Biologia Celular Y Molecular (9ed)

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y Novena edición L. C. Junqueira Profesor de Histología y Embriología, Facultad de Medicina Universidad de São Paulo. Profesor emérito de la Universidad de São Paulo. Miembro de la Academia Brasileña de Ciencias y la Academia de Ciencias del estado de São Paulo. Investigador asociado, Universidad de Chicago en 1949. Miembro del Comité Internacional de la Bioquímica del Cáncer de la Unión Internacional contra el cáncer en 1960-1965. Asesor científico de la Fundación Ciba en 1967-1985. Investigador honorario asociado, Universidad de Harvard en 1968. Miembro honorario de la Asociación Americana de Anatomistas en 1983. Comendador de la Orden Nacional del Mérito Científico en 1995. Miembro honorario de la Sociedad Americana de Biología Celular en 1998. Miembro honorario de la Sociedad Brasileña de Biología Celular en 1999.

José Carneiro Profesor Emérito, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de São Paulo. Formerly Research Associate, Department of Anatomy, McGill University, Montreal, Canadá. Formerly Visiting Associate Professor, Department of Anatomy, Medical School, University of Virginia, Charlottesville, Virginia.

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ƒ Losautoresdeestelibroyla editorial GK Ltda. comprometieronsusmejoresesfuerzospara asegurar que la información y los procedimientos presentados en el texto están de acuerdo con las normas aceptadas en el momento de la publicación, y que todos los datos fueron actualizados por los autores hasta la fecha de entrega de los originales a la editorial. Sin embargo, teniendo en cuenta la evolución de las ciencias de la salud, los cambios regulatorios gubernamentales y el flujo constante de nueva información sobre los medicamentos, esquemas terapéuticos, y las reacciones adversas a los medicamentos, se recomienda encarecidamente que los lectores siempre consulten otras fuentes confiables, a fin de asegurarse de que la información contenida en este libro es correcta y que no hay cambios en las dosis recomendadas o en la legislación reguladora. Además, los lectores pueden comprobar si hay posibles actualizaciones de la obra en http://gen-io.grupogen.com.br.

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Los autores y el editor se dedicaron a citar correctamente y dar el debido crédito a todos los titulares de derechos de autor de cualquier material de este libro, dando lugar a posibles ajustes que se les pueda realizar más adelante, que sin saberlo y sin quererlo, la identificación de algunos de estos se haya omitido.

ƒ Copyright © 2012 ƒ Junqueira, Luiz Carlos Uchoa, 1920-2006 Biologia celular e molecular / L. C. Junqueira, José Carneiro. - 9.ed. - Rio de Janeiro : GK 2012. Incluye bibliografía ISBN 978-85-277-2078-6

ƒ Versión electrónica traducida al castellano realizada en Argentina por Oíd Mortales (OM) para el Estigma del Dr VaPorEso. Publicación electrónica independiente

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Colaboradoras

Berenice Quinzani Jordão Doutora em Ciências pela Universidad Complutense de Madrid, Espanha. Professora Associada, Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas – Universidade Estadual de Londrina

Celia Guadalupe T. J. Andrade Professora Associada, Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas – Universidade Estadual de Londrina.

Chao Yun Irene Yan Professora Doutora, Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo.

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Prefacio a la Novena edición

.En general, los seres vivos son “máquinas químicas” y hoy en día, casi todo el conocimiento y estudio de estos seres se basan en el funcionamiento de las células. Las actividades celulares dependen de los tipos de moléculas que los constituyen - en especial las macromoléculas - que se refiere al estudio de la bioquímica celular. Por lo tanto, es esencial que incluso en un libro destinado a cursos de pregrado se escriba mucha información sobre las macromoléculas celulares, tales como las proteínas, el ADN y el ARN. Es necesario explicar también las moléculas más pequeñas, por ejemplo, las que proporcionan energía química para la conducción de la maquinaria celular. Debido a que es un libro de introducción, es importante que los autores mantengan un equilibrio didáctico entre la morfología celular y sus actividades básicas. Las células especializadas, más frecuentemente encontradas en agregados que también contienen material extracelular - el conjunto que organiza los tejidos biológicos - no deben ser estudiados en un trabajo destinado a estudiar las células en general, sino más bien en los libros de Histología (principalmente), Fisiología y Bioquímica, dedicados a la explicación de las funciones especializadas, restringidas a ciertos tipos de células. Las barreras entre los diferentes campos de la biología están desapareciendo, y las células se convierten en el elemento común a todos ellos. Dada la dificultad para explicar únicamente en palabras muchos procesos intra y extracelulares, así como la preocupación de los autores para facilitar el proceso de aprendizaje, esta edición de Biología Celular y Molecular cuenta con un nuevo diseño gráfico, lo que hizo que la obra no sólo sea más agradable, sino también funcional; los capítulos fueron resaltados por los colores que ayudan en la localización de diversos temas, y se han mejorado las ilustraciones con el fin de facilitar la comprensión de la materia explicada en el texto. La secuencia de los capítulos se mantiene como en las ediciones anteriores, ya que era adecuada y conveniente para el estudio; el texto, a su vez, fue plena y completamente revisado y actualizado con los descubrimientos más recientes. Con el fin de no aumentar el tamaño de la obra, se incluyeron las novedades realmente significativas para los estudiantes. José Carneiro

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Prefacio a la Primera Edición

Citología Básica presenta la información clave y los últimos descubrimientos en la biología celular, que son de interés para los estudiantes de Historia Natural, Medicina, Odontología, Veterinaria y otras ciencias biomédicas. Antes de empezar a escribir este libro, hemos elegido tres características básicas y creemos que el resultado es consistente con nuestro plan inicial. Es conciso, actualizado y abundantemente ilustrado. En el capítulo 1 se presenta una visión general, panorámica, de las células. Este capítulo es casi un resumen del libro. Su finalidad es establecer un marco sólido en el que serán introducidos los detalles de la estructura y función de las células. En el capítulo 2 se describen los métodos de trabajo empleados en citología. Los datos sobre la organización molecular de las células, esencial para entender el resto del libro, se encuentran en el Capítulo 3, mientras que en los capítulos 4-10 se describen las funciones celulares principales, evitando establecer una separación entre la morfología y función. En lugar de estudiar los orgánulos aisladamente (aparato de Golgi, mitocondrias, etc.) estudiamos cada función celular, describiendo al mismo tiempo los elementos estructurales que forman parte de ella. La diferenciación celular se estudia en el Capítulo 11. La célula vegetal, los virus, las células procariotas y las células cancerosas se describen en los cuatro capítulos finales. Nuestra principal preocupación era la elaboración de un libro de texto en un lenguaje simple, moderno y adecuado a los programas de citología de varias facultades brasileñas. Nos limitamos al estudio de las manifestaciones de la actividad celular susceptibles de aprender mediante métodos morfológicos y citoquímicos. Aun comprendiendo que la delimitación del campo de la citología es prácticamente imposible, evitamos entrar en el campo de la Bioquímica y en de la Genética, manteniendo la información de estas dos disciplinas en el mínimo absolutamente necesario para la comprensión de la fisiología celular. El capítulo 3, con algunos datos bioquímicos, se incluyó debido a que muchos cursos de Citología se imparten antes de los cursos de Bioquímica. Evitando la duplicación de materias que se imparten en otras disciplinas, desarrollamos un libro de tamaño apropiado para una extensión de los cursos de Citología que se imparten en las universidades brasileñas.

L. C. Junqueira José Carneiro

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Agradecimientos Los autores agradecen a la Editorial GK - especialmente a Juliana Affonso, editora, y María Fernanda Dionysio , revisora por la atención y por la actualización dedicadas a esta nueva edición de Biología Celular y Molecular.

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Material Suplementario Este libro cuenta con el siguiente material suplementario: 



Pruebas de auto-evaluación sobre biología celular y molecular (disponible para los lectores y profesores) Ilustraciones de la obra en formato de presentación (restringidas a los docentes)

Para acceder a este contenido, que es gratuito, el docente o el lector deben registrarse en http://gen-io.grupogen.com.br. Además, para que este material específico sea validado, es necesario informar el código existente en la etiqueta pegada en la parte interna de la cubierta del libro.

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Resumen

1 Introducción: Visión panorámica sobre la estructura, funciones y evolución de las células

2 Tecnología de la Biologia Celular e Molecular: Algunos Ejemplos

3 Bases Macromoleculares de la Constitución Celular

4 Papel de las Mitocondrias en la Transformación y en el Almacenamiento de la Energia

5 Membrana Plasmática 6 Comunicaciones Celulares por medio de Señales Químicas

7 Bases Moleculares del Citoesqueleto y de los Movimientos Celulares

8 Núcleo de la Célula 9 Ciclo Celular y Meiosis 10 11

Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas División del trabajo entre las células: Diferenciación

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Biología de las Interacciones entre la Célula-Matriz Extracelular

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Célula Vegetal

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Células Procariotas

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Mecanismos de Regulación de las Actividades Celulares: Cómo se originan algunas enfermedades

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Célula Cancerosa

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Los virus y su relación con las células

Glosario Índice Alfabético

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1 | Introdução: Visão Panorâmica sobre a Estrutura, as Funções e a Evolução das Células

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Introducción: Visión General sobre la Estructura, Funciones y Evolución de las Células ERRNVPHGLFRVRUJ

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■ Los virus son parásitos intracelulares obligados ■ Las Rickettsias y las clamidias son células incompletas y, por lo tanto, solo proliferan en el interior de una célula completa ■ Sólo hay dos tipos básicos de células : procariotas y eucariotas ■ Las células procariotas son "pobres" en membranas ■ Las células eucariotas están divididas en compartimientos ■ El citoplasma está constituido por la matriz, orgánulos y depósitos diversos ■ Membrana plasmática ■ Mitocondrias ■ Retículo endoplasmático ■ Endosomas

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Aparato de Golgi Lisosomas Peroxisomas Citoesqueleto Depósitos citoplasmáticos El núcleo contiene los cromosomas y está separado del citoplasma por una doble membrana, la envoltura nuclear Características que distinguen a las células eucariotas vegetales de las animales Origen y evolución de las células Patrones celulares y l os principales grupos de seres vivos Resumen Bibliografía

Guía ■ Para su multiplicación, los virus, estructuras que no están compuestos por células, usan la maquinaria sintética de las células que parasitan para producir macromoléculas virales ■ Sólo hay dos tipos de células básicas: las células procariotas y las eucariotas ■ Las células procariotas no tienen núcleo - El genoma está separado del citoplasma por una envoltura - y por lo general, no tienen membranas que dividen el citoplasma en compartimentos ■ Las bacterias del grupo de las rickettsias y las clamidias son células procariotas incompletas, que se multiplican sólo en el interior de células completas (células eucariotas) ■ Las células eucariotas, son más grandes, estructuralmente más complejas y contienen mucho más ADN; sus cromosomas son complejos, contienen numerosas proteínas, incluyendo a las histonas, y están separados del citoplasma por una membrana doble que contiene poros, llamada envoltura nuclear ■ El citoplasma de las células eucariotas se divide por membranas en compartimientos que contienen moléculas distintas y que realizan funciones especializadas en cada compartimiento, lo que aumenta en gran medida la eficiencia de estas células. El citoplasma de las procariotas es muy pobre en membranas, que no forman compartimentos funcionales ■ Las células eucariotas de las plantas por lo general tienen una gran vacuola citoplasmática, tienen plastos y una pared de celulosa, almacenan almidón como reserva de energía y se comunican a través de plasmodesmos. En las células eucariotas, el glucógeno constituye la principal reserva energética ■ Los cloroplastos y las mitocondrias probablemente se originaron a partir de bacterias simbióticas que se han asentado de manera definitiva en el citoplasma ■ Los seres vivos pueden ser agrupados en cinco grandes grupos o reinos: moneras, protistas, vegetales, hongos y animales ■ Los estudios moleculares filogenéticos, basados principalmente en el ARN ribosomal, separan a los seres vivos en sólo tres grandes grupos o dominios: bacterias, arquea y eucaria. Los dos primeros dominios están constituidos por las células procariotas; sólo el dominio eucaria presenta células eucariotas.

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n este capítulo se ofrece una visión general de la estructura, de las funciones y la evolución de las células, que sirven como base para el estudio de la materia que se tratará minuciosamente en los capítulos siguientes. La célula es la unidad que constituye a los seres vivos, pudiendo existir sola, en los seres unicelulares, o formar matrices ordenadas, los tejidos, que forman el cuerpo de los seres pluricelulares. En general, los tejidos tienen cantidades variables de material extracelular producido por sus células. LOS VIRUS SON PARASITOS INTRACELULARES OBLIGADOS Debido a su relación con las células y sus efectos sobre ellas, pudiendo causar enfermedades de diversa gravedad, los virus son estudiados en este libro, pero de forma resumida (Capítulo 16). Un virus no puede multiplicarse, excepto cuando parasita una célula, cuyas enzimas celulares son utilizadas para la síntesis de macromoléculas que formarán nuevos virus. Ellos no tienen todas las enzimas y las estructuras necesarias para la fabricación de otros virus; son, por lo tanto, parásitos intracelulares obligados. De hecho, los virus son parásitos moleculares, ya que inducen la maquinaria de síntesis de las células para sintetizar las moléculas que formarán nuevos virus en lugar de producir moléculas para la propia célula. Los virus que atacan a las células animales no atacan a las células vegetales, y viceversa. Por tanto, Se distinguen los virus animales y los virus vegetales. Hay, sin embargo, algunos virus vegetales que, para invadirlas, se multiplican en las células de insectos diseminadores de estos virus de una planta a otra. Los virus de las bacterias se llaman bacteriófagos, o simplemente fagos. Cada virus está formado básicamente por dos partes:  Una porción central, que lleva la información genética, es decir, un genoma constituido, dependiendo del virus, de una sola hebra o una doble hebra de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, en las cuales están contenidas, en código, toda la información necesaria para la producción de otros virus iguales.  Una porción periférica que consiste en proteínas, la cual protege al genoma, permitiéndole al virus identificar las células que puede parasitar, y en ciertos virus, facilitándole la penetración de las células. Algunos virus más grandes y más complejos tienen una envoltura lipoproteica. La parte lipídica de esa envoltura proviene de las membranas celulares; pero las proteínas son de naturaleza viral, es decir, que están codificadas por el ácido nucleico del virus. Fuera de las células, los virus se presentan como partículas que consisten en un agregado de macromoléculas y reciben la denominación de viriones. LAS RICKETTSIAS Y LAS CLAMIDIAS SON CÉLULAS INCOMPLETAS Y, POR LO TANTO, PROLIFERAN SÓLO DENTRO DE UNA CÉLULA COMPLETA Las bacterias de los grupos de las rickettsias y de las clamidias son muy pequeñas y constituidas por células procariotas incompletas, que no

tienen la capacidad de auto-replicarse independientemente de la cooperación de otras células. Asimismo, como los virus, las rickettsias y las clamidias son parásitos intracelulares obligados, porque sólo proliferan dentro de las células completas; Sin embargo, las células incompletas difieren de los virus en dos aspectos fundamentales. En primer lugar, los virus portan, codificada en su ácido nucleico, la información genética para formar nuevos virus, pero no contienen orgánulos y por lo tanto, usan la maquinaria de las células para multiplicarse. Las células incompletas, en contraste, tienen parte de la máquina de síntesis para reproducirse, pero necesitan complementos proporcionados por las células infectadas. En segundo lugar, las células incompletas tienen una membrana semipermeable, a través de la cual sucede el intercambio con el medio, lo que no pasa con los virus. La envoltura que tienen algunos virus, y que se compone principalmente de moléculas celulares, se pierde cuando estos virus entran en las células. Probablemente, las células incompletas son células "degeneradas", es decir, que, con los años, perdieron parte de su ADN, sus enzimas y por lo tanto su autonomía, convirtiéndose en dependientes de las células que se conservaron completas. SÓLO HAY DOS TIPOS BÁSICOS DE CÉLULAS: PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS La microscopía electrónica demostró que existen principalmente dos clases de células: las procariotas ( pro, primero, y karion, núcleo), cuyos cromosomas no están separados del citoplasma por una membrana, y las eucariotas (eu, verdadero y karion, núcleo), con un núcleo individualizado y bien delimitado por la envoltura nuclear. Como se verá a continuación, a pesar de que la complejidad nuclear se utiliza para nombrar a las dos clases de células, hay otras diferencias importantes entre procariotas y eucariotas. LAS CÉLULAS PROCARIOTAS SON "POBRES" EN MEMBRANAS Las células procariotas se caracterizan por la escasez de membranas. En estas células, por lo general la única membrana existente es la membrana plasmática. A diferencia de las células eucariotas, las procariotas no contienen membranas que separan a los cromosomas del citoplasma. Los seres vivos que tienen células procariotas son llamados procariotas; estas células son bacterias (como las cianobacterias o algas verde-azules, las cuales, también son consideradas bacterias). La célula procariota mejor estudiada es la bacteria Escherichia coli (Figura 1.1), que por su simplicidad estructural y la velocidad de multiplicación, ha demostrado ser excelente para los estudios de la biología molecular. E. coli tiene la forma de un bastón, con alrededor de 2 m de largo, y está separada del exterior por una membrana plasmática similar a la que envuelve a las células eucariotas. Por fuera de esa membrana existe una pared rígida. De acuerdo a la bacteria, el espesor de esta pared es muy variable. Se compone de un complejo de proteínas y glicosaminglicanos. La pared celular bacteriana tiene principalmente función de protección. En el citoplasma de las bacterias existen ribosomas que están unidos a las moléculas de ARN mensajero (ARNm), formando los polirribosomas. En general, se encuentran dos o más cromosomas idénticos, circulares, ocupando regiones llamadas nucleoides y, a menudo unidos a diferentes puntos de la membrana plasmática. Cada cromosoma, formado por ADN y proteínas, tiene un grosor de 2 nm y una longitud de 1,2 m. Las células procariotas no se dividen por mitosis y sus cadenas de ADN no se someten al proceso de condensación que conduce a la formación de cromosomas visibles bajo un microscopio óptico durante la división celular.

El citoplasma de las células procariotas generalmente no presenta otra membrana más allá de aquella membrana que la separa del medio externo (membrana plasmática). En algunos casos pueden existir invaginaciones de la membrana plasmática que penetran en el citoplasma, en donde se enrollan, formando estructuras llamadas mesosomas. Por otra parte, en el citoplasma de las células procariotas que llevan a cabo la fotosíntesis, existen algunas membranas, paralelas entre sí, y que están asociadas a la clorofila u otros pigmentos Figura 1.1 Célula procariota (bacteria Escherichia coli). La célula está rodeada por responsables de la absorción de la energía luminosa. una pared rígida fijada a la membrana plasmática. En la cara interna de la membrana, Otra diferencia entre las células procariotas y las eucariotas es la carencia de un se encuentran enzimas relacionadas con la respiración y que están representadas en citoesqueleto en las células procariotas. En las eucariotas, el citoesqueleto es resel dibujo por pequeñas almohadillas. El citoplasma contiene numerosos polirribosoponsable de los movimientos y de la forma de las células, que a menudo es complemas, pero carece del sistema de membranas que existe en las células eucariotas. El ja. La forma más sencilla de las células procariotas, generalmente esférica o en dibujo muestra dos cromosomas que son idénticos, y en este ejemplo se adhieren a forma de bastón, es mantenida por la pared extracelular, sintetizada en el citola membrana plasmática. El área ocupada por el cromosoma es llamada nucleoide. plasma y agregada a la superficie exterior de la membrana celular. Esa pared es rígida y también juega un papel importante en la protección de las células bacterianas. En la naturaleza se encuentran poblaciones bacterianas en diversos hábitats, y la pared es esencial para proteger a las células contra los factores a menudo agresivos de estos hábitats. Sin embargo, la diferencia más notable entre las células procariotas y las eucariotas es la pobreza de membranas en las procariotas. El citoplasma de las células procariotas no está subdividido en compartimientos, contrariamente a lo que ocurre en las células eucariotas, en las cuales u n extenso sistema de membranas desarrolla, en el citoplasma, las microrregiones (Figura 1.2) que contienen moléculas diferentes y realizan funciones especializadas.

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Figura 1.2 Representación tridimensional de una célula eucariota animal (célula del hígado). El núcleo está separado del citoplasma por la envoltura nuclear, de doble membrana, con poros. El citoplasma de las células eucariotas tiene un sistema de membranas muy desarrollado el cual, por motivos didácticos, solo está parcialmente representado en esta figura. Observe, por encima del núcleo, uno de los dos centriolos de la célula de la que irradian los microtúbulos (círculo violeta). Detrás de los centriolos está el aparato de Golgi. En el centro del núcleo aparece el nucléolo. (Reproducido, con autorización, de Carneiro, J:. Bases Celulares para la Fisiopatología En: Marcondes, M. et al Clínica Medicina, 3ª ed Guanabara Koogan, 1984).

LAS CÉLULAS EUCARIOTAS ESTÁN COMPARTIMENTADAS Estas células presentan dos partes morfológicamente bien distintas – el citoplasma y el núcleo -, entre las cuales existe un tránsito constante de diversas moléculas en los dos sentidos. El citoplasma está envuelto por la membrana plasmática, y el núcleo, por la envoltura nuclear. Una característica importante de las células eucariotas es su riqueza en membranas (Figura 1.2), formando compartimentos que separan los diversos procesos metabólicos gracias al direccionamiento de las moléculas absorbidas o producidas en las propias células. Aparte de esto, existen grandes diferencias enzimáticas entre las membranas de los varios compartimentos. Una célula eucariota es como una fábrica organizada en secciones de montaje, pintura, embalaje, etc. Aparte de aumentar la eficiencia, la separación de las actividades permite que las células eucariotas alcancen mayor tamaño, sin perturbación de sus funciones. EL CITOPLASMA ESTÁ CONSTITUIDO POR LA MATRIZ, ORGÁNULOS Y DEPÓSITOS DIVERSOS El citoplasma de las células eucariotas contiene a los orgánulos, como las mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, lisosomas y peroxisomas. El concepto de orgánulo no está bien definido, varía de un autor a otro. Algunos consideran a los orgánulos simplemente como unas estructuras envueltas por membranas, como en el caso de las mitocondrias y los lisosomas, por ejemplo; otros admiten como orgánulos todas las estructuras intracelulares presentes en todas las células y que desempeñan funciones bien definidas, asimismo aquellas que no estén delimitadas por membranas (por ejemplo, los centrosomas, corpúsculos basales de los cilios). Aparte de los orgánulos, el citoplasma puede presentar depósitos de sustancias diversas, como los gránulos de glucógeno y las gotitas lipídicas. Ocupando el espacio entre los orgánulos y los depósitos, también llamados inclusiones, se encuentra la matriz citoplasmática o citosol. El citosol contiene agua, diversos iones, aminoácidos, precursores de los ácidos nucleicos, numerosas enzimas, incluyendo a las que realizan la glicólisis anaerobia (Capítulo 4) y las que participan en la degradación y síntesis de hidratos de carbono, de ácidos grasos, de aminoácidos y de otras moléculas importantes para las células. El citosol contiene microfibrillas, compuestas de actina, y microtúbulos, compuestos de tubulina, cuyas unidades monoméricas se pueden despolimerizar y polimerizar nuevamente, de manera reversible y dinámica, lo que explica las modificaciones de sol para gel, y viceversa, observadas en el citoplasma. Cuando están despolimerizadas (separadas unas de otras), las moléculas de las proteínas actina y tubulina confieren mayor fluidez al citosol. Cuando están polimerizadas en microfibrillas y microtúbulos, le confieren la consistencia de gel a la región citoplasmática en la que se encuentran. MEMBRANA PLASMÁTICA Es la parte más externa del citoplasma, que separa la célula del medio extracelular, contribuyendo a mantener constante el medio intracelular, el cual es diferente al medio extracelular. Tiene cerca de 7 a 10 nm de espesor y se muestra en las microfotografías como dos líneas oscuras separadas por una línea central clara. Esta estructura trilaminar es común a otras membranas encontradas en las células y por lo tanto se la llama unidad de membrana o membrana unitaria. Las unidades de membrana son bicapas lipídicas formadas principalmente por fosfolípidos y que contienen una cantidad variable de moléculas proteicas, las cuales se encuentran en mayor cantidad en aquellas membranas con una mayor actividad funcional (las proteínas son responsables de la mayoría de las funciones de la membrana). La cara externa de la bicapa lipídica de la membrana plasmática presenta muchas moléculas de glicolípidos, con las porciones glucídicas proyectándose hacia el exterior de la célula. En las porciones glucídicas de los glicolípidos se unen las porciones glucídicas de la propia membrana, junto con glicoproteínas y proteoglicanos secretados, que son adsorbidas por la superficie de la célula para

formar un conjunto llamado glicocálix. Así, el glicocálix es una proyección de la parte más externa de la membrana, con sólo unas pocas moléculas adsorbidas y no una capa completamente extracelular como se pensaba anteriormente. LAS MITOCONDRIAS Las mitocondrias son orgánulos esféricos o, más frecuentemente, alargados (Figura 1.2). Las micrografías electrónicas muestran que consta de dos unidades de membrana, siendo la interna plegada, originando pliegues en forma de estantes o túbulos (Figura 1.3). La función principal de las mitocondrias es la de liberar energía gradualmente de las moléculas de ácidos grasos y glucosa derivados de los alimentos, produciendo calor y moléculas de ATP (trifosfato de adenosina). La energía almacenada en el ATP es utilizada por las células para realizar sus diversas actividades, tales como el movimiento, la secreción y la división mitótica. Las mitocondrias también están involucradas en otros procesos metabólicos celulares (se llama metabolismo al conjunto de procesos químicos de la degradación y la síntesis de moléculas), que varían según el tipo de célula, y que serán estudiados en otros capítulos de este libro. RETÍCULO ENDOPLÁSMICO En el citoplasma de las células eucariotas existe una red de vesículas aplanadas, vesículas esféricas y túbulos que se intercomunican, formando un sistema continuo, aunque aparecen separados en los cortes examinados en el microscopio electrónico. Estos elementos tienen una pared formada por una unidad de membrana que delimita cavidades, las cisternas del retículo endoplásmico (Figura 1.3). Las cisternas constituyen un sistema de túneles, de forma muy variable, que recorre el citoplasma. Se distinguen el retículo endoplásmico rugoso, o granular, y el liso (Figura 1.2). La membrana del retículo endoplásmico rugoso presenta ribosomas en la superficie que enfrenta al citosol. Los ribosomas son partículas densas a los electrones y se componen de ácido ribonucleico (ARN ribosómico o rRNA, [ARNr]) y proteínas. Los ribosomas de células eucariotas tienen un diámetro de 15 a 20 nm, siendo ligeramente inferiores en las células procariotas (bacterias). Cada ribosoma se compone de dos subunidades de diferentes tamaños, que se asocian sólo cuando se unen a los filamentos de ARN mensajero (ARNm). Como muchos ribosomas están asociados a un solo filamento de ARN mensajero (ARNm), se forman polirribosomas, que se dispersan en el citoplasma o quedan unidos a la superficie exterior del retículo endoplásmico rugoso. Los polirribosomas desempeñan un papel fundamental en la síntesis de proteínas. El retículo endoplásmico liso se presenta principalmente como túbulos que se anastomosan (Figura 1.2) y se continúan con el retículo endoplásmico rugoso. El retículo endoplásmico liso está muy desarrollado en ciertos tipos de células, tales como, por ejemplo, en las células que secretan hormonas esteroides, en las células hepáticas y en las células de la glándula suprarrenal. ENDOSOMAS Los endosomas forman un compartimiento que recibe las moléculas introducidas en el citoplasma de las células por las vesículas de pinocitosis, que se originan a partir de la membrana plasmática (Capítulo 5). El compartimiento endosomal se compone de elementos separados; es un extenso sistema que va desde la periferia del citoplasma hasta las proximidades del núcleo celular. Consiste en vesículas y túbulos, en cuyo interior presenta un pH ácido. Este compartimiento es responsable de la separación y el direccionamiento del material que entra en el citoplasma por vesículas de pinocitosis. Gran parte del material se encamina hacia los lisosomas; Sin embargo, muchas de las moléculas pasan de los endosomas al citosol, y otras se devuelven a la superficie celular. Los endosomas pueden ser considerados como una parte de la vía lisosomal, porque muchas moléculas que se dirigen hacia los lisosomas pasan antes por los endosomas. APARATO DE GOLGI

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Este orgánulo también se conoce como zona o complejo de Golgi, y se compone de un número variable de vesículas aplanadas circulares y vesículas esféricas de diversos tamaños, que parecen fluir de la primera (Figuras 1.2 y 1.4). En muchas células, el aparato de Golgi se encuentra situado en una posición constante, por lo general adyacente al núcleo (Figuras 1.2 y 1.5); en otras células, éste se lo encuentra disperso en el citoplasma. Este orgánulo tiene múltiples funciones; pero, entre ellas, vale la pena señalar que es muy importante en la separación y el direccionamiento de las moléculas sintetizadas en las células, dirigiéndolas hacia las vesículas secretoras (que van a ser expulsadas de la célula), los lisosomas, constituyen las vesículas que permanecen en el citoplasma o en la membrana celular (Capítulo 10). LISOSOMAS Los lisosomas son orgánulos de forma y tamaño muy variable (a menudo

miden de 0,5 a 3,0 µm de diámetro ([figuras 1.2 y 1.5]), cuyo interior es ácido y contiene diversas enzimas hidrolíticas (enzimas que rompen las moléculas mediante la adición de los átomos de moléculas de agua). Las hidrolasas de los lisosomas tienen una actividad máxima a pH ácido. Estas enzimas son sintetizadas por los polirribosomas que se relacionan con el retículo endoplasmático rugoso. Los lisosomas son depósitos de enzimas utilizadas por las células para digerir moléculas introducidas por pinocitosis, la fagocitosis, y luego, orgánulos de la célula misma. La destrucción y renovación de los orgánulos es un proceso fisiológico que permite a la célula mantener sus componentes en buen estado funcional y en una cantidad apropiada a las necesidades del momento. Los orgánulos desgastados por el uso son eliminados y sustituidos por nuevos orgánulos. Aquellos que ya no son necesarios son simplemente eliminados.

Figura 1.3 Micrografía electrónica de parte del citoplasma de una célula del tejido conjuntivo (plasmocito). Los cuerpos más oscuros y alargados son las mitocondrias. Esta célula, que se especializa en la síntesis de proteínas, es muy rica en retículo endoplasmático rugoso o granular (RER o REG). Las cisternas están dilatadas por las proteínas sintetizadas por la célula y que serán secretadas en el medio extracelular. Las proteínas aparecen como un precipitado fino y claro dentro de las cisternas del retículo endoplasmático rugoso. Aumento: 60.000X.

Figura 1.4 Micrografía electrónica del aparato de Golgi aislado de célula del intestino. Este orgánulo se compone de vesículas aplanadas (VA) y vesículas esféricas (LV) que parecen provenir de las vesículas aplanadas. Nótese también, algunos fragmentos de retículo endoplasmático liso, uno de los cuales está señalado (RE). Ampliación: x 25.000.

Figura 1.5 Micrografía electrónica de célula del tejido conectivo (macrófago). En algunos puntos, la superficie celular presenta prolongaciones irregulares. Observar el núcleo (el nucléolo no aparece en el corte), el aparato de Golgi, los lisosomas (L), el retículo endoplasmático liso (REL) y el centríolo. Ampliación: x 15.000.

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PEROXISOMAS Los peroxisomas son orgánulos que se caracterizan por la presencia de enzimas oxidativas que transfieren átomos de hidrógeno de varios sustratos para el oxígeno de acuerdo con la reacción:

Los peroxisomas contienen la mayor parte de la catalasa celular, una enzima que convierte peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno:

La actividad de la catalasa es importante porque el peróxido de hidrógeno (H2O2) formado en los peroxisomas es un oxidante fuerte y dañará a la célula si no se lo elimina rápidamente. Los peroxisomas presentan, al microscopio electrónico, una matriz granular envuelta por una membrana y un tamaño variable. Muchos peroxisomas exhiben un cristaloide, electrodenso y constituido de catalasa. Los peroxisomas son identificados al microscopio electrónico porque confieren una reacción positiva para la enzima catalasa. Estos orgánulos se han estudiado bien en células de riñón y del hígado de los mamíferos. Entre otras enzimas, contienen catalasa, enzimas de la βoxidación de los ácidos grasos, uratooxidasa y la D-aminoácido-oxidasa. Participan en el metabolismo del ácido úrico resultante del metabolismo de las bases de purina. La presencia de D-aminoácido-oxidasa está probablemente relacionada con el metabolismo de los D-aminoácidos de la pared de las bacterias que entran en el organismo, puesto que las proteínas de los mamíferos están compuestas exclusivamente de L-aminoácidos. Los peroxisomas también tienen un papel en la desintoxicación. Por ejemplo, cerca de la mitad del alcohol etílico (etanol) consumido por una persona se destruye por oxidación en los peroxisomas, principalmente en los peroxisomas hepáticos y renales. Los peroxisomas participan, tales como las mitocondrias, en la β-oxidación de los ácidos grasos, así llamada porque los ácidos grasos se descomponen en el carbono de la posición dos o beta. Los peroxisomas catalizan la degradación de los ácidos grasos, produciendo acetil-CoA, el cual puede penetrar en las mitocondrias, en la cual irá a participar en la síntesis de ATP por medio del ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs). Las moléculas de acetil-CoA pueden ser usadas en otros compartimentos citoplasmáticos para la síntesis de varias moléculas. Se estima que el 30% de los ácidos grasos se oxidan a acetil-CoA en los peroxisomas. El contenido enzimático de los peroxisomas varía mucho de una célula a otra, teniendo en cuenta también que en una misma célula, no todos los peroxisomas presentes tienen la misma composición enzimática. Estas enzimas son producidas por polirribosomas del citosol, conforme a las necesidades de la célula, y muchas veces, como una adaptación para la destrucción de moléculas extrañas que penetran en la célula, tales como el alcohol etílico y muchos fármacos.

Los peroxisomas crecen por la incorporación de proteínas sintetizadas en los polirribosomas libres del citosol que contienen una secuencia especial de tres aminoácidos cercanos al extremo carboxilo de la molécula proteica.

Esta secuencia es reconocida por receptores de membrana, y la proteína es transportada hacia el interior de los peroxisomas. Por lo tanto, los peroxisomas crecen y, después de haber alcanzado un determinado tamaño, se dividen por fisión (Figura 1.6). El proceso ha sido bien estudiado, tomando como modelo a la catalasa. La molécula de catalasa consta de cuatro polipéptidos idénticos, cada uno ligado a un grupo hemo. La catalasa es liberada de los polirribosomas del citosol en forma de polipéptidos, sin el grupo hemo, llamados apocatalasa. Las moléculas de apocatalasa, que contienen la señal para los peroxisomas, son reconocidas por la membrana de los peroxisomas y entran en este orgánulo, en el que se unen para formar los tetrámeros, que luego reciben cuatro grupos hemo. Las moléculas receptoras que quedan atrapadas en las membranas de los peroxisomas, produciendo protuberancias en la cara citoplásmica, también son sintetizadas en los polirribosomas libres y capturadas - pero no introducidas - en el peroxisoma, quedando atrapadas en la superficie de la membrana de este orgánulo. Otras enfermedades hereditarias de los peroxisomas son debido a la falta de una sola enzima, a diferencia de lo que sucede en el síndrome de Zellweger. La adrenoleucodistrofia es sólo un ejemplo de una deficiencia en solo una enzima de los peroxisomas. Esta es una mutación en el cromosoma X que generalmente se manifiesta en los niños antes de la pubertad, cuando aparecen los síntomas de la deficiencia en la secreción de la glándula suprarrenal y trastornos neurológicos. Los defectos resultantes son debidos a la acumulación en los tejidos de muchas moléculas de ácidos grasos saturados de cadena muy larga, ya que los peroxisomas de estos pacientes no oxidan los ácidos grasos saturados de cadena muy larga. Enfermedades peroxisomales Se conocen más de 25 enfermedades relacionadas con la disfunción de las actividades enzimáticas de los peroxisomas, conocidas como anomalías de la biogénesis de peroxisomas (PBD). También tenemos la enfermedad de adrenoleucodistrofia ligado al cromosoma X. Se trata de enfermedades hereditarias autosómicas recesivas poco frecuentes caracterizadas por alteraciones en el cerebro, riñones, hígado y esqueleto. La más grave es la enfermedad de Zellweger, debida a la ausencia de peroxisomas funcionales, ya que fallan los mecanismos de importación de los enzimas al interior del peroxisoma. Otras enfermedades son causadas por el error de un solo enzima o por defectos en los componentes del transporte de la membrana peroxisomal. 1 1 López-Terradas Covisa, J. M. 1999. Introducción al estudio de las enfermedades peroxisomales. Rev de Neurol. 1999 Jan;28 Suppl 1:S34-7. ENFERMEDADES HUMANAS POR DEFECTOS EN LOS PEROXISOMAS El síndrome cerebro-hepato-renal o síndrome de Zellweger, es un trastorno hereditario poco común en el que aparecen diferentes defectos neurológicos, hepáticos y renales, que conducen a una muerte temprana, por lo general en la infancia. Se observó que el hígado y los riñones de los pacientes presentan peroxisomas vacíos, constituido sólo por las membranas, sin las enzimas normalmente situadas en el interior de estos orgánulos. Estas enzimas aparecen libres en el citosol, donde no pueden funcionar normalmente. Por lo tanto, las células de estos pacientes no pierden la capacidad de sintetizar las enzimas típicas de los peroxisomas, sino más bien la posibilidad de transferir a los peroxisomas enzimas producidas. El estudio genético de los pacientes con síndrome de Zellweger detectó mutaciones en aproximadamente varios genes, todos codificadores de proteínas implicadas en el proceso de importación de las enzimas a los peroxisomas. Estos genes han sido aislados, y fue demostrado que las proteínas que codifican son receptores para enzimas de los peroxisomas, o de alguna otra manera, participan de la maquinaria responsable de la introducción de las enzimas en los peroxisomas. El número de genes y proteínas implicados muestra la complejidad del proceso de translocación de las enzimas hacia el interior de estos orgánulos.

Figura 1.6 Los peroxisomas se multiplican por un proceso todavía poco conocido de división binaria. La ilustración muestra que las proteínas para este orgánulo son sintetizadas en el citosol. Algunas quedan unidas a la membrana de la peroxisoma; Sin embargo, ciertas proteínas tienen señales peptídicas (secuencia de aminoácidos) que marcan su destino al interior de los peroxisomas. Estas moléculas proteicas atraviesan la membrana y aumentan el tamaño del orgánulo, el cual, finalmente, se divide en dos.

CITOESQUELETO Muchas células tienen forma irregular y existiendo algunas, como las neuronas o células nerviosas, con extensiones muy largas. Además, el núcleo, los orgánulos, las vesículas de secreción y otros componentes celulares tienen una ubicación definida, casi siempre constante, conforme al tipo celular. Estas observaciones llevaron a los investigadores a admitir la existencia de un citoesqueleto que desempeñaría apenas un papel mecánico, de soporte, manteniendo la forma celular y la posición de sus componentes. Estudios posteriores, además de confirmar la existencia del citoesqueleto, mostraron que su papel funcional es mucho más amplio. Él establece, modifica y mantiene la forma de las células. También es responsable de los movimientos celulares como la contracción, la formación de pseudópodos y desplazamientos intracelulares de los orgánulos, los cromosomas, vesículas y diversos gránulos. Los principales elementos del citoesqueleto son los microtúbulos, filamentos de actina y filamentos intermedios. Los microtúbulos y los microfilamentos de actina, con la

cooperación de las proteínas motoras (Capítulo 7), participan en el movimiento celular y en el desplazamiento de las partículas dentro de las células. DEPÓSITOS CITOPLASMÁTICOS El citoplasma puede contener, según el tipo celular estudiado y a su estado funcional, acúmulos, generalmente temporales, de diversas sustancias, no rodeados de membrana. Son frecuentes los depósitos del polisacárido glucógeno, en forma de gránulos esféricos con 30 nm de diámetro, que pueden existir aisladamente o agrupados (Figura 1.7). El glucógeno, un polímero de la glucosa, es una reserva de energía para las células animales. Muchas células contienen gotas de lípidos (Figura 1.8) de constitución química y tamaño muy variable. Los depósitos de pigmentos tampoco son raros; Un ejemplo es la melanina, encontradas en los cromatóforos en las células de la epidermis (capa más externa de la piel), y otro ejemplo es la lipofuscina, un pigmento

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pardo que se acumula en algunas células de larga vida tales como las neuronas y las células del músculo cardíaco, a medida que estas envejecen. Los depósitos que contienen pigmento son, en parte, responsables del color de los seres vivos, con implicaciones en los procesos de mimetismo, en la atracción para el apareamiento y en la protección contra la radiación ultravioleta de la luz solar. EL NÚCLEO CONTIENE A LOS CROMOSOMAS Y ESTÁ SEPARADO DEL CITOPLASMA POR UNA DOBLE MEMBRANA, LA ENVOLTURA NUCLEAR

Una de las principales características de la célula eucariota es la presencia de un núcleo de forma variable, sin embargo bien individualizado y separado del resto de la celula por dos membranas. Sin embargo, esta doble membrana, llamada envoltura nuclear, contiene poros que regulan el intenso tránsito de macromoléculas del núcleo al citoplasma y de este al núcleo. Todas las moléculas de ARN del citoplasma se sintetizan en el núcleo, y todas las moléculas proteicas del núcleo se sintetizan en el citoplasma. La membrana externa de la envoltura nuclear contiene polirribosomas, formando parte del retículo endoplasmático rugoso (Figura 1.2).

Figura 1.7

Figura 1.8

Figura 1.7 Micrografía electrónica: Gránulos de glucógeno; la mayoría de ellos forma racimos (flechas). Célula de hígado. Aumento: 62.000x. Figura 1.8 Electromicrografía: depósitos temporales de lípidos en el citoplasma de las células de absorción del intestino delgado. Estas células presentan muchas prolongaciones que se extienden en su superficie libre, las microvellosidades o microvilli que aumentan la superficie y facilitan la absorción de nutrientes. Nótese las mitocondrias (M) y los lisosomas (L). Después de ser absorbidos por las células, los lípidos se acumulan temporalmente en las cisternas del retí culo endoplásmico liso estando envueltas por membranas de este retículo (flechas). Aumento: 10.000x. (Cortesía de H.I. Friedman.)

CROMATINA

La observación microscópica de los preparados fijados muestra que el núcleo celular contiene gránulos de tamaño variable y forma irregular, que se colorean intensamente con colorantes básicos. El material que comprende estos gránulos fue llamado cromatina, en una época en que no se sabía nada acerca de su constitución química. Actualmente, se sabe que la cromatina se compone de ácido desoxirribonucleico (ADN) asociado a proteínas. Las células eucariotas, en comparación con las procariotas contienen una cantidad mucho mayor de ADN, que tiene una alta complejidad, estando asociados con varias proteínas tales como las histonas. Las proteínas desempeñan un papel importante en las funciones y en la organización del ADN, tanto en núcleos en interfase, es decir, que no está en mitosis, como en la condensación de los cromosomas en la división celular.

NUCLEOLO

Los nucleolos son corpúsculos en general esféricos, genralmente visibles en las células vivas, examinados bajo el microscopio sin ningún colorante. Los nucleolos contienen gran cantidad de ácido ribonucleico (ARN) y proteínas básicas, junto con una pequeña cantidad de ADN. Generalmente, los nucleolos son basófilos debido al ARN, que se tiñe con colorantes básicos; sin embargo, aquellos con alto contenido de proteínas básicas, que tienen afinidad por los colorantes ácidos, son acidófilos (el significado de basofilia y acidofilia se explicará en el Capítulo 2). CARACTERÍSTICAS QUE DISTINGUEN A LAS CÉLULAS EUCARIOTAS VEGETALES DE LOS ANIMALES Las células de los vegetales superiores (plantas) son eucariotas y se asemejan, en su estructura básica, a las células animales. Las principales diferencias se mencionarán a continuación, y para más detalles, véase el Capítulo 13.

Presencia de Paredes. Además de la membrana plasmática, las células vegetales contienen uno o más paredes rígidas que les confieren forma constante y protegen al citoplasma principalmente contra las agresiones mecánicas y la acción de parásitos. Presencia de plástidos. Una de las principales características de las células vegetales es la presencia de plastidios, también llamados plastos, que son orgánulos más grandes que las mitocondrias y como éstas, delimitadas por dos unidades de membrana. Los plastos que no contienen pigmentos son llamados leucoplastos. Los que contienen pigmentos son los cromoplastos, de los cuales los más comunes son los cloroplastos, ricos en clorofila, el principal pigmento fotosintético. Vacuolas citoplasmáticas. Las células vegetales contienen, a menudo, vacuolas citoplasmáticas mucho más grandes que las existentes en el citoplasma de las células animales. Las vacuolas de las células vegetales pueden ocupar la mayor parte del volumen celular, reducie ndo el citoplasma funcional a una delgada franja en la periferia de la célula. Presencia de almidón. A diferencia de las células animales eucariotas, que utilizan el polisacárido glucógeno como reserva energética, en las células vegetales el polisacárido de reserva es el almidón. Presencia de plasmodesmos. Las células vegetales tienen tubos de 20 y 40 nm de diámetro que conectan las células adyacentes. Estas conexiones son llamadas plasmodesmos y establecen canales para el tránsito de moléculas. Las células animales no presentan plasmodesmos; sin embargo, muchas se comunican a través de uniones comunicantes (capítulo 5), que son morfológicamente muy diferentes, pero tienen similitudes funcionales a los plasmodesmos.

Las uniones comunicantes también son llamadas uniones gap o gap junctions.

ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LAS CÉLULAS Se supone que el proceso evolutivo que dio origen a las primeras células en la Tierra comenzó hace aproximadamente cuatro mil millones de años. En ese momento, la atmósfera probablemente contenía vapor de agua, amoníaco, metano, hidrógeno, sulfuro de hidrógeno y dióxido de carbono. El oxígeno libre sólo apareció mucho más tarde, gracias a la actividad fotosintética de las células autótrofas. Hace cuatro mil millones de años, la superficie de la Tierra supuestamente estaba cubierta con grandes cantidades de agua, dispuesta en grandes "océanos" y "lagos". Esta masa líquida, llamada sopa o caldo primordial era rica en moléculas inorgánicas y contenía en solución los gases que constituían la atmósfera de aquella época. Bajo la acción del calor y la radiación ultravioleta proveniente del sol, y las descargas eléctricas, derivadas de las tormentas que eran muy comunes, las moléculas disueltas en

la sopa primordial se combinaron químicamente para constituir los primeros compuestos que contienen carbono. Sustancias relativamente complejas tales como proteínas y ácidos nucleicos, que en las condiciones terrestres actuales, sólo se forman por la acción de las células o por síntesis en los laboratorios químicos, habrían aparecido de forma espontánea al azar. Este tipo de síntesis, realizado sin la participación de los seres vivos, se llama síntesis prebiótica, y se ha demostrado experimentalmente que es posible (Figura 1.9). La acumulación gradual de los compuestos de carbono se vio favorecida por tres circunstancias: (1) la enorme extensión de la Tierra, con una variedad de nichos, donde probablemente ocurrió la formación de moléculas que se mantuvieron próximas unas con otras y, ciertamente, diferentes de las existentes en otros lugares; (2) el largo tiempo, cerca de dos mil millones de años, un periodo en el que ocurrió la síntesis prebiótica en la sopa primordial; y (3) la falta de oxígeno en la atmósfera,

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ya mencionada, un acontecimiento importante, porque las moléculas recién formadas no fueron inmediatamente destruidas por la oxidación. En la

actual atmósfera de la Tierra, la síntesis de tipo prebiótico es imposible.

Es probable que en la sopa primordial hayan surgido polímeros de aminoácidos y de nucleótidos, formándose así las primeras moléculas de proteínas y de ácidos nucleicos. Sin embargo, solamente los ácidos nucleicos son capaces de auto-duplicación, y la demostración experimental reciente que, en laboratorio, las moléculas de ARN simples son capaces de convertirse en moléculas más complejas sin la ayuda de las proteínas enzimáticas, hace suponer que la Figura 1.9 Aparato creado por Stanley L. evolución comenzó con moléculas de ARN. Como se Miller para demostrar la síntesis de molécumostrará a continuación, en el Capítulo 3, el ARN las orgánicas sin la participación de los seres puede tener actividad enzimática, propiedad que una vivos (síntesis prebiótica) en las condiciones vez se pensó ser exclusiva de las proteínas. Una vez de la atmósfera terrestre alrededor de 4 mil que aparecieron las primeras moléculas de ARN con millones de años atrás. El dispositivo contela capacidad de multiplicarse y evolucionar, se inició nía vapor de agua, proveniente del calentael camino a las primeras células. Sin embargo, era miento del balón o matraz inferior. Por el necesario que el sistema autocatalítico quedase grifo ubicado en la parte superior izquierda aislado, de manera que las moléculas no se disperse introducían, en la columna, metano, sen en el líquido prebiótico. Probablemente se amoníaco, hidrógeno y dióxido de carbono. formaron al azar moléculas de fosfolípidos, que Al pasar por el balón superior derecho, la espontáneamente, constituyeron las primeras bicamezcla era sometida a descargas eléctricas. pas fosfolipídicas, y éstas pudieron encerrar conjunLa mezcla se convertía en líquido en el tos de moléculas de ácidos ribonucleicos, nucleóticondensador y era recogido por el grifo dos, proteínas y otras moléculas. De este modo se inferior. Se observó que ese líquido contenía constituyó la primera célula, con su membrana diversas moléculas de compuestos de fosfolipídica. Los fosfolípidos son moléculas alargacarbono (moléculas orgánicas), incluyendo das con una cabeza hidrofílica y dos cadenas hidroaminoácidos. fóbicas. Cuando se disuelven en el agua, las moléculas de fosfolípidos se unen por interacción hidrofóbica de sus cadenas hidrófobas y forman espontáneamente bicapas sin necesidad de energía (Capítulo 5). Los datos disponibles en la actualidad nos permiten suponer que, a continuación del ácido ribonucleico (ARN), debe haber surgido el ácido desoxirribonucleico (ADN), formado por la polimerización de nucleótidos en un molde (template) de ARN, y los dos tipos de ácidos nucleicos empezaron a determinar los tipos de proteínas a ser sintetizadas. Teniendo en cuenta la gran va riedad de proteínas celulares, formadas por 20 monómeros diferentes (los 20 aminoácidos), es poco probable que todas las proteínas se hayan formado por casualidad. La síntesis de proteínas debe haber sido dirigida por los ácidos nucleicos, con la eliminación de las proteínas inútiles, debido al propio proceso evolutivo. Es razonable suponer que la primera célula que surgió fue estructuralmenEl comienzo de la fotosíntesis y los cambios en el ambiente fueron de gran te simple, sin duda, un procariota heterótrofo, y también que esta célula importancia para la evolución de las células y las formas de vida de hoy fue precedida por agregados de ARN, ADN y proteínas, rodeados por una existentes en la Tierra. Gracias a la fotosíntesis, surgió el oxígeno en la bicapa de fosfolípidos. Estos agregados continuaron el proceso evolutivo atmósfera, lo que permitió la aparición de células aerobias, al mismo iniciado por las moléculas de ARN, y dieron lugar a las primeras células, tiempo en que se creó una cubierta protectora de ozono en las capas que debieron haber sido procariotas estruturalmente simples. superiores de la atmósfera. Las bacterias anaerobias se restringieron a Como estas primeras procariotas eran células heterótrofas y por lo tanto nichos especiales donde no hay oxígeno. incapaces de sintetizar compuestos ricos en energía (alimentos), el proceso Se supone que el siguiente paso en el proceso evolutivo, después de que evolutivo habría sido detenido por el agotamiento de los compuestos de las células procariotas autótrofas fue la aparición de las células eucariotas. carbono formado por el proceso prebiótico, en los nichos en los que surgieTodo indica que las células eucariotas, caracterizados por su elaborado ron las células primordiales. Estas primeras células aparte de ser procariosistema de membranas, se originaron a partir de las procariotas por las tas y heterótrofas, eran también anaeróbicas, porque no había oxígeno en invaginaciones de la membrana plasmática, que fue arrastrada por las la atmósfera. Hubiera sido difícil de sostener el proceso evolutivo de las proteínas contráctiles aparecidas previamente en el citoplasma (véase más células primitivas, si ellas hubieran permanecido dependientes para su adelante en este capítulo). Esta hipótesis está apoyada por la observación nutrición, de las moléculas energéticas formadas por la síntesis prebiótica que las membranas intracelulares siguen manteniendo aproximadamente la en la sopa primordial. misma asimetría que existe en la membrana plasmática. La cara de las El mantenimiento de la vida en la Tierra dependía entonces de la aparición membranas internas que están en contacto con el citosol (matriz citoplasde las primeras células autótrofas, es decir, capaces de sintetizar moléculas mática) se asemeja a su contraparte en la membrana plasmática, y tamcomplejas a partir de sustancias simples y energía solar. Se supone que bién lo hace la cara en el interior de los compartimentos intracelulares, que surgió, en las células procariotas, un sistema capaz de utilizar la energía tiene similitud con la cara exterior la membrana plasmática (Figura 1.10). del sol y almacenarla en enlaces químicos, sintetizando así los alimentos y La internalización de la membrana fue fundamental en la evolución de las liberando oxígeno. Este nuevo tipo de célula, probablemente sería muy células eucariotas, porque formó varios compartimentos intracelulares tales similar a las "algas verde-azuladas" o cianofíceas, que son bacterias que como el retículo endoplasmático, endosomas, lisosomas y aparato de Golgi, aún existen en la actualidad. Comenzó así la fotosíntesis, que era debida a que son microrregiones, cada una con su composición enzimática típica y la aparición en las células de ciertos pigmentos, tales como la clorofila actividades funcionales específicas. Esta separación molecular y funcional (pigmento verde), que capta la radiación azul y roja de la luz solar usando aumenta en gran medida la eficiencia de los procesos celulares. su energía para activar procesos sintéticos. Hay pruebas que sugieren que los orgánulos implicados en las transformaEl oxígeno liberado por la fotosíntesis de las bacterias autótrofas se fue ciones energéticas, los cloroplastos y las mitocondrias se originaron a partir acumulando en la atmósfera. Esto produjo grandes cambios en la atmósfede bacterias que fueron fagocitadas, quienes escaparon a los mecanismos ra, debido a que las moléculas de oxígeno gaseoso (0 2) se extendieron a de digestión intracelular y se establecieron como simbiontes (endosimbionlas alturas más elevadas de la atmósfera, donde se rompieron bajo la tes) en las células eucariotas hospedadoras, formando una relación de acción de la radiación ultravioleta, originando átomos de oxígeno, muchos beneficio mutuo y que se ha convertido en irreversible con el pasar de los de los cuales se recombinaron para formar ozono (03), que tiene una gran años (Figura 1.11), debido a los cambios o mutaciones ocurridos en el capacidad para absorber luz ultravioleta. Así se formó, poco a poco, una endosimbionte (se denomina endosimbionte a un simbionte intracelular). capa de ozono que protege la superficie de la Tierra de la radiación ultraLas principales evidencias de esta hipótesis son: violeta, pero que es transparente a las longitudes de onda visibles.  Las mitocondrias y los cloroplastos contienen un genoma de ADN circular como el de las bacterias  Estos orgánulos tienen dos membranas, siendo la interna similar, en su composición, a las membranas bacterianas, mientras que la externa, que sería la pared de la vacuola fagocítica, se asemeja a la membrana de las células eucariotas hospedadoras. Además, la simbiosis entre bacterias y células eucariotas sigue sucediendo, con muchos casos ahora existentes. A lo largo de la evolución, tanto las mitocondrias y los cloroplastos fueron perdiendo su genoma al núcleo de la célula huésped, volviéndose dependientes del ADN cromosómico de las células huésped. La mayoría de las

proteínas de las mitocondrias y los cloroplastos está codificada por el ARN mensajero proveniente del núcleo celular, son sintetizadas en los polirribosomas de la matriz citoplasmática, y luego trasladadas al interior de las mitocondrias y de los cloroplastos.

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Figura 1.10 La ilustración muestra cómo probablemente aparecieron los compartimentos intracelulares, por invaginaciones de la membrana plasmática. Esta hipótesis está apoyada por la observación que las membranas intracelulares tienen una constitución molecular muy similar a la de la membrana plasmática.

Figura 1.11 Dibujo esquemático que muestra la teoría del origen bacteriano de las mitocondrias por endosimbiosis. Las células eucariotas anaerobias, primitivas, habrían fagocitado bacterias aerobias, las cuales, de alguna manera escaparon de la digestión intracelular y establecieron interrelaciones mutuamente útiles con las células hospedadoras, convirtiéndose así en aerobias. Al mismo tiempo, las bacterias, entre otras ventajas, recibieron protección y alimentación en su nueva ubicación en el citoplasma de la célula hospedadora.

¿Cómo surgieron las células eucariotas? La aparición de las células eucariotas, durante el lento proceso evolutivo, es algo difícil de elucidar, sobre todo porque no existen actualmente células intermedias entre procariotas y eucariotas, lo que facilitaría el esclarecimiento de este cambio evolutivo. Parece claro que, aunque las mitocondrias y los cloroplastos se derivan de células procariotas, es difícil imaginar la formación de una célula eucariota por la simple unión de dos células procariotas típicas. Uno de ellas tiene que haber sufrido modificaciones evolutivas que no se preservaron en las células procariotas actuales. Es posible que las células eucarióticas hayan evolucionado gradualmente en la secuencia expuesta en la siguiente figura (Figura 1.12). Una célula procariota heterótrofa y anaeróbica, ya con el sistema ADN ARN proteína funcionante, habría perdido la pared celular y aumentó gradualmente en tamaño y formó invaginaciones en la membrana plasmática. Se supone que en estas sinuosidades, se acumularon enzimas digestivas que permitieron una mejor digestión de las partículas de los alimentos. Por lo que algunas invaginaciones se desprendieron de la membrana, formando vesículas membranosas que dieron origen al sistema lisosomal, las vesículas precursoras del retículo endoplasmático, y llevaron hacia la parte profunda de la célula el ADN que estaba unido a la membrana plasmática. Con la aparición del oxígeno en la atmósfera debido a las bacterias fotosintéticas, deben haber surgido los peroxisomas, la defensa de las células contra los efectos nocivos de los radicales libres que contienen

oxígeno. Hubo un aumento del ADN, en paralelo a la complejidad celular cada vez mayor, y este ADN, que consta de cadenas largas, fue concentrado en cromosomas que fueron secretados en el núcleo delimitado por la envoltura nuclear que se formó a partir del material membranoso de la superficie celular. También ocurrió un desarrollo del citoesqueleto con la aparición de microtúbulos y aumento en la cantidad de microfilamentos. A medida que la concentración de oxígeno en la atmósfera fue aumentando lentamente, las células que incorporaron procariotas aerobios predominaron por selección natural, por dos razones: la respiración aerobia es mucho más eficiente y, además de esto, gasta oxígeno, disminuyendo la formación intracelular de radicales libres (radicales de oxígeno). Estos radicales de oxígeno dañan muchas macromoléculas, pudiendo deteriorar la función de las células. La endosimbiosis (simbiosis intracelular) de las procariotas aerobias dio lugar a las mitocondrias, orgánulos con dos membranas, siendo la membrana interna perteneciente a la bacteria precursora y la membrana externa de la célula eucariota que se estaba formando. Probablemente, los cloroplastos se originaron de una manera similar, también por endosimbiosis, pero de bacterias fotosintéticas. En el transcurso de la evolución, hubo transferencia de parte del genoma de los cloroplastos y las mitocondrias hacia los núcleos celulares; pero los cloroplastos transfirieron menos ADN, en comparación con las mitocondrias. Es posible que la endosimbiosis de las mitocondrias se produjera antes de la endosimbiosis que dio origen a los cloroplastos.

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Figura 1.12 Diseño basado principalmente en los trabajos de C. de Duve, que muestra la manera como, probablemente, se constituyeron las primeras células eucariotas, en el largo proceso evolutivo que precedió a la aparición de los seres pluricelulares. Para más explicaciones, véase el texto del t ema ¿Cómo surgieron las células eucariotas?

PATRONES CELULARES Y LOS GRANDES GRUPOS DE SERES VIVOS El más antiguo sistema de clasificación establecida por Linneo, divide los seres vivos en sólo dos reinos - el animal y vegetal. En el primero se incluyeron los heterótrofos que se alimentan por ingestión, excepto los parásitos que se alimentan por ósmosis. En el reino vegetal estaban incluidos los organismos fotosintéticos, que comprenden a las plantas, las bacterias, los mixomicetos y los hongos.     

Debido a los inconvenientes obvios de la división de la vida en dos reinos, fueron creadas otras divisiones, más elaboradas y más consistentes con los nuevos conocimientos. Sin embargo, todavía se utiliza un sistema, como el de Linneo, basado principalmente en la estructura de los seres vivos y en el modo de absorción de los nutrientes, que admite cinco reinos (Figura 1.13):

Monera: formado por las bacterias, que son los únicos seres procariotas (las cianobacterias o "algas azules", también son bacterias) Protista: comprende organismos eucariotas principalmente unicelulares de vida libre o unicelulares coloniales (protozoos y fitoflagelados) Fungi: comprende todos los hongos Plantae: que incluye las algas verdes y las plantas superiores Animalia: que incluye todos los animales, es decir, los seres que durante el desarrollo embrionario, pasan a través de la fase de gástrula.

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Figura 1.13 Esquema de los cinco "reinos" al que pertenecen a los seres vivos. El "reino" Monera, uno cuyas células son procariotas, está conformado por las bacterias (incluidas las cianobacterias o "algas verde-azuladas"). En los otros "reinos", todas las células son eucariotas. El "reino" Protista está compuesto por formas unicelulares de vida l ibre o unicelulares coloniales. El "reino" Fungi comprende a los hongos. El "reino" Plantae incluye a los vegetales superiores. En el "reino" Animalia están todos los animales.

El concepto actual de protista no es el mismo propuesto por Haeckel en el pasado. Actualmente, se encuentran entre los protistas a los protozoos y a los organismos limítrofes, como los fitoflagelados, que siempre han sido objeto de controversia, ya que eran incluidos por algunos entre los animales, y por otros entre las plantas, en la antigua clasificación en dos reinos.    

En la clasificación de Linneo, los hongos eran considerados vegetales (porque no tienen movilidad) sin clorofila, pero después fueron ubicados en un grupo separado porque presentan ciertas características propias, no compartidas ni por los animales ni por los vegetales:

no tienen clorofila ni otros pigmentos fotosintéticos no forman tejidos verdaderos no tienen pared de celulosa (característica de los vegetales), sino más bien, compuesta principalmente de quitina (característica de los animales) no almacenan almidón (reservas de nutrientes de los vegetales) como una reserva de energía, sino glucógeno (reservas de nutrientes de los animales).

Más recientemente, los avances tecnológicos en la biología molecular han permitido el estudio mucho más profundo de las relaciones evolutivas entre los organismos, enfoque llamado filogenia. De hecho, la elucidación de la evolución molecular de las células parece ser la mejor manera de aclarar los orígenes de las células existentes en la actualidad y para descubrir las características de las células primordiales, que aparecieron hace 3.5 billones de años y que son las células precursoras de las células actuales. Estos estudios pueden realizarse por medio de diversos tipos de moléculas tales como la secuencia de amino ácidos en las proteínas y de nucleótidos en los ácidos nucleicos, o la presencia o ausencia de enzimas importantes en el metabolismo de los organismos. Sin embargo, los investigadores encontraron que el análisis de la secuencia de nucleótidos en el ARN de los ribosomas, o ARNr, es una buena forma de estudiar la filogenia. Todas las células tienen ribosomas y su ARN es muy constante en sus funciones, actuando como un "reloj molecular" apropiado para estimar los cambios evolutivos que se produjeron durante los miles de millones de años desde que surgieron las primeras células en la Tierra. Incluso los cambios muy pequeños en la estructura de un ARN ribosomal hacen que este ya no sea funcional. Por lo tanto, su secuencia de nucleótidos fue bien conservada, es decir, mantenida constante, en las diversas líneas filogenéticas, y la distancia evolutiva entre los organismos puede ser detectada por las pequeñas diferencias en la secuencia de nucleótidos en el ARNr. Los ribosomas contienen tres tipos de ARN, llamados 5S, 16S y 23S en las células procariotas. En las células eucariotas, el ARNr 16S se sustituye por un ARNr 18S. La letra S, de Svedberg indica el tamaño de la molécula, que se relaciona con su coeficiente de sedimentación en una ultracentrífuga (Capítulo 3). Debido a su tamaño conveniente, los ARNr 16S (18S en las células eucario-

tas) es el más utilizado en los estudios filogenéticos. El ARNr 5S tiene sólo 125 nucleótidos, lo que limita en gran medida la información que puede proporcionar, mientras que el ARNr 23S, con 2.900 nucleótidos, es muy grande, y el estudio de su molécula es más difícil y laborioso. A raíz del estudio de la secuencia de nucleótidos en el ARNr 16S de las células procariotas y en el ARNr 18S de las eucariotas, se construyeron nuevos árboles evolutivos que dividen a los organismos en diferentes grupos de los que aparecen en las clasificaciones anteriores (Figura 1.14). Esta comparación entre los organismos se basa en el concepto que los organismos que se diversificaron antes tuvieron más tiempo para acumular modificaciones en su ARN ribosomal que los organismos que separaron más recientemente. Los investigadores que realizaron estos estudios concluyeron que la célula procariota ancestral universal inicialmente se ramificó en dos direcciones, dando lugar a los grupos o dominios Arquea y Bacteria (Figura 1.14). Más tarde, desde el dominio arquea, surgieron las primeras células eucariotas que formaron el dominio Eucaria. El dominio Arquea comprende a los procariotas metanógenos (que producen el gas metano como producto de su metabolismo) y los que viven en condiciones extremas de alta o baja temperatura y salinidad, acidez o alcalinidad elevada. Por sus características moleculares, tales como la composición del ARNr, estas células procariotas muestran algunas similitudes con los seres del dominio Eucaria y muchas diferencias con el dominio Bacterias. Aparte de las diferencias en el ARNr, las células del dominio Arquea tienen paredes celulares sin proteoglicanos, compuestos que se encuentran en las paredes de las bacterias. El dominio Eucaria abarca todo los seres constituidos por células eucariotas, y el dominio Bacteria abarca a las bacterias actualmente mejor conocidas y llamadas también eubacterias.

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Figura 1.14 Esquema que muestra la división de los seres vivos en tres grupos o dominios, basado en la secuencia de nucleótidos del ARN ribosomal. Tenga en cuenta que el grupo Eucaria se separó posteriormente del grupo Arquea, siendo el grupo Bacteria el más antiguo. Eucaria y Arquea son los más próximos, en términos moleculares, y el grupo Bacteria es el más alejado.

RESUMEN Los virus son estructuras no celulares, pero sólo se multiplican dentro de las células, cuya maquinaria utilizan para la producción de nuevos virus. Por ser parásitos intracelulares frecuentes, serán estudiados en este libro. Los virus son formados en una parte central con la información genética codificada en el ADN o en el ARN. Este genoma está protegido por una estructura que lo envuelve, constituida por unidades proteicas denominadas capsómeros. Algunos virus tienen un cubierta lipoproteica, que contiene lípidos de la célula parasitada y glicoproteínas virales. A pesar de la gran diversidad entre los seres vivos, todos constituidos por células, sólo hay dos tipos básicos de células: las células procariotas y las eucariotas. Las células procariotas son más pequeñas y se caracterizan por la falta de un sistema de membranas que divide a la célula en compartimentos funcionales. Su cromosoma consiste en ADN de doble cadena de forma circular, localizados en un espacio citoplasmático donde la matriz es menos electrondensa: el nucleoide. Generalmente, cada bacteria tiene más de una copia de ese cromosoma simple y que además del ADN contiene sólo unas pocas proteínas. En estas células existe sólo la membrana plasmática, que puede presentar pliegues dirigidos hacia dentro de las células: los mesosomas. En las células procariotas fotosintéticas, como las cianobacterias, existen algunas membranas citoplasmáticas que, asociadas con la clorofila, son responsables de la fotosíntesis en estas células. Las células procariotas no tienen citoesqueleto y son de forma simple. La forma de estas células se mantiene generalmente por la presencia de una pared extracelular rígida que también sirve como protección mecánica, función importante, porque las bacterias están presentes en nichos ecológicos muy variables y, algunas veces desfavorables. Las células eucariotas se presentan divididas en compartimentos funcionales debido a la presencia de un sistema complejo de membranas que crea microrregiones intracelulares especializadas, en las que ciertas funciones se pueden realizar de manera más eficiente. Además de esta propiedad de compartimentación, el sistema de membrana crea una superficie enorme a la que se conectan, en una secuencia predeterminada, moléculas enzimáticas y transportadoras. De esta manera, los sustratos son procesados por los diversos componentes de las cadenas enzimáticas sin la necesidad de grandes desplazamientos, que disminuirían de forma marcada la velocidad y la eficiencia de los procesos metabólicos. Entre los principales compartimientos de las células eucariotas están el núcleo, la envoltura nuclear, el retículo endoplásmico (rugoso y liso), los endosomas, el aparato de Golgi, los lisosomas, las mitocondrias, y en las células vegetales, los plastos o plastidios, como los

cloroplastos. Otra característica de las células eucariotas es tener un citoesqueleto fibrilar, responsable de los movimientos celulares y del mantenimiento de la forma - a menudo altamente compleja - de estas células. El citoes queleto está constituido por microtúbulos (aproximadamente 24 nm de diámetro), filamentos intermedios (alrededor de 10 nm de diámetro) y microfilamentos de actina (aproximadamente 6 nm de diámetro). Los microtúbulos y los microfilamentos de actina, junto con las proteínas motoras, participan en los movimientos celulares y en los desplazamientos intracelulares de los orgánulos y vesículas que contienen moléculas diferentes.

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Tecnología de la Biología Celular y Molecular: Algunos ejemplos

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ERRNVPHGLFRVRUJ   

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Preparación de cortes para estudio en los microscopios óptico y electrónico Microscopio óptico o microscopio de luz El microscopio electrónico posibilitó la visualización de las estructuras celulares que no son visibles bajo un microscopio óptico por contar con un poder de resolución mucho mayor Citoquímica: incluye diversas técnicas para la identificación y localización de las moléculas que constituyen las células La microscopía de fluorescencia se aplica generalmente con técnicas citoquímicas La inmunocitoquímica localiza moléculas proteicas específicas Las macromoléculas tales como proteínas, ADN y ARN pueden ser aisladas por cromatografía en columna El tamaño de las moléculas proteicas se puede determinar por electroforesis en gel de poliacrilamida La radioautografia es muy utilizada para estudiar las ubicaciones de la síntesis y el destino de las macromoléculas Por centrifugación es posible obtener orgánulos celulares en un estado de pureza y luego estudiar sus propiedades químicas, físicas y biológicas

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Es posible separar las células de un tejido y aislar un determinado tipo celular Estudio de las células vivas y de los cultivos de células animales y vegetales Resumen Bibliografía

La biología celular y molecular estudia objetos muy pequeños, por lo que depende enteramente de la mejora de los instrumentos y de las técnicas de investigación Para el estudio en el microscopio óptico, los tejidos son fijados, cortados y teñidos; las imágenes obtenidas se pueden almacenar en discos de computadora y posteriormente procesadas Los microscopios de contraste de fase facilitan el examen de las células vivas Con el microscopio confocal, es posible hacer cortes ópticos de la célula y la reconstrucción tridimensional por ordenador de las imágenes escaneadas de los orgánulos y otros constituyentes celulares El microscopio electrónico de transmisión tiene un poder de resolución de más de 100 veces la del microscopio óptico y reveló una serie de pequeños detalles de la estructura celular que no fueron ni siquiera percibidos anteriormente, revolucionando los estudios sobre las células El microscopio electrónico de barrido tiene como objetivo estudiar las superficies externas e internas de las células y las de los orgánulos La inmunocitoquímica se emplea para la localización de macromoléculas celulares específicas En los cultivos, las células pueden mantenerse vivas y proliferando por mucho tiempo, lo que facilita el estudio de sus funciones Los orgánulos se pueden aislar de las células por centrifugación fraccionada (centrifugación diferencial) La cromatografía en columna es una técnica utilizada para separar macromoléculas celulares La electroforesis se puede usar para identificar macromoléculas y para determinar el tamaño de las moléculas proteicas.

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os conocimientos sobre las células progresan en paralelo a los adelantos o avances en los métodos de investigación. Inicialmente, el microscopio óptico, también llamado microscopio de luz, permitió el descubrimiento de las células y el desarrollo de la teoría de que todos los seres vivos están formados por células. Posteriormente, descubrieron técnicas citoquímicas para la identificación y localización de diversas moléculas constituyentes de las células. Con el advenimiento de microscopios electrónicos, que tienen un gran poder de resolución, se observaron detalles de la estructura celular que no podrían incluso ser imaginadas por los estudios realizados con los microscopios ópticos. Casi simultáneamente con el uso de microscopios electrónicos se mejoraron los métodos para la separación de los orgánulos celulares y para el estudio in vitro de sus moléculas y sus respectivas funciones. El análisis de los orgánulos aislados en grandes cantidades, el cultivo celular, la posibilidad de manipular el genoma a través de la adición o supresión de genes y la aparición de numerosas técnicas de uso común a las diversas ramas de la investigación biológica llevó a la aparición de lo que suele ser llamada la biología celular y molecular, que es el estudio integrado de las células a través de todos los medios técnicos disponibles. Es imposible de describir, incluso de forma resumida, todas las técnicas utilizadas en los diferentes estudios sobre las células. Cada investigador ha usado su imaginación para crear los más variados enfoques, según el problema a resolver. En este capítulo, sólo a modo de ejemplo, se estudiarán algunas de las técnicas que han contribuido significativamente al progreso de la biología celular y molecular. Para mantener un tamaño razonable del libro, no se ha informado de muchas técnicas; sin embargo, algunas se describen en los capítulos que tratan de las cuestiones aclaradas por ellas. Esto hace que sean más fáciles de entender; un ejemplo es una técnica importante llamada PCR (Polimerase Chain Reaction o reacción en cadena de la polimerasa), que se describe en detalle en el Capítulo 8. PREPARACIÓN DE LOS CORTES PARA EL ESTUDIO EN LOS MICROSCOPIOS ÓPTICO Y ELECTRÓNICO Aunque es posible el estudio microscópico de las células vivas, a menudo hay ventajas en la obtención de una preparación permanente (lámina) en

el que se conservan las células, es decir, fijadas y teñidas para una mejor demostración de sus componentes. Una preparación permanente ideal debería mostrar las células con la misma estructura microscópica y composición química que poseían cuando estaban vivas. Esto, sin embargo, no es posible, y todas las preparaciones presentan artefactos, que son alteraciones producidas en las células por las técnicas utilizadas. Estos artefactos son consecuentes del procesado que sufrieron. ► Fijación. La fijación es el primer paso o primera etapa para la obtención de una preparación permanente y tiene los siguientes fines: ■ Evitar la autólisis, que es la destrucción de la célula por sus propias enzimas ■ Prevenir la actividad y proliferación de bacterias ■ Endurecer las células de manera que resistan mejor los siguientes pasos de la técnica ■ Aumentar la afinidad de las estructuras celulares por los colorantes utilizados en la microscopía óptica y aumentar el contraste en la microscopía electrónica (véase más adelante en este capítulo). La química de la fijación es compleja y poco conocida. El formaldehído (formol es la solución a 40% de aldehído fórmico) y el glutaraldehído (aldehído glutárico) fijan a las células mediante la combinación con los grupos amino de las proteínas. El glutaraldehído contiene un grupo aldehído en cada extremo de su molécula, siendo capaces de establecer enlaces o puentes entre las unidades proteicas, estabilizando la estructura cuaternaria de la proteína (Figura 2.1). El tetróxido de osmio y el glutaraldehído son los fijadores más utilizados en la microscopía electrónica porque coagulan las proteínas, causando cambios mínimos en la estructura celular. Cada uno de estos fijadores simples presenta ciertos inconvenientes, junto con algunas cualidades deseables; Por ello, se elaboraron empíricamente diversas mezclas fijadoras que contienen proporciones variables de los fijadores simples, con la finalidad de unir sus buenas cualidades y eliminar las desventajas.

Figura 2.1 Comparación de la actividad fijadora del formaldehído (formol) y del glutaraldehído (aldehído glutárico) sobre los microtúbulos, que están constituidos por dímeros proteicos (representados por las esferas). Conteniendo dos grupos aldehído, cada molécula de glutaraldehído pueden unirse a dos dímeros proteicos, manteniendo la estructura del microtúbulo. El formaldehído es incapaz de mantener esta estructura, ya que cada molécula de formaldehído (formol) tiene sólo un grupo aldehído y se une a un solo dímero. Leyendas: Formol. Grupo aldehídico único (representado a la izquierda por el punto negro). No fija al microtúbulo. Glutaraldehído. Molécula en bastón con dos grupos aldehídicos. Fija el microtúbulo.

como la eosina, el orange G y la fucsina ácida, colorean las moléculas básicas de las proteínas

► Microtomía. En su mayoría, las células forman parte de tejidos que necesitan ser cortados en rodajas finas para examinarlas bajo el microscopio. Estos cortes se realizan en un dispositivo llamado micrótomo (Figura 2.2). Para ser cortado en el microtomo, el fragmento de tejido fijado está generalmente protegido por un material que lo penetra y circunda, el cual debe tener propriedades físicas para facilitar el corte. Los tejidos utilizados para el estudio en el microscopio óptico están protegidos, es decir, incluidos en parafina o en resinas plásticas especiales, y cortados con un espesor de 1 a 6 micrómetros, por lo general. Para el estudio en el microscopio electrónico, los tejidos deben ser incluidos en resinas más rígidas tales como las de tipo epoxi. Los cortes para el microscopio electrónico son muy finos, midiendo 0,02 a 0,1 µm. Los micrótomos que cortan tejidos incluidos en parafina utilizan cuchillas de acero, y los que cortan tejidos incluidos en resinas tipo epoxi utilizan cuchillas de cristal o diamante. Estos son llamados ultramicrótomos. ►Tinción. Casi todos los orgánulos son transparentes y sin color, lo que dificulta su estudio microscópico. Para superar esta dificultad, se han creado numerosos procesos de coloración que vuelven visibles los diversos componentes celulares. La mayoría de los colorantes se comportan como una base o como un ácido. En los colorantes básicos, el grupo químico responsable del color o grupo cromóforo (khromos, color y phoro, que lleva, que carga) es catiónico. Los cromóforos de ese colorante se combinan con los grupos ácidos (aniónicos) de las moléculas celulares. Por lo tanto, las moléculas ácidas, tales como el ADN y ARN son basófilas, es decir, tienen una afinidad por los colorantes básicos. El azul de toluidina y el azul de metileno son ejemplos de colorantes básicos. La hematoxilina, un tinte comúnmente utilizado, se comporta como un colorante básico, mediante la unión a estructuras basófilas de los tejidos. En los colorantes ácidos, el cromóforo es aniónico (por lo tanto, con carga eléctrica negativa) y tiende a combinarse con los componentes celulares básicos que son eléctricamente positivos. Las estructuras ricas en grupos básicos son acidófilas por tener afinidad por los colorantes ácidos. Los colorantes ácidos tales citoplasmáticas.

Figura 2.2 Micrótomo moderno, especialmente ergonómico, para cortes de tejidos incluidos en parafina o en resina plástica. Modelo ErgoStar HM 200. (Ilustración cortesía de Microm, empresa del grupo Carl Zeiss.) Figura 2.3 Microscopio óptico moderno, binocular, con iluminación incorporada. (Fotografía proporcionada por el fabricante, Carl Zeiss).

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Figura 2.4 El grabado ilustra los diversos componentes del microscopio óptico y el trayecto del haz luminoso, desde su fuente (lámpara) hasta el ojo del observador. (1) base del microscopio (2) condensador, (3) lente objetivo, (4) cristalino del globo ocular; (A) sistema de iluminación, (B) platina, (C) tubo binocular, (D) globo ocular del observador. (Ilustración cortesía de la empresa Carl Zeiss.) Figura 2.5 Las principales unidades de medida utilizadas en biología celular son el micrómetro (µm) y el nanómetro (nm). La unidad Angstrom (Å) debe sustituirse por el nanómetro. La ilustración muestra la equivalencia entre esas unidades, comparándolas también con el milímetro (mm). Las flechas indican los límites (aproximados) de resolución del ojo humano, del microscopio óptico y del microscopio electrónico.

Figura 2.6 Esquema del cono luminoso que penetra en un objetivo, mostrando el semiángulo de abertura (µ), que incide en el cálculo de la abertura numérica (AN).

MICROSCOPIO ÓPTICO Este instrumento generalmente se usa para preparaciones coloreadas, que son observadas por transiluminación. En el microscopio óptico deben considerarse la parte mecánica y la parte óptica. La primera, con sus componentes principales, está ilustrada en la Figura 2.4. Como se mencionó antes, el microscopio óptico (Figura 2.3) consta de una parte mecánica, que sirve como soporte, y una parte óptica constituida por tres sistemas de lentes: el condensador, el objetivo y el ocular. El propósito del condensador es proyectar un cono de luz sobre las células que están siendo examinadas bajo el microscopio. El condensador es tan importante como las otras lentes del microscopio. Después de pasar a través de las células, ese haz luminoso, en forma de cono, penetra en el objetivo, el cual proyecta una imagen aumentada del objeto observado en dirección al ocular, el cual amplía nuevamente la imagen y la proyecta sobre la retina, una pantalla o una placa fotográfica. Por último, la imagen proporcionada por el ocular puede ser percibida por la retina (Figura 2.4) como una imagen situada a 25 cm del lente ocular, o puede ser proyectada en una pantalla o una placa fotográfica. La ampliación total proporcionada por el microscopio, dada por una combinación de lentes, es igual al aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular. El condensador es en general subestimado pos los que utilizan el microscopio, tal vez por no influir en el aumento de la imagen, pero influye en su nitidez y en la riqueza de sus detalles, puesto que actúa sobre el límite de resolución del sistema óptico del microscopio, aunque esta propiedad

dependa principalmente del objetivo. Se llama poder de resolución de un sistema óptico a su capacidad de separar detalles. En la práctica el poder de resolución es expresado por el límite de resolución el cual equivale a la mínima distancia que debe existir entre dos puntos para que aparezcan individualizados. Por ejemplo, dos partículas separadas por 0,3 µm aparecerán individualizadas cuando se examinan en un sistema óptico con límite resolutivo de 0,2 µm. pero si fuesen examinadas en un sistema con límite resolutivo de 0,5 µm, aparecerían fundidas como si fuesen una sola partícula de tamaño mayor (Figuras 2.5 y 2.6). El límite de resolución de las mejores lentes utilizadas en los microscopios ópticos comunes es de 0,12 µm. Por tanto, lo que determina la riqueza de detalles de la imagen dada por un sistema óptico es su límite de resolución y no su poder de aumentar el tamaño de los objetos. La propiedad de ampliar sólo tiene valor práctico si está acompañada de un aumento paralelo del poder de resolución. El límite resolutivo depende esencialmente del objetivo. El ocular aumenta sólo la imagen proyectada en su plano focal por el objetivo. Una de las características más importantes de un objetivo es su abertura numérica (AN), ya que el límite resolutivo depende principalmente de ésta y de la longitud de onda de la luz utilizada. La abertura numérica viene grabada en los objetivos y su determinación corresponde a los fabricantes de las lentes. Ella es igual al menor índice de refracción (n) interpuesto entre el corte y la lente objetivo, multiplicado por el seno del semiángulo de abertura (µ) (Figura 2.6). Tendremos entonces AN = n x sen µ, tal como muestra el esquema de la Figura 2.6.

El límite de resolución (LR) del objetivo es dado por la fórmula:

LR 

k  AN

donde k es una constante estimada en 0,61 y por otros en 0,5, y  es la longitud de onda de la luz empleada. En la práctica el objeto es iluminado por luz blanca

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constituida por diversas longitudes de onda. Generalmente se toma la longitud de onda de la banda del verde-amarillo (0,55 µm) para el cálculo del límite resolutivo, por ser el ojo humano más sensible a estos colores que a cualquier otro. Por tanto, en la práctica,

LR 

0, 61.0,55 AN

El análisis de la fórmula muestra que el límite de resolución es directamente proporcional a la longitud de onda e inversamente proporcional a la abertura numérica del objetivo. Algunos ejemplos mostrarán la importancia de la AN en la práctica y demostrarán también que la utilización de oculares de gran aumento no reporta ninguna ventaja. Admitamos las dos combinaciones de lentes siguientes: A. Objetivo de 10 x de AN 0,15 con ocular 20x: 200 x B. Objetivo de 40 x de AN 0,65 con ocular 5x: 200 x Haciendo los cálculos se verifica que, en el ejemplo A, el límite de resolución será de 2,2 µm, mientras que en el ejemplo B será de 0,5 µm. En los dos ejemplos mencionados, los aumentos son los mismos, pero la imagen obtenida por la combinación B será mucho más rica en detalles. Es lo que ilustra la figura 1-4. Los objetivos de los microscopios traen grabados otros datos, además del aumento y de la abertura numérica (fig. 1-5). En general tienen inscrito el número 160, o más raramente 170, lo que indica la longitud en milímetros del tubo del microscopio con el cual deben ser utilizados. Los objetivos dan mejores resultados cuando se emplean en un microscopio cuyo tubo tiene la distancia correcta para la cual el objetivo fue construido. Otro número que generalmente viene grabado en el objetivo es la fracción 0,17 que significa el grosor en milímetros del cubreobjetos para el cual las aberraciones de lente fueron corregidas. El grosor del cubreobjetos es particularmente importante cuando se utiliza un objetivo de gran aumento en seco. En los objetivos de inmersión, puesto que el cubreobjetos, el aceite de

inmersión y el cristal de la lente tienen el mismo índice de refracción, el grosor del cubreobjetos deja de ser un factor limitante de la calidad de la imagen. El sistema óptico del microscopio está formado por lentes compuestas, en las cuales los defectos o aberraciones están reducidos al mínimo, a pesar de no existir lente perfecta. De acuerdo con la calidad deseada del microscopio, los fabricantes pueden suministrar lentes con diversos grados de corrección de las aberraciones. En cuanto a objetivos, que poseen las lentes más complejas del microscopio, existen a la venta los siguientes tipos en el orden creciente de su perfección óptica: objetivos acromáticos, neofluares, planoacromáticos, apocromáticos y planoapocromáticos. Los acromáticos son los más usados, ya que presentan corrección suficiente para la microscopía común, a precio relativamente bajo.

Ilustración anexa A. Dos microfotografías obtenidas del mismo campo de observación y con el mismo aumento, pero con objetivos de AN diferentes. A la izquierda, objetivo de AN = 0,22. A la derecha, objetivo AN = 1. Próstata de perro. Obsérvese que la figura de la derecha es mucho más nítida. Tricrómico de Masson (x 320).

Ilustración anexa B. Grabado que ilustra un objetivo de x 25, planoacromático. AN = 0,45, construida para un tubo de 160 mm y para cubreobjetos de 0,17 mm de espesor.

► Microscopio de polarización. Cuando la luz atraviesa ciertas sustancias o tejidos de nuestro cuerpo, sufre un desdoblamiento tal que de un solo rayo luminoso a la entrada, resultan dos rayos llamados polarizados. Tal capacidad se debe a que esas sustancias poseen una ordenación interna y periódica de sus átomos. Sea o no aparente esta ordenación, se dice que tales cuerpos tienen estado cristalino. Por el contrario, las sustancias que no pertenecen a este grupo se llaman amorfas. La velocidad a la que se propaga la luz en estos cuerpos amorfos, también llamados isótropos o monorrefringentes, es siempre igual, independientemente de la dirección que siga dentro de ellos. Así pues, el cuerpo tiene un

único índice de refracción.

En los cuerpos cristalinos o anisótropos o birrefringentes, la velocidad de la luz varía según la dirección de propagación, lo que da lugar al fenómeno conocido por el nombre de doble refracción. De un único rayo luminoso resultan dos rayos refractados, que son polarizados rectilíneamente: esto es, la dirección de la vibración de la luz pasa a seguir una dirección determinada. La calcita o espato de Islandia posee en alto grado esa propiedad de birrefringencia. El uso de un haz de luz polarizada permite el estudio de determinados aspectos de la organización molecular de los componentes celulares. Al atravesar la célula, el haz de luz puede pasar a través de estructuras cristalinas o formadas por moléculas alargadas y paralelas, que dividen el

haz polarizado en dos, cuyos planos son perpendiculares. Estas estructuras se denominan anisotrópicas y son birrefringentes, ya que tienen dos índices de refracción diferentes, de acuerdo a la incidencia de la luz. Las estructuras celulares que no tienen esta organización no modifican el plano de polarización de la luz, y son llamadas isotrópicas. La microscopía de polarización utiliza las propiedades del rayo extraordinario, eliminándose el rayo ordinario. Esto se consigue por el empleo de un romboedro de espato de Islandia obtenido por fisuración v que se conoce con el nombre de nicol. Este prisma deja pasar solamente la luz polarizada rectilíneamente, eliminando el rayo ordinario por reflexión total. Actualmente se utilizan de preferencia películas polaroides, que contienen compuestos orgánicos especiales y orientados de forma que la vibración ordinaria es absorbida completamente, proporcionando un campo uniforme y superior al del nicol. Si esa luz polarizada es recibida en otro nicol o polaroide semejante al primero, no pasa cuando las secciones principales de los dos nicoles o polaroides están cruzadas, es decir, forman entre sí un ángulo recto. En cualquier otra posición, la luz reaparece con mayor o menor intensidad. Principio del microscopio de polarización El microscopio de polarización es un microscopio compuesto de una platina rotatoria a la que se han añadido dos polarizadores: uno localizado debajo de la platina (polarizador) y el otro, encima de ella, junto al ocular (anali-

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zador). Este microscopio es semejante al microscópio óptico común (véase ilustración anexa C y figuras).

Polarizador y analizador están colocados de tal manera que sus secciones principales están cruzadas, o sea, se cortan perpendicularmente. En estas condiciones el observador no ve ninguna luz en el ocular. Cuando se coloca en la platina un cuerpo amorfo, esta situación no se altera porque la luz no sufre modificación. Lo contrario ocurre cuando observamos un cuerpo cristalino o birrefringente. Entonces, y según la orientación de ese cuerpo en la platina, la luz brilla con mayor o menor intensidad. El microscopio de polarización sirve, pues, para distinguir las sustancias monorrefringentes de las birrefringentes. Además, permite conocer la ordenación interna de las sustancias birrefringentes, su orientación en escala submicroscópica. A pesar de que las birrefringencias observadas en biología son débiles, pueden estudiarse perfectamente estructuras duras de tipo cristalino o semi-cristalino, como el tejido óseo, dientes, cutículas de los invertebrados, formaciones celulósicas —como madera o cáscara de semillas—, estructu-

ras de simetría lineal —como las fibras colágenas—, fibras musculares, fibras nerviosas, fibrillas intracitoplasmáticas, cilios, flagelos y estructuras de simetría radial, como los granos de almidón y las gotitas lipídicas. El microscopio de polarización es similar al microscopio óptico común, como se mencionó antes, además de dos prismas o dos discos polaroides. Uno de esos elementos se coloca en el condensador y funciona como polarizador; el otro se coloca en el ocular y se llama analizador. La función del polarizador es iluminar la célula con un haz de luz polarizada. El analizador comprueba el efecto de las estructuras celulares en el haz polarizado. Cuando el polarizador y el analizador están con sus planos de polarización perpendiculares (cruzados), solamente las estructuras birrefringentes o anisotrópicas se pueden ver. Esto se debe a que ellas dividen el haz polarizado en dos; uno de ellos es absorbido por el analizador, pero el otro, perpendicular al primero, pasa a través del analizador y forma la imagen. Las estructuras isotrópicas no son observadas, ya que no desvían el plano de polarización de la luz, y el haz que pasa a través del polarizador llega sin cambios al analizador, en el cual es retenido.

Ilustración anexa C. Fotos de microscopios de polarización en las cuales se señalan sus partes. Aprecie bien el analizador y el polarizador. Tomadas de http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_3.htm

Figura 6-16 Figura 6-18 Figura 6-16.-Micrografía de cartílago hialino visto con luz polarizada en donde se aprecia la birrefringencia del colágeno que forma parte del pericondrio, correspondiendo a las estructuras rosadas brillantes. Tomado de Laboratorio de Investigaciones Histológicas Aplicadas. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe, Argentina (103). Figura 6-18. Micrografía de luz polarizada de fibrocélulas musculares estriadas en la cual se aprecia el patrón de bandas y estriaciones transversales. Tomado de Junquei ra y Carneiro (2005) (105). Fuente: http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_3.htm

► Microscopio de contraste de fase. Este microscopio está equipado con un sistema óptico especial que convierte las diferencias de fase de los rayos luminosos en diferencias de intensidad. Por lo tanto, las diferencias de fase, para las que el ojo no es sensible, se hacen visibles, porque se transforman en diferencias de intensidad luminosa, fácilmente perceptibles (Figura 2.7). El microscopio de contraste de fase se puede utilizar para que las estructuras celulares aparezcan oscuras (fase positiva) o claras (fase negativa) - comparar la figura 2.7 C y D. La velocidad de la luz al atravesar un cuerpo, y el índice de refracción de este dependen de la cantidad de materia presente, es decir, la densidad corporal. Cuanto mayor es la densidad, menor es la velocidad de la luz en el interior del cuerpo; menor será también el índice de refracción. Las diversas estructuras celulares tienen diversas cantidades de materia y causan diferentes retrasos en la luz que las atraviesa. Esto se traduce en diferencias de fase en la luz emergente, que, por interferencia, son transformadas en diferencias de amplitud, ocasionando diferencias en la intensidad luminosa, para las cuales la retina es sensible. La microscopía de contraste de fase se utiliza en particular para el estudio de las células vivas. Es útil para la observación de las células cultivadas, cuyo crecimiento y división mitótica pueden ser fácilmente seguidos sin el uso de colorantes. El microscopio ideado por Normaski es un tipo de microscopio de contraste de fase, que trabaja utilizando luz polarizada. Como en el microscopio de fase común, las estructuras celulares se hacen visibles debido a la interferencia de los rayos luminosos emergentes (Figura 2.7 B). 1El estudio microscópico de las células vivas es muy difícil ya que sus componentes, con raras excepciones, son incoloros y transparentes. El microscopio de contraste de fase representa un gran paso en el desarrollo de la técnica histológica, ya que permite el estudio de muchos detalles celulares in vivo. En general se utiliza en combinación con las técnicas del cultivo de células y tejidos, y también para el examen de células recientemente extraídas de animales vivos o también de material fijado, pero sin colorear. La velocidad con que la luz atraviesa un cuerpo transparente depende de la cantidad de material presente y determina el índice de refracción de este cuerpo. Cuanto mayor es la densidad, mayor es el índice de refracción y menor la velocidad de la luz en el

cuerpo. Dado que las diversas estructuras celulares tienen un índice de refracción diferente, causan diversos atrasos en las ondas luminosas que las atraviesan, dando origen a diferencias de fase entre las ondas luminosas emergentes, pero esas diferencias no son visibles. En el microscopio de contraste de fase existen dispositivos especiales que transforman estas diferencias de fase en diferencias de amplitud, produciendo en consecuencia diferencias de intensidad luminosa, para las cuales la.retina es sensible. 1 Fuente: Información extraida del libro .L.C. Junqueira, J.Carneiro Histología Básica 3° edición española correspondiente a la 6° edición de la obra original brasileña del mismo nombre. SALVAT editores. ► Microscopio confocal. Las células aisladas y los cortes de tejido son más gruesos que el plano focal del microscopio óptico. En la práctica, los portaobjetos son examinados utilizando el artificio de variar el plano de enfoque a través de la perilla del micrómetro del microscopio, lo que modifica la distancia entre las células y la lente del objetivo. Con el movimiento de la perilla del micrómetro, un plano de la célula entra en foco mientras que los otros planos quedan fuera de foco. Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de proporcionar un plano de la imagen enfocada que pierde nitidez debido a la interferencia de los rayos luminosos que pasan a través de los planos fuera de foco. De hecho, se forma una imagen nítida del plano enfocado, y simultáneamente, a esta imagen se le se superpone la imagen "borrada" de los otros planos de la célula. El microscopio confocal (Figura 2.8) resuelve este inconveniente del microscopio óptico común. En el microscopio confocal, la iluminación se realiza mediante un delgado rayo láser, que escanea el corte iluminando solamente, punto por punto, un determinado plano de la célula, realizando un verdadero "corte óptico". La imagen se forma exclusivamente por las estructuras que se encuentran en el plano de exploración escaneado sin que los componentes celulares ubicados en otros planos contribuyan a la formación de la imagen. No sólo la imagen es muy nítida, así como la célula puede ser "cortada" durante la microscopía, y los "cortes" obtenidos pueden ser utilizados de varias maneras. Generalmente, las células se someten a un compuesto fluorescente y la luz emitida se procesa en un ordenador, que envía las señales para la formación de la imagen en la

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pantalla de un monitor de vídeo. Las imágenes de los "cortes ópticos" así obtenidos se pueden almacenar en el disco del ordenador y ser utilizadas para construir una imagen tridimensional o para los cálculos de longitud,

área, volumen y otros análisis, de acuerdo con el propósito del estudio. Una vez digitalizadas, las imágenes se pueden almacenar para estudios posteriores.

Figura 2.7 Comparación entre el microscopio óptico y tres tipos de microscopía de interferencia (contraste de fases) en la observación de una célula epitelial sin tinción. A. Microscopio óptico. B. Microscopía de interferencia según Normasky. C. Microscopio de contraste de fases, con fase positiva. D. Microscopía de contraste de fase con fase negativa. (Las microfotografías fueron amablemente proporcionadas por el profesor Raúl Machado.)

EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO PERMITIÓ LA VISUALIZACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES QUE NO SON VISIBLES AL MICROSCOPIO ÓPTICO POR CONTAR CON UN PODER RESOLUTIVO MUCHO MAYOR La capacidad resolutiva de cualquier microscopio está limitada por la longitud de onda de la radiación empleada. La radiación visible permite distinguir detalles de 0,2 µm; Sin embargo, la forma de los objetos más pequeños no son visibles. Recientemente, el microscopio electrónico se ha mejorado (Figura 2.9); este emplea haces de electrones, que acelerados por una diferencia de potencial de 60.000 voltios, tienen una longitud de onda de 0,005 nm. Por el momento, no se puede disfrutar plenamente de la capacidad resolutiva de los mejores microscopios electrónicos debido a las dificultades en la preservación de las células y, especialmente, en la obtención de cortes muy finos, esenciales para la máxima resolución. Los componentes del microscopio electrónico, representados esquemáticamente, se asemejan a un microscopio óptico (Figura 2.10). Los electrones se producen debido al calentamiento en el vacío, de un filamento de tungsteno - cátodo - que emite electrones. Estas partículas se aceleran debido a una diferencia de potencial de 60-100 kV existente entre el cátodo y el ánodo. Este último, es una placa perforada en el centro y sólo permite el paso de una parte de los electrones que forman un haz. Los electrones pasan a través de una bobina o lente magnética, también llamada condensador, que los dirigirá en forma de un haz uniforme hacia el objeto. Después de atravesar el objeto en el que se desvían muchos electrones, el haz pasa a través de otra bobina, la que equivale al objetivo del microscopio óptico. Finalmente, una tercera bobina proyecta los electrones sobre una pantalla fluorescente - en la que forman una imagen visible - o sobre una película fotográfica. Los electrones desviados por ciertas estructuras de las células en estudio no contribuirán a formar la imagen. Estas estructuras aparecen oscuras y son llamadas electrondensas. Los componentes de la célula que desvían un pequeño porcentaje de los electrones aparecen en varios tonos de gris. La pantalla fluorescente donde se forma la imagen es una placa recubierta con ZnS (sulfuro de cinc), una sustancia que emite luz cuando es excitada por los electrones. En la práctica, las observaciones más cuidadosas se hacen en las micrografías obtenidas mediante la retirada de la pantalla del trayecto de los electrones, los cuales incidirán en una película fotográfica. Como las emulsiones fotográficas son sensibles a los electrones, estas registran la imagen proporcionada por el aparato.

Después de reveladas, las películas fotográficas son ampliadas 2-4 veces y las micrografías podrán ser examinadas con facilidad. La pantalla fluorescente, formada por partículas relativamente gruesas, emite poca luz con respecto a los electrones que recibe y proporciona una imagen menos contrastada que la imagen obtenida en las ampliaciones fotográficas; por lo tanto, los estudios de microscopia electrónica se realizan principalmente en las ampliaciones hechas en papel fotográfico, en lugar de hacerlo directamente en el microscopio electrónico. En el microscopio electrónico, todo el trayecto de los electrones se realiza en el vacío, una condición necesaria para la obtención de un haz de electrones, que serían desviados al colisionar con los átomos del aire; por esto, no se puede examinar células vivas, únicamente células fijadas y completamente secas. Sin embargo, hay aparatos que se usan en condiciones de bajo vacío, que pueden ser utilizados para examinar material que contiene agua, aunque sin ser capaces de obtener la buena resolución proporcionada por el microscopio electrónico común, que es de alto vacío. La preparación de las células para la microscopía electrónica requiere un cuidado muy especial. La fijación se realiza generalmente en solución de glutaraldehído tamponada a pH 7,2. También se utiliza la fijación en solución de tetróxido de osmio. Muy a menudo, estos dos fijadores se utilizan en secuencia: primero el tejido se fija en glutaraldehído y luego en tetróxido de osmio. El osmio, aparte de fijador, actúa como contraste, por ser un elemento de número másico elevado, que desvía los electrones. Las estructuras que se combinan con el osmio se ven oscuras. Además del osmio, se emplean otros átomos para fijar y aumentar el contraste entre los componentes celulares. Después de la fijación con glutaraldehído, seguido de la fijación con osmio, también se puede hacer pasar las células a través de soluciones de sales de uranio o plomo. Como las diversas estructuras celulares tienen diferentes afinidades por estos metales, mejora el contraste cuando se utiliza más de uno de estos metales. Debido al débil poder de penetración de los haces de electrones utilizados en los microscopios electrónicos, las células deben ser cortadas con un espesor de 20 a 100 nm. Para esto, se requiere la inclusión en una resina epoxi. Los cortes se realizan en micrótomos especiales (ultramicrótomos), que usan cuchillas de vidrio fracturado o cuchillas de diamante (Figura 2.11). Aparte del método de contraste con metales que se unen a los tejidos, llamados medio de contraste o coloración positiva, se usa también la llamada coloración negativa (Figura 2.12). En la coloración negativa, las

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células, los orgánulos aislados o los virus son sumergidos en soluciones que contienen átomos que desvían los electrones y luego son examinados en el microscopio electrónico. El colorante negativo queda entre las estructuras y penetra en sus depresiones y orificios, por lo que al microscopio, la estructura aparece clara, rodeada por un material electrondenso que es el colorante. Esta técnica es ampliamente utilizada en el estudio de

virus y orgánulos aislados. En ciertos casos, en particular en el estudio de virus también se utiliza la técnica de sombreado, en la que se hace la vaporización de un metal sobre una estructura, de acuerdo con un ángulo (Figura 2.13). Como sólo un lado de la estructura está cubierto por la capa de metal que se deposita durante el proceso, su forma aparece en relieve.

Figura 2.8 Microscopio confocal Zeiss. (Reproducido por cortesía del fabricante.) Figura 2.9 Microscopio electrónico, modelo EM910 de la compañía Carl Zeiss. (Cortesía del fabricante.)

Figura 2.10 Figura 2.11 Figura 2.10 Trayecto de los electrones en el microscopio electrónico. El corte de tejido se coloca justo encima de la bobina o lente del objetivo. La imagen, ya aumentada por el objetivo, es ampliadamente nuevamente por otra bobina, que la proyecta en una pantalla fluorescente. Partes: Filamento, Ánodo, Condensador, Objetivo, Proyector, Pantalla fluorescente. Figura 2.11 Algunas etapas de la obtención de los cortes para la microscopía electrónica. Los tejidos son incluidos en bloques de resina epoxi. A. Se observa el soporte del ultramicrótomo con el bloque a cortar y la cuchilla de cristal. Sujetado a la cuchilla, existe un pequeño recipiente con agua en el que se recogerán los cortes. B. Los cortes se recogen en una pantalla de 3 mm de diámetro, accionada por medio de una abrazadera. C. Aparece la pantalla con los cortes. Esta pantalla se somete a una solución de sales de uranio y de plomo, que impregnan los componentes celulares, aumentando su contraste. Entonces la pantalla es llevada al microscopio electrónico. Traducción del texto de la imagen: A. Soporte del micrótomo, Tejido incluido en la resina, Cinta de cortes flotando en el agua, Cuchilla de cristal, Borde cortante. Durante la microtomía, al subir, el soporte avanza de 50 a 100 nm y, al bajar, deja un corte flotando en el agua. B. Los cortes son retirados del agua con la ayuda de una pantalla metálica y luego se secan. C. Aspectos de los cortes sujetados a la pantalla y listos para ser “teñidos” y observados en el microscopio electrónico.

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Figura 2.12 Figura 2.13 Figura 2.12 Esquema de la técnica de coloración negativa aplicada a la demostración del bacteriófago (virus de bacteria) en este ejemplo. Con la ayuda de una pipeta se coloca sobre un soporte adecuado, una solución de ácido fosfotúngstico que contiene bacteriófagos en suspensión (A 1 y A2). Después del secado (B1 y B2), el ácido fosfotúngstico, que desvía la trayectoria de los electrones, se acumula alrededor de los bacteriófagos. En el microscopio electrónico, los bacteriófagos aparecen claros contra un fondo oscuro. Figura 2.13 La técnica de sombreado consiste en la deposición de una capa fina de metal (oro, cromo, uranio) en la célula bajo estudio. A. El metal se evapora en el vacío y debe cubrir de forma oblicua sobre la muestra. B. Aspecto observado en el microscopio electrónico.

► Microscopio electrónico de barrido. Al igual que el microscopio electrónico de transmisión, el microscopio electrónico de barrido o scanning electron microscope también utiliza un haz de electrones. Pero a partir de aquí, ellos tienen poco en común y, de hecho, son aparatos complementarios. El microscopio electrónico de transmisión tiene un poder de resolución mucho más alto, mientras que el de barrido tiene la ventaja de proporcionar imágenes tridimensionales, mediante el examen de las superficies de las estructuras. Básicamente, el microscopio electrónico de barrido (Figura 2.14) se compone de un sistema similar al microscopio electrónico de transmisión, ya que produce un haz de electrones delgado cuyo diámetro puede ser modificado. El trayecto del haz de electrones es, de inmediato, modificado por un conjunto de bobinas de deflexión que lo hacen recorrer la muestra punto por punto y a lo largo de líneas paralelas (barrido). Al llegar a la muestra, los electrones causan muchos efectos, incluyendo la emisión de electrones secundarios por parte de la misma muestra. Los electrones secundarios son recogidos por un colector, pasan por un sistema de amplificación y son transformados en puntos de mayor o menor luminosidad en un monitor de video. Las micrografías se obtienen por la fotografía de la imagen en la pantalla del monitor, y no por la acción de los propios electrones sobre una película fotográfica, como ocurre en el microscopio electrónico de transmisión. Generalmente, las muestras no necesitan ser cortadas para ser examinados en un microscopio electrónico de barrido. Objetos de 1 cm o más pueden ser examinados enteros. En la biología celular, el microscopio de barrido ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la superficie de las células mantenidas en cultivo. El material a estudiar, después de la fijación con glutaraldehído u otro fijador, es cuidadosamente secado y cubierto por una capa delgada conductora de la electricidad – generalmente de oro o platino depositados al vacío – y está listo para ser examinado en el aparato. Figura 2.14 Esquema general del microscopio electrónico de barrido. En la parte inferior de la unidad se encuentran las bombas de vacío porque la columna atravesada por los electrones debe mantenerse a alto vacío.

CITOQUÍMICA: INCLUYE DIVERSAS TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y LA LOCALIZACIÓN DE LAS MOLÉCULAS QUE FORMAN PARTE DE LAS CÉLULAS La citoquímica estudia la localización intracelular de las diversas sustancias que componen las células. Los preparados de la técnica citoquímica pueden ser examinados en el microscopio óptico y en el microscopio electrónico. En el primer caso, el producto de la reacción citoquímica se debe colorear y en el segundo, se debe dispersar los electrones, es decir, presentar "densidad a los electrones". Algunas reacciones citoquímicas siguen la ley de Lambert-Beer, es decir, producen en las células y en los tejidos una intensidad de color proporcional a la concentración de la sustancia en estudio. En tales casos, se puede utilizar un dispositivo llamado histofotómetro o citofotómetro, que determina la intensidad del color producido midiendo, de este modo, la cantidad de sustancia analizada. ►Ácido desoxirribonucleico. El ADN (o DNA, en inglés) se demuestra citoquímicamente con la reacción de Feulgen, una técnica que consiste en dos etapas. En la primera, se sumerge la cuchilla con los cortes de tejido en solución de ácido clorhídrico caliente, que promueve la hidrólisis de bases de purina, dejando libre los extremos de la desoxirribosa, que contienen radicales aldehídos libres. En el segundo paso, este ADN con radicales aldehídicos libres, a su vez, cuando está en presencia del reactivo de Schiff, se combina con los grupos aldehído de la desoxirribosa, forman un compuesto de adición insoluble y rojo. El reactivo de Schiff es una fucsina básica decolorada por el anhídrido sulfuroso. La reacción de Feulgen es específica para el ADN, y como la intensidad del

color rojo formado es proporcional a la concentración de ADN, permite el estudio cuantitativo de este ácido nucleico. A través de este proceso, se encontró que la cantidad de ADN es fija para cada especie y se duplica en la interfase, de modo que al entrar en la profase, la célula ya contiene una cantidad doble de ADN. ► Ácido ribonucleico. El estudio citoquímico del ARN se basa en su basofilia y las propiedades de la enzima ribonucleasa que ataca exclusivamente al ARN. Se hacen dos preparaciones, una de las cuales es digerida por la ribonucleasa. Después, las preparaciones se tratan con un colorante básico, tal como el azul de toluidina. Por ser fuertemente basófilo, el ARN aparece coloreado. Mediante la comparación de los dos preparados bajo un microscopio, se hace posible detectar el ARN, ya que este sólo aparecerá coloreado en el preparado que no ha sido digerido por la ribonucleasa. ► Catecolaminas. El formaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo compuestos fluorescentes. Por lo tanto, es posible la ubicación citoquímica de las catecolaminas epinefrina y norepinefrina (Figura 2.15). ►Proteínas. Las reacciones para la demostración de las proteínas totales de las células se basan en técnicas que identifican aminoácidos. Entre estas técnicas están la de Millon para la tirosina; la del diaminoazobenceno para el triptófano; y la de Sakaguchi para arginina. Las diversas proteínas celulares están constituidas por los mismos aminoácidos; por esto, las técnicas basadas en la identificación de los aminoácidos no permiten individualizar las proteínas, lo que se puede hacer con métodos de inmunocitoquímica (véase más adelante en este capítulo).

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► Polisacáridos. Un ejemplo es la técnica para evidenciar el glucógeno, que puede ser evidenciado por la reacción del ácido periódicoSchiff, universalmente conocido por la abreviatura PAS (Periodic AcidSchiff). Como se muestra en la figura 2.16, esta reacción química se basa en la acción oxidante que el ácido periódico ejerce sobre los grupos 1-2 glicol produciendo grupos aldehídos por su acción oxidante. Estos grupos, como en el caso de la reacción de Feulgen, reaccionan a su vez con la fucsina decolorada (reacitvo de Schiff), dando un compuesto de adición coloreado e insoluble. Como se explicó anteriormente, el reactivo de Schiff es fucsina básica decolorada por el anhídrido sulfuroso. La Figura 2.15 Glándula salival de mono tití. Método de Falck e Hillarp para la demostración de catecolaminas por fluorescencia. reacción no es específica para el Fibras nerviosas que contienen epinefrina (adrenérgicas) aparecen fluorescentes y situadas alrededor de las unidades secretoras. glucógeno, por tanto, se usa un Los conductos (d) están desprovistos de inervación. Aumento: 280 x (Cortesía de la Dra. Conceição Machado.) artificio para poder demostrarlo. Dado que existen en la célula otros componentes que reaccionan con el reactivo de Schiff, la especificidad de la reacción se obtiene tratando un corte previamente con una enzima glucogenolítica. En la práctica se usa la enzima alfa-amilasa para este fin. Las estructuras que en Figura 2.16 Reacción del ácido periódico y el reactivo de Schiff (reacción PAS). Fb, fucsina básica. los cortes se tiñen con PAS, pero dejan de hacerlo después del tratamiento glucogenolítico, se considera que contienen glucógeno. De este modo se demuestra la presencia de este compúesto en los tejidos y en las células. ► Enzimas. Muchas enzimas se pueden estudiar mediante técnicas Inmunocitoquímica citoquímicas. En los casos en que las enzimas son lábiles, se utilizan cortes Ciertos aminoácidos pueden identificarse mediante las técnicas citoquímide tejido congelado, no fijado. Las fosfatasas y las deshidrogenasas son cas convencionales ya descritas en este capítulo. Pero estas técnicas no ejemplos de enzimas demostrables citoquímicamente. permiten la identificación de proteínas específicas lo que puede realizarse Las deshidrogenasas son enzimas que captan el hidrógeno de un sustrato, mediante la técnica inmunocitoquímica. Esta técnica se basa en el siguiente hecho: cuando una macromolécula extraña denominada antígeno, se transfiriéndolo a otro compuesto. Existen muchas deshidrogenasas diferentes en nuestro organismo y, obviamente, en las distintas células que lo introduce en un organismo, éste generalmente reacciona, produciendo una componen, que se distinguen por la naturaleza del sustrato sobre el cual proteína llamada anticuerpo, que, a su vez, reacciona específicamente con actúan. Se llama sustrato al compuesto atacado por la enzima. La demosel antígeno. Los anticuerpos son proteínas pertenecientes al grupo de las tración citoquímica de las deshidrogenasas se lleva a cabo incubando gammaglobulinas (un tipo de proteína del plasma sanguíneo) y aparecen en el plasma cierto tiempo después de la toma del antígeno. cortes de tejido fresco (no fijado) en un sustrato adecuado, junto con un compuesto químico soluble y débilmente coloreado del tipo tetrazol. Bajo la La técnica de la inmunofluorescencia se basa también en la posibilidad de acción de la enzima, el sustrato cede hidrógeno, que a su vez es transferiacoplar sustancias fluorescentes a antígenos y anticuerpos sin que éstos do al tetrazol, reduciéndolo a un compuesto intesamente coloreado e pierdan la capacidad de reaccionar entre sí. Este principio se aplica básiinsoluble, llamado formazán, que precipita en el sitio de la actividad enzicamente de dos maneras, denominadas técnica directa e indirecta de inmunocitoquímica. mática. De este modo, la coloración aparece en los sitios de la célula que ► Inmunocitoquímica directa. Supongamos que de un determinado tiene la deshidrogenasa específica para el sustrato usado en el medio en el que se incubó el tejido. órgano de ratón (o de otro animal) se pueda extraer y purificar químicaLas fosfatasas ácidas son enzimas que hidrolizan ésteres de ácido fosfórico mente una proteína, que vamos a llamar proteína X (o antígeno). Querea pH ácido. Existen varias técnicas para la demostración de estas enzimas. mos saber en qué célula, en cual parte de la célula, o en cual estructura Una de las técnicas utilizadas para demostrar la actividad de la fosfatasa del órgano está localizada, ya que la extracción se efectuaría a partir del ácida (método de Gomori) consiste en incubar cortes de tejidos fijados en órgano entero. formol en una solución que contenga glicerofosfato de sodio y nitrato de Inyectando la proteína X a un conejo, éste formará un tipo de gammagloplomo en solución tampón a un pH 5. Por acción de la enzima se produce bulina (o anticuerpo) con la propiedad de combinarse específicamente con la hidrólisis del glicerofosfato, con liberación de iones fosfato, los cuales ella, pero no con las otras proteínas. De la sangre del conejo se puede reaccionan con nitrato de plomo formando fosfato de plomo insoluble, que extraer y purificar el anticuerpo contra la proteína X, pudiéndose unir se precipita en el lugar donde hay actividad enzimática. En una segunda químicamente este anticuerpo a un compuesto como la enzima peroxidasa, fase del método, se procede a una inmersión de los cortes en una solución que sirve como una marca (este proceso se conoce como marcación en de sulfito de amonio, que transforma el precipitado incoloro de fosfato de inmunología). La identificación citoquímica de la peroxidasa también plomo en un precipitado negro y electrondenso de sulfuro de plomo. Como identifica al anticuerpo ligado a la enzima peroxidasa. las sales de plomo son electrondensas, la reacción se puede observar en el Colocándose, sobre un corte del órgano de ratón que contiene la proteína microscopio electrónico. Esta técnica es muy utilizada para localizar y X, una solución de anticuerpo marcado con peroxidasa, habrá una combiestudiar los lisosomas – orgánulos ricos en enzimas hidrolíticas - entre las nación del antígeno (proteína X) con su anticuerpo (gammaglobulina antique se encuentran las fosfatasas ácidas. X) marcada con peroxidasa (Figura 2.17). El complejo antígeno-anticuerpo LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA SE APLICA GENERALMENque se forma no es visible al microscopio óptico o al electrónico, pero se TE A LAS TÉCNICAS CITOQUÍMICAS hará visible si la peroxidasa se evidencia con una reacción citoquímica Cuando son excitadas por ciertas longitudes de onda, algunas sustancias apropiada. absorben energía y emiten luz de mayor longitud de onda. Estas sustancias Esta revelación se hace poniendo en el corte una sustancia que, bajo la se llaman fluorescentes y el fenómeno se denomina fluorescencia. En acción de la peroxidasa, forme un compuesto coloreado y electrondenso. microscopia se utiliza la excitación con radiación ultravioleta para que la En el ejemplo de la Figura 2.17, el compuesto sobre el cual actúa la perradiación emitida incida en la banda de la luz visible. oxidasa es la 3-3'-diaminobencidina; al ser atacada por la peroxidasa, la 3Compuestos fluorescentes 3'-diaminobencidina se transforma en un compuesto insoluble, marrón Algunos compuestos fluorescentes son constituyentes normales de las claro y electrondenso. células, como la vitamina A, la riboflavina (vitamina B2) y las porfirinas, En lugar de la peroxidasa se puede utilizar como un marcador, un colorancomo consecuencia, y pueden ser identificados y localizados por microscote fluorescente unido al anticuerpo (Figura 2.18). En este caso, el preparapía de fluorescencia. do obtenido por la acción del anticuerpo sobre el corte que contiene al Varios colorantes son fluorescentes y, teniendo afinidad por ciertos compoantígeno puede ser examinado inmediatamente bajo un microscopio de nentes celulares, son utilizados para su identificación. Uno de los coloranfluorescencia. Sin embargo, la peroxidasa permite una mejor localización tes fluorescentes más usado es el naranja de acridina que se une a los porque el corte se puede estudiar con el microscopio electrónico y el ácidos nucleicos. Visto al microscopio de fluorescencia, el complejo naranja antígeno localizado, con alta resolución, en los orgánulos celulares. de acridina-ADN emite fluorescencia verde amarillenta y el complejo Una tercera manera de marcar el anticuerpo consiste en su conjugación naranja de acridina-ARN emite fluorescencia roja amarillenta. Esto hace con ferritina. La ferritina, una proteína que, debido a su alto contenido en posible la identificación y localización de los dos tipos de ácidos nucleicos. hierro, es muy electrondensa, permite el estudio de la localización de Sin embargo, la principal aplicación de la microscopía de fluorescencia se proteínas (antígenos) en el microscopio electrónico. Esta marcación no produce en combinación con métodos inmunológicos, en las técnicas encaja en el estudio en el microscopio óptico. inmunocitoquímicas que utilizan anticuerpos conjugados con compuestos Recientemente, surgió la marcación con el complejo proteína A + oro fluorescentes y que se describirán a continuación. coloidal (Figuras 2.19 y 2.20). Esta técnica consiste en la adsorción, en las LA INMUNOCITOQUÍMICA LOCALIZA MOLÉCULAS PROTEICAS moléculas de proteína A, de partículas de oro, muy pequeñas (de 5 a 20 ESPECÍFICAS nm) y electrondensas (nanopartículas de oro coloidal). La proteína A se Las técnicas de inmunocitoquímica permiten el estudio de la localización extrae de las bacterias Staphylococcus aureus, la cual además de la afiniintracelular de varias proteínas específicas. Estas encuentran con dad por el oro coloidal tiene una afinidad por una región común a las precisión un tipo particular de molécula proteica, con exclusión de todas las moléculas de todos los anticuerpos (fragmento Fc). demás proteínas existentes en las células. Esta técnica tiene gran precisión para localizar moléculas proteicas y una Como la inmunocitoquímica se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, se gran resolución debido a que las partículas de oro coloidal son muy pequedebe estudiar antes algunos conceptos básicos de esta reacción, cuyo ñas. El proceso puede llevarse a cabo en tres pasos: estudio detallado pertenece al campo de la inmunología. Para mayor ■ Incubar el tejido a ser estudiado con el anticuerpo deseado y lavar; el aclaración del tema se deben consultar los textos sobre inmunología. anticuerpo se adhiere a la proteína

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■ Incubar el tejido en la solución de proteína A + oro coloidal y lavar ■ estudiar en el microscopio electrónico. La técnica directa de inmunocitoquímica no es muy sensible y por lo tanto

poco utilizada en la actualidad. Esta técnica fue descrita para facilitar la comprensión de la técnica indirecta, mucho más útil en la práctica debido a su alta sensibilidad.

Figura 2.18 Inmunocitoquímica directa con anticuerpo fluorescente. Figura 2.17

Figura 2.17 Técnica imunocitoquímica directa. El compuesto (precipitado) formado por la acción de la peroxidasa sobre la 3-3'-diaminobenzidina es de color marrón claro y electrondenso. Por esta razón, la técnica puede ser aplicada tanto a la microscopia óptica como a la electrónica.

Figura 2:19 Figura 2.20 Figura 2:19 Estos dibujos esquemáticos muestran los conceptos básicos de la técnica de inmunocitoquímica, empleando como marcador el complejo de proteína A (una proteína estafilocócica) y partículas de oro coloidal. Figura 2.20 Micrografía electrónica de un preparado total de la bacteria Haemophilus aegyptius, productora de la fiebre purpúrica brasileña. Nótense en la figura dos tipos de células, donde las células marcadas con estrellas muestran proyecciones filamentosas marcadas con el complejo proteína A-oro, unido a un antisuero policlonal anti-25 kD. La proteína 25-kD es una subunidad proteica de las fimbrias. La célula marcada con un asterisco no muestra proyecciones filamentosas. Se observa en algunas ocasiones, la disposición lineal (que muestra la estructura filamentosa de las fimbrias, flecha) de las partículas de oro electrondispersantes, que miden aproximadamente 5 nm de diámetro. Aumento: 63.000X. (Cortesía de la Dra. Hatune Tanaka del Instituto Adolfo Lutz, São Paulo).

► Inmunocitoquímica indirecta. En esta técnica, la marcación se coloca en un anti-anticuerpo, es decir, una anti-gammaglobulina. Por su mayor sensibilidad (Figura 2.21), para demostrar la existencia de una mínima cantidad de antígeno, la técnica indirecta es la más utilizada en la práctica. Los pasos de la técnica indirecta, que utiliza dos anticuerpos, se esquematizan en la Figura 2.22. Suponiendo que uno quiere saber la localización celular de la proteína Y, también contenida en un órgano de ratón, el primer paso, consiste en la colocación, en el corte de tejido, de una solución del anticuerpo (gammaglobulina) Anti-Y, obtenida por inyección de la proteína Y en un conejo. Habrá combinación de Y con su anti-

cuerpo. En el segundo paso, se coloca sobre el corte una solución de anticuerpo contra la gammaglobulina de conejo. Este anticuerpo, que es una antigammaglobulina y, por lo tanto, un anti-anticuerpo, puede obtenerse mediante la inyección de gammaglobulina de conejo en una oveja o en una cabra. Finalmente, se tendrá un complejo formado por la proteína Y, su anticuerpo y una anti-gammaglobulina. La anti-gammaglobulina puede ser detectada por la conjugación con sustancias fluorescentes (Figura 2.23), ferritina o peroxidasa, como se describió en la técnica directa.

Figura 2.21 Esquema para demostrar la mayor sensibilidad de la inmunocitoquímica indirecta. Con la técnica directa, este antígeno celular fijaría cuatro moléculas de anticuerpo; con la técnica indirecta, este fijó 20 moléculas de antigammaglobulina.

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Figura 2.22 Esquema demostrativo de las etapas de la técnica de inmunocitoquímica indirecta. En la etapa 1, el antígeno cuya ubicación se desea determinar se combina con un anticuerpo específico para formar un complejo que no es visible ni en el microscopio óptico ni en el electrónico. El objetivo de las etapas siguientes es hacer visible este complejo. En la etapa 2, se añade antigammaglobulina marcada con peroxidasa al complejo ya formado. En la etapa 3, mediante la técnica citoquímica para la peroxidasa, se forma un precipitado visible en los microscopio óptico y electrónico, revelando así la ubicación donde el antígeno está presente cuya ubicación se deseaba conocer.

Figura 2.23 Ejemplos de la técnica inmunocitoquímica indirecta. A. Células hipofisiarias que producen la hormona luteinizante. Microfotografia obtenida con el microscopio óptico. Aumento: 500x. (Cortesía del Dr. Flávio Fava de Moraes y el Dr. Burton R. Baker.) B. Células de la glándula tiroides. Microfotografía obtenida con el microscopio de fluorescencia. Aumento: 400x. (Cortesía del Dr. Mário Camargo.)

LAS MACROMOLÉCULAS TALES COMO LAS PROTEÍNAS, EL ADN Y EL ARN PUEDEN SER AISLADAS POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Las proteínas y los ácidos nucleicos aislados de las células a menudo se separan mediante la técnica de cromatografía en columna. Esta técnica se basa en el hecho de que, al hacer una mezcla de proteínas disueltas en agua, y se la hace pasar a través de una columna constituida por una matriz sólida, porosa contenida en un tubo de vidrio, la velocidad de migración de las diferentes proteínas varían de acuerdo con la interacción de cada una de ellas con la matriz. Mandándose un flujo continuo de proteínas, que sale por la parte inferior de la columna, se pueden recoger por separado las proteínas contenidas en la muestra inicial. En cromatografía, la matriz de la columna, está fija, y se la llama fase estacionaria; existe la llamada fase móvil que eluye o corre por la columna para facilitar la separación de las sustancias. La fase móvil no debe tener afinidad con la fase estacionaria, de esta manera, se deja a las sustancias en estudio que se separan de acuerdo con sus afinidades con la fase estacionaria. Las afinidades están dadas por el grado de interacción que tienen las moléculas a separar con las moléculas de la matriz pegada a las paredes de la columna cromatográfica (fase estacionaria). Asimismo, la fase móvil puede ser líquida o gaseosa. El grado y tipo de interacción de las proteínas con la matriz de la columna pueden ser de naturaleza variable, a saber: ■ Interacción de intercambio iónico: en el que la matriz está constituida por partículas con una carga positiva o negativa y en el que la separación de las proteínas depende de las cargas eléctricas en la superficie de sus moléculas ■ Interacciones hidrofóbicas: las partículas de la matriz tienen una superficie hidrófoba, lo que retarda la migración de las proteínas hidrófobas que tienen afinidad por las partículas de la matriz ■ Filtración en gel: En este caso, la matriz sólo actúa como un tamiz, en donde las proteínas migran con velocidad variable, dependiendo del tamaño y la forma de sus moléculas ■ Interacción de afinidad: muchas moléculas biológicas interactúan con alta especificidad, como ocurre entre las enzimas y sus sustratos, entre determinados segmentos de ADN y ARN, y entre el anticuerpo y el antígeno. La técnica es, por ejemplo, utilizada comúnmente para la purificación de anticuerpos. En este procedimiento, las moléculas (anticuerpos) se unen a las partículas de la matriz que contienen el antígeno respectivo. Las otras proteínas pasan a través de la columna, pero los anticuerpos se unen a la matriz con alta especificidad y afinidad. Tras el paso de las otras proteínas, el anticuerpo es removido de la columna por medio de una solución apropiada. EL TAMAÑO DE LAS MOLÉCULAS PROTEICAS SE PUEDE DETERMINAR POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA La técnica de electroforesis en gel tiene diversas variantes, para aclarar diferentes problemas. Una de estas variantes se emplea para determinar el tamaño de las moléculas proteicas y consiste en la disolución de las proteínas en solución de dodecil sulfato de sodio (SDS). Este compuesto es un detergente fuerte, cuyas moléculas están cargadas negativamente. En presencia de un exceso de moléculas negativas de SDS, todas las moléculas proteicas también se convierten en negativas, porque todas las cargas positivas de las proteínas se neutralizan. Aparte de esto, se adiciona un agente reductor, generalmente mercaptoetanol, que rompe las uniones S-S (disulfuro) de las subunidades proteicas, destruyendo de esta manera la forma original de las moléculas proteicas, la cual puede ser muy compleja. Se coloca la mezcla de proteínas en el gel y sometiéndolo a un campo eléctrico, todas las moléculas proteicas migran hacia el polo positivo, y la

velocidad de esta migración dependerá exclusivamente del tamaño de la molécula de cada cadena polipeptídica, ya que todas las proteínas tienen una forma alargada. Gracias al SDS las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas. LA RADIOAUTOGRAFÍA ES MUY UTILIZADA PARA ESTUDIAR LOS SITIOS DE SÍNTESIS Y EL DESTINO DE LAS MACROMOLÉCULAS La radioautografía se puede aplicar como una técnica citoquímica para la detección de isótopos radiactivos. La radioautografía es una técnica que permite la localización de sustancias radiactivas en los tejidos y se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas. En esta técnica los cristales microscópicos de bromuro de plata presentes en la emulsión fotográfica actúan como microdetectores de la radiactividad. Los cristales que son alcanzados por la radiación se transforman en gránulos de plata metálica, que aparecen negros al microscopio denunciando la presencia de radiactividad en las estructuras con las cuales están en contacto. Dado que no hay átomos radiactivos en las células, dicho átomos pueden ser seguidos por radioautografía, la migración y la incorporación de compuestos radiactivos introducidos en las células con fines experimentales. Para obtener una radioautografía, un corte de órgano con el isótopo radiactivo inyectado previamente al animal se pone en contacto con una película de emulsión fotográfica. Después de cierto tiempo (período de exposición), se revela la película y los puntos negros que en ella aparecen corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo. Como la cantidad de gránulos de plata es proporcional a la radiactividad presente, ía radioautografía, además de localizar sustancias radiactivas, permite también la medida de su cantidad relativa. Por ejemplo, deseando saber qué células en un tejido son las que están sintetizando ADN, se inyecta en un animal un precursor de un ácido nucleico, la timidina marcada con tritio radiactivo (³H). La timidina será incorporada sólo en los núcleos de las células que están sintetizando ADN. Cubriendo los cortes de tejidos con una emulsión fotográfica, esta quedará impresionada por los núcleos de las células radiactivas (partículas beta emitidas por el tritio). Revelando la emulsión aparecen gránulos de plata metálica negra en la película correspondientes al núcleo de la célula cuyo ADN fue sintetizado con timidina-3H. Después de revelar la emulsión, las células pueden ser coloreadas para facilitar su estudio al microscopio. La emulsión fotográfica es básicamente una suspensión de microcristales de bromuro (u otro haluro) de plata sobre gelatina. Los cristales de bromuro de plata son los detectores de la radiactividad. La radioautografía se puede aplicar también al microscopio electrónico. El proceso es básicamente el mismo que el usado para el microscopio óptico; sin embargo, los gránulos de plata generalmente aparecen como filamentos serpenteantes debido a la mayor resolución del microscopio electrónico. De las diferentes técnicas radioautográficas, la más utilizada en biología celular es la técnica de emulsión líquida. Técnica de la emulsión líquida Para cubrir los cortes de tejidos con la emulsión fotográfica, se sumergen las preparaciones en la emulsión calentada y fundida. Después de retirar las láminas, queda sobre su superficie una fina película de emulsión. A continuación se secan y se guardan al abrigo de la luz, generalmente a baja temperatura. Finalmente pasan por un proceso de revelado semejante al usado para placas fotográficas; el corte se tiñe e inmediatamente se protege con un cubreobjetos a fin de ser observado al microscopio. Nótese

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que todo este proceso hasta el final del revelado debe realizarse en cámara oscura, iluminada sólo por la «luz de seguridad». Esta técnica se adaptó para ser empleada con el microscopio electrónico. En este caso, la emulsión se coloca sobre los cortes finos del material incluido por las resinas sintéticas, y sus gránulos de plata no aparecen globulosos, sino como filamentos, en forma de ovillo. Al microscopio óptico, esta técnica permite individualizar dos puntos radiactivos que estén separados 1 µm por lo menos; esta distancia corresponde a la resolución de la técnica. En microscopía electrónica esta resolución está aumentada de 5 a 10 veces. Esta técnica emplea emulsiones fotográficas especiales en la forma de un gel que se convierte en líquido a la temperatura de 45 °C. Los pasos son los siguientes (Figuras 2.24 y 2.25):

■ Sumergir la lámina que contiene las células radioactivas en la emulsión fundida a 45 °C ■ Remover con papel absorvente la emulsión de la parte trasera de la lámina y dejar secar a temperatura ambiente ■ Colocar los preparados en cajas al abrigo de la luz (cámara oscura), para el período de exposición durante el cual la radiación actuará sobre la emulsión ■ Después de la exposición, se revela la emulsión fotográfica, tratando la lámina como si fuera una pequeña placa fotográfica ■ A continuación, las células se tiñen y se examinan bajo el microscopio. Los gránulos negros de plata metálica indicarán las partes radiactivas de las células.

Se inyecta timidina-3H en un animal que será sacrificado una hora después. Las células que están sintetizando ADN incorporarán la timidina radiactiva inyectada.

Los tejidos son fijados, incluidos en parafina o resina, cortados en el micrótomo y adheridos en portaobjetos histológicos.

En el cuarto oscuro, la preparación es cubierta con una capa delgada de emulsión fotográfica y se almacena en la caja al abrigo de la luz por unos pocos días o meses para permitir que la radiactividad actúe en la emulsión (exposición).

Después de este período, la preparación se revela, apareciendo gránulos negros de plata sobre los núcleos radiactivos. Conclusión: De las tres células, solo una estaba sintetizando ADN en el momento de la inyección de timidina3 H.

El mismo proceso se puede realizar para la microscopía electrónica. En este caso, se debe incluir el tejido en resina, hacer cortes ultrafinos y colocarlos en las placas correspondientes, no en los portaobjetos. Debido a la gran resolución del microscopio electrónico, los granos de plata aparecen generalmente en forma de filamentos helicoidales, formando un ovillo.

Figura 2.25 Diagramas de las diferentes etapas de la técnica radioautográfica. Se toma como ejemplo el estudio de la síntesis de ADN mediante la inyección de timidina radiactiva.

Aplicaciones El método autorradiográfico ha sido ampliamente utilizado para el estudio de diversos e importantes fenómenos biológicos. Desde que se consiguió preparar artificialmente isótopos radiactivos de elementos químicos normalmente presentes en el organismo como el carbono ( 14C) y el hidrógeno (3H), fue posible marcar con estos átomos las moléculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De este modo no sólo se estudió la localización de los procesos metabólicos, sino también sus velocidades. Por ejemplo, la síntesis de proteínas puede ser estudiada por la inyección de aminoácidos marcados con l4C y 3H. Las moléculas que se formarán, mientras exista en el organismo el aminoácido marcado, quedarán radiactivas y podrán ser localizadas por la radioautografía. De modo similar se puede estudiar el metabolismo del ácido desoxirribonucleico (DNA), una vez que las células reciben timidina-3H que se incorpora en las moléculas de DNA. Varios procesos metabólicos fueron así estudiados, por ejemplo, la síntesis del DNA en el núcleo y en las mitocondrias, y la sulfa-

tación de glucoproteínas en el aparato de Golgi. La radioautografía se utiliza ampliamente para estudiar la síntesis de varias moléculas. Para esto, como en el caso del ADN mencionado anteriormente, se inyecta en un animal o se coloca en el medio de cultivo celular un precursor radiactivo de la sustancia en estudio. Para estudiar el ARN se puede utilizar adenina o uridina (Figura 2.26) y para el estudio de la síntesis y la migración de las proteínas, se utilizan aminoácidos. En general, las moléculas radiactivas utilizadas en estos experimentos están marcadas con hidrógeno (3H), carbono (14C) o azufre (35S). Estos tres isótopos emiten partículas beta (electrones) de débil poder de penetración, por lo que no causan daño a las células. Para estudiar el metabolismo normal, es preciso utilizar radiación débil para que no haya alteraciones en la función de las células por la radiación. Otros isótopos radiactivos también ampliamente utilizados en radioautografía son 131I, 125I y 32P.

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Figura 2.26 Células hepáticas incubadas durante 1 h en una solución nutritiva que contiene uridina-3H. Este nucleósido es utilizado por la célula para producir ARN. Tenga en cuenta el predominio de los granos de plata sobre el núcleo de la célula, lo que indica la síntesis de ARN. Tinción hematoxilina-eosina. Aumento: 1.500x.

POR CENTRIFUGACIÓN ES POSIBLE OBTENER ORGÁNULOS CELULARES EN ESTADO DE PUREZA Y LUEGO ESTUDIAR SUS PROPIEDADES QUÍMICAS, FÍSICAS Y BIOLÓGICAS Las técnicas que permiten el fraccionamiento celular y la obtención de fracciones relativamente puras de orgánulos contribuyeron mucho al desarrollo de la biología celular en los últimos años. El aislamiento de los componentes celulares por centrifugación representó un gran avance técnico y permitió el estudio minucioso de los siguientes componentes que han sido obtenidos en estado de relativa pureza: núcleo, nucléolo, mitocondrias, retículo endoplasmático granular, ribosomas, grânulos de secreción y grânulos de pigmento. Los orgánulos son separados por centrifugación de un homogeneizado de células en el que las membranas plasmáticas se rompen y los componentes celulares se dispersan en un medio líquido, que por lo general contiene sacarosa. Este disacárido es ampliamente utilizado debido a que mantiene la integridad de los componentes celulares y evita la tendencia de los orgánulos a coalescer cuando se rompen las células. La ruptura de las membranas plasmáticas para obtener el homogeneizado se hace generalmente por la acción mecánica de un pistón en un cilindro giratorio que contiene las células en la solución de sacarosa (Figura 2.27). También se puede hacer por medio de ultrasonidos o un dispositivo similar a una licuadora doméstica. Durante la homogeneización y las centrifugaciones que se siguen, la mayoría de los orgánulos mantiene su forma intacta. Sin embargo, el retículo endoplásmico se rompe, y como sus membranas tienden a soldarse, se forman vesículas lisas o granulares, dependiendo de si es el retículo endoplasmático liso (REL) o el rugoso (RER). Las vesículas formadas a partir de este último, cuya superficie está cargada de ribosomas, reciben la designación de microsomas. Por lo tanto, los microsomas son fragmentos del retículo endoplasmático rugoso. El aislamiento de un orgánulo mediante centrifugación depende de su coeficiente de sedimentación, es decir, su tamaño, su forma y densidad, así como de la densidad y la viscosidad de la solución en la que está siendo centrifugado. La separación de los componentes celulares por centrifugación se realiza generalmente mediante la técnica conocida como centrifugación fraccionada, o centrifugación diferencial, que consta de una serie de centrifugaciones a velocidades crecientes (Figura 2.27). Los orgánulos o inclusiones más grandes y más densas se asientan prime-

ro, y el sobrenadante de cada centrifugación se centrifuga de nuevo, pero con mayor velocidad. De este modo, los componentes celulares se separan sucesivamente, como se muestra en la Figura 2.27. Las fracciones preparadas de este modo a menudo contienen más de un componente celular, pero se pueden purificar mediante resuspensión y recentrifugación. Por ejemplo, la fracción de las mitocondrias a menudo contiene lisosomas y peroxisomas, pero los tres orgánulos se pueden separar por centrifugaciones adicionales. En general, el sobrenadante que permanece después de la última centrifugación se denomina fracción soluble. Otra técnica de fraccionamiento celular es la centrifugación contragradiente, donde las partículas se separan por sus diferencias de densidad. El gradiente consiste en una solución - que puede ser de sacarosa - cuya concentración es máxima en la parte profunda del tubo de centrífuga y mínima en la superficie. Existe, por lo tanto, en el tubo, un gradiente de densidad creciente de arriba a abajo. Inmediatamente después de que el gradiente se ha preparado, se coloca el homogeneizado sobre su superficie y se hace la centrifugación. Impulsadas por la fuerza centrífuga, las partículas penetran en el gradiente. Cada tipo de partícula en el sitio en la que existe un equilibrio entre la fuerza centrífuga de la partícula y la concentración del gradiente (Figura 2.28). Las fracciones obtenidas por cualquier técnica de fraccionamiento deben ser examinadas para el control de su pureza. Para este propósito, se puede emplear microscopios electrónicos y ópticos o métodos bioquímicos que demuestran en la fracción el predominio de un compuesto que le es característico; Por ejemplo, la fracción de los lisosomas tiene una cantidad muy alta de fosfatasa ácida, mientras que la fracción nuclear es muy rica en ADN. El control de la pureza de las fracciones obtenidas debe ser realizado al microscopio óptico (para núcleos, mitocondrias y gránulos de secreción), y en el microscopio electrónico (para ribosomas, microsomas, etc.) Una vez aislados, los orgánulos y las inclusiones pueden ser estudiados por diversos métodos. Su composición química puede ser determinada y su actividad metabólica estudiada fuera de la célula y, por tanto, en un medio estrictamente controlado. Una vez aislados, los orgánulos no están más sujetos a los mecanismos de control intracelulares, de modo que su funcionamiento puede ser probado por el experimentador con mayor libertad, aunque las condiciones sean artificiales, en comparación con el medio intracelular.

Figura 2.27

Figura 2.28 Centrifugación contra gradiente. A la izquierda, antes de la centrifugación, con la muestra colocada sobre el gradiente de concentración de sacarosa. A la derecha, después de la centrifugación, que muestra las capas, cada una de ellas conteniendo, generalmente, un tipo de orgánulo.

Figura 2.27 Esquema de la técnica de centrifugación diferencial. El sobrenadante de cada tubo es centrifugado nuevamente, cada vez con mayor fuerza centrífuga. Los dibujos de la derecha muestran los componentes celulares del sedimento de cada tubo. La fuerza centrífuga está representada por G; 1000 G significa 1000 veces la fuerza de la gravedad.

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ES POSIBLE SEPARAR LAS CÉLULAS DE UN TEJIDO Y EL AISLAMIENTO DE UN TIPO CELULAR PARTICULAR Varios procedimientos permiten la separación de las células que constituyen los tejidos. El primer paso consiste generalmente, en la destrucción de la arquitectura de la matriz extracelular (utilizando enzimas tales como la colagenasa y la tripsina) y las uniones que adhieren a las células, muy frecuentes en los epitelios glandulares y de revestimiento. Por lo tanto, es necesario retirar los iones Ca2+, que participan en la adhesión entre las células, con la ayuda de EDTA (ethilenediaminetetraacetic acid) que captura los iones Ca2 + removiéndolos del medio. Una vez separadas, las células continúan mezcladas, y los tipos celulares deseados deben ser aislados. El aislamiento de las células se puede hacer de varias maneras. Se pueden aislar por centrifugación, de acuerdo a su tamaño y densidad. Ciertas células, tales como los macrófagos, tienen una tendencia a adherirse al vidrio y a los plásticos y por lo tanto, se pueden aislar de aquellas células que no tienen esta tendencia. Sin embargo, la forma más precisa y eficiente para aislar un solo tipo de células en grandes cantidades es mediante el uso de un aparato llamado FACS (fluorescence-activated cell sorter). Las células en suspensión se tratan con un anticuerpo fluorescente que se une específicamente a la superficie de ciertas células. A medida que la suspensión de células pasa a través del aparato, las células fluorescentes se desvían a un recipiente, mientras que las no fluorescentes son recogidas en otro recipiente. ESTUDIO DE LAS CÉLULAS VIVAS Y CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES Y VEGETALES Las células extraídas del cuerpo de un animal o de una planta pueden ser estudiadas durante algún tiempo mientras están vivas. Para ello se deben colocar en un medio isotónico, que no les produce alteraciones del volumen. Como casi siempre los constituyentes celulares son incoloros y transparentes, es necesario el uso de un microscopio de contraste de fase. En algunos casos, se pueden emplear colorantes supravitales que son poco tóxicos y penetran en la célula viva, coloreando ciertas estructuras. Un tinte supravital muy empleado es el verde-jano, que tiñe las mitocondrias. Cuando se quiere estudiar células vivas por más tiempo, por lo general se acostumbra cultivarlas en soluciones nutritivas (medios de cultivo), en el que el metabolismo y el comportamiento celular son estudiados en condiciones más controladas que en el cuerpo de un animal. Los cultivos permiten el estudio de los movimientos celulares, de la mitosis, de la acción de diversas sustancias sobre las células y de la secreción, por la célula, de los productos que se acumulan en el medio de cultivo. Los cultivos son realizados principalmente en recipientes como frascos y placas, adecuados para tal fin, con células aisladas de tejidos mediante la aplicación de diversas técnicas como se ha mencionado anteriormente. La mayoría de las células no viven en suspensión en un medio líquido, y requieren una superficie sólida sobre la cual puedan crecer y dividirse. Esta superficie puede ser la pared de los recipientes de plástico en el que se hacen los cultivos; Sin embargo, la mayoría de las células no se adhieren a la pared del recipiente, a menos que estas paredes estén recubiertas por moléculas de tejido extracelular tales como el colágeno. El cultivo en frascos o placas de cultivo permite el uso de medios de cultivo químicamente definidos que consisten en aminoácidos, carbohidratos, sales minerales, vitaminas y factores de crecimiento, que son proteínas específicas, estimuladoras de la proliferación y diferenciación de ciertos tipos de células. Un ejemplo es el factor de crecimiento para células nerviosas o NGF (nerve growth factor). En ausencia de este factor, no se pueden cultivar las células nerviosas. Las células extraidas del cuerpo de un animal y cultivadas directamente constituyen los cultivos primarios. En general, las células los cultivos primarios mueren después de un cierto número de mitosis (50 a 100 mitosis), pero a veces algunas células mutan y se convierten en inmortales, es decir, se multiplican indefinidamente, constituyendo los cultivos secundarios. Las células inmortales forman los linajes o líneas celulares que no están constituidas de células enteramente normales, ya que sufrieron alguna mutación, siendo llamadas células transformadas. Sin embargo, conservan muchas de las características de las células normales, siendo utilizadas ampliamente en diversos experimentos. Las líneas derivadas de células transformadas in vitro o de células cancerosas tienen ciertas características; Por ejemplo, ellas pueden crecer sin adherirse a la pared del frasco y multiplicarse más que las células normales, alcanzando una densidad poblacional más alta. Gracias a la disociación, combinada con ingeniosas técnicas de aislamiento celular, fue posible la obtención de cultivos de clones derivados de una sóla célula. Las células de estos clones pueden expresar muchas de sus especializaciones funcionales. Los cultivos se han utilizado para los estudios del metabolismo de las células normales y cancerosas y, además, han sido valiosos para los experimentos con virus, que se multiplican sólo dentro de la célula. Se estudiaron algunos protozoos, también, en cultivos de células por que se desarrollan en el citoplasma. En la citogenética, los cultivos celulares son muy útiles, facilitando enormemente el estudio de los cromosomas de las células vegetales y animales. La determinación de los cariotipos humanos (estudio del número y de la morfología de los cromosomas de una persona) se realiza generalmente en cultivos de células de la sangre. Cuando se generalizó el empleo de cultivos de células eucariotas para cultivar los virus, se observó que algunos virus tienen moléculas fusogénicas con la capacidad de inducir a las células a fusionarse, con la formación de células binucleadas y células multinucleadas (sincitios), incluso cuando se trata de células de animales de diferentes especies. Por lo tanto, se forman células con cromosomas de diferentes especies, llamados heterocariones. Los heterocariones se han utilizado para el estudio de la fisiología del núcleo celular, y en especial los efectos del citoplasma sobre el núcleo. El virus Sendai, del grupo de los mixovirus, es el preferido para la obtención de heterocariones. Este virus, que causa en los seres humanos una enfermedad similar a la gripe, fue aislado por primera vez en Sendai, Japón, obteniendo así el nombre. Los virus inactivados por la radiación ultravioleta no pierden la propiedad de promover la fusión celular, siendo preferidos para obtener heterocariones porque así no hay proliferación viral, lo que dificultaría la observación de los fenómenos celulares. En los heterocariones binucleados, los núcleos generalmente suelen entrar

en mitosis de modo sincrónico; pero, como se forma un solo huso, el resultado es dos células hijas, cada una con un núcleo constituido de cromosomas de ambos núcleos iniciales del heterocarión. Por lo tanto, se forman las células mononucleares, pero que contienen cromosomas de especies animales diferentes. Estas células se pueden multiplicar muchas veces, aunque a menudo se produce la eliminación de un cromosoma en cada división, con una tendencia a permanecer los cromosomas de una especie, mientras que los de la otra van siendo parcialmente eliminados. El heterocarión formado por la fusión de células HeLa, que sintetizan ADN y ARN, con eritrocitos de pollo - los cuales no sintetizan ADN y casi no sintetizan ARN - proporcionan resultados significativos en cuanto a efectos del citoplasma sobre el núcleo. El estudio de este heterocarión se facilita mediante la lisis que los virus provocan en el eritrocito de pollo. Destuyendo la membrana del eritrocito, el virus aísla el núcleo de esta célula, que penetra en el citoplasma de la célula HeLa. La célula HeLa es una línea celular derivada de un carcinoma uterino humano. Una vez que el citoplasma del heterocarión deriva exclusivamente de la HeLa, cualquier modificación en el núcleo del eritrocito, solo puede ser promovido por el citoplasma de la célula HeLa. Se observa que, después de penetrar en la HeLa, el núcleo del eritrocito, que está condensado, aumenta de volumen y su cromatina se vuelve laxa, dando al núcleo un aspecto claro. Al mismo tiempo, este núcleo adquiere la capacidad para sintetizar ADN y ARN. Este experimento muestra que la actividad sintética del núcleo y su capacidad de multiplicar el material genético se ven influidos por el citoplasma. Existen muchos tipos de células vegetales que también se pueden mantener en medios de cultivo en los que crecen y se multiplican como lo hacen las células animales (Capítulo 13). La separación de las de los células vegetales requiere diferentes procedimientos. Inicialmente, es necesario someter las células a la acción de la enzima celulasa que digiere la celulosa, el principal constituyente de las paredes. La destrucción de las paredes libera las células, quedando rodeadas apenas por la membrana plasmática y que, en esa condición, son llamadas protoplastos. Los protoplastos pueden ser cultivados en medios de cultivo adecuados, de composición química definida, que les permiten crecer y dividirse por mitosis. Cuando las condiciones de cultivo son las apropiadas, los protoplastos, después de varias divisiones mitóticas, acaban formando pequeños agregados de células indiferenciadas. Estos agregados pueden ser inducidos a originar plantas totalmente nuevas, lo que indica que las células vegetales son totipotentes, lo que no ocurre con las células animales. Esta propiedad de las células vegetales cultivadas de dar origen a un nuevo individuo completo (planta) está ausente en las células animales y se ha utilizado en la agricultura. Las células vivas, animales y vegetales, pueden ser sometidas a diversas técnicas de microcirugía que utilizan instrumentos con extremidades de dimensiones microscópicas. Entre estos instrumentos, generalmente hechos de vidrio, están agujas de diversas formas, bisturíes, pipetas y electrodos. A través de la microcirugía, es posible determinar el pH intracelular, el desplazamiento y la eliminación de los orgánulos y vesículas, el trasplante de las partes de una célula a otra y la remoción, por seccionamiento, de fragmentos celulares. La microcirugía se realiza con equipos especiales, llamados micromanipuladores, que proporcionan movimientos muy precisos y delicados.

RESUMEN

El conocimiento sobre las células progresa a medida que las técnicas de investigación se perfeccionan. La aparición de un nuevo instrumento de trabajo, o la aplicación más ingeniosa de un sistema existente, siempre conduce a nuevos descubrimientos y al esclarecimiento de algunas de las funciones celulares. El estudio de la célula comenzó con el microscopio óptico, que ya en 1896, alcanzó gran eficiencia gracias a los primeros objetivos de gran resolución. El uso de este aparato en combinación con el descubrimiento de técnicas de microtomía y la coloración, permitió el estudio morfológico de las células con gran detalle. El microscopio óptico ha evolucionado con el microscopio de contraste de fase, el microscopio confocal, y la mejora de los sistemas electrónicos de intensificación, almacenamiento y procesamiento de imágenes. Otro paso fue representado por el uso sistemático de técnicas citoquímicas. Estas técnicas permitieron el conocimiento de la composición química de muchos componentes celulares que antes eran estudiados sólo desde el punto de vista morfológico. El aislamiento de los orgánulos por centrifugación diferencial o fraccionada representa otro avance importante, ya que así se han podido estudiar, in vitro, tanto la composición química precisa, como también las funciones de los orgánulos. El advenimiento del microscopio electrónico con su uso para estudios morfológicos y citoquímicos representó un gran impulso para conocimiento de las funciones celulares. La influencia del microscopio electrónico fue tan grande que llevó a una revisión completa de los conceptos morfológicos de los componentes celulares. Actualmente, la forma y estructura de los orgánulos se describen a menudo como se observa en el microscopio electrónico. El uso combinado de las técnicas modernas, incluida la radioautografía, el cultivo celular en medios Nutri-tivos definidos, el uso del microscopio de fluorescencia, del microscopio confocal, de los microscopios electrónicos, de las técnicas de criofractura y de las técnicas bioquímicas, vinieron a ampliar de tal manera el estudio de las células, que se ha convertido en habitual designar este nuevo enfoque con el nombre de Biología Celular y Molecular.

Bibliografía

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Bases Macromoleculares de la

Las células se componen de macromoléculas poliméricas La molécula de agua es asimétrica El grado de afinidad por el agua tiene un papel importante en las propiedades biológicas de las macromoléculas Las proteínas son polímeros de aminoácidos La secuencia de aminoácidos influye en la forma tridimensional y en la función biológica de las moléculas proteicas Moléculas chaperonas ayudan en la formación de las moléculas proteicas complejas y en la destrucción de proteínas defectuosas Los genes controlan el metabolismo celular a través de las enzimas La actividad enzimática es muy sensible a la acción de varios factores Para aumentar la eficiencia, las enzimas se agrupan en complejos o se unen a las membranas Las cadenas enzimáticas operan bajo la regulación Las isoenzimas son moléculas ligeramente diferentes de la misma enzima Los veinte aminoácidos permiten la construcción de una enorme variedad de moléculas proteicas con diversas funciones

Constitución

Celular

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Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos El ADN es el depositario de la información genética y la transmite a las células hijas El ARN transfiere la información genética del ADN a las proteínas El ARN puede tener acción enzimática Las moléculas de ácido nucleico se pueden caracterizar por la técnica de hibridación Los lípidos forman reservas nutritivas y tienen una función estructural en las membranas celulares Los polisacáridos forman reservas nutricionales y se unen las proteínas para formar glicoproteínas (función enzimática y estructural) y proteoglicanos (función estructural) Resumen Bibliografía

La estructura y funcionamiento de las células depende principalmente de macromoléculas formadas por la polimerización de monómeros La molécula de agua es un dipolo con características especiales que la hacen indispensable para la vida Las proteínas son polímeros de 20 aminoácidos diferentes La estructura de las moléculas de proteína tienen cuatro niveles de organización: primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria El metabolismo celular se debe a la actividad de las enzimas Por la acción del frío, se puede disminuir o detener, temporalmente, la acción de las enzimas Agrupadas en secuencia, muchas veces unidas a las membranas, las enzimas operan más eficazmente Las isoenzimas son moléculas ligeramente diferentes que actúan sobre el mismo substrato; sin embargo, a diferentes velocidades Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son polímeros de nucleótidos Hay tres tipos de ARN con diferentes funciones: ARN de transferencia, ARN mensajero y ARN ribosomal El ARN puede tener acción enzimática La hibridación molecular permite caracterizar bien las moléculas de ARN y de ADN Los lípidos son componentes importantes de las membranas celulares y forman reservas nutritivas Los polisacáridos constituyen reservas de energía en forma de glucógeno (en las células animales) y almidón (en las células vegetales), y desempeñan un papel estructural como parte de las moléculas de glicoproteínas y de proteoglicanos.

L

as moléculas que componen las células están formadas por los mismos átomos que se encuentran en los seres inanimados. Sin embargo, en el origen y la evolución de las células, se seleccionaron algunos tipos de átomos para la formación de biomoléculas. El noventa y nueve por ciento de la masa de las células está formada por hidrógeno, carbono, oxígeno y nitrógeno, mientras que en los seres inanimados de la corteza de la tierra, los cuatro elementos más abundantes son el oxígeno, silicio, aluminio y sodio. Excluyendo el agua, existe en las células predominio absoluto de los compuestos de carbono, extremadamente raros en la corteza terrestre. Por lo tanto, la primera célula y las que de ella evolucionaron seleccionaron los compuestos de carbono (compuestos orgánicos), cuyas propiedades químicas son más adecuadas para la vida. LAS CÉLULAS SE COMPONEN DE MACROMOLÉCULAS POLIMÉRICAS Es característico de la materia viva la presencia de moléculas de alto peso molecular o macromoléculas, las cuales son polímeros que consisten en la repetición de unidades más pequeñas llamadas monómeros. Los polímeros formados a partir de monómeros similares se llaman homopolímeros. Este es el caso del glucógeno, que está constituido exclusivamente por moléculas de glucosa. Los heteropolímeros se componen de diferentes monómeros. Los ácidos nucleicos, por ejemplo, son heteropolímeros. Existe una gran diversidad de macromoléculas en las células, no sólo en términos de tamaño, sino principalmente en la variedad de sus monómeros constituyentes. Los polímeros que se encuentran en los organismos vivos (biopolímeros) serán estudiados aquí en cuanto a su constitución y la importancia biológica de los procesos de interacción de estas macromoléculas. Los biopolímeros más importantes son las proteínas formadas por aminoácidos; los polisacáridos, los cuales son polímeros de monosacáridos; y los ácidos nucleicos (ADN y ARN), formados por nucleótidos. Además de los polímeros, moléculas más pequeñas, como los lípidos, agua, minerales y vitaminas, tienen un papel relevante en la constitución y el funcionamiento de las células. La diversidad estructural y funcional de un polímero depende de la variedad de sus monómeros. En la constitución de las proteínas participan 20 diferentes aminoácidos, en cuanto a los ácidos nucleicos están formados por sólo cinco tipos de nucleótidos (monómeros); Por lo tanto, las proteínas tienen un mayor polimorfismo y por lo tanto una mayor diversidad funcional que los ácidos nucleicos. A menudo, los diferentes tipos de macromoléculas se asocian para formar

complejos tales como las lipoproteínas, glicoproteínas, y proteoglicanos (proteínas combinadas con polisacáridos) y las nucleoproteínas (ácidos nucleicos más proteínas). LA MOLÉCULA DE AGUA ES ASIMÉTRICA De acuerdo a lo explicado en el capítulo 1, las primeras células surgieron en la masa líquida que cubría la mayor parte de la superficie de la tierra hace miles de millones de años atrás. Probablemente originadas al azar a partir de moléculas orgánicas antes de la existencia de cualquier ser vivo (origen prebiótico), formándose micelas que evolucionaron por la aparición de una membrana, originando, así, las primeras células. El origen de las células se asocia con el agua, de tal modo que esta es, sin excepción, la molécula más abundante en todas las células. Las moléculas de proteínas, lípidos y polisacáridos varían de una célula a otra, pero todas las células contienen agua. Este compuesto no es una molécula inerte, con la única función de llenar los espacios; por el contrario, el agua y sus iones influyen poderosamente en la configuración y en las propiedades biológicas de las macromoléculas. La molécula de agua es morfológicamente y eléctricamente asimétrica. Los dos átomos de hidrógeno con el oxígeno forman un ángulo que en promedio se estima en 104,9°. Por lo tanto, a pesar de estar representada por la fórmula H-O-H, la molécula de agua no es una vara recta. Por otro lado, debido a la fuerte atracción ejercida por el núcleo del oxígeno sobre los electrones, la molécula de agua es relativamente positiva en el lado de los dos hidrógenos, y negativa en el lado del oxígeno; es decir, la molécula de agua es un dipolo. En el espacio, en virtud de la forma de las órbitas del hidrógeno y el oxígeno, las cargas eléctricas se distribuyen de tal manera que el oxígeno ocupa el centro y los hidrógenos (relativamente positivos), los dos extremos de un tetraedro, como se muestra en la Figura 3.1. Por su naturaleza dipolar, el agua es uno de los disolventes más conocidos. El agua disuelve muchas sustancias cristalinas y otros compuestos iónicos debido a su tendencia a combinarse con iones negativos o positivos y, a menudo, mayor que la tendencia de los iones a combinarse entre sí. Por ejemplo, los cristales de NaCl se disuelven fácilmente en el agua porque, a pesar de la atracción electrostática entre el Cl - y Na+ en el cristal, cada uno de estos iones es atraído más fuertemente por el dipolo del agua. Por lo tanto, el cristal se rompe, formándose los iones hidratados de Cl - y Na+, altamente estables.

Figura 3.1 A la izquierda, el esquema de un dipolo de agua; derecha, la forma tridimensional de la molécula.

EL GRADO DE AFINIDAD POR EL AGUA TIENE UN PAPEL IMPORTANTE EN LAS PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LAS MACROMOLÉCULAS Los polímeros celulares contienen en su estructura grupos químicos que tienen afinidad por el agua (grupos polares) o que no muestran afinidad por el agua (grupos apolares), repeliéndola. Los principales grupos polares son el carboxilo, hidroxilo, aldehído, sulfato y fosfato. Las moléculas con alto contenido de grupos polares son libremente solubles en agua y se llaman hidrófilas (hidro, agua, y filo, amigo). La mayoría de los hidratos de carbono, ácidos nucleicos y muchas proteínas son hidrófilos. En contraste, hay moléculas con o sin grupos polares y por consiguiente son insolubles en agua; son moléculas hidrofóbicas (hidro, agua y fobos, aversión). Como ejemplos se pueden mencionar los lípidos, la parafina y los aceites - estas moléculas son repelidas por el agua. Hay también macromoléculas generalmente alargadas, que tienen una región hidrófila y una región hidrófoba; son las llamadas moléculas anfipáticas, dotadas de la capacidad de unirse tanto al agua y a compuestos hidrófilos, por un extremo, y a los compuestos hidrofóbicos, por el otro extremo. Las moléculas anfipáticas ejercen importantes funciones biológicas, y están presentes en todas las membranas celulares. El análisis de las fuerzas responsables de la cohesión de los monómeros en los biopolímeros mostró que hay dos tipos generales de fuerzas que pueden agruparse en función de su intensidad. Esta intensidad, a su vez,

puede ser evaluada por la energía que se requiere para llevar a cabo o deshacer estas uniones (Tabla 3.1). Por un lado están las uniones fuertes, llamadas covalentes. Son resultantes de la superposición de las órbitas externas de las moléculas y son uniones fuertes y estables que consumen grandes cantidades de energía para su realización. Es el tipo de unión que se observa en los enlaces peptídicos entre los aminoácidos que sólo se pueden deshacer con procedimientos drásticos como la hidrólisis en ácido fuerte a alta temperatura. Estas uniones requieren aproximadamente 100 kcal por mol para formarse. Por otro lado, están los enlaces débiles, de naturaleza variada, que se forman con poco gasto de energía y se pueden deshacer con procedimientos suaves como el calentamiento moderado y la alteración de la concentración iónica del medio. Los principales enlaces débiles son: los enlaces puente de hidrógeno, los enlaces electrostáticos y las interacciones hidrofóbicas. Los enlaces puente de hidrógeno se producen debido al uso común de un átomo de hidrógeno por diferentes radicales. En el caso de las proteínas, esto tiene lugar entre el nitrógeno y el carbonilo de los enlaces peptídicos diferentes (Figura 3.6). Los enlaces puente de hidrógeno son también importantes en la unión de las dos hebras de ADN, esta unión ocurre debido a los puentes que se establecen entre dos bases (Figura 3.19). Los enlaces electrostáticos son enlaces que se forman cuando un grupo ácido está unido a una base; Ejemplos son las uniones entre aminoácidos básicos y ácidos, entre los colorantes ácidos (generalmente con grupos sulfónicos) y proteínas

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básicas de los tejidos o entre los glicosaminoglicanos (que contienen grupos sulfato), y proteínas básicas. Las interacciones hidrofóbicas se producen entre las moléculas apolares que se presionan una contra la otra por la repulsión que sufren por el agua que las rodea. No es, por lo tanto, adecuadamente un enlace, como ocurre en los enlaces puente de hidrógeno o la unión electrostática, siendo más adecuadamente definida como una interacción. El ejemplo más importante de interacción hidrofóbica en biología tiene lugar en la membrana celular (Capítulo 5), en el que las dos capas de lípidos se asocian en virtud de este tipo de interacción.

La importancia biológica de estas interacciones y uniones de baja energía reside en el hecho de que estas permiten a la célula alterar, montar y desmontar las estructuras supramoleculares, como, por ejemplo, los microtúbulos y microfilamentos, lo que aumenta en gran medida su eficiencia y versatilidad funcional sin un gran gasto de energía. Si las interacciones de las macromoléculas fuesen realizadas sólo con uniones fuertes, la estructura celular sería estable, y las modificaciones de esta estructura implicarían un alto gasto de energía lo que produciría que la actividad celular sea imposible.

Tabla 3.1 Energía gastada para romper algunos enlaces moleculares de cierto interés biológico Energía Tipo de enlace Enlaces covalentes (fuertes)

Enlaces no covalentes (débiles)

(kcal/mol) H3C—CH3 C=0

88 (simples) 170 (doble)

NN

226 (triple)

Puente de Hidrógeno

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Enlace iónico Interacción hidrofóbica

5 1-3

LAS PROTEÍNAS SON POLÍMEROS DE AMINOÁCIDOS Las proteínas son macromoléculas que contienen un número variable de Laminoácidos unidos por enlaces peptídicos (Figuras 3.2 y 3.3); por lo tanto. son polímeros de aminoácidos. Las cadenas asi formadas se denominan cadenas polipeptídicas y, cuando alcanzan un cierto tamaño, reciben el nombre de proteína. Es común considerar proteínas a los polipéptidos con un peso molecular a partir de 6000 daltons (6 kDa). Aunque hay más de 150 aminoácidos, sólo 20 se encuentran en las proteínas (Figura 3.4). Estos aminoácidos 20 celulares son todos de estructura L, lo que refuerza la hipótesis presentada en el Capítulo 1, según el cual todas las células existentes en la actualidad derivan de una sola célula ancestral. La célula ancestral habría tomado los L-aminoácidos, siendo la capacidad de utilizarlos transmitida a todas las células hijas. Los aminoácidos que se encuentran en las proteínas tienen en común la presencia de un grupo NH2 (amino) y un grupo COOH (carboxilo) unidos al carbono alfa de la molécula (Figuras 3.2 y 3.3). Constituyen una excepción la prolina y la hidroxiprolina, que contienen el grupo NH (imino) en sustitución del grupo NH2. De hecho, la prolina y la hidroxiprolina son iminoácidos (Figura 3.4), pero están entre los aminoácidos, ya que tienen propiedades similares. Las proteínas se pueden clasificar en dos categorías: las proteínas sim-

ples cuyas moléculas están compuestas exclusivamente por aminoácidos y las proteínas conjugadas que se caracterizan por la presencia en sus moléculas de una porción no proteica llamada grupo prostético. Entre las proteínas conjugadas pueden mencionarse los siguientes ejemplos: nucleoproteínas, con grupo prostético que consiste en ácidos nucleicos; glicoproteínas, que contienen polisacáridos; lipoproteínas, que contienen lípidos; fosfoproteínas, cuyo grupo prostético contiene fósforo; hemoproteínas (catalasas, peroxidasas y citocromos) que contiene un grupo hemo, que es un ferroporfirina; flavoproteínas que contienen riboflavina en el grupo prostético; y finalmente, metaloproteínas, en las cuales el grupo prostético es un metal (la insulina y la anhidrasa carbónica, que contienen zinc) o un compuesto inorgánico que contiene metal, tal como, por ejemplo, la ferritina, cuyo grupo prostético es el Fe(OH)3. Los grupos NH2 y COOH son ionizables, lo que confiere carga eléctrica a las proteínas y afecta a su migración en un campo eléctrico. Conforme haya un predominio de grupos NH2 o grupos COOH, las proteínas son ácidas o básicas, respectivamente; Por ejemplo, las histonas ricas en lisina y arginina (aminoácidos con dos grupos NH 2 por molécula) son eléctricamente positivas a pH 7, por lo tanto, básicas y, por esto, se combinan con los grupos fosfato del ácido desoxirribonucleico (ADN) para formar nucleoproteínas.

Figura 3.2 Fórmula general de los alfa-aminoácidos. Figura 3.3 Formación del enlace peptídico, se indica en la parte sombreada, por la unión de dos aminoácidos y la formación de una molécula de agua.

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Figura 3.4 Las moléculas de los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas. Las cadenas laterales son responsables de ciertas propiedades químicas de los aminoácidos, se indican mediante un sombreado.

LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS INFLUYE EN LA FORMA TRIDIMENSIONAL Y EN LA FUNCIÓN BIOLÓGICA DE LAS MOLÉCULAS PROTEICAS La forma tridimensional de la molécula de una proteína está relacionada a fuesen los únicos enlaces existentes, las moléculas de las proteínas se la secuencia de aminoácidos y al número de cadenas polipeptídicas que plegarían de forma aleatoria, irregularmente. constituyen la molécula. Hay proteínas cuya molécula tiene sólo una Sin embargo, el estudio de las propiedades de las moléculas proteicas en cadena polipeptídica, mientras que otras tienen múltiples cadenas, en estado nativo muestra que se componen de cadenas polipeptídicas plegageneral unas diferentes a las otras. Por ejemplo, la hemoglobina se comdas de manera bastante regular y constante para cada tipo de proteína. pone de dos cadenas alfa (iguales entre sí) y dos cadenas beta (también Las cadenas se pliegan y enrollan de una manera compleja como para iguales entre sí). constituir una disposición espacial definida y típica de la proteína conocida Desde un punto de vista biológico, el conocimiento de la forma tridimencomo su estructura secundaria. Una estructura secundaria muy común sional de las moléculas proteicas en estado nativo (configuración nativa) es de las proteínas globulares que forman la mayoría de las proteínas celulamuy importante porque esta es la forma, dentro de la célula, en que las res es la alfa hélice (Figura 3.6). Esta configuración es debido a la formamoléculas muestran actividad e interactúan unas con las otras. Se llama ción de enlaces puentes de hidrógeno entre aminoácidos de la misma configuración nativa a la forma tridimensional que una molécula precadena, que toma la forma de sacacorchos o hélice. senta en las condiciones de pH y temperatura existentes en los organismos La cadena que contiene la estructura secundaria se pliega nuevamente vivos (Figura 3.5). sobre sí misma, formando estructuras globulares o alargadas, adquiriendo La estructura de las moléculas proteicas se mantiene mediante las siguienasí una estructura terciaria (Figura 3.7). tes fuerzas de estabilización: Muchas proteínas tienen moléculas que constan de múltiples cadenas ■ Enlace peptídico: resultante del enlace covalente peptídicas, que pueden ser idénticas o diferentes. Estas cadenas se deno■ Interacción hidrofóbica minan subunidades o monómeros. El método particular de unirse las subunidades para formar la molécula proteica recibe el nombre de estruc■ Enlaces puentes de hidrógeno tura cuaternaria de la proteína (Figura 3-8). Esta estructura se mantiene ■ Enlaces disulfuro o S-S: enlaces covalentes entre moléculas del aminoácido cisteína. gracias a la cooperación de numerosos enlaces químicos débiles, tales El número y secuencia de los residuos aminoacídicos en una cadena como los enlaces puente de hidrógeno. A través de la organización proteica cuaternaria, se forman diversas estructuras de gran importancia biológipolipeptídica determinan la estructura primaria de la proteína. La ca, tales como los microtúbulos, microfilamentos, capsómeros de virus y estructura primaria se mantiene por enlaces peptídicos, pero si éstos complejos enzimáticos que se describirán más adelante en este capítulo.

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También las fibrillas de colágeno (Figura 3.9) encontradas en el espacio extracelular del tejido conectivo están formadas por la agregación de las cadenas polipeptídicas de tropocolágeno. Se dice que una proteína es globular cuando su molécula tiene una relación de longitud-anchura inferior a 10: 1. La gran mayoría de las proteínas de las células son proteínas globulares tales como la hemoglobina, mioglobina, hemocianina, las proteínas con actividad enzimática y las

proteínas de las membranas celulares. Cuando la relación longitud-anchura es mayor que 10: 1, dicha proteína es fibrosa. Entre las proteínas fibrosas intracelulares, la queratina es la mejor estudiada (Figura 3.10). La proteína más abundante en el cuerpo de los mamíferos es el colágeno, la proteína fibrosa extracelular que constituye las fibrillas de colágeno antes mencionadas.

Figura 3.5 Figura 3.6 Figura 3.5 En la parte superior, a la izquierda, aparece una molécula proteica globosa, en su configuración nativa (forma de la molécula en las condiciones naturales dentro de la célula). En el centro, la misma molécula, sin embargo, desnaturalizada. Cómo la desnaturalización es a menudo reversible, la molécula puede volver a su forma original, como se muestra abajo a la derecha. Las pequeñas barras negras representan los radicales que se unen para establecer la configuración nativa de la proteína. Figura 3.6 Estructura secundaria (alfa hélice) de una proteína. Los enlaces puente de hidrógeno entre los aminoácidos están representados por líneas paralelas.

Figura 3.7 Esquema de las estructuras primaria, secundaria y terciaria de una proteína. En la banda negra están representados los residuos aminoacídicos (estructura primaria) y la hélice formada por ellos (estructura secundaria). Los pliegues de la molécula, demostradas por su contorno externo, en un puntillado fino, constituyen la estructura terciaria.

MOLÉCULAS CHAPERONAS AYUDAN EN LA FORMACIÓN DE LAS MOLÉCULAS PROTEICAS COMPLEJAS Y EN LA DESTRUCCIÓN DE PROTEÍNAS DEFECTUOSAS En muchos lugares del ambiente intracelular, muchas proteínas se están formando simultáneamente, lo que complica la estructuración de los complejos proteicos. Esta dificultad, provocada por el aglomerado de moléculas nacientes en el medio intracelular, es envuelta por las moléculas chaperonas, que son proteínas cuya principal función es la de unirse a las cadenas polipeptídicas nacientes, hasta que ellas se unan a otras cadenas polipeptídicas, para formar correctamente las complejas moléculas finales. Sin el trabajo de las chaperonas, se formarían muchos agregados proteicos sin actividad funcional, por la unión, aleatoria, de las numerosas cadenas polipeptídicas que se sintetizan continuamente en la célula. Las moléculas chaperonas no sólo minimizan la agregación errónea de las cadenas polipeptídicas, sino que también interrumpen las agregaciones

defectuosas y promueven la eliminación, por hidrólisis, de las moléculas proteicas incorrectamente formadas. Muchas tareas de las moléculas chaperonas se realizan con gasto de energía proporcionada por el ATP. Las chaperonas también realizan otras funciones, tales como prevenir el plegamiento de las moléculas proteicas sintetizadas en el citosol, pero, destinadas a las mitocondrias. Los mecanismos de transferencia de proteínas hacia dentro de las mitocondrias sólo funcionan para transportar moléculas desplegadas, y nunca moléculas ya plegadas en su configuración final. Después de la penetración de la proteína mitocondrial desplegada por la chaperona respectiva, las dos se separan, y la proteína mitocondrial asume su forma doblada final, activa. En otros lugares, las chaperonas también realizan otras funciones. En las cisternas del retículo endoplásmico hay una chaperona que ayuda a la orientación del plegamiento de las moléculas proteicas para que ellas asuman la conformación tridimensional correcta.

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Las principales chaperonas son denominadas hsp60 y hsp70. La abreviatura proviene de heat shock protein (proteína de choque térmico), ya que aumentan en número cuando las células son llevadas a temperaturas más altas, y el número indica el peso molecular expresado en kilodaltons (kDa). LOS GENES CONTROLAN EL METABOLISMO CELULAR A TRAVÉS DE LAS ENZIMAS Las enzimas son moléculas proteicas con la propiedad de acelerar intensamente determinadas reacciones químicas, tanto en el sentido de la síntesis como en la degradación de moléculas. Ellas son los principales responsables de la eficiencia de la maquinaria química intracelular. Gracias a las enzimas, las células ejecutan en milisegundos, la síntesis de moléculas que, in vitro, sin enzimas, requerirían de semanas de trabajo para ser sintetizadas. Además de la velocidad, las síntesis enzimáticas tienen un alto rendimiento, es decir, al final de la reacción sólo produce el producto deseado o algunos productos, pero todos útiles para las células. Por el contrario, en las síntesis de laboratorio, no enzimáticas, se forman, además de las moléculas deseadas, muchos subproductos, proporcionando de este modo una mezcla de la cual la molécula deseada debe ser separada. Si eso sucediera en el medio intracelular, habría una concentración de productos indeseables que perturbaría el metabolismo. Siendo catalizadores tan eficientes, las enzimas se han utilizado para la síntesis in vitro, tanto en el laboratorio experimental como en la producción industrial. Las enzimas son proteínas y, como tales, producen bajo el control del ADN. Ellas son los efectores de la información genética contenida en el ADN, y es a través de ellas que el ADN controla todo el metabolismo celular. Aunque casi todas las moléculas enzimáticas son proteínas, hay algunos ARN, llamados ribozimas, que tienen actividad enzimática, lo que constituye una excepción a la regla general. ►Acción enzimática. El compuesto que sufre la acción de una enzima se llama sustrato. La molécula de enzima contiene uno o más centros activos, a los cuales el sustrato se combina para la que se realice la acción enzimática. La forma tridimensional de la enzima es importante para su actividad debido a que los centros activos son regiones cuya conformación tridimensional es complementaria a la molécula de sustrato. Este estereocomplementariedad es imprescindible para comprobar el ajuste tridimensional preciso entre la enzima y sus sustratos (Figura 3.11); es a través de este ajuste que la enzima reconoce y se une con una mayor o menor intensidad (afinidad) a sus sustratos. La especificidad de las enzimas es muy variable. Algunas actúan exclusi-

vamente sobre un tipo de molécula, ni siquiera atacando su estereoisómero. Por ejemplo, la deshidrogenasa láctica es específica para el L-lactato, y la D-aminoácido oxidasa solo ataca los D-aminoácidos. Por otro lado, hay enzimas que actúan sobre varios compuestos con alguna característica estructural común. Este es el caso, por ejemplo, de las fosfatasas que hidrolizan diversos ésteres de ácido fosfórico. Para ejercer su actividad, muchas enzimas requieren cofactores que pueden ser un ion metálico o una molécula. Cuando el cofactor es una molécula, se denomina coenzima. A diferencia de la enzima en sí, que, siendo proteína, es desnaturalizada e inactivada por las altas temperaturas, por lo general las coenzimas son termoestables. Algunos cofactores están permanentemente conectados y cerca de la molécula de la enzima, mientras que otros se unen a ella temporalmente, durante la acción enzimática. El complejo formado por la enzima con el cofactor, independientemente del grado de unión química entre ellos, es llamado holoenzima. Removiendo el cofactor, queda la parte proteica de la enzima, que entonces se inactiva y se llama apoenzima. Cuando el cofactor está fuertemente ligado a la molécula de apoenzima, este constituye un grupo prostético y la enzima se debe considerar una proteína conjugada. La parte activa de muchas coenzimas contienen muchas vitaminas del grupo B, como la riboflavina, tiamina, ácido pantoténico y nicotinamida. ► Nomenclatura. Muchas enzimas son designadas por el nombre del sustrato sobre el que actúan más el sufijo -asa; por ejemplo, el ácido ribonucleico (sustrato) es hidrolizado por una enzima llamada ribonucleasa. Sin embargo, otras enzimas - incluyendo algunas de entre las mejores estudiadas-- son conocidas por nombres que no siguen esta regla; Ejemplos de ello son la pepsina y la tripsina, que hidrolizan proteínas. La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica adoptó una clasificación de las enzimas en seis categorías principales (Tabla 3.2), cada una con subdivisiones, y estableció normas para la designación más precisa e instructiva de cada enzima. Por ejemplo, para la nomenclatura de la Comisión, la enzima generalmente llamada hexoquinasa es la que cataliza la reacción ATP + glucosa  glucosa-6-fosfato + ADP debe ser llamada ATP: hexosa fosfotransferasa. Esta última denominación indica más específicamente la acción de la enzima, que es la transferencia de un grupo fosfato del ATP a una hexosa (Figura 3.11). Sin embargo, la nomenclatura internacional se utiliza poco en la práctica, porque las enzimas reciben nombres muy largos, en comparación con sus nombres comunes.

Tabla 3.2 Principales clases de enzimas de acuerdo con la nomenclatura de la Comisión de enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica. En la clasificación completa, cada clase de este cuadro será subdividido. Clase Nombre Catalizan Ejemplos Reacciones en las cuales un compuesto es reducido y otro es oxida- Deshidrogenasas, oxidasas, peroxida1 Oxidorreductasas do sas 2 Transferasas Transferencia de grupos químicos de una molécula a otra Transaminasas, transmetilasas 3 Hidrolasas Ruptura de moléculas con adición de agua Peptidasas, fosfatasas, esterasas Remoción de un grupo químico, originando un doble enlace al sus4 Liasas trato; o adición de un grupo a un doble enlace que es desarmado de Descarboxilasas, desaminasas esta forma 5 Isomerasas Reordenamientos intramoleculares que alteran la estructura tridiRacemasas, epimerasas mensional del sustrato Unión de dos moléculas, con hidrólisis de ATP u otro compuesto rico Acetilcoenzima A sintetasa, piruvato 6 Ligasas en energía carboxilasa

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Figura 3.8 Estas micrografías electrónicas muestran un ejemplo de la estructura cuaternaria de una proteína, la hemocianina, presente en la sangre de Limulus polyphenus. A. Corte de la célula productora de hemocianina, cuyas moléculas se agrupan formando cristaloides (43.000x). B. Con un mayor aumento (80.000x), son visibles las moléculas componentes de los cristaloides (hemocianina). C. Con un aumento adicional (210.000x) se observa claramente que la molécula de hemocianina es un tetrámero que aparece con aspectos diferentes de acuerdo con la posición en la que es observado (a y b). Su subunidad o monómero se muestra en c. Observe también dímeros (d) y los tetrámeros con sus cuatro monómeros globulares bien visibles (e y f). (Micrografías de W.H. Fahrenbach, Journal of Cell Biology, 44:445, 1970. Reproducido con permiso.)

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Figura 3.9 Micrografía electrónica del tejido conectivo de la piel humana. Las estructuras alargadas son fibrillas de colágeno formados por la agregación de moléculas de tropocolágeno (proteína fibrosa). Las fibrillas son estructuras proteicas cuaternarias cuyo monómero es el tropocolágeno. A la izquierda, cortes oblicuos de esas fibrillas. Aumento: 33.000x.

Figura 3.10 Micrografía electrónica de célula epidérmica de pez. Las flechas indican el límite entre dos células. Tenga en cuenta los numerosos filamentos de queratina (proteína fibrosa); M, mitocondria; M1, mitocondria doblada (invaginación) de la envoltura nuclear. Aumento: 10.000x. La micrografía inferior de la izquierda muestra los filamentos de queratina aumentados 200.000x.

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Figura 3:11 Combinación reversible entre los sustratos y el centro activo de la enzima. También demuestra la acción enzimática (ATP + glucosa  ADP + glucosa-6-fosfato). Esta figura ilustra la importancia de la estructura tridimensional de una proteína (enzima) para su actividad biológica. Es necesario que el sustrato se ajuste a la molécula enzimática para que la enzima actúe.

LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ES MUY SENSIBLE A LA ACCIÓN DE VARIOS FACTORES La actividad de las enzimas es extremadamente sensible a diversos agentes químicos y físicos, puede ser inhibida de varias maneras. La inhibición puede ser competitiva o no competitiva. Entre los factores que afectan a la actividad enzimática, llaman la atención: la temperatura, la concentración de sustrato y la presencia de activadores o inhibidores que alteran la velocidad de la acción de las enzimas. El efecto de la temperatura tiene una gran importancia práctica, ya que el frío deprime la actividad enzimática, lo que retrasa el proceso de lisis celular y el deterioro de las muestras de tejido, sangre, orina, etc. usadas en pruebas de laboratorio. En el trasplante de órganos, es común el uso de temperaturas más bajas para una mejor preservación de los tejidos a ser transplantados. Las temperaturas muy bajas obtenidas generalmente mediante el uso de nitrógeno líquido (punto de ebullición -195.8 °C) se utilizan habitualmente en la preservación de los cultivos de tejidos, muestras de tejido para análisis bioquímico posterior, semillas de plantas, espermatozoides para inseminación artificial y trasplante de embriones. ► Inhibición competitiva. Cuando una sustancia resistente a la acción enzimática, pero con una molécula muy similar con el sustrato de la enzima, se fija en los centros activos de la molécula enzimática, se dice que la inhibición es competitiva. En este caso, el inhibidor compite con el sustrato para situarse en el sitio activo y el grado de inhibición está influenciado por la concentración del sustrato. Cuanto mayor sea la concentración del sustrato, es menos probable que el inhibidor se una a las moléculas de enzima y tome sus centros activos. ► Inhibición no competitiva. Este tipo de inhibición no se ve afectada por la concentración del sustrato, dependiendo exclusivamente de la concentración del inhibidor. El caso más común de inhibición no competitiva está representado por la combinación reversible de metales pesados con los grupos -SH de la molécula enzimática. Esto cambia la forma tridimensional de la molécula de la enzima y evita su actividad. También se produce inhibición no competitiva cuando la enzima necesita ciertos iones y estos

son removidos de la solución; Por ejemplo, las enzimas que requieren Mg 2+ son inhibidas por el EDTA (ácido etildiaminotetraacético), ya que este compuesto forma un complejo con cationes divalentes y, de este modo, remueve Mg2+ de la solución. La inhibición se invierte mediante la adición de cationes Mg2+ (es reversible). PARA AUMENTAR LA EFICIENCIA, LAS ENZIMAS SE AGRUPAN EN COMPLEJOS O SE UNEN A LAS MEMBRANAS En la célula viva, la mayoría de las enzimas actúan de manera secuencial, tal que el producto de una enzima es el sustrato para la siguiente enzima. Este conjunto de enzimas que trabajan en cooperación se denomina cadena enzimática. Un sistema muy eficiente y común en las células está representado por los complejos de moléculas enzimáticas. Aquí, todas las enzimas de la cadena se asocian para formar un conjunto de moléculas que se mantienen unidas por fuerzas químicas débiles (estructura proteica cuaternaria). En la célula de levadura, por ejemplo, las enzimas que sintetizan ácidos grasos a partir de pequeñas moléculas forman una cadena que consta de siete enzimas que se asocian para formar un complejo multienzimático. Las reacciones se procesan en secuencia y las moléculas intermediarias permanecen unidas al complejo hasta la formación de la molécula de ácido graso. Esto vuelve al sistema más rápido, ya que el sustrato no tiene por qué desplazarse demasiado de una enzima a otra. Otro complejo enzimático bien estudiado es el de la piruvato deshidrogenasa. En el microscopio electrónico, el complejo enzimático de la piruvato deshidrogenasa muestra un aspecto poliédrico, y se sugirió un modelo según el cual sus enzimas debían estar organizadas (Figura 3.12). Las cadenas enzimáticas mejor organizadas y por tanto, más eficientes son aquellas que están unidas a las membranas, como por ejemplo, las enzimas de la cadena respiratoria (transportadoras de electrones) que están unidas a la membrana interna de las mitocondrias. En tales casos, no hay separación entre la molécula enzimática y la molécula estructural, pues las diferentes proteínas son, al mismo tiempo, parte de la membrana y también dotadas de actividad enzimática.

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Figura 3.12 Modelo del complejo enzimático de la piruvato deshidrogenasa. Cada esfera coloreada representa una molécula enzimática.

LAS CADENAS ENZIMÁTICAS OPERAN BAJO LA REGULACIÓN La mayoría de las enzimas no presenta constancia en sus actividades y se pueden modular fácilmente. Esta es una propiedad biológica importante porque permite a las células modificar selectivamente la actividad de ciertas enzimas, para adaptarlos a las necesidades momentáneas que surgen durante la vida de la célula. Muchas cadenas enzimáticas son moduladas por autorregulación, especialmente por el efecto del producto final de la cadena sobre la primera enzima de la secuencia. Por ejemplo, la L-treonina se convierte en L-isoleucina a través de una cadena de cinco enzimas (Figura 3.13). La primera enzima en esta cadena (E1) es la L-treonina desaminasa cuya actividad es reducida o suprimida por la L-isoleucina. Por lo tanto, la falta de L-isoleucina provoca el funcionamiento de la cadena en toda su intensidad, mientras que el exceso de L-isoleucina provoca que la cadena disminuya de ritmo, o incluso detener la producción de más L-isoleucina. Por lo tanto, la concentración de ese aminoácido en la célula se mantiene dentro de los límites normales. En este caso, se trata de una regulación alostérica. La enzima sensible a

este tipo de control – en el ejemplo citado, la L-treonina deaminasa - se llama enzima reguladora y es la sustancia inhibidora – en el caso de la Lisoleucina - que se conoce como efector o modulador. En la regulación alostérica, que es un tipo muy común de regulación enzimática, el efector se combina con la enzima en un lugar diferente del centro activo el cual es denominado centro alostérico. En consecuencia, hay un cambio en la conformación tridimensional de la molécula enzimática, con alteración del centro activo de la enzima cuya actividad catalítica es inhibida (Figura 3.14). Otras veces, la actividad de la enzima es modulada por la interacción con otras proteínas o bien mediante la adición covalente de radicales fosfato a los aminoácidos serina, treonina o tirosina presentes en la molécula enzimática. La fosforilación de proteínas juega un papel regulador importante no sólo en las reacciones metabólicas, sino también en muchos otros procesos celulares tales como el crecimiento, la diferenciación celular, el desmontaje de la envoltura nuclear en la profase y su reorganización en la telofase.

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Figura 3.13 Figura 3.14 Figura 3.13 Regulación (inhibición) alostérica. La L-treonina se transforma en L-isoleucina a través de una cadena de cinco enzimas. Sin embargo, la primera enzima de esta cadena es una proteína alostérica que es inhibida por la L-isoleucina. Por lo tanto, el exceso de L-isoleucina bloquea la síntesis de ese aminoácido y su falta la estimula. Figura 3.14 Esquema didáctico de regulación alostérica. La fijación del modulador en el centro alostérico de la proteína (enzima) modifica el centro activo, impide la unión del sustrato e inhibe la actividad enzimática.

LAS ISOENZIMAS SON MOLÉCULAS LIGERAMENTE DIFERENTES DE LA MISMA ENZIMA Ciertas enzimas existen bajo formas moleculares ligeramente diferentes en los diversos tejidos o en la misma célula de una determinada especie animal. En tales casos, la molécula de enzima se compone de cadenas polipeptídicas (monómeros) diferentes, agrupadas en proporciones variables. Las diferencias de actividad entre las enzimas son consecuencia de las diversas proporciones de los monómeros en sus moléculas. Las enzimas de la misma especie animal que actúan sobre el mismo sustrato, pero que presentan diferencias en la actividad, al pH óptimo de acción, en la movilidad electroforética o en otras características, se llaman isoenzimas. Las diferencias de actividad de las isoenzimas son utilizadas por las células para modular los efectos de estas enzimas, de acuerdo a sus necesidades. Un ejemplo bien estudiado es la isoenzima láctico deshidrogenasa. Su molécula consiste en cuatro cadenas polipeptídicas (monómeros), de dos tipos diferentes, llamados M y H. Conforme a la proporción de estos dos monómeros, hay cinco láctico deshidrogenasas, cuyas moléculas pueden ser representadas como sigue: ■ 1a: 4 cadenas M (M4H0) ■ 2a: 3 cadenas M + 1 cadena H (M3H1) a ■ 3 : 2 cadenas M + 2 cadenas H (M2H2) ■ 4a: 1 cadena M + 3 cadenas H (M1H3) ■ 5a: 4 cadenas H (M0H4) Estas cinco láctico deshidrogenasas se han aislado en forma pura. Todas atacan al mismo sustrato (ácido láctico); Sin embargo, lo hacen a velocidades diferentes. Por lo tanto, desde un punto de vista biológico, la distinción principal entre las isoenzimas es el grado de actividad de cada una. Está demostrado que existe un gen que determina la secuencia de aminoácidos del monómero M y otro que determina la secuencia del monómero H. De acuerdo a la mayor o menor actividad de cada uno de esos genes, hay una mayor producción de ARNm para M o para H y los polirribosomas producen diferentes cantidades de M y H. Como estos monómeros se unen de forma espontánea al azar para constituir las enzimas, las proporciones de M y de H dependen de la actividad de esos genes. Se trata de un control génico, a través del cual, alterando las proporciones de los monómeros producidos (cadenas polipeptídicas), los genes influyen en la estructura cuaternaria de las proteínas y pueden modular su actividad enzimática. La láctico deshidrogenasa es muy importante para la producción de energía en las células anaerobias, tales como algunas bacterias. En los mamíferos, que son seres aerobios, estas enzimas entran en juego cuando hay

una caída en el suministro de oxígeno por la circulación de la sangre (hipoxia); Esto puede suceder, por ejemplo, en el músculo estriado esquelético, cuando se lleva a cabo una muy intensa actividad muscular. Cuando las fibras musculares requieren más oxígeno del que la circulación sanguínea puede proporcionar, estas fibras entran en hipoxia. El piruvato se reduce total o parcialmente a lactato, en lugar de ser totalmente oxidado, tal como cuando no hay hipoxia. LOS VEINTE AMINOÁCIDOS PERMITEN LA CONSTRUCCIÓN DE UNA ENORME VARIEDAD DE MOLÉCULAS PROTEICAS CON DIVERSAS FUNCIONES Las proteínas son los componentes químicos más diversificados de la célula, en virtud de estar compuestos de 20 aminoácidos diferentes. Esta diversificación estructural se refleja en sus múltiples funciones biológicas (Tabla 3.4), por lo tanto, de los componentes macromoleculares de la célula, son los más polifuncionales. Además de la actividad enzimática, las proteínas tienen una función estructural importante (los filamentos intermedios, microfilamentos y microtúbulos), informacional (en las hormonas proteicas) en el movimiento de las células (ejemplificado por la actividad motora del complejo actina-miosina), y finalmente, una pequeña importancia como fuente de energía. Casi la totalidad de la energía consumida por las células es proporcionada por las moléculas de lípidos y carbohidratos. LOS ÁCIDOS NUCLEICOS SON POLÍMEROS DE NUCLEÓTIDOS Los ácidos nucleicos se forman por la polimerización de unidades llamadas nucleótidos. Cada nucleótido contiene residuos de una molécula de ácido fosfórico, una de pentosa y una de una base púrica o pirimidínica (Figura 3.15). Las bases púricas más encontradas en los ácidos nucleicos son la adenina y la guanina (Figuras 3.15 y 3.16) en general designadas con las iniciales A y G, respectivamente. Las principales bases pirimidínicas son la timina, la citosina y el uracilo (Figura 3.16), designadas por las letras T, C y U. Además de los polímeros de nucleótidos, que constituyen las moléculas de los ácidos nucleicos, las células contienen cantidades relativamente grandes de nucleótidos libres desempeñando, en particular, las funciones de coenzimas. Por hidrólisis parcial es posible retirar el radical fosfato de los nucleótidos. Aparecen compuestos llamados nucleósidos constituidos por una pentosa y una base púrica o pirimidínica (Figura 3.17). Los ácidos nucleicos son moléculas informativas que controlan los procesos básicos del metabolismo celular, la síntesis de las macromoléculas, la diferenciación celular y la transmisión del patrimonio genético de una

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célula a su progenie. Cada molécula de ácido nucleico contiene al menos una cadena de nucleótidos (polinucleótido) formada por enlaces de diéster-fosfato entre los carbonos 3 'y 5' de la pentosa, como se muestra en la Figura 3.18. Se distinguen dos tipos de ácidos nucleicos: El desoxirribonucleico o

ADN y el ribonucleico o ARN. En el ADN, la pentosa encontrada es la desoxirribosa y las bases son adenina, guanina, citosina y timina. En el ARN, la pentosa es la ribosa, y hay uridina para reemplazar a la timina; las otras bases son comunes a ambos tipos de ácidos nucleicos (Tabla 3.3).

Figura 3.15 Figura 3.16 Figura 3.15 Nucleótidos del ARN y del ADN. Están señaladas las diferentes bases (uracilo y timina). En el carbono 29, la desoxirribosa contiene al menos un átomo de oxígeno (observe los rectángulos azules). Figura 3.16 Componentes de los ácidos nucleicos (ARN y ADN).

Figura 3.17 Figura 3.18 Figura 3.17 Estructura molecular de los nucleósidos. En el ejemplo, un nucleósido formado por la adenina combinada con la desoxirribosa. Figura 3.18 Polinucleótido de ADN.

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Tabla 3.3 Características de los principales tipos de ácidos nucleicos. ADN

ARNt Ácido fosfórico, ribosa, adenina, guanina, citosina, uracilo, timina, ácido pseudouridílico, 5-metilcitosina, dimetilguanina

ARNm

ARNr

Ácido fosfórico, ribosa, adenina, guanina, citosina y uracilo

Ácido fosfórico, ribosa, adenina, guanina, citosina y uracilo

Componentes

Ácido fosfórico, desoxirribosa, adenina, guanina, citosina y timina

Funciones

Controla todo el funcionamiento de la célula; transmite la información genética para las otras células

Transporta los aminoácidos, uniendo su anticodón al codón del ARNm; determina la posición de los aminoácidos en las proteínas

A través de la secuencia de sus bases, determina la posición de los aminoácidos en las proteínas

Se combina con el mensajero para formar polirribosomas

Ubicación

Núcleo de las células eucariotas, nucleoide de las procariotas; mitocondrias y cloroplastos; algunos virus

Principalmente en el citoplasma; menor cantidad en el núcleo

Principalmente en el citoplasma; menor cantidad en el núcleo

Principalmente en el citoplasma; menor cantidad en el núcleo

Tamaño de la molécula

Muy grande; difícil de determinar

25 a 30 kDa (kilodaltons)

Depende del tamaño de la proteína que codifica; 4 variable entre 5 x 10 a 5 x 16 10 daltons

5 S a 28 S (S = Svedberg)

Filamentos simples

Ribosoma; Tamaño: células eucariotas 2,3 nm (80 S), células procariotas 1,8 nm (70 S)

Forma

Doble hélice

Filamentos simples, en ciertos virus

“Hoja de trébol”

EL ADN ES EL DEPOSITARIO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA Y LA TRANSMITE A LAS CÉLULAS HIJAS El ácido desoxirribonucleico o ADN es el responsable del almacenamiento y transmisión de la información genética. Se encuentra principalmente en los cromosomas nucleares y, en pequeñas cantidades, en los cromosomas de las mitocondrias y de los cloroplastos. En los cromosomas de las células eucariotas, el ADN se asocia con proteínas básicas, especialmente histonas. La molécula de ADN consiste en dos cadenas de nucleótidos dispuestos helicoidalmente alrededor de un eje. El paso de estas hélices se dirige en el sentido de la izquierda hacia la derecha (figuras 3.19 y 3.20). La dirección de los enlaces 3 'y 5' diéster-fosfato de una cadena se invierte con respecto a la otra cadena, como se muestra en la Figura 3.19. Se dice que estas cadenas son antiparalelas. Como resultado, en cada extremo de la molécula una de las cadenas de polinucleótidos termina en 3 'y la otra en 5' (Figura 3.19). Las bases púricas y pirimidínicas de cada cadena de polinucleótidos se encuentran dentro de la doble hélice, en planos paralelos entre sí y perpendiculares al eje de la hélice, como si fuesen peldaños de una escalera. En cada plano o “peldaño”, la base de una cadena se empareja con la base de la cadena complementaria. Debido al tamaño de las moléculas de las bases, el emparejamiento sólo tiene lugar entre timina y adenina o entre guanina y citosina de las hebras complementarias. Por lo tanto, considerando los dos polinucleótidos que constituyen la molécula de ADN, las bases están siempre apareadas en la secuencia T-A o G-C, lo que explica la existencia, en el ADN, de un número igual de moléculas de T y A, y G y C. En la doble hélice, las bases están unidas por enlaces puente de hidrógeno (Figura 3.19), siendo los principales responsables de la estabilidad de la hélice. Cuando los enlaces puente de hidrógeno se rompen - por ejemplo, por el calentamiento del ADN en solución-, las dos cadenas de polinucleótidos de la hélice sufren desnaturalización, separándose; cuando baja la

temperatura, se unen de nuevo. La desnaturalización por la ruptura de los enlaces puente de hidrógeno puede ser completa o parcial (Figura 3.21). Esta desnaturalización se produce antes en las uniones AT, que tienen dos enlaces puente de hidrógeno, siendo los enlaces CG más resistentes ya que tienen tres enlaces puente de hidrógeno (Figura 3.19). La desnaturalización parcial permite la identificación de las áreas ricas en AT y áreas ricas en GC, siendo estos últimos segmentos más resistentes a la desnaturalización. En las moléculas de ADN simples, tales como las de los bacteriófagos, esta técnica permite la localización de zonas con diferentes frecuencias de nucleótidos a lo largo de la cadena de ADN. A lo largo de la molécula de ADN, cada vuelta completa de la hélice contiene 10 nucleótidos (Figura 3.20). La doble hélice tiene un diámetro de 2 nm, y su superficie muestra dos surcos, una de las cuales es más pronunciado que el otro. Las bases (hidrofóbicas) se encuentran dentro de la hélice, y los residuos de desoxirribosa (hidrofílicos) y de ácido fosfórico (ionizado e hidrofílico) se encuentran en la periferia, en contacto con el agua intracelular. Además de los enlaces puente de hidrógeno que representan el elemento de unión principal entre las dos hebras polinucleotídicas de la doble hélice, la interacción hidrofóbica de las bases pareadas contribuye a mantener la estabilidad de la hélice de ADN. Los grupos fosfóricos ionizados negativamente, permiten al ácido desoxirribonucleico combinarse con las proteínas básicas, es decir, cargadas positivamente, o con otras moléculas eléctricamente positivas. Debido a su fragilidad y su enorme longitud, ha sido difícil determinar el tamaño exacto de las moléculas de ADN. Se sabe, por ejemplo, que la molécula de ADN del bacteriófago lambda, que infecta a la bacteria Escherichia coli, tiene un peso de 32 millones de daltons y una longitud de 17,2 mm. En la Escherichia coli, el cromosoma es una molécula de ADN, con una longitud de 1,2 mm y un peso molecular de 2800 millones de daltons.

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Figura 3.19 Pequeña parte de una molécula de ADN que muestra la disposición antiparalela de los polinucleotídios. Entre T y A hay dos enlaces puente de hidrógeno, y entre G y C, tres.

Figura 3.20 Esquema de la estructura en doble hélice de ADN, según Watson y Crick. A, adenina; T, timina C, citosina; G, guanina; P, fosfato y S, desoxirribosa.

EL ARN TRANSFIERE LA INFORMACIÓN GENÉTICA DEL ADN A LAS PROTEÍNAS A diferencia del ADN, cuya molécula está casi siempre formada por dos cadenas de polinucleótidos, la molécula de ARN es de cadena sencilla, y existe sólo excepcionalmente en forma de dobles cadenas complementarias. En ambos casos, las excepciones se encuentran en los virus: algunos tienen una sola hebra de ADN, mientras que otros tienen ARN de doble cadena complementaria. Desde los puntos de vista funcional y estructural, se distinguen tres variedades principales de ácido ribonucleico: ■ ARN de transferencia o ARNt ■ ARN mensajero o ARNm ■ ARN ribosomal o RNAr.

ARN de transferencia

De los tres tipos de ácido ribonucleico, el ARNt es el que tiene las molécu-

las de menor tamaño; están compuestas de 75 a 90 nucleótidos y tienen un peso molecular entre 23 kDa y 30 kDa. Su función es transferir los aminoácidos a las posiciones correctas en las cadenas polipeptídicas en formación en los complejos de ribosomas y ARN mensajero (polirribosomas). Para ello, el ARNt tiene la propiedad de combinarse con los aminoácidos y es capaz de reconocer ciertos sitios de la molécula de RNAm que consiste en una secuencia de tres bases. Tales secuencias, típicas para cada aminoácido, son conocidas como codón. La secuencia de tres bases en la molécula de ARNt y que reconoce el codón se llama anticodón (Figura 3.22). Para cada aminoácido hay al menos un ARNt. La molécula de ARNt es un filamento con un extremo que termina siempre en la secuencia CCA, es decir, el ácido adenilico (A) precedido por dos moléculas de ácido citidilico (C). Gracias a un proceso enzimático que consume energía liberada por la hidrólisis de ATP (Capítulo 4), un hidroxilo del ácido adenilico del extremo

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CCA está esterificado por un L-aminoácido, formándose de este modo una molécula de Acil-ARNt. La enzima que cataliza esta esterificación es específica para cada aminoácido. La molécula de ARNt tiene una región que es reconocida por la enzima, y por lo tanto, cada aminoácido está unido a su ARNt. Debido a los enlaces puente de hidrógeno que se establecen entre sus bases, todos los ARNt presentan segmentos de las moléculas formadas por una doble hélice. La representación plana, esquemática, de la molécula de ARNt (Figura 3.22) tiene la apariencia de una hoja de trébol, que muestra el anticodón en uno de sus lados. Además de la bases adenina, guanina, citosina y uracilo, comúnmente encontradas en el ARN, el ARNt contiene otras bases que no aparecen en los otros tipos de ácido ribonucleico (Tabla 3.3). Entre estas bases típicas del ARNt están, por ejemplo, la hipoxantina y la metilcitosina. El ARNt todavía tiene ácido ribotimidilico, que es un nucleótido constituido por ácido fosfórico, ribosa y la base timina, base que se encuentra comúnmente en el ADN. Además, el ARNt tiene en su molécula ácido pseudouridi-

lico, que difiere del ácido uridilico común por presentar una ribosa unida al carbono 5 de del uracilo, y no al nitrógeno 3 como es habitual (Fig 3:23). En conclusión, vemos que el ARNt tiene características que lo diferencian de los otros tipos de ARN, lo que facilita su identificación. Las regiones del ARNt que contienen las bases inusuales pueden ser importantes en la determinación de la forma de la molécula, ya que estas regiones no forman enlaces puente de hidrógeno entre las bases (Figura 3.22). Los ARNt se sintetizan inicialmente en las hebras de ADN como grandes moléculas que pasan a través de un procesamiento (splicing) haciéndose cada vez más pequeñas, antes de migrar al citoplasma. Este procesamiento de ARNt implica la remoción de determinados pedazos de la molécula más grande y la ensambladura de los fragmentos que constituirán la molécula final de ARNt. Es un proceso similar al que se describirá más adelante en este capítulo al examinar el ARNm donde ha sido más estudiado.

Figura 3.21 Figura 3.22 Figura 3.21 Desnaturalización parcial de la molécula de ADN del bacteriófago T7. La separación de los segmentos polinucleotídicos es más precoz en los segmentos con abundancia de enlaces AT (flechas) porque entre A y T sólo hay dos enlaces puente de hidrógeno. Micrografía electrónica. (H.J.Vollenweider, J.M. Sogo y T. Koller Proc. Nat.Acad.Sci. EUA, 72: 83, 1975. Reproducida con permiso.) Figura 3.22 Estructura del ARN de transferencia para el aminoácido tirosina. Además de las bases habituales, este ARNt tiene las siguientes bases: mG = N-2-metilguanosina; dhU = N-6-di-hidrouridina; omG = 2'-O-metilguanosina; dmG = 2'-dimetilguanosina; dmA N-6-dimetiladenosina; 5mC = 5-metilcitosina. La letra griega psi () representa el ácido pseudouridilico.

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Figura 3:23 Dos nucleótidos encontrados en el ARNt: en el ácido pseudouridilico, la ribosa se une al carbono 5 de la uridina, y no al carbono 3, como ocurre en el ácido uridilico. El ácido ribotimidilico contiene timina, una base que generalmente se encuentra en el ADN.

ARN mensajero

El ARNm se sintetiza en los cromosomas, tales como los demás ARN de la célula, y representa la transcripción de un segmento de una de las hebras de la hélice del ADN. Tenga en cuenta que durante la síntesis del ARNm, los filamentos de un segmento de la molécula de ADN se separan temporalmente. El peso molecular del ARNm varía según el tamaño de la molécula proteica que este codificará en el citoplasma. Por supuesto, la molécula de ARNm es mucho mayor que la proteína formada por ella, porque se requieren tres nucleótidos para codificar un aminoácido. Además, muchas proteínas se sintetizan con un segmento extra, formado por varios aminoácidos que son removidos en el acabado final de la proteína. Por lo tanto, el peso molecular del ARNm es del orden de cientos e incluso miles de daltons. En las células procariotas, las moléculas de ARNm pueden ser incluso mayores, porque en las bacterias una larga molécula de ARNm puede ser traducida a partir de sitios diferentes, originando más de una proteína, conforme al sitio del ARNm en el que la traducción tuvo inicio. Cada molécula de ARNm tiene una extensión (tail) de poli-A que es adicionado en el interior del núcleo celular, de manera que la molécula de ARNm es transcripta por una enzima que no requiere molde de ADN (template). Por lo tanto, este segmento del ARNm no está codificado en el ADN. En el otro extremo del ARNm (extremo 5'), una pequeña capucha ( cap ) de nucleótidos es añadida por otras enzimas. Los ARNm citoplásmicos derivan de precursores nucleares conocidos como hnRNA (heterogenous RNA), llamado así debido a que tienen una gran heterogeneidad en los pesos moleculares y en la composición de nucleótidos. La mayoría de los hnRNA tienen moléculas enormes, hasta 50.000 nucleótidos. Estas moléculas se rompen en el núcleo, de una manera ordenada. Ciertos pedazos son removidos y los extremos de los segmentos que codifican proteínas se unen (splicing), formándose la molécula terminada de ARNm que migra hacia el citoplasma. Se desprende de lo anterior que, en las células eucariotas, el ADN que transcribe los ARNm está constituidos por partes que van a ser traducidas en proteínas llamadas exones, y en partes que sólo separan los exones. Estas partes "silenciosas" son llamadas intrones (capítulo 9). Por lo tanto, el ADN inicialmente transcribe una molécula enorme de hnRNA de los cuales los segmentos sin significado para la síntesis proteica son removidos, ocurriendo entonces un ensamble preciso de los segmentos que llevan la codificación para un tipo de molécula proteica, y así, queda forma-

da una molécula de ARNm. Sin embargo, algunos genes no contienen intrones y las moléculas de ARNm se forman directamente a partir del ADN, hnRNA sin pasar por la etapa de hnRNA. Los intrones y el hnRNA sólo fueron encontrados en las células eucariotas y es muy improbable que existan en procariotas.

ARN ribosomal

El ARN ribosomal es mucho más abundante que los otros dos tipos de ARN, constituyendo el 80% del ARN celular. Existe combinado con las proteínas, formando partículas fácilmente visibles en el microscopio electrónico y llamadas ribosomas. Cuando se une a filamentos de ARNm, los ribosomas forman los polirribosomas (Figura 3.24), en los cuales tiene lugar la síntesis de proteínas. Existen en las células dos tipos de ribosomas que se distinguen por sus coeficientes de sedimentación determinados en la ultracentrífuga y expresados en unidades S o Svedberg. Los ribosomas de las células procariotas tienen un coeficiente de sedimentación de 70 S y son más pequeños que los ribosomas de las células eucariotas, cuyo coeficiente de sedimentación es de 80 S. Ambos tipos de ribosomas están formados por dos subunidades una mayor y una menor con diferentes características funcionales y estructurales. Las subunidades están ligadas de una manera reversible al comienzo de la síntesis de la molécula proteica, separándose cuando la proteína está terminada. La subunidad mayor de los ribosomas de las células eucariotas contiene tres tipos de ARN con una sedimentación de 28 S, 5,8 S y 5 S, y la subunidad mayor de los ribosomas procariotas, dos tipos de ARN: uno de 23 S y otro de 5 S. La subunidad menor tiene sólo un tipo de ARN: 18 S en las células eucariotas y 16 S en las procariotas. Los ribosomas de las mitocondrias y de los cloroplastos son iguales a los de las células procariotas, dato que apoya la interpretación de que estos dos orgánulos transductores de energía se originaron a partir de bacterias que se convirtieron en simbiontes de las células eucariotas. Alrededor de 50 variedades de proteínas se han identificado en los ribosomas y constituyen aproximadamente la mitad de la masa de estos corpúsculos. La basofilia citoplasmática demostrable por los colorantes básicos y removible por la ribonucleasa se debe a los ribosomas. Estos son particularmente abundantes en las células que sintetizan grandes cantidades de proteínas, las cuales tienen el citoplasma fuertemente basófilo.

Figura 3.24 Combinación de ARN mensajero con ribosomas para formar polirribosomas.

EL ARN PUEDE TENER ACCIÓN ENZIMÁTICA En algunos casos, el ARN tiene una acción catalítica, actuando como una enzima. La actividad catalítica del ARN fue descubierta mediante el estudio de la síntesis de los ARN de Tetrahymena, un protozoo ciliado. Se descu-

brió que estos ARN son inicialmente moléculas muy grandes de los cuales determinados segmentos son removidos y las partes restantes son ensambladas (splicing), formándose así la molécula final de ARNm. Todo el proceso se lleva a cabo como se evidencia in vitro, sin la participación de

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las proteínas enzimáticas. El segmento de ARN que será removido (intron) cataliza su propia remoción y la unión de los extremos de la molécula partida. Este segmento de ARN, in vitro, es capaz de catalizar la polimerización de polinucleótidos pequeños polinucleotídios en polinucleótidos con más de 30 nucleótidos, por lo que recibe el nombre de ribozima. Otros ARN con actividad catalítica fueron descubiertos poco después, como por ejemplo, los ARNt, que, por lo general, también se sintetizan en tamaño grande. En este caso, se observó que la escisión para producir la molécula de ARNt final, de menor tamaño, es catalizada por un complejo de ARN-proteína (ribonucleasa P); pero la actividad enzimática y la especificidad de este complejo son más dependientes del ARN que de la proteína. Separándose el complejo ARN-proteína en sus dos partes, sólo el ARN tiene actividad catalítica, aunque todo el complejo es más activo. Por lo tanto, en este caso el RNA es esencial para la actividad enzimática y la proteína tiene un papel secundario auxiliar. El descubrimiento de que el ARN puede tener actividad enzimática tuvo un gran impacto en las hipótesis en cuanto al origen de la vida en la Tierra. Es posible que la molécula inicial de las futuras células haya tenido sido un ARN capaz de autorreplicación. Este ARN primordial habría servido de molde (template) para el ADN, iniciando entonces la síntesis dirigida de las proteínas. LAS MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO SE PUEDEN CARACTERIZAR POR LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN Existen en el citoplasma muchos ARN diferentes, necesarios para la síntesis de muchas proteínas celulares. La caracterización de los ARN mensajeros no es fácil. Una técnica que ha sido muy útil para su estudio es la hibridación con el ADN. La doble hélice de ADN está formada por dos cadenas unidas por enlaces puente de hidrógeno que son fuerzas débiles. Estas dos cadenas se pueden separar fácilmente por calentamiento suave y pueden recombinarse mediante un enfriamiento lento; Sin embargo, las hebras separadas de ADN pueden combinarse con moléculas de ARN, método muy seguro para la caracterización de una molécula de ARN, ya que sólo se combina exclusivamente con el segmento de ADN del cual fue transcripta. LOS LÍPIDOS FORMAN RESERVAS NUTRITIVAS Y TIENEN UNA FUNCIÓN ESTRUCTURAL EN LAS MEMBRANAS CELULARES Los compuestos de carbono extraídos a partir de células y tejidos por disolventes orgánicos no polares - tales como el éter, cloroformo y benceno - se llaman lípidos. Debido a que se definen por su solubilidad en estos disolventes, y no por la estructura química, el grupo de los lípidos comprende sustancias con moléculas muy diferentes. De acuerdo con sus funciones principales, los lípidos celulares se pueden dividir en dos categorías: los lípidos de reserva nutritiva y los lípidos estructurales. Estos tienen papel importante en el mantenimiento de la estructura de las membranas celulares (capítulo 5). Las vitaminas A, E y K son lípidos dotados de importantes actividades fisiológicas. Las hormonas esteroides, entre las cuales están las de la glándula suprarrenal, las del ovario y las de los testículos, y el 1,25dihidroxicolecalciferol (sustancia activa formada en el organismo de los mamíferos a partir de la “vitamina” D) son lípidos de información (trans-

portan informaciones). Sin embargo, como ejercen funciones especializadas, y no son componentes generales de las células, no serán explicados en este capítulo. ► Lípidos de reserva nutritiva. Las reservas nutritivas de naturaleza lipídica se componen principalmente de triacilgliceroles (triglicéridos). Son compuestos formados de ácidos grasos combinados con glicerol con enlaces ésteres que se forman por la remoción de agua (Figura 3.25). Los triglicéridos se sintetizan mediante la adición de un ácido graso por vez. Por lo tanto, los monoglicéridos contienen sólo un ácido graso esterificado; los diglicéridos contienen dos y los triglicéridos, tres ácidos grasos. Los glicéridos, con predominancia de los triglicéridos, están presentes en el citoplasma de casi todas las células; sin embargo, hay células especializadas para el almacenamiento de estos compuestos ricos en energía, llamadas células adiposas. Los ácidos grasos de un triglicérido pueden ser idénticos, pero generalmente varian en el tamaño de sus moléculas y en el grado de saturación. Se dice de ácidos grasos saturados cuando no tiene dobles enlaces entre sus átomos de carbono y no puede recibir más átomos de H. Aunque representan principalmente las reservas de energía, los triacilgliceroles realizan otras funciones. Por ejemplo, como son buenos aislantes térmicos, ofrecen protección contra el frío para los animales que viven en ambientes donde la temperatura es baja, como los osos, pingüinos y otros. En estos animales existe una capa de células adiposas bajo la piel, que actúa como un eficiente aislante térmico. Los triglicéridos que contienen muchos ácidos grasos saturados son sólidos o semisólidos a temperatura ambiente, siendo llamados grasas. Las grasas predominan en el cuerpo de los animales. En las plantas, la mayoría de los triglicéridos son líquidos a temperatura ambiente y son conocidos como aceites vegetales. La abundancia de ácidos grasos insaturados, cuyas moléculas tienen forma irregular, impide la ordenación de las moléculas para formar el estado sólido. Por lo tanto, los aceites vegetales tienen un menor punto de fusión. Estos aceites son metabolizados más fácilmente por el cuerpo de los animales. Sin embargo, los aceites vegetales pueden ser convertidos en una masa sólida por el proceso de hidrogenación industrial. ►Lípidos estructurales. Estos lípidos son componentes estructurales de todas las membranas celulares: membrana plasmática, envoltura nuclear, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, endosomas, mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, etc. Muchas de las propiedades de estas membranas se derivan de las características químicas y físicas de sus lípidos. Los lípidos estructurales son más complejos que los de reserva. Sus moléculas son largas y equipadas con un extremo polar - es decir, con carga eléctrica - y una larga cadena apolar, no ionizada. El extremo polar es hidrofílico, mientras que la parte apolar, constituida por lo general por dos cadenas alifáticas, es hidrofóbica y, por lo tanto, soluble en lípidos. Los lípidos que realizan un papel esencialmente estructural, formando parte del sistema de membranas de las células, son los fosfolípidos (fosfoglicéridos y esfingolípidos), los glicolípidos y el colesterol.

Figura 3.25 Sustitución de los hidroxilos de la glicerina por ácidos grasos para formar una molécula de triacilglicerol o triglicérido (grasa neutra).

► Fosfoglicéridos. En estos fosfolípidos, uno de los hidroxilos primarios, es decir, el del carbono 1 o al del 3 del glicerol, está esterificado por el ácido fosfórico. Los otros dos hidroxilos son esterificados por ácidos grasos, siendo el ácido graso del carbono 2 en general insaturado (Figura 3.26). El fosfoglicérido más simple es el ácido fosfatídico, constituido solamente por un residuo de glicerol, uno de ácido fosfórico y dos de ácidos grasos. El ácido fosfatídico existe en pequeñas cantidades en las membranas celulares. Los fosfoglicéridos más encontrados en estas membranas son la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina y el fosfatidilinositol. ► Esfingolípidos. Un ejemplo de esfingolípido es la esfingomielina, muy abundante en las vainas de mielina del tejido nervioso. La vaina de mielina actúa como aislante eléctrico de las extensiones (axones) de las células nerviosas, siendo formadas por pliegues concéntricos de la membrana plasmática de células especializadas. La esfingomielina está constituida por una molécula de colina, una de ácido fosfórico, una de esfingosina y una de ácido graso (Figura 3.27). La principal característica estructural de los esfingolípidos es la presencia de una larga cadena de esfingosina, junto con una cadena de ácido graso, que se une a la esfingosina a través de un enlace éster (Figura

3.27). Como los fosfoglicerídios, los esfingolípidos tienen un extremo polar y dos colas no polares. Los glicolípidos tienen extremos polares formados por hidratos de carbono, especialmente D-galactosa (Figura 3.28). Sus moléculas están generalmente constituidas por moléculas glucídicas, una molécula de glicerol y dos de ácidos grasos. Los glicolípidos no contienen ácido fosfórico. Entre los principales glicolípidos, se encuentran los gangliósidos que tienen carbohidratos muy complejos. Por ejemplo, del tejido nervioso se aisló el gangliósido Gm2 constittuido por las siguientes moléculas: un ácido graso, esfingosina, D-glucosa, D-galactosa, N-acetil-D-galactosamina y el ácido N-acetilneuramínico. Los cerebrósidos (Figura 3.29) son glicoesfingolípidos, porque sus moléculas contienen esfingosina y carbohidratos. Los cerebrósidos son abundantes en las membranas de las células del tejido nervioso, especialmente en las vainas de mielina. ► Colesterol. El colesterol es un esterol, es decir, un compuesto que contiene el núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno, con un hidroxilo en el carbono 3 y una cadena alifática, con ocho o más átomos de carbono, unida al carbono 17 del núcleo (Figura 3.30). El colesterol está presente en la membrana plasmática de las células animales, lo que pasa, sin embargo, pero en cantidad mucho menor en las

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membranas de las mitocondrias y del retículo endoplásmico. El colesterol reduce la fluidez de las membranas (capítulo 5). Las células de las plantas no contienen colesterol, que se sustituye por otros esteroles, denominados colectivamente fitoesteroles. La presencia de largas cadenas hidrofóbicas en los lípidos es de gran importancia biológica, ya que son estas las que permiten la interacción hidrofóbica responsable de la asociación de lípidos para formar la bicapa lipídica de las membranas celulares. La fijación de las proteínas integrales de las membranas se produce por la interacción de las partes hidrofóbicas

de las moléculas de estas proteínas con los lípidos de las membranas. La interacción hidrofóbica es también importante en el transporte de lípidos en el plasma. Por ejemplo, los esteroides circulan unidos a una región hidrofóbica de la superficie de la molécula de albúmina, que es soluble en agua. Los lípidos tienen menor diversidad funcional que la de las proteínas y polisacáridos; presentan, principalmente, una función estructural y energética. Su actividad informativa se limita a algunas hormonas esteroides.

Figura 3.26 Figura 3.27 Figura 3.28 Figura 3.26 Fórmula de los fosfoglicéridos. El radical R puede ser la colina, la etanolamina, la serina o la treonina. Estos fosfolípidos son llamados fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidiltreonina respectivamente. Figura 3.27 Fórmula de la molécula de esfingomielina. Figura 3.28 Fórmula de la molécula de un glicolípido.

Figura 3.29 Figura 3.29 Fórmula de la molécula de un cerebrósido. Figura 3.30 Fórmula de la molécula de colesterol. La parte cíclica de la molécula es común a todos los esteroides.

Figura 3.30

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Bases Macromoleculares de la Constitución Celular

3

LOS POLISACÁRIDOS FORMAN RESERVAS NUTRICIONALES Y SE UNEN LAS PROTEÍNAS PARA FORMAR GLICOPROTEÍNAS (FUNCIÓN ENZIMÁTICA Y ESTRUCTURAL) Y PROTEOGLICANOS (FUNCIÓN ESTRUCTURAL) Los polisacáridos son polímeros de monosacáridos. Hay polisacáridos con moléculas lineales, mientras que otros tienen moléculas ramificadas. La molécula de algunos polisacáridos consiste en la repetición de un único tipo de monosacárido; son los polisacáridos simples u homopolímeros. Por ejemplo, el almidón y el glucógeno son polímeros simples de D-glucosa y no contienen otro tipo de molécula. Los polisacáridos complejos (heteropolímeros), formados por más de un tipo de monosacárido, son menos frecuentes en las células, pero algunos son biológicamente muy importantes. Los polisacáridos asociados con la superficie exterior de la membrana celular desempeñan un papel estructural e informativo, muchas veces formando parte de las moléculas de los receptores. También se encuentran como reserva de nutrientes que la célula utiliza cuando hay necesidad metabólica. ► Polisacáridos de reserva. Los polisacáridos de reserva son el glucógeno en las células animales, y el almidón en las células vegetales; son ambos polímeros de D-glucosa. ► Glucógeno. El glucógeno se produce en el citoplasma de las células animales en forma de gránulos, con un diámetro de 15 a 30 nm, por lo general dispuestos en aglomerados (Capítulo 1, Figura 1.7). Los gránulos de glucógeno, aparte del polisacárido, contienen proteínas, como las enzimas responsables de la síntesis de glucógeno y la despolimerización. La D-glucosa recibida por la célula en exceso es añadida, mediante un proceso enzimático, a los extremos de la molécula de glucógeno. En tiempos de necesidad, también por actividad enzimática, se liberan moléculas de D-glucosa, que se utilizan para los procesos metabólicos de la célula. Algunas células, tales como las del hígado, liberan glucosa a la sangre para mantener una concentración estable de glucosa en el plasma sanguíneo, lo

que es de gran importancia para las funciones de varios tejidos del cuerpo. La molécula de glucógeno tiene dimensiones variables y está muy ramificada en todas las direcciones del espacio. La figura 3.31 es una representación esquemática en dos dimensiones. ► Almidón. A diferencia de la célula animal, que almacena glucógeno, la célula vegetal tiene almidón como una reserva de energía. El almidón se compone de dos tipos de moléculas; la amilosa, un polímero lineal, y la amilopectina, un polímero ramificado, ambos compuestos por unidades de glucosa. ► Polisacáridos estructurales y de información. Además de los polisacáridos de reserva de nutrientes (almidón y glucógeno) células sintetizan otros polisacáridos que forman parte de la superficie celular donde participan en el reconocimiento entre las células para constituir los tejidos, la formación de los receptores celulares y de las uniones estructurales entre el citoplasma y matriz extracelular (Capítulo 12). Combinados con proteínas, los polisacáridos estructurales forman parte del glicocálix de las células animales, de la pared celular bacteriana y de las paredes celulares de las plantas. La mayoría de los polisacáridos estructurales y de información son heteropolímeros. Debido a su complejidad, la estructura de muchos de ellos no ha sido dilucidada. Ellos constituyen los glicosaminoglicanos, que se unen a las proteínas para formar los proteoglicanos, y la porción glucídica de las glicoproteínas, cuya estructura general se explica en el capítulo 12. La tabla 3.4 proporciona una visión general de la diversidad funcional y estructural de los principales componentes macromoleculares de las células. Los polisacáridos tienen funciones energéticas, estructurales y de información (glicocálix, hormonas glicoproteicas).

Figura 3.31 Esquema plano de la molécula de glucógeno, que, en realidad, se ramifica en todas las direcciones del espacio, como las ramas de un árbol. Cada círculo representa un residuo de glucosa.

Tabla 3.4 principales funciones celulares de las moléculas – en orden creciente de su diversidad funcional Tipo de molécula

Ácido nucleico (ADN y ARN)

Lípido

Polisacárido

Proteína

Grado de diversidad funcional

1

2

3

4

Energética Estructural Informativa

Enzimática Estructural Informativa Movimiento celular Energética

Funciones

Informativa

RESUMEN Existe, en las células, un predominio absoluta de los compuestos de carbono, a pesar de que son extremadamente raros en la litosfera (corteza terrestre). Esto sugiere que las primeras células se formaron con estos compuestos y que esta selección fue transmitida a las células siguientes durante el proceso evolutivo. Las funciones vitales dependen de la presencia de macromoléculas poliméricas de compuestos de carbono. Estos polímeros se forman por la asociación, en un número variable de unidades

Energética Estructural Informativa

o monómeros, que pueden ser iguales, como en los homopolímeros, tales como el glucógeno, o diferentes, como en los heteropolímeros, tales como los ácidos nucleicos. Los biopolímeros más importantes son las proteínas, formadas por los aminoácidos, los polisacáridos formados por los monosacáridos y los ácidos nucleicos formados por los nucleótidos. Es muy común la asociación de macromoléculas para formar complejos como las lipoproteínas, glicoproteínas, proteoglicanos y nucleoproteínas (ácidos nucleicos y proteínas).

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La asociación entre el agua y la vida es bien conocida, y toda célula es, obviamente, rica en agua. La molécula de agua es un dipolo, con un extremo eléctricamente más negativo (más rico en electrones) que el otro. Por sus propiedades, las moléculas de agua influyen poderosamente en los procesos metabólicos, también participando en la configuración espacial de las macromoléculas y, por lo tanto, la actividad funcional de estas. Las proteínas tienen una función enzimática y participan en la estructura y de los movimientos celulares. El papel de los ácidos nucleicos es principalmente informativo: constituyen los genes y son responsables de la expresión de la información contenida en ellos. Excepcionalmente, el ARN puede tener actividad enzimática. Los lípidos están presentes en todas las membranas celulares, en las cuales tienen una función estructural, y como depósitos citoplasmáticos, también representan una reserva de nutrientes que se metaboliza para proporcionar energía para la célula. Los polisacáridos en combinación con las proteínas tienen una función estructural. Aisladamente, se encuentran en forma de almidón, en las células vegetales y de glucógeno en las células animales, lo que representa un material energético importante.

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Papel de las Mitocondrias en la Transformación y Almacenamiento de la energía

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    

La glucólisis anaerobia sólo produce 2 moles de ATP por mol de glucosa Gracias a la fosforilación oxidativa cada mol de glucosa produce más de 36 moles de ATP A menudo, las mitocondrias se encuentran en lugares cercanos a los que necesitan de energía (ATP) Ultraestructura y organización funcional de las mitocondrias La transferencia de energía para la conversión de ADP en ATP se debe a un proceso quimiosmótico Las mitocondrias tienen su propio genoma, aunque incompleto

  

Origen de las mitocondrias Resumen Bibliografía

Para llevar a cabo sus actividades, las células utilizan la energía contenida en los enlaces químicos de los nutrientes, la que en general se transfiere a la adenosina trifosfato (ATP), el principal combustible celular; la enzima ATPasa rompe la molécula de ATP, liberando energía y originando adenosina difosfato (ADP) y fosfato inorgánico (Pi) La transferencia de energía de los nutrientes al ATP también puede ser realizada en el citosol sin la participación de las mitocondrias, por la fermentación (anaerobia), pero este proceso aporta sólo una pequeña parte de la energía de los nutrientes Las mitocondrias tienen la maquinaria para la fosforilación oxidativa (aerobia), muy eficiente en la transferencia de energía de los nutrientes al ATP La teoría quimiosmótica admite que la energía de los nutrientes se utiliza para generar un flujo de protones (H+), cuya energía forma ATP a partir de ADP Cada mitocondria contiene un genoma constituido por filamentos circulares de ADN de doble hélice, que codifican ARN y algunas, pero no todas, proteínas mitocondriales El genoma mitocondrial es muy compacto; con la excepción del lugar de origen de replicación, su ADN y codificador a lo largo de toda su longitud, sin secuencias no codificantes (no contiene intrones) Principalmente por falta de mecanismos de reparación del ADN, el genoma mitocondrial tiene una muy alta tasa de mutación de 5 a 10 veces mayor que la del ADN nuclear, que cuenta con procesos de reparación muy eficientes El código genético del ADN mitocondrial es ligeramente diferente del código que se supone que es el mismo desde las bacterias hasta los seres humanos

L

a energía utilizada por las células eucariotas para llevar a cabo sus actividades proviene de la ruptura gradual de enlaces covalentes de las moléculas de compuestos orgánicos ricos en energía. En la célula vegetal (Capítulo 13), estos compuestos se sintetizan con la energía resultante de la transformación de energía solar en energía química durante la fotosíntesis (photon, luz y síntesis, síntesis). En la fotosíntesis, gracias principalmente al pigmento clorofila, se procesa la acumulación de la energía solar en forma de enlaces químicos en los hidratos de carbono, especialmente hexosas, que se polimerizan para formar almidón. Las hexosas originadas en la fotosíntesis son una fuente de energía y también de carbono capaz de ser utilizado para la síntesis de diversas macromoléculas. Las células, sin embargo, no utilizan directamente la energía liberada de los hidratos de carbono y lípidos, pero utilizando un compuesto intermedio, trifosfato de adenosina (ATP), generalmente producido debido a la energía contenida en las moléculas de glucosa y de ácidos grasos. En los animales, los ácidos grasos son, desde el punto de vista cuantitativo, una fuente energética más importante que la energía aportada por los hidratos de carbono. Mientras que una molécula-gramo (mol) de glucosa genera 38 moles (moléculas-gramo) de ATP, una de ácido palmítico genera 126 moles de ATP. Un hombre adulto tiene energía depositada en forma de glucógeno suficiente sólo por un día, pero grasas (ácidos grasos) suficientes como para proporcionar energía durante 1 mes. Cuando el cuerpo está en reposo, las células utilizan más glucosa a partir del glucógeno, sin embargo, durante el ejercicio, hay movilización de los ácidos grasos depositados en la grasa. El ATP (Figura 4.1) tiene dos enlaces ricos en energía (representados por el signo ~); cuando uno de ellos se rompe, libera aproximadamente10 kilocalorías por mol. Generalmente, sólo un enlace se rompe, de acuerdo con la ecuación de la energía ATP  ADP + Pi + energía (Pi significa fosfato inorgánico y ADP, difosfato de adenosina).

El citoplasma contiene energía almacenada en los depósitos de moléculas de triacilglicéridos (grasas neutras), de moléculas de glucógeno y también en la forma de compuestos intermedios (metabolitos) ricos en energía, de los cuales el más importante es ATP, principal combustible de la célula. Los triacilglicéridos y el glucógeno representan la acumulación de la energía en una forma estable yconcentrada, pero difícilmente accesible, mientras que el ATP es un compuesto inestable, que no contiene energía tan concentrada, pero fácilmente utilizable porque la enzima que descompone la molécula de ATP (ATPasa) es muy abundante en la célula. La descomposición de la glucosa en agua y dióxido de carbono, que se produce durante la respiración celular, rinde 690 kcal / mol, mientras que la hidrólisis de los dos enlaces ricos en energía del ATP rinde 20 kcal/ mol. El glucógeno y las grasas se pueden comparar con el dinero en el banco, y el ATP con el dinero en el bolsillo. De hecho, el dinero depositado en el banco es estable (teóricamente, no objeto de robo o pérdida) y puede acumularse en grandes cantidades. Tener dinero en el bolsillo (ATP) es inestable, sólo se puede almacenar en cantidades limitadas, pero es de fácil acceso cuando sea necesario. La combustión de glucosa libera una cierta cantidad de energía y consume oxígeno. El resultado de esta operación que se puede realizar en una máquina llamada calorímetro, produce calor (690 Kcal / mol), agua y dióxido de carbono, de acuerdo con la ecuación: C6H12O6 + 6O2+ 6CO2 + 6 H2O + calor (energía) Esta combustión de la glucosa es, sin embargo, un proceso abrupto, que lleva al calorímetro rápidamente a altas temperaturas. Si esto llegara a ocurrir dentro de una célula, ella sería quemada instantáneamente. Sin embargo, las células han desarrollado un sistema que oxida lentamente los nutrientes, liberando gradualmente la energía y produciendo agua y CO2. Este proceso, que consume O2 y produce CO2, se llama la respiración celular. Las células utilizan dos mecanismos para obtener energía de los nutrientes: la glucólisis anaerobia, que tiene lugar en el citosol y la fosforilación oxidativa, que tiene lugar en las mitocondrias.

Figura 4.1 Fórmula del trifosfato de adenosina, abreviadamente llamado ATP. El símbolo ~ indica los enlaces químicos que son muy ricos en energía.

LA GLUCÓLISIS ANAEROBIA SÓLO PRODUCE 2 MOLES DE ATP POR MOL DE GLUCOSA La glucólisis anaeróbica es el proceso por el cual una secuencia de aproximadamente 11 enzimas citosólicas promueve transformaciones graduales en una molécula de glucosa sin consumo de oxígeno, produciendo dos moléculas de piruvato y liberando energía que se almacena en dos moléculas de ATP. El ATP se forma a partir de ADP y de fosfato inorgánico (Pi) existente en el citosol, de acuerdo con la ecuación: 2 ADP +2 Pi + energía de la glucosa  2 ATP En este proceso, la célula almacena 20 kcal por cada mol de glucosa degradada. Esta descomposición de la glucosa no requiere oxígeno, que es por eso que se llama glucólisis anaeróbica o fermentación. En la levadura de cerveza, bajo condiciones anaeróbicas, se produce glucólisis, convirtiéndose el piruvato en etanol después de una serie de reacciones enzimáticas. La fermentación proporciona a la levadura de cerveza de la energía necesaria para su mantenimiento y reproducción, siendo llamada fermentación alcohólica, porque el producto final es el etanol. La glucólisis es un proceso ineficiente, porque de 690 kcal / mol presentes en la glucosa, sólo 20 kcal se utilizan y las células desarrollaron, a lo largo de la evolución, mecanismos más eficientes para extraer energía de los nutrientes. GRACIAS A LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA CADA MOL DE GLUCOSA PRODUCE MÁS DE 36 MOLES DE ATP Después de la aparición del oxígeno en la atmósfera, se desarrolló una nueva vía metabólica de una mayor eficiencia energética que el de la glucólisis, la fosforilación oxidativa. De cada mol de glucosa, además de los 2 moles de ATP obtenido por la vía anaerobia, la fosforilación oxidativa produce más de 36 moles de ATP.

En la fosforilación oxidativa, el piruvato se oxida hasta que se forman agua y dióxido de carbono, con una alta eficiencia energética. A menudo se distingue en la fosforilación oxidativa, tres mecanismos diferentes, pero que se entrelazan estrechamente: la producción de acetil coenzima A (acetil-CoA), el ciclo del ácido cítrico y el sistema transportador de electrones. Como la glucólisis anaeróbica tiene lugar en el citosol, el proceso de la fosforilación oxidativa es aeróbica y ocurre en las mitocondrias (Figura 4.2). Producción de acetil coenzima A La Acetil-CoA se produce a partir de la coenzima A y del acetato, originados del piruvato o de la β-oxidación de los ácidos grasos. El piruvato, derivado de la glicolisis, y los ácidos grasos atraviesan las membranas mitocondriales y, en la matriz del orgánulo, generan acetato, que se une a la coenzima A para formar acetil-CoA. La conversión del piruvato a acetil-CoA es debido a un sistema multienzimático de la matriz mitocondrial, el complejo piruvato deshidrogenasa, que consta de múltiples copias de tres enzimas, cinco coenzimas y dos proteínas reguladoras. Este complejo convierte el piruvato en acetil CoA, liberando CO2 y que es eliminado de la mitocondria. La acetil CoA entra en el ciclo del ácido cítrico. Las enzimas presentes en las dos membranas mitocondriales transfieren ácidos grasos hacia la matriz de la mitocondria, donde son degradados por un ciclo de reacciones llamado β-oxidación de los ácidos grasos que elimina dos átomos de carbono a la vez, produciendo una molécula de acetil-CoA en cada vuelta del ciclo. La acetil-CoA así generada también entra en el ciclo del ácido cítrico, en el que la oxidación continúa.

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Figura 4.2 El diseño esquemático muestra que la glucólisis ocurre en el citosol, mientras que la producción de acetil coenzima A y la fosforilación oxidativa se procesan en las mitocondrias. La mayoría de la producción de ATP se produce en la mitocondria, debido a la oxidación de los sustratos derivados de los nutrientes, con consumo de oxígeno y formación de agua y CO2 (respiración aerobia) en contraste con la glucólisis (respiración anaerobia), que no consume oxígeno y produce poco ATP.

Ciclo del ácido cítrico Este ciclo, también llamado ciclo de Krebs o ciclo de los ácidos tricarboxílicos, es una secuencia cíclica de reacciones enzimáticas, en la cual ocurre, debido a la presencia de enzimas llamadas deshidrogenasas, la producción gradual de electrones y protones. Los electrones son capturados por moléculas complejas tales como el NAD (dinucleótido de nicotinamida y adenina), el FAD (dinucleótido de flavina y adenina) y los citocromos, que actúan como transportadores de electrones en un proceso de oxidorreducción. El hidrógeno resultante de las reacciones, se libera en la matriz mitocondrial en forma de protones (H+). El ciclo del ácido cítrico se origina con la condensación de la acetil-CoA, proveniente del piruvato o de los ácidos grasos, con ácido oxalacético, produciendo ácido cítrico. Este sufre una serie de modificaciones y termina produciendo ácido oxalacético, que, a su vez, comienza de nuevo el ciclo. El resultado final del ciclo del ácido cítrico es el siguiente: gracias a las deshidrogenasas, ocurre la producción de hidrógeno, que va a generar protones y electrones. Las descarboxilasas conducen a la producción de CO2, y en el proceso hay una reacción exoenergética que promueve la síntesis de 2 moles de ATP por mol de glucosa consumida (Figura 4.3). Por tanto, la función principal del ciclo del ácido cítrico es producir electrones de alta energía y protones, produciendo CO2; su eficiencia energética es baja. Además de estas funciones, el ciclo del ácido cítrico proporciona los metabolitos que serán usados para la síntesis de aminoácidos y carbohidratos. Sistema transportador de electrones Es una cadena, formada por enzimas y compuestos no enzimáticos, cuya función es la de transportar electrones. Entre estos transportadores de electrones están los citocromos, compuestos orgánicos ricos en hierro. A lo largo de la cadena, se transportan electrones de alta energía que ceden gradualmente esta energía, que se transmite a tres lugares específicos de la cadena, en la que se produce la síntesis de ATP. Este proceso es eficiente y produce 36 moles de ATP por mol de glucosa consumida. Allí, a lo largo de la cadena de fosforilación oxidativa, tres lugares en los que la energía liberada por la oxidación es gradualmente transferida al ATP gracias a la fosforilación del ADP. En estos lugares de la cadena, se produce el acoplamiento de liberación de energía, con el almacenamiento por fosforilación. Hay moléculas tóxicas tales como el dinitrofenol, que desacoplan esta transferencia de energía mediante el bloqueo de la síntesis de ATP y disipando la energía en forma de calor. Cuando llegan al final del sistema transportador, los electrones activan moléculas de oxígeno, produciendo O- gracias a un sistema enzimático llamado citocromo oxidasa. Este oxígeno con un electrón de más se combina con los protones para formar agua (Figura 4.3). La citocromo oxidasa es

fuertemente inhibida por el cianuro, por lo que este compuesto es un muy fuerte tóxico. Por lo tanto, la respiración celular aeróbica produce CO2, H2O y energía (calor) de acuerdo con la ecuación general: C6H1206 + 6 O2  6 CO2 + 6 H2O + energía Como en la mitocondria el consumo de oxígeno está asociado con la fosforilación del ADP, el proceso se denomina fosforilación oxidativa. El ADP se transfiere desde el citosol a las mitocondrias, donde se convierte en ATP, que pasa al citosol, en el cual funcionará como combustible celular. Por lo tanto, hay un flujo constante de ADP para dentro de la mitocondria y ATP para fuera de la mitocondria. Desde el punto de vista de la eficiencia energética, la mitocondria es mucho más eficiente que los motores construidos por el hombre. Se estima que aproximadamente la mitad de la energía liberada de los nutrientes es almacenada por las mitocondrias en moléculas de ATP; el 50% restante se disipa en forma de calor, que se utiliza para calentar el cuerpo. A MENUDO, LAS MITOCONDRIAS SE ENCUENTRAN EN LUGARES CERCANOS A LOS QUE NECESITAN DE ENERGÍA (ATP) Las mitocondrias (mitos, filamento, y condria, partícula) son orgánulos de forma redondeada o alargada presentes en el citoplasma de las células eucariotas, que participan en la respiración aeróbica y en muchas otras funciones. Estos orgánulos tienen un diámetro de 0,5 a 1 µm y la longitud varía de 0,5 a 10 µm. Son más numerosas en las células con un metabolismo energético alto, tales como las células musculares estriadas. En muchas células, las mitocondrias se distribuyen por todo el citoplasma, constantemente cambiando de posición por la actividad de las proteínas motoras del citoesqueleto. Sin embargo, en algunas células se encuentran cerca de los lugares citoplasmáticos donde hay un gran consumo de energía. En el epitelio ciliado, se acumulan cerca de los cilios; en los espermatozoides, alrededor de la parte inicial del flagelo, donde comienza el movimiento flagelar; y, en las células musculares estriadas, entre los haces de las miofibrillas (Figura 4.4). Otros ejemplos son los acúmulos de mitocondrias encontrados en las células sensoriales de la retina (Figura 4.5) y en las células transportadoras de iones, tales como las células de los túbulos contorneados del riñón (Figura 4.6). La concentración de las mitocondrias en las células transportadoras de iones se asocia con los abundantes pliegues de la membrana plasmática, lo que aumenta considerablemente el área por donde tiene lugar el transporte iónico. En estas regiones, las membranas son ricas en ATPasa, una enzima que libera la energía que se utilizará por las bombas de iones presentes allí.

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Figura 4.3 Ilustración de los principales procesos que se producen en la respiración celular aeróbica. La línea azul indica los límites de una mitocondria. Inicialmente, ocurre la producción de acetil coenzima A, que entra en el ciclo del ácido cítrico, que resulta en la producción de electrones, protones, CO2 y una pequeña cantidad de ATP. Los electrones viajan a través de la cadena transportadora de electrones y producen mucho ATP. Los protones se combinam con oxígeno, activado por el sistema de la citocromo oxidasa, produciendo agua. Tenga en cuenta que en el citosol, 1 mol de glucosa produce 2 moles de ATP, permaneciendo una gran cantidad de energía en las moléculas de piruvato. Este piruvato entra en la mitocondria, en el que la energía restante del mol inicial de glucosa es transferida a aproximadamente 38 moles de ATP. Por lo tanto, la mitocondria aumenta en gran medida la capacidad celular para aprovechar la energía contenida en los nutrientes. Tenga en cuenta también la entrada de oxígeno y ADP (difosfato de adenosina) en la mitocondria. El dibujo no muestra, pero la mitocondria también necesita Pi (fosfato inorgánico) para que el ADP se convierta en ATP.

Figura 4.4 Micrografía electrónica del músculo cardíaco, un tejido que requiere muchas mitocondrias, ya que consume mucho ATP, el cual es la fuente de energía para la contracción muscular. Observe la disposición de las mitocondrias, formando un camino paralelo a las miofibrillas. Tenga en cuenta, también, que las mitocondrias son ricas en crestas, y que la matriz mitocondrial es densa a los electrones (aparece oscura en la micrografia). 30.000x.

ULTRAESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS MITOCONDRIAS Las mitocondrias tienen dos membranas que rodean un espacio interior donde está la matriz mitocondrial. Las membranas mitocondriales, como las demás membranas celulares, son bicapas de fosfolípidos que contienen pequeñas cantidades de otros lípidos. La membrana mitocondrial externa es lisa y muy permeable a varios tipos de moléculas con un peso molecular inferior a 5 kDa (kilodaltons). Esta permeabilidad se debe a la presencia de proteínas intercaladas en las membranas, las porinas, que forman canales con un diámetro de 1 nm. Entre las dos membranas, se observa el espacio intermembranoso. Además de las diferencias entre las proteínas de las dos membranas, la membrana externa es rica en colesterol, mientras que la membrana interna es pobre en este lípido, siendo rica en cardiolipina, fosfolípidos con cuatro ácidos grasos que no existen en la membrana externa. La cardiolipina contribuye a dificultar el paso de partículas cargadas eléctricamente través de la membrana mitocondrial interna, lo que es funcionalmente importante, porque una alta concentración de iones, en la matriz de la mitocondria, perturbaría el gradiente que genera el flujo de protones y la captura de energía en el ATP, por el proceso quimiosmótico. La constitución molecular de las dos membranas mitocondriales está de acuerdo con el posible origen evolutivo de estos orgánulos a partir de simbiontes bacterianos que se asentaron en el citoplasma. La membrana mitocondrial externa es similar a la membrana plasmática de las células eucariotas y es muy sensible a los detergentes y ultrasonidos, una propiedad que se ha utilizado para romper la membrana externa y aislar, por centrifugación fraccionada, las diversas partes de las mitocondrias, como se verá más adelante. La membrana interna es muy similar a la membrana de las bacterias, y como tal, contiene el sistema de transferencia de energía para ATP.

Los fosfolípidos de las membranas mitocondriales no son sintetizados en el orgánulo, sino más bien en el retículo endoplásmico liso. Las moléculas de fosfolípidos son transferidas a las mitocondrias por proteínas transportadoras especiales, que transportan los lípidos de una membrana muy rica en estas moléculas (retículo endoplásmico liso) a la membrana de los orgánulos que tienen menor concentración de lípidos. Las mitocondrias reciben fosfolípidos por un procedimiento similar al descrito con respecto a los peroxisomas. La diferencia es que las mitocondrias, aunque incapaces de sintetizar fosfolípidos, juegan un papel funcionalmente importante, modificando las moléculas recibidas a través de las proteínas de transporte. La membrana interna tiene invaginaciones generalmente en forma de estantes, formando las crestas, que aumentan en gran medida la superficie de esta membrana (Figuras 4.6 y 4.7). En ciertos protozoos y en células que sintetizan esteroides, las crestas pueden tener la forma de tubos, lo que conduce a la aparición de estructuras circulares en el interior de las mitocondrias cuando se observa en un corte (Figura 4.8). Una misma mitocondria puede presentar crestas en estantes y crestas tubulares. En la superficie de la membrana interna que mira hacia el interior de la mitocondria, existen pequeñas partículas en forma de raqueta (Figura 4.7), que se insertan por sus agarraderos de esa membrana. Estos son los cuerpos elementales, de aproximadamente 10 nm de diámetro, donde se genera ATP y calor. Dentro de la mitocondria, se encuentra una sustancia finamente granular y electrodensa (oscura en las micrografías electrónicas) llamada matriz. Con frecuencia se observan gránulos densos a los electrones (gránulos densos) dentro de la matriz, con un diámetro de 30 a 50 nm, que contiene calcio y de función poco conocida. La matriz mitocondrial contiene hebras de ADN que son difíciles de ver en el microscopio electrónico, y ribosomas midiendo 15 nm de diámetro, por lo tanto, menores que los del citosol y similares a los de las bacterias.

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Existe alguna variación en la estructura mitocondrial dependiendo del tipo de célula y su estado funcional. En general, la cantidad de crestas y la densidad de electrones son proporcionales a la actividad respiratoria celular. El análisis de la localización de las enzimas, en los componentes de las mitocondrias, fue facilitado por la técnica de ruptura de estos orgánulos con detergentes o ultrasonido, y por el aislamiento de la membrana interna, de la membrana externa, del contenido del espacio intermembranoso y del contenido de la matriz (Figura 4.9). El estudio de estas fracciones demostró que la matriz es un complejo concentrado de cientos de enzimas entre las cuales están las relacionadas con el ciclo del ácido cítrico, con la β-oxidación de los ácidos grasos y con la replicación, transcripción y traducción del ADN mitocondrial. La membrana mitocondrial interna es la membrana celular más rica en proteínas, y que comprende: ■ enzimas y proteínas que constituyen la cadena transportadora de electrones

■ proteínas de los corpúsculos elementales, con actividad de ATP-sintetasa, sin la cual la membrana no tendría la capacidad de acoplar el transporte de electrones a la síntesis de ATP ■ proteínas que forman parte de múltiples sistemas de transporte activo. En las células procariotas (bacterias) no existen mitocondrias, y la cadena transportadora de electrones está en la cara interna de la membrana plasmática de estas células. Además de su papel en la respiración celular, las mitocondrias participan en otros procesos metabólicos importantes, tales como, por ejemplo, la síntesis de hormonas esteroides y la aparición de la apoptosis. Este proceso de muerte celular programada puede ser iniciado por la apertura de canales no específicos localizados en la membrana mitocondrial interna, con el paso al citosol de las moléculas que inician la apoptosis, tales como el citocromo c, factor inductor de apoptosis, y las caspasas que son activadas en el citosol. Las caspasas son proteasas promotoras de apoptosis (capítulo 9).

Figura 4.5 Micrografía electrónica de célula de la retina, en una región donde existe una acumulación de las mitocondrias. Observe que las mitocondrias contienen muchas crestas y presentan matriz densa a los electrones (aparece oscura en la micrografía). 50.000X.

Figura 4.6 Micrografía electrónica de mitocondria de célula renal. Note la doble membrana y las crestas, numerosas, pero menos frecuentes que en el músculo estriado cardíaco (comparar con la Figura 4.4). La matriz de aspecto granular, llena el espacio entre las crestas. 84.000x.

Figura 4.7 El dibujo esquemático muestra un resumen de los componentes mitocondriales clave y sus funciones.

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Figura 4.8 La Micrografía electrónica muestra parte del citoplasma de una célula de la capa cortical adrenal. Observe las mitocondrias que contienen invaginaciones tubulosas de su membrana interna, en lugar de estantes. Esta disposición es común en las células que sintetizan los esteroides. 60.000x.

Figura 4.9 El diagrama ilustra uno de los métodos utilizados para fraccionar las mitocondrias. Este fraccionamiento es posible porque la membrana mitocondrial externa es mucho más sensible a los detergentes y ultrasonidos que la interna. Estas membranas tienen diferencias en la constitución molecular. Entre otras diferencias, la membrana interna es rica en cardiolipina (tal como la membrana de las bacterias), y no contiene colesterol, mientras que la membrana externa no contiene cardiolipina, pero si el colesterol, y puede romperse más fácilmente. La cardiolipina es un fosfolípido con cuatro cadenas de ácidos grasos. La ilustración muestra que, en la primera etapa, la membrana mitocondrial externa está rota, manteniéndose intacta la membrana interna, que conserva la matriz mitocondrial. Posteriormente, la ruptura de la membrana interna, gracias a un nuevo tratamiento con detergente, permite la obtención de esta membrana y de la matriz mitocondrial en fracciones separadas. El proceso completo, como se muestra en los cuatro dibujos de abajo, separa cuatro fracciones: la membrana interna, la matriz, la membrana externa y el contenido del espacio intermembranoso.

LA TRANSFERENCIA DE ENERGÍA PARA LA CONVERSIÓN DE ADP EN ATP SE DEBE A UN PROCESO QUIMIOSMÓTICO Actualmente se admite que el acoplamientos del proceso oxidativo mitocondrial con la síntesis de ATP a partir de ADP ocurre por un proceso quimiosmótico. Los iones H+ (protones), producidos en el ciclo del ácido cítrico en la matriz mitocondrial, son transportados activamente a través de la membrana interna y acumulados en el espacio intermembranoso, gracias a la energía liberada por los electrones, durante su paso a través de la cadena transportadora de electrones. La energía del flujo retrógrado de protones, a través de los corpúsculos elementales, se utiliza para convertir ADP en ATP. La Figura 4.10 muestra la teoría quimiosmótica.

En un tipo especializado de tejido adiposo, el tejido adiposo multilocular, las células son ricas en mitocondrias. Estas células están especializadas en la producción de calor para la defensa contra el frío y para despertar a los animales que hibernan. La producción de calor se incrementa en gran medida en las células de ese tejido ya que la membrana interna de sus mitocondrias presenta muchas moléculas de termogenina (termo, calor, egene, generar). Esta proteína permite que los protones, acumulados en el espacio intermembranoso fluyan libremente de nuevo a la matriz, sin pasar por los corpúsculos elementales. En consecuencia, no hay síntesis de ATP y la energía derivada del flujo de protones se disipa en forma de calor (Figura 4.10).

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Figura 4.10 El esquema ilustra los mecanismos por los que la mitocondria quita energía de los nutrientes, acumulando en forma de energía química fácilmente disponibles en el ATP. Parte de la energía de los nutrientes normalmente se disipa como calor. La proteína termogenina puede funcionar como una especie de válvula, regulando la cantidad de energía de los nutrientes que van a generar calor. La termogenina juega un papel significativo en el despertar de los animales que hibernan, calentando la sangre de estos animales. El dinitrofenol, una sustancia que inhibe la fosforilación oxidativa, es un compuesto anfipático (se une por un extremo a una región hidrófoba y la otra a una región hidrófila) que desorganiza la estructura de la membrana mitocondrial interna, proporcionando un flujo retrógrado de protones sin la síntesis de ATP.

LAS MITOCONDRIAS TIENEN SU PROPIO GENOMA, AUNQUE INCOMPLETO Nuevos orgánulos se producen continuamente en la célula para satisfacer el crecimiento y la multiplicación de las células y también para reemplazar los orgánulos desgastados por el uso. Algunos orgánulos se forman de novo, como los lisosomas, que brotan de las cisternas del aparato de Golgi. Pero las mitocondrias (y los cloroplastos) se originan por el crecimiento y la división de las mitocondrias preexistentes. Estos orgánulos contienen ADN, tres tipos de ARN (ARNr, ARNt y ARNm) y todo el sistema molecular requerido para la síntesis de algunas proteínas. El ADN de las mitocondrias, como el ADN de las bacterias, codifica ARNm formados únicamente por exones, y sin intrones. El genoma mitocondrial humano, que es relativamente pequeño, tiene 16.569 nucleótidos, formando dos genes para el ARNr, 22 para el ARNt tRNA y 13 genes que codifican ARNm para la síntesis de proteínas, en un total de 37 genes. En el genoma mitocondrial, 4 de los 64 codones presentan diferentes significados del código genético universal. Una peculiaridad del ADN mitocondrial es su origen exclusivamente materno. Las mitocondrias del cuerpo se originan de las mitocondrias del óvulo sin la participación de las mitocondrias del espermatozoide. El ADN mitocondrial está presente en varias copias en forma de anillos de doble cadena, con una circunferencia de 5 a 6 µm (Figura 4.11). Este ADN,

que se replica independientemente del ADN nuclear, especifica la secuencia de aminoácidos de algunos - pero no de todas - las proteínas mitocondriales, aparte de codificar los tres tipos de ARN (Figura 4.12). La mayoría de las proteínas mitocondriales se sintetizan en el citosol, en polirribosomas libres, y luego transferidas a las mitocondrias. Las proteínas destinadas a las mitocondrias tienen un pequeño segmento de la molécula que es una señal de orientación para este orgánulo. El proceso de importación mitocondrial de proteínas es regulado por proteínas citosólicas del grupo de las moléculas chaperonas. Las proteínas destinadas a la matriz mitocondrial se mantienen distendidas por la acción de la molécula chaperona hsp 70, usando energía del ATP. Este primer paso es necesario porque las moléculas proteicas plegadas no penetran en las mitocondrias. El complejo constituído por la proteína más la chaperona es reconocido y se une a los receptores de la membrana mitocondrial externa, siendo trasladado a sitios en que la membrana mitocondrial externa y la interna se tocan (puntos de contacto). En estos sitios, la proteína se transfiere al interior de las mitocondrias, utilizando la energía del potencial eléctrico entre las membranas y la matriz de la mitocondria. En la mitocondria, otras chaperonas, utilizando la energía del ATP, hacen que la proteína se pliegue, asumiendo su conformación activa, y la señal de dirección se elimina por la acción de las proteasas (Figura 4.13).

Figura 4.11 Micrografías electrónicas de moléculas circulares de ADN, aisladas de mitocondrias de fibroblastos de ratón. Micrografía de arriba, 50.000X y, micrografía de abajo, 40.000x. (Cortesía de M.M.K. Nass.)

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Figura 4.12 El esquema muestra que las mitocondrias tienen su propio sistema genético, pero modesto, lo que genera proteínas relacionadas con la replicación de su ADN y algunas proteínas de su membrana interna. La mayoría de las otras proteínas mitocondriales (de las membranas, de la matriz y de los ribosomas) se originan en los polirribosomas citoplasmáticos. Estas proteínas son sintetizadas con una secuencia corta de aminoácidos, o señal de dirección, se unen a las moléculas cha peronas, siendo el complejo reconocido por los receptores de la superficie mitocondrial. Entonces, las proteínas son introducidas en la mitocondria, consumiendo energía de los protones del espacio intermembranoso.

Figura 4.13 Ilustración de la molécula proteica producida en el citosol, pero destinado a la matriz mitocondrial. La proteína recién sintetizada, que tiene una pequeña secuencia de aminoácidos como señal de su destino, permanece extendida por la combinación temporal con la chaperona Hsp 70. La señal es reconocida por un receptor situado en la membrana mitocondrial externa y se transfiere con gasto de energía para el interior de la mitocondria por un canal que atraviesa las dos membranas mitocondriales. Dentro del orgánulo, la proteína se pliega para asumir su forma final, con la ayuda de otra chaperona (hsp 60). Entonces, la secuencia señal es removida por una proteasa de la matriz mitocondrial.

ORIGEN DE LAS MITOCONDRIAS La existencia de ADN, de los diversos tipos ARN y de un mecanismo de autoreproducción por fisión similar al de las bacterias, aparte de otros datos, sugiere que las mitocondrias se originaron de las bacterias aerobias, que establecieron relación simbiótica con las células eucarióticas anaerobias (Capítulo 1). Los ribosomas de las mitocondrias son similares a las de las bacterias, al igual que el ADN, que, tanto en las mitocondrias como en las bacterias, codifica ARNm sin intrones. Los ribosomas mitocondriales son diferentes a los citosólicos, en tamaño, composición de proteínas y ARN, y también en la sensibilidad a los antibióticos. La cicloheximida, por ejemplo, inhibe la síntesis proteica en los ribosomas citosólicos, pero no la síntesis de proteínas en los ribosomas mitocondriales. El cloranfenicol, en cambio, inhibe la síntesis de proteínas tanto en las mitocondrias (figura 4.14) como en las bacterias, pero no en los ribosomas del citosol, siendo un antibiótico usado en la práctica médica. Durante la evolución, las bacterias habrían penetrado por fagocitosis en las células eucariotas primordiales, habiendo escapado de los mecanismos intracelulares de destrucción de células extrañas y establecido la endosimbiosis (simbiosis endocelular). Por la fagocitosis, la membrana plasmática de la célula eucariota huésped probablemente originó la membrana mitocondrial externa y la membrana de la bacteria se convirtió en la membrana

interna de este orgánulo. De hecho, la membrana externa de la mitocondria es muy similar a la membrana plasmática de las células eucarióticas, mientras que la membrana interna es similar a la composición molecular de las membranas de las bacterias. Esta endosimbiosis ofreció beneficios tanto para la bacteria aerobia, que recibió protección y nutrientes, como para la célula huésped anaeróbica, que ganó un sistema más eficiente de aprovechamiento de la energía mediante la fosforilación oxidativa, evolucionando a una célula eucariota aeróbica. A medida que la concentración de oxígeno en la atmósfera se incrementaba por la actividad fotosintética de las células, la mencionada endosimbiosis también tenía la ventaja de proporcionar un mecanismo por el que la célula huésped no sólo sea más eficiente energéticamente, como, al mismo tiempo, adquirió un mecanismo para deshacerse del exceso de oxígeno, cuya acumulación en el medio intracelular puede dañar las macromoléculas por oxidación. Se supone que, durante el proceso evolutivo, las mitocondrias perdieron gradualmente la mayor parte de su genoma, que fue transferido al núcleo de la célula huésped, y se volvieron dependientes de las proteínas codificadas por el genoma del núcleo celular.

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Figura 4.14 Micrografías electrónicas de células HeLa cultivadas in vitro. En A, célula control y en B, después de la adición, al medio de cultivo, de 50 mg/ml de cloranfenicol. Este antibiótico inhibe la síntesis proteica en los ribosomas de las bacterias (células procariotas) y de las mitocondrias. Observe, en la micrografía B, que el antibiótico provocó una disminución en la cantidad de las crestas mitocondriales. A, aumento 15.000x. B, aumento 22.000x. (Cortesía de R. Lank e S. Penman J. Cell Biol, 49:541, 1971 Reproducido con permiso.)

EXISTEN ENFERMEDADES CAUSADAS POR DEFECTOS EN EL ADN MITOCONDRIAL Hay enfermedades raras que son causadas por mutaciones en el ADN de las mitocondrias. En la enfermedad de Luft, existe un aumento en el número de mitocondrias en el tejido muscular esquelético, así como aumento del metabolismo basal del paciente. Esta condición puede simular hipertiroidismo. En estos pacientes, la fosforilación oxidativa está parcialmente desacoplada, formándose poco ATP y más calor. Tener miopatía mitocondrial infantil, una enfermedad mortal, acompañada por lesiones en los músculos esqueléticos y disfunción renal (las células musculares y renales consumen mucha energía y son ricas en mitocondrias), es el resultado de la marcada disminución o incluso la completa falta de las enzimas de la cadena transportadora de electrones. Tanto los hombres como las mujeres pueden tener enfermedades por defecto en el ADN mitocondrial, pero sólo las mujeres transmiten a la descendencia, porque las mitocondrias se heredan de los óvulos, y no del espermatozoide. Las mitocondrias del óvulo fecundado (cigoto) y de las células originadas de éste son derivadas de la multiplicación de las mitocondrias del óvulo, y, por lo tanto, maternas. La herencia mitocondrial tiene otras características que se mencionarán brevemente, ya que su estudio está más allá de los límites de este libro. Cada mitocondria tiene varias copias de su ADN (como con las bacterias), y cada óvulo contiene miles de mitocondrias que son las precursoras de todas las mitocondrias del organismo adulto. Estas copias de ADN pueden haber sufrido diversas mutaciones y no son todas iguales. En las divisiones celulares durante el desarrollo embrionario, la distribución de las mitocondrias originadas por división de las preexistentes se convierte de forma desigual entre las nuevas células. Por lo tanto, las enfermedades mitocondriales sólo aparecen cuando un determinado tejido u órgano presenta preponderancia de mitocondrias con ADN defectuoso. Esto sucede de forma aleatoria y explica la gran variabilidad en la severidad de los síntomas presentados por los miembros de una familia que presenta la misma mutación en el ADN mitocondrial. Cabe señalar también que el genoma mitocondrial carece de mecanismos de reparación del ADN accidentalmente alterado y, por lo tanto, el número de mutaciones en el ADN mitocondrial es al menos 10 veces más grande que el del ADN nuclear de la célula. Por lo tanto, la presencia de múltiples copias de ADN en el genoma mitocondrial es una ventaja porque la mutación en una copia puede no causar síntomas, debido a la actividad de las copias normales. El estudio de las enfermedades causadas por defectos en las mitocondrias se complica aún más por el hecho de que la mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas por genes nucleares, de manera que una enfermedad mitocondrial hereditaria puede ser debida a una mutación en el ADN mitocondrial, en el ADN la cromatina nuclear, o la mutación en ambos, lo que hace que sea muy complicado para dilucidar la herencia de estas enfermedades, que comprometen principalmente los tejidos que utilizan una gran cantidad de energía, lo que exige mucho ATP, como en el caso de los músculos estriados, de las células de los túbulos renales y de las glándulas. RESUMEN Para llevar a cabo sus actividades, las células utilizan la energía obtenida a través de la ruptura de los enlaces covalentes de las moléculas de los nutrientes. Las células de las plantas y las bacterias raras son autótrofas, sintetizando moléculas alimenticias complejas, a partir de moléculas inorgánicas y de la energía y solar. Las células restantes son heterótrofas. Estas no son capaces de convertir en enlaces químicos la energía solar, no

sintetizan moléculas alimenticias y, por lo tanto, dependen enteramente de los alimentos sintetizados por las células autótrofas para su supervivencia. En las células, la energía de los nutrientes se libera gradualmente y es parcialmente transferida a las moléculas de ATP (trifosfato de adenosina), que contienen enlaces ricos en energía. Otra parte se disipa en forma de calor para calentar el cuerpo. Las moléculas más energéticas utilizadas por las células son los ácidos grasos y la glucosa. Esta se degrada en la matriz citoplasmática, sin la participación de oxígeno, por el proceso de glicólisis anaerobia, y cada mol de glucosa produce 2 moles de ATP y deja como residuo 2 moles de piruvato, que todavía contiene una gran cantidad de energía. Las moléculas de piruvato y ADP pasan a la matriz mitocondrial, donde también llega oxígeno de la respiración y se forma acetil coenzima A, que entra en el ciclo del ácido cítrico. Esto y el sistema transportador de electrones producen más de 36 moles de ATP. Desde el punto de vista del aprovechamiento de energía, la ventaja de la mitocondria es enorme. Sin ella, la célula obtendría sólo 2 moles de ATP por mol de glucosa. Con la mitocondria, el rendimiento es mucho mayor. Las mitocondrias son orgánulos redondeados o alargadas situadas generalmente cerca de las regiones del citoplasma que requieren una gran cantidad de energía. Se componen de dos membranas. La externa es lisa y muy permeable. La membrana interna contiene cardiolipina, es selectiva, controla mejor el tránsito molecular en ambas direcciones, forma pliegues y se pliega hacia el interior de la mitocondria. Estos pliegues aumentan en gran medida la superficie de la membrana interna, creando más espacio para el sistema transportador de electrones que se encuentra allí. El interior del orgánulo limitado por la membrana interna contiene la matriz mitocondrial, donde están las enzimas del ciclo del ácido cítrico, así como otras enzimas, ADN y ARN de varios tipos. La energía liberada en la cadena transportadora de electrones se utiliza para el transporte de protones de la matriz al espacio intermembranoso, donde los protones se acumulan. Estos protones del espacio intermembranoso fluyen de nuevo hacia la matriz, a través de los corpúsculos elementales, cuyo flujo de esta energía se convierte, en el corpúsculo elemental, en energía química de fácil acceso, gracias a la síntesis de ATP a partir de ADP. Las mitocondrias sintetizan algunas de sus propias proteínas, pero la mayoría de las proteínas mitocondriales son sintetizadas en el citoplasma, están bajo el control del código genético del núcleo celular, siendo, después, transferida para la mitocondria por un proceso de selección. BIBLIOGRAFÍA Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed. Garland Press, New York, 1994. Garlid, K.D.: Physiology of mitochondria. In: Sperelakis, N.: Cell Physiology Source Book, 2nd ed., p. 111. Academic Press, 1998. Hatefi, Y.: The mitochondrial electron transport oxidative phosphorylation system. Annu. Rev. Biochem., 54:1015, 1985. Hinckle, P.C. and McCarty, R.E.: How cells make ATP. Sci. Amer., 283:104, 1978. Tzagoloff, A.: Mitochondria. Plenum Press, New York, 1982. Wallace, D.C.: Mitochondrial DNA in aging and disease. Sci. Amer., 277(2):22, 1997. Wallace, D.C.: Mitochondrial disease in man and mouse. Science, 283:1482, 1999.

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1 | Introdução: Visão Panorâmica sobre a Estrutura, as Funções e a Evolução das Células

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Lípidos de las membranas La membrana es una estructura lipoproteica fluída Proteínas de la membrana plasmática Glicoproteínas y glicolípidos son marcadores responsables de los grupos sanguíneos La membrana plasmática es asimétrica Visualización de las proteínas integrales de las membranas Las unidades de membrana tienen diferentes funciones Glicocálix Las células se reconocen El transporte a través de la membrana

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Membrana Plasmática ERRNVPHGLFRVRUJ

■ Reciclaje de la membrana plasmática ■ Las microvellosidades son extensiones que aumentan la superficie de absorción de las células ■ Los estereocilios son especializaciones apicales que aumentan la superficie de algunas células epiteliales ■ Adhesión entre las células a través de las CAM, glicoproteínas de transmembrana ■ Estructuras especializadas aseguran la unión celular, sellando el espacio intercelular y la comunicación entre las células ■ ¿Dónde se originan las moléculas que componen las membranas celulares? ■ Resumen ■ Bibliografía

Guía ■ ■ ■

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La membrana plasmática mantiene constante el medio intracelular, tienen receptores para hormonas y otras señales químicas, y establece conexiones, entre las células y con la matriz extracelular La membrana plasmática mantiene constante el medio intracelular, tienen receptores para hormonas y otras señales químicas, y establece conexiones, entre las células y con la matriz extracelular Todas las membranas celulares están compuestas por una bicapa fluida de fosfolípidos, en donde están insertadas las moléculas de proteína que pueden ser desplazadas, en el plano de la membrana, por actividad del citoesqueleto De acuerdo con la mayor o menor facilidad de extracción, se distinguen las proteínas periféricas y las integrales de la membrana Las moléculas de fosfolípidos y proteínas están dispuestas asimétricamente en las membranas: una cara de la membrana es diferente de la otra La superficie exterior de la membrana plasmática es rica en moléculas proteicas y lipídicas conteniendo carbohidratos. Estos hidratos de carbono son parte del glicocálix Los fibronexos (o fibronexus) que constan de diferentes moléculas proteicas, establecen la conexión entre el citoesqueleto y las moléculas de la matriz extracelular Las moléculas pueden penetrar en las células o salir de ellas por transporte pasivo, transporte activo, difusión facilitada o transporte impulsado por gradiente iónico La microvellosidades, interdigitaciones y estereocilios aumentan la superficie celular Las CAM son glicoproteínas integrales de membrana que permiten la adhesión entre las células; algunas CAM pierden la adhesividad cuando la concentración de Ca2+ es demasiado baja Las membranas plasmáticas forman estructuras de adhesión (desmosomas y la unión adherente), de sellado del espacio intercelular (zonas oclusivas) y la comunicación entre las células (unión comunicante).

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a membrana plasmática o celular separa el medio intracelular del extracelular y es la principal responsable del control de entrada y salida de sustancias de la célula. Por su reducido espesor, la membrana plasmática no es visible en el microscopio óptico y sólo puede ser vista con un microscopio electrónico. Sin embargo, su existencia era conocida antes del microscopio electrónico gracias a la utilización de técnicas indirectas. La observación de que el volumen de las células se altera de acuerdo a la concentración de las soluciones en las que se colocan (Figura 5.1) fue uno de los primeros indicios de la existencia de la membrana celular. La membrana plasmática participa en numerosas funciones celulares. Es responsable de mantener la constancia del medio intracelular, que es diferente del medio extracelular. Para que las células funcionen, crezcan y se multipliquen, es necesario que las sustancias apropiadas sean seleccionadas y transferidas al interior de la célula y las sustancias innecesarias sean impedidas de penetrar al citoplasma o bien sean eliminadas desde el citoplasma. Gracias a sus receptores específicos, la membrana tiene la capacidad de reconocer otras células y diversos tipos de moléculas, tales como, por ejemplo, las hormonas. Este reconocimiento, mediante la unión de una molécula específica (señal química o ligando) con el receptor de membrana, desencadena una respuesta que varía en función de la célula y el estímulo recibido. La respuesta puede ser contracción o movimiento celular, la inhibición o estimulación de la secreción, la síntesis de anticuerpos, proliferación mitótica, etc. A través de sus membranas, ciertas células están unidas firmemente entre sí, formando a menudo capas que delimitan los diversos compartimentos. Un ejemplo es la capa epitelial que cubre internamente el tracto digestivo y proporciona una barrera con permeabilidad selectiva, situada entre el ambiente externo (contenido del tubo digestivo) y el ambiente interno (sangre, linfa, matriz extracelular del tejido). En muchos tejidos, las membranas de las células adyacentes pueden establecer canales de comunicación entre sí, por donde tienen lugar los

intercambios de moléculas e iones que participan en la coordinación de las actividades de estos grupos de células. En muchos tejidos, las membranas celulares tienen moléculas que se unen a componentes de la matriz extracelular, participando así tanto de la fijación de las células en sitios específicos (uniones estables), como sirviendo de apoyo para la migración celular (enlaces inestables) en el interior del tejido. Además de la membrana plasmática, que será estudiada en este capítulo, las células eucariotas han desarrollado un elaborado sistema de membrana (por Ej.: Envoltura nuclear, retículo endoplasmático, mitocondrias, cloroplastos, aparato de golgi) que divide la célula en compartimentos. Las mitocondrias y los cloroplastos son subdividicos internamente por membranas, ampliando aún más la compartimentación intracelular. Por lo tanto, la célula realiza, por separado y con más eficiencia, funciones especializadas que no sepodrían realizar en un solo compartimiento. Además, muchos sistemas enzimáticos se unen a las membranas, lo que permite un ordenamiento secuencial de la actividad de cada enzima, aumentando la eficiencia del sistema. Las moléculas enzimáticas se adhieren a las membranas en una secuencia tal que el producto de una enzima es procesada por la enzima de el lado, y así sucesivamente, hasta obtener el producto final de la cadena enzimática. Un ejemplo es la cadena transportadora de electrones, cuyos componentes (enzimas y transportadores) están situados en la membrana interna de las mitocondrias y en la cara interna de la membrana celular de las bacterias. Gracias al aislamiento de las membranas (Figura 5.2) se descubrió que la membrana plasmática y las demás membranas celulares están compuestas principalmente por lípidos, proteínas e hidratos de carbono ligados a los lípidos y proteínas, pero la proporción de estos componentes varía mucho, de acuerdo al tipo de membrana. Por ejemplo, las membranas de mielina que recubren las fibras nerviosas y tienen el papel de aislante eléctrico, contienen 80% de lípidos, mientras que las membranas mitocondriales internas metabólicamente muy activas, contienen sólo el 25% de los lípidos, presentando un predominio de las proteínas responsables por el alto metabolismo de estas membranas.

Figura 5.1 Modificaciones del volumen celular de acuerdo a la concentración del medio. Arriba, las células vegetales en un medio isotónico y en un medio hipertónico, lo que provoca una plasmólisis. Volviendo al medio isotónico, la célula recupera su forma original (desplasmólisis). Abajo, eritrocitos en un medio isotónico (0,9% NaCl), en un medio hipertónico (1,5% NaCl) y en un medio hipotónico (0,6 y 0,4% de NaCl). En un medio fuertemente hipotónico, el eritrocito se rompe (hemólisis).

LÍPIDOS DE LAS MEMBRANAS Los lípidos de membrana son moléculas largas con un extremo hidrofílico y una cadena hidrofóbica. Las macromoléculas que poseen esta característica de presentar una región hidrofílica y, por lo tanto, soluble en medio acuoso y una región hidrofóbica, insoluble en agua pero soluble en lípidos, se las denomina anfipáticas. Entre los lípidos comunes en las membranas celulares se encuentran los fosfoglicéridos (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y fosfatidiltreonina), esfingolípidos y colesterol. Los fosfoglicéridos y los esfingolípidos contienen el radical fosfato y son llamados fosfolípidos. Otro constituyente anfipático importante de las membranas celulares son los glicolípidos, designación genérica para todos los lípidos que contienen hidratos de carbono, con o sin radicales fosfato. Los glicolípidos más abundantes en las células animales son los glicoesfingolípidos

que son componentes de muchos receptores de la superficie celular. Los hidratos de carbono de los glicoesfingolípidos son generalmente moléculas con seis átomos de carbono (hexosas), tales como la glucosa, manosa, fucosa y galactosa. Estos azúcares, asociados en diferentes proporciones, forman una gran variedad de cadenas glucídicas, con diferentes tamaños, lo que permite un gran número de combinaciones. Las membranas de las células animales contienen colesterol, lo que no ocurre en las células de las plantas, que contiene otros esteroles. Cuanto mayor sea la concentración de esteroles, menos fluida es la membrana. Las membranas de las células procariotas no contienen esteroles, con pocas excepciones.

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Membrana plasmática

Figura 5.2 Por estar desprovistos de orgánulos, los eritrocitos constituyen un material adecuado para el aislamiento de la membrana plasmática. Colocados en medio hipotónico, los eritrocitos se rompen, con la pérdida de la hemoglobina. Por centrifugación se pueden obtener las membranas aisladas.

Figura 5.3 Las membranas celulares están compuestas de dos capas de moléculas lipídicas con las cadenas apolares (hidrofóbicas) colocadas en el interior de la membrana y los extremos polares (hidrofílicas) orientadas hacia las superficies de la membrana. Las moléculas de las proteínas integrales están inmersas en la capa lipídica, con las porciones hidrofóbicas en el centro y las porciones hidrofílicas en la superficie de la membrana. Algunas de estas proteínas pasan a través de todo el espesor de la membrana (proteínas de transmembrana). Las proteínas periféricas no se introducen en la membrana. La inserción de los microtúbulos y los filamentos de actina en la membrana también se muestra en este dibujo.

Figura 5.4 El dibujo esquemático muestra las proteínas de transmembrana de un solo paso (A) y de varios pasajes (B). Aunque la ilustración muestra sólo una molécula de proteína periférica, que se encuentra en la cara externa de la membrana, la cara interior como se muestra en la Figura 5.3, muestra también proteínas periféricas o extrínsecas.

LA MEMBRANA ES UNA ESTRUCTURA LIPOPROTEICA FLUÍDA Todas las membranas celulares tienen la misma organización básica que se compone de dos capas lipídicas fluídas y continuas, donde se insertan moléculas proteicas (Figura 5.3), constituyendo un mosaico fluido. Este modelo explica todos los datos experimentales conocidos y es válido para todas las membranas celulares (mitocondrias, cloroplastos, retículo endoplasmático, aparato de Golgi, lisosomas, endosomas, vesículas secretoras, peroxisomas, la envoltura nuclear, membrana plasmática, entre otras). Las moléculas de la bicapa lipídica están dispuestas con sus cadenas apolares (hidrofóbicas) orientadas hacia el interior de la membrana, mientras que las cabezas polares (hidrofílicas) quedan orientadas hacia el medio extracelular o hacia el citoplasma, que son medios acuosos. Estas dos capas lipídicas están asociadas debido a la interacción hidrofóbica de sus

cadenas apolares. Las proteínas de membrana tienen residuos hidrofóbicos e hidrofílicos, y quedan inmersas en la capa lipídica de manera que:  Los residuos hidrofóbicos de las proteínas están en el mismo nivel de las cadenas hidrofóbicas de los lípidos  Los residuos hidrofílicos de las proteínas están a la altura de las cabezas polares de los lípidos en contacto con el medio extracelular o con el citoplasma. Por lo tanto, la membrana consta de una capa hidrofóbica media y dos capas hidrofílicas, una interna (lado citoplásmico) y otra externa (Figuras 5.3 y 5.4). Las moléculas de hidratos de carbono se asocian con proteínas de la membrana para formar glicoproteínas, y a lípidos formando glicolípidos que, en la membrana plasmática, aparecen en la cara externa de la mem-

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brana como componentes del glicocáliz. Cabe señalar una marcada asimetría entre los dos lados de la membrana. Varios experimentos han demostrado que las proteínas, a menos que estén fijadas por el citoesqueleto, se mueven fácilmente en el plano de la membrana. Por ejemplo, la fusión de células humanas con células de ratón esto se puede hacer mediante el tratamiento con virus Sendai - muestra que después de la fusión de las células, las proteínas de la membrana celular humanas se mueven rápidamente, mezclándose con las proteínas de la membrana celular de ratón. Estas últimas también se mueven, pero con velocidad más lenta, ya que son proteínas más grandes. Otro experimento que demuestra la fluidez de la membrana se observa cuando se

adiciona la lectina concanavalina A a un cultivo de amebas. Estas lectinas (se llama lectina a una proteína que se une fuertemente a carbohidratos específicos) tienen la propiedad de unirse químicamente a determinadas glicoproteínas de membrana específicas y se han utilizado para estudiar estas glicoproteínas que actúan como receptores. Los receptores de concanavalina A, que normalmente se distribuyen a través de toda la membrana, cuando se unen a concanavalina migran rápidamente, impulsados por el citoesqueleto, para una región dada, en el que se concentran formando un capuchón (Figura 5.5). Los cambios descritos en estos dos ejemplos muestran que la membrana es un fluido que permite el movimiento de las proteínas dentro de una matriz lipídica líquida.

Figura 5.5 Acumulación de los receptores de concanavalina A en uno de los polos de Entamoeba histolytica. Típicamente, los receptores se distribuyen en toda la membrana, pero el tratamiento con concanavalina A promueve la migración de los receptores hacia una posición polar (cap formation). El material se fijó en glutaraldehido y se trató con bencidina, para revelar la peroxidasa utilizada para marcar la concanavalina A. Aumento: 3.500X. (Cortesía de A. Martínez-Palomo.)

PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA Aunque hay diferencias entre los lípidos, que influyen en las propiedades de las diferentes membranas, la actividad metabólica de las membranas depende principalmente de las proteínas. Cada tipo de membrana tiene sus propias proteínas características, principales responsables de las funciones de la membrana. La membrana plasmática contiene una gran variedad de proteínas que se pueden dividir en dos grupos principales, las integrales o intrínsecas y las periféricas o extrínsecas, dependiendo de la facilidad de su extracción de la bicapa lipídica. Las proteínas integrales están estrechamente asociadas con los lípidos y sólo se pueden separar de la fracción lipídica a través de técnicas drásticas, tales como el uso de detergentes. El setenta por ciento de las proteínas de la membrana plasmática son integrales, y aquí se incluyen la mayoría de las enzimas de la membrana, las glicoproteínas responsables de los grupos sanguíneos M-N, proteínas de transporte, receptores para hormonas, fármacos y lectinas. Las lectinas son moléculas con al menos dos sitios activos que se unen a hidratos de carbono específicos, pudiendo causar aglutinación de células. Fueron descubiertas en las plantas, pero ahora se sabe que existen en la mayoría de los seres vivos. Son ampliamente utilizadas en biología celular para analizar la composición química de los hidratos de carbono de las glicoproteínas y de los glicolípidos presentes en la cara externa de la membrana plasmática. Las moléculas de las proteínas integrales, debido a las regiones hidrofóbicas situadas en su superficie, se unen a los lípidos de la membrana por interacción hidrofóbica, dejando solamente expuestas al medio acuoso sus partes hidrofílicas (Figuras 5.3 y 5.4). Algunas de estas moléculas proteicas atraviesan completamente la bicapa lipídica, produciendo protuberancias en ambas superficies de la membrana, denominadas proteínas de transmembrana. Las proteínas de transmembrana pueden atravesar la membrana una vez, o presentar la molécula muy larga y plegada, atravesando la membrana varias veces, por lo que reciben el nombre de proteínas de transmembrana de pasaje múltiple (Figura 5.4). Las proteínas extrínsecas se pueden aislar fácilmente, libre de lípidos, mediante el empleo de soluciones salinas. Estas proteínas se unen a las superficies interior y exterior de la membrana celular a través de diversos mecanismos. A menudo, ellas se unen a las moléculas glicosiladas de fosfatidilinositol. El conocimiento de las proteínas de la membrana plasmática se facilitó en gran medida por el estudio de la membrana de los eritrocitos de los mamíferos, debido a que estas células de la sangre no tienen un sistema interno de membranas. En estos, la única membrana existente es la membrana plasmática, que se puede aislar junto con el citoesqueleto subyacente. La separación de las proteínas de la membrana de los eritrocitos y de su citoesqueleto, por medio de electroforesis en gel, llevó al descubrimiento de tres proteínas principales que serán estudiadas brevemente a continuación, como ejemplos. Una de estas proteínas es la espectrina. Se trata de una proteína extrínseca, fibrosa (molécula altamente alargada), formada por dos polipéptidos, uno con 220 kDa y el otro con 240 kDa (kilodaltons), aproximadamente. Las moléculas de espectrina forman una cuadrícula en la superficie interna de la membrana de los eritrocitos. Se trata de una proteína del citoesqueleto, probablemente, la principal responsable de la forma de disco bicóncavo del eritrocito. La proteína llamada banda 3 (el nombre viene de su posición en el gel) es una proteína de transmembrana que atraviesa la bicapa lipídica varias veces. Por tanto, la molécula de la banda 3 tiene una forma plisada. Esta contiene algunos hidratos de carbono unido a la parte de la molécula localizada en la superficie externa del eritrocito, lo que es una característica general de las glicoproteínas de membrana. La banda 3 sirve como un camino para el paso de aniones a través de la membrana. Al pasar por los capilares pulmonares, los eritrocitos intercambian HCO- por Cl- durante el

proceso de liberación de CO2. La banda 3 es el canal a través del cual sale el HCO- y entra el Cl- en los eritrocitos. La última de las tres principales proteínas de membrana de los eritrocitos es la glicoproteína denominada glicoforina, es una proteína intrínseca que, como la banda 3, es también de transmembrana. Esta atraviesa la membrana sólo una vez, y la mayor parte de su molécula causa una protuberancia en la superficie exterior del eritrocito, donde exhibe 16 cadenas glucídicas, con 100 moléculas de hidratos de carbono, que forman parte del glicocálix. Existen, en la molécula de glicoforina, un corto segmento hidrofóbico, que queda en el interior de la membrana, y dos segmentos hidrofílicos, uno situado en el lado citoplásmico y el otro en la superficie exterior de la membrana. GLICOPROTEÍNAS Y GLICOLÍPIDOS SON MARCADORES RESPONSABLES DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS Un buen ejemplo de marcadores de la superficie celular son las glicoproteínas y los glicolípidos que determinan los grupos sanguíneos. Los grupos MN se deben tanto a la parte proteica como a la parte glucídica de la glicoforina, una glicoproteína de membrana de los eritrocitos. Los grupos A-B-O dependientes de pequeñas variaciones en la estructura de los hidratos de carbono presentes en los glicolípidos y las glicoproteínas de la membrana de los eritrocitos. Las personas con sangre de tipo A presentan la hexosa modificada N-acetilgalactosamina, en una determinada posición de las moléculas de hidratos de carbono de la superficie. Las personas con sangre de tipo B tienen, en la misma posición, la molécula de galactosa. Ahora el tipo AB se caracteriza por la presencia de moléculas de hidratos de carbono con galactosa o con N-acetilgalactosamina en la misma posición. En la sangre de tipo O, la misma posición aparece desocupada, sin mostrar ninguno de las azúcares mencionados. LA MEMBRANA PLASMÁTICA ES ASIMÉTRICA Existe una fuerte asimetría entre los dos lados de la membrana plasmática, tanto en la composición de lípidos como en la de proteínas; Por ejemplo, en la membrana de los eritrocitos la capa lipídica externa es más rica en fosfatidilcolina, mientras que en la capa lipídica en contacto con el citoplasma predominan fosfatidiletanolamina (lecitina) y fosfatidilserina. Como la molécula de fosfatidilserina tiene carga negativa, existe, además de la diferencia química entre las dos capas de la bicapa lipídica, también una diferencia en la carga eléctrica. Otra diferencia consiste en la distribución de las moléculas de glicoproteínas y de glicolípidos que se orientan con los extremos que contienen azúcares, causando protuberancias en la superficie celular (Figuras 5.3 y 5.4) y nunca en la cara citoplásmica de la membrana. Las figuras 5.3 y 5.4 ilustran la asimetría en la distribución de las proteínas. Las proteínas periféricas se concentran en la cara citoplasmática de la membrana, donde algunas pueden unirse a filamentos del citoesqueleto. En la cara externa aparecen los extremos de las proteínas integrales, incluyendo los residuos glucídicos de las glicoproteínas, que se sumarán a los hidratos de carbono complejos de los glicolípidos y las otras moléculas para formar una capa de azúcares, en la cara externa de la membrana, llamada glicocálix. VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS INTEGRALES DE LAS MEMBRANAS Esto es posible por la técnica de criofractura, que consiste en la congelación rápida del tejido, seguido de su fractura. Las superficies de fractura son desecadas y sombreadas con una capa de metal pesado depositada en un ángulo agudo y, luego con una capa de carbono que servirá de soporte. Entonces, los componentes celulares se disuelven, dejando una réplica de la superficie de fractura. Esta réplica será entonces estudiada en el microscopio electrónico. Mediante esta técnica, la membrana sufre fractura en la región que se encuentra entre las dos capas lipídicas, debido a que los lípidos están unidos por interacciones hidrofóbicas, un tipo de enlace débil. Se forman, por lo tanto, artificialmente, dos capas que exponen las caras situadas en el interior de la membrana. La capa interior, en contacto con el citoplasma, expone la llamada cara P (protoplasmática), y la capa exterior expone la

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Membrana plasmática llamada cara E (externa). La cara P mira para fuera de la célula y la cara E mira en la dirección opuesta (Figura 5.6). La técnica de criofractura muestra muy bien las proteínas integrales de la membrana, que aparecen como partículas unidas principalmente a la cara P, mientras que la cara E muestra las cavidades donde se incrustan estas partículas. LAS UNIDADES DE MEMBRANA TIENEN DIFERENTES FUNCIONES En el microscopio electrónico, la membrana plasmática y las demás membranas celulares aparecen como dos capas oscuras, separadas por una capa clara central. Se supone que este aspecto trilaminar es resultado de la reducción del tetróxido de osmio utilizado como fijador y de su deposición en los extremos polares de los lípidos. La parte central clara correspondería a largas cadenas de lípidos apolares (Figura 5.7). La misma estructura trilaminar de la membrana plasmática se ve en todas las membranas celulares. Por lo tanto, la estructura trilaminar se ha denominado unidad de membrana o membrana unitaria. La capa central, clara, mide alrededor de 3,5 nm, y sus capas oscuras miden aproximadamente 2

nm cada una. El espesor total de la unidad de membrana oscila de 7 a 10 nm. Aunque morfológicamente similares, las unidades de membrana no son las mismas, ni en la morfología ni en las funciones. Con la mejora de las técnicas de preparación de los tejidos para estudiarlos al microscopio electrónico, se encontró que las unidades de membrana difieren en el espesor de sus capas. Por otro lado, las membranas aisladas muestran propiedades enzimáticas muy diferentes, así como diferencias en su composición lipídica. Por lo tanto, aunque la organización molecular básica de las membranas sea la misma, ellas varían mucho en su composición química y en las propiedades biológicas. Una misma membrana, como la membrana plasmática, puede mostrar diferentes áreas. Por ejemplo, las membranas de las microvellosidades que recubren las células epiteliales intestinales contienen dipeptidasas y disacaridasas, enzimas responsables de las etapas finales de la digestión de las proteínas y de los carbohidratos, respectivamente, y que no existen en el resto de la membrana plasmática de estas células.

Figura 5.6 Microscopía electrónica de réplica de la membrana plasmática criofracturada. La fractura se lleva a cabo entre la capa interna y la externa de la membrana. La mayoría de las moléculas proteicas permanece adherida a la superficie de la capa interna orientada hacia fuera de la célula (cara P). Por lo tanto, la cara P de las membranas plasmáticas muestra numerosas partículas globulares. La superficie interna de la capa externa, conocida como la cara E, presenta pocas micelas proteicas. Aumento: 150.000x. (Cortesía de A. Martínez-Palomo.)

Figura 5.7 A la izquierda, aspecto de la membrana vista al microscopio electrónico (dos capas oscuras y una capa central, clara). A la derecha, disposición de los lípidos.

GLICOCÁLIX La superficie externa de la membrana plasmática tiene una región rica en hidratos de carbono unidos a proteínas o a lípidos, llamada glicocálix (Figuras 5.8 y 5.9). En su mayor parte, el glicocálix es una extensión de la propia membrana y no una capa separada, estando constituido: (1) por las porciones glucídicas de las moléculas de glicolípidos de la membrana plasmática que causan una protuberancia en la superficie de la membrana; (2) por glicoproteínas integrales de la membrana o aquellas adsorbidas después de la secreción; y (3) por algunos proteoglicanos, todos secretados y luego adsorbidos por la superficie celular. Algunos glicolípidos contienen en sus moléculas una parte glucídica muy compleja, que contiene residuos de D-glucosa, Dgalactosa, de N-acetil-D-galactosamina y de ácido N-acetil-neuramínico (ácido siálico). Entre las glicoproteínas secretadas y que pasan a formar parte del glicocálix, una de las más abundantes es la fibronectina. Esta es una molécula en forma de letra V, constituida por dos polipéptidos similares, cada uno con un peso de 250 kDa (kilodaltons). La molécula de fibronectina tiene regiones que se combinan con moléculas del medio extracelular y la superficie de otras células. Su función es unir a las células unas con otras y anclarlas a la matriz extracelular (Capítulo 12). La fibronectina establece

una continuidad entre el citoesqueleto y las macromoléculas del material extracelular de los tejidos (matriz extracelular). Las microfilamentos de actina del citoesqueleto se unen a las moléculas de la proteína vinculina, quien a su vez, se une a una proteína de la membrana intrínseca con un peso molecular de 140 kDa (kilodaltons), y esta proteína se une a la fibronectina del glicocálix. En otras regiones de su molécula, la fibronectina se une a las proteínas de la matriz extracelular, entre las que se destaca el colágeno. El grupo de macromoléculas constituidas por actina, vinculina, proteína intrínseca de 140 kDa y fibronectina, llamado fibronexus, es un vínculo de acoplamiento funcional, dinámico, entre el citoesqueleto de una célula y la superficie de otras células o a la matriz extracelular de los tejidos. Sin embargo, la fibronectina no es la única proteína que se conecta entre las células y la matriz extracelular. Las células del tejido epitelial de revestimiento, por ejemplo, se unen al colágeno por medio de la glicoproteína laminina, que es secretada por las células epiteliales y se convierte en parte de su glicocálix. El glicocálix es funcionalmente importante y su composición no es estática; varía de un tipo celular a otro y dentro de la misma célula, varía con la región de la membrana y conforme a la actividad funcional de la célula en un momento dado.

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Figura 5.8 Glicocálix en las extensiones (microvellosidades) de las células intestinales. Las microvellosidades, con filamentos en el interior, aparecen en corte transversal. Observe la membrana plasmática, desde la cual se origina el glicocálix. Micrografia electrónica. Aumento: 100.000x.

Figura 5.9 Glicocálix de las células epiteliales del intestino de rata, demostrado por el rojo de rutenio. Observe los haces de filamentos que penetran en las microvellosidades (puntas de flecha). Microscopía electrónica. Aumento: 84.000x. (Cortesía de A. Martinez-Palomo.)

LAS CÉLULAS SE RECONOCEN Numerosas evidencias demuestran que la superficie de la célula está dotada de especificidad, la que permite que las células se reconozcan entre sí y establezcan algún tipo de relación. Cultivando las células hepáticas y renales, separadas y mezcladas en un medio líquido y mantenidas bajo agitación suave, después de algún tiempo, se observa la aparición de dos grupos celulares; uno de ellos contiene solamente células hepáticas, mientras que el otro contiene sólo las células renales. Al principio, las células estaban aisladas individualmente y mezcladas; Sin embargo, como el cultivo fue mantenido en agitación suave, las células se chocaron al azar y las del mismo tipo se reconocieron entre sí, adhiriéndose unas con otras y formaron un esbozo de tejido. Otro ejemplo que muestra este papel biológico de la membrana es el fenómeno conocido como inhibición por contacto. Las células cultivadas unidas a un soporte - como un cubreobjetos, por ejemplo -, proliferan formando una lámina de una sola capa de células. Iniciando el cultivo de diversos grupos celulares, colocados en sitios separados de un mismo cubreobjetos, las células de cada grupo se multiplican sobre el cubreobjetos, formando una capa celular. Cada grupo de células crece por separado, pero, cuando las células de un grupo se encuentran con las células de otro grupo, las mitosis cesan. Curiosamente, el mismo experimento realizado con células cancerosas muestra que pierden la propiedad de la inhibición por contacto. Después de encontrarse, las células cancerosas continúan dividiéndose y amontonándose desordenadamente unas sobre otras. Al igual que con las macromoléculas en general, las proteínas de membrana son inmunogénicas, es decir, que promueven una respuesta inmune cuando penetran en un organismo extraño. Por ejemplo, el trasplante de tejidos de un animal a otro estimula al animal receptor a producir células y anticuerpos que atacan a las proteínas de la membrana plasmática de las células trasplantadas. En los seres humanos y en otros mamíferos, el mecanismo para distinguir lo que es propio del cuerpo (self) de aquello que es extraño (no-self) es la responsabilidad de un grupo de moléculas glicoproteicas de la membrana, que forman una saliente en la superficie externa y son llamadas el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) o MHC (major histocompatibility complex). Hay dos clases de CMH, llamados CMH I y CMH II. Todas las células del cuerpo, excepto algunas células del sistema inmune, contienen en la superficie el CMH I. Ciertas células del sistema inmunitario presentan el complejo CMH II en sus superficies. Los dos CMH son glicoproteínas cuyas moléculas tienen una parte constante y una parte variable. La parte variable difiere ampliamente en la secuencia de aminoácidos de persona a persona, por lo que no existe la posibilidad de que más de una persona presente un CMH idéntico. La única excepción son los gemelos univitelinos o gemelos idénticos, porque provienen del mismo óvulo y del mismo espermatozoide. Por lo tanto, sus células son genéticamente iguales, y, en estos gemelos, las proteínas celulares son idénticas. Para minimizar la respuesta inmune, la causa del rechazo de los trasplantes, se procuran donantes cuyos complejos CMH sean lo más similar posible a los del receptor. EL TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA

Para la mayoría de las sustancias, existe una relación directa entre su solubilidad en los lípidos y su capacidad de penetrar en las células. En general, los compuestos hidrofóbicos, solubles en lípidos, tales como los ácidos grasos, hormonas esteroides y anestésicos atraviesan fácilmente la membrana. En cuanto a las sustancias hidrofílicas, insoluble en los lípidos, penetran en las células con más dificultad, dependiendo del tamaño de la molécula y también de su composición química. La configuración molecular puede permitir que la sustancia sea transportada por medio de unos mecanismos especiales desarrollados durante la evolución, como el transporte activo y la difusión facilitada. Permeabilidad al agua La membrana celular es altamente permeable al agua. Colocadas en una solución hipotónica, las células aumentan de volumen debido a la penetración del agua (Figura 5.1). Si el aumento de volumen es demasiado fuerte, la membrana plasmática se rompe y el contenido de la célula se derrama, un fenómeno conocido como la lisis celular. Sin embargo, cuando se colocan en solución hipertónica, las células disminuyen el volumen debido a la salida de agua (Figura 5.1). Teniendo entrada o salida de agua, la forma de la célula también se altera, por ser determinada en parte por el estado de hidratación de los coloides celulares. En las soluciones isotónicas, el volumen y la forma de la célula no cambian. En las células vegetales se produce un fenómeno similar al observado en las células de los animales, pero las consecuencias son diferentes debido a la pared de celulosa. En solución hipertónica, las células vegetales pierden agua y disminuyen de volumen, separándose el citoplasma de la pared celular la cual es rígida. Este fenómeno se llama plasmólisis. Cuando se coloca en medio hipotónico, el volumen de las células vegetales aumenta, como ocurre con los eritrocitos, pero no se rompe debido a la pared de celulosa. Esta pared limita el aumento del volumen celular y lo mantiene dentro de un rango que no exceda la resistencia de la membrana plasmática. El aumento de volumen sufrido por una célula vegetal, al pasar de una solución hipertónica a una solución hipotónica, se llama desplasmólisis (Figura 5.1). Como se mencionó anteriormente, existe una relación directa entre la solubilidad de las sustancias en los lípidos y la facilidad con la que estas penetran en las células. Sin embargo, la membrana también es altamente permeable al agua y ciertas sustancias hidrófilas e insolubles en lípidos, tales como la urea y el glicerol, gracias a moléculas proteicas ubicadas en el espesor de la membrana, atravesándola de una cara a otra. Estas proteínas de transmembrana forman poros "funcionales", es decir, vías hidrofílicas por las que pasan muchos iones y moléculas que no pueden penetrar la barrera lipídica. Difusión pasiva Muchas moléculas entran o salen de las células por difusión pasiva, es decir, como la distribución de soluto tiende a ser uniforme en todos los puntos del disolvente, el soluto entra en la célula cuando su concentración es menor en el interior celular que en el medio externo, y sale de la célula en el caso contrario. La fuerza que impulsa al soluto para dentro o para fuera de la célula es la agitación térmica de las moléculas del soluto. La difusión pasiva no desperdicia energía. Es un proceso físico de difusión a favor de un gradiente.

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Membrana plasmática Transporte activo Otro proceso de pasaje a través de la membrana celular es el transporte activo. En este caso, hay consumo de energía proporcionada por el ATP y la sustancia puede ser transportada de un lugar de baja concentración a otro de alta concentración. Por lo tanto, el soluto en difusión activa se transporta contra un gradiente, que puede ser un gradiente sólo químico, en el caso de solutos no electrolitos, o un gradiente eléctrico y químico cuando se ioniza el soluto. Así, por ejemplo, cuando la célula transporta iones de sodio (Na+) del citoplasma (donde su concentración es baja) al medio extracelular (donde la concentración es mayor), debe vencer una barrera química, representada por la alta concentración de iones de sodio en el medio extracelular, y una barrera eléctrica, que es la suma de las cargas positivas de los iones de sodio, lo que dificulta la entrada de nuevos iones positivos en el espacio extracelular. Difusión facilitada Numerosas sustancias tales como glucosa y algunos aminoácidos, entran en las células por difusión facilitada, sin gasto de energía. En este caso, la difusión procede a favor de un gradiente, pero a una velocidad más alta que la difusión pasiva. La velocidad con la que se procesa la difusión facilitada es estereoespecífica. En consecuencia, los compuestos isómeros generalmente penetran con velocidades muy diferentes. En los eritrocitos existe difusión facilitada de D-glucosa y D-galactosa, pero lomismo no ocurre con las formas L de estos dos azúcares. La velocidad de la difusión facilitada no es proporcional a la concentración de soluto, excepto en concentraciones muy bajas. Aumentándose gradualmente la concentración de la molécula penetrante, se llega a un punto de saturación, más allá del cual la velocidad de penetración ya no aumenta. Estas y otras propiedades muestran que, en la penetración facilitada, la sustancia penetrante se combina con una molécula transportadora o permeasa, situada en la membrana plasmática (Figura 5.10). Cuando todas las moléculas transportadoras están ocupadas, la velocidad de penetración no puede aumentar. Transporte impulsado por gradientes iónicos La célula puede utilizar la energía potencial de los gradientes de iones, típicamente Na+, pero también K+ e H+, para transportar moléculas e iones a través de la membrana. El epitelio de revestimiento del intestino delgado es un ejemplo ilustrativo para entender este tipo de transporte contra gradiente. La ingestión de alimentos lleva glucosa al lumen del intestino delgado, de donde debe ser absorbida por las células epiteliales y transferida al torrente sanguíneo. El transporte de glucosa a través de la membrana plasmática de la porción apical de las células epiteliales de la mucosa intestinal se hace en contra de un gradiente de glucosa existente en el citoplasma de estas células. Se observó que esta penetración de glucosa se hace concomitantemente con la penetración de Na+. Es un cotransporte realizado con el consumo de energía proporcionado por el gradiente de Na+. La concentración de Na+ en el citoplasma de las células es muy baja debido a la actividad de las moléculas proteicas, que por transporte activo, bombean Na+ fuera de las células (bombas de Na+). Como la concentración de Na+ es alta en el lumen del intestino, estos iones tienden a penetrar constantemente en las células epiteliales de la mucosa intestinal. La energía del movimiento de los iones Na+ es utilizada por estas células para realizar el cotransporte de glucosa hacia dentro de la célula en contra de un gradiente de glucosa. Por lo tanto, los iones Na+ penetran en las células epiteliales a favor de un gradiente, proporcionando energía para impulsar a las moléculas de glucosa en contra de un gradiente. Este tipo de cotransporte, que mueve a los iones y las moléculas en la misma dirección, en el ejemplo para dentro de la célula, se llama simporte (Fig 5.11). En en estos casos de cotransporte, la proteína transportadora que permite el simporte captura tanto glucosa como Na+ en el medio extracelular (luz intestinal). La liberación de Na+ en el citoplasma, donde la concentración de Na+ es baja, provoca un cambio en la forma de la molécula transportadora, haciéndola perder su afinidad por la glucosa. Por lo tanto, la molécula de glucosa capturada en el lumen intestinal es liberada dentro de la célula epitelial intestinal. Entonces, la glucosa se difunde en el citoplasma y por la parte basal de las células epiteliales, pasa, por difusión facilitada, al tejido circundante donde entra en los capilares sanguíneos para ser distribuida en todo el cuerpo.

En otros casos de cotransporte, se observó que el ión que proporciona la energía y la molécula que es transportada se mueven en direcciones opuestas, formando lo que se denomina antiporte (Figura 5.11). En los antiportes cuando el ión proveedor de energía se mueve hacia el citoplasma, la molécula transportada se transfiere fuera de la célula y viceversa. Muchas moléculas importantes para las células, tales como los hidratos de carbono y los aminoácidos, así como los iones, pueden ser transportadas a través de simportes y antiportes, además de otros procesos de transporte mencionados anteriormente. Transporte en cantidad Según los procedimientos descritos en este capítulo, las pequeñas moléculas y los iones atraviesan la membrana plasmática y entran en el citoplasma o salen de este. Sin embargo, las células también son capaces de transferir a su interior, en bloque, grupos de macromoléculas (proteínas, polisacáridos, polinucleótidos) e incluso partículas visibles bajo un microscopio óptico, tales como bacterias y otros microorganismos. Este transporte es dependiente de cambios morfológicos en la superficie celular, donde forman pliegues que engloban el material a ser introducido en la célula (Capítulo 10). Fagocitosis Es el nombre dado al proceso por el cual la célula, gracias a la formación de pseudópodos, engloba en su citoplasma partículas sólidas que, por sus dimensiones, son visibles al microscopio óptico. Por lo tanto, la fagocitosis se puede observar fácilmente por el estudio de células vivas con los microscopios de contraste de fase. La fagocitosis se produce cuando la partícula se fija a receptores específicos de la membrana celular, capaces de desencadenar una respuesta en la que participa el citoesqueleto (Figuras 5.12 y 5.13). En los protozoarios, la fagocitosis es un proceso de alimentación; en los animales, es un mecanismo de defensa En los mamíferos, la fagocitosis se realiza principalmente por células especializadas en la defensa del organismo, tales como los neutrófilos y los macrófagos (Figura 5.14). Sin embargo, como se muestra en la Figura 5.15, varios microorganismos desarrollaron, durante la evolución, muchos mecanismos para escapar a la muerte intracelular después de ser fagocitados. (El tema de esta sección también se trata en el capítulo 10.) Pinocitosis: captación activa de macromoléculas en solución El término pinocitosis se utilizó inicialmente para designar el englobamiento de las gotitas líquidas observada en las células cultivadas. Estas células emiten prolongaciones citoplasmáticas delgadas que engloban gotitas del medio de cultivo en vesículas de hasta 1µm de diámetro. Sin embargo, este modo de pinocitosis está restringido a unos pocos tipos celulares, principalmente en los cultivos celulares. En la pinocitosis común, observada en diversos grados en todas las células, ocurre la invaginación de un área localizada de la membrana plasmática, formándose pequeñas vesículas que son impulsadas por el citoesqueleto y entran en el citoplasma. Estas vesículas transportan líquidos y son uniformes en tamaño, con 200 nm de diámetro (Figura 5.16). En algunos casos, como en las células endoteliales de los capilares sanguíneos, las vesículas de pinocitosis formadas en un lado de la célula atraviesan el citoplasma y liberan su contenido en el otro lado de la célula, funcionando como transportadoras. En la pinocitosis no selectiva, las vesículas engloban todos los solutos que están presentes en el fluido extracelular. Sin embargo, en la mayoría de las células, la pinocitosis es selectiva y se realiza en dos etapas. Al principio, la sustancia a ser incorporada se adhiere a receptores de la superficie celular; en la segunda, la membrana se sumerge y el material adherido a ella pasa a una vesícula. Esta se desprende de la superficie celular y entra en el citoplasma (Figura 5.17). Un ejemplo bien estudiado de pinocitosis selectiva se encuentra en las células precursoras de los eritrocitos que incorporan transferrina, una proteína plasmática transportadora de hierro que se utiliza para la síntesis de hemoglobina. Sin embargo, sólo existe pinocitosis en lugares específicos de la membrana, en los que hay receptores para las moléculas de transferrina. Esta pinocitosis tiene la ventaja de permitir la incorporación al citoplasma de grandes cantidades de un tipo de molécula, sin la penetración concomitante de mucha agua. (El tema de esta sección también se trata en el capítulo 10.)

Figura 5:11 En esta ilustración, los iones representados por los cuadrados (a) más concentrados del medio extracelular, avientan la molécula (b) hacia el interior de la célula, por simporte. Cuando la molécula es transportada en la dirección opuesta al movimiento de los iones, el sistema se denomina antiporte. La energía derivada del gradiente iónico de (a) se utiliza para mover la molécula o ión (b).

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Figura 5.12 El diagrama muestra que la fagocitosis resulta de la interacción de moléculas específicas. El ejemplo muestra hematíes experimentalmente cubiertos por el factor C3 del complemento (el complemento es un grupo de proteínas del plasma sanguíneo con diferentes funciones). La combinación sucesiva de las moléculas del factor C3 con los receptores se puede comparar con un cierre de una cremallera. Por lo tanto, el eritrocito es englobado en una vacuola. El receptor estimulado promueve la polimerización de monómeros de actina del citosol, que van a formar microfilamentos contráctiles. (Basado en Silverstein SC, Michl, J. y Loike JD.: International Cell Biology 1980-1981. Schweiger, H.G. (ed.) Springer, Nueva York, 1981.)

Figura 5.13 Etapas (1 a 4) de la fagocitosis de una bacteria ya atacada por inmunoglobulinas. La superficie del macrófago tiene receptores para el segmento Fc de la inmunoglobulina, que promueven la adherencia de la bacteria. En 4 aparece la bacteria dentro de un fagosoma, donde podrá ser muerta y luego digerida por las enzimas de los lisosomas. M, mitocondria; REG, retículo endoplasmático granular; C, centríolo; G, Aparato de Golgi. (Reproducido con permiso, de Carneiro, J. Bases Celulares para la Fisiopatología. In: Marcondes, M. et al. Clínica Médica, 3° ed., Guanabara Koogan, Río, 1984.)

RECICLAJE DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA Grandes cantidades de membrana plasmática se introduce en el citosol, sin que se note la contracción de la membrana, sin reducir el tamaño de la célula y sin la síntesis de nuevas moléculas para reponer la membrana eliminada. La cantidad enor me de membrana retirada de la superficie celular, por los procesos de fagocitosis y pinocitosis es compensada por la devolución de membrana de las vesículas de secreción, y también por el

retorno de membrana de las vesículas de pinocitosis después que estas liberan sus cargas en los endosomas (Figura 5.17) . Así, existe en las células en general un flujo constante de membranas, entre la membrana plasmática y la membrana de las vesículas de fagocitosis, pinocitosis, y de secreción. Las células permanecen del mismo tamaño, no sólo por la síntesis de nueva membrana plasmática, sino también por la devolución de la membrana retirada.

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Membrana plasmática

Figura 5.14 La micrografía electrónica muestra macrófagos en los que se está reproduciendo el bacilo Mycobacterium leprae responsable de la lepra.

Figura 5.15 Ilustración de tres ejemplos de mecanismos utilizados por microorganismos patógenos (pathos, enfermedad y genesis, generación) fagocitados, para evitar ser atacados por los lisosomas. A. Algunos microorganismos como los bacilos tuberculosos secretan una sustancia que impide la fusión de los lisosomas con los fagosomas. B. En esta etapa, el bacilo de la lepra se defiende desarrollando una cápsula fuerte e impermeable a las enzimas lisosomales. C. Otro ejemplo está dado por el Trypanosoma cruzi, el cual al ser fagocitado, digiere rápidamente la membrana que lo rodea (membrana del fagosoma), quedando libre en el citoplasma.

LAS MICROVELLOSIDADES SON EXTENSIONES QUE AUMENTAN LA SUPERFICIE DE ABSORCIÓN DE LAS CÉLULAS En los metazoos existen células especializadas en la absorción de varias sustancias. En los mamíferos, las células mejor estudiadas son las células del intestino delgado y las del riñón. Las células que recubren la superficie interna del intestino delgado son columnares, dispuestas en una sola capa, y sus superficies en contacto con los alimentos tienen numerosas digitaciones: las microvellosidades (Figura 5.18). Cada microvellosidad es una expansión del citoplasma recubierta por membrana y contiene numerosos haces de microfilamentos de actina responsables de mantener la forma de las microvellosidades; su glicocálix está más desarrollado que en el resto de la célula (Figura 5.9). En el intestino, la función de las microvellosidades es incrementar el área de la membrana para facilitar el transporte de nutrientes desde la luz intestinal hacia el interior de las células. A partir de entonces, los nutrientes pasan de las células al tejido conectivo y de allí a los vasos sanguíneos y linfáticos, distribuyéndose a continuación, por todo el organismo. Las microvellosidades del epitelio intestinal son paralelas entre sí y forman una capa muy suave en la superficie intestinal, el borde estriado o chapa estriada, visible al microscopio óptico. En el riñón, las microvellosidades se encuentran en la superficie libre de la capa única de células cúbicas que revisten los túbulos contorneados proxi-

males. Por la luz de estos túbulos pasa un filtrado de plasma sanguíneo que forma la orina, pero que todavía contiene muchas moléculas aprovechables. En los túbulos contorneados proximales, muchas de estas moléculas son removidas del filtrado, pasando a las células de los túbulos, de donde son devueltas posteriormente a la sangre. Las microvellosidades de estas células también están dispuestas paralelas entre sí, formando un borde estriado visible al microscopio óptico. Las microvellosidades de las células renales, como todas las microvellosidades, sólo pueden ser individualizadas al microscopio electrónico. La mayoría de las células tienen microvellosidades, aunque no tan numerosas y organizadas como los de las células absorbentes. Las microvellosidades que se encuentran en las células en general son pequeñas, de forma irregular, contienen menos filamentos y se distribuyen desigualmente por toda la superficie celular. Además de aumentar la superficie celular, algunas microvellosidades tienen membranas que contienen moléculas especiales. Por ejemplo, algunas enzimas de la membrana de las células de revestimiento intestinal sólo existen en las microvellosidades, como las disacaridasas y las dipeptidasas, responsables de la etapa final de la digestión de hidratos de carbono y proteínas, respectivamente.

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Figura 5.16 Pared de un capilar sanguíneo que muestra células endoteliales con numerosas vesículas de pinocitosis (flechas). Micrografía electrónica. Aumento: 18.000x.

Figura 5.17 Esquema de la vía endocítica y del reciclaje de la membrana plasmática. Ligandos tales como hormonas, factores de crecimiento y otras moléculas se unen a receptores específicos de la membrana plasmática y son introducidos en el citoplasma a través de las vesículas recubiertas de clatrina. Después de la liberación de las moléculas de clatrina y de proteínas asociadas a la misma, la vesícula de pinocitosis se fusiona con los componentes del compartimento endosomal, donde, debido al bajo pH, el ligando se separa de los receptores. Éstos se centran en una región particular del endosoma temprano y son devueltos a la superficie celular. Consecuentemente, tanto los receptores como la membrana plasmática son reciclados para ser utilizados de nuevo. En el siguiente paso, el ligando se puede encontrar en los lisosomas.Todos los desplazamientos de las vesículas descritos tienen lugar por la actividad de las proteínas motoras con la participación del citoesqueleto.

LOS ESTEREOCILIOS SON ESPECIALIZACIONES APICALES QUE AUMENTAN LA SUPERFICIE DE ALGUNAS CÉLULAS EPITELIALES Los estereocilios son expansiones largas y filiformes de la superficie libre de ciertas células epiteliales (Figura 5.19). Son flexuosos y, a pesar de su nombre, no tienen ni la estructura ni la capacidad de movimiento de los cilios verdaderos.

El estereocilios son más afines a las microvellosidades, distinguiéndose de éstas porque se ramifican a menudo y presentan una mayor longitud. Mientras que las microvellosidades son comunes en muchos tipos de células, los estereocilios se encuentran sólo en ciertas células epiteliales, tales como las que recubren el epidídimo y otros conductos del tracto genital masculino. Los estereocilios aumentan en gran medida la superficie de las células, facilitando el transporte de agua y otras moléculas.

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Membrana plasmática

Figura 5.18 Microvellosidades de las células epiteliales del intestino delgado. Micrografía electrónica. Aumento: 25.000x.

Figura 5.19 Estereocilios. Células epiteliales del epidídimo. Tenga en cuenta que los estereocilios son flexuosos y por lo tanto aparecen principalmente en cortes oblicuos. Micrografía electrónica. Aumento: 12.000x.

ADHESIÓN ENTRE LAS CÉLULAS A TRAVÉS DE LAS CAM, GLICOPROTEÍNAS DE TRANSMEMBRANA Se ha mencionado en este capítulo, que las células pueden reconocerse y unirse entre sí. Esta propiedad es importante en los mecanismos de desarrollo embrionario y en el establecimiento y mantenimiento de la estructura de los tejidos, desde los animales más primitivos hasta la especie humana. Las células también se adhieren a la matriz extracelular, asunto que se explicará en el capítulo 12. Las glicoproteínas de la membrana responsables de la adhesión entre las células se denominan CAM (cell adhesión molecules). Las CAM son receptores de la superficie especializadas en reconocer otras células y adherirse a ellas, para formar los tejidos y órganos. A menudo, las células responden a la unión con las CAM con pequeñas modificaciones del comportamiento, muchas veces produciendo disminución en la frecuencia de la mitosis. La inhibición por contacto en células en cultivo, ya descrita, es un ejemplo. Todas las CAM son glicoproteínas integrales de transmembrana, es decir, con un extremo de la molécula expuesto en la superficie celular y el otro extremo formando una protuberancia del lado citoplasmático de la membrana. Las IgCAM constituyen un grupo importante y sus moléculas se asemejan a la de los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig). Entre las IgCAM se pueden mencionar la C-CAM, encontradas en la superficie de los hepatocitos (células del hígado), la Ng-CAM, de las neuronas y células gliales (la glia o neuroglia está formada por células gliales que funcionan como sostén, ofrecen aislamiento eléctrico y tienen otras funciones relacionadas con la actividad del tejido nervioso), la N-CAM participa en la adhesión de las neuronas, y la I-CAM se encuentra en muchos tipos de células. La I-CAM de los leucocitos (glóbulos blancos de la sangre) participa en la adhesión temporal de los leucocitos a las células endoteliales de los vasos sanguíneos, como parte del proceso inflamatorio. Tenga en cuenta que en este caso la adhesión es transitoria, a diferencia de lo que suele ocurrir en los tejidos donde las CAM forma adherencias duraderas. También en los procesos de cicatrización de las heridas y la regeneración de tejidos, las CAM forman adherencias transitorias que se desmoronan y rehacen en un proceso dinámico relacionado con los desplazamientos celulares. La misma dinámica se produce durante el desarrollo embrionario para permitir los movimientos celulares necesarios para la formación de la estructura final de los diversos tejidos y órganos. Las cadherinas son otro grupo CAM, sin embargo, a diferencia de las IgCAM, dependen de iones Ca2+. Las cadherinas mantener la adhesión entre las células en concentraciones normales de Ca2+ en el medio extracelular, pero pierden la adhesividad cuando la concentración de este ión es muy baja. Cuando las células normales se transforman en células malignas pierden su adhesividad, separándose unas de otras. Las células malignas libres,

desprendidas, son transportadas por la sangre o por la linfa, produciendo tumores a distancia, las metástasis (Capítulo16). Incluso las CAM de las células normales pueden participar en los procesos patológicos. Un ejemplo es la afinidad del virus de la poliomielitis por las neuronas. Estos virus se unen a las CAM de las neuronas y así penetran en estas células. ESTRUCTURAS ESPECIALIZADAS ASEGURAN LA UNIÓN CELULAR, SELLANDO EL ESPACIO INTERCELULAR Y LA COMUNICACIÓN ENTRE LAS CÉLULAS A menudo, las células se unen entre sí y a la matriz extracelular a través de estructuras de unión, que se describirán a continuación, y que se pueden dividir en tres grupos: 1°, las estructuras cuya función principal es unir firmemente las células unas a las otras o a la matriz extracelular (desmosomas y uniones adherentes); 2°, una estructura que promueve el sellado entre las células (unión oclusiva, zonula ocludens o tight junction); y en tercer lugar, una estructura que establece la comunicación entre una célula y otra (unión comunicante, nexo o gap junction). Desmosoma Los desmososmas también son conocidos como macula adherens. Cada desmosoma tiene la forma de una placa redonda y está contituido por las membranas de dos células adyacentes (Figura 5.20). En el desmosoma, el espacio de 15-20 nm existente entre las membranas se mantiene sin cambios, pero aparece un material filamentoso o granular denso a los electrones (Figura 5.21). En los desmosomas, existe una capa amorfa, electrodensa en la cara citoplásmica de cada membrana, llamada placa desmosomal. En esta placa se insertan filamentos intermedios, que se sumergen en el interior de la célula (Figura 5.21). Por lo tanto, los desmosomas son lugares donde el citoesqueleto se une a la membrana celular, y, como las células se adhieren entre sí, se forma un vínculo de unión con el citoesqueleto de las células adyacentes. La constitución molecular de los filamentos intermedios que se unen a los desmosomas depende del tipo celular. En las células epiteliales están formados de queratina, pero en las células musculares del corazón se componen de vimentina. La capacidad de los desmosomas para unir las células adyacentes depende de la presencia de cadherinas, proteínas de transmembrana que exhiben adhesividad en presencia de iones Ca2+. Por lo tanto, el desmosoma sólo es capaz de fijar las células cuando la concentración de Ca2+ en el espacio extracelular es normal. Las bajas concentraciones de estos iones Ca2+ provocan la separación de las células. Los desmosomas son muy comunes en las células sometidas a tracciones, como las de la epidermis, las del revestimiento de la lengua y del esófago, y las células del músculo cardiaco. Se forman muy fácilmente en las células mantenidas en cultivo y desaparecen en las que sufren una transformación maligna (células cancerosas), tanto in vivo como en cultivos.

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La composición molecular de los desmosomas es compleja, con la participación de varias proteínas, tales como las desmoplaquinas I y II, glicoproteínas que se encuentran en las placas. Los filamentos intermedios se unen a las desmoplaquinas por medio de otras proteínas tales como la desmocalmina y la queratocalmina. Las glicoproteínas desmogleína y desmocolinas son cadherinas, glicoproteínas integrales de membrana que se unen a las membranas celulares a la altura del desmosoma y que también contribuyen a la estructura de la placa. La desmogleína y las desmocolinas son proteínas de transmembrana que causan una protuberancia tanto en la superficie externa como la superficie citoplasmática de la membrana. Las células de los epitelios se apoyan en una membrana no celular, llamada lámina basal, que separa el epitelio del tejido conectivo. La cara de las células epiteliales en contacto con la lámina basal presenta estructuras parecidas a los desmosomas, pero llamadas hemidesmosomas por no tener la mitad correspondiente a la otra célula epitelial (Figura 5.22). A pesar de su apariencia morfológica similar a la mitad del desmosoma, los hemides-

mosomas presentan diferencias moleculares con respecto a los desmosomas. Los hemidesmosomas contienen desmoplaquinas pero no contienen desmogleína, adhiriéndose a las láminas basales a través de moléculas proteicas de la clase de las integrinas (Capítulo 12). Existe un grupo de enfermedades de la piel humana, donde aparecen ampollas, genéricamente conocidas como pénfigo. En ciertos tipos de pénfigo se ha detectado en la sangre de los pacientes anticuerpos contra cadherinas de los desmosomas. En estos casos, la desorganización de los desmosomas, por la alteración de sus proteínas, causa el alejamiento de las células de la epidermis y la penetración de líquido procedente del tejido conectivo subyacente. Los desmosomas de tejidos distintos de la piel no muestran cambios en estos pacientes, lo que sugiere que hay diferencias en las proteínas que constituyen a los desmosomas de las células diferentes.

Figura 5.20 Micrografía electrónica de interdigitaciones que unen a las células epidérmicas entre sí. Aparecen también numerosos desmosomas [flechas). Aumento: 36.000X.

Figura 5.21 desmosoma. Micrografía electrónica de células epiteliales de revestimiento. Tenga en cuenta también los numerosos tonofilamentos (un tipo de filamento intermedio, hecho de queratina) en el citoplasma de las dos células. Aumento: 100.000x.

Unión adherente La unión adherente también es conocida como zonula adherens. Se trata de una formación que se encuentra en diversos tejidos. En ciertos epitelios de revestimiento, rodea la parte apical de las células, como una cinta sempiterna (zonula adherens), estando desarrollada en particular en el epitelio cilíndrico simple con chapa estriada de la mucosa del intestino. Junto a la forma de cinta, la unión adherente se presenta también con una forma oval o circular como los desmosomas. La unión adherente presenta en los cortes, un material granular y denso a los electrones en el espacio intercelular, similar al observado en los desmosomas. A nivel de la unión adherente existe deposición de material amorfo en el lado citoplasmático de cada membrana celular, formando placas, en donde se insertan los filamentos de actina que forman parte del citoesqueleto y son contráctiles. Sin embargo, el material amorfo que forma las placas de las uniones adherentes es menos compacto que el observado en las placas de los desmosomas. Las uniones adherentes, como los desmosomas, también son sensibles a los niveles de iones Ca2+, siendo interrumpidas cuando la concentración de estos iones es muy baja, lo que provoca la separación de las células. En el caso de células columnares del epitelio intestinal, la unión adherente promueve la adhesión entre las células y proporciona un soporte para colocar los filamentos para penetrar en la microvellosidades de las células epiteliales con el borde estriado. Unión oclusiva A la unión oclusiva también se le conoce como zonula ocludens y tight junction. Se trata de una banda continua alrededor de la parte apical de

ciertas células epiteliales, que sella total o parcialmente el tránsito de iones y moléculas a través de las células. Por lo tanto, las sustancias que pasan a través de la capa epitelial lo hacen a través de las células, siendo sometidas al control celular. Otra función de la unión oclusiva, es permitir la existencia de diferentes potenciales eléctricos, debido a diferencias en la concentración iónica entre los dos lados de la capa epitelial. Eso sería imposible si no hubiera libre paso de iones a través de las células. Por lo tanto, se trata de una estructura responsable de la formación de compartimentos funcionalmente separados, a menudo constituidos por capas epiteliales con uniones oclusivas bien desarrolladas. La Figura 5.23 muestra la estructura de la unión oclusiva. En el corte, esta aparece como una región donde se fusionan las cubiertas externas de las membranas plasmáticas de las dos células adyacentes. Complejo de unión Está presente en diversos epitelios cerca del extremo celular libre, estando formado por los siguientes elementos: uniones oclusivas, unión adherente en una fila de desmosomas (Figuras 5.24 y 5.25). Algunos autores no incluyen los desmosomas como parte del complejo de unión. El complejo de unión es una estructura de unión y sellado. En las células del epitelio columnar simple con chapa estriada del intestino, existe, al nivel del complejo de unión una condensación de filamentos que contienen actina, miosina y otras proteínas, que se denomina trama terminal. Los filamentos de la trama terminal se insertan en la unión adherente y se continúan con los filamentos que penetran en las microvellosidades de la chapa estriada. Los filamentos de la trama terminal son continuos también con los filamentos del resto del citoplasma, participando así en el citoesqueleto.

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Figura 5.22 Micrografía electrónica de la parte basal de una célula epitelial de revestimiento, en contacto con el tejido conjuntivo (TC). Aparecen varios hemidesmosomas uniendo la célula al tejido conjuntivo, a través de la lámina basal (LB). Existe material filamentoso que sostiene cada hemidesmosoma a la lámina basal. Piel de ratón. Aumento: 80.000X.

Figura 5:23 Microscopía electrónica de una réplica de célula de revestimiento del intestino delgado preparada por criofractura. En la región de la zonula occludens, similar a las uniones oclusivas o tight junctions, se observa una red de protuberancias de un lado de la membrana (la parte izquierda de la figura) que corresponden a las depresiones vistas en la parte izquierda de la figura. Aumento: 68.000x. (Cortesía de A. Martinez-Palomo.)

Figura 5.24 Figura 5.25 Figura 5.24 Esquemas del complejo de unión existente entre las células epiteliales del intestino delgado. Figura 5.25 Micrografia electrónica del complejo de unión. ZO, zonula occludens; ZA, zonula adherens; MA, o D, macula adherens o desmosoma. Aumento: 80.000x.

Unión comunicante También llamada nexo, unión en hendidura o gap junction (Figura 5.26), es de aparición muy frecuente, habiendo sido observada entre las células epiteliales de revestimiento, las del epitelio glandular, las musculares lisas, las musculares cardiacas y nerviosas. Esta es una estructura cuya función principal es la de establecer la comunicación entre las células, lo que permite a los grupos celulares funcionar de manera coordinada y armoniosa, formando un conjunto funcional. En la unión comunicante, las membranas de las células están separadas por sólo 2 nm. Cada unión - generalmente con forma circular - está constituida por un conjunto de tubos proteicos paralelos que atraviesan las membranas de las dos células. Cada tubo se forma uniendo dos pequeños tubos, los connexons o conexonas, pertenecientes a cada una de las células adyacentes. El connexon consta de 6 unidades proteicas. El diámetro del tubo es de 7 nm, y su poro o canal, hidrofílico, está en el intervalo

de 1,0 a 1,4 nm, lo que permite el paso de moléculas de hasta 1200 daltons. Por medio de las uniones comunicantes pueden pasar de una célula a otra por distancias apreciables, varias sustancias naturales tales como nucleótidos, aminoácidos e iones. Sin embargo, los poros de las uniones comunicantes no permiten el paso de macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos. Se ha demostrado que el AMP cíclico (un mensajero intracelular) producido en una célula en respuesta a la acción hormonal, pasa a través de las uniones comunicantes, provocando una respuesta en las células adyacentes. Esto demuestra que estas uniones pueden coordinar y ampliar la respuesta de los grupos celulares a los estímulos fisiológicos. Las uniones comunicantes pueden pasar de un estado de baja permeabilidad a un estado de alta permeabilidad y con ello abrir o cerrar la comunicación entre las células (Figura 5.27).

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Figura 5:26 Micrografía electrónica de la réplica de una unión comunicante criofracturada, que muestra la cara P de la membrana de una de las células. Tenga en cuenta que hay una acumulación de partículas globulares que se adhieren a la cara P de la membrana. La cara E, que no aparece en esta figura, contiene depresiones donde encajan las partículas de la cara A. Preparado de célula trofoblástica de embrión de ratón. Aumento: 190.000X. (Cortesía de A. Martinez-Palomo.)

Figura 5.27 El dibujo esquemático muestra el modelo de unión comunicante o gap junction, en su estado abierto (a la izquierda) y en el estado completamente cerrado (derecha). Hay un deslizamiento de las moléculas proteicas de la unión, que cierra la abertura central a través de la cual las células adyacentes se comunican.

¿DÓNDE SE ORIGINAN LAS MOLÉCULAS QUE COMPONEN LAS MEMBRANAS CELULARES? Los diversos sistemas de membranas intracelulares y la membrana plasmática, con sus especialidades, están formadas por diferentes tipos de moléculas lipídicas, principalmente fosfolípidos, y por una gran variedad de proteínas. Estas proteínas tienen funciones enzimáticas, receptoras, de adhesión y otras esenciales para las actividades funcionales de la membrana. Los lípidos se sintetizan en el retículo endoplásmico liso y la transferencia de las moléculas lipídicas sucede por más de un mecanismo. Estas moléculas pueden migrar, dejando la membrana de los retículos endoplásmico liso hacia las membranas que son continuas con el retículo. Es a través de este proceso que los lípidos pasan del retículo liso al retículo rugoso. Muy frecuentemente, la transferencia ocurre a través de vesículas que sobresalen del retículo liso o rugoso y son trasladadas por proteínas motoras apoyadas en el citoesqueleto a otros compartimentos, con los cuales se fusionan. Otro medio de transferencia está representado por proteínas

especiales del citosol que se combinan con moléculas lipídicas del retículo liso y las transfieren a las membranas de otros compartimentos. Un ejemplo es el transporte de moléculas de fosfolípidos de la membrana del retículo liso a la membrana de los peroxisomas. Las proteínas se sintetizan en el retículo endoplásmico rugoso y por lo general son transportadas por vesículas que pasan a través del aparato de Golgi (Figura 5.28). Así, las proteínas llegan a la membrana plasmática y el extremo de la molécula proteica, que estaba dentro de la vesícula, pasa a la superficie celular. Al lado de la circulación de las nuevas moléculas sintetizadas, hay un intercambio de moléculas de la membrana plasmática cuando se produce la endocitosis. Muchas moléculas que llegan a la membrana plasmática traídas por vesículas son moléculas recicladas y no necesariamente nuevas moléculas. Hay un flujo de moléculas transportadas por vesículas en los dos sentidos: desde la membrana plasmática al interior de la célula y desde los compartimentos citoplasmáticos a la membrana plasmática.

Figura 5.28 Las proteínas de la membrana plasmática son sintetizadas en el retículo endoplásmico rugoso. El ejemplo muestra moléculas de glicoproteínas, cuya cadena glucídica se inicia en el retículo siendo aumentada en el aparato de Golgi. Tenga en cuenta que la vesícula que lleva las moléculas de glicoproteínas también lleva los fosfolípidos donde se insertan. Observe, también, que el interior de la vesícula y las cisternas del aparato de Golgi y del retículo endoplásmico son equivalentes a la superficie externa de la célula. La cadena glucídica, inicialmente situada en el interior de los compartimientos mencionados, pasa para la cara externa de la membrana plasmática.

RESUMEN Por la la actividad de la membrana plasmática, las células mantienen estables la composición molecular e iónica del medio intracelular, transfiriendo hacia afuera las moléculas y los iones innecesarios e introduciendo en el citoplasma lo que necesita la célula. La membrana contiene macromoléculas proteicas específicas con alta afinidad para las moléculas producidas por otras células y que sirven como señales químicas de comunicación. Esto permite la vida de las células en sociedad, formando organismos complejos.

Todas las membranas celulares tienen una estructura molecular básica similar. Se componen de una bicapa lipídica con moléculas de proteínas incrustadas y causando protuberancias en un lado o en ambos lados de la membrana. En las condiciones de temperatura del cuerpo, la membrana es un fluído lipoproteico, disfrutando las moléculas proteicas de gran movilidad lateral en el plano de la membrana, pero sin movilidad en la otra dirección. Hay una clara asimetría entre los dos lados de las membranas. En la membrana plasmática, la cara externa es rica en receptores de glicoproteínas, mientras que en la cara interna, del lado citoplásmico, tiene

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Membrana plasmática proteínas que se unen de forma reversible a los filamentos del citoesqueleto. Los hidratos de carbono unidos a proteínas, a glicosaminoglicanos y a lípidos del lado externo de la membrana forman una capa continua de espesor variable dispuesta alrededor de las células: el glicocálix. Esta es una parte integral de la membrana y se une tanto a las moléculas intracelulares como a las moléculas del medio extracelular, estableciendo la continuidad entre el interior de las células y el ambiente en el que se encuentran. Muchas moléculas entran en las células sin consumo de energía, por el proceso de difusión pasiva. Otras son transportadas activamente, es decir, con gasto de energía. También existe el proceso de difusión facilitada, por el cual la sustancia pasa a través de la membrana sin consumo de energía, gracias a las moléculas permeasas. La transferencia de macromoléculas en cantidad hacia dentro de la célula o endocitosis es realizada por fagocitosis, pinocitosis no selectiva y pinocitosis selectiva. El tránsito en sentido inverso - es decir, para fuera de la célula - es el nombre genérico de exocitosis. En la pinocitosis selectiva, las macromoléculas a transportar se aferran a los receptores de membrana. Se forma entonces una vesícula terminada en los extremos, que al sobresalir de la membrana, está recubierta con una malla de clatrina y otras proteínas. Las vesículas endocíticas se pueden fusionar con lisosomas, orgánulos ricos en enzimas digestivas que atacan a las macromoléculas introducidas en las células. Otra función de los lisosomas es digerir, en los autofagosomas, partes de la célula que perdieron su significación funcional. Algunas veces las enzimas lisosomales son secretadas y digieren macromoléculas de la matriz extracelular. Muchas células animales presentan extensiones digitiformes de la superficie: las microvellosidades, que aumentan mucho la superficie celular, siendo numerosas en las células especializadas en la absorción, como las de la mucosa intestinal. En la mayoría de los tejidos, las células se adhieren unas a otras por medio de modificaciones de sus membranas, conocidas colectivamente como uniones celulares. A menudo, la función principal de estas estructuras es solamente la adhesión entre las células, como con los desmosomas; otras veces, su papel es el de sellar el espacio intercelular, impidiendo el tránsito molecular extracelular de tal manera que el paso tiene que ser hecho intracelularmente y por lo tanto bajo el control de sus propias células. La especialización de la membrana para formar esta estructura de sellado se llama unión oclusiva o zonula ocludens. También, en algunos lugares, hay modificaciones de las membranas de las células adyacentes para permitir el paso de una célula a otra, de iones y moléculas pequeñas que transfieren información a través de estas señales químicas, integrando la actividad de

los conjuntos celulares. Estos conjuntos muestran una marcada unidad funcional, porque todas las células responden a los estímulos (hormonales, nerviosos) recibidos, incluso si estos estímulos son recogidos solamente por algunas células del conjunto.

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

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Comunicaciones Celulares a través de Señales Químicas ERRNVPHGLFRVRUJ

■ La respuesta a una señal química puede variar dependiendo de las características del receptor ■ Las hormonas son generalmente producidas por las glándulas endocrinas ■ Las células neuroendocrinas del hipotálamo son importantes para la coordinación del sistema endocrino ■ Algunas respuestas a las hormonas son inmediatas; sin embargo, de corta duración ■ Las hormonas liposolubles tienen más tiempo de acción ■ Mecanismo de acción de las hormonas que actúan a través de receptores de membrana ■ Los receptores catalíticos son glicoproteínas de transmembrana con actividad enzimática ■ Los receptores que actúan en la proteína G aumentan la concentración de Ca2+ o de AMPc ■ Las proteínas G actúan a través de dos vías: una dependiente de AMPc y la otra dependiente de los iones Ca2+ liberados del REL por la acción del inositol trifosfato ■ Cambios adaptativos en las células diana ■ Las hormonas liposolubles actúan sobre receptores intracelulares ■ La comunicación paracrina

■ Las moléculas neurotransmisoras son responsables de la transmisión de información a través de las sinapsis ■ La membrana interna de la mayoría de las mitocondrias contiene receptores para las hormonas tiroideas (T3 y T4) ■ Resumen ■ Bibliografía

Guía ■ La comunicación entre las células se lleva a cabo principalmente por medio de moléculas informativas ■ El intercambio de señales químicas entre las células es esencial para: la formación de los tejidos, multiplicación celular, fagocitosis, síntesis de anticuerpos, atracción de leucocitos para la defensa, coordinación del metabolismo y muchas otras actividades celulares ■ La molécula que constituye la señal química se llama ligando ■ La molécula celular que se combina con el ligando y desencadena una respuesta en la célula se llama receptor ■ Didácticamente, las señales se pueden dividir en tres categorías: secreción hormonal, secreción paracrina y secreción de neurotransmisores. Las señales paracrinas pueden influir en las células que los producen (secreción autocrina) ■ En las uniones comunicantes o gap junctions, las células se comunican entre sí directamente. Hay paso de iones y moléculas pequeñas a través de canales entre las células adyacentes ■ Las moléculas de señalización (ligandos) iguales, muchas veces promueven respuestas diferentes, de acuerdo con las células diana ■ El mismo ligando puede actuar de diferentes maneras: la epinefrina es una hormona y también un neurotransmisor ■ Las moléculas de señalización que son proteínas o péptidos pequeños, cuando se combinan con los receptores de la membrana, desencadenan la maquinaria citoplasmática que produce mensajeros intracelulares tales como Ca2+ y AMP cíclico (AMPc) ■ Las hormonas esteroides y las de la glándula tiroides penetran en las células y son captadas por receptores intracelulares. Los esteroides son moléculas derivadas del colesterol ■ El complejo formado por el receptor intracelular más la hormona, se une al ADN e influencia (generalmente estimulando) la transcripción génica ■ Entre los mediadores que trabajan cerca del sitio de producción (secreción paracrina) están los derivados del ácido araquidónico de la membrana celular ■ Los principales mediadores derivados del ácido araquidónico o eicosanoides, son las prostaglandinas, los tromboxanos y los leucotrienos

E

n los organismos multicelulares, el intercambio de información a través de moléculas, que son señales o mensajeros químicos, se inicia en la vida embrionaria y constituye, durante toda la vida, el principal medio de comunicación entre las células. Estas señales son importantes para que los tejidos y órganos se formen de una manera ordenada y, después de la estructuración del cuerpo, son necesarias para coordinar el crecimiento y la función de las diversas partes del organismo. Los mensajeros químicos influyen en el metabolismo, la proliferación celular, la secreción, la fagocitosis, la producción de anticuerpos, la contracción y muchas otras actividades celulares. Prácticamente todas las funciones celulares y tisulares son reguladas por señales químicas. En este capítulo se llevará a cabo una breve descripción del contenido, y serán presentados algunos ejemplos ilustrativos. Este sistema de comunicación opera a través de moléculas de señalización o ligandos, que se unen a sitios específicos de las moléculas receptoras o receptores (Figura 6.1). Para ser definida como un receptor, una molécula debe ser capaz de reconocer específicamente otra molécula (ligando) y desencadenar una respuesta celular cuando se une con el respectivo ligando. Didácticamente, se distinguen tres tipos de comunicación, que se mencionan a continuación (Figura 6.2). ► 1° Tipo. Mediante la secreción de moléculas llamadas hormonas, que son secretadas en general por las glándulas endocrinas. Las hormonas se liberan en el espacio extracelular, penetran en los capilares sanguíneos y se distribuyen por todo el cuerpo, actuando a distancia, en las llamadas células diana. La célula diana o célula blanco, también llamada target cell, es aquella que tiene un receptor para la hormona.

► 2° tipo. Mediante la secreción de moléculas que actúan sobre las células adyacentes, siendo retenidas por la matriz extracelular en el lugar de producción y más tarde inactivadas después del ejercicio de sus funciones. En este modo de comunicación, llamada comunicación paracrina, las señales químicas actúan cerca de donde fueron secretadas. Lo usual es que la molécula secretada por un tipo celular actúe sobre células de otro tipo. Sin embargo, en la secreción paracrina, a veces las moléculas de señalización producidas por un tipo celular actúan sobre células del mismo tipo que están próximas, alcanzando también a la propia célula que originó la señal química. La secreción que actúa sobre el mismo tipo de célula se llama secreción autocrina. ► 3° tipo. Mediante la secreción de moléculas llamadas neurotransmisores. Esta secreción tiene lugar en las sinapsis, que son lugares especializados donde las células nerviosas (o neuronas), a través de sus múltiples prolongaciones, hacen contacto entre sí. Los neurotransmisores son liberados también por las prolongaciones de las células nerviosas que hacen conexión con las células musculares (Figuras 6.2 y 6.3) o con las células secretoras. El neurotransmisor atraviesa un espacio muy pequeño, de sólo unos pocos nanómetros, entre la terminal de la prolongación nerviosa (axón), y otra célula nerviosa, o una célula muscular, o una célula secretora, según sea apropiado. Además de los procesos mencionados que implican ligandos y receptores, algunas células se comunican directamente entre si a través de moléculas que pasan por canales existentes entre las células adyacentes. Estos canales están conformados por moléculas proteicas de las membranas de las dos células, en las regiones denominadas uniones comunicantes o gap junctions estudiadas en el capítulo 5.

Figura 6.1 El dibujo esquemático muestra que existe una amplia variedad de moléculas con potencial informativo en el medio extracelular. Los receptores reconocen, seleccionan e interactúan específicamente con ciertas moléculas, entre las muchas que entran en contacto con las células. Tenga en cuenta que las tres células mostradas en el dibujo tienen diferentes receptores y por lo tanto no reaccionan a las mismas señales.

LA RESPUESTA A UNA SEÑAL QUÍMICA PUEDE VARIAR DEPENDIENDO DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL RECEPTOR La mayoría de las células del cuerpo de los animales contiene un conjunto específico y genéticamente programado de receptores para las numerosas señales químicas que activan o inhiben las actividades celulares. Las respuestas de las células a las diversas señales dependen básicamente de la lista de receptores que cada célula recibió durante su diferenciación embrionaria. La respuesta de la célula diana también puede depender de las diferencias en la estructura molecular del receptor. Por ejemplo, los receptores de acetilcolina son diferentes en el músculo esquelético y el músculo cardíaco, y la acetilcolina estimula la contracción de los músculos esqueléticos, pero disminuye la velocidad y fuerza de la contracción del músculo del corazón (miocardio). Sin embargo, en la mayoría de las células, los receptores para una determinada señal son iguales, pero las respuestas pueden ser diferentes, lo que indica que la respuesta en estos casos depende de la maquinaria molecular intracelular a la que están unidos los receptores. LAS HORMONAS SON GENERALMENTE PRODUCIDAS POR LAS

GLÁNDULAS ENDOCRINAS Las células que producen hormonas generalmente constituyen órganos especializados, las glándulas endocrinas. La comunicación hormonal es un proceso relativamente lento debido a que las hormonas les toma algún tiempo para distribuirse por todo el cuerpo, llevadas por el torrente sanguíneo (Figura 6.2). Después de salir de los capilares, por difusión, las hormonas son captadas por las células que contienen receptores específicos. La especificidad de las hormonas no sólo depende de su naturaleza química, sino también de la presencia de receptores apropiados sobre las células diana. Cada tipo de célula endocrina generalmente secreta una hormona, y las células que contienen receptores para esta hormona reaccionarán de una manera correspondiente a la naturaleza de la célula diana (Figura 6.4). Por ejemplo, la respuesta puede ser la liberación de la secreción, o la inhibición de la actividad secretora, de acuerdo a la hormona y de acuerdo con el tipo de célula diana. Como las hormonas se diluyen demasiado, en la sangre y en el líquido extracelular, es esencial que los receptores las fijen con alta afinidad.

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Figura 6.2 Los dibujos esquemáticos muestran los tres tipos principales de comunicación entre las células por medio de moléculas específicas (señales químicas). A. Comunicación a través de la secreción de la hormona, que es transportada por la sangre y actúa, a distancia, en las células que contienen receptores con afinidad para la hormona (células diana). B. Comunicación de tipo paracrina, que se caracteriza principalmente por el hecho de que las moléculas informativas secretadas en el medio extracelular actúan sobre las células cercanas. Las moléculas secretadas atraviesan sólo unos pocos milímetros, como máximo unos pocos centímetros, hasta llegar a las células diana (células con receptores para la molécula de señalización). C. Comunicación a través de neurotransmisores. En este tipo de comunicación, la molécula neurotransmisora es liberada a una distancia de tan sólo 20 nm de la célula que recibe la información. Los receptores de la célula captadora se encuentran exclusivamente en el área de la membrana, frente a la terminal del axón, que es la parte final, dilatada, de esta prolongación neuronal.

LAS CÉLULAS NEUROENDOCRINAS DEL HIPOTÁLAMO SON IMPORTANTES PARA LA COORDINACIÓN DEL SISTEMA ENDOCRINO En los vertebrados, hay una conexión de los sistemas nervioso y endocrino en una región del cerebro llamada hipotálamo. El hipotálamo se comunica con la hipófisis por medio del pedículo hipofisiario. Este pedículo está formado por vasos sanguíneos y numerosas prolongaciones (axones) de las células nerviosas (neuronas) situadas en el hipotálamo. Estas son células nerviosas que secretan hormonas y por lo tanto, llamadas células neuroendocrinas. Por lo tanto, en el hipotálamo y en la hipófisis existe una relación funcional entre el sistema nervioso y el sistema endocrino, esta asociación influye en muchas funciones corporales. Las células neuro-

endocrinas del hipotálamo responden a estímulos recibidos de otras células nerviosas, secretando hormonas que se liberan en el pedículo hipofisario, penetran en los numerosos capilares sanguíneos ya existentes, y estimulan, o inhiben, la actividad secretora de las células de la parte anterior de la hipófisis. Otros axones también originados en células neurosecretoras hipotalámicas son más largos y constituyen la neurohipófisis. Estos axones llevan y liberan, en la neurohipófisis, la hormona antidiurética (ADH) y la oxitocina. La hormona antidiurética disminuye la eliminación de agua por los riñones y la oxitocina estimula la contracción de los músculos lisos del útero durante el parto.

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Figura 6.3

Figura 6.4

Figura 6.3 Comunicación intercelular a través de un neurotransmisor. El dibujo muestra un axón terminal (arriba) sobre una fibra muscular estriada (parte inferior). El axón muestra, en el corte, muchos microtúbulos y filamentos intermedios. El axón terminal tiene mitocondrias, cisternas del retículo endoplásmico rugoso y numerosas vesículas, llamadas vesículas sinápticas, que contienen el neurotransmisor acetilcolina. La parte plisada de la membrana de la fibra muscular contiene una gran cantidad de receptores para acetilcolina (no mostrada en el dibujo). Tenga en cuenta que el espacio entre la membrana plasmática del axón terminal y la fibra muscular es muy pequeño; este espacio, llamado hendidura sináptica, mide sólo 20 nm. Figura 6.4 El dibujo esquemático muestra cómo moléculas hidrofílicas afectan las funciones celulares actuando sobre los receptores (glicoproteínas) de la membrana plasmática. Las moléculas mensajeras (ligandos) hidrofílicas generalmente son de naturaleza proteica. Los factores (ligandos) de naturaleza lipídica, como las hormonas esteroides, actúan sobre receptores intracelulares. Cerca del 80% de las señales químicas, a las cuales las células se someten generalmente, son hidrofílicas. Observe, en la parte inferior del dibujo, la variedad de respuestas que dependen de las características de las células diana.

ALGUNAS RESPUESTAS A LAS HORMONAS SON INMEDIATAS; SIN EMBARGO, DE CORTA DURACIÓN Por ejemplo, el aumento de la concentración de glucosa en la sangre estimula a las células beta del páncreas endocrino para secretar insulina, una proteína muy soluble en el plasma sanguíneo. En cuestión de minutos, el .insulina se distribuye por todo el cuerpo estimulando la captación de glucosa, especialmente por las células adiposas y las células musculares, causando la reducción de los niveles normales de la concentración de glucosa en sangre. La respuesta en este caso es rápida porque en las células beta del páncreas endocrino, existe constantemente insulina lista para ser liberada, y existe una reserva de receptores de insulina y moléculas transportadoras de glucosa en la membrana plasmática de las células musculares y adiposas (Figura 6.5). La combinación de insulina con sus respectivos receptores activa la penetración de glucosa en el citoplasma, donde será almacenada en las moléculas de glucógeno, el cual es un polímero de glucosa y constituye una reserva nutricional para las células animales. LAS HORMONAS LIPOSOLUBLES TIENEN MÁS TIEMPO DE ACCIÓN Aunque la gran mayoría de las hormonas es soluble en agua y actúan sobre los receptores situados en la membrana plasmática, algunas son

liposolubles, atraviesan la membrana celular fácilmente y se unen a receptores localizados en el citoplasma y el núcleo de las células diana. Ejemplos de ello son las hormonas esteroides y las hormonas de la glándula tiroides, tiroxina o tetrayodotironina (T4) y triyodotironina (T3). Las hormonas esteroideas y tiroideas son transportadas en el plasma sanguíneo unidas a proteínas transportadoras, pero en el momento de atravesar la membrana plasmática, las proteínas transportadoras son separadas de las hormonas, y sólo las hormonas araviesan la membrana celular. Ejemplos de hormonas esteroides son la hormona sexual masculina (testosterona), las femeninas (estrógenos y progesterona) y los corticoides, hormonas producidas por la capa cortical de la glándula suprarrenal. Otra diferencia entre las hormonas hidrosolubles y las liposolubles se refiere al tiempo de permanencia en la sangre y en los líquidos tisulares. Generalmente, las hormonas hidrosolubles se eliminan de la sangre pocos minutos después de ser secretadas. En contraste, las hormonas esteroides persisten en el plasma sanguíneo durante horas, y las hormonas tiroideas durante un tiempo mayor, incluso más, muchas veces durante algunos días. Esto significa que las hormonas liposolubles tienden a mediar respuestas más prolongadas.

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Figura 6.5 El dibujo esquemático muestra algunos aspectos del estímulo producido en las células diana por la insulina, la hormona principal que regula el contenido de glucosa en la sangre. La insulina estimula la penetración de la glucosa en las células, donde se deposita en forma de glucógeno, una importante reserva de energía. En consecuencia, la insulina disminuye la concentración de glucosa en la sangre. A. célula no estimulada, apareciendo el receptor de la insulina insertada en la membrana plasmática y varias vesículas intracitoplasmáticas que contienen una reserva de moléculas transportadoras de glucosa. La cantidad de estas moléculas en la membrana plasmática es relativamente pequeña, lo que disminuye la capacidad de transporte de glucosa hacia el interior de la célula. B. La combinación de insulina con su receptor (a la derecha del dibujo) estimula la transferencia de las vesículas que contienen el transportador de glucosa para la membrana plasmática, aumentando la capacidad de captación de glucosa, debido al aumento en el número de transportadores en la membrana plasmática. C. La remoción de la insulina estimula la endocitosis de los transportadores de glucosa, que vuelven a su localización intracelular, donde permanecen en reserva para su uso posterior cuando el receptor de la insulina reciba nuevamente el estímulo hormonal.

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS HORMONAS QUE ACTÚAN A TRAVÉS DE RECEPTORES DE MEMBRANA Todas las hormonas hidrosolubles son captadas por receptores situados en la membrana plasmática de las células diana (Figura 6.4). Algunos, como los receptores para insulina, son denominados catalíticos, ya que, cuando se activan, la funcionan como enzimas, normalmente proteínas quinasas (proteína quinasas son enzimas que actúan sobre proteínas) que fosforilan el hidroxilo de la tirosina de proteínas citoplasmáticas específicas. Sin embargo, la mayoría de las moléculas de señalización hidrosolubles actúan sobre los receptores que actúan a través de una cadena de moléculas, que modifica los niveles intracelulares de AMP cíclico (AMPc) o Ca2+. El AMP cíclico y el Ca2+ son llamados mediadores o mensajeros intracelulares (Figura 6.6). Cuando las células musculares o hepáticas son expuestas a la hormona epinefrina (fabricada por la médula de la glándula suprarrenal), por ejemplo, hay un aumento en el contenido intracelular de AMPc que activa la enzima fosforilasa glicogéni-ca. Esta enzima promueve la hidrólisis del glucógeno almacenado en las células, formando glucosa. Para que el AMPc funcione correctamente como un mediador intracelular, debe ser sintetizado y degradado rápidamente; de lo contrario, su actuación permanecería por un tiempo excesivo. El AMPc se produce a partir de ATP por la enzima adenilato ciclasa, que está unida a la membrana celular. La destrucción del AMPc es debida a las fosfodiesterasas de AMPc que hidrolizan al AMPc, produciendo adenosina-5'-monofosfato (5'-AMP). La misma molécula de señalización puede aumentar o disminuir el nivel intracelular de AMPc, de acuerdo al tipo de receptor presente en la célula diana. Por ejemplo, los receptores beta-adrenérgicos, al recibir las moléculas de adrenalina, aumentan el contenido de AMPc intracelular, mientras que los receptores alfa2-adrenérgicos reducen el contenido de AMPc mediante la captación de epinefrina. Cuando varios ligandos actúan sobre una célula cuya membrana presenta receptores específicos para todos ellos, la respuesta es menor de lo que se esperaría de la suma de los estímulos recibidos. La explicación radica en el hecho de que la maquinaria de producción de los mensajeros intracelulares no es capaz de atender a todos los receptores de manera simultánea. Los receptores comparten esta maquinaria, siendo desplazados, en la bicapa

lipídica, para actuar sobre los componentes intracelulares productores de mensajeros. En este movimiento, los receptores son impulsados por los filamentos del citoesqueleto. La concentración de iones de calcio (Ca2+) en la matriz citoplasmática es extremadamente baja, mientras que la concentración de estos iones es alta en el medio extracelular y en los compartimentos intracelulares que almacenan Ca2+. Cuando una señal química se une a ciertos receptores, se forma trifosfato de inositol que promueve la apertura de los canales de Ca2+del retículo endoplasmático liso (Figura 6.7), aumentando la concentración de este ion en la matriz citoplasmática y activando los mecanismos intracelulares sensibles al calcio. Todas las células contienen bombas en sus membranas que, consumiendo energía del ATP, mueven hacia fuera de la célula el exceso de Ca2+. Además, las células contienen porciones del retículo endoplasmático liso especializadas en almacenar iones calcio (Figura 6.7). Las membranas de este retículo también contienen bombas de calcio, y, en las cisternas del retículo, hay una proteína especializada en la captación y liberación de calcio, llamada calsequestrina o calsequestrin. Las mitocondrias también pueden almacenar calcio gracias a la actividad transportadora de la membrana interna de estos orgánulos; pero funcionalmente, el retículo endoplasmático liso es el compartimiento secuestrador de calcio más importante. Se ha demostrado que el Ca2+ actúa como un mensajero intracelular en una variedad de respuestas, tales como la secreción celular y la proliferación mitótica. Dos formas fueron descritas para aumentar los niveles de calcio en respuesta a una señal química. Especialmente en las células nerviosas, la señal química abre un canal para el calcio, situado en la membrana plasmática, que está normalmente cerrado. Como la concentración de Ca2+ es más alta en el medio extracelular, la apertura de estos canales de la membrana plasmática promueve la penetración de Ca2+ en el citosol. En otras células, la señal, al unirse al receptor de la membrana genera inositol trifosfato, y éste abre los canales de calcio existentes en la membrana del retículo endoplásmico liso, promoviendo la salida repentina de calcio al citosol. Tanto el AMP cíclico como el Ca2+, que son los dos principales mensajeros intracelulares, actúan en la adición de grupos fosfato desde el ATP a ciertas quinasas proteicas, modificando la conformación espacial de estas enzimas y por lo tanto alterando su actividad.

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Figura 6.6 El dibujo esquemático ilustra la formación de mensajeros intracelulares, utilizando como ejemplo el estímulo secretor de la célula exocrina (acinar) del páncreas. La parte superior de la figura muestra las señales químicas que actúan mediante la liberación de Ca2+; la parte inferior muestra la concentración de los nucleótidos AMPc y GMPc. Todas las señales químicas que se indican a la izquierda (apenas algunos ejemplos) aumentan la secreción de la célula acinar pancreática, aunque activan diferentes mecanismos intracelulares. (Basado en Gardner, J.D. y Jensen, R.T. Gastrintestinal peptides.The basis of action at cellular level .Recent.Prog.Horm.Res., 39:211, 1983)

Figura 6.7 El dibujo muestra la participación de una proteína G en la activación intracelular a través del calcio y DAG (diacilglicerol). Los iones Ca2+ y el DAG actúan sobre la proteína quinasa C, activándola. La activación de esta enzima influye en diversas actividades celulares.

LOS RECEPTORES CATALÍTICOS SON GLICOPROTEÍNAS DE TRANSMEMBRANA CON ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La mayoría de los receptores de la membrana plasmática actúan regulando la actividad de diversas proteínas, para producir un mensajero intracelular, generalmente AMPc o Ca2+ (Figuras 6.6 y 6.7). Algunos receptores, sin embargo, trabajan más directamente y son llamados receptores catalíticos. Los receptores catalíticos son glicoproteínas de transmembrana. Los más estudiados son las proteínas quinasas (actúan sobre las proteínas) específicas para la tirosina. Estos receptores tienen una parte que se adhiere a la señal química (hormona, factor de crecimiento) expuesta en la superficie de la membrana, y la parte que se encuentra en el citoplasma tiene actividad enzimática, o está directamente ligado a una enzima. Cuando el extremo exterior de estos receptores recibe la señal química, la parte citoplasmática, que es una proteína quinasa, se activa, y transfiere el grupo fosfato terminal del ATP al grupo hidroxilo de la tirosina de determinadas proteínas. Esta familia incluye los receptores para insulina y para varios factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, platelet-derived growth factor) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermal growth factor).

Algunos receptores catalíticos (tirosina quinasas) actúan inicialmente en una proteína ligada a la superficie citoplasmática (superficie interna) de la membrana celular llamada Ras (de rat sarcoma) porque se descubrió en sarcomas (un tipo de cáncer) de ratas. La proteína Ras participa en la transmisión recibida por un receptor constituido por una tirosina quinasa (receptor catalítico) que lleva la información a través de varias etapas, hasta el interior del núcleo celular para estimular la diferenciación y prolife-

ración de la célula. La proteína Ras así como otras que unen receptores a efectores intracelulares, funciona como un interruptor que está acoplado con GTP, y desacoplado cuando este nucleótido pierde un radical fosfato y se transforma en GDP. Ras se activa cuando se combina con GTP, y se inactiva cuando se une con el GDP. La misma Ras hidroliza al GTP, que pasa a GDP, desacoplando el sistema. Sin embargo, la actividad de Ras para quitar un grupo fosfato al GTP transformándolo en GDP es muy lenta y como la concentración citosólica de GTP es superior a la de GDP, Ras permanecería activa si la célula no tuviese ningún mecanismo para desactivarlo. Las proteínas intracelulares que regulan la actividad de la proteína Ras pertenecen a dos grupos. Las proteínas activadoras de las GTPasas, denominadas GAP (acrónimo de GTP- activating proteins), aceleran la hidrólisis del GTP unido a Ras, transformándolo en GDP e inactivando a la proteína Ras. Las GAP son, por tanto, reguladores negativos, cuya actividad está contrarrestada por los reguladores positivos, las GNRP (guanine nucleotide releasing proteins). Las GNPR promueven el intercambio del nucleótido unido, estimulando la pérdida de GDP y la entrada de GTP procedente del citosol, lo que activa a la proteína Ras. Este intercambio se facilita porque el citosol contiene una mayor concentración de GTP que de GDP. La proteína Ras permanece activa durante un tiempo muy corto y, para ejercer los efectos iniciados por la unión de la señal extracelular con el receptor, entra en acción una serie de modificaciones en más de un sistema, que lleva la señal al núcleo celular. Varias proteínas quinasas participan en estos sistemas, sin embargo, el grupo más importante es una familia de proteínas conocidas como quinasas mitogénicas. Además de la Ras, existen otras proteínas ligadas a los receptores de membrana que transmiten señales al núcleo mediante la estimulación de la diferenciación y proliferación de las células. La proteína Ras fue elegida como un ejemplo por el hecho de que en el 30% de los cánceres, se encontró una proteína Ras anormal que permanece siempre activa. En los tejidos normales, las células se multiplican sólo en ciertos momentos, pero en el cáncer la multiplicación es incontrolada, debido a que los mecanismos que conducen a la proliferación celular están activados de forma permanente. En muchos tipos de cáncer (tumor maligno) fueron encontradas

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proteínas anormales estimuladoras de la mitosis, así como también la proteína anormal Ras. LOS RECEPTORES QUE ACTÚAN EN LA PROTEÍNA G AUMENTAN LA CONCENTRACIÓN DE Ca2+ O DE AMPc Los receptores con actividad de proteína quinasa, o receptores catalíticos, ya estudiados, son mucho menos diversificados y menos numerosos. Los más comunes para la recepción de señales hidrofílicas en la superficie celular son los receptores que están vinculados a la proteína de la membrana llamada proteína G, denominada así porque puede contener GDP o GTP. Esta proteína es un interruptor que está acoplado con GTP y se desacopla cuando se desfosforila el nucleótido y se convierte en GDP. Los receptores unidos a proteínas G son moléculas proteicas complejas, con siete pasajes a través de la membrana. La captura de una señal química por el segmento extracelular activa al receptor que actúa sobre la proteína G y ésta, a través de una cadena de reacciones, genera AMPc o Ca2+, que activarán a las proteínas quinasas. Las quinasas activadas por esta vía, agregarán grupos fosfato a la serina o a la treonina de ciertas proteínas, que son los blancos de la señal recibida por el receptor. Este es una vía muy importante para el funcionamiento de las células eucariotas, y ya fueron identificadas numerosas proteínas quinasas, influenciadas por los receptores unidos a las proteínas G. Las moléculas de las proteínas G están formadas por tres cadenas polipeptídicas llamadas cadenas α, β y γ. Las tres cadenas están situadas en el lado citoplásmico de la membrana celular. La cadena α tiene la capacidad de unirse al GDP o al GTP, y es la parte de la molécula de la proteína G que activa a la próxima molécula en la cadena efectora. Cuando está unida al GDP, y por lo tanto el interruptor está desacoplado, la cadena α tiene una gran afinidad por las cadenas β y γ. Por consiguiente, la molécula de la proteína G permanece inactiva y con sus tres cadenas unidas fuertemente. La unión de una señal química activa la porción citoplásmica del receptor, que luego añade un grupo fosfato al GDP de la cadena α, activándola y liberándola de las otras dos cadenas de la molécula de proteína G. Mientras el receptor está ocupado por una señal, la cadena α permanece activa y separada de las otras dos cadenas (Figura 6.7). Cuando el receptor y la señal química se separan, la misma cadena  hidroliza al GTP, transformándolo en GDT. En consecuencia, las tres cadenas de la proteína G se unen nuevamente, y el interruptor es desacoplado. Las proteínas G son de aparición muy general y se han detectado en muchos vertebrados, invertebrados y células vegetales. Esta distribución tan amplia indica que estas proteínas surgieron muy temprano en la evolución de los organismos multicelulares. La aparición de los organismos multicelulares fue un muy lento paso en la evolución, probablemente debido a la dificultad en establecer los mecanismos de comunicación entre las células, esenciales para coordinar el funcionamiento de cada célula en el beneficio del conjunto. En estos conjuntos, cada célula sólo puede realizar una pequeña parte del programa contenido en su genoma, de ahí la importancia de los mecanismos que restringen lo que cada célula puede hacer, sin perjudicar al conjunto. LAS PROTEÍNAS G ACTÚAN A TRAVÉS DE DOS VÍAS: UNA DEPENDIENTE DE AMPc Y LA OTRA DEPENDIENTE DE LOS IONES Ca2+ LIBERADOS DEL REL POR LA ACCIÓN DEL INOSITOL TRIFOSFATO Aunque los mensajeros intracelulares producidos por las proteínas G formen siempre proteínas quinasas que irán a fosforilar aminoácidos, esto se logra a través de dos vías. Una vía genera AMP cíclico (AMPc), producido a partir del ATP por la enzima adenilato ciclasa. Como el AMPc es una molécula pequeña, se difunde rápidamente a través del citosol, yendo a activar varias proteínas quinasas. La otra vía es la de romper una molécula de un fosfolípido de membrana, el fosfatidil-inositol, reacción que es catalizada por la fosfolipasa C, produciendo inositol trifosfato, el cual también es una molécula pequeña y soluble, formada por el inositol más tres grupos fosfato. En la reacción, también se forma diacilglicerol, que queda unido a la bicapa lipídica de la membrana, pudiendo ser reutilizado para formar lípidos de la membrana. El inositol trifosfato difunde a través del citosol y abre los canales de Ca2+ del retículo endoplásmico liso, principal depósito citoplasmático de Ca2+, liberando este ión al citosol. Para el correcto funcionamiento del sistema, es importante que los mensajeros sean degradados después de realizar sus funciones. El AMPc es destruido rápidamente por las AMPc fosfodiesterasas. El inositol trifosfato, a través de algunas reacciones, es transformado de nuevo al estado de fosfatidil inositol. Los iones Ca2+ son sacados del citosol a través de canales selectivos (bombas de calcio) situadas en las membranas de retículo endoplasmático liso y en la membrana celular, que transfieren Ca2+ a las cisternas del retículo o al medio extracelular, respectivamente. CAMBIOS ADAPTATIVOS EN LAS CÉLULAS DIANA Una célula expuesta al mismo estímulo (señal química) durante un largo periodo de tiempo, comienza a responder a la estimulación con una intensidad menor. A través de este proceso, llamado adaptación o desensibilización, la célula ajusta de forma reversible su sensibilidad al nivel de estímulo. En el caso de señales químicas, la desensibilización permite a las células, dentro de ciertos límites, adaptarse a cambios en la concentración de las moléculas de señalización. Esta adaptación se debe a varios mecanismos. Se puede presentar disminución en la cantidad de receptores; o estos receptores pueden ser modificados a través de la disminución de su afinidad por el ligando. Otras veces, se producen cambios en las proteínas intermediarias entre los receptores y los mensajeros intracelulares AMPc y Ca 2+.

lisosomas. Este proceso limita la acción de la hormona y regula la concentración de receptores en la superficie celular. Aunque la formación de vesículas endocíticas se produce continuamente, incluso en ausencia del ligando, existe una aceleración en el proceso cuando el ligando se une al receptor. Los experimentos llevados a cabo con fibroblastos mostraron que la presencia del factor de crecimiento epidérmico que se une a los receptores fibroblásticos, acelera de manera pronunciada la degradación de estos receptores. Por lo tanto, las altas concentraciones del ligando disminuyen el número de receptores y, en consecuencia, también reducen la sensibilidad de la célula a la señal química. A través de este tipo de regulación de los receptores “cuesta abajo” (receptors-down regulation) (menor cantidad de receptores), la célula ajusta su sensibilidad a la concentración de la molécula de señalización. La mayoría de los receptores endocitados no son digeridos por los lisosomas, sin embargo, son reciclados de nuevo a la membrana plasmática. En aquellos casos cuando hay un aumento de la concentración del ligando, hay también aumento de la cantidad de receptores situados en las vesículas endocíticas ubicadas en el citoplasma y, por tanto, inaccesibles a la señal que llega a la superficie de la célula. Hay una disminución en la sensibilidad de la célula debido al secuestro de los receptores. LAS HORMONAS LIPOSOLUBLES ACTÚAN SOBRE RECEPTORES INTRACELULARES Muchos aspectos del desarrollo intrauterino y postnatal, y las funciones de muchos órganos, están regulados por diversas hormonas esteroides. Todas estas hormonas se sintetizan a partir del colesterol, y son pequeñas moléculas, con cerca de 300 Da (Daltons), liposolubles, capaces de atravesar fácilmente las membranas celulares por difusión pasiva. Estas hormonas (p. Ej., estrógenos, testosterona) son transportadas por el plasma de la sangre en forma de complejos con proteínas anfipáticas, es decir, moléculas que tienen regiones hidrófobas a las que se unen las hormonas esteroides y regiones hidrófilas responsables de la solubilidad del complejo en el plasma sanguíneo y en el líquido que baña las células. Antes de su penetración en las células, estas hormonas se separan de la proteína transportadora que permanece en el fluido extracelular. Una vez que penetraron en las células diana, las hormonas esteroides se unen a receptores específicos y causan cambios en la conformación espacial de estos receptores (Figura 6.8). Esta modificación, que se llama activación del receptor, aumenta la afinidad del receptor para el ADN, y la posibilidad de acoplamiento del receptor proteico activado a determinados segmentos de genes nucleares específicos que regulan la transcripción de estos genes. Las hormonas tiroideas (tiroxina o T4 y triyodotironina o T3) son aminoácidos hidrófobos modificados, pero funcionan de manera similar a las hormonas esteroides.

El receptor activado por las hormonas esteroides se une a secuencias específicas del ADN e influencia la transcripción génica

Algunos tipos de receptores de hormonas esteroides se encuentran principalmente en el citoplasma, y otros son más abundantes en el núcleo. En ambos casos, los receptores (proteínas) están inactivos, y sólo adquieren actividad cuando se unen selectivamente a sus respectivas hormonas (Figura 6.8). La unión de los complejos receptor específico + hormona a sitios específicos del ADN generalmente activa a los genes cercanos, pero a veces el efecto es inhibitorio, es decir, la formación de ARNm de estos genes en general es estimulada, pero a veces es inhibida. El segmento de ADN que reconoce al complejo receptor + hormona consiste en un pequeño número de nucleótidos. Teniendo en cuenta una célula diana, parece que sólo unos pocos genes se ven afectados por una determinada hormona esteroide en particular; Por ejemplo, en la célula hepática han sido estudiadas cerca de 1000 proteínas diferentes. Cuando la célula hepática se somete a la hormona esteroide cortisol (producido por la capa cortical de la glándula adrenal), sólo seis de estas proteínas aumentan su cantidad, mientras que una proteína disminuye. El efecto del cortisol es reversible, y la velocidad de síntesis de las proteínas afectadas vuelve a la normalidad cuando se retira la hormona. También se observó que cada célula hepática contiene alrededor de 10.000 receptores y que la activación de todos estos receptores por el cortisol influencia sólo alrededor de 50 genes, un número mucho menor que el número de segmentos de ADN que fijan al receptor activado. Parece que muchos complejos de cortisol con su receptor se unen a segmentos de ADN que no tienen ningún efecto sobre la síntesis de proteínas.

Los genes regulados por las hormonas esteroides son diferentes de acuerdo al tipo de célula diana

Al igual que con las hormonas en general, la respuesta a las hormonas esteroides depende de la propia hormona y de las características de la célula diana. Los receptores pueden ser similares, pero los genes activados son diferentes, según el tipo de célula. Varios estudios han demostrado que los receptores para el estradiol y la progesterona (hormonas femeninas), y el receptor del cortisol son idénticos y están codificados por un único gen. Los receptores de la hormona esteroide masculina testosterona son diferentes y son codificados por otro gen. feminización testicular

La desensibilización es a menudo consecuencia de la endocitosis

Cuando las hormonas proteicas y los factores de crecimiento se unen a los receptores de membrana en la célula diana, con frecuencia inducen la endocitosis. Muchas vesículas endocíticas, pero no todas, se fusionan con los endosomas, donde el pH ácido separa los ligandos de los receptores, y, a veces, los receptores son digeridos por las enzimas hidrolíticas de los

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Figura 6.8 El dibujo esquemático muestra el modelo propuesto para la configuración espacial del receptor de las hormonas esteroides y los cambios sufridos por el receptor al combinarse con su hormona. A. Receptor no combinado con el esteroide; este receptor está inactivo debido a que el segmento de su molécula que tiene afinidad por el ADN está cubierto por una proteína inhibidora. B. La hormona esteroide modifica la forma del complejo receptor, libera la molécula de proteína inhibidora y expone la región del receptor que tiene afinidad por el ADN; así, el complejo entre el esteroide con su receptor se combina con ciertas secuencias de nucleótidos del ADN nuclear e influye en la actividad génica. Normalmente hay un aumento en la síntesis de ARN mensajero.

LA COMUNICACIÓN PARACRINA En el cuerpo de los animales, existen células especializadas en la secreción paracrina, es decir, en la producción de mediadores químicos de acción local; por ejemplo, la histamina y la heparina son sintetizadas por células del tejido conectivo llamadas mastocitos. Este tipo de célula tiene un citoplasma lleno de gránulos que contienen los mediadores paracrinos antes mencionados. Los gránulos son expulsados de los mastocitos por la estimulación inmune, ataque químico, la lesión tisular y otros estímulos. Muchas otras células, aunque no especializadas en este sentido, pueden producir numerosos mediadores con acción local, en la inflamación, la proliferación celular, en la contracción de los músculos lisos de los vasos sanguíneos, el tubo digestivo y los bronquios, y en la secreción celular. Como ejemplo, se mencionan las prostaglandinas producidas por prácticamente todas las células en el organismo humano. Hay por lo menos 10 familias de prostaglandinas, conocidas como PGA, PGB, PGC, PGD, PGE, PGF, PGG, PGH y PGJ. Cada una de estas familias tiene varios subtipos. Las prostaglandinas tienen efectos muy variados, y tienen gran interés biológico y médico. Todas las prostaglandinas derivan de un ácido graso con 20 átomos de carbono, el ácido araquidónico. Este ácido graso se forma a partir de los fosfolípidos de la membrana plasmática por la acción de fosfolipasas que se activan por estímulos específicos y no específicos, que varían de una célula a otra. Sería imposible mencionar a todos los efectos de las prostaglandinas. Ellas parecen regular la flexibilidad de los eritrocitos que se deforman al pasar a través de los capilares sanguíneos más finos. Algunas prostaglandinas disminuyen la secreción de ácido clorhídrico por las glándulas de la mucosa del estómago, e inhiben la formación de úlceras pépticas (úlceras del estómago). Otras participan en la regulación del sistema reproductor femenino, influyendo en el ciclo menstrual. Las prostaglandinas estimulan la contracción del músculo liso del útero y pueden inducir el aborto cuando se inyectan en el saco amniótico del embrión durante el primer trimestre del embarazo. Las inyecciones intravenosas en el noveno mes de embarazo inducen el parto. Además de las prostaglandinas, el ácido araquidónico de la membrana plasmática da lugar a otros agentes que actúan localmente. Todos los mediadores derivados del ácido araquidónico son conocidos por el nombre genérico de eicosanoides e incluyen a las prostaglandinas, los tromboxanos y los leucotrienos. Todos estos compuestos participan en el proceso inflamatorio. Los antinflamatorios de naturaleza esteroide, tales como la cortisona, inhiben la liberación de ácido araquidónico a partir de los fosfolípidos de membrana, bloqueando así la producción de todos de los mediadores locales mencionados: prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. Los antinflamatorios no esteroideos, como el ácido acetilsalicílico y la indometacina, bloquean la formación de prostaglandinas y tromboxanos, pero no impide la formación de leucotrienos. Algunas células producen el gas óxido nítrico, NO, que se disuelve y actúa como secreción paracrina (el óxido nítrico es también un neurotransmisor); por ejemplo, los macrófagos y neutrófilos secretan óxido nítrico en los sitios de inflamación, como parte del mecanismo para librar a los tejidos de los microorganismos invasores. El papel del óxido nítrico como una señal paracrina ha sido bien estudiado en las células que recubren internamente los vasos sanguíneos, llamadas células endoteliales. Las células endoteliales tienen receptores específicos que captan el neurotransmisor acetilcolina (receptores colinérgicos) liberada por las termina-

ciones nerviosas del sistema nervioso autónomo parasimpático. Los receptores colinérgicos establecen una conexión a una proteína G que estimula la formación de inositol trifosfato en una cadena que conduce a la liberación de iones Ca2+ a partir de su depósito en el REL para el citosol de la célula endotelial. El ión Ca2+ activa la sintasa del óxido nítrico presente en el citoplasma de las células endoteliales, que luego sintetiza este gas. El óxido nítrico se difunde rápidamente, atraviesa la membrana de la célula endotelial y entra, también por difusión pasiva, en el citoplasma de la célula muscular lisa, que está muy cerca. Dentro de la célula muscular lisa, el NO se une al grupo prostético hemo de la enzima soluble guanilato ciclasa, activando a esta enzima. En consecuencia, hay un aumento en la concentración del mensajero intracelular GMP cíclico (GMPc) en el citosol de la célula muscular lisa. El GMPc estimula una proteína quinasa específica que fosforila ciertas proteínas responsables de la relajación de las células musculares lisas, dando lugar a la dilatación de los vasos sanguíneos y al aumento del flujo sanguíneo a nivel local.

LAS MOLÉCULAS NEUROTRANSMISORAS SON RESPONSABLES DE LA TRANSMISIÓN DE INFORMACIÓN A TRAVÉS DE LAS SINAPSIS Las células nerviosas o neuronas son de tamaño y forma muy variados, sin embargo, con pocas excepciones, tienen un cuerpo celular o pericarion, del que salen extensiones de dos tipos: las dendritas y el axón. Este último termina con una ramificación tupida, el axón terminal (Figura 6.2). Funcionalmente, las neuronas tienen partes receptoras, conductoras y transmisoras de información. El centro trófico de la neurona o su pericarion, que contiene al núcleo, un abundante retículo endoplasmático rugoso, muchos polirribosomas libres y un aparato de Golgi bien desarrollado. Es en el pericarion donde tiene lugar la síntesis de macromoléculas, no sólo para el cuerpo celular, sino también para las dendritas y el axón. El pericarion es también el receptor de mensajes traído por las moléculas neurotransmisoras, liberadas por las terminales de los axones de otras neuronas. Las dendritas, en general numerosas, aunque cortas, son extensiones que se ramifican como las ramas de un árbol (dendro, rama), llegando a ser cada vez más finas. Tienen principalmente una función receptora, aumentando considerablemente el área para la recepción de neurotransmisores. Cada neurona tiene un solo axón, cuyo diámetro es constante en toda su longitud, aunque algunos axones son muy largos, alcanzando 1 metro de largo. El axón tiene muchos microtúbulos y filamentos intermedios, ambos en continuación con estructuras similares existentes en el pericarion. Al final de su trayecto, el axón se divide en muchas ramas, formando el axón terminal, en el cual son liberados los neurotransmisores que irán a actuar sobre los receptores situados en la membrana de la célula siguiente, que puede ser otra célula nerviosa, una célula muscular o una célula glandular. El axón terminal forma con la célula siguiente de la cadena una estructura de complejidad variable, la sinapsis. Las sinapsis que se forman entre los

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axones y las células (fibras) musculares esqueléticas son bien conocidas por su facilidad para estudiarlas, tanto por medio de técnicas fisiológicas, como por técnicas morfológicas. Estas sinapsis se denominan placas terminales motoras. El microscopio electrónico muestra que, en las sinapsis, las membranas de las dos células están separadas por un espacio de 20 nm, el espacio sináptico. La membrana plasmática del axón terminal se llama membrana presináptica, y la de la célula siguiente, membrana postsináptica (Figuras 6.2 y 6.3). La membrana postsináptica contiene receptores para el neurotransmisor liberado en la membrana presináptica. La respuesta de la transmisión sináptica es extremadamente rápida, debido principalmente a la pequeña distancia que el neurotransmisor cruza, de la riqueza de receptores y de la gran afinidad entre los neurotransmisores y sus receptores. Es necesario que el neurotransmisor sea inactivado inmediatamente, para que su acción no permanezca mucho tiempo, lo que disminuiría la capacidad de la transmisión sináptica de graduar con precisión su actividad. En el caso de la sinapsis neuromuscular (placa terminal motora), el transmisor es la acetilcolina, contenida en las numerosas vesículas sinápticas del axón terminal (Figura 6.3). La acetilcolina se libera por exocitosis, actúa sobre los receptores de la membrana postsináptica, promoviendo la contracción de la fibra muscular, y se inactiva inmediatamente por difusión y, en particular, por la acción de la enzima acetilcolinesterasa. Esta enzima es producida por la fibra muscular estriada y permanece unida al glicocáliz de estas fibras a la altura de la sinapsis. La transmisión sináptica ofrece numerosas variaciones del modelo descrito anteriormente como ejemplo, pero el estudio de estas variedades está más allá de los límites de este libro. La variedad de moléculas neurotransmisoras es muy grande. Además de la acetilcolina, se pueden mencionar como ejemplos: epinefrina, norepinefrina, ácido gamma-aminobutírico o GABA (gama-amino-butiric acid), dopamina, serotonina y glicina. A menudo, la misma molécula puede actuar como un neurotransmisor y también por otro modo de comunicación. Por ejemplo, la epinefrina y la norepinefrina, aparte de ser neurotransmisores (sintetizado en las neuronas y liberado por los axones), son producidos por la médula suprarrenal (endocrina) y distribuidas en todo el cuerpo, actuando así como hormonas. LA MEMBRANA INTERNA DE LA MAYORÍA DE LAS MITOCONDRIAS CONTIENE RECEPTORES PARA LAS HORMONAS TIROIDEAS (T3 Y T4) Se ha mencionado en este capítulo, que las hormonas tiroideas actúan sobre el ADN a través de receptores localizados en el citoplasma y en el núcleo de las células diana. Sólo como un ejemplo de la complejidad del asunto, se explicará a continuación, la acción de las hormonas tiroideas (T3 y T4) directamente en las mitocondrias.

■ Tipo 1°: La comunicación a través de hormonas que, transportadas por la sangre, van a actuar a distancia sobre las células que contienen los respectivos receptores, llamadas células diana ■ Tipo 2°: La comunicación paracrina en la que la molécula señal difunde unos pocos milímetros o centímetros en el medio extracelular y actúa sobre las células cercanas ■ Tipo 3°: La comunicación a través de las moléculas neurotransmisoras, que se produce en las sinapsis, estructuras muy especializadas que conectan, funcionalmente, una célula nerviosa (neurona) con otra, o con células musculares o con células glandulares. Una prolongación de la neurona, llamada axón conduce las moléculas neurotransmisoras y las libera en el axón terminal, el cual es uno de los componentes de la sinapsis. En la sinapsis, la membrana del axón terminal y de la célula receptora de la señal (otra neurona, una célula muscular o una glandular) están separadas por un espacio de tan sólo 20 nm. Muchas moléculas de señalización pueden actuar sobre más de uno de los dos tipos de transmisión mencionados. Como ejemplo, se pueden mencionar a las hormonas adrenalina y noradrenalina, producidas por la médula de las glándulas suprarrenales. Estas moléculas son sintetizadas también por las células nerviosas y liberadas en ciertos axones terminales. Por lo tanto, la norepinefrina y la epinefrina actúan como hormonas y como neurotransmisores. Alrededor del 80% de las hormonas son moléculas hidrosolubles (polipéptidos, proteínas) y se unen a los receptores que son proteínas integrales de la membrana de las células diana. Al combinarse con sus hormonas respectivas, los receptores activan los mecanismos intracelulares que incrementan la concentración de Ca2+ o AMPc (adenosina monofosfato cíclico). Las hormonas liposolubles, tales como las hormonas esteroides de la capa cortical de la glándula adrenal, las de los ovarios (estrógenos, progesterona) y la de los testículos (testosterona), y las hormonas de la glándula tiroides (T3 y T4) que son aminoácidos modificados, atraviesan fácilmente la membrana celular y penetran en la célula, actuarán en los receptores específicos localizados en el citoplasma y en el núcleo. Al combinarse con sus hormonas respectivas, estos receptores adquieren afinidad por ciertas secuencias nucleotídicas del ADN, con el que se combinan de forma reversible. Esta combinación altera la actividad de los genes cercanos, que pasan, por lo general, a producir más cantidad de sus respectivos ARN mensajeros, pero a veces hay una disminución y no un aumento de la transcripción génica. Como un ejemplo de la comunicación con las células cercanas (secreción paracrina), puede citarse a la histamina producida por los mastocitos (células de tejido conectivo). La histamina actúa en las células del músculo liso, células endoteliales de los capilares sanguíneos y otras. Otros mediadores parácrinos se derivan del ácido graso araquidónico (20 átomos de carbono), tales como las prostaglandinas, los tromboxanos y los leucotrienos. Los derivados del ácido araquidónico desempeñan un papel importante en la defensa, a través del mecanismo denominado genéricamente inflamación. Los neurotransmisores son de acción rápida, de corta duración y participan en las funciones cerebrales superiores y del control de la contracción muscular y de la secreción de las glándulas endocrinas y exocrinas. La neurotransmisión depende de estructuras altamente especializadas, las sinapsis. En estas estructuras, el espacio entre la membrana de la célula transmisora y la de la célula receptora es de sólo 20 nm. Los receptores de los neurotransmisores siempre se encuentran en la membrana de la célula receptora, en los sitios de en las sinapsis.

BIBLIOGRAFÍA

RESUMEN El intercambio de informaciones entre las células que constituyen el cuerpo de un ser multicelular ya se ha establecido en la etapa embrionaria y mantiene su importancia a lo largo de la vida del animal. Estas informaciones se transmiten por moléculas (señales químicas) que atraviesan varias distancias entre la célula emisora y la que recibe la señal. Las señales químicas permiten que las células se organicen en tejidos y que se formen los órganos, para la adición coherente de diferentes tejidos. Estas señales coordinan el crecimiento y las funciones de los diferentes órganos del cuerpo, controlan el metabolismo de las células situadas en diferentes órganos, coordinan la secreción de las glándulas endocrinas y exocrinas, influyen en los mecanismos de defensa como la fagocitosis, el procesamiento de antígenos (moléculas extrañas) y la síntesis de anticuerpos (moléculas inmunes). Influencian, también, la contracción del corazón, del músculo esquelético y del músculo liso situado en la pared de órganos tales como el estómago, los intestinos, el útero y los vasos sanguíneos. Casi todas las funciones celulares están reguladas por el intercambio de señales químicas entre ellas. La molécula de señalización se denomina ligando y la molécula celular que se une al ligando y que posibilita la respuesta se llama receptor. Teniendo en cuenta sobre todo la distancia recorrida por la molécula de señalización y las características de su trayecto, se distinguen tres tipos de comunicación:

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

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Microtúbulos Filamentos de actina Filamentos intermedios Movimientos celulares La mayoría de los movimientos celulares se debe al deslizamiento de estructuras macromoleculares unas encima de las otras La célula muscular estriada está altamente especializada en la transformación de la energía química en energía mecánica El sarcómero es la unidad funcional de las fibras musculares estriadas esqueléticas y cardíacas El deslizamiento de los filamentos de actina y miosina acorta los sarcómeros y causa la contracción muscular La liberación de iones Ca2+ del retículo endoplásmico liso transmite hacia el interior de la fibra muscular estriada el estímulo contráctil recibido por la membrana Otros ejemplos de la interacción de la actina y la miosina Los movimientos de los cilios y los flagelos son promovidos por los microtúbulos

■ Los microtúbulos y filamentos de actina sirven como punto de apoyo para las proteínas motoras

Bases moleculares del Citoesqueleto y de los Movimientos Celulares ERRNVPHGLFRVRUJ ■ Resumen ■ Bibliografía

Guía ■ El citoesqueleto mantiene la forma de las células y es responsable de la contracción celular, de los movimientos celulares y el desplazamiento de los orgánulos, vesículas y partículas en el citoplasma ■ Los filamentos de actina, los microtúbulos y las proteínas motoras miosina, dineína y cinesina son los constituyentes principales del citoesqueleto y responsables de los movimientos celulares ■ Los filamentos de actina se asocian a diversas proteínas y, a través de ellas, se unen a la membrana plasmática, a la envoltura nuclear y a otros componentes de las células ■ En las células eucariotas, gran parte de los movimientos se deben al deslizamiento de los filamentos de miosina sobre los de actina ■ Las células musculares están especializadas para la contracción ■ La unidad contráctil de las células musculares estriadas es el sarcómero ■ Cada sarcómero está separado del otro por una estructura que contiene desmina, la estría Z ■ En el sarcómero, además de los filamentos de actina y miosina, se encuentran otras proteínas que participan de la disposición ordenada de estos filamentos en el músculo estriado y del control de la contracción ■ Al llegar a la fibra muscular estriada, el impulso nervioso provoca un flujo de iones Ca2+ del retículo endoplásmico liso hacia el citosol, lo que provoca la contracción muscular ■ Las células mioepiteliales son contráctiles y ayudan a expulsar la secreción de las glándulas exocrinas ■ Los movimientos de los cilios y flagelos de las células eucariotas ase deben a la actividad de los microtúbulos, sin la participación del sistema actina-miosina.

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uchas células tienen forma irregular existiendo algunas, como las neuronas o células nerviosas, con extensiones muy largas. Por otra parte, el núcleo, los orgánulos, las vesículas secretoras y otros componentes celulares tienen una ubicación definida, casi siempre constante, según el tipo celular. Estas observaciones llevaron a los citólogos a admitir la existencia de un citoesqueleto que jugaría solo un papel mecánico, de apoyo, mantenimiento la forma celular y la posición de sus componentes. Otros estudios, además de confirmar la existencia del citoesqueleto mostraron que su papel funcional es mucho más amplio; éste establece, modifica y mantiene la forma de las células. Por otra parte, también es responsable de los movimientos celulares como la contracción, la formación de pseudópodos y desplazamientos intracelulares de orgánulos, cromosomas, vesículas y gránulos diversos. Los principales elementos del citoesqueleto son los microtúbulos, los filamentos de actina, los filamentos de miosina, los filamentos intermedios y varias macromoléculas proteicas. Estos elementos estructurales son un conjunto dinámico que asume diferentes aspectos de acuerdo con el tipo celular y las necesidades de la célula. De todos los componentes del citoesqueleto, sólo los filamentos intermedios son estables, ejerciendo solamente las funciones de apoyo, sin participar de los movimientos celulares. Los desplazamientos intracelulares de orgánulos y otras partículas se deben a las proteínas motoras que se pueden dividir en dos grandes grupos: las dineínas y las cinesinas, provocando desplazamientos en asociación con los microtúbulos y las miosinas, que pueden formar filamentos y actúan en combinación con los filamentos de actina. No hay ninguna proteína motora conocida que soporte los filamentos intermedios para producir desplazamientos intracelulares. MICROTÚBULOS La microscopía electrónica mostró que el citoplasma contiene cilindros muy finos y largos, llamados microtúbulos con 24 nm de diámetro. Cada microtúbulos se forma por la asociación de dímeros proteicos (Figuras 7.1 y 7.2) dispuestos en una hélice. Los dímeros tienen un peso de aproximadamente 110 kDa (kilodaltons) y se componen de dos cadenas polipéptídicas de estructuras semejantes, pero no idénticas, denominadas alfa y beta tubulinas, que se unen para formar los dímeros. En un corte transversal al microtúbulos, su pared se muestra constituida por un anillo con 13 dímeros (Figuras 7.1, 7.2 y 7.3). Los microtúbulos están en reorganización

constante, creciendo por uno de sus extremos debido a la polimerización local de los dímeros de tubulina, y disminuyendo en el otro extremo, donde predomina la despolimerización. El extremo creciente se llama el extremo más (+) y el otro extremo es menos (-). Los procesos de estiramiento y acortamiento de los microtúbulos son debido al desequilibrio entre la polimerización y la despolimerización. El citosol contiene un pool de dímeros de tubulina sin polimerizar, de modo que la formación de los microtúbulos no depende de la síntesis proteica concomitante. La polimerización de estos dímeros de tubulina para formar microtúbulos está regulada por la concentración de iones Ca2+ y por las proteínas asociadas a los microtúbulos (MAPS, microtubule associated proteins). La concentración de iones Ca2+ actúa más rápidamente en las polimerizaciones de corta duración, y las MAPS participan principalmente de las polimerizaciones más duraderas. En las células, la estabilidad de los microtúbulos varía ampliamente. Los de los cilios, por ejemplo, son muy estables, los del huso mitótico se forman en la mitosis y se rompen con el final del proceso, mientras que los microtúbulos dispersados en el citoplasma tienen vida aún más corta. Hay en la célula un intercambio constante entre los dímeros de tubulina libres en el citoplasma y los dímeros polimerizados que se encuentran en los microtúbulos. Los microtúbulos participan en el movimiento de los cilios y flagelos, el transporte intracelular de partículas, el desplazamiento de los cromosomas en la mitosis, y en el establecimiento y mantenimiento de la forma celular. El papel de los microtúbulos en el mantenimiento de la forma celular ha sido bien estudiado en los heliozoarios. Estos protozoos están rodeados por expansiones citoplasmáticas delgadas, los axonemas, que están dispuestas radialmente con respecto a la célula (Figura 7.4 A). En las micrografías electrónicas, se observa que los axonemas contienen numerosos microtúbulos, dispuestos ordenadamente en espiral (Figura 7.5 A); sin embargo, sometiéndose a estos protozoos a la acción de la molécula de urea que despolimeriza los microtúbulos, los axonemas entran en colapso y se retraen (Figura 7.4 B). Retirando la urea del medio, los axonemas se regeneran en menos de media hora. Durante el colapso de los axonemas, se produce la despolimerización de los microtúbulos con acumulación de las moléculas de tubulina en el citoplasma (Figura 7.5 B). Con la eliminación de la urea, las moléculas de tubulina se repolimerizan y reaparecen los microtúbulos y los axonemas.

Figura 7.1 Ilustración de un microtúbulo, que muestra las dos subunidades ( y β) que constituyen la molécula de tubulina. La disposición de las moléculas de tubulina crea 13 protofilamentos, que constituyen la pared del microtúbulo. El número de protofilamentos es claramente visible en el corte transversal del microtúbulo que aparece en la parte superior de la ilustración.

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Figura 7.2 Representación esquemática de los microtúbulos, los cilios y el centríolo. A. Los microtúbulos vistos al microscopio electrónico después de la fijación con glutaraldehído y ácido tánico. Las subunidades de tubulina, sin colorear, son delineadas por el ácido tánico que es electrondenso. El corte transversal de los microtúbulos revela un anillo de 13 subunidades. Los microtúbulos pueden modificar su tamaño por la pérdida de tubulina en uno de sus extremos y la adición en el otro extremo. B. El corte transversal de un cilio revela una porción central formada de microtúbulos, el axonema, que consta de dos microtúbulos centrales rodeados por nueve pares de microtúbulos. En los pares, el microtúbulo A está completo, con 13 subunidades, mientras que el microtúbulos B tiene 2 o 3 subunidades comunes con el microtúbulo A. Cuando son activados, los brazos de dineína se unen al microtúbulo adyacente y promueven la flexión de los microtúbulos, siempre que allí exista ATP para proporcionar energía. C. Los centríolos consisten en 9 tríos de microtúbulos unidos por puentes proteicos. En cada trío, el microtúbulo A está completo y consta de 13 subunidades, mientras que los microtúbulos B y C tienen subunidades de tubulina en común.

Fármacos que interfieren con los microtúbulos

Varias moléculas actúan sobre los microtúbulos, interfiriendo con el papel de estas estructuras en los procesos celulares de las que participan. En la década de 1930, se observó que el alcaloide colchicina paraliza la mitosis en la metafase, y desde entonces, la colchicina se ha utilizado en los estudios sobre los cromosomas y la división celular. Estudios posteriores mostraron que la colchicina se combina específicamente con los dímeros de tubulina y provoca la desaparición de los microtúbulos menos estables, como los del huso mitótico. Los microtúbulos de los cilios y flagelos son resistentes a la colchicina, quizás a causa de las proteínas (MAPS) asociadas con ellos. La colchicina se combina con los dímeros de tubulina y, cuando el complejo colchicina-tubulina se incorpora en el microtúbulo, evita la adición de nuevas moléculas de tubulina en el extremo más (+) del microtúbulo. Como la despolimerización en el extremo menos (-) no cesa, el microtúbulo se desintegra. Otro alcaloide que interfiere con los microtúbulos es el taxol, pero su efecto molecular es contrario al de la colchicina. El taxol acelera la formación de

los microtúbulos y los estabiliza, interrumpiendo la despolimerización. Toda la tubulina citoplasmática se polimeriza en microtúbulos muy estables. Por lo tanto, no hay tubulina libre en el citoplasma para formar los microtúbulos del huso y la mitosis no se procesa. Por lo tanto, los efectos de la colchicina y del taxol en la mitosis son similares, aunque una destruye y la otra estabiliza a los microtúbulos, lo que demuestra la importancia del sistema formado por tubulina libre y tubulina polimerizada. El taxol se utiliza en el tratamiento de tumores malignos por su capacidad para impedir la formación del huso mitótico, actuando como un potente antimitótico. La colchicina se utiliza en medicina para el tratamiento de la gota, desde la antigüedad hasta nuestros días, aunque el mecanismo de acción en este caso aún no está bien entendido. La vincristina y vinblastina, que actúan de manera similar a la colchicina, son drogas utilizadas también en el tratamiento de tumores malignos porque, como la colchicina y el taxol impiden la formación de los microtúbulos del huso mitótico, interrumpiendo la división celular.

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Figura 7.3 La micrografía electrónica muestra las moléculas proteicas que constituyen los microtúbulos (flecha). Corte transversal de la cola de un espermatozoide de rata fijado en una mezcla de glutaraldehído y ácido tánico. Este ácido promueve la deposición de ácido ósmico utilizado como contraste, en la periferia de las moléculas proteicas, que aparecen como puntos blancos constituyendo la pared de los microtúbulos (flecha). (Cortesía de V. Mizuhira.)

Figura 7.4 Fotomicrografías de un heliozoario que muestran los efectos de una solución diluida (0,15 M) de urea en los axonemas. En A, se observa un protozoo normal y en B, después de la destrucción de los microtúbulos por parte de la urea. Tenga en cuenta el colapso de los axonemas causado por la urea. Aumento: 2.500x. (Micrografias de Shigenaka, Y.L., Roth, E. y Pihlaja, D.J.: J. Cell Sci., 8: 127, 1971. Reproducido con permiso.)

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Figura 7.5 A. Micrografía electrónica. Corte de axonema de un heliozoario normal. Tenga en cuenta q ue, en el corte, los microtúbulos muestran una disposición en espiral. Cada microtúbulo aparece como un anillo electrodenso. B. Micrografía electrónica. Corte de axonema de un heliozoario expuesto durante 10 min a una solución de 0,15 M de urea. Muchos microtúbulos están destruidos y la organización en espiral desapareció. (Micrografías de Shigenaka, Y.L., Roth, E. y Pihlaja D.J., J. Cell Sci., 8: 127, 1971. Reproducido con permiso.)

Microtúbulos de los centriolos

Cada celda contiene un par de centriolos, que se encuentra cerca del núcleo y el aparato de Golgi, en una región llamada centrosoma o centro celular. El centrosoma, que en algunas células no contiene centriolo, está constituido por un material amorfo en el que se originan los microtúbulos. Por lo tanto, el centrosoma es un MTOC ( microtubule organizing center). Al microscopio óptico, el centrosoma aparece como un corpúsculo esférico, muy pequeño y demostrable solamente por tinciones especiales. El microscopio electrónico mostró que cada centríolo es un cilindro que mide 150 nm de diámetro por 300 a 500 nm de longitud. La posición de los centriolos de cada par es muy típica y constante, porque estos siempre se disponen de modo que un centriolo está en ángulo recto con el otro. Cada centríolo está constituido por un material amorfo en el que están colocados 27 microtúbulos. Estos microtúbulos están dispuestos en 9 haces, cada uno con 3 microtúbulos paralelos. Los 3 microtúbulos de cada haz están uidos entre sí (Figura 7.2). Los corpúsculos basales, en el que se insertan los cilios y los flagelos, tienen la misma estructura de los centriolos. FILAMENTOS DE ACTINA Estos filamentos (Figura 7.6) están formados por dos cadenas en espiral de monómeros globulares de la proteína actina G, que se polimerizan recordando dos collares de perlas enrollados, formando una estructura cuaternaria fibrosa (actina F). Son filamentos delgados de 5 a 7 nm de diámetro. A menudo, los filamentos de actina se agregan para formar haces más gruesos. Muy abundante en el músculo, la actina también se encuentra, aunque en menor medida en el citoplasma de todas las células, donde constituye cerca del 5 al 30% de las proteínas citoplasmáticas totales. Los

filamentos de actina participan en la formación de una capa especializada ubicada inmediatamente por debajo de la membrana plasmática, en su superficie interna, llamada corteza celular o córtex celular. La corteza celular es importante para reforzar la membrana plasmática, la cual es muy frágil, y participa en los movimientos celulares, tales como el movimiento ameboide y la fagocitosis, por ejemplo. Hay varios tipos de actina, constituyendo una familia de proteínas extremadamente conservadas durante la evolución. Más del 80% de las secuencias de aminoácidos son exactamente iguales en todos los tipos de actina. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos se encuentran en el extremo -NH2 de la molécula, y parece tener muy poca influencia en la velocidad de polimerización de los monómeros de actina. Varios fármacos que influyen en la estructura de los filamentos de actina, tales como las citocalasinas y las faloidinas (ambas extraídas de hongos), interfieren con los movimientos celulares, y se han utilizado en los experimentos sobre estos movimientos. Las citocalasinas se combinan con las moléculas de actina e impiden la polimerización de estas moléculas para formar filamentos. Las faloidinas se combinan lateralmente con los filamentos de actina, estabilizándolos. Tanto las citocalasinas como las faloidinas impiden los movimientos dependientes de actina. Como en el caso de los microtúbulos, tanto la destrucción como la estabilización de los filamentos de actina tienen el mismo efecto, mostrando que la dinámica entre los monómeros de actina de los filamentos y los del pool citosólico es esencial para la función de estos filamentos. Sin embargo, no todos los filamentos de actina son igualmente sensibles a estos fármacos. Los filamentos de las células no musculares son los más sensibles.

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Figura 7.6 La ilustración muestra que el filamento de actina es una estructura dinámica, recibiendo subunidades por un extremo, llamada extremo más (+), y perdiendo subunidades por el extremo menos (-). Esta dinámica permite que el filamento se adapte muy rápidamente a las necesidades de la célula. Sólo por excepción, como en la fibra del músculo estriado, el filamento de actina es estable.

FILAMENTOS INTERMEDIOS Son llamados así por su diámetro de 8 a 10 nm, intermedio entre los filamentos de miosina, que son más gruesos, y los filamentos de actina más finos. Los filamentos intermedios (Figuras 7.7 y 7.8) son más estables que los microtúbulos y los filamentos de actina y no están formados por monómeros precursores que se añaden continuamente y se separan, en equilibrio con un pool citoplasmático. Cuando la célula se rompe experimentalmente, los microtúbulos y los filamentos de actina se solubilizan, pero el 99% de los filamentos intermedios permanecen intactos. Una vez formados, los filamentos intermedios permanecen por mucho tiempo en el citoplasma. Estos filamentos no tienen participación directa en la contracción celular, o en los movimientos de los orgánulos, siendo principalmente elementos estructurales. Los filamentos intermedios son abundantes en las células sometidas a fricción, tales como las de la epidermis, donde se unen a especializaciones de la membrana plasmática, llamadas desmosomas, que unen a las células entre sí. También son frecuentes en los axones, que son extensiones de las células nerviosas o neuronas, y en todos los tipos de células musculares. Las células que se multiplican con mucha frecuencia, como en los cultivos y en los embriones muy jóvenes, están desprovistas de filamentos intermedios. Estos filamentos también están ausentes en las células que producen la mielina en el sistema nervioso central (oligodendrocitos). Como será estudiado a continuación, los filamentos intermedios de los fibroblastos están formados por la proteína vimentina. Se ha observado experimentalmente que la inyección intracelular de anticuerpos contra vimentina, aunque destruyan los filamentos intermedios de los fibroblastos, no tienen un efecto aparente sobre estas células, que se siguen dividiendo normalmente. Este experimento, además de la observación de que las células embrionarias jóvenes no contienen filamentos intermedios, hace suponer que las funciones de estos filamentos se refieren a las actividades de las células diferenciadas especializadas. Todos los filamentos intermedios tienen la misma estructura, estando formados por la agregación de moléculas alargadas, cada una formada a partir de tres cadenas polipeptídicas enrolladas en una hélice. A diferencia de los microtúbulos y los filamentos de actina que, en todas las células, están constituidos por las proteínas globulares tubulina y actina, respectivamente, los filamentos intermedios están formados por diferentes proteínas fibrosas (moléculas muy alargadas): queratina, vimentina, proteíTabla 7.1 Proteínas que forman los filamentos intermedios Proteína y peso molecular expresado en kilodaltons Queratinas (más de 20 tipos, 40 kDa-70 KDa) Vimentina (54 kDa) Desmina (53 kDa) Proteína ácida fibrilar glial (50 kDa) Proteínas de los neurofilamentos (60 kDa-130 kDa) Laminas A, B y C (65 kDa-75 kDa)

na ácida fibrilar glial, desmina, lamina y proteínas de los neurofilamentos (Tabla 7.1). Estas proteínas se agregan espontáneamente, sin necesidad de energía, para montar los respectivos filamentos intermedios. La vimentina, la proteína ácida fibrilar glial y la desmina son proteínas muy similares y, por lo tanto, son frecuentes los filamentos intermedios de vimentina más esas otras proteínas. Los filamentos intermedios constituidos de queratina se encuentran exclusivamente en las células epiteliales y en estructuras derivadas de ellas, como el pelo, las uñas y los cuernos. Hay muchos tipos diferentes de queratina, codificadas por un número igual de genes. Ya fue identificada una enfermedad humana, rara, originada a partir de la mutación de los genes que codifican a las queratinas de las células de la capa basal de la epidermis. La red de filamentos intermedios de queratina en estas células se vuelve frágil. En consecuencia, la capa basal de la epidermis se rompe a la menor fricción, originando espacios entre las células. Estos espacios se llenan de líquido derivado del tejido conectivo de la dermis, formándose burbujas. Los filamentos intermedios formados por la proteína vimentina son los más frecuentes, encontrados en los fibroblastos y en todas las células de origen mesenquimal, es decir, derivadas del tejido embrionario llamado mesénquima. Son ejemplos de células mesenquimales los fibroblastos, los macrófagos, las células musculares lisas y muchas otras. La desmina se encuentra en los filamentos intermedios de las células musculares lisas y en las líneas o estrías Z de las células musculares estriadas esqueléticas y cardíacas. Los astrocitos y las células de Schwann, constituyentes del tejido nervioso, presentan filamentos intermedios de proteína ácida fibrilar glial o GFAP (glial fibrillary acidic protein). Los neurofilamentos son constituyentes del cuerpo celular y de las extensiones de las neuronas, siendo particularmente abundante en los axones. Hay tres variedades de la proteína lamina, llamadas A, B y C, que participan en la constitución de la lámina nuclear, una estructura similar a una red que refuerza la superficie interior de la envoltura nuclear. Por lo tanto, a diferencia de las otras proteínas de filamentos intermedios, que son citoplasmáticas, la lamina es un componente del núcleo de la célula.

Ubicación Células epiteliales y estructuras formadas por ellas, tales como las uñas, el cabello y los cuernos La mayoría de las células originadas del mesénquima embrionario; a veces se produce sólo transitoriamente durante el desarrollo embrionario Células musculares lisas, esqueléticas y miocárdicas Dos tipos de células gliales: células de Schwann y astrocitos Cuerpo celular y las extensiones de las neuronas (principalmente axones) Lámina nuclear, estructura en red que refuerza internamente la envoltura nuclear

Los filamentos intermedios son específicos para los diversos tejidos, lo que se ha utilizado para caracterizar, en biopsias de tumores y sus metástasis, los tejidos de origen, a menudo información importante para guiar el tratamiento. Por ejemplo, la detección de queratina por inmunocitoquímica indica que el tumor es de origen epitelial y la variedad de queratina observada puede informar del tipo de epitelio en donde se formó el tumor. Las micrografías electrónicas han demostrado que los filamentos intermedios pueden unirse a los microtúbulos, los filamentos de actina, las mitocondrias, los grupos de ribosomas, la envoltura nuclear y la membrana plasmática, a través de puentes delgados formados por moléculas proteicas. La asociación con los microtúbulos es particularmente evidente en ciertas extensiones (axones) de las células nerviosas. La disolución de los

microtúbulos de los fibroblastos por medio de la colchicina, modifica la posición de los filamentos intermedios de vimentina. Mientras que los microtúbulos estén intactos, los filamentos de vimentina atraviesan todo el citoplasma, pero después del desmontaje de los microtúbulos por la colchicina, los filamentos de vimentina, demostrables por imunofluorescencia, se unen en torno al núcleo del fibroblasto. Esto indica que los microtúbulos influyen en la disposición de los filamentos intermedios. En las células estudiadas hasta ahora a este respecto, tales como los linfocitos y los fibroblastos, se observó que los filamentos intermedios se organizan en un sistema más grande en el citoplasma, yendo desde la envoltura nuclear hasta la membrana citoplasmática.

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Figura 7.7 La micrografía electrónica muestra los microtúbulos y los filamentos intermedios. Corte de prolongaciones (axones) de las células nerviosas humanas. Aumento: 80.000x.

Figura 7.8 Micrografía electrónica de un melanocito. Entre los gránulos oscuros de melanina, aparecen numerosos filamentos intermedios. Aumento: 50.000x.

MOVIMIENTOS CELULARES El examen microscópico de la célula viva muestra que se contrae, se expande, y se mueve en diferentes grados. Esto demuestra que sus orgánulos todavía no están fijos sino que se mueven de un lugar a otro dentro de la célula. El movimiento y posicionamiento intracelular de los orgánulos y de varios gránulos, está relacionado con las funciones celulares. Son ejemplos los movimientos cromosómicos en la mitosis, los movimientos de las vesículas secretoras, de las mitocondrias y muchos otros. El estudio del movimiento celular es un ejemplo de la importancia de las fuerzas débiles de las interacciones macromoleculares en la vida de las células. De hecho, los procesos que se estudiarán más adelante, está claro cómo estas interacciones individualmente débiles, cuando se encuentran en grandes cantidades pueden generar fuerzas fuertes, fácilmente reversibles, y de una potencia tal que permiten a un hombre levantar pesos de más de 100 kg, por la contracción simultánea de un gran número de fibras musculares esqueléticas. Los filamentos de actina y miosina, los microtúbulos y las proteínas motoras son responsables de la mayoría de los movimientos celulares. Entre las moléculas de estos componentes se establecen enlaces químicos débiles y reversibles, no covalentes, responsables de la fuerza impulsora. Con fines didácticos, los movimientos de las células se pueden dividir en dos grupos. ► Movimientos que causan cambios en la forma de las células. Tales procesos se ilustran por la contracción de las células musculares, las células mioepiteliales (células contráctiles presentes en glándulas exocrinas y que ayudan en a expulsar la secreción), las células endoteliales, las células mioides (presentes en los testículos), y otras. El movimiento ameboide, mediante el cual las células libres, tales como los macrófagos y los leucocitos se mueven alrededor, y la división celular o citocinesis, que se produce al final de la mitosis, también se incluyen en este grupo.

► Movimientos que no producen ningún cambio en la forma de las células. Este grupo incluye todos los procesos de transporte intracelular de material no acompañado por la deformación celular, co-mo, por ejemplo, en las corrientes citoplasmáticas o ciclosis observado en las células vegetales. Esto es también lo que ocurre en el transporte de material a lo largo de las prolongaciones de las células nerviosas, el transporte de pigmento en las células pigmentarias y en la extrusión de las vesículas de secreción de las células glandulares. LA MAYORÍA DE LOS MOVIMIENTOS CELULARES SE DEBE AL DESLIZAMIENTO DE ESTRUCTURAS MACROMOLECULARES UNAS ENCIMA DE LAS OTRAS El mecanismo de movimiento más extendido en las células eucariotas se debe al deslizamiento de fibrillas de actina sobre las fibrillas de miosina; sin embargo, los movimientos de los cilios y flagelos y el transporte intracelular de las partículas citoplásmicas son debido al deslizamiento de las proteínas motoras sobre las macromoléculas de tubulina, que forman los microtúbulos. Aunque los filamentos de actina participan activamente en el movimiento celular, también tienen funciones estructurales. Este es el caso de los filamentos de actina de las microvellosidades. Cuando se despolimerizan estos filamentos (por la acción de altas presiones, por ejemplo) las microvellosidades desaparecen, reapareciendo cuando la presión cesa y la actina se repolimeriza, reconstituyendo los filamentos. LA CÉLULA MUSCULAR ESTRIADA ESTÁ ALTAMENTE ESPECIALIZADA EN LA TRANSFORMACIÓN DE LA ENERGÍA QUÍMICA EN ENERGÍA MECÁNICA La célula muscular estriada, por ser especializada y presentar una estructura altamente diferenciada con el fin de producir el movimiento, fue el primer sistema que se analizó en profundidad. Hay dos tipos de músculo estriado: el esquelético y el cardiaco. El primero está formado por células

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muy grandes, multinucleadas, formando verdaderos sincitios y que generalmente se insertan en los huesos por medio de los tendones. El músculo estriado cardíaco es el componente principal del miocardio, la capa media y responsable de la contracción involuntaria, rítmica y contínua del corazón. Sus células son más pequeñas, por lo general tienen un solo núcleo, que se unen entre sí mediante estructuras de adhesión y se comunican a través de uniones comunicantes que sincronizan las contracciones del miocardio. Debido a la forma cilíndrica alargada, las células musculares a menudo son llamadas fibras musculares.

En la vida embrionaria, diversas células musculares primordiales o precursoras se fusionan para formar sincitios (sincitio es una estructura que consta de varios núcleos y citoplasma) que se extienden, originando las fibras musculares estriadas esqueléticas. Estas fibras se agrupan y sus extremos se unen a los tendones insertados en los huesos (Figura 7.9A). El análisis de estas fibras al microscopio óptico muestra que contienen un haz intracitoplasmático de estructuras cilíndricas delgadas - las miofibrillas (Figura 7.9B). Cada miofibrilla presenta alternativamente bandas claras o bandas I y bandas oscuras o bandas A.

Figura 7.9 Ilustración de la estructura del tejido muscular estriado esquelético y del mecanismo de contracción. El músculo (A) está formado por haces de fibras musculares. Cada fibra es un sincitio que contiene miofibrillas (B). Cada miofibrilla está formada por unidades que se repiten, los sarcómeros (C) limitados lateralmente por las estrías Z. En D, la ultraestructura de cada sarcómero muestra los filamentos finos de actina que se superponen con los filamentos gruesos de miosina. Los filamentos gruesos forman una banda oscura, la banda A. A cada lado de la banda A, el dibujo muestra una semibanda I, clara, y la estría Z. ranura A la izquierda, un sarcómero de un músculo distendido; a la derecha, sarcómero de un músculo contraido. La contracción es debida al deslizamiento de los filamentos finos sobre los filamentos gruesos. Observe los puentes que se establecen entre los filamentos.

EL SARCÓMERO ES LA UNIDAD FUNCIONAL DE LAS FIBRAS MUSCULARES ESTRIADAS ESQUELÉTICAS Y CARDÍACAS El estudio de las miofibrillas al microscopio electrónico revela que se componen de unidades que se repiten, los sarcómeros. Cada sarcómero, a su vez, está limitado por dos estrías finas y electrodensas, las estrías Z, estructuras que contienen desmina. Por lo tanto, el sarcómero es la porción de la miofibrilla limitada por dos estrías Z consecutivas, estando formado por una banda A y dos segmentos de la banda I cortada por la mitad por la estría Z (Figura 7,9 C). Un análisis más minucioso al microscopio electrónico reveló que el sarcómero se compone básicamente de dos tipos de filamentos (Figura 7.9D). Uno de ellos es fino, se inserta en las estrías Z con la participación de la proteína -actinina, se dirige en sentido medial, sin llegar, sin embargo, al centro del sarcómero. El filamento fino está compuesto principalmente por monómeros globulares de una proteína llamada actina. Estos monómeros se polimerizan en cadenas que se enrollan en doble hélice (Figura 7.10) a la que están asociadas las proteínas tropomiosina y troponina (Figura 7.11). En ciertas circunstancias, la actina se despolimeriza, presentándose en forma de moléculas globulares aisladas (actina G). Cuando estas moléculas se polimerizan para formar filamentos, reciben el nombre de actina F (Figura 7.10). Cada monómero de actina tiene un locus químico que reacciona con la miosina. Las proteínas actina, tropomiosina y troponina se asocian como se muestra en la Figura 7.12. Los filamentos gruesos ubicados en el centro del sarcómero sin alcanzar lateralmente a las estrías Z, se componen de haces de moléculas proteicas fibrilares de miosina. Cada molécula de miosina se compone de dos

polipéptidos largos enrollados que asumen la forma de una varilla larga con dos cabezas globulares en uno de sus extremos. El filamento grueso de miosina está formado por la asociación de cientos de moléculas de miosina dispuestas a diferentes alturas, formando un haz desde el cual las cabezas de miosina forman una protuberancia (Figura 7.10). Cada uno de estos engrosamientos o cabezas de miosina, contiene una región que se combina de forma reversible con la actina (Figura 7.12). EL DESLIZAMIENTO DE LOS FILAMENTOS DE ACTINA Y MIOSINA ACORTA LOS SARCÓMEROS Y CAUSA LA CONTRACCIÓN MUSCULAR La contracción muscular tiene lugar gracias al deslizamiento de los filamentos de actina sobre los de miosina en el sarcómero, con el consiguiente acortamiento de la distancia entre las estrías Z. La fuerza impulsora para este movimiento proviene de las uniones entre la actina y las cabezas globulares de la miosina, que periódicamente se doblan, generando un desplazamiento lateral, seguido por una ruptura y luego una reconstitución de la conexión (Figura 7.12). Por lo tanto, los filamentos de actina se desplazan en relación con los de miosina, de forma análoga a lo que ocurre cuando una oruga se mueve a lo largo de una rama de árbol. Los pies de la oruga representan las cabezas globulares de la miosina que se pliegan durante la contracción muscular (Figura 7.12). Comparando el músculo contraído con el distendido, se observó que, en el primero, los filamentos finos (filamentos de actina) se hacen menos visibles debido a su deslizamiento entre los filamentos gruesos, y las líneas Z se aproximan, acortando el sarcómero (Figuras 7.9, 7.13 y 7.14).

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Figura 7.10 Ilustración de la disposición y estructura de los filamentos finos (filamentos de actina) y gruesos (filamentos de miosina) en el sarcómero. El dibujo también muestra que la estría Z contiene la proteína -actinina. A la izquierda, los componentes del sarcómero; a la derecha, la estructura molecular de tales componentes.

LA LIBERACIÓN DE IONES Ca2+ DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO LISO TRANSMITE HACIA EL INTERIOR DE LA FIBRA MUSCULAR ESTRIADA EL ESTÍMULO CONTRÁCTIL RECIBIDO POR LA MEMBRANA ¿Cómo ocurre el inicio de la contracción del músculo estriado? En el músculo en reposo, la tropomiosina está en estrecho contacto con la actina, cubriendo esta molécula y evitando el contacto de las cabezas de miosina con la actina. Cuando se estimula al músculo, el aumento de la permeabilidad inducida por la estimulación de la membrana celular se transmite al retículo endoplásmico liso (REL), para liberar iones calcio en el citosol contenidos en el mismo REL. Estos iones actúan sobre la troponina promoviendo su deformación molecular, causando la separación entre la tropomiosina y la actina. Este movimiento molecular expone los grupos de actina que reaccionan con las cabezas de miosina, estableciendo así puentes entre estos dos filamentos (Figura 7.12). En la siguiente etapa, el arqueamiento de la cabeza globular de miosina, cosumiendo energía del ATP, desplaza al filamento de actina (Figura 7.12), acortando el sarcómero y causando la contracción de la fibra muscular estriada (Figuras 7.13 y 7.14). En todas las fibras musculares estriadas, tanto esqueléticas como cardiacas, la contracción se produce mediante el proceso descrito de acortamiento de los sarcómeros. Estos dos tipos de fibras musculares estriadas tienen muchas similitudes, estando constituidas por sarcómeros delimitados por estrías Z y que tienen las mismas bandas A y bandas I. En las células musculares estriadas, las mitocondrias, orgánulos productores de ATP, son numerosas y están situadas en las proximidades de las miofibrillas, ofreciendo una clara ventaja funcional, porque el ATP es el combustible utilizado para la contracción. Las células musculares lisas son fusiformes, más pequeñas que las fibras estriadas, y se encuentran principalmente en la pared del útero, estómago, intestinos, vasos sanguíneos, y muchos otros órganos. Estas fibras lisas se contraen y relajan más lentamente, funcionando de manera diferente a las fibras estriadas, también porque no contienen miofilamentos muy bien organizados como en los de las fibras estriadas. Los haces de miofilamentos de las células musculares lisas no presentan la disposición paracristalina vista en las fibras estriadas. Ellos se cruzan en el citoplasma, formando una red en tres dimensiones. Estos haces contienen filamentos de 5 a 7 nm de diámetro, formados por tropomiosina y actina, y filamentos de miosina con 12 a 16 nm de espesor. En las fibras musculares lisas, la contracción se debe también a un mecanismo de deslizamiento de los filamentos de actina sobre los de miosina, similar a lo que ocurre en el músculo estriado. La contracción por lo general comienza por la apertura de canales de Ca 2+ en la membrana plasmática, por estímulo nervioso y por el aumento de la concentración de este ión en el citosol, donde por lo general es muy baja; pero en el músculo liso, la

reacción transitoria de la miosina con la actina depende de la fosforilación de la miosina, sin la participación de la troponina. Los iones Ca 2+, cuando están en exceso en el citosol de la célula muscular lisa, forman un complejo con la calmodulina, una proteína con una alta afinidad para este ion y que también participa en la contracción en las células no musculares. El complejo calmodulina-Ca2+, activa la cinasa de la cadena ligera de la miosina, una enzima que cataliza la fosforilación de la miosina, y esta fosforilación provoca una deformación en las cabezas globulares de la miosina, que empujan a los filamentos finos de actina, determinando el acortamiento de los miofilamentos. Posteriormente, las fosfatasas remueven los radicales fosfato unidos a la miosina, las bombas de Ca2+ retiran los iones Ca2+ del citosol por proceso activo, y el músculo vuelve de nuevo al estado de relajación. Las células musculares lisas también tienen una red tridimensional de filamentos intermedios, principalmente de desmina, encontrándose también vimentina en las células musculares lisas de la pared de los vasos sanguíneos. Otra característica de las células musculares lisas en general es la presencia de los llamados cuerpos densos, que se encuentran asociados con la cara interna de la membrana plasmática, o dispersos en el citoplasma. Estos cuerpos densos contienen la proteína -actinina y otras proteínas también encontradas en las líneas Z de los músculos estriados; por lo tanto, los cuerpos densos se consideran equivalentes de esas líneas, aunque presentan una organización muy diferente. Debido a que los filamentos finos y los filamentos intermedios en el músculo liso, se insertan por un extremo, en los cuerpos densos citoplasmáticos, y por el otro, en los cuerpos densos de la membrana, la contracción debida al deslizamiento causa una reducción en el tamaño de toda la célula muscular lisa. En los músculos, ellas están unidas entre sí principalmente por las fibras reticulares (Capítulo 12), de modo que la contracción de sólo unas pocas células induce la contracción del músculo como un todo. La contracción y relajación del músculo liso son lentas porque las enzimas para la adición y eliminación de radicales fosfato a la molécula de miosina necesitan difundir por el citosol. Por otro lado, dado que el mecanismo de la contracción de las células musculares lisas es un proceso mucho menos especializado, puede ser desencadenada por numerosos estímulos además del estímulo traído por los nervios. Así, las células musculares lisas, dependiendo de los receptores que contienen, se pueden contraer por la acción de la epinefrina, serotonina, prostaglandinas, angiotensina, oxitocina y numerosas otras moléculas. Se supone que el mecanismo de contracción que actúa en las células no musculares en general y en las células musculares lisas es un proceso primitivo que, durante la evolución, condujo al mecanismo altamente especializado y eficiente de la contracción de los músculos estriados esqueléticos y cardiacos.

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Figura 7.11 Figura esquemática que ilustra cómo las proteínas actina, tropomiosina y troponina se asocian para formar los filamentos finos. En la parte superior del dibujo, los componentes libres y, debajo, los filamentos finos polimerizados. Observe que cada molécula de tropomiosina se une estrechamente a siete monómeros de actina. La troponina une la actina a la tropomiosina. Cuando aumenta la concentración de iones Ca 2+, la troponina se deforma y aleja a la molécula de tropomiosina de la de miosina. La troponina está formada por tres subunidades llamadas TnL, TnC y TnT.

Figura 7.12 El esquema ilustra el proceso molecular de la contracción muscular. El Ca 2+ liberado del retículo endoplásmico liso se une a la troponina que cambia su forma, desplazando a la tropomiosina y exponiendo las áreas receptoras de actina (en rayado) que luego se unen a las cabezas globulares de la miosina. En una segunda etapa, ocurre la hidrólisis de ATP a ADP, con la liberación de energía utilizada para plegar a la molécula de miosina. El proceso de plegado de la molécula de miosina, que genera el deslizamiento de la actina sobre la miosina, se lleva a cabo en dos regiones de la molécula. En consecuencia, los filamentos finos (actina) se desl izan sobre los gruesos (miosina), promoviendo el acortamiento de los sarcómeros y la contracción muscular. (Reproducido con permiso de Ganong, W.F.: Review of Medical Physiol, 14a ed. Lange Publications, 1989).

Figura 7.13 Micrografía electrónica de músculo estriado esquelético en estado de distensión. En el centro, oscurecida, la estría Z flanqueada por los filamentos finos (actina) y, más lateralmente por los gruesos (miosina). En R, el retículo endoplásmico liso, donde se acumula calcio en el músculo en reposo. Aumento: 100.000 x.

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Figura 7.14 La micrografía electrónica muestra la ultraestructura del músculo estriado esquelético en estado de contracción. Los filamentos finos se deslizaron a través de los filamentos gruesos, desapareciendo la zona clara (banda I) que flanqueaba a las estrías Z. Aumento: 45.000x.

OTROS EJEMPLOS DE LA INTERACCIÓN DE LA ACTINA Y LA MIOSINA A continuación se citan otros ejemplos de la interacción actina-miosina, proteínas muy difundidas en los diversos tipos celulares. La actina tiene una alta diversidad funcional, que se traduce en su capacidad de interactuar con varias proteínas presentes en la mayoría de las células, denominadas colectivamente como proteínas que se unen a la actina. Al unirse a la actina, estas proteínas desempeñan diferentes funciones: por ejemplo, la filamina une los filamentos de actina entre sí, la espectrina une a la actina a la membrana plasmática, la fimbrina forma haces de actina y la minimiosina permite el deslizamiento de partículas sobre las moléculas de actina. Hay otras proteínas que se asocian con la actina, más allá de las citadas como ejemplos. En el organismo de los mamíferos existen varios tipos de células no musculares que presentan una capacidad marcada de contracción; a continuación se mencionan los tres ejemplos siguientes: (1) las células mioepiteliales, células estrelladas que abrazan las porciones secretoras de algunas glándulas exocrinas, como las glándulas mamarias, salivales y sudoríparas; (2) las células mioides (Figura 7.15) que rodean los túbulos seminíferos de los testículos; y (3) las células endoteliales (Figura 7.16) de los capilares sanguíneos. Estos tres tipos celulares presentan muchos filamentos citoplasmáticos de actina, que, junto con la miosina, son responsables de la actividad contráctil observada. ► Citocinesis. La separación de las células hijas en el final de la mitosis (también llamada citodiéresis) también se produce debido a la interacción de la actina y la miosina, y su mecanismo se describe en el Capítulo 8. ► Microvellosidades. El polo apical de las células epiteliales de la mucosa intestinal (Figura 7.17) y de los túbulos contorneados renales presenta numerosas prolongaciones muy delgadas llamadas microvellosidades. El estudio de estas microvellosidades por microscopia electrónica e inmunocitoquímica reveló la presencia de actina, miosina y -actinina, proteínas relacionadas con la contracción, pero, en las microvellosidades tienen principalmente un papel de soporte, manteniendo la forma alargada de la microvellosidad. Las microvellosidades contienen en su interior unos 40

haces de actina. Estos se unen con engrosamientos que se presentan en el extremo de las microvellosidades (Figura 7.18) y que se unen entre sí y con la membrana plasmática a través de una variedad de proteínas (Figura 7.19). ► Movimientos morfogenéticos. Son los movimientos que se producen en los tejidos durante el desarrollo embrionario. Se sabe, por ejemplo, que los esbozos de las glándulas salivales y del páncreas se forman a través de las invaginaciones del epitelio oral e intestinal, respectivamente. Varios estudios han demostrado la presencia de filamentos de actina asociados con moléculas de miosina, formando una especie de cintura alrededor del polo apical de las células prismáticas de los epitelios que se invaginan (Figura 7.20). El deslizamiento de estos filamentos de actina sobre los de miosina promueve una constricción del ápice de las células, dándoles la forma de un cono truncado. En consecuencia, la capa de células epiteliales tiende a sumergirse en el mesénquima subyacente. Esta invaginación del epitelio puede ser reproducida in vitro, simplemente trasplantando a un medio de cultivo el esbozo glandular tomado del embrión en la edad adecuada. Agregando al medio de cultivo la citocalasina D, un inhibidor de la polimerización de actina G, se observó que, al mismo tiempo en que desaparecen los filamentos de actina, cesa la invaginación epitelial. Después de la eliminación de la citocalasina D del medio, reaparecen los filamentos de actina y el sistema reanuda el movimiento de invaginación. ► Movimiento ameboide. Dicho movimiento se produce en las células libres como las amebas, macrófagos, leucocitos y fibroblastos. El movimiento ameboide se hace mediante la extensión, por la célula, de una prolongación de la capa cortical o córtex del citoplasma, muy ricas en actina. Esta prolongación se llama seudópodo y al fijarse en un sustrato, parece tirar del resto de la célula en su dirección. Del movimiento ameboide participan actina, miosina y otras proteínas, donde la energía es suministrada por el ATP. La figura 7.21 muestra, por inmunofluorescencia, la distribución de los haces de las proteínas actina y tropomiosina en el citoplasma de fibroblastos, proteínas que participan en el movimiento de estas células.

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Figura 7.15 Micrografía electrónica de célula mioide de la pared de un túbulo seminífero del testículo. Tenga en cuenta la abundancia de filamentos finos (actina) intracitoplasmáticos (puntas de flecha). Aumento: 43.000X.

Figura 7.16 Micrografía electrónica de un corte de pared del vaso sanguíneo capilar humano. Obsérvese la presencia de haces de filamentos de actina en el citoplasma de las células endoteliales (flechas). En L, el lumen del vaso. Estos filamentos participan en la contracción que se observa en estas células. Aumento: 45.000X.

Figura 7.17 Micrografía electrónica del polo apical de una célula del intestino delgado. Observe la presencia de haces de filamentos disp uestos paralelamente en las microvellosidades y, también, en el citoplasma subyacente. Esta célula está especializada para la absorción de nutrientes, y las microvellosidades tienen la función de aumentar el área de absorción. Aumento: 15.000X.

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Figura 7.18 Figura 7.19 Figura 7.18 Ilustración del modelo que se admite para la región de las microvellosidades. Los filamentos finos de actina se insertan en el extremo de las microvellosidades y lateralmente, en las zonula adherens. Los filamentos gruesos de miosina formarían puentes con los filamentos de actina. Allí, estas proteínas, asociadas con varias otras, tienen principalmente un papel estructural, manteniendo la forma de las microvellosidades, como lo muestra con más detalles la Figura 7.19. Figura 7.19 El dibujo muestra el papel estructural desempeñado por los microfilamentos de actina y proteínas asociadas, en el mantenimiento de la forma de las microvellosidades. Estas proteínas unen a los microfilamentos entre sí y a la membrana plasmática. En el ápice o porción apical de la microvellosidad existe un material proteico que fija a los microfilamentos, contribuyendo así a la estabilidad del conjunto.

LOS MOVIMIENTOS DE LOS CILIOS Y LOS FLAGELOS SON PROMOVIDOS POR LOS MICROTÚBULOS Los cilios son estructuras que parecen pequeños pelos con 0,25 µm de diámetro constituidos por un conjunto de microtúbulos dispuestos en paralelo y rodeados de membrana (Figura 7.22). Los cilios son cortos y múltiples, y en los epitelios, siempre se encuentran en la superficie apical de las células. Los flagelos son generalmente únicos y largos y, en el cuerpo humano se encuentran sólo en los espermatozoides. Las células ciliadas, presentes en el cuerpo humano en el árbol respiratorio y en el oviducto, se asocian con las células que secretan moco y tienen la función el transporte unidireccional de una capa delgada de moco que recubre la superficie interna de estas estructuras tubulares. Por lo tanto, el polvo que llega al árbol respiratorio es capturado por el moco y se transporta a la cavidad oral, mientras que en el oviducto, ocurre un flujo de moco al útero, lo que facilita el transporte de los óvulos. El movimiento flagelar de los espermatozoides se produce por una sacudida tipo vaivén, que comienza en la base del flagelo, cerca del núcleo del espermatozoide. La actividad del flagelo mueve al espermatozoide hacia adelante. La figura 7.23 ilustra cómo se produce el movimiento ciliar y el movimiento flagelar. Tanto los cilios como los flagelos son haces de microtúbulos, por regla general, formados por nueve pares de microtúbulos dispuestos en un círculo alrededor de un par central. Los microtúbulos de los pares periféricos aparecen fusionados entre sí, mientras que en el par central se presentan separados (Fig 7.24). Se describen con más detalle en los cilios y flagelos, pequeños brazos que salen de uno de los microtúbulos de los pares periféricos que los conectan al par adyacente: están formados por una proteína, la nexina (Figura 7.24). Además de esta estructura se describen pequeños puentes que unen entre sí cada uno de los otros pares de microtúbulos periféricos. Se sabe que los pequeños brazos están constituidos por un complejo de varios polipéptidos que alcanzan un peso molecular de 400 kDa, con actividad ATPasa, llamado dineína. Una serie de experimentos, realizados con flagelos aislados de colas de espermatozoides, han demostrado que los pares de microtúbulos se deslizan entre sí durante la contracción y que la fuerza impulsora para este movimiento se deriva de la interacción de los brazos de dineína con los microtúbulos adyacentes. Según este modelo, la dineína establece contacto con la tubulina de los microtúbulos adyacentes y genera fuerzas que promueven el movimiento de deslizamiento entre los pares de microtúbulos adyacentes, provocando el deslizamiento de un par con respecto al otro. Este deslizamiento está limitado por proteínas que unen a los pares de microtúbulos entre sí. El resultado de la acción de estas fuerzas contenidas conduce a una flexión de los cilios (Figura 7.25).

De hecho, desde el punto de vista de la biología molecular, el funcionamiento de los microtúbulos es complejo, ya que muchas proteínas están asociadas con la tubulina. Tanto los cilios como los flagelos se insertan en estructuras similares a los centriolos, llamadas corpúsculos basales (Fig 7.26), que presentan 9 agregados de 3 túbulos periféricos, pero sin el par central. A menudo, los cuerpos basales presentan prolongaciones dotadas con estrías transversales que se dirigen hacia el interior del citoplasma, formando las llamadas raíces de los cilios, las que tendrían la función de sustentar y anclar los cilios en la célula (Figura 7.26). Los cuerpos basales se reproducen (Figura 7.27) por mecanismos poco conocidos. Este proceso se inicia generalmente por la aglomeración de una sustancia electrodensa, el material pericentriolar, que puede ocurrir junto a los centriolos preexistentes o, también, libre en el citoplasma, independientemente de los centriolos. Varias observaciones muestran que el ATP suministra energía para los movimientos ciliares y flagelares. Por ejemplo, la caída del contenido de ATP en los espermatozoides disminuye su motilidad; la adición de ATP a las células ciliadas o a los flagelos aislados y previamente tratados con detergente (para eliminar la membrana y facilitar la entrada de ATP) promueve vigorosos movimientos de los cilios y flagelos. Un ejemplo extremo de acúmulo de microtúbulos asociados con el movimiento flagelar del espermatozoide se ilustra en la Figura 7.28. En las células del epitelio ciliado, las mitocondrias están dispuestas principalmente en el polo apical, en una situación ideal para proporcionar a los cilios el ATP producido por ellas (Figura 7.26). Un fenómeno análogo se produce en los espermatozoides de los mamíferos, cuyo flagelo está rodeado por una espiral de mitocondrias en su porción inicial. Los cilios y los flagelos son estructuras complejas compuestas por muchas proteínas diferentes, varias de las cuales son importantes para su movimiento. El síndrome de Kartagener, llamado así en honor a su descubridor, acarrea en sus portadores frecuentes infecciones respiratorias, sinusitis crónica y esterilidad masculina. Las mujeres con el síndrome son fértiles. Este síndrome fue descrito en la década de 1930, pero sólo recientemente se descubrieron sus bases moleculares. El estudio de los espermatozoides de los pacientes con el síndrome de Kartagener mostró que los brazos de dineína están ausentes en los cilios y flagelos, lo que impide el movimiento de estas estructuras, imposibilitando el desplazamiento de los espermatozoides y el movimiento ciliar de barrido responsable de la eliminación continua de polvo que penetra en el árbol respiratorio. Recientemente, se describieron otras enfermedades con sintomatología semejante, causadas por la ausencia de otras proteínas que también participan en el movimiento de los cilios y flagelos, creando así un complejo de enfermedades: el síndrome de inmovilidad ciliar.

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Figura 7.20 El dibujo ilustra la invaginación del epitelio de la cavidad oral (A) durante la etapa temprana de la morfogénesis de las glándulas salivales. Las células centrales del brote epitelial (B) tienen forma de pirámide truncada debido a la constricción de su ápice por un cuello interno de microfilamentos (C). (De acuerdo con estudios realizados por Wessels, N.K.et al.: Science, 171:135,1971.)

Figura 7.21 Microfotografía de inmunofluorescencia obtenida con el uso de anticuerpos antiactina (izquierda) y antitropomiosina (derecha). Las figuras muestran la presencia de estas proteínas en fibras intracitoplasmáticas de fibroblastos de piel humana. La tropomiosina es una proteína que se asocia con la actina en las células. (De Lazarides, E.: J. Cell Biology, 65: 549,1975; reproducción autorizada.)

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Figura 7.22 Micrografía electrónica de corte transversal de cilios. Observe la membrana plasmática envolvente con su disposición de unida d de membrana. Dentro de cada cilio, nueve pares de microtúbulos unidos y un par central no unido. Aumento: 84.000x.

Figura 7.23 Figura 7.24 Figura 7.23 Los dibujos muestran el movimiento de los flagelos y el de los cilios. El flagelo se mueve por una contracción que se inicia en la base y se transmite a lo largo del flagelo. En la parte activa del movimiento ciliar, que mueve las partículas o la propia célula, el cilio permanece rígido (izquierda a derecha, en el dibujo). Entonces el cilio se vuelve flexible y vuelve a la posición inicial, para comenzar un nuevo ciclo. Por lo tanto, en las células fijas, el movimiento ciliar propulsa las partículas en una dirección determinada [flechas superiores). En las células libres, el movimiento ciliar mueve la célula. Figura 7.24 El esquema ilustra la ultraestructura del cilio y del flagelo, vista en un corte transversal. Observe los 9 pares unidos de túbulos periféricos, que se unen entre sí por los brazos de dineína y por uniones laterales (nexina). Los pares periféricos se unen al par central (no unido) por medio de filamentos radiales.

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Figura 7.25 Modelo molecular simplificado para explicar los movimientos ciliares y flagelares. Resultados de experimentos realizados en condiciones normales y después de la retirada del material (nexina) que une los microtúbulos de los flagelos de los espermatozoides. Los dibujos superiores muestran que la contracción de los microtúbulos que no están fijados conduce al deslizamiento de uno sobre el otro. Los dibujos inferiores muestran que la unión de los microtúbulos determina que el movimiento sea de arqueamiento, y no de deslizamiento.

LOS MICROTÚBULOS Y FILAMENTOS DE ACTINA SIRVEN COMO PUNTO DE APOYO PARA LAS PROTEÍNAS MOTORAS El estudio de los procesos de desplazamiento intracitoplasmático de partículas celulares fue facilitado por el análisis de las células donde las partículas son visibles y notoriamente transportadas dentro de las células, como en los melanóforos (Fig 7.29), células que contienen gránulos de melanina. Estos desplazamientos intracitoplasmáticos también fueron muy estudiados en las prolongaciones de las neuronas o células nerviosas (Figura 7.30). El estudio de estos y otros modelos condujo al descubrimiento de que este proceso se produce gracias a la participación de varios tipos de complejos proteicos específicos, llamados proteínas motoras (Figura 7.31). Cada complejo de proteína motora se compone de dos tipos de componentes: los componentes adaptadores, que se unen, en un lado, específicamente a las varias partículas a ser transportadas y, del otro lado, a los segundos componentes, que son los componentes motores. Estos, a su vez, se unen, en un extremo, a los adaptadores y, en el otro, a los microtúbulos o a los filamentos de actina, promoviendo el deslizamiento del complejo proteína motora+partícula a lo largo de los microtúbulos. Esto es gracias a la energía derivada del ATP por la ATPasa presente en los componentes motores. Se han descrito dos tipos de componentes motores que promueven el desplazamiento de las partículas en los microtúbulos. Uno de estos componentes consiste en las proteínas de la familia de las dineínas, que transportan partículas en la dirección del extremo más hacia el extremo menos (+ a -). Las proteínas de la familia de las cinesinas promueven el desplazamiento en la dirección opuesta (- a +). Otra familia de proteínas motoras está constituida por las miosinas, que producen movimiento en asociación con los filamentos de actina. La dirección y la velocidad del transporte intracelular de las partículas dependen de la diversidad de las proteínas motoras existentes en los diversos tipos de células.

Las células pigmentarias de los vertebrados inferiores, llamadas cromatóforos, son un modelo en el que el transporte intracelular es fácil de visualizar. Los cromatóforos que contienen pigmento negro (melanina) son grandes y fáciles de observar. Se llaman melanóforos y generalmente tienen forma estrellada. El control del desplazamiento intracelular de los gránulos de pigmento de los cromatóforos se realiza, en la mayoría de los peces, a través del sistema nervioso simpático mediante la liberación de noradrenalina en las terminaciones nerviosas, lo que promueve la rápida migración centrípeta del pigmento. La migración del pigmento en la dirección opuesta es un proceso muy lento y desigual. La microscopía electrónica reveló que los melanóforos contienen un par de centriolos de los que se irradian una gran cantidad de microtúbulos, entre los cuales están dispuestos los gránulos de pigmento. El pretratamiento de estas células con colchicina o vinblastina conduce a la despolimerización de los microtúbulos y, al mismo tiempo, a un bloqueo de la migración de los gránulos de pigmento. Estos resultados muestran que los microtúbulos desempeñan un papel importante en el transporte de los gránulos. ► Extrusión de las vesículas de secreción. En alguna etapa del ciclo secretor, los gránulos o vesículas de secreción son expulsados de la célula por un proceso de exocitosis (exo, fuera y cytos, célula). Varios estudios vienen demostrando que los microtúbulos participan en la extrusión de los productos de secreción acumulados en vesículas en el interior de las células. La participación de los microtúbulos en el proceso de extrusión de los gránulos de secreción se ilustra en la diabetes genética del roedor Acomys cahirinus, que tiene una deficiencia en los microtúbulos. En estos animales, las células productoras de insulina (células β de los islotes de Langerhans del páncreas) sintetizan insulina normalmente, pero la falta de microtúbulos impide la expulsión de los gránulos de secreción, que se acumulan en el citoplasma.

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Figura 7.26 Micrografía electrónica de la porción apical de las células ciliadas. Observe los cilios implantados en los cuerpos o corpúsc ulos basales (flechas individuales), desde donde parten las raíces de los cilios. Tenga en cuenta el acúmulo de mitocondrias, proveedoras de energía (ATP) en el ápice de estas células. Entre los cilios, se observan las microvellosidades en la superficie celular. En la flecha doble, un complejo de unión. Aumento: 25.000x.

Figura 7.27 La micrografía electrónica muestra la formación de cuerpos basales en el oviducto de una mona. Cuando se inyecta la hormona estrógeno en las monas, se forman en un corto tiempo, muchos cilios en la superficie de las células epiteliales del oviducto. Las figuras ilustran la formación de cuerpos basales (CB) al lado de un centríolo preexistente (C). En A, la fase inicial de formación y, en B, la fase más adelantada. Se cree que la mayoría de los cuerpos basales se forma sin la presencia de centriolos preexistentes. (Cortesía de Anderson, R.G.W. y Brenner, R.M.: J. Cell Biology, 50:10. 1971. Reproducción autorizada.)

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Figura 7.28 Corte transversal de la cola de un espermatozoide del sapo arbóreo Racopholus scheligelii, fijado con la mezcla de glutaraldehído-ácido tánico, seguido del tratamiento con osmio (coloración negativa). Un par de estructuras semejantes a flagelos es envuelta por aproximadamente 500 microtúbulos. Cada microtúbulo se compone de 13 subunidades globulares. (Cortesía de V. Mizuhira.)

Figura 7.29 Figura 7.30 Figura 7.29 El dibujo muestra el transporte intracelular en un melanóforo, cuyos gránulos de melanina se desplazan en dirección centrípeta, por estímulo nervioso, o centrífuga, cuando este estímulo cesa. De esta manera, los peces se adaptan al color ambiental, defendiéndose de sus depredadores. Figura 7.30 Ilustración del movimiento intracelular en los axones (prolongaciones de las neuronas) que transportan diferentes partículas con diferentes velocidades en ambas direcciones.

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Figura 7.31 El dibujo esquemático muestra la participación de las proteínas motoras cinesina y dineína en el movimiento de las partículas citoplasmáticas a lo largo de un microtúbulo. La cinesina transporta en la dirección del extremo más (+) y la dineína en la dirección del extremo menos (-) del microtúbulo. La variedad de cinesinas, dineínas, proteínas motoras y proteínas adaptadoras permite el transporte de partículas y vesículas diversas de un lugar a otro dentro de la célula.

RESUMEN Los filamentos de actina, los microtúbulos y las proteínas motoras miosina dineina y cinesina son los principales componentes celulares que participan en los procesos de movimiento. Algunas de estas estructuras del citoesqueleto también son responsables de la forma de las células. Los movimientos que provocan cambios en la forma celular (movimiento ameboide, contracción muscular, citocinesis, contracción de las células mioides) resultan de la interacción de los filamentos de actina con los filamentos de miosina. Existen, sin embargo, los movimientos que se deben a los microtúbulos, tales como los movimientos ciliares y flagelares. La energía para los movimientos se obtiene de los nutrientes, y luego se transfiere energía a los enlaces químicos en la molécula de ATP, que es la fuente inmediata de energía para los movimientos celulares. BIBLIOGRAFÍA

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

Núcleo de la Célula

8 7 ■ La envoltura nuclear protege el material genético ■ La envoltura nuclear está perforada por los complejos de poros ■ La Ran controla la dirección de la translocación de moléculas a través de los poros ■ La lámina nuclear da forma y estabilidad a la envoltura nuclear ■ La cromatina está formada por ADN complejado con proteínas ■ Estructura molecular de la cromatina ■ La cromatina y la expresión de la información genética ■ Los genes pueden estar repetidos ■ Estados funcionales de la cromatina ■ El tamaño del nucléolo varía con la actividad celular ■ Composición química y ultraestructura del nucléolo ■ Biogénesis de los ribosomas ■ Síntesis y procesamiento del ARNr ■ Montaje de las subunidades ribosomales ■ Otras funciones del nucléolo ■ Nucleoplasma ■ Resumen ■ Cromosoma metafásico: el estado más condensado de la cromatina ■ Estructura de los cromosomas metafásicos ■ El complemento cromosómico de una especie es constante ■ Cromosomas gigantes: politénicos y plumosos ■ Los cromosomas politénicos son interfásicos ■ Los cromosomas plumosos son meióticos

Celia Guadalupe T.J. Andrade Berenice Quinzani Jordão

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Resumen Manipulación del ADN: la ingeniería genética Resumen Bibliografía

Guía ■ El núcleo caracteriza a la célula eucariota ■ Los componentes principales del núcleo son la envoltura nuclear, la cromatina, los nucléolos y el nucleoplasma ■ La envoltura nuclear está constituida por dos membranas perforadas por un número variable de poros que controlan el tránsito de moléculas ■ Las proteínas nucleares se sintetizan en los polirribosomas citoplasmáticos, pero con una señal que marca su destino ■ La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en ADN y proteínas histonas ■ En Las fibras de cromatina presentes en el núcleo interfásico tienen entre 10 y 30 nm de diámetro ■ El nucléolo es el sitio de la síntesis del ARN ribosomal y el de montaje de las subunidades ribosómicas ■ La matriz nuclear define los diferentes compartimentos nucleares ■ El cromosoma en metafase está formado por un esqueleto de proteínas acídicas a las cuales se les asocia la fibra cromatínica ■ Los cromosomas gigantes son de dos tipos: politénicos y plumosos ■ Los cromosomas plumosos son meióticos; los politénicos son interfásicos ■ La ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante hizo posible la secuenciación de genes específicos ■ Un gen puede ser clonado, modificado e introducido en un organismo extraño.

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a existencia del núcleo es la característica principal que distingue a la célula eucariota de la procariota. La mayor parte de la información genética de la célula está contenida en el ADN del núcleo celular, con sólo una pequeña porción por fuera de él, en las mitocondrias y los cloroplastos. Además, el núcleo controla el metabolismo celular por la transcripción del ADN en los diferentes tipos de ARN que se traducen en proteínas, los efectores finales de la información genética. El ciclo de vida de la célula se divide en dos fases principales: la mitosis y la interfase. En la mitosis ocurre la división de la célula, mientras que el período entre las dos divisiones es la interfase. Así, según la fase en la que se encuentra la célula, se distingue el núcleo interfásico (Figura 8.1) y el núcleo mitótico. En este capítulo, se abordarán los aspectos estructurales y funcionales del núcleo interfásico, mientras que el núcleo mitótico será el tema del capítulo 9. La mayoría de las células tiene un solo núcleo, aunque hay células con dos o más núcleos. Son ejemplos algunas células hepáticas que son binucleadas y la fibra muscular estriada esquelética, que contiene varias decenas de núcleos. El núcleo generalmente se encuentra en el centro de la célula. Sin embargo, en las células que almacenan material a ser secretado, tales como las células acinares del páncreas y las caliciformes del intestino, el núcleo tiene una posición basal. Además, las células vegetales presentan un núcleo periférico debido a la gran vacuola citoplasmática. Estudios recientes muestran que el núcleo ocupa una posición fija en el citoplasma a través

de su asociación con los componentes del citoesqueleto, tales como los filamentos intermedios y los filamentos de actina (que se discute en el Capítulo 7). Generalmente, la forma del núcleo acompaña a la de la célula. Las células prismáticas tienen núcleos alargados, mientras que las células poligonales o esféricas tienen núcleos esféricos. También hay muchos núcleos de forma irregular (Figura 8.2). Por lo general es difícil percibir en el microscopio óptico la forma de las células animales; así, la forma del núcleo se usa para inferir la forma de la célula. Los cambios en la forma celular causan cambios en el núcleo, ya que se asocia con los filamentos de actina que, a su vez, se unen a las proteínas de la membrana plasmática. El tamaño del núcleo puede variar con el metabolismo y con el contenido de ADN de la célula. Las células con metabolismo alto tienen grandes núcleos. Los métodos bioquímicos permiten la detección, en estos núcleos, de una mayor cantidad de proteínas relacionadas con la transcripción del ADN. La cantidad de ADN también es un factor determinante del tamaño del núcleo. En general, los núcleos de las células de los urodelos tienen un alto contenido de ADN y se encuentran entre los más grandes que se conocen en los vertebrados; los núcleos de las aves, a su vez, con bajo contenido de ADN, son generalmente pequeños. El núcleo interfásico se compone de la envoltura nuclear, la cromatina, nucléolos y nucleoplasma (Figura 8.1).

Figura 8.1 Esquema del núcleo interfásico. La envoltura nuclear se compone de dos membranas que delimitan el espacio perinuclear. En algunas regiones, las dos membranas se fusionan, formando los poros, que están ocupados por los complejos del poro nuclear. La envoltura nuclear es continua con el retículo endoplásmico y la membrana nuclear externa tiene ribosomas adosados a su cara citoplasmática. Grumos de cromatina condensada (Cc) están asociados con la envoltura nuclear, mientras que las porciones de la cromatina descondensada (Cd) se dispersan en el núcleo. En el nucléolo, están representadas las porciones fibrilares (F) y granulares (G), así como la cromatina asociada.

LA ENVOLTURA NUCLEAR PROTEGE EL MATERIAL GENÉTICO La envoltura nuclear separa el núcleo del citoplasma, siendo responsable del mantenimiento del núcleo como un compartimiento separado y permitiendo que la célula controle el acceso a su material genético. Es visible sólo al microscopio electrónico, debido a que el espesor de sus membranas está por debajo del poder de resolución del microscopio óptico. La envoltura nuclear consta de dos unidades de membrana concéntricas, que limitan una cavidad interior, el espacio perinuclear, que tiene un espesor de 30 a 50 nm (Figuras 8.1 y 8.3) y contiene proteínas solubles. La cara nucleoplasmática de la membrana interna plasmática se asocia a una red de filamentos que constituyen la lámina nuclear. La membrana externa contiene ribosomas adheridos a su superficie citoplasmática y presenta continuidad con el retículo endoplasmático rugoso (Figuras 8.1 y 8.3), por lo que se considera una parte especializada del retículo. Las membranas de la envoltura son lipoproteicas, conteniendo alrededor de 30% de lípidos y 70% de proteínas, entre las cuales algunas son glicoproteínas. Aproximadamente el 90% de los lípidos son fosfolípidos y el 10% restante son triglicéridos, ésteres de colesterol, y colesterol. La

mayoría de las proteínas de la membrana externa es común a las membranas del retículo. Algunas, sin embargo, son específicas, tales como las de la familia de las nesprinas, que interactúan con los componentes del citoesqueleto y son responsables del anclaje y del posicionamiento del núcleo en la célula. La membrana interna tiene su propia composición de proteínas intrínsecas y periféricas, varias de ellas ya caracterizadas. Algunas establecen uniones con las proteínas de la membrana externa, pero la mayoría están involucradas con la interacción de la membrana interna a la cromatina y a la lámina nuclear. Son proteínas intrínsecas la emerina, el receptor para los filamentos de la lámina (LBR – del inglés lamina B receptor), las LAP 1 y 2 (del inglés lamina associated polypeptides), la MAN 1 y las Sun l y 2 (Figura 8.4). Las proteínas de estas membranas son sintetizadas por los polirribosomas adheridos a la membrana externa de la envoltura, es decir, en continuidad con el RER. Estas son insertadas en la membrana de la bicapa lipídica y se extienden en el plano de la membrana, situándose en la membrana interna, en la cual son mantenidas gracias a su asociación con la lámina y / o con la cromatina nuclear.

Figura 8.2 Figura 8.3 Figura 8.2 Micrografía electrónica de la médula ósea en la cual se observan células con núcleos de formas irregulares. 1. núcleo en form a de S; 2. en forma de U; 3. dos núcleos redondos; 4. núcleo alargado; 5. Núcleos con cromatina descondensada; 6. núcleos con cromatina condensada. 4.000X. Figura 8.3 Micrografía electrónica de una región de la célula, que muestra la envoltura nuclear constituida por dos unidades de membrana separadas por el espacio perinuclear. Las flechas señalan la continuidad de la membrana externa de la envoltura nuclear con el retículo endoplasmátlco. N. Núcleo. 28.500X. (Cortesía de E. C. Farias.)

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Figura 8.4 Representación esquemática de la envoltura nuclear que muestra las interacciones de las láminas con las proteínas intrínseca de la membrana nuclear interna y con los complejos de poro nuclear. Las láminas asociadas a las proteína intrínsecas y a las Nup (que constituyen el "aro de baloncesto" del complejo del poro nuclear) forman la lámina nuclear, mientras que las láminas del nucleoplasma forman parte de la matriz nuclear. Las fibras de cromatina se asocian a la envoltur a nuclear a través de las láminas. Los complejos de poro nuclear están anclados en la membrana interna por las proteínas gp210 y POM121. Las proteínas de transmembrana LAP1, LAP2, Sun y emerina atraviesan una sola vez la bicapa, mientras que el LBR es del tipo multipaso. La nesprina es una proteína unipaso, intrínseca a la membrana externa.

LA ENVOLTURA NUCLEAR ESTÁ PERFORADA POR LOS COMPLEJOS DE POROS La envoltura nuclear no es continua como otras membranas biológicas. En algunos puntos, la membrana externa se fusiona con la interna, formando los poros nucleares (Figuras 8.4 y 8.5). Estos poros están parcialmente ocupados por agregados proteicos, los complejos de poros nucleares, que permiten y regulan el tránsito de macromoléculas entre el núcleo y el citoplasma (Figuras 8.4 y 8.6). Los poros están espaciados de manera uniforme, y su número por unidad de área de la envoltura varía con el tipo de célula y con su fase funcional (Figura 8.5). Las células con alta actividad de síntesis proteica, tales como las células embrionarias, tienen una mayor cantidad de complejos de poros nucleares por unidad de área de la superficie de la envoltura. Por el contrario, las células con baja actividad metabólica, como los eritrocitos nucleados, tienen significativamente menor cantidad de complejos de poro nuclear. Los análisis detallados, que incluyen estudios al microscopio electrónico, la tomografía ultraestructural, la proteómica y la reconstitución por ordenador, permitieron la construcción de modelos tridimensionales de los complejos de poro nucleares (Figura 8.7). Estos complejos están constituidos por dos anillos proteicos que tiene una disposición octogonal y establecen el perímetro del poro. Uno de ellos está unido a la superficie del núcleo anillo nuclear -, y el otro a la superficie citoplasmática de la envoltura anillo citoplasmático. La disposición octogonal de estos dos anillos conduce al establecimiento de un canal central que está parcialmente ocupado por filamentos proteicos que sobresalen como rayos y están enredados dentro del canal. Sin embargo, ocho filamentos proteicos sobresalen de los anillos citoplasmático y nuclear, constituyendo una estructura semejante a un aro de baloncesto, sólo en el lado nuclear. El complejo del poro nuclear está anclado en la bicapa lipídica, en los puntos donde las membranas se fusionan por dos tipos de proteínas intrínsecas, la POM121 (del inglés pore membrane) y la gp210 (del inglés glycoprotein) (Figura 8.4). Se estima que los complejos del poro nuclear están formados por más de 100 moléculas proteicas, llamadas colectivamente nucleoporinas (Nup). Cada complejo contiene cerca de 30 diferentes tipos de nucleoporinas, la mayoría de ellas ya caracteri-zadas bioquímicamente, tales como Nupl53, Nup62, Nup54, Nup50, Nup35, entre otras (los números se refieren a los pesos moleculares de estas proteínas). Las Nup tiene lugares específicos en el complejo, algunas están distribuidas simétricamente, otras residen exclusivamente en la cara citoplásmica, otras en la nucleoplasmática, y otras, no obstante, establecen el perímetro del canal central (Figura 8.7). Dos clases de Nup se han identificado: (1) las que presentan secuencias de los aminoácidos fenilalanina y glicina (FG) que se repiten y se intercalan entre secuencias de aminoácidos polares de longitudes variadas y están involucradas en el transporte entre el núcleo y el citoplasma, y (2) aquellas que no presentan dominios FG y forman parte de la estructura de los complejos de poros nucleares. Las secuencias FG de las Nup quedan expuestas en los filamentos nucleares, en los citoplasmáticos y en todo el perímetro del canal central, donde participan en el transporte de moléculas. Los complejos de poro nuclear tienen un diámetro externo de 120 nm y un peso molecular de 125 MDa (megadalton = 10 6 daltons). El canal central, a su vez, tiene un diámetro de 25 a 30 nm. La disposición de los filamentos de las Nup en el interior del canal central cierra parcialmente la abertura del complejo de poro nuclear (Figura 8.7).

El tránsito de moléculas a través de los complejos de poro nuclear puede ocurrir ya sea por transporte pasivo o por transporte activo. Agua, iones y moléculas pequeñas de hasta 9 nm de diámetro atraviesan fácilmente el complejo de poro nuclear en ambas direcciones. Ellas se difunden pasivamente a través del canal central. Sin embargo, La mayoría de las proteínas y el ARN, son demasiado grandes para difundirse a través de estos canales. Estas macromoléculas complejas atraviesan los complejos de poro nuclear a través de un proceso que consume energía, en el que tanto las proteínas y el ARN son reconocidos y transportados selectivamente. Normalmente, el núcleo importa del citoplasma proteínas de alto peso molecular, tales como las ADN polimerasas (100.000 daltons) y del ARN (200.000 daltons). Las proteínas propias del núcleo son sintetizadas en el citoplasma con las señales de localización nuclear, que constan de una o dos secuencias cortas de aminoácidos ricas en lisina y arginina. Las proteínas marcadas para ser destinadas al núcleo, atraviesan los complejos del poro nuclear por un mecanismo que consume energía suministrado por el GTP. Las señales de destinación nucleares son reconocidas por los receptores de importación, que son proteínas citoplasmáticas de la familia de las importinas (Figura 8.8). Se estima que hay, en los vertebrados, alrededor de 20 diferentes tipos de importinas. La importina se une a la proteína a ser transportada, formando un complejo que, para ser translocado a través del poro, debe interactuar con las nucleoporinas. La importina del complejo importina-proteína nuclear es reconocida por las secuencias FG de las Nup, que componen los filamentos citoplásmicos, y por las secuencias FG de las Nup, que forman el canal central del complejo de poro nuclear. Estas secuencias funcionan como carriles que promueven la translocación del complejo importina-proteína por el poro. Después del transporte, la importina se desprende de la proteína y vuelve al citoplasma, en el cual puede ser utilizada en un nuevo proceso de importación. La señal de localización nuclear no es removida después que la proteína entra en el núcleo, lo que permite la reintroducción de la proteína cuando la envoltura nuclear se rehace después de la mitosis. La exportación de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma es similar a la importación de proteínas, sino que actúa en la dirección opuesta. Este proceso también está mediado por receptores de exportación específicos, es decir, una familia de proteínas llamadas exportinas (Figura 8.8). El proceso es activo, con consumo de energía suministrado por el GTP. Los ARN transcriptos en el núcleo que realizan su función en el citoplasma, es decir, el ARNm, el ARNt y el ARNr, se exportan como complejos de ARNproteínas (RNP), y las señales de exportación nuclear de estos complejos RNP están presentes en las proteínas. La única excepción encontrada fue la molécula de ARNt, ya que se ha aislado y caracterizado un tipo de exportina que reconoce y se une directamente a la misma. Las moléculas de ARNm, a su vez, se complejan con aproximadamente 20 proteínas, formando las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas o hnRNP. Una de estas proteínas, por lo menos, debe contener una señal de exportación nuclear que es reconocida y unida a una exportina, formando el complejo de exportación. Durante el proceso de translocación a través del complejo del poro nuclear, la exportina es reconocida por las secuencias FG presentes en las Nup que constituyen los filamentos nucleares y el canal central del complejo del poro nuclear y actúan como carriles en el transporte del complejo exportina-ARNm al citoplasma. Una vez en el citoplasma, la exportina libera su carga y retorna al núcleo, donde puede ser reutilizada en otro proceso de exportación. Como se verá más adelante, también los ARNr son exportados desde el núcleo en forma de partículas complejadas con proteínas, es decir, en forma de subunidades ribosomales.

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Figura 8.5 Figura 8.6 Figura 8.5 Envoltura nuclear de la ameba Entamoeba histolytica, obtenido por el método de criofractura, que muestra el gran número de poros nucleares. 20.000 x. (Cortesía de A. Martinez-Palomo.) Figura 8.6 Micrografía electrónica de corte oblicuo de cubierta nuclear de célula renal. Debajo, la cromatina condensada, que se interrumpe en las regiones correspondientes a los poros nucleares. En algunos poros es visible una estructura electrodensa, en una disposición en anillo (flechas), que constituye los complejos de poro nucleares 45.000X.

Figura 8.7 Esquema de corte de complejo de poro nuclear, formado por dos anillos proteicos que se ubican en una disposición octogonal. Del anillo citoplasmático parten ocho filamentos que se sumergen en el citosol, mientras que los filamentos salen del anillo nuclear forman una estructura similar a un aro de baloncesto en el interior del núcleo. Ambos anillos están anclados en la bicapa lipídica, en los puntos donde se fusionan las membranas. Esta disposición espacial de los anillos proteicos define un canal central, que es ocupado por filamentos de las nucleoporinas y que participan en el transporte de moléculas.

LA Ran CONTROLA LA DIRECCIÓN DE LA TRANSLOCACIÓN DE MOLÉCULAS A TRAVÉS DE LOS POROS La dirección de transporte de moléculas entre el núcleo y el citoplasma es regulada por la Ran (del inglés Ras-related nuclear protein), una proteína de bajo peso molecular que pertenece a la familia de enzimas que descomponen GTP o GTPasas. Los receptores de importación nuclear (importinas) y de exportación (exportinas) tienen dos dominios: uno que se une a Ran y otro que se une a la molécula a transportar (Figura 8.8). La Ran hidroliza al GTP, proporcionando energía para la translocación de las moléculas a través de los complejos de poro nuclear. La Ran puede adoptar dos estados conformacionales diferentes, dependiendo de su unión a la molécula de GTP o de GDP, siendo la RanGTP concentrada en el núcleo y la RanGDP en el citoplasma. El proceso de importación se inicia en el citoplasma cuando la proteína que contiene la señal de importación nuclear se une a la importina. El complejo

proteína-importina atraviesa el complejo de poro nuclear, como se ha visto anteriormente, y luego en el núcleo, la RanGTP se une a la importina, promoviendo un cambio conformacional en el sitio de unión de la importina y causando la liberación de la proteína en el nucleoplasma. El complejo importina-RanGTP vuelve al citoplasma, donde otra proteína, llamada GAP (del inglés GTPase-activating protein) o proteína activadora de GTPasa, induce la actividad hidrolítica de Ran, que rompe al GTP, adoptando la configuración RanGDP y liberando a la importina en el hialoplasma. En la exportación, que se inicia en el núcleo, la exportina se une, al mismo tiempo, a la proteína que contiene la señal de exportación nuclear y a la RanGTP (Figura 8.8). Este complejo se transloca a través del complejo de poro nuclear, y una vez en el citoplasma, la Ran, activada por la GAP, hidroliza al GTP, asumiendo la configuración RanGDP, liberando la proteína y la exportina en el citoplasma. La exportina vuelve al núcleo, en el cual irá a participar de un nuevo proceso de exportación.

Figura 8.8 Representaciones esquemáticas del transporte de moléculas a través de los complejos de poro nuclear. A la izquierda, se representa el proceso de importación de las moléculas por el núcleo. En este proceso, la molécula a ser importada contiene una señal de localización nuclear (SLN) que es reconocida por la importina y se une a ella. El complejo importina- molécula importada se une a las secuencias FG de las Nup (1), que actúan como carriles y realizan la translocación del complejo a través del canal central del poro (2 y 3). En el interior del núcleo (4), la RanGTP se une a la importina, haciendo que se libere la molécula importada en el nucleoplasma. A la derecha, se inicia el proceso de exportación cuando la molécula que se exporta contiene una señal de exportación nuclear (SEN), es reconocida por la exportina, si une a ella y a la RanGTP (1). Este complejo es reconocido por las secuencias FG de las Nup (2) y es translo-

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8 cado a través del canal central del poro (3). Ya en el citoplasma, la Ran, activada por la RanGAP, hidroliza al GTP, asumiend o la configuración RanGDP. La molécula exportada y la exportina se liberan en el citoplasma (4).

LA LÁMINA NUCLEAR DA FORMA Y ESTABILIDAD A LA ENVOLTURA NUCLEAR Asociada con la superficie interna de la envoltura nuclear, se encuentra la lámina nuclear, una red proteínica de 20 a 50 nm de espesor (Figuras 8.1 y 8.4), que se interrumpe en los poros nucleares. La lámina está constituida por las proteínas laminas que pertenecen a una clase de filamentos intermedios nucleares. En los vertebrados, hay tres genes que codifican los siete tipos de laminas: dos de tipo A (A y AΔ10) (Δ - del griego, delta); dos de tipo C (C, C2) y tres de tipo B (Bl, B2 y B3). Las laminas de los tipos A y C están codificadas por un solo gen cuyo ARN sufre diferentes modos de procesamiento (splicing alternativo), originando las cuatro laminas. Los tres tipos de laminas B, a su vez, son codificadas por dos genes, siendo que uno de ellos, también por procesamiento diferencial, origina las laminas B1 y B2. Todas las células de vertebrados expresan al menos una lamina del tipo B, mientras que las laminas de tipo A y C se expresan en células diferenciadas. Se sugiere que las laminas presentan funciones celulares y tisulares específicas. Cada molécula de lamina es un dímero de subunidades proteicas que se asocian a través de las porciones en -hélice de cada cadena polipeptídica y tiene dos porciones no helicoidales en los extremos de cada cadena. Los extremos no helicoidales, carboxilo y amino terminal, varían entre los diferentes tipos de laminas y establecen asociaciones cabeza-cola que forman los protofilamentos. Los protofilamentos, a su vez, se asocian lateralmente, formando filamentos muy similares a los filamentos intermedios del citoesqueleto, por lo que se clasifican como tales. Las laminas están asociadas con la envoltura nuclear a través de las proteínas intrínsecas de la membrana nuclear interna tales como las LAP 1 y 2, la emerina y la LBR (Figura 8.4). Ellas también se asocian a los complejos de poro nuclear probablemente a través de las nucleoporinas. Durante la mitosis, la fosforilación temporal de las laminas causa la desorganización de la lámina nuclear. Al final de la mitosis, las laminas se desfosforilan y se asocian nuevamente para rehacer la lamina, lo que lleva a la reconstitución de la envoltura nuclear. Además de mantener la forma y garantizar el apoyo estructural a la envoltura nuclear, la lámina nuclear también es responsable de la unión de las fibras de cromatina a la envoltura. La observación de que las alteraciones en la lámina afectan varias funciones nucleares ha llevado a la propuesta de funciones adicionales para la lámina nuclear, tales como la participación en los procesos de replicación y transcripción del ADN, en la expresión génica, en el mantenimiento del citoesqueleto y en la supervivencia celular.

Las mutaciones en los genes que codifican proteínas presentes o asociadas con la envoltura nuclear causan una serie de enfermedades genéticas denominadas enfermedades de la envoltura nuclear (EEN). Entre las EEN, podemos citar las laminopatías, que son causadas por mutaciones en el gen que codifica a la lamina A. Muchos de estos síndromes se describen en la literatura. La distrofia muscular deEmery-Dreifuss (EDMD), causada por una mutación en el gen que codifica la proteína intrínseca emerina, es una miopatía degenerativa caracterizada por contracturas de los músculos de los tobillos, codos y cuello. Con el progreso de la enfermedad, la conducción cardiaca se altera, pudiendo llevar al paciente a la muerte. Otro tipo de mutación que se produce en el gen que codifica a la lamina A ocasiona una distrofia muscular menos grave que la EDMD, pero que también causan anormalidades cardiacas. El diagnóstico precoz de los efectos cardíacos de la enfermedad puede salvar la vida de sus portadores. EL MATERIAL GENÉTICO ESTÁ EN LA FORMA DE CROMATINA El término cromatina (del griego khromos o khroma, color) designa, a excepción de los nucleolos, toda la porciòn del núcleo que se colorea y es visible al el microscopio óptico. En las células eucariotas, el ADN se compleja con proteínas específicas constituyendo la cromatina. Su organización es dinámica, ya que cambia de acuerdo con la fase del ciclo celular y con su grado de actividad. En el núcleo en interfase, la cromatina se presenta compacta (condensada) y /o sin condensar (laxa) (Figura 8.9). En el núcleo en división (mitosis o meiosis), la cromatina está muy compactada, constituyendo los cromosomas. Por lo tanto, la cromatina y los cromosomas representan dos aspectos morfológicos y fisiológicos de la misma estructura. La disposición de la cromatina dentro del núcleo, y su grado de condensación varían de un tipo celular a otro y son características de cada tipo celular. Además, la misma célula puede presentar cromatina con diferentes grados de condensación, de acuerdo con la etapa funcional y el estado de diferenciación en que se encuentra. En general, las células nerviosas y los espermatocitos (células precursoras de los espermatozoides), en una cierta fase, presentan cromatina poco condensada (Figura 8.10). Las células plasmáticas (células productoras de anticuerpos) tienen núcleos con grumos de cromatina densa. Los eritroblastos (eritro, rojo, y blasto, germen), las células que se convierten en los glóbulos rojos de la sangre, sufren una condensación gradual de la cromatina durante su maduración (Figura 8.9), y este proceso termina, en los mamíferos, con la expulsión del núcleo. Como se estudiará más adelante, el estado de condensación de la cromatina tiene un significado funcional importante. LA CROMATINA ESTÁ FORMADA POR ADN COMPLEJADO CON PROTEÍNAS Las proteínas que se asocian con el ADN para formar la cromatina se clasifican en histónicas y no histónicas. Por otra parte, cada vez que se aísla la cromatina, se encuentra una pequeña cantidad de ARN asociado a ella. El ADN, de acuerdo con el modelo de Watson y Crick, se compone de dos hebras de polinucleótidos complementarias y antiparalelas, que están asociadas por enlaces puente de hidrógeno, formando una doble hélice con un diámetro de 2 nm (Capítulo 3). La cantidad de ADN por núcleo varía de una especie a otra y es característico de cada especie. Esta cantidad, expresada en pares de bases (pb), se llama valor C. Las células somáticas, diploides, tienen un contenido 2C de ADN, mientras que los gametos, que tienen un contenido de ADN reducido a la mitad, presentan una cantidad C

de ADN. En los núcleos de las células eucariotas, el valor de C oscila entre 107 a 1011 pb. En los seres vivos, el análisis del contenido de ADN muestra, en general, un incremento a medida que se avanza en la escala evolutiva (Figura 8.11). Entre los vertebrados existen excepciones entre el nivel evolutivo y el contenido de ADN, y el caso más evidente es el de ciertos urodelos con un contenido de aproximadamente 30 veces superior al humano. En los peces pulmonados, también se encuentran altas tasas de ADN y, en ambos casos, la importancia biológica de este fenómeno es desconocida. Esta discrepancia en la cantidad de ADN entre los organismos fue llamada la paradoja del valor C, lo cual es una consecuencia directa de la comprobación que la cantidad de ADN en las células de los vertebrados está por encima del nivel mínimo necesario para almacenar la información genética de la especie. Esto ha conducido a la proposición de que la mayor parte del genoma de una célula eucariota no es funcional o tiene otras funciones distintas de la codificación de las proteínas. Algunos aspectos relacionados con este aparente exceso de ADN se discutirán más adelante en este capítulo. El ARN asociado con la cromatina representa el 3 % de su composición y consiste esencialmente en cadenas de ARN naciente que todavía estaban unidas a la cadena molde de ADN en el momento en que se aisló la cromatina. Las fibras de cromatina presentan ADN asociado con proteínas básicas, las histonas. Las histonas son proteínas bastante estables, no siendo constantemente renovadas, como la mayoría de las proteínas celulares. La cantidad en masa de la histona, es aproximadamente, igual a la del ADN total de núcleo, en una proporción de 1: 1. Estas proteínas tienen bajo peso molecular y tienen un fuerte carácter básico porque son ricas en aminoácidos básicos (con carga positiva), arginina y lisina. Se unen al ADN a través de la interacción de sus radicales amino con los radicales fosfato del ADN. No todos los radicales fosfato están neutralizados por las histonas, lo que confiere un carácter ácido a la cromatina, es decir, una gran capacidad para ser teñida con colorantes básicos, propiedad llamada basofilia. Como las bases nitrogenadas no se unen a las histonas, las interacciones ADN-histona son independientes de la secuencia de nucleótidos de ADN. Hay cinco tipos principales de histonas, que se clasifican en función de su contenido de lisina y/o arginina: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Las histonas H2A, H2B, H3 y H4 son moléculas pequeñas, con 102 a 135 aminoácidos. Estos cuatro tipos de histonas comparten una estructura molecular común, con las cadenas polipeptìdicas compuestas por tres de secuencias dispuestas en -hélice y conectadas por dos secuencias filamentosas, que están dispuestas como asas (Figura 8.12). Ellas presentan un largo segmento Nterminal compuesto principalmente por aminoácidos básicos. Los aminoácidos de las histonas pueden ser acetilados, metilados o fosforilados, procesos que conducen a una modificación de la carga electrostática de la histona, cambiando su interacción con el ADN e influyendo en la configuración de la fibra de cromatina. Se observó, por ejemplo, una correlación entre la fosforilación de las histonas y las diferentes fases de la mitosis. La secuencia de aminoácidos de estas histonas se ha conservado de manera excepcional durante la evolución. Las histonas H3 y H4 tienen secuencias idénticas en organismos tan diversos como el guisante y el buey, lo que sugiere que desempeñan funciones idénticas en todas las eucariotas. Los tipos H2A y H2B también tienen secuencias idénticas, con algunas variaciones propias de cada especie. Estudios recientes apuntan a la existencia de histonas con estructuras variables, codificadas por diferentes genes de los que codifican las principales histonas. Algunas de estas histonas exhiben gran homología con las histonas principales, como es el caso de las H3.3, y H2A.X H2A.Z. La asociación de las variantes de las histonas con el ADN sería responsable de los cambios en la estructura de la cromatina. Las historias del grupo H1 contiene alrededor de 220 aminoácidos (PM 23.000 daltons) y presentan tres regiones distintas: una región globular, debido al plegamiento de la cadena polipeptídica situada entre dos segmentos filamentosos, N- y C-terminales (Figura 8.12). Ellas tienen el grado más bajo de conservación durante la evolución, con variaciones entre las diferentes especies, e incluso entre los diferentes tejidos de la misma especie. La histona H1 estàn caracterizadas como histonas de unión, ya que, como se estudiará más adelante, estas participan en la función de compactación de las fibras de la cromatina. En los eritrocitos nucleados de aves, la histona H5 se encuentra para reemplazar laH1 y realiza la misma función. En los espermatozoides de algunos peces como el salmón, el tiburón y la trucha, otro tipo de proteína básica se asocia con la cromatina: son las protaminas. En estos espermatozoides, las protaminas reemplazan a las histonas. Además de las proteínas básicas, la cromatina contiene proteínas no histónicas, entre las cuales muchas son ácidas. Las proteínas no histónicas del núcleo pueden estar unidas al ADN o dispersas en el nucleoplasma. Estas constituyen un grupo muy heterogéneo, en el cual están incluidas todas las proteínas nucleares, excepto las histonas. Las células metabólicamente más activas, tales como las neuronas y las células glandulares, presentan un alto contenido de proteínas no histónicas. De acuerdo con sus actividades funcionales, es posible distinguir los siguientes grupos: ■ Proteínas que participan en la estructura de los cromosomas. Más de 30 proteínas ácidas que tienen esta función y colaboran en la organización y la compactación del ADN en los cromosomas. Entre ellas, las más relevantes son la topoisomerasa II y la condensina (discutida más adelante en este capítulo) ■ Las proteínas relacionadas con los procesos de replicación y reparación del ADN, tales como las ADN polimerasas, helicasas, topoisomerasas etc. ■ Proteínas que participan en el proceso de represión y activación génica. Entre las proteínas activadoras, están aquellas pertenecientes al grupo HMG (del inglés, high mobility group). Estas proteínas se unen a las fibras de cromatina, lo que reduce su compactación y activando así su actividad transcripcional.

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Figura 8.9 Micrografía electrónica de un corte de médula ósea. Las cuatro células que aparecen con sus núcleos son eritroblastos, precur sores de los eritrocitos. La cromatina, en estos núcleos, muestra diferentes grados de condensación, y los eritroblastos más maduros presentan los núcleos más.condensado 11.000x.

Figura 8.10 micrografía electrónica de célula de testículo. La cromatina laxa sin comprimir está uniformemente dispersa en el núcleo. Las dos membranas que componen la envoltura nuclear son claramente visibles. El nucléolo muestra una estructura doblada en ovillo. 10.000x.

Figura 8.11 contenido de ADN encontrado en el árbol filogenético. (Datos de Hood, LE. et al. Molecular Biology of Eucariotic Cells. Benjamin Publ., 1975.)

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Figura 8.12 Estructura general de las histonas H2A, H3 y H1. Las histonas H2A y H3 estàn constituidas por tres secuencias en -hélice, conectadas por dos secuencias filamentosas. Presentan un largo segmento N-terminal compuesto principalmente por aminoácidos básicos. La Histona H1 presenta una región globular, situada entre dos segmentos filamentosos, Ny C-terminal. Las regiones no helicoidales de las histonas del centro del nucleosoma se doblan, favoreciendo la formación de los dímeros, que se asocian por las regiones helicoidales. En este esquema se muestra solamente un dímero H2A y H2B.

ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA CROMATINA La unidad estructural básica de la cromatina se llama nucleosoma. El nucleosoma es una partícula con forma cilíndrica aplanada, con 10 nm de diámetro y 6 nm de altura (Fig 8.13). Cada nucleosoma se compone de 200 pares de bases (pb) de ADN asociados a un octámero de histonas. El octámero está formado por dos moléculas de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4. Las histonas H3 y H4 forman un tetrámero central, mientras que H2A y H2B forma dos dímeros que se asocian periféricamente, en cada lado del tetrámero. Cuando los preparados totales de núcleos sometidos a la digestión por proteasas son observados al microscopio electrónico, las fibras de cromatina asumen la apariencia de un collar de cuentas, las cuales mantienen una cierta distancia entre sí. Análisis bioquímicos de ese collar de cuentas revelaron que cada cuenta está constituida por el octámero de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, alrededor del cual se enrolla un segmento de ADN de aproximadamente 146 pb. Esta estructura fue nombrada centro del nucleosoma. Conectando un centro de nucleosoma a otro, se encuentra un segmento de ADN no asociado a histonas con 15 a 80 pb, llamado ADN de unión. Por consiguiente, el nucleosoma consiste en el centro del nucleosoma más uno o dos segmentos del ADN de unión, totalizando 200 pb de ADN. El collar de cuentas es el primer nivel de compactación de la cromatina y cuenta con 10 nm de diámetro, por lo que también se lo conoce como la fibra de 10 nm (Figura 8.14). El segundo nivel de compactación de la cromatina está representado por la fibra de 30 nm que se forma cuando la histona H1 se asocia al ADN de unión que llega al centro del nucleosoma y lo deja. Imágenes obtenidas con el microscopio electrónico muestran que la asociación de la H1 a los dos segmentos del ADN de unión provoca un entrelazamiento entre esos segmentos, lo que provoca que la fibra adquiera una conformación en zigzag (Figura 8.14). En la histona Hl, también contribuyen a la compactación y estabilización de la fibra la asociación entre las colas filamentosas de

las histonas que sobresalen del octámero, así como la presencia de agua y de cationes divalentes (tales como iones Mg ++, Mn ++) en una concentración adecuada. Durante la interfase, la cromatina que contiene los genes codificadores está formada, principalmente, por fibras de 30 nm, mientras que alrededor del 10% de la misma está en la forma de fibras de 10 nm, permitiendo el acceso a las enzimas implicadas en la transcripción. La adición de radicales acetilo a las histonas del octámero desenrolla la fibra de 30 nm y conduce a la formación de la fibra de 10 nm, favoreciendo la transcripción y tornando activa a la cromatina. Hasta la fecha, poco se sabe acerca de la organización de la cromatina en los niveles más compactados. Los niveles más altos de compactación parecen implicar, principalmente, a las proteínas no histónicas. Las histonas H1 y H3 parecen, sin embargo, que también participan en el proceso de compactación, una vez que la fosforilación de ambas, durante la profase, determina la condensación de los cromosomas. También en el núcleo en interfase, las fibras de 30 nm se pueden organizarse en grandes bucles, que contienen 50.000 a 200.000 pares de bases, que se unen a la envoltura nuclear a través de la lámina nuclear. Las fibras de cromatina dispuestas en bucles parecen que unen a las laminas y a la matriz nuclear por medio de segmentos específicos de ADN. Estos segmentos representan las regiones de unión a la matriz o MAR (del inglés matrix attachment regions). Los segmentos MAR presentan secuencias no conservadas, siendo, por lo general, ricas en AT. Se sugiere que estas secuencias son necesarias para que ocurra la transcripción y la replicación del ADN, habiendo sido identificado, inclusive, un sitio de unión para la topoisomerasa II. También el 10% de la cromatina interfásica está en un estado altamente condensado, llamado heterocromatina (discutido más adelante en este capítulo).

Figura 8.13 Esquema del nucleosoma. El ADN de doble hélice se enrolla alrededor del octámero de histonas H2A, H2B, H3 y H4 que forman el centro del nucleosoma. Las histonas H3 y H4 forman un tetrámero, del cual de cada lado se asocian los dímeros de H2A y H2B. Al centro del nucleosoma se le suma el ADN de unión, totalizando 200 pares de bases y formando el nucleosoma.

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Figura 8.14 Esquema de las fibras de cromatina. La porción central del nucleosoma está formada por el octámero de histonas. La asociación entre los nucleosomas adyacentes, por intermedio del ADN de unión, forma la fibra de 10 nm. Cuando la histona H1 se une a la fibra de 10 nm, se origina la fibra de 30 nm, mostrando una conformación en zigzag. La fibra de 30 nm se mantiene principalmente por las interacciones entre las colas filamentosas de las moléculas de H1.

LA CROMATINA Y LA EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA En términos moleculares, un gen puede ser definido como una secuencia de nucleótidos de ADN que se expresa en un producto funcional, es decir, en una molécula de ARN o en una cadena polipeptídica. El genoma de las células eucariotas, sin embargo, tiene un gran número de secuencias de ADN que no se traducen en productos funcionales, que no son codificadoras. Muchas de estas secuencias no codificadoras están situadas entre los genes, separando un gen de su "vecino". Otras, sin embargo, están presentes en los propios genes. Estos genes presentan segmentos codificadores llamados exones, separados por segmentos no codificantes, o intrones (Figura 8.15). Todo el gen se transcribe en una larga molécula de ARN, que es procesada, reducida de tamaño y convertida en la molécula de ARN funcional. El procesamiento de las moléculas de ARN se produce en el núcleo y consiste en el empalme o splicing de ARN, lo que implica la eliminación y la digestión de los intrones y la posterior unión de los exones (Figura 8.15). Por lo tanto, sólo los exones se conservan en el ARN maduro. El empalme o splicing es muy complejo y preciso, porque la molécula de ARN debe ser escindida en las localizaciones exactas, y los exones también deben ser unidos de manera exacta. El proceso de escisión o clivaje de los ARN y la posterior unión de las partes que formarán la molécula madura involucran moléculas de ARN, en lugar de enzimas. Como se mencionó en el capítulo 3, el ARN puede tener actividad catalítica. Estas moléculas de ARN tienen pesos moleculares bajos y por lo tanto son llamadas snARN (del inglés small nuclear ARN). En el splicing del ARNm participan cinco moléculas de snARN diferentes, a saber, U1, U2, U4, U5 y U6. Los snARN se complejan con proteínas, constituyendo snRNP (small nuclear ribonucleoproteins), que, a su vez, se asocian con otras enzimas y forman el espliceosoma. En los organismos eucariotas, la gran mayoría de los genes contienen intrones. Las excepciones son los genes que codifican las histonas y los interferones en aves y mamíferos. No se sabe si la presencia de intrones es necesaria para la actividad de los genes.

El primer paso en la expresión de un gen es su transcripción (Fig 8.16) en una molécula de ARN. La principal enzima responsable de la transcripción es la ARN polimerasa que cataliza la polimerización de los ribonucleótidos trifosfatados (ATP, CTP, GTP y UTP) en presencia de los iones Mg 2+ y Mn2+. Sólo una de las hebras de ADN se utiliza como molde; de esta manera, la molécula de ARN transcrita es complementaria a la cadena de ADN que le dio origen e idéntica a la otra cadena de ADN, siendo los nudeótidos de timina sustituidos por uracilo. Para un gen dado, siempre la misma cadena de ADN es copiada, y el crecimiento de la cadena de ARN siempre se produce en el sentido 5 ' 3'. En las células eucarióticas, hay tres tipos de ARN polimerasa, cada una de ellas responsable de la transcripción de un tipo ARN. La ARN polimerasa I transcribe los ARNr nucleares, es decir, los ARNr 28S, 5,8S y 18S; la ARN polimerasa II sintetiza los ARNm y algunos snARN; la ARN polimerasa III transcribe los ARNt, la molécula de ARNr 5S y algunos snARN. La ARN polimerasa no depende de un primer (cebador) para iniciar la síntesis. La secuencia de ADN en la cual la ARN polimerasa se une para iniciar la transcripción de un gen contiene aproximadamente 40 pb y se llama promotor. Después de la unión al promotor, la ARN polimerasa abre una región de la hélice para exponer la secuencia de nucleótidos que se transcribirá. Una de las dos hebras de ADN que están expuestas sirve como molde para el apareamiento complementario de los trifosfatos de ribonucleótidos, que son ligados uno a uno por la ARN polimerasa. La molécula de ARN polimerasa se mueve a lo largo de la molécula de ADN, desenrollando la doble hélice del ADN y exponiendo otra secuencia de nucleótidos para servir como molde. Por lo tanto, la molécula de ARN es alargada por 3'. El proceso de la adición de un nucleótido a la vez en la dirección 5' alargamiento de la cadena continúa hasta que la enzima encuentra una secuencia especial de nucleótidos en el ADN molde, la señal de término, cuando entonces la polimerasa interrumpe la síntesis. Una vez terminada la transcripción, la polimerasa libera el ADN molde, la doble hélice se reconstruye y la molécula de ARN recientemente sintetizada se libera en el nucleoplasma, en el cual será procesada.

Figura 8.15 Esquema de splicing que se produce en el núcleo. A. El ARN es sintetizado sobre un molde de ADN, que contiene segmentos codificadores o exones y segmentos no codificantes o intrones. B. Los intrones se eliminan de la molécula de ARN, inicialmente formada, a través de un proceso complejo que involucra a los snARN. A continuación, el ARN mensajero terminado, constituido exclusivamente por exones, migra hacia el citoplasma, en el que se traducirá en la cadena polipeptídica.

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Figura 8.16 Micrografía electrónica que muestra el complejo formado por la ARN polimerasa con el ADN durante la síntesis de ARN (transcripción). El ADN aparece como un filamento en el que se fijan las unidades de la polimerasa, que aparecen como gránulos densos. 40.000x. (Cortesía de R. Portmann, J.M. Sogo, K. Kollerg y W. Sillig F.E.B.S. letters, 45:64.1964)

LOS GENES PUEDEN ESTAR REPETIDOS El ADN de las células eucariotas puede tener tres diferentes niveles de repetición de sus secuencias de nucleótidos, caracterizando tres categorías de genes: los de copia única, los moderadamente repetitivos y los muy repetitivos. En los genes de copia única, cada secuencia de nucleótidos está presente sólo una vez por genoma haploide. Probablemente, a esta categoría pertenecen la mayoría de los genes estructurales, es decir, aquellos que codifican proteínas. Esta fracción es la más abundante, constituyendo aproximadamente el 58% del genoma de los mamíferos, 54% del genoma de los anfibios y 33% del genoma de las célula vegetales. La segunda categoría, cuantitativamente menor que la primera, presenta secuencias de nucleótidos que se repiten un número moderado de veces. Generalmente hay entre 100 y 10.000 copias de cada uno de estos genes en el genoma. Todos los eucariotas contienen ADN moderadamente repetitivo y su proporción aumenta en la escala evolutiva con el aumento en el tamaño del genoma. Los genes más representativos de esta clase son los genes que codifican el ARN ribosomal y aquellos que codifican a las histonas. En casi todos los eucariotas se encuentran, por genoma haploide, más de 100 copias de genes del ARN ribosómico. Los genes que codifican las histonas también son moderadamente repetitivos: de 30 a 40 copias se producen en el hombre, 100 en Drosophila y de 300 a 1000 en el erizo de mar, por ejemplo. Otro ejemplo de ADN moderadamente repetitivo está representado por los elementos genéticos de transposición o transposones, que son secuencias de ADN que se mueven de un lugar a otro en un cromosoma o incluso hacia un cromosoma diferente. Ellos se han detectado en organismos tan diversos como bacterias, hongos, virus, insectos y plantas superiores. La capacidad de transposición de estas secuencias ha dado lugar a muchas especulaciones sobre su posible implicación en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo y su papel en la evolución de los genomas eucarióticos. La tercera fracción de ADN que constituye la fracción minoritaria, dispone de secuencias de nucleótidos altamente redundantes de más de 10.000 copias de cada gen. Tales secuencias son cortas, están restringidas a regiones específicas del genoma y constituyen el llamado ADN satélite. Estas secuencias fueron llamadas así por presentar densidades de fluctuación diferentes, siendo aisladas del resto del ADN como bandas satélites, por ultracentrifugación en gradientes de densidad. En ratones y en Drosophila, este ADN altamente repetitivo se encuentra en las regiones centroméricas de los cromosomas. El número de copias de un gen también se puede aumentar en diferentes etapas del desarrollo, en respuesta a estímulos específicos, por un proceso de amplificación génica. Mientras que la redundancia es un fenómeno filogenético, la amplificación es esencialmente un fenómeno ontogénico. A través de este mecanismo, una célula puede durante la vida del individuo, producir copias adicionales de un gen y así aumentar rápidamente la producción de un ARN particular. La amplificación no es un fenómeno muy común y puede ocurrir tanto en secuencias únicas de ADN como en loci redundantes. Como ejemplos de amplificación, se pueden citar algunos pufes o bocados de los cromosomas politénicos que han aumentado el contenido de ADN, evidenciable por la reacción de Feulgen. El gen productor de la proteína coriónica del ovario de Drosophila también se amplifica. Como se discutirá más adelante, los genes responsables de la síntesis de ARN ribosomal, aparte de redundantes, son amplificados en muchos organismos. ESTADOS FUNCIONALES DE LA CROMATINA Los primeros estudios al microscopio óptico revelaron, en el núcleo en interfase, dos patrones distintos de coloración de la cromatina: una porción de coloración intensa, que fue llamada heterocromatina, y otra, menos coloreada y más homogénea llamada eucromatina. Originalmente, estos dos tipos de cromatina fueron identificados por sus diferentes estados de compactación. Se sabe ahora que hay al menos dos formas de eucromatina: aproximadamente 10% como cromatina activa, que es menos condensada, mientras que el resto, más condensado, es la eucromatina inactiva. En contraste, en un nivel aún más alto de compactación, se encuentra la heterocromatina, que no se transcribe en ARN, pero siempre permaneciendo inactiva. La misma fibra de cromatina puede presentar regiones eucromáticas continuas con regiones heterocromáticas. Por lo tanto, el material genético se organiza de tal manera que los diferentes estados de compactación se mantienen uno al lado del otro, lo que permite la aparición de alteraciones cíclicas en el nivel de compactación de la cromatina entre la interfase y la división y entre las diferentes fases de la vida de la célula. Es en la forma de cromatina activa que el ADN se expresa en la célula, porque sólo de esta manera puede ser transcrito en diferentes tipos de ARN. El proceso de transcripción se lleva a cabo sólo durante la interfase, siendo interrumpido en la división celular. Con la compactación de la cromatina, en la profase, las enzimas implicadas en la transcripción no

pueden tener acceso a las moléculas de ADN. La transcripción es retomada al final de la telofase, cuando hay descondensación. Hay evidencias de que la actividad transcripcional de la cromatina se ve reforzada por las modificaciones que implican la acetilación y ubiquitinación de las histonas. La adición de radicales acetilo a los segmentos Nterminales de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, presentes en la región central del nucleosoma, disminuye la interacción de estas proteínas con el ADN. Por lo tanto, la fibra de 30 nm se vuelve más inestable, lo que evita una compactación mayor de la cromatina y promueve la transcripción. Los radicales acetilo son añadidos a las histonas durante la fase S de la interfase y se eliminan antes del inicio de la mitosis. La ubiquitinación implica la adición de proteína ubiquitina a las histonas H2A y H2B. La ubiquitina es una proteína no histónica, ácida, lo que reduce el carácter básico de las histonas H2A y H2B, lo que conduce a cambios estructurales de los nucleosomas. Esos cambios hacen que el ADN que rodea al octámero de histonas se convierta en más accesible a la ARN polimerasa. Además, la histona H1 parece estar menos estrechamente relacionada al ADN en la cromatina activa, y los subtipos de esa histona pueden ser específicos de ese tipo de cromatina. La heterocromatina, que está compactada durante toda la interfase y es transcripcionalmente inactiva, también es duplicada más tardíamente en la fase S de la interfase. Las células interfásicas contienen dos tipos de heterocromatina: la heterocromatina constitutiva y la heterocromatina facultativa. La heterocromatina constitutiva se compone de secuencias de genes altamente repetitivas, que nunca se transcriben. Estas secuencias se encuentran en regiones específicas del cromosoma, especialmente en el centrómero, en los telómeros y en los alrededores de las constricciones secundarias. La heterocromatina facultativa es la parte de la heterocromatina que, en un mismo organismo, se presenta condensada en algunas células y descondensada en otras células. Puede contener secuencias de genes en copias únicas o moderadamente repetitivas, con sujeción a la transcripción, pero que son inactivadas. El ejemplo clásico de este tipo de heterocromatina es el cromosoma X de las hembras de los mamíferos. Uno de los dos cromosomas X en la hembra se inactiva incluso durante la vida intrauterina. La inactivación se produce cuando una o las dos moléculas de la histona H2A del octámero son sustituídas por una variante de la H2A llamada macro H2A. Esta sustitución cambia la estructura del octámero, aumentando la estabilidad del core nucleosómico y no permitiendo el acceso de la ARN polimerasa II al ADN, impidiendo su transcripción. Este proceso se produce al azar; en algunas células el cromosoma X condensado es de origen materno, y en otras, de origen paterno. Como resultado, el cuerpo de la mujer es un mosaico que contiene posiblemente en todos los órganos, células con el cromosoma X paterno inactivo y otras con el cromosoma X materno inactivo. El cromosoma X heterocromático se ve en el núcleo como una partícula esférica que se colorea fuertemente, al cual se lo denomina cromatina sexual. Esta cromatina está presente en diferentes formas; Por ejemplo, en los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos, aparece como una protuberancia del núcleo en forma de raqueta, mientras que en las células epiteliales bucales, aparece como una partícula unida a la envoltura nuclear. La presencia o ausencia de cromatina sexual permite el diagnóstico citológico del sexo. EL TAMAÑO DEL NUCLÉOLO VARÍA CON LA ACTIVIDAD CELULAR Los nucleolos son estructuras nucleares esféricas no envueltas por membrana (Figuras 8.1 y 8.10), presentes en todas las células eucariotas nucleadas. Ellos son fácilmente visibles al microscopio óptico debido a su tamaño, que puede variar de 1 a 7 µm de acuerdo con el tipo celular y el estado funcional de la célula. El tamaño de nucleolos está generalmente relacionado con la intensidad de la síntesis proteica que se produce en el citoplasma. Las células que sintetizan activamente proteínas, o secretan proteínas, o que se reproducen con frecuencia, tienen nucleolos más grandes que otros tipos celulares. La forma y la organización estructural de los nucleolos varían ampliamente entre los diferentes tipos celulares y dependen de su actividad funcional. En las células que tienen una alta actividad de producción de ribosomas, los nucleolos son generalmente grandes y complejos. Los nucléolos pequeños, en forma de anillo, se encuentran en las células que producen pocos ribosomas, tales como los linfocitos y los monocitos de la sangre. Aunque hay núcleos con dos o más nucleolos, generalmente el nucleolo es único (Figura 8.10). Los nucleolos son estructuras dinámicas que se fragmentan en la profase de la mitosis y se reorganizan en la telofase. La fragmentación de los nucléolos se produce por la acción de proteínas (que se describe en el Capítulo 9) que fosforilan algunos componentes del complejo que transcribe las moléculas de ARNr, inactivando este complejo e interrumpiendo la

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transcripción. Cuando estos componentes se desfosforilan, la transcripción se reanuda, con la consiguiente reorganización del nucleolo. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ULTRAESTRUCTURA DEL NUCLÉOLO Con la ayuda del ultrasonido, es posible romper los núcleos, liberando así los nucléolos, que luego pueden ser aislados por centrifugación fraccionada. El análisis de estas fracciones muestra que los nucléolos son estructuras densas que contienen aproximadamente un 60% de materia seca, especialmente proteínas y ARN ribosomal. También presentan una pequeña cantidad de ADN correspondiente a la cromatina que contienen los genes que codifican los ARNr, llamado ADN ribosómico (ADNr). Además de las proteínas estructurales, en el nucléolo se encuentran proteínas y ARNr que irán a componer las subunidades ribosómicas, así como las enzimas, proteínas y ARN que participan de la transcripción y de las modificaciones post-transcripcionales de los ARNr. Varias de estas proteínas ya tienen funciones bien establecidas, tales como, entre otras: la ARN polimerasa I, que es responsable de la transcripción del ADNr, las topoisomerasas I y II que participan en la descondensación y la distensión del ADNr; el UBF (del inglés upstream binding factor), un factor implicado en la transcripción del ARNr; la nucleolina, que participa en la transcripción del ADNr y del procesamiento del ARNr y la fibrilarina. Además, están presentes en el nucléolo los ARN de bajo peso molecular, los snoARN (del inglés small nucleolar ARN), que pueden estar complejados con proteínas, constituyendo las snoRNP. Un ejemplo de snoRNP, formado por la complejación de snoU3 con la proteína fibrilarina, es responsable de la escisión inicial del ARNr.

Al microscopio electrónico, tres componentes morfológicamente distintos se ven en el nucléolo: (a) el centro fibrilar, electrónlúcido y, a menudo de forma circular; (b) el componente fibrilar denso, que contiene fibrillas muy finas con 3 a 5 nm de diámetro, que pueden formar una red y (c) el componente granular, que consiste en gránulos que tienen 15 nm de diámetro (Figura 8.17). Estos componentes representan los sitios de transcripción y procesamiento del ARNr y de montaje de las subunidades ribosomales. En la mayoría de los nucléolos, los tres componentes presentan una disposición concéntrica. El centro del nucléolo aparece poco contrastado cuando es observado al microscopio electrónico (Figura 8.17). En esta región se encuentra el centro fibrilar que contiene el ADNr, las moléculas de ARN polimerasa I, las ADN-topoisomerasas I y II, así como los factores de transcripción del ARNr. Los centros fibrilares están envueltos, parcial o totalmente, por el componente fibrilar denso, en el cual son encontradas moléculas de ARNr recién transcritos y las enzimas implicadas en el procesamiento post-transcripcional del ARNr. La porción más externa contiene el componente granular, en el que se produce el procesamiento final del ARNr y está, por lo tanto, constituido por gránulos de ARNr complejados con proteínas (Fig 8.17). Los genes que codifican los ARNr se transcriben y se encuentran en los centros fibrilares o en el límite entre los centros fibrilares y el componente fibrilar denso. El procesamiento del ARNr y su complejación con proteínas comienza en el componente fibrilar denso, continuando en el componente granular, en el cual las subunidades ribosomales están en el proceso de montaje final.

Figura 8.17 Micrografía electrónica del núcleo de una célula de gametofito de Rhynchospora pubera mostrando un nucléolo. Dos centros fibrilares (CF) electrón-lúcidos ubicados en el centro del nucléolo están rodeados por el componente fibrilar denso (CFD). Mientras que el CFD es homogéneo y bastante electrodenso, el componente granular (CG) muestra un aspecto granular, adecuado a su función. 18.500x. (Cortesía de J. A. B. San Martin.)

BIOGÉNESIS DE LOS RIBOSOMAS Los genes que codifican el ARNr se encuentran en porciones de fibra de cromatina que, después de su compactación, constituirán las constricciones secundarias de los cromosomas específicos. Estas regiones fueron denominadas regiones organizadoras del nucléolo o NOR (del inglés nucleolar organizing regions). El número y la ubicación de las NOR varían de una especie a otra. En los seres humanos, por ejemplo, las NOR se encuentran en las constricciones secundarias de 5 pares de cromosomas acrocéntricos (cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22), mientras que en el frijol se encuentra en sólo un par de cromosomas. El número de NOR de una especie no refleja los nucléolos de esa especie, aunque se determina el número máximo por núcleo. En los seres humanos, que contiene 10 NOR por genoma diploide, la mayoría de las células tiene un solo nucléolo. Este fenómeno se puede explicar debido a que durante la biogénesis del nucléolo, que ocurre en la telofase, puede ocurrir ya sea la asociación de las diferentes NOR que transcriben un solo nucléolo, como la fusión de pequeños nucleolos, individualmente formados, en un solo gran nucléolo. En las células eucariotas, los genes que codifican los ARNr están presentes en múltiples copias por genoma. Las células humanas contienen aproximadamente 400 copias del gen para ARNr, dispersados en 5 pares de cromosomas, mientras que las células de Xenopus contienen aproximadamente 600 copias de este gen en un solo par de cromosomas. Las múltiples copias del gen están dispuestas en tándem, es decir, repetidas en secuencia, estando cada gen separado del siguiente por un segmento de ADN no transcrito o NTS (del inglés no transcribed spacer), que se constituye en un espaciador intergénico. Por lo tanto, el ADNr muestra secuencias transcritas alternadas con secuencias no transcritas. Cada secuencia transcrita contiene de 8000 a 13000 pb, mientras que, en las secuencias no transcritas, ese número varía mucho entre las especies. SÍNTESIS Y PROCESAMIENTO DEL ARNr Los genes que codifican el ARNr son transcritos por la ARN polimerasa I, y cada gen produce la misma transcripción primaria. En las células eucarióticas superiores, esa transcripción primaria es una molécula de ARNr de aproximadamente 13.000 nucleótidos y con un coeficiente de sedimentación de 45S, llamado pre-ARNr (Figura 8.18). El pre-ARNr contiene, en los extremos 5 ' y 3', dos espaciadores transcritos externos, ETS (acrónimo del término originario del inglés), y dos espaciadores transcritos internos, ITS1 e ITS2. Antes de abandonar el núcleo en forma de subunidades ribosoma-

les, el pre-ARNr es escindido para eliminar estos espaciadores y producir una copia de cada una de las moléculas finales de ARNr: el ARNr 28S (con 5000 nucleótidos), el ARNr 18S (con 2000 nucleótidos) y el 5.8S ARNr (con 160 nucleótidos). Las secuencias de nucleótidos que se eliminan de cada molécula de ARNr se degradan en el núcleo. A medida que la ARN polimerasa I transcribe el ADNr (ADN que codifica ARNr), se añaden proteínas a las moléculas de los pre-ARNr nacientes, formando partículas de pre-ribonucleoproteínas (pre-rRNP). La molécula de ARNr 45S presente en cada partícula de pre-rRNP es entonces clivada, por las snoRNP, en secuencias específicas para formar las moléculas de ARNr maduras (Figuras 8.18 y 8.19). La molécula de ARNr 45S (transcrito primario) se rompe inicialmente en dos, una con 32S y la otra con 20S. La molécula de ARNr 20S ARNr se escinde, dando el ARNr 18S, mientras que la escisión de la molécula ARNr 32S origina las moléculas de ARNr 28S y 5.8S. Este patrón de procesamiento se observa en las células humanas, mientras que, en otras especies, hay diferencias en el orden de algunos clivajes o escisiones. Aparte de la escisión, durante el procesamiento se producen también metilaciones en las ribosas de los pre-ARNr y la isomerización de un centenar de moléculas de uridina, que se convierten en pseudouridina. En las células humanas, se añaden unos 100 grupos metilo a las moléculas de ARNr durante su transcripción y un menor número de grupos metilo se añaden después de la transcripción. Todos estos radicales metilos se conservan durante el procesamiento, de modo que puedan ser detectados en las moléculas maduras de los ARNr. La metilación probablemente protege al ARNr de las escisiones, de modo que el ARNr en proceso sólo se escinde en los puntos no metilados. Estas modificaciones del pre-ARNr tienen también, probablemente, un papel en el montaje de los ribosomas. Los genes que codifican el ARNr 5S (con 120 nucleótidos) no están presentes en el ADNr, es decir, estos genes se encuentran en otra región del ADN, que no sea la NOR. Por lo tanto, este ARNr se transcribe fuera del nucléolo y por separado de las otras moléculas del ARNr. Estos genes están presentes en múltiples copias por genoma, y las células humanas contienen alrededor de 2000 copias de este gen también dispuestas en tándem. Los genes que codifican el ARNr 5S son transcritos por la ARN polimerasa III. El ARNr 5S no se procesa igual que los otros ARNr. Este ARNr después de transcribirse, migra hacia el nucléolo, donde forma un complejo con los ARNr 28S y 5.8S y proteínas para formar la subunidad mayor del ribosoma (Figura 8.19).

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Figura 8.19 Representación esquemática de los componentes del nucléolo y del montaje de las subunidades ribosomales. La transcripción del ADNr por la ARN polimerasa I se produce en los centros fibrilares (CF) o en el límite entre los CF y el componente fibrilar denso (CFD). El ADNr presenta secuencias codificadoras que son transcritas, intercaladas con secuencias espaciadoras, no transcritas. Las moléculas de ARNr 45S transcritas son escindidas y procesadas por las snoRNP en el CFD. Este procesamiento también implica la adición de proteínas y conduce a la formación de las fibrillas de RNP presentes en el CFD. En el componente granular (CG) se añaden a estas moléculas más proteínas y adquieren la forma de gránulos, es decir, forman las subunidades ribosomales. El ARNr 5S, transcrito a partir de un gen situado fuera del nucléolo, es importado por el nucléolo, en el cual se compleja con las moléculas de ARNr 18S y 5.8S. Estas moléculas, añadidas con más proteínas, forman las subunidades mayores del ribosoma, con un coeficiente de sedimentación de 60S. Las moléculas de ARNr 18S son adicionadas con más proteínas, formando las subunidades menores del ribosoma, con 40S. Estas subunidades, exportadas a través de de los complejos de poro nuclear de la envoltura nuclear, alcanzan el citoplasma, donde se unirán a las moléculas de ARNm para llevar a cabo la síntesis de proteínas.

RESUMEN La información genética de las células se codifica y se almacena, en su mayor parte, en el ADN del núcleo. Durante su vida, la célula pasa a través de dos etapas, siendo una con una división en dos células hijas - mitosis - y otra que se intercala entre dos divisiones sucesivas - la interfase. El núcleo, en la interfase, se puede presentar en diversas formas, pero en todas las células eucariotas, se separa del citoplasma por la envoltura nuclear, que consta de dos unidades de membrana. Esta envoltura contiene poros que regulan el intercambio de sustancias entre el núcleo y el citoplasma. Asociado con la membrana interna de la envoltura nuclear existe una red fibrilar de proteínas: la lámina nuclear. La cromatina está asociada a esa red de proteínas. La cromatina abarca todo el ADN nuclear que forma un complejo estable con proteínas básicas: las histonas. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que consta de 200 pares de bases de ADN asociado con un octámero de histonas. Dos tipos de fibras de cromatina se encuentran en el núcleo interfásico: la fibra de 10 nm, que está formada por una asociación lineal de nucleosomas, y la fibra de 30 nm, formada por la asociación de la histona H1 a la fibra de 10 nm. Mediante este proceso, la enorme cantidad de ADN existente en el núcleo de las células eucariotas es compactada, pudiendo asi alojarse dentro del pequeño volumen nuclear. La cromatina activa constituye la eucromatina, que puede estar condensada o descondensada y la cromatina inactiva, que está siempre condensada y es llamada heterocromatina. Se describen dos tipos de heterocromatina. La heterocromatina constitutiva se compone de secuencias de ADN altamente repetitivas y está siempre condensada en todas las células de un mismo organismo. La heterocromatina facultativa

no contiene ADN repetitivo, y en una especie e incluso en el mismo individuo, puede estar condensada en ciertas células y descondensada en otras. Este es el caso del cromosoma X de las células de las hembras de los mamíferos. La cantidad de ADN por núcleo, en las células de los seres vivos, muestra un aumento considerable cuando se progresa en la escala evolutiva: cuanto más evolucionado es el organismo, cuanto mayor será el contenido de ADN de sus células. Sin embargo, hay numerosas excepciones a esta regla, en parte se explica por la existencia de varias clases de ADN. Las células eucariotas presentan tres fracciones principales de ADN cuando se considera el grado de repetición de las secuencias de nucleótidos: el ADN de secuencia única, el ADN que contiene la repetición de ciertas consecuencias en un número moderado y el ADN compuesto por fracciones repetidas en un grado muy alto. Aparte de esta repetición de secuencias, el número de copias de algunas secuencias específicas puede, durante la vida del organismo, ser incrementada, con independencia de las demás secuencias, por un proceso llamado amplificación. La región organizadora del nucléolo, es decir, la porción de ADN que contiene los genes que codifican los ARN ribosomales, también pueden sufrir amplificación en algunas especies. Los nucleolos son orgánulos esféricos intranucleares no rodeados por membrana. Están compuestos por numerosas proteínas, por la porción de ADN que contiene los genes que codifican los ARN ribosomales y por los ARN ribosomales. Los nucléolos participan en la transcripción de los ARN ribosomales y del montaje de las subunidades ribosomales, aparte de la complejación de otras moléculas de ARN con proteínas, tales como el montaje de la telomerasa y de las partículas reconocedoras de la señal

CROMOSOMA METAFÁSICO: EL ESTADO MÁS CONDENSADO DE LA CROMATINA Los cromosomas son el resultado de la condensación de la cromatina que se produce durante la división mitótica o durante la meiosis. El grado de condensación es máximo en la metafase, por lo que en los estudios de la estructura cromosómica, se utilizan los cromosomas en metafase (metafásicos). ESTRUCTURA DE LOS CROMOSOMAS METAFÁSICOS El proceso de replicación del ADN es condición determinante para que la célula entre en división. Por consiguiente, el cromosoma metafásico se compone de dos moléculas de ADN, cada una presente en una de las dos cromátidas que constituyen el cromosoma. Cada cromátida es el resultado de la compactación de la fibra de cromatina de 30 nm, la cual, de acuerdo al organismo, presenta un diámetro entre 0,25 y 2 µm y una longitud de 0,25 a 30 µm (Figura 8.20). La estructura de los cromosomas metafásicos se demostró en experimentos en los que estos cromosomas fueron tratados con sustancias polianiónicas, tales como heparina o sulfato de dextrano. Estos polianiones remueven las histonas unidas al ADN. La estructura resultante conserva la morfología original del cromosoma en un esqueleto central, conocido como esqueleto metafásico. Un halo formado por muchas asas de ADN no asociados con histonas, las cuales se unen en puntos adyacentes del esqueleto que rodea al esqueleto metafásico. Por electroforesis, se determinó que el esqueleto central está constituido por más de 30 proteínas ácidas diferentes. Este experimento sugiere que el cromosoma metafásico

está formado por un esqueleto central de proteínas no histónicas, al cual la fibra de cromatina de 30 nm se asocia como asas. Las secuencias deADN que se asocian al esqueleto fueron llamadas SAR (del inglés scaffold attachment regions) o regiones de anclaje al esqueleto, y corresponden a las MAR descritas para la cromatina interfásica. Aunque la matriz nuclear y el esqueleto metafásico están constituidos por diferentes proteínas, estas tienen algunos componentes comunes, como es el caso de la topoisomerasa II. Se ha aislado y caracterizado bioquímicamente una familia de proteínas implicada en la organización estructural de los cromosomas llamadas SMC (del inglés structural maintenance chromosomes). Pertenecen a esta familia dos grandes complejos de proteínas: el complejo condensina y el complejo cohesina, relacionados, respectivamente, con la condensación del cromosoma y con el mantenimiento de la unión entre las cromátidas hermanas de un cromosoma (Figura 8.21). Las proteínas de los dos complejos exhiben las mismas características estructurales. Estas son moléculas largas que se asocian en dímeros a través de sus porciones helicoidales y exhiben dominios globulares en ambos extremos. En la región central helicoidal de las moléculas se produce un plegamiento, mientras que los extremos globulares que tienen actividad ATPásica, se unen al ADN (Fig 8.21). Con la participación de las proteínas del complejo cohesina, las dos cromátidas de un cromosoma se unen por medio de una región de constricción, denominada constricción primaria o centrómero. En esta región, la cromatina está bastante condensada y las secuencias de ADN son muy

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repetitivas (ADN satélite). En general, cada cromosoma contiene solo un centrómero y la posición de este permite la clasificación morfológica de los cromosomas (Figura 8.22). Los cromosomas metacéntricos presentan un centrómero central, dividiendo al cromosoma en dos brazos con igual tamaño. Los cromosomas con brazos de tamaños desiguales son llamados submetacéntricos. Los cromosomas acrocéntricos presentan un centrómero subterminal, desplazado hacia uno de los extremos. Los cromosomas telocéntricos presentan un centrómero terminal. Cada cromátida presenta una estructura proteica asociada lateralmente al centrómero: el cinetocoro. En la mayoría de los organismos, esta estructura tiene la forma de un disco con un diámetro de 0,3 µm y 0,1 µm de espesor. En cortes ultrafinos, el cinetocoro aparece formado por tres discos apilados. El disco más interno contacta con el centrómero, mientras que los más externos se unen a los microtúbulos que forman el huso de división. Los cinetocoros impulsan la migración de los cromosomas durante la división celular (capítulo 9). Además de la constricción primaria o centrómero, ciertos cromosomas presentan estrechamientos que siempre aparecen en el mismo lugar, las llamadas constricciones secundarias, ampliamente utilizadas en la caracterización de los cromosomas. La región organizadora del nucléolo está presente en la constricción secundaria de algunos cromosomas; Así, puede verse que, a menudo, los nucléolos se encuentran asociados a las constricciones secundarias de estos cromosomas (Fig 8.23). En los extremos del cromosoma metafásico se encuentran secuencias de ADN especiales, que constituyen los telómeros (del griego telos, final). Los telómeros evitan la adhesión de los cromosomas entre sí, manteniendo así su estabilidad. Dichas secuencias fueron bastante bien conservadas

durante la evolución: son similares en organismos tan diversos como protozoos, hongos, plantas y mamíferos. Se componen de cortas secuencias repetidas que se organizan en tándem y que contienen un bloque de nucleótidos de guanina. En las células humanas, esta secuencia es TTAGGG. Las secuencias teloméricas son replicadas por una enzima específica: la telomerasa. Debido a sus características particulares, esta enzima es capaz de mantener constantes el tamaño y las propiedades del telómero. En las células cuya telomerasa está alterada, los telómeros se modifican y se acortan. Estas señales están presentes en células transformadas o en proceso de envejecimiento. Otro tipo de caracterización de los cromosomas se realiza mediante técnicas especiales de tratamiento y tinción, lo que lleva al surgimiento de un patrón definido de segmentos o bandas diferencialmente coloreadas a lo largo del cromosoma (Figura 8.24). Las bandas pueden mostrar diferencias en la distribución de la cromatina, o incluso en la composición química de la cromatina, que ocurren a lo largo del cromosoma. Hay varias técnicas de bandeo, basadas en principios diferentes, pero cuando se utiliza una técnica particular, o patrón, el número y la posición de cada banda son específicos y constantes para cada cromosoma. Esta especificidad permitió identificar con precisión los cromosomas, mejorando significativamente el análisis de cariotipo. En la mayoría de las técnicas de bandeo, inicialmente el ADN es parcialmente metilado y a continuación es coloreado. Las técnicas de bandeo son diversas, tales como, por ejemplo, la de la banda C (el material es desnaturalizado es, renaturalizado y es teñido con Giemsa), la de la banda G (el material se trata con tripsina y es teñido con Giemsa) (Figura 8.24) y la de la banda Q (que utiliza la quinacrina como tinte fluorescente).

Figura 8.20 Dibujos esquemáticos que muestran los diversos grados de compactación de la cromatina. De arriba a abajo, primero aparece la doble hélice del ADN (2 nm); después, la asociación con las histonas para formar las fibras de 10 nm o nucleofilamentos. A esas fibras se asocian las moléculas de his tona H1, 30 nm constituyendo las fibras de 30 nm, que a continuación forman asas de 300 nm. Las asas se enrollan, formando estructuras muy compactadas con 700 nm. Finalmente, en el último dibujo, el cromosoma metafásico, el máximo grado de condensación de la cromatina.

Figura 8.21 En A, se muestra la estructura de un dímero de moléculas de cohesina o de condensina, porque ambas tienen la misma estructura. Estas moléculas presentan una región helicoidal central, por las cuales se asocian, y dos dominios globulares en cada extremo, que son responsables de la asociación con el ADN y el ATP. El dímero se pliega en la región central, estableciendo un "codo". En B, se muestran dímeros de condensina asociados a una fibra de cromatina, que compacta la fibra y ayuda en la formación del cromosoma. En C, están esquematizadas moléculas de cohesinas que se unen, a la altura del centrómero, a ambas cromátidas del cromosoma, manteniendo estas cromátidas unidas.

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Figura 8.22 Figura 8.23 Figura 8.22 Diagrama de los cuatro diferentes tipos de cromosomas, clasificados de acuerdo con la posición del centrómero. Figura 8.23 Microfotografía de una preparación total de cromosomas politénicos del insecto díptero Telmatoscopus sp. En este tipo de crom osoma es bastante evidente la asociación de los nucléolos con las constricciones secundarias, en las cuales están presentes las regiones organizadoras del nucléolo. Nu = nucléolos. Tinción orceína lacto-acética. (Cortesía de J. M. Amabis y L. C. Simões.)

EL COMPLEMENTO CROMOSÓMICO DE UNA ESPECIE ES CONSTANTE Todas las especies de animales y vegetales tienen un complemento cromosómico característico, al que se lo denomina cariotipo. El cariotipo es el conjunto de características constantes de los cromosomas de la especie, en cuanto al número, tamaño y morfología. El estudio morfológico de los cromosomas metafásicos de un individuo se puede realizar en células sometidas a tratamiento con colchicina, un alcaloide que impide la polimerización de los microtúbulos del huso durante la división. Por lo tanto, la división se detiene en la metafase, cuando la compactación de los cromosomas es máxima. En la representación del cariotipo, llamada ideograma, los cromosomas son ordenados en pares (Figura 8.25). En las células somáticas de los eucariotas, los cromosomas vienen en pares, siendo un cromosoma miembro del par de origen paterno, y el otro

de origen materno. Cada cromosoma de un par es homólogo al otro, es decir, tienen el mismo tamaño, la misma morfología y la misma secuencia génica. El número de cromosomas de una especie es constante y mantenido así durante los ciclos de división por los cuales la célula pasa. Sólo durante la meiosis, cuando se forman los gametos, se produce la reducción a la mitad del número de cromosomas de la célula. En consecuencia, los gametos son haploides, es decir, presentan n cromosomas. Las células somáticas son diploides, es decir, 2n contienen cromosomas. El número diploide de cromosomas varía mucho entre las especies, que van desde 2n = 2 en la lombriz intestinal del caballo - Ascaris megalocefala, variedad univalentes -, siendo 2n = 46 en los seres humanos (Tabla 8.1) y llegando a más de 1.000 en ciertos protozoos.

Figura 8.24 Cromosomas humanos metafásicos tratados mediante la técnica de bandas G, obtenidas por tratamiento con tripsina y posterior tinción con Giemsa. Cada cromoso ma tiene un bandeo característico que permite su identificación. 2.000x. (Cortesía de A. Wajntal.)

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Figura 8.25 Cariotipo humano. Arriba, el aspecto de una metafase como es observada en láminas. Abajo, el ideograma, en el cual los cromosomas son o rdenados en pares, de acuerdo con su morfología y tamaño. (Cortesía de G. Giménez-Martin.)

CROMOSOMAS GIGANTES: POLITÉNICOS Y PLUMOSOS En las células de algunos organismos se encuentran cromosomas gigantes, que pueden ser observados tanto al microscopio óptico como al electrónico. Son los cromosomas politénicos, encontrados en células de larvas de insectos dípteros, y los cromosomas plumosos que se encuentran en los ovocitos de anfibios. LOS CROMOSOMAS POLITÉNICOS SON INTERFÁSICOS Varios géneros de dípteros presentan, en su fase larvaria, algunos tejidos que contienen cromosomas politénicos en sus núcleos interfásicos. Se encuentran en diferentes tejidos, como en los túbulos de Malpighi, glándulas salivales (Fig 8.26), tracto digestivo, músculos, entre otros. De estos tejidos, las glándulas salivales son aquellas que presentan cromosomas más desarrollados, y por lo tanto, los más ampliamente estudiados. Estos cromosomas son excepcionalmente grandes y pueden llegar a 150-250 mm de largo. Su contenido de ADN es muy alto y puede exceder un millar de veces el contenido del cromosoma normal del mismo animal. Cada cromosoma se compone de un gran número de filamentos paralelos, de ahí el nombre de politénicos (poli = mucho; tainia = alambre, cinta). En la formación de los cromosomas politénicos, los cromosomas homólogos se emparejan longitudinalmente y luego se replican repetidamente, sin producir, sin embargo, la separación de los filamentos duplicados. Los filamentos cromosómicos presentan regiones de mayor compactación alternadas con regiones menos compactadas a lo largo de su longitud. Las regiones más compactadas constituyen los cromómeros y las menos compactadas son denominadas intercromoméricas. Cuando el par de homólogos se empareja, este emparejamiento se produce cromómero a cromómero, originando, en el cromosoma, un patrón de bandas transversales, oscuras y claras, que se alternan. Cuando ocurre la “politenización”, es decir, las diversas repeticiones de cada cromátida, las bandas oscuras y claras están en secuencia, estableciendo, respectivamente, el patrón de bandas e interbandas (Figura 8.27), característico de los cromosomas politénicos. Se supone que el 95% del ADN está en las bandas y sólo el 5% en las interbandas. El tamaño y la disposición de las bandas son característicos y constantes para cada cromosoma. Además, la disposición de estas bandas en un dado cromosoma es la misma en diferentes tejidos. El uso de técnicas citogenéticas permitió localizar algunas bandas con muchos genes, junto con otras que parecían no contener genes capaces de expresarse. El análisis de los cromosomas politénicos durante el desarrollo de la larva mostró que, periódicamente, algunas bandas sufren “desespiralización” del ADN y son más fácilmente visibles en un microscopio, formando los puffs. Cada puff se compone de numerosas asas de nucleofilamentos o cromátidas, resultantes de la desespiralización del ADN encontrado en una banda.

El estudio radioautográfico mostró que, en los puffs, hay un aumento en la síntesis de ARN, razón por la cual se colorean más intensamente y son más fácilmente visibles (Figura 8.28). La aparición de los puffs tiene un patrón específico en cada tejido, apareciendo cada uno con una cronología propia. Se puede demostrar, además, que ciertos puffs están relacionados con la producción de ciertos tipos de secreción de las glándulas salivales. Por lo tanto, los puffs ricos en ARN constituyen la manifestación morfológica de la actividad de transcripción de sus genes, es decir, corresponden a una intensa producción de ARN mensajeros específicos. Otros puffs, menos frecuentes, presentan una alta síntesis y un alto contenido de ADN, un proceso que precede a una ola de la síntesis de ARN. Estos puffs se consideran actualmente como resultado de un proceso de activa replicación génica localizada, con el probable propósito de amplificar específicamente ciertos genes, lo que permite su expresión más amplia. Por lo tanto, es el equivalente morfológico de un proceso de amplificación génica. Como ya se ha dilucidado, la tasa de formación y desaparición de los puffs es específica de cada tejido. Recientemente, se descubrieron varios factores que pueden cambiar este ritmo, acelerando o retrasando la aparición de los puffs. Los factores que ejercen este efecto son de naturaleza variada, y los estudios realizados in vitro e in vivo muestran que las modificaciones dietéticas simples (tales como la adición de galactosa), de la temperatura (choque térmico) o de la composición salina del medio pueden alterar la tasa de aparición de los puffs. Sin duda, el factor que atrajo la mayor atención hasta ahora es la hormona de la muda de los insectos, llamada ecdisona. Esta hormona es producida en la glándula prototorácica de los dípteros y participa en el control del ciclo de las larvas y la formación de las pupas de estos insectos. La inyección de esta hormona en las larvas jóvenes desencadena la aparición de puffs que suelen aparecer sólo más tarde, en el momento de la pupación, en el que opera la ecdisona producida por la propia larva. Obviamente, este es un ejemplo en el que es posible observar el equivalente morfológico de la activación de genes por una hormona. Se estima que sólo del 10 al 15% del ADN de los cromosomas politénicos se expresan simultáneamente en los puffs, estando lo restante del genoma inactivo. Varios genes transcritos están involucrados en la síntesis de enzimas digestivas, enzimas y proteínas que participan en la fase de pupa y la síntesis de proteínas estructurales. En resumen, los cromosomas politénicos permiten el estudio preciso de la transcripción no sólo desde los puntos de vista qualitativo (cuales de los genes está en actividad) y cuantitativo (cuántos genes están activos), así como también el estudio cinético (en cual época aparecen los puffs, su duración y el momento de la regresión).

Tbla 8.1 Número de cromosomas en las células diploides de algunas especies animales y vegetales Nombres científicos y comunes Nº de cromosomas (2n) Ascar is megalocefala var. univalentes (lombriz de caballo) 2 Culex pipiens (mosquito) 6 Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) 8 Didelphis paraguayensis (zarigüeya) 22 Rattus rattus (ratón) 42 Macaca mulatta (mono) 42 Homo sapiens (hombre) 46 Gorilla gorilla (gorila) 48 60 Caprahircus( cabra) Equus cabal lus (caballo) 66 Columba livia (paloma) 80 Cucumis sativus (pepino) 14 Caricapapaya (papaya) 18 Solanum lycopersicum (tomate) 24 Avenasativa (avena) 42 Solanum tuberosum (patata) 48 Gossypium hirsutum (algodón) 52 Saccharum officinarum (caña de azúcar) 80

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Figura 8.26 Microfotografía de cromosomas politénicos de núcleo interfásico de las glándulas salivales del insecto díptero Rhynchosciara angelae. A pesar de ser un núcleo interfásico, los cromosomas son claramente visibles debido a la politenia. Cada cromosoma está formado por numerosas bandas claras y oscuras alternadas. Tinción orceína lactoacética. 1.200x. (Cortes ía de J. M. Amabis.)

Figura 8.27 Dibujo esquemático que muestra la estructura de un cromosoma politénico con un puffs. Las bandas oscuras representan la coincidencia de las regiones en las que las cadenas de ADN se condensan más, es decir, los cromómeros, inexistentes en las bandas claras. El puffs representa una estructura cuyo s filamentos de los cromómeros se desdoblan para formar asas.

Figura 8.28 Microfotografía de cromosomas de Rhynchosdara angelae. En B, un puffs de ADN en la fase de expansión en el extremo del cromosoma (flechas). En A, la misma región después de la regresión del puffs. Tenga en cuenta que la banda correspondiente al puffs (flecha) es más grande que las bandas adyacentes. Esto es debido a la síntesis adicional y localizada de ADN que se produjo en el puffs (amplificación génica). A y B se tiñeron con orceína lactoacética. 1.200x. (de JM Amabis y LCG Simões Genética, 42:404, 1971. Reproducido con autorización) En C, 3 radioautografía de cromosoma de animal inyectado previamente con uridina H . Observe la acumulación de granos de plata en la región de un puffs de ARN (flechas), lo que indica una 3 intensa síntesis de este compuesto. Lo mismo sería observado en un puffs de ADN si fuese inyectada timidina H en el animal. 1200x. (Cortesía de D.C. Amabis.)

LOS CROMOSOMAS PLUMOSOS SON MEIÓTICOS Estos cromosomas (Figuras 8.29 y 8.30) se forman en la profase de la meiosis de los ovocitos de ciertos animales, como los anfibios, algunos peces y reptiles, siendo más estudiados en los anfibios, por tratarse de material fácil de manejar. Los cromosomas plumosos pueden alcanzar hasta 1,5 mm de largo. Se forman en la profase de la meiosis, específicamente en el diploteno cuando los homólogos apareados se repelen, pero todavía están unidos por los quiasmas (más detalles en el capítulo 9). Cada cromosoma se compone de dos cromátidas, y a lo largo de cada cromátida, aparecen regiones de mayor compactación de la fibra, formando los cromómeros, que se alternan con regiones con menos compactación, intercromoméricas. Algunos de estos cromómeros se desespiralizan y forman asas; el cromosoma queda con dos asas simétricas, una de cada lado, procedentes de las cromómeros que se encuentran en cada una de las cromátidas (Figuras 8.29 y 8.30). El conjunto de estas asas confiere a los cromosomas la apariencia de una pluma o de un cepillo para limpiar los tubos de ensayo,

lo que resulta en su nombre en castellano (plumoso) y en inglés (lampbrush chromosome), respectivamente. Los estudios histoquímicos y radioautográficos de estos cromosomas mostraron que, en la región de las asas, ocurre una gran síntesis y acumulación de ARN. El tratamiento de estos cromosomas con ARNasa elimina el ARN acumulado en las asas, manteniendo, sin embargo, la integridad de los filamentos. El tratamiento con ADNasa, a su vez, no elimina el ARN acumulado en las asas, pero fragmenta el filamento de cromatina en distintas regiones. Se supone que los genes presentes en las asas de estos cromosomas están siendo activamente transcritos en ARN. En consecuencia, serían homólogos a los puffs de los cromosomas politénicos, sólo que en los politénicos hay dos asas por cromómero, ya que sólo hay dos cromátidas en cada cromosoma. Sin embargo, a diferencia de los cromosomas politénicos, los plumosos transcriben durante la profase de la meiosis. La aparición de los cromosomas plumosos coincide con la fase en la que se produce un fuerte crecimiento del oocito, cuando el material macromolecular debe ser acumulado para, posteriormente, cumplir con los requisitos del

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embrión durante la fase de segmentación. Los estudios ultraestructurales realizados en este período sugieren una intensa transferencia, desde el núcleo hasta el citoplasma de ARN ribosomal y ARN mensajero para la síntesis de histonas. Cientos de nucléolos se ven asociados con la superficie interna de la envoltura nuclear. Cada nucléolo presenta un anillo de ADN que se cree que es causado por la replicación del organizador nucleolar. Estas réplicas circulares migran a la periferia del núcleo y forman el molde

para la síntesis de ARN ribosomal. Por tanto, este proceso representa una amplificación considerable de los sitios de síntesis de ARN ribosomal. Después de la profase meiótica, los cromosomas plumosos retornan a su morfología meiótica normal. En consecuencia, se diferencian de los cromosomas politénicos, que son morfológicamente estables, pero desintegrándose, de la misma manera que todo el tejido, durante la metamorfosis del insecto.

Figura 8.29 Parte de un par de cromosomas plumosos del urodelo Triturus viridescens. Los dos cromosomas están unidos por los quiasmas (flechas). En la región de la flecha doble se observa una porción del cromosoma donde los dos filamentos están separados. Este aspecto demuestra que el cromosoma, en esta fase, está formado por dos nucleofilamentos (cromátidas). (Con base en estudios de J. Gall).

Figura 8.30 Diagrama que ilustra la estructura de un cromosoma plumoso. Los nucleofilamentos dispuestos paralelamente presentan regiones cromoméricas intercaladas con segmentos intercromoméricos. Algunos cromómeros presentan parte de su nucleofilamento desespiralizado y en una intensa fase de transcripción de ARN (cromómero activo). (Rediseñado de Berkaloff et al. Biologie et Physiologie Cellulaires. Herman ed., París, 1981.)

RESUMEN Los cromosomas en la mayoría de los organismos, sólo son visibles durante la división del núcleo, específicamente en la metafase, etapa de del ciclo celular en que están altamente condensados. El cromosoma metafásico está formado por un esqueleto de proteínas ácidas, responsable por la condensación de la fibra de cromatina, que se une a este en la forma de un solenoide. Cada cromosoma se compone de dos regiones longitudinales idénticas, denominadas cromátidas, que están unidas por la constricción primaria o centrómero. La posición del centrómero define cuatro tipos de cromosomas: metacéntricos, submetacéntricos, acrocéntricos y telocéntricos. El número, el tamaño y la morfología de los cromosomas son constantes para las especies. En algunos organismos, además de los cromosomas metafásicos, en la interfase y la profase de la meiosis, se encuentran cromosomas gigantes, llamados, respectivamente, cromosomas politénicos y cromosomas plumosos. Los cromosomas politénicos se producen en diversos tejidos de algunos organismos; sin embargo, los más comunes y estudiados son los de las células de las glándulas salivales de insectos dípteros. Estos cromosomas son originados por un proceso de endoreplicación por el cual las cromátidas replicadas permanecen juntas, emparejadas, y por lo tanto el cromosoma presenta cientos de filamentos. Estos cromosomas presentan regiones más compactas, que se colorean

intensamente - las bandas -, alternadas con regiones menos compactadas que se colorean menos intensamente - las interbandas. Las bandas surgen por la yuxtaposición de los cromómeros homólogos existentes en los numerosos filamentos que componen el cromosoma. Estas bandas pueden sufrir, en determinados momentos de la vida del organismo, y también en diferentes tejidos, una despiralización, provocando una hinchazón localizada en el cromosoma. Estas estructuras fueron denominadas pufs y son lugares donde hay una intensa síntesis de ARN. Los puffs, con su patrón cronológico específico, son la manifestación morfológica de la actividad génica diferencial. Los cromosomas plumosos son fácilmente reconocibles en los ovocitos de anfibios, gracias a su gran tamaño. Vienen en pares, ya que se producen al final de la profase I de la meiosis, etapa donde el emparejamiento de los cromosomas es aún visible en las regiones de los quiasmas. Cada cromosoma del par se compone de dos cromátidas, porque en esta fase, los cromosomas están duplicados. Cada cromátida presenta regiones compactadas -cromómeros - y regiones descompactadas - las asas. En las asas ocurre una intensa síntesis de ARN y, ya que están activas según un patrón determinado, representan genes específicos en actividad. Por lo tanto, las asas son el equivalente morfológico de los puffs de los cromosomas politénicos.

MANIPULACIÓN DEL ADN: LA INGENIERÍA GENÉTICA El término ingeniería genética, en su sentido más amplio, implica una serie de procedimientos para modificar el genoma de un organismo. El desarrollo de técnicas que han permitido la manipulación del ADN revolucionó la biología molecular. Estas técnicas son llamadas colectivamente tecnología del ADN recombinante. Estas técnicas permiten que genes específicos sean aislados, secuenciados, modificados e introducidos en células en las que estos genes no se expresan. Estos procedimientos se pueden aplicar a todos los seres vivos, desde las bacterias hasta el hombre. Estas técnicas posibilitan, por ejemplo, insertar genes específicos en el genoma de bacterias, induciéndolas a producir, en cantidades comerciales, proteínas específicas y de uso médico, tales como la insulina y la hormona

del crecimiento humano. El genoma de plantas también se puede modificar, volviéndolas más productivas y más resistentes a las enfermedades. La tecnología del ADN recombinante se basa en el uso de enzimas de restricción, que realizan el clivaje del ADN en regiones específicas, facilitando el aislamiento y la manipulación de los genes individuales. Las enzimas de restricción son endonucleasas que funcionan como tijeras moleculares, es decir, tienen la capacidad de reconocer y cortar secuencias específicas en la doble hebra del ADN. Se producen en las bacterias, de las cuales son aisladas para uso en laboratorio. Se han aislado y caracterizado enzimas de restricción que permiten el reconocimiento de más de 100 secuencias de nucleótidos. Las diferentes especies de bacterias producen enzimas de restricción con diferentes especificidades, lo que hace posible

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aislar un fragmento de ADN que contiene un gen particular. Este gen puede ser clonado, es decir, a partir de el se puede obtener copias en cantidades ilimitadas. Este gen también puede ser modificado e insertado en un genoma de otro organismo. Entre las técnicas del ADN recombinante, las más importantes se describen a continuación. Hibridación de ácidos nucleicos Vuelve posible el reconocimiento de secuencias complementarias de ADN o ARN. Por lo tanto, un fragmento de ADN específico puede ser localizado en una mezcla heterogénea, siempre que se disponga de una secuencia complementaria al fragmento. Esta secuencia complementaria se llama sonda y consiste en secuencias de nucleótidos de ADN o de ARN que fueron clonadas o sintetizadas in vitro, utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos. La técnica de hibridación se describe brevemente en la Figura 8.31. Cuando el ADN se somete a temperaturas de 90 a 100 °C, los dos filamentos de polinucleótidos se desnaturalizan, es decir, se separan. Si estas hebras desnaturalizadas se incuban en condiciones apropiadas de temperatura (alrededor de 65 °C), se renaturalizan, es decir, las bases complementarias vuelven a disponerse en pares, formándose de nuevo la doble hebra. Por lo tanto, se forman híbridos entre las secuencias de ácidos nucleicos complementarias. Si la sonda radiactiva está presente en el medio de incubación, se produce el emparejamiento entre la sonda y el fragmento complementario a ella. Estos híbridos pueden formarse entre dos hebras de ADN, dos hebras de ARN o una cadena de ADN y una de ARN. Esta técnica es útil en biología, porque, entre otras aplicaciones, torna posible determinar cuantitativamente, con métodos bioquímicos, la homología (similitud) existente entre el ADN de diferentes especies. En los vertebrados, por ejemplo, se ha demostrado una fuerte hibridación entre el

ADN de los simios y el hombre (> 90%) y se encontró que disminuye a medida que se desciende en la escala filogenética desde los mamíferos a los reptiles, anfibios y peces. La homología entre el ADN de los peces y del hombre es de sólo el 20%. Estos datos proporcionan un soporte bioquímico sólido de la teoría de la evolución y han permitido una serie de estudios sobre los detalles de la evolución de los seres vivos. La hibridación molecular también posibilita cuantificar el número de copias de un gen particular existente en una célula, porque la cantidad de material radiactivo hibridado es proporcional al número de secuencias existentes. Por esta técnica fue posible saber que los genes del ARN ribosomal y de las histonas están presentes en las células en múltiples copias, mientras que los genes para el colágeno y las enzimas digestivas existen sólo en una sola copia por célula. La técnica de hibridación también ha sido ampliamente utilizada para la localización de segmentos específicos de ADN en los cromosomas, a través de la hibridación in situ. En esta variante, los cromosomas dispuestos en la lámina se someten a calor, con la consiguiente separación de las hebras de ADN. Estos cromosomas se incuban a continuación con sus sondas específicas, por un tiempo determinado, en condiciones donde se produce la hibridación. Después de la hibridación, la preparación se lava, eliminando el exceso de ADN radioactivo, y se realiza en la lámina, el proceso de autorradiografía, que indicará en los cromosomas, donde se encuentra el ADN en cuestión. La hibridación in situ también se puede hacer usando ARN radioactivo, que se unirá a las regiones cromosómicas que tienen ADN con secuencia complementaria a las bases del ARN utilizado. Una variación de esta técnica utiliza en lugar de un isótopo radiactivo, una molécula fluorescente unida al ácido nucleico, razón por la cual recibe el nombre de FISH (del inglés fluorescent in situ hibridization) (Fig 8.32).

Figura 8.31 Técnica de hibridación del ADN utilizada en biología molecular.

Clonación del ADN

Técnica que consiste en insertar un fragmento de ADN aislado en otra molécula de ADN de una célula huésped, que sea capaz de una replicación independiente. El resultado es una molécula de ADN recombinante. Si la molécula recombinante se replica en una célula huésped adecuada, pueden ser obtenidas grandes cantidades de la secuencia de ADN que fue insertada. Fragmentos de ADN humano, por ejemplo, pueden clonarse en bacterias. Por lo tanto, a partir de una sola molécula de ADN pueden ser copiados muchos miles de millones de moléculas idénticas. Además del ADN, también se puede clonar moléculas de ARN. Inicialmente, una molécula de ADN es copiada a partir de un molde de ARN, por la enzima transcriptasa reversa. La molécula de ADN obtenida es complementaria al molde de ARN, siendo denominada ADNc, y, luego, se puede insertar en el ADN de una célula huésped. El proceso de clonación se esquematiza en la Figura 8.33. Otra manera de obtener grandes cantidades de fragmentos individuales de ADN in vitro es mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés polymerase chain reaction). La PCR sólo es posible mediante el uso de un tipo de ADN polimerasa cuya actividad enzimática se mantiene incluso a temperaturas elevadas. Esta ADN polimerasa es extraída de la bacteria Thermus aquaticus, que vive en las aguas termales, y, por esto, fue denominada Taq polimerasa. La Taq polimerasa se utiliza para añadir desoxirribonucleótidos a un pequeño segmento de ADN, el primer o cebador, que dirige la síntesis del nuevo segmento de ADN sobre el molde en donde el primer se une. La PCR puede ser dividida en tres etapas básicas. (1) La mezcla de la muestra de ADN + Taq-polimerasa + primers + los cuatro nucleótidos que forman la molécula de ADN (dCTP, dATP, dGTP y dTTP) se somete a una temperatura de 92-94 °C, para que ocurra la separación de las dos hebras de ADN; (2) la reducción de la temperatura para que los primers se unan a los extremos 3ʼ de cada cadena de ADN que contienen las secuencias de nucleótidos complementarias la Taq-polimerasa va añadiendo nucleótidos a los extremos 3' de los primers, copiando las hebras de ADN y formando filamentos complementarios a cada uno de ellos; (3) la temperatura se eleva de nuevo, haciendo que las nuevas hebras de ADN se separen de las antiguas, que fueron utilizadas como molde. Finalmente, el proceso se vuelve a repetir varias veces.

En cada ciclo de repetición, el número de genes (segmentos de ADN) se duplica, y como cada ciclo dura de 2 a 3 horas, en algunas horas el ADN puede ser copiado mil millones de veces. Además de rápida, la PCR es una técnica muy sensible que puede amplificar el ADN de una sola célula. Se pueden introducir genes clonados en las células animales e incluso en las plantas. Estos experimentos han permitido la identificación de genes que controlan el crecimiento y la diferenciación de la célula, incluyendo los genes responsables del desarrollo de células cancerosas. Estos genes también pueden ser introducidos en células de la línea germinal de organismos multicelulares, lo que permite el estudio de su expresión en los organismos. Los animales transgénicos son generalmente producidos por la inyección del ADN clonado en el pronúcleo del huevo fertilizado, que se trasplanta posteriormente en una madre sustituta, en la cual se desarrolla hasta el nacimiento. Por lo tanto, el animal incorporará a su genoma un gen extraño, que ahora podrá tener su expresión estudiada en un organismo multicelular. El mismo proceso se puede utilizar para la obtención de plantas transgénicas en las que se pueden insertar genes que confieren resistencia a las plagas o que incrementen el valor nutritivo de un cereal, por ejemplo. Esta técnica, además de numerosas aplicaciones en biología molecular, también tiene importancia en el diagnóstico de varias enfermedades hereditarias y en medicina forense. Ella vuelve posible identificar a una persona mediante la comparación de las muestras que contienen células, incluso en pequeñas cantidades, ya sea de la sangre, el semen o un cabello, por lo que se utiliza en los exámenes de especialización de la policía o de la exclusión de paternidad.

Mutagénesis del ADN clonado

Técnica a través de la cual las secuencias de ADN clonado son alteradas para producir versiones modificadas de los genes, que son reintroducidos en las células o en los organismos unicelulares. Este proceso de mutagénesis in vitro puede causar deleciones, inserciones o cambios de nucleótidos en la molécula de ADN. Estos experimentos favorecen los estudios de la expresión génica, así como la determinación de la función de los productos de estos genes. Por ejemplo, algunos aminoácidos de una proteína particular se pueden cambiar, lo que permite establecer la función realizada por la misma en la célula.

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Figura 8.32 Microfotografía de cromosomas metafásicos de Solanum corymbiflorum (Solanaceae) con 2n = 24, contrateñida con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) (fluorocromo azul) y sometida a la técnica de FISH (fluorescent in situ hibridization) para detectar y localizar las secuencias de genes de ARNr con sondas obtenidas del trigo. El ADNr 45S fue marcado con biotina-14-dATP y detectado con avidina-FITC (fluorocromo verde) y el ADNr 5S fue marcado con digoxigenina-11-dUTP y detectado con antidigoxigenina-rodamina (fluorocromo rojo). 1000x. (Cortesía de Letícia N.A. Almeida Rego y André L. LaforgaVanzela.)

Figura 8.33 Diagrama que ilustra brevemente el procedimiento usado para la clonación de un gen en una bacteria. Una molécula de ARN mensajero sirve como molde para la síntesis reversa del ADN complementario (A), produciendo un híbrido ADNARN. La parte de ARN del híbrido se elimina (B), quedando una hebra de ADN monocatenario, que se duplica (C). Esta cadena doble de ADN es insertada en un plásmido (F) que fue aislado a partir de bacterias previamente infectadas (D) y abierto por la acción de una enzima de restricción apropiada (E). El plásmido híbrido resultante se introduce en bacterias, en las cuales se reproduce (H). En el paso siguiente (I), los plásmidos son aislados y las secuencias específicas de ADN sintetizadas se separan de ellos, debido a la acción de enzimas de restricción adecuadas (J). Es posible, entonces, marcar este ADN con isótopos radiactivos, produciendo de este modo lo que se denomina sonda de detección que, por hibridación, es capaz de cuantificar (cuando se trabaja in vivo) o localizar la secuencia específica de ADN (gen) en las células, cuando se hace la hibridación in situ.

RESUMEN Las modernas técnicas de análisis y manipulación genética, asociadas a métodos de análisis bioquímico de ácidos nucleicos y de proteínas, han permitido que las modificaciones sean introducidas en los genomas de los organismos. El conjunto de técnicas con esta finalidad, conocido como tecnología del ADN recombinante o ingeniería genética, consiste en la introducción de genes de una especie en un organismo de otra especie, de modo que los genes extraños puedan duplicarse, ser transcritos y traducidos en el nuevo ambiente celular. La metodología es compleja y depende del fraccionamiento del ADN con enzimas de restricción, que cortan la molécula en sitios específicos. Esta incluye numerosas técnicas, entre las que destacamos la hibridación molecular y la clonación del ADN. Las técnicas permiten el aislamiento y caracterización de genes específicos que son insertados en vectores (normalmente un plásmido bacteriano) y transferidos a células procariotas, en las cuales, además de la producción de las secuencias de ADN en gran número, el producto final (generalmente proteínas) también se produce a tasas elevadas, pudiendo alcanzar una producción a escala industrial. Estos procesos son la llamada clonación génica. La aplicación de la tecnología del ADN recombinante ha proporcionado varias ventajas: desde la determinación de la proximidad entre organismos en la escala evolutiva, la localización de genes específicos en el genoma, con la amplificación de aquellos de mayor interés científico, médico o económico, hasta la aplicación práctica directa en la vida cotidiana, como en el caso de la determinación de la paternidad. BIBLIOGRAFÍA Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 4 th ed. Garland, 2002. Bernstein, E. and Hake, S.B. The nucleosome: a little variation goes a long way. Biochem. Cell Biol., 84: 505-517, 2006. Boisvert, FM. et al. The multifunctional nucleolus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8:574-585, 2007. Crisp, M and Burke, B. The nuclear envelope as an integrator of nuclear and cytoplasmic architecture. FEBS Letters: 582: 2023-2032, 2008.

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9 | Ciclo Celular e Meiose

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Ciclo Celular y Meiosis

9 ■ El ciclo celular comprende dos etapas coordinadas: una de crecimiento y otra de división en dos células hijas ■ Fases del ciclo celular | La síntesis del ADN se produce en la fase S de la interfase ■ Duración de los períodos del ciclo ■ Eventos bioquímicos de la interfase ■ La replicación del AND es semiconservadora ■ Características generales de la replicación del ADN ■ Las células presentan mecanismos para mantener la integridad de su ADN ■ Mitosis: La división del núcleo es seguida por la división citoplasmática ■ Las características de la división citoplasmática en las células animales y vegetales

ERRNVPHGLFRVRUJ

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Control genético del ciclo celular Los controles que los complejos G1Cdk y G1/S-Cdk ejercen La acción del complejo S-Cdk Cómo el complejo M-Cdk controla la mitosis El ciclo celular está influenciado por factores de crecimiento y otras señales extracelulares Resumen La meiosis | la meiosis hace posible la reproducción sexual Control genético de la meiosis La meiosis favorece la evolución de las especies Resumen Bibliografía

Guía Toda célula proviene de la división de una célula preexistente El período que comprende las modificaciones ocurridas en una célula desde su formación hasta su propia división en dos células hijas se llama ciclo celular El ciclo celular comprende dos etapas: interfase y mitosis Cada vez que una célula se divide, su contenido debe ser duplicado para poder dividirlo en partes iguales entre las dos células hijas En los tejidos que se renuevan, las células pasan a través de la fase G1, S, G2 y M del ciclo. La fase S es el momento de la síntesis del ADN La síntesis del ADN es semiconservativa. Cada doble hélice tiene una cadena antigua y una cadena nueva Las dos cadenas hijas de una molécula de ADN se sintetizan de manera diferente: una continua y la otra discontinua La fase M o mitosis se divide en profase, metafase, anafase y telofase La progresión a través del ciclo celular está dirigida por una familia de proteínas Una serie de puntos de control regula la progresión a través de varias fases del ciclo celular Los controles operan en respuesta al tamaño celular y a señales extracelulares, tales como los factores de crecimiento e inhibición La meiosis es una división especializada en reducir a la mitad el número de cromosomas, dando como resultado la formación de gametos En la meiosis se produce el intercambio entre los cromosomas paternos y maternos El control de la meiosis se realiza por mecanismos similares a los que controlan la mitosis Los gametos resultantes de un proceso meiótico son genéticamente diferentes, lo que contribuye a una mayor diversidad de la especie.

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a capacidad de crecer y reproducirse es atributo fundamental de todas las células. En el caso de células eucariotas, el proceso básico de la génesis de nuevas células sigue un patrón cíclico que comienza con el crecimiento celular, determinado por un aumento cuantitativo coordinado de los miles de diferentes tipos de moléculas que tiene la célula, incluyendo el de su material genético, y culmina con la partición de su núcleo y citoplasma en dos células hijas. Las células originadas repiten el ciclo, y el número de células aumenta de forma exponencial. Este proceso se llama ciclo de división celular, o simplemente, ciclo celular, y sirve tanto para mantener la vida, en organismos multicelulares, como para generar la vida, en el caso de los organismos eucariotas unicelulares. A través de esto, el cuerpo humano, por ejemplo, comienza su existencia a partir de una sola célula, el cigoto, el cual pasa por duplicaciones celulares sucesivas, tanto durante el periodo embrionario como durante el desarrollo del organismo. Estas duplicaciones conducen a la formación de unos cien billones (10 14) de células, llamadas células somáticas, que componen el individuo adulto. Por lo tanto, se puede afirmar que el proceso de crecimiento de un tejido, un órgano o de todo un organismo multicelular ocurre principalmente por la multiplicación del número de sus células, y no por el crecimiento de éstas, ya que una de las propiedades celulares es mantener un volumen particularmente constante. Incluso en los adultos, las divisiones celulares todavía son frecuentes. Este proceso de multiplicación o proliferación celular, que ocurre por duplicación de las células existentes, también es responsable de la sustitución de las células muertas y por la regeneración de partes dañadas de tejidos u órganos. Las células mueren no sólo como resultado de una lesión, sino principalmente por un proceso fisiológico normal conocido como apoptosis, un tipo de muerte celular programada, que se discutirá más adelante en este capítulo. De este modo, el organismo controla y mantiene constante el número de células en tejidos y órganos, se libra de células dañadas, y también elimina las células indeseables y no permanentes de los tejidos en desarrollo durante la morfogénesis. Consecuentemente, tanto el desarrollo como el mantenimiento de tejidos y órganos en el adulto dependen de un equilibrio cuidadosamente regulado entre la proliferación celular y la muerte celular programada. La formación de nuevas células, sin embargo, no siempre se produce por el ciclo celular típico. Cuando se trata del origen de las células gaméticas, o gametos, de organismos que tienen reproducción sexual, este proceso no es cíclico. Los gametos se forman a partir de la división de células somáticas específicas, presentes en las gónadas o en los órganos del sistema reproductor masculino y femenino, llamadas células germinales. Los gametos llevan sólo la mitad del número de cromosomas, y por lo tanto la mitad de la cantidad del material genético presente en las células somáticas del mismo organismo; son, por tanto, células haploides, mientras que las somáticas son diploides. Su origen resulta, por lo tanto, de una división celular reduccional llamada meiosis, a través de la cual ocurre una reducción del contenido original del material genético. Por lo tanto, la meiosis no es simplemente otro tipo.de división celular, sino el proceso por el que una célula preexistente da lugar a células diferentes de la original y diferentes entre sí. La meiosis genera entonces una fase haploide de vida de los organismos, mientras que la fusión de dos gametos, llamada fertilización o fecundación, restaura la fase diploide, para dar como resultado una célula diploide, que inicia un nuevo organismo. La meiosis se verá al final de este capítulo. EL CICLO CELULAR COMPRENDE DOS ETAPAS COORDINADAS: UNA DE CRECIMIENTO Y OTRA DE DIVISIÓN EN DOS CÉLULAS HIJAS El ciclo celular comprende los procesos que ocurren desde la formación de una célula hasta su propia división en dos células hijas, todas iguales entre sí. El ciclo se puede dividir en dos grandes etapas: ■ Aquella comprendida entre dos divisiones sucesivas, en el que la célula crece y se prepara para una nueva división, denominada interfase ■ La etapa de división propiamente dicha, en la que se originan dos células hijas. Esta etapa se caracteriza por la división del núcleo, llamada cariocinesis o mitosis, seguida por la división del citoplasma o citocinesis (Figura 9.1). El crecimiento y la división celular deben ser regulados y coordinados que el ciclo transcurra en un equilibrio que asegure el mantenimiento de las características celulares esenciales en la progenie; por ejemplo, con el fin de mantener constante el tamaño celular en las células hijas, el crecimiento debe ser compensado con la división celular. Esto significa que la duración del ciclo tiene que ajustarse perfectamente al tiempo que la célula necesita para duplicar su tamaño. Por lo tanto, se evita que la célula sea cada vez menor, o mayor, dependiendo del tiempo de duración del ciclo en relación con la masa celular. Esta coordinación requiere que mecanismos de control operen en momentos específicos del ciclo celular. En las células eucariotas, el control del proceso de reproducción celular es realizado por varios productos génicos, que son, a su vez, regulados por factores extracelulares, sean estos nutrientes o factores de crecimiento que causan que la división celular se produzca de forma coordinada con las necesidades del organismo como un todo. De hecho, la complejidad de los organismos vivos hace que la mayoría de los procesos moleculares que los manejan sean muy diferentes, como

resultado de los diferentes tipos de vidas que tienen y de los patrones evolutivos que han sufrido. Por lo tanto, también los detalles del ciclo celular varían entre grupos de organismos filogenéticamente distantes. Sin embargo, cuanto más se sabe sobre el sistema de control del ciclo celular, más similitudes se descubren entre los diferentes organismos vivos, lo que indica un origen ancestral común y una alta conservación evolutiva de los modos de funcionamiento y de la composición de los genes y las proteínas que participan en este control. Estas proteínas son tan similares que muchas de ellas, cuando son transferidas de una célula humana a una célula de levadura, continúan realizando la misma función. FASES DEL CICLO CELULAR | LA SÍNTESIS DEL ADN SE PRODUCE EN LA FASE S DE LA INTERFASE Aunque la mitosis constituye morfológicamente la fase más espectacular del ciclo celular, es en la interfase donde se produce la duplicación de los componentes de la célula madre y, en particular, la replicación del ADN, un requisito previo esencial para que la división se produzca. Este proceso se puede estudiar mediante el uso de precursores radiactivos, usando métodos bioquímicos o radioautográficos, o por citofotometría. Cuando se dan precursores radiactivos de ADN, tales como la timidina tritiada (H3-timidina) a las células durante unos pocos minutos y éstas se procesan para la autorradiografía, se puede observar bajo un microscopio óptico, que las células en división no incorporan la H 3-timidina. Por otro lado, las células que estaban replicando su ADN en el momento de la exposición a la H3-timidina producen una imagen radioautográfica de los núcleos marcados, verificándose que pocas células en interfase estaban replicando su ADN. La observación a intervalos de tiempo fijo después de la exposición para detectar el momento en el que el bloque de células marcadas entra en mitosis, permite demostrar, entre otras cosas, que las células terminan la replicación del ADN al menos 2 horas antes de la mitosis. Por lo tanto, en las células eucariotas, la replicación del ADN se encuentra en un período intermedio de la interfase y no toma toda esta etapa. Este descubrimiento permitió la división de la interfase en tres períodos sucesivos, o la división del ciclo en cuatro fases distintas, que fueron llamadas G1, S, G2 y M. La secuencia cíclica de estas fases se ilustra en las figuras 9.1 y 9.2. En el período S ocurre la duplicación o la síntesis del ADN, de ahí el nombre de esta fase. La abreviatura G proviene del término Inglés gap (brecha). El período G1 es el tiempo transcurrido desde el final de la mitosis (M) hasta el comienzo de la síntesis de ADN (S), por lo que también es considerado período post-mitótico o pre-sintético. El período G2 es el intervalo entre la terminación de la síntesis de ADN y la mitosis siguiente, también llamado período post-sintético o pre-mitótico. Las fases del ciclo y la determinación de la duración de cada uno de ellas, se puede estudiar adicionalmente por citofotometría, en la que también se mide la cantidad de ADN de las células individuales en una población celular. Para el uso de este método, las células fijadas deben ser teñidas con tintes específicos para ADN (a través de la reacción de Feulgen, por ejemplo) o con tintes fluorescentes que se unen a puntos específicos de la molécula de ADN. Por lo tanto, el análisis realizado por medio de un citofotômetro o por la técnica de microfluorometría de flujo, la fluorescencia detectada o la intensidad de la luz transmitida a través de los núcleos es proporcional al contenido de ADN. Por lo tanto, en una población celular particular, se pueden obtener las frecuencias de células con contenido de ADN duplicado (4C), no duplicado (2C) es intermedio en 2C y 4C, que corresponderían, respectivamente, a las células en los períodos G2, G1 y S. Si las células de la población están distribuidas al azar a lo largo de las diferentes etapas del ciclo, es decir, si la población es asincrónica, entonces el porcentaje de células detectado en cualquier segmento de la interfase será proporcional a la duración de ese segmento. Si el tiempo de ciclo promedio también se conoce previamente, la duración absoluta de cada fase se puede determinar; Por ejemplo, si el tiempo del ciclo es de 20 h y 40% de la población celular se presenta en G1, se concluye que la duración de esta fase es de 8 h. El ciclo celular puede ser estudiado también usando la técnica de sincronización celular. Este método permite hacer un seguimiento de una población de células que va a través de las etapas del ciclo celular de forma sincrónica, y por lo tanto, uno puede analizar los eventos moleculares interrelacionados. Para este propósito, se puede utilizar una población celular naturalmente sincrónica. Esto ocurre en el hongo Physarum, por ser un plasmodio, o incluso al principio del desarrollo embrionario, cuando la sincronización se mantiene durante unos 10 ciclos celulares sucesivos después de la fertilización del óvulo. Como los casos de la sincronización natural del ciclo son poco frecuentes, la sincronización también puede ser inducida. Tal inducción puede ser química, utilizando inhibidores metabólicos específicos de una determinada etapa, que cuando se retiran, permiten la progresión del ciclo celular de una manera síncrona, o se pueden obtener mecánicamente; en este caso, puede ser, por ejemplo, para separar, de entre las células que crecen en una botella de cultivo, las que están en mitosis, que se vuelven generalmente esféricas y sin apretar unidas a la botella, esas células se encuentran en interfase, que se mantienen planas y unidas a la pared de la botella. A diferencia de los métodos antes mencionados, los de sincronización del ciclo se aplican más al estudio de los procesos metabólicos que siguen y que se relacionan en cada etapa de la determinación de los tiempos de duración de estas etapas.

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Figura 9.1 Figura 9.2 Figura 9.1 Esquema del ciclo celular. A la izquierda, la interfase con las fases G1, S y G2; a la derecha, la mitosis, dividida en cuatro fases. La interfase consiste en el crecimiento celular, duplicación del contenido y preparación para la nueva división. La mitosis comprende la división del núcleo y del citoplasma. Figura 9.2 Las cuatro etapas sucesivas del ciclo de división de una célula eucariota típica. Al principio de la fase G1en respuesta a las señales externas, la célula "decide" si desea continuar en el ciclo o si asume un estado quiescente llamado G0, cuya duración es muy variable. En este estado, la célula puede volver al ciclo mediante un estímulo apropiado. Ciertas células cultivadas, por ejemplo, si son estimuladas, pueden volver al ciclo, entrando nuevamente en la fase G, y comenzando a sintetizar ADN 12 h después. En el final de G1, existe un importante punto de control del ciclo, llamado punto de restricción (R), que impide la progresión del ciclo en condiciones desfavorables o insatisfactorias. Cuando se supera el p unto R, la célula pasa a través de las etapas restantes del ciclo celular hasta que dos células hijas idénticas se forman al final de la mitosis (M).

DURACIÓN DE LOS PERÍODOS DEL CICLO La célula tiene que crecer hasta alcanzar un tamaño adecuado y constante antes de dividirse. Como resultado, aproximadamente el 95% del ciclo se gasta en la interfase, pero el tiempo medio total de esta fase es variable de tipo celular a tipo celular. La duración también varía con las condiciones fisiológicas en las que la célula se encuentra, como la edad celular, la disponibilidad de hormonas y de factores de crecimiento, temperatura, presión osmótica, presión hidrostática y la presión de oxígeno externo, e incluso con el ritmo circadiano (ritmo acerca de un día) que se produce en los organismos. También hay diferencias notables en la duración del ciclo celular según el organismo que se está observando. En general, el ciclo tiene una duración de aproximadamente 12 h en los tejidos de mamíferos con un crecimiento muy rápido, y 24 h, en otros con crecimiento más lento. A su vez, en los organismos unicelulares tales como las levaduras, el tiempo de generación es mucho más corto y el período de aproximadamente 1 h y media es suficiente para la formación de dos nuevas células. La fase G1 es la de duración más variable en la mayoría de las células animales y vegetales. De hecho, este periodo puede variar individualmente de célula a célula, porque es el que más está influenciado por factores extracelulares. También es el período en el que las mutaciones y diversos inhibidores son capaces de bloquear la proliferación. En general, se toma muchas horas durante el cual crecen las células. Sin embargo, los ciclos de Amoeba proteus, Physarum sp. y Tetrahymena sp. son diferentes, donde la fase G1 está ausente y la fase G2 es la más larga de todas. Otro caso cuando G1 falta o tiene una duración despreciable es el de las células embrionarias iniciales, poco después de la fertilización, pero en este caso, no se produce el crecimiento celular. Una vez que las células entran en la fase S, los factores extracelulares no determinan más los eventos del ciclo celular, los que a su vez pasan a depender de los controles disparados intracelularmente. Por lo tanto, las etapas restantes del ciclo, incluyendo la mitosis, tienen tiempos de duración más constantes. La mitosis dura aproximadamente 1 h, siendo más larga en los tumores y en las células transformadas (Capítulo 16); G2, por lo general, dura de 2 a 4 h, y esta tiempo también aumenta en las células tumorales; el periodo S tiene una duración de 7 a 8 h. Mientras que estas fases son más constantes, la duración de cada una de ellas varía entre las especies y también entre las diferentes etapas del desarrollo del mismo organismo. Por ejemplo, la fase S tiene una duración de aproximadamente 10 h, en células maduras de Drosophila, y de menos de 4 h en células embrionarias del mismo organismo. En función de las variaciones en el tiempo de proliferación, las células animales pueden clasificarse en tres grandes categorías: ■ células que se dividen continuamente ■ células que normalmente no se dividen, pero que pueden hacerlo en respuesta a los estímulos ■ células terminalmente diferenciadas. En el primer grupo incluye las células embrionarias, las células de tejidos de renovación rápida, como las del epitelio de revestimiento del intestino delgado (que se renueva en el hombre, de 3 en 3 días), las de los folículos pilosos, las del sistema linfáticos y las de la médula ósea, en las cuales se forman las células de la sangre. Todos estos tejidos son extremadamente sensibles a los agentes o tratamientos químicos o físicos (fármacos o

radiación) que afectan a la replicación del ADN, por eso son los primeros en ser perjudicados en los tratamientos para la quimioterapia del cáncer o en la radioterapia en general. (Figura 9.3). En este grupo se incluyen también las células que tienen una proliferación más lenta, como las de la capa basal de la epidermis, las cuales, por este motivo, no manifiestan lesiones tan rápidamente. El segundo grupo está formado por células que pueden permanecer saludables durante largos períodos en un estado no proliferante, un estado de latencia o reposo con respecto al crecimiento, que se llama período G0 (Gcero), representado en la Figura 9.2. Estas células se ven privadas de los factores de crecimiento y por lo tanto mantienen un metabolismo lento con poca velocidad de la síntesis de macromoléculas; en general, presentan generalmente un tamaño reducido y tienen un contenido de ADN no duplicado. En este estado, algunos tipos celulares en G 0 pueden entrar en la fase proliferativa por un estímulo apropiado. Los nutrientes, hormonas de crecimiento o un estímulo mecánico, tales como daños causados por la cirugía pueden ser suficientes incentivos para que estas células vuelvan a entrar en el ciclo de división celular. En tales casos, el reingreso en el ciclo celular siempre tiene lugar en la fase G1, a la vez justo antes de la de la transición de la fase G 1/S, llamado el punto de restricción (punto R), lo que sería un punto crítico a aser vencido por la célula para que se pueden iniciar la fase S (Figura 9.2). El proceso de progresión hasta la fase S es lenta e irreversible; por ejemplo, fibroblastos del linaje 3T3 en cultivo requieren por lo menos 12 horas para pasar de G0-S, después de la estimulación con la adición de suero al medio de cultivo, mientras que las células que están normalmente en el ciclo requiere sólo alrededor de 6 h para pasar a través de G1 e iniciar S. Algunas células comienzan a mostrar competencia para responder a los estímulos y reanudar la capacidad de división son: los hepatocitos, fibroblastos de la piel, células renales, células del músculo liso, de páncreas, de ovario, de pulmón, células endoteliales, células de las glándulas suprarrenales y células óseas. Por último, hay tejidos cuyas células, al cesar sus divisiones y llegar a ser diferenciadas, pierden permanentemente su capacidad reproductiva y no pueden entrar de nuevo el ciclo. Este es el caso de las neuronas y las células de los músculos esqueléticos y cardíacos. Estas células permanecen indefinidamente en el período G 0 y se consideran terminalmente diferenciadas. En el caso de la pérdida de células debido a una lesión, tal como un ataque cardiaco, por ejemplo, por supuesto estas células nunca serán reemplazadas por otras células cardiacas. Sin embargo, hay otras células terminalmente diferenciadas, que no sufren autoproliferación, pero por tener corta vida, necesitan ser reemplazados de forma continua en el animal adulto. Este es el caso de las células epiteliales columnares de las porciones medial y apical de las vellosidades de la mucosa del intestino delgado, de las células más superficiales de la epidermis y de las células sanguíneas, como los eritrocitos anucleados de mamíferos. La sustitución de estas células se da por la proliferación de células no diferenciadas, llamadas células madre pluripotentes (en inglés, stem cells), que sirven de forma natural tanto de fuente de nuevas células madre como de células diferenciadas de vida * corta (para más detalles, véase Capítulo 11). Las células madre están incluidas en el primer grupo de células descrito.

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Figura 9.3 Mecanismo de acción de diversas sustancias antimitóticas. En la parte superior izquierda, el núcleo de la célula; a la derecha, el retículo endoplasmático rugoso (RER). Las sustancias que inhiben la mitosis pueden actuar en varios pasos. Paso 1 (Síntesis de los ribonucleótidos) es inhibida por la 6-mercaptopurina, un análogo de las purinas, y la diazo norleucina y azaserina, que impiden la acción del ácido fólico, necesario para la síntesis de las purinas. En la transformación de los ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos (paso 2), actúan como inhibidores la arabinosilcitosina y el fluorouracilo mediante la inhibición de las enzimas implicadas en la síntesis y polimerización de trifosfatos de desoxirribonucleótidos. La mitomicina inhibe la síntesis de ADN (paso 3), porque se une fuertemente a la doble hélice del ADN, lo que impide que esta doble hélice se abra a la replicación. En el paso 4, la síntesis de ARN es impedida por la actinomicina D, que se combina con las guaninas del ADN. En el mismo paso actúa la rifamicina, que inhibe la ARN polimerasa. La síntesis proteica (paso 5) es inhibida por la puromicina, que compite con los aminoácidos en la síntesis de los polipéptidos. Con la excepción de la rifamicina y de la puromicina, los otros compuestos mencionados son utilizados en la quimioterapia del cáncer. (Información cortesía del Prof. Ricardo R. Brentani y el Dr. Arnaldo Annes da Silva.)

EVENTOS BIOQUÍMICOS DE LA INTERFASE Durante mucho tiempo se había detectado en la interfase sólo la replicación del ADN, se pensaba en los otros períodos interfásicos como períodos de reposo celular. Hoy en día, se sabe que la interfase es una fase de intensa actividad metabólica; en esta no sólo acaece el continuo crecimiento de la célula, sino que también operan los mecanismos de control cruciales para el desarrollo coordinado de los ciclos de crecimiento, replicación y división celular. Como la síntesis de ADN es periódica en la interfase, ocupando casi exclusivamente el período S, las síntesis de ARN y proteínas se producen continuamente durante toda la interfase. Se detecta más tasa de síntesis de ARN en G1 y al inicio de S, cuando el 80% de los ARN sintetizados están representados por el ARN ribosomal (ARNr). A su vez, los ARN extra-nucleolares son sintetizados en picos durante los períodos G 1 y G2. En cuanto a la síntesis de proteínas, aunque continua, da como resultado proteínas cualitativamente diferentes que son sintetizadas en cantidades diferentes a cada período de la interfase. Pocas son las proteínas sintetizadas de forma continua a lo largo de la interfase. Este es el caso de sólo unas pocas enzimas y de las tubulinas, las cuales no aumentan bruscamente en ningún paso específico, ya que son recicladas entre el citoesqueleto y las fibras del huso durante la división celular. También es el caso una familia de proteínas llamada ciclina (véase más adelante) que se acumula continuamente durante la interfase. La síntesis de la mayoría de las enzimas sigue un patrón discontinuo, característico de cada enzima, cuya síntesis se produce en etapas específicas (aquellas enzimas más estables) o en picos (inestable).

Período G1

El período G1 se caracteriza por el reinicio de la síntesis de ARN y de proteínas, que se interrumpió durante la mitosis (período M). Con estas síntesis, la célula crece continuamente durante esta etapa, como sigue haciendo durante S y G2. Alrededor del 80% de ARN sintetizado en G1 es ARNr. Aunque algunas proteínas tienen picos de síntesis a lo largo de G 1; la mayoría de ellas, del total existente en la célula, se sintetiza de forma continua a lo largo de esta etapa. Si bien es lógico suponer que, en esta etapa, la célula se prepara para entrar en la fase de replicación del ADN, los pasos de esta preparación no fueron identificados específicamente, ya que los eventos moleculares de G 1 son poco conocidos. Sin embargo, la síntesis de algunas enzimas esenciales para la etapa del ciclo inmediatamente posterior, la fase S, como las enzimas catalizadoras de la síntesis de trifosfatos de desoxirribonucleótidos, enzimas de la síntesis de las ADN-polimerasas y enzimas activadoras de los genes que codifican las proteínas histonas, debe ocurrir durante este período, ya que aumentan en número en el inicio de la etapa S. La gran relevancia del período G1 se debe a su función controladora de una importante decisión celular: continuar proliferando o retirarse del ciclo y entrar en un estado de reposo (G0). Esta decisión está determinada principalmente por señales extracelulares (factores de crecimiento, en el caso de eucariotas superiores, y nutrientes, por ejemplo, en el caso de levadu-ras), que desencadenan diferentes respuestas intracelulares. Estas respuestas son a su vez monitoreadas por controladores internos del ciclo, constituidos por muchos componentes proteicos, que actúan induciendo o impidiendo la progresión del ciclo. Aunque presentes en la célula eucariota hace mil millones de años, sólo recientemente se identificaron estas proteínas reguladoras, y sus funciones reveladas. Estudios de la cinética del ciclo han demostrado que actúan en una serie de puntos de control durante

todo el ciclo. Uno de los puntos críticos de control estaría al final de G 1 y fue detectado inicialmente en la levadura, donde fue nombrado como start (en castellano, inicio). En las células animales, este punto de regulación se llama punto de restricción o punto R (Figura 9.2), y este punto sería reubicado sólo cuando las proteínas sintetizadas en G 1 sean acumuladas hasta que alcancen una cantidad crítica, permitiendo que posteriormente la célula transponga el punto R e inicie S. Una vez que ha pasado por el punto R, la célula está comprometida a entrar en la fase S y continuar hasta el final del ciclo de división, incluso en ausencia de estímulos adicionales. Otro mecanismo de control que se produce en G 1 es la interrumpción temporal del ciclo en esta fase, inducida por la presencia de daños en el ADN, de modo que los mecanismos de reparación operen antes de la fase de replicación. En células de mamíferos, o señal de parada en G1 está dada por una proteína conocida como p53 (sobre esto, véase también el capítulo 16), cuyos niveles intracelulares aumentan en respuesta a posibles daños en el ADN, lo que impide que la célula proceda y replique el ADN dañado. La transmisión de tales daños a las células hijas, que puede estar relacionada con la pérdida de las funciones de la p53, resulta en la acumulación de mutaciones y la inestabilidad del genoma, que contribuyen al desarrollo del cáncer. En varios tipos de cáncer humano, se observaron mutaciones de la p53, con pérdida de su función de señalización.

Período S

La iniciación de la síntesis del ADN marca el inicio del período S y, en la mayoría de los casos, es un punto de no retorno del ciclo, lo que necesariamente lleva a la división celular. Durante el período S, la célula replica su contenido de ADN (Figura 9.4), produciendo réplicas perfectas de las moléculas de ADN que contiene. Este proceso se denomina replicación. Toda célula eucariota diploide comienza su ciclo en G1 con una cantidad de ADN igual a 2C. Durante el período S, esa cantidad se duplica, de 2C a 4C, y permanece así hasta la fase del ciclo en la que se reparte por igual a las dos células hijas, las cuales vuelven a tener, nuevamente en G1, la misma cantidad 2C que la célula de origen (Figura 9.4). La replicación del ADN en células eucariotas guarda estrecha correspondencia con la replicación de las células procariotas. Por lo tanto, el mecanismo de la replicación del ADN se ha estudiado, preferiblemente, en las células más simples, tales como la bacteria Escherichia coli. Sin embargo, aunque los resultados obtenidos en esa célula procariota son, en esencia, también válidos para las células eucariotas, el proceso en eucariotas es mucho más complejo. Las células eucariotas tienen un enorme genoma, que debe ser duplicado con alta fidelidad una vez cada ciclo celular, y esto debe hacerse dentro de un corto período de tiempo, en las pocas horas ocupadas por el período S. Agregado a esto el hecho de que, en células eucariotas, el ADN nuclear se presenta en forma de fibras de cromatina (descritas en el Capítulo 8), formando un complejo con las proteínas histonas. Por lo tanto, es la cromatina la que debe sufrir duplicación en el período S, lo que requiere que no sólo el contenido de ADN sea duplicado, sino también la cantidad de las histonas. Contrariamente a lo que ocurre con todas las otras proteínas celulares, las histonas son las únicas proteínas cuya síntesis se limita a la fase S, lo que ocurre simultáneamente con la síntesis de ADN. En este período, se observan también los principios o primordios de los nuevos centríolos (llamados pro-centriolos), los cuales se alinean formando ángulos rectos con cada miembro de la pareja de centríolos existente en las células.

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Figura 9.4 Evolución del contenido de ADN (C) en el núdeo de una célula a través del ciclo celular. En la fase S se produce la duplicación de la cantidad de ADN, que permanece así durante la fase G2. Sólo en la mitosis (M) se restablece el contenido inicial.

LA REPLICACIÓN DEL ADN ES SEMICONSERVADORA Basado en el modelo de la molécula de ADN propuesto por Watson y Crick, el mecanismo básico de la replicación implica la separación de las hebras de ADN, obtenidas por el desenrollamiento de la doble hélice, seguido de una copia de cada hebra, que sirve como un molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria (Figura 9.5). La secuencia de nucleótidos de la nueva cadena está fijada bajo las reglas de pareamiento de bases, propuestas por Watson y Crick y previamente descritos en el capítulo 3. El pareamiento correcto de las bases asegura una réplica exacta de la doble hélice original. Durante la replicación, las dos cadenas del ADN original, también llamadas parentales, se copian, produciendo dos moléculas hijas, cada una con sólo

una de las cadenas recién sintetizadas. Se dice, pues, que la replicación es semiconservativa. Así, cada nueva molécula de ADN es una copia perfecta de una molécula preexistente. La replicación semiconservativa del ADN puede ser estudiada por autorradiografía, utilizándose H 3-timidina. Sin embargo, puede estudiarse usando un análogo estructural de la timidina, 5'-bromo-desoxiuridina, que se incorpora al ADN para sustituir esa base en el momento de la replicación. La presencia de este análogo en la molécula de ADN puede ser detectada por tinción diferencial de las cromátidas hermanas en los cromosomas que llegan a la segunda mitosis después de la incorporación (Figura 9.6).

Figura 9.6 Microfotografía de cromosomas de células tratadas con bromo-desoxiuridina (BrdU) durante una fase replicativa. Este compuesto entra en la molécula de ADN, en lugar de la timidina, modificando la afinidad tintorial del cromosoma, y dando como resultado, en la segunda mitosis, en cromosomas constituidos por una cromátida fuertemente coloreada y otra que se tiñe muy débilmente. Esta tinción diferencial entre las cromátides hermanas refleja la diferencia de incorporación de BrdU entre ellas y confirma que la replicación del ADN es semiconservativa. La microfotografía muestra, también, los intercambios entre las cromátidas hermanas, que pueden ocurrir durante la replicación. (Cortesía de Wolff, S. y Perry, P. Chromosoma, 48: 341,1974.)

Figura 9.5 Representación simplificada de la replicación semiconservativa del ADN. La doble hélice de ADN se abre después de haber sido desenrollada. Dos nuevas cadenas se forman como secuencias de nucleótidos complementarias a cada una de las cadenas de la molécula de ADN original. Por este mecanismo, una cadena sirve de molde, dictando la secuencia complementaria de su cadena hija. En las dos moléculas que se forman, una cadena es parental y la otra es nueva. La ubicación de la apertura de la molécula original de ADN se llama horquilla de replicación y está indicada por la flecha corta.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIÓN DEL ADN

La replicación es asincrónica

Un análisis detallado de la replicación del ADN demostró que la incorporación de precursores marcados, sea H 3-timidina o un análogo de la timidina, bromo-desoxiuridina, no se produce simultáneamente en todas las moléculas de ADN de un núcleo y que, dentro de una misma molécula, existe un patrón determinado de secuencia de síntesis; por eso se dice que la replicación del ADN es asíncrona. Dentro de un determinado tipo celular, tanto las regiones específicas del material genético, como los genes individuales, pueden comenzar y terminar su duplicación en momentos definidos en la fase S. La eucromatina, que es la cromatina genéticamente activa, comienza a replicar primero haciéndolo desde el inicio de la fase S, mientras que la heterocromatina suele ser la última en replicar al final del período S, siendo considerada, por lo tanto, de replicación tardía.

Existen orígenes de replicación

La velocidad de la duplicación del ADN se calcula alrededor de 30 mm por minuto, en la Escherichia coli, y de 0,5 a 2,0 mm por minuto (o incluso 3.000 bases / min) en los núcleos de las células eucariotas de los vertebrados. Con esta velocidad, si el proceso se iniciase en un extremo de la molécula de ADN y terminase en el otro extremo, el genoma de los vertebrados tardaría un tiempo muy largo para su replicación. Se estima que se necesitaría un mes para replicar un cromosoma humano. Eso realmente no sucede, y fue posible demostrar que, si bien en las células procariotas la molécula de ADN inicia la replicación en un solo lugar, llamado origen de

replicación en las células eucariotas existen múltiples orígenes. Por lo tanto, estas células han resuelto el problema de replicar su enorme genoma en el corto espacio de tiempo de S y superar la lenta velocidad de replicación. El número de orígenes de replicación depende del organismo, del tipo celular y está regulado durante el desarrollo. Este número puede ser de un origen cada 3 o 300 kpb (3 mil o 300 mil pares de bases.) Por ejemplo, en un cromosoma humano promedio hay al menos 200 puntos de origen. Como muchos genes activos replican en el inicio de la fase S, es posible que el papel de los orígenes de replicación específicos sea el de coordinar la replicación del ADN con la transcripción de los genes. Las células eucariotas, para iniciar la replicación en varios orígenes, tienen para ello muchas unidades de replicación distribuidas por todo el genoma, las que se denominan replicones. En cada núcleo de células de mamíferos hay de 20.000 a 30.000 replicones. Las unidades de replicación que inician simultáneamente la síntesis de ADN constituyen las llamadas familias de replicones (en inglés replicon clusters ), y diferentes familias de estas inician en diferentes tiempos. Cabe resaltar que, en cada fase replicativa, todas las unidades de replicación del genoma nuclear son replicadas, y que cada replicón se replica sólo una vez, dentro de un solo periodo S. Un complejo enzimático aislado a partir de levaduras, llamado complejo de reconocimiento de origen (ORC, en inglés), se une a los orígenes de replicación y señaliza para que otras proteínas reguladoras vengan a unirse también. Entre estas proteínas, está un gran complejo proteico, el complejo pre-replicativo o pre-RC.

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Cuando el complejo pre-RC se une a un origen de replicación, el complejo ORC es fosforilado y es iniciado el proceso de replicación. Después que tuvo lugar la replicación, el complejo pre-RC se desune del origen de replicación, impidiendo otra lectura del mismo origen.

La replicación es bidireccional

Una vez iniciada la replicación en cada punto de origen, esta se propaga a ambos lados de la molécula de ADN, es decir, en ambas direcciones, hasta encontrar, en cualquier punto, los extremos de las cadenas en formación de los replicones adyacentes. A este movimiento para los lados opuestos se lo denomina replicación bidireccional. Los estudios radioautográficos al microscopio electrónico del cromosoma de E. coli en división, mostraron que la incorporación de timidina tritiada se produce principalmente donde se separan las dos hebras de ADN de la doble hélice. Estos lugares tienen la forma de la letra Y y se llaman horquillas de replicación (Figura 9.5). La replicación bidireccional involucra dos horquillas de replicación, que se mueven en direcciones opuestas.

La replicación es semidiscontinua

La autorradiografía también demostró que las dos hebras parentales de la doble hélice serán replicadas en cada horquilla de replicación que avanza. Como veremos más adelante, la enzima responsable de la polimerización de los desoxirribonucleótidos en la síntesis de ADN, la ADN polimerasa, polimeriza sólo en la dirección 5' → 3', y luego, ambas cadenas hijas deben ser sintetizadas en la dirección 5'→ 3'. Pero, como se explicó en el capítulo 3, las dos cadenas de ADN de la doble hélice son antiparalelas, es decir, una de ellas tiene la dirección 5' → 3' y la otra la dirección opuesta, 3’ → 5’. Si las dos cadenas son antiparalelas, surge la pregunta, ¿Cómo pueden ser polimerizadas simultáneamente y la horquilla de replicación avanzar en un único sentido? Parece claro que las formas de sintetizar las dos cadenas hijas son diferentes, siguiendo un patrón de replicación semidescontinuo. Sucede que, tomando como referencia a la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, la copia de la cadena parental 3' → 5’ se puede sintetizar de forma continua. Esta cadena hija, que avanza en la dirección 5’→ 3', recibe el nombre de cadena líder o cadena continua (en inglés, leading strand). La otra cadena parental, 5' → 3' se debe copiar de forma intermitente, discontinua, mediante síntesis de una serie de fragmentos, que, después de unidos, dan origen a una cadena llamada cadena retardada o cadena discontinua (en inglés, lagging strand), como se indica en la Figura 9.7. Los fragmentos de cadena discontinua fueron llamados fragmentos de Okazaki (nombre del investigador que los describió, en 1968) y son cadenas cortas con una longitud aproximadamente constante de 1000 a 2000 nucleótidos en E. coli y de 200 a 300 nucleótidos en células eucariotas.

La replicación del ADN es realizada por enzimas

Tanto las células procariotas como eucariotas tienen enzimas conocidas como ADN polimerasas (DNApol) capaces de Sintetizar ADN a partir de sus precursores. Para catalizar esta síntesis, los precursores de ADN deben estar presentes en la forma de desoxirribonucleótidos trifosfatos. Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatos necesarios para la síntesis de ADN son dATP, dCTP, dTTP y dGTP, que contienen las bases adenina (A), citosina (C), timina (T) y guanina (G), respectivamente. Además de ser moléculas estructurales, tales desoxirribonucleótidos proporcionan energía para la síntesis de nuevas cadenas de ADN porque, ya que son precursores trifosfatados, pero cuando son incorporados en la nueva cadena de ADN, están solo en la forma de monofosfatos. La ruptura de las uniones fosfato excedentes proporciona la energía necesaria para la síntesis de ADN. Simultáneamente, se libera fosfato inorgánico. Todas las ADN polimerasas descubiertas hasta la fecha cumplen con las siguientes propiedades:  cada desoxirribonucleótido a ser incorporado se selecciona de manera que su base nitrogenada seacomplementaria y pueda entonces parear con las bases de la cadena molde, siempre haciendo pareamientos AT y GC. Por lo tanto, la secuencia de bases en la nueva molécula de ADN depende únicamente de la secuencia existente en la molécula antigua  El crecimiento de la cadena se produce siempre en la dirección 5' → 3', es decir, la enzima siempre añade un monofosfato desoxirribonucleótido (con el fosfato unido al carbono que ocupa la posición 5’ de la pentosa - C5') a una C3’ libre de un nucleótido preexistente  las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de novo, todas requieren un segmento inicial de nucleótidos (llamado primer) para dar continuidad a la cadena. Sólo pueden alargar las cadenas preexistentes y no pueden unirse dos desoxirribonucleótidos por la formación inicial de un puente fosfodiéster. En E. coli, la enzima clave en la replicación del ADN es la ADN polimerasa III (pol III), de las cuales sólo hay 10 moléculas por célula. La ADN polimerasa I (300 a 400 moléculas por célula) y la ADN polimerasa II (40 moléculas por célula) son más abundantes en la célula, una vez que tienen funciones adicionales, sea en el proceso de reparación del ADN, o como exo nucleasas mediante la eliminación de nucleótidos ya incorporados. Las células eucariotas tienen al menos cuatro ADN polimerasas localizadas en el núcleo. Las ADN polimerasas α y  (letras griegas alfa y delta, respectivamente) son responsables de la replicación del ADN nuclear y corresponden a la polimerasa III de E. coli. Durante la replicación del ADN nuclear, parece que estas dos enzimas, en una conformación dimérica,

llevan a cabo sus funciones de forma simultánea. Debido a sus características particulares, presumiblemente, la pol  replica la cadena continua, mientras que la pol  replica de una manera discontinua a otra cadena, la retardada. La polimerasa ε ( epsilon) parece estar relacionada con los mecanismos de reparación, aunque su función precisa sigue siendo incierta. La cuarta enzima de localización nuclear, la ADN polimerasa β (beta) es pequeña y actúa en el proceso de reparación. Además, existe la polimerasa γ (gamma), la cual es responsable de la replicación del ADN en las mitocondrias.

Otras enzimas están involucradas en la replicación

Para que tenga lugar el proceso de replicación, son necesarias muchas otras enzimas con funciones específicas además de las ADN polimerasas (Figura 9.8). Inicialmente, es necesario desenrollar las vueltas de la doble hélice de ADN para exponer los moldes de una sola hebra a la acción de la polimerasa, un problema más complejo en la cromatina de las células eucariotas, pero también existente en el ADN circular en espiral de la célula procariota. El desenrollado de la doble hélice es realizado por la enzima helicasa, que trabaja en cada hoquilla de replicación, por delante de la polimerasa, desenrollando progresivamente las hebras en ambas direcciones. La unión de la helicasa sólo se produce después de la acción de una proteína llamada DnaA, que inicialmente causa la separación de las cadenas en los orígenes de replicación. Debido a que ambas cadenas de ADN de la molécula original están firmemente ligadas gracias a los numerosos puentes de hidrógeno entre sus bases (Capítulo 3), el proceso de desenrollamiento también implica la ruptura de los enlaces puentes de hidrógeno, para separar las dos hebras de la doble hélice que serán copiadas. En este proceso también actúa la helicasa, consumiendo energía proporcionada por el ATP. Entonces, la porción desenrollada del ADN debe ser estabilizada, lo que se realiza con la participación de proteínas específicas, las proteínas SSP (single strand proteins) que, mediante la unión a regiones de cadenas de ADN individuales, mantienen los filamentos separados, mientras que se procesa la replicación. Estas proteínas impiden que los enlaces puente de hidrógeno entre las bases se rehagan, después de ser deshechas por la helicasa; preveniendo que estas regiones sufran torceduras, aparte de proteger los filamentos simples de una eventual degradación por parte de las nucleasas (Figura 9.8). Dada las características de la molécula de ADN, sin embargo, el desenrollamiento de la doble hélice en el punto de origen conduce a un superenrollamiento positivo del ADN más adelante, y estos giros adicionales en la hélice se acentúan aún más a medida que la horquilla de replicación aumenta de tamaño. Para evitar que este superenrollamiento ocurra, entran en juego las enzimas denominadas ADN topoisomerasas, entre las cuales hay dos tipos que se conocen como ADN girasa. Estas enzimas, para relajar el estrés por contorsión impuesto por el desenrollamiento, introducen pausas, seguidas de reuniones de enlaces fosfodiéster en la molécula de ADN; sus acciones también consumen energía suministrada por el ATP. Como se mencionó anteriormente, las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de ADN sin la ayuda de una pequeña secuencia inicial o primer, ya que sólo es capaz de añadir nucleótidos a un polinucleotídio preexistente (Figura 9.8). Estos primers son segmentos cortos de ARN, con 1 a 60 nucleótidos de longitud, dependiendo de la especie (E. coli tiene aproximadamente 5 nucleótidos, por ejemplo), cuya secuencia es complementaria a la forma natural del ADN molde. Los primers que forman parte de los pequeños fragmentos de Okazaki de la cadena discontinua son producidos por la acción de una ARN polimerasa particular, llamada primasa. En las células eucariotas, la actividad primasa se encuentra en las subunidades de la propia ADN polimerasa α, pero el primer para la cadena continua de ADN es sintetizado por la ARN polimerasa, que en general sintetiza ARN en la transcripción. En ambos casos, la ADN polimerasa (a III, en procariotas, y la DNA polimerasa α y  en eucariotas), cataliza la extensión del primer, formando, siempre en la dirección 5' → 3', una cadena de ADN que contiene un segmento inicial corto de ARN. Posteriormente, mediante la acción de otras ADN polimerasas, que muestran actividad exonucleasa 5', los primers de ARN se eliminados y sustituidos por desoxirribonucleótidos. Los fragmentos ahora completos son finalmente unidos por otra enzima llamada ADN ligasa.

La replicación y la reorganización de la fibra de cromatina

En las células eucariotas, como el ADN está unido a proteínas, formando la cromatina, no sólo el ADN debe ser replicado en la fase S, sino también las histonas, como ya se mencionó. El proceso de replicación consiste en el paso del conjunto de enzimas de replicación a través de la molécula de ADN, que se presenta organizada en nucleosomas. La fibra nucleosomal ciertamente se interrumpe durante este paso, pero no se sabe si en ese momento, las histonas están completamente separadas del ADN. El montaje del ADN recién duplicado en nucleosomas parece ocurrir justo detrás de la horquilla de replicación, de modo que a medida que esta avanza, la fibra nucleosomal va siendo inmediatamente reestructurada en las dos nuevas moléculas de ADN nacientes. Este montaje está mediado por proteínas específicas que se unen a histonas nucleosomales y las transfieren al ADN, produciéndose primariamente la asociación de los tetrámeros de histonas H3 y H4, seguida de la asociación de dímeros de H2A y H2B. Estos nucleosomas se forman tanto a partir de histonas recién sintetizadas en S como de histonas provenientes de la desintegración de los nucleosomas preexistentes, en una combinación al azar.

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Figura 9.7 Modelo de replicación semidiscontinuo del ADN. Debido a la característica de la ADN polimerasa, las dos cadenas nuevas deben ser sintetizadas en la dirección 5' → 3'. Así, en A, la cadena que usa como molde la hebra 3' → 5' es sintetizada de forma continua (también llamada cadena líder) y la otra hebra parental, la 5' → 3', es copiada de una manera discontinua, por medio de la síntesis de una serie de segmentos de nucleótidos denominados fragmentos de Okazaki. La cadena sintetizada por los fragmentos recibe el nombre de cadena discontinua o de cadena retardada. Los fragmentos de Okazaki son posteriormente sustituidos en parte y unidos por la ADN ligasa para formar una cadena ininterrumpida. B, se observa que las dos nuevas cadenas son polimerizadas por la misma ADN polimerasa dimérica, lo que obliga a la cadena parental 5' → 3' a enrrollarse, asumiendo la llamada forma de trombón. Esta disposición facilita la adición de un nuevo 5'-nucleótidos al extremo 3'-OH de ambas cadenas nacientes.

Figura 9.8 Esquema que muestra las enzimas que participan en la replicación del ADN en cada horquilla de replicación. La doble hélice es desenrollada por la acción de la helicasa ayudada por la topoisomerasa, y las cadenas simples son cubiertas por las proteínas SSP, que estabilizan esta configuración abierta. La ADN polimerasa puede actuar directamente polimerizando la cadena continua. En la cadena discontinua, opera después de la síntesis de pequeños segmentos iniciadores de ARN (primers de ARN) realizados por la ARN polimerasa. Posteriormente, los primers son removidos por otra ADN polimerasa con actividad de exonucleasa, el espacio se llena y la molécula es unida por la ADN ligasa.

LAS CÉLULAS PRESENTAN MECANISMOS PARA MANTENER LA INTEGRIDAD DE SU ADN Aunque compleja, la replicación del ADN es extremadamente precisa, se estima que sólo un error sea cometido en la replicación de 108 bases. Esta precisión se debe principalmente a una propiedad especial de la ADN polimerasa: es capaz de controlar las bases, a medida que las adiciona a la nueva cadena de ADN. Esta característica de la enzima ADN polimerasa se llama "corrección de pruebas" (del inglés, proofreading), la ADN polimerasa controla las bases añadidas e inmediatamente elimina una base errónea, antes de seguir con la síntesis de la cadena de ADN. Sería como una corrección tipográfica en la que la letra equivocada se corrige antes que finalice la palabra entera. Sin embargo, aún así, algunas bases incorrectamente emparejadas consiguen escapar de esa corrección de pruebas, y el ADN puede salir con defectos de esta replicación, haciendo que no tenga una fidelidad absoluta. Por otra parte, las macromoléculas biológicas son susceptibles a cambios químicos que surgen de errores durante la síntesis, o incluso la exposición a factores ambientales perjudiciales. El ADN sufre la acción de agentes físicos y muchos agentes químicos, algunos que normalmente se producen en la propia célula. Los rayos cósmicos y otras radiaciones con una gran cantidad de energía pueden causar lesiones por acción directa sobre el ADN, como los cambios en las bases o ruptura de la doble cadena. También pueden actuar indirectamente sobre el ADN, debido a que inducen la aparición de iones superóxido, químicamente muy activos. La radiación ultravioleta solar, aunque tenga mucho menos energía, también puede causar alteraciones tales como la formación de dímeros de timina adyacentes a la cadena de ADN. Las células tienen varios sistemas generales para proteger su ADN y otras moléculas. Los iones superóxido, por ejemplo, son destruidos por la enzima superóxido dismutasa. Los iones H + se neutralizan mediante sistemas de regulación ácido-base y de las oxidaciones intracelulares son reducidas por varios sistemas reductores, tales como el NADPH 2, el glutatión y la vitamina E. Los daños producidos al ADN son particularmente graves debido a que el ADN es el material genético que contiene toda la información para la estructura y las actividades celulares. La alteración del ADN de una célula somática se transmite a las células hijas, pudiendo formar un clon de células modificadas. Cuando se producen alteraciones en el ADN de una célula germinal (óvulo, espermatozoide o sus respectivos precursores), pueden transmitirse a las futuras generaciones de organismos afectados, siendo sus efectos aún más perjudiciales para la especie. Debido a esta

importancia, además de la alta fidelidad en el proceso de síntesis, el ADN es la única molécula que, si está dañada, puede ser reparada por la célula. Los mecanismos de reparación son muy diversificados, y por lo tanto aumenta la eficiencia en el tipo de lesión presente en el ADN. La reparación del ADN dañado se realiza en dos etapas: la primera, específica para cada tipo de defecto, y la segunda, de carácter general, igual en todos los casos. La primera etapa es la identificación de la alteración y la eliminación de la parte defectuosa de la molécula. Esta fase hace uso de varios mecanismos para identificar los diferentes defectos y cortar a través de endonucleasas (enzimas que cortan fragmentos de la parte central de la molécula de ADN), el segmento erróneo de ADN. En la segunda etapa, el segmento eliminado es sustituido por un segmento de ADN correcto (Figura 9.9). De hecho, cuando se colocan las células en presencia de un precursor de ADN radiactivo tal como la H 3-timidina, se observa que este es incorporado en las células interfásicos principalmente durante el período S; pero también se detecta una pequeña incorporación a lo largo de períodos no sintéticos, probablemente relacionada con estos procesos de reparación del ADN que requieren un cierto nivel de síntesis. La importancia biológica de la reparación del ADN puede ser evaluada tanto por el número de genes implicados en el proceso como por las consecuencias para los organismos que tienen células incapaces de reparar su ADN. Ejemplo de lo primero son las células de levadura, que tienen más de 50 genes diferentes cuyos productos (proteínas, enzimas) participan en el proceso de reparación del ADN. Ejemplo de este último está dado por los pacientes con la enfermedad hereditaria xeroderma pigmentosum, que presentan defectos en al menos siete productos génicos implicados en la reparación del ADN. Las víctimas de esta enfermedad son extremadamente sensibles a la radiación ultravioleta del sol y tienen lesiones cutáneas graves y cáncer de piel, incluso con exposiciones cortas a la luz solar. En el xeroderma pigmentosum, las células no son capaces de corregir la dimerización de las bases pirimidínicas producidas por la acción de la radiación ultravioleta.

Período G2

En el período G2 ocurren los preparativos necesarios para la siguiente mitosis, pero no todos son conocidos. Se sabe, sin embargo, que antes de que la célula pase a través del punto de transición G2/M, es críticamente importante que la replicación se haya completado y que posibles daños en el ADN hayan sido completamente reparados. Uno de los puntos de control del ciclo celular mejor definidos se produce en G2, la célula en la que ña célula se mantiene hasta que la totalidad de su genoma sea completamente replicado y reparado antes de ser repartido y transmitido a cada célula

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hija. Hay mecanismos sensores, de naturaleza molecular aún desconocida, que detectan cualquier anomalía en la replicación envian señales negativas al sistema de control del ciclo mediante el bloqueo de la activación de las moléculas que desencadenan la entrada en la mitosis. En este período aún son sintetizadas las proteínas no histónicas, que se unirán a los cromosomas durante su condensación en la mitosis. También se produce la acumulación de un complejo proteico citoplasmático, el dímero denominado complejo ciclina-Cdk (Cdk, del inglés cyclindependent kinases), que es importante en el control de todo el ciclo. Se le

considera el regulador general de la transición de G2 para M, induciendo la entrada en mitosis y siendo responsable de cuatro eventos típicos de esta fase: la condensación cromosómica, la ruptura de la envoltura nuclear, el montaje del huso y la degradación de la proteína ciclina. Los detalles sobre el complejo ciclina-Cdk y sus mecanismos de acción se verán más adelante, en el ítem Control Genético del Ciclo Celular. También durante G2, se produce la síntesis de ARN, sobre todo los extranucleolares, y continúa la síntesis general de proteínas iniciada en el periodo G1. Estos procesos sintéticos son interrumpidos sólo en el período siguiente, la mitosis. MITOSIS: LA DIVISIÓN DEL NÚCLEO ES SEGUIDA POR LA DIVISIÓN CITOPLASMÁTICA La división celular es el período en el que la célula reparte igualmente su contenido, ya duplicado en la interfase, en dos células, llamadas células hijas. Este período incluye esencialmente dos procesos: el reparto exacto del material nuclear, llamado en el sentido estricto, mitosis (del griego mitos, tejido, originalmente hilo o filamento, y el sufijo –osis: formación, impulso o conversión) o cariocinesis (Kario, núcleo y kinesis, movimiento), y la división citoplasmática o citocinesis (kitos, célula). En un sentido amplio, sin embargo, es habitual identificar la mitosis como la propia división celular. Para facilitar su estudio, la mitosis se divide en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase (Figuras 9.10 y 9.11).

Figura 9.9 Secuencia de los procedimientos en un caso de reparación del ADN. Una base dañada o erróneamente incorporada es eliminada por acción de enzimas que dejan el sitio apurínico o apirimidínico, llamado el sitio AP. Debido a la acción de otras enzimas, el sitio AP y varios nucleótidos adyacentes son eliminados de la molécula. La brecha es llenada por la síntesis y unión del nuevo segmento en su posición original. El fenómeno de la reparación del ADN explica la posibilidad de que exista una pequeña síntesis de ADN en las células que no se están dividiendo.

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Figura 9.10 Esquemas de las etapas de profase, metafase y anafase, destacando las principales características de estos períodos de la mitosis. El nucleolo está representado con sus comp onentes: CF, centro fibrilar, CFD, componente fibrilar denso y CG, componente granular. En la anafase, se observan los NDF, brotes derivados del antiguo nucléolo.

Figura 9-11 Imágenes obtenidas en un microscopio confocal láser de barrido de células cultivadas y teñidas por el ioduro de propidio en diferentes fases del ciclo celular. Gran aumento. A, profase; B, metafase; C, anafase; D, telofase inicial, en donde es visible un puente cromosómico, lo que representa una alteración mitótica; E, telofase final; F, células en interfase. (Cortesía de Renata Manelli-Oliveira y Profa Gláucia M. Machado-Santelli. Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de São Paulo.)

Profase

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La profase (pro, primera) se caracteriza por la condensación progresiva de las fibras de cromatina, inicialmente con 30 nm de diámetro y muy alargadas en el núcleo, que van gradualmente volviéndose más gruesas y más cortas, hasta formar cromosomas. Estos llegan a lograr un nivel de condensación de aproximadamente 1000 veces al estado en que la fibra de cromatina se presenta en la interfase. El proceso toma los cromosomas visiblemente individualizados (Figura 9.11) y claramente compuestos de sus dos miembros longitudinales idénticos, las cromátidas, las que llevan el material genético duplicado en la interfase anterior. Las dos cromátidas de un cromosoma son mantenidas unidas en la región centromérica, desde la replicación hasta la anafase, por puentes formados por un complejo de proteínas llamadas cohesinas (capítulo 8, Figura 8.21). La condensación cromosómica es esencial para evitar enredos o desorganización del material genético durante su distribución a las células hijas. En este proceso participan las proteínas condensinas las que, como se ha visto en el capítulo 8 (Figura 8.21), tienen una estructura similar a las cohesinas y son responsables de establecer las asas que comprimen el cromosoma. La condensación es inducida por el complejo ciclina-Cdk, el cual, cuando está activado, fosforila a las condensinas. Las condensinas fosforiladas, a su vez, se unen a la cromatina y promueven la condensación progresiva de las fibras, hasta formar los cromosomas. Varias líneas de evidencia indican que la fosforilación de las histonas H1 y H3, por el complejo ciclina-Cdk (que depende de la actividad de la quinasa denominada Aurora B) también contribuye al proceso de condensación. En consecuencia de la condensación progresiva y también de la ciclina-Cdk, que fosforila componentes del complejo de transcripción, la cromatina se va tornando inactiva, dejando de transcribir ARN, hasta que finalmente las síntesis de ARNm y de ARNr paran y la de ARNt se reduce considerablemente. Con la interrupción de la transcripción del ARNr nuevas moléculas constituyentes de la región fibrilar del nucléolo dejan de ser sintetizadas. Las ya existentes (transcripciones nacientes) se completan de forma progresiva y se combinan a los elementos de la región del componente fibrilar denso (CFD) del nucléolo. Si bien los factores de transcripción permanecen unidos a las regiones organizadoras del nucléolo (NOR) durante la mitosis, algunas subunidades de ARN pol I se disocian temporalmente de las NOR y dejan el centro fibrilar (CF) del nucléolo. Al final de la profase, cuando la cromatina se vuelve más condensada, factores de procesamiento del ARNr (tales como, por ejemplo, fibrilarina y B23, respectivamente del CFD y del componente granular, CG) y los ARN pre-ribosomales parcialmente procesados (pre-ARNr), que se habían sido asociado con el CFD dejan simultáneamente el nucléolo. Estos pasan al citoplasma y se dispersan o cubren la superficie de los filamentos cromosómicos en condensación y permanecen próximos a estos constituyendo una región pericromosómica. Por lo tanto, los nucléolos están desorganizados en esta etapa y se vuelven a organizar en la telofase. Mientras tanto, en el citoplasma, los centrosomas actúan en la formación del huso como centros nucleadores de la polimerización de tubulina en microtúbulos. Los centrosomas son estructuras que en las células animales, están constituidos por un par de centríolos (llamado diplosoma) y un material pericentriolar amorfo y electrodenso, a partir del cual emanan fibras de microtúbulos radiales. Los centrosomas más las fibras radiales componen el llamado áster. La mayoría de las células vegetales y muchos eucariotas unicelulares como Amoeba proteus, no tienen centriolos ni fibras del áster en sus centrosomas. Estas últimas células, sin embargo, se caracterizan por tener una mitosis anastral, mientras que las demás tienen la llamada mitosis astral. En ambos casos, en esta etapa hay dos centrosomas en el citoplasma, debido a que ya han sido duplicados en la interfase, los que migran a los polos opuestos de la célula. A medida que se alejan, entre ellos se polimerizan microtúbulos, utilizando moléculas de tubulina liberadas en el desmantelamiento del citoqueleto de la célula interfásica (Figura 9.10). Haces de microtúbulos formarán las fibras del huso. Cabe resaltar que algunos organismos unicelulares eucariotas tales como levaduras, hongos filamentosos y algunos protistas, siguen un tipo de

división llamado mitosis cerrada, en el que la envoltura nuclear se mantiene intacta y el huso se forma en el interior del núcleo. En eucariotas superiores, sin embargo, la mitosis es generalmente abierta, caracterizada por la desintegración completa de la envoltura nuclear para permitir el acceso de los microtúbulos del huso a los cromosomas. Entonces, física y temporalmente coordinada con otros eventos del ciclo, cuando los cromosomas están casi en la etapa final de condensación y los centrosomas ocupan posiciones opuestas, ocurre el desmontaje de la envoltura nuclear, que implica cambios de todos los componentes ya mencionados en el capítulo 8. Las membranas nucleares se rompen en varios puntos simultáneamente, originando vesículas membranosas, morfológicamente similares a las vesículas del retículo endoplásmico, que se dispersan en el citoplasma; Los complejos de poro nuclear se disocian y la lámina nuclear se despolimeriza. Aún no está claro lo que provoca la fragmentación de la envoltura nuclear, y varios mecanismos parecen contribuir a ello. En algunas especies, se propone que se inicie con el desmontaje de los complejos de poro nuclear que se correlaciona con los cambios previos en la permeabilidad de los poros. En otros casos, se observa que nucleoporinas presentes en ambos lados de los poros nucleares atraen el complejo COP I (coatómeros que promueve la formación de vesículas; se describe más adelante en el capítulo 10) y su concentración más alta podría cambiar la forma de la envoltura nuclear en vesículas. Por otra parte, las interacciones de los microtúbulos de los centrosomas con la envoltura nuclear generan fuerzas mecánicas que contribuyen a la ruptura de las laminas en un movimiento mediado por la dineína; pero la fosforilación de las proteínas intrínsecas de la membrana nuclear, tales como la gp210, y de las diferentes proteínas laminas es un factor crucial para el desmantelamiento de la envoltura. Esta fosforilación es llevada a cabo por el complejo ciclina-Cdk quinasas y por varias quinasas. Las laminas fosforiladas se disocian en dímeros de laminas libres, llevando al desmantelamiento de la lámina nuclear. En consecuencia, las membranas nucleares se fragmentan en vesículas. Con la ruptura de la envoltura nuclear, algunos microtúbulos se unen a los cinetocoros, que a la altura de los centrómeros de los cromosomas, ahora se presentan maduros. Estos se llaman ahora microtúbulos cinetocóricos (Figura 9.12). Ellos son responsables de dirigir los cromosomas a la región ecuatorial da célula. Estos acontecimientos recientes de la profase, desde la ruptura de la envoltura nuclear, son considerados por muchos autores como pertenecientes a una fase distinta, que denominan prometafase.

Metafase

En la metafase (meta, mitad), los cromosomas alcanzan un estado avanzado de condensación y por lo tanto es el momento en que las dos cromátidas se hacen realmente visibles bajo un microscopio óptico. El inicio de esta fase se define por la terminación de la alineación de los cromosomas de la en la región ecuatorial de la célula, formando la llamada placa metafásica (Figura 9.11B). Los cromosomas se mantienen en esa posición durante un corto período de tiempo por fuerzas que se distribuyen por igual entre los dos polos celulares ejercidas por los microtúbulos del huso. El huso es, en realidad, dos hemihusos (Figuras 9.10 y 9.13). Estos se componen de tres tipos de fibras: las polares que parten desde los centrosomas situados en los dos polos opuestos y que se interdigitan en la región central de la célula, sin alcanzar el polo opuesto; las cinetocóricas, que unen cada cromosoma a los dos polos opuestos; y las fibras libres, más cortas y no unidas a los polos o a los cinetocoros, de origen y función desconocida. En esta fase, la superficie de los cromosomas, excepto los centrómeros, está cubierta por una capa de espesor desigual, la región pericromosómica, constituida por componentes del procesamiento de ARNr. De la vieja envoltura nuclear, se cree que la mayoría de los complejos de nucleoporinas solubles y las laminas se distribuyen en el citoplasma y que todas las proteínas transmembrana han sido desplazadas a los túbulos del retículo endoplasmático (RE). Se observa que el RE se muestra, en esta y en la siguiente fase de la mitosis, como una densa y dinámica red de túbulos y no en cisternas aplanadas como se observa en la interfase.

Figura 9.12 Figura 9.13 Figura 9.12 Cromosomas de célula humana en metafase de la mitosis. Observe la estructura densa de los cromosomas en comparación con el citoplasma. Haces de microtúbulos (Mt) se insertan los cinetocoros (C) situados en los centrómeros. Debajo (flechas), un haz de microtúbulos polares, que pasan a través de la placa de cromosomas y se unen a los polos. 1.000.000 x de aumento. (Cortesía de R. McIntosh.) Figura 9.13 Corte longitudinal de espermatocito en la metafase. Observe los dos centriolos de cada polo, los microtúbulos que forman el huso mitótico y los cro mosomas agrupados en el

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ecuador de la célula. En el citoplasma, alrededor, mitocondrias y retículo endoplásmico liso. Aumento: 30.000 x. (Cortesía de R. McIntosh.)

Anafase

En la anafase (ana, movimiento) comienzan los eventos finales de la mitosis, cuando ocurre la ruptura del equilibrio metafísico, con la separación y la migración de las cromátidas hermanas, que ahora se llaman cromosomas hijos (Figura 9.11C). Esta liberación de las cromátidas hermanas, que permite su segregación, proviene de la degradación de de la cohesina centromérica por una proteasa llamada separasa. Durante la migración, los microtúbulos de las fibras cinetocóricas se acortan, por la pérdida de dímeros de tubulina en los extremos polares, y así reunen a los cromosomas hijos de los polos. Al mismo tiempo, se añaden moléculas de tubulina en el extremo distal (libre) de los microtúbulos polares, que crecen al aumentar la distancia entre los polos (Figura 9.10). Al mismo tiempo, y al parecer, con ayuda a otras proteínas motoras, tales como la dineína, se produce un deslizamiento entre las fibras polares del huso, que están interdigitadas en la porción central. Aunque el mecanismo de migración es objeto de mucha especulación, no hay duda de que su movimiento depende de los microtúbulos, ya que cuando estos no son polimerizados o son despolimerizados por agentes antimitóticos tales como colchicina o vinblastina, las mitosis se estacionan en la metafase. En cuanto a los elementos del antiguo nucléolo (proteínas de procesamiento inicial y tardío del ARNr, snoRNA, pre-ARNr parcialmente procesados) están tanto los que permanecen asociados a los cromosomas en la región pericromosómica, como, los que pasaron al citoplasma, en esta etapa se agrupan en estructuras de 0,1 - 3 μm de diámetro (en inglés, nucleolar-derived foci - NDF). Además, como una consecuencia del hecho que la mitosis sea abierta, cada célula en división debe rehacer la envoltura nuclear y restaurar la identidad del núcleo, lo que comienza al final de la anafase.

Telofase

La telofase (telos, final) comienza cuando los cromosomas hijos llegan a sus respectivos polos, que se caracteriza por la desaparición total de los microtúbulos cinetocóricos (Figura 9.11D). Se producen, entonces, la reconstrucción de los núcleos y la división citoplasmática, lo que lleva a la formación de las células hijas (Figura 9.11E). La descondensación de la cromatina, acompañada por la recuperación de la capacidad de transcripción, la reorganización del nucléolo y la reconstitución de la envoltura nuclear son los principales acontecimientos de la reconstrucción nuclear, que se procesan esencialmente de la dirección opuesta a lo que sucedió en la profase. Estos eventos se producen por la inactivación del complejo ciclina-CDK, que era responsable de iniciar la mitosis fosforilalando ciertas proteínas celulares. Su inactivación permite que las fosfatasas entren en actividad, desfosforilando estas proteínas, lo que deriva en la finalización de la mitosis. Hallazgos recientes han apoyado la idea de que los cromosomas hijos son descondensan porque una ATPasa hexamérica (Cdc48/p97) elimina e inactiva la quinasa Aurora B, lo que permite la apertura de la estructura de la cromatina y su descondensación, lo que parece ser un requisito para que las envolturas nucleares sean hechas de nuevo. Las etapas que se consideran cruciales para la reconstitución de la envoltura nuclear en cada polo de la célula son: el destino de las membranas para la superficie de la cromatina, la fusión de las membranas y la incorporación de complejos de poro nuclear. Una pequeña GTPasa, la proteína Ran,

juega un papel importante en el reclutamiento y la deposición de las proteínas (tales como las nucleoporinas y las proteínas de la membrana nuclear interna) sobre los cromosomas, mediante la preparación del reensamblaje de la envoltura nuclear. La Ran también controla la fusión de membranas. Varias otras proteínas implicadas en el proceso de fusión de las membranas de otros orgánulos, tales como las del retículo endoplasmático (RE) y las del complejo de Golgi, también parecen estar presentes. Para que se produzca la reconstitución de la envoltura nuclear, estudios muy recientes han demostrado que los túbulos mitóticos del retículo endoplásmico (una forma recientemente descubierta) empiezan a reorganizarse en láminas planas después que los extremos de estos túbulos se asocian directamente con la cromatina. Esta asociación se produce a través de la unión de las proteínas integrales de transmembrana, específicas de la envoltura nuclear y distribuidas por el RE, al ADN. Estos nuevos hallazgos contrastan con el modelo anterior de reconstrucción de la envoltura nuclear, que propone la fusión de vesículas del RE como la fuente principal de las membranas nucleares interna y externa. Simultáneamente con la reconstitución de las membranas, los complejos de poro nuclear se vuelven a montar desde el reclutamiento de precursores desglosados al final de la anafase. Una de las cuestiones aún no aclaradas en este proceso es la forma en que las membranas nucleares interna y externa se fusionan y generan el poro. La nucleoporina POM121 en acción combinada con el complejo Nupl07, es una proteína clave para integrar la fusión de membranas con el conjunto de los complejos de poro nuclear. Varias nucleoporinas han demostrado ser esenciales para esta reasociación, pero sus funciones exactas no se han determinado. Una vez que la cromatina está completamente encerrada por las membranas continuas que contienen los complejos de poros nucleares, las diversas proteínas nucleares anteriormente dispersadas son reimportadas por los complejos de poro nucleares, lo que lleva a la expansión de la envoltura y al crecimiento del núcleo. Entre estas proteínas están las láminas solubles que, al ser desfosforiladas, vuelven a polimerizar y reorganizar la lámina nuclear. Estos cambios son necesarios para la progresión del ciclo celular y la transcripción. Los componentes que transcriben las moléculas de ARNr son desfosforilados, y la transcripción se reactiva con la caída de los niveles de ciclina-cdk. Por lo tanto, se produce una reorganización del nucléolo (o los nucléolos si hay más de uno en la célula). Esta es el resultado de dos procesos: (a) la reanudación de la transcripción de moléculas precursoras de los ARNr partir del ADN de las regiones organizadoras de los nucléolos, que durante la condensación, estaban presentes en las constricciones secundarias de los cromosomas; y (b) reagrupamiento de los componentes inmaduros del antiguo nucléolo, que se habían dispersado por todo el citoplasma y formado en la anafase, los NDF. Ahora, estos pueden ser identificados como cuerpos prenucleolares en la superficie de cada cromosoma, mientras que disminuye el número de NDF y la región pericromosómica se fragmenta. Al final de la telofase, los componentes del procesamiento del ARNr iniciales y tardíos se reubican, en orden, en las 'regiones del CFD y del componente granular del nucléolo, respectivamente. Debido a la despolimerización gradual de los microtúbulos polares que aún permanecen, el sistema microtubular mitótico se desarma, a medida que la división citoplasmática progresa.

Figura 9.14 Esquema de la célula animal en telofase. El corte longitudinal muestra la constricción formada durante la citocinesis en la región ecuatorial de la célula, en la que todavía quedan restos de las fibras del huso y se forma un anillo contráctil, justo debajo de la membrana plasmática. En el corte transversal de esta región (a la derecha), la constricción aparece como resultado del movimiento de deslizamiento entre las proteínas miosina II y actina, que se conecta a la membrana por medio de la α-actinina. Esta constricción avanza hasta la división completa de la célula en dos células hijas.

LAS CARACTERÍSTICAS DE LA DIVISIÓN CITOPLASMÁTICA EN LAS CÉLULAS ANIMALES Y VEGETALES La citocinesis o división citoplasmática es parte de la telofase, aunque muchas veces se inicia en la anafase y termine a la final de la telofase con la formación de dos células hijas. En la célula animal, se forma una constricción, a la altura de la región ecuatorial de la célula madre, que va progresando y termina por dividir el citoplasma, lo que lleva a la separación de las dos células hijas, cada una de ellas recibiendo las mismas partes del contenido citoplásmico. Por la técnica inmunocitoquímica fue demostrada la presencia de actina y miosina en la región de estrangulamiento que se produce entre las dos células hijas en la telofase (Fig 9.14). Los filamentos de actina dispuestos en un haz e interconectados por moléculas de miosina II forman un anillo contráctil por dentro de la membrana y conectado a la misma, lo que explica el movimiento de invaginación de la membrana y la constricción que conduce a la separación de las dos células hijas.

En las células vegetales, la citocinesis se produce con la formación de un tabique a lo largo del ecuador de la célula madre, el primordio de la futura pared celular, llamado inicialmente fragmoplasto ( phragma, cerca) y más tarde, placa celular. Esta formación proviene inicialmente de la acumulación, seguida por la planificación y la posterior fusión de las vesículas procedentes del complejo de Golgi. La fusión comienza en el centro de la célula y progresa hacia las paredes laterales. Con la fusión, la membrana de estas vesículas constituyen las nuevas membranas plasmáticas de cada célula hija en esta región, que quedará separada sólo por el material que era transportado por las vesículas, material que consta de polisacáridos de la pared celular. Posteriormente se produce el engrosamiento de la pared a través de la exocitosis del contenido de las nuevas vesículas dirigidas a esa región (capítulo 13). CONTROL GENÉTICO DEL CICLO CELULAR En las últimas dos décadas ha habido notables avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares responsables de disparar y coordinar la progresión del ciclo celular, en particular con el descubrimiento de la

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implicación de la fosforilación de proteínas en este control. Diferentes modelos experimentales utilizando organismos filogenéticamente distantes como las levaduras, erizo de mar, anfibios y mamíferos, favorecieron los estudios sobre la regulación del ciclo. Con papel decisivo en el control del ciclo celular se ha aislado y caracterizado una familia de enzimas proteínas quinasas, llamadas quinasas dependientes de ciclina o el acrónimo, Cdk. Una proteína quinasa tiene como actividad básica la fosforilación de proteínas sustrato, lo que consiste en la transferencia de un grupo fosfato del ATP donante o del GTP, a aminoácidos aceptores de ese fosfato tales como serina o treonina. Las Cdk son activadas e inactivadas durante todo el ciclo, proporcionando por lo tanto, los patrones cíclicos de la fosforilación de proteínas que desencadenan o regulan los principales eventos del ciclo. La actividad de las Cdk oscila en respuesta a la asociación con proteínas reguladoras denominadas ciclinas. Las ciclinas fueron llamadas así porque tienen un patrón cíclico de acumulación y degradación durante el ciclo celular. Se sintetizan periódicamente, durante todo el período interfásico y degradadas rápidamente a finales de la mitosis. Los niveles de Cdk, a su vez, se mantienen constantes durante todo el ciclo celular. Las ciclinas comprenden una familia de proteínas presentes en todos los organismos, desde la levadura al hombre. Ellas tienen en común que comparten una secuencia conservada de 100 aminoácidos, llamada box necesaria para unirse y activar la Cdk. En las células humanas, hasta ahora se han caracterizado unos 10 ciclinas diferentes (denominadas A, B, C, D, E y así sucesivamente) y al menos 11 Cdk (Cdk 1 a Cdk 11). Actúan en diferentes combinaciones en puntos específicos del ciclo. Las Cdk realizan su función quinasa solamente cuando están asociadas con las ciclinas, formando dímeros; son los complejos ciclina-Cdk. En ausencia de las ciclinas, las CDK están inactivas. En el dímero, la Cdk es la subunidad enzimática con actividad de proteína quinasa, y la ciclina, una proteína reguladora que activa la capacidad quinasa de la Cdk para fosforilar proteínas diana específicas. Por lo tanto, la actividad del complejo ciclina-Cdk es controlada por el patrón cíclico de acumulación y degradación de la ciclina. El montaje cíclico del dímero ciclina-Cdk, su activación y posterior desmontaje son procesos centrales que conducen el ciclo celular. En todas las células eucariotas, tres fases del ciclo son estratégicas para su control, estando cada uno regulado por diferentes clases de ciclinas: las ciclinas G1/S (ciclinas E en los vertebrados), forman complejos con Cdk al final de G1 y comprometen a la célula con la duplicación de su ADN; las ciclinas S (ciclinas A en los vertebrados), que se unen a Cdk en el inicio de la fase S y son necesarias para iniciar la replicación del ADN; las ciclinas M

(ciclinas B en los vertebrados) que forman complejo con Cdk y promueven eventos de la mitosis. La mayoría de las células expresan más una clase de ciclinas, las ciclinas G1 (ciclinas D en los vertebrados) que promueven la transposición del punto de restricción R o start, al final del período G1. En los vertebrados, estas ciclinas forman cuatro diferentes tipos de complejos con diferentes Cdk. Las ciclinas D forman un complejo con Cdk4 y Cdk6, las E con Cdk2, las ciclinas A con Cdk1 y Cdk2, mientras que las ciclinas B lo hacen con Cdk1. En la literatura, estos complejos se denominan, respectivamente, como G1-Cdk, G1/S-Cdk, S-Cdk y M-Cdk, nomenclatura utilizada también en este capítulo. Los diferentes complejos ciclina-Cdk permanecen inactivos hasta que alcanzan la etapa del ciclo de la que son responsables, a partir de aquí son activados. La activación resulta de la fosforilación de un aminoácido específico cerca del sitio activo de Cdk, por acción de una proteína conocida como Cak, quinasa activadora de Cdk (del inglés Cdk-activating kinase). Esta fosforilación provoca un pequeño cambio conformacional de Cdk, lo que aumenta su eficiencia en fosforilar proteínas diana importantes en el ciclo. Otro modo de control de la actividad del complejo ciclina-Cdk se produce por la acción de una proteína quinasa llamada Wee 1, que fosforila dos aminoácidos presentes en el sitio activo de Cdk, inhibiendo su actividad, con la consiguiente inactivación del complejo. La actividad del complejo es restaurada por la desfosforilación de estos dos aminoácidos por una fosfatasa conocida como Cdc25. Esta, a su vez, es activada cuando otra proteína, la polo quinasa (PLK, polo-like kinase) fosforila algunos de sus sitios activos. Además, el propio complejo ciclina-Cdk en sí, que sufre activación, también contribuye a la fosforilación de Cdc25. El complejo ciclina-Cdk también fosforila e inhibe la Wee 1. Así, por un mecanismo de retroalimentación positivo, el complejo ciclina-Cdk es capaz de activar su propio activador, al mismo tiempo en que inhibe su propio inhibidor. Este proceso actúa al final de G2, haciendo que todos los complejos M-Cdk de la célula sean rápidamente activados y puedan desencadenar los acontecimientos que dan inicio a la mitosis. Una familia de proteínas llamadas proteínas inhibidoras de Cdk, del inglés CKI (Cdk, inhibitor proteins) también inactivan los complejos ciclina-Cdk. Estas proteínas se unen a Cdk, causando una reordenación en su sitio activo, inactivándola. El proceso se invierte cuando se disocian de Cdk. Estas proteínas actúan principalmente en el control de las fases S y G 1. Cada uno de los diferentes complejos ciclina-Cdk desencadena y controla un evento específico del ciclo celular. La forma en que este control se realiza se describe y se esquematiza a continuación en la figura 9.15. Figura 9.15 Esquema resumido de los mecanismos que controlan los eventos bioquímicos y celulares del ciclo celular. Al principio de G1, la enzima Cdk está disociada de la ciclina y por lo tanto, inactiva. Durante la fase G1, como la célula crece, las ciclinas de G1 se acumulan. Cuando alcanzan un nivel crítico, se unen y activan la enzima Cdk. El complejo quinasa activado fosforila los sustratos apropiados necesarios para desencadenar la síntesis de ADN, y luego las ciclinas de G1 son degradadas y el complejo quinasa desactivado. En G 2, las ciclinas mitóticas se acumulan, se unen a la enzima Cdk y la activan. El complejo M-Cdk activado fosforila nuevos sustratos, dirigiendo a la célula a través de la mitosis. Entonces, la rápida degradación de las ciclinas de M conduce a la inactivación de la quinasa Cdk, lo que impulsa a la célula a completar la mitosis y entrar a continuación en la interfase del próximo ciclo celular. Las enzimas fosfatasas actúan tanto en G1 como en M, revirtiendo los efectos quinasa de los complejos ciclina-Cdk.

LOS CONTROLES QUE LOS COMPLEJOS G 1Cdk Y G1/S-Cdk EJERCEN El complejo G1Cdk es responsable por la decisión de la célula de entrar o no en división y es activado por factores extracelulares, como se explica más adelante en este capítulo. En la transición de G1 a S, por otro lado, es activado el complejo G1/S-Cdk, el cual estimula la duplicación del centrosoma y desencadena la fosforilación de otras proteínas celulares, incluyendo las diversas enzimas y polimerasas que son necesarias para la síntesis de ADN, comprometiendo a la célula a iniciar la fase S. LA ACCIÓN DEL COMPLEJO S-Cdk El complejo S-Cdk, activado al final de G1; fosforila el complejo ORC (de reconocimiento de origen), visto anteriormente en este capítulo. La fosforilación y la posterior activación de este complejo desencadenan la replicación del ADN. Después de producida la replicación, el complejo S-Cdk promueve la disociación de algunas proteínas presentes en el complejo pre-RC (prereplicativo), lo que causa el desmontaje del complejo, asegurando que cada origen de replicación sea leído sólo una vez. La actividad del S-Cdk se mantiene alta durante todo el período G 2 y en el inicio de la mitosis. CÓMO EL COMPLEJO M-Cdk CONTROLA LA MITOSIS La síntesis de ciclina M aumenta durante el período de G 2 y principios de M, lo que provoca un rápido aumento en los niveles del complejo M-Cdk. Este complejo permanece inactivo hasta el final de G 2 cuando es activado por la fosfatasa Cdc25, volviéndose apto para actuar como proteinoquinasa y desencadenar los eventos de la mitosis. Sin embargo, la propia fosfatasa Cdc25 sólo actúa cuando es activada por la PLK quinasa, que, a su vez, aunque se acumule en el comienzo de la fase G2, sólo es fosforilada y por lo tanto activada a finales de G2 inmediatamente antes de la mitosis. Estudios recientes sugieren que la activación de PLK se da con la fosforilación de su aminoácido Thr210 por la quinasa Aurora A, después que se vuelve accesible para la fosforilación mediante la unión de otra proteína llamada Bora con la PLK, durante G2. Así, en una reacción en cadena, Bora y Aurora A actúan sinérgicamente en la activación de PLK, la que, fosforilando Cdc25, promueve la acción activadora sobre el complejo M-Cdk, lo que inicia la entrada en mitosis. El complejo M-Cdk activo induce la condensación cromosómica, la fragmentación de la envoltura nuclear y la reorganización del citoesqueleto para el montaje del huso. Al comienzo de la mitosis, el complejo M-Cdk fosforila proteínas presentes en el complejo de las condensinas, además de las histonas Hl y H3, activando estas proteínas y haciendo que actúen en la condensación cromosómica. El desmontaje de la envoltura nuclear, a su vez, también implica cambios en todos sus componentes, como se describe anteriormente en este capítulo, es principalmente el resultado de la fosforilación de residuos específicos de serina presentes en las laminas de la lámina nuclear, lo que provoca la separación de los filamentos de laminas en dímeros individuales. El M-Cdk fosforila todos los tipos de laminas, lo que conduce a la desorganización de la lámina nuclear. En consecuencia, las membranas nucleares se fragmentan en vesículas que se dispersan. Las

laminas, sin embargo, no son las únicas proteínas blanco del M-Cdk en este proceso. La fosforilación de una o más proteínas intrínsecas de la membrana nuclear interna tiene un papel crucial en la disociación de sus componentes. Incluso en la mitosis se produce una modificación de la dinámica de la arquitectura celular para la formación del aparato mitótico, cuando los componentes del citoesqueleto, tales como los filamentos de actina y los microtúbulos son objetivos potenciales de las enzimas quinasa. El desmontaje de los microtúbulos del citoesqueleto se produce cuando el M-Cdk fosforila las MAP (proteínas asociadas a los microtúbulos), reduciendo la estabilidad de los microtúbulos. Al mismo tiempo, fosforila y activa las catastrofinas, que son proteínas motoras que hacen el desmantelamiento de los microtúbulos. El equilibrio cíclico entre estas dos actividades de MCDK produce, en primer lugar, el desmantelamiento de los microtúbulos del citoesqueleto y, en segundo lugar, el uso de las moléculas de tubulina libres para polimerizar los microtúbulos del huso de división. Otro evento que involucra la actividad quinasa de M-CDK se produce en la transición de metafase a anafase, cuando se da la separación de las cromátidas hermanas, con la consiguiente migración de los cromosomas hijos. Esta transición es desencadenada cuando el M-Cdk activa una ligasa de proteína ubiquitina, el complejo promotor de la anafase (en inglés, anaphase-promoting complex, APC) el ciclosoma responsable de ubiquitinar varias proteínas reguladoras, es decir, unir múltiples moléculas de ubiquitina a las proteínas diana y así marcarlas para ser degradadas por proteólisis en los proteosomas 26S (Capítulo 10). Una de las principales proteínas blanco del APC es la securina, que inicialmente inhibía la proteína separasa. Con la destrucción de la securina, la separase degrada el complejo cohesina, que unía las dos cromátidas por los centrómeros hermanos, haciendo que se dividan en cromosomas-hijos, los que ahora emigran a los polos

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opuestos de la célula. Además de ser responsable de la separación de las cromátidas hermanas, el complejo APC también une las cadenas de ubiquitina a las ciclinas mitóticas, su otro objetivo importante. La consecuente degradación de la ciclina M inactiva el complejo M-Cdk y permite que las fosfatasas desfosforilen los muchos sustratos de la Cdk que habían sido fosforilados en el comienzo de la mitosis. Esto conduce al desmontaje del huso, a la descondensación cromosómica y a la restauración de la envoltura nuclear y por lo tanto conduce a la célula a salir de la mitosis y progresar a la interfase del siguiente ciclo. Por lo tanto, las etapas finales de la mitosis se rigen por dos principales mecanismos de regulación: desfosforilación de los sustratos de las quinasas Cdk y la unión de ubiquitinas a los sustratos del APC. Varios proteína quinasa, muy conservadas evolutivamente, continúan siendo detectadas como responsables de disparar los eventos más importantes del ciclo celular. La complejidad y el tamaño de la familia de quinas revelan que la regulación de funciones de las proteínas realizada a través de la fosforilación reversible, resultante de la acción de quinasas, es fundamental en el control de la progresión del ciclo celular en todas las células eucariotas. Las actuales técnicas sofisticadas de biología molecular muestran que los genes de las proteínas quinasas constituyen aproximadamente el 2% de todo el genoma humano. EL CICLO CELULAR ESTÁ INFLUENCIADO POR FACTORES DE CRECIMIENTO Y OTRAS SEÑALES EXTRACELULARES Como se señaló anteriormente en este capítulo, la proliferación de las células eucariotas superiores es controlada por muchas sustancias que fueron denominadas factores de crecimiento. El primero de estos factores descubiertos fue un péptido que estimula el crecimiento de los nervios, más concretamente produce una hiperplasia de los ganglios simpáticos de embriones de pollo. Este factor, llamado factor de crecimiento del nervio (NGF - nerve growth factor) se extrajo primero a partir de cultivos celulares de ratón. Más tarde, fueron descubiertos otros factores peptídicos, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF - epidermal growth factor), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF - fibroblast growth factor), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF - platelet derived growth factor) y el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF - insulinlike growth factor). En la proliferación de las células animales, los factores de crecimiento actúan principalmente controlando la progresión de G1-S, propulsándolas a atravesar el punto R al final de G1 y a continuar luego el ciclo de división. Si no son estimuladas en esta etapa del ciclo, las células son incapaces de pasar el punto R y entran en la llamada fase G0, en la que se detiene la proliferación, volviéndose quiescentes. Por otra parte, las células que están en G0, estimuladas por los factores de crecimiento, regresan a la actividad proliferativa, entrando de nuevo en el ciclo a partir de G 1. Los factores de PDGF y FGF vuelven a las células en G0 "competentes" para salir de esta etapa. En presencia de EGF, las células progresan en las primeras etapas de G1 y en presencia de IGF pueden superar el punto de restricción, a finales de G1, comprometiéndose con la división. Por lo tanto, FGF y PDGF son factores de competencia mientras que EGF e IGF son factores de progresión. Ellos, por lo tanto, actúan sinérgicamente para promover la transición G0→G1→S→G2→M. Del mismo modo, en las células vegetales, la hormona auxina es un factor de crecimiento que controla la progresión de G1-S. Sin embargo, a diferencia de las células animales, que después de la etapa S no necesitan de la estimulación hormonal para completar el ciclo, en las células vegetales el pasaje G2/M también es controlado por una señal hormonal. Al final de G2, la presencia de otro tipo de hormona, la citoquinina, es esencial para la entrada en mitosis, porque va a estimular la eliminación del fosfato de la proteína Cdk, promoviendo así la activación del complejo M-Cdk. Este mecanismo de regulación del ciclo celular por factores de crecimiento y de diferenciación extracelulares implica, por supuesto, la acción de los receptores de membrana mediante la estimulación de las vías de señalización intracelulares que, a su vez, van a actuar de manera reguladora en las proteínas centrales que realizan el control del ciclo celular. Muchos otros factores, además de los factores de crecimiento, están implicados en la regulación del ciclo celular, actuando como señales inhibidoras de la proliferación. Estos incluyen agentes que dañan el ADN, factores ambientales adversos o incluso contactos celulares. Estas señales antiproliferativas actúan, en general, por la inducción de proteínas que se unen al complejo ciclina-Cdk, las ya mencionadas inhibidoras de Cdk, lo que resulta en la inactividad del complejo y, por lo tanto, en el bloqueo de ciclo. Otros reguladores del ciclo celular incluyen las proteínas codificadas por los denominados genes supresores de tumores que actúan como los propios inhibidores de Cdk, cortando la progresión del ciclo y cuya inactivación conduce al desarrollo de tumores. Por ejemplo, en algunos tejidos, la actividad mitótica es inhibida por sustancias de naturaleza proteica llamadas calonas. Las calonas son producidas generalmente por los tejidos, y su presencia previene la proliferación excesiva de las células, regulando la tasa de crecimiento dentro de los límites normales. Se demostró que en casos de extirpación de parte de un

órgano, por ejemplo, del hígado, la producción de calonas específicas disminuye, con el consiguiente aumento de las mitosis en las células hepáticas. A medida que se produce la regeneración y con el consiguiente aumento de células, aumenta la producción de calonas y, como resultado, se reduce paralelamente la proliferación. Las calonas probablemente también explican el fenómeno llamado hipertrofia compensatoria, que fue observado y bien estudiado en el riñón y en el que, cuando se extirpa un órgano de un par, el otro sufre un proceso de crecimiento, seguido de un aumento de su actividad fisiológica. Por lo tanto, se observa que, en las eucariotas, la maquinaria central del ciclo celular está controlada por una red de señalización de puntos de control (checkpoints) que continuamente están averiguando en las células la existencia de aberraciones y disparando las respuestas de reparación que se necesiten. La dinámica entre estos dos actores protege a los organismos multicelulares de la proliferación no planificada y del cáncer. Lógicamente, debe tenerse en cuenta que, dependiendo de las diversas formas de interacción de los factores extracelulares con los diversos controladores internos de la proliferación celular, los mecanismos de regulación del ciclo son mucho más complejos de lo que se describe aquí y no serán objeto de más detalle en este libro. RESUMEN La alternancia de las etapas de la interfase y de la división en la vida de las células corresponde al llamado del ciclo celular, que es el proceso básico de la génesis de nuevas células. Comprende los fenómenos que se producen a partir de la formación de una célula hasta su propia división en dos células hijas. La interfase es el período entre dos divisiones. Tres fases consecutivas se describen generalmente en la interfase: G1, S y G2. En G1, la fase más variable en duración, las células muestran una intensa actividad de síntesis de ARN y de proteínas, y en ella ocurre un notable aumento en el citoplasma de las células recién formadas. En el período S, la célula replica su contenido de ADN y su centrosoma, mientras que en G2 se produce una síntesis discreta de ARN y de proteínas que son esenciales para la mitosis. En este período, ocurre la acumulación y la activación de los complejos ciclina-Cdk, que son reguladores críticos de la mitosis en todas las células eucariotas. La duplicación del ADN en la fase S, se hace de modo semiconservativo, es decir, las hebras de la doble hélice de ADN se separan, y a partir de cada una de ellas, se sintetiza una nueva cadena mediante la replicación de la molécula original. En las células eucariotas, esta replicación se inicia en numerosos puntos a lo largo de la molécula de ADN, y progresa hasta encontrar nuevas regiones en duplicación. Estos segmentos o unidades de replicación se llaman replicones. En cada replicón, la cadena naciente es iniciada por un corto segmento nucleotídico de ARN, llamado primer de ARN, que al final se retira y se sustituye por un segmento de ADN. Después de haber pasado a través de las etapas de la interfase, el núcleo entra en una división o mitosis. La mitosis se divide didácticamente en fases que describen los principales cambios morfológicos y el movimiento de los cromosomas durante el proceso. En la profase, los cromosomas comienzan su proceso de condensación, los nucléolos se desorganizan y se forman haces de microtúbulos de los centrosomas, formando el huso mitótico. La fragmentación de la envoltura nuclear marca el final de la profase, al establecer el contacto entre los microtúbulos y los cinetocoros. En la metafase, la condensación cromosómica alcanza el más alto grado, los cromosomas se disponen en una placa en la región ecuatorial de la célula, se unen a los microtúbulos del huso y mediante estos se unen a los polos opuestos de la célula. En la siguiente fase, la anafase, los centrómeros de cada cromosoma se separan y las cromátidas hermanas (ahora cromosomas hijos) son movidas hacia los polos opuestos, con la participación de las fibras del huso y de las proteínas motoras. En la telofase, los cromosomas hijos alcanzan los polos, y ocurre la reconstitución de los núcleos, con descondensación de los cromosomas, la reorganización de los nucléolos y la desagregación del huso mitótico. Después de la reconstitución de los núcleos hijos, se completa la división citoplasmática (citocinesis), creando así dos células hijas independientes. La duración del ciclo celular es variable cuando se consideran células de diferentes tejidos de un organismo, o cuando se consideran diferentes especies. En el mismo organismo, la causa principal de esta variación es la duración del período inicial de la interfase: la G 1. La fase S, la fase G2 y la mitosis en sí, tienen una duración más o menos constante para las células de diferentes tejidos de la misma especie. Los tejidos proliferativos tienen células con un ciclo celular corto, a diferencia de los tejidos no proliferativos cuyas células tienen un ciclo celular largo. Estas variaciones están influidas por factores extracelulares llamados factores de crecimiento que, cuando están presentes, inducen a las células a entrar en las etapas G1 que las conducen inexorablemente a las fases S, G2 y a la mitosis. También hay ciertas sustancias que son inhibidoras de la actividad mitótica. La proliferación celular, sin embargo, está estrechamente controlada por productos génicos, en particular los complejos ciclina-Cdk responsables de regular funciones de las proteínas celulares implicadas en eventos del ciclo celular, sobre las que operan, principalmente, efectuando fosforilaciones y desfosforilaciones reversibles, y, de este modo, controlando los puntos cruciales de paso a través del progreso del ciclo celular.

LA MEIOSIS | LA MEIOSIS HACE POSIBLE LA REPRODUCCIÓN SEXUAL El ciclo de división celular somática, discutido hasta ahora en este capítulo, se traduce en la producción de dos células hijas genéticamente idénticas y que tienen el mismo número de cromosomas que la célula que les dio origen. Estas células son diploides (2n), teniendo en cuenta que el número básico de cromosomas de una especie (ploidía) es igual a n. Sin embargo, esto no es lo que ocurre con las células germinales situadas en las gónadas de organismos animales o de vegetales que se reproducen sexualmente y que dan lugar a células sexuales o gametos / esporas. El proceso de formación de los gametos, denominado gametogénesis, que resulta de la división de una célula germinal diploide en células haploides (n), es decir, células que reciben sólo un cromosoma de cada par de homólogos y que tienen, por ende, sólo la mitad del número de los cromosomas encontrados en las células somáticas de la especie. Por otra parte, por características propias, el proceso resulta en la formación de cuatro células genéticamente diferentes entre sí y diferentes de la célula madre. Este tipo especial de división que reduce a la mitad el número de cromosomas se llama meiosis

(del griego meion, reducción). Posteriormente, como se suponía, se observó, con la ayuda de la citofotometría, que los gametos también contienen la mitad del contenido de ADN (C), característico y constante de cada especie. Esta reducción del número de cromosomas y contenido de ADN es compensada por el posterior proceso de fertilización de los gametos. Para que ocurra la reducción del número de cromosomas, es necesario que sucedan dos divisiones celulares sucesivas (que se llaman meiosis I y meiosis II) después de una sola duplicación de ADN, que debe ocurrir durante el período S anterior a la primera división (Figuras 9.16 y 9.17). La fase S de la síntesis de ADN, que precede a la meiosis por lo general tiene una mayor duración que la del período S que precede al de la mitosis, aunque, en ambos casos, el contenido de ADN se duplica a partir de 2C a 4C. Por ejemplo, en el trigo, la fase S premeiótica dura al menos 8 h a 20 °C, en comparación con el período de S de aproximadamente 3 h en los ciclos somáticos. En Lilium, la duración es de hasta 50 h, mientras que la fase S somática es de 8 h, bajo las mismas condiciones ambientales. Este estiramiento del período S premeiótico parece estar asociado con una tasa reducida de los orígenes de replicación. Una característica común con la

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fase S premitótica es la duplicación temprana de la eucromatina y tardía de la heterocromatina dentro del periodo S premeiótico. Sin embargo, los núcleos premeióticos en S exhiben 2 a 3 veces más heterocromatina que los núcleos somáticos, lo que puede jugar un papel importante en el control de los acontecimientos de las primeras etapas de la meiosis. Estos pasos iniciales incluidos en la meiosis I, contienen eventos muy diferentes de los primeros eventos de la mitosis. Con excepción de esos eventos característicos del período inicial de la meiosis, que se describen a continuación, los demás eventos de la meiosis son muy similares a los de la mitosis, ya sean los citoplasmáticos, como el montaje y desmontaje del huso, o nucleares, como la desorganización y la reorganización del núcleo. Para facilitar el estudio, cada división meiótica (I o II), como la mitosis, es dividida en las etapas de la profase, metafase, anafase y telofase (Fig 9.16). El proceso de la meiosis La profase de la primera división meiótica, o profase I, es un excesivamente largo plazo, en comparación con la profase de la mitosis. Como ejemplo, se puede observar una mayor duración de la formación de gametos en los seres humanos (oogénesis en las mujeres y la espermatogénesis en los hombres). En el caso femenino, la meiosis comienza en las células de la línea germinal (oogonias), en los folículos primarios de los ovarios aún en la fase embrionaria del desarrollo, por lo que en el quinto mes de vida intrauterina, todos los ovocitos que serán formados por la mujer, aproximadamente 1 millón de células, ya están en la profase I de la meiosis. Estas células pre-gaméticas permanecen en la profase I (en una fase específica llamada diploteno) durante varios años, por lo menos hasta la etapa de madurez sexual (pubertad), que ocurre alrededor de los 12 años de edad, o hasta los 45 a 50 años de edad. En esta fase de la vida, 20 a 30 de estas células, cada mes y justo antes de la ovulación, completan la meiosis I y llegan hasta la mitad de la segunda división meiótica (metafase II), cuando reciben el nombre de ovocitos II. Entonces, si la célula es fecundada, termina el proceso meiótico; si no, se degenera y se elimina a través de la menstruación (o período). La meiosis I da lugar a dos células: el ovocito secundario y el primer cuerpo polar, que tienen diferentes tamaños. El cuerpo polar pronto se degenera y el ovocito II es el que sigue la meiosis II, al final de la cual se forma el segundo cuerpo polar, que también se degenera. En la espermatogénesis, la profase I también es mucho más lenta que la profase de la mitosis. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en las mujeres, el inicio de la meiosis en los túbulos seminíferos de los testículos para la formación de espermatozoides sólo se produce durante la pubertad, alrededor de los 12 años de edad, y se mantiene durante toda la vida. En 24 días, las células completan la meiosis I con el mismo tamaño, ocupando de 13 a 14 días sólo con la profase I, los cuales contrastan mucho con el corto tiempo de aproximadamente 8 h, que emplea la meiosis II. En este proceso, aún son usados más de 40 días aproximadamente para la diferenciación y maduración de las células resultantes de la meiosis en los espermatozoides. Por consiguiente, el período de la profase I es el que más tiempo ocupa de toda la meiosis, que ya es de por sí un proceso mucho más lento que la mitosis. Este retraso se debe a que, durante la profase I, ocurre un evento clave de la meiosis: el apareamiento de los cromosomas homólogos. Este emparejamiento, exclusivo de la meiosis, tiene doble importancia: (a) garantiza la posterior separación adecuada de los cromosomas homólogos que son segregados entre sí de manera que tanto los núcleos hijos de esta división reciben un miembro de cada par de cromosomas; y (b) permite que ocurran intercambios de segmentos entre los cromosomas homólogos de origen paterno y materno, un fenómeno llamado recombinación genética, entrecruzamiento o crossing-over (Figura 9.17A). Ambos fenómenos tienen una gran importancia para las especies, por contribuir con una mayor diversidad genética en el proceso evolutivo, lo que volverá a ser discutido más adelante en este capítulo. Por ser una fase larga, la profase I es subdividida en las siguientes fases: leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno y diacinesis (Figura 9.17B). En la etapa llamada leptoteno, la cromatina empieza gradualmente a condensarse en los cromosomas, pero aún sólo filamentos finos son visibles bajo un microscopio óptico. De ahí vino el nombre de la fase, ya que la palabra griega leptos, significa delgado y tainia, filamento o cinta. Al microscopio óptico, son característicos de esta fase puntos de mayor condensación a lo largo de los filamentos de cromatina llamados cromómeros, que ocurren en la misma posición en ambos cromosomas de un par homólogo. Aunque se sabe por la citofotometría y la radioautografia, que los cromosomas se han duplicado en esta etapa, el microscopio óptico no muestra tal duplicación, ya que no son visibles las dos cromátidas que forman cada uno de estos cromosomas; sin embargo, son reveladas claramente por la microscopía electrónica. A escala ultraestructural aún se observa que los cromosomas se asocian individualmente con estructuras filamentosas situadas entre las dos cromátidas hermanas de cada cromosoma. Son las llamadas núcleos axiales y se convertirán más tarde en los elementos laterales del complejo sinaptonémico (Figura 9.17Bb). Los dos extremos del núcleo axial de un cromosoma están conectados a la envoltura nuclear y, a menudo en algunos organismos pueden adherirse a la envoltura en puntos muy cerca uno del otro, dando a los cromosomas una orientación definida dentro del núcleo, llamada disposición en ramo o en bouquet, que a veces se puede observar solamente en la siguiente etapa. Poco a poco, los cromosomas continúan su condensación y comienza un proceso de aproximación y apareamiento entre los homólogos, llamado sinapsis, que ha sido comparado con la unión de las dos mitades al cerrar una cremallera. El inicio del proceso sináptico se produce en la fase llamada zigoteno (del griego zygós, lazo, unión), que es la segunda fase de la profase I. La sinapsis sucede de forma ordenada, paso a paso, es decir, cromómero por cromómero, acercándose a los cromosomas homólogos, que están alineados lateralmente en una manera precisa, pero no se fusionan, permaneciendo entre ellos una distancia final de aproximadamente 150 a 200 nm. La microscopía electrónica mostró que las sinapsis cromosómicas son debidas a la formación de una estructura proteica compleja, que se dispone longitudinalmente entre los dos homólogos, llamada complejo sinaptonémico (CS) (Figura 9.17B.c). Al microscopio electrónico, se observa que consta de tres componentes electrodensos, paralalelos entre sí y al eje de cromosomas, siendo dos elementos laterales y un elemento central (Figura 9.17B.d). Cada elemento lateral, antes llamado núcleo axial, está en contacto con la cromatina de unos dos cromosomas homólogos y está conectado con el otro elemento lateral

mediante proteínas conocidas como filamentos transversales del elemento central, el cual se asocia en esta fase. De este modo se establece la unión entre el par de cromosomas homólogos. Los elementos laterales juegan un papel importante en la condensación cromosómica y en el apareamiento cromosómico, en el montaje de los filamentos transversales y evitando que roturas de la doble cadena (DSB – del inglés double-strand breaks) lleven a la recombinación entre cromátidas hermanas, sino más bien que estas DSB den lugar a un intercambio meiótico recíproco. Cuando el proceso de formación sinaptonémica se ha completado, es decir, cuando todos los homólogos se unen por complejos sinaptonémicos en toda su longitud, comienza la tercera etapa de la profase I, que es el paquiteno, durante la cual los cromosomas permanecen emparejados (Fig 9.17B.d). El conjunto formado por los cromosomas homólogos unidos por el complejo sinaptonémico se llama bivalente o tétrada; bivalente porque contiene dos cromosomas unidos, los homólogos, y tétrada, ya que está formado por las cuatro cromátidas. Los cromosomas en la forma de tétrada aparecen de manera muy gruesa bajo un microscopio óptico, lo que inspiró el nombre de la fase (del griego pachys, grueso). Esta organización de los bivalentes asegura que las regiones de ADN homólogas sean colocadas en las proximidades, de tal manera que se favorezca la aparición de un segundo evento de gran importancia en la meiosis: el intercambio de segmentos de ADN entre los cromosomas homólogos, llamado intercambio, crossing-over o recombinación genética. El intercambio es un evento molecular que implica el intercambio de genes entre cromosomas de origen paterno y materno. Es una manera controlada para asegurar que se forme al menos uno en cada par de cromosomas y que, si fueran múltiples en el mismo par, no ocurran simultáneamente en regiones adyacentes, pero que estén espaciados entre sí. Esta recombinación homóloga se inicia con la formación de roturas de la doble cadena del ADN (DSB) generadas por la proteína Spo11, que actúa con la ayuda de varias otras proteínas accesorias cuyas funciones no son bien conocidas (Figura 9.17A). El papel de Spo11 en la generación de las lesiones que inician la recombinación meiótica está muy conservado evolutivamente, ocurriendo de levadura a las plantas y mamíferos. Con la aparición de las DSB, algunas dieron lugar a la reunión intercambiada de los filamentos provenientes de cada una de las cromátidas homólogas que participan en el intercambio, seguida de un proceso de reparación mediante la sustitución de bases incorrectamente apareadas en las dos moléculas de ADN híbridas. Varias observaciones muestran claramente que el apareamiento con la formación del complejo sinaptonémico es un requisito para el intercambio, pero que la presencia del complejo no es suficiente para que esto ocurra. Estructuras electrodensas, generalmente de forma esférica o elíptica, que miden entre 30 y 150 nm de diámetro y dispuestas al azar, se observan con el microscopio electrónico en esa etapa, en estrecha asociación con la región central del complejo sinaptonémico. Son los nódulos de recombinación y estarían probablemente relacionados con la recombinación genética (Figura 9.17B.d). Los estudios realizados en varios organismos muestran una correlación entre el número y la distribución de los nódulos de recombinación con el número y la distribución de los intercambios. Esta relación íntima se ve reforzada por la observación de que, en la meiosis de organismos en que no ocurre intercambio, no se detectaron nódulos de recombinación. Podrían tener la función de proporcionar la maquinaria estructural y enzimática requerida para lograr el intercambio. A la luz de los acontecimientos que encierra, el paquiteno dura unos pocos días o semanas, a diferencia de las fases anteriores, el leptoteno y el zigoteno, que son más breves y se producen en sólo unas horas. En el diploteno (del griego diploos, doble), nombre de la etapa siguiente, la mayor parte del complejo sinaptonémico se retira del bivalente y se observa una separación precoz de los cromosomas homólogos, que luego se observan individualmente. Esta separación no es completa, porque persisten vestigios o fragmentos del complejo sinaptonémico en algunos lugares llamados quiasmas (del griego, chiasma, disposición en cruz), en los cuales los cromosomas homólogos permanecen unidos (Figura 9.17B.e). Los quiasmas pueden ser los lugares en los que en la etapa de paquiteno, se produce intercambio de genes entre los cromosomas homólogos. Aunque la relación entre el quiasma y el intercambio de ADN no es absoluta, los quiasmas son considerados la evidencia citológica del crossing-over, ya que son visibles al microscopio óptico, donde antes había un evento molecular no visible al microscopio. Recientemente, en 2005, se hizo evidente que la proteína cohesina actúa en la unión del quiasma, estabilizando estos sitios de intercambio hasta la anafase I. En la formación de los ovocitos, el diploteno es una etapa muy larga y en esta ocurre un aumento del volumen celular. Es, por lo tanto, una fase de intensa actividad metabólica, lo que explica la observación de que en el diploteno de la mayoría de las especies, los cromosomas se descomprimen para permitir la transcripción de ciertos genes. Esta descompresión es más pronunciada en varias especies de grupos filogenéticos, como peces, anfibios, reptiles y aves, en los que los espermatocitos y oocitos presentan cromosomas con una configuración muy característica, llamados cromosomas plumosos (Capítulo 8). La última etapa de la profase I se llama diacinesis (del griego dia, a través, y kinesis, movimiento) y se caracteriza por un aumento de la repulsión entre los cromosomas homólogos. Este alejamiento lleva a la llamada terminalización de los quiasmas, un fenómeno que consiste en un desplazamiento de los quiasmas a los extremos de los cromosomas a medida que la separación aumenta, de ahí el nombre que se le da a la fase. Sin embargo, durante la diacinesis, los quiasmas son mantenidos, lo cual es importante para la correcta distribución de los cromosomas durante la migración en la anafase. La falta de quiasmas, es decir, la falta de conexiones físicas resultantes de crossing-over entre los homólogos, puede conducir a una segregación inadecuada de los cromosomas homólogos o a su no disyunción, resultando en productos meióticos con falta o exceso de cromosomas, lo que causa enfermedades hereditarias tales como el síndrome de Down. También se ha postulado que el proceso de envejecimiento conduce a la pérdida de la proteína cohesina y, en consecuencia, al debilitamiento de la cohesión, lo que promueve una separación prematura de las cromátidas hermanas. Este parece ser el principal mecanismo de no disyunción y de aneuploidías relacionadas con la edad en los seres humanos. La diacinesis comprende, además, una preparación para la siguiente etapa de la división meiótica, que es la metafase I. Durante la diacinesis sucede: un marcado aumento de la condensación cromosómica, la desaparición de los nucléolos, la rotura de la envoltura nuclear, la unión de cada cromosoma del par de homólogos a las fibras del huso, que se unen a los polos opuestos de la

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célula, y el movimiento de los cromosomas a la placa ecuatorial de la metafase I. Durante las próximas etapas de la meiosis I, la metafase I, la anafase I y la telofase I, cada cromosoma continúa doble, es decir, con dos cromátidas (Figura 9.16). En la metafase I, los dos cromosomas homólogos se disponen en la placa ecuatorial lado a lado, debido a la reciente finalización del apareamiento entre ellos, del mantenimiento de los quiasmas y también porque, de una manera más compleja que en la mitosis, hasta esa etapa la proteína cohesina persiste no sólo en el centrómero, sino también a lo largo de los brazos cromosómicos. En la placa ecuatorial de esa metafase I, cada cromosoma del par de homólogos se une a los polos opuestos de la célula (biorientación) y se dispone con sus dos cinetocoros orientados hacia el mismo polo (coorientación). Esta disposición garantiza la disyunción de los cromosomas homólogos, con una distribución de los cromosomas maternos y paternos (en la mayoría de los casos llevando segmentos intercambiados) a los polos opuestos. Este tipo de segregación se produce porque en la anafase I, se eliminan selectivamente sólo las moléculas de cohesinas unidas a los brazos cromosómicos. Aquellas de la región centromérica no se destruyen debido a la acción de un protector de la cohesina, específico de la meiosis, llamado shugoshina que inhibe la fosforilación de la cohesina y su escisión. Por lo tanto, es fácil de ver, durante la anafase I, que los cromosomas que se desplazan hacia los polos celulares están formados por dos cromátidas, unidas por sus centrómeros. Por lo tanto, en la anafase I, las cromátidas hermanas de cada cromosoma migran juntas para el mismo polo de la

célula. La finalización de la primera división meiótica, en oocitos de vertebrados, está marcada por la extrusión del primer cuerpo polar. La etapa entre las dos divisiones meióticas se llama intercinesis, y en esta etapa, no hay una nueva síntesis de ADN, incluso en la telofase precedente ha ocurrido una completa descondensación cromosómica y una reorganización de los núcleos hijos. Por lo tanto, al estar desprovista de la fase S, esta intercinesis no se caracteriza como una interfase típica. Las dos células en intercinesis resultantes de la primera división meiótica, están marcadas por la presencia de un número haploide de cromosomas (n) y de una cantidad 2C de ADN, ya que cada cromosoma es incluso doble. Se dice, pues, que la meiosis I es una división reduccional. Luego, se produce la segunda división meiótica, la que se asemeja a una mitosis normal (Figura 9.16). Esta es una división ecuacional del material genético, en la que habrá una justa distribución del contenido de ADN entre los núcleos hijos. Después una nueva etapa de profase, en la que siempre se requiere un nuevo montaje del huso, las células entran en metafase, disponiendo a los cromosomas en la región ecuatorial. En la metafase II, a diferencia de la metafase I, son los cinetocoros de las cromátidas hermanas los que están orientados hacia los polos opuestos de la célula, uniéndose a las fibras del huso de lados opuestos. Así que en la anafase II, se produce la disyunción de las cromátidas hermanas que migran a los polos opuestos de la célula. En la telofase II, la última etapa de la segunda división meiótica, se produce la citocinesis, lo que da lugar a cuatro células, cada una con un número haploide de cromosomas (n) y con cantidad C de ADN (Figura 9.17).

Figura 9.16 Diagrama general ilustrativo de la meiosis en una célula hipotética con dos pares de cromosomas (2n = 4). De A a H, se representa la primera división meiótica, ante la cual ya se ha producido la síntesis de ADN. Las células que se muestran de A a E están en la profase I, específicamente en leptoteno (A), zigoteno (B) paquiteno (C) diploteno (D) y diacinesis (E). Cada una de las dos células H, derivadas de la meiosis I, tiene un número diploide (2n) de cromosomas y cantidad 2C de ADN. Estas dos células entran en meiosis II, representada de I a K. Como no se produce una nueva síntesis de ADN antes de esta división, las cuatro células indicadas por la letra K, resultantes de la meiosis, son haploides (n) y presentan un contenido de ADN igual a C. Tenga en cuenta que durante la meiosis I, se produjo un intercambio de segmentos entre cromosomas homólogos y que esto, junto con la segregación de estos cromosomas de forma independiente entre ellos, contribuye a la alta variabilidad genética de los seres que se reproducen sexualmente.

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Figura 9.17 Representación de la sucesión de los principales acontecimientos de la meiosis. A. En la etapa G, se muestra una célula diploide con un par de cromosomas homólogos, cuyo ADN se replica en la fase S, lo que produce dos cromátidas hermanas en cada cromosoma. Después de la replicación, en la profa se, se producen roturas en las dobles cadenas (DSB), que luego son reparadas por recombinación. Los quiasmas resultantes conectan los cromosomas homólogos y facilitan la adecuada sep aración de los homólogos en la primera división meiótica (meiosis I). Las cromátidas hermanas se segregan en la meiosis II. B. Detalles de los eventos de montaje y desmontaje del complejo sinaptonémico que ocurren durante las etapas de la profase I (b-d) de la meiosis.

CONTROL GENÉTICO DE LA MEIOSIS Al igual que en la mitosis de las células somáticas, la meiosis es controlada por el complejo ciclina-Cdk (discutido anteriormente en este capítulo), el cual fue, incluso, descubierto y purificado a partir de oocitos de rana. Estas células pregaméticas se convirtieron entonces en un modelo de estudio de la regulación tanto de la meiosis como del propio ciclo celular. Para que la meiosis tenga éxito, varios eventos tales como la replicación, la recombinación y la segregación cromosómica deben producirse de manera coordinada y en un orden estrictamente regulado. Hoy en día, se sabe que la quinasa dependiente de la ciclina de la fase S, que inicia la replicación (S-Cdk), también es esencial para iniciar la recombinación meiótica, ya que fosforila a la proteína Mer 2, que es la proteína implicada en la rotura de la doble cadena (DSB) específicas de la meiosis. Esta acción prepara a la Mer 2 para otra fosforilación posterior, hecha por otra quinasa, lo que modula las interacciones de la Mer 2 con Spo11 y otras proteínas necesarias para la formación de las DSB. La colaboración entre estas dos quinasas parece ser un mecanismo común de regulación de los eventos de la meiosis, lo que ayudaría a coordinar una con relación a otra. En particular, la meiosis de los ovocitos se regula en dos puntos: uno en la etapa de diploteno de la primera división meiótica, en la que los ovocitos se mantienen durante largos períodos de tiempo, y otro, en la metafase II, donde permanecen hasta la fertilización, como se explicó anteriormente. En la mayoría de los vertebrados, los ovocitos salen de la etapa de diploteno, continuando a través de las etapas restantes de la meiosis I, en respuesta a estímulos hormonales. Esta señal hormonal activa al complejo M-Cdk, que pasa a desencadenar, similar a lo que ocurre en la transición G2/M del ciclo mitótico, los eventos de la condensación cromosómica, la rotura de la envoltura nuclear y la formación del huso. En el inicio de la anafase I, el complejo promotor de la anafase (APC) promueve la degradación de la securina, que venía hasta esta etapa inactivando a la separasa, una proteína con actividad proteolítica, responsable de la escisión de una de las subunidades de cohesina, la Sccl. Así, se dispara la eliminación selectiva de la cohesina de los brazos cromosómicos. Esto permite que los homólogos paternos y maternos sean segregados, sin pérdida de la cohesión entre las cromátidas hermanas. El complejo promotor de la anafase (APC) activa también, como en la mitosis, el sistema proteolítico que degrada a la ciclina, lo que conduce a la transición de metafase a anafase I y da como resultado la inactivación del complejo M-Cdk. Estudios recientes sugieren que la separasa tiene una segunda función no proteolítica. Esta forma un complejo con la Cdk del complejo ciclina-Cdk y esta interacción inhibe mutuamente las actividades proteasa y quinasa de cada una, lo que promueve la extrusión del primer cuerpo polar, indicando la finalización de la meiosis I. Esto demuestra que la separasa puede ser necesaria no sólo para la segregación cromosómica, sino también para los eventos que conducen a la finalización de la meiosis I. Después de la citocinesis, el complejo quinasa M-Cdk vuelve a presentar actividad que se mantiene hasta la metafase II. En esta etapa, sin embargo, el mecanismo de regulación del complejo M-Cdk presenta características propias de la meiosis. Este control actúa para mantener la actividad del complejo M-Cdk, evitando la proteolisis de la ciclina y por lo tanto la inactivación del complejo, lo que era de esperar en esta etapa. Por lo tanto, no se produce la transición metafase/anafase II y la célula queda detenida en la metafase II. El factor responsable de esta interrupción en la metafase II fue identificado como un factor citoplásmico, que, ya que también fue capaz de interrumpir metafases mitóticas, fue denominado factor citostático. Más recientemente, un componente esencial de este factor fue identificado como una proteína quinasa, conocido como Mos. Esta quinasa es responsable, de forma indirecta, por la inhibición de la vía proteolítica que conduce a la degradación de la ciclina, interrumpiendo la meiosis en la

metafase II. Si es fecundado el ovocito, hay un aumento en el nivel citosólico de Ca2+, responsable de la activación de un sistema proteolítico que degrada tanto a ciclina como a Mos, lo que finalmente resulta en la inactivación del complejo M-Cdk y en la complementación de la segunda división meiótica. Por otra parte, tanto la meiosis de los ovocitos como la de los gametos masculinos sufre un control adicional en el período de intercinesis, entre la meiosis I y la meiosis II. El período de intercinesis tiene una duración variable entre los organismos más diversos, estando, incluso, ausente en algunos de ellos. La característica más destacada de la intercinesis es la falta de la fase S, es decir, la no ocurrencia de la replicación del ADN, debido a que cada cromosoma es un duplicado. Para asegurar que la fase S se suprime y la célula pase de la meiosis I a la meiosis II, los niveles de Cdk y de ciclina M deben reducirse a la mitad. Esto se consigue tanto por el incremento en la síntesis, como por la inhibición parcial de la degradación de la ciclina M. La proteína quinasa Mos también está implicada en este proceso, ya que activa la proteína quinasa activada por mitógeno (en inglés, MAP-kinase), responsable de la activación de los genes que codifican las ciclinas y activa la proteína quinasa RsK. La RsK fosforila proteínas del complejo APC, inhibiendo parcialmente su actividad en la degradación de ciclina M. Este proceso asegura que sean mantenidos niveles tales del complejo M-Cdk que impiden una nueva replicación del ADN. LA MEIOSIS FAVORECE LA EVOLUCIÓN DE LAS ESPECIES La característica principal de la meiosis es ser un tipo especial de división celular que permite a los cromosomas homólogos, presentes en la célula original, aparearse íntimamente y efectuar un intercambio de material hereditario (Crossing-over). El intercambio físico real de los segmentos de ADN entre los cromosomas maternos y paternos de un par de homólogos resulta en una mezcla de genes de los padres, lo que conduce a su vez a un aumento significativo de combinaciones genéticas. Con este aumento de la recombinación genética, hay una mayor variabilidad en los tipos de gametos formados al final de cada meiosis, lo que contribuye a una mayor diversidad de los organismos y favorece la mayor adaptación evolutiva de las especies. En última instancia, el proceso de recombinación genética acelera el proceso de evolución de las especies. Aunque el crossing-over aparentemente sea el único evento clave de la meiosis que resulta en variabilidad genética, hay un segundo factor aún más importante que este: es la segregación independiente de los cromosomas homólogos, que se produce durante la anafase I. Debido a la posibilidad de que los cromosomas homólogos migren a cualquiera de los polos de la célula, independientemente de que su origen sea paterno o materno, y por el hecho de que cada uno de los homólogos puede dirigirse para un polo de manera independiente de los demás cromosomas, surgen muchas posibilidades de combinaciones cromosómicas en cada célula hija resultado de la primera división meiótica. El número de posibles combinaciones cromosómicas, o de diferentes tipos de gametos que se pueden formar a partir de una célula madre es siempre igual a 2n, siendo n el número haploide de cromosomas de la especie, o el número de pares cromosómicos por núcleo. Por ejemplo, la meiosis de una célula con tres (3) pares de cromosomas podría dar lugar a ocho (23) tipos diferentes de gametos, incluso en ausencia de cualquier cambio o recombinación genética en esta división. Asimismo, en los seres humanos, teniendo en cuenta su n característico, aproximadamente 8 x 106 gametos genéticamente únicos podrían formarse a partir de una sola célula. Sin embargo, debido a las posibles recombinaciones, el número de gametos genéticamente distintos que se produce es incluso mucho mayor. No hay duda, pues, que la principal consecuencia de la meiosis es dar a las especies una gran diversidad durante el proceso evolutivo, asegurándoles la reproducción sexual.

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RESUMEN Las células de la línea germinal se multiplican por divisiones mitóticas de una manera similar a las células somáticas. Sin embargo, al entrar en los procesos de gametogénesis, etapa final de su programa de desarrollo, la división adquiere características especiales. Esta división, la meiosis, se compone principalmente de dos divisiones nucleares, con la síntesis de ADN una vez antes de la primera división. Las células hijas resultantes tienen la mitad del número de cromosomas y la mitad de la cantidad de ADN que las células madres. La profase meiótica de la primera división es especial porque en ella ocurre el apareamiento de los cromosomas homólogos que pueden intercambiar piezas entre sí, fenómeno denominado intercambio, recombinación o crossing-over. Los cromosomas homólogos se mantienen unidos en algunos puntos (quiasmas) resultantes de los cambios sucedidos en el intercambio, hasta la metafase. En la anafase, ya que no hay división de los centrómeros, las dos cromátidas que forman cada cromosoma se mantienen juntas. Por lo tanto, hay una reducción en el número de cromosomas por célula, aunque la cantidad de ADN sea igual al valor original (2C), debido a que cada cromosoma se duplica. La segunda división se produce por lo general poco después del final de la telofase de la primera división y es similar a una mitosis, con la separación de las cromátidas hermanas después de la separación de los centrómeros. Por lo tanto, cada célula hija tendrá la mitad del número de cromosomas y, también, la mitad de la cantidad de ADN que existía en la célula madre. Un sistema de control genético similar al que ocurre en la mitosis también opera mediante la regulación de la meiosis en dos puntos específicos: en la diploteno de la profase I y en la metafase II. La liberación de estas fases depende, respectivamente, de la estimulación hormonal y de la degradación dependiente de Ca++ de una quinasa específica de ovocitos, responsable de mantener el complejo ciclina-Cdk activo. La meiosis, formando células con la mitad del número de cromosomas típicos de la especie, permite que, con la unión de los gametos haploides (n), se restablezca, en los nuevos individuos, el número diploide (2n) de cromosomas característicos de la especie. La mezcla de los

cromosomas paternos y maternos que se produce durante la primera división meiótica y, también, el intercambio de genes en el intercambio aumentan la variación genética de los individuos en las poblaciones. La existencia de variabilidad genética es uno de los requisitos fundamentales para que se produzca la evolución. BIBLIOGRAFÍA

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas

ERRNVPHGLFRVRUJ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■

Retículo endoplásmico Composición química Las membranas del RE son lipoproteicas y asimétricas Contenido de las cisternas El RER sintetiza y secreta las cadenas polipeptídicas Las proteínas que se encuentran en el RE reciben marcación específica El REL participa en la síntesis de lípidos de la célula El REL participa en la desintoxicación en el organismo Participación en el metabolismo del glucógeno El REL almacena, libera y captura iones Ca 2+ Exportación de lípidos del REL Complejo de Golgi El complejo de Golgi está formado por varios compartimentos en secuencia Las membranas de los sacos golgianos tienen diferentes composiciones enzimáticas En el aparato de Golgi, las macromoléculas sufren modificaciones adicionales Destino y exportación de las macromoléculas El transporte intracitoplasmático por vesículas diferentes asegura el destino correcto de las macromoléculas

Celia Guadalupe T. J. Andrade Berenice Quinzani Jordão

■ Algunas proteínas son procesadas dentro de las vesículas secretoras ■ Vías intracelulares de degradación ■ Los lisosomas contienen enzimas hidrolíticas responsables de la degradación de las biomoléculas ■ Vía endocítica ■ Vía ubiquitina-proteosomas ■ Integración entre las vías de biosíntesis y de degradación ■ Resumen ■ Bibliografía

Guía ■ El establecimiento de endomembranas es una de las principales adquisiciones evolutivas de las células eucariotas ■ Los polirribosomas citoplasmáticos sintetizan proteínas que se destinan al citosol, a las mitocondrias, a los plastos (plastidios), a los peroxisomas y al núcleo ■ En el retículo endoplasmático rugoso se sintetizan proteínas destinadas al retículo, a la membrana plasmática, al aparato de Golgi, a los lisosomas y a la secreción celular ■ La glicosilación de las cadenas polipeptídicas se inicia en el interior de las cisternas del retículo rugoso y termina en el complejo de Golgi ■ El retículo endoplásmico liso participa en la síntesis y el metabolismo de los lípidos en la célula ■ La síntesis y secreción de proteínas y lípidos implica la cooperación entre el retículo endoplásmico y el complejo de Golgi ■ Las cisternas del aparato de Golgi tienen polaridad estructural y de función ■ Dentro de las cisternas golgianas se producen glicosilaciones, sulfataciones y fosforilaciones de las proteínas y los lípidos ■ La degradación del material capturado del medio extracelular se produce por las vías fagocítica y endocítica y la del material intracelular sigue la vía autofágica ■ Los lisosomas son ricos en enzimas digestivas que tienen actividad a pH ácido ■ Las proteínas celulares son degradadas por los proteosomas, complejos multienzimáticos del citoplasma y del núcleo de todas las células.

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l proceso de la evolución de las células eucariotas culminó con la adquisición de las membranas internas que llevaron a su vez a la creación de compartimentos individualizados, con diferentes composiciones químicas y funciones específicas: los orgánulos. Ellos secretan y organizan los procesos bioquímicos intracelulares, que proporcionan un marco para el desarrollo y la diferenciación celular. Los orgánulos se componen de moléculas complejas que, con la excepción de ADN, relativamente estable, están en constante renovación. La célula captura nutrientes del medio extracelular, los degrada y utiliza los productos de degradación en la síntesis de las moléculas necesarias para sus actividades. Para el mantenimiento de la estructura celular, es importante contar con mecanismos para la síntesis continua de nuevas moléculas, así como para la degradación de las macromoléculas en desuso o que ya han cumplido su función. Además de los ácidos nucleicos, estudiados en otro capítulo, las principales macromoléculas encontradas en las células son las proteínas, los carbohidratos y los lípidos. En este capítulo vamos a discutir los aspectos estructurales y funcionales de los orgánulos celulares que participan en la síntesis, destino y degradación de estas macromoléculas. RETÍCULO ENDOPLÁSMICO Todas las células eucariotas contienen retículo endoplásmico (RE), que consiste en una red de membranas que delimitan cavidades de varias maneras. Estas cavidades pueden ser también llamadas cisternas, lumen o luz. El RE se extiende desde la envoltura nuclear y atraviesa gran parte del citoplasma, formando una red tridimensional de cavidades comunicantes. La microscopía electrónica ha permitido identificar dos tipos morfológicamente diferentes de retículo: el retículo endoplasmático granular o rugoso (REG o RER), que tiene ribosomas adheridos a la cara citoplasmática de sus membranas, y el agranular o retículo endoplasmático liso (REA o REL), que no contiene ribosomas. Los ribosomas están asociados con las membranas del retículo en forma de polirribosomas, es decir, cuando están unidos por medio de una molécula de ARNm y, por lo tanto, se encuentra en plena actividad de síntesis proteica. Esta asociación siempre se produce por la subunidad mayor del ribosoma, mientras que la subunidad menor se une al ARNm. Aunque los polirribosomas pueden estar asociados a la membrana del retículo, también hay polirribosomas dispersos, libres en el citoplasma (Figura 10.1). Estos son responsables de la síntesis de proteínas que deben permanecer en el citosol o ser incorporados en el núcleo, mitocondrias, cloroplastos o peroxisomas. Ejemplos de células que sintetizan proteínas para ser utilizadas en el citosol son el eritroblasto (célula precursora de los glóbulos rojos), que sintetiza la hemoglobina, y el cianoblasto, célula productora de hemocianina, otro pigmento respiratorio (Figura 10.2). Las células que se reproducen a un ritmo rápido, como las células embrionarias o las de tumores de rápido crecimiento, muestran el citoplasma lleno de polirribosomas, que sintetizan proteínas para el crecimiento del citoplasma y del núcleo de las células hijas después de cada ciclo mitótico. Además, las proteínas sintetizadas en los polirribosomas unidos a las membranas del retículo endoplásmico son aquellas destinadas a permanecer en el misma retículo, ser transportadas al aparato de Golgi, formar lisosomas, componer la membrana plasmática o ser secretadas de la célula. Las células acinares del páncreas, que producen enzimas digestivas, y las células caliciformes intestinales son ejemplos de células que sintetizan proteínas para la secreción. Las diferencias en la ubicación y el tipo de síntesis de proteínas hacen posible clasificar las células en cuatro tipos generales, que se muestran en la figura 10.3 y se describen a continuación:  Células que sintetizan activamente proteínas que permanecen en el citosol y no son segregadas en las cisternas del RER: en estas células, las proteínas se sintetizan en polirribosomas libres en el citosol, no unidos al retículo, que ocupan gran parte del citoplasma (Figura 10.3A). Ejemplos de tales tipos celulares son los eritroblastos, las células embrionarias y las células de tumores de crecimiento rápido  Células que sintetizan y secretan proteínas en las cisternas del RER y exportan directamente a estas proteí-

nas, sin ellos sin acumularlas en gránulos: en estas células, la síntesis de proteínas se lleva a cabo por polirribosomas adheridos a la cara citoplasmática de la membrana del RER. Ellas presentan un aparato de Golgi desarrollado y, en ellas, no hay gránulos secretores. Ejemplos de este tipo de células son los fibroblastos, que secretan matriz extracelular, y las células plasmáticas, que secretan anticuerpos (Figura 10.3B)  Células que sintetizan proteínas que son secretadas en las cisternas del RER pasan al aparato de Golgi y luego se acumulan en gránulos, que por lo general se mantienen en las células para su uso posterior: es el caso de los leucocitos eosinófilos, neutrófilos y monocitos, así como de los macrófagos, que presentan gránulos en el citoplasma que contienen proteínas y enzimas con varias funciones (Figura 10.3C).  Células que sintetizan, secretan y acumulan proteínas en gránulos de secreción que serán exportados por exocitosis: son ejemplos las células secretoras exocrinas del páncreas y de la glándula salival parótida, que producen enzimas digestivas envasadas en vesículas o gránulos envueltos por una membrana que, bajo el estímulo apropiado, serán secretadas para digerir los alimentos (Figura 10.3D). Además de los polirribosomas, otras características también diferencian el RER del REL. El RER, en la mayoría de las células, se compone de láminas planas dispuestas en paralelo (Figura 10.4). Sus cavidades pueden presentarse más o menos dilatadas, de acuerdo con el estado funcional de la célula. El REL, a su vez, se muestra generalmente en forma de vesículas globulares o túbulos contorsionados (Figura 10.5), que pueden tener continuidad con el RER. Los dos tipos de retículo no sólo presentan diferencias morfológicas, sino que también presentan diferencias en la composición química y en la función, aspectos que se discutirán más adelante en este capítulo. El retículo endoplasmático sólo es visible en el microscopio electrónico, puesto que el espesor de sus membranas está por debajo del poder de resolución del microscopio óptico. Su presencia puede, sin embargo, ponerse de manifiesto al microscopio óptico, si las células se tiñen con colorantes básicos. Estas porciones teñidas fueron nombradas, inicialmente, regiones basófilas del citoplasma y, posteriormente, ergastoplasma (del griego ergazomai, elaborar). En las neuronas, estas porciones basófilas fueron llamadas corpúsculos de Nissl. Con la llegada de la microscopía electrónica, se encontró que todas estas regiones corresponden al retículo endoplasmático rugoso. El tipo de retículo y su cantidad en la célula varían entre los diferentes tipos celulares y de acuerdo con la actividad de síntesis de la célula. El retículo rugoso participa en la síntesis de proteínas, mientras que el liso está involucrado en el metabolismo de los lípidos. Por lo tanto, las células que sintetizan y secretan proteínas activamente presentan un retículo rugoso bien desarrollado, llegando a ocupar, en los cortes, una zona de citoplasma que representa más de la mitad de la superficie total de la célula. Por otro lado, en las células implicadas en el metabolismo de lípidos, tales como las células intersticiales de los testículos y las de las glándulas suprarrenales, hay una gran cantidad de retículo liso. Las hormonas secretadas por estas células son de naturaleza lipídica. Por otra parte, la posición ocupada por el retículo en el citoplasma varía de un tipo celular a otro. En la mayoría de las células, el retículo endoplásmico está situado cerca del núcleo. Las células que secretan las proteínas son generalmente polarizadas, es decir, tienen diferentes dominios estructurales y funcionales en el citoplasma. Un ejemplo son las células acinares del páncreas, que presentan retículo endoplasmático rugoso solo en la porción basal, que rodea al núcleo, mientras que la porción apical está ocupada por las vesículas de secreción. Por otro lado, las células que sintetizan muchas proteínas, pero no las acumulan – como las células plasmáticas que secretan continuamente – contienen un RER dispersado por todo el citoplasma sin localización preferencial. Las células que mantienen un nivel basal de síntesis proteica, tales como los linfocitos circulantes en la sangre y la linfa, contienen pocas cisternas del RER, que también están dispersas.

Figura 10.1 Esta micrografía electrónica de una célula que sintetiza proteínas muestra los polirribosomas, que son grupos de ribosomas unidos a una molécula de ARN mensajero. El ARN mensajero que une a los ribosomas no es visible en esta preparación. 100.000x.

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas

Figura 10.2 Micrografía electrónica de cianoblasto de Limulus. Esta célula produce un pigmento respiratorio color azul, la hemocianina. En el extremo izquierdo de la foto, aparece una pequeña porción del núcleo de la célula. Arriba, también a la izquierda, cristaloide del pigmento respiratorio he mocianina (H). El citoplasma se presenta lleno de polirribosomas, una característica de una célula que produce proteína para el citosol. Las flechas apuntan hacia vesículas aplanadas del retículo endoplasmático rugoso, raro en estas células. A la derecha, abajo, las mitocondrias (Mi). 44.000x. (Cortesía de Fahrenbach, W.H. J. Cell Biol., 44:445, 1970. Usado con permiso.)

Figura 10.3 Esquema que muestra la ultraestructura característica de los cuatro tipos generales de células con alta actividad para la síntesis de proteínas. La ultraestructura varía en función del destino de las proteínas sintetizada. (Explicación en el texto.)

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Figura 10.4 Esta micrografía electrónica de una célula que sintetiza mucha proteína, muestra bien una región rica en retículo endoplasmático rugoso (RER o REG). Las membranas del RER tienen ribosomas adheridos a su superficie exterior (citosólica). Las moléculas proteicas sintetizadas se secretan dentro de las cisternas del retículo, donde aparecen como un material granular. 84.000x.

Figura 10.5 Micrografía electrónica de corte de célula intersticial del testículo que muestra el retículo endoplásmico liso (REL o REA) formado por túbulos que se anastomosan. N = núcleo; M = mitocondria; G = gotas de lípidos. 40.000x.

COMPOSICIÓN QUÍMICA La composición química de los componentes del retículo endoplásmico se puede determinar in situ, por medio de métodos citoquímicos y/o inmunocitoquímicos o en fracciones celulares aisladas.

fluorescente o electrodenso, que está unido al anticuerpo. Las proteínas tales como las chaperonas moleculares (discutidas más adelante en este capítulo) se consideran específicas del RER y su presencia puede ser detectada por inmunocitoquímica.

Los métodos citoquímicos permiten detectar la actividad de una enzima particular que es específica del orgánulo en estudio. En el caso del retículo endoplásmico liso, la enzima glucosa-6-fosfatasa (G-6-Pasa) se considera un marcador de este orgánulo, por esa especificidad. Esta enzima participa en la obtención de la glucosa a partir del glucógeno en la glucogenólisis. Para detectar la actividad de la glucosa-6-fosfatasa, los fragmentos de tejido estudiados son fijados en glutaraldehído y luego son incubados en un medio que contiene el sustrato de la enzima - en este caso, la glucosa6-fosfato -más nitrato de plomo. La glucosa-6-fosfatasa que se encuentra en las células del tejido sacarán el fosfato de la glucosa 6-fosfato. Este, a su vez, formará complejo con el plomo para formar fosfato de plomo, un precipitado electrodenso observado en las partes del retículo en las que se encuentra la enzima. El precipitado electrodenso puede volverse visible bajo el microscopio óptico si el material se trata, a continuación, con sulfuro de amonio, tras lo cual se forma un precipitado negro de sulfuro de plomo. El uso de métodos inmunocitoquímicos (descritos en el Capítulo 2) permite, también, detectar la presencia de una proteína particular en un orgánulo. Esa proteína debe ser específica del orgánulo en estudio, con el fin de hacer posible que pueda ser reconocida por anticuerpos. El reconocimiento entre la proteína y su anticuerpo se detecta por un compuesto coloreado,

Se pueden obtener fracciones de retículo mediante el sometimiento de los tejidos homogeneizados en estudio a centrifugación fraccionada (véase el Capítulo 2 para los detalles del método), en donde la tercera fracción que sedimenta está constituida por vesículas lisas y rugosas, como resultado de la fragmentación de ambos tipos de retículo endoplasmático y del aparato de Golgi. Con el uso de solución hipotónica, y una recentrifugación, se obtienen las subfracciones de membrana y el contenido de las cavidades, que pueden tener una composición química determinada por métodos bioquímicos. LAS MEMBRANAS DEL RE SON LIPOPROTEICAS Y ASIMÉTRICAS Como el resto de las membranas biológicas, las membranas del retículo son lipoproteicas conteniendo 30% de lípidos y 70% de proteína. Estas membranas son más delgadas que la membrana plasmática, tienen aproximadamente 6 nm de espesor, lo cual es debido a la longitud más corta de las cadenas de ácidos grasos de los lípidos presentes. Los lípidos más abundantes son los fosfolípidos, representados por la fosfatidilcolina (aproximadamente el 60% del total de los fosfolípidos), seguido por la fosfatidiletanolamina (25%), fosfatidilinositol (10%), la fosfatidilserina (4%) y esfingomielina (4%). También contiene una pequeña cantidad de colesterol y glicolípidos.

Estudio in situ

Estudio de fracciones aisladas

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas Entre las proteínas se identificaron aproximadamente 30 cadenas polipeptídicas, incluyendo algunas glicoproteínas y numerosas enzimas. Las enzimas están representadas por las hidrolasas, tales como la glucosa-6-fosfatasa, las que participan en la síntesis de fosfolípidos y de esteroides, así como por las glicosiltransferasas, enzimas que catalizan la adición de oligosacáridos a las proteínas y los lípidos. En estas membranas también hay dos cadenas transportadoras de electrones, cada una con un citocromo específico: el citocromo P450 y el citocromo b 5 y sus respectivas reductasas. El RE está anclado al citoesqueleto por la CLIMP-63 (peso molecular = 63 kDa), una proteína de transmembrana, cuya cara citosólica se une a los microtúbulos, mientras que la cara luminal cara forma un esqueleto proteico en el lumen del retículo, contribuyendo así al mantenimiento de la morfología de sus cisternas (Figura 10.6). La mayor parte de estas proteínas es común a ambos tipos de RE. Las membranas del RER, sin embargo, son ricas en ciertas proteínas específicas, como las que participan en la asociación de los ribosomas y en la translocación e internalización de las cadenas polipeptídicas.

Como la mayoría de las membranas biológicas, las membranas del retículo también son asimétricas, es decir, tanto las proteínas como los lípidos se distribuyen de forma diferente entre la monocapa citosólica y la luminal. La fosfatidilcolina, la fosfatidilserina y la fosfatidiletanolamina están situadas preferentemente en la cara citosólica, mientras que la esfingomielina y el fosfatidilinositol están orientados hacia la cara luminal. La glucosa-6fosfatasa es una proteína intrínseca de la membrana, con nueve dominios helicoidales de transmembrana y el sitio activo orientado a la cara luminal de la cisterna, mientras que el citocromo b5, el citocromo P450 y sus respectivas reductasas se enfrentan a la cara citosólica. La CLIMP-63, a su vez, es una proteína de transmembrana que produce una protuberancia a ambos lados de la membrana (Figura 10.6). Esta distribución está directamente relacionada con el papel que estas proteínas desempeñan en el RE. Además, las porciones glucídicas de los lípidos y las proteínas están orientadas hacia el interior de la cisterna, a diferencia de lo que ocurre en la superficie celular.



Figura 10.6 Esquema que muestra la disposición de algunas proteínas y complejos citocromo-reductasas en la bicapa lipídica del retículo endoplásmico.

CONTENIDO DE LAS CISTERNAS El contenido de las cisternas varía según el tipo de retículo, del tipo celular y el estado fisiológico de la célula. Por lo general, contienen una solución acuosa en la que están inmersas proteínas, glicoproteínas y lipoproteínas. En los plasmocitos, por ejemplo, las cavidades contienen inmunoglobulinas; en los fibroblastos, se encuentran las cadenas de protocolágeno, mientras que en las células exócrinas pancreáticas se encuentran hidrolasas ácidas. En las células de la glándula adrenal, por otro lado, las cavidades del REL contienen hormonas esteroides.

Algunas funciones son comunes a ambos tipos de retículo

Los retículos endoplásmicos liso y rugoso desempeñan algunas funciones en común en la célula, tales como la segregación de los productos sintetizados en sus membranas dentro de sus cavidades. Por otra parte, la gran área de citoplasma ocupada por el sistema de endomembranas del retículo proporciona soporte mecánico al citosol, junto con los microfilamentos y los microtúbulos. Hay, sin embargo, algunas funciones específicas de cada tipo de retículo, las que se abordarán por separado. En resumen, el RER está involucrado en la síntesis, la segregación y el procesamiento de proteínas constituyentes de membrana y proteínas secretoras. El REL, a su vez, participa en la síntesis de lípidos, en los procesos de desintoxicación, en la degradación del glucógeno y de la regulación del Ca2+ intracelular. En las células del músculo esquelético, el REL se llama retículo sarcoplásmico y es responsable de controlar la concentración del Ca 2+ interviniente en la contracción muscular. EL RER SINTETIZA Y SECRETA LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS Las cadenas polipeptídicas sintetizadas en los polirribosomas acoplados a las membranas del RER se transfieren al interior de las cisternas mientras todavía se están traduciendo. Ellas se procesan y se acumulan en las cisternas, desde donde son transportadas, dentro de las vesículas, a sus destinos. Estas proteínas componen tanto las membranas como el interior de las cavidades del retículo endoplásmico, del complejo de Golgi y de los lisosomas. También constituirán la membrana plasmática y la secreción celular. En general, la estructura primaria de las proteínas está determinada por la secuencia de nucleótidos del ARNm que la codifica. Cada tres nucleótidos de esa secuencia se codifica un aminoácido específico y es un codón. Al inicio de la síntesis proteica, la subunidad menor de un ribosoma se asocia al primer codón situado en el extremo 5' del ARNm. A este codón así expuesto se le asocia el aminoácido específico, que fue reconocido y transportado a ese lugar por un ARNt apropiado. Así, la subunidad mayor del ribosoma se asocia a la menor. El ribosoma se mueve a lo largo de la molécula de ARNm hacia su extremo 3', traduciendo cada codón en sus respectivos aminoácidos, formando así la cadena polipeptídica. A medida que el ribosoma se mueve de un codón para los próximos, otros ribosomas se asocian con el ARNm, formando una polirribosoma. El número de ribosomas que se asocia a una sola molécula de ARNm depende del peso molecular de ese ARNm. Cuanto mayor sea la proteína codificada por dicho ARNm, mayor será la molécula de ARNm y, en consecuencia, mayor será el número de ribosomas que se asocian a ella. Cada ribosoma sintetiza una única cadena polipeptídica; Por lo tanto, el número de moléculas sintetizadas simultáneamente también depende del peso molecular del ARNm. Las proteínas que deben ser sintetizadas en los polirribosomas unidos al RER son marcadas con una secuencia de aproximadamente 20 aminoáci-

dos, llamada la secuencia señal. La secuencia señal es el primer segmento de la cadena polipeptídica que se traduce, y su secuencia de aminoácidos varía ampliamente entre las especies, pero todas ellas se caracterizan por la presencia de esta secuencia de ocho o más aminoácidos apolares. Si, por ingeniería genética, se añade una secuencia señal a las proteínas que son sintetizadas por polirribosomas citosólicos, estos pasan a unirse a las membranas del retículo, y a continuación, la proteína es producida, y puede ser secretada. A medida que la secuencia señal emerge del ribosoma, es reconocida por una partícula citoplasmática llamada partícula de reconocimiento de señal o PRS, formado por una cadena de ARN 7S complejada con seis cadenas polipeptídicas (Figura 10.7). La asociación de la PRS con la secuencia señal interrumpe la síntesis proteica, que será reiniciada sólo cuando la PRS encuentre su receptor, una proteína intrínseca localizada en la superficie citosólica de la membrana del retículo rugoso. El PRS se une a su receptor sólo cuando una molécula de GTP se une a ambos. Cuando la PRS interactúa con el receptor, se desconecta del complejo ribosoma-cadena polipeptídica de, y la subunidad mayor del ribosoma se une a un complejo proteico intrínseco a la membrana del RER, continuando con la traducción. La hidrólisis del GTP (formando GDP) hace que la PRS se disocie de su receptor. La cadena polipeptídica se transfiere a través de la membrana por los translocones que son canales acuosos que pueden llegar a 2-6 nm de diámetro (Figura 10.7). El componente central del translocón es el complejo Sec 61, que consta de tres proteínas de transmembrana llamadas  (alfa),  (beta) y  (gamma). Asociadas con el complejo Sec 61 y también implicadas en la translocación de la cadena polipeptídica, están las proteínas TRAM (del inglés translocating chainassociated membrane), el complejo proteico TRAP (del inglés, transloconassociated protein), la peptidasa señal a (ver más adelante) y el complejo OST (ver más adelante). Las proteínas del complejo Sec 61 reconocen la subunidad mayor del ribosoma, se unen a ella y funcionan como un túnel para el paso de la cadena polipeptídica. La secuencia señal se une a una ubicación específica del complejo Sec 61, provocando un cambio conformacional que abre el canal acuoso, haciendo posible que la cadena polipeptídica pase a través de ese túnel. Además, la proteína BiP (del inglés, binding protein) se asocia con el complejo Sec 61, funcionando como un tapón en el lado luminal del translocón. Cuando se abre el canal acuoso, la BiP se disocia, permitiendo el paso de la cadena polipeptídica. La primera porción de la cadena polipeptídica que cruza el túnel formado por el complejo Sec 61 es la secuencia señal. A medida que la secuencia señal atraviesa el túnel y la cadena polipeptídica penetra en las cisternas del retículo, la enzima asociada al complejo Sec 61, peptidasa señal, escinde la secuencia señal y el resto de la cadena polipeptídica se libera dentro de la cisterna (Figura 10.7). El complejo proteico OST (del inglés, oligosacaril transferase complex), asociado al translocón, añade oligosacáridos a las cadenas polipeptídicas a medida que estas son translocadas, como veremos más adelante. Por otro lado, si la proteína está destinada para componer las membranas, es decir, si es una proteína intrínseca de la membrana del RE, del aparato de Golgi o de los lisosomas, no se libera en el interior de las cisternas. En su lugar, parte de la proteína permanece insertada en la membrana del retículo, a medida que ocurre su translocación hacia el interior de la cisterna (Figura 10.8). Esto es porque, cuando la cadena polipeptídica se transloca a través de la membrana del retículo, la secuencia señal es escindida y a continuación la cadena polipeptídica es anclada en la membrana a través

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de un segundo segmento con una conformación secundaria en alfa hélice, hidrófobo, situado en la parte más interna de la cadena. Este segmento se encuentra en una secuencia de parada de transferencia y bloquea la translocación del resto de la cadena polipeptídica. Entonces, el complejo Sec 61 se abre lateralmente, liberando la proteína, que se difunde por la bicapa lipídica (Figura 10.8). Una vez introducida, se transporta como parte integrante de la membrana de vesículas que brotan del retículo y que se dirigen a las membranas de destino. Por lo tanto, la proteína se transporta a su destino final como un constituyente de las membranas, y no como una proteína soluble. Estas proteínas intrínsecas pueden pasar a través de la membrana una o más veces. Se sugiere que las proteínas que atraviesan la membrana varias veces lo hacen mediante la presentación de secuencias señal situadas en el centro de la cadena polipeptídica que se alternan con secuencias de interrupción de transferencia de la cadena. Por otra parte, algunas proteínas están orientadas con su extremo aminoterminal hacia el citosol, mientras que otras exhiben su extremo carboxiterminal a la cara citosólica de la membrana. Estas orientaciones de las proteínas que compondrán las membranas del RE, del Golgi, de los lisosomas o la membrana plasmática son establecidas a medida que las cadenas polipeptídicas son translocadas a través de la membrana del RE. El lumen del RE es topológicamente equivalente al exterior de la célula; por lo que las regiones de las cadenas polipeptídicas que son translocadas al interior del retículo corresponden a los dominios de las proteínas de la membrana plasmática que están expuestos en la superficie celular (Capítulo 5). Las proteínas que serán secretadas y, por lo tanto, liberadas en el lumen del RE, después de tener su secuencia señal escindida por la peptidasa señal, penetran en el RE en configuración primaria. La cadena polipeptídica que penetra en las cisternas del retículo puede incluso no ser funcional, lo que requiere de procesos adicionales. Estos procesos implican modificaciones post-traduccionales tales como plegamientos de la cadena, de manera que esta asuma su conformación tridimensional secundaria o terciaria, o incluso, la reunión de varias cadenas polipeptídicas para formar proteínas multiméricas (conformación proteica cuaternaria). Los plegamientos de la cadena polipeptídica se determinan por su secuencia de aminoácidos, pero son facilitados por otras proteínas llamadas chaperonas moleculares. Las chaperonas se unen de manera transitoria a la cadena polipeptídica que está siendo sintetizada, no participando de la estructura final de la proteína (Figura 10.7). Ellas garantizan el correcto plegamiento de la cadena polipeptídica, impiden la agregación y aseguran que los enlaces disulfuro sean establecidos entre los aminoácidos sulfatados. Se caracterizaron varios tipos de chaperonas, tales como la calnexina, la calreticulina, la disulfuro-isomerasa, y la Bip (ya mencionada). La calnexina es una proteína intrínseca de la membrana del retículo, mientras que la calreticulina, la Bip y la disulfuro isomerasa son proteínas solubles que se encuentra en el interior de las cisternas. Todas estas chaperonas comparten la misma función, es decir, que se unen a la cadena polipeptídica a medida que esta es translocada a través de la membrana y luego catalizan el plegamiento de la molécula y la reunión de las subunidades proteicas. Tanto la calnexina como la calreticulina tienen actividad dependiente de los iones Ca2+ y están involucradas en el procesamiento de las glicoproteínas, mientras que la BiP, que tiene actividad ATPasa, tiene un papel fundamental en el plegamiento de las proteínas no glicosiladas. La disulfuro– isomerasa, a su vez, cataliza el establecimiento de los puentes disulfuro entre los residuos de cisteína de las proteínas (Cis-S-S-Cis), que son muy importantes para la estabilidad de estas proteínas en su configuración tridimensional.

Las chaperonas también son responsables del "control de calidad" de las proteínas sintetizadas en el retículo. Aquellas proteínas que se pliegan o se arman incorrectamente regresan al citosol, pasando por el complejo Sec 61 en un proceso de translocación a la inversa, es decir, retrotranslocación o movimiento. En el citosol, son degradadas por complejos multienzimáticos, como veremos más adelante. Hasta hace poco, las chaperonas eran conocidas como proteínas de choque térmico, abreviado como Hsp (del inglés, heat-shock proteins), una familia de proteínas que se expresaban en células sometidas a altas temperaturas o algún tipo de estrés ambiental. Muchas de estas proteínas fueron, sin embargo, detectadas en células que crecen en condiciones normales, en las cuales tienen función de chaperonas. Las chaperonas también se unen a las cadenas polipeptídicas que se sintetizan en los polirribosomas libres en el citosol, manteniendo al mismo tiempo la conformación extendida de esas cadenas hasta que se complete la síntesis. Mientras que la cadena polipeptídica es transcrita y translocada a las cisternas del retículo, comienza su glicosilación, que se hace mediante la transferencia de un oligosacárido que contiene 14 residuos de azúcar, de las cuales dos residuos son de N-acetilglucosamina, tres de glucosa y nueve de manosa (Figura 10.9). Cada oligosacárido transferido está unido al grupo amino (NH 2) de los aminoácidos asparagina encontrados en la cadena polipeptídica en formación, por esto es que es del tipo denominado oligosacáridos N-ligados. Este oligosacárido es proveniente del propio retículo, en el que es polimerizado y se mantiene unido a un lípido que se encuentra en la membrana, fosfato de dolicol, de la cual es transferido, como un bloque, a la cadena polipeptídica por las proteínas del complejo OST o la oligosacariltransferasa, que es intrínseca a la membrana del RER (Figura 10.9). La energía para el enlace es proporcionada por la rotura de un enlace fosfato que mantiene al oligosacárido unido al dolicol. Aún dentro de las cisternas del retículo, dos residuos de glucosa y uno de manosa son eliminados de la cadena, por las enzimas glucosidasas I y II y manosidasa, respectivamente. Cuando el primer residuo de glucosa es retirado, las chaperonas calnexina o calreticulina se unen a la cadena polipeptídica y actúan en su plegamiento. La retirada de la segunda glucosa provoca la disociación de las chaperonas y la liberación de la cadena polipeptídica. Si la glicoproteína recién formada se pliega de forma incorrecta, es reglicosilada y otra vez es reconocida por las chaperonas. Otras moléculas de azúcar se pueden añadir más tarde en el complejo de Golgi, como se discutirá más adelante. Las proteínas sintetizadas y procesadas en el retículo endoplásmico se exportan en vesículas de transporte que surgen de la membrana del retículo y se fusionan con las membranas del complejo de Golgi. Las vesículas se derivan de una región especializada del RER que carece de polirribosomas acoplados a las membranas, llamada elemento transicional o retículo endoplasmático transicional. Las vesículas de transporte que surgen del elemento transicional se fusionan para formar una red de estructuras tubulares, que constituye el compartimento intermedio RE-Golgi. En este compartimento ocurre la selección de las moléculas, es decir, proteínas específicas del RE que han sido liberadas por error en el interior de las vesículas son recuperadas de nuevo en vesículas que brotan de este compartimiento. Este transporte se realiza por la asociación de las vesículas con microtúbulos citosólicos. Además, las proteínas destinadas a los compartimentos posteriores son enviadas a las cisternas del cis–Golgi.

Figura 10.7 Dibujo que muestra la secuencia de los principales acontecimientos ocurridos durante la síntesis proteica en el RER. La sínte sis comienza en el citosol y la primera porción de la cadena que se sintetiza es la secuencia señal, que dirige al polirribosoma a la membrana del RER. La síntesis se detiene cuando la partícula de reconocimiento de señal (PRS) se une a la secuencia señal. La síntesis se reanuda cuando el ribosoma y la proteína de reconocimiento de señal se unen a sus respectivos receptores en la membrana del RER. Cuando la traducción se reanuda, la PRS se desune y vuelve al citosol. El ribosoma se asocia con el translocón, el cual es un agregado proteico conformado por el complejo Sec 61, la proteína asociada a la translocación (TRAM), la peptidasa señal, el complejo oligosacaril-transferasa (OST) y la proteína asociada al translocón (TRAP). La BIP se asocia como un tapón en la superficie luminal del translocón y sólo se disocia cuando el complejo Sec 61 se abre como un túnel para el paso de la cadena a través de la membrana. A medida que la cadena es translocada, la secuencia señal es escindida por la peptidasa señal, las chaperonas moleculares se asocian a la cadena y el complejo OST añade oligosacáridos a la cadena polipeptídica (no mostrada). Cuando la cadena se libera dentro de la cisterna, las chaperonas hacen que adquiera su configuración tridimen-

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas sional. Una vez que la síntesis del polipéptido ha terminado, las dos subunidades ribosomales se separan y pueden ser reutilizadas.

Figura 10.8 Esquema que ilustra la inserción de una proteína intrínseca en la membrana del RER. En A y B, la cadena polipeptídica que se está sintetizando tiene segmentos en -hélice que contienen aminoácidos hidrófobos que constituyen las secuencias de parada de transferencia, y se insertan en el complejo Sec 61. C. Al final de la síntesis, el complejo Sec 61 se abre lateralmente y libera la cadena polipeptídica. D. La cadena se difunde en la bicapa lipídica.

Figura 10.9 Esquema de la glicosilación de la cadena polipeptídica en el interior de la cisterna del RER. El bloque de oligosacáridos, formado por 14 residuos de azucares, se une a la membrana por medio del fosfato de dolicol. A medida que se transloca la cadena, el bloque de oligosacáridos se transfiere al complejo OST (1) y desde éste a la cadena polipeptídica (2). Todavía en la cisterna del RER, dos residuos de glucosa (2) y uno de manosa (3) son extirpados del bloque de oligosacáridos. La cadena polipeptídica glicosilada se libera en la cisterna y asume su estructura en tres dimensiones gracias a la ayuda de las chaperonas (4).

LAS PROTEÍNAS QUE SE ENCUENTRAN EN EL RE RECIBEN MARCACIÓN ESPECÍFICA Al mismo tiempo en que el RER exporta proteínas para el complejo de Golgi, también debe mantener su propia composición química, determinante tanto de su estructura como de su función. El mantenimiento de las proteínas en el retículo depende de la concentración de Ca2+ en el interior de las cisternas, así como de secuencias de aminoácidos presentes en la molécula, que actúan como señales de destino. Estas señales actúan mediante dos mecanismos complementarios: la retención en el orgánulo y la recuperación, es decir, actúan manteniendo la proteína en el orgánulo y se requieren, también, para recuperar (recobrar) proteínas que son residentes, pero que, erróneamente, abandonaron el orgánulo. Las proteínas solubles del RE contienen una secuencia marcadora compuesta de los aminoácidos lisina o histidina, asparagina, ácido glutámico y leucina (Lys/His-Asp-Glu-Leu), conocida como KDEL o HDEL, ya que se asigna a cada aminoácido una dada letra. Si la proteína es transportada erróneamente al aparato de Golgi en el interior de las vesículas, llegando así a este orgánulo se transporta de vuelta al retículo. La secuencia H/KDEL es reconocida por un receptor específico presente en las membranas del complejo de Golgi, lo que hace que estas proteínas vuelvan al RE en vesículas que contienen ese receptor en sus membranas. Las proteínas de transmembrana, por otra parte, son seleccionadas para la retención en el RE por dos tipos diferentes de marcación. Una de ellas es una secuencia KKXX o KXKXX, donde K es el aminoácido lisina y X puede ser cualquier aminoácido. Otras son marcadas por un dominio en la proteína que contiene dos residuos de arginina situados uno al lado del otro o separados por otro aminoácido. EL REL PARTICIPA EN LA SÍNTESIS DE LÍPIDOS DE LA CÉLULA En las membranas del retículo endoplásmico liso se produce la síntesis de casi todos los lípidos que componen las membranas celulares, incluyendo a los fosfolípidos y al colesterol. Algunos de los lípidos de las membranas son producidos inicialmente en el REL y sus moléculas se completan en el complejo de Golgi. Esto le pasa a la esfingomielina y a los glicolípidos, cuyas porciones glucídicas se producen en colaboración con el complejo de Golgi. Otros implican la participación de enzimas que se encuentran en la mitocondria, como veremos más adelante. Las enzimas que sintetizan los fosfolípidos son intrínsecas de la membrana del retículo liso, con sus sitios activos formando salientes en el lado cito-

plásmico de la membrana (Figura 10.6). Como se describe en el capítulo 5, los principales lípidos de las membranas de las células eucariotas son los fosfolípidos, los glicolípidos y el colesterol. La mayoría de los fosfolípidos se sintetizan en la cara citosólica de la membrana del retículo, a partir de una molécula de glicerol y dos moléculas de ácidos grasos unidas a la coenzima A (CoA) (Figura 10.10). Inicialmente dos moléculas de ácido graso se transfieren desde la CoA a un glicerol 3-fosfato mediante aciltransferasas, dando lugar al ácido fosfatídico, que luego se inserta en la membrana. Enzimas que catalizan la adición de diferentes grupos polares al ácido fosfatídico conducen a la formación de fosfatidilcolina y fosfatidilserina. La fosfatidilserina, a su vez, se convierte en fosfatidiletanolamina por la enzima fosfatidilserina descarboxilasa, una enzima encontrada en la membrana mitocondrial interna. Por lo tanto, la fosfatidilserina sintetizada en las membranas del REL debe ser transferida a la mitocondria para ser descarboxilada y convertida en fosfatidiletanolamina, que se transporta de nuevo al REL, en el que sufre metilación (adición de un grupo metilo). La síntesis de fosfatidilinositol es más compleja e implica la participación de enzimas que se encuentran en las membranas del REL como en las membranas de las mitocondrias. Como las enzimas del REL implicadas en la síntesis se encuentran sólo en la hemicapa citoplasmática de las membranas, las nuevas moléculas de fosfolípidos se insertan en este prospecto de la membrana. Más tarde, algunas moléculas se transfieren a la monocapa interna, orientada hacia el interior de la cisterna, con la ayuda de proteínas llamadas flipasas (del inglés flip, movimiento rápido). En las membranas plasmáticas, una función similar es realizada mediante las escramblasas (del inglés scramble, mezclar), que transfieren los fosfolípidos entre las monocapas, mientras se mantiene la asimetría de los lípidos en la membrana. Además de los fosfolípidos, también el colesterol y la ceramida se sintetizan en las membranas del retículo, en un proceso que involucra a las cadenas de transporte de electrones del citocromo P450 y del citocromo b 5. El colesterol se sintetiza a partir del acetato, que, en las membranas de los hepatocitos, conduce a la síntesis de los ácidos biliares. En las células que sintetizan hormonas esteroides, tales como las células intersticiales de los testículos, las del cuerpo lúteo del ovario y las de la glándula adrenal, el colesterol se convierte en progesterona, testosterona, estradiol o desoxicorticosterona, en un proceso que implica la acción combinada de las enzimas encontradas no sólo en las membranas del REL, sino también en

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la membrana de las mitocondrias. Esta cooperación metabólica entre los dos orgánulos explica la abundancia de estos dos componentes celulares y su proximidad en las células que sintetizan esteroides (Figura 10.11). La ceramida, a su vez, es convertida en glicolípido o en esfingomielina por enzimas que se encuentran en el aparato de Golgi, como se discutirá más adelante. También en el retículo liso se produce el alargamiento y la desaturación de los ácidos grasos. Este proceso comienza con la síntesis en el citosol de ácido palmítico, que crece en longitud mediante la adición sucesiva de malonil-CoA. En la desaturación, la formación del doble enlace se produce mediante el uso de una molécula de oxígeno (02), que recibe electrones de la cadena de transporte de electrones en la que participan el citocromo b 5 y su reductasa. En las células epiteliales de absorción del intestino delgado, el REL sintetiza triglicéridos a partir de ácidos grasos y glicerol provenientes de los nutrientes que se encuentran en el lumen del intestino delgado y que son absorbidos por estas células. A continuación, las moléculas de triglicéridos sintetizadas en el REL son transferidas al medio extracelular del tejido conectivo subyacente a las células epiteliales y desde aquí son transportadas por la sangre y la linfa para ser distribuidos por el cuerpo. EL REL PARTICIPA EN LA DESINTOXICACIÓN EN EL ORGANISMO El organismo tiene la capacidad de convertir las sustancias tóxicas tales como herbicidas, defoliantes, conservantes y colorantes de alimentos, productos farmacéuticos o residuos industriales, en sustancias inocuas o de fácil excreción. Este proceso se produce en el hígado, piel, riñón y los pulmones y participan el citocromo P450 y su reductasa, que contiene un grupo Fe-S (hierro-azufre) (Figura 10.6). 0 citocromo P450 cataliza reacciones de hidroxilación en las que un sustrato orgánico (RH) es hidroxilado a R-OH, mediante la incorporación de un átomo de

oxígeno (02). El otro átomo de oxígeno se reduce a H20 por la transferencia de electrones del NADH o NADPH, que son capturados por la citocromo P450 reductasa y transferidos al citocromo P450 (Figura 10.12). La hidroxilación de un compuesto tóxico aumenta su solubilidad en agua y por lo tanto facilita su eliminación del cuerpo. La ingestión de barbitúricos promueve un marcado aumento en la cantidad de retículo liso en las células hepáticas, y hasta el RER pierde los ribosomas unidos a sus membranas y se convierte en REL. Los análisis bioquímicos de estas células mostraron un incremento en la actividad de las enzimas que metabolizan a los barbitúricos y a otros compuestos tóxicos y también evidenciaron que esta actividad se encuentra en las membranas de retículo liso. El aumento del REL, por la acción de los fármacos, contribuye a reducir el efecto de ciertos medicamentos después de un cierto tiempo de uso. En estos casos, hay un aumento tal en la actividad de las enzimas del sistema de desintoxicación que hay una necesidad de dosis mayores para promover el mismo efecto obtenido, en el principio, con pequeñas dosis, porque una parte considerable de la droga se destruye en el hígado. Es también en el retículo liso de las células hepáticas, que el pigmento de la bilis es solubilizado (bilirrubina) debido a la acción de la enzima glucuronil transferasa, por lo que es posible para la bilirrubina, en su forma soluble, que sea secretada por las células hepáticas, y sea excretada del hígado formando parte de la bilis. Cuando hay deficiencia de glucuronil transferasa, los pacientes acumulan bilirrubina insoluble en la sangre y se vuelven ictéricos (ese tipo de ictericia se llama enfermedad de Crigler-Najjar). Basado en la observación de que los barbitúricos estimula la síntesis de enzimas en el retículo endoplásmico liso, la administración de barbitúricos se utiliza en el tratamiento de este tipo de ictericia. En esta enfermedad, que puede deberse a varias causas, hay un aumento de bilirrubina en la sangre, con acumulación de este pigmento en la piel y en otros lugares, por lo que el aspecto del enfermo es amarillento.

Figura 10.10 Los fosfolípidos se sintetizan en el citosol a partir de dos moléculas de ácidos grasos-CoA y una molécula de glicerol, formando el ácido fosfatídico. El ácido fosfatídico se inserta en el lado citosólico de la membrana del REL, donde recibe diferentes grupos polares, formando la fosfatidilcolina o fosfatidilserina. Los fosfolípidos formados en la cara citosólica del REL son transferidos a la cara luminal por la acción de las flipasas.

Figura 10.11 Micrografía electrónica de partes de dos células de la región cortical de la glándula adrenal. Estas células producen hormona s esteroides. A la izquierda, dos núcleos celulares. En los citoplasmas, tenga en cuenta la acumulación de gotas de lípidos (L), mitocondrias (M) y lisosomas (Li). El retículo endoplasmático liso es abundante (flechas). En estas células, el aparato de Golgi (G) se compone de muchos sacos aplanados y dispuestos en un semicírculo. ME indica l as membranas de las dos células adya-

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas centes. 14.000x.

PARTICIPACIÓN EN EL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO Una función importante del REL de los hepatocitos y el de células renales es la glucogenólisis, es decir, la obtención de la glucosa a partir del glucógeno. Este proceso se produce por la acción consecutiva de cuatro enzimas, de las cuales sólo una se encuentra en el REL, mientras que los pasos restantes son citosólicos. La glucosa-6-fosfatasa es una proteína intrínseca de la membrana del retículo, que contiene nueve hélices transmembranales, con su sitio activo orientado hacia la cara luminal de la membrana (Figura 10.6). La glucosa 6-fosfato obtenida a partir del glucógeno por la acción de enzimas citosólicas es transportada al interior de la cisterna del RE por un transportador específico (T1) que se encuentra en la membrana. Una vez en la cisterna, la glucosa-6-fosfatasa elimina el fosfato de la glucosa 6-fosfato, liberando glucosa y fosfato inorgánico (Pi), que son transportados de nuevo al citosol por dos transportadores diferentes (T2 y T3). La glucosa así formada puede entonces salir de la célula por otro transportador. Este proceso es importante para el aislamiento y la liberación, en el torrente sanguíneo, de la glucosa para ser utilizada como una fuente de energía en otros tejidos. Si la glucosa-6-fosfato permanece libre en el citosol, esta podría ser utilizada en el proceso de la glucólisis por la propia célula. Por lo tanto, en células tales como los hepatocitos, se observa una proximidad del REL con las reservas de glucógeno del citosol. Las acumulaciones citoplasmáticas de glucógeno varían ampliamente en cantidad, en función del tipo celular y su estado funcional. En ciertas células, como en las del hígado y del músculo estriado de mamíferos bien alimentados, pueden existir extensos depósitos de este polisacárido. El glucógeno hepático, que puede llegar al 10% del peso del hígado (150 g de glucógeno en el hígado humano), se degrada en el intervalo entre las comidas para mantener constante el nivel de glucosa en la sangre (glucemia), proporcionando esta molécula energética para las otras células del organismo. La glucosa originada del glucógeno de las células musculares, sin embargo, es casi totalmente utilizada como fuente de energía para la contracción muscular, sin contribuir significativamente a la glucemia. EL REL ALMACENA, LIBERA Y CAPTURA IONES Ca2+ El retículo endoplasmático liso es el principal reservorio de Ca 2+ en el citoplasma de las células musculares y no musculares. Se sabe que el Ca 2+ regula la mayoría de los procesos metabólicos que ocurren en las células y que, por lo tanto, estas desarrollaron un sistema capaz de controlar los niveles intracelulares de este ión. Hay proteínas intrínsecas de las membranas del REL que actúan como canales, y otras como bombas de Ca 2+. Dependiendo del estímulo recibido por la célula, estas proteínas liberan Ca2+en el citoplasma o capturan estos iones en el interior de las cisternas del RE. En las cisternas del REL, la mayor parte de los iones Ca 2+ se une a proteínas solubles, tales como la calsecuestrina y las chaperonas calreticulina, BiP y disulfuro isomerasa. La calsecuestrina es principalmente responsable de la unión del Ca2+ en el músculo esquelético, mientras que la calreticulina lo hace en las células no musculares. La concentración de este ión en el citosol es muy baja, siendo, sin embargo, aumentada en respuesta al estímulo proporcionado por las señales químicas. Por ejemplo, cuando las células musculares son estimuladas por

los neurotransmisores liberados en las placas motoras, el Ca2+ sale del retículo por los canales de calcio y promueve la contracción de las miofibrillas, lo que lleva a la contracción de la célula muscular entera. Cesado el estímulo, los iones Ca2+son llevados de vuelta a las cisternas del retículo liso, mediante un proceso activo, es decir, que consume energía del ATP. EXPORTACIÓN DE LÍPIDOS DEL REL Desde el retículo liso, los lípidos son distribuidos a las diferentes membranas celulares por tres mecanismos principales: (1) son incorporados en la membrana del propio retículo y se difunden por la bicapa; (2) integran las membranas de las vesículas que brotan del retículo y se combinan con otros compartimentos; o (3) son transportados por proteínas específicas. Pertenecen al primer grupo los lípidos que formarán parte de las membranas de ambos tipos de retículo y de la envoltura nuclear. Las moléculas de lípidos distribuidas por vesículas transportadoras están destinadas para las membranas del complejo de Golgi, de los lisosomas, de los endosomas y para la membrana plasmática. Por otro lado, las moléculas que constituirán las membranas de las mitocondrias, plástidos y peroxisomas son exportadas desde el REL por las proteínas transportadoras de lípidos (LTP – del inglés lipid transfer protein), que son moléculas con aproximadamente 24 kDa. Varias LTP se han caracterizado, así como los lípidos que ellas reconocen; entre las que podemos mencionar a la CERT, que transporta la ceramida; la GLTP que transfiere glicolípidos; la FAPP2, que actúa sobre la glucosilceramida; la StAR, responsable del transporte de colesterol; y las PITP  y  que transportan fosfatidilinositol y fosfatidilcolina. Las LTP son moléculas anfipáticas, solubles, que contienen aminoácidos hidrófilos expuestos en la superficie que hace contacto con el citosol y una cavidad hidrófoba en la que se aloja la molécula de lípido a ser transportada (Figura 10.13). Ellas muestran una estructura en forma de tapa que sirve como puerta para la entrada de los lípidos. Los cambios conformacionales de las LTP conduce al movimiento de la tapa, de una forma "abierta" o "cerrada", lo que permite la unión o la liberación del lípido. Las proteínas transportadoras tienen dominios que reconocen específicamente los lípidos que se encuentran en la membrana del REL, se unen a este, lo sacan de la membrana y hacen su transporte a través del citosol. Cuando el complejo proteína transportadora-lípido encuentra otra membrana, la proteína inserta el lípido en la nueva bicapa lipídica (Figura 10.13). Este transporte tiene lugar a partir de una membrana rica en un cierto tipo de lípido – en este caso, la membrana del retículo endoplásmico liso - hacia otra, pobre en ese tipo de lípido, que pueden ser las membranas de los peroxisomas, de las mitocondrias o de los plástidos. La transferencia de los lípidos se produce al azar, lo que hace posible asumir que hay mecanismos más complejos de transporte. Las LTP son muy importantes para la salud humana, ya que las mutaciones en los genes que codifican a estas proteínas pueden causar enfermedades graves. Un ejemplo de mutación conocida, es la mutación en el gen que codifica a la proteína StAR, que conduce a la hiperplasia suprarrenal congénita, una enfermedad en la que se altera la síntesis de esteroides, con la consiguiente acumulación de colesterol (precursor de los esteroides).

Figura 10.12 Esquema de las reacciones de hidroxilación catalizadas por el citocromo P450 y su reductasa. A reductasa contiene un grupo Fe-S que recibe los electrones del NAD o del NADP y los transfiere al citocromo P450. Estas reacciones redox (óxido-reducción) conducen a la hidroxilación del sustrato orgánico (RH) a R-OH, mediante la incorporación de un átomo de oxígeno (0 2), y la formación de H20.

Figura 10.13

Figura 10.14 Figura 10.13 Los lípidos que formarán las membranas de los peroxisomas, mitocondrias o plastidios son sintetizados en las membranas del REL y son cargados y transportados a los compartimentos blanco por las proteínas transportadoras de lípidos (LTP). Las LTP tienen una estructura en forma de tapa, que se abre cuando sufren cambios

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conformacionales, permitiendo que los lípidos a ser transportados tengan acceso a la cavidad hidrofóbica de la LTP y, así, puedan ser transportados a través del citosol. Cuando el complejo lípido-LTP encuentra la membrana diana, la proteína inserta el lípido en la bicapa lipídica. Figura 10.14 Microfotografía de un corte de epidídimo que muestra complejos de Golgi impregnados con plata.

COMPLEJO DE GOLGI El aparato de Golgi fue descrito en 1898 por el biólogo italiano Camilo Golgi, en tejido nervioso contrastado con tetróxido de osmio (0s0 4). Esta técnica, así como la impregnación con nitrato de plata, permite poner de relieve el complejo de Golgi en el microscopio óptico, en el que aparece como una estructura plegada, de forma irregular (Figura 10.14). La ubicación del complejo de Golgi varía con el tipo y la función de la célula. En general, cuando se trata de una estructura única en el citoplasma, se encuentra en una región determinada, por lo general al lado del núcleo y cerca de los centríolos (Figura 10.15). En las células secretoras, por otro lado, está muy desarrollado y situado entre el núcleo y los gránulos secretores. En otras células, aparece en la forma de varios agregados que rodean el núcleo, como en las neuronas, o se propagan por todo el citoplasma, como en las células vegetales. Su tamaño varía mucho, y puede ser pequeño, como pasa en la célula muscular, mediano, como en las células entero-endocrinas (células argentafines), y grande, como en las células que secretan las glicoproteínas. La figura 10.16 muestra complejos Golgi dos tipos de células. EL COMPLEJO DE GOLGI ESTÁ FORMADO POR VARIOS COMPARTIMENTOS EN SECUENCIA La microscopia óptica, debido a sus limitaciones, fue incapaz de establecer la estructura del complejo de Golgi; esto ocurrió sólo con el advenimiento de la microscopia electrónica (Figuras 10.15 y 10.16). Este complejo está constituido por estructuras semejantes a sacos membranosos, aplanados y apilados. Estas son las cisternas del complejo de Golgi, revestidas por membranas. En la mayoría de las células eucariotas, cada pila tiene de tres a ocho sacos. En algunas algas pardas, sin embargo, hay pilas de hasta 20 sacos. El número de pilas varía de célula a célula. Algunas células animales contienen un solo saco grande, mientras que algunas células vegetales contienen docenas de pequeños montones de sacos. La pila de sacos a menudo se presenta curva, adquiriendo, en conjunto, la forma de un cuenco con una cara cóncava dirigida a la membrana plasmática, y la otra convexa, frente al retículo. Al microscopio electrónico, se observan muchas vesículas esféricas con un diámetro medio de 60 nm, asociadas con los sacos de Golgi (Figura 10.15 y 10.16). Algunas de estas vesículas transportan material del retículo endoplásmico al aparato de Golgi, mientras que otras pueden estar implicadas en el transporte de una cisterna del Golgi a otra, y también, del Golgi a otros orgánulos. Por sus funciones, son generalmente llamadas vesículas de transporte o vesículas transportadoras. Cada pila de cisternas con sus vesículas asociadas constituye una unidad del complejo de Golgi, que recibe el nombre de dictiosoma. Cada pila de sacos del complejo de Golgi tiene polaridad de ambos, estructura y función, como si estuviera formada por más de un orgánulo dispuesto en secuencia. La superficie convexa se llama cara o lado cis (cis significa “del lado de, de la parte o del lado de acá”) o superficie proximal, por estar generalmente más cerca del núcleo celular y del RE. En contraste, la cara opuesta, cóncava, se llama cara trans (trans significa 'al otro lado', 'a través de') o cara distal, por estar más alejada del núcleo o del RE y estar dirigida hacia la membrana plasmática. Las cisternas ubicadas entre estas dos caras constituyen las cisternas medianas (Figura 10.17). Asociados a las caras cis y trans se encuentran compartimentos compuestos por una red de cisternas tubulares, que constituyen, respectivamente, la red cis del Golgi y la red trans del Golgi. Las vesículas que

brotan desde el elemento transicional del RE, se fusionan, estableciendo, el compartimento intermedio RE-Golgi. Los diversos compartimentos intermedios, a su vez, se mueven, asociados con microtúbulos, en dirección a los sacos de Golgi y se fusionan para formar la red cis del Golgi. Las proteínas que se encuentran en el proceso de síntesis y secreción pasan a través de los diferentes sacos golgianos, en los que sufren modificaciones, y finalmente, las vesículas que contienen las proteínas procesadas brotan de la red trans del Golgi. No se conoce el proceso exacto de transporte entre las distintas cisternas; se sugiere que se hace por medio de vesículas que brotan de una cisterna y se fusionan con la siguiente. El Golgi está por lo tanto constituido por al menos tres compartimentos funcionales diferentes. LAS MEMBRANAS DE LOS SACOS GOLGIANOS TIENEN DIFERENTES COMPOSICIONES ENZIMÁTICAS Una forma de estudiar el complejo de Golgi es por el aislamiento de sus componentes, usando la técnica de centrifugación fraccionada. Como ya se ha mencionado en este y otros capítulos, la tercera fracción obtenida a partir de la técnica contiene vesículas del retículo liso, del retículo rugoso y vesículas del complejo de Golgi o “golgianas”. Si esta fracción se centrifuga a baja velocidad, se obtiene más cantidad de componentes golgianos que de los retículos. Por lo tanto, se puede determinar la composición química de las membranas y los contenidos de los sacos golgianos. Las membranas del complejo de Golgi, como otras membranas biológicas, son lipoproteicas, conteniendo alrededor de 40% de lípidos y 60 a 65% de proteínas. Los fosfolípidos constituyen aproximadamente el 55% del total de lípidos y están representados por fosfatidilcolina (45%), esfingomielina (12%), fosfatidiletanolamina (17 a 19%), fosfatidilinositol (8 a 9%) y fosfatidilserina (3 a 4%). El segundo grupo más abundante, alrededor de 35%, está representado por los lípidos apolares, seguido por 7% de esteroles (colesterol y sus derivados). Acerca de 30 diferentes cadenas polipeptídicas en estas membranas se han caracterizado, algunas de las cuales están glicosiladas. Existe controversia, sin embargo, si algunas de estas proteínas son residentes de las membranas golgianas o si son proteínas que se encuentran en tránsito entre las cisternas. Muchas de las proteínas residentes son enzimas relacionadas con la glicosilación (glicosiltransferasas), sulfatación (sulfotransferasas) y fosforilación (Fosfotransferasas) de los sustratos. El contenido de las cisternas del aparato de Golgi varía mucho según el tipo celular y con el estado funcional de la célula bajo estudio. En algunos tipos celulares, como en las células acinares pancreáticas, las cavidades se presentan constituidas por una solución acuosa rica en glicoproteínas, mientras que en otros, tales como en las células meristemáticas de la raíz de vegetales superiores son ricas en polisacáridos. Estudios in situ, mediante la detección de la actividad de enzimas que se encuentran en las membranas o cavidades del aparato de Golgi, permitieron establecer que los diversos sacos golgianos tienen diferentes contenidos enzimáticos, lo que refleja las diferencias de función entre ellos. Las actividades de fosfatasa ácida se concentran en la cara cis, siendo imposible determinar si esta enzima está presente en las membranas o dentro de las cavidades. La sulfatación de proteínas y de lípidos se produce por la acción de sulfotransferasas que se encuentran presentes en las cisternas medianas. Por otra parte, la actividad de la tiaminopirofosfatasa (TPPasa) se detecta en el lado trans, siendo considerada esta enzima, en algunas células, como marcadora del orgánulo.

Figura 10.15 Micrografía electrónica de un plasmocito, que produce glicoproteínas con la función de anticuerpos. El REG es abundante, y sus cisternas contienen proteínas, que aparecen como un material granular. El núcleo tiene doble membrana, estando la cara citoplasmática de la membrana externa recubierta con ribosomas. La cromatina nuclear se condensa cerca de la membrana, respetando la ubicación de los poros nucleares (flechas). Sobre el núcleo, se observa un nítido complejo de Golgi circular envolviendo un par de centriolos (C). Vesículas pequeñas se congregan en las membranas del Golgi. En las partes laterales del Golgi, se notan vesículas dilatadas nota que se destacan de sus membranas (flechas). Este ejemplo, muestra una célula que sintetiza y exporta, pero no acumula la proteína formada. 40.000x.

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas

Figura 10.16 Micrografías electrónicas de complejos de Golgi de dos tipos celulares. A. Golgi de célula secretora de moco (célula caliciforme del intestino). Tenga en cuenta, sobre todo a la derecha, el retículo endoplasmático rugoso que en ciertas regiones, pierde los ribosomas, convirtiéndose en retículo liso (flechas). A la izquierda, vesículas transportadoras convergen al aparato de Golgi, y del lado opuesto, salen grandes vesículas (V). 40.000x. B. Aparato de Golgi de célula testicular. Observe cómo los sacos membranosos están dispuestos de forma compacta. 30.000x.

Figura 10.17 Esquema que muestra los diversos compartimentos del complejo de Golgi, así como su relación con el retículo endoplasmático rugoso. Las proteínas sintetizadas en el RER son transportadas al Golgi dentro de las vesículas transportadoras o las de transición, que se fusionan estableciendo el elemento transicional del RER, que a su vez se fusiona con las membranas de la red cis del Golgi. Este material se modifica a medida que pasa a través de las diversas cisternas golgianas, lo que determina sus destinos finales en la célula. Las vesículas que brotan de la red trans del Golgi contienen, en su interior, las proteínas destinadas a componer la membrana plasmática, los lisosomas o a ser secretadas por la célula.

EN EL APARATO DE GOLGI, LAS MACROMOLÉCULAS SUFREN MODIFICACIONES ADICIONALES Los cambios post-traduccionales modfican significativamente las características funcionales de las moléculas proteicas, lo que contribuye mucho para generar la variedad de proteínas existentes en las células. Además de los cambios que todavía están sufriendo en el RE, después de su síntesis, y que influyen en su forma tridimensional, las moléculas proteicas pueden pasar por otros tipos de cambios que conducen a la creación de moléculas funcionales. En las cisternas del Golgi, se produce la hidrólisis parcial de la fracción glucídica de las glicoproteínas y la adición de nuevos azúcares cuya composición varía con el tipo de glicoproteína que se sintetiza. Este proceso, llamado glicosilación terminal, lo que resulta en la síntesis de glicoproteínas con composición química y destino diferente, conforme el tipo de glicosilación que sufren. En este proceso, se forman por dos tipos genera-

les de oligosacáridos N-ligados: los oligosacáridos complejos y los oligosacáridos ricos en manosa. Los oligosacáridos complejos se forman por la eliminación de algunos de los residuos de azúcar y la adición de otros, tales como la galactosa y el ácido siálico. A los oligosacáridos ricos en manosa, a su vez, no se le se añaden otros residuos de azúcar y mantienen el mismo número de azucares transferidos en el RE. En el complejo de Golgi ocurre, también, la adición de oligosacáridos en grupos OH de los aminoácidos treonina o serina presentes en la cadena polipeptídica, formando los oligosacáridos O-ligados. El procesamiento de las proteínas destinadas al interior de los lisosomas difiere de aquellos correspondientes a las proteínas que serán secretadas o que irán a componer la membrana plasmática. Las proteínas solubles lisosómicas son modificadas por la fosforilación del carbono que ocupa la posición 6 de un residuo de manosa, cuando la proteína está en la red cis de Golgi. Las proteínas así marcadas con residuos de manosa-6-fosfato

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son reconocidas por receptores que se encuentran en la red trans golgiana, los cuales dirigen el transporte de estas proteínas hacia los lisosomas (Figura 10.17). La enzima responsable de la fosforilación de manosa es una fosfotransferasa que reconoce un dominio específico en la cadena proteica y añade glucosaminas fosforiladas a los oligosacáridos unidos a ella. Luego se retira la glucosamina, dejando el fosfato unido a la manosa. También en el complejo de Golgi se produce las síntesis de la porción glucídica de los proteoglicanos, que son componentes de la matriz también presentes en la superficie celular. En el aparato de Golgi se polimerizan los glicosaminoglicanos que se unen a la proteína para formar proteoglicanos. En las células vegetales, el complejo de Golgi está implicado en la síntesis de las glicoproteínas y de los componentes glucídicos de la pared celulósica. La pared de las células vegetales se compone de tres clases de polisacáridos: celulosa, hemicelulosa y pectina. La celulosa es la única sintetizada en la superficie celular por el complejo de la celulosa sintasa (Capítulo 13). La hemicelulosa y la pectina, a su vez, son polimerizadas en el aparato de Golgi, en donde son transportadas, dentro de las vesículas hasta la superficie celular. El complejo de Golgi también está involucrado en el metabolismo de los lípidos, específicamente en la síntesis de glicolípidos y esfingomielina. Tanto la esfingomielina como los glicolípidos son sintetizados a partir de la ceramida y la fosfatidilcolina que fueron producidas en el REL. En la síntesis de esfingomielina un grupo fosforilcolina está unido a la ceramida, mientras que los glicolípidos se forman por la adición de residuos de azucares a la ceramida. El tipo de azúcar añadido genera los varios glicolípidos que se encuentran en las membranas de la célula. La esfingomielina se sintetiza en la superficie luminal de la membrana, mientras que los residuos de azúcar de los glicolípidos se añaden a la ceramida en la cara citosólica de la membrana de Golgi. Residuos de azúcar adicionales se transfieren a los glicolípidos en la superficie luminal de las membranas. Así, tanto la esfingomielina como los glicolípidos se encuentran sólo en la hemicapa interna de las cisternas golgianas. Estos lípidos son transportados como integrantes de la membrana de las vesículas. Con la fusión de las vesículas con la membrana plasmática, se exponen en la superficie exterior de esta última, en la cara extracelular. En las membranas de las cisternas golgianas están presentes sulfotransferasas que son responsables de la sulfatación de las proteínas, lípidos y carbohidratos, así como de la parte glucídica de glicoproteínas y glicosaminoglicanos. Los glico-saminoglicanos son polisacáridos que constituyen la matriz extracelular de las células animales, y su sulfatación les confiere el carácter ácido de estas macromoléculas (Capítulo 12). Este proceso es bien evidente en los condrocitos, las células del cartílago que secretan glicosaminoglicanos de la matriz extracelular, tales como el dermatán sulfato y la condroitina. La pluralidad de los acontecimientos posteriores a la traducción (posttraduccionales) en la formación de proteínas tiene la ventaja de que lleva a una diversidad estructural y funcional de las moléculas proteicas traducidas del mismo ARNm. Sin embargo, este proceso tiene su precio, porque, aumentando la cantidad de enzimas involucradas, también aumenta la incidencia de enfermedades relacionadas con las proteínas en cuestión, debido a la carencia de una de las enzimas implicadas en el proceso. El caso de la proteína colágeno que se encuentra en los huesos, piel, tendones, ligamentos, etc., es típica, ya que es una familia de proteínas que es muy diversa, no sólo debido a ser codificada por varios genes, sino también porque experimenta varias modificaciones post-traduccionales, tales hidroxilación, glicosilación, proteólisis limitadas, formación de una estructura terciaria variable, etc. Como ejemplos ilustrativos de las enfermedades del colágeno, se pueden citar el síndrome de Ehlers-Danlos, en la que es frecuente la presencia de piel friable, de ablandamiento de los ligamentos articulares (contorsionistas de circo) y la lesión del colágeno del ojo, vasos y el tracto gastrointestinal. Otra enfermedad que resulta de defectos post-traduccionales, que puede ser citada como un ejemplo, es un tipo de diabetes debido a la no transformación de la postinsulina (inactiva) en insulina activa, como resultado de un fallo en el proceso de proteólisis que se produce en los gránulos la secreción de las células beta de los islotes de Langerhans. La sangre de los pacientes contiene la prohormona proinsulina, en lugar de la insulina, que es la hormona activa. DESTINO Y EXPORTACIÓN DE LAS MACROMOLÉCULAS Las proteínas, los lípidos y polisacáridos son transportados desde el Golgi a sus destinos finales a través de la vía secretora. Esta via incluye la empaquetadura de las macromoléculas en diferentes tipos de vesículas de transporte, que a su vez, surgen de la red trans del Golgi y liberan su contenido en los lugares apropiados. En ausencia de señales específicas, las proteínas se transportan a la membrana plasmática mediante un flujo continuo que transporta proteínas, no selectivamente, desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi y, después, a la superficie celular. Esta vía es responsable de la incorporación de nuevas proteínas y lípidos en la membrana plasmática, así como por la secreción continua de proteínas de las células. Para ser desviadas de la vía de flujo continuo, las proteínas deben estar marcadas específicamente a otros destinos, como a los lisosomas. Las proteínas que desempeñan sus funciones en el Golgi deben ser retenidas en ese orgánulo y no ser transportadas a través de la vía secretora. El mecanismo responsable de la retención de proteínas de membrana en el complejo de Golgi parece basarse en los dominios transmembranales de estas proteínas. La mayoría de las proteínas de la membrana de Golgi presenta cortos segmentos transmembranales en alfa hélice de aproximadamente 15 aminoácidos, y estas porciones deben contribuir a la retención de estas proteínas en el aparato de Golgi. Estas señales se encuentran en las proteínas residentes del Golgi son responsables de la recuperación de tales proteínas en los compartimentos subsiguientes a lo largo de la via secretora, si se liberan erróneamente del complejo de Golgi. La vía de flujo continuo o constitutiva, que se produce en todas las células conduce a la secreción continua, no regulada, de macromoléculas, en la que la célula exocita macromoléculas a medida que las elabora. Ejemplos de la secreción continua incluyen la secreción de colágeno por los fibroblastos y de las proteínas séricas por los hepatocitos. Algunas células, sin embargo, también contienen una vía secretora regulada, en la que las macromoléculas específicas se secretan en respuesta a señales extracelulares. Son ejemplos de secreción regulada la liberación de hormonas por las células endocrinas, la liberación de neurotransmisores desde las neuronas y la liberación de enzimas digestivas por las células acinares pancreáticas.

Las proteínas son seleccionadas y tienen sus destinos definidos en la red trans del Golgi. La selección de las proteínas en la vía secretora regulada parece implicar el reconocimiento de secuencias señal comunes a diversas proteínas que entran en esta vía. En la red trans del Golgi, estas son empaquetadas en vesículas secretoras especializadas. Estas vesículas son más grandes que las otras vesículas de transporte y almacenan su contenido hasta que las señales específicas las conducen a su fusión con la membrana plasmática. En este caso, entonces, el material que está siendo secretado se acumula hasta que una señal externa desencadena su lanzamiento en la superficie celular. Por ejemplo, las enzimas digestivas producidas por las células acinares del páncreas se almacenan en vesículas secretoras hasta que la presencia de alimentos en el estómago y el intestino delgado induce su secreción. Un proceso similar se observa en las células caliciformes del intestino (Figura 10.18). En el momento en el que el cuerpo necesita, el estímulo provoca la extrusión de los gránulos de secreción por exocitosis. Los microtúbulos participan en este proceso de exocitosis. En la Figura 10.19 están representados los diversos compartimentos implicados en la secreción celular, así como la función de cada uno de ellos. Por otra parte, la formación de lisosomas implica la síntesis de las proteínas que componen sus membranas y también de proteínas solubles, que están en las cavidades del lisosoma. Como ya se ha discutido, las proteínas encontradas en el lumen de los lisosomas están marcadas por residuos de manosa-6-fosfato después de que ellas entran en el complejo de Golgi. Los receptores específicos que se encuentran en la membrana de la red trans del Golgi, los MPR (del inglés, manose phosphate receptor) reconocen la manosa-6-fosfato y las proteínas que transportan estos residuos. Los complejos resultantes de la unión receptor-proteína son empaquetados en vesículas de transporte diseñadas específicamente para los lisosomas. Estas vesículas se fusionan con los lisosomas, liberando su contenido dentro de estos orgánulos. Las proteínas de la membrana lisosomal, a su vez, son marcadas por secuencias de aminoácidos específicas en sus colas citoplasmáticas y no por los residuos de manosa-fosfato. En las células vegetales y en las fúngicas, en las que las funciones de los lisosomas son realizadas por vacuolas, la asignación de las proteínas a las vacuolas se realiza mediante secuencias cortas de aminoácidos. En los hongos, la secuencia Gln-Arg-Pro-Leu fue identificada como un marcador de las proteínas vacuolares, pero otras proteínas vacuolares parecen tener diferentes señales. EL TRANSPORTE INTRACITOPLASMÁTICO POR VESÍCULAS DIFERENTES ASEGURA EL DESTINO CORRECTO DE LAS MACROMOLÉCULAS Las moléculas sintetizadas y procesadas en el RE y en el Golgi son transportadas a los diferentes compartimentos celulares, en el interior de las vesículas. Las vesículas brotan de la membrana de un orgánulo y se fusionan con la membrana de otro o con la membrana plasmática. Para asegurarse de que las moléculas están correctamente destinadas, así como para mantener la composición química y la identidad de cada compartimento de la vía, es esencial que el proceso de gemación y fusión de las vesículas sea perfectamente regulado. Para asegurar que esto ocurre, la superficie citoplásmica de la membrana de las vesículas de transporte se cubre con proteínas, y es esta cobertura proteíca la que causa la deformación de la membrana y dirige la gemación de la vesícula. Se caracterizaron tres tipos diferentes de vesículas cubiertas, actuando cada uno en una vía de transporte diferente (Figura 10.20). Al primero y mejor caracterizado tipo pertenecen las vesículas cubiertas por la proteína clatrina que participan en el proceso de internalización de macromoléculas del medio extracelular, por endocitosis (Capítulo 5), del transporte de las enzimas lisosomales de la red trans del Golgi al endosoma, así como del reciclaje de receptores de manosa-6-fosfato para la red trans del Golgi. Se sabe que, en las células vegetales, las vesículas cubiertas de clatrina están involucradas en el transporte de proteínas para ser almacenadas en las vacuolas. La proteína clatrina se organiza como una red que cubre el exterior de la membrana (Figura 10.21). Se asocia a la membrana por medio de una familia de proteínas llamadas, en conjunto, adaptadoras de clatrina. Las moléculas adaptadoras de clatrina reconocen y se unen a la superficie citosólica de los receptores transmembranales que participan en el reconocimiento de las moléculas que están siendo capturadas y empaquetadas para el transporte. Hay cuatro tipos diferentes de adaptadoras de clatrina que ya fueron caracterizadas, llamadas AP1, AP2, AP3 y AP4, cada una de las cuales reconoce y se une específicamente a un receptor particular. Así, junto con los receptores, ellas son responsables por el reconocimiento y la selección de las moléculas que serán incorporadas en una vesícula dada. Un ejemplo de la especificidad de las AP se observa en la gemación de las vesículas que contienen enzimas lisosomales. Como se analiza en este capítulo, las proteínas lisosomales son marcadas con un residuo de manosa-6-fosfato que a su vez es reconocido por el receptor de manosa-6fosfato, MPR, que se encuentra en la membrana de la red trans del Golgi. La AP1 se une por un lado, a la parte citosólica del MPR, y del otro, a la clatrina, dirigiendo de este modo las proteínas destinadas a componer las vesículas lisosomales. La interacción lateral entre las diversas moléculas de AP y de clatrinas causa la deformación y la evaginación de la membrana en ese sitio. La fisión de la membrana para la formación de la vesícula es llevada a cabo por la dinamina, una proteína con actividad GTPasa (que rompe el GTP a GDP). La dinamina se enrolla como una hélice alrededor de la membrana evaginada y, con la hidrólisis del GTP sufre un cambio conformacional que causa una estrangulación en la membrana y la liberación de la vesícula. Los otros dos tipos de vesículas están cubiertos por la proteína coatómero o COP (del inglés coat proteins, proteínas de la cubierta) y brotan desde el retículo endoplásmico y del complejo de Golgi (Figura 10.20). El aislamiento y la caracterización de la cubierta de estas vesículas mostraron que la COP se compone de siete cadenas polipeptídicas. Las vesículas cubiertas por la COP I brotan del aparato de Golgi y hacen el transporte entre los sacos golgianos, o transporte anterógrado de las moléculas del Golgi para el retículo, el reciclaje de moléculas, como los receptores y el transporte a la membrana plasmática. Las vesículas cubiertas por la COP II, a su vez, brotan del retículo endoplasmático y hacen el transporte de las moléculas del RE al complejo de Golgi. Varios experimentos sugieren que las moléculas de COP reconocen dominios citoplásmicos específicos de proteínas intrínsecas presentes en la membrana y se unen a

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas estos dominios. Las interacciones laterales entre las distintas COP causan la deformación de la membrana y el brote de la vesícula. El reclutamiento de las moléculas de COP para la membrana requiere la unión de GTP. La hidrólisis de GTP a GDP causa la disociación de las moléculas de COP de la membrana y la pérdida de la cobertura de las vesículas. Un aspecto importante del transporte por medio de vesículas es que debe haber un reconocimiento específico entre la membrana de la vesícula y la membrana con la cual debe fusionarse. Además, la fusión entre las dos membranas debe llevarse a cabo de la manera correcta para que la vesícula descargue su contenido en el orgánulo al que fue destinada. El reconocimiento específico y la fusión posterior están mediados por proteínas

llamadas SNARE. Estas proteínas son intrínsecas a las membranas de la vesícula y del orgánulo diana, constituyendo, respectivamente las v-SNARE y las t-SNARE (la letra t se refiere a target, del inglés, objetivo, blanco, diana). Las vesículas cubiertas brotan de un compartimento exponiendo, intrínseco a sus membranas, las proteínas v-SNARE con dominios citoplásmicos prominentes. La vesícula es transportada por los microtúbulos hasta encontrar la membrana diana, que contiene, a su vez, proteínas t-SNARE con dominios enfrentados hacia el lado citoplásmico de la membrana. Los dominios v-SNARE reconocen y se unen a los dominios t-SNARE de las membranas diana, formando complejos trans-SNARE que aseguran la proximidad entre las dos membranas y la fusión.

Figura 10.18 Micrografía electrónica de células del intestino delgado. Observe una célula caliciforme típica que secreta glicoproteínas. E l núcleo (N) se encuentra en la base de la célula, región rica en retículo endoplasmático rugoso (RER). Justo por encima del núcleo, el aparato de Golgi (G). La mayor parte de la célula está ocupada por grandes gránulos secretores (S) poco electrodensos. Esta es una célula que sintetiza, segrega, acumula y exporta complejos de proteínas y polisacáridos. A los lados, células intestinales, especializadas en la absorción de nutrientes, con microvellosidades en la superficie (V). 7.500x.

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Figura 10.19 A la derecha de este esquema se señalan los distintos compartimentos celulares que participan en la secreción. A la izquierda, se hace hincapié en los procesos moleculares y funcionales que se producen en los compartimentos respectivos. La síntesis de las glicoproteínas comienza en el RER, desde donde son transportadas por vesículas a la red cis del Golgi y, sucesivamente, para los diversos compartimentos, hasta alcanzar la cúspide de la célula. Observe que la marcación de las enzimas lisosomales comienza temprano, por fosforilación, en la red cis del Golgi. Las glicoproteínas se transforman poco a poco, por las supresiones y adiciones en la parte glucídica, formándose glicoproteínas específicas. En la red trans del Golgi, las glicoproteínas se asocian con diferentes tipos de receptores específicos, siendo entonces llevadas a los sitios donde fueron destinadas. A la izquierda del dibujo se muestra un flujo inverso de vesículas, que vuelve a la membrana del retículo endoplasmático y devuelve moléculas propias de las mismas que han sido, erróneamente, llevadas al Golgi. Tenga en cuenta que el proceso, inicialmente inespecífico, se vuelve específico en su final, dirigiendo las moléculas a tres destinos: la membrana plasmática, los lisosomas y la secreción.

ALGUNAS PROTEÍNAS SON PROCESADAS DENTRO DE LAS VESÍCULAS SECRETORAS Después que las vesículas de secreción brotan de la red trans del Golgi, se retira su cubierta y su contenido se hace muy concentrado, a veces incluso aproximadamente 200 veces más concentrado que en el interior de las cisternas del Golgi. Esta condensación es probablemente un resultado de la acidificación del lumen de la vesícula, proceso inducido por una bomba de protones, que se encuentra en la membrana de la vesícula, que consume energía del ATP. Gracias a este proceso, las vesículas tienen un contenido más electrodenso, cuando son observadas en el microscopio electrónico, constituyendo los gránulos secretores. La condensación no es el único proceso al cual las vesículas secretoras están sujetas a medida que estén listas para la secreción. Muchas hormonas peptídicas y neuropeptídicas, así como las enzimas hidrolíticas a ser secretadas, se sintetizan como precursores inactivos. La formación de moléculas biológicamente activas implica una serie de divisiones que comienzan en la red trans del Golgi, continúan en las vesículas secretoras y algunas veces, también en el medio extracelular, después de la secreción. Muchos polipéptidos secretados tienen, por ejemplo, en su extremo amino terminal, una secuencia de señal pequeña que se escinde inmediatamente antes de la secreción para formar la proteína madura. Estas proteínas se sintetizan así como pro-proteínas. Un ejemplo bien conocido es la transformación de la proinsulina a insulina, que se produce en las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. En otros casos, varias moléculas de señalización son péptidos sintetizados como partes de una sola poliproteína que actúa como un precursor de múltiples productos finales cortados de forma individual de la cadena

polipeptídica original; la misma poliproteína puede ser procesada de diferentes maneras para producir diferentes péptidos en diferentes tipos celulares (Figura 10.22). En el caso de una enzima hidrolítica secretada o cualquier proteína cuya actividad puede ser perjudicial dentro de la célula que la produce, el retraso en la activación de la proteína, hasta que llega a una vesícula secretora o incluso después de que ha sido secretada, tiene la ventaja de impedirla actuar prematuramente dentro de la célula. VÍAS INTRACELULARES DE DEGRADACIÓN La endocitosis es el proceso por el cual las células capturan fluidos, macromoléculas e incluso otras células del medio extracelular (Capítulo 5). La internalización de los materiales extracelulares es por evaginaciones o invaginaciones de la membrana plasmática, con la consiguiente formación de vesículas que se sumergen en el citoplasma. Este proceso promueve la eliminación de porciones de la membrana, que no conducen a la contracción de la célula por un mecanismo de compensación con el proceso de secreción, en el que se produce un aumento de las áreas de membrana por la fusión de vesículas. Por lo tanto, existe en las células en general un flujo constante de membranas, entre la membrana plasmática y la membrana de las vesículas de fagocitosis, de secreción y de pinocitosis. Las células se mantienen del mismo tamaño, no por la síntesis de nueva membrana plasmática, sino por el retorno de la membrana retirada. Las diferentes maneras de internalización de sustancias hace que se sigan diferentes rutas intracelulares, para llegar al compartimento celular donde se produce su degradación. En esta sección, se discuten estas vías de degradación y los orgánulos que intervienen en este proceso.

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas

Figura 10.21

Figura 10.20 Figura 10.20 Dibujo esquemático que muestra la relación entre el RER y los diversos compartimentos del complejo de Golgi en la síntesis y en la distribución de las glicoproteínas. Las vesículas cubiertas por COP II brotan de las cisternas del RER y se fusionan, formando el elemento transicional, que a su vez se fusiona con las membranas de la red cis del Golgi. Las proteínas que por error dejaron el RER se recuperan dentro de las vesículas cubiertas por COP I. Estas proteínas se alteran a medida que pasan de una cisterna del Golgi a otra. Este transporte es realizado por vesículas cubiertas por COP I. De la red trans del Golgi brotan vesículas cubiertas por clatrina, que contienen en su interior enzimas lisosomales que fueron reconocidas por los receptores de manosa-6-fosfato. Las vesículas que transportan proteínas que formarán parte de la membrana plasmática o ser secretadas están cubiertas por la COP I. Figura 10.21 Vesícula cubierta, que muestra la capa constituida por una red que contiene clatrina en disposición poligonal. Para una mejor comprensión, en una parte de la vesícula la red de clatrina aparece resaltada. (Reproducido con permiso, de Carneiro J. Bases Celulares para Fisiopatología. In: Marcondes, M. et al. Clínica Médica 3ª ed Guanabara Koogan, Río, 1984).

Figura 10.22

Figura 10.23 Figura 10.22 Dibujo que ilustra la secuencia de las proteólisis limitadas de una molécula proteica muy grande, que origina varias proteínas más pequeñas con actividad hormonal. Se trata de una modificación post-traduccional, que resulta en un aumento en el número de proteínas con funciones específicas. Las líneas discontinuas indican los sitios de acción de la proteasa. Figura 10.23 Micrografia electrónica de célula de la corteza de la glándula suprarrenal. Los corpúsculos esféricos y electrodensos, con zonas más oscuras en su interior, son los lisosomas. La membrana limitante se ve claramente en los dos lisosomas centrales. 35.000x.

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Figura 10.24 Diagrama que ilustra la disposición topológica de varias proteínas intrínsecas que componen la membrana del lisosoma. Observe que la parte citosólica de estas proteínas está altamente glicosilada. También se muestran las proteínas sialina y cistinosina, que transportan, respectivamente, ácido siálico y cistina. Las cadenas polipeptídicas que rompen al ATP y componen el complejo ATPasa se enfrentan hacia el citosol, mientras que aquellas por las que los protones se difunden están inmersas en la bica pa lipídica.

LOS LISOSOMAS CONTIENEN ENZIMAS HIDROLÍTICAS RESPONSABLES DE LA DEGRADACIÓN DE LAS BIOMOLÉCULAS Los lisosomas se aislaron e identificaron por primera vez, por la técnica de centrifugación fraccionada. De la fracción rica en mitocondrias se aisló una subfracción que reveló actividad de hidrolasas ácidas. Más tarde - y gracias, sobre todo a la técnica citoquímica para la demostración de la actividad de la fosfatasa ácida, una enzima lisosomal - fue posible identificar estos orgánulos utilizando las microscopías óptica y electrónica. Los lisosomas son orgánulos con características morfológicas y dimensiones muy variables (Figura 10.23), que ocupan aproximadamente el 5% del volumen celular y están presentes en todas las células animales, excepto los glóbulos rojos. En las células vegetales, la vacuola realiza las funciones inherentes a los lisosomas de las células animales (Capítulo 13). Cada uno está rodeado de una unidad de membrana y contiene enzimas hidrolíticas que tienen actividad máxima a pH ácido, por lo tanto, denominadas hidrolasas ácidas. Recientemente, el uso de técnicas inmunocitoquímicas (Capítulo 2) hizo posible establecer la composición química de la membrana y del contenido enzimático de los lisosomas. Las membranas contienen fosfolípidos, glicolípidos y colesterol. Varias proteínas estructurales ya se han caracterizado, tales como LAMP-1 y LAMP-2 (del inglés lysosome-associated membrane proteins), LIMP (del inglés lysosomal integral membrane proteins ), y LGP (del inglés lysosomal membrane glycoproteins) (Figura 10.24). Estas proteínas están altamente glicosiladas; los oligosacáridos representan aproximadamente el 60% de su masa total. Algunas de ellas actúan como transportadoras para monosacáridos, oligosacáridos, aminoácidos, nucleótidos, oligopéptidos, etc. Una proteína transportadora ya caracterizada es la cistinosina, que transporta al aminoácido cistina al interior del lisosoma. La falta de esta proteína produce cistinosis. La cistinosis es una enfermedad que afecta principalmente el funcionamiento de los riñones, pero también otros órganos, y es causada por una mutación en el gen que codifica la cistinosina. Otro transportador identificado es la sialina, que transloca el ácido siálico hacia el interior del lisosoma. Una mutación en el gen que codifica a la sialina causa una enfermedad lisosomal conocida como enfermedad de Salla. Intrínseco a la membrana lisosomal se encuentra un complejo multienzimático, que contiene aproximadamente 13 cadenas polipeptídicas, que tiene actividad ATPasa, constituyéndose en una bomba de protones (Figura 10.24). Ocho de estas cadenas polipeptídicas forman una unidad funcional frente a la cara citosólica de la membrana, y son responsables de la descomposición del ATP en ADP + Pi. Las otras cinco subunidades se sumergen en la bicapa lipídica y funcionan como un canal a través del cual los protones (H+), resultantes de la hidrólisis, difunden al interior del orgánulo. Este proceso es a la inversa de lo que ocurre en los complejos de la ATP sintasa que se encuentran en la membrana mitocondrial interna (capítulo 4). Los lisosomas contienen alrededor de 40 tipos de enzimas hidrolíticas capaces de digerir casi todas las macromoléculas biológicas tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y oligosacáridos. El elenco de enzimas que se encuentran en los lisosomas, sin embargo, es variable según el tipo celular y depende de la especialización funcional de cada célula. Las células serían destruidas fácilmente si estas enzimas no estuvieran contenidas en un orgánulo rodeado de membrana. Se cree que el alto contenido de oligosacáridos ligados a la superficie luminal de su membrana, la protege de la acción de las enzimas hidrolíticas. El hecho de que las enzimas lisosomales son activas en pH ácido, mientras que el pH del citosol es neutro, ofrece una protección adicional contra los efectos de estas enzimas en la posible aparición de una ruptura en los lisosomas. Los lisosomas reciben sustancias extracelulares por endocitosis y el material intracelular por la vía de biosíntesis y la autofagia. Gracias a sus funciones en la degradación de los diferentes materiales internalizados e intracelulares, que son orgánulos clave en el mantenimiento de la homeostasis celular. VÍA ENDOCÍTICA La vía endocítica es responsable de la internalización y degradación de

materiales extracelulares, así como del reciclaje de proteínas y lípidos, junto con el "turn-over" de los componentes de la membrana celular. Siguen esta vía moléculas capturadas por pinocitosis mediada o no por receptores, es decir, que pueden o no ser reconocidas específicamente por receptores que se encuentran en la membrana plasmática de la célula. En la superficie de la célula, se producen el reconocimiento y la unión entre los receptores y la molécula que será endocitada. En la superficie citosólica de la membrana se unen a las moléculas AP2 (adaptadoras de clatrina) y las clatrinas, causando un reordenamiento y posterior invaginación de la membrana, para formar las vesículas de endocitosis, con diámetros menores a 100 nm. Estas vesículas se sumergen en el citoplasma y se fusionan con el compartimiento endosomal (Figura 10.25). El compartimiento endosomal se compone de un conjunto pleomórfico de túbulos y vesículas de diferentes tamaños, que se encuentran desde la periferia del citoplasma hasta la proximidad del complejo de Golgi y del núcleo. La membrana del compartimiento endosomal posee también, como los lisosomas, bombas de protones que rompen el ATP y bombean H+ en el interior de la cisterna, causando su acidificación. Las vesículas endocíticas se funden, inicialmente, con los endosomas tempranos (early endosomes), cuyo interior es más ácido (pH 6,5) que el citosol, dando como resultado, en la mayoría de los casos, la separación de algunos receptores y las moléculas endocitadas (Figura 10.25). Por lo tanto, la función principal del endosoma, es la de separar los receptores de la membrana, tales como los de la membrana plasmática, lo que permite el reciclaje de estos para usarlos en otros compartimentos celulares. Del endosoma temprano brotan los endosomas de reciclaje, que son tubulares y llevan a los receptores de vuelta a la membrana plasmática. Los receptores que todavía permanecen unidos a las moléculas endocitadas son secuestrados en pequeñas vesículas intraluminales (ILV– del inglés intraluminal vesicles), con diámetros de 50 a 80 nm, que brotan de la membrana limitante a la luz del endosoma (Figura 10.25). Aquí, parte de ellas se degrada, lo que provoca una disminución en el número de receptores de membrana, y por lo tanto, en la capacidad de respuesta de la célula a ciertas moléculas. Este proceso constituye la downregulation (regulación a la baja, hacia abajo o regulación por disminución) y es uno de los acontecimientos responsables de algunos casos de tolerancia del organismo a las drogas. En la secuencia, del endosoma temprano se forman las vesículas endosomales transportadoras (ECV), con alrededor de 0,5  m de diámetro, que contienen las moléculas endocitadas y algunas vesículas intraluminales. Las ECV son transportadas por los microtúbulos para llegar a los endosomas tardíos (late endosomes), con los que se funden (Figura 10.25). El interior de los endosomas tardíos es más ácido (pH 6,0) que el encontrado en el endosoma temprano y también contiene una mayor cantidad de vesículas intraluminales, por cuya razón son a menudo llamados endosomas multivesiculares. Por otra parte, las membranas de estas vesículas intraluminales contienen grandes cantidades del lípido ácido lisobisfosfatídico (LBPA), que se encuentra justo dentro de los endosomas tardíos y los lisosomas. Esta serie de fusiones y fisiones de vesículas y de compartimentos membranosos que se inicia en el endosoma temprano y culmina en el endosoma tardío se llama maduración endosomal. El endosoma tardío también es el compartimento con el cual se fusionan las vesículas que contienen enzimas lisosomales unidas a los receptores de manosa 6-fosfato (MPR), que brotaron de la red trans del Golgi recubiertas con AP1 y clatrina. La disminución en el pH provoca que las enzimas se disocien de los MPR y ahora, del endosoma tardío brotan vesículas que reciclan los MPR de nuevo a la red trans del Golgi. Por lo tanto, quedan sólo las enzimas hidrolíticas y el material endocitado que, con un pH cercano a 5,0, constituyen el compartimento final de la vía endocítica, el lisosoma, donde la digestión se lleva a cabo. Una característica distintiva entre el lisosoma y el endosoma tardío es la ausencia total, en el lisosoma, de receptores de manosa 6-fosfato (MPR). Las moléculas resultantes de la digestión, tales como los aminoácidos, los ácidos grasos y los carbohidratos, salen por los transportadores presentes en la membrana de los lisosomas (mencionados anteriormente) y se propagan en el citosol, donde se van a utilizar en la síntesis de diversas moléculas celulares.

Vias fagocítica y autofágica

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas La fagocitosis es un proceso que permite a las células inmunes internalizar los organismos invasores, células en apoptosis o incluso otras células. Cuando se activan las proyecciones de la membrana que rodean al blanco, se activan las vías intracelulares de señalización, conduciendo a una reorganización del citoesqueleto de actina y a la formación de una vacuola, el fagosoma, que entra en el citoplasma de la célula (Figura 10.26). Entonces estos fagosomas se fusionan con los lisosomas, formando el fagolisosoma. Las bombas de protones que se encuentran en la membrana rompen el ATP y liberan los protones a la luz del fagolisosoma, que se vuelve ácido, alcanzando valores de pH ácidos entre 4,5 y 5,0, lo que resulta ideal para la actividad de las hidrolasas ácidas. El material a ser digerido se mezcla bien con las enzimas hidrolíticas (Figura 10.26). Algunas veces permanecen en los fagolisosomas, residuos de material que ha soportado el proceso digestivo, formándose los cuerpos residuales, que se acumulan con el paso del tiempo, en las células de larga vida. En algunos tipos celulares que no se dividen, tales como las neuronas y las células musculares del corazón, los cuerpos residuales se agregan, formando partículas grandes, visibles al microscopio óptico, que contienen lípidos complejos de color marrón llamados gránulos de lipofuscina. Estos gránulos aumentan en número con la edad, y, contrariamente a lo que se creía, aún pueden ser necesarios para la degradación. Otras veces, la acumulación de material en los cuerpos residuales es el resultado de un defecto genético de los lisosomas. Estos casos son causados por mutaciones en uno o más genes que codifican una o más enzimas lisosomales, haciendo que la enzima no se exprese correctamente. Por ejemplo, en la enfermedad de Pompe, cuya aparición se produce temprano en la vida, todas las células, especialmente las hepáticas y las musculares, se cargan con grandes cantidades de glucógeno. En esta enfermedad, los lisosomas son deficientes en la enzima glucosidasa que descompone el glucógeno. La acumulación de glucógeno es más pronunciada en el hígado y el músculo, debido a que en estos tejidos hay normalmente mayor cantidad de este polisacárido. Hay muchas enfermedades genéticas en las que la falta de ciertas enzimas lisosomales puede producir acumulación de glicosaminoglicanos y lípidos. La autofagia, por otro lado, es un mecanismo utilizado por las células para degradar componentes citoplasmáticos tales como orgánulos que ya

han cumplido su vida media o estructuras a ser degradadas durante los procesos de diferenciación y de desarrollo embrionario. Estos componentes están rodeados por una doble membrana, formando una vesícula, o vacuola autofágica o autofagosoma (Figuras 10.26 y 10.27). Los autofagosomas, rodeados de esta doble membrana, se fusionan con los lisosomas formando orgánulos llamados autolisosomas (Figura 10.26). Durante la fusión, la membrana externa del autofagosoma se convierte en parte de la membrana del autolisosoma, mientras que la vesícula interna es liberada en el interior del orgánulo, donde es degradada por las enzimas hidrolíticas. En ciertas condiciones fisiológicas hay un aumento de la autofagia. Esto sucede, por ejemplo, en las glándulas mamarias cuando termina la lactancia. Durante el embarazo, aumenta el número de células secretoras de estas glándulas, para la producción de leche después del parto. Después que termina el período de lactancia, ocurre la destrucción autofágica de los restos de la secreción y de los orgánulos que ya no son necesarios. Las enzimas lisosomales, a veces, también participan en la digestión de moléculas extracelulares. Un aumento en los niveles de Ca2+ citosólico induce la fusión de las membranas de los lisosomas con la membrana plasmática, causando que las enzimas sean exocitadas en el medio extracelular. Esta secreción de las enzimas lisosómicas se produce en condiciones normales, por ejemplo en la remodelación ósea durante el crecimiento, mientras que las enzimas lisosomales digieren la matriz ósea para permitir el crecimiento esquelético. Las células que participan en la defensa y en la respuesta inmune, tales como los basófilos, mastocitos, eosinófilos y linfocitos, presentan compartimentos lisosomales especializados, llamados lisosomas secretores. Estos lisosomas realizan la secreción regulada de sus enzimas, es decir, secretan sólo en respuesta a un estímulo externo. Ellos realizan dos funciones: almacenan a las enzimas lisosomales que, en los momentos adecuados, son secretadas al medio extracelular e insertan en la membrana plasmática moléculas involucradas en el proceso de la respuesta inmune.

Figura 10.25 Esquema de la vía endocítica. La célula captura materiales del medio extracelular por endocitosis mediada o no por receptores. El material se internaliza en vesículas endocíticas cubiertas de AP2 y clatrina, que se sumergen en el citoplasma y se funden con el endosoma temprano. Del endosoma temprano brotan los endosomas de reciclaje, quienes llevan de vuelta a los receptores a la membrana plasmática, y los que no regresan, brotan como parte de la membrana de vesículas que se hunden en el lumen del endosoma temprano y no se degradan. Este proceso conduce a la downregulation de estos receptores. Del endosoma precoz se forman las vesículas endosomales transportadoras (ECV) que llevan el material endocitado en la dirección de los endosomas tardíos, con los que se fusionan. Los endosomas tardíos también se fusionan con las vesículas lisosomales cubiertas por AP1 y clatrina, que contienen las enzimas lisosomales unidas a los MPR. Con la caída del pH, los MPR se desunen de las enzimas y brotan como parte de las membranas de las vesículas que regresan a la red trans del Golgi. Este compartimiento contiene entonces sólo las enzimas hidrolíticas y el material endocitado que, con un pH 5.0, inician la degradación y están en el lisosoma.

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Figura 10.26 Las vías fagocítica y autofágica se ilustran en este esquema. En la fagocitosis cuando, el material extracelular con unas dimensiones de 0,5 m o más llega a la membrana plasmática de la célula, ésta emite extensiones que rodean y abarcan el material. Se forma, entonces, el fagosoma que se sumerge en el citoplasma y se fusiona con el lisosoma, lo que resulta en el fagolisosoma. Los complejos de ATPasa que se encuentran en la membrana del fagolisosoma rompen el ATP y bombean protones al interior del fagolisosoma, alcanzando un pH de alrededor de 5,0, activando a las enzimas lisosomales, que degradan el material fagocitado. En la autofagia, los componentes celulares están rodeadas por una doble membrana, que se dobla para formar una vesícula, el autofagosoma. Cuando el autofagosoma se fusiona con el lisosoma, su membrana externa se convierte en parte de la membrana del autolisosoma, y la vesícula se libera a la luz de autolisosoma. Cuando el pH alcanza 5,0, se produce la digestión del material autofagocitado.

Figura 10.27 Micrografía electrónica de célula acinar pancreática. Aparecen varios autofagosomas en diferentes etapas de la digestión. Observe, en 1, dos porciones del retículo endoplasmático rugoso separadas del citoplasma por una membrana y en el inicio de la alteración. 2, aparecen dos mitocondrias y retículo endoplasmático rugoso en una etapa más avanzada de la digestión. En 3, el proceso se encuentra en su fase final, en la que ya no se reconocen los orgánulos. Aumento: 45.000x.

VÍA UBIQUITINA-PROTEOSOMAS Los niveles intracelulares de proteínas son mantenidos tanto por la síntesis de nuevas moléculas como por la degradación de las moléculas existentes. La vida promedio de las proteínas celulares varía en gran medida, y su degradación es un aspecto importante de la regulación celular. Muchas de las proteínas que son degradadas tempranamente son moléculas reguladoras, tales como los factores de transcripción. El reciclaje de estas proteínas es necesario para permitir que sus niveles cambien rápidamente en respuesta a estímulos extracelulares. Las enzimas de la glicólisis, por ejemplo, tienen una vida útil muy larga, mientras que las proteínas que inician la replicación del ADN tienen una vida muy corta. Hay indicios de que los aminoácidos terminales marcan la duración de las proteínas que, después de realizar sus funciones, se degradan. Los lisosomas son incapaces de distinguir y degradar moléculas proteicas individuales que ya han cumplido sus funciones y se convirtieron en innecesarias, así como aquellas que se sintetizaron defectuosas o sufrieron algún tipo de cambio, convirtiéndose en no funcionales. Esta función se realiza por la vía ubiquitina-proteasoma, que es la principal responsable por la degradación selectiva de las proteínas. De esta manera, la degradación de las moléculas proteicas es realizada en complejos multienzimáticos llamados proteosomas. Los proteosomas se encuentran tanto en el citoplasma como en el núcleo de todas las células eucariotas. La distribución intracelular, el número de proteosomas y la relación relativa entre el

núcleo y el citoplasma variar según el tipo celular, con la etapa de diferenciación, con las condiciones fisiológicas y del microambiente, entre otros factores. En general, las células con alta capacidad de proliferación tienen una gran cantidad de proteosomas. Hay dos tipos de proteosomas ya caracterizados: los proteososomas 20S y 26S. El proteasoma 20S es de aproximadamente 700 kDa de masa, mientras que el 26S tiene 2 MDa. Ambos están compuestos por complejos multienzimáticos que están dispuestos como un cilindro, que tiene una cámara central con un coeficiente de sedimentación de 20S. El proteasoma 26S tiene, en cada extremo de la cámara, una estructura en forma de tapa, con 19S (Figura 10.28). Las diferencias entre estos dos tipos de proteosomas se enumeran en la Tabla 10.1. Mientras que la actividad del proteasoma 26S es la más compleja y la más esclarecida, abordaremos los siguientes mecanismos de acción. La cámara central se compone de cuatro anillos superpuestos, dos  externos y 2  internos, conteniendo cada uno siete enzimas. Los dos anillos interiores contienen las enzimas proteolíticas, es decir, que degradan proteínas. Cada uno tiene tres sitios activos que se enfrentan al interior de la cámara, lo que garantiza que la actividad catalítica se lleva a cabo en un ambiente aislado del citosol. Los complejos 19S reconocen y controlan la entrada de las proteínas que se degradan, y desnaturalizan estas proteínas para que sean accesibles a los sitios activos de las enzimas presentes en la cámara proteolítica (Figura 10.28).

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Orgánulos que participan en la síntesis y degradación de las macromoléculas Las proteínas que deben ser digeridas en los proteosomas 26S son marcadas por unirse de forma covalente a varias moléculas de una proteína citosólica abundante, la ubiquitina. La ubiquitina es un polipéptido de 76 aminoácidos altamente conservado en todos los eucariotas animales, vegetales, e incluso hongos. Las proteínas a ser degradadas se seleccionan por la unión de la ubiquitina a cada residuo de lisina que se encuentra en la proteína. En este proceso participan varias enzimas que activan la ubiquitina libre y promueven su unión al aminoácido. Estas enzimas se denominan E1, E2 y E3 y actúan en secuencia. La E1 escinde al ATP, activando a la ubiquitina y la transfiere a la enzima E2, que, a su vez, presenta a la ubiquitina a la E3 (Figura 10.28). La E3 se une a la proteína a ser degradada e interactúa con la E2 para establecer el enlace covalente entre la ubiquitina y la proteína diana. Este proceso se repite varias veces, de modo que las diferentes moléculas de ubiquitina son unidas a una única proteína, para formar una cadena de poliubiquitinas, que es la marca para destruir la proteína. El complejo formado por las ubiquitinas asociadas a la proteína que será destruida es reconocido por el complejo 19S, que contiene seis cadenas polipeptídicas con actividad ATPasa, una enzima que extrae del ATP la energía requerida para la actividad proteolítica. Después de reconocer la proteína ubiquitinada, este complejo extrae las moléculas de ubiquitina, que se transfieren al citosol para ser reutilizadas en un nuevo ciclo. Entonces, las enzimas del complejo desnaturalizan la proteína y liberan su acceso a la cámara proteolítica. Por lo tanto, la proteína entra en el complejo 20S, poniéndose en contacto con los sitios activos de las enzimas proteolíticas, donde es escindida en péptidos (Figura 10.28). Estos

péptidos se devuelven al citosol, en donde son digeridos hasta aminoácidos por las enzimas citosólicas. Los aminoácidos son reciclados por la célula para la nueva síntesis de proteínas o para otros fines. Los proteosomas juegan un papel crítico en el ciclo de vida de la célula. Los proteosomas que se encuentran en el núcleo degradan, entre otros, a las enzimas implicadas en los procesos de replicación y transcripción del ADN y las enzimas que regulan el ciclo celular (Capítulo 9). La actividad de los proteosomas puede ser regulada por el estrés oxidativo intracelular (causado por la acción de los radicales libres), ya que una de sus principales funciones es la de degradar proteínas dañadas por los radicales libres. En las células cancerosas, que se están dividiendo sin control, la inhibición de la actividad proteolítica de los proteosomas puede ralentizar o incluso detener la progresión del cáncer al interferir con la degradación ordenada de las proteínas que regulan el ciclo celular. Actualmente, varios compuestos inhibidores de la actividad proteolítica de los proteosomas se están probando en la terapia de esta enfermedad. Los proteosomas que han cumplido su tiempo de actividad son degradados por autofagia. INTEGRACIÓN ENTRE LAS VÍAS DE BIOSÍNTESIS Y DE DEGRADACIÓN La célula mantiene un equilibrio dinámico entre la endocitosis, la degradación y la síntesis de moléculas. Los orgánulos y los compartimentos celulares diferentes participan cooperativamente en estos procesos. La asociación entre estas vías se ilustra en la figura 10.29.

Figura 10.28 Diagrama que ilustra la degradación de proteínas en el proteosoma 26S. Al principio, la enzima E1, usando la energía de ATP se une la ubiquitina y la transfiere a la E2, que la transfiere a la E3. La E3 se une a la proteína a ser degradada y, con la ayuda de la E2, establece el enlace covalente entre la ubiquitina y la proteína. Este proceso se repite varias veces de modo que las proteínas que sufrirán degradación proteolítica son marcadas por varias moléculas de ubiquitina y luego internalizadas en los proteosomas. El proteasoma 26S es un complejo multienzimático cilíndrico que consta de una cámara proteolítica con coeficiente de s edimentación de 20S. Esta cámara tiene complejos multienzimáticos formados por cuatro anillos, dos  y dos . En cada extremo del cilindro se asocian, como tapas, las estructuras con coeficiente de sedimentación de 19S. Dentro del proteasoma, las moléculas de ubiquitina son desconectadas de las proteínas, que a su vez se descomponen en péptidos. Los péptidos, así como las moléculas de ubiquitina, se liberan en el citosol.

Figura 10.29 Diagrama esquemático que muestra la asociación entre las vías endocítica y biosintética. La vía biosintética se identifica mediante números arábigos (1 a 6) y la vía endocítica por números romanos. Las proteínas sintetizadas en el RER surgen del elemento de transición del retículo (1) en vesículas que se fusionan con la red cis-

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golgiana. Pasan a través de las diversas cisternas del aparato de Golgi (2), donde son sometidas a nuevas modificaciones y salen de la red trans del Golgi en el interior de las vesículas que tienen diferentes destinos. Las vesículas secretoras (3) se dirigen a la membrana plasmática, así como molécula s que se agregan a la membrana (4). Algunas vesículas recubiertas de clatrina que contienen hidrolasas ácidas se fusionan con el endosoma tardío (5), del endosoma tardío surgen vesículas que reciclan a los receptores de M6P de nuevo a la red trans del Golgi (6). Las moléculas endocitadas son internalizadas en vesículas que brotan de la membrana plasmática y se fusionan con el endosoma temprano (I). Del endosoma temprano se forma el endosoma de reciclaje (II) que devuelve de nuevo a los receptores a la membrana plasmática (III). En el proceso de maduración endosomal se forma el endosoma tardío que contiene el material endocitado y las hidrolasas ácidas (IV) y finalmente, el lisosoma (V), donde se produce la degradación del material.

Tabla 10.1 Diferencias estructurales y funcionales entre los proteosomas 20S y 26S. Proteasoma 20S Proteasoma 26S Compuesto por la cámara central 20S Formado por la cámara central 20S y dos subunidades 19S, una en cada extremo Degrada proteínas no ubiquitinadas dobladas o o mal montadas Degrada las proteínas poliubiquitinadas degrada, tales como las que regulan la expresión génica, las de la apoptosis y las del ciclo celular; regula los niveles enzimáticos de la célula Degradación independiente del ATP y de ubiquitina Degradación dependiente del ATP y de ubiquitina Resistente al estrés oxidativo Fácilmente inactivado en las células durante el estrés oxidativo RESUMEN Las células eucariotas presentan un complejo sistema de endomembranas, que delimitan compartimentos con funciones específicas, los orgánulos. De este sistema forman parte los dos tipos morfológica y funcionalmente distintos de retículo endoplasmático: el retículo rugoso (RER) y el retículo liso (REL). El retículo rugoso contiene polirribosomas unidos a sus membranas, mientras que las membranas del retículo liso no presentan polirribosomas. El REL está implicado en la biosíntesis y la modificación molecular de los fosfolípidos de membrana, en la síntesis del colesterol y sus derivados, así como en la desintoxicación del cuerpo. El RER participa en la síntesis y la segregación de las proteínas que irán a componer el aparato de Golgi, lisosomas, membrana plasmática, o que serán secretadas. Dentro de las cisternas del RER, las proteínas adquieren su configuración tridimensional con la ayuda de las proteínas chaperonas. Las proteínas destinadas a los peroxisomas, las mitocondrias, núcleo y los plástidos son sintetizadas por polirribosomas dispersos en el citosol. El aparato de Golgi está formado por pilas de sacos aplanados y por vesículas. Cada porción de la pila de cisternas presenta diferencias estructurales y funcionales. El lado de la pila que recibe las vesículas del retículo endoplásmico se llama cara proximal o cis. De la cara distal o trans surgen las vesículas que contienen material que fue procesado a lo largo de las cisternas golgianas. Este procesamiento implica glicosilación, sulfatación o fosforilación de proteínas y de lípidos. La fosforilación de un residuo de manosa destina enzimas para el interior de los lisosomas. El Golgi también es responsable de la polimerización de azucares, tales como los que forman las paredes de las células vegetales y los glicosaminoglicanos de las células animales. Las vesículas que brotan de la red trans del Golgi están destinadas para la secreción, para los lisosomas o para la membrana plasmática. Todo el transporte intracelular se logra mediante vesículas que brotan del retículo endoplásmico y del complejo de Golgi. Estas vesículas están cubiertas por diferentes proteínas y la cobertura depende del sitio de brote de la vesícula y del destino final de las proteínas empaquetadas en su interior. Las vesículas cubiertas llegan a su destino mediante el reconocimiento establecido entre las proteínas de su membrana y las proteínas presentes en las membranas de destino.

Las diferentes formas de captación de macromoléculas del medio extra o intracelular producen que ellas sigan diferentes vías intracelulares, hasta alcanzar el compartimiento celular donde se produce su degradación. Estas vías son la fagocítica, la autofágica y la endosomal. Las vesículas resultantes de la internalización de las diferentes sustancias son degradadas por los lisosomas, orgánulos que contienen enzimas hidrolíticas con actividad óptima a pH ácido. Los lisosomas también pueden realizar la secreción de sus enzimas y digerir componentes del medio extracelular. Los niveles intracelulares de proteínas son mantenidos tanto por la síntesis como por la degradación de estas moléculas. Las moléculas que ya no son necesarias, sintetizadas con defectos o alteradas por el uso, son marcadas para la degradación por la proteína ubiquitina, y esta degradación se realiza en los proteosomas, que son complejos citosólicos y nucleares de enzimas proteolíticas. BIBLIOGRAFÍA

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

La División del Trabajo entre las Células: Diferenciación

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ERRNVPHGLFRVRUJ Chao Yun Irene Yan

■ La diferenciación es el grado de especialización; la potencialidad y la capacidad de originar otros tipos celulares ■ La biología del desarrollo investiga la diferenciación en la embriogénesis ■ En los animales, la diferenciación celular se inicia en la etapa embrionaria de gástrula ■ La diferenciación es el resultado de una serie de expresiones génicas controladas ■ Durante la diferenciación, hay activación de ciertos genes e inactivación de otros ■ ¿Qué factores controlan los procesos de diferenciación celular?

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La diferenciación celular no se limita a los embriones y continúa en el organismo adulto El proceso de diferenciación no es irreversible Algunos tejidos contienen células madre o "stem cells", capaces de proliferar y diferenciarse para restablecer células diferenciadas Las células presentan mecanismos de autodestrucción por el proceso de apoptosis Resumen Bibliografía

Guía ■ La diferenciación da lugar a células especializadas para realizar ciertas funciones con gran eficiencia ■ Hay una relación inversa entre el grado de diferenciación de una célula y su capacidad para formar otros tipos celulares (potencial) ■ El cigoto es la célula que tiene un potencial máximo (totipotente), puede formar todas las células corporales ■ La biología del desarrollo estudia los eventos reguladores de la diferenciación celular durante la embriogénesis ■ Los reordenamientos celulares de la gastrulación y el inicio del control cigótico de la transcripción génica son eventos esenciales para la diferenciación celular durante la embriogénesis ■ La diferenciación de una célula particular depende, principalmente, de la expresión de ciertos genes y la represión de los demás (control transcripcional) ■ El control transcripcional es específico para cada tipo celular y varía desde el silenciamiento total (ninguna transcripción) hasta las diferencias sutiles en la actividad transcripcional ■ Los factores que influyen en la diferenciación pueden ser intra o extracelulares ■ La diferenciación celular no se limita a los embriones y se continúa en el organismo adulto ■ El proceso de diferenciación en algunos casos se puede invertir en un proceso conocido como desprogramación nuclear ■ La desprogramación nuclear artificial está en el corazón de toda la tecnología de la clonación de organismos completos a partir de células somáticas ■ Muchos tejidos contienen células madre, que se multiplican para mantener su propia población y dar lugar a células más diferenciadas (especializadas) ■ La médula ósea roja, donde se forman las células sanguíneas, es un buen modelo para el estudio de la diferenciación después del nacimiento ■ A la par de la proliferación y la diferenciación celular, también hay apoptosis, que es la eliminación de las células que ya no son necesarias

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n este capítulo, se estudiará la división del trabajo entre las células que constituyen el cuerpo de los seres pluricelulares. Esta distribución de funciones es una consecuencia de la diferenciación celular, que básicamente es el proceso de especialización de las células, las que a su vez ejercen, con gran eficiencia, funciones específicas. Hasta cierto punto, el cuerpo de un animal puede compararse a una sociedad, en la cual los individuos, asociándose de manera cooperativa y competitiva, ejercen funciones especializadas, tales como, por ejemplo, albañil, carpintero o pintor. La diferenciación aumenta en gran medida la eficiencia del conjunto, pero convierte a las células en dependientes una de la otra. Cada célula especializada ejerce de manera más eficiente una función específica. Por lo tanto, el cuerpo del animal se compone de varios tipos celulares que realizan funciones específicas. Esta especialización celular es evidente en la diversidad de la morfología celular existente en el organismo adulto y es la consecuencia de la expresión génica selectiva adquirida durante el proceso de diferenciación. En otras palabras, similar al profesional especializado que utiliza instrumentos pertinentes a su oficio, una célula diferenciada, además de los genes necesarios para el metabolismo básico, expresa selectivamente los genes que le son necesarios para el ejercicio de su función; por ejemplo, la neurona (célula nerviosa) expresa las proteínas necesarias para su función que no están presentes en un miocitos (célula muscular), y viceversa. Los numerosos tipos celulares que constituyen un animal adulto derivan de sólo una fuente unicelular; el cigoto. Poco después de la fecundación, la unión de la información genética proveniente de los dos gametos ofrece al nuevo organismo toda la información genética necesaria para la formación de los diferentes tipos celulares que finalmente integrarán el organismo adulto. Por lo tanto, el cigoto es la célula que tiene el máximo potencial, es decir, puede formar todas las células del cuerpo. Se dice, por tanto, que el cigoto es una célula totipotente.

LA DIFERENCIACIÓN ES EL GRADO DE ESPECIALIZACIÓN; LA POTENCIALIDAD Y LA CAPACIDAD DE ORIGINAR OTROS TIPOS CELULARES La diferenciación se comprenderá mejor considerando que cada célula está dotada con dos características: la diferenciación y la potencialidad. La diferenciación es el grado de especialización de la célula, mientras que la potencialidad es la capacidad que la célula tiene para originar otros tipos celulares. En cualquier célula, cuanto mayor es la potencialidad, menor es la diferenciación, y viceversa. Las primeras células embrionarias (blastómeros) de la mayoría de las especies animales pueden dar lugar a cualquier tipo celular. Estas células tienen cero grado de diferenciación y, por lo tanto, tienen una potencialidad de 100%, siendo denominadas totipotentes (toti = total). En el otro extremo están, por ejemplo, las células nerviosas y las células musculares estriadas cardiacas, que han perdido hasta la capacidad de división mitótica, y no pueden incluso dar lugar a otras células idénticas. Estas células son muy diferenciadas, y su potencialidad es casi nula. Los ejemplos citados son extremos, la mayoría de las células exhiben grados intermedios de diferenciación y de potencialidad (Figura 11.1). Entonces, es posible definir la diferenciación celular como un conjunto de procesos que transforman una célula indiferenciada en una célula especializada - el resultado de la acción de una serie de controles de expresión, que tienden a definir las vías bioquímicas y la morfología de una célula, capacitándola efectivamente para una función específica en detrimento de muchas otras. La disminución de la capacidad para realizar otras funciones es la restricción del potencial celular. Por lo tanto, también se puede definir diferenciación como el proceso de restricción del potencial celular. El camino que recorre una célula, desde la etapa embrionaria hasta la especialización, consiste en una secuencia de expresiones y represiones génicas controladas. Dilucidar cuáles son estos mecanismos y cómo se integran para originar al organismo son los problemas centrales de la biología del desarrollo.

Figura 11.1 Dibujo esquemático que ilustra el proceso de diferenciación celular durante la embriogénesis. Las células del embrión se diferencian en las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo), de las que se formarán todos los tejidos que componen el cuerpo. A medida que una célula se diferencia, su potencialidad disminuye proporcionalmente.

LA BIOLOGÍA DEL DESARROLLO INVESTIGA LA DIFERENCIACIÓN EN LA EMBRIOGÉNESIS Por razones prácticas, uno de los modelos experimentales más populares en el estudio de la biología del desarrollo son los anfibios. Las razones de esta elección son varias: los anfibios son vertebrados, los que en su mayoría, tienen fertilización y desarrollo embrionario externos, lo que permite la observación de los procesos embrionarios desde la fertilización hasta la formación del organismo adulto. Este desarrollo externo también facilita las manipulaciones experimentales cuyos resultados ayudan a nuestra com-

prensión de los eventos reguladores de la diferenciación celular durante la embriogénesis. Uno de los experimentos clásicos realizados en este modelo experimental es el del trasplante entre embriones de la misma especie. Este experimento determinó el efecto que tiene el microambiente circundante sobre la diferenciación de las células en diferentes etapas de la embriogénesis; En otras palabras, acompañó al proceso de diferenciación de las células del trasplante, en otro contexto tisular, en el embrión aceptor. Los trasplantes se retiran de una región dorsal y se insertan en una región ventral. Cuando se realiza esta operación en los embriones jóvenes

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(es decir, menos diferenciados), las células del trasplante se desarrollan de acuerdo con el tejido aceptor en el que son insertadas; es decir, forman tejidos ventrales. Sin embargo, cuando el injerto se hace a partir de embriones donantes más maduros, las células del trasplante forman un tejido diferente del sitio aceptor circundante (Figura 11.2). El trasplante se desarrolla en un tejido dorsal similar del tejido del donante del cual fue tomado originalmente. Se puede obtener una serie de conclusiones de este experimento. Una de ellas es que la capacidad de responder a las señales externas determinantes de la diferenciación depende de la edad celular. Las células más jóvenes tienen una plasticidad que las hace susceptibles a las señales extracelulares. Por lo tanto, las células del trasplante provenientes de embriones jóvenes siguen siendo sensibles a las señales emitidas por los tejidos circundantes en el embrión aceptor y adoptan el programa de diferenciación dictado por estas señales. Sin embargo, más allá de cierta etapa embriológica, las células que componen el trasplante en embriones tardíos, debido a que han comenzado un programa de diferenciación en el embrión donante, continúan con este programa, independientemente de las señales externas emitidas por la región ventral circundante en el embrión aceptor. Este experimento demuestra que, con el paso del tiempo, existe una restricción de la plasticidad o potencialidad celular. EN LOS ANIMALES, LA DIFERENCIACIÓN CELULAR SE INICIA EN LA ETAPA EMBRIONARIA DE GÁSTRULA El primer momento en el que podemos ver el compromiso de las células embrionarias con un programa de diferenciación es durante la gastrulación, que se produce inmediatamente después de la segmentación o clivaje (escisión). Inmediatamente después de la fertilización, el embrión sufre sucesivas divisiones mitóticas a gran velocidad en el proceso conocido como segmentación (Figuras 11.3 a 11.5). Estas divisiones celulares intensas tienen por objeto aumentar rápidamente el número de células que componen el embrión. Para acelerar este proceso, las mitosis se abrevian omitiendo las fases G1 y G2 (fases en las que hay una intensa síntesis de ARN y proteínas, lo que resulta en el crecimiento de la masa celular - Capítulo 9). Durante la segmentación, los procesos de transcripción se inhiben temporalmente y el embrión simplemente se limita a dividir entre las células hijas las moléculas de ARN previamente acumuladas en el citoplasma del óvulo durante la ovogénesis. Debido a la ausencia de las fases G1 y G2, el tamaño de las células hijas disminuye progresivamente con cada división celular. Al final de la segmentación, el volumen total del embrión no se cambia aunque el número de células es significativamente más alto. Una vez que se acumula un número suficiente de células, comienza la gastrulación (Figura 11.6). Las divisiones celulares se siguen produciendo, pero a un ritmo más lento que en la segmentación. La gastrulación es el proceso de cambio en la forma embrionaria que se caracteriza por movimientos celulares intensos (movimientos morfogenéticos), dando lugar a la definición de las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo. En esta etapa, el embrión se conoce como gástrula. También es en la gastrulación donde las células del embrión comienzan el proceso de la transcripción, y, por lo tanto, se produce la expresión génica a partir del genoma cigótico. Como se ha mencionado anteriormente, debido a la inhibición de la transcripción que se produce en la segmentación, los ARN presentes en el embrión hasta la gastrulación derivan exclusivamente del genoma materno y se acumulan en el citoplasma durante la maduración del oocito. En la gastrulación, con el inicio de la transcripción a partir del genoma cigótico, tanto el genoma materno como el paterno comienzan a contribuir al perfil proteico de las células embrionarias.

Los reordenamientos celulares de la gastrulación y el inicio del control cigótico de la transcripción génica son eventos esenciales para la diferenciación celular. El reordenamiento celular posiciona células en los microambientes que definirán el programa de diferenciación que cada célula debe seguir. El experimento de trasplante entre embriones muestra que, en las primeras etapas de la diferenciación, el microambiente celular es extremadamente importante para la definición del tejido. El proceso de reordenamiento embrionario se conoce como morfogénesis. Es un proceso que ha sido recientemente estudiado en términos moleculares. Participan en este proceso macromoléculas intracelulares y de la matriz extracelular (Capítulo 12). Los cambios en la forma celular dependen del citoesqueleto, existiendo diversas moléculas de señalización extracelulares que estimulan cambios en el citoesqueleto. Las moléculas de la matriz extracelular interactúan con los receptores de membrana de las células, activando la fosforilación en cadena de varias proteínas quinasas intracelulares que actuarán sobre el citoesqueleto. Es también por la interacción con las macromoléculas de la matriz extracelular que las células migran, por lo general en pequeños grupos. Así, en la vida embrionaria existe una intensa comunicación entre las células, y entre éstas y la matriz extracelular, para coordinar la organización del cuerpo del embrión. El efecto del medio extracelular en la diferenciación extracelular se discutirá más adelante en este capítulo. LA DIFERENCIACIÓN ES EL RESULTADO DE UNA SERIE DE EXPRESIONES GÉNICAS CONTROLADAS La deflagración del control de la expresión génica del genoma embrionario permite la producción selectiva de las proteínas celulares que son esenciales para las funciones celulares específicas al final del proceso de diferenciación. Siguiendo la analogía inicial de la profesionalización de las personas de nuestra sociedad, que sería el equivalente a la adquisición gradual y selectiva, por un profesional, de las habilidades necesarias para realizar su función. Los cambios celulares que se producen en la diferenciación son el resultado de la inactivación de ciertos genes y de la activación de otros. Por ejemplo, un eritroblasto moviliza parte de su patrimonio genético requerido para la síntesis de la hemoglobina, pero es incapaz de muchas otras funciones metabólicas. Además, aunque una neurona tenga los genes para la hemoglobina, esta no sintetiza hemoglobina, sino más bien otras proteínas específicas para su función. Todas las células de un organismo tienen los mismos genes. Los cambios celulares que se producen en la diferenciación son el resultado de la de la inactivación de ciertos genes y la activación de otros en el genoma. En otras palabras, en un organismo adulto, cada célula tiene codificada en su ADN la información necesaria para sintetizar todas las proteínas para formar un organismo completo, pero sólo una porción selecta de proteínas se produce en cada célula. El perfil proteico celular es el resultado de un conjunto de mecanismos que actúan en varias etapas entre la transcripción y la función proteica; Por ejemplo, las células nerviosas son diferentes de las células musculares, porque los genes activos son diferentes. Esta diferencia en la actividad génica da lugar a la transcripción selectiva de ciertos genes, mientras que otros no se transcriben. Por lo tanto, los ARNm difieren de una célula diferenciada a otra. En general, podemos clasificar estos mecanismos en: transcripcional y post-transcripcional. El control transcripcional se ejerce en el ADN, regulando la intensidad de la transcripción de la mayoría de los genes, determinando, por ende, la actividad génica. Los mecanismos posttranscripcionales actúan entre la transcripción del ARNm y la traducción de la proteína.

Figura 11.2 Dibujo esquemático que ilustra el trasplante entre embriones. La secuencia normal de desarrollo sería de gástrula (A) para néurula (C) para renacuajo (E). Cuando el trasplante se realiza de la región dorsal de una gástrula (A) a la región ventral de otra gástrula (B), el trasplante se desarrolla en un tejido ventral en el renacuajo aceptor. Cuando el trasplante se realiza de la región dorsal de un néurula (C) para una gástrula (D), el tejido trasplantado es más diferenciado y seguirá el programa de diferenciación original, formando un tejido dorsal en el renacuajo aceptor.

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Figura 11.3 Ilustración del proceso de segmentación de embriones de Xenopus laevis. El proceso de segmentación comparte el contenido citoplasmático del cigoto entre las células hijas. El proceso no altera el volumen total del embrión.

Figura 11.4 Segmentación del cigoto de embriones de mamíferos. El embrión aumenta el número de células sin cambiar el volumen total. Al final del proc eso de segmentación, se forma el blastocisto, con una cavidad interna (blastocele) y una masa celular interna. Las células que componen la masa celular interna formarán el embrión mismo.

Figura 11.5 Segmentación en el embrión de las aves. El proceso de segmentación comienza en el oviducto, antes de la postura, y forma una cavidad (blastocele) delimitada por dos capas de células: el epiblasto y el hipoblasto. Durante la gastrulación las células del epiblasto ingresan en el blastocele por la línea primitiva que empieza a formarse de la zona marginal posterior.

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Figura 11.6 Esquema detallado de la gastrulación en el embrión de aves y mamíferos. Liderados por el nódulo de Hensen en la región anterior, la línea primitiva se alarga y hace posible que las células del epiblasto migren hacia el blastocele. Al final de la gastrulación, el epiblasto da lugar al ectodermo; las células que migraron forman el mesodermo y el endodermo.

DURANTE LA DIFERENCIACIÓN, HAY ACTIVACIÓN DE CIERTOS GENES E INACTIVACIÓN DE OTROS El control de la transcripción regula la disponibilidad (activación o inactivación génica) de ADN para generar ARNm; Es específico para cada tipo celular y varía desde el silenciamiento total (ninguna transcripción) hasta las sutiles diferencias en la actividad transcripcional. La activación génica está mediada por proteínas nucleares (conocidas como proteínas activadoras de genes o factores de transcripción), que reconocen secuencias específicas en el ADN (regiones de control génico) y favorecen la aproximación de las proteínas necesarias para la transcripción en sí, tales como la ARN polimerasa. Los factores de transcripción importantes para la diferenciación celular son específicos para cada tipo celular; por ejemplo, un grupo de factores de transcripción, denominados factores determinantes del músculo (FDM), es esencial en las primeras etapas de la diferenciación muscular. Estas proteínas se expresan sólo en precursores de miocitos e inician la cascada de la expresión génica que caracteriza a la progresión de la diferenciación muscular. Los FDM son clave para iniciar la transcripción de genes específicos para el músculo. Los ratones cuyos FDM fueron mutagenizados no presentan el músculo esquelético. En contraste, la inactivación selectiva de genes también es importante durante la diferenciación. Como se mencionó anteriormente, a medida que la célula se diferencia, se pierde la potencialidad. Esta pérdida se produce por la inactivación génica. Hay varios niveles de inactivación génica, desde la unión de factores nucleares inhibitorios hasta las modificaciones ultraestructurales de la cromatina reguladas por modificaciones covalentes de los nucleótidos. Un ejemplo extremo de la inactivación, conocido como inactivación del X, se produce con el cromosoma sexual en hembras de mamíferos. Las hembras tienen dos copias del cromosoma X, mientras que los machos de la especie tienen un cromosoma X y un Y. Por lo tanto, las hembras tendrían el doble de genes X con respecto a los machos. Para evitar esta discrepancia, uno de los cromosomas X se inactiva al azar en cada célula durante la embriogénesis de la hembra. La inactivación resulta en la compactación del cromosoma X de modo que ninguno de sus genes puede ser transcrito. El cromosoma X inactivo es condensado y se lo identifica como el corpúsculo Barr en las preparaciones histológicas. Otro fenómeno de inactivación génica, conocido como impresión génica, comienza con la modificación covalente del ADN genómico por medio de la metilación de los nucleótidos del tipo de la citosina de genes seleccionados. Factores proteicos nucleares se asocian específicamente a estas áreas genómicas metiladas, mediaando el silenciamiento génico de esas regiones. Un ejemplo de estas proteínas es la histona en su forma desacetilada. Se cree que la combinación de metilación nucleotídica e histonas desacetiladas favorece la formación de heterocromatinas (capítulo 8). Por otra parte, las regiones con bajos niveles de metilación - llamadas hipometiladas - tienen una mayor probabilidad de ser transcritas. La importancia del equilibrio del patrón de hipermetilación e hipometilación en la regulación de la actividad génica puede ser observada en las células cancerosas. Muchas de ellas presentan a menudo un genoma con los patrones de metilación alterados, con genes anormalmente hipermetilados o hipometilados. Se cree que estas aberraciones en el patrón de metilación genómico son la causa de la desregulación génica que genera, en consecuencia, las aberraciones celulares que causan y mantienen el tumor. El control génico post-transcripcional puede ocurrir de varias maneras, afectando a la eficiencia del procesamiento del ARNm, el transporte de ARNm al citoplasma y la traducción del ARNm, mediante la variación de la vida útil del ARNm o del producto proteico. En general, la regulación posttranscripcional se produce más rápido que el control transcripcional, en respuesta a las necesidades inmediatas de la célula. A modo de control post-transcripcional de la expresión génica es la variación de la estabilidad del ARNm. El ARN mensajero más estable, que persiste en la célula durante más tiempo antes de ser degradado, permite la síntesis de una mayor cantidad de la proteína codificada por el mismo y por lo tanto influye más poderosamente en la actividad celular. Un claro ejemplo de la importancia de este mecanismo regulatorio en la función celular se produce en una forma de anemia crónica (talasemia Constant Spring). La causa de la anemia es una mutación genómica en el ARNm de la globina, proteína componente de la hemoglobina de los eritrocitos. Esta mutación da lugar a una mayor inestabilidad del ARNm de globina. Los pacientes transcriben el ARNm para la globina con la misma intensidad que los individuos normales. Sin embargo, por tener una forma inestable de ARNm de globina, el nivel de la proteína globina en los eritrocitos está muy por debajo de lo normal, dando como resultado las muertes prematuras de los pacientes.

Otro modo de control postranscripcional es la regulación del tiempo de residencia del producto proteico en la célula; es decir, la regulación de la estabilidad proteica. ¿QUÉ FACTORES CONTROLAN LOS PROCESOS DE DIFERENCIACIÓN CELULAR? La diferenciación es controlada por factores intracelulares y extracelulares, lo que requiere, por tanto, una fuerte comunicación célula-célula y célulaambiente. Los factores intracelulares se encuentran en las mismas células en diferenciación. La capacidad de la célula para responder a estímulos extracelulares o de iniciar cambios depende de las vías de señalización celulares disponibles en su repertorio (Capítulo 6). Por ejemplo, una célula que no expresa los receptores para la insulina en su membrana sería incapaz de responder a su presencia en el medio extracelular. Los factores intracelulares derivan del programa existente en el ADN de la célula, o en el caso del cigoto, del material acumulado previamente en el citoplasma. La participación de las sustancias acumuladas en el citoplasma es bien conocida, y los ejemplos más evidentes se derivan de estudios realizados sobre huevos de moluscos, ascídeos y nematodos. En el embrión, antes de la gastrulación, las células embrionarias dependen de las macromoléculas depositadas en su citoplasma, en el organismo materno, durante la ovogénesis. Estas se distribuyen de forma desigual, con diferentes concentraciones de sustancias en diferentes lugares. La compartimentalización precoz de los componentes citoplasmáticos en el cigoto crea una desigualdad que persiste en las divisiones y es responsable de la primera etapa de la diferenciación celular. En las primeras etapas embrionarias, la diferencia de contenido citoplásmico entre las células es un determinante del destino celular de las células hijas. Por otro lado, los factores extrínsecos derivan de señales provenientes de otras células, de la matriz extracelular del organismo en diferenciación (factores locales) o de agentes provenientes del medio ambiente (factores ambientales). Los factores locales son el resultado de la acción de las células que actúan enviando, por medio de moléculas, señales que inducen a ciertos tejidos a diferenciarse en una dirección particular, o de lo contrario, estas señales se derivan de la matriz extracelular. El experimento de trasplante dorsoventral en embriones jóvenes, mencionado anteriormente, es un buen ejemplo de la importancia de los factores locales extrínsecos en la diferenciación celular. Hay muchos otros ejemplos de este tipo de interacción celular en el desarrollo de los riñones, ojos, etc. Curiosamente, estos procesos de inducción se producen a lo largo de la embriogénesis, determinando una secuencia ordenada de eventos. Este es el caso, por ejemplo, de la embriogénesis óptica, en el que la vesícula óptica induce la formación del cristalino, que, a su vez, induce la formación de la córnea. Otro ejemplo se refiere a la diferenciación bien estudiada de las glándulas salivales y pancreáticas. Se encontró que el brote epitelial que va a generar estos órganos sólo se desarrolla, formando tejido glandular, cuando está en contacto con el tejido conectivo embrionario. Al colocar una lámina de material impermeable entre el epitelio del brote y el tejido conectivo, no hay diferenciación de las células secretoras. Pero cuando se interpone entre estos dos tejidos un filtro fino que permite el paso de macromoléculas, pero no de las células, la diferenciación se lleva a cabo, por lo que es claro que un mensajero químico producido por un tejido actuó en su "vecino". La acción de la matriz extracelular en la diferenciación se ejemplifica en los estudios que utilizan el cultivo de tejidos realizado en frascos recubiertos previamente por componentes de la matriz, explicados en el capítulo 12, y en los que se observó un claro efecto de los componentes de la matriz extracelular sobre el comportamiento y diferenciación de las células. Además de la acción de las células circundantes, se sabe que varias hormonas y factores de crecimiento producidos en las células distantes también afectan a la diferenciación y al metabolismo celular. Cabe señalar, también, que una sola célula puede ser al mismo tiempo receptora yemisora de señales. Las variaciones en el contenido proteico o en la expresión génica de una célula (factores intrínsecos) afectan a la señal que envía, modificando, por lo tanto, la composición del microambiente celular en la que está insertada. Por lo tanto, una única célula responde y contribuye a un conjunto de factores que interactúan, por lo que vuelve al fenómeno de la diferenciación extremadamente complejo. Varios factores ambientales pueden afectar a la diferenciación. Estos factores son variados y pueden ser físicos (rayos X, la radiactividad, temperatura), químicas (drogas ilícitas, contaminantes, fármacos), o biológicos (infección viral). Son notables efectos perjudiciales de tales agentes, también conocidos como teratogénicos (terato, malformación, y génico, generador) sobre la diferenciación en los embriones y fetos, causando diversos defectos. Por lo que es necesario evitar que las mujeres embarazadas sean expuestas a la radiación, como los rayos X. Sustan-

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cias tóxicas derivadas de la contaminación del medio ambiente o los medicamentos (como la talidomida) también pueden producir malformaciones. Las infecciones virales como la rubéola pueden causar sordera y ceguera. Agentes teratogénicos actúan principalmente en los primeros tres meses de embarazo, ya que es durante este período que los procesos de diferenciación se producen con mayor frecuencia e intensidad. Pueden actuar sobre los genes, causando mutaciones o pueden inhibir la actividad de las enzimas que juegan un papel en la diferenciación. LA DIFERENCIACIÓN CELULAR NO SE LIMITA A LOS EMBRIONES Y CONTINÚA EN EL ORGANISMO ADULTO A menudo, es común la impresión de que, poco después del nacimiento, los órganos se encuentran completamente diferenciados, y sólo les resta aumentar de volumen. Esta impresión es errónea. En los recién nacidos, las diversas secciones del cuerpo se encuentran en diferentes etapas de desarrollo y completan la diferenciación en ritmos diferentes. Por ejemplo, en el nacimiento, los riñones y el hígado no están diferenciados totalmente. El sistema nervioso también se encuentra lejos de estar completamente desarrollado en los recién nacidos. Tanto es así que la mielinización, importante para el aislamiento del "cableado" del sistema nervioso, es lenta, comenzando en el cuarto mes de vida intrauterina y extendiéndose hasta el segundo año después del nacimiento. Las conexiones entre las neuronas son incompletas en el nacimiento y se completan gradualmente durante los primeros años. Así como un adulto, el sistema nervioso sigue generando un número limitado de nuevas neuronas. En los vertebrados, tales como peces y anfibios, la neurogénesis en el organismo adulto es importante para el crecimiento ocular, que continúa durante toda la vida del animal. La neurogénesis en mamíferos adultos es hoy uno de los principales enfoques de investigación en neurociencia. Los potenciales terapéuticos de las células madre neurales y su capacidad regenerativa serán discutidos más adelante. Las glándulas mamarias son un ejemplo de diferenciación, porque se estacionan en la etapa temprana de la diferenciación de las glándulas exocrinas, es decir, en la fase de la formación de los conductos. Durante el embarazo, debido a la estimulación de varias hormonas, el proceso de diferenciación comienza de nuevo, formándose los acinos, que comienzan a secretar después del parto. Después de la lactancia, el proceso se invierte, y la glándula mamaria vuelve de nuevo a un estado similar a la que existía antes del embarazo. Es, por lo tanto, una glándula cuya diferenciación sólo se completa en el embarazo y es reversible después de la lactancia. EL PROCESO DE DIFERENCIACIÓN NO ES IRREVERSIBLE Como se explicó en las secciones anteriores, lo que ocurre es una activación y una inactivación gradual de genes a través de cambios en el ADN genómico. A excepción de los linfocitos, los núcleos de todas las células diferenciadas continúan conteniendo todos los genes que estaban originalmente presentes en el cigoto. La reversión de los procesos de restricción genómicos volvería al núcleo a su estado original cigótico. La restricción de la potencialidad por la diferenciación, en algunos casos, puede ser revertida natural o artificialmente para generar un núcleo totipotente. Este proceso de reversión se conoce como desprogramación nuclear. La desprogramación nuclear artificial está en el corazón de la tecnología de clonación de organismos completos a partir de células somáticas. El primer organismo que se clonó a partir de una célula somática fue el anfibio Xenopus laevis. Los investigadores extrajeron el núcleo de una célula epitelial del renacuajo y transfirieron este núcleo a un óvulo enucleado. Elementos citoplasmáticos del óvulo desprogramaron el núcleo epitelial, restaurando su totipotencialidad, generando todo un embrión. El desarrollo de las técnicas de desprogramación nucleares ha permitido la clonación de mamíferos a partir de células de animales adultos. La oveja conocida como Dolly fue el primer animal clonado de una célula de animal adulto (Figura 11.7). Además la oveja, otros mamíferos ya han sido clonados, lo que demuestra definitivamente que las células adultas contienen la información genética completa para generar todos los tipos celulares del organismo. Otro ejemplo de desprogramación celular pasa en la regeneración. La capacidad de regeneración del hígado, un órgano compuesto por células muy especializadas, es un ejemplo muy interesante. La eliminación experimental de dos tercios del hígado de un ratón adulto, por ejemplo, provoca una intensa proliferación de las células hepáticas restantes, que reconstituyen completamente la parte del hígado extirpada. La regeneración también se produce de manera similar en el hígado humano. Durante la regeneración hepática, hay un retorno parcial de este tejido a las condiciones embrionarias. Se sintetizan factores extrínsecos e intrínsecos característicos de la embriogénesis hepática. Por ejemplo, hay un rápido aumento en los niveles del factor de crecimiento hepático, que induce en gran medida la división celular en los hepatocitos para que repueblen la porción eliminada del hígado. Sin embargo, durante la regeneración, a diferencia de la clonación, los núcleos de los hepatocitos no se vuelven totipotentes. La desprogramación de los diferentes tipos celulares hepáticos es parcial, lo que permite solamente la aceleración de la división celular y la generación de otras células hepáticas. ALGUNOS TEJIDOS CONTIENEN CÉLULAS MADRE O " STEM CELLS", CAPACES DE PROLIFERAR Y DIFERENCIARSE PARA RESTABLECER CÉLULAS DIFERENCIADAS Otra posible fuente de sustitución y regeneración tisular en el organismo adulto son las células madre, también llamadas células troncales o “stem cells”. Debido a su potencial terapéutico, la investigación sobre células madre ha avanzado significativamente en los últimos años. Las células troncales para poder ser clasificadas como tal, deben mostrar dos propiedades básicas: la capacidad de dividirse de forma continua y la capacidad de diferenciarse en diferentes linajes celulares, con sus morfologías y funciones especializadas. En otras palabras, las células troncales son una reserva constante de células que puede diferenciarse en tipos especializados, dependiendo del tejido considerado. Hay dos categorías principales de células troncales: embrionarias y no embrionarias (también conocidas como células madre adultas). Las células madre embrionarias derivan de la masa celular interna del blastocisto. En esta etapa del desarrollo embrionario, las células de la masa

celular interna tienen el potencial de diferenciarse en todos los tipos celulares del organismo. Sin embargo, no son capaces de generar células de la porción fetal de la placenta (trofo-ectodermo), por eso se dice pluripotentes, y no totipotentes, como los blastómeros. Las células madre adultas son raras y se encuentran dispersas en los diferentes tejidos del cuerpo; en general, ellas ya expresan genes que determinan sus destinos (genes marcadores), de acuerdo a los tejidos en los que se ubican. Por ejemplo, las células madre de la epidermis producen células que se diferencian sólo para formar las células epiteliales queratinizadas características del revestimiento de la piel. Las células madre del epitelio intestinal ya están preparadas para dar origen a las células absortivas y caliciformes de este epitelio. Para tener un potencial de diferenciación más restringido que las células madre embrionarias, estas células se clasifican como multipotentes. La diferenciación de las células madre reduce en menor medida, en los tejidos de un organismo adulto, la restricción de la potencialidad que se produce en la embriogénesis de ellos. Los factores extrínsecos idénticos o muy similares a los utilizados por el embrión durante su diferenciación y organogénesis son igualmente importantes en el control de la división y diferenciaciones de los linajes de células madre embrionarias y adultas. La combinación correcta de moléculas de señalización en el medio extracelular, la matriz extracelular y la interacción célula-célula determina el destino de diferenciación de las células madre in vivo. La importancia de los factores extracelulares es tal que se postula la hipótesis de la existencia in vivo de microambientes especiales o nichos para el mantenimiento y la diferenciación de las células troncales adultas. Las células troncales adultas que son trasplantadas de su nicho de origen a otro pueden diferenciarse en otros tipos celulares que antes no podían hacerlo. Este tipo de experimento resume el experimento de trasplante dorsoventral en embriones jóvenes mencionado anteriormente en este capítulo. En la misma manera que en el trasplante, la capacidad del linaje de células madre de responder a las señales externas determinantes de la diferenciación depende de su nivel de diferenciación cuando fue aislada. Cuanto mayor sea el nivel de diferenciación de las células madre, menor resulta la capacidad de responder a factores extrínsecos, y menor es su potencialidad. Entre los investigadores, algunas fuentes de células madre han generado un interés particular debido a su potencial terapéutico: el tejido nervioso, la médula ósea y el tejido adiposo. El descubrimiento de células madre en el tejido nervioso, una vez considerado un tejido irreversiblemente postmitótico en el adulto, fue una sorpresa. Actualmente, se reconoce que hay pequeñas poblaciones de células proliferantes en las zonas restringidas del tejido nervioso. El cultivo y manipulación in vitro de estas células madre neurales mostraron que son capaces de formar neuronas y glia, lo que demuestra la multipotencialidad de esta población proliferante. Estas células madre también tienen una capacidad limitada para repoblar el sistema nervioso cuando son reimplantadas experimentalmente. El estudio de las células madre de la médula ósea roja se desarrolló gracias a las técnicas que permitieron experimentos hematopoyéticos inducidos in vivo e in vitro. Los experimentos in vivo se realizaron con la inyección de médula ósea normal en ratones cuyas células hematopoyéticas murinas habían sido previamente destruidas por fuertes dosis de rayos X. En estas condiciones, se desarrollaron colonias hematopoyéticas, procedentes del donante, en el bazo de los animales receptores. Una extensa serie de estudios in vitro mostró que estas células madre, en un medio adecuado y cuando son estimuladas por factores de crecimiento, proliferan y se diferencian, mediante la generación de varios tipos de leucocitos. Del mismo modo, se estableció que las células madre de la médula ósea roja tienen la potencialidad para originar, además de todas las células de la sangre, otros tipos celulares varios. Tienen una potencialidad similar a la de las células del tejido embrionario llamado mesénquima. Así, las células de la médula ósea, además de su uso ya conocido y habitual en el tratamiento de ciertas enfermedades de la sangre, están empezando a ser utilizadas de forma experimental para producir células cartilaginosas, óseas y de otros tejidos, abriendo la posibilidad terapéutica futura de una neoformación y reparación de tejidos destruidos por enfermedades hereditarias o adquiridas. Se ha demostrado recientemente que el tejido adiposo es una buena alternativa para el aislamiento de células madre adultas. Las células madre de este tejido de animales de laboratorio son capaces de formar condrocitos, hepatocitos, cardiomiocitos y células del linaje neurogénico. Una de las ventajas claras del tejido adiposo como proveedor de células madre es su asequibilidad. Debido a su localización anatómica, el procedimiento de recogida de este tejido es menos invasivo. A pesar de los resultados prometedores obtenidos con células madre en el laboratorio, varias cuestiones deben tenerse en cuenta antes de la incorporación de estas en las terapias biomédicas. En primer lugar, para la repoblación de tipos celulares específicos, lo que necesitamos saber son los elementos extracelulares e intracelulares que regulan la diferenciación celular a partir de un linaje de células madre particulares. Los estudios sobre la restricción del potencial celular durante la embriogénesis, han contribuido de manera significativa a este concepto. Cabe señalar que el control del potencial celular no está restringido a los factores que promueven la expresión de los genes de la diferenciación, sino también a aquellos que reprimen los destinos celulares alternativos. Esta represión es clave para evitar la diferenciación de los tipos celulares no deseados a partir de las células madre durante la terapia. Otro elemento importante que hay que dominar es la exactitud de la zona de aplicación y la efectividad en la incorporación de las células madre en el tejido diana. La incorporación errónea de células madre además de las regiones afectadas puede provocar patologías adicionales, y las bajas tasas de incorporación disminuyen la eficacia del tratamiento. Finalmente, la respuesta inmune al trasplante de células madre de donantes también debe ser controlada para evitar el rechazo celular. Por último, hay muchas cuestiones a considerar. Todos estos aspectos se están investigando intensamente para que el uso de células madre en terapias regenerativas pase a convertirse en una realidad en el futuro.

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Figura 11.7 Esquema simplificado del proceso de clonación de la oveja Dolly por transferencia nuclear. El proceso requiere dos ovejas donadoras: una del ovocito y otra de las células somáticas. El ovocito tenía su núcleo (carga n) eliminado y reemplazado con el núcleo de una célula somática (carga 2n). El embrión clonado de esta manera se cultivó in vitro por un período corto e implantado en una tercera hembra. La carga genética de Dolly es idéntica a la de la donante de las células so máticas. Este experimento demuestra que el núcleo trasplantado contenía todos los genes que se encontraban en el cigoto.

LAS CÉLULAS PRESENTAN MECANISMOS DE AUTODESTRUCCIÓN POR EL PROCESO DE APOPTOSIS Para que la diferenciación conduzca a una morfogénesis normal de los órganos, es necesario que, junto con la proliferación y diferenciación celular, exista también la eliminación de las células que ya no son necesarias. Incluso en el adulto, la destrucción programada de ciertas células es también de gran importancia funcional. El feto humano, inicialmente tiene los dedos unidos, en una especie de aleta, y luego las células situadas entre los dedos mueren y son eliminadas, quedando la mano con los cinco dedos normales. En el timo de los mamíferos adultos, se forman las células T (linfocitos T), con función defensiva, que atacan a las células extrañas al organismo, como las bacterias y los protozoos invasores, pero se forman también, una gran cantidad de células T que atacan los propios tejidos del cuerpo. Estas células son eliminadas antes de abandonar el timo, ya que podrían causar un gran daño a los tejidos del cuerpo si se liberan en el torrente sanguíneo. La diferenciación de las glándulas mamarias, ya mencionada, también solo es posible debido a que las células que se forman durante el embarazo, y que ya no son necesarias después de la lactancia materna al recién nacido, se autodestruyen, provocando que la glándula vuelva al estado que tenía antes del embarazo. Incluso durante cada ciclo menstrual, hay proliferación de tejido de la glándula mamaria, que es removido antes del siguiente ciclo menstrual. La eliminación de la cola de los renacuajos, a medida que se trans-

forman en ranas o sapos adultos, es otro ejemplo bien conocido de la muerte celular programada. En todos los casos mencionados, la muerte celular se produce por un proceso llamado apoptosis (capítulo 9), caracterizado por una compresión de toda la célula, incluyendo el núcleo, que, junto con el citoplasma, también disminuye de volumen y, al microscopio, aparece condensado y oscuro. Los orgánulos citoplasmáticos no presentan grandes cambios iniciales. La cromatina condensada del núcleo (núcleo picnótico) es dividida en fragmentos regulares por una endonucleasa que ataca al ADN. Durante la apoptosis, las células emiten brotes citoplasmáticos, que se destacan de la superficie y son rápidamente fagocitados por los macrófagos u otras células. En la apoptosis, la superficie celular se modifica, haciendo más fácil y rápida la fagocitosis. Los macrófagos que fagocitan a las células apoptóticas no sintetizan las moléculas que participan en el proceso inflamatorio. A pesar de que numerosas células entran en apoptosis simultáneamente, como pasa en el timo humano, ellas no causan inflamación. En contraste, las células que mueren por necrosis, proceso debido a las sustancias tóxicas, microorganismos u otras causas, promueven una respuesta inflamatoria en los tejidos adyacentes. Las células necróticas se muestran "hinchadas", con tumefacción de toda la célula y también aumento del volumen de los orgánulos, así como de las cisternas del aparato de Golgi y del retículo endoplasmático. Las células necróticas estallan y liberan su contenido en el medio extracelular, causando la inflamación, a diferencia de la apoptosis, en la que la célula se mantiene

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con la membrana plasmática intacta, y los brotes independientes del citoplasma, en la apoptosis, también se encuentran delimitados por la membrana celular. Por lo tanto, en la apoptosis, el contenido intracelular no se libera en el medio extracelular. Los mecanismos moleculares de la apoptosis están siendo estudiados intensamente por muchos investigadores. Se sabe que la falta de algunas hormonas y factores de crecimiento puede conducir a la apoptosis de las células diana. Por ejemplo, la falta de la hormona masculina testosterona provoca la apoptosis en las células de la próstata. Muchas células mantenidas en cultivo entran en apoptosis cuando se les priva de ciertos factores de crecimiento. Por otra parte, la apoptosis es también un mecanismo de defensa. Células penetradas por virus, bacterias o protozoos muchas veces entran en apoptosis, y lo mismo puede ocurrir cuando el ADN propio de la célula sufre alguna mutación. Dado que el cáncer resulta de mutaciones en células somáticas, la apoptosis constituye una defensa natural contra las células malignas. En todos estos ejemplos, la muerte de las células infectadas o malignas por apoptosis resulta en beneficio para el organismo como un todo, por la muerte de sólo una o unas pocas células. RESUMEN En este capítulo, hemos estudiado los pasos básicos comunes a la diferenciación de las varias células de los organismos multicelulares. Las células madre embrionarias iniciales son generalmente totipotentes, es decir, tienen la capacidad de transformarse en varios tipos de células especializadas del cuerpo. La fijación del destino de las células embrionarias es un proceso continuo que se inicia en el blastocisto e implica pasos secuenciales mediante las cuales, las células embrionarias adquieren la capacidad de tomar diferentes rutas de desarrollo. Durante la diferenciación, hay activación de ciertos genes e inactivación de otros genes. Los mecanismos de control génico se pueden clasificar en transcripcionales y post-transcripcionales. Estos eventos están regulados por la acción concertada de los factores intracelulares y extracelulares, los que a su vez están determinados por la comunicación célula – célula y célula – medio ambiente. La comunicación célula – célula (celular) puede ser mediada por mensajeros químicos producidos por otras células (hormonas, factores de crecimiento) o de la matriz extracelular del organismo en desarrollo.

Los factores de origen ambiental que afectan a la diferenciación pueden ser de naturaleza variada, entre las que se pueden mencionar a la acción de las drogas (incluyendo medicamentos y drogas ilegales), las radiaciones ionizantes (rayos X, la radiactividad, los rayos UV, etc.) y las infecciones virales. La diferenciación celular no se limita a los embriones y continúa en el organismo adulto. La maduración del tejido nervioso en los neonatos y la diferenciación de las células madre son ejemplos de eventos de diferenciación fuera del período de embriogénesis. El proceso de diferenciación se invierte durante el proceso de clonación y regeneración. Esta inversión requiere una desprogramación nuclear. Al lado de la proliferación y diferenciación celular, existe también la eliminación de las células que ya no son necesarias por el proceso de apoptosis. BIBLIOGRAFÍA

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

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Biología de la Interacción Célula – Matriz Extracelular ERRNVPHGLFRVRUJ

■ La matriz está compuesta principalmente por proteínas fibrosas (colágeno y elastina) incluidas en un gel hidrofílico de polisacáridos asociados o no a proteínas ■ Los glicosaminoglicanos y los proteoglicanos son familias de compuestos altamente hidrófilos con múltiples funciones ■ La fibronectina y la laminina son glicoproteínas alargadas, multiadhesivas y extracelulares que tienen regiones en sus moléculas que las unen a las células y a los componentes de la matriz ■ Las integrinas constituyen un complejo de receptores celulares que fijan las células a la matriz ■ La lámina basal juega un papel importante en la biología y la patología de los tejidos ■ Los componentes fibrilares y fibrosos (colágenos y elastina) de la matriz realizan diversas funciones en los tejidos ■ Resumen ■ Bibliografía

Guía ■ La matriz extracelular influye en la estructura interna y la actividad de las células ■ Las células interactúan constantemente con la matriz extracelular ■ La matriz es viscosa y se compone principalmente de colágeno, elastina, glicoproteínas, proteoglicanos y agua ■ La fibronectina y la laminina son glicoproteínas con regiones que se unen simultáneamente tanto a las células como a los componentes de la matriz ■ Los cambios postraduccionales y las mutaciones génicas pueden producir colágenos modificados, responsables de enfermedades ■ El proceso de degeneración de las fibras elásticas, que se produce con la edad es el principal responsable de la aparición de arrugas en la piel, que se intensifica por la luz solar excesiva

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os tejidos animales y vegetales no sólo están formados por células, sino que tienen un espacio extracelular a menudo rellenado por un complejo de componentes viscosos y componentes fibrosos: la matriz extracelular, de importancia fundamental para las funciones de los tejidos. El estudio de las interacciones de las células con la matriz extracelular es relativamente reciente y ha evolucionado muy rápidamente gracias al aislamiento de las macromoléculas de la matriz, y su localización por métodos inmunohistoquímicos y la caracterización de los receptores celulares para los componentes de la matriz, técnicas asociadas a menudo con el cultivo de células. Los primeros datos experimentales que permitieron caracterizar mejor esta interacción fueron obtenidos haciéndose cultivos de células en frascos previamente recubiertos con los componentes de la matriz. Esto se realizó inicialmente con colágeno, y posteriormente, con otros componentes aislados (fibronectinas, laminina, proteoglicanos), o con varias combinaciones de estas macromoléculas. Se encontró entonces que, en general, las células crecen más vigorosamente y asumen aspectos diferentes en la presencia de ciertos componentes de la matriz. Además, alteran su comportamiento en cuanto a la motilidad, la adherencia a los frascos, etc., mediante la modificación de la disposiciónintracelular de los componentes de su citoesqueleto, acorde a las macromoléculas de la matriz que recubren los frascos de cultivo. Se encontró también que los componentes de la matriz potencian sus efectos, existiendo en la actualidad en el comercio, mezclas de elementos de la matriz que hacen posible cultivar tipos de células que no crecían in vitro. El hallazgo de que las células cultivadas en presencia de la matriz mantienen más fácilmente las características fisiológicas y bioquímicas especializadas presentes in vivo en los órganos de origen fue muy importante. La ausencia de componentes de

la matriz extracelular en el medio de cultivo provoca una desdiferenciación de las células, que tienden a volver a un estado funcional no especializado. La matriz extracelular está formada por un complejo, en proporciones variables, de muchas proteínas y polisacáridos que se organizan formando una red, en gran parte responsable de la gran diversidad morfológica, funcional y patológica de los diversos tejidos. La cantidad de matriz depende del tipo de tejido, siendo especialmente abundante en los tejidos conectivos como el cartílago (Figura 12.1), tejido óseo y dermis (piel), y escaso en el tejido nervioso y en el epitelial. La matriz forma un sustrato que proporciona las condiciones adecuadas para el crecimiento y la diferenciación de las células de los diversos tejidos. Los tejidos vegetales también disponen de matriz extracelular, lo que será estudiado en el Capítulo 13. Las variaciones en la calidad y cantidad de las células y la matriz, así como el modo en que encajan entre sí, son responsables de la diversidad de los tejidos, como se demuestra mediante los siguientes ejemplos enumerados. La deposición de cristales de fosfato de calcio, explica por qué ciertos tejidos son duros, como en los huesos y los dientes, mientras que otros tienen un aspecto gelatinoso, o son rígidos, pero ceden a la presión, como el cartílago. Hay incluso tejidos tales como los tendones, en el que las fibras de colágeno de la matriz extracelular están dispuestas como cuerdas altamente resistentes a las tensiones. En la interfaz del tejido epitelial con el tejido conectivo, alrededor de las células musculares, de los capilares sanguíneos y capilares linfáticos, la matriz extracelular forma una capa delgada, la lámina basal, que es un enrejado de macromoléculas importantes para la función celular.

LA MATRIZ ESTÁ COMPUESTA PRINCIPALMENTE POR PROTEÍNAS FIBROSAS (COLÁGENO Y ELASTINA) INCLUIDAS EN UN GEL HIDROFÍLICO DE POLISACÁRIDOS ASOCIADOS O NO A PROTEÍNAS Los múltiples componentes de la matriz son secretados, principalmente, por células del tejido conectivo y se dividen en dos tipos:  aquellos constituidos por moléculas proteicas alargadas, que se agregan formando estructuras fibrilares o fibrosas, como el colágeno (Figura 12.1) y la elastina  los constituyentes que se agregan, pero no forman fibrillas o fibras, y que, a su vez, pueden tener dos subtipos: o glicoproteínas (Figura 12.2) alargadas, como la fibronectina y la laminina, cuya función principal es llevar a cabo la adhesión entre la matriz y las células o glicosaminoglicanos y proteoglicanos (Figura 12.2), que forman un gel hidratado en el que están inmersos los otros componentes de la matriz El colágeno y la elastina son responsables del andamiaje estructural y elástico de diversos tejidos. La fibronectina es responsable de la adhesión de las células no epiteliales a la matriz, y a la laminina, a su vez, es responsable de la adhesión de las células epiteliales a la lámina basal. Ya los glicosaminoglicanos y los proteoglicanos forman un gel hidrofílico, semilíquido, que permite la circulación de los nutrientes, hormonas, y otros mensajeros químicos en los tejidos conectivos. En los cartílagos, las moléculas de glicosaminoglicanos y proteoglicanos forman un complejo de puentes moleculares que unen las fibrillas de colágeno entre sí (Figura 12.1), dotando a este tejido con su importante característica de la rigidez y la discreta compresibilidad.

Figura 12.1 Representación esquemática de la organización molecular de la matriz del cartílago hialino. Las proteínas de unión se unen a la proteína central de los proteoglicanos y a las moléculas de ácido hialourónico (HA) por covalencia. Los grupos sulfato de condroitina del proteoglicano establecen los enlaces electrostáticos con las fibrillas de colágeno, lo que contribuye a la rigidez de la matriz. El otro dibujo es una ampliación del área delimitada, para mostrar mejor las interacciones de los diferentes tipos de moléculas encontradas en la matriz extracelular del cartílago hialino.

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Figura 12.2 Ilustración de la estructura molecular de los proteoglicanos (A) y de las glicoproteínas (B). Los proteoglicanos están constituidos por cadenas rectas de dímeros de glicosamina y ácido urónico (glicosaminoglicanos), que están incrustadas en una proteína alargada, adoptando el aspecto de "cepillo de botella", en el que el alambre central es la proteína y las cerdas son los glicosaminoglicanos. A su vez, las glicoproteínas se muestran constituidas por una proteína globular a la que se asocia una cadena ramificada formada por monosacáridos.

LOS GLICOSAMINOGLICANOS Y LOS PROTEOGLICANOS SON FAMILIAS DE COMPUESTOS ALTAMENTE HIDRÓFILOS CON MÚLTIPLES FUNCIONES Los glicosaminoglicanos son polímeros lineales (no ramificados) de disacáridos, uno de los cuales tiene siempre un radical amino, siendo el otro un ácido urónico. Son una familia compleja de la cual el ácido hialurónico, el sulfato de dermatán, el sulfato de condroitina y el sulfato de heparán, son los componentes principales. Presentan radicales carboxilo (del ácido urónico) y, con la excepción del ácido hialurónico, también radicales sulfato. Por lo tanto, son moléculas con carga negativa alta. Este escenario atrae a una nube de cationes (especialmente sodio), que es osmóticamente activa, atrayendo el agua, lo que explica la elevada hidrofilia de estos compuestos y la formación de un gel en la matriz extracelular. Se cree que este gel es importante en los procesos de desarrollo embrionario, regeneración de tejidos, cicatrización y la interacción con el colágeno. Se sabe, por ejemplo, que los grupos ácidos de estos compuestos interactúan con los radicales básicos de colágeno, contribuyendo a la firmeza (turgencia) de la matriz extracelular (Figura 12.1). La matriz extracelular es también importante en la enfermedad, ya que su viscosidad retarda la penetración del microorganismo en los tejidos. Las bacterias que producen enzimas capaces de digerir las macromoléculas de la matriz extracelular se infiltran más fácilmente en los tejidos. Este es el caso de los estafilococos, que secretan hialuronidasa, y del Clostridium (responsable de la gangrena), que segrega colagenasa. Con la excepción del ácido hialurónico, los otros glicosaminoglicanos mencionados están unidos covalentemente a cadenas proteicas, formando los proteoglicanos (Figura 12.2). LA FIBRONECTINA Y LA LAMININA SON GLICOPROTEÍNAS ALARGADAS, MULTIADHESIVAS Y EXTRACELULARES QUE TIENEN REGIONES EN SUS MOLÉCULAS QUE LAS UNEN A LAS CÉLULAS Y A LOS COMPONENTES DE LA MATRIZ Se denomina fibronectina a urna familia de glicoproteínas que contienen sitios de adhesión a las células, a otras moléculas de fibronectina y a componentes fibrosos de la matriz (Figura 12.3). Por lo tanto, sirven como puentes entre las células y la matriz extracelular. Se derivan de un único gen cuyo ARN premensajero (pre-ARNm) es procesado de diferentes maneras, generando más de 20 ARNm diferentes. La fibronectina es no sólo responsable de la unión célula-matriz extracelular, sino que también es importante en el desarrollo embrionario. Por ejemplo, durante la gastrulación de los anfibios, la fibronectina guía la migración de las células que originarán el mesodermo. La laminina es urna molécula formada por tres polipétidos, en forma de cruz, que también tiene partes que se unen al colágeno de tipo IV, al sulfato de heparán y a los receptores celulares de laminina, formando así puentes que conectan las células a la matriz (Figura 12.4). Como el colágeno IV y el heparán sulfato son los componentes principales de las láminas basales (véase más adelante), la laminina sirve como un puente de unión entre las células y esas láminas. LAS INTEGRINAS CONSTITUYEN UN COMPLEJO DE RECEPTORES CELULARES QUE FIJAN LAS CÉLULAS A LA MATRIZ Las células tienen una familia de receptores, situados en la membrana plasmática, que se unen a varios componentes de la matriz, entre los

cuales están el colágeno y la laminina. Cada uno de estos receptores se compone de dos moléculas de glicoproteínas alargadas que reciben el nombre genérico de integrinas. Las integrinas son proteínas de transmembrana, con un extremo exterior que se une a los componentes de la matriz y un extremo citoplásmico que se une, a través de la proteína talina, a la porción del citoesqueleto formada por actina (Figura 12.5). De este modo se establece la comunicación de la matriz extracelular con el citoplasma a través de la membrana plasmática, explicando la acción que la matriz ejerce sobre el citoesqueleto (Figuras 12.6 y 12.7). También hay integrinas en las plaquetas de la sangre, que son corpúsculos circulantes muy importantes en el proceso de la hemostasia, que tiene como objetivo prevenir la hemorragia (salida de sangre de los vasos). La hemostasia depende de la contracción de la pared vascular y de la coagulación localizada de la sangre. Dentro del vaso sanguíneo dañado, las plaquetas liberan moléculas que promueven la coagulación intravascular. A menudo, las plaquetas salen de los vasos por la ruptura de la pared vascular. Cuando esto sucede, ellas se unen a la fibronectina de la matriz extracelular y al fibrinógeno (proteína del plasma sanguíneo) por medio de las integrinas de sus membranas. Debido a esta asociación entre las plaquetas, fibrinógeno y fibronectina, los coágulos se fijan a la matriz, un proceso importante en el control de la hemorragia. En los seres humanos, se ha observado la ausencia de ciertas integrinas, debido a la mutación genética, lo que conduce a ciertas enfermedades. Por ejemplo, en la enfermedad de Glanzmann, la ausencia del receptor celular para el fibrinógeno conduce a hemorragias frecuentes. La enfermedad llamada deficiencia del factor de adhesión de los leucocitos es causada por la ausencia de una de las cadenas polipeptídicas de la integrina de los leucocitos, dando lugar a infecciones bacterianas recurrentes. El defecto en la integrina de los leucocitos dificulta la adherencia temporal de estas células defensivas a la pared vascular, impidiendo su capacidad de migrar por diapédesis a los sitios de infección y fagocitar a los microorganismos invasores.

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Figura 12.3 Figura 12.4 Figura 12.3 Diagrama que ilustra la estructura de la molécula de fibronectina dimérica, formada por dos cadenas polipeptídicas unidas por grupos S-S. Cada cadena se presenta constituida por porciones enrolladas (que se muestran como rectángulos) y por segmentos polipeptídicos flexibles que se alternan con las partes enrolladas. Cada parte enrollada está especializada en la a adhesión a ciertas macromoléculas situadas en la superficie de las células o en la matriz extracelular. (Reproducido con permiso, de Junqueira LC, Carneiro J: Histología Básica, 10 ed Editorial G-K, Río de Janeiro, 2004). Figura 12.4 Dibujo esquemático de la molécula de laminina, en forma de cruz, constituida por tres polipéptidos unidos entre sí por grupos S-S (no mostrados). Están indicadas las regiones de la molécula de laminina que se adhieren a las células y a las macromoléculas de la matriz extracelular.

Figura 12.5 Dibujo esquemático del receptor de fibronectina (una integrina), demostrando que es una proteína transmembrana que se une a la fibronectina en la región extracelular y, en el citoplasma, a través de la talina, se adhiere a la actina. La mutación genética que conduce a la ausencia de la cadena polipeptídica beta es responsable de la deficiencia del factor de adhesión de los leucocitos, dando lugar a infecciones recurrentes en los pacientes que tienen este defecto genético. La susceptibilidad a las infecciones es una consecuencia de la incapacidad de los leucocitos, células de defensa, de trasladarse, ya que sus movimientos dependen de enlaces temporales con macromoléculas del endotelio y de la matriz extracelular del tejido conectivo.

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Figura 12.6 Dibujo esquemático que muestra la inserción de los filamentos del citoesqueleto en receptores de la membrana que, a su vez, interactúan con las células adyacentes (no mostradas en el dibujo) y con las macromoléculas de la matriz extracelular. Así que hay una continuidad entre las moléculas intracelulares y las moléculas extracelulares, formando fibronexos (fibronexus). Tenga en cuenta que los puentes (alfa-actinina) entre las fibrillas de actina adyacentes crean un conjunto de moléculas de actina en contacto con un área considerable de la membrana plasmática, lo que genera las fuerzas suficientes para promover la adhesión de las células entre sí y con la matriz extracelular.

Figura 12.7 Este dibujo es una ampliación de una parte de la Figura 12.6, para mostrar los componentes del fibronexo. El filamento de actina se une a las proteínas talina y vinculina. La talina se une a una integrina de la membrana celular, que se fija a la fibronectina de la matriz extracelular. La molécula de alfa-actinina une a los filamentos de actina entre sí, creando un estructura molecular más firme.

LA LÁMINA BASAL JUEGA UN PAPEL IMPORTANTE EN LA BIOLOGÍA Y LA PATOLOGÍA DE LOS TEJIDOS La lámina basal (Figuras 12.8, 12.9 y 12.10) es un entramado de moléculas de colágeno tipo IV incluido en varias proteínas, de las cuales las más importantes son la laminina y el proteoglicano de sulfato de dermatán. Las moléculas de colágeno en las láminas basales no se disponen paralelamente en fibrillas, asociándose, sin embargo, con el aspecto de un alambre tejido de gallinero, con laminina y proteoglicanos entre sus mallas. Esta estructura forma, como una malla filtrante de carga aniónica, debido a que contiene sulfato de dermatán. Sirve, por tanto, de filtro aniónico, una característica importante para la filtración

del plasma sanguíneo y la formación de orina en los riñones. En el pulmón, la lámina basal protege este órgano contra la penetración de material transportado por el aire inhalado en los tejidos. Los componentes de la lámina basal son producidos por las células epiteliales, células endoteliales y musculares, y no por las células del tejido conectivo. Para propagarse en el cuerpo, las células de los tumores malignos de origen epitelial deben atravesar las láminas basales de los epitelios y las láminas basales de los capilares, para entrar en la corriente sanguínea o en la linfática. Una vez más cruzan la lámina basal, para salir en la dirección opuesta y formar colonias de células malignas o metástasis (del griego, meta, lejos, y stasis, detener) en varios órganos. Los mecanismos por los cuales las células inmunes, tales como los leucocitos, se adhieren al endotelio, atraviesan los capilares y se desplazan en los tejidos son de gran importancia para la comprensión de los procesos inflamatorios. Estos movimientos dependen, principalmente, de los receptores que permiten el reconocimiento entre las células y de la presencia de sustancias quimicas que atraen a las células a la proximidad de los agresores, fenómeno llamado quimiotaxis.

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Figura 12.8 Dibujo esquemático que ilustra la presencia de la lámina basal que separa el epitelio del tejido conectivo subyacente. Las células musculares y los capilares sanguíneos y linfáticos también son separados del tejido conectivo a través de las láminas basales.

Figura 12.9 Micrografía del epitelio estratificado mostrando la lámina basal que lo separa del tejido conectivo subyacente.

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Figura 12.10 Micrografía electrónica de la interfaz de una célula epitelial de la piel con el tejido conectivo subyacente. Entre estas dos estructuras, se muestra la lámina basal. Observe los hemidesmosomas que se adhieren a la lámina basal a través de filamentos intermedios.

LOS COMPONENTES FIBRILARES Y FIBROSOS (COLÁGENOS Y ELASTINA) DE LA MATRIZ REALIZAN DIVERSAS FUNCIONES EN LOS TEJIDOS El colágeno constituye una familia de proteínas alargadas de las cuales cuatro son las más conocidas; son proteínas características de los metazoos, que aparecieron y se diversificaron precozmente durante la evolución, hasta el punto de que ya hay tres tipos diferentes en los espongiarios. Se admite que los colágenos se desarrollan a partir de una proteína inicial, que se fue diversificando, asumiendo estructuras, funciones y reacciones diferentes, de acuerdo a las necesidades de cada tejido. Es la proteína más abundante en el cuerpo humano, en el que constituye el 25% de la proteína total del cuerpo. En este capítulo, se analizan brevemente las características de los cuatro tipos más conocidos, que fueron etiquetados de I a IV. Las moléculas de colágeno se componen de tres polipéptidos dispuestos en triple hélice (Figura 12.11) de aproximadamente 1.000 aminoácidos cada polipéptido. Estas triples hélices, pueden asociarse, para formar estructuras con grados crecientes de polimerización. Por lo tanto, es que en el colágeno de tipo IV, las moléculas se asocian por los extremos, formando una red con aspecto de alambre tejido de gallinero. En colágenos tipos I, II y III, las moléculas se asocian en paralelo, formando fibrillas visibles sólo al microscopio electrónico, con un diámetro que oscila entre 20 y 300 nm. En el colágeno tipo II, la polimerización se estaciona en la fase de fibrillas, como se observa en los cartílagos. En los colágenos tipos I y III, el proceso de polimerización se acentúa, y en el colágeno tipo III, estas fibrillas se agrupan, formando delgadas fibras llamadas fibras reticulares del conectivo, visibles bajo un microscopio óptico con 1 a 4 μm de diámetro. En el colágeno tipo I, el proceso va más allá y las fibras son más gruesas y con frecuencia se asocian para formar haces de fibras con un máximo de 20 μm de diámetro, constituyendo lo que se denomina fibras de colágeno del tejido conectivo (Figura 12.12). El colágeno de tipo II es característico del cartílago y se asocia estrechamente con proteoglicanos que contienen sulfato de condroitina, que le confieren una característica de compresibilidad reversible debido a la alta hidrofilicidad de los pro-teoglicanos. Funciona, más o menos, como una esponja que pierde agua cuando se comprime y se embebe de nuevo en agua volviendo a la forma original, cuando se elimina la presión. Por lo tanto, hace el papel de un resorte de naturaleza fisicoquímica, característica importante para los cartílagos de las articulaciones bajo presión. El colágeno tipo III se encuentra en los tejidos que cambian su volumen y su forma con frecuencia, como en las arterias, en los músculos lisos del tracto digestivo, en el útero, etc. En este tipo de colágeno se producen, a menudo, puentes de proteoglicanos entre las fibrillas de colágeno, otorgando a las fibras reticulares características de una elasticidad limitada, pero importante para estos órganos. El colágeno de tipo I presente en la dermis, huesos y tendones, tiene múltiples y fuertes enlaces covalentes entre sus fibrillas. Estos enlaces cruzados llegan a su nivel más alto en los tendones. El colágeno tipo I está

particularmente bien adaptado para soportar las tensiones. La Tabla 12.1 muestra las principales características de estos cuatro tipos de colágeno. Los colágenos son proteínas que experimentan numerosos cambios posteriores a la traducción (post-traduccionales), que se producen principalmente en el interior de las cisternas del retículo endoplásmico rugoso, y también, en el medio extracelular. En consecuencia, su síntesis es más compleja que la mayoría de las proteínas, lo que explica el gran número de enfermedades que resultan de una síntesis defectuosa del colágeno. Muchas de las enfermedades del colágeno son debido a las alteraciones genéticas y provocan debilitamiento de los tendones, los ligamentos y la piel. Estos síntomas pueden ser causados por diversas alteraciones en la síntesis de colágeno y se han agrupado en los síndromes de Ehlers-Danlos, de los cuales hay ocho formas clínicas conocidas (síndrome es un estado de enfermedad que se caracteriza por un conjunto de síntomas). Generalmente, los contorsionistas de circo son portadores del síndrome de Ehlers-Danlos. El debilitamiento del colágeno de los vasos sanguíneos y de los ligamentos dentales causan hemorragias frecuentes y la caída de los dientes, los síntomas característicos del escorbuto, una enfermedad causada por la deficiencia de vitamina C, un cofactor esencial para la síntesis de colágeno. Las fibras elásticas son abundantes en estructuras tales como la piel, arterias y los pulmones, lo que proporciona elasticidad a estos órganos. Las fibras elásticas presentan la capacidad de distensión cuando son tensadas, volviendo inmediatamente después a su longitud normal, cuando se interrumpe la fuerza de tracción. La elasticidad de las fibras elásticas es por lo menos cinco veces mayor que la de un filamento de caucho del mismo diámetro. Están constituidas principalmente por una glicoproteína (elastina) altamente hidrofóbica cuyas moléculas, parcialmente enrolladas, están unidas entre sí por enlaces covalentes entre sus extremos (Figura 12.13). La elastina se agrega formando fibras, que se anastomosan para formar una red (Figura 12.14), tales como en la piel y en el pulmón. En la pared de las grandes arterias, la elastina se dispone en laminillas paralelas unas con otras. Al lado de la elastina, que aparece amorfa en las micrografías electrónicas, las fibras elásticas todavía presentan una cantidad variable de microfibrillas compuestas por varias glicoproteínas tales como la fibrilina, una glicoproteína de alto peso molecular. La mutación en el gen que codifica a la fibrilina, localizado en el cromosoma 15, causa el síndrome de Marfan, caracterizado por la hiperextensibilidad de las articulaciones, el desplazamiento del cristalino del globo ocular con deficiencia visual y la dilatación de la aorta. La dilatación y el debilitamiento de la pared de la aorta pueden conducir a la ruptura de este vaso sanguíneo y a una hemorragia muy grave. Las fibras elásticas de la piel tienden a degenerar con la edad, siendo en parte responsable de las arrugas, un proceso muy acelerado por la exposición excesiva a la luz solar.

Figura 12.11 Ilustración de la constitución de la molécula de colágeno formada por tres cadenas polipeptídicas enrolladas en espiral.

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Figura 12.12 Dibujo esquemático del proceso de polimerización gradual del colágeno en las fibras de colágeno, constituidas por colágeno de tipo I. Las moléculas de colágeno se asocian en paralelo, formando fibrillas que aparecen con estrías transversales al microscopio electrónico. Numerosas fibrillas se agrupan formando una fibra, y varias fibras forman un haz. Las moléculas de colágeno tipo IV no se asocian en paralelo. El colágeno de tipo II solamente forma fibrillas. En el colágeno de tipo III, las fibrillas se asocian para formar fibras. El colágeno de tipo I es el único que produce fibras y haces de fibras.

Tabla 12.1 Características de los cuatro tipos principales de colágeno Tipo Distribución Células productoras Dermis, tendón, hueso, pigmentos I Fibroblastos (fibras de colágeno)

Grado de polimerización Máximo - fibras y haz de fibras

II

Cartílagos

Condrocitos

Pequeño - sólo forman fibrillas

III

Músculo liso, órgano hematopoyético, nervios (fibras reticulares)

Músculo liso, células reticulares

Medio - sólo forman fibras delgadas

IV

Láminas basales

Células epiteliales, endoteliales, musculares

Ninguno - las moléculas se asocian para formar una malla de soporte submicroscópica

Función Resistir la tensión Resistir la presión Resistir la tensión Soporte, filtración, barrera

Figura 12.13 Diseño del modelo más aceptado para explicar la elasticidad de las fibras elásticas. Las moléculas de elastina, parcialmente enrolladas, están unidas entre sí por enlaces covalentes entre sus extremos. Cuando se estiran las fibras, las moléculas de elastina se desenrollan, volviendo a la posición inicial una vez terminada la fuerza ejercida.

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Figura 12.14 Microfotografías que muestran fibras colágenas y fibras elásticas. En la fotomicrografía de la izquierda, se observa que las fibras elásticas son delgadas, regulares y se anastomosan, mientras que las colágenas son irregulares y no se anastomosan. La microfotografía de la derecha, hecha con microscopía de polarización, muestra las fibras de colágeno claras, contra un fondo oscuro. Esto es debido a la birrefringencia de las fibras de colágeno, consecuencia de la orientación paralela de las moléculas de colágeno, que desvían el plano de luz polarizada. Aumento de 300x.

RESUMEN Los tejidos animales y vegetales están formados por células y por material extracelular producido por las células. Este mate-rial se llama matriz extracelular. Por medio de moléculas proteicas integrales de la membrana plasmática, se establece la continuidad entre el interior de la célula y la matriz extracelular. Las moléculas del citoesqueleto se enlazan a las proteínas de membrana, que son receptores de macromoléculas de la matriz extracelular, estableciendo un vínculo entre el citoesqueleto y la matriz extracelular. Un componente importante de la matriz es la lámina basal que está dispuesta entre los tejidos epiteliales, células musculares, capilares sanguíneos y linfáticos, y el tejido conectivo. La matriz tiene un significado funcional muy amplio en los tejidos, participando en el mantenimiento de la estructura, del desarrollo embrionario y postnatal, de la proliferación celular, de la regeneración, de la nutrición y de los procesos patológicos. Los componentes fibrilares de la matriz son los diversos tipos de colágeno y las fibras elásticas. Los principales componentes no fibrilares son glicoproteínas multiadhesivas como la fibronectina y la laminina, y los glicosaminoglicanos, que generalmente están asociados con proteínas, formando los proteoglicanos.

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1 | Introdução: Visão Panorâmicasobre a Estrutura, as Funções ea Evolução das Células

Célula Vegetal

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Celia Guadalupe T.J. Andrade Berenice Quinzani Jordão

ERRNVPHGLFRVRUJ ■ La pared de las células vegetales es un tipo de matriz extracelular rígida ■ Composición química: La pared celular está constituida por fibrillas de celulosa incluidas en una matriz de otros componentes ■ Estructura de la pared celular ■ Origen y crecimiento de la pared celular ■ Las células vegetales también se interconectan y se comunican como ocurre con las células animales ■ Las células vegetales tienen vacuolas con sus propias características, diferentes de las pequeñas vacuolas de las células animales ■ Citoesqueleto: Importancia en las actividades de las células vegetales ■ Los plastos, de los cuales los más importantes son los cloroplastos, son estructuras características de las células vegetales ■ El origen evolutivo de los cloroplastos y de las mitocondrias parece haber ocurrido por los acontecimientos simbióticos independientes ■ Estructura y composición química de los cloroplastos ■ Visión general de la fotosíntesis ■ ¿Cómo funcionan los fotosistemas en la fotosíntesis? ■ Productos de la fotosíntesis ■ Fijación del C02 a través de la vía C4 ■ El metabolismo ácido de las Crasuláceas - plantas MAC ■ Fotorrespiración ■ Sistema genético de los plástidos ■ Los peroxisomas y los glioxisomas

■ ■ ■

Biotecnología vegetal Resumen Bibliografía

Guía ■ Junto con las vacuolas y una pared rígida, los plástidos son componentes típicos de las células vegetales ■ Todas las células vegetales tienen una pared celular primaria, y varias tienen una pared secundaria. La celulosa es el componente principal de la pared ■ Las células vegetales presentan una vacuola que ocupa de 5 a 95% del volumen celular ■ La vacuola tiene un papel importante en el crecimiento y en el mantenimiento de la turgencia celular; también participa activamente en la degradación macromolecular y sirve de depósito de sustancias ■ El citoesqueleto de las células vegetales está compuesto por microtúbulos y filamentos de actina, determinantes en el crecimiento celular y en la generación de corriente citoplasmática ■ Los plastidios, que sólo existen en las células vegetales, son de diferentes tipos y cuentan con genoma propio como las mitocondrias ■ Los cloroplastos realizan la fotosíntesis ■ Hay plantas que fijan C02 en compuestos de 3 carbonos y otras que lo fijan en compuestos de 4 carbonos: son las plantas C3 y C4 ■ La fotorrespiración es un proceso que implica intercambios gaseosos en la presencia de luz, típicos de las plantas C3 ■ Los peroxisomas participan de la fotorrespiración en las hojas, y los glioxisomas, en la transformación de los lípidos en carbohidratos, en las semillas oleaginosas ■ Técnicas como la fusión de protoplastos, el cultivo celular y la creación de plantas transgénicas se utilizan en la biotecnología vegetal

L

as células vegetales se asemejan a las animales en muchos aspectos de su morfología, como la estructura molecular de tales membranas y diversos orgánulos. También son similares en varios mecanismos moleculares básicos, tales como la replicación del ADN y su transcripción en ARN, la síntesis proteica y la transformación de energía a través de las mitocondrias. Se diferencian, sin embargo, en algunas características morfológicas y fisiológicas importantes. Junto con la presencia de una pared celular rígida y el desarrollo de una gran vacuola utilizada para diversos fines, los plástidos son componentes característicos de las células vegetales (figuras 13.1 y 13.2). Les confieren a estas células la capacidad de sintetizar compuestos orgánicos, utilizando C02 y la energía de la luz solar, a través de un proceso complejo llamado fotosíntesis. También hay diferencias importantes entre las células vegetales y las animales sobre la organización del ADN y la estructura y la expresión de la cromatina y los cromosomas; Sin embargo, estas diferencias son de interés más específico del área de citogenética vegetal, un tema que escapa al alcance de este libro. LA PARED DE LAS CÉLULAS VEGETALES ES UN TIPO DE MATRIZ EXTRACELULAR RÍGIDA La presencia de una pared celular rica en polisacáridos siempre se ha relacionado con una característica que, por encima de todas los demás, distingue a las células vegetales de las células animales. Se considera, no obstante, que, así como los vegetales, los tejidos animales también tienen una cubierta formada por una gran proporción de hidratos de carbono; en ambos casos, se trata de la llamada matriz extracelular. Especialmente en las plantas, es secretada como una capa organizada que constituye a menudo, una estructura gruesa, rígida y fuerte, muy compleja y, al mismo tiempo, dinámica a lo largo de la transición de la fase juvenil a la fase adulta de la planta. La pared celular impide la movilidad de las células, participa en la adhesión, de la aglutinación celular, de la interacción con las células vecinas e influye en el crecimiento, la nutrición, la reproducción y la defensa. Ella reúne propiedades mecánicas que le permiten soportar tanto las fuerzas de tensión y de compresión, así como la regulación del crecimiento celular y la adhesión. Además, la pared ayuda en el mantenimiento de la integridad osmótica de la célula, que la protege contra los efectos de la baja presión osmótica externa, ya que, en las plantas, el líquido extracelular es hipotónico, a diferencia de lo que ocurre en los animales, en el que las células están inmersas en un medio isotónico. A menudo, se forma en una barrera protectora contra las lesiones y las infecciones, para impermeabilizar la superficie de las hojas y los frutos, evitando el ataque de los organismos patógenos. Por ser rígido y fuerte, la pared celular asegura el apoyo, que actúa como esqueleto de la planta. Ella determina el tamaño celular y la forma de la propia planta. Las paredes celulares también tienen una gran importancia económica, ya que constituyen una fuente importante de alimentos, combustible, madera, papel, fibras textiles y materias primas de otros productos industriales, tales como adhesivos, espesantes industriales y aditivos alimenticios; en una perspectiva de futuro, se espera que se convierta en una fuente para biocombustibles. En las plantas, hay dos tipos de pared: la pared celular primaria y la pared celular secundaria. La primaria es la primera que se desarrolla en una célula joven (Figura 13.3) y es la única que está presente en la mayoría de las células, tales como las células que se están dividiendo activamen-

te, o en las células maduras involucradas en los procesos metabólicos tales como la fotosíntesis, la respiración y la secreción; éstas son las células vivas. La pared secundaria es secretada por las células que requieren resistencia y refuerzo estructural y, en general, después de su deposición, la célula deja de crecer y muere. Esta se forma en la superficie interna de la pared primaria durante la diferenciación del xilema, el floema y de las células especializadas en la función de sostén. Las paredes se originan al final de cada división celular, generalmente en tejidos especializados en la proliferación celular, llamadas meristemos. Las células recién formadas son pequeñas en comparación con el tamaño que asumen cuando están completamente desarrolladas. Sus paredes deben permitir el crecimiento celular, por lo que tienen que ser delgadas y semi-rígidas (Figura 13.3A). Inicialmente, se forman exclusivamente por una capa muy delgada, transparente y permeable, llamada la laminilla media, que está compuesta por un tipo especial de polisacárido (pectina) de naturaleza cementosa y gelatinosa. Después de que se completó la citocinesis, las microfibrillas de celulosa se entrelazan alrededor de las células hijas recién formadas, contribuyendo a la formación de sus paredes primarias (Figura 13.3B). Otra etapa de desarrollo de la pared se produce con el crecimiento celular y consiste en aumentar el espesor y la superficie de la pared primaria, mediante la adición de polímeros no celulósicos y de otros compuestos sintetizados y secretados por sus propias células adyacentes. Esta elongación celular debe ser coordinada entre las células vecinas para evitar qaue la pared se doble o se rompa. Esto se logra con la deposición de nuevos materiales en las paredes laterales que son paralelas al eje de crecimiento, y no en las paredes que bordean los tejidos. Después de finalizado el crecimiento celular, la pared ya no necesita ampliarse, ocurriendo, entonces, en algunas células, la formación de la pared secundaria. Se produce mediante un simple engrosamiento de la pared primaria o, en la mayoría de los casos, aparece como una nueva pared, que se forma por la deposición de capas adicionales y de composición química diferente, entre la pared primaria y la membrana plasmática. Estos tres componentes de las paredes celulares, la lámina media, pared primaria y la pared secundaria, sin embargo, son difícilmente distinguibles como capas separadas, en las observaciones realizadas con el microscopio óptico. A través de la interacción de las paredes celulares es la forma en que los tejidos vegetales están organizados. Esta interacción no es completa. Excepto por el tejido meristemático, en los tejidos restantes es común la presencia de espacios intercelulares bien desarrollados con funciones importantes, como el tejido reserva de aire, aerénquima, encontrado en las hojas flotantes y en los órganos sumergidos de las plantas acuáticas. Estos espacios intercelulares se pueden desarrollar por la separación de las paredes primarias, por la división de la laminilla media. La división comienza en las esquinas, donde se conectan más de dos células (Figuras 13.1 y 13.3), siguiendo con otras áreas de la pared; aquellos que se forma así son llamados esquizógenos. Ejemplos muy comunes de espacios intercelulares con este origen son los denominados meatos y los canales resiníferos de los pinos. Un segundo tipo de espacio intercelular es el lisígeno, cuando las células enteras se destruyen durante su formación. A este tipo pertenecen las cavidades o los canales secretores, presentes en las hojas del naranjo y del eucalipto.

Figura 13.1 Representación de la estructura de una célula vegetal, caracterizada por la presencia de la pared celular con los plasmodesmos, los cloroplastos y la vacuola, única o múltiple, que puede ocupar hasta el 95% del volumen citoplasmático.

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Figura 13.2 Micrografía electrónica de corte de la hoja de chayotera (Sechium edule L). Observar los núcleos, nucléolo, cloroplastos, vacuolas, mitocondrias y pared celular. 7.000X. (Cortesía de E. W. Kitajima.)

COMPOSICIÓN QUÍMICA: LA PARED CELULAR ESTÁ CONSTITUIDA POR FIBRILLAS DE CELULOSA INCLUIDAS EN UNA MATRIZ DE OTROS COMPONENTES La composición de las paredes varía considerablemente de una célula a otra, de un organismo a otro y de una especie a otra; sin embargo, están compuestas esencialmente de polisacáridos y proteínas. Los componentes más abundantes en todas las paredes celulares son los polisacáridos estructurales, formados por cadenas largas de azúcares, de alto peso molecular, unidos entre sí por ambos tanto por enlaces iónicos como por enlaces covalentes, que resisten la penetración física. Los tipos más comunes de polisacáridos son tres: celulosa, el principal componente, y los polisacáridos no celulósicos hemicelulosas y pectinas o compuestos pécticos. También la calosa, otro tipo de polisacárido, puede estar presente. En la mayoría de las células, esta se sintetiza sólo en respuesta a una lesión, y, en unas pocas células, se deposita en etapas específicas del desarrollo, como ocurre en el crecimiento del tubo polínico, en la formación de la tétrada del gametofito masculino (Figura 13.4), en el floema durante el invierno y en la pared inicial en formación durante la citocinesis. En las paredes celulares, las proteínas estructurales forman el segundo com-

ponente más importante. Las paredes aún contienen minerales y, en las últimas etapas de su desarrollo, pueden tener grandes cantidades de lignina. Las células que recubren los órganos aéreos también pueden tener compuestos lipídicos, tales como ceras, cutina y suberina. Por lo tanto, los componentes son variables en tipo y proporción, no sólo con la fase de crecimiento de la planta sino también con el tejido u órgano examinado. En general, mientras que la laminilla media es predominantemente rica en pectinas, la pared primaria se compone de aproximadamente 90% de polisacáridos de los cuales alrededor de 20 a 40% están representados por la celulosa, 15 a 25% por hemicelulosas y 30 % por pectina, y aproximadamente 10% de proteínas estructurales y enzimáticas, y el contenido sustancial de agua. Puesto que la pared secundaria es relativamente rica en celulosa, que constituye de 60 a 98% de su masa, y hemicelulosas, en ella no existen, o son bajos, los porcentajes de pectinas y proteínas. La lignina, presente en el 15 a 35% de su peso en seco, probablemente ocupa gran parte del espacio inicialmente ocupado por el agua, convirtiendo el estado de la matriz de un gel viscoso en un cemento relativamente rígido, no elástico.

Figura 13.3 Micrografía electrónica de un corte de antera de Rhynchospora pubera, mostrando células madre del polen (célula joven), rodeada por la pared celular, que se muestra en B, en detalle, donde se ve la pared primaria de dos células contiguas y la laminilla media entre ellas. A. 5.800x; B. 135.000x. (Cortesía de J. A. B. San Martín.)

Figura 13.4 Micrografía electrónica de un corte de antera de Rhynchospora pubera, mostrando células de meiocito, delimitadas por una pared celular de calosa. 37.000x. (Cortesía de J. A. B. San Martín.)

Celulosa

En las plantas, es el más abundante polisacárido estructural y, por lo tanto, el más abundante y útil biopolímero del mundo. Se compone de cadenas de unidades repetidas (monómeros) de D-glucosa (cuya fórmula es C6H1205), unidas covalentemente por el oxígeno entre el carbono número 1 de una glucosa y el carbono número 4 de la siguiente glucosa [enlaces β (1 → 4)], generando un polímero no ramificado lineal y que tiene una fuerte tendencia a la auto-asociación (Figura 13.5 A). (Beta – β – se refiere

a un monómero cuyo grupo hidroxilo en el carbono número 1 apunta hacia arriba. Cuando este apunta hacia abajo, se tiene una configuración alfa – ). Cada glucosa sufre un giro de 180° en relación con el monómero anterior, lo que favorece la formación de un gran número de puentes de

hidrógeno tanto inter como intracadenas, que se disponen paralelas entre sí (Figura 13.6). Esta disposición molecular rígida le confiere a la cadena de celulosa una alta insolubilidad en agua y una alta resistencia a fuerzas de tracción. Este polímero tiene una resistencia a la tracción aproximadamente igual a una fibra de acero del mismo diámetro. El número de unidades de glucosa en cada cadena puede variar de aproximadamente 8.000 en la pared primaria, hasta 14.000 a 15.000 en la pared secundaria. La interacción típica de aproximadamente 36 de estas cadenas por medio de puentes de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals genera estructuras cristalinas muy organizadas y fuertes llamadas microfibrillas, las que individualmente miden aproximadamente de 3 a 5 nm de diámetro y muchos micrómetros de longitud (estas son lo suficientemente largas como para envolver

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una célula muchas veces). La disposición en paralelo de estas moléculas refuerza la idea de que las cadenas de una microfibrilla son realizadas simultáneamente. El nivel de agregación, sin embargo, puede ser aún mayor, una vez que cerca de 250 microfibrillas se interconectan para formar fibrillas de celulosa y, por último, alrededor de 1500 fibrillas también pueden ser enrolladas juntas como alambres dentro de un cable, formando una fibra de celulosa. Cada fibra mide aproximadamente 0,5 mm de diámetro y puede alcanzar los 5 mm de longitud. Dentro de las propias microfibrillas, hay pequeños grupos de moléculas de celulosa altamente ordenadas, generando regiones cristalinas llamadas micelas,

principalmente responsables de la birrefringencia positiva de la pared. Los espacios entre las moléculas dispuestas con menos regularidad en las microfibrillas y entre las capas de microfibrillas están rellenados con los compuestos altamente hidrófilos de la matriz (pectinas, proteínas y hemicelulosas), que forman una red tridimensional hidrófila, responsable de la permeabilidad de la pared celular y que permite, en mayor o menor medida, el intercambio de nutrientes, de catabolitos y de señales químicas entre las células y el medio extracelular (Figura 13.6). En la pared secundaria, estos espacios también están llenos de componentes no polisacáridos.

Figura 13.5 Polisacáridos que constituyen la pared celular. A. Fragmento de la molécula de celulosa compuesto enteramente de monómeros de β-glucosa, representados por estructuras en forma de anillo, unidos por enlaces 1 → 4. Tenga en cuenta que los residuos adyacentes tienen orientaciones opuestas, invirtiéndose, alternativamente para mantener La linealidad del polímero. B. Molécula de xiloglucano, un ejemplo de hemicelulosa. C. Ramnogalacturonano, cuya estructura representa una molécula de pectina ácida. D. Pectina neutra ejemplificada por una molécula de arabinogalactano. En estas cadenas, los residuos de azúcares están representados por las siguientes letras: G: glucosa; X: xilosa; GL: galactosa, F: fucosa; A: arabinosa, U: ácido galacturónico; R: ramnosa. Observe que se muestran las uniones que se establecen entre cada una de esas cadenas de polisacáridos y los demás polisacáridos de la pared.

Hemicelulosas

La hemicelulosa pertenece a una clase de polímeros de pentosas extremadamente heterogénea, compuestos por diferentes tipos de monómeros además de la glucosa, cuyas cadenas están ramificadas con cadenas laterales cortas. Las hemicelulosas se clasifican según el tipo de azúcares que las componen. La clase más abundante de hemicelulosas presente en las paredes celulares primarias de la mayoría de las especies, mono y dicotiledóneas, consiste en xiloglicanos (Figura 13.5B). Estos polisacáridos tienen una cadena principal compuesta de glucosas unidas por enlaces β (1→ 4), regularmente ramificada con unidades de D-xilosa. También pueden contener otro tipo de ramificación, más larga, en la que se unen una galactosa y una fucosa a la xilosa. Esta estructura varía entre las especies. Otras categorías de hemicelulosas incluyen, por ejemplo, los xilanos, cuyo nombre está relacionado con su esqueleto de xilosas, y los glucomananos, que como su nombre indica, se componen principalmente de glucosa y manosa. En las gramíneas, en las que las hemicelulosas son frecuentes, los xiloglucanos son sustituidos por los glucuronoarabinoxilanos (que contienen principalmente xilosa, con cantidades más pequeñas de arabinosa, galactosa y ácido urónico). Entre las hemicelulosas, también se encuentran otros polímeros compuestos enteramente de residuos de glucosa, con enlaces glicosídicos no sólo del tipo β (1→ 4), sino también del tipo β (1→ 3); uno de estos beta-glucanos es la calosa. Sin embargo, las hemicelulosas no están compuestas exclusivamente por azúcares; también presentan grupos metilo y acetilo en su estructura. Las moléculas de hemicelulosa siempre tienen alguna característica estructural que les impide formar agregados, pero todas ellas se unen por puentes de hidrógeno a las microfibrillas de celulosa, formando una red estructural muy compleja. En las plantas, hay otras hemicelulosas no estructurales. Son exudados de tallos, raíces, hojas o frutos, denominados en general gomas, entre las cuales la más conocida es la goma árabe.

Pectinas

Las pectinas o compuestos pécticos, son polisacáridos complejos, hidrófilos y altamente ramificados, que comprenden varios tipos de cadenas de polisacáridos caracterizadas por la presencia de residuos de ácido D-galacturónico ligados por uniones alfa (1→4). Uno de los grupos más importantes de las pectinas es el de los ácidos poligalacturónicos o poligalacturonanos, que son homopolímeros helicoidales, en los que algunos de sus grupos carboxilo o todos ellos pueden estar metilados. En otro grupo están los ramnogalacturonanos que son heteropolímeros, en los que, además del ácido D-galacturónico, hay unidades de L-ramnosa, cuya presencia sugiere la conformación en "zig-zag" asumida por las moléculas (Figura 13.5C). Cadenas laterales de azúcares o polisacáridos neutros, de diversas configuraciones y tamaños, especialmente arabinosas, galactosas y arabinogalactanos, pueden unirse a muchos residuos de ramnosa que constituyen las ramificaciones del esqueleto poliurónico. Por lo tanto, las pectinas pueden variar considerablemente en la composición y tamaño. Hay moléculas que son altamente ácidas, llamadas pectinas ácidas (Figura 13.5C), ricas en ácido galacturónico no metilado, alargadas y relativamente no ramificadas, frente a moléculas sólo ligeramente ácidas, llamadas pectinas neutras (Figura 13.5D), con muchos de sus grupos carboxilo metilados y con largas cadenas neutras laterales. Además, las cadenas de ácidos poligalacturônicos pueden condensar con algunos cationes divalentes, en particular iones de Ca2+ que forman uniones cruzadas entre los grupos carboxilo de varias cadenas adyacentes, lo que resulta en complejos macromoleculares gigantes, en forma de un gel, conocidos

zonas de unión. Este gel hidratado de pectinas llena el espacio entre las capas fibrosas de celulosa y juega un papel funcional importante facilitando el crecimiento celular, controlando el paso de iones y moléculas y actuando como una barrera que determina la porosidad de la pared, es decir, el tamaño de las moléculas que pueden cruzarla y llegar a las células. Iones y moléculas pequeñas como el agua y la sacarosa pasan libremente a través de la pared, pero quedan excluidas las moléculas con un tamaño mayor de 15.000 daltons. La mayor parte de las moléculas que regulan el crecimiento en las plantas (hormonas vegetales), como las auxinas, citocininas y giberelinas, tienen un peso molecular por debajo de 500 daltons. Las pectinas son el blanco principal del ataque de los organismos invasores, y los productos resultantes de su destrucción son disparadores potentes de respuestas de defensa celular. También, debido a que poseen una consistencia gelatinosa, tienen utilidad comercial, siendo utilizadas en la fabricación de mermeladas y jaleas.

Proteínas

Tres tipos de proteínas se identifican en la pared celular debido a sus interacciones con los otros componentes de la pared: (a) las denominadas "proteínas lábiles", de poca o ninguna interacción, que se mueven libremente en el espacio extracelular; (b) las "débilmente unidas" por las fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógeno y uniones hidrofóbicas o iónicas, la mayoría de las cuales está cargada positivamente, lo que permite la interacción con las pectinas, que tienen cargas negativas; y (c) las que están "fuertemente unidas o covalentemente unidas" a los otros componentes de la pared. Entre estas últimas están las proteínas estructurales de la pared. La más importante de ellas es una glicoproteína llamada extensina, muy rica en el aminoácido hidroxiprolina, que se inserta en la pared durante el crecimiento de la pared primaria. La síntesis de extensina es inducida cuando las células son dañadas por una lesión, infección o congelación, y por lo tanto, de alguna manera, ayuda a proteger o reparar las células. Las proteínas estructurales interactúan de forma covalente con los polisacáridos y desempeñan un papel importante en la organización de la arquitectura y la resistencia de las paredes. Hay proteínas que ejercen una función enzimática, tales como las peroxidasas, que pueden tener una alta afinidad por el pectato de Ca2+, las endotransglicosilasas de los xiloglucanos, que rompen y rehacen enlaces glicosídicos, y una familia de endoglucanasas, la que digieren diversos carbohidratos. Entre las proteínas de la pared, también se incluyen las expansinas, que operan a pH ácido aflojando la pared, incluso si no tienen actividad enzimática. Con este fin, las expansinas provocan el deslizamiento entre las moléculas de polisacáridos, como resultado de la rotura y la formación de nuevos enlaces puente de hidrógeno entre ellas. No obstante, las proteínas de las paredes pueden desempeñar un papel en el desarrollo de la planta, el reconocimiento, la señalización, las interacciones con las proteínas de la membrana plasmática, la defensa, inhibiendo el crecimiento de muchos patógenos y su adaptación al ambiente.

Lignina

Otro componente no polisacárido de la pared es la lignina, un polímero fenólico complejo, que consiste en alcoholes fenilpropanoides y sus correspondientes ácidos, de estructura poco conocida. Por falta de un mecanismo de excreción en las plantas, se sugiere que su presencia en las células puede ser resultado de un mecanismo de desintoxicación de sustancias fenólicas que, a través del metabolismo reaccionan entre sí, formando la lignina. Su contenido en las paredes primarias es generalmente bajo. La lignificación se limita a tejidos particulares, tales como elementos del

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13 xilema y floema y se produce sólo durante la formación de la pared secundaria. A pesar de que comienza a partir de la lamela media, se extiende a las paredes primarias y secundarias, avanzando a la membrana plasmática. Por lo tanto, todas las capas se impregnan con esta sustancia rígida, hidrófoba y resistente a la degradación. La lignificación parece tener una doble función: cimentación y anclaje de las fibrillas de celulosa y, debido a su dureza, evitar que la célula sea dañada.

Otros componentes de la pared celular

Además de los compuestos citados y que pueden ser considerados mayoritarios en las paredes, otros componentes lipídicos, tales como las ceras, la cutina y la suberina, están situadas en las paredes exteriores de la mayoría de las células epidérmicas o células de revestimiento. Cutina y suberina están formadas por varios ácidos grasos de cadena larga, con sólo pequeñas diferencias entre sí. Ellas forman una matriz en la que las ceras, compuestos lipídicos de constitución compleja, están incrustadas. La combinación cutina-cera forma la cutícula, que cubre las paredes externas de las células epidérmicas. La suberina es el componente principal de las paredes de algunas células, como las células de la corteza de la patata o las de ciertos árboles. Generalmente, paredes suberinizadas muestran capas alternas de suberina y ceras. Estas capas de protección, duras e hidrófobas, regulan la evaporación del agua y protegen a las células de una lesión. Las ceras, constituyen, en particular, una importante barrera contra la pérdida excesiva de agua. Sin embargo, otros elementos de las paredes de las células pueden ser los minerales, tal como la sílice, común en las paredes de las gramíneas, y el carbonato de calcio. En algunas paredes también se detecta tanino, otra clase de polímeros fenólicos, que evita el ataque de virus y hongos y repele a los insectos. ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR Sobre la base de lo que se conoce acerca de los componentes químicos de la pared de las células de plantas superiores, un modelo estructural se ha propuesto, que parece ser válido para las paredes celulares primarias de la mayoría de las especies, incluyendo muchas monocotiledóneas y todas las dicotiledóneas (Figura 13.6). Según este modelo, las microfibrillas de celulosa están completamente cubiertas e interconectadas con una capa de hemicelulosa (xiloglicanos), de una molécula de espesor, que están dispuestas paralelas a las fibrillas de celulosa y que se unen mediante puentes de hidrógeno (aunque algunos modelos sugieren también enlaces covalentes entre estos polímeros). En el lado opuesto de cada cadena de xiloglicano, impedida por las ramificaciones de otros azúcares que contiene, no existe la posibilidad de formación de tales puentes. La red de microfibrillas de celulosa-xiloglicanos es entonces embebida por una matriz compleja de polisacáridos pécticos y proteínas. Parte de las moléculas de xiloglicanos están unidas a través de enlaces glicosídicos a las moléculas de pectinas neutras, dispuestas radialmente al eje de las fibrillas de celulosa. Los extremos de estas moléculas, a su vez, están unidas por enlaces glicosídicos a muchos residuos de ramnosa de los ramnogalacturonanos (pectinas ácidas). También se forman uniones covalentes polisacárido-proteína. Estas

se establecen entre los residuos de hidroxiprolina (y de serina) de las proteínas y residuos específicos de azúcar (tetrahidro-arabinosas, en general) de pectinas neutras, que, a su vez, se unen covalentemente a las pectinas ácidas. Como ya se mencionó anteriormente, en las paredes de las gramíneas y monocotiledóneas relacionadas, las principales hemicelulosas que se entrelazan con las microfibrillas de celulosa son los glucuronoarabinoxilanos, pero también pueden ser los glucomananos u otros glicanos específicos. La orientación de las microfibrillas de celulosa que se depositan en las paredes primarias en crecimiento sigue diferentes patrones, dependiendo del tipo celular, y este patrón se cambia incluso después que las microfibrillas se han depositado. Se sabe, sin embargo, que están dispuestas a lo largo de la misma dirección de los microtúbulos situadas justo debajo de la membrana plasmática. Por lo tanto, las microfibrillas más cercanas a la membrana plasmática tienen orientación predominantemente transversal con respecto al eje mayor de la célula, formando una especie de red de malla suelta, para permitir el crecimiento celular en la dirección longitudinal. A medida que la célula crece, más material se deposita en la superficie de esta red, con la orientación de las microfibrillas mayores asumiendo una disposición más longitudinal y volviéndose más paralelas, en respuesta al estiramiento de la pared. Este es el caso de las células del tallo, en el que las microfibrillas están orientadas principalmente en sentido perpendicular a la dirección de la expansión de las células. Estas células pueden alcanzar 20 veces su longitud original, con poco crecimiento de ancho. En comparación, en las células de tejidos de almacenamiento y cultivos celulares, las microfibrillas se depositan al azar, permitiendo que el crecimiento sea más o menos uniforme en todas las direcciones. En cuanto a la estructura de la pared secundaria, las fibrillas de celulosa asumen una disposición compleja y todavía no bien aclarada. En las células adultas, la pared secundaria tiene una o más capas muy rígidas, denominadas capa