Специальная фармацевтическая химия: КАМС-методики определения индивидуальных химических соединений в растворах и экстрактах 9785507457717

В учебное пособие включен блок теоретической информации по КАМС-методу в его двух вариантах: СРКАМС и ЛРКАМС. Приведен

139 11 2MB

English Pages 84 [85] Year 2023

Report DMCA / Copyright

DOWNLOAD FILE

Специальная фармацевтическая химия: КАМС-методики определения индивидуальных химических соединений в растворах и экстрактах
 9785507457717

Table of contents :
Обложка
Специальная фармацевтическая химия: КАМС-методики определения индивидуальных химических соединений в растворах и экстрактах
Аннотация
Введение
1. Получение и обработка хроматограмм
2. Методика проведения хроматографических измерений методом внутренней нормализации
3. Методика проведения хроматографических измерений методом внешнего стандарта
4. Методика проведения хроматографических измерений методом добавок
5. Методика проведения хроматографических измерений методом внутреннего стандарта
6. Методика проведения хроматографических измерений КАМС-методом
7. Особенности применения КАМС-методик при использовании хроматографических систем с разными видами детектирования
8. Стандартные операционные процедуры КАМС-методик
9. Параметры валидации СР-КАМС- и ЛР-КАМС-методик
Литература
Список использованных сокращений
Список использованных обозначений
Содержание
Титул back

Citation preview

А. Е. СУХАНОВ, А. Н. СТАВРИАНИДИ

СПЕЦИАЛЬНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ: КАМСМЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТВОРАХ И ЭКСТРАКТАХ Учебное пособие

•САНКТПЕТЕРБУРГ•МОСКВА•КРАСНОДАР• •2023•

УДК 615.1:543.544.5.068.7 ББК 52.82я73 С 91

Суханов А. Е. Специальная фармацевтическая хи мия: КАМСметодики определения индивидуальных химических соединений в растворах и экстрактах : учебное пособие для вузов / А. Е. Суханов, А. Н. Став рианиди. — СанктПетербург : Лань, 2023. — 84 с. : ил. — Текст : непосредственный. ISBN 9785507457717 В учебное пособие включен блок теоретической информации по КАМСметоду в его двух вариантах: СРКАМС и ЛРКАМС. Приведены суть методик определения в двух вариантах КАМСметода, теорети ческое обоснование и математический аппарат. Предложены пара метры валидации аналитической методики КАМСметода. Методики расчётов сформулированы в виде стандартных операционных про цедур. Учебное пособие предназначено для обучающихся в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом высше го образования подготовки кадров высшей квалификации в ординату ре по специальности «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», а также для аспирантов и докторантов, обучающихся по научным специальностям «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», «Ана литическая химия».

УДК 615.1:543.544.5.068.7 ББК 52.82я73 Рецензенты: К. Г. БОГОЛИЦЫН — доктор химических наук, профессор, зав. кафедрой теоретической и прикладной химии Высшей школы ес тественных наук и технологий Северного (Арктического) федераль ного университета им. М. В. Ломоносова; К. Т. ЕРИМБЕТОВ — доктор биологических наук, руководитель службы доклинических и клинических исследований ООО «Науч ноисследовательский центр „Парк активных молекул“» (г. Об нинск). Обложка Ю. В. ГРИГОРЬЕВА

© Издательство «Лань», 2023 © А. Е. Суханов, А. Н. Ставрианиди, 2023 © Издательство «Лань», художественное оформление, 2023

Введение В последние годы количественный анализ действующих соединений многокомпонентных лекарственных препаратов по содержанию нескольких действующих веществ — маркеров приобретает все большую популярность и считается эффективным подходом для целей контроля качества лекарственных форм. Однако этот подход ограничивается использованием особо чистых стандартных образцов веществ с чистотой не менее 98% действующего вещества в субстанции действующего вещества. Для решения этой проблемы китайскими учеными был создан метод КАМС (количественный анализ многокомпонентной системы) — использование одного (референтного) маркерного соединения для количественного анализа многокомпонентных лекарственных препаратов, растительных экстрактов. Однако КАМС-метод применим для определения анализируемых веществ со схожей молекулярной структурой, со схожими спектральными характеристиками и хроматографическим поведением с маркерным (реперным, референтным) соединением. Таким образом, анализируемые соединения, как правило, входят в одно химическое семейство с реперным. Кроме того, КАМС-метод используется в хемосистематике родственных растений как количественная основа для метода «отпечатков пальцев». Появляются научные работы, в которых отражены КАМС-методики с использованием непохожих по структуре соединений из разных классов веществ, как маркерного (реперного), так и анализируемых соединений. Для идентификации и определения любого вещества в растительных, грибных и животных экстрактах или любом другом растворе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией, как и любым другим физико-химическим методом анализа, в аналитической химии используют государственный стандартный образец данного вещества с чистотой как минимум 98%. Чем выше чистота государственного стандартного образца, тем эффективнее пройдет аналитическая работа по идентификации и количественному определению, а также валидации аналитической методики. Анализ проводят после пробоподготовки экстрактов тем или иным методом. Останавливаться подробно на пробоподготовке в данном пособии мы не будем. После пробоподготовки пропускают раствор государственного стандартного образца изучаемого вещества через колонку хромато3

графа с заданными параметрами хроматографирования и получают хроматографические параметры данного государственного стандартного образца. Самым важным из них является параметр — время удерживания. На оси абсцисс хроматограммы, где отображается шкала времени удерживания в минутах, на соответствующей минуте появляется хроматографический пик данного государственного стандартного образца. В данных хроматографических условиях время удерживания конкретного вещества специфично. В идентичных хроматографических условиях проводят хроматографирование экстракта растений, грибов или животных тканей. И если в идентичных условиях получают хроматографический пик на той же минуте выхода (совпадение времени удерживания), как и у государственного стандартного образца, можно сделать вывод, что данное вещество присутствует в экстракте, то есть проведена его идентификация. В свою очередь, по площади хроматографического идентифицированного пика можно определить концентрацию этого вещества в экстракте. В хромато-масс-спектрометрии наряду с относительными временами удерживания соединений получают масс-спектры соединений. Сравнение масс-спектров и хроматографических параметров определяемых соединений в экстрактах с параметрами стандартных образцов веществ дает исследователям понимание строения определяемого вещества и его содержания в экстракте. Государственные стандартные образцы реализуются в небольших флаконах, как правило, по 100 мг и менее. Некоторые стандартные образцы редкие, нарабатываются химическими компаниями по заявкам лабораторий и стоят очень дорого.

4

1. Получение и обработка хроматограмм Регистрация хроматограмм проводится с использованием специальных компьютерных программ, чаще всего поставляемых совместно с хроматографической системой. Сигнал детектора переводится в цифровой формат и регистрируется в виде зависимости величины (амплитуды) сигнала от времени. Визуализация такой зависимости от момента начала анализа до его остановки называется хроматограммой. В условиях, когда количество введенной смеси много меньше емкости хроматографической колонки, через которую непрерывно пропускают элюент, может быть получена элюентная хроматограмма — графическая зависимость сигнала прибора (по оси ординат) от времени или объема подвижной фазы (по оси абсцисс), представляет собой совокупность пиков разделяемых компонентов, каждый из которых представляет собой гауссову кривую. Схематичное изображение элюентной хроматограммы приведено на рисунке 1.

Рисунок 1 Хроматограмма смеси двух веществ

Основными хроматографическими параметрами, характеризующими поведение вещества в колонке, являются относительное время удерживания (tR), относительный удерживаемый объем (VR), фактор емкости (k), коэффициент селективности (α), разрешение (RS) и эффективность хроматографической колонки (N). Эти параметры могут быть рассчитаны для каждого хроматографического пика на хроматограмме [4]. Полученная хроматограмма анализируемой смеси позволяет определить ее качественный и количественный состав. Качественной характеристикой определяемых веществ являются времена их удер5

живания (объемы удерживания) и другие характеристики удерживания (tʹR, VʹR, k, индексы удерживания). Используя эти параметры, можно идентифицировать компоненты смеси. Сопоставление площадей или высот хроматографических пиков отдельных компонентов позволяет провести их количественное определение. В хроматографии используют несколько основных методов количественного анализа: метод внешнего стандарта, метод внутреннего стандарта, метод внутренней нормализации и метод добавок, а также метод КАМС.

6

2. Методика проведения хроматографических измерений методом внутренней нормализации В методе внутренней нормализации предполагается, что пики всех возможных компонентов смеси присутствуют на хроматограмме и сумма их площадей (S) равна 100%. Различия в чувствительности детектора к разным компонентам учитываются введением поправочных коэффициентов (Ki). Расчет содержания определяемого компонента ведут по формуле C

Si  K i



n

S  Ki

,

(1)

i 1 i

где n — число компонентов смеси; Si — площадь хроматографического пика i-го компонента; Ki — поправочные коэффициенты для каждого i-го компонента. Для выполнения измерений методом внутренней нормализации готовят два раствора — контрольный и испытуемый. Для приготовления испытуемого раствора исследуемую смесь разбавляют необходимое число раз подвижной фазой, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Для приготовления контрольного раствора необходимые количества стандартных образцов всех компонентов исследуемой смеси растворяют в подвижной фазе и при необходимости разбавляют так, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Полученные растворы хроматографируют 4–6 раз для определения времени удерживания и площадей хроматографических пиков, а также доверительных интервалов для этих параметров. Для одного из соединений, выбранного в качестве реперного (референтного), поправочный коэффициент Ki принимают равным 1. Для остальных поправочные коэффициенты рассчитывают по формуле Ki 

Sреф.  Cстанд. Sстанд.  Cреф.

,

(2)

где Ki — поправочный коэффициент для каждого i-го компонента; Sреф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cреф. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; 7

Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. Если часть компонентов неизвестна (неидентифицирована) и нет возможности добавить их в контрольный раствор в известной концентрации, то их вкладом либо пренебрегают (если площади их пиков менее 0,1% от суммы площадей всех остальных пиков), либо их поправочные коэффициенты приравнивают по величине к реперному или основному определяемому компоненту. В таком случае можно говорить о полуколичественном анализе образца или об определении относительной чистоты образца, если эти неидентифицированные компоненты являются примесными. Зная поправочные коэффициенты для всех компонентов смеси, можно определить их концентрацию в испытуемом растворе по формуле (1). Важно отметить, что применимость данного метода ограничена, поскольку необходимо добиться полного разделения всех компонентов смеси на хроматограмме, кроме того, все компоненты должны давать ненулевой отклик детектора. Если перед анализом образец разбавили растворителем, пик которого либо не виден на хроматограмме, либо отделен от пиков других компонентов образца, то применить метод внутренней нормализации возможно. Для этого надо исключить из разметки (или из расчетов) пик растворителя, тогда проведенное указанным выше способом определение процентного соотношения компонентов будет корректно описывать состав исходной смеси. Обычно метод внутренней нормализации применяют для анализа технических смесей и модельных объектов известного состава и не применяют в анализе биологических проб и растительных экстрактов ввиду их сложного и неопределенного состава.

8

3. Методика проведения хроматографических измерений методом внешнего стандарта Метод внешнего стандарта является удобным и быстрым методом определения всех аналитов в образце с использованием их стандартных образцов. Как правило, в фитохимическом анализе применяют стандартные образцы чистотой более 95% и более 98%. Стандартные образцы меньшей чистоты обычно не используются для точного количественного анализа растительных препаратов ввиду ненадежности их постоянного количественного и качественного состава. Более чистые образцы (>99,9%) часто недоступны из-за высоких затрат на их выделение и очистку. Используемые стандартные образцы зачастую выделяют из растительного сырья методами последовательной экстракции и препаративной хроматографии. Чистоту выделяемых стандартов также определяют хроматографическим методом. Под хроматографической чистотой образца понимают относительную площадь основного пика в % на его хроматограмме в чистом растворителе, не дающем сигнала (системного пика). Поскольку примеси в случае препаративного выделения целевого компонента представляют собой либо примеси из растворителей, пропускаемых через колонку в ходе последовательных циклов хроматографирования и концентрируемых в емкости с выделяемым соединением, либо близкие к выделяемому по структуре компоненты растительного образца, которые были не полностью отделены от него при таком хроматографировании, очень важно добиться наилучшего хроматографического разделения на аналитической ВЭЖХ-системе при определении чистоты стандартного образца, а также использовать чистые растворители, не содержащие тех же потенциальных примесей. В таком случае не будет перекрывания примесей из растворителей с системным и градиентным пиками на хроматограмме анализируемого стандартного образца, и их оценка будет корректной. Структурные аналоги определяемого соединения не всегда могут быть отделены от основного пика даже на аналитической ВЭЖХ-системе, поэтому дополнительно к ВЭЖХ-УФ-определению чистоты стандартного образца необходимо производить масс-спектрометрический анализ и ЯМР-спектроскопию (далее — ЯМР) для установления идентичности всех присутствующих сигналов в спектрах и подтверждения чистоты выделенного стандарта. ЯМР-анализ необходим, поскольку изомерные примеси в стандартном образце часто могут давать одинаковые сигналы в масс9

спектре и не отделяться от основного компонента на хроматограмме, что дает некорректную завышенную оценку чистоты стандартного образца. Определение концентрации методом внешнего стандарта выполняют одним из следующих способов: ● способ контрольного раствора; ● способ ограничивающих растворов; ● способ градуировочного графика (рисунок 2).

Рисунок 2 Способ градуировочного графика (слева) и способ ограничивающих растворов (справа)

Для выполнения измерений по способу контрольного раствора готовят два раствора — контрольный и испытуемый. Для приготовления испытуемого раствора растительный экстракт после фильтрации или очистки методом твердофазной экстракции разбавляют необходимое число раз подвижной фазой, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Для приготовления контрольного раствора необходимое количество стандартного образца (твердая навеска) растворяют в подвижной фазе и при необходимости разбавляют так, чтобы получаемая концентрация совпадала с ожидаемой концентрацией определяемого соединения в испытуемом растворе. Полученные растворы хроматографируют 4–6 раз для определения времени удерживания и площади хроматографического пика определяемого соединения, а также доверительных интервалов для этих параметров. Расчет содержания определяемого соединения в испытуемом растворе проводят по формуле Cстанд. =

Sстанд.  Cреф. Sреф.

,

(3)

где Sреф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества; Sстанд. — площадь 10

хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cреф. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. Для выполнения измерений по способу ограничивающих растворов готовят три раствора — контрольный раствор № 1, контрольный раствор № 2 и испытуемый раствор. Для приготовления испытуемого раствора растительный экстракт после фильтрации или очистки методом твердофазной экстракции разбавляют необходимое число раз подвижной фазой, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Для приготовления контрольного раствора необходимое количество стандартного образца (твердая навеска) растворяют в подвижной фазе. Полученный контрольный раствор разбавляют так, чтобы получаемые концентрации контрольных растворов № 1 и № 2 были ниже и выше ожидаемой концентрации определяемого соединения в испытуемом растворе в небольшое число раз (1,1–2,0 раза). Расчет содержания определяемого соединения в испытуемом растворе проводят по формуле

Cстанд.  Cконтр.1  (Cконтр.2  Cконтр.1 ) 

 Sстанд.  Sконтр.1  ,  Sконтр.2  Sконтр.1 

(4)

где Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Cконтр.1 — концентрация определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 1, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Cконтр.2 — концентрация определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 2, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Sконтр.1 — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 1; Sконтр.2 — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 2. Для выполнения измерений по способу градуировочного графика готовят не менее пяти граудировочных растворов и испытуемый раствор. Для приготовления испытуемого раствора растительный экстракт после фильтрации или очистки методом твердофазной экстракции разбавляют необходимое число раз подвижной фазой, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Для приготовления контрольного раствора необходимое 11

количество стандартного образца (твердая навеска) растворяют в подвижной фазе. Полученный контрольный раствор разбавляют в подвижной фазе для приготовления градуировочных растворов так, чтобы получаемые концентрации растворов покрывали весь интервал ожидаемых концентраций определяемого соединения в испытуемом растворе. В некоторых случаях градуировочные растворы готовят таким образом, чтобы покрыть весь диапазон концентраций, при которых наблюдается линейный отклик детектора. В диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность градуировочного графика, для определяемого соединения строится график линейной зависимости и определяется уравнение простой линейной регрессии по формуле (5): Y = a × X + b,

(5)

где a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии; X — факторный признак в уравнении простой линейной регрессии; b — свободный член простой линейной регрессии. Расчет содержания определяемого соединения в испытуемом растворе проводят по формуле S b C , (6.1) a где S — площадь хроматографического пика раствора вещества, mAU×с (при детекции вещества УФ-детектором); a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии; b — свободный член простой линейной регрессии. В случае если свободный член (b) простой линейной регрессии имеет отрицательное значение, то формула расчета имеет вид S b . (6.2) a К недостаткам проведения измерений по методу внешнего стандарта можно отнести необходимость постоянно расходовать дорогостоящие стандартные образцы каждого из определяемых соединений, а также отсутствие учета влияния матрицы образца на детектирование. В случае наблюдения значительного влияния матрицы образца на показания прибора (матричный эффект) необходимо использовать метод добавок или метод внутреннего стандарта. C

12

4. Методика проведения хроматографических измерений методом добавок Метод добавок обычно используют в хроматографическом анализе растительных материалов для уточнения идентичности хроматографического пика, а также для определения целевого компонента в тех случаях, когда нельзя пренебречь значительным влиянием матрицы образца на сигнал детектора. В состав растений зачастую входит множество близких по структуре соединений, обладающих схожими характеристиками удерживания. При использовании метода внешнего стандарта не всегда могут быть учтены факторы влияния матрицы образца: как на наблюдаемое время удерживания, так и на отклик детектора. Поскольку каждый растительный экстракт представляет собой уникальную химическую смесь, практически невозможно провести холостой опыт для оценки таких матричных эффектов, так как невозможно получить экстракт, полностью идентичный исследуемому, но свободный от содержания только одного — целевого компонента. Приготовление экстрактов для холостых измерений всегда будет сопряжено с потерей части компонентов, структурно близких к определяемому, или с использованием растительного материала другого типа, что не позволит получить полностью эквивалентный испытуемому модельный раствор. В этом заключается одно из основных отличий анализа растительных материалов от анализа биожидкостей на содержание лекарственных препаратов или экзогенных метаболитов, где можно получить свободный от аналитов образец или набор образцов для усреднения и корректной оценки матричного влияния. В методе добавок к испытуемому образцу добавляют известный или минимальный объем (такой, чтобы можно было пренебречь разбавлением) стандартного раствора определяемого соединения так, чтобы его ориентировочная концентрация в итоговом растворе с добавкой увеличилась в 2–3 раза по сравнению с исходным испытуемым раствором. В некоторых случаях готовят дополнительно растворы с добавками на 1 и/или 2 уровня выше по концентрации для проверки линейности отклика детектора в присутствии матричного влияния образца. Если зависимость площади пика от концентрации добавки (рисунок 3) не линейна, то необходимо разбавить испытуемый образец перед добавкой стандартного раствора. Расчет содержания определяемого соединения проводят графически (рисунок 3), или по формуле (7), или по формуле (8): 13

Cстанд.  Sдоб.1 

 Cдоб.2  Cдоб.1   C ,  Sдоб.2  Sдоб.1  доб.1

(7)

где Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Cдоб.1 — добавленная концентрация № 1 определяемого стандартного вещества; Cдоб.2 — добавленная концентрация № 2 определяемого стандартного вещества; Sдоб.1 — площадь пика определяемого стандартного вещества в растворе с добавкой № 1; Sдоб.2 — площадь пика определяемого стандартного вещества в растворе с добавкой № 2. Cстанд.  Sстанд. 

Cдоб. , S  станд.+доб.  Sстанд. 

(8)

где Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cдоб. — концентрация добавленная определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд.+доб. — площадь пика определяемого стандартного вещества в растворе с добавкой.

Рисунок 3 Графический способ расчета определяемой концентрации по методу добавок

В хроматографии метод добавок редко применяется для количественного анализа, так как не позволяет учесть аддитивные погрешности определения. Однако этот метод успешно используется для подтверждения при идентификации определяемого соединения по времени удерживания (рисунок 4). Для количественного анализа об14

разцов со сложной матрицей чаще всего используют метод внутреннего стандарта.

Рисунок 4 Увеличение сигнала одного из пиков после добавки определяемого соединения

15

5. Методика проведения хроматографических измерений методом внутреннего стандарта Метод внутреннего стандарта используют в хроматографическом анализе для учета влияния сложной матрицы образца на сигнал детектора, а также для учета возможных потерь и погрешностей на стадии пробоподготовки. Внутренний стандарт добавляют к образцу в известном количестве и далее проводят все необходимые стадии пробоподготовки. Также внутренний стандарт добавляют во все градуировочные образцы, а его концентрация обычно выбирается на уровне 1/3 от максимальной концентрации линейного диапазона измерений. Внутренний стандарт — отдельный компонент, не содержащийся в исследуемом образце. Он не должен необратимо реагировать с компонентами неподвижной и подвижной фазы, иметь структуру, время удерживания и фактор отклика детектора, близкие к определяемому компоненту; полностью отделяться от определяемого компонента и других компонентов пробы. Определение концентрации методом внешнего стандарта выполняют одним из двух способов: способом контрольного раствора или способом градуировочного графика (рисунок 5).

Рисунок 5 Построение градуировочного графика методом внешнего стандарта

Для выполнения измерений по способу контрольного раствора готовят два раствора — контрольный и испытуемый. Для приготовления испытуемого раствора к растительному материалу или в растительный экстракт после фильтрации или очистки методом твердофазной экстракции добавляют внутренний стандарт и разбавляют необходимое число раз подвижной фазой, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Для приготовления контрольного раствора необходимое количество стандартного образца (твердая навеска) растворяют в подвижной фазе, добав16

ляют определенное количество внутреннего стандарта и при необходимости разбавляют так, чтобы получаемая концентрация совпадала с ожидаемой концентрацией определяемого соединения в испытуемом растворе. Полученные растворы хроматографируют 4–6 раз для определения времени удерживания, поправочного коэффициента и площадей хроматографических пиков определяемого соединения и внутреннего стандарта, а также доверительных интервалов для этих параметров. Расчет поправочного коэффициента осуществляют по формуле (9) в КОНТРОЛЬНОМ растворе: Ki 

Sстанд.внутр.  Cстанд. Sстанд.  Cстанд.внутр.

,

(9)

где Ki — поправочный коэффициент для каждого i-го компонента; Sстанд.внутр. — площадь хроматографического пика раствора внутреннего стандарта; Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cстанд.внутр. — концентрация раствора внутреннего стандарта, г/мл, мг/мл, мкг/мл. Расчет содержания определяемого соединения в ИСПЫТУЕМОМ растворе проводят по формуле (10): Cстанд. 

Ki  Sстанд.  Cстанд.внутр. Sстанд.внутр.

,

(10)

где Ki — поправочный коэффициент для каждого i-го компонента, рассчитанный по формуле (9); Sстанд.внутр. — площадь хроматографического пика раствора внутреннего стандарта; Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cстанд.внутр. — концентрация раствора внутреннего стандарта, г/мл, мг/мл, мкг/мл. Для выполнения измерений методом внешнего стандарта по способу градуировочного графика готовят не менее пяти граудировочных растворов и испытуемый раствор с добавлением известной концентрации внутреннего стандарта. Для приготовления испытуемого раствора к растительному материалу или в растительный экстракт после фильтрации или очистки методом твердофазной экстракции добавляют внутренний стандарт и разбавляют необходимое число раз подвижной фазой, чтобы получаемая концентрация оказалась в диапазоне линейного отклика детектора. Для приготовления кон17

трольного раствора необходимое количество стандартного образца (твердая навеска) растворяют в подвижной фазе. Полученный контрольный раствор разбавляют подвижной фазой для приготовления градуировочных растворов так, чтобы получаемые концентрации контрольных растворов покрывали весь диапазон концентраций, при которых наблюдается линейный отклик детектора. На этой стадии при приготовлении растворов добавляют определенные количества внутреннего стандарта. В диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность градуировочного графика, для определяемого соединения строится график линейной зависимости и определяется уравнение простой линейной регрессии (уравнение (5)). Расчет содержания определяемого соединения в ИСПЫТУЕМОМ растворе проводят по формуле (11):  Sстанд.  Cстанд.внутр. , Cстанд.    b a  Sстанд.внутр. 

(11)

где Sстанд.внутр. — площадь хроматографического пика раствора внутреннего стандарта; Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cстанд.внутр. — концентрация раствора внутреннего стандарта, г/мл, мг/мл, мкг/мл; a, b — коэффициенты из полученного уравнения градуировочной зависимости (из уравнения (5)). Метод внутреннего стандарта является наиболее точным по сравнению с другими распространенными методами количественного анализа в хроматографии. К его недостаткам можно отнести необходимость использования дополнительных стандартных образцов (один внутренний стандарт не всегда хорошо подходит для определения всех компонентов пробы), а также трудоемкость метода, так как необходимо добавлять внутренний стандарт во все хроматографируемые растворы. Как следствие, увеличивается число операций, на которых возможна ошибка аналитика (человеческий фактор), а также увеличивается неопределенность получаемого результата, связанная со случайной погрешностью на всех стадиях подготовки проб, выполнения измерений и обработки результатов (статистический фактор). Тем не менее такие погрешности несоизмеримы с отсутствием учета матричных эффектов при анализе сложных растительных объектов, поэтому применение внутреннего стандарта рекомендовано во многих фармакопеях. 18

6. Методика проведения хроматографических измерений КАМС-методом Количественный анализ многокомпонентной системы по одному маркерному (реперному, референтному) стандартному соединению, или КАМС-метод, является экономичным, удобным и быстрым методом определения всех анализируемых веществ в образце по одному маркерному стандартному веществу и, таким образом, решает вопрос дефицита эталонных веществ (фитохимических стандартов). Метод вошел в современные фармакопеи Китая, Европы, Индии, Америки и США. Однако КАМС-метод применим для количественного определения анализируемых веществ со схожей молекулярной структурой, со схожими спектральными характеристиками и хроматографическим поведением с реперным соединением. Таким образом, анализируемые соединения, как правило, входят в одно химическое семейство с реперным. Кроме того, КАМС-метод используется в хемосистематике родственных растений в качестве количественной основы для метода «отпечатков пальцев». Данный метод основан на том, что вначале готовят модельные растворы как реперного, так и определяемого (-мых) соединений с известной концентрацией (мкг/мл). В последующем их хроматографируют по отдельности в идентичных хроматографических условиях. Метод может быть реализован в двух форматах: 1) СР-КАМС (среднерасчетный вариант метода количественного анализа по одному маркерному веществу); 2) ЛР-КАМС (линейно-регрессионный вариант метода количественного анализа по одному маркерному веществу). Далее будет подробно рассмотрен математический аппарат для двух методов с указанием площади хроматографических пиков, полученных на высокоэффективном жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором (для большинства органических соединений). Однако КАМС-метод равнозначно применим при использовании и других типов детекторов, например, рефрактометрического (для определения углеводов), флуоресцентного (для флуоресцирующих органических веществ), кондуктометрического (для неорганических соединений) и т. п. СР-КАМС-метод. СР — среднерасчетное (average, AVG) значение. Между относительным коррекционным фактором, площадью 19

хроматографического пика определяемого вещества и концентрацией раствора реперного (референтного) вещества есть взаимосвязь. Данная формула расчета использует концентрацию и площади хроматографических пиков из модельного раствора для одной точки: RCFi 

Sстанд.  Cреф. Sреф.  Cстанд.

,

(12)

где RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Sреф. — площадь пика реперного вещества; Среф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Сстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. Если расчет концентраций будет производиться по одной точке, то концентрации растворов реперного и определяемого веществ могут быть как одинаковыми, так и разными. При использовании метода усреднения СР-КАМС на каждом уровне концентраций можно использовать одинаковые концентрации растворов реперного и определяемого соединений. А также можно менять концентрации растворов определяемых соединений, а концентрацию раствора реперного соединения оставлять на одном уровне. Усреднение на разных уровнях концентрации дает более корректную оценку относительных коррекционных факторов, однако в случае работы в пределах линейного диапазона определяемых концентраций как для реперного, так и для определяемого соединений можно пользоваться формулой (12) на любом уровне концентраций. Чаще всего для применения метода СР-КАМС сначала рассчитывают RCFi на каждом уровне концентраций модельных растворов реперного и определяемого соединений. RCFi будет несколько отличаться на разных уровнях концентрации этих растворов. Затем рассчитывают среднее арифметическое RCFi по модельному раствору реперного и определяемого соединений по формуле

RCFi 



n

Sстанд.  Cреф. Sреф.  Cстанд.

, (13) n где n — число уровней концентрации приготовленных растворов; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора 20

определяемого стандартного вещества; Sреф. — площадь пика реперного вещества; Среф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Сстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. Диапазон концентраций как модельного раствора реперного вещества, так и модельного раствора определяемого вещества может быть отличным от указанного диапазона концентраций. Главное условие: на предлагаемом диапазоне концентраций должна сохраняться линейность градуировочного графика как для реперного, так и для определяемого соединений по отдельности. ЛР-КАМС-метод. ЛР — линейная регрессия (linear regression, LRG). Метод основан на построении уравнения линейной регрессии методом «наименьших квадратов» по уравнению простой линейной регрессии Y = a × X + b. Для этого используется серия градуировочных растворов с концентрациями, в диапазоне которых соблюдается линейность градуировочного графика. Серия градуировочных растворов (рекомендуется не менее 5 растворов) как для реперного соединения, так и для определяемых соединений. По уравнению градуировочного графика X — концентрация вещества, Y — площадь хроматографического пика. Строят градуировочный график зависимости по пяти-шести градуировочным точкам. При этом график должен быть линейным и коэффициент корреляции Пирсона (коэффициент детерминации) не ниже r2 = 0,9990. Диапазон концентраций как модельного раствора реперного вещества, так и модельного раствора определяемого вещества может быть отличным от указанного диапазона концентраций. Главное условие: на предлагаемом диапазоне концентраций должна сохраняться линейность градуировочного графика как для реперного, так и для определяемого соединений по отдельности. В диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность градуировочного графика, для реперного и определяемого соединений строится график линейной зависимости и определяется уравнение простой линейной регрессии. Для референтного стандартного вещества (формула (5)): Y = a  X + b, где Y — результативный показатель в уравнении простой линейной регрессии; X — факторный признак в уравнении простой линейной регрессии; a — эмпирический (угловой) коэффициент простой ли21

нейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; b — свободный член простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу. Для определяемого стандартного вещества (формула (14)): Y = ai  X + bi,

(14)

где Y — результативный показатель в уравнении простой линейной регрессии; X — факторный признак в уравнении простой линейной регрессии; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. Для каждого определяемого соединения рассчитывают относительные коррекционные факторы — RCFi (relative correction factor) (формула (15)): ai , (15) a где RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. При применении ЛР-КАМС-метода необходима валидация по параметру «линейность». Поскольку на каждом уровне концентраций определяемого и реперного соединений должно в идеальном случае выполняться равенство (формула (16)): RCFi 

Sопред.  Срепер. Sрепер.

 RCFi  Cопред. ,

(16)

где RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; Sопред. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Sрепер. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества; Срепер. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Сопред. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. 22

Можно проверить линейность диапазона определяемых по методу ЛР-КАМС концентраций, рассчитав показатель Y для каждого уровня концентрации определяемого соединения (формула (17)): Y = a  RCFi  Cстанд. + b,

(17)

где Y — площадь хроматографического пика стандартного или референтного вещества (в случае уравнения простой линейной регрессии); RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; Сстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. В дальнейшем, когда КАМС-методика будет валидирована, можно использовать RCFi для соединений при их определении в экстрактах растений в идентичных хроматографических условиях, в которых были экспериментально получены RCFi для каждого определяемого соединения, не используя стандартные образцы этих определяемых веществ. Определение концентрации исследуемого вещества с использованием относительного корректирующего коэффициента (RCFi) методом высокоэффективной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии проводят по формуле Cстанд. 

Sстанд.  Cреф. Sреф.  RCFi

,

(18)

где Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества; Cреф. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sреф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества; RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу.

23

7. Особенности применения КАМС-методик при использовании хроматографических систем с разными видами детектирования В жидкостной хроматографии используется целый ряд детекторов, принцип работы которых основан на самых разных физикохимических свойствах определяемых соединений. Наибольшее распространение получили спектрофотометрические детекторы с переменной длиной волны и с диодной матрицей. Принципиальные схемы спектрофотометрического детектора с переменной длиной волны и диодно-матричного детектора представлены на рисунке 6 и рисунке 7.

Рисунок 6 Схема устройства спектрофотометрического детектора с переменной длиной волны

Рисунок 7 Схема устройства спектрофотометрического детектора с диодной матрицей

Как правило, чувствительности таких детекторов хватает для решения большинства аналитических задач, кроме того, они являются достаточно универсальными, поскольку большинство органических соединений поглощает свет в диапазоне 190–210 нм. Одновре24

менно с этим многие вещества можно селективно детектировать, используя максимумы поглощения в ближней УФ-области (200–400 нм) и в видимом диапазоне длин волн (400–750 нм). Регистрация спектров поглощения с помощью диодной матрицы позволяет не только определить длины волн, соответствующие максимумам поглощения для каждого соединения, но и использовать сам спектр для идентификации и оценки оптической чистоты хроматографических пиков, что позволяет судить о перекрывании пиков нескольких соединений и в некоторых случаях проводить их деконволюцию. Принцип работы спектрофотометрических детекторов основан на основном законе светопоглощения: lg

I0  D  l c, I

(19)

где I0 и I — интенсивности потока света до и после прохождения через кювету соответственно; D — оптическая плотность раствора, l — длина оптического пути (толщина кюветы);  — молярный коэффициент поглощения раствора; c — концентрация аналита в растворе. Таким образом, поскольку толщина кюветы фиксирована в конструкции прибора (рисунок 8), фактор отклика для каждого вещества зависит от его молекулярного коэффициента поглощения при данном значении длины волны.

Рисунок 8 Схема ячейки спектрофотометрического детектора

Молярный коэффициент поглощения зависит от природы определяемого соединения. Его величина зависит от числа и типа хромофорных групп в молекуле. Под хромофором понимается группа ато25

мов в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, например, >C = O — группа в структуре аминокислот. Для близких по структуре соединений, отличающихся несколькими заместителями при основных хромофорных группах, можно предсказать, как изменится отклик детектора при данной длине волны, учитывая гиперхромный и гипохромный эффекты увеличения и уменьшения молярного коэффициента поглощения соответственно. А также важны батохромный и гипсохромный эффекты смещения максимума поглощения в длинноволновую и коротковолновую область спектра соответственно. Помимо поглощения света некоторые вещества способны к флуоресценции — поглощению кванта света и быстрой эмиссии другого кванта света с другой (большей) длиной волны. При этом интенсивность флуоресценции, а следовательно, и факторы отклика детектора будут зависеть от квантового выхода (К) для каждого определяемого соединения. Поскольку способность к флуоресценции встречается гораздо реже, чем способность поглощать свет в УФ- и видимом диапазоне, этот вариант детектирования редко применяется в анализе растительных экстрактов. Однако любопытно отметить, что некоторые соединения специально подвергают процедуре дериватизации для получения флуоресцирующих производных. Например, аминокислоты дают флуоресцирующие продукты реакции с ортофталевым альдегидом, а также вступают в реакцию с флуоренилметоксихлороформиатом. Во втором случае влияние структуры аминокислоты на флуоресценцию деривата будет меньше и можно ожидать более близких факторов отклика. Рефрактометрический детектор фиксирует любой тип анализируемых веществ независимо от структуры, молекулярной массы и других физико-химических свойств и может применяться, когда вещества не имеют интенсивного поглощения в УФ-свете, не флуоресцируют и не обладают электрохимической активностью. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления исследуемого раствора пропорционален объемной концентрации этого вещества, причем растворитель также является детектируемым веществом, так как имеет определенный показатель преломления. По этой причине рефрактометрический детектор не используют в градиентном режиме элюирования, так как практически невозможно подобрать такие параметры системы растворителей, имеющих близкие показатели преломления, чтобы не наблюдался дрейф базовой линии в заданных пределах изменения соотношения концентраций этих растворителей. 26

Кроме того, необходимо учитывать изменение комнатной температуры при отсутствии термостатирования детектора, так как чувствительность рефрактометра к изменениям температуры составляет для разных растворителей от 5∙10–4 до 5∙10–5 единиц показателя преломления на 1°С. Даже при использовании современных термостатов с контролем колебаний температуры на уровне ± 0,01°С максимальная чувствительность рефрактометрического детектора оказывается на уровне 10–8 единиц показателя преломления, что примерно соответствует 1–10 мкг/мл, а наблюдаемый уровень шума приблизительно на 2 порядка выше, чем в случае спектрофотометрического детектора. Принцип работы дифференциального рефрактометрического детектора (рисунок 9) основан на преломлении света в специальной кювете, разделенной на измерительную и сравнительную проточные камеры, заполняемые элюатом из хроматографической колонки и подвижной фазой соответственно. Отклонение прошедшего светового потока фиксируется с помощью призмы, перенаправляющей световой поток на два фотоэлемента. В отсутствие определяемого компонента выставляют нулевой уровень базовой линии, добиваясь одинакового сигнала на обоих фотодиодах вращением плоскопараллельной пластины.

Рисунок 9 Схема дифференциального рефрактометрического детектора

Несмотря на бо́льшую универсальность отклика рефрактометрического детектора по сравнению с УФ-детектором, его применение в КАМС-методиках анализа растительных препаратов ограничено достаточно узким линейным диапазоном концентраций (2–2,5 порядка) и невозможностью использовать градиентное элюирование, а также недостаточной чувствительностью для определения минорных компонентов экстрактов. Важным применением рефрактометрического детектора является определение сахаров, пики которых не регистрируются спектрофотометрическим детектором. 27

Еще одним распространенным и довольно универсальным вариантом детектирования, аналогичным рефрактометрическому детектированию, является испарительное детектирование по светорассеянию, чувствительность которого в 10–100 раз выше. Принцип работы такого детектора (рисунок 10) основан на измерении рассеяния света микрочастицами компонента, образовавшимися в результате распыления элюата под действием газа в виде мелкого аэрозоля и его последующего испарения при температурах менее 80°С.

Рисунок 10 Схема устройства испарительного детектора по светорассеянию

Еще одним преимуществом испарительного детектора по светорассеянию является возможность работы в градиентном режиме с использованием любых летучих растворителей в широком диапазоне скоростей потока. Детектор способен регистрировать сигнал для соединений менее летучих, чем подвижная фаза, то есть слаболетучих и нелетучих соединений. Отклик детектора не зависит от способности анализируемого компонента поглощать или излучать свет и является функцией массы соединения, что делает применение этого детектора в КАМС-методиках очень перспективным, однако серьезным недостатком этого варианта детектирования является нелинейность зависимости отклика от концентрации. Недавно был разработан и введен в практику еще один детектор для высокоэффективной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии — детектор заряженных частиц в аэрозоле (charged aerosol detector, CAD). Этот детектор также основан на распылении элюата из хроматографической колонки (рисунок 11), однако капли большого диаметра отфильтровываются из системы, а капли, уменьшившиеся в размере за счет испарения растворителя в потоке инертного газа, попадают в камеру электризации (переноса заряда). Далее, проходя через ионную ловушку для удаления мелких высокоподвижных ионизированных частиц, поток заряженных частиц в аэрозоле 28

попадает в зону детектирования, где агрегированный заряд на частицах регистрируется с помощью электрометра. Детектор заряженных частиц в аэрозоле полностью аналогичен испарительному детектору по светорассеянию в области применения: растворители должны быть летучими, а определяемые соединения менее летучими или нелетучими. Область линейного диапазона концентраций также невелика, но в диапазоне небольших количеств аналита (1–100 нг) можно построить линейную градуировочную зависимость и провести количественное определение. Из-за разницы в процессе распыления и формирования аэрозоля кривые отклика для этих двух детекторов неодинаковы. Отклик детектора заряженных частиц в аэрозоле также пропорционален массе вещества, попадающей в детектор в единицу времени, а не концентрации, как в спектрофотометрическом детектировании. Для большинства нелетучих соединений отклик детектора достаточно универсален с пределом обнаружения около 1–3 нг. Таким образом, детектор заряженных частиц в аэрозоле может быть успешно использован в КАМС-методиках для чувствительного определения минорных компонентов растительных экстрактов в градиентном режиме, однако нужно учитывать также, что его отклик пропорционален концентрации органического компонента в подвижной фазе, а значит, относительные коррекционные факторы должны быть пересчитаны или определены заново при изменении программы градиента или других условий разделения. Одним из недостатков рассмотренного варианта детектирования является неудовлетворительная воспроизводимость в случае загрязнения трубок и камер распыления и электризации при неправильном подборе подвижных фаз и потоков газа.

Рисунок 11 Схема устройства детектора заряженных частиц в аэрозоле 29

30

В отдельных случаях применяют электрохимическое детектирование, которое позволяет зарегистрировать пики только электроактивных компонентов смеси. Помимо большей селективности такой вариант детектирования чаще всего оказывается намного более чувствительным в сравнении с рассмотренными выше методами. Ввиду сложности конструкции рабочего электрода, которая должна обеспечивать постоянное обновление и очистку его поверхности при непрерывном поступлении элюата из хроматографической колонки, окислению/восстановлению подвергается лишь часть молекул определяемого компонента из числа попадающих в детектор в единицу времени. Регистрацию сигнала осуществляют в постоянном или импульсном режиме, выбирая рабочее значение напряжения таким образом, чтобы было возможным окисление/восстановление всех определяемых соединений. Тем не менее отклик детектора, как правило, зависит от природы определяемого соединения и для осуществления количественного анализа КАМС-методом на первом этапе работы необходимы индивидуальные стандарты всех компонентов смеси, а также необходимо провести дополнительные эксперименты по установлению стабильности значений установленных относительных коррекционных факторов в условиях продолжительной работы и возможного загрязнения поверхности рабочего электрода. Описательная статистика реперного (референтного) стандартного вещества и определяемых стандартных веществ методик СРКАМС и ЛР-КАМС представлена в таблице 1. Контрольные вопросы 1. 2. 3.

4.

5. 6.

Какие параметры используют для идентификации соединений на хроматограмме? Какие способы существуют для повышения точности идентификации? Какой способ количественного анализа следует использовать, если линейный диапазон отклика детектора не превышает двух порядков? Какой способ количественного анализа предпочтителен при анализе лекарственных препаратов с одним основным компонентом действующего вещества? С двумя? Почему? Чем количественный анализ методом КАМС принципиально отличается от метода внутреннего стандарта? Какие требования предъявляются для соединения, используемого в качестве внутреннего стандарта? В качестве реперного (референтного) стандартного вещества в КАМС-методике? 31

Сравните по чувствительности и селективности УФ-детектор и детектирование по флуоресценции. 8. Сравните по чувствительности и селективности УФ-детектор и электрохимический детектор. 9. Перечислите самые универсальные детекторы в хроматографии. Какие ограничения по применимости для них остаются? 10. Когда оправдано применение поправочных коэффициентов в количественном хроматографическом анализе? 11. Перечислите валидационные параметры, оцениваемые при аттестации хроматографических методик. Какие дополнительные параметры следует оценивать в случае КАМС-методик? 12. В чем преимущества использования КАМС-методик по сравнению с количественным анализом методом внешнего стандарта? 7.

32

8. Стандартные операционные процедуры КАМС-методик Стандартная операционная процедура подготовки диапазона концентраций стандартных растворов соединений как реперного, так и определяемого, при которых сохраняется линейность, мкг/мл* (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: приготовление растворов государственных стандартных образцов как реперного, так и определяемого соединений с целью калибровки диапазона концентраций для метода. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для проведения калибровки в методике анализа методом высокоэффективной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер анализа. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Процедура: приготовление растворов с определенным зависимым шагом концентрации. Диапазон концентраций может быть различным. Единственное требование — соблюдение режима линейности согласно уравнению простой линейной регрессии по формуле Y = a  X + b. Предлагаемый диапазон приготовления концентраций калибровочных растворов следующий: 62,5 мкг/мл — 125 мкг/мл — 250 мкг/мл — 500 мкг/мл — 1000 мкг/мл. Диапазон приготовленных концентраций калибровочных растворов может быть и иным. Главное требование: соблюдение линейной зависимости в выбранном диапазоне концентраций. 7. Подготовка калибровочных растворов: вначале приготавливают калибровочный раствор наибольшей концентрации, т. е. 1000 мкг/мл, добавляют определенное количество растворителя до разбавления раствора. Точную навеску государственного стандартного образца вещества (порошок-субстанция с чистотой не менее 98,5%) массой 20 мг растворяют в 20 мл растворителя. Это стандартный раствор * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС. 33

вещества с концентрацией 1000 мкг/мл (1 мг/мл). Полученный раствор используют для приготовления серии градуировочных растворов в диапазоне концентраций от 62,5 до 500 мкг/мл, а именно: для приготовления раствора с концентрацией 62,5 мкг/мл (0,625 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл), 125 мкг/мл (1,25 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл), 250 мкг/мл (2,5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл), 500 мкг/мл (5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл). 8. Подготовка прибора ВЭЖХ. Включают прибор, проводят настройки, подготавливают программу для хроматографирования. Проводят поочередную инжекцию калибровочных растворов в хроматографическую колонку. Получают пик на хроматограмме, записывают время удерживания, которое должно точно совпадать у всех калибровочных растворов одного и того же вещества. Записывают в файл метода каждую хроматограмму и в отчете по хроматограмме отмечают площадь хроматографического пика. Каждой концентрации калибровочного раствора соединения должна соответствовать своя площадь хроматографического пика. 9. Методика построения графика линейной зависимости, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Строят график линейной зависимости по уравнению простой линейной регрессии Y = a  X + b, где ось Х соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл, ось Y — площади хроматографического пика. Для построения калибровочных кривых определяемых соединений хроматографируют раствор как одного определяемого соединения, так и нескольких определяемых соединений в одном растворе. После хроматографирования не менее 6 стандартных растворов реперного (маркерного) или определяемого вещества (веществ) в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность диапазона концентрации, получают уравнение простой линейной регрессии. В электронной таблице озаглавливают два любых вертикальных столбца, например, заголовок первого столбца — «Концентрация», заголовок второго — «Площадь хроматографического пика». Заполняют ячейки вертикальных столбцов под названиями соответствующих столбцов экспериментальными значениями концентраций и площадей. Затем выделяют все столбцы с их названиями. В электронной таблице после выделения выбирают закладку «Вставка», подзакладку «Диаграммы» и выбирают пиктограмму точечной (скатерринговой) диаграммы. На полученном графике 34

нажимают правой кнопкой мыши по любой точке значений концентраций относительно площадей хроматографических пиков и в выпадающем меню выбирают пункт «добавить линию тренда». В появившемся меню справа на экране «Формат линии тренда» ставят галочку (точку) в «Параметрах линии тренда» — «линейная». По умолчанию галочка (точка) автоматически проставляется напротив «линейная». В этом же боковом меню «Формат линии тренда» проставляют галочки (точки) напротив «показывать уравнение на диаграмме» и «поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2)». Фиксируют (записывают) уравнение простой линейной регрессии. 10. Расчет коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) или величины достоверности аппроксимации (R^2). Статистический пакет, например, Microsoft Excel автоматически рассчитывает коэффициент простой линейной регрессии Пирсона или, точнее, коэффициент детерминации, или величину достоверности аппроксимации (R^2), который должен быть не ниже 0,9990. Стандартная операционная процедура расчета значений концентраций стандартных растворов реперного или определяемого соединений, при которых сохраняется линейность, мкг/мл* (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет уровней концентрации калибровочных растворов как реперного, так и определяемого соединений, которые использовались для построения уравнения простой линейной регрессии. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для проведения калибровки в методике анализа методом высокоэффективной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер анализа. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Математический аппарат СОП: расчет концентрации калибровочных растворов для каждой точки осуществляется по формуле для уравнения простой линейной регрессии Y = a  X + b для каждой точки градуировочного (калибровочного) графика: Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

35

C

S  bi S b ,C . a ai

В случае если свободный член (b) простой линейной регрессии имеет отрицательное значение, то формула расчета имеет вид C

S  bi S b ,C , a ai

где S — площадь хроматографического пика раствора вещества, mAU×с (при детекции вещества УФ-детектором); a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; b — свободный член простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. 7. Методика получения рассчитанной концентрации калибровочных растворов реперного или определяемого соединений: для данной цели используют, например, статистический пакет Microsoft Excel. В первую ячейку соответствующей колонки прописывают команду с символа «равно» [=значение ячейки первого показателя площади пика плюс значение b и разделить на значение а] из уравнения простой линейной регрессии, нажимают Enter. Появится значение. Затем ставят рамку на данную ячейку с полученным значением и за правый нижний уголок рамки ячейки тянут вниз до необходимого номера анализа. Автоматически рассчитываются остальные показатели рассчитанной концентрации соответственно каждой концентрации стандартного раствора реперного или определяемого соединений. Стандартная операционная процедура построения уравнения простой линейной регрессии между концентрациями калибровочных растворов реперного или определяемого веществ и площадью хроматографических пиков* (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: проверка параметра валидации «линейность» калибровочного графика и построение уравнения простой линейной реДанная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

36

грессии по калибровочным точкам концентраций калибровочных растворов реперного или определяемого соединений, а также коэффициента корреляции К. Пирсона с целью проверки тесноты и направления корреляционной связи между уровнями концентраций калибровочных растворов реперного или определяемого соединений. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для проверки валидационного показателя «линейность» калибровочного графика и построения уравнения простой линейной регрессии по калибровочным точкам концентраций калибровочных растворов реперного или определяемого соединений. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер проекта. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Математический аппарат СОП: уравнение простой линейной регрессии имеет вид: Для реперного (референтного) стандартного вещества: Y = a  X + b, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографического пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; b — свободный член простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу. Показывает усредненное влияние на результативный признак (Y) не учтенных в уравнении факторных признаков (X). Для определяемого стандартного вещества: Y = ai  X + bi, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографического пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. В случае высокоэффективной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии X соответствует концентрации калибровоч37

ных растворов реперного или определяемых соединений, а Y соответствует площади хроматографического пика относительно концентрации калибровочного раствора в одной точке. 7. Методика построения графика линейной зависимости, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Строят график линейной зависимости по уравнению простой линейной регрессии Y = a  X + b, где ось Х соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл, а ось Y — площади хроматографического пика. Для построения калибровочных кривых определяемых соединений хроматографируют раствор как одного определяемого соединения, так и нескольких определяемых соединений в одном растворе. После хроматографирования не менее 6 стандартных растворов реперного (маркерного) или определяемого вещества (веществ) в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность диапазона концентрации, получают уравнение простой линейной регрессии. В электронной таблице озаглавливают два любых вертикальных столбца, например, заголовок первого столбца — «Концентрация», заголовок второго — «Площадь хроматографического пика». Проставляют в ячейки вертикальных столбцов под названиями соответствующих столбцов экспериментальные значения концентраций и площадей. Затем выделяют все столбцы с их названиями. В электронной таблице после выделения выбирают закладку «Вставка», подзакладку «Диаграммы» и выбирают пиктограмму точечной (скатерринговой) диаграммы. На полученном графике нажимают правой кнопкой мыши по любой точке значений концентраций относительно площадей хроматографических пиков и в выпадающем меню выбирают пункт «добавить линию тренда». В появившемся меню справа на экране «Формат линии тренда» ставят галочку (точку) в «Параметрах линии тренда» — «линейная». По умолчанию галочка (точка) автоматически проставляется напротив «линейная». В этом же боковом меню «Формат линии тренда» проставляют галочки (точки) напротив «показывать уравнение на диаграмме» и «поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2)». Фиксируют (записывают) уравнение простой линейной регрессии. 8. Расчет коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) или величины достоверности аппроксимации (R^2). Статистический пакет, например, Microsoft Excel автоматически рассчитывает коэффициент простой линейной регрессии Пирсона или, точнее, коэффициент детерминации, или величину достоверности аппроксимации (R^2), который должен быть не ниже 0,9990. 38

Стандартная операционная процедура построения уравнения простой линейной регрессии между концентрациями калибровочных растворов определяемых веществ и площадью хроматографических пиков, соотнесенной с коэффициентами RCFi* (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: проверка параметра валидации «линейность» калибровочного графика и построение уравнения простой линейной регрессии по калибровочным точкам концентраций калибровочных растворов определяемых соединений, а также коэффициента корреляции Пирсона с целью проверки тесноты и направления корреляционной связи между уровнями концентраций калибровочных растворов определяемых соединений в каждой точке по отношению к коэффициентам RCFi. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для проверки валидационного показателя «линейность» калибровочного графика и построения уравнения простой линейной регрессии по калибровочным точкам концентраций калибровочных растворов определяемых соединений по отношению к коэффициентам RCFi. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер проекта. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Математический аппарат СОП: между соотношением и коэффициентом RCFi есть зависимость Sстанд.  Cреф. Sстанд.  Cреф.  RCFi  Cстанд. , , Sреф. Sреф.

где RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; Cреф. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sреф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного *

Данная стандартная процедура применима для метода СР-КАМС. 39

вещества, mAU×с; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества, mAU×с. Для каждой точки калибровочной кривой рассчитывают свой RCFi по формуле RCFi 

Sстанд.  Cреф. Sреф.  Cстанд.

,

где RCFi — относительный коррекционный фактор стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; Cреф. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Cстанд. — концентрация модельного раствора стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sреф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, mAU×с; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества, mAU×с. В дальнейшем строят проверку диапазона линейности и постоянства значений RCFi по формуле Y = a  RCFi  Cстанд. + bi, где Y — площадь хроматографического пика стандартного вещества; RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; Сстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл. 7. Методика построения графика линейной зависимости, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Строят график линейной зависимости по уравнению простой линейной регрессии Y = a  X + b, где ось Х соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл, ось Y — площади хроматографического пика. Для построения калибровочных кривых определяемых соединений хроматографируют раствор как одного определяемого соединения, так и нескольких определяемых соединений в одном растворе. После хроматографирования не менее 6 стандартных растворов реперного (маркерного) или определяемого вещества (веществ) в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность диапазона концентрации, получают уравнение простой линейной регрессии. В электронной таблице озаглавливают два любых вертикальных столбца, например, заголовок первого столбца — «Концентрация», заголовок второго — «Площадь хроматографического пика». Проставляют в ячейки вертикальных столбцов 40

под названиями соответствующих столбцов экспериментальные значения концентраций и площадей. Затем выделяют все столбцы с их названиями. В электронной таблице после выделения выбирают закладку «Вставка», подзакладку «Диаграммы» и выбирают пиктограмму точечной (скатерринговой) диаграммы. На полученном графике нажимают правой кнопкой мыши на любой точке значений концентраций относительно площадей хроматографических пиков и в выпадающем меню выбирают пункт «добавить линию тренда». В появившемся меню справа на экране «Формат линии тренда» ставят галочку (точку) в «Параметрах линии тренда» — «линейная». По умолчанию галочка (точка) автоматически проставляется напротив «линейная». В этом же боковом меню «Формат линии тренда» проставляют галочки (точки) напротив «показывать уравнение на диаграмме» и «поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2)». Фиксируют (записывают) уравнение простой линейной регрессии. 8. Расчет коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) или величины достоверности аппроксимации (R^2). Статистический пакет, например, Microsoft Excel автоматически рассчитывает коэффициент простой линейной регрессии Пирсона или, точнее, коэффициент детерминации, или величину достоверности аппроксимации (R^2), который должен быть не ниже 0,9990. Стандартная операционная процедура расчета усредненного времени удерживания (Rt), мин* (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет усредненного значения времени удерживания (Rt) в минутах по результатам не менее 6 исследований как для реперного, так и для определяемых соединений в методе ЛР-КАМС. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета среднего значения и его стандартного отклонения по результатам не менее 6 измерений времени удерживания (Rt) в минутах. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер проекта. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

41

6. Математический аппарат СОП: среднее значение рассчитывается как сумма Xi значений Rt, поделенная на количество экспериментов, по формуле 1 n X  X i , n i1 где X — среднее арифметическое значение; Xi — показатель i-го значения; n — количество показателей. 7. Методика расчета усредненного времени удерживания (Rt), например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Выделяют любую свободную ячейку. В свободной ячейке, которую заранее выделили, появляется усредненное значение Rt. Среднее значение рассчитывается путем выделения всех ячеек со значениями Rt и нажатия значка «Среднее» на ленте статистического пакета Microsoft Excel. Стандартная операционная процедура расчета относительного коррекционного фактора (RCF) для метода ЛР-КАМС (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет значения относительного коррекционного фактора (RCF; безразмерная величина) для определяемых соединений относительно реперного соединения в методе ЛР-КАМС. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета относительного коррекционного фактора (RCF) для определяемых соединений относительно реперного соединения. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер проекта. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Математический аппарат СОП: в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность градуировочного графика, для реперного и определяемого соединений строится график линейной зависимости и определяется уравнение простой линейной регрессии. Для реперного (референтного) стандартного вещества: Y = a  X + b, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографиче42

ского пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; b — свободный член простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу. Для определяемого стандартного вещества: Y = ai  X + bi, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографического пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. Для каждого определяемого соединения рассчитывают относительные коррекционные факторы — RCFi (relative correсtion factor): ai , a где RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу; a — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. RCFi 

Стандартная операционная процедура расчета усредненного относительного коррекционного фактора (RCF) для метода СР-КАМС (для реперного (референтного) стандартного вещества и определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет усредненного значения относительного коррекционного фактора (RCF; безразмерная величина) для определяемых соединений относительно реперного соединения в методе СРКАМС. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета усредненного значения относительного коррекционного фактора (RCF) для определяемых соединений относительно реперного соединения. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 43

3.2. Проверка: менеджер проекта. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Математический аппарат СОП: среднее значение рассчитывается как сумма i-х значений RCF, поделенная на число экспериментов, по формуле X

1 n X i , n i1

где X — среднее арифметическое значение; Xi — показатель i-го значения; n — количество показателей. 7. Расчет усредненного значения RCF, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Выделяют любую свободную ячейку. В свободной ячейке, которую заранее выделили, появляется усредненное значение RCF. Среднее значение рассчитывается путем выделения всех ячеек со значениями RCF и нажатия значка «Среднее» на ленте программы Microsoft Excel. Стандартная операционная процедура расчета усредненной концентрации определяемого стандартного вещества для метода СР-КАМС (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет усредненного значения концентрации определяемого стандартного вещества в методе СР-КАМС. 2. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета усредненного значения концентрации определяемого стандартного вещества. 3. Ответственность: 3.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 3.2. Проверка: менеджер проекта. 4. Подотчетность: начальник отдела. 5. Процедура: периодичность — по мере требования. 6. Математический аппарат СОП: концентрация определяемого стандартного вещества рассчитывается по формуле Cстанд. 

Sстанд.  Cреф. Sреф.  RCFi

,

где Cстанд. — концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sстанд. — площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного 44

вещества; Cреф. — концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл; Sреф. — площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества; RCFi — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу. 7. Расчет усредненного значения концентраций раствора определяемого стандартного вещества, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Выделяют любую свободную ячейку. В свободной ячейке, которую заранее выделили, появляется усредненное значение RCF. Среднее значение рассчитывается путем выделения всех ячеек со значениями концентраций растворов определяемого стандартного вещества и нажатия значка «Среднее» на ленте программы Microsoft Excel.

45

9. Параметры валидации СР-КАМСи ЛР-КАМС-методик Для целей валидации аналитических методик в рамках разработок СОП использовалась общая фармакопейная статья ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» (вводится впервые) Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания (М., 2018. — Т. 1 [1]). Валидационные характеристики, не вошедшие в вышеупомянутый выпуск фармакопеи, добавлены в соответствии с европейским изданием The fitness for purpose of analytical methods: a laboratory guide to method validation and related topics (2nd ed. — Eurachem, 2014 [6]). Валидация аналитической методики — это экспериментальное доказательство того, что методика пригодна для решения предполагаемых задач [5]. Валидации подлежат методики определения, в том числе методики определения примесей и методики определения содержания основного компонента в любом фармацевтическом средстве и субстанции для создания лекарственных препаратов. Методики проверки подлинности фармацевтического препарата или лекарственного растительного сырья подвергаются валидации при необходимости подтвердить их специфичность. Параметры, по которым необходимо проводить валидацию СРКАМС- и ЛР-КАМС-методик по определяемому стандартному веществу, представлены в таблице 2. Стандартная операционная процедура проверки линейности диапазона концентраций стандартных растворов соединений, мкг/мл* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: проверка линейности методики в диапазоне концентраций приготовленных растворов государственного стандартного образца как реперного, так и определяемого соединений. 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «линейность»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

46

47

3. Область применения СОП: данная процедура применима для проведения калибровки в методике анализа методом высокоэффективной и ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженерхимик. 4.2. Проверка: менеджер анализа. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Процедура: приготовление растворов с определенным зависимым шагом концентрации. Диапазон концентраций может быть различным. Единственное требование — соблюдение режима линейности согласно уравнению простой линейной регрессии. Предлагаемый диапазон приготовления концентраций калибровочных растворов следующий: 62,5 мкг/мл — 125 мкг/мл — 250 мкг/мл — 500 мкг/мл — 1000 мкг/мл. Диапазон приготовленных концентраций калибровочных растворов может быть и иным. Главное требование: соблюдение линейной зависимости в выбранном диапазоне концентраций. 8. Подготовка калибровочных растворов: вначале приготавливают калибровочный раствор наибольшей концентрации, т. е. 1000 мкг/мл, добавляют определенное количество растворителя до разбавления раствора. Точную навеску государственного стандартного образца вещества (порошок-субстанция с чистотой не менее 98,5%) массой 20 мг растворяют в 20 мл растворителя. Это стандартный раствор вещества с концентрацией 1000 мкг/мл (1 мг/мл). Полученный раствор используют для приготовления серии градуировочных растворов в диапазоне концентраций от 62,5 до 500 мкг/мл, а именно: для приготовления раствора с концентрацией 62,5 мкг/мл (0,625 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл), 125 мкг/мл (1,25 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл), 250 мкг/мл (2,5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл), 500 мкг/мл (5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл доводят растворителем до 10 мл). 9. Подготовка прибора ВЭЖХ. Включают прибор, проводят настройки, подготавливают программу для хроматографирования. Проводят поочередную инжекцию калибровочных растворов в хроматографическую колонку. Получают пик на хроматограмме, записывают относительное время удерживания, которое должно точно совпадать у всех калибровочных растворов одного и того же вещества. Записывают в файл метода каждую хроматограмму и в отчете по хроматограмме отмечают площадь хроматографического пика. 48

Каждой концентрации калибровочного раствора соединения должна соответствовать своя площадь хроматографического пика. 10. Методика построения графика линейной зависимости, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Строят график линейной зависимости по уравнению простой линейной регрессии Y = a  X + b, где ось Х соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл, ось Y — площади хроматографического пика. Для построения калибровочных кривых определяемых соединений хроматографируют раствор как одного определяемого соединения, так и нескольких определяемых соединений в одном растворе. После хроматографирования не менее 6 стандартных растворов реперного (маркерного) или определяемого вещества (веществ) в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность диапазона концентрации, получают уравнение простой линейной регрессии. В электронной таблице озаглавливают два любых вертикальных столбца, например, заголовок первого столбца — «Концентрация», заголовок второго — «Площадь хроматографического пика». Проставляют в ячейки вертикальных столбцов под названиями соответствующих столбцов экспериментальные значения концентраций и площадей. Затем выделяют все столбцы с их названиями. В электронной таблице после выделения выбирают закладку «Вставка», подзакладку «Диаграммы» и выбирают пиктограмму точечной (скатерринговой) диаграммы. На полученном графике нажимают правой кнопкой мыши по любой точке значений концентраций относительно площадей хроматографических пиков и в выпадающем меню выбирают пункт «добавить линию тренда». В появившемся меню справа на экране «Формат линии тренда» ставят галочку (точку) в «Параметрах линии тренда» — «линейная». По умолчанию галочка (точка) автоматически проставляется напротив «линейная». В этом же боковом меню «Формат линии тренда» проставляют галочки (точки) напротив «показывать уравнение на диаграмме» и «поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2)». Фиксируют (записывают) уравнение простой линейной регрессии. 11. Расчет коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) или величины достоверности аппроксимации (R^2). Статистический пакет, например, Microsoft Excel автоматически рассчитывает коэффициент простой линейной регрессии Пирсона или, точнее, коэффициент детерминации, или величину достоверности аппроксимации (R^2), который должен быть не ниже 0,9990. 49

Стандартная операционная процедура расчета показателя LOD* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя предела обнаружения (limit of detection — LOD) — это минимальное содержание определяемого вещества, сигнал которого можно отличить от фона. 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «предел обнаружения»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для определения показателя предела обнаружения (limit of detection — LOD) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: LOD рассчитывается по формуле LOD 

3,3  SD , ai

где SD — standard deviation (стандартное отклонение); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по стандартному веществу. Уравнение простой линейной регрессии имеет вид Y = ai  X + bi, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографического пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. Рассчитывают стандартное отклонение для свободного члена простой линейной регрессии. При построении калибровочного граДанная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

50

фика в методе ЛР-КАМС или по точкам в методе СР-КАМС программа автоматически рассчитывает и выводит уравнение простой линейной регрессии с указанием цифровых значений для индексов a и b. При этом, например, в электронной таблице Microsoft Excel строят два столбца значений. Первый столбец — значения уровней концентрации, второй столбец — соответствующая каждому уровню концентрации площадь хроматографического пика. Чтобы посчитать показатель LOD, необходимо рассчитать стандартное отклонение SD для b — свободного члена простой линейной регрессии. Статистически стандартное отклонение SD свободного члена простой линейной регрессии b рассчитывается по формуле SD  b  , SE  b   n где SE(b) — стандартная ошибка среднего арифметического свободного члена простой линейной регрессии; SD(b) — стандартное отклонение свободного члена простой линейной регрессии; n — число степеней свободы (объем выборки). Иначе LOD рассчитывается по формуле LOD 

3,3  SE  b   n , ai

где SE(b) — стандартная ошибка среднего свободного члена простой линейной регрессии; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по стандартному веществу; n — число степеней свободы (объем выборки), количество растворов с различными концентрациями. 8. Методика построения графика линейной зависимости, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Строят график линейной зависимости по уравнению простой линейной регрессии Y = a  X + b, где ось Х соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл, ось Y — площади хроматографического пика. Для построения калибровочных кривых определяемых соединений хроматографируют раствор как одного определяемого соединения, так и нескольких определяемых соединений в одном растворе. После хроматографирования не менее 6 стандартных растворов реперного (маркерного) или определяемого вещества (веществ) в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность диапазона концентрации, получают уравнение простой линейной регрессии. В электронной таблице озаглавливают 51

два любых вертикальных столбца, например, заголовок первого столбца — «Концентрация», заголовок второго — «Площадь хроматографического пика». Проставляют в ячейки вертикальных столбцов под названиями соответствующих столбцов экспериментальные значения концентраций и площадей. Затем выделяют все столбцы с их названиями. В электронной таблице после выделения выбирают закладку «Вставка», подзакладку «Диаграммы» и выбирают пиктограмму точечной (скатерринговой) диаграммы. На полученном графике нажимают правой кнопкой мыши по любой точке значений концентраций относительно площадей хроматографических пиков и в выпадающем меню выбирают пункт «добавить линию тренда». В появившемся меню справа на экране «Формат линии тренда» ставят галочку (точку) в «Параметрах линии тренда» — «линейная». По умолчанию галочка (точка) автоматически проставляется напротив «линейная». В этом же боковом меню «Формат линии тренда» проставляют галочки (точки) напротив «показывать уравнение на диаграмме» и «поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2)». Фиксируют (записывают) уравнение простой линейной регрессии. 9. Следующий шаг — получение переменных для расчета LOD: выбор в электронной таблице закладки «Данные», подзакладки «Анализ» и выбор пиктограммы «Анализ данных». В появившемся диалоговом окне «Анализ данных» из предложенного списка выбирают команду «Регрессия», нажимают кнопку «ОК». В появившемся диалоговом окне «Регрессия» в окошко «Входной интервал Y» ставят курсор и выделяют все значения без надписи столбика «Площадь хроматографического пика». В окошке программа прописывает координаты всех ячеек со значениями площадей хроматографических пиков. Аналогичные манипуляции проводят с окошком «Входной интервал X», при этом выделяя все ячейки со значениями концентрации растворов. В этом же диалоговом окне «Регрессия» в «Параметрах входа» ставят галочку (точку) у окошка «Входной интервал» и в окошке ставят курсор, при этом в электронной таблице выделяют любую свободную ячейку, которая выделяется прерывистой контурной линией, и в окошке «Выходной интервал» программа автоматически прописывает координаты выделенной ячейки. Затем в этом же диалоговом окне под надписью «Остатки» проставляют галочки (точки) напротив команд «Остатки» и «Стандартизованные остатки». Нажимают кнопку «ОК». Появляется таблица «Вывод остатков». Внутри главной таблицы находят внутреннюю таблицу со столбцом «Коэффициенты». Находят строку с заглавием «Y-пересечение», которое 52

соответствует англоязычной переменной intercept или свободный член простой линейной регрессии (b). В данной таблице в столбце «Стандартная ошибка» имеется значение данной ошибки (SE). Полученное значение рассчитывают в уравнении LOD 

3,3  SE  b   n , ai

где SE(b) — стандартная ошибка среднего свободного члена простой линейной регрессии; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по стандартному веществу; n — число степеней свободы (объем выборки), количество растворов с различными концентрациями. 10. Расчет коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) или величины достоверности аппроксимации (R^2). Статистический пакет, например, Microsoft Excel автоматически рассчитывает коэффициент простой линейной регрессии Пирсона или, точнее, коэффициент детерминации, или величину достоверности аппроксимации (R^2), который должен быть не ниже 0,9990. Стандартная операционная процедура расчета показателя LOQ* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя предела количественного определения (limit of quantitation — LOQ) — это самая низкая концентрация анализируемого вещества, которая может быть не только обнаружена, но и количественно определена в определенных пределах достоверности после проведения повторных измерений на растворе стандарта и известной низкой концентрации (например, 10–20 определений). 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «предел количественного определения»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для определения показателя предела количественного определения (limit of quantitation — LOQ) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

53

4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: LOQ рассчитывается по формуле 10  SD , LOQ  ai где SD — standard deviation (стандартное отклонение); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по стандартному веществу. Уравнение простой линейной регрессии имеет вид Y = ai  X + bi, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографического пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. Рассчитывают стандартное отклонение для свободного члена простой линейной регрессии. При построении калибровочного графика в методе ЛР-КАМС или по точкам в методе СР-КАМС программа автоматически рассчитывает и выводит уравнение простой линейной регрессии с указанием цифровых значений для индексов a и b. При этом, например, в электронной таблице Microsoft Excel строят два столбца значений. Первый столбец — значения уровней концентрации, второй столбец — соответствующая каждому уровню концентрации площадь хроматографического пика. Чтобы посчитать показатель LOQ, необходимо рассчитать стандартное отклонение SD для b — свободного члена простой линейной регрессии. Статистически стандартное отклонение SD свободного члена простой линейной регрессии b рассчитывается по формуле SD  b  SE  b   , n где SE(b) — стандартная ошибка среднего арифметического свободного члена простой линейной регрессии; SD(b) — стандартное отклонение свободного члена простой линейной регрессии; n — число степеней свободы (объем выборки). 54

Иначе LOQ рассчитывается по формуле LOQ 

10  SE  b   n , ai

где SE(b) — стандартная ошибка среднего свободного члена простой линейной регрессии; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; n — число степеней свободы (объем выборки), количество растворов с различными концентрациями. 8. Методика построения графика линейной зависимости, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Строят график линейной зависимости по уравнению простой линейной регрессии: Y = ai  X + bi, где X — факторный признак, соответствует концентрации калибровочных растворов соединения, мг/мл; Y — площади хроматографического пика (в случае уравнения простой линейной регрессии); ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; bi — свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу. Для построения калибровочных кривых определяемых соединений хроматографируют раствор как одного определяемого соединения, так и нескольких определяемых соединений в одном растворе. После хроматографирования не менее 6 стандартных растворов реперного (маркерного) или определяемого вещества (веществ) в диапазоне концентраций, при котором сохраняется линейность диапазона концентрации, получают уравнение простой линейной регрессии. В электронной таблице озаглавливают два любых вертикальных столбца, например, заголовок первого столбца — «Концентрация», заголовок второго — «Площадь хроматографического пика». Проставляют в ячейки вертикальных столбцов под названиями соответствующих столбцов экспериментальные значения концентраций и площадей. Затем выделяют все столбцы с их названиями. В электронной таблице после выделения выбирают закладку «Вставка», подзакладку «Диаграммы» и выбирают пиктограмму точечной (скатерринговой) диаграммы. На полученном графике нажимают правой кнопкой мыши по любой точке значений концентраций относительно площадей хроматографических пиков и в выпадающем меню выбирают пункт «добавить линию тренда». В появившемся меню справа на экране «Формат линии тренда» ставят галочку (точку) 55

в «Параметрах линии тренда» — «линейная». По умолчанию галочка (точка) автоматически проставляется напротив «линейная». В этом же боковом меню «Формат линии тренда» проставляют галочки (точки) напротив «показывать уравнение на диаграмме» и «поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2)». Фиксируют (записывают) уравнение простой линейной регрессии. 9. Следующий шаг — получение переменных для расчета LOQ: выбор в электронной таблице закладки «Данные», подзакладки «Анализ» и выбор пиктограммы «Анализ данных». В появившемся диалоговом окне «Анализ данных» из предложенного списка выбирают команду «Регрессия», нажимают кнопку «ОК». В появившемся диалоговом окне «Регрессия» в окошко «Входной интервал Y» ставят курсор и выделяют все значения без надписи столбика «Площадь хроматографического пика». В окошке программа прописывает координаты всех ячеек со значениями площадей хроматографических пиков. Аналогичные манипуляции проводят с окошком «Входной интервал X», при этом выделяя все ячейки со значеними концентрации растворов. В этом же диалоговом окне «Регрессия» в «Параметрах входа» ставят галочку (точку) у окошка «Входной интервал» и в окошке ставят курсор, при этом в электронной таблице выделяют любую свободную ячейку, которая выделяется прерывистой контурной линией, и в окошке «Выходной интервал» программа автоматически прописывает координаты выделенной ячейки. Затем в этом же диалоговом окне под надписью «Остатки» проставляют галочки (точки) напротив команд «Остатки» и «Стандартизованные остатки». Нажимают кнопку «ОК». Появляется таблица «Вывод остатков». Внутри главной таблицы находят внутреннюю таблицу со столбцом «Коэффициенты». Находят строку с заглавием «Y-пересечение», которое соответствует англоязычной переменной intercept или свободный член простой линейной регрессии (b). В данной таблице в столбце «Стандартная ошибка» имеется значение данной ошибки (SE). Полученное значение рассчитывают в уравнении: LOQ 

10  SE  b   n , ai

где SE(b) — стандартная ошибка среднего свободного члена простой линейной регрессии; ai — эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу; n — число степеней свободы (объем выборки), количество растворов с различными концентрациями. 56

10. Расчет коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) или величины достоверности аппроксимации (R^2). Статистический пакет, например, Microsoft Excel автоматически рассчитывает коэффициент простой линейной регрессии Пирсона или, точнее, коэффициент детерминации, или величину достоверности аппроксимации (R^2), который должен быть не ниже 0,9990. Стандартная операционная процедура расчета показателя MDL* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя предела обнаружения метода (method detection limit — MDL) — это минимальная концентрация, которая может быть определена с вероятностью 99%, что истинная концентрация больше нуля. 2. Область распространения: Европейская фармакопея VIII выпуска, Фармакопея США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для определения показателя предела обнаружения метода (method detection limit — MDL) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженерхимик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: MDL рассчитывается по формуле MDL = SD  t, где SD — standard deviation (стандартное отклонение); t — значение коэффициента Стьюдента. В руководстве к любому аналитическому прибору, как правило, указывается уровень расчетного предела обнаружения, например, мг/л, или мг/мл, или мг/г и т. п. Готовят растворы какого-либо вещества с концентрацией, превышающей уровень расчетного предела, указанного в руководстве, примерно в 4 раза. Этот раствор анализируется несколько раз, например, 9 раз в течение нескольких дней. Получены 9 значений концентраций вещества одного и того же раствора. Рассчитывают стандарт* Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

57

ное отклонение SD для 9 уровней концентраций одного и того же раствора. Открывают таблицу критических значений t Стьюдента и на пересечении 8 (число степеней свободы n = 9–1) и, скажем, уровня значимости 0,05 находят критическое значение коэффициента Стьюдента. Это критическое значение умножают на SD. 8. MDL указывает, каков нижний предел количественного определения. Самый низкий предел фактически примерно в 2,5 раза выше, чем рассчитанное MDL. MDL также используется для определения количества пиков в пробе для известной добавки. И в рутинных методах анализа увеличивают объем пробы примерно в 10–50 раз. Исходя из этого можно рассчитать процент извлечения искомого вещества. При неуклонном увеличении значения MDL данный факт говорит о систематических ошибках в аналитической методике или поломке аналитического оборудования. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения концентраций одного и того же раствора, рассчитанные в течение определенного временного интервала. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Стандартная операционная процедура расчета показателя MQL* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя предела количественного определения метода (method quantitation limit — MQL) — это самая низкая концентрация определяемого вещества, которая может быть Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

58

легко определена количественно в определенных пределах точности в обычных лабораторных условиях. 2. Область распространения: Европейская фармакопея VIII выпуска, Фармакопея США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для определения показателя предела количественного определения метода (method quantitation limit — MQL) в методах ЛР-КАМС и СРКАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: MQL рассчитывается по формуле MQL = 3  MDL, где MDL — method detection limit — представляет наименьшую концентрацию аналита, которую можно количественно определить для определенного анализируемого вещества с использованием введенной аналитической методики. 8. MQL указывает, каков нижний предел количественного определения, который может быть легко определен количественно в определенных пределах точности в обычных лабораторных условиях. 9. Вначале рассчитывают показатель MDL. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения концентраций одного и того же раствора, рассчитанные в течение определенного временного интервала. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных 59

ячеек со значениями. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Рассчитывают стандартное отклонение SD для 9 уровней концентраций одного и того же раствора. Открывают таблицу критических значений t Стьюдента и на пересечении 8 (число степеней свободы n = 9–1) и, скажем, уровня значимости 0,05 находят критическое значение коэффициента Стьюдента. Это критическое значение умножают на SD. Полученное значение MDL умножают еще и на 3. Получают переменную MQL. Стандартная операционная процедура расчета показателя precision intra-day RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «точность», «внутридневная точность» (intra-day precision). 2. Область распространения: Европейская фармакопея VIII выпуска, Фармакопея США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «точность», «внутридневная точность» (intra-day precision) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

60

8. Приготавливают три раствора определяемого вещества с различными концентрациями. Каждый раствор со своей концентрацией анализируют по 7 раз в течение одного рабочего дня (intra-day). Анализ проводится на хроматографе путем инжекции анализируемого раствора со своей концентрацией 7 раз в один рабочий день. Аналогичная процедура повторяется и для двух других растворов с различными концентрациями в течение одного рабочего дня. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения семи концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. 10. Рассчитывают среднее арифметическое значение по семи концентрациям одного раствора в течение одного рабочего дня. Рассчитывают коэффициент вариации по вышеуказанной формуле. Так как анализу подвергается раствор определяемого вещества по трем разным концентрациям, то ответ будет интервальным от наименьшего процента RSD% к наибольшему проценту RSD%. Стандартная операционная процедура расчета показателя precision inter-day RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «точность», «междневная точность» (interday precision). * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

61

2. Область распространения: Европейская фармакопея VIII выпуска, Фармакопея США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «точность», «междневная точность» (inter-day precision) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Приготавливают три раствора определяемого вещества с различными концентрациями. Каждый раствор со своей концентрацией анализируют по 7 раз в течение пяти рабочих дней (inter-day). Анализ проводится на хроматографе путем инжекции анализируемого раствора со своей концентрацией 7 раз в течение пяти рабочих дней. Аналогичная процедура повторяется и для двух других растворов с различными концентрациями в течение пяти рабочих дней. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения семи концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом 62

окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. 10. Рассчитывают среднее арифметическое значение по семи концентрациям одного раствора в течение пяти рабочих дней. Рассчитывают коэффициент вариации по вышеуказанной формуле. Так как анализу подвергается раствор определяемого вещества по трем разным концентрациям, то ответ будет интервальным от наименьшего процента RSD% к наибольшему проценту RSD%. Стандартная операционная процедура расчета показателя instrumental precision RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «инструментальная точность» (instrumental precision). 2. Область распространения: Европейская фармакопея VIII выпуска, Фармакопея США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «инструментальная точность» (instrumental precision) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

* Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

63

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Параметр «инструментальная точность» (instrumental precision), или воспроизводимость результатов на одном и том же оборудовании одного и того же образца. Измерения проводятся на одном и том же оборудовании, но разными исполнителями в разные дни, например, проведение не менее 6 анализов не менее чем за 6 недель. Приготавливают не менее 6 растворов определяемого вещества и проводят анализ на идентичном оборудовании в течение не менее 6 недель. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения не менее 6 концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Стандартная операционная процедура расчета показателя intermediate precision RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «промежуточная точность» (intermediate precision) или «внутрилабораторная вариабельность». 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «аналитическая область методики»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

64

3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «промежуточная точность» (intermediate precision) или «внутрилабораторная вариабельность» в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Данная процедура проводится двумя разными химиками-аналитиками в двух разных лабораториях, использующих две разные системы ВЭЖХ в разные дни и оценивающих чистоту определяемого вещества на трех уровнях концентрации (50%, 100% и 150%), которые охватывают диапазон метода анализа раствора определяемого вещества от 80% до 120%. Методика количественного определения должна быть применима в интервале от 80% до 120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики. Методика оценки однородности дозирования должна быть применима в интервале от 70% до 130% от номинальной дозы. В случае если валидируется методика на фармацевтический препарат, у которого известна концентрация данного препарата, то эту концентрацию принимают за 100%. Например, концентрация раствора фармацевтического препарата 40 мг/мл — 100% (раствор № 1), 50% — 20 мг/мл (раствор № 2) и 150% — 50 мг/мл (раствор № 3). В случае если валидируется методика анализа растительного или иного экстракта, в котором, как правило, нет точной установки концентрации анализируемого индивидуального соединения, то берут три уровня концентрации по другому принципу: 1-я точка концентрации немного больше значения LOQ, 65

2-я точка — посередине градуировочного графика, 3-я точка — больше середины градуировочного графика, потому что нет ожидаемого уровня концентрации анализируемого соединения, как в фармацевтическом препарате, поэтому исходим из градуировочного графика. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения семи концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. 10. Рассчитывают среднее арифметическое значение по семи концентрациям одного раствора в течение пяти рабочих дней. Рассчитывают коэффициент вариации по вышеуказанной формуле. Так как анализу подвергается раствор определяемого вещества по трем разным концентрациям, то ответ будет интервальным от наименьшего процента RSD% к наибольшему проценту RSD%. Стандартная операционная процедура расчета показателя repeatability RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «повторяемость» (repeatability) или «надежность повторного тестирования» — это степень соответствия последовательных результатов анализа одного и того же показателя в одних и тех же условиях. * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

66

2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «прецизионность», подвид «повторяемость» или «сходимость»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «повторяемость» (repeatability) или «надежность повторного тестирования» в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Повторяемость аналитической методики оценивают по независимым результатам, полученным в одинаковых регламентированных условиях в одной лаборатории одним и тем же исполнителем на одном и том же оборудовании с использованием одних и тех же реактивов в пределах короткого промежутка времени. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения шести концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне 67

«Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Стандартная операционная процедура расчета показателя intralaboratory precision RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «внутрилабораторная точность» (intralaboratory precision) в форме внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности — это степень соответствия последовательных результатов анализа одного и того же показателя в условиях одной лаборатории (разные дни, разные исполнители, разное оборудование и т. д.). 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «прецизионность», подвид «внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность»). 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «внутрилабораторная точность» (intralaboratory precision) в форме внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности — это степень соответствия последовательных результатов анализа одного и того же показателя в условиях одной лаборатории (разные дни, разные исполнители, разное оборудование и т. д.) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

68

Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Повторяемость аналитической методики оценивают по независимым результатам, полученным в одинаковых регламентированных условиях в одной лаборатории (разные дни, разные исполнители, разное оборудование и т. д.). 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения шести концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Стандартная операционная процедура расчета показателя interlaboratory precision RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «межлабораторная точность» (interlaboratory precision) в форме межлабораторной прецизионности (воспроизводимости) — это степень соответствия последовательных результатов анализа одного и того же показателя в условиях разных лабораторий (разные дни, разные исполнители, разное оборудование и т. д.). * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

69

2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «прецизионность», подвид «межлабораторная прецизионность (воспроизводимость)»). 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «межлабораторная точность» (interlaboratory precision) в форме межлабораторной прецизионности (воспроизводимости) — это степень соответствия последовательных результатов анализа одного и того же показателя в условиях разных лабораторий (разные дни, разные исполнители, разное оборудование и т. д.) в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Межлабораторная прецизионность (воспроизводимость) аналитической методики оценивают по независимым результатам, полученным в одинаковых регламентированных условиях в разных лабораториях (разные дни, разные исполнители, разное оборудование и т. д.). 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения шести концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с 70

названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Стандартная операционная процедура расчета показателя stability RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «стабильность» (stability). 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «устойчивость»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «стабильность» (stability) или «устойчивость» в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. 4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

*

71

8. Стабильность аналитической методики проверяется по измерению концентрации одного и того же раствора при хранении в течение 24–72 часов, например, в автосамплере, и измеряют концентрацию не менее 6 раз в течение короткого промежутка времени. 9. Методика расчета SD стандартного отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. В один столбец вертикально в каждую ячейку вносят значения шести концентраций одного и того же раствора, полученного после хроматографирования. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями концентраций. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. Стандартная операционная процедура расчета показателя recovery RSD (%)* (для определяемого стандартного вещества)

1. Цель СОП: расчет показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «открываемость» (recovery) или «правильность». 2. Область распространения: Российская Федерация (входит в Государственную фармакопею XIV выпуска под названием «правильность»), а также входит в Европейскую фармакопею VIII выпуска, Фармакопею США и др. 3. Область применения СОП: данная процедура применима для расчета показателя относительного стандартного отклонения (relative standard deviation — RSD), или коэффициента вариации (Cv), по параметру «открываемость» (recovery) или «правильность» в методах ЛР-КАМС и СР-КАМС. * Данная стандартная процедура применима как для метода ЛР-КАМС, так и для метода СР-КАМС.

72

4. Ответственность: 4.1. Выполнение: химик-аналитик, провизор-аналитик, инженер-химик. 4.2. Проверка: менеджер проекта. 5. Подотчетность: начальник отдела. 6. Процедура: периодичность — по мере требования. 7. Математический аппарат СОП: расчет промахов; а) расчет среднего арифметического значения показателей: X

1 n X i , n i1

где X — среднее арифметическое значение; Xi — показатель i-го значения; n — количество показателей; б) расчет среднеквадратического отклонения:

 X n



i 1

i

X

n 1

2

,

где X — среднее арифметическое значение; Xi — показатель i-го значения; n — количество показателей;  — среднеквадратическое отклонение; в) расчет абсолютной погрешности отдельного i-го измерения (по модулю): A  Xi  X , где Xi — значение возможного промаха; X — среднее арифметическое значение по результатам 6 измерений; |А| — абсолютная погрешность отдельного i-го измерения (по модулю). Рассчитывают содержание определяемого вещества в растворах для методик: а) точно известное количество определяемого компонента (С1) вводят в матрицу образца, не содержащего определяемого компонента. Проводят измерения по количественному содержанию определяемого вещества в матрице (С2) и рассчитывают относительную погрешность метода по формуле C 

C2  C1 , C1

где ∆С — погрешность анализируемого вещества в матрице, добавленного в матрицу; С1 — количество анализируемого вещества, добавленного в матрицу образца, не содержащую данного вещества; 73

С2 — количество анализируемого вещества в матрице после добавления в матрицу; б) точно известное количество определяемого компонента добавляют к образцу, содержащему определяемый компонент (метод добавок). В данном случае анализируют сам экстракт, взятый в определенном объеме. Определяют в нем количество анализируемого вещества — X1. Затем берут точно такой же объем растворителя, как и объем экстракта, и растворяют в нем известное количество анализируемого соединения — Xдоб.. Проводят анализ матрицы с добавкой и находят содержание анализируемого вещества — X2. Расчеты проводят по формуле X 

 X 2  X1   X доб. X доб.

,

где ∆X — погрешность; X1 — содержание анализируемого вещества в определенном объеме экстракта; X2 — содержание анализируемого вещества в определенном объеме экстракта после добавления пробы; Xдоб. — масса добавленного образца анализируемого вещества в определенном объеме растворителя. Проводят расчет среднего значения погрешностей по результатам не менее 6 измерений и находят значение относительного стандартного отклонения. Относительное стандартное отклонение (RSD), или коэффициент вариации (Cv), показывает степень изменчивости по отношению к среднему показателю выборки. Рассчитывается по формуле

RSD или Cv 

SD  100% , X

где SD — стандартное отклонение; X — среднее арифметическое выборки. 8. Открываемость или правильность аналитической методики проверяется методом «введено-найдено». Метод «введенонайдено» имеет две разновидности: а) точно известное количество определяемого компонента вводят в матрицу образца, не содержащего определяемого компонента; б) точно известное количество определяемого компонента добавляют к образцу, содержащему определяемый компонент (метод добавок). Вначале выявляют промахи. Выявление промахов необходимо провести до определения погрешностей измерений. Эта операция особенно целесообразна в том случае, если среди ряда измерений встре74

чаются отдельные значения, резко отличные от других. Промахи возникают, как правило, из-за неверных действий оператора, но могут также быть результатом неисправности используемых средств измерений. Во всех случаях промахи не являются характеристикой измерений, и, чтобы избежать значительных искажений результатов, их необходимо отбросить. Для объективного решения вопроса о том, был ли промахом какой-либо результат измерения, применяются специальные методы. Наибольшее распространение получили два из них: метод (критерий) 3σ («трех сигм») и табличный метод (критерий Смирнова — Греббса). В основу метода 3σ положено допущение, что результаты однократных измерений Хi могут отклоняться от их среднего арифметического значения X не более чем на 3σ. Если же какойлибо результат однократного измерения Xi отклоняется от X более чем на 3σ, то это промах. Для обнаружения промахов по методу 3σ необходимо выполнить следующие операции: подсчитать среднее арифметическое значение ряда измерений Xi, подсчитать среднее квадратичное отклонение, найти по абсолютной величине разность |А| между предполагаемым промахом Xi и средним арифметическим значением ряда измерений. Если |А| < 3σ, то проверяемая величина не является промахом и может быть использована для расчета погрешности. 9. Расчет среднего арифметического значения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Выделяют любую свободную ячейку. В свободной ячейке, которую заранее выделили, появляется среднее арифметическое значение. Среднее значение рассчитывается путем выделения всех ячеек с переменными и нажатия значка «Среднее» на ленте статистического пакета Microsoft Excel. Расчет стандартного (среднеквадратического) отклонения, например, при помощи статистического пакета Microsoft Excel. Выделяют любую свободную ячейку, в которой затем появится значение SD стандартного отклонения. Затем нажимают на пиктограмму fx («вставить функцию»). В появившемся диалоговом окне «Вставка функции» из выпадающего списка напротив «Категории» выбирают «Статистические» и в предложенном списке выбирают функцию с названием «стандотклон.г» (вычисляет стандартное отклонение по генеральной совокупности, логические и текстовые значения игнорируются). Нажимают «ОК». В появившемся новом диалоговом окне «Аргумент функции» в пустое поле «Число 1» ставят курсор и выделяют столбец со значениями концентраций, выделяя их. При этом в поле «Число 1» прописываются координаты всех выделенных ячеек со значениями. Нажимают «ОК». Появляется значение SD стандартного отклонения. 75

Расчет показателя разности |А| между предполагаемым промахом и средним арифметическим значением (по модулю). В качестве предполагаемого промаха берут каждое i-е значение из вариационного ряда значений. Сравнение показателя |A|, полученного от каждого i-го значения, с 3 значениями стандартных (среднеквадратических) отклонений. Расчет значения погрешности по одному из методов. Расчет 95%-ного доверительного интервала для показателя |А|. Не менее 6 рассчитанных значений коэффициента А помещают вертикально в свои ячейки одного столбца в электронной таблице Microsoft Excel. В любую свободную ячейку таблицы ставится курсор. Здесь появится рассчитанный 95%-ный уровень надежности. Затем во вкладке «Данные» ленты Microsoft Excel выбирают меню «Анализ данных» и из выпавшего списка выбирают «Описательная статистика». Нажимают «ОК». В диалоговом окне «Описательная статистика» в поле «входной интервал» ставят курсор и выделяют все ячейки со значениями параметра А. В ячейке диалогового окна автоматически прописываются координаты всех выделенных ячеек. Затем в «выходном интервале» в поле ставят курсор и выделяют не менее 7 ячеек вертикально, которые свободны в электронной таблице и не заняты переменными. В этих ячейках появятся записи расчетов, генерируемые программой. Ставят галочку (точку) напротив надписи «итоговая статистика» и галочку (точку) напротив надписи «уровень надежности», и в поле уровня надежности автоматически должно прописаться значение 95%. Если его нет, то прописывают. Нажимают «ОК». Появится таблица значений описательной статистики. Для расчета 95%-ного доверительного интервала используют только два значения: «среднее» и «уровень надежности 95%». Для этого в любой свободной ячейке ставят курсор и прописывают команду, которая начинается с «равно». И указывают координаты ячеек со средним значением и уровнем надежности, прописывая их. Для нижнего уровня 95%-ного доверительного интервала, например, пишут: =А1−В8, а для верхнего уровня 95%-ного доверительного интервала, например, пишут: =А1+B8. И в обоих случаях нажимают Enter. В этих ячейках появятся значения нижнего и верхнего 95%-ного доверительного интервала. А1 — координата ячейки со средним арифметическим значением, В8 — координата ячейки с 95%-ным уровнем надежности.

76

Литература 1. Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания. — М., 2018. — Т. 1. 2. Разработка методики количественного определения диосгенина из семян пажитника сенного, Trigonella foenum-graecum L. / А. Е. Суханов, А. Н. Ставрианиди, Е. Д. Кубасова [и др.] // Разработка и регистрация лекарственных средств. — 2020. — Т. 9, № 3. — С. 150–156. — URL: https:// doi.org/10.33380/ 2305-2066-2020-9-3-150-156. 3. Валидация методики ВЭЖХ-УФ количественного определения стероидного сапогенина диосгенина из семян пажитника сенного, Trigonella foenumgraecum L. / А. Е. Суханов, А. Н. Ставрианиди, Е. Д. Кубасова [и др.] // Разработка и регистрация лекарственных средств. — 2020. — Т. 9, № 4. — С. 107–114. — URL: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2020-9-4-107-114. 4. Шаповалова, Е. Н. Хроматографические методы анализа : методическое пособие для специального курса / Е. Н. Шаповалова, А. В. Пирогов; под ред. чл.-корр. РАН, проф. О. А. Шпигуна. — М., 2007. — 109 с. 5. Epstein, N. A. Validation of analytical methods: graphical and computational criteria for evaluating the linearity of methods in practice / N. A. Epstein // Drug development and registration. — 2019. — Vol. 8, is. 2. — P. 122–129. — URL: https://doi.org/ 10.33380/2305-2066-2019-8-2-122-130. 6. Magnusson, B. Eurachem guide: the fitness for purpose of analytical methods : a laboratory guide to method validation and related topics / B. Magnusson, U. Örnemark. — 2nd ed. — 2014. — URL: www.eurachem.org

77

Список использованных сокращений ВЭЖХ ВЭЖХ-УФ ЛР-КАМС СОП СР-КАМС ЯМР CAD LOD LOQ

MDL MQL

RCFi

RSD (Cv)

высокоэффективная жидкостная хроматография высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием линейно-регрессионный вариант метода количественного анализа по одному маркерному веществу стандартная операционная процедура среднерасчетный вариант метода количественного анализа по одному маркерному веществу спектроскопия ядерного магнитного резонанса charged aerosol detector — детектор заряженных частиц в аэрозоле limit of detection — минимальное содержание определяемого вещества, сигнал от которого можно отличить от фона limit of quantitation — самая низкая концентрация анализируемого вещества, которая может быть не только обнаружена, но и количественно определена в определенных пределах достоверности после проведения повторных измерений на растворе стандарта и известной низкой концентрации method detection limit — это минимальная концентрация, которая может быть определена с вероятностью 99% как отличная от нуля method quantitation limit — самая низкая концентрация определяемого вещества, которая может быть легко определена количественно в определенных пределах точности в обычных лабораторных условиях relative correction factor i-го вещества — относительный коррекционный фактор определяемого стандартного вещества по реперному (референтному) стандартному веществу relative standard deviation (coefficient variation) — относительное стандартное отклонение, или коэффициент вариации, %

78

Список использованных обозначений |A| ∆X ∆С 95% |A| a ai b bi Cдоб.1 Cдоб.2 Cконтр.1 Cконтр.2 Cреф. Cстанд. Cстанд.внутр. D ɛ I I0 k Ki n N R^2 RS Rt S SD

абсолютная погрешность отдельного i-го измерения (по модулю) погрешность в содержании анализируемого вещества в определенном объеме экстракта или в экстракте после добавления пробы погрешность определения анализируемого вещества в матрице, добавленного в матрицу 95%-ный доверительный интервал значения абсолютной погрешности отдельного i-го измерения (по модулю) эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу эмпирический (угловой) коэффициент простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу свободный член простой линейной регрессии по реперному (референтному) стандартному веществу свободный член простой линейной регрессии по определяемому стандартному веществу добавленная концентрация № 1 определяемого стандартного вещества добавленная концентрация № 2 определяемого стандартного вещества концентрация определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 1, г/мл, мг/мл, мкг/мл концентрация определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 2, г/мл, мг/мл, мкг/мл концентрация модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл концентрация модельного раствора определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл концентрация раствора внутреннего стандарта, г/мл, мг/мл, мкг/мл оптическая плотность раствора молярный коэффициент поглощения раствора интенсивности потока света после прохождения через кювету интенсивности потока света до прохождения через кювету фактор емкости поправочный коэффициент для каждого i-го компонента количество показателей, или число степеней свободы (объем выборки), или количество растворов с различными концентрациями эффективность хроматографической колонки коэффициент детерминации (величины достоверности аппроксимации) разрешение усредненное время удерживания, мин площадь хроматографического пика раствора вещества, mAU×с (при детекции вещества УФ-детектором) standard deviation — стандартное отклонение 79

SD(b) SE(b) Sдоб.1 Sдоб.2 Sконтр.1 Sконтр.2 Sреф. Sстанд. Sстанд.+доб. Sстанд.внутр. t tR VR X X1 X2 Xi Xдоб. Y

α σ С С1 С2 Сдоб.

стандартное отклонение свободного члена простой линейной регрессии стандартная ошибка среднего свободного члена простой линейной регрессии площадь пика определяемого стандартного вещества в растворе с добавкой № 1 площадь пика определяемого стандартного вещества в растворе с добавкой № 2 площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 1 площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества в контрольном растворе № 2 площадь хроматографического пика модельного раствора реперного (референтного) стандартного вещества, mAU×с площадь хроматографического пика модельного раствора определяемого стандартного вещества, mAU×с площадь пика определяемого стандартного вещества в растворе с добавкой площадь хроматографического пика раствора внутреннего стандарта значение коэффициента Стьюдента время удерживания относительный удерживаемый объем среднее арифметическое выборки или факторный признак в уравнении простой линейной регрессии содержание анализируемого вещества в определенном объеме экстракта, г или мг содержание анализируемого вещества в определенном объеме экстракта после добавления пробы, г или мг показатель i-го значения масса добавленного образца анализируемого вещества в определенном объеме растворителя, г или мг результативный показатель в уравнении простой линейной регрессии или площадь хроматографического пика стандартного или референтного вещества (в случае уравнения простой линейной регрессии) коэффициент селективности среднеквадратическое отклонение концентрация калибровочного раствора в одной точке, г/мл, мг/мл, мкг/мл количество анализируемого вещества, добавленного в матрицу образца, не содержащую данного вещества, г или мг количество анализируемого вещества в матрице после добавления в матрицу, г или мг концентрация добавленная определяемого стандартного вещества, г/мл, мг/мл, мкг/мл

80

Содержание Введение ...................................................................................................................... 3 1. Получение и обработка хроматограмм ................................................................ 5 2. Методика проведения хроматографических измерений методом внутренней нормализации ..................................................................................... 7 3. Методика проведения хроматографических измерений методом внешнего стандарта ................................................................................................ 9 4. Методика проведения хроматографических измерений методом добавок ................................................................................................... 13 5. Методика проведения хроматографических измерений методом внутреннего стандарта ......................................................................................... 16 6. Методика проведения хроматографических измерений КАМС-методом .................................................................................................... 19 7. Особенности применения КАМС-методик при использовании хроматографических систем с разными видами детектирования ....................................................................................... 24 8. Стандартные операционные процедуры КАМС-методик ............................... 33 9. Параметры валидации СР-КАМС- и ЛР-КАМС-методик ............................... 46 Литература ................................................................................................................ 77 Список использованных сокращений .................................................................... 78 Список использованных обозначений ................................................................... 79

81

3. ГОРМОНАЛЬНЫЙ ПРОФИЛЬ И ХОЗЯЙСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ

Антон Евгеньевич СУХАНОВ, Андрей Николаевич СТАВРИАНИДИ

СПЕЦИАЛЬНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ: КАМСМЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТВОРАХ И ЭКСТРАКТАХ Учебное пособие Зав. редакцией литературы по медицине, спорту и туризму В. М. Таравская Ответственный редактор В. В. Яески Подготовка макета Е. В. Веселова Корректор Е. А. Дмитриева Выпускающий В. А. Невара ЛР № 065466 от 21.10.97 Гигиенический сертификат 78.01.10.953.П.1028 от 14.04.2016 г., выдан ЦГСЭН в СПб Издательство «ЛАНЬ» [email protected]; www.lanbook.com 196105, СанктПетербург, пр. Юрия Гагарина, д. 1, лит. А Тел./факс: (812) 3362509, 4129272 Бесплатный звонок по России: 88007004071

Подписано в печать 02.03.23. Бумага офсетная. Гарнитура Школьная. Формат 84×108 1/32. Печать офсетная/цифровая. Усл. п. л. 4,41. Тираж 30 экз. Заказ № 42523. Отпечатано в полном соответствии с качеством предоставленного оригиналмакета в АО «Т8 Издательские Технологии». 109316, г. Москва, Волгоградский пр., д. 42, к. 5.

3

ГДЕ КУПИТЬ ДЛЯ ОРГАНИЗАЦИЙ: Для того, чтобы заказать необходимые Вам книги, достаточно обратиться в любую из торговых компаний Издательского Дома «ЛАНЬ»: по России и зарубежью

«ЛАНЬ1ТРЕЙД» 192029, Санкт1Петербург, ул. Крупской, 13 тел.: (812) 412185178, 412114145, 412185182 тел./факс: (812) 412154193 e1mail: [email protected] ICQ: 44618691967 www.lanpbl.spb.ru/price.htm в Москве и в Московской области

«ЛАНЬ1ПРЕСС» 109263, Москва, 71ая ул. Текстильщиков, д. 6/19 тел.: (499) 178165185 e1mail: [email protected] в Краснодаре и в Краснодарском крае

«ЛАНЬ1ЮГ» 350901, Краснодар, ул. Жлобы, д. 1/1 тел.: (861) 274110135 e1mail:[email protected]

ДЛЯ РОЗНИЧНЫХ ПОКУПАТЕЛЕЙ: интернет1магазин Издательство «Лань»: http://www.lanbook.com магазин электронных книг Global F5 http://globalf5.com/

Èçäàòåëüñòâî «ËÀÍÜ» ÅÑÒÅÑÒÂÅÍÍÎÍÀÓ×ÍÀß ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ ÄËß ÂÛÑØÅÉ ØÊÎËÛ Мы издаем новые и ставшие классическими учебники и учебные пособия по общим и общепрофессиональным направлениям подготовки. Большая часть литературы издательства «ЛАНЬ» рекомендована Министерством образования и науки РФ и используется вузами в качестве обязательной. Мы активно сотрудничаем с представителями высшей школы, научно%методическими советами Министерства образования и науки РФ, УМО по различным направлениям и специальностям по вопросам грифования, рецензирования учебной литературы и формирования перспективных планов издательства. Наши адреса и телефоны: РФ, 196105, Санкт%Петербург, пр. Юрия Гагарина, 1 (812) 336%25%09, 412%92%72 www.lanbook.com