Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

CORRIE ALLAERT VANDEVENNE MARTA ESCOLÁ RIBES

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

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© Corrie Allaert Vandevenne y Marta Escolá Ribes, 2002

Reservados todos los derechos. «No está permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright.»

Ediciones Díaz de Santos, S. A. Juan Bravo, 3-A. 28006 MADRID España

E-mail: [email protected] Internet://http:www.diazdesantos.es

ISBN: 84-7978-524-1 Depósito legal: M. 23.431-2002

Fotocomposición: Fernández Ciudad, S. L. Impresión: Fernández Ciudad, S. L. Encuadernación: Rústica-Hilo, S. L. Impreso en España

Autores • CORRIE ALLAERT VANDEVENNE, Técnico en Microbiología (Instituto Pasteur de Lille), responsable del Laboratorio de Microbiología de Alimentos y Aguas del Departamento de Tecnología de Alimentos de la Universidad de Lleida, Coordinadora del Programa EQUASE (Ejercicios de Verificación Externa de Calidad) en España en colaboración con el PHLS (Public Health Laboratory Services) del UK, Representante de la Universidad de Lleida en los ejercicios interlaboratorios de validación de métodos ISO para el CEN (Comité Europeo de Normalización). e-mail: [email protected] • MARTA ESCOLÀ RIBES, Ingeniero Agrónomo. Este libro es una versión modificada y adaptada de su Proyecto de Fin de Carrera.

Agradecimientos A Vicente Sanchis Almenar, catedrático de Microbiología de Alimentos, por su confianza y por darnos ánimos para publicar este proyecto en forma de libro. A Robert Garrofé Forca, por su fiel y eficaz colaboración técnica para la puesta a punto de los métodos y la integración de los mismos en los sistemas de calidad del laboratorio. A Nuria Sala Martí, profesora de Microbiología de Alimentos y Agraria, miembro de la comisión ISO/CEN en España, así como a Mercè Torres Grifo, profesora de Microbiología General e Higiene, por su colaboración en los ensayos interlaboratorios de validación y sus criticas constructivas.

Reflexiones «Quedé muerto así como mineral y me convertí en planta. Quedé muerto luego como planta y tomé una forma sensible. Quedé muerto luego como animal, me puse atuendo humano. ¿Cuándo me hice menos por la muerte?» RUMI

«La vida... una profundidad viva de equilibrios, siempre en movimiento y fusión, de tensiones y desahogos, en la constante transformación de creación y destrucción.» EDWARD C. WHITMONT

«As microbiologists, dealing with living organisms, we should probably have learned by now to always expect the unexpected.» SHEILA EATON, Responsable de la Organización de EQUAL del PHLS. Es la conclusión de más de 10 años de ejercicios interlaboratorios para Verificación Externa de Calidad.

«De luz y de sombra soy, quiero darme a las dos.» GABRIEL Y GALÁN VOOR BOY EN SOR

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. XIX CAPÍTULO PRIMERO PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS (PNT - AL- 001) .........................................................................

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CAPÍTULO SEGUNDO PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) .........

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Tablas de resultados ........................................................................................................... Anexo 1: Tablas de límites de confianza ........................................................................... Anexo 2: Ejemplos ............................................................................................................. Recuento en medio sólido sin identificación: Ejemplos 1 al 12 ........................................ Recuento en medio sólido después de identificación: Ejemplos 13 al 26 ......................... Recuento en medio líquido: Ejemplos 27 al 31 .................................................................

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CAPÍTULO TERCERO PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS ................ PNT - AL - 003: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30°C (método de referencia) .......................................................................................................... PNT - AL - 004: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30°C (método de rutina) ................................................................................................................. PNT - AL - 005: Método horizontal para el recuento de levaduras y mohos (método de referencia) ....................................................................................................................... PNT - AL - 006: Método horizontal para el recuento de levaduras y mohos (método de rutina) .............................................................................................................................. PNT - AL - 007.1: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica del NMP (método de referencia) ...................................................... PNT - AL - 007.2: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) .............................. PNT - AL - 008: Método horizontal para la investigación de Enterobacteriaceae con preenriquecimiento (método de referencia) ...................................................................... XIII

61 62 64 66 68 70 72 75

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ÍNDICE

PNT - AL - 009: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (método de rutina) .................................... PNT - AL - 010: Método horizontal para el recuento de coliformes totales. Técnica del NMP (método de referencia) ....................................................................................... PNT - AL - 011: Método horizontal para el recuento de coliformes totales. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) .................................................................. PNT - AL - 012: Método horizontal para el recuento de coliformes totales (método de rutina) .............................................................................................................................. PNT - AL - 013: Método horizontal para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica del NMP (método de referencia) .......................................................................... PNT - AL - 014: Método horizontal para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos (método de rutina) ........................................................................................ PNT - AL - 015.1: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS) con confirmación. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) .......................................................................................................................... PNT - AL - 015.2: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS) sin confirmación. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) .......................................................................................................................... PNT - AL - 016.1: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica con confirmación de colonias (método de rutina) ....................... PNT - AL - 016.2: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica sin confirmación de colonias (método de rutina) ......................... PNT - AL - 017: Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus (método de referencia) .......................................................................................................................... PNT - AL - 018: Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus (método de rutina). PNT - AL - 019: Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (método de referencia) ............................................................................................................... PNT - AL - 020: Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (método de rutina) ...................................................................................................................... PNT - AL - 021: Método horizontal para la investigación de Salmonella (método de referencia) ....................................................................................................................... PNT - AL - 022: Método horizontal para la investigación de Salmonella (método de rutina) .............................................................................................................................. PNT - AL - 023.1: Método horizontal para la investigación de Listeria monocytogenes (método de referencia) ................................................................................................. PNT - AL - 023.2: Método horizontal para el recuento de Listeria monocytogenes (método de referencia) ....................................................................................................... PNT - AL - 024: Método horizontal para la investigación de Listeria monocytogenes (método de rutina) .............................................................................................................. PNT - AL - 025: Método horizontal para la investigación de Campylobacter termotolerantes (método de rutina) .............................................................................................

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CAPÍTULO CUARTO PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (PNT - ME - 001) ........................................................................................................

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CAPÍTULO QUINTO PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO (PNT - ME - 002) ....................................................................................

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ÍNDICE

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CAPÍTULO SEXTO PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ...............

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Relación de medios de cultivo y PNT - AL en el que aparecen ........................................ PNT - ME - 003: Procedimiento para la preparación de la peptona salina (PS) ................ PNT - ME - 004: Procedimiento para la preparación del agar para recuento (PCA) ......... PNT - ME - 005: Procedimiento para la preparación del agar blanco (AB) ...................... PNT - ME - 006: Procedimiento para la preparación del agar glucosa y cloranfenicol (CGA) .......................................................................................................................... PNT - ME - 007: Procedimiento para la preparación del caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) ...................................................................................... PNT - ME - 008: Procedimiento para la preparación del agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG) ................................................................................................................... PNT - ME - 009: Procedimiento para la preparación del agar glucosado (AG) ................ PNT - ME - 010: Procedimiento para la preparación del agar nutritivo (AN) .................. PNT - ME - 011: Procedimiento para la preparación del caldo nutritivo (CN) ................. PNT - ME - 012: Procedimiento para la preparación del agua de peptona tamponada (APT) ........................................................................................................................... PNT - ME - 013: Procedimiento para la preparación del caldo de triptona lauril sulfato (TSL) ............................................................................................................................ PNT - ME - 014: Procedimiento para la preparación del caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL) .............................................................................................................. PNT - ME - 015: Procedimiento para la preparación del agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL) ....................................................................................... PNT - ME - 016: Procedimiento para la preparación del caldo Escherichia coli (caldo EC).. PNT - ME - 017: Procedimiento para la preparación del agua de triptona (AT) ............... PNT - ME - 018: Procedimiento para la preparación del agar con tergitol-BCIG (PTX) . PNT - ME - 019: Procedimiento para la preparación del medio de Baird-Parker (BP) ..... PNT - ME - 020: Procedimiento para la preparación del caldo de cerebro-corazón (BHI) .... PNT - ME - 021: Procedimiento para la preparación del agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF) .......................................................................................................... PNT - ME - 022: Procedimiento para la preparación del agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA) ..................................................................................................... PNT - ME - 023: Procedimiento para la preparación del medio Voges-Proskauer (MRVP) ............................................................................................................................... PNT - ME - 024: Procedimiento para la preparación del medio nitrato (MN) .................. PNT - ME - 025: Procedimiento para la preparación del agar sangre (AS) ...................... PNT - ME - 026: Procedimiento para la preparación del agar movilidad (AM) ............... PNT - ME - 027: Procedimiento para la preparación del agar triptona-sulfito con cicloserina (TSC) .................................................................................................................... PNT - ME - 028: Procedimiento para la preparación del tioglicolato (TIO) ..................... PNT - ME - 029: Procedimiento para la preparación del medio lactosa sulfito (LS) ........ PNT - ME - 030: Procedimiento para la preparación del caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio (Rappaport-Vasiliadis modificado) (RV) ................................... PNT - ME - 031: Procedimiento para la preparación del caldo selenito-cistina (SC) ....... PNT - ME - 032: Procedimiento para la preparación del agar rojo fenol y verde brillante (BGA) .......................................................................................................................... PNT - ME - 033: Procedimiento para la preparación del medio Hektoen (HK) ................ PNT - ME - 034: Procedimiento para la preparación del agar Kligler .............................. PNT - ME - 035: Procedimiento para la preparación del agar nutritivo semisólido (ANS) ... PNT - ME - 036: Procedimiento para la preparación del caldo Fraser semi (FS) ............. PNT - ME - 037: Procedimiento para la preparación del caldo Fraser completo (FC) .....

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ÍNDICE

PNT - ME - 038: Procedimiento para la preparación del agar Oxford .............................. PNT - ME - 039: Procedimiento para la preparación del agar Palcam .............................. PNT - ME - 040: Procedimiento para la preparación del agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA) ....................................................................................................... PNT - ME - 041: Procedimiento para la preparación del caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa) ......................................................................................... PNT - ME - 042: Procedimiento para la preparación del caldo de Park y Sanders ........... PNT - ME - 043: Procedimiento para la preparación del agar de Karmali (AK) .............. PNT - ME - 044: Procedimiento para la preparación del agar Butzler modificado ........... PNT - ME - 045: Procedimiento para la preparación del caldo de Brucella (CB) ............. PNT - ME - 046: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Columbia .......... PNT - ME - 047: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Mueller-Hinton PNT - ME - 048: Procedimiento para la preparación del agar citrato de hierro tres azúcares (TSI) ....................................................................................................................... PNT - ME - 049: Procedimiento para la preparación del caldo triptona de soja (TSB) ....

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CAPÍTULO SÉPTIMO PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS (PNT RE - 001) .....................................................................................................................

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CAPÍTULO OCTAVO PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS (PNT - RE - 002) ........................................................................................................

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CAPÍTULO NOVENO PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS ..................................

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Relación de reactivos y medio al que se añaden ................................................................ PNT - RE - 003: Procedimiento para la preparación del suplemento antimicrobiano de gentamicina .................................................................................................................. PNT - RE - 004: Procedimiento para la preparación de la solución estéril de yema de huevo ................................................................................................................................. PNT - RE - 005: Procedimiento para la preparación del telurito potásico al 1% .............. PNT - RE - 006: Procedimiento para la preparación de la sulfametacina al 0,2% ............ PNT - RE - 007: Procedimiento para la preparación del sulfato de polimixina B al 4% ... PNT - RE - 008: Procedimiento para la preparación del rojo de metilo ............................ PNT - RE - 009: Procedimiento para la preparación de la solución de α-naftol . ............. PNT - RE - 010: Procedimiento para la preparación de la solución de KOH al 40% ....... PNT - RE - 011: Procedimiento para la preparación del reactivo de nitratos .................... PNT - RE - 012: Procedimiento para la preparación del metabisulfito sódico al 1,2% ..... PNT - RE - 013: Procedimiento para la preparación del citrato férrico amoniacal al 1% ..... PNT - RE - 014: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el caldo Fraser semi .............................................................................................................. PNT - RE - 015: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el caldo Fraser completo ...................................................................................................... PNT - RE - 016: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar Oxford ..........................................................................................................................

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ÍNDICE

PNT - RE - 017: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar Palcam .......................................................................................................................... PNT - RE - 018: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «A» para el caldo de Park y Sanders ................................................................................... PNT - RE - 019: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «B» para el caldo de Park y Sanders ................................................................................... PNT - RE - 020: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar de Karmali ................................................................................................................... PNT - RE - 021: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar Butzler .......................................................................................................................... PNT - RE - 022: Procedimiento para la preparación del reactivo de Kovacs .................... PNT - RE - 023: Procedimiento para la preparación de la solución salina (SS) ................ PNT - RE - 024: Procedimiento para la preparación del reactivo para la investigación de la β-galactosidasa (ONPG) .............................................................................................. PNT - RE - 025: Procedimiento para la preparación de la solución de fenilalanina al 0,5% (FA) .................................................................................................................... PNT - RE - 026: Procedimiento para la preparación de la solución de cloruro férrico al 10% ..............................................................................................................................

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234 235 236 237 238 239 240 241 242 243

BIBLIOGRAFÍA GENERAL .........................................................................................

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NORMATIVA ..................................................................................................................

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INTRODUCCIÓN

El presente libro va dirigido a los profesionales y estudiantes de Microbiología del sector agro-alimentario en el control de las materias primas y los productos terminados, a los laboratorios de análisis de alimentos, a los técnicos de laboratorio, a las Universidades que realizan prácticas de microbiología de alimentos y de control de calidad. Para aplicar los métodos aquí descritos se requiere que el laboratorio disponga del material y equipos corrientes en un laboratorio de microbiología de alimentos. Este material estará debidamente calibrado, verificado y mantenido en optimas condiciones de funcionamiento según procedimientos propios del sistema de calidad de cada laboratorio y adaptado a la norma ISO 7218 (Reglas Generales para los ensayos microbiológicos). Además, cada método puede precisar algún material o equipo especifico. La implantación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y Aseguramiento de la Calidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio. Por ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin de dar uniformidad y consistencia a los análisis de alimentos que se realizan en los laboratorios de microbiología y reducir los riesgos de error por parte de las personas que realizan el ensayo. Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtención de resultados analíticos de calidad y conseguir la aceptación mutua de estos resultados entre los diferentes países, tenemos que seguirlas escrupulosamente. La elaboración de estos documentos viene dada por la necesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestión de los laboratorios, ya que hace falta asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los análisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios. Así, se ha realizado una homogeneización de los métodos de análisis de alimentos, unificando sus características en base a las normas internacionales correspondientes (ISO: International Standard Organisation; EN: European Norme; NF: Norme Française; AFNOR: Association Française de Normalisation). Junto con ellos se han redactado los procedimientos de preparación de los medios de cultivo y reactivos necesarios para realizar los ensayos, de manera que hay una explicación de cada uno de los aspectos de los procedimientos de análisis. Los resultados de los análisis son el producto final del trabajo del laboratorio, de manera que se ha de obtener un resultado fiable, lo cual es el principal objetivo de todos los sistemas de calidad. A causa de la complejidad de la norma de expresión de reXIX

XX

INTRODUCCIÓN

sultados, en el apartado correspondiente de los PNT - AL (métodos) únicamente se expone el caso general y se ha redactado un procedimiento (PNT - AL - 002) que explica detalladamente la manera de expresar los resultados en cada posible caso. En este PNT se expone en unas tablas la forma de obtener y expresar el resultado del análisis para cada PNT - AL. Además, en este procedimiento hay ejemplos de casos prácticos que ayudan a la aplicación de las fórmulas. Los métodos ISO (2 placas por dilución, confirmación de 5 colonias) suelen utilizarse como métodos de referencia y los métodos NF (1 placa por dilución, confirmación de 3 colonias) se suelen emplear como métodos de rutina, siendo los dos métodos normalizados. Con el objetivo de uniformizar todos los procedimientos del laboratorio, se han redactado unos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) que dan las instrucciones para la redacción de todos estos documentos, tanto de métodos de análisis de alimentos (PNT - AL - 001) como los de preparación y control de calidad de los medios de cultivo (PNT - ME - 001 y PNT - ME - 002) y reactivos (PNT - RE - 001 y PNT RE - 002) necesarios para ellos. Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) son un conjunto de instrucciones escritas de obligado y riguroso cumplimiento que describen cómo deben realizarse determinados métodos de ensayo, cómo deben manejarse los equipos de análisis o cómo se debe proceder ante cualquier otra actividad del laboratorio. La preparación de algunos medios de cultivo (PNT - ME) o reactivos (PNT - RE) es específica de una marca comercial. Antes de aplicarlos habrá que comprobar la composición del medio o reactivo usado en el laboratorio y adaptarlo a las instrucciones del proveedor o de la norma original. La normalización es un proceso continuo de mejoría en los análisis, y aunque los cambios sean lentos, debido al proceso de elaboración de normas internacionales, pasado algunos años es aconsejable comprobar que la norma en la que se basa el PNT no haya sufrido modificaciones. En el momento de la redacción del libro, algún método ya había salido con pequeños cambios, como por ejemplo el de recuento de enterobacterias, método en el cual se suprime la confirmación de colonias. Pero la experiencia demuestra que esta confirmación es muy útil a la hora de evitar falsos positivos en según qué productos. Así que hemos dejado la confirmación, ya que siempre es más fácil quitar pasos que no añadir. Las normas ISO, EN, NF, AENOR (Asociación Española de Normalización) se van elaborando y revisando de manera continua. Como este proceso suele ser bastante largo, es aconsejable consultar las siguientes páginas web: • • • •

ISO: http://www.iso.ch EN: http://www.cenorm.be AFNOR: http://www.afnor.fr AENOR: http://www.aenor.es

Últimamente se está realizando la validación de los métodos ISO para el CEN (Comité Europeo de Normalización), y como consecuencia se incluirán en las normas los datos de precisión (expresados en repetibilidad y reproducibilidad) definidos durante los ensayos interlaboratorios. Por este motivo, las normas de reciente publicación incluyen en la expresión de resultados el apartado «Precisión». Las demás normas se remiten a una norma general, la ISO 7218.

INTRODUCCIÓN

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El año 2000 vio la aparición de la norma ISO 17025 Prescripciones generales para la competencia de los laboratorios de calibración y ensayos. Esta norma es el resultado de un intento de armonización entre los diferentes documentos existentes, como la Guía ISO 25, la norma EN 45001 y las ISO 9000. Los cambios a destacar son los que hacen hincapié en la relación laboratorio/cliente, teniendo en cuenta la información que busca el cliente y para qué quiere esta información. En el caso de los ensayos, el método empleado para dar esta información es fundamental, así como características como la precisión en términos de repetibilidad y reproducibilidad, incertidumbres y validación. En una nota se explica que para validar métodos conviene emplear una combinación de las siguientes técnicas: • • • • •

Utilización de material de referencia. Comparación de los resultados con los obtenidos con otros métodos. Comparaciones interlaboratorios (ejercicios de verificación externa de calidad). Evaluación sistemática de los factores que puedan afectar a los resultados. Evaluación de las incertidumbres en base a principios teóricos y conocimiento práctico del método.

Mediante las incertidumbres (material de referencia empleado, métodos y equipos, condiciones ambientales, propiedades y condiciones del objeto sometido a análisis, el técnico, etc.) y los límites de confianza del método, se presenta ahora un resultado, no como un valor único, pero como un conjunto de valores numéricos, todos ellos probables. Hay que destacar que la palabra incertidumbre sale 34 veces en esta nueva norma. Con los métodos que presentamos en este libro se persigue obtener un sistema de trabajo cuyo objetivo es agilizar y facilitar las operaciones del laboratorio, al tener a mano y desglosadas por pasos todas las operaciones a seguir para realizar el análisis, asegurando al mismo tiempo que éstas se realizan correctamente. Los esquemas; en color, son un fiel reflejo de los medios de cultivo y de todas las reacciones bioquímicas que en ellos se producen; de esta manera; ayudarán a las personas que se inician en estos métodos; al reflejar las características del medio y de las colonias que crecen en él. Así; se puede saber rápidamente si el medio que se ha de utilizar se necesita en frascos, en tubos (con o sin campana) o en placas, conocer su color original y observar los cambios que sufre en el proceso. Respecto a las colonias, al estar dibujadas con su color, textura y halo, se puede comprobar si su crecimiento es el correcto. Así, estos PNT son unas guías de trabajo muy útiles a la hora de iniciar y seguir los análisis.

CAPÍTULO PRIMERO

Procedimiento general de redacción de métodos de análisis de alimentos (PNT - AL - 001)

PNT - AL - 001

PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS

1. OBJETO El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la redacción de los procedimientos de análisis de alimentos.

2. ÁMBITO DE APLICACIÓN Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL.

3. REFERENCIAS • ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes microbiológicos. • Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL. • Manual de Calidad del Laboratorio de Microbiología. • Procedimiento General de Redacción de Documentos. • Guías ENAC y ISO 17025.

4. METODOLOGÍA 1. Recopilar la documentación existente (normas internacionales: ISO, EN, AFNOR, CNAN, etc., PNT del propio laboratorio, artículos en revistas especializadas...) y la documentación en proyecto sobre el procedimiento que queremos redactar. 2. Estudiar el modo operativo del laboratorio para el cual se realiza el documento. 3. Adaptar el Procedimiento General de Redacción de Documentos a este documento.

5. PROCEDIMIENTO Los PNT realizados según el presente documento son instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar el análisis en el laboratorio, de manera que presentan una forma esquematizada de realizar los ensayos. Por consiguiente, en caso de necesitar más detalles, se deberá acudir a la documentación original (norma en la que se basan). Estos procedimientos de métodos de análisis de alimentos están formados por dos partes bien diferenciadas: • Instrucciones de trabajo • Esquema del proceso. Estos procedimientos constan de los siguientes apartados: 0. Carátula. 1. Definición. 2. Medios de cultivo. 3

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

3. 4. 5. 6. 7. 8.

Reactivos. Siembra. Recuento (en caso que se realice). Confirmación (en caso que se realice). Expresión de resultados. Esquema.

5.1. Carátula La carátula debe encabezar cada una de las páginas del PNT y ha de incluir los siguientes apartados: • • • • 5.1.1.

Título del PNT. Tipo y número del PNT. Norma en la que se basa. Número de página. Título del PNT

En este apartado deberá constar: • Tipo de análisis que se realiza: recuento o investigación, especificando si se utiliza alguna técnica en particular (sin/con revivificación/pre-enriquecimiento, por recuento de colonias, por número más probable...). • El microorganismo o grupo de microorganismos que se estudia. NOTA 1: Los nombres científicos de microorganismos, en latín, deben escribirse en cursiva, con letras minúsculas y la inicial en mayúscula (por ejemplo Salmonella), mientras que los nombres de las familias, también en latín, se escribirán del mismo modo pero sin cursiva (por ejemplo Enterobacteriaceae). Para homogeneizar los distintos títulos que aparecen en la documentación (método de referencia, método de rutina, directiva general...) se ha optado por nombrar como MÉTODO HORIZONTAL, que es la denominación que se aplica como título en las nuevas normas internacionales. Con esta denominación indicamos que los métodos se aplican a todo tipo de productos, salvo raras excepciones; estos casos particulares estarán indicados en los PNT sobre preparación de la porción analítica y diluciones decimales y son específicos de cada laboratorio. De esta manera, los métodos de referencia y de rutina se distinguen según la norma en la cual están basados (los métodos de referencia se basan en normas ISO/EN y los de rutina en normas AFNOR). Asimismo, también se ha unificado el nombre del tipo de análisis, sustituyendo ENUMERACIÓN por RECUENTO. 5.1.2. Tipo y número del PNT En el caso que nos ocupa, el número del documento vendrá precedido por las siglas PNT - AL, en referencia a su condición de procedimiento normalizado de análisis de alimentos, seguidas de un número de tres cifras (por ejemplo, PNT - AL - 011). En determinados análisis, por ejemplo, cuando se realiza un recuento del mismo microorganismo por dos técnicas distintas, el PNT se divide en dos partes. Este hecho se indicará en la

PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS

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numeración, de manera que junto al número de tres cifras seguirá un punto «.» y el número «1» o «2», según corresponda (por ejemplo, PNT - AL - 017.1). NOTA 2: Este desdoblamiento se suele manifestar también en la norma original. 5.1.3. Norma en la que se basa Dado que estos PNT son una adaptación de las normas correspondientes, según el método de trabajo del laboratorio y, por tanto, se han hecho ciertos cambios en ellas, no se puede decir que se han resumido sino que, basándose en ellas, para asegurar que los ensayos se realizan correctamente, se ha esquematizado el proceso en función de su uso en el lugar de trabajo. Estos cambios, en ningún caso son sustanciales. Así pues, en la carátula debe figurar «BASADO EN» la norma ISO/EN (para métodos de referencia) o AFNOR (para métodos de rutina) correspondiente al ensayo, indicando su número y la fecha de edición (mes y año). 5.2. Definición En este apartado incluiremos todas aquellas definiciones de términos, acciones, etc., que aparecen en el procedimiento cuya descripción puede ser importante a la hora de realizar el análisis y adaptarlo a la petición del cliente. Así, encontraremos en todos los casos la definición del microorganismo ensayado y, opcionalmente, otras explicaciones de aspectos del análisis que puedan ser de utilidad. El término o términos definidos se subrayarán, empezando la definición con letra mayúscula. En la definición se ha hecho una unificación de las definiciones, de manera que, en todos los casos, se termina con la frase «cuando el ensayo se realiza según el siguiente método», independientemente de que el documento esté basado en una norma ISO/EN o en una AFNOR. A continuación se exponen dos definiciones cuya explicación, para simplificar, se ha excluido de los PNT (pues se repiten de manera idéntica en todas las normas), pero que son de gran importancia a la hora de realizar los ensayos. • Recuento de microorganismos 1: Número de microorganismos 1 encontrado por gramo o mililitro de muestra cuando el ensayo se realiza según el siguiente método. • Investigación de microorganismos 1: Determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos 1 en una cantidad determinada de muestra cuando el ensayo se realiza según el siguiente método. 5.3. Medios de cultivo En esta sección se da la relación de todos los medios de cultivo que se utilizan en el ensayo, dispuestos según su orden de utilización, y acompañados, si se da el caso, de las siglas o abreviaturas con las que se los conoce habitualmente, entre paréntesis. Dado que muchos de estos medios se denominan de distinta manera, según la casa comercial que los suministra, los nombres que se les ha dado son aquéllos con los que se les conoce en el laboratorio en el cual se han redactado estos PNT. Para cada uno de estos medios de cultivo se ha realizado un PNT, en el cual se indica, entre otras cosas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - ME correspondiente). 1

Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

5.4. Reactivos Este apartado estará formado por una lista de los reactivos necesarios para realizar el análisis. Como en algunos métodos no son necesarios, esta sección puede no aparecer en el PNT. Entendemos por reactivos: • • • •

Suplementos de medios de cultivo. Sustratos bioquímicos para investigación de reacciones enzimáticas. Sustancias para poner en evidencia reacciones bioquímicas. Etcétera.

La denominación de estas sustancias es la que se les da en el laboratorio, aunque en algunos casos se acompaña del nombre químico del componente principal. NOTA 3: Los suplementos que se añaden a los medios de cultivo sólo se incluyen a la lista de reactivos cuando se incorporan al medio base en el momento de realizar el análisis. Para cada uno de estos reactivos se ha realizado un PNT, en el cual se indica, entre otras cosas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - RE correspondiente). Las cantidades a añadir, así como su presentación, corresponden a la marca utilizada en el laboratorio en el cual se han realizado los PNT, de manera que pueden variar en función del proveedor; en este caso se deberá cumplir con sus instrucciones. 5.5. Siembra En este apartado se explican, paso por paso, cada una de las acciones a realizar en el ensayo, desde la siembra hasta la incubación, indicando: • Medios de cultivo necesarios, señalando si se encuentran en tubos o en placas; en este caso se indicará si la siembra es en superficie o por inclusión y si se realiza doble capa. También constará en este apartado si los medios han de tener características particulares (temperatura, estar regenerado...). • Temperatura y tiempo de incubación. En general, la incubación se realizará en estufas reguladas a la temperatura indicada; en caso contrario, por ejemplo, cuando se realiza en baño termostático, deberá constar en el apartado. En aquellos análisis en los que el periodo de incubación no tiene una duración definida, pues depende de la velocidad de crecimiento de las colonias, se ha indicado el tiempo mínimo de incubación y, en caso que no se observe crecimiento, se da, entre paréntesis, el periodo máximo durante el cual se examinará si hay o no desarrollo de colonias, con la frase «+ x h si es necesario». En el caso de reacciones bioquímicas, se indica de esta manera el tiempo máximo de incubación para asegurar la negatividad. Por ejemplo, si se indica que la incubación debe ser a 30°C ± 1°C durante 24 h (+ 48 si es necesario), significa que si después de 24 h de incubación no se observa un crecimiento característico del microorganismo ensayado, se deberán mantener las placas en la estufa hasta el tiempo máximo indicado. En los procedimientos donde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el apartado en las distintas fases: Pre-enriquecimiento, Enriquecimiento, Aislamiento, Selección (puede que no se den todas). En los casos en que se realice aislamiento y selección de colonias para realizar la posterior confirmación, se deberán describir las características (color, tamaño, si forman o no halo de lisis

PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS

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o de precipitado y, de ser así, de qué color) de las colonias típicas del microorganismo ensayado en el medio correspondiente (denominadas en todos los casos como «COLONIAS CARACTERÍSTICAS»). NOTA 4: En general, la dilución madre se prepara con 10 mililitros (si el producto es líquido) ó 10 gramos (para el resto de productos) de muestra en 90 mL de peptona salina (PS) a T ambiente. 5.6. Recuento En esta sección se darán las características de los tubos positivos (ensayo en medio líquido) o de las colonias que se han de contar de cada placa (ensayo en medio sólido) y, si se da el caso, los requisitos de los tubos/placas que se han de retener para realizar sobre sus colonias las pruebas de confirmación bioquímica. En este caso, el apartado de RECUENTO puede aparecer después del de CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA incluido en el apartado EXPRESIÓN DE RESULTADOS. 5.7. Confirmación En caso de que el método requiera la realización de pruebas bioquímicas y serológicas para confirmar las colonias, se explicará cada una de ellas en este apartado, indicando sobre qué colonias o tubos se realiza, los medios y reactivos necesarios, la temperatura y el tiempo, señalando también el resultado que debe considerarse como positivo. NOTA 5: En este apartado no se explica el modo operatorio de las pruebas de la oxidasa y la catalasa, ni la realización de las tinciones Gram, ya que estas operaciones, al ser de uso habitual en el laboratorio, han de ser conocidas por todo el personal. Debido a su extensión e importancia sobre el resultado del análisis, en algunos casos se ha añadido como apartados independientes la LECTURA y INTERPRETACIÓN de las pruebas bioquímicas y serológicas. 5.8. Expresión de resultados Este apartado es un extracto del PNT - AL - 002 (Procedimiento de Expresión de Resultados) para cada método de análisis, de manera que se indica únicamente la manera de calcular el resultado para el caso general y se remite al PNT - AL - 002 para el resto de casos, así como para la consulta del significado de los símbolos que aparecen en las fórmulas, y siempre en caso de duda. Así, en el caso de recuento en medio sólido, se indicará qué placas se han de retener para calcular el resultado (en función del número de colonias, señalando si se trata de colonias en total, colonias características o colonias identificadas) y mediante qué expresión se obtendrá el número de colonias. En el caso de investigación, se indicarán las características necesarias para considerar que en la muestra hay presencia o no del microorganismo estudiado. Para el caso de recuento en medio líquido, se indicará a partir de qué tubos se ha de calcular el NMP. 5.9. Esquema El esquema es un resumen visual de todo el proceso, indicando con dibujos el orden a seguir para realizar cada uno de los pasos del ensayo; este apartado estará en la hoja final del documento.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

En una columna situada a la izquierda de la hoja indicaremos el día de análisis en el que nos encontramos, de manera que en el resto de la hoja se muestren las operaciones que se deben realizar durante el mismo. Las acciones a realizar en días distintos están separadas por una barra con una flecha. Señalar que en los procedimientos en los que en el texto se han diferenciado las distintas etapas del análisis, también se ha indicado cada paso en el esquema. El esquema empieza con la preparación de la dilución madre y el banco de diluciones (cuando es necesario). Es importante destacar que el número de diluciones que se ha dibujado es orientativo, de manera que se prepararán tantas diluciones como sea necesario, independientemente de la cantidad de tubos que se hayan dibujado. La muestra líquida, si el ensayo se realiza con un producto líquido, o la dilución madre, si se realiza con otros productos, están representadas por una bolsa de «Stomacher», y el resto de diluciones por un tubo con 9 mL de peptona salina (PS) (salvo en casos particulares, en los cuales se indicará el medio utilizado para hacer las diluciones). Debajo de cada elemento del banco de diluciones se indicará el orden de dilución correspondiente, sin paréntesis para ensayos con productos líquidos y entre paréntesis cuando se realiza dilución madre. Este orden de dilución se escribirá en todos los pasos de la siembra. A continuación, mediante unas flechas que salen de cada dilución, se indica la cantidad de muestra que se ha de sembrar en la placa o tubo. Cuando se siembran placas, cuando se realiza siembra superficial, el nombre del medio a sembrar estará encima de ellas mientras que se colocará debajo si la siembra es por inclusión, indicando en este caso la cantidad y temperatura del medio a añadir. Cuando se siembra en placas, en caso de que se deba extender el inóculo con asa de Drigalski, en el esquema aparecerá dibujada el asa, mientras que si la siembra es por aislamiento, en las placas se pintarán estrías (este aislamiento por estrías puede realizarse de distintas maneras). Si la siembra es por picadura en un tubo con medio sólido, se dibujará una línea vertical que ocupe el medio, desde la parte superior. Asimismo, cuando se siembra en medio líquido con un asa de Kolle, se dibujará este utensilio junto a los tubos. Debajo de las placas o tubos se indicará el tiempo y la temperatura de incubación, señalando también si hay características particulares que deban ser tenidas en cuenta. En los pasos de recuento y confirmación se seguirá el mismo procedimiento, dibujando en las placas el crecimiento de las colonias. El esquema finaliza con la frase «lectura y expresión de resultados», si no se ha realizado confirmación; o bien, si se han efectuado pruebas bioquímicas y/o serológicas, se darán los resultados del caso favorable. En los recuentos en medio líquido se remitirá al cálculo del NMP.

CAPÍTULO SEGUNDO

Procedimiento de expresión de resultados (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 001

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS

1. OBJETO El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la expresión de resultados de los análisis de alimentos. 2. ÁMBITO DE APLICACIÓN Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL. 3. REFERENCIAS • ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes microbiológicos. • AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para el recuento de colonias y expresión de resultados. Caso de recuento en medio sólido. • Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL. • Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento General de Redacción de Documentos. 4. GENERALIDADES El presente documento está formado por una serie de tablas que muestran la manera de realizar la expresión de resultados para cada método horizontal de recuento o investigación según la norma ISO, EN o AFNOR correspondiente. Estas tablas están ordenadas según su orden de PNT - AL, y están divididas según los tres casos posibles: • Caso general. • Estimación de pequeños números. • Ninguna colonia. Para completar este procedimiento, en el ANEJO 1 se adjuntan las tablas necesarias para el cálculo de los resultados y en el ANEJO 2 se incluyen ejemplos de cálculo para cada uno de los casos posibles, junto con un diagrama para facilitar su localización. 5. FÓRMULAS En general, para obtener el resultado de los recuentos de microorganismos en medio sólido, se utiliza la media ponderada. En los métodos de referencia, ésta se obtiene con la expresión: N=

ΣC (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

Para los métodos de rutina, la expresión utilizada es: N=

ΣC 1,1 ⋅ d 11

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Los resultados obtenidos mediante las fórmulas se han de redondear a dos cifras significativas, utilizando las reglas habituales, tal como se describe en el Apartado 6 y retener como resultado el número de microorganismos por mililitro (en productos líquidos) o por gramo (en el resto de productos), expresado como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada. Dado que en algunos casos los mismos conceptos se expresaban con letras distintas según la norma de la que estaban extraídos, se ha hecho una recopilación y homogeneización de términos, para que cada símbolo tenga el mismo significado en todas las fórmulas. 5.1. Caso general Para que un resultado se considere válido, se estima que en general es necesario contar las colonias de al menos una placa que contenga un mínimo de 15 colonias. En las fórmulas que se utilizan en el caso general, aparecen unos símbolos cuyos significados se explican a continuación: • N: número de microorganismos por mililitro o por gramo. • ΣC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas y con al menos una placa con un mínimo de 15 colonias. • Σa: suma de las colonias del microorganismo 1 calculadas después de la identificación, en todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas y con al menos una placa con un mínimo de 15 colonias. • V: volumen de inóculo aplicado a cada placa, en mililitros. • n1: número de placas retenidas en la primera dilución. • n2: número de placas retenidas en la segunda dilución. • d: nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida (d = 1 cuando la muestra para análisis se ha sembrado directamente (productos líquidos)). Para el caso de recuento después de identificación: • b: número de colonias que responden a los criterios de identificación. • C: número total de colonias por placa (antes de identificación). • A: número de colonias características que se resiembran (en general A = 5 en método de referencia y A = 3 en método de rutina). Para estafilococos coagulasa positivos (CPS): Ac: número de colonias características resembradas. Anc: número de colonias no características resembradas. bc: número de colonias características que son coagulasa positivas. bcn: número de colonias no características que son coagulasa positivas. cc: número total de colonias características de estafilococos coagulasa positivos contados en la placa. • cnc: número total de colonias no características de estafilococos coagulasa positivos contados en la placa.

• • • • •

1

Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

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5.2. Estimación de pequeños números En las fórmulas que se utilizan en el caso de estimación de pequeños números, aparecen unos símbolos, cuyos significados se explican a continuación: • Ne: número estimado de microorganismos por mililitro o por gramo. • C: número de colonias contadas. • Σe: suma de las colonias contadas después de la identificación en las dos placas (método de referencia). • a: número de colonias contadas después de la identificación. • V: volumen de inóculo aplicado a cada placa, en mililitros. • d: nivel de dilución correspondiente a la dilución madre o a la primera dilución sembrada o retenida (d = 1 cuando la muestra para análisis se ha sembrado directamente (productos líquidos)). 5.3. Casos particulares En las fórmulas que se utilizan en el caso de estimación de pequeños números, aparecen un símbolo, cuyo significado se explica a continuación. • d: nivel de dilución correspondiente a la dilución retenida. 6. REDONDEO • Si la última cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se modifica. • Si la última cifra es superior o igual a 5, la cifra precedente será aumentada una unidad. Proceder de esta forma secuencialmente con todas las cifras del número obtenido hasta que se obtengan dos cifras significativas. 7. PRECISIÓN Y LÍMITES DE CONFIANZA La precisión de los métodos de ensayo corresponde, según la ISO 17025, a la determinación de la repetibilidad y de la reproducibilidad de un método de ensayo normalizado por ensayos interlaboratorios. En la expresión de resultados hay un apartado de PRECISIÓN, que sólo se refleja en aquellos procedimientos basados en normas que incluyen esta valoración; sin embargo, se supone que en futuras modificaciones de las normas internacionales este apartado aparecerá en todas ellas, ya que la fiabilidad del método es muy importante a la hora de aceptar o rechazar el lote, producto, etc. De la misma manera, en futuras modificaciones de estas normas se cambiarán los límites superiores e inferiores para los recuentos de colonias, adaptándose a los límites de confianza; así, el límite superior pasará de 300 a 324, y el límite inferior de 15 a 10. Para estimar la validez del resultado obtenido y evitar interpretaciones demasiado estrictas, es necesario determinar el intervalo de confianza que caracterice el reparto estadístico de los microorganismos en la muestra. Así, el límite de confianza δ que caracteriza la dispersión microbiana en la muestra, con una probabilidad del 95%, se calcula mediante la expresión siguiente: ⎡ ΣC 1, 92 1, 96 ΣC ⎤ 1 δ=⎢ + ± ⎥⋅ B B ⎦ d ⎣ B

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

con: B = V · (n1 + 0,1 · n2) siendo: • • • • •

ΣC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas. n1: número de placas retenidas en la primera dilución. n2: número de placas retenidas en la segunda dilución. V: volumen de inóculo sembrado en cada placa, en mililitros. d: nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida.

NOTA: En el caso de recuento después de identificación, sustituir ΣC por Σa. CASO PRÁCTICO: El resultado del análisis de un alimento es el siguiente:

Dilución 10

10–3

10–4

> 300

198

11

2

> 300

202

11

3

10

Número de colonias

–1

–2

Placas retenidas

Con N = 1,9 · 104 por gramo, para 422 colonias contadas en las placas retenidas. El intervalo de confianza δ es: ⎡ 422 1, 92 1, 96 422 ⎤ 1 δ=⎢ + ± ⎥⋅ 2, 2 ⎦ 10 –2 ⎣ 2, 2 2, 2

δ = (191,82 + 0,87 ± 18,30) · 102 Así, los límites de confianza son:

δ1 = 1,7 · 104 y δ2 = 2,1 · 104 Para las técnicas de NMP y de estimación de pequeños números, estos límites de confianza, en la práctica, se suelen obtener mediante las tablas que se adjuntan en el ANEXO 1. Señalar que las variaciones que se dan aún pueden ser más importantes en la práctica, en particular entre los resultados obtenidos por distintos microbiólogos. 8. COMENTARIOS En este apartado queremos recalcar algunos aspectos de la norma AFNOR XP V 08-102 que son nuevos respecto a las normas publicadas anteriormente y que pueden ser útiles a la hora de resolver dudas.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

15

8.1. Casos particulares Los casos particulares, aunque son bastante improbables, se pueden presentar (por ejemplo, números muy diferentes de colonias entre las dos placas de una misma dilución, o bien una proporción muy alejada de la del factor de dilución entre las placas de dos diluciones sucesivas). En estos casos, un microbiólogo competente deberá examinar, interpretar y, si es necesario, rechazar los resultados obtenidos. 8.1.1. Recuento de colonias en total. Método de rutina En el caso que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica), calcular el número N′ de microorganismos 2 presentes en la muestra de ensayo con ayuda de la ecuación: N′ =

C V ⋅d

siendo: • C: suma de las colonias contadas en la placa con un mínimo de 15 colonias. • V: volumen de inóculo sembrado en cada placa, en mililitros. • d: nivel de dilución correspondiente a la dilución retenida. 8.2. Aplicación de los límites de confianza En el caso que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución d1, con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente: • si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), utilizar el modo de cálculo del caso general; • si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 es superior a 324 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener sólo el resultado de los recuentos de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máximo fijado en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15).

2

Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

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9. TABLAS DE RESULTADOS

PNT - AL - 003. Recuento sin microorganismos a 30°C (ISO 4833) Caso general

• Hasta 300 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si las dos placas retenidas, al nivel de la muestra a analizar (prodiuctos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias, hacer la media m de las colonias contadas en las dos placas y expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos) hay colonias, dar el resultado como:

Cálculo N=

ΣC (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias.

|

|

Ne = m: número estimado de microorganismos por mililitro (productos líquidos). Ne = m/d: número estimado de microorganismos por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del ±2% al ±37%

Ver TABLA 1

|

Menos de 1 microorganismo por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d microorganismos por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Placas retenidas

PNT - AL - 004. Recuento sin microorganismos a 30°C (NF V 08-051)

Placas retenidas • Menos de 300 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si la placa retenida, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias, dar el resultado como:

• Si no hay ninguna colonia en la placa al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) ni en la de dilución madre (otros productos), dar el resultado como:

Cálculo N=

ΣC 1,1 ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias.

|

Ne = C: número estimado de microorganismos por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1 microorganismo por mililitro (productos líquidos).

|

Ne = C/d: número estimado de microorganismos por gramo (otros productos).

|

Menos de 1/d microorganismos por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del ±10,5% para 300 colonias contadas y del –37% al +61% para 15 colonias contadas.

Ver TABLA 1

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Caso general

17

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PNT - AL - 005. Recuento de levaduras y mohos (ISO 7954)

Placas retenidas • Menos de 150 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias, expresar el resultado como número estimado de la siguiente manera:

• Si en ninguna de las dos placas al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos) hay colonias, dar el resultado como:

Cálculo N=

ΣC (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

|

Ne = C: levaduras y mohos por mililitro (productos líquidos).

|

Ne = C/d: levaduras y mohos por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.

Ver TABLA 1

|

Menos de 1 levadura y moho por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 10 levaduras y mohos por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Caso general

Caso general Placas retenidas

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias, expresar el resultado como número estimado de la siguiente manera:

• Si no hay ninguna colonia en la placa al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) ni en la de la dilución madre (otros productos), dar el resultado como:

Cálculo

• Menos de 150 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas.

• Para recuento en superficie: N=

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias.

ΣC 0,11 ⋅ d

• Para recuento en profundidad: N=

ΣC 1,1 ⋅ d

|

|

Ne = 10 × C: levaduras y mohos por mililitro (productos líquidos). N e = 10 × C/d: levaduras y mohos por gramo (otros productos).

Precisión Ver ISO 7218

Ver TABLA 1

|

Menos de 10 colonias por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 10/d colonias por gramo (otros productos).

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 006. Recuento de levaduras y mohos (XF V 08-059)

19

20

PNT - AL - 007.1. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica del NMP (ISO 7402) Cálculo del número más probable (NMP)

• Contar el número de tubos positivos para cada dilución.

• A partir del número de tubos positivos de cada una de las diluciones, determinar el coeficiente del NMP con ayuda de una tabla (ver TABLA 3).

Confirmación

• Para productos líquidos, el número de Enterobacteriaceae por mililitro es igual al coeficiente NMP dividido por 10.

• Si al menos una de las colonias características seleccionadas para la confirmación bioquímica es: | |

• Para el resto de productos, el número de Enterobacteriaceae por gramo es igual al coeficiente NMP.

Oxidasa k Glucosa j

El tubo a partir del cual se ha realizado el subcultivo se considera positivo. Precisión En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia. Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Caso general

PNT - AL - 007.2. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (ISO 7402)

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si las dos placas retenidas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias características, hacer la media m de las colonias contadas en las dos placas y expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de dilución madre (otros productos) hay colonias características, dar el resultado como:

Cálculo

• Menos de 150 colonias, al nivel • A partir de los resultados de la de dos diluciones sucesivas. confirmación bioquímica realizada sobre cinco colonias por Confirmación placa, calcular el número a de Enterobacteriaceae identificadas • Si al menos un 80% de las coloa partir de la expresión: nias características seleccionadas b son confirmadas como Enteroa = ⋅C bacteriaceae (oxidasa k y gluA cosa j el número de microorganismos presentes será el • Calcular el número N de Enteencontrado en el recuento. robacteriaceae identificadas presentes en la muestra problema • En cualquier otro caso, el númecon la expresión: ro de microorganismos se calculará a partir del porcentaje de coΣa N= lonias oxidasa k y glucosa j (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d en relación al número total de colonias seleccionadas.

|

|

Ne = m: número estimado de Enterobacteriaceae por mililitro (productos líquidos). Ne = m/d: número estimado de Enterobacteriaceae por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.

|

Menos de 1 Enterobacteriaceae por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d Enterobacteriaceae por gramo (otros productos).

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Caso general

Ver TABLA 1

21

22

• Si una de las colonias características es oxidasa k y glucosa j, la muestra se considera positiva en Enterobacteriaceae. • A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Enterobacteriaceae, según la cantidad examinada, en x gramos de producto.

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

PNT - AL - 008. Investigación de Enterobacteriaceae con pre-enriquecimiento (ISO 8523)

PNT - AL - 009. Recuento sin revivificación de Enterobacteriaceae. Técnica por recuento de colonias (NF V 08-054) Caso general

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilucion madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias características, dar el resultado como:

• Si en la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos) no hay ninguna colonias de Enterobaceriaceae, dar el resultado como:

Cálculo

• Un máximo de 150 colonias ca- • A partir de los resultados de la racterísticas y no características, confirmación bioquímica realial nivel de dos diluciones sucezada sobre cinco colonias por sivas. placa, calcular el número de Enterobacteriaceae identificadas a • Una placa ha de tener un mínipartir de la expresión: mo de 15 colonias característib cas. a = ⋅C A • Calcular el número N de Enterobacteriaceae identificadas presentes en la muestra problema con la expresión: N=

|

Ne = a: número estimado de Enterobacteriaceae por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1 Enterobacteriaceae por mililitro (productos líquidos).

|

Ne = a/d: número estimado de Enterobacteriaceae por gramo (otros productos).

|

Menos de 1/d Enterobacteriaceae por gramo (otros productos).

Σa 1,1 ⋅ d

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del +17,3% al –14,7% para 150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias contadas.

Ver TABLA 1

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Placas retenidas

23

24

PNT - AL - 010. Recuento de coliformes totales. Técnica del NMP (ISO 4831) 1. ELECCIÓN DE LAS DILUCIONES

1.

Al menos una dilución presenta tres tubos positivos:

Elegir la dilución más elevada (con menor concentracion de muestra) que presente los tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes que tengan tubos positivos (es decir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 respecto a la primera dilución escogida). Si no se ha preparado un número suficiente de diluciones en donde la más elevada presente tres tubos positivos, elegir las tres diluciones más elevadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentracion más baja de la muestra). 2.

Ninguna dilución presenta tres tubos positivos:

Cuando el caso 1 no se pueda aplicar, elegir las tres diluciones más elevadas de la serie (con menor concentracion de muestra) que contenga al menos un tuvo positivo. 3.

Casos particulares:

En todos los casos donde más de una de las tres diluciones seleccionadas no den tubos positivos, escoger la dilución menos elevada que no presente tubos positivos (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más bajas precedentes (es decir, aquéllas que tienen concentraciones de muestra 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida), excepto cuando no se encuentran tubos positivos más que al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra. En este último caso es necesario escoger las tres primeras diluciones para el cálculo del NMP, aún cuando si esta serie tiene dos diluciones que no dan tubos positivos.

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Para cada muestra, retener tres diluciones siguiendo las siguientes reglas, según el caso:

2. DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE NMP Hay que comprobar que el número de muestras analizadas por lote (ver TABLA 2 o TABLA 4), sea la adecuada para que el resultado sea válido desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o rechazar los resultados de la categoría 2 (ver TABLA 5). Para cada secuencia considerada aceptable, determinar el NMP mediante las TABLAS 2 y 4. 3. CÁLCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) El número de coliformes por mililitro o por gramo se obtiene multiplicando el coeficiente NMP por el inverso de la dilución más baja (la que tiene mayor concentración de muestra). Cuando la dilución retenida más baja corresponde a los tubos preparados a partir del medio a doble concentración (sembrados con 10 mL) habrá que dividir por 10 PRECISIÓN En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia. Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 010. Recuento de coliformes totales. Técnica del NMP (ISO 4831) (Continuación)

25

26

PNT - AL - 011. Recuento de coliformes totales. Técnica por recuento de colonias (ISO 4832) Caso general Placas retenidas

Ninguna colonia

• Si cada una de las placas retenidas contiene menos de 15 colonias características, calcular el número estimado de Ne de coliformes mediante la expresión del caso general.

• Si en ninguna de las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (producto líquido) o de la dilución madre (otros productos), hay colonias características, expresar como:

Cálculo N=

ΣC (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias características.

• Si las dos placas retenidas, al nivel de la muestra a analizar (producto líquido) o de la dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias características, dar el resultado como: |

Menos de 15 coliformes por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 15/d coliformes por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del ±16% al ±52%.

• Si cada placa contiene menos de 15 colonias características, multiplicar los límites inferiores y superiores por 1/d para obtener los límites de confianza. • Para estimación de pequeños números, ver TABLA 1.

|

Menos de 1 coliforme por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d coliformes por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

• Menos de 150 colonias características, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Estimación de pequeños números

Caso general Placas retenidas • Menos de 150 colonias características, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilucion madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias características:

• Si en la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), no hay ninguna colonia característica, dar el resultado como:

Cálculo N=

ΣC 1,1 ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias características.

|

|

C = coliformes por mililitro (productos líquidos). N = C/d: coliformes por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del –16% al +18% para 150 colonias contadas, y del –37% al +61% para 15 colonias contadas.

Ver TABLA 1

|

Menos de 1 coliforme por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d coliforme por gramo (otros productos).

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 012. Recuento de coliformes totales (NF V 08-050)

27

28

PNT - AL - 013. Recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica el NMP (ISO 7251) 1. ELECCIÓN DE LAS DILUCIONES

1.

Al menos una dilución presenta tres tubos positivos:

Elegir la dilución más elevada (con menor concentración de muestra) que presente los tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes que tengan tubos positivos (es decir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 respecto a la primera dilución escogida). Si no se ha preparado un número suficiente de diluciones en donde la más elevada presente tres tubos positivos, elegir las tres diluciones más elevadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentración más baja de la muestra). 2.

Ninguna dilución presenta tres tubos positivos:

Cuando el caso 1 no se pueda aplicar, elegir las tres diluciones más elevadas de la serie (con menor concentración de muestra) que contengan al menos un tubo positivo. 3.

Casos particulares:

En todos los casos donde más de una de las tres diluciones seleccionadas no den tubos positivos, escoger la dilución menos elevada que no presente tubos positivos (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más bajas precedentes (es decir, aquéllas que tienen concentraciones de muestra 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida), excepto cuando no se encuentran tubos positivos más que al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra. En este último caso, es necesario escoger las tres primeras diluciones para el cálculo del NMP, aún cuando si esta serie tiene dos diluciones que no dan tubos positivos.

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Para cada muestra, retener tres diluciones siguiendo las siguientes reglas, según el caso:

2. DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE NMP Hay que comprobar que el número de muestras analizadas por lote (ver TABLA 2 o TABLA 4), sea la adecuada para que el resultado sea válido desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o rechazar los resultados de la categoría 2 (ver TABLA 5). Para cada secuencia considerada aceptable, determinar el NMP mediante las TABLAS 2 y 4. 3. CÁLCULO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) El número de Escherichia coli por mililitro o por gramo se obtiene multiplicando el coeficiente NMP por el inverso de la dilución más baja (la que tiene mayor concentración de muestra). Cuando la dilución retenida más baja corresponde a los tubos preparados a partir del medio a doble concentración (sembrados con 10 mL) habrá que dividir por 10. Si el NMP es inferior al 0,3 microorganismos por mililitro o por gramo, y si se ha utilizado el método operativo apropiado para un número bajo de Escherichia coli presuntivos, el resultado deberá expresarse como «ausencia de Escherichia coli presuntivos en 1 mL o 1 g. de producto». PRECISIÓN En la técnica del NMP se pueden observar variaciones importantes. Los resultados obtenidos según este método deberán utilizarse con prudencia. Los límites de confianza se dan en las TABLAS 2 y 3.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 013. Recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica el NMP (ISO 7251) (Continuación)

29

30

PNT - AL - 014. Recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos (NF V 08-053)

Placas retenidas • Menos de 150 colonias características y/o no características, al nivel de dos diluciones sucesivas.

Estimación de pequeños números

Cálculo N=

ΣC 1,1 ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias características.

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos) contiene menos de 15 colonias características, dar el resultado como:

• Si no hay ninguna colonia en la placa al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), dar el resultado como:

|

Ne = a: número estimado de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos por mililitro (productos líquidos).

|

|

Ne = a/d: número estimado de Escherichia coli β-glucuronidasa positivos por gramo (otros productos).

|

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del –14,7% al +17,3% para 150 colonias contadas y del –37,8% al +63,4% para 15 colonias contadas.

Ninguna colonia

Ver TABLA 1

Menos de 1 Escherichia coli β-glucuronidasa positivos por mililitro (productos líquidos). Menos de Escherichia coli βglucuronidasa positivos por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Caso general

PNT - AL - 015.1. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). (ISO 6888-1) Caso general

Ninguna colonia

• Si las dos placas retenidas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias identificadas, expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos) hay colonias de CPS, dar el resultado como:

Cálculo

• Hasta 300 colonias, con 150 co- • A partir de los resultados de la lonias características y no caracconfirmación, calcular el número terísticas, al nivel de dos dilua de CPS identificados por placa ciones sucesivas. retenida mediante la expresión: • Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias características.

a=

b c c b nc nc ⋅ c = nc ⋅ c Ac A

• Calcular el número N de CPS identificados presentes en la muestra problema mediante la expresión: N=

Σa V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

|

|

Σa : número estimado V ⋅2 de CPS por mililitro (productos líquidos) Ne =

Ne =

Σa : número estiV ⋅2⋅d

mado de CPS por gramo (otros productos).

Siembra de 0,1 mL: |

Menos de 10 CPS por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 10/d CPS por gramo (otros productos).

Siembra de 1 mL: |

Menos de 1 CPS por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d CPS por gramo (otros productos).

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

Precisión Ver ISO 7218

Ver TABLA 1 31

32

PNT - AL - 015.2. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). (ISO 6888-2) Caso general

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos) contienen menos de 15 colonias características, expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), hay colonias de CPS, dar el resultado como:

Cálculo

• Hasta 300 colonias, con 100 colonias características, al nivel de dos diluciones sucesivas.

N=

ΣC V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias características.

|

|

C : número estimado de 2 CPS por mililitro (productos líquidos) Ne =

C : número estimado 2⋅d de CPS por gramo (otros productos). Ne =

Precisión Ver ISO 7218

Ver TABLA 1

|

Menos de 1 CPS por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d CPS por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Placas retenidas

PNT - AL - 016.1. Recuento estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica con confirmación de colonias (NF V 08-057-1) Caso general Cálculo

• Menos de 150 colonias características y no características, al nivel de dos diluciones sucesivas.

• A partir de los resultados de la confirmación, calcular el número de CPS identificados mediante la expresión:

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias.

a=

b c c b nc nc ⋅ c = nc ⋅ c Ac A

• Calcular el número N de CPS identificados presentes en la muestra problema mediante la expresión:

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias identificadas, dar el resultadco como:

• Si no hay ninguna colonia de CPS en la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), dar el resultado como:

Siembra de 0,1 mL: |

|

Σa N= V ⋅ 1,1 ⋅ d

Ne = A × 10: número estimado de CPS por mililitro (productos líquidos). Ne =

a × 10 : número estimado de d

|

Menos de 10 CPS por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 10/d coliformes por gramo (otros productos).

CPS por gramo (otros productos). Siembra de 1 mL:

Siembra de 1 mL:

|

Ne = a: número estimado de CPS por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1 CPS por mililitro (productos líquidos).

|

Ne = a/d: número estimado de CPS por mililitro (otros productos).

|

Menos de 1/d CPS por gramo (otros productos).

Precisión Ver TABLA 1

33

Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del +17,3% al +14,7% para 150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias contadas.

Siembra de 0,1 mL:

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

34

PNT - AL - 016.2. Recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica sin confirmación de colonias (NF V 08-057-2)

Placas retenidas • Un máximo de 100 colonias características al nivel de dos diluciones sucesivas.

Cálculo N=

ΣC 1,1 ⋅ d

• Una placa ha de tener un mínimo de 15 colonias características.

Estimación de pequeños números

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar • Si no hay ninguna colonia de CPS en la placa, al nivel de la (productos líquidos) o de la dilución mamuestra a analizar (productos lídre (otros productos), contiene menos de quidos) o de la dilución madre 15 colonias características, dar el resultado (otros productos), dar el resultacomo: do como: | N = C: número estimado de CPS por mie | Menos de 1 CPS por mililitro lilitro (productos líquidos). (productos líquidos). | N = C/d: número estimado de CPS por e | Menos de 1/d CPS por gramo gramo (otros productos). (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del +20% al –17% para 100 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias contadas.

Ninguna colonia

Ver TABLA 1

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Caso general

PNT - AL - 017. Recuento de Bacillus cereus (ISO 7932) Caso general

• Menos de 150 colonias, al nivel • A partir de los resultados de la de dos diluciones sucesivas. confirmación bioquímica realizada sobre cinco colonias por • Una placa ha de tener un míniplaca, calcular el número a de mo de 15 colonias característiBacillus cereus identificados a cas. partir de la expresión: Confirmación

a=

b ⋅C A

• Si al menos un 80% de las colonas seleccionadas son confirma- • Calcular el número N de Bacidas, tomar como número de Ballus cereus identificados presencillus cereus el número dado en tes en la muestra problema con el recuento. la expresión: • En todos los otros casos, calcular el número de Bacillus cereus a partir del porcentaje obtenido en el recuento. Redondear el resultado a un número entero de colonias.

Ninguna colonia

• Si las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias características, hacer la media m de las colonias contadas en las dos placas y expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), hay colonias de Bacillus cereus, dar el resultado como:

Cálculo

N=

Σa (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

|

|

Ne = m: número estimado de microorganismos por mililitro (productos líquidos). Ne = m/d: número estimado de microorganismos por gramo (otros productos).

|

Menos de 1 microorganismo por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d microorganismos por gramo (otros productos).

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del ±12% al ±37%.

Ver TABLA 1 35

36

PNT - AL - 018. Recuento de Bacillus cereus (NF V 08-058) Caso general Cálculo

• Un máximo de 150 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas.

• A partir de los resultados de la confirmación bioquímica realizada sobre tres colonias por placa, calcular el número a de Bacillus cereus identificados a partir de la expresión:

• Una placa ha de contener un mínimo de 15 colonias características.

a=

b ⋅C A

• Calcular el número N de Bacillus cereus identificados presentes en la muestra problema con la expresión: N=

Σa V ⋅ 1,1 ⋅ d

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias identificadas, dar el resultadco como:

• Si no hay ninguna colonia de Bacillus cereus en la placa, al nivel de la dilución madre (productos líquidos) o de la muestra a analizar (otros productos), expresar:

Siembra de 0,1 mL: |

|

Ne = a × 10: número estimado de Bacillus cereus por mililitro (productos líquidos). 10 : número estimado de d Bacillus cereus por gramo (otros productos).

|

Menos de 10 Bacillus cereus por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 10/d Bacillus cereus por gramo (otros productos).

Ne = a ×

Siembra de 1 mL: |

Ne = a: número estimado de Bacillus cereus por mililitro (productos líquidos).

|

Ne = a/d: número estimado de Bacillus cereus por gramo (otros productos).

Precisión Ver ISO 7218

Siembra de 0,1 mL:

Ver TABLA 1

Siembra de 1 mL: |

Menos de 1 Bacillus cereus por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d Bacillus cereus por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

PNT - AL - 019. Recuento de Clostridium perfringens (EN 13401)

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si las dos placas retenidas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias de Clostridium perfringens, expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), hay colonias de Clostridium perfringens, dar el resultado como:

Cálculo

• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la rísticas y no características, al confirmación, calcular el númenivel de dos diluciones sucesiro a de Clostridium perfringens vas. mediante la expresión: • Una placa ha de contener un mínimo de 15 colonias.

a=

b ×C A

• Calcular el número N de Clostridium perfringens por gramo o por mililitro mediante la expresión: N=

Σa (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

|

|

Ne = m: número estimado de Clostridium perfringens por mililitro (productos líquidos). Ne = m/d: número estimado de Clostridium perfringens por gramo (otros productos).

Precisión Ver ISO 7218

Ver TABLA 1

|

Menos de 1 Clostridium perfringens por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d Clostridium perfringens por gramo (otros productos).

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

Caso general

37

38

PNT - AL - 020. Recuento de Clostridium perfringens (NF V 08-056) Caso general

Estimación de pequeños números

Ninguna colonia

• Si la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contiene menos de 15 colonias, expresar el resultado como:

• Si no hay ninguna colonia de Clostridium perfringens en la placa, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), dar el resultado como:

Cálculo

• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la rísticas, al nivel de dos dilucioconfirmación, calcular el númenes sucesivas. ro a de Clostridium perfringens mediante la expresión: • Una placa ha de tener un mínib mo de 15 colonias. a = ×C A • Calcular el número de Clostridium perfringens identificados presentes en la muestra problema mediante la expresión: N=

Σa 1,1 ⋅ d

|

Ne = a: número estimado de Clostridium perfringens por mililitro (productos líquidos).

|

Ne = a/d: número estimado de Clostridium perfringens por gramo (otros productos).

Precisión Por razones de orden únicamente estadístico, en el 95% de los casos, los límites de confianza de este método varían del +17,3% al –14,7% para 150 colonias contadas y del +63,4% al –37,8% para 15 colonias contadas.

Ver TABLA 1

|

Menos de 1 Clostridium perfringens por mililitro (productos líquidos).

|

Menos de 1/d Clostridium perfringens por gramo (otros productos).

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Placas retenidas

PNT - AL - 021. Investigación de Salmonella (ISO 6579) • A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de identificación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Salmonella, en x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera PRESENCIA.

• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de identificación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Salmonella, en x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera PRESENCIA.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 022. Investigación de Salmonella (NF V 08-052)

PNT - AL - 023.1. Investigación de Listeria monocytogenes (ISO 11290-1) • A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Listeria monocytogenes en x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera PRESENCIA. 39

40

PNT - AL - 023.2. Recuento de Listeria monocytogenes (ISO 11290-2) Caso general

Ninguna colonia

• Si las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), contienen menos de 15 colonias de Listeria monocytogenes, hacer la media m de las colonias contadas en las dos placas y expresar el resultado como:

• Si en ninguna de las dos placas, al nivel de la muestra a analizar (productos líquidos) o de la dilución madre (otros productos), hay colonias de Listeria monocytogenes, dar el resultado como:

Cálculo

• Menos de 150 colonias caracte- • A partir de los resultados de la rísticas, al nivel de dos dilucioconfirmación, calcular el númenes sucesivas. ro a de colonias de Listeria monocytogenes confirmadas en • Una placa ha de tener un mínicada placa mediante la expremo de 15 colonias característisión: cas. b a = ×C A • Calcular el número N de Listeria monocytogenes identificados presentes en la muestra problema mediante la expresión: N=

|

m : número estimado d ⋅V de Listeria monocytogenes por mililitro o por gramo. Ne =

Σa V ⋅ (n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d

Precisión Ver ISO 7218

Ver TABLA 1

|

1 Listeria mod ⋅V nocytogenes por mililitro o por gramo.

Menos de

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Placas retenidas

Estimación de pequeños números

• A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Listeria monocytogenes en x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera PRESENCIA.

PNT - AL - 025. Investigación de Campylobacter termotolerantes (ISO 10272) • A partir de los resultados obtenidos en las pruebas de confirmación, indicar PRESENCIA / AUSENCIA de Campylobacter termotolerantes en x gramos de producto (en general 25 gramos), precisando la masa (en gramos o mililitros) de la muestra para ensayo. Con 1 colonia identificada ya se considera PRESENCIA.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 024. Investigación de Listeria monocytogenes (NF V 08-055)

41

42

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

ANEXO 1: TABLAS DE LÍMITES DE CONFIANZA

TABLA 1: Límites de confianza para las estimaciones de pequeños números de colonias

En esta tabla se dan los límites de confianza al nivel del 95% para la estimación de pequeños números, cuando el número de colonias retenidas sobre las placas es menor que 15 microorganismos*. Número de microorganismos*

Límites de confianza al nivel 95% Inferior

Superior

1

99%

>99%

1 1 3 1 3 1 1 3 1 2 1 2 2 1 1 3 1 1 3 1 3 1 1 3 1 0 2 1 1 1 3 1 1 1 2 1 1 1

0,00 0,01 0,01 0,12 0,12 0,35 0,02 0,12 0,4 0,13 0,4 0,4 0,5 0,5 0,15 0,4 0,5 0,4 0,5 0,9 0,5 0,9 0,9 0,9 0,9 0,5 0,9 1,6 0,9 1,7 3 3 1,8 3 3 9 4 9 20

0,94 0,95 1,00 1,70 1,70 3,50 1,70 1,70 3,5 2,00 3,5 3,5 3,8 3,8 3,50 3,5 3,8 3,8 3,8 9,4 4,0 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 10,4 18,1 18,1 19,9 36 38 36,0 38 40 99 99 198 400

0,00 0,00 0,00 0,05 0,05 0,18 0,01 0,05 0,2 0,06 0,2 0,2 0,2 0,2 0,07 0,2 0,2 0,2 0,2 0,5 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,3 0,5 1,0 0,5 1,1 2 2 1,2 2 2 5 3 5 10

1,40 1,40 1,60 2,50 2,50 4,60 2,50 2,50 4,6 2,70 4,6 4,6 5,2 5,2 4,60 4,6 5,2 5,2 5,2 14,2 5,6 14,2 14,2 14,2 14,2 14,2 15,7 25,0 25,0 27,0 44 52 43,0 52 56 152 152 283 570

Los límites de confianza de esta tabla tienen como finalidad dar algunas nociones sobre la influencia de las variaciones estadísticas en los resultados. Existirán siempre otras fuentes de variaciones que, en algunos casos, pueden ser importantes.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

TABLA 3: Tabla de NMP para 3 × 0,1 g. (mL), 3 × 0,01 g. (mL) y 3 × 0,001 g. (mL)

Número de resultados positivos

Coeficiente NMP/g*

Límites de confianza del 95%

0,1 g

0,01 g

0,001 g

Inferior

Superior

0

0

0