di ADP. La struttura ai raggi X dell’adenilato chinasi, determinata da Georg Schulz, rivela che, nella reazione catalizzata da questo enzima, due domini di circa 30 residui amminoacidici dell’enzima si richiudono intorno ai substrati (Figura 14.10), legandoli quindi saldamente e impedendo all’acqua di entrare nel sito attivo (l’ingresso dell’acqua indurrebbe l’idrolisi del gruppo fosforico e non il suo trasferimento). Il movimento di uno di questi due domini dipende dalla presenza di quattro residui la cui carica non si modifica. Sembra che le interazioni tra questi gruppi e il substrato legato all’enzima inneschino riordinamenti nelle vicinanze del sito che lega il substrato (Figura 14.10b). Una volta terminata la reazione dell’adenilato chinasi, il prodotto saldamente legato deve essere rapidamente rilasciato, in modo da mantenere l’efficienza catalitica dell’enzima. Tuttavia, poiché nella reazione la variazione di energia libera è vicina allo zero (il numero netto di legami fosfoanidridici rimane invariato), è necessaria un’altra fonte di energia libera perché avvenga il rilascio immediato del prodotto. Il confronto tra le strutture ai raggi X dell’adenilato chinasi priva del ligando e dell’adenilato chinasi unita a un composto artificiale, Ap5A, che imita i due substrati (AMP e ATP uniti da un quinto gruppo fosforico), mostra come l’enzima riesca a evitare la “trappola cinetica” di un legame troppo saldo tra substrati e prodotti: nel momento in cui lega il substrato, una regione della proteina lontana dal sito attivo aumenta la mobilità della sua catena, consumando parte dell’energia libera prodotta dal legame del substrato. Questa regione si “risolidifica” quando il sito di legame per il substrato si apre e i prodotti sono rilasciati. Si ritiene che questo meccanismo agisca come un “contrappeso energetico”, aiutando l’adenilato chinasi a mantenere elevata la sua velocità di reazione.

(b)

(a)

491

Figura 14.10 Modificazioni conformazionali nell’adenilato chinasi di E. coli indotte dal legame con il substrato. (a) L’enzima privo del ligando (substrato). (b) L’enzima legato all’analogo del doppio substrato; Ap5A. Ap5A è rappresentato sotto forma di bastoncini con C in verde, N in blu, O in rosso e P in giallo. I domini della proteina colorati in azzurro e in blu subiscono notevoli modificazioni conformazionali in seguito al legame con il substrato, mentre il resto della proteina (in porpora), il cui orientamento è lo stesso in (a) e (b), mantiene in gran parte la sua conformazione. [Basata su una struttura ai raggi X di Georg Schulz, Institut für Organische Chemie und Biochemie, Friburgo, Germania. PDBid (a) 4AKE e (b) 1AKE].

492

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

D I tioesteri sono composti ad alta energia L’ubiquità dei composti fosforilati nel metabolismo è coerente con la loro precoce comparsa nel corso dell’evoluzione. Tuttavia il fosfato è (ed era) scarsamente presente nel mondo abiotico: questo induce a ritenere che altri tipi di molecole fossero usati come composti ricchi di energia prima che nelle vie metaboliche cominciassero a essere utilizzati i composti fosforilati. Un probabile candidato a composto primitivo “ad alta energia” è il tioestere: a suo favore depone il fatto che si tratta di un componente delle principali vie metaboliche di tutti gli organismi conosciuti. È interessante notare che il legame tioestere è coinvolto nella fosforilazione a livello di substrato, un processo che genera ATP indipendente dalla fosforilazione ossidativa e che probabilmente si è originato prima di questo processo. Il legame tioestere compare nelle attuali vie metaboliche come intermedio di reazione (coinvolgendo un residuo di Cys nel sito attivo di un enzima) e sotto forma di acetil-CoA (Figura 14.11), il prodotto comune del catabolismo di carboidrati, acidi grassi e amminoacidi. Il coenzima A (CoASH, o CoA) è costituito da un gruppo β-mercaptoetilamminico legato con un legame amidico alla vitamina acido pantotenico che, a sua volta, è attaccata a una unità 3′-fosfoadenosinica mediante un ponte pirofosforico. Il gruppo acetilico dell’acetil-CoA è legato come tioestere alla parte sulfidrilica della β-mercaptoetilammina. Il CoA agisce quindi come trasportatore di gruppi acetilici e di altri gruppi acilici (la lettera A in CoA sta per “acetilazione”). I tioesteri sono presenti anche sotto forma di catene aciliche legate a un residuo di fosfopanteteina, unito a sua volta al grup-

Gruppo acetilico O S, C Residuo di -mercaptoetilammina

CH3

CH2 CH2 NH C

O

CH2

Adenosina-39fosfato

CH2 NH Residuo di acido pantotenico

NH2

C

O

HO

C

H

H3C

C

CH3

O

O

P

CH2

N

N

O–

O O

P

N

N O

CH2

O–

H

O

H OH

P

O–

H –O

O

H

O Acetil-coenzima A (acetil-CoA) Figura 14.11 Struttura chimica dell’acetil-CoA. Il legame tioestere è stato indicato con il simbolo ~, per evidenziare il fatto che si tratta di un legame “ad alta energia”. Nel CoA il gruppo acetilico è sostituito dall’idrogeno.

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

po OH di una serina di una proteina (Paragrafo 20.4C), invece che all’AMP, come nel CoA. L’acetil-CoA è un composto “ad alta energia”. Il ∆G°′ per l’idrolisi del suo legame tioestere è di −31,5 kJ ∙ mol−1, valore che rende la reazione leggermente più esoergonica (1 kJ ∙ mol−1) dell’idrolisi dell’ATP. L’idrolisi dei tioesteri è più esoergonica di quella dei normali esteri perché il tioestere è meno stabilizzato dalla risonanza. Questa destabilizzazione è causata dall’elevato raggio atomico di S, che riduce la sovrapposizione elettronica tra C e S, rispetto a quella tra C e O. La formazione di un legame tioestere in un intermedio metabolico conserva una parte dell’energia libera ricavata dall’ossidazione di un carburante metabolico. Questa energia libera può essere utilizzata per promuovere un processo esoergonico. Nel ciclo dell’acido citrico, per esempio, la rottura di un tioestere (succinil-CoA) rilascia una quantità di energia sufficiente per sintetizzare GTP a partire da GDP e Pi (Paragrafo 17.3E).

Introduzione al metabolismo

493

PUNTO DI VERIFICA

• Che tipo di molecole vengono utilizzate dalle cellule come moneta di scambio energetico?

• Perché l’ATP è un composto ad “alta energia”?

• Descrivete come un processo esoergonico può favorire un processo endoergonico.

• Perché l’attività della pirofosfatasi inorganica è metabolicamente indispensabile?

• Spiegate in che modo l’ATP cellulare viene rifornito dai fosfageni.

• Quali sono i ruoli della nucleoside difosfato chinasi e dell’adenilato chinasi?

• Perché il legame tioestere è un legame ad “alta energia”?

3 Le reazioni di ossidoriduzione CONCETTI CHIAVE

• I trasportatori di elettroni NAD+ e FAD accettano elettroni dai metaboliti ridotti e li trasferiscono ad altri composti.

• L’equazione di Nernst descrive la termodinamica delle reazioni di ossidoriduzione. • Il potenziale di riduzione rappresenta la tendenza che ha un composto ossidato ad accettare elettroni (a ridursi). La variazione del potenziale di riduzione di una reazione rappresenta la tendenza di un dato composto ossidato ad accettare elettroni da un dato composto ridotto.

• L’energia libera e il potenziale di riduzione sono inversamente proporzionali: più è elevato il potenziale di riduzione, più negativa è l’energia libera e più favorevole è la reazione.

Quando i carburanti metabolici sono ossidati a CO2, gli elettroni sono trasferiti a trasportatori molecolari che, negli organismi aerobici, li trasferiscono infine all’ossigeno molecolare. Il processo di trasporto degli elettroni determina la formazione di un gradiente di concentrazione protonica transmembrana che guida la sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa; Paragrafo 18.3). Persino gli anaerobi obbligati, che non effettuano la fosforilazione ossidativa, si affidano all’ossidazione di substrati per indurre la sintesi di ATP. In effetti le reazioni di ossidazione-riduzione (dette anche reazioni redox) forniscono agli esseri viventi la maggior parte dell’energia libera di cui hanno bisogno. In questo paragrafo esamineremo le basi termodinamiche della conservazione dell’energia libera durante l’ossidazione dei substrati.

A

NAD+

e FAD sono trasportatori di elettroni

I due più comuni trasportatori di elettroni sono i coenzimi nucleotidici nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+) e flavina adenina dinucleotide (FAD). La porzione nicotinamidica del NAD+ (e del suo analogo fosforilato NADP+; Figura 11.4) è il sito in cui avviene la riduzione reversibiH O le, la quale si verifica sotto forma di trasferimento di uno − ione idruro (H ; un protone con due elettroni), come inC dicato nella Figura 14.12. L’accettore terminale degli eletNH2 troni negli organismi aerobici, l’O2, può ricevere soltan+ to elettroni non appaiati (dato che ciascuno dei suoi due N orbitali molecolari a minor energia disponibili è già occuR pato da un elettrone): gli elettroni devono cioè essere traNAD+ sferiti all’O2 uno alla volta. Gli elettroni che sono rimossi

Figura 14.12 Riduzione del NAD+

a NADH. R rappresenta la porzione ribosio-pirofosforil-adenosina del coenzima. Solo l’anello nicotinamidico è interessato alla riduzione, rappresentata nella figura come trasferimento di uno ione idruro.

H

H

O C

+

NH2

H: N R NADH

CAPITOLO 14

494

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Figura 14.13 Flavina adenina dinucleotide (FAD). L’adenosina (in rosso) è legata alla riboflavina (in nero) tramite un gruppo pirofosforico (in verde). La parte riboflavinica del FAD è nota anche come vitamina B2.

NH2 N

N Riboflavina O CH2

Individuate la base, il ribosio e i gruppi fosforici di questo nucleotide. Ribitolo

P

O

HO

C

H

HO

C

H

HO

C

H

O O

O–

P O–

OCH2 O H

N

H3C

N

H

H

H OH OH

Adenosina

CH2 H3C

N

N

N

O NH

O FAD R H3C

8a 8

7a 7

H3C

9

6

9a 5a

N

10 5

N 10a

1

4a 4

N

O 2 3

N

H

O Flavina adenina dinucleotide (FAD) (forma ossidata o chinonica) H• R H3C

N

H3C

N

N

O N



H

O

H

FADH (forma radicalica o semichinonica) H•

H3C H3C

R

H

N

N

H

B L’equazione di Nernst descrive l’energetica delle reazioni di ossidoriduzione O N

N

dai metaboliti in coppie (per esempio, i due elettroni necessari per la riduzione del NAD+) devono essere trasferiti ad altri trasportatori che possono andare incontro a reazioni redox in cui sono coinvolti due elettroni, ma anche un singolo elettrone. Uno di questi coenzimi è il FAD (Figura 14.13). Il sistema ad anelli coniugati del FAD può accettare uno o due elettroni, producendo un radicale stabile (semichinone) FADH·, o la forma totalmente ridotta (idrochinone) FADH2 (Figura 14.14). Il cambiamento dello stato elettronico del sistema ad anelli indotto dalla riduzione è evidenziato dal riquadro e dagli atomi in colore verde (nel FADH2). Le funzioni metaboliche del NAD+ e del FAD richiedono che la loro riduzione sia reversibile, in modo da poter accettare elettroni, passarli ad altri trasportatori e infine venire rigenerati per partecipare ad altri cicli di ossidazione e di riduzione. Gli esseri umani non sono in grado di sintetizzare la componente flavinica del FAD: devono quindi introdurla con la dieta, per esempio sotto forma di riboflavina (vitamina B2; Figura 14.13). La carenza di riboflavina è tuttavia piuttosto rara nell’uomo, in parte a causa del forte legame tra i gruppi prostetici flavinici e i loro apoenzimi. I sintomi della carenza di riboflavina, generalmente associati a malnutrizione o a diete squilibrate, comprendono infiammazioni della lingua, lesioni ai lati della bocca e dermatiti.

H

O

FADH2 (forma ridotta o idrochinonica) Figura 14.14 Riduzione del FAD

a FADH2. R rappresenta la parte ribitolo-pirofosforil-adenosina del coenzima. Il sistema ad anelli coniugati del FAD subisce due riduzioni sequenziali a un elettrone per volta, oppure un trasferimento di due elettroni che permette di “saltare” lo stato semichinonico.

Le reazioni di ossidazione-riduzione somigliano ad altri tipi di reazioni che trasferiscono gruppi, tranne per il fatto che i “gruppi” trasferiti sono elettroni, che vengono trasferiti da un donatore di elettroni (agente riducente, o riducente) a un accettore di elettroni (agente ossidante, o ossidante). Per esempio, nella reazione

Fe3+ + Cu+ 34 Fe2+ + Cu2+ Cu+, il riducente, è ossidato a Cu2+, mentre Fe3+, l’ossidante, è ridotto a Fe2+. Le reazioni redox possono essere suddivise in due semireazioni, come Fe3+ + e− 34 Fe2+ (riduzione) Cu+ 34 Cu2+ + e− (ossidazione) la cui somma è la reazione totale precedente. Queste particolari semireazioni avvengono durante l’ossidazione della citocromo c ossidasi nel mitocondrio (Paragrafo 18.2F). Si noti che, affinché sia possibile il trasferimento degli elettroni,

CAPITOLO 14

495

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Figura 14.15 Una cella elettrochimica. La semicella che subisce l’ossidazione (in questo caso Cu+ n Cu2+ + e−) trasferisce gli elettroni liberati attraverso il filo metallico alla semicella che subisce la riduzione (in questo caso e− + Fe3+ n Fe2+). La condizione di neutralità elettrica delle due semicelle viene mantenuta dal trasferimento di ioni attraverso il ponte salino, che contiene un elettrolita.

e– Voltmetro Ponte salino

Pt

le due semireazioni devono avvenire simultaneamente. Gli elettroni sono in realtà l’intermedio comune delle due semireazioni. Una semireazione è costituita da un donatore di e– + Fe3+ Fe2+ elettroni e dall’accettore di elettroni a esso coniugato; nella semireazione ossidativa precedentemente riportata, Cu+ è il donatore di elettroni e Cu2+ è l’accettore coniugato. I due composti costituiscono insieme una coppia ossidoriduttiva, o coppia redox coniugata, analoga alla coppia coniugata acido-base (HA e A−; Paragrafo 2.2B). Un’importante differenza tra le coppie redox e le coppie acido-base è il fatto che le due semireazioni di una reazione redox, ognuna costituita da una coppia redox coniugata, possono essere fisicamente separate in modo da formare una cella elettrochimica (Figura 14.15). In questo tipo di apparecchio ciascuna delle due semireazioni avviene in una semicella separata, e gli elettroni passano da una semicella all’altra sotto forma di corrente elettrica lungo il filo metallico che collega i due elettrodi. Per completare il circuito elettrico è necessario allestire un ponte salino che fornisca una via per la migrazione degli ioni, mantenendo così la neutralità elettrica. È particolarmente semplice determinare l’energia libera di una reazione di ossidazione-riduzione, poiché basta misurare la differenza di potenziale che si stabilisce tra le due semicelle. Considerate la reazione generale Anoss+ + Brid 34 Arid + Bnoss+ in cui n elettroni per mole di reagenti sono trasferiti dal riducente (Brid) all’ossidante (Anoss+). L’energia libera di questa reazione è espressa da

⌬G

⌬G°⬘

RT ln

[Arid ][Bnoss ] [Anoss ][Brid ]

[14.4]

In condizioni reversibili, ∆G = −w′ = −wel

[14.5]

dove w′ è il lavoro a pressione e volume costanti. In questo caso w′ è equivalente a wel, il lavoro elettrico richiesto per trasferire n moli di elettroni attraverso una differenza di potenziale elettrico, ∆ℰ [dove l’unità di misura di ℰ è il volt (V), il numero di joule (J) di lavoro necessario per trasferire 1 coulomb (C) di carica]. Secondo le leggi dell’elettrostatica si ha

wel = n∆ℰ

[14.6]

dove , il faraday o costante di Faraday, è la carica elettrica di 1 mol di elettroni (1  = 96 485 C ∙ V−1 ∙ mol−1 = 96 485 J ∙ V−1 ∙ mol−1), e n è il numero di moli di elettroni trasferite per ogni mole di reagente che si trasforma. Così, sostituendo l’equazione 14.6 nell’equazione 14.5, si ottiene: ∆G = −n∆ℰ

[14.7]

Combinando le equazioni 14.4 e 14.7 e operando analoghe sostituzioni per ∆G°, si ottiene l’equazione di Nernst: DᏱ

DᏱ°

[Arid ][Bnoss ] RT ln nᏲ [Anoss ][Brid ]

e–

[14.8]

Pt

Cu+

Cu2+ + e–

CONCETTI DI BASE Reazioni di ossidoriduzione Perché una sostanza si riduca (acquisti elettroni), un’altra sostanza deve ossidarsi (perdere elettroni). In altre parole, ogni reazione di ossidoriduzione deve avere un accettore e un donatore di elettroni sia tra i reagenti, sia tra i prodotti. Nelle reazioni di ossidoriduzione, gli elettroni rimangono associati alle molecole; gli elettroni liberi non possono fluttuare dentro la cellula.

496

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

formulata per la prima volta nel 1881 da Walther Nernst. In questa equazione ℰ è il potenziale di riduzione, la tendenza di una sostanza a subire una riduzione (acquistare elettroni). ∆ℰ, la forza elettromotrice (emf), può essere descritta come la “pressione di elettroni” esercitata da una cella elettrochimica. Il valore ℰ°, che indica il potenziale di riduzione quando tutti i componenti sono nelle condizioni standard, è detto potenziale di riduzione standard. Se le condizioni standard si riferiscono a condizioni standard biochimiche (Paragrafo 1.3D), allora ℰ° è sostituito da ℰ°′. È interessante notare che, per valori di ∆ℰ positivi, nell’equazione 14.7 si hanno valori di ∆G negativi. In altre parole, un valore positivo di ∆ ℰ indica una reazione spontanea, che è in grado di compiere un lavoro chimico.

C La spontaneità di una reazione può essere determinata dalle differenze dei potenziali di riduzione L’equazione 14.7 mostra che la variazione di energia libera di una reazione redox può essere determinata misurando direttamente la sua variazione di potenziale di riduzione con un voltmetro (Figura 14.15). Queste misurazioni rendono possibile la determinazione dell’ordine di trasferimento spontaneo degli elettroni fra una serie di trasportatori di elettroni come quelli che effettuano la fosforilazione ossidativa nelle cellule. Qualsiasi reazione redox può essere divisa nelle due semireazioni che la compongono:

Anoss+ + n e− 34 Arid Bnoss+ + n e− 34 Brid dove, per convenzione, entrambe le semireazioni sono scritte in forma di riduzione. A ciascuna di queste semireazioni è possibile assegnare un potenziale di riduzione standard, rispettivamente ℰA e ℰB, e in base all’equazione di Nernst si ha: [Arid ] RT [14.9] ln ᏱA Ᏹ°⬘ A nᏲ [Anoss ]

[Brid ] RT [14.10] ln nᏲ [Bnoss ] Considerando la reazione redox complessiva che comprende le due semireazioni, la differenza di potenziale di riduzione, ∆ ℰ°′, è definita come ᏱB

Ᏹ°⬘ B

∆ ℰ°′ = ∆ ℰ°′(accettore di e–) – ∆ ℰ°′(donatore di e–)

[14.11]

Così, quando la reazione procede con A come accettore di elettroni e B come donatore di elettroni, ∆ ℰ°′ = ℰA°′ − ℰ°′, B e ∆ ℰ = ℰA − ℰB. I potenziali di riduzione standard sono usati per confrontare le affinità per gli elettroni. I potenziali di riduzione, come i valori di energia libera, devono esse-

re definiti in rapporto a standard di riferimento arbitrari, in questo caso la semireazione dell’idrogeno

2 H+ + 2 e− 34 H2 (g) nella quale H+ è in equilibrio con H2 (g) e in contatto con un elettrodo di Pt. A questa semicella è stato assegnato arbitrariamente un potenziale di riduzione standard ℰ° di 0 V (1 V = 1 J ∙ C−1) a pH 0, 25 °C e a 1 atm. Per convenzione biochimica, lo stato standard ha un valore di pH pari a 7,0 e la semireazione dell’idrogeno ha un potenziale di riduzione standard ℰ°′ di −0,421 V. Quando ∆ ℰ è positivo, ∆G è negativo (equazione 14.7), quindi il processo avviene spontaneamente. Combinando due semireazioni, in condizioni stan-

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

dard, la direzione spontanea della reazione richiede che avvenga la riduzione della coppia redox ad opera di un potenziale di riduzione standard maggiormente positivo. In altre parole, più è positivo il potenziale di riduzione standard, maggiore è l’affinità per gli elettroni della forma ossidata della coppia redox, cioè maggiore è la tendenza della forma ossidata ad accettare elettroni e quindi a ridursi. Le semireazioni biochimiche sono fisiologicamente importanti. La Tabella 14.4

elenca i potenziali di riduzione standard biochimici (ℰ°′) di alcune semireazioni biologicamente importanti. La forma ossidata di una coppia redox con un potenziale di riduzione standard largamente positivo è caratterizzata da un’elevata affinità per gli elettroni ed è un forte accettore di elettroni (agente ossidante), mentre il riducente coniugato è un debole donatore di elettroni (agente riducente). Per esempio, l’O2 è il più forte agente ossidante tra quelli riportati nella Tabella 14.4, mentre H2O, che mantiene saldamente legati i propri elettroni, è l’agente riducente più debole tra quelli elencati. Il contrario vale nel caso delle semireazioni con potenziali di riduzione standard fortemente negativi.

TABELLA 14.4 Potenziali di riduzione standard di alcune semireazioni

importanti da un punto di vista biochimico ℰ°′ (V)

Semireazione 1 2

+



O2 + 2 H + 2 e 34 H2O −

NO

+

+ 2 H + 2 e 34

3

−0,815

NO− 2



+ H2O



−0,42

Citocromo a3 (Fe ) + e 34 citocromo a3 (Fe )

−0,385

O2 + 2 H+ + 2 e− 34 H2O2

−0,295

3+

2+

Citocromo a (Fe3+) + e− 34 citocromo a (Fe2+) −

Citocromo c (Fe ) + e 34 citocromo c (Fe ) 3+

2+



Citocromo c1 (Fe ) + e 34 citocromo c1 (Fe ) 3+

2+



Citocromo b (Fe ) + e 34 citocromo b (Fe ) (mitocondriale) 3+

2+

+



−0,29 −0,235 −0,22 −0,077

Ubichinone + 2 H + 2 e 34 ubichinolo

−0,045

Fumarato− + 2 H+ + 2 e− 34 succinato−

−0,031

+



FAD + 2 H + 2 e 34 FADH2 (nelle flavoproteine) −

+





Ossalacetato + 2 H + 2 e 34 malato −

Piruvato + 2

H+

+2

e−

+

34

lattato−



Acetaldeide + 2 H + 2 e 34 etanolo +

e−

FAD + 2 H + 2

34 FADH2 (coenzima libero)

S + 2 H+ + 2 e− 34 H2S +

Acido lipoico + 2 H + 2 +

+

34 acido diidrolipoico



NADP +

H+

+2

e−

Acetoacetato + 2

H+

+2 −

H+

Acetato + 3

+2

H+

−0,197 −0,219 −0,29

34 NADPH

−0,320

+

−0,340



+2

e−

34

SO32−+

34

β-idrossibutirrato−

H+ + e− 34 21 H2 SO42−

−0,185

−0,315

Cistina disolfuro + 2 H + 2 e 34 2 cisteina −

−0,166

−0,23

e−

NAD + H + 2 e 34 NADH +

−0,040

−0,346 −0,421

e−

+2

e−

H2O

34 acetaldeide + H2O

−0,515 −0,581

Fonte: prevalentemente da Loach, P.A. (1976). In Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, a cura di G.D. Fasman, 3a ed. CRC Press, Physical and Chemical Data, Vol. I, pp. 123-130. Gli elettroni si muovono più facilmente dall’ubichinone all’acetaldeide o dall’etanolo all’ubichinone?

497

498

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Poiché si spostano spontaneamente da bassi ad alti potenziali di riduzione, in condizioni standard gli elettroni sono trasferiti dai prodotti ridotti di qualsiasi semireazione della Tabella 14.4 ai reagenti ossidati di qualsiasi semireazione soprastante (vedi l’Esempio di calcolo 14.2). Tuttavia questa reazione può avvenire a una velocità talmente bassa da non essere misurabile in assenza di un appropriato enzima. Si noti che gli ioni Fe3+ dei vari citocromi elencati nella Tabella 14.4 hanno potenziali di riduzione significativamente diversi. Questo indica che la componente proteica degli enzimi redox ha un ruolo attivo nelle reazioni di trasferimento degli elettroni, regolando i potenziali di riduzione dei centri redox legati a essa. Le reazioni di trasferimento degli elettroni hanno una grande importanza biologica. Per esempio, nella catena di trasporto degli elettroni (Paragrafo 18.2) gli elettroni sono trasferiti dal NADH a una serie di accettori con potenziali di riduzione crescenti (compreso il FAD e altri tra quelli elencati nella Tabella 14.4) fino all’O2. L’ATP è prodotto a partire da ADP e Pi tramite l’accoppiamento di questa cascata di energia libera con la sintesi del nucleotide. Il NADH agisce quindi come un coenzima di trasferimento degli elettroni ad alta energia. Infatti l’ossidazione di una molecola di NADH a NAD+ fornisce una quantità di energia libera sufficiente a sintetizzare tre molecole di ATP. Il NAD+ è un accettore di elettroni in molte ossidazioni esoergoniche di metaboliti. Comportandosi come donatore di elettroni nella sintesi di ATP, questo coenzima riveste un ruolo ciclico come trasportatore di energia libera, in modo analogo a quanto avviene con l’ATP (Figura 14.9). Ð ESEMPIO DI CALCOLO 14.2

Calcolate il ∆G°′ per l’ossidazione del NADH da parte del FAD. Combinando le opportune semireazioni si ottiene NADH + FAD + H+ 34 NAD+ + FADH2

Calcolate poi la forza elettromotrice (∆ℰ°′) in base ai potenziali standard di riduzione dati nella Tabella 14,4, usando uno dei seguenti metodi. Metodo 1 Secondo l’equazione 14.11, ∆ℰ°′ = ℰ°′(accettore di e–) − ℰ°′(donatore di e–) Poiché il FAD (ℰ°′ = −0,219 V) è l’accettore di elettroni, e il NADH (ℰ°′ = −0,315 V) è il donatore di elettroni, ∆ℰ°′ = (−0,219 V) − (−0,315 V) = +0,096 V

PUNTO DI VERIFICA

• Quali sono i ruoli metabolici del NAD+ e del FAD?

• Spiegate perché il NADH e il FADH2 sono un tipo di moneta di scambio energetico intracellulare.

• Spiegate i termini dell’equazione di Nernst.

• Quando due semireazioni si combinano, come è possibile prevedere quale composto verrà ossidato e quale invece verrà ridotto?

• In che modo il ∆ℰ è correlato al ∆G?

Metodo 2 Scrivete la reazione netta come somma delle due appropriate semireazioni. Per il FAD, la semireazione è la stessa riduttiva della Tabella 14.4, e il suo valore ℰ°′ è −0,219 V. Per il NADH, che subisce un’ossidazione e non una riduzione, la semireazione è l’inverso di quella data nella Tabella 14.4, e il suo valore ℰ°′ è +0,315 V, l’inverso del potenziale di riduzione dato nella tabella. Le due semireazioni sono sommate per ottenere la reazione totale di ossidoriduzione, e anche i valori di ℰ°′ si sommano:

FAD 2 H 2 e n FADH2 NADH n NAD H 2e NADH FAD H n NADH

FADH2

%°⬘ %°⬘ ⌬%°⬘

0,219 V 0,315 V 0,096 V

Usate poi l’equazione 14.7 per calcolare ∆G°′. Poiché due moli di elettroni sono trasferite per ogni mole di NADH ossidato a NAD+, n = 2.

⌬G °⬘ ⌬G°⬘

nᏲ⌬Ᏹ°⬘ (2)(96 485 J ? V

1

? mol

1

)(0,096 V)

18,5 kJ ? mol

1

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

4 I metodi sperimentali di studio del metabolismo CONCETTI CHIAVE

• Le vie metaboliche vengono spesso studiate seguendo il destino dei metaboliti marcati con radionuclidi o con isotopi identificabili mediante NMR.

• Le tappe di una via metabolica possono essere identificate esaminando in che modo gli inibitori metabolici e/o i difetti genetici portano all’accumulo di intermedi delle vie stesse.

• Per determinare l’espressione genetica di enzimi metabolici si utilizzano le tecniche del DNA microarray e della proteomica.

• L’attività metabolica di una cellula determina il suo metaboloma. Una via metabolica può essere esaminata a vari livelli. 1. In base alla sequenza di reazioni attraverso le quali uno specifico nutriente è convertito nei prodotti finali e al bilancio energetico di queste conversioni. 2. In base ai meccanismi mediante i quali ciascun intermedio è convertito nel metabolita che segue. Per questo tipo di analisi è necessario isolare e caratterizzare gli enzimi specifici che catalizzano ciascuna reazione. 3. In base ai meccanismi di controllo che regolano il flusso dei metaboliti lungo la via. Questi meccanismi comprendono le correlazioni tra i vari organi che regolano l’attività metabolica in funzione delle necessità dell’intero organismo.

Fornire chiarimenti di una via metabolica a tutti questi livelli è un processo complesso, che richiede il contributo di varie discipline. Le principali vie metaboliche sono note a grandi linee da alcune decine di anni, anche se in molti casi i meccanismi enzimatici di alcune tappe delle vie restano oscuri. Non sono inoltre ancora interamente conosciuti i meccanismi di regolazione dell’attività di una via metabolica nelle diverse condizioni fisiologiche. Queste aree di ricerca sono di grande interesse perché possono fornire informazioni utili per il miglioramento della salute dell’uomo e per curare le malattie dovute a disfunzioni metaboliche. La comprensione delle alterazioni metaboliche che avvengono nel cancro costituisce un’area di ricerca particolarmente attiva. Inoltre, i metabolismi dei microrganismi promettono risultati molto interessanti per la produzione di nuovi materiali biologici e processi enzimatici utili per ottenere materiali industriali, cibo e farmaci in modo non dannoso per l’ambiente. I primi studi metabolici utilizzavano organismi interi: spesso lieviti, ma anche mammiferi. Per esempio, nel 1921 Frederick Banting e Charles Best individuarono il ruolo del pancreas nel diabete, asportando chirurgicamente l’organo dai cani e osservando che gli animali operati sviluppavano la malattia (Scheda 22.2). Da allora le tecniche per studiare i processi metabolici sono diventate più raffinate: da preparazioni provenienti dall’organo intero e dal trattamento di sottili fettine di tessuto si è giunti a utilizzare cellule in coltura e organelli isolati. Gli approcci più recenti si basano sull’identificazione dei geni, dei loro prodotti proteici e dei metaboliti che si formano come risultato delle loro attività.

A I metaboliti marcati possono essere usati come traccianti Una via metabolica nella quale un composto è convertito in un altro può essere seguita tramite la marcatura specifica di un metabolita. Franz Knoop mise a punto questa tecnica nel 1904 per studiare l’ossidazione degli acidi grassi. Egli nutrì alcuni cani con acidi grassi marcati chimicamente con gruppi fenilici e isolò dalle loro urine i prodotti finali contenenti i gruppi fenilici. Dalle differenze riscontrate nei prodotti, che cambiavano a seconda se l’acido grasso di partenza

Introduzione al metabolismo

499

500

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

TABELLA 14.5 Alcuni marcatori fluorescenti usati in biochimica

Massimo di eccitazione (nm)a

Massimo di emissione (nm)

Amminocumarina

350

455

Fluoresceina

495

519

Cy3

550

570

Ficoeritrina

565

578

Texas Red (sulforodamina)

589

615

Cy5

650

670

Fluoroforo

a

Un fluoroforo (gruppo fluorescente), viene eccitato assorbendo una lunghezza d’onda della luce ed emette luce di una lunghezza d’onda maggiore (a minore energia).

marcato con il gruppo fenilico conteneva un numero di atomi di carbonio pari o dispari, Knoop dedusse che gli acidi grassi erano degradati in unità costituite da due atomi di carbonio (Paragrafo 20.2). I biochimici moderni usano un approccio simile, introducendo spesso composti marcati con un gruppo fluorescente che può essere seguito all’interno del campione del tessuto o anche in una singola cellula (Tabella 14.5). La marcatura chimica ha però lo svantaggio che le proprietà TABELLA 14.6 Alcuni isotopi radioattivi chimiche dei metaboliti marcati sono diverse da quelle dei meutilizzati negli studi biochimici taboliti normali: questo problema è stato risolto marcando le Emivita Tipo molecole con isotopi. È possibile identificare il destino di un me(tempo di di radiazione tabolita che ha un atomo marcato con un isotopo seguendo il suo Radionuclide dimezzamento) emessaa avanzamento lungo la via metabolica di interesse. L’avvento del3H 12,31 anni β le tecniche di marcatura isotopica negli anni ’40 ha rivoluzio14C nato lo studio del metabolismo. La Tabella 14.6 riporta alcuni 5715 anni β degli isotopi radioattivi (radionuclidi) più comunemente uti18 + F 110 minuti β lizzati negli studi biochimici, insieme alle loro emivite e al ti22Na 2,60 anni β+, γ po di radioattività emessa per decadimento spontaneo del loro 32 P 14,28 giorni β nucleo atomico. I composti radioattivi possono essere identi35S ficati sfruttando la loro capacità di impressionare una lastra fo87,2 giorni β tografica. In alternativa, si può misurare la luce emessa da un 45 Ca 162,7 giorni β composto fluorescente quando questo è eccitato dalle particel60 Co 5,271 anni β, γ le β e dai raggi γ emessi dal radioisotopo. 125 I 59,4 giorni γ Uno dei primi progressi verso la comprensione del metabo131 I 8,02 giorni β, γ lismo, derivato dall’uso di traccianti isotopici, è avvenuto nel 1945 con la dimostrazione di David Shemin e David Rittena Le particelle β sono elettroni, le particelle β+ sono berg che gli atomi di azoto del gruppo eme (Figura 7.2) deripositroni, i raggi γ sono fotoni. Fonte: Holden, N.E. (2009-2010) Handbook of Chemistry vano dalla glicina e non dall’ammoniaca, dall’acido glutamand Physics (90a ed.), in Lide, D.R. (a cura di), da pp. mico, dalla prolina o dalla leucina (Paragrafo 21.6A). I due ri11-57 a 266, CRC Press. cercatori lo hanno dimostrato somministrando ad alcuni ratti sostanze nutrienti marcate con 15N, isolando il gruppo eme dal loro sangue e analizzando il suo contenuto di 15N. Soltanto quando ai ratti veniva somministrata [15N]glicina il gruppo eme conteneva 15N. Questa tecnica è stata usata anche per dimostrare che tutti gli atomi di carbonio del colesterolo derivano dall’acetil-CoA, sfruttando in questo caso l’isotopo radioattivo 14C (Paragrafo 20.7A). Gli isotopi radioattivi sono diventati quasi indispensabili per stabilire le origini di metaboliti complessi. Anche le tecniche di scansione dell’intero corpo, usate spesso per individuare i siti di crescita tumorale, usano dei composti radioattivi, come il 2-deossi-2-[18F]-fluoro-d-glucosio, che vengono assimilati dalle cellule. Un altro metodo per determinare il destino dei metaboliti marcati usa la risonanza magnetica nucleare (NMR), che evidenzia specifici isotopi, tra cui 1H, 13C, 15N e 31P, sfruttando i loro caratteristici spin nucleari. Poiché lo spettro

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Glucosio e glicogeno

(a)

C2–C5 C

C6

C

Figura 14.16 Conversione di [1-13C] glucosio in glicogeno osservata in vivo mediante analisi locale NMR con 13C. (a) Spettro NMR del 13C che evidenzia l’abbondanza naturale dell’isotopo nel fegato di un ratto vivo. Si noti la risonanza corrispondente al C1 del glicogeno. (b) Spettro NMR del 13C del fegato dello stesso ratto, circa 5 minuti dopo iniezione intravenosa di 100 mg di [1-13C]glucosio (arricchito al 90%). Le risonanze dell’atomo C1 in entrambi gli anomeri α e β del glucosio sono chiaramente distinguibili l’una dall’altra e dalla risonanza del C1 del glicogeno. (c) Spettro NMR del 13C del fegato dello stesso ratto, circa 30 minuti dopo iniezione di [1-13C]glucosio. Le risonanze del C1 di entrambi gli anomeri α e β del glucosio sono molto ridotte, mentre la risonanza del C1 del glicogeno risulta aumentata. [Da Reo, N.V., Siegfried, B.A. e Acherman, J.J.H. (1984). J. Biol. Chem. 259, 13665.]

CH2

Colina N(CH3)3

C1 Glicogeno

RCOOR⬘

C1–β (b)

C1–α

Glucosio

(c)

180

120

ppm

60

501

0

NMR di un particolare nucleo si modifica al variare dell’ambiente immediatamente circostante, è possibile identificare i picchi corrispondenti a specifici atomi anche in miscele relativamente complesse. Lo sviluppo di magneti abbastanza grandi da adattarsi a esseri umani e ad animali e in grado di localizzare gli spettri in organi specifici ha consentito di studiare le vie metaboliche in modo non invasivo tramite NMR. Per esempio, l’NMR effettuata con 31P può essere utile per studiare il metabolismo energetico del muscolo, misurando con precisione i livelli di composti fosforilati come ATP, ADP e fosfocreatina. La marcatura isotopica con 13C (presente in natura solo per l’1,10%) di specifici atomi di alcuni metaboliti consente di seguire il procedere metabolico degli atomi marcati analizzando lo spettro del 13C con NMR. La Figura 14.16 illustra lo spettro NMR in vivo del 13C in un fegato di ratto, prima e dopo l’iniezione di d-[1-13C]glucosio. È possibile vedere il 13C entrare nel fegato e in seguito essere incorporato nel glicogeno (la forma di riserva del glucosio; Paragrafo 16.2).

B Lo studio delle vie metaboliche spesso prevede l’uso di agenti perturbanti

Molte tecniche usate per identificare gli intermedi e gli enzimi coinvolti nelle vie metaboliche si basano sull’utilizzo di sistemi di perturbazione della via metabolica, osservando come questo intervento esterno influenza l’attività delle varie reazioni nel loro complesso. Uno dei modi per perturbare una via è quello di aggiungere specifiche sostanze, gli inibitori metabolici, che bloccano la via a livello di una delle reazioni, causando quindi un accumulo degli intermedi che precedono il punto di blocco. Questo metodo sperimentale è stato usato per chiarire il meccanismo di conversione del glucosio in etanolo da parte della glicolisi nel lievito (Paragrafo 15.2). In modo simile, mediante l’aggiunta di sostanze che bloccano in vari punti il trasferimento degli elettroni, è stato possibile individuare la sequenza delle molecole trasportatrici nella catena mitocondriale di trasporto degli elettroni (Paragrafo 18.2B).

CAPITOLO 14

502

Introduzione al metabolismo

Difetti genetici possono causare un accumulo di intermedi metabolici. Alla de-

H CH2

C

COO–

NH+ 3 Fenilalanina

H CH2

HO

C

COO–

NH+ 3 Tirosina

O CH2

HO

C

COO–

p-Idrossifenilpiruvato

HO CH2

© 978-88-08-42096-1

COO–

OH Omogentisato

mancante nell’alcaptonuria

terminazione delle vie metaboliche ha contribuito anche la scoperta da parte di Archibald Garrod, agli inizi del XX secolo, che le malattie genetiche umane sono la conseguenza della carenza di specifici enzimi. Per esempio, dopo l’ingestione di fenilalanina o di tirosina gli individui affetti dalla condizione ereditaria non patologica conosciuta come alcaptonuria, a differenza degli individui normali, eliminano nelle urine acido omogentisico (Scheda 21.2). Questo avviene perché il fegato degli alcaptonurici è privo dell’enzima che catalizza la reazione di degradazione dell’acido omogentisico (Figura 14.17). La manipolazione genetica modifica i processi metabolici. I primi studi sul me-

tabolismo hanno portato alla straordinaria scoperta che le più importanti vie metaboliche sono pressoché identiche nella maggior parte degli organismi. Questa uniformità metabolica ha notevolmente facilitato lo studio delle reazioni metaboliche. Così, anche se una mutazione che inattiva o cancella un enzima nella via metabolica di interesse non è presente negli organismi superiori, essa può essere prodotta facilmente mediante mutageni (agenti chimici che inducono modificazioni genetiche; Paragrafo 25.4A), raggi X o, più recentemente, mediante tecniche di ingegneria genetica (Paragrafo 3.5). I mutanti desiderati che non sono in grado di sintetizzare il prodotto finale della via metabolica possono essere identificati per il fatto che la loro crescita richiede l’aggiunta di quel prodotto al mezzo di coltura. Organismi superiori ingegnerizzati privi di particolari geni (per esempio, negli esperimenti di “knockout” genico; Paragrafo 3.5D) sono particolarmente utili nei casi in cui l’assenza di un singolo prodotto genico ha come conseguenza un deficit metabolico non letale. Le tecniche di ingegneria genetica sono progredite al punto da “inattivare” selettivamente un unico gene in un particolare tessuto. Questo tipo di approccio è necessario nei casi in cui un prodotto genico è indispensabile per lo sviluppo e quindi non può essere completamente eliminato. Nel metodo opposto vi sono tecniche di produzione di animali transgenici che rendono possibile l’espressione di geni in tessuti nei quali non erano originariamente presenti.

C La biologia dei sistemi è entrata a far parte dello studio del metabolismo

H2O + CO2 Figura 14.17 Via di degradazione della fenilalanina. I soggetti affetti da alcaptonuria sono privi dell’enzima che scinde l’omogentisato; quindi questo intermedio si accumula ed è escreto nelle urine.

Che tipo di modificazione chimica avviene in ogni tappa mostrata qui?

Tradizionalmente il metabolismo è stato studiato con ricerche guidate da ipotesi formulate in precedenza: isolamento di enzimi e metaboliti e ricostruzione di una via metabolica in base a ipotesi sperimentalmente verificabili. Avendo ora a disposizione le sequenze complete del genoma, sta emergendo un nuovo approccio allo studio del metabolismo chiamato biologia dei sistemi che sfrutta anche nuove tecniche veloci e sensibili per l’analisi di grandi numeri di trascritti genici, proteine e metaboliti, e nuovi strumenti matematici e computazionali. Attraverso questa nuova metodologia vengono analizzate e integrate enormi quantità di informazioni in banche dati accessibili che permettono di caratterizzare le proprietà e la dinamica di intere reti biologiche. Il risultato è stato il progresso della nostra conoscenza sulla via che conduce dal genotipo al fenotipo. Oltre al dogma centrale della biologia (Paragrafo 3.3B), secondo il quale un gene costituito da DNA è trascritto in mRNA che a sua volta viene tradotto in una singola proteina che andrà a influenzare il metabolismo, possiamo analizzare questi livelli di espressione genica più nel dettaglio. Per esempio possiamo valutare il genoma, il trascrittoma (l’intera raccolta di RNA trascritto da una cellula), il proteoma (il gruppo completo di proteine sintetizzate da una cellula in risposta a variazioni delle condizioni) e il metaboloma (l’insieme degli intermedi metabolici della cellula) così come le loro interrelazioni (Figura 14.18). Per evidenziare la sistematica incorporazione delle informazioni preesistenti sui

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

Introduzione al metabolismo

503

meccanismi di reazione e sulle vie meGenoma Genotipo taboliche, è stato persino coniato un DNA nuovo termine, il biblioma (dal greTrascrittoma co biblion, “libro”). Nelle banche dati mRNA accessibili via Internet sono catalogate decine di vie metaboliche in cui sono Proteoma elencate anche le strutture e i nomi Enzima degli intermedi e degli enzimi che ne catalizzano le interconversioni, insieSubstrati Metaboloma me alle correlazioni tra sequenze geniche e strutture tridimensionali delMetaboliti Fenotipo le proteine (vedi Bioinformatica, Progetto 8). Due esempi di questo tipo di banche dati sono l’Enciclopedia-Banca Dati dei Geni, dei Genomi e delle Vie Figura 14.18 La correlazione tra metaboliche di Kyoto [Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomes (KEGG) il genotipo e il fenotipo. La via che connette l’informazione genetica Pathway Database], disponibile nel sito www.genome.jp/kegg/metabolism.html (genotipo) con la funzione metabolica e la BRaunschweig ENzyme DAtabase (BRENDA), disponibile nel sito www. (fenotipo) è costituita da diverse tappe. brenda-enzymes.org/. Nei paragrafi seguenti discuteremo alcune delle tecnolo- Porzioni del genoma vengono trascritte per formare il trascrittoma, che dirige gie emergenti utilizzate nella biologia dei sistemi. La genomica esamina tutte le sequenza di DNA di un organismo. Le

capacità metaboliche totali di un organismo sono codificate nel suo genoma (tutti i suoi geni). In teoria dovrebbe essere possibile la ricostruzione delle attività metaboliche di una cellula a partire dalle sue sequenze di DNA. Attualmente questo può essere fatto solo in generale. Per esempio, il sequenziamento del genoma di Vibrio cholerae, il batterio che causa il colera, rivela un ampio repertorio di geni che codificano proteine di trasporto ed enzimi per il catabolismo di una vasta gamma di sostanze nutrienti. Questi risultati sono coerenti con il complicato ciclo biologico di V. cholerae, che può condurre una vita libera, o in associazione con lo zooplancton, oppure da parassita nel tratto gastrointestinale umano (dove causa il colera). Naturalmente un semplice catalogo dei geni di un organismo non rivela come essi funzionino. Per esempio, alcuni geni sono espressi in modo continuo ad alti livelli, mentre altri sono espressi raramente, in pratica solo quando l’organismo incontra un particolare metabolita. I DNA microarray permettono di creare un quadro accurato dell’espressione genica. La costruzione di un quadro accurato dell’espressione genica è l’obiettivo

della trascrittomica, lo studio del trascrittoma di una cellula. L’identificazione e la quantificazione di tutti gli RNA trascritti di un determinato tipo cellulare rivelano quali geni siano attivi e quali no. Le cellule trascrivono migliaia di geni alla volta e quindi questo studio richiede l’utilizzo di nuove tecniche, compresa la tecnologia del DNA microarray. Si ottiene un DNA microarray o chip a DNA depositando numerosi (fino a molte centinaia di migliaia) frammenti diversi di DNA di geni noti in una disposizione (array) precisa su un supporto solido, come per esempio una superficie di vetro opportunamente rivestita. Questi DNA sono spesso cloni amplificati mediante PCR di cDNA derivati da mRNA (la PCR è discussa nel Paragrafo 3.5C), oppure le loro controparti sintetizzate tramite tecnologie robotizzate. Gli mRNA estratti da cellule, tessuti o altre fonti biologiche cresciuti in diverse condizioni, vengono quindi marcati con coloranti fluorescenti (un colore differente per ciascuna condizione di crescita) e incubati con le molecole di DNA sul DNA microarray per ottenere ibridazione. Il cDNA non ibridato è quindi asportato tramite lavaggi. La risultante intensità e il tipo (colore) della fluorescenza in ciascun punto del DNA microarray indicano quindi quanto cDNA (e di conseguenza quanto mRNA) si è lega-

la sintesi del proteoma, le cui varie attività sono responsabili della sintesi e della degradazione dei componenti del metaboloma.

Che tecniche usereste per quantificare o identificare le molecole a ogni livello?

504

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

to a una particolare sequenza di DNA complementare in ogni condizione di crescita. La Figura 14.19 mostra un chip a DNA che indica i cambiamenti avvenuti nell’espressione genica in un lievito cresciuto in presenza di glucosio, a cui poi è stato tolto il rifornimento di glucosio. Così è stato possibile mettere in relazione le differenze nell’espressione di particolari geni con i processi di sviluppo o i modelli di crescita. Per esemSCHEMA DI PROCESSO (a)

Figura 14.19 I chip a DNA (DNA microarray). (a) Rappresentazione schematica di un esperimento che mostra le differenze nell’espressione genica dei lieviti cresciuti in presenza e in assenza di glucosio. (1) Le cellule di lievito sono cresciute in terreno di coltura contenente glucosio e in terreno di coltura privo di glucosio. (2) Viene isolato l’mRNA di ciascuna popolazione di lievito. (3) La trascrittasi inversa copia l’mRNA in cDNA incorporando un colorante fluorescente rosso nel cDNA ottenuto dalle cellule cresciute in presenza di glucosio e un colorante fluorescente verde nel cDNA ottenuto dalle cellule cresciute in condizioni di digiuno dopo l’eliminazione del glucosio. (4) I cDNA ottenuti vengono mescolati. (5) I cDNA marcati ibridano con i segmenti di DNA immobilizzati sul chip di geni e vengono identificati i cDNA legati a esso che emettono fluorescenza rossa e verde. (b) Una disposizione (array) di circa 6000 geni contenente la maggior parte dei geni del lievito di birra, uno per ciascuna posizione (spot). Le macchie rosse e verdi rivelano i geni che sono attivati dal punto di vista trascrizionale rispettivamente in presenza o in assenza di glucosio, mentre le macchie gialle (rosso più verde) indicano i geni la cui espressione non è influenzata dal livello di glucosio. (c) Un apparato per eseguire un DNA microarray. In tal modo viene protetto il chip a DNA in esso contenuto e si assicura, al contempo, la presenza di una camera di ibridazione sempre nelle migliori condizioni. La lettura del risultato richiede l’ausilio di strumenti speciali per la misurazione della fluorescenza. [Per gentile concessione di Affymetrix, Inc., Santa Clara, California.]

Cellule di lievito cresciute in terreno di coltura contenente 1 1 glucosio oppure in terreno di coltura privo di glucosio. Lievito + glucosio

Lievito – glucosio 2

Isolamento dell’mRNA.

2

mRNA Colorante fluorescente rosso (CY3)

mRNA Trascrizione inversa e marcatura 3 3 con coloranti fluorescenti differenti.

cDNA rosso (CY3)

Miscelazione.

Colorante fluorescente verde (CY5)

cDNA verde (CY5)

4

cDNA CY3 + cDNA CY5

Ibridazione dei cDNA con 5 chip a DNA e scansione con laser rossi e verdi.

(b)

(c)

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

Figura 14.20 Attività trascrizionali relative dei geni in un tipo di tumore, il carcinoma epatocellulare (HCC), determinata usando DNA microarray. I dati sono presentati sotto forma di una matrice in cui ciascuna colonna rappresenta uno dei 156 campioni di tessuto [82 tumori HCC (il più comune tumore umano del fegato, tra le prime cinque cause di morte per tumori al mondo) e 74 tessuti epatici non tumorali]. Ciascuna fila rappresenta uno dei 3180 geni (quelli tra i circa 17 400 geni del microarray che presentano le maggiori variazioni nell’attività trascrizionale tra i diversi campioni di tessuto). I dati sono disposti in modo da raggruppare i geni e i campioni di tessuto sulla base della somiglianza del profilo di espressione. Il colore di ciascuna cella indica il livello di espressione del gene corrispondente in quel tessuto, rispetto ai livelli di espressione media in tutti i campioni di tessuto: il rosso brillante, il nero e il verde brillante indicano livelli di espressione di 4, 1 e 1/4 del valore della media per quel gene (come indicato nella scala sottostante). Il dendrogramma nella parte alta della matrice indica le similarità degli schemi di espressione nei diversi campioni di tessuto. [Da Chen, X., et al, Mol. Biol. Cell 13, 1929 (2002), Fig. 1. Per gentile concessione di David Botstein e Patrick Brown, Stanford University School of Medicine.]

HCC

Fegato senza tumore

pio, i DNA microarray sono stati usati per costruire un profilo di espressione genica nelle cellule tumorali, poiché tipi diversi di tumori sintetizzano tipi di proteine diverse in quantità altrettanto diverse (Figura 14.20). Queste informazioni sono molto utili per scegliere il migliore trattamento per i vari tipi di cancro. In modo simile, si possono analizzare i profili di espressione genica dei globuli bianchi del sangue, che si ottengono facilmente, per dimostrare se un paziente soffre di un’infezione batterica oppure virale; questa informazione può evitare la somministrazione non necessaria di antibiotici quando l’infezione è virale. La proteomica studia tutte le proteine della cellula. Sfortunata-

mente, la correlazione tra la quantità di un determinato mRNA e la quantità del suo prodotto proteico è imperfetta. I vari mRNA 0,25 sono infatti trascritti e degradati a velocità diverse. Inoltre molte proteine subiscono modificazioni post-traduzionali e risentono di altri tipi di modificazione che a volte avvengono in modi molto diversi tra loro (per esempio fosforilazione o glicosilazione). Di conseguenza, il numero di proteine in una cellula supera di gran lunga il numero delle molecole del loro mRNA. Un modo più affidabile della trascrittomica per valutare l’espressione genica è lo studio del proteoma di una cellula. Questo approccio proteomico richiede in primo luogo la separazione delle proteine, di solito tramite elettroforesi bidimensionale (2D) su gel, una tecnica che separa le proteine in base al punto isoelettrico in una dimensione e in base alla massa nella seconda dimensione, perpendicolare alla prima (Paragrafo 5.2D). Le singole proteine vengono quindi identificate utilizzando una spettrometria di massa in tandem per ottenere informazioni sulla sequenza amminoacidica (Paragrafo 5.3D). Queste vengono successivamente messe a confronto con le sequenze delle proteine note contenute nelle banche dati. Dato che da una singola proteina si ottengono molti peptidi, questa tecnica permette di ottenere una massa di dati ridondante e non ambigua, che consente un’identificazione certa di una determinata proteina grazie al confronto con le sequenze delle banche dati. In tal modo si possono catalogare tutte le proteine contenute in una cellula o in un tessuto in determinate condizioni. Possiamo confrontare tutte le proteine sintetizzate da una cellula in due diverse condizioni come si fa con l’mRNA? La risposta è sì. Lo si può fare utilizzando reagenti marcati con isotopi tra loro differenti che possono essere sia presenti nel terreno di coltura (per esempio amminoacidi marcati con deuterio) sia

505

0,5

1

2

4

506

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

PUNTO DI VERIFICA

• In che modo i composti marcati con radioisotopi vengono utilizzati per studiare il metabolismo?

• Quali dei radioisotopi elencati nella Tabella 14.6 potrebbero essere usati per marcare in modo specifico una proteina? Quali invece potrebbero essere usati per marcare specificamente un acido nucleico?

• Spiegate in che modo l’accumulo di un metabolita, quando un enzima è bloccato, può consentire di identificare le tappe di una via metabolica.

• Descrivete in che modo possano essere utilizzate le informazioni sul genoma di un organismo per stabilire e manipolare le sue attività metaboliche.

• Qual è la differenza tra ricerca basata sull’ipotesi e ricerca basata sulla scoperta?

• Descrivete il “dogma centrale” nell’era dell “-omica”.

• Riassumete le correlazioni esistenti tra il metaboloma, il proteoma, il trascrittoma e il genoma di un organismo.

• Perché l’analisi trascrittomica e proteomica potrebbero rivelare informazioni differenti sull’attività metabolica di un particolare tessuto?

© 978-88-08-42096-1

aggiunti all’estratto cellulare. Le proteine sono poi purificate e analizzate mediante la spettrometria di massa in tandem. Una speranza per il futuro è che si possa, confrontando tra loro i campioni provenienti da soggetti sani e malati per una determinata patologia, identificare la presenza di marcatori patologici precedentemente non rilevabili, in modo da permettere la diagnosi precoce di diverse malattie. La metabolomica analizza tutti i metaboliti di una cellula. Per descrivere lo sta-

to funzionale di una cellula (il suo fenotipo) abbiamo bisogno, oltre al genoma, al trascrittoma e al proteoma della cellula in questione, di una descrizione quantitativa di tutti i metaboliti in essa contenuti in determinate condizioni, cioè del suo metaboloma. Una cellula o un tessuto contengono però migliaia di metaboliti aventi un’enorme varietà di proprietà che rendono molto difficoltoso il compito di identificare e quantificare tutte queste sostanze. È necessario quindi servirsi di molti strumenti analitici diversi. Di conseguenza, questa enorme impresa viene suddivisa in diverse fasi. Per esempio, la lipidomica è una sottosezione della metabolomica mirata alla caratterizzazione di tutti i lipidi presenti in una cellula in determinate condizioni, compreso il modo con cui questi lipidi influenzano la struttura della membrana, le vie di segnalazione cellulari, l’espressione genica, le interazioni cellula-cellula e così via. Per esempio, è stato usato un gruppo di 10 metaboliti lipidici presenti nel sangue per prevedere lo sviluppo dei deficit cognitivi nel morbo di Alzheimer. Un’altra applicazione della metabolomica è il confronto fra vari tipi di cancro. Sebbene tutte le cellule contengano gli stessi metaboliti “centrali”, le loro modalità di utilizzo seguono vie differenti che possono essere sfruttate per inibire la crescita tumorale.

RIASSUNTO 1 Una panoramica del metabolismo • L’energia libera rilasciata dalle reazioni cataboliche di ossidazione è utilizzata per guidare le reazioni anaboliche. • La nutrizione è l’assunzione e l’utilizzazione degli alimenti per fornire energia libera e materie prime. • Gli organismi eterotrofi ottengono l’energia libera di cui hanno bisogno da composti sintetizzati da organismi chemiolitotrofi o fotoautotrofi. • Gli alimenti contengono proteine, carboidrati, grassi, acqua, vitamine e minerali. • Le vie metaboliche sono sequenze di reazioni catalizzate da enzimi che avvengono in diverse localizzazioni cellulari. • Le reazioni che si svolgono in condizioni vicine all’equilibrio sono reversibili, mentre quelle che agiscono lontano dall’equilibrio rappresentano tappe regolatorie e rendono irreversibili le vie metaboliche. • Il flusso lungo una via metabolica è controllato tramite regolazione dell’attività di enzimi che catalizzano i passaggi che limitano la velocità della via.

2 I composti “ad alta energia” • L’energia libera del composto “ad alta energia” ATP è resa disponibile dalla scissione di uno o di entrambi i legami fosfoanidridici. • Una reazione esoergonica come l’idrolisi dell’ATP o del PPi può essere accoppiata a una reazione endoergonica, per renderla più favorevole. • La fosforilazione a livello di substrato è la sintesi di ATP a partire da ADP tramite il trasferimento di un gruppo fosforico proveniente da un altro composto.

• Il prodotto comune del catabolismo di carboidrati, lipidi e proteine, l’acetil-CoA, è un tioestere “ad alta energia”.

3 Le reazioni di ossidoriduzione

• I coenzimi NAD+ e FAD sono ridotti in modo reversibile durante l’ossidazione dei metaboliti. • L’equazione di Nernst mette in relazione la forza elettromotrice di una reazione redox con i potenziali di riduzione standard e le concentrazioni dei donatori e degli accettori di elettroni. • Gli elettroni si spostano spontaneamente dal composto che ha il potenziale di riduzione più negativo verso il composto con il potenziale di riduzione più positivo.

4 I metodi sperimentali di studio

del metabolismo • Lo studio delle vie metaboliche tenta di determinare l’ordine delle trasformazioni metaboliche, i loro meccanismi enzimatici, la loro regolazione e le loro correlazioni con i processi metabolici che si svolgono in altri tessuti. • Le vie metaboliche possono essere studiate mediante l’uso di traccianti isotopici, inibitori enzimatici, mutazioni naturali e indotte con tecniche di ingegneria genetica, oppure con DNA microarray e tecniche proteomiche. • La biologia dei sistemi si prefigge l’obiettivo di descrivere quantitativamente le proprietà e le dinamiche delle reti biologiche come se fossero un tutt’uno, tramite l’integrazione delle informazioni provenienti dalla genomica, dalla trascrittomica, dalla proteomica e dalla metabolomica.

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

© 978-88-08-42096-1

507

PROBLEMI 1. Spiegate perché un organismo eterotrofo necessita di vitamine

mentre uno autotrofo no. 2. I metanogeni sono procarioti che producono metano secondo l’equazione netta 4H2 + CO2 n CH4 + 2H2O Alcuni batteri consumano metano secondo l’equazione netta CH4 + SO42− n HCO3− + HS− + H2O (a) Classificate i due tipi di batteri come autotrofi o eterotrofi. (b) Spiegate perché i due tipi di batteri vengono spesso trovati in associazione l’uno con l’altro. 3. Un ceppo di batteri isolato da un lago alcalino contenente elevate concentrazioni di arsenico è in grado di incorporare atomi di As nelle molecole biologiche. Quale classe di molecole può contenere As nella sua struttura? 4. Spiegate come mai il cadmio e il mercurio sono tossici per la maggior parte degli organismi. 5. Disponete i seguenti composti in ordine di stato ossidativo crescente.

CH

CH2OH

2OOC

CH2

A

COO2

B O

H3C

CH2

CH3

C

H3C

CH

CH2

H3C

D

C

COO2

E

6. Il reagente indicato nelle reazioni parziali mostrate di seguito

andrà incontro a ossidazione o a riduzione? (a) COO2 CH2 C

COO2 CH2

O

CH

OH

COO2

COO2

(b) COO2

COO2

CH2 CH

ATP + CoA + RCOO− 34 RCO−CoA + AMP + PPi ha un ∆G°′ = +4,6 kJ ∙ mol−1. Da dove proviene l’energia termodinamica che fa avvenire questa reazione? 14. La reazione catalizzata dalla malato deidrogenasi,

malato + NAD+ n ossalacetato + NADH + H+

OH H3C

(c) Di solito è un punto di controllo in una via metabolica. (d) Opera molto lentamente in vivo. 9. Usate i dati della Tabella 2.4 per stimare la carica netta di una molecola di ATP in vivo. 10. Quasi tutti gli enzimi che richiedono come cofattore la nicotinamide usano o NAD+/NADH o NADP/NADPH (Figura 11.3), ma non entrambi. Confrontate la carica netta di ciascun cofattore. 11. Supponendo una conservazione dell’energia di efficienza pari al 100%, quante moli di ATP possono essere sintetizzate in condizioni standard dalla completa ossidazione di 1 mol di glucosio? 12. Supponendo una conservazione dell’energia di efficienza pari al 100%, quante moli di ATP possono essere sintetizzate in condizioni standard dalla completa ossidazione di 1 mol di palmitato? 13. La reazione che porta all’“attivazione” di un acido grasso (RCOO−),

CH OH

COO2

CH COO2

7. La citrato sintasi catalizza la reazione

Ossalacetato + acetil-CoA n citrato + HS-CoA La variazione di energia libera della reazione è −31,5 kJ mol−1. (a) Calcolate la costante di equilibrio per questa reazione a 37 °C. (b) Vi aspettereste che questa reazione serva come punto di controllo per la via a cui appartiene (ciclo dell’acido citrico)? 8. Scegliete la definizione migliore per una reazione vicina all’equilibrio. (a) Opera sempre con una variazione favorevole di energia libera. (b) Ha una variazione di energia libera vicina a 0.

ha un valore di ∆G°′ di +29,7 kJ ∙ mol−1. (a) Questa reazione avverrà spontaneamente nelle cellule? (b) In che modo la reazione catalizzata dalla citrato sintasi (descritta nel Problema 7) promuove, nelle cellule, la reazione catalizzata dalla malato deidrogenasi? Qual è la variazione totale di energia libera per le due reazioni? 15. Elencate le seguenti sostanze in base al loro potere riducente decrescente: (a) acetacetato, (b) citocromo b (Fe3+), (c) NAD+, (d) SO42− ed (e) piruvato. 16. È più probabile che la forma ridotta del citocromo c ceda i suoi elettroni al citocromo a o al citocromo b ossidati? 17. In condizioni standard, le seguenti reazioni procederanno spontaneamente nel senso in cui sono state scritte? Fumarato + NADH + H+ 34 succinato + NAD+ 18. In condizioni standard, le seguenti reazioni procederanno

spontaneamente nel senso in cui sono state scritte? Cito a (Fe2+) + cito b (Fe3+) 34 cito a (Fe3+) + cito b (Fe2+) 19. I chip di geni contenenti frammenti di DNA batterico potreb-

bero essere utili per monitorare l’espressione genica in una cellula di mammifero? 20. Perché i chip a DNA contengono spesso frammenti derivati dal cDNA piuttosto che frammenti di DNA genomico? 21. Studiando l’attività cellulare i biochimici possono quantificare le sequenze di RNA convertendole in sequenze di DNA amplificabili mediante PCR (Paragrafo 3.5C) e possono quantificare le proteine mediante ingegneria genetica dei geni corrispondenti, aggiungendo una proteina fluorescente verde (Scheda 4.3). Spiegate perché i metaboliti non possono essere valutati usando questi stessi approcci. 22. I ricercatori hanno notato che pazienti differenti rispondono in modo diverso alle statine, farmaci che abbassano il colesterolo. Hanno cercato di collegare gli effetti collaterali dei farmaci a variazioni genetiche come i polimorfismi di singoli nucleo-

508

CAPITOLO 14

Introduzione al metabolismo

tidi (SNP; Paragrafo 3.4E). Quale altra informazione dovrebbero raccogliere i ricercatori per identificare i geni che hanno un ruolo nella risposta di un paziente al farmaco statina? DOMANDE DIFFICILI 23. La variazione standard di energia libera della reazione meta−1

bolica A n B è di 7,5 kJ ∙ mol . (a) Calcolate la costante di equilibrio della reazione a 25 °C. (b) Calcolate ∆G a 37 °C quando la concentrazione di A è 0,5 mM e la concentrazione di B è 0,1 mM. La reazione è spontanea in queste condizioni? (c) Come potrebbe procedere la reazione nella cellula? 24. Le cellule portano avanti reazioni anaboliche e cataboliche con molti enzimi che prendono parte a entrambi i tipi di vie metaboliche. (a) Spiegate perché questi enzimi catalizzano reazioni vicine all’equilibrio. (b) Spiegate perché vie opposte cataboliche e anaboliche devono avere enzimi diversi in almeno una delle loro tappe. 25. La quantità di energia libera per l’idrolisi dell’ATP aumenta o diminuisce se il pH aumenta da 5 a 6? 26. Il ∆G°′ per la rimozione idrolitica di un gruppo fosforico dall’ATP è circa due volte maggiore del ∆G°′ per la rimozione idrolitica di un gruppo fosforico dall’AMP (−14 kJ mol−1). Spiegate questa discrepanza. 27. Determinate se la reazione della creatina chinasi procederà nella direzione di sintesi di ATP o di fosfocreatina se la temperatura è di 25 °C, [ATP] = 4 mM, [ADP] = 0,15 mM, [fosfocreatina] = 2,5 mM e [creatina] = 1 mM. 28. Se nella cellula [ATP] = 5 mM, [ADP] = 0,5 mM, e [Pi] = 1,0 mM, calcolate la concentrazione di AMP a pH 7 e a 25 °C nella condizione in cui la reazione dell’adenilato chinasi è all’equilibrio. 29. Alcune proteine contengono tioesteri interni, che si formano quando la catena laterale di una Cys reagisce per condensazione con la catena laterale di una Gln distante pochi residui. Disegnate questa struttura. 30. Il tioestere descritto nel Problema 29 reagisce facilmente con composti con formula ROH o RNH2. Disegnate l’estere e l’amide risultanti. 31. In una miscela di NAD+, NADH, ubichinone e ubichinolo quale composto verrà ossidato? Quale verrà ridotto? 32. Gli organismi aerobici trasferiscono elettroni dalle molecole ridotte dei nutrienti all’O2 formando H2O. Alcuni organismi anaerobici utilizzano il nitrato (NO− 3 ) come accettore di elettroni provenienti dalle molecole ridotte dei combustibili. Utilizzando le informazioni elencate nella Tabella 14.4 spiegate perché gli organismi aerobici possono estrarre più energia da una molecola di combustibile rispetto a un organismo anaerobico che utilizza il nitrato. 33. Scrivete un’equazione bilanciata per l’ossidazione dell’ubichinolo da parte del citocromo c. Calcolate il valore di ∆G°′ e di ∆ℰ°′ per questa reazione. 34. In condizioni standard, l’ossidazione del FADH2 libero da parte dell’ubichinone è abbastanza esoergonica da promuovere la sintesi di ATP? 35. Un’ipotetica via metabolica a tre tappe forma gli intermedi W, X, Y e Z e utilizza gli enzimi A, B e C. Determinate l’ordine dei passaggi enzimatici nella via metabolica, tenendo conto delle seguenti informazioni. 1. Il composto Q, un inibitore metabolico dell’enzima B, causa l’accumulo del metabolita Z. 2. Un mutante dell’enzima C necessita di Y per crescere. 3. Un inibitore dell’enzima A causa l’accumulo di W, Y e Z.

© 978-88-08-42096-1

4. Il composto P, un inibitore metabolico dell’enzima C, causa l’accumulo di W e Z. 36. Una determinata via metabolica può essere schematizzata come Y

X

A

B

Z

C

D

dove A, B, C e D sono gli intermedi, e X, Y e Z gli enzimi che catalizzano le reazioni. Le variazioni fisiologiche di energia libera per le reazioni sono

X –0,2 kJ ∙ mol−1 Y –12,3 kJ ∙ mol−1 Z –1,2 kJ ∙ mol−1 (a) Quale reazione è probabile che rappresenti un punto principale di regolazione della via? (b) Se la vostra risposta alla parte (a) della domanda era giusta, in presenza di un inibitore che blocchi l’attività dell’enzima Z, è possibile che le concentrazioni di A, B, C e D aumentino, diminuiscano o non ne siano influenzate?

BIOINFORMATICA Progetto 8 Enzimi metabolici, microarray e proteomica 1. Enzimi metabolici. Utilizzate le banche dati KEGG e Enzyme Structure per ottenere informazioni sulla diidrofolato riduttasi. 2. Microarray. Imparate qualcosa di più sulla tecnologia dei microarray e sul suo utilizzo nello studio delle malattie. 3. Proteomica. Rivedete alcune metodiche e le loro limitazioni. 4. Insegnare e imparare alcune risorse per la proteomica. 5. Elettroforesi bidimensionale su gel. Ottenete dati sulla diidrofolato riduttasi dalla Swiss-2D PAGE. Progetto 9 Banche dati e strumenti della metabolomica 1. La società metabolomica. Imparate qualcosa sui marcatori biologici. In che modo essi vengono identificati, analiticamente seguiti e utilizzati per accertare uno stato patologico. 2. La banca dati del metaboloma umano. Osservate come viene seguito un metabolita umano (come l’UDP-glucosio) utilizzando la NMR e la spettrometria di massa e seguite i collegamenti alle molte vie metaboliche che utilizzano l’UDP-glucosio. 3. Il progetto PubChem. Esplorate una della banche dati più innovative all’NCBI che contiene composti, sostanze e informazioni dei dosaggi biologici sui metaboliti rappresentati da piccole molecole.

CASO DI STUDIO Caso 16 Regolazione allosterica dell’ATCasi Concetto chiave: un enzima coinvolto nella sintesi dei nucleotidi è soggetto a regolazione da parte di diverse combinazioni di nucleotidi. Prerequisiti: Capitoli 7, 12 e 14 • Proprietà degli enzimi allosterici • Meccansimi di base compresa la regolazione delle vie metaboliche

APPROFONDIMENTO Accedete alla banca dati del metaboloma umano (Human Metabolome Database, HMDB, http:// www. Hmdb.ca/) e cercate informazioni sull’acido urico. In quale via metabolica l’acido urico è un intermedio? Questa via metabolica è diversa tra le varie specie? Quali sono i composti precursori dell’acido urico? In quali composti può essere convertito l’acido urico? Qual è la normale concentrazione di acido urico nei fluidi corporei? In che modo le patologie influiscono sui livelli di acido urico?

CAPITOLO 14 © 978-88-08-42096-1

Introduzione al metabolismo

509

BIBLIOGRAFIA Aebersold, R. (2003). Quantitative proteome analysis: Methods and applications, J. Infect. Dis. 182 (supplement 2), S315-S320. Alberty, R.A. (2000). Calculating apparent equilibrium constants of enzyme-catalyzed reactions at pH 7, Biochem. Ed. 28, 12-17. Campbell, A.M. e Heyer, L.J. (2007). Discovering Genomics, Proteomics and Bioinformatics (2a ed.), Pearson Benjamin Cummings, New York. [Un’introduzione interattiva su queste discipline.] Choi, S. (a cura di) (2007). Introduction to Systems Biology, Humana Press. DeBerardinis, R.J. e Thompson, C.B. (2012). Cellular metabolism and disease: What do metabolic outliers teach us?, Cell 148, 11321144. Duarte, N.C., Becker, S.A., Jamshidi, N., Thiele, I., Mo, M.L., Vo, T.D., Srivas, R., e Palsson, B. Ø. (2007). Global reconstruction of the human metabolic network based on genomic and bibliomic data, Proc. Natl. Acad. Sci, 104, 1777-1782. Go, V.L.W., Nguyen, C.T.H., Harris, D.M., e Lee, W.-N.P. (2005). Nutrient-gene interaction: Metabolic genotype-phenotype relationship, J. Nutr. 135, 2016s-3020s. Hanson, R.W. (1989). The role of ATP in metabolism, Biochem. Ed. 17, 86-92. [Spiega in maniera eccellente perché l’ATP è un trasduttore piuttosto che un immagazzinatore di energia.] Kim, M.-S. et al. (2014). A draft map of the human proteome, Nature 509, 575-581, e Wilhelm, M. et al. (2014), Mass-spectrometry-based draft of the human proteome, Nature 509, 582-587.

Lassila, J.K., Zalatan, J.G., e Herschlag, D. (2011). Biological phosphoryl transfer reactions: understanding mechanism and catalysis, Annu. Rev. Biochem. 80, 669-702. Schulman, R.G. e Rothman, D.L. (2001). 13C NMR of intermediary metabolism: Implications for systematic physiology, Annu. Rev. Physiol. 63, 15-48. Smolin, L.A. e Grosvenor, M.B (2013). Nutrition: Science and Applications (3a ed.), Wiley. [Un buon testo per le persone interessate agli aspetti nutrizionali del metabolismo.] Staughton,, R.B. (2005). Applications of DNA microarrays in biology, Annu. Rev. Biochem. 74, 53-82. Valle, D. (a cura di), The Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease, http://www.ommbid.com/ [La maggior parte dei capitoli di questa opera enciclopedica contiene l’esame di un normale processo metabolico che viene compromesso dalla malattia. L’accesso a questo sito Internet richiede la registrazione che, però, spesso è ottenibile tramite le librerie scolastiche e universitarie.] Westheimer, F.H. (1987). Why nature chose phosphates, Science 235, 1173-1178. Zenobi, R. (2013). Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives, Science 342, 1243259. DOI: 10.1126/science.1243259. [A questo articolo è associato un identificatore dell’oggetto digitale (DOI).]

C A P I T O L O

1 5

Il catabolismo del glucosio Il protozoo Tripanosoma brucei (in viola) che causa, nell’uomo, la tripanosomiasi o malattia del sonno africana, mentre viaggia nel torrente circolatorio dell’ospite ricava la propria energia quasi esclusivamente dalla glicolisi. Sebbene sia un eucariota, questo parassita è sufficientemente diverso dal suo ospite e i suoi enzimi glicolitici sono strutturalmente diversi dai corrispondenti enzimi dei mammiferi. Essi sono quindi un bersaglio molto interessante per la progettazione mirata di farmaci che non colpiscano gli enzimi umani. [© Eye of Science/Photo Researchers, Inc.]

Il glucosio costituisce, per molte cellule, la fonte principale di energia metabolica. La fermentazione (degradazione anaerobica) del glucosio a etanolo e CO2 da parte del lievito è stata sfruttata per secoli nella produzione del pane, del vino e della birra. La ricerca scientifica sui processi chimici di questa via catabolica è iniziata tuttavia solo alla metà del XIX secolo, con gli esperimenti di Louis Pasteur e di altri scienziati. Sarebbe trascorso quasi un secolo prima che questa via metabolica fosse completamente chiarita. In questo intervallo di tempo sono state evidenziate alcune importanti caratteristiche della fermentazione. 1. Nel 1897, Eduard Buchner dimostrò che un estratto cellulare di lievito poteva fermentare il glucosio. Questa scoperta confutava la convinzione allora ampiamente diffusa che la fermentazione, così come ogni altro processo biologico, fosse mediata da una sorta di “forza vitale” intrinseca nella materia vivente, e di conseguenza portava la fermentazione nell’area di studio della chimica. 2. Nel 1905 Arthur Harden e William Young scoprirono che il fosfato è necessario per la fermentazione del glucosio. Scoprirono anche che un estratto cellulare di lievito può essere separato, mediante dialisi, in due frazioni, entrambe necessarie per la fermentazione: una frazione non dializzabile, labile ad alte temperature, che chiamarono zimasi, e una frazione dializzabile, stabile al calore, che chiamarono cozimasi. Fu infine dimostrato da altri che la zimasi è una miscela di enzimi, e che la cozimasi è una miscela di coenzimi, come NAD+, ATP e ADP, nonché ioni metallici. 3. Alcuni reagenti, come l’acido iodoacetico e lo ione fluoruro, inibiscono la formazione dei prodotti della via metabolica, causando l’accumulo degli intermedi di questa via. Sostanze diverse causano l’accumulo di intermedi differenti, rivelando quindi la sequenza di interconversioni molecolari.

CAPITOLO 15

Il catabolismo del glucosio

© 978-88-08-42096-1

511

4. Studi sulla degradazione del glucosio in vari organismi hanno indicato che, a parte alcune eccezioni, il processo avviene nello stesso modo in tutti gli organismi. I tentativi di molti ricercatori giunsero a una conclusione nel 1940, quando fu descritta per intero la via di degradazione del glucosio. Questa via, detta glicolisi (dal greco glykus, “dolce”, e lysis, “soluzione”), è anche chiamata via di Embden-Meyerhof-Parnas per ricordare il contributo dato da Gustav Embden, Otto Meyerhof e Jacob Parnas al suo chiarimento. La scoperta della glicolisi ha avuto luogo in un momento in cui erano in atto altre importanti ricerche in ambito metabolico (Scheda 15.1). La glicolisi, che è probabilmente la via metabolica meglio conosciuta, è una sequenza di 10 reazioni enzimatiche in cui una molecola di glucosio è convertita in due molecole del composto a tre atomi di carbonio piruvato, con la concomitante produzione di due molecole di ATP. La glicolisi riveste un ruolo chiave nel metabolismo energetico perché fornisce una parte significativa dell’energia libera usata dalla maggior parte degli organismi e perché prepara il glucosio e altri composti per una ulteriore degradazione ossidativa. È quindi opportuno iniziare la trattazione delle vie metaboliche specifiche prendendo in esame la glicolisi. Analizzeremo la sequenza di reazioni che portano alla degradazione del glucosio e alcuni importanti meccanismi enzimatici; esamineremo quindi le caratteristiche che influenzano il flusso glicolitico e il destino finale dei suoi prodotti. Discuteremo infine il catabolismo di altri esosi e la via del pentosio fosfato, una via metabolica alternativa per il catabolismo del glucosio in grado di fornire intermedi biosintetici.

SCHEDA 15.1

LE SCOPERTE DELLA BIOCHIMICA

Otto Warburg e gli studi sul metabolismo Otto Warburg (1883-1970)

Uno dei maggiori scienziati in campo biochimico, sia per il contributo diretto che ha dato, sia per l’influenza che ha esercitato su generazioni di giovani ricercatori, è stato il biochimico tedesco Otto Warburg. La sua lunga carriera si è svolta in un periodo in cui gli studi su organismi in toto e in estratti tissutali hanno aperto la strada alle spiegazioni molecolari delle strutture e delle funzioni biologiche. Come altri scienziati appartenenti alla sua generazione, Warburg ottenne un dottorato in chimica in giovanissima età e proseguì gli studi nel campo della medicina, anche se trascorse il resto della sua carriera dedicandosi alla ricerca scientifica e non al capezzale dei pazienti. Si interessò particolarmente a tre campi correlati alla chimica dell’ossigeno e del biossido di carbonio: la respirazione, la fotosintesi e il cancro. Uno dei primi successi di Warburg fu lo sviluppo di una tecnica di studio delle reazioni metaboliche in fette sottili di tessuti animali. Il metodo diede risultati molto più attendibili della tecnica precedente di taglio o sminuzzamento dei tessuti (queste manipolazioni tendono a rilasciare enzimi lisosomiali che degradano gli enzimi e le altre macromolecole). Warburg perfezionò inoltre la manometria, cioè la misura della pressione del gas, come tecnica per analizzare il consumo e la produzione di O2 e CO2 nei tessuti viventi. Warburg ricevette il premio Nobel nel 1931 per la sua scoperta del ruolo catalitico delle porfirine contenenti ferro (gruppi eme) nelle ossidazioni biologiche (in particolare per la reazione effettuata dal complesso enzimatico oggi noto come citocromo c ossidasi; Paragrafo 18.2F). Warburg identificò inoltre la nicotinamide come parte attiva di alcuni enzimi. Nel 1944

gli fu offerto un secondo premio Nobel per il suo lavoro sugli enzimi, ma non poté accettarlo a causa del decreto di Hitler che imponeva ai tedeschi di non accettare premi Nobel. In effetti, l’apparente condiscendenza di Warburg nei confronti del regime nazista provocò l’ira di alcuni suoi colleghi di altri paesi e potrebbe avere contribuito alla scarsa accettazione di alcune delle sue teorie scientifiche più controverse. In ogni caso, Warburg non era noto per la sua amabilità e cordialità: non creò mai una “scuola” e aveva la tendenza a reclutare assistenti ricercatori più giovani che dopo qualche anno avrebbero cambiato posto. Ciò nonostante, molti non si scoraggiarono e vinsero anche loro dei premi Nobel. Oltre alle tecniche da lui sviluppate, che furono in seguito impiegate su larga scala, e a numerose intuizioni sull’attività degli enzimi, Warburg formulò alcune teorie molto importanti sulla crescita delle cellule cancerose. Egli dimostrò che le cellule cancerose potevano vivere e svilupparsi anche in assenza di ossigeno. Inoltre, giunse a formulare l’ipotesi che l’anaerobiosi scatenasse lo sviluppo del cancro e respinse l’ipotesi che i virus lo potessero provocare, un principio già dimostrato a quel tempo negli animali, ma non nell’uomo. Agli occhi di molti Warburg era colpevole di avere equiparato l’assenza di prove alle prove dell’assenza, per quanto riguardava il cancro causato da virus. Tuttavia le osservazioni di Warburg sul metabolismo delle cellule cancerose, caratterizzato generalmente da una elevata velocità della glicolisi, erano corrette. Ancora oggi le peculiarità del metabolismo tumorale offrono opportunità per lo sviluppo della chemioterapia. La dedizione di Warburg alle sue ricerche sul cancro e in altri campi è testimoniata dal fatto che continuò a lavorare nel suo laboratorio fino a pochi giorni prima della morte, avvenuta a 87 anni. Warburg, O. (1956). On the origin of cancer cells. Science 123, 309-314.

512

CAPITOLO 15

Il catabolismo del glucosio

© 978-88-08-42096-1

1 Una panoramica della glicolisi CONCETTI CHIAVE

• La glicolisi comporta la degradazione del glucosio a piruvato utilizzando, al contempo, l’energia rilasciata dal processo per sintetizzare ATP a partire da ADP + Pi.

• La sequenza di 10 reazioni della glicolisi è suddivisa in due fasi: un investimento iniziale di energia a cui fa seguito un recupero di energia.

Prima di iniziare l’esame dettagliato della glicolisi, fermiamoci a considerare come la via si inserisca complessivamente nell’intero metabolismo animale. Il glucosio che entra nel sangue di norma deriva dalla degradazione di polisaccaridi (per esempio, glicogeno epatico, oppure amido o glicogeno provenienti dalla dieta) o dalla sua sintesi a partire da precursori non saccaridici (gluconeogenesi; Paragrafo 16.4). Il glucosio entra poi nella maggior parte delle cellule tramite un trasportatore specifico che lo trasferisce dall’esterno della cellula nel citosol (Paragrafo 10.2E). Gli enzimi della glicolisi si trovano nel citosol, dove sono liberi o debolmente associati tra loro o ad altre strutture cellulari. La glicolisi trasforma il glucosio in due unità C3 (piruvato). L’energia libera rilasciata durante il processo è impiegata per sintetizzare ATP partendo da ADP e Pi. La glicolisi è quindi una via metabolica in cui sono presenti reazioni accoppiate di fosforilazione (Paragrafo 14.2B). Le 10 reazioni della glicolisi sono schematizzate nella Figura 15.1. Si noti che l’ATP è utilizzato nelle prime reazioni della glicolisi per sintetizzare composti fosforilati (reazioni 1 e 3), ma nelle reazioni successive ne è risintetizzato il doppio (reazioni 7 e 10). La glicolisi può quindi essere divisa in due fasi.

Fase I Investimento energetico (reazioni 1-5). In questa fase preparatoria l’esosio glucosio è fosforilato e scisso in due molecole del triosio gliceraldeide-3-fosfato. Il processo consuma 2 molecole di ATP. Fase II Recupero energetico (reazioni 6-10). Le due molecole di gliceraldeide-3-fosfato sono trasformate in piruvato, con la concomitante produzione di 4 molecole di ATP. La glicolisi porta quindi a un “guadagno” netto di 2 ATP per ogni molecola di glucosio: la fase I consuma 2 ATP, mentre la fase II produce 4 ATP.

I gruppi fosforici che sono inizialmente trasferiti dall’ATP all’esosio non producono immediatamente composti “ad alta energia”. Le reazioni enzimatiche successive convertono poi questi prodotti “a bassa energia” in composti con alti potenziali di trasferimento del gruppo fosforico, che sono ora in grado di fosforilare l’ADP e formare ATP. La reazione complessiva è Glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi n 2 piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 4 H+

PUNTO DI VERIFICA

Quindi, il NADH prodotto durante il processo deve essere continuamente riossidato per con