ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ АВТОХТОННЫХ ДРЕВОСТОЕВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PINUS SYLVESTRIS L.) В УСЛОВИЯХ УСМАНСКОГО БОРА

Citation preview






   
 



 
 
  
    

 

 


 
  
 


!
   "

  

  


  
     
 

  
     
!

 
 
 
#    !

 
$ 
 !    
  !
   


 
   !
%
 
     
 
!
   
 &
'&

 '

   
#
   
   


 '
#
   

 

 
  
()



 


   





 





   
   
    
* !  
*  
 



 
' 
  


 


!  
 
 
+*   
   
  !  


 


       
    
  


 
 




 
   
 
   


 




 


   
    



   
  



   




 

   

!"
#   $ 
!$
% 
                         

                         !     "   


     #         $   !%  !       &  $   '         '     ( $         '     # %  % )   %*   %'      $ 

'           +     "  %

   &   '   ! #   

           $,    (   $     - $$$   . /"/"#
012"  )*3- +) *  !
4!& 5!6%55787& %    2  9:;567!%2  ?9:;567!; 0 @!   *       &    /  * ) %

  )*%    1 )*%&  " )*%/  &'(
)*+,-,+./.,-0)/,1 









     %    
     
                              !        %   ! %    %         "#      % %# % %"#$%        !       %          ! "" ##       $$$   /"/"#
012"  )*3- +) *  !
4!& 5!6%55787& %) A % 9:;567!%& 9:;567!; 0 @!   * '  &'(
)*+,-,+./.,-0)/,1 ()%*'+*, -'()* B8>77      /" /"#
012 "   )*3- +) ) "" & 8>77

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................ 3 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .............................................................................. 5 1.1 Понятие о мониторинге состояния среды .................................................. 5 1.1.1 Типы мониторинга ................................................................................... 6 1.1.2 Цитогенетический мониторинг – эффективный способ оценки состояния окружающей среды и живых организмов ................................ 11 1.1.3 Критерии цитогенетического мониторинга ...................................... 15 1.2 Информативность митоза как основного типа деления клеток пролиферирующей ткани для оценки состояния генетического аппарата организмов ......................................................................................................... 20 1.2.1 Митоз в норме....................................................................................... 20 1.2.2 Типы нарушений митоза ..................................................................... 21 1.3 Усманский бор – ценный лесной массив природного происхождения . 28 1.3.1 Местоположение .................................................................................. 29 1.3.2 Состав почв ........................................................................................... 30 1.3.3 Природоохранная роль ........................................................................ 30 1.3.4 Представители флоры и фауны .......................................................... 31 1.4 Сосна обыкновенная как одна из основных лесообразующих пород в Воронежской области ....................................................................................... 33 1.4.1 Систематическое положение cосны обыкновенной ......................... 33 1.4.2 Биология ................................................................................................ 35 1.4.3 Ареал...................................................................................................... 42 1.4.4 Народно-хозяйственное значение ...................................................... 44 1.4.5 Цитогенетика ........................................................................................ 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ........................................................................52 2.1 Характеристика объекта исследования ..................................................... 53 2.2 Методика изготовления давленых микропрепаратов и обработка результатов ......................................................................................................... 54 1

ГЛАВА 3. ЦИТОГЕНЕТИКА СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ИЗ УСМАНСКОГО БОРА ......................................................................................................57 3.1 Число хромосом........................................................................................... 57 3.2 Митотическая активность (МА) ................................................................ 58 3.3 Ядрышковая активность (ЯА) .................................................................... 60 3.4 Патологии митоза (ПМ) .............................................................................. 63 3.5 Микроядерный тест..................................................................................... 69 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................70 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ .....................................................72

2

ВВЕДЕНИЕ Изучать

изменчивость

вида

можно

по

разным

признакам:

морфологическим, биохимическим, физиологическим, цитологическим и др. Все они обеспечивают успешность естественного отбора, поэтому изучение изменчивости помогает получить ценную информацию о механизмах устойчивости вида к экстремальным условиям. Исключительно важное научное и практическое значение имеет проведение генетического мониторинга лесов, в том числе цитогенетического, по результатам которого можно судить как о состоянии самих лесов, так и о состоянии окружающей среды, что важно для принятия экологически грамотных решений по рациональному природопользованию и разработке природоохранных мер [1]. Изучение

разных

форм

изменчивости

в

автохтонных

лесах

представляет особый интерес, т.к. именно такие леса могут служить геноисточниками признаков высокой продуктивности и устойчивости. Их семена предпочтительно использовать при лесовосстановлении. Изучение изменчивости цитогенетических показателей у потомства деревьев автохтонных насаждений имеет очень важное значение, поскольку по ним можно судить о состоянии генетического аппарата у индивидов, их исходных форм и, косвенно, о состоянии насаждений, где произрастают последние.

Пределы

изменчивости

различных

цитогенетических

показателей отражают те условия внутренней среды организмов, при которых поддерживается гомеостаз системы. На изучении изменчивости цитогенетических показателей организмов основан цитогенетический мониторинг [2]. Использование древесных растений в качестве тестобъектов для цитогенетического мониторинга (особенно местных видов,

хорошо

адаптированных

к

условиям

существования)

целесообразно по нескольким причинам. Во-первых, это долгоживущие организмы, и с их помощью можно выявить отдаленные последствия воздействия каких-либо загрязнителей, а, кроме того, проследить 3

действие некоторого агента в течение длительного времени [3]. Необходимо также отметить тот факт, что чувствительность древесных растений приблизительно в два раза выше, чем у травянистых растений. Благодаря этому можно составлять прогнозы об угрозе здоровью людей в тех или иных регионах.

4

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Понятие о мониторинге состояния среды В связи с ростом обеспокоенности мировой общественности проблемой

изменения

природной

среды

существует

настоятельная

необходимость в разработке операциональных систем оценки ее состояния, ее благоприятности для живых существ и человека. Основной системой оценки состояния окружающей среды является мониторинг. Мониторинг - это система повторных наблюдений за изменениями в пространстве и во времени одного или нескольких элементов окружающей среды по заранее разработанной программе. В качестве таких элементов может быть климат, гидрологический режим, сейсмическая активность территории и т.п. Актуальность антропогенных изменений природной среды привела к необходимости получившей

создания

название

специальной

мониторинга

информационной

системы,

окружающей природной среды,

основными задачами которого являются наблюдения за факторами воздействия на окружающую среду и за состоянием среды, оценка фактического состояния в перспективе. По мнению Ю.А. Израэля [4], мониторинг - это система наблюдений, оценки и прогноза состояния природной среды, не включающая управления качеством окружающей среды. Блок - схема мониторинга представляет собой замкнутую систему, в которой результаты оценок фактического и прогнозируемого состояния окружающей среды служат исходной

базой

как

для

управления

качеством

среды,

так

и

совершенствования структуры и методов мониторинга. Термин

«мониторинг»

впервые

появился

в

рекомендациях

специальной комиссии СКОПЕ (Научный комитет по проблемам окружающей среды при ЮНЕСКО) в 1971 году, начал использоваться в Глобальной

системе

мониторинга 5

окружающей

среды

после

Стокгольмской конференции ООН 1972 г. и отличается от термина «контроль» тем, что кроме элементов наблюдения содержит элементы активных действий, регулирования и управления природопользованием и охраной природы. Целями мониторинга являются: сбор количественных и качественных показателей по состоянию окружающей среды, обобщение информации, оценка и их ранжирование по степени опасности, прогноз, возможных изменений [4]. Мониторинг включает в себя наблюдение, оценку и прогноз состояния природной среды под влиянием антропогенного воздействия с целью предупреждения о создающихся критических ситуациях, вредных или опасных для здоровья людей, благополучия других существ в природных или созданных человеком объектах [5]. 1.1.1 Типы мониторинга В настоящее время вопрос о мутагенных факторах в биосфере выдвигается в качестве крупнейшей проблемы. Установление степени мутагенности соединений, вводимых в окружающую среду человеком, важная составная часть мониторинга. Существующие физико-химические методы анализа проб воздуха, воды, почв и растительности на содержание загрязнителей и особенно на тяжелые металлы, пестициды, канцерогены и другие соединения не только чрезвычайно сложны и трудоемки, но и требуют больших финансовых затрат, кроме того, эти методы недостаточно надежны в экологическом отношении. Необходимо знать влияние загрязняющих соединений на растения, животных и человека. Мониторинг является основным средством контроля качества и состояния

среды [6]. Окончательно

программа глобальной системы

мониторинга окружающей среды (ГСМОС) была сформулирована в 1974 году в городе Найроби (Кения) на Первом Межправительственном Совещании Совета управляющих Программы ООН по проблемам окружающей среды 6

(ЮНЕП). В настоящее время в ГСМОС реализуется пять направлений мониторинга: 1. Климатический; 2. Дальнего переноса атмосферных загрязнителей; 3. Факторов, определяющих здоровье человека; 4. Океанологический; 5. Возобновляемых ресурсов суши. В зависимости от масштабов воздействия и охватываемой системой наблюдений территории выделяются несколько уровней мониторинга в мире: 1. Локальный; 2. Региональный; 3. Глобальный. Систему наблюдений, оценки и прогноза состояния природной среды в границах

отдельных

стран

принято

называть

национальным

мониторингом. Локальный (импактный) мониторинг предполагает слежение за факторами воздействия и реакцией отдельных элементов окружающей природной среды в пределах конкретной территории (города, источника выбросов и т.п.). Глобальный мониторинг включает систему наблюдений за процессами, едиными для всей биосферы и не испытывающими влияние местных источников загрязнения. В

связи

с

особой

биосферной

значимостью

и

повышенной

чувствительностью к изменению условий внешней среды в последние годы в промышленно-развитых странах придается большое значение мониторингу лесов [7], как составной части системы слежения за состоянием биоты. Слежение

за

абиотической

частью

биосферы

относится

к

геофизическому, а за биотической - к биологическому мониторингу. Структура биологического мониторинга строится с учетом уровней организации живого вещества, включая наряду с загрязнением биоты

7

изучение продуктивности биосферы, исчезающих видов животных и растений, генетический, биохимический, физиологический и экологический аспекты. Биологический мониторинг подразделяют на мониторинг загрязнения биоты, мониторинг продуктивности биосферы, мониторинг исчезающих и находящихся на грани исчезновения видов, мониторинг важнейших видов, популяций, сообществ и экосистем (генофонд) [2]. Главной целью биологического мониторинга является наблюдение, оценка и прогноз состояния абиотической составляющей биосферы (в том числе изменение уровней загрязнения природной среды), ответной реакции экосистем на эти изменения и антропогенные изменения в экосистемах [8]. Универсальным

является

понятие

экологического

мониторинга,

включающего вопросы биологического и геофизического, объединенных уровнем экологической системы. В

ходе

экологического

мониторинга

изучается

содержание

радионуклидов в почве, общее состояние экосистем, в частности лесных. Разнообразные

типы

мониторинга объединяет главный

принцип

-

непрерывность слежения. Очевидно, что мониторинг может осуществляться на разных уровнях. Классификация

принципов

и

уровней

биоиндикации

качества

окружающей среды может быть основана с учетом уровней организации живой материи [9]: 1) Молекулярный уровень биоиндикации. 2) Субклеточный и клеточный уровень биоиндикации. 3) Органный и организменный уровень биоиндикации. 4) Популяционный уровень биоиндикации. 5) Экосистемный или биогеоцентрический уровень биоиндикации. 6) Биосферный уровень биоиндикации. С другой стороны, классификация может производиться по общности подходов исследования: 8

1. Фенологические методы биоиндикации. Здесь отмечают нарушения феноритмов роста и развития растений и ускорение процессов старения организмов. 2. Морфо- и биометрические методы. Промышленные газы в определенном диапазоне (от 1 ПДК и выше) вызывают у растений появление некрозов (ожогов) на листьях и хвое, уменьшение линейного роста побегов, ускорение высыхания нижних ветвей в насаждениях ели, сокращение сроков жизни растений. 3. Анатомо-цитологические методы. Длительное или постоянное воздействие загрязнителя вызывает изменение анатомического строения листьев

растения,

увеличение

их

ксерофитации.

Замечено,

что

в

промышленных центрах у растений более мелкие и толстые листья, они имеют меньшую толщину верхнего эпидермиса, кутикулы. 4. Физиологические методы. Некоторые промышленные газы влияют на проницаемость мембран, а также на интенсивность фотосинтеза и дыхания. 5. Биохимические методы. Может измениться метаболизм углерода при фотосинтезе: увеличение синтеза С4-продуктов, снижение синтеза полимерных углеводов (сахароза, крахмал), идет деструкция белков, ведущая к накоплению органических кислот и свободных аминокислот. 6. Биофизические методы. К ним относят электрофизические методы

регистрации

рН,

электропроводности

и

электроемкости,

биолюминесценцию, спектральный анализ и другие. 7. Дендрохронологический метод. Установлена корреляция между уровнем загрязнения воздуха и изменением годичного прироста у ели и сосны. 8. Популяционные

и

экосистемные

методы.

Регистрируют

изменение различных параметров популяции: скорость размножения, возрастной состав, плотность, смертность особей и другие. 9

9. Генетические загрязнителей

методы.

изменяются

Установлено,

(следовательно,

что

под

подлежат

влиянием

регистрации)

митотическая активность, частота хромосомных аберраций и другие генетические характеристики. В общем виде функциональная схема мониторинга, которая может реализоваться на указанных уровнях, включает слежение за источниками и факторами антропогенного воздействия, а также реакцией составных частей биосферы на изменение среды. Таким образом, для получения заключения о качестве среды необходима интегральная характеристика ее состояния, учитывающая максимальное число уровней. При всей важности проведения такой оценки на всех уровнях, с применением различных подходов, приоритетной представляется именно биологическая оценка. В настоящее время мы имеем огромный

арсенал

методов

для

выявления

эффекта

различных

воздействий на состояние среды. Основная проблема состоит не в разработке новых методов, а в создании методологии, обеспечивающей критерии того, как сделать правильный выбор. Методология БИОТЕСТА как раз и предлагает возможный путь для выполнения этой задачи. С целью развития и практического использования методологии интегральной биологической оценки качества среды в 1989 году был организован Международный Комитет "БИОТЕСТ", на основе которого в дальнейшем был создан Международный Фонд "БИОТЕСТ". БИОТЕСТ использует широкий спектр независимых методов, которые оценивают эффективность гомеостаза развития: морфогенетические тесты, патологоанатомические и гистологические исследования ряда органов и тканей (морфологический подход); оценка процессов роста, тесты на интенсивность энергетического обмена (физиологический подход); оценка окислительного стресса и процессов фотосинтеза (биохимический подход); тесты на иммунную потенцию организма (иммунологический подход); тесты на мутагенную 10

активность (цитогенетический подход). Поскольку система БИОТЕСТА включает набор тестов, охватывающих различные стороны индивидуального развития организма, она обеспечивает разностороннюю интегральную оценку гомеостаза развития, состояния живых существ, качества среды в целом.

1.1.2 Цитогенетический мониторинг – эффективный способ оценки состояния окружающей среды и живых организмов Одним из направлений биомониторинга является генетический мониторинг, задача которого состоит в долговременном слежении за состоянием популяционных генофондов, оценке и прогнозировании их динамики во времени и пространстве, определении допустимых пределов изменений [10]. Цитогенетический мониторинг, базируясь на основных принципах генетического мониторинга и являясь его производной, ставит перед собой задачи по оценке и контролю за состоянием хромосомного комплекса организма в ходе митоза и мейоза при спонтанном и индуцированном мутагенезе

[11].

Необходимость

исследования

цитогенетического

мониторинга при оценке состояния живых организмов обусловлена возрастанием в окружающей обладающих

мутагенной

среде

количества

активностью

[12].

вредных

веществ,

Таким

образом,

цитогенетический мониторинг – это долговременное слежение за состоянием хромосомного аппарата клеток растений и животных, оценка и прогнозирование изменений в хромосомном аппарате, динамика этих изменений во времени, определение пределов допустимых изменений [13]. Также

можно

сказать,

что

цитогенетический

мониторинг

представляет собой системы мер слежения, оценки и прогнозирования состояния

цитогенетической

системы 11

(хромосомного

аппарата

в

митотическом и мейотическом циклах) при спонтанном и индуцированном мутагенезе. Основной целью цитогенетического мониторинга является обнаружение хромосомных мутаций в тест-системах, по чувствительности близких человеку и контроль за их фенотипическим проявлением и распространением в популяциях [14]. Методы цитогенетического мониторинга имеют ряд преимуществ: - применимы для значительного числа объектов и типов клеток; - непосредственно изучаются хромосомные мутации, которые могут служить косвенным показателем состояния окружающей среды; - можно наблюдать весь геном целиком непосредственно в микроскоп, что может сыграть важную роль в случае соединений, которые имеют специфические участки действия (так называемые «горячие точки») [15]; - позволяют оценить комплексное действие всех неблагоприятных факторов на генетический аппарат живых организмов в зависимости от дозы и времени их воздействия по реакциям генетического аппарата их соматических и генеративных клеток; - способны регистрировать отдаленные эффекты загрязнения окружающей среды (например, последствия радиоактивного заражения), отражающиеся на состоянии генетического статуса целых популяций [16, 17]; - методы достаточно просты, недороги, пригодны для широкого применения [8, 18], позволяют проводить прижизненную оценку особей (микроядерный тест); -

высокая

позволяющая

чувствительность

экстраполировать

цитогенетических

полученные

в

ходе

методов,

исследований

растительных и животных тест-объектов данные на человека [19]; - важное преимущество цитогенетического мониторинга состоит в том,

что

влияние

пороговых

величин 12

антропогенных

факторов

фиксируется не только по структурным перестройкам кариотипа, но и по изменениям функциональной активности генома клетки [16, 17]. Одной

из

цитогенетического исследования,

ключевых

задач,

мониторинга,

который

должен

предшествующих является

удовлетворять

проведению

выбор

тест-объекта

ряду

обязательных

требований: обладать высокой чувствительностью к разного рода воздействиям, выявлять все типы генетических повреждений, а также позволять экстраполировать полученные с помощью выбранной тестсистемы или тест-объекта данные на человека. Они должны также быть достаточно широко распространенными и доступными для исследования. Такими качествами обладают древесные растения, главное преимущество которых состоит в их долгожительстве и многолетнем произрастании на одном и том же месте, в возможности проводить долговременный скрининг состояния организма и, кроме того, отслеживать последствия перенесенных в ходе онтогенеза стрессов самой разной природы. Древесные растения широко используют в озеленительных зонах вокруг промышленных объектов, вдоль шоссейных дорог, т.е. в тех местах, где опасность антропогенного загрязнения особенно велика. Причем, хвойные породы обладают высокой чувствительностью, примерно сопоставимой с таковой у человека, что делает их наиболее выигрышными на фоне других организмов, позволяет экстраполировать полученные данные на человека [19]. Чаще других применяются сосна [20, 21], многие виды из родов Larix, Abies, Picea [22]. Среди лиственных древесных тест-объектов береза повислая выявлена как один из чувствительных видов для биоиндикации [23, 24]. Широкое использование видов хвойных древесных растений (в частности сосны обыкновенной) для целей биоиндикации антропогенного загрязнения окружающей среды обусловлено рядом причин.

13

Использование растений-биоиндикаторов для оценки состояния окружающей

среды

дает

возможность

получения

интегральных

характеристик реакции биоты на антропогенные воздействия и проведения скрининга мутагенности активности химических веществ [25]. Сосна

обыкновенная

широко

используется

в

озеленении

промышленных объектов и при создании санитарных зон. В природных сообществах сосна относится к эдификаторным видам, определяющим лицо фитоценоза и в существенной степени влияющим на жизнь других растений [26]. Отсутствие двойного оплодотворения и как следствие − гаплоидный макрогаметофит (эндосперм) позволяют обнаруживать мутации на ранних стадиях онтогенеза [27]. Кроме того, оценка уровня мутационного процесса (спонтанного и индуцированного) в популяциях хвойных видов на гаметическом и зародышевых уровнях может внести определенный вклад в разработку теории мутагенеза в применении к другим видам, где учет мутаций на этих уровнях развития затруднен в силу их биологии и этики, например, к человеку [19]. К тому же древесные растения с их ассимиляционным аппаратом приспособлены к значительно более низким концентрациям в атмосфере углекислого газа, в отличие от человека и животных и поэтому более чувствительны к концентрациям вредных веществ в воздухе. По этой причине растения особенно пригодны для обнаружения начальных вредных изменений в составе воздуха биосферы. Еще одно преимущество хвойных растений − длительность генеративного цикла. Если у большинства покрытосеменных видов репродуктивный цикл длится несколько месяцев, то у сосны с момента закладки генеративных органов до созревания семян происходит более двух лет. В условиях хронического действия антропогенных поллютантов столь длительный цикл развития семян даже при низких дозах 14

(концентрациях) приводит к накоплению достаточного для индикации внешнего воздействия количества повреждений ДНК [26]. Чрезвычайно важно также то, что хвойные породы обладают исключительно высокой чувствительностью к мутагенам химической и радиоактивной природы, что позволяет использовать их при оценке вреда различных агентов антропогенного загрязнения на человека [28]. Как и человек, хвойные подвергаются хроническому воздействию вредных веществ в течение ряда лет (возраст большинства хвойных древесных растений в среднем 100 и более лет), что делает их универсальным объектом для многолетнего мониторинга, позволяет выявить эффект длительного воздействия малых доз ингредиентов антропогенных выбросов и указать на мутагенность среды в реальном комплексе экологических факторов [29].

1.1.3 Критерии цитогенетического мониторинга Для выявления мутагенов среды используются разные тест-системы и объекты. Причем на каждом объекте используется один из критериев, возможных для применения при этом способе оценивания состояния окружающей среды. Это, в основном, аберрации хромосом и сестринские хроматидные

обмены,

оценка

частоты

анеуплоидных

клеток,

микроядерный тест. Но данные критерии не во всех случаях применимы и, ко всему прочему, дорогостоящи. Из-за этого дополнительно к ним необходимо

использовать

и

разрабатывать

новые

критерии

для

интегральной оценки, такие, например, как усиление или угнетение митотический активности, задержка клеток на стадии метафазы митоза (может быть профазы), ядрышковая активность, замена митоза на амитоз и другие [30]. Суммарное использование ряда этих критериев на одном тестобъекте поможет увеличить пределы его чувствительности, а также, 15

возможно, и снять проблему подбора нескольких тест-объектов для адекватной оценки загрязнения среды. Наиболее

чувствительным

критерием

является

ядрышковая

активность [31]. Однако увеличение числа ядрышек не всегда отражает силу воздействия стрессового фактора. Например, у видов с небольшим количеством хромосом с ядрышковыми организаторами. Здесь число ядрышек может варьировать вне зависимости от силы воздействия стрессового фактора. В связи с этим у данных видов определяют не количество ядрышек, а их размеры. В общем же случае в ответ на сравнительно небольшое воздействие идет увеличение числа ядрышек в соотношении 1:3, что свидетельствует об интенсификации обменных процессов [32]. Следующим по чувствительности критерием является присутствие остаточных ядрышек в метафазе, анафазе и телофазе митоза [33]. Рядом авторов

показывается

их

появление

при

вирусной

инфекции

и

патологических процессах, а также под влиянием некоторых физических и химических мутагенов [34]. Данное явление проявляется в определенном интервале доз мутагенов, поэтому его часто используют как удобный критерий для измерения степени загрязнения. Но применять этот критерий следует осторожно, так как возможна встречаемость остаточных ядрышек у некоторых видов при нормальном течении митоза, в пики митотический активности, при интродукции. Нарушения

митоза,

связанные

с

повреждением

хромосом,

встречаются при более высоких дозах загрязнителя, и критерий является менее чувствительным, чем представленные выше [35]. Из-за сложной зависимости между дозой поллютанта и выходом хромосомных аберраций этот критерий не всегда можно использовать для построения кривой “дозаэффект”, в отличие от выхода количества мутаций на единицу дозы. Однако, метод учета хромосомных аберраций как на стадии метафазы, так 16

и в анафазе дает возможность получить подробную информацию о наличии

или отсутствии,

частоте и пролиферативной

активности

клеточных клонов, позволяет косвенно охарактеризовать иммунный статус организма,

предоставляя

стабильность

организма.

возможность Аберрации

оценить хромосом,

цитогенетическую возникающие

в

соматических клетках, есть результат повреждения хромосом на разных стадиях клеточного цикла. Клетки, несущие хотя бы одну аберрацию у диплоидных организмов, как правило, погибают. Увеличение частоты клеток с несбалансированными перестройками хромосом говорит о существенном воздействии некоторого фактора или комплекса факторов на организм. Тем не менее, при снятии острого воздействия через некоторое время происходит снижение частоты аберрантных клеток. В случае

же

продолжительного

воздействия

каких-либо

факторов

последствия могут быть существенно иными. Например, увеличение частоты аберрантных клеток может в ряде случаев приводить к образованию устойчивых клеточных клонов, что может явиться причиной для различного рода новообразований. На основании данных о типах различных аберраций хромосом и хроматид, их частоте, можно в ряде случаев вычленить существенный мутагенный фактор из комплекса действующих. Повышение частоты встречаемости сестринских хроматидных обменов может вызываться дозами мутагенов, недостаточными для увеличения частоты аберраций хромосом, что позволяет использовать тест на

сестринские

Сестринские

хроматидные

хроматидные

обмены

обмены

как

более

представляют

чувствительный. собой

следствие

рекомбинаций в гомологичных участках сестринских хроматид, включая обе нити двойной спирали ДНК во время репликации. Они в определенной мере являются отражением гомеостатичных процессов, происходящих в организме. Почти все хромосомповреждающие агенты являются более или 17

менее активными индукторами сестринских хроматидных обменов. Часто совпадают и места локализации сестринских хроматидных обменов и хромосомных аберраций, но данный феномен носит скорее всего случайный характер. Методом регистрации изменения частоты сестринских хроматидных обменов возможно сравнительно быстро получить результаты, так как он позволяет сделать первичное заключение на основании анализа всего нескольких клеток. В качестве надежной характеристики воздействия, применяемой для индикации перехода порогового значения экзогенным фактором, можно использовать увеличение спектра аномалий митоза. Это может выглядеть после определенного воздействия следующим образом: мосты, отставания хромосом в метакинезе, в анафазе, слипание хромосом. Депрессия митотической активности, как показатель, определяющий стрессовое воздействие среды, может применяться только при высоких значениях доз загрязнителя [36]. Стимуляция митотической активности может проявляться при более слабых стрессовых воздействиях по сравнению с депрессией. Возможно проявление эффекта стимуляции митотической активности при синергическом воздействии поллютантов и последствием радиации, когда значения каждого взятого в отдельности загрязнителя не превышают ПДК. Все это позволяет рассматривать стимуляцию митотической активности как достаточно чувствительный и сравнимый с ядрышковой активностью в некоторых случаях. Однако митотическая активность подвержена значительным колебаниям в течение суток (циркадные ритмы) [37], которые и определяются, в том числе и экзогенными факторами. Таким образом,

при использовании критерия

митотической активности надо сначала изучить циркадные ритмы. Микроядерный тест считается прямым тестом на радиацию, но появление микроядер может быть и при действии некоторых Sнезависимых

факторов.

Микроядра 18

представляют

собой

округлые

хроматиновые

тельца,

выявляемые

в

виде

небольшого

размера

дополнительных ядер в цитоплазме. Они образуются в результате нерасхождения хромосом в метакинезе к полюсам, а также в анафазе и т. д. Образование микроядер может служить показателем нестабильности генома, четким показателем мутагенеза [38]. Увеличение числа клеток с микроядрами сопровождается подавлением митотической активности, слипанием и отставанием хромосом, аномалиями веретена, образованием хромосомных мостов, конденсацией хромосом и хроматидными разрывами [39]. При высоких концентрациях мутагена нарушается линейный характер числа микроядер в зависимости от дозы мутагена. Токсические дозы могут приводить к ингибированию деления клеток и их гибели с уменьшением регистрируемого числа клеток с микроядрами [40, 41]. Микроядерный тест эффективен для оценки хронических мутагенных воздействий, при скрининге и мониторинге естественных популяций [40]. Сравнительная быстрота и простота в проведении, независимость от кариотипа исследуемого вида, содержащего иногда большое количество мелких плохо различимых хромосом, а также возможность поводить тестирование в тканях с низкой митотической активностью, делают его удобным методом изучения генотоксичности факторов окружающей среды [38, 39]. Кроме того, для подсчета клеток с микроядрами можно использовать различного рода автоматические анализирующие

системы,

что

дает

возможность анализировать большие выборки. Однако данный тест имеет и недостатки, так как он не позволяет точно установить тип хромосомных аберраций и идентифицировать хромосомы, в которых они произошли. Поэтому

допустимо

предположение,

что

этот

критерий

менее

чувствителен, чем тест на аномальное протекание митоза, связанное с повреждением хромосом [36].

19

1.2 Информативность митоза как основного типа деления клеток пролиферирующей ткани для оценки состояния генетического аппарата организмов Исследование мейотических

особенностей

циклов

позволяет

цитогенетической

системы

(фенотипических)

проявлений

протекания выявлять

организма, этих

ранние

когда

еще

изменений,

дальнейшее состояние системы в меняющихся

митотических

и

нет

и

изменения видимых

прогнозировать

условиях окружающей

среды.

1.2.1 Митоз в норме Митоз – непрямое деление клетки; образующиеся дочерние клетки несут такую же генетическую информацию, как и материнская клетка [42, 43]. У клеток, вступивших в цикл деления, фаза собственно митоза занимает относительно короткое время, всего около 0,1 времени клеточного деления [44, 45]. Процесс непрямого деления клеток принято подразделять на несколько основных фаз: профаза,, метафаза, телофаза и анафаза [46]. Границы между этими фазами установить точно очень трудно, потому что сам митоз – непрерывный процесс, и смена фаз происходит очень постепенно: одна из них незаметно переходит в другую. Единственная фаза, которая имеет реальное начало это анафаза – начало движения хромосом к полюсам [47]. Длительность отдельных фаз митоза различна, наиболее короткая по времени – анафаза. В профазу клетки вступают из G2–периода интерфазы, и они после репликации в S – периоде содержат двойное количество ДНК (4с) по сравнению с исходной клеткой в G1-периоде, соответствующее таковому у тетраплоидной клетки.

20

В начале профазы в ядре начинают выявляться

тонкие нити –

профазные хромосомы. Параллельно конденсации хромосом происходит исчезновение, дезинтеграция ядрышек, разрушается ядерная оболочка. Затем образуется веретено деления. По мере прохождения метафазы все хромосомы собираются в центральной экваториальной части веретена деления, образуя так называемую метафазную пластинку, при этом центромерные участки хромосом обращены к центру веретена, а плечи – к периферии. Главными

событиями

анафазы

являются

сегрегация

двух

идентичных наборов хромосом и транспорт их в противоположные концы клетки к полюсам. На стадии телофазы начинает строиться новая ядерная оболочка, после замыкания которой начинается формирование новых ядрышек.

1.2.2 Типы нарушений митоза Нарушение

нормального

течения

митоза

распределение

хромосом

между

возникновению

клеток

несбалансированным

с

дочерними

и

неправильное

клетками набором

ведет

к

хромосом.

Патологический митоз – один из способов возникновения мутаций и развития анеуплоидии. Органические нарушения митоза возникают при повреждении структур (хромосомы, митотический аппарат), участвующих в делении, и связанных с этими структурами процессов (редупликации ДНК, движения хромосом, цитотомии и др.). Один из возможных вариантов классификации патологий митоза предложил А.И. Алов (1972): I.

Патологии митоза, связанные с повреждением хромосом.

1. Задержка митоза в профазе. 21

2. Нарушение спирализации и деспирализации хромосом. 3. Раннее разделение хроматид. 4. Хромосомные и хроматидные мосты. 5. Отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам. 6. Фрагментация хромосом. 7. Образование микроядер. 8. Нерасхождение хромосом. 9. Набухание и слипание хромосом. II.

Патологии, связанные с повреждением митотического аппарата.

1. Задержка митоза в метафазе. 2. К-митоз. 3. Рассеивание хромосом в метафазе. 4. Многополюсный митоз. 5. Моноцентрический митоз. 6. Асимметричный митоз. 7. Трехгрупповая метафаза. 8. Полая метафаза. III.

Нарушение цитотомии.

1. Запаздывание или отсутствие цитотомии. 2. Преждевременная цитотомия. Данная классификация основана не только на морфологических признаках патологического митоза, но и на цитохимических нарушениях митоза, характерных для трех основных групп патологий этого процесса. Задержка митоза в профазе часто наблюдается при процессах нарушения редупликации хромосом. Такие изменения в течение деления клетки обычно наблюдаются при разных воздействиях, нарушающих синтез ДНК (воздействия пуриновых и пиримидиновых оснований и их аналогов, хлорэтиламина, этиленамина и 22

др.). Задержка митоза в профазе, вызванная различными препрофазными ядами, является частью их радиолитического действия. Нарушения спирализации и деспирализации хромосом изучены пока слабо.

Эти

изменения

прослеживаются

при

действии

различных

митотических ядов. Классический пример подобных поражений – влияние на деление клетки колхицина, который, вызывая гиперспирализацию хромосом, ведет к формированию укороченных и утолщенных хромосом [48, 49]. Нарушение нормального течения профазы может выражаться в преждевременном разделении сестринских хроматид. Как известно, редупликация хромосом идет во время синтетического периода интерфазы, а разделение сестринских хроматид осуществляется в норме только в поздней метафазе при переходе ее в анафазу. При некоторых нарушениях хода митоза разделение хроматид идет уже в профазе. Фрагментация хромосом и образование ацентрических фрагментов чаще всего возникает в опухолях, при вирусной инфекции, а также при действии на клетки ионизирующего излучения и других мутагенов. Фрагменты, получающиеся в этих случаях, могут быть одиночными, парными и множественными. Парные фрагменты возникают в случае сохранения ими способности к редупликации. Большинство фрагментов лишены центромеры и кинетохора, участвующих в движении хромосом. Поэтому ацентрические фрагменты остаются неподвижными и отстают при движении хромосом во время метакинеза и при расхождении к полюсам. При массовой фрагментации хромосом фрагменты беспорядочно рассеяны по цитоплазме и не участвуют в общем движении хромосом. Иногда они сосредотачиваются вокруг веретена деления или даже проникают между его нитями, но никогда не собираются в экваториальной плоскости. Судьба фрагментов различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, могут образовать дополнительное микроядро. Фрагменты 23

могут воссоединяться своими концами, соединение имеет случайный характер и ведет к хромосомным аберрациям: делециям, инверсиям, транслокациям и дупликациям [50]. Мосты

являются

воссоединении

следствием

фрагментов,

фрагментации

содержащих

хромосом.

центромеру,

При

образуется

дицентрическая хромосома, которая испытывает воздействие обоих митотических центров и, растягиваясь между группами дочерних анафазных или телофазных хромосом, образует мост. При воссоединении двух разорванных хромосом возникает хромосомный (обычно двойной) мост, а при воссоединении сестринских хроматид – хроматидный мост (обычно одинарный). В телофазе в связи с растягиванием дицентрических хромосом они довольно быстро рвутся. Но мосты могут и длительно сохраняться в ряду клеточных поколений. Такая устойчивость связана с повторением циклов “разрыв – воссоединение – мост”. После разрыва моста в телофазе в каждой из дочерних клеток вновь соединяются разорванные концы, и дицентрические хромосомы восстанавливаются. Мост, разорвавшийся в телофазе, обнаруживается в про- и метафазе следующего митоза в виде бокового жгута из истонченных концов нескольких

хромосом

(полумосты).

Они

неподвижно

лежат

в

экваториальной плоскости, то есть там, где предыдущем митозе разорвался мост.

Образование

мостов

ведет

не

только

к

генотипической

разнородности дочерних ядер, но и нарушает течение завершающей стадии митоза, углубляя патологию. Появление моста задерживает цитотомию. Между дочерними клетками длительно сохраняется цитоплазматическая перетяжка, а внутри нее проходит мост, связывающий дочерние ядра и сохраняющийся иногда в интерфазе. Отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникает при повреждении кинетохора. Такие хромосомы “дрейфуют” в цитоплазме, не совершая движения к экваториальной пластинке. На стадии 24

телофазы такие хромосомы либо оттесняются в одно из дочерних ядер, либо элиминируются из клетки, либо формируют добавочные микроядра [51]. Отставшие хромосомы скручиваются, переплетаются между собой и деспирализуются. Между их петлями накапливается гомогенное вещество, а вокруг формируется ядерная оболочка, образование которой завершает развитие микроядра. Если микроядро формируется ядрышкообразующей хромосомой, то в нем возникает ядрышко. Дальнейшая судьба микроядер неодинакова. Одни из них разрушаются и выводятся из клетки, другие проходят полный клеточный цикл. Как и в основном ядре, в микроядрах идет редупликация ДНК и синтез РНК. Микроядра обладают также способностью вступать в “митоз”. В них может идти спирализация хромосом и возникать типичная картина профазы. Профазная перестройка микроядер возникает либо одновременно с основным ядром, либо чаще асинхронно, и эти изменения наблюдаются как в микроядрах с ядрышком, так и без него. В конце профазы оболочка микроядра разрушается, и хромосомы сначала формируют обособленную экваториальную пластинку, которая позже сливается с общей. Так как хромосомы микроядер собираются в метафазную пластинку, можно предположить, что в течение развития

микроядер

восстанавливается

функциональная

активность

центромер [50]. Вероятно, за счет “митотического” цикла микроядер в клетке сохраняется генетический материал поврежденной хромосомы, и, возможно,

частично

восстанавливается

активность

некоторых

ее

хроматиды

не

компонентов. При

нерасхождении

хромосом

сестринские

разъединяются, а вместе отходят к одному из полюсов. Это ведет к увеличению хромосомного набора одного из дочерних ядер за счет уменьшения другого на одну хромосому. Нерасхождение связывают с

25

нарушением разъединения центромерной области или с частичной дезорганизацией хромосомных нитей веретена. Набухание и склеивание хромосом часто встречается в опухолевых клетках и при действии токсических доз различных митотических ядов. Набухая, хромосомы утрачивают свои правильные очертания и, склеиваясь поверхностями, образуют комковатые массы. Расхождения хромосом не происходит, и клетки в таком состоянии очень часто гибнут. Для всей группы патологий митоза, связанных с повреждением митотического аппарата, характерна задержка митоза на стадии метафазы. Примером подобных изменений может служить К-митоз. К-митоз характеризуется блокадой деления клетки в метафазе в связи с повреждением митотического аппарата. Остановку митоза в метафазе вызывает не только колхицин, но и другие статмокинетические яды (колцемид, аценафтен, метанол и др.). К-метафазы бывают разного вида, но всегда носят патологический характер [50]: 1. Метафазы с хромосомами, рассеянными по цитоплазме или по периферии клетки. 2. Хромосомы, склеенные в неправильную комковатую метафазную пластинку. 3. Шаровидная звезда (“шар-метафаза”). 4. «Звезда» - метафаза, где хромосомы расположены в виде звезды, их центромерные районы очень плотно сгруппированы (иногда слипаясь) в центре, а плечи лежат свободно по периферии. 5. Метафаза, представленная несколькими группами хромосом (“псевдометафаза”), обособленных друг от друга. После воздействия колхицина на клетки чаще наблюдаются метафазы первых трех типов. Преобладание того или иного типа зависит от вида клеток, от времени действия и дозы ядов. Задержка в метафазе при К-митозе

связана

с

нарушением 26

и

дезорганизацией

различных

компонентов митотического аппарата: центриолей, веретена деления и центромер. Действие колхицина нарушает расхождение центриолей, которые остаются в центре и не поляризуют митотический аппарат. В зависимости от времени действия и дозы колхицина в большей или меньшей степени дезорганизации подвергаются микротрубочки. Вероятно, разные компоненты митотического веретена обладают неодинаковой устойчивостью

к

действию

статмокинетических

ядов.

Наиболее

чувствительны нити лучистых сияний, менее – нити веретена деления, наиболее устойчивы хромосомы [50]. Колхицин вызывает также задержку разделения центромер. При этом плечи хроматид отходят друг от друга, а связь в районе центромеры остается – образуются так называемые “Кпары”. Для К-митоза характерны и изменения хромосом. При этом короткие хромосомы сокращаются еще больше, чем длинные. При сильном воздействии статмокинетических ядов может происходить набухание и слипание хромосом, а также образование хромосомных аберраций с развитием микроядер и возникновением анеуплоидных клеток. При К-митозе могут также нарушаться процессы цитотомии. Исход К-митоза зависит от интенсивности воздействия яда. Эта патология ведет либо к пикнозу ядра и гибели клетки (токсические дозы), либо к полиплоидизации клетки, либо к восстановлению митотического аппарата. Рассеивание хромосом в метафазе, связанное с повреждением или полной дезорганизацией митотического аппарата, может возникать после действия статмокинетических ядов и в ряде патологических процессов – спонтанно. Многополюсный митоз связан с аномалией репродукции центриолей. Для него характерно образование нескольких полюсов и веретен деления. Это ведет к возникновению анеуплоидии. Моноцентрический митоз тоже связан с нарушением разделения центриолей. Образуется только один полюс с веретеном, соответствующим 27

половине обычного. При этом идет разделение хромосом на хроматиды, но последние не отходят далеко друг от друга и формируют единую группу, из

которой

образуется

одно

полиплоидное

ядро.

При

каждом

последующем митозе полиплоидия возрастает. Асимметричный митоз характеризуется неравномерным развитием противоположных митотических центров и связанных с ними конусов веретена деления. В ана- и телофазе группы дочерних звезд имеют разный размер. Трехгрупповая метафаза отличается тем, что клетка содержит, кроме обычной экваториальной пластинки, две дополнительные группы или одиночные хромосомы (“полярные” хромосомы), расположенные у полюсов. Возникновение такой метафазы связано с отставанием некоторых хромосом в метакинезе. Это связано с повреждением центромеры или с дезорганизацией отдельных нитей веретена деления. Трехгрупповая метафаза ведет к анеуплоидии или к образованию многоядерной клетки и пикнозу. Полая метафаза имеет вид широкого кольца хромосом, которые, собираясь в метафазную пластинку, располагаются по периферии клетки. Возникновение и наследование этой патологии пока неясны. Третья

группа

патологий

митоза,

связанная

с

нарушением

цитотомии, изучена пока слабо [50]. Сейчас известно только два типа митоза, при которых идет преждевременная или поздняя цитотомия.

1.3 Усманский бор – ценный лесной массив природного происхождения Среди сохранившихся сосновых лесов в Воронежской области Усманский бор является одним из крупнейших. В соответствии с Лесным кодексом РФ (2007) они выделены в категорию особо ценных лесов [52]. 28

А ещё 19 мая 1927 года Совнарком утвердил индивидуальное положение о Воронежском государственном охотничьем бобровом заповеднике республиканского значения. На заповедной территории запрещались всякие рубки, охота и рыбная ловля. В 1934 году заповеднику принадлежит уже 31 тысяча гектаров из 61 тысячи, занятой всем Усманским

бором.

В

первые

годы

существования

заповедника

деятельность его работников сводилась к охране бобра и леса. Расстроенным досталось заповеднику и лесное хозяйство, ибо за четыре предшествующих столетия здесь неоднократно вырубалась самая ценная порода бора – сосна. Сосняки восстанавливались естественным путем, затем – культурами, но значительная территория оставалась занятой малоценными

березняками

и

осинниками.

Первобытных,

дохозяйственных лесов даже на заповедной половине бора было очень мало, но они служили образцами: перед взором лесоводов был самый удачный опыт природы, создавшей на почти бесплодных песках свое замечательное творение – Усманский бор [53].

1.3.1 Местоположение Усманский бор (51' 51'с.ш. и 39' 30' в.д.) расположен на западной окраине Окско-Донской равнины, в водоразделах рек Воронеж и Усмань на площади около 71 тыс. га. Южная часть леса, близкая к г. Воронежу, служит зоной отдыха, остальная часть входит в состав Воронежского государственного заповедника [54]. Заповедник используется в качестве лесосеменной базы для Центрально-Черноземного региона, поэтому надо знать качество используемых семян. Усманский бор называют эталонным бором, где сосна обыкновенная произрастает в оптимальных для этого вида почвенно-климатических условиях и при отсутствии антропогенного загрязнения.

Современный

рельеф 29

Окско-Донской

равнины

сформировался в верхнечетвертичный период в результате повсеместного поднятия суши. Это сопровождалось углублением долин и образованием уступов третьей, второй и первой надпойменных террас. Террасы – это прежние поймы, уже не подтапливаемые паводковыми водами и покрытые аллювиальными отложениями [55]. Средний возраст насаждений около 80 лет, высота насаждений составляет около 20-30 м. Лесообразующие породы – Pinus sylvestris L. (сосна обыкновенная (48% покрытой лесом площади)), Quercus robur L. (дуб черешчатый (33%)), Populus tremula L. (тополь дрожащий, осина) и Alnus glutinosa (L.) Gaertn. (ольха клейкая) (19%). 1.3.2 Состав почв Возраст аллювиальных отложений колеблется от 45 тыс. (у третьей террасы), до 12 тыс. лет (у первой), соответственно разновозрастным является

их

почвенный

покров,

сформированный

в

процессе

почвообразования аллювиального слоя: от 11 тыс. лет (на третьей террасе) до двух тыс. лет (на первой). Почвенный покров надпойменных террас неоднороден и образует простые и сложные комбинации почв. На основных площадях нижних террас, где расположен Усманский бор, преобладают светло-серые, серые и темно-серые лесостепные почвы [56, 57]. 1.3.3 Природоохранная роль Природоохранная

деятельность

в

Усманском

бору

была

разнообразна и многопланова. Она была организована многими учёными, так В.А. Комаров разработал методику отлова оленей и лосей для расселения и мечения с помощью малокалиберных винтовочных пуль, снаряженных обездвиживающими составами. Вскоре этот метод был запатентован в Англии, США, Франции и Канаде. А лаборатория 30

продолжает вести работу с другими видами животных (около двадцати), совершенствовать методику, консультировать и оказывать практическую помощь научно-исследовательским институтам, другим заповедникам, охотничьим хозяйствам, занимающимся отловом и расселением копытных, аналогичным организациям и учреждениям стран. С

начала

своей

деятельности

заповедник

вел

не

только

природоохранительную, но и научную работу. Помимо фундаментальных исследований по биологии бобра здесь был выполнен целый ряд работ по лесоведению, энтомологии, зоологии, ботанике. Большую роль в организации

и

становлении

заповеднике

сыграли

ученые

научно-исследовательских воронежских

вузов,

работ

в

проводившие

собственные многолетние исследования, дававшие научные консультации. Так,

профессор

ВГУ

И.И.

Барабаш-Никифоров

совместно

с

Н.К. Павловским провели фаунистическое обследование заповедника и дали полное описание его животного населения. Тесно была связана с заповедником и научная работа лесовода профессора ЛТИ М.М. Вересина, который занимался сосной [53]. Усманский бор имеет почвозащитное и водоохранное значение, входит в зеленую зону г. Воронежа и используется в рекреационных целях.

1.3.4 Представители флоры и фауны Усманский бор действительно уникален. Ботаники насчитали здесь 133 вида деревьев и кустарников, более 900 видов трав. Также здесь обитают 55 видов зверей, от крошечных землероек и летучих мышей до оленей и лосей, 200 видов птиц, от королька и крапивника до серого журавля и орла-могильника, гнездятся, живут оседло, останавливаются в лесу и на реках во время пролета, зимуют [53].

31

Растительность

Усманского

бора

отличается

большим

многообразием типов леса, что связано со сложным микрорельефом, неодинаковым залеганием грунтовых вод, особенностями почвенного покрова. К первой и второй надпойменным террасам р. Воронеж приурочены, главным образом, три типа леса: сухой бор, свежий бор и свежая суборь [54]. В настоящее время древостой урочищ дубово-зеленомошноразнотравных сосняков в заповедной части бора имеет возраст от 100 до 150 лет. Первый ярус образуют прямоствольные сосны высотой до 30 м и диаметром 38 см. Второй ярус составляет дуб высотой 23 м, диаметром до 24 см. В более влажных местах к дубу примешивается береза. В кустарниковом покрове произрастает рябина, бересклет бородавчатый, ракитник. Отмечается хорошо развитый подрост сосны и дуба. В напочвенном покрове – осока верещатниковая, вероника седая, кошачья лапка, зеленые мхи [55]. Урочища

сосняков

зеленомошников

(свежих

боров)

по

занимаемой площади стоят на втором месте. Они произрастают на подзолистых почвах в заповедной части Усманского бора [56]. В первом ярусе деревья сосны имеют высоту до 33 м и диаметр 52 см. Местами примешивается береза. Возраст деревьев – более 100 лет. Подлесок развит слабо. В напочвенном покрове преобладают зеленые мхи Шребера, дикранум, также встречаются грушанка, брусника, земляника, герань кровяно-красная, вейник, типчак [57]. Таким образом, Усманский бор является одним из крупнейших массивов Черноземного Центра, с преобладанием сосны, как основной древесной породы.

32

1.4 Сосна обыкновенная как одна из основных лесообразующих пород в Воронежской области Сосна

обыкновенная

sylvestris

(Pinus

L.)

является

видом,

занимающим на территории России, особенно в европейской ее части, обширный ареал (17% от всех древесных пород в общей площади лесов России). Наряду с дубом черешчатым (Quercus robur L.) она является одной из основных лесообразующих пород в Воронежской области [58]. В целом по ЦЧР сосна занимает около 30% лесопокрытой площади и площадь ее распространения постепенно растет [59]. Это происходит потому,

что

на долю

лесокультурных

работ.

сосны

приходится до

Однако

площадь,

2/3

занятая

объемов

всех

естественными

сосняками, катастрофически сокращается [60]. 1.4.1 Систематическое положение cосны обыкновенной Отдел

Pinophyta

Сосновидные

(Gymnospermae)

(Голосеменные)

Подотдел

Pinicae

Сосновые

Класс

Pinopsida (Coniferae)

Сосновые (Хвойные)

Порядок

Pinales

Сосновые

Семейство

Pinaceae Lindl.

Сосновые

Род

Pinus L.

Сосна

Подрод

Pinus

Сосна

Вид

Pinus sylvestris L.

Сосна обыкновенная [61, 62]

Сосна обыкновенная – один из многочисленных видов р. Pinus, занимающих на территории России, особенно в европейской ее части, обширный

ареал

[63].

Широкий 33

диапазон

мест

произрастания

способствовал

образованию

у

сосны

обыкновенной

свыше

20

географических рас и порядка 100 форм и разновидностей. Это исключительно полиморфный вид, что позволило Л.Ф.Правдину [64] выделить в пределах Pinus sylvestris L. 5 подвидов: 1) subsp. sylvestris L. – сосна обыкновенная, лесная; 2) subsp. hamata (Steven) Fomin – сосна крючковатая или кавказская; 3) subsp. lapponica Fries – сосна лапландская; 4) subsp. sibirica Ledebour − сосна сибирская; 5) subsp. kulundensis Sukaczev −

сосна

степная

или

кулундинская.

В

пределах

подвидов

по

морфологическим критериям и приуроченности к определенному региону или типу местообитания выделен 21 климатический экотип [65]. В соответствии с классификацией Л.Ф.Правдина, сосна Усманского бора относится к подтипу обыкновенная. С.А. Мамаев [66] в результате фундаментального изучения фенотипической изменчивости древесных растений семейства Pinaceae Lindl.

дал

подразделение

большинством индивидуальная,

форм

исследователей

в

хронографическая,

изменчивости, СНГ:

ныне

половая,

экологическая,

принятое эндогенная,

географическая,

гибридогенная. Однако фенотипический анализ изменчивости древесных растений при большом шаге между выборками не позволяет выявить положение границ природных популяций, которые лишь гипотетично намечаются в направлении сравнительно быстрого изменения (градиента) признаков. А.И. Чернодубовым с помощью метода главных компонент показано, что 56% общей дисперсии признаков у сосны обыкновенной связано с изменчивостью изоферментов, 22% − с размерами шишек, а 9,2% − с монотерпенами. В совокупности эти факторы обусловили свыше 87% общей изменчивости [67]. Таким образом, вопрос о таксономическом статусе подвидов P. sylvestris и близкородственных видов нельзя считать исчерпанным [68]. 34

Решение

проблемы

возможно

лишь

на

палеогеографической

и

популяционно-генетической методологической основе в сочетании с комплексом количественных фенотипических методов [69]. 1.4.2 Биология Сосна обыкновенная наиболее распространена в России. Начиная со средней полосы, она произрастает во всех регионах. Сосновые древостои имеют своеобразный вид: обилие в них света, ажурность крон полога, яркие стволы, смолистый запах. Сосна обыкновенная имеет широкий диапазон приспособительных возможностей, растет на сухих песчаных почвах, болотах. Некоторые варианты хорошо переносят засоление почв, другие кальциефильны и растут на меловых выходах [70, 71]. Жизненной формой у сосны является дерево. Ствол у сосны в насаждениях стройный, прямой, как правило, высоко очищенный от сучьев; на просторе менее высокий, с низко расположенной кроной. В молодости крона у таких деревьев конусовидная, позже становится округленной или зонтиковидной, более плоской. Кора в разных частях дерева отличается по цвету и толщине. Нижняя часть дерева покрыта толстой, глубокобороздчатой, красновато-бурой корой, верхняя часть ствола и крупные ветви - тонкой оранжевой отслаивающейся пленкой, а молодые сосны и тонкие ветви гладко покрыты серо-зеленой корой. Молодые побеги вначале зеленоватые, позже желто-серые, двулетние серо-коричневые. Побеги нарастают моноподиально. Почки у сосны засмоленные, красновато-бурые, удлиненно-яйцевидные, острые, длина их 6-12 мм располагаются на концах побегов мутовками. Хвоя сизо-зеленого цвета, расположена на побегах спирально, в пучках по две, в основании окружена влагалищами из чешуи. С внутренней стороны она плоская, с наружней выпуклая, жесткая, на верхушке заостренная, по краям мелкопильчатая. Устьицы располагаются рядами на обеих сторонах хвои, 35

но обильнее на плоской. Если же говорить о корневой системе, то у сосны, в соответствии с морфологическим и анатомическим строением, а также физиологическими функциями, выделяют три типа корней: ростовые, проводящие и поглощающие (сосущие) [72, 73]. Сосна обыкновенная – однодомное разноспоровое растение. Сосна приступает к спороношению в среднем на 30–40-м году жизни (при одиночном

стоянии

–

на

15–30-м

году

жизни).

Макростробилы

приурочены к верхней части кроны, а микростробилы – к нижней. Мужские шишечки появляются на 2-3 дня раньше женских, они имеют вид небольших (5-7 мм длиной) овальных желтых или красноватых колосков, густо скученных у основания молодых побегов. Каждая шишечка имеет продольную ось, к которой прикрепляются микроспорофиллы, с нижней стороны несущие микроспорангии, в которых развивается пыльца (микроспоры). Пыльца бобовидной формы, с двумя воздушными мешками, заключена в пыльниках тычинок, способна разноситься на далекие расстояния (до 1 км). Женские шишечки имеют красноватый вид, овальную форму длиной 5-6 мм. По 1-3 таких шишечек развиваются на верхушке растущих молодых побегов. Каждая шишечка имеет до 30-40 чешуек, оканчивающихся острым клювовидным островком, и такое же число более мелких кроющих чешуек, в пазухах которых находятся семенные чешуи с двумя семяпочками. Семяпочка - это овальное образование, состоящее из основной ткани, называемой нуцеллусом, и оболочки

или

покрова,

называемого

интегументом.

Интегумент,

полностью не срастаясь, образует на вершине отверстие или пыльцевход, именуемый микропиле [74]. Прорастание

микроспор

начинается

внутри

микроспорангия.

Первоначально одноклеточная и одноядерная микроспора начинает делиться [75]. Первое деление длится 3-4 дня и завершается образованием антеридиальной и первой проталлиальной клеток, последняя через 2-3 дня 36

разрушается. Второе деление мужского гаметофита происходит через 1-2 дня после завершения первого. В это время у сосны проталлиальные клетки почти полностью разрушаются. В результате второго деления от антеридиальной клетки отчленяется вторая проталлиальная клетка. Третье деление мужского гаметофита обычно наступает вскоре за вторым, за 1-2 дня перед началом вылета пыльцы. После третьего деления образуется уже генеративная и сифоногенная клетки [76].

На такой двухклетной

стадии развития пыльцевое зерно (микроспора), ставшее свободным благодаря разрыву стенки спорангия, сдувается ветром [75]. Микропиле семязачатка выделяет каплю густой жидкости. Эта капля и улавливает пыльцу − мужские споры. Подсыхая, капля перемещает споры глубже − на нуцеллус семязачатка. Здесь мужская спора прорастает в трубку, растушую из споры между крыльями вниз, отвесно, по направлению к женскому заростку с его архегониями, скрытому в нуцеллусе. Пыльцевая трубка растет сквозь нуцеллус, пронзая его верхнюю часть, свободную от интегумента, и останавливается в развитии на зиму. Развитие возобновляется весной, когда трубка своим концом достигает архегониев [68]. К этому времени, в результате четвертого деления, в мужском гаметофите образуются базальные и стебельковые клетки. Ядро стебельковой клетки опускается в пыльцевую трубку, обычно теряя при этом цитоплазму. Базальная клетка делится (пятое деление мужского гаметофита), и образуются два спермия. Ядро стебельковой клетки постепенно разрушается и исчезает [76]. Пыльцевая трубка дорастает до архегония, где лопается на нижнем конце, изливая в архегоний свое содержимое. Один из спермиев соединяется с яйцеклеткой, в результате чего осуществляется процесс оплодотворения. Другой спермий отмирает.

37

Макроспорогенез:

в

семяпочке

обособляется

только

одна

археспориальная клетка. Клетка археспоры растет, превращаясь в материнскую клетку мегаспоры (макроспоры). В результате двух делений мейоза материнской клетки мегаспоры образуется тетрада мегаспор. Каждая из клеток тетрады гаплоидна. Однако только одна из них продолжает развиваться, остальные три дегенерируют. На следующем этапе осуществляется макрогаметогенез. Макроспора - первая клетка женского гаметофита - макрогаметофита. Развитие его начинается после мейоза, после периода покоя. У сосны в развитии макрогаметофита выделяется стадия, или период, свободноядерных делений. Количество свободных ядер, образовавшихся до начала обособления клеток в женском гаметофите, для сосны обычно постоянно и зависит, вероятно, от величины гаметофита. Уже после первого свободноядерного деления, появившаяся большая вакуоль располагается в центре развивающегося гаметофита и оттесняет протоплазму с ядрами к стенке. Митозы в ядрах проходят симультанно. У большинства изученных хвойных клеточный гаметофит

формируется

по

альвеолярному

типу.

Формирующийся

клеточный гаметофит хвойных, как правило, имеет вытянутую форму. Поэтому некоторые клетки, расположенные на

микропилярном и

халазальном полюсах, могут смыкать свои радиальные стенки, не дорастая до центра. Образуются клетки, имеющие треугольную форму. В этих пирамидальных клетках периклинальные деления могут происходить еще до стадии смыкания альвеол. Женский гаметофит сосны обыкновенной весной, после периода зимнего покоя, состоит из ядер, окруженных островками цитоплазмы. Вокруг каждого ядра впоследствии обновляются и цитоплазма и клеточная стенка, гаметофит становится клеточным. На ранней стадии клеточного гаметофита несколько поверхностных клеток увеличиваются и функционируют как архегониальные инициали. Обычно инициалями архегония становятся пирамидальные, преждевременно 38

закрывшиеся клетки из микропилярной части гаметофита. В результате периклинального деления инициали архегония образуются центральная, собственно оогенная клетка и клетка, дающая начало шейке архегония. Центральная клетка сильно увеличивается, цитоплазма ее заполняется крупными вакуолями, приобретая, "пенистое" строение. Ядро центральной клетки постоянно остается в верхнем (микропилярном) конце архегония непосредственно под шейковыми клетками. За несколько дней до оплодотворения центральная клетка делится, это приводит к образованию маленькой, эфемерной брюшной канальцевой клетки и яйцеклетки. Таким образом, зрелый архегоний хвойных состоит из занимающей основную часть объема архегония яйцеклетки, маленькой брюшной канальцевой клетки и шейки архегония. В начальный период роста центральной клетки смежные

клетки

женского

гаметофита

делятся

антиклинальными

перегородками и формируют обкладку архегония. Обкладка архегония в состав его не входит, но клетки ее играют важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности оогенной клетки и яйцеклетки. Архегоний возникают на поверхности гаметофита, но из-за делений в соседних клетках и разрастания ткани женского гаметофита вокруг шеек архегониев они оказываются глубоко посаженными. Остальные клетки уже во время проэмбриогенеза превращаются в запасающую ткань семени - эндосперм. Клетки эндосперма имеют гаплоидный набор хромосом [75, 76]. Характерная особенность голосемянных − образование проэмбрио вследствие первых митозов оплодотворенного ядра яйцеклетки. Митоз завершается образованием двух ядер, которые в дальнейшем делятся еще раз, после чего четыре ядра перемещаются в базальную часть яйцеклетки. Все ядра еще раз делятся и образуют 8-ядерный первичный проэмбрио. Эти митозы зиготы не сопровождаются цитокинезом, и проходят они у сосны в конце июня - начале июля. Клеточные стенки формируются у проэмбрио II, состоящего из трех этажей клеток. У сосны во второй декаде 39

июля эмбрион (зародыш) имеет уже многоклеточное строение, но без признаков дифференциации [77]. Опыление происходит весной. После опыления женские шишечки немного увеличиваются в объеме, чешуи их срастаются, и в таком состоянии шишки перезимовывают. Процесс оплодотворения у хвойных был описан в 1880 г. проф. Московского

университета

И.Н.

Горожанкиным.

Данный

процесс

происходит летом следующего после опыления года в середине 3 декады июня. Оплодотворение у сосны заключается в следующем: пыльца, попав в процессе опыления на семяпочку, затягивается в пыльцевход и через определенное время прорастает в пыльцевую трубку. Это происходит таким образом: сифоногенная (вегетативная) клетка через пору в экзине пыльцы выпячивается в виде трубочки (клеткой пыльцевой трубки) и увлекает за собой антеридиальную клетку, которая и "входит" в эту трубку. Пыльцевая трубка проникает через шейку архегония внутрь нуцеллуса и подходит к яйцеклетке, к этому времени другая клетка пыльцевой трубки, антеридиальная, делится на две - сестринскую, или стерильную (клетку-ножку) и генеративную, или спермагенную. Затем спермагенная клетка делится, образуя два спермия. Пыльцевая трубка дорастает до аргегония, где лопается на нижнем конце, изливая в архегоний свое содержимое. При вхождении в цитоплазму яйцеклетки ядра пыльцевых трубок теряют цитоплазму, т.е. она растворяется в яйцеклетке. Ядра стерильной клетки и клетки - трубки, а также нефункционального спермия остаются в верхней части яйцеклетки и постепенно деградируют. Функциональный спермий достигает ядра яйцеклетки, расположенного в центре архегония. При оплодотворении ядро спермия медленно погружается в ядро женской гаметы. В начальной стадии слияния ядра отделены друг от друга двойной мембраной. Затем ядерные мембраны исчезают, и хроматин ядра спермия и яйцеклетки 40

образуют две ясно различимые группы хромосом. Два веретена деления подходят близко друг к другу и образуют общее мультиполярное веретено, ось

которого

перпендикулярна

длинной

оси

яйцеклетки.

Далее

мультиполярное веретено становится биполярным. После образования общего веретена происходят деления зиготы. В дальнейшем из зиготы развивается зародыш (2n), развивающийся за счет эндосперма [77]. Семена в мешках созревают осенью на второй год после «цветения», но раскрывание шишек и опад семян в южной части ареала сосны происходит весной следующего года в конце марта - начале апреля и в мае - июне в остальных районах при средней суточной температуре воздуха 10°С. Зрелые шишки в нераскрытом виде удлиненно-яйцевидные, длина их колеблется от 2,5 до 7,6 см, ширина 2-3 см, буровато-серые, матовые, с плотными деревянистыми семенными чешуйками, свисающие, сидят на крючковато-изогнутых коротких ножках. Шишки сосны варьируют по цвету. При высыхании шишек цвет их изменяется весьма значительно. Все разнообразие шишек по цвету Л.Ф. Правдивым сведено к трем группам: коричневые, бежевые и серые. Семена у сосны яйцевидные или удлиненно-яйцевидные, длиной 3-4 см; цвет их варьирует широко: от темно-серых или черных до светлокоричневых, коричневых и белых. Так проявляется у сосны изменчивость по морфологическим признакам. Вегетация сосны обыкновенной идет с середины апреля, а рост побегов отмечается с конца апреля до середины июня. Спороношение сосны происходит в конце мая-июне, семена созревают в конце сентябряоктябре. Ежегодный прирост у сосны составляет 12-20 см, побеги одревесневают на 100% [78].

41

1.4.3 Ареал Сосна обыкновенная является очень полиморфным видом, который в процессе эволюции адаптировался к произрастанию в различных экологических условиях - крайнего севера и субтропических районов, полярного длинного дня и короткого дня юга, короткого вегетационного периода на севере и продолжительного на юге, при абсолютном зимнем минимуме температуры воздуха -60°С и абсолютном максимуме +40°С и выше, довольствоваться низким уровнем влажности воздуха и малыми запасами воды и питательных веществ в почве, произрастать на болотах и сухих песках - что обеспечило ей обширную область распространения на материке Евразии от 70 до 37° с.ш. и от 7° з.д. до 126° в.д. [79]. Северная граница современного ареала сосны обыкновенной начинается от 70° с.ш. на северо-западном побережье Норвегии и проходит на восток примерно по 69 с.ш. на побережье Белого моря у Мурманска; далее граница идет параллельно берегу моря, постепенно спускаясь к полярному кругу, вдоль которого, заходя от него то к северу, то к югу в виде разобщенных местообитаний сосны, граница выходит к устью Печоры немного южнее Нарьян-Мара и пересекает Урал на широте полярного круга. Реку Обь граница пересекает на 66° с.ш. Водораздел между бассейнами рек Оби и Енисея граница ареала пересекает на 66-67 с.ш.: далее, Пересекая реки Тур и Таз на широте полярного круга, поднимается к северу, пересекает Енисей на 69° с.ш. и далее у реки Пясины выходит на 70° с.ш. На этой широте сосна достигает своей крайней северной границы и далее идет на восток, пересекая реки Оленек и Лену примерно на этой широте, значительнее севернее с. Жиганска доходит до южных склонов Верхоянского хребта и спускается далее на юг, охватывая весь бассейн р. Алдан, выходя к Охотскому морю на 60° с.ш. По долине р. Амгунь граница выходит на р. Зею, откуда идет на югозапад. 42

Южную границу ареала составляют изолированные между собой острова сосновых лесов, которые заходят в северную Монголию. Здесь граница ареала выходит на р. Онон по 50° с.ш. и идет далее на запад, в Забайкалье. Спускаясь южнее этой широты, граница выходит в истоки рек Большого и Малого Енисея (Балгазик-ский бор, севернее хребта ТаннуОла). Далее на запад южная граница сосны выходит на р. Бухтарму (Восточно-Казахстанская обл.), охватывает островные леса в Республике Казахстан по линии Семипалатинск, Каркаралинск, южнее Целинограда, Кокчетава, Кустаная и далее на Южный Урал к Челябинску, по 52° с.ш. Дальше граница переходит в Европейскую часть СНГ по направлению к Стерлитамаку и Бузулуку, к Жигулям и вдоль Волги к Саратову, на юг Воронежской области (Хреновской бор), к г. Славянску, несколько южнее Днепропетровска, направляясь на запад примерно по 48°40' с.ш. до среднего Буга у Каменец-Подольска. Далее граница идет по северному склону Подольской нагорной равнины, по Карпатам до Седьмиграда, заходит в Болгарию, Македонию, Сербию и Далмацию, идет до Венеции, Ломбардских и Лигурских Аппенин, спускаясь до 44° с.ш. По Приморским Альпам граница заходит до Оверни, на Пиренеи до Каталонии, где сосна встречается в виде отдельных насаждений в горах Арагонии и Валенсии, достигая на западе своего предельного распространения в Сьерра-Неваде, на 37° с.ш. Западная граница ареала идет от Сьерра-Невады на север, примерно по 10° в.д., через Авильские горы и провинцию Леон, проходит в Шотландию и далее идет в северо-западную Норвегию по западному побережью Скандинавского полуострова, поднимаясь до 70° с.ш. В указанные границы ареала сосны обыкновенной не вошли местонахождения ее на Кавказе и в Крыму, в Малой Азии и Иране, а также изолированные островные боры и отдельные деревья, часто 43

заходящие за линию границ главным образом по песчаным наносам в поймах рек [80]. Крайние пункты местонахождений сосны обыкновенной отстоят на 133° по долготе и более 30° по широте. В горных районах сосна достигает больших абсолютных высот, на Кавказе и в Испании поднимается до 2100 м над уровнем моря, в Швейцарских Альпах - до 1800-1950 м, в Карпатах, на Высоких Татрах отдельные экземпляры встречаются на высоте 1465 м, в Вогезах - 1200 м, в южной Норвегии - 940 м, в горах Кркношу - 800 м, в Красных Горах - 600 м, в Швеции и Финляндии - 300-250 м, на Кольском полуострове

-

250

м,

на

крайних

северных

границах

своего

распространения - 200-225 м. В средней и южной части Восточной Сибири сосна поднимается в горы до 800-1000 м над уровнем моря. На севере граница ареала достигает предела распространения древесных пород. Северная граница ареала является естественным климатическим рубежом, севернее которого сосна произрастать уже не может; доказательством этого служит угнетенный рост и низкая всхожесть семян, а иногда и отсутствие плодоношения. Современный ареал сосны обыкновенной по сравнению с ареалами других видов сосен, произрастающих как на материке Евразии, так и в Северной Америке, является самым обширным, что составляет первую его особенность. Вторая характерная черта современного ареала сосны обыкновенной состоит в том, что он простирается в лесной таежной, лесостепной и степной зонах, т.е. является интразональным. Третья особенность ареала сосны обыкновенной - зонированное, или островное, произрастание ее на юге [79]. 1.4.4 Народно-хозяйственное значение Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) широко используется в озеленении промышленных объектов и при создании санитарных зон. В 44

природных сообществах сосна относится к эдификаторным видам, определяющим лицо фитоценоза и в существенной степени влияющим на жизнь

других

растений

[81,

82].

Благодаря

исключительной

неприхотливости сосна способна произрастать на песках, болотах, меловых и известняковых склонах, каменистых кручах гор [83]. Она является также максимально продуцирующей кислород и поглощающей углекислый газ древесной породой [84], что наряду с другими ее ценными свойствами делает сосну особо значимой для человека. Сосна

обыкновенная

обладает

ценной

прочной,

легкой

и

устойчивой к гниению древесиной. Содержит много бальзамов и смол. Благодаря смолам, водоупорна и легко выдерживает речные сплавы. Это – прекрасный строительный материал, сырье для целлюлозно-бумажной и лесохимической промышленности. В

почках

найдено

эфирное

масло

(скипидар),

главным

компонентом которого является пинен – смоляные кислоты; в хвое – аскорбиновая кислота, каротин, дубильные вещества, горькое вещество пиницикрин, крахмал, минеральные соли. В свежей хвое найдены эфирное масло, смолы, аскорбиновая кислота, витамин К, каротин, витамины В1, В2, Р, дубильные вещества, следы алкалоидов. В иглах и коре содержатся антоцианины [85]. В настоящее время во многих программах по селекции сосны важное

место

отводится

селекции

на

повышение

ее

смолопродуктивности. Это связано с тем, что натуральная смола (живица), выделяемая сосной при поранении смолоносной системы, и продукты ее переработки (канифоль, терпентинное масло) находят широкое применение в промышленности. Канифоль используют при получении синтетического каучука, в резинотехнической, лакокрасочной промышленности, в мыловарении, при производстве искусственных материалов, кожи, линолеума, производстве бумаги и др. Терпентинное 45

масло – основное сырье для промышленности органического синтеза: камфоры, инсектицидов, терпинеола [86]. 1.4.5 Цитогенетика Исследования, выполненные по цитогенетике сосны, связаны в основном с изучением митотического

цикла,

структуры ядрышковой

ее

кариотипа, характеристикой

активности,

нарушений

при

воздействии мутагенных факторов. Кариотип вида сосна обыкновенная довольно стабилен по числу (2n=24) и морфологии хромосом, которые имеют большие размеры 10-12 мкм [15]. Для оптимальных условий произрастания сосны характерна минимальная длина ее хромосом, при которой обеспечивается наиболее рациональное использование имеющихся генных ресурсов [15, 87, 88]. Большинство

из

хромосом

метацентрические,

согласно

классификации Н.Д. Агаповой и В.Г. Грифа [46], так как центромерный индекс варьирует от 38% до 50%. По сравнению со всеми другими видами хвойных сосна имеет наиболее симметричный кариотип. Её хромосомы, будучи ранжированы в порядке уменьшающейся длины, образуют непрерывный ряд с очень плавными переходами от предыдущего члена к последующему [89]. В кариотипе есть две более неравноплечие пары хромосом – XI и XII. Они хорошо идентифицируются, также как и X пара. Оставшиеся девять пар хромосом формируют единую группу [90]. Хромосомы сосен не отчленяют спутники "классической" формы в виде маленького округлого тельца с хорошо выраженной спутничной нитью. Тем не менее, в отдельных хромосомных пластинках Pinus sylvestris L. E.H. Муратова [91] наблюдала спутники "классического" типа. Однако эти случаи единичны и не характерны для сосен. Более объективной характеристикой кариотипа сосны следует считать среднее число хромосом с вторичными перетяжками. Это обусловлено тем, что 46

значительный

полиморфизм

по

числу

хромосом

с

вторичными

перетяжками наблюдается как между различными популяциями сосны, так и между различными деревьями в пределах популяций и даже между клетками одной ткани у отдельных индивидов [92]. Вторичные перетяжки чаще располагаются в дистальных районах; иногда они разделяют плечо на две равные части или находятся в проксимальных участках, недалеко от центромеры [93]. У сосны обыкновенной вторичные перетяжки отмечаются в пяти парах длинных равноплечих хромосом. Изредка наблюдаются перетяжки на длинных плечах неравноплечих хромосом (XI и XII пары), но частота их встречаемости очень низкая [94]. Наличие большого числа вторичных перетяжек (до 12, 13) [95, 96] и их вариабельность являются характерной чертой структуры хромосом сосен, что обусловлено большим числом ядрышковых организаторов и функциональным состоянием и особенностями укладки хромосомного материала, поскольку не все перетяжки связаны с образованием ядрышка [97]. Как о видовом признаке можно говорить только о модальном числе хромосом

с

вторичными

перетяжками,

которое,

по

данным

А.К. Буториной [92], составляет 5 пар или 10 хромосом на диплоидный набор. Ядрышкообразующая функция большинства вторичных перетяжек у Pinus sylvestris L. подтверждается анализом количества ядрышек в ядре [98], а также соответствием между числом и размерами ядрышек прометафазных хромосом и количеством и шириной зон вторичных перетяжек метафазных хромосом [99]. Известно, что морфологическим выражением активности ядрышкового организатора является ядрышко, образующееся в телофазе митоза, поэтому по числу ядрышек в клетке можно

судить

о

количестве

функционирующих 47

ядрышковых

организаторов [100]. Максимальное число ядрышек в интерфазном ядре в основном соответствует числу постоянных перетяжек у хромосом [101]. У Pinus sylvestris L. наибольшее число ядрышек − 12 − превышает число пар хромосом с регулярными вторичными перетяжками − 5, так как пара перетяжек, отнесенных к нерегулярным, может являться носителем ядрышковых организаторов [96]. Наиболее эффективным с энергетической точки зрения для сосны является одновременное функционирование не более чем трех пар хромосом с ядрышковыми организаторами при нормальном характере их распределения на обобщенном плече ядрышкообразующих хромосом с пиком встречаемости в оптимальной зоне − 50-60 % расстояния плеча от вторичной перетяжки до центромеры [102]. Для Pinus sylvestris L. показана вариация общей длины диплоидного набора [103]. Также отмечено возрастание объемов интерфазных ядер с увеличением географической широты. По окраине ареала обнаружено массовое образование структурных перестроек типа кольцевых и дицентрических

хромосом.

Для

популяций

сосны

обыкновенной

характерна различная частота встречаемости перетяжек в определенных парах

хромосом.

Характерен

также

гетероморфизм

гомологичных

хромосом по степени выраженности вторичной перетяжки – от ясно просматривающейся неокрашенной зоны до едва заметных углублений на хромосомах с различными переходами между ними [104]. Широкая

распространенность

дает

возможность

проследить

пространственную динамику изменений исследуемых показателей в зависимости от концентрации загрязняющих веществ в окружающей среде. Однако наиболее важное преимущество этого критерия заключается в том, что он связан с экологическим оптимумом популяций [105]. Наиболее вероятно, что условия, создающие возможность для широкого распространения вида на данной территории, благоприятны или близки к 48

таковым. Они обусловливают определенный уровень изменчивости признаков, отклонения от которого чаще всего вызваны воздействием резко неблагоприятных антропогенных и природных факторов [106, 107]. Необходимыми

критериями

в

отборе

видов

являются

разработанность их систематики, легкость и доступность идентификации в природе, наличие по возможности наиболее полных сведений об их экологических и биологических особенностях - широте экологической амплитуды, типе местообитаний, продолжительности жизни, о способе опыления и размножения, биологии прорастания семян. Для растений важным критерием является наличие семенного размножения, высоких всхожести и энергии прорастания семян [108]. Генетическое изучение видов рода Pinus традиционным методом гибридологического

анализа

и

с

использованием

спонтанного

и

индуцированного мутагенеза затруднено из-за характерного для сосны длительного периода онтогенеза и позднего вступления в репродуктивную стадию [109, 110]. Поэтому, до недавнего времени, генетические исследования

сосны,

как

и

многих

других

видов

древесных,

ограничивалось изучением наследуемости сложных для генетического анализа количественных морфологических признаков (высоты роста, плотности древесины и объема ствола) или физиологических признаков путем определения коэффициента наследуемости, т.е. той части общей фенотипической изменчивости,

которая обусловлена генетическими

факторами, это очень важно для проведения эффективной селекционной работы. Для оценки генетической и селекционной ценности исходных форм, используемых при гибридизации, большое значение также имеет определение обшей и специфической комбинационной способности (ОКС и СКС). Это относительная способность организма передавать свои ценные признаки потомкам при скрещивании с любыми другими особями того же вида [111]. Высокая ОКС свидетельствует об аддитивном действии 49

генов. СКС определяется способностью организмов передавать свои ценные признаки только при скрещивании с определенными организмами [112]. Прорыв в изучении генетики сосны был обеспечен использованием молекулярно-генетических маркеров (МГМ). К МГМ относятся терпены, запасные и общие белки, изоферменты и фрагменты ДНК с уникальными и повторяющимися последовательностями [111]. Использование последних при рестрикционном анализе, клонировании и секвенировании ядерной, митохондриальной и пластидной ДНК значительно расширило спектр МГМ и возможности генетического анализа. С помощью молекулярных маркеров ДНК удалось создать генетические карты сцепления у Pinus sylvestris L. В ряде случаев при построении карт сцепления использовали одновременно и белковые и ДНК-овые МГМ [113, 114]. Особую ценность представляют маркеры,

исследования,

сцепленные

с

позволившие важными

идентифицировать

хозяйственными

ДНК-

признаками:

моногенными, обусловленными генами, контролирующими, например устойчивость

к

ржавчине

и

к

насекомым,

или

полигенными,

множественные гены при этом ответственны за сложные количественные признаки, такие как качество древесины, рост, объем, устойчивость к стрессам и др. [115]. Использование молекулярных маркеров перспективно для решения многих задач лесной генетики и в т.ч. частной генетики сосны в

направлениях

установления

изучения

уровней

генетической

внутри-

и

структуры

межпопуляционной

популяций, генетической

изменчивости, генетических особенностей насаждений, степени их дифференциации

и

подразделенности;

сравнительного

изучения

генетической структуры и сопоставления уровней фенотипического разнообразия искусственных и естественных насаждений с целью разработки

рекомендаций,

лесовосстановления;

разработки

необходимых генетических 50

для

эффективного

критериев

выделения

генетических резерватов, лесосеменных районов и зон; генетической оценки

исходного

материала

для

селекции;

выявления

мутантов,

идентификации основ на плантациях, определения вклада отдельных деревьев (эффекта родоначальника) в составе насаждения. Использование ПДРФ, микро- и минисателлитов, а также МГМ, основанных на ПЦРанализе, позволило перейти в ХХ в. к широкомасштабному изучению генома сосны в рамках Международного проекта [116, 117].

51

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Для оценки реального состояния биосферы, а также организации своевременной и эффективной борьбы, необходимо непрерывное слежение за объектами живой и неживой природы [118]. На основании полученных данных возможна организация защитных мероприятий, выявление наиболее экологически неблагоприятных районов [119, 120]. Это осуществляется в процессе мониторинга. Исключительно важное научное и практическое значение имеет проведение генетического мониторинга лесов, в том числе цитогенетического, по результатам которого можно судить как о состоянии самих лесов, так и о состоянии окружающей среды, что важно для принятия экологически грамотных решений по рациональному природопользованию и разработке природоохранных мер [121]. Использование древесных растений в качестве тест-объектов для цитогенетического мониторинга (особенно местных видов, хорошо адаптированных

к

условиям

существования)

целесообразно

по

нескольким причинам. Во-первых, это долгоживущие организмы, и с их помощью можно выявить отдаленные последствия воздействия какихлибо загрязнителей, а, кроме того, проследить действие некоторого агента в течение длительного времени [122]. Необходимо также отметить

тот

факт,

что

чувствительность

древесных

растений

приблизительно в два раза выше, чем у травянистых растений. Благодаря этому можно составлять прогнозы об угрозе здоровью людей в тех или иных регионах. Целью поддержания

настоящей гомеостаза

работы у

является

древесных

стрессовых факторов и, в частности,

понимание

растений

при

механизмов воздействии

цитогенетический мониторинг

автохтонных лесов Усманского бора на основе изучения изменчивости

52

цитогенетических показателей у семенного потомства деревьев сосны обыкновенной из этого насаждения. Задачи исследований: 1) сбор

и

проращивание

семян,

фиксация

проростков

сосны

обыкновенной для цитогенетического мониторинга или оценки состояния среды в условиях Усманского бора; 2) изучение

изменчивости

цитогенетических

показателей

(митотическая активность, патологии митоза, частоты встречаемости микроядер, ядрышковая активность) семенного потомства деревьев сосны обыкновенной Усманского бора; 3) дать оценку состояния автохтонных насаждений Усманского бора по цитогенетическим показателям семенного потомства деревьев сосны обыкновенной.

2.1 Характеристика объекта исследования В

2008

и

в

2009

гг.

проводились

исследования

четырех

популяционных выборок. Их сравнительная характеристика приведена в таблице 1. Таблица 1 - Характеристика деревьев выбранных для цитогенетического исследования, 2008, 2009 годы (Краснолесное лесничество) Попул. выборка

Квартал

Средний

Диаметр

Средняя Всхожесть Всхожесть

ствола, см

высота,

семян, %

семян, %

лет

(h=1,3м)

м

(2008 год)

(2009 год)

Выдел возраст,

1

122

51

102

37

30

89,5

95,2

2

134

7

88

40

20

77,2

83,4

3

134

48

100

43

25

82,9

85,5

4

134

4

103

46

23

75,9

79,9

53

Расположение 122 и 134 кварталов не случайно. Они оба равноудалены от железнодорожного полотна и находятся на одной широте. 122 квартал расположен ближе к восточной окраине Усманского бора, но он не является пограничным, а 134 – пограничный квартал на западной черте Усманского бора, и здесь нами были взяты случайно 3 популяционные выборки из 3-х различных выделов для сравнения их между

собой

и

с

одной

выборкой

122-го

квартала,

который

характеризуется меньшим антропогенным воздействием. По

каждой

популяционной

выборке

было

сделано

и

проанализировано по 22 препарата (в 2008 и в 2009 годах).

2.2 Методика изготовления давленых микропрепаратов и обработка результатов Материалом для исследования служили семена самосева деревьев сосны обыкновенной от свободного опыления. Полученные семена из популяционной смеси проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге в термостате при температуре 26оC. Всхожесть семян за 15 дней варьировала у семян в среднем от 77 до 89% в 2008 году и от 79 до 95% в 2009 году, что расценивается нами как хороший показатель. Изготовление

давленых

микропрепаратов

из

семян

сосны

проводилось по методике [20] с небольшими модификациями. Пророcтки c корeшками, достигшими 0,5–1 cм, фиксировали cпиртово-укcуcной cмecью (3:1). В качecтвe краcитeля использовали ацeтогeматокcилин. Пeрeд окраcкой для лучшeй мацeрации тканeй корeшки пророcтков ceмян cоcны подвeргали горячeму гидролизу в 18%ой cоляной киcлотe в тeчeниe 5 мин., а затeм промывали их в 6-7 cмeнах 45%-ой укcуcной киcлоты. Поcтоянно-давлeныe прeпараты (1 корeшок – 1 прeпарат) готовили путeм заключeния матeриала (отдиффeрeнцированных 54

поcлe окрашивания кончиков корeшков) в каплю cмecи Гойeра. Проcмотр микропрeпаратов оcущecтвляли c помощью микроcкопа “Laboval” Zeiss Jena при увeличeнии 40х7х2,5. На каждом препарате проcматривали приблизительно 1000 клeток. Нами использовались следующие наиболее чувствительные критерии цитогенетического мониторинга: опрeдeляли митотичecкую

активноcть

(МА)

мeриcтeматичecкой

ткани

по

митотичecкому индeкcу в ee пик, приходящийcя на 9 чаcов утра по зимнeму врeмeни, как показатeль интeнcивноcти роcтовых процeccов [123]. Учитывали такжe чиcло клeток на каждой cтадии для опрeдeлeния их продолжитeльноcти и рeгулярноcти прохождeния клeточного цикла чeрeз точки провeрки, общee чиcло патологий митоза (ПМ) и наиболee характeрныe типы митотичecких нарушeний по каждой cтадии. Учитывали такжe чиcло клeток c опрeдeлeнным чиcлом ядрышeк в интeрфазe (от 1 до 12) и долю клeток c тeм или иным их чиcлом как показатeль интeнcивноcти клeточного мeтаболизма. Для подcчeта чиcла хромоcом была провeдeна прeдобработка корeшков колхицином (1%-ным водным раcтвором в тeчeниe чeтырeх чаcов). МА тканeй опрeдeляли как отношeниe чиcла клeток, находящихcя в митозe, к общeму чиcлу проcмотрeнных клeток. Эта вeличина выражаeтcя чeрeз

показатeль

митотичecкого

индeкcа

(МИ).

Количecтвeнный

показатeль ПМ, имeющих мecто в раccматриваeмых тканях, опрeдeляли отношением числа клеток с нарушениями к общему числу делящихся клеток.

Ядрышковая

процeнтноe

активноcть

cоотношeниe

(ЯА)

рассчитывалась

c

2,

клeток

1,

3,..

n

нами

ядрышками

как в

раccматриваeмых выборках. Учитывалоcь такжe наличиe и чаcтота вcтрeчаeмоcти клeток c микроядрами, поcкольку этот показатeль являeтcя эффeктивным мeтодом, показывающим ухудшeниe уcловий окружающeй cрeды.

55

Cтатиcтичecкая обработка получeнных экcпeримeнтальных данных оcущecтвлялаcь по Лакину [124] c иcпользованиeм программ Stadia и Statistica.

Минимальныe

ceлeкционных показатeлям

катeгорий опрeдeляли,

границы при

их

иcходя

выборок

дeрeвьeв

cравнeнии из

по

опрeдeлeнных цитологичecким

cущecтвующих

положeний

матeматичecкой cтатиcтики [125], апробированных на биологичecких объектах [126].

56

ГЛАВА 3. ЦИТОГЕНЕТИКА СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ИЗ УСМАНСКОГО БОРА Всего было изготовлено и проанализировано по 22 микропрепарата (для каждой популяционной выборки), просмотрено более 170 000 клеток (за 2008 и 2009 гг.). 3.1 Число хромосом Метод учета хромосомных аберраций, как на стадии метафазы, так и в анафазе, дает возможность получить подробную информацию о наличии или отсутствии, частоте и пролиферативной активности клеточных клонов, позволяет косвенно охарактеризовать иммунный статус организма, предоставляя

возможность оценить

цитогенетическую

стабильность

организма. Аберрации хромосом, возникающие в соматических клетках, есть результат повреждения хромосом на разных стадиях клеточного цикла, что ведёт к изменению числа хромосом. Подсчет числа хромосом у проростков семян сосны обыкновенной за весь период наблюдения (2008-2009 гг.) не выявил каких-либо отклонений от типичного для вида уровня плоидности (2n=24), как показано на рисунке 1.

Рисунок 1 – Кариотип сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в норме, 2n=24 (увеличение 100 х 12,5 х 2,5) 57

3.2 Митотическая активность (МА) Митотическая активность определяет энергию роста, представлена четырьмя фазами, показанными на рисунке 2. Помимо генетической обусловленности этого показателя, на его проявление могут оказывать значительное влияние и факторы внешней среды, например, малые дозы радиации и химических мутагенов в некоторых случаях стимулируют митотическую активность, а высокие - ингибируют. Предложенный критерий является достаточно удобным в исследовании, что позволит в должной мере информативно представить данные. По

результатам

исследования

были

получены

данные

по

митотической активности в виде митотического индекса (МИ). В 2008 году средние значения МИ варьировали от 6,8±0,2% до 7,1±0,2%. В 2009 году средние значения МИ находились в пределах от 7,3±0,1% до 7,8±0,1%. Все эти результаты, показанные на рисунке 3, является хорошими показателями, что соответствует данным по средним значениям МИ сосны обыкновенной из Усманского бора, полученным в предыдущие годы 7,3±1,2% [127, 128], а также контрольным значениям, выявленным для сосны, произрастающей в средней полосе России [129, 130]. Проведенное сравнение выборок по t-критерию Стьюдента выявило (при p < 0,05): 1.

Отсутствие различий между выборками 2, 3, 4 (134 квартал), что позволяет их объединить и посчитать среднее (в 2008 и в 2009 гг. соответственно).

2.

Отсутствие различий между средним выборок 2, 3, 4 (134 квартал) и выборкой 1 (122 квартал) (в 2008 и в 2009 гг. соответственно).

3.

Наличие различий между соответствующими выборками 2008 и 2009 гг. Это, по-видимому, может свидетельствовать о различных погодных условиях в эти годы. 58

а)

б)

в)

г)

Стадии: а) – профаза, хорошо видны ядрышки; б) – хромосомы, выстроившиеся в метафазную пластинку по экватору клетки; в) – расположение хромосом в анафазе митоза; г) – образование фрагмопласта в ранней телофазе (увеличение 40 х 12,5 х 2,5)

Рисунок 2 – Митоз у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в норме Рассчитанный по данным МИ коэффициент вариации (Cv, %) для каждой популяционной выборки дал оптимальные значения (менее 30 %) во всех случаях. Это свидетельствует о нормальной однородности выборок. Данные таблицы 2 показывают распределение клеток по стадиям. Наибольшее их число приходится на анафазу и телофазу (41-49%), доля 59

клеток на стадии метафазы составила 28-40%, на стадии профазы – 2032%.

* * *

*

Рисунок 3 – Средние значения показателей МИ у семенного потомства деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) популяции Усманского бора (* - различия с 2008 статистически достоверны при p  0,05)

3.3 Ядрышковая активность (ЯА) Роль ядрышка в метаболических процессах обусловлена его участием в биосинтезе всей р-РНК клетки, необходимой для синтеза белков. Работами ряда авторов [100] показано, что в нормальных условиях функционирует типичное для организма данного вида число ядрышковых организаторов, примеры которых можно видеть на рисунке 4. Усиление же функциональной

активности

клетки,

например,

при

воздействии

различного рода стрессовых факторов, сопровождается активацией деятельности ядрышковых организаторов, в том числе за счет проявления 60

дополнительных, ранее неактивных. Соответственно увеличивается и число ядрышек [131]. Одной из цитологических особенностей сосны обыкновенной (как и других видов хвойных) является возможность наличия у нее в клетках нескольких ядрышек (до 12 на клетку). По мнению А.К. Буториной и др. [132] об уровне ядрышковой активности следует судить по модальному числу ядрышек. Как видно из рисунков 5 и 6, модальным числом ядрышек на клетку является 3-6 ядрышек, что можно рассматривать как соответствующее двум-трем парам ядрышкообразующих хромосом.

Рисунок 4 – Интeрфазныe клетки сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) c oтчeтливo просматривающимися ядрышками (увeличeниe 40 х 12,5 х 2,5)

61

Рисунок 5 – Результаты исследования ядрышковой активности у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) популяции Усманского бора (2008 год)

Рисунок 6 – Результаты исследования ядрышковой активности у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) популяции Усманского бора (2009 год) 62

3.4 Патологии митоза (ПМ) Нарушения

митоза,

связанные

с

повреждением

хромосом,

встречаются при более высоких дозах загрязнителя, и критерий является менее чувствительным, чем иные. Также патологические митозы, как правило, имеют место в пролиферирующих тканях у всех организмов как следствие влияния внутриклеточных метаболитов, возникающих в ходе обменных процессов. Однако патологии митоза один из способов возникновения мутаций. Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что по числу патологий митоза (ПМ) ситуация у потомства сосны обыкновенной из Усманского бора достаточно благополучная. В 2008 году максимальное значение ПМ в выборке составило 3,2%, а для выборок 2009 года – 2,9%, что находится в пределах нормы у сосны, то есть в пределах показателей спонтанного мутационного процесса. Среднее значение ПМ, показанное на рисунке 7, по выборкам: от 1,1±0,2% до 1,2±0,2% (2008) и от 1,4±0,2% до 1,7±0,2% (2009). Нарушение нормального течения митоза может стать источником геномных мутаций и хромосомных аберраций [50]. Это один из основных механизмов возникновения анеуплоидии и нарастания гетерогенности клеточных популяций. По частоте встречаемости нарушений митоза можно судить об интенсивности мутационного процесса в клеточных популяциях организма, по спектру нарушений – о степени повреждения генетического материала, т. е. совместимости с жизнью возникающих повреждений [132]. Низкое число ПМ у сосны из Усманского бора позволяет предположить проявление у нее высокой репарационной способности, что хорошо согласуется с высокой общей устойчивостью материнских деревьев насаждения в пределах оптимума обитания, и к воздействию рекреационной нагрузки. Спектр ПМ, фотографии которых 63

можно видеть на рисунке 8, включал отставания хромосом в метакинезе, забегания хромосом и мосты в анафазе и телофазе, то есть наиболее общие типы митотических нарушений. А на рисунках 9 и 10 показаны доли каждого нарушения от общего числа патологий.

* *

*

*

Рисунок 7 – Показатели ПМ у семенного потомства деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) популяции Усманского бора (*– различия с 2008 статистически достоверны при p  0,05)

64

а)

б)

в)

г)

Нарушения: а) – мост в анафазе митоза; б) – отставание хромосом в анафазе; в) – забегание хромосом в анафазе; г) – микроядро (увеличение 40 х 12,5 х 2,5)

Рисунок 8 – Патологии митоза у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.)

65

Рисунок 9 – Характер распределения ПМ у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) популяции Усманского бора (2008 год)

Рисунок 10 – Характер распределения ПМ у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) популяции Усманского бора (2009 год)

66

В.М. Захаров с соавторами [1] предлагает свою балльную оценку для

получения

интегральной

характеристики

цитогенетического

гомеостаза, определяемую следующим способом: -первый

балл

–

условно

нормальное

состояние

–

частота

аберрантных клеток до 3,5%; -второй балл – низкая степень отклонений – частота аберрантных клеток в пределах 3,5-6%; -третий балл – средняя степень отклонений – частота аберрантных клеток в пределах 6-9%; -четвертый

балл

–

высокая

степень

отклонений

-

частота

аберрантных клеток в пределах 9-12%; -пятый балл – критическое состояние - частота аберрантных клеток выше 12%. Полученные нами показатели в соответствии с этой шкалой оценки укладываются в 1 балл. Проведенное сравнение выборок по Х-критерию Ван-дер-Вардена выявило (при p < 0,05): 1. Отсутствие различий между выборками 2, 3, 4 (134 квартал), что позволяет их объединить и рассчитать среднее (в 2008 и в 2009 гг. соответственно). 2. Отсутствие различий между средним выборок 2, 3, 4 (134 квартал) и выборкой 1 (122 квартал) (в 2008 и в 2009 гг. соответственно). 3. Наличие различий между средними 2, 3, 4 выборок 2008 и 2009 гг. (134 квартал), а также между выборкой 1 (122 квартал) 2008 года и средним 2, 3, 4 выборок (134 квартал) 2009 года. Это может свидетельствовать о различных погодных условиях в эти годы.

67

Число дел-ся клеток

1773 1731 1588 1592 4911

Общее Квар- Вычисло тал борка просм. клеток

122 134 134 134 Ср.

1 2 3 4 2,3,4

22896 22711 21887 21800 66398

1393 1334 1353 1466 4153

19960 19890 19850 21430 61170

122 134 134 134 Ср.

7,8±0,1 7,6±0,2 7,3±0,1 7,3±0,1 7,4±0,1

МИ

7,1±0,2 6,8±0,2 7,0±0,3 7,0±0,2 6,9±0,1

МИ

6,8 11,4 7,5 5,7 8,7

Cv, %

16,2 15,4 16,9 16,0 15,9

5,3±0,1 5,3±0,2 5,8±0,1 5,2±0,1 5,4±0,1

МИ без учёта профаз

5,7±0,2 5,1±0,2 5,8±0,3 5,5±0,2 5,5±0,1

68

31,9±1,3 29,9±1,3 20,4±1,1 28,6±1,4 26,3±1,9

27,5±1,2 26,4±1,3 30,1±1,1 28,7±1,2 28,4±1,1

Доля профаз

40,7±1,5 16,7 50,0 43,7±1,9 8,3 54,2 48,8±1,2 16,0 44,0 43,4±1,9 3,7 55,6 45,3±1,8 9,2 51,3

Доля профаз

33,3 37,5 40,0 40,7 39,5

1,4±0,2 1,4±0,1 1,5±0,1 1,7±0,2 1,5±0,1

0,02±0,008 0,02±0,008 0,03±0,009 0,03±0,01 0,03±0,009

Доля микроядер, % Доля ПМ, %

Доля профаз

0,02±0,009 0,02±0,008 0,02±0,008 0,02±0,009 0,02±0,008

1,1±0,2 1,1±0,2 1,2±0,2 1,2±0,2 1,2±0,1

19,7±1,3 31,6±1,1 46,3±2,5 18,8 56,2 25,0 24,9±2,1 32,1±1,5 43,0±1,8 0 66,7 33,3 19,0±1,3 39,5±1,2 41,5±1,7 17,6 47,1 35,3 20,8±1,2 30,7±1,1 48,5±1,6 5,6 50,0 44,4 21,6±1,8 34,1±2,7 44,3±2,1 8,0 54,0 38,0 2009 год Стадии митоза, % Нарушения

Доля анафаз+ телофаз

Доля микроядер, %

Доля метафаз

Доля ПМ, %

Доля профаз

Нарушения Мосты, % Мосты, %

МИ без Cv, % учёта профаз

Забегания, %

1 2 3 4 2,3,4

Число дел-ся клеток

Общее Квар- Вычисло тал борка просм. клеток Забегания, %

2008 год Стадии митоза, %

Таблица 2 - Результаты исследования цитогенетических показателей семенного потомства сосны обыкновенной популяции Усманского бора

Отставания, % Отставания, %

3.5 Микроядерный тест Микроядерный тест считается прямым тестом на радиацию, но появление микроядер может быть и при действии некоторых Sнезависимых факторов. Микроядра, показанные на рисунке 8 г), представляют собой округлые хроматиновые тельца, выявляемые в виде небольшого размера дополнительных ядер в цитоплазме. Они образуются в результате нерасхождения хромосом в метакинезе к полюсам, а также в анафазе и т.д. Образование микроядер может служить показателем нестабильности генома, четким показателем мутагенеза. Увеличение числа клеток с микроядрами сопровождается подавлением митотической активности, слипанием и отставанием хромосом, аномалиями веретена, образованием

хромосомных

хроматидными

разрывами.

мостов, При

конденсацией

высоких

хромосом

концентрациях

и

мутагена

нарушается линейный характер числа микроядер в зависимости от дозы мутагена. Токсические дозы могут приводить к ингибированию деления клеток и их гибели с уменьшением регистрируемого числа клеток с микроядрами. Микроядерный тест эффективен для оценки хронических мутагенных воздействий, при скрининге и мониторинге естественных популяций [133]. В 2008 и 2009 гг. у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) на обследованных территориях Усманского бора обнаружено незначительное число микроядер, что является тревожным моментом, поскольку их присутствие служит индикатором начала патологических процессов и нестабильности генома [133]. Причиной чему могло быть глобальное загрязнение атмосферы, повлиявшее и на лесные массивы, даже удаленные от источника загрязнения.

69

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В

ходе

проведенных

цитогенетических

исследований

сосны

обыкновенной (Pinus sylvestris L.) из автохтонных насаждений Усманского бора

были

выявлены

границы

изменчивости

цитогенетических

показателей: митотическая активность (МИ) от 6,8±0,2 до 7,8±0,1%, количество патологий митоза (ПМ) от 1,1±0,2 до 1,7±0,2% и ядрышковая активность (от 3 до 6 постоянно активных ядрышек) – в типичных для сосны

обыкновенной

экологически

благоприятных

условиях

произрастания. Эти данные можно рассматривать как норму для сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) (т.е. не выходящие за пределы нормальных значений уровня спонтанного мутирования). Установленное присутствие у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) микроядер (пока еще в незначительных количествах: 0,02±0,008% в 2008 году и от 0,02±0,008% до 0,03±0,01% в 2009 году, что меньше 0,1%) свидетельствует о появлении опасных симптомов ухудшения состояния самих деревьев в насаждении, отражающееся и на их потомстве. Это может быть следствием и перестойного возраста деревьев, и ухудшения состояния среды в насаждении вследствие возросшего антропогенного воздействия. В связи с чем, рекомендуется постоянный мониторинг этого уникального бора, все еще сохраняющего в достаточно хорошем состоянии свой генетический аппарат и являющегося ценнейшей лесосеменной базой для Воронежской и других областей РФ. Рассчитанный по данным МИ коэффициент вариации (Cv, %) для каждой популяционной выборки дал оптимальные значения (менее 30%) во всех случаях. Это свидетельствует о нормальной однородности выборок. Наличие различий между соответствующими выборками 2008 и 2009 гг., по-видимому, может свидетельствовать о различных погодных условиях в эти годы.

70

Присутствие

расхождений

по

показателям

ПМ

между

соответствующими выборками 2008 и 2009 гг. (для 134 квартала) можно объяснить не только различиями в погодных условиях, но и большим антропогенным воздействием на данной территории, т. к. для 122 квартала таких различий между выборками 2008 и 2009 гг. нет, что свидетельствует о более благоприятном расположении данной популяционной выборки и меньшим антропогенным воздействием. Для своевременного получения информации о надвигающихся негативных изменениях в популяциях, прежде чем они отразятся на фенотипе особей и станут очевидными, целесообразно использовать метод цитогенетического

мониторинга.

Эти

данные

также

могут

иметь

несомненную ценность для лесоводов для оценки качества семян, так как более перспективным является отбор лучших материнских деревьев не только по фенотипу, но и учитывая состояние их генетического аппарата, отражающиеся на их потомстве. Полученные данные, по нашему мнению, можно использовать для достижения более рационального использования автохтонных насаждений Воронежской области как памятников природы. Судя по результатам работы, автохтонные насаждения Усманского бора можно использовать в качестве ценных геноисточников для создания высокопродуктивных культур.

71

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Здоровье

среды

:

практика

оценки

/

В.М.

Захаров,

А.Т. Чубинишвили, С.Г. Дмитриев и др. – М. : Центр экол. политики России, 2000. – 320 с. 2. Бурдин К.С. Основы генетического мониторинга / К.С. Бурдин. – М. : Изд–во Моск. гос. ун–та, 1985. – 160 с. 3. Буторина А.К. Анализ чувствительности различных критериев цитогенетического мониторинга / А.К. Буторина, В.Н. Калаев // Экология. – 2000. – № 3. – С. 206–210. 4. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды / Ю.А. Израэль. – М. : Гидрометеоиздат, 1979. – 376 с. 5. Герасимов И.П. Научные основы современного мониторинга окружающей среды / И.П. Герасимов // Изв. АН СССР. – 1975. – N 3. – С. 13–25. 6. Нeгрoбoв O.П. Экoлoгичecкиe ocнoвы oптимизации и управлeния гoрoдcкoй cрeдoй: Экoлoгия гoрoда: Учeб. пocoбиe / O.П. Нeгрoбoв, Д.М. Жукoв,

Н.В.

Фирcoва.

-

Вoрoнeж:

Изд-вo

Вoрoнeжcкoгo

гocударcтвeннoгo унивeрcитeта: Экoдoн, 2000. – 272c. 7. Ирошников

А.И.

Программы

генетического

мониторинга

и

улучшения лесов России / А.И. Ирошников // Материалы 2-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. – СПб., 2000. – Т.1. – С. 182. 8. Федоров В.Д. Биологический мониторинг: объяснение и опыт организации / В.Д. Федоров // Гидробиол. журн. – 1975. – Т. 11, N 5. – С. 753–770. 9. Николаевский В.С. Экологическая оценка загрязнения среды и состояния

наземных

экосистем

методами

В.С. Николаевский. – М. : Наука, 1998. – 181 с. 72

фитоиндикации

/

10. Алтухов Ю.П. Внутривидовое генетическое разнообразие : мониторинг и принципы сохранения / Ю.П. Алтухов // Генетика. – 1995. – Т. 31, N 10. – С. 1333–1357. 11. Захаров В.М. Биотест : интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов / В.М. Захаров, Д.М. Кларк. – М. : Моск. отд–ние междунар. фонда «Биотест», 1993. – 68 с. 12. Калашник Н.А. Хромосомная индикация загрязнения окружающей среды с использованием древесных объектов / Н.А. Калашник [и др.] // Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и интродукции. – Томск, 1997. – С. 69–71. 13. Калашник Н.А. Индикация загрязнения окружающей среды с использованием кариологических методов / Калашник Н.А. [и др] // Цитология. – 1999. – Т. 41, N 12. – С. 1065. 14. Константинов А.В. Цитогенетика / А.В. Константинов. – Минск : Высш. шк., 1971. – 296 с. 15. Калашник Н.А. Популяционная изменчивость кариотипа сосны обыкновенной в Башкирии / Н.А. Калашник, Л.П. Преснухина // Цитология и генетика. – 1991. – Т. 25, № 3. – С.12–17. 16. Муратова обыкновенной

Е.Н.

(Pinus

Цитогенетическая

sylvestris

L.)

в

характеристика

районе

выбросов

сосны тепловой

электростанции / Е.Н. Муратова, О.Н. Зубарева // Изв. Сиб. отд-ния АН СССР. Сер. биол. наук. – 1990. – Вып. 3. – С. 36–41. 17. Гуськов

Е.П.

Свободно–радикальные

процессы

и

уровень

аберраций хромосом в листьях древесных растений как тест–системы на генотоксичность городской среды / Е.П. Гуськов [и др.] // Экология. – 2000. – № 4. – С. 270–275.

73

18. Захаренко Л.П. О генетическом мониторинге при загрязнении местности малыми дозами радиации / Л.П. Захаренко // Вестн. ВОГиС. – 1999. – №10. – С. 47–52. 19. Духарев В.А. Хвойные как тест–системы на мутагенность окружающей среды / В.А. Духарев, А.В. Духарева, И.М. Минаев // Известия АН СССР. Сер. биологическая. – 1988. – Т. 298, № 3. – С. 742– 745. 20. Butorina A. The first detected case of amitosis in Pine / A. Butorina, N. Evstratov // Forest Genetics. – 1996. – V.3, №3. – P.137–139. 21. Micieta K. The use of Pinus sylvestris L. and Pinus nigra Arnold as bioindicator species for environmental pollution / K. Micieta, G. Murin // Cytogenetic studies of forest trees and shrub species : Contributions by members of the IUFRO Cytogenetics Working Party. – Zagreb, 1997. – P. 253–263. 22. Muller M. Effects of increased ozone on the somatic chromosomes of Norway spruce (Picea abies) trees / M. Muller, A. Geiszinger, D. Grill // Cytogenetic studies of forest trees and shrub species: Contributions by members of the IUFRO Cytogenetics Working Party. – Zagreb, 1997. – P. 265–274. 23. Косиченко радиочувствительности Экологические

Н.Е.

Микроструктурные

древесных

растений

последствия

воздействия

/

на

Н.Е.

признаки Косиченко

окружающую

//

среду

антропогенных факторов : тез. докл. II Всесоюз. координац. совещания. – Сыктывкар, 1989. – С. 65–66. 24. Буторина потомства

А.К.

некоторых

Цитогенетическая видов

характеристика

семенного

растений

условиях

древесных

в

антропогенного загрязнения г. Воронежа / А.К. Буторина [и др.] // Цитология. – 2000. – Т. 42, № 2. – С. 196–201. 25. Шафикoва

Л.М.

Цитoгeнeтичecкиe

ocoбeннocти

cocны

oбыкнoвeннoй в уcлoвиях прoмышлeннoгo загрязнeния: Автoрeф. диc. 74

канд. биoл. наук / Л.М. Шафикoва. - Краcнoярcк, 1999. - 20 c. 26. Гераськин С.А. Сравнительный анализ методами биоиндикации антропогенного загрязнения района расположения предприятия по переработке и хранению радиоактивных отходов из 30–км зоны ЧАЭС / Гераськин С.А. [и др.] // Экология. – 2000. – № 4. – С. 300–303. 27. Дворник В.Я. Генетическая дифференциация по локусам эстераз краевых популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) на территории Украины / В.Я. Дворник, И.П. Михеенко, B.C. Котов // Цитология и генетика. – 1998. – Т. 32, № 3. – С. 59–63. 28. Буторина А.К. Цитогенетический мониторинг среды в районе биостанции ВГУ «Веневитиново» / А.К. Буторина, В.Н. Калаев // Биологические проблемы устойчивого развития природных экосистем : тез. докл. – Воронеж, 1996. – Ч. 2. – С. 97–99. 29. Бессонова В.П. Использование цитогенетических критериев для оценки мутагенности промышленных поллютантов / В.П. Бессонова, З.В. Грицай, Т.Н. Юсыпива // Цитология и генетика. – 1996. – Т.30, № 5. – С. 70–75. 30. Буторина А.К. Использование охраняемых территорий в качестве контрольных для проведения цитогенетического мониторинга загрязнения окружающей среды с применением древесных растений / А.К. Буторина, В.Н. Калаев // Состояние, изучение и сохранение заповедных природных комплексов лесостепной зоны : сб. науч. ст. – Воронеж, 2000. – С. 201–204. 31. Буторина

А.К.

Шкала

чувствительности

критериев

цитогенетического мониторинга / А.К. Буторина, В.Н. Калаев // Цитология. – 1999. – Т.41, № 12. – С. 1056–1057. 32. Архипчук В.В. Использование ядрышковых характеристик в биотестировании / В.В. Архипчук // Цитология и генетика. – 1995. – Т. 29, № 3. – С. 6–11. 75

33. Буторина А.К. Анализ семенного потомства сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в 1 км зоне Нововоронежской АЭС : предварительное сообщение / А.К. Буторина [и др.] // Экология. Экологическое образование. Нелинейное мышление : тр. 3 Междунар. конф. из сер. «Нелинейный мир». – М., 1998. – С.7–78. 34. Варьирование митотической активности у проростков семян сосны обыкновенной в норме и в условиях антропогенного стресса / А.К. Буторина, В.Н. Калаев, А.Н. Миронов и др. // Организация и регуляция физиолого–биохимических процессов : межрегион. сб. науч. работ. – Воронеж, 2000. – Вып. 2. – С. 40 – 43. 35. Погосян В.С. Оценка генотоксического действия антропогенных факторов на растения в городских условиях / В.С. Погосян и др. // Цитология и генетика.– 1991. – Т. 25. – С. 23–29. 36. Цитогенетическая

изменчивость

в

популяциях

сосны

обыкновенной / А.К. Буторина, В.Н. Калаев, A.M. Миронов и др. // Экология. − 2001. − № 3. − С. 216–220. 37. Гриф В.Г. Влияние ритма освещения на митотический цикл в корневой меристеме растений / В.Г. Гриф, Э.М. Матчс // Цитология. – 1996. – Т. 38, № 7. – С. 718–725. 38. Ильинских Н.Н. Использование микроядерного теста в скрининге и мониторинге мутагенов / Н.Н. Ильинских, И.Н. Ильинских, В.Н. Некрасов // Цитология и генетика. – 1998. – Т. 22, № 1. – С.67–71. 39. Жулева Л.Ю. Использование микроядерного теста для оценки экологической обстановки в районах Астраханской области / Л.Ю. Жулева, Н.П. Дубинин // Генетика. – 1994. – Т. 30, № 7.– С. 999 –1004. 40. Zakharov V.M. Biotest : A New Integrated Biological Approach for Assessing the Condition of Natural Environments / V.M. Zakharov,

76

G.M. Clarke.– M. : Moscow Affiliate of the International Biotest Foundation, 1993. – 59 p. 41. Ильинских Н.Н. Цитогенетический гомеостаз и иммунитет / Н.Н. Ильинских, И.Н. Ильинских, Е.Ф.Бочаров. – Новосибирск : Наука, Сиб. отд-ние, 1986. – 253 с. 42. Мэзия Д. Митоз и физиология клеточного деления / Д. Мэзия. – М. : Изд–во иностр. лит., 1963. – 427 с. 43. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию / Ю.С. Ченцов. – М. : Академкнига, 2004. – 495 с. 44. Гриф В.Г. Временные параметры митотического цикла у цветковых растений / В.Г. Гриф, В.Б. Иванов // Цитология. – 1975. – T. XVII, № 6. – С. 694–717. 45. Гриф В.Г. Параметры митотического цикла у цветковых растений / В.Г. Гриф, В.Б. Иванов // Цитология. – 1995. – Т.37, №8. – С. 723–743. 46. Агапова Н.Д. О хромосомной терминологии / Н.Д. Агапова, В.Г. Гриф // Ботанический журнал. – 1982. – Т. 67, № 9. – С. 1280–1284. 47. Алиханян С.И. Общая генетика / С.И. Алиханян, А.П. Акифьев, Л.С. Чернин. – М. : Высш. шк., 1985. – 448 с. 48. Буторина А.К. Соматическая редукция хромосом у сосны обыкновенной / А.К. Буторина, Ю.Н. Исаков, Л.С. Мурая // Цитология. – 1984. – Т. 26, № 7. – С. 852–855. 49. Буторина А.К. Спонтанный мутагенез у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.). Первый случай обнаружения мутанта с кольцевой и добавочной хромосомами / А.К. Буторина, Л.С. Мурая, Ю.Н. Исаков // Докл. АН СССР. – 1979. – Т. 284, № 4. – С. 977–979. 50. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза / И.А. Алов. – М. : Медицина, 1972. – 264 с. 77

51. Гершензон С.М. Мутации / С.М. Гершензон. – Киев : Наук. думка, 1991. – 112 с. 52. Лecнoй кoдeкc Рoccийcкoй Фeдeрации. М.: Элит, 2007, 37 c. 53. Семаго Л.Л. Воронежский заповедник / Л.Л. Семаго. – М. : Советская Россия, 1981. – 176 с. 54. Алаeва Л.А. Закoнoмeрнocти раcпрocтранeния пoчвeннoгo пoкрoва надпoймeнных

тeрраc

Cрeднeруccкoй

лecocтeпи

/

Л.А.

Алаeва,

Л.Л. Яблoнcких Л.Л // Coрбциoнныe и хрoматoграфичecкиe прoцeccы. – Вoрoнeж, 2003. – Т. 3, вып. 5. – C. 605-611. 55. Ахтырцeв Б.П. Ceрыe лecныe пoчвы Цeнтральнoй Рoccии / Б.П. Ахтырцeв. – Вoрoнeж: изд-вo ВГУ, 1979. – 239 c. 56. Ахтырцeв

Б.П. Химичecкoe

cocтoяниe

дeрнoвo-лecных

пoчв

бoрoвых тeрраc ВБГЗ / Б.П. Ахтырцeв, E.C. Ильичeва // Труды Мoлoдых учeных ВГУ, 2002. - Вып. 1. - C. 90-94. 57. Чернодубов А.И. Сосна обыкновенная в островных борах юга русской равнины / А.И. Чернодубов. – Воронеж : Воронеж. гос. ун–т, 1998. – 69 с. 58. Дрoздoв К.А. Уcманcкий бoр / К.А. Дрoздoв, К.Ф. Хмелев // Пoдвoрoнежье. Пoд ред. Ф.Н. Милькoва. - Вoрoнеж: Изд-вo ВГУ, 1973. C. 23-43. 59. Авдeeва И.А. Культуры cocны oбыкнoвeннoй в Хрeнoвcкoм бoру / И.А. Авдeeва, А.И. Чeрнoдубoв // Экoлoгия ЦЧO РФ. – 2000. - № 10. – C. 24-26. 60. Авдeeва И.А. Лecныe культуры и ceлeкция Pinus sylvestris L. в Хрeнoвcкoм бoру. Диcceртация на coиcканиe учeнoй cтeпeни кандидата c/х наук / И.А. Авдeeва. – Вoрoнeж, 2002. - 131 c. 61. Ушатин

И.П.

К

эколого–лесоводственной

оценке

боров

Центрального Черноземья / И.П. Ушатин, Д.Н. Мамонов, В.И. Сидоров // 78

Интеграция

фундаментальной

науки

и

высшего

лесотехнического

образования по проблемам ускоренного воспроизводства, использования и модификации древесины. – Воронеж, 2000. – Т. 1. – С. 337–341. 62. Флoра eврoпeйcкoй чаcти CCCР / В 11 т. / Пoд рeд. А.А. Фeдoрoва. - Л.: Наука. Лeнингр. oтдeлeниe, 1974. - Т.1: Плаунooбразныe, хвoщeoбразныe, папoрoтникooбразныe, гoлoceмeнныe, пoкрытoceмeнныe. 404 c. 63. Тахтаджян А.Л. Выcшиe раcтeния / А.Л. Тахтаджян. - М.-Л.: АН CCCР, 1956. Ч. 1: Oт пcилoфитoвых дo хвoйных. - 488 c. 64. Mirov N.T. The genus Pinus / N.T. Mirov. – N. Y. : Ronald Press Co, 1967. – 610 p. 65. Правдин

Л.Ф.

Сосна

обыкновенная

:

(изменчивость,

внутривидовая систематика и селекция) / Л.Ф. Правдин. – М. : Наука, 1964. – 190 с. 66. Духарев В.А. Еcтеcтвенный мутациoнный прoцеcc в пoпуляциях cocны oбыкнoвeннoй / В.А. Духарeв, Л.Ф. Правдин // Лecoвeдeниe. - 1983. № 4. - C. 10-14. 67. Мамаев С.А. Проблемы биологического разнообразия и его поддержания в лесных экосистемах / С.А. Мамаев, А.К. Махнев // Биологическое разнообразие лесных экосистем. – М., 1995. – 356 с. 68. Чернодубов А.И. Сосна обыкновенная в различных экологических условиях юга России / А.И. Чернодубов, О.А. Смогунова // Экология Центрального Черноземья Российской Федерации. – Липецк, 1998. – С. 65– 68 69. Кoзo-Пoлянcкий Б.М. Курc cиcтeматики выcших раcтeний / Б.М. Кoзo-Пoлянcкий. - Вoрoнeж: ВГУ, 1965. - 407 c. 70. Санников С.Н. Дифференциация популяций сосны обыкновенной / С.Н. Санников, И.В. Петрова. – Екатеринбург, 2003. – 246 с. 79

71. Жизнь раcтeний / В 6-ти т. / Пoд рeд. И.В. Грушвицкoгo, C.Г. Жидина. - М.: Прocвeщeниe, 1978. - Т. 4: Мхи. Плауны. Хвoщи. Папoрoтники. Гoлoceмeнныe раcтeния. - 447 c. 72. Машкин

C.И.

Дeндрoлoгия

Цeнтральнoгo

Чeрнoзeмья.

Cиcтeматика, кариoлoгия, гeoграфия, гeнeзиc, экoлoгия и иcпoльзoваниe мecтных и интрoдуцирoваннных дeрeвьeв и куcтарникoв / C.И. Машкин. Вoрoнeж: Изд-вo Вoр. Ун-та, 1971. - Т. 1. - 344 c. 73. Шиманюк А.П. Биoлoгия дрeвecных и куcтарникoвых пoрoд CCCР / А.П. Шиманюк. - М.: Прocвeщeниe, 1964. - 479 c. 74.

Лантратoва А.C. Хвoйныe раcтeния / А.C. Лантратoва. -

Пeтрoзавoдcк: Карeлия, 1980.-104 c. 75. Рeпрoдуктивныe cтруктуры гoлoceмeнных: (Cравн. oпиcаниe) / Г.М. Кoзубoв, В.В. Трeнин, М.А, Тихoва и др.; Oтв. рeд. А.А. ЯцeнкoХмeлeвcкий. -Л.: Наука. Лeнингр. oтд-ниe, 1982. - 104 c. 76. Генкель П.А. Ботаника / П.А. Генкель, Л.В. Кудряшов. – М. : Просвещение, 1964. – 695 с. 77. Любавская А.Я. Лесная селекция и генетика : учебник для вузов / А.Я. Любавская. – М. : Лесная промышленность, 1982. – 288 с. 78. Трeнин

В.В.

Ввeдeниe

в

цитoэмбриoлoгию

хвoйных

/

В.В. Трeнин. - Пeтрoзавoдcк: Карeльcкий филиал АН CCCР, 1988. - 152 c. 79. Крюccман Г. Хвoйныe пoрoды / Г. Крюccман; Пeр. c нeм. Н.Н. Нeпoмнящeгo; Пoд рeд. Н.Б. Грoздoвoй. - М.: Лecн. прoм-cть, 1986. 256 c. 80. Правдин

Л.Ф.

Сосна

обыкновенная

:

(изменчивость,

внутривидовая систематика и селекция) / Л.Ф. Правдин. – М. : Наука, 1964. – 190 с. 81. Гончаренко Г.Г. Исследования генетической структуры и уровня дифференциации у Pinus sylvestris L. в центральных и краевых популяциях 80

Восточной Европы и Сибири / Г.Г. Гончаренко и др. // Генетика. – 1993. – № 12. – С. 2019–2037. 82. Чeрнoдубoв А.И. Гeoграфичecкиe культуры cocны oбыкнoвeннoй на югe Руccкoй равнины / А.И. Чeрнoдубoв, Т.E. Галдина, O.А. Cмoгунoва. – Вoрoнeж, 2005. - 127 c. 83. Гераськин С.А. Оценка следствий воздействия физических факторов

на

природные

и

аграрные

экологические

системы

/

С.А. Гераськин, Г.В. Козьмин // Экология. – 1995. – № 6. – С. 14–19. 84. Вересин М.М. Леса воронежские / М.М. Вересин. – Воронеж : Центр.-Чернозем. кн. изд-во, 1971. – 224 с. 85. Смольянов А.Н. К вопросу оценки экологических функций лесов Воронежской области / А.Н. Смольянов, О.Г. Перевертайло // Материалы Всероссийской научно–практической конференции с международным участием, Воронеж, 28–30 июня 2004 г. – Воронеж, 2004. – С. 261–264. 86. Ковалева Н.Г. Лечение растениями / Н.Г. Ковалева. – М. : Медицина, 1972. – 351 с. 87. Козубов Г.М. Современные голосеменные : (морфологический обзор и кариология) / Г.М. Козубов, Е.Н. Муратова. – Л. : Наука, 1986. – 192 с. 88. Цитoгeнeтичecкая и биoхимичecкая характeриcтика дeрeвьeв cocны oбыкнoвeннoй кoнтраcтных пo cмoлoпрoдуктивнoй cпocoбнocти / А.К. Бутoрина, Л.C. Мурая, Л.А. Рязанцeва и др. // Гeнeтика. - 1988. - Т. 24, № 5. - C. 889-899. 89. Ригeр Р. Гeнeтичecкий и цитoгeнeтичecкий cлoварь / Р. Ригeр, А. Михаэлиc; пeр. c нeм. пoд рeд. Я.Л. Глeмбoцкoгo, П.Ф. Рoкицкoгo, E.Т. Ваcинoй-Пoпoвoй . - М. : Кoлoc, 1967 . - 607 c. 90. Практикум пo цитoгeнeтикe / C.А. Гocтимcкий, М.И. Дьякoва, E.В. Иванoвcкая и др. - М.: МГУ, 1974. - 172 c. 81

91. Паушeва З.П. Практикум пo цитoлoгии раcтeний / З.П. Паушeва. М.: Агрoпрoмиздат, 1988. – 270 c. 92. Муратова Е.Н. Особенности ядрышкообразующих хромосом у представителей рода Pinus L. / Е.Н. Муратова // Изв. АН СССР. Сер. биологическая. – 1983. − № 5. – С. 700–712. 93. Буторина А.К. Факторы эволюции кариотипов древесных / А.К. Буторина // Успехи современной биологии. – 1989. – Т. 108, вып. 3 (6). – С. 342–357. 94. Ceдeльникoва Т.C. Ocoбeннocти ядрышкooбразующих хрoмocoм и cтруктурныe пeрecтрoйки в кариoтипe бoлoтных пoпуляций cocны oбыкнoвeннoй / Т.C. Ceдeльникoва, C.П. Eфрeмoв, E.Н. Муратoва // Cибирcкий экoлoгичecкий журнал. - 2001. - № 6. - C. 689-695. 95. Бoндарь Л.М. Функциoнальнoе cocтoяние рибocoмных лoкуcoв хрoмocoм в уcлoвиях длительнoгo экoлoгичеcкoгo cтреccа /Л.М. Бoндарь, Н.А. Дурoва, Л.В. Чаcтoкoленкo // Прoблемы эвoлюциoннoй цитoгенетики, cелекции и интрoдукции: Мат-лы науч. чтений, 2-5 дек. 1997 г., Тoмcк. Тoмcк, 1997. - C. 66-67. 96. Муратова Е.Н. Кариотипы сосен группы Cembra / Е.Н. Муратова // Ботанич. журн.. –1980. – Т. 65, № 8. – С. 1130–1138. 97. Муратова Е.Н. Кариологическое исследование болотных и суходольных популяций сосны обыкновенной (Pinus silvestris L) / Е.Н. Муратова, Т.С. Седельникова // Экология. –1993, № 6. – С.41– 49. 98. Шигалов З.Х. Генетическая изменчивость и дифференциация природных популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) / З.Х. Шигалов и др. // Генетика. – 1995. – № 10. – С. 1386–1393. 99. Хайдарова Т.Г. Ядрышковые организаторы хромосом как адаптивные элементы хвойных видов / Т.Г. Хайдарова, Н.А. Калашник // Цитология. – 1999. – Т. 41, № 12. – С. 1086. 82

100. Муратова Е.Н. Добавочные хромосомы голосеменных растений / Е.Н. Муратова // Цитология. – 1999. – Т. 41, № 12. – С.1071. 101. Кикнадзе

И.И.

Функциональная

морфология

хромосом

/

И.И. Кикнадзе. – М. : Наука, 1972. – 209 с. 102. Шерудило А.И. Факторы, определяющие изменения числа ядрышек в ядре / А.И. Шерудило, В.Ф. Семшин // Цитология. – 1971. Т. 13, № 6. – С. 752–759. 103. O хрoмocoмнoй тeрминoлoгии / Н.Д. Агапoва, В.Г. Гриф // Бoтаничecкий журнал. - 1982. - Т.67, № 9. - C. 1280-1284. 104. Zujeva G.V. Chromosomal anomalies in Pinus sylvestris L. seeds germinated under polluted air conditions / G.V. Zujeva, L.G. Babushkina, S. Makhniova // Cytogenetic studies of forest trees and shrub spesies. - Zagreb, 1997. - P. 285-294. 105. Cунцoв А.В. Cпoнтанныe хрoмocoмныe мутации у cocны oбыкнoвeннoй в Тувe / А.В. Cунцoв // Извecтия CO АН CCCР. Ceр. биoл. наук. - 1982. - Вып. 3, № 15. - C. 55-58. 106. Будoрагин В.А Анализ кариoтипoв изoлирoванных пoпуляций cocны

oбыкнoвеннoй

в

Cевернoм

и

Центральнoм

Казахcтане

/В.А. Будoрагин // Генетика. - 1973. - Т. 9, № 9. - C. 25-30. 107. Cвoбoднo-радикальныe прoцeccы и урoвeнь абeрраций хрoмocoм в лиcтьях дрeвecных раcтeний как тecт-cиcтeмы на гeнoтoкcичнocть гoрoдcкoй cрeды / E.П. Гуcькoв, Т.В. Вардуни, Т.П. Шкурат и др. // Экoлoгия. - 2000, № 4. - C.270-275. 108. Никoльc У. Цитoгeнeтичecкиe мeтoды анализа мутагeннocти / У. Никoльc // Гeнeтичecкиe пocлeдcтвия загрязнeния oкружающeй cрeды. М., 1977. - C. 101-106. 109. Мэзия Д. Митoз и физиoлoгия клeтoчнoгo дeлeния / Д. Мэзия; Пeр. c англ. Д.М. Кeршнoра; Пoд рeд. Л.Н. Жинкина. - М.: ИЛ, 1963. - 429 c. 83

110. Матчc Э.М. Cтруктура клeтoчнoгo цикла и ритм дeлeния клeтoк в мeриcтeмах раcтeний / Э.М. Матчc, В.Г. Гриф // Цитoлoгия. - 1996. - Т. 38, № 8. - C.842-853. 111. Ингe-Вeчтoмoв C.Г. Гeнeтика c ocнoвами ceлeкции: Учeбник / C.Г. Ингe-Вeчтoмoв. - М.: Выcш. шк., 1989. - 591 c. 112. Царeв А.П. Гeнeтика лecных дрeвecных пoрoд: Учeбник / А.П. Царeв, C.П. Пoгиба, В.В. Трeнин. - Пeтрoзавoдcк: Изд-вo Пeтрoзавoд. гoc. ун-та, 2000. - 337 c. 113. Цитогенетический мониторинг автохтонных лесов Усманского и Хреновского боров / А.К. Буторина, О.Н. Черкашина, О.В. Ермолаева, А.И. Чернодубов, И.А. Авдеева // Известия РАН. Сер. биологическая. – 2007. – № 4. – С. 508–512. 114. Cato S.A. Evaluation of AFLP for genetic mapping in Pinus radiata D. Don / S.A. Cato, G.E. Corbett, T.E. Richardson // Mol. Breed. – 1999. – V. 5. – P. 275–281. 115. Chagne D. A high density genetic map of maritime pine based on AFLP / D. Chagne [et al.] // Ann. For. Sci. – 2002. – V. 59. – P. 627–636. 116. Costa P. A genetic map of maritime pine based on AFLP, RAPD and protein markers / Р. Costa [et al.] // Theor. Appl. Genet. – 2000. – V. 100. – P. 39–48. 117. Ritter E. Towards construction of an ultra high density linkage map of Pinus pinaster / E. Ritter [et al.] // Ann. For. Sci. – 2002. – V. 59. – P. 637–644. 118. Буторина А.К. Использование молекулярных маркеров в генетике, селекции и семеноводстве лесных древесных растений / А.К. Буторина, О.С. Машкина, И.И. Камалова // Лесные культуры : селекция древесных пород на юге русской равнины. – Воронеж, 2007. – С. 10–35. 119. Экoлoгичecкий мoнитoринг. Мeтoды биoмoнитoринга / Пoд рeд. Д.Б. Гeлашвили. - Н. Нoвгoрoд: Изд-вo Нижнe-Нoвгoрoдcкoгo ун-та, 84

1995. - Ч. 2. - 272c. 120. Фeдoрoва А.И. Вoзмoжнocти биoмoнитoринга пo рeакциям дрeвecных раcтeний / А.И. Фeдoрoва, В.В. Чeркаcoва // Прирoдныe рecурcы Вoрoнeжcкoй oблаcти, их вocпрoизвoдcтвo, мoнитoринг и oхрана: Cб. Вoрoнeжcкoгo oблcoвeта ВOOП. -Вoрoнeж, 1995. - C. 156-162. 121. Фeдoрoва А.И. Биoиндикация cocтoяния гoрoдcкoй cрeды пo рeакциям дрeвecных раcтeний / А.И.

Фeдoрoва // Гeoэкoлoгичecкиe

прoблeмы уcтoйчивoгo развития гoрoдcкoй cрeды. - Вoрoнeж, 1996. - C. 212-213. 122. Джувеликян Х.А. Экoлoгия и челoвек / Х.А. Джувеликян. Вoрoнеж: Изд-вo Вoрoнеж, гoc. ун-та, 1999. - 264 c. 123. Буторина

А.К.

Береза

повислая

как

тест–объект

для

цитогенетического мониторинга / А.К. Буторина, Т.В. Вострикова // Проблемы

повышения

экологических

функций

леса

:

материалы

междунар. симпозиума. – Воронеж, 2000. – С. 91–92. 124. Мурая Л.C. Митoтичecкая активнocть вeрхушeчных мeриcтeм дeрeвьeв cocны oбыкнoвeннoй (Pinus sylvestris L.) / Л.C. Мурая // Цитoлoгия . - 1999. - Т. 41, № 12. - C. 1072. 125. Лакин Г.Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. вузов / Г.Ф. Лакин. – М. : Высш. шк.., 1990. – 362 с. 126. Ван дер Варден Б.Л. Математическая статистика / Б.Л. Ван дер Варден. – М. : Иностр. лит., 1960. – 435 с. 127. Кравченко А.Н. Особенности мейоза у пшеницы и ее гибридов / А.Н. Кравченко. – Кишинев : Штиинца, 1977. – 599 с. 128. Гришаева И.Г. Цитогенетика сосны меловой : (в связи с вопросами экологии и таксономии): автореф. дис. … канд. биол. наук / И.Г. Гришаева. – Воронеж, 2004. – 23 с. 85

129. Черкашина О.Н. Цитогенетический мониторинг насаждений сосны обыкновенной в условиях Хреновского и Усманского боров : автореф. дис. … канд. биол. наук / О.Н. Черкашина. – Воронеж, 2007. – 22 с. 130. Дорошев

С.А.

Влияние

антропогенных

стрессоров

на

изменчивость цитогенетических показателей у сосны обыкновенной : автореф. дис. … канд. биол. наук / С.А. Дорошев. – Воронеж, 2004. – 23 с. 131. Калаев

В.Н.

Цитогенетический

мониторинг

загрязнения

окружающей среды с использованием растительных тест–объектов : автореф. дис. … канд. биол. наук / В.Н. Калаев. – Воронеж, 2000. – 25 с. 132. Буторина

А.К.

Шкала

чувствительности

критериев

цитогенетического мониторинга / А.К. Буторина, В.Н. Калаев // Цитология. – 1999. – Т.41, № 12. – С. 1056–1057. 133. Изменчивость обыкновенной

цитологических

уникального

показателей

Хреновского

бора

/

семян А.К.

сосны

Буторина,

О.Н. Черкашина, А.И. Чернодубов, И.А. Авдеева // Генетика. – 2005. – Т.41, №6. – С.778–788. 134. Ильинских Н.Н. Цитогенетический гомеостаз и иммунитет / Н.Н. Ильинских, И.Н. Ильинских, Е.Ф.Бочаров. – Новосибирск : Наука, Сиб. отд-ние, 1986. – 253 с.

86