Фармация №5 2008

Citation preview

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

О ДД ЕЕ РР Ж Ж АА НН И И ЕЕ СС О МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И.М. СЕЧЕНОВА РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ И МЕДИКО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

ИЗДАТЕЛЬ — ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ДОМ «РУССКИЙ ВРАЧ» ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР И.А. САМЫЛИНА РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛEГИЯ: Р.Н. АЛЯУТДИН А.П. АРЗАМАСЦЕВ В.Л. БАГИРОВА В.В. БЕРЕГОВЫХ В.А. БЫКОВ Н.Н. ДЕМЕНТЬЕВА И.И. КРАСНЮК Р.С. СКУЛКОВА А.А. СОРОКИНА Е.А. ТЕЛЬНОВА Н.А. ТЮКАВКИНА Г.В. ШАШКОВА РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ: В.Г. БЕЛИКОВ (Пятигорск) П.В. ЛОПАТИН (Москва) Д.А. МУРАВЬЕВА (Пятигорск) Р.С. САФИУЛЛИН (Казань) А.В. СОЛОНИНИНА (Пермь) Г.П. ЯКОВЛЕВ (Санкт-Петербург)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ Разработка проекта общей фармакопейной статьи «Глазные лекарственные средства». . . . . . . . . . . . . . . . 3 АКТУАЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Н.Д. Бунятян Организация проведения экспертизы и контроля качества лекарственных средств в субъектах Российской Федерации . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Н.Н. Карева, А.А. Лин, И.Е. Нильва Правовой статус саморегулируемых организаций. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 ВАЛИДАЦИЯ Р.А. Волкова, Т.А. Бектимиров Валидация методов контроля микробиологических препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Н.М. Пустошилова, Л.В. Шуленина, О.Б. Рунова, Р.А. Волкова Проблемы определения белка в биопрепаратах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ О.Г. Зорикова, А.Ю. Маняхин, С.П. Зорикова, Л.И. Моисеенко Микроэлементы в сырье и препаратах патринии скабиозолистной . . . . . . . . . . . . 19 Р.Дз. Кусова Исследование плодов барбариса обыкновенного, произрастающего в Республике Северная Осетия – Алания. . . . . . . . . . . . . 22 А.А. Матюшин, Д.А. Царев, М.А. Григоренко, И.И. Федоров, Г.В. Раменская, В.Н. Ташлицкий, В.П. Скулачев Оценка липофильности некоторых антиоксидантов нового поколения. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 К.В. Ноздрин, А.С. Осипов, Г.М. Родионова Применение метода ВЭЖХ с использованием

монолитной колонки в анализе антиоксидантов. . . . . . . . . . . . . . 29 ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКОНОМИКА Е.А. Максимкина, Л.Г. Сатаева Совершенствование лекарственного обеспечения в Республике Казахстан. . . . . . . . . . . . . . . . 32 Н.Б. Дремова, И.В. Толкачева Проблемы фармацевтического менеджмента в лечебно-профилактическом учреждении . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 А.Ж. Хаджиева, П.А. Шихаева Потребительское поведение рекреантов на рынке санаторно-курортных услуг . . . . . . . . . . . . 42 И.С. Крысанов, А.У. Магомедова, Т.Н. Моисеева, Р.У. Хабриев, Р.И. Ягудина Оценка схем лечения диффузной В-крупноклеточной лимфосаркомы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 ФАРМАКОЛОГИЯ: ЭКСПЕРИМЕНТ И КЛИНИКА И.А. Джинджихашвили, К.Б. Курахмаева, М. Хосравани, О.П. Попова, В.Ю. Балабаньян, В.Е. Петров, Р.Н. Аляутдин Возможность доставки фактора роста нервов в мозг в эксперименте in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 ОБРАЗОВАНИЕ Р.С. Сафиуллин, Н.Н. Муслимова, Г.Х. Гарифуллина Последипломное образование по специальности «Управление и экономика фармации» . . . . . . . . . . . . . . . 55 ОБЗОР Е.Ю. Шабалкина Нанодисперсные магнитные материалы в медицине и фармации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 ИНФОРМАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . .4, 49, 54

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

CONTENTS Генеральный директор Издательского дома «Русский врач» Г.С. Зольникова Директор по рекламе и маркетингу В.С. Моисеева Зав. редакцией Т.Л. Григорьева Редактор Т.C. Аверкина Технический редактор Л.Г. Юматова Верстка Ю.Н. Глебова Компьютерный набор Е.А. Козловская Журнал зарегистрирован Министерством РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникаций Регистрационный номер 77-11255 от 26 ноября 2001 г. Выходит 8 номеров в год Полное или частичное воспроизведение или размножение материалов, опубликованных в журнале, допускается только с письменного разрешения Издательского дома «Русский врач» Редакция рукописи не возвращает. За содержание рекламных материалов редакция ответственности не несет. Набор, верстка, дизайн, печать выполнены в Издательском доме «Русский врач» Подписано в печать 4.07.08 Формат 60×90/8 Бумага мелованная 90 г/м2 Печ. л. 7,5 Заказ 292 Тираж 3000 экз. Адрес редакции: Москва, Трубецкая, 8, стр.1 (12-й этаж) Для корреспонденции: 119991, Москва, Трубецкая, 8, стр. 2 Телефоны: редакция: 8(495)245-86-83 секретариат: 8(499)766-07-57 отдел рекл.: 8(495)245-86-36 E-mail: pharmacia@ mmascience.ru Web-site: www. rusvrach.ru © «Фармация», 2008 Подписной индекс по каталогу Агентства «Роспечать»: 71477

OFFICIAL MATERIALS Development of a draft general pharmacopoeial article «Eye drugs» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 TOPICAL INFORMATION N.D. Bunyatyan Organization of drug examination and control in the subjects of the Russian Federation . . . . . . . . . . . . . . 5 N.N. Kareva, A.A. Lin, I.Ye. Nilva The legal status of self-regulated organizations. . . . . . . . . . . 9 VALIDATION R.A. Volkova, T.A. Bektimirov Validation of methods for controlling microbiologicals . . . . . . . . 12 N.M. Pustoshilova, L.V. Shulenina, O.B. Runova, R.A. Volkova Problems of protein determination in biologicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 PHARMACEUTICAL CHEMISTRY AND PHARMACOGNOSY O.G. Zorikova, A.Yu. Manyakhin, S.P. Zorikova, L.I. Moiseyenko Trace elements in Patrinia scabiosifolia raw material and preparations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 R.Dz. Kusova Study of common barberry (Berberis vulgaris) grown in the Republic of Northern Ossetia-Alania . . . . . . . . . . . . 22 A.A. Matyushin, D.A. Tsarev, M.A. Grigorenko, I.I. Fedorov, G.V. Ramenskaya, V.N. Tashlitsky, V.P. Skulachev Estimation of the lipophilicity of some new generation antioxidants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 K.V. Nozdrin, A.S. Osipov, G.M. Rodionova HPLC using a monolithic column in the analysis of antioxidants . . . . . . . . . . 29

ORGANIZATION AND ECONOMY Ye.A. Maksimkina, L.G. Satayeva Improvement of drug provision in the Republic of Kazakhstan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 N.B. Dremova, I.V. Tolkacheva Problems of pharmaceutical management in a therapeutic-and-prophylactic institution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 A.Zh. Khadziyeva, P.A. Shikhayeva Consumer behavior of recreants on the sanatorium-and-spa services market . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 I.S. Krysanov, A.U. Magomedova, T.N. Moiseyeva, R.U. Khabriyev, R.I. Yagudina Assessment of treatment regimens for diffuse large B-cell lymphosarcoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 EXPERIMENTAL AND CLINICAL PHARMACOLOGY I.A. Djindjikhashvili, K.B. Kurakhmayeva, M. Hosravani, O.P. Popova, V.Yu. Balabanyan, V. Ye. Petrov, P.N. Alyautdin The possibility of delivering nerve growth factor in an in vivo experiment . . . . . . . . . . . . . . . 51 EDUCATION R.S. Safiullin, N.N. Muslimova, G.Kh. Garifullina Postgraduate training in the specialty «Pharmacy management and economics» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 REVIEW Ye.Yu. Shabalkina Nanodisperse magnetic materials in medicine and pharmacy . . . . . . . . . . . . 57 INFORMATION . . . . . . . . . . . . . . . . 4, 49, 54

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Официальные материалы

© Коллектив авторов, 2008

РАЗРАБОТКА ПРОЕКТА ОБЩЕЙ ФАРМАКОПЕЙНОЙ СТАТЬИ «ГЛАЗНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА» Н.Н. Дементьева, Т.А. Завражная, И.А. Самылина, Л.И. Митькина НИИ фармации ММА им. И.М. Сеченова

В

связи с подготовкой ХII издания отечественной фармакопеи разработан проект общей фармакопейной статьи (ОФС) «Глазные лекарственные средства», в которой были учтены требования, предъявляемые к данным лекарственным средствам (ЛС) в зарубежных фармакопеях – Европейской 5 изд., Британской, 2007, Украинской 2 изд. Глазные лекарственные формы занимают особое место среди других лекарств из-за специфики их использования и вытекающих из этого особенностей приготовления. Зоной резорбции глаза является роговица – типичный липоидный барьер толщиной около 1 мм. Она хорошо проницаема для жирорастворимых лекарственных веществ. За липидным барьером расположена водная камера. Ожидаемое действие при применении глазных лекарств заключается в доступности тканей глаза для препарата, т.е. в необходимости преодоления липидного и водного барьеров. В офтальмологической практике используются разнообразные ЛС как для создания местного эффекта в диагностических (расширение или сужение зрачка) или терапевтических целях, так и для реализации фармакологического эффекта в смежных тканях. Глазные ЛС представляют собой стерильные жидкие, мягкие или твердые ЛС, предназначенные для нанесения на глазное яблоко и/или на конъюнктиву, или для введения в конъюктивальный мешок. Глазные ЛС могут оказывать как общее, так и местное действие. В состав глазных ЛС может входить один или несколько компонентов, которые не должны оказывать раздражающее и неблагоприятное воздействие на слизистую глаза. Глазные ЛС выпускают в однодозовых и многодозовых контейнерах, снабженных при необходимости приспособлением, обеспечивающим удобство применения и предотвращающим загрязнение. По сравнению с ГФ ХI, в которую включена только ОФС «Глазные капли», в проекте ОФС предложено классифицировать глазные ЛС по следующим видам: глазные капли и спреи; глазные примочки; глазные мягкие лекарственные средства; глазные пленки; глазные порошки; глазные тампоны.

Фармация №5, 2008

В проекте ОФС введен раздел «Производство», где указаны особенности приготовления глазных ЛС с учетом стерильности, условий хранения, требований к маркировке. В разделе «Глазные капли и спреи» введены подразделы: «Определение», «Испытания» (однородность массы, однородность содержания, однородность дозирования), «Размер частиц» (для глазных капель в виде суспензий), «Общие требования», «рН», «Количественное определение», «Упаковка», «Маркировка», «Хранение», а также отражены требования, предъявляемые к производству глазных капель (изотоничность, стабильность, пролонгирование). Качество глазных капель характеризуют следующие основные показатели: соответствие анатомо-физиологическим особенностям пути введения и физико-химическим свойствам лекарственных веществ; стерильность; совместимость лекарственных и вспомогательных веществ; точность концентрации лекарственных веществ и объема (массы) капель; стабильность химическая и физическая (для суспензий и эмульсий); отсутствие механических включений. На слизистую глаза оказывают влияние величины осмотического давления и рН водных растворов лекарственных веществ. Обычно глазные капли должны быть изотоничны со слезной жидкостью, соответствующей 0,9% раствору натрия хлорида. Допускается производство растворов, осмоляльность (осмолярность) которых находится в пределах осмоляльности (осмолярности) 0,6–2% раствора натрия хлорида. В отдельных случаях глазные капли могут иметь осмоляльность большую, чем осмоляльность 2% раствора натрия хлорида. Если нет других указаний, значение рН глазных капель должно соответствовать физиологическим пределам. Недостатком глазных капель в виде водных растворов лекарственных веществ является кратковременное терапевтическое действие. Продолжительность действия может быть достигнута повышением вязкости водных растворов. Для этой цели используются поливиниловый спирт (1,5%), метилцеллюлоза (0,5%) и натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1,5%),

3

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Официальные материалы которые благодаря хорошим адгезионным свойствам обеспечивают необходимый контакт с глазом, не раздражая его и не влияя на зрение. Оптимальной для глазных капель считается вязкость 5–15 сП. Глазные капли, представляющие собой растворы, контролируют по следующим показателям: описание, подлинность, прозрачность, цветность, рН, механические включения, вязкость, осмоляльность, посторонние примеси (родственные соединения), номинальный объем, стерильность, количественное определение. Для глазных капель, представляющих собой масляные растворы, дополнительно контролируют кислотное и перекисное числа. Для глазных капель, содержащих вещества, обеспечивающие вязкость, дополнительно контролируют вязкость. Для глазных капель в виде растворов, выпускаемых в однодозовых контейнерах, дополнительно контролируют однородность массы. Для глазных капель в виде суспензий или эмульсий, выпускаемых в однодозовых контейнерах, дополнительно контролируют однородность содержания, размер частиц, седиментационную устойчивость. Для глазных капель, представляющих собой дозированные спреи, содержащих суспензии и эмульсии, дополнительно контролируют однородность дозирования. Показатель рН определяют для всех глазных капель, за исключением масляных растворов. Если нет

других указаний значение рН глазных капель должно соответствовать физиологическим пределам. Одним из основных показателей качества глазных ЛС является показатель «Количественное определение». Проводят определение действующих веществ, антимикробных консервантов и других вспомогательных веществ, указанных в частной статье. Содержание определяемых веществ указывают в граммах, миллиграммах или единицах действия (ЕД) в 1 мл ЛС. Содержание действующих веществ должно быть от 90 до 110% от содержания, указанного на этикетке, если нет других указаний в частной статье. В проекте ОФС приведены определения для глазных примочек, глазных мягких ЛС, глазных пленок, глазных порошков, глазных тампонов, а также даны ссылки на общие фармакопейные статьи, по которым устанавливаются требования для указанных глазных ЛС. Таким образом, при подготовке проекта ОФС «Глазные лекарственные средства» были учтены требования ведущих зарубежных фармакопей. ЛИТЕРАТУРА 1. Отраслевой стандарт «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения». ОСТ 91500.05.001-00. 2. ОФС «Капли глазные». Государственная фармакопея СССР ХI изд., 1987. – С. 138. 4. Европейская фармакопея, 5 изд. 5. Британская фармакопея, 2007.

Информация ПРОГРЕССИВНЫЙ ПОДХОД РЕАЛИЗУЕТСЯ В МЕДИЦИНСКОЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ИНДУСТРИИ

11 апреля 2008 г. принято решение о формировании при Правительственном аналитическом центре Межведомственной комиссии по развитию медицинской и фармацевтической индустрии. Впервые в России создается работающая модель, которая должна обеспечивать высокий уровень управленческих решений в медицинской и фармацевтической индустрии. Созданная Межведомственная комиссия по развитию медицинской и фармацевтической индустрии свободна от отраслевых ограничений.

4

Ее основная цель – определение рекомендаций для Правительства Российской Федерации по реализации концепции социально-экономического развития страны до 2020 г. На смену разобщенности подходов в решении стоящих перед различными министерствами задач должно придти конструктивное взаимодействие. Разработка стратегии отрасли с помощью рекомендаций Межведомственной комиссии послужит примером реализации общественно-государственного партнерства при равноправном участии всех заинтересованных сторон.

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация © Н.Д. Бунятян УДК 615.2/.3.07:658.562](470)

ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРТИЗЫ И КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В СУБЪЕКТАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Н.Д. Бунятян ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора

В

обеспечении населения Российской Федерации (РФ) лекарственной помощью важное место принадлежит надежному функционированию системы контроля качества лекарственных средств (ЛС), гарантирующей эффективность и безопасность фармакотерапии. Регулирование отношений в сфере обращения ЛС является государственной функцией. Правовую основу данной деятельности в РФ устанавливают Федеральные Законы: № 86-ФЗ от 22.07.1998 «О лекарственных средствах» (его можно рассматривать как отраслевой) и № 184-ФЗ от 27.12.2002 «О техническом регулировании» (межотраслевой). ФЗ «О лекарственных средствах» определяет качество ЛС как соответствие его государственному стандарту качества; безопасность – как характеристику ЛС, основанную на сравнительном анализе его эффективности и оценки риска причинения вреда здоровью; эффективность – как характеристику степени положительного влияния на течение болезни. В настоящее время рассматривается вопрос о гармонизации термина «качество ЛС» с зарубежными нормами, в которых это понятие ассоциируется с пригодностью для применения в клинике [2]. Государственная система контроля качества, эффективности и безопасности ЛС в РФ действует на федеральном и территориальном уровнях. Федеральный уровень включает федеральные органы исполнительной власти, в компетенцию которых входит: • осуществление функций по выработке государственной политики и нормативно-правовому регулированию в сфере обращения ЛС – Минздравсоцразвития России; • государственный контроль и надзор в сфере обращения ЛС – Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (Росздравнадзор); • информационная система, обеспечивающая субъекты обращения ЛС необходимой информацией (Росздравнадзор).

Фармация №5, 2008

В соответствии с переданными Минздравсоцразвития РФ Росздравнадзору полномочиями, он выполняет контрольно-разрешительные функции государственной системы контроля качества, эффективности и безопасности ЛС [3]. Росздравнадзор осуществляет свою деятельность непосредственно, а также через подведомственные учреждения, территориальные органы и/или на основании договоров с научными, экспертными и другими организациями. В ведомственном подчинении Росздравнадзора находятся 6 государственных учреждений, обеспечивающих выполнение возложенных на него полномочий, в том числе ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» (ФГУ НЦЭСМП). На территориальном уровне государственная система контроля качества ЛС представлена территориальными органами исполнительной власти, в компетенцию которых входит осуществление государственного контроля и надзора в сфере обращения ЛС. Территориальные управления Росздравнадзора, организованные в 78 субъектах РФ, осуществляют функции по контролю и надзору в сфере здравоохранения и социального развития на территории соответствующего субъекта [3]. Порядок осуществления государственного контроля качества ЛС определен Приказом Минздравсоцразвития России № 734 от 30.10.2006 «Об утверждении административного регламента Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития по исполнению государственной функции по организации проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности ЛС». Согласно Приказу, организация проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности ЛС представляет собой функцию Росздравнадзора по привлечению экспертных организаций, ученых и специалистов (экспертов) для проведения исследований, анализа и оценки объектов экспертизы (ЛС) и подготовки заключений относительно этих объектов. Не допускается передача каких-либо государственных функций от Росздравнадзора экспертным организациям

5

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация или экспертам при организации проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности ЛС. Государственному контролю подлежат все ЛС, произведенные на территории РФ и ввезенные на территорию России. Государственный контроль ЛС осуществляется по следующим направлениям [1]: • организация проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности ЛС при государственной регистрации ЛС; • организация проведения экспертизы качества при осуществлении предварительного государственного контроля ЛС; • организация проведения экспертизы качества при осуществлении выборочного государственного контроля ЛС; • организация проведения экспертизы качества при осуществлении повторного выборочного государственного контроля ЛС; • осуществление сбора и анализ информации о нежелательных побочных реакциях (НПР) ЛС; • осуществление сбора и анализа информации о качестве ЛС. При государственной регистрации ЛС экспертиза качества, эффективности и безопасности проводится путем формирования экспертных заключений в отношении данных о производстве, методах контроля, результатах доклинических, фармакологических, токсикологических и/или клинических исследований ЛС, а также при недостаточной обоснованности или неоднозначном характере результатов оценки ЛС и при противоречии имеющихся экспертных заключений. Предварительный государственный контроль проводится для ЛС: • впервые произведенных и впервые ввозимых на территорию РФ; • произведенных по измененной технологии; • выпускаемых после перерыва производства более 3 лет; • для иных ЛС при выявлении ухудшения их качества. Выборочный государственный контроль осуществляется на основании планов, которые формируются Росздравнадзором по результатам сбора и анализа информации о качестве ЛС [1]. Повторный выборочный государственный контроль осуществляется в случае возникновения сомнений в качестве препарата у субъекта обращения ЛС. Порядок подтверждения соответствия продукции устанавливает Правительство РФ. В соответствии с Постановлением Правительства РФ № 766 от 07.07.1999 «Об утверждении перечня продукции, подлежащей декларированию соответствия, порядка принятия декларации о соответствии и ее регистрации» с 01.01.2007 г. на территории РФ введено обязательное декларирование ЛС.

6

Федеральным органом исполнительной власти, имеющим полномочия по проведению работ по аккредитации, определению общих метрологических требований к средствам, методам и результатам измерений и др., является Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии (Ростехрегулирование). Для обеспечения выполнения ФЗ «О лекарственных средствах» и ФЗ «О техническом регулировании» между Ростехрегулированием и Росздравнадзором заключено соглашение о взаимодействии в области оценки соответствия, стандартизации, предоставления и получения информации. ФЗ «О техническом регулировании» определяет понятие «декларирование соответствия» как форму подтверждения соответствия продукции требованиям технических регламентов и формулирует цели, принципы, формы, схемы декларирования, права и обязанности заявителя в области обязательного подтверждения соответствия и другие вопросы, возникающие при подтверждении соответствия. Под термином «подтверждение соответствия» подразумевается документальное удостоверение соответствия продукции или иных объектов требованиям технических регламентов, положениям стандартов, сводов правил или условиям договоров. Кроме того, ФЗ регламентирует цели и принципы в области аккредитации участников системы декларирования в сфере стандартизации, получения информации и т.д. Таким образом, соответствие ЛС, находящихся в обращении на территории РФ, действующим требованиям должно быть подтверждено «Декларацией о соответствии». Участники системы декларирования ЛС: декларант (организация-производитель ЛС или организация-поставщик ЛС), аккредитованная испытательная лаборатория и аккредитованный орган по сертификации. Аккредитация органов по сертификации ЛС и испытательных лабораторий по проведению испытаний ЛС осуществляется Ростехрегулированием и Росздравнадзором с привлечением в состав комиссии специалистов других заинтересованных органов исполнительной власти с последующей выдачей аттестатов аккредитации на срок, установленный законодательством – 3 года. В настоящее время в РФ аккредитовано 7 органов по сертификации продукции, которые проводят регистрацию деклараций о соответствии ЛС: ФГУ «Центр экспертизы и контроля качества медицинской продукции» Росздравнадзора (Москва) с 5 филиалами в Новосибирске, Санкт-Петербурге, Нижним Новгороде, Казани, Ставрополе, а также 6 ООО «Окружной центр сертификации» в федеральных округах РФ. В перечень испытательных лабораторий, аккредитованных в установленном порядке на техническую компетентность и независимость с целью последующей регистрации декларации о соответствии ЛС, включено 67 лабораторий, в том числе «Испытатель-

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация ный центр ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора» и 7 испытательных лабораторий – филиалов ФГУ НЦЭСМП, а также ряд лабораторий государственных и негосударственных учреждений и организаций [1]. Основная база Росздравнадзора для экспертизы ЛС в рамках государственного контроля – ФГУ НЦЭСМП, который имеет научно-методические, кадровые и технические возможности для осуществления практически всех видов экспертизы качества, эффективности и безопасности ЛС. Непосредственными исполнителями соответствующих экспертиз в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора являются его структурные подразделения: Институт клинической фармакологии, Институт стандартизации и контроля ЛС, Институт доклинической и клинической экспертизы ЛС, Центр мониторинга безопасности ЛС, филиалы ФГУ НЦЭСМП. В Институте стандартизации и контроля ЛС испытания осуществляются в лабораториях, часть из которых имеет закрепленную номенклатуру по отдельным группам ЛС: синтетические химико-фармацевтические препараты, витаминные и гормональные препараты, антибиотики, фитопрепараты, органотерапевтические и ферментные препараты, радиофармацевтические препараты. Остальные лаборатории специализируются по методам анализа: хроматографическим, биохимическим, микробиологическим и фармакологическим. На региональном уровне Росздравнадзор привлекает к осуществлению экспертизы ЛС аккредитованные испытательные лаборатории, имеющие достаточную техническую оснащенность и кадровый потенциал. При осуществлении контроля качества ЛС, находящихся в обращении на территории РФ, с целью предотвращения попадания на фармацевтический рынок фальсифицированной и недоброкачественной продукции Росздравнадзор и его территориальные органы работают в тесном сотрудничестве с филиалами ФГУ НЦЭСМП и центрами контроля качества ЛС. Согласно приказу Минздравсоцразвития России № 627 от 07.10.2005 «Об утверждении единой номенклатуры государственных и муниципальных учреждений здравоохранения» центры контроля качества и сертификации ЛС, информационно-методические центры по экспертизе, учету и анализу обращения

средств медицинского применения, контрольно-аналитические лаборатории являются учреждениями здравоохранения. Деятельность региональных центров как учреждений здравоохранения в субъекте РФ определяется Уставом, положениями и прочими документами, утвержденными органами исполнительной власти субъекта РФ, и как правило, включает проведение экспертизы ЛС, оказание консультационно-информационных услуг, обеспечение реактивами производственных аптечных организаций и т.п. В целях совершенствования системы экспертизы качества, эффективности и безопасности ЛС Росздравнадзором предложено организовать в структуре ФГУ НЦЭСМП территориальные филиалы с возложением на них соответствующих функций. На основании письменных обращений руководителей субъектов РФ, территориальных управлений Росздравнадзора и центров контроля качества ЛС в 2005–2006 гг. организовано 15 филиалов – обособленных подразделений ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора. Они осуществляют свою деятельность на территории соответствующего субъекта РФ на основании Устава ФГУ НЦЭСМП и Положения о филиале. Филиалы различаются по технической оснащенности и кадровому потенциалу. В начале 2006 г. после проведения аккредитации испытательных лабораторий – филиалов на соответствие требованиям ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 и ГОСТ Р 51000.4-96 и получения аттестата аккредитации на техническую компетентность и независимость Росздравнадзор начал привлекать их к проведению экспертизы качества ЛС в рамках предварительного, выборочного и повторного выборочного государственного контроля. Данные по объемам выполненного государственного контроля ЛС и количеству проведенных экспертиз для подтверждения декларации соответствия в филиалах ФГУ НЦЭСМП за 2006–2008 гг. см. в табл. 1. Действенным механизмом пострегистрационного контроля ЛС является мониторинг их качества, направленный на недопущение или своевременное изъятие из обращения в субъектах РФ фальсифицированных и недоброкачественных лекарств, когда уже имеется информация в базе данных Росздравнадзора, а также в отдельно выявленных случаях, связанТаблица 1

ОБЪЕМЫ ЭКСПЕРТИЗЫ КАЧЕСТВА ЛС В ФИЛИАЛАХ ФГУ НЦЭСМП В 2006–2008 гг. Количество серий по годам Вид экспертизы Государственный предварительный контроль Государственный выборочный контроль Государственный повторный выборочный контроль Экспертиза для подтверждения декларации

Фармация №5, 2008

2006

2007

2008 (5 мес.)

—

108

168

152

221

59

—

6

—

5564

14235

5916

7

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация Таблица 2

РЕЗУЛЬТАТЫ МОНИТОРИНГА КАЧЕСТВА ЛС, ПРОВЕДЕННОГО ФИЛИАЛАМИ ФГУ НЦЭСМП РОСЗДРАВНАДЗОРА В 2006–2008 гг. Выявлено серий ЛС Год

Всего серий фальсифицированных

недоброкачественных

сомнительной подлинности

2006

372318

25

925

63

2007

1 198805

9

2127

73

2008 (5 мес)

590432

9

884

27

Всего

2161555

43

3936

163

ных с их транспортировкой или хранением. Данные о результатах мониторинга качества ЛС, проведенного филиалами ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора в 2006–2008 гг., приводятся в табл. 2. С целью унификации процедуры мониторинга качества ЛС в филиалах Центром обработки данных ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора создана информационная система «Мониторинг качества ЛС». Тем не менее актуальной остается разработка единых подходов к мониторингу качества ЛС, находящихся в обращении на всей территории РФ. Для дальнейшего развития сети филиалов ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора в системе контроля качества, эффективности и безопасности ЛС необходимо решить следующие вопросы: • стабилизация финансово-хозяйственной деятельности филиалов; • совершенствование материально-технической базы контрольных лабораторий; • дооснащение лабораторий испытательным оборудованием; • расширение участия филиалов в системе госконтроля качества ЛС; • совершенствование взаимодействия филиалов с территориальными управлениями Росздравнадзора; • внедрение системы менеджмента качества и сертификации по ISO 9001 и т.д. Как отмечает руководитель Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития профессор Н.В. Юргель, «… система государственного контроля в сфере обращения ЛС требует совершенствования лабораторной базы. Сегодня только 9% лабораторий оснащены современным аналитическим оборудованием и могут проводить полный анализ ЛС, а 70% лабораторий оснащено неудовлетворительно, поэтому необходимо развитие лабораторной сети в каждом федеральном округе Российской Федерации» [3]. Подобная сеть официальных лабораторий качества медицинской продукции (Official Medicines Control Laboratories OMCL) впервые была основана в 1994 г.

8

Европейским директоратом по контролю качества медицинских средств (EDQM) Совета Европы для оптимизации и гармонизации процессов экспертизы и контроля качества ЛС во всех странах Европейского Союза. Основной целью создания сети OMCL являлось международное сотрудничество, взаимное признание результатов экспертиз, выполненных на национальном уровне для стран ЕС, иные интеграционные процессы в сфере контроля качества ЛС [4]. Развитие лабораторной инфраструктуры в России позволит минимизировать попадание на рынок лекарств контрафактной и недоброкачественной продукции, скоординировать административную, научную и техническую деятельность существующих и вновь создаваемых контрольно-аналитических лабораторий в субъектах РФ, что положительно скажется на системе лекарственного обеспечения населения. Таким образом, в системе контроля качества, эффективности и безопасности ЛС, сложившейся в настоящее время в Российской Федерации, филиалы ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора уже заняли определенное место. Они обеспечивают выполнение государственного контроля в рамках действующих нормативных документов, приближая испытательную лабораторию к организации-производителю ЛС и сокращая сроки выдачи результатов экспертизы. В то же время успешно функционирующие филиалы ФГУ НЦЭСМП могут быть перспективными для использования их в качестве базы при организации лабораторной сети в федеральных округах Российской Федерации. ЛИТЕРАТУРА 1. Косенко В.В. Деятельность Росздравнадзора по обеспечению качества медицинской продукции // Вестник Росздравнадзора. – 2008. – № 2. – С. 16–20. 2. Мешковский А.П. Регулирование лекарственного обращения: старые проблемы и новые веяния // Ремедиум. – 2007. – № 6. – С. 6–13. 3. Юргель Н.В. Об итогах и эффективности работы Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития и ее территориальных управлений в 2007 г. // Вестник Росздравнадзора. – 2008. – № 2. – С. 4–13. 4. Oresic L.S. Work of European Official Medicines Control Laboratories // Farmaceutski Glasnik. – 2006. – Vol. 62, Part 9. – Р. 488–490.

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация © Коллектив авторов, 2008 УДК 615.12:34

ПРАВОВОЙ СТАТУС САМОРЕГУЛИРУЕМЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ Н.Н. Карева, А.А. Лин, И.Е. Нильва Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

В

последние годы в российской экономике ленность их правового статуса и создавало опредеактивизировалась деятельность отраслевых ленные трудности в реализации их задач. общественных организаций. ПредпосылВ ст. 2 Закона дается четкое определение понякой развития общественных отраслевых организаций тия «саморегулирование»: «самостоятельная и иниципослужило также усилившееся влияние государства на ативная деятельность, которая осуществляется субъбизнес и необходимость в связи с этим ектами предпринимательской отстаивать его интересы во властных или профессиональной деПринятие нового закона структурах. Ограничение вмешательятельности и содержанием создает предпосылки для ства государства в экономическую декоторой являются разработповышения ответственности ятельность субъектов предпринимака и установление стандарфармацевтического бизнеса тельства, в том числе прекращение тов и правил указанной деизбыточного госрегулирования и разятельности, а также контроль витие саморегулирования, – одна из задач админист- за соблюдением требований указанных стандартов ративной реформы. Заинтересованность во взаимном и правил». Саморегулирование может осуществлятьсотрудничестве государства и бизнеса через отраслевые ся на условиях объединения субъектов предпринимаобщественные организации возрастает также в связи тельской или профессиональной деятельности в СРО. с перспективой вступления России в ВТО и необходи- Теперь в соответствии с Законом СРО признаютмостью разработки стандартов деятельности, гармо- ся некоммерческие организации, созданные в целях низированных с международными нормами. саморегулирования, основанные на членстве, объТак как фармацевтика – одна из наиболее регу- единяющие субъектов предпринимательской деятельлируемых отраслей российской экономики, разви- ности исходя из единства отрасли производства товатие механизмов саморегулирования здесь особен- ров (работ, услуг) или рынка произведенных товаров но актуально. Вступление в силу с 1 декабря 2007 г. (работ, услуг), либо объединяющие субъектов проФедерального закона РФ «О саморегулируемых ор- фессиональной деятельности определенного вида. ганизациях» (в дальнейшем – Закон) знаменует пеПринятию Закона предшествовало широкое обреход к новому этапу развития саморегулирования суждение законопроекта «О саморегулируемых оргав России. В предшествующий период в нашей стра- низациях» (Проект 348631-3), внесенного группой из не деятельность саморегулируемых организаций 70 депутатов Государственной Думы и 2 членов Совета (СРО) в сфере предпринимательства осуществля- Федерации Федерального собрания РФ. В ходе обсужлась в соответствии с отдельными положениями дения высказывались различные мнения: от отдельных «Гражданского кодекса Российской Федерации» замечаний и предложений по данному законопроеки следующих федеральных законов: «О некоммер- ту до отрицания необходимости принятия такого Заческих организациях» № 7-ФЗ от 12 января 1996 г.; кона. Особенно активное участие в обсуждении при«О торгово-промышленных палатах в Российской няли представители финансовой системы и рынка Федерации» № 5340-1 от 7 июля 1993 г.; «Об обще- ценных бумаг, которые доказывали, что соответствуственных объединениях» № 82-ФЗ от 19 мая 1995 г.; ющий Закон не должен распространяться на их де«Об объединениях работодателей» № 156-ФЗ от ятельность. Их мнение было услышано и отчасти при27 ноября 2002 г.; «О государственной поддержке нято законодателями. Так, п.3 ст. 3 принятого Закона малого предпринимательства в Российской Феде- гласит: «действие настоящего Федерального Закона рации» № 88-ФЗ от 14 июня 1995 г.; «О професси- не распространяется на саморегулируемые организаональных союзах, их правах и гарантиях деятель- ции профессиональных участников рынка ценных буности» № 10-ФЗ от 12 января 1996 г. Отсутствие маг, акционерных инвестиционных фондов, управляотдельного законодательного акта, регламентиру- ющих компаний и специализированных депозитариев ющего деятельность СРО, обусловливало неопреде- инвестиционных фондов, паевых инвестиционных

Фармация №5, 2008

9

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация фондов и негосударственных пенсионных фондов, жилищных накопительных кооперативов, кредитных организаций, бюро кредитных историй». В текст Закона по сравнению с законопроектом внесены изменения, ужесточающие требования к СРО. Так, в законопроекте было определено минимальное количество субъектов предпринимательской деятельности, достаточное для создания СРО, – 10; в ст. 3 п. 3 пп. 1 принятого Закона это количество возросло до 25 субъектов. Очень важным представляется введение Законом в качестве обязательного требования к СРО обеспечения «дополнительной имущественной ответственности каждого ее члена перед потребителями произведенных товаров (работ, услуг) и иными лицами посредством установления в отношении членов СРО требования страхования» (ст. 3 п. 3 пп. 3). При этом в ст. 13 Закона определены способы обеспечения имущественной ответственности членов СРО перед потребителями, которые СРО вправе выбрать: создание системы личного и (или) коллективного страхования; формирование компенсационного фонда. Этой же статьей определены механизмы и процедуры использования указанных способов обеспечения имущественной ответственности СРО. Напомним, что в соответствующем законопроекте (ст.3) похожее требование было сформулировано весьма расплывчато: «наличие у СРО механизмов обеспечения ответственности ее участников перед потребителями». Кроме того, в ст. 19 законопроекта предусматривалось, что для включения в единый государственный реестр СРО необходимо представление «документов, подтверждающих наличие у некоммерческой организации механизма обеспечения ответственности участников некоммерческой организации перед потребителями произведенных ими товаров (работ, услуг)». Таким образом, по сравнению с законопроектом в самом Законе закреплена именно дополнительная имущественная ответственность каждого члена СРО перед потребителями произведенных ими товаров (работ, услуг). Также Закон определяет требования к созданию и деятельности СРО, источники формирования имущества СРО, механизмы внутреннего управления и государственного контроля за их деятельностью, правила ведения государственного реестра СРО. Попробуем проанализировать соответствуют ли ведущие СРО, действующие на фармацевтическом рынке России (фармацевтические СРО), требованиям нового Закона. В секторе фармацевтического производства наиболее авторитетной СРО считается Ассоциация российских фармацевтических производителей (АРФП), объединяющая в своем составе 12 крупнейших фармацевтических производителей, на долю которых приходится около 40% производства лекарственных средств в России. Важнейшая задача

10

АРФП заключается в содействии переходу российских производителей на стандарты GMP (надлежащая практика производства) и ISO. АРФП активно разрабатывает стандарты и правила, обязательные для ее членов. Так, например, только в 2007 г. АРФП подготовила и приняла «Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств» и «Руководство по составлению сведений о валидации процесса производства лекарственных препаратов для включения в регистрационное досье». В секторе дистрибьюции крупнейшей СРО является Союз профессиональных фармацевтических организаций (СПФО), объединяющий 56 участников фармацевтического рынка, на долю которых приходится свыше 50% общего объема реализации лекарственных средств в России. Деятельность СПФО организована по принципу реализации конкретных программ и проектов по ключевым вопросам развития фармацевтического рынка, в первую очередь по обеспечению качества лекарственных средств и фармацевтических услуг. В этой связи в настоящее время СПФО реализует следующие программы и проекты: «Добровольное декларирование происхождения лекарственных средств – Знак качества СПФО»; разработка технических регламентов, включая создание действенного механизма контроля за качеством лекарственных средств на рынке; разработка и обеспечение принятия национальных стандартов в области оптовой и розничной торговли лекарственными средствами; вопросы сертификации лекарственных средств в регионах. В сфере фармацевтического ритейла крупнейшая СРО – Российская ассоциация аптечных сетей (РААС). Учредители РААС – ведущие российские розничные фармацевтические предприятия. По состоянию на январь 2007 г. в состав РААС входят 20 аптечных сетей, которые в совокупности управляют более чем 3000 аптечными организациями в различных регионах России. Участники РААС подписали меморандум по соблюдению надлежащей аптечной практики, создали систему самоконтроля, обеспечивающую высокое качество оказания фармацевтической помощи. Они добровольно приняли на себя обязательства по соответствию более высоким стандартам лекарственного обеспечения, чем это указано в требованиях госрегулирования. Установленные правила в определенной степени ограничивают текущие конкурентные возможности участников РААС, однако они ведут к усилению конкурентных позиций участников РААС в стратегической перспективе, поскольку служат интересам отдельных потребителей и общества в целом. Следует отметить, что из всех фармацевтических СРО только в РААС имеется специально аккредитованный Инспекторат, подписавший соглашение с Росздравнадзором о сотрудничестве в области соблюдения надлежащей аптечной

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Актуальная информация практики и контроля соответствия членов РААС лицензионным требованиям. Инспекторат осуществляет контролирующие функции, в частности проверку пакета документов, подаваемых в Росздравнадзор на предмет лицензирования фармацевтической деятельности. За время работы Инспекторату удалось добиться либерализации и ускорения процесса лицензирования. РААС принимает активное участие в разработке Технического регламента по безопасности лекарственных средств и национального стандарта надлежащей аптечной практики, входит в состав координационных советов Минздравсоцразвития по противодействию распространению недоброкачественных и фальсифицированных лекарственных средств и по совершенствованию порядка розничной торговли лекарственных средств на территории РФ. Согласно результатам проведенного анализа ведущих фармацевтических СРО, все они в той или иной мере не соответствуют требованиям Закона. Наиболее благополучно обстоит дело с установлением собственных стандартов и правил. С другими требованиями Закона СРО существуют проблемы. Так, у АРФП и РААС не хватает количества членов (25), определенного Законом для внесения в «Государственный реестр саморегулируемых организаций». Самым сложным вопросом для фармацевтических СРО является выполнение требования обеспечения дополнительной имущественной ответственности каждого ее члена перед потребителями произведенных товаров (работ, услуг) и иными лицами. В настоящее время такого механизма у ведущих фармацевтических СРО нет. Более того, не удалось найти информации даже концептуального характера о подходах решения этой проблемы. Также представляется важным выполнение всех требований Закона об обеспечении доступа к информации о деятельности СРО. Так, судя по сведениям, представленным на сайтах ведущих фармацевтических СРО, из 14 требований ст.7 Закона выполняются далеко не все. Ведущие фармацевтические СРО в настоящее время обеспечивают доступ к следующей информации: о составе своих членов; условиях членства в саморегулируемой организации; содержании стандартов и правил саморегулируемой организации; структуре и компетенции органов управления и специализированных органов саморегулируемой организации; ходе и результатах экспертизы нормативного правового акта, в проведении которой СРО принимала участие. Практически отсутствует информация, доступ к которой также предусматривается Законом, а именно: об условиях, способах и порядке обеспечения ответственности членов саморегулируемой организации перед потребителями произведенных ими товаров (работ, услуг); членах, прекративших свое членство в саморегулируемой организации, и об основаниях прекращения их членства, а также о субъ-

Фармация №5, 2008

ектах предпринимательской или профессиональной деятельности, вступивших в саморегулируемую организацию; принятых в связи с осуществляемыми саморегулируемой организацией функциями органов управления саморегулируемой организации; случаях привлечения членов саморегулируемой организации к ответственности за нарушение требований законодательства Российской Федерации в части осуществления предпринимательской или профессиональной деятельности, стандартов и правил саморегулируемой организации; любых исках и заявлениях, поданных саморегулируемой организацией в суды; составе и стоимости имущества компенсационного фонда саморегулируемой организации; аттестатах, выданных членам саморегулируемой организации или их работникам по результатам обучения; результатах проведенных проверок деятельности членов саморегулируемой организации; годовой бухгалтерской отчетности саморегулируемой организации и результатах ее аудита. Кроме того, в фармацевтических СРО не сформированы предусмотренные ст. 6 Закона третейские суды для разрешения споров, возникающих между членами саморегулируемой организации, а также между ними и потребителями произведенных членами саморегулируемой организации товаров (работ, услуг), иными лицами, в соответствии с законодательством о третейских судах. Имеются проблемы с соответствием ст. 17 Закона о постоянно действующих коллегиальных органах управления фармацевтических СРО, которые должны состоять из физических лиц – членов саморегулируемой организации и (или) представителей юридических лиц – членов саморегулируемой организации, а также независимых членов. Таким образом, ведущим фармацевтическим СРО предстоит большая работа по приведению своих организаций в соответствие с требованиями Закона. Вместе с тем новое правовое пространство саморегулирования на российском рынке создает новые предпосылки для повышения социальной ответственности бизнеса. SUMMARY The legal status of self-regulated organizations N.N. Kareva, A.A. Lin, I.Ye. Nilva The activity of industrial public organizations has recently increased in Russian economy, which are caused by the economic and political background. The increasing pharmaceutical market consolidation requiring the counteraction of unfair competition, as well as the generation of intraindustrial quality standards and the creation of equal conditions for conscientious business are an important motivation for amalgamation of industrial public organizations. In addition, these processes resulted from the increased influence of the government on business and from the necessity of asserting its interests in the authoritative structures. Russia’s federal law “On Self-Regulated Organizations” that came into effect on December 1, 2007, signifies the transition to a new developmental stage of self-regulation in Russia, particularly in pharmaceutics that is one of the most regulated trades. The new legal space of self-regulation on the Russian market creates qualitative conditions for increasing the social responsibility.

11

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация © Р.А. Волкова, Т.А. Бектимиров, 2008 УДК 615.33.07

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Р.А. Волкова, Т.А. Бектимиров Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва

В

свое время Великобритания инициировала разработку правил хорошей аналитической практики (хорошей практики аналитических измерений) и определила необходимые для этого 6 принципов [13]: аналитические измерения должны соответствовать установленным целям; аналитические измерения должны проводиться с помощью методов и оборудования, которые проверены на соответствие поставленной задаче; персонал, проводящий аналитические измерения, должен быть квалифицированным и компетентным для выполнения работы, а также должен показать, что он может проводить анализ надлежащим образом; должна быть регулярная независимая оценка технического уровня лаборатории; аналитические измерения, проведенные в разных лабораториях, должны быть согласованы; организации, проводящие аналитические измерения, должны иметь систему контроля качества аналитических работ и систему обеспечения качества. С проведением валидации связано решение практически всех перечисленных задач. Валидация метода (методики) – это процесс установления пригодности метода или методики для оценки качества конкретной продукции в соответствии с требованиями нормативных документов [1, 11, 16, 17, 23]. В руководстве EURACHEM дано еще одно значение валидации: процесс установления характеристик метода или методики. Кроме того, в данном руководстве процесс подтверждения соответствия методики предназначенной цели (verification) также рассматривается как ее валидация. При валидации методик устанавливаются специфичность, линейность, предел обнаружения, предел количественного определения, диапазон определяемых величин, правильность, прецизионность (повторяемость, промежуточная прецизионность и воспроизводимость), устойчивость. Валидация методики позволяет в конечном итоге оценить неопределенность получаемых результатов при конкретном уровне достоверности. Использование стандартных и контрольных образцов, аттестованных валидированными методиками, дает основу для проведения внутрила-

12

бораторного контроля качества проведения аналитических работ. Таким образом, валидация является важнейшей частью системы обеспечения качества. За рубежом выделяют следующие стандарты, руководства и рекомендации, необходимые для системы обеспечения качества: требования к характеристикам методики; рекомендации по их установлению; рекомендации по оценке неопределенности результатов измерений; способ оценки прецизионности и правильности; оценка качества аналитических работ; требования к компетентности испытательных лабораторий [14–18, 20]. У нас в стране действуют стандарты [5, 7, 13] как аутентичные переводы соответствующих зарубежных [9, 20, 21], а также переводы стандартов по оценке качества аналитических работ для клинической химии. Необходимость валидации не подвергается сомнению, но когда и как ее проводить до сих пор остается неясным для многих аналитиков. Как правило, это связано с разной трактовкой терминов, касающихся характеристик методики (особенно прецизионности и правильности), и соответственно разным проведением их оценки в различных областях аналитических работ. Поэтому очень важно максимально подробно разработать использующуюся терминологию. При определении характеристик методики (специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, диапазон определяемых величин, правильность и прецизионность) целесообразно взять за основу термины, принятые международной конференцией по гармонизации (ICH), причем в отношении показателей точности – правильности и прецизионности следует использовать термины ГОСТ Р ИСО 5725, так как их изложение соответствует смыслу документов ICH 2QA и 2QB. Данный ГОСТ рассматривает прецизионность при 2 условиях: повторяемость (при анализе одних и тех же образцов одной методикой за короткий промежуток времени в одной лаборатории в одинаковых условиях – одним исполнителем, на одном оборудовании, с одними реактивами) и воспроизводимость (при анализе одних и тех же образцов одной

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация методикой в разных лабораториях). Если анализ одних и тех же образцов проводится в одной лаборатории одной методикой, но разными исполнителями на разном оборудовании, с разными реактивами в течение длительного промежутка времени, то вводится понятие «промежуточная прецизионность» с указанием того, какие условия меняются. Каждое предприятие должно оценивать промежуточную прецизионность, если анализ проводится в одной лаборатории, и оценивать воспроизводимость, если метод используется в двух лабораториях, например, на производстве и в отделе контроля качества (ОКК). Для фармакопейных методов, т.е. методов использующихся как минимум в двух лабораториях – в ОКК и в контрольном органе, должна оцениваться воспроизводимость с участием этих лабораторий. Утверждение стандарта ИСО 5725 как аутентичного перевода международного стандарта впервые в стране вводит понятие опорное значение, что позволяет в отсутствии эталонов и знаний об истинной величине оценивать правильность метода в различных лабораториях относительно этого опорного значения и является поводом начать разговор о таких понятиях, как погрешность и неопределенность. Перевод стандарта ISO 5725 на русский язык и признание его отечественным стандартом имеет большое значение, так как в нем впервые сказано, что сравнивать прецизионность и правильность методики в разных лабораториях можно при соблюдении конкретных условий сбора информации – повторяемости и воспроизводимости. Только в этом случае полученные результаты можно использовать для аттестации методики и квалифицированного установления ее точностных характеристик, что в свою очередь позволяет использовать их практически. Стандарты ИСО 5725 не рассматривают процесс создания методики и такие вопросы, как: постановка измерительной задачи, определение объекта измерений, измеряемой величины, условий измерения, факторов, влияющих на результаты измерения; выбор метода и методики, включая отбор проб и пробоподготовку, выбор измерительного и испытательного оборудования; оценка градуировочных характеристик. Перечисленные вопросы решаются при разработке методики и проведении ее валидации. Стандарт ISO 5725 относится прежде всего к методам испытаний и косвенным измерениям, его цель – сделать возможным сравнение результатов измерения, получаемых одной методикой на одинаковых объектах в разных испытательных лабораториях. В связи с этим более подробно остановимся на терминах «метод», «методика», «испытания». В отечественной метрологии в свое время были приняты 3 понятия: «принцип», «метод» и «методика». Принцип измерения – это физическое явление или эффект, на котором основано измерение. Метод

Фармация №5, 2008

измерения означает «прием или совокупность приемов сравнения измеряемой физической величины с ее единицей в соответствии с реализованным принципом измерения» (РМГ 29-99 поз.7.2). Методика выполнения измерений подразумевает «совокупность конкретно описанных операций, используемых при выполнении конкретных измерений в соответствии с принятым методом (Международный словарь VIM). РМГ 29-99 и ГОСТ Р 8.563-96 [6] дополняют это определение словами о «получении результатов измерений с гарантированной точностью». К сожалению, в отечественных документах понятия «метод измерения» и «методика измерений» не разделены (это относится и к оригиналам документов), используется только термин «метод измерения». Более того, в этих документах понятие «метод измерения» включает понятие «метод испытания», несмотря на то что для метода испытания важно прежде всего воспроизведение известных условий с заданной точностью. По существу в аналитической работе при контроле микробиологических препаратов мы имеем дело с методами испытаний, которые часто называем методами определения или даже методами контроля, несмотря на то, что последнее не согласуется с метрологическим пониманием термина «контроль». Принцип этих методов основывается на физических, химических, физико-химических или биологических свойствах, которые определяют исследуемый компонент (аналит). Кроме того, эти методы, как правило, требуют сложной многоэтапной пробоподготовки, предваряющей процедуру собственно измерения, что позволяет отнести их по классификации к эмпирическим методам [15]. Распространять требования к методике измерения на требования к методике испытания представляется не вполне корректным, хотя описание методики в любом случае должно соответствовать требованиям к написанию стандартной операционной процедуры. Специфичность определяется при выборе метода, она должна подтверждаться при проведении валидации конкретной методики вместе с установлением остальных ее характеристик. Наш опыт показывает, что валидации подлежит в сущности не просто метод, а аналитическая система, куда входят объект измерения (испытуемый материал), аналит (определяемый компонент) и собственно процедура. Аналогичный подход к валидации метода рассматривается в руководстве IUPAC [22]. Совокупность объекта измерения и аналита представляет собой измеряемую величину. Примером может служить определение белка в медицинских биологических препаратах: вакцины, содержащие мертиолят или фенол, анатоксины, содержащие мертиолят и низкомолекулярные компоненты: в таких препаратах содержание белка можно определять только после удаления указанных консервантов и низкомолекулярных компонентов.

13

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация Результаты определения белка могут различаться в пределах 40% в зависимости от выбора метода аттестации стандартного образца, соответственно будут различаться результаты определения белка в субстанции препарата, вследствие чего будут отличаться и дозы препарата [2]. В этой ситуации дозы одноименных препаратов различных производителей могут быть несопоставимы. Различия в результатах аттестации стандартного образца белкового препарата, полученных различными методами, обусловлены тем, что разные методы отражают разные свойства белка: метод Лоури – содержание ароматических аминокислот и пептидных связей, спектрофотометрический метод – содержание ароматических аминокислот. Иными словами, несмотря на то, что оба метода используются для определения белка, измеряемые величины в обоих методах, по существу, разные. Таким образом, правильное описание измеряемой величины необходимо для адекватной оценки показателя. Работа по валидации методик достаточно дорогостоящее мероприятие, лаборатория вынуждена сохранять баланс в отношении затрат на проведение валидации и получаемых сведений. Неразумно оценивать точность, используя сложный алгоритм, если известно, что исходные данные довольно грубые, или если требуемая точность измерений невысока [4]. Кроме того, остается актуальной проблема обоснования выбора и применимости конкретного алгоритма обработки данных, а также проверки соответствия реальных исходных данных требованиям формального аппарата [9], так как распространенной ошибкой является недооценка правильного планирования эксперимента в расчете на то, что статистическая обработка компенсирует допущенные недочеты. Можно указать 2 причины, по которым проведение полноценной валидации затруднено. Во-первых, высокая стоимость и длительность квалифицированных работ по валидации методики. Поэтому объем валидации должен решаться с учетом соотношения польза – стоимость, т.е. на основе анализа рисков. Во-вторых, отсутствие на местах специалистов в области метрологии и статистики, что не позволяет квалифицированно планировать эксперимент по оценке точностных показателей и соответственно проводить статистическую обработку. Статистические методы, которые даются в учебниках по статистике [3, 8], а также общие рекомендации руководств ICH, Eurachem и т.д. важны для понимания вопроса, но только специалист в области метрологии и прикладной математики может учесть все особенности при планировании эксперимента, а это основа для последующих расчетов. Например, в биохимии для определения белка существуют разные методы (Лоури, биуретовый, по белковому азоту, спектрофотометрический и др.), и только специалист может квалифицированно выбрать метод, максимально правильно отражающий дейст-

14

вительное содержание белка в конкретном препарате. Так, и в математической статистике для оценки стандартного отклонения могут использоваться разные подходы. Все зависит от способа получения результатов (способа сбора информации). Поэтому так важно, чтобы планирование экспериментов в области валидации осуществляли совместно специалисты в конкретной аналитической области (биохимии, химии, физики, иммунологии т.д.) и специалисты в области метрологии и математической статистики. Первые формулируют вопросы: что является измеряемой величиной, специфичностью, а следовательно, определяют влияющие факторы, предположительную область линейности и диапазон определяемых величин. Специалисты в области метрологии и статистики планируют эксперимент так, чтобы обеспечить наименьшие затраты и квалифицированно использовать методы математической статистики. В идеале аналитики должны обладать базовыми знаниями в области статистики, а метрологи, помимо знания математической статистики, должны обладать базовыми знаниями в соответствующей аналитической области. Если в группе валидации отсутствуют метрологи-статистики необходимой квалификации, при проведении валидации необходимо обеспечить максимально подробное документирование всего процесса валидации – от выбора используемых образцов и пробоотбора до расчетов и оформления конечных результатов, оборудование должно быть проверено, персонал – обучен и обладать достаточным опытом и знаниями в соответствующей области. ЛИТЕРАТУРА 1. Аладышева Ж.И., Береговых В.В., Мешковский А.П., Левин Л.М. Основные принципы проведения валидации на фармацевтическом производстве. – М.: Издательский дом «Русский врач», 2005. – 186 с. 2. Волкова Р.А., Бектимиров Т.А. Валидация количественных аналитических методик. Опыт применения МУ 3.3.2.1886-04. Биопрепараты. – 2006; 4. – С. 25–26. 3. Гланц Стентон. Медико-биологическая статистика. – М.: Практика, 1999. – 455 с. 4. Грановский В.А., Сирая Т.Н. Методы обработки экспериментальных данных при измерениях. – Л.: Энергоатомиздат, Ленинградское отд., 1990. 5. ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. 6. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений. Изд. 2002 г. с Изменениями № 1 и 2, принятыми в мае 2001 и августе 2002 гг. 7. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. 8. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. – М.: Мир, 1994. – 270 с. 9. Довбета Л.И., Лячнев В.В., Сирая Т.Н. Основы теоретической метрологии: Учебное пособие / Под ред. В.В. Лячнева. – СПб., СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 1999. 10. Международный словарь терминов в метрологии VIM (Русскоангло-франко-немецко-испанский словарь основных и общих терминов в метрологии. – ИПК Издательство стандартов, 1998). 11. Методические указания 3.3.2.1886-04. Организация, проведение и представление результатов валидации методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП. – М.: Минздрав России, 2004.

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация 12. РМГ 29-99. ГСИ. Метрология. Основные термины и определения. 13. Руководство ЕВРАХИМ/СИТАК. Количественное описание неопределенности в аналитических измерениях. Перевод с англ. / Под ред. Л.А. Конопелько. – СПб.: ВНИИМ им. Д.И. Менделеева, 2002. 14. CITAC/EURACHEM, 2000/ Guide for quality in analytical chemistry. EUROCHEM, 2002 edition. 15. EURACHEM/CITAC Guide, 2000. Quantifying uncertainty in analytical measurement. EURACHEM 2000 second edition. 16. EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method valydation and related topics, 1998. 17. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures, ICH-Q2A, 1994, 5p.

18. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, 1996, 8p. 19. ISO 3534-2: 1993 Statistics-Vocabulary and symbols-Part 2: Statistical quality control. 20. ISO 5725 (parts 1-6): 1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. 21. ISO/IEC 17025:2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. 22. IUPAC 2002. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of analysis methods // Pure Appl. Chem. – 2002. – Vol. 74, № 5. – Р. 835–855. 23. A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements. Part 2: Validation // WHO. – Geneva, 1999.

© Коллектив авторов, 2008 УДК 615.2/.3:547.96].074

ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА В БИОПРЕПАРАТАХ Н.М. Пустошилова, Л.В. Шуленина, О.Б. Рунова, Р.А. Волкова Центр инженерной иммунологии, Институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, Москва

М

ногие современные медицинские пре- и распространенных аминокислот (аланин, лизин) параты – это белки, гликопротеины или с добавлением к пробе внутреннего референс-станконьюгаты белка с различными веще- дартного образца, например норлейцина [18]. Метод ствами, например с полиэтиленгликолем. При оп- требует специального дорогостоящего оборудования. Метод Бредфорда [3] основан на связывании ределении специфической активности фармацевтического ингредиента в конечном продукте большое с белками окрашенного реагента Кумасси бриллиантового голубого G-250 (краситель значение имеет задача количеств анионной форме взаимодейсвенного определения не только Дана оценка биологической активности, но и твует с основными аминокислосуществующих методов концентрации белка. Существутами в белке) и завоевал большую определения белка ет достаточно много методов оппопулярность благодаря простоте ределения концентрации белка. исполнения. Однако метод БредМетод Кьельдаля [9] и метод с реактивом Нессле- форда зависит от аминокислотного состава и размера ра основаны на определении белкового азота (по ио- белковой молекулы белка [8, 19], пептиды менее 3 кД нам аммония) после минерализации пробы в серной не связываются с красителем [4, 5, 17]. Воспроизвокислоте. Техническая сложность метода Кьельдаля димость метода не очень высокая. ограничивает его применение при производстве биоМетод Лоури и его модификация с использовапрепаратов. Кроме того, при анализе белков, содер- нием бицинхониновой кислоты (БЦ-кислота) осножащих значительные примеси азотистых соедине- ваны на восстановлении белком ионов меди [10, 21]. ний, а также белков с необычным аминокислотным Основной вклад в результаты анализа вносят остатсоставом могут возникнуть проблемы при интер- ки ароматических аминокислот и пептидная связь. претации результатов. Общий аминокислотный ана- Чувствительность метода около 20 мкг/мл. В модилиз обладает достаточной чувствительностью [6, 24] фицированном методе [23] ионы меди образуют коми предложен для определения концентрации бел- плекс с БЦ-кислотой, что приводит к повышению ка [10, 22]. Для хорошо охарактеризованных биопре- чувствительности. В этих методах особенности испаратов ( рекомбинантные ростовые факторы и ци- следуемого белка (гомогенность и аминокислотный токины) концентрация белка в растворе может быть состав) проявляются меньше, чем в методе Бредфоропределена измерением количества стабильных да [8,19], однако на результаты анализа оказывают

Фармация №5, 2008

15

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация влияние различные вещества. Биуретовый метод основан на образовании в щелочной среде цветного комплекса ионов меди с пептидными связями молекулы белка [7]. Чувствительность метода не высока – около 1 мг/мл. Медицинские биологические препараты являются сложными биологическими объектами. Они могут содержать самые различные вспомогательные вещества, что в совокупности может многообразно влиять на результаты определения белка. Поэтому выбор метода определения белка и его применение для конкретных целей должен быть обоснован. В ряде случаев при характеристике конкретного препарата может потребоваться модификация или специальная пробоподготовка. При разработке процесса производства и оценке характеристик биопрепарата важно выбрать наиболее точный метод для оценки концентрации белка в препарате. Состав белка, являющегося гетерогенным полимером, может сильно влиять на результаты, полученные разными методами или при использовании разных калибрантов. Если используемый калибрант не соответствует тестируемой пробе, то полученные результаты не будут соответствовать действительности. Концентрация калибранта должна быть установлена с помощью обоснованного метода. Для очищенных белков может быть использован коэффициент удельной экстинкции. При приготовлении калибранта для нового разрабатываемого продукта концентрацию белка можно установить, например, с помощью аминокислотного анализа [10, 8]. Неточность определения концентрации белка в биопрепарате может привести к ошибке при интерпретации результатов в процессе производства. Рассмотрим 3 публикации по данной проблеме. Jenzano J.W. и др. [8] сравнили 5 методов определения концентрации белка при исследовании слюны человека: биуретовый, Лоури в редакции Peterson [16], модификация Лоури с БЦ-кислотой и метод Бредфорда [2, 19] с использованием фосфорной кислоты (измерение оптической плотности при длине волны 595 нм) и соля-

ной кислоты (измерение оптической плотности при 620 нм). Слюна человека представляет собой биологическую жидкость, содержащую свыше 200 различных белков, в том числе белки, богатые пролином. В первой серии экспериментов исследовали слюну 20 пациентов с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в качестве калибранта. Обнаружили, что наиболее высокий средний показатель по содержанию белка в слюне дал биуретовый метод – 2,37 мг/мл, а самый низкий – метод Бредфорда в присутствии фосфорной кислоты – 0,67 мг/мл. Метод Лоури и его модификация дали другие результаты – 1,12 и 1,11 мг/мл, соответственно. Коэффициент вариации оказался меньше всех при использовании биуретового метода, больше всех – для метода Бредфорда в присутствии фосфорной кислоты. Корреляция результатов, полученных по методу Лоури и биуретовым методом, не наблюдалась. Далее авторы исследовали смесь слюны 20 пациентов, определив в ней общую концентрацию белков по аминокислотному анализу (1,95 мг/мл). В качестве калибрантов использовали БСА, поли-L-лизин (молекулярная масса 71000), трипсиноген, лизоцим и рибонуклеазу (табл. 1). Из полученных данных видно, что только биуретовый метод со всеми используемыми калибрантами дает результаты, совпадающие с величиной, полученной по аминокислотному анализу. Данные других методов отличаются от этой величины и зависят от использованного калибранта. Наименьшее значение концентрации белка получено модифицированным методом Лоури с лизоцимом в качестве стандартного образца (0,74 мг/мл), наибольшее – методом Бредфорда в присутствии соляной кислоты c поли-Lлизином в качестве стандартного образца (65,5 мг/мл). Низкое содержание белков в слюне человека, полученное методом Лоури, совпадает с результатами исследований этим же методом сложных биологических жидкостей [11, 15]. Возможно, это связано с низким содержанием в данных объектах белков, имеющих в своем составе ароматические аминокислоты. Не пригоден для определения белка в сложных белковых смесях и метод Бредфорда, вследствие метахромазии, наТаблица 1

СОДЕРЖАНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА (В МГ/МЛ) В ПРЕПАРАТЕ СЛЮНЫ ЧЕЛОВЕКА, ОПРЕДЕЛЕННОЕ РАЗНЫМИ МЕТОДАМИ [7] Метод

Калибранты БСА

лизоцим

трипсиноген

поли-L-лизин

рибонуклеаза

Биуретовый

2,23

1,90

2,33

2,13

2,23

Лоури

1,08

0,90

1,04

2,42

0,93

Модифицированный Лоури

1,08

0,74

0,98

6,00

0,88

Бредфорд (+ HCl)

0,94

3,60

4,04

65,5

43,7

Бредфорд (+ H3PO4)

0,96

1,40

2,68

3,54

4,16

16

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация Таблица 2

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ СРЕДЫ НА ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА В РАСТВОРЕ [12] Метод Лоури

Метод Бредфорда

содержание, мкг/мл

содержание, мкг/мл

Состав среды

теоретическое

экспериментальное

отклонение, %

теоретическое

экспериментальное

отклонение, %

Этанол

100

122

+22

500

514

+3

50 мМ Na-цитратфосфатный буфер, рН 4,2

100

102

+2

500

455

-9

1М трис-HCl буфер, рН 9,0

100

127

+27

500

471

-6

2М Na-цитратный буфер, рН 3,0

100

81

-19

500

473

-5

блюдаемой для Кумасси бриллиантового голубого G-250 при связывании с белком [7, 10, 20, 21]. Согласно представленным материалам, для определения концентрации белка в продукте сложного состава оптимальным можно считать биуретовый метод. Наиболее часто используемые для определения белка методы Лоури и Бредфорда были изучены на применимость их в процессе получения глюкоамилазы из культуральной среды Aspergillus awamori NRRL 3112 [13]. Поскольку оба метода имеют ограничения, авторы вначале исследовали влияние на них используемых в технологии ингредиентов (этанол и буферные растворы), подвергая анализу стандартные растворы альбумина с концентрацией 100 и 500 мкг/мл (табл. 2). Отклонение от теоретической величины меньше при использовании метода Бредфорда (среднее значение – 4 %). 3 ингредиента (этанол, 1 М трис и 2 М натрий цитрат) значительно влияют на определение белка методом Лоури, и отсутствие данных о содержании этих компонентов в промежуточных продуктах в процессе производства не позволяет исключить это влияние путем построения калибровочного графика в присутствии этих интерферирующих компонентов. В связи с этим для оценки белкового баланса на отдельных стадиях при производстве глюкоамилазы может быть использован метод Бредфорда, но не метод Лоури. Однако общая концентрация белка в пробах, определяемая на всех этапах производства – осветление культуральной жидкости (КЖ), осаждение этанолом, супернатант – в 2–4 раза выше при использовании метода Лоури, чем при определении методом Бредфорда, т.е. методом Бредфорда не были выявлены все белки, которые выявлялись методом Лоури. На каждой стадии процесса производства невыявляемые методом Бредфорда белковые компоненты разные. На стадии осаждения этанолом таким компонентом, вероятно, является выпавший в оса-

Фармация №5, 2008

док денатурированный белок, который не взаимодействует с красителем; в осветленной КЖ – это низкомолекулярные пептиды (менее 6 кД). Поскольку метод Бредфорда не обнаруживал низкомолекулярные пептиды, следовательно, с его помощью нельзя оценить один из важных показателей производственного процесса – степень очистки глюкоамилазы. Метод Лоури, который наиболее полно отражает содержание всех пептидных компонентов в исходном сырье (КЖ) и конечном продукте (раствор белков в 50 мМ Na-цитрат-фосфатном буфере, рН 4,2), пригоден для общей оценки степени очистки продукта. Это подтвердили при оценке степени очистки глюкоамилазы по анализу исходного и конечного продуктов методом ВЭЖХ. Таким образом, в процессе разработки технологии получения глюкоамилазы для объективной оценки процесса использовали метод Бредфорда, оценивая белковый баланс и воспроизводимость результатов на отдельных стадиях, и метод Лоури – для общей оценки степени очистки продукта. В работе M. I. Knight и P. J. Chambers [10] рассмотрены проблемы, связанные с методом оценки содержания белка в конечном продукте – рекомбинантном ферменте поли(аденозин дифосфат-рибоза) полимераза-І (PARP-1), играющем ключевую роль в процессах интеграции ДНК и структуре хроматина. Клонировали ген фермента и экспрессировали белок в бакуловирусной системе. В приготовленном стандартном растворе рекомбинантного фермента определяли концентрацию белка – 10 мкг/мл – с помощью аминокислотного анализа. При использовании других методов в качестве калибранта применяли БСА, который по содержанию тирозиновых остатков (3,5%) и содержанию основных аминокислот (17 %) соответствует исследуемому белку (3,3 и 17,5% соответственно). Концентрация PARP-1 в растворе, определенная методом Лоури, оказалась равна 2,6 мг/мл,

17

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Валидация Таблица 3

СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА (В МГ/МЛ) В КАНДИДАТЕ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ЦИТОКИНА Содержание белка по Лоури калибрант-лиофилизированный препарат

калибрант-БСА

Содержание белка по коэффициенту экстинкции

Содержание белка по Лоури (паспортные данные, калибрант-БСА)

1,43

1,12

1,0

1,43

Таблица 4

СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА ПО МЕТОДУ ЛОУРИ В СУБСТАНЦИИ ЦИТОКИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА С РАЗЛИЧНЫМИ АТТЕСТОВАННЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ Концентрация белка, мг/мл аттестованная характеристика калибранта – кандидата СО калибрант -БСА 1,0

1,12

1,43

1,89

2,12

2,71

т.е. на два порядка выше установленной, а определенная методом Бредфорда – 220–240 мкг/мл – в 20 раз выше. В связи с этим для характеристики своего объекта авторы применяли метод лазерной денситометрии белковых полос в полиакриламидном геле с додецил сульфатом натрия (SDS), окрашенных флюоресцентным красителем SYPRO Orange (Bio-Rad Laboratories). Связывание красителя прямо пропорционально количеству белка, обработанного SDS, и мало зависит от состава белка. Чувствительность метода совпадает с чувствительностью метода при окраске гелей серебром (1нг/пятно). При этом наблюдали линейную зависимость в диапазоне концентраций от 50 до 500 нг/пятно [2]. Рассмотрим указанные проблемы на примере изучения стандартного образца предприятия (СО) одного из цитокинов [1], в частности кандидата в СО – цитокина в буферном растворе. Результаты определения белка, а следовательно, и аттестованная характеристика СО могут различаться в пределах 40% в зависимости от выбора стандартного образца (табл. 3). Соответственно будут различаться и результаты определения белка в субстанции препарата (табл. 4), вследствие чего будут отличаться и дозы препарата. Для аттестации СО был выбран метод по коэффициенту экстинкции. Приведенные примеры свидетельствуют о необходимости обосновывать выбор метода для определения белка в новом медицинском биологическом препарате; при определении целевого белка в качестве калибранта целесообразно использовать гомологичный белок.

18

2,70

ЛИТЕРАТУРА 1. Волкова Р.А., Бектимиров Т.А. Биопрепараты, 2006, 4. – С. 25–26. 2. Biorad (1998) SYPROк Orange Protein Gel Stain Instruction Manual, prepared and edited by Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA. 3. Bradford M. M. Anal. Biochem. – 1976, 72. – P. 248–254. 4. Compton S. J, Jones C.G. Anal. Biochem. – 1985, 151. – P. 369–374. 5. Cordova-Lopez J., Gutierrez-Rojas M., Huerta M. Biotech. Techniques. – 1996; 10: 1–6. 6. Fountoulakis M, Lahm H.W. // J. Chromatog. A. – 1998, 826. – P. 109–134. 7. Gornall A.G., Bardawill C.J. and David M.M. // J. Biol. Chem. – 1949; 177. – P. 751–766. 8. Jenzano J.W. Anal. Biochem. – 1989, 159. – P. 370–376. 9. Kjeldal J.Z., Zeitschrift fur Analytische Chemie. – 1883, 22. – P. 366–382. 10. Knight M.I., Chambers P.J. Mol. Biotechnol. – 2003, 23. – P. 19–28. 11. Levin M.J. and Ellison S.A. Arch. Oral Biol. – 1973, 18. – P. 839–853. 12. Lowry O.H., Rosebrough N.I., Farr L. et al. // J. Biol. Chem. – 1951, 193. – P. 265–275. 13. Lucarini A.C. and Kilikian B.V. Biotech. Techniques. – 1999, 13. – P. 149–154. 14. Mattila P.J. Agricul. Food Chem. – 2002, 50. – P. 6419–6422. 15. Oppenheim F.G., Hay D.I. and Franzblau C. Biochemistry. – 1971, 10. – P. 4233–4238. 16. Peterson G.L. Anal. Biochem. – 1979, 100. – P. 201–220. 17. Peterson G.L Anal. Biochem. – 1977, 83. – P. 346–356. 18. Prace N.C. In Enzymology, Engel, PC, ed. // Bios Scientific Publishers: Oxford, UK. – 1996. – P. 34–41. 19. Sapan C.V., Lundblad R.L, Price N.C . Biotechnol. Appl. Biochem. – 1999, 29. – P. 99–108. 20. Sedmak J.J., and Grossberg S.E. Anal. Biochem. – 1977, 79. – P. 544–552. 21. Shan S.B. // J. Environ. Sci. Hlth. B. – 2002, 37. – P. 493–505. 22. Smith B.J., Chapeman J.R. In Molecular Biomethods Handbook, Rapley, R, Walker, J. M, eds. – Human Press: Totowa, NJ, 1998; Chapter 41. – P. 503–525. 23. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T. et al. Anal. Biochem. – 1985, 150. – P. 76–85. 24. Weiss M., Manneberg M., Juranville J.F. et al. // J. Chromatog. A. – 1998, 795. – P. 263–275.

Фармация №5, 2008

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Фармацевтическая химия и фармакогнозия © Коллектив авторов, 2008 УДК 615.322:582.975:546.1/.9].074

МИКРОЭЛЕМЕНТЫ В СЫРЬЕ И ПРЕПАРАТАХ ПАТРИНИИ СКАБИОЗОЛИСТНОЙ О.Г. Зорикова, А.Ю. Маняхин, С.П. Зорикова, Л.И. Моисеенко Горнотаежная станция Дальневосточного отделения РАН, Уссурийск

Л

екарственные растения – лучшие природВ ходе исследования фитомассы патринии сканые источники микроэлементов. При этом биозолистной получены данные, свидетельствующие микроэлементы растений чаще связаны о наличии в ней значительных количеств Al, Ca, Fe, с биологически активными веществами органичес- K, Mg и низком содержании Hg, Mo, Se (меньше прекой природы [7]. Активность любого элемента в ор- дела обнаружения). Содержание токсичных микроганическом комплексе во много элементов (Cd, Hg, Pb) в проанараз превосходит таковую в неорлизированных образцах патриСырье и настойки патринии ганических солях. Препараты еснии скабиозолистной находится скабиозолистной содержат тественных композиций макров пределах допустимых значебогатый комплекс и микроэлементов в виде водных ний, принятых для биологимикроэлементов или водно-спиртовых извлечений чески активных добавок (БАД) из растительного сырья (настойк пище на растительной основе ки, отвары, экстракты, соки растений) содержат ком- (сухие формы) СанПиН 2.3.2.560–96 [6]. С.А. Листов плекс минеральных веществ с биологически актив- и соавт. [2] относят к токсичным микроэлементам, ными соединениями. Микроэлементы растительного помимо вышеназванных, также медь, цинк и хром. происхождения лучше усваиваются организмом, так Полученные значения последних также не превыкак находятся в оптимальных «биологических» кон- шали показателей, установленных для сырья лекарцентрациях [3]. ственных растений (РЛС) [1]. Количество элементов Цель настоящего исследования – оценка содер- в надземной и подземной частях растения значительжания микроэлементов в траве и корневищах пат- но не отличалось. Некоторое превышение содержания ринии скабиозолистной (Patrinia scabiosifolia Fisch. алюминия, лития, натрия обнаружено в корневищах, ex Link.) и водно-спиртовых извлечениях из них. меди, калия, магния, никеля, стронция, цинка – в надземной части растения (табл. 1). Экспериментальная часть Таблица 1 Объекты исследования – высушенные трава СОДЕРЖАНИЕ ХИМИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ и корневища патринии скабиозолистной, заготовВ НАДЗЕМНОЙ И ПОДЗЕМНОЙ ЧАСТЯХ ПАТРИНИИ ленные на территории Приморского края, а также СКАБИОЗОЛИСТНОЙ, МГ/КГ СУХОЙ МАССЫ настойки, полученные из этого сырья. Готовили 10% настойки на 40% этаноле методом Элемент Трава Корневища мацерации при экспозиции для полной экстракции в течение 10 сут [5]. Ag — 0,07 Количественное определение содержания элеAl 1667,7 2258,0 ментов (Ag, Al, B, Ba, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Ga, B 12,3 8,5 Hg, K, Li, Mg, Mn, Mo, Na, Ni, Pb, Se, Sr, Ti, V, Zn) в образцах сырья и препаратах проводили в АнаBa 219,7 231,3 литическом центре ДВГИ ДВО РАН на эмиссионCa 19483 18957 ном спектрометре с индуктивно связанной аргоновой плазмой Plasmaquant-110. Аналитическая проба Cd 0,62 0,64 сырья измельчалась до размера частиц, проходящих Co 1,93 1,13 сквозь сито с отверстием диаметром 1 мм (№10). Переход элементов из сырья в препарат рассчитыCr 2,64 2,86 вали в % [4].

Фармация №5, 2008

19

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

Фармацевтическая химия и фармакогнозия Продолжение табл. 1 Элемент

Трава

Корневища

Cu

14,03

8,74

Fe

1047,7

1309,5

Ga

1,44

1,46

Hg

M n > N a > S r > Z n > Ti > C u > B > V > N i > L i > C r > P b > G a > C o > Cd>Hg**>Mo**>Se** – для надземной части; Ca*>K*>Al>Mg*>Fe*>Ba>Na>Mn> Ti > Z n > S r > C u > B > N i > V > C r > C o > P b > L i > G a > Cd>Hg**>Mo**>Se**>Ag** – для подземной части. Минеральный состав препаратов зависит не только от содержания элементов в сырье, но и от метода получения препаратов. Существенное влияние на выход при извлечении минеральных веществ оказывают свойства растворителя. Установлено, что наибольшие количества минеральных веществ переходят в водные и слабоспиртовые препараты (отвары, настои, свежие соки, настойки и жидкие экстракты). Водно-спиртовые препараты с содержанием спирта до 40% по количеству макро- и микроэлементов приближаются к водным. С увеличением концентрации спирта в составе растворителя (до 96%) содержание минеральных веществ в препаратах резко падает [3]. Переход различных элементов в настойки из лекарственного сырья колеблется в пределах 0,02–24,6% для травы и 0,03–6,7% – для корневищ (табл. 2). Подвижность элементов надземной части растения выше, Таблица 2

СОДЕРЖАНИЕ ХИМИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ В НАСТОЙКАХ ИЗ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ ПАТРИНИИ СКАБИОЗОЛИСТНОЙ, МГ/КГ Элемент

Настойка травы

Переход элементов из ЛРС в препарат, %

Настойка корневищ

Переход элементов из ЛРС в препарат, %

Ag