Acta Biologica et Medica Germanica: Band 36, Heft 3/4 VIIIth Symposium Structure and Function of Erythrocytes, Part I [Reprint 2022 ed.] 9783112649985

Table of contents :
Aufnahmebedingungen
INHALTSVERZEICHNIS
SACHWORTVERZEICHNIS
AUTORENVERZEICHNIS
Section I Molecular Biology of the Erythron
Avian erythropoiesis: Cellular and molecular aspects
The structure of pre-messenger RNA and messenger RNA from erythroid cells
Specific sequences in pre-mRNA from erythroid bone marrow cells
Role of the polyadenylate sequence in the stability of globin messenger RNA injected into Xenopus oocytes
Synthesis and characterization of globin DNAs
Isolation of human globin mRNA and synthesis of complementary DNA
Stickstoff-Ökonomie und Synthese von Serin und Glyzin in Retikulozyten
The onset of hemoglobin synthesis in spleens of irradiated mice after bone marrow transplantation
Degradation of mitochondria by cytosolic factors in reticulocytes
Some properties of globin messenger RNA from a free cytoplasmic nucleoprotein of rabbit reticulocytes
Veränderungen der 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen und der Plasmaerythropoetinaktivität bei hypoxischen Neugeborenen
Beziehungen zwischen der Konformation isolierter Rattenleber mitochondrien und ihrer Angreifbarkeit durch Lipoxygenase aus Kaninchenretikulozyten
Activity of the respiratory inhibitor RF in human red cells in anaemia
Reinigung und Charakterisierung des Atmungshemmstoffes RF aus Kaninchenretikulozyten
Some properties of the lipoxygenase from rabbit reticulocytes
Creatine during bleeding anemia of rabbits
Creatine transport into human red blood cells
The transplantation of bone marrow cells with a change of hemoglobin pattern induced by bleeding
Haemoglobin as a marker in bone marrow transplants of rats
Untersuchungen zur Vitalität von Human-Knochenmark bei der Gewinnung und Tieftemperaturkonservierung
Some unusual properties of globin-mRNA isolated from rabbit reticulocytes
Discussion
Workshop
Section II Regulation of Energy Metabolism
Thermodynamics of red cell glycolysis
An extended model of the glycolysis in erythrocytes
Elementare Eigenschaften des Energiestoffwechsels der roten Blutzelle
Regulation of red cell glycolysis by calcium ions
Kinetics of human erythrocyte hexokinase: influence of temperature, ATP4-and Mg2+
The role of red cell membrane in the regulation of glycolysis and the 2,3-bisphosphoglycerate-cycle
Regulation of 2,3-bisphosphoglycerate metabolism in erythrocytes by a multifunctional enzyme
Interrelationship between energy metabolism from various substrates and the 2,3-bisphosphoglycerate bypass in human erythrocytes
pH-Dependent changes of 2,3-bisphosphoglycerate
The molecular function of hemoglobin as reflected in ligand binding data: Analysis of data on erythrocytes
Biochemische Veränderungen von Erythrozyten während einer Lagerung bei 25 °C und Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Wertes
Einfluß von Bikarbonat auf den 2,3-DPG-Gehalt konservierter Erythrozyten
Verhalten von Lebensfähigkeit, ATP- und 2,3-DPG-Gehalt resuspendierter Erythrozyten während mehrwöchiger Kältelagerung
Verhalten von Adeninnukleotiden im Konservenblut mit Adenin- und Guanosinzusätzen
Studies on NAD+ permeability in intact mitochondria from rabbit reticulocytes
Untersuchungen zur Antimyzin A-resistenten Atmung erythroider Zellen
Charakterisierung von Retikulozyten des Menschen
Phospholipid composition and some reactions of phospholipid synthesis and degradation in mitochondria and other subcellular fractions from rabbit reticulocytes
Studies on the functional significance of mitochondrial bound hexokinase in rabbit reticulocytes
Association behaviour of human erythrocyte phosphofructokinase: Dependence of molecular weight on enzyme concentration at pH 8.0
Properties of the hexokinase-phosphofructokinase system on the basis of an extended PFK-model
Kontrolle der Glykolyse bei Magnesiummangel: Untersuchungen an intakten roten Blutzellen und Hämolysaten
Relations between ion shifting, ATP depletion and lactic acid formation in human red cells during moderate calcium loading using the ionophore A 23187

Citation preview

ACTA BIOLOGICA PW ••rnifm M MrlllliD L I

IVI L U I U f i

Zeitschrift für

Bìoivissenschaften

GERMANICA •

R. Baumann • H. Dutz A. Graffi • F. Jung O. Prokop • S. M. Rapoport

VIII th Symposium

Unter Mitarbeit von:

Structure and Function

H. Ambrosius • H. Ankermann G. Dörner • H. Drischel H. A. Freye • H. Frunder E. Goetie • H. Hanson E. Hofmann • F. Klingberg W. Köhler • F. Markwardt H. Matthies • W. Oelßner G. Pasternak • A. Schellenberger E. Schubert • F. Schwarz G. Sterba • A. Wollenberger

of Erythrocytes Parti

Band 36 Heft 3I4 • igyy Seite 2g i~610 E V P 48, - M

ABMGAJ 36(3/4)291 - 6 1 0 (1977) 31002

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

Aufnahmebedingungen 1. Die ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA, Zeitschrift für funktionelle Biowissenschaften, publiziert Arbeiten aus den Fachgebieten Biochemie, Molekular- und Zellbiologie, Physiologie (einschließlich Pathophysiologie), Pharmakologie und Immunbiologie. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeiten an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Polemiken und spekulative Arbeiten, falls sie nicht wesentlich neue Gesichtspunkte enthalten. Die Arbeiten sollen den Charakter wissenschaftlicher Originalarbeiten haben. Als solche gelten alle Mitteilungen, die zur vorwärtsführenden Erweiterung des Erkenntnisstandes auf den genannten Fachgebieten führen. Originalarbeiten sollen 20 Manuskriptseiten nicht überschreiten. Kurzmitteilungen werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt; sie dürfen 5 Manuskriptseiten nicht überschreiten. Als Kurzmitteilung gelten solche Arbeiten, in denen über neue Ergebnisse berichtet wird, ohne Details einer Originalarbeit zu enthalten. Besonders aktuelle Untersuchungsergebnisse können in kurzer Form (bis 4 Seiten) im Offsetverfahren publiziert werden, wofür reproduktionsreife Manuskripte erforderlich sind. In Form von Übersichtsarbeiten (Reviews) werden Artikel entgegengenommen, die zu aktuellen Gebieten einen Überblick geben, in dem Fakten dargestellt, besprochen und kritisch bewertet werden. 3. Die Arbeiten müssen so kurz als möglich abgefaßt werden und in einem druckreifen Zustand geschrieben sein. Einleitung (Problematik), Methodik, Befunde und Diskussion sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit ist eine Zusammenfassung der wesentlichsten Ergebnisse voranzustellen, wovon bei deutschsprachigen Manuskripten auch eine englische Übersetzung notwendig ist. Arbeiten werden in Deutsch, Englisch und Russisch angenommen. Die Manuskripte sind in zweifacher Ausfertigung einzureichen. Bei Manuskripten in deutscher Sprache ist die Schreibweise des „Duden" verbindlich; bei eingedeutschten Wörtern ist die ,,K-Z"Schreibweise anzuwenden. Von den Abbildungen sind 2 Kopien sowie 1 Satz reproduktionsreife Vorlagen beizufügen. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und unbedingt einzuhalten. Manuskripte, die diesen Bedingungen nicht entsprechen, gehen unbearbeitet zur Revision an den Autor zurück. 4. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht zulässig. 5. Manuskripte sind an die Redaktion der ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA, DDR-1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70, zu senden. 6. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert; weitere Sonderdrucke können gegen Bezahlung durch den Autor erworben werden. Chefredaktion Herausgeber

Zeitschrift ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: Prof. Dr. R. Baumann, Prof. Dr. H. Dutz, Prof. Dr. A. Graffi, Prof. Dr. F. Jung, Prof. Dr. O. Prokop, Prof. Dr. S. M. Rapoport. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-108 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; Fernruf 223 6221 oder 2236229; Telcz-Nr..l1 4420; Postscheckkonto: Berlin 35021. Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. Heinz Bielka, Prof. Dr. Werner Scheler. Anschrift der Redaktion: DDR-1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. Fernruf: 569 7851, App. 222. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-582 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift erscheint monatlich. Die 12 Hefte eines Jahrganges bilden einen Band. Bezugspreis je Heft 35,— M (Preis für die DDR: 24,— M); Bandpreis 420,— M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 288,— M). Bestellnummer dieses Heftes: 1053/XXXVI/3/4. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgend ein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden © 1977 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 50117

Zeitschrift ACTA BIOLOGICA E T MEDICA GERMANICA Herausgeber: Prof. Dr. R. Baumann, Prof. Dr. H. Dutz, Prof. Dr. A. Graffi, Prof. Dr. F. Jung, Prof. Dr. O. Prokop, Prof. Dr. S. M. Rapoport. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-108 Berlin, Leipziger Straße 3—4; Fernruf 223 6221 oder 2236229; Telex-Nr. 114420; Postscheckkonto: Berlin 5021. Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto.-Nr, 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. Heinz Bielka, Prof. Dr. Werner Scheler. Anschrift der Redaktion: DDR-115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. Fernruf: 5 69 78 51, App. 222. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-582 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift erscheint monatlich. Die 12 Hefte eines Jahrganges bilden einen Band. Bezugspreis je Heft 35,— (Preis für die DDR; 24,— M): Bandpreis 420,— M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 288,— M). Bestellnummer dieses Bandes: 1053/XXXV. Urheberrecht: Alle Rechte .vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden, (c) 1976 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 50 117

INHALTSVERZEICHNIS Heft 1 Biochemie G.

D. K U N Z E U. E . E G G E R : Eine einfache Methode zur Darstellung von in 2-Stellung fettsäurespezifisch substituiertem Phosphatidylcholin U. R O T H E , W. S C H O P P U. H. A U R I C H : Enzymatischer Umsatz von Tetradekanol in heterogener Phase durch Hefe-Alkoholdehydrogenase P. E L Z E : Über die Kationenselektivität kalziumbindender Strukturen des Skelettmuskels. Eine physikochemische Interpretation als Ionenaustausch-Vorgang SCHULZE, K . JUNG,

1—5 7 — 14 1 5 - 22

Physiologie/Pathophysiologie N G U Y E N - V A N - H A I , V . M O R I T Z U. T . H E C H T : Zur Bedeutung der Stressintensität für die emotionelle und viszerale Reaktivität, insbesondere für die Blutdruckregulation

K . HECHT,

K.HECHT,

NGUYEN-VAN-HAI,

T.HECHT,

V.MORITZ

U. H . W O O S S M A N N :

23-33

Be-

ziehungen zwischen Hippokampusfunktion und belastetem Lernen in ihrer Auswirkung auf zerebro-viszerale Regulationsprozesse • K . H E C H T , A. A. G A R I B J A N U. K . T R E P T O W : Der Einfluß von Nucleus caudatusLäsionen auf die Entwicklung einer durch Lernbelastung (Stress) induzierten hypertonen Blutdruckdysregulation P. M A R E S : Entwicklung somatosensorischer evozierter Potentiale im Rattenkleinhirn

35-45 47-54 55-62

Pharmakologie H.-J. M E S T , K. E . B L A S S U. W. F Ö R S T E R : Über die antiarrhythmische Wirkung der Prostaglandine Alt E 1 , A 2 , E 2 und F 2 A am Strophanthin-Arrhythmiemodell der Katze I . v . SCHWARZENFELD, M . BLASCHKE, H . - D . FISCHER, E . RUDOLPH U W .

63 — 67

OELSZ-

NER: Die Wirkung von Arekolin auf die synaptosomale K + -Phosphatase und (N+ + K+)-ATPase R . F R A N K E u. W. M E I S S K E : Diskriminanzanalytische Struktur-Wirkungs-Analyse bei qualitativen biologischen Daten. Virostatische Wirkung von Isatin-/?isothiosemikarbazonen H. B E R C H E R U . A . G R I S K : Struktur-Wirkungs-Beziehungen halogenierter Phenyläthanolamine und Phenoxypropanolamine H. B L E Y E R , K.-U. M Ö R I T Z U. A. G R I S K : Beeinflussung der Adenylatzyklaseaktivität und des 3', 5'-AMP-Gehaltes in Herz und Großhirn der Ratte durch Diisopropylfluorphosphat

69-72 73—77 79 — 85

87 — 92

Immunbiologie P.

: Radioimmunologischer Nachweis DNA-spezifischer Antikörper . . .

93 — 101

R. K L Ö C K I N G , M. S P R Ö S S I G U. W . W Ö C K E L : Die Coxsackievirusinfizierte adulte Maus. Ein Tiermodell zum Studium der Virusmyokarditis .

103 — 109

FALCK

Virologie T H . BLUMÖHR,

IV

Inhaltsverzeichnis

Kurzmitteilungen Pathophysiologie. D . D A R G E L , M. S T E I N H A R D T U. B . S C H Ü L K E : Über das Verhalten von zyklischem 3', 5'-Adenosinmonophosphat im Blut von Schweinen während physischer Belastung 111 — 114 Pathophysiologie. Luiz A. A B R E U U. R . R A P O S O A B R E U : Akonitase-, Fumaraseund Sukzinatdehydrogenaseaktivität im Gehirn von Mäusen, die mit einer einmaligen Dosis Lithiumchlorid behandelt wurden

115 — 117

Pharmakologie. K . P Ö N I C K E U. W . F Ö R S T E R : Beeinflussung der Prostaglandinsynthese durch ultraviolette Strahlen

119 — 120

Pharmakologie. W. F Ö R S T E R u. H.-U. B L O C K : Einfluß von Oxyfedrin und Prenylamin auf die Biosynthese von Prostaglandin E 2 und F 2 A im Nierenmark-Homogenat von Kaninchen

121 — 122

Serologie. P. LUTHER: Zur Agglutination von menschlichen Erythrozyten und Aszitestumorzellen der Maus durch E x t r a k t e aus der Mistel (Viscum album L.) 123 — 126 Aufnahmebedingungen und Anleitung zur Manuskriptgestaltung 127 — 131

Heft 2 Bioch emie M. S C H U L Z E U. W . W I T S C H E L : Substrat-Stat: eine Methode zur Charakterisierung von Enzymen in konzentrierten Lösungen bei niedrigen Substratkonzentrationen 133 — 139

A . HORN, I . CLARK, R . BUBLITZ,

H. J.

SEITZ, E . P O R S C H E

U. W . T A R N O W S K I :

enzym der Glukoneogenese ?

Glyzerinkinase — ein Regulator-

141 — 154

A. POHL U. L. MAURER: In vitro-Einbau von [ 3 3 P]-Orthophosphat in die Phospholipide der Erythrozytenmembran neugeborener und adulter Hausschweine

155 — 165

E . - G . K R A U S E und P. K A R C Z E W S K I : Hemmung der zyklo-AMP spaltenden Nukleotidhydrolase des Herzens durch 5-Methyl-7-diäthylamino-s-triazol-(l, 5a)pyrimidin (Rocornal®)

166—173

u H. A U R I C H : Einfluß von ^H-Wert und Temperatur auf die Stabilität der L-Aminosäureoxydase aus dem Gift der Sandotter

175 — 182

J . KURTH

Physiologie/Pathophysiologie C.-E. V Ö L C K E R , D. S T A U S K E u. W . H A U D E : Veränderungen von Lipidkonzentrationen in Serum, Leber und Fettgewebe bei nahrungsbedingter Fettsucht von Wistarratten F . MARKWARDT, H . - P . KLÖCKING, K . SEDLARIK, J . PERLEWITZ,

183-191

J . D R A W E R T U.

J . HOFFMANN: Tierexperimentelle Untersuchungen zur thrombolytischen Wirkung von Streptokinase

V . P . D I X I T , M . A R Y A U. N . K . L O H I Y A : D i e W i r k u n g d e r H y p o t h y r e o s e a u f d e n

weiblichen Genitraltrakt von Wüstenmäusen (Meriones hurrianae Jerdon).

193 — 203

.

205 — 211

H. M A T T H I E S : Veränderungen der Markierung löslicher und solubilisierter Hippokampusproteine nach einem Lernversuch bei Ratten

213-219

H . - J . G A B R I E L : Der Einfluß eines bedingten emotionellen Zustandes auf das Entladungsverhalten von Einzelzellen des dorsalen Corpus geniculatum laterale der R a t t e

221 — 227

N . P O P O V , S . S C H U L Z E C K U.

U . Z I P P E L , U . K O L L E U.

V

Inhaltsverzeichnis Pharmakologie Über einige durch Amantadin (Adamantin) hervorgerufene Verhaltensveränderungen P A E G E L O W , S. R E I S S M A N N U. H . A R O L D : Der Einfluß potenzierender Faktoren (BPF) auf die Bradykininwirkung in vitro

I . S A F T A , B . C U P A R E N C U , M . D A N A U U. L . C O M E S : I.

229 — 233 23 5 — 244

Zellbiologie. Quantitative morphologische Untersuchungen an hypoxisch kultivierten Rattenherzmuskelzellen . . . .

H . H E R M E R S D Ö R F E R , U . K A R S T E N U. W . S C H U L Z E :

245 — 252

Immunologie A. L O S S N I T Z E R u. G. K L Ä H R : Mammatumorvirus (MTV)-spezifische Immunkomplexablagerungen in den Nierenglomeruli MTV-infizierter Mäuse

ST. ZOTTER,

253 — 257

Kurzmitteilungen Biochemie. G . C S A B A , S . U . N A G Y U. T . L A N T O S : Wirken biogene Amine auf Tetrahymena über einen zyklischen AMP-Mechanismus ? Biochemie. A. B Ü C H T E M A N N U. K . K A R A W A J E W : Eine Überschichtungstechnik f ü r Viskositätsmessungen mit dem Zimm-Crothers-Viskosimeter an Oberflächenfilme ausbildenden Substanzen, untersucht am Chromatin Pharmakologie. W. H A L L E , R. S R A P I O N J A N , P. O E H M E U. A . A . G A L O J A N : Zur Wirkung neurohormonaler Peptide auf die spontanen Pulsationen kultivierter Herzventrikelzellen neugeborener R a t t e n Pharmakologie. P. W A L S M A N N , H . H O R N , F . M A R K W A R D T , P. R I C H T E R , J . S T Ü R Z E B E C H E R , H. V I E W E G u. G . W A G N E R : Synthetische Inhibitoren der Serinproteinasen. 11. Über die Hemmung von Trypsin, Plasmin und Thrombin durch neue Bisamidinoverbindungen

259 — 261

263 — 264

265 — 267

Kl — K8

H e f t 3/4 Biochemie B . WIEDERANDERS,

S . A N S O R G E , P . B O H L E Y , U . B R O G H A M M E R , H . K I R S C H K E U.

J. L A N G N E R : Intrazellulärer Proteinabbau. VI. Isolierung, Eigenschaften und biologische Bedeutung von Kathepsin D aus der Rattenleber H . KIRSCHKE,

J . LANGNER,

B . WIEDERANDERS,

S. ANSORGE,

P. BOHLEY

U.

269 — 283

U.

Intrazellulärer Proteinabbau. VII. Kathepsin L und H : Zwei neue Proteinasen aus Rattenleberlysosomen 285 — 299 P. B O H L E Y , H . K I R S C H K E , J . L A N G N E R , B . W I E D E R A N D E R S U. S. A N S O R G E : Intrazellulärer Proteinabbau. V I I I . Einsatz doppeltmarkierter Substratproteine . 301 — 307 J . M E T H F E S S E L : Zur Organ- und Subzellularverteilung der Transamidinase bei Mensch und R a t t e 309-315 J . M E T H F E S S E L U. I . R O D I N A : Einfluß entkoppelnder Agentien auf die Transamidinase-Kapazität von Nieren und Pankreas 317 — 323 M. L U D E W I G : Zur Aktivierung der Leuzinaminopeptidase unter Wasserstoffbrücken lösenden Bedingungen 325 — 330 R. K L E I N E U. J . L E H M A N N : Das Verhalten der Leuzinaminopeptidase aus Rinderaugenlinsen in Guanidinhydrochlorid. Dissoziations- und Reassoziationsversuche 331 — 341 BROGHAMMER:

Inhaltsverzeichnis

VI

Spektroskopische Untersuchungen zur Thermostabilität höherer Strukturen von Leuzinaminopeptidase. ESR-, CD.und Fluoreszenzstudien

343 — 352

Leuzinaminopeptidase aus Rinderaugenlinsen. Untersuchungen zur Funktion der Thiolgruppen im Holo- und Apoenzym . .

353 — 357

: Untersuchungen zum Einfluß von Glutathion auf die katalytischen Eigenschaften der Leuzinaminopeptidase

359—364

u. S . M A O T S I : Versuche zur Affinitätsmarkierung der Leuzinaminopeptidase mit neuen substratanalogen Inhibitoren . . . .

365 — 378

u. J . S C H U B E R T : Isolierung und Charakterisierung einer mikrosomalen Arylaminopeptidase aus Rattennieren

379—391

G . L A S S M A N N , J . L A S C H , B . E B E R T , W . D A M E R A U U. W . K U D E R N A T S C H :

M. FROHNE

M.

U.

U. KETTMANN:

FROHNE

S. FITTKAU, W . - H . SCHUNCK

R.

KLEINE

J . LASCH

: Chemische Oszillationen in Einenzymreaktoren

393 — 399

B . H E N K E L U. H . B I E L K A : Über ionische Wechselwirkungen in Eukaryontenribosomen: Spaltung der Untereinheiten von Rattenleberribosomen durch monovalente Kationen

H. WELFLE,

401 — 411

G. G E Y E R , I . M A R Q U A R D T U. D. G L Ä S S E R : Bildung von kapselähnlichem Material bei Langzeitkultivierung von Rinderlinsenepithelzellen 413 — 419

M . IWIG,

W . B L E C H : Untersuchung der Insulin- und Glukagonsekretion am isoliert perfundierten Rattenpankreas

421—438

M. Z I E G L E R : Modulation der Hexose-induzierten Unterdrückung der Glukagonsekretion durch Somatostatin an isolierten Inseln des Rattenpankreas

439—442

Isolierung und Charakterisierung eines Rubredoxins aus Acinetobacter calcoaceticus

443 — 451

H. B A N A S C H A K : Charakterisierung der Mg-ATPase und (Na + + K + )stimulierten Mg-ATPase glattmuskulärer Zellen der A. carotis communis des Schafs

453-463

B . B I E R W O L F U.

G.

J . H A H N U.

H . A U R I C H , D . S O R G E R U. O . A S P E R G E R :

R.

PREISSU.

Physiologie/Pathophysiologie R.

u. K. S C H E I B E : Systemanalyse der multioszillatorischen Funktionsordnung im zirkadianen und ultradianen Frequenzbereich und ihr Indikationswert f ü r Belastungswirkungen, dargestellt am Beispiel verschiedener LichtDunkel-Verhältnisse bei der Intensivhaltung von Schafen 465 — 477 J . B A J G A R U . J . P A T O Ü K A : Anticholinesterasewirkung von 3-DiäthylaminophenylN-methylkarbamatmethiodid in vitro und in vivo 479—484 H.-D. F I S C H E R , A. S C H E R B E R u. A. H . S T A I B : Der Einfluß von Strophanthin und 2,4-Dinitrophenol auf die durch Skopolamin evozierte kortikale Azetylcholinfreisetzung der R a t t e 485 — 490 SINZ

D . M A T T H I A S , W . W A C H T E L , I . W O L F , C . - H . B E C K E R , E . E N G L E R U. H . J .

HERR-

: Untersuchungen an Schweinen mit Angiotensin-bedingter Blutdruckerhöhung

MANN

491—499

Toxikologie M. K A M I I S S K I : Über die Wirkung der S0 2 -Bindung durch Ammoniak auf den Schwefeleinbau im Gewebe der R a t t e

J . J O N E K , J . K O N E C K I , S T . K O S M I D E R U. 35

501 — 515

Kurzmitteilungen Pharmakologie. U. Z E H L U. W . F Ö R S T E R : Zur Bedeutung von Adenosin und Prostaglandinen f ü r die Koronarregulation des Säugerherzens

517—520

Inhaltsverzeichnis

VII

Pharmakologie. W . S Z I E G O L E I T , M . W E I S S , K . P Ö N I C K E U. W . F Ö R S T E R : Pharmakokinetische Parameter von N,N'-Bis-[3-(2'-äthoxyphenoxy)-2-hydroxypropyl]-äthylendiamin (Falirytmin®) am Kaninchen 521 — 522 Biochemie. B. K L E I T K E , H . S Y D O W und A. W O L L E N B E R G E R : Beweise für die Aktivität einer vom zyklischen AMP abhängigen Proteinkinase in isolierten Mitochondrien aus Meerschweinchen- und Rattenleber K9 — K l 7

Heft 5 Biochemie A. G. T S A M A L O U K A S , D. M A R E T Z K I , M . S E T C H E N S K A U. S. R A P O P O R T : Reifungsabhängigkeit fluoridempfindlicher Adenylatzyklase in roten Blutzellen . . . H. W I L L , B. S C H I R P K E U. A. W O L L E N B E R G E R : Stimulierung der Ca 2 + -Aufnahme durch zyklo-AMP und Proteinkinase in isoliertem sarkoplasmatischem Retikulum und Zelloberflächenmembran-angereicherter mikrosomaler Fraktion aus Kaninchenherzmuskel E.-G. K R A U S E U. A . W O L L E N B E R G E R : Verbesserte Methode zur Bestimmung von zyklo-GMP mit einem Bindungsprotein aus Puppen des Seidenspinners, BombyxmoriL

523 — 527

529—541 543— 552

Physiologie u. W . R E I M E R : Untersuchungen über die Reproduzierbarkeit von Durchblutungsmessungen an der menschlichen Stirnhaut mittelsWärmeleitsonden

H . FRAUENDORF, W . GELBRICH

K . HECHT,

S . CHOINOWSKI,

D. KUNDE,

R. MEYER,

V . MORITZ,

553 — 558

TH. SCHLEGEL,

K. W E N Z E L I D E S U. J . G Ö T Z E : Lernen und chronobiologische Regulation nach experimentell verursachter Schädigung der Koronararterienwand von Albinoratten H . R Ü T H R I C H u. J . S C H M I D T : Beziehungen zwischen Veränderungen der Spontanaktivität und der Reizbeantwortung kortikaler Neuronen unter der mikroiontophoretischen Applikation von Glutaminsäure K U L D I P C . K A N W A R U. R A M A V E R M A : Orale D 2 0-Applikation und enzymatische Veränderungen der Rattenhoden B. B I E R W O L F U. W . B L E C H : Beeinflussung der glukoseinduzierten Insulinsekretion des isoliert perfundierten Rattenpankreas durch Tolbutamid, Glukosamin, Diazoxid, Glukagon und endogenes Insulin V . V . F A N A R D Z J A N U. I . A . M A N V E L J A N : Die neuronalen Reaktionen des Nucleus ruber der wachen Katze auf Hautreize

5 5 9 - 570

571 — 576 577 — 581

583 — 595 597 — 604

Pharmakologie < E. F O L L E U. R. I . L E V E S Q U E : Durch Anästhetika hervorgerufene kardiovaskuläre, respiratorische und metabolische Veränderungen bei Ratten . . . . D. B A N S I , M . K R U G u. J . S C H M I D T : Der Einfluß von Psychopharmaka auf durch Zahnpulpareizung ausgelöste kortikale Potentiale und langanhaltende posttetanische Erregbarkeitsänderungen D. M Ü L L E R U. W . K L I N G E R : Die Bindung von Hexobarbital und Anilin an Zytochrom P-450 von Lebermikrosomen aus Kontroll- und mit Phenobarbital behandelten Ratten unterschiedlichen Alters J . H A U P T M A N N , J . H O F F M A N N U. F. M A R K W A R D T : Zur Wirkung von aromatischen Bisamidinen auf Blutgerinnungs- und Fibrinolysevorgänge

L.

605 — 612 613 — 625

627 — 633 63 5 — 644

VIII E.

Inhaltsverzeichnis

L-Karnitin als Basis cholinomimetischer Substanzen . . Die Wirkungen einiger Cholinesteraseaktivatoren auf die K o n t r a k t i l i t ä t isolierter H e r z v o r h o f p r ä p a r a t e des Meerschweinchens . .

STRACK

u. H.

SEIM :

645 — 656

J . F U S E K U. J . P A T O C K A :

657 — 661

Immunologie Untersuchungen zur Säulenfraktionierung von Immunzellen. VI. Trennung von T - L y m p h o z y t e n durch Proteinkugeln, die m i t Antigen-Antikörper-Komplexen beladen wurden

R . E C K E R T , E . M I X ' U. B . V . B R O E N :

663 — 671

Kurzmitteilungen Biochemie. R . B E R G E R : Fixierung von Trypsin an modifiziertes W o f a t i t CA 20® Biochemie. U . G R I M M , A. K N A P P U. F. H A U F E : In vivo-Studien zur Aktivierbarkeit des Phenylalaninhydroxylase-Systems bei Hyperphenylalaninämie durch Behandlung m i t Pterinen Biochemie. M . B Ö T T G E R , M . B E C K E R , H . F E N S K E U. S. S C H E R N E C K : Kein nichtkonservatives y-DNA-CD-Spektrum von Komplexen zwischen H l - H i s t o n und superhelikaler ringförmiger DNA Pathophysiologie. V. P. D I X I T U. S. S A X E N A : Untersuchungen zur Leberfunktion am Schlankaffen (Presbytis entellus entellus) nach Behandlung mit a-Chlorhydrin Immunologie. G. H Ü B N E R , N. H A R T M A N N , W.-D. J Ü L I C H U. W. W E U F F E N : Aktiv i t ä t der Thiosulfat: Zyanid-Schwefeltransferase und der 3,5-DijodtyrosinPlasma-Dejodase in Abhängigkeit von Immunisierung und Rhodanidapplikation Molekularbiologie. R . M I S S E L W I T Z , G . - R . J Ä N I G , H . R E I N , E . B U D E R , D . Z I R W E R u. K. R U C K P A U L : Differenzierung zwischen T y p I- und T y p H-Substratbindung an Zytochrom P-450 durch T e m p e r a t u r v a r i a t i o n Molekularbiologie. S . B Ö H M , H . R E I N , G . - R . J Ä N I G U. K. R U C K P A U L : Eine Infrarot-Untersuchung der CO-Komplexe von Zytochrom P-450 und P-420 . . .

673 - 674

675 — 678

679 — 681

683-686

687-690

K19—K25 K27 — K32

Heft 6 Biochemie W.

M Ü L L E R U. T. S C H E W E : Das Systemfungizid Tridemoph als Hemmstoff der A t m u n g s k e t t e von Elektronentransportpartikeln aus Rinderherzmitochondrien 693—707 R. B L U T H U. H . B A N A S C H A K : Die Bindung von Noradrenalin an menschliche Erythrozyten 709—713 R. G L A S E R : Die Rolle intrazellulärer Ladungsträger bei der Regulation des Ruhepotentials von Zellen m i t Ionenpumpen 715 — 721 K. S C H R Ö D E R , M. G R I E G E R U. S. M. R A P O P O R T : 0 2 -Verbrauch und C0 2 -Bildung durch Nierenrindenschnitte bei I n k u b a t i o n in einem optimierten Substratgemisch 723 — 733 J . L A S C H , R . K O E L S C H , P . R O T H , A . G A B E R T , I . M A R Q U A R D T U. H . H A N S O N :

Un-

tersuchungen zur Hydrolyse von Proteinen durch immobilisierte E n z y m e . .

735 — 743

Physiologie D.

U. G N Ü C H T E L : Beeinflussung der Druckrezeption des Sinus caroticus durch experimentelle Veränderung der Elektrolytverteilung . . . .

W A L L R A B E U.

745 — 756

IX

Inhaltsverzeichnis Pharmakologie D . M . JAISWAL U. D . K . BELSARE: D i e W i r k u n g v o n S a l i z y l a t u n d A d r e n o k o r t i k o -

t r o p i n auf den Cholesteringehalt in L e b e r u n d S e r u m des F a d e n s a c k w e l s e s H e t e r o p n e u s t e s fossilis (Bloch) I . K Ä S T N E R , N . R O T H u. A . W A G N E R : Der E i n f l u ß v o n E t h o s u x i m i d auf psychom o t o r i s c h e R e a k t i o n e n u n d e l e k t r o m y o g r a p h i s c h e P a r a m e t e r gesunder P r o banden K . H . W E S T E R M A N N U. A. H . S T A I B : Nigrostriatal i n d u z i e r t e m o t o r i s c h e R e a k t i o n e n der R a t t e . I. R o t a t i o n s v e r h a l t e n u n d H a l t u n g s a s y m m e t r i e n a c h i n t r a zerebraler I n j e k t i o n v o n A p o m o r p h i n u n d D o p a m i n • . . . K . H . W E S T E R M A N N U. A . H . S T A I B : N i g r o s t r i a t a l i n d u z i e r t e m o t o r i s c h e R e a k t i o n e n d e r R a t t e . I I . Cholinerge Beeinflussung v o n R o t a t i o n s v e r h a l t e n u n d Haltungsasymmetrie M . S T O P P , C H R . W E I S E , S . M E W E S U. H . B R Ä U N L I C H : Unterschiedliche H e m m w i r k u n g e n v o n 2,4-Dinitrophenol, J o d a z e t a t u n d P r o b e n e c i d auf die renale Ausscheidung v o n p - A m i n o h i p p u r a t , Z y k l o p e n t h i a z i d u n d S u l f a t e t h o x y p y r i d a z i n bei R a t t e n H . B R Ä U N L I C H U. F . K . S P L I N T E R : R e n a l e Ausscheidung v o n Langzeitsulfonam i d e n bei Flüssigkeitsbelastung u n d Ä n d e r u n g des p H - W e r t e s des H a r n s . .

757—761

763 — 772 773 — 780 781 — 786

787 — 792 793 — 798

Kurzmitteilungen P a t h o p h y s i o l o g i e . G . D Ö R N E R , N . H A G E N U. W . W I T T H U H N : D i e

frühpostnatale

Ü b e r e r n ä h r u n g als ä t i o p a t h o g e n e t i s c h e r F a k t o r d e r E r w a c h s e n e n f e t t s u c h t

799 — 803

P h a r m a k o l o g i e . A . B Ö H M , G . D U D E , H . - D . F I S C H E R , G . R E I C H E L T , A . H . S T A I B U.

S. STERNECK: Beziehungen zwischen Narkoseverlauf, N a r k o s e t i e f e u n d H i r n azetylcholingehalt der R a t t e n a c h U r e t h a n - u n d P e n t o b a r b i t a l a p p l i k a t i o n T o x i k o l o g i e . CHR. FLECK, M . STOPP U. H . BRÄUNLICH: A l t e r s a b h ä n g i g e

805 — 807

Unter-

schiede der T o x i z i t ä t v o n N a t r i u m h y d r o g e n k a r b o n a t u n d A m m o n i u m c h l o r i d bei R a t t e n 809 — 812 Immunologie. J . K A D E N , J . G R O T H U . G.-M. M Ü L L E R : Z u m V e r h a l t e n v o n Mäusel y m p h o z y t e n n a c h in v i t r o - B e h a n d l u n g m i t sauren M u k o p r o t e i n e n a u s menschlichem S e r u m 813 — 817 Pathophysiologie. R . B A U M A N N , V . M O R I T Z , W . G Ö D I C K E , J . W . P O S T N O W U . M. ZIEGLER: Insulinkinetik, Glukosetoleranz u n d L i p i d s t o f f w e c h s e l bei genetisch spontan hypertonen R a t t e n K 3 3 —K40 3. S y m p o s i u m „ I n t r a z e l l u l ä r e r P r o t e i n k a t a b o l i s m u s " 1977 Heft 7 Biochemie D.

A. W O L L E N B E R G E R , M. P O P P E I U. K . H E C H T : H o r m o n e l l e Stimulier u n g d e r B i l d u n g v o n zyklischem A d e n o s i n - 3 ' , 5 ' - m o n o p h o s p h a t in zellfreien P a r t i k e l p r ä p a r a t e n und i n t a k t e n Zellen der g l a t t e n M u s k u l a t u r der A o r t a u n d A. femoralis v o n R a t t e n im Verlaufe eines Immobilisationsstresses L. W I L L - S H A H A B , A. W O L L E N B E R G E R U. I. K Ü T T N E R : S t i m u l i e r u n g d e r A d e n y latzyklase aus R a t t e n - u n d K a t z e n h e r z d u r c h T r i j o d t h y r o n i n in Anwesenheit von 5'-Guanylylimidodiphosphat W . S C H U L Z E U. A. W O L L E N B E R G E R : Zur L o k a l i s a t i o n der A d e n y l a t z y k l a s e in r o t e n u n d weißen S k e l e t t m u s k e l n : E i n e zytochemische U n t e r s u c h u n g . . . A. W O L L E N B E R G E R U. W . W A R B A N O W : A n t a g o n i s m u s v o n D e r i v a t e n des zyklischen Guanosin-3', 5'-Monophosphats gegen die A d r e n a l i n w i r k u n g auf die Aut o m a t i e isolierter R a t t e n h e r z m u s k e l z e l l e n in d e r K u l t u r KRANZ,

819—828

829 — 835 837 — 843

845 — 851

X

Inhaltsverzeichnis Glukosestoffwechsel in verschiedenen Regionen des R a t t e n h i r n s im Verlauf eines Stresses durch Hypokinese

K . K O N I T Z E R U. S . V O I G T :

853 — 866

Physiologie/Pathophysiologie Zur Rolle der Unbes t i m m t h e i t im bedingt-reflektorischen Lernverhalten f ü r ausgewählte HerzKreislauffunktionen P . L J O W S C H I N A U . K . H E C H T : Zur asymmetrischen F u n k t i o n des Pes hippocampi bei experimentell stressinduzierter arterieller H y p e r t o n i e von Albinoratten

A . J A . M E C H E D O W A , K . H E C H T , K . T R E P T O W U. T . H E C H T :

I.

H . BAUMANN, G . MARTIN, T . G . URMANTSCHEEVA, G . D E G E N , F . WOLTER, W .

867 — 879

881-887

A.

Neurophysiologische Mechanismen der arteriellen H y p e r t o n i e u n t e r chronisch-experimentellem E m o tionalstress CHASABOVA, C H . G U R K , I . H I N A Y S U. J . L Ä U T E R :

889—913

G . D E G E N , H . B A U M A N N , D . W A L L R A B E , G . M A R T I N , I . H I N A Y S U. F . W O L T E R :

Veränderung von Blutdruck, Herzrate, Atemfrequenz und E K G u n t e r sozioemotionalem Stress bei Rhesusaffen G . D E G E N U. H . B A U M A N N : Verhaltensparametrische Kennzeichnung eines sozioemotionalen Neurotisierungsprozesses an Rhesusaffen G. Z E S C H K E U. V . G. K R A S I L N I K O V : Abfall der lokalen Gehirntemperatur infolge von Konvektion (lokale Gehirndurchblutung) und Anstieg der lokalen Gehirnt e m p e r a t u r nach A k t i v i t ä t C H . K R E H E R U . S T . N I T S C H K O F F : Experimentell erzeugte neurogen-interozeptive H y p e r t o n i e bei der R a t t e K . T R E P T O W : Die D y n a m i k von Adaptations- und Maladaptationserscheinungen bei chronischer Einwirkung schwacher Belastungssituationen im Tierexperiment T H . S C H L E G E L U. K . H E C H T : Über die Anwendung verschiedener statistischer Verfahren zur Analyse von Biorhythmen (Periodizitäten bedingt-reflektorischer Prozesse im Minutenbereich) u n t e r emotionellem Stress und Trainingsbedingungen K.HECHT,

E.

G.

V.

I. P . LJOWSCHINA,

T H . SCHLEGEL,

M. POPPEI

U. K . T R E P T O W :

915 — 925 927 — 934

935 — 941 943 — 950

951—962

963 — 971

Zur

tagesperiodischen D y n a m i k von Periodizitäten bedingt-reflektorischer Prozesse im Minutenbereich E N G L E R , D. M A T T H I A S , H . - J . H E R R M A N N U . C . - H . B E C K E R : Untersuchungen zur Blutdruckwirksamkeit verschieden hoher Dosen Angiotensin I I in Depotf o r m bei R a t t e n u n t e r definierten Umweltbedingungen M A R T I N , H . B A U M A N N U . F . G R I E G E R : Der E f f e k t von Angiotensin II-Depotapplikationen auf bioelektrische funktionelle Prozesse des Zentralnervensystems M O R I T Z , T . H E C H T U. K . H E C H T : Glukosetoleranz postnatal streßsensibilisierter Albinoratten nach chronischem Emotionsstreß im erwachsenen Alter . .

973 — 982

983 — 994

995 — 1008 1009 — 1017

Kurzmitteilungen Biochemie. T . S C H E W E U. W . M Ü L L E R : H e m m u n g der A t m u n g s k e t t e durch die Alkaloide Berberinsulfat, Alpinigenin und T e t r a h y d r o p a l m a t i n 1019 — 1021 Toxikologie. M. D R Ö Z D Z U. E. K U C H A R Z : Die W i r k u n g chronischer Stickstoffdioxydbelastung auf den Gehalt der Kollagenfraktionen in der H a u t von Meerschweinchen ' . . . . 1023 —1025 Immunologie H . D R E S S E L : Zur Untersuchung von N a t r i u m n u k l e i n a t durch den Limulusamöbozytenlysattest 1027 — 1029

Inhaltsverzeichnis Immunologie. G . S I E G E L U. J . W I L K E : Die Akkumulation von Immunglobulinen in der menschlichen Tonsille Buchbesprechung Biochemie. H . R E I N , G . - R . J A N I G , W . W I N K L E R und K . R U C K P A U L : Zirkulardichroismus von partiell gereinigtem Cytochrom P-450 aus Lebermikrosomen des Kaninchens Pharmakologie. I . P A E G E L O W , S . R E I S S M A N N und H . A R O L D : Befunde zur Kalziumabhängigkeit der Bradykininwirkung am isolierten Längsmuskel des Meerschweinchenileums Errata

XI

-1031 — 1033 1035 — 1036

K41 — K50 K51— K56

H e f t 8/9 Vorwort

1037

Prostaglandinbiosynthese : Essentielle Fettsäuren und Prostaglandine 1041 — 1049 u. H . B E K E M E I E R : Der Einfluß von Divasan®, Psychopharmaka und anderen Substanzen auf die Prostaglandinbiosynthese und die Wirkung der.Prostaglandine 1051-1052

D . A . VAN DORP

E.

VOGEL, A . J . GIESSLER

Kardiovaskuläre Wirkungen von Prostaglandinen und Fettsäuren S A M U E L S S O N : Prostaglandinendoperoxidasen und Thromboxane: Ihre Rolle in Blutplättchen sowie in vaskulären und respiratorischen glatten Muskeln G . H O R N S T R A U. A. J . V E R G R O E S E N : Die Wirkungen von Linolsäure und Prostag-landin E j (PGEj) auf die Arterienthrombose S I G M U N D U R G U D B J A R N A S O N U. J O N A S H A L L G R I M S S O N : Prostaglandine und polyungesättigte Fettsäuren im Herzmuskel O . D. Mjas, M. F. O L I V E R U. R . A. R I E M E R S M A : Prostaglandin E 1 ; freie Fettsäuren und Myokardischämie R. B O R O Y A N : Vergleichende Wirkung der Prostaglandine E 1( E 2 , Aj, F l a und F 2 a auf den Widerstand der Koronargefäße bei inträkoronarer Applikation . . . R. L. J O N E S : Wirkungsorte der Prostaglandine am kardiovaskularen System insbesondere beim Schaf R. J . G R Y G L E W S K I : Prostaglandine und der Wirkungsmechanismus von Pharmaka im Kreislaufsystem L. G R O D Z I N S K A , B. P A N C Z E N K O U. R. G R Y G L E W S K I : Hemmung der Freisetzung von Prostaglandin E-ähnlichem Material durch entzündungsverhütende NichtSteroid-und Steroidpharmaka . . . .* W. F Ö R S T E R : Prostaglandine und Prostaglandinvorstufen als endogene antiarrhytmische Wirksubstanzen des Herzens D. M A N N : Die Wirkung der Prostaglandine auf Herzarrhythmien L. S Z E K E R E S , J . B O R B O L A J R . u. J . G Y . P A P P : Die Herzwirkung von Arachidonsäure A. W E N N M A L M : Endogene Prostaglandine als Regulatoren der autonomen Neurotransmission im Kaninchenherzen P . H E D Q V I S T : Aktivitäten der Prostaglandine und Prostaglandinendoperoxide an adrenergen Neuroeffektorverbindungen

BENGT

1055 — 1063 1Ö65 — 1068 1069—1080 1081 — 1082 1083 —1090 1091 — 1096 109 7 — 1098 1099—1100 1101 — 1 1 1 2 1113 — 1117

1119—1126 1127—1133

1135 — 1139

Inhaltsverzeichnis

XII

Wirkungen der Prostaglandine beim Endotoxinschock des Hundes H. M A L M R O S : Die Ätiologie und Pathogenese der Atherosklerose P. M E N T Z K . - E . B L A S S U. W. F Ö R S T E R : Wirkungen der Prostaglandinvorstufen und anderer ungesättigter Fettsäuren auf den Koronarkreislauf und die Herztätigkeit in vivo und in vitro K.-E. B L A S S , U . Z E H L U. W . F Ö R S T E R : Einfluß von Adenosin und Prostaglandinen auf Regulationsprozesse des Koronarkreislaufs: Untersuchungen in vitro und in vivo H . - U . B L O C K U. W . F Ö R S T E R : Einfluß von Oxyfedrin und Prenylamin auf die Biosynthese der Prostaglandine E 2 und F 2 a im Kaninchennierenmark . . . P. M E N T Z , H . O P I T Z U. W . F Ö R S T E R : Wirkung ungesättigter Fettsäuren und Prostaglandine auf die Erregungs- und Kontraktionsparameter im Meerschwei nchenherzen W. W A R B A N O W : Die Wirkung von Prostaglandin E x und F 2 a auf die mechanische Aktivität isolierter Rattenherzmuskelzellen in der Kultur U . Z E H L U. W . F Ö R S T E R : Einfluß der H e m m u n g der Prostaglandinsynthese auf Herzhistamineffekte . . C H R . G I E S S L E R , P. M E N T Z , B . - L . B A Y E R U. W. F Ö R S T E R : Die Wirkung von Phospholipase A auf isolierte Herzpräparate V A L E R I A K E C S K E M E T I , K . K E L E M E N u. J . K N O L L : Dosisabhängige Wirkung der Prostaglandine auf das Membranpotential des Herzens M. K R I S K A u. V. K O V A L C I K : Die Rolle der Prostaglandine im Mechanismus des Verschlusses des Ductus arteriosus Y. B A R A K A , H . B E K E M E I E R U. R. H I R S C H E L M A N N : Einfluß der Prostaglandine und anderer Substanzen auf die Permeabilität und die Vasoreaktivität in arteriosklerotischen R a t t e n C L A Y T O N H . S H A T N E Y U. R I C H A R D C . L I L L E H E I :

1141 — 1149 1151 — 1158

1159—1160

1161 —1162 1163

1165 — 1166 1167 —1168 1169—1170 1171 — 1172 1173 — 1174 1175 — 1176

1177 — 1178

Prostaglandine, Hypertonie und Niere E . E.

: Die renomedulläre antihypertensive endokrine Funktion . . P. W E B E R U. E . Ä N G Ä R D : Stimulierung und Hemmung der renalen Prostaglandinbiosynthese: Wirkungen auf die Nierendurchblutung und die Plasmareninaktivität H. M . M A R K O V : Prostaglandine und arterielle Hypertonie L . S O M O V A : Beziehung zwischen Prostaglandingehalt und Prostaglandinsynthetaseaktivität im Nierenmark renal hypertoner und spontan hypertoner Ratten Z. J U R U K O V A u. L . S O M O V A : Zur zytoplasmatischen Granulierung der renomedullären Interstitialzellen bei experimenteller Hypertonie J . B A R T H A : Wirkung der Indomethazin-induzierten Hemmung der Prostaglandinsynthese auf den Nierenkreislauf O . R I P K A , K . K U C E R O V A , J . L I N H A R T O V A , J . O R T U. J . P E L E S K A : Radioimmuntest renaler venöser Prostaglandine bei essentieller Hypertonie G . T R I E B E , H . - U . B L O C K U. W . F Ö R S T E R : Blutdruckverhalten salzbelasteter R a t t e n bei unterschiedlichem Linolsäuregehalt der Nahrung G . T R I E B E , C H . T A U B E , H . - U . B L O C K , U . W A R T N E R U. W . F Ö R S T E R : Der Einfluß linolsäurereicher und -armer Nahrung auf die renale Prostaglandinsynthese bei R a t t e n mit neurogener Hypertonie MUIRHEAD

1181 — 1193

CARIN LARSSON,

C H . T A U B E , K . P Ö N I C K E , I . H E I N R O T H , H . - U . B L O C K , P . M E N T Z U. W .

1195 — 1200 1201 — 1205

1207—1211 1213 — 1217 1219—1220 1221 — 1222 1223 — 1224

1225 — 1226

FÖRSTER:

Der Einfluß von Antihypertensiva auf Synthese und Stoffwechsel der Prostaglandine 1227—1228

XIII

Inhaltsverzeichnis

U . R . B A U M A N N : Kompensation der'Stressreaktionen der Plasmafettsäuren durch exogenes Prostaglandin E 2 bei Affen 1229—1230

M . L . MICHAILOV

Prostaglandinantagonisten B . FREDHOLM

: Prostaglandinhemmwirkungen des Polyphloretinphosphats

. . 1233 — 1239

Klinische Anwendung der Prostaglandine in der Gynäkologie und kardiovaskuläre Nebeneffekte Klinische Anwendung der Prostaglandine in der Geburtshilfe und Gynäkologie 1243-1247 U. R E T Z K E U . R . S C H W A R Z : Kardiovaskuläre Wirkungen intravenöser Infusionen von Prostaglandin F2A und Prostaglandin E 2 in der frühen Schwangerschaft . 1 2 4 9 - 1 2 5 0 H . H A L L E , P. H E N G S T U. H . - U . L A U : Intravenöse und extraamniotische Verabreichung von Prostaglandin F2A und Kontrolle des Elektrokardiogramms, Blutdrucks und der Pulsfrequenz 1251 F . J. BRUNNBERG:

Sonstige Beiträge U. F R I C K : Wirkung des Prostaglandins F 2 a auf Heparinozyten und fibrinolytische Spaltprodukte 1255 — 1256

G . F R I C K , G . G Ö R E T Z L E H N E R U.

R . NOACK, L . AUST, W . LÜDER, M . MÖHR, H . KARST, V . ERHARDT, H . - A .

KETZ

u. K . V E T T E R : Beziehungen zwischen Serumcholesterin und Ernährung. Relatives Gewicht, Alter und Geschlecht 1257 — 1258

H e f t 10 Biochemie Kupplung von Enzymen an modifizierte Styrol-Maleinsäureanhydrid-Kopolymere 1259—1265 T A U C H E R T , M . G R U N O W , H . H A R N I S C H U. H . A U R I C H : Reinigung und einige Eigenschaften der NADP + -abhängigen Alkoholdehydrogenase aus Acinetobacter calcoaceticus 1267 — 1272 N I S S L E R , W . S C H E L L E N B E R G E R , J . W O L F U. E. H O F M A N N : Der Einfluß von Temperaturänderungen auf das kinetische Verhalten von Hefephosphofruktokinase 1273 — 1277

R . B E R G E R , J . G O M O L L U. G . L A N G H A M M E R : H.

K.

Physiologie/Pathophysiologie U . F I S C H E R , H . H Ü M M E L , W . N O W A K , H . H A H N VON D O R S C H E , U . S I L L U . H .

LIP-

: Der Einfluß der Vagotomie auf die Glukosetoleranz sowie die Reaktionen von Plasmainsulin und exokriner Pankreasfunktion nach Glukosebelastung oder Nahrungsaufnahme bei Hunden U . F I S C H E R , H . H O M M E L , W . N O W A K , U . S I L L U. H . L I P P E R T : Der Mechanismus der Insulinsekretion nach oraler Glukosegabe. VII. Exokrine Pankreasfunktion und Plasma-IRI bei Hunden mit Pankreasfisteln I . P A E G E L O W , G . S C H Ö N F E L D E R , S T . N I T S C H K O F F U. B . F L E G E L : Zur Reaktion isolierter Arterien hypertoner Kaninchen L . H U M M E L , T . Z I M M E R M A N N , W . S C H I R R M E I S T E R U. H . W A G N E R : Synthese, Stoffwechsel und Kompartment-Analyse freier Fettsäuren in der Rattenplazenta PERT

1279 — 1291

1293 — 1300 1301 — 1310

1311 — 1316

Inhaltsverzeichnis

XIV M. F. G.

D. P L O O G : Läsionen des prämotorischen Vorderlappens und das Sozialverhalten bei Totenkopfaffen (Saimiri): Eine Pilotstudie 1317 — 1326 K Ö S S L E R , G . C A F F I E R U. G . K Ü C H L E R : Einfluß homologer n-Alkansäuren auf funktionelle Eigenschaften isolierter Skeletmuskeln. I. Muskelkontraktion . 1327 — 1334 C A F F I E R , F . K Ö S S L E R u. G . K Ü C H L E R : Einfluß homologer n-Alkansäuren auf funktionelle Eigenschaften isolierter Skeletmuskeln. II. Membranruhepotential und osmotische Alkansäureeffekte 1335 — 1340 P E T E R S U.

Pharmakologie D.

Zur Beeinflussung der kumulativen Kalzium-Dosis-Wirkungs-Kurve an der isoliert perfundierten peripheren Strombahn durch Spasmolytika 1341-1346 R . F E R M U M , U . K L I N N E R U. P. M E I S E L : Versuche zum Wirkungsmechanismus von Gefäßspasmolytika. I. Wirkung von Nitroprussid-Natrium, Nitroglyzerin, Prenylamin und Verapamil an der arretierten Kalium-induzierten Kontraktur isolierter Koronararterien 1347 — 1358 R . F E R M U M , U . K L I N N E R u. P. M E I S E L : Versuche zum Wirkungsmechanismus von Gefäßspasmolytika. II. Wirkung von Nitroprussid-Natrium, Nitroglyzerin, Prenylamin und Verapamil an der Lanthan-induzierten Kontraktur isolierter Koronararterien 1359—1364 R. STORCH U. H. B R Ä U N L I C H : Ausmaß und Dauer der Stimulation der renalen 1365 — 1371 Ausscheidung von p-Aminohippursäure durch Pharmaka B. T E R H A A G : Über Bindung und Verteilung von Chlordiazepoxid (Radepur®) und seiner Metabolite im Erythrozyten-Plasma- und Erythrozyten-Puffer-System 1373 — 1378 L A M P E U. I . M A I :

Immunologie V.

A. M A J S K Y , I. P O T M E S I L O V Ä U. J . J E L I N E K : Die Bildung von Heteroagglutinin bei Ratten, die durch Äthylpalmitat „chemisch" splenektomiert wurden, im Vergleich zu chirurgisch splenektomierten Tieren . . . . 1379—1383

SEBESTIK,

S . SCHNITZLER,

E . KARASEK,

B . MAUERSBERGER,

P . OEHME

U.

P . BUNTROCK:

Reaktion heterophiler Agglutinine mit L-Zellen und unterschiedliche Toxizität von Anti-AHP gegenüber Fibroblasten und L-Zellen in vitro 1385 — 1391

Kurzmitteilungen Zellbiologie. U. B E U T E L : Die Temperaturabhängigkeit der Sedimentationsgeschwindigkeit menschlicher Erythrozyten Zellbiologie. G . C S A B A U. S . U . N A G Y : Die Wirkung von Vertebratenhormonen auf den Gehalt an zyklischen AMP in Tetrahymena Physiologie. N . R O T H : Der Einfluß eingeschobener Zusatzreize auf die sensomotorische Reaktionszeit in Abhängigkeit vom Interstimulusintervall . . . Physiologie. N . R O T H , B . P Ö G E L T , M. G I R B A R D T u. D. G E L B R I C H : Zur Charakteristik von periodischen Schwankungen der Klopf frequenz beim Tapping . . Pharmakologie. H. B R Ä U N L I C H U. R. S T O R C H : Inulin-Clearance bei Stimulation der renalen Ausscheidung von p-Aminohippursäure durch Pharmaka . . . . Pharmakologie. B . T E R H A A G U. A. B O C K I S C H : Zur antihämolytischen Wirkung einiger Benzodiazepine an menschlichen Erythrozyten Immunologie. G . U H L E N B R U C H , G . S T E I N H A U S E N , P . H A N F L A N D , B . A. B A L D O U. O. P R O K O P : Blutgruppe H-ähnliche Aktivität in Rohpräparaten von Rinderlungengalaktan Buchbesprechung Erratum

1393 — 1397 1399 — 1401 1403 — 1406 1407 — 1410 1411 — 1414 1415 — 1417 1419—1421 1423 1424

Inhaltsverzeichnis

X V

H e f t 11 Biochemie H . - J . B Ö H M E U. E . H O F M A N N : Phosphofruktokinase aus der Schweineniere: Reinigung und qualitative Charakterisierung 1425 — 1435 B . G R O S S U. P. W E S T E R M A N N : Proteine tierischer Ribosomen. X X V . Durch Poly(U) gegen Substitution mit Methylazetimidat geschützte Proteine aus Rattenleberribosomen 1437 — 1442 W . S C H O P P , J . T H Y F R O N I T O U U. H. A U R I C H : Kinetische Eigenschaften von Enzymen, insbesondere der Hefe-Alkoholdehydrogenase, nach ihrer Adsorption an Polyaminomethylstyrol 1443 — 1453 J . B L A N C K , G . S M E T T A N , G . - R . J Ä N I G U. K. R U C K P A U L : Kinetik der Elementarstufen in der Reaktionsfolge von Zytochrom P - 4 5 0 . I . Substratbindung an Zytochrom P - 4 5 0 L M 1455-1463 N . Q. KHANG,

Zellbiologie A.

B . J . T H I E L E U. C H . C O U T E L L E : E i n zellulärer RNS-Synthese-Test mit Rattenknochenmark und seine Anwendung bei der Testung von Kryoprotektiva und zur Erfassung von Schadstoffen H. J A H R U. H. Z Ü H L K E : Oxydoreduktasen und Hydrolasen als Markerenzyme f ü r die Ultrazentrifugierung Langerhansscher Inseln der R a t t e H . J A H R , B . W I L K E , D . G O X X S C H L I N G , H . Z Ü H L K E u. H . F I E D L E R : (Pro)Insulinbiosynthese isolierter Langerhansscher Inseln der Sandratte und der Wistarratte K . R E D M A N N , S . W A L L I S E R , W . K A L K O F F u. W . W E U F F E N : Zum Membraneffekt von Kaliumrhodanid und Methotrexat H . L . J E N S S E N , H . W E R N E R u. H . K Ö H L E R : Lymphokine, die die elektrophoretische Mobilität von Makrophagen beeinflussen DAENE,

1465 — 1475 1477—1486

1487—1492 1493 — 1498 1499 — 1503

Physiologie/Pathophysiologie Dynamisches Grobmodell des Blutdruckregelkreises vom Menschen auf der Grundlage orthostatischer Belastungsfolgen W . D . P F E I F F E R , L . C . D A V I S U . C H . D . V A N D E R V E L D E : Lithiumanreicherung im endokrinen Gewebe G . H I N Z , D . T H I E L E U . G . D Ö R N E R : Einfluß pränataler Unterernährung auf die spätere Gewichtsentwicklung bei Meerschweinchen J . G Ü N T H E R , A. O D D O Y U . E . S C H U B E R T : Die Wirkung von Anoxie auf Energiebereitstellung und isotonische Arbeitsleistung des Froschherzventrikels . . CH. FRITZSCH:

1505 — 1518 1519—1523 1525 — 1532 1533 — 1540

Pharmakologie M. D R Ö Z D Z : Serumglykoproteingehalt und urinäre Ausscheidung von Glykosaminoglykanen bei einem pharmakologisch erzeugten kollagenähnlichen Syndrom in Meerschweinchen 1541 — 1545 S O B Ä N S K I , J . K R U P i r i s K A , B . C E B O , J . M A Z U R U. A. K I E Ö - D E M B I N S K A : Antioxydanzien als Verstärker der entzündungsverhütenden Wirkung von Indomethazin 1547—1551

E . K U C H A R Z U.

H.

Immunologie H.

H. J . S T Ö R L U. H. B A R T H E L M E S : Untersuchung zur Spezifität eines Antiserums gegen denaturierte DNS aus Sarcina maxima 1553 — 1559

SIMON,

Inhaltsverzeichnis

XVI G.

J . B . A L E X A N D E R : Immunreaktion der Forelle (Salmo trutta auf Injektion löslicher Antigene

A . I N G R A M U.

L.)

1561 — 1570

Biochemie. H . H O P P E U. G. A . C U M M E : Ein Programm zur Berechnung von Konzentrationen freier Metabolite, Metallionen und ihrer Komplexe im chemischen Gleichgewicht 1571 —1573 Immunbiologie. P . Z I S K A : Hemmungsstudien zur Wechselwirkung von Lektin aus Vicia faba mit Kohlenhydraten 1575 —1576 Biochemie. R . M I S S E L W I T Z , M . B E C K E R , E . B U D E R , G . D A M A S C H U N U. D . Z I R W E R : CD-Untersuchungen an kondensierter DNS in NaCl-Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung K57 —K61 Physiologie. G . N O W A K , J . H O F F M A N N U. F . M A R K W A R D T : Bestimmung der Mikrothrombosierungsrate bei experimentell induzierter disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC) K63 — K68 Pharmakologie. R . M O R G E N S T E R N U. R . B L U T H : Untersuchungen zum Empfindlichkeitsverlust des glatten Muskels K69 —K75 Pharmakologie. U . Z E H L , C H . R I T T E R u. W . F Ö R S T E R : Einfluß von Prostaglandinen auf die Adenosinfreisetzung und von Adenosin auf die Prostaglandinfreisetzung im isolierten Kaninchenherzen K77 —K82

Heft 12 Biochemie Abbau von Insulin durch transformierte, kultivierte Mäusefibroblasten (L-Zellen) E . B U S S E U. H. B A N A S C H A K : Nachweis von Adenylatzyklase-Aktivität in der Arteria coronaria des Rindes E . B U S S E : Nachweis von Guanylatzyklase-Aktivität in der Arteria coronaria des Rindes E . B U S S E U. H. B A N A S C H A K : Nachweis von Proteinkinase-Aktivitäten in der Arteria coronaria des Rindes G . H E D E R , S . A N S O R G E , J . A X T U. B . M A U E R S B E R G E R :

1 577—1 586 1587 — 1594 1595 — 1601 1603 — 1611

O. RISTAU U. H. REIN : Quantitative Analyse von Absorptionsspektren und Spektren der magneto-optischen Rotationsdispersion von Hämoproteiden unter Berücksichtigung der Nullfeldaufspaltung. I. Analyse des Dikations vom Deuteroporphyrin in derQ-Bandenregion 1613 — 1624 P. LANGEN,

S. R . WASCHKE,

K . WASCHKE,

D . BÄRWOLFF,

J. REEFSCHLÄGER,

5-Formyl-2'-desoxyuridin: zytostatische und antivirale Eigenschaften und mögliche Wirkungsweisen . . . 1625 — 1633 P.SCHULZ,

B . P R E U S S E L U. C . L E H M A N N :

Physiologie/Pathophysiologie L.HUMMEL,

A . SCHWARTZE,

W . SCHIRRMEISTER

U.

H.WAGNER:

Mütterliche

Plasmatriglyzeride als Quelle für fetale Fettsäuren 1635 — 1641 K . C . K A N W A R U. V. C H A U D H R Y : Jahreszeitlich bedingte reproduktive Periodizität und Schwankungen der Schilddrüsenfunktion beim weiblichen indischen Palmeneichhörnchen (Funambulus pennanti) 1643 — 1649 V. P R Ä T , M. H A T A L A , O. S C H U C K U. V. B O H U S L A V : Einfluß einer Wasserdiurese auf den Verlauf einer experimentellen E . coli-Bakteriurie nach einseitiger Nephrektomie bei Ratten 1651 — 1656 B . NILIUS, W . BOLDT U. G . FECHNER: A u s w i r k u n g e n d e r H y p e r t r o p h i e a u f d a s

Potentiationsverhalten isolierter Ventrikelstreifen der R a t t e

1657 — 1664

Inhaltsverzeichnis

XVII

Pharmakologie J.

F. M A R K W A R D T , G. W A G N E R U. P. W A L S M A N N : Synthetische Hemmstoffe der Serinproteinasen. 13. Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehungen bei der H e m m u n g von Trypsin, Plasmin und Thrombin durch 4Amidinophenylverbindungen mit K e t o n s t r u k t u r 1665 — 1676

STÜRZEBECHER,

Immunologie : Die Beeinflussung von Immunreaktionen durch Antigen-Immunsuppressivum-Konjugäte. I. Arbeitshypothese zur I n d u k t i o n antigenspezifischer Suppression mittels Antigen-Immunsuppressivum-Konjugaten . . . K . D R Ö S S L E R , H . F I E B I G U. H . A M B R O S I U S : Die Beeinflussung von Immunreaktionen durch Antigen-Immunsuppressivum-Konjugate. II. Immunogenität von Trägerprotein-Konjugaten H. F I E B I G , K. D R Ö S S L E R , W. U L B R I C H U. H . A M B R O S I U S : Die Beeinflussung von Immunreaktionen durch Antigen-Immunsuppressivum-Konjugate. III. Physikochemische, antigene und funktionelle Eigenschaften von Trägerproteinen nach Ankopplung von 6-Merkaptopurin K. D R Ö S S L E R U. H. A M B R O S I U S : Die Beeinflussung von Immunreaktionen durch Antigen-Immunsuppressivum-Konjugate. IV. Untersuchungen zur spezifischen Suppression der humoraleri I m m u n a n t w o r t beim Meerschweinchen durch Antigen-Immunsuppressivum-Konjugate P . K R O P P E , K . D R Ö S S L E R U. H . A M B R O S I U S : Untersuchungen über die Bedeutung des Antigens bei der durch 6-Merkaptopurin beeinflußten humoralen I m m u n a n t w o r t des Meerschweinchens

H . AMBROSIUS

1677—1685

1687 — 1697

1699—1709

1711 — 1720

1721 — 1728

Kurzmitteilungen Biochemie. D . Z I R W E R , G . D A M A S C H U N , M . B E C K E R , E . B U D E R u. R . M I S S E L W I T Z : Faltenkristallisation der D N S . Zirkulardichroistische Untersuchungen 1729—1735 Biochemie. W. M Ü L L E R u. T. S C H E W E : Zur Wirkung einiger Atmungshemmstoffe auf den Tetramethyl-p-phenylendiamin-Kurzschlußweg in nicht-phosphorylierenden Rinderherz-Elektronentransportpartikeln 1737—1740 Biochemie. V . W U N D E R L I C H , S T . Z O T T E R U. G . S Y D O W : RNS-abhängige D N S Polymerase-Aktivität in intrazytoplasmatischen A-Partikeln aus Mammatumoren der Maus 1741 — 1744 Pharmakologie. E . G Ö R E S , G . R Ö S N E R , K . S P I T T K A U. I . K I E N A S T : Die Wirkung von Bis-(p-Chlorphenoxy)essigsäure auf die Serumlipide 1745 — 1747 Immubiologie. M . K O T Z S C H , J . I R M S C H E R , R . F I S C H E R , G . H E I D L u. M . M Ü L L E R : Untersuchungen zur immunologischen Spezifität des Makrophagen-Elektrophorese-Mobilitätstests bei Mäusen mit syngenen und allogenen Mammakarzinom-Transplantaten . .' 1749—1753 Buchbesprechung 1755 — 1756 Biochemie. U. Z E L C K , U. K A R N S T E D T U. P . L A N G E : Bestimmung der Ca 2 + -Aufn a h m e durch mikroskopische Membranen aus der Koronararterie des Schweins mit Hilfe einer Ca-ionen-selektiven Elektrode K83 — K88

SACHWORTVERZEICHNIS Adenosin, -freisetzung durch Prostaglandine K77 —, kardiovaskuläre Wirkungen 1161, K77 —, Koronardilatation durch — 517 —, Prostaglandinfreisetzung durch — K77 Adenylatzyklase, in der Arteria coronaria 1587 —, Beeinflussung durch Diisopropylfluorphosphat 87 —, in Erythrozyten 523 —, hormonelle Stimulierung 829 —, intrazelluläre Verteilung 837 —, im Skelettmuskel 837 Adrenalin, cGMP als -antagonist 845 Adrenokortikotropin, Einfluß auf L e b e r - u n d Serumcholesterin 757 /S-Adrenolytika, Struktur-Wirkungs-Beziehungen 79 Agghitinine,-bildung nach Splenektomie 1379 —, Reaktion heterophiler — 1385 Alkaloide, als Atmungshemmstoffe 1019 Alkansäuren, Einfluß auf Skelettmuskeln 1327,1335 Alkoholdehydrogenase, Reinigung und Eigenschaften 7, 1267 —, Tetradekanolumsatz durch — 7 —, Trägerfixierung 1443 Amine, biogene, Wirkung auf cAMP-Gehalt 259 Aminosäureoxydase, Stabilität der — 175 Anästhetika, Beziehung der -Wirkung zum Hirnazetylcholingehalt 805 —, kardiovaskuläre, respiratorische und metabolische Veränderungen durch — . . 605 Angiotensin, Blutdruckwirkung von Depot- — 983 —, Wirkung auf evozierte Potentiale 995 Antigen-Immunsuppressivum-Konjugate, Einfluß auf Immunreaktionen . . . 1677,1687, 1699,1711 Antihypertensiva, Einfluß auf Prostaglandinstoffwechsel / 1227 Antikörper,-bildung nach Splenektomie 1379 —, DNS-spezifische 93, 1553 Antilipämische Wirkstoffe 1745 Antioxydanzien 1547 Arekolin, Einfluß auf s y n a p t o s o m a l Phosphatase 69 Arrhythmie, Beeinflussung durch Prostaglandine 63 Arterien, Proteinkinasen in — 1603 —, Purinnukleotidzyklasen in — 1587,1597 —, Reagibilität isolierter — 1301 Arylaminopeptidase, aus Nierenmikrosomen 379 Atherosklerose, Ätiologie und Pathogenese ...1151 Atmungshemmstoffe 693,1019,1737 ATPase, synaptosomale — 69 —, in glattmuskulären Zellen 453 Azetylcholin, Beeinflussung der kortikalen-freisetzung 485 —, Beziehungen zwischen — und Narkoseverlauf 805 Bakteriourie, Wasserdiurese und — Biorhythmen, Analyse von — Bisamidine, Einfluß auf Blutgerinnung und Fibrinolyse Blutdruckerhöhung, siehe Hypertonie . . . Blutdruckregulation, Beeinflussung durch Stress —, dynamisches Modell der — —, Hippokampusfunktion und — Blutgerinnung, Beeinflussung durch Bisamidine

1651 963, 973 635 23, 47 1505 35 63 5

XX

Sachwortverzeichnis

Blutgruppensubstanz,-ähnliche Wirkungen von Galaktanen Bradykinin, Kalziumabhängigkeit der -Wirkung —, Potenzierung der -Wirkung

1419 K51 23 5

CGL-Zellen, Entladungsverhalten von — Cholesterin, als atherosklerotischer Faktor —, Beeinflussung des -gehalts durch Adrenokortikotropin Cholinesterase, Beeinflussung durch K a r b a m a t e —, -reaktivatoren Chronobiologie, bei Koronararterienwandschädigung Coxsackievirus, Myokarditis durch -infektion

221 1151 757 479 657 559 103

Desoxyribonukleinsäure, CD-Spektren von — —, -spezifische Antikörper —, Komplexbildung mit Histonen —, RNS-abhängige -polymerase aus A-Partikeln Desoxyuridin, 5-Formyl-2'—, biologische Effekte Dijodthyrosin-Dejodase, bei Immunisierungsprozessen Diskriminanzanalyse Diurese, bei Bakteriourie Druckrezeption, Beeinflussung durch Elektrolyte Einenzymreaktoren, chemische Oszillationen in — Elektrolyte, Einfluß auf Druckrezeption Elektromyogramm, Beeinflussung durch Sukzinimide Elektronenspektren, von Hämoproteiden Enzyme, Trägerfixierung Ernährung, pränatale Unter- und Gewichtsentwicklung Erythrozyten, Adenylatzyklase in — —, Agglutination durch Mistelextrakte —, Pharmakabindung —, Temperaturabhängigkeit der Sedimentation —, Wirkung von Benzodiazepinen auf — Erythrozytenmembran, 3 3 P-Einbau in die —

1729, K57 93,1553 679 1741 1625 687 73 1651 745 393 745 763 1613 673, 735, 1259, 1443 1525 523 123 709,1373 1393 1415 155

Fazilitation, Psychopharmaka und — 613 Fettsäuren, Beeinflussung der Plasma- durch Stress und Prostaglandine 1229 —, Einfluß auf Prostaglandinsynthese 1225 —, Freisetzung aus Triglyzeriden 1635 —, kardiovaskuläre Wirkungen 1065,1069,1081,1119,1159,1165,1223 —, Stoffwechsel in der Plazenta 1311 Fettsucht, frühpostnatale Überernährung und — 799 —, Gewebs- und Serumlipide bei — 183 Fibrinolyse, Beeinflussung durch Bisamidine 635 Fluvographie 553 Fortran-Programm, f ü r Komplexgleichgewichte 1571 Fungizide, als mitochondriale Atmungshemmstoffe 693 Galaktan, blutgruppensubstanzähnliche Wirkungen Gehirn, Adenylatzyklase und cAMP im — —, Beziehungen zwischen -temperatur und -durchblutung —, -proteine und Lernprozeß —, Glukosestoffwechsel im — —, Li + -Wirkung auf -enzyme Glukagonsekretion, im isolierten Pankreas

1419 87 935' 213 853 115 421, 439

Sachwortverzeichnis Glukoneogenese, Glyzerinkinase und — Glukose,-stoffwechsel im Gehirn Glukosetoleranz, Beeinflussung durch Vagotomie —, nach postnatalem Stress —, bei spontaner Hypertonie Glykoproteine, Serum- beim Kollagendsyndrom Glyzerinkinase, und Glukoneogenese Glykosaminglykane, Ausscheidung beim Kollagensyndrom Guanylatzyklase, in der Arteria coronaria Hämoproteide, Analyse mittels Elektronenspektren Hefe, -ADH - , -PFK Hemmstoffe, von Serinproteinasen Herz, Adenylatzyklase und zyklische Nukleotide im — —, cAMP-stimulierte Ca 2+ -Äuf nähme —, Energiewechsel im -muskel bei Anoxie —, Nukleotidhydrolasen im — —, Potentiationsverhalten isolierter -muskelstreifen —, in vitro-Kultivierung von -muskelzellen Hippokampusfunktion, und Lernbelastung Hippokampusläsion, Stresswirkung bei — Histon, DNS - Komplexe Hormone, Einfluß auf zyklische Nukleotide Hypertonie, Angiotensin-bedingte — beim Schwein —, arterielle, durch Stress —, durch Barorezeptoren-Ausschaltung —, durch Depot-Angiotensin —, Insulinkinetik, Glukosetoleranz und Lipidstoffwechsel bei — —, neurogen-interozeptive — Hypertonie, neurogene — —, Prostaglandine und — — .renale— Hypothyreose, Wirkung auf den Genitaltrakt

XXI 141 853 1279 1009 K33 1541 141 1541 1 595 1613 7 1273 1665, K l 87, 819, 829, 845 529 1533 167 '. . 1657 245,265,845,1167 35 881 679 819, 829, 1399 491 881, 889, 915 943 983 K33 943 1225 1201, 1221 1181,1207 205

Immunoglobuline, in menschlichen Tonsillen 1031 Immunreaktion, bei Fischen 1561 Immunsuppression 1677, 1687, 1699, 1711, 1721 Immunsuppressivum-Antigen-Konjugate, Einfluß auf Immunreaktion 1677, 1687, 1699, 1711 Immunzellen, Beeinflussung durch Immunsuppresivum-Antigen-Konjugate . . 1677,1687 1699,1711 —, Säulenfraktionierung von — 663 Insulin, Abbau durch Fibroblasten 1577 — , Pro-synthese in isolierten Inselzellen 1487 Insulinkinetik, bei spontaner Hypertonie K33 Insulinsekretion, Beeinflussung durch Vagotomie . 1279 — , im isolierten Pankreas 421,583 —, nach oraler Glukoseapplikation 1293 Isatin, ß-Isothiosemikarbazone, virostatische Wirkung 73 Ivarbamate, Anticholinesterase-Wirkung Karnitin, L — als Basis cholinomimetischer Substanzen Kathepsine, Isolierung und Eigenschaften Kationenselektivität, des Skelettmuskels Knochenmark, RNS-Synthese im —

479 645 269, 285 15 1465

XXII

Sachwortverzeichnis

Kollagen,-syndrom —, Stickstoffdioxydeinfluß auf — Kortex, Sozialverhalten nach-läsion Kryoprotektiva Leber, Beeinflussung des Cholesteringehalts durch ACTH —, Kathepsine aus — —, -lipide bei Fettsucht —, Proteine aus -ribosomen —, Proteolyse von -proteinen Lektine Lernprozesse, bedingt-reflektorische — —, Gehirnproteine und — —, Hippokampusfunktion und — —, nach Koronararterienwandschädigung —, Stressintensität und — Leuzinaminopeptidase, Affinitätsmarkierung der —, Aktivierung —, Dissoziations-und Reassoziationsverhalten —, Glutathioneinfluß auf die — —, H o l o - u n d Apoenzymstruktur —, spektroskopische Eigenschaften Linsenepithel, Kultivierung von -zellen Lipide, Gewebs- und Serum- bei Fettsucht Lipidstoffwechsel, bei spontaner Hypertonie Lithium, Akkumulation in endokrinen Geweben —, Einfluß auf Gehirnenzyme Lymphokine, Einfluß auf Makrophagen Lymphozyten, Einfluß von Mukoproteiden auf — —, Isolierung von T —, Lymphokine aus — Lysosomen, Kathepsine aus —

1541 1023 1317 1465 757 269, 285 183 401,1437 301 123,1557 867 213 35 559 23 365 325 331 359 353 343 413 183 K33 1519 115 1499 . . . 813 663 1499 269, 285

Makrophagen, Beeinflussung durch Lymphokine —, Elektrophorese-Mobilitätstest Mikrosomen, Arylaminopeptidase aus — — .ATPasen in— —, cAMP und Proteinkinase in — - , Ca 2 + -Bindung durch —, Zytochrom P-450 in — 627, 1455, K19, K27, Mistelextrakte, Agglutination von Blut- und Tumorzellen durch — Mitochondrien, Atmungshemmstoffe der — 693, 1019, —, ATPasen in — —, cAMP-abhängige Proteinkinase in — Muskel, siehe Skelettmuskel und Herz Mukoproteide, Einfluß auf Lymphozyten Myokard, siehe Herz Neurohormone, Wirkung auf Herzventrikelzellen Neuronen, exzitatorische Reaktionen auf Hautreize —. Spontanaktivität und Reizantwort Niere, antihypertensive Funktion — Beeinflussung der Ausscheidungsfunktion —, Beeinflussung der -ndurchblutung —, Prostaglandinbiosynthese

1499 1749 379 453 529 K83 K41 123 1737 453 K9 813

265 597 571 1181 787,1365.1411 1195, 1219 1195,1207

Sachwortverzeihnis Nierenstoffwechsel, optimiertes Substratgemisch f ü r — Noradrenalin, Bindung an Erythrozyten Nukleotide, zyklische, -abhängige Proteinkinase —, —, Bindungsproteine f ü r — —, —, biogene Amine und — - , — , Einfluß auf Ca 2 + -Aufnahme — , — , bei Einzellern — , — , in Herz und Gehirn —, —, als Hormonantagonisten —, —, hormonelle Stimulierung der -bildung — , —, bei physischer Belastung —, —, Proteinbindungstest f ü r — —, —, Spaltung durch Nukleotidhydrolase Nukleotidhydrolase, cAMP-spaltende — . . . •

XXIII 723 709 K9 543 259 529 1399 87 845 819 111 543 167 167

Pankreas, -funktion nach Vagotomie 1279 —, -funktion nach oraler Glukoseapplikation 1293 — , I n s u l i n - u n d Glukagonsekretion 421, 439, 583 —, Markerenzyme isolierter -inselzellen 1477 —, Proinsulinsynthese in -inselzellen 1487 Phenylalaninhydroxylase, in vivo-Stimulierung mit Pterinen 675 Phosphatase, synaptos.omale 69 Phosphatide, Stoffwechsel der — in Erythrozytenmembranen 155 Phosphatidylcholin, fettsäurespezifisch substituiertes — 1 Phosphofruktokinase, Reinigung und Eigenschaften 1273,1425 Phospholipase A, kardiovaskuläre Wirkungen ; . . 1171 Plasma, Fettsäurefreisetzung aus-triglyzeriden 1635 —, Pharmakabindung an -proteine 1373 Plazenta, Fettsäurestoff Wechsel in der — 1311 Potentiale, Beeinflussung der Muskelruhe— durch Alkansäuren 1335 — .evozierte 55,889,995 —, Regulation zellulärer Ruhe— 715 Prostaglandine, Antagonisten .• 1233 —, Biosynthese 119, 121, 1041, 1051, 1163, 1195,1219, 1225, 1227 Einfluß auf Blutzellen 1255 —, Einfluß auf Plasmafettsäuren 1229 —, hypertensive Wirkungen 1181 —, kardiovaskuläre Wirkungen . . . 63,517,1055,1065,1069,1081,1083,1091,1097, 1101, 1113, 1127, 1135, 1141, 1159, 1161, 1165, 1169, 1173, 1175, 1177, 1195, 1201, 1249, 1251, K 7 7 —, klinische Anwendung 1243, 1249, 1251, 1255 — , — und Nierenfunktion 1195,1207 —, -synthetase 1207 Proteinasen, lysosomale — 269, 285 —, synthetische Hemmstoffe der Serin — 1665, K l Proteine, Gehirn- und Lernprozesse 213 —, Phosphorylierung 529 543, 1603, K 9 —, ribosomale — 401, 1437 Proteinkinasen 529, 543, 1603, K 9 Proteolyse 269, 285, 301, 735 Psychopharmaka, Einfluß auf kortikale Potentiale 613 Pterine, Stimulierung der Phenylalaninhydroxylase durch — 675 Reaktion, Beeinflussung nigrostriatal induzierter motorischer -en Renin, Plasma-aktivität Revertase

773, 781 1195, 1221 . . 1741

XXIV

Sachwortverzeichnis

Rezeptoren, Anti-Anp R h o d a n i d , M e m b r a n w i r k u n g von -ionen Ribonukleinsäure, Biosynthese in Knochenmarkzellen Ribosomen, Proteine tierischer — R u b r e d o x i n , aus Acinetobacter

Schwefelstoffwechsel, S 0 2 - B i n d u n g d u r c h A m m o n i a k Serinproteinasen, synthetische H e m m s t o f f e der — Serum, Beeinflussung des Cholesteringehalts im — —, -glykoproteine, beim Kollagensyndrom —, -lipide bei F e t t s u c h t Skelettmuskel, Adenylatzyklase im — —, Alkansäurewirkungen a m — —, kalziumbindende S t r u k t u r e n —, K a t i o n e n s e l e k t i v i t ä t S o m a t o s t a t i n , E i n f l u ß auf Glukagonsekretion Spasmolytika, W i r k u n g s m e c h a n i s m u s Stickstoffdioxid, E i n f l u ß auf Kollagen Streptokinase, thrombolytische W i r k u n g Stress, Adaptationsprozesse bei -reizung —, B i o r h y t h m e n beim emotionalen —, E i n f l u ß auf chemische Regulationen —, — — zerebro-viszerale F u n k t i o n e n —, evozierte Potentiale beim emotionalen — —, Glukosetoleranz und — —, informationstheoretische -Verarbeitung —, kardiovaskuläre P a r a m e t e r beim — —, u n d P r o s t a g l a n d i n e —, sozio-emotionaler Neurotisierungs—, -Wirkung bei Hippokampusläsion —, zerebraler Glukosestoffwechsel beim Hypokinese — —, zyklische Nukleotide u n t e r — S t r o p h a n t h i n , E i n f l u ß auf kortikale Azetylcholinfreisetzung Sukzinimide, E i n f l u ß auf E M G - P a r a m e t e r Tappingfrequenz, periodische Schwankungen der — Tetradekanol, -umsatz d u r c h H e f e - A D H Thrombolyse, mittels Streptokinase Thrombose, B e s t i m m u n g der MikroTrägerfixierung, von E n z y m e n Transamidinase, Organ- u n d Subzellularverteilung —, Repression der — Triglyzeride, Beeinflussung des -gehaltes im Serum —, F e t t s ä u r e f r e i s e t z u n g aus Plasma-n Trypsin, Trägerfixierung von — Tumorvirus Tumorzellen, Agglutination d u r c h Mistelextrakte Ungleichgewichtssystem, Donnan-osmotisches — Vagotomie, P a n k r e a s f u n k t i o n nach — Virostatika Virusmyokarditis

1385 1493 1465 401,1437 443

501 K l , 1665 757, 1745 1541 183 837 1327, 1335 15 15 439 1341,1347,1359 1023 193 951 963 23 23 889 .1009 867 23,47,915 1229 915,927 881 853 819 485 763 1407 7 193 K63 673, 735, 1443 309 317 1745 1635 673 . 253,1741 123 715 1279 73, 1625 103

Sachwortverzeichnis Zirkulardichroismus, von DNS —, von Zytochrom P-450 Zyklische Nukleotide, siehe Nukleotide Zytochrom P-450, CD-Spektren —, CO-Komplexe —, Substanzbindung durch — —, Substratbindung durch — Zytostatika

XXV .1729, K57 K41 K41 K27 627 1455, K19 1625

A U T O R E N V E R Z E I C H N I S ABREU, L . A IIS ABREU, R . R 115 ÄNGGÄRD, E 119S ALEXANDER, J . B 1561 AMBROSIUS, H . . 1 6 7 7 , 1 6 8 7 , 1 6 9 9 , 1 7 1 1 , 1 7 2 1 ANSORGE, S 269,285,301,1577 AROLD, H 235, K 5 1 ARYA, M 205 ASPERGER, 0 443 AURICH, H 7, 1 7 5 , 4 4 3 , 1 2 6 7 , 1 4 4 3 AUST, L 1257 AXT, J 1577 BÄRWOLFF, D BAJGAR, J BALDO, B . A BANASCHAK, H . BANSI, D BARAKA, Y BARTHA, J BARTHELMES, H BAUMANN, H BAUMANN, R BAYER, B . - L BEEKER, C . - H BECKER, M BEKEMEIER, H BELSARE, D . K BERCHER, H BERGER, R BEUTEL, U BIELKA, H BIERWOLF, B BLANCK, J BLASCHKE, M BLASS, K . E BLECH, W BLEYER, H BLOCK, H . - U . . BLUMÖHR, T H BLUTH, R BOCKISCH, A BÖHM, A BÖHM, S BÖHME, H . - J BÖTTGER, M BOHLEY, P BOHUSLAV, V BOLDT, W BORBOLA J R . J BOROYAN, R BRÄUNLICH, H . BROEN, B . VON

1625 479 1519 . . . 453,709,1587,1603 613 1177 1219 1553 889, 915, 927, 995 1229, K 3 3 1171 491,983 679, 1729, K 5 7 1051, 1177 757 79 673, 1259 1393 401 421, 583 1455 69 63,1159,1161 421,583 87 121,1163,1223,1225,1227 103 709, K 6 9 1415 805 K27 1425 679 269, 285, 301 1651 1657 1119 1083 787, 793, 809, 1365, 1411 663

BROGHAMMER, U . BRUNNBERG, F . J . BUBLITZ, R . . . BUDER, E BÜCHTEMANN, A . BUNTROCK, P . . . BUSSE, E

269,285 1243 133

. .

. . . 1729, K19, K57 .

263 1385 • • • 1587,1595,1603

CAFFIER, G CEBO, B CHASABOVA, W . A . . CHAUDHRY, V . . . CHOINOWSKI, S . . . CLARK, I COMES, L COUTELLE, CH. . . CSABA, G CUMME, G . A . . . . CUPARENCU, B . . . DAENE, A DAMASCHUN, G. DAMERAU, W . . DANAU, M DARGEL, D DAVIS, L . C . . DEGEN, G DIXIT, Y . P DÖRNER, G . DORP, D . A . VAN DRAWERT, J . . DRESSEL, H . . DRÖSSLER, K . . DRÓZDZ, M DUDE, G

. .

. .

.

.

. . . .

. . . .

1327,1335 1547 889 1643 559 133

229

1465 259, 1399 1571 229 1465 1729, K 5 7 343 229 111 1519 . . . . 889,915,927 205,683 799,1525 1041 193 1027 1687, 1699, 1711, 1721 1023,1541 805

EBERT, B ECKERT, R EGGER, E ENGLER, E ERHARDT, B .

343

.

FALCK, P FANARDZJAN, V . FECHNER, G . . FENSKE, H FERMUM, R . . FIEBIG, H FIEDLER, H . . FISCHER, H . - D . FISCHER, R . . FISCHER, U . .

.

1 15 491,983 1257

.

V. . .

. . . . . . . .

.

.

. . . .

. . . . .

.' .

.

93 597

1657 679 1347,1359 1687,1699 1487 . 6 9 , 4 8 5 , 805 1749 1279,1293

XXVIII

Autoren Verzeichnis

FITTKAU, S 365 FLECK, CHR 809 FLEGEL, B 1301 FÖRSTER, W . . 6 3 , 1 1 9 , 1 2 1 , 5 1 7 , 5 2 1 , 1 1 0 1 , 1159, 1 1 6 1 , 1163, 1165, 1169, 1 1 7 1 , 1223, 1225, 1227, K 7 7 FOLLE, L . E 605 FRANKE, R 73 FRAUENDORF, H 553 FREDHOLM, B 1233 FRICK, G 1255 FRICK, U 1255 FRITZSCH, CH 1505 FROHNE, M 353, 359 FUSEK, J. 657 GABERT, A GABRIEL, H.-J GALOJAN, A . A GARIBJAN, A . A GELBRICH, D GELBRICH, W GEYER, G GIESSLER, A . J GIESSLER, CHR GIRBARDT, M GLÄSSER, D . GLASER, R GNÜCHTEL, U GÖDICKE, W GÖRES, E GÖRETZLEHNER, G GÖTZE, J GOMOLL, M GOTTSCHLING, D GRIEGER, F GRIEGER, M GRIMM, U GRISK, A GRODZINSKA, L GROSS, B GROTH, J GRUNOW, M GRYGLEWSKI, R : J GUDBJARNASON, S GÜNTHER, J GURK, CH HAGEN, N HAHN, G. J HAHN VON DORSCHE, H HALLE, H HALLE, W HALLGRIMSSON, J. HANFLAND, P HANSON, H HARNISCH, H

735 221 265 47 1407 553 413 1051 1171 .1407 413 715 745 K33 1745 1255 559 1259 1487 995 723 675 '. . 79,87 1099 1437 813 1267 1097, 1099 1069 1533 889 799 439 1279 1251 265 1069 1419 735 1267

HARTMANN, N 687 HATALA, M 1651 HAUDE, W 183 HAUFE, F 675 HAUPTMANN, J. . . . ' 635 HECHT, K . 23, 35, 47, 559, 819, 867, 881, 963, 973,1009 HECHT, T 23, 35, 867, 1009 HEDER, G 1577 HEDQUIST, P 1135 HEIDL, G 1749 HEINROTH, I 1227 HENGST, P 1251 HENKEL, B . 401 HERMERSDÖRFER, H 245 HERRMANN, H . J 491,983 HINAYS, 1 889,915 HINZ, G 1525 HIRSCHELMANN, R 1177 HOFFMANN, J 193, 635, K 6 3 HOFMANN E 1273, 1452 HOMMEL, H 1279,1293 HOPPE, H 1571 HORN, A 133 HORN, H KL HORNSTRA, G 1065 HÜBNER, G 687 HUMMEL, L 1311,1635 INGRAM, G. A IRMSCHER, J IWIG, M JÄNIG, G . - R . . . . . . JAHR, H JAISWAL, D. M JELÌNEK, J JENSSEN, H . L JONEK, J JONES, R . L JÜLICH, W . - D JUNG, K JURUKOVA, Z KADEN, J KÄSTNER, 1 KALKOFF, W KAMINSKI, M KANWAR, K . C KARASEK, E KARAWAJEW, K KARCZEWSKI, P KARNSTEDT, U KARST, H KARSTEN, U KECSKEMÉTI, V KELEMEN, K

1561 1749 413 1455, K 1 9 , K 2 7 , K 4 1 1477,1487 757 1379 1499 501 1091 687 1 1213 813 763 . 1493 501 577,1643 1385 263 166 K83 1257 245 1173 1173

Autorenverzeichnis KETTMANN, U . KETZ, H . - A KHANG, N . Q KIEC-DEMBINSKA, A KIENAST, 1 KIRSCHKE, H KLÄHR, G KLEINE, R KLEITKE, B KLINGER, W KLINNER, U KLÖCKING, H . - P KLÖCKING, R KNAPP, A KNOLL, J KÖHLER, H . . . KOELSCH, R KÖSSLER, F KOLLE, U KONECKI, J KONITZER, K KOSMIDER, ST KOTZSCH, M KOVALCIK, V . KRANZ, D KRASILNIKOV, V . G KRAUSE, E . - G K R E H E R , CH KRISKA, M KROPPE, P KRUG, M KRUPINSKA, J KUCEROVA, K KUCHARZ, E KUDERNATSCH, W KÜCHLER, G KÜTTNER, 1 KUNDE, D KU N Z E , D KURTH, J

353 1257 1425 1547 1745 2 6 9 , 2 8 5 , 301 253 331, 379 K9 627 1347,1359 193 103 675 1173 1499 735 1327,1335 . 221 501 853 501 1749 1175 819 935 166,543 943 117 1721 613 1547 1221 1023,1541 343 1327,1335 829 559 1 175

LÄUTER, J LAMPE, D LANGE, P LANGEN, P LANGHAMMER, G LANGNER, J LANTOS, T LARSSON, C LASCH, J LASSMANN, G LAU, H . - U LEHMANN, C LEHMANN, J LEVESQUE, R . 1 LILLEHEI, R . C LINHARTOVA, J

889 1341 K83 1625 1259 2 6 9 , 2 8 5 , 301 259 1195 343, 3 9 3 , 7 3 5 343 1251 1625 331 605 1141 1221

LIPPERT, H LJOWSCHINA, I . P LOHIYA, N . K LOSSNITZER, A . LUDEWIG, M LÜDER, W LUTHER, P

XXIX 1279, 1293 881,973 205 253 325 1257 123

MAI, 1 1341 MAJSKF, A 1379 MALMROS, H 1151 MANN, D 1113 MANVELJAN, I . A 597 MARES, P 55 MARETZKI, D 523 MARKOV, H . M 1201 MARKWARDT, F . . . 1 9 3 , 6 3 5 , 1 6 6 5 , K 1 , K 6 3 MARQUARDT, 1 735 MARTIN, G 889,915,995 MATTHIAS, D 491,983 MATTHIES, H 213 MAUERSBERGER, B 1385, 1577 MAURER, L 155 MAZUR, J 1547 MECHEDOWA, A . J A 867 MEISEL, P 1347,1359 MEISSKE, W 73 MENTZ, P 1159,1165,1171,1227 MEST, H . - J 63 METHFESSEL, J 309, 317 MEWES, S 787 MEYER, R 559 MICHAILOV, M . L 1229 MISSELWITZ, R 1729, KL9, K 5 7 MIX, E 663 ' MJES, O. D 1081 MÖHR, M 1257 MÖRITZ, K . - U 87 MORGENSTERN, R K69 MORITZ, V 2 3 , 35, 559, 1 0 0 9 , K 3 3 MQOTSI, S 365 MÜLLER, D 627 MÜLLER, G . - M 813 MÜLLER, M 1749 MÜLLER, W 693, 1019, 1373 MUIRHEAD, E . E 1181

NAGY, S. U NGUYEN-VAN-HAI NILIUS, B NISSLER, K NITSCHKOFF, ST NOACK, R NOWAK, G NOWAK, W

259, 1399 23, 35 1657 1273 943, 1301 1257 K63 1279,1293

XXX

Autorenverzeichni s

ODDOY, A

1533

OEHME, P

265,1385

SCHELLENBERGER, W . SCHERNECK, S

OELSZNER, W

69

OLIVER, M . F

1081

SCHEWE, T

OPITZ, H .

1165

SCHIRPKE, B

ORT, J

1221

SCHIRRMEISTER, W . .

PAEGELOW, 1

235, 1301,K51

PANCZENKO, B

1099

PAPP, J. G Y

1119

PATOCKA, J

479, 657

PELESKA, J

1221

PERLEWITZ, J

193

PETERS, M

. •

SCHMIDT, J

.

.

SCHÖNFELDER, G .

POPPEI, M

819,973

PORSCHE, E

141

1385 .

.

SCHUBERT, J

379 1651 111 1625

SCHULZE, G

1

SCHULZE, M

133 245,837

SCHULZE, W

.

SCHUNCK, W . - H .

.

S C H W A R Z E N F E L D , I . VON &EBESTIK, V

523, 723

REDMANN, K

1493

REEFSCHLÄGER, J

1625

REICHELT, G

805

REIMER, W

553

REIN, H

1613, K 1 9 , K27,

REISSMANN, S

235,

K41 K51

RETZKE, U

1249

RICHTER, P

.

KL

RIEMERSMA, R . A

1081

RIPKA, 0

1221

RISTAU, O

1613

RITTER, CH

K77

RODINA, 1

317

RÖSNER, G

1745

ROTH, N

763, 1403, 1407

ROTH, P

735

ROTHE, U

7

RUCKPAUL, K . RUDOLPH, E . RÜTHRICH, H

. .

.•

.

.

1455, K 1 9 , K 2 7 ,

K41 69 571

.

SAMUELSON, B

.

.

.

.

69 1379

.

SEDLARIK, K

193 645

SEIM, H SEITZ, H . J

141 . . .

523 1141

SHATNEY, C. H SIEGEL, G

1031

SILL, U

.

.

.

SIMON, H

1279, 1293

SINZ, R

1553 466

SMETTAN, G

1455

SOBÄNSKI, H SOMOVA, L

.

.

.

1547 1207,1213

SORGER, D

443

SPITTKA, K

1745

SPLINTER, F . K

793 103

SPRÖSSIG, M SRAPIONJAN, R

265

STAIB, A . H

485, 773, 781, 805 183

STAUSKE, D STEINHARDT, M STEINHAUSEN, G .

111 .

.

.

1419

STERNECK, S

805

STÖRL, H . J STOPP, M

. . . .

STORCH, R

.

.

.

1553 787,809 1365,1411

STRACK, E STÜRZEBECHER, J .

SAFTA, L

365

SCHWARZ, R

SETCHENSKA, M . RAPOPORT, S

.

1635 1249

1651

1419

.

SCHWARTZE, A

PRÄT, V

PROKOP, 0

.

213 .

K33

1625

.

SCHULZECK, S

1379

PREUSSEL, B

1301 723

POTMESILOVA, 1

453

.

7, 1 4 4 3

POSTNOW, J . W

PREISS, R

571,613

1533

SCHULZ, P

155

.

SCHRÖDER, K

SCHÜLKE, B

213

.

SCHUBERT, E

1519

POPOV, N

1311,1635 599, 963, 9 7 3

SCHOPP, W

1317

POHL, A

.

SCHNITZLER, S

PLOOG, D

1407

.

.

PFEIFFER, W . D

119,521,1227

.

.693,1019,1737

•

SCHÜCK, O

PÖNICKE, K

669 .

SCHLEGEL, T H

1317

PÖGELT, B

1273

SCHERBER, A

645 .

.

.

. . . .

1665,

Kl

229

SYDOW, G

1741

1055

SYDOW, H

K9 1119

SAXENA, S

683

SzEKERES, L

SCHEIBE, K

466

SZIEGOLEIT, W

521

Autorenverzeichnis TARNOWSKI, W T A U B E , CH TAUCHERT, H TERHAAG, B . . . THIELE, B . J THIELE, D THYFRONITOU, J TREPTOW, K TRIEBE, G TSAMALOUKAS, A . G UHLENBRUCH, G UBLRICH, W URMANTSCHEEVA, T . G V E L D E , CH. D . VAN DER VERGROESEN, A . J VERMA, R VETTER, K VIEWEG, H VÖLCKER, C . - E VOGEL, E VOIGT, S . . .' WACHTEL, W WAGNER, A WAGNER, G WAGNER, H WALLISER, S WALLRABE, D WALSMANN, P WARBANOW, W WARTNER, U WASCHKE, K WASCHKE, S . R

141 1225,1227 1267 1373,1415 1465 .1525 1443 47,867,951,973 1223, 1225 523

'

1419 1699 889 1519 1065 577 1257 KL 183 1051 853 491 763 1 6 6 5 , KL 1311,1635 1493 745,915 1 6 6 5 , KL 845, 1167 1225 1625 1625

XXXI

WEBER, P 1195 W E I S E , CHR 787 WEISS, M 521 WELFLE, H 401 WENNMALM, A 1127 WENZELIDES, K 559 WERNER, H 1499 WESTERMANN, K . H 773, 781 WESTERMANN, P 1437 WEUFFEN, W 687,1493 WLEDERANDERS, B 269, 285, 301 WILKE, B 1487 WLLKE, J 1031 WILL, H 529 WILL-SHAHAB, L 829 WINKLER, W K41 WITSCHEL, W 133 WITTHUHN, W 799 WÖCKEL, W 103 WOLF, 1 491 WOLF, J 1273 WOLLENBERGER, A . 529, 543, 819, 829, 837, K 9 WOLTER, F 889, 9 1 5 WOOSMANN, H 35 WUNDERLICH, V 1741 ZEHL, U ZELCK, U ZESCHKE, G ZIEGLER, M ZIMMERMANN, T ZLPPEL, U ZIRWER, D ZLSKA, P ZOTTER, ST ZÜHLKE, H

517, 1 1 6 1 , 1169, K 7 7 K83 935 439, K 3 3 1311 221 1729, K 1 9 , K 5 7 1575 253,1741 1477, 1487

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Zeitschrift für funktionelle

Herausgeber: R. Baumann, H. Dutz, A. Graffi, F. Jung, O. Prokop, S. M. Rapoport Chefredaktion: H. Bielka, W. Scheler Band 3 6

Biowissenschaften

VIII. Internationales Berliner Symposium über Struktur und Funktion der Erythrozyten 1.—5. August 1976 Berlin, DDR Herausgeber Prof. Dr. Dr. S. M.

RAPOPORT

Institut für Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. F.

JUNG

Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR

20 Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3 - 4

1977

Heft 3 — 4

Dear Colleagues: In opening the VIIIth Symposium on "Structure and, Function of Erythrocytes" I should like to recall that the first symposium was held 24 years ago. What are the reasons for this continuing tradition ? For one it is the well-chosen object of research, the simple red cell which has remained a focus of a variety of both practical and theoretical interests, which are partly reflected in the program of the present symposium. A second reason is that the red cell has attracted strongly motivated people who devote a good part of their life to it. This dedication has been the framework for cooperation and companionship and has greatly suppressed feelings of rivalry which are not unknown to scientists. A third reason is the continous participation of young people which has given continuity to the work without a generation gap. An important part is played by the stability of support which has been given to the organizers of these symposium by the Minister of Health and by the Rector of Humboldt-University over the entire period, for which I should like to express our great thanks. S. M. Rapoport The papers of the symposium are published in two parts. This issue (3/4) contains part I and part II will be published in the following issue (5/6). Contents of both parts are indicated at the end of issue 5/6.

Section I Molecular Biology of the Erythron

Acta biol. med. germ.. Band 35, Seite 295 — 303 (1977) Moscow State University, Moscow, USSR

Avian erythropoiesis: Cellular and molecular aspects K . G.

GAZARYAN

Erythropoiesis represents a highly suitable model for the study of gene functioning during terminal cell differentiation. From this point of view avian erythropoiesis is preferable since here the maturing erythroid cell does not lose its nucleus, which is preserved, though in largely inactivated form. Thus, using this system one can investigate not only translation problems, as in mammals, but also factors determining a change in the level of transcription, in particular, mechanisms of gene inactivation. Such studies with this model have been carried out in several laboratories [1 —4]; however, avian erythropoiesis in general has not as thoroughly been investigated as in mammals. Main processes in the terminal period of erythropoiesis are essentially similar in both cases, namely: gradual transition to the accumulation of a limited protein set, mainly haemoglobin and connected with this, specialization of nuclear and cytoplasmic functions. Morphologically this tendency is expressed in a change of basophilic cytoplasm into an orthochromic one and conversion of the rounded nucleus with relatively diffused chromatin to elongated forms with more compact chromatin. The changes in cytoplasm reflect the accumulation of haemoglobin and specialization of translation, and those in the nucleus reflect the specialization of the genome transcriptional sphere. Discussing avian erythropoiesis as a genetic model it should be noted that haemoglobin is not the only marker of interest. Besides, the serine-rich histone may be interesting as a marker. At present many investigators are paying special attention to this histone. Anaemia is provoked to obtain a great number of immature erythroid cells for studying the early stages of erythrocyte maturation. This stimulates erythropoiesis, but at the same time as is shown in mammals its picture is rather changed. Taking pigeon erythropoiesis as a model for the study of the molecular mechanisms of cell differentiation we found it desirable to compare the course of erythroid cell maturation under normal and anaemic conditions [3, 4].

296

K . G . GAZARYAN

To provoke acute anaemia, pigeons were injected daily with 15 mg of phenylhydrazine per kg of body weight for 4 days. Fig. 1 shows the changes in relative number of bone marrow erythroblasts in the course of anaemization and restoration of normal state. It is seen that soon after the treatment with the drug the latest forms of erythroblasts (i. e. polychromatic and orthochromatic) disappear. At the same time the portion of early erythroblasts, mainly basophilic ones, increases considerably reaching its peak on the 5 th day. On the 7th—8th day the latest erythroblasts appear again and the picture is normalized. In peripheral blood immature forms begin to appear rather soon, but their quantity increases after the 5th day and reaches the maximum on the 7th day. Correlating these pictures we have supposed [4] that the early forms rather than the latest erythroblasts were the precursors of most of the immature forms found in peripheral blood. To test this possibility, we injected [ 3 H]-thymidine on the 6th day of anaemization (before the period when in peripheral blood immature forms are accumulating). In erythropoiesis the ability of [ 3 H]-thymidine incorporation gradually decreases in the maturing erythroblasts and reticulocytes do not incorporate it at all. It was found that the labeled cells in normal pigeons appear in peripheral blood only after 48 hrs of [ 3 H]-thymidine injection, the mean label number in their nuclei being lower than in the latest bone marrow erythroblasts [4]. In anaemized animals the labeled cells appear already within 6 hrs and the label number in their nuclei is much higher than in the latest erythroblasts [4]. Hence, these immature forms of peripheral blood cells could hardly been considered as arising from the latest bone marrow erythroblasts. Fig. 2 shows the histograms of distribution of bone marrow erythroblast populations subject to the amount of [ 3 H]-thymidine label in their nuclei. Here, we also see the distribution of immature forms of peripheral blood. It is clearly seen that in normal conditions the histo-

Fig. 1. Changes in the number of different forms of erythroid cells in bone marrow (a) and peripheral blood (b) during anaemization. Pro. = proerythroblast; B . E . = basophilic erythroblast; P.E = polychromatic erythroblast; O.E. = orthochromatic erythroblast; E = erythrocyte; D.C. = degenerating cells.

29 7

Avian erythropoiesis

gram of immature forms of peripheral blood corresponds to that of the late erythroblasts. There is no such correspondence under anaemia, where many cells in peripheral blood with high numbers of label are observed. Cells with such an amount of label are absent among the latest erythroblasts but are present in the early ones. These data support the conclusion that immature forms of peripheral blood arise predominantly from the early erythroblasts but not from the latest. Up to now we have considered immature forms of peripheral blood on the whole. But it is known that under anaemia provoked in birds with phenylhydrazine, forms differing in the degree of maturation including erythroblast-like cells appear in the peripheral blood [1, 2]. Fig. 3 a depicts immature forms which we have observed in pigeons. Only the last one (orthochromatic reticulocyte) is present in normal animals, the rest being characteristic of anaemia. The forms designated as polychromatic and basophilic reticulocytes have cytoplasms resembling those of bone marrow polychromatic and basophilic erythroblasts, respectively. But their nuclei are somewhat more elongated as in reticulocytes. The form termed basophilic erythroblast is hardly distinguishable from the corresponding bone marrow erythroblasts. It seemed interesting to know in what relations such a "precursor-product" these forms consist. One can imagine two ways of their appearance: the first — everyone appears independently of the corresponding erythroblast form of bone marrow, the second — they are generated from each other in the order displayed in the figure 3 b. Table 1 gives the time-course of these forms labeling after [ 3 H]-thymidine injection.

0 M i l l

10203040

iM

I I i

10203040 Number of Ag-grains

10 20 3040

10203040

per nucleus (dispersion)

Fig. 2. Histograms showing distribution of different erythroid cell forms subject to the amount of [ 3 H]-thymidine label in the nuclei

298

K . G . GAZARYAN

B.R.

P.R.

O.R.

Fig. 3 a. Circulating immature erythroid forms of anaemized pigeon. B . E . = basophilic erythroblast; B . R . = basophilic reticulocyte; P.R. = polychromatic reticulocyte; O.R. = orthochromatic reticulocyte

E.

Fig. 3 b. The pathways of erythrocyte maturation in pigeon

Table 1 Appearence of different immature cell forms, labeled with [ 3 H]-thymidine in the peripheral blood. 1 mC [ 3 H]-thymidine was injected to each animal on the 6th day of anaemization. Smears of the blood cells have been prepared and used for autoradiography Hrs after [ 3 H]thymidine injection 2 6 12 24 48 72

% of labeled cells (a) and mean grain count per nucleus (b) B.R.

B.E. a

b

25 55 64 89 87 98

38 45 31 17 8 7

P.R.

a

b

21 20 58 95 91

38 40 26 14 8

—

a

O.R. b

—

a

b

-

—

—

—

—

—

—

— —

20 45 49

35 32 14

—

—

9 22

37 22

B . E . = basophilic erythroblasts; B . R . = basophilic reticulocytes; P.R. = polychromatic reticulocytes; O.R. = orthochromatic reticulocytes.

299

Avian erythropoiesis

Analysis of these data shows the following: (1) the more mature a form is, the later it appears as labeled, (2) with time, the mean label number in the nuclei of each form decreases since probably the cells with lower label come from the bone marrow (as a result of cell division and dilution of label). Meanwhile more mature forms appearing in peripheral blood (P.E. and O.E.) contain as much label as less mature forms we have at the beginning (before label dilution). These facts demonstrate directly that every more mature form of peripheral blood arises from the less mature form of peripheral blood but not from the corresponding bone marrow erythroblast. Bearing all this in mind one can propose the pathway of erythroid cell development under anaemia as shown in Fig. 3 b. This way of development ocours only during anaemia and then erythropoiesis proceeding in normal animals is restored. We have investigated some aspects of erythropoiesis under anaemia and, came to the conclusion that it hardly represents a pathological process and mature erythrocytes developing here do not basically differ in their characteristics from those arising in normal conditions. It can be supposed that in the precursor-cells giving erythroid population two developmental programs exist: one is repressed in normal and induced only under anaemic conditions. However, an alternative cannot be excluded, namely, two kinds of the precursor-cells exist but, in normal conditions, one is developing while the development of another is induced only under acute anaemia. As a result of bone marrow erythroblast conversion into mature erythrocytes, the transcriptional level considerably decreases. As estimated by [3H]-uridine incorporation in intact cells the RNA synthesis decreases 20 fold or more [3]. The decrease in the amount or activity of nuclear RNA polymerases might be a possible cause of the RNA synthesis decline in the cell. Fig. 4 shows that the total RNA-polymerase activity in the nuclei isolated from the mature erythrocytes is several fold lower than in the nuclei of bone marrow cell population taken from anaemized pigeons. The nuclei of immature cells of peripheral blood occupy the intermediate state in this respect. It was demonstrated using a-amanitine that the nucleolar RNA polymerase activity decreases more prominently than the activity of nucleoplasmic polymerases. As a result we have found in the mature erythrocyte nuclei practically only nucleoplasmic polymerase activity [5]. Several facts mentioned below show that the only decrease of RNA polymerase activity cannot explain the process of transcription inactivation taking place in erythropoiesis. This is supported by the data obtained in the analysis of non-

• +m^Cl(0.SM) Fig. 4. Endogeneous R N A - p o l y uierase activity of isolated nuclei. 1 = bone m a r r o w (anaemized); 2 = peripheral blood (anaemized); 3 = peripheral blood (normal)

ffl-NH+Cl

300

K . G.

GAZARYAN

histone proteins and histones, especially serine-rich histone. Comparison of electrophoretic spectra of the total non-histone proteins extracted from immature cells of peripheral blood or from populations of bone marrow cells and erythrocytes shows that erythrocyte protein contains considerably less components [6—8]. An interesting difference between these proteins has been revealed in the experiments on testing their ability to activate transcription in an in vitro system. The system contained erythrocyte chromatin as a template, non-histone proteins and E. coli RNA polymerase. It turns out that the proteins of bone marrow cells activate transcription like non-histone proteins from other cells which actively synthesize RNA [9], but erythrocyte proteins have no such ability. When non-histone proteins were divided into fractions weakly-bound and tightlybound with chromatin it appears that these fractions are present in erythroblast chromatin in a 1:1 ratio, with both fractions stimulating transcription (Fig. 5). In the erythrocyte chromatin only tightly-bound proteins are found. It is interesting that the spectra of the total erythrocyte proteins and the tightly-bound erythroblast fraction are similar [8]. They are most likely the same proteins. Therefore during erythrocyte maturation the weakly-bound fraction of nonhistone proteins disappears or its quantity is substantially reduced. The tightly-bound proteins are retained in the erythrocyte chromatin but lose their ability to activate transciption in an in vitro test-system. It is still unclear how these changes in the properties of non-histone proteins might be connected with gene inactivation in the maturing erythrocytes since the function of these proteins has not yet been elucidated. These events seem to reflect a decrease of the number of regulatory proteins activating transcription in chromatin but such an assumption being in accordance with the modern hypothesis about the role of non-histone proteins requires confirmation. Another group of questions centers around the role of histones, first of all serinerich histone in gene inactivation during avian erythropoiesis. It has been shown earlier [10] that if histone fractions are gradually removed from mature erytrocytes with increasing ionic strength, the difference in their template activity remains so long as histone Hi is extracted. But this difference disappears completely as soon as histone H 5 is removed. H5-histone starts to be extracted by the treatment with 0.6 M NaCl and is completely removed by 0.7 M NaCl. After- 0.7 M NaCl treatment two chromatins do not differ in their transcriptional level [10]. Fig. 6 demonstrates the same results and also gives the data on chromatin reconstruction. When proteins removed by 0.7 M NaCl are used to reconstitute the chromatins, their template activity decreases but the decrease is greater in the case when the proteins extracted from the erythrocyte chromatin are added. It is important that the decrease in the template activity was always greater irrespective of whether the erythrocyte proteins were added to the chromatin from erythrocytes or erythroblasts. Therefore one can conclude that proteins extracted from the erythrocyte chromatin with 0.7 M NaCl contain factors responsible for inactivation of the genome during erythrocyte maturation. H 5 histone is the main component of these proteins. Here is also present some quantity of Hx histone but the data available [10] prove that the latter is of less importance in creation of the difference between template activities

Avian erythropoiesis

30I Dissociation

Fig. 5

Fig. 6 •

I

1

Reconstitution

1

1

1

Untreated -Hj -H-j Reconstituted Chromatins -NHP -NHP Initial andHybric Chromatins

Fig. 5- Effect of non-histone proteins (NHP) on template activity of erythrocyte chromatin assayed with E. coli RNA-polymerase. 1 = total (extracted with 5 M NaCl-8 M urea) N H P from erythrocyte chromatin ; 2 = weakly-bound (extracted with 0.35 M NaCl) N H P from bone marrow chromatin; 3 = tightlybound (extracted with S M NaCl-8 M urea) N H P from bone marrow chromatin pretreated with 0.35 M NaCl. 100% = without adding N H P Fig. 6. Dissociation and reconstitution of chromatins. Change in template activity assayed with E. coli RNA-polymerase. Dissociation: 1 = 0.5 M NaCl; 2 = 0.7 M NaCl. Reconstitution: 3 = bone marrow proteins extracted with 0.7 M NaCl + chromatino.?; 4 = erytrocyte proteins extracted with 0 . 7 M NaCl + chromatino.7; (chromatin pretreated with 0.7 M NaCl). • = bone marrow chromatin; A = erythrocyte chromatin

of erythroblast and erythrocyte chromatins. All evidence supports the idea that H4-histone is the factor which restricts transcription in maturing erythrocytes [11].

It is assumed that H5-histone is more effective as a repressor ("superrepressor") than Hj-histone and this causes the necessity of H5-histone appearance [12]. However, several reasons prevent this problem from being completely settled: 1. B O L U N D and J O H N S [ 1 3 ] in their experiments have not revealed any essential difference between histone H 5 from chicken erythrocytes and H r histone from calf thymus. 2. Histone H 5 is also present in bone marrow cell populations, but when it is removed from the chromatin the template activity does not increase so substantially as it does after removal of the same histone from erythrocyte chromatin [10].

In this connection we have compared the repressor efficiencies of histones Hx and H s obtained from erythroblasts and erythrocytes in chromatographically homogeneous state. The results showed that (Fig. 7a, b): (1) histones Hj both from ery-

302

K . G . GAZARYAN

throblasts and erythrocytes do not differ from one another by their repressor ability; (2) the efficiency of H5-histone from erythroblasts is comparable to the efficiency of both histones Hjj (3) histone H 5 from erythrocytes possesses more pronounced repressor ("superrepressor") ability. In other words, H5-histone appearing in erythroblasts is not yet "superrepressor" which it becomes later in mature erythrocytes. This difference in repressor strengths of serine-rich histones isolated from the bone marrow and erythrocytes could be caused by a different degree of their phosphorylation. Fig. 7 c gives the data on the influence of serine-rich histone subfractions extracted from reticulocyte nuclei differentially by 0.1 M citric acid with 0.125 M NaCl and then using 5% HC104. The subtraction extracted at first (i.e. most phosphorylated) is less effective as a repressor and the last one (less phosphorylated) is the strongest repressor. These results support the conclusion that a lower efficiency of H 5 histone from erythroblasts is caused by a high degree of its phosphorylation.

10 20 30 40 SO BO 70 80 90 Histone added (p.g)

0.2 0.3 OA 0.5 0£ 0.7 0.8 03 1.0 Histone/DNA

2

4 6 Histone added

8 (/j.g)

10

F i g . 7. T h e effect of purified H 5 - a n d H r h i s t o n e s on t e m p l a t e a c t i v i t y of chromatino.7. a) • = H i f r o m e r y t h r o c y t e s ; • = H 5 f r o m e r y t h r o c y t e s ; b) A = H j f r o m b o n e m a r r o w ; • = H t f r o m e r y t h r o c y t e s ; • = H 5 f r o m b o n e m a r r o w ; • = H 5 from erythrocytes; c) s u b f r a c t i o n s w i t h d i f f e r e n t degree of p h o s p h o r y l a t i o n : 1 = e x t r a c t e d w i t h 0.1 M citric acid — 0.125 M NaCl (the 1st e x t r a c t , highly p h o s p h o r y l a t e d ) ; 2 = t h e s a m e (the 2nd e x t r a c t , m o d e r a t e l y p h o s p h o r y l a t e d ; 3 = e x t r a c t e d w i t h 5% HC10 4 (less p h o s p h o r y l a t e d ) . H 5 - h i s t o n e s of t h e s u b f r a c t i o n s were purified b y c h r o m a t o g r a p h y on CM-cellulose.

Avian erythropoiesis

303

Our results are consistent with the idea that it is H 5 -histone which plays the main role in the process of erythrocyte genome inactivation. The process apparently proceeds at least in two stages: the first step is the accumulation of phosphorylated form of the histone H 5 which is yet unable to associate tightly with chromatin and condense it. In some moment these phosphorylated molecules of H 5 -histone are substituted for non-phosphorylated ones. It remains unclear why H 5 -histone firstly appears in less active form. It seems that a definite amount of this histone should be accumulated on the chromatin at first and only after that it must start working as a "superrepressor". As demonstrated above the development process in erythropoiesis can proceed in different ways. Now, this can be related to H 5 histone behaviour. Suggesting that the process of nucleus inactivation may begin in principle at the stage of early erythroblasts as well as at the stage of the latest ones, depending on the state of erythropoietic activity. Such a situation is possible if we may accept that the factor responsible for inactivation of the nucleus is present already in early erythroblasts and it is ready to play its role. However, it does not act until the way of cell development is "chosen". In normal conditions, the action of the repressor is triggered only after the cell has passed through all stages in bone marrow. Under anaemic conditions, the repressor begins to work at the earlier erythroblasts stages. In other words, the fact that H 5 -histone appears initially in early erythroblasts in weakly active form and then as "superrepressor" may be a device which gives a possibility to choose the moment of nucleus inactivation depending on the way of cell development. The facts available at present do not permit to speak of a real mechanism of genome inactivation in erythroid cells. One can only suppose now that nuclear protein factors considered here in total participate in this mechanism but it is unclear in what manner. In particular, serine-rich histone can probably be considered only as a non-specific factor which acts together with more specific ones. References [1]

SCHERRER, K . ,

L . MARKOUD,

F . ZAJDELA,

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Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 305 — 313 (1977) Abteilung für Elektronenmikroskopie der Charité am Pathologischen Institut der Humboldt-Universität, 104 Berlin, D D R 2 Institut für Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität, 104 Berlin, D D R 3 Bereich Bioregulation des Zentralinstituts für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 1115 Berlin-Buch

1

The structure of pre-messenger RNA and messenger RNA from erythroid cells A . - M . LADHOFF 1 , B . J . T H I E L E 2 , CH. COUTELLE 3 , a n d S . ROSENTHAL 3

Summary Pre-mRNA fractions ( > 4 5 S) were characterized by electron microscopy. High salt concentrations (0.2 M ammonium acetate, pli 8) yield linear molecules of different length (0.5 —17 |J.m). In 10% of the molecules a compact-nonlinear contour (cn-contour) is detectable at one end. A significant enhancement of the number of cn-contour carrying molecules is observed after binding pre-mRNA to poly(U)-sepharose. The terminal cn-contour could be the depiction of a secondary and/or tertiary structure including the poly(A)-tail. 9 S globin mRNA appear in 80% with virtually the same cn-contour as detected in pre-mRNA molecules. After denaturing the mRNA in 80% formamide — 4 M urea in connection with heating to 90 °C for 1 Omin, a percentage of 7 7 % of stretched, linear molecules results. This structural transformation is reversible when the denatured RNA is precipitated and redissolved in 0.2 M ammonium acetate. 73% of the stretched molecules are characterized by a mean length of 0.44 |xm. This value is twice as high as commonly assumed for a globin mRNA chain. Introduction T h e r e c e n t e x p e r i m e n t a l proofs [1 — 4 ] for t h e suggested p r e c u r s o r p r o d u c t relat i o n s h i p b e t w e e n t h e n u c l e a r p r e - m R N A a n d t h e c y t o p l a s m i c m R N A [5, 6] h a v e c r e a t e d i n c r e a s e d i n t e r e s t also in t h e s t r u c t u r e of t h e s e R N A species. O n e of t h e possible m e t h o d s for t h e stud} 7 of R N A s t r u c t u r e is e l e c t r o n m i c r o s c o p y . P r e v i o u s l y we h a v e p u b l i s h e d e l e c t r o n m i c r o g r a p h s of individual p r e - m R N A a n d m R N A m o l e c u l e s f r o m e r y t h r o i d cells [7, 8]. A n i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n w a s t h e a p p e a r a n c e of a c o n t o u r , p r o b a b l y c o r r e s p o n d i n g t o a h i g h e r ordered s t r u c t u r e , on one end of 1 0 % of t h e p r e - m R N A m o l e c u l e s f r o m r a b b i t b o n e m a r r o w cells. A v i r t u a l l y s i m i l a r c o n t o u r was o b s e r v e d in m o l e c u l e s of 9 S globin m R N A f r a c t i o n s f r o m r a b b i t r e t i c u l o c y t e s . T h e s a m e c o n t o u r was also described b y D U B O C H E T et al. [9] for r a b b i t a n d duck globin m R N A m o l e c u l e s . I n t h e p r e s e n t p a p e r we show t h a t it is possible t o e n h a n c e t h e p e r c e n t a g e of c n contour carrying pre-mRNA-molecules b y binding to poly(U)-sepharose and to t r a n s f o r m t h e c n - c o n t o u r of globin m R N A t o a l i n e a r f o r m b y use of e x t e n s i v e denaturation conditions. Material and methods RNA preparation Pre-mRNA ( > 4 5 S) from rabbit bone marrow cells and 9 S globin mRNA from rabbit reticulocytes were prepared as described in detail in a previous paper [8].

306

A . M . LADHOFF, B . J . T H I E L E , C H . COUTELLE, S . R O S E N T H A L

Electron microscopy For electron microscopic investigation a simple protein-free preparation method was used. Methodical manipulations and techniques of staining were the same as described [8]. Using standard conditions RNA was dissolved in l M ammonium acetate and layered in drops of about 10|il on a hypophase of 10 mM ammonium acetate up to a final concentration of ammonium acetate of 0.2 M. In several experiments the RNA was simply dissolved in 0.2 M ammonium acetate and layered in drops of 20 or 100 ¡xl (200 jig RNA/ml) on a siliconized Petri-dish. After 20 min the grids were layered on the surface of the drops. Details of variations of the media used for induction of conformational changes of the globin mRNA are given in "Results and discussion". Results und discussion

Pre-messenger RNA DNase treated, protein-free fractions of nuclear RNA from erythroid enriched bone marrow cells, sedimenting higher than 45 S, appear in the presence of 0.2 M ammonium acetate as a bulk of linear molecules of different contour length. The frequency distribution of the length of 98 molecules is shown in Fig. 1. The distribution ranges from a length of 0.5 (xm up to 17 fxm. It is necessary to point out that the percentage of longer molecules is probably higher because some of them could not be measured due to ambiguity on contour length resulting from background contaminations. Assuming a base distance of about 0-3 nm the longest molecules found (17 (im) should consist of about 57.000 nucleotides. Electron micrographs of molecules of such a length were published in a previous paper [8]. The structural resolution of the micrographs of 1.0 to 1.5 nm permits the detection of end-to-end hybridization and the proof of longer base paired regions. In 90% of the stained premRNA molecules, no indications exist that the polynucleotide chain is of higher structural order, while in about 10% of mainly the longer molecules a quite peculiar compact non-linear contour (in the following named cn-contour) is detectable at one end. Fig. 2 shows the depiction of 3 pre-mRNA molecules carrying a terminal cn-contour. A considerable enhancement of the number

Fig. 1. Frequency distribution of the length of 98 molecules of nuclear RNA fractions ( > 4 5 S) from enriched erythroid bone marrow cells of the rabbit

Structure of pre-mRNA and mRNA

307

of cn-contour carrying molecules was registered after binding the pre-mRNA fractions to poly(U)-sepharose. The length of the terminal cn-section is characterized by a mean value of 0.40 (xm (Fig. 3)At present we cannot give a convincing explanation for this peculiar molecule contour. Because protein could never be detected in the examined RNA samples and ribosomal RNA appears completely linear, the most likely explanation of the terminal compact structure is that it is the depiction of a secondary and/or tertiary structure specific for erythroid pre-mRNA. It is likewise possible that the cn-contoured section represents a region consisting of double stranded regions functioning as processing marker proposed by R Y S K O V et al. [ 1 0 ] . Globin messenger

RNA

Molecules from the 9 S region of a sucrose density gradient after binding of polysomal RNA to poly(U)-sepharose appear with virtually the same cn-contour as 0.40 jum

I

0.2

0.4

1

0.6

0.8

1.0

Length (jum)

Fig. 3- Frequency distribution of tlie length of the terminal cn-contour of poly(A)+pre-mRNA molecules

Fig. 2. Terminal sections of poly (A)+ pre-mRNA molecules from rabbit bone marrow cells. Uranyl acetate staining ^ 21 Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3—4

308

A . M . LADHOFF, B . J . THIELE, CH. COUTELLE, S. ROSENTHAL

the terminal section of erythroid pre-MRNA. Typical contour forms of 9 S globin MRNA fractions are shown in Fig. 4. In the presence of 0.2 M ammonium acetate 80% of the molecules are characterized by a cn-contour (Fig. 4c). The cn-contour of the platinium shadowed samples corresponds exactly to that published by DUBOCHET et al. [9] if uranyl acetate staining is used [7], 4 % of the molecules are of linear character (Fig. 4 a) and the remaining percentages correspond to molecules showing contours which could be discussed as intermediate forms (Fig. 4b).

0,2 nm Fig. 4. 9 S globin m R N A f r o m r a b b i t reticulocytes prepared for electron microscopy b y adsorption a t t h e liquid-air-interphase in t h e presence of 0.2 M a m m o n i u m acetate. Contrasting was done b y staining with 10~3 M uranyl acetate in ethanol followed b y platinium r o t a r y shadowing. A) linear contour (4%); B) intermediate form (16%); C) compact-nonlinear contour (80%)

Structure of pre-mRNA and m R N A

309

Because in fractions of 9 S mRNA no protein contamination could be detected one must assume that the cn-contour is most likely the result of a structure of higher order within the mRNA molecule. The share of linear molecules could be due to a contamination of ribosomal RNA which remains stretched under these conditions. A length distribution of molecules with a cn-contour is shown in Fig. 5. The distribution ranged from 0.05 (xm up to 0-35 (¿m (mean value 0.14 fi.m). In the presence of 0.2 M ammonium acetate a partial structural transformation occurs if the RNA sample is heated for 10 min to 68 °C. The percentage of cncontours shifts from 80% down to 63% and that of the intermediate forms from 16% up to 35%. The linear form remains constant. Only when the RNA was dissolved in 80% formamide — 4 M urea (0.04 M Tris, 0.001 M EDTA, p U 7.5) and heated for 10 min to 90 °C a substantial change of linear molecules occurred. The percentage of linear molecules rises up to 77% (electron micrographs of typical linear molecules are shown in Fig. 6). 12% of the molecules remain in the cn-state while 11 % show different degrees of transformation. The results of the temperature denaturing experiments are summarized in Table 1. A distribution of the length of molecules stretched in the denaturation medium of 80% formamide and 4 M urea is shown in Fig. 7. 73% of the linear molecules are in the range between 0.1 and 0.9 (im (mean value 0.44 (J.m). To investigate the reversibility of this structural transformation, the denatured RNA was precipitated with ethanol and resuspended in 0.2 M ammonium acetate. Typical contour forms of renatured molecules are shown in Fig. 8. Only about half this material was

Table 1 Influence of the denaturation conditions on the percentage of typical contour forms of globin m R N A from rabbit reticulocytes

30 -

o |

20

"o 0>

contour form

-O

E =

( /

linear

f

intermediate

compactnonlinear

10

u

—| 0.1

,

1 , 0.2

,

1—T

0.3

0.4

room temperature

4

16

80

10 min

2

35

63

77

11

12

68*C

Length (Aim) Fig. 5- Length distribution of globin m R N A molecules from rabbit reticulocytes characterized by a compact-nonlinear contour 21*

10 min 4M

90*0

urea

8 0 % formamide

310

A . M . LADHOFF, B . J . T H I E L E , CH. COUTELLE, S . ROSENTHAL

0,2 pm Fig. 6. Linear contour form of 9 S globin m R N A after 10 min heating to 90 °C in the presence of 80% formamide, 4 M urea, 0.04 M Tris, 0.001 M EDTA, pB. 7-5• Double contrasting as described in legend to Fig. 4

Fig. 7. Frequency distribution of globin m R N A denatured by 10 min heating to 90 °C in 80% formamide and 4M urea (0.04 M Tris, 0.001 M EDTA, pH. 7.5) 15

2.0

25

Length (Aim)

transformed originally to cn-contours while the other half shows different degrees of' transformation. The length distribution of the renatured forms corresponding to cn-contour (Fig. 9) is nearly identical with the frequency distribution of the

Structure of p r e - n i K X A and t u R N A

311

length of cn-contour in the presence of 0.2 M ammonium acetate (Fig. 5)- T h e percentage of molecules which are not completely retransformed to c n - s t a t e suggests a certain degree of specificity in the formation of a structure corresponding t o the cn-contour. Compact contour forms, similar to those demonstrated here were also observed b y D U B O C I I K T et al. for messenger ribonucleoprotein particles ( m R X P ) . If we assume that the structure of the m R X P particles is t h e n a t u r a l l y occurring structure, this similarity suggests a high degree of stability

Fig. S. Compact-nonlinear contour forms of globin n i K X A after denaturation (compartì legend to Fig. 6), precipitation by ethanol and solution in (1.2 M ammonium acetate. J)oubh> contrasting as described in legend to Fig. 4.

A . M . LADHOFF, B . J . THIELE, CH. COUTELLE, S . ROSENTHAL

312

•

0.14 JJM

i

1

10

1 l^n 0.1

0.2

0-

Fig. 9. F r e q u e n c y distribution of t h e length of renatured molecules of globin m R N A characterized b y a compact-nonlinear contour

0.3

Length (Aim) of the higher order structure of the mRNA molecule, resisting even the phenolSDS-deproteinization procedure. This suggestion is supported by the temperature denaturation experiments. Taking into account these results, one must assume' that globin m R N A contains base paired sections with different degree of stability. Some could be melted at low temperature (up to 68 °C), others (most of them) need strong denaturation conditions. Another surprising result is the length of the denatured 9 S globin mRNA molecules. Assuming a nucleotide distance of about 0.3 nm the 650 nucleotides of the globin mRNA correspond to a length of 0.2 |im. This value is found for the longest compact contours, but the mean value of the bulk of the denatured molecules is 0.44 |iin, that means more than 100% higher. Although this value corresponds to the theoretical maximal length of a globin mRNA molecule stretched to Van der Waals radii [11], it should kept in mind that more than 60% of the measured molecules reached a length above 0.44 nm. The main suggestions resulting from these investigations of the globin mRNA are: Firstly, either the nucleotide distance in RNA of about 0.3 nm is too small and should be at least twice as big, or the noncoding sequence of the globin mRNA is much larger than commonly assumed. Secondly, the very broad size distribution and especially the appearance of very long mRNA molecules could be due to the contamination of 9 S reticulocyte RNA with other nonglobin mRNA. The longer molecules could also be interpreted as a sign of further processing of mRNA in cytoplasm. This might be a peculiar event under conditions of extreme anaemia but could also be a general mechanism of post-transcriptional regulation of gene expression. References [1] [2] [3]

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Specific sequences in pre-mRNA from erythroid bone marrow cells B . J . T H I E L E 1 , CH. COUTELLE 2 , H . - D . H U N G E R 2 , a n d A . P . R Y S K O V 3

Since it could be shown that the mRNA of erythroid cells contains molecules carrying covalently bound globin coding sequences, it is well established that globin mRNA is synthesized as a high molecular weight precursor [1— 3]. The conversion of the large primary transcripts to functional cytoplasmic mRNA ("processing") is one of the main problems in posttranscriptional regulation of gene expression [4]. We have investigated sequence elements of pre-mRNA which are possibly related to the processing of the large precursor molecules (oligo(U)- and double stranded sequences) and to the conversion of the translatable mature mRNA (poly(A)sequence). For our investigation on the structure and fate of the precursors of mRNA we have used rabbit bone marrow enriched in erythroid cells up to 80% of the nucleated cells by phenylhydrazine treatment [5]. Pre-mRNA fractions were obtained either by the hot phenol fractionation procedure introduced by GEORGIEV and MANTIEVA [6] or by the isolation of poly (A) carrying molecules or molecules > 4 5 S from pulse labelled total cellular RNA [7, 8]. Poly(A)-, oligo(U)- and double stranded sequences were isolated by Tl- and pancreatic RNase treatment and separation of the sequences by poly(A)- and poly(U)-sepharose chromatography respectively [9]. To compare the poly (A)- and oligo(U)-sequences isolated from erythroid bone marrow cells with sequences of pre-mRNA from other origin, base analysis and electrophoresis were performed [9]. The poly (A)-segment consists at least of 96.5% A. Poly(A) from poly(A)+ pre-mRNA (isolated from total cellular RNA extracted with phenol/SDS/urea at room temperature) shows a size distribution between 40 and 130 nucleotides with an average of 75- Hot phenol extraction of pre-mRNA however leads to a degradation to a size of about 25 nucleotides. S H E I N E S S et al. [10] have shown that poly(A) appears in the nucleus of HeLa cells as a relatively homogeneous unit of about 200 nucleotides. Our experiments suggest that this initial poly (A) in pre-mRNA of erythroblasts is not longer than 130 nucleotides. For the determination of the molecular weights standards of definite length were used, because it could be shown that the use of heteropolymers (like tRNA Abbrevations: hnRNA = heterogeneous nuclear RNA; pre-mRNA = precursor of messenger RNA; ds-RNA = double stranded RNA

316

B . J . T H I E L E , CH. COUTELLE, H . - D . H U N G E R , A . P . R Y S K O V

and 5 S RNA) as markers leads to an overestimation of the length of the poly(A)sequence [11]. We obtained quite similar results, also for oligo(U). These differences in migration could be due to the more compact secondary structure of heteropolymers rather than to differences in the charge of the bases. The oligo(U)-segment of erythroblasts pre-mRNA consists of 80% of U and is about 2 5 nucleotides long. Poly(A) + pre-mRNA of about 1 2 , 0 0 0 — 1 6 , 0 0 0 nucleotides contains 1—2 oligo(U)-sequences. No oligo(U) was detectable in poly(A) + pre-mRNA of about 1700 nucleotides as well as in mature globin mRNA. This suggests its localization to be at least 1700 nucleotides away from the 3 'end of the long pre-mRNA molecules. The occurrence of oligo(U)- sequences in mRNA of HeLa and hepatoma cells were first described by M O L L O Y et al. [ 1 2 ] and by S H E N K I N and B U R D O N [ 1 3 ] . The oligo(U) sequence obtained from the pre-mRNA of our more specialized cells shows no significant differences neither in the percentage of the total RNA nor in the base composition or the length of the oligonucleotide in comparison to their investigations. This suggests a universal signal function of the oligo(U)segment. Since the discovery of poly(A)-sequences in pre-mRNA and mRNA a possible regulatory function related to transport, translation or stability has been discussed. Experiments of M A R B A I X et al. [ 1 4 ] have ensured that the poly (A)-segment is responsible for mRNA stability. We have carried out some experiments regarding the functional meaning of the double stranded sequences in pre-mRNA [15]. For this purpose we studied the

Pre-mRNA

100-200 base pairs 3'

5'

Poly (A)

m Non informative

m RNA sequence

part

Cleavage byds RNAase

ppp

30 base pairs Release of mRNA and its transfer to cytoplasm 30 nucleotides

Elimination of hairpin branch followed by 5'end modification 7

m

rn GpppPu p

/

\

/ J

5'end modification \

/

A M

\ \ 1

30 nucleotides

m

m GpppPu p

Mature

/

W \

mRNA

Fig. 1. A hypothetical model for the localization and functioning of double-stranded regions of pre-mRNA as a separator of m R N A from non informative part of the precursor

Sequences in pre-mRNA

317

hybridization reaction of unlabelled globin mRNA from rabbit reticulocytes with a belled double strands from pre-mRNA of erythroid precursor cells, lit was. previously shown that the cytoplasmic mRNA from mouse liver or Ehrlich carcinoma cells could form RNase-stable hybrids with melted ds-RNA sequences prepared from a nuclear pre-mRNA [16]. Long ds-sequences from erythroblast pre-mRNA were shown by electrophoresis to contain about 100 nucleotide pairs. Melted double strands were hybridized with an excess of globin mRNA. 7—9% of the double strands became RNase stable and about 30% of the sequences could be bound to poly(U)-sepharose through poly(A) of the mRNA. This shows that globin mRNA contains a sequence complementary to the double stranded region of the pre-mRNA molecule. The RNase stable hybrid is about 30 nucleotides long, i.e. it corresponds to one third of one strand of the ds RNA. It is suggested that the double stranded hairpin-like structures formed the border lines between mRNA sequences and the noninformative part of the pre-mRNA. In the course of processing a part of the ds-region would be destroyed resulting in the separation of the mRNA (see Fig. 1). A part of one branch of the ds-RNA would remain bound to mRNA and could hybridizide with the ds-RNA from pre-mRNA. References [1] IMAIZUMI, T., D . DIGGELMANN, a n d K . SCHERRER: P r o c . n a t n . A c a d . Sci. U . S . A .

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Role of the polyadenylate sequence in the stability of globin messenger RNA injected into Xenopus oocytes G . MARBAIX 1 , G . H U E Z 1 , A . B D R N Y 1 , E . H U B E R T 1 , M . LECLERCQ 2 , TRENNE 1 , H . SOREQ 2 , U . N U D E L 2 , a n d U . LITTAUER 2 .

Y . CLEUTER 1 ,

H . CHAN-

Summary It is shown that the polyadenylate sequence covalently bound to the 3'-OH end of globin messenger RNA is responsible for the stability of the message when translated in Xenopus oocytes.

The existence of polyadenylate sequences (poly(A)) covalenlly bound at the 3'-OH end of most eukaryotic messenger RNAs (mRNAs) is well documented [1], It seems that these segments become shorter with ageing of mRNA and this was clearly proven in the case of mouse [2, 3] and rabbit [4, 5] globin mRNAs. However, their precise role remained so far obscure. Since the mRNAs coding for histones do not appear to contain poly (A), it seems unlikely that the presence of these sequences is required for translation. We considered the hypothesis that the length of the poly(A) segment is related to the half-life of the mRNA in a given system. One would therefore predict that poly (A)-lacking mRNA molecules would have a much shorter half-life than those containing a poly(A) stretch. A specific method was developed for removal of the 3'-OH poly (A) sequence from globin mRNA. It is based on synchronous processive phosphorolysis of mRNA using molar excess of E. coli polynucleotide phosphorylase at 0 °C in high ionic strength conditions [6]. Rabbit poly (A)-free globin mRNA obtained by this method could still be translated in ascites cell-free extracts but after long periods of incubation, the template activity of poly(A)-free mRNA leveled off earlier than that of native mRNA. This result supported the assumption that poly (A) is not required for translation but could ensure the functional stability of the message. Translation of globin mRNA in the ascites extract was active only for less than 90 minutes. To overcome the time limitation of this in vitro protein synthesizing system, we decided to compare the translation of intact and poly(A)-free globin mRNA in the in vivo system constituted by the oocytes of the frog Xenopus laevis [7]. Microinjection into oocytes permitted the use of a living cell translation machinery to compare the translational efficiency of the two globin mRNA preparations for periods of time as long as several days [8]. In this system, the initial rate of translation of poly(A)-free mRNA was close to that found for intact mRNA. However, after long incubation periods of injected oocytes (two days), the rate of globin synthesis with poly (A)-free mRNA was more than ten fold lower than with native mRNA [9]. One could thus conclude that the presence of the 3'-OH poly (A) sequence in globin mRNA is required to ensure its high functional stability.

320

G . MARBAIX e t al.

One could however argue that the enzymatic treatment which was used for poly (A) removal had perhaps also degraded some other structure in the message molecule and that this hypothetical structure was in fact responsible for the stability of globin mRNA. To test this possibility, a poly (A) sequence was resynthesized onto globin mRNA from which the poly (A) had been previously removed. This was achieved using an ATP/RNA adenyltransferase from E. coli [10]. The functional stability of this "reconstituted" globin mRNA was compared to that of poly(A)-free mRNA in Xenopus oocytes. One clearly observed that the functional stability of the message was recovered when a poly(A) segment was readded to poly(A)-free mRNA [11], This experiment definitely proved that the poly (A) sequence itself is responsible for the functional stability of globin mRNA in Xenopus oocytes. However, how translation of poly(A)-free globin mRNA was prevented after long periods of time was unknown. One possibility was that removal of the poly (A) segment reduced the stability of the message molecule and led to its degradation. Alternatively, some other process might have inactivated poly(A)-free mRNA and have interfered with its translation. To answer this question, we quantitated the amount of globin mRNA remaining in oocytes incubated after micro-injection of poly(A)-free or native mRNA preparations. This was performed by molecular hybridization with a radioactive complementary DNA probe synthesized onto globin mRNA by purified reverse transcriptase from avian myeloblastosis virus. The results of this experiment showed that 56 hrs after injection into oocytes, about 85% of poly(A)-free mRNA molecules were degraded while native, poly (A)-containing mRNA chains were almost completely preserved during the same period of time [12]. This proves that the poly(A) stretch is required to ensure the stability of the mRNA molecule itself in this cytoplasmic environment. We also compared the functional stabilities in Xenopus oocytes of globin mRNA preparations having well-defined, decreasing sizes of poly(A) segments. For the considered period of incubation of oocytes (two days) we observed that the stability remained constant for all mRNA preparations having a poly(A) stretch of more than 30 nucleotides. However, below a threshold which lies around 15 nucleotides, the poly(A) sequence did not ensure the stability of the message molecule any more [13]. A minimum length of the 3'-OH poly (A) segment is thus required to ensure its protective function. The above described experiments have been performed with haemin injected at the same time as globin mRNA since this compound is required for an efficient translation of a message [14]. This fact offered the opportunity to decide if poly(A)-free globin mRNA degradation in Xenopus oocytes depended on its translation. For that purpose, we compared the extent of degradation of poly(A)-free globin mRNA enriched in a message if injected with or without haemin. The amount of a enriched globin mRNA remaining after 72 hrs in incubated oocytes was estimated by molecular hybridization as previously described. We observed that 87% of poly(A)-free enriched mRNA was degraded at the end of the incubation period if haemin was present whilst in the absence of haemin, but 40% of poly(A)-free mRNA had disappeared [15].

Role of poly (A) and globin m R N A stability

321

As haemin per se has no degradative effect on injected native globin mRNA, the most straightforward interpretation of this result is that, in Xenopus oocytes, poly(A)-free globin mRNA must be translated for its physiological degradation to occur. Acknowledgements This work has been supported by grants of the "Fonds Cancérologique de la Caisse Générale d'Epargne et de Retraite", of the "US National Cancer Institute, Contract N O l C P 33 220" and of the "US-Israel Binational Science Foundation". References [1]

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J.

3143

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59,

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CHAN-

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CHAN-

Archs int. Physiol. Biochim. (in press)

Address of the authors: 1. Department of Molecular Biology, University of Brussels. B-1640 Rhode St-Genese, Belgium; 2. Neurobiology Unit, The Weizmann Institute of Science, P.O.B. 26, Rehovot, Israel

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 323 — 333 (1977) 1

I n s t i t u t e of Molecular Biology, Academy of Sciences, Moscow, USSR Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der D D R , 1115 Berlin-Buch, D D R 2

Synthesis and characterization of globin DNAs t-L. Y u . F R O L O V A , 2

J

A . V . T E N N O V , ' N . A . SCOBELEVA, ' L . L . KISSELEV,

CH. COUTELLE, a n d

2

2

V. HAHN,

H . GRUTZMANN

Introduction

A deep insight into the problem of gene expression and gene structure is intimatelyconnected with the necessity to isolate and to investigate appropriate individual genes. The isolation of genes from mammalian and other higher organisms remained underdeveloped although tremendous success has been achieved for prokaryotic and simple eukaryotic systems due to cloning of recombinant DNA molecules. An apparent paradox consists in the fact that at the moment it is more realistic to synthesize mammalian genes than to isolate them. Red blood cells highly specialized in the production of one type of protein and hence one dominant type of mRNA, namely globin and globin mRNA, is a unique object for the attempts to synthesize genes by means of the gene product, mRNA. Since mRNA is not a transcriptional but a posttranscriptional product the gene to be synthesized should correspond to a structural gene, not to a complete one including regulatory regions. The way from M R N A back to D N A was discovered by TEMIN and MIZUTANI [1] and BALTIMORE [2] when they found a new enzyme, RNA-dependent DNA-polymerase as an integral part of the oncogenic RNA-containing viruses. This enzyme which we call after Engelhardt "revertase" is at the moment a key component for all enzymatic gene-synthesizing systems. In 1972 it was discovered in three laboratories simultaneously that poly(A)containing mRNA could be used for the synthesis of complementary DNA strand [3 — 5]. At that time as well as now the globin messenger was the best known mRNA obtained in a pure state and preparative quantities in a number of places. In these first experiments the DNA copies (called cDNA) were probably incomplete in most cases and only single-stranded DNA was obtained. Later with the improvement of the technology for RNA-directed DNA synthesis it became possible to obtain full-length copies of globin and other mRNAs [6—11]. In essence, the most important observations here were the use of high deoxyribonucleoside triphosphate concentrations in incubation mixture, low ionic strength and the enzyme fully deprived of nuclease contaminants. Besides, the quality of mRNA preparation is of key importance. In addition to the absence of hidden breaks in polynucleotide chain and the presence of a sufficiently long poly (A) sequence at terminus a complete removal of potentional revertase inhibitors is necessary. Among them are polyvinylsulphate, heparin, dodecylsulphate, 22

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3—4

324

L. Y u

FROLOVA e t al.

bentonite and diethylpyrocarbonate used as nuclease inhibitors during isolation of m R N A preparation and poly(U) which itself inhibits revertase [12] and covers also the poly(A) portion of mRNA preventing the effective binding of the oligo(dT) primer. Poly(U) appears in preparations after the passage of m R N A through the bioaffinity columns containing poly(U). However, the problem of synthesis of double-stranded full-length DNAs which might be considered as structural genes was not solved at that time. Only in 1976 a few laboratories succeeded in enzymatic synthesis of true structural genes. Again the first structural gene to be synthesized in a test tube was a globin gene. In principle, various ways may be used for the enzymatic synthesis of genes based on the ability of revertase to catalyze DNA synthesis complementary to RNA sequence which serve as template. Fig. 1 described schematically possible ways for gene synthesis beginning with pure mRNA. In all the three versions (A, B and C) the first step is performed in the presence of revertase isolated from an oncorna virus and oligo(dT) which serves as a primer. Among the revertase transcripts full-length copies were also obtained [6, 11]. It is noteworthy that these full-length smgle-stranded globin cDNAs contain a small fraction of nuclease Sx resistant, i.e. double-helical sequences [6, 13], probably hairpins. Earlier, in 1 9 7 2 L E I S and H U R W I T Z [ 1 4 ] suggested that a 3'-terminal hairpin is generated in the course of reverse transcription. They assumed also that this short terminal hairpin might be further extended by revertase to form a double-stranded provirus DNA sequence in vivo. Scheme A (Fig. 1) corresponds to what was proposed but not proved by L E I S and H U R W I T Z . Scheme B is close to scheme A. The main difference is connected with the generation of the second DNA strand: in A it is made by revertase whereas in B the second enzyme, DNA-dependent DNA-polymerase I (Pol I) from E. coli fulfills the elongation of the second strand. In both schemes a double-stranded full-length structural gene is generated with the two chains covalently linked at one side ("hairpin gene"). To convert the hairpin gene into the "open" form the short loop between two strands might be split by Sj nuclease. Scheme B was used very recently by E F S T R A T I A D I S et al. [ 1 5 ] to synthesize globin gene. Scheme C, at variance with A and B, includes generation of a new initiation point for the second strand synthesis. Terminal nucleotidyltransferase is used to make a short homopolymeric sequence at the 3'end of the cDNA molecules. After this terminal addition reaction a complementary primer is added and DNA synthesis is performed by means of DNA-polymerase I. In scheme C the third enzyme, terminal transferase, is engaged in the process of synthesis but the Sx nuclease step is omitted.

Fig. 1. Principal pathways for m vitro enzymatic synthesis of structural genes

•

Characterization of globin DNAs

DNA -polymerase I poly id T) t M 1 1 1 1 1 1 i l I I 11 111 r m f ' poly(dA) hairpin structural gene

Legende siehe Seite 324

326

L . Y u . FROLOVA e t al.

Scheme C has been utilized by ROUGEON et al. [16] for insertion of a portion of mammalian gene into plasmid, however, only short DNA pieces were successfully incorporated into recombinant DNA molecule. The aim of the present work was to test experimentally all the above mentioned schemes (Fig. 1). Experimental procedures Purification of globin tnJRNA Rabbit globin mRNA was isolated as described [21] by oligo(dT)-cellulose chromatography and sucrose gradient centrifugation. Enzymes Avian myeloblastosis virus (AMV) DNA-polymerase (revertase) was isolated and purified as described [22]. Single stranded specific nuclease-Sj from takadiastase was purified according to the procedure described in [23], DNA-dependent DNA-polymerase I from E. coli was obtained from Boehringer. Calf thymus deoxynucleotidyl terminal transferase (TdT) was purified according to [24]. Enzymatic synthesis of DNA on RNA template The reaction mixture (100 ¡¿1) consisted of the following components: Incubation mixture 1: 50 mM Tris-HCl, p~H 8.3, 6 mM MgCl2, 4 m l dithiothreitol (DTT), 40 mM KC1, 0.1 mM (each) dATP, T T P , dGTPand 0.02 mM [ ;) H] dCTP ( 2 0 - 2 5 Ci/mmole), 100 (ig/ml of actinomycinD, 5 [Ag/ml rabbit globin mRNA, 5 fig/ml of (dT) 1 0 and 30—40 units/ml of revertase. 1 unit of activity catalyzes the incorporation of 1 nmole T T P in TCA-precipitable fraction at 3 7 °C. Incubation mixture 2: the same as in incubation mixture 1, but mRNA = 20 — 30 ¡¿g/ml, oligo(dT) 10 = 25 ¡Jig/ml, 0.2 mM (each) of dATP, dGTP, T T P and [ 3 H]dCTP (1500cpm/ pmole) and in the absence of actinomycin, incubation at 37 °C for 1 hr. For preparative purposes the reaction mixture was scaled up to 5 — 10fold. Aliquots were precipitated with TCA and counted for determination of the yield. The mixture was treated with phenol and ethanolprecipitated without or after addition of tRNA-carrier in the case of incubation mixture 1. The ethanol-precipitated material was dissolved in water, hydrolyzed with 0.3 N KOH at 37 °C for 5 or 17 hrs, neutralized, passed through the Ultrogel column AcA34, equilibrated with 0.05 M triethyl-aminobicarbonate buffer, />H 6.7. The excluded material was evaporated and solubilized in deionized water. Elongation of globin DNA The reaction mixture (100 pi.1) contained: 0.1 M cacodylate, pH 7.2, 10 mM ZnS0 4 , 1 mM CoCl2, 0.2 mM [ 3 H]TTP (300—500 cpm/pmole), 60 units/ml of deoxynucleotidyl transferase, and DNA-template. The incubation was at 37 °C for 1 hr. The procedure for the purification and isolation of the product was the same as in the previous case. Enzymatic synthesis of DNA complementary to cDNA The reaction mixture (50 |il) consisted of the following components: 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 6 mM MgCL, 17 mM KC1, 4 mM DTT, 0.4 mM (each) dATP, dGTP, T T P and ["C]dCTP (440 Ci/mole), 54 units/ml of E. coli DNA-polymerase, [ 3 H]dCMP DNA template or dT elongated [ 3 H]dCMP-DNA annealed with (dA)10. The incubation was at 30 °C for 2 hrs. The isolation and purification of the product was the same as in the previous cases. Poly aery lamide gel electrophoresis Electrophoresis at 2.5 mA/tube was run on 4.5% polyacrylamide gels in 98% formamide according to [25]- Plastic tubes (10 X 0.5 cm) were used and gels were scanned by means of Joyce Loebl Scan 400. The samples were boiled for 2 min, cooled rapidly on ice and dissolved in deionised formamide before application. 4 S, 5 S and 16 S RNAs were used as markers. After scanning gels were frozen and cut into 2 mm slices. To each slice 0.5 ml of Protosol (NEN) was added, incubated for 1 hr at 55 °C, cooled, diluted with toluene scintillator and counted in an Intertechnique S L 30.

327

Characterization of globin D N A s

S1 nuclease treatment T h e reaction m i x t u r e (500 ¡il) consisted of 0.05 M NaCl, 0.03 M CH 3 COONa, pH 4.6, 1 mM ZnS0 4 , 5% glycerol, 20 ¡jtg/ml of d e n a t u r a t e d DNA, a n d 600 units of activity of S t nuclease [26]; incubation was for 1 h r a t 37 °C. T h e samples were precipitated with TCA, washed on millipore filters a n d counted. Hydroxyapatite (HA P) chromatography 1 ml H A P (DNA grade, Biogel N T P , Bio-Rad) column was used. Fractions were eluted w i t h 0.16 M a n d 0.4 M p h o s p h a t e buffer, pH 6.8, a t 60 °C. 1 ml fractions were collected on G F / C glass filters, dried, washed with TCA, a n d counted in scintillation spectrometer. Results Revertase

catalyzed

synthesis

of globin

hairpin

gene

It has been demonstrated earlier in our laboratory [17] that reyertase catalyzes the synthesis of the DNA fraction which contains poly (dA) and does not hybridize with mRNA. This observation was extended in this work via analysis of the length of the DNA products synthesized by revertase in the absence of actinomycin D. To analyse the molecular weight of the fractions, polyacrylamide gel electrophoresis in 98% formamide has been used. It is known that under these conditions DNA and RNA chains are completely denatured [18]. Three main radioactive peaks are observed (Fig. 2). The first peak contains material the length of which is roughly equal to the double length of the mRNA used. The length of rabbit globin mRNA molecules was determined separately and found to be equal to 700 ± 50 nucleotides. The second peak (Fig. 2) is rather heterogeneous and contains fractions with a length which corresponds to the full-length and incomplete cDNAs. The third peak is a relatively low-molecular one and contains short reverse transcripts. This interpretation was strengthened further when the reaction products were separated on hydroxyapatite columns into two fractions: the first (single-stranded) fraction was eluted with 0.14—0.16 M phosphate buffer and the second (doublestranded, helical) fraction with 0.4 M phosphate. As shown in Fig. 3 the first 1200 350 700 500

x10'2

300

20

amide gel. D N A was synthesized b y revertase w i t h t h e r a b b i t globin m R N A as a t e m p l a t e . Curve 1: incubation m i x t u r e 1; curve 2: incubation m i x t u r e 2 (see " E x p e r i m e n t a l procedures").

4 0

.o-0/' I 0-0 I 8

o 12 16 20 slice number

24

28

328

L . Y U . FROLOVA e t a l .

1500 350100 500 300

sooo

slice number

Fig. 3

0

1500 350 700 500 300

4

8

12

IE 20 24 28 ' slice number

32

Fig. 4 3

Fig. 3. Radioactivity of [ H]dCMP-DNA electrophoresed on Polyacrylamide gel. DNA was synthesized by reyertase in incubation mixture 2 and then eluted from H A P a t O.lM Naphosphate (curve 1) and 0.4 M phosphate (curve 2) Fig. 4. Distribution of [ 3 H]dCMP-DNA radioactivity in Polyacrylamide gel. DNA was synthesized in incubation mixture 2

fraction contains no double-length transcripts and is presented mainly by relatively short chains. All the long transcripts are located in the "double-helical" fraction. The conditions used in our work for DNA synthesis are not the same that were used by others [15]. The authors of this work were unable to reveal double-length transcripts with a single enzyme, revertase but only after Pol I-action on the cDNA. One may assume that in the experiments of EFSTRATIADIS et al. [15] for reverse transcription, revertase is unable to catalyze the second strand formation. When we compared the products made at high and low triphosphate concentrations (Fig. 4, curves 1 and 2) the same double-length fraction was revealed and the whole pattern of radioactivity was quite similar. The only difference which we noticed was an increase in the proportion of high-molecular weight fractions accompanied by a decrease of the low-molecular weight peak. Fig. 4 shows that DNA synthesis at high mRNA and nucleoside-triphosphate concentrations in the absence of actinomycin D proceeds in a step-wise manner. The first peak corresponds to a double length of mRNA, the second one to a single length, the third one to 2/3, and the last one to 1/3—1/4. We assume that the first peak is a hairpin gene whereas all the others reflect the cDNA synthesis of various length. A discontinious character of DNA synthesis which was also observed by others [6] is probably caused by some structural features of the mRNA template. For example, long and GC-rich internal hairpins may produce "structural stops" where the rate of the synthesis is diminished. Although this question needs further

Characterization of globin D N A s

329

clarification it might be a useful tool to study the secondary structure of mRNA. T o summarize, revertase alone is able to catalyze "hairpin gene" synthesis. The conversion of hairpin gene into the open form of the double-helix might be achieved as d e s c r i b e d b y EFSTRATIADIS et al. [15].

DNA

synthesis after B and C schemes

Scheme B (Fig. 1) realized for the first time b y EFSTRATIADIS et al. [15] is based on a sequential action of two DNA-polymerases. The experiment was arranged in the following w a y . [ 3 H ] d C M P - D N A was synthesized b y revertase and isolated from incubation mixture. This preparation was used as a template-primer for D N A synthesis catalyzed b y Pol I. In this case [ 1 4 C]dCTP was used as a labeled substrate. The difference in distribution of [ 3 H] and [ 14 C] radioactivity after formamide gel electrophoresis is shown in Fig. 5. A f t e r the action of the second D N A - p o l y m e r a s e (curve 2) only one main peak of radioactivity is observed coinciding in its mobility w i t h the double-length peak made b y revertase. Incorporation into the shorter fractions is insignificant. T w o essential conclusions should be made from these d a t a : 1) D N A chains synthesized b y revertase can be elongated b y Pol I. Since it is known that this enzyme catalyzes polymerization of nucleotides only in the presence of primer with a free 3 ' - O H group [19] it means that D N A fraction made b y revertase contains internal primer, i.e. hairpins with unequal lengths where the longer side plays the role of template and the shorter one functions as a primer. This is in a good agreement with scheme B (Fig. 1). 2) The elongation of D N A chains proceeds nonrandomly since after Pol I action most of the chains, in spite of the initial heterogeneity, become equal to the double-length of globin m R N A . This observation proves also scheme A where it has been postulated that revertase acting alone produces those D N A molecules which differ in the length of the second D N A strand. xW~2

8

£

aF i g . 5. R a d i o a c t i v i t y profile of [ H ] d C M P D N A fractions a f t e r gel electrophoresis. Curve 1 (control): t h e s a m e as in F i g . 4 . ; curve 2 : [ 1 4 C ] d C M P - D N A synthesized b y D N A - p o l y m e r a s e I in t h e presence of [ 3 H ] d C M P - D N A (see curve 1)

4

3

^

0

J

4

I

8

I

I

I

I

I

I

I

L

12 18 20 24 28 32 SS 40 slice number

330

L . Y u . FROLOVA e t a l .

From Fig. 5 it is clear that the role of Pol I consists mostly in elongation of those DNA chains which were not completed by revertase. It enhances the revertase action, and therefore improves the yield of the hairpin gene fraction. Based on these data we synthesized DNA in a double polymerase system, then subjected the material to alkaline sucrose concentration gradient fractionation and recovered the peak from the region which corresponds according to the marker to the length of about 1200—1500 nucleotides. The isolated material was electrophoresed in gel in denaturating conditions (Fig. 6). It is obvious that the major fraction is about double-length of globin mRNA. The minor fraction (700 nucleotides) is presumably a cDNA fraction. After action of Sj nuclease this fraction can be hydrolyzed. The resistance of the isolated product to Sj nuclease was very high (85%). This is in agreement with the assumption that the major fraction is a self-complementary hairpin gene and the minor fraction is a single-stranded cDNA. In conclusion, scheme B although more sophisticated methodologically than scheme A is efficient in producing the hairpin gene. The yield of the double-length product is much higher than after revertase action alone. The common shortening of both schemes is connected with the necessity to use nuclease S1; to split the loop and to open the hairpin. It may happen that during this procedure the hidden breaks are produced along the DNA helix. Therefore it looks reasonable to try to eliminate this procedure due to its potentional hazard and to use the scheme C (Fig. 1) where nuclease action is avoided. The initial step of the procedure was the same as in schemes A and B, namely DNA synthesis due to revertase action. After isolation of the product it was treated with deoxynucleotidyl terminal transferase in the presence of [3H] TTP. The extent of the terminal addition reaction was followed after incorporation of [ 3 H]TTP into acid-precipitable material. The average chain length of the poly(T) at 3'ends was « 5 0 nucleotides. After sequential action of revertase and terminal nucleotidyl transferase the preparation is heterogeneous (Fig. 7, curve 1) which is a superxlO'1 10

6

1500 1200 950 700 500

300

I I II I I

B

V

l/vcA/V0 1B 24 slice number

32

40

Fig. 6. Distribution of [ 3 H,"C]dCMP-DNA radioactivity in polyacrylamide gel. [ 3 H, 1J C]dCMP-DNA fraction was synthesized by sequential action of revertase and DNA-polymerase I and isolated from a zone of alkaline sucrose centrifugation gradient containing polynucleotides of 1200—1400 nucleotides in length

Characterization of globin DNAs

331

350 700 500

300

Fig. 7. Radioactivity profile for DNAs after gel electrophoresis. Curve 1: globin [ 3 H dCMP-DNA] synthesized by revertase and elongated with terminal nucleotidyltransferase; curve 2: [14C] dCMP-DNA synthesized by DNApolymerase I in the presence of "elongated D N A " (curve 1) slice number

position of heterogeneity produced by revertase and by transferase. Again as in all other previous cases, a heavy peak is seen (hairpin gene) and the fraction slightly longer than cDNA. After addition of Pol I together with [14C]dCTP, other triphosphates and oligo(dA) an interesting length distribution was observed (Fig. 7, curve 2). A large peak appears which corresponds to the double-length of mRNA. This is expected from scheme B, since elongation of DNA should be related to the presence of internal but not an external primer. A successful elongation of the fraction of DNA molecules after action of terminal nucleotidyltransferase means that this fraction does not serve as a primer for homopolymer elongation reaction catalyzed by terminal transferase. It is known [20] that this enzyme has a strong preference for single-stranded primers, whereas }'-OH groups involved in the secondary structure are very poor primers. The inability of the terminal transferase to prevent the elongation of DNA chains by Pol I is in favour of the notion that the 3'-OH group of DNA is a part of a double-helical hairpin region. This statement has been already made on the basis of all other data mentioned above. On the other hand significant incorporation of [14C]-label into shorter fractions indicates that in this case the external primer was used since in its absence (Fig. 5) Pol I does not considerably synthesize short DNA chains, in other words the second strand of DNA was made in those cases when poly(T) appeared at 3'-end of cDNAs. In turn those cDNAs which serve as a primer for terminal transferase have single-stranded 3'-termini and therefore have no hairpin-like structure at the 3'-ends. From comparison of Fig. 7 and Fig. 5 one may conclude that two simultaneous processes take place after addition of Pol I to the "elongated" DNA preparation: -1) elongation of preexisting hairpin-containing DNA fractions, 2) synthesis of separate strands of DNAs complementary to DNAs elongated with poly(T). In the first case a full-length hairpin gene is formed whereas in the second one the double-stranded pieces of globin structural gene are made varying in length in a

332

L . Y u . FROLOVA et al.

wide range. The last statement is correlated with high Sx nuclease resistance of these fractions, « 7 0 % . Further treatment of the incubation mixture can be made in two different ways. After Sj nuclease digestion all fractions should be converted into open (doublestranded) form and then used directly for producing recombinant DNA molecules or fractionated according to the chain length. Alternatively, the mixture can be separated according to the molecular weights and then used separately. It should be stressed that scheme C is a rather complicated one since it is necessary to isolate the products three times: after revertase, terminal transferase and Pol I treatments leading to considerable loss of material. However, the advantage of this scheme consists in obtaining DNA products usefull for various types of further experimentation. Conclusions

Three schemes for in vitro enzymatic synthesis of double-stranded full-length structural genes are considered. Each of the scheme was tested experimentally using rabbit globin mRNA as a starting material. The common feature of all the protocols applied consists in exploiting the ability of RNA-directed DNA-polymerase (revertase) from avian myeloblastosis virus to copy mRNA chains in appropriate conditions via reverse transcription. It is shown that (1) revertase catalyzes the mRNA-directed synthesis of DNA chains which are twice as long as mRNA template. This fraction is presumably a hairpin gene, i.e. full-length double-helical globin structural gene with a loop linking together the two strands. (2) The same fraction can be obtained by sequential action of revertase and DNA-dependent DNA-polymerase I (Romberg enzyme) and the yield of the product is higher than after revertase alone. (3) A mixture of hairpin and double-stranded forms of globin structural gene is obtained after sequential action of revertase, terminal nucleotidyl transferase and DNA-polymerase I. In case of "open" forms a large portion of them is incomplete. This work has been performed under the scope of "Revertase" project. The authors are very grateful to Professor J . S I M A N for his kind gift of chicken plasma containing avian myeloblastosis virus, to Dr. V . P R A S O L O V who provided us with terminal nucleotidyl transferase and to Dr. T. A V D O N I N A for her participation in some experiments. References and S . M I Z U T A N I : Nature, Lond. 226, 1 2 1 1 (1970) D.: Nature, Lond. 226, 1209 (1970) M . , G . F . T E M P L E , H . F A N , and D . B A L T I M O R E : Nature New Biol. 235,

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Isolation of human globin mRNA and synthesis of complementary DNA S. A . LIMBORSKA a n d L . Y u .

FROLOVA

There are two alternative approaches towards the preparation of single genes: gene isolation and gene synthesis. Cesium salt gradient centrifugation of DNA fragments and hybridization of DNA in excess of specific RNA are the methods that are customarily used for gene isolation. This technique was chosen for purification of reiterated genes, such as ribosomal and transfer RNA genes and histone genes [1—3]- Furthermore single-stranded DNA fragments enriched in globin genes were isolated using this technique [4]. On the other hand, individual genes can be obtained by the reverse transcription of corresponding mRNA samples. This method was used for preparation of globin, immunoglobulin, ovalbumin and some other genes [5—10]. The problem of human gene isolation is of particular interest. For example they may be useful either for studying the structure, function and regulation of the activity of human genes, or as probes for detecting and quantitating specific portions of the genome or mRNA in a variety of normal and abnormal conditions. Similar to animals, human globin genes are more available for analysis. Reverse transcription of globin mRNA is the main method for obtaining these genes (complementary DNA's). In most of the works already published, samples of cDNA with a size in the range of 3 00 to 600 nucleotides, that is from 40 to 90% of the length of mRNA, were used. This may depend on the conditions of the reaction and nativeness of mRNA samples. The present paper describes the isolation and characteristics of human globin mRNA and the synthesis of complementary DNA, the greatest part of which is made of full length copies of mRNA. Material and methods Human globin m R N A was prepared from samples of normal and haemolytic anaemia blood with reticulocyte counts from 5 to 40% by a modified method described in [15]. Blood cells were centrifuged and washed three times with cold buffer, containing 0.13 M NaCl; 0.01 M Tris-HCl, pH 7.8. The washed cells were lysed at 0 °C by addition of 3 volumes of buffer containing 0.01 M Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM MgCl,, 6 mM /5-mercaptoethanol and 100 ¡xg/ml heparin. The cell membranes were sedimented at 15,000 rev./min in a Janetzki K-24 centrifuge for 20 min at 2 °C and discarded. The supernatant was carefully removed and brought to 1 % sodum dodecyl sulfate. R N A was exctracted three times with phenol, pH 8.5, chloroform-isoamyl alcohol (50:50:1 by vol.) at room temperature. R N A was precipitated with 2.5 vol. of cold redistilled ethanol. Then R N A was layered onto 5 — 20% sucrose gradients containing 0.10 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.05 M MgCl2, 5 mM EDTA, 0.5% sodium dodecyl sulphate and was centrifuged for 17 —20 hrs at 22,000 rpm in a Beckman SW-25 rotor at 20 °C; 7 —12S R N A fractions were collected. This material was put on a poly(U)-sepharose column (0.5 X 1 cm) at 20 °C in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, 0.01 M Tris-HCl,

336

S . A . LIMBORSKA, L . Y U . FROLOVA

pYL 7.5, 0.2% sodium dodecyl sulphate. The column was washed with t h e same buffer to 0.02 O.D.260. The poly(A)-containing fraction was then eluted with 0.2% sodium dodecyl sulphate at 45 °C. After that, adsorbed and nonadsorbed fractions were passed through a sephadex G-50 column in buffer containing 0.2 M sodium acetate, 0.10 M Tris-HCl, p~R 7.5. 3 — 5 [ig of each fraction were analysed by electrophoresis in 4.5% polyacrylamide gels [16]. After electrophoresis t h e gels were stained with 0.2% methylene blue and analysed in a "Chromoscan". For reverse transcription we used poly (A)-containing 9 S RNA. RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) was purified from avian myeloblastosis virus as described [8]. Samples were incubated for 1 hr a t 37 °C in t h e following mixture; 0.05 M Tris-HCl, pH 8.3, 0.04 M KC1, 6 m M MgCl,, 4 mM dithiothreitol, 0.2 mM of each dATP, dTTP, dGTP, 0.2 mM [ 3 H]-dCTP (400 cpm/pmole), 1 |xg/ml of m R N A , 5 ng/ml of oligo(dT) 10 , 100 |J.g/ml of actinomycin D and 40 units of reverse transcriptase (1 unit catalysed t h e incorporation of 1 mmole d T T P with poly(A)-oligo(dT) 10 as template at 37 °C for 15 min). Complementary DNA (cDNA) was extracted with phenol-chloroform (1:1) and was incubated in 0.3 M K O H for 18 hrs, neutralized and precipitated with 2.5 vol. of cold ethanol in the presence of yeast t R N A as a carrier. Then t h e pellet was dissolved in 0.2 M sodium acetate, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.5, and passed through a sephadex G-50 column (0.5 X 50 cm). The size of cDNA was determined by electrophoresis in 5-2% polyacrylamide gels in formamide [17]. t R N A from yeast and 9 S rabbit globin m R N A were used as markers. Gels with nonradioactive material were developed with "Stains all' (Eastman/Kodak), gels with radioactivity were cut into slices of 2 m m and dissolved in "Tissue solubilizer" (Amersham/Searle) and counted in toluene/fluorine mixture. Hybridization experiments with human globin m R N A and cDNA were carried out in 0.3 M NaCl a t 65 °C. DNA was added to m R N A a t different concentration but a t constant ratio. The mixture was heated for 5 min a t 100 °C, cooled to 65 °C and incubated for different times. At the end of t h e incubation t h e a m o u n t of hybridized DNA resistant t o nuclease S x was measured by adding 10 ng/ml E. coli denatured DNA, 1/5 vol. of buffer, containing 0.15 M sodium acetate, pH. 4.5, 6 • 10 - 1 M ZnS0 4 and 20 units/ml of nuclease Si [18] to each reaction mixture. After incubation for 40 min a t 55 °C the samples were cooled to 0 °C and acidinsoluble material was precipitated with trichloroacetic acid, collected on membrane filters and counted. Translation activity of human globin m R N A was determined in wheat germ protein-synthesizing system isolated as described [19]. The reaction mixture contained: 30 mM H E P E S (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), pH 7.6, 1 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 80mMCTP, l 6 m M creatine phosphate, 40;xg/ml of creatine phosphokinase, 100mM KC1, 2.5 mM magnesium acetate, 20 mmoles of each amino acid except leucine and 1.2 mM [ 3 H]leucine (58 Ci/mmole,) 0.4 vol. of S 23 fraction and from 5 to 20 fJ-g/ml human globin mRNA. Radioactivity was determined as described [20]. In the case of preparative synthesis 4 mg/ml of carrier human globin was added after incubation and globin was extracted and chromatographed on carboxymethylcellulose [21]. Results and discussion

Fig. 1 shows electrophoretic analysis of mRNA samples. The material adsorbed on poly(U)-sepharose column has one band corresponding to 9 S RNA. Nonadsorbed material comprises a heterogeneous population of molecules, most part of which is represented by 9 S RNA. The amount of these 9 S RNA molecules was much greater than poly(A)-containing mRNAs and is about 80% of 9S RNA peak. This fact may be explained in the sense that these mRNA molecules have very short or no poly(A)-fragments. It is known that the size of poly(A) varies in human globin mRNA [22]. In most of the papers on the isolation of human globin mRNA that have already been published there are no data on the yield of mRNA from a definite source. For the isolation of human globin mRNA we used normal blood and reticulocyte-rich blood from haemolytic anaemia. From 1000—1500 ml of

Globin m R N A and cDNA

337

Fraction

number

Fig. 2 Fig. 1. Electrophoretic analysis of human reticulocyte 9 S RNA. 1) R N A adsorbed on poly(U)-sepharose; 2) nonadsorbed R N A Fig. 2. Carboxymethyl cellulose chromatography of proteins, synthesized in vitro. Protein synthesized with human 9 S R N A template ( x X); without added R N A (o O); carrier globin protein from normal human erythrocytes ( )

normal donor blood one may obtain 5—10 (ig, and from 300 ml of blood with reticulocyte counts of about 7—8%, 1 5 — 2 0 ^ of poly (A)-containing 9S mRNA. 9 S RNA samples were analyzed in a wheat germ protein-synthesizing system. Both adsorbed on poly(U)-sepharose and nonadsorbed material appeared to be able to stimulate protein synthesis in vitro (Table 1). The samples of protein synthesized were studied by chromatography on carboxymethylcellulose. Fig. 2 shows the chromatography of the protein, synthesized in the presence and absence of human 9 S RNA. Both curves nearly coincide in the region of nonglobin proteins that may be synthesized in the system owing to the endogenous templates remaining. The peaks of radioactivity corresponding to a- and /3-globin chains are present only in the presence of mRNA, that means that our 9 S RNA from human reticulocytes contains globin mRNA. In further experiments we studied the template capacity of poly (A) containing human globin RNA for reverse transcription. In the conditions used its template activity was 2 • 10 4 pmoles cDNA/O.D.260. The demonstrated activity is similar to that of the rabbit globin mRNA and is much higher than reported for human globin mRNA [14]. Fig. 3 shows an electrophoretic analysis of cDNA in polyacrylamide gels in formamide. One can,see that most part of the cDNA has a mobility corresponding to 9 S chains. These molecules appeared to be full length copies of mRNA.

338

S . A . LIMBORSKA, L . Y U . FROLOVA

Table 1 Template activity of human globin mRNA in a wheat germ protein-synthesizing system Exp. No.

RNA sample

1

poly (A) + RNA

2

poly (A) - RNA poly (A) - RNA

mRNA input [fig/ml]

[ 3 H]-leucine incorporation [cpm]

10 20 10

1000 1200 1600 400 1750 2670

5

10 20

Fig. 4. Hybridization of cDNA in excess of human globin mRNA

Fig. 3. Electrophoretic properties of cDNA synthesized on human globin mRNA template 1S Slice number

Fig. 4 shows the hybridization of cDNA in excess of human globin RNA. It is evident that cDNA is complementary to the template used. The hybridization curve is in the CrT regions typical for described curves of human globin sequences [14]. Thus, the present paper demonstrates the isolation of globin mRNA from human reticulocytes and the synthesis of complementary DNA, most part of which is a complete transcript of human globin genes. The obtained samples of cDNA ;may be used for studies in human molecular genetics; for instance, in research of molecular causes of thalassemia. Moreover these genes may be obtained in preparative amounts by gene engineering methods and used for elucidating the general regularities of organization and function of human globin genes. We wish to thank Prof. G . P. GEORGIEV for stimulating discussions, Prof. A. E . E V D O K I MOVA, Drs. L . I . IDELSON and S . S . SOBOLEVA for reticulocyte-rich blood samples. We are grateful to Drs. S. N. KHILKO and E . E . MAKAROVSKAYA for their help in translation analysis of mRNA, and Dr. N. E . MALEEVA and Mrs. I . F U R Y G I N A for their assistance.

Globin m R N A a n d c D N A

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DÜMDEY

Zusammenfassung Aminosäuren sind das H a u p t s u b s t r a t der Retikulozyten. Der Aminosäure-pool der Retikulozyten repräsentiert eine charakteristische Selektion. Die Zusammensetzung des Aminosäurepools ist reifungsabhängig. Die vorrangige Oxydation lcurzkettiger Aminosäuren läßt ein Verhältnis von etwa 5:1 zwischen CX-Verbrauch und NH 3 -Bildung erwarten. Nach Korrektur der NH 3 -Freisetzung durch Nukleotiddesaminierung übersteigt der Quotient zwischen 0 2 -Verbrauch und NH 3 -Bildung den Erwartungswert um etwa eine Größenordnung. Die geringe Freisetzung von N H 3 bei der Energiegewinnung aus Aminosäuren resultiert aus der Wiederverwertung des Stickstoffs für die Synthese von Serin und Glyzin mit dem C-Skelett der Glukose. Zwischenprodukte der Serinsynthese sind (g-OH-Pyruvat und OH-Pyruvat. Serin und Glyzin werden bevorzugt f ü r die Hämoglobinsäuresynthese benötigt. Im Retikulozyten existiert eine Kompartmentierung des Glyzins, welche eine unterschiedliche spezifische Aktivität von Serin und Glyzin in Isotopenversuchen bedingt. Aus der zeitlichen Änderung der spezifischen Aktivität des Serins und Glyzins nach Pulsmarkierung des Serins wird der Umfang der Serinsynthese mit 15 — 30% des Glukoseumsatzes abgeschätzt.

Die meisten Wege des Zwischenstoffwechsels der Retikulozyten sind seit einigen Jahren qualitativ aufgeklärt. Wir wissen heute, daß die Aminosäuren von außerordentlich großer Bedeutung im Stoffwechsel dieser Zellen sind. Das ist zutreffend sowohl für den Energiestoffwechsel als auch für die Syntheseleistungen des Retikulozyten, die im wesentlichen in der Häm- und Globinsynthese bestehen [1], Diese Kenntnis darf uns nicht darüber hinwegtäuschen, daß wir weder die Zusammensetzung des Substratgemisches noch seine Regulation im Detail kennen. Wir wissen wenig über die Verteilung der Metabolite auf anabole und katabole Stoffwechselwege und noch weniger über die Regulationsprinzipien zwischen mitochondrialen und zytosolischen Systemen. In bezug auf die Substratverwertung der Retikulozyten verfügen wir über folgende Kenntnisse: Der Anteil der Glukose an der Gesamt-C0 2 -Bildung der Retikulozyten ist verglichen mit anderen Zellen verhältnismäßig klein. Der Anteil der Glukose steigt von weniger als 20% in sehr unreifen Zellen mit der Reifung auf 50% an der GesamtC0 2 -Bildung an [2]. Aminosäuren haben also den größten Anteil am endogenen und exogenen Substrat der Retikulozyten [3—6]. Es liegt bis jetzt noch keine komplette Analyse der intrazellulären Aminosäurekonzentrationen vor [-1, 7]. In Tab. 1 sind unter Einbeziehung von Literaturdaten unsere Kenntnisse über die Zusammensetzung des intrazellulären Aminosäure-pools zusammengestellt. Die 23*

342

M . M Ü L L E R , S . RAPOPORT, J . R A T H M A N N , R . D U M D E Y

Tabelle 1 Konzentration einiger Aminosäuren in Kaninchenretikulozyten Aminosäure Glyzin Glutamat Aspartat Alanin Serin ®-Serin Threonin andere

Aminosäure Glyzin Glutamat Alanin

1,60 0,80 0,58 0,53 0,36 0,29 0,28

± 0,60 ± 0,32 ±0,13 ± 0,20 ± 0,14 ± 0,14 ± 0,10 < 0,05

n 22 26 3 23 10 6 3

Tabelle 2 einiger Aminosäuren von Kaninchenretikulozyten verschiedenen Stadien der Entblutungsanämie K[onzentn ition (mM) 4 . - 6 . Tag

n

9 . - 1 6 . Tag

n

1,10 ± 0,28 0,70 ± 0,22 0,40 ± 0 , 1 4

7 6 7

1,80 ± 0,45 1,00 ± 0,35 0,60 ± 0,13

9 12 9

in

P (%) AVA

Konzentration

Konzentration (mM)

Zusammensetzung des Aminosäure-pools der Retikulozyten repräsentiert eine charakteristische Selektion der Aminosäuren. Glyzin überwiegt, gefolgt von Glutamat, Aspartat, Alanin, Serin und Threonin. Kürzlich konnten wir auch P-Serin mit einer etwa dem Serin entsprechenden Konzentration nachweisen. Die Konzentration aller übrigen Aminosäuren ist etwa eine Größenordnung kleiner. Die relativ großen Schwankungsbreiten lassen sich auf die Tatsache zurückführen, daß die Retikulozyten im Vollblut während einer Entblutungsanämie keine homogene Zellpopulation repräsentieren [1, 8]. Wir finden Differenzen in der Aminosäurekonzentration in verschiedenen Stadien der Anämie. Tab. 2 zeigt, daß die Aminosäurekonzentrationen im Verlauf einer Entblutungsanämie ansteigen. Der Anstieg ist signifikant für Glyzin und Alanin. In einer frühen Phase der Entblutungsanämie erscheinen sehr unreife Retikulozyten im peripheren Blut. Nach länger andauernder kontinuierlicher Entblutung treten im peripheren Blut reifere Retikulozyten auf. Die Spezifik der Reifung der Retikulozyten besteht im fortschreitenden Abbau der Organellen, Ribosomen und Mitochondrien, im partiellen Abbau der Zellmembran und in der selektiven Aktivitätsabnahme von Enzymen [1]. Aus diesem Reifungsgeschehen resultiert der Konzentrationsanstieg der Aminosäuren. Offenbar erfolgt der aktive Transport der Aminosäuren auch dann noch mit großer Intensität, wenn in reiferen Retikulozyten die Funktionsfähigkeit der Mitochondrien vermindert ist. Der Konzentrationsanstieg wird begünstigt durch den verminderten Verbrauch der Aminosäuren für den Energiestoffwechsel und für Synthesen und durch die Bildung von Aminosäuren durch intrazelluläre Proteolyse.

34)

N-Ökonomie und Aminosäuresynthese

Die Zusammensetzung des Aminosäure-pools wird insgesamt durch die in Abb. 1 zusammengestellten Prozesse beeinflußt [1]. Die pool-Zusammensetzung resultiert aus der Aminosäureaufnahme aus dem Plasma, dem Katabolismus zelleigener Eiweiße und dem Verbrauch der Aminosäuren für den Energiestoffwechsel und für Synthesen. Neuere Erkenntnisse machen es notwendig, die intrazelluläre Bildung von Aminosäuren beim Studium der Dynamik des Aminosäure-pools zu berücksichtigen. Dieser Aspekt wird Gegenstand der weiteren Diskussion sein. Welchem Stoffwechsel-Schicksal unterliegen die Aminosäuren ? Es soll nicht das Schicksal jeder einzelnen Aminosäure analysiert, sondern es sollen die Probleme dargestellt werden, die sich aus der vorrangigen Verwendung der Aminosäuren für den Energiestoffwechsel ergeben. Der Anteil einzelner Aminosäuren an der Gesamt-C02-Bildung der Zellen ist sehr different und primär eine Funktion der intrazellulären Aminosäurekonzentration [6]. In Übereinstimmung mit dem von WARBURG bestimmten respiratorischen Quotienten von etwa i [9], erfolgt die C02-Bildung bevorzugt aus aliphatischen Aminosäuren mit weniger als 6 C-Atomen. Dabei dienen Glutamat bzw. Glutamin, Aspartat und Alanin als Metabolite, die in enger Beziehung zum Zitratzyklus stehen, vorrangig der Energiegewinnung [6, 10, 11]. Die hohe C02-Bildung aus Serin und Glyzin erfolgt dagegen im Zusammenhang mit der intensiven Porphyrinsynthese der Retikulozyten [1, 6, 12, 13]. Aminosäuren, die in direkter Beziehung zum Zitratzyklus stehen, können bei ihrer Konzentrationserhöhung die unveränderte Gesamt-C02-Bildung der Retikulozyten weitgehend monopolisieren [1]. Beispielsweise können Glutamin bzw. Glutamat mit 80% den höchsten Anteil an der Gesamt-C02-Bildung erreichen [10]. Da Aminosäuren das Hauptsubstrat der Retikulozyten sind, ist eine beträchtliche Ammoniakbildung zu vermuten. Wie aus Literaturdaten hervorgeht, bleibt aber die Ammoniakfreisetzung weit hinter der nach dem Anteil der Aminosäuren am 0 2 -Verbrauch erwarteten zurück [14—16]. Die vorrangige Oxydation kurzkettiger Aminosäuren läßt ein Verhältnis von etwa 5 :1 zwischen Sauerstoffverbrauch und Ammoniakbildung erwarten. Plasma Aminosäuren

Globin Mitochondrier Ribosomen,ZellmembranProteine

^

Purine

pool

C-Quellen:

Glukose,

Ribose,Glyzerol

Abb. 1. Dynamik des Aminosäure-pools in Retikulozyten

344

M . MÜLLER, S. RAPOPORT, J . RATHMANN, R .

DUMDEY

Selbst wenn die geringe Verwertung von Kohlenhydraten und Fettsäuren für den Energiestoffwechsel in Rechnung gestellt wird, ist das aus Literaturdaten kalkulierte Verhältnis zwischen 0 2 -Verbrauch und NH 3 -Bildung von etwa 10:1 sehr hoch. Dabei muß berücksichtigt werden, daß sich die vorhandene NH 3 -Bildung im wesentlichen auf die Desaminierung von Nukleotiden, besonders von Adeninnukleotiden, zurückführen läßt. Die Nukleotiddesaminierung ist ein schneller Prozeß, der bei kurzzeitigen Inkubationen die NH 3 -Freisetzung aus Aminosäuren überwiegt. Wird diese Tatsache berücksichtigt, dann übersteigt der Quotient zwischen 0 2 -Verbrauch und NH 3 Bildung den Erwartungswert von etwa 5:1 um etwa eine Größenordnung. Die geringe Freisetzung von NH 3 bei der Energiegewinnung aus Aminosäuren ist ein Ausdruck der hohen Stickstoffökonomie der Retikulozyten. Die Stickstoffökonomie der Retikulozyten stellt seit langem ein ungelöstes Problem dar. Wir hoffen, daß wir durch unsere Untersuchung zu seiner Lösung beitragen können. Wir gingen davon aus, daß offenbar die Transaminierung die Voraussetzung für den Abbau des C-Skeletts des Glutamats und anderer Aminosäuren im Zitratzyklus ist. Die geringe NH 3 -Freisetzung bei der Energiegewinnung aus Aminosäuren spricht weiterhin dafür, daß es in Retikulozyten eine Wiederverwertung des Stickstoffs geben muß. Tatsächlich konnte der Nachweis erbracht werden, daß die oxydative Desaminierung des Glutamats, das in hohem Maße an der Energiegewinnung der Retikulozyten beteiligt ist, nur eine untergeordnete Rolle spielt. Nur etwa 10% des umgesetzten Glutamats werden oxydativ desaminiert [17]. Im Folgenden versuchten wir die Frage zu klären, wie die Wiederverwertung des Stickstoffs erfolgt. Dabei gingen wir von der Vorstellung aus, daß eine Neusynthese von Aminosäuren erfolgt. Da der Stoffwechsel der Retikulozyten außerordentlich gut der Hauptfunktion dieser Zellen, der Hämoglobinbildung, angepaßt ist, sind Serin und Glyzin prädestinierte Aminierungsprodukte. Beide Aminosäuren werden bevorzugt für die Hämoglobinsynthese verwendet. Kaninchenhämoglobin enthält nach B R A U N I T Z E R et al, [18, 19] pro Tetramer 40 Mol Glyzin und 44 Mol Serin. Zusätzlich sind 32 Mol Glyzin für die Porphvrinsynthese erforderlich. Beide Aminosäuren werden darüber hinaus auch für die Purinsynthese benötigt [1], Tatsächlich konnte nach Inkubation mit [ 16 N]-Glutamat [ 15 N]-markiertes Glyzin isoliert werden (Tab. 3)- Der Umfang der Glyzinneusynthese liegt in dem Bereich, Einbau von

15

Tabelle 3 N in Glyzin aus [ I 5 N]-Glutamat (18 — 30 mM)

Versuch Nr.

0 2 -Verbrauch (mMol/1 Zellen • Std.)

^*

9,4 6,7 4,2

2**

3**

Konzentration (mM) Glyzin | [ 15 N]-Glyzin 1,3 1,4 0,9

0,016 0,050 0,022

* Ohne Glukose; ** 24 mM Glukose. 60 min Inkubation bei 37 °C

N-Ökonomie und Aminosäuresynthese

Glukose I HAD+ NADH NH2 • 3-P- Glyzerat ® -O-Pyr

345

@-Ser Ser

NAD+ NADH 2-P-Glyzerat-—^Gtyzercct

~—QH-Pyr

®

»

Pyr

NH2

-V-

Abb. 2. Alternative Wege der Serinsynthese mit dem C-Skelett der Glukose

der aus der Höhe der C0 2 -Bildung aus Glutamat unter Berücksichtigung von pool-Verdünnungen abgeschätzt werden kann. Sehr wahrscheinlich dienen auch andere Aminosäuren, die an der Transaminierung teilnehmen, direkt oder indirekt als NH 2 -Donatoren bei der Glyzinneusynthese. Aus diesem Ergebnis ergab sich zwanglos die Fragestellung nach dem C-Skelett, nach dem NH 2 -Akzeptor für die NH 2 -Gruppe der verstoffwechselten Aminosäuren. Als NH 2 -Akzeptoren wurden durch Studien mit U-[ 14 C]-Glukose OH-Pyruvat u n d P - O H - P y r u v a t identifiziert (unveröffentlichte Befunde). Die Neubildung von Serin bzw. Glyzin erfolgt also mit dem C-Skelett der Glukose. 2 Wege werden für die Serinbildung ausgehend vom 2- bzw. 3-P-Glyzerat beschrieben [20, 21] (Abb. 2): Ausgehend von 2-P-Glyzerat geht einer Dehydrierung eine Dephosphorylierung voraus. Als ein Zwischenprodukt der Serinsynthese wird OH-Pyruvat gebildet. Auf dem 2. Syntheseweg tritt OH-Pyruvat nicht als Zwischenprodukt auf. Die Phosphatabspaltung erfolgt erst nach der Transaminierung, so daß eine Phosphoserinbildung der Serinbildung vorausgeht. In Gewebsextrakten verschiedener Spezies wurde die Existenz beider Synthesewege nachgewiesen [20, 21]. Meistens ist nur einer der Wege vorherrschend. Wir fanden, daß auch in Retikulozyten beide Synthesewege existieren, wobei über den Anteil der verschiedenen Wege an der Serinsynthese noch keine Aussage gemacht werden kann (unveröffentlichte Befunde). Als direkte Transaminierungsprodukte resultieren also Serin bzw. P-Serin. Durch P-Abspaltung wird aus P-Serin Serin gebildet, das durch Q-Abspaltung in Glyzin übergehen kann [13]. Die Serinspaltung erfolgt in einer Gleichgewichtsreaktion [22, 23]. Nach Inkubation mit U-[ 14 C]-Glukose erwarteten wir daher die gleiche spezifische Aktivität im Serin und im Glyzin. Das ist offensichtlich nicht der Fall (Tab. 4). Nach Zusatz von OH-Pyruvat zum Inkubationsmedium ist erwartungsgemäß eine starke Verminderung der spezifischen Aktivität des Serins nachweisbar. OH-Pyruvat ist, wie erläutert, eine Zwischenprodukt auf dem Syntheseweg des Serins aus dem C-Skelett der Glukose.

346

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Tabelle 4 Beeinflussung der Konzentration und spezifischen Aktivität des Glyzins und Serins durch O H - P y r u v a t Versuche Nr. -j 1 ** 2**

2** 3** 1* 3**

Aminosäure

Konzentration (mM) OH-Pyruvat

spez. Akt. (dpm/nMol) OH-Pyruvat

+ Glyzin Glyzin Glyzin Serin Serin

0,92 1,37 1,31 0,39 0,36

1,07 1,13 1,44 1,25 0,75

+ 2,38 1,21

1,07 18,40 8,10

1,71 1,10 0,84 2,03 3,87

* 10 mM O H - P y r u v a t ; ** 5 mM OH-Pyruvat. 60 min. Inkubation bei 37 °C, 20 mM Glukose

Zunächst bleibt jedoch unverständlich, daß die spezifische Aktivität des Glyzins durch OH-Pyruvatzusatz nur unwesentlich vermindert wird. Als Nächstens versuchten wir nach Pulsmarkierung mit U-[14C]-Serin aus der zeitlichen Änderung der spezifischen Aktivitäten des intrazellulären Serins und Glyzins eine Abschätzung über den Umfang der Synthese beider Aminosäuren zu gewinnen. Wir erwarteten eine zeitabhängige Annäherung der spezifischen Aktivitäten beider Aminosäuren. Meßbar ist jedoch ein annähernd paralleler Abfall der spezifischen Aktivitäten beider Aminosäuren, der mit einer hohen Anfangsgeschwindigkeit erfolgt. Die spezifische Aktivität (Abb. 3) des Glyzins liegt jedoch entgegen der Erwartung unterhalb der des Serins. Mit steigender intrazellulärer Glyzinkonzentration vergrößert sich die Differenz zwischen den spezifischen Aktivitäten beider Aminosäuren (Abb. 4). Welche Faktoren könnten die spezifische Aktivität beeinflussen ? Aus den Stoffwechselwegen des Serins und Glyzins in Retikulozyten ergeben sich Anhaltspunkte zur Beantwortung der aufgeworfenen Frage. Die Umwandlung des Serins in Glyzin und Methylen-FH 4 findet ausschließlich in den Mitochondrien der Retikulozyten statt (unveröffentlichte Ergebnisse). In dieser Hinsicht nimmt der Retikulozyt eine Ausnahmestellung ein. In anderen biologischen Systemen ist die Serin-OH-Methyltransferase überwiegend im Zytosol lokalisiert [25]. Die von diesem Enzym katalysierte Reaktion verläuft mit geringer Energietönung reversibel. Demnach kann die gegenseitige Umwandlung von Serin und Glyzin keine Quelle unterschiedlicher spezifischer Aktivitäten sein. Es bleiben noch zwei Denkmöglichkeiten zur Erklärung der unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten von Serin und Glyzin. Ihnen ist gemeinsam, daß ein langsamer Austausch einer Aminosäure, Serin bzw. Glyzin, zwischen Zytosol und Mitochondrien angenommen wird. Die erste Annahme wäre ein langsamer Einstrom von Serin in das Mitochondrium, wodurch alle nachfolgenden Schritte, d. h. die Umwandlung in Glyzin und der Ausstrom des Glyzins aus dem Mitochondrium in das Zytosol, eine geringere spezifische Aktivität aufweisen würden, vorausgesetzt, daß ein inaktiver Pool im Mitochondrium vorhanden ist.

N-Ökonomie und Aminosäuresynthese Abb. 3. Zeitabhängige Änderung der spezifischen Aktivität des Serins und Glyzins nach Pulsmarkierung des Serins. O O spezifische Aktivität des Serins; • • spezifische Aktivität des Glyzins. Intrazelluläre Glyzinkonzentration = 0,65 mM; Pulsmarkierung 15 min. Inkubationsbedingungen : 6 mM Glukose, 3 mM GluNH,, pH 7,6, 37 °C

Abb. 4. Zeitabhängige Änderung der spezifischen Aktivität des Serins und Glyzins nach Pulsmarkierung des Serins. O O spezifische Aktivität des Serins; • • spezifische Aktivität des Glyzins. Intrazelluläre Glyzinkonzentration = 1,0 mM; Pulsmarkierung 15 min. Inkubationsbedingungen : 6 mM Glukose, 6 mM GluNH 2 , 7,6, 37 °C

347

dpm/nMol

120 t (min)

Gegen diese Annahme spricht vor allem die Tatsache, daß durch Isotopenexperimente von uns gezeigt werden konnte, daß Serin, und vor allem der aus ihm stammende Cj-Rest, mit hoher Intensität im Stoffwechsel verwertet wird bzw. C0 2 liefert. Da diese Reaktionen im Mitochondrium ablaufen, ergibt sich, daß auch der Einstrom von Serin in das Mitochondrium schnell sein muß. Darüber hinaus gibt es keine Anhaltspunkte für einen beträchtlichen inaktiven Serin-Pool im Mitochondrium. Die zweite Denkmöglichkeit besteht in der Annahme, daß der Ausstrom des mitochondrial gebildeten markierten Glyzins in das Zytosol ein langsamer Prozeß ist. Dieses Glyzin würde sich mit einem großen Pool inaktiven Glyzins im Zytosol mischen. Das zytosolische Glyzin stammt in erster Linie aus dem Plasma. Höhere Konzentrationen von Glyzin verglichen mit denen von Plasma werden zwar auch in geringem Maße bei den reifen Erythrozyten einiger Spezies beobachtet und sind auf energieunabhängige erleichterte Diffusion zurückzuführen [26]. Demgegenüber haben Retikulozyten eine um vieles stärker ausgeprägte Fähigkeit, Glyzin zu konzentrieren, und diese ist durch Zyanid und Dinitrophenol hemmbar [27, 28]. Es handelt sich offensichtlich um ein aktives Transportsystem, das mit der Reifung der roten Blutzelle verschwindet. Die Aufnahme des Glyzins erfolgt über

348

M . M Ü L L E R , S. RAPOPORT, J . RATHMANN, R .

DUMDEY

glyzinspezifische Wege. Dabei addieren sich zwei Mechanismen, von denen der Hauptweg Na+-abhängig und der Nebenweg Na + -unabhängig ist [29, 30]. Eine zweite Quelle für das zytosolische Glyzin stellt der energieabhängige Proteinabbau dar [31, 32]. Wie in früheren Untersuchungen gezeigt wurde, kommt es in Retikulozyten bei Inkubation zu einem beträchtlichen Anstieg des Rest-N, der überwiegend auf die Freisetzung von Aminosäuren zurückzuführen ist. Dieser Proteinabbau ist energieabhängig und wird durch Dinitrophenol gehemmt. Daneben setzt das Dinitrophenol allerdings auch den oxydativen Abbau von Aminosäuren herab. Das Zusammenspiel beider Prozesse ist es wahrscheinlich, was für die Variationen der Glyzinkonzentrationen mit unterschiedlicher Entblutungsdauer verantwortlich ist. Eine völlige Undurchlässigkeit der Mitochondrienmembran für Glyzin ist selbstverständlich ausgeschlossen. Sie würde einen noch wesentlich größeren Unterschied in der spezifischen Aktivität bedingen. Darüber hinaus wäre es unverständlich, wie es zum Einbau von markiertem Glyzin in das Porphyr in kommt. Von großem Interesse sind erste Versuche, die wir in Gegenwart von 2,4-DNP durchführten. Diese Experimente unterstützen die getroffenen Aussagen. Unter diesen Bedingungen ist eine starke Erhöhung der spezifischen Aktivität des Serins und des Glyzins nach Inkubation mit U-[ 14 C]-Glukose und eine Annäherung der spezifischen Aktivitäten des Serins und des Glyzins nach Inkubation mit U-[ 14 C]-Glukose und nach Pulsmarkierung des Serins meßbar (Tab. 5). Wie sind diese Ergebnisse zu deuten ? 1) Eine starke Erhöhung der Serinbildung müßte eine Konzentrationserhöhung des Serins und Glyzins zur Folge haben, da die Verwertung der Aminosäuren in Gegenwart von 2,4-DNP vermindert ist. Eine solche Erhöhung der Konzentration von Serin oder Glyzin wurde aber nicht beobachtet. Man muß also eine andere Erklärung für die Erhöhung der spezifischen Aktivitäten der Aminosäuren suchen. Wir führen die Erhöhung der spezifischen Aktivitäten in erster Linie darauf zurück, daß das Serin aus dem C-Skelett der Glukose mit höherer spezifischer Aktivität gebildet wird. Welcher Mechanismus könnte aber für die Bildung von Serin und erhöhter spezifischer Aktivität verantwortlich sein ? Eine Möglichkeit beruht auf der Überlegung, daß die Radioaktivität der Zwischenprodukte der Glykolyse unterhalb von 1,3-Bisphosphoglyzerat, die aus der radioaktiven Glukose stammen, durch den Pool des 2,3-Bisphosphoglyzerats, das ja in hoher Konzentration in roten Blutzellen vorliegt, stark verdünnt wird. Das Dinitrophenol könnte den Grad der Verdünnung dadurch verringern, daß es den Anteil der Glykolyse, der über die Phosphoglyzeratkinase läuft, verglichen mit dem, der über den 2,3-Bisphosphoglyzerat-Nebenweg geht, erhöht. Es kommt nämlich unter dem Einfluß von Dinitrophenol zu einer Erniedrigung der Konzentration von ATP und einer entsprechenden Erhöhung derjenigen von ADP. Dieses ist Substrat der Phosphoglyzeratkinase und würde deren aktuelle Aktivität verstärken. Das aus 2- oder 3-Phosphoglyzerat gebildete Serin widerspiegelt unmittelbar deren spezifische Aktivität. 2) Der Ausgleich der spezifischen Aktivitäten des Serins und des Glyzins muß bedeuten, daß die Barriere, die wir für den Glyzinausstrom aus den Mitochondrien postulieren, aufgehoben ist und beide Aminosäuren im Isotopengleichgewicht

N-Ökonomie und Aminosäuresynthese

349

stehen. Diese Veränderung könnte mit dem durch das Dinitrophenol bewirkten ATP,-Abfall zusammenhängen, der eine Konformationsänderung der Mitochondrienmembran und eine Veränderung ihrer Permeabilität verursachen könnte. Insgesamt sprechen die Befunde dafür, daß es die Barriere für den Glyzinausstrom aus den Mitochondrien gibt, die durch 2,4-DNP aufgehoben wird. Es ist von großem Interesse, daß die Aufhebung des Pasteur-Effektes durch Dinitrophenol, die von uns gezeigt wurde, auch mit einer Beseitigung der mitochondrialen Barriere für die Adeninnukleotide einhergeht. Sicher ist es eine grobe Vereinfachung, wenn bei der Bilanzierung der Serin- bzw. Glyzinneusynthese aus dem C-Skelett der Glukose der sicher vorhandene Austausch zwischen dem Mitochondrien- und Zytosol-pool außer Acht gelassen wird und vereinfachend vorausgesetzt wird, daß die intrazelluläre Proteolyse den Tabelle 5 Beeinflussung der spezifischen Aktivität des Glyzins und Serins durch 2,4-DNP (5 • 10" 5 M)

Inkubationszusatz

U-[»C]-Glukose (20 mM) U-[ 14 C]-Serin (tracer) Glukose (10 mM) W,

spezifische Aktivität (dpm/nMol) - 2 , 4 - D N P | + 2,4-DNP

Aminosäure

Serin Glyzin Serin

10 H 6.7.1 ml samples were taken from 5 ml fractions, diluted by water to decrease urea concentration and precipitated with trichloroacetic acid (final concentration 10%). Radioactivity of precipitate was determined as described in Materials and methods, a) Chromatography of purified mouse globin on the column of CM-cellulose; b) chromatography of products of protein synthesis in spleen cells incubated in vitro E ^ v

5

10

15

20

25

30

Fraction number Fig. 7

Fig. 8 •

5

10

15

20

25

30

Fraction number Fig. 7. a) Sedimentation profile of t o t a l R N A isolated f r o m mouse reticulocytes in 5 t o 2 0 % (w/v) linear succrose gradient in 5 mM Tris-HCl, p H 7.4. b) Sedimentation profile of t o t a l spleen R N A isolated f r o m mouse spleen cells a f t e r incubation. T h e cells were preincubated for 20 min, t h e n [ 3 H]uridine (150 ¡xCi/40 ml of cell suspension) was a d d e d a n d incubation continued for f u r t h e r 20 min. 180 ^g of t o t a l spleen R N A were layered over 12 ml of 5 t o 2 0 % (w/v) sucrose gradient in 5 mM Tris-HCl, pH 7.4. Centrifugation conditions are described in Materials a n d m e t h o d s Fig. 8. Sedimentation profiles of t o t a l spleen R N A isolated a f t e r a) 20-minute preincubation a n d 20-min incubation w i t h [ 3 H] uridine (see Fig. 7 b); b) 20-min preincubation w i t h I N H (5 • 10~ 3 M) which was also present during f u r t h e r 20-min incubation w i t h [ 3 H]uridine; c) t h e same as in b) b u t t h e concentration of I N H was 10~2 M. I n each experiment, t h e same a m o u n t (180 ¡ig) of t o t a l spleen R N A was analyzed on gradients (centrifugation conditions see Fig. 7)

synthesis of heme in mouse spleen cells incubated in vitro (Fig. 6). Fig. 7 represents a control experiment showing [ 3 H]uridine incorporation into 9 S RNA fraction of spleen cells after in vitro incubation. The effect of 20-minute preincubation with

364

Hb synthesis in spleens of irradiated mice

INH on the incorporation of labeled uridine into 9 S RNA is shown in Fig. 8. It is evident that a 40 min incubation with the inhibitor of heme synthesis reduces uridine incorporation into 9 S R N A fraction by about 40 per cent. This result suggests that heme might be involved in the synthesis of 9 S RNA, probably globin mRNA. After addition of INH the synthesis of heme was apparently more depressed than the synthesis of 9 S RNA (Fig. 6 and Fig. 8). However, nucleated erythroid cells contain preformed heme [26] that may remain available even though new heme synthesis is markedly inhibited by INH. On the basis of these results we wish to present the following tentative hypothesis concerning biochemical events during erythroid differentiation. Erythropoietin, probably indirectly [27], triggers the appearance of globin mRNA [28—31] and the first globin chains that are synthesized combine with preformed heme. It should be pointed out that a low level of heme synthesis must occur already in erythroid precursors. The decreased level of intracellular heme induces the synthesis of ¿-aminolevulinic acid synthetase and facilitates the release of iron from transferrin (see above). This is accompanied by a significant increase in the rate of heme synthesis which is followed by further stimulation of globin mRNA transcription. Acknowledgement W e are grateful to Dr. G E R A R D hybridization experiments.

MARBAIX

for mouse globin [ 3 H]cDNA which was used in

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Degradation of mitochondria by cytosolic factors in reticulocytes T . SCHEWE, W . HALANGK, CH. HIEBSCH, a n d S. RAPOPORT

Summary The degradation process of mitochondria in rabbit reticulocytes proceeds predominately directly in the cytosol rather than in secondary lysosomes as judged by electronmicroscopy. At least five cytosolic protein factors are present in reticulocytes, which could be related to the degradation of mitochondria: the two inhibitory proteins of the respiratory chain R F and RC and three enzymes which cause a lysis of mitochondria in vitro (lipoxygenase, proteinase, phospholipase A). The properties of these factors are the subject of this paper. A hypothetic scheme of the degradation of mitochondria in reticulocytes is proposed. The degradation of mitochondria in reticulocytes is viewed as a complex interplay of various cytosolic factors and the functional state of the mitochondrial membranes. The lipoxygenase damages the membranes and triggers the penetration of the respiratory inhibitors. In this manner, a catastrophic cycle is initiated which leads to the complete breakdown of the mitochondria. Introduction

The reticulocyte represents an intermediate stage of maturation of the red cell, which is characterized by the elimination or inactivation of the nucleus on the one hand, and by the presence of functional ribosomes and mitochondria, on the other. The last stage of maturation; i.e. the transition from the reticulocyte to the normocyte, is characterized among other things by the largely complete disappearance of mitochondria, which leads to a basic switch-over in the energy metabolism of the cell to exclusive glycolysis. The breakdown of mitochondria goes hand in hand with a strong decline or complete loss of mitochondrial enzymes. Some maturation-dependent enzymes are listed in Table 1. Our research has been focused on the Table 1 following question: Which are the Strongly maturation-dependent mitochonmechanisms of the selective inactivadrial enzymes in reticulocytes tion and breakdown of mitochondria as well as of the corresponding enzy- I n n e r m e m b r a n e mes during the maturation of the red Cytochrome oxidase cell ? The speed of these events argues Succinate dehydrogenase in favour of active processes rather Matrix than of stochastic ones. The nature of (5-Aminolaevulinic acid synthetase these processes will be the subject of NADP-dependent isocitrate dehydrogenase the present contribution. Aspartate aminotransferase The reticulocyte is an excellent model a-Oxoglutarate dehydrogenase for the investigation of the basic prin- O u t e r m e m b r a n e ciples of the degradation of mitochon- Glutaminase dria. It may be hoped that the events Desoxyribonuclease

364

T . SCHEWE, W . HALANGK, CH. HIEBSCH, S. RAPOPORT

in the reticulocyte are applicable to other kinds of cells, despite their specialization. The choice of an appropriate cellular model object is a prerequisite for the study of the principles of the degradation of mitochondria. The reticulocyte possesses the following advantages in comparison with other cells: 1) The absence of new-formation of organelles due to the absence of an active nucleus and, consequently, of RNA synthesis, 2) the practical absence of the endoplasmic reticulum — except remnants [1] — and, therefore, the absence of the interplay with this organelle, 3) the nearly synchronized degradation of mitochondria during the maturation process, 4) the convenient availability of large amounts of reticulocytes. Morphological studies

Some conclusions as to the mechanism of degradation may be drawn from the morphological appearance of the mitochondria in intact reticulocytes during the maturation process; these have been studied by KRAUSE et al. [2] as well as by GASKO and DANON [3]. The mitochondria of immature reticulocytes exhibit mostly orthodox structures (Fig. la). Both condensed (Fig. lb) and vacuolized forms occur (Fig. 2) in the same cell. The partly degraded, vacuolized mitochondria predominate in the more mature cells. A few of the degradation forms of the mitochondria are located in autophagic vacuoles (secondary lysosomes, (Fig. 3))In these vacuoles activity of /9-glycerophosphatase as a marker enzyme of lysosomes was detected by Dr. W . KRAUSE by means of a histochemical method (Fig. 4). The digestion of mitochondria in phagosomes seems to play an important role in a variety of cells such as Kupffer cells [4] but appears to be of minor importance for the reticulocytes. Since most of the partly degraded forms of mitochondria

Fig. 1. Mitochondria of rabbit reticulocytes in situ. 1a: orthodox forms; l b : condensed forms; magnification: 50,000:1

Degradation of mitochondria in reticulocytes

Fig- 2

365

Fig. 3

Fig. 2. Phagocytic vacuoles in a rabbit reticulocyte. Magnification: 50,000:1 Fig. 3. Partially degraded swollen and vacuolized mitochondria on the left and normal orthodox ones (on the right) in the same reticulocyte. Magnification: 40,000:1

Fig. 4. Acid phosphatase in autophagic vacuoles of the reticulocyte. Reticulocytes from rabbits were cautiously haemolyzed by freezing and thawing to remove t h e bulk amount of haemoglobin which disturbs t h e histochemical reaction. The detection of acid phsophatase with /¡-glycerophosphate as substrate was carried out by t h e method of Mataxo and Ishii [19]. The dark spots represent precipitations of lead phosphate. Magnification: 28,000:1

366

T . SCHEWE, W . HALANGK, CH. HIEBSCH, S. RAPOPORT

appear directly in the cytosol rather than in autophagic vacuoles, the degradation process has to be brought about by means of cytosolic factors. Therefore, we have searched for factors in the cytosol of reticulocytes which are related to the degradation of mitochondria. We could detect five protein factors which were identified as: — an inhibitor of the iron-sulphur region of the respiratory chain (RF) [5,6], — an inhibitor of the cytochrome oxidase (RC) [7,8], — lipoxygenase [9], — a proteolytic enzyme [10], — a Ca 2+ -stimulated phospholipase A [11]. The respiratory inhibitors

Fig. 5 shows the action sites of the inhibitors. R F suppresses both the NADH and the succinate oxidase system of submitochondrial particles on the level of the oxidized forms of the iron-sulphur proteins of complex I and complex II. The other inhibitor, RC, acts on the oxidized species of the cytochrome oxidase. These action sites were established by measuring the enzymatic activity of partial systems of the respiratory chain, by a comparative analysis with other respiratory inhibitors and by investigation of the influence of the redox state of the submitochondrial particles on the inhibitory action [6,8]. The effect of RF is additive in the succinate oxidase system with that of the ironchelating agent TTFA, and with rotenone and amytal in the NADH-system [6]. The action of both inhibitors is prevented by succinate under anaerobic conditions, whereas subsequent aeration leads to the inhibition [6, 8]. The points of action of the two inhibitors could be confirmed with isolated respiratory enzymes. As Fig. 6 shows, soluble succinate dehydrogenase is inhibited by RF. Fig. 7 demonstrates the inhibition of soluble cytochrome oxidase by RC. In Table 2 some molecular properties of RF are compiled. The molecular properties of RF including the amino acid composition as well as the puriiication procedure in detail are the subject of the contribution by W I E S N E R et al. [ 1 2 ] . RF seems to be present only in reti-

Cyf.a/a3 Cyt.c

FeM-~4 RC FeH-0z^-*—CN~ FeM -Ml CO

Cyt.cj Hi— AntimycinA Cyt.b

Fell—-*- Rotenone, Amytal

Succinate

NADH

Fig. 5- Scheme for the action sites of R F and RC in t h e respiratory chain

0

5

10 15 RF- units

20

0

20

Fig. 6

40

SO

80

100RC{pl]

Fig. 7

Fig. 6. Inhibition of soluble succinate dehydrogenase by R F Fig. 7- Inhibition of soluble cytochrome oxidase by RC

culocytes. T A N N E R T failed to detect the protein by immunodiffusion both in bone marrow cells and in mature red cells (unpublished results). A screening for R F protein in other tissues of the rabbit by means of immunodiffusion did not supply any hint of the occurrence in cells other than reticulocytes. The various reticulocyte populations appearing in the course of bleeding anaemia differ considerably with respect to their RF content [13]. The R F activity in separated cell fractions revealed a marked biological dynamics as shown in Fig. 8. Here the cytochrome oxidase as a mitochondrial marker enzyme and the RF activity are plotted versus the decreasing RNA content which is a measure of the maturational stage of the reticulocyte. In very young, ribosome-rich cells no inhibitor is detectable. The maximal activity is reached at the very time of the steepest decline of mitochondrial constituents. Subsequently the inhibitor disappears. This may be due to the interaction with phospholipids which are liberated during the degradation process of mitochondria and which inactivate the inhibitor. From this biological dynamics it is evident that 1) the degradation of mitochondria and that of ribosomes have different kinetics and 2) R F is very likely responsible for the relatively rapid inactivation of the respiratory system of the mitochondria. Table 2 Some molecular properties of R F Property Single polypeptide chain with MW of 80,000 N-terminal glycine I P : S.55 Carbohydrate moiety Functional Fe 1 1 Essential SH-group(s) Affinity to phospholipids Tendency to aggregation and inactivation ->• counteracted by divalent metals

Evidence SDS electrophoresis; ultracentrifugation dansylation method isoelectric focusing staining on electropherograms; anthrone method chelating agents SH-reagents; amino acid analysis electrophoresis; inactivation by phospholipids storage and disc electrophoresis

368

T . SCHEWE, W . HALANGK, CH. HIEBSCH, S. RAPOPORT

Fig. 8. Biological dynamics of cytochrome oxidase ( ) and R F ( ) during t h e m a t u r a t i o n process of t h e reticulocyte. T h e age of t h e cell populations increases with decreasing R N A content. 8 7 6

5 4 3 2 1 0 Maturation [mg RNA/ml cells]

Factors causing lysis of mitochondria

R F as a macromolecule should not be able to penetrate through the mitochondrial membranes. Nevertheless, we have repeatedly observed that crude preparations of R F inhibit the respiratory chain of intact mitochondria in a relatively short time. Therefore, we have searched for factors in the reticulocyte supernatant, which induce lysis of mitochondria. We used the release of enzymes of the matrix and of the intermembrane space as a test system for such lysis factors. Three lysis factors could be detected and partially characterized (Fig. 9)- One factor turned out to be a low-molecular calcium-stimulated phospholipase A [11]. This enzyme seems to be only of secondary importance for the breakdown of mitochondria; it was not further characterized by us. Some hints for the presence of a phospholipase D were obtained by the group of AUGUSTIN [14]. Another lysis factor has been identified by us as a proteolytic enzyme. It liberates free amino groups from both haemoglobin and intact rat liver mitochondria. In all attempts to purify this factor, such as salt precipitation, cation exchange chromatography, membrane filtration etc. it behaved as a concomitant of haemoglobin. This proteinase contributes a considerable part of the total lytic activity of the stroma-free supernatant fluid of reticulocytes, but the extent of release of malate dehydrogenase never exceeded values of 20—30%, showing that this factor alone is not able to cause a complete rupture of the mitochondrial membranes. By contrast, the main lysis factor which later turned out to be a lipoxygenase causes under proper conditions a total release of matrix enzymes. The action of the lipoxygenase leads to drastic damages of the mitochondrial membranes as may be seen from electronmicrographs. Fig. 10 shows the appearance of mitochondria before and after action of lipoxygenase for 5 and 15 minutes respectively. One can observe disappearance of the outer membranes and the cristae, loss of matrix constituents as well as deformation of the remaining inner membrane. These alterations are accompanied by a formation of malonyl dialdehyde, which is a secondary product of the peroxidation of membrane phospholipids. The formation of malonyl dialdehyde and the release of malate dehydrogenase coincide with each other largely in their extent with respect to the dependence on the amount of lipoxygenase, on time and on temperature. From the temperature

Degradation of mitochondria in reticulocytes

369

dependence an energy of activation of about 11 kcal/moles and aQ 10 value of 1.8 were calculated [9]. The action of the lipoxygenase on mitochondria shows little dependence on />H. Some properties of the reticulocyte lipoxygenase are listed in Table 3. The properties of the enzyme differ from the arachidonate lipoxygenase recently described in blood platelets [15]. Furthermore, there are both common features and differences as compared with the known lipoxygenases of beans and cereals. A striking phenomenon is the dependence of the action of the lipoxygenase on the functional state of the mitochondria. The action on mitochondria is prevented by either ATP or succinate plus ADP (Table 4). The protective effect by substrates Stroma-free haemolysate

(NHi,)2S0/f precipitation 0.55

I

Chromatography

0.85 saturation Membrane filtrations (PM40; PM10)

on Sephadex A50 Filtrate Isoelectric focusing Gel -filtration on Sephadex G200 Lipoxygenase

Proteinase

Phospholipase A

Fig. 9. Scheme of t h e separation of t h e mitochondrialysis factors f r o m r a b b i t reticulocytes

Fig. 10. Action of t h e reticulocyte lipoxygenase on isolated r a t liver mitochondria. F r o m t h e left t o t h e r i g h t : mitochondria a f t e r (), 5 a n d 15 m i n u t e s incubation w i t h M L F a t 37° in 0.3 M buffered sucrose. Magnification: 50,000:1

370

T . S C H E W E , W . H A L A N G K , CH. H I E B S C H , S . RAPOPORT

Table 3 Some properties of the reticulocyte lipoxygenase M.W. : 120,000 I.P.: 5-55 Substrates mitochondria phospholipids — phosphatidyl ethanolamine — lecithin — cardiolipin polyunsaturated fatty — linoleic acid — linolenic acid — eicosatrienoic acid — arachidonic acid

/>H-optimum Km'-

Inhibitors :

acids (18:2) (18:3) (20: 3) (20:4)

7.4—7.8 (linoleic acid) 1 • 10- 4 M (linoleic acid) antioxidants — propyl gallate — a-naphthol (not tocopherol !) chelating agents - KCN — tiron serum albumin (if fatty acids are substrate), product(s) of linoleic acid peroxidation, haemoglobin

Table 4 Suppression by 10 m l succinate plus 1 mM ADP of the lipoxygenase action on rat liver mitochondria

Incubation

Aerobic Aerobic + substrate Anaerobic Anaerobic + substrate Aerobic Aerobic + substrate

Method

MDH-release MDH-release MDH-release MDH-release MDA-formation MDA-formation

Action [% MDH release or £532) 90 2 56 10 0.182 0.078

Effect

[%]

-98 -38 -89

-57

Incubation 30 min 37 °C; MDH = malate dehydrogenase, MDA = malonyl dialdehyde (determined by the thiobarbituric acid method)

is partly counteracted by respiratory inhibitors or uncouplers. One may assume that the protection against lipoxygenase is caused by energization of the inner mitochondrial membrane, but further experiments are necessary to elucidate the relationship. It should be mentioned that the susceptibility against lipoxygenase behaves very similar as certain fluorescence probes used to detect the energy state of the mitochondria [16]. By contrast, no correlation could be found between lipoxygenase attack and the conformational state of mitochondria [17]. A possible objection to the assumption of energization of the mitochondria as the reason for the lipoxygenase resistance is the fact that the first point of attack of the lipoxygenase must be the outer membrane, whereas energization takes place in the inner membrane. The basis for the varying susceptibility to lipoxygenase may consist in the state of protein-lipid interactions in the membranes. The degree of hydrophobic interactions between the fatty acid moieties of the phospholipids and helical segments of the membrane proteins may lead to different restrictions of the fluidity of the lipids and, therefore, to varying structural constraints, so that the isolene groupings as the site of action of lipoxygenase are masked more or less. The importance

Degradation of mitochondria in reticulocytes

3 71

of the protein-lipid interactions is furthermore indicated by the opposite tempera^ ture dependence of the formation of malonyl dialdehyde from mitochondria and from pure phospholipids. Whereas only little malonyl dialdehyde was formed from mitochondria below 15°, the amounts from phospholipids .at low temperatures were 20 times as high as at 37°. Hypothesis

One may assume that a complex interplay exists between the various protein factors described here and the functional state of the mitochondria, which leads to the complete breakdown of mitochondria. A hypothetic scheme is presented in Fig. 11. The numbers indicate the possible order of events. The lipoxygenase may induce holes in both membranes by peroxidation of their lipids (event 1). The attack on the inner membrane is dependent on the functional state which could be influenced by the age of the mitochondria. The lipoxygenase action permits the penetration of the respiratory inhibitors which suppress the respiration irreversibly (event 2). The interruption of the energy production via the respiratory chain leads to an

Fig. 11. Proposed scheme for the degradation of mitochondria in reticulocytes. The numbers indicate the possible order of events (see text). 25

Acta biol. med. genii., Bd. 36, Heft 3—4

372

T . SCHEWE, W . HALANGK, CH. HIEBSCH, S. RAPOPORT

ATP deficiency (event 3)- Therefore, repair mechanisms such as reacylation of lysophosphatides, phospholipid exchange and mitochondrial protein synthesis are diminished (event 4a). On the other hand, the absence of an electron flux is known to cause a greater susceptibility of the inner membrane to proteinases and phospholipases (event 4 b) [18]. Both effects lead to a preponderance of the action of degrading enzymes over the repair and renewal reactions (arrows below, event 5) Furthermore, phospholipases produce lysophosphatides and free fatty acids (event 6) which are multi-site damaging agents of the mitochondrial metabolism (events 7a and 7b). In this manner, the degradation process — once initiated — is apt to have a self-accelerating character leading to a catastrophic cascade with a complete degradation of mitochondria. Further efforts have to be made to elucidate the complex interplay of the degradation process of mitochondria in reticulocytes. Acknowledgement T h e a u t h o r s are indebted t o Dr. W . K R A U S E , H u m b o l d t - U n i v e r s i t y , Pathological Institute, Division of Electronmicroscopy, Berlin, G D R , for t h e kind performance of t h e electronmicrographs. References [1] AUGUSTIN, W . ,

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Some properties of globin messenger RNA from a free cytoplasmic nucleoprotein of rabbit reticulocytes G . H U E Z , G . MARBAIX1, P . NOKIN, a n d Y .

CLEUTER

Summary Free cytoplasmic globin messenger R N A of rabbit reticulocytes is less labelled t h a n polysomal m R N A if anaemic rabbits are injected with [ 3 2 P]-orthophosphate 1 5 h r s before their sacrifice. I t also possesses a poly(A) segment shorter t h a n t h a t of polysomal m R N A . We thus conclude t h a t free cytoplasmic globin m R N A appears during t h e maturation of rabbit reticulocytes.

A free nucleoprotein (mRNP) containing mainly a globin messenger RNA (mRNA) is found in the cytoplasm of rabbit reticulocytes [1], This entity might represent the form under which m R N A travels from the nucleus to the translation sites in the cytoplasm : in this case, the mRNA it contains should be younger than polysomal mRNA. Free m R N P might also be the last form under which one finds mRNA in maturing reticulocytes : in this case, its mRNA should be older than polysomal mRNA. In order to see which one of these two possibilities is true, we decided to compare polysomal and free cytoplasmic mRNA isolated from reticulocytes of anaemic rabbits injected with [ 32 P]-orthophosphate \5 hrs before their sacrifice. It is known that, in these labelling conditions, mRNA from young reticulocytes which just appeared in the peripheral blood will be the most radioactive [2]. Polysomes and a 5 precipitate from the post-ribosomal supernatant of these labelled rabbit reticulocytes have been prepared according to G I A N N I et al. [ 1 ] , Globin mRNA from both sources has been isolated by proteinase K digestion and poly(U)-sepharose affinity chromatography. In our experiment, 19% of globin m R N A was found free in the cytoplasm and its specific radioactivity was 75% of that of polysomal mRNA. Free mRNA thus looks older than polysomal mRNA. 55% of the free cytoplasmic mRNA was eluted from the poly(U)-sepharose column at 25 °C with low ionic-strength buffer whilst only 25% of the polysomal m R N A was eluted in the same conditions. This means that free mRNA has a shorter poly(A) stretch and is thus older [3] than polysomal mRNA. It is thus proven that, in mammalian reticulocytes, free mRNA represents mainly the last stage of the message life. This is in perfect agreement with our previous observations [2] showing that rabbit reticulocytes ageing is associated with a decrease in size of polysomes and thus with an increasing inefficiency of initiation of translation. In the oldest reticulocytes, lack of initiation leads to the appearance of free message in the cytoplasm. 1

Chercheur qualifié du F N R S .

25*

374

G . HUEZ, G . MARBAIX, P . NOKIN, Y .

CLEUTER

Most of the free message is coding for a globin and this mRNA requires haemin to be translated [4]. What becomes limiting in the initiation of translation when reticulocytes age is thus perhaps haemin. References A. M., B. G I G L I O N I , S. Biol. 240, 183 (1972)

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Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 375 — 379 (1977) Forschungsabteilung der Kinderklinik des Bereichs Medizin (Charité) der Humboldt-Universität zu Berlin, D D R

Veränderungen der 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen und der Plasmaerythropoetinaktivität bei hypoxischen Neugeborenen A . MICHEL, R . POHLE, B . ADRIAN, A . D A N I E L u n d J . GROSS

Zusammenfassung E s wurden die 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen und die Plasmaerythropoetinaktivität bei normalen und hypoxischen Neugeborenen und Säuglingen auf ihren diagnostischen Wert zur Beurteilung der Hypoxie überprüft. Erhöhungen der Erythropoetinaktivität des Plasma wurden nur bei klinisch schweren hypoxischen Zuständen gefunden (idiopathisches Atemnotsyndrom (ANS), Transposition der großen Arterien (TGA) und Hydrops universalis bei Rh-Inkompatibilität). Patienten mit TGA im Lebensalter vom 1 4 . - 5 6 . Tag hatten trotz deutlicher Hypoxie (0 2 -Partialdruck im Kapillarblut unter 22 Torr) normale Plasmaerythropoetinaktivitäten. Hierfür könnte das Auftreten des Erythropoesehemmfaktors verantwortlich sein. Erhöhungen der 2,3-DPG-Konzentration der roten Blutzellen wurden bei fast allen von uns untersuchten hypoxischen Kindern gefunden (Rh-Inkompatibilität, TGA, transitorisches ANS). Neugeborene mit idiopathischem ANS zeigen normale 2,3-DPG-Konzentrationen bei Vorliegen einer Azidose (pH 7,1 — 7,3). Erhöhungen der Plasmaerythropoetinaktivitäten sprechen für das Vorliegen einer schweren Hypoxie. Die Bestimmung der 2,3-DPG-Konzentration scheint ein empfindlicheres Kriterium zur Beurteilung der Hypoxie des Neugeborenen zu sein als die Erythropoetinaktivität. Einleitung D i e f e t a l e u n d n e o n a t a l e H y p o x i e h a t w e s e n t l i c h e n A n t e i l an der Genese verschiedener E r k r a n k u n g e n des N e u - u n d F r ü h g e b o r e n e n . D a r ü b e r h i n a u s ist die H y p o x i e U r s a c h e für viele u n t e r d e m S a m m e l b e g r i f f „ f r ü h k i n d l i c h e r H i r n s c h a d e n " zus a m m e n g e f a ß t e r K r a n k h e i t s b i l d e r , deren E r k e n n u n g u n d g e n a u e B e u r t e i l u n g in der P e r i n a t a l p e r i o d e für die r e c h t z e i t i g e P r o p h y l a x e u n d T h e r a p i e v o n B e d e u t u n g sind. Ziel der vorliegenden U n t e r s u c h u n g e n ist es, die V e r ä n d e r u n g der E r y t h r o p o e t i n a k t i v i t ä t i m P l a s m a u n d der 2 , 3 - D P G - K o n z e n t r a t i o n in r o t e n B l u t z e l l e n b e i h y p o x i s c h e n Z u s t ä n d e n des N e u g e b o r e n e n zu prüfen. E s ist b e k a n n t , d a ß es u n t e r h y p o x i s c h e n B e d i n g u n g e n einerseits z u r e r h ö h t e n 2 , 3 - D P G - B i l d u n g m i t den b e k a n n t e n A u s w i r k u n g e n auf die S a u e r s t o f f d i s s o z i a t i o n s k u r v e u n d andererseits zur E r y t h r o p o e t i n e r h ö h u n g i m P l a s m a u n d S t i m u l i e r u n g der E r y t h r o p o e s e k o m m t [ 1 — 4 ] . U n s schien ein V e r g l e i c h des P l a s m a e r y t h r o p o e t i n s u n d des 2 , 3 - D P G v o n b e s o n d e r e m I n t e r e s s e , da beide K r i t e r i e n ü b e r v e r s c h i e d e n e M e c h a n i s m e n v o m p02 a b h ä n g i g sind. Abkürzungen: 2,3-DPG = 2,3-Diphosphoglyzerat; ANS = Atemnotsyndrom; TGA = Transposition der großen Arterien; Pcap 0 2 = Sauerstoffpartialdruck im Kapillarblut

376

A . MICHEL, R . POHLE, B . ADRIAN, A . DANIEL, J . GROSS

Material und Methoden Es — — — —

wurden folgende Patientengruppen untersucht: gesunde Neugeborene als Kontrollgruppe, -Neugeborene mit Rh-Inkompatibilität, Neugeborene mit Atemnotsyndrom, Neugeborene und Säuglinge mit zyanotischen Herzmißbildungen (komplette Transposition der großen Arterien).

Die Untersuchungen erfolgten innerhalb der ersten 48 Lebensstunden. Neugeborene mit kompletter Transposition der großen Gefäße wurden darüber hinaus longitudinal untersucht (innerhalb der ersten 14 Lebenstage, vom 14. —56. Lebenstag und vom 56. Lebenstag bis zum 1. Lebensjahr). Außer der Erythropoetinaktivität im Plasma und der 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen wurden der Hämatokrit, die Retikulozytenzahl und der 0,-Partialdruck im Kapillarblut (Pcap 0 2 ) bestimmt. Die 2,3-DPG-Bestimmung der roten Blutzellen erfolgte nach der von L U I S A D A - O P P E R [5] angegebenen Methode. Die Erythropoetinaktivität des Plasmas wurde mittels eines biologischen Tests an hypertransfundierten jungfräulichen weißen Mäusen, Gewicht 20 — 25 g, in Anlehnung an die von N E C A S und N E U W I R T [6] angegebene Methode gemessen. Die Signifikanzberechnungen

wurden nach dem Wilcoxon-Test [7] durchgeführt.

Ergebnisse

Tab. 1 gibt einen Überblick über die Erythropoetinaktivität im Plasma und die 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen gesunder und hypoxischer Neugeborener. Das Plasma von gesunden Neugeborenen zeigt Eiseneinbauraten von durchschnittlich < 1 % ; die 2,3-DPG-Konzentration von roten Blutzellen beträgt 4,35 (xMol/ml Tabelle 1 Plasmaerythropoetinaktivität (% 5 9 Fe-Einbau) und 2,3-DPG-Konzentration ([¿Mol/ml Zellen) der roten Blutzellen bei gesunden und hypoxischen Neugeborenen, a gegenüber der N o r m mit p < 0,01 signifikant; b gegenüber der Norm mit p < 0,01 signifikant 59

Fe-Einbau

Hämatokrit

(%)

(Vol. %)

Diagnose

Gesunde Neugeborene (Nabelschnurblut, n = 17, > 2 5 0 0 g) Rh-Inkompatibilität (Venenblut) Anaemia neonatorum (n = 3) Hydrops universalis (n = 1) Atemnotsyndrom (ANS) transitorisches ANS (n = 4) idiopathisches ANS idiopathisches ANS (n = 1)

Retikulozytenzahl

(%)

2,3-DPG ([xMol/ml Zellen)

0,65 ± 0,61

49,7 ±

9,2

40 ± 18

0,30 ± 0,10

36,3 ±

0,4

112 ± 18

7,66 b ± 1,06

319

5,25 b

31,0

16,5

0,30 ± 0,10 3,00 ± 1,10 a (n = 6) 16,0

50,0 ± 2,0 43,1 ± 10,0 (n = 4) 58,0

40 ± 17 (n = 4)

4,35

±0,27

5,47 b ± 0,24 4,32 ± 0 , 7 0 (n = 4) 6,93 b

2,3-DPG-Konzentration bei hypoxischen Neugeborenen

3 77

Zellen. Neugeborene mit klinisch nachweisbarer Hypoxie wiesen unterschiedlich hohe Erythropoetinaktivitäten im Plasma und 2,3-DPG-Konzentrationen in roten Blutzellen auf. Deutlich erhöhte Erythropoetinaktivitäten fanden wir bei einem Patienten mit Hydrops universalis bei Rh-Inkompatibilität, einem Patienten mit idiopathischem Atemnotsyndrom (dieser Patient verstarb am 4. Lebenstag; es wurden pathologisch-anatomisch pulmonale hyaline Membranen nachgewiesen) und bei 4 Patienten mit einem idiopathischen ANS. Bei Neugeborenen mit einer Anaemia neonatorum bei Rh-Inkompatibilität oder transitorischem ANS finden wir normale Erythropoetinaktivitäten. Die 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen wurde bei fast allen hypoxischen Neugeborenen erhöht gefunden. Besonders hohe Werte fanden wir bei Patienten mit Anaemia neonatorum bei Rh-Inkompatibilität und bei einem verstorbenen Neugeborenen mit idiopathischem ANS. In Tab. 2 sind die Plasmaerythropoetinaktivität und die 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen von Neugeborenen und Säuglingen mit kompletter Transposition der großen Arterien enthalten. Die Erythropoetinaktivität im Plasma ist in der Zeit vom 1.—14. Lebenstag deutlich erhöht. Vom 14.-56. Lebenstag fällt sie trotz weiter bestehender Hypoxie (Pcap 0 2 22 Torr) ab. Danach kommt es zu einem erneuten Anstieg des Erythropoetins im Plasma. Die 2,3-DPG-Konzentration ist ebenfalls bereits in den ersten \4 Lebenstagen deutlich erhöht. Mit zunehmendem Lebensalter steigt sie weiter an. In Abb. 1 ist die Plasmaerythropoetinaktivität in ihrer Beziehung zum Pcap 0 2 dargestellt. Nabelschnurblute gesunder Neugeborener zeigen Eiseneinbauraten von 0—4%. Erhöhungen der Erythropoetinaktivität fanden wir bei Kindern mit ANS oder TGA bei p02-Werten unter 50 Torr, und zwar in den ersten 14 Lebenstagen und nach dem 56. Lebenstag. Jenseits des 14. bis zum 56. Lebenstag wurden bei p02-Werten unter 50 Torr keine erhöhten Erythropoetinaktivitäten gefunden. Bei p02-Werten über 50 Torr waren normale Eiseneinbauraten feststellbar. Tabelle 2 Plasmaerythropoetinaktivität (% 59 Fe-Einbau) und 2,3-DPG-Konzentration (¡¿Mol/ml Zellen) der roten Blutzellen von Neugeborenen und Säuglingen mit zyanotischen Herzmißbildungen Diagnose Lebensalter

59

Fe-Einbau

Hämatokrit

Retikulozytenzahl

2,3-DPG (piMol/ml Zellen)

(Torr)

po,

(%)

(Vol. %)

4,40 ± 1,90

48,4 ± 6,3

17 ± 13

5,22 ± 0,78

28 ± 6

0,60 ± 0,40

49,1 ± 3,4

17 ± 5

5,49 ± 0,64

22

5,70 ± 3,60

58,0 ± 3,6

20 ± 7

5,83 ± 1,57

32 ± 7

(%)

Transposition der großen Gefäße 1. —14. Lebenstag (n — 8) 14. —56. Lebenstag (n = 12) 56. Lebenstag [ n = 6)

±5

378

A. MICHEL, R . POHLE, B . ADRIAN, A. DANIEL, J .

GROSS

1S 74 72 10

Nabelschnurblut p02>50 p02H 7,1—7,3), die bekanntlich zur Verminderung der 2,3-DPG-Konzentration führt [8, 9, 13, 14]. Als Resultate von 2,3-DPG-Anstieg durch die Hypoxie und einem 2,3-DPG-Abfall durch die Azidose ergibt sich bei diesen Patienten eine normale 2,3-DPG-Konzentration. Sowohl die Erythropoetinaktivität im Plasma als auch die 2,3-DPG-Konzentration in roten Blutzellen sind bei den von uns untersuchten Patientengruppen als Kriterien zur Beurteilung einer perinatalen Hypoxie geeignet, sofern man die Untersuchungen in den ersten 48 Lebensstunden durchführt. Dabei sprechen Erhöhungen der Erythropoetinaktivität im Plasma für das Vorliegen schwerer hypoxischer Zustände des Neugeborenen. Die Veränderungen der 2,3-DPG-Konzentration sind nur bei gleichzeitiger Bestimmung des pYi-Wertes von diagnostischem Wert. Für die klinische Praxis, wo es auf einfache und schnelle Methoden zur Diagnostik ankommt, ist die Erythropoetinaktivität als Kriterium wegen des hohen Aufwandes kaum einsetzbar. Es ist daher notwendig, einfache Kriterien im Sinne eines Siebtestes zu finden, die es gestatten, die Hypoxie und ihre Auswirkung auf das Erythropoetin und somit auf die Erythropoese widerzuspiegeln. Möglicherweise ist die Dichte der roten Blutzellen ein brauchbarer Parameter [15,16]. Literatur [1] BENESCH, R . , U. R . E . B E N E S C H : B i o c h e m . b i o p h y s . R e s . C o m m u n . 26, 1 6 2 (1967) [2]

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1132

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A c t a biol. med. germ., B a n d 36, Seite 381 —387 (1977) Abteilung f ü r Elektronenmikroskopie der Charité a m Pathologischen I n s t i t u t der H u m b o l d t U n i v e r s i t ä t Berlin, 104 Berlin, D D R u n d I n s t i t u t f ü r Physiologische u n d Biologische Chemie der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t Berlin, 104 Berlin, D D R

Beziehungen zwischen der Konformation isolierter Rattenleber mitochondrien und ihrer Angreifbarkeit durch Lipoxygenase aus Kaninchenretikulozyten W . KRAUSE u n d W .

HALANGK

Zusammenfassung Lipoxygenase aus Kaninchenretikulozyten bewirkt a n isolierten R a t t e n l e b e r m i t o c h o n drien drastische Schädigungen der Membranen. Der Nachweis dieser Schädigung erfolgte elektronenmikroskopisch u n d d u r c h B e s t i m m u n g der Freisetzung von Malatdehydrogenase aus der Matrix. Die s t ä r k s t e Schädigung t r i t t bei den o r t h o d o x e n S t r u k t u r f o r m e n der Mitochondrien in Abwesenheit v o n S u b s t r a t auf. A T P oder A D P plus Sukzinat ü b e n einen s t a r k e n Schutzeffekt aus; die Mitochondrien bleiben hierbei kondensiert bzw. teilweise kondensiert. Der Schutzeffekt d u r c h S u b s t r a t w u r d e auch in Gegenwart des E n t kopplers 2,4-Dinitrophenol beobachtet, obwohl die Mitochondrien in die o r t h o d o x e F o r m umgewandelt wurden. I n h y p o t o n e r Saccharose ist die Mitochondrienschädigung ausgep r ä g t e r als in h y p e r t o n e r Saccharose; auch kondensierte Mitochondrien werden d u r c h Lipoxygenase geschädigt. D a h e r b e s t e h t keine Beziehung zwischen der Lipoxygenasew i r k u n g u n d d e m K o n f o r m a t i o n s z u s t a n d der Mitochondrien. Die Zugänglichkeit der F e t t s ä u r e k o m p o n e n t e der Phospholipide in der M e m b r a n f ü r Lipoxygenase h ä n g t vermutlich sowohl v o n metabolischen als auch strukturellen Einflüssen ab, die möglicherweise d u r c h Veränderungen in den Protein-Lipid-Wechselwirkungen bedingt sind. Einleitung

Die von SCHEWE et al. [1] nachgewiesene Lipoxygenase aus Kaninchenretikulozyten schädigt die Membranen der Rattenlebermitochondrien in drastischer Weise. Der Nachweis dieser Schädigungen erfolgte elektronenmikroskopisch [2] durch die Freisetzung von MDH [3] sowie durch die Bildung von Malondialdehyd [4]. Isolierte Mitochondrien unterliegen einem ultrastrukturellen Strukturwechsel in Abhängigkeit vom metabolischen Status [5, 6]. Zur Klärung der Frage, ob der Konformationszustand der Mitochondrien entscheidend für die Angreifbarkeit durch Lipoxygenase ist, wurde der Einfluß von Substraten, Adeninnukleotiden und der Osmolarität untersucht. Material und Methodik R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n wurden in 0,3 M Saccharose nach der Methode v o n D E D U V E et al. isoliert [7]. Die I n k u b a t i o n der Mitochondrien erfolgte bei 37 °C f ü r 15 min u n t e r verschiedenen Bedingungen: 1. AS; 2. AS, Sukzinat plus A D P ; 3- AS plus A T P ; 4. AS, Sukzinat plus 2 , 4 - D N P ; 5- AS in 0,15 M Saccharose; 6. AS in 0,45 M Saccharose (1. —4. in 0,3 M Saccharose). Zur Kontrolle A b k ü r z u n g e n : AS = P r o t e i n f ä l l u n g bei 0,55 S ä t t i g u n g A m m o n i u m s u l f a t aus d e m s t r o m a freien H ä m o l y s a t von R e t i k u l o z y t e n ; M D H = M a l a t d e h y d r o g e n a s e ; 2 , 4 - D N P = 2,4-Dinitrophenol

382

W . KRAUSE, W .

HALANGK

wurde nur mit Saccharose der entsprechenden Osmolarität inkubiert. Jeder Yersuchsansatz enthielt 0,5 ml Mitochondriensuspension (3 mg Protein/ml) in einem Endvolumen von 0,6 ml. Der Austritt von MDH aus der Mitochondrienmatrix während der Inkubation wurde als prozentualer Anteil der Gesamtfreisetzung nach Behandlung mit 0 , 2 % Triton X 100 nach S I E G E L u n d ENGLARD [ 8 ] b e s t i m m t .

Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung wurden die Proben nach der Inkubation mit 3%igem Glutaraldehyd vorfixiert und mit 1 %igem Osmiumtetroxid nachfixiert. Die Einbettung erfolgte in Vestopal. Die Ultradünnschnitte wurden mit dem L K B - U l t r o t o m und die elektronenmikroskopischen Aufnahmen mit dem Elmiskop I a , Siemens AG (Berlin-West) angefertigt. Ergebnisse

Isolierte Rattenlebermitochondrien sind in 0,15 M, 0,30 M und 0,45 M Saccharose kondensiert (Abb. 1). Während der Kontrollinkubation mit 0,15 M und 0,30 M Saccharose gehen die meisten Mitochondrien in die orthodoxe Strukturform über (Abb. 2). In 0,45 M Saccharose bleiben die Mitochondrien kondensiert. Durch Lipoxygenase aus Retikulozyten werden orthodoxe Mitochondrien zu Vesikeln umgewandelt (Abb. 3)- ATP oder ADP plus Sukzinat verhindern die Mitochondrienschädigung; die Mitochondrien liegen dann in der kondensierten bzw. in der teilkondensierten Konformation vor (Abb. 4 und 5). In Gegenwart von 2,4-DNP wurde auch der Schutzeffekt des Substrates beobachtet, obwohl die Mitochondrien in der orthodoxen Strukturform vorlagen (Abb. 6). Die Schädigung der Mitochondrien ist in 0,15 M Saccharose stärker als in 0,45 M Saccharose ausgeprägt (Abb. 7 und 8). Die Freisetzung der MDH während der Inkubation stimmt mit dem Grad der Mitochondrienschädigung überein (Tab. 1).

Abb. 1. Isolierte Rattenlebermitochondrien in 0,15 M, 0,3 M oder 0,45 M Saccharose in der kondensierten Strukturform, x 46000

Lipoxygenasewirkung auf Mitochondrien

383

Abb. 2. Kontrollinkubation in 0,15 M und 0,3 M Saccharose bei 37 °C für 15 min. Übergang von der kondensierten in die orthodoxe Strukturform. In 0,45 M Saccharose bleiben die Mitochondrien kondensiert. X 4 6 0 0 0

Abb. 3. Einwirkung von Lipoxygenase ohne Substrate, x 4 6 0 0 0

384

"W. K R A U S E , W . H A L A N G K

Tabelle 1 Freisetzung von MDH aus intakten Rattenlebermitochondrien durch Lipoxygenase Versuchsansatz AS in 0,3 M Saccharose AS, ADP, Sukzinat AS, ATP AS, 2,4-DNP, Sukzinat AS in 0,15 M Saccharose AS in 0,45 M Saccharose

MDH-Freisetzung

[%]

25 3 5,5 9 41 23

ultrastrukturelle Schädigung

++ — —

+ ++ +

(Abb. (Abb. (Abb. (Abb. (Abb. (Abb.

3) 4) 5) 6) 7) 8)

Abb. 4. Einwirkung von Lipoxygenase, 1 mM ADP und 10 mM Sukzinat, x 46000 Diskussion

Die Schädigung isolierter Rattenlebermitochondrien durch Lipoxygenase aus Retilculozyten erfolgt durch Lipidperoxydation der Membraniipide [1]. Isolierte Phospholipide und freie mehrfach ungesättigte Fettsäuren werden ebenfalls durch Lipoxygenase angegriffen [9], Bestimmte Parameter der Retikulozyten-Lipoxygenase, wie z. B. das Temperaturverhalten und der ^H-Wert, unterscheiden sich bei Verwendung von intakten Mitochondrien oder isolierten Phospholipiden [9], Ohne Substratzusatz werden isolierte Mitochondrien durch Lipoxygenase zu Vesikeln umgewandelt (vgl. Abb. 3). Die Schädigung wird jedoch verhindert,

Lipoxygenasewirkung auf Mitochondrien

385

wenn mit ATP oder ADP plus Sukzinat der ultrastrukturelle Übergang der Mitochondrien von der kondensierten in die orthodoxe Strukturform unterbunden wird (vergl. Abb. 4 und 5). Diese Befunde führten zunächst zu der Annahme, daß nur orthodoxe Mitochondrien durch Lipoxygenase geschädigt werden können. Durch 2,4-DNP wird die Schutzfunktion des Substrates bei der Mitochondrienschädigung durch Lipoxygenase nur teilweise aufgehoben. Die ultrastrukturelle Transformation von der kondensierten in die orthodoxe Strukturform findet in diesem Experiment statt, jedoch war die Schädigung der Mitochondrien nur schwach ausgeprägt (vgl. Abb. 6). Der Angriff auf kondensierte Mitochondrien im hypertonen Medium (0,45 M Saccharose ohne Substrat) durch Lipoxygenase sowie die Versuche mit 2,4-DNP zeigen somit, daß keine Beziehung zwischen der

Abb. 5- Einwirkung von Lipoxygenase und 1 mM ATP. x 46000

Abb. 6. Einwirkung von Lipoxygenase, 1 mM ADP, 10 mM Sukzinat und 10 (J.M 2,4-DNP. X 46000

386

W . KRAUSE, W . HALANGK

Abb. 7. Einwirkung von Lipoxygenase in 0,15 M Saccharose, x 46000

Abb. 8. Einwirkung von Lipoxygenase in 0,45 M Saccharose. X 46000

Lipoxygenasewirkung auf Mitochondrien

387

Lipoxygenase-Wirkung und dem Konformationszustand der Mitochondrien zu bestehen scheint. Die Zugänglichkeit der Fettsä'urekomponente der Phospholipide für Lipoxygenase ist möglicherweise von metabolischen und strukturellen Einflüssen abhängig, die durch Veränderungen der spezifischen Protein-Lipid-Wechselwirkungen in der Membran bedingt werden. Literatur [1] [2]

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Summary and W . H A L A N G K : Relationship between conformational state and susceptibility to reticulocyte lipoxygenase of r a t liver mitochondria

W . KRAUSE

Lipoxygenase from rabbit reticulocytes causes disruption of mitochondrial membranes and peroxidation of their lipids as judged by electronmicroscopy, release of matrix enzymes and formation of malonyldialdehyde. Without substrate mitochondria become orthodox and strong lysis by lipoxygenase appears. The lysis is prevented by A T P or A D P plus succinate; in this case mitochondria remain condensed or partly condensed. The protection by substrate was even observed in the presence of 2,4-DNP, although the mitochondria were transformed to the condensed state. Lysis was more pronounced in hypotonic t h a n in hypertonic sucrose, condensed mitochondria are also attacked. No relation seems to exist between lipoxygenase attack and t h e conformational state of mitochondria. Lysis of mitochondria is dependent on the susceptibility of the f a t t y acid moiety of phospholipids, which m a y be influenced by both metabolic and structural events via alteration of protein-lipid interactions.

26

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3 — 4

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 389—391 (1977) Institut für Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität Berlin, 104 Berlin, D D R

Activity of the respiratory inhibitor RF in human red cells in anaemia K . ZIEM a n d T.

SCHEWE

Summary Stroma-free haemolysates of red cells from patients with acute or latent anaemia inhibit the N A D H oxidase activity of submitochondrial particles from beef heart. The inhibitory activities appeared significantly more frequently in anaemic patients t h a n in normal persons and are likely due to the action of a factor which is identical or similar t o t h e inhibitory protein R F present in rabbit reticulocytes. The possible use of the inhibitor assay for clinical purpose is under discussion. Introduction

The inhibitory protein RF (formerly designated as RU-inhibitor) was first detected in Î 9 5 5 by RAPOPORT and GERISCHER-MOTHES [ 1 ] in rabbit reticulocytes. It suppresses irreversibly the mitochondrial electron transfer system at two points which are located in the two iron-sulphur regions of the NADH-ubiquinone reductase and of the succinate-ubiquinone reductase complex [2]. Until now there have been no studies on the occurrence of this inhibitor in reticulocyte-rich blood of other species with the exception of a report on inhibitory activity in chicken red cells [3]. An occurrence in human red cells should be of special interest for clinical biochemistry. Studies on rabbits have revealed that the various reticulocyte populations occurring in the course of a bleeding anaemia differ strongly with respect to their RF activity [4]. In as much as different kinds of reticulocytes may be poured out in anaemic patients dependent on the type of anaemia, variation of the inhibitory activités is conceivable which could serve as potential parameters for their characterization. The present communication deals with the following questions : 1. Is inhibitory activity detectable in human red cells ? 2. Are there any relations between inhibitory activity and anaemia ? Materials and methods The 44 blood specimens investigated originated from the following individuals : 23 normal persons, 4 anaemias due to G6PD deficiency, 8 haemolytic anaemias of unknown cause, 1 spherocytosis, 3 pancytopenias, 1 tumour anaemia, 1 osteomyelofibrosis, 1 toxic depression of bone marrow after cobalt irradiation, 1 disorder of bone marrow maturation, 1 presumable disorder of iron incorporation. The specimens were treated according to the following scheme : Washed blood cells I Osmotic haemolysis (l volume of 30% suspension plus 2 volumes of distilled water) I High-speed centrifugation (6 m i n , 18,000 X g) i

Stroma-free haemolysate (SFH) 26»

390

K . ZIEM, T . SCHEWE

Electron transfer particles (ETP) from beef heart mitochondria prepared according to CRANE et al. [5] served as test object, E T P (50—100 ¡¿g protein-Lowry-method) and S F H (10 or 20 (j.1) were incubated for 15 min at 37 °C. Thereafter the NADH oxidase activity was measured spectrophotometrically at 340 nm (0.05 M Tris-H 2 S0 4 buffer, pH 8.0, containing 1 mg/ml human serum albumin, 3 7 °C). As a criterion of R F activity the diminution of the NADH oxidase activity with elevation of the amount of SFH was used. With low amounts of S F H the inhibitory effect has often escaped detection due to the presence in erythrocytes of an unidentified respiration-enhancing factor [6], which interferes with the inhibitor, b u t which is overcome with increasing amounts of SFH. For this reason, the inhibitory effect does not show proportionality with the amount of SFH. Results and discussion

Table 1 shows a summary of the results. From the %2 test it is evident that inhibitory activity appears significantly more frequently in specimens from anaemic patients than in those from normal persons (1 % probability of error). No correlation was observed between the magnitude of inhibitory activity and the reticulocyte count. In some cases inhibitory activity appeared even in specimens of anaemic patients during phases of nearly normal haematological data (Table 2). In Table 3 the distribution of the inhibitor-positive specimens with respect to the kind of anemia is listed. No prevalences are apparent. Even though the number of specimens tested is still too low, there is some reason for the assumption that inhibitory activity in the SFH indicates an acute or latent anaemia. Therefore this assay may be useful for clinical purposes. The expense of the assay is low, however it has to be further improved in order to reduce the percentage of questionable results (Table 1). Furthermore, it has to be clarified why inhibitory activités were not detected in all anaemic bloods. The reason for the appearance of inhibitory activity with acute and latent anaemias may consist in the occurrence of predominantly juvenile red cells (reticulocytes Table 1 Screening for R F activity in blood specimens n Normal persons Patients with latent or acute anaemia

positive

questionable

negative

7 6

15 5

1 10

23 21

Table 2 Inhibitory activity in latent anaemias Tumour-anaemia H b (g/100 ml) H k (%) Reticulocytes (%) Addition of SFH-.(nl) 0 10 20

G6PD-deficiency 13-8 48.4 0.4

11.1 37-0 2.1 activity inhibition AE3i0lmm (%) 190 184 66

3 65

activity inhibition AEm/mm (%) 190 190 135

0 29

Respiratory inhibitor in human blood

391

Table 3 Cases with inhibitory activity 2

2 1 2 1 1 1

anaemias due to G 6 P D deficiency haemolytic anaemias of unknown cause spherocytosis pancytopenias t u m o u r anaemia osteomyelofibrosis toxic depression of bone marrow after cobalt irradiation

and young normocytes) in these cases. In older cells the inhibitor could be inactivated or degraded as shown for rabbit reticulocytes. Another possibility is an unusual maturation process of the reticulocytes by which the inhibitor'persists. The present results do not unequivocally prove that the inhibitory activités are due to a factor identical or similar to the inhibitory protein R F from rabbit reticulocytes. However the assumption of the role of RF as universal participant in the maturation process of the red cells would argue in favour of the presence of R F in human blood. The possible identity with rabbit RF has to be checked in further experiments. References [1]

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Reinigung und Charakterisierung des Atmungshemmstoffes RF aus Kaninchenretikulozyten R . W I E S N E R , CH. TANNERT, G . HAUSDORF, T . SCHEWE u n d S. RAPOPORT

Zusammenfassung Im stromafreien Hämolysat von Kaninchenretikulozyten kommt ein Atmungshemmstoff (RF) mit Proteinnatur vor. Er konnte folgendermaßen gereinigt werden: (NH 4 ) 2 S0 4 Fällung -> DEAE-Sephadex-Ionenaustauschchromatographie -»• Isoelektrische Fokussierung -» Gelfiltration an Sephadex G-200. Neben der Aktivitätsbestimmung wurde die Identität des Hemmstoffes immunologisch auf allen Reinigungsstufen nachgewiesen: Mit der SDS-Gelelektrophorese wurde ein Molekulargewicht von 80000 bestimmt. Das Protein hat einen isoelektrischen Punkt von 5,55 — 5,65 und besteht aus einer Polypeptidkette, wie aus SDS-Merkaptoäthanol-Gelelektrophorese und N-terminaler Aminosäurebestimmung hervorgeht. Als N-terminale Aminosäure konnte nach Dansylierung Glyzin bestimmt werden. Die Aminosäureanalyse liefert nur nach vorheriger Oxydation mit Perameisensäure reproduzierbare Werte. Der Anteil polarer Aminosäuren mit 41 Mol-% entspricht dem für lösliche globuläre Proteine. Auffallend hoch ist der Leu- und Try-Gehalt. Wird die saure Hydrolyse ohne vorherige Perameisensäureoxydation durchgeführt, tritt Huminbildung auf. Durch Reaktion von SDS-Gelen mit Schiffs Reagens und Kohlenhydratbestimmung mit Anthron-Reagens konnte die Glykoproteinnatur des Hemmstoffes nachgewiesen werden. Einleitung

Seit einigen Jahren ist bekannt, daß es sich bei dem Hemmstoff RF, der den steilen Atmungsabfall bei der Reifung der roten Blutzelle bewirkt [1 —5], um ein Protein handelt. Der Hemmstoff greift die oxydierten Eisenschwefelproteine von Komplex I und I I der Atmungskette an [6]. Neben diesem Hemmstoff gelang es R A P O P O R T und Mitarbeitern [ 7 , 8 ] einen zweiten Hemmstoff (RC) mit Proteinnatur nachzuweisen, der auf die Zytochromoxydase wirkt. Viele Eigenschaften des Hemmstoffes RF wurden bisher beschrieben. So enthält er essentielle SH-Gruppen und zweiwertiges Eisen [9], wird durch Serumalbumin [10] und Phospholipide [11, 12] inaktiviert und zeigt eine ausgeprägte biologische Dynamik [11, 13]. Darüber hinaus wurden Kenntnisse über spezifische und unspezifische Hemmstoffbindungen an ETP und deren Beeinflussung durch chaotrope Agenzien gewonnen und eine mögliche Mikroheterogenität des Hemmstoffproteins diskutiert [14]. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der systematischen Reinigung dieses Proteins und stellt einige physikochemische und chemische Eigenschaften vor. Abkürzungen: RÜ = Retikulozytenhämolysat-Überstand nach Zentrifugation; AS = Hemmstoff, der durch 0,55 (NH 4 ) 2 S0 4 -Sättigung aus RÜ erhalten wird; E T P = Elektronentransportpartikel; I F = isoelektrische Fokussierung; I P = isoelektrischer Punkt; ÄDTA = Äthylendiamintetraazetat; PAGE = Polyakrylamidgelelektrophorese; LM = Laufmittel; Dans = dansylierte Aminosäuren bzw. Proteine

394

R . W I E S N E R , C H . T A N N E R T , C . H A U S D O R F , T . S C H E W E , S . RAPOPORT

Material und Methoden AS Der Hemmstoff R F wurde bis zur Stufe der 0,55 Ammoniumsulfatsättigung ( = AS) nach einem schon früher beschriebenen Verfahren [6] aus Kaninchenretikulozyten hergestellt. Alle weiteren Präparationsschritte erfolgten unter weitgehend anaeroben Bedingungen, da sich der Hemmstoff mit zunehmender Reinheit als hoch autoxydäbel erwies. Anionenaustauschchromatograpliie Die Ionenaustauschchromatographie wurde an DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Schweden) durchgeführt. Das Gel wurde in 0,1 mM ÄDTA gequollen und vor der Äquilibrierung mit 0,03 M Tris-HCl (Me2+-frei), pH 7,2, mit Lauge und Säure behandelt und unter Stickstoff geschützt. Das Packen der Säule geschah ebenfalls unter Stickstoff mit einer Flußgeschwindigkeit von 12 ml/Std. Zur Äquilibrierung wurde mit 200 ml Puffer, der 1 mM MgCl2 enthielt, gespült. Alle verwendeten Lösungen wurden unter Stickstoff gehalten. Zur Entfernung von Schwermetallverunreinigungen aus den verwendeten Lösungen wurde „Dowex-ChelatingResin A-1" (Serva, Heidelberg) im Säulenverfafiren angewendet. Eluiert wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0,01—0,40 M. Die Fraktionierung erfolgte in 3,8 ml-Fraktionen und im Bereich der Hemmstoffelution unter anaeroben Bedingungen (N,-Zelt). Isoelektrische Fokussierung Die I F wurde in einer L K B 110 ml-Elektrofokussierungssäule durch eine Modifizierung der bei V E S T E R B E R G [15] beschriebenen Methode durchgeführt. Ein Saccharosegradient zwischen 0 und 50% wurde in der Säule erzeugt. Der Gradient enthielt 2 % Ampholine, pH 5 — 8 ( L K B Instruments). Zwischen die Anodenlösung (am Ausfluß der Säule) und den Saccharosegradienten wurde eine 2%ige Glutaminsäurelösung, die 50% Saccharose enthielt, geschichtet. Die Probe wurde etwa in der Mitte des Gradienten eingetragen. Die Fokussierungszeit betrug 60 Std. bei 600 V/24 Std. nach Einstellung einer konstanten Stromstärke wurde in 1,3 mlProben fraktioniert. Die Extinktionsbestimmung der Proben bei 280 nm erfolgte am Spektralphotometer V S U - I I (Carl Zeiss Jena), die ^>H-Messungen am MV 85 (Präcitronic). Gelfiltration Die Gelfiltration erfolgte mit Sephadex G-200 (Pharmacia, Schweden) in einer K 15/90-Säule. Das Gel wurde in 1 mM ÄDTA-Lösung gequollen; Gel und Elutionspuffer wurden wieder unter Stickstoff geschützt. Das Gießen der Säule geschah unter einem Stickstoffzelt. Eluiert wurde mit 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,0, Me 2 +-frei und 1 mM MgCl2. Vor dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit dem 3fachen Totalvolumen Puffer gespült. Die Flußgeschwindigkeit betrug 7,0 ml/Std.; Proben zu 1,8 ml wurden gesammelt. SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese Die P A G E wurde nach W E B E R und OSBORN [16] bei pH 7,0 in Gegenwart von 0 , 1 % SDS durchgeführt. Es wurde mit einem 10%igen Gel gearbeitet. Die Proteinbehandlung erfolgte in 1 % SDS und 1 % Merkaptoäthanol für 5 min in siedendem Wasserbad. Zur Frontmarkierung diente Bromphenolblau und zur Proteinanfärbung Coomassie-Blau B B R-250 in Methanol-Eisessig. Zum Glykoproteinnachweis wurden die Gele nach dem Lauf mit PerjodsäureSchiff's-Reagens behandelt [17]. Zur Entfernung von Saccharoseresten aus der I F wurden die Proteinpräparate einer Langzeitdialyse (130 Std.) unterzogen. Immunodiffusionstest Die Identität des Hemmstoffs wurde mit Hilfe eines Anti-RF-Serums mit der radialen Immunodoppeldiffusionsmethode nach O U C H T E R L O N Y [18] untersucht. Das Antiserum wurde durch Immunisierung von Meerschweinchen mit gereinigten RF-Präparaten (IF-Stufe) hergestellt. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige subkutane bzw. intrakutane Injektion von 100 — 170 iig RF-Eiweiß in physiologischer Kochsalzlösung mit komplettem Freund'schen Adjuvans (1. Immunisierung: Fußballen), inkomplettem Freund'schen Adjuvans (2. Immunisierung: Fußballen, Unterschenkel) bzw. ohne Adjuvans (3. und 4. Immunisierung: Bauchhaut) im Abstand von 8 Wochen (2. Immunisierung) bzw. einer Woche (3- und 4. Immunisierung).

Reinigung und Charakterisierung des Hemmstoffes R F N-terminale

395

Endgruppenbestimmung

Die N-terminale Endgruppenbestimmung erfolgte mit der Danysl-Methode nach G R O S und L A B O N E S S E [19] am perameisensäureoxydierten Protein. E t w a 10 nMol Protein, TCE-gefällt und mit Azeton gewaschen, wurden 2 Std. bei 0 °C mit Perameisensäure oxydiert. Das Protein wurde nach zweimaligem Lyophilisieren in 350 [¿1 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,75. unter Zusatz von 250 mg entionisiertem Harnstoff gelöst. Nach Zusatz von 250 ¡J.1 Dimethylformamid und 100 [xl azetonischer 0,l%iger Dansylchloridlösung (Fa. Sigma) folgten 2 Std. Reaktionszeit bei Zimmertemperatur. Nach TCE-Fällung, Waschen mit 0,1 M HCl/Azeton u n d Trocknen im Wasserstrahlvakuum, wurde mit 250 [xl azeotroper Salzsäure 4 Std. bei 110 °C hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde im Vakuum getrocknet, mit 50 (¿1 0,1 M Zitratpuffer, pH 3,6, aufgenommen und mit wassergesättigtem Äther extrahiert. Identifizierung der Dansyl-Aminosäure: 1. Zweidimensionale Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel G nach Stahl (Fa. Merck), Glasplatten 20 X 20 cm, 0,25 m m Schichtdicke. Das extrahierte Dansylierungsprödukt wurde zur Auftragung in Azeton — 1 M HCl (19:1 V/V) gelöst. LM 1: Toluol/Pyridin/Eisessig (75/25/1,75 ml); LM 2: Toluol/Äthylenchlorhydrin/25% wäßriges N H 3 (50/40/3,35 ml). 2. Eindimensionale Mikro-Dünnschichtchromatographie auf Polyamidfertigfolien, 8 x 4 cm, T y p K 5 41 V (Fa. Eastman). Das extrahierte Dansylierungsprödukt wurde zur Auftragung in Äther aufgenommen. LM 1: Wasser/85% Ameisensäure (200: 3,2 V/V); L M 2 : Benzol/ Eisessig (9:1 V/V). Alle Laufmittel wurden aus handelsüblichen, frisch destillierten Lösungen hergestellt. A minosäurenanalyse 10 nMol Protein wurden zur Aminosäurenanalyse unter Zusatz von Norleuzin als inneren Standard 3mal mit Perameisensäure oxydiert [20]. Die saure Hydrolyse wurde in 6 N HCl f ü r 24, 48 und 72 Std. bei 110 °C ^ 1 °C in Ampullen durchgeführt. Die Hydrolysate wurden am Rotationsverdampfer getrocknet und im Startpuffer gelöst. Die Aminosäurenanalyse erfolgte am automatischen Aminosäuren-Analysator BC 200 (Fa. Biocal) nach einem Einsäulen-Dreipuffer-Verfahren. Tryptophan wurde spektrophotometrisch am Spektralphotometer „Cary 1 4 " nach E D E L H O C H [22] bestimmt. Hemmstoffaktivität wurde im NADH 2 -Oxydase-Testsystem von E T P am Spektralphotometer „Unicam. SP 800" durchgeführt [6]. Eiweißbestimmungen erfolgten mit Biuret-Reagens. Ein qualitativer Test auf Kohlenhydrate im Protein wurde nach R O E [ 2 3 ] und S P I R O [ 2 4 ] mit Anthron-Reagens gemacht. Ergebnisse

Als Ausgang für die Reinigung des Hemmstoffproteins diente ein aus Kaninchenretikulozyten hergestelltes Hämolysat. Als Reinigungsverfahren wählten wir die Kombination von Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie, isoelektrischer Fokussierung und Gelfiltration. Die genannten Verfahren allein führten auch durch Variation der Bedingungen oder Rechromatographie nicht zu einem reinen Protein. Während der Reinigung verfolgten wir die Hemmstoffaktivität. Wie Tab. 1 zeigt, ist auch unter Anwendung anaerober und schwermetallfreier Bedingungen der Hemmstoff nur im AS stabil. Inaktivierungen gehen mit der Reinigung einher, die aber normalerweise nicht zu einer Verschiebung des Proteinprofils im Chromatogramm führen. Die Aktivitätsbestimmung wurde demzufolge nur zur Identifizierung des Hemmstoffs im Elutionsverlauf herangezogen. Die Disk-Elektrophorese im SDS-System und der immunchemische Nachweis im Ouchterlony-Immundiffusionstest waren für uns die Kriterien für die Beurteilung der Reinigungsschritte.

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R . W I E S N E R , C H . T A N N E R T , C . H A U S D O R F , T . S C H E W E , S . RAPOPORT

Tabelle 1 Stabilität v o n H e m m s t o f f R F auf verschiedenen Reinigungsstufen Probe AS DEAE-Sephadex AS AS ->• CM-Zellulose Isoelektrische Fokussierung AS AS -* Sephadex-G 200 1

Stabilität 1 stabil unstabil unstabil unstabil unstabil

Stabilität b e d e u t e t E r h a l t der H e m m s t o f f a k t i v i t ä t , gemessen im N A D H , - O x y d a s e - T e s t system

DEAE-Sephadex-Ionenaustauschchromatographie

Ein typischer Elutionsverlauf für die Reinigung an DEAE-Sephadex A-50 ist in Abb. 1 dargestellt. Unter den angegebenen Bedingungen passiert Hämoglobin ungebunden die Säule. Im zweiten Hauptproteinpeak (Fr. 50—70) wird der Hemmstoff eluiert (Fr. 58—66), der quantitativ am Austauscher gebunden war. Die Elution des Hemmstoffes beginnt bei 0,07 M NaCl und ist in Peak-Mitte 0,1 M an NaCl. Obwohl ein linearer Gradient vorgelegt wurde, entsteht unter den Chromatographiebedingungen (Schrumpfen der Gelpartikel durch Erhöhung der Ionenstärke) der in Abb. \ eingezeichnete Gradient. Der Hemmstoffpeak enthält

Chlorid-KonüRf-Enh. [M] ' pro ml

0,4 l A 7000 0,3 \s000 -5000 0,2 {4000 -13000 0,1 i-2000 •1000

0 40 50 SO 70 80 90 100 110 120 Fraktionen (je3,8ml) Abb. 1. I o n e n a u s t a u s c h c h r o m a t o g r a p h i e a n D E A E - S e p h a d e x A-50 v o n AS. P r o b e n v o l u m e n : 15 m l AS m i t 900 m g P r o t e i n ; E l u t i o n m i t NaCl-Gradienten v o n 0,01 bis 0,40 M in 0,03 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 m M MgCl 2 (Me 2 +-frei). • A NaCl-Gradient; • • E280; • • E410; X X RF-Einheiten/ml

397

Reinigung und Charakterisierung des Hemmstoffes R F

70 mg Eiweiß, etwa 7% der aufgetragenen Proteinmenge (unter Zugrundelegung von £ 280 -Werten). Die spezifische Aktivität (RF-Einheiten/mg Protein) steigt von 200 im Ausgang auf 500 nach der DEAE-Chromatographie an. Diskelektrophoretisch sind 4 Haupt- und 5 Nebenbanden nachweisbar. In Abb. 2 ist das Diskelektropherogramm von AS abgebildet. Durch die DEAE-Chromatographie werden alle Proteine abgetrennt, die im AS unterhalb der Gelmitte erkennbar sind. Isoelektrische Fokussierung und Gelfiltration Der Elutionsverlauf mit einem an DEAE-Sephadex vorgereinigten Hemmstoffpräparat ist in Abb. 3 dargestellt. Der I P des Proteins ist in einer Reihe von Versuchen zu 5,55—5,65 bestimmt worden. Bei der I F im^H-Bereich von 5—8 stellt der Hemmstoff den Hauptanteil des bei E280 absorbierenden Materials dar. Die Gipfelfraktionen (Fr. 34—36) zeigen in der Diskelektrophorese nur eine Hauptund zwei Nebenbanden, deren Anteil auf maximal 1% vom Gesamtprotein geschätzt wird, und die durch Gelfiltration (Abb. 4) an Sephadex G-200 abgetrennt wurden (s. Abb. 2).

I • E RF-Einh/mt

Q

h Abb. 2

c

15 20 25 30 35 40 45 50 55 BO S5 70 75 Fraktionen (je 1,3ml)

85 SO

Abb. 3

Abb. 2. Polyakrylamidgelelektrophorese bei pH 7,0 im SDS-System. a) Ausgangsmaterial AS; b) AS, gereinigt durch DEAE-Sephadex-Chromatographie und isoelektrische Fokussierung; c) Proteine von b) weiter gereinigt a n Sephadex G-200. Die Auftragsstellen sind oben in der Abbildung Abb. 3. Isoelektrische Fokussierung im £H-Bereich 5 — 8. Probe: Hemmstoffprotein der DEAE-Sephadex-Chromatographie (4 ml Fraktion G l u. G 2 ) . - - • E„ •—X RF-Einheiten/ml; • A£H-Gradient I En

398

R . W I E S N E R , CH. TANNERT, C. HAUSDORF, T . SCHEWE, S. RAPOPORT

0,5

0,4 Rp-Eink/ml 0,3

0,2

E Gelfiltration an Sephadex G-200. Von ROBINSON und LEABACK [25] wird die Gelfiltration als erster Reinigungsschritt empfohlen, der Trennung nach Molekulargewichten folgen Ionenaustauschchromatographie und isoelektrische Fokussierung. Mit dem von uns gewählten Reinigungsgang konnte von größeren Eiweißmengen ausgegangen werden, da die Kapazität der Austauscher sehr hoch ist. Quantitativ gesehen konnten die Hauptfremdproteine, wie Hämoglobin und Katalase, weitestgehend entfernt werden. Unter den angegebenen Bedingungen passiert Hämoglobin ungebunden den Austauscher, während Katalase und andere Fremdproteine nur z. T. vom Hemmstoff getrennt werden (s. Abb. 1), bzw. am Austauscher verbleiben. Die unvollständige Abtrennung der Katalase vom Hemmstoff und das Auftreten mehrerer Katalasepeaks ist auf eine Heterogenität der Katalase, wie sie bei der Chromatographie an DEAE-Zellulose beschrieben wurde [26], zurückzuführen. Die I F im ^>H-Bereich von 5—8 trennt den Hemmstoff mit einem IP von 5,55 — 5,65 mit hoher Reinheit ab. Mit der Zwischenschichtung von Glutaminsäure zwischen die saure Anodenlösung und den Ampholin-^H-Gradienten werden Unstetigkeiten um = 5, die durch Diffusion der Phosphorsäure (Anodenlösung) in den Gradienten zustande kommen, vermieden. Aus SDS-Diskelektropherogrammen (s. Abb. 2) der' Gipfelfraktionen der I F kann abgeschätzt werden, daß die Verunreinigungen nur etwa i % vom Gesamtprotein ausmachen. Das führte uns zu der Berechtigung, derartige IF-Präparate zur Immunisierung und eiweißchemischen Charakterisierung heranzuziehen. Nur in einigen Fällen wurden die Präparate über Sephadex G-200 weiter gereinigt. Die Immunodiffusion gegen Anti-RF-Serum (Abb. 5) zeigt, daß das zur Immunisierung eingesetzte Präparat eine hohe Reinheit hatte, da offensichtlich nur Antikörper gegen ein Antigen gebildet wurden, wie aus dem Auftreten nur einer Präzipitationslinie hervorgeht. Eine weitgehende oder vollständige Identität des RF-Proteins auf den verschiedenen Präparationsstufen (RÜ — AS — DEAE — Sephadex-IF) ist vorhanden. Ein Verlust potentieller Determinanten während der Präparation ist mit der ver-

402

R . W I E S N E R , CH. T A N N E R T , C. HAUSDORF, T . SCHEWE, S . RAPOPORT

wendeten Methode (Antiserum gegen gereinigten RF der IF-Stufe) nicht auszuschließen. Die Bestimmung nur einer N-terminalen Aminosäure (Glyzin) ist ein weiteres empfindliches Kriterium für die hohe Einheitlichkeit des verwendeten Präparats und läßt den Schluß zu, daß das relativ hochmolekulare Protein mit einem Molekulargewicht von 80000 (s. Abb. 6) nur aus einer Polypeptidkette besteht. Mit der N-terminalen Einheitlichkeit und einem konstanten Molekulargewicht des Proteins kann die am Kationenaustauscher und bei der präparativen alkalischen Diskelektrophorese erhaltene Heterogenität des Hemmstoffs [14] nur auf eine Abspaltung weniger C-terminaler Aminosäuren bzw. auf Kohlenhydratverlust zurückzuführen sein. Vergleicht man die Aminosäurezusammensetzung des Hemmstoffes mit einer von R E E C K und FISHER [27] durchgeführten statistischen Analyse der Aminosäurezusammensetzung von 200 Proteinen, so fällt der ungewöhnlich hohe Anteil an Leuzin und Tryptophan auf (Tyrosin noch nicht bestimmt), wodurch sich der Hemmstoff von anderen Proteinen unterscheidet. Der Anteil polarer Aminosäuren mit 41 Mol-% liegt innerhalb der angegebenen Grenzen von 47 ± 6 Mol-% für lösliche globuläre Proteine [28]. Der hohe Anteil an Leuzin und Tryptophan und die hydrophobe Wirkregion des Hemmstoffes in den Fe-S-Proteinen von Komplex I und Komplex II der Atmungskette deuten auf besonders hydrophobe Bereiche im Hemmstoffprotein hin. Mit dem Nachweis von Kohlenhydraten im Hemmstoff kann die Huminbildung bei der sauren Hydrolyse des Proteins und die unvollständige Aminosäurewiederfindung (bezogen auf Einwaage) erklärt werden. Mit der Reindarstellung des Hemmstoffs R F und der Möglichkeit der Antikörpererzeugung ist das Feld weiterer eiweißchemischer Untersuchungen für Studien zur subzellulären Lokalisation und quantitativen RF-Bestimmung eröffnet worden, die Gegenstand anderer Publikationen sein werden. Literatur [ 1 ] RAPOPORT, S . ,

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In the stroma-free hemolysate of rabbit reticulocytes there exists a respiratory inhibitor (RF) of protein nature. I t could be purified by the following procedure: (NH 4 ) 2 S0 4 -precipitation —>• DEAE-Sephadex A-50-chromatography —> isoelectric focusing —> gelfiltration on Sephadex G-200. In addition to the activity the identity of the inhibitor could be proved immunologically a t all steps of the purification. A molecular weight of about 8 0 , 0 0 0 was determined by gelelectrophoresis in the SDS-mercaptoethanol-system. The protein has an I P of 5-55 — 5.65 and consists of one polypeptide chain. This could be shown both by SDS-gelelectrophoresis and by estimation of only one N-terminal amino acid residue (glycine). Only after oxidation with performic acid the amino acid analysis of the protein gives reproducible values. The sum of weight-% is about 80 (without Tyr). The polarity of the protein with 41 mol-% agrees with the polarity of soluble globular proteins investigated by other authors. Acid hydrolysis without preceeding performic acid oxidation gives a sum of amino acid residues of only 35—45 weight- %, the glycoprotein nature of the inhibitor could be shown by staining t h e SDS-gels with Schiff's reagent and by carbohydrate determination with anthrone reagent.

27

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3—4

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 405—410 (1976) Institut f ü r Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität, 104 Berlin, D D R

Some properties of the lipoxygenase from rabbit reticulocytes W . HALANGK, T . SCHEWE, CH. HIEBSCH, a n d S. RAPOPORT

Summary A lipoxygenase was enriched from t h e stroma-free supernatant of rabbit reticulocytes. The enzyme causes drastic deterioration of mitochondrial membranes. The release of m a t r i x enzymes is paralleled by formation of products of lipid peroxidation. The enzyme reacts with isolated phospholipids and free cis-unsaturated f a t t y acids. Some properties were determined: molecular weight, isoelectric point, temperature and ^H-dependence and Km value for linoleic acid. The enzyme is inhibited b y reaction products and a variety of inhibitors, especially antioxidants and chelating agents. Introduction

A few years ago a protein factor which causes lysis of mitochondria was found during studies of breakdown of reticulocyte mitochondria by S C H E W E et al. [ 1 , 2 ] . First results showed that this factor is not identical with the known inhibitor proteins R F and RC from rabbit reticulocytes [3, 4]. On account of its action the factor was called mitochondria lysis factor. After exclusion of protease or phospholipase actions the peroxidation of the membrane phospholipids was tested. The enzyme was identified as a soluble lipoxygenase which causes lysis of intact mitochondria by peroxidation of mitochondrial phospholipids. Soluble lipoxygenases have been described in a number of plant materials [5]. Lipoxygenases were not detected in animal tissues until recently. N U G T E R E N [6] was the first to describe an arachidonate lipoxygenase in blood platelets. In this paper our results concerning the identification and characterization of the reticulocyte mitochondria lysis factor as a true lipoxygenase are summarized. Materials and methods The lipoxygenase was enriched from stroma-free supernatant of rabbit reticulocytes obtained b y bleeding anaemia. The osmotically haemolyzed reticulocytes were centrifuged after adjusting to pH 6.0 with 1 N HC1. To t h e resulting supernatant ammonium sulphate was added t o a final concentration of 0.55 saturation (ASo.ss). After dialysis against 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.2, an anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A 50 was carried out. The lipoxygenase was eluted a t a NaCl-concentration of 0.1 M. The active fractions were collected and further purified by isoelectric focusing in Ampholine, p H 5 — 8. The obtained enzyme fraction, while not pure, was free of haem-containing proteins. R a t liver mitochondria were prepared b y t h e method of D E D U V E et al. [7], Isolated mitochondria were suspended in a medium containing 125 mM mannitol, 60 mM KC1, 60 mM Tris, Abbreviations: M D H = malate dehydrogenase; MDA = malonyl dialdehyde; TBA = thiobarbituric acid; ASo,55 = protein fraction at 0.55 saturation of ammonium sulphate; E D T A = ethylene diaminotetraacetic acid 27*

406

W . H A L A N G K , T . SCHEWE, C H . H I E B S C H , S . RAPOPORT

10 mM KH,P0 4 > S mM MgCl, and 0.5 mM EDTA at pH 7-4. The final concentration was about 3 mg mitochondrial protein per ml. Egg lecithin was prepared as methanolic solution according to R H O D E S and L E A [8]. The tested polyunsaturated fatty acids linoleic acid (Ci8:2), linolenic acid (Cis-.j), 8,11,14eicosatrienoic acid (C2o:3) and arachidonic acid (C20:4) were a gift from Dr. N U G T E R E N (Vlaardingen, Netherlands). We thank also Dr. R E I C H M A N N (Charité, Berlin) for linoleic acid and methyl linoleate and for gaschromatographic analyses. Assay

methods

The release of mitochondrial matrix enzymes was calculated as percentage of the total release after treatment with 0.2% Triton X-100. Malate dehydrogenase was assayed according to S I E G E L and E N G L A R D [9], The formation of malonyl dialdehyde was determined with the thiobarbituric acid-method. The formation of fatty acid hydroperoxides was followed spectrophotometrically according to the method of HOLMAN [10]. The reaction mixture contained fatty acid, 0.2% sodium cholate, 5% ethanol in 0.1 M phosphate buffer, fiïï 7.4. Results

The lipoxygenase from rabbit reticulocytes causes drastic damage to membranes of isolated rat liver mitochondria [1, 2]. The lysis of mitochondria can be demonstrated by release of MDH. Fig. 2 shows the time dependent release of MDH and the formation of MDA from rat liver mitochondria. There can be observed a parallelism of membrane lysis and peroxidation of membrane phospholipids. In Fig. 1 the temperature dependence is shown. Both processes, MDH release and MDA formation, show an optimum at 3 7 °C. A parallel behaviour with respect to the dependence on fiK and the amount of enzyme was also observed. The lipoxygenase is a protein with a molecular weight of 120,000 as determined by gel chromatography on Sephadex G-200 with catalase, inhibitor RF and haemoEs32nm 0.300

-0.200

-0100

120 mm

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Fig. 2

Fig. 1. Temperature-dependent release of MDH by lipoxygenase ( • • ) and without lipoxygenase ( • • ) and formation of MDA (A A) from intact rat liver mitochondria (3 mg protein/ml). Incubation time 60 min with 3 mg ASo,55-protein fraction Fig. 2. Time-dependent release of MDH and MDA formation. Same conditions as Fig. 1. Temperature 37 °C

Lipoxygenase from reticulocytes

407

globin as markers. The isoelectric point was determined to be 5-5 by isoelectric focusing in Ampholine, 5—8. In addition to intact mitochondria the enzyme also peroxidizes purified mitochondrial phospholipids [11], egg lecithin and free cis-unsaturated fatty acids. Some properties of the lipoxygenase were determined with linoleic acids as substrate by following the formation of linoleic acid hydroperoxide. Fig. 3 shows the temperature dependence of hydroperoxide formation. It is seen that the optimum of this reaction is at 20 °C. This is different from the results with mitochondria as substrate, but in the case of isolated phospholipids the MDA formation is parallel to the behaviour with linoleic acid. After a small increase in activity up to 20 °C a strong decrease follows so that at 37 °C only about 25% of the activity remains^ The ^>H-dependence of hydroperoxide formation shows an optimum at />H 7-4 to 7.8. At p H values smaller than 6.5 the enzyme is not active (Fig. 4). 0.5-

Fig. 3. Temperature dependence of linoleic acid hydroperoxide formation (o MDA formation from egg lecithin (1 mg/ml; • •). S t a r t with 7 |j,g enzyme (fraction of isoelectric focusing)

o) and

Fig. 4. />H-dependence of linoleic acid hydroperoxide formation. 7 ¡xg enzyme (fraction of isoelectric focusing); reaction in 0.1 M phosphate buffers a t 2 °C

For linoleic acid a Km-value of about 0.1 mM is determined both at 37° and 2 °C. During reaction with free fatty acids the lipoxygenase is inactivated. It could be shown that this inactivation by per oxidized products is irreversible. To investigate the substrate specificity of the enzyme a number of polyunsaturated fatty acids was tested. Fig. 5 shows the rate of peroxidation as per cent of F max at certain concentrations of each fatty acid.

408

W . HALANGK, T . SCHEWE, CH. H I E B S C H , S. RAPOPORT

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Fig. S. Hydroperoxide formation from arachidonic acid (|=|), 8,11,14-eicosatrienoic acid (IHII), linolenicacid(|),linoleicacid ( • ) and methyl linoleate Reaction with 7 ¡xg enzyme at 2 °C

Certain trends both of the F max - and Km-values are apparent: Trend of F m a x .: C 20:3 ^ C 18:2 > C l 8 : 3 ^ C 20:4 > C 18:2 CH3 Trend of Km- C20:4

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Fig. 1. Pathways of glucose, fructose and xylitol metabolism in mammalian erythrocytes urements at time 0 and after 120 min the amount of substrate uptake, the change in the concentrations of intermediates and the amount of formation of products could be calculated *n order to construct balances of carbon metabolism of the different substrates. Results and discussion

The various studied substrates were utilized by different rates: the lowest uptake was obtained with D-ribose followed by xylitol, D-fructose, D-xylulose and D-glucose whereas with mixtures of these substrates carbon uptake was more pronounced. In order to get a wide range of carbon utilization rates, incubations were carried out at p H 7.4 as well as at />H 7.6 in order to partially release the hexokinase-phosphofructokinase system from inhibition [6]. As shown in Fig. 2 the concentration of 2,3-bisphosphoglycerate in erythrocytes is strongly influenced by the rates of substrate metabolism. When erythrocytes were incubated without substrate 2,3-bisphosphoglycerate was found to decompose at a rate of 1034nmole/ml cells/120 min regardless if incubations were carried out at pH 7.4 or 7.6. This decomposition rate of 517 nmole/ml cells/60 min is in perfect agreement with that reported by D U H M et al. [7] and RAPOPORT et al. [8] and corresponds to the rate of 2,3-biphosphoglycerate breakdown in the glycolyzing erythrocyte under steady state conditions. With substrates like D-ribose, xylitol, D-fructose or D-xylulose different low rates of carbon utilization were obtained and concomitantly different levels of 2,3-bisphosphoglycerate have been determined.

Energy metabolism and the 2,3-DPG bypass

509

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Fig. 2. Relationship between carbon utilization rates from various substrates and changes of the 2,3-bisphosphoglycerate level in human erythrocytes during the incubation period. Mean values of 1—4 experiments with duplicates each are given as [i.g atom C or ¡xmole/ml packed erythrocytes/120 min of incubation a t pH 7.4 or 7.6. Carbon utilization is expressed as ug atom C which have been utilized from a given substrate under the experimental conditions for the formation of A T P and 2,3-bisphosphoglycerate. This amount corresponds to those carbon atoms which have been degraded beyond 1,3-bisphosphoglycerate. Accumulation of intermediates above this compound as well as C 0 2 production in the pentose cycle therefore have been subtracted from the amount of carbon uptake determined. Metabolic rates above 20 ¡xg atom C/ml cells/120 min have been obtained by incubating 2.5 ml of red cells with D-glucose or D-glucose + xylitol in a final volume of 12.5 ml at^>H 7.6

From these results it appears that up to a carbon utilization rate of 14 [xg atom C/ml cells/120 min the net-decomposition rate of 2,3-bisphosphoglycerate is positively correlated to the rate of substrate utilization. When substrates were utilized at higher rates, e. g. at pYi 7-6, the 2,3-bisphosphoglycerate content did not decrease but remained constant (solid line). Only in the presence of electron acceptors like phenazine methosulphate or pyruvate accumulation of 2,3-bisphosphoglycerate did occur at pYi 7.6 (dashed line). From these results the following conclusions can be drawn: 1. The net-decomposition rate of 2,3-bisphosphoglycerate at various carbon utilization rates can be calculated by subtracting the rate of 2,3-bisphosphoglycerate breakdown with a given substrate from that determined without substrate (see calculation). 2. At carbon utilization rates between 14—28 (xg atom C/ml cells/120 min the concentration of 2,3-bisphosphoglycerate was found to be constant indicating

510

K . B R A N D , K . - H . QUADFLIEG

that steady state conditions for this intermediate have been achieved. Within this range the rate of formation and degradation of 2,3-bisphosphoglycerate is equal but it could be that this rate exceeds that of 1034 nmole/ml cells/120 min. 3. As long as 2,3-bisphosphoglycerate does not accumulate NAD is regenerated by the degradation of 2,3-bisphosphoglycerate to lactate and available for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase reaction. Only in the presence of other NADH reoxidizing systems such as phenazine methosulphate or pyruvate the 2,3-bisphosphoglycerate level was found to be increased without reducing the glycolytic rate. This result further suggests that at high metabolic rates the NAD/ NADH ratio controls the glycolytic flow rate since intermediates preceeding the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase reaction were found to be increased while after addition of the oxidant these intermediates declined. 4. 2,3-bisphosphoglycerate obviously does not inhibit the hexokinase reaction under the experimental conditions since the rate of glucose metabolism could be further enhanced by the addition of phenazine methosulphate in spite of the fact that 2,3-bisphosphoglycerate did accumulate. It therefore appears that the inhibition of hexokinase by 2,3-bisphosphoglycerate reported by GERBER et al. [9] does not contribute significantly to the control of the glycolytic flux. In Fig. 3 the change in the concentration of both ATP and 2,3-bisphosphoglycerate during the incubation period is plotted versus the carbon utilization rates from various substrates. Since in erythrocytes the degradation of one mole of 2,3-bisphosphoglycerate gives rise to the formation of one mole of ATP both compounds can be regarded as a single pool of energy sources. When the red cells were incubated without substrate the change in the concentration of [ATP + 2,3bisphosphoglycerate] amounted to 1286 nmole/ml cells/120 min on average regardless if the incubations were carried out at p~H 7A or at 7.6. This amount can be regarded as the minimum ATP requirement under the experimental conditions in vitro. Similar to the graph in Fig. 2 also the change in the concentrations of [ATP + 2,3-bisphosphoglycerate] are positively correlated to the rates of substrate utilization up to 14 fig atom C/ml cells/120 min. Beyond this rate the levels of both compounds remained constant. From these results the following conclusions can be drawn: 1. At a carbon utilization rate of 14 ng atom C/ml cells/120 min metabolic steady state has been achieved as indicated by the fact that the levels of ATP and 2,3bisphosphoglycerate remain constant. Since the rates of formation and consumption of ATP are balanced it can be concluded that 14 (J.g atom C/ml cells/120 min are able to cover the ATP requirement of erythrocytes at steady state conditions. 2. At steady state conditions i .0}4 fxmole 1,3-bisphosphoglycerate/ml cells/120 min can be assumed to have entered the 2,3-bisphosphoglycerate bypass compensating for the decomposition rate. The actual amount of carbon atoms which is metabolized via the glycolytic pathway thus forming ATP therefore can be calculated to be 14 — 3 X 1,034 = 10.9 ng atom C/ml cells/120 min. Since 3 fig atom C metabolized via the glycolytic pathway give rise to the formation of 1 (xmole ATP the ATP requirement for the glycolizing red blood cells under steady state conditions can be calculated to be 10.9 : 3 = 3 - 6 ¡¿mole ATP/ml cells/120 min of incubation.

Energy metabolism and the 2,3-DPG bypass

511

Fig. 3. Relationship between carbon utilization rates from various substrates and changes of t h e levels of [ATP + 2,3-bisphosphoglycerate] in h u m a n erythrocytes during t h e incubation period. Mean values of 1 —4 experiments with duplicates each are given as ¡j.g a t o m C or ¡xmole/ml packed cells/120 min of incubation a t pH. 7.4 or 7.6. For details see legend to Fig. 2

3. If the ATP consumption rate remains constant also under enhanced metabolic rates all carbon atoms utilized during the incubation exceeding the amount of 10.9 |ig atom C/ml cells/120 min must have been metabolized via the bypass because the concentration of ATP remained constant. In this case the share of the bypass to carbon metabolism increases with increasing metabolic rates. At a rate of 21.8 ng atom C/ml cells/120 min e. g. the share of the bypass to carbon metabolism can be calculated to be 50%. 4. After releasing the hexokinase-phosphofructokinase system from inhibition it appears that there is no further control of carbon metabolism within a wide range of metabolic rates (14—28 [ig atom C/ml cells/120 min). This could be explained by assuming that carbon metabolism proceeds mainly via the 2,3-bisphosphoglycerate bypass without net formation of ATP and NADH. Our results therefore support the concept that the overall flux of glycolysis is mainly determined by hexokinase and phosphofructokinase as has been proposed by T. A. RAPOPORT e t a l . [ 1 0 ] .

Calculations

As shown on Table 1 the rates of carbon utilization via the 2,3-bisphosphoglycerate bypass and the 3-phosphoglycerate kinase reaction can be calculated from the experimental data. The procedure of calculation is explained in the legend to

512

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Energy metabolism and the 2,3-DPG bypass

513

the Table. This calculation can be applied only to metabolic rates in which steady state is not yet achieved. Under these conditions however it is interesting to note that the share of bypass to carbon metabolism is rather constant at the different metabolic rates ranging between 18 to 29%- Beyond a carbon utilization rate of 14 |ig atom C/ml cells/120 min two possibilities can be assumed to occur: 1. The ATP consumption rate remains constant and corresponds to the ATP requirement determined to be 3-6 [xmole/ml cells/120 min. In this case, as stated below, the share of the bypass would increase with increasing metabolic rates. Since no net formation of ATP does occur in this pathway a waste of ATP would be the consequence. 2. The ATP consumption rate increases with higher metabolic rates e. g. by increased ATPase activities. In this case the share of the bypass could be assumed to remain in the range between 15—30%Which one of the two possibilities is realized in the red blood cells remains still open. Our results, however, allow to conclude that at all metabolic rates a significant amount of carbon atoms are metabolized via the 2,3-bisphosphoglycerate bypass. References and M . R I V E R A : Hoppe-Seyler's Z . physiol. Chem. 351, 5 0 1 ( 1 9 7 0 ) G., S. M I N A K A M I , and S. M. R A P O P O R T in: Cellular and Molecular Biology of Erythrocytes. H. Y O S H I K A W A and S. R A P O P O R T (ed.). Urban und Schwarzenberg, Miinchen, Berlin, Wien 1974, p. 55 [3] ASAKXJRA, T., K . A D A C H I , S . M I N A K A M I , and S . Y O S H I K A W A : J . Biochem., Tokyo 62, 184 (1967) [ 4 ] Q U A D F L I E G , K . - H . , and K . B R A N D : Z . ErnahrWiss. 14, 268 ( 1 9 7 5 ) [ 5 ] E R I C S O N , A . , and C . - H . D E V E R D I E R : Scand. J . clin. Lab. Invest. 29, 8 5 (1972) [ 6 ] M I N A K A M I , S . , and H . Y O S H I K A W A : J . Biochem., Tokyo 59, 1 4 5 ( 1 9 6 6 ) [ 7 ] D U H M , J . , B . D E U T I C K E , and E . G E R L A C H : Pfliigers Arch. ges. Physiol. 306, 3 2 9 ( 1 9 6 9 ) [8] R A P O P O R T , I., H. B E R G E R , R . E L S N E R , and S. M. R A P O P O R T in: Abstracts of the V I I I " 1 International Berlin Symposium on Structure and Function of Erythrocytes, Berlin 1976 p. 98 [ 9 ] G E R B E R , G . , H . P R E I S S L E R , R . H E I N R I C H , and S. R A P O P O R T : Eur. J . Biochem. 45, 39 (1974) [10] R A P O P O R T , T. A., R . H E I N R I C H , G. J A C O B A S C H , and S. R A P O P O R T : Eur. J . Biochem. 42, 107 (1974) [1] BRAND, K . , P . A R E S E , [2]

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pH-Dependent changes of 2,3-bisphosphoglycerate I . RAPOPORT, H . B E R G E R , R . E L S N E R , a n d S . M . RAPOPORT

Summary A systematic study of thep~H. dependent changes in the range 6.6—7.4 of 2,3-bisphosphoglycerate (2,3-DPG) was performed in the presence and absence of glucose during transitional and steady states. The results indicate that 2,3-DPGase breaks down 2,3-DPG nearly independent of pH at a rate of 480 ¡xmoles 2,3-DPG/l cells • h. The 2,3-DPG mutase is practically completely inhibited below pH 6.9. The 2,3-DPG level in the presence of glucose reaches a pH dependent steady state after about 18 h. The share of the 2,3-DPG bypass in the steady state decreases from 24% at pH 7.4 to 12% at pH 7.0. The formation of pyruvate corresponds to the breakdown of 2,3-DPG after consumption of an unknown reducing substance.

With a concentration of 4—5 mmoles/1 cells 2,3-bisphosphoglycerate (2,3-DPG) is the phosphate ester with the highest concentration in the human red blood cell. A variety of effectors are assumed to change the 2,3-DPG level under physiological and pathological conditions: 1. The effect of deoxygenation on the level of 2,3-DPG has attracted considerable attention [1—5]. 2. Some inorganic ions influence indirectly the 2,3-DPG concentration by affecting the hexokinase-phosphofructokinase-system. Others do so directly by affecting the bypass [6—16]. 3. There is an inverse ratio between the hemoglobin content of the cell and the 2,3-DPG-concentration [17—19]. 4. Some hormones [20—23] and vitamins [24, 25] are supposed to influence the 2,3-DPG level. 5. Several drugs [26—28] affect the 2,3-DPG concentration, possibly by affecting ATP consuming processes of the membrane. 6. Genetic defects of enzymes can change the 2,3-DPG concentration of the cell [29-34]. 7. Under physiological conditions the most important effector is the concentration of hydrogen ions. 2,3-DPG increases during alcalosis, while it decreases during acidosis. The original observations of a breakdown of 2,3-DPG [35—38] at low fill values, both in vivo and in vitro have been confirmed repeatedly [39—47]. Nevertheless, no systematic study of this phenomenon has been performed yet, nor has its mechanism been elucidated. At present there is a lack of understanding by what mechanism steady state concentrations of 2,3-DPG are established under various physiological and pathological conditions. The in vitro experiments carried out so far do not permit valid extrapolations to the conditions in vivo. The purpose of the present study was an investigation of the />H-dependent kinetics of 34

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3—4

516

I . RAPOPORT, H . B E R G E R , R . E L S N E R , S . M . RAPOPORT

the changes of 2,3-DPG both during transitional and steady states. It included an assessment of the flux through the 2,3-DPG bypass. Fig. 1 shows the rate of 2,3-DPG breakdown as a function of with and without glucose. The rates of breakdown are derived from short-term experiments lasting for 6 hrs. During this period the 2,3-DPG concentration decreased in a linear fashion, which means that initial velocities were measured down to a concentration of 1 mM 2,3-DPG. Without glucose a linear rate of breakdown of 480 u.moles/I cells • h was observed irrespective of In the presence of glucose at _/>H values of 6.9 or less the same rate of 2,3-DPG breakdown occurred. Above pYi 6.9 the net rate of 2,3-DPG degradation decreased and became zero at a />H exactly .maintained at 7.4. The constant and linear rate of breakdown of 2,3-DPG in intact erythrocytes in the absence of glucose which is independent of pYi and the changing pattern of metabolites suggest two conclusions: first, that the 2,3-DPG ase is saturated above 1 mM 2,3-DPG. Secondly, that the activity of the saturated enzyme is not significantly affected by pH or metabolites. Since below pH 6.9 2,3-DPG breaks down at the same rate with or without glucose the 2,3-DPG mutase must be almost completely inhibited, while the flux through the DPGase remains constant. The inhibition of the mutase cannot be due to a decrease in the concentration of its substrate 1,3-DPG both for experimental and theoretical reasons. It rather represents a pYi dependence of the intrinsic properties of the mutase. The narrow span of 0.3 intracellular pH units between complete inhibition of the mutase and its normal functioning suggests a cooperative behaviour of the enzyme. BOO

500 -

Fig. 1. Initial rates of breakdown of 2,3-DPG. a) Calculated from 2,3-DPG degradation; b) calculated from the formation of inorganic phosphate according to the formula : ¿(inorganic phosphate-H-values • 34»

518

I . RAPOPORT, H . B E R G E R , R . E L S N E R , S. M . RAPOPORT

Since DPG is an effector of a number of glycolytic enzymes the glycolytic system changes from a quasi steady state to a true new steady state after about 19 hrs. The steady state levels of 2,3-DPG are of course strongly dependent on pH, as may be seen from Fig. 4. Because of the non-linearity of the />H-dependence the ratio (Zlmmoles 2,3-DPG/lcells)/0.1 pH is not constant. In contrast to the behaviour of 2,3-DPG, ATP changes by less than 10% over the entire pH range. The DPG broken down appears in the sum of pyruvate and lactate. Fig. 5 shows the formation of pyruvate with and without glucose at different />H-values. Without glucose the pyruvate formation is independent of pH. There is hardly any accumulation for the first two hours. After the third hour pyruvate increases at a rate equal to the 2,3-DPG breakdown. Since no pyruvate appears during the first two hours, one has to postulate that about 1.5 mmoles of reducing equivalents are present to reduce pyruvate to lactate. Glutathione, a possible candidate, did not change its reduction state within the critical period. The character of the reducing substance is not yet known. In the presence of glucose the pyruvate formation becomes p H dependent. I t is very low at pH e 7.4 and increases at lower pH values without ever reaching the value occurring in the absence of glucose. A consideration of the share of the 2,3-DPG bypass on the overall glycolytic flux under various conditions is of interest (Table 1). Since under conditions of the

Fig. 4

Fig. S

Fig. 4. The influence of pH on the steady state concentration of 2,3-DPG in the presence of glucose Fig. 5. The formation of pyruvate at different pH. values with and without glucose o with glucose, pHe 7,415; • without glucose, pHe 7,415; A with glucose, pHe 6,90.

519

^H-dependent changes of 2,3-DPG

transitional state glucose influx and formation of the sum of lactate and pyruvate do not balance, and the influx in the bypass is practically nil, meaningful estimates have to be related to the output. As shown in Table 1 with decreasing pYi the share of the 2,3-DPG bypass on the glycolytic flux rises to 35% at pYie 7.0. In the steady state, glucose consumption and lactate formation are equal within the limits of analytical errors. The glycolytic rate is higher than in the transient state during the first 6 hours. The reason is probably the diminished inhibition of the hexokinase-phosphofructokinase-system because of the low level of the inhibitor 2,3-DPG. The flux through the 2,3-DPG bypass is constant over the range of pH e 7.4 to 7.2 and amounted to 24%. This is in good agreement with other data from the literature [51, 52]. At pYie 7.0 the steady state concentration of 2,3-DPG corresponds to the Km of the 2,3-DPGase and therefore the flux through the bypass is about half that at higher pH-values. The share of the bypass in the steady state is lower than that during the transient period owing to the changes in the glycolytic flux and in the flux through the bypass. The share amounted to 12% at pRe 7.0. Table 1 The share of the 2,3-DPG-bypass on the glycolytic flux in the transient and the steady state Glycolytic flux (¡imoles/1 cells) transient state (pyruvate + lactate) 7.4

—

7.0

1410

steady state (lactate) 2000 2000

Flux through the 2,3-DPG-bypass (fimoles/1 cells) transient state

—

480

Share of the bypass

steady state

transient state

480 240

35%

—

steady state 24% 12%

If one compares these in vitro results in the 2,3-DPG metabolism with those under in vivo conditions one can say that both the marked pH dependence of the steady state 2,3-DPG-concentration as well as the time course of the changes of 2,3-DPG are in very good agreement with the observations in acidotic and hypoxic conditions in vivo [43, 46, 47, 53 — 56]. DPG attains a new steady state later than all other metabolites of the glycolytic chain. Therefore these results are an experimental proof for the existence of a time hierarchy in an enzymatic system [51]. References and S . M I N A K A M I : J . Biochem., Tokyo 72, 9 8 1 ( 1 9 7 2 ) J . G O T T L I E B , W . W . M I L L E R , and M . D E L I V O R I A - P A P A D O P O U L O S : J . clin Invest. 49, 400 (1970) [3] R O R T H , M.: Scand. J . clin. Lab. Invest. 26, 43 (1970) [ 4 ] G E R L A C H , E . , and J . D U H M : Oxygen Affinity of Haemoglobin and Red Cell Acid Base Status. M. R O R T H and P . A S T R U P (Eds). Munksgaard, Copenhagen 1 9 7 2 , p. 5 5 2 [ 5 ] R A P O P O R T , I . , H. B E R G E R , S . R A P O P O R T , R . E L S N E R , and G . G E R B E R : Biochim. biophys. Acta 428, 1 9 3 ( 1 9 7 6 ) [6] K U H N , B . , G . J A C O B A S C H , and S . R A P O P O R T : F E B S Lett. 38, 3 5 4 ( 1 9 7 4 )

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The molecular function of hemoglobin as reflected in ligand binding data: Analysis of data on erythrocytes T . GROTH, C . - H . DE VERDIER,

and

L.

GARBY

Summary Hemoglobin oxygen binding d a t a on erythrocytes a t different pH, pCO, a n d bisphosphoglycerate concentrations h a v e been analyzed in t e r m s of a n extended version of t h e Herzfeld-Stanley m o d e l of 1972. T h e binding of oxygen t o s u b u n i t s w h e n t h e t e t r a m e r is in t h e q u a t e r n a r y oxy conformation was f o u n d t o be insensitive t o m o d e r a t e changes in pH a n d pC02 (0.71 i 0.05 m m H g _ 1 ) . Utilizing t h i s circumstance i t h a s been possible t o obtain, for t h e first time, unique estimates of energy p a r a m e t e r s related t o hemoglobin cooperativity a n d effector action. A t 37 °C, pH 7.2 and^>CO, 22 m m H g t h e following p a r a m e t e r values were o b t a i n e d : T h e allosteric c o n s t a n t : (1.5 i 0.4) • 10 4 ; t h e oxygen binding c o n s t a n t of t h e deoxy s t a t e : (5.4 ± 0.3) • 1 0 - 3 m m H g - 1 ; t h e 2,3-bisphosphoglycerate binding c o n s t a n t s : (3.3 ^ 1.3) • 1 0 3 1 • m o l - 1 (deoxy), (1.3 ± 0.5) • 10 2 1 • m o l - 1 (oxy). Q u a t e r n a r y transition m o s t likely t a k e s place a f t e r binding of t h e second 0 2 molecule. Following t h e concepts of P e r u t z t h e results suggest t h a t (1) p r o t o n s a n d carbon dioxide act as constraint effectors and/or as q u a t e r n a r y effectors; (2) t h e difference in t o t a l conformational energy between t h e t w o q u a t e r n a r y ligand-free states is almost exclusively confined t o molecular constraints a n d very little t o t h e difference in q u a t e r n a r y conformational energy. T h e consistency of t h e results indicate t h a t t h e model m a y be regarded as a useful t o o l for t h e description of t h e f u n c t i o n a l interrelations in t h e hemoglobin oxygenation process as reflected in oxygen binding d a t a . Introduction

Interpretation of hemoglobin oxygen binding data in terms of models for hemoglobin function on a molecular level requires critical consideration of the selection of (1) a theoretical model, (2) the experimental design, and (3) the statistical and numerical methods for the analysis. During the last two decades different theoretical models of varying sophistication have been published. In 1 9 7 4 HERZFELD and S T A N L E Y [ 1 ] proposed a general model for cooperativity of ligand binding to macromolecules. This model describes the particular states of a macromolecule in terms of differences in energy levels associated with the events that are assumed to take place, i.e. transitions between quaternary conformations and between tertiary conformations, binding of ligand to different conformational forms, interactions between quaternary and tertiary This work was s u p p o r t e d b y t h e Danish Medical Research Council a n d t h e Swedish Medical Research Council (Project No. 13X—152)

524

T . GROTH, C . - H . DE V E R D I E R , L .

GARBY

conformations, and changes in subunit aggregation. This formalism is attractive from a theoretical point of view. However, in the analysis of hemoglobin oxygen binding data the usefulness of such detailed models is limited by the difficulty of obtaining unique parameter estimates. With regard to the experimental design of hemoglobin oxygen binding experiments it is important to consider the influence of hemoglobin and effector concentrations. In most previous studies, the hemoglobin concentration has generally been very low, between 0 . 0 1 and 0 . 1 2 mmol • L tetramer. Recently A C K E R S et al. [2] have shown that under these circumstances, the dissociation of tetramer molecules into dimers is not negligible and that the presence of even small amounts of dimers may profoundly affect the shape of the binding curve. Previous data on oxygen binding in whole blood are incomplete with respect to, e.g., information on the concentration of 2,3-bisphosphoglycerate (P2-Gly) and/or red cell hydrogen ion activity, and thus cannot be used for the purposes of testing detailed models for hemoglobin cooperativity and effector action. A proper numerical and statistical analysis also requires estimation and due consideration of confidence limits of estimated descriptive parameters. This is the primary basis for a critical judgement of model adequacy and of the significance of obtained numerical values. In the present communication, several sets of oxygen binding data on intact erythrocytes at different values of pH, pC()2 and [P 2 -Gly] have been analysed in terms of an extended version of the Herzfeld-Stanley model from 1972 [3]. A less advanced study on mainly different data was reported by DE V E R D I E R et al. [ 4 ] in 1973. In accordance with the present general opinion we have, contrary to HERZFELD and S T A N L E Y [ 1 ] , regarded the oxy quaternary conformation to be without quaternary-tertiary constraints. Furthermore we have described the molecular constraints in the deoxy quaternary conformation in a more adequate way. The association constant of oxygen binding in the oxy quaternary state appeared to be insensitive to moderate changes in pH and pC02. Utilizing this circumstance, it has been possible to obtain unique estimates of energy parameters related to hemoglobin cooper ativity and effector action. - 1

Materials and methods Experiments The oxygen binding data were taken from G A R B Y et al. [5] and A R T U R S O N et al. [6]. Using a Radiometer DCA-1 oxygen binding curves were obtained for intact erythrocytes at 37 °C for pH (intracellular) of 7.0, 7-1, 7-2, 7 3: pCO, of 22, 77 mm Hg and [P 2 -Gly]: 1.4, 4.4, 9.3 mmol • l- 1 . Computations The fractional saturation of oxygen binding sites Yo 2 , was calculated from the two-state model by H E R Z F E L D and S T A N L E Y [3]. For the case that P 2 -Gly is regarded purely as a quaternary effector yo 2 can be written YO2 =

p02 •

Kg (1 + JsTdeoxy • [P2-Gly]free) • (1 + -gdeoxy • pOJ 3 Kdeoxy Kq (1 + tfdeoxy • [P2-Gly]free) • (1 + isTdeoxy pO.J* + (1 + Koxy

[P2-Gly]free) • (l + Koxy • pO,)* • oKxoxy y

+ (1 + K0Xy [P,-Gly] free) • (l + Koxy ' pO2)4

(1)

Molecular f u n c t i o n of hemoglobin

525

where Kq is t h e equilibrium c o n s t a n t for t h e t w o q u a t e r n a r y conformations in t h e absence of oxygen, Káeoxy a n d Koxy are t h e binding constants for P 2 -Gly t o t h e t w o q u a t e r n a r y conformations, a n d K¿eoxy a n d Koxy are t h e binding c o n s t a n t s for oxygen t o subunits w h e n t h e q u a t e r n a r y conformation is given as s t a t e d . T h e free concentration of P 2 -Gly is calculated according t o t h e f o r m u l a [P2-Gly]£ree = [P2-Gly]tot -

[Hb] • Yp 2 . Gly

(2)

where Yp2.Giy is the fractional saturation of P 2 -Gly. For details see [3], Following t h e concepts of PERUTZ et al. [7, 8, 9] t h e free energy change related t o q u a t e r n a r y transition (in t h e absence of oxygen) can be w r i t t e n R T In Kq = Eq + Eqt (3) where E'qt is t h e m a x i m a l energy related t o molecular constraints imposed b y bonds, e.g. saltbridges, stabilizing t h e deoxy q u a t e r n a r y conformation in t h e ligand-free state. Eq is t h e difference in energy between t h e t w o q u a t e r n a r y conformations (oxy-deoxy) exclusive of c o n s t r a i n t energy. Binding of oxygen t o a s u b u n i t induces a change in t e r t i a r y conformation, so t e r m e d inducedf i t binding. D u r i n g oxygenation energy is released b y t h e reaction of t h e h e m e groups w i t h oxygen: R T In Kdeoxy a n d R T In Kcxy for each s u b u n i t in t h e t w o q u a t e r n a r y conformations, respectively. I n t h e deoxy q u a t e r n a r y s t a t e p a r t of this energy is expended (1) t o b r e a k t h e stabilizing salt-bridges, (2) t o increase t h e constraint energy due t o strains imposed on t h e oxy t e r t i a r y s t r u c t u r e w h e n confined in t h e " w r o n g " q u a t e r n a r y s t r u c t u r e . Thus, we assume t h a t t h e energy of t h e stabilizing salt-bridges goes f r o m — E'qt t o 0, a n d t h a t t h e c o n s t r a i n t energy d u e t o " w r o n g " conformation increases f r o m 0 t o its m a x i m a l value Eqt during oxygenation. Consequently t h e following relation holds -ffdeoxy = Koxy • exp [ - (Eqt + E"qt)/4RT]

(4)

i.e. iideoxy is t h e c o n s t a n t for induced-fit oxygen binding of a s u b u n i t as constrained b y t h e deoxy q u a t e r n a r y s t r u c t u r e . I n t h e unconstrained oxy q u a t e r n a r y conformation (cf. [10]) Koxy is t h e c o n s t a n t for induced-fit binding. T h e p a r a m e t e r s (Kq, üdeoxy, -Koxy, K¿e0xy and Koxy) were estimated b y fitting t h e Yo 2 -function in a weighted least-square sense t o t h e experimental d a t a sets. A c o m p u t e r p r o g r a m for non-linear least-squares curve f i t t i n g was used [11]. W e i g h t s were given t o t h e d a t a points as calculated f r o m t h e variance of ^>02 measurements. Results and discussion

The five-parameter model described by eqns. (1—2) was found to be compatible with all data sets. The deviations between theory and experiment were less than two standard deviations of the experimental error. Despite strong correlation between Kq and Koxy it turned out that "best" estimates of the oxygen binding constant were rather constant with a small scatter between values for different pH and pC02: mean value Koyy = 0.71 ± 0.05 mmHg - 1 . The data were thus reanalysed assuming that Koxy is insensitive to moderate changes in pH and pC02 (cf. [12], [13]). At pH = 7.2 and pC02 = 22 mmHg the following estimates were obtained: K q = (1.5 ± 0.4) • 10*; if deoxy = (5.4 ± 0.3) • i0" 8 mmHg- 1 , ^deoxy =

(3-3 ± 1.3) • 1 0 3 1 • m o l - 1 a n d K o x y =

(1.3 ± 0 . 5 ) • 1 0 2 1 • m o l " 1 ) .

526

T . GROTH, C . - H . DE V E R D I E R , L . GARBY

The corresponding free energy changes on quaternary transition and binding of oxygen and P2-Gly are: - 2 4 . 8 k j • mol - 1 (Kq), - 2 1 . 4 k j • mol - 1 (/ideoxy) , - 3 3 . 9 k j • mol" 1 (Kmy), - 20.9 k j • mol - 1 (Kdeoxy) and —12.7 k j • mol - 1 (/?oxy). In Fig. 1 the ten hypothesized states of the hemoglobin molecule are ordered on a relative energy scale in units of k j • mol -1 . The differences in total energy between the two quaternary conformations at different stages of oxygenation are easily calculated from the estimates above. The figure gives a quantitative overview of the thermodynamics of hemoglobin oxygenation. The relative probabilities of the ten states were computed [3] from the estimated parameters and are shown in Fig. 2. Figs. 1 and 2 indicate that (1) quaternary transition most likely takes place after oxygenation of the second subunit, (2) the probabilities of intermediary states are surprisingly low. Binding of P2-Gly, preferentially to the deoxy state, will decrease the deoxy energy levels relative to the energy levels of the corresponding oxy states by an amount of 8.2 to 20.9 k j • mol -1 , moving the quaternary switch-over to a later stage of the oxygenation process (Fig. 3).

Fig. 1. The free energy levels of t h e ten different states in t h e process of hemoglobin oxygenation. The columns of figures to t h e left and right give t h e total constraint energies of t h e different states (0 for t h e unconstrained oxy quaternary state) • d and o indicate t h e tertiary conformation of the subunit (deoxy and oxy respectively): D and O t h e quaternary conformation

Molecular function of hemoglobin DEOXY

DEOXY OXY

1.0 Q5 )"

0.5

DEOXY OXY

05 05 T T

0

DEOXY OXY

06 05

T

527

T

0

05

OXY

0

0.5 10 " •H" "I

I

4n

0

0.25 I

0.50 I

0.75 L

1-00 yO2

Fig. 2. Probabilities, expressed as mole fraction, for t h e ten hypothesized states of hemoglobin a t five different levels of hemoglobin oxygenation (with an average number of 0, 1, 2, 3 and 4 subunits oxidized)

DEOXY STATE (T)

OXY STATE IR)

Fig. 3. Bisphosphoglycerate (P 2 -Gly) influences t h e energy levels given in Fig. 1. The preferential binding of P,-Gly t o the deoxy state implies t h a t the energy levels of the different subunit combinations in this state decrease with a value somewhere in the range between t h e energy level for P 2 -Gly binding to t h e deoxy state and t h e difference between this value and the energy level for P 2 -Gly binding to t h e oxy state. The diagram refers to the latter alternative

528

T . GROTH, C . - H . DE VERDIER, L .

GARBY

Interpretation of the estimated parameters in terms of molecular mechanisms From equations (3) and (4) follows that it is only possible to estimate the sums Eq + E'gtandE"qt + E"qt, unless specific assumptions are made about the relation between two of the three parameters, or unless one is known from independent investigations. The estimates of K = 1.5 • 104, K,deoxy = 0.054 mm Hg- 1 and Koxy = 0.71 mm Hg" 1 at pU = 7.2 and pC02 = 22 mm Hg give the sums Eq + E'qt = 24.8 k j • • mol - 1 and E'qt + E"qf = 50.4 k j • mol - 1 . According to PERUTZ [7] „the bond energy per salt-bridge may reasonably be estimated as 1 —2 kcal/mole". Assuming that the deoxy quaternary conformation is stabilized by six salt-bridges E^ obtains a value of 2 5 - 2 — 5 0 . 4 k j • mol - 1 . The lower limit of E'qt gives an estimate of E'qt (the maximal constraint energy due to "wrong" conformation) equal to 2 5 - 2 - k j • mol - 1 , and of Eq (the difference in energy between the two quaternary conformations) equal to —0.4 k j • mol - 1 . The upper limit of E'qt gives E"qt = 0 and Eq = —25.6 k j • mol" 1 .

These rough calculations show that our parameter estimates are consistent with PERUTZ' data on bond energy of stabilizing saltbridges. The lower value suggests that the difference in total conformational energy between the deoxy-oxy quaternary states (in the absence of ligand) is almost exclusively confined to molecular constraints and very little to the difference in quaternary conformational energy. This relation between Eq and E'qt seems rather plausible as the bond energy of saltbridges could be expected to be larger than the types of bonds lumped in Eq. Values of E'q approaching the upper limit, on the other hand, seem less probable as E"qt by definition should be > 0. The effect of both protons and carbon dioxide was found to stabilize the quaternary deoxy conformation (Fig. 4). Following the concepts of PERUTZ this figure suggests that both protons and carbon dioxide act as constraint effectors (changing E'qt) and/or quaternary effectors (changing Eq). The effect of carbon dioxide is negligible at pH 7.0 and increases with^H, in accordance with the idea that the changes are linked to formation of carbamate. The oxygen binding constant, Kdeoxy, showed a significant fall with phi. This is in agreement with results published by IMAI and YONETANI [12]. Furthermore, ac•—•pC02 = 22 mm Hg ixipC02= 77 mmHg

105-

70

71

72

73

Fig. 4. The effect of pH a n d carbon dioxide tension on t h e q u a t e r n a r y equilibrium constant, Kq. pH

Molecular function of hemoglobin

529

cording to the model concepts applied, protons acting on the salt-bridges (i.e. changing E'qt ) should affect not only the quaternary equilibrium (eqn. (3)), but also the oxygen binding affinity of subunits confined in the deoxy quaternary structure (eqn. (4)). The consistency of the results discussed so far increases the credibility of the model concepts applied. Despite the fact that the model is an over-simplification of the real system, it may at least be regarded as a useful approximation for the description of functional interrelations in the hemoglobin oxygenation process as reflected in oxygen binding data. It does not seem motivated to use more detailed models in this connection, e.g. by introducing parameters related to the difference in oxygen binding of a and fi subunits. Such over specifications will just add to the problem of estimating unique parameter values, unless these new parameters can be established by independent investigations. References [1]

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A c t a b i o l . med. germ., Band 36, Seite 531 — 536 (1977) 'Abteilung für Transfusions- und Transplantationswesen des Bereiches Medizin (Charité) der Humboldt-Universität, 104 Berlin, D D R 2 Bezirksinstitut f ü r Blutspende- und Transfusionswesen, 113 Berlin, D D R

Biochemische Veränderungen von Erythrozyten während einer Lagerung bei 25 °C und Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Wertes G. MATTHES1 u n d D .

STRAUSS2

Zusammenfassung Untersuchungen zum Einfluß einer £ H - K o n s t a n t h a l t u n g auf das Stoffwechselverhalten konservierter Erythrozyten wurden über einen Zeitraum von 7 Tagen bei 25 °C-Lagerung von CD-Konservenblut durchgeführt. ACD-Konservenblut diente als Kontrollwert. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: 1. Durch tägliche ^>H-Einstellung im CD-Konservenblut auf pH 7,4 wurde der extrazelluläre ^ H - W e r t aufrechterhalten, der intrazelluläre W e r t sank nach 12 Std. bereits auf 7,2 ab. 2. Auf Grund des höheren initialen ¿>H-Wertes und der nachfolgenden ^ H - K o n s t a n t haltung im CD-Blut war eine größere Stoffwechselaktivität ersichtlich. 3. Die Erhöhung des Initial-^)H und nachfolgende ^ H - K o n s t a n z im CD-Blut f ü h r t e zu einer verbesserten Erhaltung der zellulären Konzentrationen an A T P (bis zum 5- Tag der Lagerung) und 2,3-DPG (innerhalb der ersten 12 Std.). 4. Frühe Veränderungen biochemischer Parameter traten im Verlaufe der Konservierung besonders im Verhalten der Adeninnukleotide auf. Einleitung

Während der Lagerung von Konservenblut treten Veränderungen im Erythrozytenstoffwechsel auf, die je nach Stabilisatorzusammensetzung ein unterschiedliches Ausmaß besitzen. Durch den Abfall organischer Phosphatester, speziell von zellulärem ATP und 2,3-DPG, wird die Lebensfähigkeit der Erythrozyten im Empfängerorganismus herabgesetzt und die 0 2 -Transportfunktion des Hämoglobin beeinträchtigt. Im Verlaufe der Konservierung von Vollblut fällt der />H-Wert in der ACD-Konserve von etwa 7,0 auf 6,6 ab. Durch diese pH-Veränderung wird besonders der Gehalt an 2,3-DPG beeinflußt. Eine verbesserte Erhaltung von zellulärem 2,3DPG wurde durch Erhöhung des Ausgangs-/>H-Wertes in ACD- und CPD-Konservenblut beobachtet [1,2]. Eine Aufrechterhaltung des ^>H-Wertes in der Konserve kann sowohl durch Anwendung geeigneter Puffersysteme als auch durch ständige Dialyse ermöglicht werden [3]. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung des Einflusses einer _/>H-Konstanthaltung im Konservenblut während der Lagerung bei 25 °C im CDMedium auf das Verhalten biochemischer Parameter und in der Erfassung frühzeitiger Veränderungen im Stoffwechsel konservierter Erythrozyten. Die Lagertemperatur von 25 °C wurde bewußt gewählt, weil dadurch ein kürzerer Beobachtungszeitraum ermöglicht wird und eine Übertragung von Ergebnissen der 25 °C-Konservierung auf die übliche 4 °C-Konservierung grundsätzlich möglich ist [ 4 - 6 ] . 35

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3—4

532

G . MATTHES, D . SXRAUSS

Material und Methoden Blut wurde aus der Kubitalvene gesunder Spender entnommen und in 37 °C-temperierte Konservenflaschen eingefüllt (Verhältnis Stabilisator: Blut = 1:4). Die Zusammensetzung der verwendeten Stabilisatoren geht aus den Tab. 1 und 2 hervor. Nach Abnahme des Ausgangswertes wurden die Konservenflaschen sofort in ein 25 °C-Wasserbad überführt. Proben wurden zu folgenden Zeitpunkten entnommen: Stunden 0, 1, 2, 4, 8, 12; Tage 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7Täglich wurde der ^H-Wert der Konserven auf pH 7,4 durch tropfenweise Zugabe von 0,2 N NaOH eingestellt. Alle pH-Bestimmungen erfolgten bei einer Temperatur von 25 °C, mit Ausnahme des Ausgangswertes (37 °C). Die angegebenen Werte sind jeweils das Mittel aus drei Bestimmungen. Tabelle 1 Zusammensetzung der verwendeten Stabilisatorlösungen (Angaben in g/1) Substanz

Mol.Ge wicht

ACD

CD

Glukose • H , 0 Natriumzitrat • 2 H„0 Zitronensäure • H 2 0

198.0 294.1 210.0

25.0 13.2 4.8

25.0 13.2 —

Tabelle 2 Charakteristik der Stabilisatorlösungen Kriterium

ACD

CD

Zitratgehalt im Konservenblut (mM) Glukosegehalt im Konservenblut (mM) Osmolarität, gemessen (mOsm)

13-0 25.0 344 5.1

9-5 25.0 330 7-4

pH

Folgende Methoden wurden verwendet: ATP, ADP, AMP und Laktat wurden enzymatisch unter Verwendung von Testbestecken der Fa. Boehringer, Mannheim, gemessen. Die Glukosebestimmungen wurden im Automatenlabor des Klinikums Berlin-Buch durchgeführt. Die 2,3-DPG-Konzentrationen wurden nach der enzymatischen Mikromethode nach N Y G A A R D und R 0 R T H [7] durchgeführt. Die Bestimmung des extrazellulären pH-Wertes (pHe) wurde am pH-Meßgerät der Fa. Ciamann und Grahnert, Dresden, durchgeführt. Die Ermittlung der intrazellulären pH-Werte (pH^ erfolgte nach dreimaliger Gefrierhämolyse der konservierten Erythrozyten. Hämoglobin im Vollblut wurde als Zyanmethämoglobin nach D A B 7 bestimmt. Ergebnisse

Der Ausgangs-/>H-Wert in der CD-Konserve beträgt bei }7 °C 7,4. Nach Überführung in das 25 °C-Wasserbad wurde mit 0,5 ml 0,1 M Zitronensäure auf einen ^H-Wert von 7,4 eingestellt. Der extrazelluläre _/>H-Wert fiel innerhalb von 24 Std. auf 7,1 ab und wurde nachfolgend täglich mit 0,2 N NaOH auf 7,4 gehalten Zur Einstellung des pH-Wertes waren jeweils folgende Mengen an 0,2 N NaOH notwendig: 1. Tag: 1,6 ml, 2. Tag: 1,6 ml, 3- Tag: 1,4 ml, 4. Tag: 1,2 ml, 5- Tag: 1,0 ml, 6. Tag: 0,4 ml. Der intrazelluläre ^H-Wert im CD-Blut betrug bei 37 °C 7,38 und fiel im Verlaufe des ersten Lagerungstages auf 7,1 ab. Im Gegensatz zum ACD-Blut wurden hierbei jeweils vor der NaOH-Zugabe identische extrazelluläre und intrazelluläre pH-Werte ermittelt (Abb. 1). Im ACD-Blut fiel der ¿H-Wert

Vollblutkonservierung bei 25 °C unter ^ H - K o n s t a n t h a l t u n g

533

von 6,95 innerhalb von 7 Tagen auf 6,4 ab. Die Differenz zwischen und pH e betrug anfangs 0,1 ^>H-Einheiten und wurde bis zum Tag der Konservierung größer (3. Tag: 0,25 />H-Einheiten), um nachfolgend zum Ende der Lagerung wieder abzunehmen. In Abb. 2 ist das Verhalten des zellulären ATP, ADP und AMP im Verlaufe der Lagerung bei 25 °C in ACD- und CD-Blut dargestellt. Von einem mittleren Ausgangswert von etwa 0,220 Mol ATP/Mol fällt der ATPGehalt nach 6 Tagen auf etwa 20% des Ausgangswertes. Auffällig ist die deutlich bessere Erhaltung von ATP im CD-Blut bei />H-Konstanthaltung bis zum 5. Tag der Konservierung. Sowohl im ACD- als auch im CD-Blut treten in den ersten 12 Std. zwischenzeitlich Anstiege über den Ausgangswert hinaus auf. Die Konzentrationen von zellulärem ADP und AMP fallen von Ausgangswerten um

pH 7,5 7A 7.3 7,2 7,1 7.0 SJ CT

6,7 S.S £.c

5.4

37T0124 8 12 Std.

1

2

3

4

S

S

7

Tage

Abb. 1. Veränderungen des extrazellulären und intrazellulären ^H-Wertes im Konservenblut bei 25 °C-Lagerung. ACD-Blut , CD-Blut , pHe •

Std.

Tage

Abb. 2. Verhalten der Adeninnukleotide im Konservenblut bei 25 °C-Lagerung. ACD-Blut , CD-Blut , ATP • , ADP AMP • 35»

534

G . MATTHES, D . STRAUSS

etwa 0,065 Mol ADP/Mol H b bzw. 0,025 Mol AMP/MolHb im Verlaufe der ersten 12 Std. stark ab, deutlicher ausgeprägt im ACD-Blut. Nachfolgend ist von diesem Zeitpunkt ab ein Anstieg der Konzentrationen von A D P und AMP zu beobachten bis zu einem Maximum am 3- Lagerungstag. Zwischen 4. und 5. Lagerungstag fallen die ADP-Konzentrationen auf Werte um 0,01 Mol ADP/Mol Hb ab. Der zelluläre 2,3-DPG-Spiegel fällt im ACD-Blut innerhalb des ersten Lagerungstages von Ausgangswerten um 1,3 Mol 2,3-DPG/Mol H b auf 0,15 Mol 2,3DPG/Mol Hb ab. I m CD-Blut ist der Abfall von 2,3-DPG verlangsamt, jedoch werden am zweiten Lagerungstag ebenfalls Werte um 0,15 Mol 2,3-DPG/Mol H b gemessen. Bemerkenswert ist, daß im CD-Blut erst nach 12 Std. ein verstärkter Abbau von 2 , 3 - D P G auftritt (Abb. 3).

1,5 -

Std.

Tage

Abb. 3. Verhalten der 2,3-DPG-Konzentrationen im Verlaufe der Lagerung bei 25 °C. ACD-Blut • CD-Blut A •

f Tu —J I 37°cm

8 12 Std.

l 1

I 2

J

I

S

4

1 5

1 6

L 1

Tage

Abb. 4. Veränderungen der Laktat- und Glukosekonzentration konservierter Erythrozyten im Verlaufe der Lagerung bei 25 °C. ACD-Blut , CD-Blut , Glukose A, Laktat •

Vollblutkonservierung bei 25 °C unter

pH-Konstanthaltung

535

Die Laktatkonzentrationen im CD- und ACD-Blut betragen am Anfang der Konservierung etwa 0,5 Mol Laktat/Mol Hb. Im Verlaufe der Lagerung steigen die zellulären Konzentrationen von Laktat nahezu linear im ACD-Blut auf Werte um i 2,4 Mol Laktat/Mol Hb an. Eine deutlich stärkere Laktatproduktion der Zellen ist im CD-Blut ab 1. Tag zu beobachten; am 5. Lagerungstag beträgt die Laktatkonzentration 16,5 Mol Laktat/Mol Hb. Vom 5. Tag der Konservierung an ist in beiden Konservenbluten ein Sistieren der Laktatproduktion zu sehen. Im Verhalten der Glukosekonzentrationen der Konservenblute ist entsprechend vergleichbar mit der Laktatproduktion ab 1. Tag der Lagerung ein stärkerer Abfall des Glukosespiegels im CD-Blut zu beobachten (Abb. 4). Diskussion

Durch den Abfall des pH-Wertes im Konservenblut ergeben sich im Verlaufe der Lagerung umfangreiche Veränderungen im Stoffwechsel der Erythrozyten, wobei besonders die Konzentrationsabnahme an zellulärem 2,3-DPG aus klinischer Sicht bedeutungsvoll ist (Aufrechterhaltung der 0 2 -Transportfunktion des Hämoglobins). Eine Konstanthaltung des pH-Wertes während der Lagerung sollte diesen Veränderungen entgegenwirken. Durch die Verwendung eines leicht alkalischen CD-Mediums (pH 7,4) als Stabilisatorlösung und der täglichen Einstellung des extrazellulären pH-Wertes auf 7,4 im Konservenblut wurde versucht, eine Aufrechterhaltung des zellulären 2,3-DPG zu erreichen. ACD-Blut diente als Kontrollwert und zum Vergleich. Ein neutraler oder leicht alkalischer pH-Wert des Konservenblutes hat auf die Erhaltung mit 2,3-DPG konservierter Erythrozyten deutlichen Einfluß. Verschiedene Autoren [1,2, 8—10] berichten über eine verbesserte Erhaltung von zellulärem 2,3-DPG in ACD- und CPD-Blut mit erhöhtem Ausgangs-^»H-Wert und führen dies auf eine verminderte Aktivität der DPGase sowie auf die Aktivierung von Schlüsselenzymen der Glykolyse (wie Hexokinase und Phosphofruktokinase) zurück. Wie in Abb. 3 ersichtlich ist, wird im CD-Blut durch tägliche ^H-Einstellung auf einen Ausgangswert von 7,4 bei 25 °C eine Erhaltung des 2,3-DPG der Zellen innerhalb der ersten 12 Std. der Lagerung möglich. Der nach diesem Zeitpunkt parallel zum ACD-Blut eintretende stärkere Abfall ist möglicherweise auf den pH-Abfall im Konservenblut zurückzuführen, da sowohl der intrazelluläre als auch der extrazelluläre^>H-Wert nach 12 Std. Werte um 7,2 erreicht hat und der intrazelluläre />H-Wert trotz täglicher ^>H-Einstellungen des Konservenblutes auf 7,4 im Verlaufe der Lagerung weiter abfällt. Die ^H-Konstanthaltung im CD-Blut hat einen deutlichen Einfluß auf die Stoffwechselaktivität der konservierten Erythrozyten im Gegensatz zum ACD-Blut. Vom ersten Tag der Lagerung an ist sowohl eine stärker ausgeprägte Laktatbildung als auch ein größerer Abfall der Glukosekonzentration zu beobachten. Vom 5. Lagerungstag an scheint ein Versiegen der Laktatproduktion und der Glukoseverwertung in beiden Konservenbluten vorzuliegen, die zumindest nicht für CD-Blut mit der fast vollständigen Hemmung der Glykolyse ab pH-Werten von 6,6 zu erklären sind [11], Parallel zu diesem Verhalten ist die Abnahme der ATP-Konzentration zum 6. Lagerungstag hin anzusehen. Veränderungen im Verhalten der Adeninnukleotide (ATP, ADP und AMP) sind besonders in der ersten Phase der Konservierung ersichtlich und als Adaptation

536

G . MATTHES, D . STRAUSS

an die in der Konserve vorliegenden Bedingungen aufzufassen. ATP-Anstiege über den Ausgangswert hinaus werden durch den schnellen Abfall des zellulären 2,3-DPG erklärlich (deutlicher ausgeprägt im ACD-Blut [12]). Die längere Erhaltung des zellulären ATP-Spiegels im CD-Blut mit />H-Konstanthaltung ist Vergleich mit ACD-Blut besonders zwischen dem 2. und 5- Lagerungstag ausgeprägt. An Hand der ermittelten Daten ist ersichtlich, daß sich durch die gewählte Methode zur Aufrechterhaltung des />H-Wertes auf 7,4 deutliche Unterschiede im Verhalten der gemessenen biochemischen Parameter ergeben, jedoch eine Aufrechterhaltung sowohl von ATP-Gehalt als auch 2,3-DPG-Konzentration der Zellen über den Lagerungzeitraum hinweg nicht möglich wird, da die Konzentrationen von 2,3-DPG bereits nach 12 Std. stark absinken. Literatur [1] D A W S O N , [2]

R. B., M. R.

L O K E N U. D .

H.

U. H . S C H M I T T :

Blut

Transfusion 12, 46 (1972) Milit. Med. 139, 3 0 0 ( 1 9 7 4 )

CRATER:

D A W S O N , R . B . , F . R . C A M P U. N . F . C O N T E :

[3]

KLEINE, N „

[4]

S T R A U S S , D . , S . T Ä N Z E R , F . S C H M U T Z L E R , L . G Ü L K E , H . P . R E T T I G , H . R O I G A S U. H .

8, 1 4 5

(1962) J.

Folia haemat., Lpz. 101, 243 (1974) [5] S T R A U S S , D. U. H. J. R A D E R E C H T : Folia haemat., Lpz. 101, 2 3 2 (1974) [6] B A R T E L , U., L . M A N I T Z , G . M A T T H E S U. F. W E B E R : Dissertation. Humboldt-Universität Berlin, Med. F a k u l t ä t 1974 [ 7 ] N Y G A A R D , S. F., U. M. R 0 R T H : Scand. J . clin. Lab. Invest. 24, 3 9 9 ( 1 9 6 9 ) [ 8 ] A S A K U R A , T . , Y . S A T O , S . M I N A K A M I U. H . Y O S H I K A W A : Clinica chim. Acta 14, 8 4 0 RADERECHT:

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[10] [11]

DAWSON,

Anschrift der Verfasser: Dr. G E R T M A T T H E S , Humboldt-Universität Berlin, Bereich Medizin (Charité), Abteilung f ü r Transfusions- und Transplantationswesen 104 Berlin, Schumannstr. 20/21 ; Dr. D O R O T H E A S T R A U S S , Bezirksinstitut für Blutspende- und Transfusionswesen Berlin, 113 Berlin, Atzpodienstraße 11 — 13

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 537 — 542 (1977) Bezirksinstitut für Blutspende- und Transfusionswesen, 113 Berlin, D D R

Einfluß von Bikarbonat auf den 2,3-DPG-Gehalt konservierter Erythrozyten V . STIGGE, E . SXIGGE u n d D .

SCHWANKE

Zusammenfassung ACD-AG-Vollblutkonserven (Hämatokritwert 36%) und Erythrozytenresuspensionen (Hämatokritwert 80%) wurden unter Zusatz von Bikarbonat bei 4 °C gelagert. Bei den Erythrozytenresuspensionen erfolgte gleichzeitig ein Zusatz von Xylit und anorganischem Phosphat. Die erythrozytäre 2,3-DPG-Konzentration wurde in Abhängigkeit von der Bikarbonatkonzentration in Vollblutkonserven länger erhalten. In Erythrozytenresuspensionen ist die E r h a l t u n g von 2,3-DPG darüber hinaus noch wesentlich verbessert. Aus den Ergebnissen und Literaturangaben wird geschlossen, daß Bikarbonat an Metabolite des Pentosestoffwechsels fixiert wird und somit direkt a m Stoffwechsel der E r y throzyten beteiligt ist. Die P r o d u k t e der Bikarbonatfixierung können den 2,3-DPG-Haushalt der E r y t h r o z y t e n beeinflussen. Einleitung

Die Bedeutung des 2,3-Diphosphoglyzerates (2,3-DPG) für die Sauerstofftransportfunktion des Hämoglobins hat zu Versuchen geführt, das schnelle Absinken der 2,3-DPG-Konzentration in den Erythrozyten während der Blutkonservierung zu verhindern. Durch geeignete Zusätze und p~K-Veränderungen sollte der Stoffwechsel der roten Blutzellen so beeinflußt werden, daß der Abbau des 2,3-DPG gehemmt und/oder die 2,3-DPG-Synthese gefördert werden. Insbesondere pYLErhöhungen, Zusätze von Pyruvat, Fruktose, Dihydroxyazeton und anderer Stoffe wurden erprobt. B E U T L E R und W O O D [1] versuchten mit Erfolg, durch Zusätze von Bikarbonat zu im Verhältnis 1 + 1 resuspendierten Erythrozyten eine positive Stoffwechselwirkung herbeizuführen. Sie benutzten C02-diffusible Plastebeutel zur Lagerung des Blutes und beobachteten starke 2,3-DPG-Veränderungen. Eine Pufferwirkung des leichtflüchtigen Kohlensäure-Bikarbonat-Systems in den Plastebeuteln wurde nicht ausgeschlossen. Material und Methodik E s wurden zwei Untersuchungskomplexe bearbeitet: A. Venenblut von fünf unausgewählten, klinisch gesunden Blutspendern wurde bei der A b n a h m e aus der Vena cubitalis in je fünf 120 ml-Blutkonservenflaschen mit den verschiedenen - Konservierungslösungen im Verhältnis 4 + 1 gemischt. Der H ä m a t o k r i t w e r t lag bei 36%. Bei den Konservierungslösungen handelte es sich um ACD-AG-Lösungen üblicher Zusammensetzung [2] mit unterschiedlichen Zusätzen von Bikarbonat. Durch Variation des Zitronensäure/Zitrat-Verhältnisses wurde vor der Sterilisation der ¿>H-Wert der Lösung so eingestellt, daß der Anfangs-^H-Wert in jedem Konservenblut — die Kontrolle ausgenommen — bei 7,4 lag.

538

V . STIGGE, E . STIGGE, D .

SCHWANKE

Tabelle 1 Zusammensetzung der in Versuch B verwendeten Lösungen Lösung Nr.

1

2

3

Saccharose Glukose Xylit Sorbit Na 3 -Zitrat NaHCO a Na2HP04 Adenin Guanosin

234 30

204 30 30

30 30

Anfangs-/>H

— —

—

9,5 —

—

—

9,5 —

—

—

—

2,5

2,5

2,5

2,5

6,99

7,07

4

—

—

30 30 —

100 25 2,5 2,5 7,32

100 25

2,5 2,5

7,40

Angaben in mMol/1 Resuspensionslösung B. Erythrozytenkonzentrate aus ÄDTA-Blutkonserven wurden sofort nach Abhebern des Plasmas zum Zwecke der Plasmafraktionierung auf vier 1 20 ml-Blutkonservenflaschen aufgeteilt und durch Zusatz der Resuspensionslösungen unterschiedlicher Zusammensetzung (Tab. 1) im Verhältnis 4 + 1 resuspendiert. Es resultierte ein Hämatokritwert von etwa 80%. Der Stichprobenumfang b e t r u g « = 3. Die Sterilisation aller verwendeten Lösungen erfolgte in Blutkonservenflaschen nach dem Verfahren a l [2]. Die Blutkonserven wurden bei 4 j ; 2 ° C über 6 Wochen gelagert. In wöchentlichen Abständen wurden nach gründlichem Mischen unter aseptischen Bedingungen Blutproben zur Untersuchung entnommen. Die £H-Messung wurde bei 25 °C mit einer Kapillarglaselektrode durchgeführt, die 2,3-DPGBestimmung nach dem modifizierten Verfahren von N Y G A A R D and R O R T H [ 3 ] im gekoppelten optischen Test [4]. Der methodische Fehler in der Serie lag bei 5%. Der 2,3-DPG-Gehalt wurde auf die Hämoglobinkonzentration bezogen. Die dazu erfoderliche Hämoglobinbestimmung erfolgte als Zyanmethämoglobin mit einem mittleren methodischen Fehler in der Serie von 2% [2]. Signifikanzberechnungen wurden f ü r die im Abschnitt A beschriebenen Untersuchungen mit dem ¿-Test, f ü r die im Abschnitt B mit dargestellten dem [/-Test durchgeführt. Zugrundegelegt wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % • Ergebnisse

Bei einem Anfangs-^)H-Wert von 7,0, wie er in üblichen ACD-AG-Blutkonserven besteht, fällt die erythrozytäre 2,3-DPG-Konzentration innerhalb von 2 Wochen Kältelagerung auf weniger als 5% der Anfangskonzentration ab. Bei Erhöhung des Anfangs-^H-Wertes auf 7,4 bleibt die 2,3-DPG-Konzentration für eine Woche vollständig erhalten. Ein Wert von 5% der Ausgangskonzentration wird erst nach 4 Wochen erreicht (Abb. i). In Abhängigkeit von der Bikarbonatkozentration in den Vollblutkonserven wird zusätzlich zu diesem ^>H-Effekt die 2,3-DPG-Erhaltung signifikant verlängert (Tab. 2). Die pH-Werte unterscheiden sich während der Lagerung in diesen Bluten nicht (Abb. 2). Im Falle der Erythrozytenresuspensionen mit einen Hämatokritwert von 80% sinkt die 2,3-DPG-Konzentration bei vergleichbaren Anfangs-/>H-Werten etwas langsamer als in Vollblutkonserven (Abb. 3)- Unter Zusatz von Xylit wird 2,3DPG darüber hinaus signifikant länger erhalten, was den Befunden in Vollblut

B i k a r b o n a t e i n f l u ß auf 2,3-DPG-Gehalt in E r y t h r o z y t e n

539

Tabelle 2 E r y t h r o z y t ä r e 2,3-DPG-Konzentration n a c h 2 Wochen 4 °CL a g e r u n g in ACD-AG-Vollblutkonserven in Abhängigkeit v o n der B i k a r b o n a t - E n d k o n z e n t r a t i o n i m B l u t bei einem Anfangs-/>H-Wert von 7,4 Nr. ^*

2 3 4 5

Bikarbonatkonzentration (mMol/1 Blut)

2,3-DPG-Konzentration (% des Ausgangswertes)

0 0 4 10 20

4 52 73 90 102

* = Kontrolle m i t A n f a n g s - ^ H v o n 7,0

Abb. 1. Abhängigkeit der 2,3-DPG-Konzentration im ACD-AG-Konservenblut v o n der B i k a r b o n a t k o n z e n t r a t i o n w ä h r e n d einer 4 °C-Lagerung ( i 4-_s\ n — 5). o N r . 1, A N r . 2, A N r . 3, • Nr. 4, • Nr. 5 (vgl. T a b . 2)

entspricht [5]. Gleichzeitiger Zusatz von Bikarbonat hat zusätzlich eine vollständige Erhaltung der 2,3-DPG-Konzentration bis zu 5 Lagerungswochen zur Folge. Diskussion

Nachdem schon 1 9 4 0 von SCUDDER und SMITH [6] und 1 9 6 1 von NASHAT et al. [7] bei der Aufbewahrung von Erythrozyten in C0 2 -Atmosphäre eine positive Beeinflussung einiger wichtiger Eigenschaften von Erythrozyten (Überlebensrate, Spontanhämolyse, Kationenaustausch) festgestellt wurde und nachdem durch Übertragung der Erkenntnisse von JAKOBY et al. [8] über die C0 2 -Fixierung in Pflanzen auf den ErythrozytenstoffWechsel durch FORTIER et al. [9] die Enzyme

540

V . STIGGE, E . S T I G G E , D . S C H W A N K E

Abb. 2

Abb. 3

Abb. 2. Verhalten des pH-Wertes in ACD-AG-Blutkonserven mit verschiedenen BikarbonatKonzentrationen ( 5 f s ; » i = 5 ) . Zeichenerklärung vgl. Abb. 1 Abb. 3. Verhalten der 2,3-DPG-Konzentration in Erythrozytenresuspensionen aus ÄDTABlut bei unterschiedlicher Zusammensetzung der Resuspensionslösungen während der 4 °CLagerung. O Nr. 1, • Nr. 2, A Nr. 3, • Nr. 4 (vgl. Tab. 1). n = 3

Phosphoribul'okinase und Ribulosediphosphatkarboxylase in Erythrozyten nachgewiesen wurden, konnte die Teilnahme von C0 2 am Stoffwechsel der roten Blutzellen wahrscheinlich gemacht werden. Nach J A K O B Y et al. [8] wird C0 2 /Bikarbonat an Ribulosediphosphat unter Bildung eines C6-Körpers fixiert, der schnell zu Glyzerinaldehydphosphat (GAP) und Phosphohydroxypyruvat zerfallen soll. Während GAP in der Glykolyse die Bereitstellung von 1,3-DPG für die 2,3-DPG-Bildung sichert, wird beim Umsatz von Phosphohydroxypyruvat zu 3-Phosphoglyzerat (3-PG) das in der Glykolyse entstehende NADH wieder oxydiert, so daß die Laktatbildung in den Erythrozyten unter diesen Bedingungen stark vermindert ist [9]. Der Einfluß dieser Reaktionen auf den NADH/NAD + -Quotienten und die Effektorwirkung des 3-PG auf den Diphosphoglyzerat-Zyklus könnten eine gesteigerte 2,3-DPG-Bildung und verminderten 2,3-DPG-Abbau zur Folge haben. Die signifikant verbesserte Erhaltung des 2,3-DPG unter Zusatz von Bikarbonat könnte durch diese Zusammenhänge verursacht sein. Xylit als Substrat für Erythrozyten kann nach Dehydrierung und Phosphorylierung zu Xylulose-5-phosphat die Bedingungen für eine C0 2 -Fixierung an Ribulosediphosphat verbessern helfen. In Gegenwart von Xylit kommt es in Erythro-

B i k a r b o n a t e i n f l u ß auf 2,3-DPG-Gehalt in E r y t h r o z y t e n

541

tenresuspensionen mit Zusatz von Bikarbonat zu wesentlich längerer Erhaltung der 2,3-DPG-Konzentration als in den xylitfreien, aber bikarbonathaltigen Vollblutkonserven. Einseits ist der Stoffwechsel des Xylit nicht so empfindlich gegen das im Konservenblut während der Lagerung absinkende pH, andererseits wird bei der Fixierung des Bikarbonats infolge des NADH-Verbrauchs durch Phosphohydroxypyruvat das beim Xylitabbau entstehende NADH oxydiert. NADH kann damit nicht den Umsatz des GAP zu 1,3-DPG behindern. Die wahrscheinliche Beteiligung des NADH/NAD+-Systems an den Stoffwechselprozessen zur Erhaltung des 2,3-DPG geht auch aus der veränderten Situation bei Ersatz der Glukose durch Sorbit hervor. Sorbit kann nur nach Dehydrierung am Erythrozytenstoffwechsel teilnehmen. Dabei in geringem Maße zusätzlich entstehendes NADH muß den NADH/NAD + -Quotienten verschieben. Da die LDH-Reaktion dann am NADH-Umsatz stärker beteiligt wird, erfolgt eine Beeinflussung der 3-PG-Konzentration, und die 1,3-DPG-Bildung wird möglicherweise durch leichten NAD + -Mangel in der GAPD-Reaktion gestört. Daraus resultiert eine verminderte 1,3-DPG-Bereitstellung für die 2,3-DPG-Bildung und eine geringere Effektorwirkung des 3-PG auf den Diphosphoglyzerat-Zyklus. Es ist zwar kein Anstieg des 2,3-DPG während der Lagerung wie beim Glukose/ Xylit-Umsatz, zu verzeichnen eine langfristige Erhaltung des 2,3-DPG beim Ausgangswert mit seinen positiven Auswirkungen auf die Sauerstofftransportfunktion des Hämoglobins kann aber trotzdem beobachtet werden. Den Erythrozytenresuspensionen wurde neben Bikarbonat gleichzeitig anorganisches Phosphat hinzugesetzt. Obwohl nach Untersuchungen von S C H W A N K E [10] ein Zusatz von Phosphat allein in der gewählten Konzentration (25 mol/1 Lösung = 5 mMol/1 Suspension) eine Verschlechterung der 2,3-DPG-Erhaltung verursacht, könnte in Gegenwart von Bikarbonat eine Phosphatsubstitution wegen des intensiveren Stoffwechsels für die GAPD-Reaktion möglicherweise sogar erforderlich werden und damit für optimale Bedingungen zur Erhaltung der 2,3-DPG-Konzentration über mehrere Wochen mitverantwortlich sein. Literatur [ 1 ] B E U T L E R , E . , U. L . A . W O O D : V O X sang. 2 0 , 4 0 3 ( 1 9 7 1 ) [2] Deutsches Arzneibuch der D D R 7. Aufl. Akademie-Verlag, Berlin 1968 [ 3 ] N Y G A A R D , S . F., U. M . R 0 R T H : S c a n d : J . clin. L a b . I n v e s t . 2 4 , 3 9 9 ( 1 9 6 9 ) [4] S T I G G E , E . : Dissertation. Akademie f ü r ärztlliche Fortbildung, Berlin 1976 [ 5 ] S T I G G E , V . , D. S T R A U S S , H . R O I G A S U. H . J . R A D E R E C H T : Dte. Gesundheits Wes. 2 8 , 1805 (1973) [6] S C U D D E R , J., U. S M . S M I T H : Cold Spring H a r b . Symp. q u a n t . Biol. 8, 269 (1940) [ 7 ] N A S H A T , F. S . , A. K. Y A S S I N u. S . S U B H I Y A H : Archs. int. P h a r m a c o d y n . Ther. 1 3 0 , 86 (1961) [8] J A K O B Y , W . B . , D. O. B R U M M O N D U. S. O C H O A : J . biol. Chem. 2 1 8 , 811 (1956) [ 9 ] F O R T I E R , N . L . , L . G A L L A N D U. F . J . L I O N E T T I : Archs. Biochem. Biophys. 1 1 9 , 6 9 (1967) [10] S C H W A N K E , D . : Ingenieur-Arbeit. Ingenieur-Schule f ü r Chemie, Berlin 1975

F ü r die A u t o r e n . Dr. V . S T I G G E , Bezirksinstitut f ü r Blutspende- u n d Transfusionswesen, 113 Berlin, D D R , Atzpodienstr. 11 — 13

542

V . STIGGE, E . STIGGE, D . SCHWANKE

Summary V. S T I G G E , E . S T I G G E , and D. S C H W A N K E : Effect 2,3-DPG of stored erythrocytes

of bicarbonate on the content of

Both whole blood in ACD-adenine-guanosine solution (PCV about 36%) and resuspensions of erythrocytes from EDTA-blood (PCV about 80%) were stored at 4 °C with an admixture of sodium bicarbonate. To the resuspensions simultaneously were added xylitol and inorganic phosphate. The erythrocyte concentration of 2,3-disphosphoglycerate in whole blood will be preserved the longer the more bicarbonate is added. Compared with whole blood in resuspensions of erythrocytes the preservation of 2,3-DPG is significantly prolonged, probably because xylitol was added. From these results and from literature data it is concluded that bicarbonate is fixed to metabolites of the pentose metabolism. The products of the fixation of bicarbonate may influence the 2,3-DPG metabolism of the erythrocytes.

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 543 — 548 (1977) Bezirksinstitut für Blutspende- und Transfusionswesen, 113 Berlin DDR, und Institut für Laboratoriumsdiagnostik im Städtischen Klinikum, 1115 Berlin-Buch, D D R

Verhalten von Lebensfähigkeit, ATP- und 2,3-DPG-Gehalt resuspendierter Erythrozyten während mehrwöchiger Kältelagerung 1 D.

STRAUSS, W .

MEURERund D .

DEKOWSKI

Zusammenfassung Die aus ACD- bzw. ACD-AG-(Adenin-Guanosin) Blut hergestellten leukozyten- und thrombozytenarmen Erythrozytenkonzentrate wurden durch Resuspendieren auf einen H ä m a t o k r i t von ca. 55% eingestellt und 6 Wochen bei 4 °C gelagert. Die Resuspensionslösung enthielt Xylit, anorganisches Phosphat, Bikarbonat, Adenin und Guanosin. In einer Variante wurde zusätzlich Glukose, Zitrat und Saccharose zugefügt, in einer weiteren zusätzlich Sorbit. I m Sorbit-Xylit-Medium blieben der 2,3-Diphosphoglyzerat- und ATP-Gehalt länger erhalten als im Glukose-Xylit-Medium. Alle resuspendierten Eythrozytenkonzentrate wiesen höhere ATP-Werte als nichtresuspendierte auf. Zusätze von Adenin und Guanosin bereits zum Ausgangsblut (ACD-AG-Blut) waren bezüglich des ATP-Gehaltes effektiver als spätere Zusätze mit der Resuspensionslösung. Resuspendierte Erythrozyten aus einem Glukose-Adenin-Guanosin-Medium, das gleichfalls Zitrat und Saccharose enthielt, h a t t e n nach 3 Wochen Lagerung eine f ü r therapeutische Zwecke ausreichend hohe Überlebensrate von 80 bis 85%Einleitung

Die klinischen Anforderungen an eine hochwertige Erythrozytensubstitution ohne Leukozyten- und Thrombozytenbeimengungen bei insgesamt nur geringer Kreislaufbelastung des Transfusionsempfängers durch extrazelluläre Flüssigkeitszufuhr können durch die gegenwärtig üblichen Erythrozytenkonzentrate mit einem Plasmarest und „buffy coat", teilweise mit Zusatz des gleichen Volumens einer zucker-zitrat-haltigen Resuspensionslösung nicht in ausreichendem Maße erfüllt werden. Ein wesentlicher Nachteil besteht vor allem im schnellen Abfall des 2,3-DPG-Gehaltes auf Werte unterhalb 20% des Normalgehaltes innerhalb von i —2 Wochen Lagerung, wodurch eine Sauerstoffmangelversorgung von Gewebe durch konservierte Erythrozyten insbesondere nach Massivtransfusionen mit 2,3-DPG-verarmten Erythrozyten auftreten kann. Ein weiterer Nachteil besteht in einem hohen Anteil lebensunfähiger Zellen bis zu 30% nach 3—6 Wochen Lagerung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Zusätze von Xylit, anorganischem Phosphat und Bikarbonat bzw. bei Ersatz der Glukose-Saccharose-Zitrat-Resuspensionslösung durch eine Sorbit-Xylit-Lösung bei gleichzeitiger Erhöhung des Anfangs-^ H-Wertes in der Zellsuspension den ATP- und 2,3-DPG-Gehalt während der Lagerung für einen längeren Zeitraum zu erhalten. ') Ergebnisse aus dem medizinischen Forschungsprojekt „Blut-Gewebe-Konservierung und -Typisierung" des Ministeriums für Gesundheitswesen der D D R

544

D . STRAUSS, W . M E U R E R , D . D E K O W S K I

Material und Methoden Aus irisch e n t n o m m e n e m Spenderblut, versetzt mit dem Humanzitratstabilisator m i t und ohne Adenin und Guanosin (2. AB-DDR) wurde ,,buffy coat"-freies E r y t h r o z y t e n k o n z e n t r a t hergestellt, portionisiert und m i t 1/5 Volumen Resuspensionslösung A bzw. B versetzt (Tab. 1). Lösung B wurde bereits von S T I G G E [1] zur Resuspension von E r y t h r o z y t e n k o n z e n t r a t aus Ä D T A - B l u t verwendet. Die pH-Werte der deplasmatisierten Zellkonzentrate betrugen 7,1. E s t r a t keine pH-Veränderung nach Zusatz der Resuspensionslösung auf. Die Lagerung der resuspendierten E r y t h r o z y t e n k o n z e n t r a t e erfolgte bei 4 °C. I n wöchentlichen Abständen wurden A T P (Test Combination der F i r m a Boehringer, Mannheim), 2,3D P G nach N Y G A A R D und R Ö R T H [2] und der Hämoglobingehalt b e s t i m m t sowie der ^ I I W e r t bei 25 °C gemessen. Die 24-Std. Überlebensrate von E r y t h r o z y t e n wurde an gesunden Versuchspersonen mit 51 Cr-markierten Zellen bestimmt. Die E r y t h r o z y t e n waren 3 bzw. 6 Wochen in 1/5 Volumen Resuspensionslösung (Endkonzentrationen in der Zellsuspension: Glukose 12, Adenin 0,5» Guanosin 0,5, Zitrat 2, Saccharose 47 mM) gelagert worden. Tabelle 1 Endkonzentrationen der Zusätze im resuspendierten E r y t h r o z y t e n k o n z e n t r a t Substanzen

Medium A (mM)

Glukose Xylit Sorbit Na2HP04 NaHC03

6 6

Medium B (mM)

Substanzen Adenin Guanosin Na 3 -Zitrat Saccharose

—

6 6 5 20

—

5 20

Medium A (mM)

Medium B (mM) 0,5 0,5

0,5 0,5 2 47

— —

Ergebnisse 2,3-DPG-Gehalt

Der 2,3-DPG-Gehalt in heparinisiertem Spenderblut betrug 1,03 ± 0,09 Mol/Mol Hb (n = 8). Beim Erythrozytenkonzentrat aus ACD-Blut deutete sich nach Mol PPG Mol Hb 1,2

i L 0,8 0,6 0,4 0,2

0

7

14

21

28

35

42 Tage

Abb. 1. Verhalten des 2,3-DPG-Gehalts resuspendierter E r y t h r o z y t e n aus ACD-Blut während der Lagerung bei 4 CC in Lösung A bzw. B. (x -¡- s, n = 4). O O Erythrozytenkonzentrat, A A resuspendierte E r y t h r o z y t e n in Lösung A, • • resuspendierte E r y t h r o z y t e n in Lösung B, Normalwert x

ATP- und 2,3-DPG-Gehalt in Erythrozytenkonserven

545

Mol PPG Mo! Hb

Abb. 2. Verhalten des 2,3-DPG-Gehalts resuspendierter Erythrozyten aus ACD-AG-Blut während der Lagerung bei 4 °C in Lösung A bzw. B (Erläuterungen s. Abb. 1)

Resuspension mit Lösung B eine verbesserte 2,3-DPG-Erhaltung an (Abb. 1), die jedoch nur am 28. Lagerungstag signifikante Unterschiede (p < 0,05) gegenüber nicht resuspendiertem Zellkonzentrat und Resuspensionsmedium A aufwies. Wurden Erythrozytenkonzentrate aus ACD-AG-Blut hergestellt, trat der bei Konzentraten aus ACD-Blut beobachtete Anfangsverlust im 2,3-DPG-Gehalt bei der Herstellung der Zellkonzentrate nicht auf. Während der 1. Lagerungswoche betrug der Abfall nur 10—20%, im Konzentrat aus ACD-Blut jedoch 40 bis 50% vom Normalwert (Abb. 2). Im Resuspensionsmedium B blieb der 2,3DPG-Gehalt während der 1. Lagerungswoche auf dem Ausgangswert erhalten, nach 2 Wochen lagen noch 60% vor. Die Unterschiede zu Medium A sind signifikant (p < 0,05). ATP-Gehalt Der ATP-Gehalt im heparinisierten Spenderblut betrug 0,23 ± 0,05 Mol/Mol H b (n = 8). In den resuspendierten Erythrozytenkonzentrataten aus ACD-Blut wurden während des gesamten Lagerungszeitraumes signifikant höhere ATPKonzentrationen als in nicht resuspendierten gemessen. Die Maximalwerte am 7- Lagerungstag betrugen 140% des Ausgangswertes (Abb. 3). Signifikante Unterschiede (p 0,1) im ATP-Verhalten zwischen den geprüften Varianten A und B traten bei resuspendierten Konzentraten aus ACD-AG-Blut am 14. Lagerungstag auf (Abb. 4). Überlebensrate Nach 3 Wochen Lagerung betrug die Überlebensrate von Erythrozyten aus einem in Glukose-Saccharose-Zitrat-AG-Medium resuspendierten Konzentrat 82 ± 2% (n = 5), nach 6 Wochen Lagerung 77 ± 7% (n = 5).

546

D . STRAUSS, W . M E U R E R , D .

DEKOWSKI

Mol ATP Mol Hb

Abb. 3. Verhalten des ATP-Gehalts resuspendierter Erythrozyten aus ACD-Blut während der Lagerung bei 4 °C in Lösung A bzw. B. (Erläuterungen s. Abb. 1) Mol ATP Mol Hb

Abb. 4. Verhalten des ATP-Gehalts resuspendierter Erythrozyten aus ACD-AG-Blut während der Lagerung bei 4 °C in Lösung A bzw. B. Diskussion

Bei der Optimierung der Konservierungslösung für Erythrozyten sind eine Reihe von Faktoren zu berücksichtigen, wie geringe Verdünnung des Zellkonzentrates, Sterilisierbarkeit der Lösung unter Hitzeeinwirkung ohne Karamelisierung, Ver-

ATP- und 2,3-DPG-Gehalt in Erythrozytenkonserven

547

träglichkeit der zugesetzten Substanzen, da ein Entfernen der Resuspensionslösung vor der Transfusion unter den derzeitigen Bedingungen in der Praxis kaum möglich ist [3]. Daraus leiten sich u. a. die Bemühungen um den Ersatz von karamelisierenden Zuckern in einer neutralen Konservierungslösung durch nichtkaramelisierende Zuckeralkohole bzw. andere Substrate der Glykolyse des Erythrozyten ab. Dabei kann gleichzeitig der Nachteil einer verminderten Glukoseverwertung während der Lagerung infolge des ^>H-Abfalls umgangen werden. Bei der Zusammenstellung der in dieser Arbeit verwendeten Resuspensionslösungen wurde von verschiedenen Überlegungen ausgegangen. Über die Verwendung von Xylit und Sorbit als Substrate für die Erythrozytenglykolyse unter Konservierungsbedingungen lagen bereits Ergebnisse vor [1,4—6]. Der 2,3-DPGGehalt konnte mit diesen Substraten im Vergleich zur Glukose länger erhalten werden. Gleichzeitiger Zusatz von Pyruvat zur Erhöhung des NAD/NADH + Quotienten zu Beginn der Lagerung erhöht diesen Effekt [7—9].. Zusatz von Bikarbonat ließ einen erhöhten 2,3-DPG-Gehalt auf Grund der von E. STIGGE [1] und V. STIGGE et al. [10] diskutierten C0 2 -Fixierung an Metabolite des oxydativen Pentosephosphatweges erwarten. Die gewählte niedrige Konzentration von anorganischem Phosphat im Konservierungsmedium (5 mM) zielte ebenso wie Adenin- und Guanosinzusätze auf einen erhöhten ATP-Gehalt während der Lagerung hin. Anorganisches Phosphat erhöht einerseits das Trioseangebot durch eine Aktivierung der Phosphofruktokinase, andererseits auch die 1,3-DPG-Bildung als Reaktionspartner der GADPH-Reaktion. Ein Einfluß auf die phosphorolytische Spaltung des Guanosins ist ebenfalls gegeben. Die Kombination von Xylit, Sorbit, Phosphat, Bikarbonat, Adenin und Guanosin (Medium B) im Konservierungsmedium ließ einen deutlichen Effekt auf den ATP-Gehalt erkennen, weniger stark ausgeprägt war er auf den 2,3-DPG-Gehalt. D a bei den vorliegenden Untersuchungen der Anfangs-/) H im resuspendierten Erythrozytenkonzentrat nur bei 7,1 lag, blieben die zu erwartenden stärker ausgeprägten Effekte auf den 2,3-DPG-Gehalt aus. STIGGE [1] fand bei einem höheren Anfangs-/>H von 7,3 noch nach 5 Wochen Lagerung resuspendierter Erythrozyten aus ÄDTA-Blut in der von uns mit B bezeichneten Lösung 2,3-DPGWerte von 80% des Normalwertes. Aus den vorliegenden Ergebnissen ist eine Überlegenheit der Sorbit-Xylit-Lösung gegenüber der Glukose-Xylit-Lösung — alle anderen Zusätze waren in Art und Konzentration gleich — sowohl im ATP- wie auch im 2,3-DPG-Verhalten zu erkennen. Der positive Effekt des Sorbits könnte durch eine erhöhte Triosebildung aus Sorbit über Fruktose, Fruktose-1-phosphat und Dihydroxyazetonphosphat zusätzlich zur Bildung aus Xylit erklärt werden, insbesondere bei erniedrigtem />H-Wert, wenn das Hexokinase-Phosphofruktokinase-System gehemmt ist. Der Vorzug der hier gepüften Resuspensionslösungen gegenüber der bisher in der Praxis verwendeten Lösung — Glukose-Saccharose-Zitrat-AG — bei großer Verdünnung läßt sich aus den Überlebensraten ableiten. Der gefundene Anteil von 20—30% lebensunfähiger Erythrozyten entsprach einem Verlust bis zu 50% der ATP-Konzentration. Die neue Xylit-Sorbit-Lösung mit den beschriebenen Zusätzen gewährleistete eine ATP-Erhaltung auf dem Ausgangsniveau und dar36

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 3 - 4

548

D . STRAUSS, W . M E U R E R , D . D E K O W S K I

über während der ersten 3 Lagerungswochen und einen Abfall bis zur 6. Woche um nur 25%, woraus auf eine hohe Überlebensrate über 80% zu schließen ist. Aus den vorliegenden Ergebnissen ist zu schlußfolgern, daß die gewählte Zusammensetzung der Resuspensionslösung für Erythrozytenkonzentrat, die die bisherigen Erkenntnisse über den Stoffwechsel von Erythrozyten unter Konservierungsbedingungen — Adeninnukleotidverhalten, Anteil von Glukoseumsatz über den oxydativen Pentosephosphatweg, Regulation des 2,3-DPG-Zyklus — berücksichtigen, Vorteile für die Erhaltung von Lebensfähigkeit und Sauerstoff transportfunktion der Erythrozyten beinhaltet, jedoch ein optimal erscheinender Anfang-/>H- von 7,3 bis 7,4 die Vorteile noch verstärken kann. Literatur Dissertation. Akademie f ü r Ärztliche Fortbildung, Berlin 1 9 7 6 [2] NYGAARD, S. F., U. M. RÖRTH: Scand. J. clin. Lab. Invest. 24, 299 (1969) [ 3 ] STRAUSS, D . : Probl. H ä m a t . Transfus. Transplant. 2, 8 ( 1 9 7 4 / 7 5 ) [ 4 ] A S A K U R A , T . , H . N I N O M I Y A , S. M I N A K A M I U. H . Y O S H I K A W A in: International Symposium on Metabolism, Physiolgy, and Clinical Use of Pentoses and Pentitols, Hakone, Japan, 1 9 6 7 . B. L . H O R E C K E R , K . L A N G U. Y. T A K A G I (Hrsg.) Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 1969, S. 158 [5] STIGGE, V . , D . S T R A U S S , H. R O I G A S U. H. J. R A D E R E C H T : Dte. GesundheitsWes. 28, 1850 (1973) [6] L U N , A., V. STIGGE, S . Z I E M E R , D. STRAUSS U. H. J . R A D E R E C H T : Folia haemat., Lpz. 102, 335 (1975) [7] P A N I K E R , N . V . , u. E . B E U T L E R : J . Lab. clin. Med. 7 8 , 4 7 2 ( 1 9 7 1 ) [8] D E U T I C K E , B . , J . D U H M U. R . D I E R K E S M A N N : Pflügers Arch. ges. Physiol. 326, 1 5 ( 1 9 7 1 ) [9] STIGGE, V., A. L U N , S . Z I E M E R , D. STRAUSS U. H. J. R A D E R E C H T : Folia haemot., Lpz. 101, 256 (1974) [ 1 ] STIGGE, E . :

[10]

STIGGE,

V., E.

S T I G G E U.

D.

SCHWANKE:

Acta biol. med. germ. 36,

537

(1977)

Summary and D . D E K O W S K I : Survival, A T P , and 2 , 3 - D P G content of resuspended erythrocytes during storage a t 4 °C. Leukocyte- and thrombocyte-poor packed red cells obtained from ACD or. ACD-AG blood were resuspended to a hematocrit of about 55% and stored a t 4 °C. The resuspension solution consisted of xylitol, inorganic phosphate, bicarbonate, adenine (A) and guanosine (G) solved in water. In one case glucose, citrate and sucrose were also added, in another one, sorbitol. The 2,3-DPG and t h e A T P level remained for a longer period in t h e sorbitol-xylitol-medium t h a n in t h e glucose-xylitol-medium. The A T P content in t h e red cell suspension was higher t h a n in packed cells. Higher A T P values were obtained in red blood cells from whole blood with adenine and guanosine. The survival rate of resuspended red blood cells in glucose-AG-citrate-sucrose medium was about 80 — 85% after 3 weeks of storage and 77% after 6 weeks with a higher range. D . STRAUSS, W . M E U R E R ,

Acta biol. med. germ., Band. 36, Seite 549 — 553 (1977) Bezirksinstitut für Blutspende- und Transfusionswesen, 113 Berlin, D D R

Verhalten von Adeninnukleotiden im Konservenblut mit Adeninund Guanosinzusätzen V . STIGGE u n d B .

SEIDEL

Zusammenfassung Unter üblichen Lagerungsbedingungen wurde ACD-Konservenblut mit Adenin, Guanosin und beiden Purinderivaten gleichzeitig substituiert. In wöchentlichen Abständen wurden die Konzentrationen von ATP, A D P und AMP bestimmt. Aus den gewonnenen Werten ergibt sich die Schlußfolgerung daß die Substitution des Konservenblutes mit Adenin und Guanosin wahrscheinlich zu einer Synthese aller drei Adeninnukleotide führt. Die scheinbare additive Wirkung von Guanosin und Adenin auf die ATP-Konzentration muß wahrscheinlich wegen der gleichzeitigen Erfassung von GTP auf die Unspezifität der ATP-Bestimmungsmethode zurückgeführt werden. GTP hätte dann Bedeutung f ü r die Überlebensrate von Erythrozyten, die in ACD-AG-Konservierungslösung gelagert wurden. Einleitung

Die ACD-AG-Konservierungslösung für Blut wurde in der gesamten DDR eingeführt, nachdem in umfangreichen Untersuchungen die "\yirksamkeit der Purinzusätze auf den Stoffwechsel der Erythrozyten überprüft worden war. Durch den Zusatz von Adenin und Guanosin zur ACD-Konservierungslösung konnte die Lagerdauer von Konservenblut bei 4 °C von bisher 3 Wochen auf 6 Wochen verlängert werden, was den Blutkonservendepots bedeutende Vorteile bietet. Darüber hinaus konnte durch die Zusätze eine wesentliche qualitative Verbesserung des Konservenblutes insbesondere in den ersten Tagen und Wochen der Lagerung erzielt werden. Die Zusätze Adenin und Guanosin bewirken eine signifikant verbesserte Erhaltung der ATP-Konzentration der konservierten Zellen [1]. Die Konzentration des zellulären ATP korreliert unter bestimmten Bedingungen über einen längeren Zeitraum eng mit der Überlebensrate der Erythrozyten im Empfängerorganismus [2]Diese 24-Std.-Überlebensrate wird durch den Adeninzusatz signifikant verbessert. Gleichzeitiger Zusatz von Guanosin führt zu weiterer signifikanter Verbesserung der Überlebensrate [3]. Ziel der vorliegenden Untersuchungen soll es sein, über die Wirkungsweise der Purinzusätze (Synthesesteigerung oder Abbauhemmung der Adeninnukleotide), über deren Einfluß auf die Konzentration der einzelnen Adeninnukleotide und über den Anteil des Guanosins an diesen Wirkungen weitere Kenntnisse zu erlangen. 36»

550

V . STIGGE, B . S E I D E L

Material und Methodik Das Spenderblut wurde unmittelbar bei der Abnahme aus der Y. cubitalis klinisch gesunder Spender in vier 120 ml-Blutkonservenflaschen eingeleitet. In den Blutkonservenflaschen wurden die Konservierungslösungen ACD, ACD-A, ACD-G und ACD-AG vorgelegt. Die Sterilisation der Lösungen erfolgte nach dem Verfahren a l des D A B 7-DDR. Die Mischung des Blutes mit den Konservierungslösungen wurde im Verhältnis 4 + 1 vorgenommen, so daß Adenin- und Guanosinendkonzentrationen von je 0,5mMol/l Blut resultierten. Den Erythrozyten standen damit umgerechnet etwa 300 mMol jedes Purinderivates pro Mol Hämoglobin zur Verfügung. Die Lagerung des Konservenblutes erfolgte bei 4 i 2 °C über 7 Wochen. Der Stichprobenumfang betrug jeweils n = 10. I n wöchentlichen Abständen wurden aus den Konservenflaschen nach gründlichem Mischen unter aseptischen Bedingungen Blutproben zur Untersuchung entnommen. Die Bestimmung der ATP-Konzentration erfolgte mit der Test-Combination der Firma Boehringer, Mannheim, im gekoppelten optischen Test. PP IC

3-PG + A T P * 1,3-DPG + N A D H + H+ < GAP H-Wert ist. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurde bei pH 7,2 für Kontrolltiere ein ATP-Spiegel von 1350 fxM (n = 5) und für Mg-Mangelratten von 1030 ¡xM (n = 6) bestimmt; bei pH 8,2 betrugen die (n = 5) ATP. entsprechenden Werte 471 ^M (n = 5) bzw. 227 Die Glykolyserate ist sowohl bei pH 7,2 als auch bei pH 8,2 um 40—50% vermindert. Die pH-Abhängigkeit der Glykolyserate bleibt dabei voll erhalten ebenso wie die Aktivierbarkeit der Glykolyse durch Phosphat. Abb. 2. zeigt eine zusammenfassende Darstellung der prozentualen Konzentrationsveränderungen der Glykolysemetabolite und der Glykolyserate bei p H 7,2 und pH 8,2. Die Ergebnisse der Metabolitbestimmungen sind in Übereinstimmung mit der Arbeitshypothese, daß die Glykolyserate im Mg-Mangel durch

590

G . JACOBASCH, CH. GERTH, P . - G .

FABRICIUS

1300

1"

1700

¿$1500 1300 QJ100

300 700 40 Hämatokrit

Abb. 1

45

13-DPG\ 2-PG \ Pyr Laktatbildung 3-PG PEP DOAP GAP Abb. 2

Abb. 1. Wechselbeziehungen zwischen Hämatokritwert und ATP-Spiegel im Vollblut von R a t t e n im Magnesiummangel Abb. 2. Prozentuale Änderungen der Glykolyserate und der Metabolitkonzentrationen von roten Blutzellen der R a t t e im Magnesiummangel. Die Bestimmungen wurden nach 60minütiger Inkubation der Zellsuspensionen bei pH 7,2 (o) und pH 8,2 (•) bei 37 °C durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit denen entsprechender Kontrollversuche verglichen

eine Hemmung des HK-PFK-Systems gedrosselt ist. Das beweist die Abnahme des Hexose- und Triosephosphatspiegels. In Abhängigkeit vom ^H-Wert treten für Pyruvat entgegengesetzte Konzentrationsverhältnisse auf. Bei _/>H 8,2 wurde in Übereinstimmung zur Abnahme des Triosephosphatspiegels und als Ausdruck eines verminderten NADH/NAD-Quotienten ein Pyruvatanstieg festgestellt. Der Abfall des Pyruvatspiegels bei p H 7,2 ist dagegen ebenso wie im Vollblut nur deutbar, wenn N A D H durch außerhalb der Glykolyse ablaufender Prozesse oxydiert wird. Die 2,3-DPG-Synthese zeigt eine lineare Abhängigkeit zum 1,3-DPG, dessen Höhe weitgehend durch den ATP/ADP-Quotienten bestimmt wird. Unter der Annahme eines thermodynamischen Gleichgewichtes der Phosphoglyzeratkinasereaktion leitet sich unter Mg-Mangelbedingungen ein Anstieg des 3-PG/l,3"DPG-Quotienten ab. Diese Schlußfolgerung ist in Übereinstimmung mit den analysierten 3-PG- und 1,3-DPG-Konzentrationen. Eine Reihe von Beobachtungen sprechen dafür, daß die freie Mg-Konzentration der Zelle unter normalen Bedingungen weitgehend konstant gehalten wird. In diesem Zusammenhang kommt der Adenylatkinase eine Art Pufferwirkung zu. Das Enzym, das eine Gleichgewichtsreaktion katalysiert, zeigt eine hohe Enzymkapazität und große Unterschiede in den Dissoziationskonstanten der Mg-Kom-

Magnesiumabhängigkeit der Glykolyse

591

tAK OA 0,3 0,2

Abb. 3. Abhängigkeit des Massenwirkungsquotienten der Adenylatkinase (AK) vom MgSpiegel roter Blutzellen der Ratte im Vollblut

0,1 0

1

1 1 i 1 1 i

/

3. 4

5 6 7 8 3 10 Mg** (mval/StdA Zellen)

plexe [12, 13]. Die in Abb. 3 dargestellten Befunde bestätigen erwartungsgemäß den linearen Abfall des Massenwirkungsquotienten der Adenylatkinase mit steigender Mg-Konzentration. Der Einfluß des Mg-Mangels auf den freien Mg-Spiegel sowie einige freie und Mgkomplexierte Metabolitkonzentrationen wurde anhand einer Berechnung geprüft. Berücksichtigt wurden für das Rechenprogramm 2,3-DPG, ATP, ADP, AMP, P E P und Mg. Hb wurde als Ligand vernachlässigt. Für die entsprechenden Dissoziationskonstanten wurden Literatur angaben verwendet [12—15]. Tab. 2 zeigt die Ergebnisse der durchgeführten Berechnungen für Zellsuspensionen bei 3 Werten. Die Ergebnisse lassen folgende Schlußfolgerungen zu. Die Abnahme der freien Mg-Konzentrationen roter Blutzellen ist im Mg-Mangel auf Grund der Abnahme des ATP- und 2,3-DPG-Spiegels geringer als die des Gesamt-Mg. Die Konzentration der MgATP- und MgADP-Komplexe ist dagegen unter Mangelbedingungen stark vermindert. Der freie ATP-Spiegel ist bei pH 7,2 und 8,2 im Vergleich zu Kontrollwerten leicht erhöht. Tabelle 2 Analyse Mg-komplexierter und freier Metabolitkonzentration roter Blutzellen der Ratte Bedingungen pH 7,2 Kontr. Mg 4, pH 8,2 Kontr. Mg| pH 8,4 Kontr. Mg^

Mg

Mg

ATP

| MgATPl ATP

ADP

MgADP

DPG

MgDPG

132 52 319 145 229 70

13 600 8120 16000 9600 16000 9600

2981 1073 5129 2176 4810 2038

|j.Mol/l Zellwasser 5420 2692 6980 3504 6115 2705

468 255 684 435 627 391

2160 1758 930 873 494 236

1840 1316 841 737 442 199

320 443 89 136 52 37

360 218 653 359 497 198

Für die Berechnungen wurden folgende Metabolite berücksichtigt: ATP, ADP, AMP, 2,3DPG, P E P

Die durchgeführten Modelluntersuchungen an Hämolysaten sind als eine Ergänzung zu den tierexperimentellen Arbeiten aufzufassen. Da sie an weitgehend einheitlichen Zellpopulationen durchgeführt wurden, sind reifungsbedingte Stoffwechseleinflüsse auszuschließen. Ein weiterer Vorteil dieses Systems bestand darin, daß zeitliche Verlaufsstudien bei definierten Mg-Konzentrationen

592

G . JACOBASCH, C H . G E R T H , P . - G . F A B R I C I U S

möglich waren. Die in Tab. 3 zusammengefaßten Ergebnisse der Hämolysatversuche bei Variation des Mg-Spiegels bestätigen die im Tierexperiment erhobenen Befunde. Eine Verringerung des Mg-Spiegels unter 19 [¿Mol/g Hb bewirkt eine deutliche Hemmung der Glykolyse. Das Verhalten der Adeninnukleotidkonzentrationen läßt folgende Schlußfolgerungen zu. Die Senkung des MgSpiegels bewirkt eine Abnahme des ATP- und Zunahme des ADP- und AMPSpiegels. Der Anstieg der ADP- und AMP-Konzentrationen wird von dem einsetzenden Adeninnukleotidabbau überlagert. Wird die Glykolyserate durch Senkung des Mg-Spiegels auf mehr als 1 /4 gedrosselt, kommt es zu einem steilen Abfall der ATP-Spiegel und zu einer Erhöhung der Abbaurate der Adeninnukleotide. Die tiefen Adeninnukleotidkonzentrationen von Mg-Mangelzellen sind somit als das Ergebnis einer gesteigerten Abbaurate und nicht als Folge einer gehemmten Adeninnukleotidsynthese aufzufassen. Tabelle 3 Verhalten des glykolytischen Stoffwechsels bei Senkung der Magnesiumkonzentration im Hämolysat Adeninnukleotide

ATP

ADP

AMP

Glu-6-P

Mg++ (¡xMol/g Hb)

Laktat (mMol/g H b • Std.)

44 19 9

7,2 7,0 6,0

6438 6296 5873

5660 5240 4775

288 490 612

490 566 486

463

5,2 5,0 2,0 0,6 0,2

5815 401S 4357 2736 1095

4460 2682 2350 488 500

808 750 1185 773 317

547 583 822 1475 278

146 187 167 45

Chelating Resin A1 55 nl/g H b 110 200 250 500

PEP

((xMol/g Hb)

5

—

244

—

316 349 369

432 548 555 1261 830

Die Inkubationszeit betrug 90 min bei pH 7,4 und 37 °C.

Die Abnahme des Gluc-6-P- und der kontinuierliche Anstieg des PEP-Spiegels mit fortschreitender Senkung des Mg-Spiegels entsprechen, auf Grund der gehemmten Glukosephosphorylierung durch die Hexokinase und der drastischen Senkung der MgADP-Konzentration als Reaktionspartner der Pyruvatkinasereaktion, den Erwartungen. Andererseits konnte im Hämolysat im Gegensatz zu den tierexperimentellen Befunden an intakten Zellen keine Abnahme des 2,3DPG-Spiegels im Mg-Mangel festgestellt werden. Offensichtlich ist auch ohne Verringerung des Mg-Spiegels, allein durch Senkung des Wertes der 2,3-DPG-Abbau im Hämolysat nicht wie in intakten Zellen aktivierbar. Das Hämolysatsystem zeigte für Kontrollansätze über mehr als 4 Std. eine nahezu gleichbleibende Glykolyserate und konstante Metabolitkonzentrationen, d. h. ATP-bildende und verbrauchende Reaktionen befanden sich in einem annähernden Fließgleichgewicht. Die Überprüfung zeitabhängiger Prozesse unter den Bedingungen des Mg-Mangels war deshalb in diesem System möglich. Abb. 4 zeigt

Magnesiumabhängigkeit der Glykolyse

593

Abb. 4. Verhalten der Laktatbildung und der Metabolitkonzentrationen bei Senkung des Mg-Spiegels in Abhängigkeit von der Zeit. Die Verminderung des Mg-Spiegels wurde durch Zusatz von 220 [il „chelating resin A / ' / g H b bewirkt. Die Inkubation des Hämolysates erfolgte bei 37 °C, p H 7,4. Laktatbildung • • ; Adeninnukleotide • — • ; ATP • — x — • ; ADP a A; Gluc-6-Po— o ; AMP • •; PEP A •

das Verhalten der Laktatbildung und einiger Metabolitkonzentrationen bei Senkung des Mg-Spiegels durch Zusatz von 220 jj.1 „chelating resin A / ' im Verlaufe von 4 Std. Die Ergebnisse verdeutlichen, daß nach Zugabe des Komplexbildners sowohl die Senkung des ATP-Spiegels als auch die Hemmung der Glykolyse mit der Inkubationszeit zunehmen. Das bedeutet, daß die Imbalance zwischen ATP verbrauchenden und ATP bildenden Reaktionen verstärkt wird, die schließlich zum Zusammenbruch des Energiestoffwechsels führt. Der aus dem ATPDefizit resultierende ADP- und AMP-Anstieg erreicht dagegen schon nach 1 Std. ein Optimum, denn durch den Adenninnukleotidabbau wird das AMP auf einen höhereren, nahezu konstanten Wert eingestellt, während der ADP-Spiegel wieder auf Werte im Normbereich abfällt. Der kontinuierliche Anstieg des PEP-Spiegels ist ein Hinweis für eine zunehmende Hemmung der PK-Reaktion. Diskussion

Die Bedeutung des Mg als essentieller Faktor der Glykolyse ist durch zahlreiche experimentelle Daten belegt [1—4]. Dabei treten 3 Reaktionsmöglichkeiten auf: 1. eine Enzymaktivierung durch Mg++, wie sie für die Hexokinase und Pyruvatkinase bekannt ist [16, 17], 2. Mg++ als Ligand von Substraten, Produkten und Effektoren und 3- ein Hemmeffekt, wie er in höheren Mg-Konzentrationen für eine Reihe Mg-abhängiger Enzyme beschrieben wurde.

594

G . JACOBASCH, CH. GERTH, P . - G .

FABRICIUS

Für die Interpretation der durch den Mg-Mangel bedingten Störungen des Energiestoffwechsels kommt nur den ersten beiden Wirkungsmechanismen eine größere Bedeutung zu. Aus der Mehrpunktkontrolle des glykolytischen Stoffwechsels leiten sich 3 Mg-abhängige Reaktionen, die sich thermodynamisch nicht im Gleichim Gleichgewicht befinden, -die Hexokinase, Phosphofruktokinase und Pyruvatkinase-, als Angriffsorte für die im Mg-Mangel auftretenden Glykolysehemmung ab [1], Da unter normalen Bedingungen nur die HK- und PFK-Reaktion für die Glykolyserate bestimmend sind [18], wurden zunächst die Kontrollstärken dieser beiden Enzyme berechnet. Die Werte stimmen für Zellsuspensionen bei pH 7,2 und 8,2 mit denen der Kontrolltiere überein, das bedeutet, daß im Mg-Mangel das HK-PFK-Kontrollsystem der Glykolyse als Ganzes beeinflußt wird und keine isolierte Hemmung an einem der beiden Kontrollenzyme auftritt. Aus der Analyse der Mg-Komplexe und der freien Metabolitkonzentrationen (Tab. 2) leitet sich folgende Interpretation für die Hemmung des HK-PFK-Systems ab. Der tiefe Mg-Spiegel bewirkt eine partielle Hemmung der HK, die durch die Verminderung des MgATP-Spiegels noch verstärkt wird. Die P F K wird dagegen durch die auftretenden Konzentrationsveränderungen des freien Mg++ und MgATP nicht direkt beeinflußt, da der MgATP-Spiegel noch im Sättigungsbereich des Enzyms liegt und eine Aktivierung der P K F durch freies Mg ++ nicht nachweisbar ist [19]- Die Hemmung der P F K resultiert aus der Verringerung des Fru6-P-Spiegels.als Ergebnis der gedrosselten HK-Aktivität, denn die starke ATPHemmung der P F K roter Blutzellen ist kompetitiv zu Fru-6-P [1]. Da der freie ATP-Spiegel unter Mg-Ma.ngelbedingungen sogar noch ansteigt, wird auf diese Weise die Hemmung der P F K durch ATP erhöht. Die Ursache für den bei pH 8,2 und 8,4 im Vergleich zu pH 7,2 größeren ATP-Abfall (Tab. 2) ist durch den im alkalischen Bereich gesteigerten Energiebedarf der roten Blutzelle zur Aufrechterhaltung von membranabhängigen Funktionen bedingt. Der festgestellte Konzentrationsanstieg des P E P im Mg-Mangel (Tab. 1 und 3, Abb. 2) wirft die Frage auf, ob die PK als Mg-abhängiges Enzym unter diesen Bedingungen eine Bedeutung für die Kontrolle der Glykolyserate hat. Eine Berechnung zeigt, daß die Zunahme des PEP-Spiegels nicht der Ausdruck einer größeren Kontrollstärke dieses Enzyms ist, sondern sich aus dem tiefen MgADPund Mg-Spiegel ableitet. Als einzige Energiereserve bei Flux-Verminderungen der Glykolyse steht dem Erythrozyten das 2,3-DPG zur Verfügung. Eine Abnahme des 2,3-DPG-Spiegels, die prozentual immer geringer als die des ATP ist, tritt erst dann auf, wenn bereits ein deutlicher Abbau der Adeninnukleotide nachweisbar ist [4]. Mit der Verringerung des 2,3-DPG-Spiegels ist nicht nur ein begrenzter Energiegewinn verbunden, sondern auch eine Abschwächung der 2,3-DPG-Hemmung der Kinasen, insbesondere der der H K und P F K [1], Da ATP und 2,3-DPG die wichtigsten Mg-Puffer des Erythrozyten sind — sie binden unter physiologischen Bedingungen etwa 75% des zellulären Mg [20] — wird durch die Abnahme dieser beiden Metabolite eine teilweise Kompensation des freien Mg++-Spiegels erreicht. Unterstützt wird die Kompensation des freien Mg++-Spiegels durch das Adenylatsystem, da der Massenwirkungsquotient dieser Reaktion Mg-abhängig ist [1] (Abb. 3). Die Basis dafür ist wiederum der Verlust an ATP im Mg-Mangel, wodurch aus dem verminderten Anteil des

595

Magnesiumabhängigkeit der Glykolyse

MgATP-Komplexes freies Mg++ verfügbar wird; denn nur ein geringer Anteil dieses Mg ++ reagiert mit dem sehr viel schwächeren Komplexbildner ADP. Die Kompensationsmöglichkeiten reichen insgesamt jedoch nicht aus, um den freien Mg++-Spiegel konstant zu halten, d. h., ihn zu normalisieren. Diese Aussage wird durch die berechneten freien und komplexierten Glykolysemetabolite belegt (Tab. 2). Die Veränderungen des freien Mg++-Spiegels werden durch den Abbau von ATP und 2,3-DPG abgeschwächt. Der freie Mg++-Spiegel von Menschenerythrozyten, der mit Mg-empfindlichen Elektroden und unter Zugrundelegung der Komplexbildungskonstanten für Mg ++ , K + , Na + mit den Glykolysemetaboliten bestimmt bzw. berechnet wurde, liegt bei etwa 0,5 mM [1], Diese Angaben sind in guter Übereinstimmung mit denen für rote Blutzellen der Ratte (Tab. 2). Der Pufferungseffekt auf den freien Mg-Spiegel ist im alkalischen Bereich stärker als bei p¥i 7,2 ausgeprägt. So beträgt z. B. bei p H 8,4 die durchschnittliche Abnahme des zellulären Gesamt-Mg-Spiegels 56%, der Abfall der freien Mg+"""-Konzentration jedoch nur 3 8 % . Das enge Zusammenspiel von Mg ++ - und ATP-Spiegel unterstützt die Schlüsselposition, die das ATP für den Stoffwechsel, die Struktur und Ionenzusammensetzung der roten Blutzelle hat. Die Erkennung der Zusammenhänge in der Regulation des Energiestoffwechsels einschließlich der Wirkung des Mg am Beispiel des Erythrozyten ist deshalb ein Beitrag zur Aufklärung der Rolle des Mg im Zwischenstoffwechsel von Zellen mit komplizierteren Strukturen. Literatur [1]

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169 (1974) (1973)

596

G . JACOBASCH, CH. G E R T H , P . - G .

FABRICIUS

Summary and P . - G . F A B R I C I U S : Control of glycolysis in Mg-deficiency studies with intact red cells and hemolysate

G . JACOBASCH, CH. G E R T H

The behaviour of glycolytic flux and glycolytic metabolic concentrations was studied under conditions of magnesium deficiency. The Mg-deficiency was produced in whole animals (rats) by feeding a diet almost completely free of Mg and in hemolysates of men by the addition of a chelating agent. The results show that the decrease of the free Mg-level is diminished by partial destruction of A T P and 2,3-DPG. The analysis of the control strength of the overall flux leads to the conclusion that the decrease of the glycolytic rate is caused by an inhibition of the hexokinase-phosphofructokinase-control system. The decrease of the MgATP-complex and free Mg++-level explains the diminished phosphorylation of glucose by the hexokinase. The ATP-inhibition of the phosphofructokinase is amplified by a small increase of free ATP-concentration and a simultaneous decrease of the Fru-6P-level. The increase of the PEP-level is caused by the diminished free Mg++ and MgATP-complex and does not demonstrate a larger control strenght of the pyruvate kinase.

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 597 —610 (1977) Physiologisch-Chemisches Institut der Friedrich-Schiller Universität, 69 Jena, D D R

Relations between ion shifting, ATP depletion and lactic acid formation in human red cells during moderate calcium loading using the ionophore A 23187 U . TILL, H . PETERMANN, I . WENZ, a n d H .

FRUNDER

Summary Keeping constant cellular magnesium an A 23187 mediated moderate calcium loading of human red cells causes isoosmotic cell shrinkage, potassium efflux, slight decrease of cellular pH, A T P depletion connected with an increase of AMP, ADP and Pt- and enhanced lactic acid formation. The calcium loading and accompanying effects can be abolished by EGTA or by extracellular magnesium, the latter kept more than two orders of magnitude above that of calcium which was 30 |xM. Inhibition of the (Mg2+ + Ca 2 +)-dependent ATPase by ruthenium red or lanthanum decreases the calcium stimulated lactic acid formation after a lag phase. However, the A T P depletion proceeds faster and is much more pronounced under these conditions. (Mg+2 + + Na+ + K+)-dependent ATPase, hexokinase, phosphofructokinase and cell shrinkage are ruled out, too, as mediators of the A T P depletion. This suggests that an unknown A T P consuming reaction, apparently not being related to the calcium pump, causes the calcium induced A T P depletion. Introduction

Owing to the small Ca 2+ content of red cells [1 —4] and the low membrane permeability [5] the bivalent cation ionophore A 23 187 [6] progressively has been used to mediate a rapid Ca 2+ loading of intact red cells. The main accompanying effects found are: K + efflux [7—15], shrinkage connected with spheroechinocytic transformation and membrane alteration [9—12, 16—20] and ATP depletion [9, 1 0 , 1 3 , 1 5 , 1 8 , 21]. The present paper mainly deals with the responsibility of different ATP consuming processes for the ATP depletion observed. Beside ATP, the corresponding alterations of ADP and AMP levels were measured. A second point investigated is the response of the lactic acid formation on Ca 2+ loading and accompanying alterations in the adenine nucleotide pattern. To avoid possible interferences by Mg2+ on the effects of enhanced cellular Ca 2+ , experimental conditions were worked out which do not allow ionophore induced net movements of Mg2+ during the time of incubation. In order to enhance the cellular Ca 2+ content to a relatively small extent, the cells were incubated in saline media without addition of Ca 2+ . The Ca 2+ concentration of these media results from impurities and was in a range of 20—50 [¿M, increasing the normal cellular Ca 2+ content by about 50% with the help of the ionophore. Abbreviation: DOPA: dihydroxyacetone phosphate; 2.3-DPG: 2.3-diphosphoglyceric acid; E G T A : ethyleneglycol-bis-(|S-aminoethylether)-N',N'-tetraacetic acid; 1,6-FDP: fructose1,6-diphosphate; G-6-P: glucose-6-phosphate; P E P : phosphoenolpyruvate; 3-PG: 3-phosphoglyceric acid; R C : red cells. 39*

598

U . TILL, H . PETERMANN, I. WENZ, H .

FRUNDER

Materials and methods Chemicals Substances used were provided by: Ionophore A 23187 Lilli Laboratories, USA; [45Ca]CaCl2 Zentralinstitut fur Kernforschung, Rossendorf, GDR; Ouabain Merck, Darmstadt, G F R ; Procaine Jenapharm, Jena, GDR; Vinblastin Gedeon Richter, Budapest, Hungary; Cytochalasin B, Ruthenium red. Colchicine and FGTA Ferak, Berlin-West. All reagents used were reagent-grade or enzyme-grade. Preparation of red cells and incubation conditions H u m a n fresh blood was obtained by venipuncture and heparinized. After centrifugation (5 min, 2000 g), the plasma and the upper third of cell-sediment containing most of the leucocytes and reticulocytes were removed. The red cells were washed at room temperature 3 times with wash medium and resuspended with incubation medium to a hematocrit of 40— 50%. Composition of the media: Wash medium: 5 m l KC1, 1 mM Na 2 HP0 4 , 5-5 mM glucose, 146 mM NaCl, 0.16 mM MgCl2. Incubation medium: 5 mM KC1, 1 mM Na.,HP0 4 , 5.5 mM glucose, 122 mM NaCl, 24 mM NaHC0 3 , 0.16 mM MgCl,. In cases of further additions to the media, the isoosmolarity was maintained by varying the NaCl concentration. The cells were incubated in a shaking water bath at 37 °C. For purpose of comparison two or more sets from the same donor were incubated simultaneously. The preincubation time before additions amounted to 30 min. The p H value was kept constant at 7-4 with a flow of a flexible and moist mixture of CO, and air over the surface of the sample. With triethanolamine buffered media the same results were obtained. Ionophore A 23 187 was dissolved in a mixture of dimethylsulfoxide/alcohol 1 + 1 (2.6 mg ionophore/ml mixture) and added to the incubate at a final concentration of 5 The solvent was proved to be without influence on the parameters investigated. [45Ca]-CaCl, was added to the incubate at the beginning of the incubation in trace amounts. Ruthenium red was dissolved in incubation medium and added to the incubate to a final concentration of 20 |J.M. EGTA was added in the Mg 2 +-complexed form. Denaturation of the samples Denaturation was effected by 6% HC10 4 . For the determination of lactic acid and glucose the HC10 4 was added to aliquots of the incubate (3:1, v/v). For the separate determination of cellular metabolites (adenine nucleotides, 2,3-DPG, P;) and extracellular ions (K+, Mg2+, P^) respectively, aliquots of the incubate were shortly centrifuged. The supernatants were diluted to varying extents with 0.1 N HC1. Packed cells were denaturated under vigorous shaking (1:5 v/v) centrifuged and the supernatant neutralized by 5 mM K 2 C0 3 . Assays Lactic acid, glucose, A T P , A D P and A M P were determined according to B E R G M E Y E R [22] and 2 , 3 - D P G according to R O S E and L I E B O W I T Z [23]. Concentrations of Na+, K+, Mg-'+ and Ca2+ were determined by atomic absorption (AAS 1 Carl Zeiss, Jena) and P ; according to M A R T I N and D O T Y , modified by T I L L et al. [ 2 4 ] . Radioactivity measurements [45 Ca] were carried out by a Geiger-Mueller counter. To measure the cellular pli value aliquots of the incubate were centrifuged under air exclusion. After sucking off the supernatant for the purpose of hemolysis the packed cells were frozen down to —80 °C under air exclusion for 1/2 hrs. Immediately after thawing the pH value was measured by a glass electrode at 37 °C. Results

In the presence of A 23 i 97 the total cellular Mg2+ concentration can be varied from 3 to 15 (imoles/ml RC water during one hour of incubation and depends on the extracellular Mgs+ concentration. Thus, experiments were carried out to

A T P and glycolysis after calcium loading

599

determine that extra cellular Mg 2+ concentration which is in equilibrium with cellular Mg 2+ , i.e. which is not altered by Mg2+ mo-vements into or out of the red cells. The results depicted in Fig. 1 clearly show that this equilibrium concentration is between 0.1 and 0.2 mM Mg 2+ . Therefore, all experiments dealing with the effects of an A 23 187 mediated moderate Ca 2+ loading of the cells were carried out with 0.16 mM Mg 2+ in the medium which avoids changes of total cellular Mg 2+ . All media were prepared without addition of Ca 2+ except traces of [45Ca] :CaCl2 in order to establish only a small Ca 2+ loading of the cells. Therefore, the extracellular Ca 2+ content results from impurities of the salts used and was in the range of 20—50 Under these conditions the ionophore causes a strong decrease of the extracellular Ca 2+ concentration and of the extracellular total radioactivity of the added [45Ca] (Fig. 2A, B solid lines). A corresponding increase of cellular total radioactivity can be found. The main Ca 2+ influx takes place during the first 30 min. After 60 min equilibrium seems to be established (proved by long time incubation, not given in Fig. 2). From the decrease of the extracellular Ca 2+ concentration one can calculate that the corresponding increase of the cellular Ca 2+ content amounts to 10—25 nmoles per ml RC water. The ionophore causes a slight acidification within 15 min of incubation from 7.17 ± 0.03 [n = 10) to 7-12 ± 0.04 {n = 10). A decrease of the cellular pH after loading with small amounts of Ca 2+ is in accordance with data of R E E D [15]. In contrast loading with high Ca 2+ concentrations leads to opposite H + fluxes [7, 15]- It shows that there is a more complicated relationship between Ca 2+ and proton fluxes. R E E D [15] suggests that the A 2 3 1 8 7 induced H + influx at low Ca 2+ concentrations is counterbalanced by a Mg2+ efflux leading to an electroneutral Mg2+/2 H + exchange. However, the results given in Table 1 show that during an A 2 3 1 8 7 mediated moderate Mg2+ loading of the cells which is not able to

Fig. 1. Determination of the extracellular Mg2+ concentration not being altered b y A 2 3 1 8 7 . Washed red cells were incubated with a hematocrit of about 5 0 % at 37 °C and pH 7.4. T h e composition of the incubation medium is given in methods with the exception of different Mg 2 + concentrations between 0.02 — 0.42 mM a t the beginning of the incubation (ordinate). 1 5 min after the addition of A 2 3 1 8 7 (5 (xM), the extracellular Mg 2 + concentration was measured again.

600

U . TILL, H . PETERMANN, I. WENZ, H .

FRUNDER

Table 1 2

zlMg + extracellular (mM) -.023 -.069 -.075

ApH

cellular

zlMg2+ extracellular (mM)

cellular

-.09 -.09 -.01

-.075 -.098 -.175

-.014 -.05 -.085

Apn

6 aliquots of washed red cells were incubated at 37 °C in saline with different concentrations of Mg2+ between 0.219 mM and 0.417 mM. The extracellular Mg2+ concentration and t h e cellular p H were measured shortly before and 1 5 m i n after addition of A 23 187 and t h e differences are given aszl. The extracellular pJi was kept constant a t 7.4 ^ 0.03 during t h e incubation by a flexible mixture of C0 2 /air.

abolish the accompanying Ca2+ influx the celluar p H value decreases to about the same extent as under conditions were no Mg2+ movement takes place. The ionophore induced Ca2+ influx seems to be connected with a rapid turnover of the (Mg2+ + Ca 2+ )-dependent ATPase. This can be derived from the decreasing specific radioactivity of the extracellular Ca2+ during the action of the ionophore (Fig. 2C, solid line). This isotope dilution is only possible when a certain amount of primarily unlabelled cellular Ca2+ becomes accessible and leaves the cells by the Ca2+ pump against the net Ca 2+ influx. The conclusion is confirmed by further experiments with ruthenium red or LaCl3, inhibitors of the + (Mg2+ + Ca2+)dependent ATPase: The addition of ruthenium red without A 23187 was proved to have no influence on the parameters investigated. If added together with A 23187 the Ca2+ influx takes place to about the same extent but markedly faster than without ruthenium red (Fig. 2A, B broken lines). The same holds if ruthenium red is added after the application of A 23187 but before Ca2+ influx has been ceased. Then, the extracellular Ca2+ concentration decreases rapidly, too. LaCl3 was proved to give the same results as ruthenium red. The results are in accordance with a marked inhibition of the Ca2+ pumping system which otherwise would tend to retard the ionophore induced Ca2+ influx. Effects of an A 2318J

mediated moderate excess cellular calcium

All effects described in the following section and shown in Fig. 2 clearly can be attributed to the ionophore mediated Ca2+ influx into the cells: If cells are incubated with EGTA equimolar to the Ca2+ concentration in the medium a subsequent addition of A 23187 avoids Ca2+ influx and abolishes all accompanying effects. A subsequent addition of Ca2+ in excess over EGTA again brings about the same typical alterations. Fig. 3 shows this with respect to lactic acid formation, hematocrit and extracellular K + concentration. Incubation with EGTA up to a final concentration of 1 mM without A 23187 addition is proved to be without influence on the parameters investigated. Cell s h r i n k a g e : With the hematocrit method a shrinkage of about 25% of the initial cell volume can be observed (Fig. 2D). The shrinkage corresponds accurately to values given in the literature after loading with high [10, 12] as well as with very small Ca2+ amounts [7]. Therefore, the phenomenon seems to

A T P a n d glycolysis a f t e r calcium loading

601

Fig. 2. E f f e c t s of A 23187 a n d A 23187 plus r u t h e n i u m red on ion distribution, cell volume, concentrations of adenine nucleotides a n d 2,3-DPG a n d lactic acid f o r m a t i o n in h u m a n red cells. W a s h e d red cells were i n c u b a t e d a t 37 °C a n d p H 7.4 in saline w i t h 0.16 mM MgCL, t o avoid n e t m o v e m e n t of Mg 2 + a n d a b o u t 30 [¿M CaCl, t o allow Ca 2 + influx in t h e presence of A 2 3 1 8 7 . F o r purpose of labelling traces of [ 45 Ca]-CaCl, were added. x x red cells w i t h o u t a n y addition; • • red cells plus 5 (¿M A 23 187; O — o red cells plus 5 [¿M A 23 187 plus 20 ¡xM r u t h e n i u m red. F o r purpose of comparison parallel sets w i t h cells f r o m one donor were investigated simultaneously. T h e points w i t h s t a n d a r d deviations are m e a n values of 5 — 10 determinations. P o i n t s w h i t h o u t s t a n d a r d deviation are m e a n values of t w o estimations. W i t h t h e exception of G a n d I all curves h a v e been corrected t o a common p o i n t a t zero time. F o r values given in F— I, t h e ionophore induced shrinkage of cell volume is t a k e n into account. A) ext. Ca = extracellular Ca 2 + concentration; B) ext. 45 Ca = t o t a l radioactivity of e x t r a cellular Ca 2 + in % of t h e initial value; C) S. R . = specific radioactivity of extracellular Ca 2 + in % of t h e initial value = ext. 4 5 Ca/ext. Ca; D) h c t = h e m a t o c r i t ; E) ext. K+ = e x t r a cellular K+ concentration; F) cell. D P G = cellular 2.3-DPG concentration; G) cell. A T P = cellular A T P concentration; H) cell. A D P = cellular A D P concentration; I) cell. A M P = cellular A M P concentration; K) ext. P { = extracellular P j concentration; L) cell. P ; = cellular P j concentration; M) lactate = v i r t u a l lactic acid concentration per ml RC, recalculated f r o m values determined in t h e i n c u b a t e

be completely marked by a very small Ca2+ influx. In accordance with this maximum shrinkage is complete within the first 15 min after A 23187 addition whereas Ca2+ influx proceeds. The shrinkage is taken into account for the calculation of the metabolite concentrations per ml RC water.

602

U . TILL, H . PETERMANN, I . WENZ, H . F R U N D E R fimol/ml RC

- fimol/ml RC-water

^

1.6

•

1.2

S

0.8 OA

m

i 40

l

.

I

I

I""""

cell. I CATP

i

lactate

l

l

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D

I

—

30

30

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i

l

I

I

0

30

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90

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A23187

•

Ca*+

l

I

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120

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i

150 0

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I

•

A23187

•

^

SO

SO

i

i r

I

ext.K+

I

120 min 150

Ca++

Fig. 3. Influence of EGTA on the action of A 23 187Washed red cells were incubated at 37 °C, pH 7.4, in saline containing 80 [xM Mg-EGTA. After 30 min A 23187 (5 ¡xM) and after 90 min CaCl2 (3 mM) were added. Mean values of two experiments. A) cell. ATP = cellular ATP concentration; B) lactate = virtual lactic acid concentration per ml RC, recalculated from values determined in the incubate; C) hct = hematocrit; D) ext. K+ = extracellular K+ concentration During shrinkage the extracellular CI" concentration remains constant and the extracellular osmolarity is slightly increasing. B o t h facts point to the extrusion of cellular water plus ions in an isotonic composition during shrinkage. This is in accordance with other results on coupling of water efflux together with K + and CI" [11,-15], the preponderance of K + efflux over N a + influx [25] and a diminution of the sum of cellular K + und N a + concentration during shrinkage [15]. A close coupling of the shrinkage with the K + efflux seems to be very probable because it can be abolished b y incubating the cells in KC1 media [11]. Under our conditions a slight swelling of the cells is found in a K + rich medium although Ca 2 + loading, A T P depletion and increase in lactic acid formation proceed (Fig. 4). F r o m these findings it seems to be improbable that a Ca 2 + induced association of red cell spectrin with certain membrane particles [26] could cause cell shrinkage. T h i s is supported b y our experiments with procaine, cytochalasin B , colchicine and vinblastin which failed to prevent the Ca 2 + induced shrinkage. T o control how far the A T P depletion and/or enhanced lactic acid formation during ionophore induced Ca 2 + loading (see Fig. 2 G, M) are attributed to the accompanying loss of cell water a shrinkage was forced b y incubation in a hypertonic saline medium (500 mosmoles/1) to the same extent as during Ca 2 + loading. In this case A T P concentration as well as lactic acid formation are not altered. This shows t h a t shrinkage itself is not responsible for the Ca 2 + induced effects. P o t a s s i u m e f f l u x : Extracellular K + rises from 5 mM up to about 35 mM (Fig. 2 E ) . Probably, the steep increase during the first 30 min represents the sum of accelerated K + efflux and the K + extrusion caused b y shrinkage.

603

A T P and glycolysis a f t e r calcium loading

The K + efflux is a well established effect of A 23 187 mediated Ca2+ loading [7—12]. Our data are in accordance with an observation of R E E D and LARDY [7] who found the highest K + loss when incubating red cells in saline with very low Ca2+ concentrations. In the presence of A 23187 ruthenium red accelerates and increases the K + loss and establishes equilibrium between intra- and extracellular space (Fig. 2 E). L a c t i c acid f o r m a t i o n (Fig. 2M): Untreated cells show a normal linear lactic acid formation of 2.08 ± 0.44 (n = 7) [¿moles/ml RC • h. With A 23 187 the rate is with 3-58 + 0.45 (n = 13) (imole/ml RC • h nearly doubled despite the slight decrease of cellular pH value. In some cases the quotient of lactic acid formation/glucose consumption is measured and amounts to 1.78 ± 0-39 i n = 6) in untreated cells and to 3.06 ± 0.61 (n = 8) after A 23 187 addition. The enhanced value after A 23187 addition points to a possible decrease of one or more glycolytic intermediates. This could be confirmed by a few measurements of the concentration of G-6-P, 1,6-FDP, DOAP, 3-PG and PEP all of which decreased considerably. 2,3 -DPG can be ruled out as a source for lactic acid formation because of being constant during incubation with the ionophore (Fig. 2F).

%

°/o

B

-Xi 75

40

SO

30

20

25 ext.^Ca

10

hcf

L

4Ü a

I" Q: %W

o 6 0.5 a. 30

min

60

Fig. 4. A 23187 induced alterations in red cells incubated with a K+ rich medium. W a s h e d red cells were incubated a t 37 °C, p H 7.4, in saline m e d i u m of t h e following composition: 122 mM KC1, 1 mM N a , H P 0 4 , 5-5 mM glucose, 5 mM NaCl, 12 mM K H C 0 3 , 0.16 mM MgCl,, u n d e r addition of [ 45 Ca]-CaCl 2 . x x w i t h o u t A 23187; • • with A 23187 (S ¡xM). A) ext. 45 Ca = t o t a l radioactivity of extracellular Ca 2 +; B) hct = h e m a t o c r i t ; C) cell. A T P = cellular A T P concentration; D) lactate = v i r t u a l lactic acid concentration per ml RC, recalculated f r o m values determined in t h e incubate

604

U . TILL, H . PETERMANN, I. WENZ, H .

FRUNDER

A d e n i n e n u c l e o t i d e s ( F i g . 2G — I): Within 30min of incubation A 23187 induces a considerable A T P depletion down to a new level of less than 1.0 pimol/ml RC water whereas in untreated cells the level rises to about 2.4 ¡xmoles/ml RC water at the end of incubation. The fall of A T P is accompanied by a slight increase of the concentration and a large increase of the A M P concentration. The sum of the A D P three nucleotides is identical in untreated and ionophore treated t a t p i rAMPi

cells and nearly constant during the time of incubation. The quotient — [ A D P ] 2 — amounts to about 1.2 for both untreated and ionophore treated cells and remains also constant during the time of incubation (range 1.1—1.3). The dephosphorylation of A T P is in accordance with an enhancement of cellular Pi which leads to an increasing efflux followed b y rising extracellular Pt (Fig. 2 K , L). Effects of excess cellular Ca2+ on A TP consumption and lactic acid formation in the presence A TPase inhibitors In the presence of ouabain there is the same A 23187 induced A T P depletion, increased lactic acid formation and K + efflux as in the absence of this inhibitor (Fig. 5). During inhibition of the Ca 2+ pumping system by ruthenium red the Ca 2+ influx leads to a faster A T P depletion and to a steeper decrease than without the inhibitor (Fig. 2G, broken line). The main A T P depletion takes place during the first 15 min of incubation were the lactic acid formation is about as high as without ruthenium red. After 15 min the lactic acid formation decreases to 1.99 (n = 3) ¡¿moles/ml RC • h (Fig. 2M, broken line). The results of more detailed investigations on the action of ruthenium red are given in Fig. 6. 60 min after the addition of A 23187 an equilibrium between extracellular and cellular calcium is established. The addition of ruthenium red at this time does not change this equilibrium (Fig. 6 A, C, E, broken lines) whereas the addition of ruthenium red together with E G T A removes excess Ca 2+ and a considerable part of the initial cellular Ca 2+ (Fig. 6A, C, E, broken plus dotted lines). Despite different total cellular Ca 2+ the lactic acid production is identical in both cases (Fig. 6F). However, A T P remains at the low level after addition of ruthenium red (Fig. 6D, broken line) and rises up to the initial level when cellular Ca 2+ is removed by E G T A (Fig. 6D, broken plus dotted line).

A

B

mM 40

-

20

1

i 30

10 cell. ATP

// / y i

i

ext. K*

SO 0

30

SO

i

I

Fig. 5- Effect of ouabain on A 2 3 1 8 7 induced A T P depletion and K+efflux Washed red cells were incubated a t 37 °C, ^ H 7-4, in saline containing 0.3 mM of ouabain (o o ) and without ouabain ( • •) in the presence of A 23187 (5 nM). Cellular A T P concentration ( = cell. A T P ) and extracellular K+ concentration ( = ext. K+) are given as mean values of two experiments

ATP and glycolysis after calcium loading

jiM j

SO

r

—

i

/

45

%

\ /I

•

\

I

I

40 20 H

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B

I

I

I

I

I

I

I

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I

A

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I

A

SO - \ SO

— — O —

30

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/

3D

40

605

I

I

ext. "5Ca I

I

I

— ixmo!/ml RC

cell. ATP I

80

SO 40

2

20 ~

I

0

I

30

I

£0

I

S*.

30

/ i/ 120 0 1

I

E) 30

I

£0

lactate I

I

30 12Qmin

Fig. 6. Action of ruthenium red and ruthenium red plus EGTA on Ca2+ loaded red cells. Washed red cells were incubated at 37 °C and pH 7.4 in saline in the presence of A 23187 (5 ¡AM) and [45Ca]-CaCl2 (• •). After 60 min, the incubation mixture was divided into two aliquots for the purpose of different additions (arrow): o O with ruthenium red (20 [J.M); A -A with ruthenium red (20 ¡AM) plus Mg-EGTA (1 mM). Mean values of two experiments. A) ext. Ca. = extracellular Ca2+ concentration; B) hct = hematocrit; C) ext. 45 Ca = total radioactivity of extracellular Ca 2 + in % of the initial value; D) cell. ATP = cellular A T P concentration; E) S. R. = specific radioactivity of extracellular Ca2+ in % of the ext. 45 Ca initial value = — ; F) lactate = virtual lactic acid concentration per ml RC, recalculated from values determined in the incubate

Influence of Mg2+ on Ca2+ loading and accompanying effects In red cells incubated without Mg 2 + A 23187 causes the same effects as with 0.16 mM extracellular Mg 2 + . At increasing Mg 2+ concentrations above this value the action of the ionophore is reduced. Ca 2 + loading and accompanying effects are completely abolished at 10 mM extracellular Mg 2+ . The ATP depletion can be abolished already by 1 mM extracellular Mg 2+ whereas 10 mM are necessary to abolish the increase of lactic acid formation. The effects of this Mg2+" excess of at least 2 orders of magnitude with respect to the extracellular Ca2"1" concentration can be explained by Ca 2 + displacement (Fig. 7): Mg 2+ removes a part of the accumulated Ca 2 + from the cells, which leads

606

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Fig. 7. Action of ruthenium red and ruthenium red plus 10 mM extracellular Mg2+ on Ca2+ loaded red cells. Washed red cells were incubated at 37 °C and pH 7.4 in saline in the presence of A 23187 (5 (xM) and [45Ca]CaCl2 ( • • ) . After 60 min the incubation mixture was divided into two aliquots with the purpose of further additions (arrow): o - o with ruthenium red (20 (xM); ^ ^ with ruthenium red plus lOmM extracellular Mg2+. 45 A) ext. Ca = total radioactivity of extracellular Ca2+ in % of the initial value; B) cell. ATP = cellular ATP concentration; C) lactate = virtual lactic acid concentration per ml RC, recalculated from values determined in the incubate

0

SO,

60

90 min

120

to a slight increase in ATP concentration and dimishes the lactic acid formation from 3.15 ¡¿moles/ml RC • h to I.92 [¿moles/ml RC • h. Discussion

Owing to the very low extracellular Ca2+ concentration used the A 23187 induced Ca2+ loading with 10—25 [J.M excess Ca2+ remains far below the maximum loading (between 5 mM [11] and 45 mM [12]). However, slight Ca2+ loading is sufficient to initiate effects on cell volume, ion distribution, glycolysis and adenine nucleotides. Some of these effects are well established in the literature and confirmed in the present paper. Potassium

efflux

From the numerous studies on the possible mechanism of the Ca2+ induced K+ efflux in red cells [2, 7, 11—15, 21, 27—38] controversy remains. With the results of this paper the different views can be restricted: From Ca2+ loading during cold storage it was concluded that the K+ efflux is a prerequisite for the Ca2+ influx [37]. This does not hold for the A 23 187 mediated excess Ca2+ because here Ca2+ loading persists if K> efflux is prevented (Fig. 5). The ATP depletion or a competition between (Mg2+ + Na + + K+)-dependent

ATP and glycolysis after calcium loading

607

ATPase and (Mg2+ -f Ca 2+ )-dependent ATPase for ATP as a reason for the K+ efflux [29—31 > 39] seem to be improbable, too: 1. Differences in the time dependence of ATP depletion and K+ efflux do not correspond with this opinion (Fig. 2E, G.) 2. K+ efflux is not altered by ouabain (Fig. 4; [11, 15]), ruthenium red (Fig. 2E) or LaCl 3 [7]. Therefore, the most probable explanation for the K+ efflux is as follows: In the presence of A 23187 Ca 2+ binds to membrane receptors normally not accessible, leading to an increased permeability [1,1 13—15, 21—36]. This is in accordance with the following finding: The specific radioactivity of the extracellular Ca 2+ decreases after A 23187 addition by dilution with unlabelled cellular Ca 2+ . The extent of isotope dilution exceeds that part of total cellular Ca2+ which participates in isotope exchange without A 23187 [5]. Adenine

nucleotides

The A 23187 induced ATP depletion found is in accordance with the results of most authors [10, 13, 15, 18, 21]. et al. [ 1 1 ] found no ATP depletion after a short time action (2 min) of the ionophore although Ca2+ loading took place during this time. This is not contrary to our findings because of the lag phase of ATP depletion (Fig. 2 G). During long time action of the ionophore E D M O N D S O N and Li [ 1 2 ] found no ATP depletion. This may be due to the high extracellular Mg2+ concentration used there. It causes a Mg2+ loading of the cells (Fig. 1) which abolishes the Ca2+ effect on ATP (see results, influence of Mg2+). The ATP depletion is connected with an increase of ADP and a considerable increase of AMP. The sum of the adenine SARKADI

nucleotides remains constant. The q u o t i e n t ( t o t a l

concentrations)

amounts to 1.2 being the same in normal and ionophore treated cells and constant during the incubation. This value indicates thermodynamic equilibrium between the reactants of adenylate kinase (E.C. 2.7-4.3.) under cellular conditions [40—43]- During incubation with ionophore plus ruthenium red the sum of all three nucleotides remain constant, too. However, the ATP decrease and the rise in AMP are much more pronounced (Fig. 2 G, I). Contrary to the incubation without ruthenium red the ADP level decreases (Fig. 2H). As a consequence, [AMP] [ATP]

the quotient —[ADP] 2 — r i s e s from the initial value of about 1 to about 3 5 after 30 min and to about 20 after 60 min incubation. The total cellular concentrations of Mg2+ and Ca2+ as the main cations forming complexes with adenine nucleotides are approximately identical with that of normal cells. It remains to be elucidated whether this is a real or an apparent nonequilibrium of adenylate kinase reactants under those conditions. An apparent nonequilibrium could be present because the predominant part of the remaining ATP (0.2-0-3 m M) will not be available owing to a binding to hemoglobin [44] or complex formation with iron [45]-

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U . TILL, H . PETERMANN, I. W E N Z , H .

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A TP consuming processes and lactic acid formation As shown in the results the hexokinase and phosphofructokinase reaction, the (Mg2+ + Na + + K + )-dependent ATPase and the cell shrinkage are excluded as the reasons for the ATP depletion observed during A 23187 induced Ca2+ loading. Our conclusions are supported by findings of an inhibition of the (Mg2+ + Na + + + K + )-dependent ATPase by Ca2+ [28, 35]- Further, only a very small part of ATP will be consumed by the enhanced phosphatidate synthesis [18]. Therefore, the main point of interest should be restricted to the Ca 2+ pumping system of the membrane which is activated as a consequence of the enhanced Ca 2+ influx. To calculate the possible ATP consumption by this system the following findings have to be included: the maximum capacity of (Mg2+ -f Ca 2+ )-dependent ATPase in red cells amounts to 85 (i.moles/1 cells • min [11] and 150 (i.moles/1 cells • min [4], respectively. For a rough calculation a value of about 100 [i.moles/1 cells • min may be used. The most probable stoichiometry of Ca 2+ moles pumped to ATP moles split seems to be 2:1 [18], being identical \yith that in the sarcoplasmatic reticulum [30]. Further, in ghosts and membrane fragments, respectively, the enzyme seems to work with the full capacity at small Ca2+ loading (less than 10 [xM excess Ca2+) [4, 7, 46]. This corresponds to the extent of Ca2+ loading in our experiments. A cyclic flux of Ca 2+ across the membrane during the ionophore induced transport of small amounts of Ca 2+ is also assumed by SCHATZMANN and V I N C E N Z I [2], SCHATZMANN and Rossi [ 3 2 ] , SCHATZMANN [4] and L E E and S H I N [47]. The same can be derived from the results shown in Fig. 2C. Taking into account these findings and assumptions one can calculate a maximum ATP consumption of about 3 (¿moles/ml RC • h by the Ca2+ pumping system. About 2 ¡imoles/ml RC • h of ATP can be formed by the corresponding enhancement of lactic acid formation (Fig. 2 M). The remaining difference of 1 [zmoles/ml RC • h would correspond to the ATP depletion observed within the first hour after A 23187 addition (Fig. 2 G ) . So far the assumption of A L L A N and M I C H E L L [18] and F E R R E I R A and L E W [48] seems to be supported that the (Mg2+ + Ca 2+ )-dependent ATPase theoretically could be responsible for the ATP depletion. However, there are remarkable differences in the time course of ATP depletion and lactic acid formation not being consistent with this assumption (Fig. 2 G, M). Furthermore, after inhibition of the Ca 2+ pumping system by ruthenium red the ATP depletion is much more pronounced contrary to the expectation (Fig. 2 G). The ATP level decreases within the first 15 min where the lactic acid formation is as high as in the absence of the inhibitor (Fig. 2 M). The inhibiting action of ruthenium red on the Ca 2+ pumping system under these conditions clearly can be derived from the kinetics of the Ca 2+ influx (Fig. 2A—C) and corresponds to analogue results with LaCl3 [11, 49]- A further important support are the results of W A T S O N et al. [50] who showed that ruthenium red causes a specific and nearly complete inhibition of the ATP splitting by the (Mg2+ + Ca 2+ )-dependent ATPase in human red cell membranes. The concentration of ruthenium red used there was in the same range as in our incubations. This leads to the conclusion that there is a further Ca2+ sensitive ATP consuming process responsible for the ATP depletion observed during Ca 2+ loading. The lactic acid formation is increased by excess cellular Ca2+ apparently up to a maximal value, since lactic acid formation does not keep pace with the concomi-

609

ATP and glycolysis after calcium loading

tantly increased ATP consumption. Inhibiting the Ca2+ pumping system by ruthenium red abolishes the dependence of lactic acid formation on excess Ca2+ (Fig. 2 A, M, Fig. 6 F, broken line and Fig. 7 C, broken line). Removal of cellular Ca2+ in the presence of ruthenium red does not alter lactic acid formation (Fig. 6 F broken plus dotted line, Fig. 7 C broken plus dotted line). Therefore, the lactic acid formation is controlled either by an active Ca2+ pumping system or ruthenium red inhibits the glycolysis as well as the Ca2+ pumping system. After A 23187 high ADP levels with high lactic acid formation are found, after A 23 187 plus ruthenium red, however, low ADP levels with low lactate formation (Fig. 2 H, M). This can be taken as a hint that lactic acid formation is governed mainly by ADP. Further data on the relationship between Ca mediated membrane processes and glycolysis will be presented in the accompanying paper [51]. Acknowledgements We thank Drs. K . W I N N E F E L D and H . M . D A W T S C H I N S K I for carying out the atomic absorption measurements. The skillful technical assistance of Mrs. C . R I T T E R and Miss. K . B E H R E N S is gratefully acknowledged. A 23187 was a gift from Lilli Laboratories, U.S.A. References [1] [2] [3] [4] [5] [6]

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Bezugsmöglichkeiten Bestellungen sind zu richten: — in der DDR an eine Buchhandlung oder an den Akademie-Verlag, DDR-108 Berlin, Leipziger Straße 3—4 — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung für fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb — in der BRD und Westberlin an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber, 7 Stuttgart 1, Wilhelmstraße 4 - 6 — in Österreich an den Globus-Buchvertrieb, 1201 Wien, Höchstädtplatz 3 — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-701, Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-108, Berlin, Leipziger Straße 3—4.

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Membrane Antigens Von PhD. DSc. ALENA L E N G E R O V A , Prag In englischer Sprache. 1977. 171 Seiten, 45 Abbildungen, 5 Tabellen, L 6 = 16.7 cm y 24 c m, Broschur, 4 2 , — M ; Ausland 57,— M Bcst.-Nr. 5326661 Die international bekannte Autorin legt eine kritische Übersicht aller mit Membranantigenen experimentell gewonnenen Daten vor. Dabei bleibt sie nie im Theoretischen haften, sondern versucht mit Erfolg, klinisch bedeutsame Fragestellungen aufzugreifen. Dies betrifft vor allem Probleme der Transplantationsantigene und Antigene in Tumorzellen. Darüber hinaus verweist die Autorin auf Entwicklungsmöglichkeiten und -wege in den nächsten Jahren.

Humangenetik in der sozialistischen Gesellschaft Philosophisch-ethische und soziale Probleme Von Prof. Dr. phil. HANS-MARTIN D I E T L , Prof. Dr. phil. HEINZ GAHSE und Dr. phil. HANS-GEORG KRANHOLD, Magdeburg •Reihe „Philosophie und Biowissenschaften". 1977- 183 Seiten, L7 = 14,7 cm x 21,5 cm, Broschur, 13, — M Best.-Nr. 5326637 Die vorliegende Abhandlung ist ein Ergebnis der engen Zusammenarbeit von Gesellschaftswissenschaftlern, Ärzten und Biologen im Rahmen des Forschungsprojektes „Humangenetik" in der D D R . Sie stellt eine Zusammenfassung allgemeiner weltanschaulicher Probleme der Humangenetik dar, wobei die einschlägige Literatur kritisch ausgewertet wurde, sowie die Auseinandersetzung mit biologisch-anthropologistischen Auffassungen der bürgerlichen Ideologie geführt wird. Die Fragestellungen resultieren aus der medizingenetischen Praxis und der humangenetischen Familienberatung und der Forschung auf diesem Gebiet.

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