Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student: A Practical Approach [2 ed.] 3031261968, 9783031261961

This book is designed to give students an understanding of the role of microorganisms in food processing and preservatio

862 165 10MB

English Pages 163 [164] Year 2023

Report DMCA / Copyright

DOWNLOAD FILE

Polecaj historie

Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student: A Practical Approach [2 ed.]
 3031261968, 9783031261961

Table of contents :
Preface to the Second Edition
Preface to the First Edition
Acknowledgments
Contents
About the Authors
1: Food Microbiology Laboratory Safety and Notebook Record
Three Principles of Conducting Food Microbiology Lab Work
Introduction of Biosafety Level (BSL)
Lab Safety Rules
Lab Notebook Requirement
2: Staining Technology and Bright-Field Microscope Use
Major Experimental Materials
Gram Stain Procedure
Endospore Stain Procedure
Bright-Field Microscope Use
3: Enumeration of Bacteria in Broth Suspension by Spread and Pour Plating
Major Experimental Materials
Dilution Procedure
Numeration
Review Questions
4: Isolation of Foodborne Pathogens on Selective, Differential, and Enrichment Medium by Streak-Plating
Introduction of Selective and Differential Medium
Introduction of Medium for Isolating Foodborne Pathogens
Practice of Streak-Plating
Figure of Streak-Plating
Question for Review
5: Enumeration of Aerobic Plate Counts, Coliforms, and Escherichia coli of Organic Fruit Juice on Petrifilm
Major Experimental Materials
Introduction
Procedure of Plating Upon Petrifilm
6: Enumeration and Identification of Staphylococcus aureus in Chicken Salads
Major Experimental Materials
Enumeration of S. aureus in Chicken Salads
Procedure
Review Question
Lab Work Flowchart
Part of Result Figures (Work from Previous Students)
Untitled
7: Enumeration and Identification of Listeria monocytogenes on Ready-to-Eat (RTE) Frankfurters
Major Experimental Materials
Lab Work Procedure
Enumeration of L. monocytogenes or L. monocytogenes on Frankfurters
Procedure
Review Questions
Lab Work Flochart
Part of Result Figures (Work from Previous Students)
8: Isolation and Identification of Salmonella and Campylobacter spp. on Broiler Carcasses
Major Experimental Materials
Major Medium Used for Salmonella Isolation
Major Medium Used for Campylobacter Isolation
Lab Work Procedure
Figure of API-20 E Results Sheet
Review Question
API 20 E Test Results Table of Color Change
Positive Salmonella spp. Result
Lab Work Flowchart (Salmonella)
Lab Work Flowchart (Campylobacter)
Part of Results Figures (Work from Previous Students)
9: Thermal Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in Non-intact Reconstructed Beef Patties
Major Experimental Material
Lab Work Procedure
Identification of E. coli O157:H7
Procedure
USDA-Integrated-Predictive-Modeling-Program Software
Brief Procedures
References (After Class Reading)
Review Question
10: Thermal Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in Mechanically Tenderized Beefsteaks and Color Measurement
Major Experimental Material
Lab Work Procedure
Example of the Lab Result
Lab Work Flowchart
General Operating Procedure for Minolta Colorimeter CR 300 Series
Equipment Reset Steps
Results Picture from Previous Lab Sections
Color Meter Lab Work Flowchart
Review Questions
11: Evaluate Antimicrobial Activity of Chlorine Water on Apples and Measurement of Free Chlorine Concentrations
Major Experimental Material
Procedure: Two Students/One Group
Lab Work Flowchart
Test Free Chlorine Concentration Using DPD Kit Flowchart
Review Questions
12: Evaluate Cross-Contamination of Salmonella on Tomatoes in Wash Water Using Most Probable Number (MPN) Technique
Major Experimental Material
Procedure: Two Students/One Group
Lab Work Flowchart
MPN Work Flowchart
MPN Calculation Lab Work Flowchart
Review Questions
13: Cultivation of Anaerobic Bacteria in Canned Food
Major Experimental Materials
Introduction
Procedure
Procedure of Cooked Meat Medium
Procedure of Detecting Possible Clostridium Perfringens
Review Question
Pictures
14: Observation and Enumeration of Molds from Spoiled Bread
Major Experimental Material
Procedure: Lacto-Phenol Cotton Blue Stain
Enumeration of Molds in Bread
Review Question
Lab Work Flowchart
Part of Results Figures (Work from Previous Students)
15: DNA Extraction and Purity Determination of Foodborne Pathogens
Major Experimental Material
Lab Work Procedure
DNA Extraction and Purity Measurement Lab Work Flowchart
16: Practice of Multiplex PCR for Bacteria Identification
Major Experimental Material
Lab Work Procedure
PCR Lab Work Flowchart
Review Question
17: PCR Identification of Listeria Monocytogenes in Deli Meat
Major Materials and Equipment
Equipment
Procedure
Lab Work Flowchart
18: Cheese Making and Characterization
Major Materials and Equipment
Procedure
Lab Work FlowChart
19: Wine and Pickle Making and Characterization
Major Experimental Materials
Procedure
Lab Work Flowchart
Lab Work Flowchart
Lab Work Flowchart
20: Antimicrobial Resistance of Commensal Bacteria from Environment
Major Experimental Materials
Lab Work Procedure
Disk Diffusion Test
Kirby-Bauer Test Lab Work Flowchart
21: Introduction of Oral Presentation and Job Interview Preparation
Major Presentation Topics
Presentation Bodies
Suggested Peer-Reviewed Journals
Suggested Literature Search Website
Tips for a Good Oral Presentation
Presenter/Leader: Evaluation Rubrics (150 Points)
Practice of Job Interview
Tips for Job Search
Course Description
Methods of Instruction
Expected Learning Outcomes
Outlines of Topics
Required Equipment
Attendance Requirements
Grading
Grading Scale
Availability of Lecture Notes
General Education Curriculum Statement
Physical Handicap Statement
Inclusivity Statement
Cell Phone Usage
Academic Integrity Statement
Laboratory Safety Rules/Procedures
Adverse Weather Statement
COVID-19 Syllabus Statement
Course Description
Course Objectives
Reference Books
Course Evaluation
Grading Scales
Course Drops and Withdrawals
Academic Dishonesty: Plagiarism and Cheating
Student Disabilities Services
Index

Citation preview

Cangliang Shen Yifan Zhang

Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student A Practical Approach Second Edition

Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student

Cangliang Shen • Yifan Zhang

Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student A Practical Approach Second Edition

Cangliang Shen Division of Animal and Nutritional Sciences West Virginia University Morgantown, WV, USA

Yifan Zhang Department of Nutrition and Food Science Wayne State University Detroit, MI, USA

ISBN 978-3-031-26196-1    ISBN 978-3-031-26197-8 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-3-031-26197-8 © The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2017, 2023 This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed. The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use. The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations. This Springer imprint is published by the registered company Springer Nature Switzerland AG The registered company address is: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland

Preface to the Second Edition

After publishing the 1st edition for 5 years, we realize that it is better to revise and update for a 2nd edition of this food microbiology laboratory textbook. We add five new chapters including “Chapter 10—Thermal Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in Mechanically Tenderized Beef Steaks and Color Measurements”, “Chapter 11—Evaluate Antimicrobial Activity of Chlorine Water on Apples and Measurement of Free Chlorine Concentrations”, “Chapter 12–Evaluate Cross-contamination of Salmonella on Tomatoes in Wash Water Using Most Probable Number (MPN) Technique”, “Chapter 15—DNA Extraction and Purity Determination of Foodborne Pathogens”, and “Chapter 16—Practice of Multiplex PCR to Identify Bacteria in Bacterial Solutions”. We also include new lab work flowcharts for Gram-staining and endospore-staining technology in Chapter 1, pour plating and spread plating in Chapter 3, Enterotube II in Chapter 9, and Kirby-Bauer test procedure in Chapter 20. We include a new sample of syllabus with the hybrid teaching of both lecture and lab sections in one course, which will assist junior faculty/ instructors to develop similar lecture and lab courses. Division of Animal and Nutritional Sciences West Virginia University Morgantown, WV, USA

Cangliang Shen

v

Preface to the First Edition

In order to help food science students to understand the relationship between microorganism and food products, it is important to develop a food microbiology laboratory textbook. Currently, a very limited amount of food microbiology laboratory manual is commercially available, which makes it difficult for students to have a useful food microbiology laboratory manual with them. The aim of this book is to supply food microbiology lab course instructor with a useful lab manual to teach this course and food science students and food microbiologists who will be working in food industry with a readable easily understanding and following laboratory manual. This book is designed to give students an understanding of the role of microorganisms in food processing and preservation; relation of microorganisms to food contamination, foodborne illness, and intoxication; general food processing and quality control; role of microorganisms in health promotion; and federal food processing regulations. The listed laboratory exercises are aimed to provide a hands-on-­ opportunity for the student to practice and observe the principles of food microbiology especially enumeration, isolation and identification of microorganism in foods. Students will familiarize themselves with the techniques used to research, regulate, prevent and control the microorganisms in food and understand the function of beneficial microorganism during food manufacturing process. This book includes almost all pictures of each step of lab work, and all the pictures are coming from real lab practice and lab results. This lab manual is typically fit for small land-grant Institutions to teach food microbiology lab class, and for non-land grant universities who plan to develop food science course curriculum. Division of Animal and Nutritional Sciences West Virginia University Morgantown, WV, USA

Cangliang Shen

vii

Acknowledgments

I appreciate my division director Dr. Robert Taylor who assigned me to develop and teach food microbiology laboratory course when I joined West Virginia University. I got the inspiration of writing this food microbiology manual from my Ph.D. advisor Dr. John N. Sofos, University Distinguished Professor of Colorado State University. He taught me “safety, quality, and quantity” are the three basic principles to conduct any food microbiology research almost 10 years ago when I was an amateur of food microbiology. I will pass this information to my future students and readers of this lab manual. I would love to greatly appreciate Ms. Lindsey Williams, communication manager at Davis College, West Virginia University, who has helped to take all pictures of all lab works and results in each chapter. I want to thank my graduate students, Mr. Corey Coe, Mr. KaWang Li, Ms. Rebecca Stearns, and Ms. Lacey Lemonakis, and my undergraduate teaching assistants, Ms. Carly Long, Payton Southall, Jordan Garry, and Jessica Clegg, for their generous help during writing of this lab manual. The written of Chapter 14 obtained strong support from Mr. Mark Carlson at Western Kentucky University. This 2nd edition book was supported by the United States Department of Agriculture, the National Institute of Food and Agriculture-Research and Extension Experiences for Undergraduates (REEU) program (Award #2020-­68018-­30657). Finally, I would love to thank my wife Dr. Yi Xu for her love and support. This book is also dedicated to my 6-year-old son Alex Shen. Division of Animal and Nutritional Sciences West Virginia University Morgantown, WV, USA

Cangliang Shen

ix

Contents

1 Food  Microbiology Laboratory Safety and Notebook Record����������������������������������������������������������������������   1 Three Principles of Conducting Food Microbiology Lab Work������    1 Introduction of Biosafety Level (BSL)��������������������������������������������    1 Lab Safety Rules������������������������������������������������������������������������������    1 Lab Notebook Requirement������������������������������������������������������������    2 2 Staining  Technology and Bright-­Field Microscope Use��������������    9 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������    9 Gram Stain Procedure����������������������������������������������������������������������   10 Endospore Stain Procedure��������������������������������������������������������������   10 Bright-Field Microscope Use����������������������������������������������������������   11 3 Enumeration  of Bacteria in Broth Suspension by Spread and Pour Plating����������������������������������������������������������   19 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������   19 Dilution Procedure ��������������������������������������������������������������������������   20 Numeration��������������������������������������������������������������������������������������   21 Review Questions����������������������������������������������������������������������������   21 4 Isolation  of Foodborne Pathogens on Selective, Differential, and Enrichment Medium by Streak-Plating ��������   25 Introduction of Selective and Differential Medium ������������������������   25 Introduction of Medium for Isolating Foodborne Pathogens����������   25 Practice of Streak-Plating����������������������������������������������������������������   26 Figure of Streak-Plating������������������������������������������������������������������   26 Question for Review������������������������������������������������������������������������   27 5 Enumeration  of Aerobic Plate Counts, Coliforms, and Escherichia coli of Organic Fruit Juice on Petrifilm ����������   31 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������   31 Introduction��������������������������������������������������������������������������������������   31 Procedure of Plating Upon Petrifilm������������������������������������������������   32 6 Enumeration  and Identification of Staphylococcus aureus in Chicken Salads��������������������������������������������������������������������������   39 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������   39 Enumeration of S. aureus in Chicken Salads ����������������������������������   39 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������   40 xi

Contents

xii

Review Question������������������������������������������������������������������������������   40 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������   41 Part of Result Figures (Work from Previous Students)��������������������   42 7 Enumeration  and Identification of Listeria monocytogenes on Ready-to-Eat (RTE) Frankfurters������������������������������������������   45 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������   45 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������   46 Enumeration of L. monocytogenes or L. monocytogenes on Frankfurters��������������������������������������������������������������������������������   46 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������   46 Review Questions����������������������������������������������������������������������������   47 Lab Work Flochart ��������������������������������������������������������������������������   47 Part of Result Figures (Work from Previous Students)��������������������   48 8 Isolation  and Identification of Salmonella and Campylobacter spp. on Broiler Carcasses ����������������������������   53 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������   53 Major Medium Used for Salmonella Isolation��������������������������������   54 Major Medium Used for Campylobacter Isolation��������������������������   54 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������   54 Figure of API-20 E Results Sheet����������������������������������������������������   56 Review Question������������������������������������������������������������������������������   56 API 20 E Test Results Table of Color Change ��������������������������������   56 Positive Salmonella spp. Result ������������������������������������������������������   57 Lab Work Flowchart (Salmonella)��������������������������������������������������   58 Lab Work Flowchart (Campylobacter)��������������������������������������������   59 Part of Results Figures (Work from Previous Students)������������������   60 9 T  hermal Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in Non-intact Reconstructed Beef Patties������������������������������������   63 Major Experimental Material����������������������������������������������������������   63 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������   64 Identification of E. coli O157:H7����������������������������������������������������   65 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������   66 USDA-Integrated-Predictive-­Modeling-Program Software������������   68 Brief Procedures������������������������������������������������������������������������������   68 References (After Class Reading)����������������������������������������������������   68 Review Question������������������������������������������������������������������������������   68 10 T  hermal Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in Mechanically Tenderized Beefsteaks and Color Measurement����������������������������������������������������������������   71 Major Experimental Material����������������������������������������������������������   71 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������   72 Example of the Lab Result��������������������������������������������������������������   73 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������   74 General Operating Procedure for Minolta Colorimeter CR 300 Series��������������������������������������������������������������   75 Equipment Reset Steps��������������������������������������������������������������������   75

Contents

xiii

Results Picture from Previous Lab Sections������������������������������������   76 Color Meter Lab Work Flowchart����������������������������������������������������   77 Review Questions����������������������������������������������������������������������������   78 11 E  valuate Antimicrobial Activity of Chlorine Water on Apples and Measurement of Free Chlorine Concentrations ������������������������������������������������������������������������������   81 Major Experimental Material����������������������������������������������������������   81 Procedure: Two Students/One Group����������������������������������������������   82 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������   84 Test Free Chlorine Concentration Using DPD Kit Flowchart ��������   85 Review Questions����������������������������������������������������������������������������   86 12 E  valuate Cross-Contamination of Salmonella on Tomatoes in Wash Water Using Most Probable Number (MPN) Technique������������������������������������������������������������   89 Major Experimental Material����������������������������������������������������������   89 Procedure: Two Students/One Group����������������������������������������������   90 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������   91 MPN Work Flowchart����������������������������������������������������������������������   92 MPN Calculation Lab Work Flowchart ������������������������������������������   93 Review Questions����������������������������������������������������������������������������   94 13 Cultivation  of Anaerobic Bacteria in Canned Food��������������������   97 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������   97 Introduction��������������������������������������������������������������������������������������   97 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������   98 Procedure of Cooked Meat Medium������������������������������������������������   98 Procedure of Detecting Possible Clostridium Perfringens��������������   98 Review Question������������������������������������������������������������������������������   99 Pictures��������������������������������������������������������������������������������������������   99 14 Observation  and Enumeration of Molds from Spoiled Bread������������������������������������������������������������������������  103 Major Experimental Material����������������������������������������������������������  103 Procedure: Lacto-Phenol Cotton Blue Stain������������������������������������  104 Enumeration of Molds in Bread������������������������������������������������������  104 Review Question������������������������������������������������������������������������������  105 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������  105 Part of Results Figures (Work from Previous Students)������������������  106 15 DNA  Extraction and Purity Determination of Foodborne Pathogens����������������������������������������������������������������  109 Major Experimental Material����������������������������������������������������������  109 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������  109 DNA Extraction and Purity Measurement Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������  111 16 Practice  of Multiplex PCR for Bacteria Identification��������������  115 Major Experimental Material����������������������������������������������������������  115 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������  116

Contents

xiv

PCR Lab Work Flowchart����������������������������������������������������������������  117 Review Question������������������������������������������������������������������������������  117 17 P  CR Identification of Listeria Monocytogenes in Deli Meat������������������������������������������������������������������������������������  121 Major Materials and Equipment������������������������������������������������������  121 Equipment����������������������������������������������������������������������������������������  122 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������  122 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������  123 18 Cheese  Making and Characterization������������������������������������������  127 Major Materials and Equipment������������������������������������������������������  127 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������  127 Lab Work FlowChart������������������������������������������������������������������������  128 19 Wine  and Pickle Making and Characterization��������������������������  131 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������  131 Procedure ����������������������������������������������������������������������������������������  131 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������  134 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������  135 Lab Work Flowchart������������������������������������������������������������������������  136 20 Antimicrobial  Resistance of Commensal Bacteria from Environment��������������������������������������������������������������������������  139 Major Experimental Materials ��������������������������������������������������������  139 Lab Work Procedure������������������������������������������������������������������������  139 Disk Diffusion Test��������������������������������������������������������������������������  140 Kirby-Bauer Test Lab Work Flowchart��������������������������������������������  141 21 Introduction  of Oral Presentation and Job Interview Preparation����������������������������������������������������  145 Major Presentation Topics ��������������������������������������������������������������  145 Presentation Bodies��������������������������������������������������������������������������  145 Suggested Peer-Reviewed Journals��������������������������������������������������  146 Suggested Literature Search Website����������������������������������������������  146 Tips for a Good Oral Presentation ��������������������������������������������������  146 Presenter/Leader: Evaluation Rubrics (150 Points) ������������������������  146 Practice of Job Interview������������������������������������������������������������������  147 Tips for Job Search��������������������������������������������������������������������������  147 Course Description��������������������������������������������������������������������������  149 Methods of Instruction��������������������������������������������������������������������  149 Expected Learning Outcomes����������������������������������������������������������  149 Outlines of Topics����������������������������������������������������������������������������  149 Required Equipment������������������������������������������������������������������������  150 Attendance Requirements����������������������������������������������������������������  150 Grading��������������������������������������������������������������������������������������������  150 Grading Scale����������������������������������������������������������������������������������  150 Availability of Lecture Notes ����������������������������������������������������������  151 General Education Curriculum Statement ��������������������������������������  151 Physical Handicap Statement����������������������������������������������������������  151

Contents

xv

Inclusivity Statement�����������������������������������������������������������������������  151 Cell Phone Usage����������������������������������������������������������������������������  151 Academic Integrity Statement����������������������������������������������������������  151 Laboratory Safety Rules/Procedures������������������������������������������������  151 Adverse Weather Statement ������������������������������������������������������������  152 COVID-19 Syllabus Statement��������������������������������������������������������  152 Course Description��������������������������������������������������������������������������  152 Course Objectives����������������������������������������������������������������������������  153 Reference Books������������������������������������������������������������������������������  153 Course Evaluation����������������������������������������������������������������������������  154 Grading Scales ��������������������������������������������������������������������������������  156 Course Drops and Withdrawals��������������������������������������������������������  156 Academic Dishonesty: Plagiarism and Cheating����������������������������  156 Student Disabilities Services������������������������������������������������������������  156 Index��������������������������������������������������������������������������������������������������������  159

About the Authors

Cangliang  Shen   is an Associate Professor/ Extension Specialist at Davis College, Division of Animal and Nutritional Sciences and Family and Community Development, West Virginia University. Dr. Shen worked at IEH Consulting Groups (Research Associate), USDA-ARS (Postdoctoral Research Microbiologist), and Western Kentucky University (Assistant Professor) after obtaining his Ph.D. from Colorado State University. Dr. Shen is currently teaching General Microbiology, Food Microbiology Lab, and Food Chemistry courses. Dr. Shen’s research interest is in developing postharvest sanitizing procedures for reducing microbial food safety risks on poultry meat products and fresh produce. Dr. Shen has published 52 peer-review journal articles, 3 textbooks, and 2 book chapters, and secured USDA-NIFA grants over $3.1 million. Dr. Shen serves as the editorial board member of Journal of Food Protection and Food Protection Trends. Dr. Shen received Outstanding Volunteer Award of Food Microbiology Division-Institute of Food Technologists (IFT) in 2018. He was the Chair of Food Microbiology Division-IFT (2019–2020), and he is the Chair of Biotechnology DivisionIFT (2022–2023). Yifan  Zhang  is a Professor in the Department of Nutrition and Food Science at Wayne State University, Michigan. She is an Editorial Board member of Journal of Food Protection, and a member of International Association of Food Protection (IAFP), Institute of Food Technologists (IFT), and American Society for Microbiology (ASM). Prior to joining the Wayne State faculty, Dr. Zhang has worked as a Postdoctoral xvii

About the Authors

xviii

Researcher at The Ohio State University. Dr. Zhang’s research is on molecular characterization and risk analysis of foodborne bacteria, food and agricultural reservoir of antimicrobial resistance, urban agriculture, and the development of novel food safety control. Dr. Zhang is currently teaching Introductory Food Science and Advanced Food Science at the undergraduate level and Microbial Food Safety at the graduate level.

1

Food Microbiology Laboratory Safety and Notebook Record

Abstract

We will provide food microbiology laboratory safety training for all students taking this class and emphasize the importance of lab notebook record, and finally we will show students the examples of good lab notebook record.

 hree Principles of Conducting T Food Microbiology Lab Work Safety: Before doing anything in lab, ask yourself if it is safe; otherwise do not do it. Quality: All lab work should be conducted based on scientifically high quality. Quantity: Based on high quality, we will complete as much lab work as we can.

I ntroduction of Biosafety Level (BSL) BSL-1: Microbial agents are not well known for causing disease and present minimal potential hazard to lab personnel, that is, generic Escherichia coli and Pseudomonas spp. BSL-2: Microbial agents cause moderate hazard to lab personnel and environment, that is, E. coli O157:H7 and Salmonella spp.

BSL-3: Microbial agents may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure, that is, Clostridium botulinum. BSL-4: Microbial agents pose a high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections and life-threatening disease, that is, Mycobacterium tuberculosis (TB). We only use BSL-1 and BSL-2 microbial organisms in this lab manual.

Lab Safety Rules 1. Always wash your hands with antimicrobial soap water for at least 30 s before and after lab work. 2. Always wear a clean lab coat and gloves, and do not wear open toe shoes and very short pants when conducting lab work. 3. Always wear eye protection (goggles) when staining or handling hazardous laboratory chemicals. 4. Clean and sanitize your working bench with a disinfection solution before and after lab work. 5. Report any lab accidents immediately. 6. Clearly label petri dishes, tubes, and flasks before lab work; label name, bench (seat) number, date, microorganism name, etc.

© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2023 C. Shen, Y. Zhang, Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student, https://doi.org/10.1007/978-3-031-26197-8_1

1

2

1  Food Microbiology Laboratory Safety and Notebook Record

7. Place any biohazard trash into biohazard trash can. 8. Smoking, eating, drinking, or placing anything into your mouth is prohibited. 9. Do not handle any electronic devices (i.e. cell phone, ipad, laptop) while doing the lab work. 10. Please let your instructor know if you are pregnant or planning to be pregnant. 11. Know the location of nearest fire alarm pull station, fire extinguisher, eyewash station, and first aid kit.

Lab Notebook Requirement Notebooks can be checked after each lab section before you leave the classroom. The front cover of your notebook will be labeled with following information: your name, course name, professor’s name, and semester. Reserve the first three pages of your notebook for a table of contents. You will update the table of contents each week. Number all pages. Each notebook entry for any given lab period will be formatted in the following way: 1. The title.

2. A purpose statement: Describe the purpose of the exercise. Ask yourself “What are the goals of this exercise?” 3. A Materials and Methods section—The Materials and Methods for each lab will be described at the beginning of the period by the instructor. You will have an opportunity to copy this information into your notebook at the beginning of each lab period. You should describe what was needed and the steps taken (including any modifications that were made). Be as specific as possible. Be sure to use correct spelling for all microorganism names, and italicize scientific names. 4. A Results section: Record all observations in your lab notebook. Colored pencils/pens should be used to illustrate results (i.e., observations made with the microscope)—all figures/tables must have a title and legend (a description of what is being shown—label all relevant information). 5. A Discussion—Summarize your findings and discuss how the exercise helped you understand the learning objectives. Describe why something may not have worked and what you would do differently next time to improve the outcome. Each section must be labeled.

Lab Notebook Requirement

Examples of Good Notebook Records (from Ms. Payton Southall)

3

4

1  Food Microbiology Laboratory Safety and Notebook Record

Examples of Good Notebook Records (from Ms. Payton Southall)

Lab Notebook Requirement

Examples of Good Notebook Records (from Ms. Jessica Clegg)

5

6

1  Food Microbiology Laboratory Safety and Notebook Record

Examples of Good Notebook Records (from Ms. Jessica Clegg)

Lab Notebook Requirement

Class Notes

7

2

Staining Technology and Bright-­Field Microscope Use

Abstract

We will introduce bright-field microscope use and practice Gram staining with foodborne pathogens and endospore staining with Bacillus cereus. Objective  Practice Gram staining and endospore staining with common foodborne pathogens.

Introduction of Gram Stain  Gram stain was created by Hans Christian Gram (Danish microbiologist), which differentiates all bacteria into two groups Gram positive (blue/purple color) and Gram negative (pink/red color). The theory of Gram stain differentiation is based on cell wall structure and lipid component; therefore it comes out with two theory below

1. Cell wall theory: Gram-positive bacteria has heavy peptidoglycan, which helps decolorizer (alcohol) to dehydrate the Gram-positive cell Gram Stain Strain Culture  Escherichia coli wall and traps the crystal violet complex ATCC25822, Listeria monocytogenes, inside the cell wall and maintains the purple Salmonella enterica serovar Typhimurium, and color of crystal violet. Staphylococcus aureus ATCC 25923 (non-­ 2. Lipid theory: Gram-negative bacteria has high MRSA strain). lipid amount (10–15%) in the cell wall, which makes decolorizer (alcohol) to easily remove Endospore Stain Culture  Bacillus cereus. the crystal violet complex, and then colorless cell walls are stained with safranin and appear pink/red color.

Major Experimental Materials

• Bright-field light microscope. • Gram stain reagents (crystal violet, Gram iodine, 95% alcohol, safranin). • Endospore reagent (malachite green). • Sterilized loop. • Glass slides. • Lens paper. • Bunsen burner.

Gram stains need to be done on a very young fresh culture (within 24–48 h). Introduction of Bacterial Endospore  Two bacteria genera that will generate endospore (germination) under stressful environment (poor nutrition, low humidity, desiccation, and high temperature) are Bacillus and Clostridium. The calcium-dipicolinic acid (DPA) stabilizes the

© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2023 C. Shen, Y. Zhang, Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student, https://doi.org/10.1007/978-3-031-26197-8_2

9

10

endospore’s DNA along with small soluble DNA protein to protect the bacteria from stress environment. When the growth condition improves, the endospore will generate vegetative cells (sporulation). Endospore stain is intended to find the presence/absence of endospore and the location of endospore. The location of endospore is species specific which can be located in the middle of cells (central), and the end (terminal, that is, Clostridium sporogenes), or between the end and the middle (sub-terminal, that is, Clostridium botulism). Endospore stain needs to be done on old culture (>5–7 days).

Gram Stain Procedure 1. Prepare a fixed smear: label two large circles (dime) using marker onto a clean glass slide, flip over slides, place one drop of sterilized water in the center of each circle, and use loop aseptically, pick bacteria cells from stock culture, and spread them in their drops of water to cover the whole circle of the dime (Fig. 1). Note: Flipping over slides is very important; otherwise the dye from marker may damage the lens of microscope later on. A smear needs to be thin. 2. Air-dry the smear for 5 min (Fig. 2). 3. Heat fix the cells on slides by passing three times back and forth through the Bunsen flame. Heat fixing will inactivate bacteria enzyme and stick cells onto glass slides. 4. Major steps of Gram stain are the following: (a) Place your slide on staining rack, put 1–2 drops of crystal violet onto the smear for 60 s, and then gently rinse with water.

2  Staining Technology and Bright-Field Microscope Use

(b) Add 1–2 drops of Gram iodine (a mordant to help crystal violet stain strong) for 60 s, and then gently rinse with water. (c) Decolor by adding 1–2 drops of 95% alcohol for 10–15 s, and then gently rinse with water. (d) Counter-stain by adding 1–2 drops of safranin and then gently rinse with water. 5. Drain off excess water, blot dry with paper towel, and air-dry slide. 6. Observe your stained smear with low power 10X and then switch to 100X with oil immersion; record your results in the notebook. 7. Gram stain results should include three items: (1) Gram reaction, positive or negative; (2) morphology, rods, cocci, etc.; and (3) arrangement, single, chain, grape shape, tetrad, etc. 8. Please refer to Fig. 4 as a Gram staining result.

Endospore Stain Procedure 1. Smear preparation including air-drying and heat fixing is the same as Gram stain. 2. Flood the smear with malachite green (cover the whole slides with the dye, Fig. 3). 3. Heat steam slides for 3–5 min using the flame of burner back and forth couple of times, but do not let the slides dry out. 4. Cool down slides, remove dye, and gently rinse with water. 5. Add safranin onto the slide. 6. Drain off excess water, blot dry with paper towel, and air-dry slide. 7. Observe your stained smear with low power 10X, and then switch to 100X with oil immersion; record your results in the notebook.

Bright-Field Microscope Use

11

Bright-Field Microscope Use Microscope Structure

Brief Procedure 1. Stage down with course focus (large and thick wheel). 2. Spin/rotate objective lens. 3. Place 10X objective lens in position. 4. Adjust light to “low” or “10X” with condenser (iris diagram). 5. Bring stage up as high as it can reach. 6. Look into 10X ocular lens and find specimen. 7. Slightly switch 10X objective lens; add one drop of oil. (Do not take microscope out of focus.)

8. Adjust fine focus (small and thin wheel) to find specimen.

Questions for Review 1. Why Gram-positive stains purple and Gram-­ negative stains pink color? 2. Describe two conditions in which bacteria organism will stain Gram variable (showing Gram-negative results). 3. Is bacterial endosporulation a reproductive mechanism? Why? 4. Why the location of endospore is a very important information?

12

2  Staining Technology and Bright-Field Microscope Use

Figures 1. Fig 1. Clean slides and label

2. Fig 2. Smear preparation, air-drying, and heat fixing

3. Fig 3. Flooding with dye (only for endospore staining)

Bright-Field Microscope Use

4. Fig 4. Examples of Gram staining result (from previous students’ lab work)

13

14

Gram Staining Lab Work Flowchart

2  Staining Technology and Bright-Field Microscope Use

Bright-Field Microscope Use

Endospore Staining Lab Work Flowchart

15

16

Class Notes

2  Staining Technology and Bright-Field Microscope Use

Bright-Field Microscope Use Class Notes

17

3

Enumeration of Bacteria in Broth Suspension by Spread and Pour Plating

Abstract

We will practice spread plating and pour plating using 10- or 100-fold dilution technique to enumerate bacteria cells in solutions on agars.

Objective: Understand serial dilution technique, and practice spread and pour plating. Bacterial strain: Escherichia coli ATCC25822 grown in tryptic soy broth at 35 °C after 24 h.

Major Experimental Materials • Tryptic soy agar. • Buffered peptone water (0.1%), in 15 ml dilution tubes. • Water bath (50–55  °C) with melted agar (25 ml) in glass bottles. • Empty petri dishes. • Sterilized spreaders and pipette tips (200  μl and 1,000 μl).

Introduction  Most bacteria grow in support medium like tryptic soy broth incubating at 35 °C for 24 h will generate around 109cells/ml (=9.0 log10colony-forming unit/ml), which is too much to put onto agar medium to manually count the colony. Therefore, we need to do 10-fold or 100-­fold serial dilution and then add 0.1  ml of the diluted solution from the final dilution tube onto agar medium through spreading or pour plating, and count bacterial colonies after incubation. For 10-fold and 100fold dilution, we usually use 9.0 ml or 9.9 ml 0.1% buffered peptone water (BPW). Spread plating is conducted by spreading liquid solution on agar medium using sterilized plastic spreader or flamed glass spreader. Pour plating is conducted by adding liquid solution onto an empty petri dish followed by pouring 20–25 ml of melted agar, rotating the petri dish and mixing very well. Due to the use of melted agar (50–55  °C), heat-sensitive bacteria will be killed by the mild heat; the number of colonies of pour plating will be slightly lower than spread plating.

© The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG 2023 C. Shen, Y. Zhang, Food Microbiology Laboratory for the Food Science Student, https://doi.org/10.1007/978-3-031-26197-8_3

19

3  Enumeration of Bacteria in Broth Suspension by Spread and Pour Plating

20

Dilution technique figs. (ten-fold serial dilution, assume 0.1 ml of each dilution tube adding onto agar plates)

Bac. broth

9.0ml BPW (0.1%)

9.0ml BPW (0.1%)

9.0ml BPW (0.1%)

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Dilution factor of tubes

“0”

10

Final dilution factor of plates

“0”

10

-1

-2

9.0ml BPW (0.1%)

9.0ml BPW (0.1%)

10 -2

10-3 -4

-3

10

“0” Dilution  averagely spreading 1.0 ml original solution onto three agar plates, adding all colony-forming units (CFU) of three agars after incubation.

Dilution Procedure 1. The original bacterial broth is considered to be at a dilution factor of “0.”

-4

10

10

10

-5

-5

10

-6

10

2. Each dilution blank contains 9.0 ml of sterile 0.1% BPW. 3. To make a 1/10 dilution, transfer 1.0  ml of sample into a 9.0  ml sterile dilution blank (0.1% BPW). This is a 10−1 dilution. 4. Alternately, you can transfer 1.0 ml of diluent into a 9.0 ml blank and make a 10−2 dilution. 5. Continue to make dilutions as necessary. Note: We also can add 0.1 ml into 9.9 ml of diluent to make a 10−2 dilution.

Dilution technique figs. (100-fold serial dilution, assume 0.1 ml of each dilution tube adding onto agar plates).

0.1 ml

0.1 ml

Bac. broth

9.9ml BPW (0.1%)

9.9ml BPW (0.1%)

0.1 ml

9.9ml BPW (0.1%)

Dilution factor of tubes

“0”

10-2

10-4

10-6

Final dilution factor of plates

“0”

10-3

10-5

10-7

Review Questions

21

Numeration

If colonies are 30–300, count and record it; the final counts will be final colony number/final dilution factor, for example, 40 colonies on the plate with final dilution factor 10−6, and then the final count is 40/10−6  =  40,000,000  CFU/ ml = 7.60 log10 CFU/ml. If colonies on more than two plates are 30–300, count and record each and take average. If colonies are >300, record as TNTC (too-numerous-to-count).

After spread and pour plating, incubate plates inverted at 35  °C for 24–48  h; manually count colonies on the agar plates. The acceptable and countable zone is 30–300  CFU/plate (CFU— colony-­forming unit). If colonies