Methoden der Mikrobiologie: Ein Praxishandbuch [1. Aufl.] 9783662605530, 9783662608227

Dieses Lehrbuch bietet Antworten auf Fragen wie „Wie funktioniert diese mikrobiologische Methode ganz praktisch? Wie kan

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Methoden der Mikrobiologie: Ein Praxishandbuch [1. Aufl.]
 9783662605530, 9783662608227

Table of contents :
Front Matter ....Pages I-X
Isolierung und Kultivierung von Bakterien (Astrid Brandis-Heep)....Pages 1-62
Identifizierung und Differenzierung von Bakterien (Astrid Brandis-Heep)....Pages 63-106
Pilze (Erika Kothe)....Pages 107-178
Molekularbiologische Methoden (Erika Kothe)....Pages 179-212
Lichtmikroskopische Methoden (Timo Zimmermann)....Pages 213-286
Back Matter ....Pages 287-295

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Anja Störiko Hrsg. Astrid Brandis-Heep · Erika Kothe Timo Zimmermann Autoren

Methoden der Mikrobiologie Ein Praxishandbuch

Methoden der Mikrobiologie

Anja Störiko (Hrsg.) Astrid Brandis-Heep Erika Kothe Timo Zimmermann Autoren

Methoden der Mikrobiologie Ein Praxishandbuch

Hrsg. Anja Störiko Hofheim am Taunus, Deutschland

Autoren Astrid Brandis-Heep Fachbereich Biologie Philipps-Universität Marburg Marburg, Deutschland Erika Kothe Institut für Mikrobiologie Friedrich-Schiller-Universität Jena Jena, Deutschland Timo Zimmermann Advanced Light Microscopy Unit CRG-Centre for Genomic Regulation Barcelona, Spanien

ISBN 978-3-662-60553-0 ISBN 978-3-662-60822-7  (eBook) https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7 Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über 7 http://dnb.d-nb.de abrufbar. © Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung des Verlags. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Bearbeitungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Die Wiedergabe von allgemein beschreibenden Bezeichnungen, Marken, Unternehmensnamen etc. in diesem Werk bedeutet nicht, dass diese frei durch jedermann benutzt werden dürfen. Die Berechtigung zur Benutzung unterliegt, auch ohne gesonderten Hinweis hierzu, den Regeln des Markenrechts. Die Rechte des jeweiligen Zeicheninhabers sind zu beachten. Der Verlag, die Autoren und die Herausgeber gehen davon aus, dass die Angaben und Informationen in diesem Werk zum Zeitpunkt der Veröffentlichung vollständig und korrekt sind. Weder der Verlag, noch die Autoren oder die Herausgeber übernehmen, ausdrücklich oder implizit, Gewähr für den Inhalt des Werkes, etwaige Fehler oder Äußerungen. Der Verlag bleibt im Hinblick auf geografische Zuordnungen und Gebietsbezeichnungen in veröffentlichten Karten und Institutionsadressen neutral. Dieses Buch erfordert Grundkenntnisse in Laborarbeit, insbesondere Kenntnisse in Sterilarbeit und sicherheitsrelevante Kenntnisse. Die Methoden basieren auf Standardprotokollen, die sich ständig ändern. Einzelne Originalquellen werden daher nicht angegeben. Planung/Lektorat: Stefanie Wolf Springer Spektrum ist ein Imprint der eingetragenen Gesellschaft Springer-Verlag GmbH, DE und ist ein Teil von Springer Nature. Die Anschrift der Gesellschaft ist: Heidelberger Platz 3, 14197 Berlin, Germany

VII

Inhaltsverzeichnis 1

Isolierung und Kultivierung von Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Astrid Brandis-Heep

1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3

Anreicherung von Bakterien aus einer Bodenprobe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 1.2.1 1.2.2

Anreicherung aus einer Wasserprobe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Anreicherung von Escherichia coli. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Kultivierung von Escherichia coli auf Minimalmedium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.3 1.3.1 1.3.2

Spezielle Verfahren bei der anaeroben Anreicherung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4

Isolierung anoxygener phototropher Bakterien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.5 1.5.1 1.5.2 1.5.3

Direktisolierung von Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Verdünnung einer Schlamm- oder Wasserprobe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Verdünnungsreihe für aerobe Bakterien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Verdünnungsreihe für anaerobe Bakterien (Agar Shake) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.3 1.6.4

Gewinnung von Reinkulturen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

1.7 1.7.1 1.7.2 1.7.3 1.7.4

Bestimmung von Wachstum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2

Anreicherung von Bacillus subtilis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Kultivierung von Bacillus subtilis auf Minimalmedium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Anreicherung von Clostridium pasteurianum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Spezielle Gefäße und Verschlüsse für die Anaerobentechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Medienherstellung für die Kultivierung anaerober Bacteria und Archaea. . . . . . . . . 15 Winogradski-Säule. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Anreicherung grüner Schwefelbakterien (z. B. Chlorobium). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Anreicherung von Schwefelpurpurbakterien (z. B. Chromatium). . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Anreicherung von Nicht-Schwefelpurpurbakterien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Vereinzelung durch Drei-Strich-Technik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Vereinzelung durch Kreuzstrich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 Flächenausstrich mit dem Drigalski-Spatel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Vereinzelung aerotoleranter anaerober Bakterien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 Bestimmung der (Gesamt-)Zellzahl mit der Zählkammer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Bestimmung der Zellzahl mit der Membranfiltertechnik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Bestimmung der Lebendzellzahl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 Bestimmung der Zellmasse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

Identifizierung und Differenzierung von Bakterien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 Astrid Brandis-Heep

2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5

Morphologische Eigenschaften von Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Zellwand: KOH-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Zellwand: Gram-Färbung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 Nachweis von Endosporen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Test auf Beweglichkeit von Bakterien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 Kapseldarstellung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

VIII

Inhaltsverzeichnis

2.2

Physiologische Eigenschaften von Bakterien: Nachweis auf Identifizierungsmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6

Eosin-Methylenblau-Agar (EMB-Agar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 MacConkey-Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Nachweis des oxidativen/fermentativen Abbaus von Zuckern (OF-Test). . . . . . . . . . . 76 Methylrot-Test: Säure- und Gasbildung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Citrat-Agar – Citratlyase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 SIM-Agar, MIO-Agar, MIL-Agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.3.7 2.3.8 2.3.9 2.3.10 2.3.11 2.3.12 2.3.13

Physiologische Leistungen: Nachweis von Enzymaktivitäten. . . . . . . . . . . . 87 Nachweis der Katalase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 Nachweis der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 Nachweis von Indol: Tryptophanase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 Nachweis von Acetoin (Voges-Proskauer-Test) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 Nachweis der Urease-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 Nachweis der Lysin-Deaminase und -Decarboxylase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Nachweis der Phenylalanin-Deaminase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 Nachweis der Gelatinase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Nachweis der Amylase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Nachweis der Cellulase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Nachweis der Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 Nachweis von Hämolysin-Aktivität. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 Multitestsystem. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

3

Pilze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Erika Kothe

3.1

Isolierung und Kultivierung von Hefen und filamentösen Pilzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8

Hefen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Kultivierung filamentöser Pilze in Flüssigmedien. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Kultivierung filamentöser Pilze auf festen Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Isolierung von Pilzen aus flüssigen Umweltproben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 Isolierung von Pilzen aus Bodenproben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Isolierung von Pilzen aus Fruchtkörpern. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 Isolierung von Pilzen aus Pflanzenmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Stammhaltung von Pilzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

3.2

Identifizierung von Pilzen durch mikroskopische und DNA-abhängige Methoden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128

3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4

Mikromorphologische Bestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 Färbungen zur Beobachtung von Zellkompartimenten in Pilzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 Bestimmung von Pilzen durch parasitische bzw. symbiontische Stadien. . . . . . . . . . 133 Bestimmung von Pilzen durch Sequenzierung der ITS-Region. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3

Untersuchungen zu Lebenszyklen von Pilzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 Lebenszyklus und Zellzyklus bei Saccharomyces cerevisiae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 Hefen und der Übergang zu Hyphenformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Entwicklung asexueller Sporen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

IX Inhaltsverzeichnis

3.3.4



3.3.5 3.3.6 3.3.7 3.3.8

Nachweis der Einflüsse von Licht, Tagesrhythmen und Kreuzung bei der Bildung asexueller Sporen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 Kreuzung bei Basidiomyceten am Beispiel von Schizophyllum commune. . . . . . . . . . 149 Pilzkulturen und Fruchtkörperbildung bei Basidiomyceten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Kreuzung filamentöser Ascomyceten am Beispiel von Aspergillus nidulans. . . . . . . . 153 Tetradenanalyse bei Sordaria fimicola. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4

Lokalisierungen von Proteinen und Zellkomponenten in situ. . . . . . . . . . . . 157 Färbungen für den Nachweis von Enzymen und Naturstoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 Immunologischer Nachweis von Proteinen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Fluoreszenz-Videomikroskopie bei Pilzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Separieren unterschiedlicher Zellkompartimente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5

Transformationssysteme in Pilzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

4

Vektoren und Stabilität der Transformation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 LiCl-basierte Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 Elektroporation von Conidiosporen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 PEG-vermittelte Transformation bei Schizophyllum commune. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation beim Ektomykorrhizapilz Tricholoma vaccinum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 Erika Kothe

4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5

Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 Isolierung von Gesamt-DNA aus Reinkulturen und Umweltproben . . . . . . . . . . . . . . . 181 Isolierung von Plasmid-DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 Isolierung von RNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183 Konzentrationsbestimmung für Nukleinsäuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Agarose-Gelelektrophorese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3

Isolierung und Analyse von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 Herstellung von Proteinextrakten für die SDS-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . 188 Quantifizierung von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189 Proteingelelektrophorese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189

4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3

DNA-modifizierende Enzyme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192

4.4

Nachweis von Nukleinsäuren und Proteinen durch Hybridisierung und Antikörper-abhängige Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4

Southernblot-Analyse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 Northernblot-Analyse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 Westernblot-Analyse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 Enzyme-linked Immuno-Sorbent-Assay (ELISA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

4.5 4.5.1 4.5.2

Nachweismethoden durch Polymerase-Kettenreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203

Restriktionsendonukleasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192 Vektoren und Klonierung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Elektroporation von Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195

Genspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 PCR zum Nachweis von Transkripten (RT-PCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205

X

Inhaltsverzeichnis

4.5.3

Quantitative real-time-PCR (qPCR). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206

4.6 4.6.1 4.6.2 4.6.3

Sequenzierung und Genanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 Sequenzierung, Mikrobiomanalyse, Metagenom, Transkriptom . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 Homologiesuche mit BLAST. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Stammbaumerstellung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211

5

Lichtmikroskopische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Timo Zimmermann

5.1 5.1.1

Das Lichtmikroskop: Funktion und Komponenten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216

5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3

Durchlichtmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222

5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4

Fluoreszenzmikroskopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229

5.4 5.4.1 5.4.2

Präparationsmethoden für die Mikroskopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240

5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3 5.5.4

Lebendfärbungen für die Durchlichtbetrachtung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250

5.6 5.6.1 5.6.2 5.6.3

Färbungen fixierter Proben für die Durchlichtbetrachtung . . . . . . . . . . . . . . 256

5.7 5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.7.4

Färbungen für die Fluoreszenzbetrachtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277

Objektive, Vergrößerung und Auflösung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217 Köhler’sche Beleuchtung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 Phasenkontrast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224 Differenzialinterferenzkontrast. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226 Epifluoreszenzmikroskopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 Digitale Bilderfassung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Konfokale Mikroskopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 Lichtmikroskopie jenseits der Beugungsgrenze (Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239 Herstellung lebender Proben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240 Herstellung fixierter Proben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 Tuschepräparat für den Kapselnachweis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 Negativfärbungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 Vitalfärbung mit Methylenblau. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 Färbung von Speicherstoffen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 Einfach-Färbungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 Differenzialfärbungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261 Strukturfärbungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268 Fluoreszenzlebendfärbungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 Bleichschutz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 Fluoreszenzfärbungen fixierter Proben. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282 Einbettungen und Bleichschutz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284

Serviceteil. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 Stichwortverzeichnis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289

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Isolierung und Kultivierung von Bakterien Astrid Brandis-Heep 1.1 Anreicherung von Bakterien aus einer Bodenprobe – 3 1.1.1 Anreicherung von Bacillus subtilis – 3 1.1.2 Kultivierung von Bacillus subtilis auf Minimalmedium – 7 1.1.3 Anreicherung von Clostridium pasteurianum – 9

1.2 Anreicherung aus einer Wasserprobe – 11 1.2.1 Anreicherung von Escherichia coli – 11 1.2.2 Kultivierung von Escherichia coli auf Minimalmedium – 13

1.3 Spezielle Verfahren bei der anaeroben Anreicherung – 15 1.3.1 Spezielle Gefäße und Verschlüsse für die Anaerobentechnik – 15 1.3.2 Medienherstellung für die Kultivierung anaerober Bacteria und Archaea – 15

1.4 Isolierung anoxygener phototropher Bakterien – 27 1.4.1 Winogradski-Säule – 27 1.4.2 Anreicherung grüner Schwefelbakterien (z. B. Chlorobium) – 29 1.4.3 Anreicherung von Schwefelpurpurbakterien (z. B. Chromatium) – 30 1.4.4 Anreicherung von Nicht-Schwefelpurpurbakterien – 32

1.5 Direktisolierung von Bakterien – 33 1.5.1 Verdünnung einer Schlamm- oder Wasserprobe – 33 1.5.2 Verdünnungsreihe für aerobe Bakterien – 34 1.5.3 Verdünnungsreihe für anaerobe Bakterien (Agar Shake) – 35

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 A. Störiko (Hrsg.), Methoden der Mikrobiologie, https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7_1

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1.6 Gewinnung von Reinkulturen – 39 1.6.1 Vereinzelung durch Drei-Strich-Technik – 39 1.6.2 Vereinzelung durch Kreuzstrich – 42 1.6.3 Flächenausstrich mit dem Drigalski-Spatel – 43 1.6.4 Vereinzelung aerotoleranter anaerober Bakterien – 44

1.7 Bestimmung von Wachstum – 45 1.7.1 Bestimmung der (Gesamt-)Zellzahl mit der Zählkammer – 45 1.7.2 Bestimmung der Zellzahl mit der Membranfiltertechnik – 47 1.7.3 Bestimmung der Lebendzellzahl – 52 1.7.4 Bestimmung der Zellmasse – 57

3 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

. Abb. 1.1  Sammeln von Umweltproben in Wittelsberg/Ebsdorfergrund, mit Ausschnittsvergrößerungen. (© Andreas Brune, Marburg)

Bacteria und Archaea zeichnen sich durch eine Reihe einzigartiger Fähigkeiten aus: Sie fixieren molekularen Stickstoff, betreiben Photosynthese ohne Chlorophyll, nutzen anorganische Energiequellen wie NH4+, H2S, H2, Fe2+, NO2− als Elektronendonatoren und anorganische Moleküle wie CO2, NO3−, SO42−, S°, Fe3− als terminale Elektronen­ akzeptoren anstelle von O2, können mit und ohne Luftsauerstoff überleben, bei Tempe­ raturen über 80 ℃ wachsen und vieles mehr (. Abb. 1.1). Diese Vielfalt in der Ernährungsweise etwa bei der Versorgung mit Kohlen­ stoff (autotroph, heterotroph), Energie (phototroph, chemotroph) und individuellen Wachstumsfaktoren (Vitamine, Spurenelemente) müssen neben den physikalischen Bedürfnissen (Licht, Temperatur, Druck) für eine erfolgreiche Anreicherung, Isolierung und Kultivierung berücksichtigt werden. Da es unmöglich ist, alle bekannten Medien und Verfahren zur Kultivierung von Bakterien aufzulisten und zu kommentieren, beschreiben die folgenden Kapiteln bei­ spielhaft die aerobe Anreicherung und Kultivierung des Sporenbildners Bacillus subtilis, die anaerobe Anreicherung und aerobe Kultivierung von Escherichia coli und ausführ­ lich die Anreicherung und Kultivierung von Anaerobiern unter besonderer Berück­ sichtigung einiger anaerober phototropher Bakterien. 1.1  Anreicherung von Bakterien aus einer Bodenprobe 1.1.1  Anreicherung von Bacillus subtilis

Bacillus subtilis ist ein Gram-positives, aerob wachsendes, Endosporen bildendes Boden­ bakterium, das über eine hohe Amylaseaktivität verfügt und daher leicht auf stärke­ haltigen Medien angereichert und isoliert werden kann (. Abb. 1.2).

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A. Brandis-Heep

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. Abb. 1.2  Bacillus subtilis, 10.000-fach vergrößert. (© Doreen Hinkel, Marburg)

i Benötigtes Material

5 Bodenprobe 5 Kartoffel in ca. 0,5 cm dicken Scheiben 5 Leitungswasser in Tropfflasche 5 Reagenzgläser mit Kappen 5 Petrischalen 5 Wasserbad 5 Parafilm 5 Schottflaschen 1000 ml, 500 ml, 250 ml, mit Schraubdeckel 5 Pipetten 5 LB-Medium 5 LB-Agar-Platten 5 LB-Stärke-Agar-Platten 5 Lugolsche Lösung LB-Medium (Lysogeny Broth), Vollmedium für viele Bakterien Bestandteil Hefeextrakt Trypton

Menge 5 g 10 g

NaCl

5 g

Agar

20 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für LB-Stärke-Agar dem Medium 10 g/L lösliche Stärke zusetzen. Für LB-Flüssigmedium dem Medium keinen Agar zusetzen. Vor dem Autoklavieren des Mediums pH = 7 einstellen.

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A. Brandis-Heep

Lugolsche Lösung Jod-Kaliumjodid-Lösung

1 g Jod und 2 g Kaliumiodid

vollständig in ca. 5 ml Aqua dest. lösen und anschließend mit Aqua dest. auf 300 ml auffüllen

Vorgehensweise Herstellung der Medien: 5 Medienkomponenten in Schottflasche einwiegen, in Aqua dest. lösen und je nach Bedarf mit oder ohne Agar- und Stärkezusatz ansetzen. 5 Flüssigmedium vor dem Autoklavieren in 5 ml-Portionen auf die Reagenzgläser verteilen. 5 Agar- und Agar-Stärkemedium nach dem Autoklavieren in 25 ml-Portionen in die Petrischalen verteilen. Beim Autoklavieren von Medien unbedingt berücksichtigen, dass Agar- und proteinhaltige Lösungen schäumen und daher ca. ein Drittel mehr Volumen benötigen. Anreicherung: 5 Zum Abtöten der vegetativen Begleitflora jeweils 0,5 g Boden in 5 ml Wasser/ Reagenzglas suspendieren und für 20 min bei 80 ℃ im Wasserbad pasteurisieren. 5 Die Kartoffelscheiben mit der dickflüssigen Boden/Wasser-Suspension bestreichen und in Petrischalen, die mit Parafilm verschlossen sind (Schutz vor Austrocknung), bei 37 ℃ 1–2 (3) Tage bebrüten. 5 Tägliche Kontrolle der Ansätze auf Wachstum ist notwendig. Die Kartoffelscheiben (. Abb. 1.3) dürfen nicht austrocknen; deshalb auf den Boden der Petrischale ein paar Tropfen Leitungswasser geben. 5 Sobald sich (Bakterien-)Wachstum als weißer, glänzender Schleim auf den Kartoffelscheiben zeigt, dieses Kulturmaterial mit der Impföse in ­Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) zur Vereinzelung auf LB-Agar-Platten übertragen und bei 37 ℃ über Nacht inkubieren. 5 Nach erfolgreicher Vereinzelung zur Kontrolle Ausstriche auf Stärke-Agar-Platten machen, bei 37 ℃ über Nacht inkubieren und anschließend mit Lugolscher Lösung übergießen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

5 Die unverbrauchte Stärke im Agar färbt sich violett-schwarz, die mikrobiologische Amylaseaktivität wird durch Lysehöfe um die Kolonien sichtbar (7 Abschn. 2.3.9). 5 Zur Kontrolle, ob Sporen gebildet werden, kann dem LB-Medium MnCl2 (6,3 mg/L = 50  μM) zur Stimulation der Sporenbildung zugesetzt werden. 5 Mikroskopische Kontrolle der Kulturen sollte nach jedem Anreicherungs- und Ver­ einzelungsschritt erfolgen.

7 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

. Abb. 1.3  Anreicherung von Bacillus subtilis. Kartoffelscheiben mit Bodenpaste nach 24 h (a) und 48 h (b), Impfmaterial von der Kartoffel nach 60 h (c) und 72 h (d). (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

1.1.2  Kultivierung von Bacillus subtilis auf Minimalmedium

i Benötigtes Material

5 Magnetrührer 5 Sterilfilter mit Spritze 5 steriles Aqua dest. 5 Schottflaschen mit Schraubdeckeln 5 sterile Schottflaschen mit Schraubdeckeln: 1000 ml, 100 ml 5 sterile Messzylinder 5 sterile Pipetten 5 sterile Reagenzgläser oder Erlenmeyerkolben 50 und 100 ml (wenn > 250 ml, dann mit Schikanen) 5 sterile Alu-Kappen 5 sterile Pipetten 5 Roller oder Schüttler B. subtilis auf Minimalmedium (MM) nach Spizizen oder LB-Medium weiter kultivieren: SMM-Salze (5-fach konzentriert) Bestandteil

Menge

K2HPO4 · 3H2O

91,6 g

KH2PO4

30 g

(NH4)2SO4

10 g

Na3Citrat · 2H2O

5 g

MgSO4 · 7H2O

1 g

Aqua dest. ad

950 ml

pH = 7 einstellen. Die Komponenten lösen und autoklavieren.

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A. Brandis-Heep

Spurenelemente (100-fach konzentriert) Bestandteil

Menge

CaCl2

0,55 g

FeCl2 · 6H2O

1,35 g

MnCl2 · 4H2O

0,10 g

ZnCl2

0,17 g

CuCl2 · 2H2O

0,05 g

CoCl2 · 6H2O

0,06 g

Na2MoO4 × 2H2O

0,06 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Aqua dest. vorlegen und unter Rühren die Komponenten in der angegebenen Reihenfolge nacheinander zugeben. Die Lösung sterilfiltrieren 7 Abschn. 1.3.2.2. Tryptophan (Trp)/Phenylalanin (Phe) (200-fach konzentriert) Bestandteil

Menge

L-Tryptophan

0,4 g

L-Phenylalanin

0,4 g

A. dest. ad

100 ml

Die Lösung sterilfiltrieren 7 Abschn. 1.3.2.2.

C-Quellen: Glukose-Lösung (40-fach konzentriert) 20 % (w/v) Glyzerin-Lösung (100-fach konzentriert) 2,5 M Achtung: Konzentrierte Glyzerin-Lösungen sind sehr zähflüssig und können nicht exakt pipettiert werden, daher muss eine 2,5 M Glyzerin-Lösung durch Abwiegen hergestellt werden. Minimalmedium komplett SMM-Salze

200 ml

Spurenelemente

10 ml

Trp/Phe-Lösung

5 ml

Glukose-Lösung

25 ml

Aqua dest. steril ad

1000 ml

Für reproduzierbare Kultivierung von B. subtilis (. Abb. 1.4) ist es wichtig, dass sich die Vorkulturen immer in der exponentiellen Wachstumsphase befinden und keine Sporen enthalten. Daher sollte zur Kultivierung immer das gleiche Schema angewendet werden: Die Volumina der Kulturen können verändert und den jeweiligen Fragestellungen angepasst werden.

9 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

1:5 Verdünnung

15 µl

A

Agarplatte

3 ml LB-Medium 1. VK

30 ml 1x SMM+Glukose 2. VK

B

30 ml 1x SMM+Glukose

. Abb. 1.4  Kultivierungsschema für Bacillus subtilis. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Unbedingt vor dem Animpfen die Kulturen mikroskopisch auf Verunreinigungen kontrollieren! Vorgehensweise 1. Vorkultur (Über-Tag-Kultur): 5 3 sterile Reagenzgläser (RG) morgens mit jeweils 3 ml LB-Medium steril befüllen. 5 2 RG mit je einer B. subtilis-Einzelkolonie von der Agarplatte animpfen (mit steriler Glaspipette Kolonie an der RG-Wand verreiben, gründlich mixen). 5 Das 3. RG bleibt unbeimpft und dient zur Kontrolle der Sterilität. 5 Röhrchen ca. 6–8 h auf dem Roller bei 37 ℃ inkubieren. 2. Vorkultur (Übernachtkultur) . Abb. 1.4: 5 2  × 100 ml-Erlenmeyerkolben (EMK) mit je 30 ml 1 × SMM-Glukose steril befüllen. 5 Am Abend Kolben A mit 15 µl der 1. VK (bei schlechtem Wachstum auch mehr) beimpfen, gut schütteln. 5 6 ml aus Kolben A in Kolben B überführen, gut mischen. 5 Kulturen A und B über Nacht bei 200 rpm auf dem Schüttler und 37 ℃ inkubieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Auf diese Weise verläuft das Wachstum von Bacillus subtilis ohne lange Lag-Phasen reproduzierbar und berechenbar, da die Sporulation verhindert wird. 1.1.3  Anreicherung von Clostridium pasteurianum

Clostridium pasteurianum ist ein Gram-positives, Endosporen-bildendes, saccharolytisches, strikt anaerobes Bakterium, das molekularen Stickstoff fixieren kann. Die Beschreibung der Anreicherung steht beispielhaft für anaerobe Sporenbildner, wobei die Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, Spurenelemente, Vitamine und pH-Wert des Mediums dem jeweils anzureichernden Bakterium angepasst werden müssen.

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A. Brandis-Heep

i Benötigtes Material

5 Kompost- oder Gartenerde 5 Anaerobentopf mit Begasungsanlage oder Gaspak (7 Abschn. 1.3.2.2, . Abb. 1.11) 5 Wasserbad 5 Schottflasche mit Schraubdeckel 1000 ml 5 sterile Kulturröhrchen (20 ml) mit Alukappen und Gummistopfen 5 Enghalskolben, z. B. Erlenmeyer oder Messkolben 5 sterile Pipetten und sterile Pasteurpipetten 5 Stickstoff freies Anreicherungsmedium mit Saccharose 15 % (w/v) 5 Agar-/Flüssigmedium mit Glukose 2 % (w/v) Anreicherungsmedium N2-frei Bestandteil

Menge

Saccharose

150 g

CaCO3

5 g

KH2PO4

1 g

MgSO4 · 7H2O

0,5 g

CaCl2 · 2H2O

0,05 g

Hefeextrakta

0,01 g

SL 10 (7 Abschn. 1.3.2)

1 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

pH = 7,2 einstellen und autoklavieren aDer

Zusatz von Hefeextrakt spielt in dieser Konzentration als N2-Lieferant keine Rolle, stellt aber die benötigten Vitamine Biotin und p-Aminobenzoesäure zur Verfügung C. pasteurianum Aagarmedium/Flüssigmediuma

Bestandteil

Menge

Glukose

20 g

Hefeextrakt

3 g

Na-Ascorbat

1 g

NH4Cl

1 g

KH2PO4

1,5 g

K2HPO4

18,5 g

MgSO4 · 7H2O

0,5 g

NaCl

0,5 g

Agar

20 g

SL 10 (7 Abschn. 1.3.2)

1 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

pH = 6,8 einstellen und autoklavieren aFlüssigmedium: keinen Agar zusetzen

11 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Anreicherung 5 Kulturröhrchen mit Medium ca. 18 ml füllen und jeweils mit 0,2 g trockener, feinpulvriger Gartenerde beimpfen. 5 Alukappe aufsetzen, im Wasserbad auf 70 ℃ erhitzen und nach 10 min mit kaltem Wasser abkühlen. 5 Die Röhrchen mit Gummistopfen verschließen und bei 37 ℃ im Dunkeln bebrüten. 5 Nach 8 Tagen (bis zu 14 Tagen) trübt sich die Nährlösung, und es bildet sich im unteren Teil des Röhrchens ein weißer Wandbelag, Gasbildung (CO2, H2) ist festzustellen, und es riecht nach Buttersäure. 5 Mit einer sterilen Pasteurpipette eine Probe aus dem unteren Bereich des Kulturröhrchens entnehmen und je einen Tropfen in Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) auf C. pasteurianum-Agarmedium (s. u.) ausstreichen oder mit dem Drigalskispatel (7 Abschn. 1.6.3) ausplattieren. 5 Die Agarplatten/Kulturröhrchen im Anaerobentopf bei 37 ℃ unter N2-Atmosphäre oder mittels Gazpak (7 Abschn. 1.3.2.2) anoxisch bebrüten.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach drei Tagen sollten sich Kolonien auf den Agarplatten entwickelt haben, die mikroskopisch auf bewegliche Stäbchen mit terminal liegenden Sporen kontrolliert werden (7 Abschn. 5.3.1). Zellmaterial von den Kolonien, die dem erwarteten mikro­ skopischen Bild entsprechen, wird erneut mit der Drei-Strich-Technik ausgestrichen (Reinigungsausstrich 7 Abschn. 1.6.1). Mit Zellmaterial der erhaltenen Reinkultur kann eine Flüssigkultur für weitere physiologische Untersuchungen angesetzt werden, z. B. den Nachweis intrazellulär akkumulierter Stärke. 1.2  Anreicherung aus einer Wasserprobe 1.2.1  Anreicherung von Escherichia coli

Escherichia coli ist ein Gram-negatives, säurebildendes Bakterium mit charakteristischer β-Galaktosidase-Aktivität zur Verstoffwechselung von Laktose. Daher kann E. coli auf Laktose-haltigen Flüssigmedien aus Wasserproben isoliert werden. Die Beschreibung der Anreicherung steht beispielhaft für aerobe Anreicherungen, wobei die Kohlenstoff­ quelle, Spurenelemente, Vitamine und der pH-Wert des Mediums dem jeweils anzu­ reichernden Bakterium angepasst werden müssen. i Benötigtes Material

5 Wasserprobe 5 Schraubdeckelflaschen zum Kultivieren 100 ml 5 Schottflaschen mit Schraubdeckel für die Medienherstellung 1000 ml 5 Durham-Röhrchen* (. Abb. 1.5) 5 2-fach konzentriertes Laktose-Medium 5 EMB-Agarplatten (Eosin-Methylenblau Agar, Fertigmedium) 5 NB-Agarplatten (Nutrient-Agar, Fertigmedium)

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A. Brandis-Heep

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. Abb. 1.5  Schraubdeckelflasche mit Durham-Röhrchen: Unbeimpft (a) und bewachsen (b). (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Laktose-Medium Bestandteile

Menge

Pepton aus Fleisch

20 g

Fleischextrakt

6 g

NaCl

10 g

Laktose

20 g

Bromkresolpurpura

0,04 g

Aqua dest. ad

1000 ml

apH-Indikator

bei pH 7 purpurfarben, pH  200 ml dann mit Schikanen) mit Kappen 5 Schüttler 5 Glukose/Laktose-Minimalmedium Glukose-/Laktose-Minimalmedium Basalmedium Bestandteil

Menge

(NH4)2SO4

2 g

MgCl2 · 6H2O

0,2 g

KH2PO4

5,26 g

K2HPO4

14,04 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Weitere Medienkomponenten Glukose-Lösung 50 g

Aqua dest. ad 1000 ml

Laktose-Lösung 50 g

Aqua dest. ad 1000 ml

Die C-Quellen können autoklaviert werden, schonender ist sterilfiltrieren 7 Abschn. 1.3.2.2 Eisen-Lösung: 70 mg FeSO4 · 7H2O

in 5 ml 50 mM H2SO4 lösen und auf einen Liter mit Aqua dest. auffüllen und autoklavieren

Thiamin-Lösung: 20 mg Thiaminhydrochlorid

in 80 ml Aqua dest. lösen und sterilfiltrieren 7 Abschn. 1.3.2.2. Im Kühlschrank bei 4 ℃ aufbewahren

Fertigstellung des Minimalmediums Einzellösungen

ml

Basalmedium

840

C-Quelle

100

Fe-Lösung

40

Thiamin-Lösung

20

pH = 7

15 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Herstellung der Medien und Kultivierung 5 Die Medienkomponenten einwiegen, in Aqua dest. lösen und autoklavieren. 5 Nach dem Abkühlen dem Minimalmedium Zucker-, Eisen- und Thiamin-Lösung steril zusetzen 5 steril auf die jeweiligen Kulturgefäße aufteilen 5 beimpfen und bei 37° bebrüten.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das Wachstum kann photometrisch verfolgt werden (7 Abschn. 1.7.4). Auf den beschriebenen Medien ist eine kontinuierliche Stammhaltung möglich. Die Reinheit der Kultur muss regelmäßig mikroskopisch kontrolliert werden. 1.3  Spezielle Verfahren bei der anaeroben Anreicherung

Bei der Anreicherung und Anzucht strikt anaerober Bacteria und Archaea sind die Kultivierungsbedingungen unter Ausschluss von Luftsauerstoff von besonderer Bedeutung. Das Fehlen von O2 allein ist jedoch noch keine hinreichende Bedingung für Wachstum von Anaerobiern, sondern neben dem Nährmedium spielen die Gas­ atmosphäre, der Partialdruck der beteiligten Gase und insbesondere ein negatives Redoxpotenzial eine wichtige Rolle, das allein durch physikalisches Austreiben von Sauerstoff (z. B. Abkochen oder Durchgasen mit N2) nicht erreicht werden kann. 1.3.1  Spezielle Gefäße und Verschlüsse für die Anaerobentechnik

Da die meisten Kunststoffe gasdurchlässig sind, werden Anaerobier in Glasgefäßen kultiviert. Bei der Verwendung von Plastikschläuchen und Plastikverschlüssen haben sich solche aus Butylkautschuk bewährt (. Tab. 1.1). 1.3.2  Medienherstellung für die Kultivierung anaerober Bacteria

und Archaea

Um geeignete reduzierende Bedingungen in der Kultur herzustellen, stehen ver­ schiedene reduzierende Agentien zur Verfügung, die in Abhängigkeit vom gewünschten Redoxpotenzial eingesetzt werden (. Tab. 1.2). ! Die Verwendung von Cystein (1 mM) ist billig und vergleichsweise ungiftig, es

wird häufig in Kombination mit Schwefelwasserstoff (1 mM) verwendet. Unter alkalischen Bedingungen oxidiert es zum für einige Anaerobier giftigen Cystin!

1

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. Tab. 1.1  Kulturgefäße für Anaerobier Gefäß

Abmessung (cm × cm)

Volumen (ml)

Anwendung

Hungate-Röhrchen (Sovirell-Röhr­ chen) mit Butylkautschuk-Septum

12,5 × 1,5

17

Kultivierung mit Gasraum; OD-Messung ohne Probenahme

Serumröhrchen mit Butylkautschuk-Stopfen

15,0 × 1,7

26

Kultivierung mit Gasraum; OD-Messung ohne Probenahme

Schraubkappen-Röhrchen

16,0 × 1,5

22

Kultivierung ohne Gasraum; OD-Messung ohne Probenahme

Spitzröhrchen

17,5 × 1,5

18

Zum Anwachsen abgeimpfter Einzelkolonien

Schraubdeckel-Flaschen, rund

50 100 250 500 1000

Zur Kultivierung in hoher Schicht und zum Autoklavieren von Lösungen unter Verschluss

Serumflaschen mit Butylkautschuk-Stopfen

9 36 60 120

Kultivierung mit Gasraum; anoxisches Autoklavieren von Lösungen; anoxische Enzymtests

Müller-Krempel-Flaschen mit Kautschuk-Septen

150 580 1260

Kultivierung in mittlerem Maßstab

. Tab. 1.2  Redo­x­ aktive Substanzen

Substanz

E0 (mV)

Dihydroascorbat/Ascorbat

58

Dithioglykolat/Thioglykolat

−140

S°/H2S

−250

S°/HS−

−270

Cystin/Cystein

−325

Dithiothreitol (DTT) disulfid/DTT

−330

Titanium(IV)citrat/Titanium(III)citrat

−480

2 Sulfit2−/Dithionit2−

−574

1.3.2.1  Medienherstellung für die anaerobe Anreicherung i Benötigtes Material

5 Schottflaschen mit Schraubdeckel unterschiedlicher Größe je nach Bedarf 5 Serumflaschen mit Butylkautschuk-Stopfen und Crimp-Verschlüssen (. Abb. 1.7) und Crimper (Bördelzange) 5 Magnetrührer 5 Rühr-Magneten 5 Widdelkolben . Abb. 1.8 5 Begasungsanlage

17 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Alu-Bördelkappe

Serumflasche

Crimperzange Stopfen

Serumflasche mit Crimp-Verschluss

. Abb. 1.7  Serumflasche mit Crimp-Verschluss. (© Silke Werner, Marburg)

a

b N2/CO2

4

Spurenel., NaHCo3. Na2S. HCl

1

2 autokl Steigrohr

5

Probe f. pH-Kontr.

Schlauch

Lösung Quetschhahn

6

Abfüllglocke

Schlauch

3

magnet. Rührung

. Abb. 1.8  (a) Widdel*-Kolben, (b) Widdel-Kolben mit Begasungsanlage. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg) *Friedrich Widdel, Dissertation Georg-August-Universität zu Göttingen, 1980

Zusammensetzung und Herstellung der einzelnen Medienkomponenten Süß-/Salzwasser-Mediuma: Mineralsalze (Basalmedium) Bestandteil

Menge

NaCl

1,0 g/20 g

MgCl2 · 6H2O

0,4 g/3 g

KH2PO4

0,2 g

1

18

1

A. Brandis-Heep

Bestandteil

Menge

NH4Cl

0,25 g

KCl

0,5 g

CaCl2 · 2H2O

0,15 g

Aqua dest. ad

1000 ml

aSüßwassermedium

enthält die geringere, Salzwassermedium die höhere angegebene Menge

an NaCl und MgCl2

Das Basalmedium wird im Widdel-Kolben (s. u. . Abb. 1.8) autoklaviert. Das Basalmedium enthält keine Schwefelquelle, da diese in der Regel in der Form des Reduktionsmittels (Na2S oder Cystein) zugegeben wird. Werden schwefelfreie Reduktionsmittel verwendet, sollte vor dem Autoklavieren Na2SO4 · 10H2O zu 0,16 g/l zugegeben werden. Für bestimmte Bakterien können Zusätze wie Hefeextrakt, Fleischextrakt etc. vor dem Autoklavieren hinzugefügt werden. NaHCO3-Lösung (pH-Puffer): 5 2,8 g NaHCO3 (1,1 M) mit 30 ml Aqua dest. in eine Serumflasche (120 ml) geben. 5 Mit Butylkautschuk-Stopfen verschließen, zucrimpen (mit Alubördelkappen unter Verwendung einer Spezialzange s. u.) und mit Alu-Folie bedeckt autoklavieren 5 Anwendung (wenn nicht anders vermerkt): 30 ml/l Medium Das Natriumcarbonat löst sich erst beim Autoklavieren. Spurenelement-Lösung SL 10 Bestandteil

Menge

FeCl2 · 4H2O

1500 mg

ZnCl2

70 mg

MnCl2 · 4H2O

100 mg

CoCl2 · 6H2O

190 mg

CuCl2 · 2H2O

2 mg

NiCl2 · 6H2O

24 mg

Na2MoO4 · H2O

36 mg

H3BO3

6 mg

HCl 25 %

10 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

Eisen-II-chlorid in der Salzsäure lösen Die anderen Metallsalze in der angegebenen Reihenfolge hinzugeben und lösen Mit Aqua dest. auf das Endvolumen von 1000 ml auffüllen und autoklavieren Anwendung (wenn nicht anders vermerkt): 1 ml/l Medium

Weitere Spurenelementlösungen wie SL 9 bzw. SL 11 und 12 unterscheiden sich vor allem durch den Einsatz eines Komplexbildners für metallische Ionen wie Nitrilotriessigsäure (NTA) oder EDTA-Di-Natriumsalz, die das Ausfällen von Metallionen aus dem Medium verhindern. Verträglichkeit für Bakterien prüfen!

19 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Selenit-Wolframat-Lösung Bestandteil

Menge

NaOH

0,5 g

Na2SeO3 · 5H2O

3 mg

Na2WO4 · 2H2O

4 mg

Aqua dest. ad

1000 ml

Diese Lösung kann autoklaviert werden 7-Vitamine-Lösung Bestandteil

Menge

Cyanocobalamin

10 mg

p-Aminobenzoesäure

10 mg

D(+)-Biotin

2 mg

Nicotinsäure

20 mg

Ca-D(+)-Panthothenat

5 mg

Pyridoxamin-Dihydrochlorid

50 mg

Thiamin-Dihydrochlorid

10 mg

Aqua dest. ad

200 ml

Die Lösung muss sterilfiltriert (7 Abschn. 1.3.2.2) und dunkel bei 4 ℃ aufbewahrt werden Anwendung (wenn nicht anders vermerkt): 1 ml/l

Na2S-Lösung 0,5 M (Redox-Puffer) 5 3 g Na2S · 9H2O in 25 ml abgekochtem, noch heißem Wasser lösen. 5 In einer Serumflasche unter N2-Atmosphäre autoklavieren. Resazurin-Lösung 0,04 % (w/v) (Redox-Indikator) 5 40 mg Resazurin in 100 ml Aqua dest. lösen und autoklavieren. Anwendung: 1 ml/l (= 0,4 mg/l). Erhöht sich das Redoxpotenzial des Mediums auf über −42 mV, z. B. nach Eindringen von Sauerstoff, zeigt der Indikator dies durch einen Farbwechsel von farblos nach pink an.

1.3.2.2  Fertigstellen des anoxischen Mediums mit dem Widdel­­

Kolben

Herstellung des Mediums mit dem Widdel*-Kolben 5 Das Basalmedium in einem Erlenmeyerkolben ansetzen und in das Abfüllgefäß nach Widdel (Widdel-Kolben . Abb. 1.8) einfüllen. Magnetrührstab nicht vergessen!

1

20

1

A. Brandis-Heep

5 Die beiden Schraubdeckelverschlüsse (1 und 2) aufsetzen, aber nicht dicht zuschrauben. 5 Die Abfüllglocke (3) und den Gaseinlass (4) mit Alufolie verschließen. 5 Den Abfüllschlauch (5) mit einem Quetschhahn (6) dicht verschließen, damit beim Autoklavieren des Kolbens kein Medium herausgedrückt werden kann. 5 Nach dem Autoklavieren den noch heißen Widdel-Kolben mit Medium in einen Kühler einbringen (z. B. Alutopf, von Leitungswasser durchflossen). 5 Gasanschluss zur N2/CO2-Flasche (80 %/20 %) herstellen und mit 60–80 mbar durch den Gaseinlass (4) begasen. 5 Nach Austausch der Gas-Atmosphäre Kolben dicht verschließen. 5 Magnetrührer auf mittlere Rührgeschwindigkeit einstellen und das Grundmedium bis auf Raumtemperatur abkühlen. 5 Unter erneutem Gasstrom die separat autoklavierten Medienkomponenten in der aufgeführten Reihenfolge durch Schraubverschluss 1 steril zusetzen. 5 Schraubverschluss 2 dient zur Entnahme von Proben (z. B. zur Kontrolle des pH-Wertes). Fertigstellung des Basalmediums (Bestandteile 7 Abschn. 1.3.2) Einzellösungen

ml

Mineralsalze (Basalmedium)

964,5

NaHCO3-Lösung (1 M Puffer-Lösung)

30

Spurenelement-Lösung

1

Selenit-Wolframat-Lösung

1

7-Vitamine-Lösung

0,5

Natriumsulfid-Lösung (0,5 M)

2

Resazurin-Lösung

1

5 pH-Wert des fertiggestellten Mediums kontrollieren und bei Bedarf mit steriler 1 M HCl oder 0,5 M Na2CO3-Lösung (s. u.) nachstellen. 5 Beide Schraubverschlüsse dicht verschließen und durch Öffnen des Quetschhahns (6) das Medium in sterile Gefäße abfüllen. 5 Dabei die ersten 40 ml verwerfen, da dem Medium im Schlauch die Zusätze fehlen, die nach dem Autoklavieren in den Widdel-Kolben zugegeben wurden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Sollte beim Abfüllen das Medium doch mit Sauerstoff in Berührung kommen, reagiert der Redoxindikator Resazurin durch Verfärben nach pink. Das Medium entfärbt sich nach 5–15 min wieder (reduzierende Bedingungen), wenn das Medium weiter­ hin kontinuierlich mit einem sauerstofffreien Gas durchströmt wird. Danach stehen Kulturgefäße mit anaerobem Medium zur Anreicherung und Kultivierung sauerstoff­ empfindlicher Bakterien zur Verfügung.

21 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

1.3.2.3  Kontrolle des pH-Werts des Mediums

Nach Fertigstellung des Mediums sollte nach einigen Minuten unter Rühren eine Probe zur Kontrolle des pH-Wertes durch Schraubdeckel 2 entnommen werden. Ver­ änderungen des pH-Werts beim Autoklavieren kommen durch Austritt von CO2 in die Gasphase zustande und gehen mit einer veränderten Pufferkapazität einher. 5 Liegt der pH-Wert unter 8,0, kann durch Zugabe von 1 M HCl oder 0,5 M Na2CO3 der pH-Wert des Mediums korrigiert werden. 5 Die untenstehende Tabelle gibt an, wie viel Milliliter der jeweiligen Lösungen zugegeben werden müssen, um einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 in einem mit 30 mM Hydrogen­ carbonat gepufferten Medium zu erreichen. 5 Den pH-Wert nach Zugabe von Säure oder Carbonat-Lösung erneut überprüfen! 1.3.2.4  Einstellen des pH-Werts in einem Carbonat-gepufferten

Medium

i Benötigtes Material

NaCO3-Lösung 0,5 M: 5,3 g Na2CO3 in 100 ml Aqua dest. gesättigt mit CO2. Eine Serumflasche bis zu 80 % ihres Volumens befüllen, mit CO2 begasen und verschlossen autoklavieren. 5 HCl–Lösung 1M: 9,75 ml 32 % (w/w) HCl mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen und verschlossen in Schraubdeckel- oder Serumflasche autoklavieren. Einstellen eines Hydrogencarbonat-gepufferten Mediums (30 mM) auf pH 7,2 bis pH 7,4 pH-Wert gemessen

Zusatz von 0,5 M NaCO3 (ml/l)

pH-Wert gemessen

Zusatz von 1 M HCl (ml/l)

6,5

8,75

7,3

0,67

6,6

7,09

7,4

1,25

6,7

5,56

7,5

1,72

6,8

4,15

7,6

2,10

6,9

2,89

7,7

2,42

7,0

1,78

7,8

2,67

7,1

0,83

7,9

2,88

8,0

3,04

8,1

3,18

8,2

3,28

8,3

3,37

8,4

3,43

5 Sollte der pH-Wert über 8,1 liegen, ist das Medium unbrauchbar, da Sulfate und Carbonate ausfallen (an einer Trübung des Mediums erkennbar) und nicht wieder gelöst werden können.

1

22

1

A. Brandis-Heep

5 War das Medium zu sauer, ist mit einem CO2-Verlust zu rechnen, sodass der pH-Wert mit 0,5 M Natriumcarbonat-Lösung (nicht mit NaOH) eingestellt werden muss. Nach Zugabe von Salzsäure oder Carbonat-Lösung 2 min rühren zur Gleichgewichtseinstellung, dann den pH erneut kontrollieren. Der Kohlendioxidgehalt der Gasatmosphäre (20 %) ist so gewählt, dass der pH-Wert bei etwa 7,2 konstant gehalten wird. Benötigt man einen niedrigeren oder höheren pH-Wert, ist eine entsprechend Kohlendioxid-Konzentration zu wählen (s. untenstehende Tabelle). Erforderlicher CO2-Gehalt in der Gasphase (Gesamtdruck 1 bar) über dem verwendeten Kulturmedium (30 mM Hydrogencarbonat-gepuffert), um den gewünschten pH-Wert zu halten (angegeben für 30 ℃ Mediumstemperatur). CO2-Gehalt je nach pH pH-Wert des Mediums

CO2-Gehalt in der Gasphase (%)

6,6

37

6,8

26

7,0

18

7,2

12

7,4

8,2

7,6

5,3

7,8

3,4

Die Zusammensetzung und Herstellung des oben beschriebenen Basalmediums kann für viele Anaerobier verwendet werden. Durch Veränderung der Kohlenstoffquelle, der Redoxkomponenten, der Elektronendonatoren und des pH-Werts kann die jeweils benötigte Spezifizität hergestellt werden. 1.3.2.5  Begasen unter Ausschluss von Sauerstoff i Benötigtes Material

5 Spritze (5 ml) 5 Watte 5 gebogene Kanüle (10 cm × 1 mm) 5 Bunsenbrenner 5 Gas oder Gasgemisch

Anaerobes Begasen Die anaerobe Begasungstechnik wird angewandt zum Begasen von Kulturen, ohne den Stopfen durchstechen zu müssen, und zum sterilen Verschließen eines Gefäßes unter einer anoxischen Gasatmospäre (z. B. N2). Bei einem Vordruck von 300 mbar fließen ca. 30 ml Gas pro Sekunde. Aus diesem Wert kann man abschätzen, wie lange man benötigt, um einen Gasraum bestimmter Größe zu durchgasen.

23 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Vorgehensweise 5 Zum aseptischen Begasen eine 5 ml-Spritze mit Watte stopfen (. Abb. 1.9), in Alufolie verpacken, autoklavieren und mit einem Anschluss zur Begasungsanlage und einer gebogenen Kanüle versehen. Bei entsprechender Behandlung bleibt die Spritze über Monate hinweg steril. 5 Vor dem Begasen die gebogene Kanüle in der Bunsenbrennerflamme kurz erhitzen (nicht ausglühen! Die Kanüle schmilzt und wird sofort unbrauchbar) und unter Gasfluss in das Gefäß am Stopfen entlang einführen. 5 Solange begasen, bis der Gasraum vollständig durchgast ist. 5 Beim Herausziehen der Kanüle den Stopfen nur am oberen Rand anfassen und gleichzeitig so in die Öffnung drücken (nicht zu fest, sonst zerbricht der Glasrand!), dass er unmittelbar hinter der Kanüle abschließt. 5 Die Kanüle zum Herausziehen mit dem Zeigefinger in der Biegung fassen, um ein Abbrechen der Kanüle zu verhindern. Den Gashahn schließen.

1.3.2.6  Anoxische Aufbewahrung von Lösungen für den ständigen

Gebrauch

Zur Aufbewahrung Sauerstoff-empfindlicher Stammlösungen, die häufig verwendet werden, dienen spezielle Gefäße mit zwei Öffnungen. Durch die eine Öffnung wird Stickstoff über einen Wattefilter steril eingeleitet, über die zweite Öffnung, die mit einem Schraubdeckel verschließbar ist, kann mit einer Pipette Lösung entnommen werden, ohne dass ständig nach der Hungate-Technik begast werden muss.

Stopfen

gebogene Kanüle

r) te fil ril te (S te at W

Gasgemisch

. Abb. 1.9  Begasen mit der „Hungate-Technik“. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg. Zeichnung Friedrich Widdel)

1

24

1

A. Brandis-Heep

1.3.2.7  Autoklavieren von Lösungen mit flüchtigen Bestandteilen

unter Luftabschluss

! Um beim Autoklavieren unter Überdruck ein Zerplatzen der Gefäße zu verhindern, dürfen nur runde Gefäße wie Schraubdeckelflaschen, Serumflaschen, ­Hungate-Röhrchen etc., auf keinen Fall eckige Gefäße (wie z. B. Meplats-Flaschen), verwendet werden.

Vorbereitung der Lösungen zum Autoklavieren 5 Zum Autoklavieren von Lösungen mit flüchtigen Bestandteilen, die nicht unbedingt unter Luftabschluss autoklaviert werden müssen (Natriumhydrogencarbonat, Salzsäure, Natriumcarbonat u. a.), runde Schraubdeckelflaschen verwenden. Diese maximal zu zwei Dritteln füllen und fest mit einem Schraubverschluss mit Gummidichtung verschließen. 5 Zum Autoklavieren von Lösungen unter Ausschluss von Sauerstoff Röhrchen oder Flaschen verwenden, die maximal zu zwei Drittel gefüllt sind, deren Gasraum mit dem entsprechenden Gas befüllt und mit einem Gummistopfen verschlossen ist. Gummistopfen auf Serumflaschen, Müller-Krempel-Flaschen oder Hungate-Röhrchen mit dem entsprechenden Verschluss (Schraubring, Aluminiumring, Crimp-Verschluss . Abb. 1.7) befestigen, damit der Stopfen während des Autoklavierens nicht herausspringt.

1.3.2.8  Sterilisieren von Gummistopfen mit Ethanol

In der Anaerobentechnik müssen Gummistopfen vor dem Durchstechen mit 70 % (v/v) Ethanol sterilisiert werden. Mindestens 1 min einwirken lassen. 1.3.2.9  Sterilfiltration von Lösungen/Gasen

. Abb. 1.10  Sterilfiltration. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

25 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Vorgehensweise (. Abb. 1.10) 5 Hitzeempfindliche Lösungen (z. B. Vitamine) über einen Spritzenvorsatzfilter aus z. B. Celluloseacetat oder Cellulosenitrat (Porendurchmesser 0,2 µm) entkeimen. Über die chemische und thermische Beständigkeit der Filtermaterialien geben Tabellen der entsprechenden Hersteller Auskunft. 5 Spritzenvorsatzfilter und Filtriergerät steril verpackt erwerben oder vor der Sterilfiltration in Alufolie einpacken und autoklavieren werden. 5 Gase (Luft) werden ebenfalls über vorgeschaltete Wattefilter oder bakteriendichte Filter sterilfiltrieren.

1.3.2.10  Anaerobisieren mit Pyrogallol-Stopfen

Medien und Agarkulturen können mithilfe der Pyrogallol-Technik anaerobisiert werden, denn Pyrogallol bindet unter alkalischen Bedingungen Luftsauerstoff und wird dabei zu braunem Purpurogallin, CO2 und Essigsäure oxidiert. Auf diese Weise wird der für Anaerobier toxische Sauerstoff aus den Kulturröhrchen entfernt. i Benötigtes Material

5 Bakterienkultur 5 Kulturröhrchen, halb gefüllt mit Nährmedium oder Nähragar (1,5 % Agar) 5 sterile Stopfen 5 Pasteurpipetten steril 5 Impfnadel (Platin-Iridium- oder rostfreier Edelstahldraht, 0,8 mm Ø, 15 cm lang im Kollehalter) 5 Bunsenbrenner 5 Pipetten 5 Wattestopfen steril 5 Mullstopfen unsteril 5 Pinzette 5 Ethanol zum Abflammen 5 Pyrogallol-Lösung 20 % (w/v) in Aqua dest. 5 Na2CO3-Lösung 20 % (w/v) in Aqua dest.

Anaerobisieren mit Pyrogallol 5 Mit einer Pasteurpipette einen Tropfen Bakteriensuspension ins Nährmedium oder auf die Oberfläche des abgekühlten Agars übertragen. 5 Den Agar mit der Impfnadel durch das Impfmaterial 2–3 Mal senkrecht fast bis auf den Boden des Röhrchens durchstechen. 5 Zum Anaerobisieren in den freien Hals des Reagenzglases einen sterilen Wattestopfen stecken. 5 Darüber einen Mullstopfen geben (ohne die Watte zu berühren). 5 Diesen mit 0,2 ml Pyrogallol- und 0,4 ml Na2CO3-Lösung tränken. 5 Das Kulturröhrchen schnell mit einem Gummistopfen verschließen und bei der entsprechenden Temperatur aufrecht inkubieren.

1

26

1

A. Brandis-Heep

z Versuchsergebnis/Auswertung Agarkultur: Die Bakterien entwickeln sich im Stichkanal und auf der Agaroberfläche

und schwärmen – wenn beweglich – von dort in den Agar.

Flüssigkultur: Eine Trübung des Mediums zeigt Wachstum an. ! Vorsicht beim Umgang mit Pyrogallol! Pyrogallol ist gesundheitsschädlich und



kann durch die Haut aufgenommen werden. Pyrogallol-getränkte Mullstopfen als Sondermüll entsorgen. Wird aus den Pyrogallolröhrchen weiter überimpft, ist zu beachten, dass das obere Drittel des Kulturröhrchens unsteril ist.

1.3.2.11  Inkubation im Anaerobentopf

Die Inkubation von aerotoleranten, mikroaerophilen oder weniger S­ auerstoff-empfindlichen (anaeroben) Mikroorganismen erfolgt im Anaerobentopf (. Abb. 1.11) unter der gewünschten Gasatmosphäre bei entsprechender Temperatur in Medien oder auf Agarplatten, die unter O2-reduzierten Bedingungen hergestellt und beimpft wurden. Die anaeroben, ggf. reduzierenden Bedingungen im Anaerobentopf stellen das Wachstum dieser Bakterien sicher. i Benötigtes Material

5 Anaerobentopf (. Abb. 1.11) 5 Gaserzeugungskit oder Begasungsanlage

. Abb. 1.11  Anaerobentopf mit Manometer (A) und Gasanschluss (B). (© Silke Werner, Marburg)

27 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

5 Anaerobiose-Indikatorstreifen 5 Bakterienkultur 5 Petrischalen, Kulturröhrchen 5 Bunsenbrenner

Arbeiten mit dem Anaerobentopf Petrischalen oder Röhrchen nach dem Animpfen mit dem entsprechenden Einsatzgestell (Plattenkorb) in den Anaerobentopf (. Abb. 1.11) stellen und anaerobisieren durch: 1. Evakuieren mittels einer Vakuumpumpe und anschließendem Begasen des Behälters (z. B. mit Stickstoff). oder 2. fünfminütiges Durchgasen mit Stickstoff. oder 3. Verwendung eines chemischen Anaerobisierungs-Systems (z. B. GasPack-Kits) zur Erzeugung der gewünschten Gasmischung. Für anaerobe, mikroaerophile oder CO2-angereicherte Atmosphären, mit und ohne Wasserzugabe, mit und ohne Verwendung eines Katalysators: – Gasentwickler in den Anaerobentopf stellen. – Nach Zugabe von Aqua dest. zum Gasentwickler (je nach Hersteller) den Anaerobentopf rasch dicht verschließen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nun erfolgt die Entwicklung der speziellen Gasatmosphäre. Mithilfe eines ­Palladium-Katalysators, der in einem Gefäß an der Unterseite des Deckels verschraubt ist, wird im Topf unter Sauerstoffverbrauch H2 zu H2O oxidiert. Der Indikatorstreifen (oxidiert blau, reduziert farblos) zeigt an, wann die Atmosphäre im Topf reduzierend (O2-frei) ist. Wegen Kondenswasserbildung empfiehlt es sich, zuunterst eine leere Petrischale in den Plattenkorb zu stellen sowie die gefüllten Schalen mit dem Deckel nach unten einzulegen. Der Katalysator muss durch Ausglühen im Trockenschrank für 2 h bei 180 ℃ nach jeder Benutzung regeneriert werden, da das entstehende Wasser ihn inaktiviert. 1.4  Isolierung anoxygener phototropher Bakterien

Phototrophe Organismen verwenden Licht als Hauptenergiequelle zum Wachstum. Mit Ausnahme der Photosynthese bei aeroben Cyanobacterien und Prochlorophyten findet bakterielle Photosynthese unter Ausschluss von Sauerstoff statt. 1.4.1  Winogradski-Säule

i Benötigtes Material

5 Bodenschlamm eines stehenden Gewässers, Wasser vom gleichen Standort (Teich-, Seewasser) 5 Standzylinder (100, 1000, 2000 ml) oder Einmachglas

1

28

1

A. Brandis-Heep

5 Papier 5 Sägespäne 5 Ei 5 Calciumcarbonat 5 Calciumsulfat 5 Sand 5 Esslöffel

Füllen einer Winogradski-Säule . Abb. 1.12 5 Schlamm mit Cellulosefasern (Filterpapier), Sägespänen, einem Ei, einigen Blättern, einem Esslöffel CaCO3 und CaSO4 vermischen. 5 Den Standzylinder luftblasenfrei zu einem Drittel mit Schlamm füllen. 5 Schlamm mit Wasser (Teich, Tümpel oder Graben) überschichten und mit Parafilm verschließen. Die Säule am Fenster bei Raumtemperatur inkubieren.

. Abb. 1.12  Winogradski-Säule: Die nach dem russischen Mikrobiologen Sergei Nikolajewitsch Winogradski (1856–1953) benannte Säule ermöglicht die Anreicherung komplexer bakterieller Lebensgemeinschaften. Die Entwicklung teils gegenläufiger Stoffgradienten (H2S–O2) vornehmlich von Schwefel, Sauerstoff und Stickstoff erlaubt insbesondere die Anreicherung von am Schwefelkreislauf beteiligten Bakterien. Inkubiert im Licht entwickeln sich abhängig vom Inoculum neben Vertretern farbloser Schwefelbakterien und Sulfatreduzierern pigmentierte photoauto- und photoheterotrophe Organismen. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

29 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Entwicklung phototropher Organismen an der dem Licht zugewandten Seite wird als deutliche Verfärbung (grüne und purpurne Flecken) an der Säulenwand sichtbar und kann als Inokulum für die Isolierung z. B. von Grünen Schwefelbakterien und Schwefelpurpurbakterien dienen. 1.4.2  Anreicherung grüner Schwefelbakterien (z. B. Chlorobium)

Chlorobien sind Gram-negativ und obligat anaerob; sie wachsen photolithoautroph mit Sulfid als Elektronendonator und fixieren CO2 über den reduktiven Citratcyclus. i Benötigtes Material

5 Anreicherungsmaterial aus anoxischen aquatischen schwefelwasserstoffreichen Habitaten (Schlamm, Sediment oder Inoculum aus der Winogradski-Säule) 5 Schraubdeckelflaschen flach, 100 ml oder 50 ml, mit Butylkautschukstopfen 5 Serumflasche mit Crimp-Verschluss (7 Abschn. 1.3.1) und Magnetrührstab 5 Magnetrührer 5 2 M H2SO4, steril 5 Pasteurpipetten steril 5 pH-Papier 5 Widdel-Kolben mit Begasungsanlage (. Abb. 1.8) Kultivierung in: Süß-/Salzwassermedium (mineralisches Basalmedium): 7 Abschn. 1.3.2 pH 6,7–6,8 ohne Resazurin, mit 1 mM Cystein und 1 mM Na2S.

Vorgehensweise Neutralisierte Na2S-Lösung: 5 3 g Na2S · 9H2O in 25 ml abgekochtem, noch heißem Wasser lösen. 5 In einer Serumflasche unter N2-Atmosphäre autoklavieren. 5 Nach dem Abkühlen tropfenweise sterile 2 M H2SO4 auf einem Magnetrührer zugeben bis ein pH-Wert von 7,2 erreicht ist. 5 Diese Lösung sofort verwenden; sie muss immer wieder neu hergestellt werden.

Mediumzusammensetzung Einzellösungen

ml

Mineralsalze (Basalmedium)

964,5

1 M NaHCO3-Lösung Spurenelement-Lösung 7-Vitamine-Lösung

30 1 0,5

0,5 M Cystein-Lösung

2

0,5 M Na2S-Lösung (s. o.)

2

pH = 7,2

1

30

A. Brandis-Heep

1

. Abb. 1.13  Anreicherung von Chlorobien im Licht (Parallelansätze). (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Kultivierung 5 Medium wie 7 Abschn. 1.3.2.2 beschrieben herstellen und abfüllen. 5 Nach dem Animpfen die Fläschchen bei 30–35 ℃ vor einer Lampe mit einer Intensität von 1000–2000 l × (15–20 cm vor einer 60-Watt-Glühbirne) 5 Um ein Absterben der Bakterien nach Verbrauch (Oxidation) von Sulfid und Schwefel zu verhindern, muss die Kultur mit steriler Natriumsulfid-Lösung (s. o.) mit 1–2 ml/100 ml Kultur je nach Wachstumsgeschwindigkeit und Zelldichte nachgefüttert werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Zeigt sich eine farbige Trübung in den Fläschchen, werden die Kulturen, nach mikro­ skopischer Kontrolle, zur Gewinnung von Reinkulturen wie unter 7 Abschn. 1.5.3 beschrieben in Agar-Verdünnungsreihen vereinzelt (. Abb. 1.13). Die weitere Identi­ fizierung und Charakterisierung der Einzelkolonien (Reinkultur) erfolgt z. B. durch die Analyse der Pigmentausstattung, der physiologischen Charakteristika und des Sequenzierungvergleiches von Nukleinsäuren (7 Abschn. 4.1). 1.4.3  Anreicherung von Schwefelpurpurbakterien

(z. B. Chromatium)

Schwefelpurpurbakterien sind Gram-negativ und obligat anaerob; sie wachsen photo­ lithoautoroph mit Sulfid oder Thiosulfat als Elektronendonator. i Benötigtes Material

5 Anreicherungsmaterial aus aquatischen Habitaten an der Grenzschicht zwischen aeroben und anaeroben Bedingungen, z. B. Brackwassertümpel und eingetrocknete Uferbereiche mit niedriger H2S-Konzentration 5 Schraubdeckelflaschen flach, 100 ml oder 50 ml mit Butylkautschukstopfen

31 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

5 Widdel-Kolben und Gasanlage 7 Abschn. 1.3.2.2, . Abb. 1.8) Kultivierung in Süß-/Salzwassermedium: (7 Abschn. 1.3.2) pH 6,7–6,8 ohne Resazurin, mit 1 mM Cystein und 1 mM Na2S. Thiosulfat-Lösung: 10 g Na2S2O3 · 5H2O in einer 200 ml-Schraubdeckelflasche mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen, lösen und autoklavieren. 1 ml dieser Lösung steril 100 ml Medium zusetzen. Acetat-Lösung: 4,5 g Ammonium- oder 4,5 g Magnesiumacetat in 100 ml Aqua dest. lösen und autoklavieren. 1 ml dieser Lösung steril 100 ml Medium zusetzen. Ammonium- oder Magnesiumacetat verwenden, um große pH-Änderungen bei Zugabe zum Medium zu vermeiden.

Kultivierung 5 Medien herstellen und abfüllen wie in 7 Abschn. 1.3.2.2 beschrieben. 5 Nach dem Animpfen Fläschchen bei 28–35 ℃ bei Tageslicht am Fenster oder im Lichtkasten hinter einem Infrarot-Filter, der Wellenlängen über 800 nm durchlässt, inkubieren. . Abb. 1.14 5 Um ein Absterben der Bakterien nach Verbrauch (Oxidation) von Sulfid und Schwefel zu verhindern, muss die Kultur mit steriler neutralisierter ­Natriumsulfid-Lösung oder Thiosulfat-Lösung (s. o.) je nach Zelldichte und Wachstumsgeschwindigkeit wiederholt nachgefüttert werden. 5 Die Zugabe von Acetat zum Medium stimuliert das Wachstum der Chromatiaceae.

. Abb. 1.14  Anreicherung von Chromatium am Fenster. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

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z Versuchsergebnis/Auswertung

Zeigt sich eine farbige Trübung in den Fläschchen, werden die Kulturen, nach mikro­ skopischer Kontrolle, zur Gewinnung von Reinkulturen wie in 7 Abschn. 1.5.3 beschrieben in Agar-Verdünnungsreihen vereinzelt. Die weitere Identifizierung und Charakterisierung der Einzelkolonien (Reinkultur) erfolgt z. B. durch die Analyse der Pigmentausstattung, der physiologischen Charakteristika und des Sequenzierungvergleichs von Nukleinsäuren (7 Abschn. 4.1). 1.4.4  Anreicherung von Nicht-Schwefelpurpurbakterien

Nicht-Schwefelpurpurbakterien sind Gram-negativ und wachsen anaerob photoorga­ notroph, d. h. sie verwenden organische Verbindungen als Elektronendonatoren. Ihren Zellkohlenstoff gewinnen sie sowohl aus der Fixierung von CO2 als auch aus organischen Verbindungen (mixotrophes Wachstum). Eine gewisse Selektivität lässt sich daher durch die Wahl der C-Quelle im Anreicherungsmedium erzielen. i Benötigtes Material

5 Anreicherungsmaterial aus aquatischen Habitaten an der Grenzschicht zwischen aeroben und anaeroben Bedingungen, z. B. Brackwassertümpel und eingetrocknete Uferbereiche mit niedriger H2S-Konzentration (. Abb. 1.15). 5 Schraubdeckelflaschen flach, 100 ml oder 50 ml, mit Butylkautschukstopfen 5 Schottflaschen mit Schraubdeckel 1000, 250, 100 ml 5 Widdel-Kolben und Gasanlage (. Abb. 1.8) Süßwassermedium 7 Abschn. 1.3.2 pH 6,9, ohne Resazurin, mit 0,05 % Na-Ascorbat Na-Ascorbat-Lösung: 5 % (w/v) in Aqua dest. lösen, sterilfiltrieren und 10 ml/L dem anaerobisierten Süßwassermedium zusetzen. Na-Acetat-Lösung, Na-Benzoat-Lösung, Na-Formiat-Lösung, Na-Malat-Lösung: 100 mM Stammlösung in Aqua dest. herstellen unter N2-Atmosphäre autoklavieren,

. Abb. 1.15  (a) Tümpel auf den Lahnbergen, Marburg, (b) Anreicherungskulturen unterschiedlichen Alters von Rhodospirillen. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

33 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

20 ml/l dem anaerobisierten Süßwassermedium nach Bedarf zusetzen (Endkonzentration 2 mM). Hefeextrakt-Lösung: 10 % in Aqua dest. herstellen und unter N2-Atmosphäre autoklavieren. Nach Bedarf zusetzen (Endkonzentration 0,3 %).

Kultivierung Rhodospirillum rubrum: Für die Anreicherung dem Süßwassermedium 2 mM Na-Acetat oder 2 mM Na-Malat und 0,3 % Hefeextrakt zusetzen, da Aminosäuren in Form von Hefeextrakt das Wachstum begünstigen. Rhodopseudomonas palustris: Für die Anreicherung dem Süßwassermedium 2 mM Na-Benzoat, 2 mM Na-Malat oder 2 mM Na-Formiat zusetzen, die das Wachstum begünstigen. Thiosulfat wird als Elektronenakzeptor verwertet. Medien herstellen und abfüllen wie in 7 Abschn. 1.3.2.2 beschrieben. Nach dem Animpfen die Flaschen bei 28–30 ℃ bei ca. 2000 lx (60 W Glühbirne oder vergleichbare Leuchtmittel in ca. 30 cm Abstand) oder mit Tageslicht inkubieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Zeigt sich eine farbige Trübung in den Fläschchen, werden die Kulturen, nach mikro­ skopischer Kontrolle, zur Gewinnung von Reinkulturen wie unter 7 Abschn. 1.5.3 beschrieben in Agar-Verdünnungsreihen vereinzelt. Die weitere Identifizierung und Charakterisierung der Einzelkolonien (Reinkultur) erfolgt z. B. durch die Analyse der Pigmentausstattung, der physiologischen Charakteristika und des Sequenzierungver­ gleichs von Nukleinsäuren (7 Abschn. 4.1). 1.5  Direktisolierung von Bakterien

Eine Anreicherungskultur führt zu dem am besten an die jeweiligen Kulturbedingungen angepassten Organismus, denn die Selektion begünstigt den am schnellsten Wachsen­ den. Eine Direktisolierung begünstigt hingegen die am häufigsten vorkommenden Keime. Sie wird immer dann angewendet, wenn der gewünschte Organismus am natür­ lichen Standort in Überzahl vorhanden ist und somit eine natürliche Voranreicherung stattgefunden hat und geeignete selektive Medien verfügbar sind. Man legt dazu vom Probenmaterial eine Verdünnungsreihe an und inkubiert in Flüssigmedium oder direkt auf festen Nährböden. 1.5.1  Verdünnung einer Schlamm- oder Wasserprobe

i Benötigtes Material

5 Schlamm- oder Wasserprobe 5 Schottflaschen 250 ml steril

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5 Medium steril 5 Begasungsanlage für Anaerobier

Vorbehandlung einer Probe zur Anreicherung 5 20 ml Schlamm oder Wasserprobe in einer 250 ml-Schottflasche auf 200 ml mit Medium (bei anaeroben Kulturen unter Begasung mit der Hungate-Technik 7 Abschn. 1.3.2.2, . Abb. 1.9) auffüllen. 5 Entweder direkt als Inoculum verwenden oder erneut 1:10 mit Medium verdünnen.

1.5.2  Verdünnungsreihe für aerobe Bakterien

i Benötigtes Material

5 Reagenzgläser mit 4,5 ml Medium steril 5 Alukappen steril 5 Petrischalen mit Agarmedium 5 Vortex 5 Bunsenbrenner 5 Drigalski-Spatel 5 Pipetten steril

Anlegen der Verdünnungsreihe . Abb. 1.16 5 In den Reagenzgläsern eine Reihenverdünnung in Dezimalschritten (4,5 ml Medium +0,5 ml Probe) anlegen. 5 Nach jedem Verdünnungsschritt gut auf dem Vortex mischen. 5 Auf Agarplatten 0,1 ml der jeweiligen Verdünnung mit dem Drigalski-Spatel (7 Abschn. 1.6.3) ausplattieren. 5 Die Zahl der Verdünnungsschritte richtet sich nach der Zelldichte in der Ausgangsprobe und ist dann ausreichend, wenn sich jede vermehrungsfähige Zelle des gewünschten Bakteriums zu einer distinkten Kolonie entwickeln kann.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die einzeln gut voneinander getrennt liegenden Kolonien werden einem erneuten Ver­ einzelungsschritt unterzogen und können dann als Reinkultur betrachtet werden.

. Abb. 1.16  Anlegen einer Verdünnungsreihe auf der Agarplatte. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

35 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

1.5.3  Verdünnungsreihe für anaerobe Bakterien (Agar Shake) 1.5.3.1  Vorbehandlung des Agars

Bei empfindlichen Bakterien sollten wachstumshemmende Hydrolyseprodukte im Agar durch eine spezielle Vorbehandlung entfernt werden. i Benötigtes Material

5 Agar 5 Aqua dest. 5 Magnetrührer 5 Schott-Flasche 500 ml 5 (Wasserstrahl-)Pumpe mit Schlauch 5 Reagenzgläser mit Alukappen (7 RG/Verdünnungsreihe)

Agar-Reinigung 5 In eine 500 ml-Schott-Flasche, die mit Rührfisch und Deckel leer gewogen wurde, 300 ml Aqua dest. geben und 3,3 g Agar hinzufügen. 5 Die Suspension 10 min rühren, Agar absetzen lassen (ca. 10 min), das Wasser vorsichtig dekantieren oder absaugen. 5 Diesen Waschvorgang dreimal wiederholen. 5 Auf der Waage auf 100 g + Leergewicht der Flasche auffüllen, um eine (etwa) 3 %ige Agarsuspension zu erhalten. 5 Die Agarsuspension in der Mikrowelle oder im Wasserbad aufkochen. Vorsicht, Siedeverzug! 5 Je 3 ml auf 7 Reagenzgläser verteilen, mit Alukappen verschließen und autoklavieren.

1.5.3.2  Herstellen der Agar-Verdünnungsreihe i Benötigtes Material

5 7 durchnummerierte Reagenzgläser/Verdünnungsreihe mit je 3 ml flüssiger Agarsuspension (60 ℃) 5 sterile Butylkautschuk-Stopfen 5 Schraubdeckel-Flaschen mit sterilem Medium 5 Wasserbad 45 ℃ 5 Wasserbad 60 ℃ 5 Wasserbad mit Eiswasser 5 Bunsenbrenner 5 Begasungsanlage mit sterilen Begasungskanülen 5 50 ml Medium (komplett 7 Abschn. 1.3.2.2) steril in Schraubdeckelflasche/ Verdünnungsreihe 5 sterile Pipetten: 1 ml, 10 ml 5 Manometer mit Kanüle (Kontrolle des Gasinnendrucks im Roll Tube . Abb. 1.18)

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. Abb. 1.17  Verdünnungsreihe im Agar Shake. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Verdünnungsreihe 5 Nach dem Autoklavieren den Agar bei 60 ℃ im Wasserbad flüssig halten. 5 Alukappen gegen sterile Gummistopfen austauschen. 5 Für jede Verdünnungsreihe einer Agarschüttelkultur (. Abb. 1.17) das Medium in 50 ml-Schraubdeckelflaschen auf 45 ℃ vorwärmen. 5 Je 6 ml dieses Mediums in ein Reagenzglas mit 3 ml verflüssigtem Agar füllen und in ein 45 ℃ warmes Wasserbad stellen. 5 Achtung! Sollen mehrere Agarverdünnungsreihen hergestellt werden, dürfen jeweils nur die Reagenzgläser für eine Reihe vorbereitet werden, da der Agar sonst vor dem Inokulieren polymerisieren kann. 5 Sobald alle Reagenzgläser mit Medium gefüllt sind, in das erste Reagenzglas 0,1–0,5 ml der verdünnten Schlamm- oder Wasserprobe geben, mit dem Gummistopfen verschließen und zum Durchmischen einmal umdrehen. Achtung! Blasenbildung vermeiden; der Agar soll mit möglichst wenig Luft durchmischt werden. 5 Einen Tropfen dieser Agarsuspension steril mit der Pipette in das zweite Kulturröhrchen überführen. 5 Das erste Röhrchen in ein Wasserbad mit Eiswasser stellen, damit der Agar erstarrt. 5 Mit dem zweiten Kulturröhrchen wie oben beschrieben fortfahren. 5 Sobald das 7. Kulturröhrchen beimpft ist, alle Kulturröhrchen evakuieren und mit dem benötigten Gas (z. B. N2, N2/CO2 (80/20) o. a.) steril begasen. 5 Die Kulturröhrchen mit dem Gummistopfen nach unten (Vermeidung von Kondenswasser auf der Agaroberfläche) bei der gewünschten Temperatur inkubieren, bis sich gut sichtbare Kolonien gebildet haben. 5 Achtung! Da die Ränder der Kulturröhrchen mit einem dünnen Agarfilm belegt sind, vor dem endgültigen Verschließen den Rand des Kulturröhrchens erhitzen, um zu verhindern, dass der Stopfen herausschlüpfen kann (sterile Reservestopfen bereithalten!).

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Verdünnungsreihe (Agar Shake) ist dann erfolgreich, wenn im Agar Kolonien wachsen, die so weit auseinanderliegen, dass sie wie unten beschrieben aus dem Agar

37 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

entnommen werden können, ohne Zellmaterial anderer Kolonien mit abzutragen. Die Kolonie kann in einer zweiten Verdünnungsreihe erneut vereinzelt und dann als Rein­ kultur weiter charakterisiert werden. 1.5.3.3  Herstellung von Roll-Tubes

Sauerstoffempfindliche, auf gasförmige Substrate angewiesene Keime, z. B. methanogene Mikroorganismen, können auf Agaroberflächen in Petrischalen meist nicht kultiviert werden. Die Hungate-Roll-Tube-Technik ermöglicht Wachstum unter anaeroben Bedingungen durch Vergrößerung der Agaroberfläche unter Erhaltung eines großen Begasungsvolumens im Kulturröhrchen (. Abb. 1.18). i Benötigtes Material

Material und Vorgehensweise sind 7 Abschn. 1.5.3 beschrieben. Zusätzlich benötigt werden Butylkautschuk-Stopfen mit Crimp-Verschlüssen.

Roll-Tubes 5 Das Agarmedium im ersten Kulturröhrchen mit Probenmaterial beimpfen, mischen, einen Tropfen ins zweite Röhrchen überführen und sofort mit einem Gummistopfen mit Crimp-Verschluss verschließen. 5 Jetzt das Röhrchen unter kaltem Wasser zwischen den Handflächen hin und her rollen, sodass sich ein dünner Agarmediumfilm an der Innenwand des Kulturröhrchens bildet. 5 Mit den sechs weiteren Kulturröhrchen ebenso verfahren. 5 Alle Kulturröhrchen evakuieren und mit dem benötigten Gas (z. B. H2/CO2 (80/20), N2/CO2 (80/20) o. a.) zu 173 kPa (25 psi) steril begasen. 5 Kulturröhrchen aufrecht bei der entsprechenden Temperatur inkubieren. 5 Nach 24 h den Gasdruck in den Röhrchen mit einem Manometer überprüfen und wenn nötig nachbegasen.

. Abb. 1.18  Roll-Tubes. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

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Roll-Tubes, aber auch anaerobe Agarverdünnungsreihen sind nicht geeignet für gas­ bildende Bakterien wie z. B. Clostridium pasteurianum, da diese durch die Gas­ produktion während des Wachstums den Agar zerreißen! Einzelkolonien können dann nicht mehr identifiziert werden. z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Roll-Tube-Technik ist dann erfolgreich, wenn im oder auf dem Agar Kolonien wachsen, die so weit auseinanderliegen, dass sie wie unten beschrieben aus dem ­RollTube entnommen werden können, ohne Zellmaterial anderer Kolonien mit abzu­ tragen. Die Kolonie kann in einer zweiten Verdünnungsreihe im Roll-Tube erneut ver­ einzelt und dann als Reinkultur weiter charakterisiert werden. 1.5.3.4  Anzucht vereinzelter Kolonien

Ziel dieser Arbeitsschritte ist es, eine Reinkultur aus den Vereinzelungskulturen zu erhalten und anschließend in Kultur zu nehmen. i Benötigtes Material

5 Binokular 5 sterile mit Watte gestopfte Pasteurpipetten 5 Bunsenbrenner 5 steriles Medium 5 sterile 2 ml Spitzröhrchen oder 2 ml-Serumflaschen mit 0,5 ml Medium und Stopfen

„Picken“ einer Einzelkolonie 5 Einzelkolonien können mit einer ausgezogenen sterilen Pasteurpipette aus dem Agar „gepickt“ werden. (Ausziehen des schlanken Teils einer mit Watte gestopften Pasteurpipette zur Kapillare am Bunsenbrenner; die Kapillare wird so gebrochen, dass noch 2 cm an der Pasteurpipette verbleiben, . Abb. 1.19). 5 Wenig Medium (ca. 0,2 ml) in die Pasteurpipette aufnehmen. 5 In den Agar einstechen (Lupe benutzen), die gewünschte Kolonie in die Kapillare saugen und in ein mit 0,5 ml Medium gefülltes 2 ml-Röhrchen überführen. 5 Diese Suspension für eine zweite Verdünnungsreihe wie oben beschrieben verwenden oder direkt bei der gewünschten Temperatur inkubieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach der zweiten Verdünnungsreihe die Verdünnungsstufe auswählen, in der einzelne Kolonien gewachsen sind. Eine solche Kolonie „picken“ und direkt in ein mit entsprechendem Medium gefülltes Spitzröhrchen oder eine kleine Serumflasche übertragen und bei der gewünschten Temperatur kultivieren.

39 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

. Abb. 1.19  Ausziehen einer Kapillare und „Picken“ einer Einzelkolonie unter dem Binokular. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

1.6  Gewinnung von Reinkulturen

Bei der Gewinnung von Reinkulturen muss besonders penibel auf steriles Arbeiten geachtet werden; besonders bei langsam wachsenden Bakterien empfiehlt sich das Arbeiten in einer sterilen Werkbank. Für die meisten mikrobiologischen, biochemischen oder molekularbiologischen Untersuchungen muss sichergestellt sein, dass nur mit einer bestimmten Bakterien­ spezies gearbeitet wird. Daher kommen Verfahren zur Vereinzelung von Bakterienzellen, um Reinkulturen zu erhalten, ständig zum Einsatz. Grundsätzlich gibt es die Möglichkeit, eine Verdünnungsreihe anzulegen (7 Abschn. 1.5.2 und 1.5.3) und die verdünnte Bakteriensuspension auf eine Agarober­ fläche aufzubringen oder den Verdünnungseffekt durch Ausstrichverfahren zu erreichen. Die Vereinzelung einer Kultur auf einer festen Oberfläche (Agarplatte) zielt daher immer darauf ab, einzelne, getrennt liegende Zellen zu erhalten, die durch wiederholte Tei­ lungen zur Kolonie heranwachsen. Die Zellen einer Kolonie gehen somit auf eine Zelle zurück und stellen definitionsgemäß einen Klon dar. Stellvertretend für die verschiedenen Ausstrichverfahren (­Ein-Strich-Verfahren, Verfahren nach Drews, Dreifelder-Verfahren, Quadraten-Ausstrich, ­ Dreizehn-StrichVerfahren) wird hier das Verfahren der Drei-Strich-Technik und das Verfahren des Kreuzstrichs vorgestellt. 1.6.1  Vereinzelung durch Drei-Strich-Technik i Benötigtes Material

5 5 5 5

Bakterienprobe mit den zu vereinzelnden Mikroorganismen . Abb. 1.20 Steriles Reagenzglas oder Eppendorf-Cup mit Verschluss Steriler Puffer oder steriles Medium zum Verdünnen Sterile getrocknete Agarplatten

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. Abb. 1.20  Agarplatte mit Einzelkolonien. (© Silke Werner, Marburg)

5 Reagenzgläser mit Ständer 5 Bunsenbrenner 5 Impföse mit Kollehalter im Impfösenständer 5 Brutschrank

Drei-Strich-Technik . Abb. 1.21 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

5

Impföse in der prasselnden Bunsenbrennerflamme ausglühen. Abkühlen lassen. Wenig Zellmaterial von einer Kolonie mit der Öse aufnehmen. In ein steriles Eppendorf-Cup mit Medium oder Puffer übertragen, Deckel verschließen. Homogen suspendieren. Impföse ausglühen. Wenige Sekunden abkühlen. Kurz in die Suspension eintauchen und wenig Flüssigkeit aufnehmen. Deckel der Petrischale anheben und schützend über die Platte halten. Flüssigkeitstropfen mit der Impföse auf der Agaroberfläche absetzen (Tr) und anschließend wie in . Abb. 1.21 gezeigt drei parallele Striche über die Agaroberfläche ziehen (A–C jeweils drei Mal). Achtung! Ein „Pflügen“ durch den Agar lässt sich vermeiden, indem man die Impföse in einem möglichst flachen Winkel und ohne Druck über den Agar bewegt.

Wichtig: Die Impföse jeweils nach dem dritten A-Strich, B-Strich und C-Strich (evt. sind noch drei weitere Striche möglich) ausglühen und durch Aufdrücken in den freien Randbereich der Agaroberfläche abkühlen. Zwischen den Drei-Strich-Triaden keine neue Suspension aufnehmen. Anschließend werden die Platten mit der Unterseite nach oben so lange bebrüten, bis sich Wachstum zeigt.

41 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

B1 2 3

A1 2 3

C1 Tr

2 3

. Abb. 1.21  Fraktionierter Ausstrich auf einer Agarplatte. Flüssigkeitstropfen (Tr) der Bakterienprobe mit der Impföse auf der Agaroberfläche absetzen und anschließend je drei parallele Striche über die Agaroberfläche ziehen (A-C). (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Nur mit vielfachen Wiederholungen der Ausstrichtechnik gelingt die Vereinzelung von Mikroorganismen, die hyphenartig wachsen, über wachsartige Zellwände (Einlagerung von Mycolsäuren) verfügen, als Zellverband oder Biofilm vorkommen und/oder durch die Absonderung von Schleimen gekennzeichnet sind. Ausstriche mit einer sterilen Glaspipette anstelle der Impföse kann unter diesen Umständen das Ergebnis verbessern.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Bei erfolgreicher Vereinzelung sollten sich auf den Ausstrichen einzelne identisch aus­ sehende Kolonien zeigen. Dieses Ausstrichverfahren mindestens zweimal wiederholen, um sicher zu sein, dass es sich wirklich um eine Reinkultur handelt. z Mögliche Fehlerquellen

Hat die Vereinzelung nicht geklappt, d. h. liegen zumindest auf den C-Ausstrichen keine vereinzelten Kolonien, dann 5 war die Agaroberfläche zu feucht 5 ist Kondenswasser vom Deckel abgetropft 5 war die Strichlänge zu kurz 5 wurde zu viel/wenig Material aufgetragen 5 wurde vergessen, die Impföse nach den Strichserien auszuglühen bzw. nicht gut genug abgekühlt.

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1.6.2  Vereinzelung durch Kreuzstrich

Wenn die Mikroorganismen, von denen eine Einzelkolonie erhalten werden soll, nur vereinzelt in einer Probe vorkommen, empfiehlt sich der Kreuzstrich (z. B. zu Beginn einer Isolierung). . Abb. 1.22. i Benötigtes Material

5 Probe mit den zu vereinzelnden Mikroorganismen 5 Getrocknete Agarplatten 5 Bunsenbrenner 5 Impföse mit Kollehalter im Impfösenständer 5 Brutschrank

Kreuz-Strich-Technik . Abb. 1.22 5 Die mit der ausgeglühten Impföse aufgenommene Suspension mit einem Strich auf die Agarplatte geben (A). 5 Die Impföse erneut ausglühen. 5 Nach Abkühlen in Schlangenlinien (B) durch den Ausstrich (A) führen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Auf den Ausstrichen sollten einzeln liegende Kolonien entstehen, die dann wie in 7 Abschn. 1.6.1 beschrieben erneut vereinzelt werden können.

A

B

. Abb. 1.22  Vereinzelung mit dem Kreuzstrich-Verfahren. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

43 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

1.6.3  Flächenausstrich mit dem Drigalski-Spatel

Zur Reinheitskontrolle verdünnter Suspensionen, aber auch zur Lebendzellzahlbestimmung (7 Abschn. 1.7.3) wird der Flächenausstrich verwendet. Mit dem Drigalski-Spatel lassen sich Bakterien-haltige Suspensionen gleichmäßig auf der Oberfläche gut getrockneter Agarplatten verteilen. . Abb. 1.23. i Benötigtes Material

5 Bakteriensuspension 5 sterile Reagenzgläser mit Kappen 5 steriles Medium oder Puffer zum Verdünnen 5 sterile Pipetten mit Pipettierhilfe 5 Agarplatten mit trockener Oberfläche 5 Drigalski-Spatel 5 Bunsenbrenner 5 70 % Ethanol 5 Glasbecherglas aus Duran

Ausstreichen mit dem Drigalski-Spatel . Abb. 1.23 Anlegen einer Verdünnungsreihe der Bakteriensuspension (7 Abschn. 1.5.2 und 1.5.3) unter sterilen Bedingungen. 5 Drigalski-Spatel durch Abflammen mit Ethanol sterilisieren: Dafür den kurzen Schenkel des Spatels in Alkohol tauchen (ca. 10 ml abgefüllt in ein hitzebeständiges Becherglas), vorsichtig durch die Flamme des Bunsenbrenners ziehen und den anhaftenden Alkohol abbrennen lassen.

. Abb. 1.23  Ausplattieren mit dem Drigalski-Spatel. (© Silke Werner, Marburg)

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5 100 µl der verdünnten Bakteriensuspension mit steriler Pipette auf die Agaroberfläche tropfen. 5 Mit dem abgekühlten Spatel gleichmäßig unter Drehen der Petrischale die Bakteriensuspension in radialen Bahnen in die Agaroberfläche einreiben. 5 Wichtig ist zügiges Arbeiten unter dem Schutz des Deckels der Petrischale unter keimreduzierten Bedingungen (Brenner), wenn keine sterile Werkbank zur Verfügung steht! 5 Agarplatten bei der gewünschten Temperatur bebrüten, bis sich Kolonien auf der Agaroberfläche zeigen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Bei sorgfältigen Ausplattieren und ausreichender Verdünnungsstufe liegen die Bakterienkolonien gut getrennt voneinander und gleichmäßig verteilt auf der Aga­ roberfläche. Eine zu geringe Verdünnung der Ausgangssuspension führt zu einem Bakterienrasen. ! Verbrennungsgefahr beim Abflammen des Drigalski-Spatels! Nie den heißen

Drigalski-Spatel in den Alkohol tauchen.

1.6.4  Vereinzelung aerotoleranter anaerober Bakterien 1.6.4.1  Agarschüttelkultur

Aerotolerante und weniger sauerstoffempfindliche Bakterien können mit dem das ­Agar-Hochschicht-Schüttelverfahren (7 Abschn. 1.5.3) ohne Einsatz des Anaeroben­ topfes vereinzelt werden. i Benötigtes Material

5 Bakteriensuspension 5 Glas- oder Plastikröhren, 16–20 mm Ø, 12–14 cm lang, steril; ersatzweise Reagenzgläser 5 passende Gummistopfen steril 5 Nähragar in Reagenzgläsern, Agarkonzentration 1 % (w/v) 5 Wasserbad 46 ℃ 5 Bunsenbrenner 5 Pipetten steril 5 Skalpell

Herstellung der Agarschüttelkultur 5 Aus Nähragar (45 ℃) und einer verdünnten Bakteriensuspension eine Mischung herstellen (wie in 7 Abschn. 1.5.3 beschrieben). 5 Diese in einseitig verschlossene Röhren umfüllen und mit einem zweiten sterilen Stopfen das andere Ende der Röhre verschließen. 5 Bei entsprechender Temperatur bebrüten.

45 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

z Versuchsergebnis/Auswertung

Wenn sich Einzelkolonien im Agar zeigen, durch leichtes Erwärmen der Röhre die Agarsäule in eine sterile Petrischale drücken. Einzelkolonien aus dem Agar mit einem Skalpell herausscheiden und in frisches Medium übertragen. Dieses Verfahren ist für Mikroorganismen mit hoher Gasproduktion nicht geeignet! 1.7  Bestimmung von Wachstum 1.7.1  Bestimmung der (Gesamt-)Zellzahl mit der Zählkammer

Die Gesamtzellzahl einer Flüssigkultur kann in einer Zählkammer (. Abb. 1.24) unter mikroskopischer Vergrößerung bestimmt werden. Zum Auszählen von Bakterien eignet sich eine Zählkammer mit einer Kammerhöhe von 0,02 mm (z. B. Helber-Zählkammer), für größere Mikroorganismen wie Hefen, Pilzsporen oder Protozoen eine Zählkammer mit einer Kammerhöhe von 0,1 mm (Neubauer-, Thoma-, Türk-Zählkammer). a

Deckglas Außensteg

Mittelsteg (Kammerboden)

Interferenzlinien (Newton’ sche Ringe)

b

Zählnetze

Probe Deckglas 0,02 mm

. Abb. 1.24  a Zählkammer, b Schema der Zählkammer. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

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i Benötigtes Material

5 Zählkammer 5 Physiologische Kochsalzlösung (Saline) (0,9 % NaCl in Aqua dest. (w/v) 5 Pipette: Pasteur- oder Kolbenhubpipette 5 Mikroskop 5 Handzähler

Die Zählkammer besteht aus einer dicken Grundplatte mit drei parallelen Stegen, die durch Quer- und Längsrinnen begrenzt werden. Auf den mittleren Steg sind zwei Gitter­ netze eingraviert, die eine definierte Fläche haben und in je 16 Groß- und 16 × 16  Klein­ quadrate eingeteilt sind. Der mittlere Steg ist außerdem gegenüber den Außenstegen abgesenkt, sodass ein Deckglas auf die Außenstege aufgelegt einen Abstand von 0,02 mm (bzw. 0,1 mm) zum Mittelsteg hat. Damit entsteht eine seitlich offene Kammer mit definiertem Volumen. Die Fläche eines Kleinquadrats sowie die Kammertiefe sind auf der jeweiligen Zählkammer angegeben. Aus der Kantenlänge eines Kleinquadrats (KQ) von 0,05 mm ergibt sich eine Fläche von 0,0025 mm2 und bei einer Höhe von 0,02 mm ein Volumen von 5 × 10−5 mm3 (5 × 10−8 ml). Das Volumen eines Großquadrats (GQ) berechnet sich mit 8 × 10−4 mm3 (V = 8 × 10−7 ml). Arbeiten mit der Zählkammer . Abb. 1.25 5 Das Deckglas mit etwas Druck (Vorsicht, Bruchgefahr!) im Querformat auf die beiden Trägerstege aufschieben. Sitzt das Deckglas korrekt auf, sind Newtonʼsche Interferenzfarben zu sehen. Die Höhe des Zwischenraums zwischen den Trägerstegen und dem Deckglas liegt somit in der Größenordnung der Lichtwellenlängen und ist daher zu vernachlässigen, aber der Abstand zwischen Deckglas und Mittelsteg entspricht der Vorgabe. In diesem Zustand verrutscht das Deckglas beim Kippen der Zählkammer nicht. 5 Die auszuzählende Bakteriensuspension mit der Kochsalzlösung auf eine Zellzahl zwischen107 und 108 Zellen/ml einstellen (angestrebt wird eine Zellzahl/ Kleinquadrat von etwa 10 Zellen). 5 Mit der Pipette einen kleinen Tropfen der Suspension auf den mittleren Steg seitlich am Deckglas absetzen und durch Kapillarkraft in den definierten Zwischenraum einsaugen lassen. 5 2 min warten. 5 Am Mikroskop Gitternetz mit Zellen mit dem schwächsten Objekt (z. B. 10er-Vergrößerung) suchen, dann auf die 40er-Vergrößerung umschalten. 5 Die Verteilung der Zellen über die Zählquadrate kontrollieren. Bei ungleichmäßiger Verteilung die Bakteriensuspension nochmal gut aufschütteln und die Zählkammer neu befüllen. 5 Wichtig beim Zählen ist, dass die auf den Grenzlinien liegenden Zellen nicht doppelt gezählt werden. Deshalb sind beim Auszählen eines Quadrats nur die Zellen, die auf zwei Grenzlinien (z. B. oben und links) liegen, mitzuzählen und die auf den anderen beiden Linien liegenden nicht. . Abb. 1.25. 5 Zellzahl/Kleinquadrat mithilfe des Handzählers auszählen und dabei Zellzahl und Zahl der ausgezählten Kleinquadrate notieren. 5 Es sollten insgesamt 400 Zellen ausgezählt werden.

47 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

a

b Ausschnittsvergrößerung eines b-Feldes

1 b-Feld

1 c-Feld

c-Feld = 0,0025 mm2

Zähifeld

b-Feld = 16 c- Felder

• 16 b-Felder • 1 b-Feld = 16 c-Felder . Abb. 1.25  a Zählnetz der Zählkammer, b Auszählen eines Großquadrats. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Zellzahl (ZZ) pro Kleinquadrat berechnen, d. h. gezählte Zellen durch die Anzahl der Kleinquadrate teilen (Durchschnitt ZZKQ). Diesen Wert in folgende Gleichung einsetzen, um die Zellzahl pro ml zu berechnen.

ZZ



..

ml =

Ø ZZKQ × Verdunnung VKQ

Nach Benutzung Kammer und Deckglas vorsichtig mit 70 % Ethanol reinigen und mit einem fusselfreien Tuch trocknen. Hierbei ist vor allem das Deckglas, das wiederver­ wendet wird, mit Vorsicht zu behandeln, da dieses plangeschliffen und somit teurer als ein normales Deckglas ist. 1.7.2  Bestimmung der Zellzahl mit der Membranfiltertechnik

Zellsuspensionen mit niedrigen Zellzahlen (z. B. Wasserproben) können mit der Membranfiltertechnik vor der Zählung auf einem Membranfilter ankonzentriert werden. Der Filter kann dann entweder in einer Petrischale auf einem geeigneten Agarnährmedium bebrütet und die Kolonien ausgezählt oder nach Färbung direkt unter dem Mikroskop ausgezählt werden (. Abb. 1.26). i Benötigtes Material

5 Probe 5 Membranfilter, Porendurchmesser 0,2 µm, Material: s. u. jeweiliges Verfahren 5 steriles Aqua dest. 5 Briefmarkenpinzette (flache Enden) 5 Schere

1

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1

. Abb. 1.26  Membranfiltrationsapparatur, bestehend aus A: Saugflasche, B: Glasaufsatz mit Klammer und Fritte, C: Box mit Membranfiltern. (© Astrid Brandis-Heep, Mikrobiologie, Marburg)

5 Membranfiltrationsgerät mit Glasaufsatz, Fritte, Saugflasche und Vakuumschlauch, Waschflasche 5 Vakuumpumpe oder Wasserstrahlpumpe 5 Pipetten mit Pipettierhilfen 5 Licht- oder Fluoreszenzmikroskop, Okulargitternetz, Objektmikrometer, Objektträger, Deckgläschen 5 Immersionsöl 5 Färbelösungen

Vorgehensweise 5 Sterile partikelfreie Membranfilter mithilfe der abgeflammten Pinzette luftblasenfrei in eine (sterile) Filterapparatur legen. 5 Definiertes Volumen durch das Anlegen eines Vakuums filtrieren. 5 Mit sterilem Aqua dest. nachspülen.

Das Verhältnis der Höhe zum Durchmesser der Flüssigkeitssäule sollte so gewählt werden, dass eine möglichst gleichmäßige Verteilung der Bakterien auf dem Filter erreicht wird (über 3:1). Das angelegte Vakuum zur Filtration sollte ca. 13 kPa betragen. Rückschläge beim Ablassen des Vakuums werden durch den Einbau einer Waschflasche zwischen Filter­ apparatur und Pumpe verhindert. 1.7.2.1  Fixierung einer Bakterienprobe mit Formaldehyd i Benötigtes Material

5 Bakterienprobe 5 Formaldehydlösung 37 %, sterilfiltriert, eiskalt 5 Reagenzgläser oder Eppendorf Cups 5 Automatische Pipette

49 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Fixierung Zu 1 ml Bakterien-Suspension 54 µl der Formaldehydlösung geben (Formaldehydkonzentration in der Probe 2 % (v/v).

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die so fixierte Probe kann in einem verschlossenen Gefäß bei 4 ℃ im Kühlschrank mehrere Tage gelagert oder bei -20 ℃ für Wochen eingefroren werden. ! Formaldehyd ist giftig, ätzend, hautresorptiv und möglicherweise kanzerogen.

Sicherheitsdatenblatt und Betriebsanweisung beachten. Nur unter dem Abzug verwenden! Schutzhandschuhe!

1.7.2.2  Färbung mit Amidoschwarz i Benötigtes Material

5 Probensuspension: Formaldehyd fixiert (s. o.) (Probe + eiskalte, steril filtrierte 37 % Formaldehydlösung, Endkonz. 2 % (v/v)) 5 Membranfiltrationsgerät mit Aufsatz, Fritte, Saugflasche und Vakuumschlauch, Waschflasche 5 Licht- oder Fluoreszenzmikroskop, Okulargitternetz, Objektmikrometer, Objektträger, Deckgläschen 5 Immersionsöl 5 Vakuumpumpe oder Wasserstrahlpumpe 5 sterile Membranfilter aus Cellulosenitrat (0,2 µm) 5 Amidoschwarz-10-B: 1 g/100 ml Aqua dest. sterilfiltriert 5 Essigsäure 20 % 5 Petrischalen 5 Filterpapier 5 Schere

Färbung 5 Cellulosenitratfilter steril in das Membranfiltrationsgerät einlegen. 5 1–10 ml Probensuspension (abhängig von der Bakterienkonzentration) durch den Membranfilter saugen. 5 Filterpapier in eine Petrischale legen und mit Amidoschwarz tränken. 5 Den Membranfilter mit der Probenseite nach oben auf das Filterpapier legen und 30 min färben. 5 Filterpapier in eine Petrischale legen, mit Essigsäure tränken, und den Membranfilter auflegen und entfärben. 5 Das Entfärben zweimal wiederholen. 5 Filter trocknen.

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A. Brandis-Heep

z Versuchsergebnis/Auswertung





Kleine Rechtecke aus verschiedenen Bereichen des Filters ausschneiden und auf einen dünn mit Immersionsöl beschichteten Objektträger übertragen. Mit dem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung im Hellfeld (7 Kap. 5) aus­ zählen. Durch das Öl hat wird der Filter durchsichtig und die (blau-)grün gefärbten Bakterien sichtbar. Sie können mithilfe eines Okulargitternetzes ausgezählt werden. Mit dieser Methode kann man nicht zwischen lebenden und toten Zellen unterscheiden. Eine Fixierung der Membranfilter ist durch Einbettung in Einschlussharze wie Entellan® möglich (anstelle von Immersionsöl), wenn ein Dauerpräparat gewünscht wird.

Das Einbetten erfolgt, indem man auf den waagerecht liegenden Objektträgern mit einem Glasstab ca. 0,5 ml eines Eindeckmittels auftropft, um den Zwischenraum zwischen Objektträger und Deckglas auszufüllen. Sobald eine homogene Verteilung über das Präparat gewährleistet ist, vorsichtig ein sauberes Deckglas auflegen, sodass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Anschließend das Präparat waagerecht liegenlassen, bis es nach ca. 20–30 min getrocknet ist und mikroskopiert werden kann. Die so behandelten Präparate sind mindestens fünf Jahre farbstabil. 1.7.2.3  Färbung mit Acridinorange i Benötigtes Material

5 Probensuspension: Formaldehyd-fixiert (s. o.) (Probe + eiskalte, steril filtrierte 37 % Formaldehydlösung, Endkonz. 2 % (v/v)) 5 Membranfiltrationsgerät mit Aufsatz, Fritte, Saugflasche und Vakuumschlauch, Waschflasche 5 Vakuumpumpe oder Wasserstrahlpumpe 5 Licht- oder Fluoreszenzmikroskop, Okulargitternetz, Objektmikrometer, Objektträger, Deckgläschen 5 Immersionsöl 5 Erlenmeyerkolben 25 ml 5 Automatische Pipetten 5 Schere 5 Eppendorf-Cups 5 sterile schwarze Membranfilter aus Polycarbonat (0,2 µm) 5 Acridinorange: 10 mg/100 ml Aqua dest., sterilfiltriert (Aufbewahrung bei 4 ℃ im Dunkeln) 5 Immersionsöl (fluoreszensarm!) z. B. Cargille Typ A 5 Fluoreszenz-Filter: Blaufilter 450–490 nm 5 abgedunkelter Raum

51 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Färbung 5 5 5 5

10 ml Probenlösung mit 1 ml Acridinorange-Lösung im Erlenmeyerkolben mischen. 2–3 min inkubieren. Sofort in die Filtrationsapparatur geben und filtrieren. Filter entnehmen, im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen und staubgeschützt lagern. 5 Auszählung am gleichen Tag. Ausgeschnittene Stücke des Membranfilters in einen Tropfen Immersionsöl auf einen Objektträger legen und mit einem Deckglas abdecken. 5 Mikroskopieren (7 Abschn. 5.2).

z Versuchsergebnis/Auswertung



Angefärbte Bakterien leuchten im Fluoreszenzmikroskop grün oder orangerot (Grünfärbung der DNA, Rotfärbung der RNA) und können zur Bestimmung der Gesamtzellzahl ausgezählt werden. Eine Unterscheidung zwischen lebenden, geschädigten und abgestorbenen Bakterien ist nicht eindeutig möglich.

Organische Partikel fluoreszieren ebenfalls rot. Daher nur Färbelösungen verwenden, die nicht älter als vier Wochen sind. Diese immer vor Gebrauch filtrieren (Membranfilter 0,2 µm). ! Acridinorange wird in die DNA eingebaut und wirkt mutagen. Sicherheitsdatenblatt

und Betriebsanweisung unbedingt beachten. Nitril-Schutzhandschuhe verwenden. Abzug!

1.7.2.4  Färbung mit DAPI (4ʼ6-Diamidin-2-Phenylindol) i Benötigtes Material

5 Probensuspension: Formaldehyd-fixiert (s. o.) (Probe + eiskalte, steril filtrierte 37 % Formaldehydlösung, Endkonz. 2 % (v/v)) 5 Membranfiltrationsgerät mit Aufsatz, Fritte, Saugflasche und Vakuumschlauch, Waschflasche 5 Licht- oder Fluoreszenzmikroskop, Okulargitternetz, Objektmikrometer, Objektträger, Deckgläschen 5 Immersionsöl (fluoreszensarm!) z. B. Cargille Typ A 5 UV-Filter: 300–400 nm 5 Vakuumpumpe oder Wasserstrahlpumpe 5 Erlenmeyerkolben 25 ml 5 Automatische Pipetten 5 Schere 5 sterile schwarze Membranfilter aus Polycarbonat (0,2 µm) 5 DAPI: 1 mg/1 ml Aqua dest. frisch angesetzt und sterilfiltriert 5 Nonidet-P40: 0,1 % 5 abgedunkelter Raum

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Färbung 5 5 5 5

980 µl steril filtriertes Aqua dest. auf den Filter geben. 1 ml Probensuspension und 20 µl DAPI-Lösung hinzufügen. 10 min färben, dann absaugen. Zur Verbesserung der Färbung zweimal mit 1 ml 0,1 % Nonidet-P40-Lösung waschen. 5 Filter entnehmen, im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen und staubgeschützt lagern. 5 Ausgeschnittene Stücke des Membranfilters in einen Tropfen Immersionsöl auf einen Objektträger legen und mit einem Deckglas abdecken. 5 Mikroskopieren (7 Abschn. 5.2).

z Versuchsergebnis/Auswertung



Die unter UV-Anregung weiß-blau leuchtenden Bakterien auszählen (die ­AT-Basenpaarungen der DNA sind gefärbt). Die Membranfilter können bei −20 ℃ für 14 Tage ohne Qualitätsverlust eingefroren werden. DAPI interkaliert auch in RNA, wobei die Fluoreszenz allerdings fünfmal schwächer ist als bei der Bindung an AT-reiche Regionen der DNA.

! Fluorochrome sind sehr giftig, mutagen und potenziell krebserregend.

Sicherheitsdatenblatt und Betriebsanweisungen unbedingt beachten. Nitril-Schutzhandschuhe verwenden. Abzug!

1.7.3  Bestimmung der Lebendzellzahl

Die Methoden zur Bestimmung der Lebendzellzahl (LZZ) erfassen nur die ver­ mehrungsfähigen Keime, also solche, die in der Lage sind, sich unter den gegebenen Bedingungen zu teilen und auf den jeweiligen Nährböden Kolonien zu bilden. Nach dem Bebrüten können die entstandenen Kolonien, die der Zahl der lebenden Zellen in der Ausgangsprobe entsprechen, ausgezählt werden. 1.7.3.1  Ausspateln auf festen Oberflächen i Benötigtes Material

5 Bakterienkultur 5 sterile, gepufferte Pepton-Salz-Lösung 5 sterile Agarplatten mit geeignetem Medium (1,5–2 % Agar) für die zu zählenden Bakterien 5 sterile Glas-Pipetten mit Pipettierhilfe oder sterile Kolbenhubpipette mit sterilen Spitzen 5 Drigalski-Spatel 5 Ethanol 96 % 5 Bunsenbrenner

53 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Pepton-Salz-Lösung Bestandteil

Menge

Pepton aus Fleisch

1,0 g

NaCl

8,5 g

KH2PO4

0,3 g

Na2HPO4

0,6 g

Aqua dest.

ad 1000 ml

pH 7,0

Vorgehensweise 5 Verdünnungsreihe in dezimalen Verdünnungsstufen mit der Pepton-Salz-Lösung herstellen, bis die zu zählende Suspension 1000–2000 Zellen pro ml aufweist. 5 Überprüfen der Zellzahl der Verdünnungsschritte mit der Helber-Zählkammer (7 Abschn. 1.7.1). 5 Jeweils 100 µl von 3–4 aufeinanderfolgenden dezimalen Verdünnungsstufen (unter denen sich die mit geeigneter Zellzahl befindet) auf je drei Agarplatten auftropfen und mit dem Drigalski-Spatel unter sterilen Bedingungen (7 Abschn. 1.6.3) gleichmäßig verteilen. 5 Platten bei geeigneter Temperatur mit der Unterseite nach oben bebrüten.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Kolonien auszählen; optimal sind 100–200 Kolonien pro Platte. Lebendzellzahl/ml Bakterienkultur unter Berücksichtigung der Verdünnungsstufe berechnen. 1.7.3.2  Plattenguss-Verfahren (Kochʼscher Plattenguss)

Das Kochʼsche Plattenguss-Verfahren wird zur Gewinnung von Reinkulturen und zur Keimzahl-Bestimmung in Lebensmittel, Wasserproben etc. eingesetzt. i Benötigtes Material

5 Bakterienprobe 5 geeignetes Agar-Nährmedium (1–1,5 % Agar), autoklaviert 5 sterile Pepton-Salz-Lösung 5 sterile Kulturröhrchen mit Kappen 5 Petrischalen 5 sterile Pipetten 5 Wasserbad 45 ℃ 5 Vortex

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A. Brandis-Heep

Plattenguss-Verfahren 5 Die zu zählende Kultur auf eine Zellzahl von 100–200 Zellen/ml mit steriler Pepton-Salz-Lösung (s. Bestimmung der Lebendzellzahl)) einstellen (dezimale Verdünnungsschritte). 5 Jeweils 10 ml des heißen Agarnährmedium steril in die Kulturröhrchen abfüllen (je 3 Röhrchen/Verdünnungsstufe) und bei 45 ℃ im Wasserbad flüssig halten. 5 Ausgehend von der höchsten Verdünnungsstufe jeweils 1 ml Probe mit steriler Pipette entnehmen, in das Kulturröhrchen mit Agarmedium überführen. 5 Schnell gut mit dem Vortex mischen. 5 Das Gemisch sofort in eine leere Petrischale ausgießen, Deckel sofort wieder schließen. 5 Das Gemisch durch vorsichtiges Kreisen der Petrischale auf der Unterlage gleichmäßig verteilen (Luftblasen vermeiden!). 5 Zügig arbeiten, da der Agar schnell fest wird! 5 Platten mit der Unterseite nach oben bei geeigneter Temperatur bebrüten.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Kolonien im und auf dem Agar auszählen und die Lebendzellzahl/ml unter Berück­ sichtigung der Verdünnungsstufe berechnen. 1.7.3.3  Ermittlung der höchstwahrscheinlichen Keimzahl – Most

probable number (MPN)

Eingesetzt wird diese Methode zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl in der Wasser-, Umwelt- und Nahrungsmittelanalytik. Sie zielt wird entweder auf bestimmte Organismengruppen ab, deren Wachstum auf selektiven Medien begünstigt wird (besonders bei geringen Keimzahlen) oder auf das Erfassen der Gesamtpopulation bei Verwendung eines entsprechenden Vollmediums. Die Bestimmung der Most-probable-number (MPN) ist ein statistisches Verfahren, bei dem aus der Anzahl bewachsener und unbewachsener Kulturröhrchen in parallelen Verdünnungsreihen auf die Anzahl vermehrungsfähiger Keime rückgeschlossen werden kann. Die Methode beruht darauf, dass mindestens ein lebensfähiger Keim im Kultur­ röhrchen vorhanden sein muss, um bei Wachstum eine Trübung hervorzurufen. Die wahrscheinliche Keimzahl wird mit Hilfe von MPN-Tabellen ermittelt. Neben der Bestimmung von Wachstum können auch Stoffwechselleistungen der Bakterien wie Gasbildung, Enzymreaktionen, pH-Veränderungen usw. als Nachweis herangezogen werden, wenn das Wachstumsmedium entsprechend modifiziert wird. i Benötigtes Material

5 Probenmaterial, z. B. Wasser-, Lebensmittel- oder Sedimentprobe 5 Sterile Reagenzgläser für Verdünnungsreihen 5 26 Kulturröhrchen mit je 9 ml sterilem Nährmedium 5 Aqua dest. steril 5 Pipetten steril 5 MPN-Tabelle

1

55 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

MPN-Verfahren . Abb. 1.27 5 Ausgangsprobe in Dezimalschritten unter sterilen Bedingungen mit Medium (10−1, 10−2, 10−3 bis 10−5) verdünnen. 5 Mit je 1 ml dieser Verdünnungsstufen je drei Kulturröhrchen (mit 9 ml Nährmedium) beimpfen. 5 Zur Kontrolle ein Satz Röhrchen mit sterilem Aqua dest. beimpfen. 5 Bei der gewünschten Temperatur bebrüten (für Wasserproben 37 ℃, 24–48 h, ggf. auch länger).

z Versuchsergebnis/Auswertung



Nach der Bebrütung die bewachsenen Röhrchen für jede Verdünnungsstufe registrieren (= positive Röhrchen). Bakterienwachstum wird entweder durch Trübung oder den Nachweis eines typischen Stoffwechselproduktes nachgewiesen. Bei niedrigen Verdünnungen kann es dazu kommen, dass keine Bakterien wachsen (= negative Röhrchen). Zur Ermittlung des MPN-Index werden die drei Verdünnungsstufen gewählt, in denen gerade noch positive Röhrchen auftreten. Aus der Anzahl der positiven Röhrchen ergibt sich eine Zahlenkombination, der eine Indexziffer an Hand der nachfolgenden Tabelle zugeordnet werden kann (s. unten­ stehende Tabelle). Die Indexziffer beschreibt den Bereich der „Grenzverdünnung“, also den Bereich, in dem die Probenmengen sowohl Keime enthalten als auch nicht enthalten. Aus den aus drei aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen erhaltenen Ergebnissen wird die Indexziffer gebildet.

Kontrolle 1 ml

Probe

Verdünnungsstufe

9 ml Medium + 1 ml Probe

Zahl der positiven Röhrchen = Kennziffer

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml

9 ml

9 ml

1 ml 9 ml

9 ml

100

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

+

+

+

+

+





+

+

+









+

+

+

+







3

3

3

2

1

0

. Abb. 1.27  Schema zur Durchführung der Keimzahlbestimmung mit dem MPN-Verfahren. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

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1

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Nach Möglichkeit sollen dazu die drei Verdünnungsstufen, die noch positive Ergeb­ nisse zeigen, herangezogen werden. Enthält die Verdünnungsreihe keine drei Verdünnungsstufen mit positiven Ergeb­ nissen, so dürfen auch Verdünnungsstufen mit negativen Ergebnissen zur Bildung der Indexziffer verwendet werden.

Probemengen, die so viele Keime enthalten, das auf jeden Fall ein positives Ergebnis nach der Bebrütung auftritt oder Probemengen, die keine Keime enthalten und daher auf jeden Fall negative Reaktionen ergeben, sind für die Bildung der Indexziffer unbrauchbar! (Quelle: 7 http://nagl.netzreport.com/dokumente/mila4/06kultivierungmo.pdf) MPN-Tabelle für dreifachen Ansatz Anzahl der positiven Röhrchen

MPN Indexziffer

Anzahl der positiven Röhrchen

MPN Indexziffer

0

0

0

110

Quelle: Methods for the Examination for Water and Wastewater, 13. Auflage 1971, American Public Health Association

z Berechnung der Keimzahl

Aus der MPN-Tabelle wird die zur Indexziffer gehörige wahrscheinliche Anzahl abgelesen. Diese bezieht sich auf die niedrigste Verdünnungsstufe, die zur Bildung der Indexziffer herangezogen wurde. Die Keimzahl je Milliliter Probe wird durch Multi­ plikation der Keimzahl mit dem Verdünnungsfaktor errechnet.

57 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Beispiel: Die Kennziffer 321 (vergl. . Abb. 1.4) entspricht einem M ­ PN-Index von 15; daraus ergibt sich für die entsprechende Probe eine Keimzahl von 15 × 104 = 150.000 Keime/ml Probe. 1.7.4  Bestimmung der Zellmasse

Biomasse kann direkt oder indirekt quantifiziert werden. Zu den direkten Methoden gehört die Ermittlung des Trockengewichts, des Zellproteins oder Gesamtstickstoffs einer Kultur; als indirekte Methode hat sich in der Praxis die Bestimmung der optischen Dichte einer Kultur bewährt. 1.7.4.1  Bestimmung der Trübung – Aufnahme einer

Wachstumskurve

Zur routinemäßigen Bestimmung der Biomasse dient die photometrische Messung der Trübung einer Bakterienpopulation. Mit der Bestimmung der scheinbaren Extinktion (Optische Dichte, OD) kann das Wachstumsverhalten einer Kultur verfolgt werden, ohne die Zellen fixieren und abtöten zu müssen. Die Intensitätsminderung eines gerichteten Lichtstrahls beim Durchgang durch eine Zellsuspension wird gemessen. Dabei sind Zelltrockenmasse und die Optische Dichte pro Milliliter Suspension direkt proportional, OD und Zellzahl/ml nur, wenn die Zellgröße sich nicht verändert und der Linearitätsbereich eingehalten wird (s. u.). i Benötigtes Material

5 Photometer 5 Küvetten aus optischem Glas oder Kunststoff (Schichtdicke 1 cm, V = 1 ml) 5 Bakterienkultur 5 Nährmedium oder Pufferlösung zum Verdünnen oder Suspendieren 5 Pipetten steril 5 Reagenzgläser 5 Bunsenbrenner

Aufnahme einer Wachstumskurve . Abb. 1.28 5 5 5 5 5 5

5 5

Photometer einschalten und gemäß Bedienungsanleitung aufwärmen lassen Wellenlänge wählen, z. B. 578 nm oder 600 nm*. Photometer gegen Luft auf Null eichen. Küvette mit Nährmedium oder Pufferlösung befüllen und die Extinktion (= Blindwert, BW) bestimmen. Aus der wachsenden Kultur steril mindestens 1 ml Bakteriensuspension entnehmen. Küvette mit Bakteriensuspension befüllen; Linearitätsbereich beachten! Verdünnung der Bakteriensuspension ab einer OD578 = 0,5 mit Nährmedium oder Pufferlösung. Optische Dichte der Probe messen. In Abhängigkeit von der Wachstumsgeschwindigkeit der Bakterien (Verdopplungszeit) Proben während der Kultivierungszeit z. B. stündlich entnehmen.

1

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A

ΔOD578

1

B

C

D

10

A: Lag Phase B: Exponentielle Phase C: Stationäre Phase D: Absterbe Phase

1 0,1 0,01 0

500

Zeit (min)

. Abb. 1.28  Wachstumskurve auf halblogarithmischem Papier. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

*Bei geringer Zelldichte kann eine kürzere Wellenlänge, z. B. 420 nm gewählt werden, um die Empfindlichkeit der Messung zu erhöhen. Allerdings nimmt mit abnehmender Wellenlänge auch der Linearitätsbereich der Messung ab. Achtung!

5 Erreicht die wachsende Kultur eine OD578 ≥ 0,5, muss die Suspension mit Nähr­ medium verdünnt oder abzentrifugiert und das Zellpellet in der entsprechenden Menge Puffer resuspendiert werden. Erst dann erfolgt die photometrische Messung. Suspensionen gefärbter Mikroorganismen misst man bei einer Wellenlänge, bei der die Zellen selbst nicht absorbieren. 5 OD-Messungen sind nicht möglich bei mycelbildenden und zu Verklumpung neigenden Mikroorganismen sowie Suspensionen, die noch andere Partikel enthalten. 5 Zur Festlegung des Linearitätsbereichs der Messung und um Aussagen über die Beziehung zwischen OD und Zellzahl oder OD und Trockenmasse machen zu können, müssen entsprechende Eichkurven aufgenommen werden (s. u.). z Versuchsergebnis/Auswertung

Berechnen der optischen Dichte: ODProbe − BW = ΔOD578 z. B. 0,37 − 0,064 = 0,306 Wachstumskurve: Grafische Auswertung der verschiedenen ΔOD578 -Werte in Abhängigkeit von der Zeit auf halblogarithmischem Papier. Bei dieser Art der Auf­ tragung lässt sich die exponentielle Wachstumsphase der Kultur direkt erkennen und die Verdopplungszeit mit dem Steigungsdreieck unmittelbar ablesen . Abb. 1.28). 1.7.4.2  Bestimmung der Trockenmasse durch Zentrifugation i Benötigtes Material

5 Trockenschrank ohne Umluft 5 Analysenwaage 5 Zentrifuge mit Zentrifugenbechern (100–250 ml) 5 Saugpumpe mit Druckschlauch 5 Wägegefäße, z. B. Eppendorf-Cups 3 ml 5 Pinzette 5 Messzylinder 5 Messpipetten, Pasteurpipetten

59 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

5 Bakterienkultur 5 Ammoniumacetat-Puffer 50 mM, pH 6,5 (mit Essigsäure einstellen) 5 Aqua dest.

Bestimmung durch Zentrifugation 5 Wägegefäße in saubere kleine Alu-Zylinder stellen und bei 80 ℃ trocknen. Gefäße nicht mit den Fingern, sondern immer nur mit Pinzette berühren, um Messfehler zu vermeiden. 5 Optische Dichte der Kultur bestimmen. 5 Ein genau bestimmtes Volumen der Bakterienkultur (z. B. 500 ml) in Zentrifugenbecher aufteilen. 5 Mindestens 20 min zentrifugieren (12000 rpm), um ein festes Zellpellet zu erhalten. 5 Sofort nach Stillstand der Zentrifuge den Überstand vorsichtig absaugen. 5 Zellen aus mehreren Bechern in einem einzigen vereinigen. 5 Mit Ammonium-Acetat-Puffer waschen, indem das Pellet resuspendiert und dann erneut zentrifugiert wird. 5 Die trockenen Wägegefäße auf der Analysenwaage wiegen, und die Leergewichte notieren. 5 Sofort nach Stillstand der Zentrifuge Überstand absaugen, Zellen (behutsam!) in 0,5 ml Aqua dest. mit einer Pasteurpipette in das Wägegefäß überführen; mindestens zweimal mit 0,5 ml Aqua dest. nachspülen. 5 Die Wägegefäße bei 80 ℃ im Trockenschrank bis zur Gewichtskonstanz trocknen (ein bis zwei Tage) und anschließend im Trockenschrank oder Exsikkator abkühlen lassen. 5 Bei Entnahme der Proben aus dem Trockenschrank Eppendorf-Cups sofort verschließen und auf der Analysenwaage auswiegen, da die Zellen Feuchtigkeit absorbieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Vom ermittelten Gewicht zieht man das Gewicht des leeren, trockenen Gefäßes ab, dividiert die Differenz durch das ursprünglich eingesetzte Kulturvolumen und erhält die Trockenmasse mg pro ml Suspension. Das erhaltene Gewicht kann in Beziehung gesetzt werden zur zuvor bestimmten Optischen Dichte der Kultur (7 Abschn. 1.7.4.1). 1.7.4.3  Bestimmung der Trockenmasse durch Membranfiltration

Bakteriensuspensionen, insbesondere solche mit niedrigen Zellzahlen (z. B. Wasser­ proben), aber auch Pilzmycelien können mithilfe der Membranfiltrationstechnik gut auf einem Filter konzentriert, getrocknet und gewogen werden. Von Vorteil ist, dass die Wägegenauigkeit aufgrund der geringen Filtermasse zunimmt. i Benötigtes Material

5 Suspension mit Mikroorganismen 5 Membranfilter: Celluloseacetat oder Cellulosenitrat 5 Porendurchmesser 0,45 µm für Bakterien, 0,65–1,2 µm für Hefen und Pilze 5 Briefmarkenpinzette 5 Membranfiltrationsgerät mit Aufsatz, Fritte, Saugflasche und Vakuumschlauch, Waschflasche

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5 Vakuumpumpe (Wasserstrahlpumpe) 5 Analysenwaage 5 Trockenschrank ohne Umluft 5 Standzylinder 5 Pipette, 10 ml 5 Aqua dest. 5 Exsikkator mit Silikagel

Bestimmung durch Membranfiltration 5 Membranfilter mit der Briefmarkenpinzette in ein Schälchen aus Alufolie legen, bei 80 ℃ im Trockenschrank 2 h trocknen und anschließend im Exsikkator abkühlen lassen. 5 Filter auf der Analysenwaage wiegen. 5 Filter luftblasenfrei in die Filterapparatur legen. 5 Ein definiertes Kulturvolumen (50–100 ml) vorsichtig durch Anlegen eines Vakuums mithilfe der Membranfiltrationsapparatur durch den Filter saugen. 5 Mit 2 × 10 ml Aqua dest. nachspülen. 5 Filter vorsichtig von der Filterfritte ablösen und im Aluschälchen im Trockenschrank für 12 h bei 80 ℃ trocknen. 5 Im Exsikkator auskühlen und auf der Analysenwaage wiegen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Vom ermittelten Gewicht des Filters subtrahiert man das Gewicht des leeren, trockenen Filters, dividiert die Differenz durch das ursprünglich eingesetzte Kulturvolumen und erhält die Trockenmasse mg pro ml Kultur. Die Genauigkeit wird höher, wenn zwei identisch behandelte Filter übereinander in die Filtrationsapparatur gelegt, Probe und Waschwasser hindurch gesaugt und beide Filter getrennt getrocknet und gewogen werden. Der untere Filter dient als Kontrolle; eine Gewichtsveränderung kann dann entsprechend beim Gewicht des Messfilters berücksichtigt werden. 1.7.4.4  Bestimmung der Feuchtmasse

Die gravimetrische Bestimmung der Feuchtmasse einer Bakterienkultur entspricht im Wesentlichen dem Verfahren, dass zur Bestimmung der Trockenmasse beschrieben wurde. Das Verfahren ist deutlich kürzer, da der Trocknungsschritt entfällt, aber auch wesentlich ungenauer, da der Wassergehalt der Zellen sehr unterschiedlich sein kann. Sollte dieses Verfahren dennoch angewandt werden, so ist wichtig, dass die Zentrifugations- bzw. Filtrationsbedingungen standardisiert werden. Nur dann sind ver­ lässliche und vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. 1.7.4.5  Bestimmung des Proteingehalts

Die Proteinmenge lässt sich zur direkten Bestimmung der Biomasse heranziehen, da die Gesamtmenge an Protein im Verhältnis zur Gesamtbiomasse in der logarithmischen Wachstumsphase konstant bleibt und insgesamt einen genügend großen Anteil der Zell­ masse ausmacht.

61 Isolierung und Kultivierung von Bakterien

Die am häufigsten verwendete Methode zur Proteinbestimmung ganzer Zellen ist die nach Lowry et al. (1959). Mit ihr werden in zwei getrennten Farbreaktionen sowohl nach dem Prinzip der Biuret-Reaktion die Peptidbindungen als auch aromatische Amino­ säuren wie Tyrosin und Tryptophan mit dem Folin-Reagenz erfasst. Sie ist empfindlich, gelingt aber nur mit gelösten Proteinen. i Benötigtes Material

5 Bakterienkultur 5 Spektralphotometer bis Wellenlänge 750 nm 5 Küvetten (d = 1 cm) 5 Wasserbad mit Reagenzglaseinsatz 5 Zentrifuge 5 Vortex 5 Reagenzgläser mit Glaskugeln 5 Reagenzgläser klein 5 Messkolben 5 Pipetten, Automat. Pipetten mit Spitzen 5 Aqua dest. 5 Rinderserumalbumin (RSA)-Standardlösung: 50 mg ad 100 ml Aqua dest. 5 NaOH 0,3 N in Aqua dest. 5 Physiologische Kochsalz-Lösung = Saline (0,9 % NaCl in Aqua dest. (w/v)) Reagenzien für die Biuret-Reaktion Lösung A Na2CO3

20,0 g in 1000 ml 0,1 M NaOH

Lösung B CuSO4 · 5H2O Lösung

0,5 g in 10 ml 1 % Na2-Tartrat · 2H2O (w/v)

Ca

Vor Gebrauch 50 ml Lsg. A mit 1 ml Lsg. B mischen Lösung D Folin-Ciocalteus-Phenol-Reagenzb

Fertigreagenz z. B. von Merck

1 Teil Folin-Ciocalteus-Phenol mit 2 Teilen Aqua dest. mischen aHaltbarkeit bVorsicht!

maximal 24 h

Enthält Salz- und Phosphorsäure; Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung vermeiden

Schutzbrille!

Hier eine Überschlagsrechnung für „Standardbakterien“ zur Bestimmung der Zell­ menge, die für eine Bestimmung des Gesamtproteins vorbereitet werden muss: 1 ml einer Bakteriensuspension mit der OD578 = 1 enthält ca. 1 mg Feuchtzellen; diese ent­ sprechen 0,2 mg Trockenzellen und damit 0,1 mg Protein.

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Vorgehensweise Vorbehandlung der Zellen: 5 Zellsuspensionen abzentrifugieren. 5 In Physiologischer Kochsalz-Lösung resuspendieren und auf eine OD578 = 0,8–1,0 einstellen. 5 1 ml dieser Suspension mit 0,5 ml 0,3 N NaOH versetzen und 90 min bei 60 ℃ im Wasserbad behandeln, um die Proteine in Lösung zu bekommen. (Alternativ: Solubilisierung in 1 N NaOH 10 min bei 90 ℃). 5 Reagenzgläser mit Glaskugeln (Murmeln) verschließen. Anschließend bei 5000 × g 5 min zentrifugieren, um Zelltrümmer abzutrennen. Proteinbestimmung 5 Bis zu 1 ml Probe (5–200 µg Protein) in ein 10 ml-Reagenzglas* geben, Volumenausgleich mit Aqua dest. 5 Für den Nullwert 1 ml Saline ohne Protein in den Test einsetzen. 5 Zugabe von 5 ml Lösung C, gut mischen, 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. 5 Zugabe von 0,5 ml Lösung D; sofort mit dem Vortex gut mischen. 5 Nach 30 min photometrische Bestimmung der Extinktion bei 750 nm (500 nm auch möglich, aber unempfindlicher). 5 Zur Messung Testansatz in Küvette umfüllen. 5 Aufnahme einer Eichgerade mit Rinderserumalbumin; Proben werden wie oben beschrieben behandelt.

*Der Test kann auch direkt in 1 ml-Küvetten angesetzt werden, dann sind alle Volumina um den Faktor 5 zu reduzieren. z Versuchsergebnis/Auswertung



Mit einer Eichgerade, die auf Millimeterpapier oder am Computer erstellt wird, grafisch auswerten. Die gemessene Extinktion (abzüglich Nullwert) wird in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration in ein Koordinatensystem aufgetragen. Die Proteinmenge in den Proben lässt sich aus der Eichgeraden ablesen und wird unter Berücksichtigung der eingesetzten ml Bakterienkultur hochgerechnet.

Nach Ablauf der Inkubationszeit Proben zügig messen, da die entstandene blaue Farbe nicht dauerhaft stabil ist.

63

Identifizierung und Differenzierung von Bakterien Astrid Brandis-Heep 2.1 Morphologische Eigenschaften von Bakterien – 65 2.1.1 Zellwand: KOH-Test – 65 2.1.2 Zellwand: Gram-Färbung – 66 2.1.3 Nachweis von Endosporen – 69 2.1.4 Test auf Beweglichkeit von Bakterien – 70 2.1.5 Kapseldarstellung – 72

2.2 Physiologische Eigenschaften von Bakterien: Nachweis auf Identifizierungsmedien – 73 2.2.1 Eosin-Methylenblau-Agar (EMB-Agar) – 73 2.2.2 MacConkey-Agar – 75 2.2.3 Nachweis des oxidativen/fermentativen Abbaus von Zuckern (OF-Test) – 76 2.2.4 Methylrot-Test: Säure- und Gasbildung – 78 2.2.5 Citrat-Agar – Citratlyase – 79 2.2.6 SIM-Agar, MIO-Agar, MIL-Agar – 82

2.3 Physiologische Leistungen: Nachweis von Enzymaktivitäten – 87 2.3.1 Nachweis der Katalase-Aktivität – 87 2.3.2 Nachweis der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität – 87 2.3.3 Nachweis von Indol: Tryptophanase-Aktivität – 89 2.3.4 Nachweis von Acetoin (Voges-Proskauer-Test) – 90 2.3.5 Nachweis der Urease-Aktivität – 90 2.3.6 Nachweis der Lysin-Deaminase und -Decarboxylase-Aktivität – 92

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 A. Störiko (Hrsg.), Methoden der Mikrobiologie, https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7_2

2

2.3.7 Nachweis der Phenylalanin-Deaminase-Aktivität – 94 2.3.8 Nachweis der Gelatinase-Aktivität – 95 2.3.9 Nachweis der Amylase-Aktivität – 97 2.3.10 Nachweis der Cellulase-Aktivität – 99 2.3.11 Nachweis der Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität – 101 2.3.12 Nachweis von Hämolysin-Aktivität – 104 2.3.13 Multitestsystem – 105

65 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

2.1  Morphologische Eigenschaften von Bakterien 2.1.1  Zellwand: KOH-Test

Gram-positive und Gram-negative Bakterien reagieren unterschiedlich auf die Behandlung mit verdünnter Kalilauge. KOH zerstört die dünne Gram-negative Zell­ wand, DNA tritt aus und verleiht der Suspension eine hohe Viskosität. Die Zellwand Gram-positiver Organismen wird nicht angegriffen. . Abb. 2.1 i Benötigtes Material

5 Bakterienprobe aus einer Reinkultur 5 Kontrollstämme: z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis 5 Impföse oder Impfnadel 5 Bunsenbrenner 5 Objektträger 5 3 % KOH in Aqua dest. (w/v)

Vorgehensweise 5 Von einer Agarplatte mit der Impföse steril eine Bakterienkolonie auf einen Objektträger übertragen. 5 Daneben einen Tropfen der Kalilauge aufsetzen. 5 Mit der Impföse oder Impfnadel die Kalilauge kräftig in die Bakterienmasse einrühren. 5 Nach ca. 5 s Rühren die Öse oder Nadel vorsichtig nach oben aus der Flüssigkeit ziehen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Lässt sich ein schleimiger Faden aus der Suspension ziehen, so handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um einen Gram-negativen Keim. Bleibt dagegen die Viskosität der Zellsuspension unverändert, so ist der Keim vermutlich Gram-positiv. Achtung! Dies ist ein Schnelltest, der Erfahrung in der Beurteilung der Viskosi­

tät verlangt. Grundsätzlich für den Test frische Kulturen verwenden. Immer eine

. Abb. 2.1  KOH-Test: Positive KOH-Reaktion, charakteristisch für Gram-negative Bakterien. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

2

66

A. Brandis-Heep

­Gram-positive Kontrolle, z. B. Bacillus subtilis, und eine Gram-negative Kontrolle, z. B. Escherichia coli, einsetzen.

2

2.1.2  Zellwand: Gram-Färbung

Die Gram-Färbung ist auch heute noch eine der wichtigsten Färbungen in der Bakteriendiagnostik, da sie eine schnelle Differenzierung bakterieller Isolate aufgrund des unterschiedlichen Aufbaus der Zellwände ermöglicht. . Abb. 2.2 i Benötigtes Material

5 Bakterienprobe 5 Kontrollstämme: z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis 5 Bunsenbrenner, Impföse und sterile Pasteurpipetten 5 Färbeschale mit Färbebank . Abb. 2.3 5 Briefmarkenpinzette 5 Objektträger 5 Ständer zum Trocknen der Objektträger 5 Deckgläser 5 Diamantstift 5 Saugpapier 5 Plastik-Tropfflaschen mit Färbereagenzien 5 Leitungswasser 5 Stoppuhr 5 Mikroskop Reagenzien für die Gram-Färbung ­­ Färbelösung

Menge

Besonderheit

Kristallviolett-Lösung

1 g Kristallviolett in 100 ml Aqua dest. lösen

Durch einen Faltenfilter filtrieren

Lugolsche Lösung

1 g Iod und 2 g Kaliumiodid vollständig in 5 ml Aqua dest. lösen

Mit Aqua dest. auf 300 ml auffüllen

1-Propanol

100 ml unverdünnt

Safranin-Lösung

1 g Safranin in 100 ml Aqua dest. lösen

. Abb. 2.2  Gram-Färbung a: Gram-positive Bakterien, b: Gram-negative Bakterien. (© Astrid BrandisHeep, Marburg)

68

A. Brandis-Heep

2

. Abb. 2.3  Färbeschale mit Färbebank und Reagenzienständer. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Vorgehensweise Bakterienausstrich aus einer Flüssigkultur 5 Einen Tropfen Bakteriensuspension auf einem Objektträger mit wenig Leitungswasser mischen (schwache Trübung erkennbar) und durch „Breitschaukeln“ flächig verteilen, sodass ein dünner Flüssigkeitsfilm entsteht. An der Luft trocknen. Bakterienausstrich aus einer Agarkolonie 5 Mit steriler Impföse von einer Kolonie eine winzige Menge Bakterien auf den Objektträger in einen Tropfen Wasser übertragen und sorgfältig verreiben, sodass eine dünne, gleichmäßige Bakteriensuspension entsteht. An der Luft trocknen. Hitzefixierung 5 Die Objektträger mit der Schichtseite nach oben dreimal durch die schwach leuchtende, nicht prasselnde Bunsenbrenner-Flamme ziehen und abkühlen. Färbung 5 Objektträger auf die Färbebank legen und mit Kristallviolett-Lösung überschichten. 5 1 min einwirken lassen. 5 Farblösung mit Leitungswasser vorsichtig abspülen. 5 Das restliche Leitungswasser mit Lugolscher Lösung abspülen. 5 Den Objektträger mit Lugolscher Lösung bedecken. 5 1 min einwirken lassen. 5 Lugolsche Lösung mit Leitungswasser vorsichtig abspülen. 5 Objektträger mit 1-Propanol abspülen, bis keine Farbwolken mehr vom Präparat abgehen. 5 Mit Leitungswasser nachspülen. 5 Das überschüssige Wasser mit Safranin-Lösung abspülen. 5 1 min einwirken lassen. 5 Objektträger wiederum mit Leitungswasser abspülen und auf dem Ständer mit Saugpapier an der Luft trocknen.

69 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

Gram-positiv Probe ?

Gram-negativ . Abb. 2.4  Objektträger Gram-Färbung: Probe und Referenzkulturen. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das Präparat kann nach Zugabe eines Tropfens Immersionsöls ohne Deckglas im Licht­ mikroskop (7 Kap. 5.2) betrachtet werden. Gram-positive Zellen sind violett-schwarz, Gram-negative Bakterien hellrot gefärbt. . Abb. 2.4 Achtung!

Die zu untersuchenden Kulturen sollten keinesfalls älter als 48 h sein, da mit zunehmendem Alter das Gram-Verhalten variieren kann. Es ist zweckmäßig, auf demselben Objektträger in der Mitte das zu untersuchende Material aufzubringen und an beiden Seiten je ein bekanntes Gram-positives und Gramnegatives Bakterium als Referenz zu färben. Mit einem Diamantstift oder Fettstift den Objektträger entsprechend beschriften (. Abb. 2.4). Die Bunsenbrenner-Flamme sollte zum Fixieren gerade entleuchtet, keinesfalls jedoch prasselnd sein. 2.1.3  Nachweis von Endosporen . Abb. 2.5.

Endosporen von Bakterien lassen sich am einfachsten im Nativpräparat als stark lichtbrechende Strukturen im Phasenkontrast mikroskopieren (. Abb. 2.5). Eine Fär­ bung erfordert aufgrund der dicken Sporenwand, die Farbstoffe schlecht eindringen lässt, das Erhitzen des Farbstoffs mit den hitzefixierten Zellen. Detaillierte Informatio­ nen 7 Abschn. 5.4.2. Endosporenfärbung nach Wirtz.

2

70

A. Brandis-Heep

2

. Abb. 2.5  Bacillus subtilis mit Sporen, 1000-fach vergrößert. (© Bianca Warmbold, Marburg)

2.1.4  Test auf Beweglichkeit von Bakterien

Siehe . Abb. 2.6. Beweglichkeit von Bakterien ist ein wichtiges biologisches und taxonomisches Charakteristikum, das sowohl mikroskopisch (Lebendpräparat oder Geißelfärbung 7 Abschn. 5.4.2) als auch makroskopisch bestimmt werden kann. TCC-Agar enthält den Redoxindikator Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), der in oxidierter Form farblos ist (. Abb. 2.6). Bei Wachstum in Gegenwart von TTC wird der Farbstoff in die Bakterienzelle aufgenommen und zu rotem Formazan reduziert. Im 0,4 %-Agar-Nährboden können sich bewegliche Bakterien gut ausbreiten. i Benötigtes Material

5 Agarreinkultur 5 Schottflasche 5 TTC-Agar 5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 Bunsenbrenner 5 Impfnadel TTC-Agara Fleischextrakt

3,0 g

Casein pankreatisch verdaut

10,0 g

NaCl

5,0 g

Triphenyltetrazolium-chlorid (TTC)

0,5 g

Agar

4,0 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH auf 7,0 einstellen als Fertigmedium erhältlich

aAuch

71 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

. Abb. 2.6  Wachstum auf TCC-Agar. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

TCC kann als 1 %ige Stocklösung hergestellt werden und nach Bedarf vor dem Autoklavieren dem Medium zugesetzt werden (5 ml/1000 ml).

Vorgehensweise 5 Die aufgelisteten Komponenten in eine Schottflasche einwiegen und in der Mikrowelle aufkochen, bis sich der Agar löst. Vorsicht Siedeverzug! 5 In 5 ml-Portionen auf Kulturröhrchen verteilen, mit Kappen verschließen und autoklavieren. 5 Zum Beimpfen mit der Impfnadel eine Kolonie picken und in den Agar bis 1 cm vor Ende des Kulturröhrchens gerade einstechen. Die Nadel auf gleichem Weg wieder herausziehen. Inkubation bei entsprechender Temperatur, bis gutes Wachstum sichtbar ist.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Rotfärbung des Agars zeigt Wachstum an. Der Test auf Beweglichkeit ist dann positiv, wenn sich eine rötliche, sich vom ursprüng­ lichen Stichkanal ausdehnende Zone gebildet hat (. Abb. 2.6a). Ein negativer Test zeigt Wachstum nur entlang des ursprünglichen Stichkanals (. Abb. 2.6b).

2

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A. Brandis-Heep

2.1.5  Kapseldarstellung

2

Viele Bakterien bilden Schleimhüllen oder Schleimkapseln aus, besonders bei Kulti­ vierung auf zuckerhaltigen Nährböden. Diese Kapseln bestehen aus Polysacchariden, Polyalkoholen, Polyaminen oder Polypeptiden und sind im Lichtmikroskop nicht ohne Negativkontrastierung (7 Abschn. 5.4.2) erkennbar (. Abb. 2.7). 2.1.5.1  Kapsel-Darstellung nach Maneval i Benötigtes Material

5 Agarplatte mit Einzelkolonien 5 Färbeschale mit Färbebank 5 Plastik-Tropfflaschen mit Färbereagenzien 5 Briefmarkenpinzette 5 Objektträger fettfrei 5 Deckgläser 5 Filterpapier 5 Phasenkontrastmikroskop 5 Ständer mit Saugpapier Kapsel-Darstellung nach Maneval Kongorot-Lösung

1 % in Aqua dest

Fuchsin-Lösung

0,05 g Fuchsin 3,0 g FeCl3 5,0 ml Eisessig 3,9 ml Phenol (verflüssigt, 90 % w/v) 95,0 ml Aqua dest.

Vorsicht! Lösungen unter dem Abzug herstellen. Verätzungsgefahr! Sicherheitsdatenblätter beachten

Vorgehensweise 5 Einige Tropfen Kongorot auf einen Objektträger tropfen, eine Einzelkolonie darin verreiben und an der Luft trocknen. Achtung! Keine Hitzefixierung! 5 Objektträger auf die Färbebank legen und vorsichtig mit der Fuchsin-Lösung überschichten. 5 Nach 5 min die überschüssige Färbelösung in die Färbewanne ablaufen lassen. 5 Sehr vorsichtig Aqua dest. auf den Objektträger geben, damit die Zellen nicht abgewaschen werden. 5 Das Wasser vorsichtig ablaufen lassen. 5 Objektträger auf den Ständer mit Saugpapier stellen und trocknen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Bei 400-1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion mikroskopieren. Die Kapsel bleibt ungefärbt und grenzt sich klar zur Umgebung als helle Umrandung um die dun­ kel gefärbten Zellen ab (. Abb. 2.7).

73 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

. Abb. 2.7 Kapseldarstellung, Bacillus sp. (© Silke Werner, Marburg)

2.2  Physiologische Eigenschaften von Bakterien: Nachweis auf

Identifizierungsmedien

2.2.1  Eosin-Methylenblau-Agar (EMB-Agar)

EMB-Agar ist ein Selektivmedium, das neben Pepton die Kohlenhydrate Laktose und Saccharose sowie die Farbstoffe Eosin und Methylenblau enthält. Die Verwertung der Zucker in Kombination mit den Farbstoffen ermöglicht den Nachweis und die Identi­ fizierung verschiedener Gram-negativer Bakterien aus der Familie der Enterobacte­ riaceae; der Farbstoff Methylenblau unterdrückt das Wachstum vieler ­Gram-positiver Organismen, während Eosin auf pH-Änderungen von farblos nach schwarz unter sauren Bedingungen reagiert (. Abb. 2.8).

. Abb. 2.8  Escherichia coli auf EMB-Agar mit grün-metallischen Glanz. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

2

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A. Brandis-Heep

i Benötigtes Material

2

5 Reinkultur 5 Eosin-Methylenblau-Agar 5 Schottflasche mit Deckel 5 Petrischalen 5 Bunsenbrenner 5 Pipetten steril, 5 Drigalskispatel bei Flüssigkultur 5 Impföse bei Agarkultur Eosin-Methylenblau-Agar (EMB-Agar nach Levinea) Pepton aus Fleisch

10 g

Laktose

5 g

Saccharose

5 g

K2HPO4

2 g

Eosin Y (gelb)

0,4 g

Methylenblau

0,065 g

Agar

13,5 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH auf 7,2 einstellen aAuch

als Fertigmedium zu beziehen

Herstellung des Mediums 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, mit Aqua dest. auf das gewünschte Volumen auffüllen und autoklavieren. 5 Nach Abkühlen des Agars auf 65 ℃, die Schottflasche gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede im Medium auszugleichen. 5 Die Petrischalen mit ca. 25 ml Agar-Medium unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. 5 Nach dem Trocknen können die Platten mit der Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) oder dem Drigalski-Spatel im Flächenausstrich (7 Abschn. 1.6.3) beimpft und anschließend bei entsprechender Temperatur bebrütet werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung Laktose- und Saccharose-negative Bakterien wie z. B. Salmonella oder Shigella wachsen

als transparente bernsteinfarbene Kolonien.

Laktose-negative, aber Saccharose-positive Proteus vulgaris zeigen sich als dunkel­

violett gefärbte Kolonien.

Laktose-positive Enterobacter- oder Klebsiella-Species wachsen in großen schleimigen,

rosa mit dunklem Zentrum erscheinenden Kolonien. Die Kolonien der Laktose-positiven E. coli haben neben dem charakteristischen ­grün-metallischen Glanz ein dunkles Zentrum.

75 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

2.2.2  MacConkey-Agar

MacConkey-Agar ist ein Selektivmedium, das neben Pepton das Disaccharid Laktose, die Farbstoffe Neutralrot und Kristallviolett sowie eine Mischung von Gallensalzen ent­ hält. Die Verwertung von Laktose in Kombination mit den Farbstoffen ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung verschiedener Gram-negativer Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae in Fäkalien, Abwasser, Nahrungsmitteln usw. Gallen­ salze und Farbstoffe unterdrücken das Wachstum von Gram-positiven Organismen und anspruchsvollen Gram-negativen Bakterien wie Neisseria und Pasteurella. Gram-Negative können meist Gallensalze im Medium aufgrund der äußeren Memb­ ran tolerieren (. Abb. 2.9). i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 MacConkey-Agar 5 Schottflasche mit Deckel 5 Petrischalen steril 5 Bunsenbrenner 5 Pipetten steril 5 Drigalskispatel bei Flüssigkultur 5 Impföse bei Agarkultur

. Abb. 2.9  Wachstum auf MacConkey-Agar: a: Laktose-negativ, b: Laktose-positiv. (© Silke Werner, Marburg)

2

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A. Brandis-Heep

MacConkey-Agara

2

Pepton aus Gelatine

17 g

Proteosepepton

3 g

Laktose

10 g

NaCl

5 g

Gallensalzmischung

1,5 g

Neutralrot

0,03 g

Kristallviolett

0,001 g

Agar

13,5 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH auf 7,1 ∓ 0,2 einstellen aAuch

als Fertigmedium zu beziehen

Herstellung des Mediums 5 Die aufgelisteten Bestandteile des Mediums in die Schottflasche einwiegen, mit Aqua dest. auf das gewünschte Volumen auffüllen und autoklavieren. 5 Nach Abkühlen des Agars auf 65 ℃, die Schottflasche gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede im Medium auszugleichen. 5 Die Petrischalen mit ca. 25 ml unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. 5 Nach dem Trocknen können die Platten mit der Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) oder dem Drigalski-Spatel im Flächenausstrich (7 Abschn. 1.6.3) beimpft und anschließend bei entsprechender Temperatur bebrütet werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung Laktose-negative (. Abb. 2.9a) Bakterien bilden farblose, transparente Kolonien. Stark Laktose-positive (. Abb. 2.9b) Bakterien (starke Ansäuerung) bilden pink gefärbte

Kolonien mit pinkem Hof.

Schwach Laktose-positive Bakterien (schwache Ansäuerung) bilden pinke bis rote Kolo­

nien ohne Hof. Dieses Medium ist gut geeignet, um die Fähigkeit zur Fermentation anderer Zucker als Laktose zu überprüfen.

2.2.3  Nachweis des oxidativen/fermentativen Abbaus von

Zuckern (OF-Test)

Dieser Test differenziert Bakterien nach ihrer Fähigkeit, verschiedene Zucker unter aero­ ben (oxischen) oder anaeroben (fermentativen) Bedingungen unter Säure-/Gasbildung abzubauen.

77 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

i Benötigtes Material

5 Nährmedium nach Hugh und Leifson 5 Sterilfilter 5 Schottflasche mit Deckel 5 Kulturröhrchen mit Kappen im Ständer 5 Pipetten steril 5 Impföse 5 Bunsenbrenner 5 Durham Röhrchen 5 Roller 5 Pyrogallol-Stopfen (7 Abschn. 1.3.2.10) Nährmedium nach Hugh und Leifson Pepton (Trypton)

2,00 g

NaCl

5,00 g

K2HPO4

0,30 g

Bromthymolblau

0,08 g

Aqua dest. ad

900 mlb

C-Quelle 10 % (w/v)a

100 ml

pH auf 6,8 ± 0,2 einstellen a C-Quelle:

verschiedene Zucker wie Glukose, Laktose, Saccharose, Galaktose etc. 10 % (w/v) in Aqua dest. lösen und sterilfiltrieren

bVolumen

beachten, da die C-Quelle erst nach dem Autoklavieren zugesetzt wird

Herstellung des Mediums 5 Die aufgelisteten Bestandteile des Mediums in die Schottflasche einwiegen, unter Rühren lösen, pH-Wert einstellen und mit Aqua dest. auf das gewünschte Volumen auffüllen. 5 Jeweils 3–5 ml fertiges Medium in die Kulturröhrchen pipettieren und autoklavieren. Um Gasbildung nachweisen zu können, werden die Kulturröhrchen vor dem Autoklavieren mit Durham-Röhrchen bestückt (7 Abschn. 1.2.1). 5 Zugabe der sterilfiltrierten C-Quelle nach dem Autoklavieren: Endkonzentration 1 % (w/v). 5 Je zwei der OF-Kulturröhrchen mit dem Zucker, dessen Verstoffwechselung untersucht werden soll, mit je 100 µl einer Flüssigkultur oder Einzelkolonien beimpfen. 5 Inkubation aerob: auf dem Roller, Inkubation anaerob: stehend, anaerobisiert mit Pyrogallol-Stopfen (Abschn. 1.3.3). 5 Bebrütungstemperatur und -dauer sind abhängig vom zu untersuchenden Organismus, in der Regel 37 ℃ für 48 h.

z Versuchsergebnis/Auswertung Nachweis der Säurebildung mit dem pH-Indikator Bromthymolblau (Farbumschlag von

grün nach gelb bei Ansäuerung) (. Tab. 2.1). Nachweis der Gasbildung mit dem Durham-Röhrchen (. Tab. 2.1).

2

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. Tab. 2.1  OF-Test: C-Quelle Glukose, Laktose und Saccharose

2

Glukose aerob anaerob

Laktose aerob anaerob

Saccharose aerob anaerob

Gruppe

Pseudomonas aeruginosa

S neg.

S neg.

neg. neg.

Achromobacter ntitratum

S neg.

S

neg. neg.

Oxidierer, aber NichtFermentierer

Agrobacterium tumefaciens

S neg.

S neg.

S neg.

Shigella dysenteriae

SS

neg. neg.

neg. neg.

Shigella sonnei

SS

SS

neg. neg.

Vibrio cholerae

SS

neg. neg.

SS

Salmonella enteridis

SG SG

neg. neg.

neg. neg.

Escherichia coli

SG SG

SG SG

neg. neg.

Aeromonas liquefaciens

SG SG

neg. neg.

SG SG

Enterobacter aerogenes

SG SG

SG SG

SG SG

Oxidierer und Fermentierer mit Säurebildung Oxidierer und Fermentierer mit Säure- und Gasbildung

S = Säurebildung; SG = Säure- und Gasbildung; neg. = keine Säurebildung

2.2.4  Methylrot-Test: Säure- und Gasbildung

Mit diesem Test lassen sich insbesondere Enterobacteriaceae unterscheiden, die bei der anaeroben Verstoffwechselung von Glukose mehr (Gemischte Säuregärung) oder weni­ ger Säure (2,3 Butandiol-Gärung) produzieren (. Abb. 2.10). i Benötigtes Material

5 Kulturröhrchen mit anaerob auf Zucker haltigem Medium gewachsener Kultur (s. o.) 5 Pipette 5 Methylrot 20 mg in 30 ml 96 % Ethanol

Vorgehensweise 5 Zu 3 ml der anaeroben Kultur 5 Tropfen Methylrot geben und vorsichtig durchmischen.

z Versuchsergebnis/Auswertung Ein Farbumschlag nach rot zeigt einen pH-Wert unter 4,4 und damit eine hohe Säure­

produktion an. Bleibt die Farbe unverändert gelblich, entspricht dies einem pH-Wert um 6 und somit einer geringen Säurebildung.

79 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

. Abb. 2.10  Methylrot-Probe. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

2.2.5  Citrat-Agar – Citratlyase

Mithilfe der Anzucht auf Citrat-Agar können Mikroorganismen auf ihre Fähigkeiten untersucht werden, Citrat aufzunehmen bzw. Citrat zu verstoffwechseln. pH-Indikatoren im Medium geben Auskunft über die Stoffwechselleistungen. 2.2.5.1  Citrat-Agar nach Simmons

Dieser Test dient der Identifizierung von Organismen, die Citrat als alleinige Kohlen­ stoff- und Energiequelle unter Alkalisierung des Mediums (Bildung von CO2, Bicarbonat und Ammonium-hydroxid) nutzen können (. Abb. 2.11). i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 Citrat-Agar nach Simmons 5 Schottflasche mit Deckel 5 Petrischalen steril 5 Bunsenbrenner 5 Pipetten steril 5 Drigalskispatel (Flüssigkultur) 5 Impföse (Agarkultur)

2

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2

. Abb. 2.11  Wachstum auf Simmons Citrat-Agar, a: Citrat-negative Kultur, b: Citrat-positive Kultur. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

Simmons Citrat-Agara MgSO4 × 7H2O

0,2 g

NH4H2PO4

1,0 g

K2HPO4

1,0 g

Natriumcitrat

2,0 g

NaCl

5,0 g

Bromthymolblau

0,08 g

Agar

15 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH auf 6,9 einstellen aAuch

als Fertigmedium zu beziehen

Herstellung des Mediums 5 Die aufgelisteten Bestandteile des Mediums in die Schottflasche einwiegen, mit Aqua dest. auf das gewünschte Volumen auffüllen und autoklavieren. 5 Nach Abkühlen des Agars auf 65 ℃, die Schottflasche gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede im Medium auszugleichen. 5 Die Petrischalen mit ca. 25 ml unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. 5 Nach dem Trocknen können die Platten mit der Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) oder dem Drigalski-Spatel im Flächenausstrich (7 Abschn. 1.6.3) beimpft und anschließend bei 37 ℃ bebrütet werden.

81 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

z Versuchsergebnis/Auswertung Citrat-negative Bakterien zeigen kein Wachstum und kein Alkalisieren des Mediums

(. Abb. 2.11a).

Citrat-positive Bakterien zeigen Wachstum und Alkalisieren das Medium (. Abb. 2.11b).

Sichtbare Zeichen von Wachstum und der Farbwechsel des ­pH-Indikators blau von dunkelgrün im Neutralen zu blau im Alkalischen sind der Nachweis dafür, dass der Organismus Citrat verstoffwechseln kann.

Achtung! Eine Entscheidung darüber, ob die Bakterien wirklich Citrat-negativ sind oder

ob andere Gründe das Wachstum behindert haben, ist nicht möglich.

2.2.5.2  Citrat-Agar nach Christensen

Im Citrat-Agar nach Christensen, in dem Citrat nicht die einzige C-Quelle ist, sodass neben Citrat-Verwertern auch Nicht-Verwerter wachsen können, alkalisieren aber nur die Verwerter das Medium. Dies zeigt sich durch eine Farbänderung des pH-Indikators Phenolrot von Gelb (pH 6,7) nach Rotviolett (pH > 7,3). i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 Schottflasche mit Deckel 5 Petrischalen steril 5 Bunsenbrenner 5 Pipetten steril 5 Drigalskispatel – Flüssigkultur 5 Impföse – Agarkultur Citrat-Agar nach Christensena Hefeextrakt

0,5 g

L-Cystein-Hydrochlorid

0,1 g

Natriumcitrat

3 g

Dextrose

3 g

KH2PO4

1 g

Natriumchlorid

5 g

Phenolrot

0,012 g

Agar

15 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH auf 6,9 einstellen aAuch

als Fertigmedium zu beziehen

Herstellung des Mediums 5 Die aufgelisteten Bestandteile des Mediums in die Schottflasche einwiegen, mit Aqua dest. auf das gewünschte Volumen auffüllen und autoklavieren.

2

82

2

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5 Nach Abkühlen des Agars auf 65 ℃, die Schottflasche gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede im Medium auszugleichen. 5 Die Petrischalen mit ca. 25 ml unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. 5 Nach dem Trocknen können die Platten mit der Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) oder dem Drigalskispatel im Flächenausstrich (7 Abschn. 1.6.3) beimpft und anschließend bei 37 ℃ bebrütet werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung Citrat-positive Bakterien zeigen Wachstum und Farbwechsel des pH-Indikators Phenol­

rot von gelb nach rotviolett (Alkalisierung).

Citrat-negative Bakterien zeigen Wachstum, aber keinen Farbumschlag (Wachstum auf

Hefeextrakt und Dextrose).

2.2.6  SIM-Agar, MIO-Agar, MIL-Agar

Diese Agar-Arten selektionieren auf die Aktivität verschiedener Aminosäure-Deamina­ sen und -Decarboxylasen, neben dem Nachweis Beweglichkeit. 2.2.6.1  SIM-Agar: Sulfid – Indol – Motilität (Beweglichkeit)

SIM-Agar ist ein halbfestes Nährmedium zur Differenzierung insbesondere von Bakte­ rien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Mit dem SIM-Agar können drei Merkmale gleichzeitig untersucht werden: Nachweis von Sulfid:  Wenn ein Organismus in der Lage ist, Natriumthiosulfat

(Na2S2O3) zu Schwefelwasserstoff (H2S) zu reduzieren, dann reagiert gebildetes H2S mit dem im Medium enthaltenen Ammonium-Eisen-III-sulfat (NH4Fe(SO4)2) zu Eisensulfid (FeS), das als schwarzer Niederschlag ausfällt.

Nachweis von Indol:  Der Test weist die Aktivität des Enzyms Tryptophanase nach, das den Abbau von Tryptophan zu Indol, Pyruvat und Ammoniak katalysiert. Indol kann mit Kovacs-Reagenz, einer Lösung aus 4-(N,N-Dimethylamino)-benzaldehyd, Isoamylalkohol und Salzsäure unter Bildung eines roten Farbstoffs nachgewiesen wer­ den (7 Abschn. 2.3.3). Nachweis der Beweglichkeit:  Nachweis von bakteriellem Wachstum außerhalb des

Stichkanals (der Inokulationsstelle).

i Benötigtes Material

5 Agarreinkultur 5 Schottflasche mit Deckel 5 SIM-Agar 5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 Bunsenbrenner 5 Impfnadel 5 Pasteurpipetten 5 Kovacs-Reagenz (7 Abschn. 2.3.3) zum Nachweis von Indol (Tryptophanase)

83 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

SIM-Agara Trypton

20 g

Pepton

6,1 g

NH4Fe(SO4)2

0,2 g

Na2S2O3

0,2 g

Agar

3,5 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 7,3 ± 0,2 aAuch

als Fertigmedium erhältlich

Herstellung des Mediums 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, in zunächst 200 ml Aqua dest. lösen, in der Mikrowelle aufkochen, sodass der Agar sich auflöst. Achtung! Siedeverzug. 5 Nach dem Abkühlen auf das gewünschte Endvolumen auffüllen. 5 Die Kulturröhrchen mit je 5 ml des Agarmediums befüllen, mit Kappen verschließen und autoklavieren. 5 Zum Beimpfen eine Einzelkolonie mit der Impfnadel picken und den Agar bis 1 cm vor Ende des Kulturröhrchens gerade durchstechen. Die Nadel auf gleichem Weg herausziehen. Die Inkubation erfolgt bei 37 ℃ für 18–24 h. 5 Indol-Nachweis 7 Abschn. 2.3.3

z Versuchsergebnis/Auswertung Sulfid-positive Bakterien wachsen und färben den Agar schwarz. Sulfid-negative Bakterien wachsen; der Agar behält seine ursprüngliche Farbe. Bewegliche Bakterien wachsen diffus auch außerhalb des Stichkanals. Unbewegliche Bakterien wachsen nur entlang des Stichkanals. . Tab. 2.2  Wachstum auf SIM-Agar von Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae Mikroorganismus

DSMZa

H2S-Bildung

Indolbildung

Beweglichkeit

Citrobacter freundii

30039

pos.

neg.

pos.

neg.

neg.

pos.

Enterobacter aerogenes Escherichia coli

1103

neg.

pos.

pos.

Klebsiella pneumoniae

30104

neg.

neg.

neg.

Proteus hauseri früher Type Strain v. P. vulgaris

30118

pos.

pos.

pos.

Salmonella enterica Synonym S. typhimurium

19587

pos.

neg.

pos.

Serratia marcescens

30121

neg.

neg.

pos.

aDSMZ-Deutsche

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig

2

84

2

A. Brandis-Heep

Zum Nachweis der Indolbildung wird die Kultur mit 0,5 ml Kovacs-Reagenz über­ schichtet (7 Abschn. 2.3.3) Indol-positive Kulturen färben sich kirschrot nach Überschichten. Indol-negative Kulturen bleiben nach Überschichten farblos oder verfärben sich gelb­ lich. Achtung! Den Indoltest immer erst nach Auswertung der übrigen Parameter durch­

führen (. Tab. 2.2)!

2.2.6.2  MIO-Agar: Motilität – Indol – Ornithin

MIO-Agar ist ein halbfestes Nährmedium, mit dem drei Merkmale gleichzeitig unter­ sucht werden können: Nachweis der Beweglichkeit (Motilität):  Nachweis von bakteriellem Wachstum außer­ halb des Stichkanals (der Inokulationsstelle). Nachweis von Indol:  Nachweis der Aktivität der Tryptophanase beim Abbau von Tryptophan zu Indol (7 Abschn. 2.3.3) Nachweis des Abbaus von Ornithin durch die Ornithindecarboxylase (ODC):  Die

Decarboxylierung der Aminosäure Ornithin zu Putrecin durch die Ornithin­ decarboxylase führt zu einer Alkalisierung des Mediums (pH > 7) und einen Farb­ umschlag des pH-Indikators Bromkresolpurpur von Gelb nach Purpurviolett.

i Benötigtes Material

5 Agarreinkultur 5 Schottflasche mit Deckel 5 Test-Medium 5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 Bunsenbrenner 5 Impfnadel MIO-Agara Trypton

10 g

Pepton

10 g

Hefeextrakt

3 g

L-Ornithin HCl

5 g

Dextrose

1 g

Bromkresolpurpur

0,02 g

Agar

3,5 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 6,5 ± 0,2 aAuch

als Fertigmedium erhältlich

85 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

Vorgehensweise 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, in Aqua dest. lösen und in der Mikrowelle aufkochen, sodass der Agar sich auflöst. Achtung! Siedeverzug. 5 Anschließend auf das gewünschte Endvolumen auffüllen und je 5 ml auf die Kulturröhrchen verteilen, mit Kappen verschließen und autoklavieren. 5 Zum Beimpfen eine Einzelkolonie mit der Impfnadel picken und den Agar bis 1 cm vor Ende des Kulturröhrchens gerade durchstechen. Die Nadel auf gleichem Weg herausziehen. Die Inkubation erfolgt bei 37 ℃ für 18–24 h. 5 Indol-Nachweis 7 Abschn. 2.3.3

z Versuchsergebnis/Auswertung Bewegliche Bakterien zeigen diffuses (. Tab. 2.2), gleichmäßiges Wachstum außerhalb

des Stichkanals.

Unbewegliche Bakterien zeigen Wachstum nur entlang des Stichkanals. Zum Nachweis der Indolbildung die Kultur mit 0,5 ml Kovacs-Reagenz überschichten

(7 Abschn. 2.3.3).

Indol-positive Kulturen zeigen nach Überschichten eine kirschrote Färbung. Indol-negative Kulturen zeigen keine Reaktion nach Überschichten, die Lösung bleibt

farblos oder verfärbt sich gelblich.

Ornithindecarboxylase-positive Kulturen färben den Agar violett. Ornithindecarboxylase-negative Kulturen: Der der Agar behält seine ursprüngliche

gelbe Farbe.

Achtung! Den Indoltest immer erst nach Auswertung der übrigen Parameter durch­

führen!

2.2.6.3  MIL-Agar: Mobilität – Indol – Lysin

MIO-Agar ist ein halbfestes Nährmedium, mit dem drei Merkmale gleichzeitig unter­ sucht werden können: Nachweis der Beweglichkeit (Motilität):  Nachweis von bakteriellem Wachstum außer­ halb des Stichkanals (der Inokulationsstelle). Nachweis von Indol:  Abbau von Tryptophan zu Indol und Nachweis mit KovacsReagenz (7 Abschn. 2.3.3). Nachweis der Lysin-Deaminase und Lysin-Decarboxylase:  Da das Medium neben der

Aminosäure Lysin Dextrose enthält, wird zunächst der Zucker verstoffwechselt, was zu einem Absenken des pH-Werts im Medium führt, angezeigt durch den Farbwechsel des pH-Indikators Bromkresolpurpur von Purpur nach Gelb. Die Erniedrigung des pH-Werts führt zur Aktivierung der Lysin-abbauenden Enzyme. Lysin-Deaminase wird durch eine rote bzw. rot-braune Farbreaktion im oberen Zentimeter des Mediums nachgewiesen. Lysin-Decarboxylase wird durch erneute Purpurfärbung des Mediums angezeigt (pH-Wert steigt wieder).

2

86

A. Brandis-Heep

i Benötigtes Material

2

5 Agarreinkultur 5 Schottflasche mit Deckel 5 MIL-Agar 5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 Bunsenbrenner 5 Impfnadel MIL-Agara Trypton

10 g

Pepton

10 g

Hefeextrakt

3 g

L-Lysin HCL

10 g

Dextrose

1 g

Ammonium-EisenIII-Citrat

0,5 g

Bromkresolpurpur

0,02 g

Agar

3,5 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 7,0 ± 0,2 aAuch

als Fertigmedium erhältlich

Vorgehensweise 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, in Aqua dest. lösen und in der Mikrowelle aufkochen, sodass der Agar sich auflöst. Achtung! Siedeverzug. 5 Anschließend auf das gewünschte Endvolumen auffüllen und je 5 ml auf die Kulturröhrchen verteilen, mit Kappen verschließen und autoklavieren. 5 Zum Beimpfen eine Einzelkolonie mit der Impfnadel picken und den Agar bis 1 cm vor Ende des Kulturröhrchens gerade durchstechen. Die Nadel auf gleichem Weg herausziehen. Inkubation bei 37 ℃ für 18–24 h.

z Versuchsergebnis/Auswertung Bewegliche Bakterien zeigen diffuses (. Tab. 2.2), gleichmäßiges Wachstum außerhalb

des Stichkanals.

Unbewegliche Bakterien zeigen Wachstum nur entlang des Stichkanals. Indol-positive Kulturen zeigen nach Überschichten mit Kovacs-Reagenz eine kirschrote

Färbung.

Indol-negative Kulturen zeigen keine Reaktion nach Überschichten, die Lösung bleibt

farblos oder verfärbt sich gelblich.

Achtung! Den Indoltest immer erst nach Auswertung der übrigen Parameter durch­

führen!

Lysin-Deaminase-positive Kulturen zeigen eine rote bis rot-braune Farbe im oberen Teil

der Agarsäule.

Lysin-Decarboxylase-positive Kulturen zeigen eine Purpurfärbung des Mediums. Lysin-negative Kulturen bleiben gelb mit purpur- oder rotgefärbter Oberfläche.

87 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

Achtung! Kulturen, die als Ganzes purpurn gefärbt bleiben (mit einer Rotfärbung an

der Oberfläche), müssen weitere 24 h inkubiert werden, um die Fähigkeit, Lysin zu ­verstoffwechseln, eindeutig nachweisen zu können.

2.3  Physiologische Leistungen: Nachweis von Enzymaktivitäten 2.3.1  Nachweis der Katalase-Aktivität

Das bei aerobem Wachstum im Stoffwechsel gebildete Wasserstoffperoxid ist für die Zelle toxisch und wird von den meisten aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien mit dem Enzym Katalase in folgender Reaktion 2H2O2 → 2H2O + O2 zerstört (. Abb. 2.12). i Benötigtes Material

5 Agarplatte mit Einzelkolonien 5 Objektträger 5 Impföse 5 Pasteurpipette 5 Wasserstoffperoxid 3 % (v/v)

Katalase-Test 5 Eine Kolonie auf einen Objektträger übertragen. 5 Einige Tropfen H2O2 auftropfen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Bläschenbildung (O2) weist die Anwesenheit der Katalase nach. 2.3.2  Nachweis der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität

Die Cytochrom-c-Oxidase oxidiert Cytochrom c aus der Elektronentransportkette der Atmung unter Reduktion von Sauerstoff. Mit dem Oxidase-Test kann die Reaktion des Enzyms Cytochrom-c-Oxidase in einer Farbreaktion mit dem Redoxindikator Tetrame­ thyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid nachgewiesen werden (. Abb. 2.13).

. Abb. 2.12  Nachweis der Katalase-Aktivität. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

2

88

A. Brandis-Heep

2

. Abb. 2.13  Oxidase-Test, A: Keine Farbentwicklung bei Oxidase-negativer Reaktion, B: Blaufärbung der Kolonie bei Oxidase-positiver Reaktion. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

i Benötigtes Material

5 NB-Agarplatte mit Einzelkolonien 5 NB-Agarplatte mit Einzelkolonien der Positivkontrolle z. B. Pseudomonas stuzeri 5 NB-Agarplatte mit Einzelkolonien der Negativkontrolle z. B. Escherichia coli 5 2 Flaschen à100 ml mit Schraubverschluss 5 Impföse 5 Filterpapier TMPD-Testreagenz Cytochrom-c-Oxidasea N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid (TMPD)

1 % in Puffer (w/v)

Kaliumphosphat-Puffer, pH 7

100 mM

Jeweils vor Versuchsbeginn frisch ansetzen! aTeststäbchen

und Fertigreagenz verfügbar

Oxidase-Test 5 Filterpapier mit einigen Tropfen TMPD-Reagenz tränken und trocknen lassen. 5 Eine Einzelkolonie einer frischen Kultur (18–24 h) darauf verreiben. 5 Oder: Eine Einzelkolonie einer frischen Kultur (18–24 h) auf dem Filterpapier verreiben. 5 1–2 Tropfen TMPD-Reagenz auf den Kulturmaterial geben und die Farbentwicklung abwarten. Jeweils eine Oxidase-positive und Oxidase-negative Kultur zur Kontrolle anlegen.

89 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

z Versuchsergebnis/Auswertung

Bakterien sind Cytochrom-c-Oxidase-positiv, wenn eine Blaufärbung innerhalb von 5–10 s eintritt. Bakterien sind Cytochrom-c-Oxidase-negativ, wenn keine Verfärbung oder eine Ver­ färbung erst nach mehr als 2 min eintritt. Achtung! Unbedingt die Reaktionszeit beachten und immer eine Positiv- und möglichst eine Negativkontrolle mitführen. 2.3.3  Nachweis von Indol: Tryptophanase-Aktivität

Der Test dient dem Nachweis des Enzyms Tryptophanase, das Bakterien in die Lage ver­ setzt, die Aminosäure Tryptophan zu Indol, Pyruvat und Ammoniak zu verstoffwech­ seln. i Benötigtes Material

5 Kulturröhrchen mit Tryptophan-haltigem Nährmedium (z. B. SIM-Agar 7 Abschn. 2.2.6) mit gut gewachsener Kultur 5 Flasche 150 ml mit Schraubverschluss 5 Pasteurpipette Kovacs-Reagenza 4-N,N-Dimethylaminobenzaldehyd

5 g

Amylalkohol

75 ml

HCl (konz.)

25 ml

Dimethylaminobenzaldehyd in Amylalkohol lösen und konz. HCl hinzufügen Vorsicht! Schutzbrille. Im Abzug arbeiten aAuch

als Fertigreagenz zu beziehen

Indol-Test 5 Das bewachsene Kulturröhrchen vorsichtig mit 0,5 ml Kovacs-Reagenz überschichten. 5 Das Kulturröhrchen zum vorsichtigen Mischen kurz anstoßen.

z Versuchsergebnis/Auswertung Bakterien sind Trytophanase-positiv, wenn sich die organische (obere) Phase nach

wenigen Minuten rot färbt, da das entstandene Indol mit 4-N,N-Dimethylamino­ benzaldehyd zum roten Alkohol-löslichen Farbstoff Rosindol reagiert. Bakterien sind Trytophanase-negativ, wenn die organische Phase farblos bleibt. Es wurde kein Indol gebildet.

! Vorsicht! Lösung nicht in den Ausguss schütten, sondern als Sondermüll entsorgen.

Amylalkohol ist gesundheitsschädlich.

2

90

A. Brandis-Heep

2.3.4  Nachweis von Acetoin (Voges-Proskauer-Test)

2

Mit dem Voges-Proskauer-Test können Bakterienkulturen auf die Bildung von Acetoin (3-Hydroxy-2-butanon), einem Zwischenprodukt der Butandiolgärung, geprüft werden. Acetoin bildet im Alkalischen mit Kreatin (Bestandteil im Pepton des NB-Mediums) unter Verstärkung von 1-Naphthol einen roten Farbstoff. z Benötigtes Material

5 Anaerobes Kulturröhrchen mit NB-Flüssigmedium (7 Abschn. 1.2.1) und gut gewachsener Kultur 5 Positivkontrolle z. B. Enterobacter aerogenes 5 Negativkontrolle z. B. Escherichia coli 5 2 Schottflaschen à 100 ml mit Schraubverschluss 5 Vortex 5 Pipette Reagenzien zum Acetoin-Nachweisa Lösung A:

1-Naphthol 5 % (w/v) in 98 % Ethanol

Lösung B:

KOH 40 % (w/v) in Aqua dest.

aAuch

als Fertigreagenz zu beziehen

Nachweis von Acetoin 5 5 ml der anaeroben NB-Kultur mit 3 ml Lösung A mischen 5 mit 1 ml Lösung B versetzen (Reihenfolge beachten!) 5 30 s vortexen. Jeweils eine positive Kultur und eine unbeimpfte Kultur zur Kontrolle anlegen.

z Versuchsergebnis/Auswertung Der Acetoin-Nachweis ist positiv, wenn nach 5–15 min eine rosa bis rote Färbung auf­

tritt. Der Acetoin-Nachweis ist negativ, wenn das Kulturmedium kupferfarben (Färbung durch die Reagenzien) bleibt.

! Vorsicht! Lösung nicht in den Ausguss schütten, sondern als Sondermüll entsorgen.

Gefahrstoff!

2.3.5  Nachweis der Urease-Aktivität

Der Urease-Test identifiziert Mikroorganismen, die in der Lage sind, Harnstoff unter Bildung von Ammoniak und Kohlendioxid zu spalten (. Abb. 2.14).

91 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

. Abb. 2.14  Urease-Tests: A Urease-negative Kultur, B Urease-positive Kultur. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

i Benötigtes Material

5 Schottflasche 100 ml, 2000 ml (für 1000 ml Gesamtvolumen) 5 Sterilfilter (Porendurchmesser 0,45 µm) 5 100 ml Spritze 5 Reagenzglasständer 5 Ablage ca. 1–2 cm hoch 5 Kulturröhrchen mit Kappen, steril 5 5 ml Pipetten, steril 5 Bunsenbrenner 5 Impföse Christensens Harnstoff-Agara Pepton

1 g

Dextrose

1 g

NaCl

5 g

KH2PO4

2 g

Harnstoff

20 g

Phenolrot

0,012 g

Agar

15–20 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 7,0 ± 0,2 aAuch

als Fertigmedium erhältlich

2

92

A. Brandis-Heep

Herstellung des Harnstoffagars

2

5 Die aufgelisteten Komponenten (ohne Agar) in 100 ml Aqua dest. lösen. 5 Agar in 900 ml Aqua dest. in der 2000 ml-Schottflasche in der Mikrowelle aufkochen, autoklavieren und auf 60 ℃ abkühlen. Vorsicht! Siedeverzug. 5 100 ml Medium sterilfiltrieren, gut mit dem autoklavierten Agar vermischen und in 5 ml-Portionen in Kulturröhrchen steril abfüllen. Der fertige Agar hat eine gelb-orange Farbe. 5 Um eine große Inokulationsfläche und einen ca. 1 cm hohen Pfropf am Ende zu erhalten, müssen die Röhrchen zum Verfestigen auf einer geeigneten Ablage schräg abgelegt werden. 5 Danach können sie senkrecht im Kühlschrank bei 4–8 ℃ aufbewahrt werden. Der Agar darf nicht wieder erhitzt werden, da sich der Harnstoff sonst zersetzt. 5 Zum Beimpfen wird ein „dickes“ Inokulum einer Reinkultur mit der Impföse über die gesamte Schräge ausgestrichen, allerdings ohne das stumpfe Ende zu beimpfen, da dieses zur späteren Farbkontrolle dient. 5 Inkubation bei 37 ℃ für 18–24 h. 5 Kontrolle der Kulturen nach 6 h, 24 h bis zu 6 Tagen. Immer ein unbeimpftes Kontrollröhrchen mit inkubieren. Zur Kontrolle unspezifischer Proteinhydrolyse kann ein Kontrollmedium ohne Harnstoffzusatz verwendet werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung Urease-positive Kulturen zeigen eine pinke Färbung des Agars zunächst in der

Schräge, dann auch im Stumpf.

Urease-negative Kulturen zeigen keine Verfärbung des Mediums; es bleibt

­gelb-orange.

2.3.6  Nachweis der Lysin-Deaminase und -Decarboxylase-

Aktivität

Als fermentierbarer Zucker wird Dextrose verwendet. Der pH-Indikator Bromkresol­ purpur schlägt bei einem pH-Wert kleiner oder gleich 5,2 nach gelb um und ist bei einem pH größer oder gleich 6,8 violett. Lysin-Deaminase-positive Kulturen führen in Anwesenheit von Sauerstoff zur Bildung einer roten Schrägseite über einem sauren Röhrchenboden. Lysin-Decarboxylase-produzierende Kulturen verursachen eine alkali­ sche oder neutrale Reaktion am Röhrchenboden. i Benötigtes Material

5 Agarreinkultur 5 Schottflasche mit Deckel 5 Test-Medium

93 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 Ablage 5 Bunsenbrenner 5 Impfnadel, Impföse 5 Positivkontrolle: Escherichia coli 5 Negativkontrolle: Proteus vulgaris Lysin-Eisen-Agara Trypton

5 g

Hefeextrakt

3 g

L-Lysin HCL

10 g

Dextrose

1 g

Ammonium-Eisen III-Citrat

0,5 g

Bromkresolpurpur

0,02 g

Agar

13,5 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 7,0 ± 0,2 aAuch

als Fertigmedium erhältlich

Vorgehensweise 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, in Aqua dest. lösen und in der Mikrowelle aufkochen, sodass der Agar sich auflöst. Vorsicht! Siedeverzug. 5 Je 5 ml auf die Kulturröhrchen verteilen, mit Kappen verschließen und autoklavieren. 5 Um eine große Inokulationsfläche mit Pfropf am Ende zu erhalten, müssen die Röhrchen zum Verfestigen auf einer geeigneten Ablage schräg abgelegt werden. 5 Anschließend können sie senkrecht im Kühlschrank bei 4–8 ℃ aufbewahrt werden. 5 Zum Beimpfen eine Impfnadel zweimal bis zum Röhrchenboden einstechen und anschließend mit dem Inokulum einer Reinkultur über die Schräge ausstreichen. 5 Inkubation bei 37 ℃ für 18–48 h.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Fermentation von Dextrose führt zunächst zu einem Absenken des pH-Werts im Medium mit dem Umschlag des pH-Indikators Bromkresolpurpur nach Gelb im unte­ ren Bereich des Röhrchens. Lysin-Deaminase-positive Kulturen zeigen eine rote bis rot-braune Farbe des Agars auf der Schrägseite. Lysin-Decarboxylase-positive Kulturen färben den Röhrchenboden violett (z. B. Escherichia coli). Lysin-negative Kulturen zeigen einen gelben Röhrchenboden bei violetter Färbung der Schrägseite (z. B. Proteus vulgaris).

2

94

A. Brandis-Heep

2.3.7  Nachweis der Phenylalanin-Deaminase-Aktivität

2

Phenylalanin-Deaminase spaltet Phenylalanin in Phenylpyruvat und Ammoniak. Phenylpyruvat lässt sich durch Zugabe von FeCl3 durch Grünfärbung des Mediums nachweisen (. Abb. 2.15). i Benötigtes Material

5 Schottflasche mit Schraubverschluss 5 Reagenzglasständer 5 Ablage ca. 1–2 cm hoch 5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 5 ml-Pipetten 5 Pasteurpipetten 5 Bunsenbrenner 5 Impföse 5 Testreagenz 5 Positivkontrolle: Proteus vulgaris 5 Negativkontrolle: Escherichia coli Phenylalanin-Agara Hefeextrakt

3 g

K2HPO4

1 g

NaCl

5 g

KH2PO4

2 g

DL-Phenylalanin

2 g

Agar

12 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 7,3 ± 0,2 aAuch

als Fertigmedium erhältlich

. Abb. 2.15  Wachstum auf Phenylalanin-Schrägarar. (© Silke Werner, Marburg)

95 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

Testreagenz: FeCl3-Lösung: 10 % (w/v) in Aqua dest.

Herstellung des Phenylalanin-Agars 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, in geeigneter Menge Aqua dest. lösen und in der Mikrowelle aufkochen, sodass der Agar sich auflöst. Vorsicht! Siedeverzug. 5 Das Medium in 5 ml-Portionen auf die Kulturröhrchen verteilen, mit Kappen verschließen und autoklavieren. 5 Um eine große Inokulationsfläche und einen ca. 1 cm hohen Pfropf am Ende zu erhalten, müssen die Röhrchen zum Verfestigen auf einer geeigneten Ablage schräg abgelegt werden. 5 Zum Beimpfen wird das Inokulum einer Reinkultur mit der Impföse über die gesamte Schräge ausgestrichen und aerob bei 37 ℃ für 18–24 h inkubiert. Jeweils eine Phenylalanin-Deaminase positive Kultur und eine unbeimpfte Kultur zur Kontrolle anlegen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

3–5 Tropfen FeCl3-Lösung auf die gewachsene Kultur geben, dabei das Kulturröhrchen vorsichtig hin und her bewegen, um die aufgetragene Flüssigkeit gut über die Schräge zu verteilen. Achtung! Innerhalb von 1–5 min den Test ablesen, da die Farbe verblasst. Phenylalanin-Deaminase-positive Kulturen färben sich grün. Phenylalanin-Deaminase-negative Kulturen färben sich gelb. 2.3.8  Nachweis der Gelatinase-Aktivität

Der Gelatineverflüssigungstest weist die Fähigkeit von Bakterien nach, das Enzym Gela­ tinase zu bilden. Gelatinasen sind Proteasen, die extrazellulär das Protein Gelatine zu Polypeptiden und weiter zu Aminosäuren abbauen. Diese können die Bakterien dann weiter verstoffwechseln. Mit diesem Test lassen sich u. a. Spezies von Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Proteus, Pseudomonas u. a. differenzieren (. Abb. 2.16). i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 Schottflasche mit Schraubverschluss 5 Kulturröhrchen mit Kappen 5 Reagenzglasständer 5 Petrischalen 5 5 ml-Pipetten

2

96

A. Brandis-Heep

2

. Abb. 2.16  Nachweis der Gelatinase-Aktivität A: Gelatine-Hydrolyse negativ, z. B. E. coli, B: G ­ elatineHydrolyse positiv, z. B. B. subtilis. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

5 Bunsenbrenner 5 Impföse/Impfnadel 5 Drigalski-Spatel 5 Positivkontrolle: Pseudominas aeruginosa 5 Negativkontrolle: Escherichia coli 5 Testreagenz: Gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung in Aqua dest. Gelatine Flüssigmedium Pepton

5 g

Fleischextrakt

3 g

Gelatine

120 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 6,8 ± 0,2 bei 25 ℃

Herstellung des Gelatine-Flüssigmediums 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen und vorsichtig im Wasserbad (50–55 ℃) erhitzen, sodass sich die Gelatine vollständig löst. 5 Anschließend in 3 ml-Portionen auf die Kulturröhrchen verteilen, mit Kappen verschließen, autoklavieren und in senkrechter Position abkühlen lassen. Die Röhrchen können bei 4–8 ℃ aufbewahrt werden. 5 Zum Beimpfen wird das Gelatine-Medium mit der Impfnadel durchstochen und dabei Material einer hochgewachsenen Kultur übertragen. 5 Das beimpfte Röhrchen und eine Kontrolle werden bei 25 ℃ oder bei der optimalen Wachstumstemperatur des zu untersuchenden Bakteriums bis zu einer Woche bebrütet.

97 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

5 Da die Gelatine sich bei 28 ℃ zu verflüssigen beginnt, müssen die Kulturröhrchen vor der Auswertung im Eisbad oder Kühlschrank abgekühlt werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung Bei Gelatinase-positiven Kulturen bleibt das Medium flüssig (nach Abkühlung im

Kühlschrank). Bei Gelatinase-negativen Kulturen bleibt das Medium fest bzw. verfestigt sich im Kühlschrank wieder (Vergleich mit der Kontrolle). Gelatine-Agar Pepton

4 g

Hefeextrakt

1 g

Gelatine – 275 Bloom

12 g

Agar

15 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 6,8 ± 0,2

Herstellung des Gelatine-Agars 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, die gewünschte Menge Aqua dest. zugeben und autoklavieren. 5 Nach dem Abkühlen des Mediums auf 65 ℃, die Schottflasche gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede auszugleichen. 5 Die Petrischalen mit ca. 25 ml des Agar-Gelatine Mediums unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. 5 Nach dem Trocknen können die Platten mit dem Drigalski-Spatel im Flächenausstrich (7 Abschn. 1.6.3) beimpft und anschließend bei 37 ℃ für mindestens 24 h bebrütet werden. Übertragen eines Inokulums mit der Impfnadel in Form einzelner Stiche in den Agar ist ebenfalls möglich.

z Versuchsergebnis/Auswertung Gelatinase-positive Kolonien haben einen transparenten Hof. Gelatinase-negative

Kolonien weisen keinen Hof auf. Die Ausbildung des transparenten Hofs kann durch Überschichten der Petrischale mit gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung (Ausfällen nicht hydrolysierter Gelatine) ver­ stärkt werden. Auswertung nach 5–10 min.

2.3.9  Nachweis der Amylase-Aktivität

Mit Wachstum auf Stärke-Agar lässt sich die Fähigkeit von Bakterien nachweisen, die Exoenzyme α-Amylase und Oligo-1,6-Glucosidase zu bilden. Diese Enzyme

2

98

A. Brandis-Heep

hydrolysieren die glukosidischen Bindungen der Stärke und setzten Glukose frei, die dann verstoffwechselt werden kann (. Abb. 2.17).

2

i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 Schottflasche mit Schraubdeckel 5 Stärke-Agar

. Abb. 2.17  Nachweis der Stärkehydrolyse. © Astrid Brandis-Heep, Marburg. Wachstum auf Stärkeagar von Bacillus subtilis (a) und Escherichia coli (b) vor Zugabe der Jod/Kaliumjodid-Lösung. B. subtilis auf Stärkeagar nach Zugabe der Jod/Kaliumjodid-Lösung (c): Stärkehydrolyse positiv. E. coli auf Stärkeagar nach Zugabe der Jod/Kaliumjodid-Lösung (d): Stärkehydrolyse negativ. (© Astrid Brandis-Heep, ­Marburg)

99 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

5 Petrischalen 5 Bunsenbrenner 5 Impföse 5 Testreagenz: Lugolsche Lösung Stärke-Agar Fleischextrakt

3 g

Lösliche Stärke

10 g

Agar

12 g

Aqua dest. ad

1000 ml

pH 7,5 ± 0,2

Lugolsche Lösung 1 g Iod und 2 g Kaliumiodid

In 5 ml Aqua dest. vollständig lösen

mit Aqua dest. auf 300 ml auffüllen

Herstellung des Stärke-Agars 5 Die aufgelisteten Komponenten in die Schottflasche einwiegen, in Aqua dest. lösen und nach pH-Kontrolle auf das gewünschte Volumen auffüllen. Zum Lösen der Stärke das Medium unter Umrühren einmal aufkochen und anschließend autoklavieren. Vorsicht! Siedeverzug. 5 Nach dem Abkühlen des Agars auf 65 ℃, die Schottflasche gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede im Medium auszugleichen. Die Petrischalen mit ca. 25 ml unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. 5 Nach dem Trocknen die Platten mit einem einzelnen Strich oder einem Spot mit der Impföse inokulieren und anschließend bei 37 ℃ 24–48 h bebrüten. Als Inokulum eine frische Reinkultur verwenden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Sobald Wachstum gut sichtbar ist (a und b), wird der Agar mit Lugolscher Lösung über­ schichtet und die Reaktion sofort ausgewertet. Stärkehydrolyse-positive Kulturen färben den Agar schwarz-blau (Jod-Stärke-Reaktion) mit hellem transparentem Hof um die Wachstumszone (Stärke hydrolysiert) (c). Stärkehydrolyse-negative Kulturen weisen keine Hofbildung in der Wachstumszone auf (d). 2.3.10  Nachweis der Cellulase-Aktivität

Cellulolytische Bakterien besitzen verschiedene Cellulasen, die die β-1,4-glycosidischen Bindungen zwischen den einzelnen Glukose-Einheiten der Cellulose hydrolytisch

2

100

2

A. Brandis-Heep

spalten (Endo-, Exoglucanasen, Cellobiasen). Je nach Gattung findet die Hydrolyse unter aeroben Bedingungen (u. a. Pseudomonas, Erwinia, Streptomyces) oder anaeroben Bedingungen statt (u. a. Clostrirdium, Eubacterium, Ruminococcus). i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 Schottflasche 2000 ml mit Schraubdeckel 5 2 Schottflaschen à 1000 ml mit Schraubdeckeln 5 NB-Agar 5 Cellulose (Avicel, wasserunlöslich) 5 Carboxymethylcellulose (CMC, wasserlöslich) 5 Petrischalen 5 Bunsenbrenner 5 Impföse 5 Testreagenzien Cellulase-Aktivität: Nachweis der Cellulase-Aktivität mit Kongorot Bestandteil

Menge

Hefeextrakt

5 g

Trypton

10 g

NaCl

5 g

Agar

15 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Vor dem Autoklavieren werden dem Agar zugesetzt: Kultur A: Cellulose 5,0 g/500 ml Kultur B: CMC 2,5 g/500 ml Vor dem Autoklavieren den pH überprüfen

Testreagenzien Kongorot-Lösung

0,5 % (w/v) in Aqua dest.

NaCl

1 M in Aqua dest.

Herstellung und Inokulieren des Mediums 5 Die aufgelisteten Komponenten in eine Schottflasche einwiegen, mit Aqua dest. auf das gewünschte Volumen auffüllen und lösen. 5 Unter Umrühren einmal aufkochen. Vorsicht! Siedeverzug. 5 Das Medium auf zwei Schottflaschen (Kultur A und B) aufteilen. 5 5 g Cellulose-Kultur A und 2,5 g Carboxymethylcellulose Kultur B zusetzen und anschließend autoklavieren. 5 Nach dem Abkühlen des Agars auf 65 ℃, die Schottflaschen gut umschwenken, um Konzentrationsunterschiede im Medium auszugleichen. Die Petrischalen mit ca. 25 ml unter keimreduzierten Bedingungen befüllen. Gut beschriften!

101 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

5 Nach dem Trocknen die Platten mit einem einzelnen Strich oder einem Spot mit der Impföse inokulieren und anschließend bei 37 ℃ 24–48 h bebrüten. Als Inokulum eine frische Reinkultur verwenden.

z Versuchsergebnis/Auswertung z Kultur A Cellulase-positive Kolonien sind durch die Bildung eines klaren Hofs in dem ansonsten

trüben Agar zu erkennen.

Cellulase-negative Kolonien haben keinen Hof in der Wachstumszone. z Kultur B

Sobald Kolonien gut sichtbar sind, diese von der Agaroberfläche vorsichtig ablösen und auf eine frische Agarplatte oder Flüssigmedium übertragen. Die Agaroberfläche der bewachsenen Platte mit Kongorot-Lösung für 30 min über­ schichten. Die Flüssigkeit abgießen und mit der Kochsalzlösung 15 min entfärben. Dabei die Lösung mehrmals wechseln. Cellulase-positive Kolonien sind durch die Bildung eines ungefärbten Hofs in dem rot gefärbten Agar zu erkennen, da Kongorot lösliche längerkettige Glukane anfärbt. Cellulase-negative Kolonien weisen keinen Hof auf. 2.3.11  Nachweis der Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität

Der Nachweis der Reduktion von Nitrat (NOˉ3) und Nitrit (NOˉ2) hilft bei der Unter­ scheidung von Vertretern der Enterobacteriaceae von Gram-negativen Bacilli, aber auch von Neisseria-Spezies von solchen der Gattung Moraxella und Kingella oder von Corynebacterium von anderen asporogenen Gram-positiven Bacilli (. Abb. 2.18). Die Nitratreduktion bei Bakterien wird von der Nitratreduktase unter Bildung von NOˉ2 katalysiert und zeigt, dass der Organismus NOˉ3 als Elektronenakzeptor verwenden kann. NOˉ2 kann zu einer Vielzahl von Produkten weiterreduziert werden, etwa NO, N2O, N2 und NH3, abhängig vom Enzymsystem des Organismus und der Atmosphäre, in der er wächst. i Benötigtes Material

5 Reinkultur 5 Schottflaschen mit Deckel 5 Test-Medien 5 Kulturröhrchen mit Schraubdeckel 5 Durham-Röhrchen 5 5 ml-Pipetten 5 Bunsenbrenner 5 Impföse oder 1 ml Pipette steril 5 Reagenzgläser klein 5 Pipetten1 ml

2

102

A. Brandis-Heep

a

Nitrat (NO3-)

2

Nitratreduktase

b

Nitrit (NO2-) Sulfanilsäure Reagenz A

Nitrit (NO2-) Nitratreduktase

Farblose Nitrit-Sulfanilsäure + α-Naphthylamin Reagenz B

Stickstoff (N2)

Prontosil Roter Niederschlag

. Abb. 2.18  Schema der Nitrat- und Nitritreduktion. a: Nitrat- und Nitritreduktase; b: Reaktion von Nitrit mit Sulfanilsäure und α-Naphthylamin. (© Astrid Brandis-Heep, Marburg)

5 Holzstäbchen 5 Testreagenz: Griess-Illosvays-Reagenz 5 Nitrat/Nitrit-freier Zinkstaub 5 2 dunkle Flaschen ­­Nitratreduktions-Medium Fleischextrakt

3,0 g

Pepton aus Gelatine

5,0 g

Kaliumnitrat (KNO3)

1,0 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Nitritreduktions-Medium Fleischextrakt

3,0 g

Pepton aus Gelatine

5,0 g

Kaliumnitrit (KNO2)

1,0 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Achtung! Den Medien keine fermentierbaren Kohlenhydrate zusetzen. Griess-Illosvays-Reagenz Lösung A:Sulfanilsäure

0,8 g in 100 ml 5 N Essigsäure (farblos)

103 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

Lösung B: N,N-Dimethyl-α-Naphthylamin

0,6 ml in 100 ml 5 N Essigsäure (leicht gelbe Farbe)

Vorsicht! Schutzbrille und Abzug 5 N Essigsäure: Zu 713 ml Aqua dest. 287 ml Eisessig (17,4 N) geben Beide Lösungen vor Licht geschützt aufbewahren

Herstellung und Inokulieren der Medien 5 Die Komponenten beider Medien in Schottflaschen einwiegen und vorsichtig bis zum vollständigen Lösen erhitzen. 5 In 5 ml-Portionen auf Kulturröhrchen verteilen, mit einem Durham-Röhrchen versehen, mit Schraubdeckel verschließen (halbe Umdrehung) und autoklavieren. 5 Nach dem Abkühlen muss das Durham-Röhrchen vollständig mit Flüssigkeit gefüllt sein. 5 Animpfen mit einer Einzelkolonie oder aus einer Flüssigkultur, Bebrütung erfolgt bei der entsprechenden Wachstumstemperatur abhängig vom Organismus bis zu 5 Tagen.

z Versuchsergebnis/Auswertung Wachstum auf Nitratreduktions-Medium

Gasbildung im Durham-Röhrchen kontrollieren. Je 2 Tropfen von Reagenz A und B in einem kleinen Reagenzglas mischen. Mit 1 ml der hochgewachsenen Kultur versetzen und gut schütteln. Tritt innerhalb von 2 min eine Rotfärbung auf, ist der Nachweis auf Nitratreduktase positiv (NOˉ3 wurde zu NOˉ2 umgesetzt) Tritt innerhalb von 2 min keine Farbreaktion auf, gibt es mehrere Möglichkeiten: a) Das Bakterium ist nicht in der Lage NOˉ3 zu reduzieren, Nachweis auf Nitratreduktase negativ (NOˉ3 nicht zu NOˉ2 umgesetzt). b) Das Bakterium ist in der Lage, das entstandene NOˉ2 weiter zu reduzieren. c) Das Bakterium reduziert NOˉ3 direkt zu N2 Achtung! Daher sind Kontrollen unbedingt notwendig. Kontrolle

Wenig Zinkstaub mit einem Holzstäbchen in das Teströhrchen übertragen. Zn reduziert noch eventuell vorhandenes NO3ˉ zu NO2ˉ. Eine Rotfärbung bestätigt das Ergebnis: Nitratreduktase negativ, da noch eventuell vorhandenes Nitrat chemisch durch Zn reduziert wird und dann die Rotfärbung bewirkt. Tritt nach Zn-Behandlung keine Farbreaktion auf, ist der Nitratreduktase-Nachweis positiv, da das Bakterium das entstandene Nitrit reduziert hat. N2 sollte als Gasblase im Durham-Röhrchen sichtbar sein. Nitratreduktase-positiv (NOˉ3 über NOˉ2 weiter zu NO, N2O oder N2 umgesetzt). Bei Abwesenheit von Gas sollte eines der Zwischenprodukte entstanden sein.

2

104

A. Brandis-Heep

Wachstum auf Nitritreduktions-Medium

2

N2-Gasbildung im Durham-Röhrchen und auf der Oberfläche der Kultur kontrollieren, da N2-Gasbildung die NOˉ2-Reduktion häufig, aber nicht zwangsläufig begleitet (NO, N2O). Je 2 Tropfen von Reagenz A und B in einem kleinen Reagenzglas mischen. Mit 1 ml der hochgewachsenen Kultur versetzen und gut schütteln. Tritt innerhalb von 2 min eine Rotfärbung auf, ist der Nachweis auf Nitritreduktase negativ (NOˉ2 wurde nicht umgesetzt). Tritt innerhalb von 2 min keine Farbreaktion auf, ist der Nachweis auf Nitritreduktase positiv (NOˉ2 wurde umgesetzt). Pseudomonas aeruginosa reduziert NOˉ3 zu N2. Escherichia coli reduziert NO3ˉ zu NO2ˉ. Acinetobacter baumanii reduziert weder NO3ˉ noch NO2ˉ (verhält sich wie eine unbeimpfte Kontrolle). Alcaligenes faecalis reduziert NO2ˉ, aber nicht NO3ˉ. 2.3.12  Nachweis von Hämolysin-Aktivität

Blutagar ist ein Medium für Mikroorganismen, die Bestandteile des Blutes von Säuge­ tieren für das Wachstum benötigen. Der Nährboden besteht neben Pepton, Herz-Infus, NaCl und Agar bis zu 10 % aus defibriniertem Blut (Schaf-, Pferde oder Kaninchen­ blut). Es ermöglicht neben der Anzucht anspruchsvoller Keime den Nachweis hämo­ lysierender Eigenschaften. i Benötigtes Material

5 Blutagarplatten: Bezug bei einschlägigen Firmen, eigene Herstellung ist sehr aufwendig und daher nicht zu empfehlen. 5 Kulturen zum Nachweis der Hämolyse als Flüssig- oder Agarkultur 5 Sicherheitswerkbank 5 Pipetten steril 5 Bunsenbrenner 5 Drigalski-Spatel 5 Impföse

Inokulieren der Blutagarplatten Beimpfen der Blutagarplatten mit der Drei-Strich-Technik (7 Abschn. 1.6.1) oder dem Drigalski-Spatel im Flächenausstrich (7 Abschn. 1.6.3) und anschließende Bebrütung bei entsprechender Temperatur.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Unterschieden werden drei Arten der Hämolyse: α-Hämolyse: Kolonien sind von einer grünlichen Zone umgeben. Hier findet keine Hämolyse statt, sondern eine Oxidation des Hämoglobins zu Sulfhämoglobin oder Umwandlung zu Biliverdin, die die grüne Farbe verursachen. Es werden keine Hämolysine produziert.

105 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien

β Hämolyse (echte Hämolyse): Es sind klare Höfe um die Kolonien sichtbar. Das Hämo­ globin wird vollständig durch Hämolysine (Steptolysin O oder S) abgebaut (z. B. β-hämolysierende Streptococcen). γ-Hämolyse: Keine hämolytische Reaktion 2.3.13  Multitestsystem 2.3.13.1  Identifizierung von Gram-negativen (Entero-)Bakterien

mit dem Testsystem Enteropluri-Test als Beispiel für ein kommerzielles Multitestsystem

Mit diesem Testsystem können Enterobakterien und einige verwandte Arten rela­ tiv sicher biochemisch differenziert werden. In den zwölf Kammern des Teströhr­ chens (siehe unten) befinden sich Spezialmedien, die den gleichzeitigen Nachweis von maximal 15 biochemischen Eigenschaften (Stoffwechselreaktionen) ermöglichen (. Abb. 2.19). i Benötigtes Material

5 Gram-negative Bakterienkulturen aus der Familie der Enterobacteriaceae 5 Enteropluri-ID-Testkit (Lieferant: Liofilchem S.R.L.) baugleich mit Multitestsystem EnterotubeTM II BBLR 5 Kovacs Indol-Reagenz (7 Abschn. 2.3.3) 5 Spritze mit Injektionskanüle

. Abb. 2.19  Enteropluri-ID-Testkit. a: Schematische Darstellung des Testsystems. b: Teströhrchen nach Inkubation. Das getestete Bakterium ist positiv für Wachstum auf Glukose unter Gasbildung, Lysin, Adonitol, Laktose, Sorbitol und Harnstoff. Die ID Nr. 24362 = Klebsiella pneumoniae. (© Astrid BrandisHeep, Marburg)

2

106

A. Brandis-Heep

Inokulieren des Testsystems

2

5 Das zu identifizierende Isolat muss als Reinkultur auf einem nichtselektiven Vollmedium angezogen werden. Für den Test sollte die Kultur 24 h, höchstens 48 h alt sein. 5 Eine Einzelkolonie des zu untersuchenden Keims wird mit einer Impfnadel, die dem Testsystem beiliegt, aufgenommen und langsam in der vorgeschriebenen Weise durch alle zwölf Reaktionskammern gezogen. 5 Bebrütung erfolgt bei 37 ℃ für 24 h.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das Ablesen der Reaktionen erfolgt üblicherweise nach 24 h; in manchen Fällen liefert ein Ablesen nach 48 h ein genaueres Bild. Im Vergleich mit einem unbeimpften Enteropluri-ID-Testkit alle Reaktionen (außer Indol!) auf einem Auswerteformular registrieren. Unveränderter Kammerinhalt wird als negativ beurteilt. Erst nach Auswertung aller Kammern den Indoltest durchführen. Die Test-Tube so halten, dass die anaerobe H2S/Indol-Kammer nach unten zeigt. Sehr vorsichtig 3–4 Tropfen Kovacs Indol-Reagenz mit einer Injektionspritze unter die Plastikfolie in die Kammer geben. Eine positive Reaktion zeigt sich durch Rotfärbung des zugegebenen Reagenz innerhalb einer Minute. Ergebnis im Auswerteformular vermerken. Die Ergebnisse auf dem Auswerteformular führen zu einer fünfstelligen Kennzahl. Anhand dieser Kennzahl kann mittels Codebuch-Datei/Codebuch die wahrschein­ lichste Identifizierung (Gattung und Spezies) ermittelt werden.

107

Pilze Erika Kothe 3.1 Isolierung und Kultivierung von Hefen und filamentösen Pilzen – 109 3.1.1 Hefen – 109 3.1.2 Kultivierung filamentöser Pilze in Flüssigmedien – 112 3.1.3 Kultivierung filamentöser Pilze auf festen Medien – 114 3.1.4 Isolierung von Pilzen aus flüssigen Umweltproben – 117 3.1.5 Isolierung von Pilzen aus Bodenproben – 119 3.1.6 Isolierung von Pilzen aus Fruchtkörpern – 121 3.1.7 Isolierung von Pilzen aus Pflanzenmaterial – 123 3.1.8 Stammhaltung von Pilzen – 126

3.2 Identifizierung von Pilzen durch mikroskopische und DNA-abhängige Methoden – 128 3.2.1 Mikromorphologische Bestimmung – 128 3.2.2 Färbungen zur Beobachtung von Zellkompartimenten in Pilzen – 130 3.2.3 Bestimmung von Pilzen durch parasitische bzw. symbiontische Stadien – 133 3.2.4 Bestimmung von Pilzen durch Sequenzierung der ITS-Region – 136

3.3 Untersuchungen zu Lebenszyklen von Pilzen – 138 3.3.1 Lebenszyklus und Zellzyklus bei Saccharomyces cerevisiae – 138 3.3.2 Hefen und der Übergang zu Hyphenformen – 141 3.3.3 Entwicklung asexueller Sporen – 144 3.3.4 Nachweis der Einflüsse von Licht, Tagesrhythmen und Kreuzung bei der Bildung asexueller Sporen – 146 3.3.5 Kreuzung bei Basidiomyceten am Beispiel von Schizophyllum commune – 149

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 A. Störiko (Hrsg.), Methoden der Mikrobiologie, https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7_3

3

3.3.6 Pilzkulturen und Fruchtkörperbildung bei Basidiomyceten – 151 3.3.7 Kreuzung filamentöser Ascomyceten am Beispiel von Aspergillus nidulans – 153 3.3.8 Tetradenanalyse bei Sordaria fimicola – 155

3.4 Lokalisierungen von Proteinen und Zellkomponenten in situ – 157 3.4.1 Färbungen für den Nachweis von Enzymen und Naturstoffen – 157 3.4.2 Immunologischer Nachweis von Proteinen – 161 3.4.3 Fluoreszenz-Videomikroskopie bei Pilzen – 163 3.4.4 Separieren unterschiedlicher Zellkompartimente – 166

3.5 Transformationssysteme in Pilzen – 168 3.5.1 Vektoren und Stabilität der Transformation – 168 3.5.2 LiCl-basierte Transformation – 170 3.5.3 Elektroporation von Conidiosporen – 171 3.5.4 PEG-vermittelte Transformation bei Schizophyllum commune – 173 3.5.5  Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation beim Ektomykorrhizapilz Tricholoma vaccinum – 175

109 Pilze

3.1  Isolierung und Kultivierung von Hefen und filamentösen

Pilzen

3.1.1  Hefen

Geeignete Modellorganismen sind die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (. Abb. 3.1), die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe oder die humanpathogene Candida albicans (Medium für C. albicans: 7 Abschn. 3.3.2). Für diese Pilze ist hier die optimierte

. Abb. 3.1  Sprossende Hefezellen. Neben dem mikroskopischen Bild (oben links) können fluoreszenzmarkierte Membranen durch grüne Fluoreszenz- und Kernfärbung durch eine blaue Färbung mittels Immunfluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. (Größenbalken 1 µm). (© Ines Schlunk, Jena)

3

110

E. Kothe

Medienzusammensetzung angegeben. Für sie stehen Methoden zur Molekularbiologie sowie Genomsequenzen zur Verfügung, die das Arbeiten erleichtern. Neben diesen typi­ schen Ascomyceten-Hefen können aus Umweltproben aber auch andere Hefeformen isoliert werden, etwa pflanzenpathogene Rost- oder Brandpilze oder Rhodotorula und Cryptococcus, die zu den Basidiomyceten gehören.

3 Vollmedium für Hefen (YPD, yeast peptone dextrose) Bestandteil

Menge

Hefeextrakt

10 g

Pepton

20 g

Glukose

20 g

Agar

20 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium ohne Agar Minimal-Medium für S. cerevisiae (SD, synthetic defined) Bestandteil

Menge

Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren

6,7 g

Glukose oder Galaktose oder Raffinose

20 g

Supplementlösung

100 ml

Agar

20 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium ohne Agar Supplement-Stammlösung 10-fach: Adenin, Arginin, Histidin × 1 H2O, Methionin, Tryptophan, Uracil

Je 200 mg

Isoleucin, Lysin, Tyrosin

Je 300 mg

Phenylalanin

500 mg

Leucin

1 g

Valin

1,5 g

Threonin

2 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Vollmedium für S. pombe (YED) Bestandteil

Menge

Hefeextrakt

5 g

Dextroxe

40 g

Bei Bedarf: Agar-Agar (nur für Festmedien)

17 g

111 Pilze

Bestandteil

Menge

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium ohne Agar Minimalmedium für S. pombe (EMM) Bestandteil

Menge

Dextroxe

20 g

Phtaleinsäure

3 g

Na2HPO4

2 g

NH4Cl

5 g

MgSO4 × 7 H2O

1,05 g

CaCl2 × 2 H2O

14,7 g

KCl

1 g

Na2SO4

40 g

Agar

17 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium ohne Agar

Steriles Arbeiten ist zwingend erforderlich, denn in Umweltproben können auch human­ pathogene Pilze sowie Mykotoxinbildner vorhanden sein. Vorgehensweise 5 Verdünnungsreihe der Umweltprobe jeweils 1:10 mit 0,9 % NaCl herstellen 5 in Flüssigmedium oder als Koloniewachstum auf einer geeigneten Agarplatte in Vollmedium oder Minimalmedium bei Raumtemperatur kultivieren 5 Zellen durch Zentrifugation aus Flüssigmedium abtrennen

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das Wachstum von Hefen in Flüssigmedien kann durch Messen der optischen Dichte verfolgt werden und die typische Sprossung ist mikroskopisch zu sehen (7 Kap. 5 und . Abb. 3.1). Ausnahmen: z. B. Schizosaccharomyces pombe teilt sich durch einfache Zweiteilung. Hyphenformen sind mikroskopisch sichtbar (7 Kap. 5). Gärprodukte können in geeigneter Weise nachgewiesen und eine Gärbilanz aufgestellt werden (s. . Abb. 3.10 und 3.22). Die Biomasse von Pilzen kann auch durch Messung des Membransteroids Ergosterol bestimmt werden, das allerdings zur Anpassung der Membranstabilität variieren kann. Viele Hefen sind durch die dicke Zellwand gut genug gegen Platzen geschützt, um Verdünnungen mit (autoklaviertem) Leitungswasser ansetzen zu können; die Verwendung von 0,9 % NaCl ist aber schonender für die Zellen.

3

112

3

E. Kothe

Manche Hefen wachsen innerhalb weniger Stunden, andere benötigen mehrere Tage. Die meisten Hefen wachsen sehr gut bei Raumtemperatur, vermehren sich aber auch bei 4 °C noch weiter. Als Medien eignen sich insbesondere das Vollmedium YPD oder das definierte Minimalmedium SD, die für Saccharomyces cerevisiae entwickelt wurden. Für pathogene Hefen, aber auch für Umweltisolate, können weitere Medien sinnvoll sein (weitere Medien s. 7  www.dsmz.de/de/kataloge/katalog-mikroorganismen/kultivierungshinweise/liste-empfohlener-medien.html). Zur Isolierung von Hefestämmen aus Umweltproben hat sich das Medium CYM bewährt, das hier für Basidiomyceten (7 Abschn. 3.1.3) vorgestellt wird. Hefestadien filamentöser Pilze können auf denselben Medien kultiviert werden. Die Kultivierung im Fermenter ist für Hefen/Hefestadien analog zu einzelligen Bakterien möglich. Dabei ist für die ethanolische Fermentation auf Luftabschluss zu achten; ein strikt anaerobes Medium ist nicht erforderlich. Da Pilze zunächst den Sauerstoff durch Atmung verbrauchen, stellen sich Bedingungen zur Gärung bei einfachem Luftabschluss ein. Ein Gärröhrchen erlaubt das einfache Abführen des gebildeten Kohlendioxids, ohne Luft- und damit Sauerstoffzutritt zuzulassen. 3.1.2  Kultivierung filamentöser Pilze in Flüssigmedien

Für das Wachstum filamentöser Pilze (. Abb. 3.2) sind eine Vielzahl von Medien verfügbar (7 www.dsmz.de/de/kataloge/katalog-mikroorganismen/kultivierungshinweise/liste-empfohlener-medien.html). Hier werden beispielhaft je ein geeignetes Voll- und Minimalmedium für Ascomyceten vorgestellt. Um das Wachstum von Bakterien zu unterdrücken, werden beim Plattieren von Umweltproben häufig Antibiotika verwendet. Diese sollten keine hemmende Wirkung auf Mitochondrien haben, daher hat sich Ampicillin bewährt. Medien für Basidiomyceten 7 Abschn. 3.1.3.

. Abb. 3.2  Die Kultivierung von Tricholoma subannulatum auf festem Agarmedium zeigt die typische kreisförmige Ausbreitung von Pilzen. (© Katrin Krause, Jena)

113 Pilze

i Benötigtes Material Vollmedium für Ascomyceten (Malzextrakt-Medium) Bestandteil

Menge

Malzextrakt

30 g

Pepton

3 g

Agar

18 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Vor dem Autoklavieren pH 5,6 mit NaOH einstellen Für Flüssigmedium ohne Agar Minimal-Medium für Aspergillus nidulans Bestandteil

Menge

NaNO3

6,0 g

KCl

0,52 g

MgSO4 × 7H2O

0,52 g

KH2PO4

1,52 g

Glukose

10 g

Spurenelementlösung

1 ml

Agar

18 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Vor dem Autoklavieren pH 6,5 mit 1 N NaOH einstellen Für Flüssigmedium ohne Agar Spurenelementlösung: ZnSO4 × 7 H2O

22 g

H3BO3

11 g

MnCl2 × 4 H2O; FeSO4 × 7 H2O

Je 5 g

CoCl2 × 6 H2O; CuS04 × 5 H2O

Je 1,6 g

(NH4)Mo7O24 × 4 H2O

1,1 g

EDTA

50 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Spurenelementlösung mit KOH auf pH 6,5–6,8 einstellen

Die Pilze wachsen unterschiedlich schnell. Ein Myzel mit einem Zentimeter Durch­ messer kann innerhalb einer Nacht wachsen oder – je nach Art und Medium – über drei Wochen benötigen. Steriles Arbeiten ist zwingend erforderlich; besonders bei Arbeiten mit Sporen­ bildnern empfiehlt sich das Arbeiten in einer sterilen Werkbank.

3

114

E. Kothe

Vorgehensweise

3

5 filamentöse Pilze in Flüssigkulturen aus Sporensuspensionen, Mazerat des Mycels oder mit kleinen Blöckchen (1–5 mm Kantenlänge) animpfen 5 in Flüssigmedium oder auf einer geeigneten Agarplatte bei Raumtemperatur kultivieren 5 Mycel durch Filtern über Gaze, Mull oder Nylonnetz (0,5 mm) abtrennen (7 Abschn. 3.3.6), restliche Flüssigkeit ausdrücken, und Mycel mit Leitungswasser waschen 5 mit 50 ml Flüssigmedium in einem autoklavierten Metall- oder Glasbecher eines handelsüblichen Mixers für ca. 30 s auf höchster Stufe Mazerat herstellen. Die Regenerationsfähigkeit sollte durch Plattieren getestet werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Mycel wird durch radiäres Wachstum als Mycelbällchen sichtbar; Trübung ist wahr­ scheinlich durch bakterielle Kontamination verursacht. Verunreinigte Kulturen müssen autoklaviert und entsorgt werden. Wachstumsmessung durch Bestimmen der Trockenmasse (bei 105 °C trocknen, bis sich das Gewicht nicht mehr verändert). Parallelkulturen (üblicherweise drei) sind für eine statistische Auswertung essenziell. Weitere Medien sind in den anderen Unterkapiteln zu finden. Besonders bei langsam wachsenden Mycelien ist Schütteln zur Sauerstoffversorgung nicht nötig. Langsames Schütteln (oder tägliches Schütteln von Hand) kann aber das Anheften an der Glaswandung oder das Aufschwimmen eines hydrophoben Mycels ­verhindern. Viele Pilze sind empfindlich gegenüber Scherkräften, sodass zu schnelles Schütteln vermieden werden sollte. Die Kultivierung in Fermentern ist durch die Bildung von Mycel sowie von extra­ zellulären Polysacchariden oft schwierig. Dennoch kann eine kontinuierliche Kultur gelingen, wenn langsames Rühren, gute Sauerstoffversorgung sowie ein großer Durch­ messer für den Auslauf vorhanden sind. 3.1.3  Kultivierung filamentöser Pilze auf festen Medien

Für das Wachstum filamentöser Pilze stehen eine Vielzahl von Medien zur Verfügung (z. B. 7 www.dsmz.de/de/kataloge/katalog-mikroorganismen/kultivierungshinweise/liste-empfohlener-medien.html). Hier wird beispielhaft je ein geeignetes Voll- und Minimalmedium für Basidiomyceten (optimiert für Schizophyllum commune, aber übertragbar auf viele Hyphenpilze) vorgestellt. Medien für Ascomyceten sind im vorhergehenden Abschnitt beschrieben 7 Abschn. 3.1.2.

115 Pilze

i Benötigtes Material Vollmedium für Basidiomyceten (CYM) Bestandteil

Menge

Trypticase Pepton

2 g

Hefeextrakt

2 g

Glukose

20 g

MgSO4 × 7 H2O

0,5 g

KH2PO4

0,5 g

K2HPO4

1 g

Agar

18 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium ohne Agar Minimal-Medium für S. commune (MM) Bestandteil

Menge

Aspartat

2 g

Glukose

20 g

MgSO4 × 7 H2O

0,5 g

KH2PO4

0,46 g

K2HPO4

1 g

Thiamin-Stammlösung

83 μl

Agar

18 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium ohne Agar Vor dem Autoklavieren mit NaOH pH 6,3 einstellen Thiamin-Stammlösung: Thiamin

1,2 mg

Aqua dest. ad

1 ml

Steriles Arbeiten ist zwingend erforderlich; besonders bei Arbeiten mit langsam wach­ senden Pilzen empfiehlt sich das Arbeiten in einer sterilen Werkbank. Vorgehensweise 5 Animpfen auf einer Petrischale mit Impfblöckchen von ca. 2 mm Kantenlänge aus Pilzmycel mit einer ausgeglühten und abgekühlten, sterilen Impflanzette (. Abb. 3.3). 5 Es ist sinnvoll, bei langsam wachsenden Basidiomyceten vier Impfblöckchen auf einer Petrischale zu platzieren; für schnell wachsende (Zygomyceten, Ascomyceten) reicht ein Inokulat pro Petrischale.

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E. Kothe

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. Abb. 3.3  Übertragung des Inokulums auf eine frische Petrischale mit Hilfe einer Impflanzette. (© Erika Kothe, Jena)

5 Kreisförmiges Wachstum auf Agarplatten erlaubt einen Vergleich der Wachstumsgeschwindigkeit als Koloniedurchmesser auf Festmedien für die Bestimmung von Wachstumsraten (z. B. bei abiotischem Stress). 5 Wachstumsmessung durch Zuwachs der Trockenmasse (105 °C bis zur Gewichtskonstanz). s. o.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Zu Bedingungen und Kultivierung bei der Erzeugung von Fruchtkörpern gibt es eine große Zahl von Spezialliteratur. Einige weitere Methoden werden in diesem Kapitel vorgestellt. Beimpfen mit Sporensuspensionen ist möglich, wenn solche asexuellen Sporen gebildet werden. Diese werden mit sterilem Wasser abgeschwemmt und ausplattiert; das Mycel entsteht dann aus sehr vielen einzelnen Individuen durch späteres Zusammenwachsen der Hyphen (Anastomosen) zu einer einzigen Kolonie. Hier ist zu beachten, dass Asco­ myceten eine vegetative Inkompatibilität besitzen, die Anastomosen zwischen ver­ schiedenen Individuen verhindert, zwischen genetisch identischen Inokulaten aber zulassen. Eine Kultivierung aus einer Reinkultur eines haploiden Stamms ist somit ­möglich. Kultivierung auf Cellophanfolie (erhältlich als Einmachhaut; autoklaviert) zwi­ schen Agarplatte und wachsendem Mycel erlaubt es, das Luftmycel auf neues Medium zu übertragen. Einige Basidiomyceten bilden jedoch Cellulasen, die die Folie angreifen, sodass diese Art der Kultivierung nicht möglich ist. Fruchtkörper können sich auf Oberflächen bilden. Wie in der Champignon­ kultivierung werden dazu Kompost, Stroh oder Holz in Kisten oder Bleche verwendet. Da das Mycel aus einem Mazerat innerhalb eines oder weniger Tage (bei 15 bis 20 °C)

117 Pilze

zusammenwächst, kann anschließend mit einer Pipette vorsichtig flüssiges Medium unter die Mycelmatte gegeben werden, um weiteres Wachstum nach dem Verbrauch der Substrate zu ermöglichen. Licht oder geringe CO2-Gehalte (indem die Kultu­ ren nicht luftdicht verpackt werden, sodass sich das Kohlendioxid nicht anreichern kann) induzieren die Fruchtkörperbildung. Hohe Temperaturen (direkte Sonnenein­ strahlung!) können das Wachstum und die Bildung von Fruchtkörpern unterdrücken. Daher ist ein Nordfenster geeignet. Biotechnische Kultivierung nicht nur zur Fruchtkörperinduktion, sondern bei­ spielsweise auch für die Produktion von Citrat durch Aspergillus niger ist als Mycel­ matte oder in Festbettreaktoren üblich, die häufig gute Erfolge bei der Kultivierung insbesondere von Basidiomyceten erlauben. 3.1.4  Isolierung von Pilzen aus flüssigen Umweltproben

Die verschiedenen Methoden zur Isolierung müssen für das vorhandene Material sowie die Erfordernisse jeweils angepasst werden. i Benötigtes Material

5 zu untersuchende Proben 5 geeignete Medien (7 Abschn. 3.1.1) 5 Petrischalen 5 Impflanzette 5 Skalpell 5 Bunsenbrenner 5 Mikroskop und Stereomikroskop Wer mit Conidien-bildenden Pilzen weiterarbeiten will, sollte alle Arbeiten in einer sterilen Werkbank durchführen, um eine Kontamination des Labors zu vermeiden. Für langsam wachsende Pilze ist mindestens eine Werkbank für Produktschutz angeraten, um keine Verunreinigungen einzuschleppen.

Unter den Isolaten können Humanpathogene sowie Mycotoxin-Bildner vorkommen. Vorgehensweise 5 Agarplatten (7 Abschn. 3.1.1) vor der Probenahme vorbereiten und vortrocknen. Um bakteriellen Verunreinigungen vorzubeugen, sollten die Agarplatten ein Antibiotikum enthalten: Ampicillin (Endkonzentration 100 mg/l), Kanamycin (50 mg/l), Chloramphenicol (50 mg/l) oder Cefotaxim (500 mg/L). 5 Zum Transport eignen sich sterile Falcon-Röhrchen; bei hohen Außentemperaturen ist eine gekühlte Styroporbox sinnvoll. Umweltproben sollten nie lange gelagert und nie eingefroren werden, wenn die Isolierung von Mikroorganismen geplant ist. 5 Für die Isolierung von Hefen wird analog zum Plattieren von Bakterien eine Verdünnungsreihe hergestellt und ausplattiert. 5 Für die Isolierung filamentöser Pilze aus Wasserproben diese zehn Sekunden in einem Vortexmischer durchmischen und anschließend direkt plattieren.

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E. Kothe

5 Bakterielle Verunreinigungen an Pilzhyphen stellen häufig eine Herausforderung zur Herstellung von Reinkulturen dar. Daher müssen besonders langsam wachsende Pilze häufig mehrfach auf Antibiotika enthaltende Minimalmedien überimpft werden. Alternativ die Hyphen im Ultraschallbad behandeln. 5 Conidiosporen mit sterilem Wasser oder steriler 0,9 %iger Kochsalzlösung von der Platte waschen. Auch aus einem verschimmelten Rest lassen sich so Sporen gewinnen. Diese eine Stunde bei 50−60 °C inkubieren, bevor die Suspension plattiert wird.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Reinheit der Kultur sollte regelmäßig mikroskopisch kontrolliert werden (7 Abschn. 3.2.1; . Abb. 3.4), da häufig Verunreinigungen auftreten, besonders bei sehr langsam wachsenden Pilzen. Kontaminierte Platten entsorgen – die Auf­ reinigung eines Stammes durch viele Transfers auf neue Medien ist sehr mühsam und selten erfolgreich. Zusätzlich empfiehlt sich eine Überprüfung durch Sequenzie­ rung der 18 S-rDNA bzw. ITS-Region (7 Abschn. 3.2.4). Weniger schnellwüchsige Pilze werden auf einem Medium mit relativ geringem Zucker­ gehalt (ca. 2 %) isoliert. Bei der Kontrolle der Isolationsplatten sollte bedacht werden, dass auch Actinomyce­ ten filamentös wachsen (allerdings mit einem Zelldurchmesser von ca. 0,5 µm im

. Abb. 3.4  Bakterielle Verunreinigungen von Pilzstämmen sind oft schwer zu sehen. Das Bakterium Serratia marcescens bildet ein dunkelrotes Pigment, das hier am Impfstrich rechts auf der Petrischale deutlich sichbar ist. Die Bakterien, die an Hyphen des links inokulierten Pilzes Schizophyllum commune entlang wandern, führen zu einer leichten Rotfärbung. Andere Bakterien können einen isolierten Pilzstamm ebenso verunreinigen. (© Imam Hardiman, Jena)

119 Pilze

Gegensatz zu den üblicherweise 3–5 µm breiten Pilzhyphen) und auch Myxomyceten (sie gehören systematisch in die Verwandtschaft von Amöben) und Oomyceten (diese sind mit den Braunalgen verwandt) filamentöse Wuchsformen aufweisen. Schleimpilze (Myxomyceten) werden besser auf Humus angereichert, weil sie schlecht durch Plattieren zu isolieren sind. Wasserschimmel wie Saprolegnia sind Oomyceten, die man manchmal als weißen Mycelüberzug auf toten Fischen im Aquarium beobachten kann. Oomyceten sind filamentöse Organismen, die mit Braunalgen verwandt sind und Zoosporen bilden. Deshalb ist eine Anreicherung mithilfe von Ködern eine geeignete Methode zur Iso­ lierung: Auf einer Wasserprobe aus einem Tümpel oder Teich wird eine tote Fliege ausgelegt und bis zum Auftreten des Wasserschimmels etwa eine Woche in einem Nordfenster inkubiert. Diese Vorkultur ist besonders gut geeignet, die Bildung der typischen Organe der sexuellen Fortpflanzung von Oomyceten (weibliche Oogonien und die befruchtenden Antheridien) mikroskopisch zu beobachten. Neben toten Fliegen sind auch Ameisen­ eier oder gekochte und zerquetschte Hanfsaat als Köder geeignet. Eine eingesetzte Wasserpflanze (Elodea) erhöht nicht nur die Wahrscheinlichkeit der Inokulation, son­ dern verhindert auch die Kahmhautbildung. 3.1.5  Isolierung von Pilzen aus Bodenproben

Zur Isolierung bieten sich Bodenproben an; Lauberde und Kompost liefern besonders viele Pilzisolate. Auch aus Dung können bestimmte Pilze isoliert werden. Das Isolieren von Stämmen aus sexuellen oder asexuellen Sporen ist zwar besonders geeignet, um Reinkulturen zu erhalten, aber leider in vielen Fällen nicht möglich: Entweder bilden die Pilze weder Conidiosporen noch sexuelle Sporen, oder die Keimung der Sporen bzw. ihre längerfristige Vermehrung erweist sich als zu schwierig – beispielsweise bei vielen Ektomykorrhizapilzen. Eine Isolierung aus der Rhizosphäre von Pflanzen kann ins­ besondere für Hefen, aber auch für filamentöse Pilze zu höheren Ausbeuten führen. i Benötigtes Material

5 Agarplatten (7 Abschn. 3.1) sollten vor der Probenahme vorbereitet und vorgetrocknet sein. 5 Um bakteriellen Verunreinigungen vorzubeugen, sollten die Agarplatten ein Antibiotikum enthalten: Ampicillin (Endkonzentration 100 mg/L), Kanamycin (50 mg/L), Chloramphenicol (50 mg/L), Cefotaxim (500 mg/L). 5 Zum Transport eignen sich sterile Ziploc-Gefrierbeutel; der Transport in einer gekühlten Styroporbox ist bei hohen Außentemperaturen zu empfehlen. 5 zu untersuchende Proben 5 geeignete Medien (7 Abschn. 3.1.1) 5 Petrischalen 5 Impflanzette 5 Skalpell 5 Bunsenbrenner

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5 Bodensiebe mit Maschenweite 2 mm und 0,2 mm 5 Mikroskop und Stereomikroskop zur mikroskopischen Analyse.

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Zur Isolierung wird frische Wildlosung, Schaf-, Ziegen-, Kaninchenkot, oder Kuh-, Pferdemist in einer feuchten, nicht luftdicht abgeschlossenen Kammer auf angefeuchtetem Zellstoff/Papier bei Zimmertemperatur oder 50 °C angezogen.

Arbeiten mit Conidien-bildenden Pilzen sollten in einer sterilen Werkbank durch­ geführt werden, um eine Kontamination des Labors zu vermeiden. Für langsam wach­ sende Pilze ist mindestens eine sterile Werkbank für Produktschutz angeraten, um keine Kontaminationen einzuschleppen. Unter den Isolaten können Humanpathogene sowie Mycotoxin-Bildner vorkommen. Umweltproben sollten nie lange gelagert und nie eingefroren werden, wenn die Iso­ lierung von Mikroorganismen geplant ist. Vorgehensweise 5 Für die Isolierung von Hefen analog zum Plattieren von Bakterien eine Verdünnungsreihe herstellen und ausplattieren. 5 Für die Isolierung filamentöser Pilze aus Wasserproben diese zehn Sekunden in einem Vortexmischer durchmischen und anschließend direkt plattieren. 5 Bakterielle Verunreinigungen an Pilzhyphen stellen häufig eine Herausforderung bei der Herstellung von Reinkulturen dar. Daher müssen besonders langsam wachsende Pilze häufig mehrfach auf Antibiotika enthaltende Minimalmedien überimpft werden. Alternativ werden die Hyphen im Ultraschallbad behandelt. 5 Die Bodenprobe kann zunächst durch ein Sieb mit 2 mm Maschenweite vom Skelettmaterial des Bodens getrennt und im kleineren Sieb (0,2 mm Maschenweite) unter Leitungswasser gründlich ausgewaschen werden. 5 Weniger schnellwüchsige Pilze werden auf einem Medium mit relativ geringem Zuckergehalt (ca. 2 %) isoliert. 5 Eine feuchte, nicht luftdicht abgeschlossene Kammer wird mit angefeuchtetem Zellstoff/Papier hergestellt.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Reinheit der Kultur sollte regelmäßig mikroskopisch kontrolliert werden (7 Abschn. 3.2.1), da häufig Verunreinigungen auftreten, besonders bei sehr langsam wachsenden Pilzen. Verunreinigte Kulturen sollten autoklaviert und entsorgt werden. Zusätzlich empfiehlt sich eine Überprüfung durch Sequenzierung der 18 S rDNA bzw. ITS-Region (7 Abschn. 3.2.4). Bei der Kontrolle der Isolationsplatten sollte bedacht werden, dass auch Actinomyceten filamentös wachsen (allerdings mit einem Zelldurchmesser von ca. 0,5 µm

im Gegensatz zu den üblicherweise 3–5 µm breiten Pilzhyphen) und dass auch

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. Abb. 3.5  Schematische Zeichnung des Fangapparats aus drei Zellen bei Nematoden-fangenden Pilzen (© Erika Kothe, Jena)

Myxomyceten (sie gehören systematisch in die Verwandtschaft von Amöben) und Oomyceten (diese sind mit den Braunalgen verwandt) filamentöse Wuchsformen auf­

weisen. Schleimpilze (Myxomyceten) werden besser auf Humus angereichert, weil sie schlecht durch Plattieren zu isolieren sind. Eine höhere Reinheit von Isolaten erreicht man durch das Waschen von Boden­ proben in handelsüblichen Bodensieben. Eine mikroskopische Kontrolle zeigt, ob die Behandlung schonend genug war, um die Kompartimente der Hyphen nicht in zu kleine Stücke zu zerreißen, die nicht weiterwachsen könnten. Aus Dung können koprophile (also Dung liebende) Pilze isoliert werden. Unter den besonders häufig auftretenden Pilzen sind Acrasiomyceten (Schleimpilze, die phylogenetisch zu den Amöben gehören), Mucorales (Zygomyceten), Nematoden­ fänger (nematophage Pilze; . Abb. 3.5), Ascomyceten (Schimmelpilze) und Basidio­ myceten (z. B. Coprinus). 3.1.6  Isolierung von Pilzen aus Fruchtkörpern

Sexuelle Sporen, die an den Basidien des Pilzfruchtkörpers (. Abb. 3.6) gebildet werden, lassen sich besonders gut isolieren und als Reinkulturen gewinnen. Allerdings keimen viele Sporen von Waldpilzen schlecht aus. Es ist aber auch möglich, den Pilz durch ase­ xuelle Vermehrung aus dem Pseudoparenchym des Fruchtkörpers zu vermehren. Hier sollte bedacht werden, dass unterschiedliche Stadien des Lebenszyklus’ (7 Abschn. 3.2) in der Reinkultur erhalten werden. Für makroskopische Fruchtkörper-bildende Ascomyceten gelten dieselben Metho­ den. Die Kultivierung von Ascomyceten aus Flechten ist sehr schwierig und in den meis­ ten Fällen bisher nicht gelungen, obwohl Asci und Sporen gebildet werden. i Benötigtes Material

5 zu untersuchende Proben 5 geeignete Medien (7 Abschn. 3.1.1) 5 Petrischalen

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. Abb. 3.6  Fruchtkörper von Schizophyllum commune. (© Erika Kothe, Jena)

5 Impflanzette 5 Skalpell 5 Bunsenbrenner 5 steriles Leitungswasser 5 Mikroskop und Stereomikroskop zur mikroskopischen Analyse 5 Für langsam wachsende Pilze ist mindestens eine sterile Werkbank für Produktschutz angeraten, um keine Kontaminationen einzuschleppen. 5 Ein Stereomikroskop oder Mikroskop mit Objektiv für weiten Arbeitsabstand ist für die Vereinzelung gekeimter Sporen notwendig. 5 Um bakteriellen Verunreinigungen vorzubeugen, empfiehlt sich das Verwenden von Agarplatten mit Ampicillin (Endkonzentration 100 mg/l), Kanamycin (50 mg/l), Chloramphenicol (50 mg/l) oder 500 mg/l Cefotaxim.

Die Isolierung aus Fruchtkörpern sollte in der sterilen Werkbank erfolgen. Agarplatten (7 Abschn. 3.1) vor der Probenahme vorbereiten und vortrocknen. Umweltproben nie lange lagern und nie einfrieren. Zum Transport eignen sich Früh­ stücksbeutel aus Papier. Die verschiedenen Methoden zur Isolierung müssen für das vorhandene Material sowie die Erfordernisse jeweils angepasst werden.

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Vorgehensweise 5 Basidiomyceten werden aus frisch gesammelten Fruchtkörpern vegetativ vermehrt, weil sonst Infektionen mit mykotrophen und mykoparasitischen Bakterien und Pilzen zu erwarten sind. Unter sterilen Bedingungen aus dem inneren Pseudoparenchym des Huts oder Stiels einen Würfel von etwa 3 mm Kantenlänge präparieren und auf dem Medium auslegen. Die Huthaut oder das Pseudoparenchym des Hymeniums eignen sich nicht zur Isolierung. 5 Für Einzelsporisolate werden Sporensuspensionen ausplattiert und anschließend die gekeimten Sporen auf neue Agarplatten vereinzelt. Dazu werden unter dem Mikroskop frisch gekeimte Sporen mit der Spitze einer sterilen Pasteurpipette ausgestochen und durch Ausblasen auf eine neue Petrischale übertragen. 5 Unter dem Mikroskop kann die invertierte Platte direkt mikroskopiert werden, um sicherzugehen, dass die Mycelien sich noch nicht berühren und somit auch noch keine Kreuzung stattgefunden haben kann.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Reinheit der Kultur sollte regelmäßig mikroskopisch kontrolliert werden (7 Abschn. 3.2.1), da häufig Verunreinigungen auftreten, besonders bei sehr langsam wachsenden Pilzen Zusätzlich empfiehlt sich eine Überprüfung durch Sequenzierung der 18 S-rDNA bzw. ITS-Region (7 Abschn. 3.2.4). Zur Pilzbestimmung kann auch ein Sporenabdruck erstellt und die Sporen aus diesem angezogen werden. Dazu werden die ausgeworfenen Sporen in einer sterilen Petrischale gesammelt und mit 0,5 ml sterilem Leitungswasser oder 0,9 % NaCl abgewaschen. Diese Sporensuspension kann dann plattiert werden. Das Erzeugen von Einzelsporisolaten ist notwendig, damit keine Kreuzung auf der Isolationsplatte erfolgen kann und so das haploide Keimungsmycelium zur weiteren Vermehrung zur Verfügung steht. Dabei können zehn gekeimte Sporen auf eine neue Platte gesetzt werden. Bei Pilzen, die Schnallenmycel nach einer Kreuzung bilden, kann die mikro­ skopische Kontrolle auch später mit einer Kernfärbung (7 Abschn. 3.2.2) durchgeführt werden. Zur Sporenkeimung für die Isolierung haploider Mycelkulturen benötigen viele Pilzsporen besondere und noch nicht weiter definierte Bedingungen. Auch die wei­ tere Vermehrung der Monosporisolate kann schwierig sein. Insbesondere bei Ekto­ mykorrhiza-Pilzen scheint die haploide Phase im Lebenszyklus eine so untergeordnete Rolle zu spielen, dass die Isolate nach drei Wochen bis einigen Monaten nicht weiter vermehrt werden können. 3.1.7  Isolierung von Pilzen aus Pflanzenmaterial

Viele Pilze leben als phytopathogene Organismen in Pflanzen, andere als Epiphyten auf deren Oberfläche. Daneben kommen bei nahezu allen Landpflanzen auch endophytische Pilze sowie symbiontische Mykorrhizapilze (. Abb. 3.7) vor. Oomyceten (mit den Braunalgen verwandt) treten ebenfalls als Phytopathogene auf.

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. Abb. 3.7  Fruchtkörper von Tricholoma vaccinum. (© Katrin Krause, Jena)

Endophyten sind Organismen, die in Pflanzen (meist apoplastisch, also zwischen den Zellen in den Zellwänden) vorkommen und keine Krankheitssymptome auslösen. Um nachzuweisen, dass es sich nicht um einen Zufallsfund handelt, gelten aber auch hier die Koch’sche Postulate: Die Isolate müssen re-infiziert und ihr Wachstum in planta nach­ gewiesen werden! i Benötigtes Material

5 5 5 5 5 5 5

zu untersuchende Proben geeignete Medien (7 Abschn. 3.1.1) steriles Wasser steriles Zubehör Lösungen zur Oberflächensterilisation, z. B. 30 % H2O2 Mikroskop und Stereomikroskop zur mikroskopischen Analyse Um bakteriellen Verunreinigungen vorzubeugen, empfiehlt sich das Verwenden von Agarplatten mit Ampicillin (Endkonzentration 100 mg/l), Kanamycin (50 mg/l), Chloramphenicol (50 mg/l), Cefotaxim (500 mg/L). 5 Für das Arbeiten mit Conidien-bildenden Pilzen ist es angeraten, alle Arbeiten in einer sterilen Werkbank durchzuführen, um eine Kontamination des Labors zu vermeiden. Für langsam wachsende Pilze ist mindestens eine sterile Werkbank für Produktschutz angeraten, um keine Kontaminationen einzuschleppen

Die Isolierung aus Fruchtkörpern sollte in der sterilen Werkbank erfolgen. Agarplatten (7 Abschn. 3.1) vor der Probenahme vorbereiten und vortrocknen. Umweltproben nie lange lagern und nie einfrieren.

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Vorgehensweise 5 Zum Transport eignen sich sterile Gefrierbeutel, für Fruchtkörper der Pilze und Pflanzenmaterial am besten Frühstücksbeutel aus Papier. 5 Bei heißem Wetter kann der Transport in einer gekühlten Styroporbox vorteilhaft sein. 5 Die Reinheit der Kultur sollte regelmäßig mikroskopisch kontrolliert werden (7 Abschn. 3.2.1). Zusätzlich empfiehlt sich eine Überprüfung durch Sequenzierung der 18 S-rDNA bzw. ITS-Region (7 Abschn. 3.2.4). 5 Epiphytischen Pilze isolieren: Pflanzenteile direkt auf Agar aufbringen oder Pflanzenmaterial mit steriler 0,9 % Kochsalzlösung abwaschen, und die Waschflüssigkeit ausplattieren (ggf. bis 10−5 verdünnen). 5 Bei Rost- und Brandpilzen ist eine Vermehrung aus Sporidien oder von Hefestadien durch Ausplattieren möglich (7 Abschn. 3.1.1). 5 Zur Oberflächensterilisation werden 30 % H2O2 für 2 s bei Ektomykorrhiza genutzt; 3 % H2O2 für 20 min, 5 % Natriumhypochlorit für 5–10 min oder 80 % Ethanol für 6 h haben sich für Endophyten bewährt, jedoch sind je nach Festigkeit des Pflanzengewebes auch Folgen von 1 min in 95 % Ethanol, 5 min in 2 % aktivem Chlor aus NaOCl und 1/2 min in 95 % Ethanol möglich. Es folgen mehrere Waschschritte in sterilem Leitungswasser. 5 Saprotrophe Ektomykorrhizapilze und endophytische Pilze werden nach Oberflächensterilisierung gewonnen, indem diese Pflanzenteile dann auf Agarplatten ausgelegt werden (für Saprophyten CYM oder Malzagar, 7 Abschn. 3.1.1; für Ektomykorrhizapilze MMNb, 7 Abschn. 3.1.3). 5 Obligat Biotrophe können in Fängerpflanzen vermehrt werden, die neben der Wirtspflanze gesetzt und nach 4 bis 6 Wochen entfernt werden. 5 Für Endomykorhizapilze können Karotten-Haarwurzeln benutzt werden (bei einer Infektion mit Agrobacterium rhizogenes erhält man Haarwurzeln, die in vitro kultiviert werden können). 5 Um beispielsweise bei Ektomykorrhizapilzen im Boden die Ausbreitung des Mycels zu untersuchen, können vertikale Bodenscheiben erzeugt werden: 5 Mit zwei Metallplatten im Abstand von 2 cm den Boden ausstechen 5 in Quadranten von jeweils 2–5 cm Kantenlänge unterteilen 5 aus diesen eine Bodensuspension herstellen und plattieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Reinheit der Kultur regelmäßig mikroskopisch kontrollieren (7 Abschn. 3.2.1), da häufig Verunreinigungen auftreten, besonders bei sehr langsam wachsenden Pilzen. Zusätzlich Überprüfen durch Sequenzierung der 18 S rDNA bzw. ITS-Region (7 Abschn. 3.2.4). Biotrophe Pilze oder obligate Symbionten sind schwieriger zu vermehren. Für die Isolierung von Endomykorrhizapilzen (Orchideenmykorrhiza, ericoide Mykorrhiza, arbuskuläre Mykorrhiza) hat sich die Verwendung von Fängerpflanzen bewährt. Im Wurzelgewebe kann dann das Vorhandensein der eingewanderten Mykorrhizapilze analysiert werden.

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Es sollte beachtet werden, dass Conidiosporen gegenüber den zur Sterilisie­ rung verwendeten Mitteln sehr resistent sein können, sodass Verunreinigungen mit Schimmelpilzen sehr häufig vorkommen! Mit der Waschflüssigkeit können besonders schnell wachsende epiphytische Pilze isoliert werden; langsam wachsende werden mit dem direkten Auslegen der Pflanzen­ teile isoliert. Die verschiedenen Methoden zur Isolierung müssen für das vorhandene Material sowie die Erfordernisse jeweils angepasst werden. 3.1.8  Stammhaltung von Pilzen

Während die meisten Hefen und Conidiosporen wie Bakterien für die Stammhaltung in Glycerin bei -80 °C schockgefroren werden können, ist diese Methode für viele fila­ mentöse Pilze nicht geeignet, da sie ihre Lebensfähigkeit beim Einfrieren oder Auftauen verlieren. Es sind daher verschiedene andere Methoden zur Stammhaltung üblich. Eine regelmäßige vegetative Vermehrung ist die sicherste Methode, birgt allerdings die Gefahr der Seneszenz oder Anhäufung von Mutationen in den erhaltenen Stämmen. i Benötigtes Material

5 5 5 5

zu untersuchende Proben geeignete Medien (7 Abschn. 3.1.1) steriles Wasser und steriles Zubehör Mikroskop und Stereomikroskop zur mikroskopischen Analyse

Für langsam wachsende Pilze ist mindestens eine sterile Werkbank für Produktschutz angeraten, um keine Kontaminationen einzuschleppen.

Vorgehensweise 5 Die Reinheit der Kultur bei jedem Überimpfen mikroskopisch kontrollieren (7 Abschn. 3.2.1), da häufig Verunreinigungen auftreten, besonders bei sehr langsam wachsenden Pilzen. 5 Zusätzlich überprüfen durch Sequenzieren der 18 S rDNA bzw. ITS-Region (7 Abschn. 3.2.4), wenn die Kulturen mehrere Jahre gelagert wurden oder verändert erscheinen. 5 Die Lebensfähigkeit von Dauerkulturen ebenfalls überprüfen, indem neue Kulturen angelegt werden. Viele Pilze sind auch in flüssigem Stickstoff nicht sehr lange überlebensfähig bzw. überleben das Einfrieren nicht gut. Alternativ in sterilem Leitungswasser bei 4 °C lagern. 5 Kultivierung und Aufbewahrung in Agarmedien, Flüssigmedien oder auch Leitungswasser sind für einige Wochen oder Monate möglich. 5 Um Verunreinigungen zu vermeiden, kann es vorteilhaft sein, Schraubröhrchen (2 ml) zu benutzen (. Abb. 3.8). 5 Besonders für empfindliche, langsam wachsende Basidiomyceten hat sich die Lagerung von bewachsenen Agarblöckchen in Leitungswasser bei 4 °C bewährt. So sind große Stammsammlungen mit Ektomykorrhizapilzen auf der Basis dieser Methode angelegt.

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Inokulum

. Abb. 3.8  Schematische Darstellung der Stammhaltung in Schrägagarröhrchen (© Erika Kothe, Jena)

5 Bewachsene Platten können ein halbes bis ein Jahr im Kühlraum gelagert werden. Danach ist es erforderlich, die Kulturen zu überimpfen, die Reinheit zu kontrollieren und neue Stammhaltungsplatten einzulagern, die mit Parafilm verschlossen sein sollten. 5 Für kürzere Zeiträume ist die Lagerung im Gefrierfach bei -20 °C durchaus möglich. Hier ist auch das Lagern von Protoplasten möglich, die z. B. für Transformationsexperimente (7 Kap. 4) hergestellt wurden. Diese sind in 1 M Sorbitol für mehrere Wochen bei -20 °C lagerfähig. 5 Das Beimpfen von Vollmedium-Agar in 2 ml fassenden Schraubröhrchen und Einfrieren und Lagern bei -80 °C stellt eine gute Methode dar. Dabei ist das einfache Einfrieren (kein Schockgefrieren!) und Auftauen bei Raumtemperatur für viele Isolate vorteilhaft. 5 Die Stammhaltung in flüssigem Stickstoff gilt als sicherste Variante. Allerdings sind auch hier immer wieder Ausfälle zu beklagen, sodass mehrere Parallelkulturen angelegt werden müssen. 5 Die Trocknung erfolgt – wie bei Speisepilzen – nach dem Zerteilen der Fruchtkörper und dem Auffädeln der Scheiben durch Aufhängen an einem schattigen, warmen Ort, im Ofen bei 50 °C oder in einem handelsüblichen Gerät zur Herstellung getrockneter Früchte. 5 Proben für ein Herbar müssen den genauen Sammelort (am besten GPS-Daten kombiniert mit Angaben zum Lebensraum, in der Nähe vorkommenden potenziellen Wirtsbäumen bei Ektomykorrhizapilzen etc.), Datum und weitere notwendige Informationen (auf unbewachsenem Boden, Bodentyp o. ä.) enthalten.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die verschiedenen Methoden zur Isolierung müssen an das vorhandene Material sowie die Erfordernisse jeweils angepasst werden. Geeignete Vorkulturen in Flüssigmedium oder auf Platte (7 Abschn. 3.1.1), die ent­ sprechenden sterilen Gefäße für die Dauerkulturen sowie die erforderlichen Medien sollten in ausreichender Zahl vorbereitet werden. Viele Pilze und Hefen wachsen auch bei Temperaturen von 4−8 °C weiter.

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Das Einfrieren und Auftauen bei Raumtemperatur ist für filamentöse Pilze die beste Methode. Dies ist bei Bakterien- oder Hefesuspensionen nicht der Fall, die mit Glycerin und schnellem Einfrieren am besten konserviert werden können. Für die spätere Bestimmung von Elementgehalten (zum Beispiel für die Aufnahme von Schwermetallen oder Radioisotopen in Pilzen) oder auch die Lagerung für spätere DNA-Untersuchungen ist eine Trocknung ausreichend. Aus dem getrockneten Mate­ rial ist allerdings die Gewinnung lebender Isolate nicht mehr möglich. Falls die spätere Nutzung der Identifizierung unbekannter Arten dienen soll, ist das Anlegen eines Herbars sinnvoll. Aus Herbarmaterial ist auch nach Jahrzehnten und sogar mehr als hundert Jahren die erfolgreiche Gewinnung von DNA zur Sequenzie­ rung der 18 S-rDNA möglich! Für einen neuen Pilzstamm empfiehlt es sich, die Lebensfähigkeit zu Beginn regel­ mäßig durch Überimpfen auf frisches Nährmedium zu überprüfen. Langfristig ist es empfehlenswert, die Stämme einer der großen Stammsammlungen zu übereignen, die über die besten Lagerungsbedingungen verfügen. Verunreinigungen durch Schimmelsporen oder Bakterien sind insbesondere bei Lagerung in Räumen mit Milben problematisch, Sie müssen daher vermieden bzw. geeignet bekämpft werden (z. B. Kammerjäger!). 3.2  Identifizierung von Pilzen durch mikroskopische und

DNA-abhängige Methoden

3.2.1  Mikromorphologische Bestimmung

Pilze können anhand ihrer sexuellen oder asexuellen Organe phylogenetisch ein­ geordnet oder sogar bestimmt werden. Makroskopische Fruchtkörper wie die des Steinpilzes oder Pfifferlings werden anhand der umfangreichen Bestimmungsliteratur identifiziert. Bestimmungsschlüssel sind auch für Conidiosporen von Ascomyceten vorhanden. Zygomyceten können mit geeigneter Literatur anhand der Sporangien und Zygosporen oft bis zur Gattung bestimmt werden. Hier werden daher zunächst die wei­ teren mikroskopischen Bestimmungshilfen angesprochen. Pilze wachsen an den Spitzen der filamentösen Hyphen (apikal). Durch Verzweigung und die ebenfalls mögliche Verschmelzung von Hyphen derselben Art (Anastomose) entsteht ein Pilzgeflecht, das Mycel. Um dieses mikroskopieren zu können, werden ein­ schichtige Mycelien benötigt. Oft ist das Abnehmen eines Abdrucks mit einem Streifen Tesafilm möglich. Besonders die Formen von Conidien und Conidienträgern bei Asco­ myceten können so schnell zur Bestimmung herangezogen werden (7 Abschn. 3.3). Die Kreuzung ist bei einigen Basidiomyceten wie Schizophyllum commune anhand der Bildung von Schnallenzellen leicht sichtbar. Viele andere Basidiomyceten, darunter die meisten Ektomykorrhizapilze, wachsen aber auch nach einer Kreuzung ohne Schnal­ len, sodass hier eine Kernfärbung mit DAPI weiterhilft. i Benötigtes Material

5 Probenmaterial 5 Tesafilm 5 Skalpell

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5 geeignete Agarplatten (7 Abschn. 3.1) 5 sterile Deckgläschen 5 Mikroskop, Öl zur Immersionsmikroskopie (7 Kap. 5)

Abnahme eines Teils des Mycels mit Tesafilm für die mikroskopische Analyse von Umweltproben, beispielsweise Pflanzenmaterial mit Symptomen des Befalls durch phytopathogene Pilze. Vorgehensweise 5 Für die Deckgläschen-Kulturen sind Agarplatten anzusetzen (7 Abschn. 3.1); je nach Wachstumsgeschwindigkeit des Pilzes ist unterschiedlicher Vorlauf erforderlich. 5 Die Deckgläschen werden mit Ethanol gereinigt und in einer Glaspetrischale autoklaviert. Besonders bei langsam wachsenden Pilzen ist dies sinnvoll, um Verunreinigungen vorzubeugen. 5 Tesafilm (Klebeseite zum Pilzmycel) leicht auf die Myceloberfläche drücken. Sterile Bedingungen sind (sofern nicht eine Reinkultur erhalten werden soll) hierzu nicht notwendig. 5 Für bessere mikroskopische Präparate, die auch das Wachstum und damit die Beobachtung des Verzweigungstyps besser darstellen, ein steriles Deckgläschen auf das feste Nährmedium auflegen (. Abb. 3.9). 5 Tesafilm anschießend auf einen Objektträger kleben. Für Färbungen (s. u.) kann das Stück aber auch mit der Klebeseite nach oben aufgelegt werden – dazu mit einem Tropfen Wasser einen Wasserfilm zwischen Objektträger und Tesafilm erzeugen.

Inokulum

Deckgläschen

. Abb. 3.9  Schematische Zeichnung für das Anordnen der Deckgläschen auf einer Petrischale. (© Erika Kothe, Jena)

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5 Die Pilzhyphen wachsen über diese Deckgläschen, zunächst in nur einer Schicht, sodass die Deckgläschen dann auf einen Objektträger aufgebracht und mikroskopiert werden können. 5 Auf einer Agarplatte unter sterilen Bedingungen (Pinzette abflammen!) neun Deckgläschen verteilen. In die Zwischenräume die Impfblöckchen auflegen. 5 Nach dem Aufwachsen mit dem Skalpell die Verbindung zum Mycel auf dem Agar trennen. 5 Ein Deckgläschen entnehmen. Der Pilz kann nun direkt mikroskopisch auf einem Objektträger (Pilzhyphen nach oben) untersucht werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das Hyphenwachstum kann durch die Mikroskopie der einschichtigen Hyphen über mehrere Stunden verfolgt werden, sodass das apikale Hyphenwachstum sichtbar wird. Auch der Verzweigungstyp ist so erkennbar. Diese Merkmale können bei Hyphen ohne morphologische Merkmale erste Indi­ zien für die Reinheit des Stammes sein, und sie können zur Bestimmung genutzt werden. Die Bildung von Conidien oder Chlamydo- und Arthrosporen hilft bei der Bestimmung mit geeigneter Literatur. Das Mycel verzweigt sich in der Regel in einem spitzen Winkel zur Wuchsrichtung. Einige Pilze, z. B. Ashbya gossypii, wachsen mit zwei Hyphenspitzen (dichotom). Typi­ sche Merkmale der Wuchsform können ebenso zur Bestimmung herangezogen werden. Nach einer Kreuzung bilden viele Basidiomyceten ein Schnallenmycel, in dem bei jeder mitotischen Teilung eine Schnalle angelegt wird. Diese Struktur erlaubt die Kernteilung zweier unterschiedlicher Kerne in einer Zelle und sichert die ­Weitergabe beider Kerntypen an die Tochterzelle. In einer Deckgläschen-Kultur kann die Schnallenbildung an jedem eingezogenen Septum im Mikroskop (7 Kap. 5) bereits mit dem 40er-Objektiv, noch deutlicher mit dem 100er-Ölimmersionsobjektiv leicht erkannt werden. Bei Umweltisolaten kann bei Vorliegen eines Schnallenmycels bereits sicher gesagt werden, dass es sich um einen Basidiomyceten handeln muss. 3.2.2  Färbungen zur Beobachtung von Zellkompartimenten

in Pilzen

Färbungen für spezifische Strukturen in Pilzen (. Abb. 3.10) erleichtern nicht nur die Identifizierung, wie beispielsweise die Erkennung eines für Basidiomyceten typischen Dikaryons, sondern insbesondere auch die Unterscheidung pilzlicher Strukturen, etwa in Pflanzenmaterial (z. B. in Wurzeln mit arbuskulärer Mykorrhiza). i Benötigtes Material

5 Probenmaterial 5 Tesafilmstreifen oder Deckgläschenkulturen 5 Mikroskopie sowie Fluoreszenzmikroskopie 7 Kap. 5 5 Deckgläschenkulturen benötigen ausreichend Vorlaufzeit. 5 Die Färbelösung sollten vor dem Mikroskopieren bereitstehen.

131 Pilze

. Abb. 3.10  Färbung der Kerne mittels DAPI im einkernigen Stadium von Schizophyllum commune. (© Elke-Martina Jung, Jena)

Lactophenol-Baumwollblau Bestandteil

Menge

Phenol

20 g

Glycerin

40 ml

Milchsäure

20 g

Aqua dest. ad

100 ml

Sudan III-Lösung Bestandteil

Menge

Sudan III

0,1 g

Isopropanol

50 ml

Den Farbstoff in Isopropanol lösen. Direkt vor Gebrauch aus dieser Stammlösung eine Verdünnung 1:1 in Aqua dest. herstellen. DAPI-Lösung Bestandteil

Menge

4′,6-Diamidin-2-phenylindol

1 mg

Aqua dest. ad

1 ml

3

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Calcofluor White-Lösung

3

Bestandteil

Menge

Fluorescent Brightener 28

10 µg

Aqua dest. ad

1 ml

Zur Unterscheidung zwischen pilzlichen und z. B. pflanzlichen Strukturen eignet sich die Lactophenol-Baumwollblau-Färbung Membranfärbung oder Färbung von Vesikeln in der Hyphenspitze bei Ascomyceten (Spitzenkörper): Sudan III. Calcofluor färbt Chitin in der pilzlichen Zellwand. DNA wird mit DAPI, Ethidiumbromid oder Hoechst-Farbstoff angefärbt. ! Sudan III ist lipophil und carcinogen. Handschuhe tragen!

DAPI ist ein in die DNA interkalierender Fluoreszenzfarbstoff und mutagen sowie teratogen. Handschuhe tragen!

Vorgehensweise Lactophenol-Baumwollblau-Färbung: 5 Objektträger mit 70 % Ethanol säubern 5 einen Tropfen des Einbettungsmediums darauf geben 5 Tesastreifen bzw. das bewachsene Deckgläschen (Pilzhyphen zwischen Objektträger und Deckgläschen) auflegen, ohne dass Blasen entstehen 5 Überschüssige Flüssigkeit mit einem Streifen Filterpapier entfernen. Membranfärbung mit Sudan III: 5 kleine Myelstücke mit einer sterilen Pinzette entnehmen und in einem Eppendorfcup mit 200 µL frisch angesetzter Sudan III-Lösung für 30 min inkubieren 5 mit 500 µL Aqua dest. versetzen und gut durchmischen (Vortex) 5 zentrifugieren und mit 500 µL Aqua dest. auf einen Objektträger bringen. Calcofluor-Färbung: 5 ein bewachsenes Deckgläschen mit einem Tropfen Wasser und 1 µL CalcofluorLösung auf den gesäuberten Objektträger bringen 5 wie oben beschrieben weiter verfahren. Färbung mit DAPI, Ethidiumbromid oder Hoechst-Farbstoff: 5 das bewachsene Deckgläschen mit einem Tropfen Wasser und 1 µL DAPI-Lösung auf den gesäuberten Objektträger bringen 5 wie oben weiter verfahren. Nagellack fixiert das Deckgläschen auf dem Objektträger und macht das Präparat für einige Wochen haltbar.

133 Pilze

z Versuchsergebnis/Auswertung

Bei einiger Erfahrung können Hinweise auf Verunreinigung so leicht erhalten werden und eine zumindest grobe Bestimmung ist möglich. Pilzhyphen in Pflanzenmaterial sind oft nicht leicht zu entdecken. Die Pilzhy­ phen werden mit einer Lactophenol-Baumwollblau-Färbung besser sichtbar. So wer­ den auch intrazelluläre Strukturen leichter nachweisbar, insbesondere wenn keine einschichtige Lage erreicht werden kann (was bei schnell wachsenden Pilzen leicht geschieht). Das Einbettungsmedium enthält Phenol, das zur Haltbarkeit beiträgt, Milchsäure zur Konservierung der pilzlichen Strukturen und Baumwollblau zum Anfärben des Chitins der pilzlichen Zellwand. Gleichzeitig ist das Mikroskopieren mit dem 100er-Ölimmersionsobjektivs möglich (7 Kap. 5). Der rote Farbstoff Sudan III färbt alle intrazellulären Membranen wie Vesikel, Vakuolen, aber auch Membranen, sodass diese leichter im Cytosol erkannt werden. Oft sind auch Septen sichtbar, sodass die Einzelzellen, die durch Poren verbunden in der Pilzhyphe voneinander abgegrenzt sind, beobachtet werden können. Dies kann für die Zellbiologie eukaryotischer Zellen wertvolle Hinweise geben. Die Lipidfärbung mit Sudan III wird nach Auflegen des Deckgläschens bei 400- bis 1000-facher Vergröße­ rung mikroskopiert. Mit den beiden Färbungen für DAPI und Calcofluor lassen sich Unterschiede zwi­ schen einzelnen Pilzgruppen feststellen. So sind die meisten Zygomyceten syncytial, d. h. es werden keine regelmäßigen Septen eingezogen. Ascomyceten enthalten viele (meist 4–8) Kerne pro Kompartiment zwischen zwei Septen. Basidiomyceten lie­ gen dagegen als haploides Monokaryon (ein Kern pro Kompartiment) oder – nach der Kreuzung – als Dikaryon (zwei Kerne in enger räumlicher Nähe innerhalb eines Kompartiments) vor. Kerne sind im Phasenkontrast häufig schwer zu erkennen, sodass sich die DAPI-Färbung anbietet. Mit einer Calcofluor-Färbung können Zellwände angefärbt werden. Da die Fluo­ reszenz des Farbstoffs aber mit DAPI überlappt, können diese beiden Färbungen nicht kombiniert, sondern nur alternativ verwendet werden. 3.2.3  Bestimmung von Pilzen durch parasitische bzw.

symbiontische Stadien

Phytopathogene Pilze und Mykorrhizapilze sind anhand ihrer symbiontischen oder parasitischen Strukturen in Wirtspflanzen (. Abb. 3.11) sehr gut zu bestimmen. Darü­ ber hinaus hilft bei phytopathogenen oder Ektomykorrhiza-Pilzen Bestimmungsliteratur. In der Symbiose von verholzenden Pflanzen mit Pilzen (hauptsächlich Basidiomy­ ceten, aber auch einige Ascomyceten), bildet der Pilz um eine Kurzwurzel des Baumes einen „Mantel“. Die Färbung, Morphologie, Verzweigungstypen etc. können gut zur Bestimmung des entsprechenden Pilzpartners anhand entsprechender Bestimmungs­ literatur herangezogen werden. Die mit krautigen Pflanzen in Symbiose lebenden arbuskulären Mykorrhizapilze (Glomerales) werden in aller Regel durch die im Boden vorkommenden, vielkernigen Sporen bestimmt. Auch hier ist Bestimmungsliteratur vorhanden. Ein Infektionstest mit Zwiebelepidermis kann die Strukturen phytopathogener Pilze sichtbar machen.

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3

. Abb. 3.11  Ektomykorrhiza kann aus der Natur anhand der Morphotypen bestimmt werden. (© Katrin Krause, Jena)

i Benötigtes Material

Zur Vorbereitung von Deckgläschenkulturen 7 Abschn. 3.2.1. 5 Färbelösung 5 Probenmaterial 5 Rasierklinge für Blattquerschnitte 5 Zwiebelepidermis 5 eine feuchte Kammer 5 vorbereiteten Färbelösungen Lactophenol-Baumwollblau Bestandteil

Menge

Trypanblau

0,03 %

Glycerin, Lactat und Aqua dest im Verhältnis 1:1:1 mischen Trypanblau in der Mischung auflösen PVLG-Lösung zur Mikroskopie Bestandteil

Menge

Lactat

100 ml

Glycerin

10 ml

Polyvinylalkohol

16 g

Aqua dest. ad

1000 ml

5 Fluoreszenzmikroskopie 7 Kap. 5 5 Für Mykorrhiza und Phytopathogene ist das Protokollieren des Wachstums der Wirtspflanze sehr wichtig.

135 Pilze

! DAPI ist ein in die DNA interkalierender Fluoreszenzfarbstoff und mutagen sowie

teratogen. Handschuhe tragen!

Vorgehensweise Morphotyping: 5 Baumwurzeln ausgraben und die Verzweigungen der Kurzwurzeln entnehmen. Diese können mehrere Tage in Wasser gelagert werden. 5 Unter dem Binokular die in der Bestimmungsliteratur geforderten Merkmale überprüfen. 5 Da die Mykorrhizapilze z. T. eine hohe Wirtsspezifität besitzen, ist das Protokollieren der Baumart wichtig! Nachweis von Arbuskeln: 5 Wurzeln unter fließendem Wasser von Bodenpartikeln reinigen. 5 Einige Wurzeln entnehmen und 10 min in 5 % H2O2 bleichen. 5 Wurzeln in destilliertem Wasser waschen und für 30–45 min in 10 % KOH bei 95 % inkubieren. 5 3 min in 3 % HCl bei 95 °C ansäuern und mit Lactophenol-Baumwollblau 10–18 min bei 65 °C färben. 5 Zur Entfärbung in 50 % Lactat über Nacht inkubieren. 5 Mikroskopische Kontrolle sowie Auszählen des Mykorrhizierungsgrads (Mycel, Sporen, Vesikel, Arbuskel) bei 100facher Vergrößerung. Zwiebelepidermis-Infektionstest: 5 Conidien in einer verdünnten Suspension auf die Unterseite eines Zwiebelhäutchens tropfen. 5 1–3 Tage in einer feuchten Kammer inkubieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Mikroskopie von befallenen Strukturen an Pflanzen zeigt die verschiedenen Sta­ dien der Lebenszyklen der Rostpilze. Da diese Lebenszyklen im Labor nicht voll­ endet werden können – dazu sind besonders bei Rost- und Brandpilzen Signale der Wirtspflanze essenziell, die noch nicht identifiziert wurden – ist die Mikroskopie von gesammeltem Material bzw. ein Zwiebelepidermis-Infektionstest die beste Methode zur Bestimmung. Aus den verdickten Körnern des Maisbeulenbrands kann Ustilago maydis ent­ nommen und die Dekoration der Teliosporen mikroskopiert werden. Ähnlich kann man mit Quetschpräparaten anderer Rost- und Brandpilze verfahren. Für Birnen­ gitterrost (Gymnosporangium sabinae) können Blattquerschnitte angefertigt und mikroskopiert werden, die Aecidien mit dikaryontischen Sporen auf der Blattunter­ seite und Pycnidien auf der Blattoberseite zeigen. Ähnliches gilt für die Symbiosen der Mykorrhiza. Die Ektomykorrhiza wächst dabei außerhalb der pflanzlichen Zellen im Apoplasten, während endotrophe Mykor­ rhiza, ähnlich wie die Haustorien phytopathogener Pilze, in die Zellen eindringen,

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die Plasmamembran der Pflanzenzelle aber nicht zerstören, sondern innerhalb der Pflanzenzellwand die Membran zurückdrängen. Neben der arbuskulären Mykorrhiza, die hier angesprochen wird, ist Mykorrhiza bei Orchideen, Ericaceen und weiteren Pflanzengruppen beschrieben. Viele Phytopathogene (als Beispiel kann Colletotrichum lindemuthianum dienen) können in einem einfach durchzuführenden Infektionstest für phytopathogene Pilze mikroskopisch beobachtet werden. In einer Zwiebelepidermis werden die Infektions­ strukturen phytopathogener Pilze besonders deutlich sichtbar. Die Conidiosporen keimen auf der Epidermis, bilden Appressorien, und dringen in die Pflanzenzellen ein. Infektionshyphen sowie Haustorien sind sichtbar – sie dienen der Invasion von Pflanzengeweben (Appressorien durch Druck) und der Ernährung des Pilzes (Haus­ torien sind in einer lebenden Pflanzenzelle von der Cytoplasmamembran der Pflanze umgeben). 3.2.4  Bestimmung von Pilzen durch Sequenzierung der

ITS-Region

Das eukaryotische Ribosom der Pilze enthält in der 60 S großen Untereinheit eine 25 S-rRNA (homolog zur 28 S-rRNA), eine 5 S-rRNA und eine 5,8 S-rRNA. Die kleine Untereinheit des Ribosoms (40 S-Untereinheit) beinhaltet die 18 S-rRNA (. Abb. 3.12). Das mitochondriale Ribosom entspricht mit 70 S dem bakteriellen Ribosom. Die Unter­ schiede in der mitochondrialen rDNA reichen zur Unterscheidung innerhalb der Pilze aber nicht aus. Da auch die 18 S-rDNA keine ausreichende Auflösung bietet, wird die Region der internen transkribierten Spacer verwendet. Mit den üblicherweise verwendeten Primern ITS1 (im Gen der 18 S-/17 S- rRNA) und ITS4 (im Gen der 28 S/25 S-rRNA) wird ein Amplifikat von ca. 500–600 bp erzeugt, das direkt oder nach Klonierung sequenziert werden kann. Die amplifizierte Region schließt das Gen für die 5,8 S-rRNA komplett ein und enthält in den Spacer-Regionen zwischen den funktionellen rRNAs variable und hochvariable Bereiche. Diese Information ist in der Regel ausreichend für eine Ein­ ordnung auf Gattungs- oder Art-Ebene.

Primer ITS1 18S rDNA

Primer ITS4 5,8S rDNA

28S rDNA

. Abb. 3.12  Schematische Zeichnung der pilzlichen intern transkribierten Spacer(ITS)-Region mit den rRNA-Genen des Transkripts, das in Pilzen in 30–150 Kopien vorliegen kann. (© Erika Kothe, Jena)

137 Pilze

i Benötigtes Material

5 Eppendorf-Zentrifuge 5 Schüttler 5 Elektrophorese-Zubehör und Puffer (7 Abschn. 4.1.5 für molekularbiologische Arbeiten wie PCR, Sequenzierung und Klonierung) Sequenzierung von DNA als Fremdleistung hat sich bewährt. DNA Extraktionspuffer Bestandteil

Menge

Tris/Cl pH 8,5

200 mM

NaCl

250 mM

EDTA

25 mM

SDS (Natrium-Dodecyl-Sulfat)

0,5 %

Natriumacetatlösung Bestandteil

Menge

Na-Acetat

3M

Auf pH 5,2 einstellen Primer und Annealingtemperatur Primername

Sequenz

Annealingtemperatur

ITS1

5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3’

52 °C

ITS4

5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’

52 °C

Die erforderlichen Materialien und Lösungen sollten vorbereitet sein. Molekularbiologische Untersuchungen 7 Abschn. 4.5.1. Gentechnische Arbeiten können erforderlich sein. Dazu müssen die erforderlichen Berechtigungen vorliegen. Die Sequenzierung kann als Leistung eingekauft werden. Vorgehensweise DNA-Isolierung: 5 Mycel direkt von einer Kultur in ein Eppendorf-Röhrchen überführen. Dabei das Röhrchen etwa bis zum Knick locker mit Mycel füllen. 5 300 µL DNA Extraktionspuffer zugeben und das Mycel mit einer Impflanzette zerdrücken. 5 150 µL Natriumacetatlösung zugeben und für 10 min bei -20 °C inkubieren.

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5 5 5 5

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5 min bei ca. 13.000 rpm zentrifugieren. DNA mit 0,6 Vol. Isopropanol fällen und abzentrifugieren. Mit 70 % Ethanol waschen. Pellet bei 50 °C trocknen und in 50 µL Aqua dest. aufnehmen.

Amplifizierung der ITS-Region: 5 PCR-Reaktion (7 Abschn. 4.5) mit 1 µL genomischer DNA (s. o.) und den Primern ITS1 und ITS4 5 Amplifikat elektrophoretisch auf Reinheit kontrollieren (7 Abschn. 4.1.5) 5 Annealing bei 55 °C Phylogenetische Analysen: 5 Sequenzen im BLAST-Algorithmus (NCBI GenBank) auf Ähnlichkeiten mit bekannten Sequenzen untersuchen 5 für Mykorrhizapilze wird der Galaxy-Algorithmus der UNITE database for mycorrhizal fungi empfohlen 5 Alignments z. B. mit Mafft (s. EMBL-EBI; 7 https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft) erstellen 5 z. B. mit MrBayes (7 http://nbisweden.github.io/MrBayes/index.html) oder Treefinder (7 http://www.treefinder.de) Stammbäume errechnen 5 mit z. B. Figtree (7 http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) visualisieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Sofern es möglich ist, Stämme zu kreuzen, ist eine Kreuzung der bestmögliche Nach­ weis für die Zugehörigkeit zur selben Art. Die Methode hat sich insbesondere für Pilze bewährt. Die erwartete ITS-Bande sollte ca. 600 bp lang sein. Das aus der Agarose extrahierte, gereinigte Produkt kann dann direkt sequenziert werden, oft wird es sich aber empfehlen, zunächst das Produkt zu klonieren und drei Klone zu sequenzieren. Mit dieser DNA-abhängigen Methode ist eine bessere Bestimmung von Mycelien möglich, als das mithilfe morphologischer Kriterien möglich wäre. Aus den Sequenzen können Stammbäume erstellt werden, die zumindest eine Ein­ ordnung auf Gattungs-Ebene erlauben; die Bestimmung auf Art-Ebene kann schwierig sein. Die Methoden sind hier auf für die Pilze optimierte Programme beschränkt. 3.3  Untersuchungen zu Lebenszyklen von Pilzen 3.3.1  Lebenszyklus und Zellzyklus bei Saccharomyces cerevisiae

Induktion der Ascusbildung, Tetradenanalyse und Untersuchung von Mutationen im Zellzyklus von S. cerevisiae sind hier aufgeführt; die Methoden lassen sich auf andere Hefen übertragen. Dazu müssen Medien und Bedingungen entsprechend angepasst werden.

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Die Hefe Saccharomyces cerevisiae hat ein besonderes Kreuzungssystem, bei dem der Kreuzungstyp wechselt (mating type switching). Damit können in einer Reinkultur eines haploiden Stamms Ascosporen erhalten werden. Jeder Stamm enthält beide Varianten des bipolaren Kreuzungssystems; diese MAT-Loci werden aber nicht abgelesen. Der transkribierte Genort enthält eine der beiden Informationen und bestimmt den phäno­ typischen Kreuzungstyp. Durch einen – der konservativen Transposition ähnelnden – Austausch dieser Information mit der des anderen Kreuzungstyps wird eine Kreuzung unterschiedlicher Kreuzungspartner (bei der Hefe a und α genannt) möglich. Unter geeigneten Bedingungen wird die Bildung der frei vorliegenden viersporigen Asci induziert. Zudem ist S. cerevisiae durch die leichte Manipulierbarkeit ein Modellorganismus für viele Eigenschaften der Eukarya. So können durch Mutagenese oder gentechnische Veränderung Mutanten hergestellt werden. Stämme mit Temperatur-sensitiven Muta­ tionen in Genen des Zellzyklus können so synchronisiert und die Stadien mikro­ skopisch analysiert werden. Entsprechende Stämme sind in einer sehr umfangreichen Stammsammlung erhältlich; unter diesen Stämmen sind auch Deletionsmutationen für annotierte Gene. Nährstoffmangel bzw. eine nicht fermentierbare Kohlenstoff- und fehlende Stickstoff­ quelle induzieren die sexuelle Entwicklung in der Bäckerhefe. Dabei erfolgt, wie in vielen Pilzen, eine geschlossene Meiose, bei der sich die Kernhülle nicht auflöst. Dies kann bei­ spielsweise durch geeignete Immunfluoreszenzfärbungen (7 Kap. 5) dargestellt werden. Die Struktur der Asci, in denen die Meioseprodukte eingeschlossen sind, erlaubt eine Analyse der meiotischen Prozesse wie der Rekombination. Die Kontrolle des Zellzyklus kann in verschiedenen temperatursensitiven Mutanten erfolgen. Durch die Mutationen im Zellzyklus (genannt cdc nach cell division cycle), sind die Phänotypen der Mutationen erkennbar. i Benötigtes Material

5 geeignete Nährmedien 5 Brutschrank 5 Mikroskop 5 ggf. Mikromanipulator und steriles Zubehör 5 Medien: YPD oder SD (7 Abschn. 3.1.1)

Steriles Arbeiten ist erforderlich, solange Kulturen angelegt werden. Mikroskopie kann unsteril erfolgen. Die Ausstattung des Labors, z. B. mit einem Mikromanipulator, Erlaubnis für gen­ technisches Arbeiten, Mikroskopie etc. muss dem Versuch entsprechen. Vorgehensweise Induktion der Meiose: 5 Flüssigkultur (über Nacht gezogen) 1:50 verdünnen und für 4 h bei 30 °C im Schüttler inkubieren 5 die Zellen zentrifugieren und in 1 % Kaliumacetatlösung waschen 5 in knapp demselben Volumen 1 % Kaliumacetat wieder aufnehmen 5 mindestens drei Tage bei Raumtemperatur auf dem Roller inkubieren

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Tetradenanalyse bei S. cerevisiae: 5 200–400 μl sporulierter Zellen (OD600 = 2–4) zentrifugieren 5 in 200–400 μl frisch hergestellter Zymolyaselösung resuspendieren 5 für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren 5 die Zellen mikroskopisch kontrollieren, um die Effizienz der Lyse des Ascus zu gewährleisten 5 600–1000 μl Aqua dest. zum Stoppen der Zymolyase zugeben 5 Zellen mit einer Impföse als Impfstich auf eine gut vorgetrocknete Agarplatte (YPD, 7 Abschn. 3.1.1 oder Selektivmedien je nach Versuch) übertragen 5 mit einem Mikromanipulator die vier Sporen aus einem Ascus im Abstand von je 5 mm nebeneinander auf der Agarplatte platzieren 5 dabei können zwei Reihen mit jeweils 10 Tetraden auf einer Platte ausgebreitet werden 5 die Platten bei 30 °C für 2–3 Tage inkubieren 5 Replika-Plattieren ermöglicht die Analyse unterschiedlicher Phänotypen. Zellzyklus-Analyse: 5 bei permissiver Temperatur eine Vorkultur (7 Abschn. 3.1.1) ziehen 5 für ca. 2–4 h bei erhöhter Temperatur (je nach Mutation 37 oder 42 °C) inkubieren 5 betroffenen Stadien des Zellzyklus durch Mikroskopie feststellen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach einer Induktion der Meiose bilden sich üblicherweise über 50 % Asci. In der Zymolyase-Behandlung sollte der geöffnete Ascus noch mit den vier Sporen (Tet­ rade) gemeinsam sichtbar sein. Bei noch unvollständiger Öffnung der Asci weiter inkubieren und kontrollieren (frische Asci sollten nach 5 bis 10 min Zymolyasebehandlung geöffnet sein; ältere können länger benötigen). Der Zellzyklus stoppt bei nicht-permissiver Temperatur (die Temperatur, bei der der Phänotyp einer temperatursensitiven Mutation ausgeprägt wird) während der Spros­ sung, im Wachstum der Tochterzelle oder bei Trennung von Mutter- und Tochter­ zelle. Von einer einfachen Mendel’schen Verteilung abweichende Zahlen der Ascusanalyse deuten auf Rekombinationsereignisse hin. Die ungeordneten Asci von S. cerevisiae können analysiert werden, indem mit dem Mikromanipulator die vier Meioseprodukte vereinzelt werden. Ein einfaches Plattieren gibt bereits über die Verteilung der Allele in den Ascosporen Auskunft. Dominante und rezessive Erbgänge sind direkt sichtbar, da die Sporen hap­ loid sind. Eine direkte Analyse des Phänotyps ist also in allen Pilzen nach Keimung der Sporen möglich. Dies bedeutet auch, dass essenzielle Gene indirekt über die

141 Pilze

Keimungsraten der Sporen nach einer Kreuzung bestimmt werden können. In einer Tetradenanalyse ist dies jedoch mit zwei von vier überlebenden Sporen ein direkter Nachweis. Es ist daher die jeweilige Fragestellung vorher gut abzuwägen. Der Zellzyklus der Hefe ist auch durch Videomikroskopie gut darstellbar, aller­ dings muss dann gewährleistet sein, dass das Mikroskop automatisch der Hefezelle folgt und der Autofokus hier nachjustiert wird (7 Kap. 5). 3.3.2  Hefen und der Übergang zu Hyphenformen

Insbesondere für die humanpathogenen Hefen wie Candida-Spezies ist der Übergang von der Hefe- in die Hyphenform (. Abb. 3.13) mit der Pathogenese verknüpft, da Hyphen leichter in Gewebe des Wirts eindringen können. Solche Pilze mit zwei unter­ schiedlichen Vermehrungsformen werden als dimorph bezeichnet. Dies gilt auch für die Hefeformen der phytopathogenen Brandpilze, die Sporidien. Hier ist allerdings die fila­ mentöse Wuchsform, wie bei Ustilago maydis, an eine Kreuzung gebunden. Saccharomyces cerevisiae, die Bäckerhefe, dient als Modellorganismus für viele euka­ ryotische Systeme. So kann bei der Bäckerhefe ein Pseudohyphenwachstum beobachtet werden, aber auch die Bedingungen für das Umschalten von der Hefe in das Hyphen­ wachstum. Da Candida albicans als diploide Hefe vorliegt, sind genetische Untersuchungen erschwert. So müssen immer die Allele auf beiden Schwesterchromosomen deletiert werden, wenn ein rezessiver Phänotyp beobachtet werden soll. Hefe

Pseudohyphe

Hyphe

. Abb. 3.13  Schematische Darstellung des Wachstums bei Pilzen als knospende Hefe, mit nicht vollständig voneinander getrennten Zellen in Pseudohyphen oder in der Hyphenform, in der die Zellkompartimente durch Septen mit zentralen Poren verbunden sind. (© Erika Kothe, Jena)

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Ustilago maydis, der zu den Basidiomyceten mit unterteilter Basidie (Phragmobasi­ diomyceten) gehörende Brandpilz (Maisbeulenbrand), zeigt eine Hyphenbildung, die für die Infektion der Wirtspflanze erforderlich ist. Die haploiden Stadien vermehren sich auch saprotroph als Sporidien, eine sehr lang gestreckte Hefeform. Nur wenn zwei sol­ cher Sporidien mit unterschiedlichen Kreuzungstypen in zwei verschiedenen Genorten (dies wird als tetrapolares Kreuzungssystem bezeichnet, da vier unterschiedliche Kom­ binationen denkbar sind) fusionieren und eine Zygote bilden, entsteht das filamentöse, infektiöse Dikaryon (das für Basidiomyceten typische Stadium mit Kernen der beiden Elternstämme in jeder einzelnen Zelle). i Benötigtes Material

5 Flüssige und feste Nährmedien 5 Brutschrank 28 °C, 30 °C, 37 °C 5 Mikroskopie 7 Kap. 5 5 Medium für Saccharomyces cerevisiae: YPD (7 Abschn. 3.1.1) 5 Hypheninduktion kann durch Zugabe von 1 % Butanol induziert werden 5 Die Platten sollten mit Parafilm abgedichtet werden, um die Induktion nahe stehender anderer Kulturen zu vermeiden.

Sabouraud-Glucose-Agar Bestandteil

Menge

Pepton

10 g

Glukose

40 g

Agar

20 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Spider-Medium Bestandteil

Menge

Mannit

10 g

Trypton

16 g

Hefeextrakt

10 g

NaCl

5 g

K2HPO4

2 g

Agar

20 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für Flüssigmedium dem Medium keinen Agar zusetzen Potato-Dextrose-Agar (PD) Bestandteil

Menge

Potato-Dextrose-Agar (PD)

3,9 % (w/v)

Für PD-Aktivkohle, 1,0 % Aktivkohle zugeben

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5 Mikroskopie und Färbungen 7 Kap. 5 und 7 Abschn. 3.2.2. Die benötigten Materialen, Nährmedien etc. sollten vorbereitet werden. Bei humanpathogenen Pilzen ist Infektionsschutz zu beachten! Es können Berechtigungen zum Umgang mit Pathogenen erforderlich sein. Vorgehensweise Pseudohyphenwachstum bei Saccharomyces cerevisiae: 5 Vollmedium (YPD, 7 Abschn. 3.1.1) mit Induktoren wie Isoamylalkohol oder Stickstoffmangelmedium mit 1 % Butanol animpfen 5 mikroskopische Kontrolle, wenn die Hefen in Induktionsmedium überführt werden 5 eine Färbung mit Calcofluor (7 Abschn. 3.2.2) zeigt die Chitin-haltigen Zellwände und die vollständigen Septen. Hyphenbildung bei Candida albicans: 5 Minimalmedium mit Serum (SD 7 Abschn. 3.1.1 mit 10 % Kälberserum) oder Spider-Medium bei 37 °C inkubieren 5 mikroskopische Kontrolle erfolgt, wenn die Hefen in Induktionsmedium überführt werden Kreuzung von Ustilago maydis: 5 Aktivkohle-haltiges Nährmedium mit beiden Stämmen beimpfen 5 filamentöse Stadien werden als weißes Mycel sichtbar 5 die Kreuzung erfolgt auch auf der Pflanze, das Dikaryon kann dann direkt in das Gewebe der Maispflanze eindringen 5 dort könne nach zwei bis drei Wochen die typischen Tumoren mit den schwarzen Teliosporen beobachtet werden (7 Abschn. 3.2.3).

z Versuchsergebnis/Auswertung

In allen drei beschriebenen Systemen kann der Übergang von Hefe-Sprossung zu filamentösen Wuchsformen gezeigt werden; bei Ascomyceten können Pseudohyphen und

Hyphen, bei Basidiomyceten Hyphen dargestellt werden. Ein Pilz, der rein filamentös wächst, aber sehr nah mit Saccharomyces cerevisiae verwandt ist, ist Ashbya gossypii. Der Übergang von der einzelligen Hefeform in das Pseudohyphenwachstum bei Saccharomyces cerevisiae stellt ein Modell für die Bildung mehrzelliger Stadien dar. Das Pseudohyphenwachstum wird durch Stickstoffmangel ausgelöst, wenn gleich­ zeitig eine fermentierbare Kohlenstoffquelle vorhanden ist. Die meisten Hefen lassen sich durch Isoamylalkohol, aber auch in Vollmedium (YPD 7 Abschn. 3.1) zum fila­ mentösen Wachstum anregen. Ebenso geeignet ist das Überführen in ein Medium ohne Stickstoffquelle zum Erzeugen von Stickstoffmangel bei gleichzeitiger Butanol­ gabe (1 %). Damit entsteht eine Kette noch miteinander verbundener, eher länglich hefeförmiger Zellen, die mit einer gemeinsamen Chitinhülle als Filamente stabili­ siert werden. Die Pseudohyphenbildung kann mikroskopisch verfolgt werden, wenn die Hefen in Induktionsmedium überführt werden. Eine Färbung mit Calcofluor (7 Abschn. 3.2.2) zeigt die Chitin-haltigen Zellwände und die vollständigen Septen.

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E. Kothe

Die humanpathogene Hefe Candida albicans wird durch Wachstum bei 37 °C, durch Serum oder durch ein Induktionsmedium zur Hyphenbildung angeregt. Dagegen wächst sie auf YPD (7 Abschn. 3.1.1) oder Sabouraud-Medium bei 30 °C in der Hefeform. Als Induktionsmedium für das Hyphenwachstum kann Minimal­ medium mit Serum (SD 7 Abschn. 3.1.1 mit 10 % Kälberserum) oder Spider-Medium und Inkubation bei erhöhter Temperatur verwendet werden. Kreuzung von Ustilago maydis ist erforderlich, um die filamentöse Form dann auf Aktivkohle-haltigen Nährmedien zu erzeugen. Diese Wachstumsphase ist allerdings biotroph und lässt sich auf Nährmedien nicht weiter vermehren. Unter natürlichen Bedingungen erfolgt die Kreuzung auf der Pflanze; das Dikaryon kann dann direkt in das Gewebe der Maispflanze eindringen, sich dort vermehren und schließlich die typi­ schen Tumoren mit den schwarzen Teliosporen bilden (7 Abschn. 3.2.3). 3.3.3  Entwicklung asexueller Sporen

Haploide einzellige Stadien von Pilzen sind häufig die einkernigen asexuellen Sporen (. Abb. 3.14). Diese können zur Isolierung oder Mutagenese genutzt werden, sind aber auch für die Stammhaltung oder für mikroskopische Verfahren vorteilhaft. Hier wer­ den beispielhaft die unterschiedlichen Pilzgruppen behandelt. Anhand der gebildeten Sporentypen und ihrer Morphologie können viele Pilze bereits eingeordnet werden. Für die Form der Sporen existiert Bestimmungsliteratur. Arthrosporen entstehen, wenn das Mycel in Einzelzellen, häufig mit verdickter Zell­ wand, zerfällt. Dagegen werden dickwandige Chlamydosporen in Hyphen gebildet, oder sie entstehen durch Sprossung an der Hyphenspitze. Die Gruppe der Zygomyceten war zunächst als polyphyletisch beschrieben. Neuere Analysen anhand sehr großer Datensätze lassen aber den Schluss zu, dass diese Gruppe

. Abb. 3.14  Schematische Darstellung der Bildung von Conidien bei Aspergillus. Ausgehend von einer Hyphe wird eine etwas dickere Verzweigung angelegt, das Conidiophor. Dieses schwillt am Ende zu einem Vesikel an, von dem zunächst zwei weitere Zelltypen ausgehen, von denen sich schließlich die haploiden, einzelligen Conidiosporen zur axesuellen Verbreitung abschnüren. (© Erika Kothe, Jena)

145 Pilze

mit einigen basalen Pilzgruppen durchaus wieder zusammengefasst werden könnte. Die echten Zygomyceten umfassen beispielsweise den Brotschimmel, Rhizopus stolonifer oder die Mucor-Arten. Auch Pilobolus gehört zu dieser Gruppe. Ascomyceten bilden typische Conidiosporen; humanpathogene Hautpilze bil­ den häufig keine sexuellen Vermehrungsformen. Sie werden daher zu den imperfekten Pilzen, den Deuteromyceten gerechnet. Phylogenetisch handelt es sich um Ascomy­ ceten. Die Gattungen Aspergillus und Penicillium, aber auch die auf Brandflächen vor­ kommende Art Neurospora crassa, haben sich aufgrund ihrer leichten Vermehrbarkeit durch Conidiosporen als Modellsysteme durchsetzen können. Die Conidienträger ent­ stehen am Luftmycel und bilden ein apikales Vesikel, von dem aus zunächst die Metulae und an diesen, z. B. bei Aspergillus, die Phialiden genannten Zellgenerationen köpfchen­ förmig abgehen. An jeder dieser Strukturen entsteht dann in einem der Sprossung ähn­ lichen Prozess eine lange Kette von Conidiosporen. Diese sind dickwandig, einkernig und hydrophob, sodass sie leicht mit dem Wind verbreitet werden. Sie können unter geeigneten Bedingungen auskeimen und ein neues, haploides Mycel bilden. Für A. nidulans sind die Gene, die zur Bildung von Conidiosporen notwendig sind, gut charakterisiert. Eine aufeinanderfolgende Signalkette (kodiert von den Genen abacus, bristle und wet) ist notwendig, um den kompletten Zyklus der Conidienbildung zu durchlaufen. Fällt einer dieser Regulatoren aus, werden Conidienträger gebildet, bei denen die Entwicklung im entsprechenden Stadium stehen bleibt. Auch viele Basidiomyceten sind in der Lage, asexuelle Sporen zu bilden. Hier han­ delt es sich zumeist um Oidien, die wie Arthrosporen durch Zerfallen der Hyphen in Einzelzellen entstehen. Allerdings verdickt sich bei ihnen die Zellwand nicht. i Benötigtes Material

5 Mikroskop, Binokular 5 zu untersuchende Pilze in Reinkultur, z. B. Rhizopus, Mucor, Pilobolus als Zygomyceten oder Penicillium, Aspergillus, Neurospora, Botrytis, Fusarium etc. als Ascomyceten 5 von Pflanzenmaterial können Rostpilze abgenommen werden. Medium für viele Zygomyceten (Potato-Agar): Bestandteil

Menge

Kleingeschnittene Kartoffeln

300 g

In 500 ml Wasser ca. 1 h kochen Durch Mull filtern und auf 1 l auffüllen Vor dem Autoklavieren zugeben: Glukose

20 g

Agar

5 g

Hefeextrakt-Glukose-Medium Bestandteil

Menge (%)

Glukose

2,5

Hefeextrakt

0,5

Agar

1,5

3

146

E. Kothe

Saboraud-Dextrose-Medium

3

Bestandteil

Menge (%)

Glukose

4

Pepton

1

Agar

1,5

Medium für Aspergillus 7 Abschn. 3.1.2

Kulturmedien sowie die erforderlichen Reinkulturen sollten bereitgehalten werden. Um Kontamination des Labors zu vermeiden, sollten alle Arbeiten mit Conidien-bilden­ den Pilzen in einer sterilen Werkbank durchgeführt werden. Vorgehensweise Arthrosporen und Chlamydosporen: 5 Evt. Lactophenol-Baumwollblaufärbung (7 Abschn. 3.2.2) 5 Vermehrung ist auf Saboraud-Dextrose-Medium möglich. Conidien der Schimmelpilze: 5 Tesafilm-Präparate (7 Abschn. 3.2.1) zur Mikroskopie 5 Licht für die Condienbildung 5 Conidienträger können nur am Luftmycel gebildet werden, also weder am Substratmycel noch in einer Flüssigkultur.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Neben den sexuellen Zygosporen (s. u.) bilden die Zygomyceten Sporangien, also in einer Struktur zusammengelagerte asexuelle Sporen. Diese kleinen, schwarzen Köpf­ chen sind auf dem schnell wachsenden Mycel des Brotschimmels gut auszumachen. Die Sporangienträger werden an der Substratoberfläche gebildet. An einer end­ ständigen Verdickung entsteht das Sporangium, sodass die Sporen leicht verbreitet werden können. Die Conidienbildung der Ascomyceten kann auf geeigneten Nährmedien beobachtet werden. Die Mikroskopie im Durchlicht bzw. mit dem Stereomikroskop zeigt die artspezifischen Strukturen der asexuellen Sporenbildung. Auch geteilte oder verdickte Arthro- oder Chlamydosporen können für eine Artbe­ stimmung anhand geeigneter Bestimmungsliteratur herangezogen werden. 3.3.4  Nachweis der Einflüsse von Licht, Tagesrhythmen und

Kreuzung bei der Bildung asexueller Sporen

Nicht nur die Nutzung der häufig einkernigen asexuellen Sporen für die Isolierung oder die Mutagenese ist interessant, sondern es können auch die Bedingungen der Bildung oder Tagesrhythmen beobachtet werden. Diese werden hier beschrieben. Dabei werden die unterschiedlichen Pilzgruppen behandelt.

147 Pilze

Die phototaktischen und geotaktischen Bewegungen sowie das Abschleudern von Sporangien zum Licht werden für Zygomyceten beispielhaft gezeigt. Ascomyceten besitzen mehrere haploide Kerne pro Zellkompartiment (vgl. 7 Abschn. 3.3.5). Falls es sich um ein Heterokaryon handelt mit Kernen, die nach einer Kreuzung verschiedene Informationen für die Sporenfärbung tragen, können Köpfchen entstehen, an denen sich Ketten unterschiedlich gefärbter Conidiosporen befinden. Dies ist ein eindrucksvoller Nachweis der unterschiedlichen Kerne, aber auch der haploiden Natur der Conidiosporen. Mit N. crassa lassen sich grundlegende Mechanismen der Tagesrhythmik und ihrer Kontrolle nachweisen. Die Conidienbildung beginnt immer am frühen Morgen; im wei­ teren Wachstum ist dann das Substratmycel ohne aufgelagerte Conidienträger weniger deutlich sichtbar. Im Licht erfolgt diese Induktion im Rhythmus von 24 h. Es handelt sich um eine endogene Rhythmik, die sich auch im Dauerdunkel fortsetzt. Allerdings ist der endogene Rhythmus ca. 23 h lang. Wird nun unter Rotlicht täglich die Wachstumsfront markiert und das Röhrchen nach 7–10 Tagen ausgewertet, so zeigt sich eine schnellere Bildung der Banden mit Conidien als das Erreichen der täglichen Wachstumsfront. i Benötigtes Material

Für die Untersuchung der Sporangiophoren bei Zygomyceten: 5 ein sterilisiertes Spaghetti- oder Marmeladenglas 5 Alufolie 5 Rhizopus- bzw. Pilobolus-Stämme Für die Untersuchung der Conidienentwicklung bei Aspergillus: 5 Minimal-Medium für Aspergillus (7 Abschn. 3.1.2). Für die Untersuchung der Tagesrhythmik bei Neurospora: 5 Race tubes (Glasröhrchen mit an beiden Enden aufgebogenem Querschnitt; . Abb. 3.15). Hefeextrakt-Glukose-Medium Bestandteil

Menge (%)

Glukose

2,5

Hefeextrakt

0,5

Agar

1,5

Vogel-Medium Bestandteil

Menge (%)

L-Arginin

0,17

D-Glukose

0,1

Agar

1,5

Kulturmedien sowie die erforderlichen Reinkulturen sollten bereitgehalten werden.

3

148

E. Kothe

Inokulum

3

. Abb. 3.15  Race tubes zur Untersuchung der Tagesrhythmik bei Neurospora crassa. (© Erika Kothe, Jena)

Um Kontamination des Labors zu vermeiden, sollten alle Arbeiten mit Conidien-bil­ denden Pilzen in einer sterilen Werkbank durchgeführt werden. Vorgehensweise Phototropie und Geotropie: 5 In einem nicht zu flachen Gefäß (z. B. Marmeladenglas) am Boden Nähragar (PD 7 Abschn. 3.3.2) einbringen 5 Reinkultur animpfen 5 Glas von verschiedenen Seiten beleuchten bzw. auf die Seite legen 5 Ausrichtung der Sporangienträger beobachten Abschleudern der Sporangien zum Licht bei Pilobolus: 5 in einem hohen Glasgefäß, beispielsweise einem Spaghettiglas anziehen 5 mit Alufolie bis auf eine kleine Öffnung abdunkeln 5 Treffsicherheit um die Öffnung mit dem Lichteinfall beobachten und protokollieren Kreuzung unterschiedlicher Mutanten bei Aspergillus: 5 Mycelien der beiden Stämme im Abstand von ca. 1 cm auf eine Agarplatte (Hefeextrakt-Glukose-Medium oder Minimalmedium für A. nidulans) setzen 5 ca. einen Tag inkubieren 5 Im Stereomikroskop beobachten; besonders in der Zone der Interaktion können die gemischten Conidiophoren beobachtet werden. Circadiane Rhythmen bei N. crassa: 5 Race tubes mit 25 ml Vogel-Medium füllen 5 beidseitig mit Wattestopfen verschließen 5 nach dem Autoklavieren und Erkalten die Race tubes umdrehen, sodass sich der Agar auf dem Wasserfilm auf den neuen Boden dreht 5 das Röhrchen an einem Ende beimpfen und bei 28 °C im Dauerdunkel bebrüten 5 durch die nach unten weisenden Enden der Röhrchen wird CO2 abgeführt, das die Bandenbildung inhibieren würde.

149 Pilze

z Versuchsergebnis/Auswertung Die Auswirkungen externer Reize wie Licht oder Schwerkraft können ebenso gezeigt

werden wie die Conidienbildung oder endogene Rhythmen. Dies belegt eindrucksvoll, warum haploide Pilze sich für die Untersuchung von komplexen Entwicklungsvor­ gängen bei Eukaryoten besonders gut eignen. Die Sporangien der Zygomyceten sind auf einer Spitze gelagert und können bei Feuchtigkeit als Ganzes abgeschleudert werden. Die Wurfweite beträgt dabei bis zu einem Meter! Zudem ist die Ausrichtung der Sporangien zum Licht bemerkenswert. Die hier aufgeführten Methoden können einen ersten Ansatz erleichtern, wenn neue Methoden etabliert werden sollen. Hier können nur wenige Beispiele gezeigt werden; es sind aber viele weitere Untersuchungen grundlegender zellulärer Vorgänge denkbar. 3.3.5  Kreuzung bei Basidiomyceten am Beispiel von

Schizophyllum commune

Echte Saprobionten lassen sich leicht auf Nährmedium von Spore zu Spore durch den gesamten Lebenszyklus vermehren. Ektomykorrhizapilze (und damit die meisten Speise­ pilze), benötigen dagegen bisher unbekannte Wirtssignale zur Fruchtkörperinduktion. Als Modellsysteme haben sich Coprinopsis cinerea und Schizophyllum commune bewährt. Daher wird hier das Beispiel S. commune zur Erläuterung gewählt. Basidiomyceten sind normalerweise tetrapolar, besitzen also vier unterschied­ liche Interaktionstypen nach einer Kreuzung (. Abb. 3.16). Für eine erfolgreiche Kreu­ zung und anschließende Fruchtkörperbildung sind zwei unabhängige Genorte, A und B, erforderlich. Sind beide Stämme sowohl in A als auch in B verschieden (A ≠ B≠), erfolgt der Austausch der Kerne in einer Phase der Kernwanderung mit anschließen­ dem Wachstum aller Hyphenspitzen als Dikaryon mit der Bildung von Schnallen (7 Abschn. 3.2.1). Unter geeigneten Umweltbedingungen kann dann die Fruchtkörper­

. Abb. 3.16  Kreuzungsinteraktionen bei Schizophyllum commune; semikompatible (links, Mitte) und kompatible Interaktionen mit Fruchtkörperinitialen (rechts). Erklärungen der Interaktionstypen im Text. (© Erika Kothe, Jena)

3

150

3

E. Kothe

bildung erfolgen. Sind die Kreuzungpartner in beiden Genorten gleich (A = B =), wachsen die Mycelien unter Bildung von Anastomosen weiter, es erfolgt also kein Kernaustausch. Bei unterschiedlichen A-Genorten (A ≠ B=) ist ohne weitere Maßnah­ men eine markante Trennungslinie zwischen beiden Mycelien erkennbar, die barrageReaktion. Die Kreuzungspartner wachsen in entgegengesetzte Richtungen weiterhin als Monokaryon. Bei Unterschieden in den B-Loci ist für S. commune ein makroskopisch erkennbarer Phänotyp, das flat-Wachstum, erkennbar, das sich mikroskopisch durch angeschwollene Hyphen mit Ausstülpungen der Zellwand auszeichnet (A = B ≠). Hier erfolgt eine konstitutive Kernwanderung mit Auslösung und Neubildung von Septen, die dazu führt, dass in einem Zellkompartiment zwischen 0 und 20 Kerne vorliegen. Bei Coprinopsis cinerea ist, wie bei allen Tintlingen, die Meiose synchron, sodass hier Untersuchungen zur Meiose leichter durchgeführt werden können. i Benötigtes Material

5 Reinkulturen von haploiden Stämmen 5 Dikaryon 5 Medien für S. commune: CYM, MM 7 Abschn. 3.1.3.

Die Medien (7 Abschn. 3.1.1) sollten vorbereitet sein. Für diese Arbeiten sind Reinkulturen und steriles Arbeiten erforderlich. Vorgehensweise 5 Saprophytische Basidiomyceten können auf denselben Medien für eine Kreuzung angesetzt werden, die auch zur Kultivierung benutzt werden 5 zwei haploide Monokaryen (7 Abschn. 3.2.1) als Agarblöckchen ausschneiden 5 im Abstand von ca. 0,5 cm auf einer Agarplatte nebeneinander ausbringen 5 je nach Wachstum, bei S. commune nach 5–7 Tagen bei 28 °C auf CYM-Agarplatten, makroskopisch kontrollieren 5 von der Unterseite kann direkt auf der Platte mikroskopisch kontrolliert werden 5 dazu wird ein Objektiv mit großem Arbeitsabstand benötigt 5 Dikaryen werden mit einer Kernfärbung durch DAPI nachgewiesen (7 Abschn. 3.2.2) 5 Durch Abnahme von Hyphen oder eine Deckgläschenkultur werdem mit DAPI die Zahl der Kerne pro Kompartiment bestimmt 5 dünne Schnitte gelingen am besten mit einem Gefriermikrotom, sind aber auch mit der Hand als sehr dünne Scheibe quer zur gespaltenen Lamelle möglich 5 Schnitte können mit Lactophenol-Baumwollblau gefärbt werden (7 Abschn. 3.2.2)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Ein Dikaryon von S. commune wächst bei 24 °C oder Raumtemperatur nicht ganz radiärsymmetrisch und kann so makroskopisch bereits vom Monokaryon unter­ schieden werden. Zudem wird die Fruchtkörperbildung eingeleitet, was zunächst an Hyphenaggregaten erkennbar ist. Diese entwickeln sich weiter zu Primordien und schließlich den typischen Fruchtkörpern mit gespaltenen Lamellen (daher der Name Spaltblättling).

151 Pilze

Die pseudoparenchymatischen Strukturen, die die makroskopischen Frucht­ körper bilden, können in Stiel (bildet sich nur, wenn die Kulturen aufrecht gelagert werden), Gewebe (Huttrama), Huthaut und die sporentragende Schicht (Hymenium/­ Subhymendium mit Basidien und den jeweils vier Basidiosporen) unterschieden ­werden. Mikroskopisch sind diese Strukturen gut erkennbar. Die gespaltenen Pseudolamellen sind hygroskopisch, was ebenfalls im Binokular mit getrockneten und wieder benetzten Fruchtkörpern gezeigt werden kann. Im Hymenium bilden sich dann an den Basidien die sexuellen Basidiosporen. Der Aufbau des Hymenium aus spezialisierten Zellen sowie die vier meiotisch gebildeten Sporen an den Basidien können in Schnitten sichtbar gemacht werden. Eine Kernfärbung mit DAPI zeigt, dass die reifen Sporen zweikernig sind. Aller­ dings ist dies das Ergebnis einer mitotischen Kernteilung in der noch ungekeimten Spore, was mit Monosporisolaten (7 Abschn. 3.1.6) gezeigt werden kann. 3.3.6  Pilzkulturen und Fruchtkörperbildung bei Basidiomyceten

Die Pilzzucht ist insbesondere für saprophytische Basidiomyceten möglich. Dabei werden die Bedingungen in der Natur imitiert. Die entstehenden Fruchtkörper (. Abb. 3.17) entsprechen in Form und Mikromorphologie besser den in der Natur gesammelten als den auf Nähragar induzierten Fruchtkörpern und können daher für (mikro)morphologische Analysen besser genutzt werden. i Benötigtes Material

5 Reinkulturen 5 je nach Versuch: Nährmedien, Hirsesaat, Stroh etc.

Die Kultivierung auf der Fensterbank hat sich bewährt. Für Champignon oder Austernseitling reicht auch ein dämmriger Kellerraum. Die Medien (7 Abschn. 3.1.1) sollten vorbereitet sein.

. Abb. 3.17  Fruchtkörper von Schizophyllum commune mit den typischen, gespaltenen Lamellen in Laborkultur und aus der Natur. (© Erika Kothe, Jena)

3

152

E. Kothe

Weitere Medien zu Fruchtkörperproduktion werden hier beschrieben oder sind der weiterführenden Literatur zu entnehmen. Für diese Arbeiten sind Reinkulturen und steriles Arbeiten erforderlich.

3

Vorgehensweise Fruchtkörperbildung am hängenden Ast: 5 für holzzersetzende Weißfäulepilze werden Hirsesamen dreimal in Aqua dest. gewaschen 5 anschließend in Wasser autoklavieren 5 die sterilisierten und gleichzeitig aufgequollenen Samen in ein Nylonsäckchen, in Gaze oder Moskitonetz füllen und mit einer Vorkultur eines Dikaryons in Flüssigmedium (S. Abschn. 3.1.1) einrollen 5 die Wurst-ähnliche Form mit abgebundenen Zipfeln in einer mit 70 % Ethanol ausgewaschenen Plastikbox aufhängen 5 der Deckel darf nicht vollständig geschlossen sein 5 den Boden der Box mit Papier auslegen, das ständig feucht gehalten werden muss 5 zum Anfeuchten sollte autoklaviertes Leitungswasser benutzt werden, da die Fruchtkörperbildung bis zu zwei Wochen benötigen kann und anderenfalls Schimmelpilze die Kultur leicht verunreinigen 5 bei ca. 24 °C in einer milchigen, hellen PVC-Box auf der Fensterbank inkubieren, da Licht die Fruchtkörperbildung induziert. Kultivierung in Plastikbeuteln, geeignet beispielsweise für den Austernpilz (Pleurotus ostreatus): 5 Pilzinokulum ca. 3–5 Wochen im geschlossenen, strohgefüllten, feuchten Plastikbeutel inkubieren 5 wenn das Substrat mit einem sichtbaren Mycel überzogen ist, Schnitte auf einer Seite des Beutels ausführen 5 durch die abgesenkte CO2-Konzentration bilden sich Fruchtkörper 5 die Pilze wachsen aus den eingeschnittenen Löchern des Plastiksacks in die Luft. Kultivierung auf vergorenen Pferdeäpfeln, z. B. für den weißen Champignon (Agaricus bisporus) 5 Pferdemist-Kompost, der auf eine Temperatur von 18–20 °C abgekühlt ist, in ca. 60 cm hohe Beete in einem kühlen (ca. 16 °C) und zugfreien Raum (beispielsweise im Keller) füllen 5 die Beete in 6 cm tiefen Löchern mit Pilzmycel beimpfen 5 das Beet mit Stroh abdecken 5 nach ca. 2–4 Wochen ist das Mycel durch das Substrat gewachsen, und das Stroh kann entfernt werden 5 die Pilzernte erfolgt nach weiteren 2–4 Wochen in regelmäßigen Zeitabständen (flushes, unterschiedliche Zeitabstände je nach Art). Kultivierung auf Baumstämmen, z. B. für Shiitake (Lentinula edodes): 5 4–5 Monate alte Äste für mindestens 2 Tage wässern (ganz untertauchen!) 5 eine Scheibe 5–10 cm unter der Oberkante abschneiden

153 Pilze

5 5 5 5

Pilzmycel aufbringen und die Baumscheibe wieder aufnageln Baumscheibe rundherum mit Isolierband abdichten Stämme aufrecht im Schatten aufstellen und bei Bedarf wässern nachdem das Mycel den Stamm durchwachsen hat, erfolgt die Produktion von Pilzfruchtkörpern über etwa zwei Jahre hinweg in regelmäßigen Schüben (flushes).

z Versuchsergebnis/Auswertung

Auf flüssigen Medien vorgezogene Dikaryen können unter den korrekten Umwelt­ bedingungen Fruchtkörper bilden und sind somit für die Pilzzucht geeignet. Wichtig ist es, ein Substrat zu wählen, das dem natürlichen Vorkommen entspricht. So können Weißfäulepilze auf Holz, Braunfäulepilze auf Stroh oder Papier, Boden­ pilze auf Kompost angezogen werden. Die Fruchtkörperbildung kann aber nur mit saprophytischen Pilzen gelingen, die keine Signale eines Wirts benötigen, um die Fruchtkörperbildung zu induzieren. Zu beachten ist außerdem, dass nicht alle Dikaryen gleich gut zur Bildung von Fruchtkörpern in der Lage sind, sodass der Anbau verschiedener Genotypen sinn­ voll sein kann. Diese sollten aber nicht gemischt werden, da sich diese Dikaryen im Wachstum oft gegenseitig negativ beeinflussen. 3.3.7  Kreuzung filamentöser Ascomyceten am Beispiel von

Aspergillus nidulans

Die Kreuzung bei filamentösen Ascomyceten wird am Beispiel von Aspergillus nidulans (Teleomorph Emericella nidulans) vorgestellt. Die Kreuzungstyploci A und a müssen bei den Kreuzungspartnern zusammenkommen, um Asci und kugelförmige, geschlossene Fruchtkörper, die Cleistothecien, zu bilden. Die Genorte sind nicht homolog, weshalb sie nicht als Allele, sondern als Idiomorphe bezeichnet werden. Die vorgegebene Struktur der Asci, in der die Meioseprodukte und eventuell durch weitere Mitosen entstehende haploide Sporen eingeschlossen sind, erlaubt eine ein­ fache Analyse meiotischer Prozesse wie der Rekombination. Daher ist die Ascusanalyse eine wichtige Methode, Rekombinationsvorgänge oder Abstände von Genen auf einem Chromosom zu analysieren. A. nidulans bildet achtsporige Asci, die jedoch so klein sind, dass eine Ascusanalyse schwierig ist. Daher werden hier für genetische Untersuchungen die Ascosporen plattiert und die Phänotypen ausgezählt. Geeignet sind Farbmarker der Conidiosporenbildung wie wA und ya, die weiße bzw. gelbe Conidiosporen bilden, sodass das Ergebnis der Neukombination durch Kreuzung die Aufspaltung nach den Mendel’schen Regeln zeigt. i Benötigtes Material

5 Nährmedien 5 Brutschrank 5 Mikroskop

3

154

E. Kothe

Minimalmedium zur Kreuzung von Aspergillus:

3

Bestandteil

Menge

Glukose

20 g

Agar

15 g

Salzstammlösung

20 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

Salzstammlösung: NaNO3

120 g

MgSO4 × 7 H2O

10,4 g

KH2PO4

30,4 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Für die auxotrophen Stämme vor der Kreuzung, falls benötigt, 1 ml Vitaminstammlösung(en) zugeben Vitaminlösungen (je nach Bedarf, z. B.): Pyridoxalphosphat

0,1 g

p-Aminobenzoësäure

0,1 g

Aqua dest. ad

Jeweils 100 ml

Medium mit Leitungswasser herstellen (falls Aqua dest. benutzt wird, müssen Spurenelemente zugegeben werden) pH wird vor dem Autoklavieren mit NaOH auf 6,5 eingestellt

Steriles Arbeiten ist erforderlich, solange Kulturen angelegt werden. Die Mikroskopie kann unsteril erfolgen. Vorgehensweise 5 Kreuzung auf Minimalmedium ansetzen 5 dazu beide Stämme alternierend im Abstand von ca. 2 cm um den Rand einer Petrischale mit Vitaminzugabe animpfen 5 nach zwei Tagen können aus dem Bereich, in dem die Mycelien sich berühren, Agarblöckchen auf Minimalmedium ohne Vitamine überführt werden 5 nach weiteren 7–14 Tagen haben sich Cleistothecien (ca. 0,5 mm Durchmesser) gebildet, die zunächst von gelben Hülle-Zellen umgeben sind, bei Reife aber glänzend schwarz aussehen 5 Cleistothecium mit einer sterilen Impfnadel entnehmen und auf einer Agarplatte so lange rollen, bis die anhaftenden Mycelfragmente und Hüllezellen entfernt sind 5 Cleistothecium am Rand eines Eppendorfröhrchens in 500 µL sterilem Wasser mit der Impflanzette zerdrücken 5 durch die dabei austretenden Ascosporen färbt sich die Lösung rot 5 die Ascosporen können in unterschiedlichen Verdünnungen (z. B. 1:50) ausplattiert und die Phänotypen durch Überimpfen auf frische Nährmedien charakterisiert werden.

155 Pilze

yA

wA weiße Sporen

gelbe Sporen

grüne Sporen

. Abb. 3.18  Darstellung des Wegs der Pigmentsynthese in der Conidiosporenentwicklung bei Aspergillus nidulans mit den verantwortlichen Genen und resultierender Condienfarbe. (© Erika Kothe, Jena)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Der Wildtyp bildet grüne Conidiosporen. Durch Mutationen in wA, dem ersten Enzym der Pigmentsynthese, oder in yA, dem zweiten Synthesegen, entstehen weiße und gelbe Sporen (. Abb. 3.18). Die Phänotypen sind im Syntheseweg von weiß über gelb zu grün in einer genetischen Ordnung, der Epistasis angeordnet. Bei mindestens 100 ausgezählten Kolonien in dieser Kreuzung sollten 50 % weiße, 25 % gelbe und 25 % grüne Kolonien auftreten. Es sollte beachtet werden, dass auch ohne Kreuzung Asci entstehen können, sodass Asci nur eines Elternteils auftreten können. Bei Kombination mit weiteren Markern, beispielsweise einem Defekt in der Syn­ these von p-Aminobenzoësäure, kann Kopplung (gemeinsames Auftreten des gel­ ben Farbmarkers mit dem Auxotrophiemarker) nachgewiesen werden. Im Fall gekoppelter Gene ist dann ein Auszählen der Rekombinationsfrequenz möglich (die gelben Kolonien können auf Minimalmedium wachsten, tragen also den Auxotro­ phiemarker nicht; in diesem Beispiel zwischen 10 und 15 %). Dabei entspricht 1 % Rekombinationshäufigkeit einem genetischen Abstand von 1 cMorgan. 3.3.8  Tetradenanalyse bei Sordaria fimicola

Für eine echte Tetradenanalyse im geordneten Ascus können Arten der Gattung Sordaria, aber auch andere wie Podospora herangezogen werden. Acht Ascosporen sind durch eine postmeiotische Mitose entstanden und repräsentieren damit in jeder haploiden Spore einen DNA-Einzelstrang, der in der diploiden Zygote vorlag. Die erste meioti­ sche Teilung führt zu einer Verteilung der Chromosomen, die nach der ersten meioti­ schen Teilung erhalten bleibt, da im Ascus die Teilungsprodukte nicht mehr aneinander vorbei wandern können. Ist keine Rekombination erfolgt, liegen demnach vier Sporen der einen und vier der anderen Farbe nebeneinander (4:4-Verteilung; . Abb. 3.19). Als aberranter Typ werden Verteilungen mit 2:2:2:2 bezeichnet, bei denen ebenfalls vier Sporen einer Farbe und vier der anderen Farbe auftreten, die aber nicht direkt nebeneinander liegen. Nicht gekoppelte Gene bringen dabei gleich viele Verteilungen in 4:4-Verteilung des parentalen Typs (nur graue und braune Sporen) oder durch Rekombination hervorgegangene Asci (je vier durchsichtige und schwarze Sporen) her­ vor. Eine Kopplung (also Lage auf demselben Chromosom) liegt vor, wenn diese Zahlen von 50 % statistisch signifikant abweichen. Bei S. fimicola fehlt die asexuelle Conidienbildung, sodass die Gefahr einer Ver­ unreinigung mit Conidiosporen gering ist. Ebenfalls gut geeignet ist S. macrospora. Anhand von Sporenfarben, die durch einfache Mutationen verursacht werden, können die Ergebnisse einer Kreuzung sowie die genetische Kartierung direkt beobachtet wer­ den. Prinzipiell ist die Ascusanalyse aber mit jedem Ascomyceten mit geordneten Asci durchführbar.

3

156

E. Kothe

ohne Crossover

3

mit Crossover

. Abb. 3.19  Schematische Darstellung von Tetraden in den Asci (hellblauer Hintergrund, jeweils oben) und den acht DNA-Einzelsträngen der vier Chromatiden mit und ohne crossing over zwischen dem Centromer (blaue Markierung auf den Zeichnungen der DNA-Stränge, jeweils untere Bildhälfte) und einem Farbmarker der Sporen. Durch die Lage im Ascus ist nach der ersten meiotischen Teilung kein Platztausch mehr möglich, sodass die Reihenfolge der Sporen im Ascus der Lage der Chromosomen vor der Meiose entspricht. (© Erika Kothe, Jena)

i Benötigtes Material

5 Geeignete Nährmedien 5 Brutschrank 5 Mikroskop Maismehl-Agar Bestandteil

Menge

Maismehlagar

17 g

Saccharose

10 g

Glukose

7 g

Hefeextrakt

1 g

KH2PO4

0,1 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Die Kreuzung benötigt einige Zeit. Die Dauerpräparate der Asci sind allerdings einige Monate bei 4 °C haltbar. Für längere Lagerung empfiehlt sich ein Einbettungsmedium, das desinfizierend wirkt. Reinkulturen und steriles Arbeiten sind erforderlich, solange Kulturen angelegt wer­ den. Die Mikroskopie kann unsteril erfolgen.

157 Pilze

Vorgehensweise 5 Die Kreuzung von Sordaria-Stämmen mit grauen bzw. braunen Sporen erfolgt auf einer Maismehl-Agarplatte 5 bei den schnell wachsenden Ascomyceten Mycelblöckchen des einen Kreuzungspartners in die Mitte zweier gegenüberliegenden Quadranten setzen, in die verbleibenden beiden Quadranten Inokula des anderen Kreuzungspartners setzen 5 nach etwa sieben Tagen bei 25 °C werden die ersten Sporen ausgeschleudert 5 Perithecien (birnenförmige Fruchtkörper mit einer zentralen Öffnung) aus der Region der Interaktion beider Stämme mit einer Präpariernadel abnehmen 5 unter einem Deckgläschen bei leichtem Druck öffnen 5 darauf achten, dass die Asci um eine Basis herum möglichst frei liegen 5 die acht Sporen pro Ascus sollten deutlich sichtbar und die Färbung leicht erkennbar sein 5 Mikroskopie 7 Kap. 5 5 Sporenfarben der acht Sporen in den verschiedenen Asci auszählen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die genetischen Distanzen zwischen zwei Markergenen bzw. zwischen jedem Marker­ gen und dem Centromer werden aus den Zahlenverhältnissen abgelesen. So können genetische Distanzen bestimmt werden. Eine aberrante 4:4-Verteilung (2:4:2 oder 2:2:2:2 mit nur jeweils zwei Sporen­ farben) deutet auf Rekombination zwischen dem Centromer und dem genetischen Marker hin. Eine Verteilung 2:2:2:2 mit vier Sporenfarben (Tetratyp) bedeutet bei gekoppelten Genen dagegen, dass die Rekombination zwischen den Markern und dem Centromer erfolgt sein muss. Damit kann der Abstand der beiden Gene vom Centro­ mer bestimmt werden. Die Angabe in cMorgan ist die Rekombinationsfrequenz. Die Zahl der von diesen Verteilungen abweichenden Asci mit 5:3- oder 6:2-Ver­ teilungen zeigt eine Genkonversion an. Diese kann durch Auflösen der cross-over in einer Holliday-Struktur über dem Marker oder durch Reparatur eines Doppel­ strangbruchs erfolgen. In jedem Fall ist durch Reparaturvorgänge Information auf einem bzw. zwei DNA-Strängen durch Kopieren des Schwesterstrangs oder Schwesterchromatids ersetzt worden, sodass sich hier sofort die Wirksamkeit der Rekombination zur Neukombination von Genen in der Meiose ablesen lässt. 3.4  Lokalisierungen von Proteinen und Zellkomponenten in situ 3.4.1  Färbungen für den Nachweis von Enzymen und

Naturstoffen

Viele physiologische Untersuchungen ähneln denen bei Bakterien. Hier werden daher nur solche vorgestellt, die für bestimmte Pilze typisch sind – wie etwa der Ligninabbau für Weißfäule- und Braunfäulepilze. Der Nachweis der Enzymproduktion in einer bestimmten Entwicklungsstufe oder spezialisierten Hyphen sind bei Pilzen oft ein wich­ tiger Hinweis auf die Funktion. Daher werden sie hier gesondert mit den für Pilzen wichtigen Vorbedingungen dargestellt.

3

158

E. Kothe

i Benötigtes Material

5 Inkubation je nach Pilz zwischen 20 und 37 °C in Inkubatoren oder an einem nicht zu hellen Platz bei Raumtemperatur Syringaldazin

3

Bestandteil

Menge

4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyd (Azin)

Gesättigte Lösung

Ethanol

96 %

Azin in als gesättigte, ethanolische Lösung herstellen ABTS-Reagenz Bestandteil

Menge

2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonsäure

0,1 %

In Aqua dest. lösen Modifiziertes Melin-Nokrans-Medium ohne Kohlenstoffquelle (MMNb-C) Bestandteil

Menge

CaCl2

0,05 g

NaCl

0,025 g

KH2PO4

0,5 g

FeCl3-Lösung

100 μl

Thiamin

83 µg

(NH4)2HPO4

0,25 g

MgSO4 × 7 H2O

0,15 g

Glucose

0,5 g

Casein-Pepton

1 g

Agar

20 g

Aqua dest. ad

990 ml

Fortin-Lösung

10 ml

Fortin-Lösung erst in abgekühltes Medium zugeben! FeCl3-Lösung: FeCl3 × 6 H2O

0,1 mg

Aqua dest. ad

1 ml

Fortin-Lösung: KCI

3,728 g

H3BO3

1,546 g

MgSO4 × H2O

0,845 g

ZnSO4 × 7 H2O

0,575 g

159 Pilze

Bestandteil

Menge

CuSO4 × 5 H2O

0,125 g

Aqua dest. ad

1000 ml

In der angegebenen Reihenfolge lösen! Als C-Quellen können 40 g/l Cellulose oder Chitin, 2,5 g/l Lignin oder 5 g/l Pektin zugegeben werden Eisenfreies AM-CAS-Medium Bestandteil

Menge

Glukose

10 g

L-Asparagin

0,5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4 × 7 H2O

0,2 g

Agar

18 g

Aqua dest. ad

900 ml

pH 6,8 einstellen Nach dem Autoklavieren werden extra autoklavierte Lösungen zugegeben: Fe-CAS-Indikator: CAS

60,5 mg

Aqua dest. ad

50 ml

Eisenchloridlösung: FeCl3 × 6 H2O

2,7 mg

Aqua dest. ad

10 ml

Angesäuert mit einigen Tropfen 10 mM HCl Hexadecyltrimethylammonium: HDTMA

72,9 mg

Aqua dest. ad

40 ml

Weitere Medien zur Kultivierung 7 Abschn. 3.1.1; die Färbungen können unsteril aus­ geführt werden. Färbereaktionen sind durch viele weitere Enzymtests möglich. Vorgehensweise Abbau von Polymeren: 5 minimales Nährmedium ohne Kohlenstoffquelle wie modifiziertes Melin-Nokrans-Medium (MMNb-C) 5 Agarblöckchen auf entsprechendes Medien überimpfen und täglich kontrollieren 5 auch unterschiedliches Wuchsverhalten oder veränderte Hyphenmorphologie protokollieren.

3

160

3

E. Kothe

Colorimetrischer Nachweis von Enzymaktivität in situ: 5 Laccase kann nach Übertragen eines Mycelblöckchens auf MMNb-Medium mit 0,5 % ABTS durch eine blaue Farbreaktion sichtbar gemacht werden (. Abb. 3.20) 5 Enzymproduktion hier in Fruchtkörperprimordien durch tägliche Kontrolle verfolgen. 5 Andere Farbreaktionen können ebenso genutzt werden. Nachweis von Laccasen in Fruchtkörperschnitten: 5 Champignons oder Speisepilzen (gekauft oder gesammelt) in ca. 5 mm dicke Scheiben schneiden 5 mit Syringaldazin oder ABTS-Lösung befeuchten Exkretion von Siderophoren: 5 AM-CAS-Medium wird beimpft und die Farbreaktion verfolgt 5 Sollte der Pilz nicht auf dem CAS-Medium wachsen, geteilte Platten herstellen: 5 AM herstellen und Platten gießen 5 nach dem Erstarren wird die halbe Platte entfernt und unter sterilen Bedinungen durch das CAS-haltige Agarmedium ersetzt.

z Versuchsergebnis/Auswertung Auf Polymeren als Kohlenstoffquelle wie Pektin, Lignin, Chitin oder Cellulose

wachsen auch einige Bakterien. Pilze können auf dem Medium gerade so viel Ener­ gie gewinnen, dass sie als sehr feines Mycel wachsen. Ein besseres Wachstum und die Bildung von Luftmycel ist dagegen nur durch den Abbau des Polymers möglich. Durch die notwendige vermehrte Sekretion von Exoenzymen, die auch mit einer Färbung von Exozytosevesikeln belegt werden kann, kommt es bei einigen nicht gut angepassten Pilzen oft zum Abbau von Zellwandmaterial und damit zur Deformation der Hyphenwände. Zum Nachweis der Laccaseaktivität in bestimmten Strukturen der Fruchtkörper oder in Kulturen der Pilze wird Syringaldazin oder ABTS eingesetzt. Eine Farb­ reaktion zu rosa für Syringaldazin oder blau-grün für ABTS zeigt Laccaseaktivität. Die (besonders) aktiv exkretierenden Zellverbände können so identifiziert werden. Beim Nachweis der Siderophorenproduktion auf geteilten Agarplatten mit CAS-Reagenz macht man sich das filamentöse Wachstum zunutze. Damit kann ein Animpfen auf der Seite ohne toxische Produkte erfolgen, das diffundierende Hydro­ xamat wird dennoch zur Seite mit Nachweisreagenz gelangen. Ein Farbumschlag von dunkelblau zu orange zeigt die Produktion von Hydroxamat-Siderophoren an.

. Abb. 3.20  Colorimetrische Messung der Laccaseaktivität in einem miniaturisierten Ansatz in Mikrotiterplatten. (© Soumya Madhavan, Jena)

161 Pilze

. Abb. 3.21  Immunfluoreszenzfärbung von Actin (rot), Tubulin (grün) kombiniert mit DAPI (blau) und Calcofluor (dunkelblau) bei Schizophyllum commune. (© Elke-Martina Jung, Jena)

3.4.2  Immunologischer Nachweis von Proteinen

Durch den Nachweis von Proteinen in situ mit der Hilfe von Antikörpern lassen sich heterolog oder homolog exprimierte Genen lokalisieren (. Abb. 3.21). Dies lässt Schlüsse auf die Funktion der Proteine als Strukturprotein oder Enzym, als Transport­ protein an Vesikeln, als Membranprotein o. ä. zu. Voraussetzung sind verfügbare Anti­ seren mit ausreichender Spezifität oder Klonierung von Fusionsproteinen mit geeigneten Epitopen (z. B. His- oder HA-tag). Dazu kann analog der Expression von grün-fluores­ zierendem Protein GFP im nächsten Kapitel verfahren werden. i Benötigtes Material

5 Vorkulturen 5 Gefrierschrank -20 °C PIPES-Magnesium-EGTA-Puffer (PME) Bestandteil

Menge

PIPES, pH 6,7

50 mM

EGTA, pH 8

25 mM

MgSO4

5 mM

Enzymlösung zur Zellwandlyse Bestandteil

Menge

Lysing Enzyme (T. harzianum Sigma)

30 mg

PME

500 μl

Eiklar

500 μl

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E. Kothe

Phosphatpuffer-Saline (PBS)

3

Bestandteil

Menge

NaCl

137 mM

KCl

2,68 mM

Na2HPO4

8,45 mM

KH2PO4

1,47 mM

Permeabilisierungslösung Bestandteil

Menge

Triton X100

0,3 %

In PBS ansetzen Antikörper Bestandteil

Spezifität

1. Antikörper

Maus-anti-α-Tubulin (Sigma T9026) Kaninchen-anti-Actin (Sigma A2066)

2. Antikörper

Cy3-markiertes Anti-Kaninchen-Serum (Sigma C2306; Fluoreszenzfilterset F15, 24) FITC-markieres Anti-Maus-Serum (Sigma F4018, Fluoreszenzfilterset F10, 24)

Einbettungsmedium Bestandteil

Menge

Tris/HCl, pH 8

0,1 M

Glycerin

50 %

Phenylendiamin

1 mg/ml

DAPI

0,1–1 µg/ml

Da viele Tiere, die in der Antikörperproduktion eingesetzt werden, im Präserum bereits Antikörper gegen Pilze besitzen, ist eine Negativkontrolle unerlässlich! Vorgehensweise Antikörpernachweis in einer Plattenkultur in situ: 5 Kultur auf einem geeigneten Agarmedium direkt auf einer Nylonmembran animpfen 5 die Membran in den gewünschten Wachstumsstadien von der Agarplatte entfernen und weiter wie bei einem Westernblot (7 Abschn. 4.4.3) behandelt 5 ein Lyseschritt mit Zellwand-lytischen Enzymen oder mehrfaches Einfrieren und Auftauen können zur Freisetzung intrazellulärer Proteine angewandt werden.

163 Pilze

Antikörpernachweis unter einer Mycelmatte: 5 im Mixer 50 ml Flüssigmedium mit einem bewachsenen Agarblock von ca. 3 cm Durchmesser für 20 s mazerieren 5 Nylonmembran in einer Glaspetrischale autoklavieren und ohne weiteres Nährmedium mit dem Mazerat bedecken 5 nach 1–3 Tagen bildet sich auf der Membran ein vernetztes Mycel, sodass die Membran entweder auf Nähragar transferiert werden kann oder flüssiges Nährmedium unter die Membran gefüllt werden kann (Arbeiten in der sterilen Werkbank!) 5 nach Erreichen des gewünschten Wachstumsstands wird die Mycelmatte von der Nylonmembran abgehoben und die anhaftenden Mycelfragmente wie oben lysiert und wie beim Westernblot beschrieben (7 Abschn. 4.4.3) weiter behandelt. Immunfluoreszenzmikroskopie (spezifisch für Pilze): 5 kleine (ca. 1–2 mm Durchmesser) Mycelflöckchen oder eine Deckgläschenkultur (7 Abschn. 3.2.1) entnehmen 5 90 min in PME mit 3,7 % Formaldehyd fixieren 5 10 min mit PME waschen 5 Zellwand-lytische Enzyme für 20 min inkubieren (diese Zeiten sowie das optimale Enzymgemisch können für verschiedene Pilze sehr unterschiedlich sein; daher Zeitreihen untersuchen!) 5 zur Permeabilisierung für 5 min in Permeabilisierungslösung legen 5 anschließend 10 min bei -20 °C in Methanol inkubieren 5 zweimal für 15 min in PBS waschen 5 Inkubation mit dem ersten Antikörper (für anti-Actin oder anti-Tubulin 1:50, in PBS) über Nacht bei 4 °C 5 dreimal Waschen für je 10 min mit PBS 5 60 min mit sekundärem Antikörper (1:100 in PBS) bei 37 °C im Dunkeln inkubieren 5 dreimal jeweils 10 min in PBS waschen 5 Proben in Einbettungsmedium zur Mikroskopie vorbereiten und im Bedarfsfall bei 4 °C aufbewahren.

z Versuchsergebnis/Auswertung Der Nachweis von Proteinen in situ erlaubt die Zuordnung zu verschiedenen

Differenzierungsvorgängen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist hier für S. commune dargestellt; sie kann aber auch sehr gut an keimenden Conidiosporen oder an Hefen durchgeführt werden. Für Hefen wird Zymolyase als Zellwand-lysierendes Enzym eingesetzt. 3.4.3  Fluoreszenz-Videomikroskopie bei Pilzen

Durch den direkten Nachweis von Proteinen in der Zelle kann eine Lokalisierung in Echtzeit oder in Zeitrafferaufnahmen während des Zellzyklus oder unter ent­ sprechenden Signalen in der Zelle verfolgt werden (. Abb. 3.22). Auch die Interaktion

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164

E. Kothe

3

. Abb. 3.22  Lokalisierung des Pheromonrezeptors in unfusionierten Schnallenzellen von Schizophyllum commune. Um die unfusionierten Schnallen sichtbar zu machen, wurden die Kerne mit DAPI gefärbt. Durch die grüne GFP-Fluoreszenz ist eine Co-Lokalisierung mit einem Kern anhand der überlagerten Gelbfärbung in einer Schnalle möglich. (© Susann Erdmann, Jena)

von Proteinen kann mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Dazu müssen Stämme verwendet werden, die grün-fluoreszierendes Protein (GFP) oder ein anderes fluoreszierendes Protein exprimieren. Besonders die Fusion an das Zielprotein erlaubt ein Verfolgen, beispielsweise des Transports eines Transkriptionsfaktors nach Erkennen des entsprechenden Signals in den Kern. i Benötigtes Material

5 Fluoreszenzmikroskop 5 Transformation und gentechnischen Methoden (7 Abschn. 3.5)

Die entsprechenden Stämme müssen vorliegen. Hier ist die Transformation (7 Abschn. 3.5) von GFP-markierten Proteinen notwendig. Anschließend kann die Fluoreszenz(Video-)Mikroskopie durchgeführt werden (7 Kap. 5). Vorgehensweise Integrationsvektor: 5 Ektopische Integration erfordert keine Sequenzhomologie 5 Marker kann ein Resistenzgen (z. B. Hygromycinresistenz) sein 5 Falls Biosynthesemutanten vorliegen, können komplementierende Gene als Marker kloniert werden (z. B. Uracil- oder Aminosäurebiosynthese)

165 Pilze

Homologe Integration und Knock-out: 5 in der Hefe S. cerevisiae reichen 20–40 bp identische Sequenz 5 dies ist bei Ascomyceten und insbesondere bei Basidiomyceten nicht der Fall 5 Mutationen im non-homologous end joining pathway wie Deletionen von ku70 oder ku80 können hier die homologe Rekombination deutlich verbessern. 5 Hier sind entsprechende Methoden (7 Abschn. 3.5) anzuwenden. Expression von Genen: 5 für filamentöse Ascomyceten stehen zum Teil ähnlich effektive Systeme (auch auf Plasmidbasis) wie für die Hefen zur Verfügung 5 wenn die Transformation in einkernige Stadien erfolgt, ist eine Deletion möglich 5 zur Komplementation kann ein Heterokaryon (mit unterschiedlichen Kernen in jeder der vielkernigen Zellen) sinnvoll sein 5 erhaltene Stämme können zur Charakterisierung gekreuzt werden (7 Abschn. 3.3.3). Fluoreszenzmikroskopie: 5 Autofluoreszenz kann auf Minimalmedien reduziert werden 5 verschiedene Medien ausprobieren 5 Lufthyphen zeigen eine stärkere Eigenfluoreszenz als Substrathyphen. Alternative zur Deckgläschenkultur: 5 Um anstelle des aufwachsenden Luftmycels (7 Abschn. 3.2.1) ein Substratmycel zu erhalten, können Objektträger auf die Kultur aufgelegt werden, die einen extrem dünnen Film von Medium tragen 5 dazu Objektträger schräg auf eine dicken Glaspipette auflegen 5 Agar am höchsten Ende aufgeben 5 durch Ablaufen bleibt lediglich ein dünner Film auf dem Objektträger zurück.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Es sollte bedacht werden, dass sowohl die Proteinmodifikation als auch die Bildung großer Proteinkomplexe mit wechselnden, regulatorischen Untereinheiten in Euka­ ryoten eher die Regel als die Ausnahme sind. Somit kann in einer Proteinfusion eine zusätzliche Domäne an falscher Stelle durchaus zum Verlust der Funktion oder auch partieller, weniger Funktionen führen. Es ist daher anzuraten, Fluoreszenz-Video­ mikroskopie von der erfolgreichen Komplementation einer entsprechenden Deletionsmutante abhängig zu machen. Bei Eukarya ist das Expressionsniveau stark von der genomischen Umgebung des integrierten Gens abhängig, sodass homologe Integration vorzuziehen ist. Für Basi­ diomyceten kann die Transformation einkerniger Stadien wie Sporidien sinnvoll sein. In Fällen, in denen das nicht möglich ist, sind für die Interpretation weitere, unabhängige Methoden sinnvoll. Besonders eine Lokalisierung in Vesikeln sollte im Sinne eines möglichen Abbaus überprüft werden. Die Nutzung mehrerer, unabhängig erzeugter Transformationen kann ebenfalls sinnvoll sein.

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E. Kothe

Die Fusion eines fluoreszierenden Proteins am N- oder C-Terminus des zu loka­ lisierenden Proteins ist in den meisten Fällen ausreichend. Die zusätzlichen Protein­ domänen können aber störend auf die nativen Protein-Protein-Interaktionen wirken, die für die native Funktion unter bestimmten, von der sich ändernden Zusammen­ setzung des Proteinkomplexes abhängigen Bedingungen essentiell sind. Expressionssignale in Introns können an der Transkriptionskontrolle beteiligt sein. Daher sollten Introns im Gen enthalten bleiben, wenn eine homologe Expression erfolgen soll. Auch für die generelle Expression, insbesondere in Basidiomyceten, kön­ nen Introns erforderlich sein. Daher ist die Transformation mit genomischen Sequen­ zen anstelle von solchen, die auf cDNA basieren, häufig sinnvoll. Basidiomyceten aus Umweltisolaten liegen meist als Dikaryon (7 Abschn. 3.3.5) vor; einkernige Stadien sind nicht verfügbar. Dies erschwert die Herstellung von Deletionsmutanten zusätzlich. Auch Transformationssysteme sind häufig nicht so effizient, sodass die Nut­ zung einer unabhängigen Methode wie der Nachweis durch Immunfluoreszenz (7 Abschn. 3.4.2) oder Kompartimentierung (7 Abschn. 3.4.4) sinnvoll sein kann. 3.4.4  Separieren unterschiedlicher Zellkompartimente

Pilze enthalten neben der Zellwand, der Cytoplasmamembran und dem Cytosol weitere Kompartimente wie Zellkern, Mitochondrien, Vakuolen, Vesikel oder das Cytoskelett. Um eine grobe Zuordnung zu treffen, kann es sinnvoll sein, solche Kompartimente von­ einander zu trennen. Auch unterschiedliche Entwicklungsstadien können voneinander getrennt und anschließend separat auf Proteine, RNAs, Signalmoleküle, Sekundärmeta­ boliten o. ä. untersucht werden. i Benötigtes Material

5 Vorkulturen 5 Je nach Anwendung ein Laser-Dissektions-Mikroskop oder eine (Ultra-)Zentrifuge 5 Ficoll Homogenisationspuffer Bestandteil

Menge

PIPES, pH 6,9

10 mM

CaCl2

5 mM

MgSO4

5 mM

Saccharose

0,5 M

Homogenisationspuffer 2,1 M Saccharose Bestandteil

Menge

PIPES, pH 6,9

10 mM

CaCl2

5 mM

MgSO4

5 mM

Saccharose

2,1 M

167 Pilze

Waschpuffer Bestandteil

Menge

Mannitol

0,6 M

EDTA

1 mM

Tris/Cl pH 7,2

10 mM

BSA

0,4 %

Geeignete Kultivierungsbedingungen 7 Abschn. 3.1. Kompartimente der Pilzzellen können für eine grobe Lokalisierung voneinander getrennt und anschließend Proteine oder Nukleinsäuren sowie Metabolite analysiert werden. Vor der Entnahme aus den Kulturen steril arbeiten; danach ist dies nicht mehr zwin­ gend erforderlich. Vorgehensweise Mechanische Trennung von Stadien der Entwicklung: 5 Primordien der Fruchtkörperbildung oder auch verschiedene Altersstufen von Hyphen bereits makroskopisch mit dem Skalpell als Ringe ausschneiden, trennen und anschließend analysieren 5 Laser-Mikrodissektions-Mikroskopie (z. B. ältere gegenüber jüngeren Zellen, Fruchtkörperprimordien, Haustorien oder Appressorien bei phytopathogenen Pilzen etc.) 5 anschließend getrennt das Transkriptom, Proteom oder Metabolom (7 Abschn. 4.6) analysieren 5 wachsende Hyphenspitzen oder Schnallenzellen mikroskopisch vereinzeln und so gezielt untersuchen Cytosolische Fraktion: 5 Mörsern in flüssigem Stickstoff 5 in Homogenisationspuffer suspendieren 5 bei 3000 g für 10 min zentrifugieren 5 die cytosolische Fraktion im Überstand zur Proteinreinigung verwenden. Zellwandpräparation: 5 Mörsern in flüssigem Stickstoff 5 bei 3000 g für 10 min zentrifugieren 5 Niederschlag in Homogenisationspuffer aufnehmen 5 Protein aus Zellwandpräparation mit handelsüblichem Kit oder weiterer Methode extrahieren 5 je nach Anwendung für weitergehende Untersuchungen dieser Fraktion die Reinheit der Zellwandfraktion genau überprüfen. Zellkerne aus Protoplasten isolieren (für A. nidulans): 5 Mycel ernten und in flüssigem Stickstoff mörsern 5 schnell auf 4 °C erwärmen

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E. Kothe

5 im Teflon-Glas-Homogenisator in Homogenisationspuffer (ca. 100 g Feuchtgewicht in 100 ml) aufbrechen 5 im selben Puffer 1:4 verdünnen 5 durch Mull filtern (regelmäßig Filter wechseln!) 5 differentiell bei 4 °C (6000 g, 20 min) zentrifugieren 5 Pellet resuspendieren in 150 ml Homogenisationspuffer 5 zentrifugieren bei 100 g für 5 min 5 zentrifugieren bei 27.000 g für 5 min 5 die isolierten Kerne durch in 2,1 M Saccharose aufnehmen 5 zentrifugieren bei 27.000 g für 5 min 5 zentrifugieren bei 161.000 g für 15 min (Film auf der Oberfläche enthält Mitochondrien, die Kerne sind im Pellet). Isolierung von Mitochondrien (für N. crassa entwickelt): 5 Sphäroblasten durch lytische Enzyme erzeugen (7 Abschn. 3.5) 5 9 ml der Mitochondriensuspension (s. o.) in Waschpuffer verdünnen 5 auf einen zweistufigen Ficoll-Gradienten (7,5 und 13,0 % Ficoll in Waschpuffer) auftragen 5 zentrifugieren bei 10.000 g für 30 min 5 die Fraktion zwischen den Stufen langsam 1:4 in Waschpuffer verdünnen und erneut zentrifugieren (10.000 g, 20 min) 5 Pellet in Waschpuffer mit 0,5 % BSA resuspendieren

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die weitere Bearbeitung der separierten Proben kann wie in den entsprechenden methodischen Kapiteln beschrieben erfolgen. In der Reinigung der Zellkerne aus A. nidulans (s. o.) sind Membranen und Mitochondrien als Film auf der Oberfläche des letzten Zentrifugats enthalten. Die Rei­ nigung von Mitochondrien mittels handelsüblicher Kits ist besonderes für Hefen durchaus möglich; filamentöse Pilze haben aber stark vernetzte Mitochondrien, die sich durch die gesamte Hyphe ziehen und sogar Septen passieren können. Eine Isolie­ rung mit Kits ist daher meist nicht möglich. 3.5  Transformationssysteme in Pilzen 3.5.1  Vektoren und Stabilität der Transformation

Bei Pilzen sind Plasmide lediglich in Saccharomyces gebräuchlich. Dort kann die Stabili­ tät der Plasmide mit der eines ins Genom integrierten Vektors verglichen werden. In filamentösen Pilzen werden Integrationsvektoren benutzt, die als Shuttle-Vek­ toren in E. coli erzeugt und dann in den Pilz transformiert werden. Bei der Hefe erfolgt die Integration eher homolog, in den meisten Pilzen dagegen heterolog, sodass für G ­ endeletionen Stämme entwickelt wurden, bei denen die nicht-homologie Rekombination beeinträchtigt ist (Deletion von ku70, ku80).

169 Pilze

i Benötigtes Material

5 Sterile Medien (YPD), YPD- und SD-Agar (komplettiert mit allen weiteren Aminosäuren, für die der gewählte Stamm auxotroph ist) 5 Sterile Zahnstocher 5 Brutschrank 30 °C 5 Transformierte Hefestämme

Hefestämme mit Selektionsmarkergen (z. B. Synthese einer Aminosäure wie Histidin oder einer Base wie Uracil) sollten zur Verfügung stehen. Gentechnische Arbeiten unterliegen dem Gentechnikrecht und dürfen nur in dafür zugelassenen Laboratorien ausgeführt werden! Vorgehensweise Plasmidstabilität: 5 transformierten Hefestamm mit Selektionsmarkergen auf Vollmedium YPD (7 Abschn. 3.1) anziehen 5 nacheinander zehn Transfers mit anschließender Kultivierung über Nacht 5 bei einem Volumen von 200 ml pro Kultur werden aus der jeweils vorhergehenden Kultur 200 µL angeimpft 5 Hefen aus der letzten Kultur ausplattieren 5 nach dem Anwachsen auf Minimalmedium ohne Histidin bzw. Uracil übertragen 5 die sicherste Methode ist das Übertragen jeder einzelnen Kolonie auf eine Agarplatte des Selektivmediums mit einem sterilen Zahnstocher 5 nach dem Ausstreichen auf der Selektivplatte mit demselben Zahnstocher eine YPD-Platte beimpfen 5 mit einem unter der Platte liegenden Raster 100 Kolonien auf eine Platte übertragen (s. . Abb. 3.23).

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100 . Abb. 3.23  Darstellung des Zählrasters zur Übertragung von 100 Kolonien zum Kopieren und Verwenden. (© Erika Kothe, Jena)

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E. Kothe

z Versuchsergebnis/Auswertung

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Kolonien, die auf dem Selektivmedium nicht, auf YPD aber wachsen konnten, haben den Selektionsmarker verloren. Durch Berechnen der Zellteilungen bei jeweils 1:1000-Verdünnung pro Transfer kann die Verlustrate bestimmt werden. Für einen Praktikumsversuch bietet sich der Vergleich eines Markergens auf einem Plasmid mit einem durch Integration ins Genom stabilisierten Markergen an. Da die Hefeplasmide in der Mitose nicht sicher in die sich bildende Knospe gelangen, ist die Stabilität der ins Genom integrierten DNA wesentlich höher. Die Wahl eines direkt sichtbaren Markergens wie Komplementation einer Adenin-Auxotrophie (die prototrophen Kolonien sind weiß, auxotrophe rot gefärbt) kann ein Markerverlust leichter sichtbar gemacht werden. 3.5.2  LiCl-basierte Transformation

Diese Transformationsmethode wurde für S. cerevisiae entwickelt (. Abb. 3.24). Sie funktioniert aber auch für viele Hefen und kann auch für Conidiosporen ausprobiert werden. Allerdings sind dort in der Regel die Transformationseffizienzen zu gering. i Benötigtes Material

5 Zentrifuge 5 Eppendorf-Zentrifuge 5 Brutschränke für 30 °C und 42 °C 5 Eis 5 Sterile Lösungen und Medien 10 × TE Bestandteil

Menge

Tris

100 mM

EDTA

10 mM

pH 7,0 einstellen Lithiumacetatlösung Bestandteil

Menge

Lithiumacetat

100 mM

In 1 × TE ansetzen

. Abb. 3.24  Nachweis transformierter Hefezellen in einer Verdünnungsreihe auf Selektivmedium. (© Ines Schlunk, Jena)

171 Pilze

PEG/Li-Acetat Bestandteil

Menge

Polyethylenglycoll 4000

50 %

In Lithiumacetatlösung ansetzen

Die zu transformierenden Stämme sollten als Übernachtkultur zur Verfügung stehen. Gentechnische Arbeiten unterliegen dem Gentechnikrecht und dürfen nur in dafür zugelassenen Laboratorien ausgeführt werden! Vorgehensweise 5 eine Übernachtkultur von S. cerevisiae in 50 ml YPD bei 30 °C anziehen 5 OD bei 600 nm bestimmen 5 mit YPD-Medium auf 0,3 einstellen 5 bei 30 °C für 4 h inkubieren 5 10 min bei 4000 rpm abzentrifugieren 5 mit Aqua dest. waschen 5 in 1 ml Aqua dest. resuspendieren 5 10 s bei 13.000 rpm zentrifugieren 5 in einem Eppendorfcup 1,5 ml Lithiumacetatlösung resuspendieren 5 100 μl der Zellsuspension mit 100 μg DNA mischen, mit 600 μl PEG/LiAcetat versetzen und 15 s gemixt 5 30 min bei 30 °C inkubieren 5 70 μl DMSO zugeben 5 Transformationsansatz vorsichtig invertieren 5 15 min bei 42 °C inkubieren 5 1 min auf Eis abkühlen 5 zentrifugieren für 15 s bei 13.000 rpm 5 Pellet in 500 μl Selektionsmedium (je nach verwendetem Selektionsmarker SD mit allen Aminosäuren ohne die, deren Synthesegen benutzt wurde) resuspendieren und ausplattieren 5 nach 2 bis 4 Tagen zeigen sich die transformierten Kolonien.

z Versuchsergebnis/Auswertung Die Transformation von kompetenten Hefezellen erfolgt meist mit guter Trans­

formationseffizienz. Als Kontrolle sollte ein Vektor ohne Insert mitgeführt werden. Dies ist insbesondere als empty vector control zur Auswertung der Phänotypen wichtig. 3.5.3  Elektroporation von Conidiosporen

Während bei E. coli die Elektroporation die wichtigste Methode zur Transformation ist, funktioniert diese Methode bei Pilzen mit unterschiedlichen Effizienzen. Es ist daher sinnvoll, für einen neuen Pilz oder ein Umweltisolat mehrere Methoden auszuprobieren.

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E. Kothe

i Benötigtes Material

5 Vorbereitete sterile Lösungen 5 Reagenzgläser 5 Inkubationsschüttler 30 °C 5 Eis

3

PreYED Bestandteil

Menge

Hefeextrakt

1 %

Glukose

1 %

HEPES

20 mM

Auf pH 8,0 einstellen (mit 100 mM Tris) Elektroporationspuffer Bestandteil

Menge

Tris/Cl pH 7,5

10 mM

Saccharose

270 mM

Lithiumacetat

1 mM

Käfer-Minimal-Nitrat-Medium 7 Abschn. 3.1 Bestandteil

Menge

Glucose

1 %

Nitratsalze

5 %

Spurenelemente

1 %

Thiamin

0,001 %

Biotin

25 ppb

Conidiosporen aus Vorkulturen sollten vor Versuchsbeginn zur Verfügung stehen. Bei der Verwendung der Elektroporation sind die Sicherheitshinweise zu beachten. Gentechnische Methoden unterliegen dem Gentechnikrecht! Vorgehensweise 5 Conidiosporen von A. nidulans fünf Mal mit 10 ml Aqua dest. waschen 5 400 ml Käfer-Minimal-Nitrat-Medium mit allen notwendigen Zusätzen (je nach Genotyp) mit 107 Conidien pro ml animpfen 5 bei 37 °C im Schüttler (300 rpm) für 2 h inkubieren 5 abzentrifugieren und in 400 ml eiskaltem sterilem Wasser resuspendieren 5 erneut abzentrifugieren und in 25 ml eiskaltem preYED aufnehmen 5 1 h bei 30 °C schütteln (100 rpm) 5 gekeimte Conidien abzentrifugieren

173 Pilze

5 in 2,5 ml des eiskalten Elektroporationspuffers aufnehmen (damit sollten es etwa 1,6 * 109 Conidien pro ml sein) 5 auf Eis halten 5 1 µg dialysierter DNA zu 50 µl der elektrokompetenten Conidien pipettieren 5 Volumen mit sterilem Aqua dest. auf 60 µl einstellen 5 für 15 min auf Eis inkubieren 5 Elektroporation in einer 0,2 cm-Küvette bei 1.000 V, 25 µF und 400 O (die Zeit sollte zwischen 5,1 und 5,8 ms betragen) 5 1 ml eiskaltes YED-Medium in die Küvette geben 5 Ansatz in ein steriles 10 ml-Röhrchen überführen 5 15 min auf Eis inkubieren 5 90 min bei 30 °C auf einem Schüttler (100 rpm) inkubieren 5 Transformationsansatz auf Selektionsmedium ausplattieren 5 nach 2 Tagen werden erste Kolonien sichtbar, die durch Replika-Plattieren überprüft werden können.

z Versuchsergebnis/Auswertung Diese Transformations-Methode ist einfach und kann zügig durchgeführt werden. Als

Kontrolle sollte ein Vektor ohne Insert mitgeführt werden. Dies ist insbesondere als empty vector control zur Auswertung der Phänotypen wichtig. 3.5.4  PEG-vermittelte Transformation bei Schizophyllum

commune

Das hier vorgestellte Protokoll ist für den Basidiomyceten S. commune optimiert. Für andere Pilze müssen die Zeiten und Medien angepasst werden. i Benötigtes Material

5 Tischzentrifuge mit Kühlung, nicht zu weit von der sterilen Werkbank entfernt 5 Zellwand-lytische Enzyme, alternativ eigene Präparation von lytischen Enzymen aus T. harzianum, Caylase C3 oder Novozym (Sigma-Aldrich). Magnesiumsulfatlösung Bestandteil

Menge

MgSO4

1M

MES

20 mM

pH 5,9 0,5 M Magnesiumsulfatlösung Bestandteil

Menge

MgSO4

0,5 M

MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure)

20 mM

pH 5,9

3

174

E. Kothe

Sorbitollösung:

3

Bestandteil

Menge

Sorbitol

1 M

MES

20 mM

Calciumchloridlösung Bestandteil

Menge

CaCl2

1 M

MES

500 mM

pH 6,3 TE/Calcium Bestandteil

Menge

Tris

10 mM

EDTA

1 mM

CaCl2

50 mM

pH 7 PEG-Lösung Bestandteil

Menge

Polyethylenglycol 4000

44 %

MES

10 mM

pH 6,3 Rescue-Medium Bestandteil

Menge

Sorbitol

0,8 M

In CYM (7 Abschn. 3.1.3) Top-Agar Bestandteil

Menge

Agar

0,8 %

In Rescue-Medium

Die zu transformierenden Stämme sollten als Flüssigkultur nicht älter als vier Tage zur Verfügung stehen.

175 Pilze

Gentechnische Arbeiten unterliegen dem Gentechnikrecht und dürfen nur in dafür zugelassenen Laboratorien ausgeführt werden! Vorgehensweise 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Flüssigkultur 16 h wachsen lassen abzentrifugieren (4000 rpm, 15 min bei Raumtemperatur) Mycel drei Mal mit Magnesiumsulfatlösung waschen in 20 ml Magnesiumsulfatlösung aufnehmen und zur Protoplastierung 100 mg Zellwand-lytische Enzyme zugeben Protoplastierungsansatz 4 h bei 30 °C unter leichtem Schütteln inkubieren osmolarer Schock durch Zugabe von 25 ml kaltem, sterilem Aqua dest. 5 min unter leichtem Schütteln und 10 min ohne Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren Zentrifugation (20 min bei 1100 rpm, 4 °C) Protoplasten im Überstand abnehmen und auf Eis lagern aus dem Pellet dreimal mit je 25 ml 0,5M Magnesiumsulfatlösung weitere Protoplasten extrahieren die gesammelten Protoplasten mit 2,5 Vol Sorbitollösung pelletieren (20 min bei 1800 rpm, 4 °C) zwei- bis dreimal mit Sorbitollösung waschen 50 µl/ml Calciumchloridlösung zugeben und über Nacht auf Eis inkubieren die Protoplasten können bei -20 °C einige Tage aufbewahrt werden 20 µg DNA, ringförmig oder linearisiert, in 120 µl TE/Calcium aufnehmen und mit 200 µl Protoplasten versetzen nach dem Mischen 1 h auf Eis inkubieren mit 1 Vol kaltem PEG 10 min auf Eis inkubieren 2 ml Rescue-Medium zugeben und über Nacht bei 30 °C regenerieren mit 5 ml erwärmtem Top-Agar auf Selektionsmedium plattieren nach 3 bis 5 Tagen bei 30 °C die Transformanten vereinzeln

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Transformationsmethode ist vergleichsweise aufwendig und liefert weniger Trans­ formanten als dies bei den Ascomyceten der Fall ist. Zur Kontrolle der Regenerationsfähigkeit der Protoplasten werden 100 µL der Protoplastensuspension direkt auf Vollmedium plattiert. Weiterhin sollte auch hier ein Vektor ohne Insert mitgeführt werden. Dies ist insbesondere als empty vector control zur Auswertung der Phänotypen wichtig. 3.5.5  Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation

beim Ektomykorrhizapilz Tricholoma vaccinum

Hier macht man sich – wie bei der Transformation von Pflanzenzellen – zunutze, dass das phytopathogene Proteobacterium Agrobacterium tumefaciens in der Lage ist, DNA in den Kern des Wirtsorganismus zu übertragen. Dieser Prozess ähnelt molekular einer Konjugation, bei der allerdings nur ein bestimmter Teil des Plasmids als einzelsträngige

3

176

3

E. Kothe

Kopie (T-DNA) übertragen wird. Im Ti-Plasmid kann diese DNA mit Genen, die in den Wirt übertragen werden sollen, kloniert werden. Zur Induktion des Übertragungs­ mechanismus muss Acetosyringon zugegeben werden. Nach erfolgter Transformation wird mit geeigneten Antibiotika (hier Cefota­ xim) das Bakterium aus der Mischkultur wieder entfernt. Die Methode ist aufwendig, aber besonders geeignet, um Pilze mit schlechter Protoplastierbarkeit bzw. schlechter Regenerationsfähigkeit der Protoplasten zu transformieren. Hier wird als Beispiel der Ektomykorrhizapilz T. vaccinum gewählt (s. . Abb. 3.25), der bereits nach dem Mazerieren schlecht wieder anwächst. Zudem ist es ein sehr lang­ sam wachsender Pilz (ca. 3–4 Wochen für eine Kolonie von 2–3 cm Durchmesser). Er dient hier als Beispiel für langsam wachsende, schwer genetisch zugängliche Pilze. i Benötigtes Material

5 A. tumefaciens mit dem gewünschten Plasmid als Vorkultur 5 T. vaccinum als Vorkultur 5 Nylonmembran (PES 41/23 Technische Gewebe Sommer, Balingen) Vollmedium für Agrobacterium mit Kanamycin Bestandteil

Menge

Standard I (Merck, Darmstadt)

25 g

Kanamycin

50 mg

Ad 1 L Aqua dest.

. Abb. 3.25  Nylonmembranen, auf denen einzelne Mycelien vermehrt werden, die aus einem Transformationsansatz mit Agrobacterium tumefaciens hervorgegangen sind. (© Katrin Krause, Jena)

177 Pilze

Induktionsmedium Bestandteil

Menge

Acetosyringon

200 µM

In Vollmedium mit Kanamycin Ampicillin-Waschlösung Bestandteil

Menge

Ampicillin

100 µg

Ad 1 L Aqua dest., sterilfiltriert ½MMNb-Agar für Tricholoma Bestandteil

Menge

K2HPO4

10,5 g

KH2PO4

4,5 g

(NH4)2SO4

1,0 g

Na3-Citrat × 2H2O

0,5 g

MgSO4 × 7H2O

0,2 g

Thiamin

1 mg

Glukose

2,0 g

Ad 1 L Aqua dest. Selektivmedium zur Transformantenselektion Bestandteil

Menge

Hygromycin B

25 µg/ml

Cefotaxim

100 µg/ml

In ½MMNb

Die in E. coli klonierten Vektoren müssen durch Konjugation in geeignete Stämme von Agrobacterium tumefaciens, die ein Helferplasmid mit den erforderlichen vir-Genen tra­ gen, überführt werden. Gentechnische Arbeiten unterliegen dem Gentechnikrecht und dürfen nur in dafür zugelassenen Laboratorien ausgeführt werden! Steriles Arbeiten ist unerlässlich! Die langsam wachsenden Pilze sind für Kontamina­ tion sehr anfällig! Besondere Sorgfalt ist daher vonnöten. Vorkulturen sind erforderlich, besonders bei langsam wachsenden Basidiomyceten wie Tricholoma vaccinum.

3

178

E. Kothe

Vorgehensweise

3

5 Vorkultivierung von T. vaccinum auf sterilen Nylonmembranen von 1–2 cm Kantenlänge auf Petrischalen mit halbkonzentriertem MMNb-Agar bei Raumtemperatur, bis das Mycel ca. 1 cm Durchmesser hat. 5 A. tumefaciens mit dem gewünschten Plasmid (s. dazu gentechnische Arbeiten und Konjugation; hier wird als Selektionsmarker für den Pilz Hygromycinresistenz benutzt) über Nacht in Vollmedium mit Kanamycin bei 28 °C anziehen 5 abzentrifugieren (4000 rpm, 5 min) 5 in Minimalmedium mit Kanamycin und Acetosyringon anziehen 5 Bakterien für 6 h bei 29 °C auf dem Schüttler (200 rpm) inkubieren und anschließend auf eine OD von 0,1 einstellen 5 200 µL der Bakteriensuspension auf das vorgezogene Mycel geben 5 1 bis 2 Tage bei Raumtemperatur inkubieren 5 Membran abnehmen, in Ampicillinlösung waschen und auf Selektivmedium übertragen 5 nach etwa zwei Wochen sollten Transformanten an neuem Wachstum erkennbar sein.

z Versuchsergebnis/Auswertung Eine negative Kontrolle ohne Acetosyringon sollte mitgeführt werden.

Die DNA wird in die Pilzzelle übertragen, wo sie mittels der Kernlokalisierungs­ sequenzen, die die Proteine an der Einzelstrang-DNA tragen, in den Kern trans­ portiert und dort in das Genom eingebaut wird. Dies erfolgt nicht-homolog, sodass mehrere Transformanten charakterisiert werden müssen, um Effekte der Integration auf die Expression des Zielgens auszuschließen. Die Stabilität der Transformanten ist aufgrund der Integration ins Genom in der Regel sehr gut (in dem hier vorgestellten Pilz sind Transformanten über zwei Jahre stabil), während die Transformationseffizienz sehr schlecht ist. Da ein Mycel mit vielen Kernen transformiert wird, ist es notwendig, beim Überimpfen nur neu zugewachsenes Mycel zu übertragen und dies mehrfach zu wiederholen. Da es sich bei den kultivierbaren Stämmen von Tricholoma um Dikaryen han­ delt, ist lediglich eine Überexpression möglich. Eine Gendeletion würde vom zwei­ ten Kern komplementiert. Daher ist es möglich, Gene zusätzlich einzubringen und so beispielsweise Proteine mit einem zusätzlichen Epitop für die Immunfluoreszenz zu exprimieren. In Pilzen, in denen Gendeletion wegen der schlechten Transformationseffizienz nicht möglich ist, kann ein Silencing mittels antisense-RNA versucht werden. Für einige Pilze wurde auch inhibitor-RNA (RNAi) etabliert, das in diesem Fall auch zum Ausschalten eines gewünschten Gens genutzt werden kann.

179

Molekularbiologische Methoden Erika Kothe 4.1 Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren – 181 4.1.1 Isolierung von Gesamt-DNA aus Reinkulturen und Umweltproben – 181 4.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA – 182 4.1.3 Isolierung von RNA – 183 4.1.4 Konzentrationsbestimmung für Nukleinsäuren – 185 4.1.5 Agarose-Gelelektrophorese – 186

4.2 Isolierung und Analyse von Proteinen – 188 4.2.1 Herstellung von Proteinextrakten für die SDSGelelektrophorese – 188 4.2.2 Quantifizierung von Proteinen – 189 4.2.3 Proteingelelektrophorese – 189

4.3 DNA-modifizierende Enzyme – 192 4.3.1 Restriktionsendonukleasen – 192 4.3.2 Vektoren und Klonierung – 193 4.3.3 Elektroporation von Escherichia coli – 195

4.4 Nachweis von Nukleinsäuren und Proteinen durch Hybridisierung und Antikörper-abhängige Methoden – 196 4.4.1 Southernblot-Analyse – 196 4.4.2 Northernblot-Analyse – 199 4.4.3 Westernblot-Analyse – 200 4.4.4 Enzyme-linked Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) – 201

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 A. Störiko (Hrsg.), Methoden der Mikrobiologie, https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7_4

4

4.5 Nachweismethoden durch Polymerase-Kettenreaktion – 203 4.5.1 Genspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – 203 4.5.2 PCR zum Nachweis von Transkripten (RT-PCR) – 205 4.5.3 Quantitative real-time-PCR (qPCR) – 206

4.6 Sequenzierung und Genanalyse – 208 4.6.1 Sequenzierung, Mikrobiomanalyse, Metagenom, Transkriptom – 208 4.6.2 Homologiesuche mit BLAST – 209 4.6.3 Stammbaumerstellung – 211

181 Molekularbiologische Methoden

4.1  Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren 4.1.1  Isolierung von Gesamt-DNA aus Reinkulturen und

Umweltproben

Für die Isolierung von DNA sind fertige Kits geeignet, für die geringe Mengen der Nukleinsäuren ausreichen (. Abb. 4.1). i Benötigtes Material

5 Kulturen der zu isolierenden Stämme bzw. Umweltproben in ausreichender Menge 5 Geeignete Kits zur Aufreinigung von DNA (z. B. für DNA aus Boden); die entsprechenden Kits sollten vorher beschafft und nach Herstellerangaben gelagert werden 5 Gefäße 5 Wasserbad 5 Lösungen 5 Puffer 5 ggf. flüssiger Stickstoff 5 Bei vielen parallelen Ansätzen die korrekte Beschriftung nicht vergessen (Stammbezeichnung, Art der Probe, Verdünnung, etc.)

. Abb. 4.1  Agarosegelektrophorese zur Kontrolle der Isolierung genomischer DNA aus Bodenisolaten nach Ethidiumbromid-Färbung. Visualisierung unter UV-Licht. Als Marker (M) wurde eine 1 kb DNALeiter aufgetragen. Die hochmolekulare DNA ist mit RNA verunreinigt, die als kleinere Fragmente eine verschmierte Laufbahn zeigt. (© Muhammad Waqas, Jena)

4

182

E. Kothe

Schnellisolierung von DNA

4

5 Biomasse aus der Reinkultur für eine schnelle Isolierung geringer Mengen (weniger als ein Stecknadelkopf) entnehmen. 5 Biomasse zu 100 μl 5 %-iger Chelex 100 in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß geben. 5 Probe im Wasserbad bei 95 °C für 10 min erhitzen. 5 Zellreste durch Zentrifugieren pelletieren (3 min, maximale Geschwindigkeit einer Eppendorf-Zentrifuge, bei Raumtemperatur). 5 Überstand (ohne Pellet!) in ein neues Reaktionsgefäß übertragen. 5 10 μl des Überstands in einem neuen Reaktionsgefäß mit Aqua dest. 1:10 verdünnen. Isolierung von DNA aus Reinkulturen oder Wasserproben 5 Zentrifugieren bzw. bei stark verdünnten Wasserproben Filtrieren (Porendurchmesser 0,2 µm). 5 Zum Pellet (bei ca. 50 µl Volumen mit 300 µl) DNA-Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS) zugeben. 5 Gram-positive Bakterien oder Pilze mit einer Lanzettnadel zerdrücken, bis sich die Lösung eintrübt. 5 150 μl 3 M NaAcetat (pH 5,2) zugeben. 5 10 min bei -20 ℃ inkubieren. 5 5 min zentrifugieren (13.000 rpm). 5 Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführen (ohne Pellet!). 5 1 Vol Isopropanol zugeben, gut durchmischen. 5 25 min zentrifugieren (13,000 rpm). 5 Das Pellet mit 70 % Ethanol waschen und anschließend trocknen. 5 In 50 μl sterilem Aqua dest. resuspendieren. Isolierung von DNA aus Bodenproben 5 10 g Boden mit 20 ml 0,9 % NaCl aufschlämmen. 5 Weiteres Vorgehen nach Angaben des Herstellers des Kits mit ggf. weiteren Waschschritten mit 70 % Ethanol.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die isolierte DNA kann für alle molekularbiologischen weiteren Schritte wie Klonie­ rung, Amplifizierung, Hybridisierung etc. (7 Abschn. 4.2 bis 7 Abschn. 4.6) weiter­ verwendet werden. Die DNA aus Umweltproben kann Bestandteile enthalten, die beispielsweise eine Amplifizierung in der Polymerase-Kettenreaktion inhibieren, wie Huminstoffe oder Eisenhydroxide. Hier können weitere Fällungsschritte eingeführt werden. Es ist jedoch unbedingt erforderlich, die Qualität und Reinheit zu kontrollie­ ren und die Menge der isolierten Nukleinsäure zu quantifizieren. 4.1.2  Isolierung von Plasmid-DNA

Zur Plasmidpräparation stehen geeignete Kits zur Verfügung (. Abb. 4.2). Die im Kit enthaltenen Puffer und Zentrifugationssäulchen werden nach Angaben der Hersteller benutzt.

183 Molekularbiologische Methoden

. Abb. 4.2  Säulchen aus einem Kit zur Isolierung von Plasmid-DNA. (© Erika Kothe, Jena)

i Benötigtes Material

5 Kulturen der zu isolierenden Stämme bzw. Umweltproben in ausreichender Menge. 5 Geeignete Kits zur Aufreinigung von DNA (z. B. für DNA aus Boden); die entsprechenden Kits sollten vorher beschafft und nach Herstellerangaben gelagert werden. 5 Gefäße 5 Wasserbad 5 Lösungen 5 Puffer 5 ggf. flüssiger Stickstoff 5 Bei vielen parallelen Ansätzen die korrekte Beschriftung nicht vergessen (Stammbezeichnung, Probennummer)

Vorgehensweise 5 Übernachtkulturen in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführen und abzentrifugieren (13.000 rpm) 5 Extraktionspuffer zugeben; weiteres Vorgehen nach Herstellerangaben 5 die Extraktion erfolgt auf kleinen Säulchen, die mitgeliefert werden 5 das getrocknete Pellet in sterilem Aqua dest. resuspendieren

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das isolierte Plasmid kann nun für die Analyse durch Restriktionsendonukleasen, bei­ spielsweise nach einem Klonierungsschritt, oder zur Agarosegelelektrophorese ein­ gesetzt werden (7 Abschn. 4.2 bis 7 Abschn. 4.6). 4.1.3  Isolierung von RNA

RNA kann ebenfalls mit geeigneten Kits isoliert werden (. Abb. 4.3). Die RNA aus Umweltproben kann Bestandteile enthalten, die beispielsweise eine Amplifizierung in der Polymerase-Kettenreaktion inhibieren, wie Huminstoffe oder Eisenhydroxide. Hier können weitere Fällungsschritte eingeführt werden. Es ist unbedingt erforderlich, die Qualität und Reinheit zu kontrollieren und die Menge der isolierten RNA zu quanti­ fizieren.

4

184

E. Kothe

4

. Abb. 4.3  RNA-Gelelektrophorese zur Kontrolle der Integrität nach Ethidiumbromid-Färbung. Die pilzliche RNA zeigt die 18S und 28S rRNA-Banden. Zum Vergleich wurde ein RNA-Marker (M) aufgetragen. (© Jessica Pötschner, Jena)

i Benötigtes Material

5 Kulturen der zu isolierenden Stämme bzw. Umweltproben in ausreichender Menge. 5 Geeignete Kits zur Aufreinigung von DNA (z. B. für DNA aus Boden); die entsprechenden Kits sollten vorher beschafft und nach Herstellerangaben gelagert werden. 5 Gefäße 5 Wasserbad 5 Lösungen 5 Puffer 5 ggf. flüssiger Stickstoff 5 Bei vielen parallelen Ansätzen die korrekte Beschriftung nicht vergessen (Stammbezeichnung, Probennummer). ! RNA ist instabil, da RNAsen überall, auch an den Händen vorliegen. Steriles



Arbeiten ist daher erforderlich. Die Arbeiten bei Temperaturen über -20 ℃ sollten daher so schnell wie möglich durchgeführt werden. Handschuhe tragen und nur RNAse-freie Lösungen und Gefäße verwenden!

Vorgehensweise 5 Reinkulturen oder Umweltproben wie bei der DNA-Isolierung vorbereiten. 5 Max. 100 mg Material mit 450 μl Lysis Solution RL gut durchmischen und unlysierte Zellen abzentrifugieren (1 min 12.000 rpm). 5 Nach Herstellerangaben weiter verfahren; dabei Kontaminationen durch RNAse vermeiden! 5 Bei den Zentrifugensäulen kann nacheluiert werden. 5 Ein DNA-Abbau-Schritt sollte im Kit integriert sein. 5 Da DNA empfindlich gegen Scherkräfte ist, bei diesem Schritt sehr vorsichtig pipettieren. 5 Das Pellet in RNase-freiem Wasser aufnehmen!

185 Molekularbiologische Methoden

5 RNA kann für kurze Zeit auf Eis oder bei -70 ℃ gelagert werden. 5 Sollte mRNA gezielt angereichert werden, können Hybridisierungen (zur Anreicherung polyA-tragender eukaryontischer oder zur Abreicherung von r/tRNA bakterieller oder archäeller RNA) eingesetzt werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Das isolierte Plasmid kann nun für die Agarosegelelektrophorese oder im Northern­ blot eingesetzt werden (7 Abschn. 4.2 bis 7 Abschn. 4.6). 4.1.4  Konzentrationsbestimmung für Nukleinsäuren

Die Qualität und Reinheit der isolierten Nukleinsäuren kann photometrisch bei 260, 280 und 230 nm kontrolliert und gleichzeitig die Menge quantifiziert werden (. Abb. 4.4). i Benötigtes Material

5 Isolierte Nukleinsäuren 5 Photometer mit UV-Lampe, ggf. für sehr kleine Mengen.

Vorgehensweise 5 Die Proben werden bei 260, 280 und 230 nm gemessen und die Absorption notiert. 5 Ggf. muss die Lösung in sterilem Aqua dest. (für RNA RNAse-frei!) verdünnt werden (üblicherweise 1:100)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Da DNA bei 260 nm absorbiert, kann die Konzentration berechnet werden. Dabei ent­ spricht eine Extinktion von 1 einem DNA-Gehalt von 50 µg/ml für doppelsträngige DNA; einzelsträngige DNA wird mit 33 µg/ml bestimmt. Für RNA können 40 µg/ml bei einer Extinktion von 1 berechnet werden.

RNA-Konzentration Biol. Replikat

Datum der Inokulation

Datum der Ernte

Datum der RNAIsolierung

Konzentration (ng/µl)

A260/280

A260/230

Mittlere Konzentration (ng/µl)

1

27.6.

1.7.

17.2.

600,0

2,152

2,471

599,1

597,6

2,143

2,490

599,6

2,163

2,465

481,2

2,152

2,662

475,6

2,162

2,579

536,0

2,151

2,582

2

11.7.

15.7.

7.8.

497,6

. Abb. 4.4  Die Daten zeigen die Messwerte für RNA, die aus Schizophyllum commune isoliert wurde. Zwei biologische Replikate wurden bearbeitet. Die Quotienten der Messwerte bei 260, 280 und 230 nm können Auskunft über die Reinheit der Probe geben. (© Jessica Pötschner, Jena)

4

186

E. Kothe

Bei 280 nm absorbieren Proteine und Phenole. Daher ist der Quotient von 260 nm/280 nm ein Maß für Verunreinigungen mit Protein und sollte für DNA bei 1,8 liegen. Niedrigere Werte weisen auf einen zu hohen Gehalt an Proteinen hin. Bei 230 nm werden organische Moleküle gemessen. Der Wert 260 nm/230 nm sollte für eine reine DNA-Probe bei 2,0 liegen. Für die Visualisierung der Nukleinsäureaufreinigung kann ein Agarosegel (7 Abschn. 4.1.5) eingesetzt werden.

4

4.1.5  Agarose-Gelelektrophorese

Zur Qualitätskontrolle empfiehlt sich insbesondere bei Plasmiden, aber auch bei DNA und RNA eine Agarose-Gelelektrophorese. Hier werden DNA-Moleküle nach ihrer Größe und ggf. Sekundärstruktur aufgetrennt (. Abb. 4.5). i Benötigtes Material

5 0,8 % Agarosegel vorbereiten: 0,8 % Agarose in 100 ml 1xTAE-Puffer in der Mikrowelle aufkochen, auf ca. 55 ℃ abkühlen lassen, in den Gelschlitten gießen, Kamm einsetzen. 5 Ladepuffer sowie Größenmarker (käuflich, z. B. λ-PstI, oder selbst herstellen) 5 Gelelektrophoreseapparatur für Agarosegele 5 Schlitten zur Vorbereitung des Gels 5 UV-Leuchtplatte 5 Dokumentationssystem (Kamera) TAE-Puffer, 50-fache Stammlösung Bestandteil

Menge

Tris

242 g

Eisessig, rauchend

57,1 ml

0,5 M EDTA pH 8,0

100 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

. Abb. 4.5  Gelelektrophorese von Plasmiden mit unterschiedlichen Inserts (hier 18 S-rDNA). Größenmarker (gr: Gene Ruler). (© Falko Gutmann, Jena)

187 Molekularbiologische Methoden

Der Puffer muss einen pH von 8,3 ergeben (nicht mit HCl einstellen! Zu hohe Salzkonzentration im Puffer würden die Elektrophorese stören!). Laufpuffer MOPS Bestandteil

Menge

MOPS-Puffer pH 7,0

200 ml

Natriumacetat-Trihydrat

4 g

0,5 M EDTA pH 8,0

10 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

Ethidiumbromid-Färbelösung Bestandteil

Menge

Ethidiumbromid

0,5 µg

Aqua dest. ad

1 ml

! Falls Formaldehyd verwendet wird, im Abzug arbeiten!



Ethidiumbromid interkaliert zwischen den Basen der DNA und ist daher mutagen sowie teratogen. Handschuhe tragen! Bei RNA-Auftrennung besonders vorsichtig sein (RNAsen!). Bei zu starkem Abbau ggf. Formamid-haltige Gele verwenden.

Vorgehensweise 5 Proben: je 5 μl DNA-Lösung (ggf. 1:10 verdünnt, mit 1 μl Glycerin) mit 5 μl Ladepuffer mischen. 5 Proben in die Geltaschen pipettieren (Reihenfolge der Proben protokollieren!). 5 Gelelektrophorese bei 100 V für ca. 40 min mit TAE-Laufpuffer. 5 DNA im Gel im Ethidiumbromid-Bad ca. 15 min färben. 5 Unter UV-Licht mit einem Geldokumentations-System fotografieren. Spezifische Angaben für RNA-Gelelektrophorese 5 besondere, RNAse-freie Elektrophoresekammer benutzen 5 1,3 % Agarosegel mit 2 μl RNA und 1 μl Ladepuffer und 5 μl Aqua dest. (beide RNAse-frei) 5 ggf. mit 2,2 M Formaldehyd ansetzen (Achtung! Im Abzug arbeiten!). 5 Pro Spur ca. 20 µg RNA in 4,5 µl Laufpuffer (ggf. mit 3,5 µl Formaldehyd) ansetzen. 5 15 min bei 55 ℃ inkubieren. 5 Mit 2 µl Farbmarker (incl. 1 mM EDTA) in die Taschen pipettieren. 5 Ein Größenmarker für einzelsträngige Nukleinsäuren muss verwendet werden. 5 Für 15 min bei 170 V auftrennen.

4

188

E. Kothe

z Versuchsergebnis/Auswertung

4

Die genomische DNA ist als relativ große klare Bande im Gel sichtbar; erscheint eine diffuse Spur im Gel, ist die DNA zumindest teilweise abgebaut worden. Plasmide ergeben ungeschnitten einige Banden, deren Größe nicht am Größen­ marker abgelesen werden kann (durch die ringförmige Struktur und ggf. Supertwist ergeben sich andere Laufbedingungen). Die Gesamt-RNA sollte sichtbare Banden der 16/18 S- und 23/28 S-rRNAs zeigen. Sind diese nicht sichtbar, ist die RNA meist degradiert. 4.2  Isolierung und Analyse von Proteinen 4.2.1  Herstellung von Proteinextrakten für die

SDS-Gelelektrophorese

Für denaturierende Proteinauftrennung werden Proteinextrakte benötigt. Dafür müssen die Zellen aufgebrochen werden, wofür SDS und Triton im Puffer für Gram-negative Bakterien und einige Archaea bereits ausreichen können. Für Gram-positive Bakterien, Pilze oder andere schwerer zu lysierende Zellen kann eine French Press benutzt oder in flüssigem Stickstoff gemörsert werden. Neben PBS kann auch 100 mM Kaliumphosphat­ puffer pH 7,0 verwendet werden. i Benötigtes Material

5 Kulturen der zu isolierenden Stämme 5 Gefäße 5 Wasserbad 5 Lösungen 5 Puffer 5 ggf. flüssiger Stickstoff 5 Bei vielen parallelen Ansätzen die korrekte Beschriftung nicht vergessen (Stammbezeichnung, Probennummer) Phosphatpuffer Saline (PBS) Bestandteil

Menge

NaCl

8 g

KCl

200 mg

Na2HPO4

1.44 g

KH2PO4

240 mg

Aqua dest. ad

1000 ml

Vorgehensweise 5 Die Kulturen abzentrifugieren. 5 Die Proben in einem möglichst kleinen Puffervolumen resuspendieren. Dem Extraktionspuffer – üblicherweise PBS-Triton – können 0,1 % SDS oder entsprechende Mengen Nonidet P-40 oder Triton-X-100 beigemengt werden, um die Löslichkeit membrangebundener Proteine zu erhöhen.

189 Molekularbiologische Methoden

z Versuchsergebnis/Auswertung

Der Extrakt kann für die Proteingelektrophorese, den Westernblot oder im ELISA ver­ wendet werden (7 Abschn. 4.2.3, 4.3.3 und 4.4.4). 4.2.2  Quantifizierung von Proteinen

Mit Färbung kann die Proteinkonzentration colorimetrisch bestimmt werden (BradfordAssay). i Benötigtes Material

5 Photometer 5 Proteinlösung 5 Bradford-Reagenz 5 Rinderserumalbumin für eine Eichkurve

Vorgehensweise 5 Ca. 1–10 µg Protein (ggf. nach einer ersten Messung die Ausgangslösung verdünnen) in 100 µl vorlegen. 5 Bradford-Reagenz 1:5 in Aqua bidest. verdünnen. 5 1 ml Reagenz zum Protein geben, schütteln. 5 Nach 1–5 min die Proben photometrisch bei 595 nm messen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Eichgerade wird aus den Messwerten mit Rinderserumalbumin aufgetragen und die Proteinkonzentration anhand der Eichgerade ermittelt (. Abb. 4.6). 4.2.3  Proteingelelektrophorese

Sowohl zelluläre Proteine, besonders nach einer Expression bestimmter Proteine in Modellorganismen wie Escherichia coli, aber auch das Proteom einer Zelle zum 0,6 0,5

∆E 595nm

0,4 0,3 0,2 0,1 0

0

0,2

0,4 0,6 0,8 Rinderserumalbumin (mg/ml)

1

1,2

. Abb. 4.6  Beispiel für eine Eichkurve zur Quantifizierung von Proteinen. (© Erika Kothe, Jena)

4

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E. Kothe

4

. Abb. 4.7  SDS-Gelelektrophorese mit Coomassie-Blau-Färbung der aufgetrennten Proteine nach einer Enzymaufreinigung. Die Größe der verwendeten Markerproteine ist links angegeben. Der Rohextrakt (RE), die Fraktionen einer Ammonsulfatfällung sowie die aktiven Fraktionen (#) nach Aufreinigung über eine DEAD- bzw. Sepharosesäule sind aufgetragen. (© Erika Kothe, Jena)

Nachweis bestimmter Proteine durch Antikörper im Westernblot (7 Abschn. 4.4.3) können mit Proteingelektrophorese aufgetrennt werden (. Abb. 4.7). Native Protein­ komplexe werden in SDS-Gelen nicht erhalten, dafür sind spezifische Methoden not­ wendig. Die Konzentration kann colorimetrisch (Bradford-Assay, verschiedene Hersteller) bestimmt werden. i Benötigtes Material

5 Protein-Gelelektrophorese-Apparatur 5 Proteinextrakt(e) 5 Größenmarker, z. B. Rinderserumalbumin (67 kDa), ov-Albumin (40 kDa), Carboanhydrase (30 kDa), Trypsininhibitor (12 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Cytochrom c (12 kDa) 5 Trenngel zweifach konzentriert: 96,7 g Acrylamid, 3,3 g N,N′-Methylenbisacrylamid ad 400 ml Aqua dest. 5 Trenngelpuffer vierfach konzentriert: 72,7 g Tris, 16 ml DDA 10 %, ad 400 ml, pH 8,8 (mit HCl einstellen) 5 Sammelgel zweifach konzentriert: 40 g Acrylamid, 1,1 g N,N′-Methylenbisacrylamid ad 400 ml Aqua dest.) 5 Sammelgelpuffer vierfach konzentriert: 24,2 g Tris, 16 ml SDS 10 %, pH 6,8 (mit HCl einstellen) 5 Ammoniumperoxodisulfat (APS): Lösung 10 % 5 Tetramethylethylendiamin (TEMED)

191 Molekularbiologische Methoden

Probenpuffer Bestandteil

Menge

Glycerin

250 µl

SDS 10 %

330 µl

ß-Mercaptoethanol

30 µl

Bromphenolblau

1 mg

Aqua dest

390 µl

Laufpuffer, vierfach konzentriert Bestandteil

Menge

Tris-Base

30 g

Glycin

144 g

SDS

10 g

Aqua dest. ad

2500 ml

Der pH sollte bei 8,3 liegen (nicht mit HCl einstellen!) Färbelösung Bestandteil

Menge

Methanol

500 ml

Essigsäure

100 ml

Boomassie Brilliant Blue

0,6 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Entfärbelösung Bestandteil

Menge

Methanol

50 ml

Essigsäure

75 ml

Aqua dest. ad

1000 ml

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Vorgehensweise 5 Zum Gießen des Gels die Gelkammer zusammenbauen und abdichten. 5 Das entsprechende Volumen Trenngel (meist 12 %, z. B. 40 ml) mit TEMED (10 µl) und APS (200 µl der 10 % Stammlösung) mischen und blasenfrei einfüllen. 5 Die Polymerisierung setzt sofort ein, nachdem TEMED und APS zugegeben wurden! 5 Trenngel gießen und mit Isopropanol überschichten. 5 Nach dem Aushärten den überschichteten Alkohol abgießen und das Sammelgel (meist 5 %) gießen. 5 Für 16 ml Sammelgel werden 16 µl TEMED und 48 µl APS (10 %) benötigt.

4

192

4

E. Kothe

5 Nach dem blasenfreien Gießen den Kamm einsetzen. 5 Aushärten über Nacht minimiert das Risiko von Wechselwirkungen zwischen Monomeren und Cysteinen aus den Proteinen. 5 Proteingel in die Laufapparatur einspannen und Laufpuffer in beide Kammern füllen. 5 Proteinextrakt mit 5 µl Probenpuffer mischen. 5 5 min auf 95 ℃ erhitzen. 5 Vorbereitete Proben in die Taschen auftragen. 5 Gel bei 100 V laufen lassen, bis der Blaumarker das untere Gelende erreicht. 5 Gel entnehmen, das Sammelgel abtrennen. 5 Färben in Färbelösung für 1 h, Entfärben in Entfärbelösung über Nacht, bis der Hintergrund vollständig klar erscheint. 5 Dokumentation durch Fotografieren.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Ca. 100 µg Protein pro Spur auftragen, um eine gute Trennung zu erlauben. Anstelle einer Coomassie-Färbung kann eine Silberfärbung für niedrigere Nachweisgrenzen sinnvoll sein. Die blauen Banden entsprechen den nach ihrer Größe aufgetrennten Proteinen. Da SDS das Protein denaturiert, können die Molekulargewichte anhand der mit­ gelaufenen Markerproteine direkt abgeschätzt werden. 4.3  DNA-modifizierende Enzyme 4.3.1  Restriktionsendonukleasen

DNA-abhängige Restriktionsendonukleasen des Typs II mit der Erkennung von DNA-Sequenzmotiven . Abb. 4.8) schneiden die entsprechende DNA mit oder

. Abb. 4.8  Gelelektrophorese von mit der Restriktionsendonuklease BshFI behandelten PCR-Produkten der 16S-rDNA aus Bodenisolaten (gr: Gene Ruler als Größenmarker). (© Falko Gutmann, Jena)

193 Molekularbiologische Methoden

ohne überhängenden Enden. Dies hat einen Einfluss auf Klonierungsstrategien (7 Abschn. 4.3.2). i Benötigtes Material

5 Proben 5 benötigten Enzyme und Puffer der Hersteller 5 Wärmeblöcke für die Inkubation

Vorgehensweise 5 Die DNA nach Herstellerangaben im spezifischen Puffer und bei der gewünschten Temperatur inkubieren. 5 Zur Erfolgskontrolle kann eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt werden (7 Abschn. 4.1.5).

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Vollständigkeit der Behandlung kann durch Gelelektrophorese überprüft wer­ den. Die DNA wird zur Analyse im Agarosegel (7 Abschn. 4.1.5) oder zur Klonierung (7 Abschn. 4.3.2) weitergenutzt. Analytisch kann ein Southernblot (7 Abschn. 4.4.1) angeschlossen werden. Die Aktivität der Enzyme kann berechnet werden. Grundlage ist die Definition der Aktivität (U/ml), die sich auf die DNA des Phagen λ bezieht. Ein Beispiel zur Berechnung für ein Plasmid von 3 kb Größe mit 2 Schnittstellen für EcoRI: Im Genom des Phagen λ, das ca. 50 kb groß ist, sind fünf Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonuklease EcoRI. Wenn 1 µg λ-DNA innerhalb einer Stunde vollständig geschnitten wird, wird dies als 1 U definiert. 1 µg λ-DNA entspricht (bei einem Molekulargewicht von 660 für ein Basenpaar) 0,03 pMol DNA. Da fünf Schnittstellen enthalten sind, entspricht dieses 1 µg damit 0,15 pMol Schnitte. Damit wird 1 U EcoRI in einer Stunde 0,15 pMol Schnitte durchführen. Als Musterrechnung kann man folgendes verwenden: Falls 10 µg Plasmid (also 5 pMol DNA) mit zwei Schnitten pro Molekül in einer Stunde vollständig geschnitten werden sollen, werden also 10 pMol Schnitte benötigt. Da 1 U EcoRI in einer Stunde 0,15 pMol Schnitte durchführt, müssen 33 U EcoRI eingesetzt werden, um im optima­ len Puffer bei optimaler Temperatur das Plasmid vollständig zu schneiden. 4.3.2  Vektoren und Klonierung

Verschiedene Vektoren für unterschiedliche Organismengruppen wurden entwickelt (. Abb. 4.9). Hier ist vereinfachend die Klonierung eines PCR-Produkts in einem Standardvektor für E. coli beispielhaft beschrieben. Dazu den gewünschten DNAAbschnitt amplifizieren und die DNA aufreinigen. Der Vektor steht in geeigneter Form in einem PCR-Klonierungskit zur Verfügung. Ein weit verbreitetes Selektionssystem, das es erlaubt die Zellen auszusondern, in denen ein Vektor ohne Insert enthalten ist, ist das Blau-Weiß-Screening. Das Blau-Weiß-Screening beruht auf der Aktivität der ß-Galaktosidase. Das Enzym kann selbst dann arbeiten, wenn zwei Fragmente in verschiedenen Genen im selben Wirt translatiert werden. So ist das Ω-Fragment des lacZ-Gens in den Empfängerzellen

4

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E. Kothe

f1(+)

bla ori Pcil (9849)

überexprimierte psK-Laccase 11656 bp

4

trp1 Icc2

ptef1

Hindlll (5445)

. Abb. 4.9  Vektor zur Transformation von Schizophyllum commune. Der Vektor basiert auf einem Escherichia coli-Plasmid (pUC) mit zwei Sequenzen für den Replikationsursprung (ori; f1) und Selektionsmarkern für Escherichia coli (Ampicillinresistenz, bla) sowie für Tryptophan-Prototrophie im Pilz (trp). Das zu exprimierende Gen für eine Laccase (lcc2) unter dem Promotor des Translations-Elongationsfaktors EF1alpha (ptef1) sowie Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen HindIII und PciI sind angegeben. (© Eric Scherwietes, Jena)

im Chromosom kodiert, während das α-Fragment des ß-Galaktosidasegens auf dem Vektor liegt. Die Insertionsstelle für Klonierungen liegt nun innerhalb dieses Teils der ß-Galaktosidase, sodass bei Einsetzen eines Inserts kein funktionsfähiges α-Fragment und damit keine funktionsfähige ß-Galaktosidase vorliegt. Die Zellen können daher X-Gal, ein ß-Galaktosid, nicht mehr spalten und damit kein Indol freisetzen. Die blaue Färbung der Kolonien kann nicht entstehen. Damit sind weiße Klone diejenigen, die ein Insert enthalten sollten (oder aber beim Zurück-Ligieren des Vektorrückrats eine Muta­ tion zum Beispiel durch Rasterschub erhalten haben). i Benötigtes Material

5 aufgereinigte PCR-Produkte (7 Abschn. 4.5) 5 klonier- und selektionsfähiger, linearisierter Vektor (z. B. aus einem geeigneten Kit) 5 Ligase 5 entsprechende Puffer des Herstellers 5 elektrokompetente Zellen von E. coli aus einem Kit Ligationsansatz Bestandteil

Volumen

Vector (50 ng/µl)

0,5 µl

PCR-Produkt

0,5 bis 2 µl

2x Ligations-Master Mix

2,5 µl

Aqua dest. ad

5 µl

195 Molekularbiologische Methoden

Medium zur Blau-Weiß-Selektion Bestandteil

Konzentration

Standard I Medium, Merck

25 g/l

Ampicillin

100 mg/l

XGal (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid)

25 mg/l

Natürlich ist es auch möglich, das Plasmid (7 Abschn. 4.1) zu isolieren, mit einem Restriktionsenzym zu behandeln, und diese Schnittstelle mit einem aus genomi­ scher DNA erhaltenen Fragment mit denselben überhängenden Enden zu ligieren. In Ligationsansätzen empfiehlt es sich immer, unterschiedliche Mengenverhältnisse vorzulegen (z. B. 2:1, 1:1 und 1:2 im molaren Verhältnis Vektor:Insert). Nach der Ligation wird der erzeugte Vektor durch geeignete Transformation (beispielsweise 7 Abschn. 4.2.3) in Zellen überführt. Die Zellen können dann weiter charakterisiert wer­ den. Damit besteht die Möglichkeit, Klone zu selektieren, die die gewünschten Eigen­ schaften zeigen. Durch den im Vektor kodierten Selektionsmarker ist sichergestellt, dass die Empfängerzellen den Vektor enthalten. Vorgehensweise 5 Die Ligation nach der Tabelle ansetzen und über Nacht bei 14 ℃ inkubieren. 5 Danach können Ligationsansätze bei -20 ℃ gelagert werden. 5 Die Zellen nach der Transformation (7 Abschn. 4.2.3) auf Selektionsmedium plattieren (vgl. Tabelle Medium zur Blau-Weiß-Selektion oben). 5 Inkubation über Nacht bei 37 ℃.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Es sind blaue und weiße Kolonien erkennbar. Die blauen Klone enthalten den Vektor ohne Insert. Die weißen Kolonien werden weiter charakterisiert. Zur Charakterisie­ rung kann das Plasmid isoliert (7 Abschn. 4.2.2) und das Insert mit geeigneten Pri­ mern sequenziert werden. Es ist empfehlenswert, die Sequenzierung einer Fachfirma zu überlassen. 4.3.3  Elektroporation von Escherichia coli

Die Plasmide werden über eine Transformation in elektrokompetente E. coli-Zellen ein­ gebracht. Dabei wird die Zellmembran über eine kurze elektrische Entladung durch­ gängig für größere Moleküle, Ionen oder auch DNA. i Benötigtes Material

5 Elektrokompetente Zellen von E. coli (aus einem geeigneten Kit) 5 Ligationsansätze 7 Abschn. 4.2.2 5 Selektionsmedium 5 Elektroporator . Abb. 4.10

4

196

E. Kothe

4 . Abb. 4.10  Elektroporationsküvette und Pulsgeber für die Elektroporation kompetenter Zellen mit DNA. (© Erika Kothe, Jena)

Vorgehensweise 5 60 μl elektrokompetenten E. coli mit 2,5 μl Ligationsansatz auf Eis mischen. 5 Den Ansatz in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführen. 5 In einem Elektroporator bei 2,5 kV und 25 μF transformieren. 5 Danach sofort 1 ml Medium bei Raumtemperatur zugeben. 5 Vorinkubation zur Ausprägung der Ampicillinresistenz der Zellen bei 37 ℃ für 1 h. 5 Danach können transformierten Zellen ausplattiert werden (z. B. auf StdI-Medium mit Ampicillin und X-Gal). 5 Es empfiehlt sich, jeweils 50 μl und 100 μl der Transformation von 1 μl bzw. 2 μl des Ligationsansatzes auszuplattieren. Bei ungeschnittenen Vektoren müssen die Transformationsansätze hingegen ggf. verdünnt werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die erhaltenen Klone sind bereits auf das Vorhandensein des Vektors anhand der Antibiotikaresistenz selektiert. Falls ein Blau-Weiß-Screening vorgesehen ist, können die weißen Kolonien vereinzelt und dann weiter charakterisiert werden, z. B. durch eine Polymerase-Kettenreaktion, die das Insert nachweist (7 Abschn. 4.3.2). 4.4  Nachweis von Nukleinsäuren und Proteinen durch

Hybridisierung und Antikörper-abhängige Methoden

4.4.1  Southernblot-Analyse

Der Nachweis einzelner Gene in einer Gesamt-DNA ist durch die spezifische Hybridi­ sierung mit einer markierten Sonde möglich. Das kann beispielsweise den Nachweis der (einzelnen) Integration eines Gens in das Genom betreffen. Durch die Hybridisie­ rung werden spezifische Bandengrößen in einer mit einer Restriktionsendonuklease behandelten DNA sichtbar, sodass eine Abschätzung der Integrationshäufigkeit möglich wird. Gleichzeitig erlaubt die Ermittlung der Bandengröße auch, den Ort der Integration zu bestätigen, wenn Informationen über die genomische Umgebung vorliegen, beispiels­ weise zum Nachweis einer homologen Integration.

197 Molekularbiologische Methoden

i Benötigtes Material

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Agarosegel der mit Restriktionsendonukleasen behandelten DNA markierte Sonde, beispielsweise mit Digoxygenin (DIG) markiert Detektionslösungen (z. B. zum Nachweis von DIG) Nylonmembran zur DNA-DNA-Hybridisierung GelSoak I: 1 M NaCl, 0,5 M NaOH GelSoak II: 0,5 M Tris, 3 M NaCl, pH 7,4 mit HCl 0,1 % N-Lauroylsarcosin 0,02 % SDS 0,5 % Blocking Reagenz Puffer I: 100 mM Tris/Cl pH 7,5, 150 mM NaCl Puffer II: Puffer I mit 0,5 % Blocking Reagenz Puffer III: 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 SSC-Puffer, 20-fach Bestandteil

Menge

NaCl

3 M

Trinatriumcitrat

0,3 M

pH-Wert mit HCl auf pH 7,0 einstellen

Weitere Markierungsmöglichkeiten mit radioaktiv markierter Sonde benötigen ein Isotopenlabor, ein Fotolabor und Boxen für die Inkubation des Films mit der Hybridisierungsmembran bei -20 ℃. Es empfiehlt sich, die Membran zu markieren, beispielsweise durch Abschneiden einer Ecke, um die Orientierung auch nach Entwicklung des Films sicher nachvollziehen zu können. Vorgehensweise Der DNA-Transfer erfolgt aus einem Agarosegel durch saugfähiges Papier. Der Aufbau ist in . Abb. 4.11 dargestellt. 5 Das fotografierte, Ethidiumbromid-gefärbte Gel für 10 min in GelSoak I inkubieren.

Gewicht (250 -500 g) Glasplatte 3 x Whatman-Papier in 20x SSC getränkt mit Frischhaltefolie umwickelt

Agarosegel Nylonmembran 3 x Whatman-Papier in 20x SSC getränkt Stapel Papierhandtücher

. Abb. 4.11  Aufbau zum Southernblot für den Transfer von DNA aus einem Agarosegel auf die Hybridisierungsmembran. (© Lisa-Marija Ahrens, Jena)

4

198

4

E. Kothe

5 Die Lösung abgießen, und die Prozedur wiederholen. 5 Zur Neutralisierung zweimal für jeweils 10 min in GelSoak II waschen. 5 In einer Schale wie in . Abb. 4.11 dargestellt doppellagiges Whatman-Papier in 20 × SSC eintauchen. 5 Das Gel auf das Whatman-Papier platzieren und mit der Nylonmembran (zugeschnitten auf Gelgröße) bedecken. 5 Darauf zwei Lagen zugeschnittenes Whatman-Papier (darf nicht über das Gel hinausragen) legen. 5 Saugfähiges Papier (z. B. Papierhandtücher), ebenfalls auf Gelgröße zugeschnitten, zu ca. 10 cm Höhe aufschichten. 5 Mit einer schweren Platte (z. B. einem Stativfuß) beschweren und über Nacht stehen lassen. 5 Nylonmembran entnehmen, in 6 × SSC waschen, an der Luft trocknen. 5 Ggf. (je nach Angaben des Herstellers zur verwendeten Membran) die DNA durch Backen für 4 h bei 80 ℃ fixieren. Markierung der Sonde 5 Nach Herstellerangaben Oligonukleotide oder kurze Fragmente durch PCR mit Digoxigenin-markierten Nukleotiden herstellen. 5 Die Sonde bei 95 ℃ für 5 min aufschmelzen. 5 Auf Eis lagern. Hybridisierung 5 Die vorbereitete Membran in Aqua dest. abspülen und anschließend mit 20 × SSC waschen. 5 Prähybridisierung für 1 h bei 68 ℃ unter schwachem Schütteln (Rundschüttler) in 5 × SSC, 0,1 % N-Lauroylsarcosin, 0,02 % SDS und 0,5 % Blocking-Reagenz. 5 Markierte und bei 95 ℃ für 5 min aufgeschmolzene Sonde zugeben und 2–6 h bei 68 ℃ hybridisieren. 5 Waschen für zweimal 5 min bei Raumtemperatur mit 2 × SSC mit 0,1 %SDS. 5 Waschen für zweimal 15 min bei 68 ℃ in 0,1 × SSC mit 0,1 % SDS. 5 Die feuchte Membran kann zur Detektion weiter behandelt werden. Detektion 5 Zum Nachweis der hybridiserten Banden 1 min in Puffer I (100 mM Tris/Cl pH 7,5, 150 mM NaCl) inkubieren. 5 30 min in Puffer II (Puffer I mit 0,5 % Blocking-Reagenz). 5 Waschen für 1 min in Puffer I. 5 4 µl Antikörper in 20 ml Puffer 1 zugeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. 5 Waschen zweimal je 15 min in 100 ml Puffer I. 5 Beenden durch 2 min in 20 ml Puffer III (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2). 5 Die feuchte Membran im Dunkeln mit 10 ml Farbreagenz des Herstellers für ca. 1 h entwickeln.

199 Molekularbiologische Methoden

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Bandengröße kann durch den im Agarosegel mitgelaufenen Marker (z. B. λ PstI) ermittelt werden. Dazu das Gel fotografieren und die Größe der beiden abgebildeten Nachweismethoden dann in silico angleichen. 4.4.2  Northernblot-Analyse

Analog zum Southernblot kann auch RNA übertragen werden, Aufgrund der Sensitivi­ tät der RNA gegenüber RNAsen ist es sinnvoll, hier einen schnelleren Elektroblot vor­ zunehmen. Der Nachweis durch fluoreszenzmarkierte Sonden ist möglich und sinnvoll, wenn kein Isotopenlabor verfügbar ist. Die Sensitivität der radioaktiven 32P-Markierung ist aber höher. Eine Northernblot-Analyse ist besonders dann sinnvoll, wenn mit unabhängigen Methoden Transkriptmengen abgeschätzt werden sollen. Diese Methode wird zusätz­ lich zur quantitativen Reverse Transcription-PCR durchgeführt. Sie erlaubt nicht nur die Mengenabschätzung der durch Hybridisierung visualisierten Transkripte, sondern zugleich deren Größenbestimmung (z. B. für Operon-Analysen und den Nachweis inter­ ner Transkriptionsstarts). i Benötigtes Material

5 RNA-Gel der gewünschten Proben 5 Formaldehyd (RNA grade): 20 ml Formaldehyd mit 5 g Amberlite für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und dann durch einen Papierfilter filtrieren 5 Elektroblot-Apparatur 5 Nylonmembran 5 markiertes Oligonukleotid 5 Nachweisreagenzien (z. B. in einem Kit für Fluoreszenzmarkierung von Oligonukleotiden und deren Nachweis)

Es empfiehlt sich, die Membran zu markieren, beispielsweise durch Abschneiden einer Ecke, um die Orientierung auch nach Entwicklung des Films sicher nachvollziehen zu können. Bei Arbeiten mit RNA ist besondere Vorsicht angebracht, um Abbau durch RNAsen zu vermeiden. Vorgehensweise Übertragung der RNA 5 Das kurz mit Ethidiumbromid gefärbte und unter UV-Licht dokumentierte Gel kurz mit Aqua dest. waschen, um das Formaldehyd zu entfernen. 5 15 min in 10 × SSC inkubieren und dann in der Blot-Apparatur auf die Membran übertragen. 5 Waschen der Membran mit 2 × SSC, danach an der Luft trocknen. 5 Bei 80 ℃ für 2 h die RNA fixieren. 5 Danach kann wie bei der Detektion von DIG-markierter DNA (Southernblot, 7 Abschn. 4.4.1) für die Detektion der Banden auf der Membran mit der Hybridisierung weiter verfahren werden.

4

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E. Kothe

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die erhaltenen Banden zeigen die Transkriptmenge durch unterschiedliche Banden­ stärke. Dies erlaubt die Zuordnung zu verschiedenen Differenzierungsvorgängen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist in . Abb. 4.11 für S. commune dargestellt; sie kann aber auch sehr gut an keimenden Conidiosporen oder an Hefen durchgeführt werden. Für Hefen wird Zymolyase als Zellwand-lysierendes Enzym eingesetzt.

4

4.4.3  Westernblot-Analyse

Durch den Nachweis bestimmter Proteine kann in einem Zelllysat das Vorhandensein und die Größe eines mit Antikörpern reagierenden Immunogens bestimmt werden. i Benötigtes Material

5 denaturierendes Proteingel 7 Abschn. 4.2.3 5 Apparatur zum Elektrotransfer von Proteinen 5 Primärer Antikörper gegen das zu detektierende Protein (z. B. aus der Maus) 5 Sekundärer, markierter Antikörper (z. B. Ratte-anti Maus IgG-Peroxidase) 5 Nachweisreagenzien für die Enzymreaktion 5 Blotpuffer: Tris 16,2 g, Glycin 7,2 g, Methanol 1 l, ad 5 l mit Aqua dest. 5 PBS 7 Abschn. 4.2.1 5 Chlornaphtol-Reagenz: Chlornaphtol 3 mg/ml in absolutem Ethanol lösen, 1:5 verdünnt in 0,1 M TrisCl pH 7,6 5 Chemikalien wie Nonidet und Rinderserumalbumin (RSA)

Vorgehensweise Der Nachweis bestimmter Proteine erfolgt nach der Auftrennung im SDS-Polyacrylamid-Gel. Die Proteine entsprechend den Herstellerangaben in einer Elektroblot-Apparatur auf eine geeignete Membran übertragen. Die Membran mit Blotpuffer abspülen. 5 Absättigen der Membran mit 2 % BSA. 5 Der erste Antikörper sollte polyklonal sein und gegen das zu detektierende Protein gerichtet – in PBS (7 Abschn. 4.2.1) mit 1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Nonidet P-40 verdünnt, je nach Antiserum 1:200 oder stärker. 5 Im Verdünnungspuffer mit dem 1. Antikörper über Nacht inkubieren. 5 Waschen in PBS 5 Zugabe des zweiten Antikörpers, der gegen den ersten gerichtet ist (z. B. Ratte-anti-Maus-IgI, wenn der erste Antikörper aus Mausserum gewonnen wurde); dieser zweite Antikörper ist markiert, z. B. mit Meerrettich-Peroxidase. 5 In PBS waschen. 5 Den zweiten Antikörper ebenfalls verdünnen, ca. 1:500 in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin und d 0,1 % Triton. 5 Zweimal 20 min in PBS mit 0,1 % Triton waschen. 5 Nachweis z. B. mit Chlornaphtol-Reagenz. 5 Nachweisreaktion durch Zugabe von 5 µl H2O2 in 10 ml Puffer starten.

201 Molekularbiologische Methoden

. Abb. 4.12  Westernblot für Mikrotubuli-Proteine aus Tricholoma vaccinum. Als primärer Antikörper wurde ein gegen das entsprechende Protein der Maus gerichteter, käuflicher Antikörper verwendet (K: Kontrolle mit Mausproteinen, T: Proteinextrakt aus T. vaccinum). Es sind insbesondere für die Maus Multimere erkennbar. (© Katrin Krause, Jena)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Es sollten die Banden sichtbar werden, die mit den Antikörpern reagiert haben. Durch Vergleich mit einem Coomassie-gefärbten Teil desselben Gels (7 Abschn. 4.2.3) lässt sich die Größe der Proteine bestimmen (. Abb. 4.12). 4.4.4  Enzyme-linked Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)

Das Antigen wird immunologisch nachgewiesen. Dabei wird das Antigen in einem direkten ELISA an die Plastikmatrix in der 96-well-Platte gebunden, mit einem ersten und gegen diesen gerichteten zweiten Antiköper nachgewiesen und der Komplex durch die Reaktion des mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten zweiten Antikörpers sicht­ bar gemacht (. Abb. 4.13). Viele andere Methoden werden für spezielle Anwendungen genutzt, beispielsweise Sandwich-ELISA. Es gibt Kits, die die notwendigen Reagenzien enthalten. Der Proteinextrakt sollte kein Detergens enthalten. Die Proteinisolierung kann in PBS erfolgen oder das Detergens durch Dialyse vollständig entfernt werden.

4

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E. Kothe

4

. Abb. 4.13  Platte für einen ELISA. Das Chlornaphtol-Reagenz färbt solche Reaktionsgefäße blaugrün, in denen die Enzymreaktion nach Bindung des zweiten Antikörpers und Starten der Peroxidasereaktion ablaufen kann. (© Jessica Pötschner, Jena)

i Benötigtes Material Phosphatpuffer-Saline (PBS) Bestandteil

Menge

NaCl

8 g

KCl

200 mg

Na2HPO4

1,44 g

KH2PO4

240 mg

Aqua dest. ad

1000 ml

Phosphat-Citrat-Puffer (PCB) Bestandteil

Menge

Na2HPO4

9,14 g

Citronensäure

8,26 g

Aqua dest. ad

1000 ml

Resultierender pH

4,2

Detektionslösung mit 2,2′-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) Bestandteil

Menge

ABTS

1 mg

PCB ad

1 ml

2 % Rinderserumalbumin in PBS Triton-PBS: PBS, 0,1 % Triton-X-100 ELISA Reader

203 Molekularbiologische Methoden

Vorgehensweise Das Antigen in Ladepuffer vorlegen und bei alkalischem pH mit der Matrix der Mikrotiterplatte (96 well -Platte) verbinden. Es folgen Waschschritte und die Bindung des ersten und zweiten Antikörpers, bevor die Enzymreaktion gestartet wird. Die Platte darf während der gesamten Prozedur nicht austrocknen! Eine positive (reines Antigen) und eine negative (ohne Antigen-Zugabe) Kontrolle müssen immer mitgeführt werden. 5 Verdünnungsreihe des Antigens in PBS in Doppelbestimmung in die wells pipettieren; in jedem well sollen 50 µl Endvolumen vorliegen. 5 Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. 5 3 Mal waschen mit PBS; dazu den Puffer auf die Platte schütten und alles gut ausschlagen; anschließend gründlich auskippen. 5 Mit 100 µl 2 % BSA-PBS pro well für 1 h bei 37 ℃ absättigen. 5 2 Mal mit PBS waschen. 5 Pro well 50 µl ersten Antikörper, z. B. Maus-anti-Antigen in 1 % BSA-PBS, je nach Titer des Antikörpers 1:50 bis 1:200 verdünnt für 2 h bei 37 ℃ inkubieren. 5 3 Mal mit Triton-PBS waschen. 5 1 Mal mit PBS waschen. 5 50 µl sekundären Antikörper, z. B. Ratte-anti-Maus-IgG-MeerrettichperoxidaseKonjugat, 1:300 bis 1:1000 verdünnt in 1 % BSA-PBS pipettieren. 5 1,5 h bei 37 ℃ inkubieren. 5 5 Mal mit Triton-PBS waschen. 5 1 Mal mit PCB waschen. 5 50 µl ABTS-Lösung zugeben, bei 405 nm photometrisch auslesen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die enzymatische Reaktion der Meerrettich-Peroxidase wird gemessen. Da diese nur im well verbleibt, wenn der zweite Antikörper an den ersten und dieser an das Antigen gebunden hat, ist die Enzymaktivität proportional zu den Antigenmolekülen im well. Es kann sowohl eine Endbestimmung als auch die Aufzeichnung der initialen Kinetik genutzt werden, um die Menge an Antigen abschätzen zu können. Mit der gleichen Methode kann auch der Titer eines Antiserums (bei gleicher Anti­ genkonzentration und Einsetzen des ersten Antikörpers in einer Verdünnungsreihe) bestimmt werden. 4.5  Nachweismethoden durch Polymerase-Kettenreaktion 4.5.1  Genspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Genspezifische PCR erlaubt die Amplifzierung eines bestimmten DNA-Abschnitts. Dies kann genomische DNA einer Reinkultur, aber auch direkt aus einer Umweltprobe sein. Als Beispiel ist hier die weit verbreitete Amplifizierung der 16S rRNA-Markergene beschrieben. Diese Gene liegen in mehreren Kopien im bakteriellen Genom vor und sind gut konserviert, was eine Amplifikation des Abschnitts erleichtert. Diese Methodik ist ein essenzieller Schritt für die Identifizierung von Bakterien (. Abb. 4.14).

4

204

E. Kothe

4

. Abb. 4.14  Gelelektrophoretische Auftrennung von 16S-rDNA-PCR-Produkten, die aus genomischer DNA von Umweltproben amplifiziert wurden. Für Bakterien werden ca. 1450 und für Archaea ca. 950 bp erwartet. Als Größenmarker dienten λ-Pst (äußere Spuren). (© Falko Gutmann, Jena)

i Benötigtes Material

5 Zu untersuchende Proben 5 PCR-Gerät 5 Verbrauchsmaterial wie PCR-Röhrchen (0,2 ml PCR-Tubes) 5 Taq-Polymerase

Vorgehensweise 5 PCR-Reaktionsmischung als Mastermix ansetzen (berechnet auf die benötigten Ansätze, alle Bestandteile außer der Template-DNA), auf Eis! 5 Daraus jede einzelne Reaktion pipettieren, um die Vergleichbarkeit innerhalb des PCR-Programms zu gewährleisten. 5 DNA (beispielsweise aus Boden isoliert) 5 Negativkontrolle mit Aqua dest. anstelle von DNA mitführen 5 Primer, im Beispiel hier die forward und reverse Primer für die Amplifizierung von 16S-rDNA (27 F: 5’- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3’; U1492R: 5’- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) PCR-Ansatz (z. B. hier für 30 µl Reaktionsvolumen) je nach benötigter Menge Bestandteil

Konzentration

Volumen (µl)

Taq-Puffer

10 x

3

dNTP-Mix

10 mM

2,5

Forward Primer

10 pM/μl

2,5

Reverse Primer

10 pM/μl

2,5

Taq-Polymerase

5 U/μl

0,1

Template-DNA

1

Aqua dest.

18,4

205 Molekularbiologische Methoden

PCR-Programm: 5 1 initiale Denaturierung 95 ℃ für 5 min 30 bis 40 Zyklen jeweils: 5 Denaturierung 95 ℃ für 30 s 5 Primer-Annealing 57 ℃ für 45 s 5 Elongation 72 ℃ für 90 s 5 abschließende Elongation 72 ℃ für 10 min 5 Halten nach Ende der Reaktion bei 12 ℃

z Versuchsergebnis/Auswertung

Ein Agarosegel (1 % Agarose) zur Kontrolle der erzeugten Fragmentlängen anfertigen und so den Erfolg der PCR kontrollieren. Die PCR-Programme müssen für jeden Fall optimiert werden; die Hersteller der Taq-Polymerase geben Hilfestellungen bei ver­ schiedenen Problemen. Falls die Banden weiterbearbeitet werden, können sie aus dem Gel extrahiert und beispielsweise kloniert (7 Abschn. 4.3.2) oder sequenziert (7 Abschn. 4.6.1) werden. 4.5.2  PCR zum Nachweis von Transkripten (RT-PCR)

Zum Nachweis bestimmter Transkripte bietet sich die Reverse-Transkriptase-PCR an. Dazu wird RNA isoliert (7 Abschn. 4.1.3) und die (m)RNA dann mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in die komplementäre cDNA umgeschrieben. Anschließend erfolgt die PCR mit spezifischen Primern, beispielsweise um aus 1 µg RNA die cDNA zu erzeugen. Ein Mastermix erhöht auch hier (vgl. 7 Abschn. 4.5.3) die Vergleichbarkeit innerhalb der Durchführung des PCR-Programms. Eine Negativkontrolle ohne Reverse Transkriptase (RNAse-freies Wasser anstelle der RNA) muss mitgeführt werden. i Benötigtes Material

5 zu untersuchende Proben 5 PCR-Apparatur 5 Verbrauchsmaterial wie PCR-Röhrchen (0,2 ml PCR-Tubes) 5 Kit zur cDNA-Synthese, z. B. Biorad iScriptTM cDNA Synthesis Kit 5 Thaw Buffer (auf Eis bereithalten) 5 Reverse Transkriptase (auf Eis bereithalten) 5 RNA and RNase-freies Wasser (auf Eis bereithalten)

Vorgehensweise 5 Die reverse Transkription wird auf Eis nach Angaben des Herstellers vorbereitet.

4

206

E. Kothe

PCR (z. B. hier für 30 µl Reaktionsvolumen) je nach benötigter Menge

4

Bestandteil

Konzentration

Volumen

iScript Reaktionsmischung

5 x

4 µl

iScript Reverse Transkriptase

Lt. Anleitung

1 µl

Template RNA

1 µg/µl

RNase-freies Wasser x μl ad

20 µl

Den Ansatz in einem PCR-Thermocycler inkubieren (nach Angaben des Herstellers) PCR-Programm: 5 25 ℃ für 5 min 5 42 ℃ für 30 min 5 85 ℃ für 5 min 5 Halten nach Ende der Reaktion bei 4 ℃ (nur für kurze Zeit!)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die so erzeugte cDNA wird mit genspezifischen Primern in einer PCR eingesetzt, um das spezifische Transkript nachzuweisen. Für Quantifizierungen eine quantitative PCR durchführen (7 Abschn. 4.5.3). 4.5.3  Quantitative real-time-PCR (qPCR)

Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung von Genen oder Transkripten (nach cDNA-Herstellung). Mit sequenzspezifischen Primern kann die relative Kopienzahl bestimmt werden. Zur Quantifizierung werden Sonden, die unspezifisch an alle dop­ pelsträngigen DNA-Moleküle binden und erst dann fluoreszieren, eingesetzt. Die ansteigende Fluoreszenz wird während der Reaktion in einem speziellen PCR-Gerät für real-time-PCR verfolgt (. Abb. 4.15). Das sich ergebende Diagramm zeigt auf der Y-Achse die Fluoreszenz, die gegen die Zahl der erfolgten Zyklen aufgetragen wird. Der Schwellenwert, bei dem eine bestimmte Fluoreszenz erreicht wird, lässt sich als Zahl der Zyklen ablesen und beschreibt den Ct-Wert. Je früher dieser erreicht wird, desto mehr Kopien lagen ursprünglich in der Probe vor. Für eine relative Quantifizierung der Expression werden parallel Referenz­ gene gemessen und das Zielgen gegen diese normalisiert. Typische Referenzgene können 16/18S rRNA, Actin, Ubiquitin, ftsZ oder Translations-Elongationsfaktorgene sein. Die Effizienz der Reaktion muss für jede Reaktion bestimmt werden und zwischen 90 und 110 % liegen. i Benötigtes Material

5 5 5 5

zu untersuchende DNA oder cDNA real-time-PCR-Apparatur (z. B. Miniopticon) mit 48-well-Multiplates Verbrauchsmaterial wie PCR-Röhrchen (0,2 ml PCR-Tubes) Kit, z. B. Maxima SYBR Green qPCR-Reaktionsmischung

207 Molekularbiologische Methoden

. Abb. 4.15  Relative Genexpression für Glutathion-S-Transferase-Gene (gst1 bis gst10) aus T. vaccinum. Der Pilz wurde auf Medium ohne Kohlenstoffquelle gezogen, was abiotischem Stress entspricht. Die Expression wurde in Bezug zur jeweils mit Glucose gezogenen Zellen als Veränderung dargestellt (-fache Veränderung). (© Mohammad Hasan Rahman Khattak, Jena)

Der mitgelieferte PCR-Puffer enthält Maxima Hot Start Taq DNA-Polymerase, dNTPs und SYBR Green I dye. Nur das Template und die Primer werden zugefügt. Dabei wer­ den für jedes Gen, das untersucht werden soll, separate Mastermix-Ansätze vorbereitet. Eine negative Kontrolle ist immer mitzuführen. Diese enthält kein Template, um intrinsische Fluoreszenz auszuschließen, bzw. entspricht einer Kontrolle ohne Reverse Transkriptase. Zusammen zeigen sie Verunreinigungen der RNA-Präparation mit geno­ mischer DNA. Vorgehensweise Der PCR-Ansatz wird entsprechend der Tabelle auf Eis pipettiert. PCR-Ansatz (z. B. hier für 30 µl Reaktionsvolumen) je nach benötigter Menge Bestandteil

Konzentration

Maxima SYBR Green mix

Volumen (µl) 6,25

Forward Primer

10 pM/μl

0,5

Reverse Primer

10 pM/μl

0,5

Nuclease-freies Wasser

3,25

Template-cDNA/DNA

2

Gesamtvolumen

12,5

Platte mit Microseal ‚B‘ verschließen (keine Fingerabdrücke auf der Folie!) qPCR-Programm: 5 1 initiale Denaturierung 94 ℃ für 10 min 30 bis 40 Zyklen jeweils: 5 Denaturierung 94 ℃ für 20 s 5 Primer-Annealing 60 ℃ für 35 s

4

208

E. Kothe

5 Elongation 72 ℃ für 20 s 5 abschließend 60 ℃ für 2 min 5 Schmelzkurve 60 bis 95 ℃ in 0,5 ℃-Schritten Nach dem Programm bei 4 ℃ halten, um eine Elektrophorese zur Qualitätskontrolle durchführen zu können.

4

z Versuchsergebnis/Auswertung

Für eine absolute Quantifizierung werden mehrere Referenzgene genutzt. Zur Datenanalyse die Ct-Werte und die korrespondierenden Schmelztemperaturen verwenden. Um die Expression für die Ampifikationseffizienz zu korrigieren, ΔCt = Cttarget - Ctreference berechnen: ΔΔCt = ΔCttreatment - ΔCtcontrol. Die Expression (-fach) berechnet sich aus: Ratio = 2 - ΔΔCt. 4.6  Sequenzierung und Genanalyse 4.6.1  Sequenzierung, Mikrobiomanalyse, Metagenom,

Transkriptom

Obwohl Sequenzreaktionen auch im Labor selbst angesetzt werden können, ist ange­ sichts der schnellen Weiterentwicklung von Methoden in aller Regel ein Verschicken der zur Sequenzierung vorgesehenen DNA sinnvoll. Je nach benötigter Sequenzierungs­ reaktion können einzelsträngige oder doppelsträngige Sequenzierungen beauftragt wer­ den, wobei letztere natürlich eine bessere Qualität bieten, da ein Fragment von beiden Seiten durchsequenziert wird. Ebenfalls abhängig von der Aufgabe können Einzelgene mit Standard-Primern (z. B. für 16S/ITS rDNA-Sequenzierung zur Identifizierung eines Stammes) sequen­ ziert werden oder Gene mit spezifischen Primern, die dann mitgeschickt oder deren Synthese ebenfalls beauftragt wird, komplett sequenziert werden. In beiden Fällen sollte im Normalfall die DNA nach einer PCR aufgereinigt und die Qualität (7 Abschn. 4.1.5) und Menge kontrolliert worden sein. Die Firmen überprüfen Reinheit und Menge in der Regel vor dem Beginn der Sequenzierung nochmal. Für Genomsequenzierungen wird DNA der benötigten Reinheit verschickt. Es kann die Abdeckung der Sequenzen sowie die Länge der einzelnen reads vereinbart werden. Eine mindestens 30fache Abdeckung des Genoms hat sich bewährt. Sollte die Bindung von Startsequenzen für die Sequenzierungsreaktion (adapter ligation) notwendig sein, kann diese selbst oder vom Hersteller erfolgen. Die entsprechenden Firmen liefern die Rohdaten, aber auch eine erste bio­ informatische Bearbeitung und Qualitätskontrolle. Eine Mikrobiomanalyse wird mit DNA eines bestimmten Habitats durchgeführt. Hier ist ebenfalls auf ausreichende Abdeckung zu achten. In der Regel werden Primer genutzt, die 16S-rDNA bzw. ITS (internal transcribed spacer) adressieren. Ein Meta­ genom dagegen erlaubt die Rekonstruktion der einzelnen vorliegenden, vollständigen Genome. Hier sind längere Sequenzen hilfreich.

209 Molekularbiologische Methoden

Transkriptom-Daten werden aus verschiedenen Wachstumsphasen, unter Einfluss verschiedener Faktoren oder aus unterschiedlichen Umweltproben vergleichend unter­ sucht. Daher ist hier die nachgeschaltete Bioinformatik der wichtigste Schritt. In aller Regel lohnt sich die Zusammenarbeit mit einem Labor, das ähnliche Analysen schon durchgeführt und ausgewertet hat. Dasselbe gilt verstärkt auch für Proteomanalysen. Hier sind die Voraussetzungen für das Verschicken von PCR-Produkten und die Datenbearbeitung exemplarisch beschrieben. Zunächst wird das PCR-Produkt auf­ gereinigt. i Benötigtes Material

5 zu sequenzierendes PCR-Produkt 7 Abschn. 4.1.5 5 Purification Kit 5 geeignete Firma für die Sequenzierung

Vorgehensweise 5 5 5 5 5

amplifizierte DNA (PCR-Produkte) Elution mit 2 × 20 μl Elution Buffer pro Probe Proben auf einem Thermoblock bei 65 ℃ für 10 min erhitzen nach Angaben des Herstellers zur Extraktion weiter verfahren die DNA ist dann versandfertig

z Versuchsergebnis/Auswertung Die DNA kann dann an die Firma zur Sequenzierung verschickt werden; die Ergeb­

nisse der Sequenzierung sind bei geeigneten Anbietern bereits am nächsten Tag per Email verfügbar. Die erhaltenen Daten bestehen aus den Rohdaten, und die bereits von den Primersequenzen befreiten und zugeschnittenen Sequenzdaten liegen als FASTA-Datei vor. Die Sequenzen müssen kontrolliert und auf Fehler überprüft wer­ den (. Abb. 4.16). Dazu die Elektropherogramme betrachten und Stellen, an denen die peaks für eine Base nicht eindeutig sind, überprüfen. Diese Sequenzabschnitte sollten für Homologiesuchen nicht verwendet werden, da die Sequenz hier uneindeutig ist. Die Daten können nun verwendet werden, um beispielsweise eine Homologiesuche durchzuführen. 4.6.2  Homologiesuche mit BLAST

Zur Homologiesuche wird ein Algorithmus verwendet, der zunächst nach möglichst ähnlichen Sequenzen in der Datenbank sucht. Die Plattform NCBI GenBank bietet nicht nur die derzeit umfassendste Datei, sondern stellt auch den Algorithmus benutzer­ freundlich zur Verfügung. In Sonderfällen, beispielsweise für Mykorrhizapilze, können andere Datenbasen besser geeignet sein. So bietet die UNITE Datenbank den Galaxy-­ Algorithmus an. i Benötigtes Material

5 zu untersuchende Sequenzen 5 Internetzugang (7 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

4

210

E. Kothe

4 STE12

Transkriptionsfaktor, aktiviert durch eine Mitogen-aktivierte-Protein(MAP)Kinase-Signalkaskade; aktiviert Gene, die an Mating oder an invasiven Wachstumsformen beteiligt sind; kooperiert mit dem Transkriptionsfaktor Tec1p, um Gene für invasives Wachstum zu regulieren

MAC1

Transkriptionsfaktor; reguliert Gene für Kupfer-Transport

VHR2

Nicht essentielles Zellkern-Protein; Deletion hat globale Effekte auf die Transkription

MOT2

Untereinheit des CCR4-NOT-Komplexes, der die Transkription sowie den Abbau und posttrankstiptionale Modifikationen der mRNA reguliert; ist zusammen Ubc4p verantwortlich für Ubiquitinylierung von entstehenden Polypeptid-assoziierten Komplexuntereinheiten und der Histon-Demethylase Jhd2p

HAC1

Transkriptionsfaktor; basischer Leucin-Zipper (bZIP, ATF/CREB1 Homolog), aktiviert durch Stress in Form von Ansammlung falsch gefalteter Proteine im Endplasmatischen Retikulum; reguliert ungefaltete Proteinantwort (UPR) unter anderem via Membran-Biogenese

. Abb. 4.16  Auswertung von Sequenzergebnissen. Die Analyse von Sequenzen aus Schizophyllum commune ergab für Hydrophobin-codierende Sequenzen, dass Promotorstrukturen (identifiziert durch die Software MEME) Bezüge zu Metall-induzierter Expression herstellten. (© Lisa-Marija Ahrens, Jena)

Vorgehensweise 5 Die bearbeiteten, von Sequenzierprimern und ggf. von Introns befreite, sichere Sequenz (ohne nicht-bestimmte Nukleotide, die in der Sequenz als N auftauchen) als Query auf der Seite der NCBI bei BlastN eingegeben. 5 Auf Nukeotidebene oder auf Proteinebene suchen. Dazu kann eine Sequenz (Achtung, Introns!) auch konzeptionell in alle sechs möglichen Leserahmen translatiert werden. Hier muss die benutzte Codon-Übersetzung gewählt werden, die beispielsweise berücksichtigt, dass der genetische Code in einzelnen Codons variieren kann. Auch die Rückübersetzung aus einem Protein in eine Nukleinsäuresequenz ist potenziell möglich, wenn auch aufgrund des degenerierten genetischen Codes uneindeutig. Aufgrund spezifischer Codon-Usage können hier statistische Einschränkungen gemacht werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Mit dem oder den nächst-ähnlichen Proteinen oder Nukleinsäuresequenzen kann ein Alignment (. Abb. 4.17) angezeigt werden, das die Lücken zeigt, die zur Erreichung der optimalen Ähnlichkeit eingefügt werden mussten. Zu viele Lücken in den Align­ ments ohne Übereinstimmung zeigen dabei geringe Homologie an.

211 Molekularbiologische Methoden

. Abb. 4.17  Alignment für abgeleitete Proteinsequenzen der Glutathion-S-Transferasen aus Tricholoma vaccinum. Konservierte Aminosäuren sind schwarz unterlegt, konservative Austausche in Grau. (© Mohammad Hasan Rahman Khattak, Jena)

4.6.3  Stammbaumerstellung

Aus Sequenzen können sowohl phylogenetische Stammbäume als auch im Vergleich zwischen Proteinen einer Familie Aminosäuresequenz-basierte Stammbäume errechnet werden (. Abb. 4.18). i Benötigtes Material

5 zu untersuchende Sequenzen 5 geeignete Software zur Erstellung der Alignments (beispielsweise MAFFT v7, BLOSUM80 und E-INS-I) 5 geeignete Software für multiple Sequenzalignments (beispielsweise Vector NTI) 5 geeignete Software für die Visualisierung (z. B. BioEdit)

Vorgehensweise 5 darzustellenden Sequenzen auswählen 5 dabei als outgroup immer eine zwar ähnliche, aber nicht zu nah verwandte Sequenz mitführen

4

212

E. Kothe

4

. Abb. 4.18  Phylogenetischer Stammbaum der Glutathion-S-Transferasen aus T. vaccinum. Mithilfe der Analysen konnten die abgeleiteten Proteinsequenzen verschiedenen Klassen dieser Proteine (Beta, Phi, Nu, …) farbig markiert zugeordnet werden. Die bootstrap-Werte sind an den Abzweigungen angegeben. (© Mohammad Hasan Rahman Khattak, Jena)

z Versuchsergebnis/Auswertung

Der Wert für den bootstrap gibt an, wie wahrscheinlich diese Verzweigung wie­ der auftaucht, wenn der Baum neu errechnet wird. Dabei werden in der Regel 1000 Berechnungen durchgeführt. 50 % bootstrap bedeutet, dass nur in der Hälfte der Fälle einer Neukonstruktion dieses Stammbaums diese spezifische Verzweigung auf­ trat. In der Regel sollte der bootstrap über 85, besser über 95 % liegen, um eine echte Verwandtschaft (Homologie) zu zeigen. Neue Sequenzen können die Äste des Baums neu sortieren. Ein Baum, der auf zu wenigen Sequenzen basiert, ist weniger sicher als ein mit vielen verwandten Sequenzen gerechneter.

213

Lichtmikroskopische ­Methoden Timo Zimmermann 5.1 Das Lichtmikroskop: Funktion und Komponenten – 216 5.1.1 Objektive, Vergrößerung und Auflösung – 217

5.2 Durchlichtmikroskopie – 222 5.2.1 Köhler’sche Beleuchtung – 223 5.2.2 Phasenkontrast – 224 5.2.3 Differenzialinterferenzkontrast – 226

5.3 Fluoreszenzmikroskopie – 229 5.3.1 Epifluoreszenzmikroskopie – 230 5.3.2 Digitale Bilderfassung – 234 5.3.3 Konfokale Mikroskopie – 237 5.3.4 Lichtmikroskopie jenseits der Beugungsgrenze (Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie) – 239

5.4 Präparationsmethoden für die Mikroskopie – 240 5.4.1 Herstellung lebender Proben – 240 5.4.2 Herstellung fixierter Proben – 244

5.5 Lebendfärbungen für die Durchlichtbetrachtung – 250 5.5.1 Tuschepräparat für den Kapselnachweis – 251 5.5.2 Negativfärbungen – 252 5.5.3 Vitalfärbung mit Methylenblau – 253 5.5.4 Färbung von Speicherstoffen – 254

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 A. Störiko (Hrsg.), Methoden der Mikrobiologie, https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7_5

5

5.6 Färbungen fixierter Proben für die Durchlichtbetrachtung – 256 5.6.1 Einfach-Färbungen – 258 5.6.2 Differenzialfärbungen – 261 5.6.3 Strukturfärbungen – 268

5.7 Färbungen für die Fluoreszenzbetrachtung – 277 5.7.1 Fluoreszenzlebendfärbungen – 278 5.7.2 Bleichschutz – 281 5.7.3 Fluoreszenzfärbungen fixierter Proben – 282 5.7.4 Einbettungen und Bleichschutz – 284

215 Lichtmikroskopische Methoden

Das Arbeiten mit dem Lichtmikroskop ist ein unverzichtbarer Bestandteil der mikro­ biologischen Praxis. Entsprechend der gewünschten Anwendungen kommen dabei unterschiedliche Komponenten eines Mikroskops zum Einsatz. Proben, die mit Färbungen für die Durchlichtbetrachtung angefertigt werden, benötigen keine zusätzlichen Bestandteile im Lichtweg und lassen sich grundsätzlich auch an einfachen Lichtmikro­ skopen betrachten. Dies macht diese schon vor langer Zeit entwickelten Methoden für die medizinische Diagnostik weiterhin sehr wertvoll, da mit ihnen effizient und kosten­ günstig gearbeitet werden kann und sie auch in Gegenden mit schlechter Infrastruktur eingesetzt werden können. Ungefärbte Präparate (z. B. Lebendpräparate) hingegen benötigen zusätzliche Durchlichtkontrastmethoden wie den Phasenkontrast, um die in der Probe befindlichen Zellen und Strukturen sichtbar zu machen. Dafür müssen die geeigneten optischen Komponenten vorhanden sein. Die in den letzten Jahrzehnten ent­ wickelten Fluoreszenzfärbungen zeichnen sich durch ihre hohe Spezifität und Empfind­ lichkeit aus, benötigen dafür aber zusätzliche Lichtquellen und andere Komponenten, die nicht an jedem Labormikroskop installiert sind. Vor der Benutzung einer lichtmikro­ skopischen Methode muss deswegen sichergestellt werden, dass die dafür benötigten Komponenten (Phasenkontrast, zur Färbung passende Fluoreszenzfilter) am aus­ gewählten Instrument zur Verfügung stehen und Objektive mit der benötigten Vergrö­ ßerung und Empfindlichkeit vorhanden sind. Die vorhandenen Funktionen eines Mikroskops lassen sich meist nicht an seiner äußeren Form erkennen, da der Aufbau eines Mikroskopstativs etablierten Standard­ formen folgt und wenige Rückschlüsse über die (im staubgeschützten Inneren) integ­ rierten Komponenten zulässt. Ein grundsätzliches Verständnis der Bestandteile eines Mikroskops und der mit ihnen verwendbaren Methoden zur Bildgebung ist deswegen nötig, um ein angemessenes Arbeiten zu gewährleisten. Diese Inhalte liefert der erste Teil dieses Kapitels, während sich der zweite Teil mit den in der Mikrobiologie ver­ wendeten Darstellungs- und Färbemethoden beschäftigt. Eine grafische Kurzüber­ sicht der verschiedenen Anwendungen und ihrer jeweiligen am besten geeigneten Darstellungstechniken ermöglicht ein direktes Nachschlagen bestimmter Techniken außerhalb der linearen Kapitelfolge (. Abb. 5.1).

Probe Lebend Ungefärbt Elinzelne Zellen/ Abstriche

Dickere Proben/ Intrazelluläre Details

Durchlichtmikroskopie phasenkontrast

Durchlichtmikroskopie Differentialinterferenzkontrast

Fixiert Gefärbt

Durchlichtmikroskopie Hellfeld

Standarddiagnostik/ Hoher Durchsatz

Empfindlichkeit/ Spezifität

Durchlichtfärbung

Fluoreszenzfärbung

Durchlichtmikroskope Hellfeld

Fluoreszenzmikroskopie

Übersicht: Einfachärbungen

Unterscheidung: Differenzialfärbungen

. Abb. 5.1  Auswahlschema für geeignete Mikroskopie-Arten. (© Timo Zimmermann)

Konfokalmikroskopie Superresolutionsmikroskopie

5

216

T. Zimmermann

5.1  Das Lichtmikroskop: Funktion und Komponenten

Ein in der Forschung verwendetes Mikroskop besteht aus den folgenden Bestandteilen (. Abb. 5.2), die im Folgenden ausführlicher beschrieben werden: 5 Lichtquelle (A) 5 Kondensor zur Bündelung der Beleuchtung (A) 5 Objektiv (B) 5 Okular (B)

5

Diese Mikroskop-Komponenten sind entweder Teil des beleuchtenden (A) oder des betrachtenden (B) Lichtwegs. In der Durchlichtmikroskopie (z. B. Hellfeld-, Phasen­ kontrast- und Interferenzkontrastmikroskopie) befindet sich die Probe zwischen dem beleuchtenden und dem betrachtenden Lichtweg, in der Auflichtmikroskopie (Epi­ fluoreszenzmikroskopie) befinden sich beide Lichtwege auf derselben Seite der Probe und bestehen teilweise aus denselben Komponenten (Objektiv = Kondensor). Aufgrund der in der Mikroskopie verwendeten hohen Vergrößerungsfaktoren (100bis 1000fach) ist eine ausreichende Beleuchtung des betrachteten Objekts eine Grund­ voraussetzung. Dazu wird das mit der Lichtquelle erzeugte Licht mit dem Kondensor in der Probe fokussiert. Die auf diese Weise gut ausgeleuchtete Probe wird mit einem Objektiv betrachtet, sodass ein hochaufgelöstes und vergrößertes Zwischenbild entsteht, das mit dem Okular noch weiter vergrößert wird. Die heutzutage in der Forschung verwendeten Mikroskope werden als zusammen­ gesetzte Mikroskope bezeichnet, da das mikroskopische Bild mithilfe des Mikroskop­ objektivs und eines noch zusätzlich vergrößernden Okulars erstellt wird. Die für die Funktion eines Mikroskops nötigen Komponenten können in zwei ver­ schiedenen Formen angeordnet sein (. Abb. 5.2): 5 Aufrecht: Das Objektiv betrachtet die Probe von oben; die Optik für die Durchlicht­ beleuchtung befindet sich unter der Probe 5 Invers: Das Objektiv betrachtet die Probe von unten; die Optik für die Durchlicht­ beleuchtung befindet sich über der Probe. Die optischen Eigenschaften sind bei beiden Mikroskopformen ähnlich; die Anordnung der Komponenten ermöglicht jedoch unterschiedliche Anwendungen, die durch die kur­ zen Arbeitsabstände (wenige Millimeter bei Luftobjektiven mit niedriger Vergrößerung und Auflösung bis zu =100x:

Immersion (Farbkodierung): Luft: ÖI: Wasser: Glycerin: Multi-Immersion:

---Schwarz Weiß Orange Rot

. Abb. 5.3  Erklärung der auf einem Mikroskopobjektiv vermerkten Angaben und der Farbkodierungen für Vergrößerungen und Immersionsmedien. (© Timo Zimmermann)

die Erkennung des Objektivs während des Arbeitens, da die Beschriftungen eines im Objektivrevolver eines Mikroskops eingeschraubten Objektivs nicht immer leicht ables­ bar sind. Bei manchen Herstellern ist auch die Farbe der Objektivbeschriftungen ein Erkennungszeichen der mit dem Objektiv verwendbaren Durchlichtkontrastmethoden (7 Abschn. 5.2). In den in Forschungsmikroskopen verwendeten Objektiven befinden sich kom­ plexe Anordnungen optischer Elemente, bestehend aus mehreren Linsen und Blenden mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften. Da Linsen verschiedene Abbildungs­ artefakte erzeugen, werden diese Aberrationen in hochwertigen Objektiven durch passende optische Elemente intern korrigiert. Die auftretenden Artefakte können form­ verzerrender Natur (sphärische Aberrationen) sein, spektral (Farbbereiche werden nicht deckungsgleich abgebildet; chromatische Aberrationen) und die Fokusebene verzerren (Feldplanarität). . Tab. 5.1 zeigt die gebräuchlichen Objektivtypen und die von ihnen gewährleisteten Korrekturen optischer Artefakte. Zur Bilderstellung kommen in der Lichtmikroskopie zwei verschiedene Objektiv­ typen zum Einsatz: 5 Objektive mit endlicher Tubuslänge erzeugen das Zwischenbild für das Okular in einem bestimmten Abstand hinter dem Objektiv. 5 Objektive mit „unendlicher“ Tubuslänge projizieren das erhaltene Bild ins Unend­ liche; das Zwischenbild für das Okular entsteht erst mittels einer im Mikroskop befindlichen Tubuslinse. Auf „unendlich“ korrigierte Objektive ermöglichen das Einbringen zusätzlicher optischer Komponenten im Lichtweg hinter dem Objektiv, ohne dass dabei die durch die Tubuslinse gegebene Tubuslänge des Mikroskops ver­ ändert wird. Daher wird der „unendliche“ Tubus in vielen der heute verwendeten Abbildungstechniken benötigt, z. B. um Prismen und Polarisationsfilter für Inter­ ferenzkontrastmethoden hinzuzufügen.

Aberrationskorrektur

Achromatisch

Fluorit

Apochromatisch

Feldkrümmung

Apochromatisch und krümmungskorrigiert

Objektivbezeichnung

Achro, Achromat

Fl, Fluar, Fluor, Neofluar, Fluotar

Apo

Plan, Pl, Plano

Plan Apo

Höchster Grad an Korrektur von allen Abbildungsartefakten

Die besonders bei hohen Vergrößerungen bemerkbare Krümmung der Fokusebene wird korrigiert

Höchster Grad an Korrektur von sphärischen und chromatischen Aberrationen (korrigiert für drei Farbbereiche)

Teilweise chromatische Korrektur, bessere sphärische Korrekturen als bei Achromaten

Teilweise chromatische Korrektur (zwei Wellenlängen im blauen und roten Bereich des Spektrums), sphärische Korrektur nur im grünen Bereich

Beschreibung

. Tab. 5.1  In der Lichtmikroskopie verwendete Objektivtypen

Hochauflösende Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Detektion der Fluoreszenz einzelner Moleküle, Super-Resolution

Für die Korrektur der Feldkrümmung bei Achromat-Fluorit- und Apo-Objektiven bei hohen Vergrößerungen

Höchste numerische Apertur => Höchste Auflösung und Empfindlichkeit für Weißlichtfarbaufnahmen und Fluoreszenzbetrachtung

Höhere numerische Apertur möglich => Erhöhung der Auflösung und Empfindlichkeit für Weißlichtfarbaufnahmen und Fluoreszenzbetrachtung

Häufigster Objektivtyp in Labormikroskopen Durchlichtbetrachtungen mit Grünfilter, um Farbränder zu vermeiden

Verwendung

Lichtmikroskopische Methoden 219

5

220

T. Zimmermann

Die für das Objektiv benötigte Tubuslänge bzw. das Symbol für unendliche Tubuslänge sind auf dem Objektiv zusammen mit vielen weiteren wichtigen Objektiveigenschaften vermerkt (. Abb. 5.3). Aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften können unendlich korrigierte Objektive nicht in Mikroskopen mit endlicher Tubuslänge (fehlende Tubuslinse) bzw. umgekehrt verwendet werden. 5.1.1.1  Auflösung und numerische Apertur eines Objektivs

5

Auch wenn die Vergrößerung kleiner Strukturen das hervorstechendste Merkmal eines Mikroskops ist, ist das Auflösungsvermögen des verwendeten Objektivs das ent­ scheidende Kriterium für ein gutes mikroskopisches Bild (. Abb. 5.4). Die Auflösung eines Objektivs ergibt sich dabei aus den folgenden drei Komponenten: 1. dem Winkel, in dem das Objektiv einfallendes Licht erfasst (objektseitiger Öffnungswinkel, Akzeptanzwinkel) 2. dem Brechungsindex des zwischen Deckglas und Objektivlinse zu verwendenden Mediums 3. der Wellenlänge des verwendeten Lichts Die Komponenten 1) und 2) ergeben die numerische Apertur (NA) eines Objektivs, indem der Brechungsindex n des Mediums mit dem Sinus des halben Akzeptanzwinkels (∝) multipliziert wird:

NA = n × sin (∝) Die Fähigkeit eines Objektivs zur Sammlung von in der Probe gebeugten Lichtstrahlen wird durch seine numerische Apertur beschrieben. Eine höhere NA bedeutet, dass stär­ ker gebeugte Lichtstrahlen aus der Probe noch erfasst und für die Bildgebung verwendet werden können, was zu einer höheren Auflösung und Helligkeit des dargestellten Bilds führt. Die NA eines Objektivs ist seiner Vergrößerung und der benötigten Immersion (Luft/Wasser, Glycerin/Öl) angepasst, da ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung meist keine hohe Auflösung für die Betrachtung mit dem Auge benötigt. Zudem kann eine

. Abb. 5.4  Schema des Akzeptanzwinkels eines mikroskopischen Objektivs. Der für die Berechnung der numerischen Apertur verwendete halbe Akzeptanzwinkel ist als α gekennzeichnet. (© Timo Zimmermann)

221 Lichtmikroskopische Methoden

NA, die mehr Winkel erfasst als das Immersionsmedium (z. B. Luft) weiterleiten kann, keine Verbesserung erzeugen. Der Brechungsindex von in der Mikroskopie verwendeten Medien reicht von 1,0 für Luft bis zu 1,52 für die mit Ölimmersionsobjektiven verwendeten Öle. Ölimmersions­ objektive mit sehr kurzen Arbeitsabständen haben die höchste NA und sind damit am höchsten auflösend. Wegen der zusätzlich gesammelten Strahlenwinkel aus der Fokus­ ebene wird die Tiefenschärfe eines Objektivs mit zunehmender NA kleiner und die Fokusebene definierter. Die maximale mit konventionellen Lichtmikroskopen erreichbare Auflösung ist durch die 1873 von Ernst Abbe definierte Beugungsgrenze festgelegt:  d =  2NA

Abbes Formel zeigt, dass die Größe von mittels Lichtmikrokospie aufgelöst darstell­ baren Strukturen begrenzt ist, da die Wellenlänge λ des sichtbaren Lichts im kurz­ welligen blauen Bereich minimal ca. 450 nm beträgt und die numerische Apertur höchauflösender Ölimmersionsobjektive generell den Wert 1,4 nicht übertrifft. Strukturen unterhalb einer Größe von ca. 200 nm sind deswegen mit Lichtmikroskopie nicht auflösbar. Kleinere Strukturen werden im mikroskopischen Bild beugungslimitiert abgebildet, also als Punkte (genauer: Beugungscheiben, Airy-Scheiben) einer Größe abgebildet, die der maximalen Auflösung des Objektivs entspricht. Dies entspricht in etwa unserer Wahrnehmung des nächtlichen Sternenhimmels, in denen die als „Licht­ punkte“ erscheinenden Sterne entsprechend der Auflösung unseres Auges und nicht ent­ sprechend ihrer realen Größe wahrgenommen werden. 5.1.1.2  Vergrößerung Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskopbilds ergibt sich aus dem Produkt der Vergrößerungen des Objektivs und des Okulars. So liefert z. B. ein Objektiv mit 100facher

Vergrößerung in Verbindung mit einem 10fach vergrößernden Okular ein 1000fach ver­ größertes Endbild für den Betrachter. Wie in der Einführung erwähnt, dient die Vergrößerung dazu, die vom Objektiv auf­ gelösten Strukturen soweit zu vergrößern, dass sie bequem mit dem Auge betrachtet werden können. Die Gesamtvergrößerung wird dabei so gewählt, dass alle vom Objek­ tiv dargestellten Details klar für das Auge bzw. die Kamera erkennbar sind. Eine Ver­ größerung des mikroskopischen Bilds über die Auflösungsgrenze hinaus wird als „leere“ Vergrößerung bezeichnet und bringt keinen Erkenntnisgewinn, sondern verschlechtert eher das Bild, da die Übergänge zwischen Strukturen verschwommen und ungenau dar­ gestellt werden. Obwohl die Gesamtvergrößerung aus dem Zusammenspiel von Objektiv und Oku­ lar entsteht, ist es ratsam, Objektive mit hoher und Okulare mit niedriger Vergrößerung zu verwenden und nicht andersherum, da hochvergrößernde Objektive meistens höhere numerischer Aperturen haben und damit mehr auflösen. In den in der Forschung ver­ wendeten Mikroskopen sind Objektive und Okulare sinnvoll aufeinander abgestimmt. Da die Lichtsammeleffizienz durch die NA beeinflusst wird, werden für die schwa­ chen Signale in der Fluoreszenzmikroskopie (7 Abschn. 5.3) meist hohe numeri­ sche Aperturen benötigt. Das Objektiv wird bei Fluoreszenzbetrachtung auch für die Beleuchtung der Probe verwendet (Epifluoreszenzmikroskopie). Die hohe Licht­ bündelung ist hierbei wichtig für die effiziente Anregung der bei weitem schwächeren

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Fluoreszenz in der Probe. Objektive für die Durchlichtbetrachtung werden bei gleicher Vergrößerung mit einer kleineren NA und weniger Korrekturen verwendet. Die Gesamtvergrößerung des Mikroskops sollte die NA um mindestens den Faktor 500 übersteigen und den Faktor 1000 nicht überschreiten (leere Vergrößerung). Für viele Vergrößerungen sind für dasselbe Mikroskop Objektive als Achromate, Fluorite und Apochromate erhältlich. Da sie die besonders bei hochauflösenden Bildern auftretenden Artefakte unterschiedlich gut korrigieren, ist die numerische Apertur (und damit die Auflösung und Empfindlichkeit) eines Achromat-Objektivs bei gleicher Ver­ größerung meist kleiner als die eines Fluorit-Objektivs und diese wiederum kleiner als die eines Apochromat-Objektivs. 5.2  Durchlichtmikroskopie

Die bisher beschriebenen Funktionen der Auflösung und Vergrößerung sind grund­ legende Eigenschaften eines Mikroskops und beschreiben die Benutzung als Durch­ lichtmikroskop mit Hellfeldbeleuchtung. Dabei wird das gesamte Blickfeld gleichmäßig durchleuchtet und abgebildet. Falls eine Probe keine stark lichtabsorbierenden Strukturen enthält, die als dunkle Flä­ chen abgebildet werden (z. B. bei der Betrachtung der Körperanhänge kleiner Insekten), wird das entstehende Bild sehr wenige nützliche Informationen enthalten, da der Kon­ trast zwischen dem Objekt und seinem Hintergrund fehlt. Neben Vergrößerung und Auf­ lösung ist somit der Bildkontrast ein unverzichtbarer Bestandteil eines Mikroskopbilds. Da es sich bei mikroskopischen Proben jedoch meist um sehr kleine Objekte (z. B. einzelne Zellen) oder um dünne Schnitte durch ein Gewebe handelt, fehlt den meisten Proben die Fähigkeit zur Lichtabsorption, die sie für das menschliche, für Helligkeits­ unterschiede empfindliche Auge sichtbar machen würde. Der Gegenstand der mikro­ biologischen Forschung, Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze, sind für uns im Durchlichtmikroskop de facto unsichtbar. Kontrast, der die Details einer mikroskopischen Probe sichtbar werden lässt, wird in der Lichtmikroskopie mittels lichtbasierter Verfahren und mittels chemischer Färbeprozesse erzeugt. Lichtbasierte Kontrastverfahren unterscheiden sich dabei grundlegend von chemischen Färbemethoden. Sie nutzen die intrinsischen optischen Eigenschaften der Probe, um sie in helligkeitsbasierte Unterschiede umzuwandeln. Ihnen fehlt dabei die Spezifität chemischer Prozesse, bei denen nur bestimmte Stoffe in der Probe mit dem Färbemittel reagieren und somit sichtbar werden. Sichtbar werden hingegen Pha­ sen- oder Polarisationsunterschiede, die nicht durch eine bestimmte Stoffklasse, sondern durch die optische Eigenschaft einer Struktur relativ zu ihrer Umgebung erzeugt werden. Lichtbasierte Kontrastverfahren sind vor allem für die Lebendbeobachtung sehr wichtig, weil dadurch keine Färbung nötig ist, die das Verhalten der Probe beeinflussen könnte. Für die lichtbasierte und die färbungsbasierte Kontrastbildung ist eine gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfelds eine Grundvoraussetzung. Diese wird durch die im nächs­ ten Abschnitt beschriebene Einstellung der Köhler’schen Beleuchtung gewährleistet. Als nächstes werden die lichtbasierten Durchlichtkontrastverfahren beschrieben, von denen die sicherlich am häufigsten angewendete Methode die Phasenkontrastmikroskopie (7 Abschn. 5.2.2) ist. Für die Darstellung und Klassifizierung von Mikroorganismen rele­ vante Färbemethoden werden separat im zweiten Teil des Kapitels behandelt, da sie auf chemischen Bindungsprozessen und nicht auf optischen Effekten beruhen.

223 Lichtmikroskopische Methoden

5.2.1  Köhler’sche Beleuchtung

Das Einstellen der Köhler’schen Beleuchtung in einem Lichtmikroskop erzeugt eine gleichmäßig helle Ausleuchtung des Bildbereichs ohne überstrahlte Teilbereiche. Sie ist auf die heutzutage in Mikroskopen verwendeten künstlichen (Punkt-)Lichtquellen angepasst. Der Sinn der Köhlerschen Beleuchtung ist es, die konkrete Form der Licht­ quelle (z. B. die Glühwendel einer Lampe) in der Fokusebene des Mikroskops komplett defokussiert und damit gleichmäßig ausleuchtend darzustellen. Eine gut eingestellte Köhler’sche Beleuchtung ist eine Grundvoraussetzung für die Kontrastverfahren der Durchlichtmikroskopie, die in den folgenden Abschnitten beschrieben werden (. Abb. 5.5). Einstellen der Köhler’schen Beleuchtung 5 Probe mit einem Objektiv mit niedriger Vergrößerung (vorzugsweise 10x) scharfstellen. 5 Durchlichtkondensor auf Hellfeldbeleuchtung (d. h. keine Phasenringe oder Polarisationsprismen im Lichtweg) einstellen. 5 Feldblende vor der Lichtquelle auf den kleinstmöglichen Durchmesser schließen. 5 Abstand des Kondensors zur Probe so einstellen, dass die Ränder der Feldblende im Mikroskopbild scharf abgebildet werden. 5 Mittels der Zentrierungsschrauben des Kondensors die Öffnung der Feldblende in der Bildmitte positionieren. 5 Feldblende soweit öffnen, dass sie nicht mehr im Mikroskopblickfeld (oder Bild) sichtbar ist.

Im Fokus: A Defokussiert: B

A, B: konjugierte Bildebenen B) Hintere Objektivbrennebene A) Fokusebene

A gegen B: opponierende Bildebenen

B) Kondensorblende

A) Leuchtfeldblende

B) Lampe

. Abb. 5.5  Köhler’sche Beleuchtung: Im Lichtweg eines Mikroskops werden mehrere Ebenen gleichzeitig scharf dargestellt. Bei korrekt eingestellter Köhler’scher Beleuchtung sind gleichzeitig das Objekt und die Feldblende im Fokus. Diese Ebenen werden als konjugierte Bildebenen bezeichnet. Für das Auge des Betrachters befindet sich somit die Feldblende in der Bildebene des Objekts. Diesen konjugierten Ebenen stehen die komplett defokussierten „opponierenden“ Bildebenen gegenüber, in denen sich die hintere Brennebene des Objektivs, die Kondensoraperturblende und die physikalische Lichtquelle (z. B. eine Glühwendel) befinden. (© Timo Zimmermann)

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Bei der Köhler’schen Beleuchtung wird die Feldblende nur so weit geöffnet, dass das Blickfeld komplett ausgeleuchtet wird. Da andere Bereiche nicht beleuchtet werden, ist die Probe vor unnötiger Hitze geschützt. Licht, dass nicht für die Bilderzeugung benötigt wird, dringt nicht in die Probe ein, was zu weniger Streulicht führt und dadurch den Kontrast erhöhen kann. ! Bei einem Wechsel zu einer anderen Objektivvergrößerung muss die Feldblende

durch Erweiterung oder Verengung dem veränderten Blickfeld angepasst werden.

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Die Aperturblende des Kondensors bestimmt den Kontrast, die Tiefenschärfe und die Auflösung des Durchlichtbilds. Generell sollte die Öffnung der Kondensor-Apertur­ blende der NA des verwendeten Objektivs angepasst sein. Eine zu weit geschlossene Aperturblende führt zu einem teilweise kontrastreicheren, aber schlechter aufgelösten Bild, da der Öffnungsgrad der Kondensorapertur direkt zur Gesamtauflösung beiträgt. 5.2.2  Phasenkontrast

Phasenkontrastmikroskopie ist eine der am häufigsten genutzten mikroskopischen Tech­ niken überhaupt. Sie nutzt die Welleneigenschaften des Lichts. Während eine ungefärbte, mit dem Mikroskop betrachtete Probe sehr wenig direkt als Helligkeitsunterschied wahrnehmbaren Absorptionskontrast erzeugt, entsteht bei der Passage durch die Probe jedoch auch ein Versatz der gebeugten Lichtwellen (Phasenunterschied), der ungefähr ein Viertel der Lichtwellenlänge beträgt. In der Phasenkontrastmikroskopie wird dieser Phasenversatz in einen Helligkeitsunterschied umgewandelt, den das Auge erfassen kann. Dazu werden die in der Probe entstandene geringen Phasenunterschiede auf die Hälfte der Wellenlänge erhöht und danach als Helligkeitsunterschiede wahrnehmbare Interferenzen zwischen abgelenktem (phasenversetztem) und nicht abgelenktem (nicht phasenversetztem) Licht erzeugt. Ähnlich wie bei der Dunkelfeldmikroskopie wird hierfür eine Ringblende in der vorderen Fokusebene des Durchlichtkondensors verwendet. Diese sorgt dafür, dass Licht nur in einem bestimmten Winkelbereich die Probe durchdringt und ungebeugtes Licht danach in diesem Winkelbereich in das Objektiv eintritt. In der Probe abgelenkte Lichtanteile treffen das Objektiv jedoch in anderen Winkeln. Die unterschiedlichen Ein­ trittswinkel von nicht abgelenktem und abgelenktem Licht führen dazu, dass diese Licht­ anteile in unterschiedlichen Bereichen der hinteren Brennebene des Objektivs abgebildet werden. Eine in dieser Ebene im Objektiv eingesetzte Phasenplatte mit unterschiedlich dicken Bereichen verstärkt den Phasenunterschied zwischen den Lichtanteilen weiter auf einen für Interferenzbildung geeigneten Versatz von etwa einer halben Wellenlänge. Bei der Zusammenführung der nicht abgelenkten und der abgelenkten (phasenversetzten) Lichtanteile im vom Objektiv erzeugten Zwischenbild kommt es zu Interferenzen, die das abgebildete Phasenobjekt kontrastreich darstellen (. Abb. 5.6). Einstellung des Phasenkontrasts Die Bedienung der für die Einstellung benötigten Komponenten (z. B. der Zugang zu den Zentrierschrauben des Phasenrings) kann bei verschiedenen Mikroskoptypen unterschiedlich umgesetzt sein, sodass hier nur eine generelle Anweisung gegeben

225 Lichtmikroskopische Methoden

werden kann. In diesen Fällen muss das Bedienungshandbuch für das Mikroskop herangezogen werden. 5 Mikroskop im Hellfeld auf die Probe scharfstellen. Der ohne verstärkende Verfahren erhaltene Kontrast in der Probe kann noch schlecht sein, aber es sollten sich Strukturen finden lassen (Luftblasen, Probenrand), auf die scharfgestellt werden kann. Wichtig ist, dass die korrekte Fokusebene für die verwendeten Proben gefunden wird, da im nächsten Schritt (Köhler’sche Beleuchtung) der Kondensor separat auf dieselbe Ebene scharfgestellt wird. Nur damit werden alle kontrastgebenden Komponenten in ihre korrekten Positionen projiziert (. Abb. 5.5) und der gewünschte Kontrasteffekt erzielt. 5 In der Hellfeldbeleuchtung die Köhler’sche Beleuchtung einstellen 7 Abschn. 5.2.1. 5 Den zum Objektiv passenden Phasenring (Ph1, Ph2, Ph3) im Kondensor in den Lichtweg einbringen. Um einen echten Phasenkontrast zu erhalten, ist es wichtig, den jeweils zum Objektiv passenden Phasenring zu verwenden. Nur so sind die Durchmesser der Ringblende und des Rings in der Phasenplatte gleich und können zur Deckung gebracht werden. Auf dem Objektiv ist der Durchmesser des phasenversetzenden Rings der Phasenplatte als Ph1, Ph2 oder Ph3 angegeben (. Abb. 5.3). Dementsprechend muss im Kondensor Phasenring Ph1, Ph2 oder Ph3 eingestellt werden. Der Phasenringtyp sollte an der jeweiligen Position im Kondensor-Revolver bzw. -Schieber vermerkt sein. Die Verwendung eines falschen Phasenrings kann teilweise schräge Beleuchtungseffekte (ähnlich dem Dunkelfeld) erzeugen, aber keinen Phasenkontrast. Bei erstmaliger Benutzung oder falls im mit Phasenkontrast erhaltenen Bild kein guter Kontrast erzeugt werden kann, müssen die nächsten drei Schritte ausgeführt werden, ansonsten kann mit der Betrachtung der Probe fortgefahren werden. 5 Probe aus dem Lichtweg nehmen (erleichtert die folgende Zentrierung der Komponenten). 5 Das Okular aus dem Lichtweg entfernen und (falls vorhanden) durch ein Phasenteleskop ersetzen, das auf die Objektivpupille scharfstellt. Manche Mikroskope besitzen eine Bertrand-Linse, die in den Lichtweg eingebracht werden kann. In dem Fall kann die Objektivpupille direkt im Okular betrachtet werden und dieses muss nicht entfernt werden. Zweck dieses Schrittes ist es, die in der Köhler’schen Beleuchtung defokussierten Bildebenen (. Abb. 5.5) und die dort befindlichen Komponenten (Phasenring und Phasenplatte) für die weitere Justierung betrachtbar zu machen. 5 In der jetzt sichtbaren Objektivpupille sind der Phasenring des Kondensors (als leuchtender Ring) und der dunkle Ring gleichen Durchmessers der Phasenplatte des Objektivs zu sehen. Mittels Zentrierschrauben an der Fassung des Phasenrings im Kondensor (hersteller- bzw. modellspezifische Umsetzung!) den „hellen“ Phasenring mit dem „dunklen“ Ring der Phasenplatte zur Deckung bringen. 5 Das Okular wieder einsetzen. Die Probe kann jetzt betrachtet werden.

z Tipps für das mikroskopische Arbeiten

Phasenkontrast ist eine sehr nützliche Methode um ungefärbte, fast durchsichtige Pro­ ben zu betrachten, sie hat jedoch auch einige Nachteile:

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5 Um die abgebildeten Strukturen herum kommt es oft zu einer Bildung von Halos. 5 Die verwendete Kondensor-Ringblende (Phasenring) verringert die numerische Apertur des Lichtwegs (und damit die Gesamtauflösung), da nur bestimmte Einfalls­ winkel für die Beleuchtung der Probe verwendet werden. 5 Phasenkontrastbilder von dickeren Proben wie z. B. Geweben sind schwer verständlich, da Phaseneffekte von über und unter der Fokusebene liegenden Struktu­ ren das Bild stören.

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Manche dieser Nachteile können durch die Verwendung anderer Kontrastmethoden umgangen werden. Die am weitesten verbreitete Alternativmethode ist der im nächs­ ten Abschnitt beschriebene Differenzialinterferenzkontrast. 5.2.3  Differenzialinterferenzkontrast

Neben der Nutzung des Phasenkontrasts kann auch polarisiertes Licht zur Kontrast­ bildung in ungefärbten Proben verwendet werden. Dazu werden mehrere zusätzliche Komponenten im Lichtweg benötigt, in der Reihenfolge von der Lichtquelle aus: ein Polarisationsfilter (Polarisator, für die lineare Polarisierung der Schwingungsrichtung des Lichts), zwei komplementäre lichtscherende Prismen über und unter der Probe und ein weiterer Polarisationsfilter, der als Analysator im rechten Winkel zum ersten Polarisationsfilter eingebracht wird. Im Differenzialinterferenzkontrast passiert das Anregungslicht einen Polarisator, bevor es in den Kondensor eintritt. Das polarisierte Licht wird im Kondensor durch ein spezielles Prisma (Wollaston-Prisma oder meistens Nomarski-Prisma) in zwei Licht­ anteile aufgeteilt (Scherung), die räumlich leicht zueinander versetzt und im rechten Winkel zueinander polarisiert sind. Der Versatz der Lichtanteile zueinander ist hierbei sehr gering. Bei der leicht unterschiedlichen Passage der Lichtanteile durch die Probe kommt es jedoch zu Phasenveränderungen zwischen ihnen, die wie beim Phasen­ kontrast durch Strukturen in der Probe verursacht werden. Nach der Passage durch das Objektiv wird der Versatz der rechtwinklig zueinander polarisierten Lichtanteile durch ein zweites Prisma wieder aufgehoben und die Anteile in eine Polarisationsebene gebracht. Bei dieser Zusammenführung wird die Phasen­ differenz in eine Änderung der Amplitude (Helligkeit) und des Polarisationswinkels umgewandelt. Mittels eines im rechten Winkel zum ursprünglichen Polarisator angeordneten Analysators (Kreuzpolarisation) werden unveränderte Lichtanteile unter­ drückt, und die Strukturen der Probe treten im erzeugten Bild deutlich als Pseudo-Relief (mit einer hellen und dunklen Seite) hervor. Im Vergleich zum Phasenkontrast erzielt der Differenzialinterferenzkontrast eine höhere Auflösung, da die Gesamt-NA des Mikroskops (in der Zusammenwirkung von Kondensor und Objektiv) ohne eine im Lichtweg befindliche Ringblende besser genutzt werden kann. Die dadurch ebenfalls geringere Tiefenschärfe erzeugt einen definierteren Fokusbereich und bessere optische Querschnitte durch das Präparat (. Abb. 5.6).

227 Lichtmikroskopische Methoden

. Abb. 5.6  Vergleich der verschiedenen Durchlichtkontrastmethoden anhand einer Probe (Deckglaspräparat) von Escherichia coli-Bakterien (Luftobjektiv mit 40-facher Vergrößerung). a) Durchlichtbild mit komplett geöffneter Kondensorblende. Die Bakterien in der Probe sind kontrastarm und schlecht erkennbar. b) Durchlichtbild mit weitgehend geschlossener Kondensorblende. Der Kontrast ist erhöht, aber an den Rändern der Zellen kommt es zu Artefakten, die Auflösung ist vermindert und störende Hintergrundstrukturen außerhalb der Fokusebene werden sichtbar. c) Phasenkontrastbild mit sehr gutem Kontrast der Zellen gegenüber dem Hintergrund, aber Hintergrundstrukturen außerhalb der Fokusebene werden sichtbar, und es bilden sich Halo-artige Artefakte um die Strukturen. d) Differenzialinterferenzkontrastbild mit sehr gutem Kontrast der Zellen gegenüber dem Hintergrund. Der reliefartige Eindruck eines Differenzialinterferenzkontrastbildes entsteht, weil alle Strukturen im Bild auf einer Seite hell und der gegenüberliegenden Seite dunkel abgebildet werden und somit schräg angeleuchtet erscheinen. Die Bilder wirken somit dreidimensional, sind es aber nicht. Der Effekt entsteht durch die Scherung der beiden polarisierten Lichtanteile, die zwei leicht zueinander versetzte Bilder erzeugen. Bei der Wiedervereinigung der Lichtanteile treten deswegen Übergänge in der Probe als deutlich hervorgehobene Grenzen (Differenzialinterferenz) mit einer hellen und einer dunklen Seite hervor. Balken: 10 µm. (© Timo Zimmermann)

Einstellung des Differenzialinterferenzkontrasts Die Bedienung der für die Einstellung benötigten Komponenten kann bei verschiedenen Mikroskoptypen unterschiedlich umgesetzt sein, sodass hier nur eine generelle Anweisung gegeben werden kann. Das Bedienungshandbuch für das Mikroskop sollte hinzugezogen werden. 5 Mit dem Mikroskop auf die Probe scharfstellen (7 Abschn. 5.2.2). Die Probe darf keine doppelbrechenden Eigenschaften haben, deswegen können keine Plastikgefäße (wie z. B. Petrischalen) verwendet werden. 5 Einstellen der Köhler’schen Beleuchtung in Hellfeldbeleuchtung 7 Abschn. 5.2.1

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5 Wechsel zum gewünschten Objektiv. Falls die verwendeten Objektive bei Objektivwechsel nicht auf dieselbe Ebene scharfstellen (Parfokalität), muss die Probe erneut scharfgestellt werden. Obwohl Differenzialinterferenzkontrast keine speziellen Objektivkomponenten benötigt, sollten nur vom Hersteller dafür vorgesehene (und dementsprechend gekennzeichnete) Objektive verwendet werden, da der Abstand der hinteren Brennebene des Objektivs zum zweiten Prisma stimmen muss. Auf die jeweiligen Objektive abgestimmte Prismen sind deswegen auch angegeben bzw. das passende Objektiv ist auf dem Prisma vermerkt. 5 Die für den Differenzialinterferenzkontrast benötigten Komponenten in den Lichtweg einbringen: Polarisator, Analysator, Kondensorprisma, Objektivprisma. Bei erstmaliger Benutzung oder falls im mit Differenzialinterferenzkontrast erhaltenen Bild kein guter Reliefkontrast erzeugt werden kann, müssen die nächsten sechs Schritte ausgeführt werden, ansonsten kann mit der Betrachtung der Probe (letzter Schritt) fortgefahren werden. 5 Probe aus dem Lichtweg entfernen. 5 Für die Abstimmung zueinander werden folgende der für den Differenzialinterferenzkontrast benötigten oben beschriebenen Komponenten in den Lichtweg eingebracht: Polarisator, Analysator und das objektivseitige Prisma. 5 Das Okular aus dem Lichtweg entfernen und (falls vorhanden) durch ein Phasenteleskop ersetzen, das auf die Objektivpupille scharfstellt. Manche Mikroskope besitzen eine Bertrand-Linse, die in den Lichtweg eingebracht werden kann. In dem Fall kann die Objektivpupille direkt im Okular betrachtet werden, und dieses muss nicht entfernt werden. Zweck dieses Schrittes ist es, die in der Köhler’schen Beleuchtung defokussierten Bildebenen und die darin enthaltenen Komponenten für die weitere Justierung als Zwischenbild betrachtbar zu machen. 5 In den beiden folgenden Schritten (a und b) drei der vier für den Interferenzkontrast benötigten Komponenten korrekt aufeinander ausrichten: a) Das objektivseitige Prisma über seinen Justiermechanismus (hersteller- bzw. modellspezifische Umsetzung!) so im Lichtweg bewegen, dass eine diagonale dunkle Linie in der Bildmitte sichtbar wird. b) Um den Polarisator in den für eine Kreuzpolarisierung benötigten exakten rechten Winkel zum Analysator zu bringen, den Polarisator leicht hin und her drehen, bis die diagonale Linie so dunkel wie möglich erscheint. 5 Weiterhin das Zwischenbild betrachtend die Aperturblende des Kondensors nun soweit schließen dass sie am Bildrand erscheint. Durch diesen Schritt wird der Beleuchtungswinkel der Kondensoroptik dem Erfassungswinkel des verwendeten Objektivs angepasst und zu schräg einfallendes Licht, das nur als störendes Streulicht vom Objektiv erfasst werden könnte, vermieden. 5 Das Okular wieder einsetzen und das für das Objektiv passende Kondensor-Prisma in den Lichtweg einbringen. 5 Die Probe kann jetzt betrachtet werden und mittels Verschiebens des objektivseitigen Prismas die Überlagerung der Polarisationsbilder und der daraus entstehende Kontrast auf eine gewünschte Stärke eingestellt werden.

229 Lichtmikroskopische Methoden

Wegen der Verwendung von Polarisationslicht kann der Differenzialinterferenzkontrast nicht mit doppelbrechenden Materialien verwendet werden, die die Polarisation beein­ flussen. Deswegen können keine in der Zellkultur genutzten Plastikgefäße wie z. B. Petrischalen eingesetzt werden. Seit einiger Zeit bieten Mikroskophersteller jedoch Kontrastmethoden an, die ein ähnliches Erscheinungsbild erzeugen und mit Plastik ver­ wendbar sind. 5.3  Fluoreszenzmikroskopie

Auch die Fluoreszenzmikroskopie gehört zu den lichtbasierten Kontrastverfahren. Sie benötigt spezielle Lichtquellen und optische Elemente, auch wenn das Fluoreszenzsignal selbst meistens durch eine Färbung der Probe erzeugt wird. Die Visualisierung mikroskopischer Strukturen mittels Fluoreszenzmikroskopie basiert auf dem Prinzip der Fluoreszenz: der Eigenschaft mancher Moleküle, Licht bestimmter Wellenlängen zu absorbieren und als längerwelliges Licht wieder abzu­ geben. Der Unterschied zwischen den absorbierten Wellenlängen (Exzitationsspektrum) und emittierten Wellenlängen (Emissionsspektrum) ist hierbei durch die Stokes-Verschiebung beschrieben, der Differenz zwischen dem Emissions- und Exzitations­ maximum. Diese ist durch die Eigenschaften des fluoreszierenden Moleküls gegeben und für dieses charakteristisch. Die spektrale Trennbarkeit von Anregungslicht und dem für die Bildgebung ver­ wendeten Fluoreszenzlicht erlaubt im Mikroskop die hochspezifische und hintergrundsfreie Darstellung von feinsten Strukturen und sogar die Detektion der äußerst schwachen Fluoreszenz einzelner Moleküle (Einzelmolekülmessungen). Wenn in der beobachteten Probe verschiedene fluoreszierende Moleküle (Fluoro­ phore) zur Markierung unterschiedlicher Strukturen eingesetzt werden, können an einem Standard-Fluoreszenzmikroskop bis zu vier verschiedene Strukturen gleichzeitig spezifisch markiert und abgebildet werden. Geeignete Farbstoffe, Färbemethoden und Protokolle für Fluoreszenzmikroskopie werden in 7 Abschn. 5.7. dargestellt. Der große Vorteil der Fluoreszenzmikroskopie im Vergleich zu anderen Mikrosko­ pieverfahren (z. B. Durchlichtmikroskopieverfahren und auch Elektronenmikroskopie) ist die hohe Spezifität der abgebildeten Strukturen (. Abb. 5.7). Wenn die Spezifität der Markierung gegeben ist (z. B. ein hochspezifischer primärer Antikörper oder Organell­ marker), ist nur diese als helles Signal gegen einen schwarzen Hintergrund zu sehen. Die Helligkeit einer Struktur ist (idealerweise) proportional zu der Konzentration an Fluoro­ phoren an dieser Stelle und direkt quantifizierbar. In den meisten anderen Mikrosko­ pieverfahren tragen andere Komponenten zum Endbild bei, und Informationen über eine spezifische Struktur lassen sich nicht direkt aus dem Bild ermitteln, sondern müs­ sen über vorausgesetztes Wissen über die Form oder Position der gewünschten Struktur abgeleitet werden. Andererseits muss der Kontext eines spezifischen Fluoreszenzbilds oft durch zusätzliche Bildkanäle (andere Fluoreszenzmarker, Phasenkontrastmikroskopie) ergänzt werden.

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5 . Abb. 5.7  Hochaufgelöstes konfokales Fluoreszenzbild einer Lebendprobe von Mycobacterium smegmatis als Maximumprojektion des dreidimensionalen Datensatzes. Grüner Kanal: Membranfarbstoff FM 4–64. Roter Kanal: DNA-Färbung mit dem roten Nukleinsäurefarbstoff Draq5. a) Projektion der Rohdaten. b) Projektion des dekonvoluierten Datensatzes. Dekonvolution ist eine Methode zur Rückrechnung von während der Bildgebung enstandenen optischen Artefakten. Balken: 5 µm. (© Timo Zimmermann)

5.3.1  Epifluoreszenzmikroskopie

Aus optischen Gründen wird bei in biologischen Laboratorien verwendeten Fluoreszenzmikroskopen Epifluoreszenz als bildgebende Methode verwendet. Hierbei wird das Mikroskopobjektiv (siehe Übersichtsabbildung der Mikroskopkomponenten in . Abb. 5.2) sowohl zur Beleuchtung der Probe als auch zur Detektion der in der Probe generierten Fluoreszenz verwendet. Der Lichtweg eines Epifluoreszenzmikro­ skops ist in . Abb. 5.8a dargestellt. Mikroskopkomponenten, die sich auf der vom Objektiv abgewandten Seite der Probe befinden (z. B. der Durchlichtkondensor und die für Durchlichtmikroskopie verwendete Halogenlampe), werden in der Epifluoreszenz­ mikroskopie nicht verwendet und beeinflussen das Endbild nicht. Entscheidend für die Qualität des Fluoreszenzbildes sind jedoch die Eigenschaften der folgenden drei Kompo­ nenten: 1. Exzitationsfilter für das Anregungslicht, 2. Farbteiler, um Anregungs- und Fluoreszenzlicht spektral zu trennen, 3. Emissionsfilter für die Isolierung des gewünschten Fluoreszenzsignals. Diese drei Komponenten sind in vielen Fluoreszenzmikroskopen fest als Filterwürfel kombiniert (. Abb. 5.8b) und werden als komplette Einheiten in den Lichtweg ein­ gebracht. Die Beobachtung der gewünschten Fluoreszenz und auch die Aufnahme mit einer Charge Coupled Device (CCD)-Kamera (7 Abschn. 5.3.2) sind in diesem Falle sehr einfach, und es muss nur ein Filterwürfel gewählt werden, der die gewünschte Anregung und Emission gut erfasst. In komplexeren automatisierten Mikroskopen sind Exzitationsfilter, Farbteiler und Emissionsfilter jedoch in separaten Komponenten untergebracht (Exzitations- und Emissions-Filterräder) und können separat angesteuert werden. In diesem Fall muss die Kombination der geeigneten Komponenten entweder durch den Benutzer ein­ gestellt werden oder in der Mikroskop-Benutzeroberfläche eines durch einen Computer gesteuerten Mikroskops abrufbar sein.

231 Lichtmikroskopische Methoden

. Abb. 5.8  a Lichtweg für Durchlicht- und Epifluoreszenzmikroskopie. Beim Durchlichtmikroskop befinden sich die Lichtquelle und die Beobachtungsoptik (Objektiv + Okular) auf gegenüberliegenden Seiten der Probe, die durchleuchtet wird. Beim Einsatz von Epifluoreszenzmikroskopie befinden sich Lichtquelle und Beobachtungsoptik auf derselben Seite, und das Objektiv dient gleichzeitig als Kondensor. Von der in allen Richtungen erzeugten Fluoreszenz wird nur der in das Objektiv zurückgestrahlte Anteil erfasst. b Funktionsschema eines Fluoreszenzfilterwürfels. Um das sehr starke Anregungslicht von der um ein Vielfaches schwächeren Fluoreszenz zu trennen und diese somit betrachtbar zu machen, wird das Anregungslicht durch den Exzitationsfilter auf die für die Anregung des Farbstoffes benötigten Farbanteile beschränkt. Dabei ist es besonders wichtig, dass keine Farbanteile durchgelassen werden, die mit der Fluoreszenz der Probe überlappen. Das farblich definierte Anregungslicht wird mittels des Farbteilers auf die Probe gelenkt. Das zurückgestrahlte langwelligere und somit farblich unterschiedliche Fluoreszenzlicht passiert den Farbteiler und wird durch den Emissionsfilter weiter auf den für die gewünschte Fluoreszenz spezifischen Farbbereich beschränkt und somit von unspezifischen Beiträgen (z. B. Autofluoreszenz und andere Farbstoffe) getrennt. (© Timo Zimmermann)

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Benutzung von Fluoreszenzmikroskopie

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5 Fluoreszenzlampe anschalten. Einige Minuten warten, um das Erreichen einer ausreichenden Helligkeit und die Stabilisierung der Lichtleistung zu gewährleisten. 5 Falls möglich, im Durchlichtmodus (z. B. mit Phasenkontrast) mit dem Mikroskop auf die Probe scharfstellen, um die Probe nicht unnötig zu bleichen (siehe Handhabungstipps unten). 5 Zum gewünschten Objektiv wechseln. Falls nötig, Immersionsöl aufbringen und Fokus auf die Probe nachstellen. Für Fluoreszenz geeignete Objektive mit hoher numerischer Apertur verwenden, damit eine ausreichende Empfindlichkeit für die schwachen Fluoreszenzsignale gewährleistet ist. 5 Durchlicht ausschalten. Dieses würde als störender Hintergrund wahrgenommen werden. Bei automatisierten Mikroskopen geschieht dies meistens von selbst beim Wechsel in den Fluoreszenzmodus. 5 Den benötigten Fluoreszenzfiltersatz (meist als Filterwürfel) in den Lichtweg einbringen. Dieser befindet sich meistens in einem Filter-Revolver oder einem Filterschieber im Lichtweg hinter dem Mikroskopobjektiv. Die Wahl des richtigen Filtersatzes (Kombination von Anregungs- und Detektionsfilter und Farbteiler, . Abb. 5.8b) für den verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ist wichtig, um das Signal so effizient und spezifisch wie möglich wahrzunehmen und von eventuell vorhandenen anderen Farbstoffen in der Probe zu trennen. Für die möglichst spezifische Wiedergabe werden vorzugsweise Bandpass- (Darstellung eines beidseitig beschnittenen Spektralbereichs) anstelle von Langpassfiltern (nur auf der kurzwelligen Seite beschnittener Spektralbereich) verwendet, da Langpassfilter oft auch unspezifischen Probenhintergrund und falls vorhanden langwelligere Fluoreszenzfarbstoffe erfassen. 5 Fluoreszenzbeleuchtung auf die Probe geben (Öffnen des Fluoreszenzlichtwegs). 5 Falls das Scharfstellen im Durchlichtmodus nicht möglich ist, in Fluoreszenzbetrachtung fokussieren. Bei deutlich wahrnehmbaren Färbungen (z. B. DAPI-Färbung von DNA, 7 Abschn. 5.7) können diese schon relativ unfokussiert gegen den dunklen Hintergrund wahrgenommen werden – das Signal wird bei der Scharfstellung heller und deutlicher. Für das Scharfstellen sollte die am verlässlichsten im Präparat erwartete Fluoreszenzfärbung verwendet werden, da es in Abwesenheit des Fluoreszenzsignals oft keinen unspezifischen Probenhintergrund gibt, auf den scharfgestellt werden kann.

z Tipps für das fluoreszenzmikroskopische Arbeiten

In der Fluoreszenzmikroskopie müssen die oft sehr schwachen Fluoreszenzsignale effi­ zient wahrgenommen werden, sei es mit den Augen oder mit einer Kamera. Daher: 5 Die meisten in der Mikroskopie verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe verlieren durch wiederholte Beleuchtung ihre fluoreszierenden Eigenschaften, sie „bleichen“. Es sollte deswegen vermieden werden, die Probe auf dem Mikroskop unnötig dem Anregungslicht auszusetzen, d. h. den Lichtweg offen zu lassen, wenn nicht beobachtet oder aufgenommen wird. Das Bleichen von Fluoreszenzfarbstoffen kann in der Probe durch Zugabe von Anti-Bleichmitteln vermindert werden, die z. B. schädliche Radikale abfangen, bevor diese Fluorophore irreversibel chemisch

233 Lichtmikroskopische Methoden

verändern. Die Verwendung von Mitteln zum Bleichschutz von fluoreszierenden Proben wird in 7 Abschn. 5.7 genauer erläutert. 5 In einem abgedunkelten Raum arbeiten: Das Auge kann sich so an die Fluoreszenz­ signale anpassen und sie ohne Störlicht wahrnehmen. Zudem bringen die in der Fluoreszenzmikroskopie verwendeten oft hoch-aperturigen Objektive (Objektive mit einem sehr weiten Sammelwinkel 7 Abschn. 5.1.1) so kein Raumlicht in das Fluoreszenzbild ein. 5 Zur Scharfstellung mit Ölimmersionsobjektiven (deren Arbeitsabstand im Submilli­ meterbereich liegen kann) hilft es, das Objektiv bei geöffnetem Fluoreszenzlichtweg (also mit Anregungslicht in der Probe) so nahe an den Öltropfen heranzuführen, dass der Kontakt zwischen Objektiv und Tropfen zustande kommt. Dieser Über­ gang ist als plötzliches starkes Aufleuchten des gesamten Objektträgers wahrnehm­ bar, da der Kontakt mit dem Öl die Brechung des Anregungslichts stark ändert. Der Übergang ist auch in einem abgedunkelten Raum gut zu erkennen und erlaubt die schnelle Grobfokussierung auf die Probe. Erst danach muss die Probe zur genauen Fokussierung im Okular betrachtet werden. 5 Die Probe sollte lichtdicht gelagert werden, um das zwar schwache, dafür aber lange einwirkende Bleichen durch Raum- und besonders Tageslicht (UV-Anteile) während der Lagerung zu vermeiden. Fluoreszenzpräparate am besten im Kühlschrank lagern. Dies verlangsamt andere schädliche Prozesse, wie Bindungsverlust von Färbungen und Reaktionen der als Antibleichmittel eingesetzten Stoffe, die so über die Zeit ihre Wirksamkeit verlieren. ! Um die für Fluoreszenzmikroskopie nötige starke Beleuchtung der Probe mit

Anregungslicht zu gewährleisten, werden spezielle Lichtquellen verwendet. Dies können Quecksilberdampflampen, Xenonlampen und Quecksilber-XenonMischgaslampen mit 50 bis 200 W Leistung sein sowie spezielle LED-Lichtquellen. Auch wer nicht direkt für die Wartung des Fluoreszenzmikroskops zuständig ist, muss beim Arbeiten an solchen Instrumenten bestimmte Regeln beachten: 5 Quecksilberdampflampen und Mischgaslampen brauchen einige Zeit, um zu zünden und auf Betriebstemperatur zu kommen. Ebenso dauert es einige Zeit, bis sich solche Lampen wieder abgekühlt haben. Häufiges An- und Ausschalten verkürzt die Lebensdauer und kann das Lampenglas brüchig machen, was im schlimmsten Fall zu einer Explosion der Lampe führen kann. 5 Im eingeschalteten Zustand stehen solche Lampen durch das erhitzte dampfförmige Quecksilber unter einem großen Innendruck. Explodiert eine solchen Lampe, muss der Benutzer sofort den Raum verlassen, um den Kontakt mit und das Einatmen von Quecksilberdämpfen zu vermeiden. Die Dekontamination des Lampengehäuses und des Mikroskops muss ein Experte vornehmen, und der Raum muss nach einem solchen Zwischenfall gut belüftet werden. 5 Die Lampen haben eine begrenzte Lebensdauer und müssen bei Erreichen der vorgeschriebenen Lebensdauer gewechselt werden, um Probleme durch Materialermüdung zu vermeiden. Den Wechsel muss eine dafür zuständige Person unter Beachtung aller Herstellerhinweise und Sicherheitsvorkehrungen durchführen! Bei Nichtbeachtung kann es zu Verletzungen (Verbrennungen,

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Stromschläge, Explosion der Lampe) oder Vergiftungen (Quecksilber) kommen. Die Lampen müssen vorschriftsgemäß entsorgt werden. 5 Das Licht dieser Lampen ist sehr intensiv, hat UV-Anteile und wird im Mikroskop stark gebündelt, um optimale Anregung zu gewährleisten. Der Lichtweg darf deswegen nur dann zur Beobachtung geöffnet werden, wenn sich geeignete Exzitationsfilter für die Probenbeobachtung darin befinden. Lampen sollten nur eingeschaltet werden, wenn sie korrekt an das Mikroskopgehäuse angeschlossen sind, um einen unkontrollierten Lichtaustritt zu vermeiden. Eine direkte Betrachtung des aus dem Objektiv austretenden Anregungslichts sollte vermieden werden. Zu diesem Zweck sind an vielen Fluoreszenzmikroskopen Abschirmfilter angebracht, die dieses Licht von den Augen des Mikroskopbenutzers fernhalten. Bei einer Nichtbeachtung der korrekten Handhabungsvorschriften kann es zu Vergiftungen oder zu einer Schädigung der Augen kommen.

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5.3.2  Digitale Bilderfassung

Viele in der Forschung verwendete Lichtmikroskope sind inzwischen mit digitalen Kameras ausgestattet. Diese legen die aufgenommenen Bilder direkt als Dateien auf einem angeschlossenen Computer ab. Der abschließende Schritt einer mikroskopischen Beobachtung ist üblicherweise die Dokumentation in Form eines aufgenommenen Bildes. Die Eigenschaften einer Digital­ kamera unterscheiden sich von denen des Auges. Bei der digitalen Bilderfassung wird das von der Optik erfasste analoge Mikroskop­ bild in ein aus definierten Bildpunkten (Pixeln) bestehendes Bild mit konkreten Zahlen­ werten umgewandelt, die die lokale Signalintensität für den Pixel wiedergeben. Diese Analog-Digitalwandlung, bei der aus Helligkeiten Zahlenwerte gebildet werden, findet entweder in der Kamera oder in der mit der Kamera verwendeten Einsteckkarte statt, sodass im Computer ein Bild entsteht, in dem das mikroskopische Bild in die Pixel der Kamera gerastert und Helligkeitsunterschiede im Bild entsprechend des naheliegendsten Digitalwertes abgelegt werden. Besonders schwache Signale, wie sie in der Fluoreszenzmikroskopie vorkommen, benötigen sehr empfindliche Kameras für eine gute Erfassung der Signale, ohne dabei die Probe unnötig zu bleichen. z Die Eigenschaften von drei heutzutage verwendeten Kameratypen 5 CCD-Kameras: Charge coupled device(CCD)-Kameras bestehen aus einem Halbleiter­



chip mit einer Matrix aus Fotodioden mit Ladungs-sammelnden Potenzialtöpfen, die als einzelne Pixel ausgelesen werden. CCD-Kameras haben ein sehr lineares Signalabbildungsverhalten über einen weiten dynamischen Bereich und kaum Ver­ zerrungen an den Kamerarändern. Sie eignen sich deswegen sehr gut für quantitative Bilderfassungsanwendungen. In den in der Wissenschaft genutzten Kameras wird der Kamerachip meistens aktiv gekühlt. Dies reduziert Wärmerauschen und erhöht das Signal-zu-Rausch-Verhält­ nis, was besonders bei schwachen Signalen und langen Belichtungszeiten bessere Bilder ermöglicht.

235 Lichtmikroskopische Methoden



Bezüglich Empfindlichkeit und Auflösung muss zwischen Farb- und Monochrom­ kameras unterschieden werden: Letztere erzeugen intensitätsbasierte Bilder ohne Berücksichtigung der Farbanteile (vergleichbar mit Schwarz-Weiss-Bildern). Sie sind empfindlicher und haben meist eine höhere Auflösung als Farb-CCDs. Auf Farben basierende Informationen (z. B. in Differenzialfärbungen) können mit ihnen jedoch nicht direkt aufgenommen werden. Sie eignen sich deswegen eher für Fluoreszenz­ anwendungen, in denen der Emissionsfilter den spektralen Bereich definiert und nicht zum Detektionskanal gehörige Farbanteile unterdrückt werden. 5 Elektronen-multiplizierende CCD-Kameras: Kameras diesen Typs sind bei sehr nied­ rigen Lichtintensitäten wie bei Lumineszenzmessungen und manchen Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie vorteilhaft, da sie durch eine Verstärkung der durch das Auftreffen eines Photons erzeugten Ladung (Elektronen-Multiplikation) selbst schwächste Signale detektierbar und somit sogar die Emissionen einzelner Fluoreszenzmoleküle sichtbar machen. Diese erhöhte Detektionsempfindlichkeit führt jedoch zu einem erhöhten Rauschen und einer Abnahme der Linearität der Signalabbildung. Solche Kameras sind deswegen für Schwachlichtanwendungen sehr gut geeignet; bei höheren Signalstärken ist das Aufnahmeverhalten regulärer CCD-Kameras jedoch oft besser. Viele EM-CCDs können deswegen in einem dualen Modus (normal oder Elektronen-multiplizierend) betrieben werden. Aufgrund der hohen Kosten eines so empfindlichen Instruments lohnt sich der Einsatz für viele Standardanwendungen nicht, da im Durchlicht betrachtete Proben und Färbungen und auch viele Fluoreszenzanwendungen nicht verbessert werden. 5 Scientific CMOS-Kameras: Auf komplementärer Metall-Oxid-Halbleiter-Technologie (complementary metal-oxide semiconductor, CMOS) basierende Bildsensoren sind die jüngste Ergänzung der für die Mikroskopie zur Verfügung stehenden Kameraaus­ wahl. Scientific CMOS(sCMOS)-Kameras sind extrem rauscharm, schnell und mit den verwendeten Pixelgrößen im Kamerachip mindestens genauso hochauflösend wie CCD-Kameras. Sie geben meistens einen größeren Bildausschnitt als CCD- und EM-CCD-Kameras wider, da sie mit mehr Pixeln arbeiten. Neue Modelle nähern sich in ihrer Empfindlichkeit den Bereichen der EM-CCD-Kameras an (. Tab. 5.2). So wichtig hochempfindliche und hochauflösende Kameras für viele wissenschaftliche Anwendungen sind, sollte bei der Wahl des Mikroskops und der zugehörigen Kamera

. Tab. 5.2  In der Lichtmikroskopie verwendete Typen von Digitalkameras Kameratyp

Eigenschaften

Verwendung

CCD

Lineares Abbildungsverhalten, hoher dynamischer Bereich, unterdrücktes Wärmerauschen bei gekühlten Kameras Farb- und Monochrommodelle

Alle Mikroskopieanwendungen: Durchlichtmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, quantitative Bildverarbeitung und -analyse

EM-CCD

Höchste Empfindlichkeit. Mehr Rauschen, geringere Linearität und größere Pixel als CCD-Kameras

Schwachlichtanwendungen, Einzelmolekülmessungen (Super-Resolution, 7 Abschn. 5.3.4), Lumineszenz

Scientific CMOS

Rauscharm, schnell, kleine Pixelgröße, empfindlich

Schnelle Messungen, alle Mikrosko­ pieanwendungen

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Folgendes bedacht werden: Die meisten in den folgenden Abschnitten beschriebenen Färbungen, insbesondere mit Durchlicht betrachtete Färbungen, arbeiten nicht in Intensitätsbereichen, in denen so spezialisierte Aufnahmegeräte benötigt werden. Beim Arbeiten mit Fluoreszenzfärbungen sind die meisten wissenschaftlichen CCDKamers ausreichend empfindlich und die wirklichen Vorteile kommen nur in Spezial­ anwendungen, wie sie z. B. in 7 Abschn. 5.3.4 vorgestellt werden, zum Einsatz. z Tipps für das digitale mikroskopische Fotografieren

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Die Erstellung eines guten Digitalbilds hängt oft nicht von dem Einsatz der fort­ geschrittensten Technologien, sondern von der korrekten Handhabung der vorhandenen Kamera ab. Folgende Probleme können im aufgenommenen Bild auftreten – und wie beschrieben gelöst werden: 5 Das Bild auf dem Bildschirm erscheint unscharf oder fokussiert eine andere Ebene als bei der Betrachtung mit dem Okular: Die mit dem Auge wahrgenommene Fokus­ ebene des Okulars entspricht nicht immer der Fokusebene der Kamera, besonders wenn die auf das Schärfeempfinden des Beobachters eingestellte Okularkorrektur stark von der Neutralstellung abweicht. Deswegen sollte sichergestellt werden, dass im Kamerabild als fokussiert wahrgenommene Strukturen auch bei der Betrachtung mit dem Okular so erscheinen. Ansonsten sollte die dioptrische Korrektur des Okulars dementsprechend nachgeregelt werden, um ein kontinuierliches Nach­ fokussieren beim Wechsel zwischen Okular und Kamera zu vermeiden. 5 Mit dem Auge sind mehr Details erkennbar als im mit der Kamera aufgenommenen Bild: Da die Nummer der Bildpixel einer Kamera begrenzt ist, kann es zu Auf­ lösungsverlusten kommen, wenn die Pixelabmessungen nicht der Auflösungskraft des Objektivs angepasst sind und das Bild deswegen nicht voll aufgelöst erscheint. Für ein Mikroskopbild muss der kleinste auflösbare Abstand etwas mehr als zwei Pixel betragen. Die heutzutage für die Mikroskopie verwendeten Kameras erfüllen dies für hochvergrößernde hochauflösende Objektive. Die kleinsten mit Lichtmikro­ skopie erfassbaren Details lassen sich somit mit Digitalkameras erfassen. Dies gilt jedoch nur für Vergrößerungen von 100x und teilweise für 60x. Bei Nutzung von hochaperturigen Objektiven mit geringeren Vergrößerungen bilden die meisten Digitalkameras nicht mehr alle Details ab. Ein nachvergrößertes Digitalbild bringt daher keine neuen Erkenntnisse. Zur Nutzung der vollen mikroskopischen Auf­ lösung mit Digitalkameras sollte deswegen mit der maximalen Objektivvergrößerung oder einer entsprechenden optischen Nachvergrößerung im Lichtweg gearbeitet werden. 5 Das Bild hat wenig Kontrast, helle oder dunkle Bereiche erscheinen abgeschnitten: Der Kontrast eines Bilds ist der Helligkeitsunterschied zwischen hellen und dunklen Bereichen des Bildes. Er sollte so gewählt sein, dass diese Unterschiede gut mit dem Auge wahrgenommen werden können. Der maximale Kontrast entsteht, wenn die dunkelsten Strukturen als schwarz und die hellsten Strukturen des Bilds als weiß wahrgenommen werden. Dieses Kriterium allein ergibt jedoch kein gutes Bild, da die Zahl der wahrnehmbaren Zwischenwerte nicht durch den Maximalkontrast, son­ dern durch den dazwischen liegenden dynamischen Bereich gegeben ist, in den die Helligkeitswerte verteilt werden. Ein Bild aus zwei als schwarz und weiß dargestellten Graustufen hat zwar einen hohen Kontrast, aber einen winzigen dynamischen Bereich (2 Werte = 1bit). Das menschliche Auge kann ungefähr 50–60 Graustufen

237 Lichtmikroskopische Methoden





unterscheiden (entspricht ungefähr 6bit), sodass mindestens so viel dynamischer Bereich zwischen den hellsten und dunkelsten Bereichen liegen sollte. Generell ist somit ein Bild mit einem dynamischen Bereich von 256 Graustufen (8bit) für die Darstellung auf Computerbildschirmen (8bit) und für das menschliche Auge geeignet. Dabei kann der Kontrast des Bildes auf dem Bildschirm so angepasst wer­ den, dass 6bit-Unterbereiche des Bildes für das Auge kontrastreich dargestellt werden können, indem dieser Bereich zwischen der Schwarz- und Weißdarstellung gestreckt wird. Sollte die Probe ausreichend Informationen als Helligkeitsunterschiede ent­ halten, machen für quantitative Messungen auch höhere dynamische Bereiche Sinn (viele CCD-Kameras digitalisieren in 12bit, also 4096 Graustufen). Als Ganzes können die Helligkeiten dann zwar nur gestaucht (in ein 8bit-Display) dargestellt werden, die digitalisierten Helligkeitsstufen können jedoch quantitativ analysiert und dynamische Unterbereiche mittels einer passenden Kontrasteinstellung gut erkenn­ bar dargestellt werden. Für eine quantitative Analyse der Strukturen im Bild muss vermieden werden, dass Bildinhalte heller als der maximale Aufnahmewert sind oder im dunklen Hinter­ grund verschwinden, da diese Werte zwangsläufig abgeschnitten werden und nicht mehr ermittelbar sind. Der dynamische Bereich eines Bilds kann mikroskopseitig durch die Veränderung der Beleuchtungsintensität und kameraseitig durch die Wahl der Kamerabelichtungs­ zeit und teilweise auch durch die eingestellte Signalverstärkung so eingestellt werden, dass ein Bild mit gut aufgelösten Helligkeitswerten entsteht. Die Betrachtung des Histogramms (Darstellung der Häufigkeit der Grauwerte in einem Bild) hilft, einen guten dynamischen Bereich zu wählen.

5.3.3  Konfokale Mikroskopie

Ein grundlegendes Problem der modernen Lichtmikroskopie ist die Überlagerung der Informationen aus der Fokusebene mit unscharfen Bildanteilen aus den darüber und darunter liegenden Bereichen einer Probe. Für lange Zeit wurden in der Lichtmikro­ skopie deswegen nur einzelne Zellen, dünne Beläge oder dünne Gewebeschnitte, die mit komplexen Einbettmethoden und histologischen Färbungen erstellt wurden, betrachtet. Viele der heutigen Forschungsrichtungen benötigen jedoch Möglichkeiten zur Betrachtung dicker und komplexer Proben. Die mikrobiologische Forschung könnte aufgrund ihrer kleinen und mikroskopisch oft nur schwer auflösbaren Untersuchungs­ objekte als von dieser Problematik ausgenommen erscheinen, dies ist jedoch nur zum Teil so. Auch hier sind moderne Methoden zur dreidimensionalen Probendarstellung nützlich, sei es, um vielzellige Pilzstadien und Strukturen besser zu verstehen, oder um Pathogene in Wirtsgeweben darzustellen. Konfokale Mikroskopie ist inzwischen in den meisten Forschungseinrichtungen zugänglich. Wie bei allen optischen Spezialverfahren in der Mikroskopie ersteht ein ver­ bessertes Bild durch das Filtern bzw. Verwerfen von Bildanteilen, die nicht benötigte Informationen enthalten (. Abb. 5.7). Bei der konfokalen Laser-Raster-Fluoreszenz-Mikroskopie wird die Fokusebene des mikroskopischen Objektivs als „optischer Schnitt“ ohne störende Beiträge der unscharfen Strukturen über und unter der Bildebene dargestellt. Dies wird mithilfe der drei Konzepte Rasterung, Fluoreszenzanregung mit Laserlicht und Lochblenden

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in zusammenhängenden Brennebenen des mikroskopischen Lichtwegs (Konfokalität) umgesetzt. 5 Rasterung: Wird eine Probe mittels eines Lichtpunkts gerastert, der zu jedem Zeit­ punkt nur einen kleinen Teilbereich der Probe beleuchtet, entsteht weit weniger Streulicht in der Probe, als dies bei einer gleichzeitigen Beleuchtung des gesamten Bildfelds (Weitfeldbeleuchtung) der Fall wäre. 5 Laserlicht: Laser bieten sich aufgrund ihres intensiven und stark fokussierbaren Lichts als Punktanregungsquellen für die Rastermikroskopie an. 5 Konfokale Lochblenden: Obwohl schon ein Laser-Raster-Mikroskop durch redu­ ziertes Streulicht verbesserte Bilder von dicken Proben liefern kann, würde das entstehende Bild weiterhin die unscharfen Bildanteile von Strukturen über- und unterhalb der Fokusebene enthalten. Die Verwendung einer Punktbeleuchtung erlaubt jedoch (anders als die Weitfeldbeleuchtung) das Einbringen von Lochblenden in den Lichtweg. Wird eine solche Lochblende im Lichtweg dort positioniert, wo der in Probe beleuchtete Punkt auf der anderen Seite des Objektivs wieder scharf gestellt wird, so wird Licht, das aus den Bereichen über und unter der Fokusebene kommt, zu großen Teilen verworfen. Nur die scharfgestellten Anteile aus der Fokusebene passieren die Blende; die noch nicht fokussierten oder schon wieder defokussierten Anteile aus anderen Ebenen werden an der Blende zu großen Teilen verworfen. Eine Anordnung, in der optische Elemente wie die Lochblende in zur Fokusebene kon­ jugierten Ebenen des Lichtwegs eingebracht werden, wird als „konfokal“ bezeichnet und ist für diese Art der Mikroskopie namensgebend. Die auf diese Weise gerasterten und von unfokussiertem Hintergrund bereinigten Bilder können wegen der Einzelpunktrasterung (die Abtastung des Bildbereichs kann

mehrere Sekunden dauern) nicht mit bloßem Auge, sondern nur auf dem Bildschirm des Steuercomputers betrachtet werden. Das so entstandene Bild kann als „optischer Schnitt“ verstanden werden, der innerhalb einer Probe nur die Fokusebene darstellt. Eine Serie von in der Tiefe versetzten optischen Schnitten erlaubt eine dreidimensionale Rekonstruktion der Probe im Computer. Konfokale Mikroskopie wird in den biologischen Wissenschaften hauptsächlich für Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Der auf einen einzelnen Lichtpunkt reduzierte Lichtweg erleichtert die spektrale Auftrennung der detektierten Fluoreszenz auf mehrere Detektoren und die simultane Aufzeichnung mehrerer Signale einschließlich des (nicht­ konfokalen!) Durchlichtsignals mit dafür vorgesehenen Detektoren. Die möglichen Anwendungen z. B. für Fluoreszenzlebensdauer und nichtlineare Probenanregung (z. B. Zwei-Photonen-Mikroskopie, Raman-Spektroskopie) mittels hochspezialisierter Laser­ lichtquellen sprengen den Rahmen des Kapitels und haben auch keine direkte Relevanz für das praktische Arbeiten in der mikrobiologischen Forschung. Für eine weitere Ver­ tiefung sei deswegen auf die ausgiebig in diesem Feld vorhandene Spezialliteratur ver­ wiesen. ! Da in der konfokalen Mikroskopie fast ausnahmslos Laserlicht für die

Probenanregung verwendet wird, müssen beim Arbeiten die für die jeweilige Laserklasse geltenden Sicherheitsbestimmungen beachtet werden. Kommerziell angebotene Konfokalmikroskope sind für ein sicheres Arbeiten konzipiert und zertifiziert und besitzen interne Sicherungsmechanismen, die eine schädigende Bestrahlung des Auges weitestgehend ausschließen. Handlungen wie das

239 Lichtmikroskopische Methoden

Einbringen von reflektierenden Oberflächen in den Lichtweg müssen jedoch vermieden werden. Beim Arbeiten mit selbstgebauten oder modifizierten Lasermikroskopen muss die Beachtung der Regeln der Lasersicherheit sichergestellt sein.

z Tipps für das konfokal-mikroskopische Arbeiten

Die Probenvorbereitung für Konfokalmikroskopie ist zu großen Teilen identisch mit der für konventionelle Epifluoreszenzmikroskopie. Anleitungen für Fluoreszenz­ färbungen finden sich in 7 Abschn. 5.7. Da die Konfokalmikroskopie zwar räumlich sehr hochauflösend (optische Schnitte), aber wegen der sehr kurzen Anregungszeit der einzelnen Punkte und der für die Detektion nötigen Komponenten nicht sehr empfindlich ist, sollten bevorzugt deutliche Färbungen betrachtet werden. Die für die Detektion nötige Lichtmenge und die Tatsache, dass die Intensität des Anregungslichts im Beleuchtungspunkt sehr hoch sein muss, um während der kurzen Verweildauer des Rasterstrahls genügend Fluoreszenz zu generieren, kann zu erhöhtem Bleichen der Probenfluoreszenz führen, sodass in der Konfokalmikroskopie am besten sehr foto­ stabile Farbstoffe und vor Bleichen schützende Reagenzien verwendet werden. Da Konfokalmikroskopie meist für Hochauflösungsmikroskopie zum Einsatz kommt, wird als Kontrast für Transmissionsbilder oft der Differenzialinterferenzkontrast anstelle des Phasenkontrasts bevorzugt. Da das verwendete Anregungs­ laserlicht schon polarisiert ist, eignet es sich für Komponenten, die für den Differenzialinterferenzkontrast verwendet werden. Bei der Scherung des Anregungsstrahls im Objektivprisma (7 Abschn. 5.2.3) kann es jedoch zu Verzerrungen und teilweise zur Verdoppelung kleiner Strukturen kommen, da im Wollaston- bzw. Nomarski-Prisma zwei die Probe abrasternde Strahlen entstehen, die leicht zueinander versetzt sind und Strukturen in der Probe zwei Mal erfassen. Dies kann sich bei sehr hochaufgelösten Details im Konfokalbild bemerkbar machen. Da die Anzahl der Pixel in einem rasterbasierten Bildgebungsverfahren nicht von einer physikalischen Pixelgröße begrenzt werden, können mit konfokalen Mikro­ skopen erstellte Bilder durch eine Änderung der Rasterabstände leicht an die optische Auflösung des verwendeten Objektivs angepasst werden, entweder durch die Verwendung von mehr Pixeln für das gesamte Bildfeld oder durch die Einschränkung des Bildfelds bei gleichbleibender Pixelnummer (Zoom-Funktion). Die Objektiv­ vergrößerung ist deswegen für die Erstellung eines hochvergrößernden Konfokal­ bildes nicht entscheidend, wohl aber die durch die numerische Apertur des Objektivs bedingte Auflösung. Es kann auch leicht zur Entstehung von leervergrößernden Bil­ dern kommen, wenn die Bildpixelgrößen signifikant unter dem Auflösungslimit und den dadurch bedingten Vorgaben für die Bilderfassung liegen. 5.3.4  Lichtmikroskopie jenseits der Beugungsgrenze

(Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie)

Die Definition des maximalen Auflösungsvermögens eines Mikroskops entsprechend der Lichtbeugung durch Ernst Abbe im Jahre 1873 war ein essentieller Beitrag zum Ver­ ständnis der Optik von Mikroskopen, der auch heute noch seine Gültigkeit hat. Nach­ dem das so beschriebene Beugungslimit in der Lichtmikroskopie schon vor langer

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Zeit erreicht wurde, führte dies zu einer teilweisen Stagnation im Bereich der Licht­ mikroskopentwicklung, da die aufgelöste Darstellung von Strukturen unter diesem Limit als nicht möglich erachtet wurde. Erst um die Jahrtausendwende zeigten mehrere Ansätze, dass es durch die Verbindung von Entwicklungen in der Laserbeleuchtung, der fluoreszenzbasierten Probenfärbung und der Detektionsempfindlichkeit sehr wohl mög­ lich ist, Strukturen, die um ein Vielfaches unter der optischen Auflösungsgrenze liegen, aufgelöst darzustellen. Dabei wird die anhand durch die Physik der Lichtstrahlen weiter­ hin gegebene Beugungsgrenze der Strahlenoptik nicht außer Kraft gesetzt, sondern teilweise sehr elegant umgangen. Diese Entwicklungen können gerade für die mikrobio­ logische Forschung sehr interessant sein, da viele der hier untersuchten Organismen so klein sind, dass intrazelluläre Strukturen mit Lichtmikroskopie bisher nicht darstellbar waren. Einen Überblick hierzu gibt . Tab. 5.3. Die Lichtmikroskopie unterhalb der Auflösungsgrenze ist sehr geeignet für die Dar­ stellung von Mikroorganismen und ihren intrazellulären Strukturen und kann als will­ kommene Ergänzung der existierenden Mikroskopiemethoden verstanden werden. Wie bei vielen Spezialanwendungen sind die Probenvorbereitung, die benötigten Komponen­ ten und die Erstellung solcher Bilder so komplex, dass sie sich nicht für einen generellen Einsatz, sondern besser für die gezielte Anwendung mit ausgewählten Proben eignet. 5.4  Präparationsmethoden für die Mikroskopie

Im vorhergehenden Abschnitt wurden im Rahmen der Erklärung der mikroskopischen Optik mehrere Verfahren vorgestellt, die Bildkontrast in den weitgehend unsichtbaren mikrobiologischen Proben mittels optischer Elemente und den durch diese verursachten Lichtinterferenzen erzeugen. Solche Methoden sind sehr nützlich, um die Mikroorganis­ men als Ganzes darzustellen, aber es mangelt ihnen an der Spezifität, nur bestimmte Strukturen in einer Probe gezielt zu markieren oder nur bestimmte Organismen innerhalb einer Probe zu kennzeichnen. Deswegen werden auch Färbungen benötigt, die

Organismen, Strukturen und Zellbestandteile aufgrund ihrer chemischen Zusammen­ setzung erkennen und bei denen eine Färbereaktion nur an solchen Stellen stattfindet.

! Bei der Vorbereitung mikrobiologischer Proben für die Betrachtung, also während der

Präparation und Färbung und bei lebenden Kulturen auch während der Betrachtung und Entsorgung, können Haut, Kleidung, Arbeitsfläche und Mikroskop kontaminiert werden. Viele der beschriebenen Präparationen lassen die Proben unversiegelt, sodass eine kontinuierliche Kontaminationsgefahr während der Handhabung gegeben ist. Die im Labor gültigen Sicherheitsbestimmungen und Sicherheitsstufen müssen deswegen während aller Vorgänge genau beachtet werden.

5.4.1  Herstellung lebender Proben

Die hier beschriebenen Methoden eignen sich auch zur Betrachtung von Proben mit­ tels Phasenkontrastmikroskopie oder Differenzialinterferenzkontrast. In diesen Fällen sind keine weiteren Färbeschritte nötig. Solche Proben eignen sich zur Untersuchung der Form und der Beweglichkeit von Mikroorganismen. Deckglaspräparate (siehe unten) sind mit Lebendfärbungen (7 Abschn. 5.5) kompatibel, die zur weitergehenden Unter­ suchung solcher Proben verwendet werden können.

Funktionsweise

Überlagerung des Mikroskopbilds mit einem in mehrere Positionen und Orientierungen aufgenommenen Gittermuster

Fluoreszenz außerhalb eines weit unter der Beugungsgrenze liegenden Detektionsbereichs wird mit einem sehr starken zweiten Laser ausgeschaltet (stimulierte Emission)

Durch Photochemie und starke Beleuchtung wird ein Großteil der Fluoreszenzmoleküle in einen dunklen Zustand versetzt; nur einzelne Moleküle sind zu jedem Zeitpunkt in der Probe detektierbar. Deren Positionen sind mit großer Genauigkeit ermittelbar. In Tausenden Bildern werden so alle Positionen der Fluoreszenzmoleküle im Bildbereich ermittelt

Methode

Strukturierte Beleuchtung

Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Lokalisations-mikroskopie: Photoactivation Localization Microscopy (PALM), Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) und directSTORM

. Tab. 5.3  Formen der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie

Bis zu ca. 10-fach

Abhängig von der Stärke der ausschaltenden Beleuchtung und dem benutzten Fluorophor. Ca. 3-8-fache Steigerung

Verdopplung der Auflösung

Auflösungssteigerung

Frisch angesetzte Proben (einzelne angeheftete Zellen) in Spezialpuffern

Eingebettete Fluoreszenzfärbungen einzelner Zellen, Gewebeschnitte oder Gewebe

Eingebettete Fluoreszenzfärbungen einzelner Zellen oder dünne Gewebeschnitte

Anwendungen

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Deckglaspräparat

Bei einem Deckglaspräparat wird eine kleine Menge der Probe auf einen Objektträger aufgebracht und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. i Benötigtes Material

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5 Bakterienkultur 5 Impföse bzw. Pipette 5 Bunsenbrenner 5 Objektträger 5 Deckglas 5 Uhrmacherpinzette

Vorgehensweise 5 Sowohl der Objektträger als auch das Deckglas müssen fettfrei sein, um eine gleichmäßige Verteilung des Probentropfens zu gewährleisten. Dazu die Gläser durch mehrfaches Bewegen durch die rußfreie nichtleuchtende Flamme eines Bunsenbrenners vor der Benutzung entfetten. Die Glasoberflächen danach vor der Verwendung abkühlen lassen. Die benötigten Tropfenvolumen für diese Methode sind sehr gering (ca. 20 µl), um zu vermeiden, dass das Deckglas aufschwimmt oder Flüssigkeit an den Rändern des Deckglases austritt. Arbeiten mit Zellsuspensionen: 5 Suspension gut mischen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten 5 Eine kleine Menge der Suspension mit einer sterilen Pasteurpipette oder Eppendorfpipette entnehmen. Die Dichte der Zellsuspension sollte so gewählt sein, dass nur eine leichte Trübung wahrnehmbar ist. Bei zu dichter Lösung kann in einem separaten Röhrchen mit dem Einschlussmittel nachverdünnt werden, alternativ auch durch Mischung auf dem Objektträger nach dem Aufbringen. 5 Einen kleinen Tropfen der Zellsuspension aus der Pasteurpipette auf die Mitte des Objektträgers aufbringen. Feste Kulturen 5 Ein kleiner Tropfen Einschlussmittel auf die Mitte des Objektträgers pipettieren. 5 Mit einer ausgeglühten (und danach abgekühlten) Impföse eine sehr geringe Menge Zellmaterial aufnehmen. Das Zellmaterial am Einschlussmitteltropfen anfeuchten und neben dem Tropfen gründlich verreiben. 5 Den Einschlussmitteltropfen über das Zellmaterial ziehen. 5 Die Zellen gründlich im Tropfen verrühren, bis nur noch eine leichte Trübung sichtbar ist (bei zu starker Trübung kann mit Einschlussmittel nachverdünnt werden). 5 Ein trockenes und sauberes Deckglas mit einer Uhrmacherpinzette vorsichtig auflegen (den Deckglasrand auf einer Seite des Tropfens absetzen und dann behutsam über den Tropfen legen), um allzu große Lufteinschlüsse zu vermeiden. Die Fläche unter dem Deckglas sollte komplett mit Einschlussmittel gefüllt sein, ohne dass das Deckglas aufschwimmt oder Flüssigkeit an den Deckglasrändern austritt. Überschüssige Flüssigkeit kann durch Anlegen eines Stücks Filterpapier

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an den Deckglasrand abgezogen werden. Während dieses Vorgangs besteht Kontaminationsgefahr, und das angefeuchtete Papier muss entsprechend der Vorgaben für den verwendeten Organismus entsorgt werden.

Bleibt zu viel Flüssigkeit zurück, kann die Ölimmersion das Deckglas mit dem Objektiv bewegen bzw. ganz vom Objektträger ziehen. Ebenso kann das Immersionsmedium mit der Flüssigkeit an den Rändern in Kontakt kommen, was zur Zerstörung des Präparats führen und eine Grundreinigung des Immersionsobjektiv nötig machen würde. Beim Arbeiten mit Luftobjektiven (die keinen direkten Kontakt zum Präparat haben) ist dies einfacher. z Versuchsergebnis/Auswertung

Deckglaspräparate müssen nach der Herstellung zügig betrachtet werden, da das sehr kleine Tropfenvolumen auch unter dem Deckglas sehr schnell durch Verdunstung an den Rändern austrocknet, was schädlich für die betrachteten Zellen ist. Gleichmäßiges Strömen von Zellen im Bildbereich in dieselbe Richtung kann neben anderen Erklärungen ein Indiz für Austrocknen sein. Einschlussmittel kann in dem Fall durch Ablage eines Tropfens am Deckglasrand nachgefüllt werden. Dieses wird mittels der Kapillarkräfte unter das Deckglas gezogen. Optional kann das Präparat auch versiegelt werden. 5.4.1.1  Hängender Tropfen Die Beweglichkeit und Morphologie von Mikroorganismen können mit dieser Methode

schnell und einfach untersucht werden. i Benötigtes Material

5 Flüssigkultur 5 Pasteurpipette 5 Fettfreier Hohlschliffobjektträger 5 Deckglas 5 Vaseline

Vorgehensweise 5 Die Vertiefung des Hohlschliffobjektträgers gründlich mit Vaseline umrahmen, um die Haftung des Deckglases zu gewährleisten. 5 Mit einer Pasteurpipette einen kleinen Tropfen einer Flüssigkultur auf das Deckglas aufbringen. 5 Den Hohlschliffobjektträger umdrehen und so auf das Deckglas drücken, dass dieses von der Vaseline-Umrandung festgehalten wird und der Flüssigkeitstropfen auf dem Deckglas in die Vertiefung des Hohlschliffobjektträgers ragt, ohne diesen zu berühren. 5 Den Objektträger schnell umdrehen, sodass der Tropfen jetzt am Deckglas hängt. 5 Das Präparat kann jetzt mikroskopiert werden, indem auf den Tropfenrand scharfgestellt wird.

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Die Betrachtung eines hängenden Tropfens durch das Deckglas geschieht mit aufrechten Mikroskopen. Prinzipiell lässt sich der in dem Fall liegende Tropfen auch mit inversen Mikroskopen betrachten, wenn man das Präparat umdreht. Das Risiko, besonders beim Arbeiten mit Ölimmersion das Deckglas vom Objektträger abzuziehen, ist hier jedoch höher und führt leichter zu Kontaminationen der nicht so leicht zugäng­ lichen Bereiche des inversen Mikroskops um den Objektivrevolver herum. 5.4.1.2  Bewegungsanalyse

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Sowohl mit Deckglaspräparaten als auch mit hängenden Tropfen kann die Bewegung der Probeorganismen untersucht werden. Nicht jede Bewegung der beobachteten Zellen im Präparat ist jedoch eine aktive Zellbewegung. Bei aktiven Zellbewegungen kommt es zu Änderungen des Orts und der Richtung. Nicht als Zellbewegung zu betrachten sind: 5 die Brown’sche Molekularbewegung: die Zellen zittern, ohne sich von der Stelle zu bewegen: keine Ortsveränderung. 5 Strömungen in der Probe: Alle Zellen bewegen sich mit gleicher Geschwindigkeit in dieselbe Richtung: keine Richtungsänderung. Dies kann durch Austrocknen der Probe oder Wirkungen von Kapillarkräften oder Druck auf das Präparat ausgelöst werden. Die Zellbewegung kann durch die Beobachtung im Lichtmikroskop beeinflusst wer­ den, da Wärmestrahlung zur Verlangsamung bzw. Einstellung von Zellbewegungen führen kann, aber auch zu positiv oder negativ phototaktischen Bewegungen von Mikroorganismen. Die Verwendung geringer Lichtmengen und die Nutzung eines Wärmefilters sind angeraten. Manche Wärmefilter wie Pyrex-Gläser (Aklo, Schott KG1) ändern das durchgelassene Farbspektrum, was sich als Grünstich des Mikroskopbildes bemerkbar machen kann und bei Farbaufnahmen mit Digitalkameras mit einem neu durchgeführten Weißabgleich kompensiert werden kann. Das Anschalten der Beleuchtung nur zur Betrachtung und ein häufiger Wechsel des Beobachtungsfeldes (mit besonderem Augenmerk auf Bewegungsänderungen zu Anfang der Beobachtung) können helfen, falsche Beobachtungen zu vermeiden oder zumindest als solche zu erkennen. 5.4.2  Herstellung fixierter Proben

Fixierte Proben von Mikroorganismen werden für Erregernachweise mittels Färbungen erstellt. Während der Lufttrocknung des Präparats und der anschließenden Fixierung werden die Zellen in den meisten Fällen abgetötet. Bei Dauerformenbildnern (z. B. Endosporen) und anderen sehr widerstandsfähigen Bakterien (z. B. Mykobakterien) kann es jedoch vorkommen, dass die Abtötung nicht vollständig ist, und dies muss bezüglich des Kontaminationsrisikos bei der weiteren Handhabung der Proben berück­ sichtigt werden. Nach der mikroskopischen Betrachtung müssen solche Proben in ein Desinfektionsbad eingebracht und abschließend autoklaviert werden.

245 Lichtmikroskopische Methoden

5.4.2.1  Ausstrichpräparate

Um ein gutes Präparat für die weitere Färbung zu erhalten, müssen die Zellen in einer dünnen Schicht auf ein Deckglas oder einen Objektträger aufgetragen werden, damit sich die Zellen während der anschließenden Lufttrocknung gut an die Oberfläche anheften. i Benötigtes Material

5 Probenmaterial 5 Spatel, Tupfer, Impföse oder Pipette 5 Objektträger 5 Deckglas

Vorgehensweise 5 Saubere und fettfreie (durch Abflammen, 7 Abschn. 5.4.1 Deckglaspräparat) Objektträger oder Deckgläser verwenden. Je nach Beschaffenheit der Probe müssen unterschiedliche Ansätze zum Auftragen der Probe verwendet werden: 5 Abstriche (Sofortpräparate): Bei mit sterilen Tupfern erstellten Abstrichen diese in der Mitte des Objektträgers in eine Richtung abrollen. Bei der Verwendung von Spateln diese in eine Richtung in der Mitte des Objektträgers wischen und so das daran haftende Material dünn auftragen. 5 Flüssigkeitskulturen: Einen kleinen Tropfen einer ausreichend verdünnten Kultur oder Suspension in der Mitte des Objektträgers aufbringen. Um ein übermäßig dichtes Präparat zu vermeiden, sollte nur noch eine leichte Trübung der Flüssigkeit vorhanden sein. Gegebenenfalls die Lösung bis zur benötigten Trübung mit Leitungswasser verdünnen und einen kleinen Tropfen dieser Verdünnung verwenden. 5 Agar-Kulturpräparate: Bei zähflüssigen bzw. festen Proben (z. B. Agar-Kolonien) diese erst ausreichend suspendieren, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen. Dazu einen kleinen Tropfen Leitungswasser auf den Objektträger aufbringen und das zu färbende Zellmaterial in sehr kleiner Menge mit einer abgeflammten und abgekühlten Impföse aufnehmen. Das Material in den Wassertropfen eingebringen und durch Verrühren im Tropfen gleichmäßig mischen. 5 Bei den letzten beiden Probentypen die so erhaltenen Suspensionstropfen mit einer Impföse mit kreisenden Bewegungen so verstreichen, dass ein gleichmäßiger, möglichst dünner Film entsteht, der eine Fläche von ein bis zwei Quadratzentimetern bedeckt. Die Gleichmäßigkeit und möglichst geringe Schichtdicke ist für eine gute Färbung entscheidend. Alternativ können diese Probentypen auch mit folgender Methode ausgestrichen werden: 5 Den Probentropfen auf einen sauberen fettfreien Objektträger aufbringen. Die Kante eines zweiten Objektträgers so an den Rand des Tropfens anbringen, dass sich der Tropfen mittels Kapillarkräften am gesamten Glasrand verteilt. Den Tropfen dann mit dem (schräg über dem Tropfen ausgerichteten) zweiten

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Objektträger über den unten liegenden Objektträger ziehen und somit gleichmäßig verteilen. 5 Den Ausstrich vollständig an der Luft trocknen lassen. Die völlige Trocknung ist Voraussetzung für die anschließende Hitzefixierung (siehe unten), da es beim Erhitzen von noch feuchtem Material zur Beschädigung der Zellwände und zum Aufplatzen von Bakterien kommen könnte.

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Für die Lufttrocknung bietet es sich an, den Objektträger schräg aufzustellen, wobei die Ausstrichseite nach unten gerichtet sein sollte. Dadurch wird die Ablagerung von Schmutzpartikeln während der Trocknung verhindert.

5.4.2.2  Fixierung einer Probe

Die Fixierung einer Probe erwirkt die Einstellung der Zellfunktionen (Abtötung) und die Erhaltung der zellulären Strukturen. Die für Bakterienausstriche am häufigsten verwendete Fixierungsmethode ist die Hitzefixierung. Sie ist für die meisten Färbeanwendungen ausreichend; die Hitze­ behandlung führt jedoch zu Schrumpfungsartefakten und Formveränderungen und dem Verlust von intrazellulären Strukturen. Durch die Hitzebehandlung kommt es zur Denaturierung von Proteinen im Protoplasma der Zellen, was zu einer Verklumpung (Koagulation) führt und die Zellen besser an den Objektträger anheftet. Dies ist wich­ tig für die nachfolgenden Färbeschritte, weil die Zellen auf diese Weise nicht abgespült werden. Chemische Fixierungsmethoden führen zu weniger Veränderungen der Morpho­ logie (wegen der stattfindenden Probenhärtung) und (im Falle von vielzelligen Aggre­ gaten) dem Zerfall von Zellverbänden. Sie sind jedoch nicht so einfach und direkt auszuführen wie die Hitzefixierung und für die in weiteren Abschnitten beschriebenen Erregernachweismethoden nicht nötig. Hitzefixierung i Benötigtes Material

5 Ausstrichpräparat (7 Abschn. 5.4.2, Ausstrichpräparat) 5 Bunsenbrenner

Vorgehensweise 5 Das Ausstrichpräparat gut lufttrocknen. 5 Die Luftzufuhr des Bunsenbrenners so einstellen, dass die Flamme nicht leuchtet und nicht prasselt. Danach Flamme schwach stellen. 5 Den Objektträger dreimal schnell und gleichmäßig in einer senkrechten Kreisbewegung durch die Flamme ziehen. Die Präparatseite muss dabei nach oben von der Flamme weg gerichtet sein. 5 Das Präparat vor der weiteren Verwendung abkühlen lassen.

247 Lichtmikroskopische Methoden

Empfindliche Mikroorganismen, die durch die Hitzefixierung zu stark beschädigt wer­

den, müssen chemisch fixiert oder nach Lufttrocknung gefärbt werden. In diesem Fall sollte jedoch bedacht werden, dass das Material möglicherweise nicht vollständig abgetötet wurde und Kontaminationen möglich sind. Die in 7 Abschn. 5.5.1 (Färbung lebender Proben) beschriebene Kapselfärbung kann nach einer Hitzefixierung nicht mehr durchgeführt werden, da die Kapseln durch die Behandlung geschrumpft oder zerstört werden. ! Objektträger können bei der plötzlichen Erhitzung oder bei zu langem Verweilen

in der Flamme platzen. Neben der Zerstörung des Präparats entsteht damit auch Verletzungsgefahr, falls es zu einem Glasbruch und scharfen Kanten kommt. Die Lufttrocknung und anschließende Hitzefixierung kann auch mit Deckgläsern anstelle von Objektträgern ausgeführt werden. Die sehr dünnen Deckgläser sind sehr zerbrechlich und damit schwerer zu handhaben. Während der Hitzebehandlung haben sie jedoch den Vorteil, dass sie nicht so leicht springen. Bei der Verwendung von Deckgläsern können diese während der Hitzefixierung nicht mit der bloßen Hand geführt werden, da diese der Flamme bei weitem zu nahe kommen würde. Deswegen wird das Deckglas dafür in eine Cornet-Pinzette eingespannt, am besten schon für die vorangehende Lufttrocknung.

z Chemische Fixierungen

Mittels chemischer Wechselwirkungen mit einem zugegebenen Stoff durchgeführte Fixierungen sind schonender als die Hitzefixierung. Die zellulären Prozesse werden durch die Bildung chemischer Brücken (Aldehyde) zwischen oder durch Ausfällung bzw. Koagulation (Alkohole) von Proteinen gestoppt. Strukturen werden dabei an der Stelle und (mehr oder weniger) in der Form erhalten, die sie zum Zeitpunkt der Fixierung innehatten. Chemische Fixierungen sind vor allem dann anzuraten, wenn Abstriche auch andere Zelltypen (z. B. Wirtszellen für intrazelluläre Pathogene) ent­ halten, wenn die Proben mit hochauflösenden Mikroskopiemethoden betrachtet werden sollen (Konfokal- oder Superresolutionsmikroskopie, Elektronenmikro­ skopie) oder die DNA für in-situ-Hybridisierungen zugänglich sein sollte. Die Wahl des Fixiermittels (Fixans) und des am besten geeigneten Protokolls für die gewünschte Strukturerhaltung muss auf den untersuchten Organismus abgestimmt werden und kann in diesem Rahmen nur allgemein abgehandelt werden. ! Alle chemischen Fixantien sind auch für menschliche Gewebe giftig! Angemessene

Sicherheitsvorkehrungen müssen beachtet werden, um einen Hautkontakt und das Einatmen von Dämpfen zu vermeiden. Bei den vernetzenden Aldehyden muss mit Pulvern und hochkonzentrierten Lösungen (Formaldehyd ist ein Gas) unter einem Abzug gearbeitet werden. Idealerweise wird auch die Fixierung mit verdünnten Aldehydlösungen oder mit Alkoholen unter einem Abzug durchgeführt, ansonsten in einem gut belüfteten Raum. Bei der Handhabung der Fixierlösungen müssen Handschuhe (Latex oder Nitril, bei Latex: Allergiegefahr) getragen werden. Zum besseren Arbeiten mit der giftigen Fixierlösung bietet es sich an, chemische Fixierungen von luftgetrockneten Ausstrichpräparaten mit Deckgläsern anstelle von Objektträgern durchzuführen, da dies die Handhabung während der

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Fixierungs- und Waschschritte vereinfacht. Chemische Fixierungen werden auch oft in der Bakteriensuspension (bzw. mit dem zentrifugierten und resuspendierten Pellet) durchgeführt, die erst im Nachhinein auf z. B. poly-l-Lysin-beschichtete Objektträger aufgebracht werden.

z Formaldehydfixierung

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Formaldehyd reagiert mit dem Stickstoff der Aminosäuren aus den Proteinen in der Probe und vernetzt diese durch die Umwandlung seiner Aldehydgruppe in eine Methylenbrücke. Dies führt zur Fixierung und Härtung der Probe. Es ist eines der am häufigsten verwendeten chemischen Fixantien in der Mikroskopie. Für die Fixierung geeignete 3-4-prozentige Formaldehydlösungen können aus der zehnfachen Verdünnung von gesättigten wässrigen mit Methanol stabilisierten Form­ aldehydlösungen (Formalin) oder direkt (ohne Methanolzusatz) aus dem als Pulver vorliegenden Polymer Paraformaldehyd (Polyoxymethylen) hergestellt werden. Para­ formaldehyd selbst ist kein Fixans, da hierfür in Wasser als Methylenhydrat gelöste Formaldehyd-Monomere benötigt werden. Dazu muss Paraformaldehyd in wässriger Lösung erhitzt werden. Die so entstehende Formaldehyd-Lösung wird manchmal irrtümlich als Paraformaldehyd-Lösung bezeichnet. i Benötigtes Material

5 Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, s. u.) 5 Paraformaldehyd 5 1 N NaOH 5 Verdünnte Salzsäure 5 Zucker 5 50 mM NH4CL in PBS Bei Immunfärbungen zusätzlich: 5 0,1 % Triton 5 1 % Rinderalbumin Phosphatgepufferte Salzlösung Bestandteil

Menge

Kochsalz

8 g

Kaliumchlorid

0,2 g

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)

1,44 g

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)

0,24 g

Aqua dest

800 ml

Zutaten in 800 ml Wasser lösen un pH mit Salzsäure auf 7,4 einstellen, dann mit Wasser auf ein Endvolumen von 1 l auffüllen

Herstellung einer 4 % Formaldehyd-Lösung aus Paraformaldehyd (in phosphatgepufferter Salzlösung, PBS) 5 800 ml PBS unter Rühren auf 60 °C erhitzen (nicht zum Kochen bringen). 5 40 g Paraformaldehyd-Pulver unter Rühren in den erhitzten Phosphatpuffer zugeben.

249 Lichtmikroskopische Methoden

5 Da das Pulver sich nicht direkt auflöst, muss der pH erhöht werden. Dazu unter Rühren tropfenweise 1 N NaOH zugeben, bis die Lösung klar wird. 5 Nach Auflösen des Paraformaldehyds Lösung abkühlen lassen und filtern. 5 Die Lösung mit 1X PBS auf 1000 ml auffüllen. 5 Mit verdünnter HCl-Lösung dem pH auf 6,9 einstellen. 5 Die Lösung kann in Aliquots unterteilt und bei -20 °C gelagert werden. ! Wegen der Giftigkeit von Formaldehyd muss unter einem Abzug und mit

Handschuhen gearbeitet werden.

Vorgehensweise Da Formaldehydfixierungen oft für anschließende Immunfluoreszenzfärbungen (z. B. von Makrophagen) oder andere Formen der Fluoreszenzfärbung (z. B. Phalloidinfärbung) verwendet werden, ist hier ein Protokoll angegeben, das dafür (auch in Verbindung mit fluoreszierenden Proteinen als bakterielle Zellmarkierungen) geeignet ist. 5 Kulturmedium vom Präparat (z. B. mit Zellen bewachsene Deckgläser in einer Kulturschale) entfernen und Präparat zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) waschen. 5 Präparat für 30 min mit einer 4 %-Formaldehyd und 4 %-Zucker-PBS-Lösung bei Raumtemperatur fixieren. 5 Präparat zweimal mit PBS waschen (jeweils 5 min). 5 Präparat für 15 min mit 50 mM NH4CL in PBS behandeln, um noch im Präparat vorhandene Aldehyd-Gruppen zu deaktivieren. 5 Präparat einmal mit PBS waschen (5 min). Die nachfolgenden Schritte sind für Immunfluoreszenzfärbungen relevant: 5 Präparat für 5 min mit 0,1 % Triton in PBS behandeln, um Zellen zu permeabilisieren. 5 Präparat zweimal mit PBS waschen (jeweils 5 min). 5 Präparat für 15 min mit 1 % Rinderalbumin in PBS behandeln, um unspezifische Bindungen bei einer Antikörperfärbung zu verhindern.

Nach der Behandlung mit Formaldehyd sind Bakterien und andere Mikroorganis­ men fixiert, aber je nach ihren Eigenschaften sind manche nicht direkt für weitere Behandlungsschritte zugänglich. Für die in-situ-Hybridisierung sind Gram-negative Bakterien nach der Formaldehyd-Fixierung direkt weiter verwendbar, während die Zell­ wand von Gram-positiven Bakterien mit enzymatischer Verdauung durch Lysozym wei­ ter behandelt werden muss, um die nächsten Schritte der Hybridisierung zu erlauben. Alternativ können für Gram-positive Bakterien andere Fixierungen verwendet werden (50 % Ethanol-Fixierung). Bei Mischungen von Gram-negativen und -positiven Bakte­ rien, z. B. in Biofilmen kann Formaldehyd-Fixierung mit einer nicht zu langen Lysozym­ behandlung kombiniert werden, die Gram-positive Bakterien zugänglich macht, ohne Gram-negative Bakterien zu stark zu schädigen.

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z Glutaraldehydfixierung

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Glutaraldehyd ist ein sehr effizienter und flexibler Brückenbildner, da es mit zwei Aldehydgruppen und den dazwischenliegenden drei Methylenbrücken viele Ver­ bindungen eingehen kann und in wässrigen Lösungen auch als Polymer (Polyglutaral­ dehyd) mit vielen Aldehydgruppen vorliegt und somit zelluläre Proteine über größere Distanzen vernetzen kann. Es eignet sich sehr gut für die Strukturerhaltung in der Elektronenmikroskopie, kann jedoch nicht gut aus der Probe entfernt werden, was bei Fluoreszenzfärbungen zu einem erhöhten Hintergrund durch Autofluoreszenz führen kann. Die weiterhin vorhandene Reaktivität der Aldehydgruppen muss vor weiteren Behandlungen deswegen blockiert werden, z. B. durch Zugabe von Glycin, das mit den noch vorhandenen Aldehydgruppen reagiert. z Methanolfixierung

Der Alkohol Methanol kann zur Ausfällungsfixierung verwendet werden. Wie auch andere chemische Fixierungen bewahrt die Methanolfixierung viele Strukturen (z. B. eukaryotische Zellen im Ausstrich) besser als die Hitzefixierung. Da manche Mikroorganismen (z. B. säurefeste Krankheitserreger wie Mycobacterium tuberculosis) durch Hitzefixierung nicht vollständig abgetötet werden, wird die Methanolfixierung oft für die anschließenden Färbungen säurefester Bakterien (7 Abschn. 5.6.2 Differenzialfärbungen) verwendet, wenn es sich um mögliche Krank­ heitserreger handelt. Methanolfixierung liefert bessere Ergebnisse bei der Gramfärbung (7 Abschn. 5.6.2 Differenzialfärbungen). i Benötigtes Material

5 Absolutes Methanol 5 Abfallbehälter für Methanol

Vorgehensweise 5 Das Ausstrichpräparat gut lufttrocknen. 5 Präparat für zwei Minuten mit absolutem Methanol überschichten oder in Methanol einbringen. 5 Nach der Behandlung überschüssiges Methanol in einen Abfallbehälter abkippen und Präparat gut trocknen lassen. ! Methanol ist giftig und das Einatmen (gute Belüftung des Arbeitsraums/Abzug)

sowie der Kontakt mit Augen oder Haut müssen vermieden werden. Bei Kontakt die betroffene Stelle mit reichlich Wasser abwaschen, Augen gründlich ausspülen.

5.5  Lebendfärbungen für die Durchlichtbetrachtung

In diesem Abschnitt sind Färbungen aufgeführt, die an lebenden Proben ausgeführt werden können, ohne dass diese vorher ausgestrichen und fixiert werden müs­ sen. Es bedeutet nicht, dass die Proben die Färbung überleben (z. B. Polysaccharid­ färbung, 7 Abschn. 5.5.4 Färbung von Speicherstoffen) und somit weiter für

251 Lichtmikroskopische Methoden

Lebendbeobachtungen verwendet werden können. Die Färbungen sind größtenteils auf schon existierende Deckglaspräparate anwendbar. 5.5.1  Tuschepräparat für den Kapselnachweis

Bakterienzellen können von einer als Kapsel bezeichneten Schleimhülle umgeben sein, die meist aus Polysacchariden besteht, aber in einigen Fällen auch aus Polypeptiden. Die Schleimhülle ist wasserhaltig und meist farblos und daher weder im Phasenkontrast (wegen ähnlichem Brechungsindex bildet sich keine Phasendifferenz) noch im Hellfeld erkennbar. Mittels Tusche als Kontrastmittel können kapselbildende Bakterien jedoch in Form einer Negativfärbung sichtbar gemacht werden. Bei einer Negativfärbung verteilt sich das dunkle Färbemittel im wässrigen Ein­ schlussmittel, dringt dabei aber nicht in die zu visualisierenden Strukturen (Zellen oder Schleimkapseln) ein, die dadurch als helle Aussparungen gegen einen dunkleren Hinter­ grund hervortreten. i Benötigtes Material

5 Deckglaspräparat (7 Abschn. 5.4.1) 5 Chinesische Tusche 5 Demineralisiertes Wasser 5 Filterpapier 5 Phasenkontrastmikroskop

Vorgehensweise Tuschefärbungen können sowohl während als auch nach der Erstellung eines Deckglaspräparats durchgeführt werden. 5 Chinesische Tusche mit demineralisiertem Wasser in einem Volumenverhältnis zwischen 1:1 und 1:4 verdünnen. 5 Für Färbungen während der Präparaterstellung einen kleinen Tropfen der verdünnten Tusche in der Mitte eines fettfreien Objektträgers aufbringen. 5 Tuschetropfen gut mit der Probe mischen. Bei einem schon bestehenden Deckglaspräparat wird folgendermaßen verfahren: 5 Einen kleinen Tropfen der verdünnten Tusche auf den Objektträger seitlich am Deckglasrand aufbringen. 5 Ein Stück Filterpapier an der gegenüberliegenden Seite des Deckglases mit einer Kante legen und so die Tusche unter dem Deckglas durch das Präparat saugen, bis überschüssige Flüssigkeit verschwunden ist und das Deckglas nicht aufschwimmt. Die Tusche verteilt sich dabei im Präparat. Während des Vorgangs besteht Kontaminationsgefahr, und das angefeuchtete Papier muss entsprechend der Vorgaben für den verwendeten Organismus entsorgt werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Tuschefärbung kann jetzt im Phasenkontrastmikroskop betrachtet werden, Bakterienkapseln treten als helle Höfe um die (im Phasenkontrast) dunklen Bakterien

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. Abb. 5.9  Tuschenegativfärbung von Azotobacter spec. Hierbei handelt es sich um stickstofffixierende Bodenbakterien mit pleomorpher Morphologie, die von dicken, nur schwach lichtbrechenden Schleimkapseln umgeben sind. Die Tuschepartikel können diese nicht durchdringen, strömen außen vorbei und machen so die Umrisse sichtbar. Im Zentrum der Schleimkapsel erkennbar die stärker lichtbrechenden Azotobacter-Zellen. (© Jürgen Lassak, München)

hervor. Für eine gute Negativfärbung sollte die Schichtdicke zwischen Deckglas und Objektträger gering sein, damit die hellen Aussparungen der Kapseln gut erkennbar sind (. Abb. 5.9). Vorgehensweise mit luftgetrocknetem Präparat Die Tuschefärbung kann auch als luftgetrocknetes Ausstrichpräparat (7 Abschn. 5.4.2) erstellt werden: 5 Tusche und Probentropfen mischen. 5 Mischung sehr dünn ausstreichen und trocknen (keine Hitzefixierung, da dies zur Schrumpfung der Bakterien und damit zu Kapselartefakten führen kann). 5 Die Zellen in luftgetrockneten Ausstrichpräparaten können auch mit einer Einfachfärbung (z. B. Kristallviolett, 7 Abschn. 5.6.1 Einfach-Färbungen) gegengefärbt werden.

Die Kapselbildung von Bakterien kann durch Kultivierung auf Magermilchagar gefördert werden. 5.5.2  Negativfärbungen

Die oben beschriebene Tuschefärbung und andere Negativfärbungen mit sauren Farb­ stoffen wie Kongorot, Eosin und Nigrosin eignen sich nicht nur zum Kapselnach­ weis, sondern können generell die Form von Bakterien durch Aussparung darstellen, da sie nicht an die negativ geladenen Strukturen der bakteriellen Zellwände binden.

253 Lichtmikroskopische Methoden

Als Aussparung können somit auch Bakterien sichtbar gemacht werden, die mit den häufig verwendeten Farbstoffen für Einfachfärbungen wie Methylenblau nicht gut dar­ stellbar sind. Dies ist z. B. für dünne Spirillen und Spirochäten der Fall. Der Syphil­ lis-Erreger Spirochaeta pallida ist sogar entsprechend seiner schlechten Anfärbbarkeit benannt worden (lat.: pallida = bleich). i Benötigtes Material

5 Probenmaterial 5 1 % Kongorot in Aqua dest. 5 Objektträger

Vorgehensweise 5 Probe in einem kleinen Tropfen Kongorot (bzw. Eosin oder Nigrosin) auf einem sauberen und fettfreien Objektträger einbringen und mischen. 5 Ausstrichpräparat (7 Abschn. 5.4.2) erstellen. Eine besonders dünne und gleichmäßige Verteilung gelingt hierbei durch das Ziehen des Tropfens mit einem zweiten Objektträger über den unten liegenden Objektträger. 5 Das Ausstrichpräparat gut lufttrocknen (keine Hitzefixierung, um die Form empfindlicher Bakterien nicht zu ändern!).

5.5.3  Vitalfärbung mit Methylenblau

Methylenblau kann zur Unterscheidung von lebenden und abgestorbenen Zellen (Bak­ terien aber auch Pilzen, z. B. Hefen) verwendet werden, da der Farbstoff in lebenden Zellen zu einer farblosen Form reduziert wird. Tote Zellen werden auf diese Weise blau angefärbt, während lebende Zellen weitgehend farblos bleiben. i Benötigtes Material

5 Deckglaspräparat 5 Löfflers alkalische Methylenblaulösung (Ziehl-Neelsen-Färbung, 7 Abschn. 5.6.2) 5 Filterpapier

Vorgehensweise Für die Färbung wird ein Deckglaspräparat (7 Abschn. 5.4.1) verwendet. 5 Einen kleinen Tropfen Löfflers alkalischer Methylenblaulösung auf den Objektträger seitlich am Deckglasrand aufbringen. 5 Ein Stück Filterpapier an der gegenüberliegenden Seite des Deckglases mit einer Kante anlegten und so die Methylenblaulösung unter dem Deckglas durch das Präparat saugen, bis überschüssige Flüssigkeit verschwunden ist und das Deckglas nicht aufschwimmt. Die Lösung verteilt sich dabei im Präparat. Während des Vorgangs besteht Kontaminationsgefahr, und das angefeuchtete Papier muss entsprechend der Vorgaben für den verwendeten Organismus entsorgt werden.

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z Versuchsergebnis/Auswertung

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Die Probe wird mit so weit geschlossener Kondensorblende im Hellfeld betrachtet, dass auch die ungefärbten lebenden Zellen erkannt werden können. Tote Zellen erscheinen blau. Das Aussehen der Färbung ist für tote Zellen somit identisch wie in . Abb. 5.11, einer fixierten Probe von Bacillus subtilis. Die Methode ist sehr einfach; tote Zellen mit einer enzymatischen Restaktivität sind aber schwer zu erkennen. In fixierten Ausstrichpräparaten kann Methylenblau auch zur Übersichtsfärbung aller Zellen (die nach der Fixerung tot und dem Farbstoff zugänglich sind) verwendet werden (7 Abschn. 5.6.1 Einfach-Färbungen). 5.5.4  Färbung von Speicherstoffen

Mikroorganismen lagern unter bestimmten Umweltbedingungen Speicherstoffe wie Polysaccharide und Fettsäuren ein. Auslöser ist häufig ein Überschuss einer Nahrungs­ quelle, während eine andere Komponente zur direkten Weiterverwendung fehlt und sich das Wachstum der Organismen deswegen abschwächt bzw. die Population in die statio­ näre Phase übergeht. Die Speicherung der vorhandenen Quelle ermöglicht eine schnelle Wiederaufnahme des Wachstums, sobald der limitierende Faktor wieder ausreichend zur Verfügung steht. Polysaccharide werden oft in Form von kleinen Körnchen (Granula) eingelagert, bei Fetten in Form von Tröpfchen oder Granula in der Zelle. Diese sind im Mikroskop sicht­ bar und können mittels stoffgruppenspezifischer Färbungen erkannt und unterschieden werden. 5.5.4.1  Polysaccharidfärbung

Mit einer Iod-Kaliumiodid-Lösung (Lugolsche Lösung, 7 Abschn. 1.1.1 und 2.1.2) können Polysaccharidgranula in lebenden Mikroorganismen angefärbt und in ihrer Zusammensetzung unterschieden werden. i Benötigtes Material

5 Deckglaspräparat 5 Lugolsche Lösung 5 Filterpapier Lugolsche Lösung Bestandteil

Menge

Kaliumiodid

2 g

Aqua dest

5 ml

Iod

1 g

Mit dest. Wasser auf 300 ml auffüllen

255 Lichtmikroskopische Methoden

Vorgehensweise Für die Färbung wird ein Deckglaspräparat (7 Abschn. 5.4.1) verwendet. 5 Ein kleiner Tropfen Lugolscher Lösung auf den Objektträger seitlich am Deckglasrand aufbringen. 5 Mit einem Stück Filterpapier, das an der gegenüberliegenden Seite des Deckglases mit einer Kante angelegt wird, wird die Lugolsche Lösung unter dem Deckglas durch das Präparat gesaugt, bis überschüssige Flüssigkeit verschwunden ist und das Deckglas nicht aufschwimmt. Die Lösung verteilt sich dabei im Präparat. Während des Vorgangs besteht Kontaminationsgefahr und das angefeuchtete Papier muss entsprechend der Vorgaben für den verwendeten Organismus entsorgt werden.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Probe wird mit weitgehend geöffneter Kondensorblende im Hellfeld betrachtet, um die Farbinformation der Polysaccharidgranula auszuwerten. Intrazelluläre Granula aus Stärke erscheinen blau bis blauschwarz, während Granulose blau- bis braunviolett und Glykogen rotbraun dargestellt werden. Die Betrachtung im Phasenkontrast ist wegen möglicher Farbinterferenzen und den zusätzlich generierten Helligkeitsunterschieden nicht möglich. Die Färbung mit Lugolscher Lösung tötet die Zellen in der Probe ab. 5.5.4.2  Lipidfärbung mit Sudanschwarz B

Aus Fetten bestehende Einschlüsse wie Tröpfchen oder Granula können mit dem lipo­ philen Farbstoff Sudanschwarz B von anderen Einschlusskörpern (z. B. Endosporen) unterschieden werden. i Benötigtes Material

5 Probenkultur 5 Sudanschwarz B 0,3 g mit 100 ml 70 % Ethanol kurz aufkochen und vor Gebrauch filtrieren 5 Objektträger 5 Deckglas 5 Uhrmacherpinzette

Vorgehensweise 5 Einen kleinen Tropfen Sudanschwarz B auf die Mitte eines sauberen und fettfreien Objektträgers aufbringen. 5 Mit einer abgeflammten und abgekühlten Impföse eine geringe Menge Zellmaterial in den Tropfen einbringen und gleichmäßig verteilen. 5 Ein trockenes und sauberes Deckglas vorsichtig mit einer Uhrmacherpinzette auflegen (Deckglasrand auf einer Seite des Tropfens absetzen und dann behutsam über den Tropfen legen). Während der Färbezeit von 15 min darf das Präparat nicht austrocknen. Falls nötig, einen Tropfen Färbeflüssigkeit am Deckglasrand platzieren, der mittels Kapillarkräften unter das Deckglas gezogen wird und so dem Austrocknen entgegenwirkt.

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z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Probe wird mit weitgehend geöffneter Kondensorblende im Hellfeld betrachtet. Fetttröpfchen und Granula erscheinen jetzt als tiefblau-schwarze Strukturen. Ähnliche Färbungen können auch mit anderen lipohilen Farbstoffen wie Sudan III und Kongorot durchgeführt werden. 5.6  Färbungen fixierter Proben für die Durchlichtbetrachtung

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i Benötigte Materialien für die Herstellung mikroskopischer Präparate

Für eine effiziente Durchführung der Probenherstellung und der Färbeschritte der in den weiteren Abschnitten beschriebenen Färbungen benötigt man einen dafür vorbereiteten Arbeitsplatz und folgende Instrumente und Gegenstände (. Abb. 5.10): 5 Färbebank: Sie gewährleistet sauberes Arbeiten bei der Erstellung von mikroskopischen Färbungen. Diese besteht aus einem Auffangbecken zum Sammeln überschüssiger Färbelösung bzw. des in den Waschschritten verwendeten Waschwassers und einem Gestell oder Auflagebalken zur Platzierung eines oder mehrerer Objektträger. 5 Färbeküvetten (alternativ zur Färbebank): Für Färbe- und Waschschritte können die Objektträger- bzw. Deckglaspräparate auch in flüssigkeitsgefüllte Küvetten eingebracht werden. Besonders wenn viele Präparate gleichzeitig durch die Färbungsschritte geführt werden, ist die Verwendung von Präparat-Sammelhaltern und Küvetten nützlich, jedoch werden große Volumina an Flüssigkeiten benötigt

. Abb. 5.10  Färbeutensilien für die Erstellung gefärbter mikroskopischer Präparate: 1 A + B: Färbeküvette mit herausnehmbarem Einsatz für Objektträger, 1 C: Färbeküvette mit integrierter Halterung für Objektträger, 2: Spritzflaschen, 3: Tropfflasche, 4: Cornet-Pinzette (mit Detailvergrößerung), 5 A: gekrümmte Uhrmacherpinzette, 5B: gerade Uhrmacherpinzette. (© Timo Zimmermann)

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und das Verbleiben abgelöster Zellen in der Küvette kann zur Kontamination und somit zur Verfälschung des Ergebnisses nachfolgender Proben führen. Spritzflasche: Für Waschschritte können Spritzflaschen mit demineralisiertem Wasser oder Alkohol über den Färbebänken oder anderen Sammelgefäßen verwendet werden. Tropfflaschen: Zum Aufbringen der Färbelösungen eignet sich die Verwendung von Tropfflaschen. Da die verwendeten Volumina für eine Färbung klein sind und um eine sichere Handhabung zu garantieren, sollten kleine Flaschengrößen (z. B. 100 ml) verwendet werden. Cornet-Pinzette: Deckgläser können zur Handhabung während Fixierungs- und Färbeschritten in selbsthaltende Cornet-Pinzetten eingespannt werden, da sie nicht auf einer Färbebank gehandhabt werden können. Uhrmacher-Pinzette: Zur Aufnahme und Handhabung von Deckgläsern und deren Ablage auf einem Objektträger eignen sich gerade oder gekrümmte Uhrmacherpinzetten.

z Generelle Färbeschritte

5 Während der Färbeschritte muss das Färbemittel die gesamte Fläche des Ausstrichs bedecken. 5 Bei den Waschschritten mit Spritzflaschen sollte kein allzu hoher Druck auf die Flasche ausgeübt werden, damit die Zellen nicht vom zu starken Wasserstrahl abgewaschen werden. 5 Die Präparate nach den Färbeschritten so lange waschen, bis sich keine Farbwolken mehr vom Präparat lösen. 5 Überschüssiges Waschwasser mit Papiertüchern oder Filterpapier von der Unterseite des Objektträgers entfernen, aber niemals die Seite mit dem Ausstrich abwischen. 5 Bei Auflegen eines Deckglases für die Mikroskopie bildet das noch auf der Probe befindliche Wasser einen Flüssigkeitsfilm, der zur Anheftung des Deckglases führt. 5 Bei Betrachtung ohne Deckglas das Präparat lufttrocknen lassen. z Tipps für die mikroskopische Betrachtung Die Entscheidung, gefärbte Präparate mit oder ohne Deckglas zu betrachten, sollte

nach folgenden Gesichtspunkten getroffen werden: Für Luftobjektive mit niedrigen Vergrößerungen und niedriger numerischer Aper­ tur (≤0,3) kann ohne Deckglas gearbeitet und ein luftgetrocknetes Präparat ohne merkliche Qualitätsverluste betrachtet werden. Bei höheren numerischen Aperturen von Luftobjektiven muss ein Deckglas verwendet werden, da die optischen Elemente der Objektive meist „Deckglas-korrigiert“, also auf das Arbeiten mit Deckgläsern abgestimmt sind. Die vorhandene Korrektur ist auf dem Objektiv vermerkt (siehe . Abb. 5.3). Bei der Arbeit mit Ölimmersionsobjektiven kann prinzipiell auf Deckgläser ver­ zichtet werden, da der Brechungsindex des Öls dem des Deckglases sehr ähnlich ist und die Abwesenheit des Deckglases deswegen nicht unbedingt auffällt. Viele der hier beschriebenen Färbungen vertragen den Kontakt mit dem Immersionsöl und können deswegen direkt betrachtet werden. Wegen des direkten Kontakts zwischen Objektivlinse und Probe muss in dem Fall jedoch das Objektiv nach jeder Benutzung gründlich gereinigt werden. Für hochwertige Immersionsobjektive, wie sie in der

5

258

T. Zimmermann

Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, sollte immer ein Deckglas verwendet wer­ den, da der direkte Kontakt mit den Färbungen zur permanenten Verschmutzung die­ ser hochvergüteten Linsenoberflächen führen würde, z. B. durch abgelöste Zellen oder Färbeniederschläge oder durch unvollständig ausgewaschene Färbe- oder Beizmittel. 5.6.1  Einfach-Färbungen

5

Einfach-Färbungen können auch als Übersichtsfärbungen bezeichnet werden, da sie einen ersten Eindruck von der Probe ermöglichen, sich aber keine tiefer gehenden Aus­ sagen treffen lassen, z. B. zur Unterscheidung verschiedener Bakterientypen. Dafür müs­ sen Differenzialfärbungen verwendet werden, wie im folgenden Abschnitt beschrieben. Der in den Übersichtsfärbungen verwendete Farbstoff kann mit verdünntem Alkohol wieder ausgewaschen werden. Bei der Färbung unbekannter Proben sollte immer ein Organismus mit bekann­ tem Färbeverhalten mitgefärbt werden, um den Erfolg und die Qualität des Färbevor­ gangs beurteilen zu können. Soweit möglich sollten hierfür harmlose Organismen mit geeigneten Eigenschaften verwendet werden, um sicheres Arbeiten zu gewährleisten. 5.6.1.1  Methylenblau

Methylenblaufärbungen (. Abb. 5.11) wurden schon unter den Lebendfärbungen erwähnt (7 Abschn. 5.5.3), da der Farbstoff in lebenden Zellen zu einer farblosen Form reduziert wird und sich auf diese Weise lebende und tote Zellen unterscheiden lassen. In einer fixierten Probe sind alle Zellen tot (enzymatisch nicht mehr aktiv) und können angefärbt werden. Methylenblau ist ein basischer Farbstoff, dessen positive Ladung an saure Komponenten der Probe bindet, z. B. die negativ geladene bakterielle Zellwand, Proteine im Cytoplasma und Nukleinsäuren.

. Abb. 5.11  Methylenblaufärbung einer hitzefixierten Probe von Bacillus subtilis. (© Jürgen Lassak)

259 Lichtmikroskopische Methoden

i Benötigtes Material

5 Ausstrichprobe 5 Löfflers alkalische Methylenblaulösung (7 Abschn. 5.6.2 Ziehl-Neelsen-Färbung) 5 Wasser

Vorgehensweise 5 Die fixierte Ausstrichprobe vollständig mit Löfflers alkalischer Methylenblaulösung bedecken. 5 Methylenblaulösung ca. 30 s einwirken lassen – der Probendicke angepasst (dünne Ausstriche kürzer, dicke Ausstriche länger). Eine Überfärbung ist unwahrscheinlich. 5 Die Färbelösung vom Präparat abgießen und das Präparat kurz mit Leitungswasser abspülen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Methylenblau färbt Bakterien blau, vorhandene Polyphosphatgranula violett, da sie metachromatisch sind und das Absorptionsspektrum des Farbstoffs ändern. Die Fär­ bung kann deswegen auch zur Sichtbarmachung von Phosphatgranula verwendet wer­ den, da diese in vielen Färbungen nicht deutlich dargestellt werden (7 Abschn. 5.6.3). Nicht alle Bakterien lassen sich gut mit Methylenblau bzw. ähnlichen basischen Farbstoffen anfärben, z. B. dünne Spirillen und Spirochäten. In solchen Fällen können saure Farbstoffe wie Kongorot für eine Negativfärbung der Zellumrisse verwendet wer­ den (7 Abschn. 5.5.2). 5.6.1.2  Kristallviolettfärbung

Im Gegensatz zur Methylenblaufärbung eignet sich die Kristallviolettfärbung zur Sicht­ barmachung schlecht anfärbbarer Bakterien. Es kann dabei jedoch zu Überfärbungen kommen und (in Gegenwart von Proteinen) zur Ausfällung des Farbstoffes. i Benötigtes Material

5 Ausstrichprobe 5 Kristallviolettlösung Komponente A 5 Kristallviolettlösung Komponente B Kristallviolettlösung Kristallviolettlösung Komponente A Bestandteil

Menge

Ammoniumoxalat

0,8 g

Aqua dest

80 ml

Kristallviolettlösung Komponente B Bestandteil

Menge

Kristallviolett

2 g

96 % Ethanol

20 ml

5

260

T. Zimmermann

Vorgehensweise 5 Kristallviolettlösung Komponente A und B mischen. 5 Die fixierte Ausstrichprobe vollständig mit dem Lösungsgemisch bedecken. 5 Lösungsgemisch ca. 10 s einwirken lassen, angepasst an die Probendicke (dünne Ausstriche kürzer, dicke Ausstriche länger). Die Färbemethode neigt zur Überfärbung. 5 Die Färbelösung abgießen und das Präparat kurz mit Leitungswasser abspülen.

5

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Zellen zeigen eine kräftige blauviolette Färbung. 5.6.1.3  Karbolfuchsinfärbung

Die Karbolfuchsinfärbung ist eine kräftige rote Färbung mit einer Mischung aus Phenol (Karbolsäure) und basischem Fuchsin, bei der es jedoch leicht zu Über­ färbungen kommt. Karbolfuchsin wird auch bei der Färbung von säurefesten Bakterien (7 Abschn. 2.1.2 Differenzialfärbungen) und teilweise bei der Gramfärbung (7 Abschn. 2.1.2 und 5.6.2) verwendet, da es lipidlöslich ist und die wachsartige Zell­ wand durchdringt. Aufgrund dieser Eigenschaften eignet es sich zum Anfärben von Bakterien, die andere Farbstoffe nur schlecht aufnehmen. Deshalb wird es trotz seiner Giftigkeit in diesen Fällen anderen Färbereagenzien vorgezogen. Für die Färbung wird im Gegensatz zur Säurefestigkeitsfärbung (7 Abschn. 5.6.2 Ziehl-Neelsen-Färbung) ver­ dünnte Karbolfuchsinlösung verwendet. i Benötigtes Material

5 Ausstrichprobe 5 Karbolfuchsinlösung (7 Abschn. 5.6.2 Ziehl-Neelsen-Färbung) 5 Demineralisiertes Wasser

Vorgehensweise 5 Karbolfuchsinlösung 1:10 (v/v) mit demineralisiertem Wasser verdünnen bzw. kommerziell erhältliche Gebrauchslösung verwenden. 5 Die fixierte Ausstrichprobe vollständig mit verdünnter Karbolfuchsinlösung oder mit der Gebrauchslösung bedecken. 5 Karbolfuchsinlösung ca. 1 min einwirken lassen, angepasst an die Probendicke (dünne Ausstriche kürzer, dicke Ausstriche länger). Die Färbemethode neigt zur Überfärbung. 5 Die Färbelösung abgießen und das Präparat kurz mit Leitungswasser abspülen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Zellen zeigen eine starke rote Färbung.

261 Lichtmikroskopische Methoden

! Fuchsin gilt als potenziell krebserregend und darf deswegen nicht mit der Haut

in Berührung kommen oder bei der Herstellung der Stammlösungen eingeatmet werden. Phenol ist beim Einatmen und bei Berührung mit der Haut giftig und führt aufgrund seiner Säureeigenschaften zu Verätzungen.

5.6.2  Differenzialfärbungen

Im Gegensatz zu den oben beschrieben Einfach-Färbungen sind Differenzialfärbungen Mehrfach-Färbungen, bei denen mindestens zwei verschiedene Farbstoffe verwendet werden. Dabei wird nach einem ersten Färbeschritt die Probe mit einem Lösungsmittel oder einer Säure teilweise entfärbt, was je nach den Zellwand-Eigenschaften der in der Probe enthaltenen Bakterien zu einer Entfärbung oder einer Beibehaltung der Färbung führt, die diese unterscheidbar macht (Differenzierung). Um auch die entfärbten Bak­ terien erfassen zu können, werden diese in einem zweiten Färbeschritt angefärbt, sodass beide Eigenschaftstypen anhand unterschiedlicher Färbungen erkennbar sind. Bei Differenzialfärbungen sind Kontrollfärbungen mit Organismenstämmen mit klar bekannten Färbeeigenschaften (für beide möglichen Färbeergebnisse der Differen­ zierung!) sehr wichtig, um die Qualität und die Verlässlichkeit der Färbung zu verstehen und somit das Ergebnis beurteilen zu können. 5.6.2.1  Gram-Färbung

Die wichtigste Differenzialfärbung der Bakteriendiagnostik ist nach ihrem Entdecker, dem dänischen Pathologen und Pharmakologen Hans Christian Gram benannt. Mit­ tels der Gramfärbung können Bakterien in Gram-positive und Gram-negative Bakterien unterschieden werden, die sich bezüglich des Aufbaus ihrer Zellwand, ihrer Pathogeni­ tät und ihrer Empfindlichkeit gegen Anitbiotika unterscheiden (s. 7 Abschn. 2.1.2). Gram-positive Bakterien besitzen eine Zellwand aus bis zu 40 Peptidoglykanschichten. Bei Gram-negativen Bakterien ist die Peptidoglykanschicht viel dünner, die Zellen besitzen aber eine zusätzliche äußere Membran mit Lipopolysacchariden (Lypoglyka­ nen). Dieser unterschiedliche Aufbau der Zellwand führt zu dem bei der Gramfärbung beobachteten Färbeverhalten der beiden Bakterientypen. Der erste Schritt der Färbung ist dabei die Behandlung mit Kristallviolett, einem positiv geladenen Anilinfarbstoff, der mit der jodhaltigen Lugolschen Lösung nach­ behandelt wird und in einem Farbstoff-Iod-Komplex ausfällt. Bei Gram-positiven Bakterien wird dieser Komplex in der Zellwand sehr stabil zurückgehalten und beim Differenzierungsschritt mit dem Lösungsmittel Ethanol nicht wieder ausgewaschen, während Gram-negative Bakterien dabei entfärbt werden. Um die entfärbten Gram-ne­ gativen Bakterien sichtbar zu machen, wird eine Gegenfärbung angeschlossen (Safraninoder verdünnte Karbolfuchsinfärbung). Das detaillierte Protokoll für die Gram-Färbung findet sich in 7 Abschn. 2.1.2. Aufgrund des oben beschriebenen Färbemechanismus (zurückgehaltener FarbstoffIod-Komplex in der Zellwand) in dieser Differenzialfärbung müssen grundsätzlich Pro­ ben mit intakter Zellwand verwendet werden. Gram-positive Bakterien können in älteren Kulturen Gram-variabel oder Gramnegativ erscheinen, deswegen sollten nur jüngere, im Wachstum befindliche Kulturen für die Färbung benutzt werden. So werden bei Staphylococcus aureus-Kulturen unter­ schiedlichen Alters große Unterschiede beobachtet: 24 h alte Kulturen sind durchgehend

5

262

5

T. Zimmermann

Gram-positiv, bei 48 bzw. 72 h alten Kulturen gibt es einen immer höheren Anteil an Gram-negativ erscheinenden Zellen. Bei Gram-negativen Bakterien kann bei älteren Kulturen die Qualität der Gegenfärbung abnehmen. Als Vergleichsorganismen für die Kontrollfärbung können bei der Gramfärbung z. B. Bacillus subtilis für die Gram-positiven und Escherichia coli für die Gram-negativen Kontrollgruppen verwendet werden (. Abb. 5.12). Bei der Auswertung der Färbung sollten dichtere Zellanhäufungen nicht berücksichtigt werden, da es während der Differenzierung unter Umständen nicht zu einer vollständigen Entfernung des Farbstoff-Iod-Komplexes aus den Strukturen kommt und solche Anhäufungen fälschlicherweise als Gram-positiv erfasst werden können. Bei einer zu starken Entfärbung während der Differenzierung mit Ethanol oder Ace­ ton können Gram-positive Bakterien als Gram-negativ erscheinen. Ein falsches Gram-negatives Erscheinungsbild entsteht auch dann, wenn die Zell­ wände in der Probe beschädigt sind, weil dort der Farbstoff-Iod-Komplex während des Differenzierungsschritts nicht zurückgehalten werden kann. Zellwandbeschädigungen können entstehen, wenn ein nicht ausreichend getrocknetes Präparat hitzefixiert wird (7 Abschn. 5.4.2) oder wenn es in der Probe zur Autolyse der Zellen kommt. Die Zell­ wände von anaeroben Bakterien können durch den Kontakt mit Luft auch entfärben, obwohl die Bakterien Gram-positiv wären. Mit solchen Bakterien sollte in einer Anaerobenkammer mit einer sauerstofffreien Atmosphäre gearbeitet werden. Unter Gram-positiven Bakterien gibt es auch solche, die sich Gram-variabel (Gram-labil) verhalten und deren Färbeverhalten sich während des Kulturwachstums aufgrund ihrer schwächer ausgeprägten Zellwandeigenschaften mehr und mehr zu einer negativen Färbung umwandelt. Als Alternative zur sehr einfach durchzuführenden Hitzefixierung scheint die Methanolfixierung (7 Abschn. 5.4.2) teilweise eine bessere Färbung zu liefern. Dies könnte an einer besseren Erhaltung der Zellwand von Gram-positiven Bakterien liegen.

. Abb. 5.12  Gram-Färbung einer Mischung von Bacillus subtilis und Escherichia coli. Die Gram-positiven B. subtilis-Zellen erscheinen violett. Die Gram-negativen E. coli-Zellen wurden mit Safranin gegengefärbt und erscheinen dadurch hellrot. (© Jürgen Lassak, München)

263 Lichtmikroskopische Methoden

5.6.2.2  Ziehl-Neelsen-Färbung

Mykobakterien und einige verwandte Bakteriengattungen (z. B. Nocardia) können einen einmal aufgenommenen Farbstoff trotz einer Behandlung mit Säure behalten. Diese durch die lipidreiche, wachsartige Zelloberfläche dieser Bakterien bedingte Eigenschaft wird als Säurefestigkeit bezeichnet. Da Mycobacterium tuberculosis (bzw. in vielen Landern auch M. leprae) ein Krank­ heitserreger von globaler Wichtigkeit ist, stellt die Färbung säurefester Stäbchen eine für die klinische Diagnostik wichtige Anwendung dar, da sie es erlaubt, Mykobakterien schnell von den meisten anderen Bakterien zu unterscheiden. Obwohl sie zu den Gram-positiven Bakterien gehören, ist die Gramfärbung aufgrund ihrer Zellwandeigen­ schaften nicht schlüssig auf sie anwendbar. Auch wenn das Zurückhalten von Farbstoffen unter Säurebehandlung durch ihre Zellwand ein nützliches Differenzierungsmerkmal für Mykobakterien ist, erschwert es ebenso ihre vorherige Anfärbung, also das Einbringen des Farbstoffs in die Zelle. Robert Koch entwickelte 1882 das erste Verfahren zur Anfärbung von Tuberkulose-Bakterien, und Paul Ehrlich entdeckte im selben Jahr das Phänomen der Säurefestigkeit. Aufbauend auf der Verwendung von Phenol im Färbeschritt durch Franz Ziehl entwickelte Friedrich Neelsen kurze Zeit später ein Färbegemisch aus Phenol und Fuchsin (Karbolfuchsin, 7 Abschn. 5.6.1 Karbolfuchsinfärbung), das sich besser zur Färbung von Mykobakterien eignete. Der Ansatz wurde durch das von Eduard von Rindfleisch entwickelte Erhitzen des Objektträgers während der Färbung abgerundet. Säurefestigkeit ist auch eine Eigenschaft der Oocysten einiger Protozoen, daher wer­ den diese und ähnliche Färbungen auch bei der Diagnose pathogener Protozoen ver­ wendet. Als Vergleichsorganismen für die Kontrollfärbung können bei der Ziehl-Neel­ sen-Färbung Mycobacterium phlei als Beispiel für säurefeste Bakterien und z. B. E. coli oder Corynebacterium glutamicum für die nicht säurefeste Kontrollgruppe verwendet werden (. Abb. 5.13). i Benötigtes Material

5 Bunsenbrenner 5 Schutzbrille 5 Abzug 5 Karbolfuchsinlösung 5 Salzsäure-Ethanol-Gemisch 5 Löfflers alkalische Methylenblaulösung Karbolfuchsinlösung Karbolfuchsinlösung Komponente A Bestandteil

Menge

Basisches Fuchsin

1 g

95 % Ethanol

10 ml

5

264

T. Zimmermann

5

. Abb. 5.13  Ziehl-Neelsen-Färbung einer Mischung der beiden Actinobakterien Mycobacterium phlei und Corynebacterium glutamicum. Säurefeste M. phlei-Zellen erscheinen fuchsinrot, während die nicht säurefesten C. glutamicum-Zellen aufgrund der Methylenblau-Gegenfärbung hellblau dargestellt werden. (© Jürgen Lassak, München) Karbolfuchsinlösung Komponente B Bestandteil

Menge

Phenolkristalle

5 g

Aqua dest

100 ml

Phenolkristalle leicht erwärmen (Verflüssigung), in Aqua dest. lösen

Beide Lösungen mischen Salzsäure-Ethanol-Gemisch Bestandteil

Menge

25 % Salzsäure

4 ml

70 % Ethanol

96 ml

Löfflers alkalische Methylenblaulösung Löfflers alkalische Methylenblaulösung Komponente A Bestandteil

Menge

Methylenblau

0,5 g

95 % Ethanol

30 ml

Löfflers alkalische Methylenblaulösung Komponente B Bestandteil

Menge

0,01 % Kalilauge (KOH)

100 ml

Lösung A unter Rühren zu Lösung B geben

265 Lichtmikroskopische Methoden

Vorgehensweise 5 Das fixierte Präparat mit (unverdünnter) Karbolfuchsinlösung bis zum Rand des Trägers bedecken. Eine vollständige Bedeckung des zu erhitzenden Bereichs ist wichtig, um ein Zerspringen des Objektträgers (oder Deckglases) während der nachfolgenden Hitzebehandlung zu vermeiden. 5 Träger vorsichtig dreimal durch die schwach leuchtende Flamme eines Bunsenbrenners ziehen, bis es zur Dampfbildung kommt, die Lösung aber nicht siedet. Präparat zwischendurch immer abkühlen lassen (Warnhinweis unten beachten!). Die Lösung darf während des Vorgangs nicht eintrocknen. Verdampfte Flüssigkeit wird mit frischer Färbelösung ersetzt. Gesamtfärbedauer 5 min. 5 Farbstofflösung abgießen und mit Wasser gründlich spülen, bis keine Farbe mehr abläuft. 5 Für die Differenzierung das Salzsäure-Ethanol-Gemisch gleichmäßig über das schräg gehaltene Präparat laufen lassen, bis keine Farbreste mehr in der abtropfenden Flüssigkeit sichtbar sind und das Ausstrichpräparat blassrosa erscheint. Differenzierungsdauer: 2–3 min. Diesen Schritt am besten vor einem weißen Hintergrund durchführen, um die Vollständigkeit der Entfärbung besser überprüfen zu können. 5 Gründlich mit Wasser spülen. 5 Gegenfärbung mit alkalischer Methylenblaulösung. Färbedauer ca. 1 min. 5 Färbelösung abgießen und gründlich mit Wasser spülen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach der Färbung erscheinen säurefeste Stäbchen fuchsinrot, während andere Bakte­ rien und anderes Material hellblau erscheinen. Die Säurefestigkeit von Bakterien wird durch das Alter der verwendeten Kulturen und die verwendeten Nährstoffe beeinflusst und kann verschieden stark ausgeprägt sein und z. B. in älteren Kulturen signifikant abnehmen, was bei der Auswertung die­ ser Färbung und bei der Herstellung der Positivkontrolle beachtet werden muss. Die Färbung unterscheidet nicht zwischen Tuberkulose-Bakterien und anderen säurefesten Mykobakterien bzw. verwandten Gattungen, die nicht pathogen sind. Ebenso kann nicht zwischen lebenden und toten Bakterien in der Probe unterschieden werden. Mögliche Zerstörungen der Zellwände in der Probenhandhabung (z. B. während der Hitzefixierung von noch feuchten Prärparaten) führen zu einem Verlust der Säure­ festigkeit. ! Für die Hitzebehandlung während der Färbung eine Schutzbrille tragen

(Glasbruchgefahr durch Zerspringen). Wegen der giftigen Phenoldämpfe unter dem Abzug arbeiten, um das Einatmen von Dämpfen zu verhindern. Wegen der möglichen klinischen Relevanz von in der Probe nachgewiesenen säurefesten Stäbchen sollte eine Verschleppung solcher Bakterien in andere Präparate z. B. durch die gemeinsame Nutzung von Färbeküvetten vermieden werden.

5

266

T. Zimmermann

Aufgrund ihrer robusten Zellwand können säurefeste Bakterien sowohl die Fixierung als auch die nachfolgenden Färbeschritte überleben. Es sollte daher so gearbeitet werden, dass Kontaminationen vermieden werden.

5.6.2.3  Kinyoun-Färbung

5

Eine Alternative zur Ziehl-Neelsen-Färbung von säurefesten Stäbchen ist die Kinyoun-Färbung, bei der kein Erhitzungsschritt nötig ist (Kaltfärbung). Das Entstehen giftiger Phenoldämpfe wird dabei vermieden; es wird aber mit höheren Konzentrationen von basischem Fuchsin und Phenol gearbeitet. Als Vergleichsorganismen für die Kontrollfärbung können bei der Kinyoun-Färbung Mycobacterium phlei als Beispiel für säurefeste Bakterien und z. B. E. coli für die nicht säurefeste Kontrollgruppe verwendet werden. i Benötigtes Material

5 Kinyoun-Lösung 5 Salzsäure-Ethanol-Gemisch 5 Löfflers alkalische Methylenblaulösung (7 Abschn. 5.6.2 Ziehl-Neelsen-Färbung) Kinyouns Karbolfuchsinlösung Kinyouns Karbolfuchsinlösung Komponente A Bestandteil

Menge

Basisches Fuchsin

4 g

95 % Ethanol

20 ml

Kinyouns Karbolfuchsinlösung Komponente B Bestandteil

Menge

Phenolkristalle

8 g

Aqua dest

100 ml

Phenolkristalle leicht erwärmen (Verflüssigung), in Aqua dest. lösen Beide Lösungen mischen. Salzsäure-Ethanol-Gemisch Bestandteil

Menge

Konz. Salzsäure

3 ml

95 % Ethanol

97 ml

Alternative Färbelösungen:

267 Lichtmikroskopische Methoden

Gabbetts Methylenblaulösung Bestandteil

Menge

Methylenblau

1 g

Methanol

25 ml

Aqua dest.

50 ml

Schwefelsäure

25 ml

Malachitgrünlösung Bestandteil

Menge

Malachitgrün

3 g

Aqua demin.

100 ml

Vorgehensweise 5 Das fixierte Präparat mit Kinyoun-Lösung bedecken. Färbedauer 3–5 min. 5 Farbstofflösung abgießen und mit Wasser gründlich spülen, bis keine Farbe mehr abläuft. 5 Für die Differenzierung das Salzsäure-Ethanol-Gemisch gleichmäßig über das schräg gehaltene Präparat laufen lassen, bis keine Farbreste mehr in der abtropfenden Flüssigkeit sichtbar sind und das Ausstrichpräparat blassrosa erscheint. Differenzierungsdauer: 2–3 min. Dieser Schritt am besten vor einem weißen Hintergrund durchführen, um die Vollständigkeit der Entfärbung besser überprüfen zu können. 5 Mit Wasser spülen und Differenzierungsschritt wiederholen. 5 Gründlich mit Wasser spülen. 5 Gegenfärbung mit Löfflers alkalischer Methylenblaulösung. Färbedauer ca. 2–3 min. 5 Färbelösung abgießen und gründlich mit Wasser spülen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach der Färbung erscheinen säurefeste Stäbchen fuchsinrot, während andere Bakte­ rien und anderes Material hellblau erscheinen. Es gibt viele verschiedene Kaltfärbungsvarianten, die verwendet werden können: 5 Differenzierung mit 1 % Schwefelsäure anstelle des Salzsäure-Ethanolgemischs. Ein­ wirkungsdauer 2 min. 5 Kombinierte Differenzierung mit Gegenfärbung in Gabbetts Methylenblaulösung. In diesem Fall 2 min einwirken lassen; die Gegenfärbung entfällt. 5 Gegenfärbung mit 3 % Malachitgrünlösung anstelle von Methylenblau. Des Weiteren gelten die Hinweise, die für die Ziehl-Neelsen-Färbung (7 Abschn. 5.6.2 Differenzialfärbungen) aufgeführt sind.

5

268

T. Zimmermann

5.6.3  Strukturfärbungen

Strukturfärbungen erlauben es, spezielle Merkmale von Bakterien im Lichtmikro­ skop sichtbar zu machen und sie so von anderen Bakterientypen oder ähnlichen intra­ zellulären Strukturen zu unterscheiden. 5.6.3.1  Endosporenfärbung nach Wirtz

5

Einige Gram-positive Bakteriengattungen können beim Eintritt ungünstiger Umwelt­ bedingungen aus der sich teilenden vegetativen Normalform in Dauerformen über­ gehen, mit reduziertem Stoffwechsel und Resistenz gegen äußere Einflüsse. Die dabei gebildeten Endosporen können anhand ihrer Position in der Mutterzelle und ihrer Form dazu verwendet werden, die vorliegenden Bakterien genauer zu bestimmen. Reife Endosporen können im Präparat mittels Phasenkontrastmikroskopie dar­ gestellt werden, wo sie als helle Körper erscheinen und gut von den vegetativen Zellen in der Probe unterschieden werden können. Aufgrund ihrer resistenten Eigenschaften sind Endosporen für viele Zellfärbungen nicht zugänglich und erscheinen als helle Aussparungen in den gefärbten Mutterzellen. Da es jedoch auch andere intrazelluläre Strukturen gibt, von denen sie so nicht unterschieden werden können, kann es hilfreich sein, Endosporen spezifisch anzufärben und sie damit nachzuweisen. Das hierbei ver­ wendete Prinzip ähnelt dem Nachweis von Säurefestigkeit (7 Abschn. 5.6.2 Differenzial­ färbungen), da auch hier eine spezielle Hitzebehandlung die Sporen anfärbbar macht und der so eingebrachte Farbstoff anders als bei den vegetativen Zellen im Waschschritt zurückgehalten wird. Das hierfür verwendete Malachitgrün ist ein leicht auswaschbarer Farbstoff, der eine schnelle Entfärbung der (hitzebehandelten) vegetativen Zellen erlaubt. Als Färbekontrolle können ältere Kulturen von Bacillus subtilis verwendet werden. i Benötigtes Material

5 Kochendes Wasserbad 5 Malachitgrünlösung 5 Safraninlösung Malachitgrünlösung Bestandteil

Menge

Malachitgrün

5 g

Aqua demin.

100 ml

Safraninlösung Bestandteil

Menge

Safranin O

0,5 g

Aqua demin.

100 ml

269 Lichtmikroskopische Methoden

Vorgehensweise 5 Die fixierte Ausstrichprobe auf ein kochendes Wasserbad aufbringen und mit 5 % Malachitgrünlösung bedecken. 5 Das Präparat über dem dampfenden Wasserbad belassen. Färbedauer: 5 min, Färbelösung wird im Falle eines Austrocknens nachgegeben. 5 Das Präparat vom Wasserbad nehmen und solange mit Wasser waschen, bis sich kein Farbstoff mehr löst. 5 Für die Gegenfärbung das Präparat für eine Minute mit Safraninlösung bedecken. 5 Färbelösung abgießen und gründlich mit Wasser spülen

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach der Färbung erscheinen Endosporen grün, da sie die Primärfärbung Malachit­ grün zurückgehalten haben. Vegetative Zellen und umgebende Mutterzellen der Endo­ sporen erscheinen rosa, da sie mit Safranin angefärbt wurden. Aufgrund der Ähnlichkeit der Behandlung werden säurefeste Bakterien bei dieser Färbung als Ganzes angefärbt und sollten nicht mit Endosporen verwechselt werden. Die Hitzebehandlung mit Malachitgrün kann alternativ auch über einer schwachen Bunsenbrennerflamme durchgeführt werden. In dem Fall ist die Färbedauer auf ca. 1 min verkürzt, und die Färbelösung wird vorsichtig bis zur Blasenbildung erhitzt. Aufgrund ihrer Resistenz gegen Umwelteinflüsse können Endosporen sowohl die Fixierung als auch die Hitzebehandlung und Färbung überleben. Beim weiteren Arbei­ ten mit dem Präparat muss darauf geachtet werden, dass es zu keinen Kontaminatio­ nen kommt. Es existieren verschiedene Färbeansätze für die Endosporenfärbung (z. B. Erhitzen mit Karbolfuchsin nach Dorner) und kalte Varianten dieser Färbungen, bei denen längere Färbezeiten die Hitzebehandlung ersetzen sollen, die aber nicht standardisierbar sind. Der hier gezeigte Ansatz ist eine Sporenfärbung nach Wirtz und stellt eine Variante der am häufigsten eingesetzten Färbung nach Schäffer und Fulton dar, wobei eine zehnfach höhere Konzentration an Malachitgrün verwendet wird. 5.6.3.2  Polyphosphatgranula-Färbungen

Polyphosphatgranula sind intrazelluläre Strukturen, die zur Speicherung von anorganischem Polyphosphat dienen. Sie kommen in verschiedenen Mikroorganis­ mengruppen wie Bakterien, Pilzen und Algen vor. Anfangs wurden sie (auch von Max Neisser selbst) fälschlich als sporenartige Strukturen beschrieben. Ihre Bildung ist oft eine Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen wie Stressantworten und den Übergang in bzw. die Anpassung an die stationäre Phase des Wachstums. Der Mangel an essenziellen Nährstoffen bei gleichzeitigem Vorhandensein von Phosphaten und einer Energiequelle ermöglicht die Bildung von Phosphatspeicherstrukturen. In manchen Bakterien kommt es dabei zur Bildung von charakteristischen Polkörperchen (Volutin­ granula, Babes-Ernst-Körperchen), die für die medizinische Diagnostik relevant sein kön­ nen, da sie u. a. beim Diphterie-Erreger Corynebacterium diptheriae vorkommen. Diese Polyphosphatgranula werden auch als metachromatische Granula bezeichnet, da es bei vielen der verwendeten Färbungen zu einer Verschiebung des Absorptionsspektrums des gebundenen Farbstoffs zu kürzeren Wellenlängen kommt (Metachromasie). Die dicht angeordneten anionischen Phosphatgruppen in den Granula wirken hierbei

5

270

T. Zimmermann

als Chromotrope, da sie zu dichten (polymeren) Farbstoffaggregationen führen und dadurch das Absorptionsverhalten von alkalischen Farbstoffen (z. B. Methylenblau oder Toluidinblau) relativ zu ihrer monomeren Form ändern. Als Färbekontrolle kann Corynebacterium flavescens verwendet werden, mit reichlich Phosphatzusatz kultiviert. Der Wert in der klinischen Diagnostik von Corynebacterium diphteriae liegt jedoch darin, dass viele Corynebakterienarten nicht solche Granula bil­ den, worauf bei der Wahl des Vergleichsorganismus geachtet werden muss. 5.6.3.3  Methylenblaufärbung

5

Die in 7 Abschn. 5.6.1 beschriebene Methylenblaufärbung eignet sich aufgrund der metachromatischen (farbverändernden) Eigenschaften der Polyphosphatgranula zur Detektion solcher Strukturen in Bakterien, die dieser Färbung zugänglich sind. Es gilt zu beachten, dass dies nicht für alle Bakterien der Fall ist. Methylenblau färbt Bakterien blau, vorhandene Polyphosphatgranula werden auf­ grund des metachromatischen Effekts violett angefärbt. Anstelle von Methylenblau kann auch 1 % Toluidinblaulösung verwendet werden. 5.6.3.4  Toluidin-Malachitgrün-Färbung nach Albert (modifiziert

nach Layburn)

Henry Albert entwickelte mehrere ähnliche Protokolle zur Detektion von Polyphpos­ phatgranula in Diphterieerregern. Eine häufig verwendete Variante ist eine Kombina­ tion von Toluidinblau und Malachitgrün, das das ursprünglich verwendete Methylgrün ersetzte. i Benötigtes Material

5 Toluidin-Malachitgrün-Lösung 5 Alberts Jodlösung Toluidin-Malachitgrün-Lösung Bestandteil

Menge

Toluidinblau

0,15 g

Malachitgrün

0,2 g

Eisessig

1 ml

95 % Ethanol

2 ml

Farbstoffe in Alkohol lösen und zu einer Aqua dest./Eisessiglösung geben, mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen Alberts Jodlösung Bestandteil

Menge

Kaliumjodid

3 g

Aqua dest

10 ml

Iod

2 g

Kaliumjodid in 10 ml Aqua dest. lösen, Jod zugeben und mit dest. Wasser auf 300 ml auffüllen

271 Lichtmikroskopische Methoden

Vorgehensweise 5 Fixiertes Präparat mit Toluidinblau-Malachitgrün-Lösung bedecken. Färbedauer: 5 min 5 Färbelösung abgießen, Lösungsreste mit Alberts Jodlösung abwaschen. 5 Für die Nachfärbung Präparat mit Alberts Iodlösung bedecken. Färbedauer: 2 min. 5 Iodlösung abgießen, nicht waschen. 5 Färbelösung abgießen und Präparat trocknen

z Versuchsergebnis/Auswertung

Polyphosphatgranula erscheinen blauschwarz; Zellkörper sind grün angefärbt. Da Malachitgrün leicht auswäscht, wird auf das Waschen mit Wasser verzichtet. Anstelle von Alberts Jodlösung kann auch die fast identische Lugolsche Lösung verwendet werden. In dem Fall u. U. die Nachfärbedauer etwas verkürzen. 5.6.3.5  Neisser-Färbung

Die Neisser-Färbung wurde Ende des 19. Jahrhunderts vom deutschen Bakteriologen Max Neisser entwickelt. Das hier verwendete Protokoll basiert auf einer Modifikation des deutschen Bakteriologen Heinrich Gins, das eine Nachfärbung mit einer modi­ fizierten Lugolschen Jodlösung beinhaltet. i Benötigtes Material

5 Essigsaure Methylenblaulösung 5 Kristallviolettlösung 5 Modifizierte Lugolsche Lösung 5 Chrysoidinlösung Neisser I: Essigsaure Methylenblaulösung Bestandteil

Menge

Methylenblau

0,1 g

Eisessig

5 ml

96 % Ethanol

5 ml

Aqua dest.

100 ml

Neisser II: Kristallviolettlösung Bestandteil

Menge

10 % Kristallviolett in 96 % Ethanol

3,3 ml

96 % Ethanol

6,7 ml

Aqua dest.

100 ml

Neisser I und Neisser II vor der Färbung im Verhältnis 2:1 mischen

5

272

T. Zimmermann

Modifizierte Lugolsche Lösung Bestandteil

Menge

Lugolsche Lösung (7 Abschn. 5.5.4 Polysaccharidfärbung)

100 ml

90 % Milchsäure

0,9 ml

Neisser III: Chrysoidinlösung

5

Bestandteil

Menge

Chrysoidin G

0,4 g

Aqua dest.

100 ml

Vorgehensweise 5 Fixiertes Präparat mit einer frisch angerichteten Mischung von essigsaurem Methylenblau und Kristallviolettlösung bedecken. Färbedauer: 30 s. 5 Färbelösung abgießen und Präparat kurz mit Leitungswasser spülen. 5 Für die Nachfärbung Präparat mit modifizierter Lugolscher Lösung bedecken. Färbedauer: 5 s. 5 Färbelösung abgießen und Präparat kurz mit Leitungswasser spülen. 5 Kurze Gegenfärbung mit Chrysoidinlösung. Färbedauer: 10 s. 5 Färbelösung abgießen und Präparat trocknen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Nach der Färbung erscheinen Polyphosphatgranula dunkelbraun bis schwarz, während die Bakterienzellen bräunlich-gelb gefärbt sind. Alternativ kann die ursprüngliche Neisserfärbung ohne Verwendung von modif­ zierter Lugolscher Lösung verwendet werden. Neisserfärbungen werden auch in der Analyse von fadenförmigen Mikroorganismen im Abwasser verwendet, um deren Phosphatspeicherungsverhalten darzustellen. ! Das für die Gegenfärbung verwendete Chrysoidin gilt als potenziell krebserregend;

der Hautkontakt bzw. das Einatmen von Pulverpartikeln muss vermieden werden.

5.6.3.6  Geißelfärbungen

Bakterien und andere Prokaryoten besitzen verschiedene Mechanismen zur selbst­ ständigen Fortbewegung in der Umwelt und in Wirtszellen und Geweben. Dazu dienen meist Geißeln (Flagellen), längliche, auf helikal angeordneten Flagellin-Untereinhei­ ten basierende Zellanhänge mit bemerkenswerten Bewegungseigenschaften und einer Vielzahl an Erscheinungsformen, die zur Bestimmung von Bakterien und der genau­ eren Untersuchung ihres Bewegungsverhaltens genutzt werden können. Bei Bakterien werden monotriche (einzelne Pol-Geißeln), amphitriche (eine oder mehrere Geißeln an den Zellpolen), lophotriche (Flagellenbündel an einem oder beiden Zellpolen) und peritriche Formen (Geißeln über den gesamten Zellkörper verteilt) unterschieden. Auf­ grund des winzigen Durchmessers dieser Strukturen (10–50 nm) sind sie nicht direkt im auflösungslimitierten Lichtmikroskop erkennbar und benötigen strukturverstärkende

273 Lichtmikroskopische Methoden

Färbungen, um sichtbar zu werden. Dabei werden Beizmittel verwendet, die die Geißeln beschichten und damit dicker und für die Lichtmikroskopie wahrnehmbar machen. Aufgrund der Empfindlichkeit dieser Strukturen muss bei Geißelfärbungen bei der Probenvorbereitung, der Erstellung der Lösungen und der Reinigung der Objektträger mit größter Sorgfalt vorgegangen werden. Für die Färbekontrolle von Geißelfärbungen kann als Vergleichsorganismus das lophotriche Bakterium Pseudomonas fluorescens verwendet werden, dessen polares Gei­ ßelbündel gut sichtbar sein sollte. Für die Färbung können Flüssig-, Agar- und Schrägagarkulturen verwendet wer­ den. Es sollten 16–20 h alte Kulturen verwendet werden, da Bakterien in älteren Kul­ turen teilweise ihre Geißeln verlieren, z. B. wenn es zur Sporenbildung kommt. Die besten Ergebnisse liefern Kulturen in der exponentiellen bzw. in der frühen stationären Wachstumsphase. Niedrige pH-Werte der Kulturen sollten vermieden werden, da dies die Flagellenbildung stören kann. Die Kultivierungstemperatur kann die Flagellen­ bildung ebenso beeinflussen. 5.6.3.7  Leifson-Färbung

Die Leifson-Färbung verwendet die Gerbsäure Tannin, die mit dem Farbstoff Para­ rosanilin (einem der Bestandteile von basischem Fuchsin) einen Kolloidniederschlag bildet, der an die Geißel bindet und diese dabei dicker macht und anfärbt. Der TanninPararosanilin-Komplex ist alkohollöslich. Zur Ausfällung kommt es während der Fär­ bung, wenn der Alkohol schneller als das Wasser aus der Lösung verdunstet und die Konzentration des Beizmittels und Farbstoffs zunehmen. Das der Lösung zugesetzte Kochsalz beeinflusst die Ladungen des Farbstoffkomplexes und der Geißel und ist ein weiterer Bestandteil des Färbevorgangs. i Benötigtes Material

5 Bunsenbrenner 5 95 % Ethanol 5 Wachsstift 5 Leifson-Färbelösung Leifson-Geißelfärbung Komponente A Bestandteil

Menge

Kochsalz

1,5 g

Aqua dest.

100 ml

Leifson-Geißelfärbung Komponente B Bestandteil

Menge

Tanninsäure

3 g

Aqua dest.

100 ml

5

274

T. Zimmermann

Leifson-Geißelfärbung Komponente C Bestandteil

Menge

Pararosaanilinacetat

0,9 g

Pararosanilinhydrochlorid

0,3 g

95 % Ethanol

100 ml

Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 mischen. Die so erstellte Mischung im Verhältnis 2:1 mit Lösung C mischen.

5

Vorgehensweise Für Agar- und Schrägagarkulturen: 5 Mit der abgeflammten und erkalteten Impföse ungefähr ein Viertel einer gewachsenen Kolonie aufnehmen und mittels leichten Schüttelns in einem Vortex-Schüttler in 1 ml dest. Wasser lösen. Bei zu heftigem Schütteln können die Geißeln abreißen. Die Lösung sollte nur leicht trüb sein, damit der Aufstrich nicht zu dicht wird, was das Erkennen der Geißeln erschwert. Für Flüssigkulturen: 5 0,1 ml der Kultur aufnehmen und zwei Mal zentrifugieren, um Kulturreste zu entfernen, die die Färbereaktion beeinflussen könnten. 5 Den Bodensatz in 0,1 ml destilliertem Wasser aufnehmen und durch vorsichtiges Schütteln in einem Vortex-Schüttler resuspendieren. Bei zu heftigem Schütteln können die Geißeln abreißen. 5 Nach der zweiten Zentrifugation in 0,2 ml dest. Wasser lösen. Die Lösung sollte nur leicht trüb sein, damit der Aufstrich nicht zu dicht wird, sodass die Geißeln schwer zu erkennen wären. Von der gelösten Kultur kann eine Bewegungsprobe in einem Deckglaspräparat oder in einem hängenden Tropfen gemacht und im Phasenkontrastmikroskop betrachtet werden. 5 Objektträger mit 95 % Ethanol abwischen und abflammen. Die Objektträger direkt verwenden, um eine Wiederverschmutzung zu vermeiden. 5 Nach vollständiger Abkühlung des Objektträgers einen kleinen Tropfen der Kultur aufbringen und lufttrocknen lassen. Nicht hitzefixieren, da dies die Geißelstrukturen zerstört! 5 Die getrocknete Probe mit einem Wachsstift umranden, um ein Abfließen der Färbelösung zu verhindern (lange Färbedauer, alokoholische Lösung) 5 Leifson-Färbelösung aufbringen. Färbedauer 7–15 min (Alkoholverdunstung). 5 Färbelösung abgießen und Präparat vorsichtig (keine Hitzefixierung) mit Leitungswasser spülen und an der Luft trocknen lassen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Zellkörper und Geißeln erscheinen rot gefärbt. Wie viele mit Ausfällung arbeitende Färbungen funktioniert diese Methode nicht immer gleich gut, da der Erfolg dieser und anderer Geißelfärbungen von vielen

275 Lichtmikroskopische Methoden

Faktoren beeinflusst wird, darunter dem Alter der Bakterienkultur, der Dicke des Ausstrichs, dem Alter der Färbelösungen, dem pH-Wert, der Temperatur und den verwendeten Konzentrationen. Es sollten deswegen mehrere Präparate gleichzeitig erstellt werden. Falls diese und die Vergleichsfärbung nicht funktionieren, müssen die Lösungen neu angesetzt werden. In einer Variante der Leifson-Färbung wird eine Lösung von basischem Fuchsin verwendet. 5.6.3.8  Kodaka-Färbung

Eine recht einfache Färbemethode für Geißeln beschrieb der japanische Mikrobiologe Hidemasa Kodaka basierend auf einer bereits existierenden Methode aus Taiwan. Sie besteht aus wenigen Schritten und benötigt keine so gründliche Reinigung der Objekt­ träger wie die Leifson-Methode. i Benötigtes Material

5 Beizlösung 5 Gesättigte Kristallviolettlösung Kodaka-Geißelfärbung Komponente A (Beizlösung) Bestandteil

Menge

5 % wässrige Phenollösung

10 ml

Tannin

2 g

Gesättigte Kaliumaluminiumsulfat 12-Hydrat Lösung

10 ml

Kodaka-Geißelfärbung Komponente B (gesättigte Kristallviolettlösung) Bestandteil

Menge

Kristallviolett

12 g

95 % Ethanol

100 ml

Ryu-Färbelösung: Lösung A und B im Verhältnis 10:1 mischen. In der Methode von Kodaka wird die fertige Färbelösung als unbegrenzt haltbar und ohne Notwendigkeit eines Filterns vor der Anwendung beschrieben, während Ryu in der Originalmethode das Anmischen direkt vor der Anwendung vorschreibt.

Vorgehensweise 5 Tropfen mit der Bakterienkultur auf einen sauberen Objektträger aufbringen und lufttrocknen lassen. Nicht hitzefixieren, da dies die Geißelstrukturen zerstört. 5 Ryu-Färbelösung auftragen. Färbedauer 5 min. 5 Färbelösung abkippen und gründlich, aber sanft (keine Hitzefixierung) mit Leitungswasser auf beiden Seiten des Objektträgers spülen, um Färbungsartefakte zu vermeiden. 5 Präparat trocknen lassen.

5

276

T. Zimmermann

z Versuchsergebnis/Auswertung

5

Die Zellen und Geißeln erscheinen blau-violett. Wenn die hier beschriebene Tropfenmethode verwendet wird, bietet es sich an, die Präparation vom Außenrand nach innen zu untersuchen, da sich die Zellen mit Gei­ ßeln eher außerhalb befinden. In der ursprünglichen Veröffentlichung wurde die Methode für Kolonien auf Agar­ platten beschrieben und eine Geißel-schonende Transfermethode vorgeschlagen, in der die Impföse mit der aufgenommenen Bakterienkolonie nur die Oberfläche eines auf einen Objektträger aufgebrachten Wassertropfens berührt, ohne diese aktiv in den Tropfen einzumischen und dabei die Flagellen zu beschädigen. Da die nächs­ ten Schritte am luftgetrockneten Präparat durchgeführt werden, können auch andere Methoden zum Aufbringen der Bakterien verwendet werden bzw. diese Methode mit anderen Geißelfärbungen wie der Leifson-Färbung kombiniert werden. 5.6.3.9  Deckglaspräparation mit Ryu-Färbelösung nach Heimbrook

Eine weitere einfache Methode ist die Kombination von Ryu-Färbelösung mit einem Deckglaspräparat (7 Abschn. 5.4.1). i Benötigtes Material

5 Bakterienkultur 5 Impföse 5 Objektträger 5 Deckglas Phasenkontrastmikroskop, 100x Ölobjektiv Ryu-Färbelösung (s. Kodaka-Färbung, s. o.)

Vorgehensweise 5 Einen kleinen Tropfen (ca. 20 µl) Wasser in der Mitte eines sauberen Objektträgers aufbringen. 5 Abgeflammte und abgekühlte Impföse in den Wassertropfen tupfen. 5 Die angefeuchtete Impföse kurz an den Rand einer Agar-Bakterienkolonie halten. Dies ermöglicht es beweglichen Zellen, in den Tropfen überzutreten. 5 Die Impföse mit den Zellen an den Tropfen auf dem Objektträger halten. Nicht aktiv mischen, um ein Abreißen der Flagellen zu vermeiden. 5 Ein trockenes und sauberes Deckglas vorsichtig mit einer Uhrmacherpinzette auflegen (Deckglasrand auf einer Seite des Tropfens absetzen und dann behutsam über den Tropfen legen). 5 Mit einem Phasenkontrastmikroskop kann die Beweglichkeit der Zellen überprüft werden (7 Abschn. 5.2.2). Falls keine Eigenbewegungen sichtbar sind, nicht mit der Färbung fortfahren und Präparation wiederholen. 5 Präparat 5–10 min bei Raumtemperatur ruhen lassen, um ein Anheften der Bakterien am Objektträger oder Deckglas zu ermöglichen. 5 Zwei Tropfen Ryu-Färbelösung am Deckglasrand aufbringen. Durch Kapillarkräfte und Diffusion kommt es zur Vermischung mit der Zelllösung. 5 Beobachtung der Präparation mit einem 100x Ölobjektiv.

277 Lichtmikroskopische Methoden

z Versuchsergebnis/Auswertung

Die Zellen und Geißeln erscheinen blau-violett. Aufgrund der Platzierung der Tropfen mit Färbelösung am Rand kommt es im Prä­ parat zu Konzentrationsgradienten der Färbung; es sollte daher ein geeigneter Mikro­ skopierbereich ausgewählt werden. Es kommt zu Ausfällungen des Färbemittels im Präparat, die zunehmen, je mehr das Präparat austrocknet. 5.7  Färbungen für die Fluoreszenzbetrachtung

In der Durchlichtmikroskopie werden durch Absorptionskontrast oder durch mit Ver­ fahren wie Phasenkontrastmikroskopie erzeugte Interferenzen dunklere oder farbige Strukturen vor einem hellen Hintergrund abgebildet. Dabei kann es leicht zu Über­ strahlungen von Einzelheiten kommen, vergleichbar mit einem Gegenstand, den man im Gegenlicht betrachtet. In der Fluoreszenzmikroskopie werden Strukturen hell gegen einen schwarzen Hintergrund abgebildet und sind somit klarer wahrzunehmen. Dazu kommt, dass das mit Bandpassfiltern auf den relevanten Bereich des Spektrums begrenzte Fluoreszenzsignal bei weitem weniger Hintergrundinformationen enthält als ein Durchlichtbild, in dem der helle Hintergrund teilweise Verunreinigungen im Licht­ weg oder in der Probe mit abbildet (. Abb. 5.14). Das Arbeiten mit Fluoreszenzfärbungen hat deswegen im Vergleich zu Durchlicht­ verfahren zwei Vorteile: 5 Im Bild verteilte Bakterien werden als leuchtende Punkte erkannt und können (bei ausreichender Stärke des Fluoreszenzsignals) mit niedrigeren Vergrößerungen betrachtet und gezählt werden. 5 Strukturelle Einzelheiten können hochaufgelöst genauer betrachtet werden. Idealerweise können die meist sehr kleinen Organismen und Strukturen hinter­ grundfrei betrachtet werden. Da Fluoreszenzsignale meist sehr schwach und Mikro­ organismen sehr klein sind, kann schon ein geringer Hintergrund das Fluoreszenzbild stark stören. Deswegen dürfen keine Lösungen (z. B. Nährmedien) oder Einbettmedien

. Abb. 5.14  Fluoreszenzbild von Magnetospirillum gryphiswaldense-Bakterien. Zu sehen sind mit Grün fluoreszierendem Protein markierte Magnetosomen-Ketten; Polyhydroxybutyrat-Granula sind mit einem rotem Fluoreszenzfarbstoff gegengefärbt. (© Frank Müller, Bayreuth)

5

278

T. Zimmermann

mit Autofluoreszenz im detektierten Spektralbereich verwendet werden. Ebenso müssen für die Arbeit mit Ölimmersionsobjektiven Immersionsöle verwendet werden, die nicht selbst fluoreszent sind. Alle Mikroskophersteller liefern daher hintergrundfreie Immersionsöle, die für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind. Dies ist auf den Behältern vermerkt, da es auch Öle gibt, die wegen ihres Hintergrunds nur für die Durchlicht­ mikroskopie verwendet werden dürfen. Färbungen lebender Proben

5

Durch die Möglichkeit, auch schwache Signale gegen einen dunklen Hintergrund zu detektieren, können viele Fluoreszenzfarbstoffe in so geringen Konzentrationen ver­ wendet werden, dass sie für Lebendfärbungen verwendet werden können. 5.7.1  Fluoreszenzlebendfärbungen

Es gibt eine ganze Reihe von Fluoreszenzmethoden, mit denen lebende Bakterienzellen von toten Zellen unterschieden werden können. Diese Anfärbungen werden meistens nicht auf dem Objektträger, sondern mit Zellsuspensionen durchgeführt, die anschlie­ ßend als Deckglaspräparate betrachtet werden können oder für eine genauere Aus­ wertung auf Filter aufgebracht werden. 5.7.1.1  Färbungen mit Propidiumiodid

Propidiumiodid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der ein- und doppelsträngige Nuklein­ säuren bindet und im roten Bereich emittiert. Er kann nur in Zellen mit beschädigter Zellwand eindringen und ist somit ein geeigneter Farbstoff (vergleichbar mit Methylen­ blau in 7 Abschn. 5.5.3, Vitalfaerbung), um tote Zellen zu markieren. Die Fluoreszenz­ farbstoffe 4´-,6-Diamido-2-Phenylindol (DAPI), Picogreen und Acridinorange binden auch Nukleinsäuren, sind aber in der Lage, intakte Zellwände zu durchdringen und somit auch lebende Zellen anzufärben. Da sie sich spektral von Propidiumiodid unter­ scheiden lassen, können durch eine Kombination eines dieser Farbstoffe mit Propidiu­ miodid tote von lebenden Zellen unterschieden werden. 5.7.1.2  Färbungen mit SYTO und SYTOX

Ein ähnlicher Ansatz kann mit spektral unterschiedlichen SYTO- und SYTOX-Cya­ nofarbstoffen verwendet werden. Diese kommerziell erhältlichen Farbstoffe wurden dahingehend entwickelt, Nukleinsäuren effizient und hell anzufärben, wobei SYTOVarianten lebendzellpermeabel sind und SYTOX-Varianten nur Zellen mit beschädigten Zellmembranen anfärben. 5.7.1.3  Färbungen von Redoxreaktionen

Cyanoditolyl-Tetrazolium-Chlorid (CTC) ist ein Salz, das von lebenden Zellen auf­ genommen werden kann und durch die Zellatmung in einen rot fluoreszierenden Formazan-Farbstoff umgewandelt wird. Metabolisch aktive Bakterienzellen erscheinen rot im Fluoreszenzmikroskop und können dadurch von toten Zellen unterschieden wer­ den. Als Gegenfärbung für dieses rote Fluorophor kann DAPI (s. o.) verwendet werden, das alle Zellen anfärbt.

279 Lichtmikroskopische Methoden

5.7.1.4  Fluoreszenz-Gramfärbung

Mit Fluoreszenzfarbstoffen kann eine Variante der Gramfärbung durchgeführt werden, die mehrere Vorteile gegenüber der ursprünglichen Methode aufweist. Die Differenzial­ färbung kann in einem einzelnen Schritt in lebenden Proben durchgeführt werden und die Unterscheidung Gram-variabler und anaerober Gram-positiver Bakterien ist verläss­ licher. Zum Einsatz kommen dabei zwei Farbstoffe für Nukleinsäuren: Hexidiumiodid, das nur Gram-positive Bakterien anfärbt, und SYTO 13, das beide Bakterientypen anfärbt. Die Empfindlichkeit der Unterscheidung wird dabei noch dadurch erhöht, dass das rot-orange Hexidiumiodid die Fluoreszenz des grünen SYTO 13 über den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) unterdrückt, wenn beide die Nukleinsäuren derselben Zelle anfärben. Ein ähnlicher Ansatz wird in der LIVE-BacLight-Gramfärbung genutzt, in der SYTO 9 anstelle von SYTO 13 verwendet wird. In einem anderen Ansatz wird fluoreszenzmarkiertes Weizenkeim-Agglutinin dazu verwendet, an die N-Acetylgluocosamine der Zellwand von Gram-positiven Bakterien zu binden, was bei Gram-negativen Bakterien nicht direkt möglich ist. ! Alle Nukleinfarbstoffe wie DAPI, Acridinorange, Propidiumiodid und Picogreen

binden an DNA und sind somit mögliche Mutagene. Bei ihrer Handhabung muss der Kontakt mit der Haut vermieden werden; bei einem Kontakt muss die betroffene Stelle sofort mit reichlich Wasser gewaschen werden.

5.7.1.5  Fluoreszierende Proteine

Während der Farbstoff bei allen anderen Färbemethoden der lebenden oder fixierten Probe in einem mehr oder minder komplexen Färbeprozess zugefügt werden muss, sind die in der Mikroskopie verwendeten fluoreszierenden Proteine Farbstoffe, die ihre Fluoreszenz autokatalytisch in der lebenden Probe entwickeln, ohne dafür weitere Kofaktoren zu benötigen. Fluoreszenz ist in allen Organismenreichen weit verbreitet, und es gibt viele fluoreszierende oder biolumineszente Mikroorganismen. Um diese fluoreszenten Eigenschaften zu erzeugen, wird jedoch in fast allen Fällen mehr als eine Komponente zur Fluorophorbildung benötigt, was eine Nutzung als Farbstoff erschwert. Autokatalytische Fluoreszenz- oder Farbbildung eines einzelnen Proteins wurde bis jetzt nur in einer Klasse von Proteinen entdeckt, die für lange Zeit nur aus Nesseltieren wie Quallen und Korallen bekannt war und dort in vielen Varianten für den großen Farb­ reichtum dieses Tierstamms verantwortlich ist. Die erste gefundene Form war das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) der Qualle Aequorea victoria, dessen Gen in andere Organismen eingebracht in diesen Fluoreszenz erzeugt. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine werden inzwischen in allen bekannten Organismengruppen eingesetzt, um als fluoreszierendes Reporterkonstrukt Genexpression in Zellen und Geweben nachzuweisen und um in Form von genetisch kodierten Protein-Fusionen im Mikroskop die subzelluläre Lokalisation bestimmter Proteine darzustellen. Die Kombination der beiden Merkmale der Selbstfaltung (Autokatalyse) und der Färbespezifität einzelner Proteine (durch Fusionen) unterscheidet fluoreszie­ rende Proteine grundsätzlich von allen anderen Formen der mikroskopischen Präparat­ anfärbung. Die Färbung geschieht über das Einbringen eines genetischen Vektors mit dem (meist fusionierten) Gen eines fluoreszierenden Proteins, das daraufhin abhängig

5

280

5

T. Zimmermann

von der gewählten Form der Expressionskontrolle von den transformierten Zellen oder Organismen selbst hergestellt wird. Die Zielgenauigkeit der Färbung auf zellulärer Ebene über spezifische Promotoren und auf subzellulärer Ebene über Proteinfusionen lässt sich höchstens mit der Spezifität von Antikörperfärbungen vergleichen, unterscheidet sich von diesen jedoch durch die Möglichkeit, mit lebenden Zellen zu arbeiten und nicht durch die gerade bei Mikroorganismen häufigen Probleme mit der Zugänglichkeit (Zell­ wand) beschränkt zu sein. Fluoreszierende Proteine haben in den letzten Jahrzehnten die in-vivo-Mikroskopie und das Verständnis von Abläufen in lebenden Zellen revolutioniert. Spektrale Varianten des ursprünglichen Aequorea-victoria-GFP und aus anderen Organismen isolierte fluo­ reszierende Proteine bieten die Möglichkeit, Mehrfachfärbungen mit klar voneinander getrennten Fluoreszenzsignalen durchzuführen. Wie in allen Organismengruppen können auch Pilze und Bakterien mit fluores­ zierenden Proteinen markiert werden. Für Färbungen dieser Art sind molekularbio­ logische Methoden zur Erstellung eines rekombinanten Proteins und dessen Einbau in einen genetischen Vektor (z. B. eines Plasmids) nötig, die zum Standard der bio­ logischen Laborarbeit gehören und hier nicht beschrieben werden können. Protokolle zum Einbringen des genetischen Vektors in Mikroorganismen sind in 7 Abschn. 4.3 beschrieben. In diesem Kapitel liegt der Schwerpunkt auf lichtmikroskopischen Experimenten. Ein wichtiger Aspekt beim Arbeiten mit Protein-Fusionen in der Lichtmikroskopie ist, dass das natürliche Verhalten der untersuchten Proteine nicht durch die Fusion beeinträchtigt wird. Da fluoreszierende Proteine im Vergleich zu anderen genetisch angehängten Markierungen sehr groß sind (>200 Aminosäuren), müssen besonders bei kleineren Proteinen die Position (N- bzw. C-terminal) und die Länge der Verbindungs­ sequenz so gewählt werden, dass die Funktion des Proteins dadurch nicht beeinträchtigt wird. Zirkulär mutierte Varianten von fluoreszierenden Proteinen erlauben die Schaf­ fung neuer N- und C-Termini, die eine bessere Kontrolle der Proteinposition in der Fusion ermöglichen. Die Funktionsfähigkeit eines Fusionsproteins für in-vivo-Mikro­ skopie muss durch in-vitro-Tests des rekombinanten Proteins geprüft werden, bevor es in Zellen eingesetzt wird. Bei Funktionseinschränkungen müssen die Position und die Länge der Verbindungssequenz angepasst werden. Fusionsproteine werden oft zusätzlich zum ursprünglichen Protein und oft unter der Kontrolle eines anderen Promotors exprimiert. Artefakte durch Überexpression sind deswegen möglich, wie auch eine unspezifische Lokalisierung aufgrund eines Mangels an intrazellulären Partnern. Seit den ersten erfolgreichen GFP-Experimenten in E. coli ist erwiesen, dass fluores­ zierende Proteine in Bakterien exprimiert werden können. Bei der Wahl des fluoreszie­ renden Proteins sollte auf folgende Eigenschaften geachtet werden: 5 Vorzugsweise eine Variante fluoreszierender Proteine mit hoher Helligkeit ver­ wenden, also mit hohem Extinktionskoeffizienten im Anregungsspektrum für effiziente Lichtaufnahme und einer hohen Quanteneffizienz für effiziente Licht­ abgabe. Dadurch kann die für die Visualisierung nötige Konzentration in den transformierten Zellen niedriger gehalten, und Überexpressionsartefakte können vermieden werden. Neben einer hohen Helligkeit ist dabei auf eine hohe Faltungs­ effizienz zu achten, um entfaltete, nicht-fluoreszierende Fusionsproteine in der Zelle zu vermeiden.

281 Lichtmikroskopische Methoden

5 Um eine möglichst ähnliche Funktion des Fusionsproteins im Vergleich zum ursprünglichen Protein zu garantieren, fluoreszierende Proteinvarianten verwenden, die bei den verwendeten Konzentrationen nicht zur Dimeriserung oder Oligo­ merisierung neigen. Bei Reporterkonstrukten für die Genexpression, bei denen die subzelluläre Lokalisierung keine Rolle spielt, können auch helle Oligomervarianten verwendet werden. 5 Fluoreszierende Proteine haben unterschiedliche Empfindlichkeiten gegen Umwelt­ einflüsse wie den intrazellulären pH-Wert oder die Chloridkonzentration. Die gewählte Proteinvariante sollte mit dem intrazellulären Milieu kompatibel sein. 5 Die Kodonnutzung der Proteinsequenz sollte auf den Zielorganismus abgestimmt sein. Aufgrund ihrer Helligkeit und ihrer weitgehend monomeren Eigenschaften eignen sich die Varianten Venus und Citrin des gelb fluoreszierenden Proteins YFP für die Ver­ wendung in Mikroorganismen. Rote Proteine wie mCherry sind spektral gut von den grünen Varianten getrennt, aber im Vergleich zu diesen nicht sehr hell (siehe oben). Dies macht sie für die Darstellung schwacher Signale nicht geeignet. Die Fixierung von Proben mit fluoreszierenden Proteinen wird chemisch durchgeführt, um die intrazellulären Strukturen besser zu erhalten und die Hitze­ denaturierung des fluoreszierenden Proteins zu vermeiden. Bei der Fixierung mit Form­ aldehyd ist bei einigen fluoreszierenden Proteinen (z. B. bei allen Varianten von YFP) eine starke Abnahme der Fluoreszenz zu beobachten, die durch die folgenden Waschvor­ gänge und die Einbettung nur teilweise wiederhergestellt wird. 5.7.2  Bleichschutz

Organische Fluorophore verlieren bei längerer Beleuchtung mit Anregungslicht ihre Fähigkeit zur Fluoreszenz; es kommt zum irreversiblen Bleichen. Nach einigen Tausend Anregungszyklen verändert sich das Fluorophor chemisch; die dabei stattfindenden Pro­ zesse sind unterschiedlich und noch nicht vollständig beschrieben. Es kann beim Blei­ chen eines Fluorophors teilweise zur Bildung von für die Zelle schädlichen Radikalen kommen (Phototoxizität), was vor allem bei Lebendbeobachtungen problematisch ist. Fluoreszierende Proteine haben nur eine geringe Phototoxizität, da entstehende Radikale meist noch innerhalb des das Fluorophor umgebenden Kranzes aus Beta-Faltblättern reagieren und dadurch nicht mit zellulären Komponenten in Kontakt kommen. Die Wahrscheinlichkeit des Bleichens eines Fluorophors wird durch die Umwelt­ bedingungen beeinflusst. Die Gegenwart von Radikalfängern und die Abwesenheit von Sauerstoff als Reaktionspartner können die Lebensdauer von Fluorophoren erhöhen. Viele der dafür in mikroskopischen Einbettmedien für fixierte Proben verwendeten Reagenzien (s. o., Einbettungen und Bleichschutz, gleicher Abschnitt) sind nicht mit Lebendexperimenten kompatibel, einige jedoch schon. Beim Arbeiten mit lebenden Prä­ paraten können Ascorbinsäure oder n-Propylgallat dem Medium beigemischt werden, um die Bleichprozesse während der Beobachtung zu verlangsamen. Für fluoreszierende Proteine haben sich Medien ohne Riboflavine oder Pyridoxal als vorteilhaft erwiesen, ebenso die Zugabe von Rutin.

5

282

T. Zimmermann

5.7.3  Fluoreszenzfärbungen fixierter Proben 5.7.3.1  Auramin-Färbung säurefester Stäbchen

5

Als Alternative zur Ziehl-Neelsen- oder der Kinyoun-Färbung können säurefeste Bak­ terien auch mit dem Fluoreszenzfarbstoff Auramin O nachgewiesen werden. Dabei bindet Auramin an die Mycolsäuren in der Zellwand in einer Form, die durch die Säure­ behandlung nicht wieder ausgewaschen werden kann. Säurefeste Stäbchen sind als helle Fluoreszenzsignale deutlich zu erkennen. Diese Färbung zeichnet sich durch ihre hohe Empfindlichkeit und Verlässlichkeit aus, benötigt aber ein teures Fluoreszenzmikroskop zur Auswertung. i Benötigtes Material

5 Bunsenbrenner 5 Schutzbrille 5 Abzug 5 Phenol-Auramin-Lösung 5 Dunkle Flasche zur Lagerung 5 Salzsäure-Ethanol-Gemisch 5 Löfflers alkalische Methylenblaulösung (7 Abschn. 5.6.2) Phenol-Auramin-Lösung Phenol-Auramin-Lösung Komponente A Bestandteil

Menge

Auramin

0,1 g

95 % Ethanol

10 ml

Phenol-Auramin-Lösung Komponente B Bestandteil

Menge

Phenolkristalle

3 g

Aqua dest

87 ml

Phenolkristalle leicht erwärmen (Verflüssigung), in Aqua dest. lösen Beide Lösungen mischen Lagerung: In dunkler Flasche aufbewahren (Fluoreszenzfarbstoff). Etwa eine Woche haltbar.

Salzsäure-Ethanol-Gemisch Bestandteil

Menge

25 % Salzsäure

4 ml

70 % Ethanol

96 ml

283 Lichtmikroskopische Methoden

Vorgehensweise 5 Fixierte Ausstrichprobe mit Phenol-Auraminlösung bedecken. 5 Träger vorsichtig dreimal durch die schwach leuchtende Flamme eines Bunsenbrenners ziehen, bis sich Dampf bildet, die Lösung aber nicht siedet (siehe Warnhinweis unten!). Präparat zwischendurch immer abkühlen lassen. Die Lösung darf während des Vorgangs nicht eintrocknen; verdampfte Flüssigkeit wird mit frischer Färbelösung ersetzt. 5 Farbstofflösung abgießen und mit Wasser gründlich spülen, bis keine Farbe mehr abläuft. 5 Für die Differenzierung das Salzsäure-Ethanol-Gemisch gleichmäßig verteilt über das schräg gehaltene Präparat laufen lassen, bis keine Farbreste mehr in der abtropfenden Flüssigkeit sichtbar sind. Differenzierungsdauer: 2–3 min. Dieser Schritt wird am besten vor einem weißen Hintergrund durchgeführt, um die Vollständigkeit der Entfärbung besser überprüfen zu können. 5 Gründlich mit Wasser spülen. 5 Gegenfärbung mit alkalischer Methylenblaulösung. Färbedauer ca. 1 min 5 Färbelösung abgießen und gründlich mit Wasser spülen.

! Für die Hitzebehandlung während der Auramin-Färbung muss eine Schutzbrille

getragen werden (Glasbruchgefahr durch Zerspringen), und wegen der giftigen Phenoldämpfe muss unter dem Abzug gearbeitet werden, um das Einatmen von Dämpfen zu verhindern.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Säurefeste Stäbchen erscheinen mit grünlichgelber Fluoreszenz gegen den dunklen Hintergrund. Varianten dieser Färbung ersetzen die Hitzebehandlung mit Phenol-Auramin durch eine längere Einwirkzeit des Reagens (15 min). Eine 0,5 %ige Kaliumpermanganatlösung (s. Auramin-Rhodamin Färbung, unten) kann die unspezifische Fluoreszenz unterdrücken. Zu langes Einwirken dieser Lösung schwächt jedoch die Auramin-Fluoreszenz ab. 5.7.3.2  Auramin-Rhodamin-Färbung

Eine Kaltfärbungsvariante der Phenol-Auramin-Färbung kann mit einer AuraminRhodamin-Mischung durchgeführt werden. i Benötigtes Material

5 Auramin-Rhodamin-Färbelösung 5 Salzsäure-Ethanol-Gemisch 5 0,5 % Kaliumpermanganatlösung

5

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T. Zimmermann

Auramin-Rhodamin-Färbelösung

5

Bestandteil

Menge

Auramin O

1,5 g

Rhodamin B

0,75 g

Glycerin

75 ml

Phenol

10 ml

Aqua dest

50 ml

Die beiden Farbstoffe gründlich mit 25 ml Wasser und dem Phenol lösen. Das restliche Wasser und Glycerin zugeben und noch einmal mischen. Mischung filtern. Salzsäure-Ethanol-Gemisch Bestandteil

Menge

Konz. Salzsäure

0,5 ml

70 % Ethanol

99,5 ml

0,5 % Kaliumpermanganatlösung Bestandteil

Menge

Kaliumpermanganat

0,5 g

Aqua dest

99,5 ml

Vorgehensweise 5 Fixiertes Präparat mit Auramin-Rhodamin-Färbelösung bedecken. Färbedauer 15 min. 5 Gründlich mit Leitungswasser waschen. 5 Mit Salzsäure-Ethanol-Gemisch bedecken. Einwirkdauer: 5 min. 5 Gründlich mit Leitungswasser waschen. 5 Gegenfärbung mit Kaliumpermanganatlösung. Färbedauer: 5 min. 5 Gründlich mit Leitungswasser waschen.

z Versuchsergebnis/Auswertung

Säurefeste Stäbchen erscheinen mit rötlichgelber Fluoreszenz gegen den dunklen Hintergrund Die Färbung funktioniert besser, wenn sie bei 37 °C durchgeführt wird. 5.7.4  Einbettungen und Bleichschutz

Für eine längere Aufbewahrung von Fluoreszenzpräparaten sind im Handel eine Reihe verschiedener Einbettmedien erhältlich. Es kann zwischen aushärtenden und nicht aushärtenden Einbettmedien unterschieden werden.

285 Lichtmikroskopische Methoden

Fluoreszenzfärbungen werden aufgrund ihrer schwachen Signale meist mit empfindlichen hochauflösenden Ölobjektiven betrachtet. Da sowohl die Stärke des Signals als auch die Auflösung kleiner subzellulärer Strukturen (z. B. des Nukleoids) stark von der Präparateinbettung abhängt, wird hier genauer darauf eingegangen. Ein wichtiges Merkmal von Einbettmedien ist ihr Brechungsindex (7 Abschn. 5.1.1). Dieser sollte dem Brechungsindex des mit dem Objektiv ver­ wendeten Immersionsmediums angepasst sein, um zu Verzerrungen führende Ablenkungen der Lichtstrahlen beim Durchtritt durch das Immersionsmedium, das Deckglas und die eingebettete Probe zu vermeiden. Diese als sphärische Aberrationen bezeichneten Artefakte führen mit zunehmender Probentiefe zu Verlusten an Auf­ lösung und Signalstärke. Um solche Artefakte zu vermeiden, müssen die Brechungs­ indices sehr genau aufeinander abgestimmt werden (absoluter Unterschied geringer als 0,05). In der 3D-Hochauflösungsmikroskopie werden deswegen auf bestimmte Bedingungen abgestimmte Immersionsölgemische oder speziell anmischbare Ein­ bettgemische angeboten. Dabei ist auch zu beachten, dass die Temperatur des Immer­ sionsöls dessen Brechungsindex stark beeinflusst und meist nur bei 22 °C dem angegebenen Index 1,52 entspricht. Die so entstehenden Effekte sind z. B. bei der Betrachtung von Organismen in ihren Wirtstieren oder Wirtsgeweben wichtig (dicke Proben). Bei der Betrachtung von eingebetteten Abstrichen, also dünnen Präparaten, sind diese Abweichungen weniger kritisch. Einbettmedien können aufgrund ihrer Zusammensetzung in vier Kategorien unterteilt werden: Wässrig, glycerinbasiert, ölig und aus Plastik. Entsprechend ver­ teilen sich die Brechungsindices um diese Stoffgruppen, d. h. Wasser (Brechungsindex 1,34), Glycerin (1,47), Öle (um 1,53) und Plastik (1,51). Im Handel erhältliche Einbettmedien bestehen aus einer dieser vier Komponenten, teilweise aus einem polymerbildenden Mittel zur Aushärtung und einem Bleichschutz, z. B. 1,4 Diazabicyclo-Octan (DABCO), n-Propylgallat (NPG) oder p-Phenylendiamin (PPD). Wasserbasierte Einbettmedien sind z. B. GelMount und Fluorsave. Vectashield, Prolong und Mowiol sind auf eine Glycerinbasis aufgebaut. Permount, Methylsalicylat und Balsamöl sind ölbasiert. Glycol-Methacrylat, Epoxy-Harze (z. B. Epon) oder Poly­ ester-Harze bilden Plastik. Aushärtende Einbettmittel (z. B. Mowiol und Prolong) eignen sich für die Erstellung haltbarer Präparate. Diese können leicht nach Benutzung von Immersions­ ölen gereinigt werden und sind leicht zu lagern und zu handhaben. Der Brechungs­ index im Präparat ändert sich jedoch während des Aushärtungsprozesses, sodass die besten Ergebnisse erst nach vollständiger Beendigung des Prozesses (einige Tage) erzielt werden, auch wenn die Proben natürlich schon vorher benutzt werden kön­ nen. Bei der Aushärtung kann es zu einer Schrumpfung der eingebetteten Strukturen kommen, bzw. zu einer Abplattung, wie sie z. B. bei auf ein Deckglas aufgebrachten Säugetierzellen beobachtet werden kann. Diese werden so flach, dass sich z. B. die Architektur im Zellkern signifikant ändert und sich Nukleoli als deutliche Erhebungen im abgeflachten Nukleus abzeichnen, was ein klares Einbettungsartefakt darstellt. Nicht aushärtende Einbettmittel (z. B. Vectashield) müssen versiegelt werden, um ein Austrocknen der Probe und den Austritt des Einbettmediums zu verhindern. Des Weiteren kann es beim Einsatz von Immersionsobjektiven während der Betrachtung im Mikroskop zu einem Verschieben des Deckglases und zu einer Vermischung von

5

286

5

T. Zimmermann

Immersionsöl und Einbettmedium kommen. Das ist nicht gut für das Präparat und führt zur Schlierenbildung und der Zerstörung der optischen Eigenschaften des Immersionsmediums. In diesem Fall muss das Immersionsobjektiv vor der weiteren Benutzung gründlich mit einem fusselfreien Linsenpapier und 70 %igem Alkohol gereinigt werden. Als Verschlussmittel kann Nagellack verwendet werden. Es kann dabei durch die darin enthaltenen Lösungsmittel (z. B. Isopropylalkohol, besonders in Verbindung mit einem wässrigen Einbettmedium) zu einer Abschwächung der Fluoreszenz im Prä­ parat kommen. Besonders wichtig ist es, den Lack lange genug (>30 min) aushärten zu lassen, um eine Verschmutzung des hochempfindlichen Immersionsobjektivs zu vermeiden. Es können auch andere Mittel zur Versiegelung verwendet werden, z. B. Zahnwachs oder Vaseline/Paraffin-Mischungen. Ein Beispiel für ein weit verbreitetes Einbettmedium, das lange haltbare Präparate erzeugt und für dünne Proben wie Ausstriche geeignet ist, ist Mowiol. Mowiol ist ein auf Polyvinylalkohol basierendes Mittel, das ursprünglich für die Verwendung in der Elektronenmikroskopie entwickelt wurde, aber inzwischen hauptsächlich in der Licht­ mikroskopie verwendet wird. Vorgehensweise Für die Herstellung von Mowiol aus der ausgelieferten Pulverbasis sind folgende Schritte nötig: 5 6 g Glycerin in ein 50 ml Einweg-Zentrifugenröhrchen füllen. 5 2,4 g Mowiol in Pulverform hinzufügen und gründlich verrühren. 5 6 ml dest. Wasser zugeben verrühren und 2 h bei Raumtemperatur stehenlassen. 5 12 ml 0,2M Tris-Puffer (pH 8,5) hinzugeben und auf >50 °C erhitzen, bis das Mowiol völlig gelöst ist. Gelegentlich rühren. 5 20 min bei 5000 RPM zentrifugieren. 5 Der Überstand kann in 1 ml-Aliquots unterteilt werden. Die so erstellte Mowiol-Lösung ist luftdicht verschlossen für ein paar Wochen haltbar. Bei -20 °C kann sie 12 Monate aufbewahrt werden und ist nach dem Auftauen für einen Monat verwendbar.

Als Bleichschutz kann nach dem Zentrifugationsschritt optional 2,5 % DABCO hinzu­ gefügt werden. Bei Mowiol kann es aufgrund der Zubereitung aus der Pulverform zu Unterschieden im Brechungsindex zwischen verschiedenen Zubereitungen kommen.

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Serviceteil Stichwortverzeichnis – 289

© Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2020 A. Störiko (Hrsg Methoden der Mikrobiologie, https://doi.org/10.1007/978-3-662-60822-7

289

A–C

Stichwortverzeichnis

A Abbe, Ernst  221, 239 Aberration  218 – chromatische  218 – sphärische  218, 285 Absorptionskontrast  224 ABTS-Reagenz  158 Acetat-Lösung  31 Acetoin  90 Acinetobacter baumanii  104 Acridinorange  50 Actin  161 Actinomyceten  118, 120 Agaricus bisporus  152 Agarose-Gelelektrophorese  186 Agar-Reinigung  35 Agar Shake  36 Agrobacterium – rhizogenes  125 – tumefaciens  175 Airy-Scheiben  221 Akzeptanzwinkel  220 Albert, Henry  270 Alcaligenes faecalis  104 Alignment  210 AM-CAS-Medium, eisenfreies  159 Amidoschwarz  49 Amylase-Aktivität  97 Anaerobentechnik  15 Anaerobentopf  26 Anaerobier  3, 34 Anaerobisieren  25 Anastomose  116, 128, 150 Anreicherung – anaerobe  15 – grüner Schwefelbakterien  29 – von Bakterien aus einer Bodenprobe  3 – von Clostridium pasteurianum  9 – von Escherichia coli  11 – von Schwefelpurpurbakterien  30 Anreicherungsmedium N2-frei  10 Antheridien  119 Antibiotikum  117 Antikörper  162 Antikörpernachweis  162 antisense-RNA  178 Apertur  220 – numerische  220 Aperturblende  224 Apikalität  128

Appressorien  136 Arbuskeln, Nachweis  135 Arthrospore  130, 144, 146 Ascomycet  121, 128, 132, 133, 145, 165 Ascomyceten-Hefe  110 Ascus  140, 156 Ashbya gossypii  143 Aspergillus  144, 145, 147 – nidulans  113, 155, 167, 172 Aufbewahrung, anoxische von Lösungen  23 Auflichtmikroskopie  216 Auflösung  217 – eines Objektivs  220 Auramin-Färbung  282 Auramin-Rhodamin-Färbung  283 Ausspateln  52 Ausstrichpräparat  245 Ausstrichverfahren  39 Austernpilz  152 Autoklavieren  24 – von Medien  6 Autotrophie  3 Auxotrophie  170

B Bacillus  95 – subtilis  3, 262 Bäckerhefe  109, 139, 141 Bakterien – aerobe  34 – anaerobe  35 – anoxygene phototrophe  27 Bakterienausstrich  68 barrage-Reaktion  150 Basidiomycet  110, 112, 126, 128, 133, 145, 149, 165 Basidiospore  151 Begasen, anaerobes  22 Beleuchtung, strukturierte  241 Berechnung der Keimzahl  56 Bertrand-Linse  225, 228 Beugungscheibe  221 Beugungsgrenze  221 Beweglichkeit von Bakterien  70 Bewegungsanalyse  244 Bilderfassung, digitale  234 Biomasse von Pilzen  111 Birnengitterrost  135 Biuret-Reaktion  61

Blast  209 Blau-Weiß-Screening  193 Bleichen  239 – von Fluoreszenzfarbstoffen  232 Bleichschutz  281, 284 Blutagar  104 Bodenprobe  3, 119 bootstrap  212 Bradford-Assay  189 Brandpilz  110, 125, 141 Braunfäulepilz  153, 157 Bromthymolblau  77 Brotschimmel  145, 146 Brown’sche Molekularbewegung  244

C C. pasteurianum Agarmedium/ Flüssigmedium  10 Calciumchloridlösung  174 Calcofluor  132, 133, 143, 161 Calcofluor-Färbung  132, 133 Candida  141 – albicans  109, 143, 144 CCD(Charge coupled device)-Kameras  234 cell division cycle  139 Cellulase-Aktivität  99 Champignon  152 Charge Coupled Device (CCD)-Kamera  230 Chemotrophie  3 Chitin  132 Chitinhülle  143 Chlamydospore  130, 144, 146 Chlorobium  29 Chromatium  30 Citrat-Agar  79 Citratlyase  79 Cleistothecien  154 Clostridium  95, 100 – pasteurianum  9 Colletotrichum lindemuthianum  136 Conidien  128, 130, 144 Conidienbildung  146 Conidienentwicklung  147 Conidienträger  145 Conidiophor  144 Conidiospore  126, 136, 145, 155, 170, 172 Coprinopsis cinerea  149, 150

290

Stichwortverzeichnis

Corynebacterium  101 – diptheriae  269 – flavescens  270 – glutamicum  263 crossing over  156 Cryptococcus  110 Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität  87

D DAPI (4’6-Diamidin-2-Phenylindol)  51, 131, 133, 135, 150, 161 DAPI-Färbung  232 database for mycorrhizal fungi  138 Dauerformenbildner  244 Dauerkultur  126 Deckgläschen-Kultur  129 Deckglaspräparat  242 Deletionsmutant  166 Deuteromycet  145 Differenzialfärbung  261 Differenzialinterferenzkontrast  226, 239 Digoxygenin (DIG)  197 Dikaryon  130, 133, 142, 149, 150 Dimorphität  141 Direktisolierung von Bakterien  33 Distanz, genetische  157 DNA – anfärben  132 – aus Reinkulturen oder Wasserproben  182 – Extraktionspuffer  137 DNA-DNA-Hybridisierung  197 DNA-Schnellisolierung  182 DNA-Transfer  197 Drei-Strich-Technik  39 Drigalski-Spatel  43 Durchlichtbetrachtung  250, 256 Durchlichtmikroskopie  216, 222 Durham-Röhrchen  11

E Ehrlich, Paul  263 Einbettmedium  162, 284 Einzelsporisolat  123 Ektomykorrhiza  123, 125, 134 Ektomykorrhizapilz  119, 126, 149 – saprotropher  125 Elektroblot  199 Elektronen-multiplizierende CCD-Kamera  235 Elektroporation  195 – von Conidiosporen  171 Elementgehalt  128

ELISA (Enzyme-linked Immuno-Sorbent-Assay)  201 EMB-Agarplatten  13 Emericella nidulans  153 Emissionsfilter  230 Endomykorrhizapilz  125 Endophyt  124 Endosporen von Bakterien  69 Endosporenfärbung nach Wirtz  268 Enterobacter  74 Enterobacteriaceae  78, 82, 101 Enteropluri-ID-Testkit  105 Entwicklungsstadien trennen  167 Enzym, DNA-modifizierendes  192 Enzymaktivität  87 Enzyme-linked Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)  202 Enzymlösung zur Zellwandlyse  161 Eosin  252 Eosin-Methylenblau-Agar  74 Epifluoreszenzmikroskopie  216, 221, 231 Epiphyt  123 Epistasis  155 Ergosterol  111 Erwinia  100 Escherichia coli  3, 11, 74, 104, 262 Ethidiumbromid  132 Ethidiumbromid-Färbelösung  187 Eubacterium  100 Exoenzym  160 Expression von Genen  165 Exzitationsfilter  230

– – – –

von Redoxreaktionen  278 von Speicherstoffen  254 von Vesikeln  132 zur Beobachtung von Zellkompartimenten in Pilzen  130 Feldblende  223 Feldplanarität  218 Festbettreaktor  117 Feuchtmasse  60 Fixiermittel (Fixans)  247 Fixierung – einer Bakterienprobe  49 Fixierung, chemische  246, 247 Fixierung einer Probe  246 Flächenausstrich  43 flat-Wachstum  150 Fluoreszenz-Gramfärbung  279 Fluoreszenz-Videomikroskopie bei Pilzen  163 Fluoreszenzfarbstoff  232 Fluoreszenzfärbung  215, 282 Fluoreszenzmikroskop  51 Fluoreszenzmikroskopie  229 – superauflösende  239 Fluorophore  229 Formaldehyd  49 Formaldehydfixierung  248 Fraktion, cytosolische  167 Fruchtkörper  116, 124, 151 – vegetativ vermehren  123 Fruchtkörperbildung  117, 150 Fuchsin-Lösung  72 Fusion eines fluoreszierenden Proteins  166

F

G

Falcon-Röhrchen  117 Fangapparat bei Nematoden-fangenden Pilzen  121 Färbelösung  130 Farbteiler  230 Färbung  236, 240 – fixierter Proben  282 – für die Durchlichtbetrachtung  215, 250, 256 – lebender Proben  278 – lichtmikroskopische  240 – mit Acridinorange  50 – mit Amidoschwarz  49 – mit DAPI (4ʼ6-Diamidin-2-Phenylindol)  51, 132 – mit SYTO und SYTOX  278 – säurefester Stäbchen  282

Galaktosidase  11 ß-Galaktosidase  193 Gärprodukte  111 Gasbildung  12, 13 Geißelfärbung  272 Gelatinase-Aktivität  95 Genanalyse  208 GFP-Fluoreszenz  164 Gins, Heinrich  271 Glukose-/Laktose-Minimalmedium  14 Glutaraldehydfixierung  250 Gram, Hans Christian  261 Gram-Färbung  66, 261 Gram-negativ  65 Gram-positiv  65 Griess-Illosvays-Reagenz  102 Grün-fluoreszierendes Protein (GFP)  164, 279 Gymnosporangium sabinae  135

291 Stichwortverzeichnis

H Halo  226 Hämolysin-Aktivität  104 Hängender Tropfen  243 Harnstoff-Agar  91 Haustorien  136 Hefe  109, 141 – humanpathogene  141 – Übergang zu Hyphenformen  141 Hefe-Sprossung  143 Hefeextrakt-Glukose-Medium  145– 147 Hefeplasmid  170 Hefezelle – kompetente  171 – transformierte  170 Herbar  128 Heterotrophie  3 Hexidiumiodid  279 Hitzefixierung  246 Hoechst-Farbstoff  132 Holliday-Struktur  157 Homogenisationspuffer  166 Homologiesuche mit BLAST  211 Hybridisierung  196 Hydrolyseprodukt  35 Hymenium  151 Hyphe  128, 130, 141, 143, 144 Hyphenform  111 Hyphenpilz  114

I Identifizierung – und Differenzierung von Bakterien  65 – von Pilzen  128 Identifizierungsmedium  74 Idiomorphität  153 Immersion  220 Immersionsöl  278 Immunfluoreszenzfärbung  161 Immunfluoreszenzmikroskopie  163 Impfblöckchen  115 Indol  82, 89 Induktionsmedium  177 Inkubation im Anaerobentopf  26 Integration, homologe  165 Integrationsvektor  164, 168 Interferenz  224 Interferenzkontrast  216 Intern transkribierter Spacer (ITS)  136 Intron  166 Isolierung

– und Kultivierung von Bakterien  3 – und Kultivierung von Hefen und filamentösen Pilzen  109 – von Hefestämmen aus Umweltproben  112 – von Nukleinsäuren  181 – von Pilzen aus Bodenproben  119 – von Pilzen aus flüssigen Umweltproben  117 – von Pilzen aus Fruchtkörpern  121 – von Pilzen aus Pflanzenmaterial  123 – von Plasmid-DNA  182 – von Proteinen  188 ITS (internal transcribed spacer)  136, 208 ITS-Region, Amplifizierung der  138

J Jod-Kaliumiodid-Lösung  254 Jodlösung  270

K Käfer-Minimal-Nitrat-Medium  172 Kaltfärbungsvariante  267 Kapsel  72 Kapsel-Darstellung nach Maneval  73 Kapselfärbung  247 Kapselnachweis  251 Karbolfuchsin  263 Karbolfuchsinfärbung  260, 261 Karbolfuchsinlösung  263 Katalase-Aktivität  87 Keimungsmycelium  123 Keimzahl  56 – Ermittlung der höchstwahrscheinlichen  54 Keimzahl-Bestimmung  53 Kernfärbung mit DAPI  128 Kernlokalisierungssequenz  178 Kernwanderung  149 Kingella  101 Kinyoun-Färbung  266 Kits zur Aufreinigung von DNA  181 Klebsiella  74 Klonierung  194 Knock-out  165 Koch, Robert  263 Kochʼscher Plattenguss  53 Koch’sche Postulate  124 Kodaka, Hidemasa  275 Kodaka-Färbung  275 Köhler’sche Beleuchtung  223 KOH-Test  65

C–L

Kolonie, prototrophe  170 Kompartiment  166 Kondensor  216 Kondensor-Aperturblende  224 Kongorot  100, 252 Kongorot-Lösung  72 Konjugation  175 Kontamination, bakterielle  114 Kontrast  222, 236 Kopplung  155 Koprophiler Pilz  121 Kovacs-Reagenz  82, 89 Kreuzung  138 – bei Basidiomyceten  149 – filamentöser Ascomyceten am Beispiel von Aspergillus nidulans  153 Kreuzungstyp  139, 142 Kristallviolett  261 Kristallviolettlösung  66, 259 Kultivierung  114 – filamentöser Pilze auf festen Medien  114 – filamentöser Pilze in Flüssigmedien  112 – im Fermenter (Hefe)  112 – von Escherichia coli auf Minimalmedium  13

L Laccaseaktivität  160 Lactophenol-Baumwollblau  134, 150 Lactophenol-BaumwollblauFärbung  132 Laser-MikrodissektionsMikroskopie  167 Laser-Raster-FluoreszenzMikroskopie  237 LB-Medium  4 Lebendpräparate  215 Lebendzellzahl  52 Lebenszyklen von Pilzen  138 Leifson-Färbung  273 Lentinula edodes  152 Licht, polarisiertes  226 Lichtmikroskop  50, 215, 216 Lichtmikroskopie, jenseits der Beugungsgrenze  239 Lichtquelle  216 Lipidfärbung  255 LIVE-BacLight-Gramfärbung  279 Lokalisations-Mikroskopie  241 Lokalisierung von Enzymen und Naturstoffen  157 Lowry, Oliver  61

292

Stichwortverzeichnis

Luftmycel  160, 165 Lugolsche Lösung  6, 66, 99, 254, 261 Lysin-Deaminase  92 Lysin-Decarboxylase  92 Lysin-Eisen-Agar  93 Lysogeny Broth  4 Lysozym  249

M MacConkey-Agar  75 Magnesiumsulfatlösung  173 Maisbeulenbrand  142 Malzextrakt-Medium  113 mating type switching  139 MAT-Loci  139 Mazerat  114 Medienzusammensetzung  110 Medium – anoxisches  19 – CYM  112 Meerrettich-Peroxidase  200, 201 Meiose  139 Melin-Nokrans-Medium  158 Membranfärbung  132 Membranfiltration  59 Metabolom  167 Metagenom  208 Methanolfixierung  250 Methode – Antikörper-abhängige  196 – colorimetrische  157 – lichtmikroskopische  215 Methylenblau  253, 258 Methylenblaufärbung  270 Methylrot-Test: Säure- und Gasbildung  78 Metulae  145 Mikrobiomanalyse  208 Mikroskop – aufrechtes  216 – inverses  216 Mikroskopie  135 – konfokale  230 MIL-Agar: Mobilität – Indol – Lysin  85 Mineralsalze (Basalmedium)  17, 20, 29 Minimalmedium (MM) – für Ascomyceten  112 – für Aspergillus nidulans  113 – für Basidiomyceten (CYM)  114 – für S. cerevisiae  110 – für S. commune (MM)  115 – nach Spizizen  7 – SD  112 MIO-Agar: Motilität – Indol – Ornithin  84 Mitochondrien  168

Monokaryon  133, 150 MOPS-Laufpuffer  187 Moraxella  101 Morphotyping  135 Mowiol  286 Mucor  145 Multitestsystem  105 Mycel  114, 128, 130, 145, 160, 167, 175 Mycelmatte  117 Mykobakterien  244, 263 Mykorrhiza  125, 135 – arbuskuläre  130 – arbuskulärer  133 Mykorrhizapilz  123, 133 Mykotoxin  117, 120 Mykotoxinbildner  111 Myxomyceten  119

N Nachweis – der Einflüsse von Licht, Tagesrhythmen und Kreuzung bei der Bildung asexueller Sporen  146 – des oxidativen/fermentativen Abbaus von Zuckern  76 – von Proteinen in situ  163 Nachweis, immunologischer von Proteinen  161 NaHCO3-Lösung  18, 20, 29 Nährmedium nach Hugh und Leifson  77 NCBI GenBank  209 Neelsen, Friedrich  263 Negativfärbung  251 Neisser-Färbung  271 Neisser, Max  271 Neisseria  101 Neurospora  147 – crassa  145, 148, 168 Nicht-Schwefelpurpurbakterien  32 Nigrosin  252 Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität  101 Nocardia  263 Northernblot  199 NukleinsäureKonzentrationsbestimmung  185 Nukleinsäuren  181 Nukleinsäurenachweis  196

O Objektiv  216, 217 Objektivtyp  219

OF-Test (Nachweis oxidativer/fermentativer Zuckerabbau)  76 Oidien  145 Okular  216 Ölimmersionsobjektiv  257 Oogonien  119 Oomyceten  119, 123 Optische Dichte (OD)  57, 111

P Palladium-Katalysator  27 Pararosanilin  273 PBS (Phosphatpuffer-Saline)  162, 202 PBS-Triton  188 PCR  203 – zum Nachweis von Transkripten (RT-PCR)  205 PEG-Lösung  174 Penicillium  145 Pepton-Salz-Lösung  53 Permeabilisierungslösung  162 Phasenkontrast  215, 216, 224, 225 Phasenteleskop  228 Phasenunterschied  224 Phenylalanin-Deaminase-Aktivität  94 Pheromonrezeptor  164 Phialiden  145 Phosphatpuffer-Saline (PBS)  202 Photoactivation Localization Microscopy (PALM)  241 Phototrophie  3 Phragmobasidiomycet  142 pH-Wert des Mediums  21 Phytopathogenität  123 Pilobolus  145, 147 Pilz  109 – biotropher  125 – Conidien-bildender  117, 120, 124 – endophytischer  123, 125 – epiphytischer  126 – filamentöser in Flüssigkulturen  114 – phytopathogener  133 Pilze bestimmen – durch parasitische bzw. symbiontische Stadien  133 – durch Sequenzierung der ITS-Region  136 – durch Wachstum  45 Pilzgruppe  144 Pilzhyphe  120, 133 Pilzkultur und Fruchtkörperbildung bei Basidiomyceten  151 Pilzzucht  151 Plasmid  168 Plasmid-DNA  182

293 Stichwortverzeichnis

Plasmidpräparation  182 Plasmidstabilität  169 Plattenguss-Verfahren  53 Pleurotus ostreatus  152 PME (PIPES-Magnesium-EGTAPuffer)  161 Podospora  155 Polarisator  226 Polkörperchen  269 Polymerabbau  160 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)  204 Polyphosphatgranula-Färbung  269 Polysaccharidfärbung  254 Polysaccharidgranula  255 Potato-Dextrose-Agar  142, 145 Präparat, ungefärbtes  215 Präparationsmethoden für die Mikroskopie  240, 244 preYED  172 Primordien  150, 167 Prisma  226 Protein – fluoreszierendes  279 – YFP, gelb fluoreszierendes  281 Proteinauftrennung  188 Proteinextrakt  188 Proteinfusion  165 Proteingehalt  60 Proteingehalt bestimmen – mikromorphologische  128 Proteingelelektrophorese  190 Proteinnachweis  196 Proteom  167 Proteus  95 – vulgaris  74 Pseudohyphe  141, 143 Pseudohyphenwachstum  143 Pseudolamelle  151 Pseudomonas  95, 100 – aeruginosa  104 – fluorescens  273 Pseudoparenchym  121 Pyrogallol-Technik  25

Q Quantifizierung von Proteinen  189 Quantitative real-time-PCR (qPCR)  207

R Radioisotop  128 real-time-PCR  206 Referenzgen  206 Reinigung der Zellkerne  168

Reinkultur  11, 30 Rekombination  157 Resazurin  20 Resazurin-Lösung  19, 20 Reverse Transkription (RT-PCR)  199 Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)  205 Rhizopus  147 – stolonifer  145 Rhodopseudomonas palustris  33 Rhodospirillum rubrum  33 Rhodotorula  110 RNA-Gelelektrophorese  187 RNAi  178 RNA-Isolierung  183 Roll-Tubes  37 Rostpilz  110, 125 Ruminococcus  100

S Sabouraud-Glucose-Agar  142 Saccharomyces  168 – cerevisiae  109, 138, 141–143, 165, 170 Safraninfärbung  261 Salmonella  74 Saprobiont  149 Saprolegnia  119 Saprotrophie  142 Säure- und Gasbildung  78 Schimmelpilz  126 Schizophyllum commune  118, 122, 128, 131, 149–151, 161, 163, 164 Schizosaccharomyces pombe  109, 111 Schlamm- oder Wasserprobe  33 Schleimhülle oder Schleimkapsel  72 Schleimpilz (Myxomyceten)  119 Schnallen  149 Schnallenmycel  123, 130 Schnallenzelle  128, 164 Schnellisolierung von DNA  182 Schrägagar  127 Schwefelbakterien  29 Schwefelpurpurbakterien  30 Schwermetall  128 Scientific CMOS-Kamera  235 SDS-Gelelektrophorese  188 Selektionsmarkergen  169 Selektivmedium  73, 75 – zur Transformantenselektion  177 Selenit-Wolframat-Lösung  19, 20 Separieren unterschiedlicher Zellkompartimente  166 Sequenzieren der 18 S rDNA bzw. ITS-Region  126

L–S

Sequenzierung  195, 208 – der 18 S-rDNA bzw. ITS-Region  118, 120, 123, 125, 128 Serratia marcescens  118 Shigella  74 Shiitake  152 Siderophorenproduktion  160 Silencing  178 SIM-Agar  82 SL (Spurenelement-Lösung)  18 SMM-Salze  7 Sorbitollösung  174 Sordaria  155 – fimicola  155 – macrospora  155 Southernblot  196 Spaltblättling  150 Spalthefe  109 Speicherstoff  254 Sphäroblast  168 Spider-Medium  142 Spirillen  253 Spirochäten  253 Sporangien  146 Sporangiophoren  147 Spore  144 – sexuelle  121 Sporenabdruck  123 Sporen-Färbung  70 Sporenkeimung  123 Sporensuspension  116 Sporidien  141 Sprossung  111 Spurenelemente  8 Spurenelement-Lösung  18, 20, 29 Stäbchen  11 Stammbaum  138 Stammbaumerstellung  212 Stammhaltung  127 – von Pilzen  126 Staphylococcus  95 – aureus  261 Stärke-Agar  97 Sterilfiltration  8, 24 Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie  241 Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)  241 Stokes-Verschiebung  229 Streptomyces  100 Strukturfärbung  268 Substanz, redoxaktive  16 Substratmycel  165 Sudanschwarz B  255 Sulfid  82 Sulfid – Indol – Motilität  82 Süß-/Salzwasser-Medium  17, 29

294

Stichwortverzeichnis

Symbiont, obligater  125 Syncytialität  133 Syringaldazin  158, 160 SYTO- und SYTOX-Cyanofarbstoff  278

T TAE-Puffer  186 Tagesrhythmik  148 Tannin  273 Taq-Polymerase  204 TE/Calcium  174 Teliospore  135 Tetradenanalyse  140, 141 – bei Sordaria fimicola  155 Thiosulfat-Lösung  31 Toluidin-Malachitgrün-Färbung  270 Transformant  178 Transformation  165, 168 – beim Ektomykorrhizapilz  175 – LiCl-basierte  170 Transformationseffizienz  171 Transformationssystem  166 – in Pilzen  168 Transkriptom  167, 210 Tricholoma – subannulatum  112 – vaccinum  124, 175 Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)  70 Trockenmasse  58, 116 – bestimmen  114 Trübung  57 Tryptophanase  82 Tryptophanase-Aktivität  89 TTC-Agar  71 Tubulin  161 Tubuslänge  218

U Übersichtsfärbung  258 – aller Zellen  254 Umweltprobe  3 Urease-Aktivität  90 Ustilago maydis  135, 141, 143, 144

Wasserprobe  33 Wasserschimmel  119 Weißfäulepilz  153, 157 Westernblot  200 Widdel-Kolben  17–20, 29 Winogradski-Säule  28 Wuchsform, filamentöse  143

V

Y

Vektor  168, 193 Verdünnungsreihe – für aerobe Bakterien  34 – für anaerobe Bakterien  35 Vergrößerung  217, 221 Vermehrung, vegetative  126 Verunreinigung  118, 123, 124, 126, 128 Vitalfärbung mit Methylenblau  253 Vitamine-Lösung  19, 20, 29 Vogel-Medium  147 Voges-Proskauer-Test  90 Vollmedium – für Agrobacterium  176 – für Ascomyceten  112, 113 – für Basidiomyceten (CYM)  114, 115 – für Hefen  110 – für S. pombe  110 – YPD  112 von Rindfleisch, Eduard  263

YPD, yeast peptone dextrose  110

W Wachstum  45 – filamentöser Pilze  112 Wachstumsgeschwindigkeit  116 Wachstumsmessung  116 Wachstumsrate  116

Z Zählkammer  45 Zählraster  169 Zellkerne aus Protoplasten isolieren  167 Zellkompartiment in Pilzen  130 Zellmasse  57 Zellsuspension  242 Zellwand  65, 66 Zellwandpräparation  167 Zellzahl  45, 47 Zellzahl bestimmen – durch Trübung  57 – mit der Feuchtmasse  60 – mit der Lebendzellzahl  52 – mit der Trockenmasse durch Zentrifugation  58 – mit der Zählkammer  45 – mit Zellmaße  57 Zellzyklus-Analyse  140 Ziehl, Franz  263 Ziehl-Neelsen-Färbung  253, 264 Zwiebelepidermis-Infektionstest  135 Zygomycet  128, 133, 144, 146, 147 Zymolyase  140