Medicina regenerativa e ingeniería tisular: del laboratorio a la clínica

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MEDICINA REGENERATIVA E INGENIERÍA TISULAR. DEL LABORATORIO A LA CLÍNICA

Editorial Alfil

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(Introducción)

Introducción

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Academia Mexicana de Cirugía

Medicina regenerativa e ingeniería tisular. Del laboratorio a la clínica Daniel Ascencio González Especialista en cirugía plástica y reconstructiva. Maestro y Doctor en Ciencias Médicas.

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(Introducción)

Medicina regenerativa e ingeniería tisular. Del laboratorio a la clínica Todos los derechos reservados por: E 2009 Editorial Alfil, S. A. de C. V. Insurgentes Centro 51–A, Col. San Rafael 06470 México, D. F. Tels. 55 66 96 76 / 57 05 48 45 / 55 46 93 57 e–mail: [email protected] ISBN 978–607–7504–35–1

Dirección editorial: José Paiz Tejada Editor: Dr. Jorge Aldrete Velasco Revisión editorial: Irene Paiz, Berenice Flores, Victoria Ortega Revisión médica: Dr. Diego Armando Luna Lerma Ilustración: Alejandro Rentería Diseño de portada: Arturo Delgado–Carlos Castell Impreso por: Impresiones Editoriales FT, S. A. de C. V. Calle 15 Manz. 42 Lote 17, Col. José López Portillo 09920 México, D. F. Noviembre de 2008 Esta obra no puede ser reproducida total o parcialmente sin autorización por escrito de los editores. Los autores y la Editorial de esta obra han tenido el cuidado de comprobar que las dosis y esquemas terapéuticos sean correctos y compatibles con los estándares de aceptación general de la fecha de la publicación. Sin embargo, es difícil estar por completo seguros de que toda la información proporcionada es totalmente adecuada en todas las circunstancias. Se aconseja al lector consultar cuidadosamente el material de instrucciones e información incluido en el inserto del empaque de cada agente o fármaco terapéutico antes de administrarlo. Es importante, en especial, cuando se utilizan medicamentos nuevos o de uso poco frecuente. La Editorial no se responsabiliza por cualquier alteración, pérdida o daño que pudiera ocurrir como consecuencia, directa o indirecta, por el uso y aplicación de cualquier parte del contenido de la presente obra.

Introducción

Colección Platino de la

Academia Mexicana de Cirugía

Comité Editorial

José Ángel Córdova Villalobos Santiago Echeverría Zuno Jesús Kumate Rodríguez José Antonio Carrasco Rojas Humberto Mateos Gómez Fernando Torres Valadez Alejandro Reyes Fuentes

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Colaboradores

Dr. Carlos Álvarez Gayosso Instituto de Investigación en Materiales, UNAM. Capítulo 16 Dra. Graciela J. Ancona León Capítulo 16 Dr. Óscar Arias Carrión Médico cirujano por la Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca y Doctor en Ciencias Biomédicas por la Universidad Nacional Autónoma de México. Actualmente realiza el posdoctorado en la Universidad de Philipps, en Alemania. Capítulo 3 Dr. Daniel Ascencio González Especialista en cirugía plástica y reconstructiva. Maestro y doctor en Ciencias Médicas. Coordinador de Ingeniería Tisular del Laboratorio a la Aplicación Clínica, realizado en la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México, 2006. Autor del libro El estado del arte en la medicina regenerativa. Capítulos 1, 2, 4, 6, 14 Dr. Federico Barceló Santana Jefe de la División de Estudios Superiores de la Facultad de Odontología, UNAM. Capítulo 16 VII

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(Colaboradores)

Dr. Antonio Campos Muñoz Docente e investigador en histología e ingeniería tisular y responsable académico en educación e investigación médica. Profesor adjunto por oposición en Cádiz, Profesor Agregado en Oviedo y Catedrático en Granada. Investigador en el área de la Histología y la Ingeniería Tisular. Miembro de la Real Academia de Medicina de Granada y de la Real Academia Nacional de Medicina, en la que ocupa el sillón que desempeñó en su día Don Santiago Ramón y Cajal. Capítulo 8 Dra. Marta Carretero Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 11 Dra. Marcela del Río Nechaevsky Doctora en Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. Líneas de investigación: medicina regenerativa de piel, terapia génica cutánea y fotocarcinogénesis. Trabaja en el Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 12 Dr. René Drucker Colín Doctor en fisiología. Investigador Emérito del Instituto de Fisiología Celular, UNAM. Investigador Nacional de Excelencia y Emérito del Sistema Nacional de Investigadores. Coordinador de la Investigación Científica, UNAM. Investigador Emérito del Instituto de Fisiología Celular, UNAM. Capítulo 3 Dra. María José Escamez Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 11 Dra. Marta García Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 11 Dr. Miguel Angel Gómez Lim Investigador del CINVESTAV. Doctorado (PhD) en la Universidad de Edimburgo, Escocia, Reino Unido. Investigador del CINVESTAV 3D de tiempo completo. Capítulo 15

Colaboradores

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Dr. Rogelio Hernández Pando Investigador titular C. Jefe de la Sección de Patología Experimental, Departamento de Patología, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán”. Doctorado en Investigación Biomédica Básica (Inmunología), Instituto de Investigaciones Biomédicas UNAM, y posdoctorado en Inmunopatología, Department of Microbiology, School of Pathology, University College of London, Reino Unido. Capítulo 13 Dr. Fernando Larcher Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 12 Dr. José Luis Jorcano Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 12 Dra. Mariana Latorre García Capítulo 16 Dra. Dulce Adriana Mata Espinosa Maestría en Ciencias con especialidad en Inmunología. Premio a la tesis del año en Nutrición, 1999. Primer lugar en la categoría Investigación Básica. Premio anual “Dr. Gustavo Baz Prada”. Segundo lugar en el área de Salud Pública, 1997. Capítulo 13 Dr. Álvaro Meana Ministerio de Educación y Ciencia CIEMAT, Departamento de Investigación Básica, Unidad de Medicina Regenerativa. Capítulo 12 Dr. Bernardo Nadal Ginard Cardiovascular Institute and Center for Cardiovascular Health, Mount Sinai School of Medicine, Nueva York, EUA. Residente del National Heart Institute, México, 1968–1972; profesor en el Departamento de Medicina en el New York Medical College de 2003 a 2005; profesor honorario visitante. Departamento de Investigación Cardiovascular, University of Leicester, Inglaterra; profesor e investigador adjunto, Departamento de Medicina (Cardiología), Mount Sinai School of Medicine. Jefe académico oficial, investigador internacional y educacional, Cardiovascular Institute and Center for Cardiovascular Health, Mount Sinai School of Medicine, Nueva York, EUA. Capítulo 14

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(Colaboradores)

Dr. Luis Orozco Delclós Doctor en Medicina; traumatólogo y cirujano ortopédico; Director Científico del Instituto de Terapia Regenerativa Tisular. Miembro del Cuerpo Facultativo del Centro Médico Teknon, Barcelona, España. Miembro Permanente de la Fundación “Maurice E. Müller” en Barcelona, España. Miembro de la Sociedad Española de Terapia Génica y Celular; participante en la Red Temática TERCEL (Instituto de Salud Carlos III). Capítulos 9, 10 Dr. Fernando Ortiz Monasterio Profesor Emérito de la Facultad de Medicina, UNAM. Ex Jefe del Servicio de Cirugía Plástica y Reconstructiva del Hospital General de México. Ex jefe del Servicio de Cirugía Plástica y Reconstructiva del Hospital General “Manuel Gea González”. Capítulo 7 Dra. Margarita Navarrete Montesinos Capítulo 16 Dr. Filiberto Rivera Torres Capítulo 16 Dra. María Cristina Piña Barba Doctora en Ciencias (Física), Facultad de Ciencias, UNAM, 1980. Premio Sor Juana Inés de la Cruz, IIM–UNAM. Premio Maestro Ignacio Chávez, 1997. Premio de la SOMIB, 1998. Capítulo 17 Dr. Ricardo Vera Graziano Investigador en el Instituto de Investigaciones en Materiales de la UNAM (IIM) sobre el desarrollo y caracterización de materiales poliméricos y el estudio de interacciones interfaciales sólido–sólido y sólido–líquido. Sus contribuciones más importantes en investigación son 42 artículos científicos con arbitraje en revistas internacionales Capítulo 16 Dr. Agustín Gregorio Zapata González Catedrático de Biología Celular de la Universidad Complutense de Madrid; actualmente subdirector general de Investigación en Terapia Celular y Medicina Regenerativa del Instituto de Salud Carlos III y Asesor de la Dirección General de Investigación del Ministerio de Educación y Ciencia. Capítulo 5

Contenido

Presentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XV José Antonio Carrasco Rojas Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XVII Manuel H. Ruiz de Chávez Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIX Daniel Ascencio González

SECCIÓN I. INTRODUCCIÓN A LA MEDICINA REGENERATIVA E INGENIERÍA TISULAR 1. Ingeniería tisular: del laboratorio a la aplicación clínica . . . Daniel Ascencio González 2. El futuro de la biología y la medicina regenerativa . . . . . . . . Daniel Ascencio González 3. Degeneración y regeneración del sistema nervioso . . . . . . . . Óscar Arias Carrión, René Drucker Colín

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SECCIÓN II. FENÓMENOS BIOLÓGICOS Y CÉLULAS MADRE 4. La angiogénesis en la ingeniería tisular y la medicina regenerativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Daniel Ascencio González XI

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(Contenido)

5. Biología de las células madre: la base de su aplicación clínica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Agustín G. Zapata 6. Las células madre en la ingeniería tisular y en la medicina regenerativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Daniel Ascencio González

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SECCIÓN III. APLICACIONES CLÍNICAS DE LA INGENIERÍA TISULAR Y LA MEDICINA REGENERATIVA 7. Ingeniería tisular del esqueleto facial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fernando Ortiz Monasterio 8. Ingeniería tisular: estrategias para la construcción de tejidos artificiales. Modelo para la elaboración de un constructo de córnea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Antonio Campos 9. Regeneración ósea. Aplicación de células progenitoras de médula ósea expandidas con biorreactor GMP . . . . . . . . . Luis Orozco Delclós 10. Nuevas aplicaciones clínicas del plasma rico en plaquetas en patologías musculosqueléticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luis Orozco Delclós 11. La terapia génica cutánea como estrategia de intervención en la dermatología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Marta Carretero, María José Escamez, Marta García, Isabel Mirones, Fernando Larcher, Marcela del Río 12. Equivalentes cutáneos desarrollados mediante la ingeniería tisular: aplicaciones clínicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fernando Larcher, Álvaro Meana, José Luis Jorcano, Marcela del Río 13. Interferón gamma: aspectos básicos, importancia clínica y usos terapéuticos, en especial en la terapia génica . . . . . . . Dulce Mata Espinosa, Rogelio Hernández Pando 14. Presente y futuro de la regeneración del miocardio . . . . . . . . Daniel Ascencio González, Bernardo Nadal Guinard

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SECCIÓN IV. COMPUESTOS BIOFARMACÉUTICOS EN INGENIERÍA TISULAR Y MEDICINA REGENERATIVA 15. La producción de compuestos biofarmacéuticos en plantas . Miguel A. Gómez Lim

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Contenido

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SECCIÓN V. BIOMATERIALES EN INGENIERÍA TISULAR Y MEDICINA REGENERATIVA 16. Desarrollo de nuevos polímeros de restauración dental . . . . Ricardo Vera Graziano, Federico Barceló Santana, Margarita Navarrete Montesinos, Carlos Álvarez Gayosso, Mariana Latorre García, Filiberto Rivera Torres, Graciela J. Ancona León 17. Biomateriales para tejido óseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . María Cristina Piña Barba Índice alfabético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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(Contenido)

Presentación José Antonio Carrasco Rojas Presidente de la Academia Mexicana de Cirugía

La Academia Mexicana de Cirugía fue fundada en el año 1933 y los médicos fundadores establecieron como objetivo más importante vigilar la salud del pueblo mexicano, mediante el impulso a la educación y la investigación de la cirugía y ramas afines. En el marco de festividades de su Septuagésimo Quinto Aniversario, la Academia Mexicana de Cirugía ha realizado varias actividades, entre las cuales destaca la edición de una serie de libros denominada “Colección Platino”, que versa sobre los principales problemas de salud y su abordaje. La evolución de la medicina, los conocimientos de la formación de los tejidos, la tecnología de avanzada y la necesidad de trasplantes de órganos han hecho surgir nuevas áreas, como es la ingeniería tisular. El conocimiento actual de las células madre ha llevado al desarrollo de nuevos campos en numerosas especialidades, debido a la generalidad de la aplicación. Es para la Academia Mexicana de Cirugía muy gratificante poder contribuir con este libro, magníficamente realizado por su editor, el Dr. Daniel Ascencio González, cuya visión de la aplicabilidad clínica que puede tener este tipo de técnicas seguramente será parte del futuro de la medicina a corto plazo. La aplicación de células madre en todos los tejidos de nuestro organismo es una nueva expectativa del tratamiento de patologías de muy difícil manejo. Si bien ya se está empleando en algunas áreas, es necesario tener un mayor control y rigor científico para su desarrollo. La ingeniería tisular es ya una realidad como uno de los grandes avances de la medicina.

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular

(Presentación)

Prólogo Manuel H. Ruiz de Chávez Presidente Ejecutivo de la Fundación Mexicana para la Salud

La medicina regenerativa es considerada la vanguardia del tratamiento médico del siglo XXI. Esta nueva disciplina médica, interdisciplinaria por naturaleza, conjuga los conocimientos de la ingeniería aplicada y tisular, de la biología, de la física y de la bioquímica. La medicina regenerativa se apoya en la reparación de los tejidos dañados in vivo mediante la utilización de técnicas derivadas de la ingeniería tisular para reemplazar las células dañadas a causa de diversos procesos por células sanas. En un futuro no muy lejano, hará posible la creación de tejidos y órganos funcionales que puedan sustituir a los tejidos y a los órganos afectados por alguna enfermedad, daño o malformación congénita. La medicina regenerativa parte, fundamentalmente, de los nuevos conocimientos relacionados con las células madre y la terapia génica, cuyos avances más importantes se han logrado a partir de la década de 1990. En síntesis, la medicina regenerativa integra todos los procedimientos destinados a la promoción de la regeneración celular. Actualmente la medicina regenerativa y la ingeniería tisular se perfilan como dos de las bases más prometedoras para la terapéutica médica, pues son varios los casos en los cuales sus aportes se encuentran al alcance de una aplicación clínica. Además de los beneficios obvios de la aplicación clínica de estas técnicas celulares, la medicina regenerativa plantea la posibilidad de contribuir en la contención de los costos de los sistemas de salud. La alta especialización médica, la tecnología aplicada a la salud y el aumento de la población de adultos mayores contribuyen a la complejidad de la demanda de servicios de salud y, por consecuencia, a su encarecimiento. XVII

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(Prólogo)

Se estima que en los próximos 50 años la mayoría del gasto relacionado con la atención de la salud se destinará a tratamientos para enfermedades que cursen con un deterioro tisular. Con la inversión adecuada, la medicina regenerativa será capaz de producir sustitutos de piel, de cartílago y de hueso antes de 2015. Estas medidas representarán, para esa década, alternativas de solución para las complicaciones de enfermedades tan complejas como la diabetes y la enfermedad cardiovascular. Por lo tanto, su potencial económico perfila a esta industria como una de los más prometedoras a nivel internacional, con intereses que se multiplican de un sitio a otro. La obra Medicina regenerativa e ingeniería tisular. Del laboratorio a la clínica es presentada por Daniel Ascencio González, destacado médico cirujano egresado de la Universidad Nacional Autónoma de México, especialista en cirugía plástica y reconstructiva, maestro y doctor en ciencias médicas, colaborador en diversas instituciones públicas mexicanas y autor de varios artículos y colaboraciones en libros. La obra introduce un esquema de las áreas médicas más relevantes que accederán a la utilización de los principales hallazgos de la medicina regenerativa y la ingeniería tisular. Para lograr lo anterior, Ascencio echó mano de destacados médicos y científicos nacionales e internacionales, quienes son especialistas en diversas disciplinas médicas. A lo largo de los capítulos que conforman Medicina regenerativa e ingeniería tisular. Del laboratorio a la clínica Ascencio logra introducir, de manera sucinta, un tema complejo a la luz de sus diversas aplicaciones clínicas. Para detallar cada una de las áreas en las que las técnicas de regeneración tisular se han desarrollado principalmente, el libro incluye capítulos elaborados por afamados científicos mexicanos y del extranjero, lo cual contribuye a la riqueza y precisión informativa desplegada. Los trabajos aquí reunidos dan cuenta de la expansión mundial que ha sufrido esta rama de la biomedicina, la cual se perfila como revolucionaria en la atención a la salud. Sin duda, Medicina regenerativa e ingeniería tisular. Del laboratorio a la clínica será una obra de referencia indispensable para poder acercarse a una ciencia fascinante que cada vez ofrece más resultados palpables para la atención médica, sobre todo de los daños a la salud que inciden en forma creciente a la población mexicana. Con agrado saludamos esta primicia de la nueva medicina del siglo XXI.

Introducción Daniel Ascencio González

En el siglo XXI la medicina regenerativa evoluciona a la vanguardia del desarrollo biotecnológico. También en esta época da comienzo a una revolución en la atención a la salud, área en la que ofrece nuevos tratamientos para enfermedades que antes no los tenían. En la actualidad es posible manufacturar tejidos y órganos biohíbridos autólogos con el fin de regenerar y sustituir los dañados a causa de enfermedades, lesiones y anomalías congénitas. La medicina regenerativa es un campo interdisciplinario que emerge como producto de la investigación básica y utiliza los conocimientos de las biologías molecular, celular y del desarrollo, de la genética, de la ciencia de los biomateriales, de la bioingeniería y de la ingeniería tisular para reintegrar la estructura y la función al organismo. Asimismo, esta disciplina médica innova las terapias tradicionales en el trasplante con diversas estrategias como: S La inducción de la regeneración autónoma de los tejidos dañados con el uso de biomateriales, de proteínas moleculares y de células madre. S La construcción de tejidos con estos elementos en el laboratorio con el objetivo de inducir los procesos de la regeneración. S El trasplante del tejido a medios enfermos y dañados. Estos tratamientos permiten fundamentalmente dos avances: 1. El potencial real de regenerar in vivo tejidos dañados de modo inexorable. XIX

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(Introducción)

2. El poder de producir in vitro los tejidos para trasplante cuando la regeneración no sea posible, proporcionando terapéuticas definitivas para los tejidos y los órganos dañados de manera irreversible. El trasplante de dispositivos artificiales y de órganos avanza con logros importantes y seguirá siendo parte de los métodos y de las estrategias para restaurar la estructura y la función de los órganos y los tejidos en el siglo XXI. Así, la promesa regenerativa de la biología y de la medicina serán las revoluciones biomédicas de este siglo. Los adelantos en la biología de las células madre, en la ciencia de los materiales, en la transferencia nuclear, en la genética y en la ingeniería tisular se integran de manera constante a la regeneración de los órganos y los tejidos. De ahí la importancia de organizar en México un evento de nivel internacional en el que fueran abordados todos estos temas, por lo que del 16 al 20 de octubre de 2006 se llevó a cabo en la Facultad de Medicina de la UNAM el primer simposio Ingeniería tisular. Del laboratorio a la aplicación clínica. El evento estuvo dirigido a médicos, biólogos, biólogos celulares y moleculares, especialistas en biomateriales, especialistas en cirugía cardiaca y en cirugía plástica y reconstructiva, cirujanos ortopedistas, traumatólogos, cirujanos generales, neurocirujanos, cirujanos de vascular periférico, cirujanos de trasplantes, endocrinólogos, urólogos, odontólogos, periodoncistas, ortodoncistas y a especialistas de otras disciplinas relacionadas con la ingeniería tisular y la medicina regenerativa. A la reunión asistieron como invitados profesores e investigadores del más alto nivel académico de México, Europa y EUA, quienes expusieron y discutieron sus últimas experiencias relacionadas con la investigación y la aplicación clínica de células madre adultas y del cordón umbilical, y de biomateriales y de factores de crecimiento aplicados a la regeneración de hueso, cartílago, músculo cardiaco, piel, tejidos blandos y a la neurorregeneración. Como resultado de este simposio, los profesores acordaron reunir y publicar sus ponencias en este proyecto editorial intitulado Medicina regenerativa e ingeniería tisular. Del laboratorio a la clínica.

Sección I Introducción a la medicina regenerativa e ingeniería tisular Sección I. Introducción a la medicina regenerativa e ingeniería tisular

1 Ingeniería tisular: del laboratorio a la aplicación clínica

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Daniel Ascencio González

Durante la última década del siglo XX y la primera década del siglo XXI se lograron avances significativos en los campos de la biología celular, la biofísica y la bioquímica, los cuales permitieron entender las características de los tejidos vivos. Con estos conocimientos, los investigadores estudian, planean, diseñan y crean nuevos órganos y tejidos vivos para el reemplazo de los tejidos dañados o perdidos a causa de diversas enfermedades. Los avances recientes en el campo de la biotecnología revolucionaron y favorecieron el desarrollo rápido de la ingeniería tisular, área interdisciplinaria de estudios básicos que integra los conocimientos de la biología celular y molecular, la bioquímica y la ingeniería de materiales; con esta disciplina es factible crear tejidos biointeractivos in vitro y trasplantarlos con características estructurales y funcionales normales, y desarrollarlos in vivo. El objetivo es regenerar, reparar o sustituir tejidos humanos. La aplicación clínica de estos conocimientos ofrece expectativas inéditas que incluyen la posibilidad de elaborar complejos celulares nuevos que puedan servir para el reemplazo de células dañadas, con funciones deterioradas y perdidas, y como vehículo para el tratamiento de lesiones y enfermedades congénitas, traumáticas y crónico–degenerativas. Pruebas científicas demuestran que la terapia celular y la llamada medicina regenerativa ofrecen nuevas estrategias terapéuticas en la reparación y el trasplante de órganos y tejidos, y son una vía que puede proporcionar soluciones terapéuticas a diversas enfermedades que carecen hoy de tratamiento, y pueden mejorar de manera potencial las soluciones disponibles. Asimismo, la investigación en este campo proporcionará en breve información 3

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(Capítulo 1)

valiosa acerca de los mecanismos biológicos que regulan la viabilidad, la proliferación y la diferenciación celular en condiciones normales y patológicas. Varias enfermedades en las cuales existe un mal funcionamiento o la pérdida de tipos celulares específicos, en particular las afecciones relacionadas con el envejecimiento, carecen de un tratamiento efectivo, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la diabetes tipo 2, las enfermedades isquémicas del corazón y del sistema nervioso central, la osteoartritis, el envejecimiento del sistema inmunitario y la denominada inmunosenescencia. Por otra parte, cuando el daño y la pérdida celular se presentan de forma aguda a causa de traumatismos, quemaduras extensas e infartos, al problema principal se suma el mal funcionamiento tisular y orgánico, y el reemplazo de las células dañadas surge como una estrategia terapéutica más para su tratamiento. La pérdida de la función total y parcial de un tejido y de un órgano representa un alto costo económico y un problema de salud pública; es una prioridad en los sistemas mundiales de salud y las estrategias terapéuticas donde se intentan cuatro procesos: trasplantes homólogos, injertos autólogos, prótesis e ingeniería tisular.1 En la actualidad, el trasplante homólogo está limitado debido a la escasa cantidad de donantes. Cada año un número significativo de pacientes mueren en lista de espera y otro tanto no llegan a formar parte de las listas.2,3 En 1988, durante la conferencia de la National Science Foundation de EUA, se propuso definir la ingeniería tisular como “la aplicación de los principios y métodos de la ingeniería a las ciencias de la vida, por medio del entendimiento y el conocimiento formal de la estructura, la función y la interrelación de los tejidos humanos normales, para el desarrollo de sustitutos biológicos que permitan restaurar y mejorar la función humana”.4 La ingeniería tisular y la medicina regenerativa comienzan el desarrollo de la generación de tejidos y órganos funcionales in vitro, los cuales son implantados y usados en el manejo de los complejos procesos biológicos de remodelación y regeneración en diversas enfermedades y, cuando es posible, in vivo. Estos procesos involucran diseños complicados que combinan componentes biológicos vivos derivados de células y proteínas, las cuales se implantan en polímeros orgánicos y sintéticos para su construcción en un laboratorio.5 Como campo interdisciplinario, la ingeniería tisular conjuga los principios del trasplante celular e integra los fundamentos del diseño en ingeniería y la ciencia de los biomateriales; con esta metodología se intenta producir estructuras tridimensionales que deben funcionar como sustitutos biológicos, al imitar y repetir la estructura y la función de diversos tejidos.6 Los objetivos de la ingeniería tisular son fundamentalmente conservar la integridad tisular funcional, mantener la viabilidad de las células sembradas y lograr que el producto manufacturado tenga al final un uso y sea aplicado en la solución de diversas enfermedades.7

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Por otra parte, los retos que enfrentan la ingeniería tisular y la medicina regenerativa se orientan al estudio del control de la respuesta celular, al desarrollo de materiales con estructuras adecuadas que funcionen como una matriz extracelular y, finalmente, a la creación de un micromedio ambiente celular apropiado para la sobrevivencia de los órganos y los tejidos. Para alcanzar estas metas es indispensable crear estrategias novedosas y utilizar los métodos de ingeniería y los principios fundamentales del diseño de estructuras, todos indispensables y esenciales para generar tejidos viables nuevos.8 El desarrollo y la construcción de cada órgano y tejido tienen muchas variables, las cuales son inherentes a la estirpe embriológica, a la estructura macroscópica y microscópica y a la fisiología especializada que desempeña en particular cada órgano y tejido.9,10 A continuación se describen los elementos y las estrategias utilizadas en la ingeniería tisular, y los puntos más relevantes de cada uno. También se comentan los aspectos biológicos básicos celulares y moleculares los cuales dan los fundamentos para la formación de tejidos in vitro e in vivo: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Células, tejidos y cultivos celulares. Matriz extracelular (biomateriales, biomatrices, bioestructuras). Biomoléculas (factores de crecimiento) y señales mecánicas. Métodos de ingeniería y diseño. Integración vascular (angiogénesis). Regeneración, remodelación y respuesta inmunitaria.

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CÉLULAS, TEJIDOS Y CULTIVOS CELULARES En el cuerpo humano las células interactúan de manera continua con otras células y con la matriz extracelular que las rodea, y les sirve de soporte estructural. Las células de la mayor parte de los animales son altamente especializadas en forma y función, por lo cual no tienen la capacidad de una vida independiente y se encuentran agrupadas dentro de masas bien identificadas que desempeñan funciones específicas similares: los tejidos. Las diferencias estructurales y funcionales desarrolladas por los tejidos son consecuencia directa de fenómenos celulares y extracelulares. Todas las células de los tejidos están separadas e interconectadas por la matriz extracelular secretada por las propias células, la cual es distinta en cada tejido y puede ser líquida (sangre), semisólida (cartílago) y sólida (hueso). La actividad combinada entre las células y la matriz extracelular que las circunda produce las diferentes variedades de propiedades de los tejidos, como el transporte de sustancias o la función de la estructura de protección.

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Desde el punto de vista de la ingeniería tisular, de acuerdo con su función y su estructura, los tejidos se pueden clasificar en cuatro grupos en general: 1. 2. 3. 4.

Tejido epitelial, el cual cubre el cuerpo y la superficie de los órganos. Tejido conectivo, el cual une, protege y soporta las partes del cuerpo. Tejido muscular, cuya contracción produce movimiento. Tejido nervioso, el cual comienza y transmite los impulsos nerviosos de una parte del cuerpo a otra.

El cuerpo humano está formado aproximadamente por 60 mil millones de células, con 260 fenotipos diferentes. A lo largo de la vida, bajo condiciones normales y patológicas, estas células sufren de forma continua, dinámica y orquestada el proceso de diferenciación, el cual funciona en una secuencia de tiempo y espacio permitiendo integrar los sistemas de tejidos y órganos. El proceso de diferenciación comienza en la etapa más temprana del desarrollo embrionario; las distintas partes del embrión están programadas para utilizar un fragmento de su genoma para la formación de líneas celulares y de los futuros fenotipos que se adjudicarán y les permitirán distinguirse unas de otras dentro del mismo embrión. Por otra parte, las células madre adultas son una progenie especial de células presentes en los organismos multicelulares como el ser humano; poseen la capacidad de autorrenovarse de manera ilimitada y de dar lugar, mediante el proceso de diferenciación, a otros tipos celulares especializados. La función biológica principal de las células madre adultas es dirigir el desarrollo de los diversos procesos de homeostasis tisular, la regeneración de tejidos y órganos dañados, enfermos y envejecidos.11 Hasta hace poco tiempo se creía que las células madre adultas de un tejido sólo se diferenciaban y daban origen a tipos celulares del mismo tejido y órgano, y que únicamente las células madre embrionarias tenían la capacidad de generar cualquier tipo de tejido. Actualmente muchas observaciones experimentales y clínicas ponen de manifiesto que en el organismo humano adulto existen varios tipos de células madre, con una potencialidad más amplia de lo que se creía. El concepto de pluripotencialidad referido a las células madre adultas se sustituyó por el de “plasticidad”, el cual explica de forma más clara la capacidad de una célula madre de un tejido para poder generar células especializadas de un tejido diferente. Por ejemplo, la médula ósea posee células madre hematopoyéticas, las cuales tienen la capacidad de diferenciarse en distintas células sanguíneas maduras, en células progenitoras endoteliales y en células del estroma de la médula ósea, también denominadas células madre mesenquimatosas, las cuales conservan la capacidad de diferenciarse en las células maduras de varios tejidos mesenquimatosos, como la grasa, el hueso y el cartílago. En la médula ósea adulta se identificaron recientemente células que pueden diferenciarse en células no hematopoyéticas maduras de mu-

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chos tejidos como las células epiteliales del hígado, los pulmones, la piel, el tracto gastrointestinal, los miocitos cardiacos y las células del músculo esquelético; sin embargo, todavía es necesario conocer mejor los mecanismos involucrados en los procesos biológicos de estas células, los requerimientos indispensables para su diferenciación y la forma adecuada de aprovechamiento de la plasticidad de las células madre adultas para utilizarla con propósitos terapéuticos.12 Además de las células madre hematopoyéticas y de la médula ósea, el cordón umbilical, en su fracción mononuclear, también conserva una cantidad significativa de células madre progenitoras, las cuales pueden teóricamente transformarse en cualquier parte del organismo, incluso en neuronas; estudios realizados a una subpoblación de células de la sangre del cordón umbilical sugieren que la fracción mononuclear puede ser usada en el desarrollo de terapias celulares para el tratamiento de enfermedades y lesiones del tejido cerebral.13 Asimismo, mediante estudios de inmunohistoquímica y análisis genético in vitro del líquido amniótico, se demostró la existencia de células epiteliales las cuales tienen la potencia de diferenciarse en las tres capas germinales: endodermo (hígado, páncreas), mesodermo (cardiomiocitos) y ectodermo (células nerviosas). El tejido amniótico derivado de la placenta puede usarse después del nacimiento y no representa una fuente controversial de células madre; potencialmente puede ser utilizado para trasplantes celulares y para la construcción de tejidos.14 Estas células madre pueden ser cultivadas ex vivo y muestran una proliferación ilimitada y una capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula mesodérmica (osteoblastos, condroblastos, adipocitos, fibroblastos, mioblastos, entre otros). La posibilidad de utilizar estas células, normales y genéticamente modificadas en trasplantes autólogos proporciona una nueva estrategia en el tratamiento de pacientes con diversas enfermedades degenerativas.15 La sangre periférica circulante es otra fuente virtual de células madre multipotentes mesenquimatosas; se sabe que éstas comparten algunos marcadores de superficie con las células mesenquimatosas derivadas del estroma de la médula ósea, poseen una expresión genética diversa y complicada y tienen la capacidad de diferenciarse en muchas líneas mesenquimatosas. Sin embargo, la función fisiopatológica aún debe ser aclarada debido a que se sospecha que está relacionada con la migración sistémica de células multipotentes derivadas del estroma de la médula ósea y con la existencia de precursores mesenquimatosos hematopoyéticos.16 Por este motivo, es necesario identificar la fuente óptima de las células progenitoras para cada aplicación particular, así como seleccionar las diversas variedades, identificar el potencial de las células madre, elegir la mejor fuente (autóloga, homóloga o heteróloga) y buscar las células construidas genéticamente para cada órgano y tejido. Se han llevado a cabo múltiples investigaciones en relación con

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el método idóneo para obtener las células. Estos estudios están orientados a localizar una fuente de células madre adultas en tejidos tan diversos como la médula ósea, el periostio, el pericondrio y la dermis, entre otras. Una estrategia es trabajar con células de fenotipos específicos las cuales permitan mantener y regular la función dentro de las construcciones tisulares, y seleccionar los métodos particulares en cada caso para dirigir la proliferación, la diferenciación y la expansión de las células y su manipulación inmunitaria.17 Las células progenitoras adultas colocadas en un medio ambiente propicio (puede usarse en algunos casos la médula ósea) tienen la capacidad de diferenciarse e inducir la formación de tejidos como el músculo estriado, el miocardio, el hueso, el cartílago, las células sanguíneas, la piel, el hígado, las células del sistema nervioso y los islotes pancreáticos, entre otros.18 En ocasiones, una biopsia puede ser la fuente potencial de células específicas para la construcción de tejidos; cuando no es posible utilizar este método, el aporte celular puede provenir de una biopsia de otro tejido, es decir, de una fuente indirecta. Por ejemplo, para fabricar válvulas cardiacas, la fuente de células es una vena periférica la cual tiene características estructurales y funcionales semejantes.18 Asimismo, un método seguro y fácil para la construcción de válvulas cardiacas humanas se logra con el uso de células endoteliales progenitoras autólogas para el reemplazo de una válvula pulmonar; al parecer, el tejido tiene la capacidad de crecer a la par del organismo de los niños en quienes se implantó este tejido.19 En la ingeniería tisular, por lo general las células deben cultivarse para crear tejidos funcionales y estructuras biológicas in vitro; los cultivos promueven la sobrevivencia y el crecimiento, e inducen su funcionalidad. En términos generales, los requerimientos básicos para mantener un cultivo celular incluyen niveles adecuados de oxígeno, de pH, de humedad y de temperatura, así como un aporte óptimo de nutrientes y la manutención de las presiones osmóticas apropiadas para cada tejido. Los cultivos estándar en la ingeniería tisular utilizan la difusión como medio único de transporte de nutrientes y metabolitos; sin embargo, los requerimientos de los órganos grandes y de los tejidos son más complejos, por lo que debe recurrirse a otras estrategias de conservación de los cultivos. Asimismo, para mantener la funcionalidad de los cultivos deben usarse factores y estímulos adecuados, entre los cuales figuran los factores de crecimiento, las hormonas, los nutrientes y los metabolitos específicos. En ocasiones se requieren estímulos físicos y químicos. Por ejemplo, como parte de su desarrollo normal, algunas células responden a cambios de tensión del oxígeno, como sucede durante el desarrollo esquelético con los condrocitos, los cuales se adaptan a las condiciones bajas de oxígeno (hipoxia); otras células, como las endoteliales, responden al estrés del flujo sanguíneo de los vasos sanguíneos.

Ingeniería tisular: del laboratorio a la aplicación clínica

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Matriz extracelular (biomateriales, biomatrices, bioestructuras) El futuro de la ingeniería tisular y de la medicina regenerativa depende, entre otros recursos, del uso de biomateriales que imiten lo más posible la función de los tejidos, es decir, que posean características biomiméticas, biocompatibles y biodegradables, que propicien y estimulen el proceso de angiogénesis y, con preferencia, que sean estructuras tridimensionales estimuladoras de la respuesta natural de la curación de los tejidos, de los mecanismos propios de reparación y del proceso de regeneración. La matriz extracelular era considerada únicamente como una superficie estructural de soporte para las células y los tejidos; hoy se reconocen e identifican dos tipos: la soluble y la insoluble, las cuales además de tener propiedades estructurales, mecánicas y físicas, son funcionales, características y exclusivas de cada tejido (proporcionan fuerza al hueso, flexibilidad al cartílago y elasticidad a la piel, entre otros). Durante el desarrollo embrionario, la reparación de las heridas y el proceso de fibrosis, las células sintetizan y remodelan su propia matriz extracelular; el metabolismo celular dedica una cantidad importante de energía y de tiempo para transformar e interactuar con la matriz extracelular. Actualmente la matriz extracelular es denominada un sistema dinámico integrado por diversas moléculas. Por ejemplo, los 19 tipos diferentes de colágena (proteína fibrosa considerada como el mayor componente de la matriz extracelular) proporcionan la fuerza de tensión y, junto con otros componentes, facilitan la integridad estructural tisular. En la formación de la matriz extracelular también participan glucoproteínas, ácido hialurónico, proteoglicanos, glucosaminoglicanos, elastina y fibrina. Éstos interactúan con los diversos factores de crecimiento, citocinas y enzimas, y su organización y composición varían en cada órgano y tejido. La dinámica de acción entre la matriz extracelular y las células ocasiona la migración celular, la proliferación, la diferenciación, el metabolismo y el proceso de apoptosis.20 Entre las metas de la ingeniería tisular está el desarrollo de biomateriales con una función estructural y propiedades biológicas que propicien y permitan el crecimiento directo, la diferenciación y la organización del complejo celular durante el proceso de formación funcional de los tejidos, con espacios físicos y químicos para el desarrollo de los mismos. Inicialmente las estructuras utilizadas, como la matriz extracelular, procedían de materiales quirúrgicos sintéticos. En la actualidad diversos biomateriales se encuentran en investigación y desarrollo, especialmente los polímeros biocompatibles y biodegradables con características específicas, sobre todo en cuanto a diseño se refiere, que sean capaces de adaptarse a necesidades particulares. Estos biomateriales tratan de imitar la arquitectura y la composición física y química de cada tejido en particular; su funciones principa-

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les son servir como guía temporal para el crecimiento y organización de las células nuevas y proporcionar señales específicas que retengan la expresión genética de cada tejido.21 Para la elaboración de estos biomateriales se utiliza una gran variedad de polímeros de origen biológico, naturales y sintéticos, como el ácido poli–L láctico, el ácido láctico coglicólico y el ácido glicólico. Sin embargo, debido a que estos polímeros biocompatibles pueden sufrir degradación por simple hidrólisis tienen que ser aprobados por la Food and Drug Administration. Asimismo, existen otros compuestos que pretenden sustituir la matriz extracelular; sus tareas principales son actuar como una estructura sustituta y proporcionar un armazón temporal con una función biomecánica y una función bioquímica en tanto que las células sembradas logran producir, ordenar y estabilizar la función de su propia matriz extracelular. Durante este proceso, de modo ideal deben ser metabolizados o degradados por el propio tejido.22 La ingeniería tisular moderna utiliza matrices bioactivas y bioabsorbibles cuya función principal es modular una respuesta celular in vivo apropiada; la intención es continuar el desarrollo de las funciones biológicas de los tejidos después de la implantación. Con esta estrategia deben tenerse en cuenta variables como la respuesta individual, la reabsorción, la repoblación celular y la regeneración en el implante. Varios materiales sintéticos nuevos, procesados mediante diversas técnicas, se emplean para elaborar matrices de gran complejidad; por ejemplo, los tubos para construir intestino y vasos sanguíneos. Es posible proporcionar a estos materiales las características específicas para que formen partes del cuerpo tan complejas como el cartílago de la oreja o las válvulas cardiacas.23 Algunos estudios experimentales demostraron que los polímeros naturales, como los proteoglicanos y la colágena, participan de manera fundamental en la determinación del fenotipo celular. Por ejemplo, el fenotipo de los condrocitos puede conservarse con la presencia de colágena tipo II, la cual induce la diferenciación final hacia la línea cartilaginosa.24 Una variedad con número suficiente de células debe integrarse de manera ordenada y distribuirse en el espacio de una arquitectura específica; esta secuencia es imprescindible para el crecimiento tisular. La matriz extracelular representa la arquitectura. Al integrarse, las células comienzan el crecimiento dentro de una secuencia ordenada de eventos que ocurren a intervalos de tiempo preciso, en un rango de segundos, horas, días, semanas y meses. A las diferentes matrices extracelulares biodegradables se han incorporado señales moleculares solubles e insolubles y factores de crecimiento que interactúan con las diversas fuerzas mecánicas para promover adherencia, migración, división y diferenciación celular dentro de las estructuras tridimensionales. De modo ideal, los biomateriales deben ser degradados por las propias células; el proceso

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es definido por la composición del material, la superficie química y la topología. Durante este proceso, el tejido construido debe formar su propia matriz extracelular permanente. Varios materiales estructurales bioactivos tienen como funciones liberar de manera fisiológica los factores de crecimiento y servir como vehículos de transporte para inducir la liberación de moléculas dentro de las construcciones tisulares y generar una interacción entre las células y la matriz extracelular, por medio de la acción de las moléculas de adhesión, para dirigir así la formación tisular tridimensional.25 Para sembrar hepatocitos cultivados se requiere una matriz extracelular adecuada la cual les permita mantener la polarización epitelial, evento fundamental para la formación de tejido hepático nuevo.26 En conclusión, el número de células involucrado directamente durante el proceso, las señales moleculares y mecánicas, y la orientación espacial de la adhesión celular son cruciales para la migración y la diferenciación celular en los tejidos construidos. Las investigaciones enfrentan retos en la construcción de estructuras en las cuales debe controlarse la distribución espacial de las células y la combinación apropiada de los factores de crecimiento, mismos que pueden tener efectos positivos o negativos dependiendo de su concentración. Sin embargo, todavía existen preguntas por contestar en el terreno de los biomateriales: S ¿Cuál es la mejor forma de sembrar las células en la estructura? S ¿Cómo se infiltran las células en la estructura? S ¿Cuáles dimensiones y composición de la estructura permiten la mejor distribución de las células? S ¿Cómo se adhieren las células a la estructura y cómo migran? S ¿Qué efectos fisiológicos resultan en las células a causa de la interacción entre la estructura y las células? S ¿Cuál es la vida media de los compuestos bioquímicos y cuáles son sus efectos sobre la estructura del biomaterial? S ¿Qué efectos tóxicos ocurren debido a la interacción entre células, estructura y moléculas reguladoras? Existen otras tantas interrogantes que no están relacionadas con la estructura individual. Con el propósito de crear una estructura compleja tisular viable y escalable para cada tejido es recomendable el desarrollo de una guía.

Biomoléculas (factores de crecimiento) y señales mecánicas Los factores del crecimiento son las moléculas reguladoras las cuales afectan la función celular y tisular, influyen en la diferenciación, modifican la actividad

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bioquímica y regulan la proliferación celular. Estas moléculas ejercen su acción durante las etapas del desarrollo embrionario; en la vida posfetal, intervienen en la curación de las heridas y son determinantes en el desarrollo de los procesos tumorales. Hay identificados alrededor de 100 factores del crecimiento. Fundamentalmente se trata de proteínas pequeñas solubles compuestas por menos de 100 aminoácidos, las cuales influyen de manera esencial en el crecimiento. Los factores del crecimiento son denominados mitógenos y para ejercer su acción emiten una señal binaria: su presencia ocasiona el crecimiento celular y su ausencia lo detiene. Actúan como mensajeros intracelulares y, junto con las hormonas y los neurotransmisores, desempeñan una función importante en la relación celular mediante la comunicación autocrina, la comunicación paracrina y la comunicación de forma sistémica, es decir, la endocrina. La información que las células reciben es una mezcla de varios factores que a su vez responden a otros. Al recibir las señales en los receptores de la superficie de la célula, los factores del crecimiento logran ocasionar su desarrollo. Su función principal es el control externo del ciclo celular mediante el abandono de la quiescencia celular y la provocación a la célula para que entre en fase G1. Asimismo, la función de los factores del crecimiento está regulada por los diferentes mecanismos que controlan la activación genética, como la transcripción y la traslación del gen del factor del crecimiento y la modulación de la emisión de la señal por el receptor. El control de la respuesta celular por medio de moléculas con acción opuesta a la respuesta inicial es atrapado dentro de la matriz extracelular. Durante el ciclo celular, la respuesta al medio ambiente extracelular es dictada y mediada por las señales químicas moleculares y mecánicas transmitidas al núcleo de la célula, en el cual se desencadena la expresión y la represión de los genes; los productos de esta respuesta tienen la función de regular la división celular, la migración, la diferenciación y, al final, la apoptosis.27 La información aportada por las señales moleculares y mecánicas es utilizada como una estrategia metodológica en la construcción de tejidos in vivo e in vitro. Esta información fue obtenida mediante estudios de poblaciones celulares cultivadas en dos dimensiones, en las cuales se utilizaron de manera selectiva varios factores solubles de crecimiento para lograr el medio ambiente que permitió el crecimiento y el desarrollo tisular.28 Actualmente es mejor comprendida la importancia de la señal molecular dentro de los cultivos tridimensionales, del cambio de la función en la proliferación celular y de la interrelación con el tiempo y las fuerzas aplicadas durante la construcción de los tejidos. El tiempo en el cual se realizan estas acciones se denomina la cuarta dimensión y el medio ambiente celular creado es reconocido como la quinta dimensión. Todas estas variables participan de manera crucial a lo largo de la construcción tisular.29 Estos conocimientos permiten cambiar la construcción de algunos tejidos, de cultivos celulares bidimensionales a cultivos tridimensionales. Hacen posible

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crear un medio ambiente celular óptimo para propiciar la interacción entre las células y una adecuada función de los sistemas receptores de las señales moleculares, logrando así la integración y el ensamble dentro del ciclo celular. También permiten completar la información y encontrar las vías específicas de fenotipos celulares para integrarse a los complejos multimoleculares.30 Hoy es posible realizar cultivos tridimensionales para formar huesos con las propiedades necesarias para la función del tejido esquelético, sobre todo la función relacionada con el soporte de la carga mecánica.31 El estudio del desarrollo embrionario y del control de la expresión genética de la vida posnatal debe aportar nueva información para comprender los fenómenos de la división y la diferenciación celular que, de acuerdo con lo que hoy se sabe, pueden mantener el mismo fenotipo cuando están regulados por los adecuados factores del crecimiento solubles e insolubles, las moléculas de adhesión, la matriz extracelular y las fuerzas mecánicas. Esta última regulación mecanocelular es un proceso que influye en la expresión de los genes dentro de las vías metabólicas y en la estructura arquitectónica tisular ósea. Entre los múltiples estímulos físicos a los cuales están sometidos los tejidos, la gravedad es la fuerza mínima a la que están expuestos. Otros estímulos, como la fuerza de tensión y la carga mecánica, se suman a las señales moleculares que influyen en la estructura y la fisiología tisular desde la diferenciación, el crecimiento y la apoptosis.32

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Métodos de ingeniería y diseño Las construcciones tisulares tridimensionales se obtienen de la tríada conformada por las células, las señales moleculares y las matrices extracelulares. El estándar de oro son las células autólogas, las cuales permiten crear un tejido y un órgano vivo funcional y permanente sin problemas de inmunidad. Hasta hace unos años, el diseño de los tejidos con ingeniería tisular se realizaba en dos dimensiones; sin embargo, hoy se estudian los mejores métodos para obtener el crecimiento en tres dimensiones, usando estrategias como el encapsulamiento celular y la tecnología de los biorreactores. Asimismo, se investiga la forma en la cual se puede lograr la vascularización de los tejidos in vivo, y la preservación, el almacenaje y el transporte de las células y los tejidos.33 Las características anatómicas y fisiológicas son los aspectos en los cuales debe fundamentarse el diseño en ingeniería tisular. En las funciones biomecánicas, las señales mecánicas son esencialmente las reguladoras de la función de cada tejido, y son el resultado de la escala jerárquica desde el nivel molecular hasta el nivel celular, la estructura macroscópica, la fisiología de la matriz extracelular y la secuencia del tiempo en la cual las señales moleculares ejercen su acción

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sobre los tejidos. Todos estos representan factores fundamentales en el diseño y la construcción tisular e indican si deben utilizarse técnicas in vitro o técnicas in vivo.34 Con el fin de construir cada tejido debe establecerse un estudio cuidadoso. Para ilustrar este tema se presenta como ejemplo el modelo experimental de inducción extraesquelética de hueso en implantes abdominales vascularizados con epiplón, en el cual se integró la tríada compuesta por células, matrices extracelulares y factores de crecimiento. Las células fueron aportadas por el periostio y se les atribuyó una capacidad osteoprogenitora. Las matrices extracelulares utilizadas fueron la colágena tipo I y polvo de hueso desmineralizado. Los factores de crecimiento autólogos se derivaron de un concentrado de las plaquetas. Como resultado se obtuvo la formación progresiva de hueso de características normales en la pared abdominal de perros.36 Entre las estrategias del diseño se debe tener en cuenta la participación de la carga mecánica que se ejerce en un tejido como el hueso, y la participación de la conducción eléctrica, como sucede con la contracción del corazón.32

Integración vascular (angiogénesis) El proceso de angiogénesis consiste en el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los existentes. La inducción debe ser utilizada para evitar la isquemia y, por lo tanto, la necrosis tisular. La sobrevivencia de los tejidos depende de múltiples variables. El desarrollo de vasos nuevos debe ser generado dentro de los 3 a 5 días posteriores al trasplante.36 Uno de los retos de la ingeniería tisular es crear un órgano vital complejo, como el hígado, los riñones y el corazón. Teóricamente esto es posible, aunque, el problema fundamental radica en crear una estructura o matriz que sirva de patrón para el desarrollo de un sistema microvascular, elemento indispensable para el aporte adecuado de nutrientes y para remover los elementos de deshecho metabólico de los órganos.37 Las construcciones tisulares tridimensionales se pueden lograr si se consigue establecer un patrón de vascularidad específico para cada órgano y tejido. Hoy se analizan los diversos patrones de las estructuras microvasculares con el objetivo de conocer, para cada órgano y tejido, cuáles pueden ser los mejores prototipos para generar una nueva vasculatura in vitro e in vivo. Durante los procesos de formación tisular y de reparación de tejidos, la nueva vasculatura debe aportar, entre otras cosas, niveles adecuados de oxígeno y nutrientes, elementos indispensables para la sobrevivencia tisular.38

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La ingeniería tisular trabaja en el desarrollo de un modelo que sirva como patrón para formar un sistema vascular tridimensional para cada órgano e incorporarlo al diseño de la construcción de diversos órganos y tejidos.39 Por ahora es poco probable que pueda desarrollarse una estructura de microfabricación vascular específica, debido a la dificultad de penetrar y alcanzar la longitud suficiente en el interior de la compleja estructura del tejido. Sin duda, estudiar los fenómenos que ocurren desde el desarrollo embrionario aportará conocimientos nuevos a los principios de formación de los órganos y los tejidos, cuando se logre identificar los diversos estadios celulares de diferenciación y el mecanismo que regula la vasculogénesis para interrelacionarlo con los mecanismos y las vías metabólicas que se desencadenan durante la angiogénesis, y con los generados después de una lesión y la reparación inmediata de los tejidos. De esta manera se podrá evidenciar la participación de las señales moleculares y mecánicas causantes de la formación de la red vascular (celular y molecular), determinantes en el proceso de la neoangiogénesis.40,41

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REGENERACIÓN, REMODELACIÓN Y RESPUESTA INMUNITARIA La regeneración es un proceso biológico complejo mediante el cual partes del cuerpo son restauradas después de una lesión y una amputación. El proceso necesita la acción coordinada de los mecanismos que ocasionan y regulan la diferenciación y la transdiferenciación celular. Aunque los embriones de la mayoría de los vertebrados muestran una capacidad notable para regenerar estructuras dañadas, esta aptitud disminuye conforme avanza el desarrollo embrionario. En la vida posnatal a medida que el envejecimiento progresa la capacidad regenerativa aminora de manera notable. Una excepción a esta regla relacionada con la regeneración son los anfibios urodelos (tritones, ajolotes y peces teleósteos [pez cebra]), los cuales tienen la singular capacidad de regenerar tejidos e incluso órganos enteros a lo largo de toda su vida. Estos animales son modelos de estudio del fenómeno de regeneración. La respuesta biológica que ocurre durante los procesos de remodelación, reparación y regeneración es esencial, inevitable, necesaria y benéfica en el transcurso de la vida; el desarrollo de la cascada seriada de eventos normales propicia la curación de los tejidos. Sin embargo, existen muchas variables que modifican su desarrollo, como la edad, los procesos infecciosos y el estado previo de salud. El desarrollo anormal de la reparación tisular produce la formación de una cicatriz, la cual representa un obstáculo para la regeneración normal. Por esta razón se debe controlar de manera adecuada la inflamación, la infección y la inmunidad, y cuidar que estos procesos tengan un desarrollo normal.42

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(Capítulo 1)

CONCLUSIONES Y FUTURO Aunque los conocimientos obtenidos son muchos, todavía es necesario responder de manera puntual algunas preguntas relacionadas con el origen de los tejidos y sus funciones: S S S S S

¿Cómo saben las células en qué tejido madurar? ¿Cómo deben mantener los tejidos su identidad estructural? ¿Cómo coordinan los tejidos sus actividades dentro del cuerpo? ¿Por qué algunos tejidos pueden regenerarse y otros, al parecer, no? ¿Por qué los recién nacidos desarrollan menos tejido cicatricial?

La ingeniería tisular y su aplicación clínica han logrado múltiples avances en la medicina regenerativa. Actualmente la mayor parte de los órganos y los tejidos pueden ser elaborados en el laboratorio; sin embargo, todavía existen limitaciones para la aplicación clínica, razón por la cual es necesario implementar estrategias para solucionar los distintos obstáculos, entre ellas están: 1. Fabricar estructuras de polímeros que imiten exactamente la arquitectura de los órganos y los tejidos, que faciliten la acción de las señales moleculares y que interactúen con las células permitiéndoles la diferenciación, el crecimiento y la integración de todos los elementos para que funcionen como un sistema viviente. 2. Identificar una fuente específica y abundante de células madre pluripotenciales con capacidad de proliferar y llegar a establecer líneas celulares especializadas que induzcan, por ejemplo, la formación de hueso, cartílago, músculo, grasa, músculo cardiaco, etc. 3. Aislar y purificar las líneas celulares, estabilizar las líneas de crecimiento celular en cultivos por periodos largos y sin que ocurran mutaciones, manufacturar líneas celulares en cantidades suficientes para utilizarlas en diversas terapias, diferenciar células madre en todos los tipos celulares deseados para aplicarlas como tratamientos, y solucionar el rechazo potencial de las células madre homólogas debido a inmunoincompatibilidad. La investigación, el desarrollo tecnológico y la aplicación clínica de la ingeniería tisular en la medicina regenerativa representan una promesa revolucionaria en la atención de la salud, debido a las nuevas soluciones terapéuticas para los defectos de nacimiento; las lesiones traumáticas del aparato musculosquelético y de la médula espinal; las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson; las enfermedades crónico–degenerativas como la diabetes; las enfermedades del sistema cardiovascular; el cáncer, y la falla orgánica del hígado y del riñón.

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Hoy la ciencia cuenta con una multitud de conocimientos y una cantidad considerable de estos son aplicables a la práctica clínica. Se han conformado grupos multidisciplinarios dedicados a estudiar los diversos procesos y los fenómenos involucrados. La aplicación de los conocimientos básicos a la práctica clínica diaria aumenta rápidamente y es posible ayudar a la solución de los muchos problemas clínicos en los cuales no existía una solución satisfactoria.

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2 Perspectivas de la biología y la medicina regenerativa

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Daniel Ascencio González

La medicina regenerativa en el siglo XXI está a la vanguardia del desarrollo biotecnológico, crece con rapidez e inicia una revolución en la atención a la salud, ya que ofrece tratamientos potenciales a enfermedades que no los tenían. En la actualidad existe la posibilidad de manufacturar tejidos y órganos biohíbridos autólogos para regenerar o sustituir los dañados por enfermedades, lesiones o anomalías congénitas. Los trasplantes han revolucionado la atención a la salud y representan una solución para mantener la vida de un enfermo; sin embargo, tienen complicaciones y limitaciones importantes como la escasez de donantes, la posibilidad real y devastadora del rechazo, el ineludible tratamiento con inmunosupresores, el alto costo de realización y la falta de cultura de donación, entre otros más. Es muy alto el costo por el daño o pérdida de órganos y tejidos por enfermedades propias de la vejez, crónicas degenerativas, traumas o enfermedades congénitas; las pérdidas económicas son enormes en cuanto a productividad, disminución de la calidad de vida y muerte prematura, por lo que es necesario encontrar soluciones más fáciles, económicas y definitivas en los tratamientos de estas patologías. La medicina regenerativa ha emergido como un campo interdisciplinario producto de la investigación básica, que maneja conocimientos de la biología molecular, celular y del desarrollo, así como genética, ciencia de los biomateriales, bioingeniería e ingeniería tisular, con el objetivo de reintegrar estructuras y funciones al organismo, e innovar las terapias tradicionales en el trasplante con diversas estrategias, como: 19

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S Inducir la regeneración autónoma de los tejidos dañados. S Construir tejidos en el laboratorio con biomateriales. S Trasplantar el tejido a medios ambientes enfermos o dañados para inducir los procesos de regeneración. Dichos tratamientos permiten fundamentalmente dos avances: S El potencial real de regenerar in vivo los tejidos dañados irremediablemente. S Producir en el laboratorio tejidos in vitro para trasplantarlos cuando la regeneración no sea posible. Esto implica proporcionar terapéuticas definitivas a tejidos y órganos dañados de manera irreversible.1 Tener tejidos y órganos disponibles para tratar a los pacientes creó el concepto de generar “tejidos y órganos para la vida”. Virtualmente puede curar de manera definitiva enfermedades cardiacas, renales, musculosqueléticas y degenerativas del sistema nervioso central, así como diabetes, osteoporosis, lesiones de la médula espinal y quemaduras, entre otras. En la inducción de los procesos de regeneración se utilizan las propias células del individuo y se maneja el medio ambiente de la lesión o la respuesta de las células competentes con capacidad regenerativa. Por lo tanto, es fundamental entender la biología y los mecanismos de regeneración, que se establecen como prerrequisito para el desarrollo y la aplicación clínica de la medicina regenerativa.2 Entre los objetivos de la medicina regenerativa está definir los factores que inician, inducen y regulan la respuesta regenerativa, y establecer las diferencias con la respuesta fibrótica, para aplicar estos conocimientos en la regeneración funcional de los tejidos incapaces de regenerase espontáneamente o donde la respuesta está comprometida. En este capítulo se revisan los conceptos actuales de la regeneración, el paradigma de la cicatriz fetal, la herida sin cicatriz, la biología de las células madre en los procesos regenerativos y la ingeniería tisular, que fundamentan las nuevas terapéuticas.

PROCESOS REGENERATIVOS Para perpetuar las especies es necesario tener una población suficiente que alcance la madurez reproductiva y no muera de manera prematura. Por lo tanto, los organismos necesitan establecer mecanismos homeostáticos para mantener su

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integridad mediante procesos entrópicos, que equivale propiamente la regeneración de órganos y tejidos.3 Los organismos multicelulares se regeneran mediante tres mecanismos: la hiperplasia compensatoria, la desdiferenciación transdeterminada de las células maduras y la activación de las células madre.3 La regeneración es un proceso biológico universal que varía en cada especie dependiendo de la capacidad intrínseca y el nivel de organización biológica y de cada parte del organismo. En los vegetales una célula es capaz de regenerar la totalidad del organismo. Por ejemplo, las planarias regeneran todo su cuerpo a partir de un fragmento.4 La medicina regenerativa se fundamenta en las observaciones de especies inferiores, en especial los anfibios, por la capacidad excepcional de regenerar miembros completos, como la cola, la mandíbula y la retina.5 En la escala superior los mamíferos también presentan fenómenos de regeneración completa de tejidos, como el crecimiento estacional de las cornamentas de los ciervos, los conductos auditivos del conejo y las alas de los murciélagos, así como la regeneración postraumática de la falange distal de los dedos de los neonatos.6,7

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BIOLOGÍA DE LA REGENERACIÓN Los mecanismos celulares de la regeneración son esencialmente dos: la morfolaxis y la epimorfosis. La morfolaxis es la regeneración por remodelación del tejido remanente de la parte perdida, donde la proliferación celular es mínima y el proceso se desarrolla por reorganización o intercambio; el ejemplo clásico de esta forma regenerativa es la hidra, que cuando se corta en dos fragmentos, cada uno se regenera en tamaño menor y una vez terminada la regeneración los fragmentos continúan creciendo hasta alcanzar el tamaño original. En contraste, la epimorfosis se caracteriza por una intensa proliferación celular para el reemplazo del fragmento perdido. El proceso se subdivide en desdiferenciación dependiente e independiente. A través de este último proceso se regeneran las planarias a partir de las células madre preexistentes, los neoblastos inician la proliferación y migración al sitio dañado y forman una masa celular proliferativa: el blastema de regeneración, que más tarde se diferenciará en células especializadas dentro de la estructura regenerada. Los anfibios, que incluyen salamandras, tritones y ajolotes, tienen la capacidad excepcional de regenerar estructuras complejas, como miembros, colas y mandíbulas mediante el mecanismo de epimorfosis, dependiente de la desdiferenciación.8 Los mamíferos no

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pueden regenerar estructuras amputadas, excepto las mencionadas. La mayor parte de la regeneración que ocurre en los mamíferos pertenece a la subclase de la desdiferenciación independiente; es decir, pueden regenerar músculo, hueso, epitelios de la piel e intestino, sangre y neuronas mediante la activación de las células madre residentes en el mismo tejido u órgano o partir de células progenitoras.9 Durante la curación las células pueden reparar o regenerar órganos y tejidos, y reducir el tamaño de un área dañada o necrótica por eliminación del tejido necrótico y por demolición o reemplazo del tejido. La reparación de una herida y la regeneración tisular están presentes en todos los organismos multicelulares y son indispensables para su supervivencia. Después de la lesión o del proceso degenerativo los organismos multicelulares restituyen su homeostasis mediante dos procesos. El primero consiste en la sustitución de la matriz celular, que restablece inmediatamente la continuidad anatómica y ocasionalmente la fisiológica; este proceso consiste en la cicatrización, que representa la reparación por reemplazo con tejido cicatrizal sin características anatómicas ni funcionales.10 El segundo es la recapitulación de los procesos de desarrollo embrionario que formaron la arquitectura del órgano dañado y consiste en un proceso real de regeneración donde fundamentalmente se restituye un tejido de características anatómicas y fisiológicas idénticas a las del original.11

NIVELES DE ORGANIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS PROCESOS DE REGENERACIÓN La regeneración a nivel celular se desarrolla de dos maneras: cuando las células no tienen diferenciación terminal y logran entrar nuevamente en el ciclo celular como respuesta a las señales generadas en el medio ambiente de la lesión; y cuando la disolución de la matriz extracelular circunda a las células de manera invariable, lo cual indica que la matriz extracelular es un regulador importante durante el estado de diferenciación.12 A nivel molecular todas las células regulan la síntesis de proteínas como respuesta a la generación de señales bioquímicas o cargas mecánicas. Por ejemplo, los cardiomiocitos reemplazan la mayor parte de sus moléculas y aumentan la síntesis de proteínas cuando se incrementa la presión arterial o en la hipertrofia cardiaca.13 A nivel celular los organismos unicelulares pueden regenerarse con una parte del material nuclear. En los vertebrados, los axones de los nervios sensoriales y motores tienen la capacidad de regenerarse in vivo después de sufrir un corte; si permanecen intactos los tubos endoneurales, el extremo proximal del axón se

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aísla e inicia un brote de regeneración, en tanto que la porción distal se degenera más tarde en la parte proximal y avanza un cono de crecimiento a través de los tubos de las células de Schwann, para formar nuevas sinapsis que finalmente llegan al músculo y la piel.14 La regeneración a nivel tisular requiere: S Que los tejidos contengan células mitóticas competentes con receptores para señales moleculares y mecánicas, y vías de transducción que respondan y propicien un medio ambiente favorable. S Que el medio ambiente envíe señales idóneas que permitan la proliferación y diferenciación celular organizada, tanto en el sitio de la lesión como a nivel sistémico. S Que los factores que inhiben la regeneración se supriman o neutralicen. Los medios ambientes regenerativos o fibróticos son favorables para la regeneración vascular, que es esencial para la nutrición de los tejidos. La sangre, los epitelios, el pelo y las uñas tienen células mitóticas competentes capaces de regenerar tejido nuevo como respuesta al daño.15 También hay en el hueso, músculo esquelético, hígado, pequeños vasos sanguíneos, corteza suprarrenal y epitelio del riñón.

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PARADIGMA DE LA REPARACIÓN FETAL SIN CICATRIZ De manera distinta a lo que ocurre en la vida adulta, el feto en las etapas tempranas del desarrollo puede curar heridas de la piel sin formar una cicatriz.16 En esta etapa, la epidermis y la dermis se regeneran con una arquitectura normal, sin cambios estructurales en los patrones de la matriz de colágena reticular de la dermis, la glándula sudorípara y el folículo piloso.17 Hay pruebas claras de que el proceso inflamatorio desempeña el papel más importante en la reparación posnatal, ya que éste no está presente en las heridas fetales de la piel en cantidades significativas en las etapas tempranas del desarrollo. La tensión de oxígeno local puede alterar el equilibrio entre la regeneración y la formación de la cicatriz en diversas lesiones. Un prototipo de la herida que regenera sin cicatriz es la fetal, por su desarrollo en el medio ambiente relativamente hipóxico del útero. Se ha demostrado que si se mantienen condiciones hipóxicas constantes en heridas de piel durante la fase regenerativa sin cicatriz, existe poca expresión del factor inducible de hipoxia–1a (HIF–1 a), mediador central de la transcripción celular, que responde a la tensión de oxígeno y controla la cascada de genes implicados en la angiogénesis y la inflamación. En contraste, las heridas

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durante el tercer trimestre de la vida intrauterina muestran niveles altos de HIF–1a, similares a los encontrados en las heridas del adulto. Estos datos se vinculan con la reducción de HIF–1a y una respuesta débil a la hipoxia en el fenotipo regenerativo observado en el feto.18,19 La comprensión de la biología de la cicatrización fetal sin formación cicatrizal en la reparación de las heridas ayudará a desarrollar estrategias terapéuticas para reducir al mínimo la cicatriz y la fibrosis.

MECANISMOS DE REGENERACIÓN La proliferación de células diferenciadas con capacidad regenerativa induce el proceso, donde las células son liberadas de su matriz extracelular, se dividen y mantienen todas o algunas de sus funciones de diferenciación. El ejemplo clásico de la regeneración por hiperplasia compensatoria es el hígado después de una hepatectomía parcial; los hepatocitos, las células no parenquimatosas, las células de Kupffer y las células epiteliales se dividen y realizan sus funciones endocrinas y exocrinas hasta que la masa original del hígado se restituye.20 Otros tejidos que se pueden regenerar por el fenómeno de hiperplasia compensatoria son las células b de los islotes pancreáticos, los vasos sanguíneos y el músculo cardiaco.21

CÉLULAS MADRE Las células madre tienen las características de autorrenovarse y de dar lugar a células con capacidad de diferenciación. El desarrollo del embrión inicia con el cigoto totipotente, con capacidad para dar lugar a cualquier tejido, incluida la placenta. El blastocisto se forma después de 7 u 8 divisiones celulares del huevo fertilizado. La totalidad de los trillones de células del cuerpo humano adulto tiene su originen en las 100 células embrionarias derivadas del blastocito antes de su implantación; la masa interna está formada por 15 y 30 células que tienen la característica de ser pluripotentes; es decir, capaces de generar todos los tejidos y órganos durante el desarrollo embrionario.22 Las células expresan antígenos, anticuerpos específicos y sustancias características del estado embrionario, como los antígenos 3 y 4 (SSEA3 y 4), los anticuerpos TRA–1–60 y –81, la fosfatasa alcalina y niveles altos de telomerasa. Si las células madre embrionarias son aisladas en una etapa temprana o son cultivadas por periodos largos, particularmente las células de la masa interna del blastocisto, son consideradas pluripotentes por la capacidad para dar origen a cual-

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quiera de los más de 200 tipos celulares diferenciados que forman el cuerpo humano. Antes de la implantación, la pluripotencialidad de las células está restringida al epiblasto del embrión. Las células del epiblasto progresivamente se diferencian en las tres capas germinales embrionarias: ectodermo, mesodermo y endodermo, de los cuales se diferencian todos los tejidos humanos adultos.23 Por su característica de autorrenovación, las células madre representan una fuente ilimitada de células potencialmente funcionales para la investigación básica y la aplicación clínica en medicina regenerativa. Los múltiples estudios experimentales en animales han demostrado su potencial terapéutico regenerativo y ahora se inicia la caracterización de las células madre humanas y se mejorarán los cultivos, la expansión a largo plazo, el manejo de la diferenciación; junto con el mejor conocimiento de la fisiopatología de las enfermedades, que debe llevar a la aplicación clínica de los conocimientos. Es posible implantar células madre totipotentes o pluripotentes para inducir la proliferación y la diferenciación celular. Las células madre se diferencian, proliferan extensamente y generan casi todos los tipos celulares.24 El mejor ejemplo es el trasplante de la médula ósea para el tratamiento de la leucemia en pacientes que no pueden producir suficientes células sanguíneas sanas. Las células madre hematopoyéticas se obtienen de la médula de un donante y se inyectan en la circulación sanguínea, donde crecen en la médula del receptor y producen células sanas.25 Otra fuente de células madre con gran potencial regenerativo es el embrión humano, aunque debido a las controversias éticas se han iniciado estudios para utilizar la sangre del cordón umbilical como fuente de células madre.26 Las múltiples investigaciones tienen el fin de entender cómo inducir las células madre para que logren la diferenciación en las células que se necesitan. En ciertos casos, cuando se implantan células madre diferenciadas y se agregan señales locales, como factores de crecimiento, se alcanza el propósito.27 Muchos tejidos están sujetos a un proceso continuo de renovación celular, como el tejido hematopoyético y los tejidos unicelulares, como los epitelios de la epidermis y la mucosa intestinal; esta renovación se considera un proceso homeostático de mantenimiento.28 Casi todos los tejidos se regeneran cuando sufren un daño, mediante un proceso conocido como regeneración inducida por lesión. La regeneración permite mantener o restaurar la arquitectura normal de los tejidos, lo cual recapitula parte del desarrollo embrionario normal; sin embargo, el proceso no es común en los humanos adultos, en quienes la respuesta a la lesión es el fenómeno de reparación, que habitualmente concluye en la formación de tejido fibrótico, con baja o nula capacidad funcional. El resultado de una respuesta inflamatoria excesiva es la fibrosis que produce tejido de granulación fibroblástico, el cual se remodela dentro de una cicatriz con exceso de colágena.29

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En conclusión, los tejidos que no tienen la capacidad de regenerarse espontáneamente se reparan por fibrosis; si la lesión que sufren los tejidos con capacidad regenerativa es de tal magnitud que excede su capacidad regenerativa, la reparación termina con la formación de una cicatriz fibrosa. La capacidad regenerativa también puede ser anulada o neutralizada por enfermedades crónicas degenerativas y tiene como resultado la reparación por medio de fibrosis. Los procesos de regeneración de los tejidos por desdiferenciación celular o por activación de células madre recapitulan en gran parte el programa de desarrollo embrionario. Un buen ejemplo es la reparación de los huesos largos que ocurre en una fractura: después de la fase inicial de hemostasis e inflamación, las células del periostio y osteoprogenitoras se diferencian en hueso en ambos segmentos de la fractura y simultáneamente las células del estroma, el periostio y la médula ósea inician su proliferación para crear el callo blando y formar el puente que une los segmentos de la fractura. Las células del callo blando repiten los pasos de la formación ósea endocondral de la embriogénesis. Los condrocitos se condensan, diferencian y secretan la matriz cartilaginosa. La regeneración sigue el mismo patrón y secuencia: la hipertrofia, la calcificación, la invasión de vasos sanguíneos y el reemplazo por el hueso, igual que ocurre en el embrión durante el desarrollo óseo o en los núcleos de crecimiento posnatales. De la misma forma se presenta la síntesis de los componentes de la matriz, como el colágeno tipo I, IX y X, aggrecan, fibronectina, osteonectina, osteopontina y osteocalcina, que siguen patrones temporales y espaciales idénticos a los que se llevan a cabo durante el crecimiento y el desarrollo óseo. La formación de cartílago y el reemplazo son controlados por los mismos factores del desarrollo embrionario, las proteínas morfogénicas de hueso (BMPs), el factor de crecimiento y transformación beta–1 (TGF–b1), y el factor de crecimiento fibroblástico–1 (FGF1) y sus receptores que se expresan durante el proceso de condrogénesis. También se detectan los factores de transcripción ihh y gli en el cartílago maduro, y el factor Cbfa1 se manifiesta durante la formación del hueso, lo cual coincide con la expresión del gen de la osteocalcina. Aunque no está verificado, es probable que otras características de la formación endocondral embrionaria del hueso —como la sobrerregulación durante la condensación de N–cadherina, NCAM y fibronectina; la proteína ligada a la heparina; el inductor angiogénico Cyr61; y la regulación del índice de transición y proliferación de los condrocitos a condrocitos hipertrofiados por las vías de las señales de ihh– PTHrP y delta/Notch— se presenten de manera similar a lo que ocurre en la diferenciación del callo blando.30,31

Regeneración por vía de las células madre de reserva Para mantener poblaciones de células madre residentes se requiere un microambiente diferente al del tejido circundante. Los nichos de las células madre ofrecen

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doble protección para la diferenciación o estímulos apoptósicos. En la activación como respuesta a la lesión, un subconjunto de células madre son inducidas a dejar sus nichos por medio de señales que inician la proliferación y diferenciación para reemplazar el tejido dañado; el manejo adecuado del ambiente debe incluir la arquitectura de la matriz, las tensiones mecánicas, el proceso inflamatorio, la secreción de citocinas y los cambios en la tensión del oxígeno; todos pueden proporcionar un ambiente más receptivo para la actividad de las célula madre en los procesos regenerativos.32 Al principio se pensó que las células madre residentes se diferenciaban directamente en células maduras y podían sustituir los tejidos perdidos o dañados. Ahora se ha propuesto que las células madre residentes pueden inducir a células vecinas a desdiferenciarse en células progenitoras comprometidas para regenerar tejidos perdidos. Esta reprogramación celular puede lograrse por la fusión de células progenitoras con células maduras mediante reprogramación nuclear subsecuente, así como por la reprogramación de células maduras por medio de señales extracelulares cercanas de células madre.33,34 La reprogramación somática puede ser una posibilidad interesante en la terapia regeneradora, donde se asume que cada célula somática contiene suficiente información genética para crear un organismo entero y es concebible que el perfil de la expresión de una célula madura nulipotente se modifique para semejar a un progenitor comprometido con la capacidad de inducir la regeneración completa.35 Además de las células progenitoras hematopoyéticas, también las células madre adultas pueden ser de reserva, pero se diferencian normalmente en una gama de los fenotipos dentro de su linaje. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas que residen en la médula son multipotentes y dan lugar a eritrocitos, células mieloides y células del sistema inmunitario. Otras células, como las mesenquimatosas, tienen características y cualidades de células madre; también las células progenitoras multipotentes adultas han sido cultivadas de la médula ósea de humanos y roedores.36 Las células mesenquimatosas fueron asiladas primero en médula ósea y más tarde en diversos tejidos, como el adiposo, el pancreático, el musculosquelético y el nervioso. Estas células diferenciadas comprometidas maduras pueden migrar fuera de su nicho de la médula ósea y dirigirse hacia el sitio de lesión para diferenciarse. Existen estudios bien documentados de la existencia de poblaciones de células progenitoras endoteliales, nerviosas y cardiacas.37 A lo largo de la vida embrionaria y fetal los subconjuntos de células de linaje limitados que no se han diferenciado completamente residen en los tejidos, de igual forma que en la vida adulta existen como células madre adultas de reserva. Estas células residen dentro de un órgano o tejido o circulan en la sangre. Algunas se utilizan después del nacimiento para el crecimiento o para los indispensables procesos regenerativos a lo largo de la vida. Las células madre adultas de reserva se renuevan por sí mismas, casi siempre se dividen de forma asimétrica y dan lu-

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gar a una célula con un linaje limitado y a otras células madre. Tienen diversos grados de potencial de desarrollo según el tejido al que sirven. La regeneración por medio de la reserva de células madre adultas es el camino más común en la regeneración del tejido de los organismos multicelulares.38 Los tejidos derivados del ectodermo y el endodermo se regeneran por medio de células madre adultas de reserva epiteliales que residen en la capa basal del epitelio; por ejemplo, epidermis, folículos pilosos y epitelio respiratorio y digestivo.37 El hígado también contiene una población de células madre que se activan cuando el hígado es dañado más allá su capacidad para ser regenerado por las células desdiferenciadas.38 Por medio de la fusión de células madre hematopoyéticas purificadas se puede producir la generación de cardiomiocitos.39 Las células madre del hígado se consideran bipotentes, puesto que dan origen a hepatocitos y a células de los conductos biliares. Las células madre epidérmicas son unipotentes y originan un solo tipo de célula: los queratinocitos. El hecho de que una célula madre epitelial se divida o no lo logre simétrica o asimétricamente depende de la comunicación intercelular entre las células madre o del contacto íntimo entre las células madre y la membrana basal del epitelio.40 Todas las células madre adultas de reserva residen en los nichos ambientales y mantienen las características de las células madre, al mismo tiempo que permiten generar células progenitoras que experimentan diferenciación y expansión. Los estudios de las células germinales de la Drosophila y las células madre hematopoyéticas y epiteliales de los vertebrados indican que estas células madre se mantienen en sus nichos y requieren la interacción de las células madre y las células circundantes por medio de integrinas y adherinas.33,34 La activación de las células madre para inducir su división puede ocurrir durante los procesos regenerativos de mantenimiento, donde experimentan una división continua y lenta como respuesta a las señales del medio ambiente, y estimulan la producción de células progenitoras dentro de un nuevo ambiente que induce a la diferenciación. En los tejidos lesionados que no experimentan normalmente un recambio rápido, las células madre se mantienen inactivas hasta que las señales inducidas por la lesión inician su activación y movilización. Actualmente existe gran controversia acerca del potencial de desarrollo de algunas células madre adultas y si pueden ser reprogramadas a transdiferenciarse por medio de señales extracelulares de otras células;41 si es así, sería posible utilizar un tipo de célula madre autóloga, fácilmente accesible de la médula ósea para trasplantarla al sitio de la lesión y generar diversos tipos de células que se puedan integrar al tejido local. Por otra parte, hay pruebas claras de la presencia en la médula ósea y en el tejido conectivo de múltiples órganos de células madre multipotentes o pluripotentes que comparten un número considerable de cualidades con las células madre embrionarias, aunque con diferencias con las células madre adultas de reserva.42 Estas células se han aislado y cultivado al igual que las células de la

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médula ósea y las células del tejido conectivo, y ambas han demostrado que pueden diferenciarse en casi todos los tipos celulares, tanto in vivo como in vitro. El hecho de que estas células existen en la médula o en el tejido conectivo, o son realmente el resultado del proceso de desdiferenciación aún no es un asunto que esté aclarado.43 De cualquier manera, su uso en medicina regenerativa evitaría dos problemas de las células madre embrionarias: la necesidad de combatir el rechazo inmunitario y los problemas bioéticos.

Células madre vía desdiferenciación

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La desdiferenciación es la pérdida de especialización del fenotipo celular, que permite a las células diferenciarse en células madre adultas, con la posibilidad de proliferar, diferenciarse y reemplazar tejidos. La desdiferenciación es relativamente común en la regeneración de los vertebrados inferiores. Diversas especies de peces pueden regenerar sus aletas por desdiferenciación y ciertas especies de lagartos pueden regenerar su cola a través de este mecanismo. Los vertebrados que mejor utilizan la desdiferenciación son las diversas variedades de anfibios, los cuales pueden regenerar los mismos tejidos que los mamíferos por hiperplasia compensatoria o por células madre de reserva del adulto; también utilizan la desdiferenciación para regenerar una amplia variedad de tejidos y estructuras complejas, como la córnea, la retina, los nervios periféricos y el intestino, lo cual no pueden hacer los mamíferos.5

ESTRATEGIAS EN LA INVESTIGACIÓN Y MODELOS EXPERIMENTALES EN BIOLOGÍA REGENERATIVA El objetivo final de la biología regenerativa es conocer los factores que propician, inhiben o determinan si el proceso que ocurre después de una lesión se dirige a la regeneración o la fibrosis. El conocimiento se podrá utilizar para implementar terapias farmacológicas y de otro tipo que permitan estimular mediante ingeniería tisular la regeneración de los tejidos humanos dañados que no se regeneran espontáneamente o cuya capacidad regenerativa se encuentra comprometida.44 Se sabe poco sobre las condiciones que inducen a que el proceso de reparación de un tejido se dirija a la regeneración o la fibrosis. La incapacidad de un tejido para regenerar podría deberse a la ausencia de células competentes para inducir el proceso o por la insuficiencia de elementos favorables dentro del medio ambiente para inducir la regeneración, o por ambas condiciones. Las células de re-

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serva competentes para inducir la regeneración que continúan diferenciadas o indiferenciadas indican virtualmente que todas las células adultas tienen el potencial de iniciar los procesos regenerativos. Esta idea es compatible con la presencia de esta característica en todas las células.

Trasplantes de células El trasplante celular en medicina regenerativa propone la sustitución de células de un tejido dañado en una lesión; las células trasplantadas pueden ser células madre embrionarias o células madre adultas diferenciadas. Las células pueden ser normales o genéticamente modificadas y tienen el propósito de incrementar la producción de moléculas, como factores de crecimiento, que permitan y ayuden a la proliferación celular o de moléculas diseñadas para neutralizar los factores que inhiben su supervivencia. Las células diferenciadas se pueden obtener directamente de donantes, pues puede ser difícil lograr su expansión in vitro. Las células diferenciadas o sus precursores se pueden generar in vitro a partir de células madre embrionarias humanas, o de células madre adultas de reserva. Una ventaja importante de las células madre embrionarias es la posibilidad de expandirlas indefinidamente en cultivos sin perder su potencial de diferenciación. Sin embargo, las células madre embrionarias diferenciadas son homólogas, por lo cual potencialmente están sujetas al rechazo inmunitario, a menos que sean trasplantadas a un sitio “immunoprivilegiado”. Otro problema en la actualidad es que no es posible dirigir con exactitud la diferenciación de las células madre embrionarias hacia los tipos celulares necesarios. Además, por ser células provenientes de fetos, están sujetas a controversia bioética y legal. Las células madre adultas que se pueden obtener del mismo paciente tienen la ventaja de que no provocan una reacción inmunitaria ni generan controversia ética. Para utilizar células madre adultas de reserva específicas es necesario saber cómo se pueden expandir fácilmente in vitro los factores que permiten su diferenciación, la organización en el tejido y si los factores presentes en el medio ambiente del tejido lesionado pueden permitir la regeneración.45 Se han llevado a cabo diversos estudios experimentales de trasplante celulares para regenerar tejidos dañados en animales de experimentación y en seres humanos para el tratamiento de enfermedades neurológicas, como en la enfermedad de Parkinson; también se han utilizado células madre para inducir la regeneración del axón después de lesiones de la médula espinal o en la enfermedad de Parkinson. Hay pruebas sólidas de que las células implantadas proporcionan un grado mínimo de regeneración; la mayoría de los axones y las neuronas regeneradas provenían de las células del propio tejido lesionado. Esta evidencia indica que las células madre trasplantadas pueden ayudar a la supervivencia y proporcionar fac-

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tores de crecimiento que protegen a las células y permiten iniciar los procesos de regeneración46 en la diabetes,38 en las diversas etapas del infarto del miocardio47 y en los daños del cartílago articular y su restitución funcional por medio de la siembra de células en estructuras biomiméticas tridimensionales.48

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Tejidos bioartificiales El concepto de la construcción de un tejido bioartificial (ingeniería tisular) consiste esencialmente en sembrar células con capacidad regenerativa en una estructura o un andamio de un biomaterial específico que servirá, entre otras funciones, como estructura para el asiento de las células, para proporcionar elementos nutritivos a las células que les permita sobrevivir durante el proceso de construcción para después implantar el biomaterial con elementos celulares en el sitio que se necesita regenerar. Las construcciones bioartificiales pueden estar abiertas: la estructura puede ser moldeada ex profeso para formar el tejido y propiciar la invasión de los vasos sanguíneos; es decir, para el desarrollo del proceso de neoangiogénesis dentro del lecho receptor, que permita la supervivencia del tejido trasplantado. Otra manera de implantar estas construcciones es la forma cerrada, que consiste en colocar las células dentro de cápsulas. La supervivencia de este tipo de trasplante depende del fenómeno de difusión. Idealmente, las estructuras o andamios donde se implantan las células deben ser biomiméticas, con la geometría apropiada que facilite la adhesión y la máxima migración celular. Además de incorporar a los biomateriales las señales moleculares biológicas y físicas esenciales para la proliferación y la diferenciación celular, los factores que potencialmente neutralicen las moléculas que inhiben la regeneración deben ser biodegradables y permitir el crecimiento y diferenciación del tejido de regeneración. Las estructuras utilizadas son biomateriales como el colágeno tipo I, los alginatos, las cerámicas, los ácidos polilácticos y poliglicólicos, etc. Hasta ahora ningún biomaterial reúne todos los criterios para inducir la regeneración óptima, por lo que la investigación de nuevos materiales debe ser prioritaria. Las construcciones cerradas requieren el uso de células diferenciadas, mientras que en las construcciones abiertas se pueden utilizar células precursoras derivadas de células madre embrionarias o células madre adultas de reserva. Si las células se implantan en una construcción abierta y son homólogas, estarán sujetas al rechazo inmunitario, lo cual no ocurre en una construcción cerrada. Otros desafíos que necesitan salvarse en las construcciones tisulares abiertas incluyen la incorporación de factores angiogénicos al biomaterial, así como factores de proliferación y de diferenciación, además de que los biomateriales tengan patrones tridimensionales semejantes al tejido que se necesita regenerar, donde sea posible

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la máxima difusión de las células y los vasos sanguíneos, que puedan crecer y proliferar dentro del tejido trasplantado. Varios tipos de tejidos bioartificiales se han probado para reemplazar tejidos en animales de experimentación y seres humanos. Los equivalentes de la piel bioartificial ya se aplican en el tratamiento de quemaduras, heridas escisionales, úlceras vasculares y diabéticas; mientras que el hueso bioartificial se utiliza para formar un puente entre espacios de hueso. Se ha tenido éxito en construcciones bioartificiales para restituir tejidos en las vías digestivas y genitourinarias.49

Inducción química de la regeneración in vivo Esta estrategia utiliza la combinación de moléculas que estimulan y propician la regeneración, e incorpora moléculas que neutralizan a las que inhiben el proceso regenerativo. La idea es activar y reclutar localmente a las células madre adultas de reserva competentes para el proceso de regeneración e inducir la curación del tejido; es decir, evitar la intervención de células incompetentes para la regeneración o lograr que lleguen a ser competentes estimulando la hiperplasia compensatoria o la desdiferenciación de las células maduras. Las moléculas inductivas de la regeneración se pueden integrar como “mezclas moleculares solubles” o como parte de un patrón acelular de regeneración en un biomaterial al cual migrarán las células locales o circulantes. La ventaja sería eliminar los problemas de donación, el rechazo inmunitario y los problemas bioéticos, con lo cual el costo por su manejo sería relativamente bajo. Hay pruebas sustanciales de que prácticamente todos los tejidos contienen células madre adultas de reserva que no se activan ni participan normalmente en la formación del tejido cicatricial después de una lesión. Esto indica que el cuerpo humano tiene una considerable capacidad de regeneración latente. Muchos estudios experimentales y clínicos ofrecen conocimientos serios de que la médula espinal y el corazón inician procesos de regeneración después de una lesión (pero éstos pueden no desarrollarse o ser suprimidos por factores inhibitorios dentro del medio ambiente de lesión) y llevan a la formación del tejido cicatricial. De esta manera, si se lograra cambiar el medio ambiente que impide la regeneración de una lesión y transformarlo en un medio ambiente propicio para la regeneración, se podría realmente inducir un proceso regenerativo exitoso.12 Hasta ahora, la promesa en terapias de células madre es el centro de múltiples expectativas. Recientemente se describió cómo el trasplante nuclear de una célula somática es capaz de producir células inmunocompatibles y repoblar la médula ósea sin necesidad de la mielosupresión; también se sabe cómo se pueden generar las líneas embrionarias humanas a partir de células madre humanas embrionarias (hESC) sin necesidad de la destrucción de embriones, lo cual se logra extrayendo

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una célula embrionaria en la etapa de ocho células o creando embriones haploides mediante partenogénesis.50

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CONCLUSIONES El implante de dispositivos artificiales y los trasplantes continúan avanzando y seguirán siendo estrategias que permitan restaurar la estructura y la función de órganos y tejidos en el siglo XXI; sin embargo, la promesa de la biología y de la medicina regenerativa será la verdadera revolución biomédica de la centuria. Los biólogos del desarrollo han empezado a comprender cómo las células de tejidos y órganos se colocan específicamente en las posiciones correctas en el cuerpo humano. Los ingenieros tisulares crean biomateriales para reparar tejidos perdidos por lesiones o enfermedades. Unos y otros se esfuerzan en identificar las señales esenciales que rigen y desencadenan estos procesos, e intentan controlar los ciclos celulares para que desarrollen programas regenerativos. Los avances importantes en la biología de las células madre, la ciencia de los materiales, la transferencia nuclear, la genética y la ingeniería tisular han logrado integrarse para regenerar órganos y tejidos. Estas disciplinas unificadas han iniciado el campo emergente de la medicina regenerativa. Ahora se sabe que los seres humanos, al igual que los anfibios, no pierden su capacidad regenerativa después del nacimiento. Los componentes genéticos y celulares necesarios están presentes en los adultos, pero no se pueden activar completamente después de una lesión. Se espera que con el manejo de células y biomateriales se pueda manipular el medio ambiente, restaurar la función regenerativa de las células madre residentes o progenitoras, y permitir la regeneración en los seres humanos. La meta es sustituir órganos y tejidos por construcciones bioartificiales, modificar el proceso de la reparación, evitar la fibrosis y llevar a la regeneración. Se deben comparar e identificar las ventajas y desventajas de los mecanismos regeneradores obtenidos con diferentes métodos y sistemas en diversos modelos experimentales. El avance en los conocimientos de la biología celular y molecular de la regeneración y la fibrosis llevará al tratamiento de enfermedades mediante terapia celular, tejidos bioartificiales y agentes moleculares. Tenemos confianza en que en la próxima década podremos agregar el manejo de la regeneración al repertorio de los tratamientos médicos.

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(Capítulo 2)

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(Capítulo 2)

3 Degeneración y regeneración del sistema nervioso

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Óscar Arias Carrión, René Drucker Colín

Haber descubierto que neuronas nuevas continúan generándose en el cerebro adulto modificó el concepto de plasticidad cerebral y reveló mecanismos nuevos que garantizan la homeostasis del sistema nervioso. La neurogénesis, proceso que involucra la generación de neuronas nuevas, se ha demostrado en el hipocampo y en el bulbo olfatorio de los mamíferos adultos, lo cual sugiere la persistencia de células troncales neuronales a lo largo de la vida. Los precursores primarios se han identificado en zonas especializadas denominadas nichos neurogénicos. De manera interesante, la célula que da origen a las neuronas nuevas en el cerebro adulto expresa marcadores de células gliales, un linaje celular diferente al de las neuronas. Trabajos realizados durante el desarrollo del cerebro demostraron que la glía radial origina astrocitos y también neuronas, oligodendrocitos y células ependimales. Además, se sabe que la glía radial es la precursora de las células troncales neuronales del cerebro adulto. En conjunto, estos datos soportan la idea de que las células troncales se desarrollan de un linaje entre el neuroepitelio, la glía radial y el astrocito. Por este motivo, la identificación de los precursores primarios en el cerebro en desarrollo y en el cerebro adulto es fundamental para comprender el funcionamiento del sistema nervioso y para desarrollar, posiblemente, estrategias de reemplazo neuronal en diversos procesos neurodegenerativos.

ENFERMEDAD DE PARKINSON La enfermedad de Parkinson, descrita por James Parkinson en 1817, es uno de los trastornos neurodegenerativos más frecuentes y mejor estudiados. Clínica37

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(Capítulo 3)

Caudado Tálamo

Gpe NsT

GPi Putamen

Vía nigro–estriada SNc

Figura 3–1. Estructuras que integran los ganglios basales en el cerebro humano. La mayoría de los componentes se hallan en el telencéfalo, aunque la SNc se encuentra en el mesencéfalo y el núcleo subtalámico está en el diencéfalo. Las proyecciones de la SNc llegan al estriado, sobre todo al núcleo caudado y al putamen. GPe = segmento externo del globo pálido; GPi = segmento interno del globo pálido; SNc = zona de la sustancia nigra pars compacta; NST = núcleo subtalámico.

mente se caracteriza por la escasez y la lentitud de los movimientos (bradicinesia), aumento del tono muscular (rigidez), rostro inexpresivo y un temblor característico (de cuatro a cinco temblores por segundo) en reposo. Otros síntomas que destacan son una marcha festinante (arrastre de los pies), una postura flexionada y un equilibrio inestable.1 Los defectos en la función motora se deben a una degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra pars compacta (SNc), una población de neuronas en el mesencéfalo que se proyectan hacia sus blancos en el estriado, sobre todo hacia el núcleo caudado y el putamen, razón por la cual su muerte representa un déficit de dopamina en estas estructuras (figura 3–1).2 En algunas neuronas sobrevivientes se observan inclusiones citoplasmáticas eosinófilas llamadas cuerpos de Lewy, los cuales están formados por ubiquitina y a–sinucleína.3 Los síntomas de la enfermedad aparecen cuando la pérdida de las neuronas dopaminérgicas excede el umbral crítico: de 70 a 80% de las terminales dopaminér-

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gicas en el estriado y de 50 a 60% del pericarion en la SNc. Cuando los primeros síntomas aparecen, la muerte neuronal continúa y los trastornos motores progresan de manera lenta. Diversos mecanismos compensatorios retrasan la aparición de los síntomas.2 La degeneración y la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la SNc es un problema fundamental de la enfermedad de Parkinson. Esta degeneración se extiende a varios núcleos del tallo cerebral y a otras áreas del cerebro en las cuales hay células dopaminérgicas.2 Además del déficit de dopamina en el estriado, se presentan alteraciones en otros neurotransmisores como la noradrenalina, la 5–hidroxitriptamina (5–HT), la acetilcolina y el ácido g–aminobutírico (GABA). En la actualidad se desconocen las causas que generan la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, se postula que el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial, las toxinas exógenas, la acumulación intracelular de metabolitos tóxicos, las infecciones virales, la excitotoxicidad y las deficiencias en el sistema inmunitario pueden ser factores que favorezcan la aparición de la enfermedad.1,2

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Tratamiento Los primeros esfuerzos se redujeron únicamente a una ayuda sintomática y, en ciertos casos aislados, a procedimientos estereotáxicos ablativos que interrumpían la desinhibición resultante del eje globo pálido, tálamo y corteza hacia las neuronas motoras.4 A mediados de la década de 1950, Arvid Carlson demostró que 80% de la dopamina del cerebro se encuentra en los ganglios basales.5 Más tarde, Olen Horynekiewicz descubrió que el cerebro de los pacientes con enfermedad de Parkinson tenía un déficit de dopamina en el estriado, sobre todo en el putamen. A principios de la década de 1960 se demostró que la enfermedad de Parkinson se debe en gran parte a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la SNc. Sobre la base de estos conocimientos, Walter Britkmayer y Olen Horynekiewicz indicaron que la administración intravenosa de L–dihidroxifenilalanina (L–DOPA), la molécula precursora de la dopamina, lograba una corrección llamativa, aunque breve, de los síntomas. La L–DOPA atraviesa la barrera hematoencefálica y se metaboliza a dopamina en el estriado activando los receptores dopaminérgicos.2 Así, en 1967 George Cotzias demostró que la administración de cantidades gradualmente mayores de L–DOPA por vía oral podrían conseguir una mejora significativa y continua en la enfermedad de Parkinson.6 Aun cuando esta terapia proporcionó un avance significativo en el tratamiento farmacológico, incluso con el desarrollo de fármacos antiparkinsonianos más específicos, sólo se pudieron controlar parcialmente algunos síntomas de la enfermedad de Parkinson, los cuales comenzaron a reaparecer al cabo de cinco años, a la vez que se producen efectos secunda-

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(Capítulo 3)

rios molestos en forma de fluctuaciones de la respuesta motora y discinesias relacionadas con el fármaco.2,4 La limitación y la duración corta del tratamiento farmacológico llevaron al desarrollo de estrategias terapéuticas nuevas. En 1979 se propuso como una estrategia terapéutica nueva el reemplazo de las neuronas dopaminérgicas mediante un trasplante celular, con lo cual se obtuvieron resultados positivos, primero en modelos experimentales y después en humanos.7,8

PLASTICIDAD CEREBRAL Uno de los dogmas fundamentales conservado en la neurociencia hasta el siglo XX sostenía que la regeneración del sistema nervioso no puede ocurrir en las etapas de la vida adulta. Sin embargo, a partir de los trabajos de Joseph Altman en la década de 1960, quien utilizó la técnica de la autorradiografía con timidina tritiada (timidina–3H) para marcar células en división, se demostró la existencia de la neurogénesis en algunas áreas del cerebro posnatal y adulto de la rata, específicamente en el bulbo olfatorio y el giro dentado en el hipocampo.9 Estas observaciones recibieron poca atención durante los años siguientes, hasta que en la década de 1990 diversos grupos científicos reforzaron las investigaciones con las cuales se demostró que la neurogénesis persiste en los mamíferos, incluyendo a los humanos.10,11

NEUROGÉNESIS EN EL CEREBRO ADULTO Durante la etapa posnatal y a lo largo de la vida se ha demostrado en varias especies que neuronas nuevas continúan generándose en el bulbo olfatorio, en el giro dentado, en la sustancia nigra12 y quizá en algunas áreas corticales.10 Debe señalarse que estos últimos datos son muy debatidos. Sin embargo, hoy es posible especificar que las áreas con una mayor actividad neurogénica son la zona subventricular (delimitando los ventrículos) y la zona subgranular del giro dentado del hipocampo. En estas dos zonas del cerebro adulto de los mamíferos existen células con una actividad mitótica, las cuales pueden ser clasificadas en dos grupos:13,14 las células troncales (con un ciclo celular superior a 28 días) y las células progenitoras neuronales (con un ciclo celular de 12 h). Las células troncales tienen la capacidad de generar de manera continua dos tipos de células: 1. Células troncales nuevas (capacidad de autorrenovación).

Degeneración y regeneración del sistema nervioso

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2. Células progenitoras neuronales. Cuando las células progenitoras neuronales pierden su capacidad mitogénica en las etapas tempranas del desarrollo dan origen a neuronas, en tanto que en las etapas tardías generan astrocitos y oligodendrocitos.15,16 Es importante señalar que se lograron aislar y cultivar células troncales a partir de tejido cerebral post mórtem de humanos adultos.17–19 Las células troncales embrionarias son pluripotentes, es decir, tienen la capacidad de originar distintos tipos celulares en el organismo en desarrollo, en tanto que las células troncales del cerebro adulto pierden parte de esta capacidad, volviéndose multipotentes, lo cual implica que sólo pueden dar origen a tipos celulares específicos.20 Hasta hoy, la mayor controversia es determinar la naturaleza de las células precursoras en las zonas germinativas del cerebro adulto. Existen dos teorías yuxtapuestas sobre el origen celular de las células troncales en la zona subventricular:

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1. Las células troncales de la zona subventricular provienen de células ependimales,21,22 las cuales expresan nestina. 2. Provienen de células del tipo astrocítico23,24 (GFAP+ y nestina+), llamadas también células tipo B. Cabe señalar que las células progenitoras de la SNc y las células neuroepiteliales presentan inmunorreactividad a la nestina. La nestina reconoce a la proteína tipo VI de los filamentos intermedios, la cual es expresada en células troncales y progenitoras del neuroepitelio primitivo, in vivo e in vitro.21 La mayoría de los estudios refuerzan la segunda teoría, en la zona subventricular y en la zona subgranular del giro dentado en el hipocampo. Se ha demostrado que una población específica de la glía radial puede originar precursores neurales, los cuales a su vez dan lugar a neuronas y células de la glía.22,23 Durante el desarrollo embrionario tardío y posnatal, las células de la glía radial generan astrocitos;24,25 en algunas especies, la glía radial mantiene sus propiedades precursoras incluso en el animal adulto.26 En este contexto, Merkle y col. demostraron que en el adulto las células de la glía radial provienen de las células progenitoras de la zona subventricular.27 Asimismo, los estudios sobre la génesis de las neuronas corticales apuntan hacia dos teorías. La primera teoría sugiere que las células de la zona subventricular son las responsables de su origen, como sucede con las nuevas neuronas granulares y periglomerulares del bulbo olfatorio.28,29 La segunda teoría se basa en el comportamiento de las células troncales que presentan las células de la glía radial, las cuales producen neuronas y células gliales.30–33 En conjunto, estos datos soportan la idea de que las células troncales se desarrollan de un linaje entre el neuroepitelio, la glía radial y el astrocito.22,34

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(Capítulo 3)

Otro punto de controversia consiste en determinar si las nuevas neuronas en el adulto provienen del mismo tipo de células neuroepiteliales las cuales producen neuronas durante el desarrollo embrionario. Los tipos celulares retenidos dentro del neuroepitelio del sistema nervioso adulto, como las células ependimales y las llamadas células de la glía radial, son probablemente los precursores neurales equiparables a las células neuroepiteliales embriónicas, de las cuales se derivan y las cuales conservan propiedades que les permiten responder a los patrones de señales que inducen neurogénesis en el embrión.22,35,36 Por esta razón, las neuronas generadas en el adulto pueden tener distintos precursores; algunos de éstos cercanos, aunque no equivalentes de manera directa, a los precursores del neuroepitelio embrionario. Por lo anterior, se cree que las células troncales en el adulto pueden ser más especializadas y producen solamente un rango limitado de subtipos neuronales. Además, estas células son incapaces de activar las cascadas de señalización que utilizan las células troncales embrionarias y que involucran a las proteínas proneurales bHLH.

CÉLULAS TRONCALES Y PROGENITORAS DE LA ZONA SUBVENTRICULAR Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos se forma a lo largo de los ventrículos laterales una capa germinativa (zona ventricular) rica en células progenitoras neuronales, que dan lugar a las neuronas que migran hacia todas las estructuras del cerebro. En la etapa final del desarrollo embrionario se origina otra capa de células germinativas adyacente a la zona subventricular, implicada también en la generación de neuronas nuevas (figura 3–2). En el desarrollo posnatal la producción de neuronas disminuye de manera progresiva y al final la zona ventricular germinativa desaparece en el cerebro adulto manteniéndose únicamente nichos de proliferación en la zona subventricular. En estas regiones las neuronas nuevas migran a través de la vía rostral migratoria hacia el bulbo olfatorio (figura 3–2), área en la cual se diferencian dos tipos de interneuronas: las células granulares y las células periglomerulares.37–40 Diversas investigaciones permitieron determinar la presencia y el fenotipo de las células troncales en la zona subventricular del cerebro adulto de los roedores.23,41,42 Los estudios cuantitativos indican que la tasa de neurogénesis en la zona subventricular del cerebro adulto de una rata es de aproximadamente 80 000 neuronas granulares nuevas por el bulbo olfatorio, lo cual representa 1% de la población de células granulares olfatorias por día.43 A partir de los estudios realizados se determinó que en la zona subventricular existen al menos cuatro tipos diferentes de células de acuerdo con su morfología, ultraestructura, propiedades

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A

B

Linaje neuronal Identidad celular

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Marcadores identificados

Progenitor Astrocito Neuroblasto transitorio de la ZSV migrante multipotente amplificativo GFAP Nestina

Nestina

PSA–NCAM DCX, Tuj1

Neuronas inmaduras y maduras DCX, NeuN Gad65, TH

Figura 3–2. Neurogénesis en el sistema de la zona subventricular y el bulbo olfatorio. A. Vista sagital del cerebro de una rata adulta en la cual se observan células progenitoras neuronales en la zona subventricular y su migración hacia el bulbo olfatorio. B. Secuencia de los tipos celulares involucrados en el linaje neuronal y sus marcadores específicos. Modificado de las referencias 20 y 56.

electrofisiológicas y marcadores específicos, los cuales permiten su identificación (figura 3–2). Estos tipos celulares son: 1. Células ependimales ciliadas (o células tipo E) ubicadas hacia el lumen del ventrículo, las cuales participan en la circulación del líquido cerebroespinal. 2. Neuroblastos proliferativos (o células tipo A), que presentan una migración en cadena hacia el bulbo olfatorio. 3. Células astrocíticas de proliferación lenta (o células tipo B).

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4. Células transitorias amplificadoras (o células tipo C) con una proliferación activa. Estas células forman cúmulos espaciados entre las cadenas constituidas por las células tipo A en toda la zona subventricular.44 La división de las células tipo B (astrocitos monociliados de la zona subventricular) y de las células tipo C (células transitorias amplificadoras) sugiere que uno o ambos tipos celulares están implicados en la generación de neuronas nuevas (células tipo A llamados también neuroblastos). Sin embargo, las células tipo A son incapaces de autorrenovarse in vitro.45 A pesar de la propuesta de que las células progenitoras neuronales de la zona subventricular podrían ser células tipo E, los trabajos de Doetsch y col.,23 y de manera más reciente las investigaciones de Spassky y col.,46 contradicen esta hipótesis y muestran a las células astrocíticas como las protagonistas de la neurogénesis en la zona subventricular. En los experimentos de Doetsch se observó que la administración del antimitótico citocina–b–D–arabinofuranósido (AraC) elimina las células tipo A y las células tipo C, aunque no las células tipo B. Una vez que el tratamiento con AraC cesa, la población de células tipo C se regenera y se observa la formación posterior de neuroblastos. Por lo tanto, se sabe que las células tipo B son las células precursoras de las nuevas neuronas y que son capaces de producir neuroesferas (agregados de células troncales y células progenitoras neuronales), in vivo e in vitro, las cuales expresan FGF y EGF.23,24 La capacidad de generar neuroesferas in vitro también fue observada en los astrocitos extraídos de cualquier área cerebral de animales jóvenes (con menos de diez días de edad), capacidad que se pierde con el desarrollo posnatal tardío y con la maduración cerebral.24 Estos resultados demuestran el potencial neurogénico de las células tipo B presentes en la zona subventricular del cerebro adulto y aclaran de manera parcial el origen del linaje de las neuronas y de la neuroglía. Sobre la base de estos resultados se propuso un modelo neurogénico en la zona subventricular, en el cual las células tipo B dan origen a las células tipo C y éstas a su vez dan origen a las células tipo A (figura 3–2). No obstante, hasta hace muy poco no se conocía el origen exacto de estos precursores neuronales. Con los trabajos de Merkle y col. se descubrió que los astrocitos neurogénicos de las etapas adultas derivan de la glía radial, la cual persiste en la pared de los ventrículos laterales de las ratas recién nacidas.27 Al utilizar marcadores moleculares en estas células se observó que las células de la glía radial del neonato dan origen a neuronas, astrocitos, células ependimales y oligodendrocitos, los cuales desaparecen pocos días después del nacimiento. En la vía rostral migratoria se observó la presencia de neuroblastos marcados en todas las etapas de la edad adulta, y se encontró que neuronas nuevas continúan generándose a partir de los precursores derivados de la glía radial. Con este trabajo se concluyó que la glía radial es la célula precursora de neuronas y células gliales en la

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etapa neonatal, además de que genera las células tipo B de la zona subventricular, las cuales continúan creando nuevas neuronas a lo largo de la vida adulta. Las células tipo A, formadas a partir de los astrocitos subventriculares (células tipo B), migran una distancia considerable, alrededor de 5 mm en los roedores y hasta 20 mm en los primates, durante un periodo de 6 a 15 días para alcanzar el bulbo olfatorio (figura 3–2). Aun con la idea que sugiere que el bulbo olfatorio puede tener un carácter quimioatractor, su participación en la proliferación, la migración y la diferenciación de las células recién formadas permanece incierta. Al alcanzar la parte media del bulbo olfatorio, las neuronas nuevas se separan de las cadenas formadas por las células tipo A y migran radialmente para dirigirse a las capas granular y periglomerular. Ahí llegan como neuronas inmaduras, las cuales extienden ramificaciones dendríticas y más adelante se diferencian en interneuronas GABAérgicas y dopaminérgicas.47 Sobre la base de estas investigaciones puede definirse a la neurogénesis en la zona subventricular del cerebro adulto como el proceso mediante el cual las células troncales y progenitoras neuronales proliferan en la zona subventricular y originan neuroblastos que migran en cadena al bulbo olfatorio, donde se diferencian en interneuronas las cuales se integran a la red neuronal, manteniendo la homeostasis del bulbo olfatorio.20

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NEUROGÉNESIS EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON En la enfermedad de Parkinson las neuronas dopaminérgicas de la SNc se degeneran, lo cual ocasiona un déficit de dopamina en sus áreas de proyección (sobre todo en el núcleo caudado y en el putamen). Al inducirse una depleción de dopamina de manera experimental en roedores por efecto de la administración intracerebral de 6–hidroxidopamina (6–OHDA), se observa una disminución en la tasa de proliferación celular de la zona subventricular y del giro dentado.48 Esta respuesta se previene si se administra ropinirole, un agonista del receptor D2 de dopamina. La tasa de proliferación celular en la zona subventricular y el número de células progenitoras neuronales en el giro dentado y el bulbo olfatorio disminuyen en el cerebro post mórtem de los individuos que presentan enfermedad de Parkinson.48 Estas observaciones sugieren que la neurogénesis disminuye en los pacientes con la enfermedad debido al déficit de dopamina. Asimismo, existen pruebas experimentales contradictorias que indican que la SNc adulta mantiene los mecanismos de reparación.12 El objetivo de estas pruebas era determinar si la SNc adulta era una zona neurogénica. Los resultados mostraron que las neuronas dopaminérgicas que mueren son reemplazadas en una proporción muy baja (20 células nuevas por día). La tasa de reemplazo se du-

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plica cuando se destruyen de manera parcial las neuronas dopaminérgicas mediante la administración de la neurotoxina 1–metil–4–fenil–1,2,3,6–tetrahidropiridina (MPTP). Cabe resaltar que estos resultados no han sido reproducidos por otros autores;49 sin embargo, si la neurogénesis se presenta en la SNc de los humanos tendría importantes aplicaciones clínicas, sobre todo en la estrategia de reemplazo celular y en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. La evolución de este desorden podría ser determinada por la tasa de degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la SNc y también por la eficacia en la generación de nuevas neuronas.12 La neurogénesis es un proceso que continúa en la zona subventricular del cerebro adulto de los mamíferos. Los precursores neuronales generados en la zona subventricular migran a través de la vía rostral migratoria para reemplazar a las interneuronas del bulbo olfatorio. Sin embargo, recientemente se demostró que en respuesta a la lesión de la SNc algunos precursores que proliferan en la zona subventricular (identificados por medio de un análogo de timidina) se diferencian in situ en las células tirosina hidroxilasa (TH, enzima limitante en la síntesis de catecolaminas). Este proceso aumenta debido al efecto del trasplante de células cromafines en el estriado denervado y a la estimulación magnética transcraneal50 (figura 3–3). Estos resultados mostraron que ninguna célula tirosina hidroxilasa es inmunorreactiva a GFAP (marcador de células gliales), que 60% de las células tirosina hidroxilasa expresaron NeuN (marcador neuronal) y que 45% de las células tirosina hidroxilasa localizaron en conjunto con el transportador de dopamina. También en este estudio se examinaron las propiedades funcionales de las células tirosina hidroxilasa generadas en la zona subventricular.51 Utilizando la técnica de la célula completa, se registraron las células tirosina hidroxilasa en la zona subventricular de animales con lesión de la SNc y trasplante de células cromafines. La mayoría de las células tirosina hidroxilasa no desarrollaron potenciales de acción. Sin embargo, 11% de las células tirosina hidroxilasa registradas en la zona subventricular presentaron características electrofisiológicas de neuronas dopaminérgicas de la SNc y también mostraron potenciales postsinápticos espontáneos.51 Además, se determinó la liberación de DA en la zona subventricular y en un fragmento proporcional del estriado. Doce semanas después de la lesión de la SNc, la liberación de DA disminuyó 70%. No obstante, ocho semanas después del trasplante de células cromafines en ratas con lesión de la SNc, la liberación de dopamina se recuperó en la zona subventricular e incluso superó la liberación obtenida en la zona subventricular de las ratas control. Lo anterior sugiere que las células tirosina hidroxilasa recién formadas en la zona subventricular liberan DA. Estos resultados muestran por primera vez que la lesión de la SNc ocasiona la diferenciación in situ de las células precursoras que proliferan en la zona subven-

Estriado

B

TH

Estriado

C

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Merge

Ventrículo

BrdU

Ventrículo

A

Ventrículo

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Estriado

20 mm V

ZV

ZSV

Estriado

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Figura 3–3. Neuronas dopaminérgicas nuevas en la zona subventricular. Micrografías obtenidas mediante microscopia confocal de una parte del ventrículo lateral izquierdo del cerebro de una rata con lesión de la SNc y trasplante de células cromafines. A. Núcleos BrdU+. B. Células tirosina hidroxilasa+. C. Figura compuesta resultante de unir las figuras A y B. Los núcleos BrdU+ predominan en la zona subventricular. Algunas células de formación reciente (BrdU+) expresan también tirosina hidroxilasa, lo cual confirma que las células tirosina hidroxilasa+ observadas en la zona subventricular tienen su origen a partir de células progenitoras neuronales presentes en esta zona. V = ventrículo; ZV = zona ventricular; ZSV = zona subventricular.

tricular, las cuales expresan tirosina hidroxilasa y adquieren propiedades de neuronas dopaminérgicas excitables. Como dato adicional, la liberación de DA es Ca++ dependiente. La integración a la red neuronal representa un hallazgo cuya importancia funcional debe determinarse.

CONCLUSIONES En las enfermedades neurodegenerativas, una pérdida específica de células causa que los pacientes presenten síntomas psiquiátricos y neurológicos, por lo cual, la perspectiva de reemplazar las células faltantes y dañadas es muy atractiva.8,52–54

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(Capítulo 3)

La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la SNc es una característica predominante de la enfermedad de Parkinson. Por esta razón, el tejido embrionario de esta región, es rico en neuroblastos dopaminérgicos, se ha implantado en el estriado de pacientes con enfermedad de Parkinson.8 Estos ensayos clínicos apoyan la hipótesis de utilizar como estrategia el reemplazo celular en el cerebro humano. Sin embargo, existen importantes dificultades logísticas para el uso rutinario clínico de células y tejidos humanos. Estos problemas aumentan cuando el tejido proviene de una pequeña región del cerebro en desarrollo, como la SNc. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas para expandir los precursores proporciona una posible solución. Células troncales con capacidad autorregenerativa han sido identificadas en el sistema nervioso fetal y en el sistema nervioso adulto.20 Estas células troncales pueden ser cultivadas en el laboratorio por largos periodos y pueden ser diferenciadas en neuronas y en glías.20 La estrategia de reemplazo celular está basada en una serie de estudios en modelos animales, en los cuales se demostró que el implante de tejido neuronal embrionario restaura los niveles de dopamina en el estriado y puede ocasionar la recuperación funcional duradera.8,52 Los estudios clínicos probaron que las neuronas dopaminérgicas implantadas pueden sobrevivir y reinervar al estriado al menos 10 años, a pesar de que la neurodegeneración continúe.8 Estudios funcionales manifestaron que las células trasplantadas liberan dopamina en el estriado, lo cual posiblemente restaura la activación corticofrontal relacionada con los movimientos.8 Sin embargo, aunque algunos pacientes muestran una mejoría clínica, persiste una variable en el resultado funcional, pues otros pacientes presentan una mejoría modesta o nula. En 7 a 15% de los pacientes implantados ocurren movimientos involuntarios inoportunos, llamados también discinesias, aunque no hay pruebas de que los movimientos sean causados por el crecimiento dopaminérgico o de que sean una característica general del reemplazo de neuronas dopaminérgicas per se. Sin embargo, la terapia celular no se aprovecharía de manera adecuada si el cerebro adulto no conservara la capacidad regenerativa. No importa cuántas células puedan ser generadas en el laboratorio, el esfuerzo sería inútil si el cerebro adulto no las aceptara. Las pruebas experimentales sugieren que las células troncales endógenas participan en la regeneración neuronal, pues se observó que estas células proliferan en respuesta a diferentes lesiones.55 Las investigaciones llevadas a cabo en los últimos años permiten aceptar la idea de que neuronas nuevas continúan generándose en el cerebro adulto de los mamíferos. La importancia funcional de las neuronas nuevas está aún bajo investigación. Sin embargo, los resultados sorprendentes obtenidos hasta hoy indican que las neuronas nuevas se integran al cerebro adulto y participan en diferentes procesos.56 También se despertó un gran interés en la neurogénesis del cerebro adulto, debido a las potenciales aplicaciones terapéuticas.

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Agradecimientos Este proyecto fue financiado por las becas de posgrado CONACYT y DGEP a Óscar Arias Carrión, por el Fideicomiso UNAM concedido a René Drucker Colín y por el Proyecto IMPULSA–UNAM.

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(Capítulo 3)

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(Capítulo 3)

Sección II Fenómenos biológicos y células madre Sección II. Fenómebos biológicos y células madre

4 Inducción de angiogénesis en ingeniería tisular y medicina regenerativa

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Daniel Ascencio González

El estudio de los vasos sanguíneos es motivo de gran interés y estudio desde hace más de 5 000 años. Los médicos del Antiguo Egipto sugirieron la existencia de vasos sanguíneos en todo el cuerpo y les atribuyeron las propiedades de absorber varias sustancias y medicamentos y de eliminar deshechos. Aristóteles comparó los vasos sanguíneos del cuerpo humano con los arroyos que riegan los jardines; decía que se ramificaban en numerosos canales hasta alcanzar la totalidad del jardín. Los vasos sanguíneos nutren con oxígeno y otras sustancias el cuerpo de los vertebrados, ayudan al desecho del producto metabólico de prácticamente todos los tejidos y órganos, con excepción de la córnea y el cartílago, los cuales son tejidos avasculares. La fisiología normal de un tejido depende de la integridad de su vasculatura, de forma que vasos nuevos crecen durante el desarrollo embrionario y el proceso de curación de las heridas. La formación vascular nueva es un proceso complejo que depende de muchos pasos precisos. Cuando el aporte vascular se interrumpe o se daña, inicialmente sobreviene la isquemia, la cual puede originar necrosis tisular. El fenómeno está muy relacionado con la patogénesis de las enfermedades crónico–degenerativas, las enfermedades del sistema nervioso central, los padecimientos cardiovasculares y las lesiones traumáticas, las cuales pueden incapacitar y ocasionar la muerte de un tejido, de un órgano y del individuo que las padece. Durante mucho tiempo el crecimiento vascular excesivo se relacionó sólo con procesos malignos; con algunas enfermedades inmunitarias e inflamatorias crónicas; con la retinopatía, y con la psoriasis. Sin embargo, el crecimiento anormal está implicado en patologías tan diversas como la preeclampsia, los defectos de 55

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(Capítulo 4)

nacimiento, las enfermedades respiratorias, alérgicas, infecciosas, traumáticas y metabólicas del recién nacido prematuro, la obesidad, la dermatitis, las adherencias peritoneales, la sinovitis, la osteomielitis y la endometriosis, entre otras. El crecimiento vascular excesivo acelera el desarrollo de estas afecciones. Las patologías que se caracterizan por la regresión anormal de los vasos son atribuidas a niveles bajos del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), los cuales causan la disfunción de diversos órganos, como sucede en la mujer embarazada con preeclampsia.1 La pérdida progresiva de la microvasculatura de distintos órganos y tejidos está relacionada con el proceso de envejecimiento, la reducción de la densidad y la maduración de los vasos en la piel; también da origen a púrpura y a telangiectasias o angiomas.2 Por otra parte, está involucrada en la fisiopatología de la diabetes y de la retinopatía diabética,3,4 en la pérdida ósea5 y en la imposibilidad de reendoentelización después de una lesión arterial.6 Enfermedades como la diabetes, la aterosclerosis y la hiperlipidemia impiden el crecimiento vascular,7–9 en tanto que la hipertensión arterial sistémica origina rarefacción microvascular.10 La reducción de las señales moleculares angiogénicas son causa de fibrosis pulmonar11 y enfisema.12 El insuficiente crecimiento vascular ocurre en los problemas vasculares cerebrales que llevan a los accidentes vasculares.13 Los niveles insuficientes de VEGF causan la degeneración de las motoneuronas, semejante a la que ocurre en la esclerosis lateral amiotrófica.14 La angiogénesis puede ser un proceso fisiológico o fisiopatológico en el cual fundamentalmente se desarrollan vasos nuevos a partir de vasos preexistentes; es un proceso normal durante el crecimiento del organismo y en la cicatrización de las heridas, pero también interviene en el desarrollo de procesos tumorales. El estudio y la comprensión de los mecanismos que regulan los fenómenos de la angiogénesis permitirán probablemente el tratamiento de diversas enfermedades, razón por la cual será necesario establecer en los siguientes años las bases celulares y las vías que propician la compleja interrelación entre las múltiples señales moleculares que inducen los procesos en las enfermedades angiogénicas. El reto que enfrenta la ingeniería tisular y la medicina regenerativa está enfocado a inducir y construir vasos nuevos, resistentes y durables. Terapéuticamente debe resolver las dos vertientes del problema: ofrecer tratamientos antiangiogénicos seguros y eficaces y promover la angiogénesis. En 1787 Hunter relató por vez primera el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos en la cornamenta de los renos.15 En 1961 Judah Folkman describió el desarrollo de vasos sanguíneos nuevos en los procesos tumorales y la participación primordial en su nutrición y crecimiento; detalló la relación íntima entre la evolución tumoral y la angiogénesis. Una década después publicó su teoría,16 continuó sus investigaciones y logró aislar dos factores inhibidores de la angiogénesis, conocimientos que son aplicados

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en los nuevos tratamientos contra el desarrollo de diversos procesos tumorales. Los conceptos relacionados con la angiogénesis dieron lugar a muchos estudios dentro del área de la investigación básica y la aplicación clínica, en la oncología y en la medicina regenerativa. Más tarde Brem y Folkman descubrieron el primer inhibidor de la angiogénesis en el cartílago, el factor de crecimiento fibroblástico básico. En 1989 Ferrara purificó el primer factor angiogénico, el VEGF,17 considerado como el factor angiogénico más importante para el desarrollo del proceso, aunque idéntico al factor de permeabilidad vascular descubierto en 1983.18 Los vasos sanguíneos constituyen una red compleja que transporta oxígeno y sustancias nutritivas a todo el organismo; se dice que la red vascular del ser humano es tan extensa que si todos los vasos sanguíneos fueran colocados en línea circundarían dos veces la Tierra. La angiogénesis, conocida también como neovascularización, es un proceso primordial que ocurre de manera normal y patológica. Durante el desarrollo embrionario es uno de los acontecimientos más tempranos que determinan la organogénesis. Participa en la formación de la placenta y permite establecer la circulación entre la madre y el feto; en la edad adulta ocurre durante la ovulación. De manera patológica, participa en los procesos isquémicos coronarios, ayuda a la reparación del músculo cardiaco, e induce la formación y desarrollo de la nueva circulación colateral. La angiogénesis es un proceso primordial en la reparación y la regeneración tisular debido a que restaura el flujo de la sangre a los tejidos dañados. El fenómeno está regulado por la interacción precisa entre factores activadores y factores inhibidores; en condiciones normales, el organismo mantiene un perfecto equilibrio al regular las proteínas moduladoras de la angiogénesis. Diversas enfermedades, como el cáncer, la retinopatía diabética y la artritis reumatoide, se desarrollan cuando existe un desequilibrio de las sustancias reguladoras.4 Con la comprensión de los procesos celulares y moleculares de estos eventos será posible la instauración de mejores estrategias para combatir las patologías de la angiogénesis.

DESARROLLO DE LA ANGIOGÉNESIS En el complejo proceso de formación de los vasos sanguíneos capilares nuevos ocurre una cascada de eventos celulares y moleculares que involucran la producción de proteínas que tienen funciones proangiogénicas y antiangiogénicas. Los vasos pequeños son únicamente células endoteliales, en tanto que los vasos grandes están rodeados por células murales (pericitos de tamaño medio y células de músculo liso).

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(Capítulo 4)

Los mecanismos de crecimiento vascular son al menos tres: 1. La vasculogénesis, la cual consiste en la formación de vasos sanguíneos por medio de progenitores endoteliales procedentes de distintas regiones del embrión y de células de la médula ósea adulta. 2. La angiogénesis, que describe el brote vascular. 3. La arteriogénesis, la cual se refiere a la estabilización de los brotes mediante células murales. El crecimiento colateral consiste en la expansión, el crecimiento y la remodelación de vasos preexistentes para la formación de puentes con las redes arteriales colaterales. El incremento de la perfusión tisular (de los vasos proximales y de los vasos colaterales) debe aumentar el flujo al tejido y a los pequeños vasos distales que brotan y permiten distribuir el flujo sanguíneo a las células en el tejido de modo individual. La angiogénesis se desarrolla con la ayuda de una serie orquestada de eventos: en los tejidos dañados se producen factores angiogénicos de crecimiento (proteínas) que se difunden a los tejidos más próximos que, a su vez, se unen a receptores específicos de las células endoteliales de los vasos sanguíneos preexistentes. Las células endoteliales activan señales que son enviadas a los receptores de la superficie celular. Se producen moléculas y diferentes enzimas que disuelven conductos minúsculos y brotes nuevos se abren en la pared del endotelio que rodea a los vasos sanguíneos existentes. Las células comienzan su división y proliferación y emigran hacia fuera, a través de los conductos abiertos, en dirección al tejido lesionado o tumoral. Las moléculas de adhesión, como las integrinas (avb3 y avb5), favorecen el brote del nuevo vaso sanguíneo, y metaloproteinasas de la matriz auxilian en la digestión del nuevo brote capilar. Las células endoteliales comienzan la migración y continúan la formación de un tubo el cual más tarde configura el nuevo vaso sanguíneo; los vasos recién formados se conectan entre sí. Finalmente, los tubos formados se estabilizan con la ayuda de células especializadas, como los pericitos y las células del músculo liso, las cuales proporcionan una estructura a los vasos neoformados. Así, comienza la circulación sanguínea en los vasos recién formados.19 La formación vascular excesiva puede destruir los tejidos normales. Al contrario, el crecimiento vascular insuficiente puede originar isquemia del miocardio, retardo en la consolidación de las fracturas y de las lesiones cutáneas, y heridas crónicas. Estas afecciones pueden concluir en necrosis tisular. Uno de los factores angiogénicos reguladores del proceso más importantes es el VEGF, miembro de una familia de proteínas relacionadas estructuralmente que actúa ligado a receptores del VEGF (VEGFR). Funciona como un mitógeno específico de las células endoteliales in vitro y es un inductor angiogénico en una gran variedad de modelos de estudio in vivo. Participa de manera cardinal en la

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embriogénesis, etapa durante la cual es esencial para establecer un sistema vascular funcional, y también al inicio del desarrollo posnatal. Estudios en roedores demuestran que la alteración de una de las dos copias del gen del VEGF provoca la muerte del embrión. Asimismo, la inactivación del VEGF durante el inicio del desarrollo posnatal es letal. El VEGF también participa en el crecimiento esquelético, la reparación de las heridas y las funciones reproductivas. Por otra parte, es un mediador en la angiogénesis patológica, en especial en la relacionada con los procesos tumorales y, al contrario, en las enfermedades isquémicas de la retina. Otras tareas del VEGF consisten en la regulación de la migración del endotelio vascular, la proliferación celular y la permeabilidad; también se le atribuyen funciones antiapoptósicas en los vasos sanguíneos neoformados. El VEGF ejerce sus acciones al inducir el desarrollo de vasos sanguíneos nuevos; asimismo, participa en la conservación de los vasos sanguíneos inmaduros. La regulación de los efectos biológicos del VEGF están mediados por dos receptores: VEGFR–1 y VEGFR–2, y tirosinas cinasas, cuya expresión se manifiesta en el endotelio vascular. La unión del VEGF con estos receptores comienza una cascada de señales que estimulan el crecimiento, la supervivencia y la proliferación de las células del endotelio vascular. Las células desempeñan funciones en procesos tan diversos como la vasoconstricción y la vasodilatación en capilares, venas y arterias.20 En resumen, el estímulo de las células endoteliales por el VEGF ejerce un papel esencial en la angiogénesis. Otras citocinas participantes en el proceso son el factor de crecimiento tumoral a y la interleucina–8. La expresión del VEGF es estimulada por varios factores proangiogénicos, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento fibroblástico básico, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas y la interleucina–1. Otros mediadores son la fibrina, la laminina, la hialuronidasa, los factores angioestáticos endógenos, las proteínas (como la tromboespondina retinoides), y el inhibidor–4 de las plaquetas. El impacto global de estos factores es la estimulación, mediada por el VEGF, de la expresión de factores importantes para la angiogénesis, incluyendo las proteínas antiapoptósicas, las moléculas de adhesión celular y las metaloproteinasas de la matriz. Los niveles de VEGF también son regulados por las condiciones microambientales (el pH, las presiones parciales de oxígeno y sus niveles, entre otros). Por otra parte, los anticuerpos monoclonales de antiVEGF y otros inhibidores de VEGF bloquean el crecimiento de varias líneas de células tumorales.21 Algunas otras funciones atribuidas al VEGF son la estimulación de la permeabilidad de los vasos sanguíneos pequeños, la inducción de la filtración de proteínas plasmáticas y la formación de un gel extravascular de fibrina el cual proporciona un medio adecuado para el crecimiento de las células endoteliales. Los altos niveles de VEGF (como los que se presentan en el cáncer) tornan excesiva-

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 4)

Cuadro 4–1. Factores angiogénicos conocidos Factor de crecimiento fibroblástico ácido (FGF–1)

Factor estimulante de las colonias de los granulocitos macrófagos (G–CSF)

Factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF–2)

Factor de crecimiento hepático factor dispersor (HGF/SF)

Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)

Peliotropina

Factor de permeabilidad vascular (VPF) Factor de crecimiento de transformación a (TGF–a)

Proliferina

Factor de crecimiento de transformación b (TGF–b) Factor de necrosis tumoral a (TNF–a)

Folistatina Factor de crecimiento de la placenta (PlGF)

Angiogenina Interleucina–3 (IL–3) Interleucina–8 (IL–8) Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PD–ECGF)

Midcine Factor de crecimiento derivado de las plaquetas–BB (PDGF–BB) Fractalcina

mente permeable el sistema vascular, lo cual produce filtraciones, y originan una presión intersticial alta dentro del tumor y un suministro desigual de nutrientes, oxígeno y agentes terapéuticos al tumor. Estas anomalías pueden revertirse si se utiliza una terapia antiVEGF. Asimismo, el VEGF está relacionado de un modo directo con la neovascularización intraocular vinculada con la degeneración macular de la retinopatía diabética. Actualmente se estudia la inhibición del VEGF como estrategia terapéutica para la prevención de la angiogénesis, la cual ocurre en la degeneración macular y ocasiona ceguera. Además de las células del endotelio vascular, el VEGF tiene muchos efectos sobre otras células y sobre distintos procesos en los cuales se produce la angiogénesis, como la estimulación de la formación de vasos linfáticos. También tiene repercusión sobre la función inmunitaria: inhibe la maduración de las células dendríticas (acción necesaria para las respuestas celulares inmunitarias), estimula la quimiotaxis de los monocitos y contribuye a la supervivencia de las células madre hematopoyéticas y su movilización hacia los sitios de angiogénesis en los adultos (cuadros 4–1 a 4–3).22 Hoy uno de los temas de investigación en la ingeniería tisular para la construcción de tejidos está enfocado en el análisis y la regulación de los procesos de la angiogénesis. Diversos estudios cuantitativos pretenden conocer, describir y medir los complejos fenómenos de la angiogénesis y la antiangiogénesis in vivo. El entendimiento integral de la angiogénesis no es posible con los métodos de estudio de imagen comunes en sus diversas modalidades. Para estudiar la arquitectura microvascular durante la angiogénesis los especialistas desarrollaron varias técnicas. Para conocer los mecanismos fundamentales del crecimiento vascular en las

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Cuadro 4–2. Especificidad del receptor vinculado con el VEGF y sus efectos biológicos Miembro de la familia VEGF

Receptor

Función

VEGF (VEGF–A)

VEGFR–1, VEGFR–2, neuropilina–1

Angiogénesis, mantenimiento vascular

VEGF–B VEGF–C VEGF–D VEGF–E (factor vírico) PIGF

VEGFR–1 VEGFR–2, VEGFR–3 VEGFR–2, VEGFR–3 VEGFR–2 VEGFR–1, neuropilina–1

Desconocida Linfangiogénesis Linfangiogénesis Angiogénesis Angiogénesis e inflamación

construcciones tisulares se requieren análisis cuantitativos en modelos in vitro e in vivo; una vez recopilada la información será posible la fabricación de tejidos con especificaciones y características geométricas en tercera dimensión para cada paciente, y el trasplante de estos tejidos construidos. El proceso debe ser evaluado a nivel celular y molecular, y deben añadirse las nuevas medidas cuantitativas tridimensionales morfométricas para analizar la respuesta angiogénica con la ayuda de programas computarizados con fundamento en los algoritmos. Esta metodología permite medir la longitud, el diámetro, la tortuosidad y la complejidad de las ramas de los vasos en todos sus niveles.22 Otra forma de valoración son los estudios de microtomografía computarizada, con un molde radioopaco de silicón. Con el uso de la microtomografía computarizada se logró la obtención de imágenes en tercera dimensión del lecho vascular

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Cuadro 4–3. Factores inhibidores angiogénicos endógenos Angiostatina (fragmento plasminógeno) Canstatina Inhibidor derivado del cartílago Fracción del complemento CD59 Endostatina (fragmento XVIII colágena) Fracción de fibronectina Gro–b Heparinasas Fracción hexasacarida de heparina Gonadotropina humana coriónica (hCG) Interferones a, b y g Interferón inducible proteína (IP–10) Interleucina–12 (IL–12) Kringle 5 (fragmento plasminógeno)

Inhibidor de metaloproteinasa (TIMPs) 2–metoxyestradiol (2–ME) Factor derivado de pigmento epitelial (PEDF) Inhibidor ribonucleasa placentario Inhibidor activador plasminógeno Factor–4 de plaquetas (PF4) Fracción 16 kD prolactina Proteína relacionada–proliferina Retinoides Tetrahidrocortisol–S Trombospondina–1v Factor de crecimiento de transformación b (TGF–b) Tumistatina Vasculostatina Vasostatina (fracción calreticulina)

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en diversos estadios del proceso de cicatrización; estos métodos aportan datos morfológicos cuantitativos de la vasculatura en las heridas y permiten comparar otros métodos tradicionales de estudio de la angiogénesis.23–25 Recientemente se desarrolló un método que visualiza las células endoteliales, con el cual es posible cuantificar la red microvascular en sus tres dimensiones. Consiste sobre todo en retirar el tejido, criofijarlo y realizar cortes seriados de 6 m con un criostato; cada sección se marca para detectar CD–31, un antígeno específico de las células endoteliales; las secciones teñidas son fotografiadas bidimensionalmente con una cámara CCD.26 Junto con los estudios microscópicos, los estudios de inmunohistoquímica permiten integrar imágenes de alta resolución para la cuantificación celular; se analiza la relación entre las células marcadas y la morfología total del tejido. Las imágenes bidimensionales se alinean con una técnica automatizada de registro de imágenes. Una vez integrados los datos, se obtienen imágenes tridimensionales que permiten cuantificar la red microvascular en el interior del tejido.27 Un modelo cuantitativo de construcción tisular con ingeniería emplea un patrón acelular. La fibrina se usa como una matriz extracelular o como una estructura y se utiliza un factor angiogénico en el cual se observa la invasión capilar dentro del gel de fibrina. Los vasos y las células endoteliales son seudoteñidos de rojo, y la fibrina de blanco. El crecimiento de los vasos se puede observar dentro de la fibrina y las células endoteliales; solamente se observa la fibrina en la periferia, lo cual indica de manera precisa el comienzo de la angiogénesis.28 La integración de todos los métodos de evaluación que incluyan preparaciones in vitro e in vivo con microtomografía computarizada, estudios de histología e inmunohistoquímica, permitirá la investigación de la amplia variedad de redes microvasculares complejas que dependen sobre todo del medio en el que el proceso se desarrolla de manera normal y en estados patológicos. Por lo tanto, será posible el estudio de las diversas formas de desarrollo de la angiogénesis con la ayuda de métodos de alta resolución tridimensionales. El resultado de estas imágenes integradas debe reportar la medida de la densidad de la red vascular, el diámetro de los vasos, el espacio muerto y la tortuosidad.29

ANGIOGÉNESIS EN LA REGENERACIÓN TISULAR El proceso de reparación de una herida es el paradigma más representativo dentro de los procesos de regeneración tisular normal que ocurren en los organismos vivos. El restablecimiento rápido y eficaz de la microcirculación por medio de la angiogénesis se desarrolla en los mamíferos como un proceso complejo, preciso y orquestado; es el requisito primordial para que se inicie la regeneración. En

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el sitio de la herida se desarrolla más vasculatura (hipervascularización) en comparación con el tejido normal que la circunda. Las células endoteliales diferenciadas son atraídas al foco, donde se comienza la angiogénesis de la herida, producto directo de la proliferación local de las células endoteliales las cual se debe a la ruptura de la microvasculatura adyacente y al reclutamiento de células madre (funcionalmente designadas como células endoteliales progenitoras) y de células hematopoyéticas circulantes o angioblastos.30 En el sitio de la herida, las presiones parciales de oxígeno son bajas (hipoxia aguda), después se restablece la microcirculación y el aporte de nutrientes, y comienza la síntesis de los factores solubles angiogénicos que llegan a sus receptores. La combinación equilibrada de la proliferación de las células endoteliales y la estimulación de factores de crecimiento aseguran la revascularización necesaria para la regeneración tisular. La curación es muy eficaz en lesiones pequeñas, y la reparación ocurre prácticamente sin problemas y sin la necesidad de intervenciones terapéuticas. En lesiones extensas cuya pérdida de masa tisular es considerable, como en las quemaduras y en los traumatismos extensos causados por una gran fuerza mecánica, es necesaria la realización de intervenciones médicas y quirúrgicas para tratar de evitar la mayor pérdida de tejidos; en muchas ocasiones las restitución del tejido perdido no es posible.31 En comparación con los problemas agudos, el desarrollo gradual de una patología y los cambios degenerativos ocasionan por lo regular una hipoxia crónica del tejido dañado la cual conduce a heridas crónicas o a úlceras que no curan. En estos casos es fundamental la inducción de un proceso adecuado de angiogénesis y la curación normal de la patología; para lograrlo, es necesario conocer las claves que regulan la angiogénesis, en especial en las enfermedades crónico–degenerativas.31

INDUCCIÓN DEL PROCESO DE ANGIOGÉNESIS Las células y los tejidos sin un aporte vascular no pueden sobrevivir a una distancia mayor de 200 mm, es decir, requieren una red capilar que permita el transporte activo de elementos nutritivos, de oxígeno y de secreciones metabólicas para poder establecer la comunicación autocrina, paracrina y endocrina celular, y eliminar los productos de deshecho. Sin embargo, la información sobre la formación cinética y la arquitectura microvascular en tejidos construidos es escasa. Por esta razón, es indispensable inducir mediante la ingeniería tisular el proceso angiogénico en las construcciones tisulares in vitro e in vivo, además de tomar en cuenta los eventos normales y anormales como la reacción del lecho a la implantación el tejido y la respuesta a la curación provocada por el trauma, lo cual conduce a la vascularización con la formación de tejido de granulación (an-

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giogénesis más proliferación fibroblástica). De acuerdo con estas variables, el desarrollo de una adecuada red microvascular específica para cada tejido con una apropiada estructura geométrica es fundamental para el aporte de nutrientes y oxígeno, con lo cual se asegura la viabilidad, el mantenimiento y la diferenciación celular durante el tiempo necesario para que el trasplante logre su integración en el lecho receptor. Así, la neovascularización es decisivo al momento de implantar tejidos construidos, debido a que un injerto de gran volumen sin suficiente vascularidad sufrirá hipoxia y, al final, muerte celular en el centro del tejido y del órgano.32 La enfermedad isquémica del corazón y de los miembros inferiores, y las heridas crónicas son el resultado de la disminución en la producción de los factores que inducen el crecimiento vascular o del funcionamiento insuficiente de las células endoteliales; en ocasiones son consecuencia de ambos eventos. Muchos pacientes con problemas isquémicos no están en condiciones de ser tratados con los medios quirúrgicos convencionales de revascularización; por lo tanto, se requiere la implementación de nuevas estrategias biológicas de revascularización para la solución de estos problemas.33 Las estrategias para lograr una adecuada vascularización e inervación de los tejidos deben considerar primero la estructura que soporta el complejo de microvascularización e inervación y, segundo, la mejor forma de manipular el control del espacio y el tiempo de la neovascularización y la neurogénesis. También deben establecer los mejores métodos de perfusión inmediata de sangre después de la implantación del tejido construido y los métodos de evaluación funcional de la vasculogénesis y la neurogénesis.34 Para desencadenar el fenómeno de la angiogénesis se usan células endoteliales progenitoras autólogas, pues éstas tienen la capacidad de inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos. Se incluyen entre los diversos biomateriales con función estructural (polímeros naturales y sintéticos, cerámicas, metales porosos, etc.) para el desarrollo y el crecimiento vascular. La inducción de la angiogénesis también se puede lograr con el uso de células endoteliales progenitoras circulantes provenientes de la médula ósea, denominadas en su etapa adulta células endoteliales progenitoras, lo cual indica su potencial para actuar de manera fisiológica como células madre. Las células endoteliales progenitoras circulantes en adultos sanos tienen la función de reparar el endotelio. La población residente de células endoteliales progenitoras en médula ósea constituye un depósito, o reservorio, el cual puede ser movilizado en condiciones de demanda aguda y ante aun daño vascular masivo. Sin duda, la liberación de las células endoteliales progenitoras de la médula ósea a la circulación es estimulada por una variedad de señales fisiológicas y patológicas de la periferia como las quimiocinas, el VEGF y el factor estimulante de las colonias de los granulocitos macrófagos, relacionados a menudo con el desarrollo de procesos

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tumorales; también se puede inducir por medio de la liberación de hormonas, eritropoyetina y estatinas. Las células endoteliales progenitoras adultas son esenciales en la regeneración vascular, pues al ser reimplantadas en un tejido isquémico activan el proceso de crecimiento vascular. Estas observaciones sugieren que las células endoteliales progenitoras y su progenie proporcionan un sustrato para el crecimiento de endotelio nuevo y actúan como vectores y agentes curativos.35 Estas estrategias recapitulan los procesos de formación de los vasos sanguíneos en la etapa de desarrollo. Los procesos involucran tres pasos:

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1. El ensamble inicial de los progenitores endoteliales embrionarios dentro de los tubos primitivos de los vasos (la vasculogénesis). 2. La diferenciación dentro de las células maduras endoteliales para la proliferación de los brotes que forman vasos pequeños y grandes (la angiogénesis). 3. La remodelación de las arterias dentro de las grandes arterias (la arteriogénesis). El crecimiento de los vasos adultos puede ser activado por medio de la administración de los factores reguladores de la angiogénesis más importantes, como el VEGF y el FGF, los cuales estimulan a las células endoteliales residentes. Otra opción es la administración de células autólogas con la capacidad de inducir la formación de vasos nuevos. Por medio de estudios se identificaron en la sangre periférica de adultos poblaciones pequeñas de CD–34+, las cuales son células progenitoras hematopoyéticas mononucleares circulantes capaces de unirse a células endoteliales en cultivo.35 Más investigaciones sugieren que el trasplante autólogo de células endoteliales progenitoras en cantidades suficientes estimula la regeneración vascular. Las fuentes de estas células pueden ser la médula ósea y la sangre periférica, debido a su capacidad de producir la reparación endotelial. La plasticidad de las células progenitoras permite su diferenciación en elementos vasculares y elementos no vasculares, razón por la cual pueden ser empleadas en el tratamiento de la isquemia de los miembros inferiores y del miocardio, y de otros órganos que sufran un proceso isquémico agudo o crónico. Este proceso reemplaza las diferentes estructuras tisulares dañadas por la enfermedad.36 Las células progenitoras pueden ser trasplantadas sin manipulación preliminar y después de la manipulación genética ex vivo. La aplicación de células progenitoras modificadas genéticamente elimina la respuesta inmunitaria indeseable contra los vectores virales. Por otra parte, se puede realizar la regulación genética de células endoteliales del factor de crecimiento de transformación b y sus receptores. Asimismo, la terapia génica hace factible repetir el procedimiento terapéutico en caso de lesión y de recurrencia de la enfermedad. La terapia génica de la

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angiogénesis y el trasplante de células progenitoras puede ser aplicada sola y combinada por las ventajas recíprocas de ambas estrategias.37 La angiogénesis y la vasculogénesis terapéuticas pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad isquémica y de diversas enfermedades crónico–degenerativas en las cuales el problema vascular es fundamental, como la diabetes, la aterosclerosis y la hipertensión arterial, patologías en las que la neovascularización endógena no es posible. La estrategia terapéutica propone la curación por medio del aporte de factores de crecimiento y del trasplante de progenitores vasculares; la administración de estos elementos puede inducir la formación de arterias colaterales para formar una microvasculatura nueva que permita la regeneración del tejido dañado. Las fuentes de los factores angiogénicos pueden ser proteínas elaboradas de forma recombinante y la transferencia de genes y de vectores virales. En la actualidad los nuevos métodos no virales permiten elaborar estos factores y hacen el procedimiento más seguro.38 La relación de los factores de crecimiento con diferentes actividades biológicas puede ofrecer varias ventajas, eficacia y la optimización de los tratamientos. Las sustancias con actividad pleiotrópica ofrecen muchos mecanismos de acción; algunos factores angiogénicos estimulan el crecimiento de las arteriolas y los capilares, e inhiben la desestabilización vascular provocada por el estrés oxidativo. El éxito de las estructuras en la ingeniería tisular requiere el control sincronizado en la degradación de las matrices extracelulares y la remodelación del tejido. Para lograrlo, es necesario conocer la respuesta celular al implante de los polímeros biodegradables y a las condiciones fisiológicas, como el estrés mecánico y el grado de isquemia del lecho en el cual se va a implantar el tejido construido; es decir, propiciar las condiciones ambientales óptimas del lecho que va a recibir el trasplante. La medicina moderna intenta mejorar las características de los polímeros biodegradables para la construcción de la red vascular; también estudia el papel de la matriz metaloproteinasa en el remodelado vascular y de la angiogénesis. Se desarrolló un ácido poliglicólico–láctico (PLGA) y un poli–e– caprolactona (PCL en forma de estructuras con un grosor de 10 mm, un tamaño de poro < 10 mm y 80% de porosidad) para comparar la respuesta de las células vasculares ante la degradación lenta y la degradación rápida del polímero. La degradación rápida está correlacionada con el aumento de la acidez del medio local, en el cual se observa la reducción de las células vasculares de músculo liso con las que interaccionan. Un estudio determinó los atributos de la respuesta de las células vasculares de músculo liso a los polímeros PLGA y PCL mezclados, fabricados y procesados de acuerdo con la fracción de masa y los gradientes de temperatura. En las células vasculares de músculo liso se analizó la adhesión, la agregación, la proliferación y la producción de proteínas.39 Los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos forman una extensa red la cual transporta sobre todo líquidos, gases, macromoléculas y células dentro de los

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grandes y complejos cuerpos de los vertebrados. Estas estructuras vasculares están recubiertas de células endoteliales que se integran dentro de los diferentes órganos y adquieren una especialización específica en cada tejido manteniendo su plasticidad; esta característica permite el crecimiento durante la reparación de los tejidos y diversos estados patológicos. El crecimiento angiogénico de los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos está coordinado por diversos procesos biológicos, como la proliferación, la migración guiada, la diferenciación y la comunicación entre células. El crecimiento del sistema de vasos sanguíneos y vasos linfáticos es un ejemplo excelente de la delicada coordinación de los diversos procesos celulares y moleculares, y de la función que desempeña en el crecimiento de la red endotelial, desde el proceso de la morfogénesis hasta la participación en el desarrollo de diversas enfermedades, y también en los procesos de reparación y regeneración tisular. Por esta razón, su regulación es motivo de muchos estudios.40 En concreto, la estimulación terapéutica del crecimiento vascular en los tejidos isquémicos enfermos se puede lograr mediante la liberación de factores angiogénicos y de sus genes correspondientes (angiogénesis terapéutica), por medio del aporte de células vasculares progenitoras para la terapia de regeneración vascular y con la ayuda de la movilización de progenitores vasculares endógenos.

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CONCLUSIONES La angiogénesis es un proceso complejo en el cual se forman vasos sanguíneos nuevos; implica varias acciones: la proliferación de las células endoteliales; la migración y la degradación de la matriz extracelular; la atracción de pericitos y macrófagos; la proliferación de células musculares lisas; la migración y la formación de nuevas estructuras vasculares, y la formación de la nueva matriz. Para que el proceso de la angiogénesis se desarrolle de manera efectiva es necesaria la acción coordinada de diversos mitógenos que se activan e inhiben. Los descubrimientos recientes en relación con los mecanismos moleculares del crecimiento de los vasos da nuevas esperanzas para la construcción de vasos funcionales y durables para la terapéutica de tejidos isquémicos. En el futuro, las líneas de investigación deberán ser dirigidas a la creación de una red microvascular tridimensional dentro del tejido construido in vitro antes de su implantación y a la utilización de la coestimulación de la angiogénesis y la proliferación de las células del parénquima para la construcción de tejidos vascularizados in situ. Después de su implantación, los tejidos construidos en tercera dimensión dependen fundamentalmente de una adecuada vascularización. Hoy las investigaciones están enfocadas al análisis de la angiogénesis; el estudio del complicado

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proceso de vascularización se orienta a buscar las propiedades óptimas de los biomateriales que faciliten la invasión vascular. También se busca estimular el desarrollo y la maduración celular por medio de factores de crecimiento, los cuales puedan ser utilizados en dispositivos de liberación lenta, por ejemplo, en microesferas preencapsuladas. Por otra parte, las células endoteliales están involucradas directamente en la creación de la nueva red microvascular y originan circuitos arteriovenosos en los sustitutos de tejidos. El aspecto del diseño debe involucrar el método idóneo que permita inducir una diferenciación y un crecimiento celular rápidos. La ingeniería tisular involucra la definición clara de la relación entre las propiedades mecánicas y químicas de los materiales, y la estandarización de la arquitectura estructural macroscópica, microscópica y molecular. También implica el conocimiento de la repuesta inmunitaria local por los efectos que tendrá en la curación y en la restitución de la homeostasis en el sitio del implante cuando el tejido sea trasplantado, el estudio de su integración y la determinación local de la fisiología del lecho receptor y la repercusión sistémica en el paciente. Asimismo, los criterios de evaluación funcional in vitro e in vivo deben ser estandarizados. Más requerimientos de la ingeniería tisular incluyen la definición de la fuente celular idónea para cada tejido; la inclusión de las líneas de células endoteliales; la determinación de la forma en la cual se almacenarán las células y del método de obtención y separación de las células madre adultas en la médula ósea y en la sangre periférica, y el establecimiento de los modelos experimentales y las pruebas necesarias para la evaluación de la construcción de tejidos y el estudio de los problemas de vascularización y respuesta inmunitaria. El estándar de oro puede ser la integración de tejidos construidos con células autólogas, con factores de crecimiento angiogénicos (como primera opción) y con polímeros biodegradables y biocompatibles, con lo cual se evitaría la morbilidad de las zonas donadoras y el almacenamiento de órganos y tejidos homólogos, para ofrecer una mejor calidad de vida a los pacientes. Entre las metas de la ingeniería tisular está el reemplazo de los tejidos y los órganos dañados por medio de la sustitución biológica compatible de las partes dañadas; esta área comprende varios enfoques de investigación. La angiogénesis representa una necesidad indispensable en la construcción tisular tridimensional, cuya aplicación clínica revolucionará sin duda la medicina regenerativa.

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5 La biología de las células madre: base de su aplicación clínica

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Agustín G. Zapata

Los fenómenos de reposición celular que ocurren en todos los tejidos embrionarios, fetales y adultos se conocen desde hace muchos años, aunque los mecanismos que los gobiernan no se comprenden aún de manera adecuada. Se sabe de la existencia de precursores capaces de reponer las células de los tejidos adultos con un turnover celular alto, como las células del epitelio intestinal y los glóbulos rojos de la sangre, pero es más difícil conocer la condición en tejidos del músculo esquelético y el sistema nervioso central, los cuales son catalogados tradicionalmente como tejidos cuyas células perdieron la capacidad de reponer las células desaparecidas como consecuencia de haber agotado su ciclo normal de vida, del envejecimiento tisular y de alteraciones patológicas de cualquier tipo.1 Aunque hoy se sabe de la existencia de estos progenitores, se ignora su verdadero potencial y, aún más relevante desde un punto de vista práctico, se desconoce cómo modularlo a voluntad. Distintos experimentos, destacados más adelante, permitieron en los últimos años obtener líneas de células troncales embrionarias y también aislar y utilizar progenitores adultos en el tratamiento de ciertas patologías con algunos resultados prometedores. Sin embargo, es importante reconocer lo limitado de los éxitos obtenidos en este ámbito debido en gran medida a lo poco que se conoce de la biología de estas células. Por lo tanto, urge profundizar en estos estudios antes de ser incluidos en aplicaciones terapéuticas con escasas posibilidades de éxito.2 A continuación se destacan los conocimientos actuales relacionados con la biología de las células madre embrionarias y adultas, sus mecanismos de supervivencia, proliferación y diferenciación, y los problemas que todavía plantea su utilización terapéutica. 71

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CÉLULAS TOTIPOTENTES: DEFINICIÓN, TIPOS Y ORIGEN Las células totipotentes se definen como las células con la capacidad de autorrenovarse y, bajo determinadas condiciones, de diferenciarse en cualquier tipo celular especializado. Por naturaleza, esta segunda propiedad es mayor y a veces total (células totipotentes) en las células madre embrionarias, en especial en las de la masa interna del blastocisto y, en menor medida, en las células germinales primordiales de los esbozos gonadales.1 Durante el periodo fetal existen células con la capacidad de autorrenovarse y de diferenciarse en uno o varios linajes celulares, probablemente en todos los tejidos fetales y en los esbozos de los órganos. Sin embargo, se desconoce de manera exacta el origen de estas células; es posible que provengan de las células totipotentes somáticas sobrantes en todos los tejidos fetales o que las células desaparezcan por completo y una nueva oleada de progenitores emerja en el periodo fetal, sin conexión con las células totipotentes embrionarias y con capacidades de diferenciación restringidas. Una situación similar acontece en el periodo adulto. No hay duda de la existencia de células madre en los tejidos adultos, incluso algunas son caracterizadas fenotípicamente y funcionalmente, aunque en pocos casos sus capacidades de diferenciación son evaluadas a nivel clonal. Su origen y su relación con las células madre fetales y embrionarias está por determinarse, y sus capacidades de diferenciación son motivo de amplias controversias: en tanto que algunos autores consideran que sólo son capaces de generar uno o muy pocos tipos celulares, y otros afirman que las células madre adultas son más plásticas de lo que se creía hace unos años y que sus capacidades de diferenciación pueden ser moduladas por los microambientes celulares en los cuales se desarrollan, permitiendo la transdiferenciación en más de un linaje celular.3

Derivación de líneas de células madre embrionarias humanas Desde finales de 1998, cuando James Thomson publicó la obtención de varias líneas provenientes de células madre embrionarias aisladas de la masa interna de embriones humanos crioconservados,4 en distintos países se desarrollaron varias líneas a partir de metodologías relativamente similares las cuales pretenden el aislamiento del mayor número posible de células madre viables sin contaminación por el trofectodermo.5 Recientemente, el grupo de Robert Lanza, primero en ratones6 y después en células humanas,7 consiguió derivar líneas a partir no de las células troncales extraídas de la masa interna, sino de blastocistos extraídos de una mórula de ocho

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células, protocolo utilizado en las técnicas de diagnóstico preimplantacional que en un alto porcentaje, obtener un embrión viable a partir de las blastómeras restantes. Esto obvia el debate acerca de la destrucción de embriones para obtener células madre embrionarias. Sin embargo, la utilización actual de estas células en la terapia celular es imposible a causa de las siguientes razones:

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S La necesidad de crecer las células en condiciones humanas o humanizadas (GMP), lo más estandarizadas posibles. S Las dificultades para la diferenciación controlada de las células madre embrionarias en tipos celulares concretos. S Las condiciones de bioseguridad para la implantación de las células. S Lo problemas de inmunogenicidad. La mayoría de las líneas derivadas de células madre embrionarias siguen siendo obtenidas bajo condiciones no aptas para su utilización directa en pacientes, pues la capa de células de soporte utilizada y algunos de los componentes del medio de cultivo no son de origen humano, lo cual puede representar un vehículo para nuevos patógenos a los pacientes. En general, la capa de células feeder, cuyo origen era al principio murino, se sustituyó por células fibroblásticas humanas provenientes de distintos tejidos. En ocasiones se utiliza una matriz artificial, como matrigel, con lo cual se obtienen líneas sobre los componentes de la matriz extracelular humana.8 No hay duda de que se está cerca de alcanzar las condiciones GMP; sin embargo, aún se carece de protocolos bien estandarizados y reproducibles. Aunque todos los protocolos de establecimiento de líneas derivadas de células madre embrionarias incluyen experimentos que demuestran su capacidad para diferenciarse in vivo e in vitro, se requieren experimentos que permitan inducir la diferenciación de una línea a una sola estirpe celular y, más en concreto, a la que se necesita de manera específica. También es importante señalar que las líneas no son exactamente iguales y, en general, la mayoría tienen capacidades para diferenciar las células de una determinada hoja embrionaria. Por lo tanto, se debe aprender a derivar las líneas embrionarias con absoluta especificidad antes de utilizarlas con fines terapéuticos. Asimismo, si existieran protocolos para asegurar la especificidad en la diferenciación, tendrían que mejorarse las condiciones de bioseguridad antes de aplicar terapéuticamente las células, pues al ser inyectadas las células madre, las embrionarias1 y las adultas9 generan tumores en un porcentaje elevado. Este extremo es muy importante, pues sugiere que también el desarrollo tumoral comienza en una célula madre tumoral. Lo anterior lo insinúan los datos que demuestran la existencia de las llamadas cancer stem cells.10 Otras investigaciones señalan que las moléculas que regulan la actividad de las células madre embrionarias, como

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la Nanog, la nucleoestatina y las E–ras, también están implicadas en el desarrollo tumoral.10 Por esta razón, es importante encontrar moléculas y vías de señalización celular que actúen de manera distinta en las células madre normales y en las células madre tumorales, lo cual permitiría avanzar en los temas de bioseguridad indicados. Otros datos interesantes descubiertos recientemente son los relacionados con el comportamiento del PTEN (homólogo de la fosfatasa y la tensina), una fosfatasa que desactiva la fosfoinositol–3–cinasa, inhibiendo la proliferación celular en células leucémicas y progenitores hematopoyéticos normales.11 Esta molécula actúa como un supresor tumoral y mantiene quiescentes las células madre hematopoyéticas mediante mecanismos independientes, por lo tanto, se genera en su ausencia un síndrome mieloproliferativo el cual progresa a una leucemia aguda. El PTEN también “mete en ciclo” los progenitores hematopoyéticos normales, dando como resultado un aumento transitorio de los mismos y su “agotamiento” final. Aunque se resolvieran los problemas técnicos del cultivo, la diferenciación controlada y los problemas de bioseguridad, las líneas embrionarias serían reconocidas como extrañas y rechazadas por el sistema inmunitario del receptor; este problema de inmunogenicidad sólo puede soslayarse o disminuirse. Las células madre embrionarias expresan niveles bajos o nulos de moléculas del MHC; sin embargo, la expresión aumenta rápidamente con la inyección in vivo de las células y haciendo genéticamente compatibles a las líneas y al individuo receptor de las células. Entonces adquiere importancia la posibilidad de hacer genéticamente iguales al paciente (receptor) y a las líneas mediante la transferencia de un núcleo somático del paciente a un ovocito enucleado, cuyo desarrollo podría dar lugar a blastómeros o células madre del blastocisto, las cuales derivadas a líneas podrían inyectarse en el donante del núcleo sin riesgo de rechazo inmunitario. Esta técnica no es ajustable todavía en los humanos, aunque sí en varias especies de mamíferos. Existen otras aplicaciones de esta técnica de transferencia nuclear, como la obtención de líneas de células deficientes, para estudiar la patogenia de muchas enfermedades de las cuales se carece de los modelos experimentales adecuados. Es importante analizar la causa de esta baja eficacia de la transferencia nuclear, en los humanos y en las especies en las cuales se ha intentado. El estado de las células donantes de los núcleos es esencial. También los blastómeros y las células troncales embrionarias muestran una gran eficiencia, pero hay grandes diferencias entre las distintas células adultas.12,13 Por ejemplo, las células de Sertoli, los granulocitos y las células NKT son altamente eficaces, en tanto que los fibroblastos muestran una efectividad baja; la actividad de los linfocitos T y B es nula. De manera sorpresiva, algunas células adultas, como los granulocitos, son más eficientes que las células madre hematopoyéticas adultas. Los mecanismos y las

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moléculas que comienzan el programa genético embrionario son desconocidas, y posiblemente la reprogramación genética empezada mediante transferencia nuclear y la capacidad real de desarrollo sean procesos distintos.12 A diferencia de lo que pudiera creerse, parece más fácil generar líneas de células madre embrionarias tras una transferencia nuclear, que de las propias células madre derivadas de la masa interna. Aunque esta técnica fuera puesta a punto en los humanos, no representaría una solución de aplicación masiva debido a que su eficacia es muy baja y su costo es elevado. Asimismo, el número de oocitos utilizados en otros animales para conseguir sólo un embrión es muy alto. Por lo tanto, el problema debe abordarse desde otra perspectiva, tal vez obteniendo primero la línea y enucleando después sus células y transfiriendo el núcleo del paciente a éstas. En este caso, reprogramar una célula somática con un núcleo somático nuevo hace el intento particularmente difícil. Otra posibilidad a futuro es la reprogramación de células diferenciadas a un estadio indiferenciado. Esto se logra cuando se transfiere el contenido de un núcleo somático a un oocito y cuando se fusiona con una célula madre embrionaria. El reto es identificar los factores clave en la iniciación de este proceso; sin embargo, hasta el momento los resultados son escasos y contradictorios. Así, cuando se fusionan las células madre embrionarias con los precursores neurales se produce un aumento de los niveles de Nanog, lo cual resulta en una “explosión” de genes pluripotentes y en la aparición de fenotipos típicos de células madre embrionarias.14 Al contrario, los fibroblastos embrionarios y los fibroblastos adultos murinos no revierten a un fenotipo de célula madre embrionaria tras la expresión de Nanog, aunque sí lo hacen con una baja eficacia al introducirles Oct3/4 Sox2, c–myc y Klf4.15 ¿Por qué utilizar células troncales embrionarias con fines terapéuticos conlleva tantos problemas? Sin duda porque se conoce muy poco de su biología, de su fenotipo y de los mecanismos que regulan sus dos principales características: la capacidad de autorrenovación y la aptitud de diferenciarse en múltiples linajes celulares. En seguida se hace una revisión de estos aspectos.

FENOTIPO DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Conocer la biología de las células madre adultas y de las células madre embrionarias consiste primero en caracterizarlas fenotípicamente, y segundo, en utilizar marcadores específicos, a partir de su identificación, para el aislamiento de las células en condiciones altamente purificadas. Lograr esto no es fácil en ambos casos; en las células adultas, debido a su limitado número en los tejidos y a la ines-

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pecificidad de los marcadores disponibles, y en las células embrionarias debido a la falta de estos marcadores. En general, las células madre embrionarias humanas expresan los marcadores típicos de las células de los teratocarcinomas humanos y distintos de los murinos. Es fundamental tener en cuenta estas diferencias entre las células madre humanas y las células madre murinas en aspectos clave como la morfología de las colonias que forman un cultivo, la expresión de los marcadores y el comportamiento frente a los distintos factores de crecimiento y a la diferenciación, los cuales dificultan extrapolar los resultados obtenidos en los modelos experimentales clásicos (las ratas y los ratones) para aplicarlos en las células humanas. Las células madre embrionarias humanas expresan: S Ovomorulina. S Antígenos embrionarios relacionados con el queratansulfato (TRA1–60 y TRA1–81). S Antígenos tisulares inespecíficos relacionados con la fosfatasa alcalina (TRA2–49 y TRA 2–54). S Thy–1, una molécula de la superfamilia de las inmunoglobulinas. S Antígenos embrionarios específicos de estadio (SSEA). En los humanos las células son la SSEA3+, la 4+ y la 1–, en tanto que en los ratones son la SSEA3–, la 4– y la 1+. También hay diferencias en la expresión de moléculas del MHC de clase I, las cuales se expresan con vehemencia en las células murinas y con debilidad en las células humanas, aunque su expresión aumenta rápidamente tras la diferenciación.1

Mecanismos regulares de la biología de las células madre embrionarias La falta de suficiente información acerca de los mecanismos moleculares que regulan la biología de las células madre impide conocer y controlar “a voluntad” su supervivencia, proliferación y diferenciación. Sin embargo, se conocen algunas rutas de señalización (LIF gp 130–Stat3, BMP–TGFb–Smad, MAPK–ERK, Wnt, entre otros) que son importantes en las células madre embrionarias, aunque haya diferencias entre una especie y otra, y en realidad se trate de rutas importantes para la biología de muchas células madre adultas. Junto con las vías de señalización, algunos factores de transcripción (Stat3, E–ras, c–myc, Flf4, Oct4, Sox2, Nanog, entre otros) también son importantes en la biología de las células madre embrionarias.12,16 Estudios recientes en ratones señalaron los genes Nanog, Oct4, Sox2 y, en menor medida, Esrrb, Tbx3 y Tcl1 como los factores de transcripción clave en la regulación de la capacidad de autorrenovación de las células madre

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embrionarias murinas. Al mismo tiempo, estos factores bloquean la diferenciación de las células madre. Los genes Nanog, Oct4 y Sox2 son bloqueadores generales; Nanog incluso regula los niveles de Oct4 y Sox2, en tanto que Oct4 bloquea de manera específica la diferenciación en trofectodermo. Los genes Esrrb, Tbx3 y Tcl1 bloquean la diferenciación de las células madre en epiblasto.17 Los genes Oct4, Nanog y Sox2 son reguladores transcripcionales a gran escala, los cuales además cooperan con otros factores para establecer el estado de la cromatina en las células madre embrionarias.12,17 Junto con estos factores de transcripción, la propia estructura de la cromatina determina el comportamiento de las células madre embrionarias. Todas las células pluripotentes exhiben un estado dinámico único de la cromatina.18,19 Mientras el recambio de la histona H1 tarda minutos y el de las histonas del núcleo del nucleosoma H2B y H3 tarda horas; en una célula diferenciada el recambio dura sólo unos segundos y en las células madre embrionarias, poco más de un minuto.18 En este estado, cuando las histonas se separan del DNA de la cromatina no se acumulan en el nucleoplasma, sino que quedan laxamente unidas a la cromatina. No obstante, no todas las proteínas vinculadas con la cromatina son capaces de moverse tan rápido en las células pluripotentes. Tampoco todas las regiones del núcleo son iguales en este sentido. Por ejemplo, la HP1, una proteína del grupo 1 relacionada con la heterocromatina, se mueve más rápido en las células madre; sólo en las zonas de la heterocromatina y de la H3.3, localizada en las áreas de alto nivel de transcripción, no muestra un aumento de su movilidad en las células madre.18 La localización de los factores de transcripción en la estructura de la cromatina, la existencia de represores y activadores génicos y las modificaciones epigenéticas que sufre, junto con la misma estructura de la cromatina, son fundamentales en la regulación del comportamiento de las células madre embrionarias. Entre los factores de transcripción, Oct4, Nanog y Sox2 se identifican en los promotores de más de 1 000 genes (alrededor de 350 unen los tres factores) de las células madre embrionarias, muchos de ellos implicados en el crecimiento y la división celular; otros codifican factores de transcripción y enzimas modificadoras de la cromatina.20 La mitad de estos genes son transcritos en las células madre embrionarias, incluyendo los propios Oct4, Nanog y Sox2, así como los componentes de la vía de señalización de BMP y Jack/Stat. También se unen a los genes inactivos que sólo se expresarán durante la diferenciación de las células madre. Entre los represores génicos más importantes de la actividad de las células madre están el grupo Polycomb, que a su vez regula su actividad mediante los llamados elementos de respuesta a Polycomb. Entre los activadores debe mencionarse al denominado grupo Tritorax (TrxG).20 El grupo represor Polycomb está formado por el complejo PCR2 (EED, EZH2, SUZ12) que comienza el silenciamiento génico catalizando la metilación del Lys27 de la histona H3. Por su parte, el complejo PCR1 conserva la represión

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transcripcional mediante compactación de la cromatina o interfiriendo el inicio de la transcripción.20 En las células madre, las proteínas Polycomb mantienen el programa de represión génica establecido por los factores de transcripción. Los complejos PCR1 y PCR2 se localizan en los promotores de más de 500 genes, de los cuales muchos son al parecer factores de diferenciación, reprimiendo su actividad precoz; la proteína BMI–1 del complejo PCR1 es necesaria para el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas y nerviosas adultas.20 Las modificaciones epigenéticas de la cromatina también contribuyen a la regulación de la actividad funcional de las células madre. Por ejemplo, en las células madre embrionarias, los puntos de metilación de las histonas configuran dominios divalentes, con frecuencia relacionados con genes de factores de transcripción como Nanog, Oct4 y Sox2 y de moléculas implicadas en el desarrollo.21 Una vez analizados los mecanismos regulares de la biología de las células madre embrionarias, se observará a las células adultas y sus posibles aplicaciones terapéuticas.

Células madre adultas de un linaje podrían generar células de linajes distintos No hay duda de la existencia de células madre en numerosos tejidos adultos, las cuales contribuyen a su crecimiento posnatal y desaparecen, disminuyen o atenúan sus capacidades durante el envejecimiento. Lo sorprendente y controvertido es la posibilidad de que estas células no sólo sean capaces de diferenciar a células de su propio linaje sino también a las células de otros linajes cuando las condiciones de diferenciación o el medio sean favorecedores.1 Varios estudios, en especial en ratones, realizados en los últimos años sugieren que las células madre hematopoyéticas medio purificadas son capaces de engendrar hepatocitos, neuronas y células musculares, también proponen que las células del estroma de la médula ósea generan neuronas y células gliales, y que las neuroesferas (grupos de progenitores neurales del sistema nervioso central crecidos en presencia de bFGF) producen numerosos linajes somáticos, incluyendo células sanguíneas y musculares. La interpretación de estos resultados resulta difícil y controvertida debido a que la mayoría de los estudios se realizaron en condiciones no clonales y a que los marcadores fenotípicos disponibles para caracterizar y aislar las células madre adultas son limitados y, desde luego, incapaces de caracterizar todas las células madre existentes en un tejido. Es posible que lo que en realidad se inyectó sea una mezcla de precursores monopotentes o pluripotentes cuya diferenciación en un determinado medio favorece un linaje no esperado. También es posible que las células progenitoras de un linaje bajo las condiciones experimentales elegidas sufran un proceso de desdiferenciación, lo cual las con-

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vierte en multipotentes capaces de diferenciar en otros linajes tisulares. Naturalmente, cabe la posibilidad de que en ciertas condiciones las células progenitoras de un linaje sufran transdiferenciación en otro linaje distinto. Esta última posibilidad, defendida por algunos autores, es motivo de debate pues los primeros estudios, poco controlados, tuvieron errores de interpretación. Por ejemplo, la aparente transdiferenciación de los precursores hematopoyéticos en células productoras de insulina se debió en realidad a que los progenitores captaban la insulina del medio pero no la producían. En otros casos, la falta de ensayos clonales en la mayoría de los experimentos hizo imposible asegurar la existencia de un fenómeno de transdiferenciación. Además, en muchos otros análisis se demostró que las células progenitoras más que transdiferenciarse se fusionan con las células del tejido y le conceden sus capacidades de autorrenovación y de proliferación aumentando el número de células diferenciadas.22 Otra interpretación interesante de estos resultados refuerza la relevancia de los precursores específicos de tejidos más que la transdiferenciación de progenitores de un linaje a otro. La hipótesis de partida emana de dos observaciones. La primera es la existencia en los tejidos adultos de precursores capaces de hacerlos crecer después del nacimiento. Por ejemplo, el aumento del peso del corazón de un recién nacido conforme éste crece no es consecuencia exclusiva del crecimiento celular, también, en mayor o menor medida, hay un aumento del número de células como consecuencia de la proliferación y la diferenciación de precursores locales. Asimismo, en algunos tejidos, por ejemplo en los corazones infartados, el análisis de biopsias demuestra mitosis locales que indican el intento de los progenitores tisulares por reparar los tejidos dañados. Esta capacidad regenerativa existe en los tejidos de los vertebrados inferiores, pero al parecer se perdió en gran medida en los humanos. La segunda observación sugiere que, durante su supuesta diferenciación a otros linajes, los progenitores se diferencian en monocitos y macrófagos, en especial los progenitores de origen mesodérmico como los hematopoyéticos y los mesenquimales (con frecuencia utilizados en estos ensayos), los cuales secretan muchos mediadores inflamatorios y factores de crecimiento que estimularían a las células progenitoras locales a proliferar y generar las nuevas células maduras. Esta hipótesis permitió mejorar los conocimientos sobre el fenotipo de las células progenitoras tisulares, permitiendo su aislamiento del hígado, del corazón, del folículo piloso y del cuerpo ciliar, entre otros. También permitió conocer la aparente implicación de algunos factores, como Wnt5a, IGF–1 y FGF, en este tipo de procesos.23,24 Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por contestar en relación con el tema: S ¿Las células madre de un tejido, por ejemplo de la médula ósea, son capaces de transformarse en otras células de distinto linaje?

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S ¿Por qué cuando se produce una hepatectomía y un infarto de miocardio, las células madre que circulan por la sangre no se dirigen al tejido dañado y lo reparan? ¿En realidad sí lo reparan, pero de manera insuficiente? S ¿Por qué el número de progenitores locales, por ejemplo cardiacos, no son suficientes para reponer el tejido dañado tras un infarto? Es evidente la relevancia que tiene optar por una u otra interpretación de estos resultados. Si se entiende que los progenitores son capaces de la transdiferenciación, se deberá profundizar en la forma de administración, el número de células a suministrar y las moléculas que puedan atraer a los progenitores de otros tejidos. Si se entiende que la estimulación in situ de los progenitores locales es la clave, deberá procederse a la identificación de las moléculas estimuladoras.

Papel de los micromedios en la regulación de la biología de las células troncales La interpretación de los experimentos acerca de la diferenciación de las células madre adultas entiende que éstas son capaces de diferenciarse en linajes distintos de acuerdo con las condiciones en las cuales se produzca la diferenciación, y entiende también que la estimulación de las células madre locales es lo que puede reconstituir un órgano dañado. Sea lo que sea, es obvio que el medio en el cual se producen estos procesos es fundamental. La importancia de los micromedios, o nichos, en especial en los progenitores hematopoyéticos y neuronales, fue puesta de manifiesto hace muchos años y se entiende por micromedio el nicho capaz de mantener las células madre controlando su supervivencia, proliferación y diferenciación. Cada vez es más aceptada la idea de que las células madre y las células del nicho constituyen una unidad fisiológica interactiva organizada para facilitar decisiones cell fate en el adecuado medio espacial y temporal. Por lo tanto, sólo las células madre que se alberguen en el nicho apropiado podrán sobrevivir, proliferar y diferenciarse como es debido, para lo cual las células madre y los componentes del nicho deberán “intercambiar señales” para “reconocerse” y “tolerarse” mutuamente.25 La relación entre los nichos y el comportamiento de las células madre se demostró recientemente en el testículo y, más tarde, en el ovario de Drosophila. En el primero, las células germinales orientan perpendicularmente sus divisiones a las células somáticas que las delimitan, razón por la cual, una vez efectuada la división, la célula más cercana a la somática y al parecer la que más señales recibe (algunas están vinculadas con las familias Hedgehog y Wingle) permanece como precursora, en tanto que la más alejada diferencia.26,27 Antes de revisar el ejemplo del micromedio hematopoyético, sería interesante analizar la importancia de las divisiones para la biología de las células madre.

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Desde hace apenas unos años se dio relevancia a la función que las divisiones asimétricas, las cuales dan lugar a dos células hijas de distinto tamaño (un mecanismo de diferenciación conocido desde hace mucho tiempo en los tejidos vegetales), tienen en la biología de las células madre.28 Por ejemplo, los genes (Numb, Numb–like) que inducen las divisiones asimétricas de precursores neurales determinan su diferenciación.29 Sin embargo, el mecanismo no parece ser universal. Las células troncales embrionarias pueden diferenciarse tras divisiones asimétricas.30 Así, las divisiones asimétricas bloquearían la expansión del compartimento stem, lo cual es impensable durante el desarrollo embrionario y en los procesos de regeneración tisular.31 Es posible que el pool de células madre tenga un comportamiento no homogéneo o que esté en realidad constituido por subpoblaciones en cuanto a la forma de realizar sus divisiones, en las que combina simétricas y asimétricas en un mismo momento o alternando los dos modelos.31 No obstante, se trata de un modelo dinámico del comportamiento de las poblaciones celulares difícil de confirmar experimentalmente. Respecto a los nichos, quizás el micromedio hematopoyético de la médula ósea murina sea el mejor conocido, razón por la cual es revisado en este capítulo. Desde hace años se sabe que la localización de las células madre hematopoyéticas en el espacio físico denominado médula ósea no sucede al azar, sino que está estrictamente regulada por células madre dispuestas en el endostio y por su descendencia desde esa localización hasta el vaso central por el cual las células más maduras alcanzan el torrente sanguíneo.32,33 Recientemente se descubrió que esta localización en el endostio obedece a la estrecha relación que las células madre hematopoyéticas mantienen con los osteoblastos, los cuales parecen regular su funcionamiento. Así, los distintos tratamientos que acrecientan la cantidad de osteoblastos, como el suministro de la hormona paratiroidea y la eliminación de los receptores BMPR1–A para BMP, aumentan el número de células madre hematopoyéticas y, al contrario, la eliminación de osteoblastos tiene como resultado aplasia medular, la liberación de células madre y la hematopoyesis ectópica en otros tejidos.34–35 Asimismo, hoy se conocen algunas de las moléculas implicadas en estos procesos:32,36 S La N–cadherina y la b–catenina, las cuales se expresan en las células madre hematopoyéticas y en los osteoblastos, y que podrían anclar, o adherir, las primeras células al nicho en el endostio. S La señalización a través de Notch1 (expresada en las células madre), Jagged1 (osteoblasto), Tie2 (células madre) y angiopoyetina (osteoblasto) regula el anclaje y mantiene quiescentes a las células madre hematopoyéticas. S También la matriz extracelular está implicada en los procesos: la osteopontina regula la proliferación de las células madre y éstas expresan un receptor

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sensible a Ca++, elemento clave en la organización de la matriz mineral ósea, cuya ausencia impide que se alberguen en el endostio. Un ejemplo de la complejidad de estos nichos es lo que sucede durante la salida de la médula ósea de células madre hematopoyéticas mediada por el G–CSF.37 Al parecer el G–CSF estimula de manera directa e indirecta la liberación de noradrenalina, la cual reduce la actividad del osteoblasto, disminuyendo los niveles de CXCL12, una quimiocina que atrae y retiene las células madre hematopoyéticas que expresan su receptor CXCR4, lo cual induce su liberación del endostio. Así, los b–antagonistas podrían modular la movilidad de las células madre hematopoyéticas. La complejidad de los nichos y de las relaciones que se establecen dentro de ellos con las células madre es obvia.25,38 Los nichos que albergan distintas células madre deben organizarse de manera diferente. Por ejemplo, son sencillos en los tejidos con un turnover celular bajo, pero más complejos en los tejidos con un turnover continuo. En estos “medios”, los nichos deben dividirse en compartimentos, de los cuales cada uno alberga una cantidad pequeña de células madre. Al igual que las células madre, los componentes de sus nichos deben sufrir cambios en condiciones patológicas y con el envejecimiento. La relevancia de los nichos en la biología de las células madre implica preguntas cuyas respuestas sólo pueden especularse: S ¿Cómo se rellenan los nichos de las células madre si estos se vaciaran? S ¿Reciben señales las células madre desde el nicho para proliferar y diferenciarse? S ¿Cuáles son esas señales?

CONCLUSIONES El repaso de los conocimientos acerca de las células madre embrionarias y las células madre adultas incluye el señalamiento de los datos existentes, las incógnitas por resolver y los problemas a los que deberá enfrentarse la ciencia. El objetivo de este repaso es proclamar que la terapia con células madre es una esperanza pero no una realidad. Es cierto el logro de avances importantes en el ámbito de la utilización de distintos tipos celulares en la cirugía y la traumatología, y también en la fabricación de epitelio, en especial de piel, para tratar quemados, y como vehículo para la reparación génica; sin embargo, no hay datos fiables y reproducibles que aseguren la curación y la mejora con células madre de las patologías hepáticas, cardia-

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cas y neurodegenerativas. Los ensayos en humanos fracasan una y otra vez debido a que los conocimientos sobre la biología y el funcionamiento de las células madre humanas es insuficiente para dar el salto a la terapia celular.39 Se necesitan más investigaciones básicas relacionadas con las células adultas y las células embrionarias en las cuales se utilicen modelos más cercanos al humano. También se requiere controlar de manera adecuada y precisa la diferenciación de las células madre en el linaje deseado; que la diferenciación sea estable, dentro de los límites de la bioseguridad a largo plazo; resolver los problemas de la inmunogenicidad de las células y los cultivos; preparar de una gran cantidad de células en biorreactores bajo condiciones de calidad, y resolver muchos problemas acerca de la dispensación de las células a los pacientes. Con todo esto, los avances obtenidos hasta hoy aseguran un futuro esperanzador.

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Daniel Ascencio González

A lo largo de la vida los tejidos del cuerpo humano sufren un proceso de desgaste gradual, que se compensa mediante la capacidad intrínseca de autorrenovación celular; si este proceso no se generara, la esperanza de vida se reduciría de manera considerable. Una parte sustancial de las enfermedades que afectan al ser humano tienen su origen en los procesos degenerativos que durante el transcurso de la vida sufren los órganos y los tejidos, en sus manifestaciones agudas y crónicas, y a causa del proceso de envejecimiento. Las investigaciones relacionadas con las células madre permiten conocer el proceso de desarrollo de un organismo (p. ej., cómo una simple célula da origen al cuerpo humano). También se conoce la capacidad que tienen las células sanas de reemplazar a las células dañadas a causa de diversas enfermedades y del desgaste normal en los organismos adultos. Esta área prometedora de rápida expansión en la ciencia genera conocimientos nuevos los cuales llevan a los científicos a investigar la posibilidad de tratar diversas enfermedades por medio de terapias celulares; esta disciplina emergente es conocida como medicina reparativa y como medicina regenerativa. La ingeniería tisular y la medicina regenerativa tienen entre sus metas el reemplazo de órganos y tejidos afectados por enfermedades congénitas, traumáticas y crónico–degenerativas, propósito para el cual utilizan como estrategia las características singulares que poseen las células madre, o troncales, relacionadas con su capacidad de transformarse y dividirse en células específicas competentes para inducir el proceso de regeneración tisular. 85

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La medicina regenerativa ofrece expectativas terapéuticas nuevas para muchas enfermedades mediante el manejo de los mecanismos naturales que utiliza el organismo para la renovación de las poblaciones celulares, las cuales sufren desgaste a causa del proceso de envejecimiento originado por diversas enfermedades y necesitan ser renovadas. Es fundamental manipular los mecanismos de reparación, renovación y regeneración, sin olvidar que estos mecanismos dependen directamente del tiempo de evolución en el que se establece el daño y del grado de degeneración tisular de cada enfermedad. Así, en la muerte súbita de grandes cantidades de tejido (por ejemplo, los infartos del miocardio y los infartos cerebrales) no es posible restituir de inmediato la totalidad del tejido por medio de estos mecanismos para que la función del órgano pueda continuar. Las nuevas estrategias de la ingeniería tisular pueden favorecer la regeneración cuando se logra integrar de forma adecuada la tríada conformada por células madre idóneas, las cuales permitan inducir la diferenciación celular específica de cada tejido; biomateriales óptimos y los factores de crecimiento capaces, los cuales consientan el desarrollo tisular, y después, el trasplante de estos tejidos construidos in vitro o la realización del proceso in vivo. Estas estrategias representan una solución potencial para muchas enfermedades.

DEFINICIÓN Las células madre se distinguen de otros tipos celulares por dos características muy importantes: 1. Son células no especializadas y poseen la capacidad de renovarse por sí mismas durante largos periodos por medio de la división. 2. Bajo ciertas circunstancias fisiológicas y experimentales pueden convertirse en células con funciones específicas (por ejemplo, en células contráctiles del músculo cardiaco y en células productoras de insulina del páncreas). Para nombrar a las células que tiene la capacidad de autorrenovarse y de regenerarse se aceptan como sinónimos: célula madre, célula troncal, célula progenitora y stem cell. En los animales superiores, las células madre se clasifican en dos grupos: 1. Células madre embrionarias (embrionic stem cells): estas células tienen su origen y localización en la masa celular interna del embrión, durante el estadio de blastocisto entre los días 7 y 14 posteriores a la fecundación. Tienen la capacidad de generar todos los tipos celulares del organismo, característi-

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cas por las cuales son consideradas células totipotentes.1 Después de muchas divisiones otro tipo de células se derivan de las células madre embrionarias: las células madre órgano–específicas, las cuales son multipotentes y virtualmente capaces de generar órganos y tejidos, en el embrión y en el organismo adulto.2 Durante los primeros estadios de su desarrollo, en el embrión humano existe un grupo celular organizado en diversas estructuras multicelulares las cuales comienzan la construcción del organismo a los cinco días en la masa celular interna; también se delimitan las células madre embrionarias, que tienen la capacidad de formar todos los tejidos, órganos y sistemas de un individuo. Se cree que cada célula y cada tipo celular tiene la información para cambiar la orientación funcional y producir diversos tipos celulares; esta característica permite modificar la función de las células y de los grupos celulares dañados por diversas patologías.3 2. Células madre adultas: en los organismos pluricelulares estas células poseen la doble capacidad de autorrenovarse de manera ilimitada mediante el proceso de diferenciación y de originar otros tipos celulares especializados. Las células madre órgano–específicas (por ejemplo, las células de la médula ósea) pueden generar todos los tipos celulares hematopoyéticos y del sistema inmunitario; por otra parte, las células madre adultas que se encuentran en diversos órganos y tejidos del cuerpo humano están aisladas de la piel, de la grasa subcutánea, del músculo cardiaco y el esquelético, del cerebro, de la retina y del páncreas, entre otros.4 La función biológica de las células madre adultas consiste en crear estructuras orgánicas durante la etapa de desarrollo. En la etapa posnatal, las células participan en la regeneración de tejidos y órganos dañados, enfermos y envejecidos. Así, su gran potencial de desarrollo y transformación ofrece oportunidades terapéuticas nuevas a diversas enfermedades cuyas posibilidades de tratamiento son pocas o nulas. Los órganos y los tejidos del cuerpo humano tienen la singular capacidad de desarrollar dos procesos biológicos: la reparación, mediante la cual se logra la cicatrización de las heridas, y la regeneración, por medio de la cual se consigue la restitución tisular ad integrum; ambos procesos favorecen el equilibrio homeostático. Para realizarlos, el organismo utiliza un reservorio de células madre adultas cuyo proceso de maduración sigue una secuencia orquestada que varía en cada tejido y órgano, según su estirpe y naturaleza.5 Las células madre adultas y las células madre embrionarias tienen diferentes mecanismos de acciones y funciones. Las células adultas inducen y potencian la función in vivo que poseen de manera natural; de lo contrario, para su posible uso terapéutico las células madre embrionarias tendrían que ser extraídas de su medio

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natural, el embrión en desarrollo. También tendría que inducirse su crecimiento y su maduración y ser trasplantadas dentro de una construcción tisular.6 El análisis de las células madre embrionarias permite comprender mejor su función y su diferenciación, y también las circunstancias que ocurren durante el desarrollo embrionario. Las posibilidades terapéuticas son actualmente motivo de debate, razón por la cual no deben generarse falsas expectativas. Por otra parte, debe continuarse la investigación de los procesos biológicos de las células madre adultas para entender mejor sus capacidades de regenerar órganos y tejidos, y para comenzar y extender su uso terapéutico. En el organismo in vivo, es indispensable conocer a fondo la función particular de cada línea celular madre, los diversos factores que inducen la multiplicación, la maduración de cada célula especializada, y aplicar estos conocimientos en la medicina regenerativa.

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Cualquier tipo celular embrionario y extraembrionario puede ser obtenido de un embrión de pocos días de vida. En el embrión de dos células, después de la primera división del cigoto, ambas células están comprometidas en el desarrollo del embrión. Uno de los blastómeros forma los tejidos embrionarios y da origen a la masa celular interna del blastocito; estas células tienen el potencial de contribuir a formar cualquier linaje celular, razón por la cual son denominadas células totipotentes. La otra parte del blastocito forma los tejidos embrionarios mediante la conversión del trofoblasto. El proceso de diferenciación de las células de la masa celular interna del blastocito es irreversible, por lo tanto, los linajes celulares avanzan hasta la especialización y la maduración.7 Las vías de señalización que obedecen las células madre embrionarias para permanecer en un estado indiferenciado son factores específicos de esa etapa. En cultivo, las células madre embrionarias pueden transformarse en células madre del trofoblasto debido precisamente al cambio de la expresión del gen. Asimismo, las células del trofoectodermo dan origen a la capa del trofoblasto de la placenta.8 Antes de anidar el embrión, las células de la masa celular interna se organizan en dos capas, las cuales dan origen al endodermo primitivo, al endodermo extraembrionario y al epiblasto (la capa de ectodermo primitivo), que está involucrado en la generación de los tejidos del embrión y de otros tejidos extraembrionarios. En esta etapa de desarrollo, estas células son únicamente progenitoras o precursoras, y se multiplican de manera ilimitada antes de diferenciarse y de formar todos los tejidos adultos.8 En la experimentación, cuando se extraen las células de la masa celular interna del embrión y se cultivan in vitro, comienza una proliferación ilimitada y, al mismo tiempo, se mantiene el potencial que da origen a líneas de células derivadas

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de cualquiera de los linajes del embrión.9 Más tarde, cuando el embrión pasa al estadio de gástrula, inmediatamente después de la anidación, las células de la masa celular interna están comprometidas para diferenciarse en linajes específicos de acuerdo con el sitio que ocupan en el embrión; en este estadio, las células tienen la característica de ser multipotentes.10 A partir de estas células es posible obtener líneas celulares pluripotentes con la capacidad para diferenciarse en las tres capas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo) y en la línea germinal derivada in vitro de la masa celular interna; éstas son las llamadas células madre embrionarias. El factor primordial que determina la pluripotencialidad lo representa el gen Oct4, el cual se expresa sobre todo en las células totipotentes de la masa celular interna; su expresión es muy superior en comparación con la expresión de las células diferenciadas del trofoectodermo. A medida que aparecen los diversos tipos celulares diferenciados en el embrión, los niveles de expresión del Oct4 descienden hasta no ser detectables. La expresión de este gen está directamente relacionada con la totipotencia de las células en los primeros estadios del desarrollo embrionario y regula la diferenciación del embrión antes de su implante. En esta etapa, las células tienen la capacidad de autorrenovarse de manera temporal y transitoria.11 Así, se establece que las células madre embrionarias son pluripotentes pero no totipotentes. Asimismo, a pesar de contribuir a la formación de todos los tejidos fetales, no participan en la formación del trofoectodermo y del endodermo primitivo. En el cultivo de las células de la masa celular interna del blastocito, la presencia del factor inhibidor de leucemia permite mantener inmortalizadas las líneas celulares. Si se conservan las propiedades de las células madre, las líneas celulares pueden ser mantenidas por tiempo indefinido cuando está presente el factor inhibidor de leucemia y se expresan los marcadores del estado indiferenciado pluripotente, como el Oct4. En ausencia del factor, la línea celular inmortalizada no puede ser conservada en ese estado.12 En un estudio realizado en ratones y en humanos se demostró que es posible mantener la pluripotencialidad mediante la activación de la vía de señalización Wnt.13 No hay duda de que la determinación y el compromiso siguen una dirección y obedecen directamente a un grupo de genes interrelacionados y encargados de la regulación y el control de cada estadio de diferenciación y especialización celular. La expresión funciona en grupos con diferente nivel jerárquico.14 También se tiene claro que el proceso de diferenciación de una célula hacia un estadio de alta especialización está relacionado con la pérdida de la capacidad de multiplicación celular; la célula conserva la memoria histórica, como célula madre de reserva, progenitora y diferenciada. El equilibrio entre la diferenciación y la proliferación está regulado por la genética; si el equilibrio falla, puede dar origen a un proceso neoplásico. Así,

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existe una íntima interconexión entre las cascadas de expresión de los genes que regulan los tres procesos celulares fundamentales para la vida: el control de la proliferación, la diferenciación y la apoptosis.15 En resumen, las células madre embrionarias humanas y de ratones son líneas celulares permanentes derivadas de la preimplantación de embriones, las cuales manifiestan las peculiaridades de combinar las capacidad de autorrenovación con la pluripotencia y tienen la característica de conservar un cariotipo normal. En términos prácticos, estas propiedades significan que las células madre embrionarias pueden conservarse en cultivo durante periodos indefinidos y, al mismo tiempo, mantener su habilidad para diferenciarse en cualquier tipo de célula si se proporciona un medio adecuado in vivo e in vitro. En la actualidad se dispone de líneas de células madre embrionarias humanas que proporcionan fundamentos nuevos para la comprensión de la embriogénesis y de la organogénesis humana en sus etapas tempranas, y también para desarrollar de forma auténtica modelos de diversas enfermedades experimentales humanas. Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos que regulan la diferenciación de las células madre embrionarias humanas en tipos celulares específicos es muy limitado. Se necesita estudiar más acerca de las células madre embrionarias para poder contestar preguntas como: S ¿Cuáles son los mecanismos moleculares mediante los cuales se mantienen la autorrenovación y la pluripotencia? S ¿Cómo interfieren los determinantes intrínsecos y los determinantes extrínsecos en la identidad de las células madre embrionarias para mantener la pluripotencia de estas células? S ¿Cuáles son las bases celulares de la pluripotencia? S ¿Depende la renovación simétrica de las células madre embrionarias pluripotentes de la división simétrica? S ¿Depende la pluripotencia de las células madre embrionarias de la prevención activa de la diferenciación celular? ¿O depende de la inversión de la especificación de la citogénesis?

CÉLULAS MADRE ADULTAS Desde la década de 1990 se sabe que las células madre adultas pueden tener diversas fuentes en el organismo adulto: poseen la singular capacidad de diferenciarse y dar origen a células especializadas. Esta característica de pluripotencialidad tiene la función, entre muchas otras, de proporcionar el equilibrio homeostático de los tejidos, y participa en los proce-

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sos biológicos de la reparación tisular que ocurre en diversas enfermedades, debido a su capacidad, durante la etapa posnatal, de transdiferenciarse y de repoblar otro tejido con un tipo celular.16 Las células madre adultas tienen varias fuentes (la médula ósea, la sangre periférica, el cerebro, la médula espinal, el tejido graso, la pulpa dentaria, los vasos sanguíneos, el tejido musculosquelético, el epitelio de la piel, el tejido conjuntivo, la córnea, la retina, los conductos pancreáticos, entre otros). La gran plasticidad de estas células les permite dar origen a otros tejidos. Otras fuentes potenciales de células madre son la sangre del cordón umbilical y, de acuerdo con descubrimientos recientes, el líquido amniótico.17 Las células madre adultas son células indiferenciadas con la capacidad de proliferar de manera continua y de dar origen a células en el mismo estado de indiferenciación; también tienen el potencial para formar otros tipos celulares diferenciados. En su entorno, las células madre adultas de cada tejido desarrollan un programa de diferenciación propio debido a su plasticidad. En ciertas circunstancias, cuando su medio se modifica, las células madre adultas pueden cambiar el programa de diferenciación celular de acuerdo con las señales que reciban, por lo tanto, la potencialidad de las células madre puede favorecer a otros tipos celulares al colocarlas en un medio apropiado.17 Las células madre adultas poseen cualidades propias y diferentes a las de las células madre embrionarias. Sin embargo, las células madre hematopoyéticas comparten una característica con las células madre embrionarias: son susceptibles a dividirse muchas veces y renovarse, lo cual les permite mantener una población celular de tamaño adecuado. Las células progenitoras que pueden diferenciarse en otros tipos celulares tienen su origen en una sola célula madre y poseen la capacidad de repoblar el tejido original al momento de ser trasplantadas a un tejido enfermo. La autorrenovación por divisiones asimétricas que da origen a las células sanguíneas es una característica propia de las células hematopoyéticas madre, la cual permite la constante renovación del sistema hematopoyético, como en los trasplantes de médula ósea a causa de un problema maligno.18 Otro ejemplo de repoblación celular son las células madre neurales.19 Entre los mecanismos de regulación de este equilibrio destacan la plasticidad y el control del crecimiento, la diferenciación y la apoptosis.

Plasticidad La capacidad que tienen las células madre específicas de un tejido de tomar distintos caminos hacia tipos celulares diferentes a su origen se denomina plasticidad. El proceso es lento y no en todas las células la plasticidad es producto de una célula madre adulta única que logra su diferenciación hacia una línea celular.20

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Durante el desarrollo, antes de alcanzar la etapa de blastocito, las células madre adultas reciben muchas señales extracelulares. En esta etapa existen mecanismos, como la expresión del gen Oct4, los cuales frenan la diferenciación y mantienen el estado pluripotencial de la célula. La expresión del gen Oct4 está presente desde la etapa del oocito no fecundado hasta la del blastocisto, y su expresión en células totipotentes de la masa interna es superior a la detectada en las células diferenciadas del trofoectodermo. El gen está encargado de la codificación de un factor de transcripción que mantiene la totipotencialidad de las células germinales y de las células embrionarias y está presente en las células madre adultas. Durante el proceso de crecimiento y maduración la potencia de la diferenciación disminuye.21 Por otra parte, el alto nivel de la enzima telomerasa elimina el control de la proliferación celular y permite un estado “inmortalizado” de la célula y la expresión de genes cuyos productos bloquean, desbloquean y actúan en el estado de inmadurez celular. Esto implica que las cascadas de expresión de genes tengan la capacidad de regular los tres procesos celulares esenciales para la vida de un organismo: la proliferación, la diferenciación y la apoptosis, los cuales mantienen una estrecha interconexión. A lo largo del crecimiento y hasta la etapa adulta, las células madre adultas de diversos tejidos son identificadas en diferentes nichos, en los cuales no pueden recibir señales inductivas debido a la organización espacial que guardan. Estas células madre adultas con características de multipotencialidad tienen la capacidad de regenerar in vivo su tejido original y otros tejidos; cultivadas in vitro son susceptibles de diferenciarse hacia líneas celulares diferentes de la capa embrionaria que les dio origen.22,23 Las células madre adultas, las células troncales mesenquimatosas y las células progenitoras endoteliales pueden ser localizadas en la médula ósea, la cual contiene células madre multipotenciales con la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales.24 Existen muchas pruebas de la existencia de una reserva de células madre adultas pluripotentes en el organismo humano, las cuales tienen la capacidad de crecer in vitro y de diferenciarse en células de diversos tejidos. El origen del fenómeno de plasticidad de las células madre adultas persiste en la vida posnatal; las células madre adultas multipotentes y pluripotentes son descendientes de células somáticas y están presentes en distintos órganos y tejidos. Por otra parte, se sabe que las células madre hematopoyéticas migran del espacio de la médula ósea y llegan a diversos órganos a través de la sangre periférica, en los cuales pueden ocurrir los procesos de desdiferenciación y rediferenciación.25 Diversas células pueden cambiar su linaje cuando se cultivan in vitro y logran adquirir un fenotipo diferente. Se dice que la plasticidad puede ser el resultado de la fusión entre la célula donante y la célula que reside en un órgano y en un tejido.26

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Control del crecimiento, diferenciación y apoptosis El posible uso con propósitos terapéuticos de las células madre adultas, progenitoras e inmaduras, requiere el control natural que tiene toda célula de un organismo pluricelular: la proliferación, la maduración y la apoptosis. El control celular depende del estado de la célula, del tiempo de desarrollo y del lugar que ocupa en el organismo.27 Cada tipo de célula recibe diferentes señales paracrinas las cuales se integran a su vía metabólica. Estas señales, representadas por múltiples factores de crecimiento, permite a las células controlar de manera precisa su multiplicación, su maduración y la inducción del proceso de apoptosis. Si estos pasos son orquestados de manera precisa y equilibrada, el evento final puede ser la regeneración celular.28,29

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USO TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MADRE El organismo utiliza varios mecanismos para mantener la homeostasis celular fisiológica; uno de ellos consiste en la multiplicación de las células diferenciadas las cuales tienen su origen en las células indiferenciadas, en las células madre adultas y en la morfogénesis embrionaria y fetal. En la vida adulta existe una población limitada de células madre adultas indiferenciadas en prácticamente todos los tejidos y órganos. Estas células son capaces de diferenciarse para regenerar el tejido y el órgano en el cual yacen, pero su eficacia regenerativa es muy limitada debido a su escaso número. Los conocimientos y los adelantos adquiridos pueden ser aplicados en el uso terapéutico de las células madre; sin embargo, aún falta analizar a fondo algunos tejidos, como la piel (en pacientes quemados), y la variante génica de la terapia. Por otra parte, se iniciaron ya los trabajos experimentales relacionados con la regeneración de hueso, de cartílago y del músculo cardiaco. En este sentido, los aspectos más relevantes de los posibles usos terapéuticos de las células madre y las investigaciones efectuadas por diversos grupos merecen una revisión.

Fuentes de células La información aportada por el fenómeno de plasticidad de las células madre adultas supone la posibilidad de su uso terapéutico dentro de la medicina regenerativa, y como vehículo de genes en la terapia génica. La gran reserva pluripotencial de células madre adultas localizadas en la médula ósea representa el estándar de oro para el trasplante autólogo, pues las células pueden ser cultivadas y expan-

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didas sin problemas de inmunidad y de generación de tumores.30 Asimismo, estas células pueden dar origen a células hepáticas, células musculares estriadas, células del sistema hematopoyético, cardiomiocitos, entre otros,31 y también ser usadas en la terapia génica. Las células de la médula ósea se usan de manera experimental como tratamiento para la osteogénesis imperfecta.32 En estudios en animales de experimentación, la inyección de células hematopoyéticas tiene la capacidad de producir células en los conductos biliares, en los pulmones, en el tracto intestinal y en la piel.33,34 Otra fuente abundante de células madre adultas con gran plasticidad es el tejido adiposo; con las células obtenidas mediante la liposucción se pueden diferenciar in vitro tejidos como el músculo, el hueso, el cartílago y las células nerviosas. Con un grado mayor de maduración, estas células pueden alcanzar un grado de diferenciación dentro de un medio apropiado. También su información puede ser reprogramada para inducir el fenómeno de transdiferenciación in vitro.35

Posibles formas de uso terapéutico Terapia celular S Implante de células derivadas in vitro a partir de células troncales.36 S Implante de grupos celulares (como islotes pancreáticos) derivados de células madre adultas.37,38 S Activación de células madre adultas in vivo mediante el aporte de factores de diferenciación, con la ayuda de la inyección directa del factor y por medio del aporte de células productoras de estos factores.39

Terapias celular y genética combinadas S Implante de células madre modificadas genéticamente para aportar las proteínas necesarias para el funcionamiento normal.40 S Reemplazo del sistema inmunitario destruido a causa del tratamiento oncológico mediante quimioterapia o radiación, por medio de la inserción del gen que codifica la proteína de señalización intercelular (sonic hedgehog) la cual estimula el crecimiento de las células madre de un adulto.41

FUTURO USO TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS EN ALGUNAS ENFERMEDADES DEGENERATIVAS Para el uso terapéutico se debe elegir con cuidado el procedimiento y la fuente, y conocer las características de las células madre adultas. El diseño terapéutico

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depende primeramente de la etiología y del estado de desarrollo de la enfermedad a tratarse y, después, de la causa de la destrucción de las células y de la complejidad interna del órgano y del tejido. Existen algunas terapias donde es posible el uso de células madre; algunas consisten en estudios experimentales y otras en estudios preclínicos en desarrollo.

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Corazón La hipoxia en una zona del músculo cardiaco es causante de necrosis tisular. Si el área afectada es extensa se produce un infarto del miocardio, el cual en muchos de los casos requiere el trasplante del órgano; sin embargo, el procedimiento puede ser evitado si se transporta al sitio afectado células sanas que sustituyan a las células dañadas o muertas. Varias investigaciones experimentaron el uso de células madre adultas de la médula ósea para inducir la diferenciación y la transformación de estas células en cardiomiocitos.42 Otros estudios demostraron que la inyección de mioblastos esqueléticos en el miocardio dañado mediante un infarto experimental induce la regeneración del músculo cardiaco. En algunos casos, las células aún inmaduras dentro de los cardiomiocitos dañados se transforman en células sanas, se fusionan con las células dañadas, inducen el proceso de regeneración tisular y terminan como células funcionales sanas.43 En actualidad, mediante estudios experimentales y clínicos, se busca la forma de combinar células madre provenientes de la médula ósea con mioblastos esqueléticos y añadir diferentes factores angiogénicos para lograr el reemplazo de la cicatriz producida por un infarto del miocardio. Con lo anterior se busca disminuir el proceso de fibrosis y aumentar la producción de nuevas células funcionales de miocardio. Las células madre adultas también pueden transformarse en angioblastos e inducir la formación de un proceso de angiogénesis, el cual debe ayudar a la reparación y la regeneración de la zona de transición entre el área sana y la zona de infarto.44–46

Cerebro Existen pruebas convincentes que demuestran la existencia de células madre neurales en diferentes zonas del cerebro, las cuales tienen la capacidad para diferenciarse en neuronas específicas.47 Por otra parte, las células madre adultas de la médula ósea pueden seguir una vía de diferenciación hacia células neuronales. La estrategia consiste en restaurar las zonas afectadas del cerebro por medio de la inducción de la proliferación y la diferenciación in situ de las células madre neurales. Otra opción es dirigir al cerebro células troncales de la médula ósea y convertirlas en células neurales.

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La enfermedad de Parkinson se caracteriza por el envejecimiento y la autodestrucción prematura de neuronas específicas. Estudios experimentales en animales sugieren que el uso de un factor de crecimiento puede estimular la migración y el crecimiento de células madre adultas neuronales.48 Las investigaciones observaron que cuando se aplica mediante infusión directa, el factor neurotrófico derivado de las células gliales protege de la muerte celular a las neuronas dopaminérgicas; por medio de un catéter la proteína se administró en el cerebro de cinco pacientes diariamente durante 18 meses. Los resultados preliminares son alentadores, pero se requieren más estudios para implantar esta forma terapéutica.49 Antes de comenzar la fase clínica del autotrasplante del cuerpo carotídeo es necesario llevar a cabo más experimentos en animales. Hasta ahora los resultados la respaldan como una técnica útil para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.50 Otros estudios demuestran las primeras pruebas contundentes de la transformación de las células de la médula ósea en células conductoras de impulsos eléctricos; en células gliales; en células formadoras de mielina, y en neuronas en regiones afectadas por la enfermedad de Parkinson, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Huntington, la ataxia y la enfermedad de Alzheimer.51,52 La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmunitaria en la cual las células son atacadas y destruyen la vaina de mielina de los axones neuronales. En un estudio experimental se inyectaron células madre neurales por vía intravenosa y directamente en la zona interventricular cerebral. El resultado fue la reparación del área dañada; las células madre adultas entraron en las zonas desmielinizadas, se diferenciaron en células cerebrales precursoras, maduraron y dieron origen a oligodendrocitos productores de mielina. También se demostró el recubrimiento de las zonas desmielinizadas y, por lo tanto, una regeneración anatomofuncional.53

Médula espinal Puede intentarse la reparación de lesiones de la médula espinal cuando existe la sección parcial o total de las fibras nerviosas que corren a lo largo de ella. El tratamiento consiste en inducir la migración de las células madre adultas a lo largo de la médula espinal.54

Páncreas La etiología de la diabetes juvenil se atribuye a la reacción del sistema inmunitario ante las células de los islotes b del páncreas, productoras de insulina. La autodestrucción del páncreas ocurre en una edad temprana, razón por la cual las célu-

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las de los islotes transplantados y de las células implantadas vuelven a ser afectadas por la reacción autoinmunitaria.55 En varios experimentos se logró eliminar del páncreas dañado las células del sistema inmunitario autorreactivas que residen en los islotes. Al parecer, bajo estas condiciones, los islotes logran regenerarse de modo espontáneo a partir de las reservas de células madre adultas del organismo presentes en los conductos pancreáticos.56 El descubrimiento de la hormona insulinotrópica péptido–1 similar al glucagón (GLP–1) estimula las células troncales del páncreas adulto para la producción y la secreción de insulina y para la preservación de la función de las células b.57 Una opción terapéutica en la diabetes tipo I podría ser el reemplazo de los islotes pancreáticos destruidos por nuevos islotes producidos por células madre adultas; estudios en ratones observaron la transformación de las células madre del hígado en células pancreáticas. En cultivo, las células se relacionan y forman una estructura tridimensional de islotes, los cuales expresan genes pancreáticos y producen insulina y hormonas pancreáticas.58 Las células madre pancreáticas se diferencian ex vivo y producen células pancreáticas exocrinas y endocrinas, y otras células con fenotipo hepático. A su vez, las células madre presentes en los conductos pancreáticos pueden cultivarse in vitro para su maduración hasta lograr células productoras de insulina.59 Sobre la base de estos conceptos de regeneración tisular, la investigación debe dirigirse a la búsqueda de terapias que potencien de un modo directo en el paciente la proliferación y la maduración de sus propias células troncales.

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Hígado Está demostrado que las células progenitoras adultas de la medula ósea se transforman en células funcionales hepáticas y que pueden continuar su crecimiento durante muchas generaciones. También es una realidad que las células madre adultas de la médula ósea transplantadas tienen la capacidad de reparar el daño hepático, al fusionarse con las células del receptor por medio de un proceso de reprogramación.60–62 Estas aseveraciones fortalecen la posibilidad terapéutica y prueban la versatilidad de las células madre adultas en los mecanismos de reparación. La capacidad de fusión y reprogramación puede generar tejido funcional para ser usado como vehículo de genes en terapias celulares y génicas combinadas. Las células madre de la médula ósea transformadas en hepatocitos podrían servir para la evaluación de estudios de toxicidad de medicamentos y para analizar la respuesta en enfermedades hepáticas.

Enfermedades hematológicas En la actualidad es posible la preservación de la sangre del cordón umbilical, cuyo importante contenido de células madre adultas puede utilizarse sin riesgo

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para el propio donante; si existe histocompatibilidad, podría usarse en otros receptores. Las células madre adultas de la sangre del cordón umbilical tienen características hematopoyéticas, poseen antígenos y son semejantes a las células de la medula ósea, por lo que pueden ayudar en el tratamiento de inmunodeficiencias congénitas y de leucemias.63

Córnea y retina Los investigaciones demostraron la presencia de células madre adultas en la córnea, en especial en la zona del limbus. El trasplante de células madre de la córnea sirve para el tratamiento de la ceguera secundaria a lesiones por procesos inmunitarios. Por otra parte, el trasplante de células troncales limbales podría servir para tratar la ceguera causada por agentes físicos y químicos.64 Las células adultas de la médula ósea tienen la capacidad de producir angiogénesis en órganos como la retina, la cual podría ser utilizada para el tratamiento de pacientes con problemas de retina por medio del trasplante de células madre adultas y de la activación de sus propias células, con la administración conjunta de factores de crecimiento.65 El proceso de angiogénesis se logró inducir en estudios experimentales llevados a cabo en ratas: células madre de la médula ósea fueron inyectadas para inducir la regeneración de células dañadas de la retina. Este modelo puede ser utilizado como una estrategia para el tratamiento de la pérdida de la visión secundaria a la retinopatía diabética y a la degeneración macular.66

CONCLUSIONES Otros usos no terapéuticos de las células madre embrionarias y su necesidad y conveniencia para la investigación dentro de la medicina regenerativa y la ingeniería tisular son hoy motivo de debate. Las células madre embrionarias se pueden obtener de embriones humanos en las etapas iniciales del desarrollo; sin embargo, su utilización en terapias regenerativas es causa de varias controversias. En relación con la aplicación terapéutica de las células embrionarias, investigadores trabajan en la creación de las condiciones necesarias para producir estas células sin necesidad de aislarlas de embriones humanos vivos.67 El estudio de las líneas celulares embrionarias puede ser útil para conocer mejor el desarrollo de las células madre. Sin embargo, desde el punto de vista técnico, es difícil emplear las células criopreservadas debido a que una parte muy importante se congela en la fase de una, de dos o de muy pocas células, es decir, antes de tener la masa celular interna del embrión en estado de blastocisto, en la cual están pre-

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sentes las células madre embrionarias. Hace poco más de una década se empezó a conocer mejor la detección, el aislamiento y la plasticidad de las células madre adultas y se planteó su potencial uso terapéutico en la medicina regenerativa. Hoy existen líneas celulares humanas utilizadas para el análisis de la toxicología de los fármacos y como vectores para la terapia génica a partir de células madre adultas. La preparación de líneas celulares en el laboratorio obtenidas de células adultas enfermas servirá con certeza para la investigación y el tratamiento de muchas enfermedades en el futuro. El camino por recorrer en el campo de las células madre, la ingeniería tisular y la medicina regenerativa es prometedor. Sin embargo, se requiere conocer más acerca de las varias funciones de las células madre en el organismo adulto, de los mecanismos y el manejo de la autorregeneración de las células, los órganos y los tejidos lesionados, y de la historia natural de las células madre en diversas enfermedades. Aunque los conocimientos adquiridos son muchos, es necesario estudiar mejor los conceptos básicos y realizar más estudios de investigación con rigor científico para poder ofrecerlos como tratamientos en la medicina regenerativa.

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Sección III Aplicaciones clínicas de la ingeniería tisular y la medicina regenerativa Sección III. Aplicaciones clínicas de la ingeniería tisular y la medicina regenerativa

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Fernando Ortiz Monasterio

El avance del conocimiento médico junto con las innovaciones tecnológicas permiten ampliar el campo de acción de muchas especialidades. Hoy es posible llevar a cabo con seguridad procedimientos quirúrgicos cuya magnitud hubiera sido considerada de riesgo inaceptable hace algunos años. En muchas áreas, en particular en la craneofacial, se logra la reconstrucción de las malformaciones congénitas y se reparan las estructuras dañadas a causa de traumas y tumores, mediante técnicas bien estandarizadas con resultados predecibles y complicaciones mínimas. Estos procedimientos reconstructivos requieren injertos óseos y tejidos blandos que deben obtenerse del mismo paciente, situación que representa limitaciones y da lugar a la morbilidad de las zonas donadoras en otras áreas del cuerpo. Lo anterior es en particular cierto para el tejido óseo, el cual puede presentar problemas de integración al ser trasplantado. Además, el resultado final no siempre es predecible en cuanto al volumen y la fuerza estructural del injerto. Uno de los campos científicos muy explorados en la actualidad es el cultivo de hueso el cual pueda ser transplantado y tenga las características morfológicas y fisiológicas del hueso nativo. La generación de hueso in situ es otro de los ámbitos médicos más examinados. Otro recurso empleado es la distracción osteogénica, la cual tuvo su inicio en la cirugía de los huesos de las extremidades, cuya introducción en la cirugía craneofacial permitió avances considerables. El origen de las técnicas de distracción esquelética se remonta a las poleas de Chauliac en el siglo XIX, seguidas por los complicados aparatos diseñados por Malgaigne1 para elongar el esqueleto, y a las osteotomías seguidas de la separa105

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ción progresiva de los dos segmentos para lograr la formación de hueso nuevo iniciadas por Codivilla2 y sistematizadas más tarde por Ilizarof.3 La distracción osteogénica es un proceso biológico de neoformación ósea entre dos segmentos gradualmente separados por medio de tracción. El principio de esta técnica consiste en utilizar el fenómeno normal de regeneración de hueso el cual ocurre después de una fractura. La investigación de este proceso de callostasis permitió comprender mejor el fenómeno biológico y establecer conceptos generales aplicables en diferentes áreas del cuerpo. Se sabe que la masa ósea depende de la interacción entre la tracción mecánica y el aporte circulatorio. Por esta razón es importante preservar la viabilidad de los tejidos, para lo cual la osteotomía debe llevarse a cabo con una sierra de bajo poder. También es crítico preservar la médula ósea y el periostio, para conservar el aporte circulatorio. Los segmentos óseos de cada lado de la osteotomía deben inmovilizarse con una fijación rígida estable que mantenga su posición y permita la proliferación de tejido de granulación en ambos lados.4 El proceso de callostasis se lleva a cabo luego de un periodo de latencia posterior a la osteotomía para que comience el mecanismo biológico de reparación, seguido de su separación progresiva hasta lograr la elongación deseada. Una vez terminada la distracción se llega a la etapa final de remodelación, durante la cual es necesario mantener la inmovilización para obtener un callo óseo sólido. En términos generales, se deja concluir un periodo de latencia de cinco días y luego se separan los segmentos 1 mm por día. Una distracción menor de 0.5 mm por día puede ocasionar una consolidación prematura; una distracción mayor de 1.5 mm produce isquemia y osificación retardada (seudoartrosis). Los cambios de adaptación de los tejidos blandos que ocurren de manera simultánea con la distracción permiten una mayor movilización esquelética y disminuyen las recidivas. Este proceso, conocido como distracción histiogénica, contribuye de una manera muy importante a la estética de los resultados finales. La distracción histiogénica se lleva a cabo en todos los tejidos, incluyendo la piel, el tejido graso subcutáneo, los músculos, los ligamentos y las estructuras vasculares. Conviene resaltar que antes de la adopción de la distracción osteogénica, las elongaciones y los avances esqueléticos presentaban con frecuencia recidivas producidas por la tensión de los tejidos blandos. Actualmente hay numerosos estudios experimentales y clínicos relacionados con la elongación de todos los tejidos, incluyendo los nervios y la mucosa gingival. La cubierta gingival presenta características histológicas diferentes a las del resto de la mucosa bucal, las cuales le proporcionan resistencia a la abrasión y a las fuerzas mecánicas de compresión y estiramiento que ocurren durante la masticación. La cubierta gingival está formada por un epitelio escamoso compuesto de cuatro capas celulares y una capa subyacente de tejido conectivo. Las células

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epiteliales funcionan como una unidad debido a su extensa red de fijaciones intercelulares. El tejido conectivo, cuya función es dar soporte a la capa epitelial, está formado por elementos celulares y tejidos vasculares y nerviosos con abundantes fibras de colágeno. La mucosa gingival sujeta a un proceso de distracción durante 10 días se adelgaza y sufre pérdida de las papilas y de las fibras del tejido conjuntivo; se observa una proliferación de capilares en la lámina propia y el adelgazamiento de los haces de colágeno. Al cabo de ocho semanas, el espesor de la mucosa se recupera y la anatomía de los tejidos gingivales vuelve a la normalidad.5 Los músculos expuestos al proceso de distracción presentan de manera inicial una separación de las fibras acompañada de la infiltración de macrófagos. A medida que la distracción avanza, se aprecia una elongación de las fibras junto con el adelgazamiento de la masa muscular. Llevada al extremo, la distracción produce el rompimiento de las fibras seguido de un proceso inflamatorio, de una migración fibroblástica y de la proliferación de los mioblastos y de la síntesis de las miofibrillas las cuales completan la regeneración muscular.6 En comparación con otros tejidos, los nervios son menos tolerantes a la distracción, como lo demuestran clínicamente las paresias y las parálisis que ocurren después de elongaciones exageradas. En estos casos, se presentan disrupciones parciales de mielina las cuales pueden ocasionar la ruptura de los axones seguida de una degeneración walleriana.7 La experiencia advierte una relación directa entre la magnitud y el ritmo de la distracción y señala que la elongación lenta y fragmentada limita el daño de las fibras nerviosas. En la distracción en el área craneofacial con elongaciones limitadas es raro encontrar daño nervioso. La distracción en el área craneofacial comenzó con los reportes clínicos de elongación mandibular elaborados por McCarthy,8 quien utilizó esta técnica para aumentar las dimensiones de la mandíbula en pacientes con microsomía hemifacial. Las indicaciones del método se extendieron a problemas mandibulares más complejos y, posteriormente, a otras áreas del esqueleto craneofacial.9 En la actualidad, la distracción osteogénica se emplea para aumentar y modificar la forma y el volumen óseo en el cráneo, las órbitas y el tercio medio facial, con múltiples combinaciones de varios segmentos en forma simultánea. La técnica consiste en llevar a cabo osteotomías preservando la vitalidad de los segmentos óseos e introducir fijadores metálicos a cada lado de la fractura conectados a dispositivos externos e internos los cuales permitan la separación progresiva de ambos segmentos. Gracias a los estudios experimentales se sabe que la neoformación ósea sigue al vector de la distracción. Por esta razón, es necesario planear de manera cuidadosa el vector de la distracción (figuras 7–1 y 7–2). Las características anatómicas del esqueleto craneofacial obligan a planear los vectores usando un concepto tridimensional y a modificarlos durante el proceso de distracción.

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Figura 7–1. Radiografía de un paciente con hipoplasia de la rama ascendente derecha por microsomía hemifacial tomada después de la osteotomía y de la introducción de clavos de fijación en ambos lados de la osteotomía. El dispositivo para distracción externa fue colocado.

Otra aplicación de la distracción osteogénica empleada con frecuencia en el área mandibular es el transporte óseo, el cual permite trasladar hueso nativo (con su cubierta gingival) para sustituir un defecto de continuidad, como la elongación de la rama ascendente hasta llegar a la articulación temporomandibular, y para restituir la continuidad del arco mandibular interrumpida por malformaciones congénitas, quirúrgicas y postraumáticas. En estos casos, la osteotomía se lleva

Figura 7–2. Radiografía del mismo paciente al término de la distracción. Se observa una elongación de la rama ascendente de la mandíbula y comienzo de la neoformación ósea en el espacio entre los dos fragmentos.

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a cabo en tejido sano distante al muñón óseo, y la neoformación ósea se logra en el sitio de la osteotomía a medida que el muñón avanza para sustituir la pérdida. Durante la distracción ósea, el proceso normal de reparación de una fractura es alterado.3,4 Las fuerzas de tensión desarrolladas al separar los fragmentos producen cambios celulares y subcelulares, que incluyen la prolongación de la angiogénesis, acompañada de un aumento de la oxigenación tisular y un aumento de la proliferación de fibroblastos y de colágeno, orientados en la dirección del vector de distracción. Entre los tres y siete días de distracción ocurre un crecimiento de capilares en el tejido fibroso, lo cual extiende el aporte vascular hacia el centro del espacio originado por la distracción. Durante la siguiente semana aparecen trabéculas de los osteoblastos localizados dentro de las fibras de colágeno, para formar un tejido osteoide seguido por la aparición de espículas ocasionadas por la mineralización del tejido osteoide. La formación ósea continúa siguiendo el vector de la distracción y se conserva a causa del crecimiento de las trabéculas primitivas las cuales se mantienen a lo largo del proceso de distracción. Cuando las fuerzas se interrumpen comienza el proceso de consolidación, durante el cual la zona fibrosa se osifica de manera gradual. Al final de la octava semana se forma hueso nuevo seguido de la obliteración casi completa de la zona intermedia, lo cual dificulta su localización. En los huesos membranosos, este proceso de neoformación ósea es similar al de los huesos largos sometidos a una distracción gradual.3,4 La distracción osteogénica en el área craneofacial introdujo un nuevo y excitante capítulo en la cirugía de esta zona. Este método se empleó en más de 400 pacientes con hipoplasia mandibular vinculada con microsomía hemifacial, síndrome de Pierre Robin, secuelas de anquilosis temporomandibular y síndrome de Treacher Collins. El mismo concepto se aplicó para el avance del frontal en plagiocefalias y para el avance del tercio medio facial proyectando hacia adelante y hacia abajo del monobloque formado por el frontal, las órbitas y el tercio medio facial. Los resultados obtenidos con esta técnica son muy satisfactorios y las complicaciones hasta hoy son mínimas. Los procedimientos quirúrgicos se simplificaron y se eliminó la necesidad de emplear injertos óseos. El resultado puede ser considerado un proceso de ingeniería tisular in situ con tejidos autólogos inducidos por fuerzas mecánicas externas.

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8 Ingeniería tisular. Estrategias para la construcción de tejidos artificiales. Un modelo para la elaboración de un constructo de córnea Antonio Campos

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En la actualidad, la construcción de tejidos artificiales viables de naturaleza biológica equivalentes a los tejidos y órganos corporales constituye la alternativa más importante a los problemas generados por el trasplante en algunas localizaciones y a la propia imposibilidad de llevar a cabo un trasplante en algunas otras. A raíz de esta realidad, el paradigma de la ciencia histológica cambió de modo significativo en los últimos 20 años. La histología, la ciencia de los tejidos, dejó de ser meramente descriptiva y funcional, para convertirse en una ciencia constructiva cuya misión consiste en conocer cada vez mejor la naturaleza de los distintos tejidos del cuerpo humano y en elaborar y construir tejidos nuevos utilizando los elementos biológicos que los componen (células madre y factores de crecimiento) y, en algunos casos, materiales inertes y biomateriales de distinta naturaleza. Esta nueva orientación de

Histología descriptiva o funcional

Histología constructiva ingeniería tisular

Histología diagnóstica

Histología terapéutica terapia celular y tisular

Figura 8–1. Nuevo paradigma de la histología médica.

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(Capítulo 8)

la histología es conocida como ingeniería tisular. Por lo tanto, se pasó de una histología útil sólo para el diagnóstico a una histología útil para la terapéutica1 (figura 8–1). En este capítulo se exponen las estrategias fundamentales desarrolladas para construir tejidos nuevos mediante la ingeniería tisular y, a modo de ejemplo, el desarrollo de un modelo concreto para la elaboración de un constructo de córnea.

ESTRATEGIAS PARA LA CONSTRUCCIÓN DE TEJIDOS ARTIFICIALES La primera acción al momento de construir un tejido por medio de la ingeniería tisular será decidir si el tejido nuevo será generado adentro o afuera del cuerpo. Se trata de una decisión importante pues la utilización de los componentes que formarán parte del tejido pueden variar de un modo notable en cada caso. En ocasiones, para construir el nuevo tejido sólo deberán aportarse células, señales moleculares o una matriz acelular; en otros casos, como suele ocurrir cuando el tejido se fabrica en el exterior del cuerpo, será necesario aportar los tres componentes. El sitio de construcción del tejido y los componentes necesarios dependerán de la situación clínica y de la posibilidad de conseguir la sustitución más correcta y eficaz. Una práctica cada vez más frecuente en la ingeniería tisular es la construcción de tejidos sobre la base de un modelo mixto: una parte afuera del cuerpo y la otra parte adentro de éste. De acuerdo con lo expuesto, las tres estrategias a seguir para la creación de tejidos nuevos son básicamente las siguientes: 1. Ingeniería tisular mediante la transferencia celular. 2. Ingeniería tisular mediante la inducción. 3. Ingeniería tisular mediante la elaboración de constructos.

Ingeniería tisular mediante la transferencia celular En esta estrategia las células son primero aisladas, mantenidas y tratadas in vitro; después son inyectadas en la circulación sanguínea o implantadas en determinadas localizaciones del organismo, con lo cual se suple la deficiencia estructural y funcional que pueden producirse en este tipo de células.2 La mayoría de las aplicaciones clínicas que utilizan esta estrategia necesitan validarse a través de ensayos clínicos. Un ejemplo reciente de este proceder lo constituye la creación de tejido miocárdico nuevo, tras el desarrollo de un infarto,

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mediante la utilización de células satélite musculares esqueléticas y de células madre de la médula ósea.3,4 La transferencia de condrocitos autólogos en la reparación y la sustitución de cartílago articular,5,6 el traspaso de células de distinta naturaleza a pacientes con enfermedad de Parkinson,6–9 la transmisión de láminas de queratinocitos en defectos epidérmicos10 y la transferencia de islotes pancreáticos a pacientes con diabetes11 son ejemplos significativos de la utilización de esta estrategia. Hasta hoy, la transferencia de células madre hematopoyéticas del cordón umbilical y de la médula ósea es la única estrategia con un protocolo de utilización clínica bien establecido y aceptado, y la única que demuestra resultados eficaces a gran escala.3

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Ingeniería tisular mediante la inducción La construcción de un tejido nuevo puede llevarse a cabo fomentando la inducción del tejido en el seno del organismo. Para lograrlo existen diversas posibilidades de actuación. La acción más elemental consiste en la utilización de las señales moleculares, sobre todo los factores de crecimiento, capaces de estimular a las células madre pluripotentes y a las células madre progenitoras existentes en la región en la cual se desea crear el nuevo tejido, con el objeto de potenciar su proliferación, su diferenciación y su distribución en el espacio y en el tiempo. La incorporación de las señales moleculares a la región puede realizarse de manera directa y mediante la transferencia de células capaces de segregar dichos factores.12 El estímulo de la transdiferenciación es otra acción capaz de impulsar la creación de tejido nuevo en una región determinada.13 Los estudios acerca de la transdiferenciación están basados sobre la idea de que un micromedio dicta la evolución diferenciativa de una célula. Algunas señales moleculares inducen a través de este mecanismo el destino evolutivo de algunas de ellas. Por ejemplo, los trabajos de Rietze14 señalan que si se cocultivan células madre neurales marcadas con mioblastos no marcados, las células madre neurales acaban diferenciándose en células musculares marcadas. La interpretación de este hecho consiste en que las células neurales marcadas reciben señales de los mioblastos provocando la inducción, por transdiferenciación, hacia las células musculares de las primitivas células neurales. Algunos autores discuten sobre la posibilidad de que la fusión celular sea en algunos casos confundida con la transdiferenciación.15 Para aceptar que una célula alcanzó el estado de transdiferenciación deben cumplirse ciertos criterios. De modo imperativo, un conjunto de genes debe activarse en tanto que otro debe inactivarse. Si la transición tiene lugar rápidamente, los productos de ambos con-

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(Capítulo 8)

juntos de genes pueden ser coexpresados de manera transitoria en la célula, dando como resultado una célula con un fenotipo híbrido. Si la transdiferenciación transcurre lenta podría originarse un estadio en el cual los genes originales estarían inactivos y los productos de los nuevos genes activados no estarían todavía presentes.13,16 La matriz extracelular, como un producto natural y como un biomaterial elaborado de modo artificial, tiene en algunos casos la propiedad de ocasionar la formación de tejidos nuevos. De acuerdo con algunos estudios, la matriz ósea desmineralizada posee una importante capacidad osteoinductiva la cual es aprovechada en la ingeniería tisular para construir tejido óseo nuevo.17,18 Asimismo, para el tratamiento de pacientes con una pérdida importante de piel se utilizan biomateriales formados de manera esencial por láminas acelulares de colágeno y glicosaminoglicanos cubiertas de silicona, las cuales originan la regeneración de la dermis y actúan como una barrera para la pérdida de fluido. En algunos otros casos se utilizan los biomateriales y las señales moleculares para inducir la construcción de tejidos. El biomaterial actúa como una barrera creando espacio para facilitar el posterior crecimiento expansivo del tejido nuevo. Este mecanismo de ingeniería tisular es utilizado en la denominada regeneración tisular guiada, la cual se practica como tratamiento en la enfermedad periodontal. El grupo de investigación conformado por los autores de este libro realizaron algunas contribuciones en este campo. En concreto, pudieron demostrar la creación por inducción de verdadero tejido óseo mineralizado, cuando se aplica la denominada regeneración tisular guiada como terapéutica de la enfermedad periodontal. Ésta consiste en aislar la región con una membrana (la cual antes se hacía de politetrafluoretileno y hoy se fabrica de colágena) con el objetivo de separar la raíz del diente de la encía y favorecer la creación de tejido nuevo. La microscopia electrónica analítica permite evaluar fragmentos pequeños del nuevo tejido construido, su estructura ósea y su composición mineral apatítica.19

Ingeniería tisular mediante la elaboración de constructos Un constructo es la estructura formada por los tres componentes necesarios para configurar un tejido artificial y la disposición arquitectural que adoptan en relación con su ubicación en el organismo. Si el constructo reproduce de manera estricta la estructura de un tejido se denomina constructo tisular; si reproduce la estructura de un órgano con varias poblaciones celulares jerarquizadas se denomina constructo de órgano. Para la elaboración de un constructo se necesitan varias fases. La primera consiste en la reproducción y la proliferación de las células. Esta fase se desarrolla en placas de cultivo con un medio estático, que incluye factores de crecimiento,

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suero bovino fetal y suero autólogo del paciente, del cual se obtienen las células por medio de una pequeña biopsia. Aunque este mecanismo asegura la proliferación celular en la cantidad necesaria, las células pierden muchas de sus cualidades más características a causa de la desdiferenciación.20 Los condrocitos, se aplanan y acaban pareciendo células mesenquimatosas, los hepatocitos pierden la capacidad de polarizarse y de detoxificar, y las células de los túbulos renales proximales pierden su borde en cepillo y su capacidad funcional.21 La segunda fase en el proceso de la ingeniería tisular necesaria para la elaboración de un constructo consiste en el asentamiento de las células sobre el biomaterial seleccionado. La relación entre la población celular y el biomaterial es decisiva para la diseminación tridimensional de la misma población y para la óptima diferenciación de sus elementos.22 El asentamiento en el biomaterial puede llevarse a cabo de un modo estático (aplicación directa de la suspensión celular al soporte) y de una forma dinámica (aplicación de la suspensión celular a un soporte en agitación, incluyendo la rotación). En los soportes de biomaterial de menos de 2 mm, el asentamiento puede conseguirse con métodos estáticos; para los soportes mayores de 2 mm es necesario utilizar técnicas dinámicas.23 Con el objetivo de potenciar la adhesión y facilitar la proliferación, la diferenciación y la migración sobre el soporte, éste puede recubrirse con moléculas de distinta naturaleza relacionadas con la matriz extracelular (aminina, fibronectina, RGD y REDV, entre otras) y con factores de crecimiento. La tercera fase en la elaboración de un constructo implica el mantenimiento del fenotipo diferenciado en el nuevo tejido construido. Para conseguirlo, el tejido nuevo debe transferirse a un contenedor de cultivo con perfusión permanente de medio fresco y eliminación continua de metabolitos nocivos.22 El término biorreactor, utilizado en distintas aplicaciones de la medicina, se identifica en la ingeniería tisular con los diferentes dispositivos (cartuchos de perfusión, estructuras, vasos rotatorios, entre otros) en los cuales pueden llevarse a cabo cultivos dinámicos estables que se renuevan de manera continua y en los cuales se introducen otros componentes de naturaleza física y mecánica, como la microgravedad simulada, el alargamiento, la presión, la rotación, etc. En estos biorreactores el constructo se desarrolla en su diferenciación histotípica con carácter previo a su implantación, a su utilización en la investigación experimental e incluso a su empleo temporal en conexión con algunos pacientes antes de un trasplante.24,25 En la elaboración de constructos se llevan a cabo modelos sólo con un tipo de células y de material, como ocurre con algunos constructos de cartílago, y modelos con varios tipos de células y de material, como ocurre con los constructos de piel, en los cuales se utilizan fibroblastos y queratinocitos, y con los constructos de vasos arteriales, en los cuales se emplean células endoteliales y musculares. La elaboración de un tejido y de un órgano por medio de la ingeniería tisular exige, a partir del conocimiento previo de la naturaleza descriptiva de los mis-

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mos, un diseño constructivo en el cual las células, los biomateriales y las señales moleculares implicadas sean ensamblados de manera parcial o total en un biorreactor en el que se hayan reproducido o imitado los principales factores morfogenéticos que condicionan e inciden en su estructura.

MODELO PARA LA ELABORACIÓN DE UN CONSTRUCTO DE CÓRNEA La túnica fibrosa externa del globo ocular está formada por la esclerótica y la córnea. La córnea constituye la parte anterior transparente de la túnica y su función principal consiste en evitar la dispersión de la luz incidente. La córnea tiene un espesor de 0.8 a 0.9 mm en su centro y de 1.1 mm en su periferia. Su estructura histológica está constituida, de adelante hacia atrás, por tres capas o estratos: un epitelio corneal anterior de carácter pavimentoso, estratificado (de 5 a 6 hileras) y no queratinizado; un estroma conjuntivo formado por haces de fibras de colágena por lo regular dispuestos, entre los cuales existen fibroblastos modificados denominados queratocitos; y un epitelio corneal posterior constituido por una hilera de células denominadas células endoteliales. Entre los epitelios y el estroma corneal se distinguen dos bandas hialinas acelulares denominadas, membrana de Bowman y membrana de Descement respectivamente. La córnea es braditrofa, es decir, carece de vasos sanguíneos, lo cual significa que se nutre por difusión. Las células madre que generan las células del epitelio están situadas en el limbo esclerocorneal.26 La carencia de vasos y la ausencia de células de Langerhans en el epitelio corneal hicieron del trasplante de córnea un tratamiento de elección para numerosas patologías corneales que alteran la visión y que incluso pueden producir ceguera. La escasez de donantes y los fenómenos de rechazo que con frecuencia se producen plantearon la necesidad de buscar algún tipo de solución alternativa.27,28 A causa de la falta actual de donantes, la córnea constituye un órgano diana en la investigación de la ingeniería tisular. Las córneas artificiales elaboradas mediante la ingeniería tisular pueden constituir, como indicó Tegtmeyer,29 un posible modelo para la investigación in vitro de la permeabilidad de los fármacos.30,31 El desarrollo del modelo de córnea artificial que se manifiesta a continuación tiene como fin exponer la experiencia de los autores del libro en la construcción de un sustituto completo de córnea, utilizando cultivos celulares de las tres estirpes existentes en la córnea y la elaboración de un estroma artificial fabricado en laboratorio.

Cultivos celulares Los cultivos de las tres estirpes celulares existentes en la córnea se realizaron a partir de las córneas de conejos adultos. Cinco conejos de raza albina New Zealand

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fueron sacrificados bajo anestesia general, siguiendo los protocolos establecidos. Las córneas extraídas se mantuvieron a 4 _C en un medio de cultivo RPMI, suplementado con antibióticos y antimicóticos hasta el momento en el cual las córneas fueron utilizadas, para realizar el aislamiento de las células con destino a su cultivo. El aislamiento de las células epiteliales se efectúa de dos formas distintas: a partir de la disección quirúrgica del limbo corneal y de la posterior fragmentación mecánica del mismo, y a partir de la digestión enzimática con tripsina y EDTA (figura 8–1). El cultivo celular se realiza en un medio específico para queratinocitos (DMEM y HAM–F12 suplementado con EGF), sobre una capa de células alimentadoras de fibroblasto de ratón 3T3. El medio contiene 10% de suero bovino fetal, antibióticos, toxina colérica, hidrocortisona, insulina, tiroxina y adenina.32 La identificación de las células epiteliales se realizó utilizando los criterios morfológicos y después de determinar la expresión del gen queratina K12 mediante RT–PCR.33,34 El aislamiento de las células endoteliales se llevó a cabo a partir de la digestión enzimática con tripsina y EDTA, y de la posterior separación mecánica del endotelio corneal. El cultivo se realizó en un medio específico, el cual es un medio semejante al descrito anteriormente, pero sin el factor de crecimiento epidérmico. La identificación de las células endoteliales se logró determinando la expresión del gen colágena–8 y la no expresión del gen de la queratina K12. En el aspecto de la morfología, las células endoteliales modifican su clásico patrón hexagonal in vivo para ofrecer un patrón por lo general elongado.33,34 El aislamiento de las células del estroma (los queratocitos) se lleva a cabo una vez retirados de la córnea los epitelios corneales anterior y posterior. Tras la fragmentación mecánica del estroma, los explantes se cultivan en DEMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, glutamina y antibióticos. El análisis por medio de RT–PCR demostró que, a diferencia de las otras células aisladas de la córnea, los queratocitos no expresan los genes colágena–8 y queratina K12. La morfología de los queratocitos en cultivo es fusiforme.34,35

Ingeniería tisular Para la construcción de un sustituto completo de córnea, además de aislar y mantener en cultivo las tres estirpes celulares existentes en la córnea, es imprescindible fabricar en el laboratorio un sustituto del estroma corneal lo más parecido al estroma de la córnea in vivo, es decir, lo más consistente y transparente posible. En el modelo desarrollado por los autores de la obra, el material utilizado fue un gel de fibrina humana con 0.1% de agarosa.34 La fibrina, empleada también en la construcción artificial de otros tejidos,36 fue obtenida del plasma congelado de donantes de sangre, procedente del Banco de Tejidos de Granada, en España.

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Para elaborar el gel, a 12 mL de plasma humano se añadieron 10 mL de solución salina, 1 mL de cloruro cálcico y antifibrinolíticos. Cuando el gel estuvo listo se incorporaron 500 mil queratocitos cultivados en DEMEM con 10% de suero bovino fetal y, al mismo tiempo, se agregó 0.1% de agarosa. La agarosa facilita la consistencia y permite realizar suturas en las córneas artificiales. Una vez elaborado el sustituto estromal, la construcción del sustituto completo de córnea se realizó en varias fases utilizando un dispositivo de cultivo Transwell con soporte poroso. El diámetro de los poros del dispositivo es de 0.4 m, lo cual permite el paso de nutrientes, pero no el tránsito celular.30,31 La primera fase consistió en colocar sobre el soporte poroso, inmerso en medio de cultivo, una capa de células endoteliales. En la segunda fase se depositó, 24 h más tarde, sobre la capa de células endoteliales, el sustituto estromal con los queratocitos incorporados, construido de acuerdo con la metodología indicada. Durante la tercera fase se colocaron sobre el estroma las células epiteliales, las cuales se mantuvieron sumergidas en un medio de cultivo, sobre el estroma y las células endoteliales, un periodo mínimo de dos semanas. Después, durante otras dos semanas, el constructo de córnea se mantuvo en un cultivo en interfase aire y líquido, con el fin de estimular la estratificación epitelial (figuras 8–2 y 8–3).37,38 El desarrollo de la ingeniería tisular de la córnea tiene por delante una cantidad importante de retos. Primero es necesario evaluar la viabilidad de las células que se utilizan en la construcción de las córneas artificiales. Para lograrlo, además de utilizar los métodos clásicos basados en colorantes de exclusión como el azul tripano, es imprescindible introducir en los estudios de viabilidad la determinación de los iones intracelulares a través de la microscopia electrónica analítica cuantitativa. Esta metodología permite evaluar la viabilidad con carácter previo a la muerte celular y, por lo tanto, seleccionar de manera adecuada la población celular que debe utilizarse para la mejor elaboración de un constructo.35,39,40 Con este conjunto de métodos, los estudios realizados por los autores de la obra demostraron la importancia que representa seleccionar el subcultivo más apropiado para asegurar la viabilidad del constructo.41,42

Sustituto estromal con queratocitos en su interior

Células epiteliales sobre la superficie del estroma

Cultivo en interfase aire líquido

Figura 8–2. Fases en la elaboración de un constructo de córnea.

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Figura 8–3. Constructo completo de córnea con microscopia electrónica de barrido.

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Otro de los retos más importantes en la ingeniería tisular de la córnea consiste en identificar el tipo de matriz que puede proporcionar más transparencia y consistencia al estroma, pues está demostrado que los distintos materiales sintéticos, los cuales utiliza por lo general la ingeniería tisular, no pueden reproducir con eficacia el estroma original de la córnea.43 En resumen, los tejidos y los órganos construidos mediante la ingeniería tisular para uso clínico deben conseguir en su diseño: 1. La naturaleza estructural y funcional de los tejidos naturales. 2. Los tamaños y las formas deseadas. 3. La posibilidad de asegurar su viabilidad y de continuar su desarrollo tras su implantación en el cuerpo. 4. La posibilidad de integrarse completamente en el huésped.

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9 Regeneración ósea. Aplicación de células progenitoras de médula ósea expandidas con biorreactor GMP Luis Orozco Delclós

La lesión de hueso, a diferencia de otros tejidos, se cura al generar nuevo tejido óseo y no tejido fibroso cicatricial, por lo que se puede emplear en sentido estricto el término “regeneración ósea” en lugar de “reparación ósea”. Durante la curación de las fracturas se distinguen los tres procesos fundamentales que conducen a esta regeneración:

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1. Osteoinducción: activación de las células formadoras de tejido óseo. 2. Osteoconducción: depósito de las células en la trama estructural del foco lesional. 3. Osteogénesis: formación de tejido óseo por parte de las células óseas y sus progenitoras. Estos procesos se van desarrollando de forma más o menos superpuesta a lo largo de diferentes fases. La curación se inicia en el espacio que ocupa el hematoma fractuario con la formación de callo endóstico y perióstico, y sigue una diferenciación fibrocartilaginosa que asegura la continuidad entre los fragmentos (fase de urgencia). A continuación se inicia la revascularización que posibilita el despliegue de una trama colágena sobre el fibrocartílago blando con cierta estabilidad y permite la formación de hueso nuevo entre la red capilar. Después, durante la labor de reabsorción los osteoclastos abren vía a los retoños vasculares que atraviesan el foco. Los osteoblastos siguen esta vía y conforman las nuevas osteonas en las que irán quedando incluidos los osteocitos, que son células óseas más maduras (fase de normalización). A medida que se mineraliza el nuevo hueso se adquiere solidez (fase 123

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de solidificación). La remodelación del callo que protagoniza el osteoclasto se realiza desde las fases iniciales, pero tiene su expresión plástica a lo largo de los meses posteriores a la solidificación (fase de remodelación).

FACTORES QUE MODIFICAN LA CURACIÓN DE LAS FRACTURAS La mayoría de las fracturas completan todas estas fases y curan después del tratamiento ortopédico o quirúrgico, que debe conseguir la alineación correcta de los fragmentos y la estabilidad mecánica, la cual es una condición absolutamente necesaria para la consolidación. Sin embargo, con cierta frecuencia se sigue presentando una alta tasa de fracasos por falla biológica protagonizada por la devascularización del foco fractuario que imposibilita la curación. Algunos de estos fracasos son previsibles según las características de la fractura, como en las lesiones abiertas de alta energía; en otras ocasiones se deben a determinadas situaciones sistémicas que deberían ser controladas en la medida de lo posible, como las deficiencias del estado nutricional, las carencias vitamínicas o de oligoelementos —como el zinc—, y los hábitos tóxicos —como el tabaquismo o el alcoholismo. Destaca el efecto inhibidor en la consolidación que pueden ejercer algunos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) de prescripción posoperatoria habitual, como la indometacina, el ketorolaco, el ibuprofeno y el diclofenaco. Este efecto negativo está demostrado en las etapas inmediatas postraumáticas o posquirúrgicas, que precisamente son las más dolorosas y en las que parecen ser más necesarios. Por lo tanto, en el manejo de las fracturas y seudoartrosis se impone la moderación en la prescripción de AINEs, sobre todo si se administran en el posoperatorio inmediato.1 Parece ser que la consolidación se retarda en los pacientes tratados con anticoagulantes orales (antivitamina K) y heparinas de bajo peso molecular. Este efecto negativo se relaciona con la fase de la formación del hematoma y su influencia se limita al inicio del proceso. En este caso los beneficios clínicos superan los inconvenientes y no parece aconsejable prescindir de los protocolos profilácticos del tromboembolismo. También destaca la influencia negativa que pueden ejercer algunos antibióticos sobre la consolidación, lo cual constituye un aspecto poco estudiado, pero demostrado con las quinolonas. Los estudios recientes concluyen que la administración de ciprofloxacino en dosis habituales en la práctica clínica es citotóxico para el cartílago y negativo para la formación del molde cartilaginoso. Asimismo, otros medicamentos también podrían tener efectos paradójicos, como la calcitonina y los difosfonatos, pues aunque ejercen una función antirreabsortiva ósea, condicionarían una menor resistencia mecánica del foco consolidado.

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Un enfoque positivo consistiría en cuidar los factores sistémicos influyentes en la curación ósea y orientarlos a favor de la curación; es decir, proporcionarles a los pacientes lesionados una dieta adecuada rica en proteínas, suplementada con calcio, vitamina D y vitamina C; esta última es necesaria para la síntesis de colágeno, constituyente esencial del hueso. Las numerosas investigaciones han demostrado que en los ancianos hay una tendencia a la deficiencia de vitaminas C y D. También parece que los niveles de vitamina K deben ser mayores en los ancianos, para poder carboxilar la osteocalcina, por lo que sería conveniente aumentar su ingesta. Desde el punto de vista local, existen factores influyentes en el proceso de curación. Desde luego, el ambiente del foco favorable a la curación debe ser estable, aséptico y vascular. Las células progenitoras y las maduras, responsables de la mismas, se conectan mediante un lenguaje mediado por proteínas (proteínas morfogénicas y factores de crecimiento) que se liberan al medio de forma secuencial, dependiendo de la fase del proceso. Los factores locales actúan con frecuencia mediante un mecanismo paracrino: la célula reguladora libera la sustancia al medio intercelular y alcanza por difusión el receptor de la célula diana. Algunos actúan por mecanismo autocrino, donde el factor ejerce su acción sobre la misma célula que la produce. A veces el mecanismo es endocrino y pone en conexión células distantes a través del sistema vascular o del sistema linfático. En la actualidad existe una profusa investigación encaminada a identificar la función de estas proteínas, con el fin de sentar criterios y aplicarlas adecuadamente al foco de lesión, sea en forma sintética (proteínas recombinantes) o mediante un producto natural, como el plasma rico en plaquetas, que es un notable portador de citocinas y además confiere al medio una trama de fibrina muy adecuada para actuar como transportador celular.2,3

FRACASOS EN LA REGENERACIÓN ÓSEA: SEUDOARTROSIS El término seudoartrosis se refiere a la ausencia de consolidación de la fractura y desarrollo en el foco de una neoarticulación con membrana sinovial y en ocasiones con líquido sinovial. Aquí se usará el término en el sentido más amplio, como sinónimo de cualquier ausencia de consolidación, que es como lo entienden la mayoría de los cirujanos. La ausencia de consolidación se manifiesta casi siempre con dolor local, limitación funcional, atrofia muscular y deformidad de grado variable. Desde el punto de vista radiográfico pueden distinguirse dos tipos principales de seudoartrosis: S Hipertrófica: reactiva, bien vascularizada, que evoluciona con callo óseo exuberante (“en pata de elefante”), claramente visible en ambas partes del

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(Capítulo 9)

foco, el cual no es estable. El espacio interfragmentario está ocupado por fibrocartílago. La mayor parte de este tipo de seudoartrosis (90%) son secundarias a tratamientos conservadores, se deben a inestabilidad del foco y generalmente se logran curar mediante decorticación (avivamiento) y osteosíntesis. No se precisa aporte de injerto óseo. Entre la seudoartrosis hipertrófica se distingue la normotrófica, que aun siendo vascular y “reactiva”, presenta un desarrollo menos pronunciado del callo seudoartrósico (“casco de caballo” y “oligotróficas”). Se acepta que para procurar la curación de este tipo de seudoartrosis se precisa el empleo de injerto óseo. S Hipotrófica: no reactiva y sin hay callo formado, donde el trazo de fractura persiste en el tiempo y se observa un fenómeno de reabsorción del extremo de los fragmentos. Se asocia con osteoporosis regional. Sucede con frecuencia en el proceso de curación de fracturas abiertas con pérdida de sustancia ósea y atrición de las partes blandas circundantes al foco, tras procesos sépticos locales y también en fracturas donde ya se practicó una osteosíntesis que no tuvo éxito. La única similitud entre la seudoartrosis hipertrófica y la hipotrófica se encuentra en la movilidad del foco por falta de consolidación, por lo que constituye una similitud biomecánica. La etiopatogenia, la anatomía patológica, el pronóstico y el tratamiento son distintos.

TRATAMIENTO DE LA SEUDOARTROSIS HIPOTRÓFICA. INJERTOS ÓSEOS Independientemente de estabilizar la seudoartrosis con los sistemas de osteosíntesis adecuados, se precisa revitalizar el foco seudoartrósico mediante un aporte de bioinjerto, con intención de favorecer el ambiente adecuado para la regeneración ósea que necesariamente incluye la angiogénesis. El hueso trabecular autólogo se considera el “patrón de oro” de la terapia traumatológica, porque reúne propiedades osteoinductoras (porque contiene BMPs) y osteogénicas (porque contiene células progenitoras); por su estructura y origen debería comportarse como el osteoconductor ideal; sin embargo, se reconocen algunas limitaciones importantes en esta opción terapéutica. La obtención del injerto óseo autólogo a distancia del foco de lesión se realiza casi siempre a partir del ala iliaca y supone una agresión quirúrgica con una morbilidad de hasta 30%, que incluye hematomas, infecciones, lesiones neurológicas, fracturas del ala iliaca y dolor residual en la zona donante.4 Por otra parte, la disponibilidad de volumen de hueso en la zona donante es lógicamente limitada y la obtención requiere un tiempo quirúrgico no desprecia-

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ble que debe añadirse al de la intervención principal. Esto supone inconvenientes considerables, sobre todo en circunstancias más comprometidas, como en intervenciones en las que se precisa una gran cantidad de injerto o en reintervenciones que ya presentan el antecedente quirúrgico de la obtención de autoinjerto. También se reconoce que la celularidad progenitora que puede aportar la médula ósea es baja (una célula mesenquimal por cada 10 000 a 100 000 células mononucleadas de médula ósea). Es por ello que se tiende a desestimar el beneficio teórico del autoinjerto y a utilizar aloinjerto congelado o liofilizado, que por definición es acelular, pero que en teoría igualaría al “patrón de oro” en cuanto a propiedades osteoconductoras y osteoinductoras. Con el uso de aloinjertos se omite el aporte celular, pero se evita la iatrogenia sobre la zona donante, aunque esta opción no está totalmente exenta de riesgos, dada la posibilidad de transmisión infecciosa, aunque sea remota. Por otra parte, es importante que la Food and Drug Administration obligue a descartar un porcentaje significativo del aloinjerto liofilizado por no alcanzar el contenido de BMP que se considera adecuado para su comercialización. En los últimos tiempos se ha investigado intensamente y se han propuesto terapias mediante múltiples biomateriales que ejercen una función sustitutiva de autoinjertos y aloinjertos, con lo cual se eliminan unos y otros inconvenientes. Estos biomateriales, más o menos resistentes y reabsorbibles, pueden incorporar agentes inductores, como BMPs o factores de crecimiento en principio sintéticos, o impregnarse con una fuente natural de factores de crecimiento, como el plasma rico en plaquetas.2 También se ensaya con aspirados de sangre de medula ósea que se someten a centrifugación en el mismo quirófano, lo cual permite aplicar un concentrado de células mononucleadas, entre las que se encuentran las progenitoras. La mezcla celular se aplica sin determinar el número y la calidad de progenitores, ya que el producto no se caracteriza. Esta técnica evita la morbilidad por la cirugía para obtener injerto y se han realizado estudios no controlados en seudoartrosis no complicadas, pero no parece que puedan conseguirse mejoras claramente significativas en el tratamiento de casos con déficit estructural y biológico graves. En el foco de la lesión, las células depositadas competirán por el oxígeno, la glucosa y los nutrientes, y puede esperarse una mortalidad muy elevada. Se estima que para procurar un efecto regenerativo significativo con este tipo de celularidad “no seleccionada ni orientada” se precisarían cantidades de médula ósea superiores al litro y medio de aspirado de médula ósea. Hasta la fecha se sigue investigando acerca de la mejora de la osteoconducción y la osteoinducción, pero no ha sido posible mejorar “el patrón de oro” en lo referente a la osteogénesis, dada la incapacidad de aportar al foco lesionado dosis terapéuticas de células progenitoras.

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(Capítulo 9)

PROPUESTA ALTERNATIVA A LOS TRATAMIENTOS PARA LA SEUDOARTROSIS HIPOTRÓFICA RECALCITRANTE Y LA OSTEONECROSIS DE LA CABEZA FEMORAL. ENSAYOS CLÍNICOS Los fracasos biológicos recalcitrantes son los que pretenden afrontar la terapia regenerativa y la ingeniería tisular mediante un trabajo multidisciplinario. El término ingeniería tisular empezó a utilizarse en 1987, en el marco de una reunión de la National Science Foundation, en Arlington, Virginia, EUA. El objetivo que se planteaba en aquella reunión era el “desarrollo de compuestos biológicos y biomateriales implantables en el cuerpo humano con intención de reparar, mantener o mejorar la función de órganos o tejidos”. La idea era que el progreso contemplara la unión de ciencias diferentes y al mismo tiempo tan afines como la bioquímica, la biología celular o la biología molecular, y la necesidad de inmersión de las ingenierías en las ciencias de la salud. La cirugía que proponemos se mueve en el ámbito de la ingeniería tisular, porque se trata de aplicar, conjugando el conocimiento interdisciplinario, los tres fundamentos de la regeneración ósea: la osteoconducción, la osteoinducción y la osteogénesis; esta última de forma innovadora, ya que ahora, apoyados en la biotecnología avanzada, se puede aplicar el potencial terapéutico de las células progenitoras autólogas. Estas células progenitoras permanecen quiescentes en la médula ósea de los adultos y ante determinadas señales biológicas poseen la capacidad de proliferar, diferenciarse e inducir la regeneración del sistema hematopoyético e inmunitario, y de los tejidos óseo y vascular. No obstante, en algunas situaciones patológicas el organismo es incapaz de movilizar el número necesario de estas células para lograr la regeneración. Ante fracasos de consolidación ósea se puede plantear el restablecimiento de la capacidad regenerativa mediante la recolección de médula ósea a través de punción y aspiración del hueso iliaco, y su aplicación en el foco de la lesión, pero la principal limitación del uso de médula ósea no procesada es la dificultad de obtener con ella una cantidad y calidad de células progenitoras suficientes para conseguir una respuesta regenerativa. Aastrom Biosciences 1 (Ann Arbor, Michigan, EUA) desarrolló un biorreactor (Aastrom–Replicell SystemR) que cumple con las normas GMP y permite la 1 Aastrom Biosciences, Unidad de Producción Celular del Banco de Sangre y Tejidos del

Servicio Catalán de Salud, Centro Médico Teknon, Hospital General de l’Hospitalet, Hospital de Barcelona–SCIAS, Mutua Universal, Instituto de Cirugía Maxilofacial “Hernández Alfaro”, Fundación Teknon, Fundación Mutua Universal e Instituto Ortopédico de la Universidad de Würzburg–Alemania.

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Cuadro 9–1. Tasa media de expansión de los distintos linajes celulares inoculados en el biorreactor. Se observa el incremento de células que expresan los marcadores Thy1+ y CD14–, cuya presencia se correlaciona con la tasa de generación ósea

Hematopoyesis

Mesenquimales

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Endoteliales

Input (x 106)

Output (x 106)

Expansión

TCN CD34 CD15/CD11b Gly A CD14

251 8.7 123 39 18

191 1.1 153 1.6 72

0.8 0.1 1.3 0.04 4.4

CD105/CD166 Thy1 (CD90) CD146 CFU–F CD144/CD146 VEGFR1/CXCR4 VEGFR2 vWF

0.1 0.6 3.7 41 600 1.3 10 37 33

16 36 24 2 000 000 3.2 8.2 37 21

373 " 147 128 " 57 5.4 50 2.9 1.3 1.3 0.6

expansión ex vivo de células multipotenciales (con capacidad de diferenciación multilinaje) a partir del aspirado de un pequeño volumen (de 50 a 80 mL) de médula ósea de cresta iliaca autóloga. El producto celular se denomina tissue repair cells (TRC). El cultivo en el biorreactor ARS durante 12 días se realiza con tasas específicas de oxigenación e intercambio de medio, que determinan la expansión selectiva de células progenitoras. Esta tecnología de perfusión continua, que renueva continua y lentamente el medio de cultivo celular, ha demostrado mediante una citometría de flujo ensayos clonogénicos y baterías de genes selectivas que enriquecen la población de células progenitoras de linaje endotelial y mesenquimal que expresan marcadores Thy1+/CD14– al tiempo que se reducen las células diferenciadas. El aumento de células progenitoras de estas características se correlaciona exponencialmente con la formación ósea (cuadro 9–1 y figura 9–1).5,6 El TRC es rico en células adherentes que crecen formando una matriz extracelular (estroma), propician el crecimiento de los diferentes linajes progenitores y liberan señales relacionadas con la angiogénesis y la formación de tejido óseo. Se considera que el tejido lesionado tratado con TRC utiliza estas células progenitoras como parte de un proceso natural de la regeneración tisular, funcionalmente similar a lo que ocurriría al aplicar un gran volumen de médula ósea propia. En el ámbito de la terapia celular somática en humanos, las TRC han demostrado su capacidad para favorecer el injerto y la regeneración hemopoyética de forma reproducible y fiable. La viabilidad y seguridad del método se ha eviden-

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(Capítulo 9)

Frecuencia por 105 células

Correlación entre marcadores y formación de hueso actópico in vivo 25 000 CD90 (Thy1)+ R2 = 0.9736

20 000 15 000 10 000

CFU–F 5 000

R2 = 0.6926

0 0

5

10

15

Tasa de tejido óseo Figura 9–1. Es sabido que la presencia de células CFU–F en cultivo se correlaciona con la formación de hueso ectópico in vivo y su cuenta es un valor habitualmente referido en las publicaciones sobre regeneración tisular. Se tomó como referencia la presencia de células que expresan marcadores Thy+ y CD14–, cuya presencia se correlaciona con la formación ósea de forma exponencial. Su cuantificación se realiza mediante citometría de flujo.

ciado en diversos ensayos clínicos multicéntricos multinacionales (EUA y Unión Europea) desarrollados desde 1995. Las TRC administradas por infusión sistémica en más de 140 pacientes afectados por cáncer de mama o linfoma que requerían transplante de médula ósea después de terapias mieloablativas o mielotóxicas evidenciaron una respuesta al injerto idéntica a los que recibieron un transplante tradicional de una gran cantidad de médula ósea. Debe señalarse que el sistema no produce la expansión de células tumorales y que en los pacientes con cáncer produjo la eliminación de las células tumorales quiescentes en la muestra de médula ósea recolectada.7,8 Nuestro grupo de trabajo (ITRT), en funciones de I + D + I, participa junto con otras entidades en diversos ensayos clínicos que consideran la aplicación de TRC en la regeneración de tejido óseo. Desde un punto de vista esquemático la metodología común de obtención y aplicación de las TRC es la siguiente: 1. Obtención por aspirado de médula ósea bajo sedación o anestesia local (aproximadamente 60 mL). 2. Transporte del producto obtenido a la unidad de producción celular del banco de sangre y tejidos. S Selección de células mononucleares.

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S Inoculación en la biocámara de 300 x 106 células mononucleares. S Cultivo en el biorreactor ARS durante 12 días. S Recolección, caracterización y análisis finales de seguridad de las TRC. 3. Transporte de las TRC al centro quirúrgico. 4. Intervención quirúrgica según la norma, durante la que se elabora y aplica un bioinjerto constituido por una dosis de TRC y fosfato tricálcico en una proporción de 1:1, que se compacta con un volumen similar de plasma escaso en las plaquetas. Una unidad (dosis) de TRC contiene aproximadamente 132 x 106 células viables de médula ósea (132 " 85 x 106 células con un margen de confianza de 95%, en un intervalo comprendido entre un mínimo de 56 x 106 células y un máximo de 203 x 106 células). En 2003 iniciamos dos estudios piloto destinados a evaluar la viabilidad y la seguridad de las TRC en la seudoartrosis no hipertrófica de huesos largos y en la regeneración de maxilar atrófico en casos de edentulismo. Los datos obtenidos fueron muy satisfactorios respecto a la eficacia, ya que se logró la curación de los seis casos de seudoartrosis evocando un modelo de curación directa, casi per primam, en un tiempo medio de cuatro meses, y los análisis histomorfométricos de los maxilares intervenidos mostraron un incremento significativo (p < 0.01) de la altura ósea en la zona injertada con TRC frente a la arcada contralateral no injertada (control). Se entiende que el resultado de este ensayo hubiera sido aún mejor, ya que se utilizó como osteoconductor un biomaterial poco reabsorbible, como la hidroxiapatita, y el espacio ocupado por el material no reabsorbido no puede ser sustituido por tejido óseo.9–11 Es importante que el biomaterial se comporte como un soporte o transportador provisional eficaz, sin que asfixie las células en su interior, que permita la revascularización rápida a través de él y que desaparezca a medida que se va generando el nuevo tejido. Con motivo de la ley promulgada en España en mayo de 2004, relativa al uso de células manipuladas que considera como medicamentos a los productos celulares, como las TRC, se detuvo la puesta en marcha de nuevas investigaciones y se llevó a cabo el procedimiento de solicitud de autorización a la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios para la aplicación de TRC como un “producto en investigación”. La autorización fue concedida en noviembre de 2005 y a partir de esta fecha se prosiguió con los estudios referentes a seudoartrosis, los cuales sumarán datos a otros similares llevados a cabo en EUA y Alemania. Se han intervenido ya los 10 casos previstos en el estudio, uno de los cuales corresponde a una seudoartrosis recalcitrante de clavícula con pérdida de sustancia de 4 cm que no ha curado. Otro caso no solucionado, que ya lleva un año de seguimiento, corresponde a una seudoartrosis recalcitrante diafisiaria de fémur; donde el paciente no respetó la descarga de la extremidad impuesta tras la intervención y sufrió una rotura de implante a los cuatro meses, por lo que fue necesa-

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(Capítulo 9)

rio practicar una nueva osteosíntesis con la oportunidad de efectuar el estudio de una muestra de biopsia tomada en el foco lesional. El resultado demostró que en el foco existía revascularización y generación de hueso nuevo. Con base en la viabilidad del procedimiento propuesto y los datos que avalan su seguridad y orientan hacia una eficacia satisfactoria, en la actualidad se siguen programando cirugías con aplicación de TRC. Algunas tienen la categoría de “tratamiento de uso compasivo”, ya que se trata de pacientes menores de edad intervenidos en varias ocasiones sin resultados satisfactorios. En cualquier caso, el producto todavía no se encuentra en fase comercial y el procedimiento obliga a obtener la autorización de la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios para cada caso en el que se indique la intervención. En diciembre de 2006 los autores de este capítulo y su grupo de trabajo empezaron a desarrollar un nuevo protocolo basado en los mismos conceptos, pero destinado a la resolución de la osteonecrosis de la cabeza femoral. Las terapias intentadas sobre esta patología son, de algún modo, las mismas que en las seudoartrosis, ya que se trata de revitalizar la zona mediante bioinjertos o factores locales favorecedores de la regeneración ósea y de la revascularización. La osteonecrosis de la cabeza femoral presenta áreas variables de necrosis del hueso trabecular y medular que se extienden bajo el hueso subcondral. Se cree que la presión del edema medular, vinculada con la respuesta de reparación, reduce la circulación hacia la cabeza femoral, lo cual puede agravar el problema, pues se extiende la necrosis avascular. La descompresión del núcleo de la cabeza femoral, que constituye el estándar de oro en la actualidad, se justifica por la necesidad de reducir rápidamente el edema medular. Consiste en crear una o varias tunelizaciones que van de la cortical lateral externa del fémur al centro de la cabeza. A través de ellas se pueden aplicar productos inductores de la regeneración ósea, aunque también se proponen los autoinjertos corticales y esponjosos, los BMPs, el plasma rico en plaquetas y los aspirados de médula ósea, entre otros. Si ningún procedimiento logra detener la enfermedad, el hueso subcondral debilitado se desprenderá, aunque el cartílago permanezca indemne, y creará un espacio vacío que radiográficamente se traduce en el signo patognomónico de la “media luna”. La zona de cartílago articular suprayacente a esta zona ya no está sostenido por hueso y empieza a hundirse. El cartílago hundido más de 2 mm (fase de colapso) indica que la enfermedad ha dañado irreversiblemente la articulación coxofemoral y la opción terapéutica es la sustitución total de cadera. La progresión de la patología hasta la pérdida total de la articulación femoral puede producirse en 50% de los individuos luego de tres años del diagnóstico, por lo que existe un periodo durante el cual es posible actuar para intentar evitar el colapso. Dado que muchos pacientes con osteonecrosis de la cabeza femoral son relativamente jóvenes y su prótesis de cadera quizá deberá ser sustituida a inter-

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valos regulares de 10 a 20 años, el objetivo actual de la terapia consiste en retrasar la necesidad de cirugía de sustitución total de cadera hasta una edad más avanzada. Las TRC han mostrado su capacidad para injertar e inducir la reparación y la formación ósea, y para inducir la diferenciación de células endoteliales y vasos sanguíneos en ensayos en modelos animales. Se supone que el tratamiento de la osteonecrosis de la cabeza femoral antes de producirse la fractura subcondral mediante injerto con TRC reducirá significativamente o eliminará la progresión de la enfermedad. El protocolo propuesto describe un ensayo clínico controlado, aleatorio, prospectivo, no ciego y multicéntrico internacional en hombres con diagnóstico de osteonecrosis de la cabeza femoral grados II o III (clasificación de Steinberg, Universidad de Pennsylvania), con tratamiento estándar de descompresión del núcleo (grupo de control) o descompresión del núcleo más injerto de TRC (grupo de ensayo). El ensayo fue diseñado para una participación inicial de 10 pacientes tratados con TRC, con el objetivo de generar datos que determinen el tamaño de la muestra y el factor estadístico. Se tiene la intención de seguir con la inclusión de 25 pacientes tratados con TRC y 15 pacientes control con osteonecrosis comparable (el tamaño final de la muestra se determinará después del análisis de los 10 primeros sujetos). Se prevé realizar un análisis provisional del criterio de la valoración principal en los 50 pacientes (evolución de la enfermedad medida por RNM en porcentaje de volumen de osteonecrosis de la cabeza femoral entre la base de referencia, a los seis meses). Si la significación estadística alcanza 0.01 y no se producen reacciones adversas graves, se interrumpirá el estudio, se analizará en su totalidad y se presentará como ensayo en fase III finalizado. Si no se alcanza el valor alfa estadístico, el estudio seguirá incluyendo pacientes hasta llegar a 100, antes de efectuar los análisis finales de los datos. El interés de este estudio en marcha se refleja en la concesión a las TRC por parte de la Food and Drug Administration en la categoría de “medicamento huérfano” para la osteonecrosis de la cabeza femoral.

REFERENCIAS 1. Delgado AE, Alcántara T: Agentes sistémicos que modifican la consolidación de las fracturas. Rev Ortop Traumatol 2006;50(Supl 1):5–12. 2. Anitua E: Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration. Thromb Haemost 2004;91:4–15. 3. Munuera L, Galán V, Andia I, Sánchez M, Martínez JL: Agentes locales en la consolidación ósea: realidades actuales. Rev Ortop Traumatol 2006;50(Supl 1):13–21. 4. Banwart JC, Asher MA et al.: Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity. A statistical evaluation. Spine 1995;20(9):1055–1060. 5. Lundell BI, Mandalam RK et al.: Clinical scale expansion of cryopreserved small volume whole bone marrow aspirates produces sufficient cells for clinical use. J Hematother 1999;8(2):115–1127.

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(Capítulo 9)

6. Bachier CR, Gokmen E et al.: Ex–vivo expansion of bone marrow progenitor cells for hematopoietic reconstitution following high–dose chemotherapy for breast cancer. Exp Hematol 1999;27(4):615–623. 7. Cato T, Frank KKO, Attawia MA, Borden MD: Studies on the development of a tissue engineered matrix for bone regeneration. Cells Materials 1998;(8):175–181. 8. Bruder SP, Kurth AA et al.: Bone regeneration by implantation of purified, culture–expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1998;16(2):155–162. 9. Gómez BE, Orozco L, Munuera L: Agentes locales en la consolidación ósea: perspectivas de futuro. Rev Ortop Traumatol 2006;50(Supl 1):22–29. 10. Hernández AF, Marti C, Orozco L, Marinoso ML, Rodríguez L et al.: Clinical feasibility study: the use of autologous bone marrow–derived tissue repair cells (TRC) for maxillary sinus floor augmentation in edentulous humans. En prensa. 2007. 11. Solano C, Orozco L, Rodríguez L, Torrico C, Douville J et al.: Clinical feasibility study of the use of cultured enriched autologous bone marrow cells to treat refractory atrophic and hypotrophic nonunion fractures. En prensa. 2007.

10 Nuevas aplicaciones clínicas del plasma rico en plaquetas en patologías musculoesqueléticas Luis Orozco Delclós

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PLASMA RICO EN PLAQUETAS Y FACTORES DE CRECIMIENTO Tras su activación, las plaquetas liberan proteínas llamadas citocinas, algunas de las cuales se comportan como indicadoras y regulan procesos celulares clave, como la diferenciación, la mitogénesis y la quimiotaxis, que reciben el nombre de “factores de crecimiento” (FC). Los factores de crecimiento más conocidos en estructura y función son el PDGF (platelet–derived growth factor), un potente regulador que estimula la replicación celular progenitora y la proliferación de las células endoteliales, y el TGF–b (transforming–derived growth factor), un factor de proliferación y diferenciación del tejido conectivo implicado en la formación de la matriz extracelular, la osteogénesis y la condrogénesis, al cual también se le atribuye un potente efecto antiinflamatorio. Los gránulos de las plaquetas también contienen quimocinas mediadoras de la inflamación y actúan señalizando el lugar de la lesión a los leucocitos, por lo que son responsables indirectos de los mecanismos de regeneración tisular. Estas propiedades de las plaquetas se aplican con frecuencia creciente en terapia de patologías del aparato locomotor, pero si bien se comunican observaciones clínicas muy favorables, aún producen controversia en los foros científicos, quizá porque no están respaldadas por estudios clínicos potentes y por la confusión que provoca la variabilidad en los sistemas de obtención del plasma rico en plaquetas (PRP), las formas de su aplicación, los aspectos legales o las complicaciones debidas a mala praxis, pero atribuidas a la terapia. 135

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(Capítulo 10)

El término “factores de crecimiento” suele fomentar el equívoco entre quienes se inician en este tema. Los factores de crecimiento son las citocinas que pueden inducir la mitosis, la diferenciación celular, la secreción de matriz extracelular, la quimiotaxis, la inhibición de una función o incluso la apoptosis. Además pueden tener diversos efectos, a veces contrapuestos, dentro del mismo proceso biológico. La confusión en España se incrementó al unir dicho término con el de “plasma rico en plaquetas”, producto hematológico que suele emplearse como fuente de factores de crecimiento. Pero el PRP, además de factores de crecimiento como PDGF, TGF–b, EGF, IGF1, VEGF, bFGF, FGF2 o HGF, también contiene otros elementos intraplaquetarios y extraplaquetarios con gran potencial biológico, que deben valorarse para obtener conclusiones correctas; aquí se mencionan algunos en forma genérica: factores de coagulación, factores fibrinolíticos, proteasas y antiproteasas, albúmina, inmunoglobulinas, fibrinógeno, histamina, serotonina, catecolaminas, iones de calcio, ATP, trombocidina, osteonectina, osteocalcina, chemocinas y condroitín 4–sulfato.

SISTEMAS DE OBTENCIÓN DE PRP El PRP se ha utilizado desde la antigüedad como coagulante y sellador, o compactador de injertos en múltiples procesos de todas las especialidades quirúrgicas. Las formas de su preparación son muy diversas y por ello puede ser muy diversa la actividad biológica del producto. El precursor histórico del PRP fue el adhesivo de fibrina, que se obtenía con la mezcla de fibrinógeno plasmático de origen homólogo y trombina bovina. Este producto presentaba diversas ventajas, que incluyen hemostasia perfecta, sellado en minutos y fácil reabsorción, por lo que adquirió una gran importancia como agente hemostático para controlar el sangrado y evitar transfusiones. Al principio se aplicó para el sellado de fugas de líquido cefalorraquídeo y en injertos de nervio periférico, y posteriormente para el sellado de anastomosis traqueales, esofágicas o vasculares. Pero en EUA se prohibió su uso, debido al riesgo de transmisión de enfermedades víricas, hepatitis C y SIDA, entre otras, y se sustituyó el fibrinógeno homólogo por fibrinógeno autólogo, partiendo de la sangre del propio paciente obtenida días antes de la cirugía. Posteriormente se simplificó la obtención de fibrinógeno utilizando una fracción de PRP que se coagulaba con trombina bovina en el momento de la cirugía. Las propiedades físicas de esta preparación difieren del adhesivo de fibrina, ya que la concentración de fibrinógeno es más baja y la trombina de origen bovino puede originar, aunque excepcionalmente, transmisión de encefalopatía espongiforme y reacciones sistémicas secundarias —anafilaxis y coagulopatías— como consecuencia del desarrollo de anticuerpos antitrom-

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Nuevas aplicaciones clínicas del plasma rico en plaquetas en...

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bina. A pesar de éste y de otros peligros potenciales de la trombina bovina, los preparados de fibrina adhesiva todavía están disponibles en el mercado europeo. Un método de preparación de PRP muy utilizado en los hospitales de México es la extracción de aproximadamente 500 mL de sangre unos días antes de la intervención quirúrgica, para someterla a un proceso de centrifugado que fracciona los componentes sanguíneos por gradiente de densidad, para proporcionar un producto que ofrece una fracción muy rica en plaquetas y leucocitos (buffy–coat). El preparado puede congelarse y quedar disponible para la intervención unos días después. Las sucesivas modificaciones de esta técnica de obtención y preparación de PRP congelado para su empleo en traumatología se han reflejado en la bibliografía.1 La complejidad del proceso descrito hace que sólo se practique en intervenciones mayores, como recambios protésicos o artrodesis vertebrales. Por lo tanto, también es compleja la valoración de la eficacia del PRP distinta a la del sellador o compactador de injertos óseos. En este tipo de intervenciones nos parece imposible determinar el efecto inductor y acelerador de la regeneración de tejidos, donde el efecto antiinflamatorio —si lo hay— queda enmascarado por las características propias de la región anatómica intervenida. El método PRGF, diseñado por Anitua,2,3 parte de pequeños volúmenes de sangre (mayores de 10 mL) y activa la formación del coágulo mediante dosis exactas de Cl2Ca, evitando los inconvenientes de la trombina bovina. Su bajo costo facilita su empleo en intervenciones menores y otras formas de aplicación, como la inyección, lo cual ha favorecido la divulgación del concepto y el aprendizaje en el manejo del PRP. El producto final, tal como está diseñado por este autor, debe aplicarse inmediatamente después de su preparación. No contiene leucocitos y la balanza se inclina a favor de los inhibidores inflamatorios y no de los proinflamatorios (TNF–a). En su contra quizá tiene el exceso de manipulación, que compromete la bioseguridad si no se realiza en condiciones estrictas. Mediante las distintas formas de preparación del PRP se obtienen productos con diferentes propiedades biológicas y potenciales terapéuticos, y sea cual sea la metodología y la cantidad de plaquetas que contenga el PRP se puede conseguir un coágulo ex vivo, ya que esto depende de la activación del fibrinógeno y la formación de fibrina, y no del número de plaquetas. Por lo tanto, a pesar de presentar la misma apariencia, un PRP puede ser muy rico en factores de crecimiento y otro puede presentar un contenido prácticamente nulo. Esta disparidad se atribuye al desconcierto que puede detectarse entre los facultativos que se inician en el tema, ya que reciben información contradictoria sobre la eficacia del PRP. Además se ejerce en un marco legislativo confuso para este producto autólogo y se conocen algunas complicaciones posteriores al tratamiento que quizá predispongan contra esta innovación terapéutica, aunque sólo sean atribuibles a la mala práctica.

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Por otra parte, las terapias autólogas, al contrario de lo que sucede con los fármacos, no suelen beneficiarse del soporte económico que fomenta su promoción y la realización de ensayos clínicos potentes. La industria farmacéutica ensaya con factores de crecimiento recombinantes y presenta múltiples estudios in vitro o modelos animales sobre los efectos de un factor de crecimiento sintético específico con dosis determinadas. Se entiende que las conclusiones también suelen trasladarse erróneamente a los efectos que puedan tener en terapia humana los factores de crecimiento de procedencia natural y autóloga, administrados conjuntamente en forma de “multiproducto” con capacidad “automoduladora”, como el PRP autólogo que se refiere en este capítulo. En cualquier caso, se subraya que autólogo no es sinónimo de natural. En este sentido, el PRP autólogo es un producto “no natural”, pues no existe en la naturaleza y para su elaboración se precisa un proceso ex vivo, cuya aplicación terapéutica debe considerarse desde muchos aspectos, incluso el legal.

FUNDAMENTOS DE LA CAPACIDAD TERAPÉUTICA DEL PRP El PRP tiene un indiscutible efecto sellador y adherente que ayuda a mantener la coaptación de los planos dificultando la recidiva del hematoma, un problema omnipresente en las lesiones musculares. Por lo tanto, al menos debe considerarse un buen adyuvante terapéutico, aunque el principal interés de las investigaciones actuales se centra en su potencial inductor regenerativo. Los lisosomas de las plaquetas contienen una gran cantidad de enzimas proteolíticas, cuyos gránulos densos contienen factores protrombóticos y sus gránulos alfa un coctel de mediadores químicos entre los que destacan el PDGF y el TGF–b. Es el kick–off cocktail la clave para el pasaje de la fase hemostática a la regenerativa. Esta última la disparan los mediadores mitóticos de las células mesenquimales y promotoras de la angiogénesis. Además, la presencia del TGF–b en estado latente bloquea la respuesta inflamatoria inhibidora de la regeneración mediada por linfocitos.4,5 Durante el tiempo de su formación, las plaquetas tienen la propiedad de acumular numerosas moléculas del medio por endocitosis, entre las que destacan los mediadores lipídicos. Los estudios recientes indican que la esfingosina–1–fosfato, el ácido fosfatídico y el lisofosfatidato con efecto antiapoptósico de las células endoteliales están implicados en la quimiotaxis de células endoteliales, así como en su proliferación y promoción de uniones adherentes para formar estructuras de tipo capilar. La esfingosina parece fundamental en el inicio de la angiogénesis, dado que es el ligando de los receptores EDG (endothelial differentiation

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genes). Finalmente, la sobreexpresión de VEGFR2 sensibiliza el endotelio circundante ante la producción del VEGF (factor de crecimiento vasculoendotelial) para iniciar la angiogénesis a partir de las células endoteliales.6 El coágulo de fibrina actúa como primordio del nuevo tejido y como vehículo del reclutamiento celular y vascular, y será sustituido progresivamente por matriz extracelular propia del tejido afectado, producida a partir de la diferenciación celular mediada por factores del ambiente. Las señales recibidas a través de las citocinas propias del tejido dañado conducen a la diferenciación específica de tejido. La acción de factores de crecimiento, como TGF–b, bFGF, EGF, HGF e IGF1, desempeña una función importante.7,8 A continuación, en coexistencia con el proceso de la fibrinólisis y la activación endotelial, se produce la liberación in situ de factores de crecimiento secretados por los gránulos a plaquetarios que quedaron atrapados en el interior de la malla de fibrina. Este kit disparador químico funge como desencadenante de la respuesta regenerativa. El principal factor de crecimiento que hace de bisagra en estas respuestas es el TGF–b, que se secreta de dos maneras:

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a. Latente en complejos pequeños de acción inmediata que promueven la atracción de células inmunitarias y que son degradados por las enzimas furin–like liberadas por las mismas plaquetas. b. Latente de liberación tardía que forma complejos grandes ligados a la matriz extracelular fibrilar (o a la propia fibrina) por medio de la LTBP (latent TGF binding protein), degradada fundamentalmente por la plasmina en el momento de la fibrinólisis y que desencadena la respuesta regenerativa propiamente dicha. En este momento la acción del TGF–b es fundamentalmente antiinflamatoria. La regeneración de un tejido exige la formación de nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis es el motor de la regeneración desde el inicio, ya que posibilita la llegada de células troncomultilineales y proporciona factores tróficos necesarios para la homeostasis celular. El inicio de la angiogénesis se desencadena por la esfingosina–1–fosfato (SPP), también liberada por las plaquetas, que se une al receptor EDG–1 de las células endoteliales y ejerce una acción quimioatrayente en ellas. Parece que la fibronectina es un cofactor que estabiliza la interacción de la célula endotelial con la matriz extracelular. La acción subsiguiente está mediada fundamentalmente por el VEGF (factor de crecimiento vasculoendotelial), que actúa como factor inductor de la proliferación de las células endoteliales y como movilizador de células progenitoras del sistema vascular para promover la vasculogénesis. Esta respuesta coordinada a escala local y sistémica producirá un nuevo árbol vascular en la zona dañada, gobernando la formación del nuevo tejido.

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Una vez asegurado el aporte vascular, se forma un tejido intermedio de origen fibroso que actúa a modo de nicho, que albergará las células progenitoras movilizadas por los mediadores del daño celular que llegan al foco de lesión guiadas por gradientes químicos y anidan en el homing. Normalmente la célula stem queda regulada en su nicho, que es otra célula de aspecto fibroblástico. En respuesta a los estímulos mitógenos se producen progenitores y precursores de forma ordenada, que se encargarán de sustituir el primordio de tejido (tejido fibroso de granulación) por el tejido noble.

APLICACIÓN DE PRP EN LESIONES MUSCULARES Con base en lo anterior se ha propuesto un nuevo planteamiento terapéutico en las roturas fibrilares y hematomas musculares posteriores a una contusión, que son muy frecuentes en las patologías deportivas. Ante una lesión muscular, el hematoma se produce rápidamente con un contenido no sólo hemático, sino que también contiene los restos celulares consecuentes a la necrosis de miofibras. En el tratamiento de estas lesiones se siguen procedimientos normalizados,9 como la punción guiada y la infiltración de un producto cortisónico con intención antiinflamatoria. En teoría, si se procede a la eliminación del hematoma y se inyecta PRP autólogo en la cavidad, se podría favorecer la coaptación de planos, disminuir la fase inflamatoria, mejorar y acelerar el proceso regenerativo con minimización de la fibrosis, y disminuir el riesgo de recidiva del hematoma con la formación de una seudocápsula que cronifica el proceso. La selección evolutiva ha primado la aparición de una respuesta inflamatoria inmediatamente después de la lesión, ya que la reabsorción del hematoma y la respuesta ante la infección es fundamental en la resolución de las agresiones “naturales”, pero puede decirse que la inflamación no es tan necesaria en lesiones inducidas por actos “no naturales”, como los quirúrgicos; es decir, como los realizados al tratar de evacuar el hematoma. Si bien es cierto que una inflamación excesiva favorece el desarrollo de cicatriz fibrosa, es cierto que tampoco se desea la ausencia total de inflamación. El funcionalismo muscular correcto a largo plazo —a partir del mes— dependerá de que la construcción del nuevo tejido mantenga una adecuada proporción entre las miofibras y la matriz extracelular. El exceso de antiinflamación puede inclinar la balanza en contra de la matriz extracelular y regenerar un músculo en apariencia más sano y “más celular”, pero menos resistente, que incita las recaídas. Conviene recordar que el factor de crecimiento no es símil de PRP autólogo, por lo que no debería ser causa de confusión la afirmación de que el TGF–b induce la cicatriz fibrosa, ya que se fundamenta en resultados de experimentación

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en animales sometidos a altas y repetidas dosis de TGF–b de origen sintético.10 En estos casos el TGF–b aislado ejerce un efecto repetido de starter, que indudablemente induce al tejido a intentar la reparación a toda costa mediante la producción masiva de fibroblastos. Con un producto autólogo, como el PRP, no hay razón para suponer que se produzcan efectos adversos si se realiza una aplicación aislada en una fase precoz después de las 48 h de la pauta RICE (reposo, hielo, compresión y elevación), que parece imperativa. Si en máximas condiciones asépticas y de control ecográfico se practica en medio quirúrgico la evaluación y evacuación del hematoma, y sin retirar la aguja se lleva a cabo la infiltración de un volumen de PRP proporcionado al grado de la lesión —entre 4 y 8 mL—, el beneficio esperable es la disminución de la sintomatología dolorosa y una mejora en la calidad y celeridad del proceso de curación, comprobable a través de una ecografía. No se considera adecuada la administración de dosis repetidas de PRP ni de antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) en fase poslesional precoz, ya que pondrían en riesgo la acción natural de las prostaglandinas y la función plaquetaria, que son fundamentales en el proceso regenerativo de los tejidos musculares y óseos.11 Quizá sólo ante la recidiva del hematoma convenga repetir la dosis como se hace en hematomas encapsulados, donde el PRP podría sustituir el tratamiento mediante infiltración de cortisona. En el contexto de un ensayo clínico fase I–II nuestro grupo de trabajo trató 15 lesiones musculares en deportistas de alto rendimiento con distensiones y contusiones que habían generado una cavidad hemática y habían tenido una evolución tórpida. Se siguió la metodología de punción evacuadora del hematoma guiada por ecografía e infiltración del PRP en un volumen acorde al tamaño de la lesión. Los controles evolutivos clínicos y ecográficos mostraron un cambio positivo en la evolución de la lesión, que antes del tratamiento se comportaba de manera refractaria. Este efecto fue muy evidente durante la primera y la segunda semanas en la totalidad de los casos, excepto uno en el que el dolor persistió durante la primera semana como en los casos no tratados con PRP. Al disminuir el dolor, las pautas fisioterápicas, fundamentales en la patología deportiva, pudieron iniciarse más pronto y algunos de los deportistas acortaron el tiempo de inactividad competitiva. Estos resultados alentadores han motivado un ensayo clínico diseñado en fase III, comparativo y multicéntrico, que está en curso (enero de 2007).

APLICACIÓN DE PRP EN GONARTROSIS La motivación del estudio del posible efecto antiinflamatorio del PRP se debe a la repetición de observaciones preliminares durante la práctica de cirugía en ma-

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nos, pies o rodillas, localizaciones donde este efecto es más notorio. A los pacientes no se les administró medicación analgésica ni antiinflamatoria en el posoperatorio, el cual cursó sin dolor y con ausencia de signos inflamatorios, que la mayoría de las veces son significativos. Para evaluar la eficacia antiinflamatoria del PRP se consideraron como modelo de estudio prioritario las gonartrosis femorotibiales avanzadas y refractarias a los tratamientos antiinflamatorios y de rehabilitación habituales. Primero se hizo un ensayo no controlado en caballos deportivos con lesiones tendinosas y articulares (Dra. M. Prades, del Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Autónoma de Barcelona). La gonartrosis del caballo, a diferencia de la del humano, cursa invariablemente con derrame sinovial y se pudo determinar que éste no se reproducía después del tratamiento con PRP. Los mismos resultados se reprodujeron en el Hospital Veterinario de Mallorca y en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Nacional Autónoma de México (Dra. M. Masri). La mejoría del grado de cojera fue significativa y se resaltó que en la clínica animal no se considera el efecto placebo, lo cual debería ser un dato suficiente para omitir su planteamiento en los estudios en clínica humana. Aunque pendientes de los análisis con muestras más amplias y controladas, la ausencia de complicaciones y de una eficacia significativa en clínica veterinaria12 llevó a considerar que dicho efecto del PRP podía trasladarse a pacientes humanos con lesiones similares. El PRP no es un componente fisiológico en la composición del líquido sinovial y aunque es autólogo, su presencia es anómala. También se debe considerar que en situaciones traumáticas la articulación de la rodilla puede contener hasta 90 mL de sangre completa con un número total de plaquetas muchísimo mayor que las administradas de manera terapéutica, sin que ello se considere causa de complicaciones cuando las pautas terapéuticas de la hemartrosis son adecuadas. Este mismo criterio puede aplicarse a otras lesiones tendinosas o musculares donde el hematoma es omnipresente y base de los fenómenos regenerativos y reparativos. Las gonartrosis pueden suponer una mayor o una menor deformidad articular, pero el dolor es el síntoma más preeminente y la razón primordial por la que los pacientes acuden a consulta médica. No se han encontrado fibras nociceptivas en el cartílago hialino articular y el dolor se debe a estímulos químicos o mecánicos sobre la membrana sinovial, la cápsula articular, los ligamentos periarticulares, el periostio o el hueso subcondral.13 Otras causas pueden ser la periostitis vinculada con la formación de osteofitos, con microfracturas subcondrales o con infartos óseos debidos a la disminución del flujo sanguíneo y a la elevada presión intraósea. El espasmo reactivo de músculos periarticulares puede causar un dolor secundario que se suma al primario. Las causas de dolor sinovial son la inflamación debida en parte a la liberación de prostaglandinas, leucotrienos y citocinas, y a la irritación de los nervios sensiti-

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vos próximos a la sinovial suprayacente a los osteofitos. El efecto antiinflamatorio del PRP se atribuye a la liberación de factores de crecimiento, como el TGF–b, que actúan como moduladores sobre las células de la membrana sinovial, responsables de la cascada inflamatoria. En el campo de la clínica humana se diseñó un estudio, cuya intención es evaluar la seguridad del procedimiento y comprobar la ausencia de efectos tóxicos o adversos en los pacientes voluntarios, tomando como modelo principal las gonartrosis muy avanzadas y con sintomatología dolorosa grave y refractaria a los tratamientos habituales. El análisis preliminar del comportamiento de los 20 primeros casos confirmó los indicios del alto potencial antiinflamatorio en el ambiente articular y en otro tipo de patologías musculotendinosas, donde los resultados obtenidos en los modelos animales se reprodujeron con una significación estadística. Esto alentó la continuación del estudio con una muestra mayor hasta una cifra que consideramos suficiente para concluir el estudio en fase I–II. Se incluyeron 332 pacientes afectos de distintas patologías articulares y musculotendinosas, y se aplicaron 754 infiltraciones. La ausencia de acontecimientos adversos lleva a pensar que se trata de un tratamiento seguro si durante el proceso de preparación del PRP y su aplicación se sigue la metodología empleada y adaptada al regulatorio. La muestra analizada correspondiente a la gonartrosis sólo incluyó los primeros 78 casos, que ya disponían de un seguimiento mayor de seis meses; 60% se clasificaron como artrosis graves (grados III y IV, y IV de Kellgre y Lawrence).14 Estos pacientes presentaron un grado importante de impotencia funcional y algunos estaban incapacitados para la marcha. Los casos clasificados con grado menor (I y II) fueron incluidos ya avanzado el estudio y se trató de pacientes con derrame residual tras una artroscopia por lesión meniscal. El tratamiento consistió en infiltrado articular de 8 mL de la fracción rica en plaquetas de PRP obtenido mediante la metodología descrita por Anitua, pero con sustitución del pipeteado por el aspirado con jeringa en condiciones de ambiente de aire laminar. En total se aplicaron cuatro dosis en intervalos de 15 días y 84% de los casos tratados con PRP mostraron una mejoría sustancial del dolor y experimentaron una disminución en el valor de la escala visual análoga mayor de 45% en ausencia de otro tipo de tratamiento antiinflamatorio asociado. Por otro lado, no se registró ningún efecto adverso. La mejoría seguía latente seis meses después, incluso ganó algunos puntos porcentuales. Según los criterios del Osteoarthritis Research Society International Standing Committee for Clinical Trials Response Criteria Initiative estos datos suponen que el efecto del PRP adquiere un valor terapéutico (figura 10–1).15,16 Se aplica el PRP en hemoterapia o como adyuvante quirúrgico coagulante y sellador con una intención farmacológica distinta a la habitual. Por lo tanto, es necesario caracterizar el producto y dictar las dosis terapéuticas del mismo, lo

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Figura 10–1. Los valores de la escala visual análoga descienden al tercer mes de haber iniciado el tratamiento con plasma rico en plaquetas y se mantienen al sexto mes, incluso con tendencia al descenso. El análisis estadístico muestra diferencias significativas entre los grupos.

cual es imposible en cuanto a la exactitud, dada la evidente variabilidad en la composición sanguínea, tanto celular como proteínica, que van a presentar los pacientes susceptibles de ser tratados. Hasta el momento sólo se pueden indicar dosis volumétricas; por ejemplo, en la gonartrosis se administran cuatro dosis de 8 mL en intervalos de 15 días. Ésta fue una pauta dictada de forma empírica. La validación del PRP aplicado en este estudio realizado por el Banco de Sangre y Tejidos de Cataluña señala que se duplicaron (s 2.5) las plaquetas basales por mL. Las muestras presentaron una mediana de concentración plaquetaria de 530 000 plt/mL, llegando en el extremo del rango hasta las 800 x 106 mL, que en volúmenes de 8 mL supone una dosis plaquetaria de 3.69 x 109 plaquetas. Ésta es la dosis

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media con la que se obtuvieron efectos antiinflamatorios satisfactorios y que se considera eficaz. Se ignora qué sucedería si se aplicara una dosis plaquetaria superior o se recurriera a infiltrar una fracción con escasas plaquetas, y qué efecto se obtendría si se prolonga la terapia con la administración de más dosis o con otros sistemas de obtención de PRP, donde las dosis plaquetarias podrían ser mayores. Sin embargo, los resultados de eficacia son altamente satisfactorios con el método empleado, ya que benefician a casi 85% de los casos tratados. Esto permite pensar que en los estudios comparativos de costo–beneficio el método de obtención de PRP seguido quizá sería superior a otros existentes, considerando que el efecto que ahora se valora es el antiinflamatorio y no el de la inducción regenerativa tisular. La dosificación basada en el número de plaquetas infiltradas es un patrón de referencia que puede plantearse sólo provisionalmente (¿a más plaquetas más TGF–b?); sin embargo, el efecto inhibidor de la inflamación que analizamos lo ejercen en todo caso las citocinas liberadas por las plaquetas u otras extraplaquetarias, y no propiamente las plaquetas. Por lo tanto, los futuros estudios deberán considerar la determinación de citocinas en líquido sinovial antes del tratamiento y después de él, y los análisis, que son costosos, deberán realizarse en relación con ellas. En cualquier caso, estos resultados deberían posibilitar la práctica de esta terapia en condiciones controladas y avanzar en el conocimiento mediante ensayos diseñados y multicéntricos en fase III, que consideren patologías concretas y acoten al máximo los criterios de inclusión, con el fin de mostrar las auténticas posibilidades terapéuticas y la valoración costo–beneficio frente a otros procedimientos. Para finalizar, la manipulación de sangre o sus componentes se rige por una legislación muy estricta que debe conocerse. En términos legales, el PRP autólogo se considera como un autoinjerto y, por lo tanto, la regularidad de su obtención y aplicación dentro del mismo acto quirúrgico utilizado como coagulante y sellador, como compactador de injertos o como favorecedor de procesos regenerativos y reparativos no debería ofrecer dudas, siempre y cuando se realice la técnica con métodos viables y seguros. Se entiende que el concepto “autoinjerto” expresado en el terreno regulatorio aclara por completo la inocuidad del producto. Sin embargo, se discute la idoneidad de los sistemas de obtención y producción del PRP o la eficacia de una nueva aplicación terapéutica, como es la antiinflamatoria. Por lo tanto, antes de iniciar la práctica de su aplicación es necesario consultar a las autoridades sanitarias de cada país competentes en la regulación de procesos como los descritos. ¿Quién elabora y aplica el PRP?, ¿dónde?, ¿cómo? y ¿por qué? son variables que deben corresponder con la norma.

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11 Terapia génica cutánea como estrategia de intervención en la dermatología

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Marta Carretero, María José Escamez, Marta García, Isabel Mirones, Fernando Larcher, Marcela del Río

La piel es un órgano que genera grandes expectativas como blanco de estrategias de transferencia génica. Su fácil accesibilidad permite monitorear el área genéticamente modificada y, lo más importante, extirpar el tejido genéticamente modificado en caso de producirse efectos adversos. Las células cutáneas son fáciles de obtener y de expandir in vitro a partir de una pequeña biopsia de la piel. Recientemente se lograron avances extraordinarios en el desarrollo de equivalentes cutáneos obtenidos mediante la ingeniería tisular para la regeneración cutánea permanente.1–3 Asimismo, se demostró que el compartimento de las células madre epidérmicas, el cual es un elemento requerido para cualquier estrategia de terapia génica permanente en la piel, se puede modificar de manera eficaz con la utilización de diferentes vectores integrativos.4–6 Estos estudios aportaron pruebas contundentes de la factibilidad de la transferencia génica correctiva, la cual constituye un punto de partida para el desarrollo de terapias génicas in vivo y ex vivo a niveles preclínico y clínico (figura 11–1). El atractivo de la terapia génica cutánea no reside únicamente en la corrección de enfermedades de la piel sino que también permite utilizar la epidermis como biorreactor para suministrar una proteína terapéutica a la circulación sistémica. Los estudios demostraron que los queratinocitos humanos genéticamente modificados injertados en ratones inmunodeficientes pueden actuar como una fuente de proteínas sistémicas, como la hormona de crecimiento,7 el factor IX8 y la leptina.9 Actualmente se realiza un importante esfuerzo para optimizar la solución de problemas críticos, como el mantenimiento a largo plazo de niveles séricos adecuados de las proteínas terapéuticas derivadas de los queratinocitos genética147

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Ingeniería tisular

Equivalente cutáneo

Ensayos clínicos Pacientes quemados

(Capítulo 11)

Terapia genética

Modelos preclínicos

Inmunocompetentes

Inmunodeficientes Piel humana

Ratón humanizado (permanentemente/transitoria)

Porcino (transitoria: cicatrización)

Figura 11–1. Uso de los equivalentes cutáneos humanos en la ingeniería tisular y en la terapia génica cutánea.

mente modificados.10 Para la modificación genética de la piel pueden utilizarse dos métodos diferentes de transferencia génica: ex vivo e in vivo. El planteamiento ex vivo consiste en el aislamiento y la propagación in vitro de células cutáneas (queratinocitos o fibroblastos) para su modificación genética antes de su reinjerto en el paciente como parte de un equivalente cutáneo obtenido mediante la ingeniería tisular. Para el planteamiento in vivo se realiza una transferencia génica directa mediante el suministro de DNA plasmídico (por medio de una inyección directa, del método biobalístico gene gun o de la electroporación) con la ayuda de vectores virales (lentivirus, adenovirus y virus adenoasociados). Para la selección idónea del método de transferencia deben considerarse algunas cuestiones esenciales. La expresión génica transitoria es adecuada para aplicaciones como las terapias regenerativas. En este caso, el uso de vectores no integrativos, como los adenovirus recombinantes deficientes en replicación, es al parecer la mejor opción. Estos vectores se utilizan con éxito para la transferencia génica in vivo a la piel mediante la inyección subcutánea. El amplio tropismo de los vectores adenovirales permite realizar la modificación de queratinocitos, fibroblastos, células de músculo liso y adipocitos con la aplicación de esta estrategia.11 La obtención de títulos elevados de estos vectores es fácil. También, los vectores son capaces de transducir células que proliferan con actividad y células quiescentes y no se integran en el genoma de las células transducidas. Los vecto-

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res no virales evitan potenciales problemas de seguridad relacionados con los vehículos virales, pero presentan una eficacia de transferencia muy baja. Para mejorar la captación de DNA desnudo en el tejido se utilizan las metodologías de electroporación y de gene gun, además de vectores sintéticos (formulaciones liposomales, polímeros y nanopartículas). La expresión génica permanente en la epidermis requiere transducir de manera eficaz la población de células madre. Estudios preclínicos utilizaron con éxito la transferencia génica ex vivo por medio de vectores oncorretrovirales (basados en el virus Moloney).12 En este contexto, la proliferación de las células diana es un requisito obligatorio. De acuerdo con una hipótesis, bajo las condiciones normales de cultivo existe un porcentaje de células madre epidérmicas no proliferativas, lo cual dificulta su transducción eficaz mediante vectores oncorretrovirales. Por lo tanto, los vectores lentivirales (basados en el VIH), capaces de infectar queratinocitos humanos en proliferación y quiescentes, representan una estrategia alternativa para la corrección de genodermatosis, como la epidermólisis, en las cuales la cantidad de células madre puede estar limitada.6–13 Los vectores retrovirales y lentivirales se integran al azar en el genoma de sus células diana, una característica que podría comprometer la seguridad de su utilización, especialmente en aplicaciones que consisten en la modificación genética de las células madre.14 En los últimos años se realizaron importantes esfuerzos para determinar si los efectos secundarios adversos observados en un ensayo de terapia génica con células madre hematopoyéticas, exitoso en otros aspectos,15 están vinculados de manera específica con ese protocolo o si se trata de un fenómeno general que podría afectar otros tipos de células madre, productos génicos y protocolos de transducción y trasplante. Los efectos secundarios informados en este ensayo de terapia génica hematopoyética obligaron a cesar las investigaciones. Tres años después, en 2005, se reanudó en Italia un ensayo fase I–II de terapia génica cutánea para la deficiencia de laminina–5. Este protocolo, basado en el trasplante autólogo de células madre epidérmicas transducidas con un vector oncorretroviral, dio excelentes resultados en ausencia de efectos adversos.16

PATOLOGÍAS ABORDABLES MEDIANTE LA TERAPIA GÉNICA CUTÁNEA Genodermatosis Entre las enfermedades genéticas cutáneas, o genodermatosis, los trastornos monogénicos recesivos son los mejores candidatos para el tratamiento por reintroducción en el queratinocito de una única copia del gen normal. Algunos ejemplos

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(Capítulo 11)

son el xeroderma pigmentosum, la ictiosis ligada al cromosoma X y las formas juntural y distrófica de la epidermólisis bullosa.4,17,18 Una cuestión por resolver es la evasión de una potencial respuesta inmunitaria en el receptor contra la proteína terapéutica foránea, en particular en pacientes portadores de mutaciones nulas. Actualmente se dispone de modelos espontáneos de genodermatosis en animales inmunocompetentes, los cuales serán fundamentales para la validación de las estrategias de la terapia génica.19–21 Otros trastornos cutáneos, como la epidermólisis bullosa simple y la forma recesiva de epidermólisis bullosa distrófica, presentan una mutación dominante negativa que conlleva la producción de una proteína aberrante que afecta la función de su equivalente normal.22 En estos casos, el tratamiento debe estar dirigido a la supresión de la expresión del gen mutado o a la mejora de la sintomatología de la enfermedad mediante la sobreexpresión controlada del producto génico normal.

Epidermólisis bullosa Esta entidad comprende un grupo de enfermedades hereditarias cutáneas caracterizadas por defectos que afectan las queratinas del citoesqueleto celular y las proteínas involucradas en la adhesión dermoepidérmica22–25 (figura 11–2). El fenotipo clínico presenta fragilidad cutánea, ampollas y erosión en las zonas corporales expuestas a traumatismos, las cuales se pueden agravar a causa de infecciones por lo general durante el primer año de vida. La epidermólisis bullosa también puede estar relacionada con la falla multiorgánica, lo cual resulta en retraso del crecimiento y anemia. Con el fin de corregir estos trastornos, actualmente se realizan grandes esfuerzos para desarrollar protocolos óptimos de terapia génica cutánea.4,17,18 La epidermólisis bullosa se clasifica en tres categorías principales de acuerdo con el gen afectado y, por lo tanto, con el nivel ultraestructural cutáneo en el cual se producen las ampollas.22,25 La epidermólisis bullosa simplex es un trastorno autosómico dominante producido por mutaciones en los genes que codifican para las queratinas epidérmicas específicas del estrato basal (K5 o K14), lo cual afecta la función de resistencia ejercida por el citoesqueleto de queratina con el fin de mantener la estabilidad mecánica de la epidermis. La corrección genética de esta enfermedad es compleja debido a la acción dominante negativa de la proteína mutante. Por esta razón, el planteamiento mediante la terapia génica debe encaminarse a suprimir la expresión de la copia mutada del gen. Sin embargo, Lane propone un enfoque alternativo que consiste en reforzar el citoesqueleto de filamentos intermedios de los queratinocitos responsables de la epidermólisis bullosa simple con la ayuda de una red adicional de filamentos de desmina humana, la cual es una proteína que

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EBJ

Control

EBD

Queratinocito basal

1. Filamento intermedio 2. Integrina 3. Laminina

4. Colágeno VII 5. Fibroblasto 6. Colágeno I/III

7. Fibronectina 8. Colágeno IV 9. Membrana basal

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Figura 11–2. Defectos moleculares en la membrana basal relacionados con diferentes formas de epidermólisis bullosa. La epidermólisis bullosa juntural se caracteriza por mutaciones que afectan diferentes componentes de los hemidesmosomas, como las integrinas y la laminina. La epidermólisis bullosa distrófica es causada por mutaciones genéticas en el gen que codifica el colágeno tipo VII. Las imágenes de microscopia electrónica de transmisión muestran la formación de ampollas y los defectos en la adhesión dermoepidérmica en cada caso. HD = hemidesmosoma, LD = lámina densa, LL = lámina lúcida, AFl = filamentos de anclaje, Afb = fibrillas de anclaje, KIF = filamentos intermedios de queratinocito. Las imágenes de microscopia electrónica fueron cedidas con generosidad por Gache, Spirito y Meneguzzi de INSERM U634, Facultad de Medicina, Niza, Francia.

ejerce en las células musculares una función similar a la de las queratinas a través de un protocolo de transferencia génica que emplea vectores oncorretrovirales.26,27 La epidermólisis bullosa juntural es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva que puede producirse a causa de mutaciones en cualquiera de los seis genes que codifican los tres componentes de los hemidesmosomas. Podrían verse afectadas las tres cadenas que constituyen la laminina–5 (LAMA3, LAMB3 y LAMC2), el BPAG2/colágeno tipo XVII (COL17A1) y las integrinas a6/b4 (ITGA6 e ITGB4). Los hemidesmosomas son complejos multiproteicos que unen la red epitelial de filamentos intermedios con las fibrillas dérmicas de anclaje, con lo cual se mantiene la integridad de la piel en los humanos.23,28,29 Los primeros esfuerzos para lograr la corrección genética de la epidermólisis bullosa se realizaron con el uso de queratinocitos de pacientes afectados por la forma grave de la epidermólisis bullosa juntural, relacionada con la falta de ex-

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presión de una de las tres cadenas del heterotrímero laminina–5. La restauración de la expresión de la laminina–5 se logró en los queratinocitos primarios de la epidermólisis bullosa juntural utilizando vectores retrovirales,30–32 abordajes no virales de corrección estable mediados por la integrasa FC3133 y sistemas de transposones.34 El primer ensayo clínico para la epidermólisis bullosa juntural con el uso de un vector oncorretroviral, el cual codifica la cadena b3 de la laminina, lo llevaron a cabo recientemente De Luca y col. y los resultados obtenidos fueron esperanzadores. La recuperación de la expresión de la laminina–5 en los queratinocitos restauró la adhesión celular y la capacidad formadora de colonias sin afectar su potencial de diferenciación. Las células corregidas se utilizaron para generar láminas de queratinocitos, las cuales fueron después trasplantadas. Los queratinocitos genéticamente modificados fueron capaces de regenerar las hemidesmosomas normales corrigiéndose de modo satisfactorio la fragilidad cutánea característica de la enfermedad. En conjunto, todos estos resultados demuestran que la reversión fenotípica de los trastornos de adhesión mediante la transferencia génica a queratinocitos puede ser considerada una realidad hoy en día. La epidermólisis bullosa distrófica es un trastorno hereditario autosómico dominante o recesivo causado por mutaciones genéticas en el gen que codifica el colágeno tipo VII (COL7A1), principal componente de la lámina basal, que desempeña un papel crítico en la adhesión dermoepidérmica.35 La epidermólisis bullosa distrófica se caracteriza por la formación de ampollas en la piel y en las mucosas, lo cual produce una cicatrización hipertrófica. En la forma más grave del trastorno (epidermólisis bullosa distrófica recesiva de tipo Hallopeau–Siemens [EBDR–HS]), las lesiones progresan con el tiempo a carcinoma invasivo de células escamosas. Recientemente varios grupos investigaron la corrección permanente de queratinocitos humanos primarios de la EBDR–HS mediante la transferencia génica ex vivo y obtuvieron resultados prometedores en modelos animales. Ortiz–Urda y col. utilizaron un sistema de transferencia génica basado en la integrasa FC31, para completar el cDNA COL7A1 de forma estable en queratinocitos y fibroblastos aislados de pacientes con EBDR–HS.36 Asimismo, se logró una transferencia génica eficaz con un vector lentiviral autoinactivante en queratinocitos inmortalizados de la EBDR–HS.37 Sin embargo, la baja eficacia de transferencia de los vectores no virales y la ausencia de líneas celulares empaquetadoras apropiadas para los vectores lentivirales, obstaculizan su posible aplicación en ensayos clínicos. De forma alternativa, la utilización de vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia murina constituye la herramienta más adecuada para la transferencia génica ex vivo de genes terapéuticos en ensayos clínicos. Recientemente Meneguzzi y col., en contribución con los autores de la obra, generaron equivalentes cutáneos mediante la ingeniería tisular empleando queratinocitos humanos primarios de la EBDR–HS transducidos con un vector retroviral que expresa el colágeno tipo VII humano.38 La piel humana regenerada

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en ratones inmunodeficientes por medio del trasplante de queratinocitos EBDR– nulos mostró una drástica fragilidad en la adhesión dermoepidérmica y la formación de ampollas espontáneas como consecuencia de la ausencia del colágeno tipo VII y, por lo tanto, de las fibrillas de anclaje. A diferencia del vector viral utilizado, el fenotipo se corrigió después del injerto de las células EBDR–HS genéticamente modificadas. En definitiva, dos observaciones merecen especial atención en estas investigaciones. En primer lugar, se logró la recuperación de la expresión normalizada a largo plazo del colágeno tipo VII.37 En segundo lugar, se consiguió la corrección de la epidermólisis bullosa distrófica ex vivo en un contexto preclínico por medio de la utilización de un equivalente cutáneo, el cual fue utilizado antes de manera exitosa en pacientes quemados.1,38 También se demostró que los vectores virales medían de forma eficaz la transferencia del cDNA del colágeno tipo VII a queratinocitos primarios caninos de EBDR–HS.39 Las células transducidas revirtieron por completo el fenotipo de EBDR–HS in vitro, lo cual constituye la base para abordar los estudios preclínicos de la terapia génica utilizando un modelo animal inmunocompetente. Los queratinocitos son las células responsables de la mayor parte del colágeno que se deposita en la unión dermoepidérmica de la piel humana. Sin embargo, se demostró que el colágeno tipo VII secretado únicamente por fibroblastos dérmicos normales y genéticamente modificados40,41 es suficiente para restaurar la unión dermoepidérmica después del trasplante a ratones inmunodeficientes. Por otra parte, se ensayó el efecto de la inyección intradérmica directa de fibroblastos humanos sanos y de la EBDR–HS genéticamente corregidos con vectores lentivirales, en un equivalente de piel humana con EBDR–HS trasplantada a ratones inmunodeficientes. De manera destacada, el colágeno tipo VII sintetizado y secretado por estas células inyectadas se localiza precisamente en la unión dermoepidérmica formando fibrillas de anclaje, debido probablemente a la gran afinidad de la laminina–5 por esta molécula. También se ensayaron otros métodos de transferencia génica in vivo. Woodley y col. lograron corregir la EBDR–HS mediante una única inyección intradérmica de un vector lentiviral que codifica el colágeno tipo VII en una piel humana con EBDR–HS regenerada en ratones inmunodeficientes.42 Este grupo propuso una estrategia más sencilla basada en la terapia proteica, demostrando que la inyección intradérmica de colágeno tipo VII recombinante en una piel humana con EBDR–HS regenerada en ratones inmunodeficientes puede corregir el defecto.43 Xeroderma pigmentosum El xeroderma pigmentosum es una enfermedad autosómica recesiva caracterizada por un aumento de la sensibilidad a la luz ultravioleta, lo cual conlleva anormalidades cutáneas y oculares. Los pacientes tienden a desarrollar carcinomas

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cutáneos de células basales y escamosas, como melanomas. Aproximadamente 30% de los individuos presentan trastornos neurológicos, aunque éstos pueden expresarse después de los síntomas cutáneos, los cuales se manifiestan por lo general entre el primero y el segundo años de vida. Las mutaciones en distintos genes (XPA, XPB/ERCC3, XPC, XPD/ERCC2, XPE/UV–DDB/DDB2, XPF/ERCC4, XPG/ERCC5 y XPV/POLH) definen los siete grupos de complementación (XP grupos de la A a la G) y el grupo variante XPV a base de los cuales se clasifican los pacientes. Las células de los pacientes que pertenecen a los grupos de complementación de la A a la G presentan un defecto en la maquinaria de reparación a causa de la escisión de nucleótidos, a diferencia de las células del grupo XPV, las cuales tienen afectados los mecanismos de reparación posreplicación. El único tratamiento disponible para estos pacientes es paliativo y se limita a protegerlos de la luz solar. Una opción innovadora es la aplicación tópica de enzimas fotorreparadoras (endonucleasa de bacteriófago T4 [T4N5] y fotoliasa),44 cuya actividad consiste en reparar los errores en el DNA. El tratamiento con endonucleasa T4 tipo V durante un año redujo de un modo significativo en 30 pacientes la aparición de lesiones precancerosas.45 La corrección efectiva a largo plazo de la piel con xeroderma pigmentosum puede abordarse por medio de la terapia génica cutánea. En experimentos en los cuales se utilizaron fibroblastos de xeroderma pigmentosum y vectores integrativos se logró la recuperación de forma estable de los mecanismos de reparación del DNA.46,47 Sin embargo, la terapia génica debe tener como diana celular los queratinocitos, pues estas células desempeñan una función esencial en el cáncer de piel en estos pacientes. En este sentido, se logró la corrección genética de queratinocitos XPC (deficientes en mecanismos de reparación del DNA) con el uso de una estrategia de transducción retroviral. La sobreexpresión de la proteína normal XPC hizo posible que las células recuperaran el mecanismo de reparación normal del DNA.48 Además, la transferencia in vivo del gen XPA mediante un vector adenoviral a la piel de ratones XPA–knockout previno los efectos deletéreos en la piel, incluyendo la aparición de carcinoma de células escamosas, desencadenados en los ratones después de la exposición a luz ultravioleta.49 Sin embargo, al igual que para otros trastornos cutáneos hereditarios, la modificación genética permanente del compartimento de células madre epidérmicas por medio de estrategias de transferencia génica ex vivo, parece ver el planteamiento más realista y apropiado desde un punto de vista clínico. El reciente desarrollo in vitro de equivalentes cutáneos humanos de xeroderma pigmentosum48,50 constituye la base de futuros ensayos preclínicos. Como se demostró en otras genodermatosis, la regeneración in vivo de piel humana con xeroderma pigmentosum en ratones inmunodeficientes representa un modelo apropiado para validar el tratamiento de la enfermedad mediante un planteamiento de terapia génica.

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CICATRIZACIÓN DE HERIDAS Las heridas agudas y crónicas constituyen un grupo de enfermedades cutáneas de etiologías diferentes y con manifestaciones variadas. Las quemaduras son la causa más común de heridas agudas. Las heridas crónicas incluyen úlceras arteriales, diabéticas, de presión y venosas, y son las responsables de una morbilidad significativa y la reducción en la calidad de vida de los pacientes afectados. La comprensión del proceso de reparación de los tejidos es fundamental para el desarrollo de nuevos planteamientos terapéuticos. Asimismo, la generación de ratones transgénicos es primordial para el estudio de la función de los genes individuales.51 El primer evento en el proceso normal de reparación de heridas es la activación inmediata de la cascada de coagulación seguida por una respuesta inflamatoria aguda. Los leucocitos limpian la herida y liberan factores de crecimiento, los cuales inducen la formación de un tejido de granulación. El proceso angiogénico y la matriz provisional de fibrina proporcionan, respectivamente, los soportes vascular y estructural necesarios para la reepitelización. Posteriormente, la matriz provisional es reemplazada de grado en grado por una matriz más enriquecida en colágeno.52–54 Todos estos procesos están orquestados perfectamente por los factores de crecimiento y las citocinas que se liberan en distintos momentos durante la reparación del tejido.55 El trasplante de láminas epidérmicas es un tratamiento convencional para la cicatrización de heridas agudas de gran superficie y de úlceras crónicas.1,56,57 El uso reciente de equivalentes cutáneos con características muy similares a las de la piel humana nativa constituye una estrategia mejorada, cuya eficacia clínica fue constatada.1,58–61 Los factores de crecimiento, como el PDGF,62 el VEGF,63,64 el FGF65 y el KGF,66 desempeñan una función fundamental en los procesos de reparación de las heridas. Sin embargo, el uso de estos factores como proteínas recombinantes en ensayos clínicos para mejorar la cicatrización de heridas no arrojó buenos resultados, debido sobre todo a su rápida degradación en el entorno hostil de la herida.55,67–69 Una manera de eludir este inconveniente es la administración de los factores mediante la transferencia génica. Existen dos aproximaciones de terapia génica para la cicatrización de heridas. Una de ellas es la transferencia génica ex vivo a queratinocitos de genes promotores de la cicatrización, combinada con el trasplante de equivalentes cutáneos, autólogos o alogénicos. La otra es la transferencia génica in vivo de estos factores directamente al área de la herida utilizando vectores con la capacidad de producir niveles elevados de expresión proteica y de transducir células en proliferación y células quiescentes.70,71 Entre los factores de crecimiento que requieren más atención está el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el cual se produce localmente por la

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mayoría de las células en la herida y promueve la formación del tejido de granulación.55,72 La baja expresión del PDGF y de sus receptores tiene como consecuencia una cicatrización retardada en los ratones.73,74 La transferencia génica in vivo del cDNA del PDGF–A y del PDGF–B demostró ser capaz de promover la reparación de heridas en ratas.75 Además, la sobreexpresión del PDGF–A mejora la toma de los injertos durante la primera semana postrasplante, lo cual promueve la formación del tejido de granulación y el depósito de colágeno.76,77 Asimismo, la sobreexpresión del PDGF–B mejoró notablemente el proceso de cicatrización estudiado en tres modelos animales diferentes: en ratones diabéticos, en conejos (oreja isquémica)78,79 y en piel humana regenerada en ratones inmunodeficientes.71 Estos resultados alentadores promovieron el primer ensayo clínico de terapia génica para el tratamiento de úlceras crónicas utilizando un vector adenoviral que codifica el PDGF humano (PDGF/Ad5) (NIAMS–044; N01 AR–9–2238).80,81 Otro de los genes candidatos para la terapia cutánea para la cicatrización es el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el cual se produce por los queratinocitos en las heridas y activa la angiogénesis mediante la inducción de los procesos de proliferación y de migración en las células endoteliales7,64 La expresión reducida del VEGF en heridas en el modelo del ratón diabético se correlaciona con un impedimento en la cicatrización observado en estos animales.63,68,83 Además, la sobreexpresión del VEGF en la piel de los ratones transgénicos aumenta la vascularización.84,85 El grupo de autores de la obra realizó trasplantes de equivalentes cutáneos porcinos, genéticamente modificados ex vivo para la sobreexpresión del VEGF, a ratones inmunodeficientes. Esta estrategia dio como resultado un aumento en el número de vasos sanguíneos en el estroma receptor.86 Utilizando un planteamiento similar, Supp y col. también demostraron una mejoría en la toma de los injertos mediante la utilización de queratinocitos humanos los cuales sobreexpresaban el VEGF por medio de la transferencia génica retroviral.87–89 Por otro lado, se demostró la generación de una mejoría en la respuesta angiogénica y en el proceso general de cicatrización de heridas con el suministro in vivo del VEGF por medio de un vector adenoviral o de un vector viral adenoasociado en diferentes modelos animales de cicatrización impedida.90–93 Los estudios llevados a cabo por los autores de esta obra indicaron que la utilización de queratinocitos autólogos productores del VEGF, al formar parte de un equivalente cutáneo trasplantable, mejoraron la estabilidad del injerto y la calidad de la regeneración del tejido en un modelo porcino inmunocompetente.94 En conjunto, estos resultados justifican la realización de estudios adicionales con el fin de evaluar la utilidad clínica de la transferencia génica del VEGF en el tratamiento de heridas cutáneas. Los efectos de la sobreexpresión del factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) en la reepitelización en heridas cutáneas se estudiaron con detalle.55,95 Los fibroblastos expresan KGF durante la cicatrización normal de heridas y su expre-

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sión se reduce y retrasa de forma significativa en ratones diabéticos y en ratones tratados con glucocorticoides.96–98 Además se observó que los ratones transgénicos que expresan una forma dominante negativa del receptor del KGF presentan un retraso importante en la reepitelización de heridas.99 Asimismo, se demostró que en modelos animales el KGF también es responsable de la estimulación del tejido de granulación.100–102 Este factor ejerce su acción sobre las células endoteliales capilares estabilizando la barrera endotelial.103 Con la utilización de un modelo preclínico se demostró una mejoría significativa en el porcentaje de toma de trasplante a ratones inmunodeficientes cuando se injertó un equivalente cutáneo productor del KGF.104 Por otro lado, se observó una mejoría en la cicatrización de heridas cuando se utilizó un método de transferencia génica in vivo del KGF a heridas escisionales en ratones diabéticos (inyección de DNA desnudo con posterior electroporación)105 y en ratas con quemaduras (inyección liposomal).106 En conjunto, estos resultados respaldan la utilización del KGF para posibles protocolos de terapia génica cutánea. El factor de crecimiento hepático (HGF) es un potente mitógeno para los hepatocitos y presenta actividad en los procesos de reparación de tejido cutáneo, con lo cual ejerce un efecto sobre la proliferación y la migración de las células epiteliales.107 Recientemente se demostró que el trasplante en ratones inmunodeficientes de equivalentes cutáneos que sobreexpresan HGF (transferencia génica a queratinocitos mediada por retrovirus) regeneró un epitelio hiperplásico, el cual se estabilizó a las dos semanas del trasplante.108 Esta expresión transitoria coincide con el proceso de toma del injerto, lo cual puede resultar beneficioso en un contexto de reparación de tejido cutáneo y de cicatrización de heridas. En ensayos clínicos de fase I se observó que la inyección de plásmidos portadores del gen del HGF produce una mejoría significativa de las úlceras isquémicas.109 Hace poco tiempo los autores de esta obra describieron un nuevo modelo para el estudio de la cicatrización de heridas basado en la regeneración de piel humana en ratones inmunodeficientes.110 La principal ventaja de este sistema es la posibilidad de estudiar estos procesos en una piel humana madura (de 9 a 12 semanas después del injerto); también ofrece la facultad de ensayar abordajes de transferencia génica in vivo y ex vivo (figura 11–3). En este modelo humanizado se llevó a cabo el estudio de diferentes estrategias de transferencia génica de KGF y se observó en todos los casos un aumento en la cicatrización.111 Por esta razón, el modelo representa una plataforma útil para valorar el potencial terapéutico de nuevos factores como promotores del proceso de cicatrización. Finalmente, cabe destacar que la cicatrización de una herida y la toma de un injerto cutáneo pueden verse seriamente amenazadas si en el lecho dérmico se desarrolla una infección. Por lo tanto, la posibilidad de transferir a la herida genes que codifiquen para proteínas con actividad antimicrobiana es también motivo de investigaciones en todo el mundo. Los péptidos antimicrobianos naturales son

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A Vectores retrovirales

(Capítulo 11)

Transferencia genética en piel humana ex–vivo Purch de biopsia

Estudio de cicatrización

Día 0

Día 3 ph Vectores adenovirales

Día 0

Día 3 ph

Transferencia genética en piel humana in vivo

B involucrina humana

involucrina humana Re–epitelización

Día 0

Día 3 ph

Figura 11–3. Estudios de cicatrización en piel humana regenerada en ratones. El proceso de cicatrización se analizó tres días después de la herida (ph). A. Se utilizaron dos protocolos diferentes para la transferencia de genes a piel humana. Panel superior: el método ex vivo consiste en la modificación genética in vitro de queratinocitos humanos con la utilización de vectores retrovirales y en su posterior trasplante en ratones inmunodeficientes. Se observa una expresión de GFP estable en todo el injerto. Panel inferior: el método in vivo consiste en la inyección subcutánea directa de vectores adenovirales. Cuando se utiliza este sistema se observa que la expresión de GFP está localizada alrededor de la herida, coincidiendo con el sitio de inyección. B. Análisis inmunohistoquímicos del proceso de reepitelización en diferentes días posteriores a la herida (ph) utilizando un anticuerpo específico dirigido contra la involucrina humana. El marcaje positivo indica que los queratinocitos implicados en el cierre de la herida son humanos.

componentes importantes del sistema de defensa de organismos que incluyen desde plantas hasta vertebrados y exhiben un amplio espectro de actividad. Algunos se expresan en queratinocitos humanos en procesos inflamatorios, como las b–defensinas 2 y 3112,113 y la catelicidina LL37.114 La ausencia de expresión del HBD2 en quemaduras y en el fluido de las ampollas producidas por quemaduras puede ser una de las causas favorecedoras del crecimiento microbiano.115 Varias empresas de biotecnología están interesadas en la posible aplicación terapéutica de los péptidos antimicrobianos recombinantes para el tratamiento de las infecciones, pues está demostrado que las bacterias no desarrollan con facili-

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dad resistencia frente a ellos. Entre los productos desarrollados se encuentran el MBI–226R, útil en el tratamiento de las infecciones relacionadas con el catéter venoso central (Migenix Inc., Vancouver); el IMMUCEPTR, desarrollado para el tratamiento de la neumonía nosocomial (Inimex Pharmaceutical Inc., Vancouver), y el P–113DR, usado en el tratamiento de pacientes con fibrosis quística (Demegen Inc., Pittsburgh). El desarrollo de nuevas plataformas biotecnológicas de producción de proteínas recombinantes hace posible la producción de estos péptidos a gran escala y con calidad clínica; sin embargo, su elevado costo de elaboración ocasiona que la terapia génica sea una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento de las heridas infectadas. Otros estudios emplearon un vector adenoviral para sobreexpresar el péptido antimicrobiano LL37 en un modelo de xenoinjerto bronquial de fibrosis quística con el fin de revertir la susceptibilidad a infecciones.116 Los autores de esta obra también demostraron la eficacia de la sobreexpresión mediante vectores adenovirales de diferentes péptidos antimicrobianos humanos para inhibir el crecimiento bacteriano en la superficie de equivalentes cutáneos.117 En otras investigaciones se demostró que la sobreexpresión transitoria del LL37 mediante un vector adenoviral también es efectiva para prevenir el crecimiento bacteriano en un modelo animal de quemaduras infectadas.118 Además de la actividad de los péptidos antimicrobianos como antibióticos naturales, se describieron otras acciones sobre las células eucarióticas, que podrían ser beneficiosas para los procesos de reparación de heridas. La expresión del LL37 se induce en el frente de la reepitelización de heridas cutáneas humanas. La expresión de este péptido no se detecta en úlceras crónicas que no cicatrizan de modo espontáneo. En el análisis de la inhibición en heridas ex vivo utilizando anticuerpos dirigidos frente al LL37 se produce una inhibición en la reepitelización dependiente de la dosis.119 También se demostró que el LL37 puede inducir la proliferación y la migración en células epiteliales.117,120 Diversos factores de crecimiento, como el IGF–I y el TGF–a, y citocinas proinflamatorias pueden dirigir la expresión de los péptidos antimicrobianos en el tejido dañado.121 Los ratones deficientes para el homólogo murino CRAMP presentan un aporte vascular incompleto en el tejido de granulación durante el proceso de cicatrización, lo cual sugiere un papel importante para este péptido en la angiogénesis cutánea patológica. Está demostrado que el LL37 induce la angiogénesis por medio del receptor FPRL1 (formyl peptide receptor–like–1) expresado en las células endoteliales.122 Asimismo, presenta actividades antiendotóxicas123 y está implicado en la regulación de la inmunidad adaptativa, mediante la quimioatracción de diferentes células del sistema inmunitario124 y la modulación de la diferenciación de células dendríticas.125 Estos datos indican que la terapia génica antimicrobiana para la curación de heridas puede resultar beneficiosa, pues los péptidos antimicrobianos son capa-

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ces de controlar la infección y, al mismo tiempo, de contribuir de forma positiva en la regeneración del tejido a través de su acción en las diferentes etapas del proceso de cicatrización de heridas.

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 11)

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12 Equivalentes cutáneos desarrollados por ingeniería tisular: aplicaciones clínicas

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Fernando Larcher, Álvaro Meana, José Luis Jorcano, Marcela del Río

La terapia regenerativa basada en la terapia celular es un campo emergente que busca combinar el conocimiento y la práctica acumulados en distintas disciplinas con el fin de restaurar las funciones defectuosas de los órganos del cuerpo. La capacidad de las células madre embrionarias y de las células madre adultas de contribuir a estos objetivos genera grandes expectativas. Asimismo, se tiene previsto el logro de avances revolucionarios en esta área. Los equivalentes cutáneos obtenidos mediante la ingeniería tisular emergieron a lo largo de la última década del siglo XX y la primera década del siglo XXI como la tecnología de avanzada mejor estudiada y comprobada para el manejo de heridas. El estímulo inicial para su desarrollo fue el reemplazo de los autoinjertos, de los aloinjertos y de los xenoinjertos ante una pérdida cutánea grave. Sin embargo, su aplicación se extendió al tratamiento de enfermedades crónicas de la piel.1 El objetivo de este capítulo consiste en presentar una descripción amplia con los resultados más relevantes respecto a la biología regenerativa de la piel. Se incluyen diversas técnicas de la ingeniería tisular. Sin embargo, para complementar el tema es necesaria una discusión exhaustiva de los sistemas y los productos disponibles comerciales en la actualidad. Esta información se encuentra disponible en una amplia gama de fuentes.1–5

PIEL La piel recubre el cuerpo en su totalidad y es el órgano más grande en cuanto a peso y superficie. En los humanos adultos cubre un área de 1.5 a 2 m2 y representa 167

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 12)

aproximadamente 8% del peso corporal. Su estructura es muy compleja y consta de muchos componentes y anexos: folículos pilosos, glándulas sebáceas y glándulas sudoríparas. Su principal función consiste en actuar como una barrera protectora contra potenciales daños ambientales. Su flexibilidad y su resistencia resguardan al cuerpo de la fricción y del perjuicio mecánico. La piel evita la pérdida de agua y regula la temperatura corporal mediante la circulación sanguínea y la evaporación de la transpiración. Asimismo, impide la entrada al cuerpo de agentes químicos, de bacterias, de virus y de la luz ultravioleta, la piel tiene muchos nervios y terminaciones nerviosas que le confieren la función de un órgano sensorial. En presencia de los rayos solares, la piel puede producir vitamina D, una molécula fundamental en el metabolismo del calcio. La piel está compuesta por dos tejidos distinguibles en cuanto a su anatomía, su función y su desarrollo: la epidermis y la dermis. Estos tejidos están a su vez integrados por distintos tipos celulares, con grandes diferencias en estructura y función.

EPIDERMIS La epidermis es la capa externa de la piel formada en su mayoría por un tipo particular de células epiteliales, los queratinocitos. También la conforman otras células residentes como los melanocitos, las células de Merkel y las células de Langerhans, las cuales cumplen importantes funciones especializadas. La epidermis está compuesta por distintas capas, llamadas también estratos. Partiendo de la base (la zona más profunda o más interna) las distintas capas que componen la epidermis son el estrato basal, el estrato espinoso, el estrato granular, el estrato lúcido y el estrato córneo. Los queratinocitos se producen en el estrato basal, en el cual su proliferación está confinada. Después migran hacia la superficie durante el llamado proceso de diferenciación epidérmica. A lo largo de este proceso de recambio, los queratinocitos experimentan modificaciones en su estructura y en su fisiología. El ciclo de recambio tiene una duración de aproximadamente 28 días. El proceso de diferenciación epidérmica comprende cambios morfológicos y bioquímicos, los cuales están relacionados con las transformaciones temporales y espaciales en la expresión génica (figura 12–1). Proteínas específicas caracterizan los distintos estratos de la piel. Así, los queratinocitos proliferativos del estrato basal, los cuales expresan queratina 5 (K5) y queratina 14 (K14), se adhieren a la membrana basal. Los queratinocitos del estrato basal maduran y se transforman en queratinocitos suprabasales. Esta transición se distingue por la pérdida de contacto con la membrana basal, la interrupción de la proliferación, la pérdida de la expresión de las queratinas K5 y K14 y la concomitante ganancia de las que-

Equivalentes cutáneos desarrollados por ingeniería tisular...

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La piel Estrato córneo Estrato granular Estrato espinoso

Filigrina Loricrina Involucrina K1/K10

Estrato basal Células dérmicas

K5/K14, a6b4 Membrana basal

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Figura 12–1. Corte transversal de la piel que muestra los principales componentes celulares (queratinocitos epidérmicos y fibroblastos dérmicos) y la estructura estratificada de la epidermis. Las principales proteínas relacionadas con los diferentes estadios de la diferenciación y de la estratificación aparecen en los recuadros azul celeste.

ratinas K1 y K10. Por último, los queratinocitos suprabasales sufren un proceso relacionado con la apoptosis, el cual es definido como diferenciación terminal y ocasiona la formación de una capa de células muertas queratinizadas: el estrato córneo. Esta capa constituye uno de los componentes principales de la barrera protectora de la piel. El proceso de diferenciación terminal está vinculado con la expresión de proteínas marcadoras como la transglutaminasa, la involucrina, la filagrina, la loricrina, entre otras. Los folículos pilosos que, junto con las glándulas sebáceas y las glándulas sudoríparas, forman los anexos epidérmicos se configuran durante la embriogénesis a partir de la epidermis. La vaina radicular externa del folículo piloso se continúa con el estrato basal de queratinocitos. El cross talk entre los fibroblastos de las papilas dérmicas y los queratinocitos del folículo induce la proliferación y la posterior diferenciación de las células de amplificación transitoria en distintos tipos de queratinocitos del folículo piloso. Estos queratinocitos constituyen la capa adyacente a la vaina radicular externa, la vaina radicular interna con sus compartimentos y el eje del pelo con la cutícula, el córtex y, si existe, la médula. Concluido el proceso de morfogénesis, los folículos pilosos atraviesan ciclos constituidos por una fase de involución (catágeno), durante la cual se pierde la parte inferior del folículo piloso, por un periodo de latencia (telógeno) y por una fase de crecimiento (anágeno), durante la cual el cross talk entre las células de las papilas dérmicas y las células progenitoras en la región del bulge da lugar a la reconstitución de un folículo piloso completo.

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(Capítulo 12)

DERMIS La dermis es el estrato vivo que actúa como soporte de la epidermis. El principal tipo celular del cual está compuesta la dermis es el fibroblasto, cuya función es producir y mantener los elementos estructurales de la piel. Estos elementos, los cuales incluyen el colágeno y la elastina, se combinan con sustancias no fibrosas, como los glicosaminoglicanos, para formar la matriz extracelular, la cual también brinda soporte a la membrana basal, garantizando la integridad de la unión dermoepidérmica. La renovación de la estructura tisular depende de la membrana basal. En condiciones normales, el índice de recambio del colágeno es bajo, pero aumenta durante la reparación del daño. La red vascular, la cual es difícil de reemplazar, desempeña una función esencial en el proceso de la regeneración cutánea. Un aporte sanguíneo inadecuado inhibe la reparación y la falta de revascularización apropiada aumenta la formación no deseada de tejido cicatrizal. Una membrana basal compleja, compuesta por proteínas especializadas, constituye una estructura de anclaje epidérmico y dérmico, y también delimita las áreas epitelial y mesenquimal. Las mutaciones en los genes que codifican las proteínas de la membrana basal (colágeno VII y laminina–5) dan lugar a enfermedades cutáneas hereditarias de baja incidencia.

CÉLULAS MADRE EPIDÉRMICAS La regeneración de la epidermis a lo largo de la vida está a cargo de una población bien definida y especializada de queratinocitos basales: las células madre epidérmicas. El conocimiento de la biología básica de las células madre epidérmicas y de los mecanismos que regulan sus propiedades totipotenciales es la base de las potenciales estrategias terapéuticas cutáneas celular y genética. A diferencia de lo que ocurre con la célula madre hematopoyética, la definición de célula madre epidérmica humana en términos de capacidad regenerativa y de propiedades totipotenciales es aún controversial. Los avances logrados en los primeros años del siglo XXI respecto a la identificación, el aislamiento y el conocimiento de las capacidades de las células madre epidérmicas representan una gran importancia. Los estudios sobre la autorrenovación y las propiedades totipotenciales de diferenciación de las células madre epidérmicas tuvieron un auge de 2005 a 2007. Investigaciones de la piel de los ratones demostraron la existencia de una población minoritaria de células que se alojan en el área del folículo conocida como bulge. Estas células presentan el marcador fenotípico CD34+/queratina K15+ e integrina a6+, y son capaces de regenerar la epidermis y sus anexos (folículo piloso y glándula sebácea) en presencia del estímulo morfogenético de los fibro-

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blastos neonatales.6–8 Mediante la elaboración del perfil genómico de poblaciones seleccionadas en dos de los estudios se logró la obtención de los primeros perfiles moleculares de las células madre epidérmicas, en particular en las células madre de los folículos pilosos. No hace mucho tiempo se describió la existencia de la población SP (side population), que consta de células capaces de excluir el colorante Hoescht 33258, con una relación entre el núcleo y el citoplasma mayor y con la capacidad de regenerar epidermis in vivo por periodos relativamente largos.9 Algunos autores reportaron la existencia de al menos dos tipos de células madre epidérmicas con diferente localización y capacidad regenerativa,10 incluyendo las células interfoliculares y las células del folículo piloso. Sin embargo, la localización anatómica y el fenotipo de potenciales células madre epidérmicas de la piel humana aún no se esclarecen por completo, sobre todo a causa de las dificultades relacionadas con la regeneración a largo plazo in vivo en modelos experimentales. La disección cuidadosa y el análisis de los perfiles genómicos de estas células evidenciaron similitudes y diferencias entre las células del bulge humanas y las células de los ratones. Así, aunque se expresa en ciertas subpoblaciones de células, el CD34 no se expresa en el bulge del folículo piloso de la piel humana, sino en estructuras vecinas.11,12 No obstante, se logró la regeneración cutánea a largo plazo a partir de células CD34+ (Larcher y col., resultados no publicados), un hallazgo que se suma a la controversia existente. Independientemente de los esfuerzos por definir las células madre en función de marcadores específicos, se deben tener en cuenta los criterios basados en la capacidad proliferativa in vitro de los cultivos primarios de queratinocitos humanos establecidos en la década de 1980 por Green y col.13 De acuerdo con estos criterios se definen tres poblaciones: los holoclones (clones con una gran capacidad clonogénica y un gran potencial proliferativo), los meroclones (clones con un potencial proliferativo menor que el de los holoclones, originados en células progenitoras comprometidas y en células amplificadoras transitorias) y los paraclones (clones con una baja capacidad proliferativa, cercana a la diferenciación terminal). A pesar de su antigüedad, esta clasificación sigue vigente y señala que el holoclón se deriva estrictamente de las células madre epidérmicas interfoliculares en humanos. Así, los ensayos clonogénicos son los mejores predictores de las propiedades de las células madre, al menos en términos de una gran capacidad proliferativa de las potenciales células madre epidérmicas interfoliculares.13,14 Estos estudios in vitro demostraron que la forma salvaje y la forma genéticamente modificada de los clones de células epidérmicas, u holoclones en cultivo, poseen un extraordinario potencial de replicación.14 En teoría, esta capacidad es suficiente para reemplazar la epidermis no sólo de un individuo (aproximadamente 8 x 1010 queratinocitos basales) sino de toda la población humana (5 x 1020 célu-

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las). No obstante, el tema es motivo de controversia. Uno de los aspectos más sensibles en el campo de las células madre epidérmicas humanas en relación con la medicina regenerativa consiste en averiguar la existencia de una subpoblación celular con todos los atributos de las células madre o, al contrario, de células con una capacidad proliferativa limitada (definidas como una subpoblación de células amplificadoras transitorias), las cuales pueden ser programadas y reprogramadas para instrumentar la renovación a largo plazo de la epidermis.15 Sin embargo, la proporción, la función y la dinámica de los clones reproductivos epidérmicos in vivo no han sido estudiadas a detalle como lo han sido en las células madre hematopoyéticas humanas. A pesar del fracaso de los esfuerzos para evaluar las potenciales propiedades de las células madre en clones humanos individuales genéticamente modificados (holoclones) in vivo,14 los avances recientes en relación con los cultivos organotípicos y las técnicas quirúrgicas hicieron posible alcanzar este objetivo (Larcher y col.; resultados no publicados). Gran parte del actual entusiasmo por el estudio de las células madre embrionarias humanas radica en el potencial valor terapéutico de las células somáticas que originan las primeras. En tanto que las biopsias de piel son la fuente habitual de queratinocitos y de células madre epidérmicas, el objetivo de los estudios recientes consiste en la generación de queratinocitos a partir de células madre embrionarias humanas. Mediante la evaluación de la expresión secuencial de factores de transcripción específicos, Green y col. llevaron a cabo el seguimiento del desarrollo en función del tiempo y la migración del tipo celular de queratinocitos derivado de células madre embrionarias humanas en cultivo.16 En un estudio reciente realizado por los mismos autores se establecieron diferencias entre los queratinocitos posnatales y los queratinocitos derivados de células madre embrionarias humanas, lo cual demostró que estos últimos tienen un potencial proliferativo mucho menor en cultivo. Estos hallazgos sugieren que los queratinocitos individuales derivados de células madre embrionarias humanas no pueden ser expandidos para producir cultivos masivos.17 Asimismo, las investigaciones demostraron que la optimización de las condiciones de cultivo mejora la proliferación, aunque no lo suficiente para permitir su aislamiento clonal. Se espera que en los próximos años la ciencia se concentre en dilucidar el cóctel adecuado para la producción de células madre epidérmicas a partir de células madre embrionarias humanas.

REVISIÓN HISTÓRICA DEL REEMPLAZO CUTÁNEO El injerto de piel es un complemento de la cirugía moderna y sus raíces son muy antiguas. La obtención de piel autóloga y el trasplante fueron descritos hace apro-

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ximadamente 2 500 a 3 000 años en la India, donde los injertos de piel se usaban quizá para la reconstrucción de las narices que eran amputadas como un castigo judicial.18 Aunque los primeros documentos científicos se remontan a Europa en el siglo XIX.18,19 En 1863, en la ciudad de París, Paul Bert, un alumno de Claude Bernard, describió en su tesis De la greffe animale varios trasplantes de piel alogénicos y xenogénicos, razón por la cual puede considerársele como uno de los pioneros en el desarrollo de injertos de piel libre.18 En 1869 dos cirujanos, Felix Jean Casimire Guyon y Jacques Reverdin, reportaron por primera vez el uso de injertos de grosor parcial (epidérmico).19 Por su parte, Ollier y Thiersch emplearon injertos de grosor parcial en 1872 y 1886, respectivamente. Los injertos de espesor completo fueron descritos por Wolfe y Krause en 1875 y 1893, respectivamente.20–22 En la actualidad, el uso de injertos de piel es común en la cirugía dermatológica. El tratamiento de quemaduras producidas por el fuego de volcanes fue descrito por primera ocasión en los papiros de Ebers (1500 a.C.). En estos documentos se relata que lo que un médico recetaba para aliviar una quemadura era justamente una mezcla de estiércol de vaca y barro negro.23 A lo largo de los siglos subsiguientes, todos los médicos se preciaban de tener su remedio favorito para aliviar el dolor y el sufrimiento ocasionados por las quemaduras. Dupuytren, un famoso cirujano del siglo XIX detalló por primera vez la contractura que lleva su nombre y escribió: “las quemaduras son objeto de los tratamientos más bizarros”. El debate sobre el tratamiento de quemaduras de tercer grado se prolongó hasta entrado el siglo XX. Después de la Primera Guerra Mundial, por fin se logró un consenso: el mejor tratamiento para las quemaduras sería el transplante quirúrgico de piel seguido de la reducción de las cicatrices y de la medicación para aliviar el dolor de acuerdo con las necesidades. El uso de injertos en malla para cubrir extensiones grandes fue descrito por Douglas en 1930. Este sistema revolucionó el uso de injertos de espesor parcial para el tratamiento de quemaduras y de grandes pérdidas de piel.24 Durante la Segunda Guerra Mundial el marcado aumento en el número de víctimas de heridas masivas, como las quemaduras, determinó la necesidad de estudiar y desarrollar nuevas estrategias de injerto, como los trasplantes alogénicos y xenogénicos. Poco tiempo después estas estrategias debieron enfrentar los problemas de rechazo de injertos. La inmunobiología del transplante se volvió una realidad de difícil manejo.24 Actualmente en EUA alrededor de dos millones de quemaduras por año requieren atención médica. De éstas, aproximadamente 70 000 requieren internación y 15 000 son referidas a centros especializados en la atención de quemaduras y necesitan algún tipo de procedimiento de injerto de piel.1

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TRATAMIENTO ESTÁNDAR PARA LA PÉRDIDA GRAVE DE PIEL (QUEMADURAS) Hasta hoy, el tratamiento estándar para quemaduras graves se basa en el injerto de piel obtenida de una zona no dañada del cuerpo del mismo individuo (autoinjerto). Este método es razonablemente exitoso cuando se debe reemplazar tejido epidérmico, en todos los casos en que el daño no sea demasiado extenso y se disponga de suficiente piel sana. Por lo general, la piel se toma del mismo sitio varias veces y se permite que crezca entre cada toma. Este procedimiento es lento y da como resultado una piel con un efecto cosmético muy deficiente en el sitio de la quemadura. La expansión de la piel se logra con frecuencia mediante el mallado y el estiramiento del tejido donante. También es posible usar la piel de otros donantes vivos y cadavéricos (aloinjerto), y de animales como el cerdo (xenoinjerto). La piel de cadáver es muy usada en el tratamiento de heridas extensas;25 su uso entró en auge a partir de la década de 1970. Con este tipo de piel se obtiene una cobertura rápida de las heridas en los pacientes con sitios escasos para la toma de autoinjertos de piel. Por lo regular, el aloinjerto se extrae el mismo día de ocurrido el fallecimiento y se criopreserva a la temperatura del nitrógeno líquido. Aunque después de ser injertado se seca, razón por la cual debe realizarse un autoinjerto, el aloinjerto se adhiere bien a la herida durante varias semanas antes de que se presente una respuesta inmunológica de rechazo, induciendo la formación de un tejido de granulación. Por lo tanto, los aloinjertos sirven para permitir una cobertura transitoria hasta que se encuentre una solución permanente. Aunque los resultados obtenidos con el uso de piel cadavérica para la cobertura de quemaduras son satisfactorios, problemas como la disponibilidad y el costo de este tipo de piel y la potencial transmisión de enfermedades impiden la propagación de esta terapia.

CULTIVO DE CÉLULAS EPIDÉRMICAS PARA INJERTOS La aparición de los sustitutos de piel y de los cultivos de células epidérmicas como terapias experimentales para el tratamiento de heridas surgió a raíz de la necesidad urgente de lograr una rápida cobertura permanente de quemaduras extensas en los pacientes que no disponían de piel suficiente para un autoinjerto. A mediados de la década de 1970 Green y col. desarrollaron métodos para el cultivo en serie y para la expansión de queratinocitos epidérmicos basados en el uso de un cóctel de factores de crecimiento específicos y en la presencia de fibroblastos de ratones irradiados letalmente como feeder layer.26 Asimismo, Green

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informó la existencia de queratinocitos con capacidades proliferativas diferentes, incluyendo las supuestas células madre epidérmicas.13 A finales de la década de 1980 se describieron otras condiciones de cultivo para los queratinocitos, como los medios definidos con bajos niveles de calcio y libres de suero.27 La técnica para la expansión de queratinocitos in vitro propuesta por Rheinwald y Green y el uso de la dispasa, una proteasa capaz de desprender una lámina entera de células epidérmicas (en vez de desprender células individuales como en la tripsina), constituyeron un importante avance tecnológico el cual convirtió en una realidad clínica el injerto de una lámina obtenida mediante el cultivo de células. Así, en 1981 O’Connor y col. fueron los primeros en preparar con éxito láminas de queratinocitos autólogos, llamados por lo general autoinjertos de células epiteliales cultivadas para pacientes con quemaduras.28 Estudios posteriores de los mismos autores demostraron que las células injertadas persisten de modo indefinido en el paciente. Este hallazgo adquiere una gran relevancia, pues demostró que es posible mantener las funciones de las células madre epidérmicas en cultivo.29 Aunque el injerto de láminas de células epiteliales contribuyó a salvar la vida de pacientes con quemaduras graves en todo el mundo,28,30–32 la estrategia mostró varias desventajas: la fragilidad del producto, una limitada eficacia de los injertos y una ultraestructura anormal de la unión dermoepidérmica la cual causa formación de ampollas, genera contracturas y redunda en perjuicio de los aspectos estético y clínico.33,34 Poco tiempo después se volvió evidente la necesidad de un sistema de reemplazo cutáneo más robusto. La carrera para desarrollar y comercializar estos productos comenzó en la década de 1980 y continúa hasta hoy.

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SUSTITUTOS CUTÁNEOS OBTENIDOS MEDIANTE LA INGENIERÍA TISULAR Los sustitutos cutáneos obtenidos mediante la ingeniería tisular emergieron desde finales de la década de 1980 como la más estudiada con minuciosidad y la más comprobada de las tecnologías empleadas en el manejo de las heridas. Su objetivo principal consistía en reemplazar los autoinjertos, los aloinjertos y los xenoinjertos en el tratamiento de pérdidas graves de piel; sin embargo, su uso se extendió hasta el tratamiento de heridas crónicas. Los sustitutos de piel obtenidos mediante la ingeniería tisular representan una alternativa a los injertos de piel parcial. Estos evitarían el dolor, las potenciales complicaciones y las limitaciones de área relacionadas con la toma de piel natural. Asimismo, serían resistentes y fáciles de manipular, y estarían siempre disponibles en la cantidad necesaria. Respecto a su funcionalidad, el sustituto cutáneo ideal debe imitar la fisiología de la piel normal y lograr con eficacia la regenera-

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ción cutánea y la cicatrización de heridas. Estos sustitutos de piel serían económicos, impedirían el rechazo por parte del huésped y permitirían un periodo prolongado de almacenamiento. La ingeniería tisular de sustitutos cutáneos obtenidos mediante el cultivo se basa en una construcción genética de los siguientes tres componentes: las células, los factores de crecimiento y la matriz, o molde.35 Para la producción de sustitutos cutáneos mediante la ingeniería genética se ensayan diferentes combinaciones de una variedad de células, de mediadores solubles y de biopolímeros. También, para el tratamiento de heridas se emplean láminas epidérmicas de queratinocitos cultivados como aloinjertos y como autoinjertos. Se demostró que el reemplazo del tejido conectivo junto con los queratinocitos puede aumentar la fuerza mecánica de las heridas curadas y reducir la formación de cicatrices,36–38 por lo tanto, se incluyeron fibroblastos en algunos sustitutos cutáneos artificiales.39–42 Debido a las dificultades en la producción y la comercialización de equivalentes cutáneos autólogos, la mayoría de los sustitutos cutáneos obtenidos mediante la ingeniería tisular que se comercializan en la actualidad consisten en una matriz de biomaterial con células alogénicas (queratinocitos o fibroblastos o incluso ambos), derivadas por lo regular del prepucio neonatal. Entre las ventajas de esta fuente conveniente de tejido se incluyen un contenido mayor de células madre epidérmicas, un crecimiento celular más rápido y una antigenicidad reducida. Los pasos en el desarrollo y la combinación de los componentes empleados en la ingeniería genética de la piel fueron revisados en otra investigación.1 Asimismo, la historia y el estado del arte de las matrices y de los sustitutos cutáneos se resumieron en trabajos recientes.1–5 El objetivo de los autores de este capítulo no es repetir una descripción de todos los sustitutos cutáneos y de los elementos para la terapia celular de heridas disponibles en el mercado, sino detallar los avances y los desafíos actuales en este campo con el uso de productos específicos para ejemplificar ciertos conceptos, centrando la atención en los nuevos equivalentes cutáneos celulares, que son en su mayoría autólogos.

MATRICES DÉRMICAS RICAS EN FIBRINA PARA EL REEMPLAZO PERMANENTE DE PIEL A pesar de que no se ha logrado sintetizar un sustituto cutáneo ideal y de que la esperanza de que esto ocurra es irreal, recientemente se desarrolló un producto que tiene muchas de las características clínicas buscadas. Este producto se obtuvo prestando particular atención al proceso de cicatrización de heridas. Así, se seleccionó la fibrina como matriz para alojar a las células dérmicas en un equivalente cutáneo obtenido mediante la ingeniería genética. La fibrina es la matriz primaria

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y temporaria para la cicatrización de heridas; permite la migración de células epiteliales y mesenquimales las cuales reparan el tejido dañado. El coágulo de fibrina tiene la resistencia y la flexibilidad ideales para las manipulaciones necesarias en un injerto. También, los geles acelulares de fibrina disponibles son usados como vehículo para el crecimiento de láminas de queratinocitos de acuerdo con la técnica estándar de Rheinwald y Green. Este sistema, el cual reemplaza únicamente el tejido epidérmico, es empleado de manera exitosa en injertos en pacientes con quemaduras.43,44 La demostración de que los fibroblastos humanos vivos en geles de fibrina obtenida mediante la crioprecipitación permiten el crecimiento de queratinocitos sin feeder layer, constituyó un avance de gran importancia.40 Los factores de crecimiento solubles que aportan las células feeder layer y los fibroblastos humanos vivos pueden ser equivalentes. No obstante, las señales inhibitorias de la diferenciación atribuidas también a las células feeder layer son reemplazadas por señales de supervivencia las cuales se originan en la interacción entre queratinocitos, fibroblastos y fibrinas. Sin embargo, la fibrina (fibrinógeno) quizá no sea el único factor de importancia, pues el crioprecipitado de plasma contiene factores adicionales como la fibronectina y la trombospondina, las cuales pueden contribuir a la adhesión y la sobrevida de los queratinocitos. Se desarrolló una matriz rica en fibrina obtenida a partir de plasma puro que permite la generación de equivalentes cutáneos autólogos, pues los queratinocitos, los fibroblastos y el plasma derivan del mismo individuo (figura 12–2).41 Una característica importante de los moldes y los sustitutos dérmicos de fibroblastos y fibrina obtenidos mediante la crioprecipitación y a partir de plasma consiste en la posibilidad de los queratinocitos humanos de ser sembrados a bajas densidades, lo cual reduce la cantidad de células primarias necesarias para generar un equivalente cutáneo capaz de ser injertado. Al contrario, en equivalentes dérmicos con colágeno, como el APLIGRAFR, los queratinocitos se siembran a una densidad similar a la densidad de confluencia. Asimismo, el equivalente cutáneo rico en fibrina es económico y puede ser almacenado durante periodos largos. Estudios recientes realizados por el grupo de investigadores autores de esta obra demostraron la eficacia clínica de los equivalentes cutáneos basados en plasma. El equivalente cutáneo desarrollado por estos investigadores fue empleado de manera exitosa, en su versión autóloga, en la regeneración cutánea permanente en distintas situaciones: quemaduras extensas, fascitis necrotizante, resección de nevos gigantes y enfermedad injerto contra huésped, entre otras.41,42 Además de los sistemas cutáneos sólidos obtenidos por medio de la ingeniería genética que emplean fibrina (geles) como portador, se han descrito formulaciones líquidas que administran suspensiones de queratinocitos y fibroblastos en forma de aerosol;45–48 se rocían las células con una solución de fibrinógeno y trombina, la cual actúa como un adhesivo para facilitar la adhesión de las células

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Equivalente cutáneo generado por ingeniería tisular

Biopsia cutánea

Sangre

Queratinocitos

Molde 3D de fibrina Fibroblastos Figura 12–2. Desarrollo de una piel autóloga mediante la bioingeniería. Una biopsia de piel de un donante, que al mismo tiempo es paciente, sirve como fuente para el cultivo primario de fibroblastos y queratinocitos (cultivados en presencia del feeder layer). Se colocan los fibroblastos en el equivalente dérmico rico en plasma y luego se siembran los queratinocitos sobre el gel de plasma (fibrina). Cuando los queratinocitos alcanzan la confluencia, la piel desarrollada por medio de la bioingeniería está lista para ser injertada.

a la herida. El CELLSPRAYR, un producto basado en esta tecnología, ya se comercializa.

SUSTITUTOS CUTÁNEOS OBTENIDOS MEDIANTE LA INGENIERÍA TISULAR EN EL TRATAMIENTO DE HERIDAS CRÓNICAS Un alto costo y una complicada logística representan las dificultades primarias relacionadas con los sustitutos cutáneos autólogos obtenidos por medio de la ingeniería tisular disponibles comercialmente. Estas desventajas impiden su disponibilidad como productos populares en el mercado. Sin embargo, el uso de equivalentes cutáneos alogénicos para heridas crónicas tiene una historia diferente. El tratamiento de heridas difíciles, crónicas y refractarias a métodos curativos

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convencionales adquirió una importancia mayor debido al aumento de ancianos en la población del mundo industrializado y al incremento de la incidencia de diabetes mellitus y arteriosclerosis. Así, un mercado potencial de 1 a 2% de la población total de los países desarrollados promovió el desarrollo de varios productos comerciales que compiten por demostrar su ventaja clínica. Eisenbud y col. llevaron a cabo un excelente y extenso trabajo de revisión sobre la eficacia de los distintos productos (www.medscape.com).49 Aunque los avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el proceso de cicatrización de las heridas son importantes, la ciencia del tratamiento de heridas crónicas con sustitutos cutáneos es sobre todo empírica y poco conocida. Los efectos benéficos pueden abarcar desde el mantenimiento en el sitio de la herida de un ambiente húmedo y equilibrado bioquímicamente, hasta el soporte estructural para la regeneración tisular o el aporte de citocinas benéficas y de factores de crecimiento al lecho de la herida. Es más probable su función como soporte estructural, pues los sustitutos fabricados con células donantes más jóvenes suelen funcionar mejor. Mansbridge y col. informaron que la viabilidad y la actividad metabólica del componente celular de un sustituto cutáneo es esencial para su eficacia terapéutica, lo cual, de acuerdo con los autores, puede atribuirse a la necesidad de que las citocinas se expresen en forma permanente en el lecho de la herida una vez aplicado el sustituto.50 Al respecto, los autores también demostraron que la actividad metabólica, y no la capacidad proliferativa, es al parecer el suceso decisivo relacionado con la eficacia terapéutica.50 Los sustitutos cutáneos alogénicos aportan células que no persisten en el sitio receptor. Por ejemplo, el análisis de DNA de células donantes alogénicas en biopsias de heridas curadas después de la aplicación de un equivalente cutáneo (APLIGRAFR) demostró la persistencia durante un mes de las células alogénicas sólo en una minoría de pacientes con úlceras venosas y la desaparición completa de estas células a los dos meses de la aplicación del sustituto.51 Por lo tanto, en heridas crónicas el objetivo de la terapia con sustitutos cutáneos, el cual consistía en la obtención de una piel nueva en forma inmediata (teniendo en cuenta que el injerto debe prender), pretende ahora lograr una cobertura biológica temporal que acelere la regeneración de la piel y la curación de las heridas mediante la estimulación de las células cutáneas propias del lecho de la herida del receptor. La capacidad definir las causas específicas de los fracasos en la curación de las heridas puede contribuir al desarrollo de una combinación de la terapia celular y la terapia génica diseñada para brindar soluciones personalizadas para los distintos subgrupos de pacientes con heridas crónicas. En tanto que la variable especializada en la cicatrización de las heridas es la más estudiada, la calidad de la cicatrización y el manejo del dolor son variables que están adquiriendo una importancia mayor. Las terapias celulares para la curación de heridas reducirían

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Figura 12–3. Tratamiento de una úlcera crónica con piel alogénica rica en plasma desarrollada mediante la bioingeniería. A. Apariencia de una úlcera crónica dos semanas después del primer aloinjerto. Puede apreciarse de forma inteligible la reepitelización activa en los márgenes de la úlcera. B. Aplicación de piel alogénica obtenida por medio de la bioingeniería (cubierta de gasas). C. Aspecto de la úlcera cuatro semanas después del primer tratamiento. D. Fin del tratamiento seis semanas después del primer aloinjerto.

la contracción de la herida y el dolor (Meana y col.; resultados no publicados). La versión alogénica de los equivalentes cutáneos ricos en fibrina que contienen fibroblastos son usados como un medio eficaz para inducir y promover la curación a costa del paciente (figura 12–3). En la actualidad más de 100 pacientes son tratados de manera exitosa con este equivalente cutáneo con un alto índice de eficacia (Meana y col.; resultados no publicados).

TERAPIA CELULAR CONTRA TERAPIA GÉNICA PARA ENFERMEDADES HEREDITARIAS DE LA PIEL En la actualidad una amplia variedad de enfermedades hereditarias debilitantes para las cuales no existen terapias eficaces están relacionadas con la piel. Sin embargo, los especialistas en genética humana y en genómica identificaron los genes responsables de más de 80 enfermedades de la piel. Esto dirigió la atención hacia estrategias nuevas como la terapia génica cutánea.52 Recientemente se

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reportó el primer ensayo clínico exitoso para la epidermólisis bullosa juntural.53 Las correcciones permanentes implican la integración del transgen al genoma del paciente mediada por un vector. Hace poco tiempo los cuestionamientos relacionados con el peligro de la mutagénesis insercional aparecieron como resultado del desarrollo de cáncer en dos pacientes con inmunodeficiencia hereditaria, quienes se encontraban bajo tratamiento con terapia génica hematopoyética.54 Por lo tanto, aunque la terapia génica sigue siendo el estándar de oro para la corrección de enfermedades genéticas, ciertas estrategias terapéuticas alternativas, como la terapia celular, pueden resultar efectivas. Por ejemplo, la terapia celular puede ser efectiva para el tratamiento de la forma distrófica de la epidermólisis bullosa causada por la falta y la deficiencia en la producción de colágeno tipo VII por las células de la piel. El tratamiento quirúrgico estándar de los pacientes con epidermólisis bullosa distrófica conlleva por lo regular la mejoría de la seudosindactilia relacionada con la enfermedad, mediante autoinjertos de espesor dividido. Asimismo, las úlceras de la piel secundarias a la epidermólisis bullosa son tratadas como úlceras crónicas ordinarias con sustitutos cutáneos completamente alogénicos como el APLIGRAFR.5 Sin embargo, las estrategias de los autoinjertos y de los aloinjertos no ofrecen un remedio permanente para la epidermólisis bullosa distrófica; en el primer caso, porque las células autólogas reconstruyen con el paso del tiempo las lesiones, y en el segundo, porque las células alogénicas al final son rechazadas. Los especialistas desarrollaron una tercera estrategia basada en el injerto de un prototipo cutáneo rico en fibrina sintetizado mediante la ingeniería genética, el cual fue clasificado como piel quimérica debido a que está compuesto por queratinocitos autólogos y fibroblastos alogénicos. Esta estrategia se apoya en la baja y en la nula inmunogenicidad de los fibroblastos y en la capacidad de estas células de producir colágeno VII y, aunque en niveles menores que la fuente natural, los queratinocitos. Aún falta demostrar el efecto permanente de esta estrategia. Sin embargo, el sistema de piel quimérica obtenida por medio de la bioingeniería resultó útil en los ensayos preclínicos de la epidermólisis bullosa distrófica en ratones humanizados a nivel de la piel (del Río y col.; resultados no publicados). Genetrix, una empresa española dedicada a la biotecnología, solicitó y obtuvo la condición de fármaco huérfano, otorgada por la Agencia Europea para la Evaluación de Productos Medicinales, para la versión quimérica del equivalente cutáneo. En 2007 se llevó a cabo un ensayo clínico multicéntrico fase I–II con el fin de evaluar su eficacia. Asimismo, los estudios recientes realizados en ratones mostraron que los fibroblastos humanos inyectados por vía intravenosa tienen la capacidad de alojarse en heridas cutáneas, de liberar colágeno tipo VII y de favorecer la curación de heridas.55 Otra investigación reveló que la proteína purificada del colágeno tipo VII inyectada por vía intravenosa tiene un tropismo por las heridas, razón por la cual podría ser utilizada directamente como terapia proteica para la epidermólisis bullosa distrófica.

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(Capítulo 12)

DESAFÍOS Y CAMINOS FUTUROS Las pruebas abundantes demuestran que muchas de las terapias celulares para heridas ahora disponibles inducen y aceleran la reparación y la regeneración cutánea. No obstante, los avances tecnológicos pueden favorecer las aplicaciones de esta estrategia. Por ejemplo, técnicas más efectivas de preservación celular pueden prolongar el tiempo útil de almacenamiento y minimizar los problemas relacionados con el almacenamiento y el transporte. Por lo tanto, la criopreservación de equivalentes cutáneos en bicapa constituye aún un desafío importante. Algunos métodos revolucionarios, como el salado, pueden ser una alternativa al almacenamiento a temperatura ambiente y a la congelación.55,56 La importancia de la matriz dérmica radica en que brinda un molde y un sustituto dérmico para el anclaje de células mesenquimales con el fin de favorecer la regeneración tisular. Sin embargo, diferentes aspectos de la matriz dérmica no han sido estudiados de manera adecuada. Así, la durabilidad es escasa debido a la degradación y, al contrario, las dificultades en el remodelado de la matriz pueden limitar la eficacia de ciertas terapias celulares y sustitutos cutáneos. De acuerdo con lo demostrado por varios estudios, las matrices ricas en fibrina que contienen fibroblastos permiten el crecimiento de los queratinocitos y pueden ser remodeladas fácilmente, con lo cual se genera tejido dérmico rico en colágeno (humano) in vivo. Por lo tanto, estas matrices pueden ser usadas para el desarrollo de aloinjertos y de autoinjertos. Debido a los altos costos de producción, los productos de bioingeniería alogénicos en bicapa disponibles a la venta tienen un tamaño muy pequeño (de pocos centímetros cuadrados), por lo cual, sólo son adecuados para el tratamiento de heridas pequeñas. El uso de moldes más económicos, como la fibrina humana en vez del colágeno bovino, puede contribuir al desarrollo mediante la bioingeniería de mejores productos cutáneos alogénicos para cubrir superficies corporales mayores en forma transitoria. Esto, junto con la posibilidad de lograr la estratificación epidérmica antes del injerto, podría favorecer el desarrollo de productos por medio de la bioingeniería capaces de reemplazar a un costo razonable la piel cadavérica para la cobertura de quemaduras. Al respecto, los esfuerzos de las empresas por reducir aún más el costo de los sustitutos cutáneos celulares podrían cambiar el futuro de esta estrategia de manera impresionante, justificando su uso como terapia primaria y no como última opción cuando las otras estrategias fracasan, como ocurre habitualmente. Los especialistas que trabajan en el área de los reemplazos cutáneos coinciden en que el uso actual de los productos cutáneos obtenidos mediante la bioingeniería está subdesarrollado. Los desafíos respecto de la capacidad de la piel obtenida por medio de la bioingeniería de mejorar las condiciones cosméticas y estéticas aún persisten. Aunque en la actualidad se cuenta con tratamientos cosméticos mediante la bioingeniería cutánea para restaurar la pigmentación a través del injerto de melanocitos, como

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en los pacientes con vitíligo,58 los esfuerzos por generar piel humana con pelo mediante la ingeniería tisular están lejos de concretarse. La ingeniería tisular experimental con células CD34+ aisladas del bulge del folículo piloso de ratones en combinación con fibroblastos neonatales explotó las capacidades pluripotenciales de las células madre epidérmicas en cuanto a su capacidad de regenerar la epidermis interfolicular y los apéndices epidérmicos, como los folículos pilosos y las glándulas sebáceas. Es muy posible que estrategias similares con células humanas sean pronto una realidad con un gran potencial terapéutico y comercial. Una amplia y profunda comprensión del mecanismo terapéutico de los sustitutos cutáneos alogénicos obtenidos mediante la bioingeniería podría dar lugar a combinaciones ingeniosas con células genéticamente modificadas con el fin de lograr la sobreproducción de factores de crecimiento y citocinas. Al igual que muchas otras modalidades terapéuticas nuevas, la terapia celular cutánea y la bioingeniería cutánea sufrirán mejoras a medida que la ciencia básica y la ciencia aplicada continúen contribuyendo a este campo.

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(Capítulo 12)

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(Capítulo 12)

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13 Interferón gamma: aspectos básicos, importancia clínica y usos terapéuticos, con especial atención a la terapia génica

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Dulce Mata Espinosa, Rogelio Hernández Pando

El interferón gamma (IFNg) o interferón inmunitario tipo II es una proteína cuya actividad biológica fue identificada por sus propiedades antivirales in vitro. Esta molécula confiere a las células la capacidad de resistir a una infección viral interfiriendo con su replicación, de ahí su nombre.1 Sobre la base de su origen celular, los interferones tipo I, o clásicos, se dividen en dos tipos. El interferón alfa (IFNa) es una familia de 17 proteínas relacionadas entre sí, codificadas por distintos genes y sintetizadas por leucocitos. El interferón beta (IFNb) es una proteína codificada por un gen distinto y producida por fibroblastos. Los interferones tipo I son proteínas importantes en la inmunidad innata (son producidos en respuesta a la infección viral) y en el control de infecciones bacterianas. La única relación que guardan con el IFNg es su capacidad antiviral; por lo demás, los interferones tipo I no comparten los mismos receptores y tienen una estructura a nivel de proteína distinta a la del IFNg.2 El IFNg es producido por los linfocitos T CD4+ y CD8+, por las células Tg/d y por las células NK en respuesta a algún estímulo inmunitario o inflamatorio.1,3,4 Durante los últimos años se demostró que las células mieloides (células dendríticas, macrófagos y neutrófilos) también son capaces de producir IFNg a través de la estimulación con interleucina–12 (IL–12) y con interleucina–18 (IL–18).5 La autoactivación de las células mieloides por IFNg contribuye al control inicial de la infección.6 También se describió que el IFNg puede ser generado por células de origen no inmunitario como los fibroblastos y las células eritroides.2 La producción de IFNg es inducida por patógenos, por el entrecruzamiento de moléculas de superficie, por antígenos específicos, por la activación del receptor 187

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(Capítulo 13)

de células T y cuando se utilizan estimuladores de células T no específicos como la fitohemaglutinina, la concanavalina–A, los ésteres de forbol y los ionóforos. La creación de IFNg también se estimula mediante citocinas (IL–1, IL–2, IL–12, IL–18), factores de crecimiento y estrógenos.1,7 La expresión del gen del IFNg se inhibe por medio de los glucocorticoides, del TGFb de la IL–10 y del inmunosupresor ciclosporina–A a través del factor de transcripción NF–ATp.7,8 A lo largo de este capítulo son objeto de descripción los aspectos básicos más importantes del IFNg, sus características bioquímicas, su regulación genética y su participación en diversas enfermedades, además de su uso terapéutico, en particular la terapia génica con adenovirus que expresan IFNg como una nueva forma de inmunoterapia en enfermedades diversas, tanto en modelos experimentales como en pacientes.

ESTRUCTURA BIOQUÍMICA Y SÍNTESIS DEL IFNg El IFNg humano y el IFNg murino se encuentran codificados por una sola copia del gen constituido por cuatro exones y tres intrones; se localizan en el cromosoma 12 humano y en el cromosoma 10 murino. La homología de ambos a nivel de los nucleótidos es de 64% y en la región 3’ no traducida es de 68%. En cuanto a la secuencia de proteína, la homología presentada es de 40%, en contraste con la alta homología que ofrecen a nivel del cDNA. La baja homología del IFNg murino puede explicar su estricta especie–especificidad en comparación con la del IFNg humano, pues este último tiene una actividad viral sobre las células de ratones, conejos, bovinos y monos, en tanto que el IFNg murino sólo actúa sobre las células murinas.9 La forma biológicamente activa del IFNg es la de un homodímero estabilizado por fuerzas no covalentes, con subunidades de 143 a.a. (17.1 kDa) en el IFNg humano y de 133 a.a. (15.9 kDa) en el IFNg de ratón.9 El IFNa es sintetizado de manera inicial como una proteína precursora de 166 a.a. en los humanos y de 155 a.a. en los ratones, e incluye una secuencia señal de 23 y 22 a.a., respectivamente. El IFNg murino y el IFNg humano contienen dos secuencias potenciales de N–glucosilación en diferentes posiciones.9 Durante la biosíntesis del IFNg humano, los péptidos son N–glucosilados de manera variable; tres formas de IFNg que difieren en el grado de glucosilación fueron observadas por medio de un análisis electroforético de SDS–PAGE. El IFNg–I de 25 kDa contiene más carbohidratos que el IFNg–II de 20 kDa; asimismo, el IFNg–III de 15.5 kDa no contiene carbohidratos. Durante un estudio en el cual fueron tratados con una mezcla de glucosidasas se encontró que los interferones redujeron su tamaño: el IFNg–I se redujo a 18.5 " 0.5 kDa, el IFN-

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g–II, a 15.5 " 0.5 kDa, y el IFNg–III no se alteró. Aun sin la presencia de carbohidratos, la actividad antiviral se conservó.10 El punto isoeléctrico del IFNg murino es de 5.5 a 6 pH; la discrepancia entre este valor y el predicho por su naturaleza excesivamente básica se atribuye a que puede glucosilarse con ácido siálico. El IFNg murino y el IFNg el humano presentan una actividad antiviral y son sensibles al pH 2 y a la temperatura (65 _C por una hora).9 La estructura de cristal del IFNg humano confirma su naturaleza homodimérica y revela que las subunidades se sostienen en una configuración antiparalela. Cada monómero posee seis hélices a las cuales comprenden aproximadamente 62% de la estructura y no contiene hojas plegadas b. La estructura dimérica está estabilizada por el entrecruzamiento de las hélices a través de interacciones entre las subunidades. El N–terminal de cada cadena está yuxtapuesto al C–terminal de la cadena contraria mediante la intervención de los dominios helicoidales.11 El interferón puede existir relacionado con la matriz extracelular en la que ejerce un control juxtacrino. Los neutrófilos almacenan IFNg y en respuesta, liberan agentes degranulantes. Algunas poblaciones de macrófagos inducen la expresión constitutiva de IFNg reclutada en sitios de almacenaje intracelular.6

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CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS Y GENÉTICAS DEL RECEPTOR DE IFNg La actividad biológica del IFNg es mediada por un receptor específico, que se expresa en todos los tipos celulares con excepción de los eritrocitos maduros. Asimismo, este receptor es especie–específico en la capacidad de unión a su ligando,12,13 a diferencia de los receptores de los interferones tipo I. El receptor funcional del IFNg está constituido por dos proteínas de IFNgR1 (cadena de 90 kDa denominada cadena a, cadena de unión al ligando o CD119W) y dos proteínas de IFNgR2 (cadena de 60 kDa denominada cadena b, cadena de transducción de señales o factor accesorio 1) (figura 13–1).3,14 Los genes humanos y los genes murinos que codifican a los receptores IFNgR1 e IFNgR2 contienen siete exones y están localizados en el cromosoma 6 humano y el cromosoma 10 ratón, respectivamente, para el receptor IFNgR1; y en el cromosoma 21 humano y el cromosoma 16 ratón, respectivamente, para el receptor IFNgR2.1 La porción extracelular del IFNgR1 contiene el dominio de unión al ligando; la porción intracelular posee los dominios necesarios para la transducción de señales y el reciclamiento del receptor. Por su parte, la porción extracelular del IFNgR2 interacciona con el complejo IFNgR1/IFNg; la porción intracelular es necesaria para la transducción de señales.14

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Cadena b IFNgR2

(Capítulo 13)

Cadenas a IFNgR1 IFNgR2 Cadena b

JAK2

JAK2 JAK1

JAK1 IFNg

JAK1+JAK2 activados

Hormodímeros P de STAT1 P activados

P P P

P

P P P

P

P JAK1+JAK2 activados

P

P P P

P STAT1 Activación transcripcional de genes inducibles por IFNg

Figura 13–1. Mecanismo de señalización del receptor de IFNg. Tomada y modificada de las referencias 3 y14.

Los niveles de expresión de las dos cadenas que forman el receptor del IFNg difieren de modo significativo, pues la cadena a se expresa de forma constitutiva en niveles moderados a diferencia de la cadena b cuyo nivel de expresión es bajo y es regulado por estímulos externos. Por lo tanto, la cadena b es un factor decisivo en la capacidad de respuesta al IFNg en ciertas células.14 Después de que el receptor se une a su ligando, el complejo conformado por el ligando y el receptor se interna y entra en un compartimiento acidificado, donde el complejo se disocia y el IFNg liberado actúa sobre los genes blanco (ver “Transducción de señales posterior a la unión conformada por el ligando y el receptor”) y después es llevado a los lisosomas, donde es degradado. En los fibroblastos y en los macrófagos las cadenas a del receptor ingresan en una poza intracelular, en la cual se acumulan hasta que más tarde se reciclan a la superficie celular.15,16 La estructura cristalográfica del receptor revela que el dominio extracelular de unión al ligando de la cadena IFNgR1 está constituido por dos dominios tipo III

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de fibronectina (FBN–III). Estos dominios FBN–III están integrados por una estructura en sándwich formada por dos hojas plegadas b. La estructura del IFNgR2 es similar a la de la cadena IFNgR1.1,14 La estructura del complejo IFNg/IFNgR1 presenta la simetría de unión de dos IFNgR a un dímero de IFN, lo cual fue demostrado mediante un análisis de la estructura cristalográfica.17

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REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA DEL IFNg La transcripción del gen del IFNg es muy compleja y para facilitar su comprensión se dividió en dos niveles de regulación: la mutilación y la unión de los factores de transcripción y los represores. La hipometilación, o metilación, de un dinucleótido CpG en la región promotora proximal y en el primer intrón se correlaciona con la expresión endógena del gen del IFNg en células T humanas y murinas.18 Cuando la hipometilación ocurre en el elemento proximal, no se permite la unión de factores de transcripción a ella, razón por la cual no hay expresión del IFNg. Lo anterior ocurre en las células Th2.19 Los elementos que inducen a los factores de transcripción son de diferente índole. La IL–2 provoca la producción de NFkB, la IL–8 induce directamente la actividad del promotor de IFNg y la IL–12 requiere la coestimulación del aCD3/CD28. La IL–12 es necesaria para la expresión de IFNg mediante la unión de la AP1 y la STAT4 a sus sitios específicos en el promotor. Los mitógenos y la IL–18 inducen directamente AP1, y de manera positiva la expresión de IFNg.5 Los elementos que regulan de manera negativa la expresión del gen del IFNg son la ciclosporina A y los glucocorticoides; ambos tienen sitios específicos en el promotor sobre los cuales actúan directamente o por medio de factores de transcripción como el NF–AT.8 Hay descritos muchos sitios de unión de factores de transcripción en el promotor del IFNg y en diferentes elementos regulatorios, los cuales en conjunto controlan la expresión positiva y negativa del gen del IFNg (figura 13–2). La transcripción del gen del IFNg en células T es regulada in vivo a nivel de las interacciones entre el DNA y las proteínas inducibles y constitutivas. La transcripción basal se mantiene debido a la unión de varios factores de transcripción al promotor del IFNg.20 La región de –108 a –40 pares base a partir del sitio de inicio de la transcripción en el promotor del IFNg tiene la capacidad de conferir una activación específica.21 Dentro de esta región, los miembros del CREB/ATF, la AP1, los octámeros y los factores de transcripción de la familia GATA se unen a los elementos proximales (de –70 a –47) y a los distales (de –98 a –72).19 Los elementos distal y proximal y la caja TATA se conservan en los genes del IFNg de los humanos, de las

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(Capítulo 13)

NFkB NFAT –280 Y2 Y1 AP1 CD28RE NFAT E distal E proximal NFAT –786 a–776 –28D a–27D –218 –2D1 –196 a–189 –163 a–155 –100 –98 a–72 –7D a–47

NFAT

AP–2 like

AP–1

NFAT/AP–1

GATA/AP–1 ATF–2/AP1 NFAT

gg1 gg1

SP1

NFkB (p65, p50)

STAT1/4

Inicio de la transcripción de IFN

CREB/ATF–1 Oct–1 Elementos proximal y distal son los sitios de unión de miembros de CREB/ATF, AP1, octámeros y factores de transcripción de la familia GATA

Figura 13–2. Resumen de los sitios de unión regulatorios del promotor del IFNg. Tomada y modificada de las referencias 5, 19, 22 y 23.

ratas y de los ratones. Asimismo, existe una alta identidad en las secuencias del elemento distal del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM–CSF) y de las proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP–1a/b), y también del elemento proximal de la IL–2 humana. La región de –73 a –48 también es blanco del efecto inhibitorio de la ciclosporina A.21 Los elementos proximales y distales son necesarios para la expresión del IFNg en las células T de la memoria en ratones transgénicos.22 Las células T naive no producen IFNg a menos que sean activadas. La ciclosporina A puede inhibir las actividades transcripcionales de los elementos proximales y distales en las células T efectoras.23 El factor nuclear de células T activadas (NFAT) desempeña una función importante en la transcripción de varios genes de citocinas (TNFa, IL–3, IL–4, IL–5 y GM–CSF), algunas de las cuales son sensibles a los efectos inhibitorios de la ciclosporina.23 Sica y col.24 demostraron que las proteínas del NFAT y del NFkB pueden unirse en la posición de –278 a –268 del promotor, induciendo una máxima expresión del gen del IFNg. El NFATp se une a estos sitios y, junto con los factores transcripcionales inducibles por la calcineurina, potencian la expresión del IFNg. Las proteínas del NFAT se unen a sitios adicionales en el promotor del IFNg. Además de la posición –278, existe otro sitio de unión entre el NFAT y la AP1 localizado en la posición –160.23 En tanto, la inducción del gen del IFNg mediante el NFkB es mediada por la vía de los elementos en tándem IFN–gkb–C3–1P localizados en las posiciones de –786 a –776 y de –772 a –763.24

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Otro factor de transcripción es el c–Rel, el cual comparte la homología en la secuencia con el NFAT y el NFkB. Su sitio de unión está localizado en el primer intrón del gen del IFNg_humano en el que potencia la transcripción.24 El sitio de la AP1 en la posición de –196 a –183 contribuye a la expresión del IFNg inducida por mitógenos y por el tratamiento con la IL–18.5 El sitio de la AP1 y el sitio de unión a la STAT4 en la posición –238 desempeñan un papel positivo en la activación dependiente de IL–12 en células T CD4+ humanas primarias.5 El YY1 es un factor de transcripción de los denominados dedos de zinc debido a que une directamente al DNA. Este factor activa, reprime o inicia la transcripción dependiendo de la región donde se liga.25 Puede actuar como un represor de la transcripción basal del IFNg a través de la unión a dos sitios constitutivos localizados en Y1 de –199 a –203 y en Y2 de –217 a –221. Estos sitios desempeñan una función trascendente en la inhibición de la expresión del IFNg. En un primer mecanismo reprimen la actividad de la AP1 mediante el bloqueo de su interacción con el DNA (al sitio Y1) y en el segundo mecanismo activan el elemento silenciador por la unión del YY1 a la posición Y2, en cooperación con una proteína represora parecida a la AP2.25,26 En esplenocitos murinos primarios, el YY1 tiene un efecto contrario, pues en estas células comienza la expresión génica del gen del IFNg.23 La supresión de la transcripción del IFNg por mediación de los glucocorticoides utiliza una vía distinta. La inhibición específica por la dexametasona se localiza en dos sitios potenciadores CREB/AP1 localizados en la región promotora proximal.27

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TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES POSTERIOR A LA UNIÓN CONFORMADA POR EL LIGANDO Y EL RECEPTOR Como puede apreciarse en la figura 13–1, el ligando IFNg es un homodímero que se une a las dos cadenas del IFNgR1, facilitando la unión de las dos proteínas del IFNgR2 con el complejo IFNgR1/IFNg. Este suceso permite que los dominios intracelulares de los receptores se aproximen induciendo la asociación de las JAK cinasas (tirosinas cinasas de la familia de las cinasas Janus). La unión del ligando resulta en una transfosforilación de las JAK cinasas y en la subsecuente fosforilación de la tirosina 440 del IFNgR1. Por medio de su dominio SH2, una STAT1 reconoce y une cada sitio de tirosina fosforilada del IFNgR1 (444YDKPH444). El receptor IFNgR1 vinculado con la STAT1 se fosforila en tirosina y se activa. También se forman homodímeros de la STAT1, los cuales se translocan al núcleo, donde se unen a secuencias de activación del IFNg o a GAS (sitio de activación de IFNg) de genes inducibles de IFNg. El motivo intracelular (270LI271) es importante para dirigir al receptor a través de la célula, incluyendo el reciclamiento del mismo a la superficie celular.1,3,14

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Cuando no hay estímulo, los receptores IFNgR1 e IFNgR2 no se vinculan con fuerza; sin embargo, la cinasa Janus1 inactiva (JAK1) se une a la secuencia de cuatro aminoácidos (266LPKS269) del dominio intracelular del IFNgR1, en tanto que la JAK2 inactiva se agrega a una secuencia rica en prolinas (263PPSIPLQIEEYL274) en el dominio intracelular del IFNgR2.3,14 Una gran variedad de citocinas y de factores de crecimiento pueden activar la STAT1, pero ¿cuál es entonces la especificidad de la vía de señalización JAK– STAT? Para poder contestar esta pregunta, los animales deficientes del gen STAT1 sirvieron de gran ayuda,28,29 pues tienen una deficiencia en la capacidad de responder al IFNg y al IFNa. Las células derivadas de estos animales no iniciaron la transcripción de genes inducibles mediante interferón como el factor regulatorio de interferón–1 (IRF1), la proteína de unión a guanilato–1 (GBP1), el transactivador de la molécula del MHC clase II y la proteína del complemento C3. También estos animales son sensibles a la infección ocasionada por la Listeria monocytogenes y al virus de la estomatitis vesicular. En contraste, los animales deficientes de STAT1 presentan respuestas normales a la IL–6, la IL–10, el factor de crecimiento epidérmico y la hormona de crecimiento. Estos estudios revelaron la importancia de la STAT1 en los efectos biológicos mediados por el IFNg. Por lo tanto, su especificidad es dependiente de dos procesos, distintos en los aspectos temporal y espacial: el reclutamiento específico de STAT1 al receptor del IFNg activado en la membrana plasmática y la inducción específica en el núcleo de la transcripción de los genes activados mediante el IFNg por los dímeros de la STAT1 (Bach, 1997). Además del mecanismo descrito, el IFNg induce la transcripción por medio de otras vías, algunas de las cuales requieren la expresión de nuevas proteínas celulares. Por ejemplo, el IFNg induce la fosforilación de un residuo serina de la STAT1 por una o por más MAP cinasas, lo cual resulta en su activación. También puede señalizar los elementos ISRE (elemento de respuesta estimulado por interferón) mediante un factor de transcripción P48, un componente del ISGF3 y un miembro de la familia del IRF. La inducción de las moléculas del MHC–II se lleva a cabo por mediación del factor de transcripción CIITA.30 El IFNg induce la expresión del C–MYC y del C–JUN en ausencia de la STAT1.7 Los genes que codifican para las JAK, las STAT, los IRF, los SOCS (suppressors of cytokine signalling) y las fosfatasas de las STAT son regulados transcripcionalmente por el IFNg. Sin embargo, las vías de señalización pueden sobrelaparse, lo cual puede ocasionar un efecto sinérgico o antagónico.7 El factor SOCS1 inhibe el efecto biológico del IFNg, actuando mediante la vía JAK/STAT. El SOCS1 une a los cuatro miembros de la familia de las JAK al inhibir su actividad catalítica. La importancia de la acción reguladora del SOCS1 fue evidente en un estudio realizado en ratones knockout para SOCS1. Estos animales mueren entre la segunda y la tercera semana de edad a causa de necrosis del

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hígado, infiltración de macrófagos en varios órganos y múltiples anormalidades hematopoyéticas, incluyendo linfopenia. La muerte prematura de los animales se previno utilizando anticuerpos neutralizantes antiIFNg. La enfermedad se previno con la cruza de animales knockout para IFNg y para SOCS1.31

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ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DEL IFNg, SU PAPEL PATOFISIOLÓGICO El IFNg potencia la transcripción de varios genes involucrados en actividades inmunomoduladoras, antivirales y antiproliferativas (apoptosis).2 Sin embargo, como molécula inmunomoduladora el IFNg es muy pleiotrópico. Tiene la capacidad de aumentar la actividad citotóxica y fagocítica de los macrófagos. También induce la expresión de moléculas del MHC clase I y II en células dendríticas y en otras células presentadoras de antígeno, incrementa el desarrollo y la diferenciación de células T cooperadoras–1 (Th1), regula la respuesta humoral induciendo la producción de IgG2a y de IgG3 por medio de células B murinas, promueve la actividad citotóxica de los linfocitos T (CTL), de las células naturalmente citolíticas (NK) y de las células activadas por linfocinas (LAK), y también regula la producción de citocinas proinflamatorias.4,14,32 La protección inmunológica contra las bacterias y los parásitos intracelulares depende de la inmunidad mediada por las células. El IFNg se encarga de estimular células inmunitarias efectoras y, sobre todo, de activar macrófagos los cuales a su vez lisan o restringen el crecimiento de las células infectadas. Esta función es importante en la respuesta inmune contra las micobacterias. Así, un mecanismo en los ratones para eliminar la Mycobacterium tuberculosis es la producción de intermediarios reactivos del nitrógeno estimulada por el IFNg. Sin embargo, en los humanos los intermediarios reactivos del nitrógeno al parecer no desempeñan una función tan significativa.4 El IFNg se produce en grandes cantidades bajo ciertas circunstancias patológicas como un trauma, una inflamación crónica, una infección, un cáncer y la autoinmunidad. La producción de IFNg como resultado de la activación de la respuesta inmunitaria puede inhibir o potenciar la inflamación y causar daño tisular; sin embargo, cuando hay una producción masiva de IFNg (la cual es llamada síndrome de liberación citocínica aguda) se presentan manifestaciones sistémicas graves como sangrados generalizados y choque letal.31 El IFNg desempeña un papel dual debido a sus propiedades pro inflamatorias y antiinflamatorias. Se trata de una citocina que se produce en respuesta a la infección y forma parte importante de la inmunidad innata y adaptativa. El IFNg induce la sobreexpresión de citocinas proinflamatorias como la IL–12, la IL–15,

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el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), la proteína–10 inducida por IFNg (IP–10),33 el óxido nítrico sintasa inducible, la caspasa–1 y el gp91 phox. También induce la activación de los factores de transcripción proinflamatorios como el NFkB.34 El IFNg actúa incitando la expresión de genes dependiendo del tipo celular y de la presencia de otras citocinas que sinergizan (por ejemplo, el TNFa) o antagonizan (p. ej., la IL–4). El IFNg también actúa en sinergia con la IL–2 y la IL–1.4 Estas propiedades proinflamatorias contrastan con las funciones antiinflamatorias benéficas descritas en la artritis reumatoide y en la artritis estreptocócica.34 En una serie de estudios la aplicación de IFNg redujo la incidencia de la enfermedad en un modelo de rata de diabetes mellitus dependiente de insulina.35 Asimismo, el tratamiento profiláctico con esta citocina mejoró el curso de la nefritis lúpica en ratones MRL lpr/lpr.36 La IL–1 y la IL–18 son citocinas involucradas en enfermedades inflamatorias. El IFNg inhibe la producción de IL–1a al reducir los niveles de ARN mensajero en pacientes con artritis reumatoide, con lo cual se logra la supresión de la producción de IL–1a de los macrófagos del fluido sinovial. Otro mecanismo mediante el cual el IFNg ejerce una respuesta antiinflamatoria consiste en inducir la producción de antagonistas de citocinas, como la IL–18, y de receptores que compiten por las citocinas, como el IL–1Ra.34 Un mecanismo más por medio del cual el IFNg puede ejercer una actividad antiinflamatoria involucra la participación de células T reguladoras. Una expresión temprana y transitoria del IFNg estimulada por células T reguladoras evita el comienzo de una respuesta inmunitaria agresiva por intermedio de la inhibición de la activación y de la proliferación de células T al modular la función de las células presentadoras de antígeno. Una serie de resultados en pacientes demuestran que lo anterior puede estar ocurriendo.37 Asimismo, se cree que por mediación de las células T reguladoras el IFNg puede desempeñar una papel en la inducción y en el mantenimiento de la no respuesta a antígenos propios y no propios.38 Por último, otro mecanismo regulador de la respuesta inmunitaria mediado por el IFNg es la inducción de la apoptosis. Las células Th2 y T naive son sensibles al IFNg debido a que expresan ambas cadenas del receptor del IFNg, razón por la cual se provoca en ellas la apoptosis. Al contrario, la pérdida de la cadena IFNgR2 en las células Th1 hace a estas células resistentes al IFNg, con lo cual se induce su proliferación.38

INACTIVACIÓN GENÉTICA DE IFNg, IFNgR1 E IFNgR2 EN RATONES Y HUMANOS La importancia del IFNg y su receptor en la defensa contra bacterias extracelulares, bacterias intracelulares, parásitos y virus fue demostrada en ratones con inac-

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tivación genética inducida (knockout).3–14 Los ratones que carecen de IFNg y de IFNgR1 no desarrollan granulomas maduros y carecen de una inmunidad protectora ante infecciones causadas por Mycobacterium boris (Mycobacterium bovis)39,40 y por Mycobacterium tuberculosis cepa Erdman.41,42 Cuando se infectan con Mycobacterium avium, los ratones presentan una alta carga bacteriana en relación con los animales control. Tampoco son capaces de desarrollar una respuesta inmunitaria eficaz en contra de cepas atenuadas de Salmonella typhimurium, como lo hacen los humanos.43 En un estudio, los ratones IFNgR–/– pudieron montar una respuesta curativa a varios virus, con lo cual se indicó que el receptor no es el principal mediador de los efectos antivirales in vivo.3 La ausencia y las mutaciones en la cadena a del receptor del IFNg provocan que los tumores murinos trasplantados no respondan al IFNg. También, los animales inactivados en el gen de la cadena a tratados con un carcinógeno desarrollan tumores con más frecuencia que los animales control. Se han encontrado tumores humanos insensibles al IFNg, de los cuales algunos carecen de la expresión de la cadena a y otros no expresan ni JAK1 ni JAK2. Los experimentos de reconstitución en las células de estos tumores muestran que la respuesta al IFNg puede ser restaurada cuando se reemplaza la cadena a, la JAK1 o la JAK2 anormales.14 En ratones inactivados en IFNg e infectados con Klebsiella pneumoniae, el IFNg es fundamental para la resolución de la neumonía y para la aclaración de la infección pulmonar.44 También se sabe que los ratones deficientes en IFNg y en su receptor no incitan la IP10, lo cual sugiere que esta citocina es clave en la inducción de las quimiocinas necesarias para ocasionar la inflamación aguda del pulmón.33 Los ratones MLR/lpr/lpr deficientes en el receptor del IFNg se protegen de daño renal, con lo cual se demuestra que en estos animales el IFNg es una citocina esencial para el desarrollo de la nefritis.45,46 En los últimos años se identificaron y caracterizaron mutaciones en los receptores del IFNg en humanos, lo cual permitió confirmar la importancia de esta citocina en la defensa contra diferentes microorganismos.3 Las personas con mutaciones en los receptores del IFNgR147 y del IFNgR248 son más susceptibles a contraer enfermedades causadas por patógenos como micobacterias no tuberculosas (Mycobacterium bovis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium avium, y Mycobacterium chelonei, entre otras) y bacterias (como la Salmonella typhimurium). Sin embargo, rara vez se infectan con parásitos como el Toxoplasma gondii, la Legionella y la Listeria, y por agentes virales. Es muy probable que en estos pacientes el TNFa actúe como una citocina compensatoria, pues no se afectan sus niveles de expresión en presencia de la mutación del receptor.14,43 Al igual que los que tienen mutaciones en el receptor, los pacientes con autoanticuerpos contra el IFNg también son susceptibles a infecciones micobacterianas

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de baja virulencia.49 Kampmann y col. describieron la actividad funcional de los autoanticuerpos por medio de la inhibición de la producción de TNFa en presencia del suero de los pacientes. Asimismo, un estudio con microarreglos de DNAc mostró un bloqueo de los genes de respuesta al IFNg en presencia de un anticuerpo purificado de los pacientes y la inhibición de la expresión de HLA clase II, como consecuencia de la neutralización del IFNg con el suero de los enfermos.49 El IFNg ejerce un papel decisivo en la supervivencia tumoral en pacientes imunocompetentes. En varios estudios14 se mostró que algunos tumores humanos desarrollan mutaciones espontáneas en el sistema de señalización del IFNg; este proceso puede contribuir al éxito del establecimiento del tumor.

TERAPIA CON IFNg Y CON ANTIIFNg EN MODELOS ANIMALES El uso del IFNg como agente inmunomodulador y como agente apoptósico es exitoso en modelos experimentales de diferentes enfermedades (cuadro 13–1). Por otra parte, para contrarrestar los efectos adversos de esta citocina se implementaron estrategias que inhiben su actividad. En varios modelos experimentales de cáncer se utilizaron citocinas como terapia, con resultados efectivos en la regresión del tumor y sin efectos adversos.50 Nishida y col. reportaron el uso de un adenovirus que expresa el receptor del IFNg: el AdIFNgR. Este adenovirus incrementó la actividad biológica de la citocina y volvió más sensibles a las células tratadas con AdIFNgR in vitro. En estudios en ratones, cuando los adenovirus AdIFNgR fueron inyectados directamente en el tumor (el cual fue inducido mediante la inyección vía subcutánea de 1 x 106 células tumorales CT26), éste redujo su tamaño y se produjo una apoptosis en los animales tratados con AdIFNgR y con IFNg recombinante. Estos resultados se atribuyen a la inducción de la IP10, la cual es muy importante como factor antiangiogénico para la progresión del tumor.51 Una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer in vivo es el uso de adenovirus con capacidad de replicación condicionalmente (CRAd). Estos adenovirus (CNH30mIFNg) expresan de modo selectivo el transgen terapéutico (IFNg) en las células cancerosas, es decir, sólo se replican en la masa celular tumoral y no en las células normales, una especificidad que se debe al promotor que contienen. Este nuevo sistema presenta tres propiedades antitumorales: la oncólisis, la antiangiogénesis y la inducción de la respuesta inmunitaria.52 Asimismo, el tratamiento con IFNg tiene efectos supresores sobre las células Th2, disminuye la producción de IL–4 y de IL–5 e inhibe la síntesis de la IgE, logrando la reducción del infiltrado de eosinófilos en la encefalomielitis alérgica experimental y en un modelo murino de asma alérgica.53,54 También se demostró

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Cuadro 13–1. Efectos de la terapia con IFNg en modelos experimentales y en humanos Animal

Enfermedad Diabetes mellitus

Reduce la incidencia. No hay insulinitis ni desarrollo de la enfermedad

Ratones MRL36,45,46 lpr/lpr Ratones52

Glomerulonefritis autoinmune parecida al lupus eritematoso sistémico en humanos Tumores inducidos con células tumorales CT26 y Hepa1–6

Exacerbación de la enfermedad. Funciona como profiláctico pero no como terapéutico Regresión tumoral

In vitro57,58

Infecciones virales Hepatitis B y C

Eficaz para suprimir la replicación viral

Ratas60,61,64 Ratones con células T CD4+ disminuidas

Infecciones bacterianas Pseudomonas aeruginosa, Pneumocystis carinii, Legionella pneumophila

Aumenta la activación de los macrófagos alveolares y las defensas contra la Pseudo–monas aeruginosa. Reduce la intensidad de la infección causada por Pneumocystis carinii Mejora la resistencia a la infección causada por Legionella pneumophila en ratones knockout tratados con IFNg y disminuye la carga bacteriana Confiere resistencia a la infección aguda causada por Toxoplasma gondii, previene su proliferación en muchos órganos Aumenta la sobrevida y mejora el curso de la infección

Ratones knockout para IFNg

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Efecto

Ratas DP–BB

35

Ratones desnudos62,63

Infecciones parasitarias Mycoplasma pulmonis, Toxoplasma gondii

Ratones59

Infecciones micóticas Aspergillus fumigatus

Humanos68–70

Tuberculosis por cepas sensibles y resistentes a fármacos

Humanos71

Enfermedad pulmonar por micobacterias no tuberculosas

Mejoría de signos y síntomas cuando se trata a los pacientes con fármacos y con IFNg por medio de aerosol Curativa microbiológica y resolución clínica de la enfermedad

la capacidad que tiene el IFNg de suprimir el infiltrado pulmonar de eosinófilos por medio de la producción de IL–4 y de la disminución de la elaboración de leucotrienos.55 Un motivo de controversia entre la comunidad médica es el efecto del IFNg en la glomerulonefritis autoinmunitaria, una enfermedad espontánea en los ratones MRL–lpr/lpr parecida al lupus eritematoso sistémico en los humanos. Luego de una serie de investigaciones, se encontró que el IFNg funciona favorablemente como profiláctico pero no como agente terapéutico.36 En los ratones knockout que carecen del IFNg o del receptor, o que fueron tratados con anticuerpos monoclonales o con receptores solubles, se previene y se retarda el lupus murino, y la

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(Capítulo 13)

administración del IFNg acelera el desarrollo de la enfermedad.45,46 También se utilizaron de manera exitosa proteínas de fusión para neutralizar el IFNg. Constituidas por el receptor del IFNg y por segmentos del Fc (IFNg–R–IgG1Fc), estas proteínas tienen una vida media prolongada y una mayor avidez por el ligando. El IFNg también tiene un efecto paradójico en modelos murinos de diabetes. Se descubrió que la expresión de esta citocina en los islotes de Langerhans rompe la tolerancia a los antígenos de las células de los islotes e induce diabetes. Igualmente, la sobreexpresión del IFNg en los islotes inflamados produce insulinitas y la administración del receptor soluble proporciona protección.56 Por otra parte, los estudios señalaron que la administración de IFNg exógeno tiene efectos antidiabetogénicos.35 El IFNg desempeña un papel importante en la inducción de la tolerancia, por lo cual es necesario en trasplantes de órganos y de células, pues disminuye las poblaciones celulares T evitando el rechazo del injerto.56 En relación con las infecciones virales, Parvez y col. examinaron la eficacia del IFNg recombinante humano solo y con lamivudina en células en cultivo infectadas con un sistema recombinante de baculovirus. Los investigadores encontraron que el IFNg fue eficaz en suprimir la replicación viral al alterar la cinética de los intermediarios de la replicación del DNA. El tratamiento secuencial de la lamivudina y del IFNg durante seis días presentó una reducción en la formación de DNA circular cerrado covalentemente, con lo cual se logró acortar el tiempo del tratamiento. Es probable que el uso del IFNg sea una alternativa viable para los pacientes con hepatitis B crónica, para los enfermos no respondedores al IFNa y para los pacientes infectados con virus de la hepatitis B farmacorresistentes.57 En otro estudio con células de hepatoma se comparó la actividad antiviral del IFNa, del IFNb y del IFNg. Los tres interferones fueron capaces de suprimir la replicación del virus de la hepatitis C; asimismo, mediante un análisis de microarreglos, se encontró que inducen los genes que se requieren para eliminar el virus. El IFNg induce ocho genes que se expresan en máximos niveles a la sexta semana, lo cual concuerda con la disminución en la carga viral en comparación con el IFNa, que sólo induce uno. Esto indica que los genes estimulados por el IFNg tienen más relevancia funcional que los genes inducidos por el IFNa y el IFNb.58 Respecto a las infecciones micóticas, la respuesta inmunitaria de tipo Th1 y el IFNg son componentes esenciales para la defensa del hospedero contra ciertos hongos, como el Aspergillus. La administración por vía intranasal de 5 x 108 pfu de un adenovirus que expresa IFNg (AdIFNg) acrecentó cuatro veces los niveles de IFNg y de IL–12 dentro del pulmón. Igualmente disminuyó 75% la carga fúngica y aumentó la sobrevivencia de los animales, a diferencia del grupo control.59 La administración del IFNg también incrementó la resistencia del huésped a

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varios agentes bacterianos y parasitarios como la Pseudomonas aeruginosa,60 el Pneumocystis carinii,61 la Mycoplasma pulmonis,62 el Toxoplasma gondii63 y la Legionella pneumophila,64–66 entre otros. Los resultados obtenidos recientemente por los autores de este capítulo mostraron una significativa eficacia de los adenovirus recombinantes que expresan IFNg en el tratamiento de la tuberculosis progresiva experimental. La administración de una sola dosis por vía intratraqueal en animales con tuberculosis pulmonar progresiva disminuye de un modo significativo la carga bacilar en ratones infectados con micobacterias sensibles o resistentes a los antibióticos, como consecuencia de la restitución de la inmunidad Th1 protectora, con lo cual se evita el daño tisular (Mata y Hernández; manuscrito enviado a publicación).

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TERAPIA CON IFNg EN HUMANOS En concordancia con los resultados experimentales de los autores de este apartado, el IFNg tiene mucho éxito como tratamiento adyuvante en la quimioterapia de pacientes con tuberculosis sensible y resistente a fármacos (cuadro 13–1),67,68 pues los signos y los síntomas mejoran a partir del primer mes de administración, los cultivos y los frotis se vuelven negativos con la presencia de bacilos; y las lesiones observadas por medio de radiografías presentan notables mejorías.68,69 En general, el método a base de IFNg es seguro y bien tolerado. Después de un año de concluir el tratamiento con IFNg, la mayoría de las personas permanecen negativas en los estudios bacteriológicos, clínicos y radiológicos,70 aunque fue informado el caso de un paciente con una infección pulmonar progresiva causada por micobacterias no tuberculosas. La producción in vitro de IFNg en las células de sangre total con estímulo y sin él correspondió a una deficiencia del IFNg funcional. No hubo pruebas de mutación en los receptores de la IL–12 y de las citocinas IL–12 e IL–18. Los autores sugieren que el paciente tiene una anormalidad en el mecanismo de secreción o de transporte del IFNg, pues se detectaron niveles intracelulares normales o altos en las células estimuladas con PMA e ionomicina. Se les prescribió la administración de IFNg inhalados, tres veces a la semana (500 mg) durante tres meses. Al final, el tratamiento fue bien tolerado por el paciente y arrojó excelentes resultados clínicos.71 Varios estudios en pacientes con hepatitis crónica C trataron de determinar si el IFNg tiene un efecto antiviral. Aunque los resultados son aún objeto de controversia, al parecer el IFNg no reduce los niveles de RNA del virus de la hepatitis C en los pacientes infectados.72

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CONCLUSIONES En 1957 Issac y Lindenman descubrieron el interferón, una de las primeras citocinas descritas. Después de más de 50 años son vastos los conocimientos sobre su estructura bioquímica y sobre su codificación y regulación genética. Asimismo, se conocen diversas anormalidades genéticas y adquiridas en su síntesis y actividad, lo cual permite su uso como un agente terapéutico en modelos experimentales y en algunas enfermedades humanas. La terapia génica con la utilización de los adenovirus recombinantes que expresan estas citocinas puede ser una opción eficaz en el tratamiento de enfermedades infecciosas, como la tuberculosis resistente a múltiples fármacos, y en defectos innatos de la síntesis del IFNg o de sus receptores, con lo cual se contribuye al mejor control de esta enfermedad infecciosa y de otras, como las neoplásicas.

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(Capítulo 13)

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14 Presente y futuro de la regeneración del miocardio

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Daniel Ascencio González, Bernardo Nadal Guinard

El continuo aumento en la expectativa de vida y la disminución de las tasas de fecundidad incrementaron el proceso de envejecimiento poblacional en todo el mundo; estos eventos produjeron la inversión de las pirámides poblacionales y, como consecuencia, el sustancial aumento de las enfermedades crónicas degenerativas, las cuales alcanzan hoy dimensiones epidémicas. Las enfermedades cardiovasculares emergen como un problema de salud pública debido a la alta morbilidad y a la aún más elevada mortalidad, en la cual el primer lugar lo ocupa el infarto agudo del miocardio, cuyo tratamiento demanda grandes cantidades de recursos económicos y humanos que, en muchos de los casos proporcionan soluciones parcialmente satisfactorias. Se calcula que en EUA la tasa de mortalidad anual en los pacientes que sufren un infarto del miocardio es de 18% y que la cifra de quienes padecen insuficiencia cardiaca crónica como secuela rebasa los cinco millones de personas. Al menos 500 000 enfermos se suman cada año, lo cual representa alrededor de 30 000 millones de dólares para los diversos tratamientos, muchas veces paliativos, requeridos para su atención. Dentro de los primeros cinco años a partir de su inicio, la insuficiencia cardiaca crónica genera menos expectativas de solución que muchas otras enfermedades malignas.1,2 El progreso en los últimos 50 años respecto al tratamiento de las enfermedades cardiovasculares es importante; se logró tratar la enfermedad isquémica del corazón, la cual en su etapa aguda no tenía solución. Por medio de la estabilización del miocardio se consigue facilitar la eyección ventricular con la ayuda de procedimientos como la trombólisis y la revascularización, evitando parcialmente el 207

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(Capítulo 14)

daño a los cardiomiocitos y a la vasculatura de la zona isquémica; sin embargo, esto sólo es posible en menos de la mitad de los pacientes con infarto agudo del miocardio. Aun con estos procedimientos, el número de pacientes que logran la repermeabilización arterial y la óptima reperfusión del miocardio es muy bajo; con frecuencia, una insuficiencia cardiaca crónica queda como secuela. La remodelación ventricular posterior al infarto ocurre en una cantidad importante de pacientes; sin embargo, una falla cardiaca puede presentarse si no se alcanza la reperfusión del epicardio y se reestablece un proceso microangiogénico que permita la viabilidad del miocardio.3

DAÑO AL MIOCARDIO El evento que sigue al infarto agudo del miocardio es el proceso de remodelación de la pared ventricular, cuyo daño se establece a nivel celular y molecular. Comienza con la formación de tejido de granulación y con la expansión del área infartada. De modo inevitable, la dilatación de la luz del ventrículo izquierdo da inicio, la zona necrótica de cardiomiocitos es sustituida por tejido cicatrizal fibroso, el cual es incapaz de contraerse y funcionar, y las células restantes se hipertrofian. Otro fenómeno que ocurre durante el proceso es la hiperplasia de los cardiomiocitos a partir de células precursoras cardiacas. En las personas adultas, los cardiomiocitos que concluyen su ciclo celular no tienen la capacidad de regenerarse, por lo tanto, una vez establecida la lesión, ésta es irreversible. A estos sucesos se suma el daño de la microvasculatura del miocardio, lo cual produce una falla cardiaca originada por el remodelado ventricular que sigue al infarto; si no se restablece la reperfusión del epicardio y el proceso de formación microangiogénico de manera adecuada, la viabilidad cardiaca se compromete. Una vez establecida la lesión ocurre una disminución importante en el número de células miocárdicas contráctiles funcionales, lo cual se traduce en la incapacidad funcional ventricular a la que se suma la insuficiencia de la circulación coronaria. El número de pacientes que logran una repermeabilización y una reperfusión arterial óptima del miocardio es muy bajo.4 En muchos casos, la insuficiencia cardiaca avanzada requiere un tratamiento efectivo para el restablecimiento de la función cardiaca, lo cual hace que la persona lleve una vida aceptable. Para mejorar el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes, la única solución real es el trasplante cardiaco. Sin embargo, la discrepancia entre donantes y receptores, la insuficiente donación de órganos, la dificultad para almacenar órganos, las complicaciones propias del trasplante (la inmunosupresión, entre otras), los altos costos económicos y psicológicos, y la

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implementación en los hospitales de la complicada logística, lo hacen un procedimiento difícil de realizar de forma rutinaria. Por lo tanto, el grupo de pacientes en quienes puede realizarse el trasplante es muy limitado.5 Una solución parcial en los enfermos a los que es imposible realizar el trasplante es la asistencia ventricular definitiva (corazón artificial); sin embargo, las personas capaces de costear esta terapéutica son también muy pocas.

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Hipertrofia celular, hiperplasia, crecimiento celular y apoptosis La hipertrofia consiste en el aumento de la dimensión de las células; empieza durante el proceso de desarrollo y es responsable de la mayor parte del crecimiento normal del corazón. En los humanos ocurre de manera fisiológica a causa del ejercicio y como respuesta a la hipertensión arterial leve; la descompensación puede originar insuficiencia cardiaca.6 La hipertrofia es un mecanismo inevitable y necesario que aumenta la capacidad contráctil del corazón y el número de sarcómeros de las células cardiacas; el estiramiento mecánico de la pared desencadena la expresión de genes capaces de responder rápidamente, en tanto que los protooncogenes producen un cambio cualitativo en la expresión génica de la célula, cuyos productos son factores de transcripción, los cuales a su vez estimulan a los genes de la contracción. Estos eventos en conjunto conducen al crecimiento celular y a la hipertrofia cardiaca.7 La hiperplasia consiste en la producción de cardiomiocitos nuevos. La combinación de hipertrofia e hiperplasia responde a estímulos que inducen al crecimiento celular, imprescindible para satisfacer las demandas funcionales del corazón. El estímulo mecánico sobre la pared celular aumenta y la contractilidad disminuye, y se produce una alteración en el metabolismo del calcio, lo cual da lugar a la muerte celular.8 Diferentes estímulos afectan a las células cardiacas, desencadenan la cascada de eventos bioquímicos de la hipertrofia e inducen la apoptosis; sin embargo, durante el desarrollo fisiológico del corazón (desde el nacimiento hasta la edad adulta) ocurren varios estímulos que permiten mantener un equilibrio entre la inducción del proceso de crecimiento de los cardiomiocitos y la apoptosis. Estudios realizados en corazones de ratas revelaron la forma en que la apoptosis afecta a los cardiomiocitos, a las células endoteliales y a los fibroblastos, y el modo en que aumenta de forma progresiva con el envejecimiento y se incrementa con la hipertrofia. En otros estudios experimentales en ratas se observó que la muerte celular aumenta de manera sustancial cuando se induce diabetes e hipertensión.9 Distintos modelos animales proporcionan pruebas contundentes de la mortalidad celular y del número total de células que forman la masa ventricular, lo cual sustenta la hipótesis de la existencia de un recambio activo de los cardiomiocitos.

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(Capítulo 14)

En las ratas, el número total de miocitos de ambos ventrículos sufre una disminución a lo largo de la vida adulta de los roedores y un leve aumento durante el envejecimiento; por lo tanto, sin un recambio celular, los animales no sobrepasarían su corto periodo de vida sin perder la mayor parte de la masa de músculo cardiaco. En los ratones, la cifra total de cardiomiocitos por cada ventrículo equivale a 10.5 millones, de las cuales se pierden diariamente alrededor de 0.026 millones de células miocárdicas, cifra que representa 33% de la pérdida celular durante cuatro meses. En los ratones seniles, el número total de cardiomiocitos es de 7.1 millones por ventrículo, con una pérdida diaria de 0.27 millones, lo cual es igual a 420% de la pérdida celular a lo largo de cuatro meses. Estos datos aportan pruebas decisivas del alto grado de regeneración celular y, por lo tanto, del reemplazo de células muertas. Con todos estos conocimientos se puede concluir que el manejo bioquímico experimental conduce a la hipertrofia de la membrana celular, del citoplasma y del núcleo, y que la reproducción de una respuesta fisiopatológica es posible; al contrario, la inhibición de los factores involucrados puede revertir la hipertrofia. En modelos experimentales se logró la reducción del tamaño del corazón y la desaparición de la fibrosis, por lo tanto, con el uso de un tratamiento farmacológico adecuado, un corazón hipertrófico puede ser indistinguible de un corazón normal. Estos datos modifican de manera definitiva la idea de que el corazón es un órgano sin capacidad regenerativa.10,11 Por otra parte, también se estudiaron los factores que participan en el bloqueo de la división celular. El responsable del proceso es un antioncogén, una molécula que al interactuar con los factores de transcripción específicos detiene el ciclo celular; este factor es conocido como la proteína del retinoblastoma. Al contrario, cuando la molécula se activa, la división celular continúa.12 En ratones modificados genéticamente (knockout), a los cuales se les eliminó el gen de la proteína, se pudo obtener cardiomiocitos en cultivo, en división activa y con la capacidad de mantener su actividad contráctil. Por otra parte, para entender el proceso del reemplazo del número de células que mueren y del recambio celular, se realizaron experimentos en fetos de ratones de 17 días, momento en el que el corazón ya está diferenciado y las células conservan la capacidad de división activa. El análisis de las proteínas que se expresan en esta etapa de desarrollo demostró que durante este periodo la proteína del retinoblastoma aún no se expresa; al contrario, la proteína p107 se expresa, lo cual indica que está implicada en la diferenciación celular. Estas proteínas invierten su relación después del nacimiento y se mantienen a lo largo de la vida. Sobre la base de lo anterior se planteó la hipótesis de que en el corazón adulto persiste un número residual de células que conservan las características fetales, relacionadas con su patrón de expresión proteica. Los resultados permiten concluir que en los animales jóvenes alrededor de 4% de los miocitos adultos están en proceso de división, en tanto que en los animales adultos 16% de los miocitos se encuentran en este proceso. De acuerdo con

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las investigaciones, dentro de un periodo de 4 a 6 meses, una tercera parte de los miocitos cardiacos son reemplazados, lo cual indica que en un lapso de 2 a 3 años el corazón completo es capaz de regenerarse; por esta razón, se concluye que el corazón tiene una capacidad ilimitada de regeneración.13 En resumen, la falla cardiaca tiene una vía final común en la enfermedad cardiovascular, ocasionada fundamentalmente por el proceso de sobrecarga, la hipertensión, la enfermedad isquémica, el infarto y las cardiomiopatías adquiridas. De acuerdo con los nuevos conocimientos relacionados con los eventos celulares y moleculares implicados en la hipertrofia cardiaca, las señales involucradas en la inflamación, como la acción que ejerce el factor de necrosis tumoral alfa, la interleucina–6 y el estrés oxidativo, participan de manera primordial al modificar la vía reguladora de la transcripción, así como en la adaptación y en la mala adaptación que da lugar a la falla cardiaca. También participan los mecanismos paracrinos, como la acción del factor del crecimiento del endotelio vascular, y las señales intracelulares, como las de la interleucina–6 y de la glicoproteína 130, y la señal transductora y activadora del transcriptor–3.14

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Células madre embrionarias El estudio y el uso potencial de las células madre adultas humanas no generan por ahora ninguna controversia. En contraste, la posible aplicación clínica de las células madre embrionarias humanas es motivo de discusión. Desde 1981 las células embrionarias de los ratones se aíslan y se cultivan. Son consideradas células pluripotentes15 y su análisis permitió establecer las bases de la biología de las células madre. Sin embargo, a pesar de los múltiples estudios experimentales con células madre embrionarias no hay reportes de la curación de enfermedades crónicas en los ratones.16 El estudio y la aplicación clínica, a corto y mediano plazos, de ambas clases de células madre en las esferas social, política y científica generan discrepancia. Esto no significa que las células madre embrionarias, humanas y de animales experimentales no tengan un valor y un potencial extraordinario. Es evidente que las células madre embrionarias humanas son insustituibles para el estudio de los mecanismos genéticos reguladores del desarrollo humano normal y patológico, y que estos mecanismos pueden ser modificados por el medio en el cual sean colocados. Las células madre embrionarias humanas representan el único método para el análisis del mecanismo de acción y de los efectos secundarios de algunos fármacos. Sin embargo, su potencial como agentes terapéuticos, si es que lo tienen, pertenece a un futuro todavía lejano. Por otro lado, el uso terapéutico de las células madre adultas es una constante en la mayoría de los centros médicos y su importancia clínica aumentará de forma descomunal en los próximos años.16

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(Capítulo 14)

Estado actual de las células madre adultas El estudio de la biología celular y molecular de las células del cuerpo humano, mesenquimatosas y parenquimatosas, señala que éstas se encuentran en un proceso continuo de autorrenovación, es decir, dentro de un ciclo incesante normal de nacimiento, desarrollo y muerte. Gracias a este proceso es posible mantener una masa celular estable y constante. La capacidad singular de regeneración de las células parenquimatosas es parte fundamental de la homeostasis de todos los órganos y los tejidos; por medio de esta capacidad se descubrió la existencia de células madre en cada órgano y tejido adulto.16 Durante mucho tiempo se creyó que el corazón era un órgano posmitótico; es decir, que carecía de la capacidad intrínseca de autorrenovación celular y, por lo tanto, no tenía un proceso definido de homeostasis celular. Este concepto se apoyaba en la idea de que la totalidad de los cardiomiocitos se formaban únicamente durante la vida fetal, a lo más en el periodo posnatal inmediato. Se creía que durante la vida adulta su diferenciación terminaba y que las células cardiacas no tenían la capacidad intrínseca de incorporarse de nuevo al ciclo celular, por lo tanto, el órgano envejecía junto con todo el cuerpo. Asimismo, se afirmaba que las células parenquimatosas del corazón carecían de una capacidad regenerativa debido a la ausencia de células madre con la aptitud de inducir la producción de cardiomiocitos nuevos.17 Sin embargo, los estudios recientes acerca de las células madre en el miocardio modificaron esta idea; la ciencia demostró la presencia de células madre residentes en el miocardio a las cuales se les atribuye una capacidad regenerativa.

Conceptos actuales de la biología celular Los hallazgos recientes acerca de la homeostasis celular pudieron establecer que el músculo cardiaco tiene una alta potencia regenerativa a causa de la cantidad de células madre mesenquimatosas que residen en el corazón y en otros órganos y tejidos. En condiciones normales, las células tienen la capacidad de reaccionar a diversos estímulos fisiológicos y patológicos.18 La capacidad de regeneración del corazón adulto reside en las células distribuidas en las aurículas y en los ventrículos. Estas células permiten mantener el fenotipo, la conducta y el potencial de regeneración de las células madre cardiacas. Las características particulares de estas células son la posibilidad de ser clonadas y la capacidad de autorrenovación y expansión ilimitada. Por otra parte, estas células pueden dar origen a distintas células como miocitos, células endoteliales y células musculares lisas vasculares, razón por la cual son consideradas células multipotentes.19 En el miocardio de una persona adulta, la mayoría de las

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células madre cardiacas se encuentran inactivas y fuera del ciclo celular, únicamente de 2 a 3% de estas células están en proceso de replicación y diferenciación. La función específica de las células madre cardiacas consiste en el reemplazo de los cardiomiocitos y de las células vasculares dañadas a causa del desgaste normal. Existe en promedio una célula madre cardiaca por cada 1 x 103 miocitos (esta concentración es prácticamente igual a la de las células madre hematopoyéticas de la médula ósea).20 La inyección de una célula al borde de un infarto es capaz de regenerar el miocardio dañado en un infarto masivo. Alrededor de 95% de las células madre cardiacas se activan rápidamente, se multiplican y se diferencian en miocitos y células vasculares. La activación de las células madre cardiacas se presenta como respuesta al estrés fisiológico o patológico (hipoxia, ejercicio, sobrecarga de trabajo y daño celular). Por otra parte, esta activación permite la reparación extensa y difusa de microlesiones del miocardio dañado. Sin embargo, en el infarto del miocardio la activación no es posible, por lo cual, es evidente la existencia de una población de cardiomiocitos en proceso de replicación celular en el miocardio adulto.16 La homeostasis cardiaca mantiene la capacidad de respuesta a diversos estímulos fisiológicos y patológicos y permite, por medio del proceso de replicación celular, la regeneración continua de miocitos y células de la vasculatura. En teoría, en vez de dar lugar a un proceso de regeneración de células del miocardio contráctil, el contenido de células con capacidad regenerativa del miocardio no evoluciona a una cicatriz después de un infarto del miocardio. Sin embargo, no debe olvidarse que la obstrucción de una arteria principal de cualquier órgano, sin importar la cantidad de células madre que tenga, evoluciona de manera natural hacia una cicatriz en vez de experimentar un proceso de regeneración. Gracias a estos conceptos puede afirmarse que el corazón tiene una capacidad regenerativa por medio de las células madre cardiacas, a las cuales es posible aislar y expandir in vitro y estimular in vivo. Asimismo, será posible investigar la forma de inducir la regeneración con células autólogas del miocardio sin la necesidad de un trasplante celular.21

Inducción de la formación de cardiomiocitos La idea de inducir el proceso de regeneración del músculo cardiaco con células madre como una opción terapéutica al trasplante homólogo surgió en la última década del siglo XX. Los primeros estudios experimentales fueron realizados en ratones a los cuales se les practicó la ablación de la médula ósea y se les realizó un trasplante de células de la médula ósea, marcadas enzimáticamente, de animales transgénicos. En los animales trasplantados se observaron fibras musculares en todos los músculos esqueléticos; las células procedían del donador.22

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Otras investigaciones probaron la existencia de un tipo celular de médula ósea primitivo con la capacidad de diferenciarse en cualquier célula, la llamada célula madre. Esta potencia de transformación fue demostrada en casi todos los tejidos de embrión de pollo (corazón, células nerviosas, hígado, bazo y músculo esquelético, entre otros). Las células proceden de un tipo celular único: las células madre.16 Además de formar células sanguíneas, las células de la médula ósea tienen la capacidad de desarrollarse, de diferenciarse y de formar prácticamente todas las células del organismo. Estudios en los cuales se introdujeron células madre de animales consanguíneos a animales que sufrieron un infarto del miocardio demostraron que el miocardio puede regenerarse a partir de células madre. Las células fueron introducidas al borde de la necrosis y se observó en la continuidad con el tejido normal la regeneración de cardiomiocitos y de células endoteliales. En un transcurso de dos semanas la zona necrótica había sido reemplazada. Los resultados reportados fueron verificados mediante estudios morfológicos. Asimismo, desde el punto de vista funcional, se obtuvo la mejoría de la función ventricular.23 Los estudios posteriores estandarizaron el procedimiento para aislar células madre de la médula ósea y demostraron la presencia de células madre cardiacas procedentes del miocardio. Estas células se pueden cultivar e identificar mediante la presencia de fosfatasa alcalina y la expresión de receptores específicos de la membrana.10 El cultivo de un número importante de células madre es posible; sin embargo, es difícil mantener las células en un estado completamente indiferenciado. Cuando son inyectadas estas células, al igual que las células madre de la médula ósea, se desarrollan y se incorporan al corazón trasplantado, razón por la cual no es posible distinguirlas de las células originales. Por su parte, la tasa de división celular alcanza valores muy similares.24 En el corazón normal la célula madre cardiaca es multipotente, se encuentra en estado de latencia y puede entrar en una fase de división rápida cuando se estimula con factores de crecimiento. Actualmente las aplicaciones clínicas están en fase de investigación, pero la posibilidad de regenerar el tejido necrótico y los vasos coronarios ya se demostró. La diferenciación hacia un tipo celular u otro está directamente relacionada con la localización histológica.10 En virtud de los resultados de los estudios experimentales se puede concluir que el miocardio es un tejido dinámico sometido a un proceso continuo de crecimiento, renovación y muerte celular. Es posible obtener células totipotenciales de la sangre, del corazón y de otros tejidos, lo cual representa una nueva alternativa terapéutica potencial para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, en particular en los casos irreversibles y en los múltiples casos de cardiopatía isquémica, debido a que se logra el reemplazo del tejido necrótico miocárdico y vascular.

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REGENERACIÓN MIOCÁRDICA El tratamiento de diversas patologías, como la insuficiencia cardiaca, la hipertrofia y la cardiopatía isquémica, será posible si se logra inducir el desarrollo de cardiomiocitos funcionales, lo cual representa una solución a estas enfermedades que implican un problema de proporciones epidémicas.25 Hasta hace poco tiempo prevalecía la idea de que las células cardiacas no conservaban la capacidad de entrar en el ciclo celular y, por lo tanto, de dividirse. Se creía que durante el desarrollo embrionario los cardiomiocitos iniciaban un proceso de diferenciación mientras que en el citoplasma aparecían miofibrillas contráctiles. Las células mantenían su estado de diferenciación a lo largo de la vida fetal y conservaban la capacidad de dividirse únicamente hasta tres o cuatro meses después del nacimiento. A partir de ese instante el corazón alcanzaba el número máximo de cardiomiocitos y las células perdidas no tenían ninguna posibilidad de ser reemplazadas, con lo que ocurría una pérdida celular gradual hasta la muerte. Este esquema es válido para las células miocárdicas y para las células del sistema nervioso central, pero no para el resto de las células del organismo, las cuales conservan su capacidad de dividirse aun después de alcanzar el estado de diferenciación.17 Los estudios recientes ofrecen pruebas contundentes de la convivencia de las células progenitoras exógenas y las células progenitoras endógenas. Ambas poseen la singular capacidad de mantener la homeostasis cardiaca y de inducir la regeneración del miocardio después de una lesión. Este nuevo concepto biológico establece que el corazón de los mamíferos conserva la capacidad inherente de reemplazar los cardiomicitos dañados o muertos por medio de la activación de un grupo de células primitivas residentes y mediante la administración de células madre hematopoyéticas.25 Entre los investigadores que apoyan esta idea hay quienes sustentan que los cardiomiocitos se generan a partir de un precursor celular que se divide y da lugar a un grupo celular del mismo linaje. Estos conocimientos cambian los conceptos que se tenían sobre el comportamiento de las células cardiacas.26 La homeostasis cardiaca es regulada por un apartado celular caracterizado por células madre cardiacas multipotentes con la capacidad de adquirir linajes celulares diferentes a los del miocardio. De manera similar, las células madre de la médula ósea tienen el potencial de diferenciarse en células más allá de su propio tejido y de crear cardiomiocitos y vasos coronarios. El desarrollo de este proceso es conocido como plasticidad y transdiferenciación. En la actualidad, estas propiedades de las células madre de la médula ósea y de las células madre cardiacas son empleadas para reconstituir el miocardio muerto después de un infarto. La utilización de esta clase de células promete ayudar en el tratamiento de la lesión cardiaca en los humanos.27

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Así, es evidente que la formación de los miocitos continúa a lo largo de la vida posnatal, tanto en la vida adulta como en la senectud, lo cual evidencia la existencia de una reserva celular en el corazón que permite el reemplazo de células parenquimatosas. Esta característica de reciente descubrimiento tiene implicaciones importantes en la homeostasis, en el envejecimiento y en la regeneración cardiaca.28 Los resultados demuestran que en un periodo de 4 a 6 meses se puede reemplazar aproximadamente un tercio de las células cardiacas, lo cual revela que en el transcurso de dos o tres años el corazón puede regenerarse por completo. Por esta razón, se cree que los cardiomiocitos de una persona de entre 50 y 60 años de edad no tienen más de cuatro a cinco años de edad, lo que hace parecer al corazón un órgano con una capacidad ilimitada para regenerarse.10

REGENERACIÓN DEL MIOCARDIO MEDIANTE TRASPLANTE CELULAR Desde la primera vez que se llevó a cabo en 1956, el trasplante de médula ósea representó uno de los éxitos médicos del siglo XX.29 A partir de entonces, el trasplante celular se utiliza para el tratamiento de varias enfermedades, con lo cual se benefician muchos enfermos. Actualmente los procedimientos para el trasplante de médula ósea autóloga y homóloga son rutinarios.30 Sin embargo, debido a la falta de conocimientos sólidos acerca de la homeostasis celular de los tejidos y los órganos adultos, el procedimiento en el terreno de la regeneración del miocardio es limitado. Años atrás se creía que el fenómeno de autorregeneración era un privilegio de pocos tejidos, como la piel, la médula ósea y el epitelio intestinal. Se tenía la idea de que la mayoría de los tejidos y de los órganos podían sufrir un proceso de renovación lento y que después del nacimiento una gran parte de los tejidos no poseían células con la capacidad de regeneración propia del parénquima del tejido. Esta aptitud estaba circunscrita a la pared endotelial vascular en tanto que otros tejidos y órganos no tenían ninguna capacidad de renovación, como el corazón y el sistema nervioso central. Se había aceptado que en la mayoría de los órganos, el número y la función de las células parenquimatosas sufrían una disminución progresiva y continua desde el nacimiento hasta la muerte. Por esta razón, todas las terapéuticas fueron dirigidas a intentar restituir la deficiencia numérica de las células parenquimatosas funcionales de cualquier otro órgano. Estas estrategias eran paliativas y estaban orientadas a mejorar la función de las células sobrevivientes en el órgano. La posibilidad de regresar a un órgano y un tejido a su condición inicial implicaba el trasplante de células idénticas donadas por otro individuo o el trasplante de células que

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tuvieran la capacidad de diferenciarse en un tipo celular idéntico al que tenían que sustituir.15 Debido a que se consideraba que no existían las células para la mayoría de los tejidos, se creó el trasplante homólogo, el cual es ahora practicado por muchas especialidades. Así, las células madre embrionarias multipotentes surgieron como una posible fuente inagotable de células capaces de formar células y órganos, aunque su uso terapéutico continúa siendo motivo de controversia. En vista de la confusión generada por la idea errónea de considerar al miocardio como un tejido sin capacidad regenerativa, se comenzaron diversos estudios con el fin de buscar células que tuvieran la capacidad de diferenciación y que pudieran funcionar como cardiomiocitos. Las células que se estudiaron fueron los mioblastos esqueléticos,31 los cardiomiocitos fetales32 y los miocitos derivados de las células embrionarias, los cuales fueron trasplantados en animales de experimentación, en particular ratas.33 Las investigaciones no mostraron resultados concluyentes. Simultáneamente surgieron estudios relacionados con la multipotencialidad de la médula ósea34 para generar células diferentes a las sanguíneas. En el ser humano se demostró la presencia de células radicadas en el corazón con la capacidad de producir miocitos; en la circulación, estas células pueden sufrir una diferenciación hacia la línea celular miogénica y hacia células vasculares.35 Sobre la base de estos resultados, se trató de comprobar en los ratones que las células de la médula ósea enriquecidas con células hematopoyéticas tienen la capacidad de restaurar los miocitos perdidos durante un infarto36 y de mejorar la función ventricular.37 Estos hallazgos causaron grandes expectativas en la regeneración del miocardio;38 sin embargo, los trabajos reportaron resultados parciales e incompletos y no justificaron el comienzo de ensayos clínicos. La revisión de los trabajos experimentales en roedores indicó la producción de la regeneración funcional del miocardio por medio de células de la médula ósea y la capacidad de otras células adultas para regenerar el corazón, pero no explicó los mecanismos de diferenciación de las células trasplantadas. Por su parte, Nadal propuso determinar si los métodos en la regeneración del miocardio del ratón podían ser aplicados de modo directo a un organismo mil veces más grande, como el humano, independientemente de que el proceso biológico fuera similar o idéntico. Señaló que el miocardio del ventrículo del ratón tiene un grosor de aproximadamente 1 mm y un peso de alrededor de 70 mg, por lo tanto, para poder regenerar un infarto que destruye 30% de la masa ventricular se requieren 20 mg de miocardio en una capa muscular delgada. El ventrículo izquierdo de la mayoría de los pacientes que sufren un infarto del miocardio pesa cerca de 500 g y tiene un cuerpo mayor de 1 cm. Para regenerar 30% del ventrículo es necesario formar una pared muscular gruesa de 150 g con muchas arterias, arteriolas y capilares. El corazón humano es 7 000 veces mayor en comparación con el del ratón y su proceso de regeneración es más complejo. Para poder comenzar los ensayos clínicos, aún deben resolverse muchas incógnitas acerca de la

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terapia celular con células de la médula ósea, por medio del trasplante y de la movilización con citocinas. Por otra parte, se debe analizar comparativamente la regeneración cardiaca entre los ratones y los humanos en aspectos como la arquitectura de la masa, el grosor, la compleja vasculatura y la organización de las fibras del miocardio. También debe aclararse si las células de la médula ósea tienen una capacidad regenerativa semejante a la de las células madre. Si fuera posible extrapolar los resultados obtenidos en los roedores a los humanos en cuanto al número de células recibidas, como máximo se podrían regenerar entre 1 y 5 g de miocardio. En el trasplante de mioblastos esqueléticos el problema es mayor, pues con estos sólo es posible producir miligramos de tejido, además de que los métodos de medición no pueden determinar la función ventricular cuando solamente se logran producir 5 g de miocardio. Nadal concluyó que ningún trabajo experimental ha sido capaz de demostrar el trasplante de la cantidad suficiente de células y que sus descendientes sufran el proceso de diferenciación y logren mejorar el funcionamiento cardiaco.16 En los últimos años se han realizado varias investigaciones con el fin de conocer la función de las células progenitoras endógenas y de las células progenitoras exógenas en el tratamiento de la enfermedad cardiaca, y para identificar las células inmaduras con la capacidad de diferenciarse en líneas celulares diferentes del órgano de origen y emplearlas en la regeneración del corazón dañado. Las células embrionarias y las células de la médula ósea son muy estudiadas y caracterizadas. Los avances obtenidos hasta ahora son muy importantes para lograr la aplicación clínica de las células de la médula ósea en las enfermedades de origen isquémico y no isquémico del corazón;39 sin embargo, sigue la polémica respecto a la capacidad de las células de la médula ósea para adquirir las líneas celulares cardiacas, para regenerar el miocardio perdido después de un infarto, para repoblar el corazón hipertrofiado y descompensado, para generar cardiomiocitos nuevos funcionales y estructuras vasculares, y para revertir probablemente la dilatación ventricular y el adelgazamiento de la pared ventricular. En este terreno, las células madre cardiacas pueden llegar a ser las células más importantes para regenerar el corazón.40 Pruebas contundentes sostienen que el trasplante celular logra mejorar la función del corazón infartado y que un amplio rango de estirpes celulares de origen no muscular pueden mejorar la función ventricular. Lo anterior sugiere que el beneficio se debe al resultado de diversos mecanismos que inducen la verdadera regeneración del miocardio.41 Actualmente diversos ensayos clínicos analizan el uso de las células derivadas del músculo esquelético y de las células de la médula ósea; su objetivo final es el aumento de la perfusión y la contractilidad del miocardio. La investigación básica indaga las fuentes de nuevos cardiomiocitos en sitios como las células progenitoras residentes en el miocardio y las células embrionarias.42,43

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El traslado rápido de los conocimientos básicos a los ensayos clínicos origina muchos temas que requieren ser resueltos. Es necesaria la utilización de técnicas específicas para visualizar y evaluar los mecanismos involucrados en estos procesos y para comprobar la eficacia de la terapia celular. Las imágenes deben permitir rastrear in vivo diversas células y proporcionar una mejor comprensión en la evaluación de los efectos funcionales de las terapias celulares. Se requieren marcadores celulares con agentes superparamagnéticos, marcajes con radionucleótidos y pruebas de la acción que ejercen los genes en las células trasplantadas, los efectos sobre la función del ventrículo izquierdo, la perfusión del miocardio, la cuantificación del tejido cicatrizal y la viabilidad celular del miocardio.44

Estado actual de los ensayos clínicos del trasplante celular en el miocardio

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Debido a la gran confusión generada por la falta de resultados sólidos relacionados con el trasplante celular del miocardio, Nadal expuso la necesidad de establecer las bases para los modelos de estudio en animales con anatomía y fisiología semejantes a las de los humanos, y conocer la dosis y el efecto, el modo óptimo de administración y la duración del efecto. Asimismo, sugirió conocer los mecanismos celulares y moleculares que dirigen la diferenciación de las células madre cardiacas y de las células trasplantadas, que los estudios aporten la información necesaria para poder extrapolar los resultados obtenidos a los humanos y, una vez establecidos, diseñar ensayos clínicos seguros que generen resultados para poder elegir los que deben ser aplicados en la práctica clínica. Para lo anterior, Nadal propuso que los protocolos de estudio sean diseñados de forma que respondan las siguientes preguntas:17 1. ¿La capacidad de las células de la médula ósea de diferenciarse en células miocárdicas es una propiedad limitada a los roedores o es compartida por otras especies, incluyendo la humana? 2. ¿La identidad de las células de la médula ósea es capaz de generar células miocárdicas? 3. ¿Cuál es el destino a corto plazo y a largo plazo de las células trasplantadas en el miocardio de animales grandes? 4. ¿Es posible obtener un número suficiente de células autólogas con una capacidad terapéutica para producir directamente resultados fisiológicos cuantificables en un corazón de tamaño similar al del humano? 5. ¿Cuál es el mecanismo de acción de las células trasplantadas, una contribución directa a la masa contráctil o un efecto paracrino sobre el miocardio sobreviviente? 6. ¿Cuál es la ruta de administración más efectiva?

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7. ¿Cuál es el momento y la pauta óptima de administración: una administración en el posinfarto aguda, subaguda o crónica? 8. ¿Cuál es la duración del efecto beneficioso detectable sobre la función ventricular de animales grandes? 9. ¿Cuál es el mejor predictor de un efecto clínico positivo? Si lograran obtenerse las respuestas y fueran positivas a favor del ensayo clínico, para que éste sea aplicado y se establezcan reglas terapéuticas nuevas, será necesario considerar tres obstáculos importantes: a. Se fundamenta en un concepto obsoleto y equívoco de la homeostasis celular del miocardio y su regeneración. b. Será difícil determinar el destino de las células trasplantadas a largo plazo en el contexto de la longevidad de la vida humana. c. El procedimiento es muy caro en recursos humanos y materiales y, por lo tanto, estará a disposición de una fracción muy pequeña de la población candidata al tratamiento regenerativo miocárdico.17 Por lo tanto, es recomendable realizar los primeros ensayos clínicos en los enfermos en lista de espera para trasplante cardiaco con insuficiencia cardiaca terminal. Así, los riesgos serán mínimos y podrán obtenerse pruebas contundentes de los resultados del procedimiento de manera directa y detallada.17 A partir de estas reflexiones es esencial establecer el futuro del trasplante celular del miocardio. Ahora se acepta y es evidente que el miocardio adulto posee la capacidad intrínseca de regenerarse, debido fundamentalmente a la presencia de células madre residentes en el miocardio, las cuales tienen la capacidad de regenerar los miocitos y la microvasculatura. Estos conocimientos deben ser incorporados a los protocolos de regeneración del miocardio.

FUTURO DE LA REGENERACIÓN DEL MIOCARDIO Una de las áreas más prometedoras de la medicina regenerativa es la terapia celular, la cual puede ofrecer nuevos tratamientos a enfermedades con posibilidades escasas y nulas de curación. La regeneración de tejidos dañados y destruidos puede lograrse con el uso de células madre. En este ámbito, la insuficiencia cardiaca secundaria a infarto del miocardio se presenta como una de las enfermedades que con el paso del tiempo pueden ser beneficiadas con esta estrategia. La investigación cardiovascular enfrenta un reto muy interesante: encontrar un método para reemplazar los cardiomiocitos y la microvasculatura dañada y perdida a causa de un infarto del miocardio, y prevenir y revertir el proceso de remodelado cardiaco y la consecuente insuficiencia cardiaca.

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Para lograrlo se integraron diversos conocimientos de disciplinas básicas y clínicas, como la biología celular y la biología molecular, la ingeniería tisular, la biofísica, la bioquímica, la cardiología intervencionista, la electrofisiología y la cirugía cardiovascular. Asimismo, se implementaron varias estrategias que intentan la regeneración del músculo cardiaco, para lo cual es necesario elegir el tipo de células que deberá ser aplicado. Para este tipo de células se tomará en cuenta su capacidad regenerativa, la facilidad para obtenerlas y el procedimiento de trasplante. En conclusión, es necesaria una mejor comprensión de los procesos que dictan la regeneración del miocardio y, sobre la base del estudio de la biología celular y la biología molecular, la obtención de más conocimientos de estudios experimentales en animales semejantes en anatomía y fisiología a los humanos. También conviene conocer los mecanismos a nivel molecular que permiten mantener la línea de diferenciación de las células madre cardiacas y de las células trasplantadas, y poder extrapolar los resultados obtenidos a los humanos. Lo anterior tiene el fin de comenzar la prevención de la insuficiencia cardiaca y de mejorar el pronóstico de la enfermedad isquémica del miocardio.

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Sección IV Compuestos biofarmacéuticos en ingeniería tisular y medicina regenerativa Sección IV. Compuestos biofarmacéuticos en ingeniería tisular y medicina regenerativa

15 La producción de compuestos biofarmacéuticos en plantas

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Miguel A. Gómez Lim

Aunque las plantas son utilizadas desde hace miles de años con fines medicinales, su uso como biofábricas o biorreactores, para producir compuestos de interés farmacéutico es reciente. Dado que la demanda por estos compuestos crece en todo el mundo, el uso de la ingeniería genética se extiende cada vez más. Actualmente el alto costo de muchos productos farmacéuticos limita su disponibilidad y su aplicación. Al contrario, la elaboración de productos extraídos de plantas transgénicas es más barata y su almacenamiento y producción masiva es más fácil. Asimismo, este tipo de productos son más seguros que los derivados de otros sistemas. El uso de reactores y de biorreactores para la producción industrial de determinadas sustancias no es nuevo. Durante años una gran cantidad de compuestos de diversos tipos (incluyendo los farmacéuticos) han sido generados en diversos sistemas gracias a que la mayoría de los genes de cualquier origen pueden expresarse en sistemas heterólogos. El sistema de expresión ideal es el que produce materiales más seguros, con una actividad biológica mayor y en cantidades más grandes a costos más bajos. Las células de los mamíferos modificadas con técnicas de DNA recombinante tienen la ventaja de producir compuestos idénticos a los naturales; sin embargo, cultivarlas es muy costoso y su producción sólo es posible a una escala limitada. Algunos microorganismos, como las bacterias, permiten la producción de compuestos a una escala mucho mayor, pero tienen la desventaja de originar productos que no son iguales a los de origen natural. Por ejemplo, las proteínas que en los humanos son por lo general glucosiladas (es decir, unen diversos azúcares 227

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a la molécula) no son glucosiladas por las bacterias. También, las proteínas humanas que se expresan en niveles altos en la Escherichia coli adquieren con frecuencia una conformación artificial y son más propensas a precipitarse intracelularmente debido a que carecen de puentes disulfuro y a que su plegamiento es inadecuado. La producción de proteínas recombinantes en las plantas tiene varias ventajas potenciales para la formación de compuestos farmacéuticos de importancia en la medicina clínica: 1. La infraestructura industrial para los sistemas vegetales es más económica que la de los sistemas de fermentación y la de los biorreactores. 2. La tecnología para cosechar y procesar plantas y sus productos a escala industrial es accesible. 3. El requisito de la purificación del compuesto puede ser eliminado cuando el tejido de la planta que contiene la proteína recombinante se utiliza como alimento (como en las vacunas comestibles). 4. Las proteínas recombinantes se pueden dirigir a determinados compartimientos intracelulares o expresarse directamente en esos compartimientos (como el cloroplasto). 5. La proteína recombinante en plantas puede producirse a una escala industrial. 6. Los riesgos a la salud a causa de una posible contaminación del producto recombinante con patógenos humanos son mínimos. Esta tecnología tiene un impacto importante en dos áreas: en la producción de anticuerpos y sus receptores, y en la producción de compuestos biofarmacéuticos, incluyendo los antígenos.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Desde la década de 1990 las plantas demostraron ser sistemas versátiles de producción para muchas formas de anticuerpos, como IgG, IgA, quiméricos IgG/ IgA, entre otros. Las plantas tienen un gran potencial como fuente ilimitada de anticuerpos monoclonales baratos (planticuerpos) para la terapia humana y la terapia animal (cuadro 15–1). Hasta ahora, la mayoría de los anticuerpos expresados han sido en el tabaco, aunque también se han utilizado papa, soya, alfalfa, arroz y trigo.1,2 La ventaja principal de usar hojas es el rendimiento. La alfalfa y el tabaco pueden ser cosechados varias veces al año, con una producción potencial de biomasa por año de

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Cuadro 15–1. Planticuerpos terapéuticos y de diagnóstico producidos en plantas

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Aplicación y especificidad*

Promotor

Caries dental; antígeno I o II de Streptococcus mutants4 Diagnóstico; IgG antihumano6

CaMV 35S

Tratamiento para cáncer; antígeno carcinoembriónico3 semillas Tratamiento para cáncer; antígeno carcinoembriónico2,3 semillas

Ubiquitina de maíz

Tratamiento para cáncer; antígeno carcinoembriónico3 Tratamiento para cáncer; antígeno carcinoembriónico8

Doble promotor CaMV 35S Doble promotor CaMV 35S

Tratamiento para linfoma de células B; vacuna de idiotipos40

Promotor subgenómico de la proteína de la cápside del TMV Promotor subgenómico U5 de la proteína de la cápside del TMV CaMV 35S

Cáncer de colon; antígeno de superficie32

Herpes simple virus 25

CaMV 35S

Ubiquitina de maíz

Secuencias señales

Nombre o tipo de anticuerpo

Planta

Niveles de expresión

Péptido señal murino de IgG Péptido señal murino de IgG Péptido señal murino de IgG; KDEL Péptido señal murino de IgG; KDEL

Guy’s 13 (IgAs)

Nicotiana tabaccum

500 mg/g PF hojas

C5–1 (IgG)

Alfalfa

1% PST

ScFvT84.66 (ScFv)

Trigo

900 ng/g de hojas 1.5 mg/g

ScFvT84.66 (ScFv)

Arroz

ScFvT84.66 (ScFv)

Arroz

29 mg/g de hojas; 32 mg/g 3.8 mg/g de callo 27 mg/g de hojas

T84.66 (IgG)

Nicotiana tabaccum

1 mg/g de hojas

38C13 (scFv)

Nicotiana benthamiana

30 mg/g de hojas

Péptido señal murino de IgG; KDEL

CO17–1A (IgG)

Nicotiana benthamiana

No reportado

Péptido señal de extensina de tabaco

Anti–HSV–2 (IgG)

Soya

No reportado

Péptido señal murino de IgG; KDEL Líder Ω del TMV; péptido señal murino de IgG; KDEL a–amilasa de arroz

* Las acotaciones (superíndices) corresponden a las referencias al final del capítulo IgAs = IgA secretora; PF = peso fresco; PST = proteína soluble total.

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 15)

17 y 50 ton/ha, respectivamente. En contraste, la producción máxima de trigo, arroz y maíz difícilmente rebasa las 6 ton/ha. Otras ventajas del tabaco incluyen su fácil manipulación genética, la producción de un gran número de semillas (hasta un millón por planta) y la necesidad imperiosa de explorar otros usos para este insumo. Los anticuerpos producidos en las plantas son muy estables a temperatura ambiente3 y a 4 _C.1 El material vegetal que contiene al anticuerpo se puede almacenar y utilizar durante todo el año. La purificación puede realizarse en una planta de procesamiento, cuya cercanía no es necesaria. Hay muchos ejemplos de anticuerpos y sus receptores producidos exitosamente en plantas (cuadro 15–1), pero sólo uno ha sido probado en los humanos: un anticuerpo secretor quimérico IgG/ IgA contra un antígeno superficial de Streptococcus mutans, el agente causal de la caries dental. Este anticuerpo producido en el tabaco fue aplicado tópicamente en los dientes de varios voluntarios; al final, resultó ser tan eficaz como un IgG producido en un hibridoma de ratón para prevenir la recolonización de las encías por Streptococcus mutans.4 Otro ejemplo es un anticuerpo contra el virus del herpes que fue producido en la soya y que resultó muy efectivo en la prevención de la infección vaginal por virus del herpes en los ratones.5 Un aspecto importante en la producción de anticuerpos en plantas es el bajo costo. Los estudios enfocados en los gastos son muy escasos, por lo que los cálculos disponibles implican muchas suposiciones. El costo por producir IgG en la alfalfa crecida en un invernadero de 250 m2 es de 500 a 600 dólares/g, en comparación con la producción del mismo anticuerpo mediante hibridomas (células cancerosas en cultivo in vitro),6 la cual representa una inversión de 5 000 dólares/g. Sin duda, los niveles de expresión tienen un impacto significativo en los costos, por lo cual el nivel de expresión más alto reportado para un anticuerpo (500 mg/g de hoja para una IgA secretada)4 tuvo un costo de menos de 50 dólares/g. Esto contrasta con el precio de un anticuerpo purificado obtenido mediante el cultivo de células (1 000 dólares/g) y a partir de animales transgénicos (100 dólares/g). El componente más importante del valor de los planticuerpos es la purificación. Sin embargo, la expresión en los gérmenes de arroz y de trigo3 abre la posibilidad a la administración oral de algunos anticuerpos terapéuticos sin la necesidad de purificación. Lo lamentable es que, a pesar de todas estas ventajas, aún no se comercializa ningún anticuerpo obtenido de plantas. Mucho anticuerpos son sujetos a un proceso postraduccional de glucosilación, el cual es sustancial para su actividad. Sólo se ha realizado un estudio en el que se analizó la glucosilación de un anticuerpo producido en plantas y de un anticuerpo generado en las hibridomas de ratón.7 La investigación reveló que los azúcares en el anticuerpo derivado de plantas son estructuralmente más diversos: 40% de los azúcares son del tipo manosa y 60% tienen enlaces tipo b–(1,2)– xilosa y b–(1,3)–fucosa (estos enlaces son típicos de las plantas pero no se

La producción de compuestos biofarmacéuticos en plantas

231

encuentran en los mamíferos). El ácido siálico, el cual representa 10% del contenido de azúcar del anticuerpo monoclonal del ratón, no se encontró en el anticuerpo de las plantas. Sin embargo, estas diferencias en estructura al parecer no tienen ningún efecto sobre la unión al antígeno y sobre la afinidad in vitro5,6,8 y no son importantes in vivo. Un IgG producido en la alfalfa tuvo una vida media en el suero de ratones BALB/c similar a la de un anticuerpo producido en hibridomas.6 Aunque existe cierta preocupación por la inmunogenicidad potencial y la capacidad alergénica de los planticuerpos, es probable que estos no provoquen problemas en la mayoría de las personas debido a que las glucoproteínas de las plantas son ubicuas en la dieta humana. Los 60 pacientes que recibieron la aplicación oral tópica de IgA secretora específica para Streptococcus mutans4 no presentaron ninguna reacción alérgica al anticuerpo humano antirratón (HAMA).

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COMPUESTOS BIOFARMACÉUTICOS La producción de diversos antígenos en plantas transgénicas se demostró desde hace varios años.9 Lo que motivó a estos experimentos fue la idea de que algunas proteínas inmunogénicas decisivas del patógeno se podían sintetizar en las plantas y que el tejido vegetal podía usarse después como vacunas comestibles en los humanos y en los animales. De acuerdo con los resultados, esta propuesta es totalmente viable mediante el uso de proteínas bacterianas y virales (cuadro 15–2). Actualmente la vacunación a gran escala enfrenta una serie de dificultades entre las cuales se encuentran los altos costos y el riesgo de una distribución inadecuada en los lugares remotos y de difícil acceso. La mayoría de las vacunas disponibles se aplican vía parenteral (inyecciones). Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la búsqueda de opciones para sustituir las inyecciones, debido a que en algunos países hasta 30% de las inyecciones se aplican con jeringas no estériles, como resultado de los problemas económicos de estos lugares. Considerando el grave problema del SIDA, la recomendación emitida por la OMS adquiere una gran relevancia. Por motivos de bajo costo y de fácil administración, la aplicación de vacunas por la vía oral representa una buena opción. Además, con el suministro de vacunas orales se aumentan las probabilidades de que las mucosas adquieran inmunidad contra los agentes infecciosos que entran en el cuerpo a través de una superficie mucosal. Una preocupación importante respecto a las vacunas orales es la degradación de los antígenos en el estómago y en el intestino antes de que puedan inducir una respuesta inmunitaria. Para proteger a los antígenos de la degradación se desarrollaron varios métodos, entre ellos están, el uso de cepas recombinantes de microorganismos atenuados (como la Salmonella), la utilización de vehículos de bioencapsulación (como los liposomas) y el uso de plantas transgénicas. En los

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 15)

Cuadro 15–2. Antígenos humanos o animales expresados en plantas Origen de la proteína y especie blanco para la vacuna*

Proteína o péptido expresado

Planta

Nivel máximo de expresión registrado en la planta

Integridad, inmunogenicidad y capacidad protectora de la vacuna

Escherichia coli ente- Subunidad B rotoxigénica (para de la toxina humano)21 sensible al calor Vibrio cholerae (para Subunidad B humano)11,23 de la toxina sensible al calor

Maíz

No reportado

Inmunogénica y protectora por administración oral

Papa

0.30% de la PTS papa

Virus de la hepatitis B (para humano)22

Papa

< 0.01% PF

Virus de Norwalk (para humano)17

Proteína superficial de la cubierta Proteína de la cápside

La proteína intacta forma multímeros, tiene actividad de unión al receptor y es inmunogénica y protectora por administración oral Inmunogénica por administración oral

Papa

0.37% PTS

Citomegalovirus (para humano)16

Glicoproteína B

Tabaco

< 0.02% PTS

Virus hemorrágico de conejos (para conejos)19 Virus de Newcastle12,33

VP60

Papa

0.3% PTS

Proteína F

Maíz

0.1 a 0.5% de la PTS

Foot–and–mouth disease virus (para animales de granja y domésticos)12

VP1

Arabidopsis

No reportado

Inmunogénica y protectora por administración por inyección

Foot–and–mouth disease virus (para animales de granja y domésticos)15

VP1

Alfalfa

No reportado

Inmunogénica y protectora por administración por inyección o por vía oral

Rotavirus34

Proteínas VP2 y VP6 de la cubierta Glicoproteína S

Tomate

0.1 a 0.5% de la PTS

No reportado

Arabidopsis

0.6% de la PTS

Inmunogénica y protectora por administración por inyección

Glicoproteína S

Tabaco

0.2% de la PTS

Proteína intacta e inmunogénica por administración por inyección

Coronavirus transmisible de la gastroenteritis (para cerdos)13 Coronavirus transmisible de la gastroenteritis (para cerdos)20

Forma partículas tipo virus, inmunogénica por administración oral Proteína inmunológicamente relacionada Inmunogénica y protectora por administración por inyección Protectora por administración oral

La producción de compuestos biofarmacéuticos en plantas

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Cuadro 15–2. Antígenos humanos o animales expresados en plantas Origen de la proteína y especie blanco para la vacuna*

Proteína o péptido expresado

Coronavirus transmisible de la gastroenteritis (para cerdos)21

Glicoproteína S

Planta

Maíz

Nivel máximo de expresión registrado en la planta

Integridad, inmunogenicidad y capacidad protectora de la vacuna

< 0.01% PF

Protectora por administración por vía oral

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* Las acotaciones (superíndices) corresponden a las referencias al final del capítulo. PTS = proteína total soluble.

primeros trabajos con vacunas derivadas de plantas se utilizaron el tabaco y la papa.10 En teoría, la especie ideal para expresar los antígenos debe consumirse en fresco y tener altos niveles de proteínas solubles. Por lo tanto, frutos como el plátano y el jitomate, y los cereales son sistemas convenientes para este fin. En el cuadro 15–2 se describen algunos ejemplos que ilustran la variedad de los antígenos expresados en plantas transgénicas. Los antígenos derivados de las plantas inducen respuestas inmunitarias a nivel de la mucosa y del suero cuando son administrados mediante inyecciones y por vía oral en animales de laboratorio. En ocasiones los antígenos protegen a los animales contra el patógeno.11–15 Asimismo, en pruebas clínicas con voluntarios humanos, los antígenos en el tejido vegetal suministrados por vía oral son capaces de inducir una respuesta inmunitaria significativa.16–21 Por esta razón, se considera que las vacunas preparadas en plantas tienen un gran potencial. La bioencapsulación de la subunidad B de la toxina lábil de Escherichia coli en el maíz transgénico induce una fuerte respuesta inmunitaria en los ratones en comparación con la respuesta alcanzada con el antígeno desnudo, la cual es mas débil.21 Esto se debe quizá a que el antígeno está protegido contra la degradación en el intestino. La cantidad de tejido vegetal que constituye una dosis de vacuna debe ser pequeña. Por lo tanto, es muy importante alcanzar niveles altos de expresión del antígeno en el tejido vegetal. Los niveles de expresión de los transgenes se aumentan con el uso de diferentes estrategias, entre las cuales destacan la utilización de diversas señales de regulación de la expresión genética22 y la optimización del uso de los codones.14,20,21 Los niveles de expresión también pueden elevarse a través de cruzas de líneas transformadas con líneas establecidas y bien caracterizadas, la cual es una estrategia aplicada con éxito para aumentar la producción de proteína total en el maíz. Asimismo, es importante que cualquier antígeno esté presente en su forma nativa en el tejido vegetal. Por lo regular, esto se evalúa al examinar el tamaño de la proteína sintetizada y su capacidad para formar las estructuras adecuadas (p. ej., las partículas tipo virus) y, cuando sea relevante,

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 15)

demostrando actividad enzimática o de unión a un receptor.14,15,20,23 La estabilidad de las proteínas heterólogas y la ensambladura de estructuras multiméricas dependen en buena medida de la localización subcelular. Hasta ahora los principales lugares donde los antígenos se expresan son la superficie celular, el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi.20,22–24 Estos sitios permiten la producción de antígenos funcionales, aunque se sugiere probar otros compartimientos celulares, como el cloroplasto. Una estrategia relacionada con las vacunas comestibles emplea plantas transgénicas que expresan autoantígenos, por lo que, una dosis oral de un autoantígeno puede inhibir el desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria a través del mecanismo de tolerancia. Este planteamiento fue llevado a un modelo de diabetes en los ratones.25

PRODUCCIÓN DE FACTORES DE CRECIMIENTO HUMANOS EN PLANTAS Una muy importante área de aplicación de esta tecnología es la producción de factores de crecimiento humanos. Hasta ahora hay cuatro ejemplos de este tipo de proteínas expresadas de manera exitosa en plantas: el factor de crecimiento epidérmico humano,26 el factor de granulocitos estimulante de colonias,27 el factor de crecimiento parecido a la insulina28 y la proteína morfogenética de hueso29 (cuadro 15–3). Estos factores se aplican en una amplia gama de padecimientos humanos y, dado que por lo general se encuentran en cantidades limitadas en las células, su purificación y síntesis resultan complejas. Muchos se producen en las levaduras, en las células de mamíferos en cultivo e incluso en las bacterias, pero su costo es elevado. Por lo tanto, la posibilidad de producir estos factores en plantas en grandes cantidades y a un costo razonable es muy atractiva.

Cuadro 15–3. Producción de factores de crecimiento humano en plantas Aplicación o indicación potencial* Reparación de heridas y control de proliferación celular26 Neutropenia27 Varias aplicaciones médicas28 Reparación de fracturas y control de proliferación celular29

Planta

Proteína

Niveles de expresión

Tabaco

Factor de crecimiento epidérmico humano

< 0.01% de la PTS

Tabaco Arroz y tabaco Tabaco

Factor GM–CS humano Factor de crecimiento parecido a la insulina humano Proteína morfogenética de hueso humana

No reportado de 0.01 a 1% de la PTS No reportado

* Las acotaciones (superíndices) corresponden a la referencia al final del capítulo.

La producción de compuestos biofarmacéuticos en plantas

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NIVELES DE EXPRESIÓN DE COMPUESTOS BIOFARMACÉUTICOS EN PLANTAS En general, los niveles de expresión de las proteínas con aplicación farmacéutica producidas en plantas transgénicas son de menos de 1% de la proteína total soluble (PTS) (cuadro 15–4). Este límite de 1% es muy importante para una posible aplicación comercial en caso de que la proteína deba purificarse.30 En un estudio en voluntarios humanos, el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B indujo sólo una respuesta de bajo nivel en anticuerpos séricos, lo cual reflejó probablemente el bajo nivel de expresión (de 1 a 5 ng/g de peso fresco) en la lechuga transgénica.18 A pesar de las recientes mejoras en los niveles de expresión en la papa, con vistas a realizar ensayos clínicos,22 deben aumentarse más los niveles de expresión para fines prácticos. Aunque la proteína de la cápside del virus Norwalk expresada en la papa induce inmunización cuando se consume por vía oral, los niveles de la expresión son muy bajos para la administración oral a gran escala (0.37% de la PTS).17 La expresión de los genes que codifican para otras proteínas humanas en plantas transgénicas es muy baja: albúmina humana del suero, 0.020% de la PTS; proteína humana C, 0.001% de la PTS; eritropoyetina, ~0.003% de la PTS; interferón humano–b, < 0.001% de la PTS (cuadro 15–2). A pesar de los varios reportes respecto a los altos niveles de expresión, surge la imperiosa necesidad de encontrar mecanismos que aumenten los niveles de la expresión de las proteínas heterólogas para permitir su producción comercial en plantas. Un método muy exitoso para expresar proteínas heterólogas a altos niveles es el uso de replicones virales basados en el virus del mosaico del tabaco e introducidos en la célula vegetal por medio de la Agrobacterium tumefaciens. Este proceso es llamado magnifección31 y permite obtener niveles de proteína recombinante de manera transitoria de hasta 50% de la PTS.

PERSPECTIVAS Antes de cualquier aplicación a gran escala, los compuestos farmacéuticos derivados de plantas deben cumplir con los mismos estándares de seguridad y funcionamiento requeridos en otros sistemas de producción, aunque actualmente varias medicinas tradicionales están exentas de este escrutinio y no se les exige cumplir con los estándares debido a su clasificación como suplementos alimenticios. En virtud de las diversas preocupaciones ambientales relacionadas con los organismos genéticamente manipulados, manifestadas por grupos ecologistas que confunden a la opinión pública, es importante la existencia de normas reguladoras para este tipo de organismos. Es esencial distinguir entre las preocupaciones pú-

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(Capítulo 15)

Cuadro 15–4. Elaboración de proteínas importantes para la salud humana producidas en plantas Aplicación o indicación potencial* Proteínas humanas Anticoagulante26 Inhibidor de trombina26 Hormona de crecimiento35 Hormona de crecimiento35 Anemia30 Varias36

Planta

Tabaco Canola (Brassica napus) Tabaco Tabaco Tabaco Tabaco

Proteína

Proteína C humana Hirudina humana Somatotropina humana Expresión nuclear Eritropoyetina humana Interleucina–12 humana Encefalina humana

Niveles de expresión

< 0.01% de la PTS 0.3% de proteína de las semillas 7% de la PTS < 0.01% de la PTS < 0.01% de la PTS Hasta 40 ng/g de peso fresco 0.1% de proteína de las semillas No reportado

Antihiperanalgésico30

Arabidopsis

Tratamiento para las hepatitis C y B26 Tratamiento para las hepatitis C y B30 Varias37

Arroz y nabo (Brassica rapa) Tabaco

Interferón–b humano

Tomate

Interleucina–12 murina

Cirrosis hepática, quemaduras y cirugías30 Sustituto de la sangre26 Colágena38

Tabaco

Seroalbúmina humana

Tabaco

Fibrosis quística, enfermedades hepáticas y hemorragia27 Inhibidor de tripsina para cirugía de trasplantes27 Antimicrobiano39 Proteínas no humanas Hipertensión27

Arroz

Hemoglobinas a y b humanas Colágena homotrimérica humana a–1–antitripsina humana

0.05% de proteína de las semillas < 0.01% de peso fresco No reportado

Maíz

Aprotinina humana

No reportado

Papa

Lactoferrina humana

0.1% de la PTS

Tabaco y tomate

No reportado

Terapias VIH–SIDA27

Nicotiana bethamiana

Enfermedad de Gaucher26

Tabaco

Enzima convertidora de angiotensina a–Tricosantina de TMV–U1 proteína de la cápside subgenómica Glucocerebrosidasa

Tabaco

Interferón–b humano

< 0.01% de peso fresco Hasta 7.3 mg por gramo de peso fresco 0.02% de la PTS

2% de la PTS

1 a 10% de la PTS

* Las acotaciones (superíndices) corresponden a las referencias al final del capítulo. PTS = proteína total soluble.

La producción de compuestos biofarmacéuticos en plantas

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blicas verdaderas y las preocupaciones percibidas (científicas contra no–científicas). Si los compuestos farmacéuticos derivados de plantas son dañinos, capaces de persistir en el ambiente y pueden acumularse en organismos no blanco, deben tomarse las medidas adecuadas. Por lo tanto, es evidente el enorme potencial de esta tecnología para producir compuestos de interés farmacéutico y vacunas. Para seleccionar el cultivo adecuado para la producción es necesario considerar diversos factores como los niveles de producción, las condiciones de almacenamiento, los costos de establecimiento y de operación, las estrategias de purificación, el tamaño del mercado, las preocupaciones ambientales, la opinión pública y las tecnologías alternativas.

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 15)

Sección V Biomateriales en ingeniería tisular y medicina regenerativa Sección V. Biomateriales en ingeniería tisular y medicina regenerativa

16 Desarrollo de nuevos polímeros de restauración dental

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Ricardo Vera Graziano, Federico Barceló Santana, Margarita Navarrete Montesinos, Carlos Álvarez Gayosso, Mariana Latorre García, Filiberto Rivera Torres, Graciela J. Ancona León

El propósito de las resinas dentales consiste en reconstruir la función y la estética de los dientes para mantener y mejorar su calidad. Por lo tanto, las resinas dentales ideales deben ser biocompatibles con los dientes, tener propiedades mecánicas similares a las de los dientes, presentar una alta estabilidad dimensional, ser resistentes al agua y a los fluidos bucales, desarrollar una alta adhesión a la dentina y al esmalte, y presentar una textura y un color similares a los de los dientes. Asimismo, otras propiedades de la resina que deben considerarse en el consultorio dental son la facilidad de manejo, la eficacia de “curado” (reacción química) y el grado de contracción (encogimiento) durante la reacción química. Aunque no existen los materiales ideales, es necesario desarrollar compuestos afines y funcionales con la estructura dental (de manera física, química y biológica), cuyas propiedades no disminuyan con el tiempo y sellen por completo la obturación con el fin de evitar que los fluidos bucales se filtren al interior del diente.1–3 Las resinas dentales modernas son compósitos, es decir, materiales compuestos por una fase orgánica, o matriz, y una fase inorgánica, o refuerzo. La fase orgánica consiste en un monómero. La fase inorgánica es un vidrio o un componente cerámico en forma de polvo. Después de que la resina dental se implanta en el diente, la fase orgánica se hace polimerizar para que se solidifique (“curado”) y adquiera sus propiedades finales. Existen diversos tipos de resinas dentales, algunos de los cuales presentan características interesantes y ventajas competitivas. Todos los tipos muestran limitaciones que pueden ser superadas. Una de las más importantes consiste en la tendencia de la resina a perder sus propiedades iniciales después de ser implantada en el diente. Esta limitante conlleva varios 243

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 16)

efectos negativos como la falla prematura de la restauración dental y, por consiguiente, la formación de caries. Una consecuencia directa de esta falla es la seria limitación de cualquier posibilidad de aplicación de la ingeniería tisular en dientes dañados y con defectos. Por esta razón, es necesario el desarrollo de materiales de mejor calidad y mayor duración que sirvan como andamio para la reconstrucción de los tejidos dentarios.4–6 El desarrollo y la caracterización de nuevos polímeros para resinas dentales a partir del monómero 2,2–bis–4–(2–hidroxi–3–metacriloilpropoxi)–fenilpropano (Bis–GMA) funcionalizado son objeto de análisis a lo largo de este capítulo. Los materiales desarrollados tienen mejores características de adhesión y presentan una menor absorción de agua, entre otras propiedades, por lo cual reúnen varias ventajas comparativas en relación con los materiales que están ahora en uso.

ANTECEDENTES El desarrollo moderno de los materiales de obturación dental tiene una larga historia de investigación que data de 1878. Aunque fue hasta 1960, año en que sería desarrollado por Bowen, que el monómero Bis–GMA se convirtió en la base orgánica de las resinas dentales modernas, debido a que polimeriza formando una matriz de naturaleza epóxica y acrílica de buena resistencia mecánica compatible con el diente. Asimismo, el monómero permite incorporar de 70 a 80% de concentraciones de material de refuerzo inorgánico. Sin embargo, su viscosidad es muy alta, lo cual limita seriamente su aplicación clínica. Para superar este problema se mezcla por lo general con un monómero acrílico de baja viscosidad: el trietilenglicol–dimetacrilato (TEGDMA), aunque se observó que aumenta la absorción de agua y el nivel de encogimiento durante la polimerización.1–4 Entre las resinas dentales de reciente aparición se encuentran los denominados compómeros, conocidos también como resinas compuestas. Estos materiales, desarrollados en 1990, combinan la química de dos de sus antecesores: el ionómero de vidrio y la resina fotopolimerizable. Con esta combinación, los compómeros mejoran la resistencia mecánica, las propiedades estéticas, la liberación de flúor (para la formación de fluorapatita) y la facilidad de manejo para la restauración de dientes primarios y de cavidades no sujetas a grandes esfuerzos mecánicos. Los compómeros tienen una gran aceptación en Europa y en México. Se comercializan en forma de pasta envasada en ampolletas y en cápsulas individuales. Los compómeros no son tóxicos y fotopolimerizan rápidamente (en un lapso de 5 min) a temperatura ambiente en el medio bucal.6 El desarrollo de nuevos materiales continúa y es posible mediante la valoración, la investigación y la innovación por parte de investigadores, clínicos y fabricantes. La Universidad Nacional Autónoma de México manifiesta un gran

Desarrollo de nuevos polímeros de restauración dental

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interés por desarrollar y valorar nuevos materiales dentales de alta calidad. Por esta razón, el Instituto de Investigaciones en Materiales y la Facultad de Odontología trabajan en conjunto con el propósito de sintetizar, caracterizar y optimizar los materiales de restauración dental a partir de nuevas resinas acrílicas reforzadas con biovidrios, y de desarrollar tecnología nacional tomando como base las normas internacionales establecidas.7–14

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COMPOSICIÓN DE LAS RESINAS DENTALES MODERNAS1–3 La fase orgánica de las resinas dentales está compuesta por el monómero Bis– GMA o por alguno de sus derivados; por el TEGDMA como diluyente, el cual es un agente que promueve la polimerización por lo general por vía fotoquímica (en realidad es una amina terciaria, como la canforquinona, la cual se activa con la luz a una longitud de onda de 470 nm por medio de una lámpara dental); por un pigmento (el cual está elaborado a base de óxidos orgánicos); por un estabilizador de color (un absorbente ultravioleta como la benzofenona y el benzotriazol); y por un inhibidor, que evita que el material se polimerice cuando está almacenado (por ejemplo, el diterbutil–p–cresol). Esta fase orgánica se encuentra en estado líquido antes de polimerizar y constituye de 20 a 40% de la resina dental. La fase inorgánica está compuesta por un vidrio que contiene algunos de los siguientes componentes: fluoroaluminosilicato, borosilicato, cuarzo cristalino, sílice pirogénico, zirconia y cerámicas. Para promover la actividad biológica se pueden agregar aditivos de bario, estroncio, zinc, tantalio, litio y otras sustancias. Esta fase se encuentra en forma de polvo con una distribución específica de tamaño de partícula, la cual puede variar de 40 (macropartículas) a 0.0001 m (nanopartículas). Es común el recubrimiento de las partículas inorgánicas con una sustancia que promueve la adhesión entre las dos fases (agentes de acoplamiento como los alkoxiorganosilanos). Las resinas dentales de Bis–GMA tienden a ser parcialmente hidrofílicas para promover la adhesión entre la dentina hidratada y el polímero. Al principio, la resina implantada se adhiere con firmeza al diente. Sin embargo, con el transcurrir de lapsos relativamente cortos la resistencia adhesiva entre la dentina y el polímero se reduce debido a que ocurre una absorción de agua, con lo cual las propiedades finales resultan afectadas.15

DESARROLLO DE LOS COMPÓSITOS16–22 Con el objetivo de minimizar la absorción de agua, de mejorar las propiedades finales de la resina, incluyendo su resistencia adhesiva a la estructura dental, y

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(Capítulo 16)

de abatir la viscosidad inicial de la resina dental líquida se llevó a cabo un estudio muy completo cuyo desarrollo es explicado a continuación. La primera acción consistió en sintetizar el monómero Bis–GMA a partir de glicidilmetacrilato, bisfenol–A y N,N–dimetil–p–toludina.12,13 Para reducir la absorción de agua del Bis–GMA y mejorar sus propiedades mecánicas y su manejo durante la obturación dental, el monómero se modificó con dimetil–isopropilsilano con el fin de impartirle una función fisicoquímica adecuada. El producto, un monómero Bis–GMA–sililado, se purificó hasta un grado odontológico y se determinó su viscosidad y su tensión superficial. Después se mezclaron en diferentes proporciones el Bis–GMA, el Si/Bis– GMA, el TEGDMA, la canforoquinona y el dimetil–p–toluidina, y se polimerizaron las muestras. Asimismo, la cinética y el mecanismo de reacción de la fotopolimerización del Bis–GMA y del Bis–GMA–sililado se analizaron por medio de la espectroscopia infrarroja y de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Las transiciones de fase ocurridas durante la polimerización y la evolución del módulo elástico se analizaron por medio de la técnica de fotoacústica pulsada en tiempo real.11,12 El último proceso residió en caracterizar las resinas desarrolladas y comparar sus propiedades con las de las resinas comerciales, utilizando diversos métodos como la microscopia electrónica de barrido, la difracción de rayos–X, el análisis térmico, la determinación de tensión superficial y los ángulos de contacto, entre otros.

PROPIEDADES DE LOS MONÓMEROS Bis–GMA Y Bis–GMA–SILILADO18–22 La estructura química de los monómeros Bis–GMA (figura 16–1) y Bis–GMA– sililado (figura 16–2) se definió mediante la espectroscopia de resonancia magnética nuclear. En el cuadro 16–1 se aprecian las viscosidades de los monómeros, medidas por medio de reometría. Se puede observar que la viscosidad del monómero Bis– GMA–sililado es 500 veces menor en relación con la viscosidad del monómero original Bis–GMA. Este drástico abatimiento de la viscosidad se atribuye al

Figura 16–1. Estructura química del Bis–GMA.

Desarrollo de nuevos polímeros de restauración dental

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Figura 16–2. Estructura química del Bis–GMA–sililado.

aumento de la flexibilidad molecular por efecto de la sililación. El Bis–GMA solidifica a una temperatura de –7 _C en tanto que el Bis–GMA–sililado lo hace a –34 _C, lo cual comprueba la gran flexibilidad molecular del segundo. Como referencia, el TEGDMA solidifica a –81.7 _C. Al igual que las formulaciones comerciales, el diluyente TEGDMA se debe añadir a las resinas dentales de Bis–GMA para abatir su viscosidad. El Bis– GMA–sililado puede minimizar el uso de este diluyente con dos ventajas adicionales: la reducción de la absorción de agua por parte de la resina y el decaimiento de los costos. La viscosidad del Bis–GMA también se reduce por un factor de 10 al pasar de 25 a 37 _C, lo cual genera inestabilidad al momento de aplicarlo en el diente, en tanto que el cambio de viscosidad por temperatura en el Bis–GMA– sililado es mínimo (0.5 PaSs). En el cuadro 16–2 se aprecian los resultados de la tensión superficial, medidos con la ayuda del método Wilhelmy. Se puede observar que tanto a 25 _C como a 37 _C los valores de la tensión superficial del Bis–GMA–sililado son menores que los de la tensión superficial del Bis–GMA, lo cual indica que el primero tiene una mayor facilidad de mojar la superficie del diente a obturar. Se observa también que la tensión superficial a 37 _C es menor. Ambos monómeros son solubles en solventes polares como el tetrahidrofurano y la dimetilformamida, e insolubles en solventes no polares, como el n–he-

Cuadro 16–1. Viscosidad de los monómeros Temperatura (_C)

25 37

Viscosidad (pascales–segundo, PaSs) Bis–GMA

Bis–GMA–sililado

513 47

1.0 0.4

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(Capítulo 16)

Cuadro 16–2. Tensión superficial de los monómeros Tensión superficial (dinas/cm)

Temperatura (_C)

25 37

Bis–GMA

Bis–GMA–sililado

35 26

19 13

xano. Las pruebas realizadas indicaron el carácter polar de los dos monómeros y su compatibilidad, pues son solubles en los mismos solventes. Además, los monómeros mostraron densidades similares: 1.2 en el Bis–GMA y 1.1 en el Bis– GMA–sililado.

ESTUDIO DE FOTOPOLIMERIZACIÓN18–22 En un estudio de fotopolimerización se prepararon mezclas de los dos monómeros a diferentes proporciones de Bis–GMA. En todas las mezclas se agregó TEGDMA a 30% y los promotores para fotopolimerizarlos. La conversión se midió en función del tiempo de reacción (figura 16–3). Se observó que la conversión aumenta más rápido en las mezclas a proporciones monoméricas de 50/50 y 40/60; por lo tanto, en un minuto estas mezclan alcanzan 80% de conversión, con lo cual superan en gran medida el grado de conversión del resto de las mezclas. 90 80

Copolimeros de Bis–GMA/Si–(Bis–GMA) Mezcla 100/0 Mezcla 60/40 Mezcla 50/50 Mezcla 0/100

% conversión

70 60 50 40 30 20 10 0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (s) Figura 16–3. Porcentaje de conversión en función del tiempo de fotopolimerización.

Desarrollo de nuevos polímeros de restauración dental

249

7.0

% encogimiento

4 Mezcla (70/30)

E (GPa)

3 Puntos experimentales Ajuste

2 1

6.0 5.0 Copolímeros (BIS–GMA/Si–[BIS–GMA] /TEGDMA, 70/30% w/w

4.0

Mezcla 100/0

3.0

Mezcla 50/50 Mezcla 0/100 Mezcla 60/40

2.0 1.0

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

0.0

0

100

Porcentaje de conversión

200

300

400

500

Tiempo (s)

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Figura 16–4. A. Modulo elástico, E (GPa), en función del porcentaje de conversión. B. Porcentaje de encogimiento por polimerización en función del tiempo.

Cabe mencionar que a altas conversiones se abate el monómero residual, lo cual es muy deseable en implantes dentales. Por medio de la fotoacústica pulsada se midió el módulo de elasticidad en función del tiempo de reacción y del porcentaje de conversión.11,12 Se determinó que a conversiones menores de 40% las muestras aún están en estado líquido, lo cual permite deducir que las moléculas pueden disipar los esfuerzos por efecto del encogimiento, que en ese punto es de 3% (figura 16–4). Después de ese punto, las muestras se solidifican y se generan esfuerzos residuales permanentes causados por el encogimiento restante (de 2 a 3%). La mezcla a proporciones monoméricas de 50/50 mostró un encogimiento mayor debido a que esta fórmula tuvo un grado más alto de conversión a polímero. Sin embargo, a un porcentaje de conversión predeterminado el encogimiento por polimerización fue similar en todas las muestras. Así, cuanta más conversión, mejores propiedades finales.

PROPIEDADES DE LOS POLÍMEROS18–22 Las propiedades de los polímeros Bis–GMA y Bis–GMA–sililado son contrastantes. El Bis–GMA absorbe agua en tanto que el Bis–GMA–sililado, no. Esto significa que a menor proporción de Bis–GMA la absorción de agua es menor en el producto final. También se observó que el grado de hidrofobicidad aumenta ligeramente conforme incrementa el contenido de Bis–GMA–sililado en el polímero (el ángulo de contacto de avance sólo aumentó de 85 a 90_), lo cual significa que la adhesión al diente no se modifica. Por otra parte, la superficie en todas las muestras fue tersa (la aspereza es de aproximadamente 45 nm) y presentaron el

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(Capítulo 16)

mismo grado de afinidad al agua (efecto barrera). Estos resultados permiten adelantar que la absorción de agua de las resinas Bis–GMA es el factor que más debilita sus propiedades y su calidad. Todos los polímeros obtenidos resultaron ser insolubles, lo cual indica que las moléculas poliméricas están unidas químicamente (entrecruzamiento químico). Este hallazgo es favorable, pues la resistencia mecánica y el módulo elástico de un polímero entrecruzado químicamente son superiores a los del mismo polímero no entrecruzado. Por medio de la fotoacústica pulsada, en la cual un pulso de luz láser se usa como fuente estándar de ultrasonido, se midió el módulo elástico en cada una de la muestras. De nuevo, la muestra que rindió mejores resultados estadísticos fue la que tenía una proporción de 50/50 de cada polímero.23,24 Se observó también que la temperatura de solidificación (temperatura de transición vítrea) y la densidad dependen del contenido de Bis–GMA–sililado. El polímero de proporción de 50/50 es el que mostró la temperatura de transición vítrea y la densidad más altas, lo cual se atribuye a una mayor conversión en la formulación. Estas propiedades imparten al producto una estabilidad dimensional superior. A la vez, se están preparando los refuerzos inorgánicos y se estudia su efecto en las propiedades de las resinas implantadas en los dientes.22,25 Se espera que las resinas experimentales desarrolladas presenten propiedades superiores a las de las resinas comerciales y que puedan servir de andamio para la reconstrucción de tejidos suaves y duros de los dientes (dentina y esmalte).

CONCLUSIONES Las resinas de Bis–GMA–sililado mejoran significativamente las propiedades finales de las resinas dentales: mayores módulos elásticos, una absorción de agua mínima y una estabilidad dimensional alta. Antes de polimerizar, el monómero Bis–GMA–sililado muestra una viscosidad muy baja, lo cual permite reducir de un modo significativo el contenido de diluyente (TEGDMA). Asimismo, presenta una tensión superficial menor, lo cual significa una ventaja importante para la adhesión de la resina al diente después de que polimeriza. La formulación de la resina con una proporción de Bis–GMA/Bis–GMA–sililado de 50/50 mostró propiedades óptimas y un grado de conversión alto (81%) en tiempos similares a los usados en el consultorio dental. Se prevé que las resinas de Bis–GMA–sililado tendrán más probabilidades de ser usadas en un futuro en formulaciones dentales. El estudio realizado permitió desarrollar y mejorar las técnicas de síntesis del Bis–GMA–sililado de alta pureza con 86% de eficiencias. La ruta de polimerización también se optimizó con el objetivo de lograr conversiones altas y tiempos de reacción más cortos.

Desarrollo de nuevos polímeros de restauración dental

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(Capítulo 16)

21. Latorre GM: Desarrollo de compómeros con bases experimentales para aumentar la permanencia adhesiva mediante el mejoramiento de las uniones interfaciales. Tesis de doctorado en ciencias médicas, odontológicas y de la salud. Universidad Nacional Autónoma de México, 2006. 22. Rivera TF: Síntesis y caracterización de Bis–GMA silanizado y reforzado con biovidrio. Tesis de doctorado en ciencia e ingeniería de materiales. Universidad Nacional Autónoma de México (en revisión). 23. Navarrete M, Vera GR, Pineda J: Fractal characterization in Bis–GMA/TEGDMA system. Polymer Testing (en revisión). 24. Gutiérrez JR: Estudio de propiedades mecánicas de polímeros de Bis–GMA modificado. Tesis de licenciatura en ingeniería. Universidad Nacional Autónoma de México (en proceso). 25. Latorre GM, Álvarez CA, Barceló F, Vera GR: Experimental restorative materials with alumino–fluoro–calcium–silicate glass as an alternative for compomers, “New materials, old tests”. Congreso de la Academy of Dental Materials, EUA y Canadá. Lake Louise, Canadá, 30 de octubre de 2005.

17 Biomateriales para tejido óseo María Cristina Piña Barba

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MATERIALES Los materiales han sido objeto de trabajo del hombre desde que éste existe sobre la Tierra. Si bien su estudio se remonta a miles de años, ya que el hombre los emplea para su vida diaria, fue desde el nacimiento de la llamada “ciencia de los materiales” que se clasificaron en metálicos, polímeros, cerámicos y compuestos. Los materiales metálicos se caracterizan por ser buenos conductores de la electricidad y del calor, tener un brillo característico y ser sólidos a temperatura ambiente, con excepción del mercurio. Los polímeros constituyen macromoléculas, generalmente orgánicas, formadas por la unión de moléculas más pequeñas, llamadas monómeros; las proteínas son polímeros sintetizados por los seres vivos. Los materiales cerámicos son compuestos químicos o soluciones complejas que comprenden fases que contienen elementos metálicos y no metálicos, y presentan alta estabilidad y resistencia a las alteraciones químicas; asimismo, son malos conductores del calor y de la electricidad, y generalmente son aislantes. Los materiales compuestos están elaborados por dos o más componentes de los grupos anteriores, que pueden distinguirse físicamente y separarse mecánicamente; tienen varias fases químicamente distintas y propiedades superiores a la simple suma de las propiedades de sus componentes, como el hueso, que es un material compuesto por una matriz ósea (cerámica) reforzada con fibras de colágena (polímero). El estudio de los materiales se puede dividir en: 253

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 17)

S Ciencia de los materiales: estudia la composición, la estructura y las propiedades de las diversas manifestaciones de la materia en el Universo. Las propiedades de los materiales se separan para su estudio en dos grandes ramas: físicas y mecánicas. S Tecnología de los materiales: determina el modo de preparación de los materiales, ya que las propiedades físicas y mecánicas de éstos dependen de su procesamiento, como el fierro, que no tiene las mismas propiedades si se obtiene por fundición que si se hace por extrusión. La tecnología utilizada en la obtención de un material es determinante en sus propiedades físicas y mecánicas. S Aplicación de los materiales: está sujeta al material que se obtenga y sus propiedades, y puede ser médica, industrial o comercial, entre otras. Estas tres grandes ramas de la ciencia y de la ingeniería de los materiales dependen entre sí.

BIOMATERIALES Aunque todavía no hay una definición mundialmente aceptada para biomaterial, se puede decir que es un material o combinación de materiales de origen sintético o natural que puede ser usada durante cualquier periodo de tiempo, como un implante o una prótesis, que atiende, aumenta o reemplaza un tejido, órgano o función del cuerpo humano sin afectar el resto del organismo y sin resultar afectado por él, a menos que así sea diseñado, como el biodegradable. La aparición de biomateriales ha ido a la par del desarrollo de materiales avanzados diseñados mediante técnicas, metodologías, instrumentación y dispositivos científicos modernos para aplicaciones que no tienen que ver con el cuerpo humano. La figura 17–1 muestra de forma esquemática la evolución histórica del concepto y las técnicas utilizadas a lo largo del tiempo para el tratamiento de afecciones humanas. Para determinar si un material es o no biomaterial se debe evaluar su biocompatibilidad y la de los productos de la degradación o corrosión en el organismo, mientras que para evaluar el éxito del implante o de la prótesis en el cuerpo humano el criterio más importante es la evaluación de su biofuncionalidad. Éstas son las tareas de la ciencia de los biomateriales y para llevarlas a cabo se hace uso de todas las disciplinas desarrolladas hasta el momento. En el cuadro 17–1 se ilustran algunas aplicaciones de los biomateriales en diferentes especialidades médicas y quirúrgicas.

Biomateriales para tejido óseo

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Futuro Regeneración tisular Ingeniería de tejidos

Materiales bioactivos

Presente Sustitución tisular Trasplantes e injertos

Implantes y prótesis

Pasado Extirpación Figura 17–1. Desarrollo histórico de la aplicación de los biomateriales.

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Biocompatibilidad Los biomateriales tienen propiedades químicas, físicas y biológicas que les permiten mantenerse en un medio extremadamente hostil para ellos, como es un organismo vivo. La biocompatibilidad de un material puede entenderse como la aceptación de éste por parte del organismo donde es implantado y puede determinarse a través de la interacción del material con los tejidos que lo rodean. Por ello es importante tener en cuenta: 1. La reacción del organismo a los productos de la degradación o corrosión del material. No es suficiente que el material no dañe al organismo, sino que los productos derivados de su corrosión o degradación tampoco deben ser dañinos. 2. Las propiedades físico–químicas y mecánicas del material, como elasticidad, forma, fatiga, degradabilidad y corrosión, ya que éstas determinan su empleo en el organismo y, por lo tanto, su biofuncionalidad. Debido a esto, el estudio de la biocompatibilidad de un material puede dividirse en dos grandes ramas: 1. Caracterización físico–química del material, que comprende estudios como:

256

Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 17)

Cuadro 17–1. Aplicaciones de los biomateriales Área médica Regeneración tisular Cirugía general

Cirugía ortopédica

Cirugía cardiovascular

Cirugía plástica

Aplicaciones dentales y cirugía maxilofacial Oftalmología

Algunas aplicaciones Scaffolds o andamios celulares Catéteres, stents, drenajes, endoscopios, electrodos, respiradores, injertos, suturas, adhesivos, mallas, membranas, cicatrizantes, agentes hemostáticos y biosensores Prótesis de todo tipo de articulaciones (rodilla, cadera, dedos), dispositivos de fijación internos y externos, implantes, cementos óseos, lubricantes, materiales de relleno óseo y suturas Prótesis vasculares, marcapasos, válvulas cardiacas, implantes, catéteres, bombas osmóticas, stents y sistemas de dosificación de medicamentos Implantes de mama, materiales de relleno, piel artificial, colágena, agentes hemostáticos, injertos, suturas, vendajes e implantes de nariz y de oreja Implantes dentales, membranas, sistemas de liberación de medicamentos, prótesis dentales, materiales de relleno y agentes hemostáticos Prótesis oculares, lentes intraoculares, lentes de contacto, córneas, catéteres de drenaje y geles intraoculares

Otorrinolaringología

Prótesis de oído, membranas, implantes cocleares, biosensores y tráqueas biológicas

Neurocirugía

Implantes radiactivos, electrodos, implantes electrónicos y marcapasos

Sistema respiratorio

Componentes para intubación y ventilación pulmonar, respiradores, endoscopios y broncoscopios

Sistema genitourinario

Implantes de vejiga, válvulas, catéteres, stents, catéteres y controladores de incontinencia

Sistema renal Sistemas de liberación controlada

Equipos y componentes de diálisis Implantables, inyectables y transdérmicos

Radiología/braquiterapia

Implantes radiactivos, soluciones de contraste para diagnóstico, hilos, tubos, agujas y cápsulas

S Composición química del material por DRX, ICP–OES y EAA, entre otros. S Densidad, forma, geometría, estructura y microestructura del material. S Propiedades térmicas determinadas por ATG, ATD y DSC. S Propiedades mecánicas (máquina universal Instron), como elasticidad, resistencia, dureza, desgaste, fricción, fatiga, corrosión y envejecimiento. S Propiedades superficiales, como área, hidrofobicidad, textura y porosidad. S Propiedades electroquímicas, como polarización anódica o catódica, y corrosión.

Biomateriales para tejido óseo

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2. Caracterización médica biológica, que se puede dividir a su vez en estudios in vitro, que se llevan a cabo en cultivos de tejidos: citotoxicidad, genotoxicidad, proliferación y adhesión celular, biodegradación y mutagenicidad, entre otros; y en estudios in vivo, los cuales se realizan por implantación en animales (estudios preclínicos) y en seres humanos (estudios clínicos): irritación, inflamación, pirogenicidad, toxicidad sistémica, sensibilización, mutagenicidad, carcinogenicidad, interacción con la sangre y reacción a partículas extrañas.

Biofuncionalidad La biofuncionalidad tiene que ver con el desempeño del dispositivo médico que se implanta. Son importantes las características del diseño del implante, además de la biocompatibilidad del material, la geometría, el tipo de acabado superficial que tiene (hidrofobicidad, hidrofilicidad y rugosidad), las propiedades mecánicas respecto a las del tejido u órgano que lo aloja, el diseño arquitectónico del implante, etc. Clasificación

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Los biomateriales pueden clasificarse en: S Inertes: no presentan interacción con el organismo donde están implantados o bien la cápsula que produce el organismo alrededor de ellos es sumamente delgada (décimas de micra). S Porosos: presentan porosidad adecuada para que las células que los rodean puedan penetrarlos. S Bioactivos: promueven la existencia de enlaces entre ellos y el tejido que los circunda. S Bioabsorbibles: se reabsorben por el organismo una vez que cumplieron con su misión. S Biocompatibles: todos los biomateriales no clasificables en ninguno de los grupos anteriores.

ORGANISMOS REGULADORES Para llevar a cabo los estudios de biocompatibilidad y que sean reconocidos internacionalmente, hay organismos que se dedican a estandarizar cada prueba requerida para la evaluación del material, que incluye los métodos de ensayo, defini-

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 17)

ciones prácticas recomendadas y especificaciones desarrolladas por expertos de todo el mundo. Los más reconocidos son: S ASTM (American Society for Testing and Materials). Fue fundada en 1898 para el desarrollo y estandarización de las características de los materiales, los productos, los sistemas y los servicios, así como para su conocimiento. Cabe la pena aclarar que fue hasta 1974 cuando se incluyó la biocompatibilidad (antes no se evaluaba). S AFNOR (Asociación Francesa de Normalización). S AENOR (Asociación Española de Normalización). S BS (British Standards). S DIN (Deutches Institut für Normung). En los últimos años se crearon el CEN (Commitee European of Normalization) y la ISO (International Standards Organization), que se espera que sea capaz de aglutinar los diversos grupos de trabajo y organizaciones existentes.

HUESO El tejido óseo es una variedad de tejido conjuntivo caracterizado por su rigidez y gran resistencia a la tracción y compresión. La matriz extracelular ósea puede crecer sólo por el depósito de nuevo material sobre la superficie. El hueso está formado por una matriz extracelular sólida y relativamente rígida (material calcificado), y por células que pueden corresponder a osteoblastos, osteocitos y osteoclastos. Desde el punto de vista macroscópico, se divide en hueso cortical, formado por tejido óseo compacto, y en hueso esponjoso, en el cual el tejido óseo se dispone en trabéculas que delimitan las cavidades donde se ubica normalmente la médula ósea. Sus funciones incluyen sostener el cuerpo y ser la base de la locomoción, transmitir el sonido, proteger los órganos principales y almacenar los químicos del organismo. Los huesos pueden verse afectados por traumas, infecciones, tumores o algunas enfermedades propias de los mismos, lo cual hace necesaria su reparación con biomateriales, como implantes, injertos y prótesis. Sin embargo, los procesos de reparación están limitados por el tamaño de la afectación, de ahí la generación de órganos artificiales, que han resultado muy complejos y costosos, y la ingeniería de tejidos, desarrollada durante los últimos 20 años en el campo de los biomateriales. Esta técnica se emplea para regenerar o reparar la funcionalidad de los órganos y los tejidos dañados a través de una mínima intervención quirúrgica.

Biomateriales para tejido óseo

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La ingeniería de tejidos hace uso de los llamados scaffolds o andamios celulares para facilitar el crecimiento de células humanas y de estructuras tridimensionales de biomateriales usadas para el soporte de tejidos o células, y el transporte de nutrientes a los tejidos mientras la regeneración se lleva a cabo. Generalmente están hechos de biopolímeros degradables, pero para tejido óseo se han empleado andamios metálicos y cerámicos con mucho éxito, aunque no se ha probado que desaparezcan los límites de reparación.

Hueso anorgánico

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Se denomina así el hueso que es retirado de toda la materia orgánica que contiene en forma natural; este tipo de hueso se usa en implantes quirúrgicos. Se llama implante xenogénico o xenoimplante al que se obtiene de especies animales diferentes a quien lo recibe, mientras que el implante alogénico se recibe de un individuo de la misma especie y el implante autógeno es donado por el mismo paciente. Los biomateriales empleados en tejido óseo son: S Metálicos: principalmente titanio, aleaciones de titanio y aceros inoxidables con bajo contenido de carbón (SS316L). En la sustitución de tejido duro se corre el riesgo de agregar al torrente sanguíneo iones metálicos producidos por la corrosión de los metales, aunque éstos se encuentren recubiertos con cerámicas biocompatibles, como la hidroxiapatita, el carbón o el diamante. Por ello se procura evitarlos o que dichos metales sean biocompatibles y resistentes a la corrosión, ya que los iones libres causan muchos problemas, como el desarrollo de tumores. S Cerámicos: principalmente hidroxiapatita, biovidrios (basados en fosfatos y silicatos de calcio principalmente), biocerámicas (cerámicas de fosfatos de calcio) y hueso. Los biocerámicos tienen ventajas respecto de los biometales, ya que presentan bioactividad y dependiendo de su composición pueden inducir la formación y el crecimiento del hueso; sin embargo, debido a sus propiedades mecánicas todavía no pueden sustituir la función de soporte y locomoción, como en la cabeza de fémur, ni la resistencia requerida para sustituir dientes y muelas. En el Instituto de Investigaciones en Materiales de la Universidad Nacional Autónoma de México se han desarrollado los siguientes materiales para sustitución o reparación de tejido óseo (figura 17–2): S Hidroxiapatitas obtenidas por diferentes métodos. S Hueso anorgánico proveniente de bovino, denominado Nukbone, que actualmente ya fue probado en todas sus fases, incluidos los estudios in vivo en humanos.

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

(Capítulo 17)

Figura 17–2. Algunos biomateriales desarrollados en el Instituto de Investigaciones en Materiales de la Universidad Nacional Autónoma de México. 1. HA sintética pura compactada. 2. Hueso anorgánico. 3. MEB de hueso anorgánico Nukbone. 4. MEB de colágena. 5. Prótesis ocular. 6. Esponjas de colágena. 7. Algunas presentaciones de Nukbone. 8. HA sintética pura. 9. MEB de cementos óseos fraguados. HA = hidroxiapatita; MEB = microscopia electrónica de barrido.

S Cementos óseos basados en fosfatos de calcio. S Esponjas de colágena tipo I obtenidas a partir de hueso de bovino. En la Universidad Nacional Autónoma de México y en la Universidad Autónoma Metropolitana se lleva a cabo la caracterización físico–química de los materiales producidos, así como la médico–biológica hasta su fase preclínica. La fase clínica se lleva a cabo en colaboración con el Centro Médico General “Ignacio Zaragoza” del Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado. Actualmente el hueso anorgánico Nukbone y las esponjas de colágena obtenidas en el Instituto de Investigaciones en Materiales se emplean con mucho éxito como implantes y andamios celulares.

Biomateriales para tejido óseo

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INGENIERÍA DE TEJIDOS La ingeniería de tejidos es un desarrollo reciente en el campo de los biomateriales y ha tenido un progreso muy rápido en las dos últimas décadas. Es una técnica usada para reparar o regenerar órganos o tejidos dañados y restaurar su funcionalidad con la mínima intervención quirúrgica, que involucra el uso de scaffolds para facilitar el crecimiento de células humanas. La motivación principal para la adopción de scaffolds de tejidos es la escasez de órganos donadores y la administración de la vida media de medicamentos para prevenir el rechazo por parte del sistema inmunitario del paciente. Los scaffolds de tejido son estructuras tridimensionales que se usan para soportar tejidos o células mientras procede la regeneración o formación de órganos; en general se manufacturan con biomateriales poliméricos biodegradables que ayudan en el soporte de células y el transporte de nutrientes a los tejidos. Los biomateriales metálicos y cerámicos se emplean como scaffolds para tejido duro (hueso) y tienen dos aplicaciones básicas: la restauración de los tejidos y la función como controladores y liberadores de medicamentos en el tratamiento de tumores e infecciones. Siempre se ha buscado que los biomateriales sean resistentes y lo más inertes y bioactivos posible. En cambio, los scaffolds, la última novedad en cuanto a las aplicaciones de biomateriales, son deliberadamente débiles y flexibles para minimizar el daño a los tejidos y tener un tiempo de servicio finito predeterminado (tiempo de vida), mucho menor que el esperado para los implantes ortopédicos o dentales. Algunos scaffolds deben poseer una resistencia mecánica adecuada, particularmente a la compresión. Los parámetros de servicio no tradicionales para materiales de implante, como hidrofilicidad, y rapidez de absorción y de liberación de medicamentos son importantes para los materiales con los que se manufacturan los scaffolds. Hay muchas preguntas que se deben resolver, pero los estudios apenas empiezan y con ellos las aplicaciones.

REFERENCIAS 1. Abraham GA, Cuadrado TR: Métodos de caracterización. En: Sastre R, De Aza S, San Román J (eds.): Biomateriales. Italia, CYTED, 2004:173–196. 2. Aguilar MA, Piña MC, López RM, Rodríguez L, Driessens FCM: Cytotoxic and genotoxic effects of the exposition of human lymphocytes to a calcium phosphate cement in vitro. J Applied Biomechanics Biomaterials 2005;3:29–34. 3. Batchelor AW, Chandrasekaran M: Service characteristics of biomedical materials and implants. Series on biomaterials and bioengineering. Londres, Imperial College Press, 2004:3:1–14, 183–200, 229–232.

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(Capítulo 17)

4. Guzmán V, Piña BMC, Murguía N: Stoichiometric hydroxyapatite obtained by precipitation and sol gel processes. Rev Mex Fis 2005;51(3):284–293. 5. Monteiro FJ, San Román J: Introducción y desarrollo histórico. En: Sastre R, De Aza S, San Román J (eds.): Biomateriales. Italia, CYTED, 2004:17–26. 6. Morales J, Pereira C: Biocompatibilidad. En: Sastre R, De Aza S, San Román J (eds.): Biomateriales. Italia, CYTED, 2004:197–218. 7. Piña BMC: Biomateriales. Cuadernos de Posgrado No. 35. México, Facultad de Química, UNAM, 1995:35–48. 8. Piña BMC, Medina MN: Los materiales de implante. Materiales Avanzados 2004;3:6–12. 9. Piña BMC, Tejeda A, Regalado MA, Arenas I, Martín S et al.: Cerámicas mexicanas para la regeneración de piel. Gac Med Mex 2004;140(1):7–14. 10. Quinto HA, Piña BMC: Caracterización física y química de pastas de cementos óseos con ZrO2. Rev Mex Fis 2003;49(2):123–131.

Índice alfabético

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A

cutánea patológica, 159 terapéutica, 66, 67 anormalidad hematopoyética, 195 anticuerpo, 228, 230, 231 antitrombina, 136 humano antirratón, 231 purificado, 230 antígeno, 98, 196, 233 embrionario, 76 específico de estadio, 76 tisular inespecífico, 76 antiinflamatorio no esteroideo, 124, 141 aplasia medular, 81 aplicación del biomaterial, 256 dental y cirugía maxilofacial, 256 apoptosis, 9, 12, 13, 90, 91, 92, 93, 169, 196, 198, 209 aporte de nutriente, 64 de oxígeno, 64

activación de la célula madre, 21 actividad biológica del INF–g, 189 citotóxica del linfocito, 195 adenina, 117 adenovirus, 198, 200 recombinante, 201, 202 adhesión, 249, 250 adhesivo de fibrina, 136 agente molecular, 33 aislamiento clonal, 172 alfalfa, 228, 230, 231 aloinjerto, 127, 167, 174, 175, 181, 182 ampolla, 152 producida por quemadura, 158 andamio celular, 260 anemia, 150 angiogénesis, 14, 15, 23, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 66, 67, 95, 126, 129, 138, 139, 156 263

264

Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

vascular, 63 arteriogénesis, 58 arteriosclerosis, 179 artritis reumatoide, 57, 196 artrosis grave, 143 asma alérgica, 198 astrocito neurogénico, 44 ataxia, 96 aterosclerosis, 56, 66 autoantígeno, 234 autoinjerto, 127, 145, 167, 174, 175, 181, 182 cortical, 132 de célula epitelial, 175 esponjoso, 132 autorrenovación, 25 celular, 85 autorrenovación por división asimétrica, 91

B bacteria, 197, 227 extracelular, 196 intracelular, 196 bioactividad, 259 biocompatibilidad, 255, 257 bioencapsulación, 233 biofísica, 221 biofuncionalidad, 254, 255 bioingeniería, 19 cutánea, 182 bioinjerto, 126, 132 biología celular, 3, 33, 128, 212, 221 de la célula madre, 76, 82 molecular, 33, 128, 212, 221 regenerativa, 29 biomaterial, 4, 9, 10, 11, 31, 33, 68, 114, 115, 127, 131, 254, 258

(Índice alfabético)

bioabsorbible, 257 bioactivo, 257 biocompatible, 257 inerte, 257 óptimo, 86 polimérico biodegradable, 261 poroso, 257 biomolécula, 5, 11 biopolímero, 176 bioquímica, 3, 128, 221 biorreactor, 115 ARS, 129 bioseguridad, 137 biosíntesis del INF–g humano, 188 biotecnología, 3, 158 blastocisto, 24, 98 blastómero, 74 bloqueo de la división celular, 210 bradicinesia, 38 bulbo olfatorio, 40

C calcio, 125 cáncer, 16, 57, 59, 195, 198 de mama, 130 in vivo, 198 carcinoma cutáneo, 153 de célula escamosa, 154 invasivo de célula escamosa, 152 cardiomiocito, 208, 215, 217, 218 dañado, 215 fetal, 217 cardiomiopatía adquirida, 211 cardiopatía isquémica, 215 cascada inflamatoria, 143 ceguera, 60, 98 célula astrocítica de proliferación lenta, 43 célula

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Índice alfabético

autóloga, 13, 219 criopreservada, 98 cutánea, 147 de hepatoma, 200 de la médula ósea, 94, 219 del folículo piloso, 171 del nicho, 80 derivada in vitro, 94 diferenciada, 24 endotelial, 58, 67, 118, 139, 209 progenitora adulta, 65 autóloga, 64 ependimal ciliada, 43 epitelial, 7, 106 formadora de mielina, 96 glial, 37, 44, 78, 96 granular, 42 inmunitaria efectora, 195 interfolicular, 171 madre, 6, 7, 16, 24, 27, 28, 80, 85, 86, 111, 116, 214, 218 adulta, 8, 71, 72, 87, 90, 91, 92, 93, 95 de reserva, 27, 30 diferenciada, 30 humana, 211 in vivo, 94 autóloga, 28 cardiaca, 214, 221 de la médula ósea, 97 del folículo piloso, 171 del hígado, 28 embrionaria, 24, 28, 30, 71, 72, 73, 76, 86, 88, 98 humana, 30, 76, 211 pluripotente, 89 epidérmica, 28, 147, 170, 172 interfolicular, 171 hematopoyética, 6, 27, 60, 74, 78, 91, 113

265

homóloga, 16 humana, 83 neural, 91, 95, 113 normal, 74 pancreática, 97 pluripotencial, 16 pluripotente, 25 progenitora, 7, 33 residente, 26, 33 en el miocardio, 212 totipotente, 25 tumoral, 73 mesenquimatosa, 27 multipotencial, 129 multipotente, 212 muscular, 78 neuroepitelial, 42 no hematopoyética madura, 6 parenquimatosa del corazón, 212 periglomerular, 42 pluripotente, 77, 211 primitiva residente, 215 productora de insulina, 79 progenitora, 22, 28, 79, 86, 91 adulta, 8 endógena, 218 endotelial, 92 exógena, 218 multipotente, 27 neuronal, 40, 42 sanguínea, 78 satélite, 113 tipo A, 43, 45 B, 43, 45 C, 44 E, 43 tirosina hidroxilasa, 46 totipotente, 72, 87, 89, 92 transitoria amplificadora, 44 trasplantada, 219

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troncal, 40, 41, 48, 86 embrionaria, 41, 81 endógena, 48 mesenquimatosa, 92 cemento óseo, 260 cerámica, 64 cicatriz, 15, 24, 176, 213 fibrosa, 26, 140 cicatrización, 22, 156 de herida, 157, 177 aguda, 155 de la herida, 87, 179 fetal sin formación cicatrizal, 24 impedida, 156 ciencia del biomaterial, 19 cigoto, 88 totipotente, 24 ciprofloxacino, 124 cirugía cardiovascular, 256 general, 256 ortopédica, 256 plástica, 256 citocina, 194 clon, 171 colágena, 114 tipo I, 14 colágeno, 125, 170 compómero, 244 componentes del nicho, 80 composición química, 256 compósito, 243 compuesto bioquímico, 11 farmacéutico, 228 derivado de planta, 237 construcción bioartificial, 32, 33 de tejido, 68 tisular tridimensional, 14, 68 constructo, 114, 115

(Índice alfabético)

de córnea, 112, 118 de órgano, 114 tisular, 114 corazón artificial, 209 córnea, 116 artificial, 116, 118 in vivo, 117 corrosión, 259 costo–beneficio, 145 crecimiento, 13, 16 celular, 77 colateral, 58 vascular, 55, 56 criopreservación, 182 cromatina, 77, 78 cuantificación celular, 62 cuarta dimensión, 12 cubierta gingival, 106 cultivo celular, 8, 116, 117 de célula epidérmica, 174 de hueso, 105 tridimensional, 12 curación de herida, 159 de la herida, 179

D daño celular, 213 del cartílago articular, 31 nervioso, 107 decorticación, 126 déficit de dopamina, 39, 45 deformidad articular, 142 degeneración de neurona dopaminérgica, 39 macular, 60 tisular, 86 deportista, 141

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Índice alfabético

dermis, 23, 168, 170 desarrollo embrionario, 9, 12, 42, 55 posnatal, 41 tardío, 41 desdiferenciación, 21, 29, 115 transdeterminada de la célula madura, 21 desmina humana, 150 determinante extrínseco, 90 intrínseco, 90 diabetes, 16, 20, 31, 56, 66, 200 juvenil, 96 mellitus, 179 tipo 1, 97 tipo 2, 4 diabética, 32 diferenciación, 8, 9, 12, 13, 16, 22, 23, 24, 28, 31, 45, 65, 67, 73, 76, 89, 91, 92, 113, 115, 135, 214 celular, 25, 31, 136, 210 controlada, 73 de la célula madre, 77 epidérmica, 168 disfunción mitocondrial, 39 distracción externa, 108 gradual, 109 histiogénica, 106 osteogénica, 107, 108 división, 58 celular, 12, 77 rápida, 214 simétrica, 90 dopamina, 38

E edema medular, 132

267

edentulismo, 131 efecto antiinflamatorio, del PRP, 143 eficacia antiinflamatoria, del PRP, 142 elaboración de constructo, 112 elastina, 170 embriogénesis, 59 humana, 90 embrión, 6 haploide, 33 encefalomielitis alérgica experimental, 198 endostio, 81, 82 endotelio nuevo, 65 enfermedad angiogénica, 56 cardiaca, 20 cardiovascular, 207 congénita, 19 crónica degenerativa, 19, 26 de Alzheimer, 4, 16, 96 de Huntington, 96 de la vejez, 19 de Parkinson, 4, 16, 30, 37, 39, 45, 46, 48, 96 degenerativa, 7 del sistema nervioso central, 20 inflamatoria, 196 isquémica, 211 de la retina, 59 del corazón, 4, 207 del sistema nervioso central, 4 musculosquelética, 20 neurológica, 30 renal, 20 vírica, 136 epidermis, 23, 168, 169, 171 epidermólisis, 149 bullosa, 150

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

distrófica, 150, 152, 153, 181 juntural, 151, 181 simple, 150 epimorfosis, 21 equilibrio homeostático, 90 equivalente cutáneo, 177 rico en fibrina, 180 esclerosis múltiple, 96 esfingosina, 138 espasmo reactivo de músculo, periarticular, 142 espectroscopia, 246 esponja de colágena tipo I, 260 estirpe celular, 116 embriológica, 5 estrato córneo, 169 estrés fisiológico, 213 oxidativo, 39 estructura biominética tridimensional, 31 de polímero, 16 microvascular, 14 tridimensional de islote, 97 evolución de la lesión, 141 tumoral, 56 expansión, 8 expresión de INF–g, 191 génica, 193

F fabricación de tejido, 61 factor angiogénico, 57, 60 de ambiente, 139

(Índice alfabético)

de crecimiento, 12, 14, 25, 30, 76, 111, 115, 135, 136, 137, 139, 155, 194, 214 capaz, 86 del endotelio vascular, 156 epidérmico, 59, 194 humano, 234 fibroblástico básico, 59 hepático, 157 humano, 234 parecido a la insulina, 234 recombinante, 138 de granulocito estimulante de colonia, 234 de proliferación, 31 de transcripción, 26, 76, 78, 191, 193, 194 del desarrollo embrionario, 26 estimulante de colonia de granulocito, 192 de macrófago, 192 inhibidor angiogénico endógeno, 61 de leucemia, 89 neurotrófico, 96 falla cardiaca, 211 orgánica del hígado, 16 del riñón, 16 fascitis necrotizante, 177 fenómeno de plasticidad, 92 fenotipo, 6, 13, 75, 212 celular, 29 fibra colágeno, 109 de colágeno, 107 nerviosa, 107 fibrilla dérmica, 151 fibrina, 62, 117, 137, 176, 177 adhesiva, 137

Índice alfabético

humana, 182 fibrinógeno, 137 fibroblasto, 141, 148, 170, 176, 177, 190, 209 adulto, 75 alogénico, 181 embrionario, 75 neonatal, 183 fibrosis, 24, 25, 26, 29, 33, 95, 140 quística, 159 flomerulonefritis autoinmunitaria, 199 foco seudoartrósico, 126 formación de cartílago, 26 de la cicatriz, 23 de órgano, 261 tisular tridimensional, 11 fotopolimerización, 248 fracaso de consolidación ósea, 128 fractura, 124 fragilidad cutánea, 152 función ventricular, 218 fusión celular, 113

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G gástrula, 89 gen de la contracción, 209 humano, 189 inducible de IFN–g, 193 murino, 189 pluripotente, 75 generación de hueso in situ, 105 génica, 19 genodermatosis, 149 genoma, 6 giro dentado, 40 glastocito, 86, 88

glía, 48 radial, 41, 44 glucoproteína, 231 gonartrosis, 142, 143, 144 granulocito, 74

H hemartrosis, 142 hematoma, 126, 141, 142 encapsulado, 141 muscular, 140 hematopoyesis ectópica, 81 hemostasis, 26 hemoterapia, 143 hepatitis B crónica, 200 C, 136 hepatocito, 78 herida aguda, 155 crónica, 155, 178 difícil, 178 escisional, 32 pequeña, 182 hidrocortisona, 117 hidroxiapatita, 259 hiperlipidemia, 56 hiperplasia, 209 compensatoria, 21, 29 de los cardiomiocitos, 208 hipertensión, 211 arterial, 66 sistémica, 56 hipertrofia, 209, 215 hipometilación, 191 hipoxia, 8, 24, 64, 95, 213 aguda, 63 crónica del tejido dañado, 63 holoclón, 171 homeostasis, 212

269

270

Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

celular, 216 fisiológica, 93 homodímero, 193 hormona de crecimiento, 194 paratiroidea, 81 hueso anorgánico, 259 cortical, 258 esponjoso, 258 nuevo, 123, 132

I IFN–g, 188 humano, 188 implante, 254, 257, 258 alogénico, 259 autógeno, 259 dental, 261 ortopédico, 261 xenogénico, 259 inducción, 112 regenerativa tisular, 145 infarto, 211 agudo del miocardio, 207 del miocardio, 31, 95, 213, 214, 220 infección, 15, 126, 150, 157, 158, 160, 195 pulmonar, 197 viral, 39 infiltración de cortisona, 141 de madrófago, 195 inflamación, 15, 23, 26, 140, 142 crónica, 195 excesiva, 140 ingeniería de material, 3

(Índice alfabético)

de tejido, 261 genética, 227 tisular, 4, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 19, 29, 60, 63, 112, 114, 119, 128, 167, 175, 221 in situ, 109 inhibidor inflamatorio, 137 injerto, 127, 156, 258 autólogo, 4 cutáneo, 157 de melanocito, 182 de piel, 172, 173 libre, 173 en malla, 173 óseo, 105, 109 autólogo, 126 inmunidad, 15 inmunodeficiencia congénita, 98 de leucemia, 98 inmunogenicidad, 73 insuficiencia cardiaca, 215 avanzada, 208 insulina, 117 interferón, 202 alfa, 187 gamma, 187 tipo I, 187, 189 invasión vascular, 68 inyección, 231 intradérmica de colágeno tipo VII, 153 subcutánea, 148 isquemia, 14, 55, 66

L lámina de queratinocito, 177 lechuga transgénica, 235 lesión articular, 142

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de la médula espinal, 20 de la SNc, 46 muscular, 138 neurológica, 126 precancerosa, 154 tendinosa, 142 leucemia aguda, 74 ligando IFN–g, 193 linaje, 28 celular, 72, 129, 215 distinto, 80 no esperado, 78 somático, 78 línea celular, 6, 16, 152 cardiaca, 218 humana, 99 madre, 88 pluripotente, 89 de célula deficiente, 74 endotelial, 68 madre embrionaria, 75 troncal embrionaria, 71 embrionaria, 73, 74 linfoma, 130 linfopenia, 195 lupus eritematoso sistémico, 199 luz solar, 154

M macrófago, 79, 190, 195 maduración, 93 manipulación inmunitaria, 8 masa de músculo cardiaco, 210 ventricular, 217 material biomaterial, 111

271

cerámico, 253 compuesto, 253 estructural bioactivo, 11 metálico, 253 sintético, 10 matriz acelular, 112 artificial, 73 bioabsorbible, 10 bioactiva, 10 celular, 22 de biomaterial, 176 de colágena reticular, 23 extracelular, 5, 10, 11, 13, 62, 66, 114, 115, 129, 140, 189 fibrilar, 139 humana, 73 insoluble, 9 soluble, 9 ósea desmineralizada, 114 rica en fibrina, 177 medicamento huérfano, 133 medicina regenerativa, 3, 5, 16, 19, 20, 21, 25, 29, 33, 85 meroclón, 171 metal poroso, 64 metaloproteinasas de la matriz, 59 micobacteria no tuberculosa, 201 microbacteria no tuberculosa, 197 micromedio, 80 hematopoyético, 80 microtomografía computarizada, 62 migración, 12, 21, 45, 58, 115, 156 celular, 31 guiada, 67 mioblasto esquelético, 95, 217 miocardio dañado, 213 muerto, 215 miocito derivado de la célula embrionaria, 217

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

miofibra, 140 mitogénesis, 135 mitosis, 136 molécula, 3 monocito, 79 monómero, 189, 246, 247 Bis–GMA, 244, 246 Bis–GMA–sililado, 246, 250 morfogénesis, 67 morfolaxis, 21 muerte celular, 64, 209 de neurona dopaminérgica, 39

N necrosis de miofibra, 140 del hígado, 194 tisular, 14, 55, 95 nefritis, 197 lúpica, 196 neoangiogénesis, 15 neoformación ósea, 106, 108, 109 neovascularización, 64 nestina, 41 neumonía, 197 neuroblasto proliferativo, 43 neurocirugía, 256 neurodegeneración, 48 neurogénesis, 37, 40, 42, 44, 45, 46, 64 neuroglía, 44 neurona, 41, 44, 48, 78 dopaminérgica, 40, 47 de la SNc, 45, 46 específica, 95 granular nueva, 42 nicho, 81, 82, 92, 140 ambiente, 28

(Índice alfabético)

noradrenalina, 82

O octámero, 191 oftalmología, 256 organismo regulador, 257 órgano biohíbrido autólogo, 19 diana, 116 organogénesis, 57 humana, 90 osteoartritis, 4 osteoblasto, 81, 123 osteoconducción, 123, 127 osteogénesis, 123, 128 imperfecta, 94 osteoinducción, 123, 127 osteonecrosis, 133 de la cabeza femoral, 132, 133 osteoporosis, 20 osteosíntesis, 126 osteotomía, 106, 108 otorrinolaringología, 256

P paciente con cáncer, 130 con hepatitis crónica C, 201 con infarto agudo del miocardio, 208 con problema de retina, 98 con quemadura, 175, 177 inmunocompetente, 198 quemado, 153 papa, 228, 235 paraclón, 171 parálisis, 107 parásito, 196

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paresia, 107 patología deportiva, 141 musculotendinosa, 143 patológico, 213 pérdida celular gradual, 215 de neurona dopaminérgica de la SNc, 48 piel, 147, 167 planta, 227, 228 transgénica, 227, 228, 231, 235 planticuerpo, 230, 231 plasma rico en plaqueta, 125 plasticidad, 6, 7, 65, 67, 91, 99, 215 pluripotencia, 90 pluripotencialidad, 25 polimerización, 246 polímero, 249, 253 biocompatible, 10, 68 biodegradable, 66, 68 entrecruzado, 250 natural, 64 no entrecruzado, 250 para resina dental, 244 sintético, 64 preeclampsia, 56 preparación de PRP, 137 preservación de la sangre del cordón umbilical, 97 proceso de cicatrización, 62 de envejecimiento, 86 inflamatorio, 23 producción de proteína, 57 producto celular, 131 génico, 149 progenitor local, 80 proliferación, 8, 9, 21, 23, 25, 31, 45, 58, 67, 76, 79, 89, 93, 113

273

celular, 92 propiedad del polímero Bis–GMA, 249 Bis–GMA–sililado, 249 electroquímica, 256 física, 254 mecánica, 254, 256 superficial, 256 térmica, 256 proteína bacteriana, 231 del retinoblastoma, 210 heteróloga, 234, 235 humana, 228 inmunogénica, 231 morfogenética de hueso, 234 recombinante, 235 en planta, 228 viral, 231 prótesis, 4, 254, 258 protooncogén, 209 PRP autólogo, 138, 140 psoriasis, 55

Q quemadura, 20, 63, 155, 173 extensa, 177 queratina, 150, 168 K12, 117 queratinocito, 28, 148, 150, 152, 153, 154, 168, 172, 177 autólogo, 175, 181 epidérmico, 174 humano, 156, 158 posnatal, 172 suprabasal, 169 queratocito, 117, 118 quimiocina, 197 quimiotaxis, 135, 136

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de los monocitos, 60

R radiología/braquiterapia, 256 receptor de IFN–g, 190 dopaminérgico, 39 recidiva, 106 red microvascular específica, 64 reemplazo, 26 cutáneo, 175 de célula muerta, 210 del islote pancreático destruido, 97 neuronal, 37 reepitelización de herida, 157 refractaria, 178 regeneración, 15, 20, 29, 30, 31, 32, 33, 86, 87, 128, 259, 261 a nivel celular, 22 celular, 93 completa, 27 con célula autóloga del miocardio, 213 cutánea, 171 permanente, 147 de célula dañada, 98 de la célula madre cardiaca, 212 de la epidermis, 170 de tejido óseo, 130 del miocardio, 217 del sistema nervioso, 40 inducida por lesión, 25 mediada por linfocito, 138 muscular, 107 ósea, 123, 132 tisular, 57, 85, 129, 182, 256 guiada, 114 normal, 62

(Índice alfabético)

vascular, 23, 65 remodelación, 15 renovación, 86 reparación, 15, 86, 87 de herida, 159 de una herida, 62 génica, 82 ósea, 123 reperfusión del epicardio, 208 reposición celular, 71 represor génico, 77 reserva celular, 216 resina acrílica, 245 compuesta, 244 de Bis–GMA–sililado, 250 dental, 243, 245 de Bis–GMA, 247 líquida, 246 moderna, 244 resistencia adhesiva, 245 mecánica, 250 respuesta biológica, 15 restitución tisular, 87 retinopatía, 55 diabética, 57 revascularización, 132, 207 revolución biomédica, 33 rigidez, 38 ruptura fibrilar, 140

S scaffolds, 259, 261 secreción de matriz extracelular, 136 sellador, 143, 145 señal molecular, 112 paracrina, 93

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seudoartrosis, 125, 131 hipertrófica, 126 hipotrófica, 126 no complicada, 127 no hipertrófica, 131 recalcitrante de clavícula, 131 diafisiaria de fémur, 131 síndrome de liberación citocínica aguda, 195 de Pierre Robin, 109 de Treacher Collins, 109 mieloproliferativo, 74 síntesis del factor soluble angiogénico, 63 del IFN–g, 202 sobrecarga, 211, 213 soya, 228, 230 suero bovino, 117 sustancia nigra, 40 pars compacta, 38 sustituto completo de córnea, 116, 117 cutáneo, 175, 176, 182 alogénico, 179 autólogo, 178

T tabaco, 228, 230 tejido autólogo, 109 bioartificial, 31, 33 biohíbrido autólogo, 19 biointeractivo, 3 blando, 105, 106 cicatricial, 32 cicatrizal, 219

275

conectivo, 6, 107 dañado, 159, 220 destruido, 220 dinámico, 214 epitelial, 6 fibroso, 109 humano, 3 in vitro, 5, 12 in vivo, 5, 12 lesionado, 58 muscular, 6 nervioso, 6 nuevo, 112, 113 óseo, 258 tumoral, 58 tensión de oxígeno local, 23 superficial, 247, 250 terapia autóloga, 138 celular, 3, 33, 73, 83, 85, 181, 219, 220 génica, 93, 153, 202 con adenovirus, 188 cutánea, 147, 154, 157 regenerativa, 98, 148 tirosina cinasa, 193 hidroxilasa, 47 tiroxina, 117 totipotente, 88 toxina colérica, 117 exógena, 39 transdiferenciación, 72, 79, 113, 215 transferencia celular, 112 génica, 147, 152, 155 nuclear, 74, 75 trasplante, 19, 66, 115, 218

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Medicina regenerativa e ingeniería tisular...

alogénico, 173 autólogo, 93 ce célula madre epidérmica, 149 de célula endotelial progenitora, 65 cardiaco, 208 celular, 4, 30, 218 de célula, 200 de la médula ósea, 213 madre de la córnea, 98 progenitora, 66 de córnea, 116 de la médula ósea, 25 de lámina epidérmica, 155 de médula ósea, 216 de mioblasto esquelético, 218 de órgano, 200 de tejido construido, 61 homólogo, 4, 217 nuclear, 32 xenogénico, 173 tratamiento antiinflamatorio, 143 de la insuficiencia cardiaca, 214 de quemadura, 32, 173 oncológico, 94 regenerativo miocárdico, 220 trauma, 19, 195 traumatismo, 63 trofoblasto, 88 de la placenta, 88 trombólisis, 207 tuberculosis pulmonar progresiva, 201 resistente a múltiples fármacos, 202

(Índice alfabético)

U úlcera de la piel, 181 vascular, 32 ultravioleta, 154

V vacuna, 231, 233, 237 comestible, 234 vasculogénesis, 58, 139 terapéutica, 66 vector, 148 lentiviral, 149 no viral, 152 retroviral, 149, 152 sintético, 149 vidrio, 245 virus, 196 de la hepatitis C, 200 de la hepatitis B, 235 del herpes, 230 vitamina C, 125 D, 125, 168 K, 125

X xenoimplante, 259 xenoingerto, 167 xenoinjerto, 174, 175 xeroderma pigmentosum, 153, 154